Southern-northern.pdf

MATA KULIAH BIOLOGI MOLEKULER (minggu V, 14 Maret) Prodi S-2 Biologi FST – Universitas Airlangga NURMALASARI DARSONO

PENGANTAR  Dalam biologi molekuler modern, teknik blotting adalah metode yang sensitif dan dapat diandalkan untuk mengidentifikasi molekul tertentu dalam suatu sampel.  Teknik blotting yang pertama kali adalah Southern blot (1975), ditemukan oleh Prof Sir Edwin Southern (Oxford Univ)  Teknik blotting berikutnya, dinamai mengikuti Southern blot. Yaitu Northern, Western dan Eastern blot.

PENGANTAR TEKNIK BLOTTING

SOUTHERN blot deteksi DNA

NORTHERN blot deteksi RNA

WESTERN blot deteksi protein

 South Western blot : deteksi DNA binding protein

EASTERN blot deteksi post translational modified protein

TEKNIK BLOTTING  Blotting : teknik mentransfer molekul (DNA, RNA, protein) ke suatu media imobil sehingga dapat dianalisis lebih lanjut.  Prinsip dasar teknik blotting :  Separasi molekul berdasarkan ukuran atau muatannya (melalui elektroforesis)  Molekul terseparasi ditransfer ke membran  Pengikatan molekul sasaran melalui pelacak berlabel  Visualisasi hasil ikatan molekul-pelacak

TEKNIK BLOTTING

Prinsip dasar teknik blotting

TEKNIK BLOTTING

Membran untuk blotting

SOUTHERN BLOT  Pengikatan molekul DNA sasaran dengan pelacak (=probe) disebut hibridisasi key step  Hibridisasi : proses pembentukan DNA untai ganda antara DNA probe untai tunggal dengan DNA sasaran untai tunggal.  DNA sasaran dapat berupa fragmen pendek DNA, namun dapat juga DNA genom (misalnya viral genom)

TAHAPAN SOUTHERN BLOT  DNA sampel yang telah diisolasi, dipotong-potong dengan enzim restriksi.

 Larutan DNA yang telah dipotong-potong, dielektroforesis untuk proses separasi berdasarkan ukurannya.

TAHAPAN SOUTHERN BLOT  Gel yang berisi fragmen DNA hasil separasi elektroforesis, didenaturasi dengan larutan basa (untai ganda menjadi untai tunggal), kemudian ditransfer ke membran.  Membran hasil transfer merupakan replika gel elektroforesis.

TAHAPAN SOUTHERN BLOT  Membran dihibridisasi dengan penambahan probe berlabel dan diinkubasi sesuai kondisi optimum.

 Probe berikatan dengan DNA sasaran.

TAHAPAN SOUTHERN BLOT  Proses pencucian untuk membuang sisa-sisa probe, kemudian membran divisualisasikan melalui alat autoradiografi atau illuminator.

Diagram alir Southern blot

Pemanfaatan Southern Blot  Digunakan pada beragam area : penemuan gen baru dan pemetaan, kajian evolusi dan perkembangan, diagnostik, forensik  Investigasi untuk menentukan berat molekul suatu fragmen DNA dan jumlah relative DNA dalam sampel berbeda  Deteksi keberadaan partikel DNA tertentu pada sampel uji  Analisa pola genetik pada manusia  Digunakan dalam DNA fingerprint, rekayasa genetika dan ilmu forensik (uji paternal, identifikasi personal, identifikasi seksual)

Pemanfaatan Southern Blot  Pada rekayasa genetika, digunakan untuk memastikan gen asing telah tersisipkan ke sel inang  Diagnosis penyakit turunan kongenital mis : kongenital adrenal hyperplasia (CAH)  Identifikasi mutasi, delesi, dan gene rearrangement  Prognosa kanker dan prenatal diagnostik penyakit genetis  Diagnostik leukimia  Diagnostik HIV-1 dan penyakit2 infeksi

Keuntungan Southern Blot  Metode efektif untuk mendeteksi DNA spesifik pada sampel kompleks  Dapat memberikan hasil yang sangat spesifik (sampai tingkat individu) mis. : fingerprint manusia  Lebih mudah (daripada metode lain) untuk analisa pada sampel DNA yang panjang  Dapat digunakan untuk menentukan jumlah DNA  Dapat mengkonfirmasi organisme hasil rekayasa genetika

