Bab Iii.docx

BAB III METODE PENELITIAN A. Waktu Dan Tempat Penelitian Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan April sampai September 2018 dan bertempat di Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Halu Oleo Kendari. B. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang akan dilakukan yaitu penelitian eksperimental, keseluruhan tahapan dikerjakan di Laboratorium. C. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun beluntas (Pluchea indica L). yang diperoleh di daerah kendari, andounohu, lorong Belibis, Etanol 96 % (Merck®), Akuades, NaCl 0,9 % (Otsuka®), dimetil sulfoksida (DMSO) Potato Dextrose Agar (Merck®), Ketokonazol, Jamur Malassezia sp. D. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rotary vacuum evaporator (Buchi®), Laminar air flow (Chuaire®), Autoklaf (Wisecrave®), Inkubator (Froilabo®), Hot plate (Stuart®), , Timbangan analitik (Precisa®), Blender (philips), Vortex (Stuart®), Erlenmeyer (Pyrex®), Gelas kimia (Pyrex®), Gelas ukur (Pyrex®), Tabung reaksi (Pyrex®), Cawan petri (Anumbra®), Pipet mikro (Effendrof®), Lampu bunsen, Pinset, Jarum ose, Cutter, Mistar (Kenko®), Batang pengaduk, Pencadang, Labu takar (Pyrex®), Chamber, Pipet tetes, Pipet ukur, Toples kaca.

E. Variabel

1. Variabel Bebas (independent) Variabel bebas pada penelitian ini yaitu variasi konsentrasi ekstrak daun beluntas (P. indica L.) dalam sediaan gel sampo. 2. Variabel terikat (dependent) Variabel terikat pada penelitian ini yaitu a. Efektivitas antijamur ekstrak daun beluntas (P. indica L.). b. Efektivitas antijamur sediaan gel sampo ekstrak daun beluntas (P. indica L). F. Defenisi Operasional 1. Ekstrak daun beluntas adalah ekstrak yang berasal dari daun beluntas yang diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan etanol 96%, maserat yang diperoleh diuapkan pelarutnya dengan alat rotary evaporator sampai menjadi ekstrak kental. 2. Formula gel shampo ekstrak daun beluntas adalah formula sampo yang berfungsi sebagai antiketombe dibuat dengan variasi konsentrasi ekstrak. 3. Aktifitas antifungi yaitu kemampuan sediaan gel sampo ekstrak daun beluntas terhadap jamur malassezia sp penyebab ketombe. G. Prosedur Penelitian 1. Pengelolaan sampel Sampel diperoleh di Kota Kendari dimana sampel yang diperoleh diidentifikasi terlebih dahulu untuk memastikan bahwa tanaman yang diporeleh merupakan beluntas. Setelah dilakukan identifikasi, kemudian dilakukan sortasi basah, untuk membersihkan sampel dari pengotor lain. Pencucian dilakukan dengan air yang mengalur. Sampel selanjutnya dirajang menjadi potongan kecil-kecil agar proses pengeringan berlangsung lebih cepat. Sampel dikeringkan di bawah sinar

matahari dan ditutup dengan menggunakan kain hitam untuk menghindari terurainya kandungan kimia. 2. Estraksi daun beluntas Ekstraksi daun beluntas dilakukan dengan metode maserasi, dengan langkah-langkah sebagai berikut: Masukan 500 gram serbuk simplisia kedalam maserator, kemudian ditambahkan pelarut etanol 96% (pembasah) secukupnya hingga seluruh simplisia terendam, dan dibiarkan selama 10 menit agar proses pembasahan simplisia berlangsung. Tambahkan kembali etanol 96% sebanyak 2x volume etanol 96% sebelumnya (pembasah). Diamkan selama 48 jam sambil diadukaduk pada waktu tertentu. Saring ekstrak cair yang diperoleh kedalam penampung. Lalu filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kental yang kemudian ditimbang (Ulviani, 2016) 3. Skrining fitokimia a. Pemeriksaan saponin Larutan ekstrak sebanyak 2 ml ditambahkan akuades, kemudian dikocok kuat-kuat. Senyawa saponin akan menghasilkan busa setinggi 1 – 10 cm yang stabil dan tidak kurang dari 10 menit. Pada penambahan 1 tetes HCl 2N, busa tidak hilang (Pradana, 2005). b. Pemeriksaan Flavonoid Untuk senyawa flavonoid maka sampel dengan pelarut etil asetat sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan di tambahkan 2 tetes pereaksi FeCl3 1%. Larutan positif mengandung flavonoid apabila terjadi perubahan warna menjadi warna biru atau hitam kehijauan (Pradana, 2005). c. Pemeriksaan Alkaloid

