Seminario 3 Molecular Beta

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MOLECULAR MEDICINE TODAY, JANUARY 1998

Avances en terapia génica de desordenes mitocondriales Jean-Marc Collombet and Charles Coutelle Los desordenes mitocondriales están caracterizados por deficiencias proteicas que afectan la estructura y función de la mitocondria. La deficiencia de proteínas es causada por mutaciones tanto en genes nucleares como en el genoma mitocondrial. La mayoría de los enfoques actuales de la terapia génica de desordenes mitocondriales tienen como objetivo la expresión de la secuencia genética correctiva mediante la expresión nuclear/citoplasmática. Sin embargo, el genoma mitocondrial y su sistema de expresión autónoma ofrecen el potencial de una estrategia alternativa de terapia génica: la introducción de secuencias de genes nucleares dentro del genoma mitocondrial y su expresión mediante el sistema de expresión genética de la mitocondria. Además de su potencial para terapia génica, la introducción y expresión de un gen exógeno en la mitocondria proporcionaría una herramienta invaluable para la comprensión de la expresión del genoma mitocondrial y su regulación.

Traductores Scarlet Rissi Juan Torres Mª Jose Perez Sofía Mena Yael Oñate Luis Ziehe Carlos Pino Paula Rozas Karina Romero Edición Darío Vásquez Segundo Medicina UCSC 2007

La mitocondria es un organelo pequeño (0.5 – 1 μm) localizado en el citoplasma de todas las células eucariotas (revisado en ref. 1). Son las responsables de la generación de ~90% del total de suministro de ATP de una célula, la principal fuente de energía de la cual depende la vida de la célula. El número de mitocondrias por célula (10 – 2.000 en células somáticas y más de 100.000 en ovocitos) es dependiente de los requerimientos energéticos del respectivo órgano. Órganos metabólicamente muy activos como el hígado, el cerebro y el músculo esquelético poseen el mayor número de mitocondrias y son los principales órganos afectados por patologías mitocondriales. La mitocondria contiene su propio genoma, el ADN mitocondrial (mtADN). Cada mitocondria tiene 2 – 10 copias de mtADN, que codifica para algunas de las proteínas involucradas tanto en la síntesis de ATP

citoplasma de la célula y luego transferidas a la mitocondria por un sistema específico de transporte. La mitocondria esta compuesta por dos estructuras altamente especializadas: la membrana externa y la membrana interna, las cuales la dividen en dos compartimentos: el espacio intermembrana y la matriz.

Figure 1. The human mitochondrial genome, genetic and transcription map. HSP, promoter for heavy (H) strand transcription; LSP, promoter for light (L) strand transcription; OH and OL, origins of replication for H and L strands, espectively; Dloop, displacement loop; 12S and 16S rRNA, mitochondrial 12S and 16S ribosomal RNAs; ND 1 to ND 6, genes encoding complex I subunits; Cyt b, cytochrome b of complex III; COX I to COX III, genes encoding complex IV subunits; ATPase 8 and ATPase 6, genes encoding ATPase/ATP synthase; F, V, L, I, M, W, D, K, G,R, H, S, T, Q, A, N, C, Y, E, P, transfer RNAs using single letter amino-acid abbreviations. Numbered portions of the genome represent transcripts of H and L strands according to Ref. 4.

como de ARN ribosomal mitocondrial (rARN) y ARN de transferencia (tARN). La presencia de un genoma que se replica y expresa autónomamente en la mitocondria ha sido explicada por la endocitosis de procariotes en eucariotas primitivas, seguido por el desarrollo de una relación simbiótica. No obstante, la mitocondria ha perdido mucha de su autonomía durante la evolución, como consecuencia de la disminución del tamaño de su genoma. Son completamente dependientes de proteínas codificadas por el genoma nuclear, las que son sintetizadas en el

Los constituyentes principales de la membrana externa son canales que facilitan el transporte a través de la membrana de moléculas con una masa molecular hasta 10 kDa. Esta membrana contiene también enzimas que convierten lípidos en sustratos para ciclos metabólicos localizados en la matriz mitocondrial.

