2. Isolasi & Identifikasi Bakteri Escherichia Coli

BAKTERIOLOGI III LAPORAN PRAKTIKUM ISOLASI & IDENTIFIKASI BAKTERI GRAM NEGATIF PENYEBAB INFEKSI SALURAN PENCERNAAN Escherichia coli

Disusun oleh : RANI DIAN PUTRI UTAMI NPM : 411117098

PROGRAM STUDI ANALIS KESEHATAN (D-3) STIKES JENDERAL ACHMAD YANI CIMAHI 2018/2019

A. TANGGAL PRAKTIKUM Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi STIKES Jenderal Achmad Yani Cimahi pada tanggal 12, 13, dan 14 Maret 2019. B. TEORI DASAR Escherichia coli diisolasi pertama kali oleh Theodore Escherich pada tahun 1885 dari tinja seorang bayi (Merchant dan Parker,1961). E. coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 µm, diameter 0,7 µm, lebar 0,4-0,7 µm dan bersifat anaerob fakultatif. E. coli membentuk koloni yang bundar, cembung, dan halus dengan tepi yang nyata (Smith Keary, 1988; Jawetz et al., 1996). Pada umumnya bakteri memerlukan kelembaban yang cukup tinggi sekitar 85% (Madigan dan Martinko, 2005). Escherichia coli merupakan bakteri komensal yang dapat bersifat patogen, bertindak sebagai penyebab utama morbiditas dan mortalitas diseluruh dunia (Tenailon et al., 2010). Berdasarkan taksonominya E. coli diklasifikasikan sebagai berikut : Kingdom : Bacteria Divisio : Proteobacteria Kelas : Gamma Proteobacteria Ordo : Enterobacteriales Famili : Enterobacteriaceae Genus : Esherichia coli. (Todar, 2008)

Bakteri E. coli merupakan merupakan bakteri Gram negatif, bentuk batang, memilki ukuran 2,4 mikro 0,4 hingga 0,7 mikro, bergerak, tidak berspora, positif pada tes indol, glukosa, laktosa, sukrosa (Greenwood et al., 2007). Dinding

sel bakteri gram

negatif

tersusun atas membran luar,

peptidoglikan dan membran dalam. Peptidoglikan yang terkandung dalam bakteri gram negatif memiliki struktur yang lebih kompleks dibandingkan gram positif. Membran luarnya terdiri dari lipid, liposakarida dan protein. Peptidoglikan berfungsi mencegah sel lisis, menyebabkan sel kaku dan memberi bentuk kepada sel (Purwoko, 2007).

Bakteri E. coli yang menyebabkan diare sangat sering ditemukan di seluruh dunia. Bakteri ini diklasifikasikan oleh ciri khas sifat – sifat virulensinya dan setiap golongan menimbulkan penyakit melalui mekanisme yang berbeda, antar lain: a.

Enterotoksigenik E. coli (ETEC) Enterotoksigenik merupakan penyebab paling umum dari diare pada wisatawan (Travellers Diarrhea) dan diare pada bayi di negara berkembang. Ada dua macam eksotoksin yang dihasilkan dari E. coli yaitu: (1) Limfotoksin dikeluarkan bawah kendali genetik plasmid. (2) Sitotoksin yang berada di bawah kendali kelompok plasmid heterogen.

Strain

yang

menghasilkan

kedua

toksin

tersebut

menyebabkan diare yang lebih berat (Brooks et al., 2008). b. Enteroinvasif E. coli (EIEC) Menyebabkan penyakit yang mirip dengan shigellosis. Sering terjadi pada anak – anak di negara berkembang dan wisatawan yang menuju negara tersebut. EIEC menimbulkan penyakit melalui invasinya ke sel epitel mukosa usus (Brooks et al., 2008). c. Enteropatogenik E. coli (EPEC) Enteropatogenik mengacu pada serotipe E. coli tertentu yang pertama dicurigai dalam studi epidemiologi pada 1940-an dan 1950-an sebagai penyebab epidemi dan sporadis diare pada anak-anak (Frankel G. et al, 2002) d. Enterohemoragik E. coli (EHEC) Sedangkan EHEC dianggap sebagai patogen zoonosis baru yang dapat menyebabkan gastroenteritis akut dan hemoragik kolitis dengan komplikasi ginjal dan neurologis sebagai akibat dari translokasi Shiga toksin (Stx 1 dan Stx 2) di usus. Merupakan penyebab utama kematian bayi dalam Negara berkembang (Jawetz et al., 2008) e. Enteroagregatif E. coli (EAEC) Akibat infeksinya menyebabkan diare akut dan kronik pada negara berkembang. Bakteri ini ditandai dengan pola khas perlekatannya pada sel manusia. EAEC memproduksi hemolisin dan ST enterotoksin yang sama dengan ETEC (Brooks et al., 2008).

