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Faculdade de Medicina de Lisboa Curso de Mestrado Integrado em Medicina – Ano lectivo de 2007/2008 MÓDULO I.I: BIOLOGIA MOLECULAR, CELULAR E DO DESENVOLVIMENTO HUMANO E GENÉTICA, 1º SEMESTRE EXAME DE 1ª ÉPOCA Nome:________________________________________________________ Docente:_______________________________

AVALIAÇÃO Exame: Contínua:

Turma Prática:______

Final:

Este exame tem a duração de 2h, com meia hora de tolerância, sendo constituído por 20 alíneas de 1 valor cada.

1 – Comente a seguinte frase: “Nas membranas celulares, as moléculas de lípidos podem difundir sem consumo de energia no plano de cada camada da bicapa lipídica. No entanto, a permuta de lípidos entre camadas requer a acção de enzimas e o consumo de energia.” Estou de acordo com esta afirmação. Os fosfolípidos são moléculas anfipáticas (têm uma parte polar e outra apolar) que constituem a membrana celular. Esta membrana tem uma bicamada fosfolipídica que é formada por fosfolípidos ligados entre si por 3 tipos de interacções: 1-efeito entrópico (a parte hidrófoba “foge” da água “encostando-se” à parte hidrófoba dos outros fosfolípidos e assim sucessivamente); 2-forças de Van der Walls ligam as partes hidrófobas entre si; 3-interacções dipolodipolo entre as cabeças fosfolipídicas e a água e em muitos casos interacções por pontes de hidrogénio. Desta forma e porque os fosfolípidos não estão ligados entre si por ligações covalentes, a membrana celular não é rígida, pelo que os fosfolípidos podem difundir-se no plano da camada lipídica (difusão lateral). Contudo os fosfolípidos não podem passar de uma camada para a outra sem consumo de energia pois para eles passarem é necessário que a cabeça polar dos fosfolípidos atravesse a parte apolar (corpo) da bicamada e para isso é necessário consumo de energia e proteínas (enzimas) que o facilitem (V.M.P.M.) 2 – Nas células humanas existem vários tipos de RNA. 2A – Identifique os vários tipos de RNA das células humanas, indicando a sua função. O RNA mensageiro (mRNA) é formado a partir da transcrição dos genes no núcleo, sendo depois traduzido por ribossomas no citosol. A sua função é transportar a informação genética no núcleo para o citosol a fim de se produzirem proteínas. O RNA de transferência (tRNA) existe no citosol e liga-se aos aminoácidos, transportando-os até aos ribossomas para que haja síntese proteica. O RNA ribossomal (rRNA) faz parte dos ribossomas e possui actividade catalítica, participando na síntese proteica. O microRNA (miRNA), descoberto mais recentemente, desempenha funções como a destruição do mRNA. O small nuclear RNA (snRNA) faz parte de um complexo formado por proteínas e snRNA designado por spliceossome, intervindo no processo de splicing. (M.S.F.F.) 2B – Indique um tipo de RNA que existe nas células humanas mas não existe em bactérias. O snRNA (small nuclear RNA). (M.S.F.F.)

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3 – Compare o tamanho e estrutura de um gene de levedura (S. cerevisiae) com o respectivo gene homólogo humano. Um gene humano será, à partida, maior do que o correspondente na levedura. Tal facto deve-se à existência de muito maior número de intrões intercalares entre os exões (codificantes) dos genes humanos, e de esses intrões serem bastante maiores do que os presentes no genoma de levedura. (M.M.M.A.V.C)

