Fisiologia Cellulare (diffusione, Potenziale, Muscolare)

Diffusione e trasporto

Matteo Paolucci

Cenni storici •

1828 Brown (botanico) descrive il moto di granelli di polline in un liquido (utilizza microscopio), che prenderà il suo nome moto casuale a zig-zag; non è un moto vitale; brusco cambio di direzione

o

•

1905 Einstein pubblica un lavoro nel quale sostiene che la traiettoria erratica di una particella sospesa in un liquido è il risultato di collisioni casuali con le molecole di liquido

molecole colpiscono particella ; granello è rivelatore di molecole Einstein predice che il moto della particella è statisticamente regolare. La distanza

o

quadratica media aumenta linearmente nel tempo. !

"x 2 # t

!

equazione di Stokes-Einstein (vale per molecole sferiche): "

"x 2 = 2Dt

D: coefficiente di diffusione o diffusività

!

"x 2 [ m ] = = m 2 s#1 = cm 2 s#1! 2t [t] 2

D= Diffusione di una goccia di inchiostro in acqua

!

moto browniano dell’inchiostro che diffonde nell’acqua

se si prende in considerazione la sezione, all’inizio la goccia è concentrata nel punto 0 # sia al t1 che al t2 mantiene forma sferica perché la probabilità di muoversi è uguale in tutte le direzioni

quindi: ma

!

"x = "y = 0 # molecole diffondono in tutte le direzioni

"x 2

è un valore positivo

per un gas rarefatto

"x # t , per particelle più grandi (moto browniano) "x 2 # t

(distanze percorse sono più

piccole)

!

il mezzo deve essere uniforme (probabilità di urto in ogni punto del mezzo è la stessa) e omogeneo

D=

! KB " T 6# " r " $

! # cm2s-1

•

r: raggio di Stokes della particella (r di molecole sferiche)

•

!: viscosità del mezzo

numeratore: energia cinetica media delle molecole (Kb: costante di Boltzman)

!

•

se è maggiore, la diffusione è facilitata (è infatti accelerata da un aumento di temperatura)

denominatore: •

r: se r aumenta, la diffusione viene rallentata # molecole grandi diffondono meno velocemente rispetto a molecole piccole

•

!: dipende da raggio molecolare e da densità del mezzo # diffusione è più veloce in mezzo meno denso: più veloce in aria che in acqua (minore densità=meno urti)

Valori esemplificativi del coefficiente di diffusione D a 20° Molecole

PM (Dalton)

Solvente

D (m2s-1)

note

-5

Idrogeno

2

Aria

6,4 x 10

Ossigeno

32

Aria

1,8 x 10-5

aumento di r # aumento di PM (r è proporzalla rad. cub. di PM) # D diminuisce

Ossigeno

32

Acqua

1,0 x 10

-9

Glucosio

180

Acqua

6,7 x 10

-10

Emoglobina

64 x 103

Acqua

6,9 x 10-11

aumento ! del mezzo # D minore di 4 ordini

esempio: quanto tempo impiega in media una molecola di ossigeno per diffondere in 1 cm di acqua?

#

bisogna specificare T per avere D # 20°

2

10#2 ) ( "x 2 10#4 m 2 t= = = = 5 $10#4 s = 13,9ore #9 2 #1 #9 2D 2 $ (1,0 $10 ) 2 $10 m s diffusioni efficaci per distanze microscopiche; su distanze macroscopiche (mm, cm), i processi di diffusione sono molto lenti (mezzo è immobile) •

!

negli organismi pluricellulari il trasporto è principalmente convettivo o

es.: trasporto ossigeno !

ventilazione polmonare

!

circolazione sanguigna

Diffusione tende a rendere uguali le concentrazioni tra 2 compartimenti

J: vettore: va da concentrazione elevata a concentrazione minore •

flusso iniziale: max

•

flusso è detto netto: si prende in considerazione la somma algebrica del flusso positivo e di quello negativo

•

si raggiunge un equilibrio dinamico (2 velocità sono uguali)

Legge di Fick

J = "D # A #

$C $x

#

"C = #C "x

è il gradiente di concentrazione (grandezza fisica che varia a seconda

della distanza) Flusso è direttamente proporzionale a:

!

•

coefficiente di diffusione

•

superficie A !

•

gradiente di concentrazione

segno - : gradiente è negativo, serve a far diventare positivo il flusso

gradiente lineare: concentrazione diminuisce linearmente con l’aumentare della distanza # per "x positivo, "C è negativo # "C/"x negativo secondo gradiente # in discesa, down hill contro gradiente # no diffusione ma trasporto attivo (spesa energetica) es.: cellula # molecola che diffonde nel citoplasma o all’esterno; per quanto riguarda il passaggio attraverso la membrana, i mezzi sono diversi •

necessario conoscere la solubilità di x nei lipidi di membrana ## – coefficiente di partizione (solubilità relativa di una sostanza tra mezzo idrofobico e acqua)

"x =

[ x]B [ x]A

supponendo che [x]A (fase acquosa) e [x]B (fase lipidica) siano in equilibrio

considerando il tutto come la reazione [x]A⇌[x]B se x è idrofilica:

!

•

reazione diretta: sfavorita

•

reazione inversa: favorita

•

v(AB)=k(AB)[x]A

•

v(BA)=k(BA)[x]B o

se x è idrofilia, k(BA) è maggiore: [x]A!"[x]B

o

all’equilibrio v(AB)=v(BA) - se k(AB) è minore, [x]A è maggiore; se k(BA) è maggiore, [x]B è minore

Passaggio attraverso la membrana cellulare (2 fasi acquose separate da una fase lipidica)

gradiente efficace è dato da concentrazione alle due facce della membrana # [x]A’: concentrazione di x su strato lipidico della membrana che si affaccia su A •

gradiente efficace:

•

dato che:

%x

([ x] " [ x] )

!

!

[ x ]A # $ [ x ]B #

[ x ] A " = # x $ [ x ] A e [ x ] B " = # x $ [ x ] B , allora

!# $ x J = "Dx # A •

"C =

A

B

%x !

considerando "x (spessore della membrana) circa 5 nm

k(p): coefficiente di permeabilità

o

quindi:

J = "k p # A # $C !

!

kp =

Dx " # x $x

"C è la diversa concentrazione tra le due fasi acquose

Quanto più basso è il coefficiente di partizione, tanto più bassa è la permeabilità della membrana (ma influisce anche il peso molecolare)

infatti la permeabilità dell’alcol metilico è maggiore di quella dell’alcol etilico, ma il suo coefficiente di partizione è minore # alcol metilico è più piccolo Diffusione di O2 e CO2 •

processo passivo, secondo gradiente

•

MAC membrana alveolo capillare

!: flusso di massa # quantità di gas che diffonde nella membrana per unità di tempo K: coefficiente di diffusione di Krogh Area di scambio è elevatissima: pari a quella di un campo da tennis

˙ = K " A " #P M #x "P: gradiente di pressione parziale "x: spessore di membrana

!

"pO2=60 mmHg "pCO2=6 mmHg o

ma i due flussi sono praticamente uguali !

