Damaris (2)

XIV VERANO DE LA INV ESTIGA CIÓN CIENT ÍFICA (2009)

Dámaris Aleyda Rodríguez Jiménez Unidad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Nayarit, Asesor Dra. Elizabeth Morales Salinas Coordinadora de transmisión transplacentaria investigación Departamento de La Patología Universidad Nacional Autónoma de México una vaca infectada a su progenie

La Neosporosis bovina ha adquirido gran importancia a nivel mundial, siendo actualmente una de las principales causas de aborto en diversos países.

C i c

de ha sido identificada como la principal ruta de infección, aunque se ha observado que algunas crías infectadas de manera congénita, pueden sobrevivir, nacer y desarrollarse normalmente, perpetuando de esta manera la enfermedad en el hato a través de la transmisión vertical del parasito. (Anderson et al., 1995; Dubey y Lindsay, 1996; Schares et al., 1999). En ocasiones se produce la muerte fetal (Barr y col., 1994; Pare et al., 1996), pero los mecanismos que conllevan a esta no se han esclarecido en su totalidad. Algunos posibles factores que influyen en la transmisión vertical y sus consecuencias son el momento de la infección primaria, el momento de recrudecimiento de la infección persistente en hospederos infectados, los efectos de la gestación en la inmunidad materna, susceptibilidad del huésped, diversidad de la cepa del parásito y la fase de desarrollo fetal en la que se adquiere lainfección (Conrad et al., 1993; Barr et al. 1994, Williams et al., 2000; Buxton et al., 2002; Innes et al., 2002). El perro y el coyote han sido reconocidos como huéspedes definitivos de N. caninum los cuales eliminan ooquistes en las heces. En este caso, la transmisión al ganado será por la ingestión de ooquistes esporulados presentes en pastos o agua contaminados. (McAllister et al., 1998; Lindsay et al., 1999). Los perros se pueden infectar por la ingestión de placentas contaminadas con quistes del parásito. (Dijkstra et al., 2001).

Hay tres fases infecciosas reconocidas del parásito: taquizoitos, bradizoitos presentes en los quistes y esporozoitos. Los taquizoitos y bradizoitos se encuentran en los hospederos intermedios y definitivos, mientras que los esporozoitos solamente están presentes en los ooquistes que se excretan en la las heces de los huéspedes definitivos (perros y coyotes). (McAllister et al., 1998; Gondim et al., 2004). Los taquizoitos son de forma lunar, miden aproximadamente 2 x 6 µm y tienen un núcleo central, pero carecen de gránulos de amilopectina (a diferencia de los bradizoitos).Se dividen rápidamente y pueden infectar a muchos tipos de células incluyendo células neuronales, endoteliales vasculares, miocitos, hepatocitos, células renales, macrófagos alveolares, y trofoblásticas (Barr y col., 1991a, b; Dubey et al., 2002). Los taquizoitos de Neospora caninum tienen una membrana citoplasmática con 3 capas, 22 microtúbulos, 2 anillos apicales, 1 conoide, 1 anillo polar, de 1 a 3 mitocondrias, hasta 150 micronemas, de 8 a 18 rhoptrias, un aparato de Golgi, retículo endoplásmico rugoso y liso un núcleo y un nucleolo. Los quistes con bradizoitos pueden variar considerablemente en tamaño, dependiendo del número de bradizoitos que contengan. En perros se han encontrado quistes de hasta 107 µm de diámetro y con una pared de 4µm de grosor. (Dubey et al., 2002).

