Verificación Espectrofotómetro.docx
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SISTEMAS DE CONTROL DE CALIDAD Profesores: M en C Aura Hernández Olicón M en C Elizabeth Jiménez Gutierrez M en C Hilda Pérez Cervantes Dr. Luis R. Carreno Durón Autor: Suarez Gómez Alexis Gabriel Práctica: Vetificación y evaluación del uso y funcionamiento de instrumentos de medición columétrica Grupo: 5QM2 Sección: 4 Equipo: 10 Ciclo escolar 2019 Fecha de entrega Ciudad de México, 21 de febrero de 2018
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
INTRODUCCIÓN En la actualidad las determinaciones analíticas en química clínica se realizan utilizando instrumentos y equipos relativamente complejos en el laboratorio clínico, por ello para asegurar la confiabilidad de los datos es necesario conocer tanto como sea posible las características, potencialidades, limitaciones y particularidades de los instrumentos analíticos, debido a que dependen entre otros aspectos tanto del uso adecuado como del buen funcionamiento de los equipos fotométricos. Los equipos fotométricos con el tiempo presentan un cambio gradual o deterioro progresivo sus componentes, sin embargo, esto es muy difícil de detectar si no se tiene un programa control de calidad diario que incluya al menos: realizar la lectura diaria de soluciones concentración conocida, calibración periódica de la longitud de onda, linealidad y detección luz espuria.
de de de de
Dichos equipos deben mantenerse en las mejores condiciones, por ello se debe prestar atención especial en que la fuente de luz de estos instrumentos sea constante. Por lo tanto, una adecuada calibración instrumental es uno de los factores claves para lograr exactitud en los resultados analíticos. La calibración, la sensibilidad y la linealidad, son tres características que permiten verificar el correcto funcionamiento de los espectrofotómetros y se encuentran descritas en un apartado específico de los manuales de operación de cada instrumento. Las dos primeras se verifican mediante la determinación del espectro de absorción de una solución de cloruro de cobalto (CoCl2) (absorbancia máxima de 0.5 a 510 nm) y la última a través de la medición de la absorbancia de soluciones de diferentes concentraciones conocidas de dicromato de potasio (K2Cr2O7) o de permanganato de potasio (KMnO4). (3) OBJETIVO Verificar la calibración, sensibilidad y linealidad de los espectrofotómetros, utilizando una solución de cloruro de cobalto y dicromato de potasio e interpretar los resultados de acuerdo a la ley de Lamber-Beer. FUNDAMENTO Cuando la luz de una apropiada longitud de onda atraviesa una cubeta conteniendo una solución colorida, parte de la luz es absorbida por la solución, el resto es transmitida a través de la muestra hasta el detector. La luz que llega al detector se conoce como transmitancia. Cada solución colorida tiene un espectro de absorción característico que se establece a partir de la medición de la absorbancia a diferentes longitudes de onda. La longitud de onda a la cual se analiza una sustancia es generalmente, aquella a la cual se obtiene la máxima absorbancia. Por lo regular se selecciona aquella que dé la mayor sensibilidad y que más se aproxime a la ley de Beer.
