R.murray, Granner P.mayes, V.rodwell - Biochemia Harpera

BIOCHEMIA HARPERA

a LANGE medical book

Harper's

Biochemistry Twenty-second Edition

Robert K. Murray, MD, PhD Professor of Biochemistry Universtty of Toronto Daryl K. Granner, MD Professor and Chairman Department of Moiecuiar Physiology and Biophysics Professor of Medicine Vanderbitt University Nashville, Tennessee Peter A. Mayes, PhD, DSc Reader in Biochemistry Royał Veterinary College University of London Victor W. Rodwell, PhD Professor of Biochemistry Purdue University West Lafayette, Indiana

Prentice-Hall International Inc.

Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Victor W. Rodwell

BIOCHEMIA HARPERA Wydanie III Redaktor naukowy tłumaczenia Franciszek Kokot

IHhl. Medyczna CM ID

1816004318

Warszawa 1995 Wydawnictwo Lekarskie PZWL 50LAT

Copyright for the Polish Edition by ydawnictwo Lekarskie PZWL J994, 1995

Z oryginału angielskiego Harper's Biochemistry ed. 22 Copyright © 1990 by Appleton Lange Ali Rights Reserved i rozdz. 60, 64 z oryginału angielskiego Harper's Btochemistry ed. 23 Copyright © 1993 by Appleton Lange Alt Rights Reserved

pod red. prof. dra hab. FRANCISZKA KOKOTA Tłumaczyli Doc. med. ZENON ALEKSANDROWICZ (rozdz. 12—19) Prof. dr hab. MIECZYSŁAW CHORĄśY (rozdz. 35—42) Prof. dr hab. MARIAN DRÓśDś (rozdz. 57, 58) Prof. dr hab. ZOFIA KILAŃSKA (rozdz. 2—5) Prof. dr hab. LEOKADIA KŁYSZEJKO-STEFANOWICZ (rozdz. 1, 6, 32, 33) Prof. dr hab. FRANCISZEK KOKOT (rozdz. 44—56, 60, 62 i przedmowa) Prof. dr hab, WANDA MAŁGORZATA KRAJEWSKĄ (rozdz. 7, 10, l i , 34) Prof. dr hab. EUGENIUSZ KUCHARZ (rozdz. 63) Prof, dr hab. BOHDAN LEWARTOWSKI (rozdz. 59) Prof. dr hab. ANNA LIPIŃSKA (rozdz. 8, 9, 30, 31) Prof. dr hab. JERZY VETULANI (rozdz. 64) Prof. dr hab. TADEUSZ WILCZOK (rozdz. 43, 61) Prof. dr hab. MARIUSZ ZYDOWO (rozdz. 20—29) Projekt okładki i strony tytułowej Anna Dluiewaka Redaktorzy Krystyna Chąjęcka, Renata Piotrowska-Siemdzka Redaktor techniczny Joanna Głodowska Korektorzy Zespół

1SBN 83-200-1798-X Wydawnictwo Uliatskie PZWL Warszawa ]»5 Wydanie Iii Cieszyńska Drukarnia Wydawnicza ul. Pokoju I, 43-400 Cieszyn Zam. nr 2543/K-94

PRZEDMOWA / 5

Przedmowa do wydania polskiego Do rąk Czytelnika oddajemy tłumaczenie 22. wydania „Biochemii Harpera". W trakcie tłumaczenia ukazało się wydanie 23. tej ksiąŜki, wzbogacone o kitka nowych rozdziałów w stosunku do wydania 22. Dlatego teŜ, chcąc dostarczyć Czytelnikom moŜliwie aktualnej wiedzy, postanowiono włączyć do wydania 22. dwa nowe rozdziały z wydania 23. („Erytrocyty i leukocyty" oraz „PodłoŜe biochemiczne niektórych chorób neuropsychiatrycznych"), uwzględniając stan wiedzy z końca 1992 r. Jako redaktor naukowy, odpowiedzialny za obecne polskie wydanie ksiąŜki, kieruję wyrazy głębokiego szacunku i podziękowania do wszystkich Współtłumaczy za trud włoŜony w tłumaczenie poszczególnych rozdziałów. Pragnę

podkreślić, Ŝe tłumaczenie ksiąŜki natrafiało na duŜe trudności w zakresie mianownictwa biochemicznego, często nie ustabilizowanego nie tylko w skali naszego kraju, lecz takŜe międzynarodowej. ToteŜ sądzę, Ŝe wartość merytoryczna, a nie nomenklaturowa, będzie głównym kryterium oceny ksiąŜki przez Czytelników. Pragnę wyrazić nadzieję, Ŝe i obecne wydanie „Biochemii Harpera" nie tylko spełni wymagania „starych" Czytelników tej ksiąŜki, lecz takŜe przysporzy jej wielu nowych Czytelników i przyjaciół.

Prof. dr hub. med. Franciszek Kokot

PRZEDMOWA / 7

Przedmowa „Biochemia Harpera" dostarcza zwięzłej, choć dostatecznie szerokiej, wiedzy dotyczącej podstaw biochemii i biologii molekularnej. Zawiera ona liczne przykłady na to, Ŝe wiedza biochemiczna jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów podtrzymujących zdrowie oraz przyczyn i racjonalnego leczenia licznych chorób, jakimi są szczególnie zainteresowani lekarze i inni pracownicy opieki zdrowotnej. Zmiany dokonane w wydaniu 22. Dwa cele przyświecały autorom przygotowującym obecne wydanie: 1) przedstawienie moŜliwie najnowszej wiedzy biochemicznej, potrzebnej przy studiowaniu medycyny oraz 2) dostarczenie studentom medycyny i innych nauk dotyczących zdrowia ksiąŜki interesującej i lubianej przez uŜytkownika. Odzwierciedleniem tego jest układ i treść nowego wydania. • Wszystkie rozdziały zostały przeredagowane z uwzględnieniem waŜnych postępów wiedzy biochemicznej. • We wstępie większości rozdziałów zasygnali zowano główne problemy będące ich treścią. • Zredukowano szczegółowe omawianie drugorzędowych szlaków metabolicznych. • Liczne ryciny zmodyfikowano w celu po prawienia ich czytelności. • Włączono nowe rozdziały dotyczące „Wody i pH", „Witamin rozpuszczalnych w wo dzie", „Witamin rozpuszczalnych w tłusz czach", „Utleniania kwasów tłuszczowych i ketogenezy", „śywienia" i „Przemiany ksenobiotyków". • W ostatnim rozdziale, który jest równieŜ nowy, znajduje się zwięzłe omówienie bio chemicznych aspektów przyczyn i mechaniz mów chorób. Na podstawie historii choroby 8 chorych zilustrowano uŜyteczność wiedzy biochemicznej dla medycyny. Przedstawione przypadki dotyczą głównych klas przyczyn chorobowych. Rozdział ten, wraz z suple mentem omawiającym testy laboratoryjne, stanowią pomost wypełniający dotychczaso wą lukę dzielącą biochemię od kliniki.

Układ ksiąŜki Tekst składa się z 3 rozdziałów wprowadzających i 6 głównych działów. Dział 1 jest poświęcony białkom i enzymom, będącym końmi roboczymi organizmu. PoniewaŜ większość reakcji zachodzących w komórkach ludzkich ma charakter enzymatyczny, jest istotne zapoznanie się z właściwościami enzymów przed omawianiem innych problemów. W dziale II przedstawiono a) róŜne reakcje komórkowe, w których zachodzi utylizacja lub wytwarzanie nośników energetycznych oraz b) szlaki syntezy i rozkładu węglowodanów i lipidów. Ponadto przedstawiono funkcję poszczególnych związków naleŜących do wymienionych klas cząsteczek. W dziale III omówiono poszczególne aminokwasy i ich losy oraz przemiany tych związków przebiegające ze zuŜytkowaniem lub wytwarzaniem energii. W dziale IV przedstawiono strukturę i funkcję kwasów nukleinowych oraz szlak DNA-tRNA->białka. W tej części opisano równieŜ zasady technologii rekombinacji DNA, tj. zagadnienie o niezwykłych implikacjach w dyscyplinach biomedycznych. Treścią działu V są hormony i ich kluczowa rola w komunikacji międzykomórkowej i regulacji poszczególnych szlaków metabolicznych. Po to, aby hormony mogły zadziałać na komórkę, muszą mieć kontakt z błonami komórkowymi. Nic więc dziwnego, Ŝe początek tego działu jest poświęcony strukturze i funkcjom błon. Dział VI składa się z 7 specjalnych rozdziałów, w tym nowego rozdziału omawiającego przemianę ksenobiotyków i biochemiczne aspekty niektórych chorób. W suplemencie podano zwięzłą interpretację wyników badań laboratoryjnych i główne ich implikacje diagnostyczne.

8 / PRZEDMOWA

Podziękowanie Autorzy pragną wyrazić podziękowanie Panu Aleksandrowi Kugushewowi; wiele zmian dokonanych w tym wydaniu nie mogłoby być zrealizowanych bez Jego stałego zainteresowania, rady, „popychania sprawy" i zachęcania. Nasza wdzięczność naleŜy się równieŜ naszym zawodowym Kolegom i Przyjaciołom z całego świata za przekazane sugestie, mające na celu poprawienie ksiąŜki. Zachęcamy ich, aby w dalszym ciągu wykazali zainteresowanie ksiąŜką i nie szczędzili wysiłku w jej ulepszaniu. Za szczególnie cenne uwaŜamy opinie wyraŜone przez studentów.

Autorzy czują się szczególnie usatysfakcjonoszeroką akceptacją i poparciem ksiąŜki w ca ^ m świecie. Przedruki licznych wydań opublikowanych w języku angielskim ukazały sie w Japonii, Libanie, na Tajwanie, Filipinach oraz w Korei. Ponadto ksiąŜkę przetłumaczono na j ązy ^ włoski, hiszpański, francuski, portugalski, japoński, polski, niemiecki, serbsko-chorwacki i grecki, wam

, ■

_ RKM _ DKG _ PAM _ VWR

SPIS TREŚCI / 9

Spis treści 1. Biochemia i medycyna — Robert K. Murray ........................................................... 2. Biomolekuły i metody biochemiczne — Robert K. Murray .................................... 3. Woda i pH — Victor W. Rodwell ..............................................................................

Część I. Budowa oraz funkcje białek i enzymów 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

11 16 26

...................................

35

Aminokwasy — Victor W. Rodwell ........................................................................... Peptydy — Victor W. Rodwell ................................................................................. Białka: struktura i właściwości — Victor W. Rodwell ............................................ Białka; mioglobina i hemoglobina — Vtctor W. Rodwell ...................................... Enzymy: właściwości ogólne — Victor W. Rodwell .............................................. Enzymy: kinetyka — Victor W. Rodwell ................................................................... Enzymy: mechanizmy działania — Victor W. Rodwell ............................................ Enzymy: regulacja aktywacji — Victor W. Rodwell ..............................................

35 49 59 70 82 94 110 118

C z ę ś ć I I . B io e n e r g e t y k a i m e t a b o l i z m w ę g l o w o d a n ó w o r a z l i p i d ó w

131

12. Bioenergetyka — Peter A. Mayes ........................................................................... 13. Utlenianie biologiczne — Peter A. Mayes ................................................................ 14._ Fosforylacja oksydacyjna i mitochondrialne systemy transportujące — Peter A. Mayes ............................................................................ 15. Węglowodany o znaczeniu fizjologicznym — Peter A. Mayes .............................. 16. Lipidy o znaczeniu fizjologicznym — Peter A. Mayes ............................................ 17. Zarys przemian pośrednich — Peter A. Mayes ........................................................ 18. Cykl kwasu cytrynowego. Katabolizm acetylo-CoA— Peter A. Mayes ............... y 19. Glikoliza i utlenianie pirogronianu —Peter A. Mayes ........................................... 20. Metabolizm glikogenu — Peter A. Mayes ................................................................ v 21. Glukoneogeneza i kontrola stęŜenia glukozy we krwi — Peter A. Mayes ............ 22. Szlak pentozofosforanowy oraz inne szlaki przemiany heksoz — Peter A. Mayes 23. Biosynteza kwasów tłuszczowych — Peter A. Mayes ............................................. 24. Utlenianie kwasów tłuszczowych: ketogeneza — Peter A. Mayes ........................ 25. Metabolizm nienasyconych kwasów tłuszczowych i eikozanoidów — Peter A. Mayes ............................................................................................................................ 26. Metabolizm acylogliceroli i sfingolipidów — Peter A. Mayes ............................. 27. Transport i magazynowanie lipidów — Peter A. Mayes ......................................... 28. Synteza, transport i wydalanie cholesterolu — Peter A. Mayes ........................... 29. Integracja metabolizmu i dostarczanie substratów energetycznych do tkanek — Peter A. Mayes ..................................................................................................

131 139

Część III. Metabolizm białek i aminokwasów

147 161 173 188 198 207 217 226 239 251 260 274 284 294 314 329

.........................................

337

30. Biosynteza aminokwasów, które nie muszą być dostarczane w poŜywieniu — Victor W. Rodwell ......................................................................... 31. Katabolizm białek i azotu aminokwasów — Victor W. Rodwell ........................... 32. Katabolizm szkieletów węglowych aminokwasów — Victor W. Rodwell .............

337 344 357

10 / SPIS TREŚCI 33. Przemiana aminokwasów w wyspecjalizowane produkty — Victor W. Rodwell . 34. Porfiryny i barwniki Ŝółciowe — Robert K. Murray ...............................................

385 398

Część IV. Budowa, czynność i replikacja makrocząsteczek informacyjnych ...................................................................

415

35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42.

Nukleotydy — Victor W. Rodweil ........................................................................... Metabolizm nukleotydów purynowych i pi rym idy nowych — Victor W. RoJwell . Struktura i funkcja kwasów nukleinowych — Dary! K. Granner .......................... Organizacja i replika DNA — Dary/ K. Granner ........................................................ Synteza, przekształcenie i metabolizm RNA — Dary/ K. Granner ........................ Synteza białek i kod genetyczny — Dary/ K. Granner ............................................ Regulacja ekspresji genu — Dary/ K. Granner ........................................................ Technologia rekombinacji DNA — Dary/ K. Granner ............................................

415 425 443 456 476 491 508 529

Część V. Biochemia zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej komunikacji ...........................................................

549

43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52.

Błony: struktura, organizacja i funkcja — Dary/ K. Granner .................................... Charakterystyka układów hormonalnych — Dary I K. Granner ............................. Działanie hormonów — Dary! K. Granner ................................................................ Przysadka mózgowa i hormony podwzgórza — Dary/ K. Granner ......................... Hormony tarczycy — Dary/ K. Granner .................................................................. Hormony regulujące przemianę wapniową — Dary/ K. Granner ........................... Hormony kory nadnerczy — Dary/ K. Granner ........................................................ Hormony rdzenia nadnerczy — Dary! K. Granner .................................................. Hormony gonadalne — Dary I K. Granner ................................................................ Hormony trzustki i Ŝołądkowo-jelitowe — Dary/ K. Granner .................................

549 573 584 599 612 619 629 645 652 671

C z ę ś ć V I . Z a g a d n i e n i a w y b r a n e ............................................................................

693

53. 54. 55. 56. 57. 58.

693 710 721 734 749

Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w wodzie — Peter A. Mayes . . . Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w tłuszczach — Peter A. Mayes . . śywienie — Peter A. Mayes ...................................................................................... Trawienie i wchłanianie — Peter A. Mayes ............................................................. Glikoproteiny i proteoglikany — Robert K. Murray ............................................... Białka osocza, immunoglobitliny i czynniki krzepnięcia — Elizabeth J. Harfenist Robert K. Murray ............................................................. 59. Białka kurczliwe i strukturalne — Victor W. Rodwell, Robert K. Murray, Frederick W. Keetey ................................................................... 60. Metabolizm ksenobiotyków — Robert K. Murray ................................................. 61. Rak, onkogeny i czynniki wzrostowe — Robert K. Murray .................................... 62. Biochemia a choroby — Robert K. Murray ............................................................. 63. Erytrocyty i leukocyty — Robert K. Murray .............................................................. 64. PodłoŜe biochemiczne niektórych schorzeń neuropsychiatrycznych — Robert K. Murray ................................................................................................... Dodatek ............................................................................................................................... Skróty spotykane w biochemii ......................................................................................... Skorowidz ......................................................................................................................... '.

770 794 817 824 842 865 887 910 930 935

Biochemia i medycyna Robert K. Murray, MD, PhD

WPROWADZENIE Biochemia jest to nauka zajmująca się róŜnorodnymi molekułami i związanymi z nimi reakcjami chemicznymi, które zachodzą w Ŝywych komórkach i organizmach. KaŜda informacja wykraczająca poza skrajnie powierzchowną wiedzę o Ŝyciu — we wszystkich jego zróŜnicowanych przejawach — wymaga poznania biochemii. Co więcej, studenci medycyny, zdobywając solidną porcję wiedzy z zakresu biochemii, będą w stanie skonfrontować zarówno w praktyce, jak i w pracy badawczej 2 podstawowe problemy wszystkich nauk medycznych: 1) zrozumienie, jak zachować zdrowie oraz 2) zrozumienie istoty chorób i ich skuteczne leczenie. Biochemia to chemia Ŝycia Biochemię moŜna, bardziej konwencjonalnie, zdefiniować jako naukę dotyczącą chemicznych podstaw Ŝycia (gr. bios — Ŝycie). Komórka jest strukturalną jednostką organizmu Ŝywego. RozwaŜenie tej koncepcji prowadzi do funkcjonalnej definicji biochemii, jako nauki zajmującej się chemicznymi składnikami Ŝywych komórek oraz reakcjami i procesami, którym one ulegają. Zgodnie z nią biochemia obejmuje przepastne obszary biologii komórki i całość biologii molekularnej. Zadaniem biochemii jest opisanie i wyjaśnienie na poziomie molekularnym wszystkich procesów chemicznych zachodzących w Ŝywych komórkach Głównym celem biochemii jest dogłębne poznanie na poziomie molekularnym wszystkich procesów chemicznych związanych z Ŝyciem komórki. Aby wypełnić to zadanie, biochemicy

usiłują wyizolować liczne molekuły znajdujące się w komórkach, określić ich strukturę i zanalizować, jak funkcjonują. Przykładem takich działań są próby zrozumienia molekularnych podstaw skurczu — procesu związanego przede wszystkim, ale nie wyłącznie, z komórkami mięśniowymi, co wymaga oczyszczenia wielu cząsteczek zarówno prostych, jak i złoŜonych, a następnie poddania ich szczegółowym badaniom strukturalno-funkcjonalnym. Dzięki tym wysiłkom ustalono niektóre cechy molekularnych podstaw skurczu mięśni. Kolejnym zadaniem biochemii jest usiłowanie docieczenia, jak powstało Ŝycie. Wiedza na ten fascynujący temat pozostaje nadal w powijakach. Zasięg biochemii jest tak niezmierzony, jak samo Ŝycie. Gdziekolwiek to Ŝycie się pojawia, tam zachodzą procesy chemiczne. Biochemicy badają je w mikroorganizmach, roślinach, owadach, rybach, ptakach, u niŜszych i wyŜszych ssaków oraz u ludzi. Studenci nauk biomedycznych będą zainteresowani zwłaszcza biochemią 2 ostatnich grup. NaleŜy jednak docenić równieŜ biochemię mniej skomplikowanych form Ŝycia, często bezpośrednio związaną z biochemią człowieka. Ma przykład współczesne teorie regulacji aktywności genów i enzymów u ludzi emanują z pionierskich badań dotyczących droŜdŜy piekarskich i bakterii. Dziedzina rekombinacji DNA wyłoniła się z doświadczeń na bakteriach i ich wirusach. Szybkość namnaŜania się (multyplikacji) i łatwość wyekstrahowania ich materiału genetycznego czynią je odpowiednimi dla genetycznych analiz i manipulacji. Wiedza zdobyta z badania genów wirusów odpowiedzialnych za niektóre typy raka u zwierząt (wirusowych onkogenów) zapewniła gruntowny wgląd, w jaki sposób komórki ludzkie stają się nowotworów ymi.

12 / ROZDZIAŁ 1

Znajomość biochemii jest istotna dla wszystkich nauk przyrodniczych, z medycyną włącznie Biochemia kwasów nukleinowych leŜy w sercu genetyki; z kolei zastosowanie metod genetycznych staio się kluczowe do wyjaśnienia wielu dziedzin biochemii. Fizjologia, badająca funkcjonowanie organizmu, niemal kompletnie pokrywa się z biochemią. Immunologia posługuje się licznymi technikami biochemicznymi, a wiele podejść immunologicznych znalazło S2erokie zastosowanie w biochemii. Farmakologia i farmacja opierają się na rzetelnej znajomości biochemii i fizjologii, zwłaszcza Ŝe większość leków jest metabolizowana w reakcjach katalizowanych enzymatycznie, a skomplikowane interakcje pomiędzy lekami najlepiej zrozumieć za pomocą biochemii. Trucizny oddziałują na reakcje i procesy biochemiczne i to jest domeną toksykologii. Biochemiczne podejście znajduje coraz więcej zastosowania w badaniu podstawowych aspektów patologii (nauki o chorobach), np. stany zapalne, uszkodzenia komórek 1 nowotwory. Wiehi przedstawicieli mikrobiolo gii, zoologii i botaniki posługuje się niemal wyłącznie metodami biochemicznymi. Te po wiązania nie są zaskoczeniem, poniewaŜ Ŝycie, jak wiadomo, polega na reakcjach i procesach biochemicznych. Istotnie, dawne bariery mię dzy naukami przyrodniczymi padają, a bio chemia coraz bardziej staje się ich wspólnym językiem. Wzajemne oddziaływanie między biochemią a medycyną pobudza stały postęp w obu tych dziedzinach Jak wspomniano na początku tego rozdziału, 2 główne problemy pracowników nauk medycz nych, a zwłaszcza lekarzy, to: 1) zrozumienie, jak zachować zdrowie oraz 2) zrozumienie istoty chorób i ich skuteczne leczenie. Biochemia zapisała się na trwałe w obu tych fundamentalnych zagadnieniach medycyny. Faktycznie wzajemne oddziaływanie biochemii i medycyny to tak, jak szeroka dwukierunkowa ulica. Analizy biochemiczne wyjaśniły wiele aspektów z dziedziny zdrowia oraz choroby i odwrotnie, badanie róŜnych przejawów zdrowia i choroby otwiera coraz to nowe obszary przed biochemią. Wzajemna współpraca medycyny i biochemii ma waŜne implikacje filozoficzne dla tej pierwszej. Jak długo postępowanie lekarskie będzie mocno zakorzenione w gruntownej znajomości

biochemii oraz innych pokrewnych nauk podstawowych (np. fizjologii, mikrobiologii, Ŝywienia), tak długo medycyna praktyczna będzie miała racjonalną podstawę do zastosowania coraz to nowych osiągnięć wiedzy. Kontrastuje to jaskrawo z kultem niekonwencjonalnej medycyny, która często opiera się na niczym więcej niŜ na micie, poboŜnych Ŝyczeniach i braku bazy intelektualnej. PRAWIDŁOWE PROCESY BIOCHEMICZNE SĄ PODSTAWĄ ZDROWIA Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) definiuje zdrowie jako stan w pełni dobrego samopoczucia fizycznego, umysłowego i socjalnego, a nie tylko jako brak choroby lub zniedołęŜnienia. Z czysto biochemicznego punktu widzenia zdrowie moŜe być rozwaŜane jako sytuacja, » której wszystkie z wielu tysięcy reakcji wewnątrz- i zewnątrz komórkowych, zachodzących w organizmie, przebiegają z szybkością adekwatną do jego maksymalnego przetrwania w stanie fizjologicznym. Badania biochemików znajdują oddźwięk w odŜywianiu i medycynie prewencyjnej Głównym warunkiem zachowania zdrowia jest pobieranie w poŜywieniu optymalnej ilości związków chemicznych; głównymi z nich są witaminy, niektóre aminokwasy, pewne kwasy tłuszczowe, róŜne substancje mineralne i woda. Wiele zagadnień z biochemii oraz Ŝywienia dotyczy badania róŜnych aspektów tych właśnie związków chemicznych, wobec czego współdziałanie obu wymienionych dyscyplin jest bardzo ścisłe. Ponadto, ze względu na dąŜenie do obniŜenia rosnących kosztów opieki lekarskiej, najprawdopodobniej większy nacisk zostanie połoŜony na systematyczne działania w celu zachowania zdrowia i zapobiegania chorobom, tj. na medycynę prewencyjną. Zatem podejście Ŝywieniowe do przeciwdziałania np. miaŜdŜycy tętnic i nowotworom prawdopodobnie uzyska rosnące poparcie. Zrozumienie znaczenia odŜywiania zaleŜy jednak w rozległym zakresie od znajomości biochemii.

BIOCHEMIA i MEDYCYNA / 13

KaŜda choroba ma biochemiczne uzasadnienie Wszystkie choroby są manifestacją zaburzeń w cząsteczkach, reakcjach chemicznych i procesach. Główne czynniki odpowiedzialne za powstawanie chorób u ludzi i zwierząt są wymienione w tab. l-l. Wszystkie one mogą wpłynąć na jedną lub więcej zmian chorobotwórczych w reakcjach chemicznych lub molekułach organizmu.

Tabela 1 -1. Główne przyczyny chorób, wpływające na róŜnorodne mechanizmy biochemiczne w komórce lub organizmie* 1. Czynniki fizyczne: urazy mechaniczne, eks tremalne temperatury, nagle zmiany ciśnienia atmosferycznego, promieniowanie, szok elekt ryczny 2. Czynniki chemiczna i leki: pewne związki toksyczne, środki terapeutyczne itp. 3. Czynniki biologiczne: wirusy, riketsje, bak terie, grzyby, wyŜsze formy pasoŜytów 4. Brak tlenu: niedokrwienie, zmniejszenie poje mności tlenowej krwi, zatrucie enzymów ok sydacyjnych 5. Genetyczna: wrodzone, molekularne 6. Reakcje immunologiczne: anafilaksja. cho roba autoimmunologiczna 7. Zaburzania w odŜywianiu: niedobory i nad miary 8. Zachwiania równowagi wewnątrzwydzielniczej: niedobory i nadmiary hormonów * Zaadaptowano za zgodą z: Robbins SL, Cotram RS, KumarV: The Pathologic Bas/s of D/sease, wyd. 3, Saunders, 1984.