MANEJO DE TÉCNICAS PARA EL

DIAGNÓSTICO DE NEOSPOROSIS EN

En fetos de bovino congénitamente Los ooquistes de N. caninum se excretan en forma no esporulada en ANIMALES DOMÉSTICOS infectados, los quistes encontrados en las heces de los hospederos cerebro y medula espinal son raramente mayores a 50 µm de definitivos. Subsecuentemente se lleva diámetro. (Dubey et al., 1989; Barr et a cabo la esporulación, de modo que cada ooquiste contiene dos al., 1991). esporoquistes, cada uno de los cuales Los bradizoitos son delgados de 6.5 x cuenta con cuatro esporozoitos et al., 1999). 1.5 μm (Dubey et al., 2004) y (Lindsay contienen gránulos de amilopectina. Experimentalmente, se han infectado El núcleo es terminal o subterminal y perros alimentándolos con tejidos de los micronemas se arreglan con ganado bovino, búfalo de agua y Quiste de N. caninum frecuencia en forma perpendicular con venado cola blanca infectados de Elizabeth Morales Salinas manera natural con N. caninum respecto al citoplasma. Entre los bradizoitos existen estructuras (Dijkstra et al., 2001; Rodrigues et al., tubulares vesiculares. Los bradizoitos 2004; Gondim et al., 2005), los cuales y los taquizoitos se pueden identificar han arrojado ooquistes en las heces. en unos pocos de manera definitiva mediante Sin embargo solo Neosporosis inmunohistoquimica, utilizando un perros infectados de manera natural se han bovina observado ooquistes en las anticuerpo específico (McAllisterLaet al., estadio de la gestación, aunque Neosporosis es una heces fecales. (Basso et al., 2001a; 1996). generalmente sucede entre el enfermedad parasitaria causada Slapeta et al., 2002). quinto y sexto mes, pudiendo por Neospora caninum, un presentarse más de una vez en la parasito protozoario del phylum vida reproductiva de la vaca Apicomplexa que fue aislado e (Morales et al, 1997; Dyer et al, identificado por primera vez en (A) Un et grupo de taquizoitos 2000; Morales al, 2001; Dubey, Estados Unidos en 1988 por en el cerebro de un feto. 2003). Nótese taquizoitos en división Dubey et al. Sin embargo, en Noruega en el año de 1984 ya había sido notificado por Bjerkas et al un parasito protozoario causante de miositis y encefalitis en seis cachorros de perros de la raza bóxer, los cuales resultaron serológicamente negativos a Toxoplasma gondii. Hasta 1988 la enfermedad había sido diagnosticada como toxoplasmosis debido a las similitudes estructurales y biológicas entre N. caninum y Toxoplasma gondii. Esta enfermedad se caracteriza por provocar aborto en cualquier

(flechas).

(B)

Formas

de

El primer aislamiento delextracelular parásito crecimiento (flechas), de tejidos fetalesraramente de bovinovistas. se (C) Un numeroso grupo de realizó por Conrand et al en intracelulares Estadostaquizoitos Unidos en 1991.

(flecha). (D-G) Quistes (flechas), con diferentes La Neosporosis bovina es grosores de la pared actualmente reconocida como encontrados en el cerebro de una defetos las principales causas de abortados. (H) Un quiste aborto con y pérdidas económicas pared gruesa (flecha)en en el tejido neuronal la médula el ganado lechero. de Se ha espinal de un ternero de tres informado en Europa, Australia, de edad. HE. X 600. nueva días Zelanda, algunos países

asiáticos como Japón, Tailandia y Corea, y en varios países del continente americano, incluyendo México (Morales et al, 1997; Dyer et al, 2000; Morales et al, 2001; Dubey, 2003).

l o b i o l óLesiones características gen los fetos bovinos i asociadas a la infección por N. caninumen los ctejidos teñidos con H y oE. (A) Necrosis focal e

infiltración de células mononucleares en el dcerebro de un feto. (B) infiltración eGliosis, perivascular de células mononucleares, y Nneovascularización en eun ternero de tres días edad (C) ode epimiocarditis difusa en sel corazón de un feto pabortado. (D) Hepatitis por la ocaracterizada infiltración de células r mononucleares del aparénquima, sobre todo en las zonas periportales.

c a n i n u m

En México, la Neosporosis fue detectada en 1997, en un feto abortado de la raza Holstein, macho, de cinco meses de gestación, que presento lesiones histológicas características, confirmándose presencia del parasito a través de inmunohistoquimica (IHQ) (Morales et al, 1997). Por otro lado, en otros estudios,se encontró evidencia serológica contra la Neosporosis en ganado lechero en ciertas regiones de México (Morales et al, 2001; García et al, 2002). Existen estudios serológicos realizados de México, donde se encontró seroprevalencia de 72% en hatos con tasas de abortos entre 13% y 30% yde 36% en hatos con tasas de abortos hasta de 12% anual, por lo que se consideró que la enfermedad podría estar ampliamente difundida en los principales hatos lecheros mexicanos (Morales et al, 2001).

