Bacteriologia Clinica Procesamiento De Muestras

ÍNDICE GENERAL TÉCNICAS DE COLORACIÓN................................................................................................................................................. 3 Coloración de Gram ................................................................................................................................................ 3 Fundamento ................................................................................................................................................... 3 Técnica de Gram ............................................................................................................................................ 3 Interpretación.................................................................................................................................................. 4 Forma de Reportar ......................................................................................................................................... 4 Limitaciones.................................................................................................................................................... 4 Coloración de Ziehl Neelsen ................................................................................................................................... 5 Técnica de Ziehl Neelsen ............................................................................................................................... 5 Interpretación.................................................................................................................................................. 6 Técnica de la Coloración de Gram (Esquema) ....................................................................................................... 7 Técnica de la coloración de Ziehl Neelsen (Esquema) ........................................................................................... 8 Técnicas de Coloración. Ejercicios de Autoevaluación ........................................................................................... 9 TRACTO GENITOURINARIO ................................................................................................................................................ 10 Urocultivo .............................................................................................................................................................. 12 Método del Asa Calibrada (Método Semicuantitativo) .................................................................................. 12 Consideraciones .................................................................................................................................. 12 Lectura de Urocultivos según el Método del Asa Calibrada ................................................................. 12 Criterios para la Cuantificación de Urocultivos según el Método del Asa Calibrada ............................ 13 Método de Dilución (Método Cuantitativo).................................................................................................... 13 Criterios para la Interpretación de Urocultivos .............................................................................................. 14 Método del Asa Calibrada (Método Semicuantitativo). Esquema ......................................................................... 15 Método de Dilución (Método Cuantitativo). Esquema ........................................................................................... 16 Tracto Genital Alto ................................................................................................................................................ 17 Tracto Genital Bajo ............................................................................................................................................... 18 Secreciones Uretrales........................................................................................................................................... 18 Secreciones Vaginales.......................................................................................................................................... 19 Tracto Genitourinario. Ejercicios de Autoevaluación. Casos Clínicos ................................................................... 20 TRACTO RESPIRATORIO .................................................................................................................................................... 23 Tracto Respiratorio Inferior ................................................................................................................................... 24 Esputo .......................................................................................................................................................... 24 Clasificación de las muestras de Esputo.............................................................................................. 25 Criterios para la Interpretación y el Reporte del Frotis Directo de Esputo............................................ 25

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Patógenos Probables en muestras de esputo...................................................................................... 26 Criterios de interpretación............................................................................................................ 26 Aspirado/Lavado Bronquial, Cepillado Bronquial Protegido y Secreción Transtraqueal............................... 27 Criterios de Interpretación de Probables Patógenos en muestras de aspirado/lavado bronquial y cepillado bronquial protegido ............................................................................................................... 27 Secreción Traqueal y Endotraqueal.............................................................................................................. 28 Tracto Respiratorio Superior ................................................................................................................................. 28 Exudado Faringeo, Nasofaringeo y Exudado/Secreción Nasal .................................................................... 28 Tracto Respiratorio. Ejercicios de Autoevaluación. Casos Clínicos ...................................................................... 30 TRACTO GASTROPINTESTINAL ........................................................................................................................................... 33 Coprocultivo .......................................................................................................................................................... 33 Escherichia coli productora de Diarrea ......................................................................................................... 35 Esquema de Identificación de Escherichia coli Productoras de Diarrea ....................................................... 38 Tracto Gastrointestinal. Ejercicios de Autoevaluación. Casos Clínicos................................................................. 40 LÍQUIDOS ORGÁNICOS ESTÉRILES ..................................................................................................................................... 43 Sangre (Hemocultivo) ........................................................................................................................................... 43 Esquema para el Procesamiento de Hemocultivos (Repique Inicial)............................................................ 45 Esquema para el Procesamiento de Hemocultivos (Repique Final) ............................................................. 46 Consideraciones Especiales......................................................................................................................... 47 Informe de los Resultados ............................................................................................................................ 47 Líquido Cefalorraquideo........................................................................................................................................ 48 Esquema para el procesamiento de LCR ..................................................................................................... 50 Informe de los Resultados ............................................................................................................................ 50 Líquido Pleural, Pericárdico, Peritoneal y Sinovial ................................................................................................ 51 Esquema Para el Procesamiento de Otros Líquidos Estériles ..................................................................... 51 Informe de los Resultados ............................................................................................................................ 52 Líquidos Orgánicos Estériles. Ejercicios de Autoevaluación. Casos Clínicos ....................................................... 53 MUESTRAS DE TEJIDO ÓSEO, PIEL, TEJIDOS BLANDOS Y OTROS ......................................................................................... 56 Tejido Óseo........................................................................................................................................................... 56 Piel ........................................................................................................................................................................ 57 Tejidos Blandos..................................................................................................................................................... 57 Conducto Auditivo Externo.................................................................................................................................... 58 Secreciones Oculares ........................................................................................................................................... 59 Muestras de Tejido Óseo, Piel, Tejidos Blandos y Otros. Ejercicios de Autoevaluación. Casos Clínicos............. 60

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Técnicas de Coloración

TÉCNICAS DE COLORACIÓN (LIC. MARIBEL CASTELLANO GONZÁLEZ M.SC)

COLORACIÓN DE GRAM La Tinción de Gram, descrita hace poco más de cien años por Hans Christian Gram, se usa con mucha frecuencia para el examen microscópico directo de muestras y subcultivos. FUNDAMENTO: La diferencia fundamental entre una bacteria Gram positiva y una Gram negativa radica fundamentalmente en la pared celular. Las Gram positiva poseen más del 60% de su pared celular compuesta por mureína (peptidoglucano) y el resto, está representado por los ácidos teicóicos y otros componentes menos importantes. Esta armazón mureínica impide que el decolorante (alcohol-acetona) penetre la pared, y por lo tanto, disuelva la unión salina formada entre el Cristal Violeta y el Yodo con los componentes ácidos (ribosomas y ácido desoxirribonucleico del filamento cromosómico). No sucede lo mismo con las bacterias Gram negativa, cuya mureína representa menos del 10 % de los componentes de la pared. Actualmente, se conoce la compleja estructura de las bacterias Gram negativa, las cuales tienen una pared con gran cantidad de componentes grasos, especialmente lipoproteínas y lipopolisacáridos. Estos últimos son los componentes fundamentales de la llamada membrana externa, la cual es el límite externo del espacio periplasmático de la pared. Aquí es donde radica la gran diferencia con las Gram positiva. La escasa mureína y la abundancia de lípidos, permiten una acción disolvente poderosa del alcohol, sólo o mezclado con la acetona. La disolución de la pared permite que el alcohol llegue a la intimidad del citoplasma bacteriano, llevándose el colorante violeta y la bacteria queda decolorada. El otro colorante empleado, la safranina, añadido posteriormente en la última etapa de la coloración, teñirá de rojo–rosado a las bacterias previamente desteñidas. No obstante, ninguna composición química exclusiva de la pared bacteriana parece explicar la coloración con Gram; ya que las gruesas paredes de las células de levadura, que también se tiñen como Gram positiva, tienen una composición química y una estructura diferente de las bacterias Gram positiva. TÉCNICA DE GRAM Proceda a elaborar un frotis y fíjelo al calor. Coloque la lámina que contiene el extendido sobre un soporte adecuado para mantenerlo en posición horizontal. Proceda entonces a: 1. Cubrir la lámina con cristal violeta. Dejar actuar por un minuto. (Este es el colorante primario que se une a la pared celular bacteriana). 2. Lavar con agua corriente. 3. Cubrir la lámina con lugol. Dejar actuar por un minuto. (Actúa como mordiente para la unión del colorante). 4. Lavar con agua corriente.

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Técnicas de Coloración

5. Sobre la lámina, deje correr el decolorante orgánico (alcohol-acetona) hasta que la solución de lavado no salga teñida con el colorante violeta. Si lo prefiere, puede mantener la lámina sujeta entre el dedo pulgar e índice y colocarla de manera que se obtenga un ángulo de 45º. Por lo general, el tiempo requerido para la decoloración no sobrepasa los 10 segundos. 6. Lavar de nuevo con agua corriente. 7. Cubrir el frotis con una solución de safranina (colorante de contraste). Dejar actuar por 30 segundos. 8. Lavar con agua corriente. 9. Colocar la lámina con el frotis en posición vertical para escurrir el exceso de agua y permitir que seque espontáneamente al aire. En su defecto, se puede emplear papel secante. 10. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación y observar al microscopio con objetivo de 100X y ocular de 10X, lo cual resulta en un aumento total de 1.000X. INTERPRETACIÓN En base a ella, las bacterias pueden dividirse en dos grandes grupos: Gram positiva, que se tiñen con el cristal violeta y aparecen de color azul-violeta intenso y, Gram negativa, las que se tiñen con la safranina y aparecen de color rojo-rosado. Aquellas bacterias que carecen de pared celular, como los micoplasmas, no toman la coloración de Gram y, por lo tanto, no se pueden definir como Gram positivas o negativas; ya que son no reactivos a esta técnica de tinción. Existen microorganismos que se tiñen indiferentemente como Gram positivo o Gram negativo y son denominados Gram variables. Se cree que son bacterias que han perdido la habilidad de reaccionar en forma diferencial a esta coloración. Esto generalmente sucede en cultivos viejos (con más de 48 horas de incubación). Se asume que este fenómeno ocurre debido a modificaciones en la pared celular provocadas por la edad del cultivo. En consecuencia, se recomienda que los frotis sean elaborados a partir de cultivos de no más de 24 horas de incubación. Esta coloración diferencial permite observar la morfología, disposición y afinidad tintorial de las células bacterianas. FORMA DE REPORTAR Morfología: cocos, bacilos y cocobacilos. Afinidad Tintorial: Gram positiva y Gram negativa. Disposición: cocos en racimos (estafilococos); cocos en cadenas (estreptococos); cocos en pares (diplococos); cocos en grupos de cuatro (tetradas); cocos en grupos de ocho (sarcinas); cocos aislados. LIMITACIONES La coloración de Gram no permite identificar específicamente ciertas estructuras bacterianas, tales como: la cápsula, los flagelos o las esporas; así como tampoco proporciona buenos resultados en la investigación de micobacterias y hongos, salvo en el caso de algunas especies de levaduras. Estas limitaciones no son absolutas y como ya se ha demostrado; en ocasiones pueden observarse la cápsula o esporas; aunque no sean teñidas en forma específica; pero 4

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quedan expuestas contra un fondo coloreado o contrastando con el cuerpo bacteriano bien teñido. Por otra parte, las micobacterias, pueden ser vistas como bacilos; pero se hace necesario realizar la Coloración de Ziehl Neelsen o de Kinyoun para demostrar su carácter ácido resistente. Finalmente, es conveniente destacar que, existen numerosas modificaciones de las fórmulas de las soluciones utilizadas en la técnica de coloración e incluso, del tiempo empleado en cada uno de los pasos señalados. Realmente, lo importante, es el empleo de un procedimiento similar en cada laboratorio para evitar variaciones en los resultados. COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de Carbono). Este grueso material céreo, los provee de una cubierta impermeable al Cristal Violeta, y otros colorantes básicos, lo que hace que sean difíciles de colorear. Sin embargo; una vez teñidos, poseen la propiedad de resistir la decoloración con solventes orgánicos fuertes, como el alcohol ácido. Por este motivo, a estos microorganismos se les denomina Ácido Resistentes, un fenómeno descubierto por Ziehl y Neelsen en 1.882. Las micobacterias como Mycobacterium sp. y Nocardia sp.; así como los ooquistes de parásitos coccídeos, tales como: Cryptosporidium sp., Isospora belli y Sarcocystis sp., se caracterizan por sus propiedades de ácido resistencia. Es necesario un tratamiento especial para que la tinción primaria, carbol fucsina, atraviese el material céreo de los bacilos ácido-alcohol resistentes. En la técnica convencional de Ziehl-Neelsen se usa calor (coloración en caliente). La modificación de Kinyoun se denomina “método en frío” porque se usa un detergente activo de superficie, como tergitol, en lugar de calor. Utiliza un decolorante más débil (0.5-1.0 % de H2SO4) en lugar de alcohol ácido al 3 %. Esto ayuda a diferenciar entre organismos que son débiles o parcialmente ácido resistentes, particularmente, Nocardia sp. Cualquiera de los dos métodos es satisfactorio. TÉCNICA DE ZIEHL-NEELSEN 1. Elaborar un frotis a partir de un cultivo puro de M. tuberculosis. (Usar portaobjetos nuevos y libres de grasa). 2. Fijar el frotis, utilizando para ello, una plancha de calentamiento (60ºC durante 10 minutos como mínimo; y dos horas, como máximo). 3. Aplicar un papel de filtro sobre el portaobjetos con el frotis y colocar la lámina sobre un soporte de metal para la coloración.

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Técnicas de Coloración

4.

Cubrir la preparación con la fucsina fenicada (colorante primario), calentando a la llama de una lámpara de alcohol por debajo de la lámina (durante 5 a 10 minutos) hasta obtener la emisión de vapor (3 veces). (El vapor actúa como mordiente). Evite que la lámina se seque, agregando más colorante si es necesario. 5. Retirar el papel de filtro (con ayuda de una pinza) y lavar el portaobjetos con agua hasta que el colorante deje de salir. Sacudir el exceso de líquido. 6. Cubrir el portaobjetos con solución decolorante (alcohol ácido) durante 1 minuto aproximadamente. Comprobar que no se desprende más color rojo al escurrir el portaobjetos. Decolorar hasta que apenas quede una traza de color rosado. 7. Lavar con agua y eliminar el exceso. 8. Cubrir la lámina con el colorante de contraste (Azul de Metileno) y dejar en contacto por 1 ó 2 minutos. 9. Lavar con agua corriente. Escurrir y dejar secar al aire. No secar con papel absorbente. 10. Observar al microscopio óptico con objetivo de inmersión. INTERPRETACION Los microorganismos ácido-alcohol resistentes aparecerán de color rojo intenso; mientras que el fondo de los elementos celulares y otras bacterias, se tiñen de azul, el color del colorante de contraste. Las micobacterias, frecuentemente, aparecen como bacilos ligeramente curvos que muestran la propiedad de ácido resistencia (BAR). Pueden presentar gránulos más oscuros y dar la impresión de estar fragmentados.