Badania biochemiczne pomagają w diagnozie, prognozie i leczeniu Istnieje bogata dokumentacja potwierdzająca zastosowanie biochemii w zapobieganiu chorobom, diagnozie i leczeniu chorób. Wiele dowodów na to moŜna znaleźć w kolejnych rozdziałach tej ksiąŜki. JednakŜe na tym etapie, w celu zilustrowania ogromu przedmiotu i zainteresowania nim Czytelnika, wydaje się niezbędne podanie 7 krótkich przykładów. 1. Człowiek musi pobrać pewną liczbę złoŜonych cząsteczek organicznych, zwanych witaminami, aby utrzymać zdrowie. Witaminy są,

ogólnie rzecz biorąc, zamieniane w organizmie na bardziej kompleksowe cząsteczki (koenzymy), które odgrywają kluczową rolę w wielu reakcjach komórkowych. Brak którejś z witamin w poŜywieniu znajduje oddźwięk w spowodowanej tym faktem chorobie, takiej jak gnilec lub krzywica (wynikłej odpowiednio z niedoboru witaminy C lub D). Wyjaśnienie kluczowej roli witamin, lub teŜ ich aktywnych biologicznie pochodnych w komórkach zwierzęcych i ludzkich jest głównym wspólnym problemem biochemików i dietetyków od przełomu naszego stulecia. Gdy tylko ustalono, Ŝe dana choroba jest wywoływana brakiem jakiejś witaminy, wówczas stało się racjonalne jej leczenie podawaniem brakującej witaminy. 2. Fakt, iŜ wiele roślin- afrykańskich jest pozbawionych jednego lub kilku istotnych, czyli niezbędnych, aminokwasów, które muszą być dostarczone z zewnątrz w celu utrzymania zdro wia, pomógł wytłumaczyć wyniszczające nie doŜywienie białkowo-energetyczne (kwashiorkor), będące chorobą tych, dta których owe rośliny stanowią główne źródło białka. Leczenie niedoboru istotnych aminokwasów jest tu roz sądną konsekwencją, ale, niestety, nie zawsze moŜliwą do przeprowadzenia. Polega ono na zapewnieniu wywaŜonej diety, zawierającej od powiednie ilości wszystkich niezbędnych ami nokwasów. 3. Grenlandzcy Eskimosi (ang. Inuit) spoŜy wają duŜe ilości oleju rybnego bogatego w nie które wiełoRienasycone kwasy tłuszczowe (ang. polyunsaturated fatty acids; skrót — PUFA). Badania wykazały, Ŝe odznaczają się oni małym stęŜeniem cholesterolu w osoczu i rzadką za chorowalnością na miaŜdŜycę tętnic. Te obser wacje wywołały Ŝywe zainteresowanie moŜliwo ścią stosowania PUFA w celu zmniejszenia stęŜenia cholesterolu. Zarówno choroby wywołane brakiem witamin, jak i te spowodowane niedoborem istotnych aminokwasów, to przykłady zaburzeń odŜywiania (p. tab. 1-1). MiaŜdŜyca tętnic moŜe być uwaŜana za przykład zaburzenia spowodowanego nieprawidłowym odŜywianiem, ale wiąŜą się z nią takŜe inne, np. genetyczne, czynniki. 4. Stan znany jako fenyloketonuria (ang. phenylketonuria; skrót — PKU) nie leczony prowadzi do cięŜkich zaburzeń umysłowych juŜ w dzieciństwie. Podstawa biochemiczna PKU jest znana od ponad 30. lat. Jest to zaburzenie uwarunkowane genetycznie (tab. 1-1), spowo-

14 / ROZDZIALI dowane brakiem lub małą aktywnością enzymu, który przekształca fenyloalaninę w tyrozynę. W konsekwencji niedoboru enzymu, fenyloalanina i niektóre jej metabolity, takie jak fenyloketony, gromadzą się w tkankach i niszczą rozwijający się ośrodkowy układ nerwowy. Odkąd udowodniono naturę biochemicznego zaburzenia w PKU, kolejnym logicznym krokiem stało się leczenie dzieci z fenyloketonurią dietą o małej zawartości fenyloalaniny. Gdy tylko masowe testy biochemiczne na rozpoznanie PKU zaraz po urodzeniu okazały się moŜliwe do przeprowadzenia, wówczas stało się realne skuteczne leczenie tej wady metabolicznej. 5. Mukowiscydoza (łac. fibrosis cystica) jest to znana choroba gruczołów wydzielania ze wnętrznego i gruczołów potowych, uwarunko wana genetycznie (p. tab. 1-1), Charakteryzuje ją nienaturalnie lepka wydzielina, która zatyka przewody wydzielnicze trzustki i oskrzeliki. Chorzy na mukowiscydozę mają takŜe zwięk szone ilości chlorków w pocie. Ofiary tej choro by często umierają w młodym wieku na zakaŜe nie płuc. Bardzo niedawno (1989 r.) wyizolowa no i zsekwencjonowano gen związany z tą chorobą. Prawidłowy gen koduje łańcuch 1480 aminokwasów białka transbłonowego, które wydaje się być kanałem dla chlorków lub, prawdopodobnie, jakimś regulatorem takiego kanału. Nieprawidłowością u prawie 70% cho rych na mukowiscydozę wydaje się być delecja 3 nukleotydów w DNA, co powoduje brak w tym transmembranowym białku aminokwasu w pozycji 508, tj. reszty fenyloalaniny. W ja ki sposób ta delecja uszkadza czynność owego transbłonowego białka i powoduje gęs ty śluz, czeka Jeszcze na opracowanie. To waŜne zadanie powinno Ułatwić odnalezie nie nośników genu fibrosis cystica i spowo dować racj onalniej sze leczenie niŜ obecne. Prawdopodobnie moŜliwe byłoby przygoto wanie leku, który korygowałby zaburzenie w białku transbłonowym, a takŜe nie jest wy kluczone, Ŝe moŜna by wprowadzać prawid łowy gen do komórek płuc w wyniku leczenia genetycznego. 6. Analiza mechanizmu działania toksyny bakteryjnej, powodującej cholerę, dostarczyła waŜnego czynnika do zrozumienia przyczyny klinicznych objawów tej choroby (obfita bie gunka, utrata elektrolitów i wody z organizmu). 7. Odkrycie, iŜ komary przenoszące zarodźce (plazmodia) powodujące zimnicę są w stanie

wytworzyć w sobie barierę ochronną o podłoŜu biochemicznym na działanie środków owadobójczych, ma waŜne implikacje w próbach wyeliminowania tej choroby. Ten przykład i poprzednie reprezentują choroby powodowane przez czynniki biologiczne (p, tab. 1-1), Wiele analiz biochemicznych naświetla mechanizmy chorób, które z kolei inspirują badania w określonych działach biochemii Wstępne obserwacje, poczynione w początkach naszego stulecia przez angielskiego lekarza Archibalda Garroda na małej grupie wrodzonych wad metabolicznych, wzbudziły poszukiwanie biochemicznych przyczyn tego stanu. Badania dotyczące genezy przyczyn choroby uwarunkowanej genetycznie, znanej jako hipercholesterolemia rodzinna, będącej przyczyną zaawansowanej miaŜdŜycy tętnic w młodym wieku, umoŜliwiły radykalny postęp w dziedzinie receptorów komórkowych i mechanizmów przyswajania cholesterolu przez komórki. Prace z zakresu onkogenów w komórkach rakowych zwróciły uwagę na mechanizmy molekularne związane z kontrolowaniem prawidłowego wzrostu komórkowego. Te i wiele innych przykładów ilustruje, jak obserwacje poczynione w klinice mogą otworzyć szerokie obszary funkcjonowania komórek dla badań biochemicznych. TA KSIĄśKA POMOśE POWIĄZAĆ WIEDZĘ Z ZAKRESU BIOCHEMII Z PROBLEMAMI KLINICZNYMI Końcowy rozdział podsumowuje wiele koncepcji, pojawiających się w tekście, dotyczących powiązania biochemii z patologią. Przykładami są tutaj takŜe mechanizmy biochemiczne działające w poszczególnych chorobach, które powoduje kaŜda z 8 przyczyn wymienionych w tab. 1-1. W suplemencie omówiono równieŜ podstawowe rozwaŜania stosowane podczas interpretacji wyników biochemicznych testów laboratoryjnych wykonywanych rutynowo w praktyce klinicznej. Głównym celem tych starań jest pomoc i zachęta dla Czytelnika, aby umiał przetransponować wiedzę z zakresu biochemii w swoją działalność kliniczną. Wykorzystanie badań biochemicznych w odniesieniu do chorób moŜna podsumować w 5 punktach.

BIOCHEMIA I MEDYCYNA / 16

Takie badania mogą: 1) odkryć przyczyny choroby, 2) zaproponować racjonalne i skuteczne jej leczenie, 3) umoŜliwić masowe testy do wczesnej diag nozy, 4) ułatwić monitorowanie postępów choroby, 5) ułatwić ocenę skutku leczniczego.

Suplement do tej ksiąŜki opisuje najwaŜniejsze rutynowe biochemiczne testy diagnostyczne, uŜywane do wykrywania chorób (tzn. do celów określonych w pkt. 3, 4 i 5). PosłuŜy on za poŜyteczne źródło informacji przy omawianiu biochemicznej diagnostyki chorób (np. zawału serca, ostrego zapalenia trzustki).

2

Biomolekuły i metody biochemiczne Robert K. Murray, MD, PhD

WPROWADZENIE Celem niniejszego rozdziału jest przedstawienie 5 zagadnień istotnych dla zrozumienia biochemii oraz wskazania głównych kierunków pomagających w przyswojeniu wiedzy niniejszego podręcznika. Omówiono więc zwięźle kolejno: 1. Skład chemiczny organizmu i podstawowe klasy cząsteczek w nim występujących. 2. Budowę struktur komórkowych i sposobu ich wydzielania. 3. Wagę rozwiązań doświadczalnych i właś ciwego dobom metod stosowanych w biochemii. 4. Główne osiągnięcia w biochemii oraz 5. Słabo rozwinięte działy biochemii dotyczą ce m.in. rozwoju, róŜnicowania, funkcji mózgu, nowotworów i innych chorób człowieka. Wobec powyŜszego być moŜe staną się one dla niektórych Czytelników motorem przyszłego ich udziału w badaniach nad tymi problemami.

rolę w licznych procesach biologicznych i znajduje się w centrum wielu aktualnie prowadzonych badań. Pierwiastki wyszczególnione w kolumnie 3. tab. 2-1 pełnią róŜnorakie funkcje. Większość z nich spotyka się w codziennej praktyce lekarskiej u chorych z zaburzeniami równowagi elektrolitowej (K.+, Na + , Cl" i Mga+), niedokrwist ością spowodowaną niedoborem Ŝelaza (Fe2+) lub chorobami tarczycy (I"). Tabela 2-1. PrzybliŜony skład chemiczny organizmu ludzkiego (w przeliczeniu na suchą masę)* Pierwiastek Procent Pierwiastek Procent Węgiel Tlen Wodór Azot Wapń Fosfor

50 20 10 8,5 4 2,5

Potas Siarka Sód Chlor Magnez śelazo Mangan Jod

ORGANIZM LUDZKI SKŁADA SIĘ Z KILKU PIERWIASTKÓW, KTÓRE TWORZĄ RÓśNE CZĄSTECZKI

1

0,8 0,4 0,4 0,1

0,01 0.001 0,00006

* Cytowane za zgodą z: West ES, Todd WR: Textbook of Biochemistry, 3 wyd., Macmillan, 1961.

Główne pierwiastki to: węgiel (C), wodór
Główne biopołinrtery to DNA, RNA, białka, polisacharydy i złoŜone lipidy Jak przedstawiono w tab. 2-2, główne zespoły biocząsteczek w komórkach i tkankach wyŜszych zwierząt (włączając człowieka) to: DNA, RNA, białka, polisacharydy i lipidy. Te złoŜone cząsteczki są zbudowane z prostych cząsteczek, które takŜe wymieniono w tab. 2-2. Cegiełki

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 17

budulcowe DNA i RNA (ogólnie znane jako kwasy nukleinowe) to odpowiednio deoksyrybonukleotydy i rybonukleotydy, natomiast bu-

dujące białka to aminokwasy. Polisacharydy są zbudowane z prostych węglowodanów: w przypadku gfikogenu (głównego polisacharydu występującego w tkankach ludzkich) cegiełką budulcową jest glukoza. Kwasy tłuszczowe mogą

być uwaŜane za jednostki budulcowe lipidów, chociaŜ lipidy nie są polimerami kwasów tłuszczowych. DNA, RNA, białka i polisacharydy zalicza się do hiopolimerów, poniewaŜ składają się z powtarzających się cegiełek budulcowych (monomerów). Te złoŜone cząsteczki stanowią istotne „tworzywo Ŝycia". Większość przedstawionego tekstu będzie wiec związana z opisem róŜnych biochemicznych właściwości tych biopolimerów i monomerów. Takie same złoŜone cząsteczki znaleziono równieŜ wśród niŜszych organizmów, chociaŜ cegiełki budulcowe w niektórych przypadkach mogą się róŜnić od tych przedstawionych w tab. 2-2, np. bakterie nie mają glikogenu i triacylogliceroli, ale mają one inne poiisacharydy i lipidy.

Białka, tłuszcze, węglowodany, woda i składniki mineralne stanowią główne komponenty organizmu ludzkiego Skład chemiczny organizmu ludzkiego przedstawiono w tab. 2-3. Główne jego komponenty to: białka, tłuszcze, węglowodany, woda i składniki mineralne. Woda stanowi główny składnik, choć jej ilość waha się w szerokim zakresie wśród róŜnych tkanek. Polarny charakter i zdolność tworzenia wiązań wodorowych czynią wodę idealnym rozpuszczalnikiem w organizmie. Szczegółowe znaczenie właściwości wody zostanie przedstawione w rozdz. 3. Tabela 2-3. Prawidłowy skład chemiczny człowieka o masie ciała 65 kg* Kilogramy 11

17,0

Tłuszcze

9

13,8

Węglowodany

1

1,5

Woda**

40

61,6

4

6,1

Białka

Składniki mineralne Tabela 2-2. Główne złoŜone biomolekuły organiczne komórek i tkanek. Kwasy nukleinowe, białka i polisacharydy są biopolimerami zbudowanymi z poniŜej przedstawionych jednostek budulcowych. Lipidów ogólnie nie zalicza się do biopolimerów i nie wszystkie lipidy zawierają kwasy tłuszczowe jako jednostki budulcowe Blomolekula Jednostka budulcowa

Podstawowe funkcje

DNA

Materiał genetyczny

RNA

Białko

Polisacharydy (glikogen) Lipidy

2

Biochemia

Deoksyry bonu kleotyd Rybonukleotyd Aminokwasy

Matryca w biosyntezie białek RóŜnorodność pełnionych funkcji w komórkach (np, enzymy, elementy kurczliwe) Krótkotrwałe magazynowanie energii w postaci glukozy RóŜnorodne, np. składniki błon komórkowych, długotrwałe magazynowanie energii w postaci triacylogliceroli

Glukoza

Kwasy tłuszczowe

■

Procent

* Cytowane za zgodą z: Davidson SD, Passmore R, Brock JF: Human Nutrition and Dietetics, wyd. 5, Churchill Livingstone, 1973. ** Zawartość wody moŜe róŜnić się między róŜnymi tkankami, występując w małej ilości (22,5%) w kościach bezszpikowych, Zawartość procentowa wody wykazuje tendencje zmniejszania, gdy zwiększa się odsetek lipidów w organizmie.

KOMÓRKA PODSTAWOWĄ JEDNOSTKĄ śYCIA W XIX w. w badaniach Schleidena i Schwanna oraz innych pionierów, takich jak Virchow uznano komórkę za podstawową jednostkę aktywności biologicznej. JednakŜe dopiero bezpośrednio po II wojnie światowej 3 wydarzenia zapoczątkowały okres nierównomiernego rozwoju w biochemii i biologii komórki. Były to: 1) zwiększająca się dostępność mikroskopu elektronowego, 2) wprowadzenie metod pozwalających rozbijać komórki, w warunkach względnie

łagodnych, zapewniających ich funkcje, oraz 3) zwiększająca się dostępność wysokoobrotowej ultra wirówki z chłodzeniem, zapewniającej wy-

tworzenie siły odśrodkowej wystarczającej do

18 / ROZDZIAŁ 2

rozdzielenia rozbitych komórek, bez ich przegrzewania. Zastosowanie mikroskopu elektronowego ujawniło wiele nie znanych wcześniej lub słabo widocznych składników komórkowych, których rozbicie i ultrawirowanie pozwoliło na ich wydzielenie i analizę in vitro,

3 i steczka Srńdplazmatyczna

Cytozol Rybosom

Hepatocyt szczura — modelowa komórka eukariotyczna Schemat strukturalny komórki wątroby {hepatocytu) szczura przedstawiono na ryc. 2-1. Hepatocyt jest prawdopodobnie najczęściej badaną komórką ze wszystkich komÓTek pod względem biochemicznym, częściowo z powodu łatwej jej dostępności w stosunkowo duŜych ilościach odpowiednich do frakcjonowania i badania róŜnorodności jej funkcji. Hepatocyt zawiera główne organelle występujące w komórkach eukariotycznych (tab. 2-4). Są to: jądro komórkowe, mitochondria, siateczka śródplazmatyczna, wolne rybosomy, aparat Golgiego, lizosomy, peroksysomy, błona komórkowa i niektóre elementy cyt o szkieletu. Do rozbicia komórek i wydzielania organelli i wewnątrzkomórkowych cząsteczek stosuje się techniki fizyczne W celu zbadania funkcji dowolnej organelli naleŜy, w pierwszej kolejności, wydzielić ją we względnie czystej formie, wolnej od większych zanieczyszczeń innymi elementami strukturalnymi komórki. Utarty sposób, który pozwala to osiągnąć, nazywa się frakcjonowaniem subkomórkowym i ogólnie wymaga 3 operacji, tj. ekstrakcji, homogenizacji i wirowania. Większość pionierskich badań w tym zakresie wykonano wykorzystując wątrobę szczura. Ekstrakcja. Pierwszy etap w kierunku izolowania określonej organelli (czy cząsteczek) stanowi jej ekstrakcja z komórek, w których się znajduje. W większości organelle i biomolekuły są nietrwałe i tracą biologiczną aktywność; muszą więc być ekslrahowane w warunkach łagodnych (np. stosowanie roztworów wodnych i pozbawionych ekstremalnych wartości pH, ciśnienia osmotycznego i wysokich temperatur). Rzeczywiście, większość metod izolowania organelli wykorzystuje temp. 0 — 4°C (tj. w chłodni lub utrzymywanie badanego materiału w pojemnikach z lodem). Znaczna utrata aktywności moŜe mieć miejsce w temperaturze pokojowej, częściowo wskutek działania róŜnych enzymów trawiennych (proteaz, mikleaz, itd.), uwolnionych podczas rozbijania komó-

Aparat Golgiego

Błona cytoplazmatyczna

Lizosom

Ryc. 2-1. Schemat komórki wątroby szczura z jej głównymi organellami.

rek. Ogólnie stosowany roztwór do ekstrakcji organelli komórkowych zawiera 0,25 mol/l sacharozy (izotonicznej), doprowadzonej do pH 7,4 za pomocą 0,05 mol/l buforu Tris (trishydroksymetyloaminometan) — kwas solny i jony K+ i Mg2+ o stęŜeniu zbliŜonym do wartości fizjologicznych; ten roztwór jest nazywany umownie STKM. Nie wszystkie roztwory stosowane do ekstrakcji są tak łagodne jak STKM; np. rozpuszczalniki organiczne wykorzystywane do ekstrakcji lipidów i kwasów nukleinowych. Homogenizacja. Aby wyekstrahować organelle (lub biocząsteczkę) z komórek, najpierw naleŜy rozbić komórki w łagodnych warunkach. Narządy (np. wątroba, nerka, mózg) i zawarte w nich komórki mogą być rozbite w sposób standardowy przez homogenizację, podczas której napędzany ręcznie lub mechani-

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 19 Tabeła 2-4. Główne organelle wewnątrzkomórkowe i ich czynnością W zestawieniu podano tylko podstawowe funkcje związane z kaŜdą z tych struktur. W wielu przypadkach w organellach moŜe przebiegać kilka szlaków metabolicznych, procesów czy reakcji Organella lub frakcja* Znacznik (Marker)

Główne czynności

Jądro komórkowe

DNA

Miejsce chromosomów Miejsce syntezy RNA zaleŜnej od DNA (transkrypcja)

Mitochondrium

Dehydrogenaza bursztynianowa

Cykl kwasu cytrynowego, oksydacyjna fosforyiacja

Rybosom*

DuŜa zawartość RNA

Miejsce biosyntezy białek (translacja mRNA w biatka)

Siateczka śródpiazmatyczna

GI u kozo - 6 - fosfataza

Rybosomy związane z błonami są głównym miejscem biosyntezy białek Biosynteza róŜnych lipidów Utlenianie wielu ksenobiotyków (cytochrom P-450)

Uzosom

Fosfataza kwaśna

Miejsce licznych hydrolaz (enzymów katalizujących reakcje degradacyjne)

Błona cytoplazmatyczna

Na+/K + -ATPaza, 5'-nukleotydaza

Transport cząsteczek do i z komórek Wewnątrzkomórkowa adhezja i wymiana

Aparat Golgiego

Galaktozylotransferaza

Wewnątrzkomórkowy rozdział białek Reakcje glikozylacji Reakcje powstawania siarczanów

Peroksysom

Katalaza Oksydaza moczanowa

Degradacja niektórych kwasów tłuszczowych Wytwarzanie i degradacja nadtlenku wodoru

Cytoszkielet*

Brak swoistych znaczników**

Mikrof i lamenty, mikrotubule; filamenty pośrednie

Cytozol*

Dehydrogenaza mlecza nowa

Enzymy glikoltzy, syntezy kwasów tłuszczowych

* Orga nel la sta nowi wewnątrzkomórkową substrukturę otoczoną btoną i wydzieloną pr zez wirowanie przy duŜej sile odśrodkowej. W związku z powyŜszym rybosomy, cytoszkielet i cytozol nie są organellami. Zamieszczono je w tabeli ze względu na ich izolowanie przez wirowanie róŜnicowe. Mogą być rozpatrywane jako struktury wewnątrzkomórkowe lub frakcje. Organeile izolowane w toku pojedynczego cyklu wirowania róŜnicowego nie są czyste. W celu uzyskania czystych frakcji jest wymagane wielokrotne powtórzenie cyklu oczyszczania, ** Frakcje cytokszkieletowe mogą być ocenione za pomocą mikroskopii elektronowej lub przez analizę elektroforetyczną charakterystycznych dla nich białek.

cznie ttok obraca się w szklanej probówces odpowiednich rozmiarów, zawierającej pocięte kawałki narządu we właściwym środowisku, takim jak STKM. Kontrolowane obroty tłoka powodują cięcie i rozbijanie komórek, uwalniając ich składniki do roztworu sacharozy. Otrzymana zawiesina, zawierająca wiele nie naruszonych organelli, nazywa się homogenałem. Wirowanie. Frakcjonowanie składników homogenatu przez wirowanie róŜnicowe jest techniką o kluczowym znaczeniu w biochemii, W klasycznej metodzie stosuje się serię 3 odwirowań przy stopniowo zwiększających się szybkościach (ryc. 2-2), z których kaŜde dostar-

cza osadu i supernatantu. Supernatant na kaŜdym etapie poddaje się odwirowaniu. Takie postępowanie pozwala otrzymać 3-krotnie osad, nazywany odpowiednio frakcją jądrową, mitochondrialną i mikrosomalną. śadna z tak uzyskanych frakcji nie reprezentuje w pełni czystych organelli. JednakŜe, na podstawie badań w mikroskopie elektronowym oraz analizy aktywności odpowiednich enzymów — znaczników (ang, markerów) i składników chemicznych (np. DNA i RNA), stwierdzono, Ŝe głównymi elementami opisywanych 3 frakcji są odpowiednio: jądra komórkowe, mitochondria i mikrosomy. Znacznikowy enzym lub składnik chemiczny jest jednym z parametrów prawie

20 / ROZDZIAŁ 2

, Supernatant (1)

•

600 g

15,000 g

x 10 min.

x 5 min

Supernatan t (2)

Supernatant (31

105,000 g x 60 min

,Homogenat

\i

.

■:-::-i

p Frakcja Jądrowa

Frakcja mllochondfialna

, Frakcja ml kro BO ma tna

Ryc. 2-2. Schemat rozdziału frakcji wewnątrzkomórkowych za pomocą wirowania róŜnicowego. Zhomogenizowaną tkankę (np. wątrobę) początkowo poddaje się wirowaniu przy małej sile odśrodkowej, która dostarcza frakcji jądrowej {zawierającej jądra komórkowe i nienaruszone komórki) oraz supernatantu (1). Supernatant (1) dekantujesię i poddaje wirowaniu przy średniej sile odśrodkowej, które prowadzi do otrzymania frakcji mitochondrialnej {zawierającej mitochondria, lizosomy i peroksysomy) i supernatantu (2). Supernatant ten poddaje się dekantacji oraz wirowaniu przy duŜej sile odśrodkowej. Osad z tego wirowania stanowi frakcję mikrosomainą (zawierającą mieszaninę wolnych rybosomów oraz gładką i szorstką siateczkę śród plaŜ maty czną) i końcowy, klarowny płyn — supernatant {3). Ten ostatni odpowiada cytozolowi, czyli sokowi komórkowemu. RóŜne modyfikacje tego podstawowego schematu wirowania róŜnicowego umoŜliwiają izolację kaŜdej organelli komórkowej we względnie czystym stanie.

wyłącznego występowania w określonej organelli, np. fosfataza kwaśna — w lizosomach, DNA — w jądrze komórkowym (tab. 2-4). W ten sposób znacznik moŜe stanowić wskaźnik obecności lub braku w poszczególnej frakcji organelli, w których on występuje. Frakcja mikrosomalna (mikrosomy) zawiera głównie mieszaninę gładkiej i szorstkiej (siateczka śródplazmatyczna z połączonymi z nią rybosomami) siateczki śródplazmatycznej oraz wolnych rybosomów. Zawartość ostatniego supernatantu odpowiada rozpuszczalnej frakcji cytopiazmy (cytozoł). Modyfikacja tej podstawowej metody wirowania róŜnicowego przez stosowanie odmiennych środowisk do homogenizacji tkanek, róŜnych technik wirowania (np. ciągły lub skokowy gradient stęŜenia sacharozy) pozwala wydzielić lepiej lub gorzej oczyszczone postacie wszystkich organelli komórkowych przedstawionych na ryc. 2-1 i wymienionych w tab. 2-4. Opisany powyŜej schemat frakcjonowania moŜe znaleźć zastosowanie, w ogólnym zarysie, do większości narządów i komórek. Jednak frakcjonowanie komórek tym sposrobem musi być ocenione przez analizę w mikroskopie elektronowym w celu standaryzacji metody. Nie naleŜy

przeceniać znaczenia badań frakcjonowania struktur komórkowych w rozwoju biochemii i biologii komórki. Stanowi ono jedno z waŜniejszych rozwiązań doświadczalnych (patrz niŜej) i głównie dzięki jego wykorzystaniu wyjaśniono funkcje organelli, przedstawionych w tab. 2-4. Informacje o funkcjach poszczególnych organelli, przedstawione w tej tabeli, stanowią główne osiągnięcia badań biochemicznych (patrz niŜej). Rozwiązanie doświadczalne obejmuje 3 etapy Rozwiązanie doświadczalne stosowane w biochemii obejmuje 3 główne etapy: 1) izolowanie biomolekul i organelli (p. powyŜej: Wirowanie), 2) określenie struktury biomolekuł oraz 3) analizy, z wykorzystaniem róŜnych preparatów, funkcji i metabolizmu biomolekuł (tj. syntezy i degradacji). Izolowanie biomolekuł Wyjaśnienie funkcji biomolekuł, podobnie jak w przypadku organelli, wymaga przede wszystkim wydzielenia ich w czystej postaci. W tabeli 2-5 przedstawiono główne metody

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 21

wykorzystywane do rozdziału i oczyszczania biomolekuł. W tym podrozdziale nie podano szczegółów metodycznych, niektóre z nich zostaną krótko opisane w róŜnych miejscach tego podręcznika. Połączenie kilku metod jest prawie zawsze nieodzowne w oczyszczaniu biomolekuł do stanu jednorodności (wolnych od zanieczyszczeń innymi biomolekułami). NaleŜy podkreślić, Ŝe postępy biochemii są uwarunkowane rozwojem nowych metod analizy, oczyszczania i badania struktury. Na przykład biochemię lipidów zrewolucjonizowało wprowadzenie chromatografii ciecz owo-gazowej i chromatografii cienkowarstwowej. Analiza błon biologicznych i wielu białek przysparzała ogromnych trudności, aŜ do chwili wprowadzenia elektroforezy w Ŝelu poliakryloamidowym zawierającym SDS (SDS-PAGE). Wprowadzenie detergentu — siarczanu dodecylu sodu (SDS) — pozwala „rozpuścić" wiele białek do analizy elektroforetycznej, które przedtem uchodziły

Tabela 2-5. Główne metody stosowane do rozdziału i oczyszczania biomolekuł. Większość z nich jest uŜyteczna do analizy składników obecnych w ekstraktach komórkowych i innym materiale biologicznym. Połączenie kilku technik pozwala oczyścić większość biomolekuł. Zaleca się Czytelnikowi podręczniki przedstawiające szczegółowe opracowania metod wykorzystywanych w badaniach biochemicznych Frakcjonowanie za pomocą soli (np. wytrącanie siarczanem amonu) Chromatografia Bibułowa Jonowymienna (wymieniacze anionowe i kationowe) Powinowactwa Cienkowarstwowa Cieczowogazowa Cieczowa wysokociśnieniowa Filtracja Ŝelowa E le k t roto r e za Bibułowa Wysokonapięciowa Na agarozie Na octanie celulozy W Ŝelu skrobiowym W Ŝelu poliakryloamidowym W Ŝelu poliakryloamidowym zawierającym SDS U Itra w i rowan i e

raczej za nierozpuszczalne. Rozwój metod sekwencjonowama i klonowania DNA dokonał przewrotu w badaniach kwasów nukleinowych i biologii w ogóle. Określanie struktury biomolekuł Kiedy biocząsteczki zostaną oczyszczone, wtedy naleŜy określić ich strukturę. Pozwoli to na szczegółowe znalezienie zaleŜności między ich budową a Funkcją. Główne metody, wykorzystywane w analizie budowy biomolekuł, przedstawiono w tab. 2-6. Są one znane Czytelnikowi, który ma pewien zakres wiedzy z chemii organicznej. Znana swoistość niektórych enzymów czyni je bardzo uŜytecznymi narzędziami w wyjaśnieniu właściwości strukturalnych pewnych biomolekuł. Udoskonalenia w ich rozdzielaniu dokonano dzięki postępowi teoretycznemu i technologicznemu, w wyniku wprowadzenia spektrometrii masowej i spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR), które stały się metodami z wyboru do oznaczania budowy. Na przykład budowa bardzo złoŜonych łańcuchów węglowodanowych, wykryta w niektórych biomolekulach, takich jak glikoproteiny, obecnie często moŜe być wyjaśniona dzięki spektroskopii wysokorozdzielczej NMR. Najbardziej wnikliwej informacji o budowie biomolekui dostarcza dyfrakcja promieniami X i krystalografia. Zastosowanie ich było przełomem w wyjaśnieniu szczegółów budowy róŜnych białek i enzymów oraz natury podwójnego heliksuDNA. Tabela 2-6. Główne metody stosowane w określeniu struktur biomolekuł Analiza elementarna Spektrofotometria w świetle nadfioletowym i widzialnym Spektroskopia w podczerwieni, spektroskopia jądrowego rezonansu magnetycznego Zastosowanie kwasowej lub zasadowej hydrolizy do degradacji btomolekufy w badaniu jej podstawowych składników Zastosowanie enzymów swoiście degradujących biomolekuły (np. proteazy, nukleazy, glikozydazy) Spektrometria masowa L Metody swoistego sekwencjonowania {np. białek, kwasów nukleinowych) Krystalografia rentgenowska

22 / ROZDZIAŁ 2

Analiza czynności i metabolizmu biomolekuł Początkowe badania biochemiczne człowieka i zwierząt wykonywano na poziomie „całego organizmu". Przykładem były badania oddychania i śledzenie losu trawionych związków. Wkrótce stało się jasne, Ŝe cały organizm jest zbyt złoŜonym obiektem, aby moŜna było uzyskać ostateczne odpowiedzi na wiek postawionych pytań. Rozpoczęto zatem rozwijać prostsze postępowania in vitro, które usuwały wiele

komplikacji powstających w doświadczeniach na całym organizmie. W tabeli 2-7 podsumowano róŜne typy postępowania preparatywnego, dostępne obecnie w badaniach procesów biochemicznych; większość danych przedstawionych w tym podręczniku otrzymano przez ich zastosowanie. Wykaz metod przedstawiono w zmniejszającym się porządku stopnia ich złoŜoności. Zarówno wykorzystanie badań na poziomie całego organizmu, jak i inne metody postępowania mają swoje ograniczenia. Przy-

Tabela 2-7. Kolejność postępowania w badaniu procesów biochemicznych Poziom badań (metoda) Organizm zwierzęcy

Wyizolowany, perfundowany narząd Skrawki tkankowe

Uwagi Badania mogą obejmować: 1) usunięcie narządu (np. hepatektomia) 2) zmiany w diecie (np. głodzenie) 3) podawanie leków (np. fenobarbital) 4) podawanie toksyn (np. tetrachlorek węgla) 5) wykorzystanie zwierząt z określoną chorobą {np. cukrzyca) 6) stosowanie wyrafinowanych technik, jak spektroskopia NMR i to mografia emisji pozytronowej Badania na tym poziomie są często fizjologiczne, ale ich interpretacja moŜe być utrudniona przez wpływ na narządy układu krąŜenia i układu nerwowego Szczególnie uŜyteczne narządy: wątroba, serce i nerka. Takie podejście pozwala badać narząd poza wpływem innych narządów lub układu nerwowego. Zastosowanie perfuzji zapewnia, Ŝe czynności narządu są podtrzymywane przez kilka godzin Często uŜywa się skrawków wątroby. Skrawki narządu, odizolowane od innych wpływów; preparaty takie wykazują jednakŜe tendencję do degradacji w ciągu niewielu godzin, częściowo, z powodu niedostatecznego odŜywienia

Komórki

1. Szczególnie przydatne dla komórek krwi, które moŜna stosunkowo łatwo oczyścić 2. Stosowanie komórek w kulturach tkankowych jest niezbędne w wielu dziedzinach biologii

Homogenat

1. Zapewnia preparatykę w układach bezkomórkowych 2. MoŜliwość dodawania lub usuwania określonych składników (np, przez dializę) i analiza ich wpływu 3. MoŜliwość frakcjonowania przez wirowanie indywidualnych orga nelli komórkowych

Wydzielone organelte komórkowe

Szeroko stosowane w badaniach czynności mitochondriów, siateczki śródplazmatycznej, rybosomów, itp.

