1. Pemeriksaan Coliform Most Probable Number (mpn) Coliform Dan Escherichia Coli.pdf

BAKTERIOLOGI III LAPORAN PRAKTIKUM PEMERIKSAAN GRAM NEGATIF GOLONGAN COLIFORM MOST PROBABLE NUMBER (MPN) COLIFORM DAN Escherichia coli

Disusun oleh : RANI DIAN PUTRI UTAMI NPM : 411117089

PROGRAM STUDI ANALIS KESEHATAN (D-3) STIKES JENDERAL ACHMAD YANI CIMAHI 2018/2019

A. TANGGAL PRAKTIKUM

Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi STIKES Jenderal Achmad Yani Cimahi pada tanggal 05, 06, 07, dan 09 Maret 2019.

B. TEORI DASAR

MPN (most

probable

mikroorganisme

yang

number) adalah

menggunakan

data

metode dari

hasil

enumerasi pertumbuhan

mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari

sampel

padat

mikroorganisme

atau

dalam

cair

sehingga

jummlah

dihasilkan

perkiraan

kisaran

terdekat

(Sri

jumlah Harti,

2015). Bakteri coliform dalam sumber air merupakan indikasi pencemaran air. Dalam penentuan kualitas air secara mikrobiologi kehadiran bakteri tersebut ditentukan berdasarkan tes tertentu yang umumnya menggunakan tabel atau yang lebih dikenal dengan nama MPN (Most Propable Number). Dasar

estimasi

ini

adalah

estimasi

jumlah

paling

memungkinkan

organismecoliform dalam 100cc air (Suriawiria, 2008).

Metode Most Probable Number (MPN) mempunyai beberapa kelebihan, salah satunya pada volume media LBSS dan LBDS menggunakan 10 ml dan 5 ml. Pemeriksaan kehadiran bakteri coli dari air dilakukan berdasarkan penggunaan media kaldu laktosa yang ditempatkan di dalam tabung reaksi berisi tabung durham (tabung kecil yang letaknya terbalik, digunakan untuk menangkap gas yang terjadi akibat fermentasi laktosa menjadi asam dan gas). (PDAM, 2015).

MPN (most Probable Number). Metode hitungan cawan dengan menggunakan

medium

padat,

tetapi

pada

metode

MPN

dengan

menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi. Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif, yakni yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung durham) yang

diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik yang membentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas (tabung reaksi) yang digunakan juga lebih banyak (Dwidjosepuutro, 2005). Prinsip untama dari metode MPN ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin sering tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang tabung reaksi positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dari probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya kedalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negative (tidak) ini menggambarkan

konsentrasi

mikroorganisme

pada

sampel

sebelum

diencerkan (Dwidjoseputro, 2005).

Dalam metode MPN pengenceran sampel harus lebih tinggi daripada pengenceran pada hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung 1 jasad renik, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari 1 sel, sedangkan tabung yang lain mengandung sel sama sekali. Dengan demikian setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positifm sedangkan tabung lainnya negatif (Waluyo, 2004).

Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam sampel yang berbentuk cair, meskipun dapat juga digunakan untuk sampel yang berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspense

1:10 dari sampel tersebut. Kelompok jasad renik yang dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan (Dwidjoseputro, 2005). Bakteri yang paling banyak digunakan sebagai indikator sanitasi adalah E. coli , karena bakteri ini adalah bakteri komensal pada usus manusia,

umumnya

bukan

pathogen

penyebab

penyakit

sehingga

pengujiannya tidak membahayakan dan relatif tahan hidup di air sehingga dapat dianalisis keberadaannya di dalam air yang notabene bukan merupakan medium yang ideal untuk pertumbuhan bakteri. Keberadaan E. coli dalam air atau makanan juga dianggap memiliki korelasi tinggi dengan ditemukannya pathogen pada pangan. Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fekal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fekal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi Coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain (Dad,2000). Contoh bakteri coliform adalah, Esherichia coli dan Entereobacter aerogenes. Jadi, coliform adalah indikator kualitas air. Makin sedikit kandungan coliform, artinya, kualitas air semakin baik. Berdasarakan latarbelakang itulah maka penngunaan uji test MPN penting untuk dilakukan.

Bakteri coliform yang

ditumbuhkan

dengan

media

laktosa

akan

menghasilkan gas jika diinkubasi selama lebih dari 48 jam pada suhu 35˚C, itulah dasar dilakukan metode MPN dengan melihat gas yang dihasilkan dalam tabung reaksi yang kemudian disesuaikan dengan tabel MPN (Krisna, 2005). Metode MPN terdiri dari 3 langkah, yaitu :

a.