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Técnicas de Coloración

TÉCNICA DE LA COLORACIÓN DE GRAM

Cristal Violeta (1´) Lavar con agua

Lugol (1´) Lavar con agua

Lavar con agua

Safranina (30 ‘’)

Lavar con agua. Observar al microscopio óptico con objetivo de inmersión (100X). Las bacterias Gram positivas aparecerán de color violeta intenso y las Gram negativas, de color rojo. Decolorar con alcohol-acetona hasta que deje de salir el color violeta.

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TÉCNICA DE LA COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN

Lavar con agua Fucsina básica (15´) Calentar 3 veces hasta la emisión de vapores

Lavar con agua

Decolorar con alcohol ácido, hasta que deje de salir el color rojo

Colorear con azul de metileno por 1´

Lavar con agua

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Técnicas de Coloración

TÉCNICAS DE COLORACIÓN EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIÓN 1. Investiga los siguientes términos: Mureína Ácidos Teicóicos Espacio periplasmático

Peptidoglucano Ácidos micólicos

2. Si las bacterias pueden ser vistas en el microscopio sin coloración, entonces, ¿por qué? se recomienda el fijado y coloración en microbiología. 3. Supón que al colorear con Gram un extendido a partir de un cultivo puro de bacterias, al observar en el microscopio observas cocos de color rojos y púrpura, las células adyacentes, no son siempre del mismo color, ¿Qué puedes concluir?. 4. Si la coloración de Gram tiñe células humanas, ¿Cómo se observarían en un extendido?. 5. ¿Cuáles son las estructuras con pared celular deficiente? 6. ¿Cuáles son las limitaciones de la coloración de Gram? 7. Asumiendo que la coloración ácido resistente puede colorear cualquier célula, ¿puede un organismo ácido resistente ser Gram positivo o negativo?. Explique. 8. ¿Cómo se relacionan las propiedades de ácido-resistentes con la coloración de Gram? 9. ¿Cómo se realizaría el control de calidad de las técnicas de Gram y Ziehl Neelsen?

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Tracto Genitourinario

TRACTO GENITOURINARIO El tracto genital y urinario están estrechamente relacionados desde el punto de vista anatómico, y algunas enfermedades que afectan un sistema, afectan también al otro, especialmente en la mujer. El trato urinario superior y la vejiga son generalmente estériles. La uretra contiene bacterias residentes como Streptococcus, Bacteroides, Mycobacterium, Neisseria y bacilos entéricos entre otros. La mayoría de las bacterias encontradas en la orina son el resultado de la contaminación con la microbiota de la piel a su paso por la uretra. La presencia de bacterias en la orina no se considera indicativo de infección del tracto urinario, a menos que se encuentre en una cantidad significativa en la muestra. Las infecciones que se presentan en el tracto urinario pueden localizarse desde el riñón hasta la uretra. Se presentan generalmente como infecciones simples cuando no están presentes anormalidades anatómicas o neurológicas, mientras que los pacientes con procesos obstructivos, cálculos o con problemas neurológicos generalmente presentan cuadros complicados. Generalmente las infecciones urinarias se adquieren por vía ascendente, es decir, desde la uretra hasta los riñones, la vía menos usual es la hematógena, a partir de focos sépticos a distancia o infecciones generalizadas, los microorganismos que más frecuentemente utilizan esta vía son Staphylococcus aureus y Mycobacterium tuberculosis. El agente etiológico más frecuentemente aislado en infecciones urinarias es Escherichia coli, ocasionalmente, se pueden aislar microorganismos Gram positivo de los géneros Staphylococcus y Streptococcus, los cuales son significativos solo si se correlacionan con un contaje alto y un crecimiento puro del microorganismo. Existen discrepancias acerca de la necesidad o no de evaluar cultivos de orina durante la terapia antimicrobiana, algunos autores argumentan que se hace necesario repetir un cultivo de orina de 48-72 horas después iniciarse la terapia, con el objeto de evaluar la respuesta al tratamiento y justificar su uso por varios días más, hasta completar un tratamiento efectivo; es importante destacar que estos cultivos deberán ser negativos y que la presencia o ausencia de piuria, no es un indice relativo de la enfermedad. La bacteriuria positiva durante el tratamiento generalmente se puede presentar por la aparición de cepas resistentes o que fueron sensibles inicialmente; por la reinfección de un organismos resistente a la droga elegida; por insuficiencia renal lo que impide niveles adecuados del antibiótico o por la elección inadecuada del antibiótico. La recuperación del agente etiológico es positiva en un alto porcentaje (80%-95%), tanto en hombres como en mujeres, cuando la muestra ha sido recolectada correctamente, después de haber lavado los genitales externos y haber descargado los primeros mililitros de orina.

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Tracto Genitourinario

Muchas infecciones del tracto urinario como cistitis o pielonefritis, son causadas por patógenos oportunistas y están relacionadas a contaminación fecal de la uretra y a procedimientos médicos como cateterización; esta técnica no está muy indicada, excepto, que debe realizarse para confirmar un diagnóstico de etiología no muy claro o por razones terapéuticas, ya que existe un alto riesgo de infección después de la cateterización en lo pacientes sometidos a ella; por otro lado, es difícil diferenciar si los microorganismos aislados proceden de la colonización uretral normal o son de origen urinario. La punción suprapúbica es uno de los métodos más seguros y simples que existen para obviar la contaminación uretral o del introito, debe ser realizada por personal competente en pacientes donde no se ha establecido un diagnóstico de infección a pesar de la sintomatología o en los pacientes que se sospecha bacteriuria anaeróbica. La mayoría de las infecciones del tracto genital son transmitidas mediante la actividad sexual y por lo tanto se denominan enfermedades de transmisión sexual (ETS). La mayoría de la enfermedades bacterianas, si se descubren oportunamente, pueden tratarse de manera eficaz con antibióticos. El uso de preservativos previene de una manera muy efectiva su transmisión. Neisseria gonorrhoeae es el microorganismo que debe investigarse prioritariamente en muestras procedentes del tracto genital, así como en cualquier exudado o lesión que presente en individuos con enfermedades de transmisión sexual. Si el paciente es homosexual, deben obtenerse muestras rectales y orofaringeas para cultivo, lo mismo que frotis directo para tinción de Gram. La presencia, en un frotis directo de secreción uretral coloreado con Gram, de diplococos Gram negativos intra y extracelulares, es diagnóstico de uretritis por N. gonorrhoeae en el hombre, no así en la mujer en quien es necesario procesar el cultivo. La presencia de una descarga cervical en las mujeres a veces puede ser de gran ayuda en el diagnóstico, pero un frotis directo coloreado con Gram obtenido de tal descarga no puede determinar la presencia o ausencia de N. gonorrhoeae por la gran cantidad de flora que puede observarse y por tanto los cultivos deberán hacerse sin excepción. En el caso de vaginitis inespecífica, la muestra tomada de fondo de saco vaginal, previa colocación del especulo, resulta satisfactoria para el aislamiento de otros microorganismos diferentes que se involucran con mucha facilidad en este proceso infeccioso. Las muestras deben ser sembradas directamente sobre medios de placas de agar Thayer Martin o VCN, agar sangre y agar chocolate que se incuban a 35-17°C por 48 horas en atmósfera del 5 al 10% de CO2. Para el aislamiento de Gardnerella vaginalis deben sembrarse placas de agar sangre que se incuban en CO2.

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Tracto Genitourinario

UROCULTIVO 1. MÉTODO DEL ASA CALIBRADA (MÉTODO SEMICUANTITATIVO) Mezclar bien la orina. Esterilizar el Asa Calibrada (0.01 ml.) y dejar enfriar. Introducir el Asa Calibrada en posición vertical en la orina para asegurar que la cantidad apropiada de muestra se adhiera a la misma. Colocar el Asa cargada con la muestra en la parte superior de la placa, repartir el inóculo en línea recta a todo lo largo del diámetro de la placa. Sin flamear ni introducir de nuevo el asa en la orina, practicar trazados en toda la placa rayando a partir del trazo central para obtener colonias aisladas. Sin flamear, introducir nuevamente el asa verticalmente en la orina para transferir otra asada a las placas restantes (se repite el procedimiento de los dos pasos anteriores). CONSIDERACIONES En niños menores de cinco años, se recomienda utilizar el medio de GC para la recuperación de cepas de H. influenzae, ya que en esta población puede comportarse como patógeno. Antes de descartar las placas se deben reincubar por 24 horas adicionales colocando la placa de MC a temperatura ambiente, y la de SH/GC en microaerofilia a 35°C; esto se realiza con el fin de detectar crecimiento en muestras de pacientes con tratamiento antimicrobiano y favorecer el desarrollo de bacterias cuya temperatura óptima de crecimiento es de 22-25 °C (temperatura ambiente). Para el reporte de los resultados se deben utilizar los rangos especificados en la tabla Nº 1. LECTURA DE UROCULTIVOS SEGÚN EL METODO DEL ASA CALIBRADA: 0,01 ml = volumen de orina que dispensa el Asa Calibrada. 0,01 ml x 100 = 1ml (FACTOR = 100)

UFC / ml = UFC × FD

Ejemplos: a) Si crece una colonia en cualquiera de los medios, equivale a 100 UFC/ml de orina, ya que: UFC / ml = colonias contadas × 100 (Factor de dilución) ≈ 1 × 100 = 100 UFC / ml < 10 3 Reportar: NEGATIVO.

(

)

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b) Si crecen 200 colonias; UFC / ml = 200 × 100 = 20.000 UFC / ml de orina 10 4 − 10 5 Reportar: Género: Especie: Contaje: 10.000 - 100.000 UFC/ml de orina.

(

)

TABLA Nº 1 CRITERIOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE UROCULTIVOS SEGÚN EL MÉTODO DEL ASA CALIBRADA: Número de UFC 1-10 10-100 100-1000 > 1000

Número de UFC/ml < 103 (< 1000 = negativo) 103-104 (1000-10000) 104-105 (10000-100000) > 105 (>100000)

2. MÉTODO DE DILUCIÓN (MÉTODO CUANTITATIVO) Mezclar bien la orina. Tomar dos placas de SH, dos de MC y una de GC y marcarlas orina puro (OP), 10-2 y 10-4; (como lo muestra el diagrama). Tomar con una pipeta 0,1 ml de la muestra y colocarlos en la placa marcada como OP. Tomar 0,1 ml de la muestra y colocarlos en 9,9 ml de SSF, esta es la dilución 10-2; mezclar bien y colocar 0,1 ml de esta dilución en las placas marcadas 10-2. Tomar 0,1 ml de la dilución 10-2 y colocarlos en 9,9 ml de SSF, esta es la dilución 10-4, mezcla bien y colocar 0,1 ml de esta dilución en las placas marcadas 10-4. Para el rayado de las placas, utilizar una espátula en “L” o la punta de una pipeta estéril, hacer el rayado de mayor a menor dilución Incubar las placas de SH y GC en microaerofilia y las de MC en aerobiosis a 35ºC de 18 a 24 horas.

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Tracto Genitourinario

CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIÓN DE UROCULTIVOS Situación Cultivo puro en contaje ≥ 1000 UFC/ml Cultivo con dos microorganismos en contajes ≥ 10000 UFC/ml Cultivos puros de S. aureus, Candida sp., Salmonella sp., Haemophilus influenzae, y Gardnerella vaginalis en cualquier contaje Cultivo con dos o tres microorganismos en contajes de 1000-10000 UFC/ml Tres o más microorganismos

Conducta a seguir Procesar Procesar Procesar Repetir la muestra haciendo énfasis en la asepsia. Si se obtienen resultados similares identificar Se considera un urocultivo mal tomado o contaminado, excepto que el urocultivo provenga de pacientes con catéter permanente (24 horas o más), en este caso se procesa.

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Tracto Genitourinario

MÉTODO DEL ASA CALIBRADA (MÉTODO SEMICUANTITATIVO)

Verifique los datos del paciente y mezcle bien la orina

Realice un trazo central a todo lo largo de la placa en su parte central

Esteriliza el asa calibrado y espere que se enfríe

Realice los trazos laterales de la parte superior a la inferior de la placa

Introduzca el asa calibrada (0,01ml) verticalmente en la muestra de orina y verifique tomar el volumen correcto

Incube las placas: SH: 35ºC; 5-10% CO2; 18-24h MC: 35ºC; aerobiosis; 18-24 h

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Tracto Genitourinario

MÉTODO DE DILUCIÓN (MÉTODO CUANTITATIVO)

Mezclar bien la orina, transferir con una pipeta estéril 0,1 ml de la muestra a una placa de SH marcada como orina pura (OP) y 0,1 ml a un tubo con 9,9 ml de SSF marcado como 10-2.

0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml

Mezcle bien el tubo con la dilución 10-2 y transfiera con una pipeta estéril 0,1 ml a una placa de GC y a una de MC marcadas como 10-2; luego, transfiera 0,1 ml de la dilución 10-2 a un tubo con 9,9 ml de SSF marcado como 10-4. 0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml

Mezcle bien el tubo con la dilución 10-4 y transfiera con una pipeta estéril 0,1 ml a una placa de SH y a una de MC marcadas como 10-4. 0,1 ml

Las placas de SH y GC se incuban de 18 a 24 horas en microaerofilia y MC en aerobiosis a 35ºC.

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Tracto Genitourinario

TRACTO GENITAL ALTO Este tracto comprende diferentes tipos de muestras tales como: material de trompas de Falopio, ovarios, útero, etc., se deben investigar bacterias anaeróbicas en este tipo de muestras. Sembrar placas de SH, GC, VCN, MC, SB, SH y SHA, además un CT. Realizar un frotis directo coloreado con Gram. Muestra

Las placas de SH y GC se incuban en microaerofilia, MC, SB y CT en aerobiosis a 35ºC de 18-24 horas, mientras que SHA en anaerobiosis a 35ºC de 48-72 horas. El frotis directo de la muestra es importante ya que permite enviar al médico un reporte presuntivo inicial acerca del proceso infeccioso del paciente, éste se debe reportar, las formas de reporte son las siguientes: DIRECTO NEGATIVO: Al examen microscópico directo coloreado con Gram no se observó morfología bacteriana. DIRECTO POSITIVO: Al examen microscópico directo coloreado con Gram se observaron [bacterias (especificando morfología, afinidad tintorial, agrupación y semicuantificación), células (especificando tipo y semicuantificación), otros elementos (especificando cada uno y su semicuantificación)]. En cuanto al cultivo, una vez identificados los diferentes microorganismos se deben reportar de la siguiente manera: CULTIVO NEGATIVO: No se observo crecimiento bacteriano después de 48 horas (especificar el tiempo si es mayor) de incubacion. CULTIVO POSITIVO: Género: Especie: Cantidad: (escasa, moderada, abundante) Antibiograma: 17

Tracto Genitourinario

TRACTO GENITAL BAJO Este comprende muestras de secreciones vaginales, secreciones uretrales, espermocultivos, etc., en este tipo de muestras no está recomendada la investigación de bacterias anaeróbicas. Sembrar placas de SH, GC, VCN, MC y SB.