Pod Struktury organelli komórkowych Izolowanie i charakterystyka metabolitów i enzymów

Szeroko wykorzystywane, np. w badaniach czynności podstruktur mitochondriów

Klonowanie genów kodujących enzymy i białka

Izolowanie sklonowanych genów jest istotne dla badań ich budowy i regulacji, moŜe stanowić podstawę w określaniu sekwencji aminokwasowych kodowanych przez nie enzymów lub białek

Istotna część analizy reakcji chemicznych lub szlaków metabolicznych

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 23

czyną fałszywych wyników (artefaktów) doświadczeń in ntro moŜe być np. homogenizacja komórek, uwalniająca enzymy, które mogą częściowo trawić składniki komórkowe.

STRATEGIE W BADANIU REAKCJI BIOCHEMICZNYCH SA ZŁOśONE I WIELOPOZIOMOWE Niniejsza ksiąŜka w większości będzie dotyczyła złoŜonych procesów biochemicznych (np. biosyntezy białka, skurczu mięśnia), łącznie ze szlakami metabolicznymi. Szlak metaboliczny stanowi serie reakcji odpowiedzialnych za biosyntezę bardziej złoŜonego związku, zbudowanego z jednego lub wielu prostych związków, czy za degradację związku do jego końcowych produktów. O istnieniu złoŜonego procesu biochemicznego moŜna wnioskować na podstawie obserwacji poczynionych na poziomie całego organizmu, np. obserwując człowieka moŜna stwierdzić, Ŝe mięśnie szkieletowe się kurczą. Wiemy, Ŝe glukoza słuŜy jako źródło energii dla

ludzi i innych organizmów zwierzęcych, a zatem moŜna wnioskować, Ŝe musi ona być degradowana (metaboiizowana) w organizmie w celu uzyskania energii. JednakŜe, aby zrozumieć w pełni przebieg tego procesu w komórkach ludzkich, a wiedza nasza o tym jest wciąŜ niekompletna, naleŜy przeprowadzić analizy na róŜnych poziomach. Na rycinie 2-3 przedstawiono schematycznie róŜne typy obserwacji i analiz, które są nieodzowne w celu zrozumienia procesów biochemicznych, takich jak rozkład glukozy w celu uzyskania energii (proces znany jako gjikoli/a). Schemat ten stosuje się do podstawowego poziomu wszystkich głównych procesów biochemicznych omawianych w niniejszej ksiąŜce i przedstawienia ogólnej strategii w ich wyjaśnianiu. Powinien on się przypominać wtedy, kiedy kaŜdy z opisywanych głównych procesów biochemicznych (np. glikoliza, utlenianie kwasów tłuszczowych) będzie rozpatrywany, chociaŜ nie zawsze punkt wyszczególniony na rycinie będzie z nim związany. Wiele waŜnych punktów, przedstawionych w tabeli 2-7 i na ryc. 2-3, zasługuje na dyskusję.

Wnioskowania o obecności procesu biochemicznego lub szlaku metabolicznego na poziomie całego organizmu zwierzęcego Badanie mechanizmów jago kontroli in vtvo Badanie wpływu swoistych chorób (np. wrodzone bloki metaboliczne, nowotwór itp,) na Jego przebieg

ł

Umiejscowienie procesu w Jednym (lub więcej) narząd z ie(ach) Umiejscowienie procesu w Jednej (lub więcej) organem czy frakcji komórkowej Przedstawienie reakcji zaangaŜowanych w jego przebieg

t

Oczyszczanie uczestniczących w nim Indywidualnych substratOw, produktów, enzymów, koenzymów I innych składników

t t

Badanie mechanizmów Jego kontroli In vttro Ustalenie mechanizmów reakcji zaangaŜowanych w Jego przebieg Ftekonstytucja przebiegu procesu (szlaku)

ł Badanie procesu na poziomie genu za pomocą rekombinacji DNA Ryc. 2-3. Schemat ogólnego postępowania w analizie procesu biochemicznego lub szlaku metabolicznego. Wyszczególnione etapy nie muszą być stosowane dokładnie w wymienionej kolejności. Wykorzystanie ich prowadzi zwykle do wyjaśnienia szczegółów procesu biochemicznego lub szlaku metabolicznego. Schemat ten znajduje zastosowanie we wszystkich głównych szlakach metabolicznych przedstawionych w następnych rozdziałach niniejszej ksiąŜki.

24 / ROZDZIAŁ 2

1. Aby. zrozumieć proces biochemiczny na poziomie molekularnym, pomimo moŜliwości pojawienia się artefaktów, nieodzowne jest wyizolowanie i identyfikacja kaŜdego z jego składników w czystej postaci. Liczne przykłady tego będą spotykane później. 2. Istotna jest takŜe moŜliwość rekonstytucji procesu w warunkach in vitro przez systematyczną jego odbudowe z indywidualnych składników. JeŜeli po rekonstytucji z jego składników proces nie przebiega, oznacza to, Ŝe pewien krytyczny składnik został utracony i nie został wprowadzony do układu. 3. Ostatnie zdobycze technologiczne (np. spektroskopia NMR i tomografia emisji pozytronowej; ang. PET scanning) pozwalają wykrywać pewne biomolckuły na poziomie narządu i rejestrować zmiany ich ilości w czasie. Takie rozwiązania wskazują, Ŝe staje się moŜliwe wykonywanie wyrafinowanych analiz wielu procesów biochemicznych na poziomie in vivo. 4. JeŜeli wyniki badań uzyskiwanych na róŜnych poziomach pokrywają się, to ma się prawo wnioskować, Ŝe został poczyniony rzeczywisty postęp w zrozumieniu procesu biochemicznego. Jeśli pojawią się duŜe rozbieŜności przy zastosowaniu róŜnych rozwiązań doświadczalnych, to ich przyczyny muszą być badane aŜ do uzyskania racjonalnego wyjaśnienia. 5. Przedstawione sposoby preparatywne i poziomy analiz mogą być wykorzystane w badaniu róŜnic biochemicznych u zwierząt ze zmienionym stanem metabolicznym {np. głodzenie, karmienie) lub swoistymi chorobami (np. cukrzyca, rak). 6. Większość przedstawionych metod i rozwiązań moŜna wykorzystać w badaniach prawidłowych i zmienionych chorobowo komórek lub tkanek człowieka. JednakŜe naleŜy uwzględnić warunki (czas) pobierania takiego materiału i szczególnie brać pod uwagę względy etyczne prowadzenia doświadczeń z materiałem ludzkim. Zastosowanie radioaktywnych i cięŜkich izotopów przyczyniło się do wyjaśnienia procesów biochemicznych Wprowadzenie izotopów do badań w biochemii w latach 30. naszego wieku stanowiło punkt zwrotny, zatem ich zastosowania zasługują na specjalną wzmiankę. Przed ich uŜyciem bardzo trudno było „naznaczyć" biomolekuły, aby moŜna było łatwo śledzić ich los „metaboliczny". Pionierskie doświadczenia, zwłaszcza Schoenheimera i wsp., wprowadzające niektóre izotopy trwałe (np. 2D, l5N), połączone z ich detekcją na drodze spektrometrii

masowej, znalazły zastosowanie w rozwiązywaniu wielu problemów biochemicznych. Na przykład pewne zsyntetyzowane aminokwasy, cukry i kwasy tłuszczowe, zawierające odpowiednie trwałe izotopy, podaje się zwierzętom lub in vitro w toku preparatyki, aby śledzić ich los metaboliczny (np. okres połowicznego rozpadu, przemianę w inne biomolekuły). Związki znakowane trwałymi izotopami wykorzystano do poznania wielu aspektów metabolizmu białek, węglowodanów i lipidów. Z tych doświadczeń wynika jasno, Ŝe metabolizm jest bardzo aktywnym procesem, a większość związków w komórce jest stale syntetyzowana i degradowana, choć z odmienną szybkością. Te odkrycia, zdaniem Schoenheimera, zwróciły uwagę na „dynamiczny charakter metabolizmu". Tabela 2-8. Główne izotopy stosowane w badaniach biochemicznych Izotopy trwale

Izotopy promieni ot wó rcze

2

D"N

"C M Ca 131 1

Późniejsze wprowadzenie izotopów radioaktywnych oraz przyrządów umoŜliwiających pomiar ich aktywności było takŜe niezmiernie waŜne. W tabeli 2-8 przedstawiono główne trwałe i radioaktywne izotopy wykorzystywane w układach biologicznych. Zastosowanie zarówno izotopów trwałych, jak i radioaktywnych jest fundamentalne dla rozwoju kaŜdego działu biochemii. Badania za ich pomocą złoŜonych i prostych biomolekuł zarówno in vivo, jak i in vitro budzą zaufanie. Ogromny postęp, poczyniony ostatnio w sekwencjonowaniu kwasów nukleinowych, a takŜe w oznaczaniu substancji występujących w-układach biologicznych w niezwykle małych ilościach stosując metody radioimmunologiczne, opiera się na wykorzystaniu izotopów.

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 25

BIOCHEMIA, PRZEZ LICZNE ODKRYCIA, WSPIERA BIOLOGIĘ KOMÓRKI I MEDYCYNĘ PoniŜej dokonano podsumowania głównych osiągnięć w dziedzinie biochemii, zwłaszcza w odniesieniu do biochemii człowieka. Obejmują one: • Ustalenie pełnego składu chemicznego komó rek, tkanek i organizmu oraz wydzielenie i określenie budowy podstawowych związ ków w nich występujących. • Dostarczenie informacji, przynajmniej na ogólnym poziomie, o funkcjach wielu pro stych, a takŜe głównych złoŜonych biomolekuł (opisanych w dalszych rozdziałach ksiąŜ ki), W centrum zainteresowania pozostaje DNA, materiał genetyczny, z którego infor macja jest przenoszona na 1 z typów RNA (informacyjny RNA, czyli mRNA), który z kolei dyktuje kolejność (sekwencje) amino kwasów w białkach. Przepływ informacji z DNA moŜe być zapisany następująco: DNA-> RNA-+ białko. • Wydzielenie głównych organelli komórek zwierzęcych i ustalenie ich podstawowych funkcji. • Stwierdzenie, Ŝe prawie wszystkie reakcje przebiegające w komórkach katalizują en zymy; oczyszczono i zbadano wiele enzymów oraz przedstawiono obszernie właściwości i mechanizmy ich działania. • Przedstawienie szlaków metabolicznych syn tezy i degradacji głównych prostych i złoŜo nych biomolekuł. Szlak syntezy danego związ ku w zasadzie róŜni się od szlaku jego de gradacji. • Wyjaśnienie licznych aspektów regulacji me tabolizmu. • Przedstawienie, w szerokim zakresie, w jaki sposób komórki zachowują i wykorzystują energię. • Wyjaśnienie wielu aspektów budowy i funkcji róŜnych błon występujących w komórkach, których głównymi składnikami są białka i li pidy. • Przedstawienie, w ogólnym zarysie, sposobu działania głównych hormonów • Wykrycie biochemicznych podstaw wielu chorób.

POZOSTAŁO WIELE DO ZBADANIA Zdając-sobie sprawę, jak wiele zgromadzono wiadomości biochemicznych, naleŜy ocenić, jak niewiele jeszcze wiadomo w wielu działach tej nauki. Dwa istotne problemy, wymagające wyjaśnienia, dotyczą ustalenia biochemicznych podstaw rozwoju i róŜnicowania oraz funkcji mózgu. ChociaŜ obecnie dobrze poznano naturę chemiczną materiału genetycznego, prawie nic nie wiadomo o mechanizmach, które włączają i wyłączają geny w czasie rozwoju. Zrozumienie regulacji genów stanowi klucz do poznania, jak róŜnicują się komórki i jak zmieniają się w komórki nowotworowe. Wiedza o podziale komórkowym i wzroście komórek prawidłowych i nowotworowych oraz o ich regulacji jest bardzo skąpa. Rzeczywiście nic nie wiadomo na temat biochemicznych podstaw złoŜonych zjawisk ncuronalnych, takich jak świadomość i pamięć. Bardzo ograniczona jest równieŜ nasza wiedza 0 mechanizmach wydzielania komórkowego. Pomimo pewnego postępu, molekularne pod stawy większości głównych chorób genetycznych nie są wyjaśnione, ale wiele nadziei niesie tech nologia rekombinacji DNA, zwiastując zauwa Ŝalny rozwój w tej dziedzinie w ciągu kilku najbliŜszych lat. Ludzki genom moŜe być zsekwencjonowany w następnym stuleciu lub wcześniej. Wiadomości uzyskane przez tak ogromny wysiłek będą potęŜnym wyzwaniem dla biologii człowieka 1 medycyny.

PIŚMIENNICTWO Freifelder D: Physicał Biochemistry: Appiicalions to Biochemistry and Molecułar Biology. Fceeman, 1982. Fruton JS: Mołecuks and Life; Historical Essays on the Interplay of Ckemistry and Biology. Wiley-Interscience, 1972, Weinberg RA: The molecules of life. Sci Am (Oct) 1985; 253: 48. [Entire issue is of interest.]

3

Woda i pH Vicłor W. Rodwelł, PhD

WPROWADZENIE Biochemia dotyczy w większości właściwości i reakcji chemicznych związków organicznych. Często jednak się zapomina, Ŝe w komórkach Ŝywych większość reakcji chemicznych przebiega w środowisku wodnym. Woda jest czynnym składnikiem w wielu reakcjach biochemicznych i jest waŜnym czynnikiem determinującym właściwości makrocząsteczek, takich jak białka. Woda dysocjuje do jonów OH~ i H+. Termin pH stosuje się do określenia stęŜenia jonów wodorowych w komórkach oraz płynach ustrojowych i stanowi kluczowe pojęcie w biochemii i medycynie. Grupy funkcyjne (aminowe, karboksylowe itd.) biomolekuł dysocjują przy określonej wartości pH, a wiele ich właściwości biologicznych i fizycznych zaleŜy od tej dysocjacji.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Wiadomo, Ŝe dla zdrowia nieodzowna jest stałość środowiska wewnętrznego organizmu,

utrzymywana we względnie wąskich granicach. Dotyczy to ogólnego rozmieszczenia wody, a takŜe utrzymywania pH i stęŜenia róŜnych elektrolitów, np. Na+, K+, Ca2+, Mg2+ i fosforanów w organizmie. Ogólna zawartość wody w organizmie męŜczyzny waha się w granicach 55—65% masy ciała; mniejsza wartość odnosi się do osób otyłych. Dane dla kobiet są mniejsze, średnio o ok. 10%. Dwie trzecie wody organizmu stanowi płyn wewnątrzkomórkowy

(ang. intraceliular fluid; skrót — ICF), zaś pozostałą część reprezentuje płyn pozakomórkowy (ang. extracellular fluid; skrót — ECF). Około 25% ECF występuje' w osoczu.

Regulacja równowagi wodnej jest złoŜona i za-

ieŜy przede wszystkim od podwzgórza, kontrolującego pragnienie, hormonu antydiuretycznego (ADH) i czynności nerek. Stany niedoboru wody i nadmiaru wody ustrojowej są powszechne. W wielu przypadkach towarzyszy im niedobór lub nadmiar jonów sodowych. Przyczynami niedoboru wody mogą być: 1) zmniejszone jej pobieranie (np. podczas śpiączki) lub 2) nadmierne jej wydalanie (np. utrata z moczem w cukrzycy, przy silnych potach przez skórę, w ostrej biegunce u dzieci, w przebiegu chslery). Nadmiar wody ustrojowej powodują: 1) zwiększone pobieranie (np. przy nadmiernym podawaniu płynów doŜylnie) bądź 2) zmniejszone jej wydalanie (np. w ostrej niewydolności nerek). U osób zdrowych pH płynu pozakomórkowego utrzymuje się w granicach 7,35—7,45. Bufor wodorowęglanowy (HCOf/H2CO3) odgrywa szczególnie waŜną rolę w tym względzie. Kiedy pH osiąga wartość poniŜej 7,35, wtedy dochodzi do stanu określanego jako kwasica, jeŜeli zaś pH przekroczy wartość 7,45 występuje zasado wica. Zaburzenia równowagi kwasowo-zasadowej moŜna zwykle

rozpoznać oznaczając pH krwi tętniczej, pCO 2 oraz ogólną zawartość COj we krwi Ŝylnej, znając poprzednio wymienione wartości, stęŜenie HCOf. Istnieją liczne przyczyny kwasicy (ketoacydoza cukrzycowa, kwasica mleczanowa itp.) i zasadowicy (wymioty kwaśną treścią Ŝołądkową, działanie niektórych leków moczopędnych itp.). Znajomość patogenezy zaburzeń równowagi wodnej i równowagi kwasowo-zasadowej jest podstawą właściwej diagnozy i ich leczenia. Wymaga to zatem poznania tych właściwości wody, które umoŜliwiają jej odegranie kluczowej roli w biochemii.

WODA I pH / 27

Cząsteczka wody wykazuje budowę tetraedryczną Cząsteczka wody ma postać nieregularnego czworościanu (tetraedr) z atomem tlenu w jego środku (ryc. 3-1). Dwa wiązania z wodorem są skierowane w 2 rogi czworościanu, podczas gdy 2 pozostałe rogi są zajęte przez niesparowane elektrony na zhybrydyzowanych orbitalach 2sp3. Kąt pomiędzy 2 atomami wodoru a tlenem (105°) jest nieco mniejszy niŜ kąt tetraedryczny (109,5c), co przyczynia się do utworzenia nieznacznie skośnego czworościanu. Ryc. 3-2. Tetraedryczna struktura amoniaku.

STRUKTURA TETRAEDRYCZNA I DIPOLARNY CHARAKTER WODY UŁATWIAJĄ REAKCJE

Ryc. 3-1. Tetraedryczna struktura wody

Nierównomierne rozmieszczenie ładunku w cząsteczce wody przyczynia się do utworzenia dipolu (cząsteczki biegunowej) Lekko pochyla struktura czworościanu wody jest przyczyną nierównomiernego rozmieszczenia w niej ładunku. Przeciwległa do 2 atomów wodoru strona tlenu jest stosunkowo bogata w elektrony, natomiast druga strona, zawierająca względnie odsłonięte jądra wodoru, tworzy obszar o ładunku miejscowo dodatnim. Pojęcie „dipol" oznacza taką cząsteczkę, jak woda, w której ładunek elektryczny (elektrony) jest rozmieszczony nierównomiernie. Amoniak, podobnie jak woda, jest tetraedryczną cząsteczką dipolową W cząsteczce amoniaku kąty między wiązaniami atomów wodoru (107°) są zbliŜone do kąta tetraedrycznego nawet bardziej niŜ w wodzie {ryc. 3-2). Wiele związków organicznych budujących komórki jest dipolami, np. alkohole, fosfolipidy, aminokwasy i kwasy nukleinowe.

W stanie ciekłym woda jest stabilizowana przez wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe, które tworzą strukturę wielkocząsteczkową przypominającą strukturę lodu Cząsteczki wody, z powodu dwubiegunowego charakteru, tworzą uporządkowane układy (przypominające płatki śniegu). JednakŜe uporządkowanie takie, jak w cząsteczce wody, nie ogranicza się do lodu. Woda w stanie ciekłym wykazuje strukturę wielkocząsteczkową, która jest ściśle równoległa do rozkładu geometrycznego cząsteczek wody w lodzie. Zdolność cząsteczek wody do łączenia się ze sobą zarówno w stanie ciekłym, jak i stałym wynika z dipolarncgo charakteru wody. Pozostaje ona w stanie ciekłym z powodu przemijającego charakteru jej kompleksów wielkocząsteczkowych (okresu półtrwania asocjacji — dysocjacji cząsteczek wody — ok. 1 as). W stanie stałym kaŜda cząsteczka wody asocjuje z 4 innymi cząsteczkami wody. W stanie ciekłym liczba asocjujących cząsteczek jest nieco mniejsza (ok. 3,5) i w tym stanie woda swoją budową wielkocząsteczkową, z wyjątkiem przemijającej natury wewnątrzcząsteczkowych interakcji, przypomina lód w znacznie większym stopniu niŜ moŜna było początkowo przypuszczać. Dipolarny charakter cząsteczek wody sprzyja ich wzajemnemu łączeniu się w uporządkowanym, precyzyjnym szyku, wynikającym z wewnętrznej geometrii cząsteczki wody (ryc. 3-3).

28 / ROZDZIAŁ 3

V ł Ryc. 3-3. Strona Iswa: Asocjacja 2 dipoiarnych cząsteczek wody. Linia kropkowana przedstawia wiązanie wodorowe Strona prawa: Asocjacja cząsteczki wody (środkowej) z 4 innymi cząsteczkami wody za pomocą wiązań wodorowych. Struktura ta H ,, jest typowa dla lodu i w mniejszym stopniu dla wody w stanie ciekłym.

V

Oddziaływanie elektrostatyczne między jądrem wodoru jednej cząsteczki wody a wolną parą elektronów drugiej nazywa się wiązaniem wodorowym. W porównaniu do wiązań kowalencyjnych, wiązania wodorowe są raczej słabe. Rozerwanie wiązania wodorowego w wodzie (w stanie ciekłym) wymaga ok. 18,8 kJ/mol (4,5 kca!/mol), tj. ok. 4% energii wymaganej do rozerwania wiązania O—H w wodzie (461 kJ/mol=llO kcal/mol).

Słabe wiązania wodorowe odgrywają istotną rolę w biochemii, włączając stabilizacje struktury białek i kwasów nukleinowych Wiązania wodorowe, które są słabe, lecz mogą powstawać w duŜych ilościach, odgrywają istotną rolę w biochemii. Liczne wiązania

CH3 — CHj—

CHj — CH

Ryc. 3-4. Powstawanie wiązań wodorowych między cząsteczkami etanolu i wody, między 2 cząsteczkami etanolu oraz między tlenem grupy karbonylowej peptydu i wodorem grupy aminowej sąsiadującego peptydu.

wodorowe narzucają uporządkowanie struktury nie tylko wodzie, lecz takŜe innym cząsteczkom dipolowym, tak odmiennym od wody, jak alkohole, DNA i białka. Tworzenie wiązań wodorowych między przedstawicielami cząsteczek waŜnych fizjologicznie związków przedstawia ryc. 3-4. Powstawanie ich nie ogranicza się do cząsteczek wody. Atomy wodoru, połączone z atomami azotu, mogą uczestniczyć takŜe w wiązaniach wodorowych. Problem ten będzie rozpatrywany w dalszej części ksiąŜki w związku z omawianiem trójwymiarowej struktury białek oraz reguł łączenia się (parowania) zasad azotowych w DNA,

Cząsteczki wody wykazują niewielką, ale fizjologicznie waŜną, tendencję do dysocjacji, tj. tworzenia małych ilości jonów OH- i H Cząsteczki wody wykazują ograniczoną tendencję do dysocjacji (jonizowania) na jony H + iOH": H2O ~ H+ + OH" PoniewaŜ jony są w ciągłym ruchu, twcTrząc cząsteczki wody i dysocjując, trudno określić, czy pojedynczy atom wodoru Jub tlenu występuje jako jon, czy jako część cząsteczki wody. W danym momencie moŜe być jonem, a w następnym częścią cząsteczki. Jonów oraz cząsteczek wody nie rozpatruje się pojedynczo. Wiedząc, Ŝe 1 g wody zawiera 3,46 x 1022 cząsteczek, jonizację wody moŜna opisać statystycznie. NaleŜy znać prawdopodobieństwo występowania wodoru w formie jonu lub części cząsteczki wody. W przypadku gdy prawdopodobieństwo występowania wodoru w formie jonu wynosi 0,01 oznacza to, Ŝe atom wodoru ma 1 szansę na 100 bycia jonem, a 99 szans na sto — istnienia w cząsteczce wody. Faktyczne prawdopodobieństwo znalezienia atomu wodoru w postaci jonu w czystej wodzie wynosi ok. 0,0000000018, tj. 1,8 x 10~9. Zatem jest on prawie w całości częścią cząsteczki wody. Wynika z tego, ze w czystej wodzie na kaŜdy jon wodorowy i hydroksylowy przypada 1,8 x 109, tj, 1,8 mld cząsteczek wody. Jony wodorowe i hydroksylowe mają jednak znaczny wpływ na właściwości wody. Tendencję wody do dysocjacji wyraŜa się następująco: [H2O]

WODA I pH / 29

W nawiasach przedstawiono stęŜenia molowe jonów wodorowych, hydroksylowych i niezdysocjowanych cząsteczek wody*, a K nazwano stalą dysocjacji. Aby obliczyć stalą dysocjacji dla wody, natęŜy przypomnieć, Ŝe 1 mol ma masę 18 g. Jeden litr (1) (1000 g) wody zawiera zatem 1000:18 = 55,56 mol. StęŜenie molowe czystej wody wynosi więc 55,56 mol. PoniewaŜ prawdopodobieństwo występowania wodoru w formie jonowej wynosi 1,8 x 10~9, stęŜenie molowe jonu H + (lub jonów OH~) w wodzie oblicza się, mnoŜąc prawdopodobieństwo 1,8 x 10~* przez stęŜenie molowe wody, tj. 55,56, co daje wynik= 1,0 x 10"7 mol/l. Teraz moŜna wyliczyć wartość K dla wody: [H+] [ O H ]

K

[107] [107]

[HZO]

[55,56]

14

= 1,8 x

16

(mol/1)2

dla

wszystkich

roztworów

wodnych, nawet dla tych, które zawierają kwasy lub zasady. W dalszej części rozdziału stalą ta będzie wykorzystywana do obliczenia wartości pH roztworów kwaśnych i zasadowych.

pH JEST UJEMNYM LOGARYTMEM STĘśENIA JONÓW WODOROWYCH, A ŚCIŚLEJ AKTYWNOŚCI JONÓW WODOROWYCH Termin pH wprowadził w 1909 r. Sórensen, definiując pH jako ujemny logarytm stęŜenia jonów wodorowych: pH = -log[H ]

DuŜe stęŜenie molowe wody (55,56) prawie nie ulega zmianom przez dysocjację. Stąd wygodnie jest rozpatrywać wodę jako zasadniczo niezdysocjowaną (stalą). Stała ta moŜe być włączona w stałą dysocjacji K, jako nowa stała Kw, zwana iloczynem jonowym wody. Stosunek między Kw a K przedstawiono poniŜej: [OH 1,8 x 10[HZO]

10~1'1

+

= 0,018 x 10 1O"1S mol/l

K

kiego (37°C) stęŜenie H+ w wodzie jest nieco większe niŜ 10~7 mol/l. W ramach ustalonych granic wpływu temperatury, wartość Kw =

mol/l

Definicja ta, aczkolwiek niezbyt ścisła*, jest na ogół wystarczająca do celów biochemicznych. Aby obliczyć pH roztworu naleŜy: 1) oznaczyć stęŜenie jonów wodorowych (H+), 2) obliczyć logarytm dziesiętny (H+), 3) pH jest ujemną wartością znalezioną w punkcie (2). Na przykład w przypadku czystej wody w temp. 25°C:

pH = -log[H*] = -logiO

-[-7]= 7,0

K w = (K) [H t O] = [H+] [ O H ] =

- 1,8 x10

16

mol/l) (55,56 mol/l) =

= 1,00 x 10"

14

(mol/l)

1

Stałą K wyraŜa się w molach na litr, zaś Kw — w mol2 na litr2. Z nazwy wynika, Ŝe iloczyn jonowy Kw jest liczbowo równy iloczynowi stęŜeń molowych jonów H + i OH ~: Kw = [H+] [ O H ]

W temperaturze 25°C Kw = (10~7)2 m 10~14 (mol/f)2. Natomiast w temperaturach poniŜej 25°C wartość Kw jest większa, zaś powyŜej 25°C mniejsza niŜ 10~14. W temperaturze ciała ludz-

Małe wartości pH odpowiadają duŜym stęŜeniom jonów H+, a duŜe — małym stęŜeniom H+ Kwasy określa się dawcami protonów, a zasady biorcami protonów. WyróŜnia się mocne kwasy (np. HC1, H2SO4) całkowicie zdysocjowane, nawet w mocnych roztworach kwaśnych (niskie pH), oraz słabe kwasy, częściowo tylko dysocjujące w roztworach kwaśnych. Podobnie moŜna wyróŜnić mocne zasady (np. KOH, NaOH) i słabe zasady (np. Ca(OH)2>. Tylko mocne zasady dysocjują przy małych wartościach pH. Większość związków organicznych w komórkach to słabe kwasy. Wyjątek stanowią ufosforylowane związki pośrednie, które zawierają

Ściśle mówiąc, wyraŜenia w nawiasach reprezen- * scisie mówiąc, wyraŜenia w nawiasacn reprczen- ------------------------------------------------------------------------------tują raczej aktywność molową niŜ stęŜenie molowe. * pH= — log (aktywności H + )

30 / ROZDZIAŁ 3

silnie kwasową grupę pierwszorzędowego kwasu fosforowego.

