Esqui Diaglab

DIAGNÓSTICO LABORATORTIAL DA ESQUISTOSSOMOSE: métodos, vantagens e limitações Herminia Yohko Kanamura Coordenação dos Institutos de Pesquisa (CIP) Superintendência de Controle de Endemias (SUCEN) Universidade de Taubaté (UNITAU)

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA ESQUISTOSSOMOSE MANSÔNICA PARASITOLÓGICO

Pesquisa do parasita

Sedimentação espontânea Ritchie (centrifugação formol-éter) fezes (ovos) Eclosão de miracídios Kato biópsia retal tecidos (ovos, vermes, larvas) biópsia hepática

Fonte:CDC DPDx

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

Esquema do processamento das fezes através da sedimentação espontânea (método de Lutz ou método de Hoffman, Pons & Janer. a) Frasco contendo amostra fecal b) Tomar 2 a 4 gramas de fezes, colocar em frasco e desmanchar em água com um bastão de vidro ou madeira c) Coar a emulsão através de gaze ou de uma tela para dentro de um cálice cônico d) Completar o volume do cálice juntando mais água e misturando bem o conteúdo. Deixar sedimentar por uma hora ou mais; derramar o líquido sobrenadante e substituir por água limpa, ressuspendendo o sedimetno.Repetir a operação até que o sobrenadante fique claro e) Com uma pipeta Pasteur, retirar uma pequena amostra de sedimento do vértice do cálice, colocar sobre uma lâmina, cobrir com lamínula e examinar ao microscópio.

(b) (j)

Suspensão fecal

(g)

(i)

(c) (a)

3mL 7mL

(d)

(e)

Lâminas preparadas com alíquotas de 50µ L do material processado (vide item 2.1.3)

7mL

(f)

(h) 1mL

Esquema do processamento das fezes através do Sistema Coprotest® a) homogeneização do material fecal, que neste estudo foi realizada com o auxílio de agitador de tubo, por 20 segundos; b) transferência de 7mL da suspensão obtida para um tubo de centrífuga de 10mL; c) adição de 1 gota de detergente doméstico; d) adição de 3mL de acetato de etila comercial; e) homogeneização através de agitação manual vigorosa; f) centrifugação durante 2 minutos a 1500 rpm; g) descarte do sobrenadante e ressuspensão do sedimento a 7mL, com água destilada; h) nova centrifugação por 2 minutos a 1500 rpm e descarte do sobrenadante; i) ressuspensão do sedimento a 1mL, com água destilada (procedimento adotado para ajustar o volume da suspensão fecal das diferentes amostras) j) Preparo de lâminas para observação ao microscópio.

(b) (a)

(c)

(d) (e)

Esquema do processamento de amostras pelo método de Kato-Katz a) Frasco contendo fezes: homogeneização do material fecal; b) Transferência de uma porção de fezes para uma folha de papel e tamisação em tela de 105 malhas por polegada quadrada, recolhendo o material tamisado com uma espátula limpa; c) Transferência das fezes tamisadas para um cartão perfurado disposto sobre uma lâmina de vidro, preenchendo todo o espaço (volume fecal correspondente a cerca de 0,045g); d) Retirada do cartão e encobrimento da alíquota de fezes com uma lamínula de celofane previamente embebida em solução glicerinada de verde malaquita; e) Inversão da lâmina sobre uma superfície lisa e compressão das fezes de forma a se obter um esfregaço uniforme com cerca de 22mm de diâmetro.

Ovos de Schistosoma mansoni

Schistosoma mansoni eggs in Kato-Katz preparations are easily identified on the basis of size, shape and presence of the lateral spine.

S. mansoni eggs are large, measuring 114-175 µm by 45-70 µm, have a thin, transparent shell, a prominent lateral spine and contain a miracidium. Occasionally, the lateral spine may be hidden from view. Gentle tapping on the coverslip usually will reorient the egg exposing the spine to view. Viable eggs have the same appearance in faeces and in rectal biopsies.

Appearance of A. lumbricoides, T. trichuria and hookworm eggs in Kato-Katz preparations

A. lumbricoides, fertile and infertile eggs with a T. trichuria egg in the middle.

Normal and decorticated A. lumbricoides egg in a Kato-Katz preparation. Decorticated eggs may be slightly smaller than normal eggs due to the absence of the mamillated layer.

