Esercitazione Sierologia

PRINCIPI DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA Anamnesi e sintomi forniscono il primo indizio per la diagnosi di un’infezione virale. I risultati ottenuti in laboratorio consentono di: 1) confermare la diagnosi mediante l’identificazione dell’agente eziologico virale 2) definire il decorso della malattia 3) monitorare la malattia dal punto di vista epidemiologico 4) indirizzare il medico per la gestione del paziente Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

PROCEDURE DI LABORATORIO PER LA DIAGNOSI DI INFEZIONI VIRALI 1)Osservazione al microscopio elettronico del virus 2) Isolamento e identificazione 3) Dimostrazione di componenti virali (proteine, enzimi, acidi nucleici) 4) Valutazione della risposta immunitaria umorale (sierologia) Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

4) VALUTAZIONE DELLA R.I. UMORALE Importanti per: 1.infezioni acute in soggetti immunocompetenti 2.diagnosi di infezioni dovute a virus di difficile isolamento 3.Infezioni in cui la R.I. coincide con comparsa dei sintomi (Rosolia, Epatite A ecc.) 4.virus che causano malattie a lento decorso dopo la sieroconversione (HIV, HTLV-I, virus della rabbia) Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

4) VALUTAZIONE DELLA R.I. UMORALE

Importanti ancora per: 5. scopi epidemiologici 6. valutazione del decorso di un’infezione 7. infezione 1aria o reinfez. (f. acuta o cronica)

Non applicabile: 1. quando i sintomi sono precedenti alla R.I. (diagnosi retrospettiva non utile al paziente) 2. in soggetti immunodepressi occorre valutare caso per caso Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

CRITERI X DIAGNOSTICARE INFEZIONE PRIMARIA (acuta o recente): Diagnosi classica su doppio campione siero 1. SIEROCONVERSIONE (dimostrazione di avvenuta sintesi di Ac specifici tra siero acuto e siero convalescente) 2. AUMENTO DEL TITOLO di Ac SPECIFICI (>= 4X) tra siero acuto e convalescente Diagnosi rapida su unico campione (classe Ig) DIMOSTRAZ. IgM SPECIFICHE (presenza transitoria dall’inizio a poche settimane dopo l’infezione) Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

DIAGNOSI di INFEZIONE SECONDARIA (reinfezione o riattivazione): diagnosi classica su doppio campione siero AUMENTO DEL TITOLO di Ac SPECIFICI (>= 4X) tra siero acuto e convalescente diagnosi rapida su unico campione (classe Ig) DIMOSTRAZ. IgM SPECIFICHE (assenza o presenza appena rilevabile) Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

Tipico Profilo Sierologico dopo Infezione Acuta

Notare che in una reinfezione, le IgM possono essere assenti o presenti transitoriamente a basso livello Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

Il decorso di un’infezione può essere determinato valutando un PROFILO SIEROLOGICO (presenza e titolo di Ac diversi diretti contro Ag virali diversi) Es. Mononucleosi infettiva da EBV

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Es. epatite acuta da HBV

LIMITI DELLA SIEROLOGIA

* Possibilità di risultati falsi positivi o falsi negativi * Formazione di i.c. in circolo (es. Epatite B) che impediscono di evidenziare di Ac * Possibilità di reazioni crociate tra virus differenti

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I saggi SIEROLOGICI Utilizzati per la determinazione, identificazione e quantificazione di antigeni virali e anticorpi in un campione Basati sulla formazione di I.C. L’avvenuto legame Ag-Ac è evidenziato tramite diverse modalità di rilevazione:

•Inibizione dell’Emoagglutinazione (IEA) •Neutralizzazione •Fissazione del complemento •Immunofluorescenza •Test ELISA •Immunoblot (Western Blot) Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

LE REAZIONI SIEROLOGICHE Caratteristiche • Riconoscimento specifico Ag –Ac (I.C.) • Rilevano, dirett. o indirettamente, la formazione di un I.C. • 2 reagenti: un siero (anticorpi) e un antigene (ad es. proteine virali). Almeno uno dei due deve essere a concentrazione nota Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