K(CO2) è più elevata di K(O2) # K(CO2)>K(O2) "

CO2 è apolare, O2 è polare # maggiore solubilità di CO2 nei lipidi di membrana

Diffusione attraverso canali nella membrana

proteine creano pori idrofilici nella membrana •

permettono passaggio di sostanze che non riuscirebbero a passare per diffusione nei lipidi # acqua, ioni a basso PM

CANALI •

conferiscono una permeabilità selettiva alla membrana per specifiche molecole (Na+, K+, H2O, Cl-, Ca++)

•

la forza motrice per il movimento delle molecole è il gradiente elettrochimico (diffusione secondo

•

sono proteine di membrana con domini idrofobici, che permettono l’ancoraggio nella membrana, e

gradiente # passiva) domini idrofilici, che formano il poro (=tunnel idrofilico per il passaggio delle molecole)

o

molecole antifiliche su superficie idrofobia (amminoacidi idrofobici)

o

amminoacidi idrofilici in porzione di proteina che crea il tunnel

es.: aquaporina-2 (tubulo renale) – regolata dall’ADH

o

o o

domini transmembrana: amminoacidi idrofobici (triptofano) e idrofilici (istidina, ac. glutammico)

o

si trova in membrane con alta permeabilità a acqua dovuta a loro funzioni !

in epitelio del tubulo renale

!

in epitelio intestinale

!

in eritrociti

!

in epitelio del cristallino

!

diffusione semplice attraverso spazi tra lipidi (via lenta, poco efficiente; lipidi

!

attraverso canali (rapida, molto efficiente)

!

forza motrice è gradiente osmotico

H2O hanno permeabilità finita)

•

di solito sono costituiti da varie subunità tenute insieme da legami non covalenti (tetrameri, pentameri, esameri…). Ogni subunità=1 polipeptide o

diametro del poro aumenta con l’aumentare del numero di subunità

!

tetrameri: altamente selettivi # ioni; voltaggio dipendenti

!

pentameri: ligando selettivi

(# 2 subunità $ # 2 molecole di ACh) !

esameri: gap junctions

proteine connessine: •

6 connessine # 1 emiconnessone su ogni cellula # connessone

•

vie di trasmissione di molecole (anche ATP) e corrente elettrica

•

la selettività dipende da fattori quali il diametro del poro e le cariche elettriche presenti sulla superficie del poro (“filtro di selettività”) o

canale voltaggio dipendente per il potassio - sezione

!

diametro grande all’imbocco, ma poi si restringe

!

per poter passare attraverso la strettoia, lo ione si deve disidratare: "

potassio in H2O:

# raggio dello ione idratato è molto maggiore di quello dello ione

"

la prima reazione (disidratazione) non è spontanea # necessaria spesa energetica; il costo energetico necessario a rimuovere l’acqua è quello

che seleziona gli ioni (es.: costo maggiore per il sodio rispetto al potassio) "

costo è speso da cariche negative, che stabilizzano lo ione in forma

"

necessario comunque il gradiente per aver flusso netto; parte del costo

non idratata (non tutto) è recuperata da deidratazione Si possono distinguere: •

canali sempre aperti (# permeabilità costitutiva) – canali di leakage

•

canali regolati: stato chiuso/stato aperto (# permeabilità regolata) o

stato è conferito dai cancelli – gates (numero di cancelli è variabile per ogni cellula)

Canali •

voltaggio dipendenti: cancelli sensibili a voltaggio transmembrana

•

legando dipendenti: cancelli sensibili a concentrazioni di legando (segnale chimico)

Classi di canali e relativi esempi Classi

tipo

attivato da

permeabile a

funzione

canali

aquaporrina 1,2

-

H2O

permeabilità a H2O (tubulo

mente aperti

c. di leakage

-

Na+ K+ Cl-

canali voltaggio

c. rap. del sodio

"% (potenziale

Na+

potenziale di azione nella fibra

dipendenti

delayed rectifier

elettrico

K+

nervosa (e muscolare)

c. del Ca++ (vari

transmembranico)

Ca++

secrezione (NT, ormoni,

permanente-

renale, eritrocita, cristallino) potenziale di membrana a riposo

tipi)

enzimi digestivi, granule) e potenziale azione (neuroni invertebrati, fibra muscolare cardiaca e liscia)

canali ligando

recettore

dipendenti

nicotinico KACh (secreto da

ACh (acetilcolina)

GK

Na+ e K+

trasmissione neuromuscolare,

(cationi

trasm. sinaptica nei gangli

monovalenti)

autonomici

K

+

nervo vago #

cellule pacemaker – neuroni del SNC

parasimpatico) recettore di

Glu, NMDA, Kainato

Na+ Ca++

glutammato

sinapsi eccitatore del SNC (fa aumentare attività elettrica della cellula postsinaptica)

rec. di GABA

GABA

Cl-

(acido gamma

diminuire attività elettrica

aminobutirrico) rec. di glicina

sinapsi inibitorie del SNC (fa della cellula postsinaptica)

glicina

Cl-

sinapsi inibitorie del midollo spinale (se disattivato # spasmi muscolari: tetano)

canale del Ca++

IP3 e altri (inozitolo

Ca++

del reticolo

trifosfato – prodotto

migrazione, avanzamento del

endoplasmatico

intracellulare del

cono di crescita assonale)

metabolismo dei lipidi)

Canali sono alla base di moltissime funzioni cellulari! •

scambio di sostanze, motilità, trasmissione sinaptica, ritmicità…

mobilità cellulare (mitosi,

Passaggio mediato da trasportatori – trasporto

conformazioni del trasportatore •

T(cis): trasportatore aperto in cis

•

T(trans): trasportatore aperto in trans

•

S: soluto

soluto in posizione cis non legato al trasportatore # formazione complesso attivato # soluto in posizione trans non legato al trasportatore cinetica della reazione:

cinetica di saturazione: dopo un certo valore, tende a raggiungere asintoticamente un massimo (J max) si applica equazione di Michaelis-Menten (valida per enzimi e per trasportatori):

J=

J max " [ S ] [S ] + K m •

Km: costante di Michaelis-Menten [mol/L]

se [S] << (molto minore) Km # si trascura [S] al denominatore perché molto piccolo # J max e Km sono costanti # J è proporzionale a [S]: J

!

o

=

J max " [S ] Km

finchè [S] è molto piccolo, relazione tra J e S è lineare:

!

•

se [S] >> Km # si trascura Km # J tende a J max

•

se [S]=Km #

J = J max "

1 2

!

Proprietà comuni del trasporto passivo (no consumo di energia, secondo gradiente) e del trasporto attivo (consumo energia, contro gradiente) •

più rapido che semplice diffusione (per concentrazioni basse); il soluto si lega alle proteine carrier

•

cinetica di saturazione

•

specificità (addirittura fino a isomeri e stereoisomeri)

o

o

però si raggiunge saturazione: velocità non può aumentare ulteriormente

es.: trasportatori del glucosio sono selettivi per D-glucosio (L-glucosio solo diffusione)

•

inibizione competitiva da parte di molecole strutturalmente simili (es. fruttosio) o

a concentrazioni alte può bloccare siti di attacco del glucosio !

fenilchetonuria (malattia genetica) – mutazione del gene che codifica per enzima che modifica amminoacido fenilalanina in tyr # ipofenilalaninemia fenilchetoni

"

interferisce con trasportatori che portano amminoacidi a cervello #

"

mal sviluppo cerebrale (si può scoprire con test di Ames) o

competitiva: stessa forma, stessi punti di legame # invece inibizione non competitiva è data da una molecola con diversa forma e altro punto di legame sul trasportatore, che viene così modificato

Trasporto attivo e passivo •

attivo: contro gradiente – necessita di energia metabolica (ATP)

•

passivo: secondo gradiente – non necessita di energia metabolica (ATP)

k1

ATP

k2

k-1

k-2

se si aumenta substrato, reazione è favorita •

[S] in cis diminuisce, [S] in trans aumenta

•

diffusione avrebbe invece eguagliato concentrazione da entrambe le parti

Equilibrio dinamico # v1=v-1 •

v1=k1[S][Tcis]

•

v-1=k-1[STcis]

KD, costante di dissociazione:

K Dcis =

!

kdissociazione k associazione

k"1 k = 2 ; KD trans k1 k"2 o se K(D) ! è elevato # prevale dissociazione o

!

