Lezione Tecniche 2006

Le Tecnologie di Biologia Molecolare nella ricerca Biomedica

La possibilità di accedere a tecnologie del DNA ricombinante rappresenta un grande vantaggio per la ricerca biomedica.

Queste tecnologie possono essere particolarmente utili per: g) Aiuto nella formulazione di una diagnosi; h) Caratterizzazione funzionale di un fattore genetico;

Tecnologie considerate PCR RT-PCR Sequenziamento

DNA cDNA DNA

Southern Blot Northern Blot

DNA RNA

Diagnosi di difetto genetico Paziente con cariotipo XY ma con fenotipo femminile 15-20% di questi pazienti hanno un’alterazione del gene SRY Analisi del gene SRY Delezione

Totale

Parziale

Mutazione puntiforme

Delezione

Totale

Mutazione puntiforme

Parziale

PCR

Sequenziamento

Migrazione elettroforetica del DNA Il DNA (e l’RNA) possiede carica negativa e pertanto in particolari matrici (gel di agarosio e poliacrilammide) se sottoposto ad un campo elettrico tende a migrare verso il polo positivo. La velocità con cui un frammento migra verso il polo positivo è proporzionale alla sua dimensione M 1,353 bp 1,078 bp 852 bp 603 bp 310 bp 271 bp 194 bp

Necessari metodi di rilevamento per “vedere” il DNA (o RNA)

98 bp

EtBr

PCR Polymerase Chain Reaction Reazione a catena di polimerizzazione del DNA

Obiettivo Produrre una notevole quantità di copie di un frammento di DNA di interesse che viene sottoposto ad amplificazione

PCR

1988

PCR 5’ 3’

Primer F

3’

Primer Regione di interesse (non necessaria la conoscenza della sequenza) Reazione enzimatica con:

DNA polimerasi dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) A C T G 2 primers (innesco) Template (stampo)

R

5’

PCR

Animazione

Applicazioni della P C R

Fornisce una risposta qualitativa (c’è o non c’è?) su una data sequenza genomica

PCR – analisi mutazionale di geni

Prodotti di PCR

Sequenziamento diretto SSCP DDGE

PCR – Tipizzazione polimorfismi (varianti neutre del DNA)

Prodotto di PCR

Digestione enzimi di restrizione RFLP

VNTR (Variation Number Tandem Repeat) SNP (Single Nucleotide Polimorphism)

PCR – Genotipizzazione VNTR (Microsatelliti)

GATCAGCTGAGGACTATAGCCAGTCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACTGACCCAGTTTAACAGAATAGCAAC

p

M

RT - P C R Polymerase Chain Reaction Reazione a catena di polimerizzazione del DNA Il materiale di partenza è RNA che viene retrotrascritto in cDNA Studio dell’espressione dei geni (++)

RT AAAAA

AAAAA

AAAAA

AAAAA

tessuto

AAAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTTT

Reverse transcriptase cDNA

RT - PCR cDNA

PCR positiva = gene espresso nel tessuto da cui è stato estratto l’RNA

RT - PCR Qualitativa: “espresso, non espresso” Quantitativa: “quanto è espresso” (con speciali accorgimenti e/o speciali apparecchiature) Serve anche a verificare eventuali fenomeni di splicing alternativo in funzione dei primers utilizzati

Isoforma 1 Isoforma 2 Rapidità, scarsità di materiale

RT-PCR Un vantaggio della tecnologia di RT-PCR è la possibilità di amplificare e sequenziare direttamente un gene che possiede una struttura esoni/introni molto frammentata.

- Disponibilità di un tessuto che esprima il gene

RT-PCR Analisi di mutazioni che non interessano il cds ma che comprendono siti di splicing

ag

gt

ag

at

ag

gt

Splicing normale Splicing aberrante

- Disponibilità di un tessuto che esprima il gene

Sequenziamento Per sequenziamento si intende la lettura ordinata delle basi che compongono una catena di DNA La tecnologia odierna permette di attuare facilmente questo processo solo in presenza di una notevole quantità di copie del frammento da sequenziare Prodotti di PCR Cloni plasmidici, BAC, PAC DNA genomico

Sequenziamento Senso della lettura

Lettura possibile di 600-800 basi dopo l’oligonucleotide-innesco

Sequenziamento GTTTCAT AGTCAAAGTACAGTGATCATAGCGATATCGATGTGTGACAGTAG MOLTE COPIE!!!!!

Reazione enzimatica con:

DNA polimerasi dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) - 90% A C T G ddNTP (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP) – 10% A C T G 1 Primer innesco

Sintesi nuovo DNA

Sequenziamento GTTTCAT AGTCAAAGTACAGTGATCATAGCGATATCGATGTGTGACAGTAG GTCACT GTCACTAGTAT GTC GTCACTAGTATCGCTATA GTCACTAGTATCG GTCACTAGTATCGCTATAGCT GTCACTAGTATCGCTATAGCTACACAC

