Aula 6 Sebenta De Bactereologia

AULA Nº6 – CONTROLO MICROBIOLÓGICO POR AGENTES QUÍMICOS E FÍSICOS Definição de Termos Frequentemente Utilizados Existem tratamentos que tanto podem inibir o crescimento, como também matar determinados microrganismos dependendo das condições. Em determinadas situações é necessário eliminar todos os microrganismos de um objecto. No entanto, outras situações requerem apenas a destruição parcial da população microbiana. Esterilização: processo através do qual todas as células vivas, esporos viáveis e vírus são removidos de um objecto ou habitat. Quando a esterilização é efectuada por um agente químico, este último designa-se esterilizante. Desinfecção: morte, inibição ou remoção de microrganismos potencialmente patogénicos, normalmente aplicada apenas em objectos inanimados. A desinfecção tem como objectivo principal a destruição, mas também reduz substancialmente a população microbiana. Alguns esporos e microrganismos podem resistir à desinfecção, portanto esta não significa necessariamente esterilização. Sanitização: relacionada com a desinfecção, em que a população microbiana é reduzida a níveis considerados seguros pelos padrões de saúde pública, ie, níveis não prejudiciais. Anti-sepsia: prevenção de infecção ou sepsis que é conseguida através de antisépticos. Estes são agentes químicos aplicados a tecidos para prevenir infecção através da morte ou inibição de crescimento; eles também reduzem a população microbiana. Como são aplicados a tecidos, são menos tóxicos que os desinfectantes. Um desinfectante ou anti-séptico pode ser extremamente eficaz contra um determinado grupo de microrganismos, causando a sua total destruição (morte), neste caso esse agente é designado bactericida, fungicida, algicida ou viricida. Outros químicos não matam, mas previnem o crescimento dos microrganismos; se estes agentes 1

forem removidos o crescimento é retomado, estes agentes designam-se bacteriostático, fungistático.

Cinética da Morte Bacteriana A população microbiana não é morta instantaneamente quando exposta a um agente letal, a morte dá-se de uma forma progressiva. A morte populacional, como o crescimento populacional, é geralmente exponencial, ie, há uma igual redução na população para intervalos de tempo constantes. O logaritmo do nº de bactérias sobreviventes versus o tempo de exposição do microrganismo ao agente resulta numa recta:

Neste exemplo o valor do D121 (temperatura = 121ºC) é de 1 minuto. Este valor corresponde ao tempo necessário para que haja redução de 90% da população. O parâmetro D será discutido em maior pormenor mais à frente. A bactéria é definida como morta se não houver crescimento e reprodução quando inoculada numa cultura que normalmente apoiaria o seu crescimento.

Condições que Influenciam a Eficiência da Actividade dos Agentes Antimicrobianos A eficiência de um agente microbiano depende de pelo menos 6 factores: Dimensão da população: devido ao facto de uma fracção equivalente da população microbiana ser morta durante cada intervalo, uma população maior demorará mais tempo a morrer do que uma população menor. 2

Composição da população: a eficiência de um agente microbiano varia muito com a natureza dos organismos a serem tratados, isto porque os microrganismos diferem grandemente quanto à sua susceptibilidade. Os endosporos bacterianos são muito mais resistentes aos agentes antimicrobianos do que a maioria das células vegetativas e as células jovens são menos resistentes que células maduras. Concentração ou intensidade do agente antimicrobiano: normalmente, quanto mais concentrado ou intenso o agente químico, mais rapidamente os microrganismos são destruídos. Contudo, a eficiência do agente não se encontra directamente relacionada com a sua concentração ou intensidade. Até um certo ponto, um pequeno aumento da concentração do agente leva a um aumento exponencial da sua eficiência; a partir desse ponto, aumentos podem não elevar o índice de morte. Por vezes um agente pode até ser mais eficiente quando menos concentrado. Tempo de exposição: quanto mais tempo a população é exposta ao agente antimicrobiano, mais microrganismos são mortos. Temperatura: normalmente uma elevação na temperatura a que actua o agente estimula a actividade deste último. Ambiente Local: A população a ser controlada está rodeada de factores ambientais que tanto podem proteger como expor os microrganismos à destruição. Por exemplo, como o calor mata mais eficazmente a um pH ácido, comidas ácidas são mais facilmente pasteurizadas do que comidas com pH mais elevado como o leite. Outro factor ambiental importante é a presença de matéria orgânica. Esta protege os microrganismos do aquecimento e de químicos; por esta razão é necessário limpar um objecto antes que este seja desinfectado ou esterilizado.

