Cheng Production Of Diosgenin From Dioscorea Zingiberensis With Mixed Culture In A New Tray Bioreactor.docx

ABSTRAK Bioreaktor tray baru dikembangkan untuk produksi diosgenin dari Dioscorea zingiberensis dengan Trichoderma reesei dan Aspergillus fumigatus. Pengaruh kadar air awal, suhu, kedalaman tray dan waktu pencampuran diselidiki. Kondisi fermentasi terbaik adalah kadar air awal 75%, suhu bioreaktor 35 ° C, kedalaman bed bed 1,5 cm dan tiga campuran dilakukan pada hari pertama, ketiga dan kelima. Di bawah kondisi fermentasi optimal, setelah inkubasi 144 jam, konsentrasi diogenin maksimum 68,2 mmol / g terdeteksi. Pengantar Diosgenin adalah salah satu prekursor steroid yang banyak digunakan, seperti yang ditunjukkan pada sintesis kontrasepsi oral, hormon seks dan steroid lainnya di industri farmasi. [1,2] Biasanya terjadi pada umbi tanaman dalam bentuk glikosida yang disebut saponin. Persiapan diosgenin dari umbi tanaman terutama bergantung pada hidrolisasi rantai sisi glikosida dari saponin. [3] Baru-baru ini, karena biaya rendah dan kondisi ringan, transformasi mikroba telah diterapkan untuk tujuan ini. [4] Bahan baku utama yang digunakan di China adalah Dioscorea zingiberensis C.H. Wright (DZW) untuk konsentrasi saponin yang tinggi dalam umbinya. [5] Namun, sampai sekarang, sebagian besar penelitian telah dilakukan dalam skala kecil karena dua alasan. Pertama, hasil diosgenin yang diperoleh melalui transformasi mikroba lebih rendah daripada yang dicapai dengan metode tradisional hidrolisis asam. Kedua, transformasi mikroba dilaporkan dilakukan melalui fermentasi terendam, yang membutuhkan energi tinggi dan menawarkan hasil produksi rendah per volume. Untuk meningkatkan transformasi mikroba, metode fermentasi solid-state fermentasi (SSF) dengan menggunakan Trichoderma reesei dan Aspergillus fumigatus diusulkan pada penelitian sebelumnya. Hasil diosgenin maksimum 68,21 mmol / g diperoleh setelah masa inkubasi 156 jam. Nilai ini 7,71% lebih tinggi dari yang diperoleh dengan fermentasi terendam dengan kultur murni. [6] Ketika SSF dilakukan dalam skala besar, banyak jenis bioreaktor dapat digunakan. Di antara peralatan ini, bioreaktor tray adalah sistem yang paling populer karena teknologinya yang sederhana. [7] Dalam studi ini, bioreaktor tray solid state baru dikembangkan. Dibandingkan dengan tradisi satu, ia menyediakan transfer udara yang lebih baik dan dua sporulasi. Untuk mendapatkan hasil diosgenin maksimum, parameter operasi, kadar air awal, suhu, kedalaman tempat tidur dan waktu pencampuran dioptimalkan. Campuran budaya SSF

yang dilakukan di bioreaktor tray solid state baru memberikan panduan yang layak untuk operasi skala besar.