Diagnóstico de Neosporosis Diagnóstico de la infección postnatal por N. caninum Las vacas que han abortado no muestran manifestaciones clínicas y éstas solo se han observado en terneros menores de dos meses de edad. Los terneros infectados por N. caninum pueden nacer con menos peso del esperado, ser incapaces de levantarse y presentar manifestaciones nerviosas (casos revisados en Dubey y Lindsay 1996). Las extremidades (con más frecuencia las posteriores) pueden estar flexionadas o hiperextendidas y el examen neurológico puede revelar ataxia, disminución del reflejo patelar y pérdida de la consciencia propioceptiva. También pueden presentar exoftalmia y la apariencia asimétrica de los ojos. Sin embargo, debe destacarse que estos casos son muy infrecuentes y que la gran mayoría de los terneros infectados congénitamente nacen clínicamente normales. Diagnóstico del aborto causado por N. Caninum La historia clínica y los datos epidemiológicos pueden ser orientativos, pero el diagnóstico definitivo de la neosporosis precisa del examen del feto en un laboratorio de diagnóstico equipado adecuadamente. Las muestras diagnósticas incluyen el feto abortado que debe ser enviado con la placenta y suero de la madre. Si esto no es posible, entonces deben enviarse muestras de cerebro, corazón e hígado fetales. Las muestras de suero pueden obtenerse del fluido serosanguinolento acumulado en las cavidades corporales fetales. El diagnóstico laboratorial se realiza mediante el examen histopatológico del feto, técnicas de PCR y serología de la madre y del feto.

Histopatológico: La patología es un procedimiento diagnostico importante, normalmente se encuentran lesiones en varios tejidos (Dubey et al; 2006), a continuación se destacan las lesiones más importantes: Fetos y terneros muertos: se pueden encontrar lesiones degenerativas, inflamatorias y necróticas en todos los tejidos, pero son más comunes en SNC, corazón e hígado (Barr et al., 1990, 1991a; Anderson et al., 1991; Nietfeld et al., 1992; Wouda et al., 1997b; Dubey et al., 1998a, 1990b; Hattel et al., 1998; Helman et al., 1998; Boger and Hattel, 2003; Dubey et al., 2006).

Las lesiones graves son raras, pero se pueden presentar en corazón, musculo esquelético y cerebro. Se pueden presentar focos blancos en musculo esquelético y corazón los que corresponden a necrosis. También puede ocurrir hidrocefalia y presentarse focos de necrosis en cerebro (Dubey et al; 1998). A menudo los fetos están autolíticos y momificados. Hay áreas focales de decoloración en los cotiledones placentarios (Fioretti et al; 2003). Hay lesiones microscópicas presentes en varios órganos, pero son más comunes en SNC, hígado y corazón.Las lesiones en cerebro y medula espinal consisten en encefalomielitis no supurativa, caracterizada por infiltración leucocitaria en el parénquima y las meninges desde multifocal a difusa, sin embargo la lesión característica de Neosporosis en SNC consiste en focos de infiltración de células mononucleares alrededor de un área central de necrosis. La proliferación de la glía (microgliosis) es más común en fetos abortados en el tercer trimestre (Dubey et al; 2006). Ocasionalmente hay calcificación (Boulton et al; 1995). Las lesiones en miocardio pueden ser severas, pero a menudo son enmascaradas por la autolisis, comúnmente consisten en infiltración focal de células mononucleares con necrosis mínima. Las lesiones hepáticas consisten en infiltración periportal de células mononucleares y focos variables de necrosis asociados a trombos de fibrina en los sinusoides (Barr et al., 1990; Wouda et al., 1997b). Terneros neonatos: La lesión predominante es encefalomielitis. (O’Toole and Jeffrey, 1987; Parish et al., 1987; Dubey et al., 1989, 1992; Barr et al., 1991b, 1993; Dubey and Lindsay, 1996; Anderson et al., 1997; Magnino et al., 1999; Peters et al., 2001a; De Meerschman et al., 2005;).

