Resumen Seminario 4

SEMINARIO #4: PROTEÍNAS ABC La superfamilia de proteínas o ABC (ATP binding cassette) está entre las más grandes y más ampliamente expresadas. Dentro de las proteínas ABC, algunos cumplen función de transportadores y son los transportadores ABC, son proteínas integrales donde la mayoría de sus miembros son responsables del transporte activo de una amplia variedad de compuestos a través de las membranas biológicas, que incluye fosfolípidos, iones, péptidos, esteroides, polisacáridos, aminoácidos, ácidos biliares, drogas, y otros xenobióticos. Lo cuál es crítico para la mayoría de los aspectos de la fisiología de la célula, incluyendo la importación de alimentos y la eliminación de los residuos, generación de energía y señalización celular. Entre otras funciones fisiológicas importantes, están, por ejemplo, en las células procariotas las proteínas ABC median la afluencia de alimentos esenciales del ambiente, donde está con frecuencia en muy baja concentración. En los mamíferos las proteínas ABC participan en procesos como el mantenimiento de la barrera hematopoyetica (P-glicoproteína), de la visión (ABCR), y de secreción epitelial [el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis cística (CFTR)]. Estas proteínas comparten esta categoría con otras que son derivadas de los dominios de conversión de energía, los dominios relacionados con el nucleótido (NBDs), pero que se han desarrollado para usar la energía liberada por la unión y la hidrólisis del ATP en otros procesos diferentes al transporte transmembrana. Éstos incluyen las proteínas implicadas en la organización de la cromatina, la reparación de la ADN, el mantenimiento del telómero, y el transporte de ARNm a través del poro nuclear. Las mutaciones en muchos de estos transportadores se producen a raíz de desórdenes genéticos que pueden causar una falla en el transporte de un ligando específico a través de la membrana, lo cuál es la base de algunas enfermedades genéticas humanas, y la capacidad de algunos de bombear moléculas citotóxicas (tóxicos de la dieta y drogas terapéuticas) de las células confiere resistencia a los antibióticos, a los herbicidas, y a las drogas quimioterapéuticas. En humanos 49 genes ABC están organizados en siete subfamilias de A a G (tabla 1). Tabla 1: distribución de los 49 transportadores ABC humanos ABCA ABCB ABCC ABCD ABCE Subfamilia ABC1 MDR MRP ALD OABP Nombre 12 11 13 4 1 Miembros

ABCF GCN20 3

ABCG (blanco) 5 (+ 1?)

Características de cada subfamilia ABCA: Esta subfamilia contiene algunos genes ABC lagos, con >2100 aminoácidos. La proteína ABCA1 está relacionada con desórdenes en el transporte del colesterol y biosíntesis de HDL. La proteína ABCA4 transporta derivados de la vitamina A en las células fotorreceptoras, lo cuál es un paso crucial para el ciclo visual. ABCB: Los sitios donde actúan incluyen la barrera hematoencefálica y el hígado, en el retículo endoplasmático, en lisosomas y en la mitocondria, donde tiene funciones en el metabolismo de hiero y transportan los precursores de las proteínas Fe/S. ABCC: son transportadores con diversa funcionalidad que incluye transporte iones, receptor superficial de la célula, y actividades de secreción de toxinas. ABCD: Todos los genes codifican por transportadores que situados en el peroxisoma, donde funcionan como homo y/o heterodímeros en la regulación del transporte de ácidos grasos de cadena larga. ABCE y ABCF: contienen los dominios NB (de unión al nucleótido) pero no los TM (transmembrana) y no se sabe si están implicados en transporte e membrana. ABCG (blanca): esta subfamilia está compuesta por seis medios-transportadores “reversos” que tienen un NBF en el amino terminal y el dominio TM en el carboxilo terminal. El gen mamífero ABCG1 está implicado en la regulación del transporte del colesterol. Otros genes de ABCG incluyen ABCG2, de resistencia a drogas; ABCG5 y ABCG8, transportadores de esteroles en el intestino e hígado.

ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS ABC Análisis recientes de la estructura de éstas proteínas han dado lugar al modelo ATP-interruptor para la función en la cuál los dominios apareados con el nucleótido cambian entre una conformación ATPdependiente y ATP-libre. Para realizar la exportación [la importación requiere un dominio periplásmico de unión al ligando (PBP) adicional], los transportadores ABC requieren un mínimo de cuatro dominios (figura 1). Dos dominios transmembrana (TMDs) forman los sitios de unión al ligando y proporcionan especificidad, y dos NBDs dominios de unión al nucleótido que hidrolizan el ATP para conducir el desplazamiento del sustrato a través de la membrana. FIGURA 1: estructura general de las proteínas ATP-binding cassette (ABC)

