Pkm Ai - Hplc Fixx

PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWA PENENTUAN KADAR SAKARIN DAN ASAM BENZOAT PADA MINUMAN YANG DIJUAL DI MASYARAKAT DENGAN METODE HPLC(High Performance Liquid Chromatography)

BIDANG KEGIATAN : PKM ARTIKEL ILMIAH

Diusulkan oleh : Vanda Graveolita Sulistyanto Rinaldy Putra Tambunan

652017007 652017026

2017 2017

UNIVERSITAS KRISTEN SATYA WACANA SALATIGA 2019

PENENTUAN KADAR SAKARIN DAN ASAM BENZOAT PADA MINUMAN YANG DIJUAL DI MASYARAKAT DENGAN METODE HPLC(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY) Vanda Graveolita dan Rinaldy Putra Tambunan Jurusan Kimia, Fakultas Saons dan Matematika, Universitas Kristen Satya Wacana Salatiga Jl. Diponegoro No. 52-60, Salatiga 50711, Indonesia [email protected] ABSTRACT Analysis used with HPLC (High Performance Liquid Chromatography) with sample that are sold in the community such as nutrisari, green tea, kratingden, fanta, sambal and ale-ale. The purpose of analysis is to determine saccharin and benzoate contain in the sample. The phases aren sampling, maximum wavelength measurement, determine optimum condition to analyze saccharine and benzoate by making standard curve, identification of saccharine and benzoate in the sample and determine the contain. The study results showed are standard saccharine R2 value is 0.9855 and standard benzoate R2 value is 0.9869. the study also obtain benzoate LOD value is 3.372 μ/ml and LOD value is 11,242 μ/ml and for saccharine LOD value is 3.006 μ/ml and LOQ value is 9.372 μ/ml. the measurement of standard mixed solution obtain the separation of some compounds, that give a better data. The results of the analysis method of standard solutions obtained using HPLC were obtained which had an accuracy that could not be accepted or accepted, because in the chili sauce and greentea samples had more than 98% recovery. Keywords:

accuracy, standard solution, sample, HPLC ABSTRAK

Pada analisis yang dilakukan digunakan metode KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) dengan sampel yang banyak dijual di masyarakat yaitu nutrisari, green tea, kratingden, fanta, sambal, dan ale-ale. Tujuan dari analisis yaitu untuk menentukan kadar sakarin dan asam benzoat pada masing-masing sampel. Tahap metode yaitu sampeling, penentuan panjang gelombang pengukuran, menentukan kondisi yang optimum untuk analisis sakarin dan benzoat dengan membuat kurva baku, identifikasi sakarin dan asam benzoat pada sampel, dan penetapan kadar.. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini yaitu kurva baku standar sakarin memiliki R2 sebesar0,9855 dan asam benzoat memiliki R2 sebesar 0,9869. Diperoleh hasil pada asam benzoat dengan LOD 3,372 μ/ml dan LOQ 11,242 μ/ml dan untuk sakarin dengan LOD 3,006 μ/ml dan LOQ 9,372 μ/ml. Pengukuran campuran larutan standar diperoleh pemisahan senyawa-senyawa dalam campuran, dapat memberikan hasil yang baik. Didapatkan hasil metode analisa larutan standar yang diukur dengan menggunakan HPLC memiliki akurasi yang tidak dapat diterima maupun diterima, dikarenakan pada sampel sambal dan greentea memiliki % recovery lebih dari 98%. Kata kunci:

akurasi, larutan standar, sampel , KCKT

PENDAHULUAN

Seiring dengan meningkatnya pertumbuhan industri makanan dan minuman di Indonesia, telah terjadi peningkatan produksi minuman ringan yang beredar di masyarakat. Pada minuman ringan dan bahan makan sering ditambahkan pengawet dan pemanis buatan yang kadarnya perlu diperhatikan, karena apabila konsumsinya berlebihan dapat membahayakan kesehatan (Soerjodibroto, 2002 ; Jacobson, 2000). Salah satu bahan tambahan pengawet dan pemanis buatan yang sering digunakan yaitu asam benzoat dan sakarin. Asam benzoat lebih banyak digunakan dalam bentuk garamnya karena kelarutannya lebih baik daripada bentuk asamnya. Bentuk garam dari asam benzoat yang banyak digunakan adalah natrium benzoat. Benzoat dan turunannya dapat menghancurkan sel-sel mikroba terutama kapang. Natrium benzoat bekerja efektif pada pH 2,5-4 sehingga banyak digunakan pada makanan atau minuman yang bersifat asam (Winarno, 1980). Struktur kimia asam benzoat seperti terlihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Struktur kimia asam benzoat(Anonim, 1995)

Sakarin merupakan bahan pemanis sintetis yang banyak dipakai dapat menimbulkan rasa ikutan yang pahit. Rasa pahit tersebut kemungkinan besar terkait dalam struktur molekul sakarin, karena dengan pemurnian yang bagaimanapun tidak sanggup menghilangkan rasa pahitnya. Rasa pahit sakarin dapat dikurangi dengan penambahan siklamat dengan perbandingan 3 : 1, (Sudarmadji,1982). Penggunaan sakarin yang melebihi batas maksimum dapat membahayakan kesehatan, dimana telah terbukti dapat menyebabkan penyakit kanker pada hewan percobaan di laboratorium. Juga dapat menyebabkan karsinogenik dan kerusakan pada kandung kemih. Sakarin bila dikonsumsi secara berlebihan dapat menyebabkan kanker pada kandung kemih dimana sakarin tidak dapat dicerna oleh usus, dan juga tidak dapat dikeluarkan melalui urine (Renwick,1983). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu metode kromatografi yang mampu memisahkan makromolekul, senyawa-senyawa ionik, produk-produk alam yang labil, senyawa polimerik dan kelompok-kelompok polifungsional yang memiliki berat molekul tinggi dengan cara penyarian berfraksi, penyerapan atau penukar ion yang menggunakan fase gerak yang interaktif dan fase diam padat / cair yang aktif, (Firman K, dkk., 1995). Analisis pemanis sintetis dan pengawet menggunakan KCKT karena memiliki keunggulan

dibandingkan dengan Kromatigrafi Cair lainnya yaitu cepat, daya pisahnya baik, peka dengan detektor unik, kolom dapat dipakai kembali, ideal untuk molekul besar dan ion, serta mudah memperoleh kembali (Johnson, 1991). Beberapa pustaka menunjukkan bahwa metode KCKT fase terbalik merupakan metode terpilih untuk analisis campuran bahan tambahan tersebut, karena zatzat tersebut bersifat polar dan larut dalam air sehingga sulit dipisahkan menggunakan KCKT fase normal yang menggunakan kolom polar dan fase gerak yang bersifat non polar (Meyers, 2000; Nollet, 1996). TUJUAN

Pada analisis ini bertujuan untuk memperoleh analisis optimum untuk penetapan kadar sakarin, dan asam benzoat yang terdapat di dalam sampel minuman ringan dan bahan makanan secara KCKT atau HPLC. METODE