KD =

se K(D) è piccolo # prevale associazione !

TRASPORTO PASSIVO:

!

TRASPORTO ATTIVO:

"

KD CIS=KD TRANS

KD CIS < KD TRANS

in cis è favorita associazione e in trans è favorita dissociazione [S]cis può essere minore di [S]trans

Trasporto attivo:

Trasporto passivo:

Trasporto attivo si divide in primario e secondario: •

•

primario: o

legato direttamente a metabolismo dell’ATP # POMPE

o

pompa del sodio e del potassio – ATPasi Na+/K+ dipendente !

accumula K+ all’interno e Na+ all’esterno

!

ogni 3 Na+ vengono trasportati 2 K+

secondario: o

utilizza gradienti già presenti (es. ionici) per generare altri gradienti

o

trasporto Na+ dipendente del glucosio (GLUT) !

gradiente di Na+ (accumulato all’esterno# va verso interno)

!

non richiede direttamente ATP, ma gradiente di Na+ (però per creare gradiente serve ATPasi Na/K dipendente)

nell’epitelio intestinale e nell’epitelio renale sono presenti entrambi i sistemi o

circuito di Na+ # esce con pompa e rientra con gradiente

!

$: subunità catalitica

!

#: subunità regolatrice (modula attività $)

!

pompa genera differenza di potenziale elettrico transmembranico (eccesso di cariche positive all’esterno)

!

"

esterno elettropositivo

"

interno elettronegativo

uabaina: inibitore (bloccante selettivo e potente) "

veleno, ma utilizzata nei farmaci cardiaci

Ciclo ipotetico della ATPasi Na/K dipendente

Trasporto attivo secondario Na dipendente

es.: •

trasportatore Na-dipendente del glucosio SGLT1

•

trasportatore Na-dipendente di amminoacidi

•

trasportatore Na-dipendente del calcio

o

o

epitelio intestinale, tubulo renale

muscolo scheletrico, muscolo cardiaco

Trasporto di amminoacido metionina

[Na ]esterno ; = [Na ]interno +

gradienteNa + •

+

[ Met]interno [ Met ]esterno

Met si accumula all’interno e non all’esterno o

!

gradienteMet =

maggiore il gradiente di Na, maggiore è l’accumulo di Met

! Trasportatori di glucosio (GT o GLT) •

G2 (lievito) GT4 (cellule muscolari embrionali)

•

nell’adulto: o

GT1: Na-dipendente

o

GT3

o

GT5: insulino-dipendente !

insulina: ormone (pancreas) ipoglicemizzante # abbassa concentrazione glucosio nel sangue (trasporta da esterno a interno cellule)

Meccanismi di stimolazione del trasporto del glucosio

•

presente in muscolo scheletrico adipocita

Trasportatori degli amminoacidi 20 amminoacidi # 3 famiglie principali di trasportatori •

amminoacidi neutri o

A – am. piccolo e idrofilici (Na-dipendente)

o

L – leucina e am. idrofobici (trasp. passivo)

o

ASC – alanina, serina, cisteina (Na-dipendente)

•

amminoacidi acidi (ASP, GLU)

•

amminoacidi basici (ARG, LYS)

Metionina è trasportata per o

60% da L # prevale trasporto passivo

o

20% da ASC e 10% da A # Na-dipendente

o

10% NS (non saturabile) # semplice diffusione (am. neutro)

Sintesi ATP enzima ATP-sintetasi :pompa protonica •

membrana interna mitocondri

•

sfruttando un gradiente di idrogenioni, generato da trasporto elettroni nella catena respiratoria, è in grado di generare ATP

o

proteina transmembrana F0F1

o

funzionamento simile a dinamo

o

3 subunità catalitiche ($#)

Assorbimento sostanze nutritive nell’intestino •

passaggio da esterno (lume) a interno

o

passaggio dei di/tripeptidi:

o

passaggio di glucosio:

o

lipidi (scissi da lipasi – enz. pancreatico) – resi solubili tramite sali biliari e colesterolo # formazione micelle

o

acqua – elevata permeabilità grazie a canali (aquaporina-1) !

1 – via transcellulare

!

2 – via paracellulare (attraverso tight junction)

geni codificano per trasportatori •

possibili mutazioni possono dare intolleranze (es. fruttosio # gene codifica male per il trasportatore)

Potenziale di membrana

Matteo Paolucci

Quantità di carica •

e-=-1,6 x 10-19 C

•

Na+=+1,6 x 10-19 C

•

Ca2+=3,2 x 10-19 C

Costante di Faraday: F=105 C quantità di carica di una mole di ione monovalente: e- x N° Avogadro Intensità di corrente: quantità di carica che passa per una sezione in una certa unità di tempo

I=

" 1C % $#Ampere = 1s '&

Q "t

Legge di Ohm •

!

forza elettromotrice (differenza di potenziale) muove le cariche attraverso resistenze

!

•

o

per convenzione I va da + a -, anche se sono gli elettroni a muoversi

o

"V=I x R;

R="V / I;

[&=1V/1A]

due tipi di resistenze: o

resistenze ohmiche

o

resistenze non ohmiche

Condensatore: accumula cariche di segno opposto sulle due armature (separate da dielettrico # non c’è passaggio di corrente)

•

capacità: quantità di carica separata per una determinata differenza di potenziale o

Leggi di Kirchoff

C=Q/"V

•

I: resistenze in serie – "V="V1+"V2+"V3 o

differenza di potenziale totale è data dalla somma delle singole cadute di potenziale dopo ogni resistenza

•

II: maglie – la corrente entrante è uguale alla somma delle correnti uscenti o

caso specifico di legge della conservazione dell’energia

Cellula in soluzione fisiologica (# equilibrio osmotico)

in fisiologia per misura d.d.p. si usa oscilloscopio invece del voltmetro:

infilando l’elettrodo all’interno della membrana, si nota che l’interno è più elettronegativo rispetto all’esterno (millivolt)

questo è un fenomeno locale di membrana: potenziale transmembranario •

misurabile solo a cavallo della membrana

•

carica netta intracellulare è 0

•

# chiamato potenziale di diffusione

potenziale è causato da diffusione di ioni (K+) secondo gradiente

•

inizialmente K+ passa da A in B per ristabilire equilibrio (Cl- non può passare)

•

dopo il passaggio di K+,

•

o

in B c’è un eccesso di cariche positive (K+ > Cl-)

o

in A c’è un eccesso di cariche negative (Cl- > K+)

si genera un campo # E: potenziale elettrico o

"V=EA-EB

o

vettore campo elettrico va in direzione opposta alla direzione degli ioni (va da B ad A)

o

ad un certo momento il vettore diventa abbastanza grande da equilibrare il passaggio di ioni

Legge di Nernst

EA " EB = EK +

+ + RT [K ] B RT [K ] A = ln =" ln zF [K + ] zF [K + ] A B

EA-EB # all’equilibrio EK+# potenziale di diffusione del potassio z # valenza dello ione

!

[K ] RT = "2,303 Log + A F [K ] +

EK +

(in base 10)

B

Valori di 2,303 RT/F a varie T

!