Uji Penduga (Presumtive test) Sampel air diletakkan dalam tabung steril yang berisi Lactose Broth. Beberapa tabung diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35˚C,

kemudian

diperiksa

terbentuknya

gas,

karena

bakteri

akan

memfermentasikan laktosa dan menghasilkan gas. Jika gas tidak terbentuk dalam 24 jam, inkubasi diteruskan hingga 48 jam. Tes penduga dikatakan positif jika pada tabung terdapat gas yang ditandai dengan

terapungnya

tabung

durham.

Uji

ini

mendeteksi

sifat

fermentative coliformdalam sampel dan harus dikonfirmasi dengan tes konfirmatif untuk menyingkirkan keberadaan organisme lain yang memberikan hasil positif pada fermentasi laktosa.

b.

Uji Penegas (Confirmed test) Untuk uji peneguhan dilakukan untuk meneguhkan bahwa gas yang terbentuk disebabkan oleh kuman koliform dan bukan disebabkan oleh kerja sama beberapa spesies sehingga menghasilkan gas. Uji peneguhan menggunakan BGLB (Briliant Green Bile Lactose Broth) untuk golongan coliform dan EC broth untuk Escherichia coli yang diinokulasikan dengan satu mata ose media yang memperlihatkan hasil positif pada uji duga. (Andri, 2012). Tabung positif yang didapatkan dari uji penduga dilanjutkan dengan uji penegas. Sampel positif yang menunjukkan gas diinokulasi pada media Brilian Green Lactose Broth, kemudian inkubasi pada suhu 37˚C selama 48 jam. Apabila dihasilkan gas, maka uji penegas ini dinyatakan positif (Sarah et al., 2014).

c.

Uji Pelengkap (Complete test) Uji pelengkap dilakukan dengan menginokulasikan koloni bakteri pada medium agar dengan cara digoreskan dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35˚C. agar yang digunakan adalah endo agar dan Eosin Metil Blue (EMB). Pembenihan pada media agar ini mengakibatkan media agar menjadi bewarna ungu tua dengan kemilau tembaga metalik dan membentuk koloni dengan pusat gelap (Sarah et al., 2014).

Hasil metode MPN ini adalah nilai MPN, nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam sampel. Satuan yang digunakan umumnya per 100cc, makin

kecil nilai MPN, maka makin tinggi kualitas air untuk dikonsumsi (Permenkes, 2010).

Bakteri yang paling banyak digunakan sebagai indikator sanitasi adalah E. coli , karena bakteri ini adalah bakteri komensal pada usus manusia,

umumnya

bukan

pathogen

penyebab

penyakit

sehingga

pengujiannya tidak membahayakan dan relatif tahan hidup di air sehingga dapat dianalisis keberadaannya di dalam air yang notabene bukan merupakan medium yang ideal untuk pertumbuhan bakteri. Keberadaan E. coli dalam air atau makanan juga dianggap memiliki korelasi tinggi dengan ditemukannya pathogen pada pangan. E. coli adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang yang tidak membentuk spora yang merupakan flora normal di usus. Meskipun demikian, beberapa jenis E. coli dapat bersifat patogen, yaitu serotipe-serotipe yang masuk

dalam

golongan E.

coli Enteropatogenik, E.coli Enteroinvasif, E.

coliEnterotoksigenik dan E.coli Enterohemoragik . Jadi adanya E. coli dalam air minum menunjukkan bahwa air minum tersebut pernah terkontaminasi kotoran manusia dan mungkin dapat mengandung patogen usus. Oleh karenanya standar air minum mensyaratkan E. coli harus absen dalam 100 ml. (Maulana; 2010)

C.

TUJUAN PRAKTIKUM 1. Untuk menentukan kualitas mikrobiologi air sumur atau air sumur berdasarkan nilai

Most

Probable Number (MPN)

Coliform

dan

Escherichia coli. 2. Untuk mengetahui nilai MPN Coliform dan Escherichia coli sampel air sumur atau air sumur.

D.

PRINSIP PRAKTIKUM Prinsip dari metode MPN ini adalah pengenceran yang dilakukan sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang sesuai. Semakin rendah pengenceran, maka semakin positif hasilnya.

Sebaliknya jika pengenceran tinggi, maka jarang tabung yang hasilnya positif yang muncul. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung pada probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat dimasukkan ke media. Metode ini sangat dipengaruhi oleh homogenitas. Frekuensi positif dan negatif menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum pengenceran. E.