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
RESULTADOS BITÁCORA DE RESULTADOS FECHA: 20 DE MARZO DEL 2018 Verificación de la calibración, sensibilidad y linealidad de los espectrofotómetros empleados en el laboratorio clínico Resultados y observaciones Espectrofotómetro: Thermo scientific Genesis 20 Marca: Thermo scientific Codificación de usuario: 11 Unidades: nm Condiciones físicas del instrumento: buenas condiciones. Tipo de celda utilizada: volumen semireducido Solución utilizada: CoCl2 2.2% Vol. Seleccionado: ¾ de la celda Ajuste de instrumento con: HCl 1% Intervalo de λ: 450-500 nm Tabla 1. Verificación de la calibración y sensibilidad λ (nm) 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550
λ mínima seleccionada: 450 nm Verificación de la linealidad Solución utilizada: K2Cr2O7 Ajuste del espectrofotómetro: Agua destilada
A 0.216 0.290 0.342 0.388 0.431 0.477 0.509 0.496 0.438 0.342 0.249
λ máxima seleccionada: 550 nm
Longitud de onda: 500 nm
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Tabla 2. Verificación de la linealidad Conc. Conc. Absorbancia calculadas Teóricas mg/dl (500 nm) mg/dl 26.5 0.148 35.24 53 0.219 56.50 106 0.375 106.00 159 0.598 159.14 212 0.761 210.60 265 0.910 262.06 318 1.078 324.71 371 1.234 365.83 424 1.411 414.21 477 1.546 464.55 530 1.724 510.70
% de error 32.98 6.60 0.00 0.09 -0.66 -1.11 2.11 -1.39 -2.31 -2.61 -3.64
Solución con la que se hicieron las diluciones: K2Cr2O7 Factor de calibración utilizado: Fórmula para calcular las concentraciones de las diluciones: 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 Factor de dilución = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑎𝑡𝑜 Concentración =
530 𝑚𝑔/𝑑𝐿 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
Fórmula para calcular las concentraciones calculadas: 106 Factor = A106 Multiplicar el factor por cada absorbancia obtenida e verificación de la linealidad. Concentracion calculada = F ∗ Absorbancia
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ABSORBANCIA
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 440
460
480
500
520
540
560
λ(nm) Figura 1. Espectro de absorción del CoCl2 al 2.2% en HCl al 1%. 2
y = 0.0034x + 0.029 R = 0.9996
Absorbancia a 500 nm
1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
100
200
300
400
500
600
Concentración de K2Cr2O7 (mg/dL) Figura 2. Curva tipo realizada con diluciones de K2Cr2O7 (530mg/dL).
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2
y = 0.0036x R=1
Absorbancia a 500 nm
1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0.00
100.00
200.00
300.00
400.00
500.00
600.00
Concentración de K2Cr2O7 (mg/dL) Figura 3. Curva tipo obtenida al multiplicar las absorbancias por el Factor de Calibración (279.68).
Concentración Factor
600.00
y = 0.9588x + 8.1242 R = 0.9996
500.00 400.00 300.00 200.00 100.00 0.00 0
100
200
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Concentración Teórica Figura 4. Verificación de la linealidad.
500
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
% Error
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 0 -4 -6
100
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400
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Concentración
Figura 5. Porciento de error en cada uno de los puntos.
600
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Tabla 3. Resultados de calibración, sensibilidad y linealidad del grupo 5QV2.
S e c c i ó n
E q u i p o
1
2
2
3
4
5
# interno y Marca de espectro
λ (De Abs máx)
C a li b r a d o
A (λ máx)
%E
S e n s i b l e
R (inicial)
R (Factor)
m
L i n e a li d a d
Intervalo útil de trabajo
