Fisiologia - Riassunti Kandel "principi Di Neuroscienze" Cap. 6-15

6 – I canali ionici  I messaggi nervosi dipendono da rapide variazioni della DDP ai capi delle membrane •  le variazioni della DDP dipendono dalla presenza di canali ionici I CANALI IONICI SONO STRUTTURE CHE RIVESTONO GRANDE IMPORTANZA NELLA GENESI DI MESSAGGI NERVOSI Proprietà dei canali ionici: • lasciano passare gli ioni → condu&anza • velocità elevate: flussi molto ampi di corrente • riconoscono e selezionano le diverse specie ioniche → sele,vità • si aprono e si chiudono in risposta a segnali specifici (di natura ele?rica, meccanica o chimica) → regolabilità • quest’ulDma proprietà è valida solo per i canali regolabili: esistono 2 grandi classi di canali, quelli passivi e quelli regolabili • i canali passivi non sono regolabili e restano sempre aperD: sono importanD nella genesi del potenziale di riposo • i canali regolabili si dividono in 3 classi in base allo sDmolo che ne determina lo stato: • voltaggio‐dipendenG • dipendenG da ligandi • dipendenG da forze meccaniche I CANALI IONICI SONO PROTEINE CHE ATTRAVERSANO LA MEMBRANA DELLA CELLULA DA PARTE A PARTE Gli ioni sono idrofili (quindi non possono a?raversare per diffusione il doppio strato lipidico idrofobico) e a?raggono con forza le molecole  d’acqua: l’acqua è un dipolo; con l’O a?rae i caDoni e con gli H a?rae gli anioni • serve energia per vincere le forze di a?razione tra acqua e ioni • il Na+ ha dimensioni minori del K+, quindi la sua carica è maggiormente localizzata: possiede allora un campo ele?rico più  efficace ed esercita un’a?razione maggiore sulle molecole d’acqua • Na+ in soluzione è più grande di K+ in soluzione (quindi in forma idrata) • Na+ in soluzione è rallentato: la sua mobilità è minore → più piccolo è lo ione (più grande è la sua forma idrata) tanto  minore è la sua mobilità Gli ioni possono a?raversare la membrana solo in corrispondenza di canali che risultano seleMvi • teoria dei poro‐canali: nei canali esisterebbe una stre?oia, il filtro di seleMvità, nel quale gli ioni formerebbero interazioni  ele?rostaDche con residui di aminoacidi polari presenD sulle pareD del canale. Lo ione deve perdere l’acqua di idratazione,  quindi ha bisogno di energia; l’energia necessaria è garanDta solo se lo ione riesce a instaurare tu?e le interazioni possibili con  il filtro di seleUvità, e ciò è possibile solo se lo ione possiede le dimensioni adeguate. • canali K+: Na+ è escluso per il suo diametro, troppo grandi per entrare • canali Na+: K+ è escluso perché le sue dimensioni ioniche non perme?ono la contemporanea interazione con tuU gli  aminoacidi polari del filtro, e quindi non riceve sufficiente energia per la deidratazione →  la seleMvità dipende da interazioni chimiche specifiche e dalle dimensioni del filtro molecolare OGGI È POSSIBILE STUDIARE I CANALI IONICI CON METODI FUNZIONALI EsperimenD hanno permesso di vedere come alcuni canali si comporDno come semplici resistenze: la corrente unitaria, infaU, varia  linearmente con il potenziale di membrana. L’intensità della corrente di un singolo canale poteva quindi essere calcolata con la legge di  Ohm: i=V/R; tu?avia è meglio parlare di conduSanza (γ=1/R) → i=γ*V La tecnica uDlizzata per registrare il flusso di corrente di singoli canali ionici è il patch‐clamp: un microele?rodo riempito di ACh (che apre i  canali delle cellule muscolari) è poggiato sulla membrana postsinapDca (muscolare); il microele?rodo è così piccolo che aderisce a solo un  canale I CANALI IONICI DI TUTTE LE CELLULE HANNO PARECCHIE CARATTERISTICHE IN COMUNE I FLUSSI IONICI CHE ATTRAVERSANO I CANALI SONO PASSIVI Il flusso di ioni che scorre nei canali non richiedono spesa di energia metabolica; anche la direzione e l’equilibrio finale del flusso non  dipendono dai canali ma dalle forze ele?rostaDche e di diffusione presenD ai capi della membrana Ciò che dipende dai canali è la selezione dei Dpi di ioni a cui è permesso il transito Le proprietà cineGche dei flussi sono ben descri?e della conduSanza dei canali • La condu?anza viene determinata misurando la corrente che passa per il canale aperto in risposta ad una determinata forza  motrice ele?rochimica • La forza motrice eleSrochimica è determinata da 2 fa?ori: • la differenza di potenziale eleSrochimico ai capi della membrana • il gradiente di concentrazione dello ione In base alla relazione i/V (relazione tra il flusso di corrente per un canale e il voltaggio applicato), esistono 2 Dpi di canali: • canali ohmici, che si comportano come semplici resistenze (il flusso varia linearmente con il voltaggio) → condu?anza costante • canali reMficanG, che tendono a condurre maggiormente gli ioni in una direzione piu?osto che nella direzione opposta →  condu?anza variabile La velocità degli ioni (la corrente) dipende dalla concentrazione degli ioni • la corrente aumenta linearmente con la concentrazione fino a un valore massimo: saturazione (si ha saturazione quando la  concentrazione degli ioni è tale che tuU i siD polari presenD sulla parete dei canali sono legaD agli ioni)

1

• se per far passare uno ione è necessario un legame transitorio tra lo ione stesso e gli aminoacidi polari del poro, allora, come  per gli enzimi, si può quanDficare la Km (costante di dissociazione, cara?erisDca delle cineDche di saturazione); la Km è molto  elevata: il legame è molto blando, quindi si forma e si risolve molto rapidamente. Questo perme?e di raggiungere velocità  elevaGssime di conduzione ionica, necessarie per determinare rapide variazioni del potenziale di membrana L’APERTURA E LA CHIUSURA DEI CANALI COMPORTA UNA SERIE DI MODIFICAZIONI DELLA LORO CONFORMAZIONE TuU i canali posseggono 2 o più conformazioni stabili: almeno uno stato aperto e uno o 2 staG di chiusura (in realtà i canali passivi, a  riposo, sono sempre aperD); i canali nei quali si può avere questa transizione sono deU ad accesso variabile Le variazioni d’accesso di un canale comportano modificazioni diffuse di tuSa la sua struSura • nello stato aperto aumenta la velocità di conduzione degli ioni per via del lume più largo e perché sono più esposD nel poro gli  aminoacidi polari I meccanismi di regolazione dell’apertura sono principalmente 3: • canali regolaD da ligandi • ligandi con effe?o direSo sul canale (rece?ori ionotropi) • ligandi extracellulari: neurotrasmeUtori • ligandi intracellulari: Ca2+ e nucleoDdi • ligandi con effe?o indireSo sul canale (rece?ori metabotropici → aUvano cascata di 2ndi mesaggeri e fosforilaizoni) • canali regolaD da variazione del potenziale di membrana • canali regolaD da deformazioni meccaniche della membrana I canali ad accesso variabile presentano 3 staD funzionali diversi: • chiuso ma aUvabile: riposo • aperto: aMvo • chiuso e non aUvabile: refraSario Il passaggio dallo stato chiuso a quello aperto richiede energia: • nei canali voltaggio‐dipenden4, l’energia è fornita dal movimento del sensore di voltaggio del canale proteico dovuto a una  variazione del campo ele?rico della membrana • nei canali regolaD da neurotrasme6tori, l’energia è fornita dal legame del NT al sito rece?oriale • nei canali ad a6vazione meccanica, l’energia è fornita da sDramento o tensione della membrana o del citoscheletro La velocità di transizione aperto‐chiuso dipende dal segnale regolatore; la transizione è praDcamente istantanea (variazione a gradino con  cara?ere di tu?o‐o‐nulla della corrente), la durata dello stato aperto o chiuso è variabile (in media però sono pochi millisecondi) Stato di refraSarietà: • canali dipenden4 dai ligandi: il processo è de?o di desensiGzzazione, e avviene quando i canali vengono esposD a lungo  all’azione del ligando • canali voltaggio‐dipenden4: il processo è de?o di inaMvazione ed è dovuto ad un cambio di conformazione intrinseca che  avverrebbe so?o il controllo di una subunità o di una zona del canale diversa da quella che determina la loro aUvazione,  oppure a legame con Ca2+ o ancora per fosforilazione Il canale può legarsi a sostanze che ne favoriscono la chiusura o l’apertura: • inibizione reversibile (compeDDva o non compeDDva) o irreversibile LA STRUTTURA DEI CANALI IONICI PUÒ VENIR DESUNTA DA RICERCHE DI TIPO BIOFISICO, BIOCHIMICO E DI BIOLOGIA MOLECOLARE TuU i canali ionici comprendono un componente glicoproteico di base, cosDtuito da una proteina integrale di membrana; al centro è  presente un poro idrofilo cosDtuito da diverse subunità della proteina; alcuni canali possiedono subunità ausiliarie citoplasmaDche che ne  modificano le proprietà funzionali La sequenza primaria dei canali (studi su ba?eriorodopsina) conDene sequenze con aa idrofili e sequenze di circa 15‐20 aa idrofobici, che  rappresentano le α‐eliche transmembrana I GENI CHE CODIFICANO I CANALI IONICI POSSONO VENIR RAGGRUPPATI IN FAMIGLIE Le diverse famiglie di geni si sono evolute da un unico gene ancestrale; ecco le principali • canali regolaD da ligandi (ACh, GABA, glicina) • 5 subunità, ciascuna con 4 eliche; differiscono per specificità di ligando e seleUvità di ione • i canali aUvaD dal glutammato fanno parte di una famiglia diversa • giunzioni comunicanG (sinapsi ele?riche) • 12 subunità idenDche, ciascuna con 4 domini trans membrana • canali voltaggio‐dipendenG • 4 sequenze ripetute di una stru?ura di base con 6 domini transmembrana; l’ansa tra S5 e S6 è la regione P, che si  approfondì per un tra?o nella membrana e forma il filtro di sele6vità • i canali V‐D per Ca2+ e Na+ possiedono esa?amente questa stru?ura • i canali per K+ sono simili a questa stru?ura; ne esistono 3 famiglie: • canali K+ con 4 subunità separate (invece che 4 sequenze ripetute); ogni subunità rappresenta una  stru?ura di base • canali K+ a re6ficazione entrante, aUvaD da iperpolarizzazione, con 4 subunità formate da 2 domini  transmembrana (S5 e S6) connessi da regione P • canali K+ della condu?anza a riposo, con subunità  formate da una sequenza di 2 domini ciascuno  uguale a una subunità dei canali a reUficazione entrante

2

LA STRUTTURA DI UN CANALE SELETTIVO PER K+ È STATA CHIARITA DA ANALISI CRISTALLOGRAFICHE AI RAGGI X Canale ba?erico K+, presente anche nei mammiferi, con topologia di membrana semplice • 4 subunità idenDche disposte simmetricamente intorno a un poro centrale • ogni subunità è cosDtuita da 2 traM α‐elica transmembrana, connessi da un’ansa (regione P) che forma il filtro di seleMvità • nel de?aglio, il tra?o di catena extracellulare che conne?e le 2 eliche è formato da: • una catena di aminoacidi che circonda lo sbocco esterno del canale (torreSa) • la regione P: • un’α‐elica corta (elica del poro) che si approfonda nella membrana a formare la parete del poro • una catena che forma l’ansa che riveste il filtro di seleMvità • aminoacidi acidi sono situaD agli sbocchi interno e esterno del poro, per a?rarre i caDoni • l’interno del poro è rivesDto da aminoacidi idrofobici, per garanDre un’elevata velocità di passaggio degli ioni all’interno • il filtro di seleMvità è molto stre?o, ed è il tra?o che limita la velocità di transito • lo ione deve a?raversare il filtro in forma deidrata, per essere poi reidratato subito dopo il filtro, in una camera larga  contenente acqua;verso questa camera punta il dipolo formato dall’elica del poro con la sua estremità C  ele?ronegaDva • sul filtro di seleUvità  sono presenD 3 gruppi carbonilici di una glicina, una Drosina e un’altra glicina per ogni subunità;  quesD 12 gruppi (3 anelli da 4 gruppi, uno per subunità) creano un ambiente fortemente polare per i K+; le catene  laterali di quesD aminoacidi determinano una certa larghezza del poro, che deve essere tale da perme?ere oUmali  interazioni tra K+ e i gruppi carbonilici, al fine di fornire allo ione idrato energia sufficiente per la sua deidratazione • Na+ è troppo piccolo per interagire con tuU e 4 gli ossigeni dei gruppi carbonilici di ogni anello: non riceve  abbastanza energia per deidratarsi • il canale è occupato da 3 K+: la loro mutua repulsione impedisce legami duraturi con gli ossigeni dei gruppi carbonilici  e garanDsce una condu?anza elevata → Canali ionici: seleUvità elevata e elevata velocità di transito

3

7 – Il potenziale di membrana  È possibile disDnguere i canali ionici presenD nelle membrane in 2 Dpi:  • passivi: sempre aperD e non influenzaD da fa?ori estrinseci; il loro ruolo è quello di mantenere costante il potenziale di riposo • aMvi: generalmente chiusi quando la membrana è in condizioni di riposo. La loro probabilità d’apertura è regolata dal  voltaggio, dall’associazione con un ligando o dalla deformazione meccanica della membrana IL POTENZIALE DI MEMBRANA SI STABILISCE COME CONSEGUENZA DELLA SEPARAZIONE DI CARICHE ELETTRICHE DI SEGNO OPPOSTO AI  CAPI DELLA MEMBRANA PLAMSATICA La separazione di cariche è rappresentata dalla presenza di un soUle strato di ioni, rispeUvamente posiDvi e negaDvi, sulla superficie  esterna e interna della membrana • a riposo, l’esterno è posiDvo e l’interno è negaDvo • la separazione è mantenuta costante perché gli ioni non possono muoversi liberamente a?raverso la membrana, e quindi dà  origine a una DDP de?a potenziale di membrana Vm,  • VM = VINT – VEST  • Vr rappresenta il potenziale di riposo; dato che per convenzione VEST = 0, allora VR  = VINT e generalmente varia tra ‐60 e  ‐70  mV • i segnali ele?rici sono rapide variazioni di questo potenziale, dovute a flussi di corrente che compaiono in seguito  all’apertura di canali Per convenzione, la direzione del flusso della corrente è definita come la direzione ne?a delle cariche posiGve • i caDoni si muovono seguendo la direzione della corrente, gli anioni nella direzione opposta • una riduzione della separazione di cariche (il potenziale diventa meno negaDvo) è de?a depolarizzazione • un aumento della separazione di cariche (il potenziale diventa più negaDvo) è de?a iperpolarizzazione Le variazioni del potenziale che non determinano l’apertura di canali ad accesso variabile, ma che dipendono dai canali passivi, sono de?e  potenziali eleSrotonici Se la depolarizzazione supera un valore soglia, si aprono i canali voltaggio‐dipendenG che innescano un potenziale d’azione di tu?o‐o‐ nulla MISURA DEL POTENZIALE DI MEMBRANA 2 microele?rodi sono connessi ad un oscilloscopio; un ele?rodo è mantenuto fuori dalla cellula, l’altro viene inserito nella cellula; al  momento della penetrazione, l’oscilloscopio  registra un potenziale costante (potenziale di riposo) È possibile far variare il potenziale di membrana mediante un secondo paio di ele?rodi connessi a un generatore di corrente: inie?ando  cariche posiDve nella cellula, questa si depolarizza e il potenziale è meno negaDvo (dapprima si ha un potenziale ele?rotonico la cui  variazione è proporzionale all’enDtà dell’impulso di corrente, da un certo valore in poi si ha un potenziale d’azione); se invece si invertono  gli ele?rodi, con quello negaDvo all’interno, la membrana si iperpolarizza (iperpolarizzazione è puramente ele?rotonica) IL POTENZIALE DI MEMBRANA A RIPOSO È DETERMINATO DAI CANALI IONICI PASSIVI Na+ e Cl‐ sono in concentrazioni maggiori all’esterno, K+ e anioni organici (aminoacidi e proteine) sono più concentraD all’interno Di seguito l’analisi dei potenziali di cellule permeabili a uno o a più ioni, tenendo in considerazione solo i canali passivi I CANALI IONICI PASSIVI DELLE CELLULE GLIALI SONO SELETTIVI SOLTANTO PER GLI IONI K+ Le cellule gliali hanno un potenziale di riposo di ‐75 mV e presentano canali passivi permeabili quasi esclusivamente agli ioni K+ • K+ è presente in elevate concentrazioni all’interno, quindi tenderà a diffondere fuori dalla cellula seguendo il proprio gradiente  di concentrazione • in seguito a questo movimento verso l’esterno, si avrà un eccesso di cariche posiGve all’esterno con l’interno negaDvo • questa separazione di cariche dà origine a una DDP (posiDva all’esterno e negaDva all’interno) che tende ad opporsi ad un  ulteriore efflusso di K+ → gli ioni  vengono sollecitaD da 2 forze con direzione opposta: • una forza motrice chimica (gradiente di concentrazione) verso l’esterno • una forza motrice eleSrica (DDP sulle due facce della membrana) verso l’interno • ad un certo momento, il flusso do K+ verso l’esterno sarà uguale a quello verso l’interno. Il valore del potenziale al quale la  forza motrice ele?rica entrante eguaglia quella chimica uscente è de?o potenziale di equilibrio del potassio, EK+ • in una cellula permeabile solo a K+, il potenziale di riposo (determinato dal solo flusso autolimitante di K+) è uguale al  potenziale di equilibrio del potassio, cioè ‐75 mV  (Vm = EK+) Il potenziale di equilibrio si ricava dall’equazione di Nernst:

EX = −

€

RT [X]i RT [X]e ln = ln zF [X]e zF [X]i

         ricavata dal potenziale ele?rochimico μ

 RT/F a 25° = 25 mV;      ln = 2,3 log 10;          a 29°  2,3 RT/F = 60 mV • per K+, [K+]i = 400 mentre [K+]e = 20 → a 25° Ek+ vale proprio ‐75 mV • è necessaria energia per creare e mantenere costanD i gradienG ionici di concentrazione (vedi pompa Na+/K+) • potenziale eleSrochimico: Δμ = RT ln([X+]a/[X+]b) + zF (Ea – Eb)  →  forza chimica + forza ele?rica • quando  Δμ = 0, cioè all’equilibrio (forza chimica e forza ele?rica sono uguali e opposte: si annullano), è possibile  risolvere l’equazione per (Ea – Eb), cioè la differenza tra il potenziale ai due capi della membrana; Ex = (Ea – Eb): rappresenta il potenziale che eguaglia il gradiente chimico, per o?enere così Δμ = 0 e annullare i flussi  ionici LE CELLULE NERVOSE POSSEGGONO CANALI PASSIVI SELETTIVI PER DIVERSE SPECIE IONICHE Le cellule nervose sono permeabili, a riposo, a K+, Na+ e Cl‐ Esempio di una cellula che possiede canali passivi per Na+ e K+:

1

• Na+: maggiormente concentraD all’esterno → gradiente chimico entrante (opposto a quello di K+); invece si comportano come  K+, essendo caDoni, nei confronD del potenziale: forza motrice eleSrica entrante → Na+ possiede due forze che lo sospingono  nella stessa direzione • partendo da un potenziale di ‐75 mV, dovuto al movimento e all’equilibrio di K+, l’entrata di Na+ tende a spostare il potenziale  verso il proprio potenziale di equilibrio (+55 mV, posiDvo in quanto forza chimica e ele?rica hanno la stessa direzione), ma in  realtà il potenziale di riposo si sposta ben poco: nella membrana vi sono molG più canali passivi per K+ • quando Na+ comincia ad entrare, la depolarizzazione (entrata di cariche posiDve) rompe l’equilibrio di K+, che quindi  tende ad uscire in quanto l’interno è meno negaDvo; la fuoriuscita di K+ terminerà quando avrà raggiunto una  concentrazione nei due comparDmenD tale che eguaglierà il nuovo potenziale di membrana, meno negaDvo.  Maggiore è la depolarizzazione, maggiore è l’uscita di K+ • si raggiungerà un nuovo equilibrio quando l’entrata di Na+ sarà uguale all’uscita di K+: il potenziale di riposo si a?esta  su un nuovo valore Vm per il quale INA = ‐IK , e questo valore si aggira intorno ai ‐60 mV (vicino al potenziale del  potassio e lontano da quello del sodio) • per la legge di Ohm il flusso di uno ione è il prodoSo della forza motrice eleSrochimica per la conduSanza  della membrana: I = γ * (Vm – ENERNST) → se Enernst rappresenta il valore di potenziale al quale lo ione è in  equilibrio, a valori misuraD di Vm si può avere una differenza dal valore calcolato • se Vm = En → equilibrio ele?rochimico • se Vm è dello stesso segno ma superiore a En → prevale la forza eleSrica dello ione • se Vm è dello stesso segno ma inferiore a En → prevale la forza chimica dello ione (vedi K+ dopo  entrata Na+ e depolarizzazione) • se Vm è di segno opposto a En → forza ele?rica e chimica hanno la stessa direzione e lo ione non  può trovarsi in equilibrio (vedi entrata Na+) • all’equilibrio, i flussi di Na+ e K+ devono essere uguali; dato che la forza eleSromotrice di Na+ è maggiore  (sia forza ele?rica che forza chimica lo sospingono), ne consegue che la conduSanza di K+ deve essere  maggiore: i canali K+ sono così più numerosi che il flusso eguaglia quello di Na+ nonostante la modesta forza  motrice • in realtà non c’è equilibrio, a si raggiunge uno stato stazionario, in quanto né K+ né Na+ sono in equilibrio,  ma i flussi neM sono nulli I FLUSSI PASSIVI DI SODIO E POTASSIO SONO CONTROBILANCIATI DA PROCESSI ATTIVI DI TRASPORTO DEGLI STESSI IONI La cellula necessita di un meccanismo che impedisca la dissipazione dei gradienG chimici, che altrimenD avverrebbe in seguito ai flussi  ionici; per mantenere i gradienD chimici è necessario generare dei flussi opposD di cariche: • un ingresso di cariche posiDve deve essere bilanciato da un efflusso di cariche dello stesso segno La pompa sodio‐potassio sospinge Na+ e K+ contro il loro gradiente: estrude Na+ e introduce K+ • si tra?a di un trasporto aMvo, che quindi ha bisogno di energia, ricavata dall’idrolisi dell’ATP • la pompa è una proteina integrale di membrana; i siD per Na+ e ATP sono localizzaD all’interno della cellula, quelli per K+  all’esterno • ad ogni ciclo, l’idrolisi di una molecola di ATP fornisce energia per estrudere 3 Na+ ed includere 2 K+ → quindi la pompa è  eleSrogenica, perché dà origine a una corrente ionica uscente neSa che iperpolarizza leggermente la membrana GLI IONI CLORO SI DISTRIBUISCONO PER LO PIÙ PASSIVAMENTE  Molte cellule nervose posseggono canali passivi per Cl‐, ma non tu?e queste cellule possiedono meccanismi di trasporto aUvo di Cl‐ • nelle cellule senza trasporto aMvo di Cl‐ il potenziale di riposo dipende soltanto dai flussi di K+ e Na+: il loro trasporto aUvo  ne manDene costanD i flussi, mentre Cl‐ tende a disporsi ai laG della membrana secondo il proprio equilibrio eleSrochimico;  quindi ECL sarà uguale a Vr, e a riposo non vi sarà flusso di Cl‐ • alcune cellule possiedono un meccanismo di trasporto aMvo secondario, che accoppia l’uscita di K+ secondo gradiente a  quella di Cl‐ contro gradiente L’EQUILIBRIO DEI FLUSSI IONICI CHE DÀ ORIGINE AL POTENZIALE DI MEMBRANA DI RIPOSO CAMBIA TOTALMENTE NEL CORSO DEL  POTENZIALE D’AZIONE Se una cellula viene depolarizzata oltre il suo valore soglia, si aprono i canali Na+ voltaggio‐dipendenG, che perme?ono un’ulteriore  depolarizzazione con inizio di un ciclo rigeneraGvo a feed‐back posiGvo di apertura dei canali Na+ v‐d (depolarizzazione → apertura →  depolarizzazione …) • il potenziale di membrana è sospinto verso il potenziale di equilibrio del Na+: +55 mV • poiché nel corso della depolarizzazione l’efflusso di K+ conDnua, il potenziale di membrana non raggiunge mai il  potenziale del sodio, anche se al picco del potenziale d’azione gli si avvicina molto • intervengono poi due processi che tendono a ripolarizzare la membrana: • i canali Na+ v‐d subiscono inaMvazione e si chiudono • i canali K+ v‐d si aprono, con graduale aumento dei K+ uscenD; i canali K+ v‐d hanno una cineDca di apertura lenta L’EQUAZIONE DI GLODMAN PERMETTE DI ESPRIMERE IN TERMINI QUANTITATIVI IL CONTRIBUTO DEI DIVERSI IONI AL POTENZIALE DI  MEMBRANA DI RIPOSO Quando Vm (o Em) è determinato da due o più specie ioniche, l’influenza esercitata da ciascuna specie dipende dal potenziale di  equilibrio dello ione e dalla permeabilità (→ conduSanza) della membrana verso gli ioni consideraD Il grado di dipendenza del potenziale di membrana dalla permeabilità e dal potenziale di equilibrio degli ioni è espresso in termini  quanDtaDvi dall’equazione di Goldman:

Vm =

gK + E K + + gNa + E Na + gK + + gNa +

     

• il potenziale di membrana risulta dalla media ponderata dei potenziali di equilibrio di tuU gli ioni ai quali la membrana è  permeabile; il faSore ponderale di ciascuno ione è quella frazione della condu?anza ionica totale della membrana dovuta a  quel parDcolare ione. Dato che la somma dei fa?ori ponderali deve essere 1, se uno aumenta gli altri devono diminuire; ne 

€

2

consegue che maggiore è la conduSanza della membrana verso un parGcolare ione, maggiore è la capacità di quello ione di  portare il potenziale di membrana verso il proprio potenziale di equilibrio • l’equazione di Goldman vale all’equilibrio; è ricavabile dal fa?o che, all’equilibrio, i flussi ionici si devono annullare: IK + INA = 0;  dato che, per la legge di Ohm, l’intensità di corrente è uguale al prodo?o della condu?anza per la forza ele?romotrice che  agisce sullo ione [II = gI * (VM – Ei)],  se si sosDtuisce questa  formula alla somma delle intensità (che deve dare 0), e si risolve  per Vm, si oUene proprio l’equazione di Goldman • difaU, come de?o precedentemente, K+ ha alta condu?anza (quindi Vm è vicino a EK, quindi la forza motrice è bassa)  che perme?e di eguagliare il flusso di Na+ (dovuto alla grande forza ele?romotrice – ENA lontano da Vm – ma limitato  dalla bassa condu?anza) LE PROPRIETÀ FUNZIONALI DEL NEURONE POSSONO VENIR RAPPRESENTATE MEDIANTE UN MODELLO DI CIRCUITO ELETTRICO  EQUIVALENTE L’equazione di Goldman non perme?e di conoscere l’intensità delle singole correnD ioniche; tale informazione si può ricavare da un  circuito eleSrico equivalente, nel quale sono rappresentate tu?e le proprietà del neurone I CANALI IONICI SONO ASSIMILABILI AD UN CONDUTTORE E A UNA BATTERIA POSTI IN SERIE Il doppio strato lipidico è un caUvo condu?ore, in quanto è impermeabile agli ioni; nella membrana sono però immersi i canali passivi  a?raverso i quali gli ioni diffondono; il valore di condu?anza della membrana si aggira così sui 40.000 pS Ogni canale può essere rappresentato come un resistore o un conduSore di corrente ionica con una condu?anza di singolo canale γ • se il gradiente di concentrazione dello ione fosse nullo, per la legge di Ohm i = Υ * Vm • in condizioni normali, esiste un gradiente di concentrazione: la forza chimica è rappresentata come una baSeria la cui forza  eleSromotrice è data dal potenziale di equilibrio dello ione Ei • in un neurone reale, la corrente di uno ione è data dalla somma delle correnD dovute sia alla forza ele?romotrice che al  gradiente chimico:  i = (γ * Vm) – (γ * Ei) = γ * (Vm – Ei); il termine (Vm – Ei) è de?o forza motrice eleSrochimica e determina  la direzione e l’intensità  del flusso della corrente (insieme con la condu?anza) • la conduSanza misura la capacità dei canali di far passare una corrente ele?rica (1/ohm = S); poiché il flusso di corrente  dipende dagli ioni presenD, la condu?anza di una membrana non dipenderà soltanto dalle proprietà della membrana stessa,  ma anche dalla  concentrazione degli ioni presenD in soluzione (senza ioni non c’è flusso!) • la conduSanza complessiva di tuU i canali, per esempio, del K+ (gK) a riposo sarà uguale al numero dei canali passivi K+ per la  condu?anza di ogni singolo canale: gK = NK * γK • nel circuito equivalente, il canale è rappresentato da un conduSore (con valore pari alla condu?anza complessiva g per lo  ione) in serie con una baSeria di valore pari al potenziale di equilibrio dello ione; la polarità della ba?eria indica una FEM  negaDva per K+ e Cl‐ (polo posiDvo all’esterno) e una FEM posiDva per Na+ (polo posiDvo all’interno) IL MODELLO DI CIRCUITO EQUIVALENTE DELLA MEMBRANA COMPRENDE DIVERSE BATTERIE, DEI CONDUTTORI, UN CONDENSATORE E UN  GENERATORE DI CORRENTE I liquidi extracellulari e il citoplasma sono eccellenD condu?ori (sezione trasversa ampia e molD ioni per il trasporto delle cariche): sono  assimilabili ad un corto circuito (un condu?ore a resistenza zero)   [NB: l.e. e cit. sono ele?ricamente neutri] Il corto circuito è connesso alle estremità degli elemenD che rappresentano ciascun 4po di canale passivo (baSerie e conduSori in serie) Al circuito viene aggiunto un generatore di corrente, che rappresenta la pompa Na+/K+ ATP‐dipendente che è eleLrogenica (manDene  costante la carica delle ba?erie ioniche generando flussi ionici aUvi che controbilanciano i flussi ionici dei canali passivi) Infine, si aggiunge un condensatore, che esprime una proprietà passiva della membrana: la capacità; la capacità è la proprietà ele?rica di  un elemento non condu?ore (isolante) che consente un accumulo di cariche quando tra le superfici opposte dell’isolante stesso viene  mantenuta una DDP; la membrana è quindi un condensatore • la capacità si misura in farad (F: la separazione di 1 C di cariche ai capi di una capacità di 1 F genera una ΔV di 1 V) • V = Q / C USO DEL MODELLO DI CIRCUITO EQUIVALENTE PER IL CALCOLO DEL POTENZIALE DI MEMBRANA A RIPOSO Sapendo che Vm a riposo è costante, allora, come abbiamo de?o, IK + INA = 0. Dal circuito è possibile ricavare il valore di ogni corrente (che  sono uguali ed opposte), in quanto ogni branca del circuito fornisce i daD necessari: il potenziale di equilibrio dello ione (ba?eria) e il valore  della condu?anza complessiva (il condu?ore) • a riposo, Vm = ‐69 mV (vicino a Ek = ‐75 ,V); al picco del potenziale d’azione, Vm = +50 mV (vicino a Ena = +55 mV) • gli ioni Cl‐, dato che si distribuiscono passivamente, hanno Ecl = Vm = ‐69 mV → Vm è stabilito dai movimenD di Na+ e K+, e Cl‐  si muoverà fino a raggiungere delle concentrazioni tali che la forza ele?rica che si oppone al nuovo gradiente chimico sia  esa?amente uguale al potenziale di membrana • NB le correnD uscenD sono posiDve, mentre quelle entranD sono negaDve NB: EQUAZIONE DI GOLDMAN‐HODGKIN‐HUXLEY ‐ Formulazione originaria:

Vm =

€

RT PK [K + ]e + PNa [Na + ]e + PCl [Cl− ]e ln       P: permeabilità (facilità del passaggio dello ione – cm/s) F PK [K + ]i + PNa [Na + ]i + PCl [Cl− ]i

• l’importanza di uno ione nel determinare il valore di Vm è tanto maggiore quanto più elevate sono la sua concentrazione e la  sua permeabilità • se la permeabilità di uno ione è parDcolarmente predominante, l’equazione diventa Vm = RT/F ln[X]e/[X]i → come l’equazione  di Nernst per quello ione altra formulazione:

Vm =

gK + E K + + gNa + E Na + gK + + gNa + • la conduLanza sosDtuisce la permeabilità: esprimono lo stesso conce?o, la facilità di passaggio degli ioni • i potenziali di equilibrio di ciascuno ione vanno a sosDtuire i fa?ori RT/F ln [X]e/[X]i, come previsto dall’equazione di Nernst

€

3

8 ‐ Meccanismi di comunicazione locale: le proprietà eleSriche  passive del neurone Tu?e le cellule possiedono un potenziale di membrana, ma solo i neuroni e le cellule muscolari hanno la proprietà di dare origine a segnali ele?rici,  che possono venir condoU a grandi distanze I messaggi possono essere so?o forma di potenziali d’azione, potenziali sinapDci o potenziali di rece?ore in risposta a uno sDmolo:  corrispondono a  variazioni conDnue del voltaggio transmembrana I neuroni posseggono 3 proprietà ele?riche passive: • La resistenza della membrana a riposo • La capacità della membrana • La resistenza assiale intracellulare dei prolungamenD (assoni e dendriD) Queste proprietà rappresentano la via di ritorno con la quale si chiude il circuito, quindi determinano l’andamento temporale e l’ampiezza delle  variazioni dei potenziali; perme?ono inoltre di stabilire se un potenziale sinapDco un un dendrite determinerà l’insorgenza di un potenziale d’azione  a livello del cono d’emergenza dell’assone; infine influenzano la velocità di conduzione di un potenziale d’azione   LA RESISTENZA DI INGRESSO DETERMINA L’AMPIEZZA DELLE VARIAZIONI PASSIVE DEL POTENZIALE DI MEMBRANA Nella maggior parte dei neuroni esiste una relazione lineare tra l’enDtà della corrente inie?ata e le conseguenD variazioni del potenziale di  membrana (relazione corrente‐voltaggio); questa relazione rappresenta la resistenza di ingresso del neurone, Rin • Quindi il neurone si comporta come un semplice resistore, almeno quando si inie?ano cariche negaDve (iperpolarizzazione) e quando si  inie?ano cariche posiDve ma solo fino ad un certo valore (depolarizzazione so?o soglia) • Sopra il valore soglia il neurone non si comporta come un semplice resistore, in quanto si aprono i canali voltaggio‐dipendenD  che danno origine ad un potenziale d’azione La resistenza di ingresso determina l’ampiezza della depolarizzazione che si oUene in risposta ad un’iniezione di corrente conDnua: per la legge di  Ohm, ΔV = I * Rin • A intensità costante, la cellula con la resistenza più grande va incontro ad una variazione di potenziale maggiore Per un neurone ideale sferico senza processi, la Rin dipenderà dalla densità dei canali passivi e dalle dimensioni del neurone (maggiore superficie,  maggior numero di canali, minore resistenza) • Per paragonare le resistenze di neuroni diversi, si uDlizza la resistenza di un’area unitaria di membrana, la resistenza specifica di  membrana Rm (Ω*cm2), che dipende dalla densità di canali passivi e dalla loro condu?anza Per o?enere la Rin totale, Rm va divisa per la superficie (infaU una superficie maggiore implica una minor resistenza): Rin = Rm / 4πa2 (→ area della  sfera: a è il raggio del neurone LA CAPACITÀ DELLA MEMBRANA PROLUNGA L’ANDAMENTO TEMPORALE DEI SEGNALI ELETTRICI L’andamento temporale dell’intensità della corrente e delle variazioni di potenziale conseguenD è diverso: mentre la corrente varia a gradino, la  variazione di voltaggio (invece di essere anch’essa a gradino, come in un semplice circuito) aumenta e decade più lentamente; questa proprietà della  membrana è dovuta alla sua capacità Per far variare il potenziale ai capi di un condensatore, è necessario aggiungere o togliere cariche dal condensatore stesso: ΔV = ΔQ / C • sapendo che ΔQ, ovvero la variazione di carica, viene determinata da un flusso di corrente a?raverso il condensatore, Ic, e che la  corrente viene definita come movimento ne?o di cariche nell’unità di tempo (Ic = ΔQ / Δt), sosDtuendo ΔQ si oUene: ΔV = Ic * Δt / C →  l’enDtà della variazione di potenziale ai capi di un condensatore in risposta ad un impulso di corrente dipende dalla durata della corrente  stessa La capacità è dire?amente proporzionale all’area delle armature (maggior numero di cariche accumulabili) e inversamente proporzionale alla  distanza tra le armature • dato che le membrane hanno la stessa composizione (stesso spessore dello strato isolante), è possibile individuare una capacità  specifica Cm per area unitaria; la capacità di ingresso totale di una cellula, Cin, è data dal prodo?o di Cm per l’area della cellula: Cin =  Cm (4πa2 ) • come abbiamo de?o, nelle cellule il potenziale aumenta col tempo finchè dura la corrente; dopo un certo tempo, però,  il voltaggio  tende a diventare costante: difaU la membrana è schemaDzzabile come un condensatore in parallelo con una resistenza (che  rappresenta tuU i suoi canali). QuesD elemenD sono posD in parallelo perchè la corrente può passare sia per i canali che per il  condensatore, e per questo viene disDnta in corrente ionica Ii  o corrente capaciGva Ic: la prima passa per i canali, la seconda fa variare  la carica ne?a custodita sulla membrana. La corrente totale It è data dalla loro somma • La capacità riduce la velocità con cui varia il potenziale di membrana in risposta a un impulso di corrente • se la membrana fosse soltanto una resistenza, un impulso a gradino determinerebbe un cambiamento istantaneo del  potenziale • se la membrana fosse soltanto una capacità, un impulso a gradino determinerebbe una variazione lineare del potenziale • essendo sia una resistenza che una capacità, la risposta reale combina insieme le cara?erisDche delle due risposte pure:  inizialmente la pendenza iniziale di Vm in funzione del tempo è idenDca a quella che avrebbe un elemento puramente  capaciGvo, mentre l’ampiezza e la pendenza finale sono quelle di un elemento puramente resisGvo; • bisogna tenere in considerazione il fa?o che, essendo la resistenza e il condensatore posD in parallelo, il voltaggio a?raverso le  due branche di circuito deve essere sempre lo stesso ed uguale al potenziale di membrana → Vr = Vc; da notare anche che Vr  varia istantaneamente con il variare di Ir, mentre Vc aumenta lentamente con il tempo • se si genera una corrente, essa fluirà subito nella branca del condensatore (all’inizio, It = Ic): se passasse nella branca della  resistenza, essa aumenterebbe istantaneamente, e Vr non sarebbe uguale a Vc

1

• più la corrente passa nel condensatore, più questo si carica e aumenta Vc (si fa più posiDvo); aumentando Vc, deve crescere  anche Vr, quindi una parte sempre maggiore della corrente totale viene so?ra?a a Ic per essere indirizzata come Ir (o Ii) alla  resistenza. Di conseguenza, il potenziale comincerà a crescere sempre più lentamente. Quando la corrente totale sarà uguale  alla corrente resisDva, Ic sarà uguale a 0, quindi, considerando che ΔV = Ic * Δt / C, il potenziale di membrana non cambierà più • It sarà allora uguale a 0 e la corrente ionica posiDva che passa a?raverso il resistore dovrà tornare nella cellula come corrente  capaciDva uguale e contraria: Ii = ‐Ic, finchè la carica del condensatore non verrà dissipata  La fase crescente della variazione di potenziale è descri?a dall’equazione:  • τ è la costante di tempo della membrana, pari al prodo?o della resistenza di ingresso per la sua capacità (RinCin), e rappresenta il tempo  che impiega il potenziale di membrana ad aumentare fino al 63% (= 1 ‐ 1/e) del suo valore stazionario finale  LE RESISTENZE DELLA MEMBRANA E DELL’ASSOPLASMA INFLUENZANO L’EFFICIENZA CON CUI VENGONO CONDOTTI I SEGNALI ELETTRICI L’ampiezza di un potenziale eleLrotonico so?o soglia che venga condo?o lungo i dendriD o l’assone, decresce progressivamente con la distanza dal  suo punto di origine • la resistenza al flusso delle correnD di un prolungamento del neurone aumenta con l’aumentare della lunghezza del prolungamento  (maggiori collisioni tra ioni) e diminuisce con l’aumentare del diametro (maggior numero di ioni trasportabili) • poichè i dendriD presentano un diametro piccolo, la loro resistenza al flusso di ioni che si portano verso il cono di emergenza è  apprezzabile • è possibile rappresentare i prolungamenD come piccole unità cilindriche di lunghezza unitaria, ciascuna delle quali cosDtuisce un circuito  elementare formato da una resistenza e una capacità in parallelo; tuU i circuiD sono connessi da resistori che rappresentano le  resistenze assiali di ogni segmento di citoplasma • inie?ando corrente per un tempo elevato (tale che  la corrente capaciDva sia diventata nulla), il potenziale varia dipendendo dai  valori della resistenza di membrana rm (Ω*cm ‐ di un cilindro unitario di membrana) e dalla resistenza assiale ra (Ω/cm): difaU  queste rappresentano due elemenD resisDvi in serie nel circuito precedente, a?raverso i quali la corrente sfugge verso l’esterno • la resistenza assiale totale è la resistenza interposta tra il sito di iniezione e il sito di fuga della corrente: rx = ra * x, dove x è la  distanza dal punto di iniezione (aumenta con la distanza): una frazione maggiore di corrente passerà perciò a?raverso la  mebrana in prossimità del sito di iniezione che non in zone più distanD, in quanto le correnG tendono sempre a seguire le vie a  minor resistenza • il decremento della ΔV con la distanza assume una forma esponenziale:  • λ  è la costante di spazio della membrana, e corrisponde alla distanza alla quale ΔVm è decaduto al 37% (1/e) del suo  valore iniziale   la costante di spazio sarà tanto maggiore quanto migliore sarà l’isolamento della membrana (quanto  più elevato è rm) e quanto migliore sarà la conducibilità del volume di citoplasma (quanto più basso è ra); maggiore è  la costante di spazio, maggiore è la distanza di propagazione della corrente prima che venga dissipata completamente • resistenza assiale ra = ρ / πa2  (resistenza specifica di volume unitario di citoplasma / area della sezione) Ω/cm • resistenza di membrana rm = Rm / 2πa (resistenza specifica di un’area unitaria Ω*cm2  → densità dei canali /  circonferenza della sezione) Ω*cm → maggiore è la circonferenza, maggiore è l’area, maggiore è la densità dei  canali (il numero di canali è proporzionale alla loro densità e all’area di membrana) • quindi le variazioni di diametro (a = raggio) controllano i parametri che determinano la costante di spazio: di fa?o, la  costante di spazio è determinata dalle proprietà intrinseche della membrana (ρ e Rm) e dal diametro → la costante di  spazio è tanto più lunga quanto maggiore è il diametro del processo     •

    la costante di spazio è proporzionale alla radice quadrata del raggio di un processo; in generev varia  tra 0,1 e 1 mm • la costante di spazio è una misura dell’efficienza della propagazione passiva (eleSrotonica) delle variazioni di  potenziale; l’efficienza di propagazione ha dire?e conseguenze sul processo di sommazione spaziale e sulla  conduzione del potenziale d’azione a?raverso circuiD locali •

GLI ASSONI DI GRANDI DIMENSIONI VENGONO ECCITATI PIÚ FACILMENTE DI QUELLI PICCOLI DA IMPULSI EXTRACELLULARI DI CORRENTE Gli assoni di diametro maggiore hanno soglia più bassa per le correnD extracellulari; quanto maggiore è il diametro dell’assone, tanto più bassa sarà  la resistenza assiale verso il flusso delle correnD longitudinali, perchè maggiore sarà il numero delle parDcelle intracellulari caricate (ioni) per unità  di lunghezza dell’assone: negli assoni più grandi entra una frazione maggiore della corrente totale ed essi saranno depolarizzaD con maggiore  efficienza SIA LE PROPRIETÀ PASSIVE DELLA MEMBRANA CHE IL DIAMETRO DEGLI ASSONI INFLUENZANO LA VELOCITÀ DI PROPAGAZIONE DEL POTENZIALE  D’AZIONE La conduzione eleSrotonica è un fa?ore limitante della velocità della propagazione del potenziale d’azione: la resistenza assiale e la capacità di  membrana limitano la velocità con cui la depolarizzazione si propaga nel corso del potenziale d’azione. Si prenda come riferimento un circuito  equivalente rappresentante due segmenD adiacenD della membrana di un assone, connessi da un segmento di assoplasma (ra); ogni segmento è  formato da una resistenza (rm) e un condensatore (Cm) posD in parallelo • maggiore è la resistenza dell’assoplasma, minore è il flusso di corrente (I = V / R), maggiore il tempo necessario per far variare la carica  presente sul segmento di membrana adiacente