Bahan dan metode Bahan Umbi DZW dibeli dari Kota Yunxi, provinsi Hubei, China. Selulase (10.000 IU / g) dan a-amilase (2000 IU / g) dibeli dari Shandong Longda Bioproduct Co., Ltd., Shangdong, China. pNitrophenyl-b-Dglucopyranoside (pNPG), p-nitrophenyl-a-L-rhamnopyranoside (pNPR) dan standar diosgenin dipasok oleh Sigma Company, Shanghai, China. Standar diosgenin-3-O- [b-Dglukopiranosil (1! 4)] - a-L-rhamnopynosyl (diosgenin-glukosida-rhamnosida) dipasok oleh Nantong Kanmaike Co., Ltd (Jiangsu, China). Standar diosgenin-3-O- [b-D-glukopiranosil (1! 4)] - b-Dglucopyranside (diosgenin-diglucoside) dan standar trillin (diosgenin-glukosida) berasal dari Zhongkangweiye Co., Ltd. (Shanghai, China). Semua bahan kimia lain yang digunakan adalah grade analisis dan dipasok oleh Sinopharm Chemical Reagent Shanghai Co., Ltd (Shanghai, China). Mikro organisme T. reesei (ACCC 30597) dibeli dari Koleksi Budaya Pertanian China (Beijing, China). A. fumigatus diisolasi dari umbi DZW fermentasi alami di laboratorium kami dan diidentifikasi oleh SICC (Sichuan Microbiological Resources Infrastructure & Culture Collection Center, China). Dua strain jamur dikontaminasi dengan 50% (w / v) saponin dan disimpan pada suhu 4 ° C dengan agar kentang dextrose (PDA) dan subkultur setiap 14 hari. Untuk mempersiapkan spora, T. reesei dan A. fumigatus dibudidayakan di lereng PDA selama tujuh hari. Spora kemudian dipanen dengan larutan 5 mL 0,1% (v / v) Tween 80 dan diinokulasi ke media PDA steril untuk menyiapkan inokulum. Pretreatment DZW DZW umbi diolah untuk memulihkan pati dan serat dari umbi-umbian tanaman dengan metode yang telah kami jelaskan sebelumnya. [8] Residu diolah dengan DZW (PDZW) dan digunakan sebagai substrat untuk SSF.

Fermentasi solid-state di bioreaktor tray baru Bioreaktor baru (2 m £ 1,5 m £ 1 m) dibuat dari plexiglass. Tiga rak aluminium vertikal setinggi 55 cm, lebar 35 cm dan tinggi 1 m ditempatkan di bioreaktor. Seperti ditunjukkan pada Gambar 1, masing-masing rak berisi empat tingkatan. Lapisan terbuat dari pipa baja stainless

berlubang yang mendukung nampan. Dibandingkan dengan bioreaktor tray tradisional, dengan baja tahan karat berlubang, aksesibilitas O2 ke nampan meningkat dan akumulasi panas metabolik di tempat tidur tray dilepaskan. Untuk mencegah kontaminasi bakteri, udara disaring melalui membran selulosa asetat 0,45 mm sebelum dipasangkan ke bioreaktor. Tray fermentasi dengan dimensi 50 cm £ 30 cm £ 15 cm ini terbuat dari rangka wire mesh stainless steel. Bagian bawah dan sisi tray ditutupi dengan delapan lembar kain kasa; penutup tray ditutupi dengan empat lembar kain kasa untuk mencegah kontaminasi. Bagian dalam tutup tray dipasang dengan rake untuk memastikan distribusi massa dan perpindahan panas yang seragam dalam proses fermentasi. Suhu dan kelembaban di bioreaktor dikontrol secara otomatis oleh AC dan humidifier di bioreaktor.

Gambar 1. Diagram dua dimensi (a) dan tiga dimensi (b) dari bioreaktor fermentasi padat yang baru. Sumber sinar ultraviolet (UV); 2: kondisioner basah; 3: AC; 4: rak aluminium; 5: pompa udara; 6: pipa berlubang; 7: baki; 8: saringan yang disterilkan; 9: wadah air; 10: filter kasa: 11: gas keluar; dan 12: menyapu.

SSF skala ditingkatkan dilakukan di bioreaktor baru di atas. Berdasarkan komposisi percobaan tingkat labu, padatan substrat dibuat dengan media yang mengandung pepaya 2,67% dan 0,27% K2HPO4 pada pH 5,8 dan ditempatkan di baki. [9] Substrat padat PDZW dan media fermentasi disterilkan pada suhu 121 ° C selama 20 menit. Setiap tray fermentasi dengan media

