Biofisica Del Sangue 3

IL SANGUE – Seconda parte ASPETTI GENERALI DEL SANGUE e DEFINIZIONI DI SOLUZIONE E SOSPENSIONE Vediamo cos’è il sangue. Il sangue è un tessuto formato prevalentemente da due componenti:una parte liquida e una parte cellulare. La parte cellulare è formata da tre stipiti cellulari: gli eritrociti, i linfociti e le piastrine. Il numero di globuli rossi è di 5.000.000 circa per millimetro cubo di sangue, il numero di globuli bianchi è di circa 5.000 per millimetro cubo(circa mille volte inferiore al numero di eritrociti),il numero di piastrine è di circa 200.000 per millimetro cubo. Ricordiamo sempre che la concentrazione è per millimetro cubo. Il volume di sangue, a proposito, è di circa 5 litri; è ,più esattamente, il 12% del volume del peso corporeo: ad esempio un individuo di 70 kg ha un volume di sangue di circa 5 litri. Non tutto il sangue è formato dalla parte corpuscolata, che ne rappresenta il 45%, il resto è formato dal plasma, la componente liquida del sangue. La componente liquida del sangue contiene vari elementi: - i Sali .Una serie di anioni e di cationi che, sommati tra di loro, rendono conto della concentrazione degli ioni nel plasma, nei liquidi extracellulari e anche in quelli intracellulari, anche se in proporzioni diverse;quindi rendono conto dell’osmolarità nei liquidi corporei. Quindi nell’acqua che compone il plasma ci sono questi Sali. - le proteine plasmatiche. Classificabili tra i componenti organici e, soprattutto per fisiologia, sono delle componenti molto importanti. Queste sono responsabili della maggior parte delle funzioni che sono state elencate nella lezione precedente riguardo il sangue. - lipidi. Essi non sono presenti sottoforma di lipidi disciolti, ma sono sempre legati alle proteine, soprattutto alle albumine. Le albumine funzionano da vettori che solubilizzano ad esempio i grassi, le vitamine lipidiche o gli ormoni di tipo lipidico. - Zuccheri. Sono in forma solubile perché sono idrosolubili. Quindi il plasma è la componente liquida nella quale sono dispersi in soluzione tutti questi componenti e nel plasma troviamo in sospensione le cellule che compongono la componente cellulare del plasma. Che differenza c’è tra soluzione e sospensione? La soluzione è una mescolanza in un solvente ( per esempio l’acqua) di soluti in maniera omogenea di modo che , se io andassi a campionare con una micropipetta un volumettino di questo litro di soluzione e andassi a vedere che concentrazione c’è in questo volumetto, questo valore sarebbe esattamente uguale a quello che c’è in tutta la soluzione. La soluzione è tale grazie al basso peso molecolare del soluto che è disperso nel solvente. Ripetendo la soluzione è una mescolanza omogenea di solvente e di soluto tale per cui la concentrazione del soluto nel solvente è uguale per tutta la soluzione. Il plasma è una soluzione. Fino ad ora abbiamo considerato la definizione chimica di soluzione. La soluzione dal punto di vista fisico è caratterizzata dal fatto che le molecole del soluto sono molto piccole e possono essere considerate come delle strutture puntiformi che diffondono la luce che le colpisce in maniera omogenea. Dal punto di vista ottico questo fa sì che se voi prendete una soluzione, per esempio acqua e zucchero, mescolate in modo che tutto sia omogeneo e poi guardate la soluzione controluce, la vedete limpida. Quindi una soluzione fisicamente si distingue perché otticamente è una soluzione limpida, trasparente. Ora nella nostra soluzione, il plasma, ci sono, però, degli elementi corpuscolati, ad esempio i globuli bianchi e gli eritrociti, che hanno delle dimensioni infinitamente grandi rispetto al singolo ione. Il globulo rosso, che ha una forma assolutamente importante dal punto di vista fisiologico, ha un raggio medio di circa 4 μn nella parte più ampia e uno spessore di circa 0,1 / 0,4 μn. Dunque è molto grande rispetto al singolo ione e ha una forma molto particolare per cui la luce che colpisce il globulo rosso, e vale lo stesso per i linfociti, viene diffratta in maniera disomogenea nella soluzione a seconda dell’angolo di incidenza (ricordiamo che la superficie è disomogenea, non è una superficie sferica). Il risultato è che dal punto di vista fisico la presenza dei globuli rossi rende il sangue una sospensione non una soluzione e la diffrazione disomogenea rende la sospensione opaca. Quindi se prendete il sangue e lo diluite un po’ con la soluzione fisiologica in modo da vedere il fenomeno e provate a guardare il sangue controluce non vedrete un liquido trasparente, ma un liquido opaco. Questa sospensione diventa immediatamente limpida se voi rompete i globuli rossi per esempio utilizzando dei sistemi per emolizzare i globuli rossi (l’emolisi è la rottura dei globuli rossi). In condizioni normali la vita media dei globuli rossi è di circa 120 giorni. L’emolisi può essere

