Aula 1 Sebenta De Bactereologia

Autores: Ana Mafalda Ana Teresa Dalila Daniel Silva Dário Martins Diana Fábio Pereira Filipa Calisto Inês Domingues Inês Martins Joana Santos Leonor Marta Gaspar Marta Silva Mónica Nuno Graça Pedro Ferreira Sónia Moreira Vanessa Leonardo Vanessa Sousa

Índice

Aula nº 1 – História e Impacto da Microbiologia Aula nº 2 – Morfologia e estrutura das células bacterianas Aula nº 3 – Elementos estruturais das células bacterianas (continuação) Aula nº 4 – Nutrição Microbiana Aula nº 5 – Crescimento Microbiano Aula nº 6 Aula nº 7 Aula nº 8 Aula nº 9 Aula nº 10 Aula nº 11 Aula nº 12 Aula nº 13 Aula nº 14 Aula nº 15 – Aula nº 16 Aula nº 17 Aula nº 18 Aula nº 19 Aula nº 20 – Aula nº 21 – Aula nº 22 Aula nº 23 -

AULA Nº 1 – História e Impacto da Microbiologia A Microbiologia tem sido frequentemente definida como o estudo de organismos e agentes demasiado pequenos para serem vistos a olho nú, isto é, o estudo de microorganismos; dado que objectos com menos de 1 mm de diâmetro não podem ser

Limite de Visibilidade

metros 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

1000 μm ou 1 mm 200 μm ou 0,2 mm 100 μm Algas Protozoário 10 μm Fungos 1 μm Bactérias 0,2 μm ou 200 nm 100 nm

10-8

10 nm

10-9

1 nm

10-10

1Ǻ

Visível

Microscópio Óptico

Vírus

Microscópio Electrónico

Fig. 1.1 – a) Limites de tamanho dos vários tipos de microorganismos e requisitos mínimos para os observar. b) Comparação de tamanho entre vários tipos de microorganismos para mais fácil compreensão das suas diferenças de tamanho. -2-

bem vistos e têm que ser examinados com um microscópio, à Microbiologia interessa sobretudo organismos e agentes tão pequenos como isto, ou mais pequenos ainda, conforme se mostra na Fig 1.1 a); na parte b) dessa figura mostra-se, para comparação de tamanho, uma paramécia (um protozoário) com Escherichia coli (uma bactéria) no seu interior. A paramécia tem um comprimento de 200 μm (= 0,2 mm), enquanto que a Escherichia coli mede apenas 1,5 μm (= 0,0015 mm)! Se isto já é pequeno, então os bacteriófagos e vírus são coisas mínimas, já só visíveis através de microscópios electrónicos (estão na ordem dos nanómetros, em que 1 nm = 1x10-9 m = 1 x 10-6 mm = 0,000001 mm)!!! Posto isto vejamos agora, de forma muito rápida e simples, os microorganismos estudados pela microbiologia, em:

O Mundo Microbiano O Mundo Microbiano é fundamentalmente constituído por:

 Microorganismos eucariontes (5 a 200 μm)  Algas: são microorganismos unicelulares fotossintéticos que, em conjunto com as cianobactérias produzem cerca de 75 % do O2 no planeta, e são a base das cadeias alimentares aquáticas; a Fig 1.2 mostra exemplos destes microorganismos;

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Fig 1.2 – Exemplos de algas: Chlamidomonas sp. Gymnodinium sp. dinoflagelado

 Protozoários: são microorganismos unicelulares que geralmente apresentam motilidade; muitos deles funcionam como predadores do mundo microbiano, porque obtêm nutrientes ingerindo matéria orgânica

e

outros

micróbios;

são

encontrados em vários meios, e alguns habitam os tractos digestivos de animais onde ajudam na digestão de materiais complexos, como a celulose; são poucos

Fig. 1.3 – Paramécia vista ao microscópio.

os que causam doenças em humanos e outros animais; a Fig. 1.1 mostra uma paramécia (que é um protozoário) em esquema, e a Fig. 1.3 mostra uma vista ao microscópio óptico.  Fungos: um grupo mais diverso de microorganismos que englobam formas unicelulares

(como

multicelulares alguns

as

(como

fungos

são

leveduras)

os

e

cogumelos); usados

em

Fig. 1.4 – Exemplos de fungos: Saccharomyces cerevisiae em gemulação, ao microscópio electrónico Um cogumelo Ascomyota em reprodução assexuada, visto ao microscópio electrónico (x1,200)

fermentações (fabrico de pão e de cerveja por exemplo) e produção de antibióticos, outros causam doenças em plantas e animais); esemplos de fungos são dados na Fig 1.4.  Microorganismos procariontes (0,4 a 20

μm)  Algas azuis: outro nome para as cianobactérias;

estas

bactérias

são

especiais na medida que são capazes de efectuar fotossíntese, contribuindo para a produção de O2. Ver Fig. 1.5 para alguns exemplares;  Bactérias:

são

procariontes

unicelulares; a maior parte tem parede

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Fig. 1.5 – Cianobactérias representativas: Nostoc Anabaéna spiroides e Microcystis aeruginosa

celular

que

contém

peptidoglicano.

