Teza Doctorat Muresan Cezara (umf A

Universitatea de Medicina si Farmacie „Victor Babes” Timisoara

Analogii-GnRH in reproducerea umana asistata Tehnici actuale in reproducerea umana asistata – ICSI si crioconservarea

Doctorand: Muresan Maria-Cezara

Conducator stiintific Academician Prof. Dr. Ioan Munteanu

2005

Universitatea de Medicina si Farmacie „Victor Babes” Timisoara

Analogii-GnRH in reproducerea umana asistata Tehnici actuale in reproducerea umana asistata – ICSI si crioconservarea

Dr. Muresan Maria Cezara

Conducator stiintific Academician Prof. Dr. Ioan Munteanu

Cuvant inainte Sterilitatea / infertilitatea ca patologie ocupa un loc important in cadrul ginecologiei. Adeseori tratamentul sterilitatii necesita timp si rabdare din partea pacientei, succesul (obtinerea sarcinii) fiind si el asteptat in timp. Cu tot ajutorul medical acordat, ramane un procent din cuplurile cu sterilitate care nu vor concepe. Numarul acestor cupluri a fost insa influentat odata cu introducerea fertilizarii in vitro – o realizare de seama a secolului XX. Problema conceptiei in exteriorul organismului i-a preocupat pe oamenii de stiinta cu multe decade in urma. La inceputul secolului XX (1900) este citat biologul Ilya Ivanov cu cercetarile sale despre inseminarea artificiala la animale. Initial studiile s-au limitat la animale. Cand s-a observat ca incercarile au dat roade, s-a trecut si la aplicarea acestor proceduri la om. Pionierii in acest domeniu sunt considerati a fi britanicii P. Steptoe si R.G. Edwards, carora le datoram fertilizarea in vitro de astazi. Ei sunt cei care au reusit fecundarea in vitro a gametilor feminin si masculin, cu obtinerea embrionului, implantarea sa intrauterina, si obtinerea unei sarcina ce s-a finalizat cu nasterea primului “copil in eprubeta” (notiune ce avea sa se incetateneasca mai tarziu). Ei si-au anuntat succesul printr-un scurt articol intr-o revista de specialitate. Acestui prim success i-au urmat multe altele si in curand tehnica fertilizarii in vitro s-a extins pe aproape intreg globul. De-a lungul anilor s-au adus imbunatatiri ale metodei si s-au dezvoltat noi tehnici, mai performante, care sa permita cresterea ratei sarcinilor la cuplurile cu sterilitate. Fertilizarea in vitro poate fi considerata, pe drept cuvant, una dintre minunile lumii, reprezentand o cucerire fantastica a stiintei, totodata, implinind visul multor cercetatori. Astfel, prin fecundarea in vitro s-au rezolvat problemele multor familii fara copii, carora pana atunci le era imposibil sa conceapa. La noi in tara meritul introducerii acestei metode ii apartine Academicianului Prof. Dr. Ioan Munteanu, cu o veche preocupare in domeniul sterilitatii si care a luptat pentru progresul medicinei romanesti. Chiar de la prima fertilizare in vitro efectuata la 20.05.1995, in cadrul Centrului de Laparoscopie, Chirurgie Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din Clinica Universitara de Obstetrica-Ginecologie „Bega”, Timisoara, s-a si obtinut sarcina. La 6.02.1996 s-a nascut primul roman „din eprubeta”. Am avut sansa de-a ma numara printre invataceii d-lui Acad. Prof. Dr. Ioan Munteanu, care mi-a calauzit pasii spre acest capitol al ginecologiei – sterilitatea - si in final tratamentul

II

sterilitatii – tehnicile de reproducere asistata. Acesta este in parte si motivul pentru care am ales reproducerea asistata ca tema pentru teza de doctorat. Doresc pe aceasta cale sa aduc multumirile mele si profunda recunostiinta d-lui Acad. Prof. Dr. Ioan Munteanu, personalitate marcanta in ginecologia din Romania, conducatorul stiintific al prezentei teze de doctorat. De asemenea ii sunt recunoscatoare pentru generozitatea cu care mi-a indrumat cercetarea, pentru materialul bibliografic pe care mi l-a pus la dispozitie, pentru indicatiile competente pe care mi le-a oferit si care sunt izvorate dintr-o inegalabila experienta si valoare, cat si pentru sustinerea in definitivarea acestei teze. Pentru aprofundarea cunostintelor in domeniul reproducerii umane am beneficiat de o bursa DAAD (Deutscher Akademischer Austauschdienst) in cadrul pregatirii pentru doctorat si am urmat un stagiu de 6 luni la Clinica Universitara de Ginecologie, Heidelberg, Germania, in Departamentul de Fertilizare in Vitro. Acest departament are o veche traditie in tratamentul sterilitatii si in tehnicile reproducerii umane asistate. Am avut la dispozitie material bibliografic, acces la baza de date si am lucrat efectiv in cadrul acestei sectii. Ii multumesc colectivului acestui departament, condus de Prof. Dr. Thomas Strowitzki si Prof. Dr. Thomas Rabe, care au avut intotdeauna un sfat competent pentru cercetarea mea. Multumirile mele se indreapta si catre dl. Prof. Dr. Virgil Ancar, Spitalul Sf. Pantelimon Bucuresti, care a condus cursul si stagiile de pregatire in cadrul supraspecializarii de fertilizare in vitro, pe care am urmat-o. Cu Domnia sa mi-am sustinut examenul de supraspecializare in anul 2005. Cu ocazia efectuarii acestei supraspecializari am beneficiat si de cunostintele d-lui Prof. Ancar, o personalitate de seama in domeniul reproducerii umane asistate in Romania. Nu in ultimul rand doresc sa-i multumesc familiei mele, care m-a sustinut si m-a incurajat in realizarea - si mai ales in finalizarea tezei si care m-a impulsionat in momentele mai dificile din conceperea lucrarii.

III

Introducere Lucrarea de fata s-a conturat si a luat nastere in urma sfaturilor competente ale d-lui Academician Prof. Dr. Ioan Munteanu, renumita personalitate a ginecologiei romanesti, recunoscuta si peste hotare, initiatorul fertilizarii in vitro in tara noastra. Domnia sa este conducatorul stiintific al acestei teze. O serie de date si informatii am avut ocazia sa le obtin de la Departamentul de Fertilizare in Vitro din cadrul Clinicii Universitare de Ginecologie din Heidelberg, Germania. Acolo am urmat un stagiu de 6 luni in cadrul unei burse doctorale DAAD. Subiectul acestei teze abordeaza tratamentul modern al sterilitatii, si anume reproducerea umana asistata. Este un domeniu unde cercetarile, si mai ales cele legate de capitole intricate, ca embriologia si diagnosticul genetic preimplantational – asteapta inca multe raspunsuri si noi descoperiri. Am ales in partea generala a tezei, pentru inceput, descrierea hormonului hipotalamic GnRH, precum si motivele si criteriile pentru care acesta este considerat a avea rol central in reproducerea umana. Am insistat asupra unor aspecte moderne, descrise mai recent, si anume activitatea generatorului de pulsuri-GnRH. La fel sunt expuse si amanunte legate de receptoriiGnRH. Din structura hormonului hipotalamic au derivat substante cu mecanism analog – agonistii- si antagonistii-GnRH (Capitolul 1). In acest mod am efectuat o trecere spre clasa de substante - a analogilor-GnRH, care sunt utilizate pe scara larga in reproducerea umana asistata. Rolul lor este de-a produce o supresie a functiei hipofizare. Protocoalele cu agonisti-GnRH sunt cunoscute si sunt aplicate mai demult, spre deosebire de protocoalele cu antagonisti-GnRH, care sunt de data mai recenta. Cele 2 tipuri de analogi inca constituie subiect de dezbatere si controverse referitor la impactul lor asupra ratei sarcinilor in urma tehnicilor de reproducere asistata. Am descris structura substantelor agoniste si antagoniste, inclusiv exemple de preparate utilizate in practica clinica. Am subliniat avantajele si dezavantajele acestor doua clase de substante si am detaliat protocoalele terapeutice. Totodata am expus si datele statistice din studii de specialitate, din literatura internationala, cu referire la diversele tipuri de protocoale (Capitolul 3). In cadrul stimularii ovariene controlate se utilizeaza clomifen citratul, gonadotropinele, combinarea celor doua sau asocierea gonadotropinelor. Dupa ce am trecut in revista un scurt

IV

istoric al preparatelor gonadotropinice, m-am axat pe descrierea mecanismului cresterii foliculare sub actiunea gonadotropilor hipofizari, inclusiv teoria celor doua compartimente celulare. Am considerat necesara amintirea si detalierea mecanismului intim al recrutarii si dezvoltarii folicolului dominat pentru a justifica semnificatia gonadotropinelor in reproducerea umana asistata. Un ultim capitol al partii generale se refera la tehnicile reproducerii umane asistate. Initial am descris fertilizarea in vitro conventionala, clasica, si mai apoi tehnicile de micromanipulare a gametilor umani, culminand cu metoda microinjectarii intracitoplasmatice a unui singur spermatozoid in ovocit – metoda ICSI si care scurtcircuiteaza toate barierele ce stau in calea patrunderii spermiei in ovocit. In completarea descrierii acestor tehnici, cu amanunte si din partea de biologie, am adus cateva imagini din microscopie ale ovocitelor, a celulelor in stadiul de prezigot si a embrionilor. In finalul partii generale am amintit si studii din literatura, care redau rezultate ale tehnicilor reproducerii umane asistate. Pentru a se putea aplica metodele reproducerii umane asistate este deci nevoie de a stimula controlat ovarul (este vorba de o suprastimulare controlata) prin terapie cu gonadotropine (modern cu preparate sintetizate genetic), motiv pentru care am insistat asupra preparatelor gonadotropinice, in capitolul 2. Pentru a evita cresterea prematura a LH-ului endogen, fiind cunoscute efectele sale negative asupra maturarii foliculare si pentru a evita o ovulatie necontrolata in cadrul schemelor de stimulare ovariana, se doreste inhibarea hipofizei. In acest scop se administreaza agonistii- sau antagonistii-GnRH. In acest mod am conceput si am structurat partea initiala a tezei – partea generala. Partea speciala este o expunere comparativa, in cadrul unui studiu propriu, a protocoalelor cu agonisti- si antagonisti-GnRH, in ideea de-a desprinde unele observatii referitoare la influenta lor asupra ratei sarcinilor, obiectivul final al reproducerii umane asistate. Studiul este unul retrospectiv, intins pe o perioada de 3 ani (1999; 2000 si 2001). In cadrul acestei analize am luat in calcul o serie de factori, incercand sa gasesc corelatii intre varsta pacientei, durata si doza stimularii ovariene cu gonadotropine, nivelul estradiolului seric obtinut in ziua inducerii ovulatiei, cu rasunet asupra raspunsului ovarian. Pentru fiecare an si grup de paciente din cadrul fiecarui protocol sunt redate procentele tehnicilor reproducerii umane asistate aplicate si a rezultatelor lor: numarul de ovocite recoltate, numarul de celule fecundate.

V

Subcapitolele „Observatii” cuprind detaliat complicatiile de tipul raspunsului redus („low response”) sau a celui exagerat (sindrom de hiperstimulare) la terapia de stimulare ovariana. Pentru aceste complicatii am incercat sa gasesc ce factori au influentat raspunsul ovarian inadecvat – corelatii intre varsta pacientei, durata medie a stimularii ovariene si numarul mediu de unitati de gonadotropina administrata, nivelul mediu al estradiolului seric obtinut, comparativ cu valorile medii ale acestor parametri pentru intreg lotul de paciente. De asemenea am precizat la fiecare acest caz ce tip de protocol s-a aplicat. Subcapitolele „Concluzii” redau detaliat numarul si evolutia sarcinilor obtinute, inclusiv tehnica aplicata, tipul protocolului utilizat si gonadotropina administrata. Fiecare statistica in parte cuprinde un subcapitol ”Discutii” cu remarci comparative asupra influentei acestor parametri in rata sarcinilor. Am considerat deosebit de utila expunerea statisticii Centrului de Laparoscopie, Chirurgie Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din cadrul Clincii Universitare de Obstetrica-Ginecologie „Bega”, Timisoara. Avand in vedere ca acest centru este un centru de referinta in Romania si a acumulat deja experienta in domeniu, am amintit statistica pe primii 5 ani de activitate. Un ultim capitol din partea speciala acorda atentie crioconservarii, metoda moderna ce ofera posibilitatea pastrarii la –196°C a celulelor fecundate si a spermatozoizilor si cu utilizarea lor ulterioara, dupa decongelare. In acest capitol, dupa o scurta expunere teoretica, am dorit sa reliefez impactul agonistilor- versus antagonisti-GnRH in obtinerea acestor celule, si anume care tip de protocol se insoteste de un procent mai mare de celule fecundate, din care o parte se crioconserva. Procesul congelarii si al decongelarii, dar si calitatea celulelor fecundate, posibil influentata (?) de agonisti/antagonisti au impact asupra ratei supravieturii celulare dupa decongelare. Prin aceste cercetari, teza de fata isi propune o discutie si unele observatii asupra avantajelor si dezavantajelor protocoalelor cu agonisti comparativ cu antagonisti-GnRH in cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata, cu impactul lor asupra ratei sarcinilor si incearca prin aceasta sa contribuie la un progres al tratamentului cuplurilor cu sterilitate, ce intra in programe de reproducere asistata.

VI

Abrevieri GnRH: hormon eliberator de gonadotropine GABA: acid gamaaminobutiric SNC: sistem nervos central FSH: hormon foliculostimulant LH: hormon luteinizant HCG: coriogonadotropina umana TSH: hormon tireostimulant rFSH: preparat recombinat al FSH HMG: gonadotropina umana obtinuta din urina menopauzala FSH-HP: preparat inalt purificat al FSH ß-HCG: fractiunea beta a hormonului coriogonadotropinic uman E2: estradiol PCOS: sindromul ovarelor micropolichistice FIV: fertilizare in vitro ET: embriotransfer GIFT: transfer intratubar al gametilor ZIFT: transfer intratubar al zigotului ZD: perforarea zonei pellucida PZD: disectia partiala a zonei pellucida SUZI: inseminare subzonala ICSI: injectie intracitoplasmatica a spermatozoidului MESA: aspirarea microchirurgicala a spermatozoizilor din epididim TESE: extragerea chirurgicala a spermatozoizilor din testicul PESA: aspirare percutan a spermatozoizilor epididimali PN: pronuclei UI: unitati internationale ESHRE: Societatea Europeana de Reproducere Umana si Embriologie

VII

Cuvant inainte Introducere Abrevieri Cuprins A. Partea generala

pag. 1

GnRH – molecula princeps in reproducere Gonadotropii – terapie de stimulare ovariana Agonisti si antagonisti-GnRH; protocoale in cadrul reproducerii umane asistate Tehnici de reproducere umana asistata. De la fertilizarea in vitro la tehnicile de micromanipulare si ICSI Capitolul 1- GnRH - rolul si implicatia sa in reproducere

pag. 2

Capitolul 1.1 GnRH – molecula princeps in reproducere Capitolul 1.2 Generatorul de pulsatii GnRH Capitolul 1.3 Influentele neurotransmitatorilor Capitolul 1.4 Variatia fiziologica a pulsatiilor GnRH Capitolul 1.5 Structura GnRH Capitolul 1.6 Receptorul GnRH Capitolul 2 – Gonadotropii

pag. 13

Capitolul 2.1 Scurt istoric Capitolul 2.2 Structura si efectele generale ale gonadotropilor hipofizari Capitolul 2.3 Reglarea secretiei gonadotropilor hipofizari VIII

Capitolul 2.4 Efectele gonadotropilor hipofizari in reglarea cresterii foliculare Capitolul 2.5 Gonadotropii utilizati in suprastimularea ovariana controlata Capitolul 3 – Analogii-GnRH

pag. 25

Capitolul 3.1 Agonistii-GnRH Capitolul 3.2 Protocoale de stimulare ovariana controlata ce cuprind in schema lor agonisti-GnRH Capitolul 3.3 Efectul agonistilor asupra fazei luteale Capitolul 3.4 Antagonistii-GnRH Capitolul 3.5 Protocoale de stimulare ovariana controlata ce cuprind in schema lor antagonisti-GnRH Capitolul 4 – Raspunsul pacientelor la stimularea ovariana controlata

pag. 36

Capitolul 4.1 Raspuns insuficient al pacientelor la terapia de stimulare Capitolul 4.2 Raspuns exagerat al pacientelor la terapia de stimulare. Sindromul de hiperstimulare ovariana Capitolul 4.3 Medicatia hormonala administrata in reproducerea asistata si cancerul Capitolul 5 - Tehnici de reproducere umana asistata – fertilizarea in vitro (FIV)

pag. 43

Capitolul 5.1 Istoric Capitolul 5.2 Tehnici de recoltare ovocitara Capitolul 5.3 Extinderea FIV in lume. FIV in Romania Capitolul 5.4

IX

Tehnica FIV Capitolul 5.5 Prelucrarea spermei Capitolul 5.6 Controlul fecundatiei Capitolul 5.7 Realizarea embriotransferului Capitolul 5.8 Rezultatele generale ale FIV Capitolul 5.9 GIFT (gamete intrafallopian transfer) si ZIFT (zygote intrafallopian transfer) Capitolul 6 - Tehnici de micromanipulare in cadrul reproducerii umane asistate

pag. 62

Capitolul 6.1 Tehnici de micromanipulare anterioare ICSI Capitolul 6.2 ICSI (intracytoplasmatic sperm injection) Capitolul 6.3 Tehnica microinjectarii Capitolul 6.4 Rezultatele ICSI B. Partea speciala Studiu comparativ pe 3 ani al administrarii agonistilor- si antagonistilor-GnRH in reproducerea umana asistata referitor la rata sarcinilor

pag. 78

Capitolul 1 – Statistica pe 3 ani pentru protocoalele cu agonisti-GnRH in reproducerea umana asistata

pag. 80

Capitolul 1.1 Statistica pe anul 1999 pentru protocoalele cu agonisti-GnRH a. Material si metoda

X

b. Rezultate c. Observatii d. Concluzii e. Discutii Capitolul 1.2 Statistica pe anul 2000 pentru protocoalele cu agonisti-GnRH a. Material si metoda b. Rezultate c. Observatii d. Concluzii e. Discutii Capitolul 1.3 Statistica pe anul 2001 pentru protocoalele cu agonisti-GnRH a. Material si metoda b. Rezultate c. Observatii d. Concluzii e. Discutii Capitolul 1.4 Statistica pe cei 3 ani pentru protocoalele cu agonisti-GnRH a. Material si metoda b. Rezultate c. Observatii d. Concluzii e. Discutii Capitolul 2 – Statistica pe 3 ani pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH in reproducerea umana asistata

pag. 135

Capitolul 2.1 Statistica pe anul 1999 pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH a. Material si metoda

XI

b. Rezultate c. Observatii d. Concluzii e. Discutii Capitolul 2.2 Statistica pe anul 2000 pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH a. Material si metoda b. Rezultate c. Observatii d. Concluzii e. Discutii Capitolul 2.3 Statistica pe anul 2001 pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH a. Material si metoda b. Rezultate c. Observatii d. Concluzii e. Discutii Capitolul 2.4 Statistica pe cei 3 ani pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH a. Material si metoda b. Rezultate c. Observatii d. Concluzii e. Discutii Capitolul 3 – Discutii

pag. 190

XII

Capitolul 4 – Statistica pe primii 5 ani a Centrului de Laparoscopie, Chirurgie Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din cadrul Clincii Universitare de Obstetrica-Ginecologie „Bega”, Timisoara

pag. 206

Capitolul 5 – Crioconservarea

pag. 215

Capitolul 5.1 Crioconservarea si locul acesteia in cadrul reproducerii umane asistate Capitolul 5.2 Efecte fizice in cursul congelarii Capitolul 5.3 Substantele crioprotectoare Capitolul 5.4 Crioconservarea celulara Capitolul 5.5 Rezultatele dupa decongelarea celulelor crioconservate obtinute in urma ciclurilor cu agonistiGnRH in cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata Capitolul 5.6 Rezultatele dupa decongelare a celulelor crioconservate obtinute in urma ciclurilor cu antagonisti-GnRH in cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata Capitolul 5.7 Discutii crioconservare Capitolul 5.8 Concluzii crioconservare Capitolul 6 -- Concluzii generale

pag. 246

Bibliografie

pag. 253

XIII

A. Partea generala

GnRH – molecula princeps in reproducere Gonadotropii – terapie de stimulare ovariana Agonisti- si antagonisti-GnRH; protocoale in cadrul reproducerii umane Tehnici de reproducere umana asistata. De la fertilizarea in vitro la tehnicile de micromanipulare si ICSI

1

Capitolul 1 GnRH - rolul si implicatia sa in reproducere Capitolul 1.1 GnRH – molecula princeps in reproducere In controlul nervos al sistemului reproductiv feminin rolul central il detine GnRH (gonadotropin releasing hormone, LHRH(F) – luteinizing releasing hormone sau factor) - un hormon cu secretie pulsatila, produs in neuronii din unele zone ale hipotalamusului (nucleul arcuat, zona preoptica, zona periventriculara anterioara) [1]; [2]. Secretia hormonala este realizata in nucleii hipotalamici; ulterior, la nivelul terminatiilor axonilor, hormonii sunt eliberati in sistemul port hipofizar si prin circulatia descrise de Gr.T Popa si Fielding (1930) ajung la nivelul hipofizei anterioare [3]; [4]. La acest nivel se elibereaza gonadotropii: hormonii FSH (hormon foliculostimulant, folitropina) si LH (hormon luteinizant) (secretati tot in sistem pulsatil) cu rol in coordonarea ciclului menstrual. De abia in 1978 s-a demonstrat si s-a recunoscut interventia hormonului GnRH in reglarea functiei ovariene, rol constatat prin faptul ca administrarea continua a GnRH determina secretia scazuta a hormonilor FSH si LH. Este meritul cercetarilor a 2 oameni de stiinta – Dr. Andrew Schally si Dr. Roger Guillemin si a echipelor lor de studiu, care au reusit descrierea structurii si sinteza GnRH (1971). Activitatea acestora a fost incununata prin decernarea premiului Nobel in domeniul fiziologiei endocrinologiei reproductive (1977) [5]; [6]. Neuronii secretori ai GnRH isi au originea extracerebral, la nivelul placii olfactive si migreaza de-a lungul nervului olfactiv spre septul nazal si strabat placa cribriforma, ajungand in final la nucleul arcuat. Afectarea migrarii neuronale asociaza hipogonadismul hipogonadotrop cu anosmia (sindrom Kallmann). Migrarea neuronala si pasajul acestora prin placa cribriforma sunt influentati de o serie de factori reglatori. S-a constatat ca GnRH este prezent in structurile nervoase embrionare inca din saptamana 9-10 de gestatie, dar de abia din saptamana 14-15 sunt realizate toate conexiunile intre neuronii hipotalamici si sistemul port hipofizar iar FSH si LH sunt detectati din saptamana a 10-a de gestatie la nivelul structurilor nervoase si in sange la 12 saptamani de gestatie [7]; [8].

2

Nivelurile embrionare/ fetale de FSH si LH cresc pana la jumatatea perioadei de gestatie ca apoi sa scada. GnRH este secretat in tot timpul vietii intrauterine, cu rol in perioada fetala tardiva si in cea neonatala (rol in dezvoltarea normala a organelor genitale externe). Secretia pulsatila a GnRH are un rol crucial in mentinerea functiei reproductive. Modificari ale ritmului pulsatil cauzate, de exemplu, de stress sau de infectii pot afecta functia endocrina a hipofizei si a gonadelor. Activitatea pulsatorie a hipotalamusului este influentata de diversi neurotransmitatori de tipul norepinefrinei, a dopaminei, a serotoninei, a acidului gamaaminobutiric (GABA), de steroizi (estradiol, progesteron, testosteron), de opioide endogene (beta-endorfina), de neuropeptide (neuropeptidul Y, proencefalina) [9]. Capitolul 1.2 Generatorul de pulsatii GnRH Neuronii GnRH apartin unei retele hipotalamice, numita generator de pulsatii GnRH, care induce si coordoneaza secretia episodica a neuropeptidelor. Acest concept de generator de pulsatii GnRH a fost verificat initial experimental si ulterior dovedit si la om si este general valabil pentru toate mamiferele [10]. Generatorul de pulsatii GnRH are urmatoarele caracteristici: este localizat in regiunea arcuata a hipotalamusului mediobazal; reprezinta o proprietate intrinseca a acestei structuri, capabila de-a functiona fara stimuli neuronali extrahipotalamici sau stimuli hormonali. Pulsatiile GnRH coincid cu pulsatiile gonadotropinelor. Eliberarea ritmica de GnRH in sistemul port hipofizar determina o secretie pulsatila de gonadotropine [11]. Recent s-au descris din punct de vedere electrofiziologic componentele acestui generator de pulsatii GnRH. Acestea sunt cresteri ritmice ale unei activitati electrice la nivelul unor unitati multiple, care sunt sincrone cu initierea pulsatiilor de LH. Prin analiza unei singure unitati s-a evidentiat faptul ca aceste descarcari electrice reprezinta o crestere a ratei descarcarilor unitatilor individuale si nu activarea unor celule dormante [12]. Importanta secretiei pulsatile a fost verificata experimental (pe maimuta). Prin lezarea hipotalamusului mediobazal si, prin administrarea exogena de GnRH in ritm continuu, se constata scaderea nivelului gonadotropinelor. Administrarea pulsatila exogena de GnRH a restabilit nivelul de gonadotropine anterior leziunii hipotalamice. Mentinerea unui ritm constant

3

de GnRH exogen poate induce totusi cicluri ovulatorii. Se poate aplica acest efect si la femei cu secretie endogena deficitara, la care se va administra GnRH exogen prin pompa de GnRH pentru a restabili ovulatia. Generatorul de pulsatii GnRH are rol determinant in reglarea ciclului reproductiv feminin. Acest generator de pulsatii GnRH este supus unor variatii importante in cursul fazelor ciclului menstrual, in special datorita influentei modulatorii a steroizilor gonadali. Factori de tipul neurotransmitatorilor si neuropeptidelor moduleaza activitatea generatorului de pulsatii GnRH prin medierea actiunii hormonilor steroizi sau prin medierea efectelor inhibitorii ale factorilor externi: stress, somn, efort fizic crescut, aport caloric redus (in anorexia nervoasa apare amenoree hipogonadotropica pe motivul scaderii secretiei GnRH datorate cresterii opioizilor endogeni, care inhiba activitatea generatorului de pulsatii GnRH). Activitatea generatorului de pulsatii GnRH este oprita in sarcina si in alaptare. Orice schimbare in frecventa pulsurilor GnRH va modifica la randul sau fazele unui ciclu menstrual normal. Pulsatii de GnRH de frecventa inalta au ca efect exprimarea LH α-ARNm si nu a LH β –ARNm sau a FSH β –ARNm. Pe de alta parte o frecventa joasa a pulsatiilor GnRH induc exprimarea FSH β –ARNm. Secretia fiziologica a pulsatiilor GnRH se insoteste de eliberarea atat a FSH cat si a LH de la nivelul hipofizei [13].

4

Fig. 1 - Redarea schematica a controlului prin feed-back a axului hipotalamo-hipofizo-ovarian NE=norepinefrina, E=epinefrina, DA=dopamina and EOP=opiode endogene (Marshall JC: Regulation of gonadotropin secretion. In DeGroot LJ (Eds): Endocrinology (ed3). Philadelphia, Saunders Press, 1995: 1993-2007) Capitolul 1.3 Influentele neurotransmitatorilor Neurotransmitatorii care influenteaza constant secretia de GnRH sunt catecolaminele, opiozii endogeni, dopamina, neuropeptidul Y, galanina (cu rol mai redus) (Fig 1). Opiozii de la nivelul SNC au in parte rolul de-a transmite si de-a amplifica inhibitia prin feed-back a steroizilor gonadali asupra secretiei de GnRH, jucand un rol important in eliberarea dinamica a gonadotropinelor in fazele ciclului menstrual [14]. Activitatea opioizilor endogeni si a

5

receptorilor acestora este reglata de estradiol si de progesteron; concentratia lor variaza functie de concentratiile steroizilor, adica la inceputul ciclului menstrual – in faza foliculara incipienta, cand secretia de estradiol este mica, atunci si concentratia opioizilor va fi scazuta. In faza luteala creste concentratia opioizilor endogeni. O inhibitie a opioizilor in faza foliculara tardiva sau in faza luteala (cand nivelurile lor sunt crescute) va produce o defrenare/dezinhibitie a GnRH-ului si implicit vor creste si nivelurile de gonadotropi [15]. Administrarea intraventricular a norepinefrinei in mod pulsatil stimuleaza secretia de LH. Tratamentul cu fenoxibenzamina (blocant al receptorilor α-catecolaminergici) inhiba secretia de GnRH si de gonadotropi, tratamentul cu analogi morfinici scade secretia de gonadotropine si tratamentul cu antagonisti opioizi (naloxone) creste eliberarea de LH [16]. Administrarea de naloxone in faza foliculara incipienta nu are ca efect modificari in secretia diurna de GnRH si de LH, dar in cadrul secretiei nocturne va inhiba scaderea nivelului de GnRH, iar in faza foliculara tardiva va produce o crestere in frecventa si amplitudine a FSH si LH. Se presupune ca opioizii endogeni au rol si in declansarea ovulatiei prin influentarea peak-ului de LH preovulator. Activitatea opioizilor scade la mijlocul ciclului menstrual si astfel este defrenata secretia de FSH si LH [17]. In ceea ce priveste influentele dopaminei asupra modularii activitatii generatorului de pulsatii GnRH se presupune ca are un efect de inhibare indirecta, mediata prin actiunea opioizilor si posibil un efect de stimulare directa a secretiei de GnRH. S-a demonstrat prin studii experimentale ca steroizii sexuali influenteaza atat in sens stimulator cat si in sens inhibitor secretia de GnRH, efectele fiind in functie de durata si de doza. Efectele lor sunt mediate de opioizii endogeni (neuromediatori de tipul β endorfinei, norepinefrinei, dopaminei, neuropeptidului Y). Neuronii din zona preoptica si nucleul arcuat prezinta o densitate mare de receptori estrogenici, pe de alta parte estrogenul este capabil sa induca receptori pentru progesteron la nivelul neuronilor in zona mediobazala a hipotalamusului [18]; [19]. Neuronii secretanti de opioizi prezinta o concentratie mare de receptori pentru steroizii sexuali, la fel si neuronii dopaminergi exprima receptori pentru estrogen si progesteron [20]. Neuronii GnRH prezinta insa o densitate scazuta a receptorilor pentru steroizii sexuali [21]. Sinapsele intre neuronii GnRH includ GABA si GnRH. Neuronii GABA au rol de pacemaker, nivelurile crescute si prelungite de GABA la nivel hipotalamic afecteaza negativ

6

activitatea generatorului de pulsatii GnRH. Aria preoptica (la nivelul hipotalamusului anterior) contine neuroni GABA [22]. Prezenta sinapselor GnRH intre neuronii secretanti de GnRH explica exprimarea receptorilorGnRH la nivel hipotalamic. Injectarea intraventricular de GABA determina oprirea generatorului de pulsatii GnRH, cu scaderea marcata consecutiv a LH-ului si scaderea exprimarii GnRH si a receptorului-GnRH in hipotalamus in analogie cu receptorul-GnRH din hipofiza. Functia si expresia genica a acestor receptori este in stricta dependenta de expunerea episodica la ligand. Daca oprirea generatorului de pulsatii GnRH este asociata cu reducerea exprimarii genice, atunci se produce un control autocrin al generatorului de pulsatii GnRH prin receptorii-GnRH hipotalamici. Generatorul de pulsatii GnRH este reglat la diferite niveluri prin controlul transcriptiei atat a genei GnRH cat si a genei receptorului-GnRH hipotalamic. Controlul autocrin al neuronilor GnRH este cheia functionarii generatorului de pulsatii GnRH. Studii in vitro mai recente au evidentiat ca semnalele ritmice pot proveni chiar din neuronii GnRH. Elucidarea mecanismului de pacemaker si integrarea celulelor componente reprezinta o provocare pentru viitor. Capitolul 1.4 Variatia fiziologica a pulsatiilor GnRH Ca structura, GnRH este un decapeptid, cu timp de injumatatire scurt, de 2-5 minute. Secretia pulsatila este diferita in cadrul fazelor ciclului menstrual, atat amplitudinea cit si frecventa descarcarii pulsatiilor (in faza foliculara amplitudinea este mai mica, dar frecventa mai crescuta). Se considera ca fiecare puls de GnRH poate actiona la nivel hipofizar. Intervalul dintre doua pulsatii este intre 70-90 minute. Frecvente inalte (mai mult de 1 puls/ora) stimuleaza secretia de LH, pe cand o frecventa mai joasa este raspunzatoare de secretia de FSH. Secretia de GnRH si de gonadotropine este diferita in functie de varsta, astfel ca imediat dupa nastere si in primele luni de viata creste secretia de GnRH si gonadotropi (posibil datorita steroizilor sexuali de tipul estradiolului matern, care induc secretia de GnRH) [8]. Dupa primul an de viata si pana la pubertate copiii au niveluri scazute de gonadotropi si de hormoni sexuali. Pulsatiile de GnRH si de LH in perioada prepubertara au o frecventa si amplitudine joasa: 1 puls

7

la 3-4 ore la fetite si 1 puls/ora la baieti. Odata cu maturarea axului hipotalamo-hipofizo-ovarian la pubertate se produce dezvoltarea unui model de secretie circadiana a LH-ului. Accentuarea nocturna a secretiei gonadotropinelor marcheaza instalarea dezvoltarii sexuale. Cresterea nivelurilor circulante de LH reflecta o crestere in amplitudine si o mai mica crestere in frecventa a pulsatiilor GnRH in timpul fazelor initiale ale somnului. Pe parcursul maturarii se accentueaza pulsatiile de LH spre trezire. Se presupune ca dezinhibitia secretiei LH este determinata de un mecanism dependent de centri superiori din SNC (Fig. 2) [23]; [24]. La pubertate este modificat raspunsul sistemului neuroendocrin sub influenta steroizilor. Initial, cresterea nocturna a secretiei de GnRH va influenta pozitiv secretia de FSH, care este inhibata de cresterea secretiei estrogenice. Ulterior, cresterea in continuare a secretiei de GnRH (in sensul amplitudinii si a frecventei) va influenta pozitiv secretia LH-ului. Estrogenii la randul lor vor accentua secretia de LH [25].

Fig. 2 - Variatiile plasmatice al LH in decurs de 24 ore la fetite cu profil hormonal normal versus hyperandrogenemie in pubertatea precoce versus pubertatea intarziata. In pubertatea precoce cresc pulsatiile LH in somn (prezente, dar anormale in caz de hiperandrogenemie), ulterior la pubertate pulsatiile se stabilizeaza la fetitele cu profil hormonal normal.

8

Fig. 3 - Nivelurile plasmatice ale hormonilor in cadrul ciclului menstrual. Sagetile indica pulsatiile GnRH, distanta dintre ele reprezinta frecventa pulsatiilor iar lungimea sagetilor – cantitatea de GnRH secretata. (Marshall JC et al: Gonadotropin-releasing hormone pulses: Regulators of gonadotropin synthesis and ovulatory cycles. Recent Prog Horm Res 47:155-189, 1991) In perioada fertila a femeii secretia de GnRH este supusa influentelor steroizilor sexuali (Fig. 3). In postmenopauza apare o dezinhibare a productiei de GnRH, urmata de o crestere a nivelurilor de FSH si LH, consecinta a incetarii functiei ovariene (nu mai exista supresia estrogenilor). Capitolul 1.5 Structura GnRH Lantul aminoacidic al GnRH este urmatorul: pGlu-His-Trp-Ser-Tir-Gli-Leu-Arg-Pro-GliNH2. GnRH provine dintr-o molecula precursoare de dimensiuni mari: pre-pro GnRH, care contine 92 aminoacizi. Prin studii enzimatice s-a constatat ca aminoacidul din pozitia 6 este implicat in inactivarea hormonului (clivarea enzimatica a legaturii peptidice 6-7 produce peptide biologic inactive), pe cand aminoacizii din pozitiile 2 si 3 au rol in secretia gonadotropilor. Pozitiile 1, 6 si 10 sunt implicate in mentinerea structurii spatiale si in legare.

9

De la sinteza GnRH s-au mai descoperit la om si alte izotipuri (in total 3 izotipuri, cu diferente de aminoacizi in structura – tipul I, II si III, conform tabelului 1) [26]. Se considera ca genele pentru GnRH uman tipul I si II se afla pe cromozomul 8 si respectiv 20; gena pentru tipul III inca nu a fost stabilita. De asemenea inca nu este elucidat daca cele 3 izotipuri de GnRH au roluri fiziologice diferite si nu este cunoscuta inca distributia receptorilor pentru cele 3 izotipuri. Izotipul I este GnRH-ul clasic care actioneaza in reglarea secretiei gonadotropilor. Tabel 1 - Izotipuri GnRH Secventa aminoacizilor GnRH nativ

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

pGlu

His

Trp

Ser

Tir

Gli

Leu

Arg

Pro

GliNH2

GnRH izotip I

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

GnRH izotip II

1

2

3

4

His

6

Trp

Tyr

9

10

GnRH izotip III

1

2

3

4

5

6

Trp

Leu

9

10

Efectul GnRH la nivel hipofizar se manifesta prin legarea hormonului de receptorii membranari specifici prezenti la nivelul celulelor gonadotrope [27]. Aceste celule reprezinta aproximativ 10% din masa celulara a adenohipofizei. Dupa legarea de receptori are loc activarea sistemului “second-messenger” (fosfolipaze, calmodulin, proteinkinaza C, inozitolfosfat, acid arahidonic, leucotriene, AMPc), care vor conduce la producerea de gonadotropine. O celula este capabila sa secrete atat FSH cat si LH, eliberarea si secretia gonadotropilor fiind stabilita de GnRH. Capitolul 1.6 Receptorul GnRH Membrana celulelor adenohipofizare secretante de gonadotropi are doua locusuri de legare pentru moleculele de GnRH; receptorii pentru GnRH reprezinta de fapt zona cu afinitate crescuta, iar partile cu afinitate mica sunt endopeptidaze. Receptorul pentru GnRH este o glicoproteina ce are in structura sa si acid sialic.

10

Legarea GnRH de receptorul membranar implica modificarea structurii complexului hormon-receptor specific si internalizarea totala a acestui complex, care urmeaza a fi degradat lizozomal, in celula. Eliberarea de gonadotropi implica un proces dependent de Ca2+. Se considera ca internalizarea complexului are rol in mecanismul de actiune al agonistilor-GnRH si este mai putin important in secretia gonadotropilor [9]. Receptorii au o distributie uniforma la nivelul celulei. Dupa formarea complexului GnRH-receptor apare migratia laterala a acestuia de-a lungul membranei celulare. Dupa internalizarea complexului GnRH-receptor o parte sunt degradati intracelular iar o parte se reintorc la nivelul membranei. Concentratia receptorilor membranari diminua odata cu inaintarea in varsta si in cursul lactatiei si creste dupa ovariectomie. Refacerea rapida a receptorilor la nivelul membranei celulare este o proprietate a GnRH-ului de-a mentine si regla concentratia receptorilor sai. Studiile mai recente au constatat ca receptorul pentru GnRH are o parte extramembranara, 7 parti transmembranare helicoidale si o parte intracelulara care este legata de o proteina G [28]. La marea majoritate a vertebratelor exista mai multe tipuri de receptori. Locusul genic pentru receptorul tipului I de GnRH este la nivelul cromozomului 4 iar locusul genic pentru tipul II se afla pe cromozomul 1 [29]; [30]; [31]. La om este clar dovedit doar un tip de receptor GnRH. Legarea hormonului de receptor la nivelul celulelor gonadotrope implica activarea proteinei G cu eliberarea de “second messenger”, activarea protein-kinazei si eliberarea ionilor de Ca2+ [32]; [33]. Aceasta cascada are ca efect final secretia de gonadotropi. Secretia pulsatila este situatia fiziologica in organism, daca insa se administreaza GnRH in mod constant, continuu, aceasta va fi insotita de o crestere initiala a sintezei si secretiei de gonadotropi (efectul de “flare-up”), ca apoi sa apara o desensibilizare a hipofizei cu scaderea consecutiva a gonadotropilor. Se stie in cadrul acestui mecanism ca semnalizarea postreceptor este importanta si ca pierderea receptorilor (“down-regulation”, supresia) joaca un rol de initiere a fenomenului [34]. Administrarea continua a GnRH are urmatoarele efecte asupra celulei hipofizare: Scaderea numarului de receptori membranari de la nivelul celulelor gonadotrope; Blocarea canalelor de calciu, care sunt mediate de acesti receptori; Incapacitatea celulelor gonadotrope de a transforma gonadotropii din forma nesecretanta in cea secretanta;

11

Hipofiza devine refractara la molecula de GnRH. Odata cu descifrarea structurii hormonale si prin izolarea substantei s-a reusit si sinteza unor compusi, numiti analogi ai GnRH, care au proprietati, afinitate fata de receptori, stabilitate, activitate intrinseca diferita de molecula nativa. Astfel, dupa aceste caracteristici si dupa mecanismul lor de actiune analogii se impart in agonisti si antagonisti ai GnRH. Ei isi gasesc multiple aplicatii in tratamentul diferitelor afectiuni, ca de exemplu: in endometrioza; in tratamentul sterilitatii; preoperator in cazul fibroamelor uterine (GnRH inhiba cresterea leiomioamelor si prin efect negativ asupra proliferarii celulare si prin inducerea apoptozei); mai recent in tratamentul cancerului mamar si cel al prostatei.

12

Capitolul 2 Gonadotropii Capitolul 2.1 Scurt istoric Adenohipofiza secreta sub actiunea GnRH hormonii gonadotropi – FSH (hormon foliculostimulant, folitropina) si LH (hormon luteinizant). Zondek (in 1926-1927) a descoperit ca functia ovariana se afla sub controlul hormonal a gonadotropilor. Ulterior, la mijlocul secolului XX extractele urinare al gonadotropilor de la animale au fost introduse in tratamentele de stimulare ovariana, initial experimental apoi si la om, obtinandu-se prima sarcina (1960) [35]; [36]. Cercetari si perfectionari continue au avut ca rezultat inlocuirea gonadotropilor de la animale (datorita efectelor adverse – anticorpi, boala Creutzfeldt-Jacob) cu gonadotropina umana menopauzala (obtinuta din urina femeilor aflate in postmenopauza, HMG). Ca si mod de actiune HMG prin continutul sau in FSH induce cresterea nivelului de FSH in faza foliculara (zilele 3-7) si permite o recrutare foliculara mai mare. Aceste preparate au efecte adverse datorita unui continut crescut de proteine, chiar daca ele sunt administrate intramuscular (intoleranta, reactii alergice). Pe langa acest fapt HMG contine si LH (menotropina: 75 UI FSH si 75 UI LH) si are contraindicatii relative in cazul pacientelor cu PCOS (risc de aparitie a sindromului de hiperstimulare ovariana) [124]. In anii ´80 s-au sintetizat preparatele HMG cu o componenta extrem de redusa a LH-ului (urofolitropina: 0,1 UI LH la 75 UI FSH). Acestea au fost inlocuite apoi in anii ´90 cu preparate de FSH inalt purificate (FSH-HP; highly purified follitropin), care au eliminat componentele proteice si fractiunea LH si care se pot administra subcutan [37]. In prezent se utilizeaza preparate de FSH uman recombinat (rFSH), sintetizat prin inginerie genetica. Ele se obtin prin introducerea genelor ce codifica subunitatile α si β ale FSH in vectori de expresie ce sunt transferati in linii celulare ovariene ale hamsterului chinezesc. Aceste noi substante cu administrare subcutana sau intramusculara au si alte avantaje fata de predecesorii lor; iar pe langa acestea nu exista nici riscul de infectie si nici de formare de anticorpi antigonadotropina [38]; [39].

13

Capitolul 2.2 Structura si efectele generale ale gonadotropilor hipofizari Ca structura, gonadotropii hipofizari sunt heterodimeri formati din 2 subunitati polipeptidice glicozilate (α si β), lantul α este comun pentru FSH, LH, TSH (hormon tireostimulant) si HCG (coriogonadotropina umana). Cele 2 lanturi contin legaturi non-covalente si resturi oligozaharidice. In cadrul fiecarei subunitati exista legaturi disulfidice: 5 in lantul α si 6 in lantul β. Lantul α al FSH contine 92 aminoacizi si lantul β - 118 aminoacizi, care ii confera proprietati unice si legarea de receptorul specific. Glucidele din componenta FSH sunt fructoza, galactoza, manoza, glucozamina, galactozamina si acidul sialic, ultima componenta fiind responsabila pentru timpul de injumatatire a hormonului (3-4 ore). Cu cat cantitatea de acid sialic este mai mare, cu atat timpul de injumatatire este mai prelungit. Lantul β-FSH contine 2 unitati carbohidrat acid sialic pe cand lantul β-LH doar una singura [40]. Gena pentru subunitatea α-FSH este localizata pe cromozomul 6p21.1-23, exprimata in diferite celule si gena pentru subunitatea β - pe cromozomul 11p13, exprimata in celulele hipofizei si aflata sub controlul GnRH, inhibata de actiunea inhibinei [41]. Cunoasterea si mapping-ul epitopurilor functionale pentru actiunea intra- si extracelulara a hormonului are o importanta aparte in intelegerea functiei atat a hormonului in sine cat si a receptorului sau. Recent s-a descris structura tridimensionala a FSH legat de regiuni extracelulare ale receptorului sau (FSHRHB) (Fig.4). Structura complexului hormon-receptor dovedeste ca amandoua subunitatile sunt implicate in mod diferit in legarea de receptorul specific, subunitatii α ii revine rolul stereochimic [42].

14

Fig. 4 - Structura tridimensionala a FSH Efectele FSH sunt dependente de sex: la femei in perioada reproductiva actioneaza stimulator asupra cresterii foliculare si asupra secretiei esterogenice, la barbat, in sinergie cu testosteronul efectele se rasfrang asupra stimularii spermiogenezei. LH este sintetizat in aceleasi celule adenohipofizare si sub acelasi stimul. Lantul α are 89 aminoacizi si lantul β contine o secventa specifica de 112-115 aminoacizi care ii confera activitatea hormonala proprie. Ca si in cazul FSH, greutatea moleculara a hormonului este in jur de 30000-38000 Daltoni si continutul oligozaharidic este intre 16-30%. Se cunoaste doar o singura gena care codifica lantul β (pe cromozomul 19q13,3) si gena pentru receptorul LH se afla pe cromozomul 2p21 [43]. Efectele LH la femeie in perioada reproductiva, in faza foliculara, sunt de stimulare a folicolului in secretia de estrogeni (in sinergie cu FSH). Peak-ul preovulator al LH completeaza diviziunea ovocitului (meioza I) si in faza luteala LH are rol de stimulare a corpului galben de-a secreta progesteron. Fiziologic, secretia LH in faza foliculara incipienta este mai scazuta noaptea, in cursul somnului. La barbat LH actioneaza asupra celulelor interstitiale testiculare si stimuleaza secretia testosteronului.

15

Capitolul 2.3 Reglarea secretiei gonadotropilor hipofizari Legarea GnRH de receptorii specifici membranari adenohipofizari are ca urmare sinteza, secretia si depozitarea gonadotropilor. Se sintetizeaza lanturile α si β ale FSH si LH si ulterior glicozilarea acestor subunitati. Dupa sinteza lor, moleculele FSH si LH sunt stocate in granule si hormonul va fi eliberat prin exocitoza. In secretia gonadotropilor sunt implicate urmatoarele mecanisme: leucotrienele au rol in secretia hormonala si proteinkinaza C are ca efect sinteza si secretia gonadotropilor. Influxul de Ca2+ extracelular si activarea intracelulara a Ca2+ sunt raspunzatoare de eliberarea gonadotropinelor din depozite. Reglarea secretiei gonadotropilor se bazeaza pe mecanisme de feed-back. Se descriu 3 arcuri de feed-back, cu efect de stimulare sau de inhibare: arcul lung, scurt si ultrascurt (Fig. 5). Arcul lung se refera la controlul exercitat de steroizii gonadali atat asupra hipotalamusului cat si asupra hipofizei. Feed-back-ul pozitiv exercitat de estradiol este exemplificat de peak-ul de LH preovulator iar controlul negativ consta in reglarea secretiei de FSH prin inhibina. In faza foliculara estrogenii reduc secretia gonadotropilor, dar influenteaza in mod pozitiv sinteza si depozitarea gonadotropilor (feed-back negativ). Progesteronul isi exercita controlul in mod special asupra hipofizei si indirect asupra hipotalamusului, atat prin mecanism de feed-back pozitiv cat si negativ, dar implica existenta secretiei estrogenice.

16

Fig. 5 - Reglarea secretiei gonadotropilor Bucla de reglare scurta consta in controlul gonadotropinelor asupra secretiei lor de catre hipofiza. Bucla de reglare ultrascurta se refera la controlul sintezei si secretiei de GnRH chiar prin intermediul acestui hormon. Gonadotropii prin actiunea lor la nivel ovarian induc formarea unui folicol dominant, ovulatia si secretia corpului galben. Exista teoria celor 2 compartimente celulare (Fig. 6) care explica interactiunea intre celulele granuloase si tecale din cadrul folicolului, dar si aceasta teorie este incompleta.

17

Fig. 6 – Teoria celor doua compartimente celulare Capitolul 2.4 Efectele gonadotropilor hipofizari in reglarea cresterii foliculare FSH isi incepe actiunea in faza finala a unui ciclu menstrual si in faza foliculara incipienta a urmatorului ciclu menstrual. Celulele granuloasei din folicol poseda receptori pentru FSH. Acesti receptori isi cresc numarul odata cu cresterea nivelului intraovarian si periferic de FSH printr-un mecanism de feed-back pozitiv [44]. Mecanismul de actiune al FSH la nivelul receptorilor celulelor granuloasei implica un mecanism postreceptor mediat AMPc care induce diferentierea si proliferarea celulelor granuloasei [45]. Factorii locali care intervin in procesul de proliferare celulara sunt activina, β-TGF (transforming growth factor), factori paracrini. Cresterea in continuare a FSH va produce proliferarea ceulelor granuloase si, potentat de estrogeni, va induce receptori pentru LH la nivelul celulelor granuloase. Asa cum am amintit anterior, cresterea secretiei de estradiol si inhibina exercita un efect de feed-back negativ (arcul

18

lung) asupra secretiei hipofizare de FSH. Prin acest fenomen se inhiba cresterea si maturarea altor folicoli in afara celui dominant. Un eveniment cheie in reglarea ciclului ovarian este peak-ul de gonadotropine de la mijlocul ciclului. Folicolul dominant secreta in continuare estradiol, care daca ajunge la concentratia serica de aproximativ 150 pg/ml, mentinuta pentru minim 36 ore, exercita un feedback pozitiv: la nivelul hipotalamusului creste secretia de GnRH iar la nivelul adenohipofizei accentueaza sensibilitatea acesteia fata de GnRH, cu descarcare de FSH si LH. Ca o particularitate: in cursul peak-ului preovulator secretia de GnRH nu mai este pulsatila. Actiunea sinergica a FSH si a estradiolului creeaza un mecanism intraovarian autoreglator care induce multiplicarea rapida a celulelor granuloase si prin urmare cresterea foliculara. Spre deosebire de celulele granuloase care au receptori atat pentru FSH cat si pentru LH, celulele interstitiale tecale nu exprima receptori decat pentru LH. Legarea LH de acesti receptori are ca urmare formarea androgenilor, etapa antemergatoare fiind cea de scindare enzimatica a colesterolului. Androgenii reprezinta substratul sintezei de estrogeni prin procesul de aromatizare, proces realizat in celulele granuloase [44]. Androstendiona difuzeaza in lichidul folicular si ca raspuns la efectul citocromului P450 (indus de FSH in celulele granuloase) are loc procesul enzimatic de aromatizare cu formarea estronei. Ulterior estrona sub actiunea 17-βhidroxilazei este transformata in estradiol. Astfel, LH are o actiune secundara fata de FSH, dar o actiune modulatoare in raspunsul folicolului la FSH. Pe baza studiilor in vitro efectuate la nivelul tesutului ovarian s-a putut stabili ca LH stimuleaza activitatea aromatazei si sinteza inhibinei in celulele granuloase din folicolul dominant si ca inhibina are rol paracrin in cresterea secretiei de estrogeni de catre folicolul dominant [46]; [47]. Daca insa la nivelul folicolului cantitatea de FSH este insuficienta, atunci exista posibilitatea ca folicolul sa fie degradat datorita efectului nociv al expunerii la o concentratie mare si neadecvata de androgeni nearomatizati. Diferite cercetari in vitro, atat experimentale cat si la om, au putut dovedi ca in celulele granuloase FSH stimuleaza formarea unui factor care induce la randul sau o crestere a expresiei citocromului P450c17α-ARNmesager stimulata de LH la nivel tecal si astfel o crestere a sintezei androgenilor [48].

19

Alti factori care intervin in proliferarea si diferentierea celulara sunt factorii de crestere insulinlike (IGF-I si IGF-II) precum si inhibina. Acestia sunt considerati factori paracrini de reglare [49]. Receptorii pentru LH de la nivelul celulelor granuloase sunt raspunzatori de inducerea secretiei progesteronului. In cadrul fazei luteale scade numarul receptorilor pentru FSH si LH. Datele mai sus enuntate sunt exemplificate in figurile de mai jos (Fig. 7; Fig. 8).

Zi ciclu menstrual Fig. 7 - Nivelurile serice ale gonadotropilor, progesteronului si inhibinei. Mecanismele intracelulare in cadrul fazei foliculare. [9]

20

Zi ciclu menstrual Fig. 8 - Selectarea folicolului dominant [9]

21

Folicol preantral

Cresterea foliculara

Fig. 9 - Mediul androgenic si estrogenic intrafolicular in cadrul fazei foliculare [9]

Figura 9 exemplifica importanta mediului estrogenic in autoreglarea foliculara, respectiv importanta mediului androgenic cu rol reglator in dezvoltarea foliculara. Prin urmare FSH si LH sunt de importanta majora in reglarea cresterii foliculare, ei intervin in recrutarea si selectarea folicolului dominant, in maturarea acestuia si secretia sa estrogenica. Capitolul 2.5 Gonadotropii utilizati in suprastimularea ovariana controlata In urma celor descrise mai sus se deduce utilitatea gonadotropinei in cadrul terapiei de stimulare ovariana la pacientele cu sterilitate. Prima sarcina in urma acestui tip de tratament a fost obtinuta in 1960 de Lunenfeld [50].

22

Ulterior preparatele de gonadotropina au fost introduse si in cadrul protocoalelor de suprastimulare ovariana controlata din cadrul tehnicilor de reproducere asistata. Administrarea lor in ciclul folicular incepe de timpuriu – din faza foliculara incipienta - in ziua a 3-a, deoarece selectarea folicolului dominant se realizeaza pana in ziua 5-7. Scopul este de-a matura mai multi folicoli in ideea de-a creste numarul ovocitelor si implicit rata fertilizarii si a sarcinilor. Totusi protocoalele de stimulare ovariana se adapteaza functie de raspunsul fiecarei paciente, fiind un tratament individualizat. S-au imaginat mai multe tipuri de protocoale, unele cu doza mica de gonadotropina la inceputul stimularii, ca apoi doza sa fie in continuare scazuta (protocolul Norfolk, “step-down”), iar altele, ca protocolul Bonn (“step-up”) folosesc o doza mai crescuta de gonadotropina de la inceputul stimularii, ca apoi sa creasca aceasta doza pana anterior ovulatiei. Amandoua aceste protocoale au avut insa rezultate similare in ceea ce priveste numarul ovocitelor recoltate la punctia foliculara [51]; [52]; [124]. Sintetizarea rFSH a insemnat un enorm pas inainte in cadrul stimularii ovariene controlate. Prima sarcina obtinuta in urma stimularii ovariene cu rFSH a fost in 1992 [53]. Aceste preparate s-au impus si actualmente se folosesc pe scara larga in tratamentul de suprastimulare ovariana controlata din cadrul protocoalelor diverselor proceduri ale reproducerii umane asistate. Pana in ziua de astazi exista multiple studii care pledeaza in favoarea utilizarii rFSH, referitor la actiunea sa in cadrul stimularii ovariene comparativ cu HMG, in ceea ce priveste numarul si calitatea ovocitelor, rata sarcinilor [54]. Se folosesc 2 preparate rFSH: folitropina α (sub forma comerciala Gonal-F, Serono) si folitropina β (preparatul Puregon, Organon). S-a constata ca in urma administrarii preparatului folitropin α efectele la locul administrarii sunt mai reduse [55]. Ca mod de actiune al rFSH se cunoaste ca normalizeaza raportul LH/FSH si optimizeaza steroidogeneza foliculara [124]. Odata cu introducerea pe scara larga a preparatelor sintetizate genetic s-a dorit compararea eficientei lor fata de substantele utilizate pana atunci (FSH urinar). Rezultatele unui studiu clinic multicentric, randomizat au fost publicate in 1995 si au dovedit superioritatea rFSH (atat folitropin α cat si β) fata de FSH-urinar in ceea ce priveste: numarul ovocitelor (mai multe in cazul rFSH); durata stimularii (mai scurta pentru rFSH) si numarul de unitati FSH administrate (mai putine pentru rFSH). Numarul embrionilor de calitate inalta a fost mai crescut la loturile care au primit rFSH. Conditiile de inhibitie hipofizara, tipul de protocol, numarul pacientilor a

23

fost identic pentru grupele studiate. Nu s-au remarcat insa date semnificativ statistice in ceea ce priveste rata implantarii si rata sarcinilor la grupele studiate [39]. O alta comparatie s-a efectuat intre preparatul rFSH si FSH inalt purificat. Rezultatele unui studiu prospectiv randomizat, simplu orb folosind folitropin α versus FSH-HP in aceleasi conditii de protocol lung (cu acelasi tip de analog-GnRH) au relevat un numar mai mare de ovocite obtinute prin stimularea ovariana cu rFSH, numar mai mic de zile si doza mai redusa de FSH in cazul rFSH. De asemenea, ca si in compararea cu FSH urinar, diferenta ratei sarcinilor a fost nesemnificativa statistic (48% respectiv 47% per embriotransfer). In ceea ce priveste incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana rezultatele sunt de asemenea comparabile. Totusi numarul de embrioni crioconservati a fost mai mare (3.2±3.0 versus 1.7±2.5, p<0,0001) in cazul lotului folosind rFSH fata de FSH urinar inalt purificat [56];[57]. Este cunoscuta degradarea enzimatica a gonadotropilor de catre enzimele digestive, astfel ca inca nici un preparat sintetizat pana acum nu se poate administra decat parenteral (subcutanat sau intramuscular). Totusi, in urma observatiilor efectuate in timp asupra femeilor cu sterilitate la care s-a efectuat stimularea ovariana cu gonadotropine s-a constatat ca nivelul seric crescut al estradiolului (insumat prin secretia folicolilor stimulati) induce o crestere prematura a nivelului de LH (”LH surge”) prin efect de feed-back pozitiv. Acest peak de LH, survenit mai rapid decat intr-un ciclu normal, actioneaza defavorabil asupra folicolilor, in sensul ca nu toti se afla in acelasi stadiu de maturare, deci nu toti sunt folicoli preovulatori. Se produce o luteinizare precoce cu cresterea nivelului progesteronic fata de concentratia sa normala din faza foliculara. Efectul negativ se repercuta in final asupra ratei sarcinilor [58];[59]. Aceste concluzii au schimbat radical tratamentul de stimulare ovariana din protocoalele utilizate pentru reproducerea asistata, introducand astfel preparate care sa produca initial o supresie a hipofizei (pentru a evita cresterea LH-ului endogen) si sa mentina aceasta inhibitie, pentru ca ulterior sa se initieze stimularea ovariana cu gonadotropi [60].

24

Capitolul 3 Analogii-GnRH Capitolul 3.1 Agonistii-GnRH Introducerea terapiei cu analogi-GnRH in stimularea ovariana controlata reprezinta o etapa moderna in cadrul reproducerii asistate. Din aceasta clasa se contureaza 2 tipuri de substante: agonistii-GnRH si antagonistii-GnRH. Sunt agenti terapeutici care au fost sintetizati cu scopul de-a creste efectul GnRH. Comparativ cu molecula nativa, sunt substante cu o rezistenta mai crescuta fata de degradarea enzimatica, au o stabilitate mai mare si prezinta si o afinitate mai crescuta fata de receptoriiGnRH (aproximativ de 100 - 200 de ori). Sintetizarea lor are loc prin modificarea configuratiei moleculei native in pozitiile 6 sau/si 10 (modificarea la ambele niveluri are efect cumulativ). Modificari la nivelul aminoacizilor din pozitiile 2 si 3 rezulta in substante cu efect antagonist. Deletia aminoacidului din pozitia 10 se insoteste de legarea crescuta a substantei [61];[62]. O alta caracteristica este faptul ca timpul de injumatatire este mai lung si sunt substante mai potente. Tabelul 2 reda principalii agonisti-GnRH iar tabelul 3 - secventa aminoacizilor in preparatele agonistilor-GnRH comparativ cu molecula nativa [63]. Tabel 2 - Exemple de agonisti-GnRH, preparate farmaceutice si modul de administrare leuprolide

Enantone Gyn

i.m /Depot

buserelin

Suprefact

s.c/intranazal

nafarelin

Synarela

intranazal

goserelin

Zoladex

s.c/Depot

histrelin

Supprelin

s.c.

triptorelin

Decapeptyl, Diphereline

i.m/Depot

25

Tabel 3 - Secventa aminoacizilor in molecula nativa si analogi-GnRH Secventa aminoacizilor 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

pGlu

His

Trp

Ser

Tir

Gly

Leu

Arg

Pro

Gli-NH2

Buserelin

1

2

3

4

5

D-Ser

7

8

9

Etilamida

Goserelin

1

2

3

4

5

D-Ser

7

8

9

AzGli

Leuprorelin

1

2

3

4

5

D-Leu

7

8

9

Etilamida

Triptorelin

1

2

3

4

5

D-Trp

7

8

9

Gli-NH2

Nafarelin

1

2

3

4

5

D-Nal

7

8

9

Gli-NH2

GnRH nativ

Eficacitatea agonistilor administrati sub forma spray-urilor nazale este de 2-5% comparativ cu efectul obtinut pe cale subcutanata; toleranta insa este deosebit de crescuta si efectele secundare sunt minime [62]. S-a constatat ca administrarea continua a agonistilor-GnRH se insoteste de o crestere de scurta durata a receptorilor membranari, cu eliberarea depozitelor de FSH si LH, dupa care se produce fenomenul de internalizare a complexului receptor-hormon, cu scaderea ulterioara a numarului de receptori. Prin internalizare, acest complex este supus degradarii enzimatice lizozomale. Canalele de calciu, care sunt dependente de acesti receptori, vor fi blocate. Se pierde capacitatea celulei de-a transforma gonadotropii dintr-o forma nesecretanta intr-una secretanta. De asemenea se constata ca hipofiza devine refractara la stimularea GnRH nativ. Sinteza de novo a receptorilor nu poate compensa o pierdere rapida a acestora, pierdere care are loc prin acest fenomen. Totodata se inhiba si mecanismele postreceptor. Efectul este de scadere al FSH si LH in celulele gonadotrope (Fig. 10).

