Mi Proyecto De Tesis Moreno 2018 - I.docx

UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE LA AMAZONÍA FACULTAD DE INGENIERÍA Y CIENCIAS AMBIENTALES CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

PROYECTO DE TESIS.

“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y DETERMINACIÓN DE COMPUESTO FENÓLICOS DE LA HOJA DE DALEDALE (calathea alloua)”

Investigador: MORENO RAMIREZ, Arnol.

YARINACOCHA - 2018 PERÚ – UCAYALI

I. 1.1.

PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

Descripción de la situación problemática. El Perú posee una variedad de plantas silvestres los cuales en estos últimos años están siendo estudiados, por su composición antioxidante y los beneficios en la salud humana. Uno de estas son las hojas de daledale, el cual tiene como componente principal antioxidante fenólicos. El daledale es una planta que se desarrolla en bosques lluviosos y templados de terrenos bajos de Perú, especialmente en el departamento de Amazonas, San Martin, Loreto y Ucayali, siendo común su aparición en la parte occidental del Amazonas. Actualmente los pobladores usan como consumo directo sin saber los benéficos de sus compuestos antioxidativos, y como medicina tradicional le atribuye a la tintura de las hojas propiedades para el tratamiento de la cistitis y como diurético. El problema radica en el desconocimiento y falta de investigación de las propiedades antioxidantes que nos ofrecen muchas plantas silvestres que son conocidas y cultivadas desde hace ya muchos años atrás, pero que no son aprovechadas adecuadamente. La importancia del estudio se realiza con la finalidad de obtener una evaluación estandarizados, saludable de buena calidad y accesible para el consumidor sustituyendo parcialmente en bebidas, hasta en un producto gastronómica, el cual dependerá de varios análisis para llegar a nuestros objetivos propuestas, se basa en su gran aporte de polifenólicos del estudio en determinación de la hoja de daledale, dentro de estas propiedades, la actividad antioxidante es muy importante y garantizar al consumidor como producto final en la medicina tradicional.

1.2.

Enunciado de problema ¿Será posible evaluar la actividad de antioxidante y la determinación de compuestos fenólicos de la hoja de daledale?

II.

JUSTIFICACIÓN

El daledale (calathea alloua), es una de la especies representativas de la selva Peruana, en los departamentos de Loreto, Amazonas, Madre de Dios, San Martín, y Ucayali, en la época de siembra es en mayor precipitación pluvial, la cosecha y conservación de producto la parte más aprovechada es en las hojas y el bulbo de la raíz. La cosecha se realiza manualmente. Científicamente,

la

solución

del

problema

de

investigación,

generará

conocimiento científico en aplicación como base para futuras investigaciones. Como son los componentes químicos en el género Maytenus presenta alcaloides esper midínicos y sesquiterpénicos, auronas, calconas, cumarinas, ácidos fijos y débiles catequinas, fenoles simples, saponinas, quinonas y triterpenos. Tecnológicamente, la investigación impulsará las ideas de innovaciones en la industria farmacéutica como suplemento en la medicinales naturales, tal es el caso de antioxidante con la utilización de la hoja de daledale y a su vez, mostrará la tendencia hacia nuevas presentaciones de productos medicinales en la región, que generarán una base de nuevas tecnologías aplicadas hacia la industria farmacéutica. Socioeconómico, impulsará a desarrollar productos de innovación en la medicina suplementarios, generando mayor inversión de especies productoras de antioxidantes de la hoja de daledale, teniendo como resultado mayor ingresos, tanto para los productores y consumidores, a través de la industrialización. Popularmente, los eventos nosológicos en los que se emplean, son la inflamación de vejiga, infección orinaría, dolores estomacales; los efectos medicinales atribuibles son: antidisentérico, antihelmíntico, antiinflamatorio, afrodisiaco).

III.

3.1

OBJETIVOS

Objetivo General

-

Evaluar la actividad de antioxidante y la determinación de compuestos fenólicos de la hoja de daledale (calathea alloua)

3.2

Objetivo Especifico

-

evaluar la actividad de antioxidante de las hojas de daledale mediante análisis funcional.

-

Determinar los compuesto fenólicos de la hoja de daledale mediante HPLC.

IV.

HIPÓTESIS

Es posible evaluar la actividad de antioxidante y la determinación de compuesto de fenólicos de la hoja de daledale (calathea alloua).

V. 5.1.

REVISIÓN DE LITERATURA

Antecedentes de investigación Según (1), En su tesis de grado para optar el título Químico Farmacéutico, “EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FENOLES TOTALES Y FLAVONOIDES DE HOJAS DE DIFERENTES GENOTIPOS DE UGNI MOLINAE TURCZ”. Las propiedades de la murtilla se deben, en parte, a la presencia de diferentes compuestos fenólicos en sus hojas. Debido a que estos compuestos pueden variar por diversos factores, como el genotipo, en este estudio se realizó un análisis comparativo respecto a la capacidad antioxidante (ensayo FRAP), el contenido fenólico total (CFT) (ensayo de Folin-Ciocalteu) y el contenido de flavonoides (ensayo colorimétrico con AlCl3) de extractos etanólicos seriados (EETs) de hojas de 10 genotipos de murtilla (8-2, 14-4, 19-1, 19-1ha, 22-1, 23-2, 27-1, 311 y ZF-18), los cuales fueron cultivados bajos las mismas condiciones. De acuerdo a los resultados obtenidos, los EETs de los 10 genotipos presentaron diferencias significativas entre sí (p<0,05), siendo el EET ZF18 el que obtuvo el mayor CFT, (260,6 ± 3,7 mg EAG/g ES) y el genotipo 31-1 el que obtuvo la mayor cantidad de flavonoides (53,5 ± 0,8 mg quercetina/g ES). En relación a la actividad antioxidante, los EETs de los genotipos ZF-18 y 27-1 fueron los que obtuvieron los mayores valores FRAP en todos los distintos tiempos de medición, con un máximo de 5,40 ± 0,12 y 4,93 ± 0,05 mol Fe2+/g ES a los 60 minutos, respectivamente. Según (2), para acceder al grado académico de Magister en Alimentos (Mención en Ciencias),

“ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS

COMPUESTOS FENÓLICOS CONTENIDOS EN LAS SEMILLAS DE LA VID (Vitis vinifera l.)”. Para ello se compararon distintos solventes para la extracción de fenoles de las semillas de la uva, de modo de obtener el extracto más concentrado en compuestos activos con la mínima degradación de su poder antioxidante durante el proceso de obtención. La concentración de fenoles totales de los extractos se determinó por el método Folin Ciocalteu. El poder reductor de los extractos se midió empleando el método de Oyaizu. El extracto fue concentrado al vacío, y se verificó la conservación del poder reductor en el extracto concentrado,

por el método de Oyaizu. El extracto de semillas concentradas y sin concentrar se empleó en un sistema real sujeto a oxidación, tal como el jugo de manzanas. El grado de oxidación del jugo se midió por el método de Özoglu. Se evaluó la actividad antioxidante

del extracto líquido

concentrado de semillas de vid, respecto de otros antioxidantes comerciales como ácido ascórbico y dióxido de azufre. El sustrato oxidable fue el jugo de manzanas, y el grado de oxidación se midió por el método de Özoglu. El análisis estadístico de los datos se realizó mediante el análisis de la varianza; cuando no fue posible emplear el mencionado análisis, debido a que no se verificaban los supuestos básicos para su aplicación, Para obtener un extracto antioxidante a partir de semillas de vid se utilizó una extracción con agua a 90ºC, durante 4 horas. La relación sólido- líquido empleada fue de 1g de semillas enteras por 10 ml de solvente. El extracto obtenido presentaba una concentración de 12,587

mg de fenoles totales por gramo de semillas de uva

extractadas y un poder reductor de 1,290 unidades. Como consecuencia del análisis de la cinética de extracción, el tiempo de tratamiento se redujo de 4 horas a 3 horas. La concentración del extracto se realizó al vacío a 60ºC, verificándose un aumento del poder reductor en el extracto concentrado, comprobado sobre jugo de manzanas. Comparando el extracto concentrado y el extracto sin concentrar se observa que la concentración de fenoles totales aumentó 29,57 veces, mientras que el poder reductor aumentó 37,39 veces.

Según ORTIZ, et al. (2009). examinó la CAPACIDAD ANTIOXIDANTE Y ANTINITROSATIVA

DE

LOS

EXTRACTOS

Y

FLAVONOIDES

AISLADOS DE HOJAS Y CORTEZA DE BAUHINIA KALBREYERI HARMS (CASCO DE VACA. FABACEAE). Los antioxidantes de la planta colectada en Ibagué, mostraron capacidad para estabilizar radicales libres, poder reductor del ion Fe+3, habilidad para que lar el Fe+2, descomponer el peróxido de hidrógeno, y aptitud para capturar especies reactivas de nitrógeno, entre ellas el óxido nítrico (NO). Las pruebas de comparación múltiple mostraron al extracto etanólico de corteza y al acuoso de hojas como los tratamientos de mayor efectividad en las pruebas aplicadas. Se encontraron diferencias significativas entre los extractos, y entre ellos y los flavonoides aislados (p<0.05). La actividad antioxidante de la planta parece fundamentarse en el conjunto de

derivados fenólicos. Los resultados obtenidos indican que el potencial antioxidante de B. kalbreyeri es comparable con el del hidroxitolueno butilado y el ácido ascórbico, utilizados como antioxidantes por la industria alimentaria y farmacéutica. Según Muñoz C, et al. (2015). DETERMINARON EL CONTENIDO DE COMPUESTOS FENÓLICOS EN EXTRACTOS OBTENIDOS A PARTIR DE LA EXTRACCIÓN SÓLIDO - LÍQUIDO DE PULPA LIOFILIZADA (1:10), empleando como disolventes agua, etanol y mezcla etanol-agua (7:3), a tres temperaturas 20, 50 y 70 °C. Los rendimientos de extracción variaron entre el 26,85 % y el 50,07 %, observando rendimientos más elevados en los extractos acuosos. Se observó que el contenido de compuestos fenólicos fue directamente proporcional a la temperatura de extracción y varió entre 1469,32 ± 152,14 y 5272,51 ± 424,89 μg de ácido gálico/g de pulpa liofilizada, obteniendo valores más altos para la mezcla etanol-agua (7:3). La actividad antioxidante encontrada varió entre 20,44 ± 2,57 y 51,01 ± 1,93 mmol/L TEAC/g de pulpa liofilizada, observando una menor actividad en los extractos etanólicos. Tanto en el rendimiento de extracción, como en la determinación del contenido de fenólicos y la actividad antioxidante se observó un efecto significativo de la temperatura de extracción, asociado a cada disolvente. Los resultados obtenidos, ratifican que la C. lineatifolia es un producto natural con alto contenido de compuestos bioactivos, con potencial antioxidante.

Según ROSALES, M. et al. (2003). EVALUARON EL CONTENIDO DE TANINOS CONDENSADOS Y FENOLES TOTALES, EXPRESADOS COMO ÁCIDO TÁNICO, EN EXTRACTOS ETANÓLICOS Y ACUOSOS DE LAS CORTEZAS DE OCHO ESPECIES DE PINO ABUNDANTES EN EL ESTADO DE DURANGO. Los extractos etanólicos lo obtuvieron por maceración durante 48 h con etanol acuoso al 50 % y los acuosos con agua, a ebullición y reflujo. La evaluación de taninos condensados se realizó mediante el número de Stiasny y los fenoles totales se evaluaron por el método de Folín-Ciocalteu utilizando ácido tánico como estándar. Los rendimientos en extracto o sólidos totales extraídos, Stiasny, taninos condensados y fenoles fueron mayores en los extractos etanólicos que en los acuosos, en todas las especies. Se encontraron diferencias estadísticas en la concentración de compuestos fenólicos entre los

solventes de extracción utilizados y entre las especies. Los extractos etanólicos de las cortezas de Pinus leiophylla, P. ayacahuite, P. durangensis y P. teocote presentaron la mayor concentración de taninos condensados y fenoles, mientras que las especies P. cooperi y P. engelmannii presentaron la menor concentración.