2

• minore è il flusso di corrente, maggiore il tempo necessario per far variare il potenziale di membrana (ΔV = ΔQ / C → ΔV = I * Δt / C : ΔQ  varierà lentamente ) • maggiore è la capacità della membrana, maggiore dovrà essere il numero di cariche che devono essere depositate per far variare il  potenziale → la corrente dovrà scorrere per un tempo maggiore Il tempo necessario perchè la depolarizzazione si propaghi lungo l’assone è funzione sia della sua resistenza assiale ra, che della sua capacità per  unità di lunghezza cm (F/cm) → la velocità della propagazione passiva varia in maniera inversa al prodo?o ra cm  Esistono due meccanismi per aumentare la velocità di propagazione: • è possibile aumentare la velocità di conduzione aumentando il diametro del filamento assile della fibra nervosa (ra diminuisce con il  quadrato del diametro, mentre cm aumenta in proporzione dire?a: l’effe?o globale è quello di diminuire ra cm) • un secondo meccanismo prevede il processo di mielinizzazione mediante il quale la membrana è avvolta da membrane di elemenD  gliali: perme?e di aumentare di 100 volte lo spessore della membrana assonale; poichè la capacità di un condensatore è inversamente  proporzionale allo spessore del materiale isolante (C ∝ A / D), la mielinizzazione fa diminuire cm e quindi ra cm ; inoltre è molto più  vantaggiosa del solo aumento del diametro (e perme?e di mantenere piccole dimensioni). • il processo di mielinizzazione fa aumentare anche rm e quindi la costante di spazio λ; • difaU i canali ionici passivi rendono mal isolata la cellula: aumentando la loro resistenza, diminuisce la loro  condu?anza, quindi la cellula è più isolata • la corrente non è comunque sufficiente per scorrere lungo tu?o il filamento: sono necessari dei traU di interruzione della  mielina (ogni 1‐2 mm) rappresentaD dai nodi di Ranvier, nei quali vi è una densità molto elevata di canali Na+ voltaggio‐ dipendenG, che amplificano(rigenerano)3 3 con cadenza periodica l’ampiezza del potenziale d’azione, impedendone  l’esDnzione; in quesD traU nudi di membrana, la capacità elevata (molto bassa invece nei traU internodali) rallenta la  conduzione, che per questo è de?a conduzione saltatoria • il processo è favorevole anche dal punto di vista metabolico, in quanto la rido?a necessità di canali perme?e un risparmio di  ATP, che deve essere idrolizzato dalle pompe per riprisDnare i gradienD ionici di concentrazione

3

9 ‐ I segnali propagaG: il potenziale d’azione La proprietà delle cellule nervose di inviare messaggi a lunga distanza dipende dalla loro capacità di generare potenziali d’azione, che sono segnali  rigeneraGvi la cui ampiezza non tende a ridursi lungo il decorso dell’assone L’INSORGENZA DEL POTENZIALE D’AZIONE È DOVUTA A FLUSSI IONICI CHE ATTRAVERSANO CANALI VOLTAGGIO‐DIPENDENTI EsperimenD sull’assone di calamaro dimostrarono come la conduSanza della membrana aumenta notevolmente nel corso di un potenziale d’azione:  si dimostrò quindi che il potenziale d’azione  è dovuto a una modificazione dei flussi ionici Hodgkin dimostrò poi che la depolarizzazione che dà origine al potenziale d’azione determina  un aumento transitorio della permeabilità della  membrana verso Na+ (difaU, allontanando lo ione dai liquidi extracellulari, si riduce l’ampiezza del potenziale) che sovrasterebbe l’elevata  permeabilità che la membrana ha, a riposo, verso K+; la fase discendente è dovuta invece a un aumento della permeabilità verso K+ LE CORRENTI DI SODIO E DI POTASSIO CHE PASSANO ATTRAVERSO I CANALI VOLTAGGIO‐DIPENDENTI VENGONO MISURATE CON LA TECNICA DI  BLOCCO DEL VOLTAGGIO La tecnica di blocco del voltaggio perme?e il mantenimento di un potenziale di membrana stabile e pari a un valore desiderato; senza questa  tecnica, il potenziale non può rimanere stabile, per via dell’accoppiamento (feed‐back posiDvo) fra potenziale di membrana e condu?anza dei canali  Na+ e K+ (→ depolarizzazione → apertura canali Na+ v‐d → ulteriore depolarizzazione → ulteriore apertura …) • la tecnica consiste nell’inieSare nell’assone una corrente uguale ed opposta a quella che scorre a?raverso i canali v‐d; l’enDtà della  corrente che deve venir erogata per mantenere il potenziale costante è la misura della corrente che passa per la membrana. Inie?ando  una corrente uguale ed opposta, non ci sono variazioni del potenziale, e quindi impedisce l’apertura di altri canali. • l’apparato è provvisto di un generatore di corrente, che impone alla membrana un potenziale scelto dallo sperimentatore; la corrente  causa quindi una depolarizzazione della membrana, che apre i canali v‐d. Il flusso di ioni a?raverso quesD canali farebbe variare il  potenziale, se non fosse che il meccanismo di feedback (negaDvo) dell’apparato (dovuto ad altri ele?rodi) genera una corrente uguale  ed opposta a quella dovuta all’apertura dei canali, di modo che il circuito di blocco di voltaggio impedisce automaDcamente che la  corrente ionica possa far variare il potenziale di membrana dal valore imposto • per ogni valore di potenziale imposto, la condu?anza dei canali v‐d è misurata tramite l’analisi del valore della corrente uguale ed  opposta che bisogna generare • inoltre, la tecnica perme?e di separare la corrente di membrana nelle sue componenD ioniche e capaciGve • se V non varia, anche Q resta costante (V = Q / C) e non si ha flusso di corrente capaciGva (I = ΔQ / Δt); la corrente capaciDva è  presente solo quando è in corso una variazione di V: il flusso di corrente sarà presente solo all’inizio e alla fine della variazione  a gradino di V, e sarà presente in maniera istantanea • durante il gradino, si ha corrente ionica; una volta o?enuta, si può calcolare la dipendenza dal tempo e dal voltaggio delle  variazioni di conduSanza, determinate dall’apertura e chiusura dei canali Na+ e K+ Hodgkin e Huxley uDlizzarono questa tecnica per misurare le modificazioni della conduSanza di membrana verso Na+ e K+ in risposta a variazioni  sistemaDche del potenziale di membrana • dapprima imposero piccole depolarizzazioni (10 mV): inizialmente si ha una breve corrente uscente capaciGva, seguita da una corrente  ionica uscente di intensità minore, che persiste per tu?a la durata dell’impulso depolarizzante; interrompendo l’impulso depolarizzante,  si osserva una breve corrente entrante capaciGva, quindi la corrente di membrana torna a zero • la corrente ionica costante è de?a corrente di fondo Ii, ovvero la corrente che passa a?raverso i canali passivi, la cui  condu?anza è de?a conduSanza di fondo gi • effe?uando depolarizzazioni di enGtà maggiore, le correnD hanno intensità maggiore; inoltre, il tracciato è più complesso: dopo la  corrente uscente capaciDva e l’inizio della corrente ionica di fondo, si osserva un’ampia corrente entrante di breve durata, seguita da  una corrente uscente che raggiunge un plateau mantenuto finchè è presente l’impulso depolarizzante • evidentemente, la depolarizzazione apre in successione due Dpi di canali aMvi differenD (uno a corrente entrante e uno a  corrente uscente) • per separare le due correnD e determinare il loro proprio andamento temporale, modificarono la composizione degli ioni in soluzione • sosDtuendo Na+ con colina, si elimina la corrente entrante • più recentemente sono state introdo?e la tetrodotossina TTX, che blocca il canale v‐d Na+, e il tetraeGlammonio TEA, che  blocca il canale v‐d K+ LE CONDUTTANZE VOLTAGGIO‐DIPENDENTI DEL SODIO E DEL POTASSIO SI POSSONO CALCOLARE A PARTIRE DALLE RISPETTIVE CORRENTI Per la legge di Ohm, I = g (Vm ‐ E) [intensità = conduLanza x forza motrice eleLrochimica]; è quindi possibile calcolare la conduSanza da  quest’equazione: g = I / (Vm ‐ E); questo calcolo va fa?o separatamente per ogni ione, del quale bisogna considerare l’intensità e il potenziale di  equilibrio. Per conoscere il potenziale di equilibrio sono necessarie la concentrazione intracellulare ed extracellulare, ma si può anche determinare  sperimentalmente, trovando il valore di Vm al quale la corrente inverte la propria polarità (cioè quel valore di potenziale necessario per pareggiare la  forza chimica, e superato il quale la forza ele?rica, opposta a quella chimica, prevale, facendo cambiare così direzione al flusso ne?o); in tal caso, il  potenziale di equilibrio prende il nome di potenziale di inversione; una volta calcolata l’ampiezza delle conduSanze, è possibile verificare anche il  loro andamento temporale La misura delle condu?anze di Na+ e K+ mostra che tra i canali esistono due analogie e due differenze: • analogie funzionali: • entrambe le popolazioni di quesD canali si aprono in risposta a impulsi depolarizzanG a gradino del potenziale di membrana • man mano che la depolarizzazione aumenta, anche la probabilità e la frequenza di apertura di entrambi i Dpi di canali aumenta • differenze: • i canali K+ e Na+ v‐d differiscono per la velocità di apertura ( i canali Na+ v‐d sono più veloci)

1

• differiscono inoltre per le loro risposte verso le depolarizzazioni protraSe nel tempo (i canali Na+ tendono a chiudersi: mentre i  canali Na+ vano incontro a inaMvazione, i canali K+ rimangono aperG per tu?a la durata della depolarizzazione) • i canali Na+ possiedono 3 staD diversi, corrispondenD a 3 diverse conformazioni: in ordine, possono essere allo stato di  riposo (chiusi), aMvato (aperD), inaMvato (chiuso); l’inaUvazione scompare con la ripolarizzazione della membrana  fino al suo potenziale di riposo negaDvo • il tempo di apertura e di riaUvazione dipende dalla cineDca delle reazioni che controllano l’accesso ai canali Na+:  perchè il canale sia aperto, devono essere aperte entrambe le sue porte, quella di aMvazione (chiusa al potenziale di  riposo) e quella di inaMvazione (aperta al potenziale di riposo; si chiude lentamente in risposta a una  depolarizzazione) → il canale è in grado di condurre ioni soltanto per un breve periodo, nel corso di una  depolarizzazione, quando entrambe le porte sono aperte È POSSIBILE RICOSTRUIRE IL POTENZIALE D’AZIONE CONOSCENDO LE PROPRIETÀ DEI CANALI DEL SODIO E DEL POTASSIO Secondo il modello di Hodgkin e Huxley, in potenziale d’azione comporta la seguente successione di evenD • una depolarizzazione della membrana determina l’apertura dei canali v‐d Na+ (aumento gNa) con comparsa di una corrente entrante di  Na+; parte quindi un processo rigeneraGvo (entrata Na+ → depolarizzazione → apertura canali Na+ …) che spinge il potenziale di  membrana verso ENA • la depolarizzazione limita la durata del potenziale d’azione: • provoca la graduale inaMvazione dei canali Na+ (riduzione gNa) • determina, con qualche ritardo, l’apertura dei canali K+ v‐d • compare quindi la branca discendente del potenziale d’azione, dovuta alla corrente uscente di K+ che ripolarizza la membrana • dopo la ripolarizzazione, compare un’iperpolarizzazione transitoria de?a potenziale postumo (dovuto al fa?o che i canali K+, che si  sono aperD in ritardo, si chiudono qualche tempuscolo dopo che Vm è tornato al proprio valore di riposo, trascinando così il potenziale  verso EK) • il potenziale è poi seguito da un periodo di refraSarietà, suddiviso in due fasi disDnte: • il periodo di refra?arietà assoluta, che segue immediatamente il potenziale d’azione, durante il quale è impossibile provocare  l’eccitamento della cellula • il periodo di refra?arietà relaGva, durante il quale è possibile far insorgere un potenziale d’azione, ma solo applicando sDmoli di  intensità maggiore di quelli normalmente richiesD per raggiungere la soglia • quesD periodi di refra?arietà sono dovuD all’inaMvazione dei canali Na+ e all’aumentato numero di canali K+ aperG: se un  impulso è troppo vicino al precedente, non può generare un potenziale perchè i canali Na+ saranno ancora inaUvaD • il potenziale d’azione è un evento tuSo‐o‐nulla: una volta raggiunto il valore soglia di potenziale, non può non parDre il potenziale  d’azione; se una depolarizzazione è so?o soglia, aumenta la corrente entrante Ina, ma aumentano anche le correnD uscenD IK (apre  infaU i canali K v‐d) e II (varia la FEM degli ioni passanD per i canali passivi). La depolarizzazione può conDnuare a crescere grazie alla  grande sensibilità al voltaggio e alla rapida cineGca di aMvazione dei canali Na+ v‐d. Il valore soglia è quel valore per il quale la  corrente ionica neSa cambia senso diventando entrante, ovvero la corrente Na+ supera le correnD uscenD; da questo valore in poi il  potenziale è obbligato a parDre per via del suo caraSere rigeneraGvo (apertura di nuovi canali Na+ v‐d) LA PRESENZA DI CANALI VOLTAGGIO‐DIPENDENTI CON PROPRIETÀ DIVERSE AUMENTA L’EFFICACIA CON CUI I NEURONI TRASMETTONO  MESSAGGI IL SISTEMA NERVOSO È IN GRADO DI ESPRIMERE UNA RICCA GAMMA DI CANALI IONICI VOLTAGGIO‐DIPENDENTI MolD neuroni posseggono canali Ca2+ volt‐dip che si aprono in risposta alla depolarizzazione della membrana (grande forza ele?rochimica  entrante); alcuni neuroni possiedono anche canali Cl‐ volt‐dip  Esistono poi canali si Gpo h, permeabili ai caDoni monovalenD e aUvaD lentamente da una iperpolarizzazione: determina la comparsa di una  corrente depolarizzante nell’ambito dei voltaggi vicini al potenziale di riposo Esistono almeno 4 Gpi principali di canali K+ v‐d, formaD da 4 subunità ciascuna con 6 domini • il classico canale studiato da H&H ad a6vazione lenta, de?o a reMficazione ritardata (delayed recGfier) • i canali Ca2+ dipendenG: per essere aUvaD hanno bisogno sia di Ca2+ intracellulare che della depolarizzazione • il canale di Gpo A, con la stessa cineDca dei canali NA+ (aUvazione rapida  e inaUvazione nel caso di depolarizzazione prolungata) • il canale di Gpo M, che si aUvano molto lentamente in seguito a piccole depolarizzazioni intorno al potenziale di riposo; può esser  chiuso da ACh • esiste poi canali annoveraD tra i v‐d, ma il cui meccanismo di apertura è stre?amente chemio‐dipendente: i canali a reMficazione  entrante (inward recGfier); la stru?ura di quesD canali (4 subunità a 2 domini) manca dell’elica S4, che rappresenta il sensore di  voltaggio. Sono comunque dipendenD dal voltaggio in quanto sono chiusi da bloccanG citoplasmaGci (Mg2+, poliamine) la cui presenza  a livello dello sbocco del canale dipende dal potenziale di membrana: sono aperD al potenziale di riposo (l’ele?ronegaDvità adiacente  alla membrana allontana quanto basta gli ioni dal canale); sono responsabili del leakage del K+ Una vasta gamma  di canali v‐d garanDsce una maggiore e più complessa capacità di analisi I MECCANISMI DI ACCESSO DEI CANALI IONICI VOLTAGGIO‐DIPENDENTI SONO SOTTO IL CONTROLLO DI DIVERSI FATTORI CITOPLASMATICI Le variazioni intracellulari di Ca2+ possono esercitarie notevoli influenze modulatorie sull’apertura e chiusura di diversi canali ionici; la  concentrazione di Ca2+ liberi nel citoplasma a riposo è estremamente bassa, quindi, in seguito all’apertura di canali Ca2+, la concentrazione varia  notevolmente. Il Ca2+ può agire esercitando diversi effeU: può aprire canali K+ Ca2+dipendenG, può inaUvare altri canali, può aUvare protein‐ fosfatasi Ca2+ diepdenD Quindi l’ingresso di Ca2+ può esercitare due effeU: • dà un contributo alla depolarizzazione (entrata cariche posiDve) • ha effe?o modulatorio sull’apertura e chiusura di diversi canali (es.: apre canali K+ e chiude canali Ca2+; in questo caso quindi, l’entrata  di Ca2+ ha un cara?ere autolimitante, perchè il Ca2+ innesca due processi di ripolarizzazione) 2

Oltre che dal ruolo del Ca2+, l’accesso dei canali ionici viene modulato dall’aUvità sinapDca di altri neuroni, dalla concentrazione di secondi  messaggeri, dallo stato di fosforilazione dei canali IL LIVELLO DI ECCITABILITÀ PUÒ ESSERE DIVERSO DA UNA ZONA ALL’ALTRA DELLO STESSO NEURONE I dendriG possiedono canali ionici v‐d per K+ e Ca2+, che modificanola conduzione eleLrotonica passiva dei potenziali sinapDci; possono essere  influenzaD da potenziali retrogradi a partenza dalla zona di innesco La zona di innesco rappresenta il punto a soglia più bassa, in quanto è la zona deputata all’origine del potenziale d’azione; per questo possiede  un’elevata densità di canali Na+ v‐d e anche canali sensibili a piccole variazioni di voltaggio, come i canali di Gpo M, K+ di Gpo A, Gpo h (aUvaD da  iperpolarizzazione) e Ca2+, che sono deputaD alla trasformazione di segnali analogici (potenziali sinapDci) in segnali digitalici (potenziale d’azione) L’assone, deputato alla conduzione del potenziale d’azione, possiede canali v‐d Na+ e K+; nei nodi di Ranvier, non c’è bisogno di canali v‐d K+ per la  ripolarizzazione, che avviene dire?amente con l’inaUvazione dei canali Na+ Le terminazioni delle sinapsi chimiche possiedono canali v‐d Ca2+, deputato alla liberazione del neurotrasmeUtore LE PROPRIETÀ ECCITABILI VARIANO DA UN TIPO DI NEURONE ALL’ALTRO Il modo in cui ogni neurone risponde a un certo segnale di ingresso sinapDco (ad esempio, la frequenza di scarica) dipende dalle proporzioni dei  diversi Gpi di canali v‐d che esso possiede nella zona integraDva e nella zona di innesco. Cellule con diversi Dpi di canali possono rispondere in modo  diverso, anche opposto, alle depolarizzazioni o alle iperpolarizzazioni LE PROPRIETÀ FUNZIONALI DEI CANALI VOLTAGGIO‐DIPENDENTI POSSONO VENIR MESSE IN RELAZIONE CON LA LORO STRUTTURA MOLECOLARE Innanzitu?o, si è dovuto procedere al riconoscimento di stru?ure fisiche che avessero le cara?erisDche di quelli che oggi chiamiamo canali: si sono  ad esempio trovaD i canali Na+ marcando le membrana con TTX (tetrodotossina); si è visto che la densità di TTX è notevole nei nodi di Ranvier I CANALI VOLTAGGIO‐DIPENDENTI SI APRONO IN MANIERA TUTTO‐O‐NULLA Gli esperimenD di patch‐clamp, che misurano la corrente che passa per un singolo canale, hanno dimostrato che, in generale, i canali voltaggio‐ dipendenD hanno due staD di condu?anza: aperto o chiuso. Ogni canale si apre in maniera di tuSo‐o‐nulla, e quando è aperto, dà origine a un  impulso di corrente di durata variabile, ma di intensità costante. La condu?anza di singolo canale può variare tra 1 e 20 pS L’APERTURA DEI CANALI VOLTAGGIO‐DIPENDENTI PER IL SODIO È REGOLATA DA UNA RIDISTRIBUZIONE DELLE CARICHE PRESENTI ALL’INTERNO DEI  CANALI STESSI I canali sono dotaD di una carica d’accesso situata in un preciso punto della loro parete, che , in virtù delle variazioni del potenziale di membrana, è  susceUbile a spostamenG nel piano della membrana. DifaU, questa carica posiDva, a riposo si trova verso l’interno (negaDvo), mentre durante la  depolarizzazione si sposta leggermente verso l’esterno. Questo movimento della carica è riscontrabile in un esperimento di blocco di voltaggio come  una piccola corrente uscente visibile all’inizio (e una entrante alla fine) della variazione di potenziale (è riscontrabile perchè l’apparato di blocco deve  fornire una piccola carica che possa controbilanciare il movimento di cariche), ed è chiamata corrente d’accesso Ig. Si può notare che il canale Na+  risulD aperto in questo esperimento anche quando non vi è passaggio di corrente al suo interno: dopo una deplarizzazione prolungata, il canale  aperto viene inaMvato da una stru?ura vincolata LA SELETTIVITÀ DEL CANALE VOLTAGGIO‐DIPENDENTE PER IL SODIO DIPENDE DALLE DIMENSIONI, DALLA CARICA E DALL’ENERGIA DI IDRATAZIONE DI  QUESTO IONE Il filtro di seleMvità del canale Na+ è rappresentato da 4 traU intramembranosi (domini P) di idenDca stru?ura; in punD equivalenD, 2 contengono  acido glutammico, gli altri 2 lisina e alanina. I gruppi carbossilici dell’acido glutammico sono caricaD negaDvamente, e a?raggono caDoni sulla  superficie esterna del poro; i caDoni entrano in una stre?oia in cui possono passare soltanto 1 Na+ con 1H2O. La seleUvità dipende dal fa?o che  l’acqua di idratazione deve essere sosDtuita dalle interazioni con i gruppi carbossilici; l’efficacia delle sosDtuzioni dipende dalle dimensioni dello ione  (deve avere le giuste dimensioni per poter reagire con tuU i gruppi presenD: K+ è troppo grande per poter reagire efficientemente con tuU) Il ruolo degli aminoacidi polari è stato riconosciuto dopo diminuzione del pH: in questo caso si riduce la condu?anza dei canali aperD, perchè,  secondo la loro curva di 4tolazione, gli aminoacidi non posseggono più le loro cariche I CANALI VOLTAGGIO‐DIPENDENTI PER IL POTASSIO, IL SODIO E IL CALCIO DERIVANO TUTTI DA UN UNICO GENE ANCESTRALE DifaU quesD canali hanno in comune parecchi traU di molecola funzionalmente importanD Stru?ura del canale Na+: è formato da una grande glicoproteina (α) e da due polipepDdi più piccoli (β1 β2). La prima possiede le proprietà  fondamentali del canale, le seconde hanno funzione regolatoria • α è formata da 4 sequenze ripetute, ciascuna delle quali possiede 6 traM intramembranosi S1‐S6; tra S5 e S6, si trova un’ansa  idrofobica, il segmento P, che si approfonda parzialmente nella membrana con la funzione di formare la parete del poro • il tra?o S4 è molto conservato: si tra?a del sensore di voltaggio; in quest’elica, ogni 3 aminoacidi è presente un residuo caricato  posiGvamente (lisina o arginina). Quando la membrana si depolarizza, l’elica S4 si sposta, e i suoi residui caricaD posiDvamente sono  avvicinaD all’esterno della membrana I canali K+ contengono non 4 sequenze ripetute con queste cara?erisDche, bensì 4 subunità, ognuna della quali con i soliD 6 traU intramembranosi I domini regolatori sono invece assolutamente indipendenD e diversi Le differenze funzionali tra canali simili sono dovute alla presenza di differenG domini regolatori (vedi i vari Dpi di canali v‐d K+) NB: il tra?o S4, non necessario nei canali non v‐d, possiede poca carica o non è proprio presente in questo Dpo di canali • nei canali K+ a reMficazione entrante può mancare del tu?o: l’apertura dipende dall’iperpolarizzazione che spinge fuori dal canale nel  citoplasma gli ioni Mg2+ bloccanD L’inaMvazione, per i canali che ne sono provvisD (Na+ e K+ di Dpo A), è dovuta a diversi moduli molecolari: • nei canali K+ di Dpo A, il canale è bloccato dalla sua estremità N‐terminale • nei canali Na+, il canale è bloccato dal tra?o citoplasmaDco di catena che conne?e i domini III e IV