26

Fig. 10 - Efectul legarii GnRH de receptor (molecula nativa si analogii-GnRH) Valorile FSH si LH din ser scad, consecutiv scade si actiunea acestor hormoni. Nivelul seric al estradiolului atinge nivelul postmenopauzal. Nu se mai produce cresterea si maturarea foliculara. Blocarea hipofizei persista pe toata durata administrarii agonistului si este reversibila odata cu intreruperea tratamentului. Normalizarea functiei hipofizare se reia, in medie, in 6 saptamini. Efectul de „flare-up” consta intr-un efect de stimulare initială a hipofizei, dupa care se instaleaza efectul de supresie propriu-zis. Dupa 14-21 de zile de la initierea terapiei se ating valori ale E2 ca in postmenopauza (<50 pg/ml). Acest efect de “flare-up” declanseaza o crestere initiala de 5 ori a concentratiei de FSH si de 10 ori a LH dupa un interval de 12 ore de la administrare si consecutiv se inregistreaza un nivel seric al estradiolului marit, de aproximativ 4 ori [64]. Dupa acest efect initial de “flare-up” nivelul FSH va scadea mai rapid decat cel al LH.

27

Administrarea continua a agonistilor, asa numita castrare medicamentoasa, are aplicatii in tratamentul preoperator al fibromului uterin, in tratamentul endometriozei, in cancerul mamar cu receptori pozitivi pentru estrogeni, in pubertatea precoce, si nu in ultimul rand in cadrul tehnicilor de reproducere asistata. La barbat terapia cu agonisti isi gaseste aplicatii in cancerul de prostata. In administrarea de lunga durata se constata si unele efecte nedorite, cum ar fi bufeurile (81% din cazuri), cefaleea (30% din cazuri), greata si vertij (21 % din cazuri), scaderea libidoului, labilitate psihica [65]. Nu este de neglijat deloc pericolul aparitiei osteoporozei. S-a constatat ca la o administrare de 6 luni apare o scadere a masei osoase intre 3,4% si 7,4% [66]. Agonistii-GnRH au fost introdusi in protocoalele de stimulare ovariana controlata din cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata in scopul prevenirii cresterii premature si necontrolabile de LH („LH surge”). Cresterea prematura de LH are efecte nedorite asupra maturarii foliculare, implicit asupra calitatii ovocitelor si embrionilor [67]. Se considera ca anterior introducerii acestei terapii in jur de 15-20% din ciclurile de stimulare erau abandonate pe motivul cresterii premature de LH, astfel ca prin administrarea unui agonist GnRH s-a realizat astfel o imbunatatire a ratei sarcinilor [68]. Protocoalele de stimulare ovariana controlata folosesc atat efectul de „flare-up” cat si supresia hipofizara produsa prin efectul de „down-regulation” al receptorilor-GnRH. Conform datelor statistice, peste 78,8% din protocoalele in cadrul fertilizarii in vitro asociaza agonisti-GnRH si stimulare ovariana cu preparate de FSH [69]. Capitolul 3.2 Protocoale de stimulare ovariana controlata ce cuprind in schema lor agonisti-GnRH Diedrich si colab. (1994) au constatat ca introducerea agonistilor a scazut rata ciclurilor cu raspuns anormal pana la 2 % si permite planificarea momentului declansarii ovulatiei [68]. Anterior introducerii terapiei cu analogi-GnRH (atat agonisti cat si antagonisti), datorita cresterii premature a secretiei endogene de LH, in jur de 20% din cicluri FIV erau abandonate (stimulare doar cu gonadotropine) [70].

28

In cele ce urmeaza sunt redate cele mai des folosite tipuri de protocoale de stimulare ovariana controlata ce cuprind inschema lor antagonisti-GnRH. Protocoalele scurt si ultrascurt („short”, „ultrashort”) exploateaza efectul de “flare-up”, adica nivelul crescut al secretiei gonadotropinice de la inceputul administrarii medicatiei, folosind acest fenomen in sensul cresterii foliculare. In cadrul protocolului scurt („short protocol”) - administrarea agonistului este zilnică, incepand cu ziua 1 a ciclului menstrual, pina la stabilirea declansarii ovulatiei. Stimularea ovariana cu FSH incepe din ziua 5 a ciclului menstrual. Protocolul ultrascurt („ultrashort protocol”): agonistul GnRH se administreaza doar in zilele 2,3 si 4 ale ciclului menstrual. Stimularea cu FSH incepe in ziua 2 a ciclului menstrual. Avantajele acestor 2 tipuri de protocoale sunt: durata stimularii este mai redusa si implicit costul medicatiei utilizate este mai redusa. Dezavantaje: concentratia serica a LH-ului este crescuta in prima parte a fazei foliculare, cu efect negativ asupra maturarii foliculare [71]. Nu intotdeauna peak-ul de LH poate fi prevenit. Prin studii retrospective s-a demonstrat ca numarul de ovocite obtinute prin punctie foliculara, numarul de embrioni si rata sarcinilor a fost mai bun in cazul utilizarii protocoalelor lungi (independent de preparatul folosit) [72]. In studii prospective rata difera, dar nu semnificativ. Protocolul lung („long protocol”) este cel mai frecvent folosit, efectul scontat este cel de desensibilizare a hipofizei, anterior initierii stimularii ovariene cu FSH. Administrarea subcutanata/intranazala/intramusculara-depot a agonistului GnRH se incepe din mijlocul fazei luteale (cel mai frecvent, din ziua 20-22) sau de la inceputul fazei foliculare (ziua 1 a ciclului menstrual). Dupa 14 zile de inceputul tratamentului se considera ca s-a realizat supresia hipofizei si se efectueaza determinari hormonale (LH < 10 mUI/ml si E2 < 50 pg/ml), se considera necesara o ecografie transvaginala de rutina pentru a depista eventualele formatiuni ovariene chistice (care temporizeaza administrarea de FSH), ca apoi sa se inceapa stimularea ovariana cu FSH. Efectul supresiv hipofizar indus de agonistul-GnRH dureaza pe tot parcursul stimularii ovariene cu FSH (in medie 10-14 zile). Inducerea ovulatiei cu 10.000 UI HCG se produce la dimensiunea foliculilor > 17 mm si niveluri serice de E2: 300-400 pg/ml/folicul.

29

Avantajul acestui protocol lung este dat prin inceperea administrarii agonistului din faza medioluteala si care consta in coinciderea cresterii fiziologice a gonadotropilor din aceasta perioada a ciclului cu efectul de “flare-up”. Acest tip de protocol ofera o sincronizare a maturarii foliculare si se permite recrutarea unui numar mai mare de foliculi si implicit de ovocite. Dezavantajul poate exista in administrarea pe o sarcina incipienta, care nu este sesizata (nu s-au constatat insa efecte malformative) [73]. Protocolul ultralung („ultralong protocol”) foloseste administrarea agonistului cu 1-3 luni înainte de momentul începerii stimulării cu FSH. Capitolul 3.3 Efectul agonistilor asupra fazei luteale La 8 zile dupa administrarea HCG pentru inducerea ovulatiei se constata o scadere marcata a concentratiilor serice de estrogeni si progesteron. Secretia endogena de LH ramine in continuare blocata si se produce astfel o luteoliza precoce. Biopsiile de endometru releva o incetinire in procesul de transformare secretorie in peste 50% din ciclurile stimulate [74]. Agonistii se leaga de receptorii prezenti la nivel folicular (la nivelul celulelor granuloase) si au ca efect o scadere a productiei de progesteron. Acest fenomen a fost demonstrat pe baza studiilor in vitro. Tot prin studii clinice s-a demonstrat impactul negativ al agonistului-GnRH asupra corpului galben si a functiei luteale. Posibil insa ca mecanismul de actiune sa nu fie direct, avand in vedere ca dupa oprirea administrarii agonistului acesta este eliminat rapid din organism. Inhibarea sintezei de gonadotropine persista inca o perioada dupa intreruperea medicatiei (mai ales in cazul protocoalelor lungi) astfel ca efectul asupra functiei luteale este unul indirect, prin imposibilitatea eliberarii LH-ului hipofizar. Este deci obligatorie o sustinere a fazei luteale. Aceasta se face prin administarea progesteronului – direct sau indirect – prin administarea HCG (fiind cunoscut faptul ca HCG are o structura foarte asemanatoare cu a LH- ului). Uneori se adopta amandoua modalitatile. Progesteronul se administreaza pe cale orala sau vaginala; s-a demonstrat faptul ca acestea au o mult mai buna absorbtie decat calea intramusculara. Dezavantajul administrarii HCG este faptul ca poate produce sau accentua sindromul de hiperstimulare ovariana, daca acesta este deja existent, situatie in care se prefera administrarea de progesteron. Concluziile lui Blumenfeld si Nahhas asupra ratei sarcinilor (mai crescute) si

30

numarului avorturilor (mai scazute) in urma sustinerii fazei luteale cu HCG se bazeaza si pe faptul ca HCG are rol in implantarea embrionara prin producerea unor factori specifici [75]. Administrarea progesteronului se incepe in ziua punctiei foliculare si se continua pentru 14 zile. Administrarea HCG pentru sustinerea fazei luteale sau asocierea sa cu progesteronul se decide in functie de situatia clinica si nivelul estradiolului seric. De obicei HCG se administreaza in zilele 1,4,7 dupa punctia foliculara [76]. Capitolul 3.4 Antagonistii-GnRH Fac parte din clasa analogilor-GnRH. Acesti compusi iau nastere prin modificarea moleculei de decapeptid, care se leaga la nivel de receptor membranar hipofizar, fara insa a determina eliberarea de gonadotropine (ca in cazul agonistilor, prin efectul de „flare-up”). Pana in momentul de fata s-au sintetizat substante ce au fost incadrate in 3 clase sau generatii de antagonisti. Substantele care s-au impus in schemele de tratament utilizate astazi sunt cetrorelix si ganirelix (Tabel 5). Prima generatie de antagonisti a rezultat prin inlocuirea aminoacizilor din pozitiile 2 si 3 din GnRH nativ (His si Trp), dar aveau efecte supresive doar la doze foarte crescute. Potenta acestui tip de substanta a fost crescuta prin modificarea aminoacizilor din pozitia 1 si 6 si prin incorporarea unui D-aminoacid in pozitia 6 (D-Arg), rezultand substante de generatia a 2-a, dar care au avut efecte alergice (edem, eritem local, induratie), anafilactoide nedorite (edem generalizat, reactie anafilactica) prin activitate histaminica accentuata. Acest efect secundar a fost indepartat odata cu sintetizarea produsilor de generatia a 3-a, prin inlocuirea D-Arg din pozitia 6 cu D-ureiloalkil aminoacid [77]. Tipuri de antagonist-GnRH de generatia a 3-a sunt cetrorelix, iturelix, azaline B, ganirelix, abarelix si antarelix. In urma administrarii lor se obtine o supresie hipofizara mai marcata pentru LH (70%) si mai putin pentru FSH (30%) dupa 6 ore de la administrare. Alte modificari aduse generatiei 3 si substantelor ce sunt inca in studiu sunt la nivelul aminoacizilor din pozitiile 1,2,3,6 si 10 [78]; [79]; [80]. In tabelul 4 sunt redate principalele substante antagoniste-GnRH [63].

31

Tabel 4 - Principalii antagonisti-GnRH Secventa aminoacizilor GnRH

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

pGlu

His

Trp

Ser

Tir

Gly

Leu

Arg

Pro

Gli-

nativ

NH2

Cetrorelix

D-Nal

D-Phe

D-Pal

4

5

D-Cit

7

8

9

D-Ala

Nal-Glu

D-Nal

D-Phe

D-Pal

4

Arg

D-Glu

7

8

9

D-Ala

Antide

D-Nal

D-Phe

D-Pal

4

NicLis

D-

7

Lis(iPr)

9

D-Ala

7

hArg

9

D-Ala

NicLis Ganirelix

D-Nal

D-Phe

D-Pal

4

5

DhArg

Azalina B

D-Nal

D-Phe

D-Phe

4

Phe

D-Phe

7

Lis(iPr)

9

D-Ala

Antarelix

D-Nal

D-Phe

D-Pal

4

Phe

D-Hcit

7

Lis(iPr)

9

D-Ala

Tabel 5 - Antagonisti-GnRH folositi in practica clinica Antagonist GnRH

Denumire

(DCI)

comerciala

Cetrotide

Cetrorelix

Orgalutran

Ganirelix

Cale administrare

Doza recomandata

Doza minima eficienta

s.c.

Doza unica

2 mg

s.c.

Doza multipla

0,25 mg/zi

s.c.

Doza multipla

0,25 mg/zi

Efectul este de scadere al gonadotropinelor si implicit a steroizilor sexuali la cateva ore de la administarea lor. Efectul secundar cel mai important este de eliberare a histaminei, cu efecte locale si sistemice. Acest fenomen se produce prin existenta receptorilor-GnRH la suprafata celulelor mastocitare. Un alt efect secundar este cel de precipitare. Principiul actiunii este diferit de cel al agonistilor. Antagonistul se afla in competitie cu molecula nativa la nivel de receptori membranari hipofizari. Efectul de antagonizare incepe imediat, fara stimularea initiala a hipofizei si este dependent de doza. La intreruperea medicatiei, in decurs de citeva zile se normalizeaza functia hipofizara (comparativ cu agonistii, unde reluarea functiei hipofizare are loc aproximativ la 6 saptamini). Antagonistul nu are ca efect epuizarea rezervelor hipofizare a gonadotropilor si nici nu inhiba sinteza acestora. Pe baza inhibitiei competitive la nivelul situsurilor de legare se poate si 32

“doza” efectul antigonadotrop al antagonistilor, cu rol in moderarea concentratiei restante de estradiol. Moderarea concentratiei serice a E2 este importanta in diminuarea efectelor secundare ale tratamentului cu antagonisti. Capitolul 3.5 Protocoale de stimulare ovariana controlata ce cuprind in schema lor antagonisti-GnRH Administrarea de scurta durata a antagonistului-GnRH inhiba secretia endogena hipofizara si previne peak-ul precoce de LH [81]. Spre deosebire de agonisti, nu se produce o desensibilizare a hipofizei, ci efectul de supresie se realizeaza prin inhibarea competitiva a receptorilor hipofizari. Protocolul german – Lübeck - foloseste administrarea zilnica de cetrorelix (doze mici – 0,25 mg/zi), subcutanat, incepand din ziua 5 sau 6 a ciclului menstrual, pana la declansarea ovulatiei. Stimularea cu FSH se incepe din ziua 2 a ciclului menstrual, cu ajustarea pe parcurs a dozei. Supresia de LH a fost rapida, s-au atins concentratii serice < 2 mUI/ml si nu s-a semnalat peakul precoce de LH [82]. Declansarea ovulatiei cu 10.000UI HCG s-a efectuat conform criteriilor ecografice (dimensiunea folicolilor >17 mm) si hormonale (E2: 300-400 pg/ml/folicol). Sustinerea fazei luteale cu 5000 UI HCG s-a efectuat in ziua 2 si 5 dupa punctia foliculara. Initial, pentru a stabili doza optima eficienta de cetrorelix, s-au utilizat comparativ pe loturi de paciente doze de 3 mg, 1 mg si 0,5 mg. S-a constatat ca s-a obtinut o mai buna crestere a concentratiei de estradiol la grupul ce a folosit 0,5 mg antagonist si rata formarii pronucleilor la grupul de 0,5 mg cetrorelix a fost de 67,7 % [9]. Actualmente, in protocolul adoptat unanim, se utilizeaza doza de 0,25mg/zi cetrorelix. Protocolul francez, descris de grupul lui Olivennes [83] consta intr-o administare unica, subcutanat de cetrorelix (3 mg), la un nivel seric al E2 de 150-200 pg/ml/ folicul > 14 mm ( in general in ziua a 9-a). Daca in decurs de 48 h nu se indeplinesc criteriile de declansare a ovulatiei se mai administreaza o doza de antagonist. Adminstrarea de FSH incepe in ziua a 2-a a ciclului menstrual. Monitorizarea ecografica si hormonala (E2, LH, progesteron) este zilnica. Declansarea ovulatiei s-a produs cu 10.000 UI HCG cand au fost indeplinite criteriile ecografice si hormonale cunoscute. Sustinerea fazei luteale s-a efectuat cu progesteron natural administrat intravaginal.

33

Sub aceasta medicatie, hipofiza este in continuare sensibila la secretia endogena de GnRH si ramane reactiva [82]. Dat fiind faptul ca la oprirea medicatiei antagoniste secretia endogena de LH se reia rapid, in cateva ore, s-a discutat necesitatea sustinerii fazei luteale. Si in aceasta problema exista suficiente controverse. Se pare ca totusi este influentata intr-o oarecare masura activitatea corpului galben [84]. Este posibil ca dupa inhibitia hipofizara produsa de antagonistii-GnRH sa se reia ciclul ovulator printr-o administare pulsatila de GnRH. Dezavantajul agonistului fata de antagonist este faptul ca prin efectul initial de “flare-up” produce o crestere de LH, care chiar daca este redusa, induce la randul ei o sinteza crescuta de androgeni, mediu care este defavorabil dezvoltarii foliculare. Pe de alta parte, luand in considerare modul de actiune al antagonistului – prin mecanismul de blocare competitiva a receptorilor-GnRH, se deduce ca efectul sau are o durata de instalare rapida, dar odata oprita medicatia, se revine rapid la situatia initiala. Efectul antagonistului este dependent de durata si doza administrata, o doza crescuta de antagonist s-a dovedit a fi defavorabila pentru rata sarcinilor din ciclurile FIV (Mannaerts, 1998 – studiu multicentric) [85]. In protocoalele utilizand antagonist s-a declansat ovulatia si prin administrarea GnRH, incercand astfel evitarea sindromului hiperstimularii ovariene, care este favorizat si de HCG. In figura 11 sunt redate protocoale de stimulare ovariana utilizate in tehnicile de reproducere asistata, folosind agonisti sau antagonisti-GnRH in vederea supresiei hipofizare.

34

Fig. 11 - Protocoale de stimulare ovariana cu agonisti/antagonisti-GnRH

35

Capitolul 4 Raspunsul pacientelor la stimularea ovariana controlata Capitolul 4.1 Raspuns insuficient al pacientelor la terapia de stimulare In cadrul protocoalelor de suprastimulare ovariana controlata se poate intalni un raspuns inadecvat, redus al pacientelor (situatie cunoscuta sub denumirea de „low-responder”). Este motivul pentru care ciclurile de stimulare se intrerup, se abandoneaza. Acesta situatie apare in 924% din ciclurile de stimulare (Keay, 1997) din cadrul fertilizarii in vitro (FIV) si nu se mai ajunge la punctia foliculara [86]. Conditiile de definire a situatiei expuse sunt: nivel seric al estradiolului < 500 pg/ml, cu dezvoltarea a ≤ 3 folicoli dominanti. Determinarea hormonilor bazali a pacientelor care intra in cadrul protocoalelor de suprastimulare ovariana controlata au relevat o valoare crescuta a FSH bazal (care la determinari repetate in cursul unui an se mentine ridicata), valori bazale ale estradiolului de asemenea crescute si LH bazal < 3 mUI/ml. Explicatia este data de scaderea rezervei ovariene de folicoli, care determina o secretie mai scazuta a inhibinei. In aceste conditii, conform arcului de reglare ovar-hipofiza, se va secreta o cantitate mai crescuta de FSH, care la randul ei va detemina cresterea estradiolului bazal. In aceste circumstante poate aparea peak-ul prematur de LH, luteinizarea precoce a ovocitelor, cu alterarea calitatii lor [87]. Cel mai frecvent rezerva foliculara ovariana scazuta se intalneste odata cu inaintarea in varsta a femeii, dar se descriu si situatii similare la femeile tinere [88]. S-au incercat multiple variante de adaptare a protocoalelor de stimulare ovariana cu scopul de-a reduce semnificativ rata de abandon a ciclurilor de stimulare. O varianta este de scadere a dozei si a timpului de inhibitie hipofizara a agonistului-GnRH, care la randul sau poate afecta raspunsul ovarian. Astfel ca la protocolul lung cu agonist se opreste doza acestuia la instalarea menstruatiei, ulterior se administreaza doze mai crescute de gonadotropine [89]. O alta posibilitate este aplicarea protocoalelor scurt si ultrascurt la „low-responder”, care se bazeaza pe efectul initial de „flare-up” al agonistului, cu stimularea gonadotropinelor endogene si inducerea cresterii foliculare. Se administreaza in cadrul protocoalelor scurte (modificate) doze mai crescute de agonist-GnRH si doze mai mari de gonadotropine [90]. 36

Criteriile de abandonare a ciclurilor de stimulare sunt [91];[92]; [124]: •

Nivel seric al estradiolului < 600 pg/ml, asociat cu numar redus de folicoli ≥ 16 mm (≤ 3);

•

Cresterea prematura a LH-ului (> 10 mUI/ml) sau nivel seric al progesteronului > 1,5 ng/ml anterior inducerii ovulatiei;

•

Sindrom de hiperstimulare ovariana (ovare mari, > 8 cm, cu numar mare (>10) de folicoli < 16 mm si nivel seric al estradiolului > 3500 pg/ml

•

Probleme de organizare

Capitolul 4.2 Raspunsul exagerat al pacientelor la terapia de stimulare. Sindromul de hiperstimulare ovariana Am amintit printre criteriile de abandonare a ciclurilor de stimulare si sindromul de hiperstimulare ovariana - o complicatie de temut si nu rar intalnita in protocoalele din reproducerea asistata. Este inversul situatiei fata de raspunsul insuficient („low-response”) la stimularea cu gonadotropine, fiind un raspuns exagerat, insotit de un nivel seric crescut al estradiolului si cu manifestari clinice variate, in functie de gradul severitatii. Este o complicatie indusa iatrogen, care se insoteste de extravazarea plasmei in spatiul interstitial si acumularea lichidului in cavitati, cu formare de edeme, ascita, hidrotorace si hidropericard. Hipovolemia se insoteste de alterarea perfuziei renale, cu oligurie si in final insuficienta renala acuta. Hemoconcentratia este cauza complicatiilor tromboembolice ce survin in acest sindrom de hiperstimulare ovariana. De asemenea apar insuficienta respiratorie si hepatica. De obicei aparitia sindromului de hiperstimulare se instaleaza la cateva zile dupa punctia foliculara, frecvent in perioada embriotransferului. Prevenirea sindromului de hiperstimulare este destul de dificila, deoarece dozele de gonadotropine folosite pentru a obtine o stimulare ovariana adecvata sunt foarte apropiate de dozele ce induc aceasta complicatie. In protocoalele pentru FIV/ICSI se incepe cu doze progresiv crescande de gonadotropine, cu monitorizarea indeaproape a numarului si dimensiunii folicolilor si a cresterii estradiolului seric. Administrarea HMG si rFSH in doze crescute odata cu initierea stimularii ovariene are ca efect cresterea unui numar mai mare de folicoli, care se vor dezvolta

37

progresiv si acumuleaza receptori pentru LH. In final ei vor suferi un proces mai accentuat de luteinizare. Unii autori considera ca folosirea unui protocol fix de stimulare nu scade aparitia sindromului de hiperstimulare ovariana [93]. De asemenea introducerea agonistului-GnRH nu scade riscul sindromului de hiperstimulare ovariana. Se considera ca pacientele cu sindrom de ovare polichistice (PCOS) si cele cu disfunctie ovariana, clasificarea OMS II (cu secretie normala de gonadotropi hipofizari) au o predispozitie si un risc mai mare de dezvoltare a sindromului de hiperstimulare ovariana [94]. Nu exista nici o metoda care sa excluda complet aceasta complicatie. In general este asociata unor nivele ridicate de estradiol seric in faza preovulatorie, dar se poate intalni si la nivel scazut de estradiol. Pe de alta parte se descriu si situatii in care paciente cu valori foarte crescute de estradiol nu dezvolta sindrom de hiperstimulare ovariana [95] . S-a raportat in cateva situatii izolate aparitia sindromului de hiperstimulare ovariana si in cicluri spontane [96] (fie la paciente cu PCOS sau la paciente cu profil hormonal normal). O serie de date din literatura de specialitate apreciaza incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana pentru formele moderate si severe la valori cuprinse intre 3,1% - 6% respectiv 0,25% - 1,8% [97]. S-au imaginat mai multe clasificari ale acestui sindrom de hiperstimulare ovariana, fiecare insa este supusa modificarilor. Clasificarea OMS [98] cuprinde 3 grade de severitate: •

gradul I (forma usoara) se refera la marirea in volum a ovarelor, bilateral (< 6cm), estradiol seric > 1500 pg/ml, progesteron seric > 30 ng/ml

•

gradul II (forma moderata) asociaza marirea in volum bilateral (pana la 12/12 cm) a ovarelor cu disconfort abdominal, greata, voma, diaree, crestere ponderala, estradiol seric la niveluri crescute

•

gradul III (forma severa) asociaza pe langa ovarele marite in volum (> 12 cm), simptomele descrise la gradul anterior si estradiolul crescut si prezenta lichidului de ascita, eventual si hidrotorace/hidropericard; hipovolemie care poate evolua pana la soc hipovolemic, hemoconcentratie marcata, tulburari electrolitice, tromboembolism.

38

O varianta de clasificare, mai recenta, este cea a lui Golan si colab. [99]. Forma usoara Grad 1 – distensie si disconfort abdominal Grad 2 – se adauga greata, varsaturi ± diaree, dimensiunile ovarelor sunt cuprinse intre 5-12 cm Forma moderata Grad 3 – semnele/simptomele formei usoare, la care se adauga prezenta ascitei (descrisa ecografic) Forma severa Grad 4 – semnele/simptomele formei moderate la care se adauga prezenta ascitei si/sau hidrotoracelui si dispnee Grad 5 – toate cele enumerate anterior, la care se adauga modificari ale volumului sanguin, ale vascozitatii sanguine prin hemoconcentratie, tulburari ale coagularii si alterarea perfuziei si functiei renale. Complicatiile sindromului de hiperstimulare ovariana •

Complicatiile vasculare sunt cele date de hemoconcentratie, se induce un status de hipercoagulabilitate si apar fenomene tromboembolice. Se constata cresterea nivelelor serice ale complexului plasma α2 – antiplasmina, trombina-antitrombina III, scaderea precalicreinei si a APTT;

•

Complicatii hepatice;

•

Insuficienta respiratorie;

•

Insuficienta renala acuta (prerenala, indusa de hipovolemie);

•

Complicatii gastro-intestinale;

•

Torsiune anexiala sau ruptura unui chist ovarian.

Asa cum am mai amintit, declansarea ovulatiei prin administrarea HCG determina inducerea sindromului de hiperstimulare ovariana. Din acest motiv, in conditii de risc nu se indica HCG pentru sustinerea luteala. Se poate inlocui HCG ca inductor al ovulatiei cu agonist-GnRH iar pentru sustinerea luteala se va administra progesteron (intravaginal). Durata si severitatea sindromului este mai accentuata in cazul instalarii sarcinii.

39

Fiziopatologia sindromului de hiperstimulare ovariana In conceptia clasica se considera ca o crestere a permeabilitatii capilare este raspunzatoare de acumularea lichidului in spatiul interstitial si in cavitati. Exista si o explicatie mai moderna (Balasch si colab.) care presupune ca tulburarile circulatorii nu se datoreaza hipovolemiei, ci unei vasodilatatii arteriolare marcate la nivel periferic, urmata de cresterea patului vascular si hipotensiune arteriala consecutiva. Astfel se va produce in mod compensator o crestere a frecventei cardiace si a debitului cardiac [100]. La nivel ovarian se remarca cresterea in volum a acestora, cu edem stromal, prezenta zonelor de necroza, neovascularizatie, chiste foliculare hemoragice si luteinice. S-au studiat intens mediatorii cresterii permeabilitatii vasculare. Un factor implicat in acest proces este sistemul renina-angiotensina. Concentratia acestor substante este crescuta in plasma si in directa corelatie cu severitatea sindromului de hiperstimulare ovariana. Factorul de crestere endoteliala (VEGF: vascular endothelial growth factor) joaca un rol important in patogenia hiperstimularii. Este o proteina ce leaga heparina si actioneaza direct auspra endoteliului cu inducerea angiogenezei. In vivo creste permeabilitatea vasculara si are implicatii in angiogeneza din cadrul dezvoltarii embrionare. Alte studii au gasit o corelatie intre VEGF si angiogeneza din cadrul tesuturilor cu reinnoire ciclica (de tipul endometrului) si activitate crescuta a VEGF in folicolul luteinizat [101]; [102]. VEGF este implicat si in reglarea angiogenezei ciclice ovariene, creste permeabilitatea vaselor la nivel ovarian si poate fi un factor in producerea lichidului din chistele ovariene. Este depistat in celulele tecale ale folicolului dar nu se depisteaza in corpul galben degenerat sau in folicolul atretic. Cresterea rapida a folicolilor din cursul stimularii si luteinizarea lor necesita angiogeneza marcata. Conform concluziilor extrase din studii, VEGF este factorul major implicat in producerea permeabilitatii capilare si in formarea ascitei din sindromul de hiperstimulare ovariana. Alte cercetari recente si-au indreptat atentia spre interleukine si rolul lor in patogenia sindromul de hiperstimulare ovariana, dar nu li se atribuie acelasi rol important ca si pentruVEGF [103]. Odata stabilit diagnosticul de sindrom de hiperstimulare ovariana se impune o monitorizare si supraveghere (clinica si paraclinica) atenta a pacientei. Formele usoare si moderate nu necesita spitalizare, care insa devine obligatorie in formele severe. Parametrii de laborator care se urmaresc sunt: determinarea hematocritului si a numarului hematiilor,

40

creatinina si ureea sanguina, ionograma sanguina si urinara, profil al coagularii, transaminaze, monitorizarea urinii. Printre alte analize se determina si ß-HCG-ul seric. Ecografia este utila in urmarirea dimensiunii ovarelor, a prezentei lichidului de ascita, eventual a prezentei sarcinii. Tratamentul medical cuprinde restabilirea echilibrului volemic si acido-bazic prin administrarea de fluide intravenos, electroliti, albumina, plasma-expanderi. Albumina corecteaza tulburarile hemodinamice, creste presiunea oncotica si nu permite extravazarea lichidului din patul vascular, este o substanta cu timp de injumatatire lung (10-15 zile). Prevenirea sau tratarea fenomenelor tromboembolice implica administrarea anticoagulantilor. La pacientele cu oligurie intra in discutie administrarea dopaminei. Tratamentul chirurgical se refera la evacuarea lichidului de ascita prin paracenteza sau prin punctie vaginala ecoghidata. Se imbunatateste starea generala a pacientei, se amelioreaza simptomele, creste debitul renal si clearence-ul de cretainina. Prezenta hidrotoracelui impune drenajul pleural. Laparoscopia, sau mai rar laparotomia, se practica doar in cazul torsiunii ovariene, a rupturii unui chist anexial sau in cazul tratamentului sarcinii extrauterine asociate sindromului de hiperstimulare ovariana. Sindromul de hiperstimulare ovariana s-a intalnit in statistica Centrului de Fertilizare in Vitro si Embriotransfer al Clinicii Universitare de Obstetrica-Ginecologie “Bega”, Timisoara doar in 30 cazuri (pe perioada 20.05.1995-31.12.1999), acestea fiind forme usoare si medii. Nu s-au inregistrat forme severe. La 1 caz cu torsiune de ovar chistic la 12 saptamani gestatie s-a intervenit si s-a rezolvat pe cale laparoscopica, sarcina a evoluta ulterior normal, pana la termen [95]; [104]; [105]. Masurile de prevenire ale sindromului de hiperstimulare ovariene cuprind identificarea factorilor de risc (paciente cu PCOS, tinere, cu estradiol seric crescut, cu sindrom de hiperstimulare aparut in stimulari anterioare, ecografic se descriu numerosi folicoli de dimensiuni mici si folicoli ≥ 15 mm). O alta metoda este de retinere fata de administrarea HCG in scopul inducerii ovulatiei („coasting”) la estradiol seric crescut, cu continuarea agonistuluiGnRH si oprirea medicatiei gonadotrope de stimulare. Monitorizarea concentratiei serice a estradiolului (scaderea la 3000 pg/ml) reprezinta decizia de administrare a HCG [106]. Inlocuirea HCG cu agonist-GnRH ca inductor al ovulatiei este alta masura de prevenire a sindromului de hiperstimulare ovariana. Aspirarea foliculara, suportul luteal cu progesteron,

41

crioconservarea embrionilor si embriotransferul lor in alt ciclu, administrarea profilactica a albuminei la punctia foliculara sunt alte posibilitati de prevenire a hiperstimularii. Capitolul 4.3 Medicatia hormonala administrata in reproducerea asistata si cancerul In urma tratamentului hormonal care se administreaza in cantitati crescute sau cu durata prelungita in cadrul protocoalelor din reproducerea asistata, respectiv repetarea protocoalelor in intervale de timp variate s-a ridicat si problema efectelor secundare ale acestei medicatii. Cea mai de temut complicatie in timp este fireste cancerul. S-au efectuat multiple studii in acest sens in centre de reproducere asistata si in institutii de cercetare de referinta din intreaga lume si s-a dovedit ca medicatia utilizata in tratamentul infertilitatii nu este cancerigena. Cu toate aceste rezultate mai sunt necesare in viitor si alte studii care sa urmareasca in timp efectele terapiei hormonale in infertilitate [107]; [108]; [109].

42

Capitolul 5 Tehnici de reproducere umana asistata - fertilizarea in vitro (FIV) Capitolul 5.1 Istoric Conform explicatiei din enciclopedie, termenul de fertilizare in vitro reprezinta procedeul de-a concepe un embrion uman in exteriorul organismului matern. Se refera la cultivarea in laborator a ovocitelor si spermatozoizilor, cu plasarea ulterior a embrionului/embrionilor transcervical intrauterin [124]. Tendintele de-a concepe in vitro au existat inca de demult, astfel ca din punct de vedere istoric se descriu incercarile lui M.C. Chang, care a relizat prima fertilizare in vitro la mamifer (iepure) in 1959 [110] . In urmatoarea decada aceste incercari s-au extins si la om. Secolul 20 este marcat de multiple evenimente, dar unul in mod special a atras atentia lumii intregi. Cercetarile de durata ale echipei de la Bourn Hall Clinic, Marea Britanie, formata in principal de ginecologul P. Steptoe si fiziologul R. G. Edwards, au fost incununate de succes la 25 iulie 1978, prin nasterea fetitei Louise Brown („test tube baby”), provenind dintr-un cuplu cu sterilitate de cauza tubara. Ei au marcat acest eveniment, ce avea insa sa schimbe radical posibilitatile de reproducere de la acel moment incolo, cu un scurt articol aparut in revista Lancet [111]; [124]. Stradaniile lor de-a obtine o sarcina in vitro s-au concretizat initial pe modele experimentale si ulterior la om. In 1971, in urma multor incercari, Edwards si colab. au reusit cresterea in vitro a ovocitelor fertilizate pana la stadiul de blastocist, lucru imposibil de realizat pana atunci [112]. In 1976 au obtinut o sarcina tubara (un succes, dar totodata un esec prin implantarea embrionara ectopica) [113]. Capitolul 5.2 Tehnici de recoltare ovocitara Ca si metoda, Steptoe si Edwards au obtinut ovocitul dintr-un ciclu menstrual spontan, prin aspirarea lui laparoscopica (pacienta avand o patologie tubara ireversibila), ulterior acesta a fost fecundat in vitro si reimplantat prin embriotransfer. Intre timp s-a modificat calea de 43

recoltare a ovocitelor, fiind introdusa cea prin punctie transvaginala ecoghidata. La introducerea FIV in SUA (1981) se practica recoltarea ovocitara prin laparoscopie dar, ulterior, in 1983 s-a efectuat prima aspirare ovocitara transvaginala ecoghidata, aceasta fiind astazi curent folosita [114]. Avand in vedere dezvoltarea actuala a laparoscopiei se poate practica in continuare acest tip de recoltare, mai ales daca se doreste in mod special vizualizarea pelvisului (in situatia unei patologii cunoscute sau presupuse) si in timpul recoltarii ovocitare se poate actiona si terapeutic (liza aderentelor). Totusi in ziua de astazi ramane rar folosita aceasta metoda, este necesara experienta si indemanarea operatorului; in unele situatii punctia foliculara poate fi mai anevoioasa si interventia mai prelungita. Aparitia ecografiei a permis o noua abordare a diagnosticului si tratamentului organelor micului bazin. In 1981 Lenz a efectuat prima punctie foliculara sub ghidaj ecografic, metoda sa fiind o punctie transabdominala transvezicala ecoghidata (transducer abdominal). Aceasta tehnica are si ea dezavantajele ei (este dureroasa, produce frecvent hematurie, retentie de cheaguri), fiind mai dificil de abordat ovarele si in cele din urma a fost abandonata [115]. Urmatoarea tehnica de aspirare ovocitara a fost cea prin punctie transvaginala, dar ghidata ecografic transabdominal (metoda descrisa de Gleicher in 1981). Si aceasta tehnica a fost inlocuita odata cu aparitia si perfectionarea transducerului vaginal. O alta varianta este aspirarea ovocitara transuretrala si prin vezica urinara folosind un ghid ecografic transabdominal (este folosita daca abordul ovarian este dificil, ovare inaccesibile vaginal, daca exista o infectie vaginala sau daca sonda vaginala este defecta). In 1985 Wikland si colab. au descris pentru prima data modul de aspirare al ovocitelor prin punctie transvaginala ecoghidata transvaginal, prin atasarea unui ac de punctie la transducerul vaginal. Este tipul de punctie folosit astazi in toate centrele de fertilizare in vitro [116]. Avantajele acestui tip de punctie sunt evidente: vizualizarea mai buna a organelor pelvine (apropierea de sonda a ovarelor), dureri mult mai atenuate (fata de recoltarea transvezicala ecoghidata), prin buna vizualizare a ovarelor se permite o aspirare adecvata a folicolilor si obtinerea astfel a mai multor ovocite (inclusiv spalarea repetata a folicolilor pana la evidentierea ovocitelor), risc mai mic de perforare a unui organ (risc de lezare a unui vas, intestin sau vezica urinara < 1%), absenta disuriei, a infectiei (prezente in punctia transvezicala). Este de altfel si varianta de punctie cea mai acceptata de paciente [124].

44

Anii care au urmat au fost marcati de noi evenimente si progrese, in sensul ca s-a introdus stimularea ovariana controlata (initial cu clomifen si apoi cu gonadotropine), s-au introdus ulterior analogii-GnRH in cadrul protocoalelor de stimulare ovariana. Tratamentul de stimulare ovariana controlata a permis obtinerea mai multor ovocite mature, care evident au dus la crestera ratei implantarii/ciclu si la cresterea procentului sarcinilor. Agonistii-GnRH au permis scaderea procentului de cicluri abandonate pe motivul peak-ului spontan si premature de LH. Astfel incat la inceputul practicarii FIV rata sarcinilor a fost mult redusa (8%), ca apoi la sfarsitul anilor ´80 cel mai probabil datorita introducerii terapiei cu analogi-GnRH, ea sa creasca in jur de 15%. De la inceputurile ei FIV a mai suferit si alte modificari, nu numai referitoare la modul de colectare al ovocitelor sau la modul de stimulare ovariana, ci si paleta de indicatii a fost reconsiderata. Initial FIV a fost practicata la cupluri cu sterilitate de cauza tubara, s-a extins insa si la paciente cu endometrioza in diverse stadii, patologie uterina, sindromul ovarelor polichistice (PCOS), infertilitate idiopatica. In plus, la pacientele cu insuficienta ovariana primara, menopauza precoce sau ovariectomizate s-a introdus FIV cu ovocite donate. Mai mult, FIV este aplicata si la cupluri cu factor masculin al sterilitatii sau cu infertilitate de cauza imunologica. Capitolul 5.3 Extinderea FIV in lume FIV in Romania Intre timp aceasta tehnica de reproducere asistata s-a extins pe tot globul. La 4 ani de la nasterea lui Louise Brown in Marea Britanie, s-a nascut in Germania, la Erlangen, primul baietel (Oliver) prin FIV iar in 1983 s-a obtinut primul copil “in eprubeta” in SUA. De atunci aceasta tehnica a cunoscut un enorm avant, numai in Germania s-au practicat pana in anul 2002 peste 60.000 cicluri FIV [117]. In Romania s-a introdus aceasta metoda a reproducerii asistate in anul 1995, cand la Timisoara, la Clinica Universitara de Obstetrica-Ginecologie “Bega”, echipa condusa de Acad. Prof. Dr. Ioan Munteanu a realizat prima fertilizare in vitro (20.05.1995) la o pacienta cu sterilitate tubara, la care s-a obtinut sarcina, urmata de nasterea primului baietel roman conceput “in eprubeta” (Daniel-Ioan), la 6 februarie 1996 [124]. Astfel ca Romania devenea a 18-a tara in lume in care se practica FIV [123]. Ulterior acest success a fost urmat de multiple altele [122].

45

Centrul de fertilizare de la Timisoara - centru de referinta - a fost urmat de infiintarea altora similare in Bucuresti, Cluj, Constanta [118]; [119]; [120]; [121]. Capitolul 5.4 Tehnica FIV Tehnica fertilizarii in vitro si a embriotransferului presupune dupa o selectare riguroasa si incadrare corecta a cuplurilor cu sterilitate in programele de reproducere asistata cateva etape clare si precise. Fiecare laborator de embriologie detine o aparatura specifica (de exemplu: incubator, centrifuga, microscop cu lumina inversata, cu contrast de faza, care sa aiba o suprafata de lucru cu posibilitati de incalzire, camera Makler, instalatie de apa pura, banc de lucru, consumabile, altele). Laboratorul este curatat si intretinut cu substante speciale, nonembriotoxice. Dupa stimularea ovariana prealabila (conform protocoalelor enumerate si folosind supresia hipofizara cu analogi-GnRH) se induce ovulatia prin administarea a 10.000 IU HCG intramuscular. Recoltarea ovocitara se va efectua la 34-39 ore (optim la 36 ore) de la administrarea HCG. Recoltarea ovocitara prin punctie vaginala ecoghidata direct este efectuata in conditii de asepsie in laboratorul de fertilizare sau in sala de operatie. Se prefera o anestezie generala i.v. de scurta durata. Anterior punctiei este necesar de verificat pompa de aspiratie si acul care urmeaza a fi atasat de sonda vaginala printr-un dispozitiv special construit. Pacienta se afla in decubit dorsal pe masa ginecologica, cu membrele inferioare in abductie. Se introduce un specul si se efectueaza lavajul din abundenta cu ser fiziologic a vaginului, dupa care se scoate speculul si se introduce transducerul vaginal (sonda cu frecventa 5-7,5 MHz, preferabil transducer electronic si nu mecanic, pentru calitatea imaginii) cu acul de punctie atasat. Operatorul poarta manusi sterile netalcate, masca, boneta. La nivelul transducerului vaginal se aplica un capison steril cu o cantitate mica de ecogel. Ecograful are la nivelul ecranului o linie de ghidaj care ajuta la pozitionarea si manevrarea acului (este indicat ca acul sa coincida cu linia de ghidaj) (ecograf Siemens, Kranzbuehler, Kretz). Inainte de punctionare se reverifica aspectul ovarelor (prin modificarea pozitiei sondei in cele 2 planuri), daca exista ansa intestinala interpusa, a se evita confunzia unui folicol cu sectiunea transversala a venei iliace. Punctionarea foliculara se poate efectua fie cu un sistem de punctie automat sau manual. Acul de punctie in

46

sistemul automat are dezavantajul ca la fiecare punctionare foliculara perforeaza peretele vaginal, cu risc mai mare de sangerare. La sistemul manual este intepat peretele vaginal o data pentru ovarul drept si o data pentru cel stang. Punctionarea se incepe cu folicolii cei mai usor accesibili, cei mai apropiati de transducer. Se punctioneaza si folicolii mici, care pot contine si ei ovocite mature (mai rar) (Fig. 12). Daca este necesar se poate efectua lavajul unui folicol cu aspirarea sa ulterior (in cazul in care nu s-a identificat ovocitul din prima aspirare). Inainte de extragerea sondei vaginale, la terminarea interventiei se verifica fundul de sac Douglas (poate contine fina lama de lichid – sangerare in urma procedurii aplicate). Se controleaza punctele de punctie vaginala si o eventuala sangerare se opreste de obicei prin compresie de scurta durata. Conform protocolului de la Bourn Hall Clinic se pot administra la sfarsitul interventiei antibiotice (de exemplu autorii acestui ghid propun acid clavulanic: 1,2 g Augmentin i.v. si metronidazol: 1 g Flagyl intrarectal) [125].

Fig. 12 - Aspectul ecografic al unui ovar stimulat Complicatiile unei punctii foliculare transvaginale sunt in parte determinate de indemanarea si experienta operatorului. Pe de alta parte gradul de accesibilitate (mai dificil sau nu) al ovarelor sau sindromul aderential pelvin preexistent pot contribui la cresterea incidentei complicatiilor. Complicatiile se refera in general la sangerare, infectie, punctia unui organ pelvin. Fiecare centru de fertilizare are statistica sa proprie. Brinsmead si colab. constata un numar mare de complicatii: 2-7% punctie venoasa, 40% sangerare la nivelul vezicii urinare, 24 % sangerare vaginala, 14 % perforatie intestinala, 10% dureri pelvine post-punctie, 3% infectii in micul bazin [126].

47

La sfarsitul interventiei pacienta este de obicei supravegheata timp de 2 ore (se prefera repausul in clinostatism) dupa care poate parasi unitatea unde s-au recoltat ovocitele. Este bine ca pacienta sa mentina legatura cu medicul care a efectuat punctia inca o perioada de aproximativ 12 ore, timp in care pot aparea alte complicatii acute. Ovocitele recoltate sunt preluate in laborator de catre embriolog. O persoana cheie in relizarea tehnicilor de reproducere asistata o reprezinta tocmai embriologul. Ovocitele umane sunt foarte sensibile la variatiile de temperatura, care pot produce modificari ireversibile in fusul mitotic, cu afectare cromozomiala. Embrionii obtinuti din FIV si la care s-au depistat anomalii cromozomiale pot contribui la explicatia procentului de sarcini biochimice sau avorturi spontane intalnite dupa FIV sau GIFT (transfer intratubar de gameti), posibil tocmai prin degradarea termica. Astfel incat in timpul manipularii ovocitelor si a embrionilor este necesara pastrarea unei temperaturi constante [127]. Dupa recoltarea lor prin aspirare foliculara (in eprubete) se identifica ovocitele la microscop. Complexul cumulus–ovocit se poate vizualiza prin marimea lui si cu ochiul liber. Continutul folicular se varsa din eprubeta pe placi Petri si se vizualizeaza la microscop (cu placa termica incalzita la 37 ºC si marire optica 40-125x). Manevra este rapida si efectuata in conditii sterile. Se spala pentru indepartarea sangelui daca este necesar, cu ajutorul unei pipete. Se transfera imediat in mediul de cultura. Placile cu godeuri in care se transfera ovocitele sunt placi cu capac (transparent). Pe fiecare se inscriptioneaza numele pacientei. Fiecare ovocit aflat in mediu este ulterior examinat la microscop in ceea ce priveste calitatea lui, gradul de maturare (prezenta sau absenta veziculei germinale, prezenta globulului polar, ovocite degenerate, ovocite luteinizate) (Fig. 14; Fig. 15). Ovocitul matur este o celula rotunda, cu citoplasma clara, se vizualizeaza primul globulul polar; cumulus oophorus are o densitate scazuta, de asemenea corona radiata are o densitate celulara scazuta (Fig.13). In timpul examinarii se mentin stabile temperatura si pH-ul. Ovocitele vor fi apoi introduse in incubator, unde se pastreaza pana la momentul inseminarii cu sperma (aproximativ la 3-4 ore de la punctia foliculara).

48

Fig. 13 - Ovocit de calitate foarte buna

Fig. 14 - Ovocit imatur

Fig.15 - Ovocit de calitate scazuta Spatiul de lucru al embriologului trebuie sa fie in imediata vecinatate a incaperii unde se practica aspirarea ovocitelor, pentru a permite o manevrare rapida a acestor celule. Pentru fiecare pacienta se intocmeste un formular/fisa tip care cuprinde pe langa datele personale si cele inscrise de embriolog si cateva elemente de anamneza (cicluri anterioare, particularitati ale FIV anterioare daca este cazul), date despre proba de sperma. Actualmente exista numeroase medii de cultura comercializate industrial si numai este nevoie de prepararea lor in laborator. Placile cu mediul de cultura ovocitar sunt echilibrate in incubatorul CO2 cu 24 ore anterior punctiei foliculare in ceea ce priveste parametri pH, temperatura, osmolaritate. Mediul incubatorului contine amestecul de gaze in urmatoarea proportie 5% CO2, 5% O2, 90% N2 sau aer imbunatatit cu 5% CO2; obligatoriu temperatura constanta (37ºC), umiditate crescuta si posibilitatea de echilibrare rapida la manevrele de inchidere-deschidere. 49

Capitolul 5.5 Prelucrarea spermei A doua etapa dupa identificarea, spalarea si transferul ovocitelor in mediul de cultura este reprezentata de prelucrarea spermei. Spre deosebire de mediul de cultura ovocitar, mediile de preparare a spermei nu necesita incubare anterioara. De-a lungul timpului s-au dezvoltat mai multe metode de prelucrare, de obicei fiecare laborator preferand una din aceste tehnici. Scopul acestei preparari este de indepartare a lichidului seminal, care contine factori ce impiedica capacitatia si fertilizarea; se doreste indepartarea detritusurilor si a resturilor celulare si concentrarea spermatozoizilor cu mobilitate progresiva. Sperma se obtine prin masturbare, se colecteaza intr-un recipient steril cu aproximativ 2 ore inainte de momentul inseminarii ovocitelor. Se pot prepara si probe crioconservate si ulterior decongelate. Dupa recoltarea spermei se lasa la lichefiat 30 minute, dupa care se examineaza la microscop in camera Makler. Se stabileste daca se intrunesc criteriile OMS ale spermogramei si se urmareste mobilitatea spermatozoizilor. Ei pot fi cu mobilitate rapid progresiva, mobilitate progresiva incetinita, nu progreseaza, avand miscari pe loc sau sunt imobili. Caracteristicile unei spermograme normale (normospermie, normokinezie) conform criteriilor OMS (1992) [128]: Volum ≥ 2 ml pH: 7,2 – 8 Numar total/ejaculat: ≥ 40 x 106 Numar spermatozoizi/ml: ≥ 20 x 106 Mobilitate: ≥ 50 % cu mobilitate progresiva (clasele „a si b”) sau ≥ 25% mobilitate rapida liniara (categoria „a” pana la 60 min de la colectare) Morfologie: ≥ 30 % forme normale In spermograma trebuie sa se regaseasca >50% spermatozoizi vii, numaratoarea leucocitelor < 1x106 iar testul MAR sa fie negativ (anticorpi antispermatici). Modificari in unul din parametri enumerati sau asocierea lor produce alterarea capacitatii de fertilizare. Kruger si colab. au stabilit niste criterii stricte asupra morfologiei spermiei, de asemenea cu implicatii in rata fertilizarii [129].

50

In ceea ce priveste morfologia spermiilor s-au gasit multiple corelatii intre aceasta si fertilitatea [130]. Spermatozoizii sunt clasificati in 5 categorii: normali, cu cap anormal, anomalii ale gatului/piesei intermediare, anomalii ale cozii, imaturi. Conform clasificarii OMS o spermograma normala trebuie sa cuprinda > 30% forme normale (anterior valoarea era > 50%). Alta metoda de evaluare morfologica este reprezentata de criteriile stricte ale lui Thinus Kruger si colab. - Tygerberg Hospital, Africa de Sud. Acest sistem de clasificare se coreleaza tot mai mult cu rezultatele FIV in comparatie cu clasificarea OMS. Defectele luate in calcul sunt aceleasi ca si la incadrarea OMS, dar diferenta rezida in faptul ca aceste criterii foarte stricte trebuie intrunite ca spermiile sa fie apreciate ca normale. Conform acestor criterii > 14% forme normale sunt considerate pentru ca o sperma sa fie fertila. Restul se divide in 2 grupe: 5-14% forme normale: modelul “G”: prognostic bun de fertilizare (G: good) 0-4% forme normale: modelul “P”: prognostic prost de fertilizare (P: poor) In opinia lui Riedel si colab., pentru ca o sperma sa intruneasca proprietatile minime neceare pentru fecundare in cazul FIV conventional trebuie ca numarul total de spermatozoizi sa fie minim 5x106, mobilitatea progresiva cel putin 30% si morfologia normala minim 30% [131]. Orice alta modificare in sens negativ a parametrilor unei spermograme altereaza fertilitatea si are un prognostic de reusita mai redus. Metodele de prelucrarea a spermei Tehnica Percoll urmareste separarea spermiilor cu mobilitatea crescuta (care avand o densitate mai mare se sedimenteaza la partea inferioara a recipientului) de mediile de prelucrare, pipetate in concentratii/densitati diferite. Tehnica Percoll foloseste un coloid din particule silicate invelite in polivinilpirolidona (PVP), considerat actualmente cu potential toxic. A fost retras de catre producatori, in ideea sigurantei. Etapele metodei au fost descrise de Braude si Bolton [132]. In eprubeta de centrifuga se pipeteaza mediu Percoll dupa cum urmeaza: la fundul eprubetei 1 ml mediu Percoll 80%, deasupra un strat de mediu 40% (1 ml) si ultimul strat – cel superficial – sperma lichefiata. Se prepara astfel 2 eprubete continand mediu cu gradiente diferite si sperma la suprafata. Sperma este obtinuta si lasata la lichefiat dupa modalitatea descrisa mai sus, respectiv o proba din sperma se evalueaza anterior prelucrarii ei la camera Makler. Se centrifugheaza la

51

300 rotatii timp de 20-30 minute, dupa care se arunca supernatantul iar sedimentul de la fundul eprubetei (pellet) ce contine spermatozoizii, se suspenda in mediul de cultura FIV (mediu universal, Medicult) – 1,5 ml. Se centrifugheaza din nou la 550 rotatii timp de 10 minute. Se resuspenda sedimentul in 0,2 ml mediu FIV si se preleveaza 10 µl care se numara in camera Makler si se apreciaza mobilitatea, restul spermei se foloseste pentru inseminarea ovocitelor. Este posibil ca aceste gradiente sa protejeze sperma in timpul centrifugarii. Metoda Percoll a fost in timp inlocuita cu tehnica Sil Select, care foloseste gradiente de 45% si 90% ale unei solutii de particule de siliciu acoperite cu silan si care sunt diluate intr-o solutie salina tamponata cu mediul Earle. Pasii tehnicii Percoll se regasesc in procedeul Sil Select. Metoda swim-up (descrisa de Lopata si colab. in 1976) [133]: principiul metodei urmareste separarea spermatozoizilor mobili care dupa centrifugare migreaza din sediment spre mediul proaspat adaugat si de aici vor fi selectionati pentru inseminare. Etapele acestei tehnici sunt urmatoarele: se amesteca in raport de 1:1 o proba din ejaculatul lichefiat (la fundul unei eprubete de centrifuga) cu mediu FIV. Sperma se obtine prin masturbare intr-un recipient steril si prelucrarea ei incepe dupa 30 minute, timp necesar lichefierii. Dupa amestecarea probei de sperma cu mediul FIV se centrifugheaza la 550 rotatii timp de 10 minute. In cursul centrifugarii se depune sedimentul cu spermatozoizi la fundul eprubetei iar supernatantul care contine lichidul seminal cu componentele lui se arunca. Se resuspenda sedimentul in 3 ml mediu universal FIV si se centrifugheaza din nou timp de 10 minute la 550 rotatii. Supernatantul se arunca si se acopera sedimentul cu 1 ml mediu universal FIV dupa care se incubeaza in incubatorul CO2. In acest timp spermatozoizii mobili vor ascensiona in mediul proaspat adaugat, suspensia devenind opaca. Se pipeteaza 200 µl de la suprafata eprubetei in alta mai mica si se masoara 10 µl din suspensie care se evalueaza in camera Makler (numar si mobilitate). Aceasta tehnica are un prim timp in care mixeaza sperma neprelucrata cu mediul FIV, situatie care in cursul centrifugarii favorizeaza formarea de radicali oxidanti (ROS reactive oxygen species) (in cantitate mai crescuta in sperma neselectionata fata de cea selectionata prin metoda stratificarii). Acesti produsi induc procese de peroxidare a

52

lipidelor in spermii normale sau anormale si scad capacitatea lor de fecundare. ROS sunt produsi in mod special de polimorfonucleare (existente in mod normal in componenta spermei, sunt de 3 feluri: anioni superoxid, peroxizi de hidrogen si radical hidroxil. Plasma seminala contine antioxidanti care neutralizeaza ROS). Acesta reprezinta un dezavantaj important al tehnicii swim-up [134]; [135]. Se utilizeaza si alte tehnici derivate din cele descrise mai sus. Tehnica mini-swim-up urmareste concentrarea spermatozoizilor mobili in cel mai mic volum de mediu posibil, fiind aplicata in cazul oligoastenosteratozoospermiei. Etapele procedeului cuprind prepararea spermei dupa metoda swim-up si dupa acoperirea sedimentului cu 1 ml mediu universal FIV se transfera intr-un tub Eppendorf, de unde se centrifugheaza la 550 rotatii timp de 2-3 minute. Se indeparteaza cu grija supernatantul si se resuspenda sedimentul cu 5-10µl mediu universal FIV. Se incubeaza de la cateva minute pana la cateva ore. Suspensia se utilizeaza la inseminarea ovocitelor in cadrul FIV clasice sau se foloseste pentru injectarea spermatozoidului in ovocit in cadrul ICSI (injectia intracitoplasmatica a spermatozoidului). Filtrarea printr-un filtru de vata de sticla are ca principiu separarea spermiilor moarte sau anormale (care adera de acest filtru) de cele mobile, care traverseaza filtrul [136]. Adaugarea de pentoxifilina – imbunatateste mobilitatea spermiilor. Deoarece s-a constatat ca altereaza unele mecanisme intracelulare s-a renuntat la aceasta tehnica de crestere a calitatii spermei. Centrifugarea – urmareste separarea celulelor si a componentelor plasmei seminale de spermii. Se amesteca mediul de prelucrare cu sperma si se centrifugheaza de cateva ori la 300-550 rotatii. Sedimentul obtinut se resuspenda cu mediu si se utilizeaza pentru inseminarea ovocitelor. O metoda moderna de evaluare a concentratiei spermei si de stabilire a tipurilor de mobilitate este CASA (computer-assisted semen analysis), care necesita un echipament costisitor. Nu se efectueaza insa anterior unei evaluari OMS a spermogramei [179]. Sperma prelucrata dupa una din tehnicile descrise anterior se utilizeaza pentru inseminarea ovocitara in vitro, procedeu efectuat aproximativ la 3-4 ore (dupa unii autori 4-6 ore) de la recoltarea ei. Nu s-au remarcat insa procente diferite ale sarcinilor, chiar daca inseminarea s-a

53

efectuat la un interval mai mare (20 ore) de la aspirarea foliculilor, iar daca dupa 24 ore nu s-au constatat celulele cu 2 pronuclei se mai poate tenta o inseminare sau o injectie intracitoplasmatica a spermatozoizilor [137]. Numarul obisnuit de spermatozoizi la o inseminare este de 100.000 spermatozoizi mobili/ml sau 25.000 per ovocit. Daca dupa prelucrarea spermei se constata o mobilitate mai scazuta se va creste concentratia lor. Placile cu capac ce contin in godeurile lor ovocitele suspendate in mediul de cultura se scot din incubator si se aseaza pe placa microscopului aflata la 37 °C. Se calculeaza cantitatea/concentratia de spermatozoizi ce urmeaza a fi inseminati si se pipeteaza rapid in fiecare godeu. Dupa ce s-a finalizat pipetarea se inchide capacul si se verifica sub microscop cantitatea de spermatozoizi, dupa care se introduc placile din nou in incubator. Daca a fost necesar de adaugat o concentratie mai mare de spermatozoizi, se vor reimprospata mediile de cultura mai rapid, deoarece spermatozoizii in concentratie crescuta consuma substantele nutritive. Capitolul 5.6 Controlul fecundatiei Incubarea ovocitelor inseminate are loc inca 16-20 ore, dupa care urmeaza controlul fecundatiei prin vizualizarea pronucleilor la microscopul cu lumina inversata (40-250 x marire optica). In acest moment ovocitele sunt inconjurate de corona radiata si de celulele din cumulus. Pentru o buna vizualizare se indeparteaza celulele granuloase (disectia embrionului), se cauta numarul de pronuclei. Se evalueaza in continuare din punct de vedere morfologic ovocitele fecundate (aspectul citoplasmei, fragmentarea), grosimea zonei pellucida. Aspectul normal intalnit este cel de celula cu contur regulat, cu citoplasma clara, cu 2 pronuclei (2PN), 2 globuli polari, cu zona pellucida intacta (Fig.16). Se mai pot intalni tot ca situatie normala si aspecte de citoplasma fin granulara. Zigotul cu numar aberant de PN nu se pastreaza pentru embriotransfer (Fig.17). Totusi s-a determinat prin analiza FISH ca zigotul cu 1 PN poate avea numar diploid de cromozomi si daca clivarea lui ulterioara este normala se va putea folosi pentru implantare [138].

54

Fig.17 - Multipli PN (aberant)

Fig.16 - Celula cu 2 PN

In general se selecteaza ovocitele cu 2 PN si se incubeaza inca 24-30 ore, timp in care embrionul format se divide si ajunge in faza de 4 – 8 celule (Fig. 1; Fig.19). Zigotii care s-au selectat pentru cultura ulterioara se transfera in alte recipiente ce contin mediu de cultura preechilibrat. Nu se amesteca cu zigotii cu numar aberant de PN, care se cultiva separat. Embriologul noteaza toate datele constatate la fiecare zigot in parte. Intarzierea fecundarii poate fi o cauza de defect morfologic al ovocitului in marea majoritate a cazurilor (37%), mai rar un defect al spermiei (14,8%) si de obicei embrionii au o evolutie normala [139]. Conform altor observatii, la ovocitele care dupa un numar de 17-27 ore de la inseminare nu au prezentat aspectul de 2 PN s-a putut remarca a 2-a zi aspectul normal de clivare embrionara, totusi 30% din zigoti si-au oprit evolutia a 2-a zi si rata de implantare a fost mai scazuta la acesti embrioni comparativ cu cei proveniti din ovocite normal fecundate (6% comparativ cu 11,1%). La analiza citogenetica s-au constatat anomalii cromozomiale ale acestor embrioni [140]; [141].