Bahan yang digunakansampel (fanta, nutrisari, sambal, ale-ale, greentea, kratingden), glukosa standart, akuades. Alat yang digunakan KCKT yang terdiri dari pompa KCKT model LC-6A, detektor UV-VIS model SPD-6AV, rekorder dan integrator model C-R4A Chromatopac (Shimadzu). Kolom C18 Latek (15 cm x 4,0 mm). Spektrofotometer UV-VIS 1601 (Shimadzu). pH meter (Jenway). Neraca analitik (Ohaus). Pengaduk ultrasonik(Branson 3200). Saringan filter eluen dan sampel 0,45 µm (Whatman). Filter syringe. Sampling minuman Proses sampling minuman ringan berkarbonasi dilakukan berdasarkan merek yang beredar di pasaran. Lima merek minuman ringan berkabonasi dan satu merek bahan makan dipilih untuk dijadikan sampel dalam penelitian ini. Pemilihan sampel berdasarkan atas informasi kandungan bahan-bahan yang ditambahkan ke dalam sampel tersebut. Penetapan panjang gelombang pengukuran Panjang gelombang pengukuran yang digunakan yaitu UV 254 nm. Menentukan kondisi percobaan optimum untuk analisis sakarin dan asam benzoat Larutan campuran bahan baku pembanding sakarin dan asam benzoat di dalam pelarut aquabides, disuntikkan sebanyak 20 µl ke dalam kolom menggunakan fase gerak campuran methanol dan buffer asetat pH 5 dengan perbandingan 15:85 dengan suhu 30˚C. Pembuatan kurva baku sakarin dan asam benzoat Dibuat larutan induk (sakarin dan asam benzoat) pada 1000 ppm. Dilakukan pengenceran sakarin dan asam benzoat dari larutan induk dengan variasi konsontrasi (2,5; 5; 10; 15; 20; dan 25 ppm). Larutan diambil sebanyak 60 µl. Masing-masing konsentrasi larutan diinjeksikan pada HPLC detector UV pada panjang gelombang 254 nm dengan fase diam berupa kolom vertex, Eurospher 100-5 C18,150x4.6 mm dan fase gerak methanol : buffer

asetat pH 5 (15:85), laju alir 1,5 mL/menit, temperature 30°C, dan volume injeksi 20 µL. Diamati kromatogram yang masing – masing larutan yang dihasilkan. Dibentuk kurva kalibrasi sakarin dengan antara konsentrasi dengan luas area. LOD dan LOQ sakarin dan asam benzoat LOD dan LOQ dihitung melalui persamaan garis linier dari kurva kalibrasi, dengan rumus : Q=

𝑘 .𝑆𝑏 𝑆1

Keterangan : Q = LOD atau LOQ k = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantitasi Sb = Simpangan baku respon analitik dari blangko S1 = Arah garis linier (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y = bx + a) Penentuan Selektivitas Dibuat larutan campuran standar yang terdiri dari sakarin dan asam benzoat. Larutan diambil sebanyak 60 μl. Masing-masing konsentrasi larutan diinjeksikan pada HPLC detector UV pada panjang gelombang 254 nm dengan fase diam berupa kolom vertex, Eurospher 100-5 C18,150x4.6 mm dan fase gerak methanol : buffer asetat pH 5 (15:85). Dengan laju alir 1,5 mL/menit, temperature 30°C, dan volume injeksi 20 μL. Diamati kromatogram yang masing – masing larutan yang dihasilkan. Dihitung nilai Selektifitas campuran dengan rumus :

Dimana: RtA = waktu retensi puncak pertama RtB = waktu retensi puncak kedua WA = lebar alas puncak pertama WB = lebar alas puncak kedua Identifikasi sakarin dan asam benzoat dalam sampel Sampel minuman ringan dan saos dilarutkan dalam akuades. Selanjutnya larutan sampel diambil sebanyak 0,1 mL dimasukan dalam labu ukur 10 mL kemudian digenapkan dengan menggunakan akuades sampai batas tera. Disaring sampel kemudian filtrate yang dihasilkan dimasukkan ke dalam vial. Diambil Larutan sebanyak 60 µl. Diinjeksikan masing-masing konsentrasi larutan pada HPLC detector UV 254 nm dengan fase diam berupa kolom vertex, Eurospher 100-5 C18,150x4.6 mm dan fase gerak methanol : buffer asetat pH 5 (15:85), laju alir 1,5 mL/menit, temperature 30°C, volume injeksi 20 µL. Perhitungan sampel dihitung dengan rumus sebagai berikut : 𝑋 𝑌 = 𝑋′ 𝑌′