condotta con diversi agenti chimici. Se voi trattate del sangue con del sapone vedrete che il sangue è diventato un liquido trasparente perché abbiamo spezzato tutti i globuli rossi. Abbiamo trasformato una sospensione un soluzione. Dal punto di vista fisico dobbiamo aggiungere che il sangue è un liquido non newtoniano, cioè si comporta come un liquido che non segue le leggi di Newton, leggi che condizionano lo scorrimento del sangue, o comunque di un altro fluido, in un vaso. Un liquido non newtoniano è un liquido la cui viscosità è variabile, non è costante; il liquido newtoniano è un liquido che, al variare della temperatura, al variare del diametro del tubo in cui questo liquido scorre, rimane invariato. Vedremo che ,a seconda del raggio in cui il liquido scorre, cambia e anche di molto la sua viscosità. Quindi il sangue dal punto di vista fisico si comporta come un liquido non newtoniano. Il sangue è rosso. Perché? Voi credete che esistano degli animali con il sangue blu o verde? Sì, esistono. Il colore del sangue nell’uomo è dato dall’emoglobina che è un pigmento respiratorio. A seconda del pigmento respiratorio utilizzato, questo può assorbire la luce a varie lunghezze d’onda. La struttura dell’emoglobina (anche della mioglobina) è tale che assorbe la luce a lunghezze d’onda caratteristiche dell’infrarosso, del rosso. Ci sono degli altri animali, ad esempio dei molluschi, che hanno dei pigmenti di altro colore: l’eritrocruorina è blu, l’emocianina è verde. Sono tutti pigmenti respiratori abbastanza simili tra di loro, però ,a seconda di quello che si utilizza, il sangue è di un colore o dell’altro. Il colore del sangue non è costante, non è sempre rosso: può variare dal viola/blu, rosso cupo e rosso brillante. Il sangue arterioso è di un bel rosso brillante, il sangue venoso è viola/blu, perché? La differenza sta nella percentuale di saturazione del sangue. Tanto maggiore è la percentuale di saturazione dell’emoglobina, tanto più l’assorbimento della luce si sposta verso il rosso e quindi il colore diventa vivace. Il sangue arterioso è appena passato dai polmoni e si è ossigenato: ha una percentuale di saturazione di circa il 98%. Il sangue che ritorna all’atrio destro si chiama invece sangue venoso misto , tale perchè è sangue che proviene da vari distretti corporei ognuno dei quali ha estratto dal sangue una certa quantità di ossigeno: alcuni ne estraggono di più, altri ne estraggono di meno. Non è sempre uguale l’estrazione. Tanto più ossigeno un tessuto estrae tanto minore è la quantità di ossigeno che rimane nel sangue e quindi tanto più desaturata è l’emoglobina. Il sangue proveniente dal muscolo che ha un’attività muscolare intensa sarà molto desaturato perché il muscolo ha estratto molto ossigeno quindi quel sangue sarà più blu/violaceo di quello proveniente da un altro tessuto che ne ha estratto meno. Quindi si parla di sangue venoso misto perché tutto questo sangue venoso a differente concentrazione di ossigeno converge nell’atrio dove viene rimescolato. Il sangue che poi andrà al polmone sarà una mescolanza di quello proveniente dai vari distretti. COAGULAZIONE / DIFFERENZA TRA PLASMA E SIERO / EMATOCRITO Vedremo tra un’attimo quelle che sono le equazioni che ci permettono di stabilire come si fa a ottenere il volume del plasma. Se voi prendete del sangue estraendolo dal letto vascolare e lo lasciate in un bicchiere di vetro, in una provetta, in una capsula Petri ( vaschetta di vetro da laboratorio), il sangue si coagula con un meccanismo chiamato di coagulazione. La coagulazione che cosa comporta? Comporta che vengano attivate una serie di reazioni chimiche complesse che portano alla formazione del coagulo rosso, una struttura tridimensionale formata da una maglia di fibrina che intrappola i globuli bianchi e i globuli rossi e poi si ritrae, diminuisce di volume. Quindi il coagulo è una struttura gelatinosa che congloba tutta la parte corpuscolata e retraendosi il coagulo fa come una spugna che retraendosi butta fuori l’acqua: si retrae per impedire la fuoriuscita degli elementi corpuscolari del sangue ed espelle del liquido. Cos’è questo liquido? Il siero che contiene l’acqua, tutti i Sali che abbiamo visto esserci nel plasma, tutte le proteine plasmatiche tranne il fibrinogeno che è quella proteina che alla fine della cascata chimica della coagulazione serve per formare la maglia stabile di fibrina: la fibrina si forma per attivazione del fibrinogeno. Quindi il fibrinogeno non c’è più in quel liquido che compone il siero perché è stato usato e trasformato in fibrina. Il siero, se volete, è il plasma privato del fibrinogeno. Il siero viene molto usato nei laboratori d’analisi perché è molto comodo da preparare e ha alcuni vantaggi dal punto di vista dell’utilizzo. Quindi spesso in laboratorio si vede l’analisi delle varie componenti del sangue utilizzando il siero. In alcuni casi, però, è meglio utilizzare il plasma. Come facciamo a tirare fuori il plasma dal sangue dal momento che appena tiriamo fuori il sangue dal letto vascolare questo coagula? Ovviamente dovremo trattarlo con delle sostanze specifiche : anticoagulanti. Quindi si estrae una siringa di sangue dal paziente e lo si mette in una provetta nella quale precedentemente abbiamo aggiunto un volumino( pochi μl) di un’anticoagulante. L’anticoagulante interferisce con la serie

di reazioni che inducono alla formazione del coagulo; il coagulo non si forma e quindi rimangono i globuli rossi sospesi nel plasma come se fossero nel letto vascolare. Se prendete il sangue e lo mettete in una provetta che ha un sostegno in maniera tale che la sua posizione sia verticale, all’inizio il sangue arriva ad un certo livello, ma è tutto sangue, è tutto rosso,dopo un po’ (un’ora o due) vedrete che non c’è più il sangue tutto rosso: c’è una parte sotto rossa dove ci sono i globuli rossi e una parte sopra dove non ci sono più i globuli rossi e c’è uno strato di liquido trasparente. Vuol dire che i globuli rossi sono sedimentati, scesi (figura 1). Scendendo lasciano un volume di plasma: quello sopra è soltanto plasma.

FIGURA 1 Questo è un modo per determinare l’ematocrito (ht). L’ematocrito è il volume dei globuli rossi in percentuale nel volume totale e, in un paziente normale, varia tra il 42 e il 45%. Non è vero che si nasce con l’ematocrito del 51%: lo dicono i ciclisti e tutti quei cretini che prendono l’eritropoietina e altre vaccate varie per far aumentare l’ematocrito.

PROTEINE PLASMATICHE e il loro TRACCIATO ELETTROFORETICO Incominciamo adesso a parlare delle proteine plasmatiche. Proteine plasmatiche (circa 6 gr/dl di plasma): -albumine (60%) -globuline(39%) -fibrinogeno(meno dell’1%) Nel plasma le proteine plasmatiche sono circa 6 / 7 grammi per decilitro di cui meno dell’1% è rappresentato dal fibrinogeno che è la proteina dal più alto peso molecolare (superiore al milione di Dalton o comunque sempre superiore a 350.000 Dalton), le albumine sono le più piccole (hanno un peso di circa 68.000 Dalton) importanti da ricordare per quei processi di scambio del liquido nei capillari ematici e nel rene e sono le proteine più abbondanti rappresentando circa il 60% della componente proteica; infine le globuline sono intorno al 39%, con un peso che varia dai 150.000 ai 350.000 Dalton e sono suddivisibili in altre sottoclassi (α1, α2, β, γ ) ,ognuna di queste con le proprie funzioni specifiche. Ora parliamo delle funzioni più importanti delle proteine: -1: trasporto. Lo abbiamo già visto per il sangue; consentono sia il trasporto di gas sia quello di soluti. Il trasporto di gas non è soltanto a carico dell’emoglobina,ma anche a carico delle proteine in generale. L’emoglobina può trasportare sia O2 sia CO2, però c’è un trasporto di Co2 anche da parte di proteine plasmatiche. Le proteine plasmatiche trasportano la CO2 formando dei composti che si chiamano carbamino- composti che trasportano circa il 30% di CO2 nel sangue,quindi è una componente importante. -2: difesa. -3:funzioni difensive dell’emostasi e della coagulazione. - 4: potere tampone.

