Croma Intro 06 & 09-02-09

Es la porción del cromatograma donde sólo se aprecia la elución de la fase móvil, sin señal debida al soluto.

Es el tiempo requerido para que la fase móvil traslade un analito desde el punto de inyección, hacia la fase estacionaria, a través de esta, hasta el detector, hasta el ápice del pico. El volumen de retención (VR), es el producto del tiempo de retención por el caudal volumétrico, según: VR = t R F C

Es el tiempo requerido para que la fase móvil traslade un analito desde el punto de inyección, hacia la fase estacionaria, a través de esta, hasta el detector, hasta el ápice del pico. El volumen de retención (VR), es el producto del tiempo de retención por el caudal volumétrico, según: t´R = tR - tM; V´R = VR – VM

En función del tiempo y volumen de retención se define como:

VR FC = tR En función de los parámetros de la columna se define como:

πd 2 L FC = ε 4 tM donde d = diámetro interno de la columna, L = longitud de la columna, ε= porosidad total del material de empaque (fase estacionaria). Para materiales de empaque sólidos, el valor de ε se encuentra entre 0.35 y 0.45, mientras que para materiales de empaque porosos se hallará entre 0.70 y 0.90. En columnas capilares ε = 1.

Puede estimarse el flujo volumétrico apropiado si se tienen columnas de distinto diámetro interno, asumiendo que los materiales de empaque de las dos columnas poseen densidades iguales, utilizándose la siguiente ecuación: (FC )1 (FC )2 = 2 d1 d22

Ejemplo: Una análisis se ha desarrollado con una columna de 4.6 mm de diámetro interno a una velocidad de flujo de 2 mL/min. Si se desea obtener la misma velocidad lineal del analito en una columna de 9.4 mm de diámetro interno, ¿cuál debe ser la velocidad de flujo volumétrico?

La velocidad lineal promedio u de la fase móvil se mide como el tiempo de migración de un soluto no retenido a través de la columna:

Ejemplo: La velocidad lineal promedio en un sistema cromatográfico fue 43 cm/s a través de una columna de 15 m. ¿Cuál es el valor de tM?

A la misma velocidad de flujo, las columnas con distintos diámetros internos operan a diferentes velocidades. Para comparar el desempeño entre columnas objetivamente es necesario operarlas a la misma velocidad lineal.

La siguiente escala muestra la relación existente entre velocidad lineal y velocidad de flujo para columnas empacadas de diámetros selectos (se asume que tienen la misma densidad de empacado).

Es una medida de qué tanto una molécula de muestra es retenida en la fase estacionaria en la columna durante una separación isocrática. Se define como el cociente entre el tiempo adicional que le toma a un soluto eluir respecto a un soluto no retenido (para el cual k´=0), entre el tiempo de elución de un soluto no retenido:

t R − t M t´ R KVS VR − VM k´= = = = tM tM VM VM

donde VS y VM son los volúmenes de la fase estacionaria y la fase móvil, respectivamente. Según las ecuaciones anteriores, se deduce que k´puede variar entre 0 e infinito. Si el soluto no se retiene, su tR = tM, y si se retiene de forma irreversible, su tR=∞.

El valor de k´ puede ajustarse modificando la fuerza de elución de la fase móvil: • En fase reversa, k´ disminuye al aumentar la proporción del componente orgánico (MeOH, ACN, THF), y al aumentar la proporción de agua. • En fase normal, k´ disminuye al aumentar la proporción del solvente polar y aumenta al aumentar la proporción del no polar. • En cromatografía de intercambio iónico, k´ disminuye al aumentar la concentración del contraión (buffer o sal agregada), o la proporción de solvente orgánico. • La variación de pH de la fase móvil puede aumentar o disminuir k´ de acuerdo a las características ácido base del analito.

La medición de k´ es una operación frecuente, ya que es n valor que se emplea tanto para evaluar la retención como para ajustar la separación de analitos. Para mezclas de pocos componentes k´ se ajusta entre 2 y 10, y para mezclas de muchos componentes entre 0.5 y 20 si fuera necesario alojar en el cromatograma un gran número de picos.

Es el cociente entre los coeficientes de capacidad (k´) de un par de picos. Si no existe separación, α=1, y su valor aumenta al aumentar la separación. Para dos picos A y B:

A diferencia de k´, α no depende de la fuerza de elución, sino de la afinidad del soluto respecto de la fase móvil y de la columna. Así, una disminución de la fuerza de elución la fase móvil produce un aumento de la retención, que en general no se acompaña de cambios de selectividad. Es decir, el aumento será proporcional para todos los solutos y el cociente entre ellos se mantendrá aproximadamente constante.