Métodos Físicos de Controlo Microbiano Os quatro agentes físicos mais utilizados no controlo microbiano são:

Calor: é um dos métodos mais utilizados para destruir microrganismos. Pode ser aplicado tanto o calor húmido como o calor seco. Devido ao calor ser tão utilizado no controlo microbiano, é essencial que existam parâmetros de medida da eficiência da morte pelo calor:

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TDP (thermal death point): a mais baixa temperatura à qual uma suspensão microbiana é morta em 10 minutos. TDT (thermal death time): o tempo mais curto necessário para matar todos os organismos numa suspensão microbiana a uma temperatura específica e sob condições definidas. Valor D (decimal reduction time): unidade mais realista e mais precisa já que é teoricamente impossível “destruir completamente”

os

numa

Traduz

amostra.

microrganismos o

tempo

necessário para matar 90% da população (redução da população para 1/10) de uma amostra a uma dada temperatura. O valor D

é

inversamente

proporcional

à

temperatura como ilustrado no gráfico. Os valores D são utilizados para fazer uma estimativa da resistência de um microrganismo a diferentes temperaturas através do cálculo do valor Z, sendo que este é o aumento de temperatura necessário para reduzir o valor D a 1/10.

Valores de D e Z de alguns organismos patogénicos:

-

Calor

húmido:

mata eficazmente bactérias, vírus e fungos. A exposição a água a ferver durante 10 min é suficiente para destruir células vegetativas e esporos eucarióticos. Infelizmente a temperatura de ebulição da água (100ºC) não é elevada o suficiente para destruir endosporos bacterianos, estes podem sobreviver horas na ebulição. Assim concluímos que a ebulição não esteriliza. 4

Condições

aproximadas

para a morte pelo calor húmido:

Esterilização por calor húmido: deve ser realizada a temperaturas acima dos 100ºC para destruir todos os esporos bacterianos, isto requer o uso de vapor saturado sob pressão. É conseguida com auxílio de um AUTOCLAVE: - numa atmosfera de vapor de água, isenta de ar, todas as bactérias são mortas, mesmo sob a forma esporulada, em 20 min – 115/120ºC. - água é fervida para produzir vapor que é libertado para o interior da câmara do autoclave; o ar que inicialmente se encontra no interior da câmara é forçado a sair até que a câmara esteja cheia de vapor saturado e que os outlets estejam fechados; vapor saturado e quente continua a entrar na câmara até que sejam atingidos os valores de temperatura e pressão desejados (geralmente 121ºC), a esta temperatura o vapor 5

saturado destrói todas as células vegetativas e endosporos de um volume pequeno em 10 a 12 min mas o tratamento continua até aos 15 min para maximizar a segurança. - Usos: meios de cultura; objectos de borracha; certos plásticos; vidro; instrumentos de colheita; descontaminação de culturas microbianas, produtos patológicos, objectos contaminados. Efeito do ar retido na temperatura de autoclavagem:

Indicadores de esterilização: - indicadores biológicos: utilizam-se endosporos de Bacillus stearothermophilus (muito resistentes); depois da autoclavagem a cultura é incubada por vários dias, se não houver crescimento bacteriano significa que a esterilização foi bem sucedida; possui a desvantagem de demorar algum tempo. - indicadores químicos: papel indicador que muda de cor quando a temperatura é suficiente para a autoclavagem; fita cola na qual aparece a palavra estéril; mudança de cor ou aparecimento da palavra estéril significa que a esterilização foi eficaz. - Calor seco: os itens a serem esterilizados são colocados num forno a 160170ºC durante 2-3 horas. A morte bacteriana resulta da oxidação dos constituintes celulares e desnaturação de proteínas (destruição de microrganismos a temperatura vizinha da de carbonização da matéria orgânica). Apesar de ser menos eficaz que a esterilização por calor húmido, o calor seco não provoca a corrosão do vidro ou metais e pode ser utilizado para esterilizar pós, óleos, etc. No entanto, o calor seco não é indicado para materiais termossensíveis, como alguns plásticos e borracha.