São

abundantes

em

variadíssimos

ambientes

(ex.: solo, água, ar, interior do nosso organismo, pele, …) e algumas vivem em

Fig. 1.6 – Algumas bactérias (x 1000): Clostridium tetani Streptococcus pneumoniae

ambientes com condições extremas de temperatura, pH ou salinidade. Umas causam doenças, outras são benéficas em muitos aspectos: reciclam elementos da biosfera, degradam tecidos mortos, e produzem vitaminas; os termos Eubactérias e Arqueobactérias diferenciam os dois tipos principais de bactérias: Arqueobactérias distinguem-se de Eubactérias em vários aspectos, nomeadamente nas suas sequências de RNA ribossomal, não têm peptidoglicanos e têm lípidos de membrana únicos; para além disso algumas Arqueobactérias geram gás metano e muitas vivem em ambientes extremos. Ver Fig. 1.6.

 Vírus São entidades acelulares que têm que invadir uma célula para se poderem replicar; são os mais pequenos de todos os microorganismos, mas isso não os torna menos potentes como agentes patogénicos; são basicamente constituídos por material genético (DNA ou RNA) envolvido numa cápsula proteica (a cápside). Na Fig.1.7 são mostrados alguns exemplos de vírus.

 Viróides São agentes infecciosos que consistem apenas em RNA

 Priões Como os Viróides, são também agentes infecciosos mas que consistem só em proteína. Um exemplo de um Prião é o que causa a doença de Creutzfeldt-Jakob (a variante humana da “doeça das vacas loucas”), e o que causa a

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Fig. 1.7 – Exemplos de Vírus: Bacteriófagos (os vírus das bactérias) Rotavírus (x 48500) Estrutura simplificada de um Vírus

própria BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy – Encefalopatia Espongiforme Bovina = “doença das vacas loucas”). Agora que já se tem uma ideia dos microorganismos que fazem parte do Mundo microbiano, debrucemo-nos um pouco sobre os…

Marcos Históricos da Microbiologia A descoberta dos microorganismos A primeira pessoa que publicou observações extensivas de microorganismos foi Antony van Leeuwenhoek (1632 – 1723) que passava muito do seu tempo livre a construir microscópios compostos de 2 lentes convexas seguras entre duas placas de prata. Estes microscópios podiam aumentar cerca de 50 a 300 vezes, e ele poderá ter iluminado as suas preparações colocando-as entre 2 pedaços de vidro e a luz fazendo um ângulo de 45º em relação ao plano da amostra. Isto cria uma forma de microscopia em campo escuro, onde os microorganismo aparecem claros sobre um fundo escuro, e logo, mais facilmente visíveis.

Leeuwenhoek

enviou

as

suas

descrições das suas observações à Royal Society de Londres, onde é hoje claro que ele observou bactérias e protozoários. Por mais importantes que fossem as suas observações, a Microbiologia permaneceu estagnada por 200 anos. Pouco progresso foi feito porque as observações microscópicas não permitiam colher informação para entender a Biologia desses microorganismos, e eram também precisas

técnicas

laboratoriais

que

permitissem isolar microorganismos e pô-los Fig. 1.8 – a) Antony van Leeuwenhoek b) Réplica do microscópio usado por Leeuwenhoek e demonstração do seu manuseamento c) Desenhos de Leeuwenhoek das bactérias da boca Humana

em cultura. Muitas destas técnicas foram desenvolvidas enquanto os cientistas se

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debatiam com o conflito sobre a Teoria da Geração Espontânea. Esta teoria defendia que os microorganismos podiam desenvolver-se a partir de matéria não-viva. A teoria foi posta à prova por muitos cientistas, mas só Louis Pasteur (1822 – 1895) conseguiu resolver a questão de uma vez por todas. Ele começou por filtrar ar através de algodão e descobriu que objectos semelhantes a esporos de plantas tinham ficado no algodão. Se um pedaço do algodão fosse colocado em meio estéril, com ar filtrado através dele, havia crescimento de micróbios. A seguir ele preparou frascos com soluções nutritivas, aqueceu os seus gargalos numa chama e conferiu-lhes várias formas curvas, mantendoos abertos para a atmosfera [Fig. 1.9 b)]. Pasteur depois ferveu as soluções por uns minutos e deixou-as arrefecer. Não houve crescimento (isto é, não houve geração espontânea),

