Micobiota Alternate En Milanesas De Soja Y Verdura

MICOBIOTA ALTERNATE EN MILANESAS DE SOJA Y VERDURA

Adrián Hernández Tipa

Universidad Nacional de Mar del Plata

Facultad de Ciencias Agrarias

Agosto de 2005

MICOBIOTA ALTERANTE EN MILANESAS DE SOJA Y VERDURA

Adrián Hernández Tipa

Monografía presentada como requisito parcial para optar al grado de Licenciado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos.

Licenciatura en Ciencia y Tecnología de los Alimentos Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Mar del Plata.

Agosto de 2005

MICOBIOTA ALTERANTE EN MILANESAS DE SOJA Y VERDURA

Adrián Hernández Tipa

Director: Dr. Federico Laich

................................

Asesor: Ing. Agr. Yolanda Andreoli

................................

Asesor: Lic. Osvaldo Cuello

...............................

Delegado del Decano:

...............................

AGRADECIMIENTOS

•

Al dueño de la empresa donde realice este proyecto. Sin

su permiso no hubiera sido posible mi trabajo. •

A Federico Laich, Yolanda Andreoli y Osvaldo Cuello,

quienes me guiaron en mi trabajo. •

A Yoli y Elsa del Laboratorio de Microbiología de Suelos

de I.N.T. A. Balcarce, quienes me a yudaron cuando el trabajo me desbordaba. •

A la profesora Graciela Vacarezza de la Facultad de

Ciencias Veterinarias, UNICEN, Tandil, quien me permitió utilizar el servidor de la Facultad y acceder a valiosísima información.

ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN. ................................................................. 1 1.1. Los hongos como contaminantes y degrad adores de los alimentos. ........................................................................... 1 1.1.1. Principales es pecies cont aminantes. ........................... 3 1.1.2. Condiciones ambientales para el desarrollo de la mic obiota. ......................................................................... 5 1.2. Problemas del consumo de alimentos contaminados con hongos. ............................................................................... 7 1.2.1. Principales mic otoxinas y su efecto en el humano. ....... 8 1.3. M étodos de control del crecimiento de contaminantes. . 12 1.4. Objetivos. .................................................................... 14 2. MATERI ALES Y MÉTODOS. ................................................ 16 2.1. Proceso de elaboración. ............................................... 16 2.2. Identificación de la micobiota contaminante. ................ 18 2.2.1. Muestreo. ................................................................ 18 2.2.2. Aislamiento y purific ación. ........................................ 19 2.2.3. Identificación primaria. ............................................. 20 2.3. Origen de los contaminantes identificados en las milanesas. .......................................................................... 20 2.4. Tratamiento térmico. .................................................... 21 2.5. Efecto del pan rallado como contaminante. .................. 23 2.6. Contaminación cruzada. ............................................... 24 2.8. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio. ... 26 3. RESULT ADOS. ................................................................... 27 3.1. Identificación de la micobiota contaminante. ................ 27 3.1.1. Materias primas. ...................................................... 27 3.1.2. Milanesas. ............................................................... 27 3.1.3. Ambiente. ................................................................ 30 3.2. Origen de los contaminantes identificados en las milanesas. .......................................................................... 30 3.3. Tratamiento térmico. .................................................... 35 3.4. Efecto del pan rallado como contaminante. .................. 37 3.5.Contaminación cruzada. ................................................ 38 3.6. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio. ... 40 4. DISCUSIÓN FIN AL. ............................................................ 42 5. BIBLIOGRAFÍ A. ................................................................. 46

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1: Escala visual de contaminación utilizada en la evaluación de las milanesas de zapallo y cebolla. ................................. 36 Tabla 2: Efecto de la contaminación cruzada en milanesas de cebolla y zapallo. La escala utilizada para cuantificar el grado de contaminación se detalla en el apartado 2.6. ................... 50

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Proceso de fabricación de las milanesas de Soja. ........ 28 Figura 2: Esquem a del ensayo aplicando un shock térmico a las milanesas una vez escaldadas. ........................................... 33 Figura 3: Estado de 4 milanesas de verdura con una semana de almacenamiento, después de la incubación a 25º C en cámara húmeda durante 7 días. ...................................................... 41 Figura 6: Recuento de contaminantes en muestras de pan rallado recolectadas en diferentes tiempos del proceso de elaboración. ........................................................................................ 45 Figura 7: Desarrollo de colonias fúngicas en las placas de Petri con el medio de cultivo APA 5% Rosa de Bengala, 2% NaCl y pH 5,5. Las placas corresponde a las muestras de pan rallado sin usar (izquierda) , pan rallado usado (centro), y pan rallado de las bandejas (derecha). Todas las placas corresponden a la misma dilución, lo que permite la comparación entre ellas. ... 46 Figura 8: Milanesas sin rebozar sin shock (izquierda) y con shock (derecha). ......................................................................... 47 Figura 9: Milanesas rebozadas sin shock (izquierda) y con shock (derecha). ......................................................................... 48 Figura 10: Milanesas de cebolla incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones). En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin contaminación cruzada). ........................................................................... 51 Figura 11: Milanesas de zapallo incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones). En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin contaminación cruzada). ........................................................................... 52 Figura 12: Crecim iento fúngico a 20º C sin el agregado de sorbato de potasio, con sorbato y con sorbato sobre papel estéril evitando la contaminación cruzada. ..................................... 53

RESUMEN Los hongos filamentosos tienen la capacidad de desarrollarse sobre la superficie de muchos alimentos con un típico aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Si

bien

es

cierto

elaboración

de

componentes

que

ciertas

ciertos

de

los

especies

productos

mismos,

son

útiles

alimenticios

muchas

especies

en o

la de

fúngicas

intervienen en la formación de micotoxinas y en la alteración de diferentes tipos de alimentos. En estos casos se considera que el producto no es apto para el consumo. El objetivo del presente trabajo fue determinar el origen de la contaminación fúngica e identificar las especies existentes en la elaboración de milanesas de soja y verdura en una fábrica ubicada en el SE bonaerense. Para ello, se realizó un estudio cuantitativo

y

desarrollaban

cualitativo a

almacenamiento

través de

las

de del

diferentes proceso

milanesas.

especies de

En

que

elaboración

este

análisis

se y se

determinó la micobiota existente a partir de los productos utilizados como materia prima (harinas, pan rallado, etc.), y sobre el producto elaborado y almacenado. Las principales especies aisladas fueron identificadas como Penicillium spp.,

Aspergillus spp., Rhizopus spp. Alternaria sp. y Cladosporium spp. La presencia de hongos filamentosos en el alimento se debió principalmente a la contaminación ambiental rallado

utilizado

aplicación

de

un

en

el

rebozado

tratamiento

final

térmico

del previo

y al pan

producto. al

La

rebozado

disminu yó significativamente la concentración de levaduras en unidades formadoras de colonia por gramo (ufc), mientras que el recuento de ufc de hongos filamentosos se incrementó luego del rebozado y a través del periodo de almacenamiento. Por último, la utilización de sorbato de potasio y la conservación

de

las

milanesas

a

bajas

temperaturas,

incrementó

significativamente la vida útil del producto.

ABSTRACT Moulds have the aptitude to develop on surfaces of man y food w ith their typical velvet or cotton y aspect, sometimes pigmented. Though it is true that certain species are useful in the production of food products or their components, many fungi species intervene in the formation of m ycotoxins and in the alteration of different types of food. In these cases it is considered

that

the

product

is

not

suitable

for

the

consumption. The aim of the present w ork was to determine the origin of the fungi spoilage and to identify the species in the production of soybean and vegetable escalopes in a factory located in the SE of Province of Buenos Aires. There, a quantitative and qualitative stud y of different species developing during the process of production and storage of the product w as realized. In this anal ysis the existing m ycobiota w as determined from the products used as raw material (flours, breadcrumbs, etc.), and from the elaborated and stored product. The principal isolated

species

Aspergillus

spp.,

w ere

identified

Rhizopus

spp.

as

Penicillium

Alternaria

sp.

spp., and

Cladosporium spp. The presence of spoilage moulds in the food w as related principall y to the environmental contaminants and to the breadcrumbs used. The application of a thermal shock

before

the

final

rolled

in

breadcrumbs,

decrease

significantl y the yeast colon y forming units per gram (cfu), w hereas moulds cfu increased after the treatment and during storage. Finall y, the application of potassium sorbate and conservation at low temperature, increase the shelf-life of the product.

1. INTRODUCCIÓN. En los últimos años la dieta de los argentinos se ha visto orientada hacia alimentos más saludables y de menor costo y la

soja

ha

desempeñado

un

papel

mu y importante

como

reemplazante de las proteínas de origen animal, ya sea bajo la forma de leche, milanesas o hamburguesas de soja. Si bien las cantidades

de

soja

que

se

pierden

por

contaminaciones

microbiológicas durante la elaboración de los alimentos son importantes, no existen publicaciones que citen el problema y menos aún, que traten de enumerar o explicar cuáles son los microorganismos

implicados, ni como evitar la alteración de

este tipo de alimentos. El presente trabajo se llevó a cabo en una fábrica familiar de milanesas de soja ubicada en la ciudad de Tandil. Si bien la producción de la fábrica es pequeña y la ma yoría de la mercadería se vende en comercios de la ciudad, la intención del propietario fue aumentar su producción y el área de venta hacia otras ciudades.

En estas circunstancias el tiempo que

transcurre entre elaboración y consumo es ma yor y por lo tanto se detectaron problemas de contaminación y desarrollo de

microorganismos.

presente

trabajo

Ante fue

esta

situación

identificar

la

finalidad

los

del

principales

microorganismos contaminantes, detectar su fuente de inóculo y proponer modificaciones durante la elaboración para evitar la aparición y desarrollo de microorganismos.

1.1. Los hongos como contaminantes y degradadores de los alimentos. Los consumidores de los países desarrollados tienen una actitud más crítica a la hora de elegir que comer y que beber como

consecuencia

de

la

vida

moderna.

Por

ende

los

microbiólogos en alimentos tienen cara a cara el enorme

desafío de garantizar la frescura de los alimentos que está implícita en la demanda de los consumidores. Los alimentos con procesos menos severos, libres de aditivos, más seguros y fáciles

de

preparar

son

buscados

debido

a

la

alta

concientización del consumidor en lo que respecta a nutrición y salud (Loureiro y Querol, 1999). Actualmente existe un amplio conocimiento y comprensión de los hongos en la contaminación alimenticia. En los últimos 5-10

años

se

lograron

los

mayores

progresos

que

han

contribuido a prevenir la contaminación causada por hongos, remarcándose su importancia en la contaminación alimenticia tras el descubrimiento de las micotoxinas (Filtenborg et al., 1996). A pesar de las innovaciones científicas aplicadas a la identificación de microorganismos, la mayoría de los métodos de análisis estándar, así como otros métodos utilizados en la industria de alimentos, siguen utilizando los pasos clásicos establecidos hace ya algunas décadas: 1)

mezcla/homogeinización

de

la

muestra;

2)

dilución

decimal del homogeneizado; 3) siembra de las diluciones en el medio apropiado 4) aislamiento, purificación e identificación de los microorganismos. En algunos casos se necesita aplicar técnicas de preenriquecimiento o de selección previo a la siembra. (Loureiro y Querol, 1999). Generalmente

los

alimentos

no

son

tratados

como

un

ecosistema, tal vez porque no sean considerados sistemas “naturales”. Sin embargo, si lo son, ya que los almacenes de alimentos

son

vastos.