Diagnóstico de Neosporosis

Diagnostico de Neosporosis

Técnicas serológicas Identificación de N. caninum en tejidos teñidos con hematoxilina y eosina: Hay varias técnicas disponibles para la detección de anticuerpos frente a N. caninum en el ganado. Todas estas técnicas se basan en antígenos de El numero de parásitos que se encuentran en tejidos de bovino es taquizoitos. importante señalar la están detección anticuerposes pordifícil IFI usualmente Es bajo, aun cuando losque fetos biendepreservados (Inmunofluorescencia indirecta) por ELISA pueden dar resultados falsos observar taquizoitos en tejidos o teñidos con H&E. La respuesta inflamatoria negativos en caso de sueros provenientes de fetos menores de 5 meses de iniciada por el parasito matando a las células huéspedes, también puede matar al parasito, por lo tanto es muy raro encontrar taquizoitos bien gestación. conservados en fetos muertos (Dubey and Lindsay, 1996; Dubey et al., 2006). Las técnicas -que detectan anticuerpos específicos frenteo En los tejidosserológicas teñidos con H&E los taquizoitos son séricos generalmente redondos aunN.poco caninumse utilizan habitualmente para demostrar la infección en los alargados, es importante observar el núcleo vesicular y diferenciarlos bovinos adultos yhuésped en el rebaño, permiten conocer si et la neosporosis es causa de las células en degeneración (Dubey al., 2006). En tejidos del fallo reproductivo comparando la prevalencia de la infección en las bovinos, los quistes miden de 5-50µm de diámetro y el grosor de la vacas pared que abortan y en aquellas que no lo hacen. Sin embargo, aunque un varia. Los bradizoitos dentro del quiste cuentan con núcleos terminales que resultado serológico positivo ayuda de a identificar un animal adulto infectado, se colorean de rojo con la reacción acido periódico de Schiff (Dubey et al; un resultado negativo no descarta definitivamente la infección porque los 2002). anticuerpos séricos frente a N. caninum pueden fluctuar con la edad y el estado de gestación. Inmunohistoquimica

La IFI fue la primera técnica serológica aplicada a la neosporosis y frecuentemente ha sido es utilizada como prueba referencia. Las pruebas La inmunohistoquímica más sensible que lade tinción convencional de H y ELISA, muestras de sueroeno leche, carecenydetodos la subjetividad la E parausando demostrar N. caninum las lesiones, los tejidosdeque IFI y al poder automatizarse permiten un análisis más rápido de las muestras presenten lesiones deben ser examinados por medio de inmunohistoquímica y(Boger las hace muy útiles el caso de estudios monoclonales epidemiológicos a gran escala. y Hattel, 2003).enTanto los anticuerpos como policlonales Para mejorarcontra la especificidad dese laspueden pruebasutilizar ELISA(Cole tradicionales, basadas eny específicos N. caninum et al., 1994; Dubey elLindsay, uso de1989) antígeno completo o extractos solubles de taquizoítos, se han y ambos son comercialmente disponibles. Los anticuerpos utilizado taquizoítos enteros, complejos estimulantes la inmunidad policlonales derivados de conejos parecen ser másdefiables que los (iscoms), antígenos recombinantes y antígenos purificados pordiagnóstico. afinidad. Por anticuerpos monoclonales derivados del ratón, para fines de La otra parte, se han desarrollado varias pruebas ELISA de avidez que permiten reactividad cruzada de anticuerpos de N. caninumfrente a otros protozoarios distinguir entre las fases aguda la Neosporosis. del phylum Apicomplexa, comoylocrónica son T.degondii y Sarcocystis spp puede ser mínima sin embargo, estos protozoarios raramente se asociandirecta, con el cuyas aborto También se han normalizado las pruebas de aglutinación en el ganado (Anderson etyal.,no 1991; Canadáanticuerpos et al., 2002; secundarios Van Maanen ventajas son bovino su simplicidad requerir et al., 2004). específicos. El diagnóstico de la neosporosis bovina se ha facilitado con la Usualmente, utilizando inmunohistoquimica puedenla detección distinguir de los comercialización de diferentes pruebas ELISA no que se permiten grupos de taquizoitos dealos quistes, a menos que se utilicen anticuerpos anticuerpos séricos frente N. caninum. específicos para bradizoitos (McAllister et al., 1996b). Los tejidos con alta Actualmente, utilizados en laslapruebas serológicas de concentraciónlos deantígenos peroxidasa, en especial placenta, deben serproceden tratados con taquizoítos obtenidos en cultivos celulares de aislados bovinos y caninos de tripsina o pepsina. N. caninum. Por inmunohistoquímica N. caninum es, en la mayoría de los casos, identificado en el cerebro, el corazón y el hígado y rara vez en otros órganos, incluyendo la placenta. En el estudio de Wouda et al. (1997b), N. caninum se encontró en el cerebro de 71 (89%), en el corazón de 11 (14%) y en el hígado de 21 (26%) de 80 fetos.