Keterangan : x = konsentrasi larutan standar, x’= konsentrasi sebenarnya, y = luas area larutan standar, dan y’= luas area sampel Tes recovery digunakan untuk menguji akurasi metode. Tes recovery dilakukan pada 3 konsentrasi berbeda dan masing-masing diulang 3 kali. Konsentrasi masing-masing larutan baku yang digunakan sama dengan yang digunakan pada uji presisi. % 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 =

𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 𝑥 100% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada percobaan dilakukan pengecekan kadar senyawa sakarin dan asam benzoat yang terdapat didalam beberapa minuman ringan dan saos yang dijual dipasaran dengan menggunakan HPLC (High Performance Liquid Chromatography). HPLC merupakan mekanisme pemisahan yang terjadi didasarkan pada kompetensi antara fase gerak dan sampel berikatan dengan kolom. Zat yang keluar terlebih dahulu, adalah zat yang yang lebih polar daripada zat yang lainnya, sedangkan zat yang tertahan lebih lama d\ari kolom, merupakan zat yang lebih non polar. Semakin polar fase gerak, waktu tambat sampel semakin lambat dan semakin non polar fase gerak, sampel semakin cepat keluar (Meyers,2000). Metode HPLC ini digunakan karena mampu menganalisis sampel yang relatif kecil serta memiliki resolusi, selektivitas dan sensitifitas yang sangat baik (Rohman, 2007). Fase yang diaplikasikan pada metode ini adalah fase terbalik (reverse phase) dimana fase diam (stasioner) bersifat nonpolar atau kurang polar dibandingkan fase geraknya sehingga analit dapat tertahan sampai fase gerak (pelarut) yang cukup polar mengelusinya keluar kolom (Nollet, 1996). Mode operasional yang digunakan pada percobaan kali ini adalah mode isokratik dimana komposisi fase gerak dan laju kolom dibuat tetap sebesar 1,5 mL/menit. Fase diam yang digunakan yaitu Eurospher 100-5 C18. Fase diam C18 bersifat non polar sehingga pada kondisi ini apabila suatu campuran yang terdiri dari beberapa senyawa dielusi pada kolom C 18 dengan fase gerak yang polar, senyawa yang relatif non polar cenderung tertahan di kolom sehingga waktu retensinya lebih panjang dibandingkan senyawa lain yang relatif lebih polar (Snyder et al., 1997). Selain itu, kolom C18 memiliki jumlah C yang banyak sehingga sifat fase diam ini cenderung bersifat non polar, akibatnya pemisahan terhadap sakarin maupun asam benzoat akan semakin baik (Gandjar & Rohman, 2007). Fase gerak yang digunakan pada metode ini yaitu campuran methanol : buffer asetat pH 5 (15:85). Fase gerak yang digunakan bersifat polar.Larutan buffer berperan sebagai pengontrol pH pada fase gerak serta mengatur protonasi didalam kolom sehingga kuat lemahnya interaksi analit dengan gugus silanol dapat diatur menggunakan buffer. Sedangkan

senyawa metanol merupakan senyawa yang bersifat polar berdasarkan indeks kepolaran metanol 5,1 (Romadanu, 2014). Fase gerak memegang peranan penting dalam pemisahan analit karena migrasi analit diatur oleh interaksi fase gerak dan fase diam. Migrasi analit terjadi karena adanya kompetisi antara fase gerak dan analit untuk dapat terikat pada sisi-sisi aktif dari fase diam. fase gerak yang dipakai biasanya merupakan campuran dua atau lebih pelarut yang kekuatannya berbeda (Ibrahim,1995). Detektor yang digunakan pada percobaan ini adalah detektor UV. Detektor UV merupakan detektor yang banyak digunakan pada pemakaian instrumen KCKT, karena sebagian besar solut mampu menyerap sinar ultraviolet (Harris, 1999). Panjang gelombang yang digunakan yaitu pada 254 nm. Hal ini dikarenakan kebanyakan senyawa organic menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut. Pada percobaan ini dilakukan pembuatan kurva baku dari sakarin dan asam benzoat. Kurva baku merupakan suatu kurva yang dibuat dengan membandingkan antar konsentrasi kadar dengan luas areanya. Melalui kurva baku dapat diketahui linieritas metode yang digunakan. Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Sehingga diperoleh data pada grafik 1. Sebagai berikut :

