Bmc Electroforesis

ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS Definición: Método de análisis basado en la migración diferencial de sustancias en solución cargadas eléctricamente, por efecto de la aplicación de un campo eléctrico.

Aplicación a: • • • • • •

Proteínas en general ADN y ARN Nucleótidos Aminoácidos Polisacáridos Fosfolípidos.

CLASIFICACION: a) Según el soporte: • • • • •

Geles de poliacrilamida Geles de agarosa Tiras de acetato de celulosa Geles de almidón Papel de filtro b) Según las características de la moléculas a separar:

* Carga * Peso molecular (P.M.) * Punto isoeléctrico (p.I) * Combinaciones de las anteriores

TEORIA Una partícula cargada eléctricamente con la carga q colocada en un medio determinado y bajo la acción de un campo eléctrico se verá sometida a dos fuerzas: A) la fuerza de atracción o fuerza propulsora, llamada fuerza eléctrica (Fe) B) la fuerza resistente, llamada resistencia viscosa (Fs). A)    Fuerza eléctrica:  (1)  Fe = E . q    

Fe V E = ---- = -----q I

E : campo eléctrico V : diferencia de potencial aplicada q : carga de la partícula

sobre la longitud ( l )

B) Resistencia viscosa: ( 2 ) Fs = 6π η r v η = viscosidad del medio r = radio de la partícula v = velocidad de la partícula

La partícula es empujada por la Fe y su velocidad (v) aumenta hasta un valor tal que ambas fuerzas se equilibran: E . q = 6π η r v

Fe = Fs Despejando la velocidad tenemos: (3) r

q v = E . ----6π η

q q En cambio, el factor    -----    depende del medio ( η  ) y de la partícula      ---6π η r r q Esta relación: ---- , se llama Movilidad Electroforética 6π η r y se representa por la letra µ .

q µ = −−−−

6π η r

Según (3) la velocidad será: v = E . µ ,    v = V/l . µ La velocidad de la partícula (v) en una electroforesis es proporcional al campo aplicado (E) y a su Movilidad Electroforética (µ).

Electroforesis en tiras de acetato de celulosa

Cátodo -

Siembra

Anodo +

Siembra Anodo

Cátodo +++

-

Fuente de Poder (V)

+

-

+

Siembra Anodo

Cátodo +++

-

Fuente de Poder (V)

+

-

+

Siembra Anodo

Cátodo +++

-

Fuente de Poder (V)

+

-

+

Siembra Anodo

Cátodo +++

-

Fuente de Poder (V)

+

-

+

Siembra Anodo

Cátodo +++

-

Fuente de Poder (V)

+

-

+

Siembra Anodo

Cátodo +++

-

Fuente de Poder (V)

+

-

+

Carga de aminoácidos en función del pH Glicina COOH H3N+

C H

H

Carga de aminoácidos en función del pH Glicina COOH C

H3N+

H

H

H3N+ C H

+

+pK1: 2.34

NaOH

COO-

pH

H

Carga de aminoácidos en función del pH Glicina COOH C

H3N+

H

H +

COOH3N+ C

H

H2N

C

H

H

+-

-

pK1: 2.34 NaOH

COO-

pK2: 9.6 pI: 5.97

H

pH

Ejercicio: Para separar una mezcla de proteínas se realizó una electroforesis con un buffer pH= 4.5. De acuerdo a la siguiente tabla de datos, conteste: Proteína pI a....................2.3 b....................4.5 c..................10.5 d....................9.2 e.....................3.8 K. L. M. N.

La proteína e migró al cátodo. Las proteínas a y d migraron al cátodo. La proteína a está más alejada que la e del lugar de siembra. La proteína e está más alejada que la a del lugar de siembra.

