Virologia Cultivo De Virus 3/16

Virología Cultivo de Virus

3/16

 Unidad de Capacitación a Entidades Civiles

 Curso Básico de Virología para Civiles

 Rough Cibernus  Supervisor: Tte.1: Arturo Martínez  2 Z.M. Tegucigalpa 1996 Curso Básico de Virología para Civiles

Cubierta de Proteinas RNA

Nucleo

Cubierta Viral

Human Immunodeficency Virus

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CULTIVO DE LOS VIRUS  ANIMALES EXPERIMENTALES  TÉCNICAS DE CULTIVO EN EMBRIÓN DE POLLO.

 TÉCNICAS DE CULTIVO CELULAR Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS 1. ANIMALES EXPERIMENTALES a) Siempre ha sido importante en virología b) Es un medio para aislar y desarrollar a muchos de los virus c) Pero….. La etica sobre el buen trato hacia los animales ha sido un problema (financiamiento, aceptación de artículos en las publicaciones etc etc)

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CULTIVO DE LOS VIRUS 1. ANIMALES EXPERIMENTALES d) Solo bajo las siguientes circunstancias: i. Virus que no puedan replicarse en embriones de pollo o en cultivos celulares. ii. Para el estudio de la patogénesis de la enfermedad y es aquí donde es de gran utilidad. iii. En casos de investigaciones epidemiológicas. iv. Para atenuar virus de humanos: Virus de la fiebre amarilla, virus Vaccinia. v. Para pruebas de seguridad y antigenicidad de vacunas para obtener las licencias. vi. Para probar agentes antivirales quimioterapeúticos Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS 1. ANIMALES EXPERIMENTALES d) Solo bajo las siguientes circunstancias: vii. En la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales. viii. Son fuente de órganos para los cultivos celulares. ix. Son fuente de sangre (eritrocitos y PMN) para muchas pruebas. EJEMPLOS: PICORNAVIRUS Virus de la Fiebre aftosa RATÓN LACTANTE.

RABDOVIRUS Virus de la Rabia RATÓN LACTANTE

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CULTIVO DE LOS VIRUS 1. ANIMALES EXPERIMENTALES EJEMPLOS: ADENOVIRUS CANINO Virus de la Hepatitis Infecciosa Canina (IHC) CUYES en altas dosis. PERROS, ZORROS por las vías subcutánea (S/C); intraperitoneal (I/P); oral; intravenosa (I/V)

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CULTIVO DE LOS VIRUS 1. ANIMALES EXPERIMENTALES EJEMPLOS: CORONAVIRUS Virus de la Bronquitis Infecciosa Aviaria (BIA) EMBRIONES DE POLLO Gastroenteritis Transmisible del Cerdo ((GET) LECHONES de lactantes a varios días

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CULTIVO DE LOS VIRUS 1. ANIMALES EXPERIMENTALES EJEMPLOS: HERPESVIRUS Virus de la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina (IBR) CUYES recién nacidos Rinoneumonitis Equina (ER) LECHONES de lactantes a varios días HAMSTERS recién nacidos Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS 1. ANIMALES EXPERIMENTALES EJEMPLOS: HERPESVIRUS Virus de la Enfermedad de Aujeszky (VEA) CONEJOS; CUYES; RATONES, CABRAS; CABALLOS; PERROS; Y MUCHOS ANIMALES MAS LOS MAS SUSCEPTIBLES LOS GATOS ORBIVIRUS. Virus de la Lengua Azul CORDEROS; RATONES Y HAMSTERS lactantes a varios días

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CULTIVO DE LOS VIRUS 1. ANIMALES EXPERIMENTALES EJEMPLOS: ORTHOMYXOVIRUS Virus de la Influenza PORCINA: RATONES Y HURONES: neumonía EQUINA: RATONES Y HURONES: neumonía AVIARIA: POLLUELOS, PATOS: signos respiratorios y muerte PAPOVAVIRUS Virus del Papiloma oral del Conejo: CONEJOS Virus del Papiloma de Shope: CONEJO COLA DE ALGODÓN Virus del Papiloma Bovino: BECERROS Virus del Papiloma Genital Porcino: CERDOS Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS

2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO.