mesmo

estando

os

frascos

expostos ao ar. Pasteur concluiu que não houve crescimento porque o pó e os germes tinham ficado encurralados nas paredes dos Fig. 1.9 – a) Louis Pasteur a trabalhar no seu laboratório. b) A experiência da Geração Espontânea (ver texto)

gargalos curvos. Se os gargalos fossem partidos, o crescimento começava de imediato. Pasteur não só resolveu a questão da

controvérsia, como também mostrou como manter as soluções estéreis. As experiências de Pasteur deram lugar à Era Dourada da Microbiologia (Golden Age of Microbiology). Em 60 anos (1857-1914), foram descobertos micróbios que causavam doenças, grandes avaços na compreensão do metabolismo microbiano fora alcançados e técnicas de isolamento e caracterização de micróbios foram melhoradas. O papel da imunidade na prevenção de doenças e controlo dos micróbios também foi identificado, vacinas foram desenvolvidas e técnicas de prevenção contra infecções cirúrgicas foram introduzidas.

O reconhecimento do papel dos microorganismos com agentes etiológicos (= causadores) de doenças Grande parte da Humanidade acreditava que as doenças eram devidas a forças sobrenaturais, vapores venenosos (miasmas) e desequilíbrios entre os 4 humores que se

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pensava estarem presentes no corpo. A teoria dos humores sempre tinha sido bem aceite desde o tempo do médico grego Galeno (129 – 199). Só no século XIX é que apoios para a ideia de que os microorganismos eram causas de doenças, se começaram a acumular. Alguns exemplos são o de Agostino Bassi (1773 – 1856) que demonstrou que um microorganismo podia causar uma doença quando em 1835 ele concluiu que uma doença dos bichos da seda era devida a um fungo; o próprio Louis Pasteur descobriu a pedido do governo Francês que outra doença dos bichos da seda (que estava a arruinar a indústria da seda) era devida a um protozoário. Provas indirectas

vieram

do

cirurgião inglês Joseph Lister (1827 – 1912) na prevenção de

infecções.

Lister

desenvolveu um sistema de cirurgia

anti-séptica

feito

para prevenir a entrada de micróbios em ferimentos: os instrumentos esterilizados

eram e

fenol

era

aplicado a pensos cirúrgicos e

Fig. 1.10 – Pioneiros das práticas de assepsia. Aqui vê-se um cirurgião a pulverizar a área com um anti-séptico.

por vezes era aplicado na área de cirurgia. O sistema revolucionou a cirurgia e deu provas fortes para o papel dos microorganismos em doenças porque o fenol (que mata bactérias) também prevenia infecções nos ferimentos. Apesar disto a primeira demonstração directa do papel de bactérias em doenças veio dos estudos de antrax pelo médico alemão Robert Koch (1843 – 1910). Koch usou os critérios propostos pelo seu antigo professor, Jacob Henle (1809 – 1885) para estabelecer a relação entre o Bacillus anthracis e o antrax, tendo publicado as suas descobertas em 1876. Os seus postulados só foram delineados por inteiro após o seu trabalho na causa da tuberculose. Ele Fig. 1.11 – Robert Koch, a examinar uma amostra no seu laboratório.

demonstrou que a tuberculose era causada por um bacilo, Mycobacterium tuberculosis (também conhecido por bacilo de koch), e recebeu o -8-

prémio Nobel da Fisiologia ou Medicina em 1905. Os postulados de Koch tornaram-se no pilar de suporte no relacionamento de micróbios com doenças. São eles: 1) O microorganismo tem que estar presente em todos os casos da doença mas ausente em organismos sãos; 2) O microorganismo tem que ser isolado e crescido em cultura pura; 3) A mesma doença tem que resultar quando o microorganismo é inoculado num hospedeiro são; 4) O mesmo microorganismo tem que ser isolado de novo do hospedeiro doente ou morto. os Tabela 1.1 – Doenças e seus agentes etiológicos descobertos no séc XIX. postulados não são Por

vezes,

exequíveis,

como

acontece com o caso da

lepra:

Mycobecterium

foram

Antrax

Bacillus anthracis

Koch

1876

Neisser

1879

Neisseria gonorrhoeae

Gaffky

1884

Malária

Pasmodium spp.