Le proteine sono delle sostanze anfotere e hanno un ph isoelettrico tra 5 e 5,5. Quando sono poste in una soluzione più basica, le proteine cedono il loro H+ e diventano negative: esse si comportano quindi come degli acidi deboli. Se il ph del mezzo varia, a seconda di come varia, le proteine potranno tenersi il loro H+ se il mezzo diventa più acido o rilasciare il loro H+ se diventa più basico. Le proteine plasmatiche possono dunque far variare il ph della soluzione. Parliamo della pressione colloido-osmotica. La pressione colloido osmotica è chiamata così perché è la pressione osmotica sviluppata dai colloidi e i colloidi presenti nel plasma sono le proteine. Abbiamo detto che i Sali sono responsabili della pressione osmotica dei liquidi corporei : abbiamo detto 300 milliosmoli circa che in termini di pressione corrispondono a 5.000 mmHg. Le proteine sono responsabili di una quota di pressione aggiuntiva.

FIGURA 2 Se questo è il nostro capillare abbiamo qui dentro abbiamo il sangue dove consideriamo nel plasma, ma anche nel globulo rosso, una pressione legata alla presenza dei Sali di circa 5.000 mmHg. Fuori dal capillare abbiamo sempre 5.000 mmHg di pressione osmotica legata ai Sali perché tutti e tre i compartimenti sono in equilibrio. Le proteine plasmatiche sono soltanto nel plasma ( in realtà ce ne sono un pochino anche fuori). Le proteine plasmatiche hanno delle dimensioni tali che non riescono , come fanno invece i Sali, ad uscire dal globulo rosso. Le proteine non escono in quasi tutti gli organi o ne escono pochissime (tranne nel fegato)e quindi rimangono ad una concentrazione maggiore nel plasma rispetto a fuori. Allora oltre ai 5.000 mmHg queste proteine sviluppano una pressione osmotica in più che è di circa 28 / 30 mmHg e, siccome le proteine stanno dentro al vaso e non fuori, esercitano un richiamo di acqua da fuori verso dentro. Quindi rimanendo nel vaso, invece di uscire, le proteine aggiungono alla pressione osmotica normale, una pressione osmotica aggiuntiva che viene chiamata pressione colloido- osmotica perché le proteine sono dei colloidi e, per sottolineare il fatto che siano proprio loro a determinarla, viene definita anche pressione oncotica. Fuori questa pressione è trascurabil perché ci sono poche proteine o non ci sono del tutto. Se ci sono dei casi di infiammazione in cui le proteine escono, anche le proteine fuori dal vaso sono in grado di esercitare una pressione fuori dal vaso che di nuovo è proporzionale secondo la legge di Van Toff: П = cp . R. T Quindi la pressione colloido-osmotica sviluppata dalle proteine anche in questo caso è proporzionale alla loro concentrazione. Più ce ne è più c’è un richiamo d’acqua dall’esterno verso l’interno. Questo è importante quando si va a considerare lo scambio di liquido tra il plasma e i tessuti intorno perché non dimentichiamo che la funzione ultima del circolo è quella di portare il sangue al capillare. La funzione è quella di far passare acqua, soluti, dall’interno del capillare alla cellula che sta lì fuori e ha bisogno di acqua, ossigeno, soluti, ecc… Quindi la funzione ultima è quella di consentire il passaggio di liquidi e soluti dal capillare alla cellula e, a questo livello, la presenza delle proteine plasmatiche che esercitano questa pressione colloidoosmotica vedremo diventa importante perché condiziona questi scambi. Siccome vi parlo di proteine vi faccio vedere questa che è l’elettroforesi delle proteine plasmatiche.

FIGURA 3 L’elettroforesi è una pratica molto comune in biochimica. E’una pratica che consente di frazionare le molecole presenti in una soluzione in base a come si comportano nel campo elettrico. Come si fa per avere questo strano grafico? Si prende un pochino di plasma con dentro le proteine, si mette una gocciolina di questo plasma su un gel apposito( gel di acetato di cellulosa posto in una vaschetta) e si mettono le proteine.

FIGURA 4 Dal disegno si nota la striscettina di acetato di cellulosa dove si mette la gocciolina di plasma. La striscetta viene tirata da due graffette che la tengono bene tesa e i campi vengono bagnati da una soluzione di cui conosciamo il ph( in genere si utilizza una soluzione dal ph molto basico: si usa il tampone fosfato). Cosa succede ? Per quello che dicevamo prima, siccome le proteine hanno un ph isoelettrico =5,5 , se io le metto a bagno come lì nell’acetato, in una soluzione che ha un ph più basico, per esempio 8 , che cosa succede? Le proteine cedono il loro H+ al mezzo che è molto basico e , cedendo l’H+ diventano negative. Adesso faccio passare la corrente ovvero collego questo sistema ad un circuito elettrico, faccio passare corrente in modo che da una parte ci sia il polo positivo, dall’altra parte il polo negativo. Cosa succede? La mia proteina è carica negativamente e dunque è attratta dal polo positivo e comincia a correre lentamente sul gel . Quindi tutte le proteine contenute in questa goccia di plasma migrano in questa direzione. Tutte le proteine si spostano, ma non tutte si spostano alla stessa velocità: quelle più grosse hanno un ingombro sterico maggiore su questo substrato di gel e saranno frenate, quelle più piccole, avendo un ingombro sterico minore, viaggiano più velocemente .Questo non dipende solo dall’ingombro sterico. Se voi avete una proteina piccola e una proteina grande e tutte e due hanno la stessa carica negativa, questa carica negativa sulla proteina più piccola si distribuirà su una superficie sferica più piccola quindi la densità di carica sarà maggiore che non la densità di carica della proteina grande. Quello che trascina la proteina non è la carica in sé, ma è piuttosto la densità di carica cioè la carica ripartita sulla superficie. In questo caso la densità di carica della