Escherichia coli biasanya berkolonisasi di saluran pencernaan dalam beberapa jam setelah masuk ke dalam tubuh dan membangun hubungan mutualistik. Namun, strain non-patogenik dari E. coli bisa menjadi patogen, ketika adanya gangguan di dalam pencernaan serta imunosupresi pada host (Sanz-Garcia et al., 2009; Sharma et al., 2011; Janny et al., 2012). Bakteri E. coli dapat membentuk koloni pada saluran pencernaan manusia maupun hewan dalam beberapa jam setelah kelahiran. Faktor predisposisi pembentukan koloni ini adalah mikroflora dalam tubuh masih sedikit, rendahnya kekebalan tubuh, faktor stres, pakan, dan infeksi agen patogen lain. Kebanyakan E. coli memiliki virulensi yang rendah dan bersifat oportunis (Songer & Post 2005). Ditjenak (1982) melaporkan bahwa E. coli keluar dari tubuh bersama tinja dalam jumlah besar serta mampu bertahan sampai beberapa minggu. Kelangsungan hidup dan replikasi E. coli di lingkungan membentuk koliform. E. coli tidak tahan terhadap keadaan kering atau desinfektan biasa. Bakteri ini akan mati pada suhu 60 0C selama 30 menit. E. coli bersifat patogen karena dapat menyebabkan infeksi pada manusia dan hewan. Seorang bakteriolog yaitu Theodor Escherich , mengidentifikasi E. coli dari babi yang menderita enteritis. Enteritis merupakan peradangan usus yang bisa menyebabkan sakit perut, mual, muntah, dan diare baik manusia maupun hewan. E. coli merupakan bakteri yang bisa hidup pada lingkungan yang berbeda. Bakteri ini dapat ditemukan di tanah, air, tanaman, hewan, dan manusia (Berg 2004; Bhunia 2008; Manning 2010). Genus Eschericia merupakan bakteri berbentuk batang (1x4 μm), motil, dan mesofilik. Bakteri ini sering ditemukan di dalam pencernaan manusia, hewan berdarah panas, dan burung (Ray 2004; Duffy 2006; Bhunia 2008). Spesies terpenting dari genus Eschericia ialah E. coli (Ray 2004; Adams dan Moss 2008). E. Coli merupakan famili Enterobacteriaceae yang termasuk bakteri enterik. Bakteri enterik ialah bakteri yang bisa bertahan di dalam saluran pencernaan termasuk sruktur saluran pencernaan rongga mulut, esofagus, lambung, usus, rektum, dan anus. E. coli bisa hidup sebagai bakteri aerob maupun bakteri anaerob. Oleh karena itu, E. coli dikategorikan sebagai anaerob fakultatif (Manning 2010).

C. TUJUAN PRAKTIKUM Untuk melakukan kultur dengan sampel feses agar dapat mengidentifikasi bakteri yang mengineksi saluran pencernaan. D. ALAT DAN BAHAN 1. Alat Tabel 1. Alat yang Digunakan Dalam Praktikum No.

Nama Alat

Spesifikasi

1.

Tabung Reaksi

Volume 20 mL

2.

Tabung Durham

Tinggi 35mm ; Diameter 6mm

3.

Object Glass

5.

Ose Tusuk

Kawat NiCr

6.

Mikroskop

Lensa Objektif 100x

7.

Rak Pewarnaan

8.

Cawan Petri

9.

Ose Bulat

10.

Bunsen

11.

Korek Api

12.

Rak Tabung Reaksi

13.

Tempat sampel Steril

14.

Autoklaf

-

Volume 20 mL Kawat NiCr Volume 200 mL 12 Lubang; Ukuran 20 x 10 cm Volume 100 mL Suhu 37°C

2. Bahan Tabel 2. Bahan yang Digunakan Praktikum No. 1.

Spesifikasi

Nama Bahan Sampel

feses a. Mac Conkey Agar b. Gula-gula (Glukosa, Laktosa, Manitol, sukrosa c. Methyl Red (MR)

2.

Media

d. VP e. Sulfur Indol Manitol (SIM) f.