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- Outros processos de controlo microbiano pelo calor: - Pasteurização (leite): Clássica: 63ºC por 30 min. HTST (high temperature short-term pasteurization): utilizada para maiores quantidades da amostra; 72ºC por 15 seg, seguido de refrigeração rápida. UHT (ultrahigh-temperature sterilization): 140-150ºC por 1-3 seg; produtos submetidos a este método não necessitam de refrigeração e podem ser conservados a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 meses. Tindalização: método descontínuo de aquecimento de material; com um 1º aquecimento eliminam-se as células vegetativas, esperam-se 24 hrs, sendo que neste intervalo de tempo os esporos germinam, sendo depois eliminados pelo 2º tratamento térmico.

Baixas Temperaturas: apesar do ênfase estar sobre a destruição dos microrganismos, muitas vezes a técnica de controlo mais conveniente é a inibição do seu crescimento e reprodução pelo uso de refrigeração ou congelação. A congelação é um óptimo método de conservação e armazenamento de produtos por um longo prazo, já a refrigeração conserva os produtos apenas por um curto período de tempo, pois esta desacelera a reprodução e crescimento microbiano mas não os trava por completo. 7

Ultrafiltração: excelente forma de reduzir a população microbiana em soluções de material temossensível e por vezes também pode ser utilizada para esterilizar soluções. O filtro remove os microrganismos mas não os destrói. Existem dois tipos de filtros: - Filtros de profundidade - Membranas filtrantes: filtros circulares de membranas porosas feitas de nitrato de celulose, acetato de celulose, policarbonato e outros materiais sintéticos. Membranas com poros de aproximadamente 2 μm são utilizadas para remover a maior parte das células vegetativas, mas não removem vírus. As membranas são normalmente antecedidas de filtros de profundidade que removem as partículas de maiores dimensões para que estas não entupam a membrana filtrante. A solução é sugada pelos filtros com a ajuda de um aspirador e é colectada num recipiente previamente esterilizado.

Segurança no trabalho: o ar também pode ser esterilizado por filtração. Câmaras biológicas de segurança de fluxo laminar utilizando filtros HEPA (high efficiency particule air) é um dos sistemas d filtração de ar mais importantes. A câmara de fluxo laminar força o ar a atravessar os filtros HEPA. Isto protege um trabalhador dos 8

microrganismos

a

serem

manipulados

(vírus

tumorais,

DNA recombinante,

Mycobacterium tuberculosis) dentro da câmara e impede a contaminação do ar.

Hotes de fluxo laminar de alta segurança contendo filtros HEPA (poro de 0,2 μm).

Radiações: consiste em incidir um determinado tipo de radiação no material a esterilizar. UV: possui um fraco poder penetrante; utilizada na esterilização de superfícies e salas, sendo que as lâmpadas de UV têm de estar desligadas quando estas superfícies ou salas estão a ser usadas, devido aos danos que esta radiação poderá causar na pele e olhos. Ionizante: possui um elevado poder penetrante, daí ser tão eficaz na esterilização; destrói endosporos bacterianos e células vegetativas, no entanto não é eficaz contra vírus; radiação gama do cobalto 60 é utilizada para esterilizar antibióticos, hormonas, suturas, alimentos, plásticos e material descartável; possui a desvantagem de ser muito dispendioso.

Agentes Químicos Anitmicrobianos Agentes químicos são normalmente utilizados na desinfecção e anti-sepsia, sendo que muitos factores influenciam a eficiência desses agentes.