GTCACTAGTATCGCTATAGCTACACACTGTCATC

Sequenziamento GTTTCAT AGTCAAAGTACAGTGATCATAGCGATATCGATGTGTGACAGTAG G GT GTC GTCA GTCAC GTCACT GTCACTA GTCACTAG GTCACTAGT GTCACTAGTA GTCACTAGTAT GTCACTAGTATC Migrazione elettroforetica GTCACTAGTATCG GTCACTAGTATCGC + GTCACTAGTATCGCT GTCACTAGTATCGCTA Lettura fluorocromi GTCACTAGTATCGCTAT GTCACTAGTATCGCTATA GTCACTAGTATCGCTATAG GTCACTAGTATCGCTATAGC GTCACTAGTATCGCTATAGCT GTCACTAGTATCGCTATAGCTA GTCACTAGTATCGCTATAGCTAC GTCACTAGTATCGCTATAGCTACA GTCACTAGTATCGCTATAGCTACAC

Sequenziamento -

+

Lettore laser

Animazione

Ibridazione Acidi Nucleici SONDA (DNA o cDNA)

TAGCAAACGCATCACGTCA

TAGCAAACGCATCACGTCA ATCGTTTGCGTAGTGCAGT

Ibridazione Acidi Nucleici

In funzione di alcuni parametri operativi della tecnica possiamo ottenere ibridazioni altamente specifiche oppure permettere ibridazioni meno specifiche.

Southern Blot Attuata sul DNA DNA digerito con enzimi di restrizione e sottoposto a elettroforesi Tecnica che fornisce una risposta qualitativa e quantitativa Tecnica utilizzata per individuare la presenza (o assenza) di un frammento di acido nucleico in un genoma

Southern Blot Migrazione Gel agarosio 10 Kb

DNA

Trasferimento su membrana di nylon

Digestione con EcoRI

Denaturazione Con NaOH

Fissazione

M

T -

5 Kb 3 Kb 2 Kb 2.5 Kb

+

Southern Blot ATGGCAGTAACG Marcatura

ATGGCAGTAACG

Ibridazione

Lavaggi

Rivelazione

Southern Blot

3 Kb

EcoRI

EcoRI

ATGGCAGTAACG 3 Kb

Applicazioni possibili Identificazione aberrazioni cromosomiche strutturali Delezioni Duplicazioni Inversioni …… Tutte quelle aberrazioni cha causano un cambiamento della lunghezza del frammento compreso tra i due siti di taglio dell’enzima utilizzato e contenente la sequenza specifica della sonda utilizzata.

SB - Delezione EcoRI

EcoRI

EcoRI

EcoRI

WT

wt/wt wt/-

-/-

EcoRI

SB - Delezione EcoRI

EcoRI

EcoRI

EcoRI

WT

wt/wt wt/-

-/-

EcoRI

EcoRI

SB - Duplicazioni EcoRI

EcoRI

EcoRI

EcoRI

WT

wt/wt wt/-

-/-

EcoRI

EcoRI

EcoRI

SB - Inversioni EcoRI

EcoRI

EcoRI

EcoRI

WT

wt/wt wt/-

-/-

EcoRI

EcoRI

EcoRI

delezione EcoRI EcoRI

Paziente 10

Paziente 9

Paziente 8

Paziente 7

Paziente 6

Paziente 5

Paziente 4

Paziente 3

Paziente 2

Paziente 1

Test.

Southern Blot - Test

Southern Blot – tra specie diverse Attuando lavaggi meno stringenti posso evidenziare sequenze simili tra specie diverse, ossia permettere un minor numero di legami tra sonda e sequenza omologa, e quindi evidenziare la presenza o meno di una sequenza simile. ZOO-BLOT

Chiken

Turtle

Sheep

Goat

Cattle

Pig

Rat

Mouse

Cat

Dog

H. Sapiens

ZOO - Blot

Northern Blot Attuata sull’RNA RNA non digerito Tecnica che fornisce una risposta qualitativa e quantitativa Tecnica utilizzata per individuare la lunghezza di un mRNA e per studiare l’espressione di un gene nei diversi tessuti

Northern Blot AAAAAAA

AAAAAAA

Migrazione Gel agarosio 10 Kb

AAAAAAA AAAAAAA

M

T -

5 Kb

Trsferimento Su membrana

3 Kb mRNA 2 Kb 2.5 Kb

+

Fissazione

Northern Blot ATGGCAGTAACG Marcatura

ATGGCAGTAACG

Ibridazione

Lavaggi

Rivelazione

Northern Blot

3 Kb

ATGGCAGTAACG 3 Kb

AAAAAAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

Espres. Ubiquitaria

Splicing Alternativo Rene

Placenta

HeLa

Surrene

Cervello

Intestino

Pelle

Milza

Fegato

Ovaio

Testicolo

Northern Blot

AAAAAA

Espres. Specifica Rene

Placenta

HeLa

Surrene

Cervello

Intestino

Pelle

Milza

Fegato

Ovaio

Testicolo

Northern Blot

AAAAAA

Quantitativa Rene

Placenta

HeLa

Surrene

Cervello

Intestino

Pelle

Milza

Fegato

Ovaio

Testicolo

Northern Blot

AAAAAA

Quantitativa HeLa

14 dpc

13 dpc

Testis 12 dpc

11 dpc

10 dpc

14 dpc

13 dpc

12 dpc

11 dpc

10 dpc

Northern Blot Ovary

Southern e Northern Blot Tecniche di ibridazione di acidi nucleici Tecniche cha forniscono una risposta quantitativa Tecniche cha forniscono una risposta qualitativa

Southern e Northern Blot Evidenziare e quantificare la presenza di una regione genomica Evidenziare e quantificare la presenza di un trascritto di un gene in un dato tessuto in un dato momento