4 – Durante a replicação do DNA em células humanas: 4A – Quantas novas cadeias de DNA são sintetizadas? Diga como se designam. São formada duas novas cadeias, por cada ciclo de replicação. Designam-se cadeia lagging e cadeia leading. (S. P. F.). 4B – Explique o mecanismo de síntese das cadeias de DNA durante o processo de replicação. O processo de replicação é um processo semi-conservativo uma vez que as duas novas moléculas, que se originam a partir de uma única molécula de DNA, são constituídas por uma cadeia da molécula-mãe (conservada) e por uma nova cadeia sintetizada de novo. O processo de replicação começa pelo reconhecimento de uma sequência específica (origem de replicação) por um complexo que recruta a DNA polimerase. Através da actuação de uma helicase, as duas cadeias-molde separam-se, originando uma forquilha de replicação. A actuação de duas proteínas auxiliares, topoisomerase e proteína de ligação a cadeia simples, garante, por um lado, que não ocorra super-torsão da molécula de DNA e, por outro lado, que a cadeia simples se mantenha estável. A DNA polimerase sintetiza novas cadeias apenas no sentido 5´→ 3´ pelo que as duas cadeias-molde, antiparalelas serão replicadas de forma diferente: a cadeia-molde orientada de 3´→ 5´ será replicada de forma contínua pela adição sucessiva de novos nucleótidos pela DNA polimerase, no sentido 5´→ 3´. A cadeia-molde orientada de 5´→ 3´ é replicada de forma descontínua pela formação dos fragmentos de Okazaki, que se iniciam com um pequeno primer de RNA ao qual a DNA polimerase vai adicionando nucleótidos no sentido 5´→ 3´. Todos estes fragmentos são finalmente unidos pela DNA ligase, após excisão destes primers de RNA e sua substituição por desoxirribonucleótidos. (S.S.). 5 – Comente a seguinte frase: “A transcritase reversa existe exclusivamente em retrovírus.” Esta afirmação é falsa. De facto, nas células humanas, a transcriptase reversa é responsável por eventos de retrotransposição conduzindo à criação de grandes quantidades de DNA repetitivo os retrotransposões. Durante os eventos de retrotransposição estes fragmentos de DNA são transcritos a RNA e convertidos novamente em DNA pela transcriptase reversa para posteriormente se voltarem a integrar noutro local do genoma. (M.S.S.F.) Outro exemplo de transcriptase reversa com actividade em células humanas é a telomerase. A síntese de telómeros que ocorre em estadios precoces do desenvolvimento, é mediada pela telomerase que usa um molde de RNA para repor os telómeros perdidos em cada divisão celular. (M.M.C.)

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6 – Uma equipa de investigadores isolou um novo antibiótico. 6A – Indique o nome de dois antibióticos e explique o seu mecanismo de acção. Ampicilina e Penicilina- Antibióticos com acção anti-bacteriana, inibem a síntese dos peptidoglicanos, principais componentes das paredes celulares bacterianas conduzindo à morte destas células. (M.A.S.R.) Oligomicina e Antimicina- Antibióticos com acção fungicida, inibem a cadeia respiratória, impedem a fosforilação oxidativa comprometendo a vida das células afectadas. (M.M.C.) Aminoglicosídeos (estreptomicina) Tetraciclinas, - Antibióticos com acção anti-bacteriana que interferem com a subunidade 30S do ribossoma procariota. Não afectam as células eucariotas. (M.F.)

6B – Para conhecer o mecanismo de acção do novo antibiótico em bactérias, a equipa de investigadores pretende saber se esta molécula inibe a síntese de DNA, RNA ou de proteínas. Que tipo de experiências devem ser realizadas para obter a resposta pretendida? Para comprovar se o mecanismo de acção do antibiótico inibe a síntese de DNA poderíamos marcar radioactivamente os nucleótidos livres timina (não integra nas moléculas de RNA) colocaríamos as células em meio com o antibiótico. Se porventura observássemos que, ao fim de algumas horas, estes nucleótidos livres radioactivos estavam integrados em moléculas de DNA, verificávamos que a síntese não teria sido inibida uma vez que estes nucleótidos teriam sido activamente usados pela DNA polimerase para a formação de novas moléculas de DNA. Se pelo contrário as timinas radioactivas não tivessem sido integradas em moléculas de DNA, poderíamos constatar que o antibiótico inibia a síntese de DNA. Para comprovar se a inibição ocorria ao nível do RNA procederíamos exactamente da mesma forma mas marcaríamos apenas os nucleótidos uracilo que não integram DNA mas apenas RNA. Segundo a mesma lógica, se estes nucleótidos radioactivos não fossem integrados em moléculas de RNA, significaria que a transcrição estaria inibida. Finalmente, para comprovar a inibição da síntese proteica podíamos também pensar de forma análoga mas teríamos que marcar radioactivamente aminoácidos livres. Se verificássemos que estes não ficavam integrados nas cadeias polipeptídicas poderíamos deduzir que a síntese proteica estaria inibida. (S.S.) 6C – A equipa concluiu que o novo antibiótico inibe a síntese proteica. Face a este resultado, a nova molécula não pode ser administrada a seres humanos. Concorda com esta afirmação? Justifique. Não concordo com a afirmação porque o antibiótico pode inibir a síntese proteica por inibição da actividade dos ribossomas. Os ribossomas procarióticos são diferentes dos ribossomas eucarióticos, assim o novo antibiótico pode inibir a síntese proteica nas bactérias não tendo qualquer efeito na síntese proteica das células humanas. (J.M.N.R.)