La membrana interna se encuentra muy doblada para crear crestas que aumentan la superficie de la membrana. Es impermeable a iones, una propiedad esencial para mantener un gradiente electroquímico para la función de la ATPasa/ATP sintasa, una enzima localizada en la membrana interna que produce ATP por fosforilación oxidativa. Dos otros tipos de proteína son componentes integrales de la membrana interna: canales específicos que regulan la transferencia de sustratos a través de la membrana, y proteínas de la cadena respiratoria (complejos I, II, III y IV). Estas últimas generan la posterior reoxidación de dos coenzimas

NADH + H y FADH, localizadas en la matriz y que permiten la transferencia electrónica y el bombeo de protones para crear el gradiente electroquímico. La matriz contiene enzimas involucradas en la oxidación de piruvato y ácidos grasos, el ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo de Krebs) y el ciclo de la urea. También contiene el mtADN, polisomas mitocondriales, tARN y varias enzimas necesarias para la replicación autónoma, transcripción y traducción del mtADN.

El genoma mitocondrial Muchos genes mitocondriales de mamiferos han sido secuenciados, ellos son circulares, ADN de doble hebra con un tamano de 16 – 17 Kb. Los origenes de replicacion para de las 2 hebras de AND tienen diferentes lugares en este AND. El genoma mitochondrial guarda 37 genes. Ellos codifican los 2 ARN ribosomales, 22 ARN de transferencia y 13 genes mas que codifican subunidades de muchos complejos de la cadena de respiracion mitochondrial; 28 de estos genes estan ubicados en la banda H de la hebra de mtDNA, de los cuales 12 o 13 codifican subunidades proteicas. Los genes restantes estan localizados en la hebra L. La presencia de genes de las dos hebras implica que ambas son transcribibles. El mtDNA esta organizado en genes contiguos sin intrones.Las secuencias intergenicas son raras. La mas larga, la D-Loop (Loop de dislocacion), es de alrededor de 1 Kb de longitude, contiene muchas zonas de regulacion de replicacion y transcripcion del genoma mitochondrial. Muchas caracteristicas diferencian el genoma mitochondrial del nuclear (1) El mtDNA es inherentenmente maternal, siendo

transmitido por el citoplasma del oocito. Hay una muy baja cantidad de mitocondrias paternales en los espermatozoides, los cuales son eliminados en el embrion, tienen un efecto insignificante en el contenido mitochondrial del descendiente. (2) El genoma mitocondrial no es replicado en sincronizacion con la division cellular. (3) El codigo genetico mitochondrial de mamiferos difiere del codigo gentico universal en 4 codones (UGA: Stop --7 Trp; ADA: He --7 Met; AGA: Arg --7 Stop; AGG: Arg --7 Stop). (4) La mayor frecuencoia de mutaciones en el genoma mitochondrial (10 a 100 veces mas que en el genoma nuclear), es probable por el resultado de la carencia de histonas y su efecto protector, y quiza por la ausencia de un sistema de reparacion de AND efectivo y exacto. Como sea, esto ultimo es aun controversial. (5) En contraste a los inherentes desordenes geneticos causados por mutaciones en el genoma nuclear los cuales estan presentes en todas las celulas del individuo, pacientes con enfermedades mitocondriales raramente tienen solo mtDNA mutante (homoplasmy). En general el tipo salvaje (wild-type) y mtDNA mutante coexisten en sus celulas (heteroplasmy), y la cantidad de los 2 tipos varia segun los tejidos y celulas a traves de la vida, debido de la distribucion al azar de mitocondrias en las celulas hijas durante la division cellular. Por cada tejido, un diferente umbral de mtDNA mutante tiene que ser alcanzado antes que el fenotipo patologico, causado por la mutacion, se manifieste