Según MURILLO, et al. (2007). EVALUARON LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS ACUOSO Y ORGÁNICOS DE BAUHINIA KALBREYERI HARMS, REPORTADA POR LA MEDICINA FOLCLÓRICA COLOMBIANA COMO ANTIDIABÉTICA. Se evaluaron los extractos midiendo su capacidad de captación de radicales libres utilizando el método del 1,1-difenil-2-picrilhidracil (DPPH). Los extractos etanólicos y acuosos, alcanzaron una actividad secuestrante del radical DPPH mayor a 90% en casi todas las concentraciones (5-120 mg/ml); las concentraciones efectivas fueron bajas, confirmando el alto potencial antioxidante. El poder reductor reveló depender del solvente extractor y del uso de hoja o corteza, pero independiente de la concentración; el extracto etanólico de corteza evidenció alto potencial reductor. Los extractos etanólico y acuoso de corteza mostraron la mayor cantidad de fenoles. La planta puede ser considerada una buena fuente de antioxidantes naturales, que podrían contrarrestar el exceso de radicales libres, y así ejercer las propiedades terapéuticas atribuidas, más que actuar como hipoglucemiante.

Según ROSALES, et al. (2009). EVALUARON LA CONCENTRACIÓN DE FENOLES TOTALES, FLAVONOLDES Y PROANTOCLANLDLNAS EN EXTRACTOS DE ACETONA ACUOSA 70% (EXTRACTO CRUDO) Y EXTRACTOS SEMIPURIFICADOS POR PARTICIÓN LÍQUIDO– LÍQUIDO CON ACETATO DE ETILO (EXTRACTO ORGÁNICO), DE CORTEZAS DE PINUS COOPERI, PINUS ENGELMANNII, PINUS LEIOPHYLLA Y PINUS TEOCOTE. Asimismo se determinó la actividad antioxidante de los extractos por las técnicas de radical ácido 2,2'– azinobis–3–etilbenzotiazolin–6–sulfónico

(ABTS.+),

desoxi–d–ribosa

(atrapamiento de radical hidroxilo), y por la inhibición de la oxidación de lipoproteínas de baja densidad (LDL). Se realizó una comparación cromatográfica de los extractos por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). La concentración de fenoles fue de 491 mg g–1a 604

mg g–1, los extractos orgánicos presentaron mayor concentración de flavonoides (292 mg g–1a 385 mg g–1) que los extractos crudos (259 mg g–1a 314 mg g–1), mientras que la concentración de proantocianidinas fue mayor en el extracto crudo (186 mg–1 a 286 mg g–1) que en el orgánico (70 mg g–1a 151 mg g–1). La capacidad de captura del radical ABTS fue de 49,48% a 57,44%, similares al que presentó el estándar catequina (57,92%). La capacidad de captura del radical hidroxilo varió de 25,85% a 48,46% y fue mayor en el extracto orgánico en todas las especies. La inhibición de oxidación de LDL fue de 64,41% a 89,39%, con valores más altos en el extracto orgánico. Los cromatogramas de HPLC muestran semejanza de los compuestos químicos en las cuatro especies. Se identificó el flavanol catequina a baja concentración en todas las especies. El compuesto principal en P. cooperi, P. engelmannii, y P. teocote, es similar en las tres especies y por espectro de UV corresponde a una flavanona.

Según ORDOÑEZ, et al. (2011). CUANTIFICARON EL CONTENIDO DE POLIFENOLES

TOTALES

Y

ANTIOXIDANTE

MEDIDA

POR

EVALUARON LA

LA

CAPACIDAD

ACTIVIDAD DE

INHIBIR

RADICALES DPPH EN HOJAS, FLORES, CORTEZA Y FRUTO DE DOS VARIEDADES DE GUAYABA (PSIDIUM GUAJAVA L.). La hoja (tiernas, maduras y yemas terminales), corteza, flores y frutos de las variedades rosada y blanca fueron recolectados, blanqueados en agua a ebullición por 30 seg., oreado temperatura ambiente (25ºC)/ 2-3 h, secado 65ºC/ 14- 16 h molido y envasado. En las muestras se realizó la determinación de polifenoles totales y la capacidad de inhibir el radical del radical 2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Según los resultados el mayor contenido de polifenoles totales correspondió a las hojas tiernas de guayaba rosada 16,466 ± 0,46 EAG (g/100g) y blanca 15,388 ± 0,24 EAG (g/100g) y el menor contenido se encontró en el fruto variedad rosado 1,435 ± 0,01 EAG (g/100g) y blanco 0,363 ± 0,01 EAG (g/100g). La mejor capacidad de inhibición el radical DPPH lo presentó las hojas tiernas de ambas variedades rosada IC50 14,086 ± 0,09 µg/mL y blanca IC5015,463 ± 0,25 µg/mL y la menor capacidad lo presento el fruto. En conclusión, la guayaba tienen un potencial para ser usado como neutraceutico a las hojas (tiernas, maduras y yemas terminales), corteza y flores y como bebida funcional a la fruta procesada.

Según RENE, et al. (2014). APLICARON UN DISEÑO FACTORIAL FRACCIONADO, PARA SELECCIONAR LAS VARIABLES CON MAYOR EFECTO SOBRE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE, EL CONTENIDO DE FENOLES Y EL RENDIMIENTO DE LA EXTRACCIÓN UTILIZANDO CO2 SUPERCRÍTICO COMO SOLVENTE SOBRE HOJAS Y TALLOS DE SALVIA OFFICINALIS L. El tiempo de extracción, el flujo de CO2, la presión de la cámara de extracción y la temperatura de separación se modificaron según el procedimiento simplex para hallar empíricamente las condiciones que produjeran extractos de salvia con el valor más alto de la combinación lineal de rendimiento de extracción, capacidad antioxidante y contenido total de fenoles.