La variación de α puede lograrse de varios modos, pero lo que se intenta es variar la interacción entre los parámetros del sistema cromatográfico: • Modificando el componente “activo” de la fase móvil (en fase reversa, MeOH por ACN o THF; en fase normal, cloroformo por diclorometano o metilterbutil-éter). • Modificando el pH de la fase móvil. • Empleando aditivos como reactivos de apareamiento, complejantes, etc. • Cambiando la fase estacionaria.

Es una expresión cuantitativa de la calidad de la separación, definida como la distancia entre dos picos dividido entre el promedio de sus anchos. Cuando se mide en unidades de tiempo:

para dos picos A y B dados.

Para un par de picos adyacentes, Rs>1.5 significará una separación completa.

Para las situaciones donde las alturas de los picos difieren, se utiliza la siguiente forma no canónica para la Rs, surgida de los experimentos computacionales de Snyder:

El número de platos (N) requeridos para la separación de dos solutos adyacentes varía inversamente con la retención relativa y con el coeficiente de partición.

El incremento en el valor de k´ disminuye en magnitud el valor de (k´+1)/k´ :

Una columna puede entonces tener una selectividad adecuada pero tener una pobre eficiencia (los picos pueden resolverse bien pero no ser lo suficientemente agudos). Por otro lado, los picos pueden ser agudos pero no resolverse satisfactoriamente (buena eficiencia pero mala selecividad).

Esta medición resulta útil para: • Calcular la eficiencia de la columna en función de sus platos teóricos (N). • Calcular la resolución cromatográfica. • Calcular manualmente el área de los picos, y en algunos integradores electrónicos se ingresa como dato de ajuste de la integración.

El ancho del pico puede tomarse en varias posiciones (a varias alturas), y si la señal fuera perfectamente gaussianas, el resultado de la estimación no variaría. Como ésta condición raramente ocurre, es necesario indicar el método empleado, el cual puede ser: • Al 60.7% de la altura del pico (Wi). En este lugar se encuentran los puntos de inflexión y en una distribución normal, la sección horizontal de la curva corresponde a dos desviaciones estándar (2σ). • Al 50% de la altura del pico (Wh, ancho de pico a media onda). • En la base del pico (Wtan). Este valor se obtiene prolongando la línea base por debajo del pico y midiendo el segmento de línea, delimitado por la extrapolación de las ramas ascendente y descendente del pico. • Pueden tomarse medidas en otras secciones del pico.

• Pueden

pico.

tomarse medidas en otras secciones del

• Desarrollado

en 1941 por Martin y Synge para CLL

(partición). • Establece un símil entre la cromatografía y una distribución contra corriente, donde la partición entre las dos fases se repite varias veces en forma encadenada. A diferencia de éste fenómeno, la cromatografía es un proceso continuo, aunque puede imaginarse la columna como una serie de rodajas o cortes diferenciales en cada uno de los cuales se establece un equilibrio transitorio (K) a medida que la fase móvil avanza.

Cada corte se denomina “plato”, y su espesor “altura equivalente”. Entonces para una columna de longitud “L”, con “N” platos teóricos, la altura equivalente es:

La eficiencia, y por ende su “poder” separativo se estima en función del número de platos teóricos.

Una separación busca no sólo aumentar el factor de selectividad (α), sino disminuir al mínimo el ancho de los picos (W). Según el ancho del pico, N es:

donde W es medido sobre la linea base y expresado en unidades de tiempo.

N y H dependerán de: • Diámetro, morfología y calidad de las partículas de fase estacionaria. • Calidad del empaquetamiento (relleno de la columna). • Envejecimiento del empaquetamiento. • Existencia de vaciamientos, canales o disrupciones del empaquetamiento, producidos por disolución o golpes.

No existe un criterio unificado para la medición de la eficiencia (operativamente ni en cuanto a especificaciones, solutos de referencia), o para la expresión de los resultados, sin embargo estas mediciones son útiles para: • Comparación de materiales de empaque y métodos bajo las mismas condiciones experimentales. • Optimización de métodos analiticos. • Controlar la idoneidad de los métodos. • Controlar el estado de una columna a lo largo de su vida útil.

Es una de las formas más comunes de alejamiento de la curva gaussiana y su medición es importante puesto que puede llevar a errores considerables de cuantificación, e incluso a ocultar picos adyacentes. Se calcula según:

AS10%

b = a

donde a y b son las medidas entre la línea que une el máximo del pico con la línea de base y los extremos anterior y posterior del pico, tomados al 10% de su altura.

Un pico simétrico tendra un As=1, mientras un pico con “cola” (asimetría posterior), tendrá un As>1. Un pico con asimetría anterior tendrá un As<1.