Efecto Del Ph Y La Concentración De La Intensidad De Fluorescencia De Riboflavina.docx

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Practica No. “Efecto del pH y la concentración de la intensidad de fluorescencia de riboflavina”. Grupo 5QM2 Sección 3 Autor: Suarez Gómez Alexis Gabriel Profesor: QFP Carolina Acuña González Ciclo escolar 2019

Ciudad de México, 26 de marzo del 2019

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Objetivos:    

Conocer el manejo de un fluorómetro de filtros. Conocer los factores fisicoquímicos que pueden abatir la fluorescencia. Determinar el efecto del pH del disolvente sobre la intensidad de fluorescencia. Determinar el efecto de la concentración de riboflavina en la intensidad de fluoescencia.

Fundamento La radiación electromagnética se origina cuando las partículas excitadas (átomos, iones o moléculas) se relajan a niveles de menor energía cediendo su exceso de energía en forma de fotones. La excitación puede producirse por diversos medios, tales como el bombardeo con electrones u otras partículas elementales, que generalmente conduce a la emisión de rayos X; la exposición a achispas de corriente alterna o al calor de una llama, un arco o un horno, la cual produce radiación ultravioleta, visible o inflarroja; la irradiación con haz de radiación electromagnética, que produce radiación fluorescente; una reacción química exotérmica que produce quimioluminiscencia. La radiación emitida por una fuente excitada se caracteriza adecuadamente por medio de un espectro de emisión, que generalmente toma la forma de una representación gráfica de la potencia relativa de la radiación emitida en función de la longitud de onda o de la frecuencia. Entre los métodos de fotoluminiscencia. La fluorescenica y la fosforescenica son el resultado de la absorción de la radiación electromagnética y la disipación de la energía mediante la emisión de la radiación. Resultados Tabla1. Resultados de la curva de calibración de riboflavina en diferentes medios. Riboflavina Intensidad de Intensidad de Intensidad de Intensidad de (ppm) fluorescencia en fluorescencia en HCl fluorescencia en fluorescencia en H20 0.1M CH3COOH 0.9M NaOH 0.1M 0 4.83 4.81 4.84 4.83 1 5.77 4.78 5.59 4.83 2 6.62 4.79 6.3 4.85 3 7.11 5.17 6.69 4.86 4 8.06 5.33 7.27 4.87 5 8.71 5.4 8.09 4.87 10 11.5 5.83 10.29 4.69 50 15.96 6.28 13.52 4.93 pH 5 1 3 13

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Figura 1. Resultados de la curva de calibración de la riboflavina en diferente medios.

Intensidad de fluorescenica (RFC)

10

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0

1

2

3

4

5

6

Riboflavina (ppm) Intensidad de fluorescencia en H20

Intensidad de fluorescencia en HCl 0.1M

Intensidad de fluorescencia en CH3COOH 0.9M

Intencsidad de fluorescencia en NaOH 0.1M

Figura 2. Resultados de la curva de calibración de la riboflavina en diferente medios a una concentración máxima de 5 de Riboflavina.

Preguntas adicionales.

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 1. ¿Por qué se deben conocer las longitudes de onda de máxima excitación y de máxima emisión? Es necesario conocer las longitudes de onda de máxima excitación y de máxima emisión para poder llevar a cabo una determinación cuantitativa de un compuesto por fluorometría, la longitud de onda de máxima excitación es el parámetro en el cual absorbe energía radiante y la longitud de onda de máxima emisión es el parámetro al que emite la radiación electromagnética. 2. Diga cuáles son las formas coenzimáticas de la riboflavina y cuál es su papel en el metabolismo celular. Las formas coenzimáticas de la riboflavina son el FMN y el FAD. Flavin adenin dinucleótido (FAD). Es un coenzima transportador de electrones semejante al NAD+, ahora bien, nunca como un transportador libre, de una proteína enzimática llamada flavoproteína (FP). Así también de forma distinta al NAD+, el FAD acepta dos electrones y dos iones hidrógeno en una típica reacción de óxido-reducción. La conversión de FAD a la forma reducida FADH puede ocurrir en dos etapas, el FAD puede participar en la transferencia de uno o dos electrones en las reacciones químicas en las que participa. 3. Estructura resonante de la riboflavina

Riboflavina a un pH ácido

Riboflavina a pH 7

Riboflavina a un pH alcalino

4. Diferencias entre fluorescencia y fosforescencia. Fluorescencia Ocurre de manera más rápida, se completa en 10-5segundos o menos a partir del tiempo de excitación. En las mediciones de fluorescencia, la fuente excita el analito y provoca la emisión de radiación característica, la cual se mide generalmente de manera perpendicular al rayo incidente que proviene de la fuente.