Diagnóstico serológico Mediante inmunoblot se han identificado antígenos inmunodominantes de 17, Las 29/30, pruebas 37 y 46serológicas kDa y proteínas tienen conlaunventaja peso molecular de que de pueden 25, 65ser y 116 aplicadas kDa en antemortem el suero de bovinos y proporcionan infectados información naturalmente sobre(Baszler la etapaetdeal.la1996, infección. Atkinson En los et terneros al. 2000a,o 2000b, ganadoSöndgen vacuno adulto, et al. 2001, pocosÁlvarez-García días despuésetdeal.la2002). infección Sin primaria embargo,aparecen el inmunoblot anticuerpos no se IgM ha utilizado e IgG específicos. como un método Los niveles corriente de IgM de específico diagnóstico,alcanzan sino como su técnica pico después confirmatoria de 2 de semanas otras pruebas de la infección serológicas y disminuyen (Atkinson et por al. 2000a, debajo2000b, de losSöndgen límites de et al. detección 2001). Así, (prueba el reconocimiento de aglutinación de Neospora, tres o cuatro NAT) antígenos a las 4 semanas inmunodominantes de la infección de 17, (MAREZ 29/30, De 37 et y 46 al., kDa 1999), porlos el niveles suero de IgG vacas aumentan infectadas durante naturalmente las primerassesemanas ha considerado hasta 3-6 meses como después confirmación de la de infección la infección experimental (Schares primaria et al. (Conrad 1998).etAdemás, al., 1993b;cuando Dubey et el al., inmunoblot 1996; Uggla se utiliza et al., para 1998,analizar MAREZfluidos De et fetales, al., 1999; seSchares ha comprobado et al., 1999c, que 2000; incrementa Williams significativamente et al., 2000;laTrees sensibilidad et al. de2002). la serología Después fetal (Söndgen de que los et taquizoitos al. 2001). o los ooquistes inducen la infección primaria, un aumento inicial en la IgG1 específica es seguido por un ligero aumento de IgG2 (De MAREZ Validación las pruebas serológicas et al., 1999, de Williams et al., 2000; Andrianarivo et al., 2001). Es frecuente que las pruebas serológicas mencionadas se utilicen tanto para No se abortos observaron niveles de elevados de IgA terneros infectados evaluar sospechosos neosporosis comoenpara identificar bovinos experimentalmente con ooquistes (MAREZ De et al., 1999). Los niveles de infectados de diferente edad y sexo. Sin embargo, se han realizado pocos anticuerpos persistir durante las la vida, pero atécnicas veces estudios queespecíficos comparen pueden y evalúen críticamente diferentes fluctúan y están por debajo de los límites de detección de las pruebas serológicas utilizadas en el diagnóstico de la neosporosis bovina. Dos serológicas. la primera en infección por N.decaninum la avidez aspectos queDespués deberíande considerarse la validación estas pruebas sonde la anticuerpos específicos con el de tiempo (Bjorkman et al., 1999, 2005) selección apropiada deaumenta la población referencia y las estrategias de ymuestreo. esto puede proporcionar en cierta medida, información sobre la duración de una infección primaria. Se han desarrollado varias técnicas para diferenciar Pararespuestas establecerbajas la población de referencia se han considerado las de IgG (indicativo de una reciente infeccióndiferentes primaria, aspectos como la de presencia dede anticuerpos precalostrales el aproximadamente 2 meses duración) específicos de las respuestas altas deenIgG ternero recién nacido (como indicador de la infección de la madre asumiendo (indicativo de una infección crónica). Por lo general, las respuestas altas de la gran de la transmisión congénita), la utilización simultánea IgG se eficacia han observado en bovinos infectados naturalmente por másdededos 6 pruebas(Bjorkman serológicas para confirmar infección uso de ladelIFIganado como meses et al., 1999, 2003). la Después de yla el vacunación prueba de referencia. Aunque, uso de la la interpretación IFI como prueba referencia con vacunas inactivadas de N. el caninum, de ladeinformación parece no ser suficientemente seguro en un estudio de validación porque serológica podría ser difícil. Una vacuna consistente en taquizoitos derivados todavía node hay consenso en los puntos deestá cortecomercialmente respecto a la serología de cultivo células muertas y adyuvante disponiblede y adultos y fetos entre los distintos laboratorios de diagnóstico y porque la en IFI es utilizada en varios países (por ejemplo, en los EE.UU. (Estill, 2004), no puede reacciones positivas poco claras o poco En Costa Ricaresolver ( Romero et al., 2004) y en Nueva Zelanda (Heuerespecíficas. et al., 2003)). estosvacuna casos, de la carácter utilización inmunoblot -más específicopermitiría un Otra no del comercial que también consiste en taquizoitos diagnóstico inequívoco (Söndgen et al. 2001). derivados de cultivos celulares y adyuvante ha sido recientemente utilizada La manera sensibilidad y la especificidad de una prueba diagnóstica variar de experimental para la vacunación de ganado bovinopueden en Argentina por diversos comoLos la edad del animal o la fase con de la infección. (Moore et factores, al., 2005). animales inoculados estas vacunas desarrollaron respuestas de anticuerpos similares a los de ganado naturalmente infectado con N. caninum (Choromanski y Block, 2000, Andrianarivo et al., 2001; Moore et al., 2005).

