Lecture 4 2006

сайты связывания транскрипционных факторов

(не всегда)

UAS

core promoter

Upstream Activating Sequences

TATA inr

участок начала транскрипции

YYANt/aYY пиримидиновый бокс

ген

для инициации транскрипции РНК полимеразой II необходимы шесть так называемых «общих» (general) факторов транскрипции

сайты связывания транскрипционных факторов

(не всегда)

UAS

core promoter

Upstream Activating Sequences

TATA inr

участок начала транскрипции

YYANt/aYY пиримидиновый бокс

ген

TAFs (TBP-associated factors) обеспечивают связывание с промоторами, не содержащими ТАТА бокса

TFIID

содержат участки взаимодействия с тканеспецифичными транскрипционными факторами

TAFs

TBP

TAF(II)250 имеет активность ацетилтрансферазы TAF(II)55 ингибирует эту активность

сайты связывания транскрипционных факторов

(не всегда)

UAS

core promoter

Upstream Activating Sequences

TATA inr

участок начала транскрипции

YYANt/aYY пиримидиновый бокс

ген

При наличии сильного промотора с ТАТА боксом один TBP может заменить TFIID и обеспечить инициацию транскрипции по крайней мере in vitro

TBP

сайты связывания транскрипционных факторов

(не всегда)

UAS

core promoter

Upstream Activating Sequences

TATA inr

участок начала транскрипции

YYANt/aYY пиримидиновый бокс

ген

различные транскрипционные факторы

TAFs TFIID UAS

TBP TATA core promoter

inr

участок начала транскрипции

YYANt/aYY пиримидиновый бокс

ген

TAFs TFIID UAS

TBP TFIIA TFIIB

inr

ген

TFIIA и TFIIB стабилизируют взаимодействие TBP с ДНК, контактируя одновременно с ДНК и TBP

TAFs TFIID UAS

TBP

Pol II TFIIF

TFIIA TFIIB

inr

ген

TFIIF обеспечивает посадку РНК полимеразы II на формирующийся коплекс

TAFs TFIID UAS

TBP

Pol II TFIIF

TFIIA TFIIB

TFIIH

ген

TFIIE

Последними к комплексу присоединяются TFIIE и TFIIH. TFIIH представляет собой АТФ-зависимую ДНК-хеликазу, которая обеспечивает локальное плавление ДНК в точке начала транскрипции

Промотор узнает не РНК полимераза II, а входящий в состав TFIID фактор TBP

Даже в том случае, когда промотр не имеет выраженного ТАТА бокса, ключевую роль в узнавании промотора играет фактор TFIID, который взаимодействует с транскрипционными факторами, связанными с UAS. Функцию посредников при этом выполняют TAFs.

Остальные “общие” транскипционные факторы стабилизируют комплекс РНК Полимеразы II с промотором и обеспечивают локальное плавление ДНК

Перед началом элонгации выделяют особую стадию «освобождения промотора» При этом часть общих транскрипционных факторов остается на промоторе, тогда как другие (TFIIF) перемещаются вместе с элонгирующим полимеразным комплексом. В момент освобождения промотора элонгирующий комплекс остается крайне нестабильным и может легко «соскачить с ДНК». Комплекс заметно стабилизируется после включения 8-9 нуклеотидных остатков (именно такова длина ДНК-РНК гибрида в составе транскрипционного комплекса)

Важную роль в переходе от «инициаторного» к элонгирующему комплексу играет фософорилирование сериновых остатков 2 и 5 в повторяющихся много раз гегтапептидах YSPTSPS С’-концевого домена каталитической субъединицы РНК-полимеразы II. Первичное фосфорилирование серинов 5 осуществляет киназная субъединица (Kin28) транскрипционного фактора TFIIH

Для РНК полимеразы II и ее аналогов у других организмов характерна тенденция к временной (пауза) или бессрочной (арест) остановке элонгации. Для обеспечения эффективной элонгации необходим целый ряд вспомогательных факторов, один из которых (TFIIF) является общим фактором транскрипции.