fermentasi yang mengandung 7,5 £ 106 T. reesei spora / g PDZW sudah disiapkan. Fermentasi dilakukan pada 30 § 1 ° C dan 200 mL / menit laju alir udara. Setelah fermentasi 48 jam pertama, 100 mL media fermentasi mengandung 1,5 £ 107 A. fumigatus spora / g PDZW ditambahkan dan dicampur dengan gulungan logam di tutup baki. Kondisi percobaannya adalah sebagai berikut: kadar air awal 70% - 85%, suhu 30? 45 ° C, ketebalan medium 1 sampai 2,5 cm dan pencampuran 1? 4 kali. Dalam penelitian ini, empat strategi pencampuran yang berbeda diterapkan. Dalam Strategi 1, satu pencampuran dilakukan pada hari kedua. Dalam Strategi 2, dilakukan dua pencampuran masing-masing pada hari kedua dan keempat. Dalam Strategi 3, tiga pencampuran dilakukan masing-masing pada hari pertama, ketiga dan kelima. Dalam Strategi 4, empat pencampuran dilakukan pada hari pertama, ketiga, keempat dan kelima. Durasi keseluruhan fermentasi adalah tujuh hari. Untuk setiap perlakuan, sampel 10 g dipanen dari tengah dan keempat sisi alas substrat setiap 24 jam dan konsentrasi diosgenin ditentukan. SSF kemudian dilakukan pada kondisi yang dioptimalkan dan biomassa jamur, aktivitas 10-a-rhamnase dan b-glukosidase dan konsentrasi saponin di substrat terdeteksi. Semua percobaan dilakukan secara rangkap tiga dan data yang disajikan dalam angka adalah nilai ratarata.

Analisis Konsentrasi diosgenin Sampel fermentasi dikeringkan pada suhu 60 ° C dan ditimbang, kemudian dicampur dengan lima kali volume CHCl3 (b / v) dan ultrasonicated selama 30 menit. Ekstrak CHCl3 disaring melalui membran 0,45 mm dan dipekatkan sampai kering. Residu kering kemudian dilarutkan dalam 1 ml metanol 100% (v / v). Konsentrasi diosgenin ditentukan oleh kromatografi cair bertekanan tinggi (KCKT) sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Huang et al. [5].

Konsentrasi saponin Perubahan saponin (diosgenin-diglucoside, diosgenin-glukosida-hamnosida, diosgeninglukosida) di PDZW dalam proses SSF ditentukan oleh spektrometri massa HPLC (HPLC? MS). Sampel fermentasi dikeringkan, ditimbang dan diekstraksi dengan lima kali volumenya nbutanol (b / v). HPLC Agilent 1100 ditambah dengan perangkap ion selektif Agilent (MSD) Ion Trap diterapkan untuk menganalisis ekstrak n-butanol. Instrumen tersebut dijalankan dengan

kolom LC Zorbax Eclipse XDB-C18 (Ukuran partikel 150 mm, ukuran partikel 5 mm, dan ukuran pori 80 A, ujung ganda monomer) pada suhu 40 ° C dalam mode ionisasi negatif pada kisaran m / z 400? 1000 dengan laju alir 1 mL / menit. Fase gerak adalah air (A) dan CH3CN (B). Program gradien adalah 50? 75% (B, v / v) untuk 15 menit pertama, 75? 92% (B, v / v) selama 15? 17 min dan 92% (B, v / v) untuk yang terakhir 16 mnt. a-Rhamnase dan aktivitas b-glukosidase Sampel fermentasi ditangguhkan dalam air 40 mL, disentrifugasi pada 10.000 r / menit (Eppendorf 5424 sentrifugal, Jerman) dan 4 ° C selama 15 menit. Residu dicampur dengan 30 mL air dan kemudian disentrifugasi. Solusinya digabungkan dan disesuaikan sampai 100 mL. Aktivitas enzim (a-rhamnase or b-glucosidase) pada supernatan terdeteksi dengan menggunakan pNPR atau pNPG sebagai substrat mengikuti metode yang kami laporkan [10]. Satu unit (IU) aktivitas a-rhamnase (atau b-glukosidase) didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengeluarkan 1 mmol p-nitrofenol dalam 1 menit. Hasil dan Diskusi Dalam makalah kami sebelumnya, parameter operasional SSF budaya campuran dioptimalkan pada tingkat labu goyang. [6] Ketika percobaan ditingkatkan dalam bioreaktor baki, kadar air awal, suhu fermentasi, ketebalan tray dan waktu pencampuran perlu ditangani lagi. Kandungan air awal Kandungan kelembaban awal substrat merupakan parameter kunci SSF, yang harus dipertimbangkan untuk mencapai efisiensi transformasi maksimum. Ini memainkan peran penting dalam pertumbuhan mikroba, produktivitas enzim dan reaksi biotransformasi dalam proses SSF. Pertumbuhan jamur dan akumulasi produk dalam sistem ini terjadi dekat atau pada permukaan substrat padat dengan kadar air rendah. [11,12] Kandungan air yang lebih tinggi dapat menyebabkan pengurangan transfer oksigen dan ruang antar partikel, yang akan menghambat pertumbuhan mikroorganisme, sementara kadar air yang lebih rendah dapat menyebabkan pengurangan hasil enzim karena pertumbuhan suboptimal, osmotik tinggi dan sedikit pembengkakan substrat. Dengan demikian, memberikan tingkat air optimum untuk mengendalikan aktivitas air substrat untuk mencapai hasil produk maksimal sangat penting dalam SSF. Kandungan kelembaban awal diselidiki dalam penelitian kami di kisaran 70% - 85%, dengan kenaikan 5%. Setiap hari, sampel dikumpulkan dari tray dan konsentrasi diosgenin dan