proteina piccola è più grande e quindi viene attratta verso il polo positivo più velocemente. Se noi dopo un quarto d’ora fermiamo il circuito e vediamo dove sono piazzate le proteine, troveremo che le più piccole sono più vicine al catodo, mentre dietro avremo le più grosse. L’elettroforesi ci spiega proprio questo. Ci dice qual è l’esito di tutto questo. Sul grafico nelle ordinate deve essere indicata la concentrazione, sulle ascisse il volume. Allora nel caso normale la concentrazione delle albumine è molto alta e le albumine sono quelle che si trovano più a sinistra, più vicine al catodo. Alle albumine seguono le globulina α1, α2, β, γ . Non c’è il fibrinogeno perché questa prova è fatta sul siero e non sul plasma. Perché usiamo il siero e non il plasma? Il plasma sarebbe troppo grande e mi salterebbe la lettura di tutte le proteine. In un diagramma del genere l’area ha un significato importante. A cosa serve l’elettroforesi? A evidenziare quante sono, ad esempio, la albumine rispetto alle globulina ed ogni frazione ha una percentuale importante. Il tracciato elettroforetico di un paziente è importante per determinare se il paziente ha un sangue normale oppure no . Si può stabilire ad esempio se c’è un’infezione in corso; nel grafico qui sotto (figura 5) c’è un caso di ipergammaglobulinemia ovvero vengono prodotte troppe gammaglobuline e ciò vuol dire che c’è un’infezione in atto. Potreste vedere anche un’ipoalbulinemia, cioè è prodotta troppa poca albumina e questa potrebbe essere a carico di una alterazione epatica.

FIGURA 5 Come fa questa curva a dirmi quante sono le albumine in percentuale rispetto al totale? In ordinata c’è la concentrazione e in ascisse la distanza percorsa cioè il volume di distribuzione. In un diagramma in cui un asse è la concentrazione e l’altra asse è il volume, l’area della curva è la quantità perché dimensionalmente la quantità per la legge della diluizione che abbiamo già visto è concentrazione per volume. L’area della curva è il prodotto dell’ordinata per l’ascissa e viene calcolato mediante una procedura che si chiama integrale. Facciamo un’inciso sull’integrale.

FIGURA 6

Se io ho un’area rettangolare (figura 6) come faccio a trovare il valore? Base per altezza(a per b) io faccio l’area che,indicando x1,x2,y1,y2 sarà uguale a Δx . Δy.

FIGURA 7 Adesso prendiamo quest’altra figura (7). E’ molto più complicato? No. Indicando sempre x1, x2, y1,y2, l’area in questo caso sarà (Δx . Δy)/ 2 perché è base per altezza diviso 2 .

FIGURA 8 Allora in questo grafico (figura 8) sull’asse delle ordinate c’è la velocità, su quello delle ascisse c’è il tempo e vado dal punto a al punto b, nel senso che a tempo 0 parto, corro a velocità costante per 10 minuti. Quanto spazio ho percorso? Allora la velocità = spazio / tempo. Se io calcolo questa area che dimensioni avrà? Avrà le dimensioni della velocità per il tempo e quindi è uno spazio.

FIGURA 9 Lo stesso concetto lo applico anche nel caso in cui il grafico non sia così facile ( figura 9). Se io ho un grafico come questo con la concentrazione sull’asse delle ordinate e il volume su quello delle ascisse, l’area di questa cosa qui avrà le dimensioni della concentrazione per il volume : è

una quantità. Allora quando io ho il tracciato elettroforetico l’area totale del tracciato mi dà l’area delle albumine + area delle globuline α1 + area delle globuline α2 + area delle globuline β + area delle globuline γ. Se io misuro l’area totale ho la quantità totale di proteine che io ho messo nel volumetto di liquido su cui ho fatto l’elettroforesi. Se misuro l’area dei singoli picchi trovo l’area per esempio dell’albumina. Quindi area albumina / area di tutti i picchi = percentuale delle albumine rispetto al totale. Adesso il problema è trovare l’area delle albumine, delle globuline, fare la somma e fare i conti. Come faccio a trovare l’area se la figura geometrica è complicata come questa? Faccio l’integrale. In alcuni casi le funzioni sono molto semplici e possono essere descritte da una retta, un’iperbole, una parabola e allora basta fare l’integrale dell’equazione e si arriva direttamente ad un valore.

FIGURA 10 Se la funzione è complicata si misura l’area da un punto di vista grafico non dal punto di vista matematico o analitico e si fa questo ragionamento: se io divido la base in tanti segmenti tutti uguali tra di loro io posso immaginare di tirare delle linee e immaginare che l’area di questa figura geometrica è la somma dell’area di ogni singolo tratto.

FIGURA 11 Prendete questo pezzo qua (figura 11). Mettiamo che questo segmento ab sia un segmento lineare, l’area sarà facile da trovare sarà base . altezza /2. poi facciamo nel secondo pezzetto l’area del rettangolo + area del triangolo delineato dal segmento lineare bc e così via. Il problema è che non sempre il segmento ab è una retta, se fosse una curva come faccio? Allora divido la base in segmenti più piccoli possibili, infinitesimali. E se i segmenti sono infinitesamente piccoli, arrivo a farli così piccoli in modo che il segmentino in alto diventi in effetti rettilineo. Allora se questi segmenti sono rettilinei l’area di ogni tratto la calcolerò come la base . l’altezza … Ingrandiamo l’immagine..