Grafik 1. Kurva Baku Sakarin dan Asam Benzoat

KURVA BAKU SAKARIN DAN ASAM BENZOAT 140000

100000

Area

y = 5100.1x + 4477.2 R² = 0.9869

y = 5456.4x + 5835.5 R² = 0.9855

120000

KURVA BAKU ASAM BENZOAT

80000

KURVA BAKU SAKARIN

60000 Linear (KURVA BAKU ASAM BENZOAT)

40000 20000

Linear (KURVA BAKU SAKARIN)

0 0

10

20

30

konsentrasi

Berdasarkan hasil scanning kurva baku pada variasi kosentrasi sakarin dan asam benzoat standar dari rentang 2,5 hingga 20 ppm untuk sakarin dan 2,5 ppm sampai 25 ppm untuk asam benzoat diperoleh nilai luas area peak untuk masing-masing konsentrasi, kemudian luas area peak yang diperoleh diplotkan dengan konsentrasi larutan standar, dimana hasil plot berupa kurva linear dengan persamaan regresi linearitas y=ax+b dengan R2 sebagai determinan linearitas (Ermer dan Miller, 2005). Determinan linearitas ditentukan dari

nilai koefisien korelasi (r) yaitu ≥ 0,99 (AOAC,2013). Dari percobaan diperoleh persamaan y= 5456,4x + 5835,5 dengan R2= 0,9855 untuk sakarin dan persamaan y= 5100,1x + 4477,2 dengan R2= 0,9869 untuk asam benzoat. Nilai r yang diperoleh mendekati satu sehingga dapat dikatakan bahwa kurva memiliki kelinieran yang tinggi, artinya dengan meningkatnya konsentrasi sakarin dan asam benzoat maka luas area juga akan mengalami kenaikan yang linier, sehingga metode yang digunakan telah memenuhi syarat linieritas untuk digunakan pada penetapan kadar sakarin dan asam benzoat dalam minuman ringan dan saos yang dijual di pasaran. Penentuan LOD dan LOQ pada sakarin dan asam benzoat Tabel 1. Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi pada Asam Benzoat Konsentrasi 2,5 5 10 15 20 25

Area 13791 30587 56015 82756 114344 124630

Retention time 6,817 6,867 6,867 6,967 6,917 7,017

SD 5733,689

LOD 3,372692

LOQ 11,24231

Tabel 2. Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi pada Sakarin Konsentrasi

Area

Retention time

SD

LOD

LOQ

2,5

25342

3,217

5469,175

3,007024

9,372248

5

29584

3,117

10

57248

3,117

15

84055

3,067

20

119409

3

Dari hasil Grafik 1. dilakukan pengujian nilai LOD dan LOQ pada larutan standar sakarin dan asam benzoat. LOD (Limit of Detection) menggambarkan konsentrasi analit terkecil dalam sampel yang masih dapat diukur. Nilai tersebut ditentukan melalui ratio Signal to Noise (S/N) dengan cara mengukur analit pada konsentrasi yang telah diketahui terhadap blanko. Nilai LOD untuk KCKT didasarkan pada S/N yaitu sebesar 3:1 (Anonim, 2006; Snyder dkk., 1997). Sedangkan LOQ(Limit of Quantification) menggambarkan konsentrasi terendah analit dalam sampel yang dapat dianalisis dengan presisi dan akurasi di bawah kondisi percobaan tertentu. Nilai tersebut ditentukan dengan membandingkan Signal to Noise yaitu sebesar 10:1 (Anonim, 2006). Diperoleh hasil pada tabel 1. Untuk asam benzoat dengan LOD 3,372 μ/ml dan LOQ 11,242 μ/ml. Dan hasil pada tabel 2. Untuk sakarin dengan LOD 3,006 μ/ml dan LOQ 9,372 μ/m.