A. lumbricoides and T. trichuria eggs. Characteristic features of both are preserved in this preparation

A. lumbricoides and hookworm egg.

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

Ocorrência de variações nos resultados do exame parasitológico (Kato-Katz) em 6 pacientes com infecções baixas (menos de 100 ovos por grama de fezes) e teste sorológico positivo. Amostras coletadas (A) e lâminas examinadas (L) A1 A2 A3 A4 A5 A6

Paciente

1 2 3 4 5 6

L1

L2

L3

L1

L2

L3

L1

L2

L3

L1

L2

L3

L1

L2

L3

L1

L2

L3

-

-

-

+

+

+

+ +

-

-

+ -

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

-

+ -

+ +

-

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

 IMUNOLÓGICO Detecção de anticorpos Reação intradérmica (hipers.imediata) heterólogos - KLH Antigeno homólogos Soro - diferentes técnicas sorológicas

Reação de imunofluorescência ELISA Western blot

ovo cercária verme

Extrato Total Frações purificadas DNA recombinantes

Detecção de antígenos circulantes no SORO anticorpos monoclonais e policlonais na URINA

CCA CAA P30-32

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

ALGUMAS APLICAÇÕES IMPORTANTES PARA OS MÉTODOS SOROLÓGICOS -Diferenciar infecção aguda da crônica -Verificar cura parasitológica -Diferenciar infecção ativa da passada -Inquéritos epidemiológicos -Programa de Vigilância Epidemiológica

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

Dinâmica de resposta imune humoral na esquistossomose

Reação de imunofluorescência para detecção de anticorpos IgM (RIF-IgM) Antígeno: cortes de vermes fixados em solução de Rossman e incluídos em parafina

Conjugado fluorescente: anticorpos anti-IgM marcados com isotiocianato de fluoresceína

Imunofluorescência Indireta Adição do soro desconhecido

Lâmina com Ag. fixado

Incubação e lavagem

Visualização ao microscópio

Adição do conjugado anti-humano, incubar e lavar

Reação de imunofluorescência indireta (RIF-IgM) com soro de paciente com forma aguda da esquistossomose

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

Reação de imunofluorescência indireta (RIF-IgG) com soro de paciente com forma aguda da esquistossomose

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

Reação de imunofluorescência indireta (RIF-IgG) com soro de paciente com forma crônica da esquistossomose

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

RIF-IgM (cortes de vermes parafinados) PARA VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA E CONTROLE DA ESQUISTOSSOMOSE EM ÁREA DE BAIXA TRANSMISSÃO

Prevalência parasitológica (Kato-Katz) e sorológica (RIF-IgM) nas populações estudadas das diferentes regiões (dados do primeiro inquérito) 60

Kato-Katz RIF-IgM

% positividade

50

40

30

20

10

0

VRibeira

GSPaulo

Campinas

regiões

VParaíba-1

VParaíba-2

Número e porcentagem (%) de casos para cada combinação de resultados do teste sorológico (RIF-IgM), entre os indivíduos que submeteram amostras de sangue nos cinco inquéritos realizados, nas diferentes regiões estudadas. Resultado da RIF-IgM em cada inquérito

Número ( %) de casos p/ cada combinação de resultados da RIF-IgM, em cada uma das regiões estudadas Vale do Grande Vale do Paraíba Ribeira São Paulo Campinas localidade-1 localidade-2

1°

2°

3°

4°

5°

N P

N P

N P

N P

N P

65 (21,8%) 121(40,5%)

151(93,2%) 6 (3,7%)

69 (95,8%) 0

41 (56,9%) 14 (19,4%)

54 (79,4%) 6 (8,8%)

N N N N

P N N N

P P N N

P P P N

P P P P

6 (2,0%) 32 (10,7%) 3 (1,0%) 22 (7,4%)

2 (1,2%) 0 0 0

0 0 0 0

2 (2,8%) 1 (1,4%) 0 0

6 (8,8%) 0 1 (1,5%) 0

P P P P

N P P P

N N P P

N N N P

N N N N

1 (0,3%) 0 0 2 (0,7%)