Существует и негативный фактор элонгации NELF, который стимулирует остановку PolII. NELF связывается с комплексом PolII-DSIF

стимулирует РНказную активность полимеразы II

Энхансеры и сайленсеры модулируют «скорость» транскрипции

1 минимальный промотор

2

ген-репортер (САТ)

энхансер минимальный промотор

ген-репортер (САТ)

3

энхансер минимальный промотор

ген-репортер (САТ)

количество продукта или мРНК

1

2

3

номер конструкта

Энхансеры могут располагаться где угодно

перед промотором иногда непосредственно и тогда они фактически выполняют роль UAS иногда на большом расстоянии (более 100 Kb)

р р

ген ген

внутри гена

р

ген

после гена

р

ген

Не вполне ясно, что именно регулируют энхансеры А. Скорость работы промотора (число инициаций в единицу времени) ? Б. Статус промотора (активный / неактивный) ?

Механизм работы энхансеров также остается неясным

Все известные в настоящее время энхансеры представляют собой площадки для связывания транскрипционных факторов. Транскрипционные факторы могут быть универсальными и тканеспецифичными Соответсвенно, и энхансеры могут быть универсальными и тканеспецифичными

Большинстви вирусных энхансеров являются универсальными Энхансеры вирусов SV-40, Polyoma, CMV универсальный транскрипционный фактор Sp1

Примером тканеспецифичных энхансеров могут служить энхансеры глобиновых генов эритроид-специфичный транскрипционный фактор GATA-1

Перед началом активной транскрипции должна быть осуществлена активация хроматина

Ацетилирование гистонов Ремоделирование нуклеосом (SWI/SNF) Удаление белков гетерохроматина (HP1) Замещение стандартных нуклеосмом нуклеосомами, содержащими вариантные формы гистонов (Н3.3, Н2A.Z)

NuRF

UAS

core promoter

inr

ген

NuRF

UAS

core promoter

inr

ген

NuRF

UAS

core promoter

inr

ген

NuRF

TFIID TBP UAS

core promoter

inr

ген

NuRF

DNase I HSS

TFIID UAS

TBP

Pol II TFIIF

core promoter

TFIIA TFIIB

TFIIH inr TFIIE

ген

Расстояние между промотором и активаторным участком часто бывает достаточно большим. Тогда возникает два HSS - на промоторе и на активаторном участке

TFIID UAS

HSS на активаторном участке

TBP

Pol II TFIIF

core promoter

TFIIA TFIIB

TFIIH inr

ген

TFIIE

HSS на промоторе

Большинство специфических транскрипционных факторов содержат ДНК-связывающий и активаторный домены. Специфичность взаимодействия определяется ДНКсвязывающим доменом.

Активаторные домены являются достаточно разнообразными (нет никакого консенсуса, часто просто аминокислотная последовательность с чередующимися кислыми и гидрофобными аминокислотными остатками).

Активаторные домены большинства транскрипционных факторов (даже из разных организмов) являются взаимозаменяемыми.

Что именно является мишенью для активаторных доменов остается не ясным.

ОРГАНИЗАЦИЯ ДОМЕНА β - ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА -18 -21,5

-10,9 -14,7

-6,1

эмбриональный

фетальные

взрослые

ДЕЛЕЦИИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТАЛАССЕМИЯХ

-18

-10,9 -14,7

-21,5

-18 -21,5

-6,1

-10,9 -14,7

-6,1

При Испанской талассемии домен β - глобиновых генов утрачивает предпочтительную чувствительность к ДНКазе и изменяется время его репликации (реплицируется в конце S фазы )

Регуляторные элементы, локализованные в 5’- концевой области домена β - глобиновых генов кур, обеспечивают высокий и не зависящий от позиции интеграции уровень экспрессии трансгенов в эритроидных клетках трансгенных мышей (Grosveld et al. 1987).

-21,5

-10,9 -14,7

-6,1

β

Уровень экспрессии β - глобинового гена

-18

10

20 Число копий

Идентификация LCR в домене бета-глобиновых генов базировалась на двух группах экспериментальных результатов: 1. Анализ последствий делеций в 5’-концевой области домена 2. Изучение влияния изучаемых регуляторных элементов на экспрессию трансгенов

HS5 HS4

HS3 HS2

HS1

β

HS5 HS4

HS3 HS2

HS1

β

HS1

β

HS2

β

HS3

“Транзиент” трансфекция

β

HS4

β

HS5

β

Анализ характера экспрессии в тканях трансгенных мышей

HS1

β HS2

β HS3

β

Не выраженная активность в обоих типах экспериментов

Сильный эритроид-специфичный энхансер В трансгенных мышах обеспечивается высокий и не зависящий от позиции интеграции уровень экспрессии в эритроиднах клетках

