GENETICA MOLECULAR 1
2
3
13 / 11 / 200
Los números del genoma humano Total de genes estimado Genes identificados
20.000-25.000
19073
Genes secuencia conocida Descripción fenotípica Otros
Genes mitocondriales
12527 374 6172
enes localizados por cromosoma
Genes con localización física 1097
11419
717 617
206
37
429
532
683
508
406
427
413
717
601
641 356
328
443
664
160
727
277
139
286
45
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Características de los genes humanos que codifican proteínas. Característica
Mediana
Promedio
Tamaño exones
122 bp
145 bp
43.317
Número exones
7
8.8
3.501
Tamaño intrones
1.023 bp
3.365 bp
27.238
3’ UTR
400 bp
770 bp
689 (crom. 22)
5’ UTR
240
300
463 (crom. 22)
1.100 bp
1.340 bp
1.804
367 aa
447 aa
14 kb
27 kb
Secuencia codificadora (CDS) Extensión genómica
Tamaño muestra
1.804
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Los genes humanos varían enormemente en tamaño y cantidad de exones
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La densidad de genes no es homogénea
Región del HLA de tipo III en el cromosoma 6p21.3
Gen de la distrofina en el cromosoma Xp21
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La densidad génica se correlaciona con el bandeo cromosómico
Xp21
6p21.3
BANDAS G Claras Comparativamente ricas en GC Sensibles a la DNAsa Condensación tardía en el ciclo celular Replicación temprana Alta densidad génica Pobres en secuencias repetidas
oscuras Comparativamente ricas en AT Insensibles a la DNAsa Condensación temprana en el ciclo celular Replicación tardía Baja densidad génica Ricas en secuencias repetidas 8
Aunque es raro, existen genes solapados y anidados A) Región del HLA de tipo III en el cromosoma 6p21.3
B) Intrón 26 del gen de la neurofibromatosis tipo 1
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El tamaño de los genomas No existe una buena correlación entre el tamaño del genoma y complejidad genética Existe una tamaño mínimo del genoma necesario para incrementar la complejidad
Se detecta una gran variación en el tamaño del genoma dentro de un mismo phylum
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Secuencias de DNA repetitivas
Generalmente, los genes son codificados por secuencias únicas de DNA Los genomas más grandes dentro de un mismo phylum no contienen necesariamente más genes Una gran parte del ADN repetitivo puede proceder de los elementos transponibles
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Contenido en repeticiones del genoma humano Derivados de elementos transponibles
Pseudogenes procesados
Repeticiones de secuencias sencillas
Duplicaciones segmentales 10-300 kb
Bloques de secuencias repetidas en tándem (centrómeros, telómeros,...)
Derivados de trasposones
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Contenido en repeticiones del genoma humano
Elementos
H. sapiens
D. melanogaster
C. elegans
A. thaliana
LINE/SINE
33.40%
0.70%
0.40%
0.50%
LTR
8.10%
1.50%
0.00%
4.80%
DNA
2.80%
0.70%
5.30%
5.10%
Total
44.40%
3.10%
6.50%
10.50%
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ORGANIZACION GENERAL DEL GENOMA HUMANO
GENOMA NUCLEAR
GENOMA MITOCONDRIAL
genes y secuencias relacionadas 25%
ADN extragénico 75%
Codificante 2.5%
No codificante 22.5%
Moderada o altamente Repetido 30%
35000 genes proteínas
500 RNA funcionales
Repetidos en tándem o agrupados 18%
Repetidos dispersos 12%
Satélite
4 genes rRNA Cortos (SINEs)
Largos (LINEs)
>40 tRNA
Minisatélites
Microsatélite
>500 otros RNA funcionales
Intrones, secuencias no traducidas
Secs. únicas o bajo número de copias 45%
Pseudogenes
Fragmentos génicos
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INGENIERIA GENETICA Deberán quedar bien claros los siguientes puntos: •¿Cómo se manipula el DNA? •Las endonucleasas (enzimas) de restricción • Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación, organismo huésped, selección de vectores •Vectores eucarióticos •Organismos transgénicos •Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto •Mapas de restricción •Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción •La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) •La secuenciación del DNA
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Manipulación del DNA Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse en un conjunto heterogéneo de secuencias. Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de DNA específico Esta tecnología se denomina: Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o ingeniería genética Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica
Propiedad básica del DNA que permite su manipulación: El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado 16
