Lecture 5 2006

А.С. Спирин 2006 г.

Лекция 5

РИБОСОМА КАК МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАШИНА

РАБОЧИЙ (ЭЛОНГАЦИОННЫЙ) ЦИКЛ РИБОСОМЫ

КОНТУРЫ ДВУХ РИБОСОМНЫХ СУБЧАСТИЦ 70S РИБОСОМЫ В ДВУХ ПРОЕКЦИЯХ

ПОДВИЖНОСТЬ СТРУКТУРНЫХ БЛОКОВ РИБОСОМЫ: ВЗАИМНАЯ ПОДВИЖНОСТЬ ТРЕХ ДОЛЕЙ МАЛОЙ РИБОСОМНОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ

ПОДВИЖНОСТЬ СТРУКТУРНЫХ БЛОКОВ РИБОСОМЫ: ВЗАИМНАЯ ПОДВИЖНОСТЬ ДВУХ РИБОСОМНЫХ СУБЪЕДИНИЦ

КОНЦЕПЦИЯ СМЫКАНИЯ – РАЗМЫКАНИЯ СТРУКТУРНЫХ БЛОКОВ ПРИ ФУНКЦИОНИРОВАНИИ •Макромолекулярный комплекс, оперирующий с большими лигандами или субстратами, должен осциллировать между сомкнутым (сжатым, закрытым) и разомкнутым (более рыхлым, открытым) конформационными состояниями. •Комплекс разомкнут – структурные блоки слегка раздвинуты, – чтобы принять лиганд или реакционный субстрат, или разрешить движение лиганда внутри комплекса, или дать возможность лиганду или продукту уйти. •Комплекс сомкнут – структурные блоки тесно сжаты, – чтобы иммобилизовать и фиксировать лиганд или реакционный субстрат для осуществления точного узнавания и/или химической реакции.

ГИПОТЕЗА СМЫКАНИЯ-РАЗМЫКАНИЯ РИБОСОМЫ

A.S. Spirin (1968) Doklady Akad. Nauk SSSR 179, 1467-1470. - (1969) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 34, 197-207.

LOCKING-UNLOCKING HYPOTHESIS

Unlocked state – for accepting and moving tRNAs

Translocation

Binding of aminoacyl-tRNA

Locked state – for closing substrates and promoting chemical attack Transpeptidation

LOCKING-UNLOCKING HYPOTHESIS

Unlocked state – for accepting and moving tRNAs

Translocation

Binding of aminoacyl-tRNA

Locked state – for closing substrates and promoting chemical attack Transpeptidation

Смыкание спиралей РНК головки и плеча 30S субъединицы при связывании антикодоновой шпильки в А-участке

J.M. Ogle, F.V. Murphy, M.J. Tarry, and V. Ramakrishnan (2002) Cell 111, 721-732.

Selection of tRNA by the Ribosome Requires a Transition from an Open to a Closed Form J.M. Ogle, F.V. Murphy, M.J. Tarry, and V. Ramakrishnan Cell 111, 721-732 (2002)

Selection of tRNA by the Ribosome Requires a Transition from an Open to a Closed Form J.M. Ogle, F.V. Murphy, M.J. Tarry, and V. Ramakrishnan Cell 111, 721-732 (2002)

ПОДВИЖНОСТЬ СТРУКТУРНЫХ БЛОКОВ РИБОСОМЫ: ПОДВИЖНОСТЬ L1-ПРОТУБЕРАНЦА БОЛЬШОЙ РИБОСОМНОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ

J. Harms et al. (2001) High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107: 679-688.

ЭЛОНГАЦИОННЫЙ ЦИКЛ В ТЕРМИНАХ СМЫКАНИЯ-РАЗМЫКАНИЯ РИБОСОМЫ

Термин «молекулярная машина» применяется главным образом для обозначения макромолекулярных устройств, участвующих в относительно крупномасштабных перемещениях макромолекул или их комплексов.

Термин «молекулярная машина» применяется главным образом для обозначения макромолекулярных устройств, участвующих в относительно крупномасштабных перемещениях макромолекул или их комплексов.

В ходе таких перемещений обычно используется свободная энергия гидролиза нуклеозидтрифосфатов или других экзэргонических реакций. (В особых случаях – бактериальные жгутики - для движения может использоваться непосредственно трансмембранный ионный потенциал).

