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Practica 12

Interacciones Planta-Microorganismos [Subtítulo del documento]

Universidad de Guanajuato División de Ciencias Naturales y Exactas Licenciatura Biología Experimental Laboratorio de Fisiología Vegetal Maestra Paulina Guzmán Guzmán

Integrantes: Aguilar Serna Elizabeth Lugo Delgado Karla Rangel Salazar Diana Karina

Fecha de entrega: 12 de noviembre

Objetivo Observar la interacción entre plantas de sorgo y hongos del género Trichoderma, identificando los efectos en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Observar el efecto de la interacción sorgo – Trichoderma ante la presencia de un hongo fitopatógeno, determinando el grado de daño ocasionado por el patógeno.

Introducción El tomate (Solanum lycopersicon L.) es considerado una de las hortalizas de mayor importancia en muchos países de mundo, ocupando el segundo lugar solo superado por el cultivo de la papa (1). Entre las enfermedades más importantes que afectan a este cultivo se encuentra la marchitez vascular, cuyo agente causal es Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Sacc.) Snyder y Hansen, responsable de pérdidas en los rendimientos de hasta un 60%, afectando también la calidad del producto. Esta enfermedad afecta al menos 32 países en gran diversidad de condiciones, informándose hasta el momento, tres razas, las cuales se distinguen por su virulencia en materiales que contienen genes de resistencia. Las especies de Fusarium causantes de marchitez siguen un patrón similar de infección; penetran por la raíz y colonizan en el tallo de las plantas el sistema vascular. Sin embargo, la colonización, se restringe tanto en cultivares resistentes como susceptibles, a la región de entrada inicial del patógeno, debido a la oclusión de los vasos por geles, deposiciones de calosa y tilosas. En los cultivares susceptibles, la colonización continúa (distribución secundaria) cuando los geles y calosas son degradados por el efecto de enzimas pectolíticas del patógeno y el crecimiento de las tilosas es inhibido. En los cultivares resistentes, flavonoides del tipo de las catequinas y sus productos de oxidación inactivan las enzimas, y la distribución secundaria es confinada a los puntos de infección inicial. El análisis genético de aislamientos de Fusarium oxysporum Schlecht se realiza utilizando pruebas para determinar grupos de compatibilidad vegetativa (por sus siglas en inglés VCG) y análisis de patrones de bandas obtenidos por técnicas moleculares como Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP), Polimorfismo del ADN amplificado al azar (RAPD) y huella genética de ADN. La compatibilidad vegetativa es una prueba objetiva que determina similitud alélica en los loci que gobiernan la compatibilidad del heterocarión, pero no el grado de diferencia genética en general entre aislamientos de la especie. Modo de acción y desarrollo de la enfermedad Los primeros síntomas de la enfermedad son el amarillamiento del follaje, comenzando con la caída de las hojas. Las hojas infectadas posteriormente muestran un encrespamiento bajo, seguidamente se oscurecen y se secan. La parte superior de la planta se marchita durante el día y se recupera en la noche, pero el marchitamiento empeora hasta que la planta se marchita completamente observándose el oscurecimiento vascular en los tallos y los pecíolos infectados de las hojas grandes. Las plantas afectadas y sus sistemas de raíces se atrofian. El patógeno puede estar en el suelo como saprófito durante muchos años sin un hospedante.

La infección por nematodos formadores de agallas provoca cambios fisiológicos en la raíz. Esto trae como consecuencia que variedades de tomate resistentes a Fusarium se vuelvan susceptibles al hongo. Además, otros factores como las altas temperaturas (por ejemplo, 27-28 °C), el tiempo seco y el suelo ácido (pH 5-5,6) favorecen el desarrollo de la enfermedad.

Materiales      

Plantas tratadas con conidias de F. oxysporum, y con agua, de la parte I de esta práctica. Micropipeta 100µL. Puntas para micropipeta. Cinta métrica. Solución 1x106 conidias/mL de F. oxysporum. Cinta métrica. o 4 charolas de 6 macetas, con tierra húmeda.

Procedimiento Parte I (Fruto)

Parte II (Hojas)

Resultados parte I (Fruto)

Figura 1. tomate (Solanum lycopersicum), divido en 4 partes para las diferentes pruebas.

