Conspect 2005

Предисловие Настоящий курс был прочитан на кафедре молекулярной биологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова в 2005 году профессором Сергеем Владимировичем Разиным. Данный документ представляет собой переведённый в электронный вид конспект этих лекций, записанный мною; поэтому стиль изложения краток и предполагает некоторое знакомство читателя с предметом курса. Помимо этого, существенным и неотъемлемым приложением (или источником?) данного документа являются презентации, сделанные лично Сергеем Владимировичем и благосклонно предоставленные нам, студентам, для подготовки к экзамену. Поскольку презентации, также как и весь курс, являются предметом Закона об авторском праве, распространение данных документов среди лиц, не являющихся студентами или аспирантами кафедры, а также сотрудниками Лаборатории структурно-функциональной организации хромосом ИБГ РАН, является нарушением закона. Приношу искреннюю благодарность Сергею Владимировичу за поистине фундаментальный и интересный курс, а также Ксении Александровне Астаниной за любезно предоставленный мне конспект девятой лекции. Светлана Лебедева 26 августа 2005 Москва

Index 2-мерный э/ф........................................................42 30 нм фибрилла......................................................7 ARS............................................................................41 Bromo-домен...........................................................15 CAF-1.........................................................................48 CHIP...........................................................................10 Chromo-домен.........................................................15 CMV...........................................................................40 Cot-ДНК...................................................................27 CpG-островки..........................................................12 CTCF..........................................................................34 CTCF-белок.............................................................30 DHFR-локус............................................................43 enhancer-blocking assay.......................................28 facilitators...............................................................18 fiber autoradiography...........................................47 footprinting.................................................................. in vivo.....................................................................21 FRAP..........................................................................37 FRET..........................................................................38 GFP.............................................................................37 Hispanic......................................................................... deletion..................................................................19 HMG.............................................................................6 IDC............................................................................39 LCR......................................................................20, 22 LIS.............................................................................26 MAR и инсуляторы...............................................32 MBD-домен..............................................................15 NAP-1/2....................................................................48 nuclear halo..............................................................24 NURF.........................................................................19 ORC............................................................................41

PML................................................................................. тельца...................................................................40 Position Effect Variegation..................................14 PRE.............................................................................16 RCAF..........................................................................49 replication timing....................................................48 S/MARs....................................................................25 SCS и SCS’..............................................................29 suHw...........................................................................31 SWI/SNF...................................................................7 switching...................................................................19 TAF II 250..............................................................17 TAF II 55.................................................................17 TFIID........................................................................17 Timing репликации...............................................19 topoisomerase............................................................8 Travers......................................................................10 UAS............................................................................17 α-глобиновый домен...........................................35 β-глобиновый домен................................................ ori...........................................................................44 Активный хроматин...............................................8 временные зоны репликации...........................46 гиперчувствительный сайт..................................7 Гипотеза гистонового кода.................................6 Гистоновые варианты............................................5 ДНК-полимеразы.................................................40 импринтинг............................................................34 Импринтинг.............................................................13 Инициация................................................................... этапы....................................................................45 инсулятор................................................................28 Ме-К4........................................................................14

Ме-К9........................................................................14 МеСР-1.......................................................................14 МеСР-2......................................................................14 метод определения полярности лидирующих цепей.........................................47 Неактивный хроматин..........................................11 нуклеосомы................................................................. во время репликации......................................48

Петли ДНК.............................................................24 репликация.............................................................40 Система инактивации генов Polycomb............15 ТАТА.........................................................................17 фокусы репликации............................................36 хромосомные территории.................................39 энхансеры................................................................18

Оглавление Предисловие........................................................................................................................................................ ........1 Index............................................................................................................................................................ ...................1 Оглавление............................................................................................................................................. .....................2 Список сокращений............................................................................................................................ .......................2 Лекция 1..................................................................................................................................................................... ....3 Лекция 2........................................................................................................................................................... .............7 Транскрипция через нуклеосомы............................................................................................. .......................11 Лекция 3.............................................................................................................................................................. .........11 Лекция 4.................................................................................................................................................... ..................16 Лекция 5.................................................................................................................................................................... ..24 Существуют ли структурные домены в хроматине, соответствующие функциональным доменам генома?............................................................................................................................ .....................24 Лекция 6.................................................................................................................................................................... ..28 Инсуляторы................................................................................................................................................... .........28 Лекция 7.................................................................................................................................................................... ..35 Компартментализация клеточного ядра................................................................................................... ....36 Лекция 8.................................................................................................................................................................... ..40 Репликация ДНК у высших эукариот............................................................................................................40 Инициация репликации................................................................................................................................. ....40 Этапы инициации репликации у эвкариот................................................................................................ ..45 Лекция 9.................................................................................................................................................................... ..46 Репликоны и кластеры репликонов..............................................................................................................47 Нуклеосомы во время репликации............................................................................................................ ....48 Приложение............................................................................................................................................ ..................49 Программа курса (2005 год).............................................................................................................. ..............49 Рекомендованная литература................................................................................................................. ...........51

Список сокращений HS LS FACS OBR TP ELFH RIP BND SnuPE HPFH DMR PHD SIR

high salt low salt fluorescence activated cell sorter ori of bidirectional replication transition point early labelled fragment hybridization replication initiation point mapping benzoylated naphtoylated DEAE (for enrichment nascent DNA) single nucleotide primer extention assay hereditary persistence of fetal hemoglobin differentially methylated region 2 Zn++ binding domains silence information regulators

ARBP SATB1 HMG HSS,HS DHFR CHO Br-dU

attachment region binding protein special ATrich sequece binding protein 1 high mobility group hypersensitive site dihydrofolatereductase chinese hamster ovary cells bromdeoxyuridine

мои: TF(s) nu dsDNA NM Y Ас me ме Р s/u кл. э/ф в/д а.к.

transcription factor(s) nucleosome(s) double-stranded DNA nuclear matrix yeast (S.cerevisiae) acetylation methylation метилирование phosphorylation subunit клетка(и) электрофорез взаимодействие(я) аминокислота(ы), аминокислотный(ая,ые)

Лекция 1 Основные особенности организации генома эукариот: 1. ДНК – длинная 1-2м (диаметр ядра 10-20 мкм) Генетический материал должен быть компактно упакован в ядре, но упаковка должна давать возможность быстрого вовлечения в транскрипцию определённых частей генома, и не может быть единообразной. В ядре, окрашенном DAPI, видны гетерохроматиновые светящиеся «глыбки» и эухроматин («неоднородность»). Схема упаковки ДНК в хроматин:  2 нм dsDNA 1x (точно известны) 

10 нм



30 нм фибрилла (дискуссионна: o соленоид – предложен из принципа наименьшей энергии и виден в микроскоп o зигзаг – более вероятен) 6 nu на виток 40х петли ДНК на ядерном матриксе 50 витков на петлю



nu

6-7x

(точно известны)

NM



700х всё, что дальше, вплоть до метафазной хромосомы, - неизвестно.

гистоны Коровые гистоны +Н1

Белки, способствующие компактизации негистоновые белки Н2А, Н2В – Lys-rich HMG-белки Н3; Н4 – Arg-rich белки, участвующие в образовании неактивных

хроматиновых доменов (НР1, SIR и RAD белки Y)

Гистоны.

Модификации гистонов по NH2-группе: Ас, ме и др. Ser – по ОН-группе – Р гистонов. Все коровые гистоны имеют L-образную форму, основу которой составляет длинная αспираль. N-концевой домен не уложен специфически, С-концевой домен может быть немного структурирован в виде маленьких α-спиралей. N-концевой «хвост» подвергается модификациям. 2 димера Н2А∙Н2В 4 тетрамера Н3∙Н4

nu: цилиндр 6х11 нм

линкер

позиция Н1 до сих пор неясна (скорее всего, он скрепляет концы DNA, входящей и выходящей из nu) Соотношение Н1:nu не стехиометрическое, не 1:1, и оно может меняться в разных участках хроматина. ДНК на nu не защищена от действия стафилококковой и других нуклеаз. Wallings(?) и двое других учёных экстрагировали хроматин в растворе с низкой ионной силой (0,2 мМ EDTA) и увидели nu в электронный микроскоп. Тот же самое (т. е. набор фрагментов, кратных 200 п.н.) дают результаты расщепления стафилококковой нуклеазой.

эл. микроскоп

обработка нуклеазой

Nu регулярны и могут быть закристаллизованы. Сейчас их структура известна с разрешением 1.6-1.8 Å. Молекула ДНК находится на поверхности nu частицы и доступна для действия стафилококковой нуклеазы в высокой концентрации и ДНКазы I. «Парочки» Н2А∙Н2В находятся: одна – в том месте, где ДНК входит, а другая – где ДНК выходит из нуклеосомы (они связаны с частичным разворачиванием нуклеосомы при транскрипции Pol II).Н3∙Н4 тетрамер стабилен и находится в центре. 2 витка ДНК лежат параллельно, и между ними (за счёт бороздок) есть участки, и «хвосты» двух гистонов (Н3 и Н2В) проходят между ними. Молекула ДНК и бороздки ориентированы одинаковым образом, и между ними есть пространство.

Н3∙Н4

DNA

Н2А∙Н2В

В растворе можно получить димеры и тетрамеры гистонов, и даже целый кор, но в жизни всё собирается с помощью энзиматического механизма.

0.5 М NaCl может удалить Н1, но nu остаётся стабильной. При определённой концентрации соли можно получить кор или отдельные гистоны. Ас гистонов. Пионером был Тёрнер (GBR). На каждом гистоне есть несколько мишеней для Ас. Изоформ (т.е. возможных комбинаций, вариантов Ас-я отдельной nu) больше, чем число nu в ядре (2∙109/200 ≈ 107). Поли(ADP)-рибозилирование. Известно давно, но функции неизвестны. Как правило, присутствует в повреждённой ДНК и, возможно, является сигналом репарации. Также оно несколько разрыхляет хроматин и, возможно, этим способствует репарации. В основном «хвосты» Н1 + 1 сайт в Н2В. В глобулах возможны нековалентные взаимодействия поли(ADP)-рибозы с белками, в т.ч. в гистоновых вариантах.

 Гистоны сначала рассматривали как носителей генетической информации, затем – как регуляторов генной экспрессии. Гистоновые варианты. Регуляторы должны быть гетерогенны. 1970-е гг. – работы Бойлера (но вариантов получилось много больше, т.к. был протеолиз). Затем думали, что всего 5 вариантов + Н5 (аналог Н1 у птиц), а гистоны считались только структурными белками. В настоящее время : 1) функциональная роль гистоновых модификаций, 2) гистоновые варианты, которых очень много, и они кодируются разными генами. Н1:

Н5 в эритроцитах птиц Н11-Н18 в мышиных клетках и в лягушке

Н2А:

macro H2A (64% гомологии, неактивный хроматин) H2A.Bbd (42% гомологии, активный хроматин) H2A.Z (активный хроматин)

Н3:

CENP-A (центромерный белок) Н3.3 (активный хроматин)

Являются ли эти варианты функциональными? Это решается нокаутом: 1-2 нокаута не влияют, а 4 гена нокаутировать – уже плохие последствия. Н1 вариант в ооците Xenopus в кластере 5SRNA: в позднем ооците заменяется на другой. Н3.3 – связывание определённых ионов на поверхности nu – привлечение систем ремоделинга. Н2А.macro и H2A.Bbd имеют мало гомологии с Н2А. Если взять кл., слабо облучить (до степени 10-15 разрывов в ДНК) и покрасить антителами к Н2А.Х:

10-15 «фокусов» Н2А.Х (привлекают лигазу IV, ДНКзавистмую протеинкиназу и др.)

Н2А.1 – 10 генов, Н2А.2, Н2А.Bbd, Н2А.Х, Н2А.Z, macro H2A.1, macro H2A.2 – по одному гену. Гипотеза гистонового кода: nu различны в функциональном отношении, модификации гистоновых «хвостов» и гистоновые варианты образуют комбинации, которые являются сигналами, регулирующими состояние хроматина; т.о., гистоны – не только структурные белки, но и сигнальные молекулы, интегрированные в структуру хроматина. macro H2A.1 и 2 имеют протяжённый негистоновый район.

Негистоновые белки хроматина.

HMG-белки тоже вымываются 0,5М NaCl, быстро движутся в э/ф и тоже считаются белками хроматина. Это 3 группы белков:  HMG-1/-2 ≈ 10% от количества гистонов. Имеют HMG-домен (HMG1-box), несколько (3) α-спиралей, связывающихся с малой бороздкой ДНК, частично разворачивающих цепь, что приводит к её резкому изгибу (нарушаются стекинг-в/д); являются архитектурными факторами хроматина. Эти домены есть в большом количестве других белков.  HMG-14/-17 ≈ 1% от количества гистонов. Не содержат ДНК-связывающих доменов. Есть домен, который связывается с нуклеосомными частицами (только гомо-, но не гетеродимеры). Приводят к разрыхлению 30нм фибриллы.  HMG-I/-Y≈ 0,1% от количества гистонов. В а.к. последовательности есть домен АТhook (9 а.к., (+) заряжен, Gly-Arg-Pro, связывается с малой бороздкой АТ-богатых последовательностей.) Стабилизация двойных спиралей. АТ-hook заякоривает на малой бороздке многие белки. Функции HMG-белков не определены до настоящего времени. Они являются прототипами белковых доменов и могут работать в паре с различными TFs. Если для TF нужен изгиб, он может связаться с HMG-1 доменом, который сделает изгиб, без которого TF не свяжется с ДНК (т.о. HMG способствуют оптимальной посадке TFs и также являются транспортным средством для них). Это умозрительная схема.

Распределение нуклеосом на ДНК.