Simon Citrat (SC)

g. Urease h. Triple sugar Iron Agar (TSIA) a. Krystal violet b. Lugol 3.

Zat Pewarna

c. Alkohol 96% d. Safranin 0,25% a. Kovacks

4.

Reagen

b. α-naftol 5% & KOH 40% c. Methyl Red

E. PROSEDUR KERJA 1. Hari pertama Melakukan penanaman sampel feses pada media slektif MC dengan cara isolasi 4 kuadran, lalu di inkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. 2. Hari kedua Amati pertumbuhan koloni bakteri pada media, kemudian lakukan pewarnaan gram, untuk melihat bentuk, sifat, dan susunan dari bakteri tersebut. Lalu dilakukan uji gula gula ( glukosa, laktosa, manitol, dan

sukrosa) dan dilakukan juga penanaman uji biokimia pada SC, Urease, MR, VP, TSIA, dan SIM. Kemuadian di inkubasi 24 jam pada suhu 370C 3. Hari ke tiga Di lakukan pengamatan pada uji gula gula ( glukosa, laktosa, manitol, dan sukrosa) dan pengamatan pada uji biokimia SC, Urease, MR, VP, TSIA, dan SIM. Pada SIM di tambahkan dengan reagen kovaks , pada MR di tambah reagen Metil Red 1%, dan pada VP di tambah reagen 5% αnaphtol + KOH 40%. Setelah itu amati perubahan yang terjadi. F.

HASIL PENGAMATAN 1. Hari ke- II Penanaman pada media MC (Mac Conkey)

Pertumbuhan Koloni -

Bentuk

: Bulat

-

Ukuran

: 1-2 mm

-

Warna

: Pink

-

Elevasi

: Cembung

-

Pinggiran

: Rata

-

Ciri khas lain : Fermenter

-

Permukaan

: Basah

Pewarnaan Gram :

Bentuk

Basil

Sifat

Gram Negatif

Susunan

Monobasil

Tersangka

Escherichia coli

2. Hari ke-III Hasil Uji Biokimia Gambar

Hasil Pengamatan

Hasil

Glukosa : Fermenter, Glukosa : Fermenter, gas (+)

gas (+)

Laktosa : Fermenter, Laktosa : Fermenter, gas (+)

gas (+)

Sukrosa : Fermenter, Sukrosa : Fermenter, gas (+)

gas (+)

Manitol : Fermenter, Manitol : Fermenter, gas (+)

gas (+)

MR : positif (+)

MR : positif (+)

terbentuk cincin

terbentuk cincin

berwarna merah

berwarna merah

VP : negatif (-)

VP : negatif (-)

SIM

SIM

Sulfur : negatif (-)

Sulfur : negatif (-)

Indol : positif (+)

Indol : positif (+)

Terbentuk cincin

Terbentuk cincin

berwarna coklat

berwarna ungu- coklat

Molitity : positif (+)

Molitity : positif (+)

SC

SC

: negatif (-)

Urease : negatif (-) TSIA

: negatif (-)

Urease : negatif (-)