Desórdenes mitocondriales Tradicionalmente los desórdenes mitocondriales han sido definidos como condiciones heredadas causadas por

deficiencias de proteínas que funcionan en la mitocondria (revisado en referencias 13, 14). No obstante, las mutaciones mitocondriales adquiridas han sido reconocidas como contribuyentes en enfermedades degenerativas. Pacientes con mitocondriopatías se presentan con una variedad de síntomas clínicos, y la manifestación en un órgano depende no sólo de la expresión de los genes mutados en el tejido, sino también en los requerimientos energéticos del respectivo tejido. Los órganos mas usualmente afectados son el corazón, músculo esquelético y Sistema Nervioso Central, pero otros órganos pueden estar involucrados, cada uno por si solo o en combinación. Las enfermedades mitocondriales se pueden clasificar bioquímicamente en tres categorías: 1) Deficiencias de enzimas involucradas en el transporte de solutos a través de las membranas mitocondriales. 2) Deficiencias de enzimas de ciclos metabólicos en las mitocondrias. 3) Deficiencias de la cadena respiratoria que principalmente causan miopatías mitocondriales. Diferentes mutaciones en el genoma nuclear, algunas de las cuales han sido identificadas, son responsables de las dos primeras categorías de defectos. Se han observado muchas deficiencias en la cadena respiratoria. Estas son: 1) deficiencias en cada uno de los complejos, encontradas en el siguiente orden de frecuencia: Complejo I > IV > III > II y V. 2) Deficiencias combinadas (en general de I y IV) y 3) Mas raramente deficiencias generalizadas de la cadena respiratoria. Algunas de estas deficiencias,

como las del complejo V son resultado de mutaciones en el genoma nuclear. De todos modos, mutaciones de delecion del genoma mitocondrial también son responsables de un número de neuropatías mitocondriales causadas por deficiencia de la cadena transportadora de electrones. Mutaciones Puntuales

Mutaciones puntuales ocurren en el ARNt mitocondrial, en genes de RNAr y en genes codificantes de proteínas. Mutaciones de genes que codifican de ARNt (asociado con Myoclonic epilepsy and ragged red fiber (MERRF) y encefalomiopatía mitocondrial con acidosis láctica y episodios stroke-like) y ARNr (asociado con sordera inducida por aminoglicosido (AID)) son de herencia materna y conducen a una traducción ineficiente de ARN mensajeros mitocondriales. Mutaciones en genes codificantes de proteínas (asociados con la neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON) y debilidad muscular neurogénica, ataxia y retinitis pigmentosa (NARP)) son responsables de sustituciones aminoacidicas en la secuencia proteica y también son de herencia materna. Mutaciones en el gen de ATPasa 6 también se heredan maternalmente y en el síndrome de Leigh. De todas formas, este síndrome ha sido recientemente relacionado con una deficiencia en el complejo II de origen nuclear. Deleciones

Las deleciones del ADN mitocondrial se encuentran en miopatias oculares, síndrome de Kearns-Sayre, enfermedad de Pearson y síndrome de Wolfrom. Estas deleciones ocurren casualmente en una región particular

del ADN mitocondrial, lindado en el inicio del gen para COX I (codificante de las subunidades del complejo I) y el final del gen de citocromo b. El tamaño de estas deleciones varia entre 1 y 8 Kb, y se han clasificado mas de 120 deleciones diferentes. Dos de ellas son llamadas comunes, porque están presentes en cerca de un 60% de los pacientes afectados por deleción. La herencia mendeliana recesiva y dominante se muestra en oftalmoplejia progresiva externa (PEO); pacientes que poseen deleciones múltiples de 2.0-10.0 kb y por lo menos dos loci nucleares han sido relacionados a su presencia. Se ha sugerido que estos codifican factores nucleares que son importados en la mitocondria y juegan un rol importante en replicación mitocondrial. Mutaciones o ausencia de estos factores pueden causar deleciones por una replicación defectuosa del ADN mitocondrial. Duplicaciones

También han sido reportadas duplicaciones en el DNA mitocondrial. Duplicaciones parciales se originan por inserción de una molécula de DNAmt delecionado en una molécula normal. En las duplicaciones en tandems dos ADNmt forman un dímero. El ADNmt duplicado de tamaño variante entre 23 y 26.5 kb pueden, en algunos casos, representar un estado intermedio para la formación de moléculas de ADNmt delecionado.