Realizar un frotis directo coloreado con Gram. Muestra

Realizar un examen al fresco (solo en secreciones vaginales).

Las placas de SH ,GC y VCN se incuban en microaerofilia, MC y SB en aerobiosis a 35ºC de 18-24 horas. El frotis directo de la muestra es importante ya que permite enviar al médico un reporte presuntivo inicial acerca del proceso infeccioso del paciente. SECRECIONES URETRALES: Los directos de secreciones uretrales procedentes de pacientes masculinos para la investigación de Neisseria gonorrhoeae, se deben reportar de la siguiente manera: INFORME NEGATIVO: Al examen microscópico directo coloreado con Gram no se observaron diplococos gram negativos intra o extra celulares. INFORME POSITIVO: Al examen microscópico directo coloreado con Gram se observaron diplococos Gram negativos intra y/o extra celulares en cantidad (abundante, moderada o escasa).

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Tracto Genitourinario

SECRECIONES VAGINALES: A las secreciones vaginales se les debe hacer un examen al fresco y un extendido coloreado con Gram. Para el examen al fresco, preparar una suspensión fuerte en 0,5 ml de SSF (0,85%), incubar a 37ºC por 30 minutos, esto se hace para favorecer la motilidad de Trichomonas vaginalis y facilitar su visualización. El reporte se debe realizar de la siguiente manera: EXAMEN AL FRESCO AL EXAMEN AL FRESCO SE OBSERVARON (Células epiteliales, leucocitos, células claves, bacterias, Trichomonas vaginalis, levaduras, etc.), especificar cantidad. DIRECTO COLOREADO CON GRAM AL EXAMEN MICROSCOPICO DIRECTO COLOREADO CON GRAM SE OBSERVARON. (Células epiteliales, polimorfonucleares, células claves, levaduras, bacterias [especificando morfología, afinidad tintorial y agrupación], etc., especificando la cantidad). CULTIVO NEGATIVO: Si es negativo para los potencialmente patógenos investigados, reportar: FLORA VAGINAL NORMAL EN CANTIDAD (Abundante, moderada o escasa). CULTIVO POSITIVO: Si es positivo para los potencialmente patógenos investigados, reportar: Género: Especie: Cantidad: Antibiograma:

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Tracto Genitourinario

TRACTO GENITO URINARIO EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIÓN 1. Investiga los siguientes términos: Microbiota Pielonefritis Cistitis Enfermedad inflamatoria pélvica Uretritis inespecífica Uretritis gonocócica Especulo Salpingitis

Litiasis renal Punción suprapúbica Bacteriuria Vaginitis Vaginosis Vaginitis inespecífica Thayer-Martin Disuria

2. 3. 4. 5.

¿Qué criterios se deben tomar en cuenta para elegir el método de urocultivo a utilizar? ¿Por qué en un urocultivo las placas de SH y GC se incuban en atmósfera microaerofílica?. ¿Por qué urocultivos con tres o más microorganismos no se deben procesar en el laboratorio? ¿Por que urocultivos puros con S. aureus, Candida sp., Salmonella sp., Haemophilus influenzae, y Gardnerella vaginalis en cualquier contaje se procesan? 6. ¿Cuáles serían las muestras de orina aptas para la investigación de bacterias anaeróbicas? 7. ¿Cómo sospecharía de una tuberculosis renal y que pruebas realizaría para comprobarla en el laboratorio? 8. ¿Cuáles son las bacterias que más frecuentemente producen infecciones urinarias? 9. ¿Si un paciente presenta un cuadro clínico de infecciones urinarias a repetición y en los urocultivos no se aísla ningún microorganismo, de que agentes bacterianos no convencionales sospecharía y como los detectaría en el laboratorio? 10. ¿Por qué se utilizan criterios en la interpretación de un urocultivo y no se procesa y reporta todo lo que crece en los medios de cultivo? 11. Mencione los agentes bacterianos productores de infecciones genitales no cultivables en el laboratorio de bacteriología de rutina y las diferentes metodologías diagnósticas que se utilizan para su detección.

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Tracto Genitourinario

CASOS CLÍNICOS 1. Mujer de 21 años de edad que se presentó en el servicio médico de la universidad refiriendo aumento de la frecuencia urinaria de dos días de evolución, acompañada de urgencia urinaria y disuria. La orina adquirió un color rosado o sanguinolento durante 12 horas aproximadamente. La paciente no tenía antecedentes de infección de vías urinarias, pero había iniciado su vida sexual activa recientemente y utilizaba diafragma y espermicida. La temperatura de ingreso fue de 37,5 °C, frecuencia cardiaca de 105/minuto y presión arterial de 105/70 mmHg. A la exploración física únicamente se encontró como dato anormal dolor leve a la Crecimiento en el cultivo palpación profunda del área suprapúbica. Las pruebas de laboratorio indicaron una elevación ligera de la cuenta leucocitaria 10.500/ml, con 66% de PMN. El nitrógeno ureico sanguíneo, la creatinina, glucosa y electrolitos séricos se encontraron normales. El sedimento urinario contenía leucocitos innumerables, eritrocitos en cantidad moderada y muchas bacterias, sugestivo de infección de las vías urinarias. El cultivo reveló el crecimiento en contaje de más de 100.000 UFC/ml de orina de un bacilo Gram negativo que creció en MC. La paciente curó a los tres días de terapia con Trimetoprim-sulfametoxazole. ¿Que cuadro clínico presentó la paciente? ¿De que microorganismo(s) sospecha como productor(es) del cuadro clínico? ¿Qué factores predisponentes favorecieron la aparición del cuadro? 2. Hombre de 67 años de edad que presentó fiebre y choque a los tres días después de haberse sometido a una resección transuretral de la glándula prostática. Dos semanas antes el paciente había presentado obstrucción urinaria con retención secundaria al crecimiento de la glándula; el diagnóstico fue hiperplasia prostática benigna. Fue necesaria la cateterización vesical. Al finalizar la cirugía, se dejó un catéter vesical conectado a un sistema cerrado de drenaje. Dos días después de la cirugía, el paciente presentó fiebre de 38°C, al tercer día del postoperatorio mostró confusión y desorientación, así como temblores muy intensos; la temperatura fue de 39°C, la frecuencia cardiaca de 120/minuto y la tensión arterial de 90/40 mmHg. A la exploración física el paciente contestó correctamente su nombre, pero se encontraba desorientado en tiempo y lugar. La exploración de la región cardiopulmonar y del abdomen fue normal. Se encontró sólo ligero dolor en el área costovertebral del riñón izquierdo. Las pruebas de laboratorio indicaron un hematocrito y hemoglobina normales, pero con elevación de la cuenta leucocitaria de 18.000/ml con 85% de PMN. El nitrógeno ureico Crecimiento en el cultivo sanguíneo, la creatinina, la glucosa y los electrolitos séricos se hallaron normales.

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Tracto Genitourinario

Se colectó una muestra de orina a través del catéter mediante aguja y jeringa. El sedimento urinario contenía leucocitos innumerables, algunos eritrocitos y numerosas bacterias, lo cual indicaba una infección de vías urinarias. El urocultivo mostró crecimiento de más de 100.000 UFC/ml de un Gram negativo que creció en MC, confirmándose así el diagnóstico de infección del tracto urinario. Se realizó un hemocultivo y se aisló el mismo microorganismo. El paciente fue tratado con líquidos, cefalosporinas de tercera generación, gentamicina y tobramicina por vía intravenosa, logrando recuperarse por completo, La misma cepa bacteriana se aisló de otros pacientes en el mismo hospital. ¿De que microorganismo(s) sospecha como productor(es) del cuadro clínico? ¿Qué factores predisponentes favorecieron la aparición del cuadro? ¿Hubo compromiso renal? ¿Qué complicaciones sufrió el paciente? ¿A qué otras conclusiones se puede llegar en este caso? 3. Niño de 8 años que, desde hace un mes, presenta enrojecimiento de la mucosa del glande y tumefacción prepucial asociadas a la emisión de una secreción purulenta que mancha la ropa interior y que, en las últimas 24 horas, muestra una coloración verdosa. Simultáneamente se viene quejando de escozor y ligeras molestias no relacionadas con la micción. Se refieren dos procesos amigdalares en las seis últimas semanas. A la exploración se aprecia buen estado general, está febril y existe una tumefacción prepucial con eritema veteado de la mucosa del glande. La retracción completa del prepucio permite la salida de una secreción espesa y verdosa, alojada en el repliegue balanoprepucial. Un examen directo de la secreción se puede apreciar en la fotografía, y el cultivo muestra crecimiento de colonias beta hemolíticas, mientras que, en las secreciones faríngeas solo crece flora saprofita. El urocultivo es normal así como el sedimento en fresco de la orina, el hemograma y la velocidad de sedimentación. Los niveles iniciales de ASLO fueron de 492 U/ml con descenso en el control de convalescencia. Fue tratado con penicilina V durante 7 días apreciándose mejoría desde el segundo y aparente curación desde el cuarto. Cinco semanas más tarde reaparece la tumefacción y el exudado purulento en el que vuelve a cultivarse el mismo microorganismos aislado anteriormente, el paciente es tratado con eritromicina durante 10 días, remite el proceso no presentado, posteriormente, recaídas. ¿Que cuadro clínico presentó el paciente? ¿De que microorganismo sospecha como productor del cuadro clínico?

Frotis directo

Crecimiento en el cultivo

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Tracto Respiratorio

TRACTO RESPIRATORIO El tracto respiratorio superior comprende la cavidad oral, la nasofaringe y la orofaringe. La gran cantidad de flora normal presente en la nariz, cavidad oral y faringe hace que los cultivos de tracto respiratorio deben ser interpretados con mucha precaución. El aislamiento de algunos patógenos potenciales como S. aureus, H. influenzae, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, algunos miembros de la familia Enterobacteriaceae; así como algunas especies de levaduras, no representan un papel importante en la etiología infecciosa del tracto respiratorio superior (TRS), a menos que, su cantidad predomine sobre la flora normal, se presenten en cultivo puro o se encuentren en pacientes hospitalizados en muy malas condiciones generales o inmunosuprimidos que pueden ser colonizados fácilmente por estos microorganismos. Neisseria meningitidis, Streptococcus pyogenes y Corynebacterium diphtheriae, son los microorganismos que tienen verdadera relevancia en las infecciones del TRS, aún cuando se encuentren en portadores sanos. En pacientes hospitalizados, pacientes en coma o incapaces de recolectar muestras adecuadas de esputo y en los cuales se sospecha de infecciones pleuropulmonares, producidas por microorganismos aeróbicos y anaeróbicos, las secreciones del tracto respiratorio inferior (TRI) se deben obtener por aspiración transtraqueal percutánea, las muestras obtenidas de esta manera previenen la contaminación con la flora orofaríngea. Generalmente las muestras de esputo son recogidas inadecuadamente, presentándose en la mayoría de los casos contaminación con la flora orofaríngea, en estas muestras es muy difícil determinar cual de los muchos patógenos potenciales aislados es el responsable de una infección pulmonar. El cultivo rutinario para el diagnóstico de una neumonía bacteriana aguda representa un trabajo difícil, si la muestra no ha sido tomada adecuadamente. Un frotis directo de la muestra coloreado con Gram puede ser de gran ayuda, se dice que una muestra es adecuada para cultivo, cuando se observan menos de 10 células epiteliales por campo y al menos igual o mayor cantidad de polimorfonucleares con el objetivo de menor aumento. En algunos casos, la etiología de una infección pulmonar podrá ser determinada por una biopsia de pulmón obtenida por fibronoscópia, una toracocentesis, aspiración de un absceso o empiema o biopsia abierta de pulmón.

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Tracto Respiratorio

TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR ESPUTO A pesar que las infecciones del tracto respiratorio inferior son una causa importante de morbilidad y mortalidad, el diagnóstico de estas infecciones es frecuentemente complicado debido a la contaminación, durante su recolección, de las muestras con microorganismos del tracto respiratorio superior. Debido a que el tracto respiratorio superior puede ser colonizado por microorganismos potencialmente patógenos no involucrados en infecciones del tracto respiratorio inferior, el laboratorio debe asegurar que la muestra que se procesa sea apropiada. La muestra debe ser examinada microscópicamente para asegurar su calidad y en la búsqueda de microorganismos asociados con una respuesta inflamatoria celular. Las muestras aceptables son: esputo, aspirado traqueal y transtraqueal, lavado bronquial, bronquioalveolar, cepillado bronquial, biopsia bronquial y Aspirado pulmonar o biopsia de pulmón. Las muestras inaceptables son: saliva en lugar de esputo, esputos con 24 horas o más de tomados e hisopados. Es importante procesar la muestra lo más rápidamente posible, ya que una demora en el procesamiento de 1 a 2 horas puede conducir a la pérdida de microorganismos patógenos fastidiosos y a un sobrecrecimiento de bacilos Gram negativos. Todas las muestras de tracto respiratorio deben ser procesadas en cabinas de seguridad biológica, o se debe utilizar mascarilla, para evitar riesgo de contaminación por aerosoles. Las muestras mediante un procedimiento invasivo se deben tratar como “valiosas” ya que, el procedimiento para su toma es un riesgo para el paciente, por lo que esta debe ser manejada y evaluada adecuadamente para evitar su repetición. Cuando es solicitado, se pueden investigar bacterias anaeróbicas en muestras de cepillado bronquial protegido, siempre y cuando las muestras se hayan tomado y transportado adecuadamente. Los aspirados/lavados bronquiales o cepillados no protegidos no son muestras aceptables para el cultivo de bacterias anaeróbicas. Al analizar muestras del tracto respiratorio inferior, como esputo, es importante realizar un frotis. Este debe ser observado con objetivo de 10X, esta visualización permite verificar la calidad del esputo, ya que una buena muestra posee una relación de 2 células polimorfonucleares por cada célula epitelial, además, permite detectar la presencia de estructuras fúngicas u otras estructuras no convencionales. Se deben examinar como mínimo 10 campos microscópicos, haciendo especial énfasis, en aquellos con presencia de células polimorfonucleares. Posteriormente se debe observar la lámina con objetivo de 100X y semicuantificar las células epiteliales, polimorfonucleares y los microorganismos como: escasos, moderados y abundantes.