55

Fig.18 - Embrion cu 2 celule

Fig.19 - Embrion cu 4 blastomere

Capitolul 5.7 Realizarea embriotransferului (ET) Cuplul la care urmeaza sa se efectueze embriotransferul (ET) trebuie sa ia decizia impreuna cu medicul si embriologul asupra numarului de embrioni ce urmeaza a fi transferati si asupra posibilitatii crioconservarii zigotilor supranumerari. Se crioconserva zigotii cu 2 PN, clar vizibili, cu zona pellucida intacta si cu contur celular regulat. La 48 ore de la punctia foliculara embrionii ajung in stadiul de 4 pana la 8 blastomere. Se selecteaza embrionii calitativ inalti si se transfera maxim 3 (in functie de particularitatile cazului chiar 1 sau 2 embrioni). Embrionii de ziua a 2-a se afla de fapt in stadiul in care in vivo ei se regasesc in trompa. Clasificarea embrionilor in functie de numarul blastomerelor, de marimea si forma lor, aspectul citoplamei si simetrie incearca sa stabileasca embrionii calitativ cei mai buni. Aceste clasificari sunt insa incomplete si sufera mereu imbunatatiri. O varianta de clasificare este urmatoarea [142]: Gradul 1 – numar par sau impar de blastomere, regulate, sferice, zona pellucida intacta, fragmentarea blastomerelor < 10% Gradul 2 – apare neregularitate a formei si fragmentare ≤ 10% Gradul 3 - < 50% din blastomere apar fragmentate, restul embrionului trebuie sa corespunda gradului 2

56

Gradul 4 - > 50% din blastomere sunt fragmentate Gradul 5 – zigot cu 2 PN in ziua a 2-a Gradul 6 – blastomere lizate, embrion fara viabilitate. Rata implantarii scade semnificativ odata cu cresterea gradului de apreciere calitativa a embrionilor. ET se realizeaza ziua 2 sau 3 de la recoltarea ovocitara. Se poate implanta embrionul si in stadiul de blastocist, in ziua 5-6 de la punctia foliculara, stadiu in care embrionul patrunde in cavitatea uterina in vivo si care se insoteste de un procent mai mare al implantarii (Fig. 20). Se prefera embrionii calitativ inalti. Daca in ziua a 2-a se intalnesc doar zigoti cu 2 PN se mai pastreaza in mediu de cultura inca o zi, pentru a se obtine clivarea scontata.

Fig.20 - Blastocist ziua a 5-a Pacienta se afla in decubit dorsal pe masa ginecologica, cu membrele inferioare in abductie. Se aplica un specul si se efectueaza lavajul vaginului cu ser fiziologic dupa care se tamponeaza cu un tampon steril. Medicul (care poarta manusi sterile netalcate) va cateteriza canalul cervical cu un cateter special de embriotransfer, patrunzand in cavitatea uterina in imediata vecinatate a fundului uterin (fara insa a-l atinge). Se extrage mandrenul cateterului si se asteapta embriologul. Aceasta manevra trebuie sa fie atraumatica. In acest timp embriologul extrage embrionii din mediul de cultura, dupa ce i-a selectat pe cei mai aspectuosi (1, 2 sau maxim 3 embrioni). Se aspira embrionii intr-un cateter impreuna cu mediu si

57

se ataseaza unei seringi, ce contine de asemenea mediu. Volumul care se transfera este de 15-20 µl. Embriologul introduce cu miscari fine cateterul cu embrioni prin teaca cateterului plasat intrauterin si injecteaza continutul (mediu si embrioni), dupa care este obligatorie verificarea microscopica, pentru a nu se lasa embrioni pe parcursul cateterului. ET se poate efectua si ecoghidat. Unele centre folosesc calciu ca marcaj (vizibil la ecoghidaj) pentru a indica pozitia intrauterina a varfului cateterului. Daca ET a reusit se va extrage cateterul si speculul iar pacienta ramane in repaus aproximativ 2 ore. Testul de sarcina se efectueaza la 10-12 zile dupa ET (βHCG). In aceasta perioada faza luteala este sustinuta cu progestativ: progesteron micronizat (doza variabila, de obicei 3x200 mg/zi, intravaginal sau oral). Conform unui studiu efectuat in anul 2004 (studiu dublu-orb, randomizat, controlat placebo) la care s-au administrat 10 mg piroxicam per os cu 1-2 ore anterior ET, s-a constatat o rata mai mare de implantare (18,7 versus 8,6%) si o rata mai mare de sarcini (46,7% versus 27,6%) comparativ cu lotul control. Pacientele care au intrat in studiu au avut varsta sub 40 de ani; cauza tubara, masculina de sterilitate, endometrioza, infertilitate idiopatica. Nu s-a observat un beneficiu al administrarii piroxicamului in cazul infertilitatii idiopatice sau la paciente peste 40 ani. La aceste paciente s-a efectuat FIV/ET cu embrioni proaspeti (ET la 72 ore dupa inseminarea ovocitelor) sau cu embrioni decongelati (la 72 ore dupa declansarea ovulatiei). Efectul se datoreaza posibil cresterii fluxului sanguin uterin, scaderii contractilitatii uterine ce apare frecvent in cursul ET si care poate fi raspunzatoare de expulzia embrionului [143]. Capitolul 5.8 Rezultatele generale ale FIV Initial rata de succes in urma FIV/ET a fost de 20-25%, actualmente rata sarcinilor/embriotransfer depaseste in unele centre 25%. Desigur ca aceste procente sunt influentate de varsta pacientei, de factorul masculin supraadaugat. In jur de 5% din sarcinile obtinute sunt sarcini extrauterine, explicate probabil prin ovulatiile multiple si nivelurile hormonale crescute prin suprastimulare [144]. Rata sarcinilor multiple este ridicata, se situeaza in jur de 30%, fiind crescuta si de ET cu 2 sau 3 embrioni. Rata avorturilor este comparativa cu populatia care concepe natural (in jur de 20 %). Un studiu efectuat intre anii 1994-1999 pe 6045 ET a constatat o rata de 16% avorturi

58

(cazuri de sarcina incipienta, definita inainte de 6-7 saptamani de gestatie), avand ca factori de risc fumatul si transferul unor embrioni de calitate redusa [145]. Ceea ce este deosebit de important si s-a constatat in urma supravegherii copiilor nascuti din sacini provenite FIV/ET este ca acest procedeu nu creste numarul malformatiilor congenitale; acestea se situeaza la nivelul populatiei care concepe pe cale naturala. Datele furnizate de grupul Norfolk pentru rata cumulativa a sarcinilor pentru 1-6 cicluri FIV/ET sunt urmatoarele [146]: 1 ciclu: 13,5% 2 cicluri: 25,3% 3 cicluri: 38,5% 4 cicluri: 47% 5 cicluri: 49,3% 6 cicluri: 57,8% S-au exclus din start cuplurile cu factor masculin de sterilitate. Rata sarcinilor nu se modifica radical la cicluri FIV/ET succesive. Pacientele care parcurg intre 3-6 cicluri au o sansa buna de-a obtine sarcina. Datele sunt similare cu cele obtinute la Hallam Medical Centre (Londra) unde 45 % din femeile < 35 ani au nascut 1 copil in cadrul a 5 cicluri FIV/ET [147]. Capitolul 5.9 GIFT (gamete intrafallopian transfer) si ZIFT (zygote intrafallopian transfer) De la primele reusite ale FIV pana in ziua de astazi s-au adus multiple perfectionari metodei, dar au fost dezvoltate si alte procedee, in scopul de-a imbunatati rata sarcinilor. O metoda de reproducere asistata este reprezentata de GIFT (gamete intrafallopian transfer), adica transferul intratubar al gametilor. Ofera avantajul ca fecundatia are loc in vivo, embrionii se formeaza in mediul lor natural si parcurg traseul lor fiziologic spre cavitatea uterina. Se evita astfel riscul de expulzie al embrionilor, care exista in cazul unui ET. Transferul gametilor are loc prin doua modalitati, fie se introduc in trompa pe cale laparoscopica prin capatul distal tubar, fie se introduc transcervical-transuterin sub ghidaj ecografic [148]. Este important de injectat foarte lent, cu o viteza de 1µl/secunda, iar volumul injectat este de asemenea redus (<50µl).

59

Tehnica presupune obtinerea spermei cu minim 2 ore inainte de inceperea procedurii. Sperma se obtine si se prepara ca la tehnicile descrise pentru FIV clasic. Se doresc in final obtinerea a 3-5 milioane spermii mobile/ml, astfel incat in trompa se vor transfera 100.000200.000 spermii. Recoltarea ovocitara are loc prin punctie foliculara transvaginala ecoghidata direct (transvaginal), metoda care a fost expusa la FIV conventionala. Recoltarea ovocitara se mai poate efectua pe cale laparoscopica, dar foarte rar. In urma aspiratului folicular se identifica ovocitele, se spala si se selecteaza cele mature (metafaza II). Manipularea ovocitelor se face in conditii constante de temperatura, pentru a evita degradarea lor datorita variatiilor termice. Pe o placa Petri calda (37°C) se picura 50-100 µl din suspensia spermei prelucrate si ulterior se transfera ovocitele. Se spala o seringa si un cateter GIFT cu mediu de cultura si se aspira amestecul ovocite-sperma (20 µl aer, 30-40 µl ovocite+sperma, 10-20µl aer). In cazul in care volumul de sperma a fost insuficient, se prefera aspirarea in cateter dupa cum urmeaza: 20 µl aer, 10-15 µl sperma, 10 µl ovocite suspendate in mediu, 10-15 µl sperma, 20 µl aer [142]. Continutul cateterului se transfera imediat in trompa. La sfarsitul procedurii este obligatorie examinarea cateterului sub microscop, pentru a nu ramane ovocite pe parcursul acestuia. Rata sarcinilor obtinute in urma procedeului GIFT, conform datelor provenind din SUA si Canada pe anul 1991, au fost de 26,5% nasteri/punctie foliculara. In acelasi an (1991) rata sarcinilor pentru FIV/ET a fost de 15,25%/punctie foliculara (18% pentru femeile de varsta <40 ani). S-a exclus din start factorul masculin. Numarul de sarcini extrauterine a fost comparabil pentru cele doua tehnici (3% pentru GIFT si 5% pentru FIV/ET) si numarul de sarcini multiple a fost de asemenea comparabil (aproximativ 30%) [149]. World Collaborative Report on Assisted Reproduction a publicat in 1993 rezultatele a 99.314 de cicluri FIV/ET, dintre care 10% au fost reprezentate de GIFT. Rata sarcinilor clinice in cazul FIV a fost de 17,9% si o rata de nou nascuti vii de 12,9%. Comparativ cu FIV, in cazul GIFT procentele au fost mai ridicate: 29,3% rata sarcinilor clinice si 20,8% procentul nou nascutilor vii. Probabil ca acestea se datoreaza faptului ca procesul de fecundare se realizeaza in vivo, in conditiile sale naturale, cu parcurgerea unui traseu natural pana la implantare, implicand inca o serie de factori necunoscuti [150]. O alta posibilitate de transfer intratubar (tot in ideea de-a creste rata implantarii si a sarcinilor) presupune plasarea zigotului la acest nivel (ZIFT – zygote intrafallopian transfer),

60

modalitatile de transfer fiind ca la GIFT. Statisticile din anul 1991 arata ca numarul de sarcini/punctie ZIFT este de 19,7%. Odata cu introducerea ZIFT entuziasmul a fost mare, dar actualmente se considera ca ZIFT nu este superior FIV/ET. Conform datelor din unele cercetari clinice rezultatele FIV sunt comparabile cu cele GIFT/ZIFT [151]; [152]. Alegerea uneia dintre variante depinde si de istoricul pacientei. Daca a fost verificata fecundarea cu alta ocazie, se poate tenta GIFT. Evident ca daca exista leziune tubara, cele 2 metode - GIFT si ZIFT, nu isi au rostul si se aplica FIV/ET. S-a mai descris si transferul tubar de embrioni (TET – tubal embryo transfer) care presupune transferul embrionilor clivati in trompa sau POST (peritoneal oocyte and sperm transfer) – transferul de ovocite si sperma intraperitoneal, metode care sunt de ordin istoric [153].

61

Capitolul 6 Tehnici de micromanipulare in cadrul reproducerii umane asistate Capitolul 6.1 Tehnici de micromanipulare premergatoare ICSI Esecul fecundarii la procedeul conventional de FIV/ET este o problema majora in cazul cuplului cu factor masculin preponderent. Rata fertilizarii in aceste cazuri este cu mult mai scazuta fata de alte etiologii ale sterilitatii (factor tubar, endometrioza, chiar si infertilitatea idiopatica). In anii ′80 s-au pus la punct metode de microinjectie care au reusit imbunatatirea procentului fertilitatii si la aceste cupluri cu factor masculin. Scopul este de a indeparta barierele naturale care se afla in calea spermatozoizilor, spermatozoizi care prezinta anomalii de numar, mobilitate sau asocierea acestora, posibil si alti factori. Este vorba de procedeele ZD (zona drilling – perforarea zonei pellucida, Gordon si colab.), PZD (partial zona dissection – disectia partiala a zonei pellucida) (Cohen si colab.), SUZI (subzonal insemination – inseminarea subzonala) (Ng si colab.), ICSI (intracytoplasmic sperm injectioninjectarea intracitoplasmatica a unui spermatozoid intr-un ovocit) (Lanzendorf si colab., Palermo si colab.), care au imbunatatit substantial ratele de fertilizare si au crescut si ratele de implantare in mod simtitor. Reprezinta un enorm progres al tehnicilor de reproducere asistata. Zona drilling (ZD) a fost efectuata pentru prima oara pe embrion uman de catre Gordon si Talansky in anul 1986, reusind digestia enzimatica a zonei pellucida cu o solutie acida Tyrode. S-a dovedit ulterior ca aceasta substanta inhiba dezvoltarea embrionara si metoda a fost abandonata [154]. O alta varianta de penetrare a zonei pellucida pentru a usura patrunderea spermiilor este PZD (partial zona dissection). A fost practicata in 1989 de Cohen si colab.[155]; [156]. Dupa creearea unui orificiu la nivelul zonei (metoda mecanica) s-a incubat ovocitul cu sperma (100.000 spermatozoizi/ 50 µl). Rata fertilizarii a fost imbunatatita si rata sarcinilor a crescut. Totusi o deschidere mai mare la nivelul zonei poate face embrionul vulnerabil la alti factori sau poate favoriza eliminarea unor blastomere prin acest orificiu [157]. PZD se poate aplica unor 62

cupluri cu factor masculin moderat modificat, nu se poate realiza daca nu exista spermatozoizi capacitati, cu reactie acrozomiala si mobili; doar acestia pot patrunde liber prin orificiul creeat. Se intalneste mai frecvent in cazul PZD polispermia, ceea ce reduce implicit numarul de embrioni pentru ET. O tehnica mai elaborata, care faciliteaza si mai mult penetrarea spermiilor prin inlaturarea si mai accentuata a obstacolelor, este SUZI (subzonal insemination). Prima sarcina obtinuta dupa acest procedeu de microinjectie/micromanipulare a fost in 1988 (Ng si colab.) [158]. Se injecteaza aproximativ 3-5 spermatozoizi in spatiul perivitelin (se evita injectarea unui numar foarte mare pentru a nu favoriza polispermia). La fel ca si pentru metoda anterioara (PZD) doar spermatozoizii capacitati si cu reactie acrozomiala pot penetra in continuare oolema, dar spre deosebire de PZD, in cazul SUZI se pot injecta spermatozoizi imobili sau cu mobilitate foarte scazuta. Se aplica cazurilor cu oligozoospermie, astenozoospermie, teratozoospermie sau combinarea acestora [159]. Capitolul 6.2 ICSI (intracytoplasmic sperm injection) ICSI (intracytoplasmic sperm injection) implica injectarea directa a unui singur spermatozoid in interiorul ovocitului. ICSI a fost aplicata ca tehnica inca din anii ’60 pe model experimental pentru a cerceta succesiunea evenimentelor ce au loc in cadrul fecundarii [160]. Ulterior s-a aplicat pe scara larga in modelele experimentale in studiul fuziunii gametilor, a formarii celor 2 PN. La om a fost introdusa de diverse grupuri de studiu (Cohen si colab., Lanzendorf si colab., Ng si colab., Palermo si colab., Fishel si colab.) intre anii 1988-1992. Lanzendorf si colab. au efectuat prima ICSI pe ovocit uman in scopul studierii formarii pronucleului masculin [161], [180]. Prima sarcina obtinuta la om a fost in 1992 de catre Palermo si colab. [162]. Tehnica ICSI scurtcircuiteaza penetrarea oolemei si fuziunea cu membrana ovocitara si poate injecta intraovocitar orice spermatozoid. S-a demonstrat ca dupa injectarea capului spermatozoidului se produce decondensarea si eliminarea materialului genetic cu formarea ulterior a pronucleului masculin. Astfel ca se poate injecta si spermatozoid imobil sau mort sau cu defecte majore [163].

63

Injectarea capului spermatozoidului sau numai a nucleului are ca efect decondensarea nucleului; centriolul proximal (din portiunea intermediara) va forma fusul mitotic si joaca un rol important in formarea si dezvoltarea embrionului. Prin aceasta se deduce ca atat capul cat si piesa intermediara a spermatozoidului au rol in dezvoltarea embrionului [164]. Imobilizarea mecanica a spermatozoidului (anterior efectuarii ICSI) prin compresia si rularea cozii sale induce in grad variabil alterarea si in unele situatii chiar pierderea acrozomului, modificare ce se insoteste de o rata mai crescuta a fertilitatii [186]. Prin perfectionarea acestei tehnici de microinjectie s-au adus mari sperante cuplurilor carora pana atunci le era imposibil sa conceapa. Succesul ICSI depinde de tehnica injectarii, caracteristicile spermei si ale ovocitelor (maturarea ovocitara). Factorul decisiv este insa activarea ovocitului si nu reactia acrozomiala [165]. Nu este inca clar stabilit care este factorul de activare ovocitara, se pare ca spermatozoidul joaca acest rol, posibil prin eliberarea unui factor citoplasmatic [164]. Dintre toate procedeele de micromanipulare care se aplica in caz de factor masculin de infertilitate, este evident ca ICSI are procentul cel mai crescut de reusita, s-au obtinut cele mai mari rate de sarcini, fiind actualmente metoda preferata pentru reproducerea asistata. Indicatiile ICSI Ejaculat: - oligozoospermie (< 20 x106) - astenozoospermie (< 40% spermatozoizi cu mobilitate progresiva, din care minim 10% sunt tip „a”) - teratozoospermie (conform criteriilor stricte ale lui Kruger < 14% forme normale) combinarea celor 3 parametri - globozoospermie - anticorpi antispermatici prezenti (testul MAR pozitiv) - esecul repetat la FIV/ET conventional (absenta fecundarii) - ejaculare retrograda Sperma din epididim (absenta congenitala a vaselor deferente, esec la reanastomoza dupa sterilizarea masculina – vaso-epididimostomie sau vaso-vasostomie, obstructie bilaterala a ductelor deferente)

64

Spermatozoizi testiculari (indicatiile spermei epididimale, fibroza epididimala, azoospermia de diverse cauze, necrozoospermia) Succese mai mari se obtin la injectarea unui spermatozoid mobil intraovocitar. Daca nu se depisteaza in proba de sperma decat spermatozoizi imobili, se recurge la teste de viabilitate. Testul cu eozina exclude spermatozoizii morti. Testul de reactie la mediul hipoosmotic urmareste identificarea spermatozoizilor vii, care avand membrana intacta si introdusi in mediul salin hipoosmotic acumuleaza apa in portiunea lor distala. Acestia vor fi selectati pentru ICSI [166]. Unele studii au considerat ca anticorpii antispermatici nu influenteaza negativ sansele ICSI [167]. In cazul in care in ejaculat nu se gasesc spermatozoizi vii se poate recurge la obtinerea unei probe testiculare de spermatozoizi. Obtinerea spermatozoizilor din epididim se face printr-o metoda microchirurgicala – MESA (microsurgical epididymal aspiration) care presupune extragerea lor prin aspirare, sub anestezie generala. Mai rar se foloseste PESA (percutaneous epididymal sperm aspiration) care este o aspirare percutana efectuata in anestezie locala [168]. Daca nici in proba epididimala nu se gasesc spermatozoizi se apeleaza la biopsia testiculara. Uneori si aceasta poate fi repetata. Se intalnesc situatii la care nici in cazul biopsiilor testiculare repetate (in cazul azoospermiei) nu se identifica spermatozoizi. Ca tehnica se practica fie o biopsie testiculara deschisa, excizionala (TESE – testicular sperm extraction) sau o biopsie prin aspirare pe ac subtire [169]. Prelucrarea pieselor de biopsie se face fie mecanic, fie enzimatic. Foarte frecvent se crioconserva spermatozoizii din piesele de biopsie sau din epididim, evitand astfel procedeele microchirurgicale [170]. Capitolul 6.3 Tehnica microinjectarii Pentru a efectua procedeul ICSI este necesara o aparatura performanta, care sa permita injectarea unui spermatozoid intr-un ovocit. Echipamentul pentru ICSI presupune un microscop cu lumina inversata, cu putere de marire de 200-400 x, cu placa de lucru ce se incalzeste si mentine temperatura constanta. La acest microscop sunt atasate 2 unitati de manipulatori care permit miscari in cele 3 planuri, un manipulator electric ce permite miscari mai ample, mai putin fine si un manipulator hidraulic cu un joystick, care este utilizat la miscarile fine. Micropipetele

65

de sticla, care sunt dirijate de manipulatoarele descrise, au rolul de-a fixa ovocitul (una dintre pipete) si de-a aspira si ulterior injecta spermatozoidul (cealalta pipeta) (Fig. 21). Sistemul de manipulare este conectat de micropipete prin tuburi de teflon, in care se afla ulei mineral. Cele 2 micropipete au lungimea de 10 cm, prezinta cateva diferente intre ele, amandoua sunt insa angulate, formand intre cele 2 brate un unghi obtuz si cu orizontala un unghi de 30°. Micropipeta de fixare are orificiul extern al bratului scurt (nivelul la care se fixeaza ovocitul) sectionat vertical, diametrul extern este de 80-100µ si cel intern de 15-20µ. Micropipeta de aspirareinjectare are varful bratului scurt retezat oblic (nivel la care se aspira spermatozoidul, se inteapa oolema si apoi se injecteaza), diametrul interior: 5-6µ si cel extern: 7-8µ. Aceste micropipete se comercializeaza industrial, exista insa centre/laboratoare care le manufactureaza singure. Intregul sistem de micromanipulare este plasat pe o masa rezistenta la vibratiile din mediul extern. Se poate atasa un monitor la sistemul optic si se urmareste procedeul pe ecranul monitorului. De asemenea exista si posibilitatea efectuarii unor filmari sau a unor imagini statice.

Fig.21 - Cele 2 micropipete de sticla ale sistemului de microinjectie Ovocitele se recolteaza in aceeasi maniera ca si in FIV conventionala. Se alege procedeul cel mai potrivit de stimulare ovariana si aspirarea foliculara are loc la 36 ore dupa administrarea HCG, prin punctie vaginala ecoghidata transvaginal. Eprubetele cu lichidul folicular sunt preluate de embriolog, se identifica ovocitele, se indeparteaza cumulus oophorus si corona radiata (mecanic si enzimatic cu hialuronidaza) pentru o mai buna apreciere a maturitatii celulelor si pentru a permite injectarea acestora. Pentru ICSI se aleg doar ovocitele mature –

66

metafaza II (si nu ovocite imature sau degenerate ca in Fig. 22). Se vizualizeaza la microscop cu marire optica 200x, se analizeaza si apectul zonei pellucida, care trebuie sa fie intacta. Ovocitele cu vezicula germinala prezenta se cultiva in mediu 24 ore si se injecteaza ulterior (in cazul in care ovocitele in metafaza II sunt putine). S-au obtinut putine sarcini in urma injectarii ovocitelor imature [171]. Dupa selectarea ovocitelor mature, spalate si denudate, acestea se pastreaza in incubator in mediul de cultura pana in momentul injectarii.

Fig. 22 - Ovocit degenerat Spermatozoizii pentru microinjectie se obtin fie din prepararea ejaculatului sau prin procedee microchirurgicale - spermatozoizi obtinuti de la nivelul epididimului sau testicul. De asemenea se poate prelucra sperma crioconservata. Prepararea spermei a fost deja expusa. Tehnica de injectare propriu-zisa consta in plasarea unei placi speciale pe suprafata incalzita a microscopului (37°C), placa care are 1 godeu central ce contine solutie PVP (polivinilpirolidona) si 1µl din suspensia de sperma, plasata la periferia picaturii PVP. Rolul solutiei PVP este de-a incetini miscarea spermiilor, pentru ca acestea sa fie mai usor aspirate si totodata previne aderarea spermiilor de peretii micropipetei. Godeul central este inconjurat de alte 8 godeuri ce contin fiecare cate un ovocit plasat in mediul de cultura, acoperit cu ulei mineral. (Fig. 23) Microinjectia se efectueaza la microscopul cu lumina inversata, la marire optica de 400x.

67

Fig. 23 - Placa de microinjectie cu cele 9 godeuri Se urmaresc 3 etape importante: -

selectarea si aspirarea spermatozoidului (de preferat mobil) in micropipeta

-

pozitionarea corecta a ovocitului (prin fixarea lui cu micropipeta de fixare)

-

inteparea mebranei ovocitare inainte de injectarea spermatozoidului.

Primul timp este de alegere al spermatozoidului viu, mobil si care dupa imobilizare se aspira in micropipeta corespunzatoare. In momentul aspiratiei se urmareste lezarea cozii spermatozoidului, dar intotdeauna la un punct inferior de piesa intermediara (care contine centriolul proximal). S-a dovedit ca imobilizarea spermiei are rol in activarea ovocitara, care constituie un punct cheie in mecanismul fecundarii (prin eliberarea unor factori citozolici din spermie). Aspirarea spermatozoidului in micropipeta are loc intotdeauna intai cu coada, astfel incat capul spermiei se afla intotdeuna mai aproape de varful micropipetei. Se urmareste injectare celulei impreuna cu un volum minim de mediu. Se aspira de fiecare data doar un spermatozoid in pipeta, pipeta ce contine solutie PVP. Micropipeta de fixare va mentine intr-o pozitie stabila ovocitul, printr-un usor proces de aspirare. S-a constatat ca pozitionarea corecta este cea cu globulul polar in pozitia „6”, perforarea oolemei avand loc la ora „3” si micropipeta de fixare imobilizeaza ovocitul la ora „9” (Fig. 24).

68

In aceasta pozitie nu se lezeaza fusul mitotic in cursul injectarii. Urmatorul pas este de penetrare a zonei pellucida (relativ usor) si a oolemei (mai dificil) cu varful micropipetei ce contine spermatozoidul. Penetrarea are loc in planul ecuatorial al ovocitului (Fig. 25). Pentru a facilita inteparea membranei ovocitare se aspira usor cu micropipeta de aspirare (artificiu de tehnica). O accelerare a fluxului semnifica penetrarea membranei si patrunderea ooplasmei in micropipeta. Se opreste suctiunea si se injecteaza incet spermatozoidul in citoplasma ovocitului (Fig. 26), dupa care se retrage micropipeta de aspiratie. In acelasi mod se procedeaza cu urmatoarele ovocite. Se injecteaza doar un spermatozoid intr-un singur ovocit (Fig.27). Nu se injecteaza mai mult de 3-4 ovocite succesiv intr-o etapa.

Fig. 24 - Fixarea ovocitului

Fig. 25 - Inteparea oolemei, spermatozoidul se vizualizeaza in micropipeta

69

Fig. 26 - Injectarea spermatozoidului

Fig.27- ICSI, ovocit fixat, cu primul globul polar in pozitia „12” (mai rar)

Dupa injectarea tuturor ovocitelor, acestea se spala, se transfera in placi ce contin mediu de cultura, acoperit cu ulei de parafina si se introduc la incubator (temperatura 37°C, atmosfera de 5% O2, 5% CO2, 90% N2). Controlul fertilizarii are loc la 16-20 ore de la microinjectarea ovocitelor, prin vizualizarea celulelor cu 2 PN, la fel ca si in cazul FIV clasice (Fig. 28). Si in cazul ICSI, embriologul noteaza pe o fisa tip datele pacientei, numarul de ovocite injectate, gradul lor de maturare, aspectul lor, aspectul zonei pellucida, descrierea spermatozoizilor si provenienta lor, procedeul de prelucrare a spermei, eventual daca s-a folosit sperma crioconservata. La controlul fecundarii se noteaza aspectul celulelor, numarul PN si al globulilor polari. Se aleg pentru ET (embriotransfer) doar celulele cu 2 PN. Ovocitele injectate care prezinta doar 1 PN (aproximativ 3%) posibil ca au rezultat din activare partenogenetica si nu se transfera. Ovocitele injectate ce au 3 PN (aproximativ 4 %) probabil ca nu au eliminat cel de-al 2-lea globul polar si nici acestea nu se transfera [172].

70

Fig.28 - Prezigot, sunt vizibili cei 2 PN Ovocitele cu 2 PN care au fost selectate pentru ET se pastreaza in mediu de cultura in incubator inca 24 ore. Dupa aceea se examineaza la microscop si se apreciaza numarul si aspectul blastomerelor, fragmentarea celulara. Se stabileste o clasificare a calitatii embrionilor dupa dimensiunea si egalitatea blastomerelor si numarul de fragmente anucleate. Sunt 4 categorii de incadrare a embrionilor: •

Tip A: embrioni calitativ foarte buni, fara fragmente anucleate, blastomerele au aceeasi marime;

•

Tip B: embrioni calitativ buni, blastomere inegale si fragmente anucleate ≤ 20% din volumul embrionului;

•

Tip C: embrioni calitativ mediu, fragmente anucleate 21-50% din volumul embrionului;

•

Tip D: embrioni slab calitativ, cu fragmente anucleate ≥ 50% din volumul embrionului.

In urma acestei clasificari se transfera doar embrionii de tip A,B,C. Se prefera transferul a 2 embrioni, in functie de particularitatile cazului si 3 embrioni, dar niciodata peste 3 embrioni. Datele actuale sustin ca in urma ciclurilor de stimulare ovariana in vederea ICSI este posibil in 90% din cazuri transferul a macar unui embrion si nu exista influente determinate de provenienta spermatozoizilor [172].

71

De obicei se transfera embrioni de 48 ore, dar s-au obtinut rate similare de implantare si in cazul transferurilor cu embrioni de 72 ore (Fig. 29 a si b). Embrionii tip A sau B care sunt in plus se pot crioconserva.

a

b

Fig. 29 a si b - Embrioni (ICSI) cu 8 blastomere (72 ore) (in imaginea b: in planul focusat se vizualizeaza 6 din cele 8 blastomere) Modalitatea de ET este similara cu cea din FIV clasica, descrisa deja. Sustinerea fazei luteale are loc de asemenea cu progesteron (doze variabile, intravaginal sau oral) – cel mai frecvent sau cu HCG (administrat intramuscular). Efectuarea testului de sarcina prin determinarea β-HCG are loc la 10-12 zile de la ET. Capitolul 6.4 Rezultatele ICSI Odata cu introducerea tehnicii ICSI si cu perfectionarea echipelor de lucru a crescut tot mai mult numarul practicarii acestui procedeu, astfel ca in 1993 s-au raportat 3.157 cicluri ICSI, numarul lor a crescut la 12.586 in 1994 si in 1995 a ajuns la 47.654 (Tarlatzis, 1996) [173].

72

Cel de-al 2-lea raport al ESHRE Task Force despre ICSI cuprinde rezultatele a 13.666 cicluri ICSI efectuate in 1994 de catre 94 centre in 24 tari [174]. Din aceste cicluri ICSI in 94,4% s-au injectat spermatozoizi din ejaculat, in 4,1% din epididim si in 1,5% spermatozoizii erau de provenienta testiculara. In 12.284 din aceste cicluri s-au obtinut in medie 8,3 ovocite/ciclu stimulat. Rata de supravietuire a ovocitelor dupa ICSI (dupa injectare) a fost de aproximativ 90%, nu s-au observat diferente in functie de provenienta spermiilor. Rata sarcinilor (β-HCG pozitiv)/punctie foliculara a fost intre 28-32,8%, de asemenea nu s-au semnalat diferente semnificative intre cele 3 grupe de spermii. Din numarul total de sarcini s-au nascut in 71,2 % din cazuri – 1 copil, in 26,2% din cazuri – gemeni si in 2,4% din cazuri-tripleti. In dorinta de-a cunoaste cat mai clar siguranta si eficacitatea ICSI, Societatea Europeana de Reproducere Umana si Embriologie (ESHRE) a stabilit cateva obiective majore in scopul de-a colecta anual rezultatele clinice. Aceste rezultate insumate pe perioada 1993-1995 (din centrele unde se efectueaza ICSI) au aratat ca din totalul de 39.675 de cicluri – 36.774 au folosit spermatozoizi din ejaculat, 1784 spermii din epididim si 1153 cicluri – spermii din testicul. Rata de fertilizare raportata la originea spermatozoizilor a fost de 61,5% pentru ejaculat, 57,6% pentru epididim si 51,5% pentru testicul. Rata sarcinilor viabile a fost de 23,9%; 25,7% si respectiv 31,3%. Prin urmare rata fertilizarii si a sarcinii a fost crescuta si nu a depins de provenienta spermatozoizilor. Nu s-a remarcat un risc mai crescut pentru malformatii majore sau minore si a fost considerat ca similar fata de FIV/ET sau conceptia naturala. Pe de alta parte, incidenta aberatiilor legate de cromozomul sexual si a celor autozomale au fost mai crescute la copiii rezultati din sarcini ICSI fata de populatia neonatala generala. Explicatia rezida in mostenirea anomaliilor cromozomiale provenite de la mama cat si defecte depistate de-novo la nivelul cromozomilor sexuali si autozomali [183]. O statistica pe un numar de 2820 cicluri ICSI (Liu si colab., 1995) a aratat urmatoarele rezultate: s-au injectat 29.415 ovocite in metafaza II, adica o medie de 10,4 ovocite/ciclu. Numarul de ovocite intacte dupa ICSI a fost de 26.228 (89,2% din ovocitele injectate). Numarul de ovocite injectate cu succes/ciclu a fost de 9,3. Numarul de ovocite fertilizate a fost 18.364, adica 70% din ovocitele injectate cu succes, care reprezinta 62,4% din ovocitele in metafaza II, respectiv 50,4% din ovocitele obtinute/punctie foliculara. Numarul de ovocite ce au prezentat fertilizare anormala a fost de 2185 (care au prezentat prezigoti cu 1 PN si cu 3 PN). In tabelul 6

73

sunt redate sumarizat datele fertilizarii si a dezvoltarii embrionare in functie de provenienta spermei utilizate in cadrul ICSI [175]. Tabel 6 - Statistica pe 2820 cicluri ICSI cu spermii de diferite proveniente Spermii din ejaculat

Spermii din epididim

Spermii din testicul

Cicluri ICSI

2572

128

120

Ovocite injectate

26.343

1.628

1.444

% ovocite intacte

89%

90%

89%

16.758

844

767

67

71

dupa microinjectare Celule cu 2 PN

% embrioni transferati 74

Din tabel reiese ca numarul de embrioni transferati a fost ceva mai mare in cazul ICSI cu spermatozoizi din ejaculat fata de cei obtinuti din epididim si din testicul. Tabel 7 - Rata sarcinilor in functie de numarul de embrioni transferati si de provenienta spermatozoizilor Ejaculat

Epididim

Testicul

Numar

%

Numar

%

Numar

%

Cicluri

2572

-

128

-

120

-

Transfer

2382

93

117

91

108

90

1 embrion

21/204

10

1/7

14

2/14

14

2 embrioni

78/321

24

3/15

20

4/13

32

2 embrioni (electiv) 3 embrioni

218/488

45

3/14

21

3/12

25

253/694

36

17/37

46

10/21

48

3 embrioni (electiv) >3 embrioni

254/544

47

17/24

71

11/20

55

47/131

36

9/20

45

13/28

46

Sarcini/ET

871/2382

37

50/117

43

43/108

40

Sarcini/ET

Sarcini/ciclu

34

39

74

36

Daca se analizeaza la acelasi numar de cicluri ICSI rata sarcinilor /numar embrioni transferati si dependent de provenienta spermatozoizilor se obtin datele sumarizate in tabelul 7. Din tabel reiese ca din cele 2820 cicluri ICSI initiale s-a efectuat embriotransfer in 2607 (92,6%) cicluri. Rata de transfer a fost comparabila la cele 3 grupuri care au folosit spermatozoizi de la 3 niveluri diferite. Rata sarcinilor/transfer a fost de asemenea similara pentru ICSI cu spermatozoizi din ejaculat (37%) fata de spermatozoizi din epididim (43%) si din testicul (40%). Rata sarcinilor a fost influentata pozitiv daca ET s-a efectuat cu 2 sau 3 embrioni electivi. Statisticile expuse si multe alte studii clinice efectuate ulterior confirma rata de fertilizare si de implantare crescuta, eficienta crescuta a metodei ICSI fata de celelalte tehnici de reproducere asistata in cazul sterilitatii de cauza masculina. Alegerea unei metode de reproducere asistata depinde de factorul de infertilitate, de succes, de costurile procedurii si nu in ultimul rand de riscuri. FIV/ET clasic, conventional are ca indicatie clara factorul tubar de sterilitate, endometrioza, factorul masculin usor alterat, PCOS, factorul idiopatic. GIFT si ZIFT nu se aleg in caz de afectiuni ale trompelor. Totodata GIFT si ZIFT cu transfer per laparoscopic necesita sala de operatie, anestezie si cresc costurile metodei. Exista si situatii rare in care o patologie a colului uterin poate contraindica transferul transcervical de embrioni si atunci se prefera GIFT sau ZIFT. ICSI este de departe preferata in caz de factor masculin cu afectare de diverse grade, in special in afectare severa sau in caz de esec repetat al FIV/ET [153]. Succesele tehnicilor de reproducere asistata in Germania pe anul 2002 sunt redate comparativ - FIV/ET si ICSI - in Registrul National de FIV (Deutsches IVF Register - DIR) conform tabelului 8 [117].

75

Tabel 8 - Succesele tehnicilor de reproducere umana in Germania (2002) Numar

Procent

Cicluri stimulate

69961

100 %

Punctii foliculare

62306

91,3%

FIV

21502

89,8%

ICSI

36465

96,7%

FIV

5632

26,2%

ICSI

9696

26,6%

FIV

2708

12,6%

ICSI

4855

13,3%

Rata fertilizarii

Sarcini clinice

„Baby-take home” rate

Datorita multor aspecte necunoscute ale ICSI, sarcinile cuplurilor care apelau la acest procedeu au fost urmarite foarte atent, respectiv evolutia ulterioara a copiilor a fost atent studiata. S-au efectuat multiple diagnostice prenatale in scopul de-a sesiza aberatiile cromozomiale si mai ales daca aceasta tehnica de microinjectie favorizeaza ea insasi anomaliile cromozomiale. In 1995 s-au efectuat diagnostice prenatale (prin biopsie de vilozitati coriale sau amniocenteza) la primele 486 de sarcini obtinute prin ICSI si s-au constatat 6 (1,2%) anomalii cromozomiale, dintre care 1 trisomie 21 (0,2%) (la o pacienta de 41 ani) si restul de 5 – anomalii ale cromozomilor sexuali. Observatiile au condus la faptul ca se iregistreaza o foarte usoara crestere a aberatiilor legate de cromozomii sexuali [176]. Din 877 copii nascuti din sarcini ICSI (1995) la 23 (2,6%) s-au inregistrat malformatii congenitale majore, insa procentul nu este crescut comparativ cu malformatiile obtinute in populatia generala [177]. In’t Veld si colab. [181] raporteaza o incidenta crescuta a aberatiilor cromozomiale legate de cromozomul sexual, depistata intr-un numar redus de teste de diagnostic prenatal, dependente de varsta materna. Alte rezultate in urma testelor prenatale [180] efectuate pe 1082 sarcini obtinute prin ICSI (la Centre for Reproductive Medicine of the Brussels Free University Hospital) au constat ca din cele 690 amniocenteze efectuate - 15 au prezentat anomalii, din 392 76

biopsii de vilozitati coriale - 13 au fost anormale; 7 cordocenteze - care au fost probe martor anterioare unor amniocenteze si care au fost normale. Varsta medie a gravidelor carora li s-a efectuat amniocenteza a fost de 32,7 ani si a celor cu biopsie de vilozitati coriale – 32,1 ani. S-a constatat un procent de 1,66% (numar de paciente: 18) anomalii cromozomiale. Dintre acestea, 9 (0,83%) au fost legate de cromozomul sexual si alte 9 anomalii (0,83%) au fost autozomale. Este considerat semnificativ crescut procentul aberatiilor cromozomiale legate de cromozomul sexual. Incidenta aberatiilor autozomale (trisomii) poate fi corelat cu varsta materna, iar a celor structurale care este mai mare fata de populatia generala (si in procent mai crescut fata de literatura: 0,36% versus 0,07%) [182] se poate explica prin patologia factorului masculin, care este purtator de anomaliile structurale. Cu toate ca in urma acestor constatari nu exista motive majore de ingrijorare referitor la procentul malformatiilor congenitale in urma aplicarii ICSI, totusi unul din obiectivele majore referitor la ICSI stabilite de Societatea Europeana de Reproducere Umana si Embriologie (ESHRE Task Force) este acela de urmarire in continuare a copiilor proveniti din sarcini ICSI [178]; [183]. Un studiul multicentric a incercat stabilirea unui profil psihologic al copiilor la varsta de 5 ani si care provin din sarcini ICSI, comparativ cu copiii din sarcini obtinute prin conceptie naturala. S-au ales cativa parametri ce au fost respectati pentru toti copiii (varsta mamelor, varsta copiilor, genitorii). Din punct de vedere al dezvoltarii cognitive nu s-au sesizat diferente. In cadrul unor subteste s-au observat insa diferente semnificative care implica activitatile motorii de asamblare, de desen, la un numar mare de copii ICSI. Au fost puse pe seama prezentei stress-ului mai crescut in familiile cu copii ICSI, cu diferente in educatie, ce pot induce unele tulburari comportamentale la copil. Si aceste aspecte ale evolutiei psihologice la copiii ICSI necesita studii suplimentare [184]; [185].

77

B. Partea speciala

Studiu comparativ pe 3 ani al administrarii agonistilorGnRH si al antagonistilor-GnRH in reproducerea umana asistata cu referire la rata sarcinilor Observatii si discutii

78

Obiectivele acestor statistici analizate separat pe cei 3 ani (1999- 2000-2001) si ulterior insumarea datelelor pe perioada totala, urmaresc stabilirea unor parametri clinici sau/si paraclinici, care pot influenta raspunsul la terapia aplicata, adica tratamentul supresiv hipofizar realizat prin intermediul agonistilor-GnRH si stimularea ovariana controlata. Studiul acestei teze incearca sa desprinda unele observatii referitoare la eficienta terapiei agoniste versus antagoniste, care in final se rasfrange asupra ratei sarcinii, ce constituie scopul final al reproducerii asistate. Medicatia agonista este utilizata de o perioada mai lunga si s-a „incetatenit” atat pentru practicieni, cat si pentru paciente. Substantele antagoniste sunt sintetizate de data recenta si experienta cu administrarea lor fireste ca nu o depaseste pe ce a agonistilor-GnRH. La introducerea in practica clinica au avut de intampinat unele reticente. Datele din literatura bazate pe studii clinice dovedesc daca nu superioritatea fata de agonisti, dar totusi unele avantaje ale antagonistilor-GnRH care trebuie luate in considerare. Voi analiza pacientele care au apelat la tehnici de reproducere asistata si carora li s-au administrat agonisti-GnRH sau antagonisti-GnRH in scopul inhibarii secretiei hipofizare endogene. Efectele agonistilor- si ale antagonistilor-GnRH si rolul lor in cadrul reproducerii asistate a fost detaliat pe larg in partea generala a tezei.

79

Capitolul 1 – Statistica pe 3 ani pentru protocoalele cu agonisti-GnRH in reproducerea umana asistata

Capitolul 1.1 Statistica pe anul 1999 – agonisti-GnRH a. Material si metoda In anul 1999 s-au adresat in vederea reproducerii asistate si au fost selectionate un grup de 258 paciente. Varsta medie a pacientelor a fost de 34,2 ani, cu mediana de 34,5 ani. Pacienta cea mai tanara din grupul analizat a fost de 21 ani, respectiv varsta cea mai inaintata a fost de 46 ani. Repartitia pe grupe de varsta este redata in urmatorul tabel (Tabel 1.1.1). De remarcat ca majoritatea pacientelor se situeaza in grupul 35-39 ani, urmate de pacientele cu varsta cuprinsa intre 30-34 ani. O alta impartire functie de varsta imparte lotul de paciente in 2 parti egale: varsta < 35 ani: 129 paciente, varsta ≥ 35 ani: 129 paciente. Tabel 1.1.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor (agonisti-GnRH/ 1999) Varsta (ani)

Numar paciente

Procent

< 30

44

17,05 %

30-34 ani

85

32,94 %

35-39 ani

96

37,20 %

≥ 40 ani

33

12,79 %

Pacientele au intrat in protocol de stimulare ovariana controlata, utilizandu-se mai multe tipuri de gonadotropine. Preparatul cel mai des administrat a fost rFSH, urmat apoi de combinatia rFSH cu HMG, HMG administrat singur, FSH-HP administrat singur sau asociat cu rFSH sau HMG, conform tabelului 1.1.2 si figurii 1.1.1 de mai jos.

80

Tabel 1.1.2 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/ 1999) Tip gonadotropina

Numar paciente

Procent

rFSH

200

77,51 %

HMG

20

7,75 %

FSH-HP

1

0,38 %

rFSH + HMG

34

13,17 %

rFSH + FSH-HP

1

0,38 %

rFSH + HMG + FSH-HP

2

7,75 %

rFSH

200

HMG FSH-HP

150

rFSH+HMG

100

rFSH+FSH-HP rFSH+HMG+FSH-HP

rFSH

HMG

FSH-HP

rFSH+HMG

rFSH+FSH-HP

0

rFSH+HMG+FSH-HP

50

Fig. 1.1.1 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/ 1999)

81

Durata stimularii ovariene controlate a fost in medie de 11,46 zile, cu mediana de 11 zile. Cea mai scurta perioada de stimulare a fost de 7 zile, respectiv cea mai lunga de 21 de zile. Deviatia standard: 2,203. Pentru stimulare s-au folosit o medie de 2784,98 UI FSH (din preparatele enuntate anterior), cu o mediana de 2400 UI, deviatia standard: 1692,569. Cantitatea maxima administrata a fost de 14.700 (!!!) UI FSH si cantitatea cea mai redusa de 750 UI FSH. La pacienta la care s-a administrat aceasta doza enorma a prezentat, in ciuda stimularii masive, un raspuns insuficient („low responder”). Protocolul cel mai des aplicat a fost cel lung („long protocol”) in 239 cazuri (92,63%), urmat de cel scurt („short protocol”) in 12 cazuri (4,65%) si apoi ultra-lung („ultralong protocol”) in 7 cazuri (2,71%), conform figurii urmatoare (Fig. 1.1.2).

12

7

Protocol lung

Protocol scurt 239

Protocol ultralung

Fig. 1.1.2 - Incidenta tipurilor de protocol cu agonist-GnRH / 1999 Nivelul E2 seric obtinut in urma stimularii ovariene, masurat anterior inducerii ovulatiei cu HCG a fost ca valoare medie 1862,16 pg/ml, cu mediana de 1563 pg/ml. Valoarea maxima a estradiolului seric a fost de 22.580 pg/ml iar cea minima de 135 pg/ml, deviatia standard: 82

1747,692. Daca se urmareste defalcat valoarea estradiolului seric determinat anterior punctiei se obtine urmatorul tabel (Tabel 1.1.3). Marea majoritate a pacientelor (53,09%) cu tratament de stimulare ovariana au prezentat valori serice ale E2 peste valoarea mediana, deci peste 1500 pg/ml. Tabel 1.1.3 - Valorile defalcate ale E2 seric (agonisti-GnRH/ 1999) Nivel E2 seric (pg/ml)

Numar paciente

Procent

< 1000

56

21,70%

1000-1499

65

25,19%

1500-1999

49

18,99%

≥ 2000

88

34,10%

Pe langa determinarea serica a estradiolului s-a efectuat si masurarea LH-ului, pentru a surprinde o crestere (nedorita) a hormonului endogen. Valoarea medie a LH-ului la grupul de 258 de paciente a fost de 2,43 mUI/ml, cu mediana de 2 mUI/ml. Valoarea maxima inregistrata a fost 38 - si cea mai mica de 0,1 mUI/ml; deviatia standard: 2,698. Examinarea ecografica a urmarit evolutia folicolilor ca masura a reactivitatii la tratamentul de stimulare ovarian. Sunt date valorile determinate anterior stabilirii momentului inducerii ovulatiei (Tabel 1.1.4). Asa cum de fapt este de asteptat in urma stimularii ovariene controlate, se doreste obtinerea unui numar mai mare de folicoli de 16-18 mm si respectiv > 18 mm, comparativ cu folicolii de dimensiuni mai mici. Din tabelul expus reiese ca numarul mediu si mediana folicolilor > 18 mm este mai mare fata de valorile folicolilor de 13-15 mm si 16-18 mm. Tabel 1.1.4 - Parametri statistici ai folicolilor masurati prin ecografie (agonisti-GnRH/ 1999) Dimensiune

Media

Mediana

folicoli

Numarul

Numarul

Deviatia

minim

maxim

standard

13-15 mm

2,61

2

0

10

2,246

16-18 mm

3,26

3

0

22

2,726

> 18 mm

3,67

4

0

11

1,828

83

La grupul de paciente studiate s-au efectuat punctii foliculare in vederea FIV conventionale in 135 de cazuri, iar in 115 situatii s-au aspirat ovocitele si s-a procedat la microinjectia lor, conform metodei ICSI. 8 cicluri nu au fost urmate de punctie foliculara (Fig. 1.1.3). La 6 microinjectari din cadrul ICSI s-au utilizat spermii de provenienta testiculara, recoltate prin biopsie (TESE). FIV conventionala: 135 cazuri (52,32%); ICSI: 115 cazuri (44,57%); Cazuri nepunctionate: 8 (3,10%).

8

115

FIV

135

ICSI Cazuri nepunctionate

Fig. 1.1.3 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul grupului cu agonisti-GnRH pe anul 1999 b. Rezultate In urma punctiilor foliculare s-a obtinut un numar mediu de 8,26 ovocite, cu mediana de 8 ovocite. Numarul maxim de ovocite aspirate a fost de 29 iar numarul minim: 0 ovocite, deviatia standard: 5,410 (Tabel 1.1.5).

84

Tabel 1.1.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu agonisti-GnRH/1999 Numar mediu

Mediana

Numar maxim

Numar minim

Deviatia

recoltat

recoltat

standard

29

0

5,410

ovocite 8,26

8

Controlul fecundarii realizat la 16-20 ore dupa inseminarea/microinjectarea ovocitelor a aratat urmatoarele observatii: numarul mediu de celule cu 2PN este de 3,89; cu mediana de 3 celule cu 2PN. Numarul maxim de ovocite fecundate s-a inregistrat pentru 23 si numarul minim: 0; deviatia standard: 3,191 (Tabel 1.1.6). Tabel 1.1.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN/ protocol cu agonisti-GnRH/1999 Numar mediu

Mediana

celule cu 2PN 3,89

3

Numar maxim

Numar minim

Deviatia

celule cu 2PN

celule cu 2PN

standard

23

0

3,191

Crioconservarea s-a efectuat la 126 de paciente; dintre acestea in 68 de cazuri (53,96%) a fost vorba de celule cu 2PN provenite din FIV iar in 58 de cazuri (46,03%) celulele cu 2PN au provenit din fecundarea ovocitelor microinjectate in cadrul procedurii ICSI (Fig 1.1.4). Embriotransferul s-a efectuat cu 1; 2 sau 3 embrioni. Au fost 28 de cazuri fara embriotransfer raportate la cele 258 cicluri initiale. Media embrionilor transferati a fost de 1,85 iar mediana de 2 embrioni.

85

70

Crio-FIV

65 CrioICSI

68

60

58

55 50

Fig. 1.1.4 - Incidenta crioconservarii ca provenienta a celulelor fecundate din FIV, respectiv ICSI (agonisti-GnRH/ 1999) La 56 de paciente s-a inregistrat sarcina (inclusiv sarcina biochimica). Evolutia cazurilor in parte este redata in urmatorul tabel (Tabel 1.1.7). Din avorturile spontane s-au descris situatii cu 1, 2 sau 3 saci amniotici; la sarcinile extrauterine a fost 1 caz cu 2 saci amniotici, respectiv la sarcinile gemelare si triple au existat cazuri cu oprirea in evolutie pe parcurs a 1 respectiv 2 fat/feti, in final sarcina evoluand spre o nastere monofetala. Tabel 1.1.7 - Evolutia sarcinilor la pacientele cu agonisti-GnRH/1999 Sarcina

Sarcina

Avort

biochimica

Sarcina

Nastere

Nastere

Nastere

ectopica

monofetala

gemelara

tripla

Nr. cazuri

6

7

3

34

6

0

Procent

10,71%

12,5%

5,35%

60,71%

10,71%

0

86

Complicatiile care s-au inregistrat in cadrul acestui lot de 258 de paciente se grupeaza in: •

lipsa raspunsului la stimularea ovariana controlata („low responder” – cu valori mici ale E2 seric, dezvoltare minora a folicolilor)

•

cresterea prematura a LH-ului endogen (supresie insuficienta prin agonist-GnRH)

•

aparitia sindromului de hiperstimulare ovariana.

Motivele pentru care nu s-a mai practicat punctia foliculara la cele 8 paciente au fost: in 7 cazuri lipsa raspunsului la stimularea ovariana si in 1caz instalarea sindromului de hiperstimulare ovariana, cu prezenta in amnadoua ovarele a mai mult de 40 folicoli de ≥ 10 mm. In tabelul de mai jos sunt redate sumarizat elementele importante care constituie criterii de diagnostic al statusului de „low responder” (Tabel 1.1.8). Tabel 1.1.8 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara) (agonisti-GnRH/1999) Caz

Cauza

Varsta

Tip

Durata

Nr.

Tip

E2

LH

Nr. folicoli

(ani)

FSH

stimularii

total

protocol

(pg/ml)

(UI/l)

- 13-15

UI

agonist

- 16-18 - > 18

1

Low

25

rec

10 zile

1725

long

797

1

1/ 2/ 3

25

rec

12 zile

2105

long

464

0,4

2/ 2/ 3

41

rec+HMG

12 zile

7200

long

213

2,4

0/ 0/ 2

40

rec+HMG

13 zile

6600

long

400

3,1

0/ 0/ 1

32

rec

12 zile

2400

long

135

3,1

0/ 1/ 1

37

rec+HMG

25 zile !!

14.700

short

277

38 !!!

0/ 1/ 1

response 2

Low response

3

Low response

4

Low response

5

Low response

6

Low response

7

Low

!! 25

rec

9 zile

750

long

158

0,1

10/ 4/ 0

25

rec

7 zile

900

long

2264

2,3

5/ 1/ 1

response 8

Sindr. hiper-

> 40 fol.≥10

stimulare

mm

87

c. Observatii 1. De remarcat ca in aceste 7 cazuri varsta medie a pacientelor este de 32,14 ani; deci o varsta tanara. Este stiut ca marea majoritate a pacientelor cu raspuns scazut la stimulare se incadreaza in grupe de varsta mai inaintate, care au o rezerva ovariana in mod fiziologic redusa. Nivelul seric scazut al E2 corespunde cu criteriul clasic de intrerupere a ciclului de stimulare si la monitorizarea ecografica se constata un numar insuficient al folicolilor dominanti. 2. Doar 1 caz a prezentat o crestere prematura de LH, la aceasta pacienta a fost nevoie de o stimulare excesiva - de 25 de zile si cu o doza totala imensa de FSH: 14.700 UI rFSH asociat cu HMG, cu un E2 seric extrem de redus. Protocolul cu agonist-GnRH a fost unul scurt, in dorinta de-a exploata efectul initial de „flare-up” al administrarii agonistului si de-a creste FSH-ul endogen si implicit dezvoltarea foliculara. In ciuda acestei strategii aplicate rezultatul la stimularea ovariana a fost dezastruos. 3. La o pacienta la care nu s-a mai practicat punctie foliculara a fost vorba de intreruperea ciclului nu datorita raspunsului redus, ci dimpotriva - datorita reactiei exagerate la stimularea ovariana, cu o dezvoltare a unui numar de > 40 folicoli ≥ 10 mm la o doza de numai 900 UI FSH in decurs de doar 7 zile si un E2 seric de 2264 pg/ml.

Incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana in grupul de 258 de paciente a fost de 11 cazuri, adica 4,26 %, un procent deloc de neglijat comparativ cu statisticile din literatura (conform celor expuse in partea generala). Detaliile referitoare la sindromul de hiperstimulare ovariana sunt schematizate in tabelul de mai jos (Tabel 1.1.9).

88

Tabel 1.1.9 - Sindrom de hiperstimulare ovariana (agonisti-GnRH/ 1999) Caz

Grad

E2

Punctie

ET

Criocons.

Sarcina

Avort/

hiperstim.

(pg/ml)

folic.

1

II

1058

da

da

-

da

nastere

2

II

2493

da

da

-

da

avort

3

II

3568

da

da

-

da

avort

Nastere

gemel. 4

II

1400

da

nu

da (tot)

-

-

5

II

8139

da

nu

da (tot)

-

-

6

I

2385

da

da

-

da

nastere

7

II

1640

da

da

-

da

avort

8

III

2264

nu

-

-

-

-

9

II

1635

da

da

-

da

nastere

10

I/ II

1388

da

da

-

da

nastere

11

II/ III

2342

da

da

-

da

nastere

d. Concluzii 1. Sindromul de hiperstimulare ovariana apare in lotul studiat cel mai frecvent de gradul II (forma moderata), rar in formele extreme: usoara sau severa. 2. Valoarea medie a estradiolului seric inainte de declansarea ovulatiei a fost de 2573,81 pg/ml, cu aproximativ 1000 pg/ml mai ridicat fata de valoarea medie si mediana calculate pentru intregul lotul de 258 de paciente. 3. Nu este obligatorie asocierea sindromului de hiperstimulare cu valori crescute ale estradiolului seric. Ca exemplu de exeptie in neconcordanta estradiol seric – aparitia sindromului de hiperstimulare este cazul unei paciente de 37 ani, cu protocol lung si stimulare cu rFSH timp de 11 zile, doza totala de 1200 UI, estradiol seric: 22.580 pg/ml, folicoli: 13-15 mm= 8; 16-18 mm= 7; > 18 mm= 5. La FIV s-au aspirat 24 ovocite, 23 sau fecundat, dintre care 20 s-au crioconservat. Embriotransferul s-a efectuat cu 3 embrioni. Nu s-a obtinut nici o sarcina. Nu s-a semnalat sindrom de hiperstimulare ovariana.

89

4. In 10 cazuri din 11 (90,90%) de sindrom de hiperstimulare ovariana s-a efectuat aspirarea foliculara; doar la 1 caz cu un numar de > 40 folicoli ≥ 10 mm s-a abandonat ciclul de stimulare. Acest caz a si prezentat forma severa de sindrom de hiperstimulare. 5. Din cele 10 cazuri punctionate numai la 2 paciente nu s-a realizat embriotransferul si toate celulele in stadiul de 2PN au fost crioconservate. S-a considerat ca o masura de siguranta aceasta evitare a embriotransferului. 6. Toate cazurile la care s-a efectuat embriotransferul au fost insotite de prezenta sarcinii (evolutia ulterioara fiind de 3 avorturi si 5 nasteri). Alte incidente: -

in 2 cazuri: nu s-a realizat fecundarea pe motivul absentei spermiilor;

-

la 1 caz nu s-a efectuat ET pe motivul prezentei unui polip endometrial;

-

la 1 caz nu s-a realizat ET si s-a preferat crioconservarea pe motivul prezentei unui endometriom.

Din 258 cicluri de stimulare initiate - 8 nu au fost urmate de punctie foliculara, deci s-au efectuat doar 250 de punctii (96,89% din cicluri punctionate). Din aceste 250 de punctii la 1 caz nu s-au aspirat ovocite si din acest numar de 250 punctii in 16 cazuri nu s-a realizat fecundarea. O apreciere a esecurilor din totalul de 258 de cicluri de stimulare initiale este urmatoarea (Tabel 1.1.10): - 8 cazuri nepunctionate (intreruperi de cicluri: 3,1%); - 1 caz fara ovocite; - 16 cazuri fara fecundare; - 29 cazuri fara embriotransfer realizat. Tabel 1.1.10 Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu agonisti-GnRH/ an 1999 Total

Total punctii efectuate

Total cazuri cu celule

cicluri

Total ET efectuate

cu 2PN

stimulare

Numar

Procent

Numar

Procent

Numar

Procent

258

250

96,89%

233

90,31%

229

88,75%

90

Sarcini/ 1999: 56 •

34 sarcini au rezultat din FIV/ET si 22 sarcini - din ICSI (1 sarcina din crioTESE);

•

51 paciente care au obtinut sarcina (inclusiv biochimica) au fost stimulate cu rFSH, 3 paciente: stimulare ovariana cu HMG, 2 paciente: rFSH asociat cu HMG;

•

la 53 de paciente s-a aplicat protocolul lung, la 3 paciente – protocolul ultra-lung.

Rata sarcinilor/ciclu: 21,70 % Rata sarcinilor/punctie: 22,40% Rata sarcinilor/embriotransfer: 24,45% Rata implantarii = nr. saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 28,38% Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 15,50% e. Discutii 1. Comparativ cu lotul de 41 de paciente care au urmat tratament de stimulare ovariana controlata si cu anatgonisti-GnRH in schema de protocol pe perioada anului 1999, lotul de paciente cu schema cu agonisti-GnRH a fost mult mai numeros, ceea ce semnifica o complianta mai mare fata de acest tip de medicatie. 2. Procentul majoritar al pacientelor din grupul studiat se afla intre 35-39 ani, urmat indeaproape de pacientele cu varsta 30-34 ani. 3. In urma parametrilor calculati referitor la durata, tipul si doza totala a unitatilor de gonadotropina nu se remarca diferente semnificative cu lotul de paciente cu protocol cu antagonist-GnRH. De asemenea numarul de ovocite recoltate si numarul de celule cu 2PN este comparabil la cele 2 grupe de paciente. 4. Rata sarcinilor calculate in functie de numarul de cicluri de stimulare/ punctii efectuate/ embriotransferuri realizate este net superior la lotul de agonisti versus antagonisti-GnRH.

91

Capitolul 1.2 Statistica pe anul 2000 – agonisti-GnRH

a. Material si metoda In anul 2000 s-au adresat in vederea reproducerii asistate si au fost selectionate un grup de 303 paciente. Varsta medie a pacientelor a fost de 34,46 ani, cu mediana de 35 ani. Pacienta cu varsta cea mai tanara din grupul analizat a fost de 23 ani, respectiv varsta cea mai inaintata a fost de 45 ani. Repartitia pe grupe de varsta este redata in urmatorul tabel (Tabel 1.2.1). De remarcat ca pacientele intre 35-39 ani sunt grupul cel mai numeros, dar urmate indeaproape de pacientele cu varsta cuprinsa intre 30-34 ani. Tabel 1.2.1 - Repartitia pacientelor pe grupe de varsta (agonisti-GnRH/anul 2000) Varsta (ani)

Numar paciente

Procent

< 30

56

18,48 %

30-34 ani

93

30,69 %

35-39 ani

103

33,99 %

≥ 40 ani

51

16,83 %

Dintre tipurile de gonadotropine utilizate in cadrul protocoalelor de stimulare ovariana controlata se observa ca preponderent a fost administrat rFSH (76,23%) (Tabel 1.2.2, Fig. 1.2.1). Tabel 1.2.2 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/anul 2000) Tip gonadotropina

Numar paciente

Procent

rFSH

231

76,23%

HMG

42

13,86 %

FSH-HP

2

0,66 %

rFSH + HMG

28

9,24 %

92

250

200

rFSH HMG

150

FSH-HP 100 rFSH+HMG 50

0

Fig.1.2.1 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/anul 2000) Durata stimularii ovariene controlate cu preparatele de gonadotropina enumerate a fost in medie de 11,24 zile, cu mediana de 11 zile. Cea mai scurta perioada de stimulare a fost de 6 zile, respectiv cea mai lunga de 24 de zile. Deviatia standard: 2,gonadotropina, cu mediana de 2250 UI, deviatia standard: 1337,421. Cantitatea maxima administrata a fost de 8400 UI gonadotropina si cantitatea cea mai redusa de 825 UI gonadotropina. Ca si in statistica anului 1999, cel mai des aplicat a fost protocolul lung („long protocol”) in 269 cazuri (88,77%), urmat de cel scurt („short protocol”) in 22 cazuri (7,26%) si apoi ultralung („ultralong protocol”) in 12 cazuri (3,96%); situatie rezumata in urmatoarea figura (Fig. 1.2.2).

