Lecture 2 2006

Fig. 1. (a, b, and k) Soluble chromatin from chicken erythrocyte nuclei vitrified in [approx]5 mM M+ and imaged unfixed and unstained in the frozen hydrated state

Bednar, Jan et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14173-14178

Copyright ©1998 by the National Academy of Sciences

Fig. 3. (a) Stereo pair of a 3D model of a 9-nucleosome segment of a chicken erythrocyte chromatin fiber imaged in [approx]5 mM M+

Bednar, Jan et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14173-14178

Copyright ©1998 by the National Academy of Sciences

Намотанная на нуклеосомы ДНК организована в “скрытую” или компенсированную суперспираль, которая может быть обнаружена после удаления гистонового октамера. Феномен особенно хорошо изучать на кольцевых молекулах

2М NaCl

Linking number paradox

топоизомераза топоизомераза 2М NaCl

нагревание Нагревание + релаксация

13 11

Lk – linking number – число перекрещиваний нитей ДНК Tw – twisting – количество витков двойной спирали ДНК Wr – количество супервитков

Lk = Tw + Wr

Разделение топоизомеров в низковольтном агарозном форезе

Существуют различные способы оценки размеров петель ДНК, закрепленных на ядерном матриксе. Согласно большинству имеющихся данных, размер петель составляет от 50 до 200 т.п.н.

Петли ДНК в ядрах клеток CHO, экстрагированных 2M раствором NaCl

Для активных генов характерна предпочтительная чувствительность к ДНКазе I при обработке последней ядер или пермеабилизованных клеток В эритроидных клетках глобиновые гены предпочтительно чувствительны к ДНКазе I ДНКаза I ovalbumin βA-globin

Существует целый ряд факторов, влияющих на степень конденсации хроматина, среди которых наиболее изучено ацетилирование гистонов

Как выделить транскрипционно-активную фракцию хроматина?

Выделение коротких фрагментов хроматина, солюбилизирующихся при коротком нуклеазном переваре

Фракционирование на ртутной колонке (Allfrey)

Ацетилирование лизиновых остатков в N­”хвостах” гистонов Н3 и Н4

Лизиновый остаток в аминокислотной цепи

N O

C C γ α β C C

C δ

ε C

O

O

-

N+

O

Acétyl-CoA C O

-

HAT (Histone

HDAC

AcétylTransférase)

C O

(Histone Désacétylase)

CoA N Ацетлированный остаток лизина утрачивает заряд

C O

C

C

C C

ε C

C

N C O

ДНК

P O

В нуклеосомной частице существует много доступных для ацетилирования лизиновых остатков

Анализ уровня ацетилирования гистонов электрофоретическая система принцип разделения electrode:

SDS

AU (Acetic Acid – Urea)

по размеру

1M acid, pH ~3 in 5-8 M urea по размеру и заряду

_

+

++ ++

H3

H4

135 aa

H3 H3 H4

102 aa

electrode:

135 aa

+

++ +

H4

102 aa

_

Densitometry of Coomassie dye

Для активного хроматина характерен повышенный уровень ацетилирования гистонов

Ацетилирование гистонов не только препятствует компактной упаковке нуклеосомной нити, но и приводит и пространственной реорганизации самих нуклеосом. Считается, что такая реорганизация облегчает транскрипцию организованной в нуклеосомы ДНК HAT

HDAC

Bazett-Jones DP, Mendez E, Czarnota GJ, Ottensmeyer FP, Allfrey VG. Nucleic Acids Res. 1996 Jan 15;24(2):321-9. Нуклеосомы не связавшиеся с иммобилизированными на носителе ионами ртути

Нуклеосомы, связавшиеся с ртутной колонкой

Хроматин, собранный in vitro (в экстрактах из эмбрионов дрозофилы) с использованием плазмидной ДНК и гиперацетилированных гистонов, обладает всеми основными характеристиками активного хроматина Krajewski and Becker, 1998

Ацетилированные гистоны были получены из клеток CV1, обработанных трихостатином А (TSA)

Хроматин, собранный с использованием ацетилированных гистонов, обладает повашенной чувствительностью к ДНКазе I

Хроматин, собранный с использованием ацетилированных гистонов, в меньшей степени ограничивает конформационную подвижность ДНК, чем обычный хроматин -H1

+H1

Модификации гистона Н3 • •

N-концевой домен без модификаций N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP 4 lysines (K9, K14, K18, K23) мишени для ацетилирования

•

N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP Avec deux sérines (S10, S28) phosphorylées

•

N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP Avec 3 lysines (K4, K9, K27) méthylées

•

N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP Avec 3 arginines (R2, R17, R26) méthylées