: positif (+) gas TSIA

: positif (+) gas

G. PEMBAHASAN Berdasarkan hasil pengamatan, koloni E. coli pada media MC berwarna merah ditunjukan pada gambar 2b. Hal ini sesuai dengan protocol manual dari BD edisi ke-2 yang menyatakan bahwa Koloni bakteri koliform yang terisolasi akan berwarna merah jambu tua karena media MC Agar mengandung kristal violet dan garam empedu yang menghambat organisme Gram-positif memungkinkan organisme Gram-negatif untuk tumbuh. Berdasarkan hasil pengamatan uji biokimia yang telah dilakukan pada 15 isolat E. coli dari 10 sampel yang telah diambil, hasil uji biokimia indol, MR, VP, Citrat, motilitas, Urease, TSIA dan gula-gula. Uji indol bertujuan mengidentifikasi kemampuan bakteri menghasilkan indol dengan menggunakan enzim tryptophanase (Leboffe, 2011). Produksi indol di dalam media dimungkinkan karena adanya tryptophan. Bakteri yang memiliki enzim tryptophanase menghidrolisis tryptophan. menjadi indol, piruvat dan amonia. Hal ini digunakan sebagai bagian dari prosedur IMViC, sebuah tes yang dirancang untuk membedakan antara anggota keluarga Enterobacteriaceae (Hemraj, 2013). Tryptophan adalah asam amino esensial, yang teroksidasi oleh beberapa bakteri yang mengakibatkan pembentukan indol, asam piruvat dan amonia. Uji indol dilakukan dengan inokulasi organisme uji ke dalam tryptophan broth, yang mengandung tryptophan. Indol yang dihasilkan dideteksi dengan menambahkan reagen Kovac’s ini yang menghasilkan cincin berwarna merah. Lapisan alkohol berkonsentrasi warna merah berbentuk cincin terdapat di bagian atas. Hasil indol positif dinyatakan dengan adanya cincin merah hal ini disebabkan karena Indol bereaksi dengan aldehida (Sridhar, 2006). Hasil uji indol pada isolat bakteri E. coli adalah positif yang ditunjukan adanya cincin merah pada bagian atas. Uji MR bertujuan untuk mendeteksi kemampuan organisme dalam memproduksi dan mempertahankan produk akhir asam stabil dari fermentasi glukosa. Beberapa bakteri menghasilkan sejumlah besar asam dari fermentasi. Methyl Red adalah indikator pH, yang tetap berwarna merah pada pH 4,4 atau kurang. (Sridhar, 2006) Setelah inkubasi, indikator pH Methyl Red ditambahkan ke dalam kultur bkteri. Methyl Red berwarna merah pada pH di bawah 4,4 (hal ini menunjukkan hasil positif) dan kuning pada pH

di atas 6,0. Warna oranye menunjukkan pH menengah dan dianggap hasil negatif (Hemraj, 2013). Hasil pengamatan untuk Uji MR pada isolat bakteri E. coli adalah positif yang ditunjukkan dengan larutan berwarna merah. VP adalah tes yang digunakan untuk mendeteksi acetoin dalam kultur cair bakteri. Pengujian ini dilakukan dengan menambahkan alpha-naftol dan kalium hidroksida dengan kaldu Voges Proskauer yang telah diinokulasi dengan bakteri. Warna merah cherry menunjukkan hasil yang positif, sedangkan warna kuningcoklat menunjukkan hasil negatif. Tes ini tergantung pada pencernaan glukosa menjadi acetylmethylcarbinol. Jika glukosa pecah, maka akan bereaksi dengan alpha-naftol (VP reagen 1) dan kalium hidroksida (VP reagen 2) untuk membentuk warna merah. Alpha-naftol dan kalium hidroksida adalah bahan kimia yang mendeteksi acetoin (Sridhar, 2006). Dalam tes ini dua reagen, 40% KOH dan alpha-naftol ditambahkan setelah inkubasi dan terkena oksigen. Jika terdapat acetoin, acetoin akan teroksidasi dengan adanya udara dan KOH menjadi diacetyl. Diacetyl kemudian bereaksi dengan komponen guanidin dari pepton, adanya alphanaftol menghasilkan warna merah. Peran alpha-naftol adalah untuk katalis dan penguat warna (Hemraj, 2013). Hasil pengamatan untuk uji VP adalah negatif yang ditunjukan tidak adanya perubahan warna terhadap larutan VP. Media uji motilitas digunakan untuk menentukan motilitas dari suatu mikroorganisme. Uji motilitas sering kali digunakan dalam diferensiasi dari Enterobacteriaceae (Shields dkk, 2013). Hasil pengamatan uji motilitas E. coli adalah positif, hal ini ditunjukan adanya pertumbuhan bakteri disekitar area penusukan. Pergerakan dari bakteri tersebut karena media semisolid (uji motilitas) dirancang dengan mengurangi konsentrasi agar pada media yaitu sekitar 0,4% pada media yang hanya cukup untuk mempertahankan bentuknya sementara memungkinkan pergerakan bakteri bergerak (Leboffe, 2011). Uji citrat dilakukan dengan inokulasi mikroorganisme ke dalam media sintetis organik, "Simons Citrate broth" apabila natrium sitrat adalah satusatunya sumber karbon dan energi. Bromothymol blue digunakan sebagai indikator saat asam sitrat dimetabolisme, menghasilkan karbondioksida yang menggabungkan natrium dengan air untuk membentuk natrium karbonat

yang merupakan produk alkaline yang menghasilkan perubahan warna dari hijau menjadi biru dan hal ini menunjukkan tes tersebut positif. (Sridhar, 2006). Hasil pengamatan untuk uji Citrat adalah negatif yang ditunjukan tidak adanya perubahan warna terhadap media uji citrat. Hasil pengamatan dari uji urea yang telah dilakukan adalah negatif, hal ini ditunjukan karena tidak ada perubahan warna pada media uji urea. Uji Urease