°C

2,303 RT/F [mV]

0

54,20

10

56,18

20

58,17

30

60,15

37

61,54

Potenziale di equilibrio: potenziale elettrico quando c’è equilibrio tra forza chimica (A#B) e forza elettrica (B#A)

•

corrente è uguale a 0 quando il potenziale elettrico è uguale e opposto al potenziale chimico

Calcolo del potenziale di equilibrio di alcuni ioni fondamentali concentrazioni ioni in cellula muscolare di mammifero a 30° [mmoli/L] K+

Na+

Cl-

Interno

155

12

4

Esterno

4

155

120

Potenziale di equilibrio a 30° EK+= -60,15 log (155/4)! -97 mV ENa+= -60,15 log (12/155)! +66 mV ECl-= +60,15 log (4/120)! -90 mV Nella maggior parte delle cellule il potenziale di membrana a riposo è molto vicino al potenziale di equilibrio del potassio, perché la membrana è quasi esclusivamente permeabile al potassio Potenziale di membrana a riposo è direttamente proporzionale a log[Kesterno]/[Kinterno]

•

a potenziali molto negativi si discosta da previsioni perché interviene anche il sodio (potenziale diventa meno negativo)

•

sostituendo il sodio con la colina (infatti, mentre è impossibile sostituire ciò che è all’interno della cellula, è facile cambiare ciò che è all’esterno # soluzione), il grafico segue perfettamente i valori predetti

o •

catione come il sodio, ma non riesce a passare attraverso canali

iperkalemia: aumenta concentrazione di K+ nel sangue # troppo K+ extracellulare o

varia il Ke # nel grafico, a diversi valori di Ke il potenziale di membrana è influenzato in maniera diversa

Conduttanza g=1/R [Siemens, S]

I="V/R # I=g"V Passaggio K+ attraverso membrana

•

IK+=gK+(Em-EK+) gK+ # data da canale

•

Em-EK+ # differenza tra potenziale di membrana e potenziale di equilibrio del potassio o

supponendo che !

Em=-20 mV

!

EK+=-97 mV

IK+=gK+[-20-(-97)]=gK+(+77) " o

ione si muove da interno verso esterno

supponendo che !

Em=-97 mV

!

EK+=-97 mV

IK+=0 # ione non passa: non basta il canale, per muovere lo ione c’è bisogno anche di f.e.m. o

supponendo che !

Em=-110 mV

!

EK+=-97 mV

ione si muove da esterno a interno # contro gradiente Canali specifici per Na+ e K+ su membrana cellulare

quanto vale Em? •

IK+=gK+(Em-EK+)

•

INa+=gNa+(Em-ENa+)

Em stabile quando la somma algebrica delle due correnti è 0 •

IK++ INa+=0 o

gK+(Em-EK+)+ gNa+(Em-ENa+)=0

Equazione di Goldman Hodgkin Huxley:

Em =

gK + E K + + gNa + E Na + gK + + gNa +

simile a media ponderata: !

!

xP =

P1 x1 + P2 x 2 + ...+ Pn x n P1 + P2 + ...+ Pn

è la media ponderata dei potenziali di membrana pesati sulle rispettive conduttanze

!

se conduttanza è uguale a 0 per uno ione # impermeabilità a quello ione

!

pot. ! di membrana può variare rapidamente; variazioni # segnali

Potenziale di membrana

# Cambio rapporti di permeabilità: •

1) gK+>> gNa+

•

2) gNa+>> gK+

•

3) gK+>> gNa+

Pompa sodio/potassio # elettrogenica •

contribuisce al potenziale di membrana o

debolmente in cellule nervose

o

pesantemente in altre cellule

•

deficit di cariche positive all’interno; Em negativo sodio può rientrare attraverso canale

•

potassio può rientrare attraverso pompa o

# creazione corrente (IK+T e INa+T sono dovute al trasportatore)

quindi si ottiene un Em stabile se IK++ INa++ IK+T + INa+T =0

Modello elettrico del potenziale di membrana •

circuito necessita di: batteria, resistenze, condensatore

+

•

•

batteria del potassio: "V # Em-EK+ o

se Em è 0, EK+ tende a far uscire K+

o

infatti: !

canale # K+ all’esterno

!

trasportatore # K+ all’interno

batteria del sodio: "V # Em-ENa+ o

se Em è 0, ENa+ tende a far entrare Na+

o

infatti: !

canale # Na+ all’interno

!

trasportatore # Na+ all’esterno

Ioni cloro – solo trasporto passivo

ECl-=Em •

a seconda della direzione Em, ICl- cambia direzione

•

se Em=0 # ECl-=0: stessa concentrazione di Cl- all’interno e all’esterno

Generalmente le resistenze sono variabili •

permeabilità può cambiare in base a diversi fattori: o

canali voltaggio dipendenti: cambiano permeabilità a seconda del potenziale di membrana

Fasi del potenziale di azione (fibra nervosa)

quando pot. supera il valore soglia, si innesca pot. d’azione

dopo innesco valore soglia, rapida depolarizzazione durata del pot. varia a seconda delle cellula •

cellule nervose: molto rapido # trasmissione segnale

•

cellule muscolari cardiache # stimolo di contrazione

o o

processo molto rapido: può avvenire 500 volte in un secondo 4-5 impulsi al minuto, dai 60 ai 200 al min.

Variazione di permeabilità della membrana

Em come media ponderata depolarizzazione # rapido aumento conduttanza Na+ ripolarizzazione # rapida diminuzione conduttanza Na+ e aumento conduttanza K+ Conduttanza determinate da canali voltaggio-dipendenti Potenziale soglia # si aprono canali voltaggio-dipendenti per Na+ (prima erano chiusi) •

fanno entrare Na+ o

depolarizzazione ulteriore !

si aprono ulteriori canali "

ecc. # processo esplosivo; si arriva fino quasi a ENa+

Cellula si ripolarizza •

si aprono canali voltaggio-dipendenti del potassio o

“Delayed rectifier”: riporta pot. di membrana a riposo; stabilizzano pot. membrana a valori negativi

•

canali del sodio si inattivano (sono aperti ma un meccanismo impedisce passaggio ioni) o

conduttività per sodio diminuisce molto rapidamente

Introduzione alla fisiologia delle membrane eccitabili •

eccitabilità: capacità della membrana biologica di generare attivamente unsegnale elettrico in

•

segnale: prende il nome di potenziale d’azione (spike=punta)

•

potenziale d’azione si innesca solo se Em supera in certo valore soglia

•

cellule in grado di generare un potenziale d’azione prendono il nome di cellule eccitabili (neurone,

risposta ad uno stimolo; si differenzia quindi dalla risposta passiva

fibra muscolare, cellule endocrine) •

ampiezza [differenza tra il potenziale a riposo e massimo potenziale depolarizzato] del potenziale d’azione è indipendente da intensità stimolo # evento “tutto o nulla” (a differenza della risposta passiva # proporzionale a intensità stimolo)

•

fenomeno non lineare: effetto “crinale” # analogia con esplosione

•

forma e durata del potenziale d’azione dipendono dal tipo di cellula

•

al potenziale d’azione è sempre associato un periodo di tempo nel quale la membrana non è eccitabile # periodo refrattario o

periodo refrattario assoluto (non è possibile generare nuovo spike)

o

periodo refrattario relativo (membrana parzialmente eccitabile: si può creare nuovo spike ma serve uno stimolo di intensità maggiore rispetto al primo # aumento del valore soglia)

o

# limita la frequenza con cui una cellula può generare impulsi !

•

p. r. assoluto determina durata massima del potenziale d’azione

la fase di depolarizzazione rapida è dovuta all’attivazione di canali voltaggio-dipendenti del sodio; la fase di ripolarizzazione è dovuta a due fattori: o

inattivazione dei canali del sodio

o

attivazione ritardata dei canali voltaggio-dipendenti del potassio

Funzioni del potenziale di azione •

è il segnale elettrico nella membrana della fibra muscolare che innesca la cascata di eventi alla base della contrazione muscolare (accoppiamento eccitazione-contrazione)

•

è il segnale che induce il rilascio del neurotrasmettitore nei terminali sinaptici