3

DIVERSE SUBUNITÀ MINORI FORNISCONO UN CONTRIBUTO ALLE PROPRIETÀ FUNZIONALI DEI CANALI VOLTAGGIO‐DIPENDENTI DEL SODIO, DEL  CALCIO E DEL POTASSIO Per le subunità β, γ e δ, viste le specifiche funzioni regolatrici, non esiste alcuna omologia LA VARIETÀ DEI TIPI DI CANALI VOLTAGGIO‐DIPENDENTI È DOVUTA A NUMEROSI MECCANISMI GENETICI Possono esistere diversi geni o meccanismi di rimaneggiamento dell’mRNA; inoltre diverse subunità possono essere accoppiate LE MUTAZIONI A CARICO DEI CANALI VOLTAGGIO‐DIPENDENTI SONO ALLA BASE DI DIVERSE MALATTIE NEUROLOGICHE SPECIFICHE Paralisi iperkalemica periodica: mutazione punDforme della subunità α del gene dei canali v‐d Na+ del muscolo scheletrico; i canali si inaUvano  incompletamente: il nuovo potenziale di riposo è ‐40 mV, valore al quale la maggioranza dei canali Na+ è inaUvata → paralisi Atassia periodica: mutazioni punDformi del canale v‐d K+ a reUficazione ritardata → diminuisce la corrente uscente e quindi la ripolarizzazione →  aumenta la raffica di scarica degli impulsi (Drosophila Shaker)

4

10 ‐ Uno sguardo panoramico sui meccanismi della trasmissione  sinapGca La sinapsi  rappresenta il punto in cui due neuroni si me?ono reciprocamente in conta?o: il segnale viene così trasmesso da una cellula all’altra I meccanismi fondamentali di trasmissione sinapDca sono 2: la trasmissione eleSrica e la trasmissione chimica. Inoltre, la cellula può modificare  l’aUvità sinapDca a?raverso modulazioni di vario Dpo e grazie alla plasGcità delle cellule nervose. • La trasmissione eleSrica è rapida e stereoGpata; i segnali inviaD sono semplici; non consentono l’invio di messaggi inibitori e non  determinano variazioni di lunga durata delle proprietà ele?riche delle cellule postsinapDche • Le sinapsi chimiche sono più duMli e producono comportamenD più complessi; possono dare risposte sia eccitatorie che inibitorie;  possono indurre modificazioni di lunga durata e hanno la capacità di amplificare i segnali neuronali LE SINAPSI POSSONO ESSERE ELETTRICHE O CHIMICHE O?o Loewi dimostrò che, oltre alla trasmissione ele?rica, esiste anche una trasmissione chimica. InfaU, vide che una sostanza chimica, l’ace4lcolina,  trasme?e segnali dal nervo vago al cuore (esperimento del cuore di rana) Le sinapsi chimiche e quelle ele?riche possiedono cara?erisDche morfologiche completamente diverse • nelle sinapsi chimiche, i neuroni sono indipendenD e separaD dalla fessura sinapGca • la corrente non passa dire?amente da una cellula all’altra (la corrente presinapDca si disperde a?raverso i canali passivi della  cellula presinapDca), ma ha la funzione di determinare la liberazione di neurotrasmeMtore che diffonde per la fessura fino a  interagire con un receSore postsinapGco, che determina la depolarizzazione postsinapDca. Il sistema è quindi susceUbile di  ritardo (latenza), ma garanDsce unidirezionalità • nelle sinapsi eleSriche esiste conDnuità citoplasmaDca tra i due neuroni (che sono quindi a conta?o) • i canali delle giunzioni comunicanG creano una via ad alta condu?anza tra le due cellule: la corrente passa dire?amente, quindi  non è presente ritardo sinapDco, ed inoltre la trasmissione può essere bidirezionale NELLE SINAPSI ELETTRICHE LA TRASMISSIONE DEI SEGNALI È PRATICAMENTE ISTANTANEA La corrente presinapDca (che prende origine dai suoi canali v‐d) deve essere abbastanza grande da poter far variare significaDvamente il potenziale  della cellula postsinapDca. Per intensificare la corrente, le sinapsi hanno sviluppato meccanismi basaD sulle dimensioni delle terminazioni: • la terminazione presinapGca presenta grandi dimensioni: può così contenere un maggior numero di canali v‐d • la terminaione postsinapGca è in genere più piccola, in quanto minori sono le dimensioni, maggiore è la resistenza di ingresso (Rin =  Rm / 4πa2), quindi, per la legge di Ohm (ΔV = ΔI * Rin) maggiore sarà la variazione di potenziale a una data corrente Le sinapsi ele?riche sono state dimostrate dopo l’osservazione che, in cerD Dpi di sinapsi, non si ha latenza, e ciò è incompaDbile con una sinpasi di  Dpo chimico; inoltre, in questo Dpo di sinapsi, la variazione di potenziale della cellula posGnapGca è direSamente proporzionale all’ampiezza e alla  forma della variazione  della cellula presinapGca. Qualsiasi impulso nella cellula presinapGca evoca una risposta graduata nella cellula  postsinapGca, mentre nelle sinapsi chimiche si hanno risposte postsinpaDche solo dopo il raggiungimento di una soglia. Le correnD trasportate sono sia depolarizzanD che iperpolarizzanD (vedi il potenziale postumo); la trasmissione a livello delle sinapsi chimiche è  analoga alla propagazione eleSrotonica dei segnali ele?rici so?o soglia lungo il decorso degli assoni La bidirezionalità di queste sinapsi è dovuta ala fa?oche la trasmissione dei segnali tra neuroni dipende dalle loro proprietà passive NELLE SINAPSI ELETTRICHE I CANALI DELLE GIUNZIONI COMUNICANTI METTONO IN CONNESSIONE DIRETTA UNA CELLULA CON L’ALTRA Nelle sinapsi ele?riche, lo spazio tra due neuroni è solo di 3,5 nm invece di 20 nm; questo spazio è a?raversato dai canali proteici delle giunzioni  comunicanG, a?raverso i quali passa la corrente. Le giunzioni comunicanD sono formate dall’appaiamento di  due emicanali, deU connessoini, uno  su ciascuna cellula e perfe?amente allineaD e a mutuo conta?o; il poro (1,5 nm di diametro) perme?e il passaggio anche di piccoli metaboliD. Ogni  connessone è formato  da 6 subunità de?e connessine, a loro volta formate da 4 segmenG transmembrana. Oltre a domini per il riconoscimento  delle altre connessine, le anse extracellulari di ogni connessina svolgono la funzione di riconoscimento omofilico con le connessine dell’altra cellula,  mentre le anse intracellulari hanno funzione regolatrice: infaU le giunzioni hanno la proprietà di chiudersi in risposta a determinaD sDmoli  citoplasmaDci, quali l’abbassamento del pH intracellulare o l’aumento della concentrazione intracellulare di Ca2+ (indice di un’alterazione cellulare).  Alcune giunzioni possiedono anche sensibilità al voltaggio (sinapsi re6fican4) cara?erizzate da unidirezionalità di trasmissione, oppure sensibilità a  neurotrasmeUtori liberaD nelle vicinanze. Il meccanismo di apertura e chiusura prevede la rotazione di ciascuna connessina di un emicanale l’una  rispe?o all’altra LA TRASMISSIONE ELETTRICA PERMETTE LA SCARICA RAPIDA E SINCRONA DELLE CELLULE INTERCONNESSE DALLE GIUNZIONI COMUNICANTI La funzione delle sinapsi eleSriche è quella di garanDre risposte rapide, uDli ad esempio in caso di fuga o di pericolo; risulta uDle anche nel me?ere  in connessione interi aggregaG di neuroni, coordinandoli. Questa coordinazione di parecchie cellule perme?e di o?enere gli stessi effeU di una  cellula grande da molte cellule piccole connesse tra loro; la loro connessione fa sì che la resistenza effeMva dell’intero aggregato diviene minore  della resistenza di ciascuna cellula. Una minore resistenza determina, per un certo valore di corrente, una minore variazione di potenziale (ΔV = ΔI *  R); quindi, per raggiungere la soglia, sarà necessaria una corrente maggiore rispe?o a quella necessaria per far scaricare una cellula sola; è quindi più  difficile che le cellule accoppiate scarichino potenziali d’azione. Ma questo effe?o garanDsce un vantaggio ada?aDvo: nelle cellule accoppiate  eleSricamente, i potenziali compaiono in maniera improvvisa e sosso forma di tuSo‐o‐nulla (in quanto, se si supera la soglia, tu?e le cellule aprono  i canali Na+ e scaricano in maniera sincrona) Quindi, oltre a conferire velocità e sincronia alla trasmissione, le sinapsi ele?riche possono anche trasme?ere segnali metabolici (i canali sono  grandi e non seleUvi, e lasciano passare secondi messaggeri come IP3 e AMPc)

1

LE GIUNZIONI COMUNICANTI SONO IMPORTANTI PER LE FUNZIONI DELLA GLIA E NELLE SUE ALTERAZIONI PATOLOGICHE Le giunzioni comunicanD pongono in mutua connessione sia neuroni che cellule gliali, che formano così una sorta di rete nel sistema nervoso  centrale; quando si sDmolano le vie nervose, negli astrociD aumenta la concentrazione intracellulare di Ca2+, che si trasme?e a tu?a la rete. Anche  nelle cellule di Schwann sono presenD giunzioni comunicanD, che conne?ono, mantenendoli uniD, i vari straD di mielina: nella malaUa di Charcot‐ Marie‐Tooth, il gene che codifica per quesD canali ha subito mutazione. LE SINAPSI CHIMICHE FUNGONO DA AMPLIFICATORI DI SEGNALI Nelle sinapsi chimiche non esiste conDnuità stru?urale tra i neuroni: è presente la fessura sinapGca (20 nm). La trasmissione dipende dalla  liberazione di neurotrasmeMtore dalla cellula presinapDca. I NT sono sostanze chimiche in grado di legarsi a receSori presenD sulla cellula  postsinapDca; sono liberaD a livello delle terminazioni presinapDche, dove le vescicole sinapGche che contengono il NT si fondono con la membrana  presinapDca. Le vescicole si accumulano a livello delle  zone aMve, regioni specializzate del neurone presinapDco. L’arrivo di un potenziale d’azione  presinapGco determina l’ingresso di Ca2+ a?raverso i canali Ca2+ v‐d della zona aUva; il Ca2+ favorisce i processi che portano all’esocitosi del NT. Una volta liberato, il NT diffonde nella fessura e si lega al proprio receSore: questo legame induce l’apertura o la chiusura di canali ionici. TuU  quesD passaggi determinano la comparsa di un ritardo sinapGco di diversi ms.  Una proprietà importante delle sinapsi chimiche è l’amplificazione: una sola vescicola libera migliaia di molecole di neurotrasmeUtore;  considerando che per aprire un canale postsinapDco bastano 2 molecole di NT, verranno comunque aperD migliaia di canali nella cellula  posDnapDca. I NEUROTRASMETTITORI SI LEGANO A RECETTORI POSTSINAPTICI La trasmissione sinapDca comporta un processo di trasmissione (liberazione del NT) e un processo receMvo (il NT si lega al rece?ore) Esistono quindi delle somiglianze con la trasmissione endocrina, anche se i NT non sono trasportaD a distanza nel torrente circolatorio, ma  interagiscono solo con la cellula con cui fanno sinapsi. La trasmissione sinapGca ha due vantaggi su quella endocrina: è più rapida e più proieMva  (minore distanza da percorrere e il bersaglio non è un Dpo cellulare ma una cellula precisa).  L’effeSo sull’elemento postsinapDco non dipende tanto dal  neurotrasmeUtore, ma dai suoi receSori: ad esempio, l’ACh, a seconda del Dpo di  rece?ore, può eccitare (→ giunzione neuromuscolare) od inibire (→ parasimpaDco vagale sul cuore) la cellula postsinapDca • tuU i rece?ori dei neurotrasmeUtori hanno due cara?erisDche biochimiche in comune: • sono proteine ce a?raversano la membrana a tu?o spessore, con zona rece?oriale all’esterno della cellula • esercitano una funzione effeSrice sulla cellula bersaglio modulando l’apertura o la chiusura di canali ionici I RECETTORI POSTSINAPTICI REGOLANO L’ACCESSO AI CANALI IONICI CON MECCANISMI SIA DIRETTI CHE INDIRETTI I rece?ori che agiscono direSamente sull’accesso dei canali ionici sono complessi receSori‐canale, in quanto consistono di un’unica macromolecola  con diverse subunità: comprendono un dominio extracellulare che forma il rece?ore e un dominio transmembrana che forma il canale ionico. Sono  deU receSori ionotropici (o regolaG da ligandi). Il legame con il neurotrasmeUtore induce una modificazione conformazionale che apre o chiude il  canale. Es.: receLore nico4nico per l’ACh. Spesso sono formaD da 5 subunità da 4 domini transmembrana • determinano l’insorgenza di potenziali rapidi di breve durata I rece?ori che regolano indireSamente l’accesso ai canali ionici sono macromolecole disGnte dai canali sui quali agiscono. Il legame con il  neurotrasmeUtore induce la modifica di reazioni metaboliche intracellulari, catalizzando la formazione di secondi messaggeri (rece?ore →  trasdu?ore ‐ proteina G → effe?ore ‐ adenilato ciclasi, fosfolipasi C) e la conseguente aUvazione di protein‐chinasi: regolano dunque alcuni canali  determinandone lo stato di fosforilazione / defosforilazione. Es.: receLori per la noradrenalina e per la serotonina, receLori muscarinici per  l’ACh.Spesso sono formaD da una subunità con se?e eliche transmembrana • determinano la comparsa di aUvità sinapDche più lente e durature (fino a minuD)

2

11 ‐ La trasmissione a livello della sinapsi neuromuscolare:  trasmissione sinapGca direSa La sinapsi neuromuscolare è la giunzione tra un motoneurone e una fibra muscolare scheletrica; la cellula muscolare postsinapDca è normalmente  innervata da un solo assone presinapDco, che libera un solo Dpo di neurotrasmeUtore che apre un solo Dpo di canale ionico postsinapDco. LA GIUNZIONE NEUROMUSCOLARE COSTITUISCE IL MODELLO D’ELEZIONE PER LO STUDIO DELLA TRASMISSIONE SINAPTICA DIRETTA L’assone del motoneurone si specializza nella sua parte terminale in numerose soUli branche senza guaina mielinica; ciascun ramo si espande a  formare i boSoni sinapGci, che si confrontano con zone specializzate della membrana muscolare de?e placche motrici. In corrispondenza dei  bo?oni, la membrana muscolare si invagina in profonde depressioni de?e pieghe giunzionali, che contengono i receSori del neurotrasmeUtore al  loro apice. Il neurotrasmeUtore è l’aceGlcolina ACh, e il rece?ore è il receSore nicoGnico per l’ACh. La fessura sinapGca è larga circa 100 nm, e conDene una membrana basale cosDtuita da collagene e contenente l’enzima aceGlcolinesterasi, che  idrolizza ACh (inaUvandolo) a colina e acetato.  Nella profondità delle pieghe giunzionali, la cellula muscolare è ricca di canali Na+ v‐d. La liberazione del neurotrasmeUtore avviene, nel motoneurone, a livello delle zone aMve, dove si aprono le vescicole sinapGche; ogni zona aUva è  situata di fronte ad una piega giunzionale della cellula muscolare. I bo?oni sinapDci contengono, oltre alle vescicole, mitocondri e canali Ca2+ v‐d, che si aprono all’arrivo di un potenziale d’azione: l’entrata di Ca2+  innesca il processo di liberazione del neurotrasmeUtore I MOTONEURONI ECCITANO IL MUSCOLO APRENDO CANALI IONICI A LIVELLO DELLA PLACCA MOTRICE La placca motrice della cellula muscolare, in seguito alla liberazione del neurotrasmeUtore, si depolarizza rapidamente, ed è quindi registrabile un  EPP (end‐plate potenGal) o potenziale di placca, con ampiezza parDcolarmente elevata, di circa 70 mV, abbastanza per dare origine ad un  potenziale d’azione (questa è una differenza importante con i potenziali postsinapDci eccitatori EPSP del sistema nervoso centrale, che non  raggiungono 1 mV di ampiezza: necessitano perciò di un processo di convergenza per dare origine ad un potenziale d’azione); il potenziale d’azione  si genera dopo l’apertura dei canali Na+ v‐d nelle pieghe giunzionali, aUvaD (aperD) proprio dal potenziale sinapDco IL POTENZIALE SINAPTICO DELLA PLACCA MOTRICE È DETERMINATO DA CORRENTI IONICHE CHE PASSANO ATTRAVERSO CANALI IL CUI ACCESSO È  REGOLATO DALL’ACETILCOLINA ImportanD studi sulla giunzione neuromuscolare sono staD svolD da Fa? e Katz, che tra?arono la sinpasi con curaro (una miscela di tossine che  bloccano la trasmissione sinapDca legandosi ai rece?ori nicoDnici dell’ACh); conclusero che il potenziale sinapGco è dovuto ad un flusso di corrente  entrante nella regione della placca motrice, che si propaga poi passivamente (difaU diminuisce con la distanza dalla placca, per l’imperfe?o  isolamento della membrana muscolare ‐ la carica si perde uscendo dai canali passivi e dalla capacità). Il flusso entrante è riscontrabile solo a livello  della placca motrice in quanto è l’unica regione contenente canali ionici aUvaD dall’ACh. Il potenziale di placca insorge rapidamente e decresce  lentamente: ma la corrente di placca, entrante dai canali ACh, insorge e decade molto più rapidamente del potenziale che determina; difaU l’ACh è  liberato istantaneamente, e rimane presente nella fessura finchè non diffonde all’esterno o non viene idrolizzato dall’aceDlcolinesterasi,  determinando così la chiusura rapida dei canali ACh. Il più lento decorso del potenziale di placca rispe?o alla corrente (infaU cambia con lentezza e  si instaura con ritardo) è determinato dal fa?o che la corrente impiegherà tempo per caricare e scaricare la capacità della membrana del muscolo. IL CANALE IONICO DELLA PLACCA MOTRICE È PERMEABILE SIA AL SODIO CHE AL POTASSIO Per individuare gli ioni responsabili della corrente sinapDca sono staD messi a punto esperimenD che misurassero la forza motrice chimica che spinge  gli ioni. La corrente di placca che determina il potenziale postsinapDco eccitatorio (EPSP) è definita come: IEPSP = gEPSP * (VM ‐ EEPSP) • IEPSP: corrente di placca;  gEPSP: condu?anza dei canali aUvaD da ACh;    EEPSP: forza motrice chimica, o ba?eria (dipende dai gradienD di  concentrazione degli ioni);    Vm della membrana muscolare a riposo = ‐90 mV • la corrente di placca, al potenziale di riposo, è entrante: quindi anche la forza motrice chimica che grava sugli ioni deve essere entrante  (negaDva, più posiDva di ‐90 mV) • EEPSP si può ricavare tramite esperimenD di blocco di voltaggio: depolarizzando progressivamente la membrana, si ridurrà la forza  motrice ele?rochimica, e quindi anche la corrente entrante, fino ad arrivare ad un valore di potenziale di membrana esa?amente uguale  al valore della forza motrice ele?rochimica. A questo valore di potenziale, non vi sarà alcuna corrente sinapDca ne?a (forza ele?rica V e  forza chimica E sono bilanciate): questo valore è de?o potenziale di inversione. Portando il potenziale di membrana sopra questo  valore, l’apertura dei canali ACh determinerà una corrente uscente • NB: l’aUvità sinapDca tende a portare Vm verso Eepsp: se Vm > Eepsp → iperpolarizzazione; se Vm < Eepsp → depolarizzazione Se la corrente entrante fosse dovuta solo al Na+, EEPSP (misurato tramite ricerca sperimentale in blocco di voltaggio del potenziale di inversione)  sarebbe uguale al potenziale di equilibrio di Na+, cioè +55 mV: invece è risultato che EEPSP è uguale a 0: se ne è dedo?o che i canali ACh non sono  permeabili ad un solo ione, bensì sono permeabili sia a Na+ che a K+ in misura molto simile. Durante un potenziale sinapGco, Na+ entra e K+ esce. Il  valore di 0 mV rappresenta la media ponderata dei potenziali di equilibrio dei due ioni La permeabilità per entrambi gli ioni è dovuta al diametro largo del poro (0,8 nm, misurato a?raverso passaggio di tetrameDlammonio); anche Ca2+  riesce a passare, mentre gli anioni sono bloccaD dalla presenza di cariche negaDve fisse nel canale Al potenziale di riposo di ‐90 mV, si ha comunque depolarizzazione in seguito all’apertura dei canali, perchè a questo valore di potenziale la forza  motrice che grava su Na+ è molto maggiore di quella su K+ (che è più vicino al proprio potenziale di equilibrio); a 0 mV, non si ha corrente; sopra, la  forza ele?rochimica sui K+ è più forte, si avrà quindi corrente uscente IL POTENZIALE DI INVERSIONE DEL POTENZIALE DI PLACCA Il potenziale di inversione di una corrente trasportata da più specie ioniche è determinato da due fa?ori: 1