berguna

untuk

mengidentifikasi

organisme

yang

mampu

menghidrolisis urea yang dapat menghasilkan amonia dan karbon dioksida terutama untuk mengetahui mikrooeganisme tersebut mempunyai enzim urease atau tidak. Urease merupakan enzim konstitutif yang menghidrolisis urea menjadi karbon dioksida dan ammonia ( NH2 ) 2CO + H2O → CO2 + 2NH3 (Brink, 2013). Urea dihidrolisis menjadi amonia oleh organisme positif urease akan mengatasi buffer dalam jangka menengah dan mengubahnya dari oranye menjadi merah muda . hasil pengamatan untuk uji uraease pada E. coli menunjukan hasil negati, hal ini dikarenakan Organisme negatif urease baik tidak menghasilkan perubahan warna dalam media atau mengubahnya kuning dari produk asam. (Leboffe, 2011). TSIA agar adalah media deferensial yang digunakan dalam menentukan fermentasi karbohidrat dan produksi H2S. Selain itu, ujia TSIA ini juga dapat mendeteksi

adanya

gas

hasil

dari

metabolisme

karbohidrat.

TSIA

membedakan bakteri berdasarkan fermentasi mereka laktosa, glukosa dan sukrosa dan produksi hidrogen sulfida. TSIA yang paling sering digunakan dalam identifikasi Enterobacteriaceae, meskipun berguna untuk bakteri gram negatif lainnya (Lehman, 2005). Hasil dari pengamatan untuk uji TSIA pada E. coli menunjukan hasi A /A dengan gas positif dan H2S negatif. Warna kuning pada keseluruhan media tersebut dikarenakan E. coli pada media TSIA dapat memfermentasikan glukosa, laktosa dan sukrosa. Gas positif dikarenakan gas yang dihasilkan oleh fermentasi karbohidrat akan muncul sebagai celah di media atau akan mengangkat agar-agar dari bagian bawah tabung (Leboffe, 2011). Media uji motilitas digunakan untuk menentukan motilitas dari suatu mikroorganisme. Uji motilitas sering kali digunakan dalam diferensiasi dari Enterobacteriaceae (Shields dkk, 2013). Hasil pengamatan uji motilitas pada E. coli adalah positif, hal ini ditunjukan adanya

pertumbuhan bakteri disekitar area penusukan. Pergerakan dari bakteri tersebut dikarenakan media semisolid (uji motilitas) dirancang dengan mengurangi konsentrasi agar pada media yaitu sekitar 0,4% pada media yang

hanya

cukup

untuk

mempertahankan

bentuknya

sementara

memungkinkan pergerakan bakteri bergerak. (Leboffe, 2011). Menurut Ijong dan Dien tahun 2011, hasil uji biokimia untuk E. coli umumnya isolat uji memfermentasi laktosa dan menghasilkan asam dan gas, indol dan metil red positif, oksidase negatif, tidak menggunakan sitrat sebagai sumber energi dan motil, sedangkan uji lainnya memberikan hasil yang bervariasi. H. KESIMPULAN Dari hasil praktikum Isolasi & Identifikasi Bakteri Gram (-) penyebab infeksi saluran pencernaan Escherichia coli pada sampel feses didapatkan hasil dari uji kemiripan 100% mengarah pada tersangka bakteri Escherichia coli.

I.

DAFTAR PUSTAKA Jawetz, E., J.L. Melnick., E.A. Adelberg., G.F. Brooks., J.S. Butel., dan L.N. Ornston. 1995. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi ke-20 (Alih bahasa : Nugroho&R.F.Maulany). Jakarta : Buku Kedokteran EGC. Tenailon., Skurnik D., Picard B., Denamur E. (2010). The Population Genetics Of Commensal Escherichia coli. Nature Review Microbiology. Madigan MT, Martinko JM, Brock TD. 2006. Brock Biology of Microorgnisms. New Jersey: Pearson Prentice Hall. Brooks., et al. 2008. Mikrobiologi Kedokteran. Ed. 23. Jakarta : EGC. Frankel G., 2002. Microbial attachment to food and food contact surfaces. Adv. Food Nutr. Res. 43: 319-370. Berg HC. 2004.Eschericia coli in Motion. New York: Springer. Manning SD. 2010.Escherichia Coli Infections. New York: Infobase Publishing.Hlm:16.