Lecture 7 2006

Курс лекций А.С. Спирина по молекулярной биологии 2006 г. Лекция 7

3’-КОНЦЕВЫЕ СТРУКТУРЫ РИБОСОМНЫХ РНК МАЛЫХ РИБОСОМНЫХ СУБЪЕДИНИЦ (30S и 40S)

E . coli 16S RNA:

5'.... G G

G m 26 A G m 26 A G C G C A U U G G C C G C G A U A U U G GAUCA

Rat 18S RNA:

CCUCC

UUA

OH

5'.... G G

G m 26 A U m 26 A G C G C A U U G G C C G C G U A U A U G GAUCAUUA

OH

”слабая” м Р Н К 5'

5'

3'

3'

ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ «СИЛУ» мРНК

(1) Инициаторный кодон: AUG > GUG > UUG > AUA, etc. (2) SD: сила спаривания с рРНК. (3) Расстояние между AUG и SD (5 – 12 нуклеотидов – оптимально). (4) Вовлеченность во вторичную и третичную структуру. (5) «Энхансерные» последовательности «вверх» от SD.

РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ

НЕЗАВИСИМАЯ ИНИЦИАЦИЯ НА ЦИСТРОНАХ ПОЛИЦИСТРОННЫХ мРНК A

3'

5'

B

INDUCED INITIATION 5'

3'

C

REINITIATION 5'

3'

Bacterial proton ATPase α 3β 3γ 1δ 1ε 1 a1b2c10-15

F1 (soluble part) B a

E c

F b

H δ

A α •

F0 (membrane part) G γ •

D β

C ε

INDEPENDENT INITIATION (A) AND TRANSLATIONAL COUPLING (B) A

3'

5'

B

INDUCED INITIATION 5'

3'

C

REINITIATION 5'

3'

ИНДУЦИРОВАННАЯ ИНИЦИАЦИЯ

L10

4 x L7/L12

rplJ

rplL

INDEPENDENT INITIATION (A) AND TRANSLATIONAL COUPLING (B, C) A

3'

5'

B

INDUCED INITIATION 5'

3'

C

REINITIATION 5'

3'

РЕИНИЦИАЦИЯ:

Trp operon of E. coli E

D

C

B

UGAUG

A UGAUG

Gal operon of E. coli E

T

K UAA GAA AUG

Полицистронные мРНК, кодирующие рибосомные белки E.coli 5'

5'

5'

5'

5'

5'

S12

S7

EF2

EF1

S10

L3

L4

L23

L2

L22

L19

S3

L16

L29

L14

L24

L5

S14

S8

L6

L18

S5

L30

L15

S13

S11

S4

α

L17

L11

L1

L10

L12

3'

S17

3'

3'

3'

3'

β

β'

3'

cопряженная трансляция с реинициацией; белки-репрессоры обведены кружком; операторы отмечены маленьким заполненным кружком

MS2 RNA: C - L - S JUNCTION

CAAGGUCUCCUAAAAG GLN GLY LEU COAT PROTEIN

LEU

LYS

LYSIS PROTEIN MET GLU THR ARG PHE PRO GLN GLN AUG GAAACCCGAUUCCCUCAGCAAUCGCAGCAAACUCCGGCAUC ASP GLY ASN PRO ILE PRO SER ALA

SER ILE

GLN ALA

GLN ALA

THR ASN

PRO SER

ALA GLY

SER ILE

1678

THR ASN ARG ARG ARG PRO UACUAAUAGACGCCGGCCAUUCAAACAUGAGGAUUACCC TYR

PHE

LYS

HIS

GLU

SER THR LEU TYR VAL LEU ILE PHE LEU ALA UUCAACUCUUUAUGUAUUGAUCUUCCUCGCGAUCUUUCUCUCGAAAUUUACCAAUCAAUU PHE ASN SER LEU CYS ILE ASP LEU PRO ARG

LEU LEU SER LEU LEU GLU ALA VAL ILE GCUUCUGUCGCUACUGGAAGCGGUGAUCCGCACAGUGACGACUUUACAGCAAUUGCUUACUUAA ALA SER VAL ALA THR GLY SER GLY ASP

