Unidad 2 Clases

Unidad 2

Duplicación o Replicación del DNA Debido a la temporalidad de los seres vivos, para que una especie no se extinga ha de haber al menos un momento en el que la información biológica (características morfológicas y fisiológicas) se replique y a partir de esas copias aparezcan

La duplicación es la capacidad que tiene el ADN de hacer copias o réplicas de su molécula. Este proceso es fundamental para la transferencia de la

Características de la replicación •Es semiconservativa - al final cada molécula de ADN nueva presenta una cadena original y una cadena nueva.

•La replicación siempre se realiza adicionando nucleótidos en dirección 5' → 3'

• Es semidiscontinua - en una de las cadenas se sintetizan

filamentos bastante grandes y de forma continua, mientras que en la otra (cadena retardada) la síntesis es discontinua, ya que se van sintetizando fragmentos pequeños que se disponen de manera separada.

• Es bidireccional - a partir de un punto dado, la duplicación progresa en dos direcciones.

•El proceso de duplicación del DNA es controlado

enzimáticamente, asegurando así una alta fidelidad en la información que contiene la copia.

1. Replicación semiconservativa El modelo semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953) proponía que el ADN de doble hélice separa sus dos cadenas y cada una sirve de molde para sintetizar una nueva siguiendo las reglas de complementariedad de las bases nitrogenadas. Dicho modelo fue demostrado por Meselson y Stahl en 1957, el nombre de semiconservativo, es debido a que las dos dobles hélices recién sintetizadas poseen una cadena vieja (una mitad vieja) y otra nueva

replicación

2. Adición de nucleótidos endirección

Unión a través del grupo fosfato del nucleótido nuevo con el grupo hidroxilo (OH) libre del nucleótido anterior

La enzima que cataliza la adición de los nucleótidos se denomina Polimerasa de ADN

Inicio de la replicación •El sitio de inicio de la replicación (origen de replicación o replicón) consiste en secuencias específicas de nucleótidos reconocidas por proteínas específicas (polimerasas, helicasas, primasas). •En el origen de replicación las cadenas que conforman la doble hélice son separadas y da inicio la replicación en ambas cadenas. •A medida que la replicación continúa la horquilla de replicación se mueve a través del ADN.

3. Replicación semidiscontinua y asimétrica

cadena líder

cadena retardada cadena líder

Debido al antiparalelismo del ADN y a que las ADN polimerasas solamente sintetizan en la dirección 5'- 3', la síntesis de una de las cadenas se puede realizar de forma continua, mientras que la otra se sintetiza de manera discontinua (cadena retardada), a base de fragmentos cortos (fragmentos de Okazaki) .

4. Replicación bidireccional A partir de un punto de origen progresa en dos direcciones opuestas, existiendo dos puntos de crecimiento u horquillas de replicación. Si se observan simultáneamente las dos horquillas de replicación, a un lado del origen la hélice de nueva síntesis se polimeriza de forma continua, mientras que al otro lado del origen se polimeriza de forma discontinua.

Cadena líder

Cadena retardada

Las ADN polimerasas solamente sintetizan ADN en la dirección 5' – 3’. Para que puedan iniciar la síntesis de ADN necesitan un extremo 3' OH al que ir añadiendo nucleótidos, y ese extremo lo suministra un ARN de tamaño pequeño que se denomina ARN cebador o "primer". La síntesis de ADN comienza, por tanto, sintetizando un corto segmento de ARN denominado primer, el cual es sintetizado por una enzima denominada Primasa. ADN 3´

5´

5´

3´ - OH primer ARN

ADN

cadena vieja cadena nueva

La Primasa es una ARN polimerasa que utiliza como molde ADN. Primasa actúa: • 1 vez sobre la cadena líder (1 primer) • Múltiples veces sobre la cadena retardada: 1 vez/fragmento Okazaki generado Primer de RNA: 23-30 nucleótidos (E. coli) 10 nucleótidos (eucariotas) Tasa error DnaG: 1/104nucleótidos Los errores de ARN no son heredados porque el primer siempre es sustituido por ADN