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7 – Qual o efeito a nível celular e tecidular de mutações que eliminam a função das queratinas? As queratinas são constituintes dos filamentos intermédios, associados ao suporte e resistência e tecidos, como a pele por exemplo. Mutações genéticas que comprometem a função das queratinas conduzem à perda de resistência mecânica das células em tecidos (em células em cultura as queratinas não são indispensáveis). Um exemplo é a doença Epidermólise Bulhosa, em que a mutação num gene de queratina leva a que a pele dos indivíduos afectados não resista ao stress mecânico, apresentando lesões características. (adaptado de MMMAVC)

8 – Compare “imprinting” e inactivação do cromossoma X. 8A – Em que consiste cada um destes fenómenos? Ambos os fenómenos são de natureza epigenética. O imprinting é um fenómeno que envolve aproximadamente 70 genes e que resulta da inactivação de um alelo consoante a sua origem, materna ou paterna; por exemplo, o gene humano H19 tem o alelo paterno inactivado. A inactivação do alelo paterno ocorre em indivíduos de ambos os sexos. Este imprinting genético estabelece-se precocemente durante o desenvolvimento embrionário, após um apagamento temporário durante a gametogénese. A inactivação do cromossoma X resulta da necessidade de controlar a quantidade de genes transcritos pelos dois cromossomas X, inactivando-se um deles aleatoriamente no sexo feminino. Assim, o gene Xist origina um RNA não codificante que se liga ao cromossoma X e conduz à sua inactivação transcricional, a modificações das histonas (metilação) e do próprio DNA (metilação). ( adaptado de MMAVC)

8B – Explique como cada um destes fenómenos condiciona a manifestação de determinadas doenças genéticas. O fenómeno de imprinting surge associado a doenças genéticas em que a mutação do mesmo gene pode originar sintomas diferentes, dependendo de a mutação ser herdada do pai ou da mãe, por exemplo os síndromes de Prader-Willi e Angelman. Como afecta um centro de imprinting, a mutação tem efeitos diferentes consoante afecta o alelo materno ou o paterno. Dado que a inactivação do cromossoma X no sexo feminino é aleatória, nas células em que o cromossoma inactivado é o portador da mutação esta não tem expressão, levando a que os sintomas de doença sejam mais atenuados. (adaptado de MSFF)