Laveran

1880

Koch

1882

Tuberculose Difteria

Mycobecterium tuberculosis Corynebacterium diphtheriae Streptococcus

Pneumonia

relacionadas com os seus

Data

Salmonella typhi

pura. doenças

Investigador

Febre Tifóide

isolado em cultura outras

Agente

Gonorreia

leprae não pode ser

Muitas

Doença

Tosse

agentes

Convulsa

infecciosos no séc.

pneumoniae Bordetella pertussis

Klebs e Loeffler Fraenkel Bordet e Gengou

1883-1884 1886 1906

XIX, como exemplifica a tabela 1.1. Para além

disto,

também

se

desenvolveram

instrumentos e meios para efectuar isolamento e

cultura

de

microorganismos.

A

implementação do agar por Fannie Eilshemius Hesse como agente solidificador e a produção das caixas de Petri por Richard Petri são os exmplos mais marcantes. Patogenes virais também foram estudados neste tempo. A descoberta dos vírus e o seu papel na doença tornou-se possível pela -9-

Fig. 1.12 – a) doença do mosaico do tabaco; b) representação esquemática do vírus do mosaico do tabaco (a amarelo a cápside, e a vermelho o RNA). O diâmetro da cápside é de 20 nm. c) O aspecto do vírus ao microscópio

construção de um filtro de porcelana, feito por Charles Chamberland, em 1884. O filtro foi usado para estudar a doença do mosaico do tabaco, por Dimitri Ivanowski e Martinus Beijerinck, de onde se descobriu que os extractos da planta, mesmo sendo filtrados, eram infecciosos. Dado que o agente passava por filtros designados para reter bactérias, o agente tinha que ser ainda mais pequeno do que uma bactéria. Beijerinck propôs que o agente fosse um “vírus filtrável”, e, eventualmente, mostrou-se que os vírus eram agentes infecciosos acelulares minúsculos.

O nascimento da imunologia O reconhecimento dos microorganismos como agentes causadores de doenças abriu portas ao progresso na determinação de como os animais resistem a doenças e no desenvolvimento de técnicas que protegessem humanose gado dos microorganismos. Os primeiros avanços foram conseguidos por Edward Jenner que demonstrou que a imunidade contra a varíola pode ser conferida por inoculação de amostras retiradas de pústulas de vacas infectadas (1798). Mais tarde, Pasteur e Roux descobrem que incubando microorganismos por longos intervalos de forma sucessiva fazia com que eles perdessem a sua patogenicidade; com isto ganharam terreno no combate à cólera da galinha, injectando as galinhas com estas culturas atenuadas, às quais Pasteur chamou de vacina (do Latim vacca, vaca) em honra a Jenner. Pouco depois, Pasteur e Chamberland desenvolvem a vacina do antrax tratando culturas com bicromato de sódio ou incubando-as a 4243ºC. Depois foi a vez da vacina da raiva, desenvolvida por um método diferente: o patogene era atenuado fazendo-o crescer num hospedeiro anormal, o coelho. Foi com esta vacina que Pasteur tratou um rapaz de 9 anos,

Fig. 1.13 – Elie Metchnikoff a trabalhar no seu laboratório

Joseph Meister. Como forma de agradecimento pelo desenvolvimento de vacinas, pessoas de todo o mundo contribuíram para a construção do Instituto Pasteur em Paris. Paul Erlich e Shibasaburo Kitasato descobrem que a injecção da toxina diftérica inactivada, em coelhos, leva à produção de uma antitoxina, uma substância no sangue que neutralizava a toxina e protegia da doença (essas antitoxinas são o que se conhece hoje em dia com anticorpos). Elie Metchnikoff descobre depois a fagocitose dos microorganismos pelos glóbulos brancos em 1884.

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Marcos históricos do desenvolvimento dos agentes quimioterápicos Todos os acontecimentos potenciaram o desenvolvimento de agentes químicos que pudessem ser usados em terapia. Embora algumas das descobertas tenham sido acidentais, alguns exemplos são dados aqui: •

1900: Paul Erlich tratou uma forma de tripanosomiase no rato utilizando o corante vermelho de trypan; utilizou derivados arseniacais no tratamento da Sífilis;

•

1929: Alexander Fleming descobre a penicilina;

•

1935: Domagk trata uma infecção estreptocócica com um derivado da sulfamida;

•

1940: Chain consegue produzir penicilina de forma estável;

•

1944: Waksman descobre a estreptomicina – Streptomyces griseus.