93

22

Protocol lung

12

Protocol scurt 269 Protocol ultralung

Fig. 1.2.2 - Incidenta tipurilor de protocol cu agonist-GnRH / anul 2000 Corelarea foliculometriei cu nivelul E2 seric obtinut in urma stimularii ovariene au fost factorii decisivi pentru alegerea momentului inducerii ovulatiei cu HCG. Valoarea medie a E2 seric a fost de 1877,16 pg/ml, cu mediana de 1529 pg/ml. Valoarea maxima a estradiolului seric a fost de 27.669 pg/ml iar cea minima de 205 pg/ml, deviatia standard: 1917,754. Daca se urmareste defalcat valoarea E2 seric determinat anterior punctiei se obtine urmatorul tabel (Tabel 1.2.3). Marea majoritate a pacientelor (33%) cu tratament de stimulare ovariana au prezentat valori serice ale E2 peste 2000 pg/ml iar 51,81% din paciente au avut concentratia E2 seric peste valoarea medianei. Tabel 1.2.3 - Valorile defalcate ale E2 seric (agonist-GnRH/ anul 2000) Nivel E2 seric (pg/ml)

Numar paciente

Procent

< 1000

71

23,43%

1000-1499

75

24,75%

1500-1999

57

18,81%

≥ 2000

100

33%

94

Determinarea concentratiei serice a LH-ului isi gaseste utilitatea in depistarea unei cresteri premature a hormonului endogen, ce semnifica o inhibitie hipofizara insuficienta. Valoarea media a LH-ului in lotul de paciente a fost de 2,57 UI/l, mediana de 2,1 UI/l. Valoarea maxima depistata a fost de 21,6 UI/l la o pacienta la care s-a si intrerupt ciclul de stimulare si nu s-a mai efectuat punctia foliculara. Valoarea minima determinata a fost de 0,1 UI/l si deviatia standard: 2,073. In corelatie cu valoarea E2 seric se efectueaza ecografii seriate – foliculometrii care determina raspunsul ovarian la terapia aplicata. Tabelul urmator (Tabel 1.2.4) sumarizeaza dimensiunile folicolilor si parametri statistici ai acestora. Scopul stimularii este de-a creste folicoli dominanti in amandoua ovarele. Se remarca din tabel ca media si mediana folicolilor > 18 mm este mai mare decat a folicolilor de dimensiuni mai mici. Tabel 1.2.4 Parametri statistici ai folicolilor masurati prin ecografie (agonist GnRH/anul 2000) Dimensiune

Media

Mediana

folicoli

Numarul

Numarul

Deviatia

minim

maxim

standard

13-15 mm

2,99

2

0

15

2,431

16-18 mm

3,14

2

0

24

2,626

> 18 mm

3,60

3

0

16

2,059

Tehnicile de reproducere asistata care s-au utilizat in cazul lotului de 303 de paciente ce au urmat protocol cu agonisti-GnRH pe anul 2000 au fost: FIV conventionala in 209 cazuri si ICSI in 91 situatii. La pacientele cu ICSI, in 14 cazuri originea spermiilor a fost testiculara, prin decongelarea probelor recoltate cu alta ocazie (crio-TESE). In 3 situatii s-a abandonat ciclul si nu s-au punctionat folicolii (Fig. 1.2.3). •

FIV: 209 cazuri (68,97%);

•

ICSI: 91 cazuri (30,03%);

•

Cazuri nepunctionate: 3 (0,99%).

95

3

91

FIV

291

ICSI Cazuri nepunctionate

Fig. 1.2.3 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul grupului cu agonisti-GnRH pe anul 2000 b. Rezultate In urma punctiilor foliculare s-a obtinut un numar mediu de 8,29 ovocite, cu mediana de 8 ovocite. Numarul maxim de ovocite aspirate a fost de 32 iar numarul minim: 0 ovocite, deviatia standard: 5,465 (Tabel 1.2.5). Tabel 1.2.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu agonisti-GnRH/ anul 2000 Numar mediu

Mediana

ovocite 8,29

8

Numar maxim

Numar minim

Deviatia

recoltat

recoltat

standard

32

0

5,465

Controlul fecundarii realizat la 16-20 ore dupa inseminarea/microinjectarea ovocitelor a relevat urmatoarele: numarul mediu de celule cu 2PN este de 3,56; cu mediana de 3 celule cu 2PN. Numarul maxim de ovocite fecundate a fost 16 si numarul minim: 0; deviatia standard: 3,530 (Tabel 1.2.6).

96

Tabel 1.2.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (agonisti-GnRH/ anul 2000) Numar mediu

Mediana

celule cu 2PN 3,56

3

Numar maxim

Numar minim

Deviatia

celule cu 2PN

celule cu 2PN

standard

16

0

3,530

Crioconservarea s-a efectuat la 121 de paciente; dintre acestea in 73 de cazuri (60,33%) a fost vorba de celule cu 2PN provenite din FIV iar in 48 de cazuri (39,66%) celulele cu 2PN au provenit din fecundarea ovocitelor microinjectate in cadrul procedurii ICSI (Fig 1.2.4).

80 60 40

73

48

20 0 Crio-FIV

Crio-ICSI

Fig. 1.2.4 - Incidenta crioconservarii ca provenienta a celulelor fecundate din FIV, respectiv ICSI (agonisti-GnRH/ anul 2000). Embriotransferul s-a efectuat cu 1; 2 sau 3 embrioni. Au fost 66 de cazuri fara embriotransfer raportate la cele 303 cicluri initiale. Media embrionilor transferati a fost de 1,67 iar mediana de 2 embrioni, deviatia standard: 1,052

97

Din cele 303 paciente care au inceput stimularea ovariana in vederea reproducerii asistate, la 64 de cazuri a survenit sarcina. La o pacienta s-a stabilit ecografic diagnosticul de sarcina intrauterina concomitent cu sarcina extrauterina, din acest motiv neconcordanta dintre 64 sarcini inregistrate fata de 65 (care reprezinta suma sarcinilor din tabel). Sarcinile intra- si extrauterina simultana s-au soldat cu avort si respectiv salpingectomie. Evolutia sarcinilor inregistrate este redata in urmatorul tabel (Tabel 1.2.7). Tabel 1.2.7 - Evolutia sarcinilor la pacientele cu agonisti-GnRH/ anul 2000 Sarcina

Sarcina

Avort

biochimica

Sarcina

Nastere

Nastere

Nastere

ectopica

monofetala

gemelara

tripla

Nr. cazuri

13

13

5

23

11

0

Procent

20,31%

20,31%

7,81%

35,93%

17,18%

0

In cadrul acestor sarcini s-au constatat in cateva situatii malformatii fetale cu ocazia investigatiilor prenatale si ulterior la examinarea postpartum a nou nascutilor. •

1 avort a fost efectuat din motiv terapeutic, fiind stabilit diagnosticul de trisomie 21, pacienta avand varsta de 41 ani!!!

•

La o nastere monofetala s-a stabilit ca malformatie keilognatopalatoskizis.

•

2 nasteri gemelare au prezentat de asemenea malformatii.

Inregistrarea anomaliilor depistate ca procent in cadrul acestor sarcini a fost de 6 feti la 64 sarcini: 9,37%. Acest procent ridicat se explica odata prin prezenta trisomiei 21 la o pacienta cu varsta > 35 de ani, situatie care se intalneste cu frecventa mai crescuta si in conceptiile naturale. Pe de alta parte, la 2 sarcini gemelare se remarca malformatii – de asemenea este cunoscut faptul ca riscul malformativ creste la sarcinile multiple fata de cele monofetale. c. Observatii Ca si esec intalnit in cadrul stimularii ovariene, asa cu am redat si in celelalte statistici, mentionez lipsa raspunsului la terapie. Cele 3 paciente la care nu s-a mai practicat punctie foliculara au avut raspuns ovarian redus la tratamentul de stimulare si s-au intrunit criteriile de abandonare a ciclului de stimulare, cu

98

niveluri scazute ale E2 seric si intr-un caz s-a intalnit o crestere prematura a LH-ului endogen. La pacienta care a prezentat cresterea prematura a LH-ului, la un nou ciclu de stimulare s-a obtinut raspuns favorabil din punct de vedere al dezvoltarii foliculare, cu un numar de 17 ovocite la punctie, dar fara a se fecunda ulterior niciunul (Tabel 1.2.8). Varsta medie a pacientelor a fost de 34 ani, doar pacienta la care nu s-a obtinut nici un raspuns (fara crestere foliculara) a avut 42 de ani. Toate pacientele au fost stimulate cu rFSH, in cadrul protocoalelor lungi cu agonisti-GnRH, cu o durata medie de stimulare de 11 zile. Tabel 1.2.8 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara) - agonisti-GnRH/ an 2000 Caz

Cauza

Varsta

Tip

Durata

Nr.

Tip

E2

LH

Nr.

(ani)

FSH

stimularii

total

protocol

(pg/ml)

(UI/l)

folicoli

UI

agonist

- 13-15 - 16-18 - > 18

1

Low

33

rec

13 zile

3300

long

236

0,1

1/ 2/ 3

27

rec

7 zile

975

long

1127

21,6

1/ 3/ 2

42

rec

11 zile

2475

long

294

1,4

0/ 0/ 0

response 2

↑ prematura LH

3

No response

Pentru alte 3 paciente s-a constatat situatia de „low responder”, dar s-a practicat totusi punctia foliculara, in ciuda valorilor scazute ale estradiolului seric si ale numarului extrem de redus al folicolilor. La pacienta cu varsta de 43 de ani s-a intalnit chiar valoarea cea mai scazuta a estradiolului din intreg lotul de 303 paciente care au urmat tratament de stimulare ovariana cu protocoale ce cuprindeau in schema agonist-GnRH / anul 2000. Din aceste 3 paciente cu raspuns scazut la stimulare intr-un caz nu s-au aspirat ovocite si in 2 cazuri la punctia foliculara s-a recoltat cate 1 ovocit, fara insa a se fecunda (Tabel 1.2.9). La aceste paciente varsta medie a fost de 36,33 ani, doar 1 pacienta a fost de 43 de ani. Media unitatilor de gonadotropina administrata a fost 4500 UI, deci a fost necesara o doza mare de stimulare. In 2 situatii s-a asociat rFSH cu HMG in vederea stimularii ovariene.

99

Cu toate acestea nivelul E2 seric s-a mentinut in toate cele 3 cazuri < 500 pg/ml si dezvoltarea folicolilor a fost minima. La o pacienta s-a virat de la protocolul lung la cel scurt la a doua incercare, in scopul folosirii efectului de „flare-up” al agonsitului, dar fara efectul dorit. S-a remarcat doar o scadere a duratei si dozei de stimulare (cazul 1 si 2 din tabel). Tabel 1.2.9 - Cicluri cu punctie efectuata, dar cu status de „low responder” – agonisti-GnRH/ an 2000 Caz

Cauza

Varsta

Tip

Durata

Nr.

Tip

E2

LH

Nr.

Rezultat

(ani)

FSH

stimularii

total

protocol

(pg/ml)

(UI/l)

folicoli

punctie

UI

agonist

- 13-15 - 16-18 - > 18

1

Low

33

rec+HMG

14 zile

5400

long

415

0,5

0/ 2/ 1

resp.

FIV, Ø ovocite

2

Low

33

rec+HMG

8 zile

4800

short

282

3,1

1/ 1/ 1

resp.

FIV, 1 ovocit Ø fecund.

3

Low

43

rec

10 zile

3300

long

resp.

205

1,6

1/ 1/ 1

FIV, 1 ovocit, Ø fecund.

Din cele 2 tabele anterioare, care exemplifica statusul de „low responder” al unor paciente, se remarca ca factorul varsta nu are in aceste cazuri rol decisiv. O complicatie a stimularii ovariene controlate este sindromul de hiperstimulare ovariana, exemplificat in tabelul de mai jos (Tabel 1.2.10). Nu s-au remarcat cazuri de gravitate crescuta in grupul de 303 paciente analizate.

100

Tabel 1.2.10 - Sindrom de hiperstimulare ovariana - agonisti-GnRH/ an 2000 Caz

Grad

E2

Nr.

Punctie

hiperstim.

(pg/ml)

folicoli

folic.

ET

Criocons.

Sarcina

Avort/ Nastere

- 13-15 - 16-18 - > 18

1

II

2856

1/2/5

da

da

-

nu

-

2

II

3513

7/7/3

da

da

-

da

nastere gemel.

3

II

1125

3/6/5

da

nu

-

-

-

4

I

2925

2/2/4

da

da

-

nu

-

5

II

935

1/1/2

da

da

da

avort

6

II

1106

2/1/6

da

da

-

nu

-

7

II

5018

1/5/8

da

da

-

nu

-

8

II

1100

1/2/4

da

da

-

da

avort

9

II

8123

14/24/1

da

nu

da (tot)

-

-

10

I

1082

1/1/10

da

da

-

nu

-

•

Doar 3 situatii au fost insotite de prezenta sarcinii.

•

Incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana la totalul de 303 paciente este de 3,3%.

•

Media E2 seric la aceste 10 cazuri a fost de 2778,3 pg/ml, cu extremele intre 925 si 8123 pg/ml.

•

La pacienta cu valoarea cea mai crescuta a estradiolului seric (8123 pg/ml ) s-a preferat crioconservarea tuturor celulelor cu 2PN, fara a se mai efectua embriotransferul. Prezenta unei sarcini ar fi agravat sindromul de hiperstimulare. Tot la aceasta pacienta s-au dezvoltat foarte multi folicoli de 13-15 si 16-18 mm (14 respectiv 24), factor ce a inclinat de asemenea spre evitarea embriotransferului. d. Concluzii

Din numarul de 303 paciente care au inceput ciclul de stimulare ovariana controlata: •

in 3 cazuri nu s-a efectuat punctie foliculara;

•

la 4 paciente la aspiratia folicolilor nu s-au recoltat ovocite (punctie negativa);

•

in 57 de situatii nu s-a realizat fecundatia;

101

•

la 2 paciente s-au crioconservat toate ovocitele fecundate (toti prezigotii) si nu s-a mai efectuat embriotransferul;

•

in total la 66 de paciente ciclul de stimulare inceput nu s-a finalizat cu embriotransfer (Tabelul 1.2.11).

Tabel 1.2.11 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu agonisti-GnRH/ an 2000 Total

Total punctii efectuate

Total cazuri cu celule

cicluri

Total ET efectuate

cu 2PN

stimulare

Numar

Procent

Numar

Procent

Numar

Procent

303

300

99%

246

81,18%

237

78,21%

Sarcini/ 2000: 64 •

43 sarcini au fost obtinute din FIV/ET si 21 de sarcini – din ICSI (3 sarcini din crioTESE);

•

la 47 de paciente stimularea s-a efectuat cu rFSH, la 10 paciente – cu HMG, la 2 paciente cu FSH-HP, la 5 paciente: asociere rFSH cu HMG;

•

din aceste paciente care au obtinut sarcina s-a aplicat protocolul lung la 59 de paciente, cel scurt la 3 paciente si cel ultra-lung la 2 paciente.

Rata sarcinilor/ciclu: 21,12 % Rata sarcinilor/punctie: 21,33% Rata sarcinilor/embriotransfer: 27% Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. embriotransferuri: 27% Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 11,22%

e. Discutii 1. Numarul pacientelor care au inceput cicluri de stimulare ovariana controlata si au avut protocoale cu agonisti-GnRH/ anul 2000 este de 8 ori mai mare comparativ cu ciclurile cu antagonisti-GnRH din acelasi an.

102

2. Grupul majoritar al pacientelor care au urmat terapia de stimulare a fost intre 30-39 ani (64,68%); procente foarte apropiate ale pacientelor de 35-39 ani cu cele de 30-34 ani. 3. Varsta pacientelor care au prezentat „low response” la terapia de stimulare nu a reprezentat un factor favorizant pentru aceasta situatie nici in cadrul pacientelor cu protocol cu agonist-GnRH, nici la cele cu antagonist-GnRH. 4. Pentru stimularea ovariana s-a preferat rFSH si a fost utilizat in procent covarsitor protocolul lung. 5. Din cele 64 de sarcini survenite la lotul de 303 paciente, in 59 de cazuri s-a utilizat protocolul lung, in 2 cazuri protocolul ultra-lung si in 3 cazuri protocolul scurt. Se observa ca rata de implantare a fost mai crescuta (19,47%) in cazul aplicarii protocolului lung. 6. In urma tratamentului de stimulare s-a obtinut un numar mediu de 8,29 ovocite, cu mediana de 8 ovocite, deviatia standard: 5,465. In cazul protocoalelor cu anatgonistiGnRH/ 2000 s-au aspirat un numar mediu de 8,24 ovocite, mediana: 7 ovocite, deviatia standard: 5,741. Datele sunt comparabile, fara a exista diferente semnificative. Este cunoscut din datele din literatura ca in cazul protocoalelor cu antagonisti-GnRH se obtin ceva mai putine ovocite [190]. 7. In cazul agonistilor-GnRH/ anul 2000 - rata sarcinilor/ciclu; rata sarcinilor/punctie; rata sarcinilor/ET; rata implantarii si respectivbaby take home rate sunt cu mult mai mari comparativ cu ciclurile cu protocoale antagonisti-GnRH/ 2000. Pentru fiecare protocol cu agonist- respectiv anatagonist-GnRH in parte procentele de punctii efectuate raportate la numarul de cicluri initiate; rata de fecundare si rata embriotransferurilor sunt asemanatoare.

103

Capitolul 1.3 Statistica agonisti-GnRH pe anul 2001

a. Material si metoda Un grup de 271 de paciente au urmat in anul 2001 tratament de stimulare ovariana controlata in vederea efectuarii metodelor de reproducere asistata. Aceste paciente au avut in schema lor de terapie agonisti-GnRH ca medicatie de supresie hipofizara, medicatie administrata sub diverse protocoale (exemplificate in partea generala a tezei). Pacientele au avut media de varsta de 34,77 ani, cea mai tanara pacienta cuprinsa in acest lot a fost de 22 de ani si cea mai varstnica – de 45 de ani; mediana: 35 de ani, deviatia standard: 4,690. Asa ca si la celelalte interpretari ale loturilor de paciente din anii 1999 si 2000, voi prezenta repartitia (procentul) femeilor incluse in studiu in functie de grupe de varsta (Tabel 1.3.1). Tabel 1.3.1 - Repartitia pacientelor pe grupe de varsta (agonisti-GnRH/anul 2001) Varsta (ani)

Numar paciente

Procent

< 30

43

15,86 %

30-34 ani

81

29,88 %

35-39 ani

99

36,53 %

≥ 40 ani

48

17,71 %

Ca si in celelalte loturi de paciente, grupul majoritar este format de femeile cu varsta intre 35-39 de ani, urmat imediat de cele cu varsta intre 30-34 de ani. Insumate procentele pentru aceste 2 varste depasesc cu mult numarul pacientelor ce se situeaza la extreme, adica < 30 de ani si > 40 de ani. Este explicabila incidenta mai crescuta a femeilor > 35 de ani care se adreseaza centrelor de reproducere asistata, deoarece tendinta femeilor moderne este de-a se implica social activ, fapt care amana in acest fel momentul (poate chiar si dorinta) conceptiei.

104

Gonadotropinele care au fost utilizate pentru stimularea ovariana au fost in special preparatele sintetizate genetic, urmate de gonadotropinele sintetizate din urina menopauzala, asocierea celor 2 preparate enumerate si in cel mai mic procent - preparatele gonadotropinice inalt purificate (Tabel 1.3.2) (Fig. 1.3.1). Conform statisticilor prezentate in partea generala s-a dovedit ca preparatele moderne - cele sintetizate genetic - sunt superioare celorlalte gonadotropine in ceea ce priveste calitatea si numarul ovocitelor si a embrionilor. Tabel 1.3.2 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/anul 2001) Tip gonadotropina

Numar paciente

Procent

rFSH

229

84,50 %

HMG

35

12,91 %

FSH-HP

3

1,10 %

rFSH + HMG

4

1,47 %

rFSH 250

229

200

HMG

150

35 4

3

100

rFSH+HMG

50 0

FSH-HP

Fig. 1.3.1 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/anul 2001)

105

Durata stimularii ovariene controlate cu preparatele de gonadotropina enumerate a fost in medie de 11,41 zile; cu mediana de 11 zile. Cea mai scurta perioada de stimulare a fost de 6 zile, respectiv cea mai lunga de 29 de zile. Deviatia standard: 2,350. Pentru stimulare s-a folosit o medie de 2556,86 UI gonadotropina, cu mediana de 2250 UI, deviatia standard: 1232,866. Cantitatea maxima care a fost administrata s-a ridicat la valoarea de 9225 UI gonadotropina, iar cantitatea cea mai mica de unitati a fost de 1050 UI gonadotropina. Ca si in statistica anului 1999 si 2000, cel mai des uzitat protocol pentru inhibitia hipofizara a fost cel lung („long protocol”) in 253 de cazuri (93,35%), urmat de cel scurt („short protocol”) in 10 cazuri (3,69%) si apoi ultra-lung („ultralong protocol”) in 8 cazuri (2,95%); situatie redata de urmatoarea figura (Fig. 1.3.2).

10

8

Protocol lung

Protocol scurt

253 Protocol ultralung

Fig. 1.3.2 - Incidenta tipurilor de protocol cu agonist-GnRH / anul 2001 Determinarea E2 seric corelat cu foliculometria sunt factori determinanti ai stabilirii momentului inducerii ovulatiei si implicit al zilei de punctie foliculara. Media valorilor E2 seric pentru lotul de 271 de paciente este 2042,04 pg/ml, cu mediana de 1800 pg/ml si deviatia 106

standard de 1369,984. Cea mai mica valoare determinata a fost de 34 pg/ml (!!!) si cea mai crescuta s-a situat la 10.889 pg/ml. Tabelul 1.3.3 reda procentul pacientelor in functie de anumite paliere valoarea E2 seric, cu scopul de-a vizualiza pacientele cu concentratii ale hormonului mai mici sau mai mari fata de medie si mediana. Tabel 1.3.3 - Valorile defalcate ale E2 seric (agonist-GnRH/ anul 2001) Nivel E2 seric (pg/ml)

Numar paciente

Procent

< 1000

49

18,08 %

1000-1499

57

21,03 %

1500-1999

50

18,45 %

≥ 2000

115

42,43 %

Pe langa determinarea serica a E2 este necesara si masurarea LH-ului, pentru a urmari eficienta inhibitiei hipofizare realizata de catre agonistul-GnRH. Cresterile premature de LH produc o luteinizare precoce a folicolului si au efect negativ asupra calitatii ovocitului. In cazul de fata, la lotul de paciente, s-a determinat o medie a LH-ului ca fiind la 2,34 mUI/ml, cu mediana: 2 mUI/ml si deviatia standard: 2,157. Cea mai mare valoare a LH-ului din acest grup de paciente s-a situat la 28,2 mUI/ml si cea mai mica valoare inregistrata a fost de 0,1 mUI/ml. Monitorizarea ecografica urmareste practic succesul stimularii ovariene prin cresterea folicolilor, ca masura a tratamentului aplicat. Tabelul 1.3.4 de mai jos exemplifica parametri statistici ai folicolilor. Tabel 1.3.4 - Parametri statistici ai folicolilor masurati prin ecografie (agonist GnRH/anul 2001) Dimensiune

Media

Mediana

folicoli

Numarul

Numarul

Deviatia

minim

maxim

standard

13-15 mm

2,74

2

0

10

2,182

16-18 mm

2,89

2

0

13

2,283

> 18 mm

4,16

4

0

16

2,356

107

Metodele de reproducere asistata care s-au aplicat pentru obtinerea embrionilor au fost FIV conventionala si ICSI. La 181 de paciente s-a practicat FIV clasica si la 84 de paciente – ICSI (din acestea - 10 cazuri au folosit spermii pentru microinjectie recoltate prin biopsie testiculara, proba fiind crioprezervata pana in momentul folosirii ei: crioTESE). La 6 paciente nu s-a mai efectuat punctia foliculara pe motivul raspunsului redus la terapia de stimulare si s-au oprit ciclurile de stimulare (Fig. 1.3.3). •

FIV: 181 cazuri (66,78 %);

•

ICSI: 84 cazuri (30,99 %);

•

Cazuri nepunctionate: 6 (2,21 %).

FIV

6

ICSI Cazuri nepunctionate

84 181

Fig. 1.3.3 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul grupului cu agonisti-GnRH pe anul 2001 b. Rezultate Punctiile foliculare au fost urmate de recoltarea unui numar mediu de 8,76 ovocite, cu mediana de 8 ovocite. Numarul maxim de ovocite aspirate a fost de 25 iar numarul minim: 0, deviatia standard: 5,281 (Tabel 1.3.5).

108

Tabel 1.3.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu agonisti-GnRH/ anul 2001 Media

Mediana

ovocitelor 8,76

8

Numar maxim

Numar minim

Deviatia

recoltat

recoltat

standard

25

0

5,281

In urma controlului fecundarii la intervalul de 16-20 de ore de la inseminarea conventionala sau microinjectia ovocitelor s-a obtinut un numar mediu al celulelor cu 2PN de 3,71; mediana de 3 celule cu 2PN, deviatia standard: 3,047. Cel mai mare numar de ovocite fertilizate a fost de 17 iar numarul minim: 0 (Tabel 1.3.6). Tabel 1.3.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (agonisti-GnRH/ anul 2001) Media

Mediana

celulelor cu

Numar maxim

Numar minim

Deviatia

celule cu 2PN

celule cu 2PN

standard

17

0

3,047

2PN 3,71

3

Crioconservarea a fost posibila la 136 de paciente; dintre acestea in 91 de cazuri (66,91%) a fost vorba de celule cu 2PN provenite din FIV iar in 45 de cazuri (33,08 %) celulele cu 2PN au provenit din fecundarea ovocitelor microinjectate in cadrul procedurii ICSI (Fig 1.3.4). Parametrii statistici pentru celulele crioconservate releva urmatoarele: media celulelor crioconservate a fost de 1,93, cu un maxim de 14 si minim de 0 celule, respectiv mediana de 0,5 celule si deviatia standard: 2,568. Embriotransferul s-a efectuat cu 1; 2 sau 3 embrioni. Au fost 41 de cazuri fara embriotransfer raportate la cele 271 cicluri initiale. Media embrionilor transferati a fost de 1,76 iar mediana de 2 embrioni, deviatia standard: 0,925

109

100 80 60 40

91

45

20 0

Crio-FIV

Crio-ICSI

Fig. 1.3.4 - Incidenta crioconservarii ca provenienta a celulelor fecundate din FIV, respectiv ICSI (agonisti-GnRH/ anul 2001) In urma tehnicilor de reproducere asistata s-a inregistrat un numar total de 59 de sarcini. Dintre acestea, la o pacienta de 40 de ani s-a stabilit diagnosticul de trisomie 18 si s-a efectuat avort terapeutic (la 18 sapatamani de gestatie). La alta pacienta, de 38 de ani, prin efectuarea biopsiei de vilozitati coriale, s-a constatat o aberatie cromozomiala a produsului de conceptie, care a fost urmata de avort terapeutic (la 9 sapatamani de gestatie). Amandoua sarcinile au provenit din embrioni obtinuti in urma FIV conventionale. In afara de aceste 2 cazuri nu s-au inregistrat si alte anomalii. Procentul aberatiilor cromozomiale pentru acest grup de paciente este 3,38 %. Trebuie luat in considerare ca acest procent este dat si de faptul ca varsta celor 2 femei a fost > 35 de ani (risc natural mai crescut pentru aneuploidii).Nu s-au intalnit sarcini triple. Preponderente au fost sarcinile monofetale. Se remarca in acest lot de paciente ca procentul

110

avorturilor, al sarcinilor ectopice si al celor multiple (considerate „esec” al reproducerii asistate) se inscriu in procentele enuntate de datele din literatura (Tabel 1.3.7). Tabel 1.3.7 - Evolutia sarcinilor la pacientele cu agonisti-GnRH/ anul 2001 Sarcina

Sarcina

Avort

biochimica

Sarcina

Nastere

Nastere

Nastere

ectopica

monofetala

gemelara

tripla

Nr. cazuri

8

9

1

34

7

0

Procent

13,55%

15,25%

1,69%

57,62 %

11,86 %

0

c. Observatii Esecurile terapiei de stimulare ovariana controlata, manifestate prin lipsa de raspuns la medicatie, au fost inregistrate in numar de 6 pentru grupul de paciente analizate, cazuri care nu s-au soldat cu punctie foliculara (Tabel 1.3.8). Pacientele care nu au raspuns favorabil la medicatia de stimulare ovariana au prezentat o medie de varsta de 34,5 ani, doar 2 dintre ele s-au situat la 38 si 42 de ani. Nici in aceste cazuri varsta nu are rolul esential in lipsa de raspuns la tratamentul aplicat. Pentru aceste paciente s-a folosit o medie a unitatilor de gonadotropina (4150 UI) mult peste media calculata pentru intregul lot de 271 de paciente (2556,86 UI). Media duratei de stimulare a fost insa asemanatoare: 12 zile fata de 11 zile pentru intregul lot. Cazurile 5 si 6 reprezinta doua incercari de stimulare la aceeasi pacienta. Prima tentativa a folosit protocolul lung. Avand in vedere esecul - prin lipsa de raspuns si cresterea prematura de LH - s-a preferat pentru urmatoarea stimulare inhibitia hipofizara prin protocolul scurt, care in acelasi timp, prin efectul sau initial de „flare up” sa stimuleze secretia de FSH endogen, sperandu-se astfel o imbunatatire a situatiei. Nici aceasta a doua modalitate nu a avut succes.

111

Tabel 1.3.8 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara) - agonisti-GnRH/ an 2001 Caz

Cauza

Varsta

Tip

Durata

Nr.

Tip

E2

LH

Nr.

(ani)

FSH

stimularii

total

protocol

(pg/ml)

(UI/l)

folicoli

UI

agonist

- 13-15 - 16-18 - > 18

1

Low

33

rec

14 zile

6300

long

348

1,9

1/ 0/ 1

42

rec

12 zile

3450

long

121

0,8

0/0/1

38

HMG

10 zile

6000

short

34 !!!

3,9

0/0/0

28

rec+HMG

15 zile

2775

long

892

1,9

0/0/1

33

rec

12 zile

2325

long

192

28,2

1/ 0/ 0

33

rec

9 zile

4050

short

534

5,1

0/ 0/ 2

response 2

Low response

3

No response

4

No response

5

↑ prematura LH; low response

6

Low response

Reactia pacientelor in sensul hiperstimularii s-a inregistrat in 8 cazuri, descrise in tabelul 1.3.9. Sunt amintiti in tabel numarul de folicoli si dimensiunile lor, precum si concentratiile E2 seric, care conform definitiei gradelor de hiperstimulare, cresc odata cu gravitatea sindromului. Nu este insa obligatorie aceasta corelare. •

La 6 paciente din cele 8 enumerate nivelul E2 seric s-a situat > 1500 pg/ml. Media valorilor E2 seric la cele 8 paciente este de 3929,5 pg/ml, cu mult mai ridicata fata de media valorilor pentru intregul lot de 271 de paciente (2042,04 pg/ml).

•

Gravitatea sindromului de hiperstimulare a fost usoara si moderata.

•

In toate cele 8 cazuri s-a efectuat embriotransferul.

•

Nu a fost cazul de crioconservare a celulelor cu 2PN.

•

Se remarca ca 7 din aceste 8 cazuri s-au insotit de prezenta sarcinii. Este cunoscut faptul ca sarcina poate agrava sindromul de hiperstimulare.

112

Tabel 1.3.9 - Sindrom de hiperstimulare ovariana (agonisti-GnRH/ 2001) Caz

Grad

E2

Nr.

Punctie

hiperstim.

(pg/ml)

folicoli

folic.

ET

Criocons.

Sarcina Avort/

- 13-15

Nastere

- 16-18 - > 18

1

II

1889

9/4/5

da

da

-

da nastere

2

II

6696

9/7/6

da

da

-

da nastere

3

II

2712

5/8/4

da

da

-

da nastere

4

II

3143

3/2/6

da

da

-

nu

5

II

5608

7/2/5

da

da

-

da nastere

6

II

1326

1/1/3

da

da

-

da nastere

7

I/II

8592

8/7/7

da

da

-

da nastere

8

I

1470

3/2/3

da

da

-

da avort

d. Concluzii Din totalul de 271 de paciente care au inceput ciclurile de stimulare in 6 cazuri nu s-a efectuat punctie foliculara (pe motivul abandonarii ciclurilor). •

La 2 punctii foliculare nu s-au recoltat ovocite.

•

In 33 de situatii nu s-a realizat fecundarea.

•

In total la 41 de paciente nu s-a efectuat ET (date sumarizate in tabelul 1.3.10).

113

Tabel 1.3.10 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu agonisti-GnRH/ an 2001 Total

Total punctii efectuate

cicluri

Total cazuri cu

Total ET efectuate

fecundare realizata

stimulare

Numar

Procent

Numar

Procent

Numar

Procent

271

265

97,78 %

238

87,82 %

230

84,87 %

Sarcini/ 2001: 59 •

41 de sarcini din totalul de 59 s-au obtinut in urma metodei FIV/ET si 18 sarcini – din aplicarea tehnicii ICSI (1 sarcina din crioTESE)

•

la 55 de paciente care au obtinut sarcina s-a administrat rFSH in vederea stimularii ovariene, la 2 paciente: HMG si la 2 paciente: FSH-HP

•

dintre aceste paciente care au obtinut sarcina - protocolul lung a fost aplicat in 58 de cazuri si la 1 pacienta s-a utilizat protocolul ultra-lung.

Rata sarcinilor/ciclu: 21,77 % Rata sarcinilor/punctie: 22,26 % Rata sarcinilor/embriotransfer: 25,65% Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 26,52 % Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 15,12 % e. Discutii 1. Se remarca fata de anul anterior (2000) o scadere a numarului de paciente carora li s-a administrat protocol cu agonisti-GnRH si o crestere a pacientelor care au apelat la protocoalele cu antagonisti-GnRH. Acest fapt se datoreaza probabil si prin castigarea in experienta in terapia cu antagonisti-GnRH, cat si prin interpretarea rezultatelor (a procentului de sarcini) ca fiind comparabil intre agonisti- si antagonisti-GnRH. 2. Media de varsta a pacientelor din lotul agonisti-GnRH este de 34,77 ani, comparativ cu 33,66 ani la lotul ce a folosit antagonisti-GnRH. 3. Durata de stimulare cu gonadotropina este asemanatoare la cele 2 loturi, la fel si frecventa crescuta a administrarii preparatului rFSH fata de alte gonadotropine. Difera

114

insa doza de stimulare, care la lotul cu antagonisti-GnRH este in valoare medie mai mica decat la lotul cu agonisti-GnRN (1975,35 UI versus 2556,86 UI). 4. Procentul de raspuns nefavorabil la tratament, cu intreruperea ciclului este comparabil la cele 2 loturi, desigur fiecare raportat la numarul total de cicluri initiale. 5. Media ovocitelor si a celulelor cu 2PN este usor mai scazuta in grupul cu agonisti-GnRH comparativ cu antagonisti-GnRH/ anul 2001. 6. Rata sarcinilor raportata la numarul de cicluri initiate, la numarul de punctii efectuate si la numarul de embriotransferuri realizate este insa superioara in grupul cu agonisti-GnRH fata de antagonisti-GnRH: Rata sarcinilor/ciclu: 21,77% versus 14,08% Rata sarcinilor/punctie: 22,26 % versus 14,49% Rata sarcinilor/ET: 25,65% versus 16,12% Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 26,52 % versus 17,74% Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 15,12 % versus 9,85%.

115

Capitolul 1.4 Statistica pe 3 ani (1999-2000-2001) - Agonisti-GnRH a. Material si metoda In perioada celor cei 3 ani studiati (1999; 2000; 2001) un total de 832 de paciente s-au adresat in vederea reproducerii asistate si au urmat protocoale de stimulare ovariana ce cuprindeau in schema lor agonisti-GnRH (Tabel 1.4.1) (Fig. 1.4.1). Media de varsta a pacientelor se situeaza la 34,49 ani, cu mediana de 35 de ani si deviatia standard: 4,727. Varsta minima din acest grup de paciente a fost de 21 ani si varsta maxima de 46 ani. Tabel 1.4.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor - agonisti-GnRH/ 3 ani Varsta pacientelor (ani)

Numar paciente

Procent

< 30

143

17,18 %

30-34

259

31,12 %

35-39

298

35,81 %

≥ 40

132

15,86 %

Se remarca ca in cei 3 ani examinati separat, majoritatea pacientelor se situau in grupele de varsta 30-34 sau 35-39 ani, iar datele insumate arata ca procentul majoritar al pacientelor ce au urmat tratament in cadrul tehnicilor de reproducere asistata au avut varsta cuprinsa intre 35-39 ani, urmate indeaproape de pacientele in intervalul de varsta 30-34 de ani. Pacientele tinere < 30 ani si cele cu varsta ≥ 40 ani au de asemenea valori apropiate ca procente, dar sunt cu aproximativ jumatate mai putine (fiecare luate separat) decat cele din grupele 30-34 si 35-39 de ani. Femeile cu varsta >35 ani se adreseaza mai frecvent consultului si terapiei in vederea reproducerii asistate. Un factor important este acela ca actualmente femeia moderna este

116

implicata activ in viata sociala si profesionala si pe acest motiv amana momentul conceptiei dupa varsta de 30 sau chiar 35 de ani.

< 30 ani

143 132

30-34 ani 259

35-39 ani

298

> 40 ani

Fig. 1.4.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor - agonisti-GnRH/ 3 ani Pacientelor ce au urmat protocoale cu agonisti-GnRH li s-au administrat mai multe tipuri de gonadotropine in vederea stimularii ovariene controlate, conform tabelului 1.4.2 si figurii 1.4.2. Tabel 1.4.2 - Repartitia tipurilor de gonadotropine - agonisti-GnRH/ 3 ani Tipuri gonadotropine

Numar paciente

Procent

rFSH

660

79,32%

HMG

97

11,65%

rFSH + HMG

66

7,93%

FSH-HP

6

0,72%

rFSH + FSH-HP

1

0,12%

rFSH + HMG + FSH-HP

2

0,24%

117

Din tabel si figura se observa ca cel mai frecvent s-a utilizat preparatul sintetizat genetic. In partea generala a tezei am amintit studii care analizeaza comparativ rFSH si HMG si apoi rFSH si FSH-HP si evidentiaza superioritatea rFSH referitor la calitatea ovocitelor si a embrionilor. Costul acestei medicatii sintetizata genetic ramane inca ridicat si constituie un argument suficient de important pentru alegerea si altor tipuri de gonadotropine.

660

rFSH

700 600

HMG

500 400

rFSH + HMG

300

rFSH

HMG

6 FSH-HP

rFSH+HMG+FSHHP

0

1 rFSH+FSH-HP

2

100

FSH-HP

97

66 rFSH + HMG

200

rFSH+FSH-HP rFSH+HMG+FSHHP

Fig. 1.4.2 - Repartitia tipurilor de gonadotropine din stimularea ovariana - agonisti-GnRH/ 3 ani Asa cum se intalneste si in literatura de specialitate, protocolul lung a fost si in acesti 3 ani cel mai des aplicat protocol cu agonisti-GnRH la lotul de 832 de paciente. Avantajele si dezavantajele fiecarui protocol in parte, precum si momentul introducerii medicatiei supresive hipofizare si durata administrarii agonistului-GnRH au fost prezentate pe larg in partea generala. Protocolul lung a fost urmat ca frecventa de catre protocolul scurt si pe locul al treilea s-a situat protocolul ultra-lung (Tabel 1.4.3); (Fig. 1.4.3).

118

Tabel 1.4.3 - Incidenta tipurilor de protocol cu agonisti-GnRH/ 3 ani Tip protocol

1999

2000

2001

TOTAL

Lung

239

269

253

761

Scurt

12

22

10

44

Ultra-lung

7

12

8

27

•

Protocol lung: 761 cazuri (91,46%);

•

Protocol scurt: 44 cazuri (5,28%);

•

Protocol ultra-lung: 27 cazuri (3,24%).

800 700 761

600 500 400 300 200 27

100

44

0 Protocol lung

Protocol scurt

Protocol ultra-lung

Fig. 1.4.3 - Incidenta aplicarii celor 3 protocoale cu agonisti-GnRH/ 3 ani

119

Durata medie a stimularii ovariene a fost comparabila in cei 3 ani studiati (Tabel 1.4.4) si comparabila cu datele din studii internationale. Insumate, datele au fost urmatoarele: durata medie a stimularii ovariene: 11,36 zile, valoarea minima - 6 zile si cea maxima - 29 zile, mediana: 11 zile, deviatia standard: 2,336. Un procent de 56,37 % din paciente au necesitat o durata a stimularii intre 11-15 zile, fiind intervalul cel mai apropiat de mediana si media perioadei calculate pentru intregul lot; este comparabila si cu statistica generala. Valori ceva mai lungi (16-19 zile) si foarte prelungite ale stimularii (≥ 20 zile) s-au intalnit in procente scazut (Tabel 1.4.5). Tabel 1.4.4 - Parametri statistici ai duratei de stimulare ovariana - agonisti-GnRH/ 3 ani An studiat

Durata

Minim zile

Maxim zile

Mediana

Deviatia

medie a

stimulare

stimulare

(zile)

standard

stimularii (zile) 1999

11,46

7

21

11

2,198

2000

11,24

6

24

11

2,438

2001

11,41

6

29

11

2,350

TOTAL ani

11,36

6

29

11

2,336

Tabel 1.4.5 - Variatia pacientelor in functie de numarul de zile de stimulare ovariana - agonistiGnRH/ 3 ani Nr. zile stimulare

Nr. paciente

Procent

≤ 10 zile

324

38,94 %

11-15 zile

469

56,37 %

16-19 zile

34

4,08 %

≥ 20 zile

5

0,60 %

In ceea ce priveste doza medie calculata pentru unitatile de gonadotropina administrata la cele 832 de paciente a fost de 2635,19 UI, doza minima a fost de 750 UI si doza maxima la care s-a ajuns in cursul tratamentului – 14.700 UI (!!!); mediana: 2250 UI gonadotropina si deviatia 120

standard: 1428,368 (Tabel 1.4.6). Se observa ca doza medie de UI pentru fiecare an in parte cat si cea calculata pentru intreaga perioada de 3 ani se situeaza in jurul valorii de 2500 UI si usor mai crescuta peste aceasta valoare. Valorile maxime determinate pentru gonadotropinele administrate pentru fiecare an in parte este insa foarte diferita, fiind cauzata de raspunsul la terapia de stimulare al fiecarei paciente in parte si sugereaza statusul de „low responder”. Tabel 1.4.6 - Parametri statistici ai gonadotropinelor - agonisti-GnRH/ 3 ani An studiat

Doza medie

Minim doza

Maxim

Mediana

Deviatia

a stimularii

stimulare

doza

(UI)

standard

(UI)

(UI)

stimulare (UI)

1999

2784,98

750

14.700

2400

1692,569

2000

2577,42

825

8400

2250

1337,421

2001

2556,86

1050

9225

2250

1232,866

Total ani

2635,19

750

14.700

2250

1428,368

Ca si determinare hormonala a fost indispensabila si deosebit de importanta masurarea valorii serice a E2 pe parcursul stimularii, iar rezultatele din tabele se refera la ultima valoare anterior punctiei foliculare, fiind in ziua administrarii HCG. Acest hormon reflecta practic functia foliculilor si raspunsul la terapia de stimulare. De o deosebita utilitate este si dozarea serica al LH-ului, in vederea controlului supresiei hipofizare si a eficientei agonistului-GnRH. Pe perioada celor 3 ani valoarea medie a E2 seric, masurat anterior inducerii ovulatiei, a fost pentru intregul lot de paciente de 1926,21 pg/ml, cu o valoare minima obtinuta in ziua administrarii HCG de 34 pg/ml (!!!) si o valoare maxima de 27.669 pg/ml; mediana: 1602,5 pg/ml, deviatia standard: 1702,215. Tabelele urmatoare reflecta determinarile E2 seric pe paliere de valori. Ca si constatare: cele mai multe paciente (36,41 %) au avut valori ale E2 seric > 2000 pg/ml in ziua administrarii HCG, valori care se apropie de concentratii ce pot produce un sindrom de hiperstimulare ovariana, (Tabel 1.4.7 si tabel 1.4.8).

121

Tabel 1.4.7 - Valorile defalcate ale E2 seric (pg/ml) - agonisti-GnRH/ 3 ani Nivel E2 seric (pg/ml)

Numar paciente

Procent

< 1000 pg/ml

176

21,15 %

1000-1499 pg/ml

197

23,67 %

1500-1999 pg/ml

156

18,75 %

>2000 pg/ml

303

36,41 %

Tabel 1.4.8 - Parametri statistici ai nivelului E2 seric - agonisti-GnRH/ 3 ani An studiat

Nivel mediu Minim nivel

Maxim

Mediana

Deviatia

E2 (pg/ml)

nivel E2

(pg/ml)

standard

E2 (pg/ml)

(pg/ml) 1999

1862,16

135

22.580

1563

1747,692

2000

1877,16

205

27.669

1529

1917,754

2001

2042,04

34

10.889

1800

1369,984

TOTAL ani

1926,21

34

27.669

1602,5

1702,215

In ceea ce priveste valorile LH se constata urmatorii parametrii statistici (Tabelul 1.4.9). Tabel 1.4.9 - Parametri statistici pentru LH seric - agonisti-GnRH/ 3 ani Determinare

Valoarea

Valoarea

Valoarea

Mediana

LH seric

medie

minima

maxima

1999

2,43 UI/l

0,1 UI/l

38 UI/l

2 UI/l

2,698

2000

2,57 UI/l

0,1 UI/l

21,6 UI/l

2,1 UI/l

2,073

2001

2,34 UI/l

0,1 UI/l

28,2 UI/l

2 UI/l

2,157

TOTAL ani

2,45 UI/l

0,1 UI/l

38 UI/l

2 UI/l

2,307

standard

Doar in 4 cazuri (0,48%) au fost sesizate valori ale LH-ului > 10 UI/l. 122

Deviatia

3 paciente au fost stimulate cu rFSH si la o pacienta i s-a administrat asocierea rFSH si HMG. In 3 situatii supresia hipofizara s-a realizat in cadrul unui protocol lung si la pacienta cu asocierea de gonadotropine s-a preferat protocolul scurt. Foliculometria seriata este un parametru important de urmarit alaturi de dozarea E2 seric si semnifica reactivitatea pacientei la tratamentul administrat prin raspunsul ovarian. Am ales ca parametru de urmarire marimea foliculara, cu 3 paliere de dimensiuni, pentru evaluarea raspunsului ovarian. Masurarea ecografica a folicolilor s-a efectuat in paralel cu cea a dozarii E2 seric, valorile din tabel fiind ultimele masurate (anterior inducerii ovulatiei). La lotul de 832 de paciente in cei 3 ani s-au obtinut urmatoarele valori in cadrul protocoalelor cu agonisti-GnRH (Tabel 1.4.10): Tabel 1.4.10 - Parametri statistici pentru foliculometrie - agonisti-GnRH/ 3 ani Dimensiune

Numar

Numar

Numar

Mediana

Deviatia

folicoli

mediu

minim

maxim

13-15 mm

2,79

0

15

2

2,298

16-18 mm

3,09

0

24

3

2,554

> 18 mm

3,80

0

16

4

2,107

standard

(mm)

Tehnicile de reproducere asistata aplicate cel mai des in cei 3 ani luati separat si per ansamblu au fost fertilizarile conventionale, comparativ cu ICSI. De remarcat ca numarul de cicluri abandonate a variat intre 0,99 si 3,1% in cei 3 ani analizati si valoarea procentuala raportata la totalul de paciente a fost de 2,04%, care nu reprezinta o cifra semnificativa. (Tabel 1.4.11); (Fig. 1.4.4).

123

Tabel 1.4.11 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul protocoalelor cu agonistiGnRH/ 3 ani An

Nr.

FIV

ICSI

Fara punctie

paciente

Numar

Procent

Numar

Procent

Numar

Procent

1999

258

135

52,32%

115

44,57%

8

3,10%

2000

303

209

68,97%

91

30,03%

3

0,99%

2001

271

181

66,78%

84

30,99%

6

2,21%

17

2,04%

TOTAL

832

525

63,10%

290

34,85%

17

FIV/ET

290 525

ICSI

Fara punctie

Fig. 1.4.4 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul protocoalelor cu agonistiGnRH/ 3 ani 124

b. Rezultate Punctiile foliculare efectuate pentru FIV sau ICSI au recoltat o medie de 8,43 ovocite, numarul maxim de ovocite aspirat in cadrul unei punctii fiind de 32 iar numarul minim de 0, mediana: 8 ovocite, deviatia standard: 5,387. La controlul fecundarii realizat la 16-20 ore de la inseminarea sau microinjectarea ovocitelor s-a obtinut o medie de 3,71 celule cu 2PN, numarul maxim a fost de 23 celule cu 2PN si un numar minim de 0 celule cu 2PN (absenta fecundarii), mediana: 3 celule cu 2PN, deviatia standard: 3,273. S-au luat in calcul toate ciclurile de stimulare ovariana initiate. ET s-a efectuat cu 1, 2 sau maxim 3 embrioni (criteriile au fost variate: varsta pacientei, patologie, aspectul embrionilor, posibilitatea crioconservarii). Numarul mediu de embrioni pentru transfer a fost de 1,76, mediana: 2 embrioni, deviatia standard: 0,958. Au existat si situatii in care nu s-au transferat embrioni pe motivul sindromului de hiperstimulare (au fost crioconservati), fie calulele cu 2PN s-au oprit in evolutie. Cazul cel mai nefericit este cel la care in urma inseminarii/microinjectarii ovocitelor nu s-a realizat fecundarea. Au fost in total 135 cazuri la care nu s-a realizat embriotransfer. Rata realizarii embriotransferului a fost de 83,77% pentru cele 832 cazuri. Din totalul de 832 de cicluri initiale s-a reusit crioconservarea in 383 de cicluri (Tabel 1.4.12). S-a crioconservat o medie de 1,97 celule cu 2PN, numarul maxim fiind de 20, respectiv numarul minim de 0 celule cu 2 PN; mediana: 0, deviatia standard: 2,860. Tabel 1.4.12 - Repartitia crioconservarii functie de tehnica de reproducere asistata - agonistiGnRH/ 3 ani An

Nr.

Total crio

paciente

Crio-FIV

Crio-ICSI

Numar

Procent

Numar

Procent

1999

258

126

68

53,96%

58

46,03%

2000

303

121

73

60,33%

48

39,66%

2001

271

136

91

66,91%

45

33,08%

TOTAL

832

383

232

151

39,42%

125

60,57%

c. Observatii Complicatiile de tipul raspunsului redus la stimularea ovariana („low responder/no responder”) intalnite pe parcursul celor 3 ani la cele 832 de paciente s-au soldat cu intreruperea ciclului de stimulare si neefectuarea punctiei foliculare. Au existat si 3 cazuri la care in ciuda existentei criteriilor de abandonare a stimularii s-a tentat totusi aspirarea foliculara dar fie a fost punctia negativa – fara ovocite sau unicul ovocit extras nu s-a fecundat. In tabelul urmator (Tabel 1.4.13) sunt redate toate cazurile de „low responder” (cu sau fara punctie), situatie stabilita in functie de criteriile ecografice si hormonale. S-au exclus cazurile la care nu s-a efectuat punctia pe motivul sindromului de hiperstimulare. Tabel 1.4.13 - Raspunsul redus la terapia de stimulare – agonisti-GnRH/ 3 ani Low

Varsta

responder

Medie UI

Protocol agonist-

Durata

medie

gonado-

medie

(ani)

tropina

stim.

GnRH lung

scurt

34,22

4425,27

12,27

rFSH

HMG

rFSH+HMG

11

1

6

lung

(zile) 18 cicluri

ultra-

Tip gonadotropina

14

4

0

Raspunsul exagerat la terapia de stimulare, manifestat sub forma sindromului de hiperstimulare, se intalneste in 29 de cazuri (3,48%) din totalul de 832 cicluri cu agonisti-GnRH/ 3 ani. Formele si gravitatea acestui sindrom au fost de la cea usoara la moderata si severa, cu preponderenta celei moderate (in 21 de cazuri). Valoarea E2 seric se coreleaza in majoritatea situatiilor, exista insa si exceptii, la care nu se intalneste E2 seric crescut. Acest fapt a fost amintit in partea generala; fiind citate si cazuri de sindrom de hiperstimulare care apare in ciclu spontan (rar). Valoarea medie a E2 seric determinate pentru aceste paciente a fost de 3018,31 pg/ml, care se situeaza cu mult peste concentratia medie a E2 seric calculat la lotul total de 832 de paciente (1926,21 pg/ml). La 18 paciente s-a inregistrat si prezenta sarcinii.

126

d. Concluzii In perioada celor 3 ani analizati s-au obtinut pentru cele 832 de cicluri de stimulare ovariana controlata cu protocoale cu agonisti-GnRH un numar total de 179 de sarcini (21,51%). Nu s-au obtinut decat 27 sarcini biochimice (15,08%), 29 sarcini s-au terminat cu avort (spontan sau terapeutic) (16,2%) iar numarul sarcinilor ectopice s-a ridicat la 9 (5,02%). Sarcinile multiple au fost de asemenea reduse comparativ cu sarcinile monofetale (13,40% versus 50,83%), sarcinile multiple fiind reprezentate doar de sarcini gemelare. Rata avorturilor, a sarcinilor extrauterine si a celor multiple se inscriu procentual in datele din literatura de specialitate (exemplificat in partea generala) (Tabel 1.4.14). Tabel 1.4.14 - Numarul de sarcini/ nasteri la pacientele cu agonisti-GnRH/ 3 ani An

Nr.

Nr.

Sarcini

paciente

sarcini

biochimice

1999

258

56

6

2000

303

64

2001

271

59

TOTAL

832

179

Sarcina

Nastere

Nastere

Nastere

ectopica

monofetala

gemelara

multipla

7

3

34

6

0

13

13

5

23

11

0

8

9

1

34

7

0

91

24

0

27

Avort

29

9

21,51%

Sarcini/ 1999: 56 •

34 sarcini au rezultat din FIV/ET si 22 sarcini - din ICSI (1 sarcina din crioTESE);

•

51 paciente care au obtinut sarcina (inclusiv biochimica) au fost stimulate cu rFSH, 3 paciente: stimulare ovariana cu HMG, 2 paciente: rFSH asociat cu HMG;

•

la 53 de paciente s-a aplicat protocolul lung, la 3 paciente – protocolul ultra-lung.

Sarcini/ 2000: 64 •

43 sarcini au fost obtinute din FIV/ET si 21 de sarcini – din ICSI (3 sarcini din crioTESE);

•

la 47 de paciente stimularea s-a efectuat cu rFSH, la 10 paciente – cu HMG, la 2 paciente cu FSH-HP, la 5 paciente: asociere rFSH cu HMG;

127

•

din aceste paciente care au obtinut sarcina s-a aplicat protocolul lung la 59 de paciente, cel scurt la 3 paciente si cel ultra-lung la 2 paciente.

Sarcini/ 2001: 59 •

41 de sarcini din totalul de 59 s-au obtinut in urma metodei FIV/ET si 18 sarcini – din aplicarea tehnicii ICSI (1 sarcina din crioTESE);

•

la 55 de paciente care au obtinut sarcina s-a administrat rFSH in vederea stimularii ovariene, la 2 paciente: HMG si la 2 paciente: FSH-HP;

•

dintre aceste paciente care au obtinut sarcina - protocolul lung a fost aplicat in 58 de cazuri si la 1 pacienta s-a utilizat protocolul ultra-lung.

Conform tabelelor 1.4.15 – 1.4.17 si a figurilor 1.4.5 - 1.4.7 se conclude ca: •

de la introducerea rFSH, acesta a castigat in incredere si si-a dovedit superioritatea fata de preparatele gonadotropinice anterioare, fiind administrat in studiul actual in procent de 85,47%;

Tabel 1.4.15 - Frecventa tipurilor de gonadotropine in cadrul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ agonisti-GnRH Nr. sarcini 1999 2000 2001 TOTAL Procent rFSH

51

47

55

153

85,47%

HMG

3

10

2

15

8,37%

FSH-HP

0

2

2

4

2,23%

rFSH+HMG

2

5

0

7

3,91%

128

60 50

1999

40

2000

30

2001

20 10 0

rFSH

HMG

FSH-HP

rFSH+HMG

Fig. 1.4.5 - Frecventa tipurilor de gonadotropine in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ agonisti/GnRH •

tipul de protocol care a fost administrat in cazul marii majoritati a pacientelor a fost cel lung (94,97%). Exista acumulata o experienta suficient de mare in cazul acestui protocol si literatura de specialitate confirma avantajele acestuia;

Tabel 1.4.16 - Frecventa tipurilor de protocoale cu agonisti-GnRH in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani Nr.sarcini 1999 2000 2001 TOTAL Procent Protocol lung

53

59

58

170

94,97%

Protocol scurt

0

3

0

3

1,67%

Protocol ultra-

3

2

1

6

3,35%

lung

129

60 50

1999

40

2000

30

2001

20 10 0

Protocol lung

Protocol scurt

Protocol ultralung

Fig. 1.4.6 - Frecventa tipurilor de protocoale cu agonisti-GnRH in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani •

fertilizarile conventionale FIV/ET au fost in fiecare an superioare ca numar tehnicilor de microinjectie ICSI (65,92% versus 34,07%) si aplicate conform indicatiilor fiecarei metode.

Tabel 1.4.17 - Incidenta tehnicilor reproducerii asistate in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ agonisti/GnRH 1999 2000 2001 TOTAL Procent Total

56

64

59

179

FIV/ET

34

43

41

118

65,92%

ICSI

22

21

18

61

34,07%

sarcini

130

1999

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

2000 2001

FIV/ET

ICSI

Fig. 1.4.7 - Incidenta tehnicilor reproducerii asistate in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ agonisti/GnRH Din 258 cicluri de stimulare initiate in anul 1999: •

8 cazuri nepunctionate;

•

1 caz fara ovocit la punctie;

•

16 cazuri fara fecundare;

•

in total: 29 cazuri fara ET.

Cele 303 paciente care au inceput ciclul de stimulare ovariana controlata in anul 2000: •

in 3 cazuri nu s-a efectuat punctie foliculara;

•

la 4 paciente la aspiratia folicolilor nu s-au recoltat ovocite (punctie negativa);

•

in 57 de situatii nu s-a realizat fecundatia;

•

la 2 paciente s-au crioconservat toate ovocitele fecundate (toti prezigotii) si nu s-a mai efectuat ET;

•

in total la 66 de paciente ciclul de stimulare inceput nu s-a finalizat cu ET.

Din totalul de 271 de paciente care au inceput ciclurile de stimulare in anul 2001: 131

•

in 6 cazuri nu s-a efectuat punctie foliculara (pe motivul abandonarii ciclurilor);

•

la 2 punctii foliculare nu s-au recoltat ovocite;

•

in 33 de situatii nu s-a realizat fecundarea;

•

in total la 41 de paciente nu s-a efectuat ET.

(Tabel 1.4.18) Tabel 1.4.18 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu agonisti-GnRH/ 3 ani

An

Total

Total punctii

Total cazuri cu

cicluri

efectuate

fecundare realizata

Total ET efectuate

stimulare

Numar

Procent

Numar

Procent

Numar

Procent

1999

258

250

96,89%

233

90,31%

229

88,75%

2000

303

300

99%

246

81,18%

237

78,21%

2001

271

265

97,78 %

238

87,82 %

230

84,87 %

TOTAL

832

815

97,95%

717

86,17%

696

83,65%

Datele finale ale ratei sarcinilor sunt exemplificate in tabelul 1.4.19. Toate procentele defalcate pe ani in parte pentru rata sarcinilor/ciclu se coreleaza cu procentele din statisticile generale de 20-25% iar baby take home rate pentru cei 3 ani (13,82%) este de asemenea comparabila cu datele din literatura. Rata sarcinilor/cicluri stimulate: 21,51% Rata sarcinilor/punctii efectuate: 21,96 % Rata sarcinilor/embriotransfer: 25,68% Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 27,29% Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 13,82%.

132

Tabelul 1.4.19 - Rata sarcinilor – protocol agonisti-GnRH/ 3 ani Rata sarcini/ciclu Rata sarcini/ punctie Rata sarcini/ET Rata implantarii Baby take home rate

1999 21,70%

2000 21,12%

2001 21,77%

TOTAL 21,51%

22,40%

21,33%

22,26 %

21,96%

24,45%

27%

25,65%

25,68%

28,38%

27%

26,52 %

27,29%

15,50%

11,22%

15,12 %

13,82%

e. Discutii 1. Numarul de paciente care s-a adresat intr-o perioada de 3 ani unui centru de reproducere umana asistata si au fost incluse in program de stimulare ovariana cu protocol agonistiGnRH a fost cu mult superior lotului de paciente cu protocol cu antagonisti-GnRH. O explicatie este faptul ca agonistii sunt cunoscuti mai demult si experienta acumulata cu acestia este mai mare. Sinteza substantelor antagoniste si introducerea lor in practica curenta este de data mai recenta. Este necesara o perioada de timp pentru a fi acceptata aceasta medicatie atat de medic cat si de pacienta. 2. Se remarca ca media de varsta a pacientelor se situeaza la 34,49 ani, cu mediana de 35 de ani, extremele sunt de 21 de ani si 46 de ani. Conform tendintei actuale a femeii moderne de implicare activa in viata profesionala, se deduce de ce perioada alocata conceptiei se situeaza in jurul acestei varste. 3. Din punctul de vedere al tipului de protocol – cel lung a fost aplicat in procent covarsitor in cei 3 ani analizati separat si per ansamblu, existand mai bune rezultate cu acest protocol. 4. Referitor la stimularea ovariana, preparatul care s-a impus este cel sintetizat genetic, cu efecte mai bune asupra numarului si calitatii ovocitare si embrionare, comparativ cu celelalte gonadotropine cunoscute.

133

5. Durata stimularii ovariene este in medie de 11,36 zile, majoritatea pacientelor (56,37%)sau incadrat in grupa perioadei cuprinse 11-15 zile. 6. Valoarea medie a E2 seric (dozat in ziua inducerii ovulatiei) a fost 1926,21 pg/ml pentru intregul lot de 832 de paciente, cu o valoare minima - 34 pg/ml (!!!) si o valoare maxima de 27.669 pg/ml (dependent de raspunsul individual); mediana: 1602,5 pg/ml. 7. Cresteri premature al LH-ului endogen> 10 UI/l s-au determinat doar in 4 cazuri (0,48%) LH-ului, ceea ce semnifica o buna complianta a tratamentului. 3 din aceste cazuri au fost asociere de protocol lung si rFSH, iar intr-o situatie a fost vorba de protocol scurt si rFSH+HMG. 8. Incidenta tehnicii clasice de FIV/ET a fost cu mult mai crescuta fata de metoda microinjectiei ICSI, atat in cazul intregului lot de paciente cat si la cele care au obtinut sarcina. ICSI are indicatii clare, limitate la un grup mai restrans de patologie, in special la cea masculina si care poate constitui un factor de fertilitate mai scazuta. 9. Numarul mediu de ovocite recoltat prin punctie foliculara a fost de 8,43, care se inscrie in datele din literatura de specialitate. 10. Ciclurile abandonate pe motivul de raspuns redus la terapie, complicatia de low responder sau dimpotriva, cea de sindrom de hiperstimulare ovariana nu se afla procentual la valori care sa depaseasca statisticile generale. 11. Rata sarcinilor/ciclu: 21,51% si baby take home rate se incadreaza de asemenea in parametri generali.