Kerugian Southern Blot    

Relatif lebih mahal daripada uji biomolekul lainnya Membutuhkan SDM yang sangat ahli/terampil Memerlukan waktu lama dan rumit Membutuhkan jumlah DNA yang cukup banyak

Contoh Aplikasi Southern Blot “Differentiation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli strains by using restriction endonuclease DNA profiles and

DNA fragment polymorphisms” Tujuan :  Mengetahui perbedaan profil DNA C.jejuni dan C.coli yang dipotong dengan RE EcoRV (sampel ayam dan manusia)  Mengetahui pola penularannya ke manusia

Contoh Aplikasi Southern Blot

Hasil elektroforesis setelah dipotong EcoRV

Contoh Aplikasi Southern Blot

Hasil Southern blot dengan probe EcoRV DNA

NORTHERN BLOT  Teknik untuk mendeteksi sekuens RNA spesifik  Diperkenalkan tahun 1977 oleh James Alwine, David Kemp and George Stark (Stanford University).  Dinamakan megikuti urutan setelah Southern blot.

TAHAPAN NORTHERN BLOT  RNA diisolasi dari sampel biologis

 Sampel RNA perlu penanganan ekstra hati-hati karena mudah kontaminasi dan degradasi

TAHAPAN NORTHERN BLOT  Sampel RNA diseparasi melalui elektroforesis berdasarkan ukurannya

 Gel hasil elektroforesis berisi RNA hasil separasi

TAHAPAN NORTHERN BLOT

 Gel diblotting ke membran untuk mentransfer RNA yang sudah diseparasi

TAHAPAN NORTHERN BLOT  Membran dihibridisasi dengan penambahan buffer dan probe berlabel. Probe berlabel akan berikatan dengan RNA sasaran

 Membran dicuci untuk membuang sisa probe

TAHAPAN NORTHERN BLOT  Membran divisualisasi dengan autoradiografi atau reaksi chemiluminescens

 Membran menghasilkan pola ekspresi dari RNA sasaran

DIAGRAM ALIR NORTHERN BLOT

Pemanfaatan Northern Blot  Studi ekspresi gen pada level mRNA).  Deteksi ukuran mRNA  Studi tentang RNA (degradasi, splicing, umur paruh)  Studi RNA splicing  Studi IRES (internal ribosom entry site)  Metode konfirmasi hasil rekayasa genetika

Keuntungan Northern Blot  Metode NB sudah diterima secara luas  Metode langsung untuk checking atau konfirmasi (= gold standard)  Protokol serbaguna, dapat menggunakan macam2 probe (label radio aktif atau non radio aktif bahkan oligonukleotida).  Jika sampel RNA terdegradasi oleh RNAse, kuantifikasi ekspresi hanya sedikit terpengaruh

Kerugian Northern Blot  Penggunaan radioaktif memerlukan SOP khusus untuk pembuangan  Prosedur memerlukan waktu lama, mulai preparasi sampai mendapatkan hasil  Metode NB kurang sensitive dibandingkan RTPCR. Sensitivitas dapat ditingkatkan dengan penggunaan membran bermuatan positif atau probe antisense spesifik  Tidak dapat digunakan untuk multiple probes

Contoh Aplikasi Northern Blot “Differential expression of four genes encoding 1-

aminocyclopropane-1-carboxylate synthase in Lupinus albus during germination, and in response to indole-3-acetic acid and wounding” Tujuan : mengetahui perbedaan ekspresi gen kelompok ACS (ACC synthase) pada kondisi cekaman perlukaan dan senescence Kelompok gen ACS adalah gen utama pada sintesa etilen.

Contoh Aplikasi Northern Blot

Contoh Aplikasi Northern Blot

Video Animasi Southern Blot

VIDEO : SOUTHERN HYBRIDIZATION.mp4

Video Animasi Northern Blot

VIDEO : Northern Blot.mp4

TERIMA KASIH

LATAR BELAKANG BERBAGAI TEKNIK REKAYASA GENETIKA

bb