FIGURA 12 Consideriamo il segmento di base Δx infinitesamente piccolo e il segmento in alto lineare (ab), conoscerò facilmente l’area del rettangolo delimitato superiormente da ac (base . altezza), ma come farò a conoscere l’area del triangolo soprastante? Che altezza prendo per calcolare l’area di tutto? Prendo l’altezza pari a metà di questo tratto perché i due triangoli in neretto nella figura sono uguali tra di loro allora l’area di abc è uguale all’area acde. Quindi in pratica se io divido in segmenti sempre più piccoli otterrò che l’area totale non è altro, segmento per segmento, che la somma dell’area di tanti rettangolini. Quindi questo è il procedimento dell’integrale. Per arrivare a definire l’area di una superficie si procede con l’integrale . L’integrale è il prodotto dimensionale dell’altezza per la base. Ecco perché nel tracciato elettroforetico l’area di ogni singola frazione ci permette di ricavare l’area di ogni singolo picco proteico. I valori normali sono indicati nel diagramma 1. Il rapporto tra le albumine e tutte le globuline messe insieme è circa 1:4 ( comunque tra 1:3 e 1:5). Se vedete un’elettroforesi di un paziente come nel diagramma 2 vedete subito che ci sono degli squilibri perché le albumine sono scese e, se la somma di tutti i picchi deve essere 100, se un picco diminuisce gli altri aumentano di conseguenza, però la cosa importante, che si vede proprio anche graficamente, è che questo picco ( quello che indica le γ globuline) che prima era molto piccolo, ora si è davvero innalzato molto arrivando al 40% quindi questo soggetto ha un’ ipergammaglobulinemia, ha un’infezione di qualche tipo. Quindi ecco perché questo tracciato è importante dal punto di vista funzionale e bisognerà chiederlo ogni giorno ad ogni paziente. BIOFISICA Incominciamo a parlare un po’ di biofisica. Vi ho detto prima che il sangue è composto da una parte corpuscolata e da una parte liquida. Allora possiamo fare questa stima. A.

Vs : Vgr = 100: ht Ht = Vgr/Vs . 100

Vs = volume del sangue Vgr = volume dei globuli rossi totali presenti nel sangue Ht = ematocrito Fate una proporzione e possiamo dire che il volume del sangue, posto uguale a 100, sta al volume del globulo rosso, intendendolo come volume totale dei globuli rossi presenti nel sangue,come 100 sta ad ht (ematocrito). Questa proporzione ci consente di esprimere il

volume totale della parte corpuscolata in relazione al volume del sangue. Quando parliamo di ematocrito ci si riferisce ai globuli rossi. Come mai non si parla mai di globuli bianchi e piastrine? Perché i globuli rossi sono 5.000.000 per mm cubo, i globuli bianchi sono 5.000 per mm cubo(1.000 volte meno) quindi meno dell’1% del volume totale di cellule del sangue è composto da globuli bianchi e piastrine, quindi il 99,5% è formato da globuli rossi e quindi quando si parla di ematocrito la componente che si va ad indagare non è quella dei globuli bianchi o dell piastrine, ma quella dei globuli rossi. Quindi potremo esprimere l’ematocrito dicendo che è il rapporto tra volume dei globuli rossi / volume del sangue moltiplicato per 100. Questa è la definizione classica di ematocrito. Se volete, conoscendo l’ematocrito, stabilire il volume del sangue, non fate altro che risolvere questo calcolo derivante sempre dalla proporzione A : Vs = Vgr / ht . 100 Potete anche esprimere il volume del sangue, o meglio potete calcolare il volume del sangue, conoscendo il volume del plasma e l’ematocrito perché sono ovviamente correlati. B.

Vs :Vpl = 100: (100 – ht) Vs = Vpl/ (100 – ht) . 100

Vpl = volume plasma Ponendo il volume del sangue pari a 100, il volume del globulo rosso è l’ematocrito quindi il volume del plasma sarà 100 meno l’ematocrito. Il volume del sangue sta al volume del plasma come 100 sta a 100 meno l’ematocrito. Quindi il volume del sangue è il volume del plasma / (100-ematocrito) . 100. Vi dico subito che questo valore, che calcoleremo dopo, si aggira al 41%, 42%. E’ importante adesso chiarire bene il concetto di densità. Il sangue è considerato un liquido non newtoniano perché la sua viscosità è variabile. Attenzione a non confondere la viscosità con la densità: sono cose molto diverse: hanno due unità di misura diverse, due valori diversi, sono concettualmente del tutto differenti. Per densità si intende il rapporto tra massa e volume. Densità = massa / volume Q=c.V

c=Q/V

δ = grammi / cm3

δ = densità

Grammi è una massa e cm3 è un volume. Dilemma amletico: la concentrazione e la densità hanno la stessa unità di misura perché entrambe sono massa su volume, ma assolutamente no!! Sono due cose diverse. La concentrazione è la quantità del soluto in un volume di solvente: la concentrazione delle proteine plasmatiche è grammi di proteine in 100 ml di plasma. Quindi in questo caso voi avete una soluzione in cui c’è del solvente in acqua e avete sospese i grammi di proteine quindi la concentrazione mi dice quanti grammi di proteine ci sono in un certo volume di liquido. Consideriamo ora la densità. Voi prendete un pezzo di torta : è un solido (ha una massa ). Pesate la torta e vien fuori che la torta è 50 grammi. Che volume ha questa torta? La torta ha una forma cubica, fate il calcolo: è lunga 5 cm e è alta 5 cm. 5.5.5= 125 cm3. Allora la densità della torta sarà 50 grammi /125 cm3. Capite che è diverso? Questa è la massa e il volume di un solido. La concentrazione è la massa di un soluto in un volume di solvente. E’ sempre quantità diviso volume, ma in un caso è il volume di un solido (la densità) , nell’altro è quella di un liquido. La densità vale per un solido, ma anche per un liquido: Per esempio la densità dell’acqua distillata a 20° C è di 1 gr /cm3 : vuol dire che se voi prendete 1 cm3 di acqua distillata a 20°C vuol dire che quella lì pesa 1 grammo. L’acqua è una struttura molto particolare perché sapete che la sua densità varia : il ghiaccio galleggia ( è sempre acqua); se galleggia è perché la densità del ghiaccio è inferiore a quella dell’acqua. Il ghiaccio nella sua struttura tridimensionale a parità di peso ha un volume maggiore e quindi la densità del ghiaccio è inferiore a quella dell’acqua. Quindi la densità del plasma, del globulo rosso e del sangue sono diverse. La densità del plasma è un po’ più alta di quella del l’acqua distillata perché ci sono dentro un po’ di soluti e quindi quelli pesano di più della singola molecola di acqua. La densità maggiore è quella del globulo rosso ed è pari ad 1,10 gr / cm3 quindi 1,03 gr

/ cm3 il plasma e il sangue ha un valore intermedio tra plasma e globulo rosso ed è di circa 1,06gr / cm3. La differenza di densità tra il globulo rosso e il plasma circostante è quello che provoca un fenomeno importante che è l’eritrosedimentazione. Immagino che voi sappiate che un esame clinico, ematico importante e molto frequente è la misura della velocità di eritrosedimentazione, la famosa VES ( velocità di eritrosedimentazione).

