Aula 1 E 2

Mestrado Integrado em Medicina Dentária - 1º Ciclo

SEBENTA PRÁTICA DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR II

Ano Lectivo 2008/2009

BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR II Mestrado Integrado em Medicina Dentária – 1º Ciclo Professor Regente: Isabel Barahona Assistente: Susana Bandarra Ano lectivo 2008/2009 PLANEAMENTO DAS AULAS PRÁTICAS As aulas práticas são obrigatórias e têm a duração de 3 horas, ministradas de 15 em 15 dias. 1. Programa das Aulas Práticas Objectivo: Produção de uma Proteína Recombinante por Engenharia Genética 1º e 2º Aula Extracção de DNA cromossomal. 3º e 4º Aula Amplificação do gene que codifica a proteína Vif por PCR (polimerase chain reaction). Análise dos resultados em electroforese em gel de agarose. 5º e 6º Aula Noção de vectores e de clonagem. Extracção de DNA plasmídico, com e sem fragmento de DNA inserido. 7º e 8º Aula Restrição dos DNAs preparados anteriormente (cromossomal e plasmídicos). Análise dos resultados obtidos após a separação dos fragmentos de DNA por electroforese em gel de agarose. 9º e 10º Aula Transformação de E.coli preparados anteriormente.

com

os

DNAs

dos

plasmídeos

11º e 12º Aula Preparação de proteínas. Análise de proteínas por electroforese em gel de poliacrilamida.

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2. Calendário Dia 9-03-09 10-03-09/17-03-09 11-03-09/18-03-09 23-03-09 24-03-09/31-03-09 25-03-09/1-04-09 20-04-09 14-04-09/21-04-09 15-04-09/22-04-09 4-05-09 28-04-09/5-05-09 29-04-09/6-05-09 25-05-09 12-05-09/26-05-09 13-05-09/27-05-09 8-06-09 2-06-09/9-06-09 3-06-09/17-06-09

Turno Turma 4 Turma 1/Turma2 Turma 3/Turma 5 Turma 4 Turma 1/Turma 2 Turma 3/Turma 5 Turma 4 Turma 1/Turma 2 Turma 3/Turma 5 Turma 4 Turma 1/Turma 2 Turma 3/Turma 5 Turma 4 Turma 1/Turma 2 Turma 3/Turma 5 Turma 4 Turma 1/Turma 2 Turma 3/Turma 5

Trabalho Prático 1ª e 2ª Aula 1ª e 2ª Aula 1ª e 2ª Aula 3ª e 4ª Aula 3ª e 4ª Aula 3ª e 4ª Aula 5ª e 6ª Aula 5ª e 6ª Aula 5ª e 6ª Aula 7ª e 8ª Aula 7ª e 8ª Aula 7ª e 8ª Aula 9ª e 10ª Aula 9ª e 10ª Aula 9ª e 10ª Aula 11ª e 12ª Aula 11ª e 12ª Aula 11ª e 12ª Aula

2. Avaliação A frequência da cadeira é obtida através da realização com informação positiva de todos os trabalhos práticos e na realização de um exame prático, no final do semestre, com obtenção de classificação igual ou superior a 10 valores. A classificação final: 30% (nota prática) + 70% (nota teórica)

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1ª/2ª Aula

I. Resumo sobre ácidos nucleicos I.I DNA/RNA I.II Estrutura de um gene procariótico e eucariótico

II. HIV1-VIF III. Objectivos das aulas práticas 1. Preparação de DNA cromossomal de células linfocitárias infectadas com o HIV1. 2. Obtenção do gene VIF de HIV1 por PCR 3. Extracção de DNA plasmídico (no qual se clonou o gene VIF) 4. Confirmação da clonagem do gene VIF. 5. Transformação de E.coli para produção de VIF em larga escala. 6. Extracção e confirmação da produção de proteínas. Estudo das tecnologias do DNA recombinante

I.I. Resumo sobre ácidos nucleicos Os ácidos nucleicos são moléculas que armazenam e transmitem a informação nas células. O primeiro dos ácidos nucleicos a ser descoberto foi o DNA (ácido desoxirribonucleico). O DNA (RNA no caso de alguns vírus) constitui o suporte universal de toda a informação genética que define as características de cada ser vivo. Foi em 1953 que, com os trabalhos de James Watson e Francis Crick, passou a ser possível entender o modo como na natureza se encontra codificado todo o programa que comanda o desenvolvimento dos organismos vivos – determinando as características estruturais e funcionais próprias de cada célula e de 4

cada espécie – e como essa informação é conservada de geração em geração.

As células têm duas moléculas portadoras de informação: o ácido desoxirribonucleico (DNA) e o ácido ribonucleico (RNA). Tal como as proteínas, são polímeros lineares. O DNA e o RNA são constituídos por 4 monómeros diferentes, os nucleotídeos ou nucleótidos.