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DISCUSIÓN El espectro de absorción obtenido es el esperado ya que el CoCl2 presenta la mayor absorbancia a 510 nm debido a que en esta longitud de onda se presenta una interacción más estrecha entre la materia y la energía (absortividad), por lo tanto se puede decir que el espectrofotómetro Dlab número 1 se encuentra calibrado. La absorbancia registrada en esta longitud de onda (510 nm) es de 0.616 y se encuentra fuera del rango 0.475-0.525, el cual se obtuvo con el valor esperado de absorbancia (0.5) y agregándole un 2.5% de error por arriba y por debajo de este valor, como la absorbancia obtenida sobrepasa este rango podemos decir que el espectrofotómetro no es sensible, esto se puede deber a una falla en la lámpara, ya sea porque ha superado su tiempo de vida media o bien que se encuentre sucia (llena de polvo) o bien que la celda ocupada se encuentre muy rayada. Es importante mencionar que para poder validar los datos que se obtienen de un equipo, es necesario que se haga la determinación al menos 5 veces, ya que si se realiza solo una vez, los datos no son realmente representativos y por lo tanto existe mayor grado de incertidumbre. La verificación de la calibración y sensibilidad del equipo se realiza con CoCl2 debido a que a 510 nm se realizan la mayoría de las pruebas clínicas de rutina. En la verificación de la linealidad del equipo se obtuvo un gran intervalo de trabajo que va desde 0.623 a 1.35 de absorbancia. Los demás putos por arriba o por debajo de este intervalo se descartan debido a que el porciento de error es muy grande y no se generarían datos confiables. En el primer puto el % de error es excesivamente grande, esto se debe a que en este punto la concentración del analito es muy pequeña y se podría confundir con el ruido del equipo. En los demás puntos donde se presenta un % de error mayor al 2.5% por arriba o por abajo del valor real, el analista es responsable de ese error que se pudo haber cometido al momento de realizar las diluciones. Es por eso que las determinaciones se deben realizar por lo menos 5 veces para tener datos más representativos y confiables que reduzcan el grado de incertidumbre. CONCLUSIONES
Es necesario realizar 5 veces la determinación para validar los datos. No se puede verificar si el equipo se encuentra calibrado o si es sensible, debido a que no se ajustó a cero de absorbancia con el blanco en cada una de las longitudes de onda. El equipo presenta linealidad en un intervalo de 0.623 a 1.35 de absorbancia a una longitud de onda de 500 nm. Se debe ajustar a cero de absorbancia con el blanco, cuantas veces sea necesario.
REFERENCIAS 1. Alva Estrada S.I., Benito Mercadé C., Programa de evaluación de la calidad entre laboratorios. I. Diagnóstico del funcionamiento de espectrofotómetros. 1991: 1719.
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2. Alva Estrada S.I., Benito Mercadé C., Programa de evaluación de la calidad entre laboratorios. III. Estudio del efecto de la calibración sobre la calidad analítica. 1991: 19-24. 3. Arderiu Fuentes X., Lacambra Castiñeiras M. J., Compaño Queralto M. J., Bioquímica clínica y patología molecular, Vol. I., Ed. Reverte, ed. 2a, Barcelona, 1998.
SISTEMAS DE CONTROL DE CALIDAD Profesores: M en C Aura Hernández Olicón M en C Elizabeth Jiménez Gutierrez M en C Hilda Pérez Cervantes Dr. Luis R. Carreno Durón Autor: Suarez Gómez Alexis Gabriel Práctica: Vetificación y evaluación del uso y funcionamiento de instrumentos de medición columétrica Grupo: 5QM2 Sección: 4 Equipo: 10 Ciclo escolar 2019 Fecha de entrega Ciudad de México, 21 de febrero de 2018
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INTRODUCCIÓN En la actualidad las determinaciones analíticas en química clínica se realizan utilizando instrumentos y equipos relativamente complejos en el laboratorio clínico, por ello para asegurar la confiabilidad de los datos es necesario conocer tanto como sea posible las características, potencialidades, limitaciones y particularidades de los instrumentos analíticos, debido a que dependen entre otros aspectos tanto del uso adecuado como del buen funcionamiento de los equipos fotométricos. Los equipos fotométricos con el tiempo presentan un cambio gradual o deterioro progresivo sus componentes, sin embargo, esto es muy difícil de detectar si no se tiene un programa control de calidad diario que incluya al menos: realizar la lectura diaria de soluciones concentración conocida, calibración periódica de la longitud de onda, linealidad y detección luz espuria.
