Genetica Molecular

  • Uploaded by: kremenchutzky
  • 0
  • 0
  • June 2020
  • PDF

This document was uploaded by user and they confirmed that they have the permission to share it. If you are author or own the copyright of this book, please report to us by using this DMCA report form. Report DMCA


Overview

Download & View Genetica Molecular as PDF for free.

More details

  • Words: 1,391
  • Pages: 41
GENETICA MOLECULAR 1

2

3

13 / 11 / 200

Los números del genoma humano Total de genes estimado Genes identificados

20.000-25.000

19073

Genes secuencia conocida Descripción fenotípica Otros

Genes mitocondriales

12527 374 6172

enes localizados por cromosoma

Genes con localización física 1097

11419

717 617

206

37

429

532

683

508

406

427

413

717

601

641 356

328

443

664

160

727

277

139

286

45

4

Características de los genes humanos que codifican proteínas. Característica

Mediana

Promedio

Tamaño exones

122 bp

145 bp

43.317

Número exones

7

8.8

3.501

Tamaño intrones

1.023 bp

3.365 bp

27.238

3’ UTR

400 bp

770 bp

689 (crom. 22)

5’ UTR

240

300

463 (crom. 22)

1.100 bp

1.340 bp

1.804

367 aa

447 aa

14 kb

27 kb

Secuencia codificadora (CDS) Extensión genómica

Tamaño muestra

1.804

5

Los genes humanos varían enormemente en tamaño y cantidad de exones

6

La densidad de genes no es homogénea

Región del HLA de tipo III en el cromosoma 6p21.3

Gen de la distrofina en el cromosoma Xp21

7

La densidad génica se correlaciona con el bandeo cromosómico

Xp21

6p21.3

BANDAS G Claras Comparativamente ricas en GC Sensibles a la DNAsa Condensación tardía en el ciclo celular Replicación temprana Alta densidad génica Pobres en secuencias repetidas

oscuras Comparativamente ricas en AT Insensibles a la DNAsa Condensación temprana en el ciclo celular Replicación tardía Baja densidad génica Ricas en secuencias repetidas 8

Aunque es raro, existen genes solapados y anidados A) Región del HLA de tipo III en el cromosoma 6p21.3

B) Intrón 26 del gen de la neurofibromatosis tipo 1

9

El tamaño de los genomas No existe una buena correlación entre el tamaño del genoma y complejidad genética Existe una tamaño mínimo del genoma necesario para incrementar la complejidad

Se detecta una gran variación en el tamaño del genoma dentro de un mismo phylum

10

Secuencias de DNA repetitivas

Generalmente, los genes son codificados por secuencias únicas de DNA Los genomas más grandes dentro de un mismo phylum no contienen necesariamente más genes Una gran parte del ADN repetitivo puede proceder de los elementos transponibles

11

Contenido en repeticiones del genoma humano Derivados de elementos transponibles



Pseudogenes procesados



Repeticiones de secuencias sencillas



Duplicaciones segmentales 10-300 kb



Bloques de secuencias repetidas en tándem (centrómeros, telómeros,...)



Derivados de trasposones

12

Contenido en repeticiones del genoma humano

Elementos

H. sapiens

D. melanogaster

C. elegans

A. thaliana

LINE/SINE

33.40%

0.70%

0.40%

0.50%

LTR

8.10%

1.50%

0.00%

4.80%

DNA

2.80%

0.70%

5.30%

5.10%

Total

44.40%

3.10%

6.50%

10.50%

13

ORGANIZACION GENERAL DEL GENOMA HUMANO

GENOMA NUCLEAR

GENOMA MITOCONDRIAL

genes y secuencias relacionadas 25%

ADN extragénico 75%

Codificante 2.5%

No codificante 22.5%

Moderada o altamente Repetido 30%

35000 genes proteínas

500 RNA funcionales

Repetidos en tándem o agrupados 18%

Repetidos dispersos 12%

Satélite

4 genes rRNA Cortos (SINEs)

Largos (LINEs)

>40 tRNA

Minisatélites

Microsatélite

>500 otros RNA funcionales

Intrones, secuencias no traducidas

Secs. únicas o bajo número de copias 45%

Pseudogenes

Fragmentos génicos

14

INGENIERIA GENETICA Deberán quedar bien claros los siguientes puntos: •¿Cómo se manipula el DNA? •Las endonucleasas (enzimas) de restricción • Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación, organismo huésped, selección de vectores •Vectores eucarióticos •Organismos transgénicos •Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto •Mapas de restricción •Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción •La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) •La secuenciación del DNA