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Tracto Respiratorio

CLASIFICACION DE MUESTRAS DE ESPUTO Células por campo microscópico* Grupo Leucocitos Celulas epiteliales planas 6 <25 <25 5 >25 <10 4 >25 10-25 3 >25 >25 2 10-25 >25 1 <10 >25 Grupos 4, 5 y 6 aptos para cultivo.

*Aumento de 100 (objetivo 10x)

Criterios para la Interpretación y el Reporte del Frotis Directo de Esputo Microorganismo predominante: si se observa predominio de un microorganismo en áreas de inflamación, este se debe semicuantificar y reportar, si además se observan otras bacterias, se deben semicuantificar y reportar conjuntamente como “y morfotipos bacterianos mixtos”. Microorganismos no predominantes: semicuantificar y reportar “morfotipos bacterianos mixtos”. Si no se observan microorganismos: reportar “no se observaron microorganismos”. Estructuras fúngicas y células de levadura: semicuantificar y reportar “hifas presentes”; si es posible describir la apariencia de las hifas (segmentadas, pseudomicelio, etc.). No semicuantificar y reportar levaduras separadamente, a menos que sean el microorganismo predominante o estén presentes en cantidad abundante. Cuando una muestra de esputo es apta para cultivo se debe sembrar en placas de

Sembrar placas de SC, GC, MC, SB y SCK.

Realizar un frotis directo coloreado con Gram.

Muestra

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Tracto Respiratorio

Las placas de SC y GC se incuban en microaerofilia, MC y SB en aerobiosis a 35ºC de 18-24 horas; mientras que la placa de SCK se incuba a 35°C en anaerobiosis por 24 horas. Después del período de incubación se procede a la interpretación de los probables patógenos Patógenos Probables en muestras de esputo Un patógeno probable (PP) se puede definir como todo microorganismo que ha sido asociado con infecciones del tracto respiratorio inferior. Estos incluyen, patógenos adquiridos en el hospital, tales como miembros de la familia Enterobacteriaceae, Ps. aeruginosa, otros bacilos Gram negativos y hongos, así como patógenos adquiridos en la comunidad como por ejemplo: S. pneumoniae y H. influenzae, entre otros. Criterios de interpretación: Si al interpretar un cultivo, no hay PP presentes, reportar: “aislamientos consistentes con microorganismos presentes en el tracto respiratorio superior”. Si uno o dos PP están presentes; semicuantificar, identificar y realizar pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (PSA) a cada PP; además se debe reportar y cuantificar la flora normal. Si más de dos PP están presentes; semicuantificar, identificar y practicar PSA en los dos PP predominantes. Si no hay PP predominantes, semicuantificar y reportar descriptivamente; además, se debe reportar y semicuantificar la flora normal. Si crecen más PP que flora normal; cuantificar, identificar y realizar PSA de los PP que crecen en cantidad de moderada a abundante; además se deben reportar descriptivamente los PP que crecen en cantidad escasa; reportar y cuantificar la flora normal. Cultivo puro de un microorganismo que forma parte de la flora normal; semicuantificar, identificar y reportar. Si no se aíslan microorganismos después de cultivos repetidos, en presencia de células inflamatorias, se debe sospechar de patógenos poco frecuentes como Actinomyces, hongos, virus, Rickettsiae, Chlamydia y Mycoplasmas. El reporte del cultivo se realiza de la siguiente manera: CULTIVO NEGATIVO: Si es negativo para los potencialmente patógenos investigados, reportar: FLORA NORMAL DE OROFARINGE EN CANTIDAD (Abundante, moderada o escasa).

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Tracto Respiratorio

CULTIVO POSITIVO: Si es positivo para los potencialmente patógenos investigados, reportar: Género: Especie: Cantidad: Antibiograma: ASPIRADO/LAVADO BRONQUIAL, CEPILLADO BRONQUIAL PROTEGIDO Y SECRECIÓN TRANSTRAQUEAL Sembrar en: Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y SHA y SAC, además de .un CT

Realizar un frotis directo coloreado con Gram. Muestra

Las placas de SH y GC se incuban en microaerofilia, MC y SB en aerobiosis a 35ºC de 18-24 horas; mientras que la placa de SHA y SHAK se incuba a 35°C en anaerobiosis por 48 horas. Después del período de incubación se procede a la interpretación de los probables patógenos. Criterios de Interpretación de Probables Patógenos en muestras de aspirado/lavado bronquial y cepillado bronquial protegido Si hay PP presentes, semicuantificar e identificar todos los PP, sin importar la cantidad y realizar PSA a los dos PP predominantes o con crecimiento de moderado a abundante. Si hay cultivo puro de un microorganismo de la flora normal identificar. Crecimiento de múltiples tipos de microorganismos, reportar “microorganismos múltiples, indicativo de flora normal de tracto respiratorio superior”.

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Tracto Respiratorio

SECRECION TRAQUEAL Y ENDOTRAQUEAL: Sembrar en:

Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y un tubo de CT

Realizar un frotis directo coloreado con Gram.

Muestra

En este tipo de muestras no se investigan bacterias anaeróbicas ya que la contaminación con flora orofaringea es frecuente, para su interpretación se utilizan los criterios de muestras contaminadas con flora de orofaringe como en el caso de esputo. LIQUIDO PLEURAL: Los aspectos relacionados al procesamiento de liquido pleural serán tratados en la sección de “Líquidos Orgánicos Estériles”. TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR EXUDADO FARINGEO, NASOFARINGEO Y EXUDADO/SECRECIÓN NASAL*: Sembrar en: Sembrar placas de SC, GC, MC, SB, SCK y Löeffler**.

* Realizar un frotis directo coloreado con Gram a fin de determinar la importancia clínica de asilamientos de Moraxella catharralis. Muestra

** Incluir en muestras de Exudados Faríngeos y Nasofaríngeos de niños menores de 12 años.

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Tracto Respiratorio

El reporte del cultivo se realiza de la siguiente manera: CULTIVO NEGATIVO: Si es negativo para los potencialmente patógenos investigados, reportar: FLORA OROFARINGEA (NASOFARINGEA O NASAL) NORMAL EN CANTIDAD (ABUNDANTE, MODERADA O ESCASA). CULTIVO POSITIVO: Si es positivo para los potencialmente patógenos investigados, reportar: Género: Especie: Cantidad: Antibiograma:

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Tracto Respiratorio

TRACTO RESPIRATORIO EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIÓN 1. Investiga los siguientes términos: Infección pleuropulmonar Aspirado transtraqueal percutáneo Fibronoscopía Toracocentesis Pseudomicelio Rinorrea Disnea Anorexia

Absceso Empiema Morfotipos Hifas Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) Leucocitosis Diaforésis Tonsilitis

2. De todas las muestras que se pueden obtener a partir del tracto respiratorio inferior, mencione las que son aptas para la investigación de bacterias anaeróbicas 3. ¿Por qué se utiliza sangre de carnero en el procesamiento de las muestras de tracto respiratorio? 4. En el caso de un exudado nasal con Moraxella catharralis ¿por qué es importante la realización del frotis directo? 5. ¿Por qué en las muestras susceptibles de contaminación con flora orofaríngea se utilizan los criterios de interpretación de probables patógenos? 6. ¿Qué ventajas ofrece la realización de un frotis a partir de muestras de esputo antes de su cultivo? 7. ¿Cuáles son los microorganismos más frecuentemente implicados en infecciones del tracto respiratorio? 8. ¿Qué microorganismos de difícil diagnóstico producen infecciones en el tracto respiratorio y cuales son las metodologías que se emplean en su diagnóstico?

CASOS CLÍNICOS 1. Hombre de 35 años que llego a la emergencia a causa de fiebre y dolor en el hemitórax izquierdo al momento de toser. Cinco días antes, había iniciado un cuadro con signos de infección respiratoria superior de origen viral con irritación faríngea, rinorrea y aumento de la tos. Un día antes de presentarse al hospital, el paciente comenzó con dolor torácico izquierdo al momento de toser o al respirar profundamente; 12 horas antes de su ingreso se despertó con escalofríos intensos y diaforésis. El interrogatorio más detallado reveló que el paciente solía beber cantidades de moderadas a muy abundantes de alcohol, y fumaba una cajetilla de cigarros diariamente desde 30

Tracto Respiratorio

hacía 17 años aproximadamente. El paciente trabajaba como mecánico reparador de automóviles; tenía antecedentes de dos hospitalizaciones previas, hacía cuatro años debido a un síndrome de abstinencia alcohólica y dos años atrás debido a bronquitis aguda. Al momento del ingreso presentó una temperatura de 39°C, frecuencia cardiaca de 130/minuto y tensión arterial de 120/80 mmHg. Durante la exploración física se encontró a un individuo con un sobrepeso ligero, con tos constante y que oprimía su tórax izquierdo con cada acceso de tos. La tos era productiva, con un esputo no muy viscoso de color amarillo rojizo (herrumbroso). La exploración del tórax mostró un diafragma con movimientos normales; a la percusión se encontró matidez del campo pulmonar izquierdo en su región lateral posterior, dato sugestivo de un síndrome de consolidación pulmonar. Los ruidos respiratorios (bronquiales) se auscultaron en la misma región de la matidez junto a estertores crepitantes secos, compatibles con una consolidación pulmonar y presencia de moco viscoso en la vía aérea. El resto de la exploración física fue normal. Las placas radiológicas del tórax Frotis directo de la muestra revelaron una consolidación densa del lóbulo basal izquierdo correspondiente a una neumonía bacteriana. El hematocrito fue del 45%; la cuenta leucocitaria fue de 16.000/ml con 80% de células PMN y una cuenta total de PMN de 12.800/ml, 12% de linfocitos y 8% de monocitos. La química sanguínea incluyendo electrolitos séricos resultó normal. El esputo era espeso, de color amarillento a rojizo, de aspecto purulento. La tinción de Gram del esputo reveló la presencia de muchas células PMN y bacterias, el cultivo reveló el crecimiento de colonias alfahemolíticas, se realizaron hemocultivos y se aisló el mismo microorganismo. Se inició terapia antimicrobiana con penicilina G por vía parenteral y la administración de líquidos intravenosos, a las 48 horas, la temperatura del paciente se normalizó Crecimiento en el cultivo y el paciente comenzó a toser arrojando grandes cantidades de esputo purulento. El régimen con penicilina se continuo durante siete días, al realizar el seguimiento del paciente, a las cuatro semanas desde su ingreso al hospital, se observó la remisión total de la consolidación pulmonar. ¿De que microorganismo sospecha como productor del cuadro clínico? ¿Qué factores predisponentes favorecieron la aparición del cuadro? ¿Qué otras complicaciones sufrió el paciente? ¿Si después de aplicar el tratamiento el paciente no mejora, a que puede deberse esto?

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Tracto Respiratorio

2. Paciente de 76 años de edad, varón, con criterios de EPOC desde hace 10 años y en tratamiento con esteroides sistémicos e inhalados desde hace 7. Actualmente presenta disnea de pequeños esfuerzos. Desde hace 13 días presenta fiebre (38°C) y empeoramiento de su función respiratoria (disnea en reposo) con tos productiva purulenta que no mejora con el tratamiento antibiótico que habitualmente utiliza para las exacerbaciones infecciosas de su proceso respiratorio (ciprofloxacina 750 mg/12 horas). Los análisis de sangre muestran leucocitosis con desviación izquierda y en la radiografía de tórax se aprecian infiltrados difusos que son difíciles de evaluar ya que probablemente se apreciaban en radiografías previas. Se obtuvieron esputos para examen microscópico directo y cultivo. En la fotografía se muestra la tinción de Gram del esputo. ¿De que microorganismo sospecha como productor del cuadro clínico? ¿Es este microorganismo frecuente produciendo enfermedad respiratoria? Indique las metodologías diagnósticas que se utilizan para su detección e identificación. 3. Una niña de 3 años visita el hospital presentando anorexia, molestia en la garganta, y malestar general. El examen físico revela una membrana gris extensa que recubre las amígdalas, la úvula, el paladar blando y las paredes de la faringe, los intentos por remover la membrana produjeron sangrado, la madre indica que la niña no ha recibido ninguna de las inmunizaciones obligatorias para su edad. ¿Cuál sería el diagnóstico más acertado? Mononucleosis infecciosa Tonsilitis herpética Difteria Tonsilitis estreptocócica ¿Asumiendo que el microorganismo es no hemolítico en placas de AS, cual sería el agente etiológico? ¿Cuál seria el tratamiento más adecuado en este caso? ¿Qué muestra se tomaría para el diagnóstico? Describa la metodología diagnóstica para su aislamiento e identificación.

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Tracto Gastrointestinal

TRACTO GASTROINTESTINAL La alta incidencia de los procesos infecciosos entéricos en la población general, junto con sus elevados índices de morbi-mortalidad entre determinados grupos etarios (niños y ancianos) hacen que este tipo de patología constituya un motivo de especial interés, tanto desde el punto de vista clínico como microbiológico. El número de microorganismos implicados en cuadros entéricos se ha ampliado durante los últimos años debido, entre otros factores, al mejor conocimiento de la clasificación taxonómica de los diferentes agentes etiológicos y al desarrollo de métodos diagnósticos cada vez más sensibles. La aparición de agentes infecciosos que en antaño eran raros o casi desconocidos en nuestro entorno, se ha visto favorecida por la mayor frecuencia de viajes intercontinentales y el aumento de los movimientos migracionales. Finalmente, el incremento del número de pacientes inmunocomprometidos (SIDA y tratamientos inmunosupresores) ha supuesto un elemento de importancia capital en relación con este grupo de enfermedades infecciosas. Ante la sospecha de un cuadro de infección gastrointestinal debe hacerse una detallada historia clínica y un correcto estudio microbiológico. Los antecedentes epidemiológicos (edad, historia reciente de viajes, aparición esporádica o como parte de un brote, tipo de alimento sospechoso, período de incubación), la existencia de factores predisponentes (inmunosupresión), la presencia de signos y síntomas clínicos (fiebre, dolor abdominal, manifestación de nauseas y vómitos) y el tipo de diarrea (acuosa, mucosa o sanguinolenta) pueden orientar acerca del microorganismo implicado. No obstante, el diagnóstico definitivo clínicamente se puede obtener mediante pruebas de laboratorio COPROCULTIVO Las muestras de heces o de hisopados rectales se siembran en:

Sembrar placas de CBM, TCBS, SSA, XLD, MC y ANG. Sembrar además los siguientes caldos de enriquecimiento Cthio, APA y Selenito.