de de de de
Dichos equipos deben mantenerse en las mejores condiciones, por ello se debe prestar atención especial en que la fuente de luz de estos instrumentos sea constante. Por lo tanto, una adecuada calibración instrumental es uno de los factores claves para lograr exactitud en los resultados analíticos. La calibración, la sensibilidad y la linealidad, son tres características que permiten verificar el correcto funcionamiento de los espectrofotómetros y se encuentran descritas en un apartado específico de los manuales de operación de cada instrumento. Las dos primeras se verifican mediante la determinación del espectro de absorción de una solución de cloruro de cobalto (CoCl2) (absorbancia máxima de 0.5 a 510 nm) y la última a través de la medición de la absorbancia de soluciones de diferentes concentraciones conocidas de dicromato de potasio (K2Cr2O7) o de permanganato de potasio (KMnO4). (3) OBJETIVO Verificar la calibración, sensibilidad y linealidad de los espectrofotómetros, utilizando una solución de cloruro de cobalto y dicromato de potasio e interpretar los resultados de acuerdo a la ley de Lamber-Beer. FUNDAMENTO Cuando la luz de una apropiada longitud de onda atraviesa una cubeta conteniendo una solución colorida, parte de la luz es absorbida por la solución, el resto es transmitida a través de la muestra hasta el detector. La luz que llega al detector se conoce como transmitancia. Cada solución colorida tiene un espectro de absorción característico que se establece a partir de la medición de la absorbancia a diferentes longitudes de onda. La longitud de onda a la cual se analiza una sustancia es generalmente, aquella a la cual se obtiene la máxima absorbancia. Por lo regular se selecciona aquella que dé la mayor sensibilidad y que más se aproxime a la ley de Beer.
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RESULTADOS BITÁCORA DE RESULTADOS FECHA: 20 DE MARZO DEL 2018 Verificación de la calibración, sensibilidad y linealidad de los espectrofotómetros empleados en el laboratorio clínico Resultados y observaciones Espectrofotómetro: Thermo scientific Genesis 20 Marca: Thermo scientific Codificación de usuario: 11 Unidades: nm Condiciones físicas del instrumento: buenas condiciones. Tipo de celda utilizada: volumen semireducido Solución utilizada: CoCl2 2.2% Vol. Seleccionado: ¾ de la celda Ajuste de instrumento con: HCl 1% Intervalo de λ: 450-500 nm Tabla 1. Verificación de la calibración y sensibilidad λ (nm) 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550
λ mínima seleccionada: 450 nm Verificación de la linealidad Solución utilizada: K2Cr2O7 Ajuste del espectrofotómetro: Agua destilada
A 0.216 0.290 0.342 0.388 0.431 0.477 0.509 0.496 0.438 0.342 0.249
λ máxima seleccionada: 550 nm
Longitud de onda: 500 nm
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Tabla 2. Verificación de la linealidad Conc. Conc. Absorbancia calculadas Teóricas mg/dl (500 nm) mg/dl 26.5 0.148 35.24 53 0.219 56.50 106 0.375 106.00 159 0.598 159.14 212 0.761 210.60 265 0.910 262.06 318 1.078 324.71 371 1.234 365.83 424 1.411 414.21 477 1.546 464.55 530 1.724 510.70
% de error 32.98 6.60 0.00 0.09 -0.66 -1.11 2.11 -1.39 -2.31 -2.61 -3.64
Solución con la que se hicieron las diluciones: K2Cr2O7 Factor de calibración utilizado: Fórmula para calcular las concentraciones de las diluciones: 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 Factor de dilución = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑎𝑡𝑜 Concentración =
530 𝑚𝑔/𝑑𝐿 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
Fórmula para calcular las concentraciones calculadas: 106 Factor = A106 Multiplicar el factor por cada absorbancia obtenida e verificación de la linealidad. Concentracion calculada = F ∗ Absorbancia
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ABSORBANCIA
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 440
460
480
500
520
540
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λ(nm) Figura 1. Espectro de absorción del CoCl2 al 2.2% en HCl al 1%. 2
y = 0.0034x + 0.029 R = 0.9996
Absorbancia a 500 nm
1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2
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Concentración de K2Cr2O7 (mg/dL) Figura 2. Curva tipo realizada con diluciones de K2Cr2O7 (530mg/dL).
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y = 0.0036x R=1
Absorbancia a 500 nm
1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2
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Concentración de K2Cr2O7 (mg/dL) Figura 3. Curva tipo obtenida al multiplicar las absorbancias por el Factor de Calibración (279.68).
