Paf

Ricardo Correia Bioquímica

Amiloidose

Índice

Introdução…………………………………………………………………….. 2 Bases moleculares da PAF………………………….…………………...… 6 Manifestações……………………………………………….……………… 12 Diagnóstico………………………………………………………………….. 14 Tratamento…………………...……………………………………………... 16 Conclusão………………...…………………………………………………. 18 Resumo…………………………………………………………………..….. 19 Bibliografia………………………………………………………….......…… 20

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Amiloidose

Introdução

A amiloidose pode ser definida como a deposição extracelular da proteína fibrosa amilóide num ou mais locais do corpo. O amilóide é amorfo, eosinofílico, extracelular e de distribuição ubíqua. Os órgãos afectados apresentam consistência elástica e um aspecto céreo, rosado ou cinza. O aumento dos órgãos, especialmente do fígado, dos rins, do baço e do coração, pode ser proeminente. Ao exame microscópico, o amilóide adquire uma coloração rósea com a hematoxilina-eosina e mostra metacromasia com cristal violeta (isto é, cora-se com cor diferente daquela que cora os demais tecidos). Em vez de verde ou roxo cora de vermelho aos corantes verde metileno, violeta de cresila e violeta de genciana. O melhor corante para a identificação do amilóide é o vermelhocongo produzindo a sua coloração uma birrefrigência esverdeada peculiar (as vezes vermelha ou azul amarelada) quando os cortes examinados no micorscópio de polarização, sendo este o procedimento mais útil para estabelecer a presença de amilóide, e ao exame com ultra violeta mostra uma fluorescência avermelhada.

Biopsia

de

língua

hematoxilina-eosina:

corada

por

substâncias

róseas distribuídas entre fragmentos musculares

sugerindo

substância

amilóide.

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Amiloidose

Biopsia de língua corada com vermelho Congo: birrefringência no

microscópio

com

luz

polarizada.

A) Biopsia cardíaca corada com vermelho Congo específico para substância amilóide (a substância amilóide apresenta-se com a coloração avermelhada no interstício e ao redor dos vasos; B) biopsia cardíaca corada com hematoxilina-eosina (a substância amilóide não se cora como se pode observar ao redor dos vasos e no interstício; C) biopsia hepática corada com vermelho Congo mostrando a substância amilóide em tom avermelhado ao redor dos vasos e, em menor intensidade no interstício; D) biopsia hepática corada pela hematoxilina-eosina mostrando o infiltrado amilóide em tom claro em torno dos vasos e no interstício (aumento 400x ).

Todos os tipos de amilóide humano consistem em fibrilas finas, rígidas e sem ramificação que, nos cortes teciduais, medem cerca de 10 x 10-9 m

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Amiloidose

(100 Ǻ) de diâmetro. As fibrilas amilóides isoladas possuem um aspecto fibroso delicado, fino e sem ramificações. A fibrila (ou filamento) individual possui um diâmetro de aproximadamente 7 x 10-9 m (70 Ǻ) e tende a agregar-se lateralmente. Cada fibrila (filamento) possui subunidades de protofibrilas de 3 a 3.5 x 10-9 m (30 a 35 Ǻ) de diâmetro. A difracção aos raios X de fibrilas isoladas de amilóide revela em padrão beta cruzado, o “lençol pregueado” de Pauling e Corey, indicando que as cadeias polipeptídicas se dirigem transversalmente ao eixo longitudunal da amostra de fibrila. Estas proteínas constituintes do amilóide, principalmente com aminoácidos ácidos (em inúmeras sequências diferentes) formam peptídeos empilhados e dobrados, isto é, adquirem uma estrutura em folha pragueada beta (“pragueamento β”), que lhe confere a característica de resistência à degradação, formando uma estrutura molecular em lâmina ou folha pragueada antiparalela, semelhante à β-queratina.

Modelo de uma fibrila.

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Amiloidose

Modelo de 4 fibrilas.