Todos los fragmentos de Okazakicomienzan por un primer. Posteriormente, la ADN polimerasa III lleva a cabo la síntesis del fragmento de ADN correspondiente hasta llegar al siguiente primer. En ese momento, la ADN polimerasa I sustituye a la polimerasa III. La ADN polimerasa I se encarga de retirar el ARN (primer) mediante su actividad exonucleotídica 5'- 3' OH y al mismo tiempo rellena el hueco sintetizando ADN. Por último, los dos fragmentos de Okazaki tienen que unirse, por lo que es necesario enlazar el extremo 3'OH de un fragmento con el 5'P del siguiente fragmento. Dicha labor de sellado

Mecanismo de acción de las ligasas

unen fragmentos de ADN adyacentes a través de enlaces fosfodiester

Resumen de la síntesis de cadena retardada

Síntesis de primer RNA (primasa) Extensión para formar fragmentos de Okazaki (Polimerasa III) Síntesis de un nuevo fragmento de Okasaki Remplazo del oligo de RNA por DNA (Polimerasa I) Unión de los fragmentos (ligasa)

Otras proteínas involucradas en

Helicasas Enzimas dependientes de ATP encargadas de separar la doble cadena, desempeñan un papel fundamental para que se puedan sintetizar los primers en la cadena retardada.

Proteínas de unión a ADN de cadena sencilla (SSB, single strand binding) Previenen

la

formación

de

estructura

secundaria

y

apareamientos internos en la cadena sencilla (paterna), evita el reensamblajedel dúplex mientras ocurre la síntesis de la cadena hija. Además protege a la cadena sencilla del ataque de nucleases. La unión de esta proteína favorece la unión de las siguientes.

Problemas topológicos en la replicación La separación de la doble hélice produce superenrollamientos (enrollamientos del eje de la doble hélice)

La “relajación” del superenrollamiento requiere roturas de la doble hélice

Topoisomerasas: Clase I y II Topo I: Cortan 1 cadena DNA Topo II: Cortan las 2 cadenas DNA

Topoisomerasa ADN topo1

Corte en una cadena, formar el enlace ADNfosfotirosina

Liberar tensión y resellar las cadenas

Enlace covalente: 5’P(DNA)-Tyr

Horquilla de replicación: Actividades participantes (Resumen) Desenrollamiento doble hélice (topoisomerasa) Separación de las cadenas (helicasas)

(Mantenimiento de las cadenas separadas)

Previenen la formación de estructura secundaria (prot. de unión a cadena sencilla)

Primosoma - unión de helicasa y primasa en cadena retrasada

(Síntesis del RNA primer)

Primasa

(Eliminación primer, Síntesis relleno)

Polimerasa III

Polimerasa I

cadena líder

Ligasa cadena retardada

Tarea :MODELOS DE REPLICACIÓN CONSERVATIVO Y DISPERSIVO Modelo Conservativo: cuando el ADN doble hélice se replica

se producen dos dobles hélices, una de ellas tiene las dos hebras viejas (está intacta, se conserva) y la otra doble hélice posee ambas hebras de nueva síntesis.

Modelo Dispersivo: Cuando el ADN doble hélice se replica se

originan dos dobles hélices, cada una de ellas con hebras que poseen tramos viejos y tramos de nueva síntesis en diferentes proporciones.

semiconservativ o

conservativo

dispersivo

Recapitulando….. •La replicación es la capacidad que tiene el ADN de hacer copias de su molécula. •Es un proceso de alta fidelidad (casi no se cometen errores). menos de 1 error/109 nucleótidos •El replicón es la unidad del ADN en la cual ocurren actos individuales de replicación. El replicón contiene un origen donde comienza la replicación y un final donde ésta se detiene, además contiene todos los elementos de control necesarios. para la •La replicación es semiconservativa, semidiscontinua, bidireccional y siempre ocurre en dirección 5‘→ 3‘. •Durante el proceso de replicación intervienen diversas enzimas: Topoisomerasas, Helicasas, Prot. de unión a

cadena retardada

Cadena líder

Polimerasas en E. coli dna polimerasa i 2.