Según CORONADO, M. y SILVA, M. (2008). UTILIZARON UN DISEÑO COMPUESTO CENTRAL (DCC) PARA INVESTIGAR EL EFECTO DE LAS VARIABLES INDEPENDIENTES DENOMINADAS CONTENIDO DE ETANOL EN EL DISOLVENTE HIDROALCOHÓLICO (%, V/V), TEMPERATURA

(ºC),

TIEMPO

(MIN)

Y

RELACIÓN

DISOLVENTE/MATERIA PRIMA (ML/G) SOBRE LAS RESPUESTAS DENOMINADAS RENDIMIENTO DE EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS (Y1) Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE (Y2). El DCC consistió de 16 puntos factoriales, 8 puntos axiales y 7 repeticiones en el punto central. Los datos fueron analizados utilizando el software Design Expert y para predecir cada respuesta se utilizó modelos polinomiales de segundo orden. El análisis de regresión, mostró que los modelos obtenidos para las respuestas Y1 e Y2 explicaron más del 92,48 y 96,81% de la variación obtenida, respectivamente. Mediante la aplicación de la metodología de Deseabilidad Global sobre los modelos polinomiales estimados se determinó que los niveles óptimos de las variables en estudio son 45,48% (v/v), 55,04 ºC, 26,79 min and 7,5 ml/g. Los valores de rendimiento de extracción y actividad antioxidante estimados por los modelos bajo los niveles óptimos de las variables son 91,55 % (p/p) y 5409,39 (μg eq. Trolox/g), respectivamente, y los obtenidos experimentalmente son 90,52 % (p/p) y 5354,27 (μg eq. Trolox/g). Se observaron una concordancia entre ambos resultados, por lo que afirma que los modelos empíricos obtenidos por la Metodología de Superficie de Respuesta pueden ser usados exitosamente para describir adecuadamente la relación

Según MUÑOZ C, et al. (2015). DETERMINARON EL CONTENIDO DE COMPUESTOS FENÓLICOS EN EXTRACTOS OBTENIDOS A PARTIR DE LA EXTRACCIÓN SÓLIDO-LÍQUIDO DE PULPA LIOFILIZADA (1:10), EMPLEANDO COMO DISOLVENTES AGUA, ETANOL Y MEZCLA ETANOL-AGUA (7:3), A TRES TEMPERATURAS 20, 50 Y 70 °C. Los rendimientos de extracción variaron entre el 26,85 % y el 50,07 %, observando rendimientos más elevados en los extractos acuosos. Se observó que el contenido de compuestos fenólicos fue directamente proporcional a la temperatura de extracción y varió entre 1469,32 ± 152,14 y 5272,51 ± 424,89 μg de ácido gálico/g de pulpa liofilizada, obteniendo valores más altos para la mezcla etanol-agua (7:3). La actividad antioxidante encontrada varió entre 20,44 ± 2,57 y 51,01 ± 1,93 mmol/L TEAC/g de pulpa liofilizada, observando una menor actividad en los extractos etanólicos. Tanto en el rendimiento de extracción, como en la determinación del contenido de fenólicos y la actividad antioxidante se observó un efecto significativo de la temperatura de extracción, asociado a cada disolvente. Los resultados obtenidos, ratifican que la C. lineatifolia es un producto natural con alto contenido de compuestos bioactivos, con potencial antioxidante que puede ser utilizado en la industria agrícola, farmacéutica, cosmética y de alimentos. 5.2.

Daledale (Calathea alloua) 5.2.1.

Descripción Botánica Según (3) El daledale es una planta de la familia de las Marantáceas, perenne y silvestre de la amazonia, nativa del norte de américa del sur y el caribe, tiene como forma macollas (brotes originados en la base de un mismo pie) de aproximadamente 1 m. de altura. Presenta raíces tuberosas ovoides o cilíndricas, de 2 a 8 cm de largo, y 2 a 4 cm de diámetro. Las hojas tienen base envolvente que forma pseudotallo cortos, peciolos largos y acanalados, son simples, alternas, con ápice acuminado, láminas elípticas, parecidas de las hojas de plátano.

5.2.2.

5.2.3.

Clasificación Taxonómica

Reino

:

Plantea

División

:

Magnoliophyta

Clase

:

Liliopsida

Subclase

:

Commelinidae

Orden

:

Zingiberales

Familia

:

Marantáceas

Género

:

Calathea

Especie

:

Calathea alloua

Forma de usos Según (3). Menciona las formas de uso del daledale. -

Alimento: las raíces tuberosas se consume cosida y frescas en ensaladas, que se, mantiene una textura crujiente.

-

Medicinal: en américa del sur, la medicina tradicional le atribuye a la tintura de las hojas como tónica y antiescrofulosa, que tiene las propiedades para el tratamiento contra la cistitis y como diurético. Las hojas frescas eran empleadas por los pueblos indígenas para la confección de ropas para bebes, por ser resistentes y durables.

5.2.4.

Zona de cultivo. Es de clima tropical lluviosos, que rinde más a pleno sol. Soporta sombra, y la producción es menos. Crecen en suelo en textura media, buen drenaje y abundante agua. Los suelos arcillosos limitan el crecimiento de las raíces tuberosas (3). Los suelos arenosos son buenos, siempre y cuando tenga agua suficiente. La prolongación es por rizomas y plántulas de la base del tallo. Se cosecha a los 8 a 12 meses, cavando alrededor de la planta para sacar los tubérculos (1). Se puede almacenar el producto durante unas 10 semanas.

5.2.5.

Potencial.

Según (3) consiste, que el daledale parece haberse originado el norte de Suramérica, aunque se desconoce su área precisa. La especie fue usada por varios grupos de amerindios y poblaciones modernas de la Amazonia, quienes consumen las raíces tuberosas o preparan extractos de hoja para utilizarlos como remedio casero para la cistitis o como diurético. Las variedades cultivadas se proponga en forma vegetativa a partir de tallos del tipo de rizoma, los rendimientos son muy variables (100g a 2.2 kg por planta) y los estimados de rendimiento van 2 a 40 t/ha. 5.2.6.