Los

alimentos

como

hábitat

de

microorganismos son mu y ricos en contraste del suelo, agua y vegetales. Dadas las condiciones fisicoquímicas correctas, una población

de

microorganismos

será

capaz

de

crecer

y

desarrollarse en ese alimento. En los alimentos “vivientes” como las frutas y vegetales frescos, un gran número de mecanismos de defensa son aplicados en contra de la invasión de microorganismos. Pero en los alimentos que se encuentran en un estado de latencia o no vivos los factores a tener en cuenta

son

hidrógeno, tensión

de

temperatura

de

carbono),

actividad gases

agua,

(de

concentración

procesado

(especialmente

consistencia,

y

iones

almacenamiento),

oxígeno

composición

de

y

dióxido

nutricional,

de

efectos

específicos de solutos y la presencia de conservantes (Pitt y Hocking, 1997).

1.1.1. Principales especies contaminantes. Los

mohos

son

capaces

de

crecer

en

todo

tipo

de

alimentos: cereales, carne, lácteos, frutas, vegetales, frutos secos y productos de éstos. El crecimiento fúngico resulta en diversos

tipos

de

alteraciones

alimenticias:

flavores

desagradables, toxinas, decoloración, pudrición y formación de

propágulos

patógenos

o

alérgenos

(Chelkowski,1991;

Bigelis, 1992; Tipples, 1995). El deterioro de las propiedades sensoriales

es

a

menudo

causada

por

la

producción

de

exoenzimas: lipasas, proteasas y carbohidratasas (Bigelis, 1992). Una vez que éstas enzimas se encuentran dentro del alimento continúan su actividad independientemente de la destrucción o la remoción del micelio (Tindale et al ., 1989; Whitfield et al ., 1991; Lily y Viani,1995). Con respecto a las levaduras, los reportes publicados hace unos 30-40 años atrás, afirmaban que el riesgo que provocaban las levaduras en la salud humana no era significante. Sin embargo, a partir de la década de los 80 existen trabajos de investigación que refieren por primera vez la necesidad de reevaluar el impacto en la salud pública causada por las levaduras

en

alimentos

(Loureiro

y

Querol,

1999).

La

contaminación

producida

alteración

las

de

por

levaduras

propiedades

físicas

consiste o

en

sensoriales

una del

alimento como resultado de su actividad. En las bebidas ácidas

con

o

conocidas,

sin

azúcar

estando

ocurren

las

caracterizadas

alteraciones

por

una

más

abundante

producción de gas que puede llegar a deformar envases, formar sedimentos, aromas y gustos alterados. En otro tipo de alimentos pueden

las

principales

provocar

son

alteraciones el

que

crecimiento

las

levaduras

superficial,

la

decoloración, la producción de gas, la formación de biofilms, flavores

desagradables

y

cambios

de

textura

(Loureiro

y

Querol, 1999). La micobiota xerofílica está caracterizada por ser la de mayor capacidad para crecer bajo condiciones de actividades de agua (a w ) de 0,85 y es asociada mu y comúnmente a alimentos

de

humedad

intermedia,

inclu yendo

cereales,

nueces, especias y un amplio espectro de alimentos secos (Hocking y Pitt, 1988). Según un estudio realizado en harinas Australianas

(Berghofer,

2003)

los

microorganismos

más

frecuentemente detectados en las harinas fueron Bacillus spp., coliformes y mohos. Se aislaron 102 Unidades Formadoras de Colonia por gramo (U.F.C./g) de levaduras y 103 U.F.C./g de mohos,

siendo

los

mohos

más

comúnmente

aislados

Aspergillus, Penicillium Penicillium, Cladosporium y Eurotium spp. Los causantes más frecuentes de la contaminación de panificados son los hongos y levaduras. Los géneros de hongos más importantes aislados a partir de los panificados españoles son Eurotium , Cladosporium y las especies mas xerotolerantes

de

Penicillium

Penicillium

y

Aspergillus

(Abellana et al . 1997b). Según Ramos (2002) a causa de la a w de los productos panificados (0,75–0,90), los hongos alterantes son

comúnmente

xerófilos,

encontrándose

especies

de

Eurotium y Aspergillus . Estos mohos son destruidos durante el horneado, por lo tanto la contaminación proviene de las esporas ambientales o de las superficies que se encuentra en contacto con el producto durante el enfriado (Seiler, 1988; Fustier et al. 1998 ). El crecimiento fúngico en panificados durante el almacenamiento es un problema serio que ocasiona importantes pérdidas económicas. A causa de la baja a w de estos

productos

(0,75-0,90),

la

contaminación

fúngica

es

comúnmente producida por las especies más xerofílicas del género Aspergillus. Las especies de Eurotium , formalmente conocidas como las del grupo de Aspergillus glaucus tienen u n crecimiento óptimo a 0,70-0,80 a w en sustratos que contienen altas concentraciones de sal o azúcar (I.C.M.S.F., 1980). En porotos de soja se ha encontrado que los mohos son importantes

contaminantes.

Los

géneros

aislados

más

frecuentemente son Penicillium , Aspergillus , Scopulariopsis ,

Mucor , Rhizopus y Cladosporium . Las especies de Aspergillus encontradas y aisladas fueron A. candidus, A. flavus, A.

fumigatus, A. niger, A. ochraceus, A. sydowii y y A. versicolor. (Kacàniovà, 2003) . Rabie (1997) encontró que la micobiota de los granos de cebada sometidos a malteado también variaba según su etapa de proceso: los granos sin remojar dieron conteos más altos de Alternaria alternata, Rhizopus oryzae, Epicoccum nigrum y

Mucor spp, sin embargo, en los granos preremojados se obtuvieron conteos más altos de Penicillium spp.

1.1.2. Condiciones ambientales para el desarrollo de la micobiota. Anderson y Smith (1971) y Deans et al . (1980), demostraro n que la formación y germinación de conidios y esporas depende principalmente de las condiciones de crecimiento (sustrato, a w

y temperatura), lo que revela las limitaciones de los métodos microbiológicos

basados

en

la

enumeración

de

esporas

formadas para evaluar el crecimiento fúngico. El concepto de a w introducido por Scott (1957) es la forma más útil para expresar la disponibilidad de agua existente para el crecimiento de microorganismos (Lace y y Magan, 1991) y su actividad enzimática (Acker, 1963). La a w no es el único factor ambiental

que

influencia

y

sobrevivencia

crecimiento temperatura,

pH,

el

crecimiento

estarán

concentración

de

fúngico.

influenciados oxígeno

y

por

dióxido

Su la de

carbono, y la presencia de conservantes. Cuando uno de estos factores es subóptimo, el efecto inhibitorio de la a w reducida tiende a incrementarse. Los niveles de a w correspondientes al rango de contenidos de humedad pueden ser trazados para proveer una isoterma de sorción de agua. Esta isoterma es mu y útil, pues no sólo nos muestra

a

que

contenidos

de

humedad

son

conseguidos

niveles de a w deseables o indeseables, sino que también nos indican

que

significativos

serán

pequeños

cambios

del

contenido de humedad en términos de a w . Por ende, es una guía

útil

para

almacenamiento moderadas crecimiento

y

determinar de

la

alimentos

preservados fúngico

en

longitud

conservados

solo

por

su

alimentos

del a aw

periodo

de

temperaturas reducida.

El

inadecuadamente

almacenados puede provocar la inducción de producción de micotoxinas (Jimenez et al ., 1991; Scudamore y Hetmanski, 1995). Las isotermas de sorción de agua de cereales y de otros productos han sido estudiadas y publicadas por diferentes autores: en arroz por Rahgaswami (1973), Hunt y Pixton (1974) y Gough y King (1980); en harina de trigo por Bushuk y Winkler (1957), Pratap et al . (1982) y Leiras e Iglesias (1991); y en harina de arroz, harina de arroz aglutinada y arroz aglutinad o Abdullah et al. (2000).

1.2. Problemas del consumo de alimentos contaminados con hongos. La consecuencia más grave de la presencia de mohos en los alimentos es

que éstos

pueden

llegar a ser

capaces

de

producir toxinas si las condiciones son favorables. Estas toxinas se denominan micotoxinas y son metabolitos tóxicos que ingeridos en cantidad suficiente, provocan intoxicación en el hombre y animales. Una micotoxicosis es un problema alimentario, que no es infeccioso ni contagioso (Bourgois, 1994). Como para todas las sustancias tóxicas ha y que distinguir entre

intoxicaciones

las

agudas

que

se

producen

por

la

ingestión de una sola vez o varias veces seguidas de una dosis relativamente elevada de toxinas, y las intoxicaciones crónicas que se manifiestan después de la ingestión de pequeñas dosis repetidas durante largos periodos. Estas últimas son las que afectan en ma yor grado al ser humano ya que al demostrarse que la Aflatoxina B1 es cancerígena, las concentraciones necesarias para producir una intoxicación son mínimas (Moss, 2002). Estas intoxicaciones provo can problemas pasajeros o crónicos, que afectan

a varias funciones del organismo:

alteraciones hepáticas, renales, de los centros nerviosos, circulatorias, del tracto digestivo, etc. Las micotoxinas son producto del metabolismo secundario de los mohos y no todos las elaboran. Además el tipo de sustrato

y

las

condiciones

ambientales

juegan

un

papel

importante en el nivel de su producción. Es por esta razón por la que no es suficiente detectar en un alimento una especie de moho tóxico para considerar a un alimento peligroso.

Las micotoxinas más importantes son las:

Aflatoxinas,

producidas por A. flavus y A. parasiticus ; la Zearalenona producida por especies del género Fusarium ; la Ocratoxina que es

producida

por

A.

ochraceus

y

viridicatum ;

P.

los

Tricotecenos que son producidos sobre todo por especies del género Fusarium y también por otras especies de mohos como

Stachybotris , Trichotecium , Myrothecium , Dendrodochium , etc; la Patulina que es producida por numerosos mohos pero principalmente por P. expansum y la Fumonicina producida principalmente por F. moniliforme. En la alimentación humana la diversificación de la dieta impide la absorción regular de

cantidades suficientes de

toxinas para llegar a ser peligrosas a excepción de países castigados por el hambre. Actualmente, el consumidor tiene la tendencia

a

creer

que

todo

lo

natural

es

bueno,

pues

precisamente las micotoxinas son un ejemplo de moléculas naturales elaboradas espontáneamente por mohos en nuestro ambiente y que pueden ser el origen de graves intoxicaciones. Son típicos contaminantes biológicos y por lo tanto se debe prestar especial atención en el control de su desarrollo. Una de las principales fuentes de contaminación de mohos micotoxigénicos, es el aire (Cvetni et. al, 1997). En Croacia se expusieron al aire 350 cajas de Petri durante 10 minutos y se identificaron 3.400 colonias de 22 géneros distintos, siendo los géneros mas frecuentes Cladosporium (44.7%), Penicillium (34.4%),

Alternaria

(26.3%),

Aspergillus

(21.6%)

y

Absidia

(12.2%). Encontrándose que el 16,9 % de los aislados de los géneros

Aspergillus ,

Fusarium

y

Trichoderma

eran

potencialmente productores de micotoxinas.