Actividad polimerasa (síntesis en dirección 5’ 3’)

3.

Actividad correctora (revisora) por su función de exonucleasa (remoción de nucleótidos erróneos).

4.

Actividad reparadora, retira los primers de ARN (función de exonucleasa) y rellena el hueco con su actividad de polimerasa.

 

dna polimerasa ii Actividad correctora , el papel que juega en la replicación del ADN es desconocido.

dna polimerasa iii Es la enzima que realiza la mayoría de la replicación del ADN, el corazón catalítico del enzima lo constituyen las subunidades  (encargada de la polimerización),  (realiza la función correctora

Las principales características de las ADN Polimerasas de E. coli, se pueden resumir en la siguiente tabla:

El proceso de síntesis de ADN tiene que producir dos moléculas exactamente

iguales,

cualquier

error

que

se

cometa

se

convertirá en una mutación. Las ADN polimerasas deben ser bastante fieles copiando el ADN. Para ello poseen una función correctora de pruebas que retira el último nucleótido introducido de forma incorrecta. Esta función se realiza debido a la actividad de exonucleasa 3´– 5´.

Función correctora (actividad exonucleasa 3´- 5´) cadena templad o

error apareamient o

G T Sitio actividad exonucleasa 3´ -- 5´ Polimerasa ADN (I, II y III)

Actividad polimerasa Función elongación

Actividad exonucleasa (3´) Función correctora

ADN Polimerasa III (E. coli)

Posee muchas cadenas o subunidades polipeptídicas. Es un dímero asimétrico, una mitad del dímero se encarga de sintetizar la cadena retardada y la otra mitad sintetiza la cadena líder. El corazón catalítico lo conforman las subunidades  (alfa),  (épsilon) y  (teta). La subunidad  (tao) interviene en la unión del dímero. El complejo - (gama-delta) produce la unión al ADN molde. La subunidad  (beta)

La tendencia de la enzima a permanecer unida al molde en lugar de disociarse y reasociarse se le conoce como procesividad. Se puede definir como el numero de nucleótidos incorporados por evento de unión entre la enzima y el DNA. Se considera que la estructura tipo rosca que forma la subunidad  de la polimerasa III desempeña un papel clave en la procesividad de la enzima. Como regla general el incremento en la procesividad disminuye la probabilidad de reducir errores.

Replicación en E. coli (I)

Enzimas que participan en la iniciación: •Dna B (helicasa– separa las dos cadenas) •SSB (Prot de unión a cadena sencilla – evita

la formación de estructura secundaria y reensamblaje del duplex) •Dna G (primasa – síntesis de primer ARN) •Topo I, III y girasa (topoisomerasas - libera estrés torcional generado por el desenrrollamiento de la cadena de ADN)

•Otras enzimas

Dna A - reconoce el origen de replicación y contribuye a separar las cadenas. Dna C - actúa conjuntamente con la DNA B

Enzimas que participan en el alargamiento: DNA polimerasa I y III Ligasa – unión de los fragmentos de Okazaki Enzimas que participan en la terminación: •TUS - frena a la horquilla de replicación

Terminación de la replicación Una vez que ha comenzado la replicación, las dos horquillas de replicación avanzan en sentidos opuestos y con una misma velocidad, hasta encontrarse en un punto diametralmente opuesto a origen (OriC ) donde se desensambla el complejo de replicación. Existen además sitios específicos de terminación (sitios Ter) que son reconocidas por la proteína Tus (Terminus Utilization Substance). La unión de la proteína Tus a la secuencia frena a la horquilla de replicación correspondiente mediante una actividad

Replicación en E. coli (II) El origen de replicación en E. coli (Ori C) tiene 245 pb de longitud, 3 secuencias (13pb) y 4 secuencias (9pb) casi idénticas repetidas en tandem