Азотистые основания не контактируют с гистонами => нет жёсткой сиквенс-специфичности. Гистоны могут связываться почти с любой последовательностью. Но есть последовательности, более либо менее предпочтительные для nu. Разные последовательности имеют разную способность изгибаться. Оптимум – чередование АТ-пар (к nu) и GC-пар (снаружи). GC preferred

Эти пары определяют «гнучесть» ДНК (есть программы, по которым можно это подсчитать). AT preferred

Если какая-то последовательность занята TF, он не пустит более слабо связывающуюся nu => «дырка» в распределении ДНК -> гиперчувствительный сайт.

МЕТОД НЕДОСПАСОВА: DNAse I основная последовательность меченый зонд

последовательность до первого разрыва

Что есть гиперчувствительный сайт? То, что свободно от nu. Но если nu ремоделировать, эта ДНК тоже подвергается атаке нуклеаз. Sangama (Alain Wolf) – создала библиотеку гиперчувствительных сайтов (потенциальных регуляторных участков) ДНК. Подвижность нуклеосом на ДНК („phasing“). Nu от некого барьера расположены в определённой фазе. UAS – upstream activating sequence – если она закрыта nu, ген будет выключен.  SWI/SNF комплекс Y в присутствии АТР двигает nu влево-вправо и частично дестабилизирует их. Работает с небольшим числом генов. Это ремоделирующий комплекс. 1. Он может модифицировать nu, ослаблять контакты с ДНК. 2. „sliding“ – может подвинуть nu 3. м. перебросить nu на другую молекулу ДНК Т.о., он имеет 3 активности.  NURF (nucleosome remodelling factor) – у Drosophila. Только 1 активность – „sliding“, причём статистически (налево-направо). Основная единица этих комплексов – АТРаза (Swi, Iswi).  NURD (nucleosome remodelling and histone deacetylation) – основная s/u – Mi2. Все эти комплексы состоят из 10 и более s/u, и только 1 из них обладает ремоделирующей активностью. Сейчас показано, что в природе эти комплексы не неспецифичны. АТРаза выполняет свою функцию где угодно. Остальные s/u определяют специфичность посадки ремоделирующего комплекса на определённый промотор. Ремоделинг всего хроматина привёл бы к хаосу в кл. Все вспомогательные единицы призваны донести 1 активную s/u до определённого класса мишеней. Т.о. возможно регулировать процесс развития.

Лекция 2 30 нм фибрилла. 1-я модель (Klug) – соленоид, 6 nu на виток. Это – термодинамически наиболее стабильная структура, образующаяся в растворе. В ядре – если быстро заморозить хроматин (Woodcock, Jan, PNAS 1998) – зигзаг; в отличие от жёсткого соленоида, он динамичен, расстояние между nu может меняться.

Atomic force microscope: тонкая игла, которой проводят над молекулой -> её колебания переводятся в изображение. Варьируя [NaCl], можно вызвать сильное изменение формы этой фибриллы и сколлапсировать в итоге в большую структуру (и также с MgCl2). [Соли] варьируют в небольших пределах. Топология. Пусть концы ДНК фиксированы в кольце или на поверхности. На 1 nu приходится 1.8 витка, и если nu убрать, возникнет суперспираль. ДНК динамична в зависимости от температуры или интеркалирующего агента. Если нагреть ДНК с Wr =0, она раскрутится на 2 витка => Lk = const (не изменяется), Tw уменьшается на 2, Wr = 2. Ферменты: nicking-closing enzyme (topoisomerase I) – релаксируют ДНК (то же самое можно сделать ДНКазой). Topoisomerase II может релаксировать супервитки и расцеплять катенаны. На э/ф суперспираль бежит быстрее всех, релаксированная форма – медленнее всех, и линейная (форма с двуцепочечным разрывом) – посередине. Топоизомеры разделяются на продолжительном низковольтном э/ф. Можно нагреть молекулы, релаксировать при разных температурах и затем охладить до какой-либо одной температуры. В любом случае всегда получится распределение топоизомеров, а не какой-то фиксированный Wr. Топоизомеразы не релаксируют витки, намотанные на nu. Linking number paradox: экстракция 2М NaCl 4-х nu даёт не 8, а 4 супервитка. Брюнель доказал, что Tw ДНК неодинаков в растворе и в том случае, когда она фиксирована на поверхности, и этой разницы достаточно для компенсации половины супервитков – т.е. дело в параметрах самой двуцепочечной молекулы ДНК. В геноме ДНК организована доменами, которые аналогичны кольцевым молекулам. Концентрированным солевым раствором экстрагировали из ядер гистоны: исследовали седиментационные свойства с добавлением или без интеркалирующего агента (если концы фиксированы, образуются супервитки, и ДНК будет компактна). При добавлении EtBr ДНК оседает всё быстрее, а затем – обратная фаза (закручивание в обратную сторону).

коэффициент седиментации

[EtBr] В микроскопе можно увидеть «halo» ДНК при окраске DAPI. (Затем были знаменитые фото Laemmli – но там много разрывов в ДНК, и суперспирали не видны.)

Активный хроматин. Большая часть ДНК эукариот не транскрибируется, а активная часть в разных клетках организма не одинакова. Weingraub – обработка изолированных ядер ДНКазой I переваривает предпочтительно активные гены (увеличили [ДНКазы] и гибридизировали с овальбуминовым или β-глобиновым зондом; метка в β-глобиновом исчезала при титровании ядер эритроцитов, гены овальбумина же были стабильны. В клетках яйцевода – наоборот). Первое доказательство корреляции степени компактизации ДНК и активности генов. 1982 (Lawson) – анализ широкой геномной области – вся область чувствительна к ДНКазе, включая гены, псевдогены и всё остальное, т.е. весь длинный хроматиновый домен в 50-100

kbp находится в активной конформации. «Открытая» конформация – nu цепь, «закрытая» соленоид или зигзаг. Факторы: 

Активный хроматин содержит Ас гистоны



Ме – в общем случае (но не всегда) более предпочтительно для неактивного



утрата Н1 -> декомпактизация



факторы ремоделинга (не могут сдвигать равновесие, лишь ускоряют переход тудасюда)



де-Ас гистонов – инактивация.

Способы выделения активного хроматина: 1.

Слабая обработка ДНКазой -> можно выделить короткие участки, которые предпочтительно относятся к активным генам. (Солюбилизируются отдельные nu или ди-тринуклеосомы, которые существенно обогащены активными генами.)

2. Алфри: колонка с иммобилизованной Hg задерживает некоторые nu – ртуть реагирует с SH-группой в Н3-гистоне, которая как раз спрятана внутри nu, т.о., задерживаются только декомпактизированные nu. Активность этих фракций, как и в первом случае, проверялась гибридизацией с активно транскрибируемыми генами. Тут получаются только мононуклеосомы.

Ac

SH SH

Canonical nucleosome

Ac

SH

Активная нуклеосома имеет форму подковы, она разворачивается из-за Ас, и SH-группа доступна

Что показал химический анализ: 

Намного больше форм Ас гистонов (в общем) – считали, что уменьшение (+) заряда влияет на разрыхление nu, и только потом узнали сайт-специфическое Ас. Allfray (NAR): лукообразная форма nu, задерживающихся на колонке, видна в микроскоп. Т.о., разворачивание nu есть свойство активного хроматина.



FACT (facilitated chromatin transcription) – удаляет Н2А∙Н2В димер (или дестабилизирует его), что также характерно для активных nu.



H2A.Z и Н3.3 встречаются в повышенной концентрации в активном хроматине. Н2A.Z может удерживать на поверхности ионы Cu++. Zn++, Mn++ - многие факторы ремоделирования связываются с nu посредством этих металлов, которые стабилизируют это взаимодействие.



Специфичность модификаций – основную роль играет «переключатель» К9 (Ме <-> Ас); К4-Ме – способствует активации. S10-P включает Ас К9. Krajewski, Becker, 1998. Ас гистонов действительно является основным факторов образование ДНКазочувствительного хроматина, т.е. причиной, а не следствием. Они собрали хроматин из Ас и не ацетилированных гистонов (гликостатин А – ингибитор HDAC – им можно обработать клетки и выделить гистоны, которые Ас почти по всем позициям.) 2 пула гистонов – Ас и неацетилированные. Чтобы правильно собрать nu, использовали экстракт поздних эмбрионов Drosophila (с помощью антител удалили эндогенные гистоны и ДНК). 6 kb плазмиду собрали в nu с Ас и неацетилированными гистонами. Сравнили все параметры: в момент сборки nu часть их деацетилировалась, а часть ацетилировалась, нон е сильно. Анализировали микрококковой нуклеазой: спейсинг – одинаков. Оба образца обработали увеличивающейся [DNAse I]: доказали, что гиперчувствительность к ней была обусловлена повышенным Ас. Ещё: конформационная подвижность. nu не дают ДНК раскручиваться при повышении температуры (раскручиваются только спейсеры, т.е. ≈ 1/3 ДНК). 40°С -> 6 kb плазмида раскручивается так, что появляется 6 супервитков, а ДНК в nu – так, что только 2 супервитка. Хроматин, собранный с Ас нуклеосомами, в меньшей степени ограничивает конформационную подвижность ДНК. Т.о., в свободной ДНК 6 супервитков, в ДНК с нормальными nu – 2, а в ДНК с Ас nu – 4. Это не зависит от Н1: разница сохраняется. Т.о., продемонстрировано, что Ас гистонов является причиной возникновения свойств активного хроматина – предпочтительной чувствительности к ДНКазам и снижения ограничения конформационной подвижности.

Метод иммунопреципитации хроматина (CHIP, chromatin immunoprecipitation) – позволяет изучать распределение Ас форм гистонов в протяжённых доменах генома. Ядра обрабатывают НСОН в средних условиях (1 сшивка на белок), и обрабатывают УЗ (на мелкие фрагменты). Существуют антитела к любым формам Ас и Ме по любым позициям гистонов => с их помощью можно осадить необходимую фракцию на protein A-сефарозе. Нагревание -> можно расшить сшивку и сравнить количественным/полуколичественным PCR представленность определённых последовательностей во фракции и в целом геноме. β-глобиновый домен: есть пики 10-15 kb, плато и места с пониженным уровнем Ас. Есть хорошая корреляция с чувствительностью к ДНКазе (даже не суммарное Ас, а Ас по определённым позициям).

Итог. Для активного хроматина характерен повышенный уровень Ас гистонов. Распределение Ас гистонов можно изучать с помощью CHIP. Области повышенного уровня Ас совпадают с областями повышенной чувствительности к ДНКазе I. (Иногда домены тканеспецифичных генов в активных доменах, например α-глобиновых, не соответствуют этому.) Динамика хроматина регулируется НАТ и HDAC, которые входят в состав больших многосубъединичных комплексов, что связано с тем, что такие ферменты необходимо точно направить в тот или иной домен, чтобы регуляция была возможна. Одна HDAC входит в 2 МДакомплекс, который напрвляет её к тем участкам генома, которые должны быть активированы. Travers 1999: RNAPol II может быть «транспортным средством», которое тащит за собой комплексы, которые осуществляют прогрессивное ацетилирование протяжённого геномного

домена. Для этого необходим низкий уровень транскрипции. С комплексом Pol II связана НАТ => постепенная активация протяжённого домена. Показано существование транскриптов доменного уровня. (Которые затем разрушаются в ядре.) HDAC – входит в 2 комплекса: 1) NuRD 2MDa, 2) SIN3. Оба комплекса имеют белки, которые связывают Ме ДНК (М3, МСР2), которые привлекают эти комплексы в Ме ДНК. 1) NuRD – на ранних стадиях вместе с Polycomb включает Hox-гены, 2)SIN3 - работает с ядерными рецепторами гормонов и включает соответствующие гены. Есть ещё несколько HDAC.

Транскрипция через нуклеосомы Pol II-комплекс много больше нуклеосомы. («детская коляска vs паровоз») Считалось, что гистоны удаляются при её движении. В.Л. Карпов: метод нуклеосомных теней: гистоны избирательно пришиваются к модифицированной по 1 нуклеотиду ДНК -> э/ф в одном направлении -> протеолиз -> э/ф в перпендикулярном направлении. ДНК без белка даёт диагональ. Если есть белок на ДНК, она движется медленнее (3 диагонали: ДНК, ДНК+кор, ДНК+кор+Н1). Анализировали рибосомный и Hsp-промотор: Hsp-промотор дал почти чистую диагональ, в кодирующих же последовательностях все nu на месте.

после Heat shock: 5’ Hsp

кодирующая последовательность

5’ Hsp

кодирующая последовательность

Вроде бы nu сбрасываются (но это зависит от метода пришивки). Скорее всего, nu при транскрипции остаются, но модифицированные и не могут пришиваться. Wang: хроматин достаточно неподвижен, и при транскрипции впереди Pol II – (+), сзади – (-) суперспирализация. Nu должны развернуться по центру симметрии, чтобы из (+) перескочить в (-), а это энергетически невыгодно. Гарри Фильзенфельд: решил проверить – с помощью В. Студитского. Взяли RNAPol фага Т7 (которая в жизни nu встретить не может!). Входя на территорию октамера, Pol начинает раскручивать nu, ДНК за Pol может сделать «обратный хвост» и накручивается на nu -> затем динамическое равновесие с возможным возвратом назад -> Pol в итоге пройдёт. По этой модели после 25 nt м.б. пауза в транскрипции, которую можно заметить. Модель: 1 nu + промотор Т7 – и действительно, после 35 nt RNAPol делает паузу => можно выделить промежуточный продукт. Потом есть ещё 2-я пауза (см. статью в Cell). Но модель абсолютно небиологична. C Pol II, однако, никаких пауз не видно. Nu перескакивает из области «до» в область «после» Pol II, но пауз нет. (Pol II вытесняет Н2А∙Н2В димер.)

