Aula 10 Sebenta De Bactereologia

AULA Nº 10 – Regulação do metabolismo bacteriano (continuação) Regulação da expressão genética nos procariotas A regulação do Metabolismo Bacteriano é indispensável para a sobrevivência dos microrganismos, pois permite-lhes responder às variações do meio ambiente. Assim, perante uma alteração do meio, o microrganismo tem de adaptar o seu metabolismo aos recursos existentes de modo a conseguir sobreviver. Há diferentes mecanismos de regulação:

Regulação Alostérica: Um regulador liga-se ao centro alostérico e altera o centro activo da enzima, modificando a sua afinidade para o substrato. A ligação formada é electrostática não covalente. Regulação da quantidade de proteína, que pode ocorrer a diversos níveis: Regulação ao nível da iniciação da transcrição:

Regulação da transcrição por factores Sigma: Os factores sigma são moléculas responsáveis pelo reconhecimento, de forma específica, de um determinado promotor, consoante as necessidades da bactéria. Ou seja, por exemplo, se considerarmos uma sequência com um promotor azul e um promotor encarnado, um factor sigma azul só iria reconhecer apenas o respectivo promotor azul e não o encarnado. Assim, uma mudança do factor sigma faz com que

sejam transcritos outros genes, pois o reconhecimento de cada promotor leva à transcrição de apenas um respectivo conjunto de genes. Deste modo, em casos de adaptação da bactéria, esta pode passar a sintetizar outros factores sigma que assim reconhecem outros promotores importantes para que a bactéria possa dar resposta às novas necessidades e, assim, conseguir adaptar-se. Controlo negativo:

Indução: É o fenómeno de aumento da expressão de um operão, resultante da presença de uma molécula indutora. Um exemplo é o operão lactose que codifica para a enzima Beta-galactosidase O operão lactose é constituído por uma sequência promotora, um gene Lac Z e um gene Lac Y (antes, há um gene repressor que codifica uma proteína repressora). Na ausência de lactose, uma proteína alostérica repressora liga-se ao final do promotor, numa região denominada operador, e inibe a transcrição do operão. Só na presença de lactose, a conformação do repressor é alterada, o que modifica a sua afinidade para o operador. Como tal, na presença de lactose ocorre a transcrição do operão e a síntese da enzima Beta-galactosidase, que degrada a lactose em glicose e galactose. Assim, diz-se que neste caso a lactose funciona como indutor.

Co-Repressão: É o fenómeno de inibição da expressão de um operão resultante da presença de uma molécula repressora. Um exemplo é o operão triptofano: O operão triptofano é constituído por uma sequência promotora, um gente trpE e um gene trpA. Na ausência de triptofano, a transcrição do operão ocorre normalmente. Só na presença de triptofano a conformação de uma proteína alostérica é alterada, o que modifica a sua afinidade para uma região do promotor designada por operador. Como tal, a proteína liga-se ao operador e inibe a transcrição do operão na presença de triptofano. Assim pode dizer-se que o triptofano funciona como repressor.

Controlo Positivo:

Activação cAMP/CAP: O operão lactose é constituído por uma sequência promotora, um gene LacZ e um gene LacY. Na ausência do cAMP (AMP cíclico), a molécula CAP não se consegue ligar ao promotor, não ocorrendo transcrição. Só na presença de cAMP, a molécula CAP é activada, ligando-se ao promotor, o que permite a sua interacção com a RNApolimerase e a ocorrência da transcrição. Assim, o AMP cíclico (complexo cAMP-CAP) proveniente da conversão do ATP pela adenilciclase na ausência de glicose, funciona como activador. Regulação ao nível da terminação da transcrição:

Terminação prematura da Transcrição – fenómeno de atenuação: O fenómeno de atenuação, processo de terminação prematura da transcrição, deve-se à falta de um determinado aminoácido. Considere-se o exemplo do operão triptofano: O operão tem na sua constituição uma sequência promotora. O promotor apresenta na sua zona terminal um operador e uma região líder. Esta região líder é responsável pelo controlo da transcrição após a ligação da DNA-polimerase ao promotor, sendo constituída por uma sequência líder (codifica a síntese do péptido líder) e um atenuador. A região líder, quando transcrita, origina 4 segmentos complementares que formam estruturas em forma de cabeça de alfinete levam à terminação da transcrição, não chegando a ocorrer transcrição dos genes propiamente ditos do operão triptofano. A RNA-polimerase liga-se ao promotor e desloca-se ao longo da sequência líder, sintetizando RNA mensageiro. Se não ocorrer tradução do mRNA formado, os segmentos 1, 2, 3 e 4 da região líder associam-se, impedindo assim a dissociação da RNA polimerase, não havendo interrupção da transcrição. Na presença de triptofano ocorre a tradução do mRNA sintetizado, no entanto ao atingir o codão de terminação UGA existente entre os segmentos 1 e 2, a tradução pára.