1.2.1. Principales micotoxinas y su efecto en el humano.

Las

aflatoxinas

inmediatos,

son

además

compuestos

de

con

efectos

inmunosupresores,

tóxicos

mutagénicos,

teratogénicos y carcinogénicos. El principal órgano afectado por la carcinogénesis de las aflatoxinas es el hígado. La evaluación de los resultados epidemiológicos y de laboratorio llevada

a

cabo

en

1987

por

el

Centro

Internacional

de

Investigaciones sobre el Cáncer (CIIC) determinó que existen suficientes datos demostrativos del efecto carcinogénico de mezclas naturales de aflatoxinas en el ser humano, las cuales se clasifican por ello como carcinógeno del Grupo 1, salvo en el caso de la aflatoxina M1, que se considera posiblemente carcinogénica para el hombre (Grupo 2B) (I ARC, 1987) Se han registrado varios brotes de aflatoxicosis en países tropicales, la ma yoría entre adultos de las poblaciones rurales con una nutrición deficiente y cuyo alimento básico era el maíz. El cuadro clínico llevaba a sospechar una intoxicación hepática

aguda,

morfológicas

que

se

observadas

confirmó en

las

por

las

muestras

alteraciones de

necropsia

hepática, indicativas de hepatitis tóxica. (Tandon et. al. 1977) Las tasas de mortalidad en la fase aguda eran del 10%-60%. Transcurrido

un

año,

los

supervivientes

no

presentaban

ictericia y la mayoría se habían recuperado clínicamente. (Bha t and Krishnarnachari, 1977). También se han señalado a las aflatoxinas como posibles factores

etiológicos

de

un

cuadro

de

encefalopatía

y

degeneración grasa similar al síndrome de Re ye, frecuente en países de clima cálido y húmedo. Con degeneración grasa, palidez y aumento de tamaño del hígado y los riñones, unidos a edema cerebral grave. El

ácido

3-nitropropiónico

(3-NPA)

es

un

metabolito

secundario de Artbrinium sp., género de hongos considerados causantes de una forma de intoxicación alimentaria aguda

denominada “intoxicación por la caña de azúcar mohosa” (Liu, 1988). Durante el periodo 1972-1988, resultaron afectadas 884 personas y se produjeron 88 (10%) defunciones. (Liu et al ., 1992). El principal dato epidemiológico es el reducido número de personas en cada brote (entre una y cinco), siendo las víctimas

en

su

mayoría

niños

y

jóvenes.

El

periodo

de

incubación suele ser de entre 2 y 3 horas a partir de la ingestión de la caña de azúcar mohosa,

y se desarrolla

principalmente con vómitos, distonía, desviación unilateral de la mirada, convulsiones, espasmo cardopedal y coma. Entre el 10% y el 50% de los pacientes se ven afectados por un cuadro de distonía tardía, consecuencia de la necrosis simétrica y bilateral de los núcleos basales. En el adulto, el 3-NP A causa síntomas gastrointestinales; no son frecuentes los signos de encefalopatía grave. (Ludolph et al. , 1991) Las ocratoxinas son metabolitos secundarios de cepas de

Aspergillus y Penicillium presentes en los cereales, el café y el pan, así como en todo tipo de productos alimenticios de origen animal en muchos países. (Speijers y Van Egmond, 1993) La más frecuente es la ocratoxina A, que también es la más tóxica. Se ha comprobado que tiene efectos nefrotóxicos, inmunosupresores, carcinogénicos y teratogénicos en todos los animales de experimentación estudiados hasta el momento (Criterios de Salud Ambiental). Se registró en Italia un caso de insuficiencia renal aguda debido posiblemente a la inhalación de ocratoxina A en un granero que había permanecido cerrado por 2 años (Di Paolo e t

al., 1994). Los síntomas aparecieron al cabo de 24 horas, durante las cuales el paciente presentó tensión epigástrica transitoria, dificultad respiratoria y pirosis retroesternal. La biopsia investigó

mostró la

cromatografía

una

necrosis

presencia de

capa

tubular

de

ocratoxina

fina

demostró

aguda, A

en

pero

no

se

sangre.

La

cualitativamente

la

presencia de la micotoxina en el trigo del granero. No existe fase aguda; los primeros signos y síntomas son inespecíficos, consisten en cansancio, cefaleas, pérdida de peso y palidez. A lo largo de varios años va instaurándose una proteinuria leve de proteínas de bajo peso molecular, sin hipertensión, pero con anemia aplásica o normocrómica. La nefropatía endémica se caracteriza por lesiones bilaterales y fundamentalmente crónicas de la corteza renal (degeneración tubular, fibrosis intersticial e hialinización glomerular). En fases avanzadas de la enfermedad disminu ye mucho el peso y el tamaño de los riñones, que muestran una fibrosis cortical difusa, por lo general sin signos de inflamación (Radoni ć et al ., 1966; Vukeli ć

et al ., 1992). El

CIIC

clasificó

la

ocratoxina

A

como

un

compuesto

posiblemente carcinogénico para el ser humano (Grupo 2B) (I ARC, 1987). Los tricotecenos son micotoxinas producidas sobre todo por

miembros

sintetizan

del

hongos

género de

Fusarium ,

otros

aunque

también

(como

Trichoderma,

géneros

las

Trichothecium, Myrothecium y Stachybotrys) . Hasta la fecha se han aislado 148 tricotecenas pero sólo unas pocas se han detectado como contaminantes de los alimentos. De ellas las más

importantes

también

como

son

el

desoxinivalenol

vomitoxina,

el

(DON),

nivalenol

conocido

(NIV)

y

el

diacetoxicirpenol (D AS), mientras que la toxina T-2 es menos común. (Criterios de Salud Ambiental , 1990). Las

manifestaciones

tricotecenos acompañadas

consisten de

habituales en

vómitos.

de

la

intoxicación

inmunodepresión La

primera

y

po r

náuseas,

micotoxicosis

por

tricotecenos que se identificó fue la aleucía tóxica alimentaria, en la URSS en el año 1932, con una tasa de mortalidad del 60%. (Gajdušec, 1953).

En varios casos, la micotoxicosis por tricotecenas se debió a una única ingestión

de pan elaborado con harina tóxica

(Bhat et al. , 1989) o de arroz (Ueno, 1971), (Wang et al., 1993). En los animales de experimentación los tricotecenos son 40 veces más tóxicos por inhalación que por vía oral (98). La zearalenona es producida principalmente por Fusarium

graminearum y especies afines, sobre todo en el trigo y el maíz, pero también en el sorgo, la cebada y los piensos compuestos. La zearalenona y sus derivados tienen efectos estrogénicos en varias especies animales (infertilidad, edema vulvar, prolapso vaginal e hipertrofia mamaria en hembras, y feminización de los machos, con atrofia testicular y aumento de tamaño de las mamas) (Peraica et al. , 2000). Las fumonicinas son micotoxinas producidas en todo el mundo por Fusarium moniliforme y especies afines cuando crecen

en

maíz.

Tienen

importancia

toxicológica

las

fumonicinas B1 y B2; las demás aparecen en concentraciones mu y bajas y son menos tóxicas. En la India se informó de un brote

único

de

intoxicación

aguda

transmitida

por

los

alimentos y causada posiblemente por la fumonisina B1. (Bath

et

al., 1987).

abdominales,

La

enfermedad

borborigmos

se y

caracterizaba diarrea

por

dolores

transitorios,

que

comenzaban entre media hora y una hora después de consumir pan ácimo preparado con sorgo o maíz mohos. Los pacientes se recuperaron por completo al suprimir la exposición a la toxina y no se produjeron defunciones. Las toxinas de F. moniliforme han sido clasificadas por un grupo de trabajo del CIIC como posiblemente carcinogénica para el ser humano (Grupo 2B) (I AR C, 1987).

1.3. Métodos de control del crecimiento de contaminantes. Un

método

alimentos

a

para

prevenir

la

contaminación

medio

procesar

puede

ser

la

fúngica

en

aplicación

del

"concepto barrera" o el método de conservación combinada. Este método utiliza varias “barreras”, que separadamente no otorgan la conservación adecuada, pero combinadas brindan la conservación conveniente. Estas barreras pueden ser cambios en la temperatura, a w , pH, calentamiento mínimo o la adición de conservantes. Para que éste concepto sea utilizado en forma exitosa, la influencia de varios factores intrínsecos y extrínsecos

sobre

el

crecimiento

fúngico

necesitarán

ser

cuantificados. El factor más importante dentro de los factores ambientales

que

afectan

la

germinación,

crecimiento

y

establecimiento fúngico sobre sustratos ricos en nutrientes probablemente sea la disponibilidad de agua (Magan, 1988; Cooke y W hipps, 1993). El rango de valores de a w que permiten la germinación de esporas es ma yo r a la temperatura óptima, y generalmente es requerida una ma yor a w para la formación de la espora que para la germinación. Es por ello que el nivel de a w es de importancia práctica para controlar la aparición y severidad de la alteración producida por mohos. Comúnmente se observa que los alimentos más fácilmente degradables por la actividad de microorganismos y cambios químicos, son usualmente los que poseen una a w

mayor (Abdullah, et al .,

2000). La ácidos

mayoría débiles

de

los

agentes

orgánicos.

conservantes

Estas

moléculas

clásicos inhiben

son el

crecimiento de células bacterianas y fúngicas. El ácido sórbico también inhibe la germinación de esporas bacterianas (Sofos y Busta, 1981; Blocher y Busta, 1985). Según Eklund (1983, 1985) y Peth ybridge et al ., (1983). La actividad antimicrobiana de todos estos ácidos débiles depende principalmente de la molécula sin disociar. Los conservantes ácido débil existen en

solución en un equilibrio dependiente del pH entre el estado disociado y no disociado. La actividad inhibitoria es óptima a bajo pH debido a que favorece al estado no disociado y

no

cargado

es

de

la

molécula.

De

esta

forma,

la

molécula

permeable a través de la membrana y por ello capaz de ingresar a la célula. Sin embargo, la acción inhibitoria se debe a los compuestos que atraviesan la membrana plasmática en el estado disociado. Subsecuentemente, al encontrarse con un pH ma yor dentro de la célula, la molécula se disocia resultando que el escape de los aniones y protones hacia el exterior de la membrana no sea posible. Una reducción del pH desde 6,0 a 5,0-5,2 resulta en un gran incremento relativo en la proporción de

la

forma

no

disociada

(Chirife

y

Favetto,

1992).

En

conclusión, las moléculas de conservantes difunden al interior de la célula hasta que el equilibrio es alcanzado y provoca la acumulación de aniones y protones dentro de la célula (Booth y Kroll,1989). Por otro lado, se ha propuesto que la inhibición del crecimiento por los conservantes ácido débil se debe a un gran número de acciones, incluyendo la disrupción de la membrana (Freese et al ., 1973; Stratford y Anslow , 1998; Brace y et al ., 1998), inhibición de las reacciones metabólicas esenciales,

estrés

en

la

homeostasis

del

pH

intracelular

(Salmond et al ., 1984; Cole y Keenan, 1987; Brace y et al ., 1998) y acumulación de aniones tóxicos (Eklund, 1985). En las levaduras, también se ha propuesto que la acción inhibitoria de los conservantes ácido débil es debida a la inducción de una respuesta a un stress enérgico que atenta a restaurar la homeostasis y resulta en la reducción de los pooles de energía disponible para el crecimiento y otras funciones metabólicas esenciales. Stratford y Anslow (1998) propusieron que el ácido sórbico actúa como una sustancia activa a las membranas de los microorganismos y no como un conservante ácido-débil.