Estructura proteica básica de las proteínas ABC en amarillo. Otros dominios asociados no comunes en todas las proteínas ABC en color blanco. La unión de un sustrato al PBP (proteína periplásmica de unión al soluto) se muestra como un círculo negro. Los NBDs de las proteínas ABC están cerca de la membrana plasmática pero no se integran a ella. Algunas proteínas ABC contienen dominios adicionales o proteínas asociadas. La mayoría de los miembros de la subfamilia del MRP (ABCC: proteínas de resistencia a multidrogas) tienen un TMD adicional (TMD0 en) de la función desconocida. Un polipéptido de unión (linker) NBD1-TMD2 de longitud variable está presente en muchas proteínas del ABC. En algunos casos, el linker es importante para la regulación de la función de la proteína por fosforilación. Finalmente, en bacterias muchas proteínas periplásmicas de unión al sustrato se asocian con la entrega el substrato al complejo de transporte. Los NBDs, pero no los TMDs, son homólogo a través de la familia y cada NBD tiene siete motifs característicos altamente conservados, pero no invariables (figura 2), incluyendo los motifs Walker A y B comunes en muchas proteínas ABC, las asas aromáticas D, H, y Q, que son únicos en la familia. FIGURA 2: Los NBDs son homólogos y tiene motifs altamente conservados como lo son los motifs Walker A y B, y las asas aromáticas Q, D y H La presencia NBDs conservados es constante con las funciones variadas de las proteínas ABC, ya que éstas dependen sobre todo de la divergencia de los dominios transmembrana (TMDs), mientras que la unión y la hidrólisis del nucleótido, comunes a todas las proteínas del ABC, requieren el NBDs conservado. Los motifs llamados Walker A y Walker B están localizados entre 100 y 200 aminoácidos de diferencia en cada NBD, son conservados en todos los miembro de la superfamilia de transportadores ABC y deben venir juntos en la estructura terciaria para coordinar el nucleótido entre ellos. Además, único en las proteínas ABC, está una secuencia altamente conservada (ALSGGQ) ubicada entre los motifs Walker A y B, en lo que hace referencia a su nombre ABC o motif C (figura 2). La función de esta secuencia no está bien determinada, pero se ha implicado directamente en el reconocimiento, unión e hidrólisis del ATP. La histidina del asa-H tiene todo el contacto con el nucleótido. El asa-D puede formar un enlace de hidrógeno con el motif Walker A. La glutamina del asa-Q también entra en contacto con el γ-fosfato del ATP mediante una molécula de agua. El asa-Q es el sitio del cambio conformacional importante y el acoplador entre los dominios de conversión de energía y los dominios de unión al ligando de proteínas ABC. Por otro lado, el NBD dimérico es una estructura secundaria del mecanismo celular y a que éste purificado e aislado de su TMD es generalmente monomérico. Todos ellos son homodiméricos dentro del complejo de transporte, ya que in vivo se dimerizan para hidrolizar el ATP, la asociación es transitoria. En una estructura “dímero de NBD cerrado” muestra que los NBDs encierran dos moléculas de ATP en el interfaz. La presencia de dos moléculas de ATP es significativa porque implica que los sitios de unión al nucleótido en concordancia y que la energía derivada de la unión del ATP y de la formación del dímero cerrado de NBD está utilizada en un solo paso del ciclo del transporte.

PROTEÍNAS ABC COMO TRANSPORTADORES El nucleótido que se une al monómero de NBD produce cambios conformacionales. Los cambios estructurales inducidos por el ATP en cada NBD, aunque son importantes, no son responsables del movimiento de la energía que se extrae del ATP para el transporte del sustrato. Se ha propuesto que los cambios en las interacciones entre los dos NBDs durante el ciclo del transporte pueden proporcionar este movimiento de energía. Un esquema de interacciones posibles entre el NBDs durante el ciclo de la unión/hidrólisis del ATP se representa en la figura 3. Desde cada sitio de unión al ATP en los dos NBDs, la unión del ATP promueve la dimerización de los NBDs. Después de la hidrólisis del ATP, la repulsión electrostática entre el fosfato inorgánico unido al motif C y el ADP unido al motif A podía conducir a la disociación del dímero de NBD. El fosfato se lanza rápidamente, y en el lanzamiento del ADP el ciclo puede recomenzar. El transporte del substrato se puede dar en la formación o la disociación de los dímeros. Esencialmente, los transportadores deben completar un ciclo en medio estados de alta y baja-afinidad para el ligando en diversos lados de la membrana. El mecanismo de interruptor del ATP describe cómo estos estados se juntan en el ciclo catalítico del ATP de manera persistente con los datos estructurales disponibles.