Figura 2. División #1 con daño únicamente por la punta de la pipeta.

Figura 4. División #3 inoculada con 1x10-6 conidias de F. oxysporum silvestre.

Figura 3. División #2 inoculada únicamente con agua.

Tabla 1. Medidas de diámetro de infección y daño mecánico en fruto.

División

Diámetro (cm)

1 2 3 4

1cm 0.7 cm 1.7 cm 1.6 cm

Figura 5. División #4 inoculada con 1x10-6 conidias de F. oxysporum mutante

Grafica 1. Comparacion de infeccion o daño en fruto 2 Conidia silvestre

1.8

Conidia mutante

1.6

Diametro (cm)

1.4 1.2

Daño mecanico

1

Agua

0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

1

2

Numero de division en fruto

3

4

Resultados parte II (Hojas)

Figura 6. Hoja #1 Daño con punta de pipeta.

Figura 7. Hoja #2 con agua inoculada.

Figura 8. Hoja #3 inoculada con 1x10-6 conidias de F. oxysporum silvestre.

Figura 9. Hoja #4 inoculada con 1x10-6 conidias de F. oxysporum mutante

Tabla 2. Grado de infección y daño mecánico en hojas

División

Diámetro (cm)

1 2 3 4

+++ +

Discusión de resultados Durante esta práctica se analizó y observo el mecanismo de infección del hongo F. oxysporum al inocularse en hojas y en frutos de tomate (Solanum lycopersicon), por lo que pudimos hacer una comparación del daño que realiza el hongo a comparación de un daño mecánico. En primer lugar, se conoce que F. oxysporum es un hongo que se encuentra en el suelo e infecta a la planta generalmente por su raíz, y normalmente se desarrolla en el fruto en estado maduro, especialmente aquéllas que han caído de la planta o estuvieron de otra manera en contacto con el suelo. Sin embargo, la manera de infectar tanto a las hojas como al fruto fue inoculando tanto la cepa silvestre como la mutante. De manera silvestre cuando el hongo ataca a plantas adultas, éstas muestran amarillamiento, que comienza por las hojas bajeras y, por lo general, mueren. Esto se da a causa de que el mecanismo de acción de este hongo es infectar a la planta de tomate por sus conductos xilemáticos. Al realizar la inoculación del hongo silvestre pudimos ver que la hoja infectada presentaba signos de marchitez y un cambio en la coloración de las hojas (oscurecimiento de ésta), corroborando que el hongo sí se propaga por los conductos xilemáticos, atrofiando sus sistemas. El hongo secreta enzimas y pequeñas proteínas durante la colonización de los vasos xilemáticos de la planta de tomate; estas proteínas promueven la colonización del hospedante, por ejemplo, por la supresión de los mecanismos de resistencia basales. El repertorio de proteínas efectoras determina la virulencia de un patógeno hacia un hospedante particular. Así mismo se apreciaron las hojas de tomate cubiertas por micelio, encontrando un total daño de la planta y en sus vasos xilemáticos. En los estadíos tempranos de la infección, la interface entre el patógeno y el hospedante está grandemente confinada al xilema.  Para poder atacar a la planta, el hongo tiene que percibir las señales químicas y físicas del hospedante y responder con los cambios metabólicos y morfogenéticos requeridos para el desarrollo patogénico. Tales cambios incluyen directamente el crecimiento de las hifas, la adhesión a la superficie vegetal, la diferenciación de las estructuras de infección especializadas y la secreción de enzimas líticas y fitotoxinas. Es por ello que apreciamos el micelio creciendo alrededor de la hoja. Muchas de estas respuestas requieren la síntesis de productos génicos específicos y dependen de las vías de transducción de señales conservadas involucradas con la activación de proteínas G, las señales de adenosín monofosfato cíclico (AMPc) y las cascadas de proteínas quinasas activadas por mitógenos. Y para evitar la defensa de la planta contra el hongo, éste produce moléculas que suprimen las fitoalexinas (compuestos que ayudan a limitar la dispersión del patógeno). Así mismo se sabe que la planta de tomate, como un mecanismo de defensa, produce la α- tomatina la cual es una saponina producida por las plantas de tomate con la habilidad para unirse a los esteroles presentes en las membranas y causar la pérdida de la integridad de la membrana de su patógeno, sin embargo, el hongo F. oxysporum tiene una alta resistencia a esta enzima. Es por ello que, en la práctica, para analizar el mecanismo de virulencia, se utilizó una cepa mutante. El daño encontrado por la cepa mutante, tanto en las hojas como en el fruto de tomate, no tuvo el mismo grado de infección que la silvestre, y esto se debe a que la cepa de F. oxysporum silvestre produce la enzima tomatinasa (Tom1), que degrada la α-tomatina hasta derivados menos tóxicos. Dicho gen (tom1) es deficiente en la cepa mutante que se inoculo y se encontró que efectivamente muestra un retraso en el proceso de infección, lo que indica que Tom1, aunque no es esencial para la patogenicidad, es necesaria para la virulencia completa de F. oxysporum.