Incubar las placas de 18 a 24 horas a 35°C en aerobiosis, el caldo selenito y el APA se incuban en las mismas condiciones pero de 6 a 12 horas, mientras que, la placa de CBM se incuba por 48 horas a 42°C en atmósfera microaerofílica, el Cthio se incuba a 4°C por 24 horas. Una vez incubados, los caldos de enriquecimiento se repican a placas, de la siguiente manera:

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Tracto Gastrointestinal

Repicar en placas de MC, SSA y XLD

Caldo Selenito

Repicar en placas de TCBS y ANG

Agua Peptonada Alcalina

Repicar en CBM

Campy-Thio

CULTIVO NEGATIVO: Si no se aíslan enteropatógenos, reportar: NO SE AISLARON BACTERIAS ENTEROPATÓGENAS CULTIVO POSITIVO: Si se aísla algún enteropatógeno, reportar: Género: Especie: Antibiograma: Grupo Serológico (si es el caso)

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Tracto Gastrointestinal

ESCHERICHIA COLI PRODUCTORA DE DIARREA Escherichia coli es un bacilo Gram negativo que pertenece a la familia Enterobacteriaceae; coloniza el tracto gastrointestinal de los niños durante las primeras horas de su vida y permanece confinada al lumen intestinal sin causar ningún tipo de daño; sin embargo, en hospedadores debilitados e inmunocomprometidos o cuando las barreras intestinales son violadas, aún las cepas de la flora normal “no patógenas” pueden causar infección. Por otra parte, existen clones altamente adaptados de E. coli que son capaces de causar infección aún en los hospedadores más resistentes, estos clones han evolucionado y adquirido ciertos determinantes de patogenicidad que le dan la capacidad de causar un gran número de infecciones en el hombre. Las infecciones producidas en el humano por E. coli están limitadas a las superficies mucosas (infecciones urinarias y entéricas) o se pueden diseminar a través del organismo provocando cuadros sistémicos (sepsis/meningitis). Generalmente tres síndromes clínicos están asociados a la infección por cepas patógenas de E. coli: a) infecciones del tracto urinario; b) sepsis/meningitis; c) enfermedad entérica/diarrea. De estas infecciones, las del tracto urinario son las más frecuentes, encontrándose que en algún punto de sus vidas al menos el 12% de los hombres y del 10-20% de las mujeres experimentan bacteriuria aguda sintomática. Existen algunas cepas de E. coli capaces de producir cuadros diarreicos; la clasificación de estas categorías enteropatógenas se hace en base a su mecanismo de patogenicidad. En la actualidad existen seis categorías enteropatógenas: E. coli enteropatogénica (ECEP), E. coli enterohemorrágica (ECEH), E. coli enteroagregativa (ECEA); E. coli enteroinvasiva (ECEI), E. coli enterotoxigénica (ECET) y E. coli enteroadherente difusa (ECAD). Para causar infección, E. coli sigue la misma estrategia de infección utilizada por la mayoría de los patógenos que atacan las mucosas: a) colonización de las mucosas, b) evasión de las defensas del hospedador, c) multiplicación y d) daño al hospedador. Las características más resaltantes de las cepas de E. coli que causan diarrea es la colonización de la superficie de la mucosa intestinal a pesar de los movimientos peristálticos y de la competencia por los nutrientes con las bacterias de la flora normal (incluyendo otras cepas de E. coli). La presencia de fimbrias de adherencia a las superficies es virtualmente una característica de todas las cepas de E. coli, incluyendo las variedades no patógenas; sin embargo, las cepas de E. coli productoras de diarrea poseen antígenos fimbriales específicos que potencian su capacidad de colonizar el intestino y le permiten adherirse a la mucosa del intestino delgado, un sitio que en condiciones normales no es colonizado. Otro aspecto importante en la patogenicidad de E. coli es su versatilidad genética. Esta versatilidad es conferida por dos configuraciones genéticas: plásmidos con genes de virulencia e islas de patogenicidad cromosómica. Las seis categorías enteropatógenas de E. coli han demostrado poseer al menos una propiedad relacionada con virulencia unida a un plásmido. Las cepas de ECEI, ECEP, ECEH y ECEA generalmente poseen familias de plásmidos altamente conservadas que codifican múltiples factores de virulencia. Las implicaciones epidemiológicas y los estudios realizados en voluntarios a principio de la década de los 50 establecieron el papel patógeno de los serogrupos clásicos de E. coli como causa de diarrea, especialmente los 35

Tracto Gastrointestinal

serogrupos O55, O111 y O127. Una vez establecido el papel patógeno de ECEP su detección e identificación se basó únicamente en el serotipo “O”:”H”. Actualmente, ECEP se detecta e identifica en base a su mecanismo de patogenicidad y no por su serología. ECEP se define como “toda cepa de E. coli capaz de producir el fenómeno de adhesión/destrucción (attaching/effacing) y que no produce la toxina Shiga (Stx)”. La característica más importante de la infección por ECEP es el fenómeno histopatológico de attaching/effacing (A/E) que se observa en muestras de biopsia intestinal de pacientes y animales infectados. Este fenómeno se caracteriza por una destrucción de las microvellosidades y adherencia íntima entre las bacterias y la membrana de las células epiteliales. Esta adherencia incluye cambios marcados a nivel del citoesqueleto de la célula intestinal y acumulación de actina polimerizada que se sitúa en una estructura en forma de pedestal, esta se puede extender hasta 10µm hacia fuera de la célula epitelial en estructuras semejantes a pseudópodos. Otra categoría importante de E. coli asociada a la producción de diarreas es ECET, este patógeno se hizo importante a finales de la década de los 60 y principios de los 70, principalmente por los trabajos desarrollados por Gorbach y Sack en Calcuta. ECET ha demostrado ser una causa importante de diarrea en países poco desarrollados, atacando principalmente a niños; además, ECET es el agente etiológico más frecuentemente implicado en la diarrea del viajero, mientras que la diarrea por ECET en Estados Unidos y otros países desarrollados es rara, presentándose solo brotes ocasionales. La infección por ECET es adquirida por la ingestión de agua y alimentos contaminados, la bacteria coloniza el extremo proximal del intestino delgado, sitio crítico para la interacción hospedador-parásito, donde la bacteria elabora sus toxinas: enterotoxina termolábil (LT) y enterotoxina termoestable (ST). La diarrea se presenta con las siguientes características clínicas: diarrea acuosa, náuseas, dolor abdominal y fiebre de bajo grado. Las cepas de ECET pueden producir una de las dos toxinas o ambas a la vez. En 1971, DuPont y col. describieron ciertas cepas de E. coli que causaban una diarrea del tipo disentería invasiva en voluntarios, estas cepas de serotipos distintos a los de ECEP y ECET eran muy similares a Shigella en muchos aspectos: eran no mótiles, no fermentaban la lactosa y los antígenos “O” mostraban reacciones cruzadas con los de Shigella y su característica patogénica principal era la de invadir y proliferar dentro de las células epiteliales y causar eventual muerte de esta, esta nueva categoría se denominó ECEI. ECEI tiene predilección por la mucosa del colon como sitio favorito para la interacción hospedador-parásito. Clínicamente la enfermedad está caracterizada por fiebre, dolor abdominal severo, malestar, toxemia y diarrea acuosa seguida por una disentería severa con grandes cantidades de heces con sangre y moco, una coloración del moco fecal revela una gran cantidad de polimorfonucleares (PMN). El esquema preciso de patogenicidad de ECEI hasta ahora no ha sido elucidado. Estudios de la patogénesis de ECEI sugieren que sus características patogénicas son virtualmente idénticas a las de Shigella sp., ambos microorganismos han demostrado invadir el epitelio del colon y elaboran una o más enterotoxinas secretoras que pueden jugar roles en la patogénesis de la diarrea. 36

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El modelo actual de patogénesis de Shigella sp. y ECEI comprende: a) penetración de la célula epitelial, b) lisis de la vacuola endocítica, c) multiplicación intracelular, d) movimiento a través del citoplasma y e) extensión a las células adyacentes, cuando la infección es severa, esta secuencia de eventos produce una fuerte reacción inflamatoria la cual se manifiesta por la formación de úlceras a nivel de la mucosa intestinal. ECEI produce principalmente brotes epidémicos, los casos esporádicos son pocos debido quizás a mal diagnóstico de laboratorio, posiblemente las cepas de ECEI sean mal identificadas como Shigella sp. o como cepas de E. coli de la flora normal. Las epidemias documentadas de ECEI usualmente tienen origen en agua o alimentos contaminados, la incidencia de este microorganismo en países desarrollados es baja, pero se presentan ocasionalmente epidemias de origen alimentario, los casos esporádicos ocurren en algunas áreas, generalmente, donde Shigella también es prevalente, la transmisión persona-persona también ha sido documentada. El reconocimiento de una nueva categoría enteropatogénica de Escherichia coli (ECEH) resultó de dos observaciones epidemiológicas claves, la primera fue reportada por Riley y col. en 1983 quien investigó dos epidemias de una enfermedad gastrointestinal distintiva, caracterizada por un severo dolor abdominal, diarrea acuosa seguida por diarrea con sangre y en ocasiones fiebre de bajo grado. Esta enfermedad denominada colitis hemorrágica (HC) estuvo asociada con la ingestión de hamburguesas poco cocidas en una cadena de restaurantes de comida rápida. En los coprocultivos de estos pacientes se aisló un serotipo de E. coli raramente aislado con anterioridad O157:H7. La segunda observación clave fue hecha por Karmali, también en 1983, quien reportó la asociación de casos esporádicos de síndrome urémico hemolítico (HUS) con citotoxina fecal y cepas de E. coli productoras de citotoxina en las heces. El HUS es definido por la tríada de falla renal aguda, trombocitopenia y anemia hemolítica microangiopática. Este síndrome está precedido típicamente por una diarrea hemorrágica indistinguible de la HC; de esta manera dos observaciones microbiológicas, una basada en un serotipo raro de E. coli y otra basada en la producción de una citotoxina específica, condujo al reconocimiento de una nueva e importante clase de patógeno entérico que causa enfermedad intestinal y renal. La aparición súbita de casos producidos por ECEH O157:H7 llevaron a que se le denominara “patógeno emergente” y surgió la pregunta de si este microorganismo siempre estuvo presente y simplemente no se diagnosticó como ocurrió con Legionella sp. o es verdaderamente un patógeno nuevo. Después que E. coli O157:H7 fue reconocida como causa de HC y HUS el centro para la prevención y el control de enfermedades (CDC) en Atlanta, revisó más de 3.000 cepas de E. coli serotipiadas entre 1973 y 1983, encontrando que solo un aislado pertenecía al serotipo O157:H7. El laboratorio de salud pública del Reino Unido también encontró un solo aislamiento de O157:H7 entre 15.000 cepas de E. coli serotipiadas entre 1978 y 1982, mientras que el laboratorio del centro para el control de enfermedades en Canadá encontró 6 cepas de O157:H7 entre 2.000 aislamientos de pacientes con diarrea entre 1978 y 1982. Lo anterior demuestra que la presencia de cepas de E. coli O157:H7 se ha incrementado

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Tracto Gastrointestinal

verdaderamente en años recientes y no que fue mal identificada antes de 1982. Sin embargo, el HUS es una entidad clínica bien reconocida desde antes de 1982.

ESQUEMA DE IDENTIFICACIÓN DE ESCHERICHIA COLI PRODUCTORAS DE DIARREA Tomar de 5 a 10 colonias fermentadoras de la lactosa

Muestra de Heces Mc

I

M (+)

ANp

ANp

(-) Descartar

Serología de ECEP-ECET

I (+)

M

(+) Serología Individual

ECEP Titulación Adherencia a células Hep-2 Bioquímica

ECET Hibridación Elisa RPLA Bioquímica

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Tracto Gastrointestinal

ESQUEMA DE IDENTIFICACIÓN DE ESCHERICHIA COLI PRODUCTORAS DE DIARREA (CONT....) Lisina

I (+)

ANp

M (-)

ECEI Invasión a células Hep-2 Bioquímica

(-) Serología de ECEI

(+) Descartar

ECEH Tomar de 5 a 10 colonias no fermentadoras del Sorbitol

Muestra de Heces McS

I

S

(-) Descartar

Serología de ECEH O157:H7

I (+)

S (-)

ANp

ANp (+) Inmovilización H7 Toxicidad en células VERO Pruebas bioquímicas

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TRACTO GASTROINTESTINAL EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIÓN 1. Investiga los siguientes términos: Sepsis Meningitis Transposón Toxemia Citotoxina Trombocitopenia Patógeno emergente

Movimientos peristálticos Plásmido Bacteriófago Vacuola endocítica Anemia hemolítica microangiopática Colitis hemorrágica Síndrome urémico hemolítico

2. Mencione los enteropatógenos más frecuentemente involucrados en cuadros gastrointestinales. 3. ¿Cuáles son los microorganismos capaces de producir intoxicación alimentaria y cual es la metodología que se utiliza para su detección y diagnóstico? 4. Indique el brevemente el mecanismo de patogenicidad de los enteropatógenos más frecuentemente involucrados en cuadros diarreicos.

CASOS CLÍNICOS 1. Paciente de 45 años que refiere desde hace 10 años cuadros de dolor epigástrico típicamente ulceroso de aparición ocasional, unas 3-4 veces al año. Varios estudios radiológicos con contraste demostraron la presencia de una lesión ulcerosa duodenal con deformación bulbar. En la actualidad consulta por un nuevo brote de dolor acompañado por nauseas y vómitos de contenido alimentario. En la exploración no se encuentra ningún hallazgo de interés excepto un discreto dolor a la palpación en epigastrio. La analítica fue normal y en el estudio radiológico no se aprecian cambios con respecto a radiografías previas. Se realizó una endoscopia digestiva alta, tomando muestras de biopsia de antro. Se realizó tinción de Gram de una de dichas biopsias, mostrándose en la fotografía el resultado de la misma, se observaron bacilos Gram negativos curvos. Se realizó además una prueba de ureasa rápida de dicha muestra, que resultó positiva.