1.4. Objetivos.

La soja es uno de los cultivos más importantes de la Argentina tanto en superficie sembrada como en niveles de producción. Tanto los aceites como las harinas de soja son ampliamente

consumidos

en

el

país

ya

sea

por

sus

propiedades nutritivas como por sus bajos precios. De las comidas con soja, la milanesa de soja es la más conocida y aceptada en nuestro medio. Ha y innumerables variantes para este preparado. Estas recetas se publican mu y usualmente en revistas, libros e internet y van desde triturar los porotos y formar una masa con condimentos, hasta mezclar distintas harinas, entre ellas la harina de soja con huevo y especias. A medida que se extendió su consumo apareció en el mercado la venta minorista de harinas de soja en comercios naturistas

y

fraccionadores.

En

la

medida

que

la

soja

reemplazó a otros alimentos en la dieta de los argentinos, fueron

apareciendo

elaboración innumerables

de

pequeñas

milanesas

pequeñas

y

de

empresas soja.

medianas

dedicadas

Actualmente empresas

a

la

existen (P yMES)

dedicadas exclusivamente a la elaboración de éste producto. Además, la popularidad de éste producto es tal que figura en las cartas de numerosos restaurantes de Argentina. En lo que respecta a alimentos a base de soja no existen antecedentes

que

describan

su

micobiota.

Tampoco

éste

producto se encuentra bajo una legislación y no es nombrado en el Código Alimentario Argentino (C. A. A.). Sólo, existen trabajos que enumeran los contaminantes encontrados en productos cárnicos con agregados de proteínas o aislados de soja. Como se expreso anteriormente, el desarrollo del presente trabajo se llevó a cabo en una fábrica familiar de milanesas de soja ubicada en la ciudad de Tandil.

Los objetivos fueron: 1. Identificar

la

micobiota

contaminante

durante

la

elaboración del producto. 2. Detectar las principales fuentes de contaminación y los puntos críticos durante su manufactura. 3. Realizar modificaciones durante la elaboración que permitan disminuir el desarrollo de microorganismos a través de cambios en el proceso y mediante la adición de conservantes.

2. MATERIALES Y MÉTODOS. 2.1. Proceso de elaboración. En la fábrica se elaboran principalmente dos tipos de milanesas: milanesas de soja y de verdura. Las milanesas de soja son producidas con una mezcla de harina común, harina aglutinada y harina de soja. En el caso de las milanesas de verdura, la harina de soja es reemplazada por verdura fresca hervida

y

triturada

o

por

verdura

deshidratada

que

se

reconstitu ye antes de formar la masa. Estos ingredientes son inicialmente mezclados e hidratados en una amasadora de panadería, hasta formar una masa con la consistencia deseada. Posteriormente, la masa se estira por medio de una sobadora eléctrica hasta obtener una lámina de medio centímetro de espesor. Estas láminas son cortadas manualmente con un molde que posee la forma definitiva de la milanesa. Para el armado final se ubica una porción de queso cremoso en el centro de dos láminas de masa y se cierra presionando sobre los bordes. Una vez armadas las milanesas, se someten a un proceso

de

escaldado

en

agua

hirviendo.

Para

ello

se

sumergen en el agua hasta que las mismas emergen a la superficie. Por último, las milanesas se escurren y se rebozan con pan rallado y una mu y pequeña cantidad de orégano y perejil deshidratado. El proceso implica gran cantidad de mano de obra y se detalla en la figura 1.

Mezcla

AMASA

Agu

Ma

ESTIRA Lámi

Tapa

CORTAD

COLOCA CIÓN

Tap a COLOC ACIÓN

PEGA milan DO DE

ALMAC ENADO

ESCAL DADO

ENVASA

ALMAC ENADO

REBO ZADO Per

REFRIG

Ques

Pan Rall

Figura 1: Proceso de fabricación de las milanesas de Soja.

2.2. Identificación de la micobiota contaminante. 2.2.1. Muestreo. En todos los casos, las muestras se tomaron asépticamente y se conservaron en placas de Petri o en tubos de ensayo estériles para su posterior traslado al laboratorio. En el caso de las materias primas (harinas y especias deshidratadas) se extrajeron las muestras a partir de los recipientes que habían recibido menor manipulación en la empresa, para determinar la calidad microbiológica al momento de llegada a la fábrica. Las muestras de milanesas fueron extraídas durante las diferentes etapas del proceso de elaboración (figura 1). Se analizaron milanesas de soja y de verdura, obteniéndose en ambos casos las siguientes muestras:

•

masa sin estirar.

•

masa estirada (en el caso de la masa de soja, se obtuvo

además una muestra a las 24 h posteriores a su elaboración y conservada en frío).

•

milanesa sin cocinar.

•

milanesa cocida y sin rebozar.

•

milanesa cocida y rebozada.

Paralelamente, se realizó un muestreo ambiental con la finalidad de identificar la micobiota presente en la fábrica. Para ello se realizaron dos tipos de muestreos. En uno de ellos se analizó la contaminación existente en el aire y en el otro la contaminación de las superficies de trabajo. Para el primer caso, se destaparon en diferentes lugares de la fábrica placas de Petri conteniendo el medio de cultivo

AP A (papa 200 g

sometida a una decocción de 1 hora; azúcar 20 g; agar 15 g; agua destilada 1.000 ml; pH 6,0; autoclavado a 121º C durante

20

min.)

durante

5

minutos

(método

gravimétrico).

Posteriormente, las placas fueron incubadas en el laboratorio a 25º C durante 5 días. En el segundo caso, se realizaron hisopados de la superficie de las mesas de trabajo y de las bandejas donde se colocaban las milanesas a enfriar. Para ello, se utilizaron hisopos comerciales estériles que fueron introducidos en un tubo de ensayo con solución fisiológica estéril (cloruro de sodio 0,85%) y posteriormente se frotaron en un área de 10 cm 2 por distintas partes de la mesa de trabajo.

Una

conservaron

vez

recolectada

dentro

de

la

la

muestra,

solución.

los

A partir

hisopos de

ésta,

se se

realizaron diluciones seriadas de 1/10 y las mismas fueron sembradas

en

superficie

en

placas

de

Petri

con

AP A

e

incubadas a 25º C durante 5 días.

2.2.2. Aislamiento y purificación. Las muestras de masas y milanesas fueron incubadas en cámaras

húmedas

a

25º

C

durante

7

días.

Para

ello

se

utilizaron bandejas con tapa que fueron desinfectadas con alcohol etílico comercial y ubicadas bajo luz UV en la cámara de flujo laminar durante 10 minutos. Luego se colocaron en su interior tres papeles de diario estériles por cámara y se hidrataron con agua estéril. También se dejaron en cámara húmeda 3 milanesas de soja, con más de una semana de elaboración, que presentaban signos

de

alteración

fúngica

con

distinta

micobiota

predominante. Transcurridos los 7 días, se repicaron las colonias de mohos y levaduras con diferencias morfológicas entre sí, en placas de Petri con medio AP A. Este procedimiento se repitió tantas veces como fue necesario hasta obtener un cultivo puro.

Los conidios de los diferentes aislamientos de hongos filamentosos y las células de levaduras fueron conservados en glicerol al 20 % a –20º C para su posterior análisis.

2.2.3. Identificación primaria. Se realizó la identificación primaria de los aislamientos obtenidos utilizando la clave taxonómica de Pitt y Hocking (1997).

2.3. Origen de los contaminantes identificados en las milanesas. Debido a la diversidad de hongos filamentosos obtenidos a partir de las muestras de milanesas, se realizó un nuevo muestreo con la finalidad de determinar el origen de las contaminaciones. Para ello, se obtuvieron muestras a partir de:

•

Perejil deshidratado.

•

Acelga deshidratada.

•

Harina de soja.

•

Harina común.

•

Pan rallado.

•

Harina aglutinada.

•

Milanesa de espinaca con queso sin cocinar.

•

Milanesa de espinaca con queso cocida sin rebozar.

•

Milanesa de espinaca con queso cocida y rebozada.

•

Milanesa de soja sin queso sin cocinar.

•

Milanesa de soja sin queso cocida sin rebozar.

•

Milanesa de soja sin queso cocida y rebozada.

•

Milanesa de soja con queso sin cocinar.

Cada una de las muestras fueron procesadas de la siguiente manera: se colocaron 10 g de muestra en 90 ml de solución

fisiológica

estéril

dentro

de

recipientes

cerrados

herméticamente y fueron agitados vigorosamente durante 15 min. En el caso de las muestras con mu y baja densidad, como el perejil y la acelga deshidratada, se colocó 1 g de muestra en 99 ml de solución fisiológica. A partir de las diluciones obtenidas y después de ser agitadas se realizaron diluciones seriadas de 1/10 en solución fisiológica estéril hasta 10 - 8 . Estas diluciones fueron sembradas por duplicado en placas de Petri con el medio de cultivo AP A e incubadas a 25º C durante 5 días, para luego realizar los recuentos de mohos y levaduras. A partir de éstas placas se aislaron los microorganismos predominantes

de

cada

muestra

para

su

posterior

identificación. En el caso de los aislamientos que presentaron dificultades durante

la

purificación

como

consecuencia

de

una

contaminación masiva con hongos Mucorales, se realizó la siembra en el medio AP A con el agregado de ácido láctico hasta llegar a pH 5,6 y con un 5% de rosa de bengala para inhibir el crecimiento de Rhizopus spp. y Mucor spp.

2.4. Tratamiento térmico. Con la finalidad de disminuir el tiempo de enfriado de las milanesas en la fábrica luego del escaldado, se realizó un

shock térmico con agua fría después de realizar el tratamiento térmico. El tiempo de exposición de las milanesas durante el enfriado es importante ya que en su interior se encuentran una porción de queso que mantiene mucho el calor. Debido a ello las

milanesas

se

exponen

durante

un

tiempo

largo

a

la

contaminación ambiental ya que se enfrían a temperatura ambiente. Con el shock térmico mediante enfriado además de tener

un

efecto

negativo

para

el

desarrollo

de

los

microorganismos se pretendía que las milanesas estuvieran expuestas a la micobiota ambiental el menor tiempo posible.

Para este experimento se usaron 16 muestras al azar de milanesas de soja a medida que se desarrollaba el proceso productivo. La mitad de estas muestras fueron expuestas a un

shock térmico llevado a cabo por inmersión en una batea de agua

fría.

Cuatro

milanesas

con

shock

térmico

fueron

rebozadas y cuatro se dejaron sin rebozar. Idéntico tratamiento se realizó con las milanesas sin shock térmico. Las muestras para el análisis de los microorganismos se extrajeron en dos momentos: 0 h y 12 h, según se representa en la figura 2.

tiem

Milanesa Milanesa sin Rebozar

tiem po

Sin Shoc

Con Shoc

Figura 2: Esquema del ensayo aplicando un shock térmico a las milanesas una vez escaldadas.