• la conduSanza relaGva degli ioni (gK e gNA) • il potenziale di equilibrio degli ioni stessi (EK e ENA) Al potenziale di inversione, le correnD entrante ed uscente sono bilanciate: INA + IK= 0   (ricorda che I = g * (V ‐ E)) Sapendo che al potenziale di inversione Vm = Eepsp, si può sosDtuire quest’equazione e risolvere per Eepsp:  A livello della giunzione neuromuscolare, Eepsp = 0 mV, ENA = +55 mV, EK = ‐100 mV È anche possibile calcolare il rapporto tra le condu?anze dei due ioni: gNA / gK = 1,8 → la conduSanza del canale ACh è maggiore per Na+ LA TECNICA DEL PATCH‐CLAMP PERMETTE L’ANALISI DEI FLUSSI DI CORRENTE CHE PASSANO ATTRAVERSO SINGOLI CANALI IONICI ATTRAVERSO OGNI SINGOLO CANALE DIPENDENTE DALL’ACETILCOLINA PASSA UNA CORRENTE UNITARIA DI INTENSITÀ COSTANTE I canali si aprono e si chiudono a gradino, dando origine a piccolissimi impulsi re?angolari di corrente ionica. Se il potenziale resta costante, i canali  lasciano passare sempre lo stesso impulso di corrente. Il gradino di corrente unitaria cambia in funzione del potenziale di membrana, perchè da esso  dipende la forza motrice (Vm ‐ Eepsp) → legge di Ohm: Iepsp = gepsp * (Vm ‐ Eepsp)  (per singolo canale I → i e g → γ) • la relazione corrente‐voltaggio è lineare, e perciò la conduSanza è costante e indipendente dal potenziale (in media, 30 pS) → il canale  si comporta come un semplice resistore • a potenziale costante, le correnD dei singoli canali vanno incontro ad incremenD a gradino, di Dpo tuSo‐o‐nulla; se più canali si aprono  simultaneamente, le correnD si sommano linearmente; NB: la corrente è entrante se il potenziale mantenuto è so?o 0 mV, uscente se  superiore a 0 mV Ciò che varia tra i canali è la durata dell’apertura e il tempo fra due aperture successive: è però calcolabile un tempo medio di apertura I canali ACh non sono sensibili alle variazioni di voltaggio, ma solo al ligando: per aprirsi, ogni canale ha bisogno di 2 ACh LA CORRENTE DI PLACCA È DETERMINATA DA QUATTRO FATTORI SDmolando un nervo motore, si ha un notevole e rapido aumento di concentrazione di ACh, che aumenta la condu?anza totale della membrana di  placca. La concentrazione di ACh diminuisce poi molto rapidamente nella fessura sinapDca (in 1 ms) per idrolisi e diffusione; i canali cominciano  quindi a chiudersi in maniera casuale (nel senso che, mentre si aprono tuU contemporaneamente in risposta allo stesso sDmolo, la durata della loro  apertura è diversa). Per ogni canale che si chiude, viene meno un gradino di corrente unitaria; visto il loro grande numero, il decadimento della corrente totale assume  però gli aspeU di un fenomeno conDnuo (l’andamento temporale della corrente di placca totale è la sommatoria degli impulsi di corrente che  passano per i singoli canali ACh). Si può quindi calcolare la conduSanza sinapGca totale: gEPSP = n * γ, dove n è il numero medio dei canali aperD  dall’ACh e γ è la condu?anza di singolo canale. n = N * p0, cioè il numero medio di canali aperD è dato dal numero totale di canali per la probabilità  che ogni canale sia aperto, e tale probabilità dipende dalla concentrazione del neurotrasmeUtore Quindi, la corrente totale di placca è data da: IESPS = N * p0 * γ * (Vm ‐ EEPSP)   I qua?ro fa?ori che determinano la corrente di placca sono quindi: • il numero totale dei canali nella placca (N) • la probabilità che un canale sia aperto (p0) • la conduSanza di ogni canale aperto (γ) • la forza eleSromotrice che agisce sugli ioni (Vm ‐ Eepsp) La corrente sinapGca neSa dipende dalla somma algebrica dei flussi opposD di Na+ e K+, dipendenD dalla FEM di ognuno; al potenziale di riposo,  prevale la corrente entrante Na+. A questa corrente ne?a corrisponde una corrente di intensità uguale ma di direzione opposta che ritorna  all’esterno tramite i canali passivi e la capacità della membrana LE PROPRIETÀ MOLECOLARI DEL CANALE DIPENDENTE DALL’ACETILCOLINA SONO OGGI BEN NOTE I CANALI REGOLATI DAI NEUROTRASMETTITORI HANNO CARATTERISTICHE DIVERSE DAI CANALI VOLTAGGIO‐DIPENDENTI I canali regolaD da ligandi presentano due differenze fondamentali dai canali voltaggio‐dipendenG: • il canale ACh è il solo responsabile della genesi del potenziale d’azione: non devono essere aUvaD in tempi successivi due Dpi diversi di  canali voltaggio‐dipendenD • i canali aUvaD da ligando non presentano rigenerazione: l’entrata di Na+ non apre ulteriori canali tramite depolarizzazione (ciò che dà il  cara?ere tu?o‐o‐nulla ai canali voltaggio‐dipendenD); il numero di canali aUvaD da ACh dipende esclusivamente dalla concentrazione  di ACh: la depolarizzazione prodo?a non ha la capacità di aprire ulteriori canali ACh. Quindi, non possono dare origine dire?amente ad  un potenziale d’azione: per fare ciò, il potenziale di placca deve essere in grado di aUvare i canali voltaggio‐dipendenD circostanD. Il canale nicoDnico ACh è bloccato dalla α‐bungarotossina SIA IL RECETTORE NICOTINICO PER L’ACETILCOLINA CHE IL RELATIVO CANALE SONO COSTITUITI DALLA STESSA MACROMOLECOLA Il rece?ore ACh della giunzione neuromuscolare è di Dpo ionotropico, quindi è un canale aUvato dire?amente, ed è de?o nicoGnico; è una  glicoproteina formata da 5 subunità: 2α, β, γ, δ. Il sito di legame per ACh è presente in ognuna delle due subunità α sul versante extracellulare, e  presenta alta affinità per ACh: il canale si apre solo se tuU e due i siD presentano legame con ACh. Tu?e e 5 le subunità presentano 4 eliche  transmembrana M1‐M4. Le 5 subunità sono disposte in modo da circondare un poro, verso il quale ognuna si affaccia con la sua elica M2, e in  corrispondenza di queste eliche le subunità possiedono 3 anelli di cariche negaGve che selezionano i caDoni Il complesso receSore‐canale appare suddiviso in 3 porzioni: un largo vesDbolo di entrata all’esterno, un poro ristre?o a?raverso la membrana, una  larga uscita all’interno Il segmento M2 presenta una piegatura centrale; quando il canale è aperto, la piega del segmento è addossata alle pareD, andando a formare il filtro  di seleMvità (espone infaU dei residui di treonina, il cui atomo di ossigeno ele?ronegaDvo può compensare la perdita dell’acqua di idratazione);  quando il canale è chiuso, la piega è rivolta verso il centro del poro, occludendolo APPENDICE. È POSSIBILE CALCOLARE LA CORRENTE DI PLACCA PARTENDO DA UN MODELLO DI CIRCUITO EQUIVALENTE Il circuito equivalente della placca motrice deve possedere 3 branche in parallelo: 2

• una branca rappresenta il flusso della corrente sinapGca che a?raversa i canali aMvaG dal neurotrasmeMtore • una branca rappresenta la via di ritorno della corrente a?raverso i canali passivi (della membrana non sinapDca) • una branca rappresenta il flusso della corrente capaciGva ai capi della matrice lipidica della membrana, che funge da condensatore Le branche nelle quali la corrente passa a?raverso i canali devono quindi essere composte da una resistore (la conduSanza dei canali) e da una  baSeria (la forza ele?romotrice) poste in serie La conduSanza dei canali ACh dipende dal numero di canali aperG, quindi dalla concentrazione di ACh; il valore di questa condu?anza è di 5*10‐6 S,  cioè 5 volte la condu?anza dei canali passivi (gi). La baSeria in serie con questa condu?anza ha il valore del potenziale di inversione  della corrente  sinapDca Eepsp = 0 mV (→ somma algebrica ponderata dei potenziali di equilibrio Na+ e K+). La corrente che passa per questa prima branca è data  da Iepsp = gepsp * (Vm ‐ Eepsp) Determinando l’andamento dei flussi nel tempo, è possibile ricostruire l’andamento temporale del potenziale di placca (dipendente dai canli ACh  aUvi e dalle proprietà passive di membrana): • all’inizio dell’aUvità sinapDca eccitatoria (fase dinamica), i canali ACh sono aperD, quindi si avrà corrente entrante neSa a?raverso i  canali, per via della grande FEM di Na+ al valore del potenziale di riposo (‐90 mV) • poichè le correnD scorrono in una maglia chiusa di  circuito, la corrente sinapDca entrante lascerà la cellula come corrente  uscente, che può passare a?raverso una via di conduLanza (i canali passivi → Ii) e una via capaci4va (Ic); quindi Iepsp = ‐ (Ii +  Ic) • NB: Ic è presente anche nel caso di genesi del potenziale d’azione, ma in quel caso il cara?ere rigeneraDvo  depolarizzazione → apertura → entrata … fa superare di molto e rapidamente questa corrente uscente, determinando  così una rapida variazione del potenziale • inizialmente, questa corrente uscente sarà tu?a capaciGva Ic;  • col tempo, la capacità si carica, e aumenta la variazione di potenziale; quindi la corrente Ic diminuisce per lasciare spazio alla  corrente Ii, che garanDsce la stessa variazione di potenziale nella branca della resistenza. Da notare che questa corrente uscente  per i canali passivi è favorita dall’aumento della FEM uscente, mentre contemporaneamente diminuisce la FEM entrante • la diminuzione della FEM entrante è anche dovuta alla chiusura dei canali ACh; ad un certo punto, si arriva ad una situazione per la  quale la corrente entrante è esa?amente controbilanciata dalla corrente uscente per i canali passivi (Iepsp = ‐Ii). In questo momento,  non si ha corrente capaciDva (Ic = 0). La mancanza di corrente capaciDva blocca la variazione di potenziale: Ic = Cm * ΔV/Δt, quindi se  non c’è corrente capaci4va il potenziale non varia. Questo punto equivale al picco del potenziale • questo stato stazionario è però perso, dal momenD che Iepsp diminuisce per via della conDnua chiusura di altri canali: inizia il processo  di ripolarizzazione, perchè Ii uscente è ora maggiore di Iepsp entrante • Ad un certo momento della depolarizzazione, tuU i canali ACh saranno chiusi; è però misurabile una corrente entrante dovuta a Ic (la  carica entra a?raverso la capacità) Al momento del picco (Iepsp + Ii = 0;  Ic = 0), è possibile calcolare il potenziale di membrana, potendo misurare sia la corrente entrante Iepsp che la  corrente uscente e conoscendo le rispeUve condu?anze e il loro potenziale di inversione / equilibrio. InfaU, sapendo che la somma delle correnD  deve dare 0, e sosDtuendo quest’equazione son la legge di Ohm, risolvendo infine per Vm, si ha  , una versione  dell’equazione di Goldman, basata sulla media ponderata dei potenziali di inversione / equilibrio ponderaD (ovvero delle forze eleSromotrici delle  ba?erie della corrente sinapDca e di quella passiva) sulla rispeUva condu?anza rispe?o alla condu?anza totale (= 1). Questo Vm rapprenenta quindi  il potenziale al livello del picco. • quando la condu?anza gi dei canali passivi è molto maggiore di quella dei canali ACh (quando sono chiusi), Vm tende a Ei • quando la condu?anza gepsp dei canali ACh è molto maggiore di quella dei canali passivi (quando sono aper4), Vm tende a Eepsp • il valore del potenziale di membrana al picco è di ‐15 mV (calcolata tenendo conto che la condu?anza dei canali ACh aperD è 5 volte  quella dei canali passivi)

3

12 ‐ I meccanismi di integrazione sinapGca La maggior parte dei neuroni del sistema nervoso centrale impiega receSori ionotropici per la trasmissione rapida dei messaggi; nel sistema  nervoso centrale, la complessità dei sistemi di comunicazione cellulare porta a riconoscere alcune differenza rispe?o alla giunzione neuromuscolare: • le fibre muscolari sono innervate da un solo motoneurone, mentre le cellule del SNC ricevono connessioni da cenGnaia di neuroni;  inoltre differiscono i rispeUvi EPSP evocaD sulla cellula postsinapDca da ogni fibra afferente: nella placca è di 70 mV, nei neuroni di 0,2 ‐  0,4 mV • le fibre muscolari ricevono soltanto impulsi eccitatori, mentre i neuroni del SNC  ricevono segnali sia eccitatori che inibitori • nella fibra muscolare, le connessioni sono mediate da un unico neurotrasmeUtore (ACh), con un solo rece?ore ad effe?o eccitatorio;  nel SNC, esiste una vasta gamma di neurotrasmeMtori, ciascuno dei quali può modificare l’aUvità di diversi Gpi di canali ionici,  reagendo sia con receSori ionotropici che con receSori metabotropici. Ne consegue che i neuroni devono integrare i segnali sinapDci  entranD per garanDre un’unica risposta coordinata • la sinapsi neuromuscolare è di efficacia risoluDva, cioè ogni potenziale in arrivo sul motoneutone è seguito da un potenziale d’azione  sulla fibra muscolare; invece le afferenze in arrivo sul motoneurone, invece, non sono mai risoluGve: per innescare un potenziale  d’azione, è necessario sommare le risposte di almeno 50 neuroni eccitatori presinapDci, altrimenD il potenziale sinapDco non risulterà  abbastanza ampio I NEURONI DEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE RICEVONO SIA SEGNALI ECCITATORI CHE INIBITORI I primi esperimenD sulle sinapsi del SNC sono state effe?uate sulle connessioni tra i neuroni che mediano il riflesso da s4ramento. Il complesso  prevede un neurone sensiGvo proveniente dal muscolo, entrante nel midollo spinale dalle corna posteriori, un motoneurone che innerva lo stesso  muscolo e un motoneurone che innerva il muscolo antagonista, entrambi uscenD dalle corna frontali del midollo. Le connessioni all’interno della  sostanza grigia midollare tra il neurone sensiDvo possono essere direSe (eccitatorie) o mediate da un interneurone (inibitorie) SDmolando il neurone sensiDvo, si ha un EPSP (potenziale postsinap4co eccitatorio) nel motoneurone che innerva lo stesso muscolo e un IPSP  (potenziale postsinap4co inibitorio) nel motoneurone che innerva il muscolo antagonista • l’EPSP prodo?o dall’aUvità di una sola cellula sensiDva è molto piccolo (0,2 ‐ 0,4 mV), e non è necessario per raggiungere la soglia (che  necessita di una depolarizzazione di 10 mV; infaU, nei neuroni del SNC, il valore del potenziale di riposo è di ‐65 mV, mentre il valore  della soglia è di ‐55 mV) • per raggiungere una depolarizzazione sufficiente, è necessaria la convergenza di molte afferenze eccitatorie, i cui potenziali sinapDci  eccitatori vengono integraG dal neurone postsinapDco per dare origine ad un potenziale d’azione • l’inibizione sinapGca si oppone all’eccitamento (va sommata algebricamente agli sDmoli eccitatori) ed esercita un controllo molto  efficace sulle cellule spontaneamente a6ve (ruolo di modellamento dell’inibizione), ad esempio le cellule pacemaker del cuore LE SINAPSI ECCITATORIE E INIBITORIE HANNO MORFOLOGIA ULTRASTRUTTURALE DIVERSA L’effe?o della liberazione di neurotrasmeUtore dalla cellula presinapDca non dipende dal neurotrasmeUtore stesso, ma dal Gpo di receSori  presenD sulla membrana postsinapDca e dal Gpo di canali ionici che si aprono • in generale nel SNC il glutammato reagisce con rece?ori che determinano eccitamento, mentre il GABA e la glicina con rece?ori che  determinano inibizione Nel sistema nervoso sono presenD due Dpi morfologici molto comuni di connessioni sinapDche: • le sinapsi di Gpo I di Gray, di Dpo glutammatergico, quindi eccitatorie • queste sinapsi presentano fessura ampia (30 nm), zone aUve relaDvamente ampie e filamenD densi evidenD, con vescicole  rotondeggianD; generalmente, sono sinapsi presenD sulle spine dendriGche • le sinapsi di Gpo II di Gray, di Dpo GABAergico, quindi inibitorie • queste sinapsi hanno invece una fessura più stre?a (20 nm), zone aUve più piccole, filamenD densi meno evidenD, non  presentano membrana basale e le vescicole appaiono appiaUte; generalmente, terminano vicino al soma L’ATTIVITÀ SINAPTICA ECCITATORIA È MEDIATA DA CANALI ATTIVATI DAL GLUTAMMATO E SELETTIVI PER IL SODIO E IL POTASSIO Gli EPSP dei motoneuroni spinali sono dovuD all’apertura di canali ionici aUvaD dal legame del glutammato con il proprio rece?ore; quesD canali  sono permeabili sia al Na+ che al K+. Il meccanismo è quindi analogo a quello dei canali ACh della giunzione neuromuscolare; possiamo quindi dire  che anche per quesD canali il potenziale di inversione si aggira intorno a 0 mV. La differenza principale sta però nel fa?o che, per avere una  depolarizzazione suffientemente ampia per raggiungere la soglia, e dare così origine ad un potenziale d’azione a livello del cono d’emergenza (che è  l’elemento integraGvo), lo sDmolo iniziale deve essere forte abbastanza da reclutare parecchie fibre afferenG. I receSori del glutammato si possono suddividere in due categorie: • i canali ionotropici, ad azione eccitatoria, a loro volta divisi in due categorie: • i rece?ori non‐NMDA, come i rece?ori AMPA e kainato (il nome viene dagli agonisD) • i rece?ori NMDA • i canali metabotropici, aUvaD dall’acido ACPD, ad azione sia eccitatoria che inibitoria (aUvazione fosfolipasi C → IP3 e DAG) I motoneuroni possiedono sia rece?ori NMDA che non‐NMDA, con differente azione: • i rece?ori non‐NMDA si aprono subito in risposta al glutammato (quindi già a valori di potenziale vicini a quelli di riposo); cosDtuiscono  la componente precoce e più ampia dell’EPSP, aprendo canali permeabili a Na+ e K+ • i rece?ori NMDA danno origine alla componente tardiva dell’EPSP, in quanto possiedono 3 parDcolari proprietà: • il canale corrispondente presenta conduSanza elevata e permeabilità anche al Ca2+ • l’apertura del canale richiede la presenza di glicina come cofaSore • esperimenD sui NMDA sono staD faU in presenza di APV (acido amino‐fosfonvalerianico), bloccante seleUvo dei NMDA • la sua apertura dipende sia dalla presenza di un neurotrasmeMtore che dal voltaggio

1

• la dipendenza dal voltaggio presenta un meccanismo diverso rispe?o a quello dei classici canali voltaggio‐dipendenD:  difaU non avviene una modificazione conformazionale, bensì il voltaggio opera su par4celle bloccan4 come il Mg2+  extracellulare: al potenziale di riposo (→ interno negaDvo, ‐65 mV) gli Mg2+ si legano con forza al canale, bloccandolo.  Quando la membrana si depolarizza (per azione dei canali non‐NMDA), gli Mg2+ vengono allontanaD per repulsione  ele?rostaDca, perme?endo così il passaggio di Na+ e K+ a?raverso il canale • se si allontanano Mg2+ da liquido extracellulare, i rece?ori NMDA perdono la dipendenza dal voltaggio • il massimo flusso a?raverso i canali NMDA si ha quando è presente glutammato e la cellula è depolarizzata • la schizofrenia comporterebbe un’alterazione funzionale dei rece?ori NMDA • possedendo entrambi i Dpi di rece?ori, si può dire che l’EPSP che compare quando il potenziale ha il suo normale valore di riposo  dipende dall’aUvazione dei rece?ori non‐NMDA (gli NMDA sono bloccaD da Mg2+); la depolarizzazione che ne consegue perme?erà  l’apertura dei canali NMDA. I canali NMDA possiedono anche la cara?erisDca di aprirsi e chiudersi lentamente: così la fase tardiva  dell’EPSP è apprezzabile, specialmente in seguito ad una scarica di potenziali d’azione ad alta frequenza, in quanto si vanno sommando  le depolarizzazione dovute ai numerosi EPSP. Gran parte della corrente tardiva è trasportata da Ca2+, il che vuol dire che oltre alla  depolarizzazione tardiva, vengono aUvaD nella cellula postsinapDca enzimi Ca‐dipendenG e protein‐chinasi dipendenG da 2ndi  messaggeri. Poichè comunque i rece?ori NMDA richiedono un notevole livello di aUvità presinapDca per funzionare in pieno, le  modificazioni di lungo termine mediate dai rece?ori NMDA vengono anche de?e modificazioni sinpaGche aMvità‐dipendenG • un eccesso di glutammato può portare ad eccitotossicità, in quanto si potrebbe avere un eccessivo ingresso di Ca2+ a?raverso i  canali NMDA, che può causare l’aUvazione di proteasi e fosfolipasi Ca‐dipendenD, con formazione di radicali liberi IN GENERALE, L’ATTIVITÀ SINAPTICA INIBITORIA È MEDIATA DA CANALI SELETTIVI PER IL CLORO, ATTIVATI DAL GABA E DALLA GLICINA Il GABA è il principale neurotrasmeUtore inibitorio del cervello e del midollo spinale; agisce su due Dpi di rece?ori: • i receSori GABAa, di Dpo ionotropico, che regola l’accesso a un canale Cl‐ • il receSore GABAb, di Dpo metabotropico (accoppiato a proteine G), la cui funzione finale è quella di aprire un canale K+ La glicina è meno diffusa come neurotrasmeUtore, e agisce a?raverso receSori ionotropici che aUvano canali Cl‐; è uDlizzata nel midollo spinale da  parte degli interneuroni inibitori (vedi il circuito del riflesso da sDramento) Bisogna considerare che il potenziale d’equilibrio di Cl‐ è di ‐70 mV, e che la sua concentrazione extracellulare è molto maggiore; mentre la forza  chimica lo spinge all’interno, quella ele?rica lo spinge all’esterno: quando le due forze sono opposte (come per K+), il potenziale di equilibrio ha  segno negaDvo. Dato che il potenziale di equilibrio ha quindi lo stesso segno del potenziale di membrana intorno ai valori di riposo, a seconda di  quale dei due potenziali è più grande (Vm o ECl), si può inverDre il flusso di Cl. A riposo (‐65 mV), Vm è inferiore, come valore assoluto, di ECl (‐70  mV, quindi Vm è meno negaDvo; vedi cap. 7), quindi prevale la forza chimica che fa entrare Cl iperpolarizzando la cellula; se con blocco di voltaggio  si porta Vm a valori più bassi di ‐70 mV, Cl tende a uscire, depolarizzando la cellula e portandola verso ECl. Inoltre, dato che la corrente per  convenzione segue la direzione delle cairche posiGve, una corrente entrante di Cl è considerata come corrente uscente. Quindi, oer potenziali  superiori a ECl, il flusso entrante di Cl determina una corrente uscente che depolarizza la cellula. In sintesi, un IPSP inibitorio dipende da un aumento di condu?anza verso i Cl‐. È POSSIBILE REGISTRARE LE CORRENTI DI SINGOLO CANALE ATTIVATE DAL GABA E DALLA GLICINA Analogamente ai canali aUvaD da ACh e glutammato, anche i canali Cl‐ aUvaD da GABA e glicina si aprono in maniera di tuSo‐o‐nulla; la  condu?anza del canale aUvato da glicina (46 pS) è maggiore di quello aUvato da GABA (30 pS; il canale aUvato da glicina presenta un maggiore  diametro a livello del poro); queste misurazioni sono state o?enute con la tecnica del patch‐clamp I MECCANISMI MEDIANTE I QUALI L’APERTURA DEI CANALI DEI CLORO IONI INIBISCE LE CELLULE POSTSINAPTICHE Abbiamo de?o di come al potenziale di riposo della membrana (‐65 mV), leggermente più posiDvo di ECl (‐70 mV), sia possibile un flusso entrante di  Cl‐ secondo gradiente di concentrazione, nel caso in cui i suoi canali vengano aperD da NT inibitorio. La risultante corrente uscente iperpolarizza la  cellula. Vi sono, però, molD neuroni che presentano Vm = ECl = ‐70 mV; in queste cellule l‘aumento della condu?anza di Cl‐ non cambia il potenziale, in  quanto non si ha FEM per il movimento di Cl‐. Nonostante non avvenga iperpolarizzazione, queste cellule possiedono comunque un meccanismo  inibitorio mediato dal Cl‐ • le afferenze sinpaDche inibitorie influenzano l’ampiezza di un EPSP insorto simultaneamente. DifaU, l’efficienza con cui un EPSP è in  grado di portare la membrana verso la soglia dipende da: • dalla conduSanza dei canali sinapGci eccitatori e dalla FEM delle baSerie (forza chimica) • dalla conduSanza di tuU gli altri canali ionici (come i canali passivi e i canali sinapDci inibitori) riuniD in un’unica via di  condu?anza (ciò è possibile dato che ECl è uguale a Vm) • secondo l’equazione di Goldman, Vm dipende dalla media ponderata delle ba?erie delle condu?anze sinpaDche eccitatorie e delle  condu?anze dei canali passivi secondo il fa?ore di ponderazione, rappresentato dalla frazione della condu?anza totale propria di  ciascuna via. Quindi il ruolo dei canali sinapDci inibitori è quello di portare la membrana verso il valore di riposo, aumentando la  condu?anza dei canali passivi • oppure, secondo la legge di Ohm, ΔVepsp = Iepsp / gi • l’ampiezza della depolarizzazione prodo?a nel corso dell’EPSP dovrà diminuire se aumenta la condu?anza dei canali passivi • l’aumento di condu?anza dovuto all’aumento di IPSP è de?o effeSo di corto circuito o di shunt Quindi, i meccanismi di inibizione dovuD all’apertura dei canali GABAa sono: l’iperpolazrizzazione per entrata di Cl‐ e l’aumento della conduSanza  di membrana (con generazione di una corrente uscente che cortocircuita le correnD entranD depolarizzanD) È anche possibile che l’apertura sia dovuta, come nel caso dei receSori GABAb, all’apertura di canali K+; EK nelle cellule nervose è pari a ‐80 mV, più  negaDvo quindi di Vm a riposo. L’apertura dei canali K+ allora perme?e la fuoriuscita di K+ secondo gradiente di concentrazione, iperpolarizzando e  inibendo la cellula L’apertura dei canali Cl‐ aUvaD dal GABA può addiri?ura produrre un eccitamento dopo un periodo di intensa aMvità: potrebbe infaU avvenire un  ingresso talmente elevato di Cl‐ nella cellula, che, raddoppiando la sua concentrazione intracellulare, il suo potenziale di equilibrio si modifica di  2

