Indagine Istologica E Colorazioni Di Base

INDAGINI ISTOLOGICHE  L’indagine istologica per la microscopia ottica si compie attraverso una serie di 6 fasi: PRELIEVO, FISSAZIONE, INCLUSIONE, TAGLIO DELLE SEZIONI, COLORAZIONE e MONTAGGIO DEL VETRINO.

PRELIEVO  Il prelievo del tessuto o dell’organo va effettuato immediatamente dopo la morte dell’animale sacrificato, per non andare incontro alla degradazione dovuta all’azione di microrganismi (come le muffe) o all’azione di enzimi litici endocellulari liberati dall’organismo stesso dopo la morte.

FISSAZIONE  È una tappa fondamentale per avere un buon preparato. Lo scopo è di bloccare i rapidi processi di degenerazione cellulare e tissutale e di avere quindi un quadro risultante che sia il più possibile vicino a quello del vivente.  I metodi di fissazione provocano tutti una disidratazione del pezzo perché, sottraendo acqua ai tessuti, si va ad alterare il microambiente delle proteine (e perciò degli enzimi), impedendone l’azione.  I fattori decisivi per una buona fissazione sono: 1) Temperatura di fissazione: deve essere bassa, sui 4-5°C, sempre perché è essenziale bloccare l’azione enzimatica. Contemporaneamente non si deve mai raggiungere gli 0°C, in quanto l’acqua presente nei tessuti cristallizzerebbe, danneggiandoli. 2) Volume del pezzo da prelevare: deve essere piuttosto piccolo in quanto la fissazione si compie prima in superficie e solo successivamente nelle parti profonde. Più il volume del pezzo è piccolo, più la fissazione risulterà veloce. Ovviamente sono molto migliori i pezzi con grande superficie e piccolo volume (è meglio, ad esempio, una lamina di un cubo).  La fissazione può essere di due tipi: CHIMICA o FISICA. La prima fa uso di fissativi che agiscono con meccanismi differenti e che hanno il compito, o di bloccare l’azione degli enzimi, o di stabilizzare i tessuti (formando legami con i componenti dei tessuti stessi); la seconda ha un vantaggio notevole e cioè quello di non utilizzare sostanze che possono provocare alterazioni chimiche nel pezzo da trattare. La fissazione fisica più utilizzata è il congelamento unito alla disidratazione (FREEZEDRYING).  Per quanto riguarda la fissazione di tipo chimico, invece, il discorso si fa un po’ più complicato in quanto il tipo di fissativo varia a seconda dell’inclusione che si desidera fare (per la microscopia elettronica, o per l’ottica, ad esempio), a seconda del pezzo che dobbiamo andare ad includere, e a volte anche a seconda della colorazione che poi dovremo effettuare sulla fetta tagliata.  Generalmente, per lavori come quelli che eseguiremo durante l’internato, si utilizzerà la formalina, un buon fissativo per la maggior parte delle colorazioni utilizzate, e per il tipo di inclusione (inclusione in paraffina) comunemente effettuato.

INCLUSIONE DEI PEZZI PRELEVATI IN PARAFFINA USIAMO COME ESEMPIO L’INCLUSIONE DOPO FISSAZIONE IN FORMALINA.  Dopo aver tagliato i pezzi, li pongo in formalina in modo che questi vengano fissati.  Porli in alcool 80° (occorre la disidratazione completa del pezzo, visto che la paraffina non è solubile in H2O) dove possono rimanere anche per alcuni giorni (i tempi variano a seconda delle dimensioni del pezzo da trattare).  Poi effettuare un passaggio in alcool 96° (max 8 ore), e quindi in alcool assoluto (min 2-3 ore).  A questo punto, per completare la disidratazione, è necessario effettuare un passaggio in xilolo (max 30 minuti).  Adesso è il momento dell’immersione in paraffina. Si hanno due tipi di paraffina, che vengono distinti per il loro grado di purezza: paraffina I (impura per la presenza di residui di xilolo) per almeno 30 minuti (per pezzi piccoli), e quindi paraffina II (più pura, avrà la medesima composizione della paraffina di inclusione) per 2 ore minimo.   I passaggi in alcool 80° e 96° servono per pulire il pezzo. Allo scopo di detergerlo più rapidamente, il 1° giorno posso cambiare più volte l’alcool 80° e quindi posso effettuare più cambi anche con il 96°.  In linea di massima: Lunedì mattina Martedì mattina Martedì pomeriggio Mercoledì mattina Mercoledì pomeriggio