Antioxidantes Se considera como antioxidante a toda sustancia que hallándose presente a bajas concentraciones con respecto a las de un sustrato oxidable, que inhiben o retrasan la oxidación de otras moléculas mediante la inhibición de la propagación de la reacción de oxidación (4). Un antioxidante es cualquier molécula capaz de prevenir o retardar la oxidación de otras moléculas, generalmente sustratos biológicos como lípidos, proteínas o ácidos nucleicos. Asimismo todo antioxidante prolonga la vida útil de los alimentos protegiéndolo contra el deterioro causado por la oxidación (5). 5.2.6.1.

Clasificación de los antioxidantes - Antioxidantes endógenos Los antioxidantes endógenos o antioxidantes enzimáticos actúan a nivel intracelular. Existen tres sistemas principales de enzimas antioxidantes: superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CTL) y glutatión peroxidasa (GPX).

- Antioxidantes exógenos

Los extractos naturales están constituidos por diversos

compuestos

diferente

como

compuestos

de

naturaleza

polifenoles,

tiólicos,

ácido

química

isoprenoides, ascórbico

y

polisacáridos que en conjunto contribuyen, bajo diferentes

mecanismos

ejercer

la

actividad

antioxidante (GORMAZ, 2005).

Algunos de los antioxidantes no enzimáticos son: el glutatión en su forma reducida (GSH), algunos minerales como selenio, cinc, o vitaminas como riboflavina, ácido ascórbico (vitamina C) y αtocoferol (vitamina E), éstos son esenciales para la defensa contra el daño oxidante debido a que actúan

como

cofactores

de

las

enzimas

antioxidantes (KRINSKI, 2000). 5.2.7.

Compuesto fenólicos Los polifenoles se encuentran distribuidos ampliamente en alimentos de origen vegetal: frutas, cereales, hortalizas y bebidas, que intervienen como antioxidantes en alimentos de origen vegetal, para la obtención y preparación de alimentos con un alto contenido en estos compuestos, presenta una reducción en la oxidación de los alimentos; a la vez que se obtienen alimentos más saludables por conservar el valor nutricional (4).

Los polifenoles son conocidos principalmente como ácidos fenólicos y flavonoides, los ácidos fenólicos han sido repetidamente implicados como antioxidantes naturales en frutas, hortalizas y otras plantas, especialmente los flavonoides y los antocianos muestran una gran capacidad para captar radicales libres causantes del estrés oxidativo, atribuyéndoseles a su vez un efecto beneficioso en la prevención de enfermedades (6). A los compuestos fenólicos se les atribuyen actividades biológicas beneficiosas para la salud. Entre éstas destacan sus

efectos

vasodilatadores,

antiinflamatorios,

antialérgicos,

antivirales, bactericidas, estimuladores de la respuesta inmune y antioxidantes (6) 5.3.

Definición de términos básicos. 5.3.1.

Antioxidante Es una molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación de otras moléculas. La oxidación es una reacción química de transferencia de electrones de una sustancia a un agente oxidante. Las reacciones de oxidación pueden producir radicales libres que comienzan reacciones en cadena que dañan las células. Los antioxidantes terminan estas reacciones quitando intermedios del radical libre e inhiben otras reacciones de oxidación oxidándose ellos mismos.

5.3.2.

Radicales libre Los radicales libres son sustancias químicas muy reactivas que introducen oxígeno en las células, produciendo la oxidación de sus partes, alteraciones en el ADN, y que provocan cambios que aceleran el envejecimiento del cuerpo. Esto es debido a que el oxígeno, aunque imprescindible para la vida, es también un elemento químico muy reactivo.

5.3.3.

Compuestos fenólicos En la naturaleza existe una amplia variedad de compuestos que presentan una estructura molecular caracterizada por la presencia de uno o varios anillos fenólicos. Estos compuestos podemos denominarlos polifenoles (7).

VI. 6.1.

METODOS

Ubicación y descripción del área de estudio

La investigación se realizara en las instalaciones de la universidad nacional intercultural de la amazonia, ubicado en la Carretera a San José km 0.5, Puerto Callao, cuya materia prima es recolectada en la restinga, de un fundo; cuyas Coordenadas: 8°50′123″N 74°35′17″E (mapa), se empleara los ambientes del laboratorio de bioquímica, laboratorio control de calidad de agua. El proyecto de investigación tiene un periodo de seis meses para su respectiva ejecución, contando con la disponibilidad de materiales y equipos necesarios para su ejecución. 6.2.

Identificación y descripción de materiales de investigación 6.2.1. Materia Prima e Insumo La hoja del daledale, (calathea alloua) fue cosechada en el distrito de Yarinacocha en la provincia de Pucallpa, departamento de Ucayali. Las hojas del daledale serán cortadas de tamaño de 35 cm del ápice superior (cortadas en cuatro partes}, lavadas con agua potable y deshidratadas a 60 °C por 5 horas, luego se molieron y tamizaron en malla de 0,5 mm de luz. Las muestras secas y molidas de daledale, se empacaron en bolsas de polietileno y se almacena en refrigeración para su análisis posterior 6.2.2. Materiales de Laboratorio -

Microcubetas de poliestireno (1 x 1 x 4,5 cm).

-

Micropipetas (1 O- 200 11L y 200- 1000 11L).

-

Tips (1.00 y 1000 ul).

-

Fiolas (25, 50 y 1 00 ml).

-

Vasos de precipitación (50, 100 y 500 ml).

-

Frascos de vidrio color ámbar (1 ,5 cm de diámetro).

-

Embudo de vidrio.

-

Vasos de precipitación (50, 100, 500 ml).

-

Tubos de vidrio con tapa (0,5 de diámetro).

-

Gradilla.

-

Papel craf

-

Tubos de plástico de poliestireno (14 ml).