conseguenza diventando più posiDvo del potenziale di riposo. In queste condizioni, l’apertura dei canali Cl‐ perme?e allora la fuoriuscita di Cl‐  (prevalendo la forza ele?rica su quella chimica), depolarizzando la cellula (appare infaU una corrente entrante). QuesD effeU parDcolari possono  avvenire durante a?acchi epileUci o possono avere un ruolo nella genesi di aUvità cerebrali oscillatorie a frequenze ripeDDve. I RECETTORI SINAPTICI PER IL GLUTAMMATO, IL GABA E LA GLICINA SONO PROTEINE INTEGRALI DELLA MEMBRANA I rece?ori GABA e glicina appartengono alla stessa famiglia dei rece?ori nicoGnici dell’ACh, mentre i rece?ori glutammato fanno parte di una  diversa famiglia di rece?ori. I RECETTORI DEL GABA E DELLA GLICINA Come il complesso rece?ore‐canale dell’ACh, i rece?ori di Dpo GABAa possiedono 5 subunità (2 α, 2 β e 1 γ); il rece?ore canale della glicina è  composto da 3 α e 2 β. InfaU per aUvare il rece?ore GABAa sono necessarie 2 molecole di GABA, mentre per aUvare il rece?ore della glicina sono  necessarie 3 molecole di glicina. Ogni subunità è cosDtuita da un’estremità N‐terminale extracellulare (sito di legame del neurotrasme6tore)  seguito da 4 domini transmembrana (M1‐M4); il dominio M2 forma le pareD del poro. A differenza del canale ACh (che conDene aminoacidi carichi  negaDvamente nelle vicinanze del filtro di seleUvità), quesD rece?ori contengono aminoacidi neutri o caricaG posiGvamente, selezionando così gli  anioni. I canali aUvaD dal GABA si legano a parDcolari classi di sostanze: le benzodiazepine, i barbiturici e l’alcool I RECETTORI DEL GLUTAMMATO I rece?ori del glutammato appartengono ad una famiglia di geni diversi. All’interno di questa famiglia, si riconoscono i geni che codificano per i  rece?ori AMPA e kainato, stre?amente correlaD tra loro, e i geni che codificano per i rece?ori NMDA TuU, comunque, sono proteine transmembrana composte da 4 subunità, ognuna delle quali cosDtuita da 3 eliche transmembrana (M1, M3 e M4).  Il poro del canale sarebbe formato dal tra?o di catena che conne?e la prima e la seconda elica (M1‐M3, simile alla regione P dei canali v‐d K+; in  praDca è presente un’ansa parzialmente transmembrana al posto dell’elica M2) Il sito di legame per il glutammato è cosDtuito da due domini disDnD: uno si trova all’estremità N‐terminale extracellulare di una subunità, e l’altro  dal tra?o di catena che conne?e i segmenD M3 e M4 Le proprietà del poro dei rece?ori AMPA e NMDA sono diverse, e sono dovute alla presenza di un solo aminoacido differente nella regione M2 che  forma il poro: • i rece?ori NMDA, nell’ansa corrispondente a M2, contengono un residuo neutro di asparagina in tu?e le subunità • i rece?ori AMPA, nel tra?o corrispondente di M2, contengono un residuo privo di carica di glutammina in 3 delle 4 subunità, e  un’arginina nella subunità GluR2 • è sufficiente la presenza di un’arginina per impedire il passaggio di Ca2+, che possono quindi passare solo a?raverso i rece?ori‐ canali NMDA (si ha repulsione ele?rostaDca tra l’arginina e il Ca2+); se viene fa?o saltare il processo di ediDng (revisione)  durante il quale la glutammina viene sosDtuita da arginina, il canale è permeabile al Ca2+ Il meccanismo per il quale la cellula riesce a raggruppare quesD rece?ori‐canali in siD parDcolari della membrana è dovuto all’aUvità di proteine con  domini PDZ, che fungono da supporto sul quale viene assemblato un complesso di proteine postsinapDche NB: i canali aMvaG da ligandi possono essere suddivisi in 3 famiglie: quelli aUvaD dall’ATP, il gruppo ACh, GABA, glicina ed infine la famiglia  glutammato ALTRI RECETTORI‐CANALI PRESENTI NEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE Nel SNC possono trovarsi i rece?ori ionotropici della serotonina (5HT), ad effe?o eccitatorio rapido. Inoltre, sono presenD rece?ori ionotropici  aUvaD dall’ATP (purinergici) nella muscolatura liscia innervata dall’ortosimpaDco e in altri traU del SNC e SNA (questo canale è permeabile a Na+, K+  e Ca2+; il suo potenziale di inversione è intorno a 0 mV). SIA I SEGNALI ECCITATORI CHE QUELLI INIBITORI VENGONO INTEGRATI DAI NEURONI IN UN’UNICA RISPOSTA Un motoneurone può ricevere fino a 10.000 diverse terminazioni presinapDche, alcune eccitatorie ed altre inibitorie, con differenze riguardo la forza  del segnale e il punto di sinapsi sul motoneurone stesso. Gli impulsi trasmessi  dalle diverse afferenze possono rinforzarsi mutuamente od elidersi Gli EPSP prodoU da ciascuna afferenza, di ampiezza 0,2 ‐ 0,4 mV, sono troppo piccoli per far raggiungere alla cellula postsinapDca la soglia  necessaria per dare origine ad un potenziale d’azione; bisogna anche considerare la presenza di IPSP che allontanano ancor di più dalla soglia. L’impaSo relaGvo di ciascuna afferenza dipende da diversi fa?ori: • dalla localizzazione • dalla grandezza e dalla forma  della sinapsi • dalla vicinanza e dall’efficacia di altre sinapsi vicine contemporaneamente aUve QuesD segnali afferenD di natura opposta vengono integraD nel neurone postsinapDco mediante un processo di integrazione neuronale: in risposta  a tu?e queste afferenze, la cellula deve scegliere se inviare o no un segnale Il sito di integrazione, il punto in cui si decide se dare origine ad un potenziale d’azione, è rappresentato dal cono di emergenza dell’assone. Questa  regione presenta una soglia molto inferiore rispe?o alle altre parD della cellula, perchè possiede una maggior densità di canali Na+ v‐d. La soglia a  livello del cono è a ‐55 mV, quindi rispe?o allo stato di riposo, basta una depolarizzazione di 10 mV per far parDre il segnale, mentre nel soma la  soglia è più alta, a circa ‐35 mV. Il valore del potenziale a livello del cono d’emergenza rappresenta l’elemento decisionale da cui dipende l’aUvità  integraDva del neurone. Poichè l’integrazione neuronale dipende dalla sommazione dei potenziali sinap4ci che diffondono passivamente verso la zona di innesco, essa è  influenzata da due proprietà passive della membrana: • l’integrazione è influenzata dalla costante di tempo τ, che determina l’andamento temporale del potenziale sinapDco, e quindi  influenza la sommazione temporale, ovvero il processo per il quale una serie di potenziali sinapDci che si succedono nel tempo, nello  stesso sito, vengono sommaD nella cellula postsinapDca. Maggiore è la costante di tempo, maggiore è la probabilità che avvenga la  sommazione temporale, ovvero che due segnali afferen4 consecu4vi, provenien4 da un neurone presinap4co ad azione eccitatoria si  sommino 3

• τ dipende dalla resistenza e dalla capacità di ingresso della membrana: τ = Rin * Cin; rappresenta il tempo impiegato da Vm per  aumentare fino al 63% (1‐ 1/e) del suo valore finale; in presenza di una lunga costante di tempo, un EPSP impiega più tempo ad  esDnguersi, avendo così una maggiore probabilità di sommarsi ad altri successivi • sommazione temporale: 1 unico input, arrivo sulla cellula postsinapDca in rapida successione • l’integrazione è anche influenzata dalla costante di spazio λ, che determina il decremento delle correnD depolarizzanD nel corso della  loro propagazione passiva. Nelle cellule con elevata costante di spazio, i segnali ele?rici riescono a raggiungere la zona di innesco senza  subire un elevato decremento; se la costante di spazio è breve, il segnale può anche decadere prima di raggiungere la zona di innesco.  La costante di spazio influenza il processo di sommazione spaziale, per il quale afferenze provenien4 da diversi neuroni presinap4ci che  agiscono sul neurone postsinap4co in si4 diversi si sommano, sempre che la costante sia abbastanza elevata da perme?ere la  propagazione dei segnali fino al punto di incontro senza eccessivo decremento; quindi, maggiore è la costante di spazio, maggiore è la  probabilità che diverse afferenze, provenienD da zone diverse della cellula (da diverse sinapsi), sommandosi, possano portare a soglia il  cono d’emergenza • λ dipende dalla resistenza di membrana e dalla resistenza assiale (citoplasmaDca) dei prolungamenD: λ = √(rm / ra); è quindi  proporzionale alla radice quadrata del raggio: λ = √[(Rm / ρ) * (a / 2); rappresenta la distanza, a parDre dal punto di origine del  potenziale, alla quale Vm è decaduto al 37% (1/e) del valore iniziale • sommazione spaziale: 2 input separaD, arrivo contemporaneo su cellula postsinapDca Comunque il processo di propagazione non è totalmente passivo, in quanto anche i dendriD possiedono canali Na+, K+ e Ca2+ v‐d deputaD ad  amplificare i deboli EPSP, ma comunque la densità di quesD canali non è sufficiente a determinare una propagazione rigeneraDva del potenziali  d’azione, quindi in sostanza la propagazione rimane eleSrotonica NEI NEURONI DEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE LE SINAPSI HANNO DISPOSIZIONE DIVERSA A SECONDA DELLA LORO FUNZIONE I Dpi più frequenD di sinapsi sono quelli asso‐assonici, asso‐somaGci e asso‐dendriGci (che possono essere localizzate sulle spine o sul tronco del  dendrite) La vicinanza di una sinapsi alla zona di innesco dell’elemento postsinapDco è chiaramente di grande importanza per determinarne il grado di  efficacia LE SINAPSI LOCALIZZATE SUL SOMA CELLULARE, IN GENERALE, SONO INIBITORIE L’azione cortocircuitante delle sinapsi inibitorie (ovvero di generare una corrente uscente ‐ entrata di Cl‐ ‐ che cortocircuita la corrente entrante  proveniente dalle sinapsi eccitatorie) è molto più efficace se si esplica a livello del soma. DifaU, una depolarizzazione nata in un dendrite deve  passare per forza a?raverso il soma, per portarsi verso il segmento iniziale dell’assone. L’aUvità inibitoria a livello del soma può quindi  cortocircuitare la depolarizzazione passante; se l’inibizione avvenisse nelle porzioni distali del dendrite, non circuiterebbe nessuna depolarizzazione,  perchè queste prenderebbero origine più a valle e sarebbero dire?e senza ostacoli verso il cono d’emergenza. InfaU, le principali sinapsi inibitorie  sono localizzate sul corpo cellulare dei neuroni. LE SINAPSI LOCALIZZATE SULLE SPINE DENDRITICHE SONO PER LO PIÚ ECCITATORIE Sui dendriD, le sinapsi possono essere localizzate sulle spine o sul tronco; le spine sono siD di ingresso altamente specializzaD, e contengono  rece?ori glutammatergici sia non‐NMDA che NMDA immersi in una matrice (“densità postsinapDche”); in questa zona di membrana delle spine,  sono presenD protein‐chinasi Ca / calmodulino ‐dipendente II, aUva quando entra Ca2+ a?raverso i canali NMDA. Alla base della spina è presente un  restringimento, che consente di limitare l’aumento della concentrazione intracellualre di Ca2+ alla spina (come se fosse un comparDmento separato) LE SINAPSI LOCALIZZATE SULLE TERMINAZIONI ASSONALI SVOLGONO PER LO PIÚ AZIONI MODULATORIE Le sinapsi asso‐assoniche non influenzano la zona di innesco, ma influenzano indire?amente l’aUvità del neurone postsinap4co andando a regolare  la quanGtà di neurotrasmeMtore che viene liberata dalle terminazioni nervose sulle quali fa sinapsi

In breve, il processo di integrazione è influenzato dalla sommazione spaziale e temporale e dalla localizzazione delle sinapsi

4

14 ‐ La liberazione dei neurotrasmeMtori LA LIBERAZIONE DEI NEUROTRASMETTITORI È REGOLATA DALLA DEPOLARIZZAZIONE DELLE TERMINAZIONI PRESINAPTICHE EsperimenD condoU sulla sinapsi gigante del calamaro hanno permesso di vedere come, in questa sinapsi, la cellula presinapDca dà origine ad un  potenziale d’azione di 110 mV, che determina la liberazione di un neurotrasmeUtore e genera la comparsa di un potenziale sinapDco di grande  ampiezza nella cellula postsinapDca. I potenziali d’azione sono dovuD all’ingresso di Na+ e alla fuoriuscita di K+ a?raverso i rispeUvi canali v‐d.  Diminuendo i potenziali presinapDci, diminuiscono anche quelli postsinapDci; se la diminuzione fa scendere so?o soglia il potenziale presinapDco,  quello postsinapDco scompare del tu?o. Ne consegue che la liberazione del neurotrasmeMtore (valutato dall’ampiezza del potenziale  postsinapDco) appare stre?amente dipendente dall’enDtà della depolarizzazione presinapGca. Altri esperimenD (con blocco dei canali Na+ mediante TTX) dimostrarono che la liberazione di NT non è dipendente dall’ingresso di Na+ nella cellula  presinapDca, bensì è dipendente da qualsiasi depolarizzazione indo?a  (basta che superi il valore soglia, ovvero superi di 40 mV il valore del  potenziale di riposo). La quanGtà di NT liberato dipende dall’ampiezza del potenziale presinapDco: nell’ambito delle depolarizzazioni entro le quali  viene liberaD il NT (40 ‐ 70 mV sopra il livello di riposo), una depolarizzazione di 10 mV determina un aumento di 10 volte della quanDtà di NT  liberato (relazione ingresso‐uscita tra il potenziale presinapDco e quello postsinapDco di Dpo logaritmico). L’ingresso di Na+ è importante solo in  quanto induce depolarizzazione. Mantenendo bloccaD con TTX i canali Na+, si è cercato di vedere se la fuoriuscita di K+ avesse un ruolo importante nella liberazione di NT: bloccando  i canali K+ con TEA e inducendo una depolarizzazione, il neurotrasmeUtore viene comunque liberato normalmente (si può dedurre dal fa?o che i  potenziali postsinapDci rimangono di ampiezza normale); soltanto, la liberazione è protra?a nel tempo, per via della mancata ripolarizzazione. Da  notare che oltre un certo livello di depolarizzazione presinapDca, non si libera ulteriore NT: si raggiunge un plateau. Quindi, per la liberazione di NT non sono necessari nè flussi di Na+ nè di K+: modificazioni di quesD flussi hanno effeU solo sull’ampiezza e sulla  durata dei potenziali pre e postsinapDci. LA LIBERAZIONE DEI NEUROTRASMETTITORI È INNESCATA DALL’INGRESSO DI CALCIO Sono staD riscontraD canali Ca2+ v‐d lungo le membrane assonali; in realtà, la loro maggiore concentrazione si ritrova a livello delle terminazioni  presinapGche. Il Ca2+ ha un notevole gradiente di concentrazione entrante (4 ordini di grandezza differenD tra l’esterno e l’interno). All’interno delle  terminazioni, il Ca2+ può svolgere due funzioni: induce una depolarizzazione e si comporta da messaggero intracellulare, informando le stru?ure  adibite alla liberazione del NT. Tu?o ciò è stato dimostrato tramite esperimenD di blocco di voltaggio in presenza di TTX e TEA (quindi con blocco dei canali v‐d Na+ e K+):  depolarizzazioni graduali determinano la graduale comparsa di una corrente entrante di Ca2+ e la seguente graduale liberazione di NT con rela4vo  potenziale postsinap4co. I canali Ca2+ v‐d restano aperD per tu?a la durata della depolarizzazione, non andando incontro ad inaUvazione. La  dipendenza della liberazione di NT non è lineare all’enDtà di Ca2+ entrante: quando l’ingresso di Ca2+ raddoppia, la liberazione aumenta di 16 volte;  è necessario quindi che 4 Ca2+ si leghino al sensore del calcio. L’ingresso di Ca2+, che comunque è sempre piccolo,a livello delle zone aMve è 10 volte maggiore che nelle altre regioni della terminazione. Questa  localizzazione dei canali fa sì che nel corso del potenziale d’azione la concentrazione di Ca2+ aumenG localmente (anche di mille volte).  Probabilmente il sensore del calcio, responsabile della liberazione rapida dei NT, ha bassa affinità per Ca2+. Quindi sono necessarie concentrazioni  di Ca2+ molto maggiori di quanto non siano necessarie generalmente nel citoplasma,ed è per questo che si cerca di rendere efficiente il processo,  andando ad aumentare la concentrazione solo localmente dove serve: così il NT può essere liberato solo in determinate zone localizzate. Inoltre, non  appena si chiudono i canali Ca2+, le elevate concentrazioni localizzate si perdono subito per diffusione, bloccando così la liberazione di NT non  appena inizia la ripolarizzazione. I canali Ca2+ si aprono più lentamente dei canali Na+, pertanto l’ingresso di Ca2+ compare all’inizio della ripolarizzazione e termina alla fine della  ripolarizzazione stessa. Il tempo necessario per l’apertura dei canali Ca2+ è causa del ritardo sinapGco cara?erisDco della trasmissione sinapDca di  Dpo chimico. La liberazione di NT in risposta al Ca2+ entrante è invece quasi istantanea, perchè il Ca2+ entra nelle vicinanze dei siD di rilascio, e la  diffusione per traU così brevi è rapidissima. La durata del potenziale d’azione è importante nel determinare la quanGtà di Ca2+ che entra nella terminazione (e quindi la quanDtà di NT  liberato): maggiore è la durata, maggiore è il Ca2+ entrante, maggiore la quanDtà di NT liberato. I canali Ca2+ sono presenD nelle cellule nervose, muscolari scheletriche e cardiache ed endocrine; i Dpi di canali sono quelli L, P/Q, N, R, T. • la subunità α1 forma il poro del canale; le sue varie Dpologie sono omologhe alla subunità α1 del canale Na+ v‐d, essendo formate da 4  sequenze ripetute di un dominio idenDco formato da 6 eliche transmembrana (che comprendono il sensore S4 del voltaggio) e da un  traSo P che forma le pareD del poro • le diverse Dpologie di subunità α1 si disDnguono per la differente dipendenza dal voltaggio delle loro proprietà di accesso, per  diversa sensibilità verso agenD farmacologici bloccanD e per le diverse funzioni fisiologiche svolte • altre subunità (α2, β, γ e δ) modificano le proprietà del canale L’aMvazione dei canali di Dpo L, P/Q, N e R richiede una depolarizzazione assai pronunciata (bisogna arrivare a ‐20 o ‐40 mV per aprirli) e sono deU  canali Ca2+ aMvaG da alto voltaggio I canali di Gpo T sono invece deU canali aMvaG da basso voltaggio, che si aprono in risposta a depolarizzazioni relaDvamente modeste, vicino ai  valori di soglia (‐60 / ‐40 mV). Svolgono quindi un’importante funzione di controllo dell’eccitabilità cellulare per potenziali vicini a quello di riposo,  sopra?u?o nelle cellule segna‐passi nervose e del cuore. Nelle cellule nervose, comunque, la liberazione rapida di NT è mediata parDcolarmente dai canali di Dpo P/Q, N e R; i canali di Dpo L rivestono un  ruolo importante nella più lenta liberazione dei neuropep4di dalle cellule nervose e degli ormoni dalle cellule endocrine. DifaU i primi 3 Dpi di canali  sono concentraD a livello delle zone aUve, mentre quelli L sono assenD dalle zone aUve, occupandosi esclusivamente della trasmissione sinap4ca  lenta. I NEUROTRASMETTITORI VENGONO LIBERATI IN PACCHETTI UNITARI DETTI QUANTI Ogni quanto determina la comparsa di un potenziale postsinapDco di ampiezza costante, de?o potenziale sinapGco quantale; queste rispote,  sommandosi, formano il potenziale sinapDco totale. 1