FIGURA 13 Dunque qui c’è il disegnino del globulo rosso immerso nel plasma e il puntino rappresenta il centro di gravità del globulo rosso, il baricentro del globulo rosso. Assumiamo che il globulo rosso sia puntiforme ( non è puntiforme ). Il nostro globulo rosso che è immerso nel liquido a quali forze è sottoposto? Sarà sottoposto a due forze. Una è il suo peso che tende a farlo scendere nel liquido( la forza di gravità agisce su tutti i corpi compreso il globulo rosso), però nel momento in cui è immerso nell’acqua è soggetto ad un’altra forza che è la spinta archimedea che dice, voi lo dovreste sapere, che tutti i corpi immenrsi in un fluido ricevono una spinta dal basso verso l’alto pari al peso del volume del liquido spostato. Quindi quando andremo nella vasca da bagno spostiamo dell’acqua e , se la vasca fosse più grande, riceveremmo una spinta dal basso verso l’alto. E’ lo stesso principio del galleggiamento degli scafi. Abbiamo una forza peso che tende a spostare il globulo rosso verso il basso e una forza di galleggiamento (FL)che lo spinge in su . Queste forze hanno la stessa direzione, ma verso opposto quindi dovremo calcolare come forza risultante la differenza tra le due. Dunque : FR= FP

–

F

L=

F

P

-S

A

= M.g – M

LI .

g

F R = forza risultante F P = forza peso F L = S A = spinta archimedea g = costante di gravità terrestre M L = massa del liquido spostato Ricordando che δ = M / V e dunque M = δ . V Quindi sostituendo nella formula precedente : V gl . δ gl . g - V

L .δ L.

g =

V gl = volume del globulo rosso δ gl = densità del globulo rosso V L = volume del liquido spostato δ L = densità del liquido spostato Allora siccome il volume del liquido spostato è uguale al volume del globulo rosso diremo: V gl . g . ( δ gl – δ L )

L’osservazione da fare è che: F R < 0 allora il globulo rosso sedimenta F R > 0 allora il globulo rosso è sospinto verso l’alto F R = 0 allora il globulo rosso è sospeso nel plasma Il sughero galleggia nell’acqua perché la densità del sughero è inferiore a quella dell’acqua e quindi il sughero sta in cima, galleggia sull’acqua. Un pezzo di ferro scende nell’acqua perché la sua densità è maggiore di quella dell’acqua e lo stesso fa il globulo rosso. Esso sedimenta perché la sua densità è 1,10 gr/ cm3 invece di 1 gr /cm3 . Quindi la forza risultante è positiva e quindi il globulo rosso comincia a scendere. Però intanto che scende abbiamo un corpo che si sposta in un fluido . Nel momento in cui si sposta incontra un attrito viscoso e l’attrito viscoso, come vedremo, dipende da molti fattori. Comunque per una legge ( la legge di Stokes) un corpo sferico che scorre a velocità costante in un fluido la forza di attrito esercitata dal fluido sulle superfici del corpo sferico può essere ricavata da questa formula : F

A=

6.П.r.η.v

F A = forza di attrito r = raggio della sfera η = viscosità del liquido v = velocità Quindi il globulo rosso che sta scendendo scende a velocità costante quando la forza con cui scende cioè la forza risultante è uguale e contraria alla forza di attrito. Se la forza di attrito fosse molto più alta della forza che spinge il globulo rosso verso il basso cosa farebbe il globulo rosso ? Si fermerebbe. Come se voi mettesse il globulo rosso nel miele : il fluido è talmente viscoso e l’attrito è talmente elevato che il globulo rosso non scende. Se invece la forza di attrito e la forza risultante sono uguali il globulo rosso scende a velocità costante. Se la forza risultante fosse maggiore della forza di attrito la velocità sarebbe non costante, ma continuerebbe a crescere quindi il globulo rosso scenderebbe di moto uniformemente acellerato. In realtà in questo caso si fa in modo che il globulo rosso scenda di moto uniforme e quindi la forza di attrito sia uguale e contraria alla forza risultante. F

A

=F

R

6 . П . r . η . v = V gl . g (δ gl – δ L ) v = V gl . g ( δ gl – δ

L

) . 1 / (6. П . r ) . 1/ η

v = velocità con cui il globulo rosso sedimenta nel plasma = VES VES = 4/ 3 . П . r 3 . 1 / (6 . П . r . η ) . g ( δ gl – δ pl) = 2/5 mm / h 4/3 . П . r3 = volume del globulo rosso che è assimilabile al volume di una sfera r = raggio del globulo rosso = 4 μm r3 = raggio al cubo П = 3,14 η = 1,6 centipois g = 980 cm/s2 Una domanda classica dell’esame è calcolare la velocità di eritrosedimentazione utilizzando questa formula. Il risultato è che la velocità è tra i 2 e i 5 mm / h (h=ora). Nel caso però che ci siano delle modificazioni della superficie del globulo rosso e questo si verifica in alcune circostanze ( ad esempio in un caso infiammatorio). Quello che succede è questo. Immaginate di avere la vostra provetta con i globuli rossi.