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Amiloidose

Bases moleculares da PAF

A polineuropatia amiloidótica familiar (PAF), mais conhecida por “doença dos pezinhos” ou paramiloidose, foi descrita pela primeira vez na população portuguesa, em doentes da região da Póvoa do Varzim, em 1952, pelo eminente neurologista, o Professor Corino de Andrade. A “doença dos pezinhos” é uma doença neurológica, crónica, progressiva e hereditária de transmissão autossómica dominante que afecta o sistema nervoso nas suas vertentes motora, sensitiva e autónoma. A Paramiloidose continua ainda a ser uma doença incurável. Pensando-se que esta era uma doença tipicamente portuguesa, rapidamente se verificaram outros casos por todo o mundo. Daí afirmar-se que a propagação da doença a nível mundial ter sido feita pelos portugueses através das suas rotas de comércio e de navegação, principalmente para a Suécia e Japão. Outra hipótese levantada é a de terem sido os Vikings a trazerem esta doença para o nosso país. A PAF está associada à deposição nos tecidos – em particular nos nervos – da substância fibrilar altamente insolúvel amilóide. As fibras de amilóide são constituídas por sub-unidades de uma proteína do sangue que transporta hormonas da tiróide e Vitamina A. Em situações normais, a transtirretina (TTR) que circula no sangue é solúvel nos tecidos, contudo, quando ocorrem determinadas mutações na TTR que alterem a sua estrutura, por razões ainda desconhecidas, esta proteína forma fibras de amilóide nos tecidos. A substituição de uma única base, de valina por metionina, em posição 30 origina TTR Met 30, que é a principal forma mutada de TTR nos doentes de PAF, em Portugal. A mutação é transmitida de uma forma autossómica dominante. Se o progenitor for portador heterozigótico (quase todos os casos), a probabilidade de um filho ser também portador da mutação é de 50%. A mutação Met 30 ocorre em diferentes países do mundo, tendo o seu maior foco em Portugal, seguido do Japão, Suécia, a ilha de Maiorca, Brasil e Itália. A doença tem idade de início entre os 25 e 35

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anos (podendo ocorrer depois dos 50), inicia-se nos membros inferiores, afectando a sensibilidade aos estímulos (por exemplo, térmicos), a capacidade motora, e é fatal, com evolução média, em 10 anos. As fibras de amilóide resultam duma alteração (mutação) no braço longo do cromossoma 18 do gene que codifica a TTR. A substituição neste gene de um único nucleótido (unidade estrutural dos ácidos nucleicos) em adenina por um em guanina (bases constituintes dos nucleótidos), na posição 30, leva a que seja codificado o aminoácido metionina (Met) em vez de valina, o qu vai originar uma proteína com características diferentes.

Como é dominante, se os indivíduos forem homozigóticos (tiverem os dois elementos do par do cromossoma 18 com a mutação) têm 100% de probabilidade de transmitir a doença aos seus descendentes. Se forem heterozigóticos (só um dos cromossomas afectado) a probabilidade desce para 50%. O facto de um indivíduo ser homo ou heterozigótico parece não agravar a sintomatologia, havendo até casos de homozigotas assintomáticos.

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Amiloidose

Substituição duma Adenina por uma Guanina, no exão 2, levando à substituição de uma Valina original por uma Metionina na posição 30 da proteína (TTR Val30Met).

Enquanto a TTR normal é solúvel no plasma e estável nos tecidos, a mutada é solúvel no plasma

mas

instável

nos

tecidos,

polimerizando (agregando) e formando fibras de amilóide.

As fibras, ao serem observadas ao microscópio de luz polarizada, aparecem esverdeadas, devido à dupla refracção da luz incidente.

Deposição de substância amilóide num tecido

de

PAF

observado

ao

microscópio de luz polarizada.

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Amiloidose

Como existem outras proteínas com capacidade de polimerizar, quando os investigadores observam depósitos de amilóide em tecidos, para terem a certeza que se trata de TTR, coram-nos com anticorpos específicos dessa proteína obtidos após injecção de TTR num animal que a reconheça como proteína diferente.

Localização de depósitos da TTR no tecido muscular corados com anticorpos.