Concentración Factor
600.00
y = 0.9588x + 8.1242 R = 0.9996
500.00 400.00 300.00 200.00 100.00 0.00 0
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Concentración Teórica Figura 4. Verificación de la linealidad.
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% Error
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36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 0 -4 -6
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Concentración
Figura 5. Porciento de error en cada uno de los puntos.
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Tabla 3. Resultados de calibración, sensibilidad y linealidad del grupo 5QV2.
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# interno y Marca de espectro
λ (De Abs máx)
C a li b r a d o
A (λ máx)
%E
S e n s i b l e
R (inicial)
R (Factor)
m
L i n e a li d a d
Intervalo útil de trabajo
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DISCUSIÓN El espectro de absorción obtenido es el esperado ya que el CoCl2 presenta la mayor absorbancia a 510 nm debido a que en esta longitud de onda se presenta una interacción más estrecha entre la materia y la energía (absortividad), por lo tanto se puede decir que el espectrofotómetro Dlab número 1 se encuentra calibrado. La absorbancia registrada en esta longitud de onda (510 nm) es de 0.616 y se encuentra fuera del rango 0.475-0.525, el cual se obtuvo con el valor esperado de absorbancia (0.5) y agregándole un 2.5% de error por arriba y por debajo de este valor, como la absorbancia obtenida sobrepasa este rango podemos decir que el espectrofotómetro no es sensible, esto se puede deber a una falla en la lámpara, ya sea porque ha superado su tiempo de vida media o bien que se encuentre sucia (llena de polvo) o bien que la celda ocupada se encuentre muy rayada. Es importante mencionar que para poder validar los datos que se obtienen de un equipo, es necesario que se haga la determinación al menos 5 veces, ya que si se realiza solo una vez, los datos no son realmente representativos y por lo tanto existe mayor grado de incertidumbre. La verificación de la calibración y sensibilidad del equipo se realiza con CoCl2 debido a que a 510 nm se realizan la mayoría de las pruebas clínicas de rutina. En la verificación de la linealidad del equipo se obtuvo un gran intervalo de trabajo que va desde 0.623 a 1.35 de absorbancia. Los demás putos por arriba o por debajo de este intervalo se descartan debido a que el porciento de error es muy grande y no se generarían datos confiables. En el primer puto el % de error es excesivamente grande, esto se debe a que en este punto la concentración del analito es muy pequeña y se podría confundir con el ruido del equipo. En los demás puntos donde se presenta un % de error mayor al 2.5% por arriba o por abajo del valor real, el analista es responsable de ese error que se pudo haber cometido al momento de realizar las diluciones. Es por eso que las determinaciones se deben realizar por lo menos 5 veces para tener datos más representativos y confiables que reduzcan el grado de incertidumbre. CONCLUSIONES
Es necesario realizar 5 veces la determinación para validar los datos. No se puede verificar si el equipo se encuentra calibrado o si es sensible, debido a que no se ajustó a cero de absorbancia con el blanco en cada una de las longitudes de onda. El equipo presenta linealidad en un intervalo de 0.623 a 1.35 de absorbancia a una longitud de onda de 500 nm. Se debe ajustar a cero de absorbancia con el blanco, cuantas veces sea necesario.
REFERENCIAS 1. Alva Estrada S.I., Benito Mercadé C., Programa de evaluación de la calidad entre laboratorios. I. Diagnóstico del funcionamiento de espectrofotómetros. 1991: 1719.
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
2. Alva Estrada S.I., Benito Mercadé C., Programa de evaluación de la calidad entre laboratorios. III. Estudio del efecto de la calibración sobre la calidad analítica. 1991: 19-24. 3. Arderiu Fuentes X., Lacambra Castiñeiras M. J., Compaño Queralto M. J., Bioquímica clínica y patología molecular, Vol. I., Ed. Reverte, ed. 2a, Barcelona, 1998.