Directo de la muestra

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¿De qué microorganismo sospecha como productor del cuadro clínico? ¿Qué otras pruebas de laboratorio realizaría para confirmar el diagnóstico? ¿Cuál es el mecanismo de patogenicidad, mecanismo de transmisión y la epidemiología de este microorganismo? 2. Cuatro miembros de una familia de granjeros emigrantes ingresaron al hospital a causa de diarrea y fiebre, las cuales se habían iniciado de 6 a 12 horas previas a la admisión. El padre de la familia tenía 28 años de edad, la madre 24 y los niños seis y cuatro años. El día anterior la familia había ingerido en una comida ensalada mixta de vegetales verdes, carne picada, frijoles y tortillas preparadas por otra persona del campamento. Otro niño de la familia de ocho meses de edad, no había consumido estos alimentos y no presentó la enfermedad. Aproximadamente 24 horas después de la comida, los niños presentaron retortijones abdominales, fiebre y diarrea acuosa. Estos síntomas persistieron durante 12 horas previas al ingreso y en ambos niños la diarrea se volvió sanguinolenta. Los padres de los niños presentaron síntomas similares 6 y 8 horas previas, pero no evacuaron heces con sangre visible. Los padres refirieron que muchas otras personas del campamento también desarrollaron una enfermedad similar durante las dos semanas anteriores. Las medidas de higiene y de saneamiento del campamento eran precarias. A la exploración física presentaron temperaturas de 39 a 39,5°C y sus padres de 38°C. Todos desarrollaron taquicardia y su aspecto era evidentemente de enfermedad aguda. Ambos niños parecían deshidratados. Las cuentas leucocitarias variaron desde 12.000 hasta 16.000/ml, con 55 a 76% de células PMN. En el examen de materia fecal en fresco se identificaron múltiples leucocitos. Las heces de los niños macroscópicamente contenían sangre y moco. Se realizaron coprocultivos obteniéndose crecimiento en las placas de MC, SSA y XLD. Ambos niños se hospitalizaron para rehidratarlos con líquidos vía intravenosa y administrarles ampicilina. Los padres se trataron de manera ambulatorio con líquidos orales y ciprofloxacina por vía oral. Todos se recuperaron sin complicaciones. El departamento de salud pública promovió la implantación de mejores condiciones de saneamiento en el campamento. ¿De qué cuadro(s) clínico(s) sospecha? ¿Cuál o cuáles serian los agentes etiológicos? ¿Qué colonias seleccionaría de cada medio de cultivo? ¿Por qué hay diferencias en el tratamiento de los padres con respecto a los niños?

A

B C

Crecimiento en SSA

Crecimiento en XLD

Crecimiento en MC

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Tracto Gastrointestinal

¿Cuáles serían las medidas a implementar en el campamento para mejorar las condiciones de saneamiento? 3. Un hombre de negocios de 50 años de edad desarrolló un cuadro diarreico 24 horas después de haber llegado de Asia, presentó diarrea intensa, las heces eran acuosas tipo agua de arroz. El cultivo reveló rápido crecimiento de un cultivo casi puro en la superficie de un agar TCBS. ¿El probable diagnóstico es? Fiebre tifoidea Cólera Intoxicación alimentaria por Staphylococcus aureus Shigelosis Amibiasis ¿Asumiendo que un bacilo Gram negativo no motil se aísla de las heces, el diagnóstico probable sería? Fiebre tifoidea Cólera Intoxicación alimentaria por Staphylococcus aureus Shigelosis Amibiasis ¿Asumiendo que la enfermedad fue adquirida por el consumo de huevos crudos infectados, cuál de los siguientes microorganismos sería el patógeno más probable? Salmonella sp. Vibrio sp. Staphylococcus aureus Shigella sp. Entamoeba histolytica ¿Asumiendo que el agente etiológico sea Vibrio cholerae, cuales serían sus características morfológicas y de crecimiento en el laboratorio? ¿Cuál sería la terapia más efectiva?

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Líquidos Orgánicos Estériles

LÍQUIDOS ORGÁNICOS ESTÉRILES Sangre (Hemocultivo) El pronto y seguro aislamiento e identificación de microorganismos presentes en un proceso de septicemia es una de las funciones más importantes de un laboratorio de microbiología. Las indicaciones para obtener cultivos representativos de sangre están relacionados con las condiciones clínicas del paciente. Las bacteriemias continuas se presentan en endocarditis, fiebre tifoidea y brucellosis; mientras que las intermitentes se presentan usualmente en otras infecciones. En cuadros donde se sospecha una endocarditis bacteriana por ejemplo deben tomarse tres hemocultivos separadamente y en intervalos que no superen las 24 horas. Este procedimiento será suficiente para recuperar el agente etiológico. En bacteriemias intermitentes como las que se pueden presentar en cuadros de infección urinaria, gastrointestinal o epiglotitis, tres cultivos de sangre colectados en un período de 24 a 48 horas son usualmente suficientes para aislar del agente causal. Si el paciente ha recibido algún agente antimicrobiano antes de la toma de la muestras deben tomarse un total de 45 muestras de sangre separadamente en un tiempo no mayor de 48 horas. Las condiciones en la toma de la muestra de sangre deben ser asépticas, limpiando primero la zona de la piel con agua y jabón, alcohol de 80-95% y aplicando luego una solución de yodo al 2% en forma concéntrica de adentro hacia afuera, alrededor del sitio de la punción. Esta solución deberá permanecer sobre la piel al menos un minuto para que ocurra una verdadera antisepsia. No deberá tocarse la superficie de la piel con los dedos a menos que estos hayan sido desinfectados previamente. Se recomienda colectar de 5-10 ml de sangre en cada toma, pues un volumen menor reducirá el porcentaje de recuperación de los microorganismos presentes en algunas bacteriemias. En neonatos y niños menores de 6 años. La colección de 1-5 ml de sangre puede resultar satisfactoria y la sangre deberá ser inoculada directamente sobre el medio de cultivo, al lado del paciente, bien sea con jeringa estéril o con un equipo de extracción desechable. Una concentración óptima de sangre en el medio de cultivo puede relacionarse en proporción del 10% de sangre por cantidad de medio de cultivo: para 50 ml de medio 5 ml de sangre son suficientes con el fin de reducir la actividad normal bactericida de los mediadores químicos y celulares de la inmunidad. Cualquier efecto bactericida remanente, después de diluir la sangre en el medio de cultivo puede ser abolido mediante la adición de sulfonato sódico de polianetol (SPS), el cual además de ser anticoagulante posee actividad antifagocítica y anti-complementaria. Los medios para hemocultivos que pueden obtenerse comercialmente son: Caldo de Tripticasa de Soya, Caldo Columbia, caldo de Infusión Cerebro Corazón o el tradicional medio de Ruiz-Castañeda que son satisfactorios cuando son envasados bajo condiciones de vacío, con atmósfera de C02 y con un contenido adecuado de SPS y sacarosa. Algunos de estos medios obtenidos comercialmente pueden ser útiles para el aislamiento de microorganismos anaerobios presentes en la sangre, como el Caldo Columbia preparado bajo condiciones anaeróbicas.

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Líquidos Orgánicos Estériles

Cuando se quiere descartar la presencia de cualquier clase de microorganismos aeróbicos (Streptococcus spp., Enterobacterias), anaeróbicos (Bacteroides spp., Fusobacterium spp.) o microorganismos exigentes (Brucella spp., Listeria spp.) deben tomarse diferentes botellas de hemocultivo que provean las diferentes atmósferas necesarias según los requerimientos de cada microorganismo que puedan encontrarse en una bacteriemia ya sea monomicrobiana ó polimicrobiana. Una vez tomadas las muestras de sangre, las botellas de hemocultivo se deben incubar a 35-36°C y deben ser examinadas diariamente hasta el décimo día para evidencia de crecimiento. Los microorganismos de importancia clínica son recuperados en este periodo hasta en un 95% de los casos. Sin embargo, períodos de incubación más prolongados pueden ser necesarios, en el caso de pacientes con enfermedad repetitiva, que han recibido tratamientos antimicrobianos o en entidades como la endocarditis o la endarteritis causadas por microorganismos de crecimiento lento y exigente. Inmediatamente se visualice alguna positividad en el cultivo debe obtenerse una pequeña muestra del hemocultivo para hacer una preparación directa y subcultivos en placas en condiciones aeróbicas y/o anaeróbicas y en atmósfera de C02. El frotis directo de Gram proveerá una información preliminar del microorganismo aislado y deberá ser reportado rápidamente al médico tratante. Cuando el hemocultivo permanece macroscópicamente negativo deben hacerse subcultivos sobre placas a las 24 y 48 horas así como al 8° día. Estos subcultivos son necesarios para asegurar la recuperación de ciertos microorganismos como Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus spp, N. meningitidis, N. gonorrhoeae, levaduras, etc. La recuperación de microorganismos como Corynebacterium spp., Bacillus spp. y estafilococos coagulasa negativa entre otros, pueden considerarse contaminantes, a no ser que sean aislados en varias de las muestras. Las Enterobacterlas, Bacteroides spp., Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophllus spp. y Pseudomonas aeruginosa son siempre hallazgos clínicamente importantes. Ciertos microorganismos como Brucella son fácilmente aislados cuando se inocula el medio bifásico de Ruiz-Castañeda; este debe ser incubado hasta por cuatro semanas con subcultivos hasta dos veces por semana sobre medios de agar Brucella o agar suero dextrosa con antibiótico para tratar de recuperar el microorganismo. Este medio difásico también es útil en la recuperación de las Neisserias patógenas presentes en la sangre. Por último, una bacteriemia polimicrobiana ha sido reportada en un 18% de los cuadros sépticos y presenta una más alta mortalidad que las infecciones monomicrobianas.

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ESQUEMA PARA EL PROCESAMIENTO DE HEMOCULTIVOS (REPIQUE INICIAL)

Incubar 24 horas a 35°C Realizar Repique Inicial

Frasco A: Sembrar placas de SH, GC, MC y un tubo de CST

Frasco A

Mezclar el frasco, transferir 5 ml de sangre a un tubo estéril, centrifugar y descartar el sobrenadante, resuspender bien el sedimento y sembrar los medios de cultivo

Incubar 48 horas a 35°C Realizar Repique Inicial

Si el frasco muestra signos macroscópicos de positividad, realizar un examen directo coloreado con Gram y enviar informe provisional

Frasco B: Sembrar placas de SH, GC, MC, SHA y un tubo de CT

Frasco B

Las placas de SH y GC se incuban a 35°C por 18-24 horas en microaerofilia, la placa de MC y los caldos se incuban en aerobiosis, mientras que SHA en anaerobiosis por 48 horas. Las placas y caldos se deben incubar como mínimo por 48 horas antes de descartarlos como negativos.

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ESQUEMA PARA EL PROCESAMIENTO DE HEMOCULTIVOS (REPIQUE FINAL)

Revisar diariamente y el 8° día realizar el repique final

Frasco A: Sembrar placas de SH, GC y un tubo de CST

Frasco A

Mezclar el frasco, transferir 5 ml de sangre a un tubo estéril, centrifugar y descartar el sobrenadante, resuspender bien el sedimento y sembrar los medios de cultivo

Revisar diariamente y el 8° día realizar el repique final

Si el frasco muestra signos macroscópicos de positividad, realizar un examen directo coloreado con Gram y enviar informe provisional

Frasco B: Sembrar placas de SH, GC, SHA y un tubo de CT

Frasco B

Las placas de SH y GC se incuban a 35°C por 18-24 horas en microaerofilia, los caldos se incuban en aerobiosis, mientras que SHA en anaerobiosis por 48 horas. Las placas y caldos se deben incubar como mínimo por 48 horas antes de descartarlos como negativos.

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CONSIDERACIONES ESPECIALES: Revisar los hemocultivos diariamente, si se detectan signos de positividad sembrar en los medios respectivos y realizar frotis. Si se observa crecimiento a las 24 horas en el frasco B, este se debe repicar y se debe realizar un frotis coloreado con Gram. Si los frascos de hemocultivo continúan negativos, hacer el repique final al 8° día de incubación. Si se observa crecimiento de algún microorganismo identificar y realizar pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos. Siempre que se observe un directo positivo se debe enviar un reporte provisional al médico. INFORME DE LOS RESULTADOS INFORME PROVISIONAL POSITIVO DE DIRECTO COLOREADO CON GRAM, Generalmente se envía a las 24-48 horas, a fin de informar al médico sobre la morfología, agrupación y afinidad tintorial del microorganismo. Ejemplo: FRASCO (A ó B): Al examen microscópico directo coloreado con Gram, se observaron (describir la morfología, afinidad tintorial y agrupación bacteriana). INFORME PROVISIONAL DE CULTIVO NEGATIVO Se envía a las 96 horas, reportar: FRASCO (A, B ó A=B): No se ha observado crecimiento de bacterias (aeróbicas, anaeróbicas o aeróbicas y anaeróbicas) después de 96 horas de incubación. INFORME PROVISIONAL DE CULTIVO POSITIVO Se envía a las 96 horas cuando solo se conoce el género o grupo al que pertenece el microorganismos, reportar: Frasco (A, B ó A=B): Género: Especie: en estudio Antibiograma: en estudio INFORME DEFINITIVO DE CULTIVO NEGATIVO Se envía a los 10 días de incubación y después del repique inicial y final, reportar: FRASCO (A, B ó A=B): No se observó crecimiento de bacterias (aeróbicas, anaeróbicas o aeróbicas y anaeróbicas) después de 10 días de incubación.