-

Mechero Bunsen.

-

Termómetro (O- 100°C).

6.2.3. Reactivos - 2.2 - azinobis -3- etilbenzotiazolina -6- ácido sulfónico (ABTSo+; Sigma Chemical Ca. USA). - 1.1 diphenyl -2- picrylhidrazyl (DPPH; Sigma Chemical Ca. USA). - Folin ciocalteau (Sigma Chemical Ca. USA). - Carbonato de sodio (Sigma Chemical Ca. USA). - Ácido gálico (Sigma Chemical Ca. USA). - Ácido ascórbico (Sigma Chemical Co. USA). - Etanol (95 %). 6.2.4. Equipos de Laboratorio - Balanza analítica plus (Ohaus Ca. Suiza). - Espectrofotómetro (UV-1201 Genesys 8 - Estufa (Precisión Scientific, USA). - Potenciómetro (lnolab Ca. Alemania). - Refractómetro (Labor Min Hungría). - Refrigeradora (Admira! USA). - Cámara de secado. - Baño María (Precisión Scientific, USA) con temperatura regulable. - HPLC

6.3.

Procesamiento

La actividad antioxidante de los extractos se midió empleando el método ABTS (6-sulfonato-3-etilbenzotiazolina) Y DPPH radical 1,1' diphenyl -2picrylhidrazyl , las mediciones de absorbancia se realizaron a 740 nm Y 515 nm empleando un espectrofotómetro (Génesis 20). El radical ABTS se generó por la reacción de oxidación del ABTS (2,2’-azino-bis-(3etilbenzotiazolin-6-sulfonato de amonio)) (3,5 mM) con persulfato de potasio (1,25 mM). Después de 24 h de reacción, se diluyó el reactivo ABTS concentrado con solución tampón fosfato a pH 7,4 hasta absorbancia 0,70, a una longitud de onda de 740 nm. Para la evaluación se emplearon 10 μL del extracto diluido en DMSO (Dimetilsufoxido) y 990 μL de la solución del radical ABTS+. Luego de 30 min de reacción a temperatura ambiente y en la oscuridad, se leyó el cambio en la absorbancia respecto a la referencia del reactivo. Se midió también el blanco y la referencia del solvente y la muestra en iguales condiciones. Los resultados se expresaron como IC50 (Porcentaje de inhibición de la muestra) y como valores TEAC mediante la construcción de una curva patrón usando diferentes concentraciones de TROLOX® (ácido 6-hidroxi2, 5, 7,8-tetrametil-2-cromanocarboxílico). 6.4.

Variables 6.3.1. Variables independientes X1 = hoja de daledale 6.3.2. Variables dependientes Y1 = actividades de antioxidantes Y2 = Compuesto fenólicos

6.5.

. Población y muestra

6.4.1. Población La cantidad de plantas del daledale que se empleará para el experimento, serán todos las que se encuentre entre las zonas específicas; de la restinga – Distrito de Yarinacocha. 6.4.2. Muestra

Como muestra se tomó tres ejemplares de la siembra de daledale, de cada sector de los fundos provenientes como el Trapiche, Fundo Pablo y el fundo Charapita, las cuales se encontraban a una distancia de 20 a 50 m de fundo a fundo. 6.6.

Tratamientos 6.5.1. Evaluación de la actividad antioxidante

Según (7), sostiene los siguientes métodos en la evaluación de la actividad antioxidantes y en la determinación de compuestos fenólicos, en desarrollo de las pruebas experimentales y análisis estadísticos. a)

Radical

2,2

azinobis

-3-ethylbenzotiazolina-6-ácido

sulfónico (ABTSo+).

Se realizó por el método del radical catión 2,2'- azinobis -3 etilbenzotiazolina

-6-

ácido

sulfónico

(ABTS0+).

La

preparación del reactivo ABTSo+ (7mM) fue en extracto acuosos - hoja de daledale (EAHD), extracto hidroalcoholico – Hoja de daledale (EHHD) y en el extracto de etanol de 95 % - Hoja daledale (EEHD) en una solución a 140 M. En las concentraciones se establecieron cuatro muestras de secado de diferentes temperaturas (50°C, 60°C, 70°C y T.A.), en diferentes concentración, de ésta solución stock se preparara soluciones de trabajo a partir de estas soluciones de trabajo se tomó 10 L que fueron reaccionadas con el ABTS0+.

La reacción in vitro se generó en una microcubeta de polietileno (1 x 1 x 4 cm) muestra (10 L) y ABTS0 + (990 L) luego

inmediatamente

se

procedió

a

la

lectura

correspondiente usándose un espectrofotómetro Genesys 8. Las absorbancias se registraron a 740 nm de longitud de onda cada 60 segundos por 30 minutos.

La inhibición de secuestro del ABTSo + fue determinado por la siguiente expresión: % de inhibición del ABTSo = [(Ac Am)/Ac] x 100 Donde: Ác = Absorbancia de la reacción del blanco del ABTSo+ Am = Absorbancia de la reacción de la muestra a los 30 minutos.

Materia Prima (Hoja de daledale – seca)

Extracto Hidroalcoholico EHHD

Extracto Acuoso EAHD

M1 50°C

M2 60°C

M3 70°C

M4 T.A.

M1 50°C

M2 60°C

M3 70°C

Extracto etanol 95° EEHD

M4 T.A.

M1 50°C

M2 60°C

M3 70°C

Reacción con ABTS0+ y monitoreando la absorbancia de 740 nm

Determinación del % de inhibición, EVC, (equivalente en vitamina C), IC50

Donde: EAHD: Extracto Acuoso de la Hoja de Daledale. EHHD: Extracto Hidroalcoholico de la Hoja de Daledale EEHD: Extracto Etanol de la Hoja de Daledale M (1, 2, 3, 4): Muestras de repeticiones de diferentes temperaturas Figura 1. Diseño experimental para la evaluación de la actividad antioxidante en el con ABTSo+

M4 T.A.

b) Método del radical 1,1' diphenyl -2- picrylhidrazyl (DPPHo) El procedimiento para la preparación del reactivo: el DPPHo se disolvió a través del extracto acuoso hoja de daledale (EAHD), extracto hidro - alcohólico hoja daledale (EHHD) y el extracto en etanol al 95 % hoja daledale (EEHD), preparándose una solución stock de 1 mM.