К молекулярным машинам обычно относят • системы полярного транспорта частиц вдоль микротрубочек (тубулин – кинезин и тубулин - динеин) и микрофиламентов (актин – миозин) внутри клетки, • двигательные системы жгутиков и ресничек эукариотических клеток, • мышечное сокращение, основанное на перемещении миозина вдоль актиновых филаментов, • трансмембранные АТФ-синтазы, ионные насосы и другие трансмембранные переносчики, а также • транслирующие рибосомы, • ДНК-полимеразные и РНК-полимеразные ферментные комплексы. • (Особый случай молекулярных машин – двигательная система бактериальных жгутиков).

Молекулярная машина – молекулярное устройство (макромолекулярный комплекс), способное трансформировать химическую энергию в направленное молекулярное движение.

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАШИН (по сравнению с механическими макро-машинами)

(1) Малая масса – ничтожная инерция: невозможность сохранения количества движения, в том числе использования маховиков, катящихся колес и маятников.

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАШИН (по сравнению с механическими макро-машинами)

(1) Малая масса – ничтожная инерция: невозможность сохранения количества движения, в том числе использования маховиков, катящихся колес и маятников.

(2) Гибкость и подвижность сочленений, доменов и боковых групп – отсутствие механической точности: невозможность использования жестких рычагов, толкателей, крюков, рукояток, осей для передачи усилий в трансмиссионных устройствах.

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАШИН (по сравнению с механическими макро-машинами)

(1) Малая масса – ничтожная инерция: невозможность сохранения количества движения, в том числе использования маховиков, катящихся колес и маятников.

(2) Гибкость и подвижность сочленений, доменов и боковых групп – отсутствие механической точности: невозможность использования жестких рычагов, толкателей, крюков, рукояток, осей для передачи усилий в трансмиссионных устройствах.

(3) Броуновское движение и тепловые конформационные флуктуации: мгновенная диссипация любой формы механической энергии, невозможность ее сохранения для полезного использования.

Поскольку ни механическая энергия, ни точная механика устройств не могут быть реализованы на молекулярном уровне, молекулярные машины должны рассматриваться как транспортные машины без моторов и механических трансмиссий.

Что является «движущей силой» (“motive force”), которая побуждает макромолекулярный комплекс к направленному перемещению, а его части - к перестройке, сближению, раздвиганию?

(1) Частицы молекулярных размеров и их структурные модули не требуют побудительных сил для движения в водной среде – их постоянно «тормошит» броуновское движение!

(2) Для того чтобы обеспечить направленность движения, необходим лишь механизм отбора движений в определенном направлении из беспорядочных тепловых флуктуаций («молекулярный храповик», «демон Максвелла»).

ТРИ «КИТА», на коих базируются молекулярные машины Броуновское движение как единственный источник движения машины. Отбор движений («демон Максвелла») лиганд-индуцируемая фиксация положений или ее частей. Экзэргонический химический процесс лиганда, катализируемый машиной.

– машины превращения

Brownian ratchet mechanism, thermal ratchet mechanism = = «термально-храповиковый механизм»? = = демон Максвелла

EF-Tu (EF1A) GTP form

GDP form

GTP

РИБОСОМА КАК МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАШИНА основные постулаты:

(1) Крупно-блочная подвижность макромолекулы-машины.

(2) Броуновское движение как источник внутримолекулярной подвижности и сдвигов вдоль матрицы.

(3) Химически индуцированные изменения сродства блоков макромолекулы-машины к лигандам и матрице как «демон Максвелла».

RIBOSOME MOVIE

БЕСКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ СИНТЕЗА БЕЛКА

БЕСКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА •Во второй половине 50-х г.г. в ряде лабораторий было показано, что биосинтез белка не требует целостности клетки и может продолжаться в клеточных гомогенатах и клеточных экстрактах, при условии подачи энергии в форме АТФ и ГТФ. •В 1961 г. М. Ниренберг нашел способ удаления эндогенных мРНК из клеточного экстракта бактерий и программирования белкового синтеза экзогенными мРНК и синтетическими полирибонуклеотидами путем их добавления в клеточный экстракт. Это открытие послужило началом экспериментальной расшифровки генетического кода.