Fig.2 Localización de las mutaciones puntuales, deleciones y duplicaciones más comunes en el genoma mitocondrial, responsables de desórdenes. Las mutaciones puntuales se indican con una flecha en la posición del nucleótido en el genoma mitocondrial de acuerdo a la numeración en ref.4. Los

números entre paréntesis representan la posición de las mutaciones menos frecuentes. Los nombres de los síndromes asociados aparecen entre paréntesis: LHON neuropatía óptica de Leber; NARP debilidad muscular neurogénica, ataxia y retinitis pigmentosa; MERRF epilepsia mioclonica asociada a ragged red fibers; MELAS encefalomiopatia mitocondrial, acidosis láctica episodios strokelike; PEO oftalmoplejia progresiva externa; AID sordera inducida por aminoglicosido. 1 y 2 indican la región de las deleciones 4997 y 7436 pb, respectivamente; 3 indica la región del síndrome de la delecion autonómica dominante y de muchos de los casos espontáneos de deleción.

Los tratamientos actuales para el trastorno mitocondrial En la actualidad, no hay un tratamiento eficaz para la mayoría de los trastornos mitocondriales El principal criterio que se ha utilizado hasta la fecha es la aplicación de un tratamiento farmacológico para evitar los defectos metabólicos o para favorecer las rutas metabólicas alternativas. Por ejemplo, el benzoato de sodio o el fenilacetato de sodio se da a los pacientes con defectos enzimáticos situado en el ciclo de la urea con el fin de desarrollar una ruta alternativa para la excreción del exceso de nitrógeno metabólico. Para las miopatías mitocondriales, los electrones aceptores como los de la vitamina C, los de la Menadiona, los de la ribot1avin o los de la coenzima Q 10 se utilizan para compensar deficiencias en los complejos de la cadena respiratoria de electrones. Esto mejora la condición del paciente en el corto plazo, pero no puede detener la progresión de la enfermedad. En los casos más graves, se ha intentado el trasplante de órganos: por ejemplo, los trasplantes de hígado por deficiencias es la ornitina transcarbamilasa

(OTC) y el trasplante de corazón para la cardiomiopatía

Terapia génica para los trastornos mitocondriales La terapia génica puede proporcionar estrategias para el tratamiento causal de tales patologías. Este enfoque puede ser definido como la entrega de un homólogo funcional de un gen defectuoso de una célula somática, a fin de corregir una deficiencia de las funciones celulares. Idealmente, esto debería conducir a la persistencia de la expresión de genes terapéuticos en los niveles fisiológicos adecuados en las células, después de una sola aplicación. La obtención de este objetivo por recombinación homóloga in vivo en este momento no es factible por razones técnicas. Sin embargo, varias estrategias alternativas de terapia génica que se han desarrollado, son también aplicables a algunas patologías mitocondriales

Reparto genético al núcleo celular Para corregir una deficiencia causada por una mutación en un gen nuclear, la estrategia más obvia es complementar el gen defectuoso, mediante el uso de una terapia (génica) que emplee un vector expresante del gen correcto después de alcanzar el núcleo celular. En este caso, el transgen es transcrito en el núcleo, y a continuación el transcrito es transportado al citosol para la transducción. La proteína Normal Resultante es trasportada selectivamente hacia la mitocondria mediante un mecanismo de Importación Natural basado en la identificación de una secuencia peptidica señal (alrededor de 20 residuos aminoacídicos ubicados en el extremo N- Terminal de la secuencia de la proteína activa), esta es posteriormente incluida en la matriz mitocondrial. Esta

