Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Benda bercahaya seperti matahari atau bohlam listrik memancarkan spektrum yang lebar terdiri atas panjanggelombang. Panjang gelombang yang dikaitkan dengan cahaya tampak itu mampu mempengaruhi selaput pelangi mata manusia dan karenanya menimbulkan kesan subyektif akan ketampakan (vision). Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200 – 380 nm), daerah visible (380 – 700 nm), daerah inframerah (700 – 3000 nm) (Khopkar 1990). Menurut Cairns (2009), spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna terbentuk. Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu : Sumber Cahaya Monokromator Kuvet Detector
Prinsip dasar spektrofotometri ini adalah apabila suatu sinar melalui senyawa tertentu, maka senyawa tersebut akan menyerap sinar dengan panjang gelombang tertentu. Warna senyawa (larutan) tergantung pada jenis sinar yang dipancarkan yang tertangkap oleh mata kita, sehingga senyawa ada yang berwarna maupun yang tidak berwarna (Suhartono,1989). Keuntungan utama pemilihan metode spektrofotometri ini adalah bahwa metode ini memberikan metode sangat sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang sangat kecil. Spektrofotometri menyiratkan pengukuran jauhnya penyerapan energi cahaya oleh suatu sistem kimia itu sebagai suatu fungsi dari panjang gelombang radiasi, demikian pula pengukuran penyerapan yang menyendiri pada suatu panjang gelombang tertentu. Analisis spektrofotometri digunakan suatu sumber radiasi yang menjorok ke dalam daerah ultraviolet spektrum itu. Dari spektrum ini, dipilih panjang-panjang gelombang tertentu dengan lebar pita kurang dari 1 nm(Sastrohamidjojo,1999). kalibrasi menurut ISO/IEC Guide 17025:2005 dan Vocabulary of International Metrology (VIM) adalah serangakaian kegiatan yang membentuk hukuman antara nilai yang ditunjukkan oleh instrumen ukur atau sistem pengukuran atau nilai yang diwakili oleh bahan-bahan ukur dengan nilai-nilai yang sudah diketahui yang berkaitan dengan besaran yang diukur dalam kondisi tertentu.
Dengan kata lain, kalibrasi adalah kegiatan untuk menentukan kebenaran konvensional nilai penunjukkan alat ukur dan bahan ukur dengan cara membandingkan terhadap standar ukur yang mampu telusur (traceable) ke standar nasional untuk satuan ukuran dan/atau internasional. Sementara interval kalibrasi adalah : 1. Kalibrasi harus dilakukan secara periodik. 2. Selang waktu kalibrasi dipengaruhi oleh jenis alat ukur, frekuensi pemakaian, dan pemeliharaaan. ü Bisa dinyatakan dalam beberapa cara :
Dengan waktu kalender
Dengan waktu pemakaian
Kombinasi cara pertama dan kedua, tergantung mana yang lebih dulu tercapai.