•

N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP Onze des 30 résidus sont modifiables : N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP

Модификации гистона Н3 • •

N-концевой домен без модификаций N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP 4 lysines (K9, K14, K18, K23) мишени для ацетилирования

•

N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP 2 sérines (S10, S28) мишени для фосфорилирования

•

N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP Avec 3 lysines (K4, K9, K27) méthylées

•

N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP Avec 3 arginines (R2, R17, R26) méthylées

•

N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP Onze des 30 résidus sont modifiables : N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP

Модификации гистона Н3 N-концевой домен без модификаций

• •

• •

N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP 4 lysines (K9, K14, K18, K23) мишени для ацетилирования N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP 2 sérines (S10, S28) мишени для фосфорилирования N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP 3 lysines (K4, K9, K27) мишени для метилирования N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP Avec 3 arginines (R2, R17, R26) méthylées N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP Onze des 30 résidus sont modifiables : N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP

Модификации гистона Н3 N-концевой домен без модификаций

• •

• •

N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP 4 lysines (K9, K14, K18, K23) мишени для ацетилирования N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP 2 sérines (S10, S28) мишени для фосфорилирования N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP 3 lysines (K4, K9, K27) мишени для метилирования N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP 3 arginines (R2, R17, R26) мишени для метилирования N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP Onze des 30 résidus sont modifiables : N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP

Расположение сайтов, по которым могут осуществляться модификации гистонов

утверждение о том, что в активном хроматине гистоны ацетилированы, а в неактивном метилированы не является верным Метилирование по некоторым позициям (например K4 гистона Н3) является типичным для активного хроматина

Распределение ацетилированных форм гистонов в протяженных доменах генома можно изучать с использованием метода иммунопреципитации хроматина (ChIP)

Области, характеризующиеся повышенным уровнем ацетилирования гистонов Н3 и Н4, в первом приближении совпадают с областями, характеризующимися предпочтительной чувствительностью к ДНКазе I.

Для активных доменов хроматина характерен повышенный уровень ацетилирования гистонов. Распределение ацетилированных форм гистонов в протяженных областях генома можно изучать с помощью иммунопреципитации хроматина CHIP

В доменах бета-глобиновых генов и других доменах ткане-специфичных генов области, характеризующиеся повышенным уровнем ацетилирования совпадают с областями предпочтительной чувствительности к ДНКазе I

Динамика хроматиновых доменов регулируется ацетилазами и деацетилазами гистонов. Как гистон-ацетилазы, так и гистондеацетилазы входят в состав больших мультисубъединичных комплексов

HAT

Охарактеризован ряд ферментов, избирательно модифицирующих индивидуальные остатки лизина в гистонах H3 и Н4

Murine G9a is H3-K9 methyltransferase SUV39H1 and murine Suv39h1--mammalian homologues of Drosophila Su(var)3-9 and of Schizosaccharomyces pombe clr4--encode histone H3-specific methyltransferases that selectively methylate lysine 9 of the amino terminus of histone H3 in vitro

MOF is Drosophila site-specific MYST family histone acetyltransferase that acetylate H4 at specific positions in male X-chromosome

РНК-полимераза может служить “транспортным средством”, обеспечивающим прогрессивное ацетилирование протяженного геномного домена Travers, 1999

Cуществует мнение, что ацетилированные гистоны в транскрипционно-активном хроматине постепенно замещаются вариантными формами гистонов. Это замещение может иметь процессивный характер, причем процессивность может обеспечиваться белками, связанными с элонгирующей РНК-полимеразой II

Workman, Jerry L. and Abmayr, Susan M. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 1429-1430

Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences

Для анализа распределения вариантных форм гистонов в протяженных областях генома используют метод иммунопреципитации и последующую гибридизацию с олигонуклеотидными чипами (ChIP on CHIP)

Genome-scale profiling of histone H3.3 replacement patterns. Mito Y, Henikoff JG, Henikoff S.

H3.3 замещает H3 в местах активной транскрипции, особенно, если H3 метилирован по лизину 4

Distributions of H2A.Z and AcH2A.Z at two housekeeping genes, GAPDH and vimentin and the tissue-specific gene carbonic anhydrase in HD37 erythroblasts

Характерные для активного хроматина вариантные формы гистонов также могут ацетилироваться, причем присутствие ацетилированных вариантных форм гистонов (в частности H2A.Z, хараткерно для промоторов активных генов

Distributions of H2A.Z and AcH2A.Z at two housekeeping genes, GAPDH and vimentin and the tissue-specific gene carbonic anhydrase in HD37 erythroblasts. The bottom panel shows four amplicons at inactive sequences in HD37 cells and 15DCE. B/I values (the ratio of the Bound to the Input signal for an amplicon) above the unity lines represent ‘fold enrichment’ achieved by the antibodies. I/B values are plotted below the unity lines when the Bound signal is less than that of the Input: this ratio represents ‘fold depletion’.