A TTR é uma proteína tetrámera (constituída por quatro subunidades), relacionada com o transporte da RBP (proteína de ligação da Vitamina A), de lípidos e da tiroxina (hormona da tiróide). Se o indivíduo for homozigota, tem as quatro subunidades mutadas, se for heterozigota poderá ter uma, duas ou três. No entanto, se o mecanismo de deposição das fibras for o mesmo, o que ainda está em investigação, tanto faz ser homo ou heterozigota. Existem outras mutações na TTR, algumas das quais não patogénicas, que estão associadas à Met 30. Em Portugal foram identificadas famílias com a dupla mutação (Met 30 e Met 119), verificando-se que a doença aparece mais tardiamente e a sua evolução é menos acentuada. A protecção que a segunda mutação (Met 119) faz da sintomatologia clínica está relacionada com o facto de, para se formarem fibras, haver necessidade da TTR se dissociar nas suas quatro subunidades. Como a Met 30 o faz muito facilmente e a Met 119 oferece grande resistência a essa dissociação, a associação das duas atenua a sintomatologia.

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Amiloidose

Proteína de tanstirretina (TTR) – vista lateral.

Proteína de transtirretina (TTR) – vista superior.

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Duas RBP ligam-se a um tetrámero de TTR.

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Amiloidose

Manifestações O acúmulo de grandes quantidades de amilóide pode comprometer o funcionamento normal de muitos órgãos. Os sintomas da amiloidose dependem do local onde o amilóide se acumula. Muitos indivíduos apresentam poucos sintomas, enquanto outros apresentam uma doença grave e potencialmente letal. A principal zona afectada pela doença são os membros inferiores (daí o nome “doença dos pezinhos”), alastrando-se, contudo, mais tarde, aos membros superiores e outras zonas do corpo. A maioria dos casos começa com polineuropatia periférica (perda de destreza motora, dor e sensação), frequentemente seguida por alguns sinais nervosos autónomos. Relativamente às fibras motoras, verificam-se atrofias musculares, abolição dos reflexos tendinosos e uma marcha em “steppage”. A nível autónomo, são comuns os problemas cardíacos (desde a hipotensão ortostática até diferentes arritmias e obstruções auriculoventriculares de primeiro e segundo graus). A disfunção eréctil é um dos primeiros distúrbios. Desenvolvem-se então disfunções gastro-intestinais, com graves prisões de ventre e diarreias e, por vezes, incontinência fecal. Dificuldades nos esvaziamentos gástricos com náuseas e vómitos são também frequentes. As disfunções da bexiga com retenção ou incontinência estão ambas presentes em casos avançados da doença. A proteinúria é frequentemente a expressão do envolvimento dos rins, diminuindo a taxa de filtração glomerular e a diminuição do despejo da creatinina. Nas fibras sensitivas é normal a perda progressiva da sensibilidade, começando pela dor e temperatura e depois as sensações tácteis, vibratórias e articulares. Graças a uma das funções da TTR, a sua anormalidade leva também a perturbações oculares.

Sinais e Sintomas da Amiloidose Doença cardíaca e arritmia Primária

Doença renal, incluindo insuficiência Distúrbios gastrointestinais, como perfuração, sangramento, dismotilidade e obstrução

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Aumento do fígado ( hepatomegalia ) Redução na função do baço Insuficiência da adrenal e outras glândulas Neuropatia, levando a impotência, problemas gastrointestinais e hipotensão ortostática ( quando se levanta rapidamente ) Síndrome do túnel do carpo Alterações neurológicas, como espessamento, mudança de cor, púrpura ao redor dos olhos Aumento na língua, dificuldade respiratória e apnéia nocturna Doenças pulmonares Inchaço nas articulações dos ombros Facilidade de sangramento Doença renal, incluindo insuficiência ( causa do óbito em 4060% dos casos ) Secundária

Aumento do fígado ( hepatomegalia ) Aumento do baço ( esplenomegalia ) Doenças cardíacas ( mais leve que nas outras amiloidoses ) Distúrbios do sistema nervoso