Эритроид-специфичный энхансер В трансгенных мышах обеспечивается высокий и не зависящий от позиции интеграции уровень экспрессии в эритроиднах клетках

HS4

β

Эритроид-специфичный энхансер В трансгенных мышах обеспечивается высокий и не зависящий от позиции интеграции уровень экспрессии в эритроиднах клетках

HS5

β

Инсулятор, работающих в разных типах тканей и в клетках разных организмов MAR элемент

Фрагменты ДНК, взаимодействующие с белками, можно идентифицировать с использованием метода band-shift. В дальнейшем сайты связывания белков можно картировать с использованием различных вариантов фут-принтинга

band-shift экстракт специфический конкурент

footprinting

In vivo footprinting

Внесение разрывов или других модификаций в ДНК in vivo

Выделение ДНК

Синтез комплементарных цепей, начиная со специфического праймера ( )

Лигирование асимметричного фрагмента ДНК ( содержащего второй праймер

“Горячий” PCR

),

Во фрагментах LCR, проявляющих энхансерную активность, обнаружены многочисленные участки связывания различных транскрипционных факторов, в том числе:

GATA-1, NF-E2, AP1, CP2, EKLF Продемонстрировано, что в эритроидных клетках, продуцирующих глобины, эти факторы связаны с LCR in vivo

In vivo footprinting on HS2 and HS3 HS2

HS3

Регуляторные последовательности, расположенные в участках гиперчувствительности 1 - 4 по6разному влияют на активацию экспрессии различных глобиновых генов по ходу развития (Frazer et al., 1993)

Регуляторные последовательности, расположенные в участках гиперчувствительности 1 - 4 по-разному влияют на активацию экспрессии различных глобиновых генов по ходу развития (Frazer et al., 1993)

Ни один из тестированных HS не обеспечивал предпочтительной экспрессии фетальных генов на соответствующей стадии развития плода. Детектируемый уровень экспрессии этих генов на правильной стадии обеспечивался только при их интеграции в составе конструкта, содержащего HS3

Правильная временная активация экспрессии различных глобиновых генов человека в развивающемся эмбрионе трансгенных мышей происходит лишь при интеграции в мышиный геном конструктов, включающих полноразмерный домен β - глобиновых генов человека с LCR и фланкирующими последовательностями (инсерции размером 150 Kb [Gaensler et al, 1993], 248 Kb [Peterson et al., 1993], 160 Kb [Huang et al., 2000].

Области контроля локуса β - глобиновых генов различных млекопитающих организованы сходным образом

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ LCR 1. Прямое взаимодействие LCR с промоторами индивидуальных генов, Конкуренция промоторов за контакт с LCR

2. Распространение некого активирующего сигнала от LCR в сторону промоторов. Сборка исходного активирующего комплекса на LCR обеспечивается высокой концентрацией участков связывания белковых факторов

3. Перемещение домена из неактивного компартмента ядра в активный

Looping model

Механизм действия LCR “flip-flop” модель mouse

human

В каждый конкретный момент должен экспрессироваться лишь один из генов домена Порядок активации экспрессии индивидуальных генов домена по ходу развития организма должен определяться позицией гена по отношению к LCR

Ген, расположенный ближе всего к LCR, предпочтительно экспрессируется в эмбрионах трансгенных мышей

Yolk-sac

Fetal liver

Adult

Tanimoto et al., 1999

Действие LCR имеет направленный характер

Yolk sac

Adult

Распространение активационного сигнала от LCR к промоторам

LCR

P2

P1

P1

P2

P3

РНК-полимераза может служить “транспортным средством”, обеспечивающим распространение активационных сигналов от LCR к промоторам индивидуальных генов Travers, 1999

Деффекты LCR могут быть компенсированы посредством оверэкспрессии транскрипционного фактора EKLF

Crossing to mice overexpressing EKLF or defective on EKLF expression

EKLF - erythroid-specific transcription factor (zinc-finger protein) that interacts with GT motif in β - globin gene promoter and in the LCR. This factor is required for β - globin gene expression in the definitive stage. It is also known to interact with SWI/SNF family of proteins.