•

è il segnale che induce il rilascio di ormoni da cellule endocrine

•

è alla base della conduzione dei segnali elettrici a lunga distanza nelle fibre nervose (assoni); a differenza della conduzione elettrotonica (passiva), la conduzione del potenziale d’azione avviene senza decremento, grazie al fatto che il potenziale d’azione si autorigenera lungo la fibra (ampiezza costante)

•

nelle fibre amieliniche il potenziale d’azione si autorigenera in ogni punto della fibra; nelle fibre mieliniche il potenziale si autorigenera solo nei nodi di Ranvier. Nel tratto intendale il potenziale si propaga tramite conduzione elettrotonica. In tal modo si raggiunge un compromesso “ideale” tra velocità di conduzione ed efficienza. o

amieliniche # più lente

o

mieliniche # più rapide

Modello cellulare •

Young (1936) scopre che lungo il filamento nel tentacolo del calamaro non è un vaso sanguigno, bensì una fibra nervosa (assone) gigante; diametro 1-2 mm

•

Cole e Curtis (1939) introducono un elettrodo nell’assone di calamaro o

elettrodo introdotto non tocca le pareti # misura potenziale transmembranario

o

possibile spremere assoplasma fuori da assone # rimangono solo pareti !

si sostituisce citoplasma con altre soluzioni fisiologiche: forma del potenziale con assoplasma o soluzione rimane la stessa (può cambiare solo altezza spike)

dimostrarono che la conduttanza della membrana (assolemma) aumenta di 40x durante il potenziale di azione. Ciò sembra confermare la teoria di Bernstein, secondo la quale durante il PDA avviene un “collasso” della barriera della membrana (membrane breakdown) !

ma pensavano a permeabilità indiscriminata a tutti gli ioni # Em sarebbe però uguale a 0

•

Hodgkin e Huxley (1939) scoprono che, all’apice del PDA, il potenziale di membrana acquista valori nettamente positivi (# overshoot). Ciò contraddice la teoria di Bernstein

•

Hodgkin e Katz (1949) dimostrano che il fenomeno dell’overshoot è determinato da ENa+ ed è dovuto all’entrata di ioni Na+ durante il PDA

•

Hodgkin e Huxley (1952) sviluppano la tecnica del Voltage Clamp (morsa di voltaggio) per misurare gli spostamenti degli ioni in seguito a variazioni rapide del potenziale di membrana. Scoprono che la depolarizzazione della membrana induce una corrente entrante (inward current) seguita da una corrente uscente (outward current) o

Voltage Clump induce variazioni del potenziale di membrana a piacimento e consente di mantenere un certo potenziale costante

o

a certi potenziali costanti (variabile indipendente # x=Em) si misurano varie correnti (variabile dipendente # f(x)=Im)

o

late current rimane costante finchè non varia potenziale # canale potassio rimane sempre aperto, e si chiude solo al variare del potenziale

o

a riposo scorre corrente (canali leakage aperti) # viene sottratta dal modello, analisi

o

early current # portata da Na+

solo della corrente ulteriore # a riposo, I=0 o

late current # portata da K+

o

curva è somma delle due curve di corrente del sodio e del potassio !

per vedere una delle due curve sostituirono Na+ con Colina (ione non permeante)

"

curva del sodio si ottiene per sottrazione da curva del potassio e di entrambe (curva potassio ottenibile da sostituzione sodio con colina)

! !

INa+ # corrente entrante si attiva rapidamente: early current IK+ # corrente uscente più lenta; raggiunge valori massimi in tempi più lunghi: late current – delayed rectifier

! o

corrente di potassio è continua, corrente di sodio va incontro a in attivazione

Isolamento farmacologico – neurotossine (al posto di colina) !

TTX tetrodotossina (pesce palla); bloccante selettivo dei canali voltaggio dipendenti del sodio (esperimento con TTX dà stessi risultati di quello con colina) "

TEA ammoniotetraetile; bloccante selettivo dei canali del potassio

•

Hodgkin e Huxley (1952) deducono che la permeabilità (conduttanza) della membrana per Na+ e per K+ è una funzione del tempo e del potenziale di. La rivoluzione concettuale operata da H&H consiste nel fatto di aver considerato la permeabilità al Na+ e al K+ come due fenomeni separati, e di aver indicato il potenziale di membrana quale variabile che determina la permeabilità # due meccanismi separati=superamento teoria del collasso

•

H&H calcolano le costanti cinetiche per le variazioni della conduttanza

•

questi esperimenti hanno permesso di definire le due proprietà fondamentali delle macromolecole che oggi sappiamo essere alla base delle variazioni del potenziale di membrana: i canali ionici (i canali ai tempi di H&H non erano conosciuti!) o

1 – PERMEAZIONE: ognuna delle componenti della corrente obbedisce alle leggi di Ohm, e il suo potenziale di inversione (reversal potential) è pari al potenziale di equilibrio secondo Nernst

IIONE = gIONE (Vm " E IONE (Nernst)) gli spostamenti degli ioni avvengono esclusivamente per diffusione seguendo il rispettivo gradiente elettrochimico; non interviene nessuna forza addizionale

!

o

2 – ATTIVAZIONE (GATING): le permeabilità a Na+ e K+ hanno un andamento temporale completamente differente durante la depolarizzazione. Modificazioni delle concentrazioni degli ioni cambiano la direzione del flusso di corrente, ma non l’andamento temporale !

canali potassio # attivazione; formati da 4 particelle (gate) “n” "

il canale è aperto solo se tutte e 4 le particelle sono aperte

#

IK + = gK + " n 4 " ( E m # E K + )

n4 # probabilità (composta) che il cancello sia aperto 0'n'1;

n(Em, t): funzione del pot. di membrana e del tempo

!

!

canali sodio # inattivazione; formati da 3 cancelli di attivazione e uno di inattivazione "

canale è aperto solo se sia i 3 che quello di inattivazione sono entrambi aperti #

INa + = gNa + " m 3 " h " ( E m # E K + )

andamento di m analogo ad n; andamento di h è speculare

!

TRASMISSIONE SINAPTICA Sinapsi = zona di contatto tra 2 neuroni •

trasmissione: o

elettrica [muscolatura liscia, cellule epiteliali fegato]

o

chimica (95%) [sistema nervoso centrale]

Trasmissione elettrica

o

continuità citoplasmatica

o

se si iniettano cariche positive, impulso depolarizzante passa anche in cellula postsinaptica

o

flusso è bidirezionale (stesso effetto con stimolazione di una o altra cellula)

o

non rettificanti

o

non esiste specializzazione morfologica delle cellule

Trasmissione chimica

o

arrivo potenziale d’azione # rilascio neuro trasmettitore: traduzione del messaggio elettrico in messaggio chimico

o

o

cellula specializzata !

presin.: vescicole

!

postsin.: recettori

depolarizzazione o iperpolarizzazione in cellula postsinaptica è dovuta al neurotrasmettitore

o

flusso unidirezionale

Cellula neuronale:

depolarizzazione # flusso eccitatorio – E meno negativo iperpolarizzazione # flusso inibitorio – E più negativo equilibrio:

•

ENa+ # depolarizzazione membrana tende a questo valore, ma non ci arriva: nel frattempo apertura dei canali del potassio e chiusura dei canali del sodio

•

EK+ # flusso verso l’interno è un flusso inverso che si genera per l’accumulo di cariche positive all’esterno; quando si egualgliano i due flussi si raggiunge il potenziale di equilibrio

•

considerando Em=-90mV, il gradiente elettrochimico del sodio è maggiore ("V=145 mV [-90-55]) # preponderante entrata di cariche positive

Sinapsi di tipo elettrico (presenza di connessine)