Cada nucleótido é formado por três partes distintas: a) Ácido fosfórico b) – Oses – pentose: ribose no RNA; desoxirribose no DNA A: Adenina c) Base orgânica nitrogenadas: Purinas G: Guanina C: Citosina Pirimidinas T: Timina U: URacilo

Os nucleótidos estão ligados entre si por ligações fosfodiester. Como um polipeptídeo, uma cadeia de ácido nucleico possui uma orientação química: a extremidade 3’OH, com um grupo hidroxilo livre ligado ao carbono 3’ de uma - ose; a extremidade 5’P, com um grupo fosfato livre ligado ao carbono 5’ de uma – ose. Esta direccionalidade dá origem à convenção de que sequências polinucleotídicas são sintetizadas no sentido 5’→3’ (da esquerda para a direita). A orientação de uma cadeia de um ácido nucleico é uma propriedade extremamente importante.

→DNA A estrutura da dupla hélice do DNA consiste em duas cadeias polinucleotídicas enroladas uma à volta da outra, complementares, antiparalelas, unidas entre si por pontes de hidrogénio através das bases que se emparelham, respectivamente: - A com T, através de duas pontes de hidrogénio (A=T) 5

- G com C, através de três pontes de hidrogénio (GΞC)

O DNA encontra-se em diferentes locais na célula e pode assumir diferentes configurações, tal como indicado na tabela I.

Tabela I- Localização e configuração do DNA na célula

Localização do DNA

Configuração do DNA

Cromossomas Eucariotas

Linear em cadeia dupla

“Cromossomas” Procariotas

Circular em cadeia dupla

Mitocôndrias

Circular em cadeia dupla

Cloroplastos

Circular em cadeia dupla

Plasmídeos

Circular em cadeia dupla

Em vírus (bacterianos e animais)

Linear em cadeia dupla Linear em cadeia simples Circular em cadeia dupla

→RNA A –ose do RNA – a ribose – possui mais um grupo hidroxilo do que a desoxirribose do DNA e a timina é substituída pelo uracilo. Pode assumir as mesmas configurações do DNA e pode também formar hélice híbrida com uma cadeia de RNA e outra de DNA durante a transcrição, sendo uma forma transitória. 6

⇒Os RNAs mais relevantes são: • • • • •

mRNA - RNA mensageiro tRNA - RNA de transferência rRNA - RNA ribossomal hnRNA - RNA heterogéneo nuclear (só nas células eucariotas) sRNA - pequeno RNA (só nas células eucariotas)

Os RNAs são cadeias simples de nucleótidos com uma extremidade inicial 5’P e uma extremidade 3’OH. ⇒ As funções de cada tipo de RNA são: • mRNA - transporte da informação contida no DNA. • tRNA - ligação entre a linguagem nucleotídica (mRNA) e a linguagem proteica (aminoácidos). Cada molécula de tRNA liga-se ao mRNA e a um aminoácido. • rRNA - molécula estrutural do ribossoma. • hnRNA - conjunto de transcritos primários que existem no núcleo e vão dar origem aos mRNA, tRNA, rRNA e sRNA. • sRNA - papel importante no processamento (splicing).

I.II Estrutura de um gene procariótico e eucariótico → O gene procariótico Em procariotas, os genes com funções relacionadas encontram-se geralmente num grupo designado por operão. Um operão é um conjunto de genes contínuo com funções relacionadas, controlados por um único promotor que origina um mRNA contendo sequências codificantes para mais do que uma proteína. Os mRNAs resultantes da transcrição de genes procarióticos: • não possuem intrões • são policistrónicos

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Fig. 1: Estrutura de um gene procariótico.

Fig. 2: Regulação do operão lac em E. coli.

→ O gene eucariótico Há três tipos básicos de genes eucariotas. Os genes transcritos pela RNA polimerase I (rRNA), os genes transcritos pela RNA polimerase II (mRNA) e os genes transcritos pela RNA polimerase III (tRNA).

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Ao contrário dos mRNAs procarióticos, os mRNAs resultantes da transcrição de genes eucarióticos: • possuem intrões, logo têm que ser processados (splicing) • são monocistrónicos- um polipéptido por mRNA

• processo de transcrição e tradução não acoplado

Fig. 3: Estrutura de um gene eucariótico que codifica uma proteína.

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Produção de uma Proteína recombinante pela tecnologia do DNA recombinante DNA cromossomal de células linfocitárias infectadas com o HIV1

Obtenção do gene VIF de HIV por PCR.