Una vez realizado el ensayo, a cada una de las milanesas se le realizaron cortes longitudinales separados entre sí por 1 cm de longitud. Tres fragmentos al azar por milanesa fueron

incubados a 25º C en una placa de Petri ubicada dentro de una bandeja con papel estéril embebido en agua estéril para crear una cámara húmeda. Cada placa de Petri con sus tres cortes de milanesa fue designado como una muestra. Los restos de muestra que no fueron introducidos en cámaras

húmedas

se

conservaron

a

temperatura

de

refrigeración para su posterior observación. Luego de 7 días de incubación a 25º C se sacaron las placas de Petri para su observación y se le tomaron fotografías con una cámara digital.

2.5. Efecto del pan rallado como contaminante. A partir de los ensayos anteriores se observó que las milanesas al ser rebozadas incrementaban los recuentos de UFC de mohos. Es por eso que se decidió analizar el estado del pan rallado que llegaba a la fábrica y como progresaba su estado al continuar el proceso de elaboración. Para realizar este análisis se tomaron muestras al azar del pan rallado antes de ser sacado de las bolsas en las cuáles llegan a la fábrica (P AN SIN US AR), del pan rallado que va quedando en las asaderas donde se rebozan las milanesas (P AN USADO), del pan rallado que se encontraba en las bandejas donde se almacenan las milanesas (P AN B ANDEJ A), y del pan que se encontró en la mesa de trabajo (P AN MES A). Paralelamente, se tomó una muestra de la harina común, la harina aglutinada y la harina de soja. Con la finalidad de poder comparar los valores de UFC/g de pan rallado entre las diferentes muestras, se determinó el contenido de humedad en estufa hasta peso constante y se consideró dicho valor en el cálculo de la población microbiana.

Se

tomaron

muestras

de

10

g

que

se

colocaron

en

recipientes estériles con 90 ml de agua destilada estéril y fueron

homogeneizadas

durante

30

min

con

un

agitador

automático. Las muestras de pan rallado se dilu yeron hasta 10 5

para luego ser sembradas por duplicado en placas de Petri

con medio AP A con el agregado de ácido láctico hasta pH 5,5, 5 % de rosa de bengala y un 2% de NaCl (para disminuir la a w del medio de cultivo). Las muestras 10 - 2 , 10 - 3 y 10 - 4 se sembraron por duplicado. Por otra parte, se quiso determinar el efecto del pan rallado en la contaminación de origen ambiental sobre las milanesas. Para ello, se tomaron muestras de milanesas que fueron expuestas toda la noche. Un grupo de milanesas se las dejó sin

rebozar,

otro

grupo

fue

rebozado

con

pan

rallado

previamente esterilizado en autoclave y un último grupo fue rebozado con el pan rallado que se usa habitualmente. A su vez, la mitad de las muestras de cada grupo se tomaron inmediatamente después de elaboradas y la otra mitad se las tomó al día siguiente luego de que ha yan pasado la noche expuestas al ambiente de la fábrica. Con este experimento se intentó comprobar el nivel de la contaminación ambiental en el que las milanesas pueden llegar a estar expuestas. Las muestras una vez tomadas se llevaron refrigeradas al laboratorio y allí fueron colocadas a 25º C durante 5 días. Se realizó una evaluación cuali-cuantitativa visual del grado de contaminación fúngica.

2.6. Contaminación cruzada. A partir de los datos anteriores se observó que el escaldado era un proceso muy eficaz a la hora de disminuir los recuentos tanto de mohos como de levaduras. Sin embargo, después de

que las milanesas se rebocen los recuentos de levaduras se incrementaban. Como las bandejas utilizadas para almacenar las milanesas una vez elaboradas, antes de escaldar y después de escaldar, se compartían se sospechó de una contaminación cruzada. Para

ello

se

tomaron

muestras

de

milanesas

cocidas

y

rebozadas. Se utilizaron 10 milanesas de cebolla y 10 de zapallo. Una mitad de cada tipo de milanesa se las ubicó sobre papel esterilizado y la otra mitad sobre las bandejas. Una vez que el interior de las milanesas alcanzó la temperatura del ambiente (aproximadamente 5 h), éstas fueron introducidas dentro de placas de Petri estériles e incubadas a 10º C durante 10 días. De ésta forma se pretendió determinar el grado de contaminación que aportaban las bandejas. Para determinar el grado de contaminación se constru yó previamente una escala visual que ponía en evidencia los diferentes niveles de contaminación (Tabla 1).

Tabla 1: Escala visual de contaminación utilizada en la evaluación de las milanesas de zapallo y cebolla.

Valor numérico 1 2 3

Descripción de la contaminación Aparición de las primeras levaduras Levaduras numerosas o aisladas Aparición de los primeros hongos filamentosos

4 5 6

7

8

9

10

11

12

Los hongos blancos afectan bordes de las milanesas Las colonias blancas afectan 1/3 de la superficie Las colonias fúngicas blancas afectan ½ de la superficie Las colonias fúngicas blancas afectan toda la superficie Las colonias fúngicas blancas afectan toda la superficie y las negras y verdes ocupan por lo menos 1/5 de la superficie Las colonias fúngicas blancas “blanquean” 1/3 de la superficie Las colonias fúngicas blancas “blanquean” la mitad de la superficie Las colonias fúngicas blancas “blanquean” casi toda la superficie Las colonias fúngicas blancas “blanquean” toda la superficie

2.8. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio. Con la finalidad de determinar el efecto del agregado de un conservante

sobre

la

inhibición

del

desarrollo

de

contaminantes, se elaboró una experiencia en la cual se le agregó a la masa un 0,66 % de Sorbato de Potasio para asegurar un tiempo de vida útil del producto sin que éste sea alterado por la actividad de los mohos y levaduras. Se realizó un lote de milanesas de zapallo con un 0,66 % de sorbato de potasio y otro sin el agregado del mismo. Las muestras una vez enfriadas hasta temperatura ambiente se envasaron en una bolsa de polipropileno y se colocaron en observación a 4º C y 20º C. El grupo de milanesas almacenadas a 20º C fueron enfriadas sobre papel estéril y sobre las bandejas donde son almacenadas habitualmente. Se tomaron 2 muestras para cada tratamiento, lo que hace a un total de 12 milanesas de soja y 12 de zapallo. El día en que las muestras fueron envasadas se consideró DI A 0 y a partir de allí se contaron los días hasta la aparición de las primeras levaduras y de los primeros mohos. Las evaluaciones se realizaron visualmente, considerando la siguiente escala: las milanesas que presentaron desarrollo de colonias de levaduras en su superficie fueron calificadas con el valor 1, y las milanesas con desarrollo de colonias de mohos se calificaron con el valor 3.

3. RESULTADOS. 3.1. Identificación de la micobiota contaminante. 3.1.1. Materias primas. En el caso de las especias deshidratadas el número de colonias de levaduras fue superior al de los hongos. En cambio

en

las

harinas,

los

niveles

de

contaminación

detectados no fueron importantes, existiendo predominio de hongos por sobre las levaduras. Los géneros de hongos filamentosos encontrados mas comúnmente fueron Penicillium,

Aspergillus y Rhizopus . Con respecto al queso el microorganismo encontrado más comúnmente fue Geotrichum candidum . En este ensa yo era de esperar que el pan rallado contuviera altos niveles de contaminación fúngica, sin embargo, dichos niveles no fueron lo suficientemente altos como para poder justificar la contaminación de las milanesas. Dentro de los mohos más comúnmente encontrados en esta materia prima se destacan los géneros Aspergillus, Penicillium, Eurotium y algunas levaduras filamentosas.

3.1.2. Milanesas. Una vez realizados los aislamientos y la purificación de los principales hongos filamentosos que se desarrollaban sobre la superficie de las muestras de masa y milanesas (ver apartado 2.2.1.), se identificaron los mismos como:

Penicillium, Cladosporium,

Aspergillus, Alternaria,

Geotrichum, Monascus

filamentosas y no filamentosas).

Rhizopus, y

Mucor,

levaduras

(

Se encontró que a medida que el proceso de elaboración avanzaba, el número de especies contaminantes y la cantidad presente de cada una de ellas se incrementaba. En la masa de acelga sólo se

encontraron algunas colonias aisladas de

levaduras filamentosas, sin embargo, una vez estirada la masa el número y la diversidad morfológica de las levaduras, se incrementó. En todos los casos la masa de soja contenía una mayor contaminación que la masa de acelga. Algo similar ocurrió al comparar la masa antes y después de estirarla. Previo

a

éste

procedimiento

se

encontraron

colonias

de

levaduras color blanco y algunas colonias de mohos, mientras que

después

del

estirado

el

número

y

la

variedad

se

incrementaron. Todas las muestras de milanesas que fueron tomadas antes de que éstas fueran sometidas al escaldado presentaron una contaminación inferior al observado luego de que éstas fueran hervidas. En este caso el producto estaba totalmente invadido. Es probable que el escaldado elimine la población de bacterias y transformen a los nutrientes del alimento en formas que se presenten más disponibles para ser utilizadas por los mohos y levaduras. Como se expresó anteriormente, en todos los casos se encontró

que

las

milanesas

de

acelga

tenían

menor

contaminación que las de soja. En ambos casos las muestras sin escaldar poseían un bajo número de colonias en superficie de

levaduras,

bacterias

y

mohos.

En

las

muestras

ya

escaldadas el número de colonias aumentó considerablemente. En la ma yoría de los casos las muestras escaldadas estaban prácticamente invadidas en toda la superficie por colonias de

Rhizopus spp. y por colonias de levadura blancas. Estas últimas generalmente se desarrollaban sobre las muestras sin escaldar en los lugares donde no se desarrollaban los mohos. Las

milanesas

escaldadas

y

rebozadas

se

encontraban

invadidas

por

microorganismos

en

toda

la

superficie,

predominando Rhizopus spp. a excepción de algunos sectores colonizados por levaduras blancas o de pigmentación rosada. En el caso de las milanesas que se recolectaron en fábrica después de transcurrida una semana de elaboración (Figura 3), se identificaron mohos de los géneros Aspergillus, Rhizopus,

Penicillium y Geotrichum , además de levaduras color blanco o rosa.

Figura 3: Estado de 4 milanesas de verdura con una semana de almacenamiento, después de la incubación a 25º C en cámara húmeda durante 7 días.

3.1.3. Ambiente. A partir de las placas de Petri expuestas a la contaminación ambiental (ver apartado 2.2.1.) se aislaron e identificaron mohos de los géneros Aspergillus, Penicillium, Cladosporium y

Geotrichum . En el caso de las placas de Petri ubicadas en las bandejas, utilizadas para el enfriado de las milanesas, se aislaron los géneros encontrados en las placas anteriores además de algunas especies de los géneros Alternaria y

Monascus . De los hisopados realizados en las mesas de trabajo, mesadas y en las bandejas antes y después de ser utilizadas se llegó a la conclusión de que las superficies de trabajo podrían llegar a ser una fuente de contaminación importante de levaduras. El análisis cuantitativo de dichas muestras fue inconsistente, existiendo muestras con altísimos niveles y otras con niveles casi nulos lo que podría estar generado en una limpieza poco homogénea de las superficies.