Ore 09.00 Ore 09.00/13.00 Ore 13.00 Ore 18.00 Ore 19.00 Ore 13.00 Ore 16.00

Alcool 80° (uno o più cambi) Alcool 96° (uno o più cambi) Alcool assoluto Xilolo Paraffina I Paraffina II Inclusione dei pezzi

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 Per l’inclusione: prendere lo stampo metallico dalla stufa, versarvi un po’ di paraffina liquida, prendere il pezzo e posarlo nella vaschetta.  Aspettare che intorno al pezzo si formi un alone perché versando la paraffina per rabboccare lo stampo, il pezzo potrebbe spostarsi, quando ciò è avvenuto versare la paraffina liquida sul pezzo facendo attenzione che non si formino bolle d’aria e che il pezzo sia completamente coperto.  Aspettare finché la paraffina non si è solidificata bene, quindi mettere il tutto in frigorifero per 5 minuti.  Una volta estratto il pezzo dallo stampo, questo è già pronto per essere tagliato.

PREPARAZIONE DELLE SEZIONI PER IL MICROTOMO  Prendere il pezzo incluso e montarlo sul cubetto di legno (se non è già montato e se non è stato incluso sulle lamine di plastica per l’inclusore), fluidificando la paraffina con una spatola di ferro riscaldata.  Mettere il tutto in frigorifero per alcuni minuti.  Preparare il microtomo. Montare la lama e quindi il pezzo sul supporto avendo cura di porlo parallelamente alla lama.  Preparare una vaschetta con H2O distillata e gelatina (agar agar) e scaldarla su una stufetta (la temperatura su una stufa a termostato dovrebbe essere di 37°/40°.  Avere sempre a disposizione del ghiaccio per raffreddare la paraffina in cui è incluso il pezzo.  Posizionare le misure del taglio sullo spessore desiderato (in generale 8-10 m per il tessuto nervoso, e 4 m per gli altri tessuti. A volte però le misure vanno variate).  Prelevare le fettine con un pennellino e depositarle nella vaschetta in modo che si distendano sul pelo dell’acqua. Fare attenzione perché la temperatura dell’acqua non sia troppo alta: scioglierebbe la paraffina.

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TECNICHE DI COLORAZIONE SPARAFFINATURA DELLE FETTE  I passaggi per la sparaffinatura delle fette sono sempre gli stessi, qualsiasi colorazione dobbiamo effettuare: Soluzione di immersione Xilolo I Xilolo II Alcool assoluto (100°) Alcool 96° Alcool 80° Acqua distillata

Tempo di immersione 5 minuti 5 minuti 5 minuti 2 minuti 2 minuti 2 minuti

 I tempi di immersione possono variare leggermente a seconda della dimensione della fetta sul vetrino e del suo spessore. Ovviamente, una fetta di dimensioni e spessore maggiori, avrà bisogno di un maggior tempo di immersione per poter essere sparaffinata in modo adeguato.  Il passaggio in acqua, generalmente è d’obbligo. Se dovesse essere necessario saltarlo, sarà indicato nella procedura specifica della colorazione presa in esame.