aproximación deducida a partir de la CLASICA estrategia de terapia génica desarrollada para genes nucleares codificantes, y la opción de un sistema vector portador de genes terapéuticos define la eficiencia de la transfección, el nivel y la duración de la expresión de genes terapéuticos y los posibles efectos del sistema. Sistemas de Reparto genético empleando Vectores virales recombinantes (ver tabla) y no virales pueden ser usados para esta aproximación. Sin embargo, ellos son aun poco eficientes para el reparto génico y son actualmente usados mayoritariamente para transferir plásmidos, los cuales (presentando un problema), no son mantenidos por las células en división por lo que requieren repetidas aplicaciones. No es una sorpresa que los vectores no-virales NO hayan sido usados en acercamientos para terapia de enfermedades mitocondriales. Dado el bajo número de genes nucleares conocidos codificantes para proteínas mitocondriales y la ausencia de modelos animales para enfermedades mitocondriales, solo unos pocos experimentos de terapia génica han sido intentados para corregir este tipo de patologías. Sin embargo, 2 modelos en ratones para la deficiencia de OTC, en ratones del tipo sparse-fur (Spf)) y Spf –ash (donde ash stands para anormalidad de piel y cabello), han otorgado la base de la terapia genica para esta enfermedad usando vectores adenovirales y retrovirales, demostrando la prueba para el principio de la terapia génica en enfermedades mitocondriales cromosomalmente no hereditarias.

La inyección endovenosa de un 1ª generación de vector adenovirus conteniendo el OTC cDNA de rata en ratones Spf-ash recién nacidos produjo variados incrementos en la actividad hepática OTC en algunos animales, por otro lado la transferencia viral del gen OTC fue expresada en un ratón de 15 semanas después de la administración viral, mostrando una actividad hepática OTC de 50% del nivel normal y normalizando el Sparse- Fur fenotipo característico de los ratones con deficiencia OTC. Usando una 2ª generación de adenovirus OTC construido, un grupo de científicos (Ye et al), consiguió la corrección del defecto metabólico en los ratones Spf adultos por un periodo de 2 semanas. Una corrección bioquímica parcial de la deficiencia OTC fue también obtenida en hepatocitos primarios de ratones Spf Y Spf –ash, después de la transducción con un vector retroviral conteniendo el OTC cDNA humano. Deficiencias en branched-chain Cetoácido Deshidrogenasa (BKDH) y Ornitina Aminotransferasa (OAT) también se han intentado tratar con estrategias de expresión nuclear. Mueller et al, obtuvieron una corrección total de la deficiencia BCKDH en fibroblastos cultivados después de haber sido infectados con retrovirus expresantes de secuencias génicas codificantes para la subunidad E2 del complejo multienzimático BCKDH, el 75% de la actividad nativa de esta enzima fue encontrada en estos fibroblastos en cultivo al menos 7 semanas después de la transducción . Sullivan et al obtuvieron una sobreexpresión de la actividad nativa OAT en más de 150 ocasiones en epitelio pigmentador de la retina humana cultivado

usando una 1ª generación de vectores adenovirales. Estos acercamiento convencionales basados en terapia génica podrían ser usados también para corregir enfermedades mitocondriales causadas por una sóla mutación en una proteína codificada por el genoma mitocondrial, como en el caso de LHON o NARP. En cada caso, la diferencia en el código genético entre el núcleo y la mitocondria tiene que ser tomado en cuenta para la construcción de una secuencia genética correctiva. Gracias a los grandes avances en la síntesis de oligonucleótidos y la tecnología PCR, este problema ha sido resuelto. En síntesis, una secuencia codificante para una secuencia peptídica señal específica, necesaria para el proceso de importación de la proteína terapéutica hacia la mitocondria, debería ser añadida la región 5´ (prima) del gen terapéutico. Nagley et al, demostraron la potencialidad de esta aproximación terapéutica para la corrección de los defectos en el DNA mitocondrial, en levaduras mutantes con una delección en el gen de la ATP-asa 8. Después de la expresión nuclear del gen modificado para la ATP-asa 8 mitocondrial en las condiciones ya mencionadas, una subunidad ATP-asa 8 funcional fue sintetizada en el citosol e importada hacia la mitocondria, corrigiendo de esta forma el defecto ATPásico en este organismo.