ASP

ILE ASP

ARG PRO

TYR

PHE LEU

THR HIS

PRO

LEU SER

VAL SER

CYS ARG ARG GLN AUG UCGAAGACAACAAAGAAG MET SER LYS THR REPLICASE

SER LEU

THR ASP

LYS GLU

THR ASP

PHE ILE

LEU PHE

THR

THR TYR

GLN THR

GLN LYS

ASN GLN

GLN ALA

ARG LYS

GLN SER

LEU ILE

SER

LEU ILE

LEU ALA

THR TYR

LEU 1902

ТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕПРЕССИЯ

Полицистронные мРНК, кодирующие рибосомные белки E.coli 5'

5'

5'

5'

5'

5'

S12

S7

EF2

EF1

S10

L3

L4

L23

L2

L22

L19

S3

L16

L29

L14

L24

L5

S14

S8

L6

L18

S5

L30

L15

S13

S11

S4

α

L17

L11

L1

L10

L12

3'

S17

3'

3'

3'

3'

β

β'

3'

cопряженная трансляция с реинициацией; белки-репрессоры обведены кружком; операторы отмечены маленьким заполненным кружком

Рибосомный белок S8 как репрессор трансляции полицистронной L5 мРНК 16S RNA

S8 C

C

A

U G C G C G • U C G C G C G C

mRNA A

A A

G • U C G G G C U A A U G G C A A U U U A G A U G C

L5

L24

U A

5' .... U A A

A G G U U U

C

U A C A A A G A C... . 3'

5' . .. C G G

A

A

A

A A C

G • U U • G G C U A A U G C A U C G U A G • U A A A U C U • G U • G G C U A U A U • G C U U.. .. 3'

SacL1-23SрРНК

MjaL1-мРНК

TthL1-мРНК 23SрРНК мРНК

SacL1-23SрРНК

TthL1-мРНК

RIBOSOMAL PROTEIN SYNTHESIS: AUTOREGULATION translation: r-protein synthesis

r-protein release

binding r-protein mRNA

rRNA ribosome assembly

repression

Две стабильные шпильки лидерного участка мРНК, кодирующей ThrRS (а) и вторичная структура треониновой тРНК (b) A. Torres-Larios et al. (2002) Structural basis of translational control by Escherichia coli threonyl tRNA synthetase. Nature Str. Biol. 9:343-347.

ThrRS

tRNAThr

Threonyl tRNA synthetase can repress its own synthesis

Лидерный участок мРНК, кодирующей треонил-тРНК-синтетазу, и его связывание с рибосомой L. Jenner et al. (2005) Translational operator of mRNA on the ribosome: How repressor proteins exclude ribosome binding. Science 308: 120-123.

Domain 2 environment

Regulation of Threonyl-tRNA-synthetase mRNA translation

Jenner et al. Science. 2005

PHAGE MS2 RNA

36

1635

174

S YNTHETASE

L YSIS

3' 3569

130

C OAT 1308 1335

A PROTEIN

5'

390

3395

26

1902

1179

1678 1724 1761

129

MS2 RNA: C - L - S JUNCTION II A A A A G L INIT U A U C G C G U A C A U A G C SD G C A C A G C G U A A U A U C C G C G C A U A C U A U G G C U A U A U A U C G A U G C C G G C U A GAC GCAAACUC ≈ 200 nt

III C TERM C

U A A U C U A C G G C

ACUA

IV

A U A G A C G C C G GCCAUUCAAA

A

SD

GGUAAGU

I

G G A G U A C

U U

A C C C A S U INIT G UCG...........3'

CGCU.................5'

PHAGE MS2 RNA

36

1635

174

S YNTHETASE

L YSIS

3' 3569

130

C OAT 1308 1335

A PROTEIN

5'

390

3395

26

1902

1179

1678 1724 1761

129

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ СОБЫТИЙ ПРИ ИНФЕКЦИИ ФАГОМ MS2 •

Трансляция начинается с независимой инициации синтеза С белка.

•

Элонгация на С цистроне приводит к расплетанию вторичной структуры, блокирующей инициаторный участок S цистрона.

•

Начинается трансляция S цистрона (индуцированная инициация).

•

Синтезированная молекула репликазы связываются с инициаторным участком С цистрона и блокируют его (трансляционная репрессия).

•

Рибосомы, инициировавшие трансляцию С цистрона до этого момента, продолжают трансляцию, терминируют, и синтезированные молекула С белка связываются с инициаторным участком S цистрона и блокируют его (трансляционная репрессия).

•

До момента репрессии успевает синтезироваться достаточное количество репликазы на S цистроне, чтобы начать и продолжать репликацию РНК.