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EMATOSSILINA – EOSINA  Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi: Soluzione di immersione Acqua di fonte Ematossilina di Mayer Acqua di fonte Eosina G Acqua di fonte Alcool 80° Alcool 96° Alcool assoluto (100°) I Alcool assoluto (100°) II Xilolo

Tempo di immersione 1 minuto 8 – 10 minuti * Almeno 2 minuti ** 15 – 20 secondi Passaggio veloce *** Passaggio veloce *** Passaggio veloce *** 2 minuti 2 minuti 4 minuti

* = La variazione tra 8 e 10 minuti è indicata in quanto il colorante “nuovo” colora più facilmente ed è sufficiente un minor numero di minuti di immersione. Se dovesse essere necessaria una colorazione molto pallida, per far sì che l’ematossilina non copra altre strutture positive al colorante “parallelo”, potrebbero essere sufficienti anche soli 2 minuti di immersione. ** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in ematossilina, serve a differenziare la tonalità del colorante che, da un rosso brunastro di partenza, deve raggiungere un colore violetto intenso. Una volta raggiunta la gradazione di colore desiderata, si può procedere al passaggio successivo. *** = Si effettuano solamente passaggi veloci (e cioè immersioni rapide con un certo movimento del vetrino all’interno del pozzetto) per dilavare l’eosina in eccesso senza toglierla del tutto. Nel passaggio in alcool assoluto, la possibilità di dilavare il colorante cessa, in quanto manca la componente acquosa. Durante i passaggi veloci si consiglia di portare avanti un vetrino alla volta fino all’alcool assoluto. EMATOSSILINA = Colorante basico che si lega agli acidi nucleici e dà un colore violetto. EOSINA = Colorante acido che si lega alle proteine basiche del citoplasma e dà un colore rosso-rosato. EMATOSSILINA-EOSINA = Colorazione di base che ci permette di identificare chiaramente, all’interno di un tessuto, i nuclei delle cellule che lo compongono (colorati in viola) e le strutture cellulari di base (il cui citoplasma è colorato in rosa).

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VAN GIESON  Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi: Soluzione di immersione Acqua di fonte Ematossilina di Mayer Acqua di fonte Soluzione Van Gieson Acqua di fonte Alcool 80° Alcool 96° Alcool assoluto (100°) I Alcool assoluto (100°) II Xilolo

Tempo di immersione 1 minuto 8 – 10 minuti * Almeno 2 minuti ** 30 secondi Passaggio veloce *** Passaggio veloce *** Passaggio veloce *** 2 minuti 2 minuti 4 minuti

* = La variazione tra 8 e 10 minuti è indicata in quanto il colorante “nuovo” colora più facilmente ed è sufficiente un minor numero di minuti di immersione. Se dovesse essere necessaria una colorazione molto pallida, per far sì che l’ematossilina non copra altre strutture positive al colorante “parallelo”, potrebbero essere sufficienti anche soli 2 minuti di immersione. ** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in ematossilina, serve a differenziare la tonalità del colorante che, da un rosso brunastro di partenza, deve raggiungere un colore violetto intenso. Una volta raggiunta la gradazione di colore desiderata, si può procedere al passaggio successivo. VAN GIESON = Dà una colorazione giallo-rosata ai tessuti: il tessuto connettivo e le fibre collagene colorano in rosso, il tessuto muscolare e l’epitelio corneificato colorano in giallo. L’ematossilina dà il tipico colore violetto ai nuclei cellulari.

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ALCIAN BLU  Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi: Soluzione di immersione Acido acetico 3% Alcian blu (soluzione a pH 2.5) Acido acetico 3% Acqua di fonte Ematossilina di Mayer Acqua di fonte Alcool 80° Alcool 96° Alcool assoluto (100°) I Alcool assoluto (100°) II Xilolo

Tempo di immersione 3 minuti * 30 minuti 3 minuti ** Passaggio veloce 8 – 10 minuti *** Almeno 2 minuti **** 1 minuto 1 minuto 2 minuti 2 minuti 4 minuti