Amino acids

POLY(U)-DIRECTED CELL-FREE TRANSLATION SYSTEM: RIBOSOMES Poly(U) Phe-tRNA EF1 + EF2 GTP GTP-regenerating system (PEP + PK)

Mg2+ 10 mM; K+/NH4+ 100 mM pH 7.5

Product: POLYPHENYLALANINE

POLY(U)-DIRECTED CELL-FREE TRANSLATION SYSTEM: RIBOSOMES Poly(U) Phe-tRNA EF1 + EF2 GTP GTP-regenerating system (PEP + PK)

Mg2+ 10 mM; K+/NH4+ 100 mM pH 7.5

Product: POLYPHENYLALANINE

But also Leu, Ile, Ser, Tyr and Val are incorporated in small amounts!

ОШИБКИ ТРАНСЛЯЦИИ: ЛОЖНОЕ КОДИРОВАНИЕ

Ложное кодирование на poly(U) 5' Phe

tR N A

3' 5' tR N A

2

L eu

3' 5' tR N A

4

L eu

3' 5' tR N A

1

Ser

3' 5' tR N A

1

Val

3'

G • U A U A U

U †• U A U G U

C A A

U U U

U V• U G U A U

U V• U A U C U

3'

5' Ile

tR N A 5'

3'

3'

5' tR N A

L eu

3

5'

3'

3'

5' tR N A

L eu

5

5'

3'

3'

5' tR N A

Tyr

5'

3'

3'

5' tR N A

5'

2

Val

3'

G • U A U U U

G • U A U G U

U A A

*

U U U

G Q• U U U A U

G • U A U C U

3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5'

Ложное кодирование: проскок терминирующих кодонов

КИНЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА ЛОЖНОГО КОДИРОВАНИЯ При комплементарном и частично комплементарном спаривании триплетов разница в константах сродства определяется в основном разницей времен жизни комплексов (т.е. скоростями диссоциации), тогда как скорости формирования комплексов не сильно различаются. J. Ninio, 1974.

КИНЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА ЛОЖНОГО КОДИРОВАНИЯ При комплементарном и частично комплементарном спаривании триплетов разница в константах сродства определяется в основном разницей времен жизни комплексов (т.е. скоростями диссоциации), тогда как скорости формирования комплексов не сильно различаются. Отсюда следует, что точность выбора антикодона тРНК будет уменьшаться при увеличении скорости последующей стадии элонгационного цикла и возрастать при задержке последующей стадии (транспептидации). J. Ninio, 1974.

РАБОЧИЙ (ЭЛОНГАЦИОННЫЙ) ЦИКЛ РИБОСОМЫ

РАБОЧИЙ ЦИКЛ ТРАНСЛИРУЮЩЕЙ РИБОСОМЫ (ЭЛОНГАЦИОННЫЙ ЦИКЛ)

Связывание

КИНЕТИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ («РЕДАКТИРОВАНИЕ») КОДИРОВАНИЯ R S * : m R N A + A a -tR N A : E F 1 A : G T P (1 ) s c a n n in g (R S * : m R N A ) : (A a -tR N A : E F 1 A : G T P ) (2 ) re c o g n itio n R S * : m R N A : A a -tR N A : E F 1 A : G T P (3 ) G T P h y d ro ly s is R S * : m R N A : A a -tR N A : (E F 1 A : G D P ) + P (4 ) E F 1 re le a s e R S * : m R N A : A a -tR N A + E F 1 A : G D P (5 ) lo c k in g in a s ite R S * : m R N A : A a -tR N A

(4 ') c o rre c tio n R S * : m R N A : (E F 1 A : G D P ) + A a -tR N A ( 5 ') v a c a t i o n R S* : m R N A + EF1A : G D P

(6 ) tra n s p e p tid a tio n R S * : m R N A : P e p t-tR N A

c o n tin u a tio n o f th e c y c le

i

re tu rn to th e s ta rt

ОШИБКИ СВЯЗЫВАНИЯ Аа-тРНК: СДВИГ РАМКИ СЧИТЫВАНИЯ

ИНДУКЦИЯ СИНТЕЗА АНТИЗИМА ОРНИТИН-ДЕКАРБОКСИЛАЗЫ ПОЛИАМИНАМИ ПУТЕМ СДВИГА РАМКИ мРНК 3'