# 6 connessine = 1 connessone (contiene amminoacidi con catene laterali neutre o idrofobiche # contatto con membrana) ogni subunità attraversa la membrana ed è unita alle altre da un’ansa:

Motoneurone SNP cellule di Schwann - gliali # assoni motori, rivestiti da guaina mielinica

bottoni sinaptici: zona di congiunzione tra assone e fibra muscolare # pieghe giunzionali con elevato numero di recettori colinergici •

•

presinapsi: o

vescicole con neurotrasmettitore (acetilcolina ACh)

o

zone dense

postsinapsi o

recettore acetilcolina (ligando dipendenti, funziona da canale)

TRASMISSIONE COLINERGICA:

recettore-canale ACh ACh si lega a subunità $

selettivo sia a Na+ che a K+ (Na+ verso interno, K+ verso esterno)

M2: catena rivolta verso l’interno del canale # stesso amminoacido: Glu

SINAPSI CHIMICA – legame recettore # cambio istantaneo in postsinaptica

SINAPSI NEUROMUSCOLARE

nel terminale nervoso avvengono 2 eventi distinti

•

potenziale di placca (canali recettori ACh) – supera sempre livello soglia

•

canali voltaggio-dipendenti Na+

si sommano

•

in presenza di curaro i recettori colinergici sono bloccati # si riduce sottosoglia il potenziale di placca

Ampiezza del potenziale diminuisce con distanza da assone:

Divisione in segmenti neuronali:

•

resistenze: canali passivi

•

condensatore: membrana (capacità # separazione cariche)

"Vm=Im x R

"Vm =

Q C

capacità elettrica

" µF % $#cm 2 '&

flussi ionici di dissipazione vanno diminuendo con la distanza:

!

o

Rm # canali ionici passivi

o

Ra # resistenza assiale (scontri ioni / volume citoplasmatico)

Ra = ra!" x

!

Costante di spazio (: costante di spazio

"Vm = "V0 # e$x / % (: decremento del 37% di "Vm # 37% di "V0 individua la distanza x a cui corrisponde un "Vm pari al 37% di "V0

!

# proprietà passiva del neurone

Voltage Clamp

porta cariche positive

all’esterno:

ne evita l’accumulo •

impedita genesi di un potenziale d’azione, ma è possibile misurare i flussi ionici

mantenendo un nuovo

potenziale di

riposo, si misurano i flussi

entranti o

uscenti:

•

Potenziale di placca o

se Eepsp fosse dovuto a solo movimento di soli Na+

in realtà Eepsp è dovuto sia a Na+ che a K+; più si avvicina a potenziale di equilibrio della specie ionica, meno corrente è generata

prevalente potenziale sodio # prevalente flusso di cariche entranti # allontanamento da potenziale sodio

potenziale di inversione: media ponderata tra i 2 potenziali di equilibrio (ENa+= 55; EK+= -100); Eepsp = 0 mV

SISTEMA NERVOSO CENTRALE sinapsi più piccole (sinapsi neuromuscolare: 70 mV)

# processo di sommazione di potenziali eccitatori o inibitori: •

EPSP: excitatory post synaptic potentials

•

IPSP: inhibitory post synaptic potentials

o

asson hillock: numerosi canali volt dip. – presenti elementi che danno il via alla partenza del segnale !

all’hillock deve arrivare un potenziale alto: "

sommazione

"

poco decremento (necessaria alta ()

a 1 mm # con (=0,1 mm – necessarie numerose sinapsi

o

ACh – a seconda del tipo di recettori, o eccitatori o inibitori (rec. muscarinici – muscolo cardiaco)

ESOCITOSI – vescicole: 1 – citoscheletro o

mobilizzazione (entrata Ca++)

2 – compartimento di trasporto o

trafficking – targeting

3 – ancoraggio, “priming” o

zona attiva # formazione del poro di fusione # rilascio !

tutto il processo avviene in pochi ms (processi sovrapposti)

ancoraggio delle vescicole: proteine attorno a vescicole

priming: rendere competenti le vescicole alla secrezione o

trattamento e riconoscimento proteico

poro di fusione: specie molecolari su membrana o

vescicole riconoscono le proteine sulla membrana presinaptica

# formazione poro EPP (potenziale placca) aumenta esponenzialmente con [Ca2+] – effetto cooperativo

[Ca2+] extracellulare # 10.000 [Ca2+] intracellulare

•

Mg2+: inibitore competitivo Ca2+ # sposta verso destra la retta di proporzione

EPP " [Ca 2+ ]

3,9

(proporzionale a)

Ponendo una fibra muscolare in soluzione a bassa concentrazione di Ca2+ extracellulare: •

stimolazione tramite elettrodo: rilascio quasi nullo di neurotrasmettitori

•

aumentando [Ca2+]

!o

stimolo # rilascio neurotrasmettitori

o

senza stimolo # non succede niente

o

dopo stimolo # non succede niente

# [Ca2+] extracellulare deve essere presente prima del sopraggiungere dello stimolo

superficie presinaptica: zone dense condensate in Array •

canali Ca2+ voltaggio-dipendenti in corrispondenza dei siti di rilascio (maggiore efficacia)

•

Ca2+ disancora vescicole

Clatrine avvolgono la membrana delle vescicole in endocitosi postsinaptica •

Dense-core: vescicole più grandi di quelle del SNC

•

nel sistema immunitario, mastociti o

contengono istamina (esocitosi e endocitosi); rilascio dopo interazione con IgE

Esocitosi misurabile tramite misura della capacità elettrica

separazione cariche: CAPACITÀ 1f(femto)F=0,1 µm2 allo stesso tempo la membrana è misura della resistenza (canali)

"Vm= Q/C esocitosi # aumenta dimensione della membrana: fusione delle vescicole

o

# aumenta capacità

o

nel momento in cui c’è un picco di capacità # picco di concentrazione Ca2+

fusioni sono diverse: diversa grandezza delle vescicole

Meccanismo di rilascio del neurotrasmettitori: quintale

MEPPS # potenziale di placca in miniatura •

in assenza di stimolazione, spontanei

potenziale d’zione su membrana postsinaptica dovuti a apertura di canali colinergici (flusso entrante di Na+) o

attirati da neurotrasmettitori !

dipende da fusione delle vescicole

ogni depolarizzazione è un multiplo di un potenziale d’azione unitario (più piccolo riscontrabile: circa 0,4 mV), ma il potenziale di placca da -90 a -20 # -70 mV MEPP: determinata da fusione di una singola vescicola •

non c’è risposta più piccola del MEPP

•

anche a riposo c’è un’attività di base

durante un MEPP si aprono 2000 canali colinergici 1 MEPP=0,4 mV # 1 canale ACh=0,2-0,3 µV

per aprire un canale colinergico (5 subunità) servono 2 molecole di ACH !

una vescicola contiene all’incirca 5000 ACh # non tutto il neurotrasemttitore arriva sui canali:

! !