* = Il primo passaggio in acido acetico, serve a mordenzare la fetta in modo che questa “si prepari” alla colorazione tramite la soluzione di alcian. ** = Il secondo passaggio in acido acetico, serve a dilavare l’alcian in eccesso (quei residui che non hanno colorato specifiche strutture, ma sono solo rimasti a “sporcare” la colorazione) dalla fetta. *** = La variazione tra 8 e 10 minuti è indicata in quanto il colorante “nuovo” colora più facilmente ed è sufficiente un minor numero di minuti di immersione. Se dovesse essere necessaria una colorazione molto pallida, per far sì che l’ematossilina non copra altre strutture positive al colorante “parallelo”, potrebbero essere sufficienti anche soli 2 minuti di immersione. **** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in ematossilina, serve a differenziare la tonalità del colorante che, da un rosso brunastro di partenza, deve raggiungere un colore violetto intenso. Una volta raggiunta la gradazione di colore desiderata, si può procedere al passaggio successivo. ALCIAN BLU = E’ una colorazione specifica per i mucopolisaccaridi acidi, che generalmente viene usata in associazione con la colorazione in ematossilina (per meglio evidenziare le strutture cellulari). I mucopolisaccaridi acidi vengono colorati in azzurro intenso (così come la cartilagine, ove presente). Se la colorazione è usata in associazione con Van Gieson, il colore Alcian Blu diventa verde.

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REAZIONE P.A.S.  Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi: Soluzione di immersione Acido periodico 1% Acqua di fonte Reattivo di Schiff Acqua di fonte Ematossilina di Mayer Acqua di fonte Alcool 80° Alcool 96° Alcool assoluto (100°) I Alcool assoluto (100°) II Xilolo

Tempo di immersione 5 minuti * Passaggio veloce 15 minuti ** Almeno 5 minuti *** 8 – 10 minuti **** Almeno 2 minuti ***** 1 minuto 1 minuto 2 minuti 2 minuti 4 minuti

* = Il passaggio in acido periodico serve a provocare una reazione chimica all’interno del tessuto trattato: si ha la formazione di aldeidi. ** = Il reattivo di Schiff è tossico, perciò va maneggiato con cura, andrebbero usati i guanti. Non deve venire a contatto con alcun tipo di metallo, altrimenti si ossida e non colora più; se dovesse accadere che la soluzione di lavoro si ossidasse, non riutilizzarla ma gettarla via. Il reattivo va tenuto in frigorifero, al riparo dalla luce. Quando si effettua questo tipo di colorazione occorre prendere lo Schiff dal frigorifero appena prima dell’utilizzo, in modo che sia ancora fresco. *** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione nel reattivo di Schiff ha la funzione di evidenziare il colore rosso fucsia tipico di questa colorazione. Infatti, il reattivo è di colore trasparente (se fosse rosa potrebbe essere stato contaminato da residui di acqua) e non evidenzia colorazione all’interno del tessuto fintanto che non si immerge il vetrino in acqua. **** = La variazione tra 8 e 10 minuti è indicata in quanto il colorante “nuovo” colora più facilmente ed è sufficiente un minor numero di minuti di immersione. Se dovesse essere necessaria una colorazione molto pallida, per far sì che l’ematossilina non copra altre strutture positive al colorante “parallelo”, potrebbero essere sufficienti anche soli 2 minuti di immersione. ***** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in ematossilina, serve a differenziare la tonalità del colorante che, da un rosso brunastro di partenza, deve raggiungere un colore violetto intenso. Una volta raggiunta la gradazione di colore desiderata, si può procedere al passaggio successivo. P.A.S. = E’ un tipo di colorazione particolare, in quanto si tratta di un metodo ISTOCHIMICO (vengono effettuati legami di tipo chimico tra alcune sostanze all’interno del tessuto, in modo da evidenziarle). L’immersione in acido periodico forma delle aldeidi alle quali si lega poi il reattivo di Schiff (formando un composto color magenta, insolubile), colorandole elettivamente nel tipico rosa fucsia, in modo che esse siano visibili al microscopio ottico. Tra i componenti tissutali P.A.S.-positivi, abbiamo le membrane basali, la colloide della tiroide e della ghiandola pituitaria, l’elastina, la chitina e le mucine neutre.