•

На ново-растущих +цепях РНК инициируется синтез А белка.

•

На новых РНК идет массированный синтез С белка, который накапливается и полностью блокирует синтез репликазы.

Общая схема механизма выключения трансляции мРНК метаболитом: метаболит-индуцированная стабилизация конформации, блокирующая рибосомо-связывающий участок мРНК (RBS) B.J. Tucker and R.R. Breaker (2005) Riboswitches as versatile gene control. Current Opinion in Structural Biology 15: 342-346.

Общая схема механизма выключения (слева) и включения (справа) трансляции мРНК метаболитом E. Nudler and A.S. Mironov (2003) The riboswitch control of bacterial metabolism. Trends in Biochem. Sci. 29: 11-17.

А

Б

Блокада RBS

Освобождение RBS

Схема выключения трансляции мРНК, кодирующих ферменты биосинтеза тиамина W. Winkler, A. Nahvi and R.R. Breaker (2002) Nature 419: 952-956.

Схема регуляции трансляции мРНК, кодирующих ферменты синтеза нуклеотидов аденин-связывающим аптамерным модулем A. Serganov et al. (2004) Chem. Biol. 11: 1729-1741.

АНТИСМЫСЛОВЫЕ РНК: micF RNA U

U G

C G C A U U C G G U U

3'-end :

5'-end :

HO

C G U A • G G C C A A

UUUUUU

GACAGAACUU

micF

CUUUAUCC

A

U

U GACGGC

C

CAUUUGUCUGUAAGUCUUUACUUACUGCCAUUAUUUA AGUGG

CAGGUG

C U

A

U

A

U C C

UUACUACUAUCGC

UCAUAAA

AUGAGGGUAAUAAAU A

A AUG

C

A

C A

A

AUGA

A

A C

AUAAGAUC AGCGCAAUAUUCUGG

UCACUUCCAAAA C

AGUGAUCG

A

G U G U C A A A A C

G A

C A

C

C

A

A

RNA

U

C

G

ANTISENSE RNA (induced by high osmolarity)

C

A C A G U U U A U G

U U A U U C U U A

U A A C U A A A A U P : 5'-end

A U

C

C

CUGCUCUGUUA

A

ompF

A

mRNA

(synthesis of protein that forms pores for small molecules)

: 3'-end

АНТИСМЫСЛОВЫЕ РНК: “Out RNA” transcribed from IS10 insertion sequence of Tn10 transposon

pIN SYNTHESIS OF TRANSPOSASE mRNA (“in RNA”)

TRANSPOSASE

SYNTHESIS OF ANTISENSE RNA (“out RNA”)

pOUT

GENE

Включение трансляции мРНК, кодирующей белок стрессового ответа у E. coli, стресс-индуцированной малой антисмысловой РНК F. Repoila, N. Majdalani and S. Gottesman (2003) Small noncoding RNAs, coordinators of adaptation processes in Escherichia coli: the RpoS paradigm. Mol. Microbiol. 48: 855-861.

rpoS мРНК

Низкая температура

реимущества регуляции на уровне трансляции: 1) Быстрота ответа. 2) Обратимость (и, следовательно, консервация ресурсов мРНК). 3) Точная подгонка количества синтезируемого белка к потребности клетки в нем. 4) Координированный синтез семейств белков. 5) Пространственный контроль синтеза белков в клетке. 6) Регуляция синтеза белков при клеточной дифференцировке. 7) Регуляция синтеза белков в отсутствие активности клеточного ядра (например, в раннем эмбриогенезе).

Model for internal initiation of translation on picornavirus IRESes IRES A

300

400

500 200 586 AUG 100

600

743 AUG

Pyrimidine-rich region

IRES B

5'

600

AUG

UUUC... UU

AUG scanning

500 300

700

100

800

enteroviruses rhinoviruses

cardioviruses

834 AUG

unstructured spacer, starting window

400 Pyrimidine-rich region

IRES oligopyrimidine tract

aphthoviruses

3'

SCANNING OF mRNA BY 40S-eIF COMPLEX

initiation 60S association

eIF's

40S : eIF's

translation scanning nATP

nADP + nP

i

nGTP nATP

nADP + nP

m 7 Gpp RBS

5'-UTR

i

nATP

nADP + nP

nGDP + nP

i

i

A NN AUG G INITIATION SITE

G

3'