La scoperta dei quanG di NT è seguita all’osservazione di piccoli potenziali postsinapGci spontanei di circa 0,5 mV nella giunzione neuromuscolare,  che decadono ele?rotonicamente con la distanza, chiamaD potenziali di placca in miniatura MEPP. In assenza di sDmolazione, i MEPP si presentano  ad intervalli casuali e la loro frequenza può essere aumentata depolarizzando la terminazione presinapDca: quindi, quesD evenD ele?rici  rappresentano piccole quanGtà di NT liberate in maniera conDnua dalle terminazioni presinapDche. L’ampiezza costante di quesD MEPP, 0,5 mV, è un valore troppo grande per poter rappresentare l’apertura di un solo canale‐rece?ore per ACh (il cui  valore è di 0,3 μV), bensì rappresenta la sommazione della corrente elementare di circa 2000 canali. Sapendo che ogni canale ACh, per essere  aperto, deve legarsi a 2 molecole di ACh (possedendo 2 subunità α), e che parte dell’ACh liberato è perso per idrolisi e diffusione prima di  raggiungere il rece?ore, si può pensare che per produrre un MEPP di 0,5 mV siano necessarie 5000 molecole di ACh. Sono staD eseguiD ulteriori esperimenD sempre sulla giunzione neuromuscolare: ad esempio, sono staD evocaD dei potenziali dopo aver incubato la  giunzione in soluzioni a basse concentrazioni di Ca2+. I risultaD dimostrano che, diminuendo la concentrazione di Ca2+, il potenziale di placca si  riduce drasDcamente (non raggiungendo più i suoi 70 mV); la minima risposta o?enuta è comunque di 0,5 mV, e tuU i potenziali o?enuD sono  mulGpli interi del potenziale sinapGco unitario (con ampiezza e forma sovrapponibili) • le variazioni della concentrazione di Ca2+ non hanno effe?o sulle dimensioni del quanto di NT, ma influenzano piu?osto il numero  medio di quanG che vengono liberaG in risposta all’arrivo di un potenziale d’azione presinapDco • queste osservazioni hanno permesso di capire come la liberazione di NT avvenga aSraverso quanG di dimensioni costanG • in condizioni normali, l’arrivo di un potenziale d’azione e il conseguente aumento di Ca2+ intracellulare, portano alla liberazione di 150  quanD, ciascuno da 0,5 mV, in 1‐2 ms. La frequenza di liberazione è in questo caso aumentata di 100.000 volte CALCOLO DELLA PROBABILITÀ DI LIBERAZIONE DI UN QUANTO DI NEUROTRASMETTITORE La liberazione di un quanto di NT è un evento casuale,la cui probabilità di apertura segue una distribuzione poissoniana La liberazione è un evento di Dpo binomiale o di Bernoulli, perchè l’evento ha solo due alternaDve possibili: può avvenire o no la liberazione; inoltre,  la probabilità che venga liberato un quanto è indipendente dalla probabilità di liberazione di altri quanD p rappresenta la probabilità di successo, mentre q (= 1 ‐ p) rappresenta la probabilità di insuccesso; n è il numero totale di quanD liberabili; il  prodo?o p * n fornisce m, ovvero il numero medio di quanD liberaD per ogni impulso, ed è de?o contenuto o emissione quantale. Per conoscere la distribuzione delle risposte, bisogna espandere, conoscendo i valori di p e q, il seguente binomio: (q + p)n; espandendo il binomio,  sia p che q assumeranno, come esponente, tuU i valori da 0 a n. L’esponente assegnato a p indica il numero di quanD con liberazione  contemporanea: infaU, ogni prodo?o all’interno dell’espansione del binomio calcola la probabilità di liberazione contemporanea di un numero di  quanD che va da 0 a n. Secondo calcoli svolD, m può variare da 300 (sinapsi neuromuscolare) a 1‐4 (gangli simpaDci); anche p è molto variabile, da 0,7 a 0,1; in generale, si  può dire che n indichi la riserva di quanD liberabili o il numero di zone aUve, e che p rappresenD la probabilità che una vescicola si porD ad un sito  aUvo (mobilizzazione) e che un potenziale d’azione scarichi il quanto trasportato alla zona aUva (probabilmente dipende dall’ingresso di Ca2+) I NEUROTRASMETTITORI SONO CUSTODITI E LIBERATI DA VESCICOLE SINAPTICHE I quanD corrispondono a vescicole, in cui sono depositate diverse migliaia di molecole di NT, che viene liberato in seguito a fusione della vescicola  con la membrana plasmaDca a livello di siD specializzaD, le zone aMve. Queste zone, corrispondenD alle pieghe giunzionali della cellula muscolare,  consistono di siD di accumulo delle vescicole su materiale ele?rondenso. Le vescicole che liberano NT sono chiare e piccole (mentre quelle che  liberano neuropepGdi sono grandi a centro scuro, e non si trovano a livello delle zone aUve, partecipando alle aUvità sinapDche lente a cara?ere  modulatorio) La trasmissione quantale è stata dimostrata in tu?e le sinpasi chimiche del SNC (tranne che in alcune sinpasi della reDna); la differenza, però,  rispe?o alla giunzione neuromuscolare sta nel fa?o che, a livello del SNC, ogni potenziale d’azione libera solo 1‐10 quanG (infaU è presente una sola  zona aUva per sinapsi invece di 300) La liberazione di NT da ogni zona aUva ha il cara?ere di un evento tuSo‐o‐nulla, e la probabilità di liberazione dipende dalla quanDtà di Ca2+  entrante nella terminazione Esistono tu?avia delle sostanze impiegate nelle sinapsi chimiche che non hanno bisogno di essere accumulate in vescicole: tra queste sostanze  permeabili  alla membrana ci sono le prostaglandine, i metaboliD dell’acido arachidonico e alcune sostanze gassose come CO o NO. Queste sostanze  possono funzionare sia come messaggeri chimici che come segnali retrogradi che diffondono dal neurone postsinapDco a quello presinapDco,  regolando così la liberazione di NT Un altro meccanismo di trasporto è il trasporto all’esterno tramite proteine trasportatrici (aUvato in caso di grandi concentrazioni intracellulari) Il 90% dell’ACh lascia la cellula in modo lento e conDnuo, ma non ha effe?o sulla trasmissione in quantoè diffuso e non mirato I NEUROTRASMETTITORI VENGONO LIBERATI DALLE VESCICOLE SINAPTICHE PER ESOCITOSI Una volta appurata la trasmissione quantale, si sono cercate prove riguardo l’uDlizzo di vescicole da parte della cellula per la liberazione del NT. Le sinapsi sono state studiate mediante tecniche di crio‐fraSura: congelando il tessuto e ricoprendolo con plaDno, le membrane tendono a  fra?urarsi lungo il piano che offre minor resistenza, che è quello che passa tra i due foglieU lipidici. Vengono così esposte la faccia P citoplasmaDca  della membrana (che conDene le proteine transmembrana, in quanto sono ancorate al citoscheletro) e la faccia E esterna complementare Mediante l'uDlizzo di questa tecnica, sono state fa?e 3 importanD osservazioni: • lungo entrambi i margini delle densità presinapDche sono presenD una o due file di parDcelle intramembranose, riconosciute come  canali Ca2+ v‐d: la loro densità e la loro vicinanza al sito di liberazione delle vescicole sono in accordo con i valori intracellulari di Ca2+  necessari e con il minimo tempo di latenza tra l’apertura dei canali e la liberazione di NT • nel corso dell’aUvità sinapDca, compaiono in queste zone invaginazioni della membrana, ad indicare un processo di esocitosi • queste invaginazioni compaiono solo durante la liberazione di NT (sono quindi transitorie) Altri studi dimostrarono che l’aumento delle invaginazioni (che corrispondono a vescicole appena fuse con la membrana) è dire?amente  proporzionale all’ampiezza della risposta postsinapDca Infine, sono state misurate anche le variazioni della capacità della membrana, in quanto la fusione delle vescicole  con la membrana fa aumentare la  superficie della membrana stessa, e la capacità è proporzionale alla superficie (C ∝ A / D); queste variazioni sono comunque molto piccole

2

I MECCANISMI DI ESOCITOSI COMPORTANO LA FORMAZIONE DI UN PORO DI FUSIONE L’esocitosi avviene tramite formazione di un poro di fusione, che deve a?raversare tu?a la membrana sia delle vescicole che quella plasmaDca;  durante l’esocitosi, il poro si allarga rapidamente, mentre la sua conduSanza aumenta in maniera notevolissima La liberazione del NT è un processo rapidissimo (dura una frazione di ms); quindi le proteine che determinano la fusione delle vescicole devono  essere già presenD intorno al poro di fusione. Il poro di fusione è cosDtuito da due emicanali, uno nella membrana plasmaDca e uno nella  membrana della vescicola, che entrano in conta?o durante il processo di ancoraggio della vescicola; la liberazione rapida di NT inizia prima ancora  che la dilatazione del poro e la fusione della vescicola siano complete. Queste informazioni sono state rilevate a?raverso una parDcolare tecnica di  patch‐clamp, de?a voltmetria, che trasforma il passaggio di NT a?raverso il poro in un passaggio di corrente, misurabile tramite ele?rodo: la  trasformazione del NT in corrente è dovuta all’applicazione di un voltaggio elevato, che ossida i gruppi aminici dei NT che li contengono (es.:  serotonina); gli ele?roni liberaD danno origine ad una corrente proporzionale alla quanDtà di NT liberato LE VESCICOLE SINAPTICHE VENGONO RICICLATE La quanDtà totale di membrana presente nelle vescicole, nelle cisterne e nella membrana plasmaDca resta costante: la membrana delle vescicole  che si è aggiunta a quella plasmaDca viene rapidamente ricuperata e riciclata dando origine a nuove vescicole sinapDche. Il ricupero può avvenire  a?raverso 3 diverse vie: • nella via classica la membrana eccedente viene ricuperata so?o forma di piccole cavità rivesDte da clatrina; questo processo è il più  importante, e necessita di una proteina de?a dinamina • nella via de?a mordi e fuggi le vescicole non si fondono interamente con la membrana, ma il NT è liberato a?raverso un poro di fusione;  questo processo avviene quando il ritmo di liberazione è lento; è la forma più rapida di riciclaggio • nella via dell’endocitosi di massa si formano delle vescicole non rivesDte da clatrina; questa via è uDlizzata quando i ritmi di liberazione  sono elevaDssimi Le vescicole ricuperate per endocitosi si fondono poi con endosomi, che cosDtuiscono comparDmenD interni di membrane. La velocità con cui le  membrane vengono ricuperate sembra dipendere dall’enDtà della sDmolazione dell’esocitosi LA LIBERAZIONE DEI NEUROTRASMETTITORI DALLE VESCICOLE SINAPTICHE RICHIEDE L’INTERVENTO DI NUMEROSE PROTEINE Il processo che porta alla liberazione del neurotrasmeUtori è formato da diverse tappe, ognuna cara?erizzata da diversi gruppi di proteine che  svolgono funzioni diverse: • inizialmente, la vescicola è vincolata in modo che non si muovi casualmente • le vescicole sono poi indirizzate verso le zone aUve • giunte nelle zone aUve, vengono ancorate in quesD siD e vengono modificate per facilitare la loro fusione • infine, in risposta ad un aumenD di Ca2+, le vescicole si fondono con la membrana plasmaDca e liberano il loro contenuto per esocitosi • una volta liberato il NT, si procede al ricupero secondo una delle 3 vie descri?e, fino a depositare le membrane negli endosomi 1. FISSAZIONE E MOBILIZZAZIONE: Le vescicole che non si trovano nelle zone aUve sono fissate al citoscheletro perchè non si muovino casualmente; cosDtuiscono un magazzino di  riserva. Il vincolo al citoscheletro è garanDto da proteine presenD sulla faccia esterna della membrana della vescicola, le sinapsine. Quando la  sinapsina I non è fosforilata, blocca le vescicole sui filamenD di acDna. Quando invece entra Ca2+ nella cellula (in seguito alla depolarizzazione),  questo aUva la protein‐chinasi Ca / calmodulino ‐ dipendente, che fosforila la sinapsina I, determinando il distacco delle vescicole dal  citoscheletro. 2. INDIRIZZAMENTO / DISLOCAZIONE: L’indirizzamento è garanDto dalle proteine Rab3A e Rab3C, che sono proteine G che si legano sulla superficie esterna della membrana della  vescicola; per svolgere la loro funzione, idrolizzano GTP a GDP e P, e sono infine liberate all’esterno durante l’esocitosi 3. ANCORAGGIO ‐ MODIFICAZIONE ‐ FUSIONE ‐ RILASCIO: I processi di ancoraggio e modificazione rendono le vescicole pronte per andare incontro alla fusione con la membrana in risposta all’entrata di Ca2+:  infaU questo è un meccanismo di secrezione regolata, differente dalla conDnua secrezione cos4tu4va, che avviene indipendentemente dalla  presenza di Ca2+ (ribosomi → RER → Golgi → vescicole: esocitosi) In questo periodo di preparazione della vescicola, in a?esa dello sDmolo, bisogna innanzitu?o che avvenga il legame tra la vescicola e il sito di  membrana deputato all’esocitosi: avvengono infaU dei legami tra proteine della membrana della vescicola (le v‐SNARES; quelle del SNC sono le  VAMP o sinaptobrevine) e proteine della membrana plasmaDca bersaglio (le t‐SNARES; quelle del SNC sono la sintaxina e la SNAP‐25). Queste  SNARES vengono degradate dalle tossine tetanica e botulinica (metallo‐proteasi zinco dipendenD). L’interazione tra queste SNARES prevede che le 4  eliche (1 da VAMP, 1 da sintaxina e 2 da SNAP‐25) si leghino tra loro ponendosi parallele alla membrana. Per perme?ere il ricupero delle vescicole, il complesso deve essere disaggregato: intervengono due proteine citoplasmaDche: la NSF e la SNAP (che  non c’entra niente con la SNAP‐25). La SNAP si lega al complesso t‐SNARE/v‐SNARE, NSF è un’ATP‐asi che si lega a SNAP, e uDlizza l’energia derivante  dall’idrolisi per sciogliere il complesso È importante anche un’altra proteina delle membrane delle vescicole: la sinaptotagmina p65; questa possiede due domini C2 che si legano ai  fosfolipidi con elevata calcio‐dipendenza. p65 può quindi cosDtuire un importante sensore della concentrazione di Ca2+ perchè, in seguito  all’entrata di Ca2+, penetra in profondità nel doppio strato lipidico della membrana presinapGca; può funzionare anche da v‐SNARE, in quanto si lega  alla sintaxina. Sono staD proposD due modelli per il funzionamento della sinaptotagmina: • il primo modello prevede che p65 fungerebbe da agente bloccante della fusione (regolatore negaDvo della liberazione di NT, blocca  l’esocitosi); l’ingresso di Ca2+ me?e rapidamente fine al blocco, dando inizio alla liberazione • il secondo modello prevede che p65 agisca da regolatore posiGvo dei meccanismi di liberazione e promuova aUvamente la fusione  delle vescicole • è possibile che esistano isoforme diverse con entrambe le cara?erisDche Inoltre la sinaptotagmina p65 è un rece?ore per la proteina adaSatrice AP‐2 della clatrina, necessaria per il legame di quest’ulDma alla membrana,  che deve avvenire nei processi di endocitosi; il legame della clatrina perme?e poi il distacco della vescicola vellutata grazie all’azione di una GTP‐asi  de?a dinamina, che forma un anello a?orno al collo della vescicola.

3

In sintesi, il Ca2+ è importante in quanto mobilita le vescicole (tramite induzione della fosforilazione delle sinapsine) e perme?e l’apertura del  complesso del poro di fusione (favorendo il legame tra p65 vescicolare e la membrana plasmaDca) LE QUANTITÀ DI NEUROTRASMETTITORE CHE VENGONO LIBERATE DIPENDONO DALLE QUANTITÀ DI CALCIO CHE ENTRANO NELLA CELLULA NEL  CORSO DEL POTENZIALE D’AZIONE L’efficacia delle sinapsi chimiche può essere modificata (plasGcità sinapGca), e le modificazioni possono essere a breve o a lungo termine; queste  modificazioni possono essere controllate da due Dpi di processi: intrinseci al neurone (variazione del potenziale o della frequenza di scarica) o  estrinseci al neurone (afferenze provenienD da altri neuroni) Ora verranno esaminate le modificazioni di breve termine delle quanGtà di neurotrasmeMtori liberaG, dovute sia a modificazioni intrinseche che  estrinseche, ma che infine agiscono tu?e sulla concentrazione intracellulare di Ca2+ LA CONCENTRAZIONE INTRACELLULARE DEL CALCIO LIBERO VIENE REGOLATA DA MECCANISMI CELLULARI INTRINSECI In alcune cellule si ha un ingresso modesto ma costante di Ca2+ anche quando il potenziale è a valori di riposo: l’ingresso è dovuto ai canali Ca2+ v‐d  di Gpo L, che non presentano inaUvazione. L’ingresso di Ca2+ aumenta con la depolarizzazione e si riduce con l’iperpolarizzazione: piccole variazioni  del potenziale possono quindi influenzare anche di molto l’efficacia sinapDca. Un altro meccanismo di modificazione dell’aUvità sinapDca è dovuto ad un’aMvità intensa: nella maggior parte delle cellule nervose, una scarica di  potenziali d’azione ad elevata frequenza può essere seguita da un periodo durante il quale il potenziali d’azione determinano l’insorgenza di  potenziali postsinapGci di ampiezza progressivamente maggiore. • La s4molazione a frequenza elevata del neurone presinap4co è de?a sGmolazione tetanica (500‐1000 potenziali/sec) • L’aumento dell’ampiezza del potenziale postsinap4co che si osserva durante una sDmolazione tetanica è de?o potenziamento • L’aumento che persiste dopo la cessazione della sDmolazione è de?o potenziamento post‐tetanico, e può durare per parecchi minuD Probabilmente il potenziamento post‐tetanico dipende dalla saturazione transitoria dei diversi sistemi deputaD al tamponamento della  concentrazione intracellulare di Ca2+ (su RER e mitocondri); si ha così un temporaneo aumento di Ca2+ residui in seguito ai ripetuD potenziali  d’azione, che vanno a perme?ere una maggiore liberazione del NT, che corrisponde quindi ad un aumento dell’ampiezza del potenziale postsinapDco  (si può dire che i Ca2+ residui garanDscono una certa memoria cellulare) Quindi, i meccanismi intrinseci di regolazione a breve termine della concentrazione intracellulare di Ca2+, e quindi della quanDtà di NT liberato,  sono la variazione del potenziale di membrana della terminazione presinapGca (azione sui canali Ca2+ v‐d) e la sGmolazione ad alta frequenza del  neurone presinapGco (che agisce negaDvamente sui meccanismi di tamponamento di Ca2+) LA CONCENTRAZIONE INTRACELLULARE DEL CALCIO LIBERO VIENE REGOLATA DALLE SINAPSI ASSO‐ASSONICHE PRESENTI NELLE TERMINAZIONI  PRESINAPTICHE Ecco invece i meccanismi estrinseci. Sono principalmente dovuD all’influenza di sinapsi asso‐assoniche che, facendo sinapsi nei pressi della  terminazione presinapDca, controllano seleUvamente l’aUvità di singole diramazioni neuronali: ad esempio, controllano l’ingresso di Ca2+ nelle  terminazioni presinapDche del neurone postsinapDco (rispe?o alla sinapsi asso‐assonica), aumentando o riducendo di conseguenza la liberazione  dei neurotrasmeUtori. Da notare che, se la sinapsi asso‐assonica va a diminuire la concentrazione di Ca2+ nella terminazione presinapDca,  determinando una diminuzione della liberazione di NT e quindi influenzando una terza cellula, svolge un processo de?o inibizione presinapGca, per  disDnguerlo dall’inibizione postsinapGca, che è il classico processo di iperpolarizzazione di una cellula postsinpaDca di modo che la cellula stessa  non possa generare un potenziale d’azione. Allo stesso modo, l’eccitamento del neurone presinapDco tramite la sinapsi asso‐assonica è de?o  facilitazione presinapGca, e determina una maggiore quanDtà di NT liberato, eccitando maggiormente una terza cellula. Per quanto riguarda l’inibizione presinapGca, sono staD individuaD 3 meccanismi diversi: • aUvazione di rece?ori metabotropici che determinano la contemporanea chiusura dei canali Ca2+ e apertura dei canali K+ v‐d • aUvazione di canali Cl‐ regolaG da GABA (cortocircuito di inibizione) • aUvazione di rece?ori metabotropici che determinano l’inibizione direSa del processo di liberazione del NT indipendentemente dalla  presenza di Ca2+ La facilitazione presinpaGca è in genere dovuta ad un aumento dell’ingresso di Ca2+, con meccanismi alternaDvi che possono chiudere canali K+  (prolungando la durata del potenziale d’azione e quindi dell’entrata di Ca2+) o che possono determinare la liberazione di NT indipendentemente  dalla presenza di Ca2+; può avvenire un maggiore ingresso di Ca2+ anche in seguito ad una maggiore depolarizzazione, causata da un’ulteriore  apertura dei canali ionotropici della terminazione presinapDca

La maggior parte delle cellule eccitabili traduce, in ulDma analisi, l’eccitamento ele?rico in altre forme di aUvità. Le cellule eccitabile usano la  propria energia ele?rica per produrre flussi di Ca2+ regolaD da canali Ca2+ v‐d. I Ca2+ fungono da messaggeri intracellulari capaci di aUvare molte  funzioni cellulari. I canali Ca2+ sono l’unico anello di passaggio tra la depolarizzazione e una serie di aUvità non ele?riche