Larutan ekstrak sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diperiksa adanya senyawa alkaloid dengan cara larutan ekstrak ditambah 2 tetes pereaksi Dragendorf. Hasil positif jika terbentuk endapan berwarna merah jingga atau cokelat muda sampai kuning/oranye (Pradana, 2005). d. Uji kandungan tannin Sebanyak 1 gram ekstrak daun beluntas dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 3 tetes besi (III) klorida. Keberadaan tanin ditandai dengan terbentuknya warna hijau kehitaman (Harborne, 1987). e. Uji kandungan terpenoid Sebanyak 1 gram ekstrak daun beluntas dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 0,5 mL etanol 96%, setelah itu dikocok, lalu ditambahkan 0,5 mL asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat sebanyak 2 mL. Keberadaan terpenoid ditandai dengan terbentuknya warna merah atau ungu (Harborne, 1987). H. Formulasi Sediaan Gel Shampo Formulasi yang digunakan pada penelitian ini mengacu pada formula sediaan gel shampo oleh Budiman (2015), dengan komposisi sebagai berikut : Minyak atsiri lemon, Natrium lauril sulfat, HPMC, Carbomer, Propilenglikol, Methyl paraben , Propil paraben , Pewangi lemon dan Akuades. I. Formulasi HPMC dikembangkan dalam 50 ml aquades yang sudah melalui proses pemanasan dan didiamkan hingga dingin (1). Air yang dipanaskan pada suhu 60o C ±20 ml dimasukkan kedalam beaker glass Tambahkan Sodium Lauryl Sulfate dan EDTA, dan TEA aduk sampai larut (2). Larutkan menthol dengan propilen glikol secukupnya, aduk sampai larut kemudian tambahkan

metil paraben (3). Larutan sodyum laurit sulfat (2) dimasukan sedikit demi sedikit dalam masa gel (1) diaduk hingga homogen (4) masukan ekstrak beluntas sedikit demi sedikit (5), masukan campuran (3) kedalam campuran (5) tambahkan mentol aduk perlahan hingga homogen tambahkan air panas sampai batas kalibrasi botol 100 ml. Tabel 1. Formula sediaan Gel sampo Konsentrasi (% b/v) Kegunaan No

Bahan

FI

FII

FIII

Ekstrak daun beluntas

1,5

3

4,5

2.

Sodium Lauril Sulfat

10

10

10

3.

HPMC

2

2

2

2

Basis Gel

5.

Propilen Glikol

15

15

15

15

Humektan

6.

EDTA

0,3

0,3

0,3

0,3

Pengkhelat

7.

Metil paraben

0,02

0,02

0,02

0,2

Pengawet

8.

Mentol

qs

qs

Qs

Qs

Pengaroma

Akuades

ad 100

ad 100

ad 100

Ad 100

Pelarut

1.

9.

FIV Zat Aktif 6 10

Surfaktan

J. Uji aktivitas antifungi sediaan gel shampo a. Sterilisasi alat dan bahan Alat dan bahan yang akan digunakan harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat gelas seperti cawan petri, tabung reaksi ose bulat dicuci bersih kemudian dikeringkan pada suhu kamar. Setelah kering alat-alat gelas tersebut kemudian dibungkus dengan kertas lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit (Ansel, 2008).

b. Pembuatan media Sabouraud Dextrose Agar (SDA). Media agar dibuat dengan melarutkan 65 gram SDA ke dalam 1 L akuades panas. Serbuk SDA dilarutkan sedikit demi sedikit hingga menjadi larutan yang homogen Kemudian media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121ºC selama 20 menit (Rosyida, 2013). Pada pembuatan media dilakukan secara aseptis dengan cara bagian ujung alat dipanaskan dan ditutup dengan kapas dan alumunium foil. Masing-masing media yang disterilkan dalam autoklaf dan diatur pada suhu 121O C selama 15 menit (Widyasanti, 2016). c. Media peremajaan jamur Media Sabouraud Dextrose Agar (SDA) disuspensikan sebanyak 65 g serbuk Sabouraud Dextrose Agar dalam 1 liter aquades. Masing-masing suspensi dipanaskan hingga mendidih sambil diaduk rata selama 15 menit kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C. Media kultur untuk mikroba uji berupa sejumlah 5 mL media agar yang telah disiapkan sebelumnya, dimasukkan dalam tabung reaksi. Tabung reaksi yang telah berisi media agar tersebut kemudian disumbat dan disterilisasi dengan menggunakan autoklaf. Kemudian tabung reaksi tersebut diletakkan dalam posisi miring dan dibiarkan memadat. Kemudian kultur murni bakteri atau jamur yang telah didapat sebelumnya digores pada agar miring menggunakan ose bundar (Fisheri, 2017). a. Media dasar SDA dilarutkan dalam aquadest kemudian dipanaskan di atas hot plate sampai mendidih dan diperoleh larutan jernih. Media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. b. Pembuatan larutan ekstrak