134

Capitolul 2 – Statistica pe 3 ani pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH in reproducerea umana asistata

Capitolul 2.1 Statistica protocoalelor cu antagonisti-GnRH - anul 1999

a. Material si metoda Numarul de paciente la care s-au efectuat tehnici de reproducere asistata utilizand antagonisti-GnRH in cadrul schemelor de stimulare ovariana au fost 41. Varsta medie a acestora a fost de 36,21 ani, mediana: 37 ani, cu valorile minime si maxime de 24 si 42 ani. Deviatia standard: 4,210 (Tabel 2.1.1). Tabel 2.1.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor (antagonist-GnRH/ 1999) Varsta pacientelor (ani)

Numar paciente

Procent

< 30

3

7,31 %

30-34

5

12,19 %

35-39

24

58,53 %

≥ 40

9

21,95 %

Se observa din acest tabel ca majoritatea pacientelor s-au incadrat in grupul de varsta 3539 de ani. Stimularea ovariana a folosit mai multe tipuri de preparate, cel mai frecvent a fost administrat rFSH (in 31 cazuri, 75,6%) (Tabel 2.1.2); (Fig. 2.1.1). Tabel 2.1.2 - Preparate de gonadotropine in stimularea ovariana (antagonist-GnRH/ 1999) Procent

Tipuri gonadotropine

Numar paciente

rFSH

31

75,6 %

HMG

4

9,75 %

rFSH+HMG

5

12,19 %

FSH-HP

1

2,43 %

135

1 5

rFSH

4 HMG

rFSH+HMG

31

FSH-HP

Fig. 2.1.1 - Repartitia preparatelor gonadotropinice in stimularea ovariana (antagonist-GnRH/ 1999) In total s-au folosit pentru stimularea ovariana o medie de 2176,58 UI gonadotropina, cu limitele intre 525 UI si 6000 UI; mediana: 1875 UI, deviatia standard: 1118,79. Durata medie a stimularii a fost de 9,58 de zile, cu limitele intre 6 si 17 zile, mediana: 9 zile, deviatia standard: 2,144. Dintre tipurile de protocol cu anatgonist-GnRH a fost preferat protocolul german (Lübeck) in 37 de cazuri, fata de protocolul francez – in 3 cazuri (Fig. 2.1.2).

136

3

protocol Lubeck

37

Protocol francez

Fig. 2.1.2 Tipurile de protocol cu antagonist-GnRH/ an 1999 Valoarea maxima atinsa a estradiolului seric a fost in medie de 1141,39 pg/ml, cu extremele intre 219-2650 pg/ml, mediana: 1056 pg/ml, deviatia standard: 553,508 (Tabel 2.1.3) Tabel 2.1.3 - Valori defalcate ale estradiolului seric (pg/ml) (antagonist-GnRH/ 1999) Nivel E2 (pg/ml)

Numar paciente

Procent

< 1000 pg/ml

20 cazuri

48,78%

1000-1499 pg/ml

14 cazuri

34,14%

1500-1999 pg/ml

4 cazuri

9,75%

>2000 pg/ml

3cazuri

7,31%

Ca si o observatie: valoarea minima a estradiolului a fost de 219 pg/ml, totusi la aceasta pacienta s-a efectuat punctie foliculara si s-a obtinut si fecundare. Complicatii de tipul sindromului de hiperstimulare ovariana nu s-au intalnit la cele mai mari nivele atinse ale estradiolului seric, ci la un nivel mediu, de 1269 pg/ml.

137

Concentratia medie serica a LH-ului a fost de 2,38 mUI/ml, cu extremele de 0,1 si 27,9 mUI/ml, mediana: 1,6 mUI/ml, deviatia standard: 4,301. Ecografic s-au descris folicoli cu dimensiunile (Tabel 2.1.4): •

Media folicolilor 13-15 mm: 2,4. Mediana: 2 folicoli, deviatia standard: 2,013;

•

Media folicolilor 16-18 mm: 2,12. Mediana: 2 folicoli, deviatia standard: 1,791;

•

Media folicolilor > 18 mm: 4,12. Mediana: 3 folicoli, deviatia standard: 2,767.

Preponderenti au fost folicolii > 18 mm, asa cum de fapt se si doreste in cadrul unei stimulari ovariene controlate. Tabel 2.1.4 - Parametri statistici ai folicolilor (antagonisti-GnRH/anul 1999) Dimensiune

Media

Mediana

Numarul

Numarul

Deviatia

minim

maxim

standard

folicoli 13-15 mm

2,4

2

0

7

2,013

16-18 mm

2,12

2

0

6

1,791

> 18 mm

4,12

3

1

17

2,767

Tehnicile de reproducere asistata care s-au efectuat au fost FIV conventionala in 24 cazuri si ICSI in 16 situatii, dintre care la 1 pacienta s-au folosit spermii crioconservate si decongelate, obtinute din biopsie testiculara (TESE). Intr-o situatie nu s-a aplicat nici o metoda pe motivul abandonului ciclului („low responder”) (Fig. 2.1.3). •

FIV: 24 cazuri (58,53%);

•

ICSI: 16 cazuri (39,02%);

•

Cazuri nepunctionate: 1 (2,43%).

138

1 FIV conventionala

16 24

ICSI

Caz nepunctionat

Fig. 2.1.3 - Tehnici de reproducere asistata aplicate (antagonisti-GnRH/anul 1999) b. Rezultate Numarul de ovocite obtinute in medie la aspiratul folicular a fost de 7,56, cu valoarea minima de 0 (intr-un caz in care s-a efectuat punctie foliculara, cu toate ca se intruneau criterii de abandon a ciclului) si valoarea maxima de 19 ovocite. Mediana: 6 ovocite, deviatia standard: 4,975 (Tabel 2.1.5). Tabel 2.1.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu antagonisti-GnRH/ anul 1999 Numar mediu

Mediana

ovocite 7,56

6

Numar maxim

Numar minim

Deviatia

recoltat

recoltat

standard

19

0

4,975

Fecundarea, obtinerea celulelor cu 2 PN, s-a intalnit in 39 de cazuri din totalul de 41 cicluri stimulate (95,12%). Media celulelor fertilizate a fost de 4,19, cu limite intre 1 si 12 celule cu 2 PN, mediana: 3 celule cu 2 PN, deviatia standard 3,226 (Tabel 2.1.6).

139

Tabel 2.1.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (antagonisti-GnRH/ anul 1999) Numar mediu

Mediana

celule cu 2PN 4,19

Numar maxim

Numar minim

Deviatia

celule cu 2PN

celule cu 2PN

standard

12

1

3,226

3

Numarul de embrioni care s-au transferat au fost intre 0 si 3, niciodata > 3 embrioni, cu o medie de 2,07, mediana de 2 embrioni si deviatia standard: 0,905. Crioconservarea celulelor cu 2 PN s-a putut efectua in 20 de cazuri, dintre care in 14 situatii celulele au provenit din FIV conventionala si in 6 cazuri – de la ICSI. Media celulelor cu 2 PN care s-au crioconservat a fost de 2,12, cu extremele de 1 si 10 (fig. 2.1.4).

14 12 10

14

8 6

6 4 2 0

Crio-FIV

Crio-ICSI

Fig. 2.1.4 - Incidenta crioconservarii ca provenienta a celulelor fecundate din FIV, respectiv ICSI (antagonisti-GnRH/ anul 1999).

140

In urma acestor proceduri s-a obtinut un total de 4 sarcini, evolutia acestora fiind urmatoarea: •

2 avorturi spontane (la 6 si 8 saptamani de gestatie)

•

2 nasteri - la termen, pe cale naturala, sarcini monofetale, copiii nascuti – cariotip normal

Nu s-a intalnit nici o sarcina biochimica, extrauterina si nu au fost sarcini multiple (Tabel 2.1.7). Tabel 2.1.7 - Evolutia sarcinilor la pacientele cu antagonisti-GnRH/ anul 1999 Sarcina

Sarcina

Avort

Sarcina

Nastere

Nastere

Nastere

biochimica

spontan

ectopica

monofetala

gemelara

tripla

Nr. cazuri

0

2

0

2

0

0

Procent

0

50%

0

50%

0

0

c. Observatii Esecurile intalnite au fost 2 la numar, reprezentate de o crestere prematura de LH si o situatie de „low responder”. •

Situatia de „low responder” se descrie la o pacienta de 38 de ani, la care s-a stimulat ovarian cu rFSH timp de 11 zile, un numar total de UI de 1875, in cadrul protocolului Lübeck. Estradiolul seric maxim obtinut a fost de 381 pg/ml si valoarea LH a fost de 0,1 mUI/ml. Ecografic s-au masurat 2 folicoli 13-15 mm si 2 folicoli > 18 mm. Avand in vedere criteriile de abandon ale stimularii la aceasta pacienta nu s-a efectuat punctie foliculara (Tabel 2.1.8).

•

Cresterea prematura de LH s-a intalnit la o pacienta de 41 de ani, la care s-a aplicat protocolul francez, stimularea fiind cu rFSH timp de 9 zile, total UI FSH: 1575. Estradiolul seric a fost de 771 pg/ml si LH a crescut la 27,9 mUI/ml. Ecografic s-au masurat 4 folicoli de 13-15 mm si 2 folicoli > 18 mm. Cu toate ca aspectul ecografic, cel al nivelurilor hormonale si varsta pacientei au pledat pentru intreruperea stimularii, totusi s-a efectuat aspirat folicular in cadrul FIV conventionale, dar nu s-a obtinut nici un ovocit (Tabelul 2.1.9).

141

Tabel 2.1.8 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara)- antagonisti-GnRH/ anul 1999 Caz

Cauza

Varsta

Tip

Durata

Nr.

Tip

E2

LH

Nr.

(ani)

FSH

stimularii

total

protocol

(pg/ml)

(UI/l)

folicoli

UI

- 13-15 - 16-18 - > 18

1

Low

38

rec

11 zile

1875

Lubeck

381

0,1

2/ 0/ 2

response

Tabel 2.1.9 - Cicluri cu punctie efectuata, dar cu status de „low responder” – antagonisti-GnRH/ anul 1999 Caz

Cauza

Varsta

Tip

Durata

Nr.

Tip

E2

LH

Nr.

Rezultat

(ani)

FSH

stimularii

total

protocol

(pg/ml)

(UI/l)

folicoli

punctie

UI

- 13-15 - 16-18 - > 18

1

↑

41

rec

9 zile

1575

francez

771

27,9

4/ 0/ 2

prematura

FIV. Øovocit

LH

Observatii particulare: •

Valoarea cea mai mica a estradiolului seric din grupul de 41 de paciente a fost de 219 pg/ml (valoare extrem de redusa) la o pacienta de 35 de ani, stimulata ovarian cu 1800 UI rFSH timp de 8 zile, in cadrul protocolului Lübeck. Valoarea masurata a LH-ului: 3,2 mUI/ml. Folicolii masurati ecografic au fost: 3 folicoli 13-15 mm; 1 folicol 16-18 mm; 2 folicoli > 18 mm. S-a efectuat FIV conventionala si s-au obtinut 6 ovocite, dintre care 2 s-au fecundat. Embriotransferul s-a efectuat cu 2 embrioni, dar nu s-a obtinut nici o sarcina.

•

Toate cele 4 sarcini obtinute au fost in urma punctiei foliculare din cadrul FIV clasice, la toate pacientele s-a folosit ca si gonadotropina - rFSH si s-a utilizat protocolul Lübeck. Ca si complicatie in sensul raspunsului exagerat amintesc 1 caz de sindrom de

hiperstimulare ovariana grad I, care a aparut la o pacienta in varsta de 39 ani, la care s-a stimulat 142

cu rFSH timp de 6 zile, doza totala: 1275 UI, s-a aplicat protocolul Lübeck. Valoarea maxima a estradiolului seric a fost de 1269 pg/ml, iar LH a fost de 0,2 mUI/ml. Ecografic folicolii au fost in numar de 17 si toti > 18 mm. S-a practicat FIV clasica si s-au recoltat 19 ovocite, dintre care 11 s-au fecundat. 3 dintre aceste celule s-au cultivat pana a 2-a zi si s-a efectuat embriotransfer cu 3 embrioni. Restul de 8 celule cu 2 PN s-au crioconservat. Nu s-a obtinut nici o sarcina. De remarcat: criteriul de intrerupere a stimularii a fost indeplinit prin numarul mare de folicoli > 18 mm, dar cu o secretie inadecvata de estradiol (mica pentru numarul si dimensiunea folicolilor, neconcordanta). S-a indus ovulatia cu 10.000 UI HCG si s-a sustinut faza luteala cu progesteron intravaginal 600 mg/zi. d. Concluzii Din cele 41 cicluri stimulate initial la 1 caz nu s-a efectuat punctie foliculara pe motivul „low responder” (s-au efectuat doar 40 punctii). In 2 cazuri nu s-au obtinut ovocite (1 caz nu a fost punctionat si intr-un caz nu s-au recoltat ovocite. Prin urmare, din totalul de 41 cicluri stimulate, doar in 39 de cazuri s-a realizat embriotransferul (Tabel 2.1.10). Tabel 2.1.10 - Rezultatele ciclurilor cu antagonisti-GnRH/ an 1999 Numar cicluri

Total punctii efectuate

Total ET realizate

stimulate

Numar

Procent

Numar

Procent

41

40

97,56%

39

95,12%

Rata sarcinilor/ciclu: 9,75% Rata sarcinilor/punctie: 10% Rata sarcinilor/embriotransfer: 10,25% Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 10,25% Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 4,87%

143

e. Discutii 1. Numarul de paciente din lotul ce au utilizat protocoale de stimulare ovariana cu antagonisti-GnRH in schema au fost intr-un numar de 6 ori mai redus comparativ cu pacientele care s-au adresat reproducerii asistate si care au fost incluse in protocoale cu agonisti-GnRH. 2. Varsta medie a pacientelor se situeaza intre 35-39 ani. 3. Tipul de gonadotropina, durata medie a stimularii si doza medie totala a unitatilor de gonadotropina sunt similare la lotul agonist versus antagonist-GnRH. 4. Numarul de punctii foliculare raportate la ciclurile initiale de stimulare ovariana si procentul de ET realizate, raportate tot la ciclurile de stimulare, se ridica la valori similare cu situatia intalnita la grupul cu agonist-GnRH. 5. Media si mediana ovocitelor rezultate in urma punctiei foliculare sunt mai reduse comparativ cu grupul de paciente din acelasi an si carora li s-a administrat protocol cu agonist-GnRH 6. Complicatii de tipul „low response” si sindrom de hiperstimulare ovariana se intalnesc in procent redus (2,43%). 7. Totalul de sarcini obtinute au fost in urma tratamentului de stimulare cu rFSH in cadrul protocolului Lübeck. Acest tip de protocol a fost administrat in procent majoritar comparativ cu protocolul francez. 8. Raportarea sarcinilor la numarul de cicluri de stimulare/ la numarul de punctii efectuate si la numarul de ET realizate este mult mai scazut in grupul antagonist-GnRH versus agonist-GnRH.

144

9. Baby take home rate are valori reduse atat in comparatie cu datele din literatura de specialitate, cat si fata de rezultatele obtinute la lotul de paciente cu agonist-GnRH.

145

Capitolul 2.2 Statistica protocoalelor cu antagonisti-GnRH - anul 2000

a. Material si metoda Un numar de 37 de paciente au efectuat cicluri cu antagonisti-GnRH in anul 2000. Varsta medie a pacientelor a fost 34,13 ani, cu limitele intre 26-43 ani, mediana: 34 ani, deviatia standard: 4,001. Pacientele majoritare s-au situat in grupul de varsta 30-39 ani. Doar 3 paciente din grupul de 37 au avut varsta <30 ani. (Tabel 2.2.1) Tabel 2.2.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor care au efectuat cicluri cu antagonistGnRH/ 2000 Varsta pacientelor

Numar paciente

Procent (%)

<30 ani

3

8,1

30-34 ani

16

43,24

35-39 ani

15

40,54

≥ 40 ani

3

8,1

Pentru stimularea ovariana s-au folosit preponderent preparatele de rFSH (34 paciente), la 2 paciente s-a utilizat HMG iar la 1 pacienta s-au combinat cele 2 preparate (rFSH si HMG) (Fig. 2.2.1). Durata medie a stimularii cu gonadotropina a fost de 9,83 zile, durata cea mai scurta fiind de 7 si cea maxima de 31 zile, mediana: 9 zile, deviatia standard: 3,869. Media uitatilor de gonadotropina folosite pe parcursul stimularii ovariene a fost de 1939,32 UI FSH, cu extremele de 900 si 6225 UI, mediana: 1650 UI, deviatia standard: 912,635.

146

35 30 25

34

rFSH

20 HMG

15 HMG+rFSH

10 5 0

2

1

Fig. 2.2.1 - Preparate folosite pentru stimularea ovariana (antagonist-GnRH/ 2000) Tipurile de protocol cu antagonist-GnRH au fost: •

Protocolul francez (doza unica): 6 cazuri (16%)

•

Protocolul Lűbeck: 31 cazuri (84%) (Fig. 2.2.2)

6

31

Protocol francez

Protocol Lubeck

Fig. 2.2.2 - Tipurile de protocol cu antagonist-GnRH/ anul 2000

147

Nivelul seric obtinut pentru E2 (valoarea medie) in ziua administrarii HCG a fost de 1237,13 pg/ml, cu valoarea minima de 101 si maxima de 5494 pg/ml (Tabel 2.2.2), mediana 1105 pg/ml, deviatia standard: 1012,796. Se observa ca in 48,64 % din cazuri cresterea estradiolului seric pe parcursul stimularii (determinata inaintea administrarii HCG) a fost < 1000 pg/ml. In aceste cazuri se inscriu si cele la care s-au abandonat ciclurile de stimulare pe motivul cresterii monofoliculare sau a scaderii concentratiei de estradiol. Tabel 2.2.2 - Nivelul defalcat al estradiolului seric – antagonisti-GnRH/ an 2000 Nivel seric estradiol

Nr. cazuri

%

< 1000

18

48,64

1000-1500

9

24,32

1500-2000

4

10,81

>2000

6

16,21

(pg/ml)

S-a controlat pe parcursul stimularii si nivelul LH-ului endogen (mUI/ml), a carui valoare medie a fost de 2,056; cu minima de 0,1 si maxima de 19,6 mUI/ml, mediana 0,9 mUI/ml, deviatia standard: 3,305. Doar 1 caz a prezentat o crestere prematura de LH (> 10 mUI/ml), constituind un criteriu de abandon al ciclului si nu s-a efectuat punctie foliculara. Masurarea ecografica a folicolilor a aratat urmatoarele valori (Tabel 2.2.3): •

Folicoli 13-15 mm - (media): 2,67 (valori extreme: 0-10);

•

Folicoli 16-18 mm - (media): 2,35 (valori extreme: 0-10);

•

Folicoli > 18 mm - (media): 3,51 (valori extreme: 0-12);

148

Tabel 2.2.3 – Parmateri statistici pentru folicoli – protocol cu antagonist-GnRH/ an 2000 Dimensiune

Media

Mediana

folicoli

Valoarea

Valoarea

Deviatia

minima

maxima

standard

13-15 mm

2,67

2

0

10

2,224

16-18 mm

2,35

2

0

10

1,917

> 18 mm

3,51

3

0

12

2,168

Din totalul de cicluri cu antagonist-GnRH/ anul 2000, la 21 cazuri s-a efectuat FIV/ET si la 13 cazuri - ICSI. (Fig. 2.2.3) Majoritatea ciclurilor au fost de fertilizare conventionala. 3 cicluri din 37 totale au fost abandonate si nu s-a mai practicat punctie foliculara. •

FIV 21 cazuri (56,75%);

•

ICSI: 13 cazuri (35,13%);

•

Cazuri nepunctionate: 3 (8,1%).

3

13

FIV/ ET

21

ICSI

Cazuri nepunctionate

Fig. 2.2.3 - Proportia FIV/ET si ICSI la cele 34 cicluri antagonisti GnRH/ anul 2000 cu punctie efectuata (din totalul de 37 cicluri stimulate)

149

b. Rezultate La punctia foliculara s-au obtinut in medie 8,24 ovocite comparabil cu datele din literatura), cu valoarea minima de 0 si maxima de 24 ovocite, mediana: 7 ovocite, deviatia standard: 5,741 (Tabel 2.2.4). Tabel 2.2.4 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu antagonisti-GnRH/ anul 2000 Numar mediu

Mediana

ovocite 8,24

7

Numar maxim

Numar minim

Deviatia

recoltat

recoltat

standard

24

0

5,741

Fecundarea (celulele cu 2 PN) a fost controlata la 16-20 ore de la inseminarea sau microinjectarea ovocitelor si s-a constatat o medie de 4,05 celule cu 2 PN, cu extremele intre 0 si 13 celule cu 2 PN, mediana: 3 celule cu 2 PN, deviatia standard: 3,390 (Tabel 2.2.5). Tabel 2.2.5 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (antagonisti-GnRH/ anul 2000) Numar mediu

Mediana

celule cu 2PN 4,05

3

Numar maxim

Numar minim

Deviatia

celule cu 2PN

celule cu 2PN

standard

13

0

3,390

Celulele crioconservate (in stadiul de 2 PN) au fost in medie 2,05, cu limitele intre 1 si 10 celule. Crioconservarea s-a efectuat in total la 17 cazuri, dintre care la 6 s-au obtinut celulele cu 2 PN din cicluri ICSI si la 11 cazuri celulele crioconservate au provenit din cicluri FIV/ET. (Fig. 2.2.4).

150

CrioFIV/ET

6 11

Crio-ICSI

Fig. 2.2.4 - Raportul celulelor cu 2 PN crioconservate ca provenienta din cicluri FIV/ET si ICSI Media embrionilor transferati a fost de 2, cu limitele intre 0 (unde nu s-a obtinut fertilizare) si 3, mediana: 2 embrioni, deviatia standard: 1. Nu s-a transferat un numar mai mare de 3 embrioni (nici chiar la varsta extrema din grupul studiat). In urma tehnicilor de reproducere umana asistata la grupul de 37 paciente care au efectuat protocol de stimulare ovariana ce cuprindea in schema lor antagonist-GnRH s-a obtinut un numar de 3 sarcini: •

1 sarcina a fost biochimica (cresterea β-HCG si scaderea lui pe parcurs, fara a se vizualiza sac gestational ecografic);

•

2 sarcini au fost terminate prin nasteri. Amandoua sarcinile au fost multiple: una tripla, terminata prin operatie cezariana la 33 S.G; cei 3 nou nascuti au prezentat stenoza intestinala, parintii au fost depistati cu deficit de 21-OH hidroxilaza si mama a dezvoltat diabet gestational. A 2-a sarcina multipla a fost gemelara, terminata prin operatie cezariana la 37 SG (Tabel 2.2.6).

Toate cele 3 sarcini au provenit din embrioni de la cicluri FIV, in care s-a folosit pentru stimularea ovariana rFSH si protocol Lübeck cu antagonisti-GnRH.

151

Tabel 2.2.6 – Evolutia sarcinilor obtinute in urma tehnicilor de reproducere asistata – protocol anatagonist-GnRH/ an 2000 Sarcina

Sarcina

Avort

Sarcina

Nastere

Nastere

Nastere

biochimica

spontan

ectopica

monofetala

gemelara

tripla

Nr. cazuri

1

0

0

0

1

1

Procent

33,33%

0

0

0

33,33%

33,33%

c. Observatii Esecurile in aceste 37 de cazuri au fost reprezentate de: •

1 crestere monofoliculara;

•

2 valori scazute ale E2 seric pe parcursul stimularii;

•

2 cazuri cu absenta fecundarii.

Varsta pacientelor la care s-au inregistrat aceste esecuri a fost de: 26 ani: E2 seric scazut; 29 ani: E2 seric scazut; 32 ani: crestere monofoliculara; 34 ani: absenta fecundarii; 36 ani: absenta fecundarii. Se poate remarca ca in acest grup de paciente varsta acestora nu poate constitui un factor implicat in raspunsul slab („low responder”) la stimularea ovariana controlata. Din totalul celor 37 cicluri nu s-a efectuat punctie foliculara in 3 cazuri, cu abandonarea ciclurilor, si anume (Tabel 2.2.7): •

1 caz a prezentat o crestere monofoliculara (1 folicol > 18 mm), la o pacienta de 32 ani, cu E2 seric: 442 pg/ml, cu nivel seric al LH-ului: 19,6 mUI/ml, protocol francez (doza unica) si un total de 1500 UI rFSH pe parcursul a 8 zile de stimulare;

•

Al 2-lea caz - cu concentratia serica a E2 de 204 pg/ml, (1 folicol =15 mm), concentratia LH endogen= 4,2 mUI/ml, la care s-a efectuat protocolul Lübeck, cu un total de 6225 UI 152

rFSH pe o durata de 31 de zile de stimulare. Varsta pacientei a fost de 29 ani. De remarcat durata enorma de stimulare, cu o cantitate foarte mare de FSH administrat si cresterea foliculara si hormonala insuficienta. Pacienta a avut un raspuns foarte prost la acest tip de protocol, care nu a fost determinat de factorul varsta. •

Al 3-lea caz: nivelul seric al E2 redus, de 101 pg/ml, (ecografic: 10 folicoli intre 13 - 15 mm), concentratia LH endogen= 3,1 mUI/ml. Protocolul cu antagonist Gn-RH a fost cel german-Lübeck si stimularea ovariana s-a efectuat cu rFSH 900 UI in total, pe o durata de 10 zile. Varsta pacientei a fost de 26 de ani. Nici in acest caz varsta pacientei nu a reprezentat un motiv pentru „low responder”.

Tabel 2.2.7 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara)- antagonisti-GnRH/ an 2000 Caz

Cauza

Varsta

Tip

Durata

Nr.

Tip

E2

LH

Nr.

(ani)

FSH

stimularii

total

protocol

(pg/ml)

(UI/l)

folicoli

UI

- 13-15 - 16-18 - > 18

1

Low

32

rec

8 zile

1500

francez

442

19,6 !!

0/ 0/1

29

rec

31 zile !!

6225

Lubeck

204

4,2

1/ 0/ 0

26

rec

10 zile

900

Lubeck

101

3,1

10/ 0/ 0

response si ↑ LH 2

Low response

3

Low response

Celelalte 2 cazuri de esec au fost reprezentate de absenta fecundarii: •

1 caz – pacienta de 34 de ani, la care s-a practicat protocolul Lübeck, cu 2700 UI rFSH, timp de 9 zile, nivelul E2 seric: 912 pg/ml si al LH-ului: 2,1 mUI/ml. S-au obtinut prin punctie foliculara 2 ovocite si s-au inseminat conventional (FIV).

•

Al 2-lea caz: pacienta de 36 de ani, protocol Lübeck; 1500 UI rFSH pe o durata de 9 zile, E2 seric: 2022 pg/ml si LH: 3 mUI/ml. La punctia foliculara s-au obtinut 8 ovocite care au fost inseminate conventional (FIV).

153

Tabel 2.2.8 - Cicluri cu punctie efectuata, dar cu status de „low responder” – antagonisti-GnRH/ an 2000 Caz

Cauza

Varsta

Tip

Durata

Nr.

Tip

E2

LH

Rezultat

(ani)

FSH

stimularii

total

protocol

(pg/ml)

(UI/l)

punctie

Lubeck

912

2,1

FIV, 2

UI 1

Low

34

rec

9 zile

2700

response

ovocite, Ø fecund.

2

Low

36

rec

9 zile

1500

response

Lubeck

2022

3

FIV, 8 ovocite, Ø fecund.

Ca si o observatie la cele 2 cazuri de absenta a fecundarii se remarca similitudini : ale varstei pacientei, a tipurilor de protocoale stimulate si a tipurilor de gonadotropina utilizata, cat si durata stimularii ovariene. In al 2 –lea caz nivelul E2 seric a fost mult crescut fata de primul, cu un numar evident mai mare de folicoli punctionati, fapt ce reiese si intr-un numar mai mare de ovocite obtinute. Amandoua cazurile au fost FIV clasica. Varsta pacientelor (in jur de 35 ani) nu a constituit un motiv de abandon a ciclului de stimulare, in aceste cazuri s-au obtinut folicoli si sau aspirat ovocite. Din punct de vedere al tipurilor de protocoale folosite se observa ca in cazul celui francez s-a obtinut o crestere monofoliculara cu abandonarea stimularii ovariene si o crestere a LH-ului endogen. Doza de antagonist-GnRH (3 mg) a fost administrata in ziua a 7-a a ciclului menstrual. Protocolul Lübeck s-a utilizat in celelalte 4 situatii de esec: 2 cazuri cu absenta fecundarii si 2 cazuri de nivel scazut al estradiolului seric. Complicatiile inregistrate in cele 37 cazuri de stimulare ovariana folosind un protocol cu antagonisti-GnRH au fost reduse, limitandu-se la 1 caz (2,7%) de hiperstimulare ovariana stadiul II/III, la o pacienta de 33 de ani. S-a folosit in acest caz protocolul francez, s-a stimulat cu un total de 1800 UI rFSH timp de 8 zile, estradiol seric: 1191 pg/ml. S-au punctionat 1 folicol 13-15 mm, 10 folicoli 16-18 mm si 3 folicoli > 18 mm. Ovocitele (11 obtinute) au fost supuse tehnicii

154

de microinjectie ICSI si in urma fecundarii s-au obtinut 5 celule cu 2 PN, dintre acestea 3 s-au crioconservat si 2 s-au incubat pana a 2-a zi pentru embriotransfer. In acest caz nu s-a obtinut sarcina. De remarcat in acest caz numarul mare de folicoli cu dimensiunea de 16-18 mm, fara insa a avea un nivel crescut de estradiol seric in momentul declansarii ovulatiei. Fenomenul de hiperstimulare s-a dezvoltat pe parcurs. d. Concluzii Din cele 37 de cicluri stimulate initial, la 3 cicluri nu s-a efectuat punctie foliculara (s-au efectuat doar 34 punctii). In 2 cazuri nu s-a obtinut fecundare (s-au efectuat doar 32 embriotransferuri) (Tabel 2.2.9). Tabel 2.2.9 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu antagonisti-GnRH/ an 2000 Total

Total punctii efectuate

cicluri

Total cazuri cu

Total ET efectuate

fecundare realizata

stimulare

Numar

Procent

Numar

Procent

Numar

Procent

37

34

91,89%

32

86,48%

32

86,48%

Rata sarcinilor/ciclu: 8,1% Rata sarcinilor/punctie: 8,82% Rata sarcinilor/embriotransfer: 9,37% Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 15,62% Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 5,4% e. Discutii 1. Majoritatea pacientelor care efectueaza cicluri de stimulare in cadrul tehnicilor de reproducere asistata se incadreaza in grupele de varsta 30-34 si 35-39 de ani, cu mici diferente de la un an la altul si comparabile intre loturile de paciente care urmeaza protocoale cu agonisti-GnRH fata de cele cu antagonisti-GnRH.

155

2. Durata medie a stimularii cu gonadotropina a fost de 9,83 zile pentru lotul cu antagonistGnRH / an 2000 fata de lotul cu agonist-GnRH/ an 2000, la care a fost ceva mai lunga, de 11,24 zile. 3. Media uitatilor de gonadotropina folosite pe parcursul stimularii ovariene la lotul cu protocol cu antagonist-GnRH a fost de 1939,32 UI fata de lotul cu agonist-GnRH la care a fost mai ridicata, de 2577,42 UI. 4. Procedeele de reproducere asistata utilizate au fost in amandoua loturile in procent mai crescut FIV conventionale. De remarcat ca procentul cazurilor nepunctionate, a ciclurilor abandonate, a fost mai mare in grupul cu antagonisti-GnRH fata de cel cu agonisti-GnRH ( 8,1% fata de 0,99%). 5. Numarul mediu al ovocitelor recoltate prin aspirare foliculara (8,24 versus 8,29) si al celulelor fecundate (4,05 versus 3,56) este fara diferente semnificative la grupul antagonist- fata de agonist-GnRH. 6. Incidenta sindromuluii de hiperstimulare ovariana este ceva mai redusa (2,7%) in lotul cu antagonist-GnRH fata de agonist-GnRH (3,3%). 7. Rata sarcinilor obtinute in urma aplicarii portocolului cu antagonist-GnRH se situeaza la valori mai mici fata de protocolul cu agonist-GnRH. •

Rata sarcinilor/ciclu: 8,1% versus 21,12 %

•

Rata sarcinilor/punctie: 8,82% versus 21,33%

•

Rata sarcinilor/ET: 9,37% versus 27%

•

Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 15,62% versus 27%

•

Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 5,4% versus 11,22%

156

Capitolul 2.3 Statistica protocoalelor cu antagonisti-GnRH - anul 2001

a. Material si metoda In anul 2001 un numar de 71 paciente au efectuat cicluri de stimulare ovariana care cuprind in schema antagonisti-GnRH. Varsta medie a pacientelor a fost de 33,66 ani, cu valoarea minima de 27 ani si cea maxima de 42 ani; mediana: 34 ani; deviatia standard: 4,159. Din totalul de 71 de paciente grupul majoritar a fost reprezentat de femeile cu varsta intre 30 - 39 ani (Tabel 2.3.1). Tabel 2.3.1 - Repartitia pacientelor pe grupe de varsta (antagonisti-GnRH/anul 2001) Varsta (ani)

Numar paciente

Procent

< 30

15

1,4 %

30-34

27

38,02 %

35-39

23

32,39 %

≥ 40

6

8,45 %

Pentru stimularea ovariana s-a apelat la mai multe tipuri de gonadotropine: rFSH in 64 cazuri; HMG in 6 cazuri; rFSH+HMG - 1 caz, asa cum este ilustrat in urmatorul tabel si in figura de mai jos (Tabel 2.3.2), (Fig. 2.3.1). Se remarca, ca si in toate grupurile de paciente analizate pana acum, ca rFSH a fost administrat cel mai frecvent. Tabel 2.3.2 - Tipurile de gonadotropine utilizate in stimularea ovariana (antagonisti-GnRH/anul 2001) Tipuri gonadotropine

Numar paciente

Procent

rFSH

64

90,14 %

HMG

6

8,45 %

rFSH+HMG

1

1,4 %

157

1 6

FSH rec

HMG

64 FSH rec+HMG

Fig. 2.3.1 Repartitia frecventei tipurilor de gonadotropine utilizate in stimularea ovariana (antagonisti-GnRH/anul 2001) Durata stimularii ovariene a fost in medie de 10,23 zile, durata minima fiind de 7 zile si cea maxima de 17 zile; mediana: 10 zile, deviatia standard: 2,174. Pentru stimulare s-au administrat o medie de 1975,35 UI gonadotropina, doza minima a fost de 450 UI si doza maxima - de 7425UI; mediana: 1800 UI, deviatia standard: 963,118. Dintre cele 2 tipuri de protocoale cu antagonisti-GnRH, cel german – Lübeck (doze multiple) a fost aplicat in toate cele 71 de cazuri si cel francez (doza unica) in nici un caz. Prin stimularea ovariana s-a atins o medie a E2 seric (determinat in ziua inducerii ovulatiei) de 1834,30 pg/ml, cea mai mica valoare a estradiolului masurata a fost de 142 pg/ml iar cea maxima de 8704 pg/ml; mediana: 1610 pg/ml, deviatia standard: 1247,689. In tabelul 2.3.3 sunt redate defalcat valoarile E2 seric.

158

Tabel 2.3.3 - Valorile defalcate ale estradiolului seric (pg/ml) (antagonisti-GnRH/anul 2001) Nivel E2 seric (pg/ml)

Numar paciente

Procent

< 1000 pg/ml

17 cazuri

23,94%

1000-1499 pg/ml

13 cazuri

18,30%

1500-1999 pg/ml

15 cazuri

21,12%

>2000 pg/ml

26 cazuri

36,61%

Determinarea concentratiei serice a LH-ului a relevat o medie de 2,12 mUI/ml, cu o valoare minima obtinuta de 0,1 mUI/ml si una maxima de 18,7 mUI/ml; mediana 1,3 mUI/ml, deviatia standard: 2,987. Masuratoarea ecografica a folicolilor a demonstrat urmatoarele (Tabel 2.3.4): •

Folicoli 13-15 mm - (media): 3,09 (valori extreme: 0-10)

•

Folicoli 16-18 mm - (media): 2,84 (valori extreme: 0-12)

•

Folicoli > 18 mm - (media): 4,05 (valori extreme: 1-11)

Tabel 2.3.4 - Parametri statistici ai folicolilor (antagonisti-GnRH/anul 2001) Dimensiune

Media

Mediana

folicoli

Numarul

Numarul

Deviatia

minim

maxim

standard

13-15 mm

3,09

2

0

10

2,778

16-18 mm

2,84

2

0

12

2,364

> 18 mm

4,05

4

1

11

2,260

In anul 2001, pentru cele 71 paciente care au urmat protocoale cu antagonisti-GnRH, s-au efectuat un total de 26 FIV conventionale si un numar de 43 ICSI (din care in 2 cazuri s-au folosit spermii din biopsii testiculare decongelate (crioTESE) (Fig. 2.3.2). In 2 situatii, la care era planificata FIV, nu s-a mai practicat punctie foliculara, cu abandonarea stimularii ovariene pe motivul raspunsului insuficient la terapie. FIV: 26 cazuri (36,61%); 159

ICSI: 43 cazuri (60,56%); Cazuri nepunctionate: 2 (2,81%) 2

26 43

FIV

ICSI

Cazuri nepunctionate

Fig. 2.3.2 - Repartitia tehnicilor de reproducere asistata din cadrul protocoalelor cu antagonistiGnRH/2001 b. Rezultate In urma punctiei foliculare s-au recoltat ovocite, cu o valoare medie de 9,028 ovocite, mediana: 7 ovocite, numarul minim aspirat a fost de 0 ovocite si numarul maxim de 31 ovocite; deviatia standard: 6,940 (Tabel 2.3.5). Tabel 2.3.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu antagonisti-GnRH/ anul 2001 Numar mediu

Mediana

ovocite 9,02

7

Numar maxim

Numar minim

Deviatia

recoltat

recoltat

standard

31

0

6,940

160

La controlul fecundarii s-a obtinut o medie de 4,07 celule cu 2 PN, mediana: 3 celule cu 2 PN; deviatia standard: 3,473. Au fost situatii unde nu s-a realizat fecundarea; numarul maxim al ovocitelor fecundate a fost de 14 (Tabel 2.3.6). Tabel 2.3.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (antagonisti-GnRH/ anul 2001) Numar mediu

Mediana

celule cu 2PN 4,07

Numar maxim

Numar minim

Deviatia

celule cu 2PN

celule cu 2PN

standard

14

0

3,473

3

In 5 cazuri nu s-a realizat fecundarea ovocitelor, dintre acestea - 4 au provenit din punctie foliculara efectuata in cadrul FIV si 1 caz a fost prin aspirat folicular pentru ICSI. La 2 paciente nu s-au recoltat ovocite, fiind vorba de 2 cazuri de FIV clasica. In 35 cazuri s-a efectuat crioconservarea celulelor cu 2 PN, din acest total, 23 (65,71%) au reprezentat crioconservari ale celulelor fecundate provenite din ICSI si in 12 cazuri (34,28%) - celule provenite din FIV clasica (mediana: 1, deviatia standard: 0,503) (Fig. 2.3.3).

12

Crio-FIV

23

Crio-ICSI

161

Fig. 2.3.3 - Crioconservarea celulelor cu 2 PN ca provenienta din diferitele tehnici de reproducere asistata (antagonisti-GnRH/ 2001) Numarul maxim posibil de celule cu 2 PN care s-au crioconservat a fost de 12, numarul minim fiind de 2, media celulelor crioconservate: 2,29; mediana: 0, deviatia standard: 3,173 (Tabel 2.3.7). Tabel 2.3.7 Parametri statistici ai celulelor crioconservate (antagonisti-GnRH/ 2001) Nr celule cu 2

Media

Mediana

PN crioconservate

2,29

0

Numar

Numar

Deviatia

minim

maxim

standard

0

12

3,172

Numarul embrionilor care s-au transferat a variat intre 0 si maxim 3 embrioni, mediana: 2, deviatia standard: 0,883. In urma acestor proceduri s-a obtinut un numar total de 10 sarcini (14,08%), dintre care: •

1 sarcina biochimica

•

2 avorturi spontane (la 7 si 14 saptamani de gestatie)

•

7 nasteri. Din aceste sarcini 2 au fost gemelare din start. La 1 caz unul dintre feti s-a oprit in evolutie la 15 saptamani de gestatie, celalalt fat a evoluat pana la 36 saptamani de gestatie, dupa care a fost extras prin operatie cezariana (greutate: 2295 g, IA-8/9), deci pana la final a evoluat ca o sarcina monofetala.

•

Nu s-au intalnit sarcini extrauterine si nici sarcini triple (Tabel 2.3.8).

Tabel 2.3.8 - Evolutia sarcinilor in urma protocoalelor cu antagonisti-GnRH / 2001 Sarcina Sarcina

Avorturi Sarcini

Nasteri

Nasteri

Nasteri

biochimica spontane extrauterine monofetale gemelare cu tripleti Nr.

1

2

0

6

1

0

10%

20%

0

60%

10%

0

cazuri Procent

162

c. Observatii Esecuri de tipul ciclurilor abandonate s-au intalnit in 2 situatii de “low responder”, in care nu s-a mai practicat punctia foliculara. •

La un caz s-a masurat nivel scazut de E2 seric. Este vorba de o pacienta in varsta de 29 de ani, cu stimulare ovariana cu rFSH in cadrul unui protocol Lübeck in vederea efectuarii punctiei foliculare pentru FIV. S-au folosit un total de 2175 UI FSH pe o durata de stimulare de 11 zile. S-au dezvoltat doar 3 folicoli de dimensiune > 18 mm, cu estradiol de 142 pg/ml, valoarea LH: 0,1 mUI/ml.

•

Cel de-al doilea caz s-a inregistrat la o pacienta de 32 de ani, de asemenea cu terapie de stimulare ovariana cu rFSH in cadrul protocolului Lübeck, in vederea FIV. Durata stimularii a fost de 8 zile, s-au administrat un total de 3600 UI, estradiolul determinat anterior punctiei a fost de 161 pg/ml si valoarea LH: 1,7 mUI/ml. Ecografic s-au dezvoltat 1 folicol de 13-15 mm, 1 folicol de 16-18 mm si 1 folicol > 18 mm. Si in acest caz s-a renuntat la efectuarea punctiei.

In cele 2 cazuri pacientele au prezentat statusul de “low responder”, cu dezvoltare foliculara inadecvata si o crestere insuficienta de E2. Au fost intrunite criteriile de intrerupere a stimularii ovariene si nu s-a mai practicat punctie foliculara. In cel de-al 2-lea caz se remarca o cantitate mai crescuta de gonadotropina administrata pacientei, cu raspuns foarte slab in urma acestei stimulari. Tabel 2.3.9 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara)- antagonisti-GnRH/ an 2001 Caz

Cauza

Varsta

Tip

Durata

Nr.

Tip

E2

LH

Nr.

(ani)

FSH

stimularii

total

protocol

(pg/ml)

(UI/l)

folicoli

UI

- 13-15 - 16-18 - > 18

1

Low

29

rec

11 zile

2175

Lubeck

142

0,1

0/ 0/ 3

32

rec

8 zile

3600

Lubeck

161

1,7

1/ 1/ 1

response 2

Low response

163

Esecul fecundarii – efectuarea aspiratului folicular cu recoltarea ovocitelor dar absenta fecundarii acestora (absenta celulelor cu 2 PN) s-a inregistrat la 5 paciente. Sunt exemplificate in cele ce urmeaza detaliat aceste situatii (Tabel 2.3.10). Tabel 2.3 10 - Absenta fecundarii in grupul de paciente cu protocol cu antagonisti-GnRH/an 2001 Caz

Varsta

Tip

Proto-

Zile

Total

E2

LH

Fol.

Fol.

Fol.

(ani)

gonado

col

de

UI

pg/ml

UI/l

13-

16-

>

15

18

18

mm

mm

mm

tropina 1

35

rFSH+

Stim.

IVF

ICSI

Nr. ovoc.

Lubeck

13

7425

1536

2

3

3

3

DA

-

2

HMG 2

27

rFSH

Lubeck

9

2025

1143

1,2

2

1

4

DA

-

6

3

27

rFSH

Lubeck

12

1125

8704

14,8

10

12

2

DA

-

23

4

34

rFSH

Lubeck

9

2025

1620

1,1

2

5

1

-

DA

8

5

39

rFSH

Lubeck

10

2850

810

0,6

1

2

4

DA

-

4

Ca si remarca generala asupra acestor paciente se observa varsta lor cu o variatie larga, intre 27 si 39 ani. Remarci particulare asupra acestor cazuri: La pacienta cu varsta de 35 ani (cazul 1) s-au asociat gonadotropine pentru stimulare ovariana (rFSH si HMG), fiind vorba si de durata cea mai lunga a stimularii – 13 zile. Tot in acest caz s-a inregistrat si un numar foarte mare de unitati de gonadotropina folosite (7425 UI), cu o dezvoltare relativ modesta a folicolilor si o crestere moderata a estradiolului seric. Numarul de ovocite recoltate a fost redus: 2. Avand in vedere acest esec al fecundarii, la pacienta in cauza s-a repetat cu ocazia altei incercari stimularea, dar cu rFSH (numar mult mai scazut de unitati administrate fata de prima tentativa: 3600 versus 7425UI), cu o crestere mai accentuata a folicolilor > 18 mm (4 ca numar) si s-a efectuat de aceasta data ICSI. Din cele 3 ovocite recoltate s-a fecundat doar 1 (toate cele 3 ovocite au fost mature, metafaza II). Raspunsul a fost de asemenea slab referitor la dezvoltarea foliculara, dar s-a probat totusi fecundarea, fara obtinerea unei sarcini. Cazul 2 - pacienta de 27 ani – a mai prezentat o stimulare anterioara, similara ca tip de gonadotropina si antagonist-GnRH, dar cu durata mai lunga de stimulare (14 zile fata de 164

9 zile). In incercarea anterioara s-a realizat o dezvoltare foliculara asemanatoare si s-a obtinut un numar de 2 ovocite cu fecundarea doar a uneia. Raspunsul la stimulare a fost si in acea prima incercare foarte modest. La pacienta de 27 ani (cazul 3), la care s-a inregistrat nivelul seric cel mai crescut al E2: 8704 pg/ml, s-a determinat si o concentratie mare a LH-ului: 14,8 mUI/ml. Dezvoltarea foliculara a fost exagerata referitor la numarul folicolilor moderati (10 folicoli de 13-15 mm), folicolii de 16-18 mm au fost in numar de 12 si s-au descris doar 2 folicoli > 18 mm. Numarul de ovocite recoltate a fost foarte mare (23 ovocite). Ca si o observatie aparte: nu s-a semnalat sindrom de hiperstimulare ovariana la aceasta pacienta, desi erau indeplinite conditiile hormonale. Ca si o posibila explicatie a esecului fecundarii trebuie luata in considerare cresterea prematura aLH-ului, care a produs o luteinizare a folicolilor, cu alterarea calitatii ovocitare. De mentionat pentru aceasta pacienta s-a efectuat ulterior, o alta stimulare (tot protocol Lübeck cu antagonisti-GnRH), dar cu microinjectarea ovocitelor (ICSI) si s-a realizat fecundarea, dar fara a se obtine in respectiva procedura si sarcina. Cazul 4 (pacienta de 34 ani) a mai efectuat o procedura ICSI anterioara (tot protocol cu antagonisti-GnRH), in urma caruia s-au microinjectat 3 ovocite mature si s-a obtinut fecundarea pentru 2 celule, fara a se obtine sarcina. La cazul 5, pacienta de 39 ani, s-a demonstrat prezenta fecundarii la o fertilizare conventionala anterioara, in conditii de stimulare asemanatoare referitor la durata (12 versus 10 zile) si cantitatea de rFSH administrat (2550 versus 2850 UI), tot protocol cu antagonisti-GnRH. Dezvoltarea foliculara si cresterea estradiolului seric a fost relativ aceeasi (1038 versus 810 pg/ml). S-au recoltat 6 ovocite, dintre care 2 s-au fecundat, nu s-a obtinut sarcina. O alta observatie se refera la cazul unei paciente din grupul de 71 stimulari, la care s-a inregistrat cel mai crescut nivel de LH seric (18,4 mUI/ml). La aceasta pacienta s-a efectuat stimulare ovariana cu rFSH (total: 450 UI) in vederea unei inseminarii intrauterine. Tinand cont de raspunsul pacientei la terapie (estradiol seric maxim: 1172 pg/ml, 1 folicol: 16-18 mm, 3 folicoli > 18 mm) si cu acordul acesteia s-a administrat antagonist-GnRH (protocol Lübeck: 2 doze de 0,25 mg/zi, incepand cu ziua 11 de ciclu menstrual) si s-a virat la FIV clasica. S-au

165

recoltat 4 ovocite, care s-au fecundat toate. Nu s-a efectuat embriotransfer in urma punctiei, ci cele 4 celulele cu 2PN s-au crioconservat in acel stadiu. Ca si complicatii se citeaza 3 cazuri de sindrom de hiperstimulare ovariana: 2 cazuri de grad II si un caz de grad III. Doar la cel de grad III s-a inregistrat si sarcina, care a evoluat pana la termen (Tabel 2.3.11). •

1 caz cu severitate de grad II s-a inregistrat la o pacienta de 35 ani, care s-a stimulat ovarian cu rFSH, durata de 13 zile, numar total de 2100 UI FSH, in cadrul protocolului Lübeck, valoarea maxima a E2 seric in urma stimularii: 1429 pg/ml, valoarea LH: 0,3 mUI/ml, Ecografic se descriu 1 folicol de 13-15 mm, 4 folicoli de 16-18 mm si 4 folicoli > 18 mm. In urma punctiei foliculare s-au obtinut 4 ovocite, care au fost microinjectate conform procedeului ICSI. Controlul fecundarii a aratat doar o celula cu 2 PN. ET s-a realizat cu 1 embrion. Nu s-a obtinut sarcina.

•

Cel de-al 2-lea caz: pacienta de 29 ani, stimulare ovariana cu rFSH timp de 8 zile, valoarea totala a gonadotropinei: 1050UI, protocol Lübeck , valoarea maxima a estradiolului seric: 2993 pg/ml si LH: 2 mUI/ml. Masurarea ecografica anterior declansarii ovulatiei a relevat 10 folicoli cu dimensiuni de 13-15 mm, 4 folicoli de 16-18 mm si 2 folicoli > 18 mm. Aspiratul folicular a obtinut 17 ovocite (12 in metafaza II si 5 cu vezicula germinala), dintre care prin tehnica ICSI s-au fecundat doar 8. ET s-a efectuat cu 2 embrioni si 6 celule in stadiul de 2 PN au fost crioconservate. S-a obtinut o sarcina monofetala, care a evoluat pana la termen. Sindromul de hiperstimulare ovariana a fost ca si gravitate corespunzatoare gradului III.

•

Al 3-lea caz: sindrom de hiperstimulare ovariana grad II la o pacienta de 32 ani, cu stimulare ovariana in cadrul protocolului Lübeck efectuata cu rFSH, timp de 11 zile, doza totala de 1525 UI. S-au masurat ecografic 8 folicoli de 13-15 mm, 8 folicoli de 16-18 mm si 7 folicoli > 18 mm. Aici s-a procedat la efectul de “coasting”, si anume s-a oprit stimularea cu rFSH si s-a continuat administrarea antagonistului-GnRH (inceput in ziua a 8-a de stimulare si 8 doze administrate in total) pana la scaderea E2 seric si de abia in acest moment s-a administrat HCG pentru inducerea ovulatiei. E2 seric masurat anterior inducerii ovulatiei a fost de 2872 pg/ml si valoarea LH: 0,8 mUI/ml. Punctia foliculara pentru IVF conventionala a extras 31 ovocite, dintre care doar 9 s-au fecundat. Toate cele

166

9 celule in stadiul de 2 PN s-au crioconservat. La aceasta pacienta nu s-a efectuat ET in urma punctiei, s-a considerat prea riscant si s-a amanat ET pentru un ciclu spontan. Tabel 2.3.11 - Sindrom de hiperstimulare ovariana - antagonisti-GnRH/ an 2001 Caz

Grad

E2

Nr.

Punctie

hiperstim.

(pg/ml)

folicoli

folic.

ET

Criocons.

Sarcina

Avort/ Nastere

- 13-15 / 16-18 / > 18

1

II

1429

1/4/4

da

da

-

nu

-

2

III

2993

10/4/2

da

da

-

da

nastere monofet.

3

II

2872

8/8/7

da

nu

da (tot)

-

-

d. Concluzii Din totalul de 10 sarcini obtinute - 5 (50%) au fost in urma procedeului clasic de FIV/ET si celelalte 5 sarcini s-au inregistrat in urma procedeului de microinjectie ICSI. La toate pacientele s-a utilizat protocolul Lübeck. Gonadotropina folosita a fost rFSH in 9 cazuri din cele 10 (procent majoritar de 90%) si intr-un caz s-a administrat HMG. Evolutia sarcinilor dupa FIV/ET: •

1 sarcina biochimica

•

1 avort spontan

•

1 nastere (sarcina gemelara cu 1 fat oprit in evolutie si 1 fat nascut)

•

1 nastere (sarcina gemelara)

•

1 nastere (sarcina monofetala).

Evolutia sarcinilor dupa ICSI: •

1 avort spontan

•

4 nasteri (sarcini monofetale).

167

La cele 71 de cazuri s-au intrerupt ciclurile de stimulare in 2 situatii de „low responder” si nu s-a efectuat punctie foliculara (punctie doar in 69 cazuri). La 5 paciente s-a inregistrat esec al fecundarii. La 1 caz de sindrom de hiperstimulare ovariana s-a preferat crioconservarea celulele cu 2 PN. La o pacienta, pe motivul unei stimularii mai marcate in vederea unei inseminari intrauterine, s-a virat la FIV si ovocitele recoltate si ulterior fecundate s-au crioconservat in stadiul de 2 PN, urmand de asemenea un embriotransfer intr-un ciclu spontan. In concluzie, din cele 71 cicluri stimulate initial in 9 cazuri nu s-a efectuat embriotransfer (Tabel 2.3.12). Tabel 2.3.12 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu antagonisti-GnRH/ an 2001 Total

Total punctii efectuate

cicluri

Total cazuri cu

Total ET efectuate

fecundare realizata

stimulare

Numar

Procent

Numar

Procent

Numar

Procent

71

69

97,18%

64

90,14%

62

87,32%

Rata sarcinilor/ciclu: 14,08% Rata sarcinilor/punctie: 14,49% Rata sarcinilor/embriotransfer: 16,12% Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 17,74% Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 9,85%. e. Discutii 1. Grupul de paciente cu varsta intre 30-34 ani a fost cel mai bine reprezentat in cadrul lotului de 71 paciente care au inceput cicluri de stimulare cu protocol cu antagonistiGnRH si ca procent imediat urmator au fost pacientele ce s-au situat intre 35-39 de ani. 2. Gonadotropina rFSH a fost administrata in procent majoritar ca terapie de stimulare ovariana.

168

3. S-a utilizat in exclusivitate protocolul Lübeck. 4. In cadrul acestui lot de paciente s-a folosit mai des tehnica microinjectiei ovocitelor – ICSI fata de FIV conventionala, posibil si prin dezvoltarea in timp a acestei metode si a indemanarii si experientei echipei de embriologi. 5. Rata sarcinilor raportata la numarul de cicluri; la numarul de punctii si la numarul de embriotransferuri efectuate, respectiv baby take home rate se ridica la procente mai mari fata de loturile de paciente cu protocol cu antagonist-GnRH din anii 1999 si 2000, si comparabile cu datele din literatura.

169

Capitolul 2.4 Statistica pe 3 ani (1999-2000-2001) – protocoale cu antagonisti-GnRH a. Material si metoda In cei 3 ani studiati (1999; 2000; 2001) un total de 149 paciente au urmat protocoale de stimulare ovariana ce cuprindeau in schema lor antagonisti-GnRH (Tabel 2.4.1); (Fig. 2.4.1). Tabel 2.4.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor - antagonisti-GnRH/ 3 ani Varsta pacientelor (ani)

Numar paciente

Procent

< 30

21

14,09%

30-34

48

32,21%

35-39

62

41,61%

≥ 40

18

12,08%

18

21 < 30 ani

48 62

30-34 ani 35-39 ani > 40 ani

Fig. 2.4.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor - antagonisti-GnRH/ 3 ani

170

Varsta minima a acestui grup de paciente a fost de 24 ani si varsta maxima de 43 ani. Media varstei totalului de paciente este de 34,48 de ani si mediana de 35 de ani, deviatia standard: 4,246. Se remarca ca daca in datele examinate pe cei 3 ani separat majoritatea pacientelor se situau in grupele de varsta 30-34 sau 35-39 ani, datele insumate arata ca procentul majoritar al pacientelor ce au urmat tratament in cadrul tehnicilor de reproducere asistata au avut varsta 3539 ani, cu un procent foarte apropiat al pacientelor tinere < 30 ani de al celor ≥ 40. In general se adreseaza consultului si terapiei in vederea reproducerii asistate femei care au deja un istoric obstetrical sau ginecologic, cu esec in conceptie, care au epuizat alte variante de tratament pana in acel moment si care prin natura situatiei ajung la o varsta > 35 ani. Cu toate acestea, tendinta generala a femeilor (observata pe plan mondial) este de-a concepe natural dupa varsta de 30, chiar si 35 de ani. In cazul acestor paciente ce au urmat protocoale cu antagonisti-GnRH s-au folosit mai multe tipuri de gonadotropine pentru stimularea ovariana controlata, conform tabelului 2.4.2 si figurii 2.4.2. Tabel 2.4.2 Repartitia tipurilor de gonadotropine din stimularea ovariana - antagonisti-GnRH/ 3 ani Tipuri gonadotropine

Numar paciente

Procent

rFSH

129

86,57%

HMG

12

8,05%

rFSH+HMG

7

4,69%

FSH-HP

1

0,67%

Din tabel se remarca de departe procentul mare pe care l-a castigat rFSH in competitia pentru stimularea ovariana fata de celelalte preparate existente. Avantajele si rezultatele medicatiei au fost descrise la partea generala a acestei lucrari. Totusi si in ziua de astazi costul acestei medicatii sintetizata genetic ramane ridicat, mai ales in situatia in care pacienta isi asigura terapia. Sunt tari in care programele de sanatate finanteaza cateva incercari in cadrul tehnicilor

171

de reproducere asistata. Se pot astfel prefera (in unele situatii particulare) si alte tipuri de gonadotropine pe seama costurilor mai reduse.

rFSH

140 120

HMG

100 80 60

rFSH + HMG

40 20

FSH-HP

0 FSH- rFSH + HMG HP HMG

rFSH

Fig. 2.4.2 Repartitia tipurilor de gonadotropine din stimularea ovariana - antagonisti-GnRH/ 3 ani Cele 2 tipuri de protocoalele de stimulare ovariana care cuprind in schema lor antagonisti-GnRH au fost detaliate din punct de vedere al dozelor si modului de administrare in partea generala a tezei. S-a constatat ca la pacientele studiate pe durata a celor 3 ani s-a aplicat majoritar protocolul Lübeck, care foloseste o doza zilnica de 0,25 mg antagonist-GnRH, cu repetare pana in momentul declansarii ovulatiei. Protocolul francez s-a administrat in 9 cazuri (6,04%), iar protocolul Lübeck la 140 paciente (93,95%) (Fig. 2.4 3).