1 (0,6%) 0 0 1 (0,6%)

0 0 0 0

1 (1,4%) 0 0 1 (1,4%)

0 0 0 0

P P P P P P P

P N N N P P P

P P P N N N N

N P N N P N P

P P P P P P N

15 (5,0%) 11 (3,7%) 6 (2,0%) 4 (1,3%) 2 (0,7%) 1 (0,3%) 0

0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 2 (2,8%) 0 0

0 0 0 0 4 (5,6%) 0 0

0 0 0 0 0 0 1 (1,5%)

N N N N N N N N

N N N P P P P P

P P P N P P N N

N N P N P N P N

P N N P N P P N

4 2 1 1

0 0 0 0 1 (0,6%) 0 0 0

0 0 0 0 0 1 (1,4%) 0 0

0 0 0 0 0 1 (1,4%) 3 (4,2%) 4 (5,6%)

0 0 0 0 0 0 0 0

162 (100%)

72 (100%)

72 (100%)

68 (100%)

TOTAL

(1,3%) (0,7%) (0,3%) (0,3%) 0 0 0 0

299 (100%)

Número e porcentagem (%) de casos para cada combinação de resultados do teste sorológico (RIF-IgM), entre os indivíduos que submeteram amostras de sangue nos cinco inquéritos realizados, nas diferentes regiões estudadas. Resultado da RIF-IgM em cada inquérito 1° 2° 3° 4° 5°

Número ( %) decasos p/ cada combinação deresultados da RIF-IgM, em cada uma das regiões estudadas Vale do Grande Vale do Paraíba Ribeira São Paulo Campinas localidade-1 localidade-2

N P

N P

N P

N P

N P

65 (21,8%) 121(40,5%)

151(93,2%) 6 (3,7%)

69 (95,8%) 0

41 (56,9%) 14 (19,4%)

54 (79,4%) 6 (8,8%)

N N N N

P N N N

P P N N

P P P N

P P P P

6 (2,0%) 32 (10,7%) 3 (1,0%) 22 (7,4%)

2 (1,2%) 0 0 0

0 0 0 0

2 (2,8%) 1 (1,4%) 0 0

6 (8,8%) 0 1 (1,5%) 0

299 (100%)

162 (100%)

72 (100%)

72 (100%)

68 (100%)

TOTAL

Resultado da RIF- IgM em cada inquérito 1°

2°

3°

4°

5°

Número ( %) de casos p/ cada combinação de resultados da RIF-IgM, em cada uma das regiões estudadas Vale do Grande Vale do Paraíba localidade-1 localidade-2 Ribeira São Paulo Campinas

P P P P

N P P P

N N P P

N N N P

N N N N

1 (0,3%) 0 0 2 (0,7%)

1 (0,6%) 0 0 1 (0,6%)

0 0 0 0

1 (1,4%) 0 0 1 (1,4%)

0 0 0 0

P P P P P P P

P N N N P P P

P P P N N N N

N P N N P N P

P P P P P P N

15 (5,0%) 11 (3,7%) 6 (2,0%) 4 (1,3%) 2 (0,7%) 1 (0,3%) 0

0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 2 (2,8%) 0 0

0 0 0 0 4 (5,6%) 0 0

0 0 0 0 0 0 1 (1,5%)

Resultadoda RIF-IgM em cadainquérito 1°

2°

3°

4°

5°

N N N N N N N N

N N N P P P P P

P P P N P P N N

N N P N P N P N

P N N P N P P N

T O T AL

N úmero ( % ) de casos p/cadacombinação de resultados da RIF-IgM , em cadauma das regiõesestudadas V ale do G rande V ale doParaíba Ribeira São Paulo Campinas localidade-1 localidade-2

4 2 1 1

(1,3% ) (0,7% ) (0,3% ) (0,3% ) 0 0 0 0

0 0 0 0 1 (0,6% ) 0 0 0

0 0 0 0 0 1 (1,4% ) 0 0

299 (100% ) 162 (100% ) 72 (100% )

0 0 0 0 0 1 (1,4% ) 3 (4,2% ) 4 (5,6% )

0 0 0 0 0 0 0 0

72 (100% )

68 (100% )

