Brb

République algérienne démocratique et populaire Université Djillali Liabes Faculté de Médecine Département de Pharmacie

TP N°03 Dosage de la bilirubine sanguine. Réalisée par: • ZIDOUR Mehdi Nabil • GHERMI Mohamed. • CHAREF KHODJA Meriem. • BETTAYEB Mohamed Amine. • TAHRI Mahmoud. 4 ème année pharmacie G05. Année universitaire : 2008 / 2009

TP N 03

HEMATOLOGIE - DOSAGE DE LA BILIRUBINE

I- Généralités : La bilirubine est le produit de dégradation de la protoporphyrine IX constituant de l'hème, qui est le groupement prosthétique des hémoprotéines représentées essentiellement par l’hémoglobine. La bilirubine est un pigment jaune, dont l'accumulation anormale dans le sang et les tissus détermine un ictère (ou " jaunisse "), qui peut relever de causes très diverses. La bilirubine intègre le bol alimentaire au niveau de l’intestin grêle, avec les autres pigments biliaires. Elle est le principal pigment des fèces, responsable de leur couleur jaunâtre. Dans les globules rouges, c'est plus précisément la dégradation de l'hémoglobine qui transforme l'hème en bilirubine. Cette substance donne sa couleur jaune à l'urine et aux selles, ainsi qu'aux ecchymoses. Dans l'organisme humain normal, le taux de BNC (bilirubine non conjuguée) est inférieur à 17 µmoles/l (10 mg).

Figure 1 - Structure chimique de la BRB

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IIII- Métabolisme : 1- Production de la bilirubine : La bilirubine est le principal produit de dégradation de l'hème. La bilirubine est formée principalement dans la rate, grâce à deux enzymes, l'hème oxygénase (microsomale) et la biliverdine réductase (cytosolique). La source principale de la bilirubine est la destruction des hématies, dont la durée de vie est de 90 à 150 jours. En outre, 10 à 20 % de la bilirubine proviennent d'autres sources : en premier lieu, le catabolisme de l'hème hépatique (principalement celui des cytochromes) ; en second lieu, la destruction dans la moelle des précurseurs des hématies avant leur libération dans le sang périphérique (érythropoïèse inefficace). Un gramme d'hémoglobuline donne lieu à la formation de 36,2 mg de bili- rubine. La production quotidienne de bilirubine est de l'ordre de 250 à 350 mg par jour. Les étapes de la synthèse de la bilirubine sont : hème → biliverdine → bilirubine.

2- Captation par le foie La bilirubine ainsi formée est transportée dans le sang liée à l'albumine. Le pigment est ensuite capté par l'hépatocyte après dissociation avec l'albumine. Cette captation de la bilirubine se fait très probablement par diffusion facilitée par l'intermédiaire d'un transporteur. Plusieurs protéines impliquées dans ce transport ont été identifiées et l'une d'entre elles a été récemment exprimée dans des ovocytes de xénope et clonée. Dans les hépatocytes, la bilirubine est liée à des protéines cytosoliques, principalement la ligandine, qui appartient à la famille des glutathion-transférases. Cette liaison rend compte du stockage d'une certaine quantité de bilirubine dans l'hépatocyte. La bilirubine conjuguée est également liée à ces protéines et dans une certaine mesure stockée dans l'hépatocyte. En outre, un transfert rapide de la bilirubine (qui est fortement lipophile) dans les membranes intracellulaires a été mis en évidence.

3- Conjugaison hépatocytaire La bilirubine native (ou bilirubine non conjuguée) est très peu soluble dans l'eau. La conjugaison est donc une étape obligatoire pour que la bilirubine puisse être excrétée dans la bile. La conjugaison se fait principalement avec l'acide glucuronique grâce à une enzyme du réticulum endoplasmique, la bilurine

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- glucuronyl transférase. Cette enzyme est située dans la membrane du réticulum. Elle fait partie d'une famille d'uridine-diphosphates (UDP) - glucuronyl transférases. Le donneur d'acide glucuronique est l'acide UDP - glucuronique, qui doit être transféré dans la lumière du réticulum endoplasmique, pour être disponible pour la conjugaison. D'autres conjugaisons, notamment au glucose et au xylose, sont importantes chez le chien, le chat, la souris et le lapin.

4- Excrétion dans la bile La plus grande partie de la bilirubine est excrétée dans la bile sous forme conjuguée. Le transport de la bilirubine de l'hépatocyte dans la bile à travers la membrane canaliculaire se fait grâce à un transporteur, souvent désigné sous le nom de cMOAT (c pour canaliculaire, multiple organic anion transporter). Ce transporteur est en effet commun avec les colorants (BSP, ICG), le glutathion et les conjugués du glutathion, les opacifiants biliaires, les leucotriènes et certains antibiotiques comme la rifamycine. Il s'agit d'un transport actif, utilisant l'ATP. Il est différent du transporteur responsable de l'excrétion des acides biliaires dans la bile. Le cMOAT est génétiquement déficient chez les patients atteints d'un syndrome de Dubin-Johnson. Dans ce cas, l'excrétion des acides biliaires et leur concentration dans le sang sont normales.