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9 – Nos organismos eucariotas, determinadas sequências de DNA são especificamente reconhecidas por proteínas capazes de regular a expressão genética. 9A – Como se denominam estas sequências? As sequências de DNA especificamente reconhecidas por proteínas capazes de regular a expressão genética são os enhancers e os promotores (M. A. S. R.) e sequência repressoras (I.L.F.O.) 9B – Qual pode ser a sua posição relativamente à sequência codificante do gene cuja expressão é regulada? O promotor localiza-se junto aos genes que vão ser transcritos, antes do nucleótido +1, onde se inicia a transcrição. É também onde se liga o complexo de iniciação da transcrição. Os enhancers promovem a transcrição e podem localizar-se antes dos genes ou depois, podendo estar junto a esses genes ou mais afastados sendo que neste último caso formam-se alças de DNA para que o enhancer possa entrar em contacto com o complexo de iniciação da transcrição. (M. A. S. R.) No caso das sequências repressoras elas podem também estar antes ou depois dos genes, mais ou menos afastados. 10 – Relativamente à Síndroma de Imunodeficiência Severa Combinada: 10A – Explique como esta doença pode ser causada por uma mutação no gene codificante para uma subunidade do receptor da interleucina-7. A síndroma de imunodeficiência combinada caracteriza-se por uma ausência/ défice das principais células efectoras da resposta imunitária - linfócitos T, mediadores da imunidade celular, e linfócitos B, produtores de anticorpos. Para que estas células se desenvolvam são necessários processos de diferenciação (nomeadamente, a recombinação somática dos seus receptores específicos para antigénios), sobrevivência e proliferação. A interleucina-7 actua sobre precursores linfocitários imaturos (presentes na medula óssea no caso dos linf. B, e no timo para os linf. T), promovendo a sua maturação. Perante uma mutação do gene codificante para uma subunidade do seu receptor, a IL-7 deixará de poder exercer a sua função, ficando o desenvolvimento linfocitário bloqueado em fases prematuras (pró-B e pró-T), o que se traduz num sistema imunitário deficiente em linfócitos e, como tal, muito permissivo a múltiplas infecções oportunistas graves que põe em risco a vida dos doentes, particularmente durante a infância. (DSS,JCP,MMV) 10B – Explique a razão da sua incidência ser muito superior em indivíduos do sexo masculino. Esta doença hereditária é recessiva e o gene em causa localiza-se no cromossoma X. Devido à ausência de um segundo cromossoma X homólogo, os homens manifestam automaticamente a doença ao receberem um X mutado de uma mãe portadora (saudável), ao passo que as filhas dessa mesma mãe serão saudáveis desde que recebam um X normal do seu pai. Isto porque a inactivação do cromossoma X nas células da mulher é aleatória, resultando num mosaico em que 50% das células (linfócitos, neste caso) transcreverão o X normal, o que é suficiente para um sistema imunitário funcional. Assim sendo, enquanto que um filho de mãe portadora e de um pai saudável tem 50% de hipóteses de herdar a doença, uma filha desse casal será sempre saudável (eventualmente portadora). Na realidade, uma mulher só sofrerá desta patologia se o seu pai for doente. Como esta doença é muitíssimo grave (risco de morte por infecções na infância se não for tratada por transplante de medula óssea), a procriação de pais doentes é altamente desaconselhada, e como tal a incidência da doença no sexo feminino é muito menor do que no sexo masculino. (ASL,LMR, MDB) 5

11 – As células humanas sofrem uma série de alterações durante a mitose e durante a apoptose. 11A – Descreva as alterações moleculares que ocorrem no núcleo no início da mitose. No início da mitose verifica-se uma condensação da cromatina em cromossomas individualizados pela fosforilação de condensinas pelo complexo MPF (ciclina B/cdc2). Verifica-se uma desintegração das lâminas nucleares e consequente desintegração do invólucro nuclear. (S.M.P.F.)

11B – Descreva as alterações moleculares que ocorrem no núcleo durante a apoptose. Numa célula apoptótica são activadas as caspases, que clivam proteínas. A sua acção dá-se sobre proteínas nucleares como, por exemplo, as lâminas, comprometendo a integridade do invólucro nuclear de forma irreversível. As caspases clivam também um inibidor de DNase; assim, esta DNase vai proceder à degradação do DNA nuclear, segundo um padrão específico (a cada 200 bp, entre os nucleossomas). Assim, em consequência da activação das caspases vai haver, no núcleo, condensação da cromatina, degradação do DNA e ainda degradação do invólucro nuclear. (adaptado de MMMAVC) 11C – Compare os dois processos, salientando as principais diferenças. A diferença essencial entre a mitose e a apoptose reside na reversibilidade/irreversibilidade das acções que compreendem. Na mitose, a fosforilação (reversível) leva a uma condensação do DNA em cromossomas e à desagregação do invólucro nuclear, contudo, após a mitose, estas fosforilações são revertidas: o DNA volta a descondensar e o invólucro é reconstituído nas células filhas. Pelo contrário, baseando-se a apoptose na clivagem dirigida por caspases (acção irreversível), não permite que as estruturas originais sejam recuperadas. Assim, a mitose leva à proliferação ou renovação celular e a apoptose à morte celular. (adaptado de MMMAVC)

= FIM =

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