Figura 3. Modelo de la asociación/de la disociación de NBDs durante el ciclo del unión/hidrólisis del ATP. El primer paso (a) implica unir el ATP a un monómero NBD por la interacción con los sub-dominios

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proteicos anti-paralelos (rojos), que produce una rotación en el subdominio. b) El ATP que se une al monómero NBDs es seguido por la dimerización conducida por los cambios conformacionales que favorecen la interacción del ATP encerrado con la secuencia del motif C del otro monómero. c) El ATP se hidroliza, y los cambios del conformacionales se invierten. d) La repulsión electrostática entre el ADP del motif A de un monómero y el fosfato del motif C del otro monómero podría desestabiliza el dímero.

TRANSPORTADORES ABC Y RESISTENCIA A MULTIDROGAS La rama “C” es una de las más grandes de las 7 ramas de la superfamilia ABC, y en seres humanos, se compone de 13 proteínas. Además de 10 MRPs (proteínas de resistencia a multidrogas), incluyen proteína resistente del cáncer de pecho (BCRP) y los receptores SUR1 y SUR2A/B de urea sulfatada. El desarrollo de la resistencia del multidrogas (MDR) ocurre durante el tratamiento de muchas enfermedades malignas e infecciosas y es a menudo la causa de la falla del tratamiento. No se ha identificado ningún mecanismo que puede explicar resistencia de drogas anticáncer en uso común, y se acepta extensamente que la resistencia clínica es multifactorial. Sin embargo, el descubrimiento hace más de 30 años de la P-glicoproteína (Pgp/MDR1) demostró que era posible que confiera una sola proteína resistencia a un número relativamente grande de drogas estructural diversas con diversos mecanismos de la acción, abarca típicamente una amplia gama del tipo drogas de producto natural, pero no incluye a otros agentes quimioterapéuticos clínicamente importantes, tales como compuestos del platino, análogos de nucleósido, o agentes alquilantes. Las proteínas de resistencia a multidrogas (MRPs) se pueden dividir en dos subfamilias: “largas” (MRP1, -2, -3, -6, y -7) y “cortas” (MRP4, -5, -8, -9, y -10). Las MRPs cortas tienen una estructura típica del transportador del ABC con dos dominios (TMDs) y dos NBDs, mientras que los MRPs largos tienen un TMB adicional en el NH2-terminal (figura 4). Figura 4: topología de las MRPs cortas y largas. El COOH y NH2 terminal de las MRPs cortas está intracelularmente y tiene dos dominios TMD (en la figura MSD) y dos NBD. Las MRPs largas con dos dominios NBD y tres dominios TMD, donde el último es el que le da la característica al grupo. El COOH terminal es intracelular pero el NH2 es extracelular. Se puede observar que las sub-unidades TMDs tienen 6 dominios transmembrana cada uno. In vivo, varios MRPs son contribuyentes importantes de la distribución y la eliminación de una amplia gama de drogas anticáncer, no-anticáncer y de metabolitos. La resistencia de Multidrogas (MDR) es una clase de resistencia adquirida en microorganismos y células cancerígenas a la quimioterapia, drogas que son caracterizadas por diversa estructura química y diverso mecanismo de la acción. 7 Pero también la MDR producida por las MRPs es expresado en tejidos no malignos de nuestro organismo, se cree que se función es dar protección a los tejidos de xenobióticos y sustancias tóxicas. Las características que determinan si un compuesto será transportado o no, no se han entendido totalmente, aunque los sustratos comparten algunas características comunes tales como lipofilicidad alta, peso molecular relativamente alto y una naturaleza amfipática.

Figura 4: modelo hipotético del ciclo de transporte de ls MRP1 y posiblemente de otros MRPs IMSD1-NBD1 y MSD2-NBD2 se muestran en azul y violeta, respectivamente. TMD0 no se muestra para simplificar y porque no se require para el transporte de algunos de sus sustratos, como LTC4.

Los pasos del funcionamiento de algunas las proteínas ABC de MDR son los siguientes (semejante a figura 4): • Paso I: La unión del Ligando al TMDs en alta-afinidad abren la conformación del dímero de NBD, induciendo una creciente afinidad hacia el ATP. • Paso II: la unión del ATP induce la formación del dímero cerrado de NBD, que alternadamente induce un gran cambio conformacional del TMDs suficiente para desplazar el ligando. • Paso III: La hidrólisis del ATP inicia la disolución del dímero cerrado del NBD.

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• Paso IV: El fosfato y el ADP (o pirofosfatos y ADPs) se lanzan fuera de la estructura para terminar el ciclo del transporte y para restaurar la proteína a un estado de alta-afinidad para el ligando.