StęŜenie (mol/1) (a)

PoniŜsze przykłady ilustrują sposób obliczania pH roztworów kwaśnych i zasadowych: Przykład. Jakie jest pH roztworu, w którym stęŜenie jonu wodorowego wynosi 3,2 xlO"4 mol/l?

= -log (3,2x10"*) 4 = -log (3,2) -logCIO" )

=-0,5+4 = 3,5 Przykład. Jakie jest pH roztworu, w którym stęŜenie j o nu hyd ro ksylo wego wyno si 4,0 x 10"4 mol/l? Aby rozwiązać to zadanie, naleŜy określić ilościowo wartość pOH, które jest równe —log [OH~]; wartość tę moŜna wyprowadzić z definicji K: 14

[OH-] = 10" zatem +

log [H ] + log [ O H ] = log 10" lub

pH + pOH = 14

A następnie: [ O H ] = 4,0 x 1 0 * pOH = -log [ O H ] = -log (4,0 x 10 4

1og(10" ) =

4

) = -log (4,0) -

-0,60 + 4,0 = 3,4 i teraz

pH = 14 - pOH = 14 - 3,4 = 10,6

Przykład. Jakie jest pH roztworu (a) 2,0xl0" ! mol/l KOH, (b) 2,0 x 10"* mol/l KOH? W roztworach tych jony OH~ pochodzą z 2 źródeł: KOH i wody. PoniewaŜ pH określa całkowite stęŜenie jonów [H+] (pOH — całkowite [OH ]) naleŜy obydwa źródła brać pod uwagę. W pierwszym przypadku udział wody w całkowitej puli [OH~] jest nieistotny, czego nie moŜna powiedzieć w drugim przypadku.

(b)

Molowość KOH 2,0xicr 2 2,0 2 [0H-] 2 KOH xl O" 7 [OH-j z wody 1,0x10" 2 Całość [0H-] 2,00001 x10~

6

2,0x10" e 2,0x10~ 7 1,0x10" 6 2,1 x10"

W momencie podjęcia decyzji o znaczeniu udziału wody, pH moŜna wyliczyć jak powyŜej. , W przedstawionych przykładach przyjęto załoŜenie, Ŝe mocna zasada KOH jest w pełni zdysocjowana, a stęŜenie molowe jonów OH~ równa się stęŜeniu molowemu KOH. ZałoŜenie to jest słuszne dla względnie rozcieńczonych roztworów mocnych zasad i kwasów lecz nie dotyczy słabych zasad i kwasów. Ze względu na fakt, Ŝe te słabe elektrolity tylko w niewielkim stopniu dysocjują w roztworach, naleŜy przed obliczeniem całkowitego [H+] (lub całkowitego [OH~]) oraz obliczeniem pH, obliczyć stęŜenie H+ (lub stęŜenia OH~) z danego stęŜenia molowego kwasu (lub zasady), wykorzystując stałą dysocjacji. Biomolekuły zawierają grupy funkcyjne czynne o istotnym znaczeniu fizjologicznym, które zachowują się jak słabe kwasy Wiele związków organicznych Ŝywych komórek ma grupy funkcyjne, typowe dla słabych kwasów lub zasad. Jedna lub więcej grup funkcyjnych — głównie grupy karboksylowe, aminowe lub utworzone w wyniku drugorzędowej dysocjacji fosforanowej estrów fosforanowych — występują we wszystkich białkach i kwasach nukleinowych, większości koenzymów oraz metabolitów pośrednich. Aby zrozumieć wpływ wewnątrzkomórkowego pH na budowę i aktywność biochemiczną tych związków, naleŜy poznać sposób dysocjacji (równowagi protono-

Tabela 3-1. Przykłady słabych kwasów i sprzęŜonych z nimi zasad Kwas

SprzęŜona zasada

CH3COOH

CH3COO-

CH3NH3

CH3NH2

OH

O"

H+N

NH

N

NH

WODA I pH / 31

wej) grup funkcyjnych słabo kwaśnych i słabo zasadowych. W laboratoriach badawczych i klinicznych rozdział i identyfikacja tych związków opiera się na znajomości przebiegu dysocjacji ich grup funkcyjnych. Protonowa forma kwasu (HA lub RNH+) odnosi się do kwasu, zaś nieprotonowa (A~ lub RNH2} — do sprzęŜonej z nim zasady (tab. 3-1). Podobnie moŜna opisać zasadę (np. A~ lub RNH2) i sprzęŜony z nią kwas (np. HA lub RNH+) (lac. conitmgere — połączyć razem). Względną moc słabych kwasów i zasad wyraŜa sie ilościowo przez ich stale dysocjacji, które obrazują ich tendencje do jonizacji. PoniŜej podano wyraŜenia stałej dysocjacji (K.) dla 2 przedstawicieli słabych kwasów: i R—NH+ R—COOH ++ R—COO + ] [H + ]

IR-COO

[R—COOH] R-NH

Z powyŜszych równań, odnoszących K do [H+] i do stęŜenia niezdysocjowanego kwasu i sprzęŜonej z nim zasady, wynika, Ŝe gdy IR—COO] = R—COOH

lub gdy [R—NHZ] = [R— NHj]

to wtedy K = [H+]

MoŜna to wyrazić słowami: gdy rodzaj jonów zasocjowanych (protonowych) i zdysocjowanych (sprzęŜone zasady) występuje w równych stęŜeniach, wówczas przewaŜające stęŜenie jonów wodorowych [H+] jest równe liczbowo stałej dysocjacji K.

Jeśli obliczy się logarytmy powyŜszego równania i obie strony pomnoŜy się przez — I, to

H *+ R—NH2

K [H+] -log[H

K = [R—MH2] [H [RNHj]

PoniewaŜ wartości liczbowe K dla słabych kwasów są ujemnymi liczbami wykładniczymi, wygodniej jest wyraŜać K jako pK, gdzie:

Z definicji —log K opisuje się jako pK, zaś — log [H+] jako pH. W związku z tym moŜna ostatnie równanie zapisać

p K = -l o g K

pK = pH

tj. pK grupy kwasowej jest takim pH, w którym Tabela 3-2. Stałe dysocjacji i wartości pK dla przedstawicieli kwasów karboksylowych Kwas Octowy Gluta rowy Cytrynowy

pK

K 5

1,76x10

4,75

(1-rz.)

4,58 x10"

5

4,34

(2-rz,)

3,89x10" 6

5,41

(1-rz.)

8,40x10"

4

3,08

(2-rz.) (3-rz.)

1,80x10"E 4,00x10" 6

4,74 5,40

NaleŜy odnotować, Ŝe pK odnosi się do K tak, jak pH do stęŜenia H + . W tabeli 3-2 przedstawiono wartości K i pK dla kwasu mono-, di- i trikarboksylowego. NaleŜy podkreślić, Ŝe grupy mocniejszych kwasów mają mniejsze wartości pK.

stęŜenia postaci protonowej i niepro tonowej są

równe. Wartość pK kwasu moŜna oznaczyć doświadczalnie przez dodanie 0,5 równowaŜnika* zasady na równowaŜnik kwasu. Powstałe w ten sposób końcowe pH będzie odpowiadać pK kwasu. Charakter słabych kwasów i buforów, które są roztworami słabych kwasów i ich soli opisuje równanie Hendersona-Hasselbalcha Wartość pH roztworu zawierającego słaby kwas jest zaleŜna od stałej dysocjacji tego kwasu, jak przedstawiono powyŜej dla słabo kwaśnej wody. ZaleŜność tę opisuje, w przystęp-

* Według układu SI pojęcie równowaŜnika chemicznego nie jest uŜywane, jednak w tym tłumaczeniu określenie to świadomie utrzymujemy {przyp. red. nauk. tłum.).

32 / ROZDZIAŁ 3

nej formie, równanie Hendersona-Hasselbalcha, wyprowadzone poniŜej. Słaby kwas HA dysocjuje w następujący sposób:

Zatem w przypadku zobojętnienia w połowie pH = pK. 2. Kiedystosunek(;A-]/[HA]wynosi 100:1

HA~ H + +A" Stała dysocjacji dla tej reakcji dysocjacji wynosi:

pH = pK + log 100/1 = pK + 2 3. Kiedy stosunek [A~]/[HA] wynosi 1:10

" [HA] Po pomnoŜeniu na krzyŜ:

pK + (-1)

pH = pK +■ log-

[H+] [ A ] = K[HA] 1,0 -

Po podzieleniu obu stron przez [A~] i

0,8

10

o

Po zlogarytmowaniu obu stron:

■o

I%

■og[H+] [HA]

li 1*08

[A ] log K + log Po pomnoŜeniu przez — 1 - f c » g [ H+ ] = -l o g K - l og

[HA ]

Po podstawieniu zamiast —log H+ i —log K odpowiednio pH i pK otrzymuje się [HA]

i

ojpK -3

pK -2

pK -1

pK 0

pK +1

pK +2

pK +3

łtyc. 3-5. Typowa krzywa miareczkowania wykreślona na podstawie wyników obliczeń z równania Hendersona-Hasselbalcha.

pH = pK - log [A]

Z kolei usuwa się znak minus, odwracając ostatni człon równania: pH = pK 4 log [HA]

Ta ostatnia forma równania, opisywana jako równanie Hendersona-Hasselbalcha, słuŜy do wyliczania równowagi protonowej, np.: 1. Kiedy kwas jest zobojętniony dokładnie w połowie, tj. A~ =[HA]. W tych warunkach pH = pK + tog

[A] [HA]

pK +- log— =pK + 0

Jeśli równanie zastosuje się dla róŜnych stos u n kó w [ A- ] /[ H A] w za kr e s ie 1 0 M0 " 3 i przedstawi na wykresie wyliczone wartości pH. to otrzymany wynik opisuje krzywą miareczkowania słabego kwasu (ryc, 3-5).

Roztwory słabych kwasów i ich soli buforują pH w przypadku dodania lub usuwania protonów Roztwory słabych kwasów i sprzęŜonyct z nimi zasad (lub słabych zasad i sprzęŜonycl z nimi kwasów) wykazują zjawisko buforowa nia, tj. zdolności utrzymywania pH. Wartość pt roztworu buforowego po dodaniu mocnego kwasi lub mocnej zasady nie zmienia się bardziej niŜ p< dodaniu takiej samej objętości wody. Zjawisk*

WODA I pH / 33

buforowania moŜna najlepiej zilustrować poprzez miareczkowanie słabego kwasu lub zasady wykorzystując pH-metr. W innym rozwiązaniu moŜna obliczyć przesunięcie pH, które ma miejsce w przypadku dodania kwasu lub zasady do zbuforowanego roztworu. W przedstawionym przykładzie, zbuforowany roztwór (mieszanina słabego kwasu i sprzęŜonej z nim zasady, pK = 5,0) wykazuje początkowo w jednej z 4 wartości pH. MoŜna obliczyć przesuniecie pH, które wystąpi, jeśli zostanie dodany 0,1 mmol/1 K.OH na kaŜdy milirównowaŜnik kwasu w roztworze (o stęŜeniu 1 mmol). Początkowe pH 5,00 [" ] początkowe 0,50 0,50 1,00

0,30 2.33

5,37 0,70 0,20 4,00

5,60 0,80 0,12 7,33

f 1,0-

5,86 0,88

2

3

4

5

6

7

8

Ryc. 3-6. Krzywa miareczkowania kwasu typu HA.

Punkt {) wskazuje pK o wartości 5,0.

Dodanie 0,1 mmol KOH powoduje 0,60

0,80

0,40 [A f/[HA]końcowe Kortcowe pH

ipH

1,50

0,90 0,20 0,10 0,02 4,00 9,00

0,98

0,176 5,18

49,0 0,602 5,60

0,95 5,95

1,69 6,69

0,18

0,23

0,35

0,83

Zmiana pH, wywołana przez dodanie 1 mmol jonów OH~ róŜni się znacznie w zaleŜności od pH. Przy wartościach pH zbliŜonych do wartości pK, roztwory buforowe utrzymują skuteczniej pH, co określa się ich efektem buforującym. Roztwory słabych kwasów i sprzęŜonych z nimi zasad są najskuteczniejszymi układami buforowymi w zakresie pH równym pK + 2,0 jednostki pH.

Oznacza to, Ŝe aby zbuforować roztwór w pH X, moŜna wykorzystać słaby kwas lub zasadę, których pH nie róŜni się od pH X więcej niŜ o 2 jednostki pH. Na rycinie 3-6 przedstawiono ładunek eJektryczny 1 cząsteczki kwasu jako funkcję pH.

3 — Biochemia

Ładunek ułamkowy —0,5 nie oznacza, Ŝe pojedyncza cząsteczka jest obdarzona ładunkiem ułamkowym, lecz wyraŜa statystyczne prawdopodobieństwo, Ŝe ma ona ładunek —0,5. Przyjęcie ładunku elektrycznego makrocząsteczek jako funkcji pH stwarza podstawę dla wielu uŜytecznych technik rozdziału, włączając eiektroforetyczny rozdział aminokwasów, białek osocza i nieprawidłowych hemogJobin. W komórkach Ŝywych bufory fosforanowy i wodorowęglanowy, oprócz białczanowych, stanowią podstawowe bufory.

PIŚMIENNICTWO Segel IM: 1968.

Biochemical

Calcuiations.

Wiley,

CZĘŚĆ I Budowa oraz funkcje białek i enzymów

4

Aminokwasy Victor W. Rodweli, PhD

WPROWADZENIE

genne) muszą być dostarczane w poŜywieniu, poniewaŜ nasz organizm nie moŜe ich synśywe komórki wytwarzają makrocząsteczki tetyzować w ilościach niezbędnych do pod(białka, kwasy nukleinowe, polisacharydy), które trzymania wzrostu (dzieci) i utrzymania zdrosłuŜą jako składniki strukturalne, katalizatory, wia (dorośli). Metabolizm aminokwasów przyhormony, receptory lub magazyny informacji czynia się do powstania wielu biomedycznie genetycznej. Te makrocząsteczki są biopolime- waŜnych związków. Na przykład dekarboksylarami, utworzonymi z jednostek monomerycz- cja pewnych aminokwasów prowadzi do ponych lub cegiełek budulcowych. Jednostkami wstania amin, wśród których cześć pełni waŜne monomerycznymi w kwasach nukleinowych są funkcje biologiczne (np. histamina i kwas 7-anukleotydy, w złoŜonych polisacharydach — po- minomasłowy [GABA]). Liczne choroby są chodne cukrowe, a w białkach — L-a-amino- spowodowane nieprawidłowościami transportu kwasy. aminokwasów do komórek. W pewnych warunChociaŜ białka mogą takŜe zawierać poza kach moŜe dojść do pojawienia się w moczu aminokwasami, dodatkowe substancje (np. znacznej ilości jednego lub wielu aminokwasów hem, cukrowce, tłuszcze), ich trójwymiarową — takie stany określa się jako aminoacydurie. strukturę i właściwości biologiczne warunkuje w głównej mierze rodzaj aminokwasów, kolejność, w jakiej łączą się ze sobą w łańcuchu WSZYSTKIE AMINOKWASY polipeptydowym oraz ich przestrzenne ułoŜenie,, ZAWIERAJĄ PRZYNAJMNIEJ 2 GRUPY FUNKCYJNE względem siebie. Aminokwasy pełnią dodatkowe funkcje Aminokwasy zawierają 2 grupy funkcyjne, tj. w komórkach. W tabeli 4-4 i 4-5 przedstawiono niektóre biologicznie waŜne substancje, które aminową i karboksylową. W a-aminokwasach obie te grupy połączone są z tym samym (a) wywodzą się z aminokwasów. H

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Niektóre aminokwasy wydają się być zaangaŜowane w przenoszeniu impulsów w układzie nerwowym, czego przykładem są glicyna i kwas Ryc. 4-1. glutaminowy. Aminokwasy podstawowe (egzo- kwasu.

\a R-C-NHj I

COOH

OH

Dwie formy przedstawienia j.-amino-

36 / ROZDZIAŁ 4

atomem węgla (ryc. 4-1). ChociaŜ w przyrodzie występuje ok. 300 aminokwasów, tylko 20 z nich występuje w białkach (tab. 4-3). Całkowita hydroliza* biatek dostarcza 20 L-a-aminokwasów. NaleŜy podkreślić, Ŝe białka wszystkich form Ŝycia — roślin, zwierząt, drobnoustrojów — zawierają te same 20 aminokwasów. Przyczyną tego jest uniwersalność kodu genetycznego, co stanie się oczywiste dla Czytelnika w toku omawiania tego zagadnienia później (p. rozdz. 30). W skład niektórych białek wchodzą pochodne aminokwasów, utworzone po ich włączeniu w cząsteczkę białka (p. lab. 6-4). Z wyjątkiem glicyny, dla której R (R — łańcuch boczny aminokwasu) stanowi atom wodoru (ryc. 4-1), wszystkie 4 podstawniki związane z atomem węgla et-aminokwasów są róŜne. Tetrąędryczne. ułoŜenie 4 róŜnych podstawników wokół atomu węgla a (tzw. węgiel asymetryczny) nadaje aminokwasom właściwość op.tyczna. (zdolnośćTjio_ _skręcania . płaszczyzny światła spolaryzowanego). ChociaŜ pewne aminokwasy występujące w białkach są prawoskrętne, a niektóre lewoskrętne, w pH 7,0 wszystkie mają bezwzględną konfigurację porównywalną z konfiguracją aldehydu L-glicerynowego, stąd opisuje się je jako L-a-aminokwasy.

Ogólne reakcje chemiczne aminokwasów moŜna przewidzieć znając właściwości grup funkcyjnych Grupy funkcyjne aminokwasów — karboksylowa i aminowa — wykazują typowe dla nich reakcje, np. tworzenie soli, estryfikację, acyla-

RÓWNOWAGI PROTONOWE AMINOKWASÓW W zaleŜności od pH otaczającego środowiska aminokwas moŜe mieć ładunek dodatni, ujemny lub nie mieć Ŝadnego ładunku Aminokwasy zawierają co najmniej 2 zjonizo wanc, słab o k waś ne gr up y: — COOH i —NHt- W roztworze obie formy tych grup.

* Hydroliza = rozerwanie wiązania kowalencyjnego przy udziale cząsteczki wody.

jedna naładowana, a druga obojętna, występują w równowadze protonowej: +

R—COOH « R—COO" + H+ H

W równowadze tej R—COOH i R—NH^ reprezentują związki protonowe lub kwaśne, natomiast R—COO~ i R—NH2 — zasady sprzęŜone (protonobiorców) z odpowiednimi kwasami. ChociaŜ zarówno R—COOH jak i R NH; są słabymi kwasami, R—COOH jest znacznie silniejszym kwasem niŜ R—NH r W pH osocza krwi czy przestrzeni śródkomórkowej (pH odpowiednio 7,4 i 7,1) grupy karboksylowe istnieją prawie całkowicie jako jony karboksyjowe — R—COO~. Przy tych wartościach pH większość grup aminowych występuje w f o r m i e z a s o c j o wa n e j ( p r o t o n o we j ) — R—NH3. Ze względu na przewaŜającą postać zjonizowaną aminokwasów we krwi i większości tkanek, naleŜy przedstawić ich budowę tak, jak na ryc. 4-2A. NaleŜy pamiętać, Ŝe struktura B (ryc. 4-2) nie moŜe istnieć w Ŝadnym pH. Przy dostatecznie niskim pH, w którym cofa się jonizacja grupy karboksylowej, znacznie słabsza kwaśna grupa aminowa będzie występować takŜe w formie protonowej. PrzybliŜone wartości pKa dla grup a-karboksylowej i oc-aminowej wynoszą odpowiednio 2 i 10 (tab. 4-1). Przy pH wynoszącym 2 jednostki poniŜej wartości pKa, kwas w ok. 99% ma formę protonową. JeŜeli pH stopniowo wzrasta, to proton z grupy karboksylowej odłącza się znacznie wcześniej niŜ z grupy R—NH 3 • W kaŜdym wystarczająco wysokim pH do utworzenia przewagi grupy aminowej R—NH2 musi być równieŜ obecny jon karboksylowy (R—COO~). JednakŜe w wielu reakcjach, poza równaniami równowagi protonowej, stosuje się wzory aminokwasów w formie B. +

NH, 0-

NHj

II O 8

Ryc. 4-2. Poprawna struktura ^jonizowanego aminokwasu w pH fizjologicznym lub blisko pH fizjologicznego (A). Postać B (niezjonizowana) nie występuje w Ŝadnym pH, ale jest często' uŜywana, dla wygody, przy omawianiu chemii aminokwasów.

AMINOKWASY / 37 Tabela 4-1. Słabo kwaśne grupy aminokwasów występujących w białkach SprzęŜony kwas

SprzęŜona zasada

PrzybliŜona wartość pK

a-Karboksylowa

R—COOH

R—COO"

2.1 ±0,5

Nie a-kar boksy Iowa (asparaginian, glutaminian)

R—COOH

R—COO"

4,0 + 0,3

f

Imidazolowa (histydyna)

1--------- R

r v

6,0

^-Aminowa

R-NH +

R—NH2

9,8 ±1,0

s-Aminowa (lizyna)

R-NH^

R—NHa

10,5

Fenolowa OH (tyrozyna)

Guanidynowa (arginina)

Sulf hydry Iowa (cystein3)

10,1

1 11+R—N— C—NH2

H NH j II R—N— C—NH2

R—SH

R - S-

H NH2

Względną moc słabych kwasów wyraŜają wartości pK, Względną moc słabych kwasów wyraŜa się przez ich stale dysocjacji Ka lub przez ich pK — ujemny logarytm ze stałej dysocjacji:

W tabeli 4-1 przedstawiono wartości pK dla grup funkcyjnych 20 aminokwasów spotykanych w białkach. Całkowity ładunek (algebraiczna suma wszystkich dodatnio i ujemnie naładowanych grup) aminokwasu zaleŜy od pH lub stęŜenia protonów otaczającego środowiska. MoŜliwość zmiany ładunku aminokwasów i ich pochodnych, przez umiejętne sterowanie pH, ułatwia fizyczny rozdział aminokwasów, peptydów i białek.

12,5 ■

8,3

Punkt izoelektryczny aminokwasu (pl) jest to takie pH, przy którym nie jest on obdarzony Ŝadnym ładunkiem i nie porusza się w polu elektrycznym Strukturę aminokwasu alifatycznego, takiego jak alanina, w pH odpowiadającym punktowi izoelektrycznemu przedstawia ryc. 4-3.

NrV

Ryc. 4-3. Struktura postaci zjonizowanej lub jonu obojnaczego alaniny. ChociaŜ jon obojnaczy alaniny ma grupy obdarzone ładunkiem elektrycznym, nie wędruje w polu elektrycznym.

♦ Dla wygody zapis Ka lub pKtt będzie stosowany, w przypadku aminokwasu z tylko dwiema lecz opuszczony później w przypisach dotyczących grupami zjonizowanymi (np. alanina) nie ma symboli. niejasności w wyliczeniu pl. PoniewaŜ wartość

38 / ROZDZIAŁ 4

W mocnym kwasie (pH ponlŜeji); całkowity ladunek= + l

O B pH ok. 3; całkowity ładunek = o

pH ok. 6 - ft całkowity ładunek = -1

D W mocno) zasadzie (pH powyŜej 11); całkowity ładunek = -2

Ryc. 4-4. Równowagi protonowe kwasu asparaginowego.

pK, (R—COOH) = 2,35 natomiast pK 2 (R—NH*) = 9,69, to punkt izoelektryczny (pl) alaniny wynosi:

2,35+9,69 Pl

= 6,02

Wyliczenie wartości pl dla aminokwasu z dodatkowymi grupami zjonizowanymi, poza tymi związanymi z węglem ot, jest bardziej skomplikowane. Na rycinie 4-4 przedstawiono róŜne formy jonowe kwasu asparaginowego. Jakie będzie zatem pH odpowiadające punktowi izoelektrycznemu dla tego aminokwasu? W poszukiwaniu pl dla kwasu asparaginowego trzeba napisać wszystkie moŜliwe formy jonowe tego związku w kolejności, w której pojawiają się w roztworach — od silnie kwaśnych, poprzez obojętne do zasadowych (porównaj przykład kwasu asparaginowego na ryc. 4-4). Następnie naleŜy rozpoznać formę izojonową, jon obojnaezy lub obojętny (jak na ryc. 4-4B). Punkt izoelektryczny (pl) jest to pH w środku pomiędzy wartościami pK po obydwu stronach form izojonowych. W omawianym przykładzie: 2,09+ 3,86 Pl =

2,98

Takie rozwiązanie jest równieŜ stosowane do obliczania wartości pl aminokwasów z innymi, dodatkowymi grupami dysocjującymi, np. lizyny lub histydyny. Po napisaniu wszystkich moŜliwych form elektrycznie naładowanych aminokwasów zasadowych — lizyny i argininy — naleŜy zapisać, Ŝe: pK2+ pK3 P ' = --------- « -------

Wartość pl dla lizyny wynosi 9,7; dla argininy 10,8. Czytelnik powinien umieć określić pl dla histydyny. Określenie wartości pK po kaŜdej stronie jonu obojnaczego przez sprawdzenie form naładowanych, nie ogranicza się do aminokwasów. MoŜna ją stosować do obliczania ładunku cząsteczki z kaŜdą liczbą grup dysocjujących. MoŜliwość wykonywania takich obliczeń okazuje się bardzo przydatna w laboratorium klinicznym, gdyŜ pozwala przewidzieć ruchliwość elektroforetyczną związków w polu elektrycznym i dobrać właściwe bufory do ich rozdziału. Na przykład, w buforze o pH 7,0 moŜna rozdzielić 2 typy cząsteczek: z pl 6,0 i 8,0, poniewaŜ cząsteczka z pI = 6,0 będzie mieć większy całkowity ujemny ładunek przy pH 7,0 niŜ cząsteczka z pI = 8,0. Podobne rozwaŜania stosują się do rozdziałów na złoŜach jonowych zarówno dodatnio, jak i ujemnie naładowanych polimerów (np. DEAE-celuloza, Ŝywica Dowex 1), Rozpuszczalność i temperatura topnienia aminokwasów odzwierciedlają ich charakter jonowy Obecność elektrycznie naładowanych grup większości aminokwasów przyczynia się do ich rozpuszczalności. W formie jonowej rozpuszczają się one łatwo w rozpuszczalnikach polarnych, takich jak woda i etanol, ale nie rozpuszczają się w rozpuszczalnikach niepolarnych, jak: benzen, heksan i eter. Wysoka temperatura topnienia (punkty topnienia powyŜej 200DC) odzwierciedla ilość energii potrzebnej do pokonania sił jonowych stabilizujących strukturę sieci kryształów.

AMINOKWASY / 33 Tabela 4-2. Podział L-at-aminokwasów występujących w białkach na podstawie względnej polarności ich grup R. W grupie niepolarnej jest mała bądź nie ma wcale róŜnicy w ładunku elektrycznym między regionami, podczas gdy w grupie polarnej róŜnica ta jest względnie duŜa Aminokwasy

Aminokwasy

niepolarne

polarne

Alanina

Arginina

Izoleucyna Leucyna Metionina Fenyloa Janina Prolina Tryptolan Walina

Asparagina Kwas asparaginowy Cysteina Kwas glutaminowy Glutamina Glicyna Histydyna Lizy na Sery na Treonina Tyrozyna

PODZIAŁ AMINOKWASÓW WYSTĘPUJĄCYCH W BIAŁKACH NA PODSTAWIE WZGLĘDNEJ POLARNOŚCI ICH GRUP R Aminokwasy występujące w białkach moŜna podzielić na 2 duŜe grupy na podstawie poiarności grup R. przyłączonych do atomu węgla a. W celu ułatwienia przedstawiania niezwykle długich sekwencji amin o kwasowych niektórych białek, praktykuje się stosowanie jednoliterowych symboli aminokwasów (tab. 4-3). Aminokwasy w stanie wolnym lub związanym (nie będące składnikami białek) odgrywają waŜną rolę w procesach przemiany materii (tab. 4-4 i 4-5). Na przykład ornityna, cytrulina i kwas argininobursztynowy uczestniczą w biosyntezie mocznika, katanie naturalnym występuje ponad 20 D-aminokwasów. NaleŜą do nich Dalanina i kwas D-glutami nowy ścian komórkowych niektórych bakterii oraz róŜne D-aminokwasy wchodzące w skład antybiotyków.