ALAT DAN BAHAN

1. Alat Tabel 1. Alat yang Digunakan Dalam Praktikum No.

Nama Alat

Spesifikasi

1.

Tabung Reaksi

Volume 20 mL

2.

Tabung Durham

Tinggi 35mm ; Diameter 6mm

3.

Pipet Volume

4.

Balp

5.

Mikropipet

Volume 100 uL dan 1000 uL

6.

Tip Kuning

20 uL – 200 uL

7.

Tip Biru

8.

Cawan Petri

9.

Ose Bulat

10.

Bunsen

11.

Korek Api

12.

Rak Tabung Reaksi

13.

Tempat sampel Steril

14.

Autoklaf

Volume 10 mL Karet

1000 uL Volume 20 mL Kawat NiCr Volume 200 mL 12 Lubang; Ukuran 20 x 10 cm Volume 100 mL Suhu 37°C

2. Bahan

Tabel 2. Bahan yang Digunakan Praktikum No.

Nama Bahan

Spesifikasi

1.

Sampel air sumur

100 mL a. Media Lactose Broth (Single strain & Double Strain)

2.

Media

b. Media Escherichia coli Broth c. Media Endo Agar

F.

PROSEDUR KERJA 1. Hari Pertama Dilakukan pengambilan sampel air sumur dengan cara bersihkan mulut keran dengan sabun, kemudian disterilkan dengan cara membakar mulut keran dengan api. Dibuka penuh keran dan dibiarkan mengalir selama 2-3 menit, kemudia ditutup. Diambil botol steril dan dibuka keran dan ditampung airnya sampai ¾ bagian botol. Kemudian dilanjutkan uji presumtif dengan ditanam pada 9 tabung yang berisi media Lactose yang terdiri dari 3 tabung lactose broth double strain yang kemudian dipipet sampel air sebanyak 10 mL dan dimasukkan pada masing-masing tabung lactose broth double strain. 3 tabung lactose broth single strain yang kemudian dipipet sampel air sebanyak 1 mL dan dimasukkan pada masing-masing 3 tabung lactose broth single strain. 3 tabung lactose broth single strain yang kemudian dipipet sampel air sebanyak 0.1 mL dan dimasukkan pada masing-masing

3 tabung lactose broth single strain, dihomogenkan 9 tabung tersebut. Kemudian 9 tabung tersebut diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam.

2. Hari Kedua Dilakukan uji penegas dengan ditanamkan hasil positif dari uji presumtif sebanyak satu ose kedalam masing-masing tabung yang berisi media Escherichia coli broth , jumlah tabung ini sesuai dengan hasil positif dari uji presumtif. Diinkubasi dengan suhu 450C selama 24 jam.

3. Hari Ketiga Dilakukan perbandingan hasil uji penegas dengan tabel MPN untuk menentukan perkiraan jumlah bakteri Escherichia coli pada sampel air. Kemudian dilakukan uji pelengkap dengan ditanamkan dengan ose hasil positif dari uji penegas ke media Endo Agar. Diinkubasi dengan suhu 370C selama 24 jam.

4. Hari Keempat Diamati hasil dari uji pelengkap, apabila pada media Endo Agar terdapat bakteri berwarna : a. Ungu  Klebsiella peneumoniae & Enterobacter aerogenes b. Ungu metallic  Escherichia coli

G. HASIL PENGAMATAN 1. Hasil Pengamatan Hari Kedua

Gambar 2 Hasil Gambar 3 Hasil Uji Presumtif Lactose Uji Presumtif Broth Single Strain Lactose Broth 0,1 mL Single Strain 1 mL

Gambar 1 Hasil Uji Presumtif Lactose Broth Double Strain 10 mL 2.

Hasil Pengamatan Hari Ketiga

Gambar 4. Hasil Uji Penegasan Tabel 3. Hasil Angka Uji Penegasan Hasil Uji Penegasan

Jumlah Tabung Positif

DS 10 mL

3

SS 1 mL

0

SS 0,1 mL

1

Hasil ini dibandingkan dengan table MPN seri 3 di dapatkan jumlah perkiraan Escherichia coli dari sampel air sebesar 39MPN/100mL.