FIGURA 14 V1 e V2 sono i due globuli rossi. Allora la densità del globulo rosso V1 sarà : δ 1 = M1 / V1 La densità del globulo rosso 2 sarà: δ 2 = M2 / V2 i due hanno la loro densità più o meno simile quindi scendono tranquilli ed hanno una velocità media di eritrosedimentazione di 5 mm/ h. Però adesso interviene un fattore infiammatorio. In questo caso si instaura uno strano comportamento della membrana in cui si attuano delle differenziazioni della membrana che interagisce in maniera diversa rispetto a prima e diversa dalla membrana degli altri globuli rossi cioè queste membrane diventano più affini le une verso le altre e questi globuli rossi invece di essere dispersi come sono normalmente si uniscono tra di loro a formare delle pile , si impilano l’uno sull’altro fino a formare delle strane strutture in cui tanti globuli rossi impilati tra di loro (4,5, 10 globuli rossi). Queste strutture si chiamano rouleaux. E queste strutture hanno una densità maggiore a quella del singolo globulo rosso , perché? Perché la massa del singolo globulo rosso rimane quella che è e però , siccome si pigiano l’uno sull’altro, il volume totale del rouleaux è inferiore alla somma dei volumi di tutti i rouleaux cioè la densità del rouleaux sarebbe uguale alla M1 + M2 , ma il volume del rouleaux è inferiore a V1 + V2 . Quindi la somma delle masse è uguale, ma la somma dei volumi no e allora la densità aumenta. Se aumenta la densità , in base all’equazione che abbiamo visto prima, aumenta la differenza di densità tra il rouleaux e il plasma e aumenta la velocità con cui il rouleaux scende verso il basso. Per cui voi fate fare un esame del sangue al vostro pazienta , gli chiedetela VES e la VES di questo pazienta non è 5, è 81 ad esempio. E’ un parametro molto aspecifico: non vi dice quale problema c’è, quale patologia. La patologia può andare da un ascesso al dente ad uno stato febbrile a un’influenza ad una leucemia. Però è un termine indicativo che ci sia qualche cosa che non va quindi è un termine importante. Questa è l’espressione diretta da cui si può derivare il valore preciso di ematocrito? Partendo dalla densità scriviamo quale è l’ematocrito di un soggetto normale. Come si fa? Si parte sempre dalle masse. M sg = M gl +M pl M sg = massa del sangue M gl = massa dei globuli rossi M pl = massa del plasma Ricordando sempre che M = δ . V δ sg . V sg = δ gl . V gl + δ pl . V pl Attenzione !! Un errore comune che si fa è quello di dire V sg = V gl + Vpl !!! E’ sbagliato !! Per poterlo dire dovremmo avere le stesse densità: soltanto se tutte e tre le densità fossero uguali potremmo fare una cosa del genere. Ma sono diverse quindi non possiamo farlo!! Allora assoceremo al V sg = 100 V gl = Ht

V pl = 100 – Ht Quindi sostituendo δ sg . 100 = δ gl . Ht + δ pl (100 – Ht) δ sg . 100 – δ pl . 100 = δ gl . Ht – δ pl . Ht 100 . ( δ sg – δ pl) = Ht . ( δ gl – δ pl) Ht = 100 . ( δ sg – δ pl ) / (δ gl – δ pl) Ht = 100. ( 1,06 – 1, 03 ) / ( 1,10 – 1,03) = 42,8% Per avere un valore di ematocrito più alto cosa bisogna fare? In entrambi i casi è una vaccata quella che si fa comunque si può o diminuire la densità del globulo rosso rispetto a quella del plasma. Vedi medici sportivi con gli atleti che fanno queste porcherie!! Riprendiamo il volume del sangue. Il sangue è circa il 7% del peso corporeo in volume, però in realtà questa è una stima che si fa sulla base delle misure effettive. Può essere utile misurare il volume del plasma e del sangue in un paziente : adesso sapete che, conoscendo l’ematocrito, se avete il volume di plasma potete conoscere il volume di sangue; se avete il volume di sangue potete conoscere il volume di plasma e così via. Allora, una volta che si sa l’ematocrito, la cosa più facile da conoscere è il volume di plasma. Siccome l’ematocrito è circa il 45% del volume totale di sangue se abbiamo 5 litri di sangue abbiamo circa 3 litri di plasma e circa 3 litri di globuli rossi. Questi sono numeri approssimativi : se dovete fare un’analisi su un paziente dovete avere dati più precisi. Allora come si fa a misurare il volume del plasma e poi ovviamente quello del volume di sangue conoscendo l’ematocrito? Un metodo che però non si fa sul paziente è quello del dissanguamento. E non è applicabile nemmeno sull’animale da esperimento perché non tutto il sangue viene estratto e allora si è dovuti inventare un sistema preciso che come al solito si basa sull’equazione della diluizione. Q s = c . V pl Q s = quantità di soluto Inietto la quantità di soluto nella vena del paziente , aspetto che giri bene, quando si è dispersa in tutto il volume del plasma io faccio il prelievo di sangue, tiro fuori il plasma, misuro la concentrazione di questa sostanza che ho messo. Misuro la concentrazione, la quantità la conosco perché l’ho messa dentro io e ottengo : V pl = Q s / c C è la concentrazione di soluto 5 minuti dopo averlo iniettato. Questo va bene se voi foste degli ingegneri. Il problema è questo: bisogna decidere di utilizzare la sostanza giusta. Questo è stato un bel problema perché la sostanza da utilizzare deve avere dei requisiti, deve essere: - non tossica → se voi iniettate una sostanza tossica nel paziente misurate la sua concentrazione nel plasma e poi è morto e allora non vi serve a niente; - non deve essere metabolizzabile → se usate una sostanza che viene o assorbita o prodotta, quella quantità Q s che avete iniettato dopo un po’ non è più la stessa perché o è stata assorbita oppure ne viene prodotta, invece dovete essere sicuri che quel Q s deve rimanere in quella quantità nel circolo; - non deve uscire dal letto vascolare → se esce dal letto vascolare va nell’interstizio e non lo trovate più nel plasma e quindi di nuovo la quantità totale diminuisce e voi non potete più misurare V pl perché Q s non è più quella che avete introdotto voi, ma di meno. Questa sostanza in effetti esiste. Nei primi tempi veniva usato il blu ivans. Il blu ivans è un colorante non tossico, è blu, se viene mescolato al plasma si lega alle albumine e quindi transita insieme alla albumine. Non è tossico, non viene metabolizzato perché, siccome voi tenete questo tracciante per pochi minuti nel plasma, non si fa in tempo a metabolizzare una proteina quindi quella che avete messo dopo dieci minuti è ancora lì. Quindi andava