Entrega génica a la mitocondria Ya que el genoma mitocondrial de los mamíferos es esencialmente un episoma multi-copiado presente en todos los tipos celulares; nosotros, además de otros investigadores, hemos presentado la

interrogante de si este genoma puede ser manipulado con el fin de corregir una mutación mitocondrial o si puede incluso expresar un gen extraño dentro de la mitocondria. Como la mitocondria posee su propia maquinaria de replicación, transcripción y traducción, un gen exógeno insertado dentro del mtDNA puede ser propagado y expresado de manera estable, sin ser integrado dentro del genoma nuclear. Además, si la mitocondria puede ser explotada para este propósito, quizás puede ser usada también como un sistema de entrega no-patogénico y no-inmune. Sin embargo, a pesar del pequeño tamaño del genoma mitocondrial, el progreso en esta área está quedando muy atrás de los avances en la transferencia génica nuclear. Probablemente, el desafío más importante en el presente es el de desarrollar procedimientos para la introducción de DNA en la mitocondria. Idealmente, esto debería lograrse con células intactas o incluso tejido. Sin embargo, la doble membrana mitocondrial ha hecho de esto una tarea desafiante, incluso con el organelo aislado. Como se señalo anteriormente, estas membranas presentan estrictas barreras físicas y funcionales, las que son atravesadas naturalmente solo por procesos selectivos de transporte activo. Si se usan otros medios para entrar, la membrana interna debe ser atravesada sin pérdida del estado dual de las membranas, que es esencial para la función mitocondrial. Mecanismos de importación naturales para ácidos nucleicos son solo conocidos en unas pocas moléculas de RNA. tRNA ha demostrado, in vivo e in vitro, ser selectivamente importado dentro de la

mitocondria de levadura; este transporte requiere, en el sistema in vivo, la presencia de al menos 2 proteinas citoplasmáticas. Un mecanismo similar en células de mamífero es hasta ahora desconocido, pero se piensa que un nucleótido-135 de RNA, codificado nuclearmente, es requerido para el procesamiento de RNA mitocondrial y, por lo tanto, debe ser importado dentro de la mitocondria. Sin embargo, esto es aun controversial y, por ser estos mecanismo de transporte desconocidos, su uso para la importación de ácidos nucleicos foráneos no es factible. Varias técnicas para la introducción de DNA foráneo en la mitocondria han sido probadas. Intentos tempranos de transferir fagos liposomalmente encapsulados y marcados fluorescentemente en mega-mitocondrias de células de hígado de ratón, no han sido continuados, probablemente por la baja eficiencia de este procedimiento.

Bombardeo biolístico Varias investigaciones han exitosamente introducido DNA externo en mitocondrias y cloroplastos, respectivamente, de la levadura, Chlamydomonas y plantas mediante bombardeo biolístico de todas las células con DNA unido a partículas de tungsteno de ~0,51 μm. Aunque no sin problemas, esto ha conducido a la restauración de la funcion de estos organelos, pero no ha sido un éxito en células de mamíferos o en aisladas mitocondrias de mamíferos.

Secuestro de la vía de importación de proteínas El cotransporte de DNA con proteínas nucleares codificadas, que son naturalmente importadas hacia la mitocondria, o en el uso