Bruce, K. et al. Nucl. Acids Res. 2005 33:5633-5639; doi:10.1093/nar/gki874 Copyright restrictions may apply.

Distributions of H2A.Z, AcH2A.Z, AcH4, AcH3 and AcH2B at the lysozyme locus in HD37 erythroblasts

Bruce, K. et al. Nucl. Acids Res. 2005 33:5633-5639; doi:10.1093/nar/gki874 Copyright restrictions may apply.

Гистон-деацетилазы также входят в состав больших мультисубъединичных белковых комплексов NuRD (2 MDa) (Nucleosome Remodeling and histone Deacetylation

(млекопитающие и ксенопус)

SIN3 (млекопитающие и дрожжи) связывание с метилированной ДНК

MeCP2

nucleosome remodeling

Помимо HDAC 1 и 2 известно еще 4 гистондеацетилазы

Удаляются ли нуклеосомы при транскрипции? Метод белковых теней

Работающая РНК-полимераза раскручивает ДНК, создавая домен позитивной суперспирализации перед собой и домен негативной суперспирализации позади себя. Нуклеосома связывает негативные супервитки в силу чего с чисто энергетичесой точки зрения она будет стремиться переместиться в негативно суперспирализованный домен

Перенос кор-частицы за полимеразу (модель Фельзенфельда, подтвержденная Студицким в экспериментах с использованием РНК полимеразы фага Т7)

Ключевую роль в обеспечении возможности транскрипции полимеразой II ДНК, организованной в нуклеосомы играет временное удаление димера H2A-H2B Взаимодействие димера H2A.Z-H2B с тетрамером (H3-H4)2 слабее, чем взаимодействие с тетрамером димера Н2A-H2B в нормальной нуклеосомной частице (вывод, сделанный на основе анализа кристаллической структуры нуклеосом, построенный из нормальных и вариантных форм H2A) Экспериментально продемонстрировано, что РНК-полимераза II избирательно связывается с хроматином, в котором нуклеосомы не солержат одного из димеров H2A-H2B. Pol II

В модельном эксперименте продемонстрировано, что транскрипция через нуклеосому приводит к практически полной утрате одного из димеров Н2A-H2B

H3-H4 H2A-H2B H2A-H2B

Элонгационный комплекс

H3-H4 H2A-H2B H3-H4

Pol II H2A-H2B

H3-H4

Главную роль в удалении димера H2A-H2B (H2A.Z-H2B) играет фактор элонгации транскрипции FACT, выполняющий функцию шаперона

FACT

SSRP1 (HMG-box-containing protein p140/hSpt16 (человеческий гомолог дрожжевого Spt16./Cdc68) С-концевая часть Spt16 обогащена кислыми аминокислотами, что является характерной особенностью всех переносчиков гистонов)

FACT физически взаимодействует с нуклеосомами. Для оптимальной эффективности транскрипции FACT должен присутствовать в эквимолярном количестве по отношению к нуклеосомам (в модельной системе)

FACT участвует как в дестабилизации и разрушении нуклеосом перед продвигающимся транскрипционным комплексом, так и в сборке нуклеосом после прохождения транскрипционного комплекса. FACT взаимодействует с димерами H2A-H2B (зеленые прямоугольники) Другой фактор (Spt6) служит переносчиком димеров Н3-Н4 (желтые прямоугольники)

Фактор Сhd1, участвующий в сборке нуклеосом, физически взаимодействует с одной из субъединиц FACT (SSRP1)

АКТИВНЫЙ ХРОМАТИН 1. Повышенный уровень ацетилирования гистонов 3. Частичная утрата димеров Н2А-Н2В (при участии белкового комплекса FACT (Facilitated Chromatin Transcription) 6. Частичное разворачивание нуклеосом (разрушение дисульфидного мостика между двумя молекулами Н3 и экспозиция свободных SH групп) 9. Присутствие специфических вариантов «коровых» гистонов (H2A.Z, H3.3) 11. Недопредставленность Н1 и некоторое обогащение различными типами HMG белков. Нуклеосомы, построенные при участии H2A.Z могут удерживать на поверхности ион металла (Mn++, Zn++, Cu++). Наличие иона металла на поверхности нуклеосом обеспечивает возможность связывания факторов ремоделирования хроматина, содержащих PHD домены

Транскрипционно-активная фракция хроматина характеризуется реорганизацией 1. индивидуальных нуклеосом 2. 30 нм фибриллы