O Impacto da microbiologia Citando o falecido cientista e escritor Steven Jay Gould, “nós vivemos na Era das Bactérias”. Elas foram os primeiros organismos vivos no nosso planeta e vivem onde a vida é possível. Mais, a biosfera depende da actividade delas e elas influenciam a actividade humana de várias formas: •

Na alimentação: os microorganismos são usados no fabrico de pão, vinho, queijos e iogurtes;

•

Na Saúde: são causa de inúmeras doenças infecciosas;

•

Na Agricultura: fazem a nitrificação dos solos por fixação do azoto atmosférico, e algumas provocam doenças em plantas;

•

No ambiente: estão directamente ligadas ao ciclo do carbono, do azoto e do enxofre;

•

Na indústria: são fonte de vitaminas, antibióticos, álcool, ácidos orgânicos, esteróides, enzimas, aminoácidos, etc…

Devido a isto a Microbiologia é uma disciplina que tem múltiplos ramos que assentam todos sobre aspectos básicos e aspectos aplicados. Os aspectos básicos preocupam-se com a biologia dos microorganismos e incluem os ramos da Bacteriologia, Micologia, Virologia, genética microbiana, bioquímica, fisiologia microbiana e estrutura

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microbiana. Os aspectos aplicados dizem respeito aos problemas práticos tais como doenças, água e tratamento de águas residuais, conservas alimentares e produção de alimentos, e uso de micróbios na indústria.

Que futuro tem a Microbiologia? Existem muito boas perspectivas acerca do futuro da Microbiologia, principalmente por duas razões: a primeira é que a Microbiologia tem uma missão muito mais clara do que a que têm muitas outras disciplinas científicas; a segunda, é porque a Microbiologia tem um enorme significado prático. A Microbiologia Clínica e de Saúde Pública, bem como a Imunologia continuarão a ser áreas de exploração intensa, pois várias doenças infecciosas (tanto novas como velhas) estão mais uma vez a dispersarem-se e a ser destrutivas: novas pandemias como a SARS (Síndrome Aguda Respiratória Severa), a Gripe das Aves, bem como outras menos recentes, como sejam a SIDA, a malária, a Tuberculose, a Cólera, Hepatites B e C e Gastroenterites são bons exemplos. Para além disto, há que ter em conta que muitos agentes infecciosos estão a ganhar resistência aos métodos terapêuticos usados (sobretudo contra os antibióticos). Microbiologistas também serão necessários para criar novos medicamentos e vacinas, e para vários outros assuntos relacionados (por exemplo, para estudar e aprofundar o conhecimento sobre as defesas do organismo, e sobre como os patogenes interagem com as células do hospedeiro, ou ainda para se saber aproveitar as relações simbióticas ímpares entre os microorganismos e o Homem, de modo a que se possam traçar estratégias de vectorização de fármacos e de vacinas). Mais: a Microbiologia Industrial e Ambiental também têm muitos desafios e oportunidades: os microorganismos são cada vez mais importantes na indústria e no controlo ambiental, e é necessário aprender a usá-los de novas formas: microorganismos podem ser fonte de alimentos de alta qualidade, de enzimas para uso industrial, podem ser usados para degradar poluentes e resíduos tóxicos, ou como vectores para tratar doenças e aumentar a produtividade agrícola, para além da contínua necessidade de proteger as colheitas de danos microbianos. Há uma área que também precisa de maior pesquisa: a Diversidade Microbiana. Estima-se que menos de 1% dos micróbios da Terra tenham sido cultivados, de modo que conseguir cultivar os micróbios que ainda não foram postos em cultura vai ser área de mais esforços. Também há muito que fazer em relação a microorganismos que vivem

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em ambientes extremos. Por último, a microbiologia defronta-se com uma nova ameaça, que não é menos importante: o Bioterrorismo (recordem-se os ataques de Bioterrorismo com Antrax em Nova York, Washington e na Florida, em 2001 – lembram-se dos envelopes com pó?).

Esta foi uma vista muito generalizada sobre a Microbiologia, na medida em que se discutiram assuntos muito variados, que dizem respeito aos vários ramos desta disciplina. A presente sebenta é de Bacteriologia, e as próximas aulas passarão a ser exclusivamente dedicadas a esse ramo. Bibliografia usada para a aula nº 1: Slides das Teóricas Prescott, Harley, and Klein’s MICROBIOLOGY, de Joanne M. Willey, Linda M. Sherwood e Christopher J. Woolverton, Edição Internacional – 7ª edição, McGrawHill, Cap. 1

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