Lecture 5 2006 Part 1

Cуществуют ли структурные домены в хроматине, соответствующие функциональным доменам генома ?

Упаковка ДНК в ядре осуществляется в несколько этапов

Петли ДНК в ядрах клеток CHO, экстрагированных 2M раствором NaCl

Ядерный матрикс

Ядерное “гало” (nuclear halo)

Существуют различные способы оценки размеров петель ДНК, закрепленных на ядерном матриксе. Согласно большинству имеющихся данных, размер петель составляет от 50 до 200 т.п.н.

Для установления относительного расположения генов в петлях ДНК было предложено анализировать относительную представленность изучаемых фрагментов ДНК в препаратах солюбилизированной и связанной с ядерным матриксом ДНК, полученных после дозированной обработки ядер нуклеазами

ACTIVE VIRAL GENES IN TRANSFORMED CELLS LIE CLOSE TO THE NUCLEAR CAGE. Cook, P.R., Lang, J., Hayday, A., Lania. L., Fried, M., Chiswell, D.J. and Wyke, A.1982. EMBO J. 1, 447-452. RNA IS SYNTHESIZED AT THE NUCLEAR CAGE. Jackson, D.A., McCready, S.J., Cook, P.R. 1981. Nature 292, 552-555. RIBONUCLEIC ACID PRECURSORS ARE ASSOCIATED WITH THE CHICK OVIDUCT NUCLEAR MATRIX. Ciejek, E.M., Nordstrom, J.L., Tsai, M.-J. and O'Malley, B.W. 1982. Biochemistry, 21, 4945-4953. REPLICATION AND TRANSCRIPTION DEPEND ON ATTACHMENT OF DNA TO THE NUCLEAR CAGE. Jackson, D.A., McCready, S,J. and Cook, P.R. 1984. J. Cell. Sci. Suppl. 1, 59-79. TRANSCRIPTION OCCURS AT A NUCLEOSKELETON. Jackson, D.A. and Cook, P.R. 1985. EMBO J. 4, 919-925. REPLICATION OCCURS AT A NUCLEOSKELETON. Jackson, D.A. and Cook, P.R. 1986. EMBO J. 5, 1403-1410. ASSOCIATION OF TRANSCRIPTIONALLY ACTIVE VITELLOGENIN II GENE WITH THE NUCLEAR MATRIX OF CHICKEN LIVER. Jost J.-P. and Seldran, M. 1984. EMBO J. 3, 2205-2208. THE OVALBUMIN GENE IS ASSOCIATED WITH THE NUCLEAR MATRIX OF CHICKEN OVIDUCT CELLS. Robinson, S.I., Nelkin, B.D. and Vogelstein, B. 1982. Cell 28: 99-106. THE ASSOCIATION OF ACTIVE GENES WITH THE NUCLEAR MATRIX OF THE CHICKEN OVIDUCT. Robinson, S.I., Small, D., Idzerda, R., McKnight, G.S. and Vogelstein, B. 1983. Nucl. Acids Res. 15, 5113-5130.

ISOLATION OF THE NUCLEAR MATRIX USING PROGRESSIVE NUCLEASE DIGESTION FOLLOFED BY HIGH SALT EXTRACTION.

ПЕРМАНЕНТНЫЕ и ЗАВИСЯЩИЕ ОТ ТРАНСКРИПЦИИ участки прикрепления ДНК к ядерному матриксу

nuclear halo

nuclear matrix

Total

nuclear matrix DNA Hybridization with cloned DNA fragments of the chicken domain of alpha-globin genes nuclear matrix DNA fromfrom active Nuclear matrix DNA nuclei of erythroblasts inactive nuclei of erythrocytes π

ori / initiation area

αD

0

permanent attachment sites

nuclear matrix DNA fromfrom inactive Nuclear matrix DNA nuclei of mature erythrocytes or active nuclei of erythroblasts sperm cells π

αA

+10 kb

ori / initiation area

0

αD

αA +10 kb

transcription-dependent attachment sites

Nm-Blasts

Nm-Cytes

Обнаружение MAR/SAR (SMAR) элементов

(SAR)

SARs/MARs

AT-богатые легкоплавкие последовательности. Предпочтительно денатурируют при высоком уровне суперспирализации ДНК Не обладают выраженной гомологией на уровне нуклеотидных последовательностей, хотя часто содержат ААТАААYААА блоки. Другой отличительной чертой является присутствие последовательностей, склонных к образованию изгибов и различных неканонических вторичных струтур Полное отсутствие видовой и тканевой специфичности Часто присутствуют на границах ДНКазо-чувствительных доменов, но встречаются и внутри геноов и даже в экзонах. Часто колокализуются с различными регуляторными элем ентами В ряде случаев, особенно часто в растительных клетках, защищают трансгены от позиционных эффектов

MAR-связывающие белки ARBP (Attachment Region Binding Protein) = MeCP2 SAF-A - p120 - SP120 - hnRNP U Lamins A, B and C, NuMA and Desmin SATB1 (special AT-rich sequence binding protein 1) узнает легкоплавкие последовательности ДНК, включающие ATC мотивы

Не существует никаких доказательств того, что все MAR элементы или значительная их часть связана с ядерным матриксом в живой клетке Протяженные фрагменты петель ДНК, организованной в хроматин, можно удалить из инкапсулированных в агарозе ядер посредством электроэлюции при физиологической ионной силе. При этом из ядер удаляются многие MAR элементы.

MAR

Нет никакой разницы между MAR и SAR элементами NUCLEAR MATRIX WITH ENTANGLED DNA

N UCLEUS NUCLEAR HALO

HS extraction

LIS extraction

MAR

treatment with restrictases NUCLEAR MATRIX WITH BOUND DNA FRAGMENTS and CLEAVED-OFF DNA

treatment with restrictases NUCLEAR MATRIX AND RELEASED DNA FRAGMENTS some of which contain MARs MAR-binding sites

MAR

spontaneous reassociation of MARs with MAR-binding sites on the nuclear matrix precipitation of the fast-sedimenting complexes THE NUCLEAR MATRIX WITH PRE-BOUND DNA FRAGMENTS

RECONS TITUTED IN VITRO COMPLEX of MARs WITH the NUCLEAR MATRIX

RES ISTANT TO HS EXTRACTION

NON-RESISTANT TO HS EXTRACTION

Electrophoretical separation according to sizes

Positions of LARs on DNA can be mapped using DNA loop excision protocol

Кластер рибосомных генов разрезается топоизомеразой II ядерного матрикса на фрагменты, размер которых кратен длине индивидуального повтора

Общий принцип метода вырезания и петель ДНК топоизомеразой II ядерного матрикса и последующего картирования границ петель