Prezentacija Slo

GENSKO SPREMENJENE ČLOVEŠKE CELICE: ZAUSTAVIMO SEPSO

Skupina

Modificiranje sistemov v sesalskih celicah – Primerjava s prokarionti: več podobnosti kot razlik – Slabosti: bolj kompleksne, bolj počasne in dražje – Priložnosti: razumevanje kompleksnih sistemov, možen razvoj medicinskih aplikacij

Kaj je sepsa? – Na leto prizadene 750.000 ljudi v EU – številke v ZDA so približno enake – V enem od petih primerov se konča s smrtjo – Med 10 najbolj pogostimi vzroki smrti v ZDA

Kaj je sepsa? – Pretiran vnetni odziv, ki ga sproži patogen – Vsesplošno razširjena aktivacija vnetnih in kolaguacijskih poti

infekcija

vnetni procesi

Kaj je sepsa? – Pride do kritične odpovedi organov – Bolezenske znake povzroči pretiran odziv gostitelja na infekcijo in ne toliko sama prisotnost patogena

infekcija

vnetni procesi

Tollu podobni receptorji (TLR) prepoznajo patogen – Glavni senzorji nespecifičnega imunskega odgovora Molekule TLR: – 11 različnih membranskih receptorjev pri človeku – Prepoznavajo različne molekule značilne za patogene

TLRs in njihovi agonisti

PAMP TLR

IRAK1Kinase

IRAK1Kinase

DD MyD88

MyD88

IRAK4Kinase

DD

P

TRAF6

P

P

TRAF6

TAK1 TAB1

P

TAB2

TLR TLR

P

TRAF6

P

TAB2

P

P

IKKβ

IKKα IKKγ

IκBα NFκB

P

NFκB P65/50

P

P

TAB2 P

TRAF6TAK1 TAK1TRAF6 TAB1 TAB1 MEKK3 MEKK3 Ubc13 Ubc13 Uev1A Uev1A

P65

TNFα IL-1 COX2...

P

TAK1 TAB1

nucleus

P

“Vse poti vodijo v MyD88”

MyD88

Naš projekt Osnovni koncept: Delna inhibicija pretiranega celičnega odziva.

Izvedba: V sesalske celice vstaviti konstrukt s povratno zanko – inhibitorjem (dnMyD88), ki bo za določen čas zavrl signalizacijo TLR signalne poti

Zaporedje PEST

PEST

PEST

Gene Expression

Matematični model

Poenostavljen model TLR signalizacije

Model z dodano povratno zanko (MyD88)

Cytoplasmic NF-κB

Inflammatory mediators

Nuclear NF-κB

Običajen odziv celic ob infekciji Inflammatory mediators

Cytoplasmic NF-κB

Nuclear NF-κB

Odziv celic z vstavljeno povratno zanko ob ponovljeni stimulaciji

Naše BioKocke Registrska številka

Ime

BBa_J52008

rluc

BBa_J52010

NFκB

BBa_J52011

dnMyD88-linker-rLuc

BBa_J52012

rluc-linker-PEST191

BBa_J52013

dnMyD88-linker-rluc-linker-PEST191

BBa_J52014

NFκB+dnMyD88-linker-rLuc

BBa_J52016

eukaryotic terminator

BBa_J52017

eukaryotic terminator vector

BBa_J52018

NFκB+rLuc

BBa_J52019

dnTRAF6

BBa_J52021

dnTRAF6-linker-GFP

BBa_J52022

NFκB+dnTRAF6-linker-GFP

BBa_J52023

NFκB+rLuc-linker-PEST191

BBa_J52024

NFκB+dnMyD88-linker-rLuc-linker-PEST191

BBa_J52026

dnMyD88-linker-GFP

BBa_J52027

NFκB+dnMyD88-linker-GFP

BBa_J52028

GFP-PEST191

BBa_J52029

NFκB+GFP-PEST191

BBa_J52034

CMV

BBa_J52035

dnMyD88

BBa_J52036

NFκB+dnMyD88

BBa_J52038

CMV-rLuc

BBa_J52039

CMV+rLuc-linker-PEST191

BBa_J52040

CMV+GFP-PEST191

BBa_J52642

GFP

BBa_J52648

CMV+GFP

Sestavljanje BioKock – Priprava zapisov za fuzijske poroteine s PCR (overlap extension) – Vnos v vektorje iz zbirke BioKock, ki vsebujejo zapis za domeno ccdB – Priprava modificiranega vektorja s trajno vključenim terminatorjem – Priprava končnih konstruktov s standardizirano tehniko sestavljanja BioKock

Transfekcija Celična linija HEK293 - Ne izražajo TLR - Imajo ohranjene signalne poti

Metode Detekcijski sistemi za merjenje odziva celic: - ELISA - Pretočna citometrija - Luciferase Assay - Mikroskopija

ELISA – detekcija prostega NF-κB

peroxidase

NF-κB biotin

streptavidin

ELISA - rezultati

Pretočna citometrija – detekcija fosforilirane kinaze ERK

Detekcija aktivacije transkripcije z luciferaznim testom Dvojni luciferazni test Dva različna luciferazna reporterska encima – Eksperimentalni reporter (NF-κB-fLuc) – Konstitutivni reporterski gen (CMV-rLuc)

Pospešena razgradnja proteinov z dodanim zaporedjem PEST

Inducibilno izražanje proteinov pod kontrolo promotorja NF-kB

MyD88

DD

X luc

MyD88

Zakaj ni inhibicije ?

Reporterska domena na C-koncu dnMyD88 prepreči interakcijo s TIRdomeno TLR

Če je to res, potem bi moralo delovati brez C terminalne fuzije?

DA! Povratna zanka deluje!

Zaključek • Princip princip BioKock smo uspešno prenesli tudi na sesalske celice. • Uspešno smo uvedli sistem povratne zanke, ki omejuje celično aktivacijo ob inflamatornem procesu. • Naš konstrukt oponašajo naravni mehanizem tolerance, le da se aktivira dosti hitreje • Poenostavljen model TLR signaliziranja zajame vse osnovne značilnosti signalne kinetike.

Delo za jutri • Skrajševanje življenjske dobe inhibitorja z uvedbo zaporedja PEST na njegov N-konec • Konstrukcija vektorjev za stabilno transfekcijo (dodatna rezistenca za celične linije).