15

Manipulación del DNA Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse en un conjunto heterogéneo de secuencias. Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de DNA específico Esta tecnología se denomina: Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o ingeniería genética Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica

Propiedad básica del DNA que permite su manipulación: El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado 16

Herramienta básica Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato. •Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar) •Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes 5´-GGATCC- 3´ 3´-CCTAGG- 5´

17

EcoRI: E. Coli BamHI: Bacillus amyloliquefaciens

Dos tipos de cortes: •Corte plano: extremos romos •Corte escalonado: extremos pegajosos o cohesivos 18

Herramienta básica

Las enzimas de restricción tipo II: Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos 19

Clonación del DNA •DNA foráneo (secuencia que se desea clonar) •Vector de clonación (vehículo)

Vector híbrido

•Organismo huésped (E. Coli) •Selección de vectores

20

C l o n a c i ó n d e l D N A

Vectores de clonación

Fago λ

•Fago λ (2 sitios de corte) < 24 kb

•Cromosomas artificiales P1 (derivados del bacteriófago P1, pueden aceptar insertos de 80 y 100 kb

21

C l o n a c i ó n

Vectores de clonación

•Cósmido: extremos cos λ + DNA plásmido (origen replicación) + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb •BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plásmido F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas

Cósmido

d e l D N A 22

C l o n a c i ó n d e l D N A

Huésped: E. coli Inserción del vector híbrido en el huésped: •Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma •Fago λ (transducción, inserción en DNA huésped) •Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido)

23

C l o n a c i ó n

Selección de vectores híbridos •Plásmido: resistencia a antibióticos

d e l D N A

•Fago λ : Inserción en E. coli (sólo se puede empaquetar el DNA de λ si contiene el inserto foráneo)

24

C l o n a c i ó n d e l D N A

Obtención de la secuencia que se clona

•Un gen •Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene intrones): uso de la transcriptasa inversa que hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina humana recombinante en bacterias) •Síntesis automatizada de DNA in vitro: a partir de la secuencia aminoacídica se puede hacer DNA con la ayuda del código (no región promotora ni controladora de la expresión) ~100bp •Fragmentos del genoma por digestión con enzimas de restricción (aleotoria o perdigonada, Shotgun) •Se obtiene genoteca, juego completo fragmentos clonados del genoma del organismo 25

Vectores eucarióticos

Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas •Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs): Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de levadura + (telómero levadura) Puede incorporar más de 500 kb de DNA

Resistencia a antibiótico (p.e., ampr)

Origen de replicación del DNA de levadura (ARS) Región centromérica (CEN)

Origen de replicación bacteriano (ori)

Linealización (con endonucleasas) y adición de extremos teloméricos

Telómero

ampr

ori

CEN ARS

Telómero 26

Separación fragmentos

Reptación de los fragmentos a través del gel de agarosa

27

DNA teñido con bromuro de etidio emite fluorescencia con luz UV

28

Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos

Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda

•Transferencia en Southern (Southern blotting) •Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con RNA

29

Mapas de restricción mediante enzimas de restricción

30

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

31

32

33

•Secuenciación

Usos de la PCR

•DNA fósil (evolución,

arqueología, historia) DNA traza Fósiles Mamut lanudo (40000 años) Abraham Lincoln (síndrome de Marfan, afecta tejido conectivo, fribrilina) Hombre Neandertal -> Hablaba como nosotros?

34

Secuenciación de DNA La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA permite un conocimiento más completo de la estructura y función de un gen. •La base molecular de mutaciones específicas en un gen pueden investigarse •Las secuencias del DNA han revelado regiones reguladoras comunes a todos los genes •La comparación de secuencias de diferentes especies provee estimas de las tasas de evolución molecular •Secuenciación de genomas: estructura del genoma

Disoxi

Métodos: Secuenciación manual (inicial) Químico (Maxam y Gilbert 1977) Didesoxi (Sanger 1977) Secuenciación automatizada (1986,…)

Didesoxi35

Secuenciación del DNA

36

Secuenciación automatizada del DNA

37

38

39

40

41

Related Documents


More Documents from "Vanessa"

Antigua
May 2020 20
Glucidos 2
June 2020 9
Edad Media
May 2020 17
Citoesqueleto
June 2020 2
Aminoacidos 1
June 2020 6