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ALCIAN – P.A.S.  Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi: Soluzione di immersione Acido acetico 3% Alcian blu (soluzione a pH 2.5) Acido acetico 3% Acqua di fonte Acido periodico 1% Acqua di fonte Reattivo di Schiff Acqua di fonte Ematossilina di Mayer Acqua di fonte Alcool 80° Alcool 96° Alcool assoluto (100°) I Alcool assoluto (100°) II Xilolo

Tempo di immersione 3 minuti * 30 minuti 3 minuti ** 1 minuto 5 minuti *** Passaggio veloce 15 minuti **** Almeno 5 minuti ***** 8 – 10 minuti ****** Almeno 2 minuti ******* 1 minuto 1 minuto 2 minuti 2 minuti 4 minuti

* = Il primo passaggio in acido acetico, serve a mordenzare la fetta in modo che questa “si prepari” alla colorazione tramite la soluzione di alcian. ** = Il secondo passaggio in acido acetico, serve a dilavare l’alcian in eccesso (quei residui che non hanno colorato specifiche strutture, ma sono solo rimasti a “sporcare” la colorazione) dalla fetta. *** = Il passaggio in acido periodico serve a provocare una reazione chimica all’interno del tessuto trattato: si ha la formazione di aldeidi. **** = Il reattivo di Schiff è tossico, perciò va maneggiato con cura, andrebbero usati i guanti. Non deve venire a contatto con alcun tipo di metallo, altrimenti si ossida e non colora più; se dovesse accadere che la soluzione di lavoro si ossidasse, non riutilizzarla ma gettarla via. Il reattivo va tenuto in frigorifero, al riparo dalla luce. Quando si effettua questo tipo di colorazione occorre prendere lo Schiff dal frigorifero appena prima dell’utilizzo, in modo che sia ancora fresco. ***** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione nel reattivo di Schiff ha la funzione di evidenziare il colore rosso fucsia tipico di questa colorazione. Infatti, il reattivo è di colore trasparente (se fosse rosa potrebbe essere stato contaminato da residui di acqua) e non evidenzia colorazione all’interno del tessuto fintanto che non si immerge il vetrino in acqua. ****** = La variazione tra 8 e 10 minuti è indicata in quanto il colorante “nuovo” colora più facilmente ed è sufficiente un minor numero di minuti di immersione. Se dovesse essere necessaria una colorazione molto pallida, per far sì che l’ematossilina non copra altre strutture positive al colorante “parallelo”, potrebbero essere sufficienti anche soli 2 minuti di immersione. ******* = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in ematossilina, serve a differenziare la tonalità del colorante che, da un rosso brunastro di partenza, deve raggiungere un colore violetto intenso. Una volta raggiunta la gradazione di colore desiderata, si può procedere al passaggio successivo. ALCIAN – P.A.S. = Anche questa è una colorazione istochimica, e quindi è più specifica delle semplici colorazioni istologiche. Evidenzia i mucopolisaccaridi acidi in azzurro intenso e i mucopolisaccaridi neutri in rosa fucsia. I nuclei cellulari sono colorati con il blu-violetto tipico dell’ematossilina.

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P.A.S. ORANGE  Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi: Soluzione di immersione Acido periodico 1% Acqua di fonte Reattivo di Schiff Acqua di fonte Ematossilina di Mayer Acqua di fonte Orange G Acqua di fonte Alcool 80° Alcool 96° Alcool assoluto (100°) I Alcool assoluto (100°) II Xilolo

Tempo di immersione 5 minuti * Passaggio veloce 15 minuti ** Almeno 5 minuti *** 8 – 10 minuti **** Almeno 2 minuti ***** 20 – 30 secondi Passaggio veloce 1 minuto 1 minuto 2 minuti 2 minuti 4 minuti