kehilangan air ditentukan. Seperti ditunjukkan pada Gambar 2, pada semua percobaan berjalan, konsentrasi diosgenin maksimum 61,6 mmol / g DZW diamati setelah enam hari fermentasi dengan kadar air awal 75%. Dengan kondisi ini, kelembaban turun menjadi 70,5% setelah enam hari operasi. Konsentrasi diosgenin adalah 52,3, 51,2, 37,7 mmol / g bila kadar air awal masingmasing 70%, 80% dan 85%. Kandungan air turun menjadi 66,7%, 71,2% dan 77,9% pada hari ketujuh. Kehilangan kelembaban selama fermentasi rendah karena atmosfer jenuh di bioreaktor. Fitur ini dikaitkan dengan desain bioreaktor (membran luar) dan operasinya (udara jenuh sebelum masuk kabinet). Suhu Pengaruh suhu ditentukan dengan menyesuaikan AC pada nilai berkisar antara 25 sampai 40 ° C dengan kenaikan 5 ° C (Gambar 3). Telah diamati bahwa konsentrasi diosgenin tertinggi (63,2 mmol / g) diproduksi pada suhu 35 ° C. Suhu yang lebih rendah atau lebih tinggi menyebabkan produksi diosgenin dengan hasil yang sedikit lebih rendah. Ketika AC ditetapkan pada suhu 40 ° C, suhu di tempat tidur tray mencapai 46,9 ° C dalam proses fermentasi, yang terlalu tinggi untuk pertumbuhan jamur dan produksi enzim. Kedalaman tempat tidur Kedalaman tempat tidur merupakan faktor penting lainnya dalam bioreaktor baki. Ini mempengaruhi pertumbuhan jamur dan produksi enzim. [7] Parameter ini disesuaikan pada nilai mulai dari 1 sampai 2,5 cm dengan kenaikan 0,5 cm dan konsentrasi diosgenin, perubahan suhu dan kehilangan air ditentukan setiap hari. Konsentrasi diosgenin tertinggi dicapai saat substrat PDZW di atas nampan 1,5 cm (Gambar 4). Karena ketebalan lapisan menurun, kehilangan air di tempat tidur substrat tinggi, yang menghasilkan hasil diosgenin rendah. Dengan meningkatkan kedalaman bedengan sampai 2 cm, suhu substrat PDZW meningkat secara signifikan selama proses fermentasi. Panas metabolik yang dihasilkan dalam reaksi biotransformasi terakumulasi di tempat tidur, yang mempengaruhi aktivitas enzim dan menyebabkan hasil diosgenin rendah. Selanjutnya, di tray dengan kedalaman bed yang lebih besar, miselium yang diangkat diangkat di sampul tempat tidur, yang menghalangi sirkulasi udara. Sebagai pencampuran substrat diinokulasi dapat memecahkan masalah ini, pengaruh waktu pencampuran juga dipelajari. Mencampur waktu Operasi pencampuran sangat penting dalam bioreaktor baki. Pencampuran dapat mematahkan jaringan miseli jamur yang padat dan menghancurkan permukaan padat untuk

mengekspos luas permukaan sporulasi baru. [13,14] Dengan mencampur, akumulasi panas metabolik dilepaskan dan suhu tinggi di tempat tidur fermentasi dapat dihindari.