Esto indica que, al afectar este gen, es posible que la eficiencia de la α- tomatinasa aumente, afectando directamente al hongo. Así mismo analizamos que el daño en las hojas como en el fruto es muy distinto, pues encontramos que en las hojas se desarrolla micelio mientras que en el fruto se puede ver el círculo de infección, con el cambio de coloración a negro. Sin embargo, no se analizó el daño por dentro del fruto por lo que se puede decir que afecta de manera más significativa a las hojas que al fruto.

Conclusión

Cuestionario Explica el mecanismo de acción de Fusarium en el tomate: Las esporas después del transporte se depositan sobre los substratos de cultivo. El micelio se desarrolla a continuación. La contaminación se hace a nivel de la raíz, por heridas o aperturas naturales. El hongo se desarrolla en primer lugar en los vasos vasculares del tubérculo antes de llegar a los de toda la planta. El período de incubación es de 2 a 13 semanas. Los síntomas exteriores no son pues inmediatamente perceptibles. Es necesario esperar en principio que las plantas infestadas hayan alcanzado la edad de 3-4 meses. Por el contrario, a partir del principio de la infección, estas plantas constituyen una fuente temible de contaminación de los cultivos sanos.

Durante el final del período de vegetación (en el momento de la floración), cuando los días son calurosos que se manifiestan más claramente los síntomas. Cuanto más contaminados estén los ciclámenes en estado joven, más rápida será la evolución del síntoma (sobre todo en período de fuerte insolación después del trasplante). Pero la función del substrato es importante: todos no presentan la misma receptividad frente a la fusariosis. En caso de ataque, la muerte de la planta es ineluctable. Al principio de la infección, la enfermedad sólo afecta en general a un único lado de la planta. Las hojas amarillean en los bordes y los limbos se enrollan. En el punto de inserción del peciolo aparece también una decoloración. Estas manchas van a agrandarse y amarillear progresivamente. Los limbos de las hojas más afectadas se marchitan y se vuelven marrones. Las hojas reposan entonces en el borde de las macetas ya que los peciolos no pueden sostenerlas más. Estos síntomas sólo aparecen en primer lugar en las hojas más viejas. En esta fase, un examen meticuloso del sistema de raíz y la superficie del tubérculo no revelará ninguna anomalía.

Compara el crecimiento de cada una de las cepas de fusarium, señalando las principales diferencias entre ellas.

Fruto

Flor

Cepa Silvestre En fruto el diámetro de infección es mas grande y la coloración en el orificio de inoculación es marrón Hoja con desarrollo de micelio de la cepa silvestre en toda la superficie y cambio de coloración en el radio de infección a marrón.

Cepa mutante Diámetro de infección menor y la coloración en el orificio de inoculación es amarillento El crecimiento y desarrollo en la hoja es menor, únicamente se observa un ligero cambio de coloración en el radio de infección, tornándose la hoja un poco amarillenta en esa zona.

Con base en los resultados obtenidos ¿Cómo explicas que una cepa sea más patogénica que otra? La diferencia entre la cepa mutante y la cepa silvestre es que el gen afectado en la mutación provoca una disminución en la eficacia de infección en la planta, el proceso de infección se debilita y se alenta, por lo que la infección por la cepa silvestre es mas fuerte y se puede apreciar más el daño tanto en el fruto como en las hojas

Bibliografía https://www.cyclamen.com/es/profesional/enfermedades/8/25 http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1010-27522012000100001