* = Il passaggio in acido periodico serve a provocare una reazione chimica all’interno del tessuto trattato: si ha la formazione di aldeidi. ** = Il reattivo di Schiff è tossico, perciò va maneggiato con cura, andrebbero usati i guanti. Non deve venire a contatto con alcun tipo di metallo, altrimenti si ossida e non colora più; se dovesse accadere che la soluzione di lavoro si ossidasse, non riutilizzarla ma gettarla via. Il reattivo va tenuto in frigorifero, al riparo dalla luce. Quando si effettua questo tipo di colorazione occorre prendere lo Schiff dal frigorifero appena prima dell’utilizzo, in modo che sia ancora fresco. *** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione nel reattivo di Schiff ha la funzione di evidenziare il colore rosso fucsia tipico di questa colorazione. Infatti, il reattivo è di colore trasparente (se fosse rosa potrebbe essere stato contaminato da residui di acqua) e non evidenzia colorazione all’interno del tessuto fintanto che non si immerge il vetrino in acqua. **** = La variazione tra 8 e 10 minuti è indicata in quanto il colorante “nuovo” colora più facilmente ed è sufficiente un minor numero di minuti di immersione. Se dovesse essere necessaria una colorazione molto pallida, per far sì che l’ematossilina non copra altre strutture positive al colorante “parallelo”, potrebbero essere sufficienti anche soli 2 minuti di immersione. ***** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in ematossilina, serve a differenziare la tonalità del colorante che, da un rosso brunastro di partenza, deve raggiungere un colore violetto intenso. Una volta raggiunta la gradazione di colore desiderata, si può procedere al passaggio successivo. P.A.S. ORANGE = Colorazione istochimica; un’estensione della P.A.S. reazione. E’ la colorazione elettiva per l’ipofisi, in quanto serve a distinguere, all’interno della popolazione cellulare dell’ipofisi, i diversi tipi di cellule. Nell’ipofisi anteriore, infatti, le cellule basofile si colorano in fucsia ( Schiff), quelle acidofile in arancio (orange G) e quelle cromofobe in blu- violetto (ematossilina). In genere, con il color giallo-arancio tipico dell’orange G, si colorano appunto le cellule acidofile dell’ipofisi anteriore, i globuli rossi ed i vasi sanguigni.

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CRESILVIOLETTO (COLORAZIONE DI NISSL)  Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi: Soluzione di immersione Acqua di fonte Cresilvioletto Acqua di fonte Alcool 96° Alcool assoluto (100°) I Alcool assoluto (100°) II Xilolo

Tempo di immersione 1 minuto 3 – 5 minuti * Passaggio veloce ** Passaggio veloce *** 2 minuti 2 minuti 4 minuti

* = Il tempo di immersione può variare a seconda dello spessore della fetta, della intensità di colore desiderata, e della freschezza della soluzione di cresilvioletto (più è fresca, meglio colora). ** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in cresilvioletto deve essere necessariamente molto veloce. Infatti l’acqua dilava molto facilmente il colorante dalla fetta, che rischia di rimanere troppo chiara. *** = Si passa direttamente in alcool 96° (saltando il passaggio in 80°) per lo stesso motivo che ci impone di effettuare un passaggio veloce in acqua: il colorante si dilaverebbe troppo. Se però la fetta dovesse essere molto colorata, e fosse necessario schiarirne la tonalità, è possibile effettuare un passaggio intermedio in alcool 80°, sempre stando molto attenti a non perdere completamente la colorazione. CRESILVIOLETTO = Questa colorazione è specifica per gli acidi nucleici e per la sostanza di Nissl (componente del sistema nervoso). È appunto utilizzata come colorazione di base all’interno del sistema nervoso.