Лекция 3 Неактивный хроматин. На чистой ДНК транскрипция in vitro идёт много лучше, чем на хроматине (раньше думали, что хроматин вообще неактивен). В клетке немало ситуаций, когда ген нужно выключить навсегда: большинство генов дифференцированных клеток (их активация -> раковые заболевания и др. расстройства).

15 лет назад – изучение silencing’а, репрессии генов. Использовали клетки Drosophila. В инактивации генов участвует Ме ДНК. Б.Ванюшин (60-е гг.) – открыл m5C. (Ферменты: ДНКметилтрансферазы и деметилазы). Изучали распределение Ме оснований: количество m5C неодинаково в разных типах клеток. Затем научились секвенировать и определять позиции Ме оснований. (Лаборатория Бюрде в Эдинбурге и др.) В эукариотах превалирует: meCpG (всегда 2 С симметрично; GpC - никогда) GpCme Минорный случай – meA. Как это смотрят? Самое простое – рестриктазами, которые расщепляют неМе ДНК и не режут Ме ДНК.

ССGG Hpa I не режет Ме GGCC Msp I режет Ме Нра I

me Msp I

CCGG GGCC

me

Msp I

me Sma I

CCCGGG GGGCCC

и др. рестриктазы

Метод чувствителен, но неточен, не узнаёт несимметричные CpG. m5C -> Т – это используется в методе дисульфидного картирования (секвенируют конвертированный участок и сравнивают с исходным сиквенсом). m5C – нестабилен и сам превращается в Т => в эволюции количество С в эукариотических ДНК постепенно уменьшается. Статистически CpG=GpC – это выполняется в прокариотах. У эукариот их в 5 раз меньше: CpG/GpC ≈ 0.2 => количество мишеней для Ме-я в 5 раз меньше. Существуют определённые районы, в которых это правило нарушается и CpG/GpC ≈ 1 (CpGостровки). Эти островки, как правило, не Ме (а 80% расбросанных по геному CpG Ме-ны). Они не Ме, т.к. имеют много сайтов связывания TFs (например SP1 - CCGCCC), их связывание с ДНК препятствует Ме-ю. CpG island CpG/GpC ≈ 1

CpG/GpC ≈ 0.2

housekeeping gene CpG содержат участки начала репликации и промоторы генов домашнего хозяйства1 (CpG island promoters). Промоторы большинства тканеспецифичных генов2 находятся обычно вне CpG-островков (CpG poor promoters). Все сайты связывания TFs, контролирующих гены домашнего хозяйства, находятся в пределах CpG-островков (эти островки могут быть разного размера), и не выходят за их пределы. Ещё одна особенность CpG island promoters: одни и те

1 2

например, генов PCNA или CDC2 например, BSA или β-казеина

же TFs обеспечивают инициацию транскрипции в 2х направлениях по 2м цепям (1 цепь в одном направлении, 2я цепь – в другом). Что, где и когда Ме? Ме-е de novo в бластоцисте: после слияния гамет вся ДНК деМе-ся до нуля, а затем вся заново Ме-ся специфическим ферментом (характерным только для этой стадии, в отличие от поддерживающей метилазы), при этом места, где связывается фактор SP1, CpG islands, не Ме-ся de novo. Поддерживающая метилаза: имеет NLS, каталитический домен и домен, ингибирующий de novo метилирование. Достраивает асимметричные CpG после репликации. В G1 нет локализации фермента (по иммуноокрашиванию), в S фазе она концентрируется в фокусах репликации. Поддержание паттерна родительского Ме-я. Импринтинг – Полное выключение одного из гомологов гена, расположенного на одной из родительских хромосом. Существуют гены, которые экспрессируются только на материнской или только на отцовской хромосоме (imprinted genes). Важную роль играют дифференцированно Ме-е районы (внутри него есть участок, богатый CpG, который на одной хромосоме Ме, на другой не Ме – ICR, imprinting choice region, переключатель). Метилированный фрагмент ДНК подавляет активность рядом расположенного промотора, даже если сам промотор не Ме, путём создания неактивного хроматинового домена. Например, перед кластером α-глобиновых генов кур находится CpG островок, который избирательно Ме-н в неэритроидных клетках. CpG (650 bp)

Nhe I Nhe I

αD промотор (не Ме)

Sac I

САТ

Sac I

Поставили CpG островок перед промотором и Ме-ли его (есть фермент SSS1, который метилирует вообще все CpG). Этот конструкт ввели в эритроидные клетки: Ме CpG подавляло активность САТ, но дополнительное метилирование промотора не уменьшало активность. CAT assay

αD CpG αD me CpG αD me CpG me αD 20%

100%

(Если Ме весь ген, активность САТ = 0.) Где ещё Ме ДНК: -сателлиты -транспозоны -тканеспецифичные гены Эти фрагменты воткнули из плазмиды в геном -> то же самое. Механизмы: 1. TFs не могут взаимодействовать с ДНК, если С Ме-ны. (Метод картирования сайтов этих TFs – защита от Ме.) TFs: NFκB, AP-2, E2F; но не SP1 (Ме-insensitive TF)!

T F

T F PolI

2. Ме может привлечь большой белок, который закроет все сайты связывания TFs (белок-медиатор МеСР-1, который связывает группу из нескольких mеС, и МеСР-2, который связывает один meC и привлекает SIN3 и HDAC). T F

T F

MeCP-1

S

PolI H

Me CP -2

3. Формируется длинный неактивный хроматиновый домен ( = «гетерохроматин»), упакованный компактно (в отличие от (1) и (2)), в котором все гены не работают. (1) и (2) – для небольших участков.

T F

DNAse I

Эти протяжённые домены изучают на Drosophila и Y. Drosophila: PEV – Position Effect Variegation – эффект положения. ген white: у мутантных мух с помощью транспозона можно интегрировать нормальный ген в случайную часть генома -> много вариантов: он может интегрировать в активный хроматин => нормальные мухи; может в неактивный => белые глаза; и в нестабильную часть куда-то рядом с гетерохроматином (например, рядом с центромерой) => глаза пятнистые (в разных клетках гетерохроматин распространяется на неодинаковое расстояние). Один раз установившись, pattern сохраняется в ряду кл. делений. У дрожжей – telomere mating type locus – подобное есть и у мышей. Mожно получить супрессорные мутации, подавляющие образование «странных» фенотипов – мутации по генам, участвующим в образовании гетерохроматина. Этот мутационный анализ выявил: Модификации Н3 по К9 – Ме или Ас. В транскрибируемом хроматине К4-Ме, К9-Ас. Если К9-Ме, он может привлекать ряд белков, и диспергированная структура укладывается в компактный гетерохроматин. SUV39H1 (SUpression of Variegation) – мутация по гену, который кодирует метилазу гистонов. Тот же эффект -> мутация по гену, кодирующему НР1 (структурный белок гетерохроматина эукариот). Он не узнаёт ДНК, а только Ме-К9. Кооперативный эффект: НР1 привлекает HDAC, HMT и др. белки -> распространение гетерохроматина происходит кооперативно, охватывая протяжённые области, пока что-нибудь его не остановит. Высшие эукариоты: Ме-К9 и НР1. Ме-К4 полностью препятствует Ме-ю К9, и такой хроматин остаётся активным. Y: вместо НР1 – SIR (silencing information repressor) – аналогичный белок. У дрожжей 2 области гетерохроматина: теломеры и МАТ-локус. SIR1 не взаимодействует с ДНК и не узнаёт её. RAP1 – белок, узнаёт ДНК в теломерах. ORC – комплекс, который сидит на ori репликации, но может и узнавать те последовательности, которые должны быть гетерохроматинизированы, и с ним связывается SIR -> компактная упаковка (многофункциональность!). Теломеры и центромеры – конститутивный гетерохроматин. Аналогичные структуры формируются в разных частях генома («факультативнный гетерохроматин» - но участвуют те же самые белки, и организация абсолютно такая же). Сигнал образования неактивного хроматина: Ме не ДНК, а гистонов. Нокаут Н3 К9метилтрансферазы у дрожжей препятствует Ме-ю ДНК!

Dmts

HDAC

ДНКметилтрансфераз а

НР1 me

me

Первичный сигнал – Ме К9. Привлекаются, с помощью НР1, ДНК-метилтрансферазы и HDACs. С Ме ДНК связываются MBDs (особые белки, которые узнают Ме ДНК) и привлекают HDAC – это закрепляет Ме состояние. Обратимо это или нет? До прошлого года не знали деметилаз гистонов. В 2004 нашли К4деметилазу (способствует инактивации хроматина). (Shi et al Cell 2004) Другой способ – разобрать nu и собрать из неМе гистонов – при репликации и репликативно-независимым путём (для этого есть особый фактор). Домены для связывания гистонов (обнаружены биоинформатически):  Bromo-домен – связывается с Ас Lys (активный хроматин). НАТ, RSC (комплекс ремоделирования хроматина), TAF II 250, CCG1, р300коактиватор, некоторые TFs. В основном К9-Ме.  Chromo-домен – связывает К9-Ме. НР1, Мi2 (АТР-азная субъединица комплекса NURF – это HDAC и ремоделирующий комплекс). MBD-домен – обеспечивает связывание с Ме CpG. Прототип- МеСР-2. Есть MBD1, 2а, 2Ь, 3, 4. MBD3 не связывается с Ме CpG (кроме эмбрионов Xenopus). Остальные вроде бы связываются с Ме ДНК. МеСР-2 привлекает ряд ферментов для формирования гетерохроматина и содержит домен, репрессирующий транскрипцию РНК-полимеразой II, может привлекать Sin3A-комплекс и различные HDAC. Эти комплексы получают иммунопреципитацией: 1) СНО; 2) осадить антителами к МеСР-2; 3) расшить и посмотреть, что там есть. Мутации МеСР-2 – Rett-синдром (самки в возрасте 2х недель перестают развиваться и умирают).

MBD-domain N

transcription repression domain

MBD

TRD

C

основные мутации У мышей с нокаутом МеСР-2 – то же самое. (Достаточно удалить ген только в мозговой ткани.) Nestin-Cre и *-Cre – делеции с использованием Cre-рекомбиназы. Nestin-промотор работает только в нервной ткани. Под этот промотор поставили Cre -> развился синдром. Белок, который содержит MBD3 и не связывается с ДНК: мутации по нему летальны, т.к. это scaffold-элемент HDAC-комплекса NURD. Мутации по MBD1,2а,2Ь,4 приводят обычно к раку (как и любое нарушение регуляции в клетке), но не летальны. Нокауты по всем белкам, связывающимся с Ме ДНК, не летальны (мыши рождались, развивались, потом появлялись опухоли). Нокаут по ДНК-метилазе de novo жёстко летален – противоречие?! Правда, есть ещё один белок, который вроде бы связывается с Ме ДНК, нокаут по которому ещё не делали.

Система инактивации генов Polycomb.

Не связана с гетерохроматином непосредственно. Эти белки есть почти у всех организмов. Несколько функций:  репрессия гомеобоксных (гомеоидных) генов

Первичная сегментация: в каждом сегменте экспрессируется 1 ген, а другие жёстко репрессированы.



Polycomb response elements (PRE)– последовательность, с которой связывается комплекс белков Polycomb. С ними же связываются белки группы Trithorax (тогда эти элементы зовутся TRE) – это активация данных генов, в отличие от Polycomb. Эти белки не узнают ДНК. ДНК узнают: GAGA, Pho, Zesta. С ними связываются остальные белки, кроме PSC, который взаимодействует с TFIID-комплексом на промоторе. PS

TFIID

PRE

P

PS Прямое взаимодействие с TFIID и подавление инициации транскрипции (он обязательно должен провзаимодействовать до начала транскрипции!)





Также существуют факторы, препятствующие работе комплексов ремоделирования хроматина. При активации (например, MLL-комплекс) комплексы ремоделирования привлекаются. PRE работают подобно энхансерам и сайленсерам – на большом расстоянии и с помощью петель. если под них подставить другой ген, он тоже будет выключен. Играет роль при развитии эритроидных клеток. Система альтернативна гетерохроматиновой системе, т.к. нет spreading’а. Статус (активный-неактивный) гена сохраняется в ряду поколений.

Лекция 4. Инициация транскрипции Pol II у высших эукариот.

UAS сайты связывания TFs

ТАТА (не всегда)

INR YYANt/aYY пиримидиновый бокс

ГЕН

ТАТА-бокс: - у CpG-промоторов его вообще нет - на нём собирается транскрипционный комплекс. Транскрипция начинается на инициаторном участке INR (пиримидиновый бокс). UAS – upstream activating sequence – площадка для связывания различных TFs. Pol II сама по себе не взаимодействует с промотором и не может его узнавать. Для того чтобы посадить её на промотор, нужен ряд общих (general) TFs, которые узнают промотор. TFIID – мультисубъединичный комплекс, который узнаёт промотор. ТВР – узнаёт непосредственно ТАТА-бокс. In vitro при наличии ТАТА-бокса только ТВР достаточно для инициации. В клетке, однако, нужны TAFs. TAF II 250 – HAT TAF II 55 – антагонист Осуществляют взаимодействие TFIID c TFs, сидящими на UAS.

TAFs TFs

TFIID TB

UAS

Остальные – для посадки Pol II и стабилизации. TFIIA и TFIIB – стабилизация, взаимодействуют с ДНК и ТВР одновременно. TFIIF – обеспечивает посадку Pol II на INR, он взаимодействует с TFIID и TFIIA, TFIIB, а с другой стороны – с Pol II. TFIIH – хеликаза, обеспечивает локальное расплавление TFIIE – роль неясна. Самое главное: полимераза не узнаёт промотор сама по себе. Даже без ТАТА-бокса ключевую роль в узнавании промотора играет ТВР, который взаимодействует с TFs на UAS посредством TAFs. Всё это – если нет nu.