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CULTIVO DE LOS VIRUS 2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL: 1. Raza o línea de Gallina de postura (huevo fértil) a) Plymonth Rock b) Rhode Island c) New Hamshire d) Wyandotte

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CULTIVO DE LOS VIRUS 2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL: 2. Huevo fértil a) Cascarón

¡NO¡

delgado malformado defectos, protuberancias, áspero

Al golpear

Resonancia (+) BUENOS Resonancia (-) MALOS Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS 2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL: 2. Huevo fértil b) Tiempo de puestos - Máximo 5 días - Se almacenan

HACIA ARRIBA A 13°C HUMEDAD 40%

CAMARA DE AIRE

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CULTIVO DE LOS VIRUS 2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL: A LAS 3 HORAS DE FERTILIZADO EN EL OVIDUCTO LA YEMA PRESENTA ENTRE 2 Y 4 CELULAS, EL DISCO DELGADO (GASTRULACION) SE FORMAN DOS CAPAS: HACIA ARRIBA EXTERNA=ECTODERMO DE 16 A 20°C INTERNA=ENDODERMO SE INICIA LA EL BLASTODERMO APARECE COMO UNA INCUBACION MEMBRANA FORMADA POR SEGMENTACIONES VOLTEO DIARIO SUCESIVAS SE FORMA UNA AREA CENTRAL= “ZONA PELUCIDA” Y BORDES GRUESOS= AREA OPACA” DE AQUÍ A LA POSTURA= ES AQUÍ DONDE SE DETIENE EL PROCESO DE DIVISION Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS 2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL: 2. Huevo fértil C) Selección - Tamaño: UNIFORME - Forma: UNIFORME - Peso: 56 a 65g

HACIA ARRIBA A 13°C HUMEDAD 40%

CAMARA DE AIRE

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CULTIVO DE LOS VIRUS 2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL: 2. Huevo fértil d) Manejo - Adecuado - Con mucho cuidado - Movimientos bruscos la cámara de aire

HACIA ARRIBA A 13°C HUMEDAD 40%

CAMARA DE AIRE

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CULTIVO DE LOS VIRUS 2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO. CONDICIONES DE INCUBACION DEL HUEVO FERTIL: 1. Colocación con la cámara de aire hacia arriba 2. Limpieza: solo mecánica, no Con trapos húmedos ni lavarlos 3. Temperatura: 37.7°C +/-1 4. Humedad relativa: 50 a 60°C 5. Voltea varias veces al día: de 2 a 8 veces en un ángulo de 45° 6. Ventilación:. Relación optima: O2 del 21% y CO2 del 0.5% Curso Básico de Virología para Civiles

Inoculación en huevo embrionado 1 embrión

2 cavidad amniótica

3 Yema

4 Albúmina

5 cavidad alantoidea 6 cavidad corioalantoidea 5 Membrana corioalantoidea 6 cascarón 9 cámara de aire Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS RUTAS DE INOCULACION EN EMBRION DE POLLO

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CULTIVO DE LOS VIRUS RUTAS DE INOCULACION EN EMBRION DE POLLO 1. CAVIDAD ALANTOIDEA Edad del embrión: 9 a 11 días Vol. 0.1 a 0.2 ml VIRUS: Virus de la Enfermedad de Newcastle Virus de la Bronquitis Infecciosa Virus de Influenza Virus de las Paperas Virus de la Encefalitis Equina del Oeste Virus de la Encefalitis Equina del Eeste Virus de la Encefalitis Equina de Venezuela EFECTO: Muerte embrionaria Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS RUTAS DE INOCULACION EN EMBRION DE POLLO 2. CAVIDAD AMNIOTICA Edad del embrión: 7 a 10 días Vol. 0.1 a 0.2 ml VIRUS: Virus de la Enfermedad de Newcastle Virus de la Bronquitis Infecciosa Virus de Influenza Virus de las Paperas Virus de la Encefalitis Equina del Oeste Virus de la Encefalitis Equina del Este Virus de la Encefalitis Equina de Venezuela EFECTO: Muerte embrionaria

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CULTIVO DE LOS VIRUS RUTAS DE INOCULACION EN EMBRION DE POLLO 3. MEMBRANA CORIOALANTOIDEA Edad del embrión: 11 a 13 días Vol. 0.1 a 0.5 ml VIRUS: Virus de la Enfermedad de Aujeszky Virus de la Laringotraquetis Infecciosa Virus de la Viruela aviaria EFECTO: Pústulas en la membrana Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS RUTAS DE INOCULACION EN EMBRION DE POLLO 4. CAVIDAD O SACO VITELINO Edad del embrión: 6 a 8 días Vol. 0.1 a 1.0 ml BACTERIA: Chlamidias Rickettsias EFECTO: Muerte embrionaria Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS 3. TECNICAS DE CULTIVO CELULAR El termino de “cultivo de tejidos” es hoy en día sinonimo de “cultivo celular”. Es el crecimiento y mantenimiento del tejido o células vivas “in vitro”.