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Características de um desinfectante desejável: - largo espectro - activo em fracas concentrações e na presença de matéria orgânica - não tóxico para as pessoas - não corrosivo - inodoro, ou odor agradável - baixa tensão superficial - solúvel em água e em lípidos - estável e barato - acção rápida - não ser afectado por factores ambientais (luz) - compatível com sabões, detergentes e outros produtos químicos - efeito residual na superfície - não poluente

Principais agentes desinfectantes e anti-sépticos: Fenóis e derivados

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Actividade: - bactericida contra as formas vegetativas incluindo o M. tuberculosis - sem acção sobre endosporos, à temperatura ambiente Vantagens: - activos contra M. tuberculosis - efectivos na presença de matéria orgânica - mantêm-se activos nas superfícies bastante tempo após aplicação Desvantagens: - odor desagradável - podem causar irritação da pele

Álcoois

Actividade: são bactericidas e fungicidas mas não esporicidas Aplicações: - anti-sepsia da pele e instrumentos médicos (termómetros) - desinfecção e descontaminação de superfícies e bancadas

Compostos Halogenados

São solúveis em água e libertam o iodo lentamente para minimizar irritações e queimaduras. Actividade: 11

- importantes agentes antimicrobianos - destroem todas as formas vegetativas mas não são esporicidas Aplicações: - iodo é usado como anti-séptico para a pele - o cloro é usado no tratamento de águas municipais e piscinas e na indústria alimentar Pastilhas de cloro - ácido peracético: utilizado como alternativa a compostos clorados; desinfectante hospitalar de superfícies (instalações, equipamentos e utensílios) em contacto com matéria orgânica.

Aldeídos

Modo de acção: inactivam ácidos nucleicos e proteínas, originam ligações cruzadas e alquilações. Actividade: - eficazes contra formas vegetativas e esporos - podem ser utilizados como químicos esterilizantes Aplicações: desinfecção de equipamentos hospitalares e de laboratório. Nota: o glutaraldeído apresenta vantagens relativamente ao formaldeído, já que é menos irritante e mais activo.

Compostos de amónio quaternário

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Actividade: destroem formas vegetativas microbianas, mas não são esporicidas nem actuam contra o M. tubercolosis. Aplicações: desinfecção de talheres e pequenos instrumentos, anti-sépticos para a pele. Vantagens: - estáveis - não tóxicos - suaves e não irritantes Desvantagens: são inactivados pela água dura e sabões.

Gases esterilizantes

Actividade: - microbicida e esporicida - o Oet é um agente alquilante de elevado poder penetrante Aplicações: - material descartável empacotado em papel ou polietileno - artigos de plástico (caixas de petri, seringas, suturas, catateres) - Oet é explosivo e tem acção irritante nas mucosas. Requer a utilização de câmaras especiais que controlam a concentração de Oet, temperatura e humidade - condições de esterilização: 5 a 8 hrs a 38ºC ou 3 a 4 hrs a 54ºC, 40-50% de humidade, concentração Oet 700 mg/l

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Níveis de actividade dos desinfectantes:

Avaliação da Eficiência do Agente Antimicrobiano Dilui-se o desinfectante e adiciona-se o microrganismo que fica a incubar durante x min. Ao fim desse tempo o microrganismo é replicado para um meio de cultura novo, aguardando-se 1 a 2 dias par verificar se ele se desenvolveu ou não.

Determinação do índice de fenol: Teste de avaliação em que a actividade do desinfectante é comparada com a do fenol. Técnica: 14

- série de diluições do fenol e do desinfectante em estudo, inoculam-se com as bactérias (Salmonella typhi e Staphylococcus aureus) - colocar em banho de água a 20 ou 37ºC - subculturas em meio novo com intervalos de 5 min e incubar 2 ou mais dias A diluição que inibe o crescimento ao fim de 10 min de contacto mas que não inibe ao fim de 5 min é utilizada para calcular o índice de fenol.

Quanto mais elevado o índice de fenol  mais eficaz o desinfectante. Um índice de fenol maior que 1  Desinfectante mais eficaz que o fenol.

Coeficiente de fenol (CF) de alguns desinfectantes:

Bibliografia usada para a aula nº 6 Slides das Teóricas Prescott, Harley, and Klein’s MICROBIOLOGY, de Joanne M. Willey, Linda M. Sherwood e Christopher J. Woolverton, Edição Internacional – 7ª edição, McGrawHill, Cap. 7

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