Энхансеры и сайленсеры.

1

мРНК Р (минима льный)

CAT

123

2 enh

Р

CAT

3 Р

enh

CAT

Изучение вирусных промоторов (SV40) выявило энхансеры. Энхансеры мало чем отличаются от UAS. Функция энхансеров не зависит от позиции или ориентации. Энхансер может располагаться непосредственно перед промотором (энхансер-промоторный блок) и выполнять роль UAS, а может быть на большом расстоянии (десятки-сотни т.п.н.) перед и после гена или даже в интроне. Механизм действия энхансеров пока неясен. Модели:  „facilitators“ 

„tracking-looping“



„looping“

e e

Все энхансеры являются площадками для связывания TFs. Они могут быть универсальными и тканеспецифичными. Вирусы SV40, полиомы и CMV обладают универсальными энхансерами. Энхансер вируса SV40 – это просто 5 сайтов связывания для SP1 (активирует промоторы в разных типах клеток). В эукариотическом геноме универсальных энхансеров мало (они нужны только вирусам). Пример тканеспецифичного энхансера . эритроидный, который работает с тканеспецифичным TF - GATA-1. SILENCER – обнаружен почти вместе с энхансером. Особой разницы по механизму, видимо, нет – площадка для связывания TFs, которые могут как активировать, так и подавлять транскрипцию. Перед началом транскрипции необходимо развернуть 30нм-фибриллу (в ряде случаев – замещение гистоновых вариантов Н3.3 и Н2А.Z); Ас-е гистонов и ремоделинг.

NURF

ТАТА

UAS

INR

ГЕН

Если промотор закрыт nu -> фактор NURF (за счёт энергии АТР перемещает nu туда-сюда, сайты открываются-закрываются). Как только сядет TF -> стабилизируется конфигурация nu. Приходит здоровый TFIID => 1-2 nu могут быть удалены с ДНК. Это будет DNAse hypersensitive site (т.к. эти белки не обеспечивают такой защиты от ДНКазы). Если энхансер далеко: петля будет очень длинной, и она тоже организована в nu => 2 гиперчувствительных сайта: на промоторе и на энхансере/UAS.

Домен β-глобиновых генов человека. Первая и хорошо изученная модель (в том числе из-за талассемии). 1 2 3 4 5

ε

Gγ

Aγ

δ

β

β,δ - взрослые Gγ,Aγ - фетальные ε – эмбриональный 1-5 – участки гиперчувствительности (hss) (в любых эритроцитных клетках) Переключение (switching) гемоглобинов: birth

ε

α

β

δ,γ

В момент экспрессии каждого из генов появляются дополнительные гиперчувствительные сайты на промоторе каждого из генов. Делеции при талассемиях: Dutch – всё, кроме β (ранняя гибель) Hispanic – затрагивает только hss 2-5 Dutch

Hispanic

Но ни один из генов не экспрессируется: все будет закручено в 30 нм фибриллу. Timing репликации: транскрибируемые гены реплицируются в начале S-фазы (глобиновые гены в эритроидных клетках), а неактивные (теломеры, центромеры) – в конце (как и

глобиновые

гены

при

hispanic

deletion). Normal early replicating

Hispanic late replicating

Предположили, что где-то в месте делеции находится LCR – регуляторная последовательность, которая отвечает за статус хроматина, утрата которого приводит к изменению статуса домена. Grossfeld: заметил, что уничтожаются 4 из 5 hss. Взяли кусок ДНК с hss и слепили с βгеном -> трансгенные мыши; и следили за человеческой мРНК β-глобина. β PEV – эффект положения (трансген не будет экспрессироваться, если попадёт в гетерохроматин). В эмбриональных клетках всё развёрнуто => может попасть куда угодно. Много копий гена: уровень экспрессии не пропорционален числу копий. Если трансфецировать клетки β-глобиновыми генами, уровень транскрипции не пропорционален числу копий. Но с таким конструктом с LCR в определённых пределах выполнялась линейная зависимость => LCR достаточен, чтобы обеспечить локальную декомпактизацию хроматина? При большом числе копий гены встречаются тандемно => инактивируются по другому механизму, блокирующему тандемные повторы (это RNAi ?) Идентификация LCR основана на 2х экспериментах: 1) Изучение делеций LCR, приводящих к инактивации 2) Изучение трансгенов

1

2

3

4

5

β

β

β

β

β

Эти hss расклонировали по одному и сделали 1) мышей и 2) транзиентную трансфекцию эукариотических клеток. hss1: не обладал активностью hss2: сильный эритроид-специфичный энхансер hss3: такая же активность hss4: такая же активность (но их локальная концентрация должна быть высокой, т.е. должно быть несколько конструктов рядом) hss5: не обладал энхансерной активностью и оказался инсулятором. Какие белки с ними связываются? Чтобы выяснить это, есть 2 метода – Band Shift и Footprinting (они используются сейчас). Есть базы данных сайтов TFs; если ни один не подходит, делают ДНКазный или с защитой от Ме footprinting. Это всё in vitro. In vivo footprinting: Берут кл. -> пермеализуют -> обрабатывают ДНКазой.

primer

primer

blunt end

Потом дополнительно дают меченый праймер, проводят «горячий» PCR и наносят на сиквенсовый гель. Могут не только исчезать полосы, но и появляться новые сайты! Можно также использовать S1-нуклеазу (чтобы выявить локальные изгибы и денатурации ДНК). LCR: GATA-1 и другие эритроид-специфичные факторы сидят на инвитровых hss.

Frazer et al 1993: а если под контроль 1-го из hss встроить 4 гена, будет ли нормальный switching? Лишь 1 hss: switching полностью нарушен, взрослые экспрессируются на фетальной стадии и наоборот. Для нормального switching’a нужны как минимум hss 2-5 все вместе => они не вполне идентичны. Если вставить весь глобиновый домен 150 kb вместе с LCR – нормальное переключение генов в трансгенных мышах. Но это на одной системе. Универсально ли это? β-глобиновые гены всех млекопитающих устроены сходным образом. Изучены LCR β-глобиновых генов у человека и у кур (лучше всего). В других генах можно обнаружить элементы со сходными свойствами, но они не всегда выполняют все функции, присущие LCR. Большинство этих LCR тканеспецифично (металлотионеин – в большинстве тканей). Не всегда это перед генами: в лизоциме LCR «диспергирован» по всему домену, и делеция любого из этих элементов нарушает экспрессию в эктопических позициях независимо от места интеграции. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ LCR. Несколько моделей: 1) Прямое взаимодействие LCR с промоторами индивидуальных генов. (подобно энхансеру) LCR – один, а промоторов – 5 => конкуренция промоторов за LCR (в одно время работает только 1 ген) => flip-flop модель (или looping) (но гены работают не совсем по очереди)

LCR

TFIID 2) распространение некоего активирующего сигнала от LCR в сторону промоторов (модель Траверса: на LCR собирается белковый активирующий комплекс, который обеспечивает высокую концентрацию белковых факторов и затем транспортируется посредством Pol II) 3) Перемещение домена из неактивного компартмента ядра в активный (где выше локальная концентрация разных TFs) Отсюда: 1) вероятность активации гена зависит от расстояния до LCR (у человека, но не у кур, эмбриональный ген находится первым, и вероятность образования петли больше) – но на всех стадиях будут экспрессироваться все гены с разной эффективностью (это обнаружено у мыши, но у человека взрослые гены на эмбриональной и фетальной стадии полностью ингибированы.) Не объясняет инактивации фетальных генов (на самом деле существует два субдомена, каждый из которых – в рамках теории Траверса). Ген, расположенный ближе всего к LCR, предпочтительно экспрессируется в эмбрионах мышей. Cre-lox-система: рекомбиназа может вырезать последовательность и встроить назад в инвертированном виде => в эмбрионах таких мышей экспрессируется сильнее всего взрослый ген. Если перевернуть LCR – весь домен инактивируется (hss5 - инсулятор). LCR

ε

G

γ

A

γ

2) «Градиент активации» или «прыгающий сигнал»?

δ

β

LCR

LCR Гипотеза Траверса: активный комплекс белков собирается на LCR, затем его тащит за собой Pol II. Показано: δ

негенный промотор (при его делеции ни один из генов не экспрессируется!)

β

intergenic tranxcript (leakage transcription) для активации домена

Это же подтверждает ряд экспериментов: если сделать hss2-делецию, LCR значительно слабее (≈ на 75%) подавляет PEV, и вообще LCR становится слабым. Это можно восстановить овер-экспрессией TFs (EKLF). Важно, чтобы большая часть сайтов была занята, а не порядок hss. Дополнительные аргументы: 1) Не обнаружено ни одного белкового фактора, который может связываться только с LCR. (в LCR просто намного больше концентрация этих факторов) 2) Отдельные hss из LCR могут защитить трансген от PEV только при множественной интеграции (Ellis et al 1993) 3) Francastel et al 1999: HS2 – области контроля локуса β-глобиновых генов обеспечивают перемещение трансгена из гетерохроматина в эухроматиновую область. HS2

β

β

трансген

гетерохроматин Но непросто понять, причина это или следствие транскрипции. Делеции: на куриных клетках DT40 (имеют мощную систему гомологичной рекомбинации => использовали Neo. Его плюс в том, что это не эктопически, а в нормальной хромосомной позиции.) В мышиных LCR делеции ни к чему не приводили (ни одного из 6 hss), делеции же 6-ти или 4-х hss -> транскрипция уменьшалась почти до нуля, а конформация хроматина осталась активной! Человеческая хромосома в мышиной клетке: делеция 2-5 hss: гены не экспрессировались, а конформация хроматина открыта. А в Испанской делеции (она чуть больше по длине) – хроматин уже неактивен! 1) возможно, там находятся неидентифицированные контролирующие элементы 2) ещё возможно, что LCR дублирован (для надёжности), и сохранение этого элемента достаточно для поддержания хроматина в активной конформации.

Лекция 5. Существуют ли структурные домены функциональным доменам генома?

в

хроматине,

соответствующие

петли 30нм фибриллы

HD HAT TFs

?

ядерный матрикс

active loop

?

inactive loop

?

Петли ДНК в экстрагированных 2М NaCl (убирает гистоны) ядрах. Ядерный матрикс – если убрать гистоны и ДНК -> белковая структура, сохраняющая форму и некоторые особенности морфологии ядра (остаточное ядрышко). Ядерное «гало» (nuclear halo) – когда все петли сливаются в одну «корону». размеры гало зависят от степени суперспирализации ДНК (при обработке топоизомеразой оно становится больше)

Размер петель? Cook et al – титровали ядерное гало EtBr (при этом константа седиментации меняется, т.к. суперспирализация уменьшается). коэффициент седиментации

[EtBr]

если обработать ДНКазой (по одному разрыву в петлю), то получится структура с коэффициентом S, как у релаксированных петель.

Фрагменты ДНК между двумя разрывами – это примерно 2 петли (или 2 плеча одной петли). Другой способ – отщепление ДНК от нуклеоида. relaxed supercoiled

В среднем размер петель 50-150 kb.

Насколько специфично прикрепление петель?

обрезать петли нуклеазой

проанализировать участки прикрепления к матриксу:

Изучить соотносительное представительство разных генов в местах, прикреплённых к NM

с разные концентрации нуклеазы

b

a

Почти все активные гены оказались прикреплёнными к NM. В эритроидных клетках глобиновые гены прикреплены к NM, в яичниках – нет. Т.о., первична транскрипционная активность генов, которые затем прикрепляются к матриксу. А есть ли система без транскрипции и репликации? Ядерные эритроциты кур: сравнили участки прикрепления в эритробластах и эритроцитах гены

NM эритроцит

эритробласт

Оказалось, что есть 2 участка прикрепления – перед и после генного кластера. Есть конститутивные участки и временные. Garrard: идентификация MAR-элементов. Матрикс без ДНК + клонированные фрагменты ДНК: при увеличении концентрации конкурирующей ДНК какие-то фрагменты остаются в ядерном матриксе (MAR), какие-то полностью вымываются. концентрация конкурирующей ДНК

Для получения гало используется солевой раствор, и считали, что осаждается транскрипционный комплекс с РНК. Стали использовать детергент LIS и смотреть, какие участки остаются с матриксом (SAR, Laemmli). Это оказались те же самые последовательности. S/MARs: - легкоплавкие АТ-богатые последовательности (всегда денатурируют первыми, и даже более богатые АТ последовательности плавятся хуже). - гомологии между ними обнаружено не было (часто, впрочем, встречаются ААТАААУАААблоки); есть последовательности, склонные к образованию изгибов и неканонических вторичных структур. - длина «расплывчатая» (от 200 bp до 10 kb, в среднем 1 kb)

- полное отсутствие тканевой/видовой специфичности (первый MAR из Hsp дрозофилы «ловился» на любой NM из человека, дрозофилы и У). - часто присутствуют на границах ДНКазочувствительных доменов, встречаются внутри генов и даже экзонов. Часто колокализуются с инсуляторами, энхансерами, сайленсерами, промоторами и регуляторными последовательностями. - в растительных клетках 2 MAR’a защищают трансген от позиционных эффектов. Western-blot: искали MAR-связывающие белки (но в SDS не все белки ренатурировали). Это:  ARBP (attachment region binding protein) – но это оказался МеСР2  SAF-A – p120 – SP120 – hnRNPV – если смешать SAF-A с ДНК, можно получить петли (хотя почти все белки это образуют).

Lamins A, B, C, NuMA, Desmin SATB-1 (special AT-rich sequence binding protein) – связывается легкоплавкими мотивами. Нет доказательств, что MARs связываются с матриксом в живой клетке.  