Hereditária

Distúrbios gastrointestinais, como diarreia e perda de peso Doenças cardíacas Doença renal

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Amiloidose

Diagnóstico

O diagnóstico específico de amiloidose depende da obtenção de uma amostra de tecido por biopsia e da demonstração do amilóide com colorações apropriadas. No entanto, em quaisquer síndromes hereditárias, especialmente naquelas que apresentam uma modalidade autossómica dominante de herança e se caracterizam por neuropatia periférica, neufropatia ou cardiopatia, deve ser aventado o diagnóstico de amilóide. Ao suspeitar desse diagnóstico, convém realizar um aspirado da camada adiposa subcutânea abdominal ou uma biopsia retal. Se houver alguma razão específica para não realizar esses procedimentos, poderão ser biopsiados outros locais, tais como pele, gengivas ou o órgão suspeitado. Todos os tecidos obtidos devem ser corados com vermelho-congo e examinados ao microscópio de polarização em busca de birrefringência verde.

Biopsia

renal

corada

com

vermelho Congo, mostrando o aspecto

fluorescente

da

proteína amilóide.

A PAF é uma doença autossómica dominante. Habitualmente, num indivíduo afectado ocorre a presença de uma cópia normal e de uma cópia alterada (mutação). A cada um dos filhos o indivíduo em causa transmite um dos genes (a cópia normal ou a mutação). O outro gene do indivíduo ser-lhe-á transmitido pelo outro elemento do casal. Independentemente da mutação estar presente no homem ou na mulher, da doença já se ter ou não manifestado (até mesmo no caso do doente já ter sido submetido a transplante hepático), de se tratar de um primeiro ou segundo filho, rapaz ou rapariga, a probabilidade de transmitir o gene normal é de 50% e a probabilidade de 14

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transmitir a mutação também é de 50%. Como forma de evitar a transmissão da doença, os indivíduos com antecedentes familiares com PAF devem verificar se possuem o gene mutado. A prevenção da transmissão da doença permite aos casais em risco de terem filhos com a mutação, o nascimento de crianças que se sabe terem dois genes normais (e por isso nunca terão a doença nem a transmitirão a futuros descendentes). Uma possibilidade é proceder ao diagnóstico Pré-Natal, sendo realizada uma amniocentese às 14/16 semanas de gravidez. No caso do exame ser positivo (confirmação da presença da mutação no feto), faz-se a interrupção da gravidez por volta das 17 semanas. Contudo, este diagnóstico pode parecer agressivo para alguns casais sobre o ponto de vista ético, religioso e moral. Outra é o diagnóstico pré-implantatório. Nesta possibilidade há uma combinação de diversas áreas da biotnecologia: fertilização in vitro, cultura de embriões e sua biopsia, diagnóstico genético ao nível de uma única célula, amplificação da região do gene com interesse por PCR e detecção da mutação por análise de restrição enzimática, entre outros procedimentos. Neste método procede-se à administração de medicamentos e a uma vigilância da mulher, à colheita no laboratório das células da linha reprodutiva dos dois elementos do casal, à fertilização in vitro (conhecida como a técnica dos «bebés proveta») e ao teste dos embriões. Os embriões são criados em laboratório e ao terceiro dia já devem ter entre 8 a 12 células. Nessa altura faz-se uma biopsia, retirando-se duas células do embrião, sendo depois analisadas geneticamente de forma independente. Passado 42 horas tem-se o resultado e se o diagnóstico for negativo, o embrião é implantado no útero da mãe. Só são transferidos os embriões sem a mutação mas a mulher só fica grávida em cerca de 20% dos casos. Outra alternativa é a doação de gâmetas (neste caso as células não têm origem no elemento do casal com a mutação pelo que o filho não receberá dele nenhuma informação genética).