Penentuan Selektivitas Nilai resolusi digunakan sebagai parameter untuk menunjukkan selektifitas metode analisis berdasarkan pemisahan antar puncak (peak) dengan nilai yang baik adalah ≥ 2 (Snyder dkk., 1997). Literatur lain menyebutkan bahwa nilai Rs ≥ 1,5 sudah menunjukkan pemisahan puncak yang baik (Sastrohamidjojo, 2002). Hasil pengukuran waktu retensi dan lebar alas puncak yang berdekatan dengan puncak sakarin dan asam benzoat pada beberapa sampel yaitu seperti pada Tabel 3. Tabel 3. Hasil Rs pada Beberapa Sampel Sampel

Resolusi (Rs)

Sambal 1%

6,775

Kratingdeng 1%

6,623

Greentea 1%

7,727

Ale-ale 1%

6,040

Hasil pada Tabel 3. menunjukkan bahwa pemisahan senyawa dalam campuran dapat memberikan hasil yang baik (Merry, 2012) dikarenakan resolusi pada semua sampel diatas 1,5. Identifikasi sakarin dan asam benzoat dalam sampel Pada penetuan kadar sampel dilakukan dengan mengambil sejumlah sampel minuman (fanta, greentea,nutrisari, kratingdeng, ale-ale) dan saos sambal yang dilarutkan dengan akuades dengan setiap sampel memiliki konsentrasi 1%. kemudian disaring dengan menggunakan syringe filter dengan ukuran partikel 0,45 mikron. Tujuan dari menggunakan syringe filter yaitu untuk memperkecil partikel pada larutan yang sudah di encerkan. Ukuran sampel yang sangat kecil ini digunakan untuk menghindari penyumbatan pada kolom yang akan menyebabkan kerusakan pada alat. Dilakukan pengukuran nilai spike dengan menambahkan senyawa standar pada sampel untuk memastikan kandungan yang terdapat dalam sampel tersebut. Kemudian sampel dan spike diinjeksikan pada HPLC sehingga diperoleh hasil peak yang sama antara pengukuran spike dengan senyawa standar. Hal ini dikarenakan peak tersebut mempunyai waktu retensi yang masuk pada kisaran waktu retensi dari larutan standar. Pada Tabel 4. dapat dilihat bahwa sampel beberapa sampel minuman dan saos sambal mengandung bahan tambahan seperti sakarin dan asam benzoat. Namun untuk sampel nutrisari tidak terdeteksi senyawa sakarin dan asam benzoat. Kemudian dilakukan uji akurasi yaitu ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Rata-rata persen recovery yang diterima adalah 98-102% (Emre dan Miller, 2005). Berdasarkan hasil tersebut menunjukkan bahwa metode analisa larutan standar yang diukur dengan menggunakan HPLC memiliki akurasi yang tidak dapat diterima maupun

diterima, dikarenakan pada sampel sambal dan greentea memiliki % recovery kurang dari 98%. Tabel 4. Kadar Sakarin dan Asam Benzoat pada Sampel RETENTION TIME

LUAS AREA

KONSENTRASI %RECOVERY TERUKUR SAKARIN BENZOAT SAKARIN BENZOAT SAKARIN BENZOAT SAKARIN BENZOAT SAMPEL 3,000 6,933 460 17429 0,045 2,849 98,18 43,02 SAMBAL 3,100 6,833 12896 12579 1,272 2,056 49,11 58,87 KRATINGDENG 3,217 6,917 84 913 0,008 0,149 99,67 97,02 GREENTEA 6,517 6819 1,115 77,71 FANTA 3,000 6,967 1733 9484 0,171 1,550 89,58 68,99 ALE-ALE NUTRISARI KESIMPULAN