только

с

Ядра заплавляли в агарозу, обрабатывали нуклеазой в 0,14 M NaCl и элюировали фрагменты – но S/MARs вымывались прекрасно LIS: почему изолируются те же самые MARs? LIS разрушает все участки прикрепления => при добавлении нуклеазы -> смесь NM с аффинными сайтами и фрагментов ДНК с MARs и без (competitor), поэтому результат одинаков. Доказательство: полученную структуру (NM + SARs) экстрагировали NaCl -> все фрагменты вымываются. Солевую структуру реэкстрагировать нельзя. Как отрезать индивидуальные петли от ядра? Топоизомераза II + VM-26: ковалентный аддукт скрытыми DSB SDS

со

Потом петли можно разделить посредством pulse-field э/ф Разрезать редкой рестриктазой (Spi) и использовать непрямое мечение концов

(Экстракция солью не уменьшает активность топоизомеразы II). На метaфазных и интерфазных хромосомах получили петли 50-150 kb. Гибридизация с рибосомной пробой: ladder (расщепление 1 раз на рибосомный повтор, размер топоизомеразных фрагментов кратен длине индивидуального повтора). Топоизомераза II – растворимая – может вносить «шум», атакуя hss – но её можно убрать 2М NaCl-экстракцией. В рибосомном кластере разрыв - непосредственно перед промоторами.

NM attachment areas NM sites

attachment

Показано, что участки прикрепления (LARs, loop attachment areas) не маленькие, а протяжённые и разной длины (3,5 kb в клетках китайского хомячка и 4 kb в c-myc). (распределение петель) Транскрипция через участки прикрепления идёт, возможно, так же, как и через nu.

Ген дистрофина человека.

- длина 2000 kb (самый большой известный ген) - находится в Х-хромосоме (линия клеток с одной Х-хромосомой, чтобы не путать активную с неактивной – организация может быть разной) - выявляются короткие участки прикрепления и длинные зоны:

В дистрофине длинная зона прикрепления соответствует hot-spot рекомбинации. Действительно ли петли, картированные так, соответствуют петлям в гало? FISH: биотинилированная проба гибридизуется с ДНК и окрашивается антителами с флуоресцентным красителем. (Например, Alexo – он яркий, не выцветает и имеет много цветов). Для одного гена этого недостаточно => для усиления используют в 5 слоёв вторичные антитела – тогда можно увидеть уникальный ген. Прогибридизовали -> увидели «звёздное небо» (из-за повторов). Cot – [c]∙tренатурации (уникальные гены ренатурируют медленно, а повторы очень быстро). + Cot-ДНК – избыток холодной пробы => увидели петлю! Получили размер, измерив на снимках – 200 kb. Пробы из участков прикрепления – она внутри матрикса, пробы из петли, как правило, в петлях. Т.о. карта, построенная по топоизомеразе, совпала c цитологическими исследованиями. Проба из протяжённой зоны (250 kb) ядерного матрикса не выходит за рамки ядра. Вывод: нет петель, разделённых короткими прикреплениями, а есть 2 компартмента. Как соотносятся LARs с S/MARs? Х-хромосома дрозофилы: S/MARs >> LARs, но они компактизуются. Видимо, большинство S/MARs – потенциальные участки прикрепления. (Например, размер петель много < в эмбриональных клетках.)

Никакого соответствия (кроме кластера рибосомных транскрипционными единицами нет. Нашли соответствие между петлями и репликонами.

генов)

между

S/M/LARs

и

1. распределение импульсной метки

chase

в середине S фазы На границе G1/S метка остаётся в составе ядерного матрикса => участки начала репликации локализованы в NM. 2. Картировали LARs и ori и нашли колокализацию между ними. (в индивидуальных генах, как c-myc и α-глобиновых генах кур) => Петли – фрагменты между двумя ori (взаимосвязь репликации с петельной организацией). 1982 – чёткая корреляция между длиной петель ДНК и длиной репликонов. ВЫВОД: -геномная ДНК организована в петли не случайным образом -фрагменты ДНК, лежащие в основании петель, могут быть протяжённы и содержат MARs и другие специфические элементы (палиндромы) -границы петель не совпадают с границами транскрипционных единиц -ori расположены в начале петель у границ закрепления на ядерном матриксе. РЕКОМБИНАЦИЯ: участки прикрепления к NM близки друг к другу в пространстве (хотя далеки по линейной длине ДНК) – 3D организация ДНК – важнейший эпигенетический фактор – воспроизводится из поколения в поколение и играет функциональную роль. Одна из версий – обмен субъединиц топоизомеразы II -> транслокация. Это in vitro. In vivo аддукты стимулируют работу системы NHEJ. Возникают вторичные лейкозы при лечении топоизомеразными ингибиторами. Существует ли корреляция позиций прикрепления ДНК к ядерному матриксу и hot-spots рекомбинации? AML/ETO: bcr прикреплены к NM (в нормальных клетках).

Лекция 6 Инсуляторы - функциональные элементы генома, способные разделять домены. 2 подхода: структурный (домены) и функциональный (инсуляторы). Функции инсуляторов: 1)разделение энхансера и промотора 2)барьерная Прекращение коммуникации энхансера и промотора: enhancer-blocking assay:

enh инсулятор

Активность энхансера и его действие в другом направлении не подавляются

промотор

! – при этом (в отличие от сайленсера) энхансер не портится и активирует ген с другой стороны. Просто ограничение сферы действия энхансера. Дрозофила: Hsp-домен, активно изучался. С 2х сторон домен фланкирован HSSs – SCS и SCS’ (specialized chromatin structure). Взяли эмбриональный энхансер (из желточного мешка) и lacZ. Вставили SCS в Р-элемент и стали вставлять в различные места, а также вставили MAR и случайные последовательности. Расположенные так: , случайная последовательность

полная экспрессия

MAR

случайная последовательность и MAR не мешали экспрессии. SCS между промотором и геном блокировали экспрессию. В другую сторону энхансер работал прекрасно. В человеческих клетках: метод защиты от подавления неомицина. Система G418-Neo. % колоний конструкт:

энхансер

neo

устойчивые клетки

вставить инсулятор

I

λ

γ-Neo λ enh

I

γ-Neo I enh

I γ-Neo I I enh

Но в эукариотах такая ДНК интегрирует случайно и тандемно, поэтому энхансеры окружали с 2х сторон инсулятором. Так искали инсуляторы у позвоночных. Другой подход: кольцевой конструкт с промотором, энхансером и репортером (эписома). активность САТ САТ

ins

CAT-enh CAT-I-enh

enh

CAT-I-enh-I ins

Обнаружено, что гетерохроматина.

инсуляторы

гетерохроматин I

способны

Р

ограничивать

распространение

(propagation)

гетерохроматин трансген

I

В норме инсуляторы подавляют PEV. У дрозофилы (нет тандемной интеграции) – прямая зависимость между числом копий и экспрессией трансгена. -> не все инсуляторы одновременно обладают двумя активностями (enhancer-blocking и domain boundary) -> эти активности можно разделить (сайты связывания одних белков ответственны за один эффект, а других – за второй) Хорошо изучены 10-20 инсуляторов3. 5’-концевой инсулятор β-глобинового домена кур.

enh 4 1

3 2 HSS №4 = ins

C

этим

N

инсулятором

связывается

CTCF-белок (CTC-binding factor). Это фактор, регулирующий экспрессию c-myc.

AT-hook

C

Имеет 11 Zn-fingers -> пластичность для взаимодействия с очень разными последовательностями ДНК. Имеет также АТ-hook (HMG-y тоже имеет этот ДНК-связывающий домен, который связывает АТ-богатые области.) Footprint: обнаружили 5 сайтов связывания TFs, номер II – для CTCF. Все сайты проанализировали enhancer- blocking assay: II+III – только enhancer- blocking I + III-IV – только защита от PEV => именно CTCF отвечает за первую активность. Его гомологи нашли у всех эукариот.

SCS’ – boundary Drosophila Hsp locus – Aurora promoter simultaneously Su(Hw) – in gipsy insulator – enhancer of LTR-gipsy transcript CTCF binding sites – enhancer block in β-globin – in c-myc promoter repress transcription γ-globin human – block of LCR action on adult δ,β – production of β-globin UASrpg – block spread heterochromatin in HML HMR – HMR boundary – UAS for TEF eveP – enhancer block, GAGA-dependent, promoter of eve gene 3

Другой пример: Gipsy. В нём есть инсулятор, с которым связывается suHw-белок. ! 2 инсулятора сами себя инактивируют! enh ins ins P

В локусе Hsp генов дрозофилы: последовательности (инсуляторы). Чем отличаются

Zw5

и

BEAF

–

факторы,

LCR

которые

связывают

и

SCS-

инсуляторы?

LCR

(мощный позитивный регулятор, от которого распространяется позитивный сигнал)

ins

ins

инсулятор – граничный сигнал, защищающий от любого воздействия снаружи; между инсуляторами – «чистый лист»

insLCR

случай β-глобинового домена

С механизмом действия инсуляторов вопрос тёмный. 2 группы моделей: 1) «дорожной пробки» - инсулятор мешает движения активирующего комплекса РНК-полимеразы по гипотезе Траверса 2) образование петли . она не может образоваться из-за нарушения инсулятором высших уровней структуры хроматина кольцевые минихромосомы EBV . взяли HSS 2 и 4 из куриного домена ε

E

out

E

I

in both

% AvaI cut

I

E

I

E

I

E

SCS

SCS дрозофилы не работает как инсулятор в человеке (т.к. у человека только CТCF, а у мухи очень много других регуляторных белков)

Наличие HSS в промоторе служит признаком того, что промотор активировался под действием энхансера, оно подавляется при подстановке инсулятора. Также можно порезать незащищённый промотор рестриктазой – результат такой же. Стали смотреть ацетилирование гистонов: I Ас-е (enrichment) то же самое с Н3 и Н4

E

E

ε out

I

все Ас собрались на энхансере но не двигаются дальше из-за in ε

Значительная часть RNAPol задерживается на энхансере, в случае инсулятора между энхансером и промотором – он подавляет траффик Pol от энхансера к промотору Pol II

эти 2 эффекта зависят от CTCF: CTCF

in

ε, out

ε

in

иммунопреципитация антителами к Pol II

с

В мутантах по CTCF Ас-е худо-бедно распространяется, и большая часть Pol II находится на промоторе, как в интактной клетке. По крайней мере CTCF критичен для Pol II. Domain boundary: на мухе (домен Hsp) удалось показать, что могут образовываться независимые хроматиновые домены. Zw5 BEAF

сшивка

рестриктазы

может образоваться петля по липким сайтам, т.к.белки вместе. Потом брали праймеры из scs и scs’ => 1)продукт и из scs и из другой последовательности или 2) продукта не получалось

Вывод: scs и scs’ контактируют друг с другом. Исследовали инсулятор Hw (Hairy Wing) (красили антителами к нему политенные хромосомы и подбирали пробы, которые с ним колокализуются). Пробы: A

С

B

Hw

Gipsy

Потом гибридизовали пробы с ядерными гало: в конструкте без центральной инсерции видели с помощью 3х проб петлю, с инсерцией -> непонятная структура ( вроде бы петля, притянутая в ядро за серединку). Связаны ли MAR и инсуляторы? - у мухи MAR не обладают энхансер-блокирующей активностью - другие опыты: MAR изучали в основном как блокирующие позиционные эффекты, т.е. bordering-элементы.

1) Канонические АТ-богатые MARs – не защищают ген от позиционных эффектов и не влияют на экспрессию. 2) Фейзенфельд: -выделял ядерный матрикс (от 0,5 до 2М NaCl) и смотрел распределение CTCF: большая часть CTCF сидит в матриксе. -взяли этот инсулятор и тестировали на S/MARs: после отмывки ядерного матрикса инсулятор сидит там количественно. Если CTCF нарушен – инсулятор не связан с матриксом. ИТОГ: -SCS-элементы дрозофилы не обладают активностью MAR - ряд тестированных MAR не блокирует энхансеры в стандартном тесте - многие тестированные MAR в большей или меньшей степени защищают трансген от позиционных эффектов (особенно чётко – у высших растений) Откуда берутся MARы? HSS

в β-глобиновом локусе млекопитающих такого резкого перехода нет. Возможно, этот инсулятор обладает только enhancerblocking activity

профиль чувствительности к ДНКазе

3-5kb

3-5kb

На 5 kb много чего можно разместить – и энхансер-блокирующие, и bordering-элементы. В эукариотической клетке очень эффективный механизм, который инактивирует тандемы, в том числе трансгены. Эту механизму не препятствуют даже инсуляторы. Поэтому надо работать на 1 копии (с помощью Cre или других рекомбиназ или вирусов). Результаты будут гораздо более чёткими. НУЖНЫ ЛИ ИНСУЛЯТОРЫ? Анализировали нокауты по инсуляторам. Инсулятор β-глобинового домена: ins CTCF enh LCR

Вырезали инсулятор, переместили в эритроидные клетки: ничего не было. (И даже границ гетерохроматинового домена слева LCR не раздвинул) Домен гена лизоцима кур: концевой MAR инсулятор не нужен для защиты гена от PEV в эктопических позициях. (в этом домене LCR диспергирован) Прямая зависимость уровня экспрессии от числа копий. Уберём энхансер -> экспрессия падает. Но убирание инсулятора никак не влияет. В β-глобиновом домене есть ещё 3’-инсулятор:

1 2 3 4 5

ε

Gγ

Aγ

δ

β ins

enh

талассемия: экспрессируются δ и β на ранней стадии 1 2 3 4 5

ε

Gγ

Aγ

δ

β делеция

enh

Анализ импринтинга (это селективная инактивация аллеля в материнской либо в отцовской хромосоме, сопровождается метилированием ДНК соответствующей области, т.о. импринтинг – регулируемое создание неактивного домена): Igf2-ген не экспрессируется на материнской хромосоме, экспрессируется на отцовской, ген Н19 – наоборот. Это связано с 2-3 kb участком, который метилирован в отцовской хромосоме и неметилирован в материнской (ICR, imprinting choice region) – или дифференцированно метилированный район. В нём нашли несколько сайтов связывания CTCF. Это кондиционный enhancer-blocking element (связывание с CTCF полностью зависит от метилирования).