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Cultivo celular: Tipos de cultivo celular  Cultivo celular primario  Cultivo celular secundario  Cultivo células diploides  Establecimiento de línea celular  Origen del cultivo celular  humanos  animales Curso Básico de Virología para Civiles

Tipos de clasificación del cultivo celular Estacionario Rotatorio Suspensión Perfunsión Explante o cultivo de órganos

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Monocapa de cultivo celular

Células epiteliales

Células fibroblásticas Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS 3. TECNICAS DE CULTIVO CELULAR Los “Cultivos de organos” es el mantenimiento de piezas de tejidos organizados (explantes traqueales membrana sinovial) in vitro. Esta técnica es muy útil para el aislamiento de infecciones persistentes tales como el virus de la Artritis-Encefalitis-Caprina (Retroviridae: Género:Lentivirus): Co-cultivos de leucocitos o PMN de la sangre o la leche con células de la membrana sinovial. O explantes traqueales como los Coronavirus Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS 3. TECNICAS DE CULTIVO CELULAR Los “Cultivos de tejidos” es el mantenimiento de piezas de tejidos desorganizados embebidos en coagulos y plasma in vitro. A partir de estos cultivos, las células en forma individual se pegaban en el fondo del cristal o plástico y empezaban a desarrollarse hasta formar un monoestrato celular. Hoy en día es una técnica obsoleta. Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS 3. TECNICAS DE CULTIVO CELULAR Los “Cultivos de células” es el mantenimiento de células in vitro. Es un tejido disociado en una suspensión de células en forma individual, por un tratamiento enzimático como lo es la TRIPSINA Las células se lavan con medio de cultivo celular; se cuentan y se mantienen en ese medio para células. Se colocan en botellas de vidrio o de plástico y estas se pegaban en el fondo y empiezan a desarrollarse hasta formar un monoestrato celular. Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS Medio de cultivo celular para crecimiento: Nutrientes requeridos para el crecimiento celular. 1. Es una solución salina isotónica 2. Glucosa 3. Vitaminas, coenzimas; aminoácidos 4. Sol. “bufferada” a pH 7.2 a 7.4 o con bicarbonato, ambos buffer a base de fosfatos pueden sustituirse con HEPES: ácido N-2hidroxietilpiperazina-N´-2-etanosulfonico ó TES ácido N-tris-(hidroximetil)metil-2aminometanosulfonico; proven mejor estabilidad del pH y reducen lo requerimentos de CO2. 5. Además contiene antibioticos para inhibir el crecimiento bacteriano 6. Suero fetal bovino máximo 10 %.

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CULTIVO DE LOS VIRUS Medio de cultivo celular para mantenimiento: El medio contiene los nutrientes requeridos para el crecimiento celular. 1. Es una solución salina isotónica 2. Glucosa 3. Vitaminas, coenzimas; aminoacidos 4. Sol. tamponada o “bufferada” a pH 7.2 a 7.4 o un sistema tamponado con bicarbonato, ambos buffer a base de fosfatos pueden sustituirse con HEPES: ácido N2-hidroxietilpiperazina-N´-2-etanosulfonico ó TES ácido N-tris-(hidroximetil)metil-2-aminometanosulfonico; prooven mejor estabilidad del pH y reducen lo requerimentos de CO2. 5. Además contiene antibioticos para inhibir el crecimiento bacteriano

6. Suero fetal bovino al 2 al 5 %. Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS Cultivo celular primario: 

Tejidos de fetos o de jóvenes se colectan asépticamente. A) B) C) D)

Riñón de mono verde Riñón de embrión humano Tejido amniótico Embriones de ratón, pollo

2. Células epiteliales y fibroblastos 3. Se parten en pequeñas piezas de cerca de 2 mm3. 4. Se incuba en presencia de tripsina durante 30 minutos. 5. Se produce una suspensión de células. 6. Se centrifuga a baja velocidad para remover el exceso de tripsina. 7. Se suspenden en medio de cultivo celular, 8. Se incuban a 37°C en tubos con tapan 9. Durante varios días de forma un capa continua ó confluente 10. Solo se mantienen durante 5 a 10 generaciones

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CULTIVO DE LOS VIRUS Cultivo celular primario: 4.

Tejidos de fetos o de jóvenes se colectan asépticamente. A) Riñón de mono verde B) Riñón de embrión humano C) Tejido amniótico D) Embriones de ratón, pollo 2. Células epiteliales y fibroblastos 3. Se parten en pequeñas piezas de cerca de 2 mm3. 4. Se incuba en presencia de tripsina durante 30 minutos. 5. Se produce una suspensión de células. 6. Se centrifuga a baja velocidad para remover el exceso de tripsina. 7. Se suspenden en medio de cultivo celular, 8. Se incuban a 37°C en tubos con tapan de vaquelita o de plástico. 9. Durante varios días de forma un capa continua ó confluente 10. Solo se mantienen durante 5 a 10 generaciones 11. Se utilizan mucho para la elaboración de vacunas Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS Cultivo de células diploides: 1. Células de los mismos tejidos de fetos o de jóvenes. A) B) C)