"

diffusione

"

degradazione enzimatica (ACh esterasi)

il contenuto di una singola vescicola è definito QUANTO fusione vescicole: eventi indipendenti – tutto o niente – studiabili con leggi di probabilità "

P: probabilità fusione; q: probabilità non fusione;

"

singola vescicola: P=1-q

"

2 vescicole: (P+q)2=P2+2Pq+q2

"

3 vescicole: (P+q)3=P3+3Pq2+3P2q+q3

in sinapsi neuromuscolare: P=0,7

P+q=1

•

sinapsi periferiche (rapporto 1:1 presinapsi-postsinapsi): bisogna garantire elevato fattore di sicurezza

in sinapsi SNC: P=0,1-0,2 •

dipendono da sommazione temporali di molte sinapsi # regolazione più fine

ampiezza MEPP: o

temperatura

o

proprietà passive della membrana postsinaptica !

resistenza di membrana (meno canali # più resistenza)

!

capacità

numero di recettori presenti sulla membrana postsinaptica # sensibilità

o

Ca2+: non influenza l’ampiezza del potenziale unitario, ma la frequenza degli eventi di rilascio Interazione vescicola/presinapsi (disancoraggio, mobilitazione, targeting) •

fosforilazioni regolano il funzionamento di alcune molecole (es.: canali) Ca2+ calmoduline (all’interno del liquido citoplasmatico della presinapsi)- kinasi che

o

fosforilano substrati (# sinaptofisina-P) •

fase di ancoraggio VAMPS (sinaptobrevine) espresse su membrana della vescicola

o

!

interagiscono con proteine integrali (SNAP-25, Sintaxina) della membrana della presinapsi (faccia citoplasmatica)

!

formano SNARE complex: complesso recettoriale sensibile a NFS

!

tossina botulinica # taglia VAMPS: impedisce la fusione della vescicola # non c’è trasmissione alla postsinapsi

Sinaptotagmina (su vescicola)

o

!

recettore Neurexina su presinapsi

!

implicate nella formazione del poro di fusione

!

tossina: latrotoxina (impedisce la formazione del poro) "

fa uscire le vescicole massicciamente ma non le fa rientrare per endocitosi: prima spasmo poi paralisi

•

fusione vescicole # attacco su membrana e rilascio del neurotrasmettitore attraverso il poro – 2 modalità: o

completa: fusione completa e riformazione vescicole per endocitosi

o

kiss and run: chiusura poro transiente e conservazione vescicola (dipende dal corredo molecolare sulla membrana)

nella stessa sinapsi sia fusione completa che kiss and run vescicole in presinapsi: organizzate in compartimenti

Ampiezza dipende da proprietà passive del neurone

"Vm = "V0 # e$x / %

!

COSTANTE DI SPAZIO

•

caso 1 – ( (0,1 – 1 mm)

•

caso 2 – (=1 mm

( troppo piccolo # non si sommano – non c’è impulso

A e B integrati da SOMMAZIONE SPAZIALE COSTANTE DI TEMPO (altra caratteristica passiva dei neuroni) # processi di sommazione temporale

dipende da caratteristiche passive della membrana •

se membrana fosse solo una resistenza:

•

ma membrana è anche capacità (separazione delle cariche interno/esterno):

•

dato che la membrana ha sia caratteristiche di resistenza che di capacità:

direttamente proporzionale a I

se avesse solo caratteristiche di capacità # aumento separazione cariche

all’inizio si comporta come capacità: !

impulso va a modificare la quantità di carica ai lati della membrana # deposita cariche positive all’interno

ma cariche tendono a scorrere attraverso i canali ionici (# resistenze) Costante di tempo:

! " = R#C

"Vm = Im # R # (1$ e$t / % )

- rappresenta il tempo al quale il "V(m) equivale al 63% del valore del "V(m)

finale

!

o

( # fase discendente – decadimento "V

o

) # fase ascendente – aumento "V

con il perdurare della corrente, sempre meno cariche saranno disponibili per la separazione, e sempre più cariche saranno disposte ad attraversare le resistenze # capacità regola la velocità di variazione del "V(m) !

velocità di variazione del "V(m) decresce con il tempo

!

) oscilla tra 1 e 20 msec

un neurone con costante di tempo elevata tende a favorire la sommazione degli impulsi

Fisiologia Muscolare

Matteo Paolucci

Muscoli: 40% massa corporea •

generano forza: movimento F=m*a

•

opposizione ad altre forze o

(estensioni gambe, dorso, collo:opposizione a gravità)

o

tono vasomotore:impedisce dilatazione vaso dovuta a pressione sanguigna (muscoli lisci)

Muscolatura: •

liscia (involontaria): o

apparato gastrointestinale (peristalsi): tubo, sfinteri

o

apparato genito-urinario

o

vie respiratorie

o

muscoli oculari interni (muscolo ciliare # muove il cristallino, muscolo pupillare # restringe e allarga la pupilla)

•

striata: o

scheletrica (volontaria): muscoli scheletrici (origine e inserzione su scheletro), muscoli oculari esterni

o

cardiaca (involontaria)

Proprietà cellule muscolari: •

eccitabilità (fenomeno elettrico): capacità di rispondere a stimoli generando potenziale d’azione

•

contrattilità (fenomeno meccanico): capacità di generare contrazione muscolare # forza

# accoppiamento elettro-meccanico differenze nei tipi muscoli dell’origine dello stimolo: •

scheletrico: deve essere innervato; stimolo non originato nel muscolo ma dal sistema nervoso

•

cardiaca e liscia: stimolo intrinseco proveniente dallo stesso muscolo # cellule modificate

(anestesia # inibizione nervi # paralisi # desensibilazione) (pacemaker) Sarcomero: unità anatomo-funzionale (unità che da sola è in grado di svolgere tutte le funzioni dell’organo,es: alveolo, neurone etc)del muscolo; porzione di fibra muscolare compresa tra due linee (linee Z) visibili in sezione al microscopio elettronico

Due tipi di filamenti: -sottili (composti di actina, proteina filamentosa) -spessi (proteina miosina) +titina -filamenti sottili si inseriscono sulle linee Z (circolari # nel piano è un disco; si inseriscono come “setole in spazzola”) -filamenti spessi non ancorati su linee Z # filamenti sottili e spessi sono parzialmente sovrapposti # bandeggio del sarcomero

Bande: •

I: isotropa (zona adiacente a linee Z, no sovrapposizione di filamenti sottili e spessi, prende due emisarcomeri adiacenti)

•

A: anisotropa (zona di sovrapposizione, al centro della banda A solo filamenti spessi # banda H

# al centro di tutti i filamenti spessi passa linea M) #alternate nel sarcomero

filamento sottile

filamento spesso

varie ipotesi di contrazione (# avvicinamento linee z): •

accorciamento dei filamenti

•

teoria dello slittamento dei filamenti: aumenta il grado di sovrapposizione attraverso lo scivolamento degli uni sugli altri # teoria corretta

MIOSINA E ACTINA Miosina: proteina filamentosa – dimero formato da 2 catene pesanti (200 kDa ciascuna); ad ogni catena pesante sono associate 2 catene leggere (20 kDa) •

catene pesanti: o

porzione a bastoncello ($-elica) – coda filamentosa

o

estremità globulare (testa)

o

tra le 2 porzioni: collo

o

teste di miosina protendono lateralmente in ogni punto del filamento spesso (vedi fig. B)

o

catene leggere: funzione regolatrice

Actina: polimero formato da monomeri di actina, tenuti insieme da legami non covalenti •

filamenti sottili: F-actina (filamentosa)

•

monomeri: G-actina (globulare)

o o

polimero avvolto a coiled coil monomeri possono associarsi solo in un determinato orientamento

hanno estremità + e -: determinano direzione del movimento delle teste di miosina •

proteine regolatrici associate ad actina: o

complesso della troponina

o

tropomiosina (filamentosa) – non parallela al filamento sottile, ma lo avvolge !

si inserisce nelle 2 scanalature tra i 2 filamenti

3° filamento: proteina che si estende dalla linea M alla linea Z: TITINA (vedi fig. B) •

determina lunghezza a riposo del sarcomero # è elastica

contrazione: •

diminuisce distanza Z-Z

•

accorciamento banda I

•

banda A rimane costante

teste di miosina camminano sui filamenti di actina

CICLO DELLA CONTRAZIONE MUSCOLARE

rigidità muscolare: o

attiva

o

rigor mortis

Legge di Hook (molla)

F = "k#x

!

ritorno elastico (elastic recoil) ioni Ca2+: •

azione su miosina (testa # siti enzimatici ATP-asi)

•

azione su troponina c (associata con actina) # sensore-interruttore Ca2+ dipendente

Miosina: ATP-asi calcio-actina dipendente o

senza: 1 scissione ogni 30 sec.