4

15 ‐ I neurotrasmeMtori La trasmissione a livello delle sinapsi chimiche richiede 4 processi, dei quali i primi 2 sono presinapDci e i successivi 2 sono postsinapDci: • la sintesi del neurotrasmeMtore • il suo immagazzinamento e la sua liberazione • l’interazione con il suo receSore • lo smalGmento del neurotrasmeUtore dalla fessura sinapDca PER ENTRARE NEL NOVERO DEI NEUROTRASMETTITORI, I MESSAGGERI CHIMICI DEVONO SODDISFARE QUATTRO CRITERI L’esistenza di sostanze chimiche con funzione di neurotrasmeMtore è stata dimostrata da O?o Loewi, che scoprì che le terminazioni vagali del cuore  di rana liberavano ACh; lavori successivi, come quelli di Dale sulla trasmissione adrenergica e colinergica e quelli di Katz sulle vescicole e sul processo  di esocitosi, hanno fornito numerose informazioni sui neurotrasmeUtori, ma viste le differenD cara?erisDche che sono state riscontrate, spesso  contrastanD, è difficile fornire una definizione rigida e completa. In generale, si potrebbe definire neurotrasmeMtore una sostanza che viene liberata da una cellula nervosa a livello di una sinpasi e che esercita la  propria influenza, in maniera specifica, su una cellula postsinapGca. Quindi i NT differiscono dagli ormoni in quanto il bersaglio è già presente a  livello della sinapsi, e non deve essere raggiunto tramite il torrente circolatorio (ma anche questo non è sempre vero). Sempre in generale, in quanto  non è sempre vero, i neurotrasmeUtori non svolgono processi autocrini (esistono meccanismi di feedback basaD su autorece?ori). Generalmente,  gli effeU dei NT durano poco (da ms a pochi minuD), ma esistono esempi di modificazioni di lungo termine. Sono comunque limitate le sostanze che sono senza dubbio NT; in generale, una sostanza non è un neurotrasmeUtore se non soddisfa i seguenD 4  criteri: • viene sinteGzzata dal neurone • è presente nella terminazione presinapGca e viene liberata in quanDtà sufficiente per esercitare un’aMvità definita su un neurone  postsinapGco o un organo effe?ore • quando venga introdo?a dall’esterno (come un farmaco) in concentrazioni opportune, è in grado di riprodurre esa?amente l’azione del  neurotrasmeUtore liberato per via endogena • esiste un meccanismo specifico per il suo smalGmento dal sito dove esercita la propria aUvità (la fessura sinapDca) Oltre ai neurotrasmeMtori, il sistema nervoso uDlizza anche un’altra classe di sostanze per inviare messaggi: i neuropepGdi • i NT sono contenuD in vescicole piccole e chiare; i NP sono contenuD in vescicole grandi a centro denso. Le prime sono liberate per  esocitosi a livello delle zone aMve so?o dipendenza da Ca2+, le seconde sono liberate per esocitosi semplice • le vescicole grandi possiedono al loro interno anche NT; sono Dpiche dei neuroni catecolaminergici e serotoninergici (granuli  simili si ritrovano nella midollare del surrene) • le vescicole piccole sono Dpiche di neuroni che uDlizzano NT come ACh, glutammina, GABA, glicina  ESISTE UN NUMERO LIMITATO DI NEUROTRASMETTITORI COSTITUITI DA SOSTANZE A BASSO PESO MOLECOLARE Queste sostanze a basso peso molecolare sono 9; tranne l’ATP, sono delle amine, e tranne l’ACh, sono o derivano da aminoacidi. Sono molecole di  basso peso molecolare che portano una carica ele?rica, che si formano da vie biosinteDche brevi, i cui precursori derivano dai principali substraD  carboamidi del metabolismo intermedio. Generalmente, la loro sintesi è catalizzata da enzimi citoplasmaDci. ACETILCOLINA Non è nè deriva da un aminoacido; la sua biosintesi comprende un’unica reazione catalizzata dalla colin‐aceGltransferasi; la colina non è sinteDzzata  dal tessuto nervoso, e deve essere quindi introdo?a con la dieta e trasportata al tessuto nervoso. L’ace4l‐CoA deriva dalle principali vie metaboliche.  Tra i neuroni colinergici si trovano i motoneuroni del midollo spinale (quindi tu?e le giunzioni neuromuscolari), nel SNA, tuU i neuroni pregangliari  e quelli postgangliari parasimpaGci; nel cervello, neuroni del nucleo bassale a proiezione diffusa NEUROTRASMETTITORI COSTITUITI DA AMINE BIOGENE Fanno parte di questo gruppo le catecolamine, la serotonina e l’istamina (anche se è un derivato dell’imidazolo) La famiglia delle catecolamine comprende la dopamina, la norepinefrina e l’epinefrina, e sono tu?e sinteDzzte a parDre dall’aminoacido essenziale  Grosina a?raverso una via biosinteDca comune che comprende 5 enzimi; possiedono tu?e il nucleo del catecolo formato da un anello benzenico  diidrossilato in 3,4 • la sintesi della dopamina è garanDta da 3 dei 5 enzimi: • il primo enzima è la Grosin‐idrossilasi, un’ossidasi che converte la Grosina in L‐DOPA (L‐diidrossi‐fenilalanina); questo è  l’enzima limitante la velocità di sintesi; necessità come cofa?ore una pterina ridoLa Pt‐2H, che si riforma a parDre da pteridina  Pt per opera della pteridin‐reduSasi, catalizzata da NADH • la L‐DOPA è quindi decarbossilata da una decarbossilasi, a o?enere dopamina e CO2 • la dopamina è uDlizzata in 4 vie dopaminergiche: le vie nigrostriatale (importante per il controllo del movimento; alterata nel  Parkinson), mesolimbica e mesocorGcale a livello della substan4a nigra mesencefalica, e la via a partenza dal nucleo arcuato  dell’ipotalamo verso l’ipofisi regolando alcune secrezioni ormonali • la sintesi della norepinefrina conDnua per questa via, uDlizzando dopamina come substrato: • l’enzima dopamina β‐idrossilasi converte la dopamina in norepinefrina; questo enzima ha la parDcolarità di essere associato  alla superficie interna della membrana delle vescicole aminergiche (la norepinefrina è l’unico NT sinteDzzato all’interno di  vescicole) • la norepinefrina è il NT dei neuroni a proiezione diffusa del locus coeruleus e dei neuroni postgangliari simpaGci • la sintesi dell’epinefrina avviene nella midollare del surrene:

1

• la presenza dell’enzima feniletanolamina‐N‐meGl‐transfersasi meDla la norepinefrina in epinefrina (adrenalina); è necessario  SAM (S‐adenosil‐me4onina) come donatore di meDli; essendo un enzima citoplasmaDco, la norepinefrina deve uscire dalle  vescicole. La liberazione di adrenalina comporta una nuova riimmisione nelle vescicole dopo la sintesi • la sintesi dei diversi NT dipende dal corredo enimaGco espresso in ciascuna cellula; la sintesi è anche so?oposta ad un elevato livello di  regolazione: • nei gangli del SNA, la sintesi della norepinefrina è regolata per via transinapGca: una moderata aUvità presinapDca induce  modifiazione dell’aUvità di secondi messaggeri nei neuroni postsinapDci. QuesD secondi messaggeri aumentano la  disponibilità di norepinefrina tramite la fosforilazione, AMP‐c dipendente, della Grosin‐idrossilasi; la fosforilazione aumenta  l’affinità per il cofa?ore pteridinico. Se l’aUvità presinapDca si protrae nel tempo, si osservano modificazioni anche nella sintesi  di Drosin‐idrossilasi (viene sollecitato il suo gene a produrre mRNA); questa induzione della Grosin‐idrossilasi è mediata  sempre dalla protein‐chinasi AMP‐c dipendente, che fosforila una proteina aUvatore della trascrizione, CREB La serotonina (5‐idrossi‐triptamina o 5‐HT) è un indolo che deriva dal triptofano (anch’esso un indolo), conDene quindi un pirrolo (5 atomi con 1 N)  e un benzene condensaD. La sua sintesi necessita di 2 enzimi: la triptofan‐idrossilasi (ossidasi simile alla Drosin‐idrossilasi: 5‐H) e la 5‐idrossi‐ triptofano decarbossilasi (simile alla L‐DOPA decarbossilasi); il primo enzima è quello che controlla la via. La triptofan e la Drosin‐idrossilasi sono  sinteniche, ovvero i loro geni sono in siD vicini dello stesso cromosoma. • neuroni serotoninergici sono localizzaD nei nuclei del rafe della linea mediana del tronco encefalico (→ controllo dell’a?enzione e  funzioni cogniDve complesse); probabilmente la serotonina è implicata nella patogenesi delle forme depressive L’istamina deriva dall’aminoacido isGdina: entrambe queste molecole comprendono un imidazolo, ovvero un anello a 5 atomi con 2 N. Nei  mastociG, l’istamina liberata per via autocrina agisce nei processi infiammatori, nel controllo dei vasi, della muscolatura liscia e delle ghiandole  endocrine; nel SNC, appare concentrata nell’ipotalamo • è sinteDzzata a parDre da isDdina, che viene decarbossilata da un enzima cara?erisDco dei neuroni istaminergici • l’istamina, nel tessuto nervoso, è un precursore di due dipepDdi: la carnosina e l’omocarnosina, forze implicate nella funzione olfaUva NEUROTRASMETTITORI DI NATURA AMINOACIDICA Mentre l’ACh e le amine biogene sono prodo?e soltanto in determinate cellule nervose, gli aminoacidi sono universalmente diffusi. Gli aminoacidi  uDlizzaD come neurotrasmeUtori sono il glutammato e la glicina (non essenziali). Il glutammato è il neurotrasmeUtore più diffuso del SNC; è prodo?o a parDre da α‐chetoglutarato, intermedio de ciclo di Krebs. Dopo la  liberazione, può essere riassorbito (tramite co‐trasporto di NA+ accoppiato a contro‐trasporto di K+) sia dalle cellule nervose che dalla glia; in  quest’ulDmo caso,  viene converDto a glutamina dall’enzima glutamino sintetasi. La glutamina diffonde poi nei neuroni dove è idrolizzata a  glutammato La glicina è sinteDzzata a parDre da serina, è il principale neurotrasmeUtore degli interneuroni inibitori del midollo spinale L’acido γ‐aminobuGrrico GABA viene sinteDzzato a parDre da glutammato (a?raverso l’acido glutammico decarbossilasi); è uDlizzato da  interneuroni inibitori del midollo spinale, del cervelle?o (cell. a canestro e di Purkinje), dell’ippocampo, del bulbo olfaUvo e della reDna (cell.  amacrine) ATP E ADENOSINA L’adenina, la guanina e i loro derivaD sono delle purine; una trasmissione di Dpo purinergico è stata riscontrata nei neuroni simpaGci che si  distribuiscono al do?o deferente, alla vescica, alla muscolatura cardiaca e nei plessi nervosi deputaD all’innervazione della muscolatura liscia del  canale alimentare. È molto importante per la genesi del dolore: i tessuD lesi liberano ATP, che eccita terminazioni nude delle fibre C dei neuroni  sensiDvi. I NEUROTRASMETTITORI A BASSO PESO MOLECOLARE SONO ASSUNTI CON MECCANISMI ATTIVI DALLE VESCICOLE La presenza di aminoacidi è cara?erisDca di tu?e le cellule, quindi quelli con funzione di trasmeUtore avranno bisogno di un meccanismo per essere  disDnD da quelli a funzione metabolica; la cellula riconosce gli aminoacidi neurotrasmeUtori a?raverso comparGmenGzzazione: difaU i NT sono  inclusi nelle vescicole. Le concentrazioni di NT nelle vescicole sono molto elevate, e per raggiungerle sono necessarie V‐ATPasi (vescicolari); l’energia  derivante dall’idrolisi di ATP citoplasmaDco è uDlizzata per creare un gradiente di pH, con ingresso di protoni nella vescicola. A?raverso trasporto  aUvo secondario (1 NT dentro per 2 H+ fuori) vengono poi concentraD gli aminoacidi all’interno della vescicola (processo energia‐dipendente). Sono staD riconosciuD 4 Dpi di trasportatori: uno per ACh, uno per in NT aminici, uno per il glutammato e uno per GABA e glicina La necessità di vescicole per la liberazione di NT fa sì che anche il riciclaggio deve essere rapido; la specificità del trasportatore della sostanza  trasportata è molto elevata, mentre l’affinità per i NT è invece modesta: la Km è bassa per i trasportatori degli aminoacidi (presenD in elevate  concentrazioni nel citoplasma), mentre è invece elevata per il trasportatore delle amine (le cui concentrazioni citoplasmaDche sono minori e  possono cosDtuire un fa?ore limitante) NUMEROSI PEPTIDI NEUROATTIVI POSSONO FUNGERE DA NEUROTRASMETTITORI Il processo di sintesi dei neurotrasmeMtori prevede la sintesi degli enzimi delle varie vie biosinteDche dei NT stessi a livello citoplasmaDco nel corpo  cellulare, quindi la loro distribuzione tramite trasporto assonale lento (come per tu?e le proteine del citosol; il trasporto rapido è esclusiva degli  organi membranosi), infine la loro azione a livello delle terminazioni, dove sinteDzzano il NT. Il processo di sintesi dei pepGdi neuroaMvi prevede invece la sintesi di proteine secretorie nel corpo cellulare. Queste vengono modificate nel loro  percorso a?raverso il RER e l’apparato di Golgi, da dove escono come vescicole secretorie che si trasformano in vescicole grandi a centro denso, che  migrano nelle terminazioni per trasporto assonale rapido (infaU sono organuli membranosi) Esistono almeno 50 pepDdi neuroaUvi, tra cui pepDdi che fuori dal sistema nervoso svolgono funzioni ormonali (angiotensina e gastrina) o  neuroendocrina (ossitocina, vasopressina, somatostaDna, LH, TSH). Quando sono liberaD dire?amente nei siD nei quali sono in grado di produrre i  loro effeU hanno funzione neurotrasmeUtoriale o funzione modulatrice (sostanza P e encefaline sono importanD nella percezione del dolore). I pepGdi neuroaMvi possono essere suddivisi in famiglie, 10, i cui membri hanno sequenze aminoacidiche simili; le principali famiglie sono: oppioidi,  neuroipofisari, tachichinine, secreDne, insuline, somatostaDne, gastrine e altri.

2

Si può osservare che  durante la loro sintesi, diverse di queste sostanze vengono codificate da un unico mRNA che codifica per un lungo pre‐pro‐ ormone de?o anche poliproteina; questo fa?o garanDsce un meccanismo di amplificazione, ovvero la produzione di più copie dello stesso pepDde  a parDre da una sola poliproteina, oppure la produzione di numerosi pepDdi diversi. Questo meccanismo è stato idenDficato per la prima volta nelle  proteine codificate da piccoli DNA virali Il rimaneggiamento delle proteine precursori ha luogo all’interno del sistema principale di membrane del neurone ed in stru?ure vescicolari (difaU  sono presenD delle proteasi specifiche associate a queste membrane; i diversi Dpi di proteasi riconoscono i siD di taglio da parDcolari sequenze  aminoacidiche, ad esempio a?raverso interazioni con aa carichi) • tra i diversi Dpi di proteasi, sono da ricordare le serinproteasi (tripsina e chimotripsina, tagliano il pepDde in corrispondenza di residui  basici), le Gol‐endopepGdasi, le aminopepGdasi (idrolizzano l’N‐terminale) e la carbossipepGdasi B (idrolizza il C‐terminale se basico) Il rimaneggiamento è fondamentale nel determinare il Dpo di pepDde che verrà prodo?o: un esempio è dato dal rimaneggiamento della pro‐ oppiomelanocorGna (POMC), uno dei 3 membri della famiglia degli oppioidi (con encefaline e dinorfina); lo stesso mRNA è presente nei lobi  anteriore e medio dell’ipofisi, ma i pepDdi prodoU sono diversi. InfaU nel lobo anteriore il taglio proteoliDco produce ACTH e β‐LPH, mentre nel  lobo intermedio quesD prodoU sono ulteriormente tagliaD a α‐MSH, γ‐LPH e β‐END; altro esempio è l’insulina, con il taglio del pepDde C. I  meccanismi con cui vengono effe?uaD diversi tagli nei diversi neuroni possono dipendere dalla presenza di proteasi diverse o da glicosilazioni del  pro‐ormone in siD diversi I NEUROTRASMETTITORI DI NATURA PEPTIDICA E QUELLI COSTITUITI DA SOSTANZE DI BASSO PESO MOLECOLARE SONO DIVERSI SOTTO MOLTI  ASPETTI Le differenze tra i neuropepeDdi e i neurotrasmeUtori si riscontrano sopra?u?o nella sede di sintesi, nel Gpo di vescicole, nel meccanismo di  liberazione  per esocitosi: Sede di sintesi: • i neuropepDdi si formano nel corpo cellulare, senza meccanismi di trasporto nelle vescicole • i neurotrasmeUtori si formano nelle terminazioni nervose, con meccanismi di trasporto nelle vescicole Tipo di vescicole: • i pepDdi sono concentraD in vescicole grandi a centro denso originate dalla faccia trans dell’apparato di Golgi; come i granuli secretori  delle cellule non nervose, seguono la via della secrezione cosGtuGva. Le vescicole grandi a centro denso non possiedono le proteine per  limitare i processi di liberazione a livello delle zone aUve e per il ricupero: possono liberarsi in qualsiasi punto e, non essendo  ricuperate, possono essere usate una sola volta. Una volta liberaD i pepDdi, è necessario a?endere che altri giungano dal corpo cellulare • i NT sono concentraD in vescicole piccole e chiare che seguono la via della secrezione regolata. Le vescicole piccole o sinapGche  possiedono proteine che ne limitano la liberazione a livello delle zone aMve e che ne perme?ano il ricupero: per questo la liberazione  rapida può essere protra?a nel tempo Meccanismo di liberazione: • le vescicole grandi vengono liberate da un aumento generalizzato della concentrazione intracellulare di Ca2+ (il che richiede frequenze  di sDmolazioni molto elevate) • le vescicole sinapGche vengono liberate da un aumento localizzato di Ca2+ a livello delle zone aMve I NEUROTRASMETTITORI DI NATURA PEPTIDICA E QUELLI COSTITUITI DA SOSTANZE A BASSO PESO MOLECOLARE POSSONO COESISTERE NELLA  STESSA TERMINAZIONE E VENIR LIBERATI CONTEMPORANEAMENTE Nel caso di una loro contemporanea liberazione, neuropepDdi e neurotrasmeUtori possono esercitare aUvità sinergiche su una stessa cellula  bersaglio. Ad esempio, nelle giunzioni neuromuscolari, il pepDde  correlato al gene della calcitonina CGRP, liberato insieme ad ACh, aUva l’adenilato‐ciclasi, e  l’AMPc perme?e la fosforilazione di proteine che garanDscono un aumento della forza di contrazione sviluppata. Oppure si può avere co‐liberazione di glutammato e dinorfina, dove il primo ha effeU eccitatori e il secondo inibitori: si parla di co‐trasmissione, in  quanto entrambe le sostanze liberate possiedono rece?ori postsinapDci. Invece la co‐liberazione di ATP non rappresenta un esempio di co‐trasmissione, in quanto le cellule postsinpaDche possono non possedere i rece?ori  purinergici, non subendo quindi alcun effe?o da parte di ATP Spesso, per capire se una sostanza liberata ha effeU nella trasmissione, è uDle considerare se venga liberata in quanGtà sufficienG. Per riscontrare la  presenza di messaggeri chimici nelle sinapsi si ricorre quindi a metodi istochimici. Ecco alcune tecniche che vengono uDlizzate: • è possibile rendere fluorescenG le catecolamine e la serotonina se esposte a vapori di formaldeide • tramite l’ibridazione in situ è possibile idenDficare i neuroni nei quali viene espresso il gene di un determinato enzima necessario per la  sintesi di un neurotrasmeUtore: mRNA del neurone è ibridato con DNA complementare marcato. • la localizzazione dei NT può avvenire anche tramite metodi immunocitochimici • aminoacidi, amine e neuropepDdi che possiedono gruppi aminici primari possono essere rintracciaD tramite autoradiografia • per la localizzazione immunoistochimica è necessario disporre di anGcorpi specifici per i NT, legaD a loro volta da un secondo  anDcorpo fluorescente (immunofluorescenza indireSa) • una localizzazione ultrastru?urale si può o?enere con i sistemi perossidasi‐anDperossidasi o uDlizzo di anDcorpi legaD a parDcelle  ele?rondense di polvere d’oro LA TRASMISSIONE SINAPTICA HA TERMINE CON L’ALLONTANAMENTO DEL NEUROTRASMETTITORE DALLA FESSURA SINAPTICA Lo smalDmento del NT dalla fessura sinapDca è necessario per evitare la desensiGzzazione dei receSori dovuta alla conDnua esposizione al NT,  rendendo così la sinapsi refra?aria, esistono 3 meccanismi per lo smalDmento del NT: • la diffusione, che, in parte, perme?e l’allontanamento di tuU i NT • la degradazione enzimaGca, sopra?u?o nelle sinapsi colinergiche: in queste, infaU, i rece?ori sono situaD nella parte sporgente della  membrana muscolare, mentre l’enzima aceDlcolinesterasi è situato all’interno delle pieghe giunzionali. In questo modo, ogni molecola di  ACh venuta in conta?o con un rece?ore cadrà facilmente nella piega: ogni molecola verrà quindi uDlizzata una sola volta, e il processo 

3

scandisce così la successione dei messaggi da trasme?ere. Inoltre si viene a creare un deposito di colina, trasportata con meccanismo ad  alta affinità nelle terminazioni nervose. • quesD 2 meccanismi sono gli unici disponibili per i neuropepDdi; i NT, invece, vengono allontanaD dalla fessura più rapidamente; difaU i  neuropepDdi hanno in genere effeU più lunghi. La rapidità di allontanamento dei NT è dovuta alla presenza di un terzo meccanismo di  inaUvazione, il principale: la riassunzione, che ha il vantaggio di perme?ere un riuDlizzo della molecola di NT. La riassunzione avviene  tramite trasportatori ad alta affinità. QuesD trasportatori possono essere suddivisi in 2 gruppi: • il primo gruppo è formato dai trasportatori del glutammato • la forza motrice è garanDta dal co‐trasporto di 2 Na+ e dal contro‐trasporto di K+ e uno ione in grado di modificare il  pH (OH‐ o HCO3‐) • il secondo gruppo è formato dai trasportatori di GABA, glicina, norepinefrina, serotonina e colina, cara?erizzaD da una  stru?ura che possiede 12 domini transmembrana • la forza motrice è garanDta dal co‐trasporto di 1‐3 Na+ e 1 Cl‐ • le forze motrici sono comunque sufficienD a muoversi contro‐gradiente: l’interno possiede concentrazioni 4 ordini di grandezza più  elevate rispe?o all’esterno • nelle cellule amacrine della reGna la liberazione di NT non avviene a?raverso vescicole, ma a?raverso una liberazione v‐d  (si inverte il  gradiente ele?rochimico di Na+ durante la depolarizzazione) ma non Ca2+ dipendente, dovuta all’inversione della direzione di trasporto  di quesD trasportatori Altri neurotrasmeMtori sono delle sostanze non liberate tramite vescicole, in quanto sono permeabili alla membrana: NO e l’acido arachidonico; il  primo si forma dall’ossidazione dell’arginina, il secondo viene liberato dai fosfolipidi di membrana a?accaD dalla fosfolipasi A2. NO ha funzione di  messaggero retrogrado oppure di messaggero sinapDco con receSore intracellulare; la sua azione è quella di sDmolare la produzione di GMPc  aUvando la guanilil ciclasi

4