En las concentraciones se establecieron cuatro muestras de secado de diferentes temperaturas (50°C, 60°C, 70°C y T.A.), en diferentes concentración, a partir de estas soluciones de trabajo se reaccionaron con el DPPH° (100 M). La reacción in vitro, se generó en una microcubeta de poliestireno (1 x 1 x 4 cm) DPPH° (950 L), luego se procedió a su lectura usándose un espectrofotómetro Génesis. Las absorbancias se registraron a 515 nm cada 60 segundos por 30 minutos.

La inhibición de secuestro del DPPH° fue determinado por la siguiente expresión: % de inhibición DPPH° = [(Ac-Am) 1 Ac] x 100 Donde: Ac = Absorbancia de reacción con DPPH0 • Am = Absorbancia de la reacción de la muestra a los 30 minutos

Los resultados son sometidos a un análisis estadístico comparando las concentraciones, utilizándose un la variable independiente es el % de inhibición del DPPHo+ y la variable dependiente es la concentración de los extractos, donde existió diferencia significativa aplicamos la prueba de Duncan (p < 0,05).

El más alto % de inhibición del DPPHo fue expresado en equivalente de vitamina C, a los 30 minutos, construida de la curva estándar de 1 - 6 mg/100 ml.

El % de inhibición del DPPH0 (p < 0,05) obtenido con cada uno de las 4concentraciones; fue utilizada para determinar ~1 coeficiente de inhibición (IC50) del DPPHo • Este coeficiente de inhibición nos indica la cantidad de la hoja de daledale requerido para inhibir el 50 % del radical libre DPPHo

Materia Prima (Hoja de daledale – seca)

Extracto Hidroalcoholico EHHD

Extracto Acuoso EAHD

M1 50°C

M2 60°C

M3 70°C

M4 T.A.

M1 50°C

M2 60°C

M3 70°C

Extracto etanol 95° EEHD

M4 T.A.

M1 50°C

M2 60°C

M3 70°C

Reacciones con DPPH y monitoreado a una absorbancia de 515 nm

Determinación del % de inhibición, EVC, IC50. Donde: EAHD: Extracto Acuoso de la Hoja de Daledale.; EH HD: Extracto Hidro-alcoholico de la Hoja de Daledale EEHD: Extracto Etanol de la Hoja de Daledale M (1, 2, 3, 4): Muestras de repeticiones de diferentes temperaturas Figura 2. Diseño experimental para la evaluación de la actividad antioxidante con DPPHo

M4 T.A.

6.5.2. Correlación entre el contenido de compuestos fenólicos y la actividad antioxidante.

La evaluación de la correlación entre el contenido de compuestos fenólicos y la actividad antioxidante se realizó del siguiente modo: a)

Evaluación de compuestos fenólicos Para la evaluación de polifenoles totales se utilizó el siguiente método: - Método de Folin ciocalteau La preparación del reactivo de Folin ciocalteau en solución acuosa, Seguidamente se preparó una solución stock del extracto acuoso de la hoja de daledale, de ésta solución stock se prepararon soluciones de trabajo para las reacciones in vitro. A partir de éstas soluciones de trabajo se tomó 100 L en las soluciones que fueron reaccionadas con: 100 L de Folin ciocalteau y 2 mL de bicarbonato de sodio, para completar la reacción se dejó reposar por 30 minutos.

La reacción se generó en una microcubeta de poliestireno (1 x 1 x 4,5 cm) luego inmediatamente se procedió a su lectura correspondiente usándose un espectrofotómetro Genesys 8. Las absorban das se registraron a 740 nm de longitud de onda.

b) Determinación de compuesto fenólicos Después de la evaluación con el método de Folin ciocalteau, luego se determinó los compuesto fenólicos con el equipo de laboratorio de HPLC, en demostrar que tipo de compuesto existen en la hoja de daledale, para el uso medicinal y agroindustrial.

Materia Prima (Hoja de daledale – seca)

Extracto Hidroalcoholico EHHD

Extracto Acuoso EAHD

M1 50°C

M2 60°C

M3 70°C

M4 T.A.

M1 50°C

M2 60°C

M3 70°C

Extracto etanol 95° EEHD

M4 T.A.

M1 50°C

M2 60°C

M3 70°C

Reacción con el Folin ciocalteau por 3 minutos

Reacción con el Bicarbonato de sodio por 30 minutos

Monitoreo de la absorbancia a 740 nm

Determinación de tipos de compuesto fenólicos - HPLC

Figura 3. Diseño experimental para la evaluación y Determinación de Compuesto Fenólicos.

6.7.

Recolección de los datos

M4 T.A.

Los datos se obtendrán mediante observación directa que emitirán los de equipos de medición, estos previamente calibrados 6.7.1. Fuentes de Información

Fuente primaria Para la recolección de información en el proyecto, se usará la técnica de observación, la cual nos permitirá reconocer de manera clara el problema planteado en la presente investigación para dar una solución óptima en la evaluación de la actividad de antioxidantes y la determinación de compuesto fenólicos de la hoja de Daledale. Fuentes secundarias Se obtendrá información a partir de fuentes secundarias externas a través de artículos encontrados en bases de datos (Universia, Science direct, Dialnet, Scielo, entre otras), y tesis publicadas en diferentes bibliotecas virtuales del país o el extranjero, que contienen información relacionada con el tema de interés y nos dará un amplio conocimiento de cómo podrían comportarse las variables dependientes al tener una manipulación controlada de las variables independientes. 6.7.2. Unidad experimental y unidad de medición Se tomará como unidades experimentales, 50 gramos de materia prima, para cada una de los ensayos de extracción del principio activo, así como sus respectivas repeticiones. 6.7.3. Tipo de muestreo Se comprenderá un muestreo a lazar o intencional, del sector de los fundos provenientes como el Trapiche, Fundo Pablo y el fundo Charapita; donde se obtendrá muestras representativas mediante la inclusión en la muestra de ejemplares de daledale de fácil accesibilidad y que presenten un mayor largo y diámetro de las hojas frescas, a fin de evitar generar daños drásticos cuando las hojas se extraen.