de sus péptidos de señal de objetivo mitocondrial, es una aproximación fisiológica a este problema. Oligonucleótidos (24 nucleotidos) puedes ser transferidos in Vitro hacia aisladas mitocondrias de levaduras como conjugados con una proteína de fusion que contiene una presecuencia mitocondrial (derivado del precursor de la subunidad IV de la citocromo oxidasa de la levadura) y una enzima nuclear codificada modificada (mouse dihidrofolato reductasa). En una extensión a este enfoque, Seibel han introducido una secuencia de 320 bp de DNA externo, covalentemente ligado a un oligopeptido Nterminal liderador de secuencia de OTC en mitoconrdias de ratas; 37% de este conjugado fue completamente traslocado en la matriz. La efectiva escisión de la presecuencia del DNA exógeno por el procesador peptidasa mitocondrial (MPP) después de la traslocacion podría ser esencial para permitir una eficiente replicación y transcripcion, y la conformacion lineal del DNA en este concepto podria tambien poseer un problema por su replicación y expresión en la mitocondria. Los autores especulan que esta aproximación podría ser usada en combinación con transferidor mediado por liposoma del DNAproteina conjugada en las celulas. Esto podria, de todas formas, decrecer substancialmente la eficiencia de todo el procedimiento. Taylor han recientemente sugerido el uso de este método mediante la introducción de oligomeros de acido nucleico de proteina antisentido en la mitocondria para selectivamente inhibir la replicación de genomas mitocondriales defectuosos en enfermedades mitocondriales causadas por un defecto mtDNA heteroplasmico.

Electroporación Una aproximación electroporética (la electroporación es una técnica que se basa en la aplicación de un elevado voltaje a las células durante un periodo de tiempo muy corto. Durante ese tiempo las células despolarizan sus membranas y se forman pequeños orificios por los que penetran las moléculas (proteínas, DNA etc) que se encuentran alrededor. Pasada la despolarización muchas células sufren daños irreparables y mueren (en muchos casos más del 90%) pero algunas (5 al 10% habitualmente) se recuperan y han incorporado las moléculas deseadas. La ventaja de esta técnica es que se aplica a millones de células a la vez y habitualmente se obtienen eficiencias de entrada de las moléculas del 100% de las células que sobreviven (centenares de miles a millones). ) para introducir un plásmido de DNA exógeno de 7.2 kb en la matriz de una mitocondria aislada ha sido desarrollada en nuestro laboratorio recientemente. DNA completamente funcional puede ser introducido en una mitocondria intacta (como lo han demostrado ensayos enzimáticos de enzimas marcadoras, medición del estado de acoplamiento mitocondrial y microscopia electrónica). También hemos insertado, recientemente, una secuencia de DNA que codifica para la OTC humana (ornitina transcarbamilasa del inglés ornithine transcarbamylase, EC 2.1.3.3) según el uso del codón mitocondrial, en el genoma mitocondrial, entre dos tRNAs contiguos, dándole el potencial de ser procesado correctamente desde el transcrito primario mitocondrial. Así como con el procedimiento descrito anteriormente, para la introducción de DNA en la mitocondria por medio de

targeting de péptidos, el único criterio para juzgar el futuro potencial de éste método para terapia génica es la función. Por lo tanto estamos actualmente trabajando en la introducción de este procedimiento en mitocondrias aisladas y probando su expresión en un sistema transcripcióntraducción in organello. Si se puede mostrar la expresión exitosa de la secuencia de DNA introducida, el próximo paso sería la introducción de la mitocondria manipulada en células.

Introducción de mitocondrias “terapéuticas” en células. Debería ser posible microinyectar la mitocondria que contiene este genoma modificado en hepatocitos deficientes en OTC y en ovocitos de ratones spf o spf-ash (siglas para sparse fur (spf) y sparse fur-abnormal skin and hair respectivamente), proporcionando el primer sistema modelo para la corrección in vitro e in vivo de enfermedades mitocondriales, a través de la manipulación del genoma mitocondrial. Otro medio para la introducción in vitro de mitocondrias manipuladas en células puede ser la endocitosis. Tal procedimiento podría, quizás, ser mejorado cubriendo a la mitocondria con secuencias básicas de péptidos que lleven un ligando diana. Hemos usado tal idea para la entrega de genes mediada por receptor y hemos demostrado que un ligando diana de integrina permite la captación intracelular eficaz de un bacteriófago al interior de células de mamíferos. Recientemente, Kagawa y Hayashi han mostrado la corrección de células con un modelo de deficiencia mitocondrial por

medio de la transferencia de mitocondrias normales por fusión citoplástica in vitro. Ellos sugieren que podría ser posible usar esta técnica como una estrategia terapéutica in vivo mediante la infusión de citoplastos que contengan mitocondrias normales. Estos citoplastos podrían ser generados a partir de las células heteroplásmicas de un paciente por selección in vitro de mitocondrias normales, seguido de tratamiento con citocalasina. Los citoplastos deberían fundirse con las células afectadas, complementándolas con mitocondrias normales a un nivel por sobre el umbral necesario para prevenir la manifestación de la enfermedad.