Ejercicio Cuál es el mejor buffer para separar estas cuatro proteínas:

Proteína pI a..............5.2 b..............7.4 c..............8.5 d..............3.4

Buffer pH 1.............9.2 2.............8.5 3.............5.2 4.............3.0

Electroforesis de Proteínas 1) SDS-PAGE 2) Enfoque iso-eléctrico (Iso-electric focusing) 3)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)

SDS - PAGE Geles de poliacrilamida

2β-Mercaptoetanol ?

El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que desnaturaliza proteínas “envolviendo” el esqueleto polipeptídico y les confiere carga negativa.

PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Armado del soporte Formación del gel Siembra de la muestra Corrida Fijación y Coloración Desteñido Secado Análisis

-

+

   Siembra

Determinación de Pesos Moleculares por SDS-PAGE Movilidad relativa de una Proteína (Rf).

St. (PM)

Muestra

66000

También llamado relación al frente.

4500 03470 0

Banda 1 Banda 2

Distancia Recorrida por Proteína.

Rf= Distancia Recorrida por Colorante.

19000 10000

Azul de Bromofenol

PM

Curva de Calibración de proteínas por SDSPAGE al 12 % y = -73873x + 67578 R2 = 0,9569

70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Rf (cm)

B1=5.43 cm B2=5.55 cm D.R.Col = 9.4 cm. Calcular el Rf y el PM para cada muestra.

Electroforesis de Proteínas 1) SDS-PAGE 2) Enfoque iso-eléctrico (Iso-electric focusing) 3)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)

Enfoque iso-eléctrico (Iso-electric focusing) Dos corridas: 1) Enfoque de anfolitos, gradiente de pH. 2) Enfoque de proteínas.

NaOH

pH 10

 3 H3PO4

Electroforesis de Proteínas 1) SDS-PAGE 2) Enfoque iso-eléctrico (Iso-electric focusing) 3)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)

2-D PAGE (PAGE Bidimensional)

Electroenfoque (Separación por pI)

SDS-PAGE (Separación por Peso Molecular)

ELECTROFORESIS Uso en la profesión veterinaria, fundamentalmente en la separación e identificación de sustancias de componentes biológicos, especialmente líquidos como: suero, orina, líquido cefaloraquídeo, líquido de punciones, leche, etc.

Análisis de proteínas lácteas por electroforesis Las proteínas de la leche se dividen en dos grupos: • Caseínas son las que precipitan a pH 4.6 a 20ºC. Están compuestas por las fracciones αs1, αs2, β y κ; corresponden al 80 % del total de •

proteínas lácteas. Proteínas del suero: α-lactalbúmina y β-lactoglobulina. Las caseínas son muy importantes por su valor nutritivo y también por su influencia sobre los derivados lácteos. Hay alta correlación entre contenido de caseínas y rendimiento quesero; también influyen sobre características tales como el sabor, textura, etc.

Objetivo 1: e identificar las fracciones de caseínas

Separar

bovinas y caprinas por SDS-PAGE.

Resultados

SDS-PAGE Caseínas Bovinas M

M

St. St.

Caseínas Caprinas St. St.

M αs2

αs2 αs1 β κ

αs1 y β

κ C.B. C.B. C.B.S. β-Cn

C.B.: Muestras individuales bovinas C.B.S.: St. de Caseína Bovina (Sigma) β-Cn.: St. de beta-caseína (Sigma).

C.B.S. C.S.

C.T.

C.B.S.: St. de Caseína Bovina (Sigma) C.S.: St. de Caseína Caprina (Sigma). C.T.: Muestra de Caseína Caprina de la raza Toggenburg.

Objetivo 2: Estudiar la actividad proteolítica de la enzima Pepsina porcina sobre la B.S.A. (Albúmina Sérica Bovina)

Resultado Tiempo en minutos en degradación de BSA por Pepsina porcina. BSA

0

St.

10

0

20

10

20

30

30

45

45

60

60 (min)

St.