Positividade (%) por método parasitológico (Kato-Katz) e sorológico (RIF-IgM), de acordo com a condição “tratamento anterior para esquistossomose” (população de Itariri, Vale do Ribeira)

Tratamento anterior Sim

Total 122

Kato-Katz Total Positivos No. % 112 10 8,9

Total 122

RIF-IgM Positivos No. % 104 85,2

(4,6 - 16,2)

Não

506

401

34

8,5 (6,0 - 11,8)

(77,4 - 90,8)

505

250

49,5 ( 45,1 - 53,9)

ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) Substrato incolor

Substrato colorido

AVALIAÇÃO DE MÉTODO IMUNOENZIMÁTICO PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS IgM CONTRA ANTÍGENOS CIRCULANTES DE S. mansoni

Análise comparativa dos resultados obtidos pelo ELISA-IgM em relação aos outros testes E L I S AI g M

Outros Métodos RIFI-IgM

Positivo Negativo Positivo

193

5

T otal 198

0,89

N=591

RIFI-IgG

Negativo

25

368

393

Positivo

177

19

196

Negativo

41

354

395

Positivo

200

105

305

(0,740-0,820)

0,59

N=591

Kato-Katz

(0,845-0,925)

0,78

N=591

E L I S A- I g G

Indice Kappa

Negativo

18

268

286

Positivo

8

3

11

(0,525-0,650)

0,04

N=481 Negativo

171

299

470

(0,038-0,042)

Análise dos dados preliminares com relação ao Projeto de Pesquisa em desenvolvimento no município de Holambra “Implantação de método imunoenzimático para detecção de anticorpos IgM contra antígenos circulantes do S. mansoni (ELISA-IgM), e avaliação para incorporação no programa de controle da esquistossomose em área de baixa endemicidade”

• Total de amostras séricas encaminhadas ao Instituto Adolfo Lutz = 93 • Total de amostras já submetidas a IgM-RIF = 73 • Total de amostras já submetidas a IgM-ELISA = 71 • Positividade sorológica pela IgM-RIF = 35,6% (26/73) • Casos positivos pelo Kato Katz: - 7 casos – com 9 lâminas (3 amostras x 3 lâminas) - 3 casos – com 3 lâminas (1 amostra x 3 lâminas) - 2 casos – com 2 lâminas (1 amostra x 2 lâminas)

Comparação de resultados entre IgM-RIF e IgM-ELISA Dados preliminares de Holambra IgM -ELISA +

-

IgM-RIF +

21

5

26

-

8

37

45

29

42

71

Resultados Preliminares - Estudo em Holambra Resultados das lâminas de Kato-Katz RIFI-IgM

ELISA-IgM

01

2+

02

Resultado

A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

POS

+

N

N

N

N

N

N

1

N

N

X

3+

+

N

N

N

N

N

N

N

N

N

03

3+

+

N

N

N

N

N

N

N

N

N

04

3+

+

N

N

N

N

N

N

3

2

4

05

1+

+

N

N

N

N

N

N

N

N

N

06

2~3+

+

N

N

N

N

N

N

N

N

N

3+

+

N

N

1

N

N

1

N

N

N

X

08

2~3+

+

2

4

15

2

2

14

N

N

16

X

09

2~3+

+

N

N

N

07

X

NEG

Resultados Preliminares - Estudo em Holambra continuação

Resultados das lâminas de Kato-Katz RIFI-IgM

ELISA-IgM

10

3~4+

+

11

2+

+

3

4

12

1+

neg

N

13

1+

neg

14

3+

15

Resultado

C1

C2

C3

POS

5

1

5

19

X

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

1

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

-

N

N

N

N

1

1

N

N

A1

A2

A3

B1

B2

B3

N

N

N

11

2

1

N

N

N

N

N

N

+

N

N

1~2

neg

N

16

1+

neg

17

3+

+

18

2~3

+

X

X

NEG

Freqüência de anticorpos anti-T.canis e anti-S.mansoni, de acordo com a faixa etária. anti-T.canis 70

anti-S.mansoni

Positividade (%)

60

50

40

30

20

10

0

1-5

6-10

11-15

16-20

21-30

31-40

41-50

51-60

>60

faixa etária (anos)

Peruíbe - SP