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Amiloidose

Tratamento

Quando a amiloidose é causada por uma outra doença, o tratamento desta normalmente alentece ou reverte a amiloidose. No entanto, quando a amiloidose se manifesta em pacientes com mieloma múltiplo, as manifestações que resultam na hospitalização inicial estão relacionados muito mais à doença amilóide que ao mieloma. Nesses casos, o prognóstico é extremamente sombrio, e a expectativa de vida costuma ser inferior a seis meses. A amiloidose generalizada costuma ser uma doença lentamente progressiva que resulta em morte após vários anos, embora possa ter um melhor prognóstico do que se suspeitava no passado. A sobrevivência média na maioria das grandes séries é de um a quatro anos, porém inúmeros indivíduos com amilóide foram acompanhados por cinco a dez anos ou mais. Não existe uma terapia específica para qualquer variedade de amiloidose. A terapia racional deve ser dirigida para (1) reduzir os estímulos antigénicos crónicos que produzem o amilóide, (2) inibir a síntese e a deposição extracelular das fibrilas amilóides e (3) promover a lise ou a mobilização dos depósitos pré existentes de amilóide. Já foram utilizados inúmeros agentes para tratar a amiloidose, no entanto, não havendo qualquer prova da sua eficácia. Ainda não existe um tratamento etiológico para a polineuropatia amiloidótica familiar. Tratando-se de um caso de amiloidose hereditária com produção de transtiretina e, mesmo esta proteína causando lesões neurológicas e cardíacas fatais, ela é produzida no fígado, sendo o transplante hepático a única forma efectiva de travar a progressão da doença. O transplante deve ser realizado antes dos 50 anos de idade, início da doença há menos de 5 anos, sintomas localizados aos membros inferiores ou apenas alterações dos hábitos intestinais, ausência de sinais e sintomas de insuficiência renal ou cardíaca. A taxa de sobrevivência aos 5 anos após o transplante hepático é de 80%. O transplante hepático é uma hipótese terapêutica, iniciada na Suécia em 1991 e, em Portugal, pela Unidade de Transplante Hepático de Curry Cabral,

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em 1992. O objectivo desta intervenção reside na diminuição da concentração de proteína mutada no plasma sanguíneo, já que mais de 90% da TTR Met 30 é produzida no fígado, pelo que se espera que o seu transplante pare a progressão da doença e que assim a TTR Met 30 desaparecesse do soro. Duas terapias têm sido usadas para reduzir os altos níveis de TTR Met30 no sangue para prevenir futuros depósitos ou para reduzir os já existentes: a imunoadsorção e a plasmoforese. Mas, também por não serem muito eficazes, se olha para o transplante hepático como a melhor solução. A “Plasmapheresis” necessita de ser repetida varias vezes por mês, o que não é prático e leva a uma deterioração da qualidade de vida. A Imunoadsorção levanta algumas dúvidas sobre a eficácia, custos e previsibilidade. Está provado que a TTR Met 30 desaparece do soro dos doentes brevemente após o transplante. Contudo, a duração da doença antes do transplante parece ser um importante factor para a melhoria. Os casos de sobrevivência diminuem em doentes com a doença sintomática há mais de 7anos. Há quem defenda a praticabilidade de um transplante fígado-coração (nos casos de disfunção dos 2 órgãos traz bons resultados). Às vezes recorre-se a um transplante triplo: coração, fígado e rim. A recuperação da temperatura ao nível dos pés e das mãos é breve após a cirurgia. A recuperação da função nervosa periférica é mais lenta e limitada. A melhoria nos distúrbios sensitivos e autónomos é observada durante o primeiro ano após o transplante. Não foram observados melhoramentos na função motora ou nos danos dos órgãos. Não pode ser esquecido que a TTR não é unicamente sintetizada no fígado, sendo também sintetizada nos plexos coroideos e na retina. A produção de TTR pelos plexos coroideos não cessa após o transplante de fígado. Os problemas oculares são comuns e podem-se tornar sérios após o transplante de fígado. Têm vindo a ser estudadas algumas novas possibilidades para o futuro para a cura da PAF, como: Fase de Priming, que consiste em impedir a dissociação do tetrámero em monómeros, e consequentemente formação de espécies intermediárias (potencialmente amiloidogénicas); Fase de Extensão, inibindo a associação das espécies intermediárias e crescimento das fibras e Fase de Disrupção, fazendo a desagregação de fibras já formadas. Outra 17