Fosforescencia Ocurre de manera más lenta, se puede extender durante minutos u horas después. Dado a su baja intensidad para aumentar la eficiencia, la fosforescencia se realiza a bajas temperaturas en medios rígidos, como los vidrios.

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Las bandas de fluorescencia constan de un gran número de líneas muy estrechas entre sí. Ha sido usado para la determinar la cantidad de aminoácidos, proteínas, coenzimas, vitaminas, ácidos nucleicos, alcaloides, porfirinas, esteroides, flavonoides y muchos metabolitos.

La fosforescencia molecular ha sido utilizada para la determinación e una variedad de especies orgánicas y bioquímicas, en las que se incluyen ácidos nucleicos, aminoácidos, pirina y pirimidina, enzimas, hidrocarburos policíclicos y pesticidas.

5. Aplicaciones de la fluorescencia • La fluorescencia ha demostrado ser una herramienta valiosa en la identificación de derrames de petróleo. La fuente de un derrame de petróleo se puede identificar comparando el espectro de emisión de fluorescencia de la muestra del derrame con el de la fuente sospechosa. La estructura vibracional de los hidrocarburos policíclicos presente en el petróleo hace posible este tipo de identificación. • Métodos de fluorescenica cuantitativos para determinar la cantidad de aminoácidos, proteínas, coenzimas, vitaminas, ácidos nucleicos, alcaloides, porfirinas, esteroides, flavonoides y muchos metabolitos. • Debido a su sensibilidad, la fluorescencia se utiliza ampliamente como técnica de detección para los métodos de cromatografía líquida. Discusión. Haciendo referencia a la fluorescencia cabe mencionar que es uno de los diversos mecanismos por los que una molécula puede regresar al estado basal después de que ha sido excitada por absorción de radiación, entre los factores que pueden abatir dicho mecanismo son el pH, la concentración del analito, presencia de la luz visible y la temperatura, entre los cuales se evaluó el pH, con respecto a la figura 1 y 2 de la curva de calibración de la riboflavina en diferente medios: agua, ácido acético, HCl y NaOH, cabe mencionar que el agua en función al cambio de la concentración de la riboflavina y de las lecturas de intensidad de fluorescencia expresada en unidades de fluorescencia resonante (RFU), mantiene la proporcionalidad cumpliendo la ley de Bouguer y Beer, dado a que la radiación emitida es proporcional a la concentración del analito. Con respecto al medio en ácido acético igualmente se cumple con dicha proporcionalidad aunque en menor medida en comparación con el agua. Con respecto al ácido clorhidrico posiblemente a mayores concentraciones se llegara a cumplir dicha proporcionalidad dado a la tendencia del gráfico, mientras que a medio alcalino se pierde completamente la proporciolnalidad, teniendo baja fluorescencia, entre las causas de una baja fluorescencia se atribuye al pH parámetro que se varió, por ejemplo a pH ácido la fluorescencia baja dado a que los grupos amino se protonan perdiendo resonancia en la molécula, por ello a pH 7 (H2O) hay mayor RFU, dado a que en la molécula ocurren mayor número de resonancias por su conjugación. Sin embargo a pH alcalino no hay fluorescencia, dado a que la molécula se desprotona, llegandose a romper perdiendo la capacidad de poder llegar a emitir la radiación electromagnética que se le hacía incidir.

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Conclusión.  

A pH neutro se da el máximo de fluorescencia. La riboflavina manifestando resistencia a ácidos débiles, pero ya no en ácidos fuertes.

Referencia bibliográfica 

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José María Tijón Rivera, Rosa Olmo López, Amando Garrido Pertierra, César Teijón López, María Dolores Blanco Gaitán. Bioquímica estructural. 2ª ed. Madrid: Editorial TÉBAR; c2009. 35pp. Douglas A. Skoog, Donal M. West, F. James Holles, Stanley R. Crouch. Química analítica. 9a ed. México: CENGAGE Learning; c2015. Pp. 762-769

Plagio.