Dari percobaan yang sudah dilakukan didapatkan hasil bahwa kandungan sakarin pada sambal 0,045 ppm; kratingdeng 1,272 ppm; greentea 0,008 ppm; ale-ale 0,171 ppm sedangkan untuk kandungan asam benzoat pada sambal 2,849; kratingdeng 2,056 ppm; greentea 0,149 ppm; fanta 1,115 ppm; ale-ale 1,550 ppm. Metode yang digunakan dalam penelitian ini memiliki validasi yang akurasi namun tidak presisi dikarenakan terdapat beberapa % recovery pada sakarin dan asam benzoat yang tidak diantara 98%-102%. Namun untuk selektivitas semua sampel dikatakan hasil baik dikarenakan Rs ≥ 1,5. UCAPAN TERIMAKASIH

Terimakasih kepada para pihak yang bersangkutan dalam penelitian ini, termasuk ketua laboratorium yang telah mengijinkan kami untuk melakukan penelitian ini. Terimakasih juga kepada dosen pembimbing yang telah membantu dan membimbing kami dalam melakukan penelitian ini. Tak juga kami ucapkan terimakasih kepada asisten dosen yang telah membantu kami juga dalam melakukan penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Ed.IV,47-48,548,Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Anonim, 2006, The United State Pharmacopeia, 29 th Ed., 3050-3053, United State Pharmacopeia Convention Inc., Rockville AOAC, 2013, Official Methods of Analysis 2013, Guidelines for Standard Method Performance Recuirements, Appendix F, p.9 Ermer, J., dan Miller, J.H.McB. (2005). Method Validation in Pharmaceutical Analysis. A Giude to Best Practice. Weinheim: Wiley-VchVerlag GmbH & Co. KGaA. Halaman 253 Firman Kurnia, Amir Musadad, Slamet Ibrahim, Marlia Singgih, Daryono Hadi, Rahmana Emran, (1995), Panduan Praktikum Analisis Farmasi Fisikokimia, Departemen Farmasi ITB, Bandung. Johnson, E.L., Robert Stevenson. Dasar Kromatografi Cair, Terj. dari Basic Liquid Chromatography, oleh Padmawinata, Bandung : Institut Teknologi bandung, 1991 : 1-27, 90-117. Merry. 2012. Optimasi pH, Komposisi Serta Laju Alir Fase Gerak Pada Penentuan Kadar Natrium Benzoat dan Kalium Sorbat Dalam Bahan Makanan Dengan Teknik HPLC (Skripsi). UI ; Jakarta Meyers, RA. Enclyclopedia of analytical chemistry, vol 13, New York : John Wiley and Sons Ltd, 2000 : 11428-11450. Meyers, RA. Encyclopedia of analytical chemistry, vol 5, New York : John Wiley and Sons Ltd, 2000 : 4066-4067. Nollet, Leo. Handbook of food analysis, vol 2, New York : Marcell Dekker Inc, 1996 : 17451746, 1835-1844, 1853-1857. Renwick A.G., (1983), The Fate of Nonnutritive Sweeteners in Body, in Developments in Sweeteners In Foof Additives, Volume 2, Grenby T. Parker K, Lindley M., Applied Science Publishers, London. Romadanu, R, Hanggita, S, & Lstari, SD. 2014. Pengujian Aktivitas Ekstrak Bunga Lotus (Nelumbonucifera),. Fishtech, vol.3. no.1, hal. 1-7 Sastrohamodjojo, H., 2002, Kromatografi, 67- 77, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Shrivastava, A., & Gupta, V. B. (2011). Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods, 2(1), 21–25. https://doi.org/10.4103/2229-5186.79345 Snyder, L.R., Kirkland, J.J and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, 2nd, 644-646, 686-702, John Willey & Sons Inc., New York Soerjodibroto, Waluyo, 2002. Menyimak kandungan soft drink, 26 Februari: 1 hlm.http://www. kompas.com/health/news/ 0202/26051556.html, 26 Maret 2019, pk. 22.31. Sudarmadji S., (1982), Bahan-bahan Pemanis, Penerbit Agritech, Yogyakarta. Winarno, Srikandi F, Dedi F, 1980, Pengantar Teknologi Pangan, PT Gramedia, Jakarta.