Tabela 4-3. L-s-aminokwasy występujące w białkach* Nazwa

Symbol

Wzór strukturalny

Aminokwasy z. alifatycznymi łańcuchami bocznymi H—CH™COCT

Glicyna

Gly [G]

Alanina

Ala [A]

Walina

Vaf [V]

Leucyna

Leu [L]

Izoleucyna

Ile [1]

CH3

,CH—CH—COO"

t

H,C

X

7>

CH—CB—CGO"

40 / ROZDZSAŁ 4

cd. tab. 4-3 Nazwa

Symbol

Wzór strukturalny

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym grupy hydroksylowe (OH) Sery na

CH^CH^rC&O-

Ser [S]

Treonina

Thr[T]

Tyrozyna

Tyr [Y]

.---.Li

^łJLJf-

CH,-CH—OH—COCT

OH *NHj

patrz niŜej

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym atomy siarki Cysterna*

Cys [C]

Metionina

Met [M]

SH fl^ CH;— CH3-CH—COO" CH SH ;C

H

3

H COO

O^~Cn3

Aminokwasy z łańcuchem Kwas asparaginowy

rwij

-^

bocznym zawierającym grupy kwaśne lub ich amidy

•

Asp[D]

"OOC—C Hs —CH—COO" t 1L 1 M

flfTJ

Asparagina

Asn [N]

.$.

HjN-C-CH, -C H —COO" 0 ^H,

Kwas glutaminowy

Glu ! El

"OOC—C H 2—C H3 —CH—COO"

Glutamina

Gin [Q]

H,N—C—CH 2—C H2 ~CH—COO-

Aminokwasy z łańcuchem

bocznym zawierającym grupy zasadowe

H—N—CH2—CH,—CH? —CH—COO"

I Arginina

+

NH5

Arg r

NH,

Lizy na

H s - CH, —CH, —C H S - CM—

[R]

COO" +

H3

Histydyna j

I

Lys [K]

C H,—GH—COO*

NH,

AMINOKWASY / 41 cd. tab. 4-3 Nazwa

Symbol

Wzór strukturalny

Aminokwasy zawierające pierścień aromatyczny -Histydyna

His [H]

Fenyioaianina

Phe {F]

Tyrozyna

Tyr[Yl

Tryptofan

Trp[W]

patrz wyŜej \ — / >—CHj—CH^COO"

pCH;—CH—cocr H

i------------1

Immokwasy Ptoiina

Pro [P]

*. Z wyjątkiem hydroksyl i zyny (Hyl) thydroksyproliny (Hyp), które są włączane w wiązania peptydowe jako lizyna i proiina, a następnie hydroksylowane, swoiste tRNA istnieją dla wszystkich aminokwasów przedstawionych w tej t3be/i. Ich włączanie w białka pozostaje pod bezpośrednią kontrolą genetyczną. ** Cystyna składa się z 2 reszt cystetn połączonych wiązaniem disiarczkowym: I "OOC—CH—CHZ —S—S—CH2—CH—COO" NH +

Tabela 4-4. Przykłady oc-aminokwasów nie występujących w białkach, ale spełniających istotną rolę w metabolizmie ssaków Nazwa po tuczna i systematyczna Homocysteina (kwas 2amino--4-merkaptoma słowy) Kwas cysteinosulfinowy {kwas 2-amtno-3-sulfinopropionowy) Homoseryna (kwas 2-amino-4-hydroksymasłowy)

Wzór strukturalny w pH obojętnym

Znaczenie

CH 2 — CH ? —CH—COCf ł

SH

NH 3

H2—CH—COO" CH2—C

so t^

CHS—CHS

Związek pośredni w biosyntezie metiortiny Związek pośredni w katabotizmie cysteiny Związek pośredni w metabolizmie treoniny, asparaginianu i metioniny

42 / ROZDZIAŁ 4

cd. tab. 4-4 Nazwa potoczna i systematyczna

Wzór strukturalny w pH obojętnym

Ornityna (kwas 2,5-diaminoamylowy)

Znaczenie

C H2—CH2—CH2—bi—COO"

Cytrulina (kwas2-amtno-5-ureidoamylowy)

Związek pośredni w biosyntezie mocznika

I NH,

Kwas argininobursztynowy

■NH CH2~™CHj11 "CHj

JW.

HN—C—NH"COO—CH2—C—COO*

Dopa {3,4-dihydroksyfenyloalanina)

3—T

V—CH,

Prekursor meianiny

HO

3-Monojodotyrozyna

CH,—

HO

Prekursor hormonów tarczycy

I

3,5 - D i j od oty r ozy n a

HO

-CH,

3,5,3'-Trijodotyronina (T 3) .

Tyroksyna (3,5,3',5'-tetrajodotyronina; T4}

jw.

HO

CH,

jw.

AMINOKWASY / 43 Tabela 4-5. Przykłady nie a-aminokwasów waŜnych dla metabolizmu ssaków Nazwa potoczna i systematyczna B-alanina (kwas 3-aminoproprionowy) Tauryna {kwas 2-amtnoerytosu)fonowy) Kwas y-aminomasłowy (GA8A)

Wzór strukturalny

Znaczenie

CH2—CH2—COO"

Składnik koenzymu A i witaminy

[ + NH3 CH2—CH2—SO3"

pantoteiny

Występuje w Ŝółci w połączeniu z kwasami Ŝółciowymi

11

On2—v*r12—^rl2—UUU

NeuroprzekaŜnik powstający z

(kwas 4-aminomasłowy)

glutaminianu w tkance mózgowej

Kwas fi-aminuizumasłowy

H 3 N+—CH 2 —CH—COO"

(kwas 2-metylo-3-aminopropionowy)

WŁAŚCIWOŚCI POSZCZEGÓLNYCH AMINOKWASÓW ZALEZĄ ÓD ICH GRUP R PRZY ATOMIE WĘGLA a Glicyna, najmniejszy aminokwas, moŜe „dopasować się" łatwo w obszary trójwymiarowej struktury białek, niedostępne dla innych aminokwasów i występuje w obszarach, w których łańcuchy peptydowe ulegają silnemu zwinięciu. Alifatyczne grupy R jłaniny, waliny, leucyny jjzoleucyny oraz aromatyczne grupy R fenyloajaniny, tyrozyny i tryptofanu są hydrofobowe i ta właściwość ma waŜne znaczenie w uporządkowaniu cząsteczek wody w białkach, w bezpośrednim sąsiedztwie tych grup. Te aminokwasy są charakterystyczne przede wszystkim dla wnętrza łańcuchów białek cytozolowych. Naładowane grupy R aminokwasów zasadowych odgrywają kluczową rolę w utrzymywaniu swoistej konformacji białka przez tworzenie wiązań typu soli. Przerwanie i odtworzenie wiązań typu soli towarzyszy utlenowaniu i odtlenowaniu hemoglobiny {p. rozdz. 7). Ponadto aminokwasy z dodatnio lub ujemnie naładowanymi grupami R uczestniczą w układach „przekazywania ładunku" (ang, „charge relay"). które przesyłają ładunki na znaczne odległości podczas katalizy enzymatycznej. Histydyna ponadto pełni wyjątkową i waŜną funkcję w katalizie enzymatycznej, gdyŜ wartość pK jej formy protonowej układu imidazolowego dopuszcza w pH 7,0 działanie jej jako katalizatora zasadowego lub kwasowego.

Końcowy produkt katabolizmu pirymidyny, występujący w moczu niektórych osób

ĆH3

Pierwszorzędowa grupa alkoholowa seryny i pierwszo rzędowa grupa tioalkoholowa (—SH) cysteiny są doskonałymi czynnikami nukleofilowymi, których funkcja jest waŜna dla katalizy. Z kolei drugorzędowa grupa alkoholowa treoniny jest dobrym czynnikiem nukleofiiowym, aczkolwiek nie jest znany jej udział w katalizie. Dodatkowo, poza katalityczną rolą grupy —OH w przypadku seryny i tyrozyny, odgrywa ona rolę w regulacji aktywności niektórych enzymów, których aktywność katalityczna zaleŜy od stanu ufosforylowania reszt serylowych lub tyrozylowych.

5

" L I |3H

6-1 Tryptofan

1-


I <3

Fenyioalanlna

"r- 1^1 240

260 DłusjoSć fali [nm|

1 ---------------- r 280

Ryc. 4-5. Widma absorpcyjne tryptofanu, tyrozyny

i fenyloalaniny.

___

44 / ROZDZIAŁ 4

Aminokwasy nie absorbują światła widzialnego (tj. są one bezbarwne) i, z wyjątkiem aminokwasów aromatycznych: tryptofanu, tyrozyny, fenyloalaniny i histydyny, nie absorbują światła nadfioletowego o długości powyŜej 240 nm. Jak przedstawiono na ryc. 4-5 większość światła nadfioletowego o długości fali powyŜej 240 nm, absorbowanego przez białko, pochłania zawarty w nim tryptofan.

Ryc. 4-7. Fluorescamma.

REAKCJA Z NINHYDRYNĄ LUB FLUORESCAMINĄ SŁUśY DO WYKRYWANIA AMINOKWASÓW

RÓśNORODNOŚĆ TECHNIK ROZDZIAŁU AMINOKWASÓW

Ninhydryna (ryc. 4-6). Powoduje oksydacyjną dekarboksylację aminokwasów, w wyniku czego powstają CO Z , NH 3 i atdehyd uboŜszy o jeden atom węgla w porównaniu z macierzystym aminokwasem. Zredukowana ninhydryna reaguje wtedy z uwolnionym amoniakiem, tworząc niebieski kompleks, który absorbuje światło o długości 570 nm. NatęŜenie barwy niebieskiej powstałego kompleksu stanowi podstawę

Chromatografia We wszystkich rodzajach chromatografii cząsteczki rozdzielają się między fazę stacjonarną a ruchomą (tab. 4-6). Rozdział zaleŜy od względnej tendencji cząsteczek mieszaniny do ich silniejszego wiązania się z jedną z tych faz. ChociaŜ

przedstawione techniki rozdziału dotyczą głównie aminokwasów, ich zastosowanie nie ogranicza się tylko do tych cząsteczek.

ilościowej metody oznaczania aminokwasów, za

pomocą której moŜna wykryć mikrogramowe ilości aminokwasów. Aminy, inne niŜ a-aminokwasy, takŜe reagują z ninhydryna, tworząc barwny niebieski kompleks, ale bez tworzenia CO2. Powstawanie CO? wskazuje zatem na obecność a-aminokwasów. Peptydy i NH$ reagują takŜe z ninhydryna, lecz znacznie wolniej niŜ a-aminokwasy. Pro lina i 4-hydroksyprolina tworzą z ninhydryna kompleks o barwie Ŝółtej.

Ryc. 4-6. Ninhydryna.

Fluorescamina (ryc. 4-7). Jest czulszym związkiem, za pomocą którego moŜna wykryć nanogramowe ilości aminokwasów. Podobnie jak ninhydryna, fluorescamina tworzy kompleks z aminami innymi niŜ a-aminokwasy.

Tabela 4-6. Relacje zachodzące między fazami w chromatografii TYP chromatografii Chromatografia podziałowa na stałych sorbentach; filtracja Ŝelowa Chromatografia jonowymienna Chromatografia podziałowa między cienką warstwą ciekłego złoŜa i przepływającym gazem

Faza stacjonarna

Faza ruchoma

Ciekła

Ciekła

Stała

Ciekła

Ciekła

Gazowa

Chromatografia bibułowa Chromatografia bibułowa, pomimo wypierania jej przez bardziej wyrafinowane metody, wciąŜ znajduje zastosowanie w rozdziałach aminokwasów. Próbki aminokwasów nanosi się na pasek bibuły, w określonym punkcie, w odległości 5 cm od jego końca. Następnie pasek zawiesza się w szczelnym naczyniu (komorze) zawierającym rozpuszczalnik (ryc, 4-8).

AMINOKW ASY / 45

TnT Kierunek wędrówki Pasek rozpuszczalnika iblbutyj 1

Naczynia 2 rozpuszczalnikiem

Ryc. 4-8. Chromatografia bibułowa zstępująca (przekrój komory).

Rozpuszczalniki stosowane do rozdzielania aminokwasów są mieszaninami wody, alkoholi, kwasów lub zasad. Bardziej polarne składniki rozpuszczalnika wiąŜą się z celulozą i stanowią fazę stacjonarną, zaś mniej polarne składniki — fazę ruchomą. Tak jest w klasycznej chromatografii podziałowej. W chromatografii podziałowej w odwróconej fazie polarności fazy ruchomej i stacjonarnej są odwrócone (np. przez

Kierunek

* ■

wędrówki rozpuszczalnika Lys Asp

Glv

_ Start

•

1

Thr

Cys His Arg Ser

1

Glu

i i

Tvr

Pro Val

Met Trp Phe Leu

#

Ryc. 4-9. identyfikacja aminokwasów występują cych w białkach. Po rozdziale mieszaniny amino kwasów techniką chromatografii bibułowej zstępu jącej w układzie n- butanol -kwas octowy-woda plamy aminokwasów wywołano za pomocą ninhydryny. _______________________________

pierwotne zanurzenie bibuły w roztworze silikonu). Chromatografię podziałową w odwróconej fazie stosuje się do rozdziału niepolarnych peptydów lub lipidów, niepolarnych związków, takich jak niektóre aminokwasy. WyróŜnia się 2 typy technik stosowanych do rozwijania chromato gram u; chromatografię wstępującą i zstępującą, tj. odpowiednio gdy rozpuszczalnik wędruje przez bibułę z naniesioną próbą w górę lub w dół. Kiedy rozpuszczalnik zbliŜy się prawie do końca bibuły, wtedy wyjmuje się ją, suszy i przeprowadza reakcję identyfikacji badanych związków (w przypadku aminokwasów przeprowadza się reakcję z 0,5% roztworem ninhydryny w acetonie, po czym ogrzewa przez kilka minut w temp. 90—110°C. Aminokwasy z duŜymi niepolarnymi łańcuchami bocznymi (Leu, Ile, Phe, Trp, Val, Met, Tyr) wędrują dalej niŜ te z krótszymi niepolarnymi łańcuchami bocznymi (Pro, Ala, Gly) lub z polarnymi łańcuchami bocznymi (Thr, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lys, Cys) (p. ryc. 4-9). Odzwierciedla to większą względną rozpuszczalność cząsteczek polarnych w hydrofilowej fazie stacjonarnej, zaś cząsteczek niepolarnych w rozpuszczalnikach organicznych. W grupie cząsteczek niepolarnych (Gly. Ala, Val, Leu) zwiększeniu długości niepolarnego łańcucha bocznego towarzyszy zwiększenie ruchliwości tych cząsteczek. Stosunek odległości przebytej przez aminokwas do odległości przebytej przez czoło rozpuszczalnika, mierzonych od miejsca naniesienia mieszaniny aminokwasów, opisuje się jako wartość Rf tego aminokwasu (względną ruchliwość). Wartości Rf dla danego aminokwasu zmieniają się w zaleŜności od warunków doświadczalnych, np. od stosowanego rozpuszczalnika. ChociaŜ moŜliwa jest próbna identyfikacja aminokwasu za pomocą samej wartości Rf, bardziej wskazane jest rozdzielenie chromatograficzne nieznanej mieszaniny aminokwasów równocześnie ze znanymi aminokwasami wzorcowymi. Wobec tego ruchliwość moŜe być porównana do ruchliwości wzorców (np. jako RAia raczej niŜ jako Rf). Ruchliwości, przedstawione jako względne wobec standardowych, róŜnią się mniej niŜ wartości Rf z kolejnych doświadczeń. Zawartość aminokwasów moŜna oznaczyć ilościowo, wycinając kaŜdą plamę i eluując odpowiednim rozpuszczalnikiem, a następnie przeprowadzając analizę kolorymetryczną (z ninhydryną). W innym rozwiązaniu bibułę

46 / ROZDZIAŁ 4

spryskuje się ninhydryną, a natęŜenie barwy wyeluowanych plam mierzy się w fotometrze z zapisem natęŜenia światła przepuszczanego lub odbitego. W innej technice — chromatografii bibułowej dwuwymiarowej, próbkę nanosi się w jednym rogu kwadratowego arkusza bibuły i rozdziela w odpowiednio dobranej mieszaninie rozpuszczalników. Po wysuszeniu i usunięciu rozpuszczalnika arkusz obraca się o 90°C i rozdziela w innej mieszaninie rozpuszczalników (ryc. 410).

Butanol-kwas octowy-woda (4:1:5).

Ryc. 4-10. Dwuwymiarowa chromatografia aminokwasów (przerysowano, nieznacznie zmodyfikowano z: Levy A. J. i Chung D.: Two-dimensional chi-omatographyof aminoacidsonbuffered papers. Aria!. Chem. 1953; Copyright ©1953 by American Chemical Society; zamieszczono za zgodą).

Chromatografia cienkowarstwowa WyróŜnia się 2 odrębne klasy chromatografii cienkowarstwowej (ang. thin-layer chromatography; skrót — TLC). Pierwsza — chromatografia cienkowarstwowa podziałowa (ang. partition thin-layer chromatography: skrót — PTLC), w pełni przypomina chromatografię bibułową podziałową. W metodzie PTLC wykorzystuje się te same układy rozpuszczalników i sposoby identyfikacji badanych związków, co w chromatografii bibułowej. Natomiast bibułę zastępuje płytka pokryta cienką warstwą sproszkowanej celulozy lub innego względnie obojętnego złoŜa. MoŜliwy jest równieŜ wariant PTLC w odwróconej fazie. Z kolei druga klasa — adsorpcyjna TLC (adsorption thin-layer chromatography; skrót

— ATLC), nie przypomina chromatografii bibułowej i opiera się na innych zasadach. W tej technice rozpuszczalnik (który nie musi być dwuskładnikowy lub bardziej złoŜony) eluuje składniki próby z zaadsorbowanych miejsc na aktywowanym sorbencie, takim jak praŜony Ŝel krzemionkowy. Metoda ATLC znajduje zastosowanie do rozdziału związków niepolarnych, takich jak lipidy, i stąd nie jest przydatna dla części aminokwasów i większości peptydów. Chromatografia jonowymienna Całkowita analiza reszt aminokwasowych po hydrolizie łańcucha peptydowego wymaga na ogół automatycznej chromatografii jonowymien-

nej. Pełen rozdział, identyfikacja i oznaczenie ilościowe hydrolizatu białkowego nie trwa dłuŜej niŜ 3 h. W metodzie Moore'a i Steina stosuje się kolumny (krótką i długą) zawierające formę Na+ sulfonowanej Ŝywicy polistyrenowej. Kiedy kwaśny hydrolizat w pH 2,0 zostanie naniesiony na kolumny, aminokwasy wiąŜą się z jonem Na+ wymieniacza kationowego. Następnie kolumny eluuje się cytrynianem sodu w zaprogramowanych warunkach pH i temperatury. Krótką kolumnę eluuje się jednym buforem, zaś długą — dwoma, W eluatach z kolumn wywołuje się reakcję z odczynnikiem ninhydrynowym, a odczyty natęŜenia barwy przeprowadza się w kolorymetrze przepływowym. Dane są rejestrowane na katodowej lampie obrazowej ze sprzęŜonym komputerowym odczytem integracji powierzchni pól rozdzielonych aminokwasów (ryc. 4-11).

570 nm

Ryc. 4-11A

AMINOKWASY / 47 55 °C

570 nm -pH 3,25-pH 4,25C. 4-11. Automatyczna analiza kwaśnego hydrolizatu białkowego na kolumnach Dowex 50 Moore'a iSteina (w temp. 55°C). A; Do rozdziału aminokwasów zasadowych uŜyto krótkiej kolumny (5,0x0,9 cm), stosując elucję roztworem o pH 5,28; potrzebny czas = 60 min. B: Do rozdziału aminokwasów obojętnych i kwaśnych uŜyto dłuŜszej kolumny (55 x 0,9 cm), stosując elucje najpierw buforem o pH 3,25, a potem buforem o pH 4,25. Norleucynę uŜyto jako substancję wzorcową {tzw. wzorzec wewnętrzny). Aminokwasy zasadowe pozostają związane na kolumnie; potrzebny czas =180 min. Eluowane próbki reagują z odczynnikiem ninhydrynowym, a pomiar ich gęstości optycznej jest dokonywany przy długości fal światła 570 nm i 440 nm. Przy 440 nm wykrywa się jedynie prolinę i hydroksyprolinę. Oś rzędnych — gęstość optyczna w skali logarytmicznej: oś odciętych — czas w min (reprodukowano za zgodą: Prof. ET. Mert, Pardue University).

Elektroforeza wysokonapięciowa Elektroforeza wysokonapięciowa (ang. high-voltage electrophoresis; skrót — HVE) rozdzielająca aminokwasy, polipeptydy i inne amfolity (cząsteczki, których ładunek całkowity zaleŜy od pH otaczającego środowiska) w polu prądu stałego ma wiele zastosowań w biochemii. W analizie aminokwasów najczęściej uŜywanymi nośnikami są arkusze bibuły albo cienkowarstwowe płytki powleczone sproszkowaną celulozą. W rozdziałach wielkocząsteczkowych polipeptydów i białek uŜywa się usieciowanego Ŝelu poliakryloamidowego. W analizie oligomerów nukleotydowych wykorzystuje się głównie 2 złoŜa — agarozę i Ŝel poliakryloamidowy. Rozdział amfolitów, umieszczonych w polu elektrycznym o napięciu 2000—5000 V w ciągu 0,5—2 h, zaleŜy od ich ładunku elektrycznego i masy cząsteczkowej, W przypadku cząsteczek obdarzonych jednakowym ładunkiem elektrycznym, szybciej będą wędrować cząsteczki o mniejszej masie. Ładunek elektryczny jest jednak waŜniejszym czynnikiem w określeniu stopnia osiągniętego rozdziału. Elektroforeza HVE znajduje zastosowanie w analizie aminokwasów, małocząsteczkowych polipeptydów,

niektórych białek, nukleotydów i fosfocukrów. Próbki nanosi się na nośnik zwilŜony buforem o odpowiednim pH i łączy się ten nośnik ze zbiornikami buforu za pomocą bibułowych łączników, a cały układ z bibułą moŜna przykryć płytą szklaną lub zanurzyć w chłodziwie węglowodorowym. Po podłączeniu prądu cząsteczki obdarzone ładunkiem dodatnim wędrują w roztworze o wybranym pH w kierunku katody, a cząsteczki z ładunkiem ujemnym — w kierunku anody. W celu zidentyfikowania rozdzielonej próby elektroforegram wybarwia się odczynnikiem ninhydrynowym (aminokwasy, peptydy), bromkiem etydyny i ogląda w świetle lampy UV (oligomery nukleotydowe) itd. Wybór pH „narzucają" wartości pK grup zjonizowanych cząsteczek w mieszaninie.

NAJWAśNIEJSZĄ REAKCJĄ AMINOKWASÓW JEST TWORZENIE WIĄZANIA PEPTYDOWEGO W zasadzie tworzeniu wiązania peptydowego towarzyszy odłączenie 1 mola wody, powstającego z grupy a-aminowej jednego aminokwasu

48 / ROZDZIAŁ 4 — NH

Alanina

OH + H O Walina

hydrolizy wiązania peptydowego. Aby przeprowadzić biosyntezę wiązania peptydowego między dwoma aminokwasami, najpierw musi ulec aktywacji grupa karboksylowa. Chemicznie grupę karboksylowa moŜna przekształcić w chlorek kwasowy. W przyrodzie, aktywację zapoczątkowuje kondensacja z ATP (p. rozdz. 30).

HSO

PIŚMIENNICTWO

CHpeptyd; alanyiowaltna (Ala-Val) Ryc. 4-12. Aminokwasy połączone wiązaniem peptydowym (obszar zaciemniony).

i grupy oc-karboksylowej drugiego aminokwasu (ryc. 4-12). Reakcja ta nie przebiega jednak tak, jak przedstawiono na tej rycinie, gdyŜ stała równowagi reakcji jest przesunięta w kierunku

Barrett GC: Chemistry and Biochemistry ofthe Amino Acids. Chapman & Hal], 1985. Davies JS: Amino Acids and Peptides. Chapman & Hali. 1985. Gehrke CW, Kuo KCT, Zumwalt RW, Kenneth CT: Amino Acid Analysis by Gas Chromatography. 3 vols. CRC Press, 1987. Hancock WS: Handbook ofHPLCfor the Separation of Amino Acids, Peptides. and Proteins. 2vols. CRC Press, 1984. Hugli TE: Techniaues in Protein Chemistry. Academic Press, 1989. Rattenbury JM: Amino Acid Analysis. Halstead Press, 1981.

5

Peptydy Victor W. Rodweli, PhD

WPROWADZENIE Po połączeniu grup aminowych i karboksylowych aminokwasów z utworzeniem wiązań peptydowych, składowe ami no kwasowe określa się resztami aminokwasowymi. Peptyd składa się z dwóch lufo więcej reszt aminokwasowych połączonych wiązaniami peptydowymi. Peptydy zawierające więcej niŜ 10 reszt aminokwasowych nazywa się polipeptydarni, ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Peptydy są związkami budzącymi szerokie zainteresowanie, szczególnie w endokrynologii. Wiele hormonów jest peptydami i mogą być podawane chorym w celu korygowania ich niedoborów (np. wstrzyknięcia insuliny chorym na cukrzycę). Pewne antybiotyki są peptydami (np. walinomycyna i gramicydyna A), a nieliczne z nich substancjami przeciwnowotworowymi (np. bleomycyna). Szybka synteza chemiczna i technologia rekombinacji DNA ułatwiły produkcję znacznych ilości hormonów peptydowych. Wiele z nich występuje w organizmie w stosunkowo małych stęŜeniach, co utrudnia moŜliwość ich wydzielenia w ilościach wystarczających do leczenia. Ta sama technologia pozwala syntetyzować inne peptydy, dostępne z naturalnych źródeł w niezwykle małych ilościach (np. niektóre peptydy i białka wirusowe), wykorzystywane do produkcji szczepionek.

PEPTYDY TWORZĄ SIĘ Z L- K AMINOKWASÓW POŁĄCZONYCH WIĄZANIAMI PEPTYDOWYMI Na rycinie 5-1 przedstawiono tripeptyd utworzony z reszt aminokwasowych alaniny, cysteiny i waliny. NaleŜy odnotować, Ŝe tripeptyd składa się z 3 reszt aminokwasów ych. ale nie zawiera 3 wiązań peptydowych. Umownie strukturę peptydu zapisuje się rozpoczynając od lewej strony N-końcową resztą aminokwasów ą (z wolną grupą a-aminową), a kończąc po prawej stronie C-końcową resztą aminokwasową (z wolną grupą a-karboksylową). Przedstawiony peptyd ma jedną wolną grupę a-aminową oraz 1 wolną grupę a-karboksylową. JednakŜe w niektórych pepiydach końcowe grupy aminowe lub karboksylowe mogą być podstawione (np. N-formyloamina lub amid grupy karboksylowej) i w ten sposób nie są wolne.

Alanyb-

cysteinylo-

walina

Ryc. 5-1. Wzór strukturalny tripeptydu {wiązania peptydowe zaciemniono).

Prosta metoda przedstawiania wzorów strukturalnych peptydów Aby w prosty sposóbzapisać wzór strukturalny peptydu, w pierwszej kolejności rysuje się jego „szkielet" z połączonych grup oc-NHU 4 — Biochemia

50 / ROZDZIAŁ 5

i a-COOH oraz atomów węgla a. Następnie wpisuje się w odpowiednie miejsca łańcucha atomy węgla a (patrz niŜej). NaleŜy więc: 1. Narysować szkielet (zyg-zag) i dodać N-końcową grupę aminokwasową:

2. Dopisać atomy węgla a, grupy a-karboksylowe i a-aminowe:

COOH3N

3. Dopisać właściwe grupy R i atomy wodoru a do atomów węgla a: SH 0

H

CH,

II V H

A

K

G Y

A

Ryc. 5-2. Przykład zapisu jednoliterowymi i trójI(terowymi symbolami reszt aminokwasowych przedstawiający pierwszorzędową strukturę heksapeptydu, zawierającego, jako N-końcowy aminokwas, kwas glutaminowy (Glu, E) oraz jako Ckońcowy — alaninę {Ala, A).

Glu-Lys-(A!a,Gly,Tyr)-His-Ala Ryc. 5-3. Przykład heptapeptydu, zawierającego fragment o niepewnej strukturze pierwszorzędowej (w nawiasie).

+

H

G!u-A!a-Lys-Gly-Tyr-Ala E

\

00

H O H CH, CH,

Kolejność aminokwasów określa strukturę pierwszorzędową peptydu Pierwszorzędową strukturę peptydu określa liczba, budowa chemiczna i kolejność (sekwen-

Symboli trój- i jednoliterowych uŜywa się w zapisie aminokwasów w peptydach PoniewaŜ polipeptydy (białka) mogą zawierać 100 i więcej reszt aminokwasowych, w celu przedstawienia ich struktury pierwszorzędowej (ryc. 5-2) stosuje się symbole albo trój- albo jednoliterowe (tab. 4-3, kolumna 2).