SER

ASP

5'

UGC UCC UGAU GUC Polyamines

STOP

+1 shift (after 35 upstream codons)

ОШИБКИ ТРАНСЛОКАЦИИ

“НЕПОТРИПЛЕТНАЯ” ТРАНСЛОКАЦИЯ «Проскальзывание» по гомополимерному участку: Lys-tRNA 3'

UUU*5'

AAAAAAAAA

Phe-tRNA 3'

AAG5'

UUUUUUUUU

“НЕПОТРИПЛЕТНАЯ” ТРАНСЛОКАЦИЯ «Проскальзывание» по гомополимерному участку: Lys-tRNA 3'

Phe-tRNA

UUU*5'

3'

AAAAAAAAA

AAG5'

UUUUUUUUU

«Соскальзывание» на смежный триплет: Leu-tRNA 3'

GAG5'

CUU U → C UUU (+1)

Leu-tRNA 3'

AAU*5'

U UUA → UUU A (-1)

“НЕПОТРИПЛЕТНАЯ” ТРАНСЛОКАЦИЯ «Проскальзывание» по гомополимерному участку: Lys-tRNA 3'

Phe-tRNA

UUU*5'

3'

AAAAAAAAA

AAG5'

UUUUUUUUU

«Соскальзывание» на смежный триплет: Leu-tRNA 3'

Leu-tRNA

GAG5'

3'

CUU U → C UUU (+1)

AAU*5'

U UUA → UUU A (-1) «Прыжок»:

Met

Lys Ser

Leu

Gly

Tyr

Leu

Arg

Gly

Pro

AUG AAA AGC UUA GGG UAU CUU UAG CUA CGG GGC CCU (мутантная β-галактозидаза)

HIV

mRNA:

gag-pol

A

JUNCTION

Asn 5'- AAU

6

C A

Phe UUU

7

Leu

8

UUA

U

GG GAA GA Arg

9

Glu

U C C U U C C G G U C

G G G A A G G C C A G

10

SLIPPAGE -1

A

G

GAAUUAAAG GGC -3'

СДВИГ РАМКИ ПРИ ТРАНСЛЯЦИИ RF2-мРНК В ОТСУТСТВИЕ RF2

25 sense codons, then UGA

RF2

A

p e p tid y l-tR N A G ly U

G A C G CA G A U C A C G A U G G A ta k e o ff s ite

U C C C G A U

G G s te m -lo o p G C U A U C la n d in g U s ite v a r i a b l e s p a c e r A U A G A A A U A CC U CA U A A U U A A G A G A U U A U U G G A U U A G G U 50nt G A P

B

U

C C G A U A ta k e o ff G s ite G U A G A C G C A G A U C A C G

U C G G C U A U C U A U

G G ly

L eu

A G A A A U A CC U C A U A A U U A A G A G A U U A U U G G A U U A G G U la n d in g s ite

tm RNA

21-ая АМИНОКИСЛОТА И ЕЕ КОДИРОВАНИЕ

(Codon UGA)

G U

G A C G U U

C U G C A

G G

C C

C

A U A

C

.....GC GCU CGU GUC

A U C

C G C G G • U G C C G A C G UG A U AAU GGC GCA AUG.....

СПЕЦИАЛЬНАЯ ШПИЛЬКА В 3’-НЕТРАНСЛИРУЕМОЙ ОБЛАСТИ мРНК, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ УСТАНОВКУ Sec-tRNA НА UGA КОДОН В ТРАНСЛИРУЕМОЙ ОБЛАСТИ

Robert Walczak, Philippe Carbon, and Alain Krol (1998) An essential non-Watson-Crick base pair motif in 3’UTR to mediate selenoprotein translation RNA 4:74-84

SELENOCYSTEINE INSERTION ELEMENT OF 3’-UTR IN EUKARYOTIC mRNA

Robert Walczak, Eric Westhof, Philippe Carbon, and Alain Krol (1996) A novel RNA structural motif in the selenocysteine insertion element of eukaryotic selenoprotein mRNAs RNA 2:367-379