3.2. Origen de los contaminantes identificados en las milanesas. A partir

de

las muestras de

diferentes ingredientes

y

milanesas recolectadas en la fábrica (ver apartado 2.3.) se determinó que los recuentos en el pan rallado no justificaban el incremento de la contaminación que se observaba al rebozar las milanesas (Figura 4), a pesar de los comentarios del fabricante. Debido a sus apreciaciones el pan rallado aparecía como una posible fuente de contaminación importante, sin embargo, esto no se demostró a través de los recuentos. Otro ingrediente con altos niveles de contaminación fúngica dentro

de

las

materias

primas

utilizadas

durante

la

elaboración, fue el perejil deshidratado, que se utilizó junto con el pan rallado para rebozar a las milanesas. Sin embargo, la cantidad de perejil deshidratado utilizada como rebozador fue ínfima, por lo que tampoco justificaría el incremento en la contaminación de las milanesas rebozadas. A partir del recuento de microorganismos realizado en las harinas utilizadas en la fábrica, se observó que ninguna de las muestras presentó concentraciones de mohos y levaduras importantes, sin embargo, en algunas repeticiones las colonias de bacterias impedían el desarrollo de los microorganismos fúngicos. En la harina de soja las concentraciones de U.F.C. de mohos duplicaron a las de las harinas comunes y las harinas aglutinadas. Los recuentos de las U.F.C. de levaduras fueron siempre nulos como se puede observar en la figura 4. Si

bien

en

el

apartado

3.1.2.

se

expresó

que

los

microorganismos invadían con mayor facilidad las milanesas ya escaldadas, en los recuentos en placa se encontró que el número de éstos era mucho más bajo que en las milanesas sin escaldar. Con respecto a las muestras de milanesas rebozadas se

observó

una

tendencia

a

aumentar

el

número

de

contaminantes. Este efecto podría estar explicado por el ma yor manipuleo que recibe el producto o por una ma yor exposición a la contaminación ambiental (Figura 5).

1.000.000

Log U.F.C. / g

100.000

10.000

1.000

100

10

Mohos

R al la do Pa n

Ag lu tin ad a

H ar in a

H ar in a

de

So ja

D es hi dr at ad a

Ac el ga

Pe re jil

D es hi dr at ad o

1

Levaduras

Figura 4: Recuento de mohos y levaduras en diferentes materias primas.

100000000 10000000 1000000

U.F.C. / g

100000 10000 1000 100 10 1 M. espinaca s/ cocinar

M. espinaca cocinada

M. espinaca rebozada mohos

M. Soja s/ cocinar

M. Soja cocinada

M. Soja Rebozada

levaduras

Figura 5: Recuento de mohos y levaduras en milanesas de espinaca con queso y milanesas de soja con queso durante el proceso.

Al comparar las milanesas de espinaca y de soja antes de ser cocinadas se puede observar que los recuentos de mohos de las milanesas de espinaca son menores que los de soja. Es mu y posible que la espinaca contenga naturalmente alguna sustancia

que

inhiba

el

crecimiento

fúngico.

Una

vez

escaldadas las milanesas, presentaron una fuerte disminución de los recuentos de mohos y más aun de levaduras que llegaron a ser casi nulos. Sin embargo, se pudo observar una importante

recontaminación

después

de

rebozar

con

pan

rallado las milanesas, lo que indicaría que algunas de las materias primas utilizadas en el rebozado, como el pan rallado o el perejil deshidratado, están fuertemente contaminadas o bien la fuente de esta contaminación podría ser atribuida al medio ambiente en el cual se rebozan.

1.000.000

Log. U.F.C. / g

100.000 10.000 1.000 Se desarrollaron bacterias que inhibieron el desarrollo fúngico

100 10 1 Pan sin Usar

Pan Usado

Pan Bandeja

Pan Enfriado

Pan Enfriado

Pan Mesa

Estado del Pan Hongos totales

Hongos xerofilos

Aspergillus / Eurotium

Levaduras totales

Levaduras filamentosas

Figura 6: Recuento de contaminantes en muestras de pan rallado recolectadas en diferentes tiempos del proceso de elaboración.

En la figura 6 se puede observar los géneros que prevalecen en la micobiota presente del pan rallado a medida que éste va avanzando en las etapas del proceso de producción.

Un dato que llama la atención es el nivel de U.F.C. de levaduras del pan de las bandejas. Las bandejas son utilizadas para almacenar las milanesas una vez terminadas y luego de ser cocidas vuelven a ser depositadas sobre las mismas bandejas, para su enfriado. En el Pan Mesa los recuentos fueron nulos por estar los medios de cultivo totalmente contaminados por bacterias que podrían haber interferido en el crecimiento de posibles hongos contaminantes. En la Figura 7 se observan las diferencias en el tipo de población contaminante que se desarrollan en las distintas muestras

de

pan

rallado.

La

fotografía

de

la

izquierda

representa el pan rallado sin usar y en este caso se observan 50 colonias de mohos, de los cuales 40 pertenecen al género

Eurotium . La fotografía del centro representa al pan rallado usado. En la misma se observan 25 colonias de mohos, donde solamente 6 corresponden al género Eurotium . Finalmente la fotografía de la derecha corresponde al pan de las bandejas, la cual presenta muy pocos mohos y un gran predominio de las levaduras.

Figura 7: Desarrollo de colonias fúngicas en las placas de Petri con el medio de cultivo APA 5% Rosa de Bengala, 2% NaCl y pH 5,5. Las placas corresponde a las muestras de pan rallado sin usar (izquierda) , pan rallado usado (centro), y pan rallado de las bandejas (derecha). Todas las placas corresponden a la misma dilución, lo que permite la comparación entre ellas.

3.3. Tratamiento térmico. En este ensa yo se le aplicó un enfriado mediante inmersión en agua fría a un lote de milanesas ( shock térmico). Luego se tomaron muestras rebozadas y sin rebozar de milanesas con y sin shock (ver apartado 2.4.) . A partir de las muestras (cortes de milanesas) ubicadas en cámara húmeda se observó que:

•

No existió diferencias entre las muestras con y sin

shock . •

Cuando las milanesas fueron rebozadas no se observó

diferencias entre las muestras del tiempo 0 y 12 h.

•

Cuando las milanesas no fueron rebozadas las muestras

recolectadas a las 12 h presentaron mayor contaminación que las del tiempo 0. En las figuras 8 y 9 se observa el desarrollo fúngico sobre las milanesas incubadas a 25º C durante 7 días en cámara húmeda.

0

12

0

Figura 8: Milanesas sin rebozar sin shock (izquierda) y con shock (derecha).

12

0

12

0

12

Figura 9: Milanesas rebozadas sin shock (izquierda) y con shock (derecha).

Al no existir diferencias entre las muestras con y sin shock pero si entre las muestras rebozadas y sin rebozadas, sumado a que los recuentos en pan rallado no son tan elevados como eran de esperar, se consideró la posibilidad de que el pan rallado podría ejercer un efecto adicional con respecto a la captación de contaminantes.

3.4. Efecto del pan rallado como contaminante. Para comprobar la existencia de algún fenómeno físico del pan rallado que origine una ma yo r captación de esporas del medio

ambiente,

se

realizó

la

siguiente

experiencia.

Se

utilizaron milanesas sin rebozar, rebozadas con pan rallado previamente esterilizado y rebozadas con pan rallado común. De los resultados obtenidos se observó que:

•

Las muestras rebozadas con pan estéril tenían una

contaminación similar a las milanesas sin rebozar.

•

Las milanesas rebozadas con pan rallado común estaban

mucho más contaminadas y totalmente colonizadas.

•

Las

diferencias

momento

y

las

entre

las

tomadas

12

muestras h

tomadas

después,

en

el

no

fueron

identificados

fueron

significativas.

•

Los

principales

contaminantes

Penicillium spp. y Rhizopus spp. De todos los resultados anteriores se conclu yó que ninguna de las materias primas poseía niveles de contaminación de levaduras importantes como así tampoco niveles de mohos suficientes

como

para

justificar

los

encontrados

en

las

milanesas una vez rebozadas. La materia prima con recuentos más altos de levaduras que se pudo hallar fue el Pan Rallado de las bandejas. Esto podría indicar una posible contaminación cruzada

en

ese

punto

del

proceso,

lo

que

incrementaría

significativamente las U.F.C. de levaduras en la superficie de las milanesas.

3.5.Contaminación cruzada. Debido a que las bandejas donde se dejaban enfriar las milanesas escaldadas eran las mismas donde se almacenaban las milanesas antes de ser escaldadas, se decidió comprobar si existía una posible contaminación cruzada. Para ello se realizó un ensa yo que consistió en enfriar sobre papel estéril y sobre

las

bandejas

utilizadas

habitualmente

en

fábrica,

milanesas de cebolla y de zapallo escaldadas y rebozadas (ver apartado 2.6.). En la tabla 2 se representan los resultados. Tabla 2: Efecto de la contaminación cruzada en milanesas de cebolla y zapallo. La escala utilizada para cuantificar el grado de contaminación se detalla en el apartado 2.6.

Nivel de contaminación de las milanesas almacenadas a 10ºC Día Día Día Día Día Día 6 Día 7 D 1 2 3 4 5 Cebolla en 0,00 0,00 0,00 0,60 3,00 5,80 7,00 9 papel estéril Cebolla en 0,00 0,00 0,80 2,00 4,80 6,40 8,40 10 bandeja Zapallo en 0,00 0,00 0,00 0,40 5,00 6,40 7,20 11 papel estéril Zapallo 0,00 0,00 0,00 2,00 6,80 11,40 12,00 12

en bandeja Se pudo observar que las milanesas de cebolla tuvieron una tendencia a inhibir el crecimiento de los mohos ya que su crecimiento se ve retardado con respecto a las milanesas de zapallo.

Este

efecto

inhibitorio

de

la

cebolla

sobre

el

desarrollo de microorganismos fue reportado por Mei-chin y Shih-ming (1999) y por Abdel-Hafez y El-Said (1997). Benkeblia (2004) encontró que las cepas de Aspergillus niger, Penicillium

cyclopium

fueron

concentraciones

de

fuertemente aceites

inhibidas

esenciales

de

por cebolla

bajas y

ajo.

Fusarium ox ysporum presentó una menor sensibilidad a los extractos de estos aceites esenciales. En

la

figura

10

y

11

se

exponen

fotografías

que

corresponden a milanesas en el sexto día de incubación.

Repeti

Repeti

Figura 10: Milanesas de cebolla incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones). En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin contaminación cruzada).

Repeti

Repeti

Figura 11: Milanesas de zapallo incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones). En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin contaminación cruzada).

3.6. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio. Se

elaboraron

milanesas

de

zapallo

con

el

sistema

habitualmente utilizado en fábrica y con el agregado de 0,66 % de sorbato de potasio. Las milanesas fueron enfriadas sobre las bandejas y sobre papel estéril, según se expresa en el apartado 2.8. Las muestras se incubaron a 4 y a 20º C y se registraron los niveles de contaminación en la escala explicada en el apartado 2.8.

Nivel de Contaminación

3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

Días Sin Sorbato

Con Sorbato

Con Sorbato Sobre Papel

Figura 12: Crecimiento fúngico a 20º C sin el agregado de sorbato de potasio, con sorbato y con sorbato sobre papel estéril evitando la contaminación cruzada.