IIIIII- Valeurs usuelles 1- Bilirubine totale Naissance 1ière semaine 2ième semaine 3ième semaine 4ième semaine >1 mois et adulte :

14 - 45 µmol /l 45 - 210 µmol /l 17 - 190 µmol /l 10 - 50 µmol /l 5 - 25 µmol /l 5 - 17 µmol /l

8 - 25 mg /l 25 - 120 mg /l 10 -110 mg /l 6 - 30 mg /l 3 - 15 mg /l 3 -10 mg /l

2- Bilirubine libre = indirecte Adulte :

3 -12 µmol /l

2 - 7 mg /l

3- Bilirubine conjuguée = directe Adulte : 3

2 - 5 µmol /l

1 -3 mg /l UDL - Pharmacie

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IVIV- VARIATIONS PATHOLOGIQUES : LES ICTERES 1- Ictères par excès d'apport (dits « préhépatiques »): Principales causes : . Syndromes hémolytiques : les plus fréquents . Ictères par dérivation (la bilirubine se forme à partir de précurseurs de l'hème non incorporée dans les G.R.) Symptomatologie biologique : . Plasma : augmentation exclusive de la bilirubine non conjuguée . Urines : augmentation de l'urobilinogène urinaire.

2- Ictères par déficit de l'UDPl'UDP-glucuronyl transférase Principales causes : . Ictère du nouveau-né : déficit transitoire de l'enzyme . Déficits congénitaux : a) Maladie de GILBERT : bénigne, due à un déficit partiel de l'enzyme ; b) Maladie de CRIGLER-NAJJAR : maladie grave avec risque d'ictère nucléaire. Symptomatologie biologique : . Plasma : augmentation de la bilirubine non conjuguée, . Urines : pas d’↑ de l’urobilinogène ;

3- Ictères à bilirubine mixte : Principales causes : . Hépatites aiguës Anomalies du transport, de la conjugaison et de l'excrétion hépatocytaire . Cirrhoses . Maladie de DUBIN-JOHNSON : maladie congénitale rare et relativement bénigne comportant un défaut d'excrétion de la bilirubine conjuguée. Symptomatologie biologique : . Plasma : proportions variables de bilirubine conjuguée et non conjuguée, .Urines : ↑ bilirubine ;

4- Ictères à bilirubine conjuguée : Principales causes : - Obstructions biliaires intra ou extra hépatiques (cholestase) Symptomatologie biologique : . Plasma : augmentation exclusive de la bilirubine conjuguée . Urines : urobilinogène : 0 . ↑↑ bilirubine . Selles : décolorées par absence des métabolites de la bilirubine.

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V- Dosage de la bilirubine : 1- Conditions de Prélèvement (c’est un examen d’ d’urgnece): Prélèvement de sang veineux (en général au pli du coude), avec le garrot laissé le moins longtemps possible. Le tube de prélèvement peut contenir un anticoagulant de préférence l’héparine. Il doit être conservé à l'abri de la lumière avant que le dosage ne soit effectué. Il n'est pas indispensable d'être à jeun. Indiquer d'éventuels traitements en cours car certains médicaments peuvent modifier les résultats.

2- Conservation: Les échantillons doivent être protégés d’une lumière directe car la bilirubine est photolabile. Les échantillons peuvent être stockés réfrigérés pendant 3 jours2.

3- Intérêt clinique Au moins quartes sortes de bilirubines coexistent dans le sérum : la bilirubine direct (BD) correspond à la bilirubine dite mono et di-conjuguée (β et γ Bilirubine) ainsi qu’a la fraction δ qui est liée très fortement à l’albumine ; la bilirubine α, non conjuguée ou bilirubine indirecte, qui est transportée par l’albumine. La bilirubine totale (BT) est la somme de ces différentes formes. On distingue les ictères où prédomine la bilirubine indirecte (ictère hémolytique, maladie de Biermer, Thalassémie …etc.), des ictères ou prédomine la bilirubine directe (obstruction des voies biliaires extra ou intra-hépatique, hépatites virales …etc.). Enfin les ictères ou les deux formes de bilirubine sont présentes sans prédominance (cirrhose, maladie de Dublin-Johnson).

4- Principe de dosage La plupart des méthodes actuellement utilisées pour doser la bilirubine sont basées sur la réaction entre la bilirubine et des solutions acides sulfaniliques diazotées. Dans des solutions aqueuses, seule la bilirubine directe (conjuguée) réagira de cette manière. Ce réactif de la bilirubine directe utilise une méthode diazo acide. La bilirubine conjuguée réagit avec l’acide sulfanilique diazoté pour produire une azobilirubine acide, dont l’absorbance est proportionnelle à la concentration en bilirubine directe de l’échantillon et peut être mesurée à 550 nm. Pour les analyseurs bichromatiques la lecture du blanc doit se faire à 660 nm.

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5- Mode opératoire Blanc

BT

R1(D) ml R2(T) ml

1.5

R3(I) µm Echantillon Calibration

Blanc

BD

1.5

1.5

1.5 50

100

100

50 100

100

Après lecture au spectrophotomètre à 550 nm on obtient les valeurs suivantes : • Bilirubine totale : Blanc (témoin) : 0,037 Réaction : 0,115

Calcul : [BT] = (0,155-0,037) x 19.1 [BT] = 2,253 mg/dl • Bilirubine direct : Blanc (témoin) :0,040 Réaction : 0,159

Calcul : [BD] = (0,159 – 0,040) x 14 [BD] = 1,66 mg/dl • Bilirubine indirect : [BI] = [BT] – [BD] [BI] = 0,593 mg/dl

CES VALEURS SONT ASSEZ ASSEZ FAUSSES FAUSSES EN RAISON DES CONDITIONS CONDITIONS AVEC LES QUELLES CE TP A ETE REALISE. REALISE.

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