Diagnostico de Neosporosis

Aunque la Neosporosis bovina se ha reconocido en México, los estudios seroepidemiológicos a la fecha han sido escasos. La detección de anticuerpos anti-Neospora caninum específicos en el suero de bovinos ha sido muy útil y satisfactoria para el diagnostico de la infección y ha demostrado ser adecuada para investigaciones seroepidemiológicas (Wouda et al, 1992; Pare et al, 1994, 1996; Schares et al, 1997; Morales et al, 2001).

Se ha reconocido que la técnica de ELISA es consistente, objetiva, rápida y precisa (Bjorkman et al, 1994; Williams, 1999); proporciona alta sensibilidad y especificidad, siendo más practica respecto al número de muestras que se pueden analizar en comparación con la IFI (Pare et al, 1995; Barr et al, 1995 Dubey et al, 1996). Paré et al, en 1995 notificaron, 89% de sensibilidad y 97% de especificidad en el caso de ELISA. Otros laboratorios describieron sensibilidad y especificidad de 92%-98% y 87%-100%, respectivamente. No se han descrito reacciones cruzadas con otros protozoarios, incluyendo Toxoplasma gondii. Serología maternal y fetal La detección de anticuerpos frente a N. caninum en el suero o líquidos fetales mediante IFI (Conrad et al. 1993, Paré et al. 1995, Otter et al. 1997, Slotved et al. 1999) o ELISA (Paré et al. 1995, Slotved et al. 1999) indica infección fetal porque no existe transmisión transplacentaria de anticuerpos de la madre al feto. Sin embargo, varios trabajos han demostrado la baja sensibilidad de la serología fetal (Barr et al. 1995, Reichel y Drake 1996, Wouda et al. 1997a, Gottstein et al. 1998, Slotved et al. 1999), a pesar que puede ser mejorada utilizando el inmunoblot (Söndgen et al. 2001), porque un resultado negativo no asegura la inexistencia de infección por N. caninum. Esto puede ser debido a la falta de inmunocompetencia fetal (fetos de menos de cuatro meses), al transcurso de un intervalo de tiempo corto entre la infección y la muerte fetal o a la autolisis fetal que puede degradar las inmunoglobulinas y de esta manera disminuir la cantidad de anticuerpos específicos. Por otra parte, la detección de anticuerpos de Neospora en los fluidos fetales no demuestra que la infección haya causado la muerte fetal, porque la mayoría de terneros con anticuerpos precalostrales son clínicamente normales. Por ello, la serología fetal no puede usarse como única prueba diagnóstica para confirmar el aborto por N. caninum en fetos aislados. La presencia de anticuerpos específicos en el suero de vacas abortadas es solo indicativa de la exposición a Neospora y, por ello, un resultado negativo no puede excluir a la neosporosis como causa del aborto.