18

Nivel de Contaminación

3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

Días Sin Sorbato

Con Sorbato

Con Sorbato Sobre Papel

Figura 13: Crecimiento fúngico a 4º C sin el agregado de sorbato de potasio, con sorbato y con sorbato sobre papel estéril evitando la contaminación cruzada.

De los resultados obtenidos (Figuras 12 y 13) se observa que: 1. Las milanesas tratadas con sorbatos (enfriadas en bandejas o en papel estéril) e incubadas a 4º C, permanecieron durante más tiempo sin la aparición de mohos en superficie. 2. El

enfriamiento

de

las

milanesas

(con

sorbato

e

incubadas a 4º C) sobre papel estéril retardó 3 días la aparición de las levaduras. 3. La disminución de la temperatura de almacenamiento a 4º

C

provocó

un

retraso

en

la

aparición

de

los

contaminantes mayor al observado por el agregado de sorbato. 4. En todas las muestras excepto las que no estuvieron en

contacto

con

las

bandejas,

las

levaduras

se

desarrollaron antes que los mohos. 5. Al evitar la contaminación cruzada a 4º C, el desarrollo de microorganismos se retarda 3 días.

18

4. DISCUSIÓN FINAL. Antes de dar comienzo a la pasantía se visitó la fábrica para conocer la problemática y mediante una observación general del proceso se sugirió al fabricante envasar las milanesas a 20º C y no a mayores temperaturas debido a que el vapor que condensaba dentro del envase generaba humedad que podría ser utilizada por los microorganismos. Además, se propuso reemplazar el material de envase se polietileno por uno de polipropileno. Durante el desarrollo de la presente pasantía se llevaron a cabo dos etapas de trabajo claramente diferenciadas. En la primera, el objetivo principal fue detectar el origen de las contaminaciones fúngicas a través del análisis de las materias primas utilizadas durante la elaboración de las milanesas (harinas,

especias,

pan

rallado,

etc)

y

el

análisis

de

la

población ambiental. En una segunda etapa se detectaron los puntos

críticos

modificaciones

de en

contaminación el

proceso

y

se

llevaron

productivo

para

a

cabo

mejorar

la

calidad sanitaria y vida útil del producto final. Durante el desarrollo de la primera etapa, se determinó que muchos de los microorganismos presentes en las materias primas también lo estaban en los productos intermedios. Sin embargo, a medida que el proceso de elaboración avanzaba, se incrementaba el número de especies y sus concentraciones. El tratamiento térmico o escaldado a que son expuestas las milanesas durante su elaboración, provocó una importante disminución de la población de microorganismos. No obstante, el producto final contenía un número de especies mucho ma yor y concentraciones más altas de microorganismos que los productos intermedios o las milanesas recién escaldadas. Este hecho

podía

deberse

principalmente

a

dos

motivos:

contaminación de las materias primas utilizadas después del escaldado o contaminación ambiental. Por tal motivo se realizaron una serie de muestreos y ensayos que permitieran determinar el origen concreto de los microorganismos

aislados.

El

pan

rallado

utilizado

en

el

rebozado, fue la materia prima más estudiada debido a que parecía ser una posible fuente de contaminación. A través de los análisis se determinó que el pan rallado contenía un importante número de mohos, pero éstos no parecían ser suficientes para causar la contaminación producida en las milanesas

rebozadas.

Por

otro

lado,

a

partir

de

este

ingrediente no se aislaron levaduras y sin embargo, éstas eran frecuentemente aisladas desde muestras de milanesas. Debido a

esto,

se

comenzaron

los

estudios

de

contaminación

ambiental. En este caso se encontró que en el aire y en las bandejas de enfriamiento existían las mismas especies que fueron encontradas en las milanesas. Además, a partir de muestras recogidas en la superficie de las bandejas donde se colocaban las milanesas sin escaldar y que más tarde se colocaban las milanesas ya rebozadas, se aislaron las mismas colonias de levaduras que se desarrollaban en las milanesas. De esta forma se comprobó que la contaminación cruzada en las bandejas donde se enfrían las milanesas y la exposición al medio ambiente, eran los causales de la mayor parte de la micobiota asociada o crítica. Una vez detectado el origen de las contaminaciones se inició con la segunda etapa del trabajo. En este caso se realizaron

una

serie

de

experimentos

que

permitieron

confirmar y evitar la contaminación cruzada en las bandejas. Por tal motivo, la sugerencia principal que se realizó al fabricante fue la de mantener una estricta limpieza de las bandejas

y

evitar

compartir

las

mismas

con

milanesas

escaldadas y sin escaldar. A su vez, es importante mencionar

que en el caso de que se use el mismo carro para colocar milanesas crudas y cocidas, las bandejas donde se colocan las cocidas se deberán encontrar en la parte superior del carro ya que de lo contrario las esporas fúngicas, restos de pan rallado y

otras

materias

contaminadas,

podrían

caer

sobre

las

milanesas ya escaldadas. Para disminuir el nivel de contaminación ambiental, se sugiere

la

colocación

de

un

presurizador

de

aire.

Este

artefacto tomará el aire del exterior, lo filtrará y lo enviará al interior. De esta manera siempre que una puerta o ventana se abra el aire saldrá y nunca podrá ingresar. La importancia de que no entre aire sin filtrar radica en que de esta forma se evita el ingreso de partículas de polvo con esporas fúngicas y células de microorganismos adheridas a él. En caso de no ser posible crear una presión positiva dentro de la fábrica se deberán evitar las corrientes de aire dentro de la misma. De esta forma se disminuirá la cantidad de partículas de polvo en el aire que vehiculizan a los microorganismos presentes en el aire. Con el objetivo de aumentar la vida útil del producto, se realizaron pruebas adicionando un conservante a la mezcla de las milanesas. Para ello se utilizó un inhibidor del desarrollo fúngico, como es el sorbato de potasio. De acuerdo a las características

del

producto

y

al

mercado

al

cual

está

orientado, este conservante es el que mejor se adapta ya que a bajas

concentraciones

su

sabor

es

indetectable

y

es

considerado GR AS (Generalmente Reconocido Como Seguro) por el Codex Alimentario. Sin embrago, se debe recalcar la importancia de prevenir la contaminación antes de inhibirla con conservantes ya que según Steels (2000) la concentración inhibitoria mínima aumenta con el tamaño del inóculo. Altas concentraciones conservantes

de

células

requieren

considerablemente

concentraciones

mayores

para

evitar

de el

crecimiento. Es por esto que la recomendación final que se realizó al fabricante, fue aplicar una dosis de 0,10 a 0,66% de sorbato,

mantener

almacenadas

a

4º

la C

temperatura y

evitar

la

de

las

milanesas

contaminación

cruzada

producida por las bandejas de enfriamiento. Otra alternativa a considerar es el agregado de una pequeña cantidad de ácido cítrico para aumentar la eficiencia del sorbato de potasio. Marin et al. (2002) encontró que en los panificados

españoles

el

sorbato

de

potasio

actúa

eficientemente a valores bajos de pH (Blocher and

más

Busta,

1985) y de a w . Es indispensable que el envasado del producto se realice a una temperatura inferior a 20 ° C. De esta forma el agua de las milanesas

se

terminará

condensaciones

dentro

de del

evaporar envase

y

que

desarrollo de colonias de microorganismos.

no

se

podrían

producirán llevar

al

5. BIBLIOGRAFÍA. •

Abdel-Hafez

and

El-Said.

1997.

International

Biodeterioration & Biodegredation; 39 (1): 67-77.

•

Abdullah; Naw aw i and Othman. 2000. Fungal spoilage of

starch-based foods in relation to its w ater activity; Journal of Stored Products Research 36 (2000) 47-54. Oct;27(4):203-6.

•

Abellana;

Torres

Sanchis

and

Ramos.

1997b.

Caracterización de diferentes productos de bollería industrial: II. Estudio de la micoflora. Alimentaria 287. pp. 51-56.

•

Acker, L., 1963. Enz yme activity at low water contents.

Recent Ad vances in Food Sciences 3, 239-247.

•

Anderson

and

Smith.

1971.

The

production

of

conidiosphores and conidia b y newly germinated conidia of Aspergillus niger. Journal of General Microbiolog y, 69, 185197.

•

Benkeblia.

2004.

Antimicrobial

activity

of

essential

oil

extracts of various onions ( Allium cepa ) and garlic ( Allium

sativum ); Lebensm.-Wiss. u.-Technol. 37: 263–268. •

Berghofer;

Microbiolog y

Hocking; of

w heat

Di

Miskell y

and

flour

and milling

Jansson. in

2003.

Australia.

International Journal of Food Microbiolog y. 85(1-2):137-149.

•

Berghofer;

Microbiolog y

Hocking; of

w heat

Di

Miskell y,

and

flour

and milling

Jansson. in

2003.

Australia;

International Journal of Food Microbiolog y; 85 (1-2):137-149.

•

Bhat and Krishnarnachari. 1977. Follow up study of aflatoxic

hepatitis in parts of w estern India.

Indian Journal of Medical

Research, 1977, 66: 55-58.

•

Bhat; Beedu; Ramakrishna and Munshi. 1989. Outbreak of

trichothecene m ycotoxicosis associated w ith consumption of mould-damaged w heat production in Kashmir Valley, India. Lancet. 1989 Jan 7;1(8628):35-7.

•

Bhat; Shetty; Amruth and Sudershan.1987. A foodborne

disease outbreak due to the consumption of mould y sorghum

and

maize

containing

fumonisin

m ycotoxins.

Clinical

toxicolog y. 35:249-255.

•

Bigelis.1992.

Food

enz ymes.

En:

Finkelstein

and

Ball

(editors), Biotechnolog y of Filamentous Fungi. Technolog y and Products. Butterworth-Heinemann, Boston, MS, pp. 361-415.

•

Blocher and

Busta. 1985. Multiple modes of inhibition of

spore germination and outgrow th by reduced pH and sorbate. Journal of Applied. Bacteriolog y 59:467–478.

•

Booth and

Kroll. 1989. The preservation of foods by low

pH. En: Gould, G.W. (Ed.), Mechanisms of Action of Food.

•

Bourgois;

Mescle

and

Zucca,

1994.

Aspectos

microbiológicos de la seguridad y calidad alimentaria. Journal de Microbiología Alimentaria. 1:131-139.

•

Brace y; Hol yoak; Coote. 1998. Comparison of the inhibitor y

effect of sorbic acid and amphotericin B on Saccharom yces cerevisiae:

is

grow th

inhibition

dependent

on

reduced

intracellular pH?. Journal of Applied Microbiolog y. 85(6):10561066.

•

Bushuk and Winkler. 1957. Sorption of w ater vapour on

w heatflour, starch and gluten. Cereal Chemistr y 34, 73.

•

Chelkow ski (editor) .1991. Cereal grain. M ycotoxins, Fungi

and Quality in Dr ying and Storage. Elsevier, Amsterdam.

•

Chirife and Favetto. 1992. Some physico-chemical basis of

food

preservation

by

combined

methods.

Food

Research

International. 25 (5): 389-396.

•

Cole; Keenan. 1987. Effects of w eak acids and external pH

on the intracellular pH of Z ygosaccharom yces bailii, and its implications in w eak-acid resistance. Yeast 3: 23–32.

•

Cooke and Whipps. 1993. Ecoph ysiolog y of Fungi. Oxford.