Herramienta básica Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato. •Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar) •Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes 5´-GGATCC- 3´ 3´-CCTAGG- 5´
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EcoRI: E. Coli BamHI: Bacillus amyloliquefaciens
Dos tipos de cortes: •Corte plano: extremos romos •Corte escalonado: extremos pegajosos o cohesivos 18
Herramienta básica
Las enzimas de restricción tipo II: Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos 19
Clonación del DNA •DNA foráneo (secuencia que se desea clonar) •Vector de clonación (vehículo)
Vector híbrido
•Organismo huésped (E. Coli) •Selección de vectores
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C l o n a c i ó n d e l D N A
Vectores de clonación
Fago λ
•Fago λ (2 sitios de corte) < 24 kb
•Cromosomas artificiales P1 (derivados del bacteriófago P1, pueden aceptar insertos de 80 y 100 kb
21
C l o n a c i ó n
Vectores de clonación
•Cósmido: extremos cos λ + DNA plásmido (origen replicación) + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb •BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plásmido F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas
Cósmido
d e l D N A 22
C l o n a c i ó n d e l D N A
Huésped: E. coli Inserción del vector híbrido en el huésped: •Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma •Fago λ (transducción, inserción en DNA huésped) •Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido)
23
C l o n a c i ó n
Selección de vectores híbridos •Plásmido: resistencia a antibióticos
d e l D N A
•Fago λ : Inserción en E. coli (sólo se puede empaquetar el DNA de λ si contiene el inserto foráneo)
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C l o n a c i ó n d e l D N A
Obtención de la secuencia que se clona
•Un gen •Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene intrones): uso de la transcriptasa inversa que hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina humana recombinante en bacterias) •Síntesis automatizada de DNA in vitro: a partir de la secuencia aminoacídica se puede hacer DNA con la ayuda del código (no región promotora ni controladora de la expresión) ~100bp •Fragmentos del genoma por digestión con enzimas de restricción (aleotoria o perdigonada, Shotgun) •Se obtiene genoteca, juego completo fragmentos clonados del genoma del organismo 25
Vectores eucarióticos
Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas •Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs): Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de levadura + (telómero levadura) Puede incorporar más de 500 kb de DNA
Resistencia a antibiótico (p.e., ampr)
Origen de replicación del DNA de levadura (ARS) Región centromérica (CEN)
Origen de replicación bacteriano (ori)
Linealización (con endonucleasas) y adición de extremos teloméricos
Telómero
ampr
ori
CEN ARS
Telómero 26
Separación fragmentos
Reptación de los fragmentos a través del gel de agarosa
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DNA teñido con bromuro de etidio emite fluorescencia con luz UV
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Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos
Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda
•Transferencia en Southern (Southern blotting) •Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con RNA
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Mapas de restricción mediante enzimas de restricción
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La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
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•Secuenciación
Usos de la PCR
•DNA fósil (evolución,
arqueología, historia) DNA traza Fósiles Mamut lanudo (40000 años) Abraham Lincoln (síndrome de Marfan, afecta tejido conectivo, fribrilina) Hombre Neandertal -> Hablaba como nosotros?
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Secuenciación de DNA La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA permite un conocimiento más completo de la estructura y función de un gen. •La base molecular de mutaciones específicas en un gen pueden investigarse •Las secuencias del DNA han revelado regiones reguladoras comunes a todos los genes •La comparación de secuencias de diferentes especies provee estimas de las tasas de evolución molecular •Secuenciación de genomas: estructura del genoma
Disoxi
Métodos: Secuenciación manual (inicial) Químico (Maxam y Gilbert 1977) Didesoxi (Sanger 1977) Secuenciación automatizada (1986,…)
Didesoxi35
Secuenciación del DNA
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Secuenciación automatizada del DNA
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