Observaciones La expresión de una secuencia de ADN extranjeras en las mitocondrias de mamífero aislado abriría el camino para nuevos enfoques experimentales en comprender el genoma y la manipulación de expresión y su regulación, que podría dar lugar a estrategias de corrección genética de las enfermedades mitocondriales. El logro de este objetivo y / o la introducción eficaz de las mitocondrias en su conjunto somáticas in vivo de las células diana sería el último requisito para su aplicación en terapia genética. Todavía queda un largo camino por recorrer. Sin embargo, la introducción de toda manipulación de organelos es, en principio, similar a la del problema en vivo de la entrega de construcciones de cromosomas artificiales. En caso de resolverse, una vez más, en analogía con el sistema de cromosomas artificiales, sería posible comenzar a abordar la multitud de problemas que tendrán que ser resueltos por el uso de las mitocondrias y su sistema de la expresión de los genes, no sólo para la corrección de las enfermedades

mitocondriales, pero Quizá también por lo general estable, y no la integración de vectores de genes terapéuticos para la entrega.

Glosario Cromosomas Artificiales: un mínimo episomal estable de genes que contienen la construcción de telómeros, orígenes de la replicación del ADN y elementos para la función del centrómero. Puede replicarse y segregar durante la división celular como una entidad independiente y puede llevar grandes fragmentos genómica del gen de interés en las células diana. Bombardeo biolistica: Medios físicos de la entrega de genes a las células por bombardeo de alta velocidad (pistola de particulas) de las células con micropartículas de tungsteno recubiertas con el ADN de interés. Fusion de citoplastos: Citoplasto son células enucleadas por una combinación de centrifugación y tratamiento de citocalasina. Cuando el citoplasto se fusiona con células nucleadas, ellas transfieren sus mitocondrias a la otra celula. Heteroplasmido: describe celulas que contienen ambos: mutante y tipo salvaje de genoma mitocondrial. Histonas: son un grupo de proteinas cargadas muy positivamente. Son la principal proteina contenida en el núcleo y juega un rol fundamental en el empaquetamiento del DNA como estructuras de cromatina. Homoplasmido: descripción de celulas que contienen ambos genomas mitocondriales, mutante y “salvaje” (entiéndase como natural) Transcripción/Traducción en organelos: porque de las caracteristicas especificas de la expresión genica mitocondrial, transcripcion/traducción mitocondrial in Vitro tiene que llevarse a cabo con las mitocondrias aisladas intactas.

Peptido lider: Una breve secuencia de aminoácidos situados en la N - terminal de algunas proteínas inmaduros. Tiene la capacidad de orientar las proteínas intracelulares a su sitio de funcion tales como mitocondria o al retículo endoplasmático. El péptido líder es escindida fuera funcional en la proteína madura. Megamitocondria: Grandes mitocondrias hasta alrededor de seis veces el tamaño de las mitocondrias normales, generados in vivo en ratones con la alimentación por cuprizone.(bisciclohexanona oxaldihidrazona) Vectores no virales: Estos evitan la toxicidad / inmunogenicidad y la posible inserción de mutagénesis /oncogénesis de vectores virales. Liposomas catiónicos con la capacidad de obligar a la transferencia de ADN entre las células por endocitosis / fagocitosis son las más utilizadas. Vectores virales: Virus recombinantes se prestan normalmente para replicación deficientes por la eliminación de partes esenciales de la naturaleza del tipo de genoma, que son sustituidos por un casete que contiene la expresión de genes terapéuticos.