C

Igf2

Igf2

Н19

enh

enh

Н19

enh

enh

если ICR метилирован, Ме-е распространяется на промотор гена Н19

C

Такой же механизм у DM1 локуса человека. Инактивация Х-хромосомы:

Xa

Xi

Xist

C enh

Tsix

?

предположительно энхансер, но не найден

?

Xist

enh

Tsix

Ещё примеры: в большинстве районов, где есть импринтинг, найдено очень много компонентов системы CTCF.

Не все домены имеют чётко определённые границы. Существует ограниченное число моделей, где можно выявить ДНКазочувствительные/устойчивые домены. Но нет доказательств, что большая часть генома так организована. Даже β-глобиновый домен человека погружён внутрь домена одорантных рецепторов. в домене лизоцимных генов (тканеспецифичны) нашли маленький housekeeping ген. α-глобиновый домен: эта часть хроматина имеет много генов, и во всех тканях ДНКазочувствительна. Этот домен перекрывается с большим housekeeping геном, в интроне которого и находится Hss40 (LCR α-глобинового домена). HS40

ζ2 α2 α1 θ1

Grossfeld: 2 модели: «чёткие»/strong (β-глобиновый) и «размытые»/weak (α-глобиновый) домены. В размытых доменах инсуляторы – может быть – сидят на границе, т.к. в середине они бы мешались. Чёткие домены: Hsp locus Drosophila (*интересное исключение – инсулятор одновременно является промотором следующего гена Aurora), β-глобиновый домен кур и человека, МАТ локус дрожжей.

Лекция 7. Домены открытого типа могут включать тканеспецифичные гены. Механизм этого: большинство энхансеров не являются универсальными. По стерическим причинам комплекс белков, который собирается на энхансере, может быть комплементарен комплексу белков на промоторе или нет. система маргинальных дисков дрозофилы

enh Pdpp

enh Pdpp

Poaf

Phsp

функциональная изоляция регулирующих механизмов в доменах, содержащих перекрывающиеся гены: существенное увеличение специфичности влияния энхансера на определённый промотор или на определённую группу промоторов

α-глобиновый домен: постоянно открытый хроматин (ДНКазочувствителен во всех клетках), но только в эритроидных клетках уровень Ас-я повышен по сравнению с другими клетками. В β-глобиновом домене есть подобные субдомены: уровень Н3К9-Ас очень высок в LCR и области взрослых генов (а эмбриональные гены не ацетилированы).

ζ2 α2 α1 θ1

enh/LCR

ins/MAR (регулирующий)

Ме-зависимый (-) регулирующий элемент

неэритроидные клетки: только 1 транскрипт

нестимулированные эритроидные клетки: 2 транскрипта трансдоменный транскрипт эритроидные клетки: много транскриптов  трансдоменный транскрипт транскрипты глобинов

FISH: есть линии эритроцитарных клеток, в которых не экспрессируются глобины (а экспрессируется только длинный транскрипт) их можно индуцировать -> дифференцировка клеток и экспрессия глобиновых генов => FISH детектирует их в 2х локусах ядра и в цитоплазме.

Компартментализация клеточного ядра. Нужна структурная основа для организации мультиферментных комплексов транскрипции и репликации. К примеру, фокусы репликации (Nakamyra): метили ДНК Br-dU in vivo, а затем

красили антителами к нему => в S-фазе увидели фокусы (их число много меньше, чем число индивидуальных репликонов). Картинка меняется в течение S-фазы, фокусы сливаются, а в конце S-фазы видны блоки репликации гетерохроматина. Такие фокусы назвали Speckles – «пятнышки». Эти фокусы (P.Hook) – репликационные фабрики - «груши» 185х157 нм. Сначала думали, что это только для репликации. Но: антитела к факторам сплайсинга -> то же самое.

С транскрипцией - то же самое (антитела к Р-CTD или включить биотин в nascent RNA) => фокусы транскрипции. (они колокализуются) Структурной основой этой организации является, скорее всего, ядерный матрикс. Нуклеазы -> LS (0.5M NaCl) -> HS (2M NaCl) -> Triton X-100 -> остаётся структура, которая по форме и морфологии напоминает ядро (внутренний матрикс + ядрышки + ламины) (10% белков, 1.9% ДНК, 29% РНК,

1.5% фосфолипидов). Фокусы репликации видны и на ядерном матриксе. То же самое с фокусами сплайсинга и транскрипции. Стали искать в белках некие сигнальные последовательности, которые обеспечивают закрепление белков на ядерном матриксе. Делали делеционный анализ: например, AML – нашли делецию, при которой этот белок не локализуется на ядерном матриксе. Эту последовательность пришили к GAL4, который в норме не сидит на матриксе -> ядерный матрикс окрашивался антителами к GAL4. Стали пришивать разные аминокислотные последовательности к флуоресцентному белку (shotgun) и смотреть, куда он идёт => можно найти последовательности, которые обеспечивают локализацию белка в разных компартментах ядра (в ядрышке, гетерохроматине, на периферии и в других таинственных компартментах: околоядрышковом компартменте с неизвестной функцией, фокусах репликации, транскрипции и сплайсинга). Гетерохроматиновый компартмент: теломеры дрожжей собраны в ограниченное число компартментов; рДНК дрожжей, большая часть которой не работает, образует выпетленный из центра неактивный компартмент. Sir2

rDNA gen. DNA

Sir2

Перемещение гена в неактивный хроматиновый домен сопряжено с его инактивацией. DHFR (дигидрофолатредуктаза) и глобиновые гены сразу после митозов в середине ядра, а через 2 часа глобиновые гены уходят на периферию и инактивируются. Вокруг гетерохроматина находится локальная высокая концентрация белковых факторов => гену достаточно просто физически попасть в эту зону, чтобы инактивироваться. Современные метод анализа: живые клетки, покрашенные флуоресцентным маркёром: GFP и его модификации. Р

EGFP, ECFP, EYFP

Ampr

MCS 5’ (сюда вставляем свой белок)

MCS 3’

К примеру, слили 3 GFP c фактором процессивности PCNA –> его распределение в ядре не изменилось, хотя GFP довольно большой. Такого белка около 5% => неважно, функционально активен он или нет, главное – такая же локализация (а именно, локализуется он в репликационных фабриках). В большинстве случаев он, что интересно, сохраняет и активность. GFP

GFP

PCNA

GFP FRAP – fluorescent recovery after photobleaching- насколько лабильна организация ядра? Лазером разрушают светящийся агент в одной полосе ядра -> держат клетку в фокусе и смотрят, уже через

10 секунд происходит восстановление исходной структуры. Т.о., происходит довольно быстрый обмен между нуклеоплазмой и большей частью компартментов. Околоядрышковый компартмент: полностью восстанавливает свечение за 5 минут.

FRET – fluorescent resonance energy transfer – насколько близко друг к другу располагаются молекулы? Подбирают пару красителей так, что λem1=λex2 (GFP-YFP), и если белки рядом друг с другом (менее 6 нм), то второй краситель возбуждется -> происходит наложение цветов => другой цвет. ХРОМОСОМЫ. Рабл: порядок, в котором расположены хромосомы в метафазной пластинке, сохраняется и в интерфазном ядре. Cremer: метод повреждения: сначала разрушить что-нибудь в ядре лазером, потом дать предшественник, меченный биотином -> он будет включён при репарации -> дождаться метафазы и посмотреть, какие из хромосом оказались помечены. Большое число препаратов может дать информацию о расположении хромосом. Вывод: гомологи лежат не рядом, и особого порядка нет. Когда сортером стали выделять индивидуальные хромосомы – сделали библиотеки (без повторов) => можно сделать специфические праймеры к индивидуальным хромосомам и увидеть их. (Техника дифференциальной окраски хромосом). Основной вывод: хромосомы не полностью диспергированы в интерфазном ядре, красится только одна локальная зона. Но ядро трёхмерно => лазерная конфокальная микроскопия. Можно сделать последовательную серию снимков на расстоянии 1-2 μм, причём толщина среза практически равна 0. Компьютерные программы собирают 3D изображение ядра. Вывод: есть хромосомы, которые находятся в центре ядра, а другие – на периферии. Хромосома 19 – в центре, очень богата генами; хромосома 18 – в основном гетерохроматин, на периферии. Почти все хромосомы можно покрасить разными цветами: 1)гомологи, как правило, находятся далеко друг от друга 2)у цыплёнка все большие хромосомы бедны генами и находятся на периферии, все малые хромосомы богаты генами и находятся в центре, и есть ещё промежуточные хромосомы (по генам и по положению).

зеленый цвет - минихромосомы (наиболее богатые генами) красный цвет - “большие” хромосомы (наиболее бедные генами) сиреневый цвет - средние хромомосомы (промежуточная плотность генов) Где находятся хромосомы реально? Параметр – расстояние от центра ядра до периферии (измеряется в % от радиуса ядра, радиальная позиция определяется совокупностью сигналов со всей хромосомы). Это хорошо на лимфобластах, у которых ядро ≈ шару (но нужно осторожно фиксировать их ). Одновременно можно покрасить FISH центромеру и какой-либо ген. Хромосомы располагаются на «орбитах», или хромосомных слоях вокруг центра ядра. Если хромосомы находятся в одном слое, вероятность транслокации между ними повышается. Если транслокация произошла между центральной и периферической хромосомами, гибрид будет болтаться где-то посередине (т.е. это зависит от физических свойств самой хромосомы). Изохоры: гены в основном находятся в GC-изохорах, АТ – пустоваты. Распределение хромосом не жёсткое, с неким максимумом, не по Гауссу. t(9;22) (транслокация между 9-й и 22-й хромосомами)- эти хромосомы (и другие тоже) образуют группу, в которую входит по одному из гомологов каждой пары.

Выводы: -интерфазные хромосомы занимают неперекрывающиеся, относительно компактные области, называемые хромосомными территориями. -центромера находится на наиболее удалённой от ядра границе хромосомной территории. -богатые генами хромосомы – в центре ядра, бедные – на периферии -не существует корреляции между физическим положением генов в ядре и их положением по длине ДНК -хромосомы, участвующие в транслокации, находятся в одном слое и даже образуют сцепленные группы Модели: 1) IDC – interchromatin domain compartment: все ядерные факторы, системы транспортных путей, находятся между хромосомными территориями. Постулирует размещение активных генов на поверхности хромосомных территорий. 2) Матрикс образует каналы, куда выходят петли ДНК

RNP being transportized to cytoplasm

active gene attached through immobilized Pol II

DNA loops attached to NM through ori forming replication clusters (foci)

NPC

Эта модель не требует расположения активных генов на границе хромосомной территории.

NM channel

Mahy Nikola L.: мерили расстояние от края хромосомной территории до активных и неактивных генов и не выявили никакой корреляции (в т.ч. на моделях принудительной дифференцировки клеток – при активации они не перемещаются). Позиции генов в индивидуальных хромосомных территориях эволюционно консервативны (у человека и у приматов), но почему это важно, неясно. При более высоком разрешении видно, что хромосомная территория похожа на губку, и активные гены лежат близко к внутренним каналам. Есть ли что-то, что держит хромосомные территории, кроме взаимного отталкивания? К примеру, предшественник

проэритробласты

макрофаги

В недифференцированных клетках территории маленькие и плотные, а в проэритробластах некоторые хромосомные территории очень сильно диспергированы (хотя уровень транскрипции не особо отличается).

Некоторые особо активно транскрибирующиеся гены детектируются очень далеко от хромосомной территории собственной хромосомы (т.е. происходит выпетливание, а куда – неясно). Выпетливание неслучайно, они находятся рядом с PML-тельцами (от слова парамиелоидный лейкоз), это компартменты, которые нашпигованы TFs и другими факторами для транскрипции.



Инфекция CMV: он синтезирует некий белок, который разрушает PML-тельца, чтобы самому попользоваться TFs.

Лекция 8 Репликация ДНК у высших эукариот Вся классика основана на E.coli Общие свойства репликации у про- и эукариот: 1-semireplicative 2-bidirectional 3-RNA primers Ферменты: много ДНК-полимераз α, β, γ, δ, ε, ι(йота) 3-4шт. Только α обладает активностью праймазы. Чтобы реплицировать очень длинную эукариотическую ДНК, ДНК-полимераза должна быть процессивной и по возможности не делать ошибок. α-полимераза имеет низко-промежуточную процессивность. β – процессивна только вместе с PCNA (proliferating cells nuclear antigen). δ, ε – вместе с PCNA Кроме β, все обладают высокой точностью. δ или ε – продолжающие полимеразы (кто из них что синтезирует, пока неизвестно. Есть специфические полимеразы, которые вставляют чего угодно против тиминовых димеров, например, и т.п. Участники элонгационного комплекса: • pol α/праймаза • pol δ + PCNA • RF-C (несколько субъединиц, укрепляет весь комплекс) • RPA – аналог SSB, несколько субъединиц • хеликаза • топоизомераза I (топоизомераза II нужна только , чтобы разделить катенаны, т.е. уже после репликации). RF-C до некоторой степени увеличивает процессивность полимеразы δ + PCNA. Хеликазы. Долго их не находили у эукариот. У SV40 есть Т-антиген (многофункциональный белок) – 3’-5’ процессивная хеликаза (скорость 75-100 п.н. в мин., АТР-зависимая). МСМ2-7 (потому что гексамер) комплекс: в клетках высших эукариот. АТР-зависимый. Фосфорилирование активирует эту хеликазу.