3. Hasil Pengamatan Hari Keempat

0

0

0.1mL 10mL 3 3

Gambar 5 Hasil Uji Pelengkap Tidak Ditumbuhi Bakteri (Negatif) H. PEMBAHASAN Pada percobaan ini, dilakukan pengujian kualitas sampel air dengan cara mengamati ada tidaknya bakteri Escherichia coli dalam sampel air tersebut, karena bakteri ini merupakan indikator sanitasi. Keberadaan coliform fekal (Escherichia coli) ini dapat membuat kualitas air tidak baik karena air dapat terkontaminasi. Pengujian kualitas air meliputi tiga tahap, yaitu uji pendugaan (Presumtive test), uji penetapan (Comfirmed test), dan uji lengkap (Complete test). Berdasarkan Uji Penduga pada percobaan yang dilakukan dengan sampel yang volumenya 10 ml terdapat 3 buah tabung yang hasilnya positif semua. Pada sampel yang volumenya 1 ml terdapat 3 buah tabung hasilnya juga negatif. Sedangkan pada sampel 0,1 terdapat 1 buah tabung yang hasilnya positif. Semakin banyak volume suatu sampel maka semakin banyak pula bakteri yang terkandung di dalamnya. Hasil ini diperkuat diperkuat dengan uji penguat (confirmed test) (Gambar4) sebanyak 4 tabung sampel yang positif Coliform. Nilai MPN yang diperoleh dari hasil pengujian menunjukkan jumlah bakteri coliform pada air sumur sebesar 39 MPN/100 ml (Gambar 4).

Namun ketika dilakukan pelengkap (complete test) tidak tumbuhnya bakteri pada media Endo yang menandakan bahwa pada sampel air sumur tidak mengandung/ tidak terkontaminasi bakteri golongan Coliform. Hal ini bisa disebabkan oleh beberapa kemungkinan yaitu : 1. Kemungkinan ose yang masih dalam kondisi panas ketika mengambil satu ose dari hasil uji penegasan dan penanaman pada media Endo Agar yang menyebabkan bakteri telah mati. 2. Kemungkinan gelembung yang terdapat pada tabung durham adalah gelembung palsu karena kurang adanya gelembung yang terperangkap pada saat pembuatan media dan bisa karna gelembung yang terbentuk pada saat dihomogenkan Menurut penelitian Wandrivel (2012) produksi gas pada tabung reaksi menunjukkan adanya pertumbuhan koloni bakteri coliform pada medium yang digunakan sehingga dapat dimasukkan ke dalam tabel perkiraan untuk mendapatkan total bakteri coliform yang terkandung dalam 100 ml sampel air. Hasil dari jumlah tabung yang positif dibandingkan dengan tabel MPN (Most Probable Number). Hasil perhitungan jumlah coliform menggunakan tabel MPN (Most Probable Number) dapat menentukan kualitas suatu produk. 3. Kemungkinan memang sampel air sumur yang diperiksa tersebut tidak terkontaminasi Escherichia coli.

I.

KESIMPULAN Dari hasil praktikum pemeriksaan gram negatif golongan coliform most probable number (MPN) coliform dan Escherichia coli pada sampel air sumur daerah Cimahi pada uji penegasan didapatkan MPN Escherichia coli sebesar 39 MPN/100mL tetapi dengan tidak tumbuhnya bakteri pada Endo Agar sehingga dapat disimpulkan bahwa air tersebut tidak terkontaminasi bakteri Escherichia coli . Hal ini sesuai dengan Permenkes RI No.32/2017 dimana syarat untuk air higienis dan sanitasi adalah 0 MPN/100mL. Sehingga kondisi air pada daerah Cimahi dapat disimpulkan dalam kondisi yang baik.

J.

DAFTAR PUSTAKA Dad. 2000. Bacterial Chemistry and Physiology. John Wiley & Sons, Inc. New York. Depkes RI, 2010. Permenkes RI No. 492/MENKES/PER/IV/2010. Tentang Persyaratan Kualitas Air Minum. Depkes RI, Jakarta. Dwidjoseputro,

D.

2005. Dasar-Dasar

Mikrobiologi

Cetakan

ke-13.

Percetakan Imagraph. Jakarta. Krisna. 2005. Ada Coliform di Water Tap ITB (1). http://www.itb.ac.id/news/557.xhtml. [Diakses 11 Maret 2019]. Permenkes RI No.32/2017/ syarat untuk air higienis dan sanitasi Sarah, R. E., Apriliana, E., Soleha T. U, and Warganegara, E. 2014. Most Probable Number (MPN) Test of Coliform Bacteria in Household Suriawiria, U. 2008. Mikrobiologi Air. PT Alumni: Bandung. Wandrivel R,. Suharti N,. Lestari Y. 2012. Kualitas Air Minum yang Diroduksi Depot Air Minum Isi Ulang di Kecamatan Bumus Padang Berdasarkan Persyaratan Mikrobiologi. Jurnal Kesehatan Andalas Vol. 1. No. 3