6.7.4. Técnicas de recolección de datos Los datos se obtendrán mediante observación directa que emitirá el

equipo de

Espectrofotómetro (UV-1201),

HPLC,

esto

previamente calibrado. Para la recolección de datos se utilizaran alavés instrumentos como tablas, revistas científicas que contenga estudios previos relacionados a la planta y su uso en la salud.

Además se empleara un diario de campo, en el que se consignará la información obtenida de las diferentes observaciones que se llevaran a cabo. De la mano se utilizara las entrevistas semi estructuradas, por ser un valiosos instrumento que nos aportara información adicional a la obtenida atreves de los equipos empleados, en las entrevistas se trataran aspectos como, modo de preparación y parámetros de selección de las plantas. 6.8.

Procesamiento de los datos.

Los resultados de la investigación se trasladaran a través de programas estadísticos los cuales mostraran el porcentaje o cantidad de antioxidantes y compuestos fenólicos por parte fisiológica de la planta, que presenten las muestras evaluadas.

Entre los programas a considerar; Excel gráficos y cálculos, SPSS para el análisis estadístico y STATGRAPHICS.

VII.

CRONOGRAMA

MESES

ACTIVIDAD 1

2

3

4

5

6

7

8

Presentación y aprobación proyecto tesis

X

Revisión de literatura

X X X X X X X X

Adquisición insumos (Hojas)

X X X

Preparación de la muestra.

X X X X X

Inmersión de la partes fisiológicas ( Hoja

X X X X X

Daledale), aplicaciones de los métodos ABTSo , DPPHo, Folin Ciocalteau, HPLC, Tres extractos (EAHD, EHHD Y EEHD) Proceso de extracción.

X X

Análisis del Antioxidante y compuesto fenólicos.

X X

Recolección de datos Procesamiento de datos Redacción Presentación y aprobación

X X X X X X X X X X X X X X X X

Sustentación

X

Publicación

X

VIII.

PRESUPUESTO

Costos (s/.) ITEM 1.Material biológico 1.1 Hoja Daledale 2. Materiales de Escritorio 2.1 Internet 2.2 Cuaderno de apunte A

Unidad

Hora Unidad

Cantidad

-

PRECIO unitario (s/.) -

Monto total -

2.5 Lapicero 2.6 folder 3.Equipo

Unidad Unidad

150 3 0.5 200 3.00 2

3.1.alquiler de cámara fotográfica 4. Análisis de laboratorio

Unidad

1

100,00

100.00

Unidad Unidad Unidad Unidad Unidad Unidad Unidad

1 10 2 1 2 1 1

0.00 44.00 0.00 360.00 20.00 0.00 500.00

0.00 440.00 0.00 360.00 40.00 0.00 500.00

Lt

200 ml

4800.00

960.00

Lt

200 ml

5600.00

1120.00

Lt

200 ml

1000.00

200.00

Hojas A4 Unidad

500 6

0.30 40.00

150.00 240.00 4426.50

2.3 Papel Bond A4 2.4 Impresiones

4.1. Estufa 4.2. Espectrofotómetro 4.3. Balanza analítica digital (*) 4.8. Potenciómetro (pH) 4.9. Refractómetro 4.10. Baño María 4.11. HPLC 5. Reactivos 5.1. 2.2 - azinobis -3etilbenzotiazolina -6- ácido sulfónico (ABTSo) 5.2. 1.1 diphenyl -2- picrylhidrazyl (DPPH) 5.3. Folin ciocalteau 6.Elaboración de Informe Final 6.1 Impresiones 6.2 Empastado TOTAL

Millar Hoja A4

1.50 2.00 28 0.3 0.50 5.00

225.00 6.00 14.00 60.00 1.50 10.00

IX.

BIBLIOGRAFÍA

1. BUSTAMANTE, PAULA DENISSE VALENZUELA. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FENOLES TOTALES Y FLAVONOIDES DE HOJAS DE DIFERENTES GENOTIPOS DE UGNI MOLINAE TURCZ. . Santiago - CHILE : s.n., 2015 . 2.

PALADINO, SILVIA CRISTINA. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS CONTENIDOS EN LAS SEMILLAS DE LA VID (Vitis vinifera l.). Universidades Nacionales de Cuyo : s.n., 2010.

3. BRACK EGG, ANTONIO. Peru: Diez mil años de domesticacion. Lima - Peru : Bruño, 2003. 4. VALVERDE., MARTÍNEZ -, PERIAGO, M. y RUS, G. significado nutricional de los compuestos fenólicos en la dieta. . s.l. : ALAN, 2000. 5. CADENAS, E. Y L. PARKER. Hadbook of antioxidants. New York. USA : Madison, 2002. 6. MARTÍNEZ FLÓREZ S., GONZÁLES GALLEGO J., CULEBRAS J.M., TUÑÓN M.J. Los Flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Universidad de la Habana : s.n., 2002. 7. RUIZ, IRIS OLIVIA YANCE. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE, POLIFENOLES TOTALES EN EL EXTRACTO ACUOSO DE HIERBA LUISA (Cymbopogon citratus Staph), Y SU ESTABILIDAD EN MODELOS DE BEBIDA. TINGO MARIA- PERÚ : s.n., 2004. 8. GONZÁLEZ - TORRES, M. C. y BETANCOURT-RULE, M. Y. ORTÍZ. Daño oxidativo y antioxidantes. Bioquímica. 2000. 9. LEÓN, J. Botánica de los cultivos tropicales. Instituto Americano de . San José-Costa Rica : s.n., 1968.