Las vacas que abortan fetos infectados por N. caninum generalmente tienen títulos de anticuerpos elevados (Otter et al. 1997, Wouda et al. 1998b), pero los anticuerpos pueden fluctuar y disminuir rápidamente después del aborto (Conrad et al. 1993, Schares et al. 1999b). Sin embargo, dos trabajos muestran que la cinética de la respuesta de anticuerpos frente a Neospora durante la gestación puede ser una herramienta muy útil para predecir el aborto o la transmisión vertical de N. caninum a la descendencia en vacas infectadas crónicamente (Paré et al. 1997, Quintanilla-Gozalo et al. 2000). La determinación del título de anticuerpos específicos en una sola muestra recogida de cada una de las vacas del rebaño en el momento de la inseminación y/o diagnóstico de gestación podría ayudar a predecir hasta 6168% de futuros posibles abortos (Quintanilla-Gozalo et al. 2000). Diagnóstico por reacción en cadena de polimerasa (PCR) La PCR desempeña un papel importante en el diagnóstico de la infección por N. caninum. En la mayoría de las PCR se utilizan los protocolos para detectar ADN de N. caninum en los tejidos de fetos abortados o de otros huéspedes intermediarios. Sin embargo, también otras muestras, como de líquido amniótico (Ho et al., 1997), líquido cefalorraquídeo (Peters et al., 2000; Buxton et al., 2001; Schatzberg et al., 2003), y heces de perro o coyote contaminados con ooquistes (Basso et al., 2001; Hill et al., 2001; Slapeta et al., 2002b; McGarry et al., 2003; Gondim et al., 2004a; Schares et al., 2005) han sido examinados por PCR para identificar la presencia de ADN de N. caninum. Los primeros intentos para la detección de DNA de N. caninum en sangre de bovinos infectados naturalmente fallaron (Guy et al., 2001). Recientemente, se informó que es posible identificar a N. caninum en el ADN de la sangre de bovinos infectados crónicamente (Ferré et al., 2005; Okeoma et al., 2004). Recientemente, se han desarrollado protocolos de PCR no sólo para detectar sino también cuantificar ADN de N. caninum en muestras. La PCR cuantitativa se ha convertido en uno de los métodos clave para el estudio de la patogénesis de Neosporosis en la especie bovina y evaluar la actividad de las vacunas y fármacos terapéuticos o profilácticos (Cannas et al., 2003a, 2003b; Collantes-Fernandez et al., 2004, 2005; Esposito et al., 2005). La PCR cuantitativa se utilizó también en estudios epidemiológicos para estimar la carga de parásito N. caninum en el semen de toros seropositivos infectados experimentalmente (Ortega-Mora et al. 2003; Caetano da Silva et al., 2004; Ferré et al., 2005). Las ventajas de esta técnica son su elevada especificidad y sensibilidad y la capacidad de amplificar pequeñas cantidades de ADN de N. caninum en una gran variedad de tejidos. Además, la PCR funciona bien cuando los fetos se encuentran autolíticos, lo que es frecuente en el caso del aborto por Neospora.

TECNICA Histopatología

VENTAJAS Se pueden observar las lesiones características en los fetos, como son: Necrosis focal e infiltración de células mononucleares en el cerebro, gliosis, infiltración perivascular de células mononucleares, y neovascularización, epimiocarditis linfoplasmocitaria multifocal o difusa y hepatitis caracterizada por la infiltración de células mononucleares del parénquima, sobre todo en las zonas periportales.

INCONVENIENTES A menudo los fetos están autolíticos y momificados. Con la tinción de rutina (H y E) es difícil observar taquizoitos al microscopio. Se requiere que el patólogo revise varios cortes histológicos con el propósito de incrementar la posibilidad de observar parásito.

Inmunohistoquimica

La inmunohistoquímica es más sensible que la tinción Hay problemas con los fetos autolíticos. convencional de H y E para demostrar N. caninum en los tejidos, principalmente en SNC, corazón e hígado.

Inmunofluorescencia indirecta

Se utiliza como técnica de referencia y es útil para el Es tardada y subjetiva, ya que no puede resolver reacciones diagnostico de Neosporosis principalmente en estudios positivas poco claras o poco específicas. experimentales.

ELISA

Se ha reconocido que la técnica de ELISA es consistente, objetiva, rápida y precisa, proporciona alta Puede proporcionar resultados falsos negativos en caso de sensibilidad y especificidad, siendo más practica fetos de menos de 5 meses de edad. respecto al número de muestras que se pueden analizar Hay una mínima reactividad cruzada en relación a otros en comparación con la Inmunofluorescencia indirecta. protozoarios del filum Apicomplexa.

PCR

Elevada especificidad y sensibilidad y la capacidad de amplificar pequeñas cantidades de ADN de N. caninum en una gran variedad de tejidos. Además, la PCR funciona bien cuando los fetos se encuentran autolíticos, lo que es frecuente en el caso del aborto por Neospora.

Se requiere analizar numerosas muestras en casos clínicos para incrementar la sensibilidad. La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro)

Barr, B.C., Conrad, P.A., Dubey, J.P., Anderson, M.L. Neospora-like encephalomyelitis in a calf: Pathology,

TABLA DE LAS PRINCIPALES TECNICAS DIAGNOSTICAS: VENTAJAS ultraestructure, EandINCONVENIENTES. immunoreactivity.1991 J. Vet. Diagn. Invest., 3: 39-46.