Zapis struktury pierwszorzędowej za pomocą trójliterowych symboli, połączonych kreskami reprezentującymi wiązania peptydowe, jest zrozumiały i jednoznaczny. Kreski zwykle pomija się w zapisie sekwencji peptydów przy uŜyciu symboli jednoliterowych. W przypadku niepewności w ustaleniu kolejności fragmentu polipeptydowego, wątpliwą sekwencję reszt aminokwasowych umieszcza się w nawiasie i oddziela przecinkami (ryc. 5-3). Zmiana w pierwszorzędowej strukturze peptydu moŜe zmieniać jego aktywność biologiczną Podstawienie pojedynczego aminokwasu przez inny, w liniowej sekwencji polipeptydu o 100 lub więcej resztach aminokwasowych, moŜe zmniejszyć lub znieść jego aktywność biologiczną oraz powodować potencjalnie powaŜne następstwa (np. niedokrwistość sierpowata). Wiele dziedzicznych wad metabolicznych wynika ze zmiany pojedynczego aminokwasu w określonym białku. Wprowadzenie nowych metod badania struktury białek i DNA przyczyniło się do poszerzenia wiedzy o biochemicznych podstawach wielu dziedzicznych chorób metabolicznych. Peptydy są potielektrolitami, których ładunek zaleŜy od pH otaczającego środowiska Wiązanie peptydowe (amidowe) nie ma ładunku w Ŝadnym waŜnym fizjologicznie pH. Powstawaniu peptydów z aminokwasów w pH

PEPTYDY / 51

7,4 towarzyszy utrata jednego ładunku dodatniego i ujemnego przy utworzeniu jednego wiązania peptydowego. JednakŜe peptydy są cząsteczkami obdarzonymi ładunkiem elektrycznym w pH fizjologicznym dzięki ładunkom ich grup C- i N-końcowych oraz grup funkcyjnych występujących w polarnych resztach aminokwasowych przyłączonych do atomów węgla a (p. tab. 4-1). Liczba moŜliwych konformacji peptydu jest wymuszona siłami niekowalencyjnymi Polipeptydy mogą wykazywać róŜną konformację (ułoŜenie przestrzenne), jednak w roztworze przewaŜa tendencja do niewielkich zmian konformacyjnych. Konformację peptydów utrwalają takie czynniki, jak zawada przestrzenna, oddziaływania kulombowskie, wiązania wodorowe i hydrofobowe (p. rozdz. 6). Tak jak w przypadku białek, do fizjologicznej aktywności polipeptydów jest nieodzowna specyficzna konformacja. WIELE MAŁO CZĄSTECZKOWYCH PEPTYDÓW WYKAZUJE AKTYWNOŚĆ FIZJOLOGICZNĄ Komórki zwierząt, roślin i bakterii zawierają róŜnorodne małocząs tęcz k owe polipeptydy (3—100 reszt aminokwasowych) o istotnej aktywności fizjologicznej. Niektóre z nich, łącznie z większością polipeptydowych hormonów ssaków, zawierają tylko wiązania peptydowe, utworzone między grupami a-aminowymi i 7-karboksylowymi, 20 L-a-arninokwasów występujących w białkach. JednakŜe w polipeptydach mogą równieŜ występować dodatkowe, ,,niebiałkowe" aminokwasy, lub teŜ pochodne aminokwasów budujących białka. Krótki polipeptyd — bradykinina, czy.anik zj32ui£^szaJ3«y.jłapica.e.inięśni^ła
Glutation (ryc, 5-4). Jest nietypowym tripeptydem, w którym N-końcowy kwas glutaminowy wiąŜe się z cysteiną wiązaniem nie-ot-peptydylowym. Jest związkiem niezbędnym do działania niektórych enzymów. Glutation i en-

0 N I H

SH CH2 CHj I CHj H-C-NHS

coo-

cooRyc. 5-4. Giutation (y-glutamylocysteinyloglicyna).

zym — reduktaza glutationowa — uczestniczą w powstawaniu prawidłowych wiązań disiarczkowych w wielu białkach i hormonach polipeptydowych (p. rozdz. 6). Antybiotyki jolipeptydowe. Są wytwarzane przez grzyby i zawierają zarówno D- jak ...LLcaminokwasy, a takŜe aminokwasy nie występujące w białkach. Zalicza się do nich np. tyrocydynę i gramicydynę S, cykliczne polipeptydy zawierające D-fenyłoalaninę oraz niebiałkowy aminokwas — ornitynę. NaleŜy podkreślić, Ŝe wymienione polipeptydy nie są syntetyzowane na ry boso mach. Hormon tyreotropowy (TRH). W tym wariancie peptydowym N-końcowy kwas glutaminowy- ulega, cyklizacji do kwasu piro glutamino we.gOjjiatomiast N-końcowa grupa karboksylowa jjroliny występuje jako amid (ryc. 5-5).

Ryc. 5-5. (TRH).

Piroglutamylohistydyloprolinoamid

W niektórych przypadkach polipeptydy ssaków w swojej cząsteczce mogą zawierać więcej niŜ 1 fizjologicznie czynny peptyd, np, (3-lipotropina. Ten hormon przysadki pobudza uwalnianie kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej. W strukturze pierwszorzędowej pMipotropiny występują fragmenty łańcucha wspólne dla innych hormonów peptydowych o odrębnych właściwościach fizjologicznych (ryc. 5-6). Długi polipeptyd jest prekursorem krótszych polipeptydów.

52 / ROZDZIAŁ 5 GL T S O R L R N G D S P N A G

« D L V » A E K

A N O G E G P N A L E H

K OrETSXPlTrftYMl €Y HTFYRYW G / S YPYP YKYDl K

S L !_■»

R

0-Endorflna y-Endorfina a-Endorflna Enkefallna metloninowa Byc. 5-6. Pierwszorzędowa struktura fMipotropiny. Reszty 41-58 reprezentują hormon pobudzający melanocyty (p-MSH). Reszty 61—91 zawierają sekwencje odpowiadające wskazanym endorfinom.

ZŁOśONĄ MIESZANINĘ PEPTYDÓW MOśNA ROZDZIELIĆ PODCZAS ELEKTROFOREZY LUB CHROMATOGRAFII Chromatografia i elektroforeza wysokonapięciowa (HVE) Techniki, które jako podstawę rozdziału wykorzystują ładunek elektryczny, znajdują zastosowanie zarówno w badaniach polipeptydów, jak i aminokwasów (p. rozdz. 4). Wartość pK. C-końcowej grupy karboksylowej polipeptydu jest większa niŜ grupy a-karboksylowej odpowiedniego aminokwasu (oznacza to, Ŝe grupa karboksylowa peptydu jest słabszym kwasem). Odwrotnie, N-końcowa grupa aminowa polipeptydu jest silniejszym kwasem (ma mniejszą wartość pK) niŜ grupa aminowa aminokwasu, od którego on pochodzi (tab. 5-1).

Tabela 5-1. Wartości pK glicyny i peptydów glicynowych

9.60 8,17 7,91

Gly Gly-Gly GlyGty-Gly

Filtracja Ŝelowa W metodzie automatycznego sekwencjonowania wykorzystuje się niewielką liczbę peptydów o długości 30—100 reszt aminokwasowych. JednakŜe wiek wielkocząsteczkowych polipeptydów moŜe być nierozpuszczalnych, z powodu odsłonięcia w procesie dcnaturacji uprzednio niedostępnych reszt hydrofobowych. Nierozpuszczalnośc polipeptydów moŜna pokonać przez ich rozpuszczenie w moczniku, alkoholach, kwasach organicznych lub zasadach, ale czynniki te ograniczają stosowanie technik chromatografii jonowymiennej w ich oczyszczaniu. Okazuje się, Ŝe filtrację Ŝelową duŜych hydrofobowych peptydów moŜna przeprowadzić, uŜywając roztworów kwasu mrówkowego lub octowego w duŜych stęŜeniach (1—4 mol/1). Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa w fazie odwróconej Skuteczną techniką tv oczyszczaniu wielkocząsteczkowych, niepolarnych peptydów jest wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (ang. high performance liquid chromatography; skrót — HPLC) na niepolamych nośnikach, z wykorzystaniem polarnych rozpuszczalników. Na rycinie 5-7 przedstawiono 'rozdział bromocyjanowych fragmentów ludzkiej globiny płodowej za pomocą tej techniki. Połączenie

...-

PEPTYDY / 53

o

Ryc. 5-7. Profil elucyjny rozdziału bromocyjanowych fragmentów ludzkiej globiny pfodowej, uzyskanej metodą HPLC w odwróconej fazie. Przedstawiono oznaczenia dowolnie numerowanych fragmentów OL i 7 łańcuchów (reprodukowano dzięki uprzejmości: J.D. Pearson i wsp.r Deparrment of Biochemistry, Pardue Ur>iversity).

filtracji Ŝelowej i HPLC w odwróconej fazie stosuje się do oczyszczania złoŜonych mieszanin peptydów, otrzymanych w wyniku częściowego trawienia białek.

Wysokonapięciowa elektroforeza (HVE) na sitach molekularnych Sączenie molekularne, w połączeniu z rozdziałem związków i wykorzystujące ładunek, ułatwia ich rozdział. Oprócz skrobi i agarozy, najczęściej uŜywanym nośnikiem jest usiedowany polimer akryloamidu (CH2 = CHCONH,,). Podczas elektroforezy w Ŝelu poliakryloamido-

wym (ang. polyacrylamide gel electrophoresis; skrót — PAGE) roztwór białka nanosi się na spolimeryzowany akryloamid, w odpowiednim buforze, uformowany w postaci płytki lub w ru■rkach. Czynnikiem sieciującym złoŜe poliakryloamidu moŜe być 2—10% roztwór metyłeno-tó-akryloamidu (CH2 = CONH)? - CH2 lub podobne związki sieciujące. Rozdział naniesionych prób, w odpowiednim buforze, dokonuje się pod wpływem prądu elektrycznego. Identyfikację poiipeptydów po rozdziale elektro foretycznym przeprowadza się za pomocą barwienia Ŝeli błękitem brylantowym Coomas-

sie lub solami srebra, natomiast polinukleolydów — bromkiem etydyny. Popularną odmianą elektroforezy jest PAGE w warunkach denaturujących. Białka przed elektroforeza, poddaje się gotowaniu w odpowiednim buforze, a następnie rozdziela w obecności czynników denaturujących — mocznika lub siarczanu dodecylu sodu (SDS). Ujemny ładunek cząsteczek \ CH1 - (CH,), L - SO3") pokrywa białka w stosunku 1 cząsteczka SDS na 2 wiązania pcptydowe. ["o „obładowanie" białek ładunkami czyni je silnie ujemnymi (anionami). Późniejszy rozdział białek jest oparty na wielkości ich masy cząsteczkowej. Metoda SDS-PAGE jest szeroko stosowana do określania masy cząsteczkowej białek przez porównanie ich ruchliwości elektroforetycznej z ruchliwością białek wzorcowych o znanej masie cząsteczkowej.

PIERWSZY ETAP W OKREŚLANIU STRUKTURY PIERWSZORZĘDOWEJ PEPTYDU TO POZNANIE JEGO SKŁADU AMIN0KWASOWEG0 W analizie struktury peptydów najpierw przeprowadza się hydrolizę wiązań peptydowych łączących aminokwasy. PoniewaŜ wiązania te są trwałe w roztworach o obojętnym pH, przeprowadza się hydrolizę kwaśną lub zasadową. Kataliza enzymatyczna jest stosunkowo mało przydatna do przeprowadzenia pełnej hydrolizy wiązań peptydowych. KaŜdy typ hydrolizy białek przebiega z utratą pewnych reszt aminokwasowych. Metodą z wyboru jest hydroliza w zatopionych, odpowietrzonych probówkach w 6 mol/l roztworze HC1 w temp. HO^C. Podczas takiej hydrolizy wszystkie reszty tryptofanu i cysteiny oraz większość reszt cystynowych ulegają zniszczeniu. W obecności jonów metali dochodzi do częściowej utraty metioniny i tyrozyny. Glutamina i asparagina ulegają deamidacji do kwasów: glutaminowego i asparaginowego. Odzysk seryny i treoniny jest niepełny, a ilość tych aminokwasów zmniejsza się w miarę przedłuŜania czasu hydrolizy. Niektóre wiązania między resztami aminokwasów obojętnych (Val-Val, Ile-Ile, Val-Ile, Iłe-Val) ulegają rozbiciu tylko w ok. 50% po 20 h hydrolizy. Zwykle przeprowadza się hydrolizę próbek (w powtórzeniach) przez 24, 48, 72 i 96 h, ekstrapolując potem zawartość seryny i treoniny do czasu zerowego. Zawartość waliny i izoieucyny oznacza się po 96 h hydrolizy. Amino-

5* / ROZDZIAŁ 5

kwasy dikarboksylowe i ich amidy oznacza się razem i przedstawia łącznie jako „Glx" i „Asx". Cysteina i cystyna przechodzą w trwałą w środowisku kwaśnym pochodną (np. kwas cysternowy) przed hydrolizą. Hydroliza zasadowa, w czasie której ulegają zniszczeniu seryna, treonina, arginina i cysteina, a wszystkie aminokwasy ulegają racemizacji, jest stosowana do oznaczania tryptofanu. Po hydrolizie prób ich skład aminokwasowy moŜe być oznaczony podczas automatycznej chromatografii jonowymiennej (p. ryc. 4-11) lub HPLC. Sekwencjonowanie pierwszego białka przeprowadził Fred Sanger, za pomocą odczynnika mającego od tej pory jego nazwisko Minęło juŜ ponad 30 lat od określenia przez Sangera pełnej sekwencji aminokwasowej hormonu polipeptydowego — insuliny. W metodzie Sangera najpierw rozdzielono insulinę na 2 łańcuchy polipeptydowe A i B, po czym poddano swoistemu trawieniu enzymatycznemu do krótkich peptydów, zawierających odcinki sekwencji zachodzących. Następnie zastosowano związek — i-fluoro-2,4-dinitrobenzen (ryc. 5-8), tworzący pochodne tylko Ryc. 5-8. Reakcja aminokwasu z 1 -fluoro-2,4--N-CH -COOH

CH-COOH dinitrobenzenem (odczynnikiem Sangera). Odczynniki nazwano od nazwiska laureata nagrody Nobla (1958), biochemika Fryderyka Sangera, który zastnsowal go w celu oznaczenia pierwszorzędowej struktury insuliny. Odczynnik ilościowo aryluje wszystkie wolne grupy aminowe, dając intensywnie Ŝółto zabarwione 2,4-dinitrofenyloaminokwasy. Pochodne te łatwo się oznacza ilościowo za pomocą spektrototometru. Oprócz reszt N-końcowych, fluorod(nitrobenzen reaguje takŜe 'z grupami; e-aminową lizyny, imidazolową histydyny, hydroksyl ową tyrozyny i grupą SH cysteiny. PoniewaŜ grupa dinitrofenylowa nie jesi usuwana podczas kwaśnej hydrolizy, stosuje sieją do analizy N-końcowego aminokwasu polipeptydów.

z N-końcowymi resztami aminokwasowymi peptydów, które po hydrolizie usuwano i identyfikowano. Porównanie sekwencji zachodzących pozwoliło Sartgerowi jednoznacznie wydedukować sekwencje obydwu łańcuchów insuliny. Pomimo Ŝe metoda Sangera jest wciąŜ stosowana, 2 inne techniki zrewolucjonizowały oznaczanie struktury pierwszorzędowej polipeptydów (białek). Pierwsza z nich, wprowadzona w 1967 r., to metoda automatycznego usuwania i identyfikowania N-końcowych reszt aminokwasowych peptydów, jako ich pochodnych fenylotiohydantoinowych (degradacja Edmana). Druga — wprowadzona niezaleŜnie przez Sangera oraz Maxama i Gilberta — polega na szybkim sekwencjonowaniu DNA genów kodujących poszukiwane białko. Obecnie optymalną strategią jest stosowanie obydwu równocześnie. Technika automatycznej degradacji Edmana, choć szybsza w analizie sekwencji peptydów od metod Sangera, napotyka trudności i dostarcza wolniej wyników niŜ metoda sekwencjonowania DNA. Technika sekwencjo no wania DNA nie dostarcza jednak nieomylnych, jednoznacznych wyników dotyczących pierwszorzędowej struktury białek. NajpowaŜniejsze trudności w sekwencjonowaniu genów eukariotycznych są związane z obecnością w ich obrębie intronów — sekwencji nukleotydowych nie ulegających ekspresji w dojrzałym białku. Pomimo to, główna przewaga tej metody polega na stosunkowo łatwej detekcji i sekwencjonowaniu regionów prekursorowych cząsteczek, które mogą „umknąć" wykryciu w technice degradacji Edmana (wskutek dojrzewania przed jego wydzieleniem). Metody sekwencjonowania DNA i degradacji Edmana naleŜy traktować jako uzupełniające się. Zrewolucjonizowały one i daleko posunęły naszą wiedzę o pierwszorzędowej strukturze białek. Oznaczanie pierwszorzędowej struktury polipeptydów za pomocą techniki automatycznej degradacji Edmana Ze względu na fakt, Ŝe wiele białek składa się z więcej niŜ jednego łańcucha polipeptydowego, połączonych wiązaniami niekowalencyjnymi lub przez mostki disiarczkowe, pierwszy etap stanowi dysocjacja i rozdzielenie indywidualnych łańcuchów poiipeptydowych. Czynniki denaturujące (mocznik, chlorowodorek guanidyny) rozbijają wiązania wodorowe i dysocjują niekowalencyjnie połączone polipeptydy,

PEPTYDY / 55

a czynniki utleniające i redukujące rozrywają mostki disiarczkowe (ryc. 5-9). Następnie peptydy rozdziela się metodami chromatograficznymi. Wielkocząsteczkowe polipeptydy muszą ulec rozszczepieniu do peptydów o długości nadającej się do automatycznego sekwencjonowania Aparaty słuŜące do automatycznego sekwencjonowania (sekwentatory) analizują skutecznie polipeptydy o długości 20—60 reszt aminokwasowych. Ten fakt wpływa na wybór techniki rozcinania polipeptydów oraz oczyszczania otrzymanych fragmentów. Zmierza się więc do uzyskania niewielkiej liczby dłuŜszych fragmentów (o długości 30—100 reszt aminokwasowych). Korzystne jest zatem bardzo swoiste i pełne rozszczepienie łańcucha polipeptydowego w określonych miejscach. Takie wymagania spełnia rozszczepienie za pomocą bromocyjanu (CNBr), trypsyny lub o-jodozobenzenu. CNBr. Reszty cysteiny są najpierw modyfikowane przez kwas jodooctowy. CNBr rozcina Ryc, 5-9. Rozszczepienie łańcuchów poiipepty-

=O

wówczas łańcuch polipeptydowy (w większości ilościowo) tylko w miejscach występowania reszt metioninowych, po ich stronie karboksylowej. PoniewaŜ metionina występuje rzadko w polipeptydach, takie rozszczepienie powoduje powstawanie fragmentów peptyd owych o właściwej długości. Trypsyna. Trypsyna nacina łańcuchy pohpeptydowe po karboksylowej stronie reszt lizyny i argininy. Jeśli reszty lizyny najpierw przeprowadzi się w pochodne za pomocą bezwodnika kwasu cytrakonowego (reakcja odwracalna), w celu zmiany ładunku reszt hzynowych z dodatniego na ujemny, to trypsyna rozszczepia tylko reszty argininowe. Wykorzystanie pochodnych reszt argininowych jest mało uŜyteczne z powodu stosunkowo duŜego „nadmiaru" reszt hzynowych w białkach. JednakŜe jest przydatne do kolejnego rozszczepiania CNBr fragmentów. o- Jodozobenzen. Związek len rozszczepia swoiście i ilościowo miejsca względnie rzadko występujących reszt: Trp-X. Nie wymaga wcześniejszej osłony innych reszt aminokwasowych. Hydroksyloamina. Hydroksyloamina rozrywa względnie rzadko wiązania: Asn-Gly, chociaŜ nie w sposób ilościowy. Proteaza V8. Enzym ze Staphylococcus aureus rozcina peptyd przy resztach Glu-X, z wyraźną wybiórczością w stosunku do reszty X o charakterze hydrofobowym. Wiązanie Glu-Lys nie ulega rozszczepieniu przez tę proteazę. Ta reakcja jest wykorzystywana do kolejnej degradacji CNBr fragmentów.

Łagodna kwaśna hydroliza. W toku

O =

dowych połączonych wiązaniami disiarczkowymi (pole zaciemnione) za pomocą czynników utleniających (kwas nadmrówkowy, strona lewa) bądź redukujących (2-merkaptoetanol; strona prawa) prowadzące do utworzenia 2 peptydów — odpowiednio z resztą kwasu cysteinowego lub resztą cysteiny Iową.

takiej hydrolizy ulega rozerwaniu rzadko spotykane wiązanie Asp-Pro. 2 lub 3 procesy trawienia pierwotnego polipeptydu, przy resztach Met, Trp, Arg i Asn-Gly, połączone z odpowiednio nadtrawionymi powstałymi fragmentami, zazwyczaj pozwalają określić pełną sekwencję polipeptydu. Oprócz wyjątkowych trudności w oczyszczaniu fragmentów peptydowych, oznaczenie pierwszorzędowej struktury polipeptydu moŜna wykonać, dysponując zaledwie kilkoma jego mikromolami. Mieszanina peptydów, otrzymana z rozszczepienia polipeptydu, musi być rozdzielona do homogennych peptydów przed ich sek we ncjo no wan i em Oczyszczanie fragmentów peptydowych przeprowadza się głównie przez ich filtrację

56 / ROZDZIAŁ 5

Ŝelową w kwasie octowym lub mrówkowym, wykorzystując technikę HPLC w odwróconej fazie (ryc. 5-7), albo w toku chromatografii jonowymiennej na fosfocelulozie lub na złoŜu sulfofenyło-Sephadex w roztworach kwasu ortofosforowego. Sekwencjonowanie z zastosowaniem odczynnika i reakcji Edmana Automatyczna analiza sekwencji aminokwasów wykorzystuje fenyloizotiocyjanian (odczynnik Edmana) i reakcje, w wyniku których usuwana jest N-końcowa grupa aminowa peptydu, jako pochodna fenylotiohydantoinowa (reakcja Edmana, ryc. 5-10). Metoda tzw. degradacji Edmana polega na kolejnym odłączaniu reszt am i no kwasowych od aminowego końca peptydu. Główną część reaktora stanowi obracające się naczynie szklane, zapewniające przebieg reakcji na ścianie naczynia w postaci cienkiej warstwy. To ułatwia ekstrakcję i kolejne usuwanie rozpuszczalników. W pełni zautomatyzowanym aparacie moŜna zsekwencjonować do 30—40 reszt aminokwasowych w 1 ciągu operacyjnym (w wyjątkowych przypadkach do 60 lub nawet 80 reszt). Aparat jest zaprogramowany do wykonywania kolejnych degradacji reszt aminokwasowych od N-końca polipeptydu. Po usunięciu pierwszego N-końcowego aminokwasu, wydzieleniu i identyfikacji powstaje następna w kolejności N-końcowa pochodna Edmana, itd. (ryc. 5-10). Pochodne fenylotiohydantoinowe rozdziela się techniką HPLC i identyfikuje na podstawie ich kolejności i miejsca elucji. Wnioskowanie o pełnej strukturze pier wszo rzędowej po I i peptydu wymaga sekwencjonowania nakładających się peptydów W przypadku oznaczenia sekwencji reszt aminokwasowych wszystkich uzyskanych CNBr peptydów wciąŜ nie znana jest informacja, dotycząca kolejności ułoŜenia tych peptydów w łańcuchu białkowym. W celu uzyskania jednoznacznych danych o pierwszorzędowej strukturze białka, naleŜy otrzymać i zsekwencjonować dodatkowe CNBr peptydy, których N-i i C-końcowe reszty nakładają się. Te

dodatkowe peptydy otrzymuje się technikami, które rozrywają białko w miejscach innych niŜ reszta metioninowa (np. przez trawienie chymotrypsyną). Jednoznaczne określenie struktury pierwszo rzędowej, przez porównanie sekwencji

NH3

R' Fsnylolzotlocyjanlan (odczynnik Edrnana) I peptyd Fenylotiohydantnina I peptyd krótszą o jedną resztę aminokwasową

Ryc. 5-10. Fenyloizotiocyjanian przeprowadza

R' O Kwas fenylotlohydanloinowy

resztę aminokwasową (lub N-końcową resztę poliH+, nitrometan

peptydu) do fenylotiohydantoiny. Fenyloizotiocyjanian reaguje z grupami aminowymi aminokwasów i peptydów, co prowadzi do powstania kwasów fenylotiohydantoinowych, które po dodaniu kwasu, w rozpuszczalnikach niehydroksytowych, cyklizują do pochodnych fenylotiohydantoinowych. Reakcję tę wykorzystuje się głównie w celu identyfikacji N-końcowych reszt peptydu w metodzie automatycznego sekwencjonowania polipeptydów.

PEPTYDY / 57

peptydowych, przypomina sposób analogiczny do budowy układanki (ryc. 5-11). W celu umiejscowienia wiązań disiarczkowych peptydy. z kontrolnych oraz zredukowanych lub utlenionych białek, rozdziela się metodą dwuwymiarowej chromatografii lub elektroforezy i chromatografii (tzw. finger-printing). Identyfikacja za pomocą ninhydryny ujawnia w produkcie trawienia białka kontrolnego 2 mniejsze peptydy, zaś w białku, na które działano wymienionymi powyŜej czynnikami, 1 nowy peptyd. Mając informację dotyczącą sekwencji tych peptydow, moŜna wyznaczyć w nich połoŜenie wiązań disiarczkowych. Peptyd Y

Paptyd X Paptyd Z

1 C —końcowy fragment

N —końcowy fragmenl

peptydu X

peptyd u Y

Ryc. 5-11. Nakładające się sekwencje peptydu Z stosuje się w celu stwierdzenia, Ŝe peptydy X i Y występują w pierwotnym białku w kolejności X-*Y, a nie Y-»Z.

N

SYNTEZA PEPTYDOW METODAMI AUTOMATYCZNYMI Rycina 5-12 ilustruje procedurę syntezy dipeptydu A -B za pomocą automatycznej, stałofazowej techniki Merrifielda, podsumowującej wszystkie reakcje wymagane do zsyntetyzowania peptydu o dowolnej długości. Te etapy syntezy obejmują: 1. Zablokowanie N-końcowego aminokwasu A (otwarty prostokąt) i aminokwasu B (zaciemniony prostokąt) za pomocą grupy /-butylooksykarbonylowej (t-BOC) (■): O II (CH3)—C—O—C—

co prowadzi do utworzenia pochodnych /-BOC-aminokwas A i /-BOC-aminokwas B.

C

Ryc. 5-12. Schematyczne przedstawienie syntezy powstającego dipeptydu za pomocą techniki wprowadznnej przez IWerrifielda. Wyjaśnienie symboli znajdzie Czytelnik w towarzyszącym tekście.

2. Aktywację grupy karboksylowej (-BOC-aminokwas B za pomocą dicykloheksylokarboimidu(DCC) (A): N C = N-C H

6 (

3. Reakcje grupy karboksylowej aminokwa su A (który staje się C-końcową resztą peptydu) z zaktywowaną, nierozpuszczalny Ŝywicą poli styrenową ($). 4. Usunięcie grup blokujących z połączeń f-BOC-aminokwas A, za pomocą kwasu trifluorooctowego w temperaturze pokojowej (TFA, FjC—COOH). Uwaga. W praktyce etapy 3 i 4 moŜna pominąć, gdyŜ Ŝywica z danym Ŝ-BOC-aminokwasem, połączone wiązaniem estrowym z fe-

58 / ROZDZIAŁ 5

nyloacetamidometylowym (PAM) „łącznikiem" zakotwiczonym w Ŝywicy polistyrenowej, są dostępne w sprzedaŜy. 5. Kondensacje zaktywowanej grupy karboksylowej połączenia t-BOC-aminokwas B z wolną grupą aminową unieruchomionego ami nokwasu A. 6. Usunięcie blokującej grupy f-BOC za po mocą TFA (p. etap 4). 7. Uwolnienie dipeptydu A—B od cząste czek Ŝywicy przez działanie fluorowodoru (HF) w dichlorometanie w temp, — 2°C, Pierwsze osiągnięcia techniki Merrifielda dotyczyły syntezy łańcucha A (21 reszt) i łańcucha B (30 reszt) insuliny w ciągu 11 dni oraz enzymu — rybonukkazy trzustkowej z wydajnością 18%. Kolejne jej udoskonalenia skróciły czas syntezy wiązania peptydowego do ok. 1 h i znacznie zwiększyły wydajność. Technika Merrifielda otworzyła nowe nadzieje nie tylko w badaniach de novo syntezy białek o określonej strukturze pierwszorzędowej, lecz takŜe w immunologii, do produkcji szczepionek i hormonów polipeptydowych i być moŜe takŜe w leczeniu wybranych wrodzonych wad metabolicznych.

PIŚMIENNICTWO Allen G: Sequencing of Proteins and Peptides. North Holland, 1981. Bhwon AS: Protein/Peptide Sequence Analysis: Current Methodologies. CRC Press, 1988.

Cantor CR, Schimmel PR: Biophyskal Chemistry, Part I: The Conformation of Macromolecules. Freeman, 1980. Dayhoff M {editor): Atlas of Protein Seąuence and Structure. Vol 5. National Biomedicai Research Foundation, Washington, DC. Doolittle RF: Ol" uris and orfs: a Primer on How to Analyze Derived Amino Acid Seąuences. University Science Books. 1987. Hewick RM, Hunkapiiler MW. Hood LE, Dryer WJ: A gasliquid solid phase peplide and protein sequenator. J Biol Chem 1981; 256: 7990. Hunkapiiler MW, Hood LE: Protein sequence analysis: automated microseąuencing. Science 1983; 219: 650. LipmanDJ, PearsonWR: Similar amino acid seąuences: chance or common ancestry?/Mo/Bw/19Sl; 16:9. Mahoney WC, Smith PK, Hermodson MA: Fragmentation of proteins with o-iodosobenzoic acid: Chemical mechanism and identification of o-iodosobenzoic acid as a reactive contaminant that modifies tyrosyl residues. Biochemistry 1981; 20: 443; Methods Enzymol. Vols. 47; 48, 49, 91 (published continuously). Meriifield RB: Solid phase synthesis. Science 1986; 232: 341. Pearson JD et al: Reversed-phase supports fó"r thc resolution of iarge denatured protein fragments. / Chromatogr 1981; 207: 325. Regnier FE. Gooding K.M: High performance liquid chromatography of proteins. Anal Biochem 1980; 103: 1. Strickler JE, Hunkapiller MW, Wilson KJ: Ulility of the gasphase sequencer for both liąuid- and solid*phase degradation of proteins and peptides at Iow picomole levels. Anal Biochem 1984; 140: 553.