Инициация репликации. 1. Существуют ли ori, как в прокариотах? 2. Если они есть, то что их определяет (нуклеотидная последовательность, хроматин, факторы)? 3. Какие белки участвуют в инициации? 4. Какая последовательность событий приводит к: a. инициации и b. 1 раз на цикл? Экспериментальные подходы:

-модельные системы (вирусы и плазмиды), реплицирующиеся автономно -бесклеточные системы -функциональный и структурный подходы ARS-элементы дрожжей

cloning site

selective marker

случайные последовательности ДНК дрожжей

только если плазмида реплицируется, нормальные колонии будут расти на селективной среде

реплицируется не реплицируется

Выявили в реплицирующихся клонах АТ-богатый консенсус А/ТТ3АТА/GТ3А/Т (любая мутация его уничтожает). Есть АТ-богатая область, последовательность, имеющая способность легко денатурировать, и фланкирующие вспомогательные последовательности – места связывания TFs. (Это не консервативные участки). А/ТТ3АТА/GТ3А/Т А/ТТ3АТА/GТ3А/Т А/ТТ3АТА/GТ3А/Т А/ТТ3АТА/GТ3А/Т А А /ТТ3АТА/GТ3А/Т /ТТ3АТА/GТ3А/Т сайт связывания ORC (ACS, ARS Consensus Sequence)

ABF1

AT rich

транскрипционный фактор - чтобы растолкать хроматин

А

/ТТ3АТА/GТ3А/Т

легкоплавкая область

ABF1

консервативный кор

сайты белков

связывания

вспомогательных

ABF1

ORC A

B1

B2

B3

ORC – ori recognition complex – состоит из 6 белков, ORC ORC

которые связываются с ARS; к нему присоединяется CDC6 (Cdt1) и МСМ2. После репликации на каждом ARS сидит по ORC (Сdc6 и Cdt1 уходят). Работают ли ARS на дрожжевых хромосомах? Как найти ori?

1)

“switch“ – переключение (можно картировать место, где происходит переброс с

leading на lagging цепь, т.е. инверсия полярности для leading и lagging strand. 2) выделить меченые фрагменты Оказаки 3)

выделить

новосинтезированную

ДНК

и

с помощью

PCR

анализировать

представленность различных фрагментов. (Но надо знать, где искать ori). 4) Репликационные интермедиаты нестандартно бегут в электрофорезе. а) 2-мерный э/ф Хубермана: 1-е направление в обычных, 2-е направление в щелочных условиях. (в щелочных условиях бегут только короткие фрагменты)

слишком длинные фрагменты

б)

2-мерный

электрофорез:

различные

проба в центре видит весь спектр синтезированны х фрагментов

интермедиаты

бегут

по-разному

1-е направление по массе 2-е направление по массе и по форме

Это метод более продуктивен. Изучали, консервативны ли nu после репликации. Добавляли ингибитор белкового синтеза, выделяли ДНК и резали нуклеазами (к примеру, старые нуклеосомы защищали бы только лидирующую цепь).  Тогда не знали, что в присутствии ингибитора белкового синтеза фрагменты Оказаки вообще не синтезируются!

метод лидирующих цепей: гибридизация с чипом, содержащим лидирующую или отстающую цепь. (фрагменты Оказаки выделить сложнее) 5’ экзонуклеаза фага λ: не съедает только ту ДНК, которая ещё праймирована РНК. У дрожжей реально работающие ori колокализуются с ARS в хромосомах. Существует много ARS элементов, которые работают в плазмиде, но не работают в хромосомах (=> нужно что-то ещё, например особая структура хроматина или другие особенные элементы). Если 2 ARS в одной плазмиде: обычно работает только один из них. У высших эукариот всё сложнее. Существует несколько модельных систем: 1) DHFR-локус CHO (chinese hamster ovary cells) – картировали всеми методами. Клетки синхронизировали, давали Br-dU импульсную метку в S-фазе и смотрели, какая область представлена в этой фракции: это были т.н. oriβ и oriγ.

DHFR oriα

0

MAR oriβ

oriγ

17kb

23kb

широкая зона 50kb

По фрагментам Оказаки сузили область до 1 kb. Но электрофоретически выявили 50kb зону, в любой точке которой может происходить инициация. Все метода количественные (показывают наиболее вероятную точку), а э/ф – качественный. Гибридизация с чипами: есть предположительные позиции инициации, которые накладываются на oriβ и oriβ’.

oriβ

oriβ’

oriβ’ находится 5kb downstream и в 2 раза слабее, чем oriβ Функциональный тест на ori? -клонировать в плазмиду и смотреть, может ли она реплицироваться, а потом устроить делеционный анализ. Но в эукариотах даже pUC может автономно реплицироваться (т.е. реплицируется в них чего угодно), а сильно уровень инициации ничего не увеличивает. Анализ репликации плазмид в эукариотических клетках: 1) при трансфекции дают Br-dU => получают ДНК light-light, heavy-light и heavy-heavy -> разделить в градиенте CsCl и гибридизовать разные фракции с плазмидой. Сайт GATC: DpnI – режет only me (т.е. исходные)

MboI – режет only non-me (т.е. реплицированные) SauIIIA – режет всё что угодно ДНК: Hirt-> смесь input и реплицированой ДНК. В эукариотах может реплицироваться любая последовательность, и чем она длиннее, тем больше вероятность репликации. (втыкают эукариотическую ДНК в бактерию). Вирусы SV40, полиома: один ori совпадает с ранним и поздним промотором: это GC-богатый палиндром, АТ-богатая область+энхансеры. Это «доменная структура» участков репликации, состоящая из главных зон (сайт связывания Т-антигена) и вспомогательных.  можно нокаутировать ori в живых клетках (но это непросто)  можно ori вырезать -> в плазмиду с селективным маркером -> интегрировать в геном и проводить делеционный анализ (но вопрос, «куда попадёт»). Системы Cre и Rflp – специфических рекомбиназ – решение этого вопроса (заняло 6-7лет). Известные ori: DHFR, c-myc (1kb upstream of the promoter, lost in Burkitt’s lymphoma), βглобиновый (между взрослыми генами), β-глобиновый (downstream). Все они обладают свойствами репликатора (т.е. обеспечивают инициацию на себе в эктопической позиции). ( Ещё: murine IgH, avian histone’s, avian α-globin, CHO rhodopsin, CHO ribosomal gene, CHO rDNA, ACE – ampliphication control element of drosophila chorion, human Hsp70-5’ ) Oriβ из локуса DHFR: провели делеционный анализ.  блок GGCC (замена на GATC и делеция приводят к сильному снижению активности репликатора)  АТ-богатый район (делеция также приводит к очень сильному уменьшению активности) Но замена на функциональный аналог из других ori восстанавливает активность.  Изогнутые фрагменты ДНК: фазированные АТ последовательности (I-V) (делеции приводят к сильному снижению активности ori) поменяли на GC (прямая ДНК) – ori тоже не работает  Участок связывания белка RIP60 (изолирован из DHFRб 2 участка связывания вместе формируют петлю 800 kb, возможно, эта петля облегчает плавление) (его связывание усиливает изгиб ДНК) – то же самое. Репликаторы позвоночных не видоспецифичны: репликатор человека работает в эктопической позиции в СНО и наоборот. 2)β-глобиновый домен.

δ

β

репликатор

leading strand assay FISH (copy number unsynchronized cells)

measure

in

Есть клеточная линия, в которой этот участок вместе с генами делетирован => там не происходит инициации репликации (8 kb deletion Lepore). Это 2 независимых репликатора (P и I), которые находятся рядом друг с другом. Делеционный анализ Выявил некие необходимые участки в этих репликаторах: - пурин-богатые последовательности (AnGm)k Один из ori колокализован с промотором β-глобинового гена: -(ССААТ)-бокс – необходимый элемент для работы; его выкинули (убили промотор), но репликатор работал (к вопросу о связи репликации и транскрипции). (Ещё к вопросу: а в DHFR локусе делеция промотора ведёт к инактивации ori ) Для нокаутов нужна линия клеток, в которой работает HR (гомологичная рекомбинация) – это DT40-цыплячья линия; для изучения человека делают гибрид с DT40. С помощью Cre сделали разные делеции и получили похожие данные (по собственной позиции, похоже на эктопическую). Важно: 1. Это 2 независимых репликатора

2. AG-rich участки – в обоих репликаторах 3. АТ-rich участок (не нужен) 4. палиндром 5. MAR 6. HSS 7. CCAAT (не нужен) Эукариотические ori:  расплетающие ДНК элементы  S/MARs  консенсусы ARS дрожжей  пиримидиновые тракты (СТ-богатые)  какой-то консенсус   полипуриновые тракты  сайты связывания TFs и белков репликации  промотор-энхансерный мотив  АТ-богатые и гнутые области 3) Ori laminB2-локуса (500 kb intergenic space)– тоже репликатор. -имеется footprint длиной 290 bp (существенно при анализе). С этим участком связывается ORC ( у высших эукариот он в принципе может связаться с любой АТ-богатой областью, но с разной силой) -есть АТ-богатые участки (несущественно для работы). Они находятся внутри footprint, и замена на GC не уменьшает активности. -большинство ori – в CpG островках (где промоторы конститутивных генов и постоянно свободный хроматин). Если CpG выбросить, эффективность репликации уменьшится в 2,5 раза (но это было показано на куске pBS -> это должен быть мощный me блок).  Hamlin тоже исследовала DHFRна делеционный анализ с помощью гомологичной рекомбинации. При делеции oriβ, oriβ+ oriβ’ и почти целиком 50kb зоны активность инциации не падает, а инициация идёт на оставшихся участках. Как влияет транскрипция: большая 75kb естественная делеция (промотор + экзон 1 + интрон 1 DHFR) -> инициации не происходит (нет «оборванной петли»). Если делетировать всё, но оставить небольшой промотор и участки посадки TFs, инициация идёт. Можно поставить другой активный промотор – инициация всё равно идёт. Подставили Hsp-промотор -> тоже нормальная инициация. ВЫВОДЫ. 1. В клетках высших эукариот репликация может инициироваться где угодно 2. В эмбриональных клетках (до средней бластулы) инициация на расстоянии каждые 2-4 kb, тоже самое в экстрактах Xenopus (к примеру, его рДНК гены имеют репликоны по 10 kb) 3. В неэмбриональных клетках (дефицит факторов) существуют предпочтительные места рекомбинации (узкие, как в β-глобиновом, и широкие, как в DHFR локусе). 4. Короткие элементы включают AT-rich, AG-rich блоки, изогнутые последовательности и сайты связывания белков. Они могут быть разными, и между ori нет гомологии. 5. Нужна ли транскрипция? В одних работах - нужна, в других работах – не нужна.

Этапы инициации репликации у эвкариот 1.

С предпочтительными местами связывается комплекс ORC Связано с клеточным циклом: в конце митоза -> разрушение митотических регуляторов ->уровень Сdc6 и Cdk1 (и anaphase promoting complex) поднимается -> они связываются с ORC. С ORC связывается также МСМ2 и МСМ7 – компоненты процессивной хеликазы. Это пререпликативный комплекс (pre-RC) 2. Хеликаза снимается с места, Cdc6 и другие белки ORC удаляются с ori (чтобы не было второй инициации). Но ORC2 сидит на ori, маркируя его.

Чтобы не было повторной инициации: -у дрожжей фосфорилирование ORC, который становится неактивным (а в G1 это фосфорилирование снимается) -у высших эукариот ORC1 убиквитинилируется и отправляется в протеасому. Т.о. большая часть белков ORC убирается.

Лекция 9 Есть 2 типа функциональных доменов, связанных с репликацией: -репликоны -временные зоны репликации

репликационная луковица

Допустим, что есть клонированная область, в которой выделены несколько участков. Добавляют Br-dU для мечения новосинтезированной ДНК.

a

b

c

d

e

Затем меченые фрагменты разделяют в сахарозном градиенте и проводят количественный PCR. Где больше всего сигнал -> ori. Если брать размерные фракции: разное количество праймеров дают сигнал.

Competitive PCR assay 20 additional nucleotides competitor DNA

target DNA probe

competitor concentration target concentration heteroduplexes competitor target

Репликоны и кластеры репликонов Скорость движения репликативной машины очень маленькая.  Huberman, Riggs: взяли асинхронно растущие клетки. Внесли Н3Т, отмыли, потом внесли в среду с в 10 раз меньшей концентрацией. Метод fiber autoradiography: ДНК надо распластать на слайде. => обнаружены кластеры репликации на среднем расстоянии ≈ 100 kb друг от друга. Все репликоны симметричны и двунаправлены. Но существуют и асимметричные, и однонаправленные репликоны.



Потом стали использовать метод определения полярности лидирующих цепей: в присутствии ингибитора синтеза белка фрагменты Оказаки не синтезируются. Метят Br-dU (в градиенте или с антителами к Br-dU) -> предпочтительная гибридизация всегда с одной цепью ДНК. Там, где сменяется полярность цепи – ori.

+

-

+

-

+

-

новосинтезированная ДНК

проба слева от ori

проба ori

проба справа ori

от

В геноме человека существуют очень длинные (700 т.п.н.) и крайне асимметричные репликоны. Последнее указывает на возможность генетической детерминации концов репликонов. Участки терминации должны быть строго детерминированы. Репликоны могут быть очень разные по длине.  LCR в β-глобиновом локусе кур контролирует использование ori между генами δ и β глобина. 