172

150

140

100

9

50 0

Protocol Lubeck

Protocol francez

Fig. 2.4.3 - Incidenta aplicarii celor 2 protocoale cu antagonisti-GnRH/ 3 ani Durata medie a stimularii ovariene a fost comparabila in cei 3 ani studiati (Tabel 2.4.3) si comparabila cu datele din studii internationale. Tabel 2.4.3 - Parametri statistici ai duratei de stimulare ovariana - antagonisti-GnRH/ 3 ani An studiat

Durata

Minim zile

Maxim zile

Mediana

Deviatia

medie a

stimulare

stimulare

(zile)

standard

stimularii (zile) 1999

9,58

6

17

9

2,144

2000

9,83

7

31

9

3,869

2001

10,23

7

17

10

2,174

TOTAL ani

9,95

6

31

9

2,683

Insumate, datele au redat urmatoarele: durata medie a stimularii ovariene a fost de 9,95 zile, valoarea minima de 6 zile si cea maxima de 31 zile, mediana: 9 zile, deviatia standard: 2,683. Un

173

procent de 69,79% din paciente au necesitat o durata a stimularii ≤ 10 zile, comparabila si cu statistica generala. Valori foarte prelungite ale stimularii (≥ 15 zile) s-au intalnit in cazuri de raspuns redus la stimulare si aceasta doar intr-un procent scazut (Tabel 2.4.4). Tabel 2.4.4 - Variatia pacientelor in functie de numarul de zile de stimulare ovariana antagonisti-GnRH/ 3 ani Nr. zile stimulare

Nr. paciente

Procent

≤ 10 zile

104

69,79 %

11-15 zile

40

26,84 %

16-19 zile

4

2,68 %

≥ 20 zile

1

0,67 %

Doza medie a unitatilor de gonadotropina administrata la cele 149 de paciente a fost de 2021,779 UI, doza minima a fost de 450 UI si doza maxima la care s-a ajuns in cursul tratamentului – 7425 UI; mediana: 1800 UI gonadotropina si deviatia standard: 994,482 (Tabel 2.4.5). Tabel 2.4.5 - Parametri statistici a gonadotropinelor in stimularea ovariana - antagonisti-GnRH/ 3 ani An studiat

Doza medie

Minim doza

Maxim

Mediana

Deviatia

a stimularii

stimulare

doza

(UI)

standard

(UI)

stimulare

1999

2176,58

525 UI

6000 UI

1875

1118,79

2000

1939,32

900 UI

6225 UI

1650

912,635

2001

1975,35

450 UI

7425 UI

1800

963,118

Total ani

2021,779

450 UI

7425 UI

1800

994,482

Determinarile hormonale au vizat masurarea valorii serice a estradiolului anterior punctiei foliculare, care reflecta secretia foliculilor, precum si nivelul seric al LH-ului, pentru a depista o eventuala crestere prematura a acestui hormon (efect nedorit de altfel). 174

Pe perioada celor 3 ani valoarea medie a estradiolului seric, masurat anterior inducerii ovulatiei a fost de 1495,34 pg/ml, cu o valoare minima obtinuta in acest moment de 101 pg/ml si o valoare maxima de 8704 pg/ml; mediana: 1259 pg/ml, deviatia standard: 1084,019. Tabelele urmatoare reflecta determinarile estradiolului seric defalcat, cu o preponderenta a valorilor < 1000 pg/ml in cursul stimularii. Dar nici valorile > 2000 pg/ml, care se apropie de concentratii ce pot induce posibil un sindrom de hiperstimulare ovariana, nu au fost intr-un procent neglijabil (23,48%) (Tabel 2.4.6 si Tabel 2.4.7). Tabel 2.4.6 - Valorile defalcate ale E2 seric (pg/ml) pe cei 3 ani - antagonisti-GnRH Nivel E2 seric (pg/ml)

Numar paciente

Procent

< 1000 pg/ml

55 cazuri

36,91%

1000-1499 pg/ml

36 cazuri

24,16%

1500-1999 pg/ml

23 cazuri

15,43%

>2000 pg/ml

35 cazuri

23,48%

Tabel 2.4.7 - Parametri statistici ai nivelului E2- antagonisti-GnRH/ 3 ani An studiat

Nivel mediu

Minim nivel Maxim

Mediana

Deviatia

E2 (pg/ml)

E2 (pg/ml)

(pg/ml)

standard

nivel E2 (pg/ml)

1999

1141,39

219

2650

1056

553,508

2000

1237,13

101

5494

1105

1012,796

2001

1834,30

142

8704

1610

1247,689

TOTAL ani

1495,34

101

8704

1259

1084,019

In ceea ce priveste valorile LH se constata urmatorii parametrii statistici (Tabelul 2.4.8). Doar in 4 cazuri au fost sesizate valori ale LH-ului > 10 UI/l. Toate aceste paciente au fost stimulate cu rFSH. In 2 dintre aceste cazuri cu crestere prematura a LH-ului s-a considerat ca este mai practic sa se intrerupa stimularea si s-a abandonat ciclul. La aceste 2 paciente s-a aplicat protocolul francez si stimulare ovariana cu rFSH. 175

Celelalte 2 cazuri au fost punctionate in cadrul FIV conventionale, cu protocol Lübeck si stimulare cu rFSH; in amandoua situatiile s-au recoltat ovocite (1 pacienta cu LH= 18,7 UI/l a prezentat fecundare, dar fara sarcina; la a 2-a pacienta, cu LH= 14,8 UI/l nu s-a realizat fecundarea ovocitelor, posibil datorita luteinizarii si a aspectului lor de ovocite postmature. Tabel 2.4.8 - Parametri statistici pentru LH seric - antagonisti-GnRH/ 3 ani Determinare

Valoarea

Valoarea

Valoarea

Mediana

Deviatia

LH seric

medie

minima

maxima

1999

2,38 UI/l

0,1 UI/l

27,9 UI/l

1,6 UI/l

4,301

2000

2,05 UI/l

0,1 UI/l

19,6 UI/l

0,9 UI/l

3,305

2001

2,12 UI/l

0,1 UI/l

18,7 UI/l

1,3 UI/l

2,987

TOTAL ani

2,18 UI/l

0,1 UI/l

27,9 UI/l

1,2 UI/l

3,449

standard

Ca si o concluzie partiala in urma schemelor de tratament cu antagonisti-GnRH se observa ca protocolul Lübeck a fost mult mai des aplicat (93,95%) in cele 149 cazuri analizate. Din cele 4 paciente cu crestere prematura a LH-ului (> 10 UI/l), 2 au apartinut grupului la care s-a produs supresia hipofizara cu doza unica de antagonist, adica in cadrul protocolului francez. La aceste 2 paciente s-a renuntat la a se mai practica punctia foliculara. Celelalte 2 paciente cu valori ale LH-ului > 10 UI/l au apartinut protocolului Lübeck, s-a efectuat punctie, cu fecundare intr-un caz si fara fecundare in al doilea. Posibil ca efectul antagonistului-GnRH in cadrul unui protocol cu doza unica de administrare sa nu realizeze in toate situatiile o inhibitie suficienta a hormonilor endogeni. Foliculometria alaturi de dozarea parametrilor hormonali reflecta raspunsul ovarian adecvat sau inadecvat (in sensul raspunsului insuficient sau exagerat) la terapia de stimulare administrata. Din acest motiv a fost ales ca parametru de urmarire si dimensiunea foliculara, cu 3 paliere de dimensiuni, pentru evaluarea raspunsului ovarian. Masurarea ecografica a folicolilor a aratat pentru cei 3 ani urmatoarele valori obtinute in cadrul protocoalelor cu antagonisti-GnRH (Tabel 2.4.9):

176

Tabel 2.4.9 - Parametri statistici pentru foliculometrie - antagonisti-GnRH/ 3 ani Dimensiune

Numar

Numar

Numar

Mediana

Deviatia

folicoli

mediu

minim

maxim

13-15 mm

2,81

0

10

2

2,456

16-18 mm

2,52

0

12

2

2,123

> 18 mm

3,93

0

17

3

2,385

standard

(mm)

La grupul de 149 paciente care au apelat la tehnici de reproducere asistata si la care s-au introdus protocoalele de stimulare ovariana cu schema de antagonisti-GnRH s-au efectuat un total de 71 FIV conventionale, 72 microinjectari ICSI si in 6 situatii nu s-a mai practicat punctie foliculara (abandon cicluri). Analizat pe cei 3 ani separat se observa ca numarul de paciente a crscut simtitor in anul 2001 fata de cei 2 ani anteriori, In anul 2001, atat in valoare absoluta cat si procentual, procedeul ICSI a fost mult mai des aplicat (60,56%). Per global insa practicarea FIV clasice comparativ cu ICSI nu a aratat diferente semnificativ statistic (47,65% versus 48,32%) (Tabel 2.4.10); (Fig. 2.4.4). Numarul de cicluri abandonate per total se situeaza la valoarea de 6 (4,02%), cu o crestere usoara a valorii pentru anul 2000, unde s-a si inregistrat cel mai mic numar de paciente carora li s-a administrat protocol cu antagonist-GnRH. O posibila explicatie pentru practicarea din ce in ce mai frecvent a procedeului ICSI este utilitatea aplicarii lui in cazuri de esec intalnit in cadrul FIV clasice (absenta pronucleilor), motiv pentru care trebuie verificat procesul de fecundare si in mod special in cazurile cu sterilitate masculina. Inainte de punerea la punct a metodei ICSI, lipsa fecundarii in cadrul FIV conventionale ramanea deseori fara o explicatie clara.

177

Tabel 2.4.10 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul protocoalelor cu antagonistiGnRH/ 3 ani An

Nr.

FIV

ICSI

Fara punctie

paciente

Numar

Procent

Numar

Procent

Numar

Procent

1999

41

24

58,53%

16

39,02%

1

2,43%

2000

37

21

56,75%

13

35,13%

3

8,10%

2001

71

26

36,61%

43

60,56%

2

2,81%

6

4,02%

TOTAL

149

71

47,65%

72

48,32%

6

FIV/ET

71 ICSI

72

Fara punctie

Fig. 2.4.4 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul protocoalelor cu antagonistiGnRH/ 3ani

178

b. Rezultate In urma punctionarii foliculare pentru FIV sau ICSI s-au obtinut o medie de 8,42 ovocite, numarul maxim de ovocite aspirat la o punctie fiind de 31 iar numarul minim de 0, mediana: 7 ovocite, deviatia standard: 6,154 (Tabel 2.4.11). Tabel 2.4.11 - Parametri statistici pentru ovocite (antagonisti-GnRH/ 3 ani) Media

Mediana

Nr. ovocite 8,42

7

Numar

Numar

Deviatia

minim

maxim

standard

0

31

6,154

La controlul fecundarii realizat la 16-20 ore de la inseminarea sau microinjectarea ovocitelor s-au obtinut o medie de 4,1 celule cu 2PN, un numar maxim de 14 celule cu 2PN si un numar minim de 0 celule cu 2PN (absenta fecundarii), mediana: 3 celule cu 2PN, deviatia standard: 3,364. S-au luat in calcul toate ciclurile de stimulare ovariana initiate (Tabel 2.4.12). Tabel 2.4.12 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (antagonisti-GnRH/ 3 ani) Nr celule cu 2

Media

Mediana

PN crioconservate

4,1

3

Numar

Numar

Deviatia

minim

maxim

standard

0

14

3,364

Embriotransferul s-a efectuat cu 1, 2 sau maxim 3 embrioni, numarul mediu de embrioni pentru transfer a fost de 1,89, mediana: 2 embrioni, deviatia standard: 0,923. Au existat si situatii in care nu s-au transferat embrioni pe motivul sindromului de hiperstimulare (au fost crioconservati) sau in urma culturii celulelor cu 2PN a 2-a zi embrionii sau oprit in evolutie sau, cazul cel mai nefericit, la care in urma inseminarii/microinjectarii ovocitelor nu s-a realizat fecundarea. Au fost in total 17 cazuri la care nu s-a realizat embriotransfer. Rata realizarii embriotransferului a fost de 88,59% pentru cele 149 cazuri.

179

Din totalul de 149 cicluri initiate s-a reusit crioconservarea in 72 cicluri (Tabel 2.4.13). S-a crioconservat o medie de 4,5 celule cu 2PN, numarul maxim fiind de 12, respectiv numarul minim de 1 celula cu 2 PN; mediana: 4, deviatia standard: 2,823. In acest calcul au fost stabiliti parametrii statistici doar pentru cele 72 de cicluri cu crioconservari efectuate. Tabel 2.4.13- Repartitia crioconservarii functie de tehnica de reproducere asistata - antagonistiGnRH/ 3ani An

Nr.

Total crio

paciente

Crio-FIV

Crio-ICSI

Numar

Procent

Numar

Procent

1999

41

20

14

70%

6

30%

2000

37

17

11

64,7%

6

35,29%

2001

71

35

12

34,28%

23

65,71%

37

51,38%

35

48,61%

TOTAL

149

72

c. Observatii Numarul de paciente care au prezentat un raspuns insuficient la stimularea ovariana controlata si la care nu s-a mai practicat punctie foliculara sunt in numar de 6 (4,02%). Din tabelul 2.4.14 se constata ca varsta medie a pacientelor este de 31 de ani, mai mica decat varsta medie a totalului de 149 de paciente (34,48 ani), deci in acest caz varsta nu are rol important in suspicionarea raspunsului redus la terapia de stimulare ovariana. In toate situatiile s-a utilizat rFSH ca si tip de gonadotropina si in 5 din 6 cazuri (83,33%) s-a aplicat protocolul Lübeck. Valoarea medie a UI de gonadotropina este 2712,5. Durata stimularii ovariene a fost in medie de 13,16 zile, prelungita fata de 9,95 zile, care reprezinta media duratei de stimulare pentru intregul grup de paciente. Numarul maxim de zile atins a fost de 31, situatie cand s-a administrat si doza cea mai mare de rFSH dintre aceste 6 paciente (si anume 6225 UI). Valorile E2 seric s-au situat sub < 500 pg/ml (media valorilor: 238,5 pg/ml).

180

Doar la o singura pacienta s-a inregistrat cresterea prematura a LH-ului endogen, fiind vorba de in acest caz de aplicarea protocolului francez. Exista o corelatie clara pentru aceste cazuri a statusului de „low responder” cu durata medie a perioadei de stimulare ovariana si cu nivelul scazut al E2 seric. Factorul varsta nu este implicat in aceste cazuri. Tabel 2.4.14- Cicluri abandonate (fara punctie foliculara)- antagonisti-GnRH/ 3 ani Caz

Cauza

Varsta

Tip

Durata

Nr.

Tip

E2

LH

Nr.

(ani)

FSH

stimularii

total

protocol

(pg/ml)

(UI/l)

folicoli

UI

- 13-15 - 16-18 - > 18

1

Low

38

rec

11 zile

1875

Lübeck

381

0,1

2/ 0/ 2

32

rec

8 zile

1500

francez

442

19,6 !!

0/ 0/1

29

rec

31 zile !!

6225

Lübeck

204

4,2

1/ 0/ 0

26

rec

10 zile

900

Lübeck

101

3,1

10/ 0/ 0

29

rec

11 zile

2175

Lübeck

142

0,1

0/ 0/ 3

32

rec

8 zile

3600

Lübeck

161

1,7

1/ 1/ 1

response 2

Low response si ↑ LH

3

Low response

4

Low response

5

Low response

6

Low response

Au existat si situatii de raspuns ovarian inadecvat, dar in care totusi s-a efectuat punctia foliculara. In aceste 3 cazuri exemplificate in tabelul 2.4.15 este vorba de paciente la care in urma punctiei s-au recoltat un numar de 0; 2 si respectiv 8 ovocite, dar nici una din FIV nu s-a insotit de fecundare. Varsta medie a acestor 3 paciente este de 37 de ani, toate au fost stimulate cu rFSH si doar intr-un caz s-a aplicat protocolul francez, acesta fiind insotit si de cresterea LH-ului endogen (27,9 UI/l). Numarul de UI de gonadotropina a variat intre 1500 si 2700.

181

Durata stimularii a fost in toate cele 3 cazuri de 9 zile si comparabila cu durata medie de stimulare (9,95 de zile) a lotului total de paciente. Concentratia medie a E2 seric pentru aceste 3 paciente se situeaza sub valoarea medie a lotului total de 149 de paciente (1235 pg/ml comparativ cu 1495,34 pg/ml). Se remarca din nou asocierea protocolului francez cu cresterea prematura a LH-ului endogen, existand astfel posibilitatea ca o doza unica de antagonist sa fie insuficienta in realizarea supresiei hipofizare. Tabel 2.4.15 - Cicluri cu punctie efectuata, dar cu status de „low responder” – antagonistiGnRH/ 3 ani Caz

Cauza

Varsta

Tip

Durata

Nr.

Tip

E2

LH

Rezultat

(ani)

FSH

stimularii

total

protocol

(pg/ml)

(UI/l)

punctie

francez

771

27,9

FIV.

UI 1

↑

41

rec

9 zile

1575

prematura

Øovocit

LH 2

Low

34

rec

9 zile

2700

Lubeck

912

2,1

response

FIV, 2 ovocite, Ø fecund.

3

Low

36

rec

9 zile

1500

Lubeck

2022

response

3

FIV, 8 ovocite, Ø fecund.

Sindromul de hiperstimulare s-a inregistrat la 5 cazuri din totalul de 149 de paciente si reprezinta un procent de 3,35%. S-au constatat toate tipurile de gravitate ale acestui sindrom. Valoarea medie a E2 seric pentru cele 5 paciente este de 1950,8 pg/ml si este mai mare decat valoarea medie a lotului total de 149 de paciente (1495,34 pg/ml) (factor pozitiv de corelare al aparitiei sindromului de hiperstimulare). Se remarca conform definitiei criteriilor de abandonare a ciclurilor de stimulare prezenta mai multor folicoli mici sau a unui numar mare de folicoli dominanti. Doar 1 caz s-a insotit de prezenta sarcinii.

182

La o singura pacienta s-au crioconservat toate celulele fecundate si nu s-a efectuat ET, aceasta fiind considerata o masura de siguranta (Tabel 2.4.16). Tabel 2.4.16 - Sindrom de hiperstimulare ovariana - antagonisti-GnRH/ 3 ani Caz

Grad

E2

Nr.

Punctie

hiperstim.

(pg/ml)

folicoli

folic.

ET

Criocons.

Sarcina

integral

Avort/ Nastere

13-15 / 16-18 / > 18

1

I

1269

0/0/17

da

da

-

nu

-

2

II/III

1191

1/10/3

da

da

-

nu

-

3

II

1429

1/4/4

da

da

-

nu

-

4

III

2993

10/4/2

da

da

-

da

nastere monofet.

5

II

2872

8/8/7

da

nu

da (tot)

-

-

d. Concluzii Numarul total de sarcini in perioada celor 3 ani analizati pentru cele 149 cicluri de stimulare ovariana controlata cu protocoale cu antagonisti-GnRH a fost de 17. Nu s-au obtinut decat 2 sarcini biochimice, 4 avorturi spontane si nici o sarcina ectopica. Sarcinile multiple au fost de asemenea reduse comparativ cu sarcinile monofetale (17,64% versus 47,05%), date care nu depasesc cele inregistrate in statisticile mondiale (exemplificat in partea generala) (Tabel 2.4.17). Tabel 2.4.17 - Numarul de sarcini si evolutia lor la pacientele cu antagonisti-GnRH/ 3 ani An

Nr.

Nr.

Sarcina

Avort

Sarcina

Nastere

Nastere

Nastere

paciente

sarcini

biochimica

spontan

ectopica

monofetala

gemelara

tripla

1999

41

4

0

2

0

2

0

0

2000

37

3

1

0

0

0

1

1

2001

71

10

1

2

0

6

1

0

TOTAL

149

17

2

4

11,76%

23,52%

0

183

8

2

1

47,05%

11,76%

5,88%

O particularitate care s-a intalnit in grupul de paciente a fost cea referitoare la o sarcina initial gemelara, a carei evolutie a fost ulterior monofetala: unul dintre feti s-a oprit in evolutie la 15 saptamani de gestatie iar celalalt si-a continuat evolutia pana in momentul extractiei sale prin operatie cezariana (la 36 saptamani de gestatie). Sarcini/1999 Cele 4 sarcini au provenit din FIV conventionale, unde s-a utilizat rFSH pentru stimularea ovariana si s-a aplicat procedeul Lübeck. Sarcini/ 2000 Toate cele 3 sarcini au provenit din embrioni de la cicluri FIV, in care s-a folosit pentru stimularea ovariana rFSH si protocol Lübeck Sarcini/ 2001 Din totalul de 10 sarcini, 5 sarcini au provenit din embrioni FIV si 5 sarcini din embrioni ICSI. In 9 cazuri s-a utilizat rFSH si protocol Lübeck, doar in 1 caz s-a administrat HMG in vederea stimularii ovariene si s-a aplicat tot protocolul Lübeck (1 sarcina obtinuta in urma tehnicii ICSI). Insumand sarcinile pe cei 3 ani se pot conclude urmatoarele: •

pentru stimularea ovariana s-au folosit in 16 cazuri rFSH (94,11%) si in 1 caz HMG (5,88%) (Tabel 2.4.18); (Fig. 2.4.5)

Tabel – 2.4.18 - Frecventa tipurilor de gonadotropine in cadrul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ antagonisti-GnRH Nr. sarcini 1999 2000 2001 TOTAL Procent rFSH

4

3

9

16

94,11%

HMG

0

0

1

1

5,88%

184

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

1999

2000

2001

rFSH

HMG

Fig. 2.4.5 - Frecventa tipurilor de gonadotropine in cadrul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ antagonisti-GnRH •

din 17 sarcini inregistrate in urma schemelor cu antagonisti-GnRH, acestea au fost in exclusivitate obtinute dupa inhibitia hipofizara conform protocolului Lübeck (Tabel 2.4.19); (Fig. 2.4.6);

Tabel 2.4.19 - Frecventa tipurilor de protocoale cu antagonisti-GnRH in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani Nr.sarcini 1999 2000 2001 TOTAL Procent Protocol

4

3

10

17

100%

0

0

0

0

0

Lübeck Protocol francez

185

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

1999 2000 2001

Protocol Lubeck

Protocol francez

Fig. 2.4.6 - Frecventa tipurilor de protocoale cu antagonisti-GnRH in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani •

in 12 cazuri din total (70,58%) embrionii au provenit in urma fecundarii ovocitelor punctionate in cadrul FIV conventionale. In 5 cazuri (29,41%) s-au obtinut sarcini dupa embriotransferul in urma fecundarii ovocitelor microinjectate conform metodei ICSI (Tabel 2.4.20); (Fig. 2.4.7).

Tabel 2.4.20 - Incidenta tehnicilor reproducerii asistate in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ antagonisti/GnRH 1999

2000

2001

TOTAL

4

3

10

17

FIV/ET

4

3

5

12

70,58%

ICSI

0

0

5

5

20,51%

Total

Procent

sarcini

186

5

1999

4.5

2000

4

2001

3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 FIV/ET

ICSI

Fig. 2.4.7 - Incidenta tehnicilor reproducerii asistate in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ antagonisti/GnRH S-au inceput 149 de cicluri de stimulare in cei 3 ani descrisi, dintre care punctii foliculare s-au efectuat doar in 143 situatii si embriotransferuri in 133 cazuri (Tabel 2.4.21). Numarul mai mic de punctii foliculare se explica pe baza abandonarii ciclurilor (situatie detaliata la fiecare an in parte) iar numarul mai mic al embriotransferurilor este dat de esecul fecundarii dupa inseminarea/microinjectarea ovocitelor, respectiv absenta embrionilor. Au fost si cazuri particulare in care s-au crioconservat celulele cu 2PN, urmand a fi decongelate si transferate cu ocazia unui ciclu spontan (in situatia sindromului de hiperstimulare ovariana) (in acest mod nu sa mai ajuns la embriotransfer in urma ciclului inceput).

187

Tabel 2.4.21 - Rezultatele ciclurilor cu antagonisti-GnRH/ 3 ani Total cicluri stimulare

Total punctii efectuate Numar

Procent

Total cazuri cu Total ET efectuate fecundare realizata Numar Procent Numar Procent

1999

41

40

97,56%

39

95,12%

39

95,12%

2000

37

34

91,89%

32

86,48%

32

86,48%

2001

71

69

97,18%

64

90,14%

62

87,32%

3 ani

149

143

95,97%

135

133

89,26%

90,60%

Comparativ pentru cei 3 ani se remarca o scadere a ratei embriotransferului in anul 2000 fata de ceilalti ani, in acest an s-a inregistrat si cel mic mare numar de paciente cu antagonisti-GnRH. Rata punctiilor efectuate in anul 2000 este de asemenea cea mai mica procentual comparativ cu celilalti doi ani. Rata sarcinilor/cicluri stimulate: 11,40% Rata sarcinilor/punctii efectuate: 11,88 % Rata sarcinilor/embriotransfer: 12,78% Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 15,03% Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 7,38% (Tabel 2.4.2). Tabelul 2.4.22 - Rata sarcinilor – protocol antagonisti-GnRH/ 3 ani Rata sarcini/ciclu Rata sarcini/ punctie Rata sarcini/ET Rata implantarii Baby take home rate

1999 9,75%

2000 8,1%

2001 14,08%

TOTAL 11,40%

10%

8,82%

14,49%

11,88%

10,25%

9,37%

16,12%

12,78%

10,25%

15,62%

17,74%

15,03%

4,87%

5,4%

9,85%.

7,38%

188

e. Discutii 1. Se observa ca in anii 1999 si 2000 numarul de paciente care au inceput cicluri de stimulare si au beneficiat de protocoale cu antagonisti-GnRH au fost apropiate (41 si 37), dar numarul pacientelor a crescut pentru anul 2001 la 71 de cazuri. Explicatia rezida in faptul ca a crescut complianta pacientelor la un tratament relativ recent introdus, s-au sedimentat informatiile despre antagonisti. Acelasi lucru este valabil si pentru clinicieni, care au castigat si ei in experienta si in incredere in aplicarea unui protocol diferit. 2. Tehnicile de reproducere asistata care au fost aplicate in aceasta perioada de 3 ani au fost comparabile ca incidenta: 47,65% FIV si 48,32% ICSI, dar numarul de sarcini obtinute in urma FIV este mai mare (70,58%) fata de cele rezultate din ICSI (29,41%). 3. Cu toate ca numarul mediu de ovocite recoltate si media celulelor fecundate este comparabil cu datele din literatura, totusi rata sarcinilor se situeaza la procente scazute.

189

Capitolul 3 - Discutii

In introducerea partii speciale am expus obiectivele prezentului studiu. Este o analiza comparativa a doua substante provenite din structura hormonului hipofizar GnRH, si anume agonistii si antagonistii-GnRH. Odata cu introducerea tehnicilor de reproducere umana asistata sau pus la punct si tratamentele de stimulare ovariana. S-a constatat ca pentru evitarea cresterii premature a LH-ului endogen, care compromite ovocitele prin luteinizare precoce si influenteaza in sens negativ calitatea acestora si prin aceasta rata fertilitatii, este necesar de introdus un protocol care sa inhibe secretia hipofizara de gonadotropi. In acest mod s-au dezvoltat protocoalele cu agonisti-GnRH. Aceste protocoale sunt deja folosite uzual, exista experienta in aplicarea lor si se obtin rezultate bune cu ele. Evolutia cercetarilor a introdus mai recent medicatia antagonista, care prin protocoalele sale a adus avantajul reducerii duratei de stimulare, cu administrarea unei doze mai scazute de gonadotropine comparativ cu protocoalele deja existente, ce folosesc agonisti. Astfel se obtine si o reducere a costurilor suportate de pacienta. Se ridica insa intrebarea daca efectul lor asupra ratei sarcinii este similar; de crestere, sau dimpotriva, de scadere a ratei, fata de protocoalele devenite clasice pana in momentul introducerii antagonistilor. Aceasta analiza isi propune o comparare a celor doua medicatii, in final fiind analizata rata sarcinilor/ ciclu; rata sarcinilor/ punctie, rata sarcinilor/ ET; rata implantarii si take home baby rate. Am luat in considerare mai multi parametri pentru a gasi impactul si influenta lor in raspunsul pacientei la terapie. Acesti factori, separat sau asociat, pot juca un rol in raspunsul ovarian, in numarul de ovocite recoltate si calitatea lor, au efecte asupra procesului fecundarii si implantarii embrionului. Studiul se intinde pe durata a 3 ani (1999, 2000 si 2001), este retrospectiv si analizeaza comparativ loturile de paciente care s-au adresat Departamentului de Reproducere Asistata (din cadrul Clinicii Universitare de Ginecologie, Heidelberg) si care au intrat in protocoale de stimulare ovariana pentru FIV sau ICSI. S-au luat in calcul mai multi parametri: varsta, durata tratamentului, doza de stimulare si medicatia gonadotropinica administrata, tipurile de protocoale aplicate. Monitorizarea foliculara si cea hormonala (estradiol si LH seric) sunt considerati markeri ai raspunsului ovarian la stimulare, respectiv LH-ul reda statusul inhibat corect al

190

hipofizei. Rezultatele sunt reprezentate de numarul de ovocite recoltate, numarul de celulele fecundate si, in special, sarcinile obtinute (cu detaliile specifice). Obtinerea sarcinilor este de altfel scopul reproducerii umane asistate, iar rata sa constituie obiectivul prezentei analize: si anume aprecierea influentei celor doua clase de analogi-GnRH asupra fertilitatii. Datele obtinute au fost prelucrate cu ajutorul regresiei logice. Modelul pentru aceasta este cel binomial, unde „p” reprezinta probabilitatea succesului. p/(1-p) descrie relatia probabilitatilor intre succes si esec. Este redata urmatoarea corelatie lineara:  p   = α + β x log 1 − p  unde α reprezinta termenul general, iar prima parte a relatiei este logit din “p”. Evaluarea s-a efectuat cu ajutorul procedeului SAS GENMOD (Generalized Models). Acest procedeu permite evaluarea datelor prin regresia logica si in acelasi timp se iau in considerare valorile pentru aceeasi pacienta care sunt interdependente. Pacientele care s-au adresat in vederea reproducerii asistate si au urmat tratament ce a inclus protocoalele cu agonisti-GnRH sunt in numar de 832, de aproximativ 6 ori mai numeroase, comparativ cu cele ce au inclus protocoale cu antagonisti-GnRH - in numar de 149. Aceasta diferenta se explica si prin increderea castigata in timp de agonsiti fata de antagonisti, prin experienta acumulata cu terapia cu agonisti si poate existenta unei rezerve fata de antagonisti, introdusi mai recent in practica clinica, si implicit o experienta de utilizare mai mica. Un prim factor care este luat in discutie se refera la varsta pacientelor. Este deja obisnuit pentru centrele de reproducere asistata ca pacientele incluse in terapie sa se situeze in jurul varstei de 35 de ani sau chiar peste aceasta varsta. Se motiveaza aceasta incidenta crescuta a varstei ≥ 35 de ani, prin faptul ca in perioada contemporana femeia moderna este angrenata mai mult in viata sociala/profesionala, interesul reproductiv (implinirea familiala) trecand pe loc secund. Astfel ca momentul conceptiei este de multe ori amanat, dupa implinirea carierei. Factorul varsta este important, deoarece este implicat in raspunsul ovarian: femeile cu varsta > 35 de ani pot prezenta o frecventa mai crescuta a abandonarii ciclului de stimulare.

191

Se remarca din tabelul 3.1 ca varsta medie si mediana sunt ceva mai crescute in cazul protocoalelor cu antagonisti, de asemenea procentul pacientelor cu varsta cuprinsa intre 35-39 de ani il depaseste pe cel din protocoalele cu agonisti. Este posibil ca aceasta crestere sa fie explicata si prin faptul ca o serie de paciente ce au apelat in trecut la protocoalele cu agonisti sa incerce o noua stimulare cu medicatia mai recenta, in speranta obtinerii sarcinii cu un tratament mai modern. Extremele varstelor sunt comparabile (21 versus 24 de ani respectiv 46 versus 43 de ani). Tabel 3.1 - Comparatie a parametrului varsta pentru protocoalele cu agonisti/antagonisti Varsta medie (ani)

Mediana (ani)

Procent cazuri cu varsta 35-39 ani

Agonisti-GnRH

34,49

35

35,81%

Antagonisti-GnRH

36,21

37

41,61%

Standard Parameter DF Estimate Varsta

1

-0.0780

Error

Wald 95%

Chi-

Confidence Limits

0.0201

-0.1173

Parameter

Estimate

Standard Error

Varsta

-0.0780

0.0184

-0.0387

Square

Pr > ChiSq

15.10

0.0001

95% Confidence Limits -0.1141

-0.0419

Z Pr > |Z| -4.24

<.0001

Distributia pacientelor in functie de varsta in cele doua loturi analizate este comparabila, conform analizei statistice. Referitor la stimularea gonadotropinica, sunt de departe preferate preparatele sintetizate genetic, si anume rFSH. Acest fapt este constata in studiul actual pentru amandoua protocoalele agonist/antagonist, dar este valabil si pentru celelalte centre mondiale unde se practica reproducerea umana asistata. FSH recombinat are prioritate fata de celelalte preparate deoarece are activitate pur FSH, evita reactiile alergice; are insa dezavantajul unui cost mai ridicat. A doua optiune in stimularea ovariana ramane HMG (Tabel 3.2). Din punctul de vedere al stimularii

192

ovariene, amandoua substantele – agonist si antagonist - au utilizat acelasi tip de gonadotropine, cu influente pozitive asupra numarului si calitatii ovocitelor, asa cum dovedesc datele din literatura. Tabel 3.2 - Comparatie a tipurilor de gonadotropina din stimulare - protocoale cu agonisti/antagonisti rFSH

HMG

Agonisti-GnRH

79,32%

11,69%

Antagonisti-GnRH

86,57%

8,05%

Parameter

DF

Estimate

Error

Square

Pr >ChiSq

recFSH

1

-0.7336

0.4270

-1.5706

0.1034

2.95

0.0858

HMG

1

-1.2141

0.4620

-2.1197

-0.3085

6.90

0.0086

FSH-HP

1

0.0159

0.7380

-1.4305

1.4624

0.00

0.9828

Parameter Estimate

Standard Error

recFSH HMG FSH-HP

0.4385 0.4190 0.6810

-0.7337 -1.2140 0.0156

Confidence

Limits

95% Confidence Limits -1.5931 -2.0352 -1.3192

0.1258 -0.3927 1.3503

Z Pr > |Z| -1.67 -2.90 0.02

0.0943 0.0038 0.9818

In urma analizei statistice, protocoalele cu analogi-GnRH au folosit pentru stimularea ovariana aceleasi gonadotropine cu diferente nesemnificative statistic (rFSH, HMG), cu exceptia FSH-HP. Durata medie a stimularii ovariene a fost pentru pacientele cu protocoale cu agonisti mai lunga fata de cazurile cu antagonisti, acelasi lucru este valabil si pentru mediana (Tabel 3.3). Valorile extreme ale perioadei de stimulare sunt comparabile (minim 6 zile si maxim 29 zile agonist versus 21 zile antagonist). Pacientele utilizand protocoale cu agonisti au prezentat un procent de 38,94% pentru durata ≤ 10 zile si 56,37% pentru o perioada intre 11-15 zile. Antagonistii-GnRH au avut un procent de 69,79% din paciente cu durata a stimularii ≤ 10 zile si 26,84% din cazuri cu stimulare intre 11-15 zile.

193

Din studiu reiese ca durata stimularii este mai scurta in cazurile cu antagonisti comparativ cu agonisti, ceea ce este consemnat si in datele din literatura. Procentele pacientelor care au necesitat o perioada de stimulare prelungita (> 15 zile, fiind inclusa aici si perioada > 20 de zile) sunt comparabile: agonisti 4,68% iar anatagonisti 3,35%. Tabel 3.3 – Comparatie a duratei stimularii ovariane – protocoale agonisti/antagonisti Durata medie a

Mediana (zile)

stimularii (zile) Agonisti-GnRH

11,36

11

Antagonisti-GnRH

9,95

9

Doza medie a gonadotropinei utilizata in stimulare este alt factor luat in discutie. Este cunoscut faptul ca in cadrul protocolului cu antagonisti este o durata mai redusa de stimulare care poate atrage dupa sine si un necesar mai scazut al unitatilor de FSH. Din cadrul protocoalelor cu agonisti, cel lung are de obicei necesarul cel mai crescut de unitati de FSH. In analiza actuala se observa o diferenta de 600 UI intre valorile medii ale dozelor de FSH din cadrul stimularii ovariene. Se observa in tabelul 3.4 ca in cazul protocoalelor cu agonisti este necesara o doza medie de gonadotropi mai crescuta. De altfel si valorile extreme ale dozelor, in speta cele maxime atinse in stimulare, sunt mult mai mari pentru agonisti (14.700 UI) fata de antagonisti (7425 UI). Tabel 3.4 – Comparatie a dozei medii de unitati FSH – protocoale agonisti/antagonisti Doza medie (UI)

Mediana (UI)

Agonisti-GnRH

2635,19

2250

Antagonisti-GnRH

2021,77

1800

Chiar daca au existat diferente intre durata totala a stimularii si cantitatea totala de gonadotropina administrata, acesti parametri nu au influentat semnificativ statistic succesul protocoalelor (nasterea).

194

Tipurile de protocoale din cadrul fiecarei medicatii supresive hipofizare au si ele importanta lor, demonstrata in practica de-a lungul anilor prin rezultatele obtinute. Avantajele pentru fiecare tip de protocol le-am expus in partea generala. Agonistii au utilizat cel mai frecvent protocolul lung (91,46%) si in cazul antagonistilor s-a folosit protocolul Lübeck (cu doze multiple) in 93,95% din cazuri. In anul 2001(ultimul an studiat) protocolul Lübeck s-a administrat in exclusivitate. In cercetarea actuala protocolul francez nu a produs o inhibitie corespunzatoare a hipofizei, astfel incat din 9 cicluri cu protocol francez, in 2 cazuri s-a inregistrat cresterea prematura a LH-ului (22,22%). La 140 de cazuri cu protocol Lübeck s-au remarcat tot 2 situatii de crestere prematura a LH-ului (1,42%). Este evidenta diferenta intre cele doua procente ale protocoalelor cu antagonisti si dovedeste, cel putin pentru analiza actuala, faptul ca supresia hipofizara („downregulation) a fost inadecvata in cazul administrarii unice a antagonistului (protocol francez) si in aceste situatii s-a intrerupt ciclul de stimulare. Raspunsul ovarian la stimulare este in mod fidel caracterizat de corelarea a doi parametri, si anume dezvoltarea folicolilor ovarieni si secretia de estradiol a acestora, cuantificate prin numarul si dimensiunea ecografica a folicolilor si ,respectiv, concentratia estradiolului seric. Acesta este motivul pentru care am inclus in analiza comparativa acesti factori si valorile lor sunt redate astfel: pentru dezvoltarea folicolilor - numarul/dimensiunea lor in ziua in care se stabileste momentul administrarii HCG (ocazie cu care se si opreste stimularea); iar pentru estradiol concentratia serica a acestuia in ziua administrarii HCG. Pacientele care au fost incluse in protocoalele cu agonisti au inregistrat o valoare medie a E2 seric in ziua inducerii ovulatiei cu aproximativ 500 pg/ml mai mult decat valoarea aceluiasi hormon la pacientele ce au folosit antagonisti (Tabel 3.5). Valorile maxime ale E2 seric la care sa ajuns au fost de 27.669 pg/ml pentru o pacienta din lotul cu agonisti fata de 8704 pg/ml – valoarea maxima atinsa la o pacienta cu antagonisti-GnRH. Valorile mai crescute ale E2 seric in cazul agonistilor sunt in corelatie si cu durata mai prelungita a stimularii ovariene si cu doza medie mai crescuta de administrare a gonadotropinelor.

195

Tabel 3.5 – Valoarea medie a E2 seric comparativ pentru agonisti/antagonisti Valoare medie

Mediana (pg/ml)

(pg/ml) Agonisti-GnRH

1926,21

1602,5

Antagonisti-GnRH

1495,34

1529

Din datele publicate in literatura actuala se considera ca nu exista o corelatie semnificativa intre valoarea E2 seric si rata obtineri sarcinilor in cadrul FIV la protocoalele unde inhibitia hipofizara este realizata cu agonisti-GnRH. Sunt studii retrospective care sugereaza acest fapt. Totusi, pentru practica clinica, sunt utile studii prospective care sa aduca noi informatii, atat in cadrul protocoalelor cu agonisti, cat si pentru antagonisti [187]. Incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana in cadrul lotului cu agonisti a fost de 3,48% iar pentru pacientele cu antagonisti - 3,35% . Valorile mai crescute ale E2 seric din grupul agonistilor nu se coreleaza intotdeauna cu incidenta aparitiei sindromului de hiperstimulare. Este si concluzia care se desprinde din analiza pacientelor cu sindrom de hiperstimulare, detaliata in cadrul fiecarui an si tip de protocol. Acestea sunt probate si de statisticile din literatura, care nu au gasit o corelatie clara intre concentratia E2 seric si aparitia hiperstimularii, cu toate ca in majoritatea cazurilor acest sindrom se insoteste de valori crescute ale hormonului amintit [189]. Exista insa un consens asupra faptului ca E2 seric crescut poate reprezenta un marker important in depistarea multor paciente cu risc de hiperstimulare ovariana. Dozarile hormonale cuprind pe langa E2 seric si determinarea concentratiei LH seric. Este deosebit de utila aceasta masuratoare a hormonului endogen, tocmai in eventualitatea surprinderii unei cresteri premature a acestuia. Aceasta crestere precoce reprezina un criteriu de abandonare a ciclului si semnifica un esec al stimularii ovariene. Pacientele cu protocoale cu agonisti au prezentat 4 situatii (0,48%) ale valorii LH > 10 UI/l, dintre care 3 cazuri au avut asociere de rFSH si protocol lung; respectiv 1 caz de asociere rFSH+HMG si protocol scurt. Pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH s-au inregistrat tot 4 cazuri de crestere prematura a LH-ului (2,68%). Cele 2 paciente cu asociere rFSH si protocol francez au intrerupt stimularea, pe

196

cand la celelalte 2 cazuri de rFSH si protocol Lübeck s-a efectuat punctia foliculara, dar fara obtinerea unei sarcini. Se considera in cazul protocoalelor cu antagonisti ca realizarea unei supresii hipofizare marcate in ziua a 8-a de stimulare se insoteste de o rata mai mare a obtinerii sarcinii si de evolutivitate a acesteia. La pacientele cu LH< 0,5 UI/l in ziua a 8-a de stimulare a fost inregistrata cea mai mare rata de implantare si apoi de sarcina in evolutie [188]. In analiza prezenta valoarea medie a LH-ului pentru agonisti a fost de 2,45 UI/l si mediana 2 UI/l, iar pentru antagonisti – de 2,18 UI/l, mediana: 2,2 UI/l. Foliculometria seriata a fost permanent corelata cu dozarea E2 seric. Amandoua protocoalele dovedesc prin valorile medii ale folicolilor, exemplificate pe paliere de dimensiuni, o predominanta a folicolilor > 18 mm, ceea ce reprezinta si scopul stimularii ovariene controlate – de-a obtine folicoli dominanti si nu folicoli multi si de dimensiuni reduse (Tabel 3.6). Tabel 3.6 – Numarul folicolilor comparativ agonisti/antagonisti Dimensiune

Agonisti-GnRH

Antagonisti-GnRH

folicoli (mm)

Numar mediu

Mediana

Numar mediu

Mediana

13-15

2,79

2

2,81

2

16-18

3,09

3

2,52

2

> 18

3,80

4

3,93

3

Rata sarcinilor este influentata si de tehnica reproducerii asistate, in sensul ca pentru fiecare metoda exista indicatii clare de aplicare, respectiv fiecare tehnica are o rata specifica de succes. Numarul pacientelor cu cicluri cu antagonisti a crescut din anul 2000 la anul 2001, la fel si procentul celor la care s-a efectuat ICSI. Se remarca din tabelul 3.7 ca numarul ciclurilor intrerupte, care nu s-au soldat cu punctie foliculara, este usor mai crescut in cazul ciclurilor cu antagonisti. Se poate corela aceasta informatie si cu faptul ca tot in cazurile antagonstilor procentul cresterii premature a LH-ului este mai ridicat fata de agonisti. Comparativ insa cu numarul de punctii efectuate in cadrul fiecarui tip de protocol, cazurile care au ramas nepunctionate sunt in procent foarte reduse.

197

Tabel 3.7 - Frecventa tehnicilor de reproducere umana asistata – comparativ agonisti/antagonisti FIV

ICSI

Fara punctie

Agonisti-GnRH

525 (63,10%)

290 (34,85%)

17 (2,04%)

Antagonisti-GnRH

71 (47,65%)

72 (48,32%)

6(4,02%)

Se observa ca frecventa ICSI in protocoalele cu agonist fata de antagonist se situeaza la valorile 34,85% versus 48,32%. Diferenta rezida si din indicatiile pentru care s-a efectuat ICSI : severitatea cazului, tipul sterilitatii, rezultatele de la punctii anterioare (daca s-au efectuat). Prin diferenta restul cazurilor au beneficiat de FIV, in cazul agonistilor in proportie de 63,10% fata de antagonisti – 47,65%. Punctiile s-au insotit de o valoare medie a ovocitelor comparabila intre cele doua tipuri de protocoale, respectiv asemanatoare cu datele din literatura (Tabel 3.8). O concluzie foarte importanta care se desprinde din aceste date este ca protocolul cu antagonisti nu influenteaza in sens negativ numarul si calitatea ovocitelor obtinute per punctie foliculara. Tabel 3.8 – Comparatie intre numarul ovocitelor recoltate / punctie foliculara – agonisti/antagonisti Numar mediu al

Mediana ovocitelor

ovocitelor recoltate

recoltate

Agonisti-GnRH

8,43

8

Antagonisti-GnRH

8,42

7

Fecundarea, apreciata prin prezenta celulelor cu 2PN, arata aceleasi rezultate comparativ pentru pacietele care au urmat protocoale cu agonisti-antagonisti, ca si in cazul ovocitelor. Tabel 3.9 - Comparatie intre numarul celulelor fecundate / punctie – agonisti/antagonisti Numar mediu al

Mediana celulelor cu

celulelor cu 2PN

2PN

Agonisti-GnRH

3,71

3

Antagonisti-GnRH

4,10

3

198

Diferenta, de altfel minora, intre aceste valori medii poate fi explicata prin faptul ca in cazul antagonistilor s-a utilizat in procent mai crescut procedeul ICSI (48,32%) fata de protocoalele cu agonisti (34,85%) iar in cazul ICSI se scurtcircuiteaza toate barierele intre spermatozoid si mediul intern al ovocitului. Rezultatele expuse demonstreaza ca substantele antagoniste nu au efect negativ asupra fecundarii, in sensul in care acesta depinde in mare masura, pe langa alti factori, si de calitatea ovocitelor. Deci agonistii si antagonistii-GnRH au rezultate similare in ceea ce priveste numarul si calitatea ovocitelor si numarul celulelor fecundate. Am considerat sa compar si valorile medii ale embrionilor transferati, pentru ca se poate deduce de aici calitatea embrionilor (daca s-a produs clivajul la prezigoti si daca acestia si-au continuat evolutia pana la stadiul de embrion). Intotdeauna s-au transferat intre 1 si 3 embrioni. Tabel 3.10 - Comparatie intre numarul embrionilor transferati – agonisti/antagonisti Numar mediu al

Mediana

Cazuri fara

embrionilor

embrionilor

embriotransfer

transferati

transferati

Agonisti-GnRH

1,76

2

135 16,23%

Antagonisti-GnRH

1,89

2

16 10,73%

Parameter ET

DF

Estimate

1

0.7522

Standard Wald 95% Error Confidence Limits 0.1276

0.5020

1.0023

Parameter Estimate

Standard Error

95% Confidence Limits

ET

0.1052

0.5455

0.7517

199

ChiSquare

0.9578

Pr > ChiSq

34.74

Z Pr > |Z| 7.15

<.0001

<.0001

Sarcinile care s-au inregistrat la cele 832 de paciente care au efectuat cicluri de stimulare si au utilizat protocoale cu agonisti-GnRH pentru supresia hipofizara sunt in numar de 179 (21,51%) (Fig. 3.1). De remarcat ca 91(50,83%) din totalul acestor sarcini au fost nasteri monofetale. Pacientele care au urmat protocoale cu antagonisti-GnRH au fost in numar de 149 si din acestea 17 au obtinut sarcina (11,40%). Majoritatea acestor sarcini (un numar de 8, respectiv 47,05%) s-au terminat cu nastere monofetala.

Numar sarcini

900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

832

Total cicluri

149

179

Cicluri agonisti

17

Cicluri antagonisti

Fig. 3.1 – Numarul total de sarcini si numarul total de cicluri initiale pentru protocoalele cu agonisti/ antagonisti-GnRH Tipurile de gonadotropine care s-au administrat la aceste paciente care au obtinut sarcina au fost: •

rFSH in 153 de cazuri (85,47%);

•

HMG in 15 cazuri (8,37%);

•

rFSH+HMG in 7 cazuri (3,91%); 200

•

FSH-HP in 4 cazuri (2,23%).

Gonadotropinele care s-au utilizat in stimularea ovariana controlata pentru aceste 17 paciente care au obtinut sarcina au fost: •

rFSH: 16 cazuri (94,11%);

•

HMG: 1 caz (5,88%) (Fig. 3.2).

160 140 120 100 80 60 40 20 0

rFSH HMG rFSH+HMG FSH-HP

Protocoale cu agonisti

Protocoale cu antagonisti

Fig. 3.2 – Tipurile de gonadotropine la pacientele cu sarcini din cadrul protocoalelor cu agonisti/ antagonisti-GnRH Tipurile de protocoalele care s-au aplicat pentru fiecare medicatie cu analog-GnRH in parte la pacientele cu sarcina au fost urmatoarele: •

Agonisti-GnRH:

Protocol lung: 170 cazuri (94,97%); Protocol scurt: 3 cazuri (1,67%); Protocol ultralung: 6 cazuri (3,35%).

201

•

Antagonisti-GnRH:

Protocol Lübeck: 17 cazuri (100%); Protocol francez: 0 cazuri. Se remarca ca protocolul lung in cadrul agonistilor-GnRH a fost cel mai frecvent aplicat; este de altfel si tipul de protocol cu care se lucreaza cel mai des in practica clinica. Iar pentru categoria sarcinilor din protocoalele cu antagonisti-GnRH, protocolul Lübeck a fost aplicat in exclusivitate. Ca si tehnici ale reproducerii asistate in cazul sarcinilor provenite din stimulare ovariana si protocol agonist-GnRH s-au practicat FIV/ET in 118 cazuri (65,92%) si ICSI in 61 de situatii (34,07%), dintre care 5 sarcini cu spermii provenite din crioTESE. Sarcinile pacientelor provenite din lotul cu antagonisti-GnRH au fost obtinute in urma punctiei foliculare in cadrul FIV/ET in 12 cazuri (70,58%) si ICSI in 5 cazuri (29,41%) (Fig. 3.3).

80

70,58%

70 60 50 40 30

29,41% 65,92%

20

Antagonisti

34,07%

10 0

FIV/ ET

Agonisti

ICSI

Agonisti

Antagonisti

Fig. 3.3 – Raportul procentual al tehnicilor de reproducere asistata la pacientele care au obtinut sarcina in cadrul protocoalelor cu agonisti/antagonisti

202

Se remarca din acest grafic ca tehnicile de reproducere asistata au avut aproximativ aceeasi distributie procentuala pentru succesul ciclurilor de stimulare (obtinerea sarcinilor), indiferent de analogul-GnRH folosit in cadrul protocolului. Evolutia sarcinilor in cadrul celor 2 protocoale este redata cantitativ si procentual in urmatorul tabel (Tabel 3.11): Tabel 3.11 – Evolutia sarcinilor la cele 2 tipuri de protocoale Evolutia

Sarcina

sarcinilor

biochimica

Agonisti-

27

GnRH

Avort

Sarcina

Nastere

Nastere

Nastere

ectopica

monofetala

gemelara

tripla

29

9

91

24

0

15,08%

16,20%

5,02%

50,83%

13,40%

0%

Antagonisti-

2

4

0

8

2

1

GnRH

11,76%

23,52%

0%

47,05%

11,76%

5,88%

Exista o neconcordanta intre totalul de 179 de sarcini pentru pacientele cu agonisti-GnRH si insumarea in tabel a sarcinilor (180) pentru acelasi lot de paciente, explicata prin faptul ca la o pacienta s-a diagnosticat ecografic sarcina intrauterina concomitent cu sarcina extrauterina si care s-a terminat prin avort si salpingectomie totala. De mentionat ca sarcinile ectopice, rata avorturilor si incidenta sarcinilor multiple pentru cele 2 categorii de analogi-GnRH nu au depasit procentual statisticile generale. Scopul final al reproducerii asistate este obtinerea sarcinilor monofetale, deoarece sunt cunoscute riscurile materno-fetale ale sarcinilor multiple. Succesul tehnicilor reproducerii umane asistate este considerat a fi nasterea unui copil sanatos [191]. O statistica efectuata pentru anul 2001 la Centrul de Fertilizare in Vitro Monash (Australia) a analizat nasterile cu fat viu, unic, la termen si care au provenit dintr-o sarcina FIV/ET. La acest centru, se considera ca un cuplu care urmeaza un tratament in cadrul protocoalelor pentru FIV are o sansa de 11,1% de-a naste un fat viu, unic, la termen/ ciclu de stimulare. Astfel ca standardul pentru succesul in cadrul programelor FIV este considerata nasterea la termen a unui singur copil viu si sanatos/ ciclu FIV initiat (BESST: Birth Emphasizing a Successful Singleton at Term). 203

Conform criteriilor stabilite de standardul BESST, la lotul studiat pe cei trei ani se obtin urmatoarele valori : •

in urma aplicarii protocolului cu agonist-GnRH s-au inregistrat un total de 91 de nasteri monofetale la 832 cicluri de stimulare (10,94%) ;

•

in cazul protocolului cu antagonisti-GnRH numarul de nasteri monofetale a fost de 8 din totalul de149 de cicluri initiale, adica 5,37%. Ca si o observatie se constata ca in cadrul protocolului cu agonist-GnRH valoarea

obtinuta pentru criteriile BESST se apropie de datele din literatura. Incidenta malformatiilor intalnite in sarcinile din studiul actual pentru cele doua clase de medicatie supresiva a hipofizei a fost in numar de 6 sarcini (3,35%) din totalul de sarcini obtinute cu agonisti-GnRH si 1 sarcina (5,88%) in cazul aplicarii antagonistilor-GnRH. Sarcini cu malformatii/ lotul cu agonisti-GnRH: 1 trisomie 21 la o pacienta de 41de ani (ICSI); 1 fat cu keilognatopalatoskizis(FIV/ET); 2 nasteri gemelare cu malformatii (neprecizate) (1 FIV/ET si 1 crioTESE); 1 trisomie 18 la o pacienta de 40 de ani (FIV/ET); 1 aneuploidie (neprecizata) prin biopsie vilozitati coriale la o pacienta de 38 de ani (FIV/ET). Aceste malformatii au fost intalnite la 4 cazuri cu sarcini provenite din FIV/ET si 2 sarcini - in urma efectuarii ICSI (dintre care la 1 crioTESE). Este destul de dificil de apreciat daca procedeul ICSI, respectiv crioTESE, prezenta sarcinii multiple sau varsta unora dintre paciente au jucat un rol in incidenta malformatiilor din aceasta categorie de paciente. Sarcini cu malformatii/ lotul cu antagonisti-GnRH: 1 caz la o sarcina tripla (cu malformatie intestinala la toti fetii), provenita din FIV/ET. Nici in grupul pacientelor incluse in terapia cu antagonist-GnRH nu se pot stabili concluzii pertinente pentru cauza malformatiilor.

204

Din tabelul 3.12, unde sunt sumarizate ratele sarcinilor calculate pentru cele doua tipuri de protocoale cu agonisti-, respectiv antagonisti-GnRH, se observa detasat o diferenta neta intre procentele obtinute pentru agonisti, care se incadreaza in statistica generala si ratele stabilite in cazul antagonistilor, care sunt evident mai mici. Tabel 3.12 – Rata sarcinilor comparativ intre protocoalele cu agonisti/ antagonisti Agonisti-GnRH

Antagonisti-GnRH

21,51%

11,40%

Rata sarcinilor/punctii

21,96 %

11,88 %

Rata sarcinilor/ET

25,68%

12,78%

Rata implantarii

27,29%

15,03%

Baby take home rate

13,82%.

7,38%

Rata sarcinilor/cicluri stimulare

Din analiza statistica reies urmatoarele : •

Pentru parametrul varsta - fiecare an in plus scade probabilitatea obtinerii unei sarcini ce se finalizeaza cu nastere si care este semnificativ statistic;

•

Pentru parametrul embriotransfer creste semnificativ probabilitatea obtinerii unei sarcini cu fiecare embrion in plus transferat, dar acest lucru este valabil pana la numarul de 3 embrioni;

•

Alegerea protocolului cu antagonist-GnRH se repercuta negativ asupra succesului, fiind pe analiza actuala considerat semnificativ statistic, cu valoarea lui ˝ p ˝ situata putin peste limita de 0,05;

•

Tehnica ICSI din cadrul reproducerii asistate are un succes scazut, dar nesemnificativ statistic pe analiza luata in discutie;

•

Unele paciente din loturile studiate au parcurs mai multe cicluri de stimulare. Cu toate ca nu exista un model unitar pentru analiza diferentelor intre acestea, se poate remarca ca sansa de succes este mai mica pentru a doua incercare si creste usor pentru a treia incercare, aceasta corelatie nefiind insa semnificativ statistic

205

Capitolul 4 – Statistica pe primii 5 ani a Centrului de Laparoscopie, Chirurgie Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din cadrul Clincii Universitare de Obstetrica-Ginecologie „Bega”, Timisoara Rezultatele pe o perioada de 5 ani de la infiintarea primului centru de reproducere umana asistata din Romania, si anume Centrul de Laparoscopie, Chirurgie Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din cadrul Clinicii Universitare de Obstetrica-Ginecologie „Bega”, Timisoara, au fost publicate in Revista Obstetrica si Ginecologia, vol. XLVIII, Nr 1 [95]. Pe perioada 20.05.1995-31.12.1999 s-au efectuat 433 fertilizari in vitro, din care au rezultat 88 de sarcini (rata de sarcini: 20,32%). Din acestea: 63 (71,59%) au fost sarcini unice; 8 (9,09%) – sarcini gemelare; 4 (4,54%) sarcini triple; 1 (1,13%) sarcina cvadrupla. S-au inregistrat 12 avorturi (13,63%). Take home baby rate: 17,55% (la momentul respectiv 76 sarcini erau in evolutie). Rata implantarii: 21,24%. Numarul de copii: 92 S-au grupat pacientele in functie de tipul sterilitatii: primara si secundara, respectiv sterilitate de cauza masculina. Cauzele sterilitatii la pacientele care s-au adresat in cadrul acestui centru sunt sumarizate in tabelul 4.1. Sterilitatea secundara tubara este in procent majoritar (65,58% din cazuri), asa cum era si de asteptat, iar cea prin factor masculin se afla la un procent < 10%. De asemenea este specificat in tabel si procentul pacientelor la care s-a inregistrat sarcina.

206

Tabel 4.1 - Statistica pe afectiuni Patologie

Paciente

Gravide

Sterilitate primara tubara

69 (15,93%)

14 (15,90%)

Sterilitate secundara

284 (65,58%)

56 (63,63%)

22 (5,08%)

6 (6,81%)

15 (3,46%)

3 (3,40%)

17 (3,92%)

2 (2,27%)

16 (3,69%)

5 (5,68%)

10 (2,30%)

2 (2,27%)

tubara Sterilitate primara idiopatica Sterilitate cu endometrioza Sterilitate secundara andrologica Sterilitate primara andrologica Sterilitate primara hiperandrogenemica Cele mai multe paciente care au intrat in protocoale terapeutice in vederea efectuarii fertilizarii in vitro au fost cu varsta cuprinsa intre 36 si 40 de ani (32,56), conform tabelului 4.2. Tabel 4.2 - Statistica pe grupe de varsta Varsta

< 30 ani

31-35 ani

36-40 ani

41-42 ani

> 42 ani

Paciente

95 (22,40%)

127

141

47 (10,85%)

23 (5,31%)

(29,33%)

(32,56%)

Activitatea primilor 5 ani (1995-1999) a cuprins numai protocoale cu agonisti-GnRH. In cadrul schemelor de stimularea ovariana s-a practicat long protocol sau short protocol (Tabel 4.3). Sunt amintite si preparatele cu care s-a realizat inhibitia hipofizei. Cel mai des uzitat a fost long protocol. Dupa supresia hipofizara se incepe stimularea ovariana cu gonadotropina, initial 3 fiole/zi – 3 zile, apoi 2 fiole/zi si ulterior se ajusteaza doza functie de ecografie si profilul hormonal.

207

In short protocol se incepe agonistul-GnRH in ziua a 2-a de ciclu menstrual si se continua pana in ziua declansarii ovulatiei, gonadotropina se introduce in ziua a 4-a. Gonadotropinele utilizate in cadrul acestor protocoale au fost: HMG, FSH-HPsi rFSH (preparate comerciale: Pergonal, Humegon: 75 UI FSH + 75 UI LH; Metrodin: 75 UI FSH; Puregon: 50, 100, 150, UI rFSH). Tabel 4.3 Tipuri de stimulare folosite in Centrul de Fertilizare in Vitro de la Clinica Universitara de Obstetrica-Ginecologie “Bega” Mod de stimulare

Short protocol

Paciente

Gravide

48 (11,08%)

7 (14,58%)

28 (6,46%)

9 (32,14%)

30 (6,92%)

10 (33,33%)

104 (24,01%)

21 (20,19%)

22 (5,08%)

6 (27,27%)

Agonist-GnRH (Uno Enantone) + HMG

Short protocol Agonist-GnRH (Uno Enantone) + FSH

Short protocol Agonist-GnRH doza zilnica (Decapeptyl 0,1) + HMG

Short protocol Agonist-GnRH doza zilnica (Decapeptyl 0,1) + FSH

Short protocol Agonist-GnRH doza zilnica (Decapeptyl 0,1) + recFSH

208

11(2,54%)

2 (18,18%)

56 (12,93%)

9 (16,07%)

25(5,77%)

6 (24%)

97 (22,40%)

14 (14,43%)

12 (2,77%)

4 (33,33%)

Long protocol Agonist-GnRH retard (Zoladex)+ HMG

Long protocol Agonist-GnRH retard (Zoladex)+ FSH

Long protocol Agonist-GnRH retard (Decapeptyl 3,75)+ HMG

Long protocol Agonist-GnRH retard (Decapeptyl 3,75)+ FSH

Long protocol Agonist-GnRH retard (Decapeptyl 3,75)+ recFSH

In urma punctiei foliculare s-au recoltat la majoritatea pacientelor (48,26%) un numar de ovocite cuprins intre 5-10, conform tabelului 4.4. La aceste pacientele au si survenit cele mai multe sarcini. Tabel 4.4 Numar de ovocite recoltate Numar

1-4

5-10

11-15

16-20

>20

110

209

75 (17,32%)

30 (6,92%)

9 (2,07%)

(25,40%)

(48,26%)

10 (9,09%)

42 (20,09%)

15 (20%)

17 (56,66%)

4 (44,44%)

ovocite Paciente Gravide

Intreruperea ciclurilor de stimulare initiale s-a produs la 54 paciente (14,71%), datorita urmatoarelor motive: 13 paciente au prezentat chiste ovariene 5 cazuri - datorita sindromului de hiperstimulare ovariana 41 de paciente nu au raspuns corespunzator la tratamentul aplicat.

209

Sindromul de hiperstimulare ovariana s-a intalnit in statistica Centrului de Fertilizare in Vitro si Embriotransfer al Clinicii Universitare de Obstetrica-Ginecologie “Bega”, Timisoara doar in 30 cazuri (pe perioada 1995-1999), acestea fiind forme usoare si medii. Nu s-au inregistrat forme severe. La 1 caz cu torsiune de ovar chistic la 12 saptamani de gestatie s-a intervenit chirurgical si s-a rezolvat pe cale laparoscopica. Sarcina a evoluat ulterior normal, pana la termen. Aspecte de embriologie De la cele 433 de cazuri punctionate s-au recoltat 3070 ovocite. Luand in considerare numarul de ovocite recoltate/caz, distributia este urmatoarea (Tabel 4.5): Tabel 4.5 – Numar ovocite recoltate/caz Nr.

1-3

4-7

8-11

12-15

16-20

>20

Nr. cazuri

65

169

88

72

30

9

Procent

15%

39%

20%

17%

7%

2%

ovocite/caz

Prelucrarea spermei a inclus metoda swim-up in caz de normospermie si metoda Percoll in caz de oligospermie severa. Inseminarea ovocitelor s-a efectuat cu 100.000 spermii bine mobile/godeu daca s-a folosit mediu Ham’s F10 si 60.000-80.000/godeu daca s-a folosit mediul FIV Medicult, intr-un godeu existand 1-4 ovocite. Daca s-a folosit ca si mediu de cultura al ovocitelor si embrionilor mediul FIV Medicult si inseminarea a fost cu 100.000 spermii/godeu sa sesizat aparitia unui procent maai ridicat de prezigoti cu 3 PN. Referitor la calitatea spermei la cele 433 cazuri cu FIV, situatia a fost urmatoarea: 398 (92%) cazuri cu normospermie 35 (8%) cu oligoastenozoospermie. Din punct de vedere statistic distributia pe numar de pacienti a acestui parametru se prezinta astfel (Tabel 4.6):

210

Tabel 4.6 - Distributia numarului de spermatozoizi din prelucrarea spermei / cazuri Nr.

0-10

11-20

21-40

41-70

71-100

> 100

Nr. cazuri

13

22

69

143

91

95

Procent

3%

5%

16%

33%

21%

22%

spermatozoizi (milioane/ml)

La interpretarea acestor date trebuie luat in considerare faptul ca majoritatea cuplurilor la care s-a practicat FIV au prezentat infertilitate de cauza feminina Urmatorul tabel 4.7 expune informatii referitor la volumul spermei recoltate. Statistic situatia se prezinta astfel: Tabel 4.7 – Volumul spermei recoltate/ cazuri Volum

< 2ml

2,1 - 4 ml

4,1 - 6 ml

6,1 - 8 ml

> 8 ml

Nr. cazuri

65

207

130

21

9

Procent

15%

48%

30%

5%

2%

Fecundarea La cele 433 cupluri s-au recoltat un total de 3070 ovocite. Din acest numar de ovocite 2501 (81,5%) s-au fecundat iar 568 (18,5%) au fost nefecundate. La cele 2501 ovocite fecundate – 2311 (92,4%) au prezentat 2PN si 190 (7,6%) au prezentat 3PN. La 5 din cazurile FIV nu s-a obtinut fecundare. 3 din aceste cazuri au fost cu normospermie si s-au recoltat 4; 6 si respectiv 9 ovocite. In aceste cazuri se poate suspiciona o cauza (genetica) legata de spermie (lipsa acrozomului?). La 2 din cazuri s-au recoltat 7 si respective 8 ovocite, dar a existat factorul masculin reprezentat prin oligoastenozoospermie (Tabel 4.8).