Białka: struktura i właściwości

6

Victor W. Rodweli, PhD

WPROWADZENIE Białka to wielkocząsteczkowe polipeptydy. Granica oddzielająca duŜe polipeptydy od małych białek przebiega zazwyczaj między masami cząsteczkowymi 8000 — 10 000. Białka proste są zbudowane tylko z aminokwasów. Białka złoŜoee^awierąją dodatkowe związki nieaminokwasowe, takie jak hern, pochodne witamin, lipidy lub węglowodany. Ten rozdział dotyczy białek prostych. W innych rozdziałach zostaną omówione typowe białka złoŜone, jak hemowe, glikoproteiny i lipoproteiny, a takŜe właściwości białek prostych o szczególnie odrębnej strukturze, takich jak kolagen i białka kurczliwe. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Białka odgrywają wiodącą rolę w czynności i budowie komórki. W celach diagnostycznych szeroko stosuje się analizę niektórych białek i enzymów krwi. Dobrym przykładem jest oznaczenie elektroforetyczne stosunku zawartości albumin do globulin osocza, które stanowi integralną część rozpracowania diagnostycznego w chorobach wątroby. Analiza lipoprotein oraz immunoglobulin osocza, za pomocą elektroforezy oraz innych metod, jest powszechnie stosowana w diagnostyce odpowiednio swoistych typów hiperlipoproteinemii i zaburzeń odporności. Prawidłowy ludzki mocz zwykle jest wolny od białek, a więc stwierdzenie znaczącej proteinurii stanowi zazwyczaj waŜny sygnał chorób nerek, takich jak róŜne postacie ich stanów zapalnych.

BIAŁKA SĄ KLASYFIKOWANE W RÓśNE SPOSOBY W CELU ZILUSTROWANIA RÓśNORODNYCH WŁAŚCIWOŚCI ICH FUNKCJI STRUKTURALNYCH Ze względu na brak uniwersalnego, wszechstronnie zadowalającego systemu klasyfikacji białek, powszechnie stosuje się kilka wzajemnie przeciwstawnych sposobów ich podziału. Wszystkie one mają raczej ograniczoną wartość jako pomoc w zrozumieniu wielu kluczowych właściwości białek. Utrzymywanie się w uŜyciu tych klasyfikacji i terminów — zwłaszcza w laboratoriach klinicznych — zmusza do krótkiej refleksji. PoniŜej zostaną przedstawione podstawowe cechy systemów klasyfikacji, opartych na rozpuszczalności białek, ich kształcie, funkcji, właściwościach fizycznych oraz trójwymiarowej strukturze. Klasyfikacja na podstawie rozpuszczalności System klasyfikacji białek oparty na ich rozpuszczalności i rozwinięty w latach 1907—1908 jest nadal stosowany w zawęŜonym stopniu, zwłaszcza w biochemii klinicznej (tab. 6-1). Rozgraniczenia między klasami nie są przekonywające. Wyraźne rozróŜnienie, np. miedzy albuminami i globulinami, nie moŜe być przeprowadzone jedynie na podstawie ich rozpuszczalności w wodzie lub roztworach soli. Klasyfikacja na podstawie kształtu Dwie obszerne klasy białek mogą być wyodrębnione za pomocą ich stosunku osiowego (długości do szerokości). Białka globularnc, dla których wartość tego stosunku jest mniejsza od 10 i na ogół nie przekracza 3—4, mają łańcuchy polipeptydowe ściśle pofałdowane i zwinięte.

60 / ROZDZIAŁ 6 Tabela 6-1. Klasyfikacja białek oparta na ich rozpuszczalności Albuminy

Rozpuszczalne w wodzie i roztworach soli. śadnych szczególnych aminokwasów

Globuliny

Słabo rozpuszczalne w wodzie, ale dobrze w roztworach soli. śadnych szczególnych aminokwasów

Prolaminy

Rozpuszczalne w 70 80% etanolu, ale nierozpuszczalne w wodzie i etanolu absolutnym. Wzbogacone w arginine Histony Rozpuszczalne w roztworach soli (i kwasów nieorganicznych*) Nierozpuszczalne w wodzie ani w Skleroprotetny roztworach soli. Wzbogacone w Gly, Aia, Pro * Przyp. tłum.

NaleŜą do nich m.in. insulina, albuminy i globuliny osocza oraz wiele enzymów. Białka włókienkowe, dla których wartości stosunków osiowych są większe niŜ 10, zawierają odcinki łańcuchów polipeptydowych zwiniętych śrubowo lub w heliks i połączone krzyŜowo wiązaniami kowalencyjnymi lub wodorowymi. Przykładami białek włókienkowych są: kerą.tyna, miozyna, kolagen i włóknik.

Tabela 6-2. Główne funkcje biafek Funkcja

Białka (przykłady)

Katalityczna

Enzymy

Strukturalna Ochronna

Kolagen, elastynar keratyny Włóknik, immunogiobuliny, interferon

Regulatorowa

Kalmoduiina

Regulacja genowa Histony, białka represorowe Regulacja Insulina hormonalna Skurcz Transport

Aktyna, miozyna Albumina (bilirubina, kwasy tłuszczowe itp.), hemoglobina (tlen)Jipoproieiny (róŜne lipidy), transferyna (Ŝelazo)

Klasyfikacja na podstawie czynności Zgodnie z ich funkcjami biologicznymi, białka mogą być sklasyfikowane np. jako strukturalne, katalityczne lub transportowe (tab. 62). Białka katalityczne (enzymy), stanowiące większość tych związków, są ujmowane w klasy według typu reakcji, którą katalizują.

Klasyfikacja na podstawie właściwości fizycznych Dla białek budzących zainteresowanie medyczne, wyspecjalizowane systemy klasyfikacji pozwalają rozróŜnić ściśle spokrewnione białka. W powszechnym uŜyciu są np. 2 układy nazewnictwa lipoprotein osocza, a 3. jest rozwaŜany. Pierwszy z nich wyodrębnia ot]-, ot2-, P- i Y-lipoproteiny na podstawie ich ruchliwości elektroforetycznej w środowisku o pH 8,6. Lipoproteiny są takŜe klasyfikowane pod względem ich zachowania się podczas sedymentacji jako: chylomikrony, VLDL, LDL, HDL i VHDL. Ponadto 6 obszernych klas lipoprotein osocza moŜe być rozpoznanych w zaleŜności od występowania w nich apoprotein A, B, C, D, E lub F, które z kolei róŜnicuje się za pomocą kryteriów immunologicznych.

Klasyfikacja na podstawie struktury trój wy m ia ro wej Białka mogą być zróŜnicowane na podstawie występującej w nich struktury czwartorzędowej lub jej braku (patrz niŜej). Ponadto podobieństwa w strukturze, wykryte głównie przez krystalografię promieniami X, dostarczają cennej podstawy do klasyfikacji białek. Na przykład białka łączące się z nukleotydami mają w strukturze trzeciorzędowej wspólną „domenę wiąŜącą nukleotyd" i mogą być ewolucyjnie spokrewnione. W miarę rozszyfrowywania dalszych struktur krystalicznych moŜliwe będzie rozpoznanie i ustalenie dodatkowych wspólnych domen.

PIERWSZORZĘDOWA STRUKTURA BIAŁEK WYWODZI SIĘ Z KOWALENCYJNEGO POŁĄCZENIA L-a-AMINOKWASÓW WIĄZANIAMI PEPTYDOWYMI Wprawdzie wiodącą rolę wiązań peptydowych w białkach wydedukowano dawno temu, na podstawie wielorakich faktów, to jednak najbardziej przekonywającym dowodem nie-

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 61

zbędności jedynie tych wiązań stalą się pełna synteza chemiczna insuliny i rybonukleazy, wyłącznie w wyniku połączenia aminokwasów za pomocą wiązań amidowych. Wiązanie łączące atomy węgla grupy karbonyiowej i azotu w wiązaniu peptydowym ma częściowo charakter wiązania podwójnego ChociaŜ peptydy zapisuje się z pojedynczym wiązaniem łączącym atomy a-karboksylu i a-azotu, wiązanie węgiel—azot w rzeczywistości ma częściowo charakter wiązania podwójnego (ryc. 6-!). Nie ma tu Ŝadnego swobodnego O O

obrotu wokół wiązania łączącego atomy C i N, a wszystkie 4 atomy' przedstawione na ryc. 6-1, leŜą w tej samej płaszczyźnie (tj. są koplanarne). Przeciwnie, rozległa swobodna rotacja zachodzi wokół pozostałych wiązań szkieletu polipeptydowego. Te koncepcje są przedstawione na ryc. 6-2, gdzie wiązania obdarzone swobodnym obrotem są okółkowane strzałkami, a współpłaszczyznowe (koplanarne) atomy znajdują się w obszarach zacienionych. Ta półsztywność ma waŜne konsekwencje w uporządkowaniu struktury białek powyŜej poziomu pierwszego rzędu. W uzupełnieniu do wiązań peptydowych, które tworzą „szkielet" łańcucha polipeptydowego, dodatkowe wiązania kowalencyjne i niekowalencyjne przyczyniają się do stabilności polipeptydów.

H

C H

H

Ryc. 6-1. Stabilizacja rezonansowa wiązania peptydowego nadaje mu częściowo charakter wiązania podwójnego i stąd sztywność połączenia C-N.

Mostki disiarczkowe uformowane przez reszty cysterny tworzą kowalencyjne wiązania w obrębie oraz pomiędzy polipeptydatni niektórych białek Wiązanie disiarczkowe, utworzone między 2 resztami cysteiny, łączy 2 części łańcucha polipeptydowego za pomocą reszty cystyny. Wiązanie cystynowe jest oporne na warunki powodujące denaturację białka. Kwas nadmrówkowy (utleniający wiązanie S-S) lub fS-merkaptoetanol (redukujący mostki S-S z utworzeniem 2 reszt cysteiny) rozdziela łańcuchy polipeptydowe połączone wiązaniami disiarczkowymi bez wpływu na ich strukturę pierwszorzędową (ryc. 5-9). NIEKOWALENCYJNE WIĄZANIA RÓWNIEś STABILIZUJĄ CZĄSTECZKĘ BIAŁKA

Ryc. 6-2. Wymiary calkowiciewyciągniętegotańcucha polipeptydowego. 4 atomy w zacienionych obszarach są wspó! płaszczyzn owe (kop la na me) i tworzą wiązanie peptydowe. Niezacienionymi są: atom węgla a, atom wodoru a i grupa a-R danego aminokwasu. Swobodna rotacja zachodzi wokół wiązań łączących węgiel a z azotem a i węglem cc-karbonylowym (białe strzałki). Rozciągnięty łańcuch poiipeptydowy stanowi więc strukturę pół23 sztywną, w której / atomów jego szkieletu jest utrzymywanych w stałych wzajemnych powiązaniach płaszczyznowych. Odległość pomiędzy sąsiednimi atomami węgla (/wynosi 0,36 nm. Podano równieŜ odległości międzyatomowe i kąty pomiędzy wiązaniami, które nie są równowaŜne. (Przerysowano i reprodukowano za zgodą z: L Pauiing, L. P. Corey, H. R. Branson: Proc. Nałl. Acad. Sci. USA 1951:37:205).

Trzy główne typy wiązań niekowalencyjnych szczególnie się przyczyniają do utrwalenia struktur białkowych. Wielokrotne wiązania wodorowe stabilizują ogólną strukturę białek Wiązania wodorowe. utworzone pomiędzy: resztami w łańcuchach bocznych peptydowo związanych aminokwusówj-iłtomami wodoru i tlenu w samych wiązaniach peptydowych oraz między resztami polarnymi na powierzchni białek i cząsteczkami wody, odgrywają waŜną rolę w utrzymaniu struktury białek powyŜej pierwszego rzędu (p. niŜej: heliks a i struktura P).

62 / ROZDZIAŁ 6

Interakcje hydrofobowe przyczyniają się do stabilizacji wnętrza cząsteczek białkowych Niepolarne łańcuchy boczne aminokwasów obojętnych w białkach dąŜą do zasocjowania. Powiązanie nie jest stechiometryczne, wobec tego nie istnieje prawdziwe wiązanie. Tyra niemniej ich duŜa liczba powoduje, Ŝe te oddziaływania odgrywają znaczącą rolę w utrzymaniu struktury białek. Elektrostatyczne oddziaływania wiąŜą reszty powierzchniowe w białkach Wiązania typu soli, czyli elektrostatyczne, tworzą się albo między przeciwstawnie naładowanymi grupami w łańcuchach bocznych amino k wasó w, alb o po międ zy r eszta mi Ni C-końcowymi a innymi ugrupowaniami o przeciwnym ładunku. Na przykład w pH fizjologicznym s-aminowa grupa lizyny dźwiga ładunek netto + 1, zaś nie-a-karboksyl asparaginianu i glutamianu — czysty ładunek — 1. Mogą więc one nawzajem oddziaływać elektrostatycznie, stabilizując cząsteczki białka.

Dane rentgenograficzne wykazały obecność powtarzających się jednostek o długości 0,5—0,55 nm wzdłuŜ długiej osi a-keratyn włosa i wełny. Niestety, Ŝaden wymiar rozciągniętego łańcucha poiipeptydowego nie wynosił 0,5— 0,55 nm (ryc. 6-2). Tę oczywistą anomalię rozstrzygnęli Pauling i Corey, którzy zaproponowali ukształtowanie łańcucha polipeptydowego a-keratyny w formie a-heliksu (ryc. 6-3). W strukturze tej grupy R wystają na zewnątrz od centrum heliksu (ryc. 6-4). Na jedenjJsok śruby (zwój a-heliksu) przyj>adajL&reszt aminokwasowych, a odległość "przebyta przez jeden skręt (inaczej: odległość między Ryc. 6-3. Przedstawienie helikalnej konfiguracji

Związki denaturujące białka rozrywają w nich wiązania niekowafencyjne, powodując utratę aktywności biologicznej Denaturacja białka za pomocą takich odczynników, jak: mocznik, siarczan dodecylu sodu (SDS), umiarkowane stęŜenie jonów H4 lub OH~ rozrywa wiązania wodorowe, hydrofobowe i elektrostatyczne, z wyjątkiem wiązań kowalencyjnych: peptydowych lub disiarczkowych. HELIKS a JEST JEDNYM Z MOTYWÓW STRUKTURALNYCH UTRZYMUJĄCYCH UPORZĄDKOWANE KONFORMACJE W BIAŁKACH Odkrycie, Ŝe łańcuchy polipeptydowe charakteryzują się bardzo uporządkowanymi konformacjami, utrzymywanymi przez wiązania wodorowe, stało się głównym postępem pojęciowym. Wprawdzie istnienie tych bardzo uporządkowanych struktur zostało potwierdzone przez krystalografię rentgenowską, jednak było ono najpierw zaproponowane w wyniku rozwaŜań teoretycznych.

Skok 0,54 nm (3.6 reszt)

głównego łańcucha polipeptydowego wokół osi a-heiiksu.

BiAŁKA: STRUKTURA i WŁAŚCIWOŚCI / 63

0,5 r Ryc. 6-4. Przekrój poprzeczny heltksu a. Łańcuchy boczne (R) wystają na zewnątrz heiiksu. Promienie van der Waalsa są większe niŜ wykazano na rycinie, stąd wewnątrz heiiksu prawie nie ma wolnej przestrzeni. (Nieznacznie zmodyfikowano i reprodukowano za zgodą z: Stryer L; Biochemistry, wyd.2, Freeman, 1981, Copyright© 1981 by W. H. Freeman and Co).

zwojami*) wynosi 0,54 nm. Odstęp przypadający na Jedną resztę aminokwasem A wzdłuŜ osi ctheliksu wynosi 0,15 nm. Właściwości a-helik-su są następujące: 1. Strukturę cc-heliksu stabilizują miedzyaminokwasowe wiązania wodorowe. KaŜde z nich jest utworzone przez atom H połączony z azotem jednego ugrupowania peptydowego (NH) i znajdujący się między silnie elektroujemnymi atomami (układami*), tj. wymienionym azotem peptydowym oraz tlenem grupy karbonylowej (ĆO) 4. z kolei reszty aminokwasowej w strukturze pierwszorzędowej. 2. KaŜde wiązanie peptydowe uczestniczy w wytworzeniu wiązania wodorowego, co za pewnia maksymalną stabilność. 3. Wszystkie atomy azotu peptydowego i tle nu karbonylowego reszt aminokwas owych w łańcuchu głównym są zaangaŜowane w wiąza nia wodorowe, co znacznie zmniejsza hulrofilowy (zwiększając hydrofobowy) charakter regionu a-helikalnego. 4. Heliks ot formuje się spontanicznie, ponie waŜ — przy najmniejszym zuŜyciu energii — stanowi najbardziej stabilną konformację łańcucha polipeptydowego. * Przyp. tłum.

Ryc. 6-5. Wiązania wodorowe (kropki} uformowane między atomami H i O stabilizują polipeptyd w konformacji a-heltkalnej. (Przedrukowano za zgodą z; Haggis G. H. i wsp. tntroduetion to Motecular Biology. Witey, 1964).

Tabela 6-3. Wpływ róŜnycfi reszt aminokwasowych na formowanie heiiksu a

Heliks a stabilizują (utrwalają)

destabilizują

kończą (przerywają)

Ala

Arg

Pro

Asn Cys Gin His Leu Met Phe Trp Tyr Val

Asp Glu Gly Lys Ile Ser Thr

Hyp

64 / ROZDZIAŁ 6

5. Prawozwojowy heliks występujący w biał kach jest znacznie bardziej trwały niŜ lewoskrętny, gdy resztami są L-aminokwasy. 6. Resztami destabilizującymi heliks są: pro.liną_(w której atom N jest częścią sztywnego pierścienia, co uniemoŜliwia rotację wokół wią zania N C) oraz aminokwasy z naładowanymi elektrycznie lub masywnymi grupami R, które elektrostatycznie lub fizycznie przeszkadzają w uformowaniu heliksu (tab. 6-3).

RÓWNOLEGŁE I PRZE CiW RÓWNO LEGŁE POFAŁDOWANE ŁAŃCUCHY STANOWIĄ DRUGI TYP ROZPOZNAWALNIE UPORZĄDKOWANEJ STRUKTURY Pauling i Corey zaproponowali równieŜ drugie uporządkowanie struktury białka, tj^jtruktury p, czyli pofałdowanej kartki (inaczej: pofałdowanego łańcucha, pofałdowanego lub „splisowanego" arkusza*) (ang. f3-pleated sheet; p — poniewaŜ to była druga struktura po opisanym najpierw a-heliksie). W heliksie J. łańcuch polipeptydowy jest zwarty, natomiast w_. strukturze p (inaczej: fałdowej, „harmonijkowej" lub „dywanowej"*) pozostaje on niemal całkowicie rozciągnięty (ryc. 6-6). Struktura P noslnazwę przeciwrównoległej, gdy sąsiadujące łańcuchy polipeptydowe biegną w przeciwnych kierunkach (N-koniec jednego łańcucha do C-końca drugiego) (ryc. 6-6); luedy łańcuchy podąŜają w tym samym kierunku jest ona nazywana równoległą (nie wykazano). W wielu białkach występują współbieŜne i przeciwbieŜne regiony struktury p. MoŜe ją formować 2—5 przylegających łańcuchów polipeptydowych. Na rycinie 6-7 przedstawiono region rybonukleazy, w której 3 odcinki łańcucha polipeptydowego tworzą strukturę p. Heliks a jest stabilizowany mostkami wodorowymi między wiązaniami peptydowymi, oddzielonymi od siebie 4 resztami w sensie struktury pierwszorzędowej, podczas gdy strukturę fS utrwalają wiązania wodorowe między segmentami peptydowymi oddalonymi od siebie w sensie struktury pierwszorzędowej (ryc. 6-7).

Przyp. tłum.

Ryc. 6-6. W przeciwrównoległej fałdowej strukturze p sąsiednie łańcuchy polipeptydowe biegną w przeciwnych kierunkach. Wiązania wodorowe między grupami NH i CO sąsiednich łańcuchów stabilizują tę strukturę. Łańcuchy boczne (R) aminokwasów znajdują się powyŜej i poniŜej płaszczyzny kartki. O atomy węgla; © atomy azotu; O atomy wodoru. (Zmodyfikowano i reprodukowano za zgodą z: Siryer L: Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981, Copyright © 1981 by W. H. Freeman and Co.).

ZAKRĘTY p UMOśLIWIAJĄ POLIPEPTYDOM PRZYJMOWANIE KSZTAŁTÓW GLOBULARNYCH Polipeptydy z reguły formują zbite masy globularne, muszą więc istnieć moŜliwości zmiany kierunku łańcucha polipeptydowego. Jednym z nich jest utworzenie ciasnej pętli zakrętu P (inaczej: skrętu p, zwrotu p1 lub zwrotu typu spinki do włosów*), w której tlen grupy karbonylowej jednej reszty łączy sie wiązaniem wodorowym z wodorem amidowym aminokwasu oddalonego o 3 reszty do przodu. Często w zakrętach p występują prolina i glicyna. Część struktury przestrzennej (geometrii) zakrętu p jest ukształtowana w prolinie, która bardziej niŜ inne aminokwasy podlega konfor* Przyp. tłum.

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 65

ASPEKTY STRUKTURY BIAŁEK ROZWAśA SIĘ POD KĄTEM 4 POZIOMÓW UPORZĄDKOWANIA Struktura pierwszorzędowa Strukturę pierwszego rzędu stanowi, jak w przypadku peptydów, kolejność aminokwasów w łańcuchu lub łańcuchach polipeptydowych oraz umiejscowienie wiązań disiarczkowych, jeŜeli one w tych łańcuchach występują.

Ryc. 6-7. Cząsteczka rybonukleazy trzustki wołu jest zbudowana z pojedynczego łańcucha 124 reszt połączonego poprzecznie w 4 miejscach za pomocą wiązań disiarczkowych. Region a-heliksu ujęto w kropkowany owal, a region struktury fałdowej zacienione Pozostałe części cząsteczki występują giównie w postaci przypadkowego zwoju. Centrum aktywne enzymu znajduje się w miejscu związania jonu fosforanowego (PO^~). (Zaadoptowano z: Kartha G., Bello J.r Harker D.: Tertiary structure of nbonuclease. Naturę 1967; 213:862) Białko zostato w całości z syntetyzowane chemicznie.

macyjnym ograniczeniom. Dla kontrastu mała grupa R. pozwala glicynie działać jako giętki „zawias" między regionami polipeptydu, którego ugrupowania R sprzyjałyby inaczej bardziej rozciągniętej konformacji. REGIONY BIAŁEK, KTÓRE NIE SĄ UFORMOWANE W HELIKSY, STRUKTURY p LUB ZAKRĘTY % WYSTĘPUJĄ WTZW. KONFORMACJI „PRZYPADKOWEGO" (NIEPLANOWANEGO) ZWOJU Znaczne części cząsteczki białkowej mogą występować w konformacji przypadkowego (nieplanowanego) zwoju (ang. random-coil; kłębek statystyczny) (ryc. 6-7), Termin „przypadkowy" jest niefortunny, poniewaŜ moŜe bardziej implikować mniejsze biologiczne znaczenie niŜ regionów o duŜej powtarzalności. Dla funkcji biologicznej regiony przypadkowego zwoju są równie waŜne, jak heliks a lub konformacja p. 5 — Biochemia

Struktura drugorzędowa Struktury drugiego rzędu, czyli przestrzenne współzaleŜności między aminokwasami zwartymi w pierwszorzędowym strukturalnym zakresie, mogą być regularne (np. heliks a, struktura f>) lub przejawiać niewiele tej regularności (np. przypadkowy zwój). Struktura trzeciorzędowa Ogólne rozmieszczenie i wzajemne powiązanie roŜnych regionów lub domen oraz poszczególnych reszt amin o kwas owych w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym stanowi trzeciorzędową strukturę białka. Wprawdzie rozgraniczenie pomiędzy strukturą drugo- i trzeciorzędową nie jest wyraźne, struktura trzeciorzędowa wyraŜa wzajemne przestrzenne usytuowanie reszt aminokwasowych, które — generalnie — są daleko od siebie w- sensie budowy pierwszego rzędu. Struktura czwartorzędowa Białka wykazują strukturę czwartego rzędu, jeŜeli składają się z 2 lub więcej łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniami innymi

niŜ kowalencyjne (tj. niepeptydowymi lub disiarczkowymi*). Siłami stabilizującymi te agregaty są wiązania wodorowe i elektrostatyczne (typu soli) utworzone miedzy resztami aminokwasowymi na powierzchniach łańcuchów polipeptydowych. Takie białka noszą nazwę oltgomerów, a pojedyncze łańcuchy polipeptydowe je

* Cząsteczka białka nie dająca się, przynajmniej potencjalnie, rozdzielić na podjednostki (związane wiązaniami mekowalencyjnymi) nie ma struktury czwartorzędowej. Przykładami białek bez struktury czwartorzędowej są: rybonukleaza (1 łańcuch) i chymotrypsyna (3 łańcuchy). Przyp. tłum. zaczerpnięty z: Morawiecki A. (red.): Nowe polskie słownictwo biochemiczne. PWN, 1983, s. 113.

66 / ROZDZIAŁ 6 tworzące określa się jako protomery, monomery lub podjednostki.

Wiele białek oligomerycznych zawiera 2 lub 4 protomery, nosząc odpowiednio nazwy dimerów lub tetramerów. Oligomery zbudowane z więcej niŜ 4 protomerów są równieŜ rozpowszechnione, zwłaszcza wśród enzymów regulatorowych (przykładem — karbamoilotransferaza asparaginianowa). Białka oligomeryczne odgrywają szczególną role w regulacji wewnątrzkomórkowej, poniewaŜ protomery mogą przyjmować względem siebie róŜne ułoŜenia przestrzenne, co powoduje zmiany we właściwościach oligomeru. Niektóre białka tworzą kompleksy wielkocząsteczkowe Asocjację róŜnorodnych białek czynnościowych, z których kaŜde ma 4 poziomy struktury, w wielofunkcjonalne makromolekularne kompleksy spotyka się w transporcie elektronów, biosyntezie kwasów tłuszczowych i metabolizmie pirogronianu. DRUGORZĘDOWĄ I TRZECIORZĘDOWĄ STRUKTURĘ BIAŁEK WYZNACZA SEKWENCJA AMINOKWASÓW W ŁAŃCUCHU POLIPEPTYDOWYM Skoro tylko utworzy się łańcuch polipeptydowy, grupy R aminokwasów kierują swoistym zwijaniem się poszczególnych jego regionów (struktura drugo rzędowa), jak równieŜ zasocjowaniem tych regionów (struktura trzeciorzędowa). Dowodzi tego klasyczne doświadczenie. Zadziałanie na rybonukleazę łagodnym związkiem redukującym (P-merkaptoetanolem) i czynnikiem denaturującym (mocznikiem lub guanidyną; p. niŜej) inaktywuje ją tak, Ŝe przyjmuje konformację przypadkowego zwoju. Powolne usunięcie czynnika denaturującego i łagodne ponowne utlenienie, w celu rekonstrukcji wiązań S—S, prowadzi do niemal kompletnego odtworzenia aktywności enzymatycznej. Nie jest więc niezbędne postulowanie niezaleŜnej genetycznej kontroli uporządkowania struktury białka powyŜej poziomu pierwszego, poniewaŜ budowa pierwszorzędowa wyznacza drugorzędową, trzeciorzędową oraz (kiedy jest obecna) czwartorzędową strukturę (tj. konformację) cząs-

teczki białkowej. Rodzimą konformacją białka, takiego jak rybonukleaza, wydaje się być ta,

która jest term o dynamicznie najbardziej stabilna w danym otoczeniu, np. w hydrofilowym w przeciwieństwie do hydrofobowego. Struktura białka moŜe być modyfikowana podczas po trans! acyjnego dojrzewania, takiego jak konwersja prcproenzyirm w postać katalitycznie aktywną lub usunięcie peptydowego „lidera" (peptydu sygnałowego), który przeprowadza poprzez błonę białka przeznaczone „na eksport'7. Stosunkowo słabe oddziaływania odpowiedzialne za utrzymanie drugo-, trzecio- i czwartorzędowej struktury białek ulegają łatwo rozerwaniu, powodując utratę ich aktywności biologicznej Naruszenie rodzimej struktury nosi nazwę denaturacji. Fizycznie denaturacja moŜe być rozpatrywana jako zaburzenia konformacji łańcucha polipeptydowego, nie wpływające aa jego strukturę pierwszorzędowa. Dla protomeru proces ten moŜe być przedstawiony tak, jak na ryc. 6-8. Dla białka oligomerycznego denaturacja moŜe obejmować rozdysocjowanie protomerów, czemu towarzyszą zmiany wich konformacji.

Enzym aktywny (natywny) Dsnaturacja Enzym nieaktywny (z denaturowany) Ryc. 6-8. Zobrazowanie denaturacji protomeru.

Biologiczną aktywność niszczą mocne kwasy lub zasady, wysoka temperatura, detergenty jonowe (amfipatyczne), związki chaotropowe (mocznik, guanidyną), cięŜkie metale (Ag, Pb, Hg) lub rozpuszczalniki organiczne. Zdenaturowane białka są na ogół gorzej rozpuszczalne i ulegają wytrąceniu. Znajduje to zastosowanie w laboratorium klinicznym. Do krwi lub surowicy, w której oznacza się zawartość małych cząsteczek (np. glukozy, kwasu moczowego, leków), generalnie najpierw dodaje się kwasu trichlorooctowego, fo sforo wolframowego lub fosforomolindenowcgo w celu strącenia białek.