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INFORME DEFINITIVO DE CULTIVO POSITIVO Se envía a los 10 días de incubación, después de conocer la identificación definitiva del microorganismo y la susceptibilidad a los antimicrobianos, reportar: Frasco (A, B ó A=B): Género: Especie: Antibiograma: Si solo uno de los frascos (A ó B) presenta crecimiento, entonces reportar de acuerdo con los resultados obtenidos en cada uno de los frascos. LÍQUIDO CEFALORRAQUIDEO El examen de LCR en aquellos pacientes sospechosos de tener un proceso infeccioso del SNC representa uno de los más importantes procedimientos de urgencia que debe realizar el laboratorio de microbiología clínica, debido a la necesidad urgente de administrar una terapia antimicrobiana apropiada cuando se identifica el verdadero agente etiológico y reducir las serias complicaciones que pueden ser fatales en muchas ocasiones. Las infecciones bacterianas del SNC son en general de curso agudo y rápidamente progresivas, mientras que las ocasionadas por micobacterias, hongos, leptospiras o protozoos son generalmente insidiosas en su evolución. La punción lumbar es el método de elección para el diagnóstico de las infecciones del SNC; debe ser realizada por personal competente y bajo estrictas condiciones de asepsia para evitar contaminación de la muestra y confusión en la identificación del agente etiológico. El LCR debe colectarse en tubos estériles con tapa rosca, no deben utilizarse tubos con tapones de algodón o de caucho. Hay diferentes procedimientos para detectar la presencia de microorganismos, así como la presencia de antígenos o sustancias bacterianas en el LCR. Básicamente un frotis directo coloreado con Gram y un cultivo detectará la presencia del agente patógeno, pero es posible obtener comercialmente algunos tipos de reactivos con el objeto de detectar antígenos microbianos cuando el cultivo del LCR permanece negativo o para confirmar la identidad del microorganismo aislado. El transporte inmediato de la muestra al laboratorio para su procesamiento es esencial pues algunos microorganismos exigentes como H. influenzae. o N. meningitidis pueden no sobrevivir mucho tiempo. Una muestra suficiente de 5 ml de LCR deberá ser obtenida para análisis microbiológico, para el examen citoquímico y/o serológico. Cuando la muestra llega al laboratorio inmediatamente se debe sembrar en los medios de cultivo y realizar el frotis directo. El LCR debe centrifugarse para concentrar los microorganismos, el sobrenadante se retira con una pipeta estéril y se coloca en un tubo estéril, el sedimento se debe resuspender bien y con ayuda de una pipeta sembrar los medios de cultivo y realizar el frotis directo. Algunos microorganismos como H. influenzae requieren de hasta 60 minutos de

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centrifugación cuando se presenta un escaso número de bacterias en el LCR. Las preparaciones directas coloreadas con Gram o Ziehl Neelsen deben examinarse cuidadosamente tratando de cubrir un gran número de campos microscópicos. La respuesta inflamatoria puede ser de ayuda en el diagnóstico de una meningitis. La respuesta leucocitaria es generalmente de PMN en meningitis bacteriana, mientras que en una tuberculosa, micótica, leptospiral o por protozoos es de linfocitos. Los cambios citoquímicos pueden ocurrir en pacientes con abscesos cerebrales, sin embargo los frotis directos coloreados con Gram y los cultivos del LCR son generalmente negativos en estos casos a menos que haya una ruptura al espacio subaracnoldeo o ventricular. En el caso de las meningitis bacterianas parcialmente tratadas, pueden desarrollarse cambios en el aspecto citoquímico del LCR y la tasa de recuperación del agente etiológico disminuye. Si se sospecha una meningitis por Criptococcus, una gota del sedimento del LCR es mezclada con una gota de tinta china o una solución de nigrosina sobre un portaobjeto limpio, se cubre con una laminilla y se observa con una baja intensidad de luz al microscopio, con objeto de 40X. La presencia de células con apariencia de levaduras, en gemación y encapsuladas son presuntamente diagnósticas de Criptococosis. Debe tener cuidado en la diferenciación de levaduras no encapsuladas, eritrocitos, leucocitos o burbujas de aire. En algunos casos de meningitis por Cryptococcus neoformans. puede haber o no una pequeña respuesta celular y disminución en los valores de la glucosa. La positividad del examen directo de tinta china puede llegar a un 80-85% y la positividad de la reacción con partículas de látex puede ser hasta de un 95-100% en un paciente con Criptococosis. En cuadros clínicos de meningoencefalitis de dudosa etiología, en pacientes con antecedentes de haber nadado en estanques o piscinas de agua dulce antes de la aparición de síntomas, deberá realizarse un examen de LCR para amibas de vida libre. Una gran variedad de procedimientos Inmunológicos han sido desarrollados para el diagnóstico rápido de meningitis bacteriana. La inmunofluorescencla, hinchamiento de cápsula, contrainmunoelectroforesls, coaglutinaclón y aglutinación con partículas de látex son algunas de las técnicas más conocidas. La utiIidad de estas técnicas puede aplicarse en aquellos casos cuando un diagnóstico presuntivo inmediato y confiable es necesario, para aplicar una terapia antibiótica adecuada.

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ESQUEMA PARA EL PROCESAMIENTO DE LCR

Sembrar placas de SH, GC, MC, SB, SHA y tubos de CST-sup y CT

Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al médico Muestra

INFORME DE LOS RESULTADOS INFORME PROVISIONAL NEGATIVO DE DIRECTO COLOREADO CON GRAM, AL EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO COLOREADO CON GRAM NO SE OBSERVÓ MORFOLOGÍA BACTERIANA Y POLIMORFONUCLEARES (en el caso de estar presentes se debe reportar la cantidad). INFORME PROVISIONAL POSITIVO DE DIRECTO COLOREADO CON GRAM, AL EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO COLOREADO CON GRAM, SE OBSERVARON (describir la morfología, afinidad tintorial y agrupación bacteriana) Y POLIMORFONUCLEARES (en el caso de estar presente se debe reportar la cantidad). CULTIVO NEGATIVO NO SE OBSERVÓ CRECIMIENTO BACTERIANO DESPUÉS DE 48 (especificar si es mayor el tiempo) HORAS DE INCUBACIÓN. CULTIVO POSITIVO Género: Especie: Antibiograma:

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Líquidos Orgánicos Estériles

LÍQUIDO PLEURAL, PERICÁRDICO, PERITONEAL Y SINOVIAL Las aspiraciones percutáneas de liquido pleural, pericárdico, peritoneal y sinovial deberán ser hechas con absoluta asepsia para evitar la contaminación de las muestras y prevenir la introducción de cualquier microorganismo en espacios anatómicos estériles. Las muestras deberán ser recolectadas directamente en un tubo estéril con tapa de rosca. Si se sospecha de una infección por bacterias anaeróbicas, se colocará la muestra rápidamente en un tubo de transporte para muestras anaeróbicas o en caldo de carne con glucosa para ser procesadas posteriormente en el aislamiento de microorganismos anaeróbicos. Las muestras de líquido pleural y sinovial frecuentemente se coagulan, los coágulos que se forman atrapan en su interior a los microorganismos presentes en la muestra, lo que dificulta su detección. Para evitar esto se puede agregar al tubo una pequeña cantidad de sulfonato sódico de polianetol (SPS) o de heparina estéril antes de la toma de la muestra, para emulsificarla y procesarla adecuadamente. Los líquidos claros o ligeramente turbios deben centrifugarse, procesando luego el sedimento; las muestras francamente purulentas deberán examinarse directamente. Se debe realizar un frotis directo coloreado con Gram y sembrar la muestra en SH, GC, MC, SB, SHA, CT y CSTsup. Las placas de SH y GC deben incubarse en microaerofilia para favorecer la recuperación de microorganismos exigentes como Neisserias patógenas, Streptococcus spp., Haemophilus spp. y Listeria spp. En el caso de líquido peritoneal se aconseja utilizar una placa de ASAK ya que esta muestra puede contaminarse fácilmente con el contenido intestinal.

ESQUEMA PARA EL PROCESAMIENTO DE OTROS LÍQUIDOS ESTÉRILES

Sembrar placas de SH, GC, MC, SB, SHA y tubos de CSTsup y CT

Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al médico Muestra

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Líquidos Orgánicos Estériles

INFORME DE LOS RESULTADOS INFORME PROVISIONAL NEGATIVO DE DIRECTO COLOREADO CON GRAM, AL EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO COLOREADO CON GRAM NO SE OBSERVÓ MORFOLOGÍA BACTERIANA Y POLIMORFONUCLEARES (en el caso de estar presentes se debe reportar la cantidad). INFORME PROVISIONAL POSITIVO DE DIRECTO COLOREADO CON GRAM, AL EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO COLOREADO CON GRAM, SE OBSERVARON (describir la morfología, afinidad tintorial y agrupación bacteriana) Y POLIMORFONUCLEARES (en el caso de estar presente se debe reporta la cantidad). CULTIVO NEGATIVO NO SE OBSERVÓ CRECIMIENTO BACTERIANO DESPUÉS DE 48 (especificar si es mayor el tiempo) HORAS DE INCUBACIÓN. CULTIVO POSITIVO Género: Especie: Antibiograma:

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Líquidos Orgánicos Estériles

LÍQUIDOS ORGÁNICOS ESTÉRILES EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIÓN 1. Investiga los siguientes términos: Septicemia Cultivo monomicrobiano Endocarditis Espacio subaracnoideo Citoquímica Inmunofluorescencia Coaglutinación 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Bacteriemia Cultivo polimicrobiano Endarteritis Espacio ventricular Meningoencefalitis Contrainmunoelectroforesis Aglutinación

Describa los pasos a seguir para la toma de una muestra de sangre para hemocultivo. ¿Cuáles son los microorganismos más frecuentemente involucrados en bacteriemias? ¿Para qué se utilizan los caldos de enriquecimiento en las muestras de líquidos orgánicos estériles? ¿Qué utilidad tiene agregar sucrosa a los frascos de hemocultivo? ¿Cuáles son los microorganismos más frecuentemente aislados en muestras de LCR? ¿Cómo realizaría el diagnóstico de una tuberculosis meníngea? ¿Qué utilidad tiene realizar un frotis directo en muestras de líquidos estériles, explique su importancia? Indique como se toman las muestras de LCR, líquido sinovial y líquido peritoneal o ascitico.

CASOS CLÍNICOS 1. Paciente de 72 años que ingresa por un cuadro de un mes de fiebre, escalofríos, síndrome constitucional, disuria y polaquiuria. Posteriormente apareció disnea, tos, edemas periféricos y desorientación. En la exploración destacaba fiebre de 38.5°C, cianosis, taquipnea, disminución global del murmullo vesicular y crepitantes bibasales, hepatomegalia dolorosa a 4 cm, y edemas maleolares. En la analítica destacaba 7800 leucocitos (81.1% neutrófilos, 13.7% linfocitos). La gasometría mostraba pH 7,47, pO2 46 y pCO2 36. La radiografía de tórax mostraba un patrón intersticial micronodular difuso y bilateral, con tendencia confluente en LSI. En hemocultivos en medios 53

Líquidos Orgánicos Estériles

para micobacterias creció el organismo que se muestra en la fotografía. Dicho organismo creció también en muestras de orina y esputo procesadas para investigación de micobacterias. ¿Cuál es el probable diagnóstico? ¿Esta infección es sistémica o localizada? ¿Qué metodologías utilizaría para aislar este microorganismo de muestras de sangre y orina? 2. Paciente de 17 años de edad, mujer, sin antecedentes de interés, que acude a urgencias por presentar de forma brusca un cuadro de 16 horas de evolución de fiebre de 39-40ºC, escalofríos, malestar general, cefalea, obnubilación y sensación de debilidad. En el momento del ingreso, la exploración física evidenció fiebre de 39.7ºC, tensión arterial de 80/40, rigidez de nuca y aparición de múltiples lesiones petequiales por toda la superficie del cuerpo, siendo las mismas confluentes en algunas localizaciones. La analítica de sangre mostró leucocitosis (18000 células/ml) con neutrofilia (85 % polimorfonucleares). Se realizaron hemocultivos y una punción lumbar. El estudio citoquímico del líquido cefalorraquídeo demostró 13000 células/ml, con predominio de polimorfonucleares (90 %), 14 mg/dl de glucorraquia y más de 400 mg/dl de proteinorraquia. No se visualizaron bacterias en la tinción de Gram del líquido. Sin embargo, a las 24 horas de incubación, tanto los hemocultivos como el cultivo del líquido se positivizaron, observándose en la tinción de Gram de los frascos de hemocultivo el microorganismo de la imagen, que resultó ser el mismo que apareció en el LCR. ¿Cuál es el probable diagnóstico? ¿Cuál es el microorganismo responsable? 3. Un soldado de 20 años de edad se enferma repentinamente, presentando escalofríos, vómitos, malestar general y fiebre alta. Horas después se quejaba de rigidez en la nuca y posteriormente convulsionó, se observó el desarrollo de petequias sobre el abdomen. En horas de la tarde del mismo día, tres soldados más fueron admitidos al hospital de la base con la misma sintomatología. ¿Cuál es el diagnóstico más probable? Poliomielitis Meningitis tuberculosa Meningitis por H. influenzae Meningitis meningocócica Tétano

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Líquidos Orgánicos Estériles

Si el directo de LCR revelo la presencia de cocobacilos pleomórficos Gram negativos pequeños, entonces el probable agente etiológico es: Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Proteus vulgaris Yersinia pestis ¿Asumiendo que el microorganismos aislado del LCR del paciente da la prueba de la oxidasa positiva, cuando crece en medios sólidos, el diagnóstico más probable es:? Poliomielitis Meningitis tuberculosa Meningitis por H. influenzae Meningitis meningocócica Tétano Si el diagnóstico se encuentra ubicado entre meningitis por H. Influenzae y meningitis tuberculosa, ¿cuál de las siguientes pruebas diferenciaría más rápidamente los cuadros clínicos? Prueba de la tuberculina Coloración de Ziehl Neelsen del LCR Inoculación en conejos. Método de fijación rápida en Bordet-Gengou. De los diagnósticos presuntivos listados a continuación, ¿cual se beneficiaría más con un régimen de Penicilina G? Poliomielitis Meningitis tuberculosa Meningitis por H. influenzae Meningitis meningocócica Tétano

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Muestras de Tejido Óseo, Piel, Tejidos Blandos y Otros

MUESTRAS DE TEJIDO ÓSEO, PIEL, TEJIDOS BLANDOS Y OTROS TEJIDO ÓSEO La muestra colectada en cuadros infecciosos que se presentan en procedimientos ortopédicos deben ser colocados en un medio de transporte de Stuart si hay exudado supurativo y la muestra se ha tomado con hisopos, para evitar su desecación. Si se trata de una biopsia de tejido óseo debe utilizarse un tubo de rosca con 5 ml de CST o caldo infusión cerebro corazón para colocar la muestra de hueso. Llevar los tubos al laboratorio rápidamente para su procesamiento. El tubo con la muestra de biopsia debe incubarse por 24-48 horas a 36-37°C. Luego repicar en placas de SH, GC, MC, SB y SHA. La muestra transportada en medio de Stuart debe sembrarse en los mismos medios de cultivo y adicionalmente en CT. Observar el crecimiento obtenido para tratar de aislar el microorganismo implicado. Si las muestras han sido obtenidas por aspiración de material supurativo en procesos de osteomielitis, deben ser colocadas en un tubo de rosca estéril, llevadas al laboratorio y procesadas para aislamiento de microorganismos aeróbicos (S. aureus, Streptococcus spp, Enterobacterias) y microorganismos anaerobios (Clostrldlum spp, Fusobacterium spp, Bacteroldes spp.), tratando de clarificar la etiología de estos cuadros infecciosos, donde pueden involucrarse diferentes tipos de microorganismos. Debe hacerse al mismo tiempo un frotis directo para colorear con Gram; el frotis directo puede servir de ayuda si la muestra no ha sido contaminada con flora normal de la piel y se observa una morfología bacteriana predominante, acompañada de polimorfonucleares. Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y un tubo de CT Si la muestra fue tomada por aspiración de un sitio donde se sospeche infección por bacterias anaeróbicas, incluir SAH y SHAK

Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al médico Hisopado o Aspirado

CT incubar de 18 a 24 horas a 35°C

Repicar a placas de SH, GC, MC, SB y SHA.

Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al médico Biopsia de tejido óseo

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Muestras de Tejido Óseo, Piel, Tejidos Blandos y Otros

PIEL Las muestras de piel deben ser obtenidas de varias de las lesiones que se observen, una vez que hayan sido correctamente desinfectadas. Si las lesiones son cerradas la muestra debe ser colectada por aspiración con una jeringa estéril. Si se presentan exudados debe descartarse el material de la superficie y los exudados del interior deben ser utilizados para análisis bacteriológico. Siempre debe examinarse una preparación directa coloreada con Gram con el fin de observar una morfología bacteriana predominante que pueda ayudar a clarificar la etiología de la lesión. La presencia de abundantes cocos Gram-positivos acompañados de abundantes polimorfonucleares en pacientes con furunculosis podría sugerir aislamiento positivo de Streptococcus spp. o Staphylococcus aureus.

Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y un tubo de CT

Hisopado o Aspirado

Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al médico

Si la muestra fue tomada por aspiración de un sitio donde se sospeche infección por bacterias anaeróbicas, incluir SAH y SHAK

TEJIDOS BLANDOS La presencia de abscesos, heridas y ulceras supurativas constituyen los principales focos infecciosos que pueden producirse a nivel de tejido blando. El uso de hisopos de algodón para la toma de muestras procedentes de estas lesiones es impropio e inadecuado, pues además de facilitar una contaminación con flora microbiana de piel, mucosa o gérmenes del medio ambiente, es una muestra que no puede ser procesada para investigar microorganismos anaeróbicos frecuentemente implicados; la forma más conveniente para obtener muestras adecuadas en la formación de abscesos debe ser por punción aspirativa con jeringa y aguja estériles. Cuando se presentan lesiones en piel y mucosa que no muestran material supurativo, la mejor manera de obtener una muestra representativa es realizando una biopsia abierta del tejido comprometido. Una vez que la muestra ha sido tomada debe ser transportada rápidamente al laboratorio especialmente si se quiere investigar la presencia de microorganismos anaeróbicos. Los microorganismos que rutinariamente pueden aislarse comprenden: S. aureus, Streptococcus spp, Enterobacterlas y Pseudomonas spp, pero debe investigarse la presencia de Actinomicetos, Brucella spp, micobacterias, hongos, parásitos y bacterias anaeróbicas si se desea clarificar la completa etiología del cuadro para un tratamiento antimicrobiano adecuado. El frotis directo coloreado con Gram es representativo si se visualiza un número suficiente de microorganismos de morfología característica y podría, de alguna forma servir de indicativo para sospechar la presencia de determinado microorganismo.

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Muestras de Tejido Óseo, Piel, Tejidos Blandos y Otros Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y un tubo de CT Si la muestra fue tomada por aspiración de un sitio donde se sospeche infección por bacterias anaeróbicas, incluir SAH y SHAK

Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al médico

Hisopado o Aspirado

CT incubar de 18 a 24 horas a 35°C

Repicar a placas de SH, GC, MC, SB y SHA.

Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al médico Biopsia

CONDUCTO AUDITIVO EXTERNO Los hallazgos bacteriológicos encontrados en pacientes con cuadros de otitis media han sido consistentemente los mismos en muchos estudios realizados. De allí que no se justifica realizar una timpanocentesis excepto en aquellos cuadros de infecciones recidivantes o en niños recién nacidos, quienes pueden presentar una etiología diferente a la hallada en niños mayores de cinco años. Una muestra de secreción purulenta tomada con un hisopo de algodón estéril, después de haber desinfectado convenientemente la zona adyacente al conducto auditivo puede ser representativa para el aislamiento del agente causal. Colocar la muestra en el medio de transporte de Stuart o sembrar en medios primarios de cultivo teniendo en cuenta que los agentes etiológicos más frecuentes en otitis media aguda pueden ser: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y Streptococcus pyogenes. Sin embargo, algunas veces Branhamella catharralis, Ps. aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae y S. aureus pueden aislarse a partir de secreciones de oído medio en infantes. La realización de un frotis directo coloreado con Gram no es de mucha utilidad, a menos que se observe un solo tipo de microorganismo y presencia de polimorfonucleares abundantes.

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Muestras de Tejido Óseo, Piel, Tejidos Blandos y Otros Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y un tubo de CT

Hisopado

Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al médico

Si es una muestra de oído medio tomada por timpanocentesis o de oído interno, incluir placas de anaerobiosis

SECRECIONES OCULARES Cuando se presentan procesos infecciosos como conjuntivitis o queratitis generalmente hay problemas para la toma adecuada de la muestra. El uso de hisopos de cualquier tipo no está recomendado por el problema de la poca cantidad de muestra que se puede obtener. Un inconveniente adicional es la actividad antimicrobiana de los anestésicos locales que se deben aplicar. La queratoconjuntivitis puede ser producida por bacterias, actinomicetos, hongos o virus y se recomienda que la muestra sea tomada con el asa bacteriológica antes de la aplicación del anestésico local y la raspadura de la córnea sea tomada después de la aplicación del mismo. La muestra debe ser tomada, de preferencia por el oftalmólogo y procesada rápidamente, se debe realizar un frotis coloreado con Gram y cultivo. En algunas ocasiones deben realizarse coloraciones húmedas con hidróxido de potasio para observar estructuras de hongos, si tal preparación es requerida por el médico tratante. Los medios de cultivo que se deben sembrar son ASH, GC, MC, SB y un CT, las placas se deben incubar hasta 48 horas para buscar microorganismos exigentes como Haemophilus spp., S. pneumoniae, N. gonorrhoeae, Corynebacterium spp. y Streptococcus spp. que pueden involucrarse en estos procesos infecciosos con mayor o menor frecuencia. Las preparaciones directas coloreadas con Gram son útiles en casos de oftalmía purulenta por N. gonorrhoeae, donde se observarán diplococos Gram negativos intra y extra celular de morfología característica.

Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y un tubo de CT

Muestra

Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al médico

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Muestras de Tejido Óseo, Piel, Tejidos Blandos y Otros

MUESTRAS DE TEJIDO ÓSEO, PIEL, TEJIDOS BLANDOS Y OTROS EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIÓN 1. Investiga los siguientes términos: Desecación Furunculosis Recidiva Queratitis Oftalmía Eritema Febrícula 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Osteomielitis Tímpanocentesis Conjuntivitis Queratoconjuntivitis Metáfisis Plétora Megalia

Indique los microorganismos más frecuentemente involucrados en infecciones del tejido óseo. ¿Para qué se utilizan los caldos de enriquecimiento en este tipo de muestras? ¿Cuáles son los microorganismos más frecuentemente involucrados en infecciones de la piel? ¿Qué utilidad tiene realizar un frotis directo en este tipo de muestras? ¿Cuáles son los microorganismos más frecuentemente involucrados en infecciones del oído? ¿Cómo procesaría una muestra de secreción de quemadura?

CASOS CLÍNICOS 1. Paciente de 15 años que acude por fiebre de 38-39ºC, dolor, hinchazón e impotencia funcional en tobillo izquierdo de 10 días de evolución. No refiere ningún antecedente de interés. La exploración general era normal. El tobillo estaba hinchado, caliente y enrojecido, y era doloroso a los movimientos pasivos y activos. La analítica de sangre elemental fue normal. La radiografía del tobillo mostró una lesión osteolítica en la metáfisis. Se extrajeron 10 ml de líquido articular que contenía abundantes polimorfonucleares. Se realizó un abordaje quirúrgico de la lesión, extrayéndose un material purulento. Se realizó una tinción de Gram de dicho material, cuyo resultado se muestra en la fotografía. Los hemocultivos y el cultivo de líquido

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Muestras de Tejido Óseo, Piel, Tejidos Blandos y Otros

articular fueron negativos. En el cultivo del material extraído del hueso creció el organismo responsable del cuadro. ¿Cuál es el probable diagnóstico? ¿De qué microorganismo sospecha como productor del cuadro clínico? ¿Cómo procesaría en el laboratorio la muestra? 2. Niña de 10 días de edad, que acude al servicio de urgencias por febrícula, irritabilidad y ligera descamación facial acompañada de lesiones cutáneas vesiculosas en piernas. Los padres de la criatura notaron que la descamación facial había comenzado pocos días después de ser dada de alta del hospital y que su inicio fue peribucal. En este momento es diagnosticada de "descamación fisiológica del recién nacido" pero su asociación con algo de "fiebre" y la erupción vesiculosa en piernas 2 días después, les obligó a consultar de nuevo. Antecedentes obstétricos: Embarazo controlado y sin incidencias de interés. Nacida a término de parto vaginal y con sufrimiento fetal agudo. Peso 3.100 g, talla 49 cm. Antecedentes Familiares: Sin interés. Padres no consanguíneos. En la exploración física: Peso 3.250 g, talla 49 cm. Temperatura de 37,9ºC. Buen estado general. Coloración cutánea que impresiona de plétora vs. eritema con descamación cutanea perioral y de frente. Es fácil despegar la piel al traccionar de los bordes descamados e incluso, con el simple roce, zonas de piel sana. En miembros inferiores la lesión cutánea consiste en múltiples vesículas milimétricas y agrupadas de forma homogénea que afecta exclusivamente a muslos, rodillas y parte superior de tobillos. Se consigue, también mediante roce, despegar parte de epidermis en tiras largas. No se encuentran lesiones a otros niveles. La auscultación cardiopulmonar es normal y el abdomen, blando, depresible y sin megalias. Neurológico normal. Se realizó un hemocultivo y se aisló una cepa de Staphylococcus aureus. ¿Cuál es el probable diagnóstico? ¿Qué pruebas realizaría para confirmar el diagnóstico? ¿Cuál sería el tratamiento a indicar? 3. Hombre de 57 años de edad que se presentó al hospital con una crisis convulsiva. Tres semanas previas al ingreso había presentado cefaleas frontales que remitían con aspirinas. Las cefaleas se presentaron de manera recurrente, incluso el día anterior a su admisión. En la mañana del ingreso, el paciente había sufrido de convulsiones focales al presentar movimientos involuntarios del lado derecho de la cara y el brazo. Durante su estancia en la emergencia, el paciente presentó una crisis convulsiva generalizada que se controló con diazepam, fenitoína y fenobarbital por vía intravenosa. La información proporcionada por la esposa reveló que el paciente se 61

Muestras de Tejido Óseo, Piel, Tejidos Blandos y Otros

había sometido a una extracción dental y colocación de un puente cinco semanas antes. El paciente no tenía antecedentes de tabaquismo, era bebedor social únicamente y no recibía tratamiento farmacológico. El resto de la historia clínica no arrojó más datos de utilidad. La temperatura al ingreso fue de 37°C, frecuencia cardiaca de 110/minuto y tensión arterial de 140/80 mmHg. A la exploración física el paciente se encontró somnoliento y con disminución de su capacidad de atención. El paciente podía mover todas las extremidades, aunque el brazo derecho lo movía menos que el izquierdo, sugestivo de posible aumento de la presión intracraneal. El resto de la exploración física resultó normal. Las pruebas de laboratorio resultaron normales. La punción lumbar no se llevó a cabo ni se examino el LCR, debido al posible aumento de la presión intracraneal secundaria a una lesión ocupativa. Los hemocultivos resultaron negativos. El análisis con tomografía computarizada de la cabeza del paciente identificó una lesión localizada de aspecto anular y 1,5 cm de diámetro en el hemisfério parietal izquierdo, sugestiva de absceso cerebral. El paciente se sometió a un proceso de neurocirugía con toma de biopsia de la lesión, la cual se extrajo por completo. El cultivo del material necrótico de la lesión reveló la presencia de Prevotella melaninogenica y Streptococcus anginosus. El examen patológico del tejido sugirió que la lesión tenía varias semanas de evolución. El paciente recibió terapia antimicrobiana durante cuatro semanas, no volvió a presentar convulsiones ni mostró déficit neurológico subsecuente. Un año después, se descontinuaron los medicamentos anticonvulsivos. ¿Qué factor predisponente favoreció a que este paciente desarrollara un absceso cerebral? ¿Los microorganismos aislados forman parte de la flora normal del cuerpo? ¿Qué importancia tiene el cultivo del material del absceso después del proceso quirúrgico? ¿Qué condiciones favorecen el desarrollo de abscesos cerebrales?

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Bibliografía Consultada

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA Brooks, G.; Butel, J.; Morse, S. Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 17 Edición. Editorial El Manual Moderno. México. 2002. Charles, K. Microbiology Review. Sixth Edition. Medical Examination Publishing Company. INC. USA. 1977. De la Maza, L.; Pezzlo, M.; Jo Baron, E. Color Atlas of Diagnostic Microbiology. Mosby. USA. 1997. Edmond, R.; Rowland, H.; Welsby. P. Color Atlas of Infectous Diseases. Third Edition. Mosby-Wolfe. España. 1995 Inglis, T. Microbiology. Second Edition. Churchill Livinstone. 1999. Manual de Técnicas Básicas para un Laboratorio de Salud. OPS. Publicación Científica N° 439. 1983. Miller, J. A Guide to Specimen Management in Microbiology. ASM Press.1996. Steve, A.; Dennis, S. Microbiology. A Photographics Atlas for the Laboratory. Benjaming Cummings Editors. 2001.

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LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE BIOANÁLISIS PRÁCTICA PROFESIONAL DE BACTERIOLOGÍA

REALIZADO POR: LIC. ARMINDO PEROZO MENA M.SC

MARACAIBO, ABRIL 2003