Cinetica sigmoide: o

a basse [Ca2+], aumento V è esponenziale – effetto cooperativo

o

poi porzione lineare fino a saturazione

percentuale di saturazione dei siti di legame coincide con velocità di consumo dell’ATP o

al di sotto della soglia si ha praticamente una forza nulla

movimento asincrono delle teste: o

forza generata durante power stroke !

se tutte le teste lavorassero sincronicamente, movimento sarebbe a scatti

movimento sincrono nel miocardio Motori molecolari •

macchine proteiche che generano forza o energia da energia chimica (ATP)

•

2 famiglie: o

lineari !

su elementi del citoscheletro: "

sarcomero # MIOSINA (direzione lineare delle teste di miosina)

"

trasporto di vescicole # KINESINE, DINEINE (trasp. assonale anterograda/retrogrado)

" ! o

•

fuso mitotico (trasporto di cromosomi)

su acido nucleico: ribosoma su mRNA

rotativi: !

ATP-sintetasi

!

flagelli dei batteri e code spermatozoi

motori lineari # processività: o

movimento deve essere sempre nella stessa direzione

o

passo: power stroke – 10nm (working distance)

MECCANICA MUSCOLARE muscolo: elasticità passiva # molla

Isteresi elastica scossa muscolare – twitch – facendo passare una scossa elettrica attraverso il muscolo

contrazione tetanica: forza mantenuta a lungo •

contrazione continua

latenza: espressione della cascata biochimica fino all’attivazione del ciclo muscolare contrazione avviene solo se lo stimolo supera la soglia del potenziale di azione aumentando l’intensità dello stimolo, aumenta l’intensità del twitch fino a un valore massimo di forza

# le cellule hanno diversi valori soglia (alcune lo hanno più alto)

Relazione temporale tra potenziale d’azione, concentrazione intracellulare di calcio e contrazione nella fibra muscolare

o

accoppiamento eccitazione-contrazione

sommazione temporale --<> contrazione tetanica (tetano muscolare)

•

ogni scossa dura 200-300 ms con pochi ms di refrattarietà (meno degli intervalli dei cicli)

•

impulsi al secondo: Hz

•

o

2/s – 1 stimolo ogni 0,5 s

o

10/s – 1 stimolo ogni 100 ms

o

50/s – 1 stimolo ogni 20 ms

andamento del [Ca2+] segue l’andamento di ogni forza: o

transienti # nel twitch

o

oscillazioni # tetano imperfetto

o

concentrazione elevata stabile # tetano perfetto

è [Ca2+] che determina il tipo di forza •

50 Hz: frequenza della corrente elettrica # induce corrente tetanica in chi subisce una scossa

Contrazione: •

isometrica

•

isotonica

o o

F = "k#x

lunghezza del muscolo non cambia # generazione di forza senza accorciamento accorciamento # forza generata costante

•

- contrazione si può esprimere come: F # pura forza

•

"x # puro accorciamento

•

L(0): lunghezza propria muscolo – stirato passivamente

•

F attiva: curva a campana

!

o

generata da stimolo elettrico

o

L*: lunghezza ottimale del sarcomero per cui la forza è massima # 2,2 µm (sarcomero) !

permette interazione ideale tra actina e miosina

!

cuore: dilatandosi aumenta l’efficienza sistolica # volumi maggiori # portano a lunghezza ottimale "

cuore con scompensi: dilatato oltre lunghezza ottimale

•

F passiva + F attiva = F totale

•

titina responsabile di curve a campana: se stesa troppo o troppo poco si perde in efficienza o

efficienza dei cicli di contrazione muscolare # titina

CONTRAZIONE ISOTONICA sul muscolo agisce una forza costante legge di Hill:quanto più grande è la forza peso, tanto più lento è l’accorciamento quanto più è piccola la forza peso del carico, tanto è più rapido l’accorciamento relazione asintotica (iperbolica) velocità/carico

o

P(0): peso esattamente uguale alla forza massima che il muscolo può generare

o

*: rottura dei ponti trasversali

o

P: forza peso del carico

velocità: accorciamento "x in un determinato t P(0) in contrazione isotonica corrisponde ad una contrazione isometrica (non c’è più accorciamento) •

contrazione isometrica è condizione particolare della contrazione isotonica

aumentando il peso oltre P(0) # muscolo si allunga (stirato) # V negativa •

V=

!

oltre punto critico, rottura dei ponti trasversali

b " (P0 # P) P+a •

P: variabile indipendente

•

P(0): carico massimo (isometrico)

•

a e b: parametri determinati sperimentalmente o

sono quelli che danno il miglior fitting

metodo statistico di fitting: somma degli scarti quadratici minimi; da vari punti sul grafico si ricava la linea più simile o

valori non sono esattamente quelli che ci si aspetta (non giacciono esattamente sulla curva) # errori di misura

•

se P=P(0) # V=0

•

se P=0 # V=V max= (b/a)*P(0)

forza esercitata nel power stroke # sposta il filamento sottile di un determinato passo ("x) •

se "x è percorso in poco t # V è alta

•

se "x è percorso in t alto # V è bassa

o o

c’è meno tempo di generare forza c’è più tempo di generare forza

Muscolo papillare isolato (parete del miocardio) •

condizioni isotoniche

•

frequenza di stimolazione: 1/s

in presenza di adrenalina: !

a carico costante, V di contrazione aumenta

!

a V costante, forza di contrazione è maggiore

# aumenta V o forza di contrazione generata MUSCOLATURA LISCIA (apparato gastrointestinale, parete dei vasi sanguigni, vie respiratorie, muscoli oculari interni, apparato genito-urinario) Particolarità della muscolatura liscia: LISCIA contrazione muscolare iniziata da: •

potenziale d’azione

•

attivazione di recettori di membrana da

SCHELETRICA contrazione iniziata dal potenziale d’azione nel sarcolemma

parte di antagonisti (acetilcolina, noradrenalina) attivatori della contrazione: aumento [Ca2+] nel

attivatore della contrazione: aumento [Ca2+] nel

citosol e PKC (parete dei vasi – protein kinasi C)

citosol

rilascio di Ca2+ mediato da:

rilascio di Ca2+ da parte del recettore di Ryr

•

RyR

•

IP3-R (inosil fosfato)

(rianodina) dal reticolo sarcoplasmico

•

canali voltaggio dipendenti del sarcolemma

•

scambiatore Na+/Ca2+

velocità dei cicli regolata da fosforilazione delle light

velocità dei cicli regolata da [Ca2+] – [calmodulina]

chain LC20 della miosina modificazione covalente della miosina (fosforilazione

attività ATP-asica della miosina; nessuna

LC20) # MCLK/miosina fosfatasi: enzimi che regolano

modificazione covalente della miosina (P: rimane

la fosforilazione della miosina

imprigionato nella tasca che lega ATP)

•

MCLK: kinasi # fosforila # cicli veloci

•

fosfatasi # defosforila # cicli lenti

complesso Ca2+-calmodulina attiva MCLK

Ca2+: •

aumenta attività ATP-asica della miosina

•

causa cambio conformazionale del complesso troponina-tropomiosina

muscolo liscio non genera movimenti rapidi, ma forze costanti •

•

es.: pareti vasi o

forza costante per contrastare pressione che tende a dilatare i vasi

o

movimento del sangue dovuto a pressione, non a muscoli

apparato digerente: o

onde di contrazione lenta # generano peristalsi – movimento del bolo alimentare nella direzione appropriata