Gambar 2. Kinetika produksi diosgenin (a) pada reaktor SSF baru dengan kadar kelembaban awal yang berbeda: 70% (diagonal kiri), 75% (diagonal kanan), 80% (garis horizontal) dan 85% (batang hitam). Kinetika kehilangan kadar air sedang (b) selama SSF dengan kadar kelembaban awal yang berbeda: 70% (); 75% (); 80% (); dan 85% (). Penyimpangan standar kurang dari 10%.

Gambar 3. Kinetika produksi diosgenin (a) pada reaktor SSF baru pada suhu inkubasi yang berbeda: 25 ° C (diagonal kiri), 30 ° C (diagonal kanan), 35 ° C (garis horisontal) dan 40 ° C (batang hitam ). Perubahan suhu (b) di tempat tidur tray selama SSF pada suhu AC

yang berbeda: 25 ° C (); 30 ° C (); 35? C (); dan 40? C (). Penyimpangan standar kurang dari 10%.

Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa mencampuradukkan Strategi 3 (yaitu tiga pencampuran pada hari alternatif) merupakan metode yang paling baik untuk SSF (Gambar 5). Dalam percobaan, pencampuran dapat memecahkan aglomerat PDZW menjadi potongan kecil pada kisaran 3? 6 mm. Dengan demikian, luas permukaan sporulasi baru terbentuk. Dengan strategi pencampuran, suhu di tempat tidur tray berada pada kisaran 35? 38,5 ° C dan kadar airnya 70% - 75%, yang sesuai untuk pertumbuhan jamur. Dengan kondisi ini, diogenin 0,68,2 mmol / g diproduksi. Di sisi lain, dengan sedikit pencampuran, jaringan padat terbentuk di permukaan substrat PDZW dan permukaan yang kurang baru terpapar. Konsentrasi diosgenin yang diperoleh dengan mencampuradukkan Strategi 1 dan 2 masing-masing adalah 66,3 dan 67,3 mmol / g. Namun, lebih banyak pencampuran tidak menghasilkan lebih banyak hasil diosgenin, 67,5 mmol / g diosgenin dicapai dengan mencampuradukkan Strategi 4. Pencampuran yang berlebihan dapat menyebabkan gangguan miselia yang berlebihan, yang menurunkan sporulasi. Dibandingkan dengan operasi pencampuran terus menerus, Strategi 3 dari tiga kali pencampuran dapat mengurangi risiko kontaminasi bakteri dan lebih ekonomis. Hasil ini serupa dengan yang dilaporkan oleh Schutyser et al. [15], yang menemukan bahwa ketika biji suling jagung basah ditransformasikan oleh T. reesei dalam kondisi SSF, operasi pencampuran yang sering tidak diinginkan.

Gambar 4. Kinetika produksi diosgenin (a) pada reaktor SSF baru dengan kedalaman tray yang berbeda: 1 cm (diagonal kiri), 1,5 cm (diagonal kanan), 2 cm (garis horizontal) dan 2,5 cm (batang hitam). Kinetika kehilangan kadar air sedang (b) dan perubahan suhu pada

tempat tidur tray (c) selama SSF dengan kedalaman tray yang berbeda: 1 cm (); 1,5 cm (); 2 cm (); dan 2,5 cm (). Penyimpangan standar kurang dari 10%.

Gambar 5. Kinetika produksi diosgenin (a) pada reaktor SSF baru dengan waktu pencampuran yang berbeda: sekali (diagonal kiri), dua kali (diagonal kanan), tiga kali (garis horizontal) dan empat kali (batang hitam). Kinetika kehilangan kadar air sedang (b) dan perubahan suhu pada tempat tidur tray (c) selama SSF dengan waktu pencampuran yang berbeda: sekali (); dua kali ( ); tiga kali ( ); dan empat kali (). Penyimpangan standar kurang dari 10%.