Домены, которые характеризуются временем репликации: -раннереплицирующиеся гены -позднереплицирующиеся гены (гетерохроматин, сателлиты, центромеры). Существует строго определённое время репликации (replication timing). К примеру, изучали oriβ в эктопической позиции. 2 подхода: 1) (изучение относительной представленности пробы в ДНК, изолированной из клеток на разных стадиях S-фазы) можно разделить клетки на разных стадиях с помощью прибора-сортера (RACS). 2) (подсчёт относительного количества клеток в асинхронной культуре, содержащих 2 копии интересующего нас фрагмента) интересующая нас область -> in situ гибридизация с ядрами. Если реплицировался -> сигнал в виде «восьмёрки». (если гены экспрессируются синхронно)

Но в случае импринтинга гены могут реплицироваться асинхронно.  Существует определённая корреляция между активностью гена и временем его репликации. Активные гены, потенциально активные гены, как правило, реплицируются в первой половине S-фазы. Конститутивный гетерохроматин реплицируется в конце Sфазы. Многие гены (тканеспецифичные) реплицируются в начале S-фазы в тех клетках, где эти гены активны и в конце S-фазы в тех клетках, где они неактивны. (интересно, что в β-глобиновом LCR HS4 важен только для установления поздней репликации, HS2 же – для обоих типов тайминга репликации) Регуляторные модули различаются. LCS – late consensus sequence – (представляет собой AG-rich blocks) – необходимы для поздней репликации у дрожжей (хотя подавляющее большинство ori дрожжей инициирует в начале S-фазы). В Х-хромосоме (активной и неактивной) используется всегда один и тот же ori. Метод чипов и эрреев: было что-то подтверждено.  (ну просто он позволяет анализировать время репликации сразу на протяжении целой хромосомы)

Нуклеосомы во время репликации Старые нуклеосомы удаляются => новые нужны. Собираются из гистонов, синтезирующихся в цитоплазме. CAF-1 – chromatin assembly factor – подхватывает ацетилированные Н3 и Н4 NAP-1/2 (1-Drosophila, 2-human) – nucleosome assembly protein – связывает 2 димера Н2А∙Н2В, сажает на Н3, Н4; ацетилирование убирается и получается новая нуклеосома. Вариантные гистоны включаются по другому механизму. Сборка nu in vitro: если просто смешать ДНК и гистоны, получаются непонятные агрегаты. Если добавить шаперон (вещество, уменьшающее заряд гистонов) -> самосборка нормальных нуклеосом, но они расположены нерегулярно. =>нужен ещё фактор ремоделирования хроматина (ACF или CHRAC=ACF+Acf1+ISWI). ASF1 – antisilencing factor (дрожжевой гомолог CAF-1)

Новые

Ас-гистоны

+

ASF1

=

RCAF

H3 ∙H4 H3 CAF-1 PCNA ∙H4

(replication-coupling

assembly

factor)

NU

H2A H2A ∙H2B ∙H2B NAP-1/2

Приложение Программа курса (2005 год) I. ХРОМАТИН Организация нуклеосомы Расположение нуклеосом вдоль молекулы ДНК (файзинг и гиперчувствительные сайты, комплексы ремоделирования хроматина) Гистоновый код (варианты гистонов и ковалентные модификации гистонов и их значение, методы изучения распределения модифицированных и вариантных форм гистонов вдоль молекулы ДНК (ChIP)) Особенности трех групп HMG белков Упаковка хроматина в 30 нм фибриллу Транскрипционно-активный хроматин (методы изучения, основные отличия на уровне индивидуальных нуклеосом и на уровне упаковки в структуры высшего порядка, предпочтительная чувствительность к ДНКазе активных генов, домены хроматина, отличающиеся повышенной чувствительностью к ДНКазе, сборка транскрипционноактивного хроматина in vitro, ферменты, осуществляющие ацетилирование и деацетилирование гистонов, прогрессивное ацетилирование гистонов в транскрипционно-активных геномных доменах, гипотеза Траверса Топология ДНК организованной в нуклеосомы (компенсированные супервитки, linking number, twisting, конформационная подвижность ДНК, ограничения, налагаемые на конформационную подвижность организацией ДНК в нуклеосомы) Транскрипция ДНК, организованной в нуклеосомы (что происходит с нуклеосомами, роль локальной суперспирализации (гипотеза Ванга), роль комплексов ремоделирования хроматина) Неактивные хроматиновые домены (метилирование ДНК, изменения в характере метилирования в ходе клеточного цикла, ДНК метилазы, CpG островки, импринтинг, механизмы подавления транскрипции посредством метилирования ДНК; белки, связывающиеся с метилированной ДНК; сайт-специфичное метилирование гистонов; белки гетерохроматина и общие принципы организации гетерохроматиновых доменов, взаимосвязь между метилированием ДНК и метилированием гистонов; белки группы Polycomb и их роль в инактивации генов). II. ТРАНСКРИПЦИЯ

Организация промотора у эукариот и сборка пре-инициаторного комплекса РНК полимеразы II, общие транскрипционные факторы Энхансеры и сайленсеры Многоэтапная активация гена (активация хроматинового домена, и активация промотора, роль комплексов ремоделирования хроматина, специфические транскрипционные факторы и методы картирования сайтов связывания транскрипционных факторов на молекуле ДНК) Гипотеза доменной организации генома (домен бета-глобиновых генов, как наиболее хорошо изученная модель, область контроля локуса домена бета-глобиновых генов, эксперименты по идентификации области контроля локуса, модульная организация области контроля локуса, области контроля локуса других геномных доменов, механизм работы области контроля локуса Инсуляторы (идентификация инсуляторов, энхансер-блокирующие элементы и пограничные элементы, методы изучения инсуляторов, CTCF и другие белки, участвующие в работе инсуляторов, кондиционные инсуляторы, роль инсуляторов в установлении импринтинга Домены с размытыми границами и домены, содержащие перекрывающиеся гены. Особенности регуляторных систем доменов с размытыми границами. Роль ацетилирования гистонов в “демаркации” геномных доменов и субдоменов III. ТРЕТИЙ УРОВЕНЬ УПАКОВКИ ДНК (ПЕТЛИ ДНК, ЗАКРЕПЛЕННЫЕ НА ЯДЕРНОМ МАТРИКСЕ) Эксперименты, демонстрирующие существование закрепленных на ядерном матриксе петель ДНК. Специфичность организации ДНК в петли (методы изучения и основные результаты). Последовательности ДНК, локализованные в основаниях петель, MAR и SAR элементы; белки, связывающиеся с MAR элементами. Соотношение между петлями ДНК и функциональными единицами генома (транскриптонами и репликонами). IV. КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЯДРА. Фокусы репликации и транскрипции. Кластеры репликонов и репликационные “фабрики”. Другие компартменты. Роль ядерного матрикса в поддержании архитектуры ядра. Активные и неактивные компартменты внутри ядра. Методы изучения компартментализации ядра (флуоресцентная микроскопия, конфокальная микроскопия, FISH, FRAP, FRET). Хромосомные территории, Радиальные позиции интерфазных хромосом, расположение активных генов внутри хромосомных территорий, интерхроматиновый компартмент, модели пространственной организации ядра, роль ядерной архитектуры в определении предпочтительных позиций хромосомных перестроек. V. Репликация ДНК у эукариот. Общие черты систем репликации у прокариот и эукариот ДНК полимеразы и вспомогательные факторы репликации, участвующие в образовании белкового комплекса репликативной вилки. Процессивные ДНК хеликазы ARS элементы дрожжей (модульная организация, консервативный элемент (consensus) и вспомогательные последовательности. Белки, связывающиеся с ARS, соответствие между ARS и участками начала репликации в дрожжевых хромосомах. Методы картирования участков начала репликации. Картирование точек смены матриц для лидирующих цепей и цепей оказаки (mapping of OBR – origin of bidirectional replication). Анализ представленности различных последовательностей в препаратах новосинтезированной ДНК. Электрофоретические методы картирования участков начала репликации Участок начала репликации локуса DHFR (сравнение результатов картирования, полученных с использованием разных методических подходов). Модульная организация участков начала репликации ДНК-содержащих вирусов. Функциональные тесты на активность репликатора в клетках высших эукариот. Автономная репликация плазмид. Изучение активности репликаторов в эктопических геномных позициях. Делеционный анализ репликаторов в нормальной хромосомной позиции.

Основные этапы инициации репликации у высших эукариот. Роль белков ORC и белков комплекса МСМ. Понятие о репликонах (эксперимент Ригса и Хубермана). Картирование репликонов в протяженных областях генома Ранние и поздние репликоны. Временные зоны репликации. Методы изучения времени репликации (“тайминга”) различных генов. Регуляторные элементы, контролирующие время репликации. Соотношение между транскрипционной активностью и временем репликации.

Рекомендованная литература 1. 2. 3. 4.

5. 6. 7. 8. 9.

10.

11. 12. 13.

14. 15. 16. 17.

Астанина К.А. 2005. Курсовая работа (обзор литературы; посвящён гиперчувствительным сайтам) Якутенко И.И. 2005. Курсовая работа (обзор литературы; посвящён хромосомным территориям) Кибанов М.В. 2005. Курсовая работа (обзор литературы; посвящён некоторым механизмам формирования гетерохроматина) Bednar J, Horowitz RA et al. 1998. Nucleosomes, linker DNA, and linker histone form a unique structural motif that directs the higher-order folding and compaction of chromatin. PNAS USA 95:14173 Blanton j, Gaszner M, and Schedl P. 2003. Protein:protein interactions and the pairing of boundary elements in vivo. Genes and Development 17:664 Dorsett D. 1999. Distant Liasions: long-range enhancer-promoter interactions in Drosophila. Differentiation and gene regulation, Current Opinion in Genetics & Development, 9:505 Gdula D., Gerasimova T., Corces V. 1996. Genetic and molecular analysis of the gypsy chromatin insulator of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9378 Iarovaia O., Bystritsky A. et al. 2004. Visualization of individual DNA loops and a map of loop domains in the human dystrophin gene. Nucleic Acids Research 32(7):2079 Krajewski W., Becker P. 1998. Reconstitution of hyperacetylated, DNase I-sensitive chromatin characterized by high conformational flexibility of nucleosomal DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1540 Lagarkova M., Iarovaia O, and Razin S. 1995. Large-scale fragmentation of mammalian DNA in the course of apoptosis proceeds via excision of chromosomal DNA loops and theor oligomers. JBC 270(35):20239 Mahy N., Perry P. et al. 2002. Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories. JCB 157(4):579 Majumder P., and Cai H. 2003. The functional analysis of insulator interactions in the Drosophila embryo. PNAS 100(9):5223 Miassod R., Razin S., and Hancock R. 1997. Distribution of topoisomerase II-mediated cleavage sites and relation to structural and functional landmarks in 830 kb of Drosophila DNA. Nucleic Acids Research 25(11):2041 Hübscher U., and Seo Y. 2001. Replication of the Lagging Strand: A Concert of at Least 23 Polypeptides. Molecules and cells, 12(2):149 Travers A. 1999. Chromatin modification by DNA tracking. PNAS 96(24):13634 Tyler J. 2002. Chromatin assembly. Minireview. Eur. J. Biochem. 269:2268. Репликация (к лекции 8): o Dijkwel P., Wang S., and Hamlin J. 2002. Initiation Sites Are Distributed at Frequent Intervals in the Chinese Hamster Dihydrofolate Reductase Origin of Replication but Are Used with Very Different Efficiencies. Molecular And Cellular Biology 22(9):3053 o Dijkwel P., and Hamlin J. 1997. Mapping Replication Origins by Neutral/Neutral TwoDimensional Gel Electrophoresis. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 13:235 o Dijkwel P., and Hamlin J. 1999. Physical and Genetic Mapping of Mammalian Replication Origins. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 18:418 o Friedman K., and Brewer B. 1995. Analysis of Replication Intermediates by TwoDimensional Agarose Gel Electrophoresis. Methods in Enzymology 262:613

o o o

o o

o

Gerbi S. Mapping origins of DNA replication in eukaryotes. Methods in Molecular Biology 296:167 Gerbi S. and Bielinsky A. 1997. Replication Initiation Point Mapping. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 13:271 Giacca M., Pelizon C., and Falaschi A. 1997. Mapping Replication Origins by Quantifying Relative Abundance of Nascent DNA Strands Using Competitive Polymerase Chain Reaction. A Companion to Methods in Enzymology 13:301 Hamlin J., and Dijkwel P. 1997. On the nature of replication origins in higher eukaryotes. Current Opinion in Genetics and Development 5:153 Kobayashi T., Rein T., and DEPamphilis M. 1998. Identification of Primary Initiation Sites for DNA Replication in the Hamster Dihydrofolate Reductase Gene Initiation Zone. Molecular And Cellular Biology 18(6):3266 Cubizolles F., and Gaster S. 2001. The nucleosome: from wallflower to Queen of the Ball. Meeting report. Genome Biology 2(10): reports 4023.1–4023.4

18. Репликация (к лекции 9):  Gomez M., and Brockdorff N. 2004. Heterochromatin on the inactive X chromosome delays replication timing without affecting origin usage. PNAS 101(18):6923  Simon I., Tenzen T., et al. 2001. Developmental regulation of DNA replication timing at the human β globin locus. EMBO 20(21):6150  Woodfine K., Fiegler H., et al. 2004. Replication timing of the human genome. Human Molecular Genetics 13(2):191  Yompakdee C., and Huberman J. 2004. Enforcement of Late Replication Origin Firing by Clusters of Short G-rich DNA Sequences. JBC 279(40):42337. См. также многочисленные ссылки в презентациях.

Au revoir!

этот рисунок не должен рассматриваться как карикатура или нечто подобное; с глубоким уважением к Сергею Владимировичу он выполнен мною в меру моих художественных способностей и призван дать представление о нём тем читателями, что паче чаяния не знакомы с ним лично