Ekstrak kental daun beluntas dibuat dalam beberapa seri konsentrasi menggunakan pelarut dimetil sulfoksida (DMSO). Setiap seri konsentrasi dibuat dengan menambahkan pelarut DMSO ke dalam beberapa gram ekstrak kental daun beluntas, sampai volumenya 2 mL (Rosyida, 2013). c. Uji aktivitas antijamur Media dasar SDA dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan mengeras. Pada permukaan lapisan dasar diletakkan 6 pencadang dan diatur sedemikian rupa sehingga terdapat daerah yang baik untuk mengamati zona hambat yang terjadi. Suspensi jamur uji dituang ke dalam cawan petri di sekeliling pencadang. Dikeluarkan pencadang dari cawan petri terbentuk sumur yang akan digunakan untuk larutan uji, larutan control positif (+) dan larutan kontrol negatif (-). Diteteskan larutan uji ekstrak sampel dan sediaan gel shampo, larutan kontrol positif (+) dan larutan kontrol negatif (-). Dilakukan pengulangan secara triplo dengan cara yang sama. Diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 370C selama 3-5 hari (Elvira, 2017). Diamati zona hambat yang terjadi di sekitar sumuran kemudian diukur diameter zona hambat secara horizontal dan vertical dengan menggunakan penggaris berskala. Tabel 2. Daerah hambatan aktivitas antimikroba (Greenwood, 1995; Glenn, 1996). Diameter ≥ 21 mm 11-20 mm 5-10 mm ≤ 5 mm

Interpretasi Sangat kuat Kuat Sedang Lemah

Parameter yang diukur dalam pengujian antimikroba ialah perubahan visual dari besarnya diameter zona bening yang terbentuk di sekitar sumuran pada media pertumbuhan bakteri dan jamur dalam pengujian aktivitas antimikroba. Pengamatan dilakukan dengan mengukur area bening di luar sumuran menggunakan jangka sorong. Pengukuran zona bening yang terbentuk dapat dilihat pada gambar dibawah (Ariyanti, 2014).

Gambar 11. Cara perhitungan diameter diameter daerah hambat 𝑃𝑒𝑛𝑔𝑢𝑘𝑢𝑟𝑎𝑛 𝑑𝑖𝑎𝑚𝑒𝑡𝑒𝑟 𝑑𝑎𝑒𝑟𝑎h h𝑎𝑚𝑏𝑎𝑡 = 2𝑥𝑧 -2𝑦𝑧

Ket : 2xz = diameter zona bening dan sumuran 2yz = diameter sumuran a,b,c,d = sisi pengukuran zona bening Diameter zona bening yang diukur seperti pada Gambar. Pengukuran dilakukan pada empat sisi yaitu pada sisi a, b, c dan sisi d, kemudian dihitung nilai rata-rata dari hasil pengukuran empat sisi tersebut. Cara menghitung rata-rata diameter zona bening yaitu : 𝑎 +𝑏 +𝑐 +𝑑 4 Pengukuran diameter daerah hambat pada sampel penelitian yang telah selesai dilakukan, dilanjutkan dengan membandingkannya terhadap kontrol positif. Hasil perbandingan tersebut dijadikan acuan terhadap seberapa besar aktivitas antimikroba yang terkandung dalam ekstrak tanaman sehingga jika sampel penelitian memiliki aktivitas terhadap jamur dan bakteri patogen uji, zona bening yang terbentuk di sekitar sumuran menandakan bahwa pertumbuhan mikroorganisme telah dihambat oleh senyawa-senyawa yang terdapat sampel penelitian.