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LUXOL  Dopo aver effettuato la sparaffinatura, saltando l’immersione in acqua distillata, occorrono i seguenti passaggi: Soluzione di immersione Luxol Fast Blue Alcool 96° Acqua distillata a) Carbonato di litio b) Alcool 70° c) Acqua distillata Acqua distillata Cresilvioletto Acqua di fonte Alcool 96° Alcool assoluto (100°) I Alcool assoluto (100°) II Xilolo

Tempo di immersione Tutta la notte a 60°C * Risciacquo ** Passaggio veloce Passaggi veloci ripetuti*** 1 minuto 3 – 5 minuti **** Passaggio veloce ***** Passaggio veloce ****** 2 minuti 2 minuti 4 minuti

* = Avere cura di chiudere bene il contenitore con la soluzione e i vetrini. Il colorante, infatti, è a base alcolica, ed evaporerebbe in fretta, alla temperatura necessaria per la colorazione. ** = Effettuare più lavaggi di risciacquo con alcool 96° in modo da togliere ogni residuo di colorante in eccesso. *** = Ripassare in a, b e c finché la sostanza grigia e quella bianca non sono ben differenziate l’una dall’altra: il colore blu-verde dei fasci di sostanza bianca, deve contrastare i colori pallidi della sostanza grigia. **** = Il tempo di immersione può variare a seconda dello spessore della fetta, della intensità di colore desiderata, e della freschezza della soluzione di cresilvioletto (più è fresca, meglio colora). ***** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in cresilvioletto deve essere necessariamente molto veloce. Infatti l’acqua dilava molto facilmente il colorante dalla fetta, che rischia di rimanere troppo chiara. ****** = Si passa direttamente in alcool 96° (saltando il passaggio in 80°) per lo stesso motivo che ci impone di effettuare un passaggio veloce in acqua: il colorante si dilaverebbe troppo. Se però la fetta dovesse essere molto colorata, e fosse necessario schiarirne la tonalità, è possibile effettuare un passaggio intermedio in alcool 80°, sempre stando molto attenti a non perdere completamente la colorazione. LUXOL = Si tratta di una colorazione elettiva per il tessuto nervoso. Serve ad evidenziare in modo chiaro e preciso i fasci di sostanza bianca all’interno del sistema nervoso centrale. Questi fasci vengono colorati in blu dal luxol, mentre il cresilvioletto colora in viola le cellule nervose.

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IMPREGNAZIONE ARGENTICA Metodo Bielschowsky modificato da Gless  Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi: Soluzione di immersione Sol. acquosa fresca di Nitrato d’Argento 20% Formalina 10% Acqua di fonte Argento ammoniacale Formalina 10% Acqua di fonte Tiosolfato di sodio 5% Acqua di fonte Alcool 80° Alcool 96° Alcool assoluto (100°) I Alcool assoluto (100°) II Xilolo

Tempo di immersione 5 minuti * Almeno due cambi ** Lavaggio accurato 40 secondi / 1 minuto *** Almeno due cambi di 1 minuto ciascuno **** Lavaggio accurato ***** 3 minuti Lavaggio accurato 1 minuto 1 minuto 2 minuti 2 minuti 4 minuti