Replicación en eucariotas • Velocidad de alargamiento: La velocidad de polimerización en eucariotas es mucho menor que en procariotas E. coli = 500 nt/s levaduras = 60 nt/s; Drosophila = 40 nt/s y ratón = 30 nt/s • Origen de replicación: En eucariotas existen múltiples replicones (múltiples orígenes de replicación) levadura = 500, Drosophila= 3500, ratón = 25000 y plantas = 35000 • En eucariotas la división celular tiene lugar una vez que el ADN se ha replicado, dicha replicación tiene lugar durante la fase S del ciclo celular (8 h aproximadamente) • En eucariotas los fragmentos de Okazaki son más cortos Procariotas =1000 a 2000 nucleótidos Eucariotas = 100 a 200 nucleótidos •

El control es más complejo

Ori C

burbuja de replicación

Número de orígenes de replicación Escherichia coli

1 origen de replicación

Saccharomyces cerevisiae Células humanas

origen

horquilla de replicación

300 orígenes de replicación 20 000 orígenes de replicación

origen

burbuja de replicación

replicón

replicón

Polimerasas en eucariotes Para la replicación de ADN en células eucariotas se utilizan dos polimerasas diferentes, una para sintetizar la hélice conductora y otra para producir la hélice retardada. La ADN polimerasa  sintetiza la cadena retardada mientras que la ADN polimerasa  sintetiza la cadena líder, ambas enzimas tienen función correctora (exonuleasas 3´– 5´).

Control de la Replicación durante el ciclo celular El control de la replicación está íntimamente ligado al ciclo celular, cada célula hija ha de tener la misma cantidad de DNA que la madre. Debe haber un acoplamiento entre replicación y división celular de manera que solo puede iniciarse una ronda de replicación por división celular. Deben existir controles para que: • Solo ocurra replicación en la fase S. • Determinar cuantos orígenes estén activados a la misma vez. • Los orígenes de replicación que se están activando lo hagan siguiendo un patrón determinado para cada tipo de célula (primero se activan

Primero se replica la cromatina activa (menos condensada ) y al final la heterocromatina o forma inactiva (fuertemente empaquetada )

1. En la fase G1 se comprueba que las condiciones ambientales son favorables y le permiten continuar a fase S. 2. En G2 es donde se comprueba que la célula esta bien, que el DNA se ha replicado completa y correctamente y la célula entra en mitosis. La célula no se divide hasta que se asegura que la descendencia va a estar en condiciones adecuadas. Las cinasas dependientes de ciclina (CDKs) y las ciclinas son proteínas que controlan puntos clave de regulación en la fase G1 y en las fase G2 (el comienzo de la fase M o de la fase S). La ciclinas se unen a las CDKspara activarlas. En su forma activa éstas disparan determinados mecanismos que están relacionados con el comienzo de la fase S o M. Los niveles de ciclinas, varían a lo largo del ciclo celular. Ciclinas G1 (fase G1) ---- max (punto Start) da inicio de la fase S CiclinasG1 (fase s) y Ciclinas mitóticas ---- max da inicio de la fase M

Los cromosomas eucarióticos son moléculas de DNA lineales, con extremos especializados llamados telómeros (estructuras que confieren estabilidad al cromosoma). Todas las polimerasas conocidas extienden la cadena de ADN en dirección 5’3’ y para iniciar la síntesis se requiere un primer. La síntesis de la cadena líder se completa hasta el final, PERO, la cadena discontinua (retardada) se iría acortando en cada ronda de replicación

ADN 5´

3´

3´

5´ - OH

ADN

cadena vieja cadena nueva

primer ARN

ADN 5´

3´

3´

5´ - OH

ADN

primer ARN

cadena vieja cadena nueva

5´ …_ GGGGTT 3´ …_ CCCCAA

La

enzima

que

evita

GGGGTT

GGGGTT

CCCCAA

5´

hijas en cada ciclo celular es

3´

AACCCCAAC

telomera sa

La telomerasa es un complejo de ribonucleoproteina sintetiza

un fragmento de DNA a partir de un RNA molde.

Añaden en los

extremos 3´segmentos lineales de ADN. No necesitan molde ya que intrínsecamente poseen un

5´

ARN molde

llamada telomerasa.

que

3´

este

acortamiento en las cromátidas

(RNA+proteínas)

GGGGTT

+ primasa

Este ARN de la enzima se posiciona sobre el ADN y a partir del extremo 3‘OH comienza la síntesis de secuencias en tandem TTGGGG. Una vez añadido algunos nucleótidos la enzima se transloca (actuando así como molde movible) para comenzar otra vez y así se van sintetizando las secuencias repetidas del telómero. Esto mecanismo permite el alargamiento del extremo protuberante 3’ OH.