Assim, o ribossoma pára neste região, permitindo o emparelhamento dos segmentos 3 e 4 numa estrutura terminadora que provoca a dissociação da RNA-polimerase e a interrupção da transcrição. Na ausência de triptofano, a tradução do mRNA ocorre até o ribossoma atingir os dois codões triptofano adjacentes do segmento 1. Assim, o ribossoma pára no segmento 1, permitindo o emparelhamento dos segmentos 2 e 3, ficando o segmento 4 desemparelhado. Deste modo, não se forma a estrutura terminadora em forma de cabeça de alfinete poli-U, pelo que a RNA-polimerase não se dissocia, continuando assim a transcrição dos genes do operão triptofano. Regulação ao nível da tradução:

Antisense: É o processo de inibição da tradução do mRNA sintetizado pela ligação de um sRNA ao mRNA. Os sRNA são filamentos simples e pequenos de RNA que têm uma sequência de bases complementar de um determinado mRNA codificante. A ligação por complementaridade do sRNA ao mRNA conduz à inibição da tradução do mRNA pelos ribossomas. Um exemplo deste tipo de mecanismo de regulação é a regulação da síntese de porinas na membrana externa da E. coli. As proteínas mais importantes são as OmpC, do poro mais estreito, e a OmpF, do poro mais largo. A regulação da transcrição é feita pela proteína OmpR (que inibe a transcrição da OmpF por ligação ao operador) e pelo gene micF (codifica um sRNA que emparelha com o mRNA da OmpF, em condições hiperosmóticas).

Hierarquia dos sistemas de regulação: A regulação metabólica bacteriana faz-se através de vários sistemas que visam uma melhor e mais rápida adaptação do microrganismo ao meio ambiente. Estes sistemas apresentam uma organização hierárquica, distinguindo-se: - Operão: Unidade de transcrição que corresponde a uma sequência de DNA que integra diferentes genes com actividades relacionadas, ou seja, origina um RNA mensageiro poligénico que codifica proteínas envolvidas numa mesma função. - Regulão: Conjunto de genes ou operões que são regulados por uma molécula (factor sigma) reguladora comum, uma vez que possuem todos a mesma sequência operadora. - Modulão: Conjunto de operões ou regulões que são regulados por uma proteína (factor sigma) reguladora global comum, uma vez que possuem todos a mesma sequência operadora. Por exemplo, quando há uma limitação na fonte de carbono, ocorre a síntese de cAMP que vai activar a CAP, levando assim à expressão do modulão Crp. Seguidamente, o Crp vai regular positivamente a expressão de enzimas catabólicas, que vão regular-se pelo feed-back.

Influência do meio ambiente na fisiologia Bacteriana: As bactérias são sensíveis ao meio ambiente em que se encontram, na medida em que os sensores presentes na membrana externa, que reconhecem moléculas do meio ambiente, transformam os estímulos em sinais, que através de reguladores levam ao reconhecimento de determinados operões alvo que codificam a síntese de proteínas que irão assim constituir a resposta celular aos estímulos. Deste modo, o stress ambiental leva a bactéria a sintetizar uma grande variedade de proteínas para os mais diversos fins. Sistemas de regulação a dois componentes: - uma proteína sensora que detecta as alterações dos estímulos ambientais, - uma proteína reguladora, que regula os genes necessários para a resposta adequada. Assim, para que a resposta metabólica a essas variações ambientais seja especificamente direccionada, as bactérias desenvolveram um sistema de sinalização e transdução de sinal extra ou intracelular que envolve dois componentes: - uma proteína sensora que detecta as alterações dos estímulos ambientais, - uma proteína reguladora, que regula os genes necessários para a resposta adequada. A proteína sensora tem a função de quinase/fosfatase que, através de fosforilação/desfosforilação, sinaliza ao seu par que irá actuar como proteína reguladora, activadora ou repressora da transcrição. A reacção de transdução de sinal que envolve este sistema ocorre em três etapas: - Primeiro ocorre uma auto-fosforilação, com transferência do grupo gamafosfato do ATP para a cadeia lateral do resíduo de histidina da proteína sensora. - O segundo passo é a transferência do grupo fosfato, que estava ligado à histidina para um resíduo aspartato da proteína reguladora. - No terceiro e último passo, o grupo fosfato é transferido do fosfoaspartato para a água (hidrólise).

A proteína sensora faz parte da família das histidinas quinases, e é geralmente regulada em resposta a mudanças ambientais. A proteína reguladora faz parte de uma família de proteínas reguladoras de resposta e, quando fosforilada, sofre uma mudança conformacional tornando-se activa.

Exemplos de Sistemas reguladores a Dois-componentes em bactérias: - Sistema EnvZ/ OmpR: osmoregulação - Sistema NtrB/ NtrC: Controlo da assimilação de azoto, em que NtrB é a proteína sensora e NtrC é a reguladora. - Sistema ArcB/ ArcA: Respiração aeróbia - Quimiotaxia Bacteriana - Esporulação: Bacillus subtilis

Numa resposta generalizada ao Stress, considera-se um Estimulão, ou seja, há um grande conjunto de genes a responder aos estímulos.

Análise proteómica. Considerando o exemplo da resposta do Mycobacterium tuberculosis à hipoxia: O bacilo da tuberculose, perante diferentes % de Oxigénio, entre 1% e 20%, produz diferentes conjuntos de proteínas, que podem ser identificadas fazendo electroforeses e estudadas. 20% O2

5% O2

1% O2

O fenómeno de “Quorum sensing”: As bactérias podem comunicar umas com as outras e desenvolver acções cooperativas através de um processo denominado “Quorum sensing” ou AutoIndução. Assim, este fenómeno explica a comunicação intercelular de uma população de bactérias. Assim, “Quorum sensing” é o fenómeno através do qual as bactérias regulam a sua própria população (activando ou desactivando determinados genes) por síntese e secreção de determinadas moléculas proteicas sinalizadoras denominadas feromonas. Este fenómeno depende da dimensão da população, ou seja, só para uma determinada concentração de modelador no meio é que existe a activação de um determinado sistema de regulação do metabolismo bacteriano. Este fenómeno de cooperação bacteriana pode traduzir-se na produção de: - Comunidades organizadas (biofilmes) - Factores de virulência que tornam as bactérias patogénicas - Antibióticos - Moléculas bioluminescentes - Indução de transferências genéticas