Conclusiones:

El diagnostico clínico de Neosporosis es difícil, debido a que el único signo que presenta el ganado bovino es el aborto y no se encuentran lesiones macroscópicas en los fetos. Se pueden utilizar herramientas diagnosticas como la histopatología, ya que los fetos presentan lesiones características principalmente en SNC, corazón e hígado. Para obtener resultados más confiables se puede utilizar la inmunohistoquimica; la reactividad cruzada de anticuerpos de N. caninumfrente a otros protozoarios del phylum Apicomplexa como lo son T. gondii y Sarcocystis spp es mínima y son raramente asociados con el aborto en el ganado bovino. También se pueden aplicar técnicas serológicas que proporcionan la ventaja de que se pueden emplear antemortem y brindan información sobre la etapa de la infección. Se ha reconocido que la técnica de ELISA es consistente, objetiva, rápida y precisa; así mismo el reciente uso de PCR desempeña un papel muy importante como herramienta diagnostica, ya que no solo se detecta el ADN de N. caninum sino que también se puede cuantificar. Aunque la Neosporosis bovina se ha reconocido en México, los estudios seroepidemiológicos a la fecha han sido escasos. La detección de anticuerpos anti-Neospora caninum específicos en el suero de bovinos ha sido muy útil y satisfactoria para el diagnostico de la infección. Referencias: ÁLVAREZ-GARCÍA, G.; PEREIRA-BUENO, J.; GÓMEZ-BAUTISTA, M.; ORTEGA-MORA, L.M., 2002. Pattern of recognition of Neospora caninum tachyzoite antigens by naturally infected pregnant cattle and aborted foetuses. Vet. Parasitol., 107: 15-27. Anderson, M. L., P. C. Blanchard, B. C. Barr, J. P. Dubey, R. L. Hoffman, and P. A. Conrad. 1991. Neosporalike protozoan infection as a major cause of abortion in California dairy cattle. J. Am. Vet. Med. Assoc. 198:241– 244. Anderson, M. L., C. W. Palmer, M. C. Thurmond, J. P. Picanso, P. C. Blanchard, R. E. Breitmeyer, A. W. Layton, M. McAllister, B. Daft, H. Kinde, D. H. Read, J. P. Dubey, P. A. Conrad, and B. C. Barr. 1995. Evaluation of abortions in cattle attributable to neosporosis in selected dairy herds in California. J. Am. Vet. Med. Assoc. 207:1206–1210. Anderson, M. L., J. P. Reynolds, J. D. Rowe, K. W. Sverlow, A. E. Packham, B. C. Barr, and P. A. Conrad. 1997. Evidence of vertical transmission of 356 DUBEY ET AL. CLIN. MICROBIOL. REV. Downloaded from cmr.asm.org at UNAM INST DE INVEST BIOMEDICAS on June 29, 2009 Neospora sp. infection in dairy cattle. J. Am. Vet. Med. Assoc. 210:1169–1172. Andrianarivo, A. G., Barr, B. C., Anderson, M. L., Rowe, J. D., Packham, A. E., Sverlow, K.W. and Conrad, P. A. (2001). Immune responses in pregnant cattle and bovine fetuses following experimental infection with Neospora caninum. Parasitology Research, 87, 817^825. ATKINSON, R.; HARPER, P.A.W.; REICHEL, M.P.; ELLIS, J.T., 2000a. Progress in the serodiagnosis of Neospora caninum infections in cattle. Parasitol. Today, 16: 110-114. ATKINSON, R.A.; COOK R, W.; REDDACLIFF, L.A.; ROTHWELL, J.; BROADY, K.W.; HARPER, P.; ELLIS, J.T., 2000b. Seroprevalence of Neospora caninum infection following an abortion outbreak in a dairy cattle herd. Aust. Vet. J., 78: 262-266.

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Las Anderson, pruebasM.L. serológicas como sonfetallaencephalitis IFI y ELISA utilizadas parawith el diagnostico de fetos abortados pueden ser subjetivas, ya que un resultado Barr, B.C., and Blanchard, P.C.: lo Bovine and myocarditis associated Cole, R. A., D. S. Lindsay, B. L. Blagburn, D. C. Sorjonen, and J. P. Dubey. 1995. Vertical transmission of protozoal infection. 1990 Vet. Pathol., 27: 354-361. negativo podría no ser definitivo al suponer falta de inmunocompetencia fetal, intervalo tiempo corto entre infección y aborto o la autolisis y Neospora caninumde in dogs. J. Parasitol. 81:208–211. degradación de Dubey, Ig, deJ.P. igual manera enNeospora-like el caso de unainfections muestra de suero Barr, B.C., Anderson, M.L., and Conrad, P.A.: protozoal associated with bovineun abortions. 1991 Vet. Pathol., 28: 110-116. resultado negativo.

de una vaca infectada, podría ocurrir la fluctuación de anticuerpos y arrojar

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