211

Tabel 4.8 – Realizarea fecundarii la cazurile punctionate Fecundatie

0%

<50%

51-70%

71-90%

91-100%

Nr.cazuri

5

17

106

149

156

Procent

1,15%

4%

24,5%

34,5%

35,85%

%/caz

S-au efectuat constatari avand in vedere corelatia dintre ziua recoltarii si procentul de fecundatie. Ovocitele recoltate in ziua 15 de stimulare s-au fecundat in procent de 95%, cele recoltate in ziua a 16-a s-au fecundat in 89%, ovocitele recoltate in ziua 14 s-au fecundat in procent de 82%. Numai 61% din ovocitele recoltate in ziua 12 si 13 au fost fecundate. Daca au existat mai mult de 3 embrioni si recoltarea ovocitelor a fost in ziua 14 sau 15 de stimulare, s-au cultivat embrionii pentru 72 ore (ajung in stadiul de 8 celule). Daca numarul de embrioni a fost intre 1-3 s-au transferat in ziua a 2-a. In mod obisnuit se transfera un numar ≤ 3 embrioni. La pacientele > 40 ani si daca au fost disponibili mai multi embrioni s-au transferat si 4 embrioni. Cu privire la calitatea embrionilor, marea majoritate au avut un ritm de dezvoltare corespunzator, cu morfologie normala, dar au existat si embrioni cu blastomere inegale sau fragmentate sau embrioni care au ramas in stadiul de 2 PN sau de zigot nesegmentat (Tabel 4.9). Tabel 4.9 – Repartitia pe clase a embrionilor din punct de vedere al calitatii lor Calitate

Clasa I

Clasa II

Clasa III-IV

embrioni

Embrioni opriti in dezvoltare

Nr. embrioni

1394

370

246

41

Procent

68%

18%

12%

2%

La un numar mai mic de cazuri s-au cultivat embrionii in mediul FIV Medicult si numarul de embrioni cu blastomere fragmentate a fost mai mare comparativ cu cei cultivati in mediul Ham’s F10.

212

Tabel 4.10 – Rezultatele cazurilor punctionate Total cazuri

Nr. cazuri cu fecundare

punctionate

prezenta

Nr. cazuri cu ET realizat

Numar

Procent

Numar

Procent

428

98,84%

428

98,84%

433 Rezultate

In urma celor 428 de embriotransferuri s-au inregistrat 88 de sarcini. Rata sarcinilor/embriotransfer: 20,32%. La 34 gravide (38,65%) embriotransferul s-a efectuat a 2-a zi dupa punctie, cu embrioni in stadiul de 2-4 blastomere. La celelalte 54 gravide (61,36%) embriotransferul s-a efectuat la 72 ore dupa punctie, embrionii avand in general 7-8 sau 8-12 blastomere. Sarcina s-a instalat dupa primul embriotransfer la 61 paciente (69%) si la 15 paciente (17%) sarcina a survenit dupa al 2-lea embriotransfer. Doar la 12 paciente (14%) sarcina s-a instalat dupa a 3-a incercare. Observatii Daca se ia in considerare varsta pacientei, rezultatele sunt urmatoarele: •

95 paciente au avut varsta < 30 ani (28%) si la 27 din ele (28 %) s-a instalat sarcina;

•

268 paciente au avut varsta intre 30-40 ani (65%) si din acest grup la 54 s-a instalat sarcina (20,14%)

•

70 paciente (7%) au avut varsta > 40 ani si doar la 7 din ele (10%) a survenit sarcina.

Sarcina a survenit in procentul cel mai mare la pacientele tinere < 30 de ani. Concluzii La inaugurarea primului centru de FIV din Romania s-a inregistrat si primul success (prima punctie s-a insotit de sarcina, urmata de nastere). Pe perioada celor 5 ani de activitate s-a inregistrat o rata de graviditate prin FIV de 20,32%, comparabila cu a altor centre. Nu s-au intalnit malformatii ale fetilor.

213

Discutii In urma rezultatelor obtinute in cadrul Centrului de Laparoscopie, Chirurgie Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din cadrul Clinicii Universitare de Obstetrica-Ginecologie „Bega” pentru o perioada de 5 ani de activitate se poate afirma ca rata de success este influentata de mai multi factori: •

varsta pacientei - se considera ca sansele sunt mai mari la o varsta < 30 ani;

•

tipul stimularii ovariene;

•

numarul de ovocite recoltate, cifra optima fiind de 6-10 ovocite;

•

calitatea si tipul mediului de cultura folosit;

•

numarul de spermii bine mobile/godeu;

•

ziua embriotransferulu; se considera optim embriotransferul la 72 ore.

214

Capitolul 5 Crioconservarea

Capitolul 5.1 Crioconservarea si locul acesteia in cadrul reproducerii umane asistate

Definitia crioconservarii consta in pastrarea celulelor si a organismelor (in cazul reproducerii asistate - embrioni) la temperaturi mai mici decat temperatura de congelare (de obicei la –196°C), situatie in care sunt oprite toate procesele metabolice celulare. Initial crioconservarea s-a aplicat experimental si dupa ce s-au obtinut sarcini la animale, utilizand celule care au fost congelate/ decongelate, s-a trecut si la om [192]. Din punct de vedere istoric primele sarcini care s-au obtinut utilizand celule crioconservate (si anume spermatozoizi) au fost in anul 1953. Spermatozoizii au fost pastrati la gheata, la - 80°C si s-a utilizat glicerolul ca agent crioprotector [193]. Cercetarile experimentale ulterioare s-au extins si prin congelarea/ decongelarea ovarelor de soareci si sobolani, care au fost transplantate de la un animal la altul, s-a obtinut ovulatie si gestatie [194], [195]. Tehnicile de crioconservare au parcurs etape de dezvoltare, celulele fiind conservate in azot lichid (la - 196°C), astfel ca la un deceniu dupa raportarea primelor sarcini obtinute prin folosirea spermatozoizilor congelati/ decongelati s-au comunicat primele sarcini care au utilizat spermii crioconservate in azot lichid [196]. Mai mult, in 1984, s-a nascut primul copil obtinut din decongelarea unui embrion in stadiul de 8 celule, care a fost transferat intrauterin (1984 - Queen Victoria Hospital, Melbourne, Australia) [197]. Desigur ca si aceasta metoda de pastrare a celulelor a starnit multiple controverse, atat din punct de vedere medical, cat si etic, religios si legal. In functie de legile existente in fiecare tara se pot crioconserva gametii feminini si masculini, tesut ovarian, tesut testicular, celule in stadiul de prezigoti (cu 2 pronuclei), embrioni, blastocisti. Se considera ca prin crioconservarea celulelor in stadiul de 2PN fata de crioconservarea embrionilor se pot evita o serie de aspecte 215

etice, sociale, morale si religioase legate de acest procedeu. Pe de alta parte s-a ajuns la concluzia ca rata poliploidiilor este crescuta la sarcini ce au fost obtinute din ovocite crioconservate (atat la animale, cat si la om) [198], [199]. Crioconservarea este aplicata pe scara larga in urma efectuarii tehnicilor de reproducere umana asistata si se motiveaza necesitatea ei pe baza urmatoarelor aspecte: •

existenta mai multor ovocite sau embrioni /ciclu FIV;

•

permite evitarea unei noi stimulari si implicit reduce costul acesteia;

•

creste rata sarcinii / pacienta / punctie (sau per ciclu);

•

permite evitarea sindromului de hiperstimulare ovariana. Se ridica uneori si probleme legate de factorul masculin (numarul de spermatozoizi

poate fi variabil de la o recoltare la alta, cu fluctuatii mari) sau partenerul este absent in ziua inseminarii ovocitelor. In aceste situatii este utila crioconservarea spermiilor din ejaculat. In cazul unei azoospermii cunoscute se impune recoltarea spermiilor prin biopsie testiculara si este justificata crioconservarea spermatozoizilor, pentru a evita punctii testiculare repetate.

Capitolul 5.2 Efecte fizice in cursul congelarii Congelarea per se consta in formarea cristalelor de gheata in citoplasma. Prin cedarea energiei termice o celula sufera un proces de racire, temperatura ajunge la punctul de inghet si il poate depasi, fara a se produce cristalizarea (fenomen denumit in literatura de specialitate „supercooling”). Formarea spontana a cristalelor extracelular va determina o crestere usoara a temperaturii datorita energiei termice ce se elibereaza prin formarea cristalelor. Ulterior, temperatura atinge din nou temperatura de inghet. Dupa o perioada de echilibru termic (temperatura mediului fiind mai scazuta, acesta absoarbe energia termica eliberata), va predomina temperatura scazuta, astfel incat procesul de racire continua. Declansarea cristalizarii in mediul extracelular se produce la valori termice de -5°C si in mediul intracelular are loc la -10°C.

216

-3°C

Datorita discrepantei intre punctele de inghet ale mediilor intra- si extracelulare, apa intracelulara va fi cedata mediului extracelular printr-un gradient osmotic. Tot mai multa apa extracelulara va cristaliza, iar electrolitii din mediul extracelular se vor concentra. In concluzie, acest proces favorizeaza supravietuirea celulara la scaderi in continuare ale temperaturii, formandu-se cantitati mici de cristale intracelular, ce nu lezeaza celulele (proces denumit „rescuable ice formation”). Absenta acestui proces se insoteste de formarea intracelulara de cristale de gheata, urmate de degradarea celulei (denumirea incetatenita in literatura este „lethal intracelular ice formation”) [200]. Factorii de care depinde lezarea celulei in cadrul procesului de congelare si decongelare sunt [201]: •

specia (umana, animala);

•

stadiul celular;

•

crioprotectori (tipul si concentratia lor);

•

viteza de congelare si de decongelare;

•

amorsarea cristalizarii;

•

temperatura la care se introduce in azot lichid. Deteriorarea celulara trebuie evitata in cursul congelarii prin evitarea formarii cristalelor

de gheata intracelular, care se produc in intervalul de temperatura - 15°C si

- 60°C. Dar si cu

ocazia decongelarii celulele vor parcurge acest interval, insa in sens invers [202]. Afectarea celulara in cadrul congelarii/ decongelarii rapide La viteze mari de congelare se produce cristalizarea intracelulara, dar in echilibru osmotic (celulele isi pastreaza forma). Cu cat viteza de congelare este mai mare, cu atat se formeaza mai multe cristale mici. La o temperatura mai mica de - 90°C cristalele se afla intr-un stadiu dezorganizat. Incalzirea de la - 90°C la - 40°C induce fenomenul de recristalizare, astfel incat cristalele se aglomereaza si cresc in dimensiuni. Cristalele mici au o energie de suprafata mare, au tendinta de a scade aceasta energie superficiala prin scaderea suprafetei, astfel incat se produce cresterea si aglomerarea cristalelor si au loc distrugeri membranare si lezare celulara. Recristalizarea necesita timp, necesitand o viteza de decongelare mai scazuta. La o decongelare rapida se trece peste acest interval de timp critic, nu apare recristalizarea si nu apar modificari importante in structura cristalelor [200].

217

Leziuni celulare in cadrul congelarii lente Cristalizarea intracelulara este exclusa daca 90% din apa intracelulara a fost cedata mediului, fenomen ce necesita insa timp. Celulele sunt expuse o perioada indelungata unor conditii hipertone. Dupa cristalizare, apa cedata mediului extern determina concentrarea intracelulara a sarurilor. Se considera ca exista o agresiune asupra lipidelor si lipoproteinelor membranare prin concentratia crescuta de electroliti, cu formare de discontinuitati membranare, care la decongelare permit liza osmotica a celulei printr-o crestere a permeabilitatii membranare. O alta ipoteza presupune producerea de mici leziuni la nivelul membranei celulare in cursul deshidratarii (de la un anumit volum celular), care ulterior permit liza osmotica in cursul decongelarii. In concluzie, procesul de congelare rapida necesita si o decongelare rapida (pentru evitarea recristalizarii), respectiv congelarea lenta este urmata de o decongelare lenta (pentru evitarea lizei osmotice). Leziuni celulare prin fenomenul de „supercooling” Punctul de inghet al majoritatii mediilor se situeaza intre - 3°C / -5°C. „Supercooling” reprezinta fenomenul de depasire al acestui punct, astfel incat se ajunge la - 12°C sau temperaturi mai scazute, fara aparitia cristalizarii. Pentru evitarea fenomenului de „supercooling” se induce cristalizarea la - 3°C / - 6°C, (adica imediat la temperaturi aflate sub punctul de inghet). Inducerea cristalizarii extracelulare si initierea procesului de deshidratare se produce prin atingerea solutiei/ introducerea unui instrument racit (tija/ bagheta la al carei capat temperatura este mai scazuta). Fenomenul a primit denumirea de „insamantare” („seeding”). Viteza optima de congelare este cea la care se evita formarea intracelulara de cristale, dar care este suficienta pentru a expune cat mai putin celulele unor efecte de liza. [124], [200], [201]. Termenul „racire” se refera la scaderea temperaturii de la valoarea temperaturii camerei la 5°C si cel de „congelare” se refera la scaderea temperaturii de la 5°C la - 30°C.

218

Rata de racire a unei celule depinde de permeabilitatea celulei si de raportul dintre suprafata si volum. De exemplu in cazul ovocitului, care este o celula mare, rata optima de racire este < 1°C / minut.

Capitolul 5.3 Substantele crioprotectoare

Crioprotectorii sunt substante care prin adaugarea lor incearca sa protejeze celulele in procesul de inghet. Ele sunt reprezentate de: glicerol, zaharoza, polivinilpirolidona (PVP), dimetilsulfoxid (DMSO), 1-2 propandiol. Ca si caracteristici generale - sunt substante cu greutate moleculara mica, sunt miscibile cu apa si penetreaza usor celula. Ele se adauga in solutie in concentatii de 1 pana la 2 molar. Protectia celulara se obtine prin efectul acestora de deshidratare celulara produsa inainte de congelare, prin efectul hiperton pe care il creaza in mediul de congelare. De obicei timpul de expunere la crioprotectori este de 10-20 minute. Crioprotectorii se impart in 2 clase: substante penetrante si nepenetrante. penetrante (sunt cel mai des folosite; exemple de crioprotectori penetranti sunt DMSO si glicerolul). Sunt substante hidrofile, cu un efect puternic deshidratant. Efectul lor este de scadere a punctului de inghet, astfel la 1 mol DMSO temperatura se va reduce de la -10°C la 35°C / -45°C, permitand intarzierea cristalizarii si astfel ramane mai mult timp pentru deshidratarea intracelulara, in special in cazul congelarii lente. Efectul lor consta probabil in legarea apei intracelulare si cedarea ei la temperaturi mai scazute, astfel incat se ajunge abia atunci la concentratii critice de electroliti; nepenetrante (exemplul este PVP – care este relativ toxic; alt crioprotector nepenetrant este sucroza). Efectul lor consta in extragerea apei intracelulare (deshidratare) si astfel se scade concentratia electrolitilor extracelulari. Prin urmare ei cauzeaza o scadere a punctului de congelare si astfel temperatura la care mediul intracelular va ingheta este mult mai redusa. Totodata se reduce si concentratia absoluta a sarurilor ce raman in solutia/mediul necongelat si se evita „efectul de solutie”. Acest efect este nociv prin alterarea structurii

219

membranare (lipide si lipoproteine) la o expunere celulara indelungata intr-un mediu cu concentratii crescute de saruri. Efectele adverse ale crioprotectorilor sunt cele de toxicitate pentru PVP, iar glicerolul si DMSO pot interfera cu Na+/K+ ATP-aza (la anumite concentratii). Este important ca in cadrul decongelarii sa se indeparteze crioprotectorul prin spalari succesive. Amorsarea cristalizarii are loc prin procesul de „insamantare” („seeding”) cu urmatoarele efecte: •

scurteaza fenomenul de supercooling;

•

cristalizarea extracelulara se induce la temperaturi usor scazute sub punctul de inghet. Ca si metode se descriu:

•

adaugarea crioprotectorului, echilibrare la 0°C, introducerea eprubetelor cu celule intr-o baie

la -6°C / -7°C ; dupa 5-10 min. se introduce o bucata de gheata, ce va induce cristalizarea; •

amorsarea cristalizarii printr-un instrument in prealabil racit;

•

cu eprubete la al caror capat exista o tija in “L”; la extremitatea inferioara a acesteia se atinge

o temperatura mult mai scazuta (10-20 K) si se produce amorsarea cristalizarii. Crioconservarea in sistem deschis (este varianta moderna) consta in plasarea eprubetelor deasupra unui recipient cu azot lichid la -196°C . Starea de vapori a azotului de la suprafata lichidului are temperaturi tot mai mari pe masura cresterii distantei fata de suprafata lichidului. Eprubetele se vor deplasa cu o anumita viteza spre recipientul cu azot lichid, unde in final vor fi scufundate. Decongelarea nu necesita aparatura speciala, produsul congelat se trece direct din azot lichid intr-o baie de apa la 20°C / 30°C. Ulterior, prin diluare, se indeparteaza o cantitate de crioprotector si se urmareste microscopic viabilitatea celulara. Celulele intacte se cultiva 30 min. - 3 ore in mediul specific, dupa care se mai observa inca o data microscopic. Celulele cu pronuclei se vor folosi ulterior pentru transferul intrauterin. Nu s-au observat anomalii (scindare ADN, aberatii numerice sau morfologice cromozomiale) la nivelul celulelor dupa crioconservare. Crioconservarea se aplica pentru: ovocite mature/ imature, celule in stadiul de 2 PN, embrioni (!), spermatozoizi. Se descriu multiple protocoale pentru congelare, cat si pentru decongelare (manual sau computerizat) si care includ timpi si viteze diferite pentru aceste procese.

220

Capitolul 5.4 Crioconservarea celulara

Crioconservarea spermatozoizilor a fost anticipata de Spallanzani in 1776, care a observat pentru prima data ca spermatozoizii isi pastreaza motilitatea dupa ce au fost expusi la temperaturi scazute. Prima sarcina dupa inseminare intrauterina ce a folosit spermatozoizi decongelati a fost obtinuta in 1953 [124], [193], [201]. Indicatiile crioconservarii spermatozoizilor sunt: •

neoplazie ce necesita radio- si chimioterapie si care este urmata de sterilitate;

•

sterilizare chirurgicala (vasectomie);

•

tulburari de ejaculare;

•

absenta partenerului in ziua efectuarii inseminarii intrauterine, FIV, ICSI;

•

variatii largi ale calitatii spermei;

•

donatori/ banci de sperma. Crioconservarea spermatozoizilor din tesutul testicular se recomanda in cazul tumorilor

testiculare, a biopsiei testiculare in cazul azoospermiei sau pentru evitarea unei noi biopsii. Fara crioprotectori supravietuirea celulara este de < 15%, ceea ce implica necesitatea adaugarii de substante crioprotectoare, care scad mult punctul de inghet, mentin pH-ul, scad concentratia electrolitilor. Se utilizeaza glicerol in concentratie de 5-10%. Adaugarea crioprotectorului se face treptat, pentru a preveni hiperosmolaritatea, a minimaliza leziunile si a evita deshidratarea celulara severa. Spermatozoidul are o permeabilitate crescuta la glicerol, care este dependenta de temperatura [203]. Dupa decongelare se urmareste viabilitatea spermatozoizilor, motilitatea, capacitatea de fecundare. S-a constatat ca: •

motilitatea spermatozoizilor este afectata dupa decongelare, in special la spermograme cu

oligo/ astenospermie; •

morfologia spermatozoizilor consta in afectarea membranei acrozomiale si a portiunii

terminale [204];

221

•

referitor la capacitatea de fecundare si rata sarcinilor: nu exista studii edificatoare (se

compara sperma proaspata si cea decongelata de la acelasi individ). Diversele studii ofera concluzii contradictorii [205]. Se stie insa ca procesele de congelare si decongelare actioneaza negativ asupra unei spermograme deja alterate [206]. Se pot folosi substante ce optimizeaza presiunea osmotica si pH-ul, previn contaminarea bacteriana si stabilizeaza membrana celulara, denumite „extender” sau substante cu rol in stabilizarea membranei celulare (de ex. galbenus de ou) si care poarta denumirea de „cryobuffer”. Procesul de congelare utilizeaza 2 metode: tehnica cu vapori (sistem deschis) sau in tehnica in sistem computerizat. Procesul de congelare cu vapori: consta in plasarea orizontala a tuburilor 15 min la 35 cm deasupra nivelului lichidului, apoi inca 15 min la 15 cm, dupa care se scufunda in azot lichid la 196°C. Congelarea in sistem computerizat are urmatoarele etape: racirea cu 1°C/min pana la 5 °C; congelarea cu o viteza de 10°C/min pana la -80°C si apoi de 25°C/min pana la -130°C, unde se mentine o ora, dupa care se scufunda in azot lichid la -196°C. Decongelarea consta in plasarea recipientelor cu sperma la 37°C timp de 10 min (in cazul procesului de congelare cu vapori) sau la temperatura camerei timp de 10 min (pentru sistemul computerizat). Se indeparteaza crioprotectorul si se analizeaza sperma si se prepara pentru inseminare intrauterina, FIV, ICSI. Si aici este valabil ca o congelare rapida obliga la o decongelare rapida, respectiv o congelare lenta - la o decongelare lenta. Crioconservarea ovocitelor implica unele aspecte etice, juridice. Se indica in: •

afectiuni oncologice (inainte de radio- si chimioterapie);

•

in caz de interventii chirurgicale terapeutice pentru afectiuni benigne ale ovarului;

•

terapie ce afecteaza ovarul, de exemplu in endometrioza. Rata sarcinilor/transfer este mult scazuta (4-5%) fata de celule cu 2 PN. S-a constatat si

ca rata poliploidiei este crescuta deoarece apar modificari la nivelul granulelor corticale si

222

membrana devine permisiva pentru spermatozoizi, se produce liza membranara, apar modificari ale zonei pellucida. Polispermia si poliploidia se pot evita prin aplicarea ICSI [198]. Se studiaza crioconservarea ovocitelor imature (rezultate bune se inregistreaza dupa ICSI) si a tesutului ovarian [207]. S-a observat ca in cazul crioconservarii ovocitelor imature in stadiul de vezicula germinala apare o protectie a cromozomilor (care se afla in profaza primei diviziuni meiotice si sunt protejati de o membrana nucleara). Ulterior aceste celule au fost decongelate si maturate in vitro iar dupa fertilizarea in vitro s-a ajuns la dezvoltare embrionara si la obtinerea de sarcini. Aceste rezultate au fost obtinute doar la animale [208]. In cazul cercetarilor la om, maturarea in vitro a ovocitelor imature care au fost congelate si ulterior decongelate a intampinat numeroase dificultati [209]. Crioconservarea celulara in stadiul de 2 pronuclei (2PN) prezinta unele avantaje, si anume: •

schimbul osmotic este mai rapid si expunerea la crioprotector este mai scurta (5 - 10 min fata

de 30 - 90 min - ca in cazul ovocitelor); •

rata supravietuirii este mai crescuta;

•

se evita o noua recoltare de sperma. Crioconservarea embrionilor presupune de obicei congelarea embrionilor de ziua a 2-a.

Rata de supravietuire si rata ciclurilor la care s-a efectuat un ET este mai scazuta decat cea a ciclurilor cu celule cu 2PN [210], [211]. Discutii Observatiile si discutiile privind rolul crioconservarii se refera asupra obtinerii unei sarcini folosind celule crioconservate. Asa cum am prezentat se pot utiliza gameti, celule deja fecundate (stadiul de prezigot) sau embrioni. Locul si avantajele utilizarii crioconservarii in cadrul reproducerii umane asistate sunt redate schematizat : •

se poate creste rata sarcinii/ ciclu FIV;

•

se evita sindromul de hiperstimulare ovariana;

•

se evita o noua punctie foliculara si se scad implicit costurile;

•

este importanta in ICSI;

223

•

permite diagnosticul preimplantational. Conform datelor din literatura - rata sarcinilor, evolutia acestora si rata nasterilor este

comparabila in cazul tehnicilor reproducerii asistate ce folosesc embrioni proaspeti fata de cei crioconservati si decongelati. Crioconservarea, dupa unele tehnici noi ca ICSI, poate ridica cateva probleme (prin injectarea spermatozoidului se pot produce lezari ale zonei pellucida si ale oolemei, care sa permita modificari in pasajul apei si a crioprotectorilor). Rezultatele dupa FIV si ICSI ale diferitelor studii ofera date comparabile referitoare la rata implantarii si rata sarcinilor. In sensul acestor consideratii teoretice am intentionat efectuarea unei analize comparative a crio-ciclurilor pentru o perioada de 3 ani (1999-2000-2001) si rezultatele (numarul sarcinilor obtinute) prin embriotransferul cu celule decongelate. Au fost luate in studiu celule care au provenit din cicluri FIV si ICSI anterioare, la care in protocoalele de stimulare s-au administrat agonisti-GnRH sau antagonisti-GnRH. Am cautat si posibile efecte asupra calitatii celulare produse de cele 2 clase de substante; efecte care se pot repercuta in sensul unui numar mai scazut de sarcini. Celulele crioconservate au fost in stadiul de 2PN si la decongelare s-a urmarit viabilitatea celulara si ulterior diviziunea acestora. Pacientele la care s-au urmarit acesti parametri au fost tratate in cadrul Departamentului de Fertilizare in Vitro din cadrul Clinicii Universitare de Ginecologie, Heidelberg, Germania. Embriotransferul cu celule decongelate s-a efectuat fie in ciclu spontan, dupa o prealabila monitorizare a folicolului dominant corelat cu secretia de estradiol, a cresterii endometriale si a determinarilor peak-ului de LH, in vederea stabilirii momentului optim (ET se efectueaza de regula la 3 zile dupa detectarea peak-ului de LH). Pentru pacientele la care s-a considerat efectuarea unui ciclu substituit hormonal, s-au administrat preparate cu estrogen, in scopul pregatirii endometrului. O schema cuprinde administrarea de estradiol valerat (2 mg): 2 tablete/zi pentru zilele 3-6 de ciclu menstrual, apoi cresterea la 3 tablete/ zi pentru perioada zilelor 7-10, urmata de o noua ajustare a dozei la 4 tablete/zi din ziua 11 a ciclului menstrual. Doza de estrogen se adapteaza inainte de embriotransfer si se adauga progesteron intravaginal. Aceasta medicatie estro-progestativa se administreaza in continuare si dupa ET (in dozele stabilite de medic) si in cazul prezentei sarcinii – pana la 12 saptamani de amenoree. De obicei se asociaza si progesteron injectabil

224

(intramuscular-50 mg/zi) cu 2 zile anterior ET, care se continua de asemenea pana la determinarea testului de sarcina, respectiv pana la 12 saptamani de amenoree in cazul existentei sarcinii. Exista si alte scheme de pregatire hormonala a endometrului, ce cuprind fie stimulari cu gonadotropine (injectabil) sau chiar o supresie hipofizara prin administrarea din faza medioluteala a ciclului menstrual a unui agonist-GnRH. Cand s-a realizat supresia (verificata prin control ecografic si hormonal) se reduce doza de agonist-GnRH si se incepe o terapie de substitutie cu 2 mg/zi estradiol valerat (oral) timp de 6 zile, apoi se creste doza la 4 mg/zi alte 4 zile, cu o noua crestere la 6 mg/zi timp de 4 zile, ca apoi sa se reduca doza la 4 mg/zi din ziua a 14-a. Administrarea de progesteron decurge din ziua a 15-a si se dubleaza dupa ziua a 17-a. Embriotransferul se efectueaza in ziua 17 a ciclurilor stimulate [212].

225

Capitolul 5.5 Rezultatele dupa decongelarea celulelor crioconservate obtinute in urma ciclurilor cu agonisti-GnRH in cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata

a. Material si metoda In anul 1999 - 141 de paciente s-au prezentat pentru embriotransfer (ET) cu celule provenite din crioconservare (crio-ET). Varsta lor medie a fost de 34,531 ani, cu extremele de 44 si de 24 de ani, mediana – 35 ani si deviatia standard – 4,071. Numarul de paciente din anul 2000 a fost comparabil cu cel anterior (143 de paciente) si se remarca o usoara crestere in anul 2001 a numarului de paciente (160) care au solicitat embriotransfer cu celule decongelate provenite in urma ciclurilor FIV si ICSI anterior. Din tabelul de mai jos (Tabel 5.5.1) se poate constata o suprapunere a varstei pacientelor si in ceea ce priveste varsta medie, extremele varstelor pacientelor incluse in lotul de studiu precum si mediana (care este de 35 de ani in calculul pentru cei 3 ani insumati). Tabel 5.5.1 – Parametrul varsta in cazul pacientelor care au efectuat crio-ET An

Nr.

Varsta

Varsta

Varsta

Mediana

Deviatia

paciente

medie

maxima

minima

(ani)

standard

(ani)

(ani)

(ani)

1999

141

34,531

44

24

35

4,071

2000

143

33,993

43

22

34

4,030

2001

160

33,918

44

24

35

4,572

Total - 3

444

34,137

44

22

35

4,245

ani Embriotransferul a fost efectuat la paciente fie in ciclu spontan fie in ciclu stimulat hormonal (susbtituit). S-au efectuat in acest sens determinari hormonale serice, cu evaluarea parametrilor estradiol si LH pentru stabilirea momentului optim al ET.

226

In tabelul 5.5.2 sunt exemplificate valorile estradiolului seric (pg/ml) comparativ pentru fiecare an si, ulterior, pentru perioada celor 3 ani insumati. Tabel 5.5.2 – Valorile pentru estradiolul seric (pg/ml) in cazul crio-ciclurilor spontane si stimulate Estradiol

Valoare

Valoare

Valoare

Mediana

Deviatia

seric

medie

maxima

minima

1999

188,340

501

4

168

91,083

2000

327,615

750

24

303

140,269

2001

318,844

656

89

299

129,622

Total - 3

280,850

750

4

257

137,565

standard

(pg/ml) An

ani In acelasi sens s-a dozat si valoarea serica a LH-ului (Tabel 5.5.3). Tabel 5.5.3 – Determinarea LH-ului seric (mUI/ml) in cazul crio-ciclurilor spontane si stimulate LH seric

Valoare

Valoare

Valoare

Mediana

Deviatia

(mUI/ml)

medie

maxima

minima

1999

3,750

47

0,1

1,6

6,233

2000

18,764

70,5

0,2

14,2

15,339

2001

21,761

83,6

0,7

17

15,620

Total - 3

15,223

83,6

0,1

11,4

15,412

standard

An

ani b. Rezultate/ anul 1999

227

Din punctul de vedere al numarului de crio-cicluri, in anul 1999 au fost 14 crio-cicluri spontane si 116 crio-cicluri stimulate efectuate. In alte 11 cazuri la care s-a initiat tratamentul hormonal de pregatire a endometrului nu s-a putut realiza embriotransferul, deoarece la decongelare toate celulele au fost degenerate. Deci, totalul de crio-cicluri stimulate initiate a fost de 127. Din crio-ciclurile spontane in 9 cazuri (64,28%) celulele decongelate au provenit din FIV, in 4 cazuri (28,57%) au provenit din cicluri ICSI si in 1 caz (7,14%) din GIFT. In ciclurile de provenienta a celulelor congelate si ulterior decongelate s-au folosit protocoale cu agonisti si rFSH in 12 cazuri (85,71%), HMG la 1 pacienta (7,14%) si combinarea rFSH + HMG intr-o situatie (7,14%). Degenerarea celulara in cadul procesului de decongelare s-a constatat in 4 situatii (28,57%) (degenerare doar a unor celule cu 2 PN, astfel incat ET a fost realizabil). Aceste cazuri au avut celule crioconservate cu provenienta din cicluri anterioare FIV. La aceste cicluri FIV in protocoalele de stimulare s-a utilizat rFSH la 3 paciente si HMG la o pacienta. Referitor la crio-ciclurile substituite (stimulate hormonal), din cele 127 initiate, doar la 116 s-a realizat ET. Diferenta de 11 paciente o reprezinta cazurile la care in cadrul decongelarii au degenerat toate celulele, nemaipermitand ET. Din totalul de 127 de cazuri cu crio-cicluri substituite la un numar de 68 de cazuri (53,54%) celulele au provenit din cicluri anterioare FIV iar la 55 de cazuri (43,30%) – din cicluri anterioare ICSI. In 4 situatii (3,14%) nu sunt precizate protocoalele de stimulare si procedura tehnicii de reproducere asistata in cazul provenientei celulelor congelate. Analizand din protocoalele de stimulare de provenienta se constata ca s-au utilizat produsele de rFSH in 108 cazuri (85,03%), HMG in 6 cazuri (4,72%), FSH-HP in 4 cazuri (3,14%), rFSH+HMG : 4 cazuri (3,14%), rFSH+HMG+FSH-HP: 1 caz (0,78%). La 4 paciente nu sunt date despre protocoalele de stimulare (3,14%). Degenerarea celulara dupa decongelare a fost intalnita in 59 de cazuri (46,45%), din care in 39 de situatii celulele au provenit din cicluri FIV anterioare si in 19 situatii din cicluri ICSI anterioare. La 1 pacienta nu se precizeaza metoda de reproducere asistata utilizata. Protocoalele de stimulare au folosit in 49 de situatii rFSH, la 4 paciente – HMG, la 3 paciente rFSH+HMG, la 1 pacienta: FSH-HP, la 1 caz : rFSH+HMG+FSH-HP si 1 caz este neprecizat.

228

Observatii Din aceste date se observa pentru crio-ciclurile din anul 1999 o preponderenta a ciclurilor FIV si a rFSH utilizat in schemele de stimulare ovariana controlata. In total la crio-ciclurile din 1999 s-a constatat deteriorare celulara la decongelare in 63 de cazuri din cele 141 de paciente initiale, reprezentand un procent de 44,68%. c. Rezultate/ anul 2000 In anul 2000 s-au initiat un total de 143 de crio-cicluri. La 1 pacienta s-a interupt criociclul pe motivul cresterii insuficiente a endometrului, nefiind urmat de decongelare celulara. In alte 11 cazuri nu s-a efectuat ET din cauza degenerarii tuturor celulelor cu 2 PN decongelate. Un numar initial de 43 de paciente au solicitat ET in crio-ciclu spontan, doar la 41 de paciente s-a realizat ET iar in 2 situatii degenerarea celulara la decongelare nu a mai permis ET. Celulele crioconservate si decongelate au provenit in 23 de cazuri (53,48%) din cicluri anterioare FIV, in 19 situatii din cicluri anterioare ICSI (44,18%) si la 1 pacienta – din GIFT (2,32%). Protocoalele de stimulare ovariana controlata au inclus rFSH la 34 de paciente (79,06%), HMG la 7 paciente (16,27%) si rFSH+HMG in 2 cazuri (4,65%). In ceea ce priveste degenerarea celulara la decongelare (doar a unor celule sau a tututor celulelor), ea a fost intalnita in 18 situatii (41,86%); dintre acestea in 9 cazuri celulele au provenit din cicluri anterioare FIV si in 9 cazuri din cicluri anterioare ICSI. Pentru cazurile in care s-a intalnit deteriorare la decongelare s-a remarcat ca in 14 situatii s-a utilizat rFSH in stimularea pentru ciclurile de provenienta celulara, in 2 situatii – HMG si in 2 cazuri rFSH+HMG. Crio-ciclurile substituite hormonal au fost in total de 99, dar pe motivul deteriorarii tuturor celulelor in urma decongelarii numai la 90 de paciente s-a putut efectua ET. Ciclurile de provenienta au fost FIV in 57 de cazuri (57,57%), ICSI in 40 de situatii (40,40%) (din acestea 2 ICSI-TESE) si la 2 cazuri (2,02%) nu sunt precizate aceste date. Medicatia de stimulare ovariana controlata in aceste cicluri de provenienta a utilizat rFSH la 85 de paciente (85,85%), HMG la 9 paciente (9,09%), FSH-HP la 1 caz (1,01%) si rFSH +HMG la 2 paciente (2,02%). In alte 2 cazuri (2,02%) nu se specifica aceste date.

229

Din totalul de 99 de crio-cicluri substituite - la 55 de paciente (55,55%) s-a remarcat alterare celulara dupa decongelare. In aceste situatii celulele crioconservate au provenit in 30 de cazuri din cicluri FIV si in 25 de cazuri din cicluri ICSI. Dintre gonadotropinele folosite in stimularile ovariene din ciclurile de provenienta (urmate de alterare celulara la dezghetare) s-a folosit rFSH in 48 de cazuri, HMG la 5 paciente si rFSH+HMG la 2 paciente. Observatii Ca si pentru anul 1999, crio-ciclurile din anul 2000, atat cele spontane cat si substituite, au avut celule ce au provenit in majoritate din cicluri anterioare FIV iar rFSH a fost preferat in protocoalele de stimulare ovariana controlata. In ansamblu - la 73 de paciente (51,40%) din totalul de 142 de paciente cu crio-cicluri (am exclus acea pacienta la care s-a abandonat crio-ciclul pe motivul endometrului subtire) se constata deteriorare celulara in urma decongelarii. Degenerarea celulara se refera la o parte din celulele decongelate sau la intregul numar de celule dezghetate. d. Rezultate/ anul 2001 Pentru anul 2001 au fost incluse initial in lotul de studiu un numar de 160 de paciente, la care urma sa se efectueze ET cu celule decongelate, care au provenit din cicluri cu agonisti GnRH. Spre deosebire de grupul de paciente din anul 2000, nu au fost abandonari de crio-cicluri pe motiv al cresterii necorespunzatoare a endometrului. In total in 13 situatii nu s-a realizat embriotransferul pe motivul alterarii celulare integral la decongelare. Crio-ciclurile spontane au fost in numar de 60 (initiale) si 56 realizate efectiv (cu embriotransfer efectuat). La 4 paciente s-a constatat la decongelare o degradare a tututor celulelor. Din aceste paciente – in 35 de cazuri (58,33%) celulele au provenit din cicluri anterioare FIV si 25 (41,66%) din cicluri ICSI (dintre care 1 TESE). La aceste cicluri de provenienta s-au administrat in protocoalele de stimulare rFSH in 47 din cazuri (78,33%), HMG – 12 cazuri (20%) si rFSH+HMG in 1 situatie (1,66%). Degenerare la decongelare s-a constatat la 31 de cazuri (a uneia, mai multor sau a tuturor celulelor cu 2PN) si doar la 4 paciente nu s-a ajuns la finalitatea procedurii (adica la ET). Aceste 31 de cazuri de deteriorare celulara au provenit din 20 cicluri anterioare FIV si 11 cicluri

230

anterioare ICSI. S-a utilizat la aceste paciente in ciclul de stimulare rFSH in 27 de cazuri; HMG in 3 cazuri si rFSH+HMG la 1 pacienta. Numarul de crio-cicluri substituite hormonal a fost initial de 100, dar numai la 91 de paciente s-a finalizat prin ET. In 9 cazuri celulele alterate la decongelare nu au mai permis ET. Ciclurile de origine a celulelor congelate/decongelate au fost cicluri FIV la 67 de paciente (67%); cicluri ICSI la 30 de paciente (30%) (dintre care - 1 TESE) si in 3 cazuri – GIFT (3%). Ciclurile de origine au folosit ca schema de stimulare ovariana rFSH in 88 de situatii (88%), HMG in 10 cazuri (10%) si FSH-HP la 2 paciente (2%). In urma decongelarii celulelor cu 2PN s-a remarcat la 44 din cazuri prezenta deteriorarii a unora sau a tuturor celulelor, la 9 paciente din numarul total fiind alterare celulala in totalitate. Celulele degenerate au provenit din cicluri anterioare FIV in 27 de cazuri si ICSI in 17 cazuri; respective protocoalele de stimulare ovariana controlata au cuprins rFSH la 38 de paciente, HMG la 4 paciente si FSH-HP la 2 paciente. Observatii Efectuand calculul in ansamblu la cele 160 de paciente care au fost incluse in crio-cicluri (spontane si substituite hormonal) pentru anul 2001 se remarca ca la 75 dintre ele a fost prezenta deteriorare celulara la decongelare (a uneia sau mai multor celule cu 2PN), reprezentand un procent de 46,87%. Ca si in anii anteriori, ciclurile FIV de origine a celulelor crioconservate au predominat fata de ciclurile ICSI, iar GIFT s-a intalnit intr-un numar extrem de redus de paciente. Protocoalele de stimulare ovariana controlata pentru ciclurile de origine a celulelor crioconservate au utilizat rFSH in procent covarsitor.

231

Capitolul 5.6 Rezultatele dupa decongelare a celulelor crioconservate obtinute in urma ciclurilor cu antagonisti-GnRH in cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata

a. Material si metoda Am considerat acelasi mod de interpretare al rezultatelor pentru pacientele cu crio-cicluri, care au fost incluse in studiu pentru anii 1999-2000-2001, dar de aceasta data cu crio-ET efectuat cu celule crioconservate provenite din cicluri ce au avut in protocoalele lor antagonisti-GnRH. Ca si o observatie, numarul de paciente care au solicitat crio-ET a fost in continua crestere de la un an la altul, dar semnificativ in numar mai redus fata de crio-ciclurile cu celule crioconservate ce au provenit din cicluri anterioare si au utilizat in protocoalele lor agonistiGnRH. Numarul total de crio-cicluri din antagonisti-GnRH (reprezentat de 69 de paciente) este a sasea parte din numarul pacientelor cu crio-cicluri din agonisti-GnRH, fiind 444. Parametrul varsta (varsta medie, mediana, limitele extreme) este superpozabil in cele 2 tabele cu crio-cicluri (utilizand celule crioconservate din cicluri de origine cu agonisti-GnRH, respectiv antagonisti-GnRH) (Tabel 5.6.1). Tabel 5.6.1 – Parametrul varsta in cazul pacientelor care au efectuat crio-ET An

Nr.

Varsta

Varsta

Varsta

Mediana

Deviatia

paciente

medie

maxima

minima

(ani)

standard

(ani)

(ani)

(ani)

1999

17

34,058

40

24

35

4,534

2000

23

35,957

40

30

36

2,961

2001

29

33,655

42

27

33

3,647

Total - 3

69

34,521

42

24

35

3,771

ani

232

Ca si pentru crio-ciclurile cu celule originare din protocoale cu agonisti-GnRH, in cazul de fata am analizat si momentul optim de efectuare al ET (atat pentru crio-cicluri spontane cat si pentru cele substituite hormonal) prin prisma analizelor hormonale. Au fost incluse aici determinarile serice ale estradiolului (pg/ml) si a LH-ului (mUI/ml) (Tabel 5.6.2 si Tabel 5.6.3). Tabel 5.6.2 – Valorile pentru estradiolul seric (pg/ml) in cazul crio-ciclurilor spontane si stimulate Estradiol

Valoare

Valoare

Valoare

Mediana

Deviatia

seric

medie

maxima

minima

1999

246,812

568

97

189,5

145,514

2000

339

1038

145

227

215,018

2001

282,931

486

118

291

100,538

Total - 3

293,397

1038

97

258

159,452

standard

(pg/ml) An

ani Tabel 5.6.3 – Determinarea LH-ului seric (mUI/ml) in cazul crio-ciclurilor spontane si stimulate LH seric

Valoare

Valoare

Valoare

Mediana

Deviatia

(mUI/ml)

medie

maxima

minima

1999

4,293

21

0,1

1,7

6,230

2000

19,260

64,6

0,1

13,4

17,669

2001

27,517

231

2,3

18,5

41,176

Total - 3

19,260

231

0,1

13,2

30,046

standard

An

ani

233

b. Rezultate/ anul 1999 Crio-ciclurile din anul 1999 au fost in numar de 17, dintre care 1 caz crio-ciclu spontan si 15 cazuri de crio-cicluri substituite hormonal. La 1 pacienta s-a abandonat si nu s-a mai efectuat ET pe motivul cresterii insuficiente a endometrului, nu s-a mai produs nici decongelarea celulelor cu 2PN. La restul de 16 crio-cicluri initiate s-a reusit efectuarea ET, deci nu a existat alterarea tuturor celulelor dupa dezghetare. Crio-ciclul spontan a utilizat celule provenite din ciclu FIV anterior si folosind in schema sa de stimulare ovariana controlata rFSH, pe langa protocolul cu antagonist-GnRH. In acest criociclu nu s-a constatat degenerare celulara la decongelare. Crio-ciclurile substituite hormonal au avut celule crioconservate cu origine in cicluri FIV in 8 cazuri (53,33%) si cicluri ICSI in 7 cazuri (46,66%). Stimularea ovariana controlata in ciclurile de origine a folosit rFSH pentru 14 paciente (93,33%) si FSH-HP la 1 caz (6,66%). Din aceste crio-cicluri in 5 situatii a aparut degenerare celulara in urma dezghetarii si aceste celule au provenit din 3 cicluri FIV si 2 cicluri ICSI, respectiv gonadotropinele pentru stimularea ovariana au fost rFSH in 4 situatii si FSH-HP la 1 pacienta. Observatii Aceste date furnizeaza informatii despre “comportamentul” celulelor crioconservate la decongelare si ciclurile lor de provenienta, incercand o relationare intre substantele folosite in protocoalele de stimulare si modificarile ce apar in procesul dezghetarii. Ciclurile de provenienta majoritare au fost FIV si rFSH a fost preferata pentru stimularea ovariana controlata. La numarul total de 16 paciente (a fost exclusa pacienta la care s-a interupt crio-ciclul din cauza cresterii necorespunzatoare a endometrului) s-au constatat doar 5 cazuri de deteriorare celulara, care reprezinta un procent de 31,25%. c. Rezultate/ anul 2000 Anul 2000 a inregistrat un numar de 23 de paciente la care s-au initiat crio-cicluri, si anume la 8 paciente a fost vorba de crio-ciclu spontan; la 15 paciente – crio-ciclu substituit

234

hormonal si doar in 3 cazuri din total nu s-a realizat ET din cauza degradarii celulare integral dupa dezghetare. Cele 8 paciente la care s-a inceput crio-ciclul spontan au avut celulele cu origine in cicluri anterioare FIV in 2 cazuri (25%) si cicluri anterioare ICSI in 6 situatii (75%). Pentru aceste cicluri de origine s-au administrat gonadotropine de tipul rFSH la 6 paciente (75%) si rFSH+HMG la 2 paciente (25%). La 1 pacienta nu s-a efectuat ET (toate celulele degenerate), deci au fost doar 7 cazuri care s-au finalizat prin ET. Degenerarea celulara la decongelare s-a remarcat doar in 2 cazuri (unul fiind cu deteriorarea tuturor celulelor); acestea au provenit din ciclu FIV la 1 pacienta si din ciclu ICSI in celalalt caz, ambele situatii au avut in schema de stimulare ovariana rFSH. Pentru cele 15 cazuri de crio-cicluri substituite initiate s-au decongelat celule de provenienta din 12 (80%) cicluri FIV anterioare si 3 cicluri ICSI anterioare (20%). Toate cazurile au folosit in protocolul de stimulare ovariana controlata rFSH (100%). La decongelare s-a remarcat ca in 2 cazuri din 15 paciente s-au deteriorat toate celulele si nu s-a mai efectuat ET iar la alte 9 paciente a fost o alterare doar a unora din celulele dezghetate, deci in total au fost 13 ET. Prezenta degenerarii celulare s-a constatat la celule care au provenit din 9 cicluri FIV si 2 cicluri ICSI anterioare, toate ciclurile de stimulare ovariana au avut in schema lor rFSH. Observatii Calculand in ansamblu din cele 23 de paciente care au fost incluse in studiul criociclurilor, la 13 dintre ele s-a intalnit degradare celulara in cadrul dezghetarii, reprezentand un procent de 56,52%. Aceste celule au provenit din 10 cicluri FIV anterioare si 3 cicluri ICSI anterioare. Deci, si pentru anul 2000, ciclurile de provenienta majoritare au fost cele FIV si gonadotropina cea mai des uzitata din cadrul stimularii a fost rFSH. d. Rezultate/ anul 2001 Pentru anul 2001 numarul de paciente a caror rezultate au fost luate in calcul a fost de 29. Din acest total de 29 crio-cicluri initiate, doar in 3 situatii nu s-a finalizat prin ET datorita degradarii celulare complete prin decongelare.

235

Crio-ciclurile spontane initiate au fost in numar de 9 si doar 8 realizate (1 caz cu degenerare celulara totala la decongelare). Celulele dezghetate au fost cu origine din 4 cicluri FIV anterioare (44,44%) si 5 cicluri anterioare ICSI (55,55%), iar gonadotropinele din protocolul de stimulare au fost rFSH la 6 paciente (66,66%) si HMG in 3 situatii (33,33%). Degenerare celulara (totala sau partiala) prin decongelare s-a intalnit in aceste crio-cicluri in 4 cazuri; 3 fiind cu celule de origine din cicluri FIV si 1 caz – ciclu anterior ICSI. Gonadotropinele din protocoalele de stimulare au fost rFSH pentru 3 paciente si HMG pentru 1 pacienta. Crio-ciclurile substituite hormonal s-au aplicat la 20 de paciente, doar 18 s-au finalizat cu ET. Celulele crioconservate au provenit din 10 cicluri FIV anterioare (50%) si 10 cicluri ICSI anterioare (50%) (din care 1 TESE). Protocoalele din ciclurile de stimulare au fost cu antagonisti-GnRH si rFSH pentru toate cele 20 de paciente (100%). Prin decongelare s-a produs alterarea unora dintre celule sau a tuturor in 11 cazuri; celule care au provenit din 6 cicluri FIV anterioare si 5 cicluri ICSI anterioare. La toate aceste 11 paciente schemele de stimulare ovariana au administrat rFSH. Observatii Calculul degenerarii celulare (partial sau complet) prin dezghetare la toate cele 29 de paciente cu crio-cicluri/ anul 2001 este de 15 cazuri, semnificand un procent de 51,72%. Celulele crioconservate au fost cu origine majoritatea in cicluri anterioare FIV si rFSH a fost administrat preponderent pentru stimularea ovariana.

236

Capitolul 5.7 Discutii crioconservare

Schematizand intr-un tabel (Tabel 5.7.1) datele procentuale ale deteriorarii celulare in urma procedeului de decongelare a celulelor in functie de substantele administrate in protocoalele de origine, respectiv agonisti-GnRH versus antagonisti-GnRH, se obtin urmatoarele rezultate: Tabel 5.7.1 – Alterarea celulara prin decongelare (exprimata procentual) in functie de agonistGnRH versus antagonist-GnRH An

Degradare celulara

Substanta din protocolul de origine Agonist-GnRH

Antagonist-GnRH

1999

44,68

31,25

2000

51,40

56,52

2001

46,87

51,72

(%)

Analiza acestui tabel reda comparativ pentru cei 3 ani procentul constatat dupa dezghetare a celulelor crioconservate degradate si se observa ca nu exista discrepante majore intre aceste date. In anul 1999 procentul crio-ciclurilor cu agonisti-GnRH in ciclurile de origine a celulelor este ceva mai crescut decat pentru ciclurile cu antagonisti-GnRH. O explicatie se poate gasi si prin faptul ca in 1999 s-a inregistrat cel mai mic numar de paciente cu criocicluri/antagonisti-GnRH din intregul lot studiat. Pentru urmatorii 2 ani insa criociclurile/antagonisti-GnRH inregistreaza un procent usor crescut fata de crio-ciclurile/agonistiGnRH. In cadrul aceleiasi clase de substante administrate in protocoalele de origine (atat pentru agonisti cat si pentru antagonisti) se remarca ca in anul 2001 apare o scadere a procentului de alterare prin decongelare.

237

Am calculat rata de supravietuire celulara la decongelare pe perioada celor 3 ani insumati, atat pentru crio-ciclurile care au provenite din protocoale anterioare cu agonisti-GnRH, respectiv cu antagonisti-GnRH. Supravietuire celulara la decongelare/ crio-cicluri cu protocoale anterioare cu agonisti-GnRH: 67,82% Supravietuire celulara la decongelare/ crio-cicluri cu protocoale anterioare cu antagonisti-GnRH: 67,04%. Cele doua rezultate sunt similare! Rezultatele arata ca in cazul crioconservarii efectele de degradare asupra celulelor sunt strict dependente de procesele de congelare/ decongelare, iar analogul GnRH ( agonistiiGnRH sau antagonistii-GnRH) din protocoalele de origine a celulelor nu are nici o influenta asupra calitatii celulelor.

238

Capitolul 5.8 Concluzii crioconservare

Rezultatul final al acestor crio-cicluri (spontane sau substituite hormonal) il reprezinta de fapt obtinerea unei sarcini. O problematica a acestei teze de doctorat o alcatuieste intrebarea referitoare la influenta agonistilor-GnRH versus antagonisti-GnRH asupra calitatii celulare (a celulelor crioconservate), si in special la degradarea acestora in urma decongelarii, la care se adauga deteriorarea prin procesul dezghetarii per se. Voi reda comparativ numarul de sarcini obtinute in urma decongelarii celulelor crioconservate din cicluri de origine ce au cuprins in protocoalele lor agonisti-GnRH sau antagonisti-GnRH, cu referiri si asupra tehnicilor de reproducere asistata si a gonadotropinelor administrate in stimularea ovariana (Tabel 5.8.1 si Tabel 5.8.2). Sarcini /crio-cicluri care au provenit din protocoale cu agonisti-GnRH In anul 1999 s-au obtinut din crio-cicluri un numar total de 16 sarcini, dintre care 5 au fost avorturi spontane; 2 sarcini extrauterine si 9 s-au finalizat prin nasteri. Din sarcinile avortate – 1 a fost o sarcina tripla. Din sarcinile care au evoluat pana la nastere – 1 sarcina a fost gemelara, 1 sarcina a prezentat malformatie fetala si la 1 pacienta (sarcina gemelara) s-a depistat la unul dintre feti cu trisomie 21 (s-a efectuat embrioreductie la acel produs de conceptie si s-a nascut un copil normal). Numarul de sarcini din anul 2000 a fost de 18; dintre care 3 avorturi spontane, 1 sarcina extrauterina, 14 nasteri (dintre care 3 gemelare). Doar la 1 nou-nascut s-a descris o malformatie izolata (keilognatoskizis). In anul 2001 s-au inregistrat un numar de 34 de sarcini, evolutia lor fiind distribuita astfel: 8 sarcini biochimice, 7 avorturi spontane (1 avort gemelar), 19 nasteri (dintre care 4 gemelare, 1 tripla).

239

O scurta analiza a acestor date releva faptul ca numarul de sarcini a fost in continua crestere de la un an la altul si ciclurile FIV de origine a celulelor crioconservate au fost egale intr-un an si in rest mai numeroase fata de ciclurile ICSI. Dintre gonadotropinele administrate in stimulare s-a preferat rFSH; restul tipurilor de gonadotropine au fost in numar comparabil. Tabel 5.8.1 – Numarul de sarcini din crio-cicluri/ agonisti-GnRH An

1999

2000

2001

Nr. crio-cicluri

141

144 (143)

160

16 (11,34%)

18 (12,58%)

34 (21,25%)

Crio spontan

1

2

12

Crio substituit

15

15

22

Neprecizat

0

1

0

FIV

8 (5,67%)

11 (7,69%)

24 (15%)

ICSI

8 (5,67%)

6 (4,19%)

10 (6,25%)

0

1 (0,69%)

0

RFSH

14

17

30

FSH-HP

2

0

1

HMG

0

0

3

Neprecizat

0

1

0

Nr. sarcini

Neprecizat Tip gonadotropina

Sarcini / crio-cicluri care au provenit din protocoale cu antagonisti-GnRH Pentru anul 1999 la cele 17 paciente din lotul de studiu s-a obtinut un numar de 2 sarcini, din acestea 1 a fost biochimica si la celalalt caz s-a inregistrat un avort spontan. Anul 2000 inregistreaza la cele 23 de paciente incluse in studiu, la care s-au efectuat ET cu celule crioconservate provenite din cicluri cu antagonisti-GnRH in protocoalele de origine, un numar de 6 sarcini. Evolutia acestora a fost de 3 avorturi spontane si 3 nasteri (cu feti unici).

240

In anul urmator – 2001 – la cele 29 de crio-cicluri initiate s-a obtinut un numar de 7 sarcini; dintre acestea 2 au fost avorturi spontane si 5 s-au finalizat prin nastere (1 nastere gemelara).

Tabel 5.8.2 – Numarul de sarcini din crio-cicluri/ antagonisti-GnRH An

1999

2000

2001

17

23

29

2 (11,76%)

6 (26,08%)

7 (24,13%)

Crio spontan

0

2

2

Crio substituit

2

4

5

FIV

1 (5,88%)

4 (17,39%)

3 (10,34%)

ICSI

1 (5,88%)

2 (8,69%)

4 (13,79%)

RFSH

1

6

5

FSH-HP

1

0

0

HMG

0

0

2

Nr. crio-cicluri Nr. sarcini

Tip gonadotropina

Ca si pentru crio-ciclurile cu celule de provenienta din protocoale cu agonisti-GnRH, in acest tabel ce analizeaza datele din crio-cicluri/ antagonisti-GnRH se remarca ca numarul de sarcini este in crestere de la un an la altul, dar numarul lor este mai mic comparativ cu acelasi an si cu crio-ciclurile/ agonisti-GnRH. Pentru procedurile de reproducere asistata aplicate nu se poate trage o concluzie, deoarece variaza de la un an la altul si in sensul cresterii si al scaderii numarului tehnicilor FIV fata de ICSI. Totusi rFSH din medicatia de stimulare ovariana este mai des administrata fata de celelalte gonadotropine. Figura 5.8.1 ilustreaza comparativ numarul sarcinilor obtinute in urma crio-ciclurilor care au folosit celule crioconservate cu provenienta din cicluri cu agonisti-GnRH fata de cele cu antagonisti-GnRH. 241

35 30 25 20 15

34 16

10

7

18 6

2

5 0

1999

2000

2001

Nr sarcini criocicluri/agonisti-GnRH Nr sarcini criocicluri/antagonisti-GnRH Fig. 5.8.1 - Numarul sarcinilor din crio-cicluri cu agonisti-GnRH versus antagonisti-GnRH Este evident ca din cele exemplificate numarul sarcinilor obtinute folosind celule crioconservate din cicluri anterioare cu agonisti-GnRH in schema de stimulare il depaseste pe cel utilizand celule crioconservate cu originea din cicluri cu antagonisti-GnRH. Totusi trebuie facut si comentariul referitor la numarul pacientelor carora li s-a administrat agonist-GnRH si de asemenea este mai mare fata de lotul pacientelor cu antagonisti-GnRH. Importanta este rata sarcinilor/crio-ciclu; rata sarcinilor/ET si „baby take home rate”. Am ilustrat comparativ numarul de sarcini raportat la numarul de crio-cicluri pentru pacientele la care s-au administrat agonisti-GnRH (Tabel 5.8.3), respectiv antagonisti-GnRH (Tabel 5.8.4) in ciclurile de origine ale celulelor crioconservate. Baby take home rate repezinta numarul de copii nascuti vii raportat la numarul de crioET efectuate.

242

Tabel 5.8.3 – Rata sarcinilor crio-cicluri/ agonisti-GnRH An

Nr. crio-

ET

Nr. total

Sarcini/

Sarcini/

Baby

cicluri (din

realizat

sarcini

crio-cicluri

ET

take

(%)

(%)

home

agonistiGnRH)

rate (%)

1999

141

130

16

11,34 %

12,30%

7,69

2000

143

131

18

12,58%

13,74%

12,97

2001

160

147

34

21,25%

23,12%

17,00

Tabel 5.8.4 – Rata sarcinilor crio-cicluri/ antagonisti-GnRH An

Nr. crio-

ET

Nr. total

Sarcini/

Sarcini/

Baby

cicluri (din

realizat

sarcini

crio-cicluri

ET

take

(%)

(%)

home

antagonistiGnRH)

rate (%)

1999

17

16

2

11,76%

12,50%

0

2000

23

20

6

26,08%

30,00%

15

2001

29

26

7

24,13%

26,92%

23,07

Un alt parametru este compararea efectuata intre rezultatele (numarul de sarcini) obtinute in urma ciclurilor de stimulare ce au utilizat analog-GnRH in schema lor si celule crioconservate provenite din cicluri anterioare cu analogi-GnRH. Comparatia se realizeaza in cadrul aceluiasi tip de substanta – agonist sau antagonist-GnRH. Tabelul 5.8.5 ilustreaza procentual rata sarcinilor/ciclu de stimulare respectiv rata sarcinilor/crio-cicluri din protocoale de stimulare ce au in schema lor agonisti-GnRH si din crio-cicluri cu provenienta celulara in cicluri anterioare cu agonist-GnRH. Aceleasi date obtinute sunt redate (tot procentual) referitor la rata sarcinilor/ET cu embrioni proaspeti si cu embrioni proveniti din celule cu 2PN decongelate si baby take home

243

rate. Tabelul 5.8.6 cuprinde aceleasi comparatii dar efectuate in cadrul clasei antagonistilorGnRH. Tabel 5.8.5 – Rezultate comparative intre protocoale de stimulare cu agonisti-GnRH si criocicluri/ agonisti-GnRH Agonisti-GnRH

Crio-cicluri cu protocoale anterioare cu agonistiGnRH

Rata sarcinilor/cicluri

21,51%

15,31%

Rata sarcinilor/ET

25,68%

16,66%

Baby take home rate

13,82%.

12,74%

Tabel 5.8.6 – Rezultate comparative intre protocoale de stimulare cu antagonisti-GnRH si criocicluri/ antagonisti-GnRH Antagonisti-GnRH

Crio-cicluri cu protocoale anterioare cu antagonistiGnRH

Rata sarcinilor/cicluri

11,40%

21,73%

Rata sarcinilor/ET

12,78%

24,19%

Baby take home rate

7,38%

14,51%

Similar cu rezultatele din studiile publicate, numarul de sarcini obtinute folosind embrioni proaspeti este mai mare fata de cele ce au utilizat embrioni proveniti din celule cu 2PN criocongelate. Acest rezultat este valabil in cadrul clasei agonistilor-GnRH. Asa cum am remarcat in urma rezultatelor procentuale ale supravietuirii celulare la decongelare, agonistii- si antagonistii-GnRH nu au influente diferite asupra calitatii celulare si efectele fizice din cadrul congelarii/ decongelarii sunt cele care dicteaza rata de supravietuire. Datele obtinute in cazul antagonistilor-GnRH nu sunt in acelasi sens, situatie in care criociclurile dovedesc o rata mai buna a sarcinilor cu celule crioconservate (valori de 2 ori mai mari fata de ciclurile initiale de stimulare !). Acest fapt poate fi interpretat si prin prisma unui numar mult mai mic al ciclurilor cu antagonisti care au fost efectuate - atat protocoalele de stimulare cu

244

antagonisti cat si crio-ciclurile care au provenit din aceste protocoale au fost mult mai reduse ca numar fata de cele cu agonisti-GnRH. Analiza statistica (utilizand acelasi model aplicat si pentru calculele anterioare) evidentiaza faptul ca ET cu celule crioconservate se repercuta negativ asupra ratei sarcinilor, fiind un parametru semnificativ statistic, cu valoarea lui p < 0,0001. Analysis Of Initial Parameter Estimates

Parameter

DF

Estimate

Standard Error

kryo Embrtran Scale

1 1 0

-1.0334 0.7522 1.0000

0.3977 0.1276 0.0000

Wald 95% Confidence Limits

-1.8128 0.5020 1.0000

ChiSquare

Pr > ChiSq

6.75 34.74

0.0094 <.0001

-0.2540 1.0023 1.0000

Analysis Of GEE Parameter Estimates Empirical Standard Error Estimates

Parameter Estimate

kryo Embrtran

-1.0332 0.7517

Standard Error

0.4072 0.1052

95% Confidence Limits

-1.8314 0.5455

245

-0.2351 0.9578

Z Pr > |Z|

-2.54 7.15

0.0112 <.0001

Capitolul 6 Concluzii generale 1.