Pocillos: 1: St (PM): 14.3, 18.4, 24, 34.7, 45, 66 KD 2: (BSA) a tiempo “0” con Pepsina. 3: Idem 2 pero a t: “10” minutos. 4: a “20” min. 5: a “30” min. 6: a “45” min 7: a “60” min. 8: St igual que en pocillo 1 P:

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Hemoglobina Hemoglobina (PM=64500): formada por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas α (141 aa) y dos cadenas β (146 aa).Cada subunidad tiene un grupo Hemo con un átomo de Hierro en estado ferroso (Fe2+) que son los que convierten a la Hb en una proteína cromogénica.

Objetivo 3: Evaluar

el comportamiento de la Hemoglobina corrida por SDS-PAGE, bajo condiciones desnaturalizantes.

Resultados

SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb) SDS-PAGE (12%) Tinción con Azul de  Coomasie

PM aprox.

64.500 34.000 17.000 14.000

Hb (BSA) SUERO

SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb) SDS-PAGE (12%) Tinción con Azul de  Coomasie

PM aprox.

PM aprox.

64.500

17.000 14.000

34.000 17.000 14.000

SDS-PAGE (15%)  Sin tinción

Hb en diferentes concentraciones Hb (BSA) SUERO

Ejercicios 1) Se realiza una electroforesis en un buffer pH 7.6, de una mezcla de

tres proteínas (a, b y c) cuyos pI son: pI (a) = 4.3 pI (b) = 5.6 pI (c) = 8.3 De acuerdo con estos datos: a) las proteínas (a) y (b) migrarán al ánodo. b) las proteínas (b) y (c) migrarán al ánodo. c) las proteínas (a) y (b) migrarán al cátodo. d) la proteína (b) migrará al cátodo.

2)

Se desea separar por electroforesis una mezcla de tres proteínas I, II, y III) utilizando un buffer pH 5.2. Teniendo en cuenta los siguientes datos: pI

P.M.

I

………...4.7……..110.000

II

..……...4.0………60.000

III

..……...6.9……..150.000

Puede predecirse que: a)

la proteína I se dirigirá al ánodo, y las proteínas II y III al cátodo.

b)

II estará más alejada que I del lugar de siembra.

c)

III estará más cerca del ánodo que I y II.

d)

I estará más alejada que II del lugar de siembra.

3) Se realizó la electroforesis bidimensional de una muestra de suero normal canino. A partir de los siguientes datos identifique las proteínas. PROTEINAS PM pI Albúmina                             69000                 4.9  α1-globulina                      195000                 2.7  α2-globulina                      820000                 5.4  β-globulina                         143000                 5.6       γ-globulina                         160000                 7.3

pH 2

pH 9

3) Se realizó la electroforesis bidimensional de una muestra de suero normal canino. A partir de los siguientes datos identifique las proteínas. PROTEINAS PM pI Albúmina                             69.000                 4.9       α1-globulina                      195.000                 2.7                      α2-globulina                      820.000                 5.4                      β-globulina                         143.000                 5.6                     γ-globulina                         160.000                 7.3

pH 2

pH 9

Electroenfoque

SDS-PAGE

1) La figura adjunta muestra un gel SDS-PAGE. Las proteínas han sido teñidas con azul de coomassie. Se han aplicado 5 muestras distintas: •1,2 y 3.) Proceso de Purificación. •4.) Proteína Purificada •5.) El material purificado (banda C) con tres marcadores de peso molecular A, B y D.

St.

Curva de calibración de estándares de P.M. por SDS-PAGE.

P.M.

A......100.000 B........40.000 D.........4.000

y = -134904x + 118644 R2 = 0,9992

120000

A

100000 P.M.

80000

D

60000

B

40000 20000

D

0 0

¿Cuál es el peso molecular de la proteína pura?

0,2

0,4

0,6

0,8

Rf

1

5) La protein-kinasa dependiente de cAMP de mamíferos muestra un peso molecular en condiciones nativas de 178.000. En SDS-PAGE esta proteína da lugar a una banda de 39000 y otra de 50000. ¿Cómo se explican estos resultados?