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PROTEÍNAS DE RESISTENCIA A MULTIDROGAS Y CÁNCER Los estudios de muestras clínicas han revelado la expresión extensa del MRPs en una variedad de tipos de tumores, particularmente en el caso de MRP1. La expresión extensa de MRP1 en tejidos finos normales proporciona un desafío adicional a determinar las implicaciones de su presencia en muestras clínicas. Se tiene la evidencia de la expresión elevada de MRP1 en una variedad de tumores sólidos, incluyendo los cánceres comunes tales como el pulmón, el pecho, y la próstata. Actualmente hay poca evidencia de una asociación entre el resultado de la expresión del transportador y la respuesta al tratamiento o a la enfermedad. Un examen de la presencia de MRP2 en los varios cánceres, encontró que la proteína fue expresada con frecuencia y los niveles que variaban en tejido renal, gástrico, pecho, pulmón, y ovarios.

PROTEÍNAS DE RESISTENCIA A MULTIDROGAS Y LÍPIDOS Todos los lípidos biliares son secretados de una manera controlada por los transportadores del ABC. La proteína MDR-2 (ABCB4), produce la secreción de la fosfatidilcolina (PC). La bomba de exportación de las sales biliares (BSEP) es el producto del gen del ABCB11 y es responsable la mayor parte de del transporte de la sal de bilis del hepatocito. Las ABCG5 y ABCG8 están presentes en genes casi contiguos, se expresan en el hígado y el intestino pero no en otros tejidos finos, son los encargados de la exportación del colesterol (C). La PC es el portador principal de C, y cuando está ausente, C no puede moverse aunque las sales biliares estén presentes, esto indica que las sales biliares no son eficaces para mover de la membrana C y PC a la bilis. Las sales biliares solubilizan el colesterol pobremente, y la PC es requerida para la solubilizar en miscelas la C en bilis. La secreción del colesterol no se relaciona cuantitativamente con la secreción de fosfolípidos.

PROTEÍNAS DE RESISTENCIA A MULTIDROGAS Y ATEROSCLEROSIS La apoptosis de macrófagos tiene un papel importante en la evolución de placas ateroscleróticas, y los macrófagos apoptóticos se concentran en las áreas de ruptura de la placa. La apoptosis del macrófago puede ser inducida por una carga de colesterol libre o por la producción de oxLDL (lipoproteína de baja densidad oxidada). Los oxiesteroles y los 7-ketocolesterol son abundantes en las placas ateroscleróticas humanas, los primeros inducen la expresión inflamatoria de monocito-macrófagos, y la acumulación celular de los segundos conduce a la producción creciente de especies reactivas de oxígeno (ROS) e induce apoptosis en varios tipos de células, incluyendo macrófagos, células endoteliales, y las células de músculo liso. Por lo tanto, tienen probablemente un papel importante en la patogénesis de la aterosclerosis. El HDL en concentraciones fisiológicas relevantes tiene un papel protector potente contra el apoptosis del macrófago inducido por cualquier método. El HDL tiene características antioxidantes y antiinflamatorias, el HDL rompe la prooxidación inflamatoria de los fosfolípidos oxidados derivados de LDL o de las células que cuentan con enzimas tales como lipoproteína asociada a fosfolipasa A-2 y paraoxonasa en HDL. Un aspecto de la función de HDL mediado vía ABCG1 celular, es decir, el flujo de oxiesteroles tóxicos de las células, de tal modo protegiendo macrófagos contra apoptosis inducido por oxiesteroles. Se ha demostrado que ABCG1 tiene un papel necesario y suficiente en promover el flujo del 7ketocolesterol de las células a HDL. El flujo del colesterol se puede mediar por ABCA1 y ABCG1, mientras que el 7-ketocolesterol y los oxiesteroles relacionados modificados en la posición C7 son exportados selectivamente al HDL por ABCG1. La apoptosis creciente del macrófago en lesiones tempranas puede dar lugar a lesiones pequeñas como resultado de la fagocitosis eficiente de células apoptóticas por los macrófagos sanos; sin embargo, en lesiones avanzadas, la apoptosis de macrófagos y otras células pueden causar la inflamación y la desestabilización de las placas ateroscleróticas. Así, es probable que el flujo del 7-ketocolesterol vía el macrófago ABCG1 tenga un papel protector en placas ateroscleróticas avanzadas. Por otra parte, la acumulación del oxiesterol en células endoteliales conduce a la producción de especies reactivas de oxígeno y a la inactivación de la relajación vascular NO-dependiente. La proteína ABCG1 aparece ser expresada perceptiblemente en el endotelio arterial, el camino HDL/ABCG1 podría también tener un efecto protector en la función endotelial. Las terapias que aumentan niveles de HDL, están activando probablemente el camino de flujo de ABCG1-oxiesterol en los macrófagos y posiblemente las células endoteliales, que probablemente produce efectos beneficiosos en aterosclerosis.

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