Replicación de •Plásmidos •Virus (cadena doble, sencilla, lineales o circulares) •ADN mitocondrial

Elementos genéticos lineales 1. Algunas ADN polimerasas añaden la primera base (nucleótido) a un OH de proteínas específicas que se unen a los extremos de los cromosomas lineales. 3. Estas proteínas tienen como función el reconocimiento de los extremos cromosómicos. 5. Estas proteínas no son eliminadas y están

Circularización de los elementos lineales ADN lineal

círculo rodante

estructura  (teta)

circularización por extremos cohesivos

Modelo replicativo tipo teta Replicación bidireccional a partir de un origen, da lugar a intermediarios replicativos que

asemejan

griega .

a

la

letra

forma replicativa (doble cadena))

origen

enzima de ruptura ruptura

Modelo replicativo del círculo rodante ADN circular de cadena sencilla (Fago X174)

ruptura punto de crecimiento cadena desplazada punto de crecimiento

una vuelta completa

ADN circular de cadena doble (Fago lamda)

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR ( de sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction) es una técnica para la síntesis "in vitro" de secuencias específicas de ADN.

Kary Mullis en 1983 presentó la PCR Premio Nobel de Química (1993)

La técnica se basa en la replicación del ADN realizada por la ADN polimerasa. Esta enzima realiza la síntesis de una cadena complementaria de ADN (5´- 3´) usando un molde (cadena sencilla), a partir de una región de doble cadena. Para sintetizar la región dada se usan unos primers (iniciadores) que son complementarios a cada uno de los extremos 3´del fragmento de ADN que se desea amplificar. Región de doble cadena de interés molde de cadena sencilla (templado)

Primer 2

Primer 1

síntesis del fragmento por la polimerasa

La reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas: 3. Desnaturalización

del

ADN

doble

cadena

– separación de las dos cadenas por incubación a 9397ºC. La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.

5. Hibridación de los primers (iniciadores) a cada una de las cadenas - los primers se unen a las zonas 3´ complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. La hibridación ocurre a una temperatura entre los 45-60º C (temperatura que favorece el apareamiento por complementariedad entre los primers y la cadena molde)

7. Extensión (elongación)- se produce la síntesis de una cadena sencilla en la dirección 5´- 3´ mediante la ADN polimerasa (produciéndose un fragmento de doble

1 ciclo

94°C, 30 s – desnaturalización 45-60 °C, 30 s – alineamiento 72°C, 1 min –extensión (1000pb)*

*El tamaño del fragmento a amplificar rige el tiempo necesario para la extensión. Es importante no realizar un número alto de ciclos para evitar errores de replicación y productos no específicos. Procurar utilizar el menor número de ciclos posibles.

A partir del ciclo 3 la acumulación del ADN ocurrirá en forma exponencial Después de 25 ciclos (30 millones de veces)

Elementos que componen la reacción

Elementos esenciales:

§DNA polimerasa termoestable §Un par de oligonucleótidos (primers) §dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) §Cationes bivalentes: La concentración de Mg (MgCl2) resulta fundamental

para la polimerasa. Además bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la reacción

§Buffer (Tris-HCl pH 8.0) §Cationes monovalentes:

concentraciones del ión K+ favorece la desnaturalización de secuencias cortas

concentraciones de K+ ayudan a la desnaturalización de secuencias largas

§DNA molde (0.01 – 0.1g)

Propiedades y aplicaciones de las polimerasas termoestables

Consideraciones para el diseño de oligonucleótidos (primers):

§ contenido G+C 40% - 60% § longitud 18-25 nucleótidos § evitar secuencias invertidas repetidas § evitar

complementariedad oligonucleótidos

entre

§ Tm de los oligos no debe diferir más de 5°C § procurar extremo 3’OH sea G o C

los