abbastanza bene e per un po’ si è utilizzato il blu ivans. Poi in tempi più recenti si sono utilizzate delle proteine radioattive e, se voi doveste mai misurare il plasma di un paziente, lo farete utilizzando la tecnica con le albumine radioattive anche perché queste sono molto sensibili : ne potete mettere pochissime e la risposta è molto buona. Però adesso c’è il problema che anche le albumine sono delle sostanze endogene e, anche se poco, un po’ dal letto vascolare escono. E allora si sono dovuti fare un po’ di ragionamenti. In più un problema che si è dovuto affrontare è il fatto che se voi iniettate una quantità Q, un bolo Q, voi prendete questa quantità qui e la diluite in un pochino di soluzione fisiologica e lo iniettate. Fate conto di iniettare questa quantità Q s nel letto vascolare del paziente, però io voglio misurare il volume di tutto il sangue del paziente , non solo quello che c’è qui: quello che c’è nel fegato , nel muscolo, nell’encefalo. Quindi se io lo inietto qui come faccio a misurare il volume che c’è nel fegato o nell’encefalo? Devo dargli tempo per aspettare che si rimescoli. I primi minuti questo bolo non si è mescolato perché bisogna che si sposti questa quantità Q girando più volte nel circolo finchè si è ben rimescolato . Allora vediamo di ricominciare ad affrontare questo problema. Prendiamo un grafico: in ordinata mettiamo la concentrazione e in ascisse mettiamo il tempo. Dobbiamo immaginare che questa quantità Q sia fatta di una sostanza che non esce ( noi sappiamo che esce e dopo ne teniamo anche conto) . Pensiamo al fatto che questa si debba rimescolare. Allora se io metto al tempo 0 questo bolo di sostanza Q s dentro nel letto vascolare all’inizio e poi dopo un minuto faccio di nuovo un prelievo qua il cubetto insieme al sangue ha fatto tutto il giro e si trova di nuovo qui : è un po’ diluito, ma non è ancora diluito in tutto il volume di sangue, ci mette un po’. Se io quindi ogni due o tre minuti faccio un prelievo via via che il tempo passa vedo che, siccome il liquido si rimescola con questo soluto, la concentrazione del soluto che prima era alta qua pianino pianino scende un po’ . Quando non scende più vuol dire che ha fatto abbastanza giri per essersi mescolata bene con tutto il plasma e quindi la concentrazione non cambia più. Quindi se io immagino che questo soluto non esca , che ci sono delle biglie e queste girano che cosa succede? Vedrei una cosa del genere. Vedrei una curva fatta così.

FIGURA 15 Questa curva è la curva che descrive il rimescolamento. La concentrazione qua , C del soluto qui così è la concentrazione che assume il mio soluto , il mio marker quando il mio rimescolamento è totale e quindi è una concentrazione che mi va bene perché è quella che voglio quando tutto si è rimescolato. Ci siamo? Ora però la mia sostanza non è fatta così perché in realtà o gli metto delle biglie di vetro e non è il caso ( ci sono in realtà delle microsfere che sono delle palline che vengono usate in laboratorio e che possono essere delle dimensioni che si vuole ) . Ma non possiamo iniettare delle microsfere in un paziente. Quindi nel paziente noi usiamo delle albumine e queste escono. Allora cosa pensiamo? Se io ho una sostanza che esce la quantità di questa sostanza nel tempo diminuisce. Se diminuisce questa quantità diminuisce la concentrazione , giusto? Quindi se io avessi una sostanza che metto dentro e si mescola istantaneamente con tutto il plasma e fosse fatta in modo tale da non uscire dal letto vascolare che cosa vedremmo? Vedremmo che se questa sostanza qua , la stessa, fosse una sostanza che non subisce più il rimescolamento, facciamo finta che appena metto dentro di colpo si rimescola ( non è vero, ma ammettiamo che sia vero) che concentrazione avrebbe? Questa.

Qui ci vuole del tempo . Se noi ammettiamo che invece che volerci questo tempo si distribuisca istantaneamente allora io prendo questa quantità Q s, la metto dentro, istantaneamente abbiamo questa concentrazione. Adesso noi però abbiamo questa sostanza e mettiamo che, a differenza di questa , la sostanza esca. Se esce Q s diminuisce piano piano e la concentrazione anche diminuisce pianin pianino. Quindi io troverei una cosa del genere.

FIGURA 16 Questa è la curva che io troverei se ci fosse solo l’uscita del tracciante. La realtà è , come al solito più complicata delle due cose perché è la frammistione delle due cose. Quindi quando io metto dentro il mio soluto Q s ,di quantità Q, quello che io devo affrontare è il fatto che si rimescola, ma intanto che si rimescola esce. La curva reale è la somma delle due: è questa che vi disegno in rosso.

FIGURA 17 Allora adesso abbiamo costruito parte per parte la curva. Adesso ve la ridisegno. Voi fate l’esperimento e avete una curva che è questa ( la disegno in rosso dato che è in rosso anche lì). Come faccio a calcolare la concentrazione che mi serve? Qui lo so qual è la concentrazione . Quale sarebbe qui la concentrazione? Sarebbe questa : c al tempo 0, perché questo punto è il punto in cui io sono al tempo 0 per cui al tempo 0 io ho la quantità Q che è ancora tutta intera ( non l’ ho ancora persa, giusto?). Questa concentrazione è la concentrazione a cui il mio tracciato si ripartirebbe in tutto il volume di plasma al tempo 0 prima di avere avuto qualsiasi fenomeno di uscita. Quindi se io riuscissi a misurare questo c 0 semplicemente io direi questo lo conosco quindi questo lo conosco perché l’ho pesato, quindi c 0 lo misuro e quindi V pl = Q s / c 0. In realtà io ho una curva del genere quando faccio la mia prova con il mio paziente. Non ho queste tre fasi. Io ho questa curva. Domanda : come faccio a trovare c 0 ? Analizzo la curva e vedo che un tratto è curvilineo ( questo tratto curvilineo è quello che riflette il fenomeno del rimescolamento che ha un andamento esponenziale). Alla fine del tratto di rimescolamento vedete che questo tratto è rettilineo, ma anche questo tratto è rettilineo perché l’uscita è continua e ha un andamento lineare. Quindi se io esamino questa curva nel momento in cui la curva da curvilinea diventa lineare, vuol dire che è finito il rimescolamento. Se io estrapolo la fase lineare della curva al tempo 0 ottengo questo punto che è il punto che io sto cercando. Questo è il mio c 0. Questo punto è il punto che io posso recuperare dalla curva

sperimentale una volta che io ho individuato la fase lineare della curva, la estrapolo al tempo 0 perché questa fase lineare è quella che descrive l’uscita. Se io la estrapolo al tempo 0 trovo la concentrazione. Se il rimescolamento fosse più rapido avrei una curva che si linearizza prima, se fosse più lento la curva si linearizzerebbe dopo. Avete capito? Quindi questa qui è la costruzione della curva in tre fasi per cercare di capire quali sono le componenti facendo delle assunzioni, l’altra è la curva così come la vedete nel paziente e il modo con cui si può tornare indietro e tornare a individuare il c 0. Una volta che avete c 0 il Q 0 lo conoscete derivate il volume del plasma e sulla base dell’ematocrito riuscite anche a misurare quant’ è il volume del sangue. Questo è il metodo corretto per misurare il volume plasmatico.