Дополнительные аргументы в пользу модели, предполагающей, что оновной чертой LCR является высокая концентрация участков связывания транскрипционных факторов, взаимодействующих и с другими регуляторными последовательностями

1. Не обнаружено ни одного белкового фактора, способного связываться только с регуляторными элементами типа LCR

2. Отдельные HSS из LCR домена β - глобиновых генов человека и других LCR способны защищать трансген от позиционных эффектов только при множественной интеграции (Ellis et al., 1993; Sabbatini et al., 1999)

HS2 области контроля локуса β - глобиновых генов человека обеспечивает перемещение трансгена из гетерохроматиновой в эухроматиновую область (Francastel et al., 1999) HS2

β

β трансген

Центромерный гетерохроматин

Трансген предпочтительно чувствителен к ДНКазе и активно экспрессируется

Трансген относительно резистентен к ДНКазе и не экспрессируется

Deletions at the Mouse LCR

5’ HS sites 4.2 6 5 4

–62.5 –60.7 MOR 5’β5

MOR 5’β4

MOR 5’β3

MOR 5’β2

3

2

1

MOR 5’β1

ε y gene

∆ 4.2, 5, 6, 5’β1 Open chromatin conformation Normal or near normal gene expression

∆ 5,6

∆ 3

∆ 4

∆ 2

∆ 1

2

1

∆ 1–6 Open chromatin conformation Very low level of gene expression

∆ 1–4

Deletions at the Human LCR

5’ HS sites 6

7 HOR 5’β6

HOR 5’β5

HOR 5’β4

HOR 5’β3

HOR 5’β2

5

4

3

HOR 5’β1

ε gene ERV-9

Open chromatin conformation No gene expression

Closed chromatin conformation No gene expression

∆ 2–5

Hispanic deletion (∆ 2–5 + 27 kb)

Некоторые делеции в 3’-концевой области домена приводят к талассемиям, связанным с тем, что в эмбриональных клетках начинают экспрессироваться “взрослые” гены

-21,5

-18

-14,7

-10,9

-6,1

эмбриональный

фетальные

взрослые

инсулятор

-21,5

-18

-14,7

-10,9

энхансер

-6,1

эмбриональный

фетальные

взрослые

делеция

энхансер

Инсуляторы - функциональные элементы генома, способные разделять домены Инсуляторы предотвращают действие энхансера на промотор, расположенный за инсулятором, не подавляя активностиэнхансера и не препятствуя его действию в другом направлении

ген В

ген А

энхансер инсулятор

О наличии в том или ином фрагменте ДНК блокирующей энхансеры активности можно судить в эксперименте по подавлению уровня экспрессии гена неомицина

Раньше считалось, что блокирующую энхансер активность инсулятора можно наблюдать только после интеграции конструкта в геном клетки-мишени. Недавно было показано, что аналогичный эффект можно наблюдать и на кольцевых плазмидах, присутствующих в клетке в виде эписом. P

CAT gene

P

P

CAT gene

CAT gene INS

INS β/ε enhancer

β/ε enhancer

β/ε enhancer

INS

Относительная активность CAT CAT-β/ε enhancer CAT-INS-β/ε enhancer CAT-INS-β/ε enhancer-INS

50%

100%

Инсуляторы - функциональные элементы генома, способные разделять домены Инсуляторы ограничивают распространение на окруженный инсуляторами трансген негативных сигналов из хроматина хозяйской клетки

трансген Гетерохроматин хозяйской клетки

инсулятор

Гетерохроматин хозяйской клетки

Не все инсуляторы обладают одновременно способностью направленно подавлять действие энхансера (“enhancer-blocking”) и подавлять распространение негативных хроматиновых сигналов в участке интеграции (“domain boundary”).

В инсуляторах, проявляющих обе активности, разные функциональные домены ответственны “enhancer-blocking” и domain boundary. Можно, получить делеционные мутанты, утратившие лишь одну из этих активностей.

Один из наиболее хорошо изученных инсуляторов, обладающих как барьерной, так и блокирующей энхансеры функциями, расположен на 5’-конце LCR домена бета-глобиновых генов кур.

СTCF связывается с рядом известных инсуляторов и необходим для “enhancerblocking” активности

Делеционный анализ инсулятора

enhancer-blocking activity no bordering activity

no enhancer-blocking activity bordering activity

LCR

Ins

Ins

Ins LCR

Механизм действия инсуляторов остается неясным. Существующие модели базируются на в равной мере гипотетических моделях действия энхансеров

Согласно одной из недавно предложенных моделей, окруженный инсуляторами домен перемещается в активный компартмент ядра, расположенный рядом с ядерными порами (Laemmli, 2002)