* = Questo passaggio va effettuato al buio e alla temperatura di circa 50°C. Bisognerà perciò evitare l’esposizione alla luce diretta durante l’immersione del vetrino nella soluzione e quindi porre la vaschetta in stufa. Inoltre, la soluzione di nitrato d’argento non deve venire a contatto con metalli di alcun genere, perciò dovremo aver cura di evitare questo tipo di contatto. N.B.: la soluzione in oggetto va FILTRATA con una certa scrupolosità prima dell’immersione del vetrino, al fine di evitare un eccessivo deposito di residui sulla fetta. ** = Dopo aver fatto raffreddare la soluzione di nitrato d’argento, ed aver accuratamente sgocciolato il vetrino, senza però lavarlo in acqua, è necessario effettuare un “lavaggio” in formalina 10%, ed i due cambi si rendono fondamentali in quanto al primo cambio la soluzione viene “sporcata” eccessivamente per effettuare un buon lavaggio. *** = Asciugare delicatamente il vetrino con la sezione e porlo nella soluzione di argento ammoniacale, che deve essere preparata al momento. **** = Dopo aver sgocciolato i vetrini, immergerli in formalina (i due cambi hanno esattamente la stessa funzione che avevano al primo passaggio in questa soluzione). Durante l’immersione la fetta dovrebbe assumere un color tabacco intenso. ***** = Dopo il lavaggio in acqua, è utile un passaggio ulteriore per indicare se l’impregnazione è avvenuta correttamente: osservare il vetrino al microscopio ottico. Se le strutture da evidenziare sono già tutte ben chiaramente differenziate, procedere con il resto della colorazione, diversamente, se l’impregnazione non è completa, effettuare nuovamente i passaggi dall’immersione in argento ammoniacale in poi. RISULTATO = I neuroni e le neurofibrille sono colorate in nero, sia per quanto riguarda il pirenoforo, che per l’assone, i nuclei assumono una tonalità dal nero al marrone, e la colorazione di fondo è bronzo-dorato. Si mettono in evidenza in nero anche le fibre amieliniche e le terminazioni nervose.

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P.T.A.H.  Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi: Soluzione di immersione Fluido di Zenker Acqua di fonte Soluzione di Lugol Alcool 96° Acqua distillata Permanganato di Potassio Acido ossalico 5% Acqua di fonte Acqua distillata Soluzione P.T.A.H. Alcool 96° Alcool assoluto (100°) I Alcool assoluto (100°) II Xilolo

Tempo di immersione 20 minuti a 60°C 5 minuti 10 minuti 15 minuti* 3 minuti 8 minuti** 3 minuti*** 3 minuti Passaggio veloce 24 ore Passaggio veloce**** 4 minuti 2 minuti 4 minuti

* = Il tempo di immersione è indicato approssimativamente, in quanto questo passaggio serve per decolorare le fette: se dovesse essere necessario, si può aumentare il tempo. ** = Come per il reattivo di Schiff, è necessario prestare attenzione affinché la soluzione non venga a contatto con metalli di alcun genere. *** = L’acido ossalico decolora completamente la fetta dall’eccesso di permanganato. **** = Il passaggio in alcool 96° serve a cominciare la disidratazione, ma bisogna stare attenti a non lasciarvi le fette troppo tempo. E’ sufficiente scuotere il vetrino nel pozzetto dell’alcool 96° per qualche secondo e passare all’immersione in alcool assoluto. RISULTATO = Questa colorazione è specifica per il sistema nervoso centrale. Nel cervello e nel midollo spinale il corpo cellulare dei neuroni si presenterà in giallo-arancio, le fibre nervose in viola-blu e le fibre mieliniche in viola intenso. Ovviamente all’interno del midollo il viola sarà più intenso per la presenza di un maggior numero di fibre mieliniche.

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SAFRANINA – VERDE LUCE  Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi: Soluzione di immersione Safranina alcolica di Pfitzner Acqua distillata Soluzione acquosa satura di acido picrico Verde luce Alcool assoluto (100°) I Alcool assoluto (100°) II Xilolo

Tempo di immersione 24 ore Passaggio veloce Differenziare* 30 secondi 2 minuti** 2 minuti** 4 minuti

* = Il tempo varia a seconda della velocità di differenziazione. La cosa migliore per capire quando togliere le fette dall’acido picrico sarebbe aiutarsi con il microscopio finché non si nota che il citoplasma è decolorato quasi completamente. ** = Se si nota un eccessivo scolorimento del verde durante i passaggi in alcool assoluto, ridurre i tempi al minimo necessario per una disidratazione accettabile e passare in xilolo. SAFRANINA – VERDE LUCE = Colorazione di insieme che può essere messa a parallelo con la classica ematossilina-eosina. Il citoplasma viene colorato dal verde luce e presenta perciò diverse tonalità di verde mentre i nuclei si colorano in rosso.

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