Analogii-GnRH ca substante derivate din structura hormonului hipotalamic GnRH si-au

gasit aplicabilitatea si in reproducerea umana asistata. Introducerea acestor substante in protocoalele de stimulare ovariana controlata au imbunatatit considerabil rezultatele tehnicilor reproducerii asistate prin efectul lor de supresie hipofizara, astfel evitatandu-se ovulatiile necontrolate. 2.

Sinteza agonistilor-GnRH (prin inlocuirea cel mai frecvent a 2 aminoacizi din pozitiile 6

si 10 ale decapeptidul moleculei native de GnRH) a fost urmarea fireasca a descoperirii structurii si a sintezei hormonului. In schimb, pentru sinteza antagonistilor-GnRH (in sensul unor substante cu efecte secundare minime si cu un profil farmacocinetic sigur) a fost necesara o perioada de aproape 30 de ani. Astfel, pentru agonistii-GnRH exista o experienta de utilizare mai bogata comparativ cu antagonistii-GnRH. 3.

Substantele agoniste au fost concepute pentru a determina o stimulare hipofizara mai

accentuata, respectiv a antagonistului pentru a exercita un efect inhibitor asupra hipofizei (« hipofizectomie » medicamentoasa) si astfel asupra secretiei gonadotropilor. S-a constatat insa ca in cazul administrarii continue a agonistului-GnRH, dupa o faza initiala de stimulare hipofizara (efectul de ″flare-up″), se obtine un efect supresiv hipofizar. Aceste efecte ale analogilor-GnRH au fost exploatate in cadrul protocoalelor de stimulare ovariana controlata din tehnicile reproducerii asistate. Schemele cu antagonisti-GnRH insa implica o durata mai redusa a protocolului si prin urmare si costuri mai scazute ale medicatiei de stimulare administrate. 4.

Motivele pentru care introducerea antagonistului-GnRH in protocoalele reproducerii

asistate nu a reusit sa devanseze rezultatele (rata sarcinilor) obtinute in urma aplicarii agonistilorGnRH nu sunt pe deplin cunoscute si se efectueaza cercetari care incearca gasirea unor explicatii (vezi efectele asupra hormonilor sexuali, IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, IGFBP-4 si PAPP-A). 5.

Faptul ca antagonistul-GnRH presupune o durata de stimulare ovariana mai scurta si doza

totala a medicatiei gonadotropinice este mai redusa, poate avea efecte asupra numarului de ovocite recoltate si deci si a embrionilor obtinuti (posibil uneori mai scazut in cazul antagonistilor-GnRH fata de agonisti-GnRH).

246

6.

Din studiul efectuat pe cei 3 ani pentru pacientele care au parcurs cicluri de stimulare

ovariana in cadrul protocoalelor cu agonisti-GnRH si cu antagonisti-GnRH reiese ca varsta pacientei este un parametru important. Fiecare an in plus scade probabilitatea obtinerii unei sarcini care se finalizeaza prin nastere. Parametrul varsta este semnificativ statistic. 7.

Distributia pacientelor in functie de varsta la grupul cu agonisti-GnRH este comparabila

(in urma analizei statistice) cu varsta pacientelor din lotul cu antagonisti-GnRH. Se remarca in general o preponderenta a pacientelor cu varsta situata peste 35 de ani, usor mai crescut in grupul cu antagonisti-GnRH (41,61% versus 35,81%). Aceasta diferenta se poate explica prin faptul ca pacientele au apelat initial la protocoale cu agonisti-GnRH. Esecul reproductiv sau alta indicatie au condus la cea de-a 2-a optiune terapeutica (protocoalele cu antagonisti-GnRH). 8.

Gonadotropinele utilizate in medicatia de stimulare ovariana controlata au fost rFSH,

HMG, FSH-HP sau combinarea a 2 sau chiar 3 dintre ele. Pentru amandoua tipurile de analogiGnRH a predominat in protocoalele de stimulare rFSH, urmat de HMG (procente comparabile), nefiind inregistrate date semnificative statistic. 9.

Este cunoscut in literatura faptul ca protocoalele cu antagonisti-GnRH au o durata mai

scurta si ca gonadotropinele utilizate in stimulare se administreaza in doza totala mai mica comparativ cu schemele cu agonisti-GnRH. Aceleasi concluzii se desprind si din studiul actual, insa se considera ca diferentele dintre durata totala a stimularii si cantitatea totala a gonadotropinelor nu au repercusiuni asupra succesului (nasterea), neavand influenta semnificativa statistic. 10.

In cadrul lotului de paciente cu antagonist-GnRH am remarcat o supresie hipofizara

insuficienta pentru protocolul francez, adica in cazul administrarii unei doze unice de antagonist. Astfel ca pentru actualul studiu se considera ca rezultate mai bune se obtin printr-o administrare repetitiva a antagonistului-GnRH, ca si in protocolul Lübeck. 11.

Valorile medii ale estradiolului seric in cazul pacientelor ce li s-a administrat agonist-

GnRH sunt cu aproximativ 500 pg/ml mai crescute fata de pacientele din lotul cu antagonistGnRH, aspect care se coreleaza cu durata de stimulare gonadotropinica mai lunga. Nu este inca clar definit daca valoarea estradiolului seric are impact covarsitor asupra ratei obtinerii sarcinilor. De altfel nici incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana nu se coreleaza intotdeauna cu valori mari ale estradiolului seric. Datele analizei actuale se suprapun peste datele din literatura.

247

12.

Monitorizarea serica a LH-ului este utila in depistarea cresterii premature a LH-ului.

Pentru studiul de fata protocoalele cu agonisti-GnRH au avut in 0,48% din cazuri valori ale LH >10 UI/l, iar pentru antagonisti-GnRH procentul a fost de 2,68%. Conform studiilor se considera pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH ca realizarea supresiei hipofizare marcate in ziua a 8-a de stimulare se insoteste de o rata mai mare a sarcinilor si de evolutivitate a acesteia. Pentru valori ale LH-ului < 0,5 UI/l in ziua a 8-a de stimulare se constata cea mai mare rata de implantare si apoi de sarcina in evolutie 13.

Frecventa aparitiei sindromului de hiperstimulare ovariana este similara pentru cele 2

tipuri de substante: 3,48% in cazul agonistilor versus 3,35% pentru antagonisti-GnRH, amandoua protocoalele au utilizat HCG pentru inducerea ovulatiei. 14.

Numarul folicolilor dominanti nu a variat semnificativ in cadrul celor 2 loturi de

paciente; in cazul agonistilor-GnRH numarul mediu si mediana folicolilor dominate au fost 3,80 si 4 comparativ cu 3,93 si 3 pentru antagonisti-GnRH. 15.

Calculul statistic referitor la cele 2 tehnici aplicate in cadrul reproducerii asistate: FIV si

ICSI pentru lotul de paciente arata ca metoda ICSI a inregistrat un succes mai redus, dar acest parametru nu este semnificativ statistic. O posibila explicatie a succesului mai mic in cazul ICSI fata de metoda FIV se poate datora indicatiilor procedurii ICSI - in caz de esec reproductiv prin FIV, infertilitate idiopatica, factor masculin cu afectare severa. Toate aceste situatii se insotesc obisnuit si frecvent de rate scazute de fertilizare. 16.

Analiza cazurilor releva ca numarul de cicluri ICSI a crescut de la un an la altul, dar

acestea raman totusi mai putine fata de FIV conventionala. 17.

Tehnicile de reproducere asistata au avut aproximativ aceeasi distributie procentuala

pentru succesul ciclurilor de stimulare (obtinerea sarcinilor), indiferent de analogul-GnRH administrat (FIV/ET : 65,92% pentru agonist versus 70,58% pentru antagonist ; respectiv ICSI : 34,07% din protocoale cu agonist versus 29,41% din protocoale cu antagonist). 18.

Punctiile foliculare s-au insotit de un numar mediu al ovocitelor, comparabil intre cele 2

tipuri de protocoale (agonisti- si antagonisti-GnRH). Este deosebit de importanta concluzia desprinsa din aceasta analiza, si anume ca protocolul cu antagonisti-GnRH nu influenteaza in sens negativ numarul si calitatea ovocitelor recoltate/punctie foliculara. 19.

In urma fecundarii, numarul de celule cu 2PN arata aceleasi rezultate in cadrul

protocoalelor cu agonisti-GnRH, cat si cu antagonisti-GnRH. Astfel incat se deduce ca

248

antagonistul nu are efecte nefavorabile asupra procesului de fecundare, acesta depinzand de multipli factori. 20.

Embriotransferul s-a efectuat la lotul de paciente cu un numar intre 1 si maxim de 3

embrioni. Pentru fiecare embrion in plus transferat se creste semnificativ statistic probabilitatea obtinerii unei sarcini. 21.

Repetarea ciclurilor de stimulare ovariana controlata la aceeasi pacienta a condus la

concluzia ca a 2-a incercare are o rata de succes mai mica decat prima si la o a 3-a incercare sansa de succes creste usor. Avand in vedere ca nu toate pacientele au parcurs acelasi numar de cicluri de stimulare si nu exista in acest sens un model unitar, nu se poate considera semnificativa statistic aceasta corelatie. Totusi este de remarcat aceasta diferenta fata de datele furnizate de grupul Norfolk care arata o crestere a probabilitatii succesului de la primul la cel deal saselea ciclu pentru aceeasi pacienta (pag. 59). 22.

Din compararea rezultatelor obtinute in urma administrarii agonistilor-GnRH si a

antagonistilor-GnRH in cadrul protocoalelor de stimulare ovariana, rezultate care se refera la rata sarcinilor/cicluri; rata sarcinilor/punctie; rata sarcinilor/ET; rata implantarii si baby take home rate, se remarca ca pentru toti acesti parametri valorile procentuale sunt mai crescute in cazul agonistilor-GnRH. Aceste rezultate se inscriu in statisticile internationale si au semnificatia unui impact mai bun al agonistului-GnRH asupra succesului (obtinerea sarcinii si finalizarea prin nastere). 23.

O analiza comparativa a protocoalelor cu agonist-GnRH si antagonist-GnRH din cadrul

acestui studiu releva faptul ca antagonistul-GnRH are totusi efect negativ asupra succesului si este considerat semnificativ statistic, cu valoarea lui « p » putin peste limita 0,05. 24.

Daca se considera ca standardul pentru succesul in cadrul reproducerii asistate este

nasterea unui singur copil viu si sanatos/ciclu FIV initiat (BESST : Birth Emphasizing a Successful Singleton at Term) [191] – atunci pentru grupul cu agonist-GnRH rezultatul este de 10,94% si pentru pacientele la care s-a aplicat protocolul cu antagonist - de 5,37%. Comparativ cu o statistica pe anul 2001 a Centrului de Fertilizare in Vitro Monash – Australia, valoarea obtinuta pentru agonist-GnRH se apropie de datele din literatura. 25.

Incidenta anomaliilor constatate la studiul de fata este de 3,35% pentru sarcinile obtinute

din protocoalele cu agonist-GnRH si de 5,88% in cazul protocoalelor cu antagonist-GnRH. In interpretarea acestor procente intra si varsta pacientelor ( in 3 cazuri > 35 de ani), prezenta

249

sarcinii multiple si foarte dificil de estimat – tipul procedurii aplicate (in cazul ICSI). Valorile procentuale ale incidentei anomaliilor se incadreaza intre limitele din literatura de specialitate. 26.

Reversibilitatea rapida a functiei hipofizei dupa oprirea medicatiei antagoniste lasa loc

altor posibilitati terapeutice, care sa scada riscul sindromului de hiperstimulare ovariana. Astfel ca o alta aplicatie a agonistului-GnRH se refera la declansarea ovulatiei in loc de HCG, in cazul protocoalelor de stimulare ovariana controlata in care s-a utilizat antagonist-GnRH pentru supresia hipofizara [215]. S-a remarcat un numar mai mare de ovocite de metafaza II [216], insa rata sarcinilor in evolutie a fost mai scazuta si rata avorturilor mai crescuta in cazul utilizarii agonistului-GnRH fata de HCG ca inductor al ovulatiei [217], [218] din aceste protocoale cu antagonist-GnRH. Explicatia poate fi data de un defect de faza luteala in cazul agonistului-GnRH comparativ cu HCG. Un avantaj al declansarii ovulatiei cu agonist-GnRH fata de terapia standard cu HCG se remarca prin scaderea incidentei sindromului de hiperstimulare ovariana [215], dar dupa alti autori nu se poate stabili inca o concluzie clara [217]. 27.

Mecanismele intime, la nivel de procese intracelulare, prin studierea concentratiei

hormonilor sexuali (estradiol, progesteron si testosteron) din lichidul intrafolicular si a raportului acestora, au menirea de-a stabili daca exista un efect semnificativ al agonistului- sau antagonistului-GnRH asupra secretiei steroizilor in vivo. S-au gasit diferente semnificative statistic in cazul concentratiei medii a E2 folicular, ca fiind mai scazut la pacientele tratate cu antagonist-GnRH si corelat cu valoarea medie serica a E2 la aceleasi paciente. Nu s-au gasit diferente semnificative ale concentratiei progesteronului folicular iar testosteronul folicular a fost in concentratii similare. Raportul E2/ testosteron folicular a fost scazut la lotul tratat cu antagonist-GnRH. Nu au fost diferente referitor la raportul progesteron/ testosteron si E2/ progesteron la cele 2 grupuri de substante. Este cunoscut efectul nefavorabil al mediului androgenic intrafolicular in cadrul dezvoltarii foliculare si se stabileste astfel ca terapia cu antagonist-GnRH in cadrul stimularii ovariene are un efect important asupra steroidogenezei foliculare [213]. 28.

Alte studii se preocupa de efectele IGF (Insulin-like growth factors) si proteinele lor de

legare (IGFBP), care au rol major in reglarea autocrina si paracrina a foliculogenezei. Se compara concentratiile din lichidul folicular a IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, IGFBP-4 si PAPP-A (pregnancy-associated plasma protein) si raporturile dintre acestea in scopul de-a gasi o diferenta in concentratiile acestor substante in cadrul protocoalelor cu agonist- si cu antagonist-GnRH din

250

stimularea ovariana controlata. Rezultatele au aratat ca durata stimularii ovariene a fost semnificativ mai lunga, doza de gonadotropine, concentratia serica de E2, precum si numarul de ovocite recoltate au fost mai crescute in grupul cu agonisti-GnRH (long protocol). Concentratiile din lichidul folicular pentru IGF-II si IGFBP-4 au fost semnificativ mai crescute si raportul: IGFI/ IGFBP-4 a fost semnificativ mai scazut in grupul cu agonisti-GnRH (long protocol). Valoarea E2 seric/ folicol matur nu a diferit pentru cele 2 substante. Se concluzioneaza ca exista diferente in mediul intrafolicular in ciclurile cu agonist-GnRH fata de antagonist-GnRH, dar totusi nu sau semnalat diferente in rezultatele clinice [214]. 29.

Aceste studii dovedesc ca fiecare substanta are avantaje si dezavantaje si nici una nu o

poate inlocui pe cealalta, astfel incat raman inca multe raspunsuri de gasit inainte de-a inclina balanta spre terapia cu agonist-GnRH sau cu antagonist-GnRH. Este util de-a adapta fiecare situatie in functie de particularitatea cazului, de-a folosi diferentiat cele 2 substante, cu ajustare optima in cadrul protocoalelor FIV. 30.

Introducerea crioconservarii in cadrul reproducerii asistate aduce un plus de avantaje prin

existenta mai multor ovocite sau embrioni /ciclu stimulare; prin evitarea unei noi stimulari si reducerea costului acesteia; creste rata sarcinii / pacienta / punctie (sau /ciclu) si permite evitarea sindromului de hiperstimulare ovariana. 31.

Evaluarea procentuala a supravietuirii celulare dupa decongelare arata ca agonistii-GnRH

si antagonistii-GnRH utilizati in ciclurile de origine a celulelor nu influenteaza acest parametru. Deteriorarea celulara este dependenta de efectele fizice din cadrul procesului de dezghetare si analogii-GnRH nu influenteaza negativ crioconservarea. 32.

Compararea procentuala a sarcinilor rezultate prin ET cu embrioni proaspeti versus celule

crioconservate denota faptul ca in cazul agonistilor-GnRH rata sarcinilor cu embrioni proaspeti este superioara celei cu celule congelate/ decongelate. Pentru antagonisti-GnRH, situatia este oarecum contradictorie, in sensul ca ET cu embrioni proaspeti are valori mai mici fata de rata sarcinilor cu celule crioconservate. Inclusiv in compararea ratelor sarcinilor prin ET cu celule crioconservate intre agonisti si antagonisti, balanta procentuala inclina in favoarea antagonistilor. Acest rezultat se poate interpreta in contextul unui numar mult mai redus al ciclurilor de stimulare cu protocoale cu antagonisti-GnRH fata de agonisti si a numarului de crio-cicluri din antagonisti (numarul ciclurilor si al crio-ciclurilor ce au folosit protocoale cu antagonisti de

251

GnRH pot fi un esantion nereprezentativ statistic). Se impun studii ulterioare care sa verifice aceste ultime rezultate. 33.

Analiza statistica evidentiaza faptul ca ET cu celule crioconservate se repercuta negativ

asupra ratei sarcinilor, fiind un parametru semnificativ statistic, cu valoarea lui p < 0,0001.

252

BIBLIOGRAFIE 1. Nauta WJH, Haymaker W, (1969) Hypothalamic nuclei and fiber connections in Haymaker W, Anderson E, Nauta WJH (eds); The Hypothalamus, Charles C Thomas Publisher: 136-209 2. Carmel PW, Araki S, Ferin M (1976) Pituitary stalk portal blood collection in rhesus monkeys: evidence of pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH), Endocrinology 99: 243-248 3. Lechan RM, Toni R (2004) Functional Anatomy of the Hypothalamus and Pituitary, Chapter 3b in Neuroendocrinology, Hypothalamus and Pituitary, Grossman A (ed), Endotext.org 4. Barry J, Hoffman GE, Wray S (1985) LHRH-containing systems, In Handbook of Chemical Neuroanatomy 4, GABA and Neuropeptides in the CNS, Part I, Björklund A, Hökfelt T (eds), Amsterdam-New-York-Oxford Elsevier: 166-215 5. Filicori M, Flamigni C (1995) Treatment with GnRH Analogs: Controversies and Perspectives, Parthenon Publishing Group: Xiii 6. Arimura A (1991) The backstage story of the discovery of LHRH, Endocrinology 129: 1687-1689 7. Rasmussen DD, Gambacciani M, Swartz W, Tueros VS, Yen SSC (1989) Pulsatile gonadotropin-releasing hormone release from the human mediobasal hypothalamus in vitro: Opiate receptor mediated suppression, Neuroendocrinology 49: 150 8. Waldhauser F, Weissenbacher G, Frisch H, Pollak A (1981) Pulsatile secretion of gonadotropins in early infancy, European Journal of Pediatrics 137 (1): 71-74 9. Felberbaum R, Rabe T, Diedrich K (2000) Gonadotropin-Releasing Hormons: Agonists and Antagonists in Rabe T, Diedrich K, Strowitzki T (Eds.): Manual on Assisted Reproduction, Springer Verlag Berlin-Heidelberg: 133-164 10. Wildt L, Hausler A, Marshall G, Hutchinson IS, Plant TM, Belchetz PE Knobil E (1981) Frequency and amplitude of gonadotropine-releasing hormone stimulation and gonadotropin secretion in the rhesus monkey, Endocrinology 109: 376 11. Knobil E (1989) The electrophysiology of the GnRH pulse generator, J Steroid Biochem 33: 669

253

12. Jarry H, Molecular Mechanism of the GnRh pulse generator, Dept. of Clin and Exptl. Endocrinology, University of Gottingen, Germany, Deutsche Forschungsgemeinschaft grant JA 398/4) 13. Grunwald K, Rabe T, Runnebaum B (2000) Physiology of the menstrual cycle, in Rabe T, Diedrich K, Strowitzki T (eds), Manual on Assisted Reproduction, 2nd updated Edition, Springer Verlag Berlin-Heidelberg: 29 14. Yen SCC, Quigley ME, Reid RL, Cetel NS (1985) Neuroendocrinology of opioid peptides and their role in the control of gonadotropin and prolactin secretion, Am J Obstet Gynecol 152: 485 15. Wehrenberg WB, Ling H, Bohlen P, Esch F, Brazeau P, Guillemin R (1982) Physiological roles of somatocrinin and somatostatin in the regulation of growth hormone secretion, Biochem Biophys Res Commun 109: 562 16. Prendergast K, Heras-Herzig A, Dalkin A (2002) GnRH – Gonadotropin Physiology and Pathology in Neuroendocrinology, Hypothalamus and Pituitary, Grossman A (ed), Endotext.org 17. Rossmanith WG, Mortola JF, Yen SCC (1988) Role of endogenous opioid peptides in the initiation of the midcycle luteinizing hormone surge in normal cycling women, J Clin Endocrinol Metab 61: 695 18. Gross DS (1980) Effect of castration and steroid replacement on immunoreactive gonadotropin-releasing hormone in the hypothalamus and preoptic area, Endocrinology 106: 1442-145 19. Jarry H, Leonhardt S, Schwarze T, Wuttke W (1995) Preoptic rather than mediobasal hypothalamic amino acid neurotransmitter release regulates GnRH secretion during the estrogen-induced LH surge in the ovariectomized rat, Neuroendocrinology, 62(5): 479-86 20. Romano GJ, Krust A, Pfaff DW (1989) Expression and estrogen regulation of progesterone receptor mRNA in neurons of the mediobasal hypothalamus: an in situ hybridization study, Mol Endocrinol 3:1295 21. Fox SR, Harlan RE, Shivers BD, Pfaff DW (1990) Chemical characterization of neuroendocrine targets for progesterone in female rat brain and pituitary Neuroendocrinology 51: 276

254

22. Jarry H, Leonhardt S, Wuttke W (1991) Gamma-aminobutyric acid neurons in the preoptic/anterior hypothalamic area synchronize the phasic activity of the gonadotropinreleasing hormone pulse generator in ovariectomized rats, Neuroendocrinology, 53(3): 261-7 23. Wu FC, Butler G,. Kelnar CJ, Huhtaniemi I, Veldhuis JD (1996) Ontogeny of pulsatile gonadotropin releasing hormone secretion from midchildhood, through puberty, to adulthood in the human male: a study using deconvolution analysis and an ultrasensitive immunofluorometric assay, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 81(5): 1798-1805 24. Apter D, Butzow TL, Laughlin GA, Yen SS (1993) Gonadotropin-releasing hormone pulse generator activity during pubertal transition in girls: pulsatile and diurnal patterns of circulating gonadotropins, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 76(4): 940-949 25. Grunwald K, Rabe T, Runnebaum B (2000) Physiology of the menstrual cycle, in Rabe T, Diedrich K, Strowitzki T (eds), Manual on Assisted Reproduction, 2nd updated Edition, Springer Verlag Berlin-Heidelberg: 27 26. GnRH Agonists, Antagonists and Assisted Conception (2002) Thieme Medical Publishers: Semin Reprod Med 20(4): 349 –364 27. Clayton RN, Catt KJ (1981) Gonadotropin-releasing hormon receptors: characterization, physiological regulation and relationship to reproductive function, Endocr Rev 2: 186209 28. Probst JC, Skutella T, Muller-Schmid A, Jirikowski GF, Hoffmann W (1995) Molecular and cellular analysis of rP1.B in the rat hypothalamus: in situ hybridization and immunohistochemistry of a new P-domain neuropeptide, Brain Res Mol Brain Res 33: 269-276 29. Kottler ML, Lorenzo F, Bergametti F, Commercon P, Souchier C, Counis R (1995) Subregional mapping of the human gonadotropin-releasing hormone receptor (GnRH-R) gene to 4q between the markers D4S392 and D4S409, Hum Genet 96: 477-480 30. Millar R, Lowe S, Conklin D, et al. (2001) A novel mammalian receptor for the evolutionarily conserved type II GnRH. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 9636-9641

255

31. Neill JD, Duck LW, Sellers JC, Musgrove LC (2002) A gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor specific for GnRH II in primates, Biochem Biophys Res Commun 282: 1012-1018 32. Stojilkovic SS, Reinhart J, Catt KJ (1994)Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways, Endocr Rev 15: 462-499 33. Kaiser UB, Conn PM, Chin WW (1997) Studies of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) action using GnRH receptor-expressing pituitary cell lines, Endocr Rev 18: 4670 34. Conn PM, Crowley WF Jr. (1994) Gonadotropin-releasing hormone and its analogs, Annu Rev Med 45: 391-405 35. Zondek B (1926) Uber die Funktion des Ovariums, Z Geburtshilfe Gynakol 90: 327 36. Zondek B, Aschheim S (1927) Das Hormon des Hypophysenvorderlappens; Testobjekt zum Nachweis des Hormons, Klin Wochenschr 6: 248 37. Howles C, Barri P, Cittadini E, Diedrich K, Fioretti P, et al. (1993) Metrodin HP: clinical experience with a new highly purified follicle stimulating hormone preparation suitable for subcutaneous administration, In Lunenfeld B (ed) FSH alone in ovulation induction, Parthenon, New York: 45-61 38. Loumaye E, Campbell R, Salat-Baroux J (1995) Human follicle-stimulating hormone produced by recombinant DNA technology: a review for clinicians, Hum Reprod Update 1: 188-199 39. Recombinant Human FSH Study Group (1995) Clinical assessment of recombinant human follicle-stimulating in stimulating ovarian follicular development before in vitro fertilization, Fertil Steril 63: 77-86 40. Rajaniemi HP, Petaja-Repo UE, Pietila EM (1996) Structure and functional significance of the carbohydrates of the LH/CG receptor, Mol Cell Endocrinol 125(1-2): 101-105 41. Ulloa-Aguirre A, Timossi C (1998) Structure-function relationship of follicle stimulating hormone and its receptor, Human Reproduction Update vol 4, nr 3: 260-283 42. Fan QR, Hendrickson WA, Nature (2005) 433: 269-277 43. Lamminen T, Min Jiang, Manna PR, Pakarinen P, Simonsen H, Herrera RJ, Huhtaniemi I (2002) Functional study of a recombinant form of human LHß-subunit variant carrying

256

the Gly102Ser mutation found in Asian populations, Molecular Human Reproduction Vol. 8, No. 10: 887-892 44. Dorrington JH, Armstrong DT (1979) Effects of FSH on gonadal functions, Rec Prog. Horm Res 39: 301 45. Richards JS (1994) Hormonal control of gene expression in the ovary, Endocr. Rev 15: 752-751 46. Hillier SG (1991) Regulatory functions for inhibin and activin in human ovaries J Endocrinol 131: 171-175 47. Findlay JK (1993) An update on teh roles of inhibin, activin and follistatin as local regulators of folliculogenesis, Biol Reprod 48: 15-23 48. Smyth CD, Miro F, Whitelaw PF, Howles CM, Hillier SG (1993) Ovarian thecal/interstitial androgen synthesis is enhanced by a follicle-stimulating hormonestimulated paracrine mechanism, Endocrinology 133: 1532-1538 49. Giudice L (1992) Insulin-like growth factors and ovarian follicular development, Endocr Rev 13: 641-669 50. Lunenefeld B, Menzi A, Volet B (1960) Clinical effects of human postmenopausal gonadotropin, Rass Clin Ter Sci Affini 59: 213-217 51. Diedrich K, Van Der Ven H, Al-Hasani S, Krebs D (1988) Ovarian stimulation for in vitro fertilisation, Hum Reprod 3: 39-44 52. Jones HW, Acosta A, Andrews MC, Garcia JE, Jones GS, Mantzawinos T, McDowell J, Sandow B, Veeck L, Whibley T (1983) The importance of follicular phase to success and failure in in vitro fertilization, Fertil Steril 40: 317-321 53. Devroey P, Van Steirteghem A, Mannaerts B, Coelingh Bennink H (1992) First singleton term birth after ovarian superovualtion with rh-FSH, Lancet 340: 1108-1109 54. Daya S, Gunby J (1999) Recombinant versus urinary follicle stimulating hormone for ovarian stimulation in assisted reproduction, Hum Reprod 14: 2207-2215 55. Brinsden PR, Akagbosu F, Gibbons , et al. (1998) Gonal-F versus Puregon: results from a randomized, assessor-blind, comparative study in women undergoing assisted reproductive technologies, Hum Reprod 13: 0-140 56. Berg C, Howles CM, Borg K, et al. (1997) Recombinat human follicle stimulating hormone (r-FSH; Gonal-F) versus highly purified urinary FSH (Metrodin HP): results of

257

a randomized comparative study in women undergoing assisted reproductive techniques, Hum Reprod 13: 0-185 57. Ancar V, Costea D, Vladareanu R (1999) Puregonul in stimularea ovariana – experienta Clinicii Medsana Bucuresti, vol rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 30 58. Macnamee MC, Howles CM (1987) The occurence, characteristics and management of the LH surge in IVF, Hum Reprod 2, Suppl 1:46 59. Urbancsek J, Rabe T, Grunwald K, Kiesel L, Runnebaum B (1990a) Analysis of hormonal changes during combined buserelin/hMG treatment, Hum Reprod 5: 675-681 60. Fleming R, Adam AH, Barlow DH, Black WP, Macnaughton MC, Coutts JRT (1982) A new systematic treatment for infertile women with abnormal hormone profiles, Br J Obstet Gynaecol 89: 80-83 61. Fujino M, Kobayashi S, Obayashi M (1972) Structure activity relationships in the Cterminal part of luteinising-hormone (LHRH), Biochem Biophys Res Commun 49: 863869 62. Moghissi KS (2000) A Clinician’s Guide to the Use of Gonadotropin-Releasing Hormone Analogues in Women, Medscape General Medicine 2(1) 63. Akagbosu FT (1999) The use of GnRH agonists and antagonists in infertility, in A textbook of In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Brinsden PR (Ed), 2nd Edition, Parthenon Publishing Group: 84 64. Lemay A, Maheux R, Faure N, Jean C, Fazekas ATA (1984) Reversible hypogonadism induced by a luteinizing releasing-hormone (LH-RH) agonist (Buserelin) as a new therapeutic approach for endometriosis, Fertil Steril 41: 863-871 65. Kiesel L, Runnebaum B (1992) Gonadotropin-releasing-Hormon und AnalogaPhysiologie und Pharmakologie,Gynakol Geburtshilfliche Rundsch 32: 22-30 66. Matta WH, Shaw RW, Hesp R, Evans R (1988) Reversible trabecular bone density loss following induced hypoestrogenism with GnRh-analogue Buserelin in premenopausal women, Clin Endocrinol 29: 45-51 67. Loumaye E (1990) The control of endogenous secretion of LH by gonadotropin releasing hormone agonists during ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization and embryo transfer, Hum Reprod 5: 357-376

258

68. Schmutzler RK, Diedrich K (1990) Basic and clinical aspects of GnRH agonists in reproduction. Int J Gynecol Obstet 321: 311-324 69. De Mouzon J, Lancaster P (1995) World collaborative report 1993, 15th World Congress on Fertility and Sterility, Montpellier, September 17-22, 1995 70. Diedrich K, Diedrich C, Santos E, et al. (1994) Suppression of the endogenous luteinizing hormone surge by the gonadotropin-releasing hormone antagonist Cetrorelix during ovarian stimulation, Hum Reprod 9: 788-791 71. Regan L, Owen EJ, Jacobs HS (1990) Hypersecretion of luteinising hormone, infertility and misscarriage, Lancet 2:1141-1144 72. Tan Sl, Kingsland C, Campbell S, Mills C, Bradfield J, et al. (1992) The long protocol of administration of gonadotropin-releasing hormone agonist is superior to the short protocol for ovarian stimulation for in vitro fertilization, Fertil Steril 57: 810-814 73. Ron-El R, Golan A, Herman A, Raziel A, Soffer Y, Caspi E (1990) Midluteal gonadotropin-releasing hormone analog administration in early pregnancy, Fertil Steril: 572-574 74. Smitz J, Devroey P, Bourgain C, Camus M, VanWasberghe I, Wisanto A, VanSteirteghem AC (1988) Luteal supplementation regimes after combined GnRH agonist/HMG superovulation, J Reprod Fertil Abstr Ser 2:18 75. Blumenfeld Z, Nahhas F (1988) Luteal dysfunction in ovulation induction: the role of repetitive human chorionic gonadotropin supplementation during the lutael phase, Fertil Steril 50: 403-407 76. Costea D, Ancar V, Pacu I (1999) Suportul luteal in Reproducerea Asistata, vol rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 43 77. Schally AV (1999) Luteinizing hormone-releasing hormone analogs: their impact on the control of tumorigenesis, Peptides 20:1247-1262 78. Klingmuller D, Diedrich K, Sommer L (1993) Effects of the GnRH antagonist Cetrorelix in normal women, Gyneocl Endocrinol 7: 2 79. Bajusz S, Kovacs M, Gazdag M (1988) Highly potent antagonists of luteinizing hormone-releasing hormone free of edematogenic effects. Proc Natl Acad Sci U S A, 85: 1637- 1641

259

80. Nestor JJ Jr, Tahilramani R, Ho TL, Goodpasture JC, Vickery BH, Ferrandon P (1992) Potent gonadotropin releasing hormone antagonists with low histamine-releasing activity, J Med Chem 35: 3942-3948 81. Dittkoff EC, Cassidenti DL, Paulson RJ, Sauer MV, Wellington LP, et al. (1991) The gonadotropin releasing hormone antagonist (Nal-Glu) acutely blocks the luteinizing hormone surge but allows for resumption of folliculogenesis in normal women, Am J Obstet Gynecol 165: 1811-1817 82. Felberbaum R, Reissmann T, Diedrich K (1995) Entwicklung und Anwendungsmoeglichkeiten der GnRH-Antagonisten im Rahmne der SterilitaetstherapieEine Uebersicht, Fertilitaet 11: 11-21 83. Olivennes F, Fanchin R, Bouchard P, De Ziegler D, Taieb J, Selva J, Frydman R (1994) The single or dual administration of the gonadotropin-releasing-hormone-antagonist Cetrorelix in an in vitrofertilization-embryo transfer program, Fertil Steril 62: 468-476 84. Lin Y, Kahn JA, Hillensjo T (1999) Is there a difference in the function of granulosa luteal cells in patients undergoing in vitro fertilization either with gonadotropin-releasing hormone agonist or antagonist? Hum Reprod 14: 885-888 85. Mannaerts B, Devroey P, Abyholm T, Diedrich K, Hedon B, et al. (1998) A double blind randomised dose finding study to the efficacy of the gonadotropin-releasing hormone antagonist ganirelix (Org 37462) to prevent premature luteinizing surges in women undergoing ovarian stimulation with recombinant follicle stimulating hormone (PuregonR), Hum Reprod 13: 3023-3031 86. Keay SD, Liversedge HN, Mathur RS, Jenkins KM (1997) Assisted conception following poor ovarian response to gonadotropin stimulation, Br J Obstet Gynaecol 104: 521-527 87. Klein NA, Battaglia DE, Fujimoto VY, Davis GS, Bremner WJ, Soules MR (1996) Reproductive aging: accelerated ovarian follicular development associated with a monotropic FSH rise in normal older women, J Clin Endocrinol Metab 81: 1038-1045 88. Hannoch J, Lavy Y, Holzer H, Hurwitz A, Simon A, et al. (1998) Young low responders protected from the untoward effects of reduced ovarian response, Fertil Steril 69: 10011004

260

89.

Faber BM, Mayer J, Cox B, Jones D, Toner JP, et al. (1998) Cessation of gonadotropin-releasing hormone agonist therapy combined with high-dose gonadotropin stimulation yields favorable pregnancy results in low responders, Fertil Steril 60: 826-830

90.

Weissmann A, Farhi J, Royburt M, Nahum H, Glezerman M, et al. (2003) Prospective evaluation of two stimulation protocols for low responders who were undergoing in vitro fertilization-embryo transfer, Fertil Steril 79, Nr 4: 886-892

91.

Urbancsek J, Rabe T, Grunwald K, Runnebaum B (1990b) Diagnose, Haufigkeit und klinische Bedeutung des vorzeitigen Anstiegs/Gipfels bei Patientinnen eines IVF/GIFT Programmes, Geburtsh Frauenheilkd 50: 454-462

92.

Urbancsek J, Rabe T, Thuro H, Grunwald K, Runnebaum B (1991b) Kombinierte Behandlung mit einem GnRH-Analogon und Gonadotropinen bei IVF-ET/GIFT Patientinnen nach vorangegangenen erfolglosen reinen HMG-Stimulation, Zentralbl Gynaekol 113: 563-574

93.

Rizk B, Vere M (1991) Incidence of severe ovarian hyperstimulation syndrome after GnRH agonist/HMG superovulation for in vitro fertilization, Proceedings of the VII World Congress on In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Paris, Hum Reprod

94.

Rizk B, Aboulghar MA, Mansour RT, et al. (1991) Severe ovarian hyperstimulation syndrome: analytical study of twenty-one cases, Proceedings of the VII World Congress on In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Paris, Hum Reprod: 368-369

95.

Munteanu I, Checiu I, Checiu M, Policec S, Craina M, Budau G, Hrubaru N, Vladescu E (2000) 5 ani de fertilizare in vitro (FIV) in Romania, Obstetrica si Ginecologia, vol. XLVIII, Nr 1: 73-79

96.

Abdalla HI, Rizk B (1999) Ovarian Hyperstimulation Syndrome, In Assisted Reproductive Technology, Abdalla HI, Rizk B (eds), Abingdon Oxford Health Press: 3739

97.

Lunenfeld B, Insler V, Glezerman M (1993) Diagnosis and treatment of functional infertility, Publ Blackwell Wissenschaft, Berlin, 3rd rev. ed: 98

98.

World Health Organization (1973) Agents stimulating gonadal function in humans, WHO Tech Rep Series, Nr 514

261

99.

Golan A, Ron El R, Herman A, et al. (1989) Ovarina hyperstimulation syndrome: an update review, Obstet Gynecol Surv 44: 430-440

100.

Balasch J, Arroyo V, Carmona F, et al. (1991) Severe ovarian hyperstimulation

syndrome: role of peripheral vasodilatation, Fertil Steril 56: 1077-1083 101.

Ravindranath N, Little-Ihrig LL, Phillios HS, et al. (1992) Vascular endothelial

growth factor messenger ribonucleic acid expression in the primate ovary, Endocrinol 131: 254-260 102.

Millauer B, Wizigmann-Voos S, Schnurch H, et al. (1993) High affinity VEGF

binding and developmental expression suggest FLK-1 as a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis, Cell 72: 835-846 103.

Schenker JG (1999) Ovarian Hyperstimulation Syndrome – Experimental and

Clinical Data, vol. rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 21 104.

David S, Munteanu I, Policec S, David D, Bernad E (1999) Sindromul de

suprastimulare ovariana – forma grava la Centru de Fertilizare in Vitro din Clinica Bega, vol rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 48 105.

Munteanu I, Checiu I, Policec S, David S, Craina M, Vladescu E (2001) Apects

regarding ovarian hyperstimulation syndrome at the IVF Center of the Universitary Clinic of Obstetrics and Gynecology „Bega”, Timisoara, Romania, Gynecol Endocrinol, Vol 15, Suppl Nr 5: 138 106.

Sher G, Salem R, Fernman M, et al. (1993) Eliminating the risks of life-dangering

complications following overstimulation with menotropin fertility agents: a report on women undergoing in vitro fertilization and embryotransfer, Obstet Gynecol 81: 10091011 107.

Burkman RT, Tang MTC, Malone KE, Marchbanks PA, McDonald JA, et al.

(2003) Infertility drugs and the risk of bresat cancer: findings from the National Institute of Child Health and Human Development Women’s Contraceptive and Reproductive Experiences Study, Fertil Steril 79, Nr 4: 844-851 108.

Healy DL, Venn A (2003) Infertility medication and the risk of breast cancer,

Fertil Steril 79, Nr 4: 852-854

262

109.

Althuis MD, Scoccia B, Lamb EJ, Moghissi KS, Westhoff CL, et al. (2005)

Melanoma, thyroid, cervical, and colon cancer risk after use of fertility drugs, Am J Obstet Gynaecol 193: 668-674 110.

Chang M C (1959) Fertilization of rabbit ova in vitro, Nature 184: 466–467

111.

Steptoe PC, Edwards RG (1978) Birth after the reimplantation of a human

embryo, Lancet 2(8085): 366 112.

Steptoe PC et al. (1971) Human blastocysts grown in culture, Nature 229: 132–

133 113.

Steptoe PC, Edwards RG (1976) Reimplantation of human embryo with

subsequent tubal pregnancy, Lancet 1: 880-882 114.

Gleicher N, Friberg J, Fullan N, Giglia RV, Mayden K, Kesky T, Siegel I (1983)

Egg retrieval for in vitro fertilization by sonographically controlled vaginal culdocentesis, Lancet 2: 508-9 115.

Lenz S, Lauritsen JG, Kjellow M (1981) Collection of human oocytes for in vitro

fertilization by ultrasonically guided follicular puncture, Lancet 1: 1163-1164 116.

Wikland M, Enk L, Hamberger L (1985) Transvesical and transvaginal

approaches for the aspiration of follicles by the use of ultrasound, Ann NY Acad Sci 442: 683-689 117.

Kuenstliche Befruchtung oder assistierte Reproduktion, Kap.3.3 In Gynaekologie

und Geburtshilfe-Lehrbuch fuer Studium und Praxis, Schmidt-Matthiesen H, Wallwiener D (eds), 10.Auflage, Schattauer Verlag Stuttgart, 2005: 139-146 118.

Munteanu I, Checiu I, Policec S (1995) Fertilizarea in vitro si embriotransfer in

Romania, Obstetrica si Ginecologia XLIII: 167-170 119.

Checiu I, Checiu M, Policec S, Munteanu I (1998) Aspecte al experientei

Centrului IVF Bega cu privire la tehnica fecundatiei in vitro si a cultivarii embrionului uman, vol rezumate Al XII-lea Congres National de Obstetrica si Ginecologie, Iasi: 38 120.

Munteanu I, Rabe T, Checiu I, Policec S (1999) Realizarea reproducerii umane

asistate in Romania, vol. rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 27 121.

Munteanu I, Anastasiu D, Gluhovschi A, Craina M, Dorneanu F (1999) Rezultate

si perspective pentru mileniul urmator privind Reproducerea Umana Asistata in Romania,

263

vol rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 62 122.

Policec S, Munteanu I, Checiu I, David S (1998) Experienta Centrului de

Fertilizare in Vitro a Clinicii „Bega” Timisoara in stimularea ovariana pentru fertilizarea in vitro, vol. rezumate Al XII-lea Congres National de Obstetrica si Ginecologie, Iasi, 2730 mai 1998: 79 123.

Rabe T, Gör ÜB, Urbancsek J, Runnebaum B (1997) Assisted Reproduction, In

Runnebaum B, Rabe T (eds.), Gynecological Endocrinology and Reproductive Medicine, Vol. 2, Reproductive Medicine, Springer Verlag Berlin Heidelberg: 333 124.

Rabe T, Munteanu I, Strowitzki T, Vladescu E (2000) Notiuni de reproducere

umana asistata, Capitolul 2.8 in Munteanu I (ed), Tratat de Obstetrica, Editura Academiei Romane, Bucuresti: 175-234 125.

Brinsden PR (1999) Oocyte recovery and embryotransfer techniques for in vitro

fertilization, in A textbook of In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Brinsden PR (Ed), 2nd Edition, Parthenon Publishing Group: 180 126.

Brinsmead M, Stanger J, Oliver M, Shumack J, Raymond S, Clark L (1989) A

randomized trial of laparoscopy and transvaginal ultrasound-directed oocyte pick-up for in vitro fertilization, J In Vitro Fertil Embryo Transfer 6: 149-154 127.

Pickering S, Braude P, Johnson M, et al. (1990) Transient cooling to room

temperature can cause irreversible disruption of the meiotic spindle in the human oocyte, Fertil Steril 54: 102-108 128.

World Health Organization. (1992) WHO Laboratory Manual for the Examination

of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. Cambridge: Cambridge University Press 129.

Kruger TF, Menkweld R, Stander FSH, et al. (1986) Sperm morphologic features

as a prognostic factor in in vitro fertilization, Fertil Steril 46: 1118-1123 130.

Surcel IV, Apostol S, Lerintiu S, Parastie S (1998) Semnificatia unor parametri

morfologici in evaluarea capacitatii de fertilizare a spermei, vol rezumate Al XII-lea Congres National de Obstetrica si Ginecologie, Iasi, 27-30 mai 1998: 80-81 131.

Riedel HH, Hubner F, Ensslen SC, et al. (1989) Minimal andrological

requirements for in vitro fertilization, Hum Reprod 4: 73-77

264

132.

Braude PR, Bolton VN (1984) The preparation of spermatozoa for in vitro

fertilization by buoyant density centrifugation. In Feichtinger W, Kemeter P (eds) Recent Prognosis in Human In Vitro Fertilization. Palermo: Cofese: 125-134 133.

Lopata A, Patullo MJ, Chang A, et al. (1976) A method for collecting motile

spermatozoa from human semen, Fertil Steril 27: 677-684 134.

Aitken RJ, Clarkson JS (1987) Cellular basis of defective sperm function and its

association with the genesis of reactive oxygen species by human spermatozoa, J Reprod Fertil 81: 459-469 135.

Aitken RJ (1989) The role of free oxygen radicals and sperm function, Int J

Androl 12: 95-97 136.

Daya S, Gwatkin RBL, Bissessar H (1987) Separation of motile human

spermatozoa by means of a glass bead column, Gamete Res 17: 375 137.

Fisch B et al. (1989) The effect of preinsemination interval upon fertilization of

human oocytes in vitro, Hum Reprod 4: 954-956 138.

Levron J, Munne S, Willadsen S, Rosenwaks Z, Cohen J (1995) Male and female

genomes associated in a single pronucleus in human zygotes, J Assist Reprod Genet 12, Suppl: 27s 139.

Oehninger A, Acosta AA, Veek LL, Simonetti S. Muasher J (1989) Delayed

fertilization during in vitro fertilization and embryo transfer cycles: analysis of cause and impact of overall results, Fertil Steril 52: 991-997 140.

Plachot M, Veiga A, Montagut J, et al. (1988) Are clinical and biological IVF

parameters correlated with chromosomal disorders in early life: a multicentric study, Hum Reprod 3: 627-635 141.

Plachot M, Mandelbaum J, Junca AM, Cohen J, Slat-Baroux J (1993) Coculture

of human embryo with granulosa cells, Contracept Fertil Sex 19: 632-634 142.

Elder KT (1999) Laboratory techniques: Oocyte collection and embryo culture,

Ch. 12, In A textbook of In Vitro fertilization and Assisted Reproduction, Brinsden PR (Ed), second edition, 1999, Parthenon Publishing Group: 185-201 143.

Barclay L (2004) Piroxicam may increase pregnancy rate from in vitro

fertilization and embryo transfer, Fertil Steril 82: 816-820

265

144.

Fernandez H, Coste J, Job-Spira N (1991) Controlled ovarian hyperstimulation as

a risk factor for ectopic pregnancy, Obstet Gynecol 78: 656 145.

Winter E, Wang J, Davies MJ, Norman R (2002) Early pregnancy loss following

assisted reproductive technology treatment, Hum Reprod, Vol 17, 11: 3220-3223 146.

Guzick DS, Wilkes C, Jones HW Jr (1986) Cumulative pregnancy rates for in

vitro fertilization, Fertil Steril 46: 663 147.

Tan SL, Royston P, Campbell S, Jacobs HS, Betts J, et al. (1992) Cumulative

conception and livebirth rates after in vitro fertilization, Lancet 339: 1390 148.

Asch RH, Balmaceda JP, Ellsworth LR, Wong PC (1985) Gamete intrafallopian

transfer (GIFT): a new treatment for infertility, Int J Fertil 30: 41 149.

Society for Assisted Reproductive Technology, The American Fertility Society

(1993) Assisted Reproductive Technology in the United States and Canada: 1991 results from the Society for Assisted Reproductive Technology generated from the American Fertility Society Registry, Fertil Steril 59: 956 150.

Lancaster PAL (1995) Evaluation of infertility treatment: multicenter trial or

national registers? In Hedon B, Bringer J, Mares P (eds) Fertility and Sterility, Carnforth, UK: Parthenon Publishing: 465-468 151.

Balmaceda JP, Alam V, Roszjtein D, Ord T, Snell K, Asch R (1992) Embryo

implantation rates in oocyte donation: a prospective comparison of tubal versus uterine transfers, Fertil Steril 57: 362 152.

Tanbo T, Dale PO, Aabyholm T (1990) Assisted fertilization in infertile women

with patent fallopian tubes, A comparison of in vitro fertilization, gamete intrafallopian transfer and tubal embryo stage transfer, Hum Reprod 5: 266 153.

Assisted Reproduction (1994) Chapter 31, In Clinical Gynecologic Endocrinology

and Infertility, 5th edition, Speroff L, Glass RH, Kase NG (eds), Williams and Wilkins: 931-946 154.

Gordon JW, Talansky BE (1986) Assisted fertilization by zona drilling: a mouse

model for correction of oligospermia, Journal of Experimental Zoology 239: 347-354 155.

Cohen J, Malter H, Fehilly C, Wright G, Elsner C, et al. (1988) Implantation of

embryos after partial opening of oocyte zona pellucida to facilitate sperm penetration, Lancet ii: 162

266

156.

Malter HE, Cohen J (1989) Blastocyst formation and hatching in vitro following

zona drilling of human embryos, Gamete Research 24: 67-80 157.

Payne D (1994) Embryo viability associated with microassisted fertilization,

Chapter 10: Micromanipulation techniques, In Bailliere’s Clinical Obstetrics and Gynecology, S. Fishel (ed), Bailliere Tindall Cambridge University Press, Vol 8: 157-175 158.

Ng SC, Bongso TA, Ratnam SS, Sathananthan H, Chan CL, et al. (1988)

Pregnancy after transfer of multiple sperm under the zona, Lancet ii: 8614-8790 159.

Ng SC, Bongso TA, Ratnam SS (1991) Microinjection of human oocytes: the

technique for severe oligoasthenoteratozoospermia, Fertility and Sterility 56: 1117-1123 160.

Hiramoto Y (1962) Microinjection of the live spermatozoa into sea urchin eggs,

Experimental Cell Research 27: 416-426 161.

Lanzendorf SE, Maloney MK, Veeck LL, Slusser J, Hodgen GD, et al. (1988b) A

preclinical evaluation of pronuclear formation by microinjection of human spermatozoa into human oocytes, Fertility and Sterility 49: 835-842 162.

Palermo G, Joris H, Devroey P, Van Steirteghem AC (1992) Pregnancies after

intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte, Lancet 340: 17-18 163.

Lanzendorf SE, Maloney M, Ackerman S, Acost A, Hodgen G (1988a)

Fertilising potential of acrosome-defective sperm following microsurgical injection into eggs, Gamete Research 19: 329-337 164.

Hung-Ching Liu (1997) Embryonic therapy for implantation enhancement,

Chapter 5, In Embryonic Medicine &Therapy, Jauniaux E, Barnea E, Edwards E (eds), Oxford University Press: 80 165.

Lundin K, Sjogren A, Nilsson L, Hamberger L (1994) Fertilization and pregnancy

after intracytoplasmic microinjection of acrosomeless spermatozoa, Fertility and Sterility 62:1266-1267 166.

Casper RF, Meriano JS, Jarvi KA, et al. (1996)The hypo-osmotic swelling test for

selection of viable sperm for intracytoplasmic sperm injection in men with complete asthenospermia, Fertil Steril 65: 972-976 167.

Nagy ZP, Verheyen G, Liu J, et al. (1995) Results of 55 intracytoplasmic sperm

injection cycles in the treatment of male immunological infertility, Hum Reprod 10: 1775-1780

267

168.

Shrivastav P, Nadkarni P, Wensvoort S, et al. (1994) Percutaneous epididymal

sperm aspiration for obstructive azoospermia, Hum Reprod 9: 2058-2061 169.

Tournaye H, Clasen K, Aytoz A, et al. (1998) Fine needle aspiration versus open

biopsy for testicular sperm recovery: a controlled study in azoospermic patients with normal spermatogenesis, Hum Reprod 13: 901-90 170.

Ancar V, Costea D, Vladareanu R (1999) Experienta Clinicii Medsana Bucuresti

in Reproducerea Asistata prin ICSI - comentariu pe 86 cazuri, vol rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 30 171.

Jardoudi KA, Hollanders JMG, Sieck UV, et al. (1997) pregnancy after transfer of

embryos which were generated from in-vitro matured oocytes, Hum Reprod 12: 857-859 172.

De Vos A, Van Steirteghem A (1997) Intracytoplasmic sperm injection In New

Insights in Gynecology and Obstetrics: Research and Practice, Ottesen B, Tabor A (eds), Carnforth, UK, Parthenon Publishing Press: 89-96 173.

Tarlatzis B (1996) Report on the activities of the ESHRE task force on

intracytoplasmic sperm injection, In Genetics and Assisted Human Conception, Van Steirteghem A, Devroey P, Liebaers I (eds), Oxford University Press: 160-176 174.

Van Steirteghem A, Bonduelle M, Hamberger L, et al. (1998) Assisted

reproduction by intracytoplasmic sperm injection: a survey on the clinical experience in 1994 and the children born after ICSI, carried out until 31 December 1993, Hum Reprod 13: 1737-1746 175.

Liu J, Nagy Z, Joris H, Tournaye H, Smitz J, et al. (1995) Analysis of total 76 total fertilization failure cycles out of 2732 intracytoplasmic sperm injection cycles, Hum Reprod 10: 2630-2636

176.

Liebaers I, Bonduelle M, Legein J, Wilikens A, Van Assche E, et al. (1995a) Follow-up of children born after intracytoplasmic sperm injection, In Hedon B, Bringer J, Mares P (eds), Fertility and Sterility. A current overview. Proceedings of the 15th World Congress on Fertility and Sterility, Montpellier, 1995, Parthenon: 409-412

177.

Liebaers I, Bonduelle M, Van Assche E, Devroey P, Van Steirteghem A (1995b) Sex chromosome abnormalities after intracytoplasmic sperm injection, Lancet 346:1095

268

Bonduelle M, Hamberger J, Loris H, Tarlatzis BC, Van Steirteghem AC (1995b)

178.

Assisted reproduction by intracytoplasmic sperm injection: an ESHRE survey of clinical experiences until 31 December 1993, Hum Reprod Update 1, no 3, CD-ROM 179.

Guidelines on the application of CASA technology in the analysis of spermatozoa

(1998) Hum Reprod, Vol. 13, Nr. 1: 142-145 180.

Incidence of chromosomal aberrations in children born after assisted reproduction

through intracytoplasmic sperm injection (1998), Editorial, Hum Reprod, vol.13 no.4: 781–782 181.

In’t Veld P, Brandenburg H, Verhoeff A, et al. (1995) Sex chromosomal

abnormalities and intracytoplasmic sperm injection, Lancet, 346:773 182.

Jacobs P, Browne C, Gregson N, et al. (1992) Estimates of the frequency of

chromosome abnormalities detectable in unselected newborns using moderate levels of banding, J. Med. Genet, 29: 103–106 183.

Tarlatzis BC (1999) Benefits and risks of ICSI in the treatment of male infertility,

vol. rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 15 184.

Ponjaert-Kristoffersen I, Bonduelle M, Barnes J, Nekkebroeck J, Loft A, et al.

(2005) International Collaborative Study of Intracytoplasmic Sperm Injection-Conceived, In Vitro Fertilization-Conceived, and Naturally Conceived 5-Year-Old Child Outcomes: Cognitive and Motor Assessments, Pediatrics, 115(3): e283 - e289 185.

Ponjaert-Kristoffersen I, Tjus T, Nekkebroeck J, Squires J, Verté D, et al. (2004)

Psychological follow-up study of 5-year-old ICSI children, Hum Reprod 19(12): 27912797 186.

Takeuchi T, Colombero LT, Neri QV, Rosenwaks Z, Palermo GD (2004) Does

ICSI require acrosomal disruption? An ultrastructural study, Hum Reprod, 19(1): 114117 187.

Kosmas IP, Kolibianakis EM, Devroey P (2004) Association of estradiol levels on

the day of hCG administration and pregnancy achievement in IVF: a systematic review, Hum Reprod 19(11): 2446-2453 188.

Kolibianakis EM, Zikopoulos K, Schiettecatte J, Smitz J, Tournaye H, Camus M,

Van Steirteghem AC, Devroey P (2004) Profound LH suppression after GnRH antagonist

269

administration is associated with a significantly higher ongoing pregnancy rate in IVF, Hum Reprod, 19(11): 2490-2496 189.

Mohamed Aboulghar (2003) Prediction of ovarian hyperstimulation syndrome

(OHSS), Estradiol level has an important role in the prediction of OHSS, Hum Reprod, 18 (6): 1140-1141 190.

Out HJ, Rutherford A, Fleming R, Tay CCK, Trew G, et al. (2004) A randomized,

double-blind, multicentre clinical trial comparing starting doses of 150 and 200 IU of recombinant FSH in women treated with the GnRH antagonist ganirelix for assisted reproduction, Hum Reprod, Vol. 19, No. 1: 90-95 191.

Min JK, Breheny SA, MacLachlan V, Healy DL (2004) What is the most relevant

standard of success in assisted reproduction? The singleton, term gestation, live birth rate per cycle initiated: the BESST endpoint for assisted reproduction, Hum Reprod 19 (1): 37 192.

Mazur P (2000) Stopping biological time. The freezing of living cells, Annals

New York Academy of Sciences, Part XI: Cryopreservation: 514-529 193.

Bunge RG, Sherman JK (1953) Fertilizing capacity of frozen spermatozoa, Nature

172: 767 194.

Deanesley R (1954) Immature rat ovaries grated after freezing and thawing, J

Endocrinol 2: 197 195.

Parker AS (1956) Grafting of mouse ovarian after freezing and thawing, J

Endocrinol 14 xxi 196.

Sherman JK (1963) Improved methods of preservation of human spermatozoa by

freezing and freezing-drying, Fertil Steril 14: 49 197.

Trounson A, Mohr L (1983) Human pregnancy following cryopreservation,

thawing and transfer of an eight cell embryo, Nature 305: 707 198.

Al-Hasani S, Diedrich K, van der Ven H, Reinecke A, Hartje M, Krebs D (1987)

Cryopreservation of human oocytes, Hum Reprod 2: 695-700 199.

Chen C (1986) Pregnancy after human oocyte cryopreservation, Lancet 1: 884

200.

Edwards R, Brody S (eds.)(1995) Principles and Practice of Assisted Human

Reproduction, W.B. Saunders Company: 335-343 si 455-457

270

201.

Rabe T, Diedrich K, Strowitzki T (eds) (2000) Manual on assisted reproduction,

Springer Verlag, Heidelberg : 339-377 202.

Mazur P (1984) Freezing of living cells: mechanism and implications, Am J

Physiol 247: C125-C142 203.

Serres C, Jouannet P, Czyglik F, David G (1980) Effects of freezing on

spermatozoa motility in David G, Price WS (eds) Human artificial insemination and semen preservation, Plenum, New York: 147-161 204.

Henry MA, Noiles EE, Gao D, Mazur P, Critser JK (1993) Cryopreservation of

human spermatozoa. The effects of cooling rate and warming rate on the maintenance of motility, plasma membrane integrity and mitochondrial function, Fertil Steril 60:911-918 205.

Cohen J, Edwards RG, Fehilly CB, Fishel SB, Hewitt J, et al. (1985) In vitro

fertilization usin cryopreserved donor semen in cases where both partners are infertile, Fertil Steril 43: 570-574 206.

Englert Y, Delvigne A, Vekemans M, Lejeune B, Hemlisz A et al. (1989) Is fresh

or frozen sperm to be used in in vitro fertilization with donor sperm? Fertil Steril 51: 661664 207.

Fabbri R, Porcu E, Marsella T, Rochetta G, Ventroli S, Flamigni C (2001) Human

oocyte cryopreservation: new perspectives regarding oocyte survival, Hum Reprod 16 (3): 411-416 208.

Martino A, Songsasen N, Leibo SP (1996) Development into blastocysts of

bovine oocytes cryopreserved by ultra-rapid cooling, Biol Reprod 54: 1059-1069 209.

Son WY, Park SE, Lee KA, Lee WS, Koo JJ et al (1996) Effects of 1,2

propanediol and freezing-thawing on the in vitro developmental capacity of human immature oocytes, Fertil Steril 66: 995-999 210.

Ludwig M, Al-Hassani S, Felberbaum R, Diedrich K (1999) New aspects of

cryopreservation of oocytes and embryos in assisted reproduction and future perspectives, Hum Reprod 14 Suppl. 1: 162-185 211.

Reubinoff BE, Pera MF, Vajta G, Trounson AO (2001) Effective

cryopreservation of human embryonic stem cells bt the open pull straw vitrification method, Hum Reprod 16(10): 2187-2194

271

212.

Sathanandan M, Macnamee MC, Wick K, et al. (1992) Clinical aspects of human

embryo cryopreservation, in Brinsden PR, Rainsbury PA (eds) A Textbook of in Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Carnforth UK, Parthenon Publishing 213.

Garcia-Velasco JA, Isaza V, Vidal C,Landazabal A, Remohi J, et al. (2001)

Human ovarian steroid secretion in vivo: effects of GnRH agonist versus antagonist (cetrorelix), Hum Reprod 16 (12): 2533-2539 214.

Young Sik Choi, Seung-Yup Ku, Byung-Chul Jee, Chang-Suk Suh, Young Min

Choi, et al. (2006) Comparison of follicular fluid IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, IGFBP-4 and PAPP-A concentrations and their ratios between GnRH agonist and GnRH antagonist protocols for controlled ovarian stimulation in IVF-embryo transfer patients, Hum Reprod doi:10.1093/humrep/del091 (advance access 04.2006) 215.

Olivennes F, Fanchin R, Bouchard P, et al. (1996) Triggering of ovulation by a

gonadotropin-releasing hormone (GnRH) agonist in patients pretreated with a GnRH antagonist, Fertil. Steril 66(1):151-153 216.

Humaidan P, Ejdrup Bredkjær H, Bungum L, Bungum M, Grøndahl ML,

Westergaard L, Yding Andersen C (2005) GnRH agonist (buserelin) or hCG for ovulation induction in GnRH antagonist IVF/ICSI cycles: a prospective randomized study, Hum Reprod 20(5):1213-1220 217.

Griesinger G, Diedrich K, Devroey P, Kolibianakis EM (2006) GnRH agonist for

triggering final oocyte maturation in the GnRH antagonist ovarian hyperstimulation protocol: a systematic review and meta-analysis Hum Reprod Update 12(2):159-168 218.

Kolibianakis EM, Schultze-Mosgau A, Schroer A, van Steirteghem A, Devroey P,

Diedrich K, Griesinger G (2005) A lower ongoing pregnancy rate can be expected when GnRH agonist is used for triggering final oocyte maturation instead of HCG in patients undergoing IVF with GnRH antagonists, Hum Reprod 20(10): 2887-2892

272