LE REAZIONI SIEROLOGICHE Applicazioni • Disponendo di un antigene noto è possibile dimostrare in quel siero la presenza di anticorpi specifici per quell’antigene • Disponendo di un siero contenente un anticorpo noto è possibile dimostrare in quel materiale la presenza di un antigene riconosciuto dall’anticorpo Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

Reazione di Emoagglutinazione

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Emoagglutinazione Fase 1:Diluizioni seriali del virus vengono incubate con una quantità fissa di G.R. virus agglutinante

virus non agglutinante

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Emoagglutinazione Fase 2: Se il virus agglutina, i G.R. sedimentano formando un ampia area. Diversamente formano un sedimento compatto virus agglutinante

virus non agglutinante

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Emoagglutinazione Fase 2: virus agglutinante

In sintesi virus non agglutinante

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Emoagglutinazione

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Inibizione dell’Emoagglutinazione Principio: Se in un siero sono presenti virus agglutinante, quando contatto con il virus, questo capacità e l’ulteriore aggiunta provoca agglutinazione.

Ac contro un lo metto a perde la sua di G.R. non

Se il siero non contiene Ac contro il virus, questo è libero di agglutinare i G.R.

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Inibizione dell’Emoagglutinazione

Il titolo anticorpale corrisponde alla più alta diluizione in cui si osserva ancora inibizione dell’EA

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Test di NEUTRALIZZAZIONE Basata sulla proprietà degli anticorpi neutralizzanti di interferire e bloccare l’infettività del virus (di solito bloccano il legame con il recettore) Un set di anticorpi viene mescolato ad una preparazione virale; l’infettività del virus viene misurata su cellule indicatori. Permette la definizione dei diversi sierotipi di un virus: ( HSV1 e HSV2, Poliovirus 1, 2 e 3, Coxsackie A e B) Utile sia in diagnostica che per lo sviluppo di vaccini Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

Test di NEUTRALIZZAZIONE

dopo 5 giorni cellule KB

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Fissazione del complemento

IMPORTANTE: occorre scomplementare il siero del paziente Presenza di Ac nel siero

Complemento fissato

Assenza di Ac nel siero

Complemento libero Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

Fissazione del Complemento

Fissazione del Complemento in Micropiastra. Le righe 1 e 2 sono ottenute con campioni di siero rispettivamente in fase acuta e convalescente. (usate diluzioni 1 a 2 dei sieri). L’incremento del titolo è significativo e indica una recente infezione. Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

Test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) • Struttura del supporto di matrice inerte dove avviene il test ELISA

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Test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) • 1° step: si aggiunge il siero del paziente

Si forma l’immunocomplesso Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

Test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 2° step: A) Ab α IgG (IgM) umane se si ricercano gli Ab B) Ab α Ag specifico se si ricercano gli Ag virali Questi Ab sono coniugati con un enzima che catalizza una reazione colorimetrica (di solito una perossidasi)

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Test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 3° step: aggiunta del cromogeno, substrato della reazione catalizzata dalla perossidasi. L’intensità della colorazione è proporzionale alla quantità di Ab (o Ag) specifici presenti nel siero. La lettura è effettuata tramite uno fotometro a lunghezza d’onda determinata (tra 450 e 650 nm)

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TEST ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Virologia Applicata E.A. Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

ELISA for HIV antibody

Microplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity Dr. Massimo Giorgi unipi -2008

IMMUNOFLUORESCENZA per la ricerca degli Ab • Come principio è analoga al test ELISA

Si legge al microscopio a fluorescenza a data λ

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IMMUNOBLOT (Western Blot)

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Western Blot HIV-1 Western Blot • Lane1: Positive Control • Lane 2: Negative Control • Sample A: Negative • Sample B: Indeterminate • Sample C: Positive

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