Pertumbuhan jamur dan produksi enzim di bioreaktor baki Di bawah kondisi optimal di atas, kinetika pertumbuhan jamur dan aktivitas enzim dalam fase biotransformasi dipelajari. Ketika dua strain jamur diinokulasi di PDZW, pertumbuhannya eksponensial dalam dua hari pertama (Gambar 6 (a)). Kemudian, karena konsumsi sumber karbon, pertumbuhan jamur terus meningkat namun lebih lambat dan mencapai maksimal pada hari keenam. Aktivitas a-rhamnase meningkat perlahan untuk mencapai nilai maksimum 26,8 IU / g PDZW pada hari ketiga, dan kemudian sedikit menurun. Aktivitas b-glukosidase tertinggi diamati pada hari kelima (Gambar 6 (b)). Biotransformasi saponin pada bioreaktor baki Biotransformasi empat saponin perantara utama dengan waktu dalam sistem SSF juga dipelajari (Gambar 6 (c)). Sebelum biotransformasi, konsentrasi diosgenin- diglucoside, diosgenin-gluocoside-rhamnoside, diosgenin-glukosida dan diosgenin di media adalah 8,33, 1,46, 0,58 dan 0,66 mmol / g. Pada fase fermentasi, kandungan diosgenin-diglucoside meningkat secara bertahap sampai nilai 19,4 mmol / g dalam tiga hari pertama dan kemudian turun menjadi

0,54 mmol / g perlahan dalam empat hari ke depan. Kandungan diosgenin-glukosiderhamnosida meningkat perlahan menjadi nilai 8,49 mmol / g dalam empat hari pertama dan kemudian menurun. Pada hari ketujuh, 0,98 mmol / g diosgenin-gluocoside-rhanmoside terdeteksi di substrat PDZW. Konsentrasi diosgenin-glukosida meningkat secara bertahap menjadi nilai 4,33 mmol / g dalam tiga hari pertama dan kemudian turun menjadi 2,11 mmol / g sedikit dalam empat hari ke depan. Kandungan diosgenin dalam PDZW meningkat tajam dan mencapai nilai maksimum 68,2 mmol / g (0,028 g / g) pada hari keenam. Hasilnya sesuai dengan perubahan aktivitas biomassa dan enzim dalam sistem SSF. Selama biotransformasi, dengan a-rhamnase dan b-glucosidase yang diproduksi oleh T. reesei dan A. fumigates, diosgenin-diglucoside, diosgenin-glukosida-rhamnosida dan diosgenin-glukosida dihasilkan dari saponin rantai gula yang lebih lama dan dihidrolisis menjadi saponin rantai gula yang lebih pendek. Saponin glikosida, yang terikat pada diosgenin dalam saponin, dihidrolisis secara bertahap dari gula terminal sampai aglikon dilepaskan. Selain itu, dibandingkan percobaan labu goyang sebelumnya, [6] biotranformat saponin di bioreaktor tray serupa.

Gambar 6. Kinetika pertumbuhan biomassa (a) dan aktivitas enzim (b) a-rhamnase () nd bglukosidase () selama SSF kultur campuran. Profil (c) konsentrasi diosgenin-diglucoside (~), diosgenin-glukosida-rhamnosida (), diosgenin-glukosida (4) dan diosgenin ($) selama SSF kultur campuran. Penyimpangan standar kurang dari 10%. Meskipun optimasi lebih lanjut dengan menggunakan metodologi surface response mungkin masih diperlukan, hasil yang diperoleh dalam penelitian ini menunjukkan bahwa reaktor nampan baru dapat dianggap menjanjikan untuk produksi diosgenin skala besar, karena memiliki keunggulan pengoperasian yang mudah, efektivitas biaya dan eko ramah bioreaktor desain Kesimpulan

Bioreaktor tray baru untuk produksi diosgenin dari PDZW dengan T. reesei dan A. fumigatus disajikan dalam penelitian ini. Kondisi operasi dioptimalkan untuk efisiensi transformasi tertinggi. Produksi diosgenin maksimal dicapai dengan kadar air awal 75%, yang sesuai untuk biotransformasi mikroba. Produksi diosgenin dimaksimalkan pada suhu 35 ° C karena suhu pertumbuhan optimal untuk pertumbuhan jamur dan produksi enzim. Kedalaman tray bed dan waktu pencampuran juga dioptimalkan. Konsentrasi diosgenin tertinggi dicapai ketika substrat PDZW pada nampan setebal 1,5 cm dan tiga campuran dilakukan pada hari pertama, ketiga dan kelima. Di bawah kondisi optimum, diperoleh diosgenin 68,2 mmol / g (0,028 g / g). Reaktor tray baru memiliki manfaat pengoperasian yang mudah, efektivitas biaya dan bio ramah lingkungan