Gene VIF

DNA plasmídico

Gene VIF

Clonagem do gene VIF

Transformação de E. coli para produção de VIF em larga escala

Extracção e confirmação da produção de proteína 10

Extracção e purificação de DNA cromossomal de Escherichia coli Introdução O DNA de origem bacteriana pode ser extraído por métodos diferentes consoante se trata de DNA cromossómico ou de DNA extracromossómico como é o caso de plasmídeos. Na purificação de DNA cromossómico a parede celular da bactéria, se for gram-positiva, é aberta por tratamento com lisozima, no caso de bacilos, ou em conjunto com lisostafina no caso de estafilococos, ambas são enzimas hidrolíticas que actuam sobre o peptidoglicano da parede celular. Em bactérias gram-negativas pode primeiro enfraquecer-se a parede celular por congelamento e descongelamento e adição de EDTA antes do tratamento com lisozima. A lise celular é completada por adição de um detergente por exemplo SDS em solução salina tamponada. Estes detergentes vão solubilizar as membranas dissolvendo principalmente os lípidos. O lisado após este tratamento deve ficar transparente. Na solução de lise as células ficam num meio tamponado, hipotónico e com pH óptimo para a actuação da lisozima (normalmente tampões Tris-EDTA, pH 8,0). É importante a presença de EDTA nesses tampões, uma vez que é um agente quelante. O EDTA vai complexar os iões Mg2+ necessários à actividade das DNAses celulares impossibilitando assim a sua acção sobre o DNA durante ou após a lise. Depois da lise a solução é tratada normalmente com uma RNAse para hidrolisar o RNA, nomeadamente a RNAse I (a qual só é activa na completa ausência de Mg2+ e quebra selectivamente as ligações internucleotídicas entre os nucleotídeos pirimidicos 3’ e os nucleotídeos adjacentes) e com uma protease de largo espectro (proteínase K) para degradar as proteínas. As proteínas residuais e oligopeptídeos podem ser removidas com solventes orgânicos tais como o fenol e clorofórmio. Com este tratamento a maior parte das proteínas será desnaturada e entrará para a fase orgânica ou precipitará na interface das fases aquosa e orgânica. O DNA em solução, na fase aquosa com aspecto límpida e viscosa, é precipitado com etanol ou isopropanol, sendo a precipitação facilitada quando adicionado ao DNA 1/10 do volume de acetato de sódio. A precipitação tem como objectivo a concentração do DNA de alta massa molecular e a remoção de pequenos oligonucleotídeos de DNA e RNA (caso se tenha omitido o tratamento anterior com RNAse), de 11

parte dos detergentes e solventes orgânicos usados na extracção das proteínas. O maior ou menor grau de purificação do DNA genómico depende das experiências a que se destina. Se for para uma análise de restrição ou ligação a um vector de clonagem é necessário obter preparações puras. Devido ao seu grande comprimento as moléculas de DNA em solução são altamente susceptíveis de se fragmentarem. Assim a agitação excessiva durante a purificação resultará numa redução do peso molecular médio do DNA. A utilização de soluções tamponadas contendo uma concentração de 10 a 25% (p/v) de sacarose poderá ajudar a minimizar a quebra do DNA à medida que este é libertado da célula. Objectivo: Isolamento de DNA genómico de Escherichia coli. Parte Experimental: 1. Inocular meio de cultura LB com E.coli; crescer durante a noite a

37ºC com agitação (200 rpm). (Realizado de véspera) 2. Retirar 1 ml da suspensão celular para um tubo eppendorf e

centrifugar a 10 000 rpm durante 5 minutos. 3. Lavar o sedimento 1 vez com 800 µl de NaCl 0,9% ou H2O. 4. Centrifugar durante 5 min a 10 000 rpm. Retirar o sobrenadante. 5. Ressuspender o sedimento celular em 700 µl de STET. 6. Adicionar 40 µl de uma solução de lisozima (10 mg/ml, em água

destilada), homogeneizar e incubar 10 minutos à temperatura ambiente.

7. Juntar 5 µl de proteínase K (20 mg/ml) e incubar a 37ºC durante

15 minutos. 8. Proceder a duas extracções com 500 µl de fenol/TE. 9. Proceder a duas extracções com 500 µl de clorofórmio: álcool

isoamilico (24:1). 10. Adicionar à fase aquosa final 50 µl de acetato de potássio 3M e

500 µl de isopropanol (ou 2 volumes de etanol), homogeneizar e incubar 5 minutos á temperatura ambiente.

11. Centrifugar a 10 000 rpm durante 15 minutos, para obter o

sedimento do DNA genómico. Em alternativa pode retirar com um palito o DNA para um novo eppendorf.

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12.Retirar o etanol, inverter o tubo e deixar secar 5 minutos à temperatura ambiente. 13. Dissolver o DNA em 50 µl de TE. Guardar a -20ºC.

Reagentes: STET:

8% (p/v) sacarose 5% (v/v) triton x-100 50 mM EDTA 50mM de Tris-HCl (pH 8)

TE:

10mM Tris-HCl (pH 8) 1 mM EDTA (pH 8)

QUESTÕES:

1- Como é que o DNA está organizado nas células procariotas e nas células eucariotas?

2- Quantas moléculas de DNA existem numa célula procariota e numa célula humana?

3- A que tipo de moléculas é que o DNA está associado e como?

4- Quantos genes existem numa célula Humana? E quantos destes codificam proteínas?

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5- Como é que os genes estão dispersos numa célula animal?

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