Riñón de embrión humano Tejido amniótico Embriones de ratón, pollo

2. Células de tipo fibroblástico y epiteliales 3. Solo se mantienen durante 100 generaciones 4. Se utilizan mucho para la elaboración de vacunas o para estudios experimentales 5. Se almacenan en Nitrógeno liquido a -70 a -196°C Curso Básico de Virología para Civiles

CULTIVO DE LOS VIRUS Cultivo de líneas celulares continuas: 1. Células inmortales originadas de células cancerigenas o bien transformadas A) Riñón de embrión humano B) Tejido amniótico C) Embriones de ratón, pollo 2. Son células epiteliales de origen tanto del ectodermo como del endodermo indiferenciables 3. Son células fibroblásticas de origen mesodérmico indiferenciables 4. Se almacenan en Nitrógeno liquido a -70 a -196°C

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Cultivo de líneas celulares continuas

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Efecto citopático Células normales

Infección con poliovirus

RhMK cells

HEp-2 cells

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Cultivo de líneas celulares continuas

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Hemadsoción: Eritrocitos de cuye adsorbidos en células de riñón infectadas con virus de las paperas

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TIPOS DE CULTIVOS CELULARES Líneas celulares continuas: Cell Culture Collection Committe, CCCC LINEA CELULAR

ESPECIE ORIGEN

TEJIDO ORIGEN

MORFOLOGIA

HeLa

HUMANA

CARCINOMA CERVIX

EPITELIAL

DETROIT-6

HUMANA

MEDULA OSEA ESTERNAL

EPITELIAL

L-132

HUMANA

PULMON EMBRIONARIO

EPITELIAL

KB

HUMANA

CARCINOMA ORAL

EPITELIAL

AV3

HUMANA

AMNION

EPITELIAL

Hep-2

HUMANA

CARCINOMA LARINGE

EPITELIAL

CHO

HAMSTER CHINO

PULMON, OVARIO

FIBROBLASTO

B14-FAF-G3

HAMSTER CHINO

RIÑON

FIBROBLASTO

NCTC, Clona 2555

RATON

TEJIDO CONECTIVO

FIBROBLASTO

CCRF-S-180II

RATON

SARCOMA 180

FIBROBLASTO

BHK-21

HAMSTER

RIÑON

FIBROBLASTO Curso Básico de Virología para Civiles

Cuerpos de inclusión

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Cuerpos de inclusión

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Cultivo de líneas celulares continuas EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

FECCIÓN POR UN ENTEROVIRUS EN UNA LINEA CONTINUA DE CÉLULAS MBRIONARIAS DE PULMÓN HUMANO (HEL): Áreas de células redondeada secas” entre islotes de células normales (ver flecha) Curso Básico de Virología para Civiles

Cultivo de líneas celulares continuas EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

INFECCION POR HERPES SIMPLEX TIPO 2 EN CELULAS RENALES: Células en contraste de fase en donde las células afectadas (ver flecha) están agrupadas y refráctiles Curso Básico de Virología para Civiles

Cultivo celular de líneas celulares continuas

EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

ELULAS INFECTADAS CON EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO. En la líne continua de células epiteliales humanas Curso Básico de Virología para Civiles

Cultivo de líneas celulares continuas EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

CELULAS INFECTADAS CON EL VIRUS SICITIAL RESPIRATORIO. A MAYOR AUMENTO). En la línea continua de células epiteliales humana Se observan células gigantes multinucleadas Curso Básico de Virología para Civiles

Cultivo de líneas celulares continuas EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

INFECCION CON EL VIRUS HVI-1 EN LA LINEA DE LINFOCITOS HUMANOS Células gigantes multinucleadas, además de espacios sin células. Curso Básico de Virología para Civiles

Efecto de los virus sobre los cultivos celulares VIRUS

EFECTO

EFECTO CITOPATICO Picornavirus

Células redondeadas, muerte y destrucción de la monocapa celular

Herpesvirus

Englobamiento celular, mas con el tipo 2 que con el tipo 1

Adenovirus

Agrupación de células redondeadas parecidos a racimos de uvas

Paramyxovirus

Células gigantes multinucledas SINCITIOS (fusión celular)

NO EFECTO CITOPATICO Orthomyxovirus

Células afectadas capaces de adsorber a los eritrocitos HEMOADSORCION

Togavirus

Interferencia viral, previene ECP de otros virus

Rhinovirus

Interferencia viral, previene ECP de otros virus tales como ECHOvirus Curso Básico de Virología para Civiles

Usos del cultivo celular Diagnóstico Produ cción de An tí gen os Produ cción de biol ógi cos

Produ cción de anti cuer pos m onoc lon ale s

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Anticuerpos monoclonales

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