Blackw ell Scientific.

•

Criterios

de

Salud

Ambiental

Nº

105,

1990.

Selected

mycotoxins: ochratoxins, trichotecenes, ergot. Report of an Expert Committee. Ginebra, Organización Mundial de la Salud.

•

Cvetni, Zdenka and Pepeljnjak, S. 1997. Distribution and

mycotoxin-producing ability of some fungal isolates from the air; Atmospheric Environment; 31 (3):491-495.

•

Deans; Gull and Smith. 1980 Ultrastructural changes during

microc ycle conidiation of Aspergillus niger. Transactions of the British M ycological Society, 74, 493-499.

•

Di Paolo; Guarnieri ; Garosi; Sacchi; Mangiarotti and Di

Paolo. 1994. Inhaled m ycotoxins lead to acute renal failure. Nephrolog y, dial ysis and transplantation, , 9 (4): 116-120.

•

Eklund. 1983. The antimicorbial effect of dissociated and

undissociated sorbic acid at different pH levels; Journal of Applied Bacterilogy 54: 383.

•

Eklund. 1985. Inhibition of microbial grow th at different pH

levels

by

benzoic

hidroxibenzoic

and

acid.

propionic

acids

International

and

esters

Journal

of

of

p-

Food

Microbiolog y. 2 (3):159-167.

•

Filtenborg;

Frisvad

and

Thrane.

1996.

Moulds

in

food

spoilage; International Journal of Food Microbiolog y 33 (1): 85102.

•

Freese; Sheu and Galliers. 1973. Function of lipophilic

acids as antimicrobial food additives. Nature 241:321–325.

•

Fustier; Lafond; Champagne and Lamarche. 1998. Effect of

inoculation techniques and relative humidity on the grow th of moulds

on

the

surfaces

on

yellow

layer

cakes.

Applied.

Enviromental. Microbiolog y 64:192–196.

•

Gajdušec. 1953. Acute enfectious hemorrhagic fevers and

myctoxicoses in

the

Union

of

Soviet

Socialist

Republics.

Medical science publication No. 2, Walter Reed Army Medical Center, Washington.

•

Gough

and

King.

1980.

Moisture

content

or

relative

humidity equilibria of some tropical cereal grains. Tropical Stored Products Information 39, 13-17.

•

Hocking and Pitt. 1988. Tw o new species of xerophilic fungi

and a further record of Eurotium halophilicum. M ycologia 80: 82-88.

•

Hunt

and

behaviour

Pixton.

and

1974.

Moisture

measurement.

En:

-

its

significance,

Christensen,

C.M.

(Ed.),

Storage of Cereal Grain and their Products, 2nd ed. American Association of Cereal Chemists, St Paul, MN, pp. 2-14.

•

I. A.R.C. Momgraphs on the evaluation of Carcinogenic Risk

to

Humans.

1987.

Suplement

7.

Overall

evaluations

of

carcinogenicity: an updating of I AR C Monographs volumes 1 to 42.

Report

of

an

I ARC

Expert

Committee.

L yon,

Centro

Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer, 1987.

•

I.C.M.S.F.

Affecting

1980.

Life

and

Microbial

Ecolog y

Death

Microorganisms.

of

of

Foods.

Factors

New

York.

Academic Press.

•

Jiménez; Mateo; Querol; Huerta and Hernández. 1991. Effect

of the incubation conditions on the production of patulin b y Penicillium griseofulvum isolated from w heat. M ycopathologia 115, 163-168.

•

Kacàniovà. 2003. Feeding So ybean Colonization b y

Microscopic Fungi; Trakya Univ J Sci, 4(2):165-168. http://www.trakya.edu.tr/Enstituler/FenBilimleri/Dergi/pdf/86Ka caniova.pdf.

•

Lacey and Magan. 1991. Fungi in cereal grains: their

occurrence,

w ater

and

temperature

relationships.

En:

Chelkow ski, J. (Ed.), Cereal Grain. M ycotoxins, Fungi and Quality in Dr ying and Storage. Elsevier, Amsterdam, pp. 77117.

•

Leiras, and Iglesias. 1991. Water vapour sorption isotherms

of tw o cake mixes and their components. International Journal of Food Science and Technology 26, 91-97 .

•

Lil y

and

Viani.

(editors);

1995;

Espresso

Coffee:

The

Chemistr y of Quality. Academic Pas. London.

•

Liu X . 1988. Artthrinium sp. And the deteriorated sugarcane

poisoning.

En:

Aibara

et.

al.,

editors .

M ycotoxins

and

Phycotoxins. Symposium,

Ab stacts of the Seventh International IUP AC Tokio,

16-19

August

1988.

Tokio,

Japanesse

Asociation of Mycotoxicolog y, 1988:26.

•

Liu; Luo and Hu. 1992. Studiess on epidemiology ang

etiolog y of mold y sugarcane poisoning in China. Biomedical and enviromental sciences 5: 161-177.

•

Loureiro and Querol. 1999. The Prevalence and Control of

Spoilage Yeast in Foods and Beverages; Trends in Food Science & Technolog y; 10 (11): 356-365.

•

Ludolph; He; Spencer; Hammerstad and Sabri . 1991. 3-

nitropropionic- acid exogenous animal neurotoxin and possible human striatal toxin. Canadian journal of neurogical sciences; 18: 492-498.

•

Magan. 1988. Effect of w ater potential and temperature on

spore germination and germ-tube grow th in vitro and on straw leaf sheaths. Transactions of the British M ycological Society, 90, 97-107.

•

Marín; Gu ynot; Neira; Bernardó; Sanchis and Ramos. 2002.

Risk assesstment of the use of suboptimal levels of weak-acid preservatives

in

the

control

of

mould

grow th

on

baker y

products; International Journal of Food Microbiolog y; 79: 203211.

•

Marín; Gu ynot; Ramos; Sala and Sanchis. 2002. Combined

effects of w eak acid preservatives, pH and w ater activity on grow yh of Eurotium secies on sponge cake; International Journal of Food Microbiolog y; 76:39-46.

•

Mei-chin and Shih-ming. 1999. Inhibitor y effect of seven

Allium plants upon three Aspergillus species; International Journal of Food Microbiolog y; 49: 49–56.

•

Moss. 2002. Risk assessment for aflatoxins in foodstuffs;

International Biodeterioration & Biodegradation 50 (3-4): 137142.

• de

Peraica; Radi ć ; Luci ć and Pavlovi ć . 2000. Efectos tóxicos las

micotoxinas

en

el

ser

humano.

Boletín

de

la

organización Mundial de la Salud, Recopilación de artículos Nº

2, 2000. Artículo publicado en ingles en el Bulletin of the World Health Organization, 77 (9): 754-766.

•

Peth ybridge;

Ison

and

Harrigan.

1983.

Dissociation

constant of sorbic acid on w ater and w ater-gl ycerol mixtures at 25º

C

from

conductance

measurements.

Journal

of

Food

Technolog y 18: 789.

•

Pitt and Hocking. 1997. Fung y and Food Spoilage; Blackie

Academic & Profesional; Chapter 2. Preservation Procedures, Elsevier, London, pp. 119–160.

•

Pratap; Singh and Maharaj. 1982. Equilibrium moisture

content

of

some

flours.

Journal

of

Food

Science

and

Technolog y India 19, 153-158.

•

Rabie; Lübben; Marais

and Jansen van Vuuren. 1997.

Enumeration of fungi in barley; International Journal of Food Microbiolog y; 35 (2): 117-127.

•

Radoni ć ;

Radoševi ć

and

Zupani ć .

1966.

Endemic

nephropath y in Yugoslavia. En: Mostovi and Smith. Editors. The kidne y. Baltimore, Williams & Wilkins, 1966: 503-502.

•

Rahgasw amy, J.R., 1973. Observations on the sorption o f

water vapour b y rice and sorghum. Journal of Food Science and Technolog y India 10, 59-61.

•

Ramos; Marin; Guynot; Neira; Bernardó and Sanchis. 2002.

Risk assessment of the use of sub-optimal levels of weak-acid preservatives

in

the

control

of

mould

grow th

on

baker y

products. International Journal of Food Microbiology 79: 203211.

•

Salmond;

Kroll

and

Booth.

1984.

The

effect

of

food

preservatives on pH homeostasis in Escherichia coli. Journal of General Microbiology 130, 2845–2850.

•

Scott.

1957.

Water

relations

of

food

spoilage

microorganisms. Ad vance Food Research 7, 83-127.

•

Scudamore and Hetmanski. 1995. Natural occurrence of

mycotoxins and mycotoxigenic fungi in cereals in the United Kingdom. Food Additives and Contaminants 12, 377-382.

•

Seiler.

1988.

Microbiological

problems

associated

w ith

cerealbased foods. Food Science Technolog y Today 2, 37– 41.

•

Sofos and Busta. 1981. Antimicrobial activity of sorbate.

Journal Food Protection 44, 614–622.

•

Speijers and Van Egmond. 1993. Worlw ide ochratoxin A

levels in food and feeds. En: Crepp y E. E. et. al. , editors. Human

ochratoxicosis

and

its

pathologies.

Montrouge,

Colloque INSERM/John Libbe y Eurotext Ltd. 1993, 231:85-100.

•

Steels;

James;

Roberts

and

Stratford.

2000.

Yeast

30;16(13):1173-83.

•

Stratford and Anslow . 1998. Evidence that sorbic acid does

not inhibit yeast as a classic 'w eak acid preservative'; Letter of Applied Microbiolog y 27(4):203-6.

•

Tandon; Krishnamurth y; Kosh y; Tandon; Ramalingasw ami;

Bhandari and Mathur . 1977. Stud y of an epidemic of jaundice, presumabl y

due

to

toxic

hepatitis,

in

Northwest

India.

Ngu yen.1989.

Fungi

Gastroenterolog y; 72: 488-494.

•

Tindale;

Whitficld;

Levingston

and

isolated from packaging materials: their role in the production of

2-4-6-trichloroanisole.

Journal

of

Science

in

Food

Agriculture; 49, 437 447.

•

Tipples. 1995. Quality and nutritional changes in stored

grain. En: D.S. Jayas. N.D.G. White and W.E. Muir (editors). Stored Grain Ecosystems. Marcel Dekker. New York. pp. 325 351.

•

Ueno.

1971.

Toxicological

and

biological

properties

of

fusarenon-x, a citotoxic m ycotins of fusarium ni vale Fn-2B. En:

Purchase

IFH,

ed.

M ycotoxicosis

in

human

health.

Proceedings of a Symposium Pretoria, 2-4 September 1970. Edinburh Mac Millan: 163-178.

•

Vukeli ć ;

Šoštari ć and

Belicza. 1992. Pathomorfolog y of

Balkan endemic nephropath y. Food and chemical toxicolog y, 1992, 30: 193-200.

•

Wang; Feng and Tong. 1993. Human toxicosis caused b y

moudl y rice contaminated w ith Fusarium T-2 toxin. Biomedical and enviromental sciences; 6: 65-70.

• and

Whitfield; Ngu ycr and Last. 1991. Effect of relative humidity chlorophenol

chlorophenols

to

content

on

the

chloroanisols

fungal in

conversion

libreboard

of

cartons

containing dried fruit. International Science. Food Agriculture; 54. 595 604.