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possibilidade em estudo e a atenuação com a Diethylstilbestrol estrogénio

(DES).

sintético,

A

DES

potente

é

um

inibidor

competitivo da hormona da tiróide para a TTR. Contém dois grupos fenil hidrofóbicos com substituintes hidroxil ligados por um grupo etileno, apresentando uma estrutura molecular semelhante ao resveratrol, composto descrito como inibidor da fibrilogénese

Conclusão Concluiu-se que o transplante de fígado pára o progresso da doença no ponto de evolução, sendo mesmo possível demonstrar objectivamente, nalguns casos, regressão de lesões. Pelo contrário verifica-se que em casos graves não há benefício com o transplante hepático, uma vez que as graves lesões já estabelecidas nos diversos órgãos vão condicionar a evolução. Mas coloca-se o problema de escassez de fígados para transplante. Assim, futuramente será de esperar a possibilidade de transplantação de células hepáticas (os hepatócitos), obtidos através de cultura de tecidos. Neste caso não seria necessário transplantar a totalidade do órgão, permitindo mais transplantes.

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Resumo

As amiloidoses são um vasto grupo de doenças que é definido pela presença de depósitos de proteína insolúvel nos tecidos, sendo classificadas consoante os sinais clínicos e o tipo bioquímico da proteína amilóide envolvida. Estas doenças afectam, sobretudo, os rins, o coração, o aparelho gastro-intestinal, o fígado, a pele, os nervos periféricos e os olhos, podendo, no entanto, atingir qualquer órgão. A proteína amilóide foi assim designada por Rudolf Virchow em 1854 com base na sua cor após coloração com o iodo (de amarronzado para azulado, semelhante ao que ocorre com o amido). O amilóide possui singulares características ultra-estruturais, bioquímicas e de difracção aos raios X. Agora sabe-se que existem múltiplas formas clínicas e bioquimicamente diferentes de amilóide que são assim classificadas em virtude da estrutura fibrosa ímpar que todas elas possuem. O amilóide é amorfo, eosinofílico, extracelular e de distribuição ubíqua. Os órgãos afectados apresentam consistência elástica e um aspecto céreo, rosado ou cinza. A polineuropatia amiloidótica familiar (PAF) foi pela primeira vez descrita na população portuguesa, em doentes da região da Póvoa do Varzim, em 1952, pelo Professor Corino de Andrade. A PAF está englobada nas amiloidoses hereditárias, sendo uma doença neurológica, progressiva, crónica e de transmissão autossómica dominante. A “doença dos pezinhos” é uma doença neurológica, crónica, progressiva e hereditária de transmissão autossómica dominante que afecta o sistema nervoso nas suas vertentes motora, sensitiva e autónoma. A PAF está associada á deposição nos tecidos – em particular nos nervos – da substância fibrilar altamente insolúvel amilóide. As fibras de amilóide são constituídas por sub-unidades de uma proteína do sangue que transporta hormonas da tiróide e Vitamina A. As manifestações da doença começam entre os 25 e 35 anos (podendo ocorrer depois dos 50), inicia-se nos membros inferiores, afectando a sensibilidade aos estímulos (por exemplo, térmicos), a capacidade motora, e é fatal, com evolução média, em 10 anos.

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A Paramiloidose continua ainda a ser uma doença incurável. Pensando-se que esta era uma doença tipicamente portuguesa, rapidamente se verificaram outros casos por todo o mundo. Daí afirmar-se que a propagação da doença a nível mundial ter sido feita pelos portugueses através das suas rotas de comércio e de navegação, principalmente para a Suécia e Japão. Outra hipótese levantada é a de terem sido os Vikings a trazerem esta doença para o nosso país.

Bibliografia


www.icb.ufmg.br
www.hepcentro.com.br
www.manualmerck.net
www.paramiloidose.com
http://paramiloidose.tripod.com
http://medicina.med.up.pt
Harrison Medicina Interna 13ª edição; volume 2: 1701-1706

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