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 67

Po usunięciu ich, przez wirowanie, analizuje się wolny od białek supernatant.

Tabela6-5. Zmodyfikowane nie-a-funkcyjne grupy w białkach*

WraŜliwość większości enzymów na ogrzewanie, kwasy oraz proteazy, stanowi podstawę wstępnego badania, stwierdzającego czy daną

Grupy modyfikowane

reakcję katalizuje enzym. Ekstrakt komórek, obdarzony aktywnością enzymatyczną, który traci tę właściwość w wyniku zagotowania, zakwaszenia i ponownego zobojętnienia lub zadziałania proteazą, zapewne zawiera jakiś enzym w charakterze katalizatora. Często na denaturację jakiegoś enzymu wpływa obecność jego substratu. Pojawienie się zmiany konformacyjnej podczas związania substratu dowodzi, Ŝe nowa konformacja moŜe być trwalsza lub mniej trwała niŜ poprzednia.

PIERWSZORZĘDOWE STRUKTURY BIAŁEK SĄ OZNACZANE METODAMI STOSOWANYMI DO SEKWENCJONOWANIA PEPTYDOW Z białek złoŜonych usuwa się najpierw grupy prostetyczne (np. hem), a wiązanie disiarczkowe utlenia się w celu uzyskania liniowych polipeptydów (p. ryc. 5-9). Techniki stosowane do Tabela 6-4. Modyfikacja grup a-COOH i a-NH 2 w białkach* Grupy modyfikowane a-COOH N-ace tyłowa

N -metylowa

Ala Asp

Ala Asp

Gly

Gly

Gly

Met

Met

Met

Ser Thr

Ser Thr

Amidowa N-formylowa

Asp Glu Gly His Met Phe Pro

Tyr

Val

Val

* Według R. Uy, F. Wold: Posttranslational covalent modification of proteins, Science 1977; 198:890. Copyright © 1977 American Association for the Advancement of Science, w modyfikacji autora rozdziału za zezwoleniem autorów cytowanej pracy.

—OH PO3H2 Ser Thr Tyr

Mto-et-N N- metylowa N dimetylowa N-trimetylowa Arg His Lys

Lys

Arg Lys

* Według R. Uy, F. Wold: Posttranslational covalent modification of proteins. Science 1977; 198:890. Copyright © 1977 by the American Association for the Advancement of Science, w modyfikacji autora rozdziału za zezwoleniem autorów tej pracy.

sekwencjonowania tych polipeptydów przedstawiono w rozdz. 5. Wprawdzie większość białek 2awiera tylko aminokwasy wymienione w tab, 4-3, pochodne tych reszt równieŜ występują w niektórych białkach (tab. 6-4 i 6-5). Jakkolwiek omówienie metod uŜywanych do zidentyfikowania owych pochodnych aminokwasowych nie wchodzi w zakres tego rozdziału, jednak ich obecność moŜe komplikować określenie struktury pierwszorzedowej.

Drugorzędowa i trzeciorzędowa struktura białek jest analizowana za pomocą krystalografii rentgenowskiej Techniki poprzednio stosowane, pozwalające wnioskować o występowaniu w białkach struktur helikalnych (np. optyczna dyspersja rotacyjna, wymiana protonów trytu) zostały wyparte przez rentgenowską analizę krystalograficzną. Promienie X są kierowane na kryształ białka oraz na jedną z jego pochodnych, zawierającą dodatkowo jon cięŜkiego metalu. Promienie ulegają rozproszeniu w sposób zaleŜny od gęstości elektronów w róŜnych częściach cząsteczki białkowej. Obrazy zbioru plamek dyfrakcyjnych, uzyskane na błonie fotograficznej (po jej wywołaniu), są tłumaczone na tzw. mapy rozkładu gęstości elektronowej, które po ułoŜeniu jednej na drugiej pozwalają krystalografowi skonstruować wiarogodny model danego białka. Krystalografia rentgen o graficzna, chociaŜ czasochłonna, kosztowna i wymagająca specjalistycznego przeszkolenia, ujawniła szcze-

68 / ROZDZIAŁ 6

gólowe i precyzyjne obrazy z usytuowaniem wszystkich aminokwasów w wielu białkach. Nie moŜna nie docenić jej ogromnego wkładu do naszego dzisiejszego pojmowania struktury białek. Wyłoniona technika zobrazowania magnetycznego rezonansu (ang. magnetic resonance imaging; skrót — MRI) została ostatnio wykorzystana do zanalizowania trójwymiarowej struktury małego białka. Technika MRI wydaje się mieć szansę zastosowania do większych białek. Metody fizyczne stosowane do zbadania czwartorzędowej struktury białek Badanie czwartorzędowej struktury białka oligomerycznego obejmuje określenie liczby i rodzaju obecnych w nich protomerów, ich połoŜenia względem siebie oraz łączących je oddziaływań. Zakładając, Ŝe oJigomery nie ulegają denaturacji podczas procedury stosowanej do oznaczenia masy cząsteczkowej, wiele metod moŜe dostarczyć o niej danych. Te same techniki mogą być wykorzystane do określenia masy cząsteczkowej protomeru po wcześniejszym zdenaturowaniu oligomeru. Ultrawirowanie, filtracja Ŝelowa i elektroforeza w Ŝelu pozwalają oznaczyć masę cząsteczkową białek oi izomerycznych Rozwinięta przez Svedberga technika ultrawirowania mierzy szybkość sedymentacji* w polu siły odśrodkowej ok. 105 x g. W ostatnich latach istnieje tendencja, aby zastąpić ją mniej złoŜonymi metodami. W pokrewnej technice, tj. ultrawirowaniu w gradiencie gęstości sacharozy, nawarstwia się

* Matematycznym wyrazem tej szybkości jest tzw. stała sedymentacji S20, tj. szybkość opadania warstwy roztworu białka pod działaniem jednostki siły odśrodkowej, wyraŜona w jednostkach układu cgs, sprowadzona do gęstości i lepkości wody w temp. 20°C. Dla większości białek wartości liczbowe stałej sedymentacji wahają się w granicach l,510~ 13 — 2010~"; dla cząsteczki białka o kształcie kulistym jednostka stałej sedymentacji (1I0""13) odpowiada masie cząsteczkowej ok. 16 000. (Przyp. tłum. zaczerpnięty z: SkarŜytiski B.: Chemia fizjologiczna, t. I, PWRiL, 3956, s. 85).

białka wzorcowe i badane na gradient stęŜeń roztworów sacharozy (5—20%), przygotowany w probówce plastikowej. Po ultrawirowaniu przy 10 5 x g przez kilkanaście godzin (np. w ciągu nocy) przekłuwa się mały otworek w dnie probówki, zbiera jej zawartość w postaci kropel w serii kolejnych małych probówek i oblicza ruchliwości na podstawie względnego połoŜenia białek w gradiencie. Masę cząsteczkową białka globu larnego moŜna określić z jego ruchliwości w sicie molekularnym Kolumny z Ŝelu Sephadex lub podobne matryce, mające „pory" o wiadomym rozmiarze kalibruje się, stosując białka o znanej masie cząsteczkowej. Poszukiwaną masę cząsteczkową nieznanego białka oblicza się z porównania jego objętości elucyjnej z objętościami elucyjnymi białek wzorcowych. MoŜna popełnić duŜe błędy, jeŜeli cząsteczka białka jest bardzo asymetryczna albo oddziałuje silnie ze związkami, z których zostały wyprodukowane molekularne sita. Elektroforeza w Ŝelu poliakrylamidowym (PAGE) to jeszcze jedna metoda oznaczania masy cząsteczkowej Białka wzorcowe rozdziela się elektroforetycznie w 5—15% Ŝelach poliakrylamidowych o zmiennej porowatości, wybarwia się je na obecność białek, generalnie błękitem Coomassie lub tzw. srebrem, i masę cząsteczkową oznacza względem ruchliwości elektroibretycznej wzorców. Najbardziej powszechne zastosowanie tej techniki, PAGE-SDS, pozwala oznaczyć masę cząsteczkową protomeru w wyniku wcześniejszego zdenaturowania oligomeru (np. przez zagotowanie w roztworze detergentu w obecności p-merkaptoetanolu) i rozdzielenie w Ŝelach zawierających detergent jonowy — siarczan dodecylu sodu (SDS). KOMPLEKSY BIAŁKOWE MOGĄ BYĆ UWIDOCZNIONE PRZEZ ELEKTRONOWĄ MIKROFOTOGRAFIĘ Uzyskane w mikroskopie elektronowym powiększenia rozmiarów średnicy nawef 100000 razy pozwalają uwidocznić białka o bardzo duŜej masie cząsteczkowej, takie jak cząstki

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 69 Tabela 6-6. Czwartorzędowe struktury wybranych enzymów* Enzym (oligomer)

Liczba protomerów

Masa cząsteczkowa protomeru

Aminotransferaza asparaginianowa serca kury Syn ta za kwasów tłuszczowych wątroby goiębia Fruktozobisfosfataza wątroby królika

22 2" 2**

50 000 230 000 29 000 37 000

Aminotransferaza ornitynowa wątroby szczura Karboksylaza propionylo-CoA serca świni LDH serca, wątroby lub mięśni wołu

44 4**

33 000 175 000 35 000

ATPaza mitocriondrrów serca wołu

10

Syntetaza glutaminowa Escherichia coli Karboksylaza acetylo-CoA wątroby kury

12 2** 10**

26 0O0 48 500 4 100 000 409 000

* Zaadaptowano z: Klotz I. M., Langerman N. R., Darnall D. W.: Cłuaternary structure of enzymes, Annu Rev Biochem 1970; 39:25. ** Niezidentyfikowane podjednostek.

wirusów, kompleksy enzymatyczne i białka oligomeryczne. W tabeli 6-6 podano przykłady liczby oraz mas cząsteczkowych protomerów stanowiących czwartorzędowe struktury wybranych enzymów.

PIŚMIENNICTWO Advances in Protein Chemistry. Academic Press, 1944 to datę, [Annual publicalion.] Celis JE. Bravo R: Two-dimensional Gel Electrophoresis of Proteins. Methoiłs and Applications. Academic Press, 1984. Chothia C. Principles that determine the structure of proteins. Annu Rev Biochem 1984; 53:537. Dunn MJ: Gel Electrophoresis of Proteins. Wright, 1986.

Franks F: Characterization of Proteins. Wright, 1986 One AD, Braun W, Wuthrich K. Studies by l H NMR and distanoe geometry of the solution conformation of the a-amylase inhibitor tendamistat. / Mol Biol 1986; 189:377. Lennarz WJ (editor): The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycarrs. Plenum Press, 1980. L'Italien JJ: Proteins: Structure and Function. Plenum Press, 1987. Rosę CD, Geselowitz AR, Lesser GJ, Lee RM, Zehfus MH. Hydrophobiciiy of amino acid residues in globular proteins. Science 1985; 229:834, Schlessinger DH: Macromolecular Seąuencing and Analysis: Selected Methods and Applications. AR Liss, 1988. Schott H: Affinity Chrotnatography. Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. Marcel Dekker, 1984. Wittmann-Liebold B, Solnikow J, Erdmann VA: Advancetl Methods in Protein Microseąuence Analysis. Springer Verlag, 1986.

7

Białka: mioglobina i hemoglobina Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE W rozdziale tym omówiono zaleŜność struktury i funkcji na przykładzie mioglobiny i hemoglobiny, białek nie tylko bardzo istotnych fizjologicznie, lecz takŜe obrazujących, w jaki sposób struktura białek decyduje o ich funkcji biologicznej.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Białka hemowe biorą udział w transporcie i magazynowaniu tlenu, transporcie elektronów oraz fotosyntezie. Badania mioglobiny i hemoglobiny ujawniły istnienie cech struktury wspólnych dla wielu białek, jak równieŜ istnienie zaleŜności między strukturą a funkcją. Ponadto umoŜliwiły one poznanie molekularnych podstaw chorób genetycznych, takich jak niedokrwistośc sierpowata (wynik zmienionych właściwości powierzchniowych podjednostki p hemoglobiny) i taJasemie (przewlekłe dziedziczne choroby hemolityczne, charakteryzujące się upośledzeniem syntezy hemoglobiny). Badania wykazały, Ŝe cyjanek i tlenek węgla stanowią śmiertelne zagroŜenie, poniewaŜ uniemoŜliwiają fizjologiczną funkcję odpowiednio oksydazjŁ cytocJLrpmowei-J^hemoglobiny, a stabilizacja struktury czwartorzędowefnieutJenowanej hemoglobiny przez 2,3-bisfosfoglicerynian (BPG) stanowi podstawę mechanizmów choroby górskiej i adaptacji do duŜych wysokości.

ZDOLNOŚĆ MIOGLOBINY I HEMOGLOBINY DO MAGAZYNOWANIA I TRANSPORTU TLENU WIĄśE SIĘ Z OBECNOŚCIĄ PROSTETYCZNEJ GRUPY HEMOWEJ I JONU śELAZAWEGO Grupą proste ty czną mioglobiny i hemoglobiny jest hem, cykliczny tetrapirol nadający tym białkom zabarwienie czerwone. W tetrapirolu 4 pierścienie pirolowe są połączone mostkami tt-metinowytni, tworząc płaski układ cykliczny (ryc. 7-1). Podstawniki w pozycjach P pierścieni

n

Ryc. 7-1. Pirol. Węgle a fączą się za pomocą mostków metinowych tworrac cykliczny tetrapirol. Przy węglach p występują podstawniki charakterystyczne dta swoistych tetrapiroli, np. hemu.

pirolowych określają rodzaj pochodnej tetrapirolu. W hemie w pozycjach p znajdują się grupy metylowe (M), winylowe (V) i pfbpionianpwe (P) ułoŜone w następującej kolejności: M, V, M, V, M, P, P, M (ryc. 7-2). W centrum tego układu znajduje się atom Ŝelaza w formie jonu Ŝelazawego (Fe2+), Innymi białkami, w których grupą prostetyczną jest tetrapirol zasocjowany z jonem metalu są cytochromy (Fe2+ i Fei+), katalaza, 2,3-dioksygenaza tryptofanowa oraz chlorofil (Mg2+). Funkcja biologiczna cyto-

BIAŁKA: MJOGLOBtNA f HEMOGLOBINA / 71

Ryc. 7-2. Hem. Pierścienie pirolowe, węgle mostków metinowych i atom Ŝelaza Fe'4 + leŜą praktycznie w jednej płaszczyźnie. Piąte i szóste wiązanie

nu, wewnątrz cząsteczki mioglobiny znajdują się wyłącznie aminokwasy niepolarne (np. Leu, Val, Phe i Met). Mioglobina, pierwsze białko, którego strukturę rozszyfrowano rentgenograficznie, jest bogata w ot-heliks Mioglobina jest silnie upakowaną, w przybliŜeniu kulistą cząsteczką o wymiarach 4,5x3,5 x2,5 nm(ryc. 7-3). Niemniej jednak jej

koordynacyjne Fe 2+ są usytuowane prostopadle, znajdując się nad i pod płaszczyzną hemu. Na uwagę zasługuje rodzaj podstawników przy węglach P pierścieni piroiowych, centralnie połoŜony atom zela2a oraz polarne łańcuchy boczne, które są zwrócone na zewnątrz cząsteczki mioglobiny.

chromów wynika z utlenienia i redukcji atomu Ŝelaza. W przeciwieństwie, w przypadku mioglobiny i hemoglobiny utlenienie Fe2+ wiąŜe się z utrat -A przez te białka ich aktywności biologicznej.

Utlenowana mioglobina mięśni stanowi rezerwę tlenu Fnnk^pt iTiinplrthiTiy jftst ma^Tynnwfinie t1f»-

nu w mięśniach. W warunkach niedoboru tlenu (np. w przypadku intensywnych ćwiczeń fizycznych) tlen utlenowanej miogiobiny jest wykorzystywany w mitochondriach mięśni do syntezy ATP na drodze fosfcrylacji oksydacyjnej. Poza dwoma wyjątkami reszty polarne znajdują się na zewnątrz, a niepolarne wewnątrz cząsteczki mioglobiny Mioglobina jest to pojedynczy łańcuch polipęptydowy o masie cząsteczkowej 17 000 zbudowany zejj_5J)reszt aminokwasowych rozmieszczonych w "cKaraktery styczny dla białek globularnych sposób. Zewnętrzna cześć cząsteczki białka jest polarna, a wnętrze — niepolarne. Reszty aminokwasowe, zawierające zarówno grupę polarną, jak i niepolarną (np. Thr, Trp i Tyr), są skierowane swoją niepolarną częścią do wnętrza częsteczki. Poza 2 resztami histydynowymi, biorącymi udział w wiązaniu tle-

Ryc. 7-3. Model mioglobiny opracowany na podstawie analizy rentgenograficznej. W modelu zaznaczono wyłącznie węgle s, (Reprodukcja za zgodą z: Dickerson R. E.r w: The Proteins, wyd. 2, t. 2, Neurath H, [red], Academic Press, 1964).

struktura jest nieregularna i wykazuje brak symetrii. Okojo 75% ^"^nyfia wy^t^ry^\yfgarnie R prąwnslfi-^tiiyrh a-heiiksów o długości 7—20 aminokwasów. Licząc od N-końca odcinki helikalne oznacza się kolejnymi literami od A do H, natomiast fragmenty między helikalne literami 2 odcinków helikalnych, które one łączą. Poszczególne aminokwasy określa się za pomocą litery oznaczającej hełiks, w którym dana reszta występuje, oraz liczby wskazującej jej pozycję od końca N w tym heliksie. Na przykład „His F8" odpowiada 8, reszcie w heliksie F zidentyfikowanej jako histydyna. Odległe w rozumieniu struktury pierwszorzędowej reszty aminokwasowe (np. w róŜnych heliksach) ze względu na ułoŜenie przestrzenne łańcucha polipeptydowego mogą znajdować się blisko

72 / ROZDZIAŁ 7

siebie, jak na przykład histydyna F8 (proksymalna) i histydyna E7 (dystalna) {ryc. 7-3). Drugorzędowa i trzeciorzędowa struktura mioglobiny w roztworze ściśle odpowiada strukturze mioglobiny krystalicznej. Wykazują one identyczne widma absorpcji, obie wiąŜą tlen. a zawartość cc-heliksów w strukturze mioglobiny w roztworze (oznaczona za pomocą dyspersji skręcalności optycznej i dichroizmu kołowego) jest porównywalna z zawartością ujawniony przez analizę rentgenograficzną.

His praksymalna (F8)

Pierwszorzędowa struktura a po mioglobiny zapewnia prawidłowe upakowanie białka w obecności hetnu Przekształceniu mioglobiny w pozbawioną hemu apomioglobine, wskutek obniŜenia pH do 3,5, towarzyszy zmniejszenie zawartości struktury a-helikalnej, a w obecności mocznika całkowity jej zanik. Usunięcie mocznika poprzez dializę i dodanie hemu przywraca całkowicie strukturę helikalną, a w obecności Fe2+ aktywność biologiczną (wiązanie tlenu). Wskazuje to, Ŝe informacja zawarta w strukturze pierwszorzędowej apomioglobiny jest odpowiedzialna za swoiste upakowanie białka w obecności hemu. Stwierdzenie, Ŝe struktura pierwszorzędowa białka determinuje jego strukturę drugo- i trzeciorzędową okazało się być uniwersalne. Histydyny F8 i E7 odgrywają unikatową rolę w wiązaniu tlenu przez mioglobinę W mioglobinie grupa hemowa znajduje się w zagłębieniu między heliksem E i F (ryc. 7-3). Polarne, propionianowe łańcuchy boczne hemu są skierowane na zewnątrz cząsteczki mioglobiny, a jego pozostała część znajduje się we wnętrzu białka, gdzie, z wyjątkiem His_F_8 j.His Ę7, otaczają go reszty niępolarne. Atom Ŝelaza piąj^mwiąza niemkoordvnacvjnvm wiąŜesie z pierścieniem imidazoTowym His F8 określanej mianem histydyny proksymalnej (ryc. 7-4). Po drugiej stronie płaszczyzny hemu w stosunku do His F8 znajduje się His E7, określaną mianem histydyny dystalnej, która jednak nie zajmuje szóstej pozycji koordynacyjnej Ŝelaza (ryc. 7-4). Atom Ŝelaza umiejscowiony nieco poza płaszczyzną hemu przesuwa się w jej kierunku po związaniu tlenu W mioglobinie pozbawionej tlenu atom Ŝelaza jest wysunięty o ok. 0,03 nm (0,3 A) poza płaszczyznę hemu w kierunku His F8. W przy-

His dystalna (B7)

Ryc. 7-4. Wiązanie tlenu z Ŝelazem hemowym podczas reakcji utlenowania. W reakcji tej istotną rolę odgrywają pierścienie imidazolowe 2 reszt histydynowych globiny, łączące się z Ŝelazem he mowym. (Reprodukcja za zgodą z: Harper H. A. i wsp., Physiologische Chemie, Springer-Verlarg, 1975). ________________________________

padku utlenowanej mioglobiny, w którejjjm, zajmuje szósta, pozycje koordynacyjną, Ŝelazo jeśT~ wy sunięte poza płaszczyznę hemu tylko ook. 0,01 nm(0,l A). Utlenowaniu mioglobiny towarzyszy więc ruch atomu Ŝelaza, a w konsekwencji His F8 i reszt kowalencyjnie połączonych z His F8, w stronę płaszczyzny grupy prostetycznej. Skutkiem tego zjawiska jest zmiana konformacji części białka. Apomioglobina zmniejsza powinowactwo Ŝelaza hemowego do tlenku węgla W utlenowanej mioglobinie wiązanie między atomem tlenu i Fei+ jest prostopadłe~db płaszczyzny nemu. Drugi atom tlenUj w stosunku do płaszczyzny hemu, jest przyłączony natomiast pod kątem 121 stopni z dala od histydyny dystalnej (ryc. 7-5). Około 25 000 razy silniej niŜ tlen do wyizolowanego hemu wiąŜe się tlenek węgla (CO). ChociaŜ CO znajduje się w atmosferze w ii oś-

BIAŁKA: MLOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 73 O III Oc

I

I

Ryc. 7-5. Preferowane kąty wiązania tlenu i tlenku węgla do atomu Ŝelaza w hemie.

ciach śladowych, a podczas prawidłowego katabótizmu hemu powstają jedynie niewielkie jego ilości, nasuwa się pytanie, jak to się dzieje, Ŝe O2, a nie CO zajmuje szóste miejsce koordynacyjne w Ŝelazie hemu mioglobiny. Przyczyną jest przestrzenna zawada, jaką stanowi otoczenie "Fiemu w mioglobinie. Preferowane ułoŜenie CO przyłączonego do Ŝelaza hemowego jest dla wszystkich 3 atomów (Fe, C. O) prostopadłe w stosunku do płaszczyzny hemu (ryc. 7-5). Podczas gdy taka orientacja jest moŜliwa w^przypadku wyizolowanego hemu, w mio-

KRZYWE DYSOCJACJI TLENOWEJ MIOGLOBINY I HEMOGLOBINY OBRAZUJĄ ICH ODMIENNE FUNKCJE FIZJOLOGICZNE Mioglobina jest białkiem magazynującym, a nie"transportującym"tlen.llość_przyłączonego do mioglobiny tlenu (wyraŜona w „procentach nasycenia") zakŜv od jego stęŜenia (wyraŜonego jako pO2, czyli stęŜenie cząstkowe tlenu) w nąjbliŜszyjn_gtoczeniu Ŝelaza hemowe^o. ZaleŜność międzypbi i ilością związanego tlenu obrazują graficznie krzywe dysocjacji tlenowej. Dla mioglobiny krzywa dysocjacji tlenowej w. warunkach izotermicznych ma kształt hiperboli

(ryc. 7-7). W naczyniach włosowatych płuc, Ryc. 7-7. Krzywa dysocjacji tlenowej mioglobi

globinie histydy na dystalna stanowi przestrzenną

zawadę dla wiązania CO pod tym kątem (ryc. 7-6). Powoduje to, Ŝe CO wiąŜe się w mniej korzystriejTcbnfiguracji, co zmniejsza siłę wiązania hem-CO o ponad 2 rzędy wielkości, do wartości ok. 200 razy przewyŜszającej wiązanie hem-O2. Pomimo tego w warunkach fizjologicznych niewieika część mioglobiny (ok. 1%) występuje w formie karboksymioglobiny.

Ryc. 7-6. Kąty wiązania tlenu i tlenku węgla do atomu Ŝelaza hemu w mioglobinie, Histydyna dystalna E7 stanowi przestrzenną zawadę dla wiązania CO pod preferowanym w stosunku do płaszczyzny hemu kalem (180°),

ny. Na uwagę zasługuje zaleŜność stopnia utlenowanra i ciśnienia cząstkowego tlenu w płucach (100 mm Hg), tkankach (20 mm Hg) i pracujących mięśniach (5 mm Hg). _____________

w których pOj wynosi 100 mm Hg, mioglobina mogłaby skutecznie wiązać tlen. PoniewaŜ jednak wartość pO2 w Ŝyłach i mięśniach wynosi odpowiednio 40 i 20 mrn_Hgj a mioglobina nie oddaje znacznej części związanego tlenu nawet przy ciśnieniu 20 mm Hg nie moŜe ona słuŜyć jako przenośnik tlenu z płuc do tkanek. Dopiero w warunkach niedoboru tlenu, towarzyszącego duŜej aktywności fizycznej, kiedy pO, w mięśniach spada do 5 mm Hg, mioglobina uwalnia związany tlen, który w mitochondriach mięśni jest wykorzystywany do biosyntezy ATP w wyniku fosforylacji oksydacyjnej.

74 / ROZDZIAŁ 7

HEMOGLOBINA TRANSPORTUJE TLEN, DWUTLENEK WĘGLA I PROTONY MIĘDZY PŁUCAMI I TKANKAMI Hemoglobina, zawarta w erytrocytach kręgowców, spełnia dwie główne funkcje biologiczne; 1) przenosi O2 z płuc do tkanek i 2) przenosi CO2 i protony z tkanek do phic w celu wydalenia. Mimo Ŝe biochemia porównawcza hemoglobin kręgowców jest bardzo interesująca, przedmiotem dalszych rozwaŜań są hemoglobiny ludzkie. KONSEKWENCJĄ CZWARTORZĘDOWEJ STRUKTURY HEMOGLOBINY SĄ JEJ WŁAŚCIWOŚCI ALLOSTERYCZNE Właściwości poszczególnych hemoglobin są prawidłowością wynikającą z ich struktury czwartorzędowej (jak równieŜ drugo- i trzeciorzędowej). Czwartorzędowa struktura hemoglobiny jest odpowiedzialna za nowe, dodatkowe w stosunku do mioglobiny, właściwości, które warunkują jej unikatową funkcję biologiczną i pozwalają na jej precyzyjną regulację. Właściwości allosteryczne (gr. allos — inna, steros — przestrzeń) hemoglobiny stanowią ponadto model do zrozumienia innych białek allosterycznych. W przeciwieństwie do mioglobiny, hemogtobina jest tetramerem Hemoglobina w odróŜnieniu od jednołańcuchowej mioglobiny nie mającej struktury czwartorzędowej, jest tetramerem składającym się z 2 par identycznych łańcuchów polipeptydowych, czyli podjednostek (określanych jako a, p, 7,8, S itd.). Podobne pod względem długości polipeptydy a (14l) reszt aminokwas owych) i P (146 jeszt aminokwasowych) hemoglobiny A (HftA) są kodowane przez róŜne geny i mają odmienną strukturę pierwszorzedową. W przeciwieństwie, łańcuchy p, y i 5 hemoglobin ludzkich charakteryzuje duŜa konserwatywność ich sekwencji. Najczęściej występujące hemoglobiny mają następujący skład tetrameru: HbA j (podstawowa hemoglobina prawidłowa u ludzi dorosłych) = ąj^, ^^(hemoglobina płodowa) = a2Y2, HBS ^hemoglobina sierpowatych krwinek czerwonych) = <x2S2, HbA2 (hemoglobina prawidłowa u ludzi doros-

łych stanowiąca ok. 2,5%* Hb całkowitej) = Mioglobina i podjednostki P hemoglobiny mają praktycznie identyczną strukturę drugorzędową 1 trzeciorzędową Pomimo róŜnic w rodzaju i liczbie aminokwasów, mioglobina i łańcuchy polipeptydowe P HbA wykazują praktycznie identyczną strukturę drugorzędową i trzeciorzędową. To ścisłe podobieństwo, dotyczące równieŜ umiejscowienia hem u i odcinków helikalnych, jest przynajmniej w części wynikiem substytucji aminokwasów o podobnych właściwościach i równoznacznych pozycjach w strukturze pierwszorzędowej mioglobiny i podjednostki P HbA. Nawet występowanie 7 a nie 8 odcinków helikalnych w łańcuchu P nie zmienia zasadniczego podobieństwa strukturalnego tych polipeptydów. Podobnie jak w przypadku mioglobiny, zarówno podjednostki ot, jak i p HbA charakteryzuje obecność hydrofobowych reszt aminokwasowych wewnątrz cząsteczki (z wyjątkiem 2 reszt His w kaŜdej podjednostce), a hydrofilowych na zewnątrz cząsteczki. Uttenowaniu hemoglobiny towarzyszy wsunięcie Ŝelaza w płaszczyznę hemu oraz zmiana konformacji sprzęŜonej apoproteiny wywołana przemieszczeniem histydyny proksymalnej Tetramcryczna hemoglobina wiąŜe 4 cząsteczkftlenu (hem kaŜdej podjednostki wiąŜe jedną cząsteczkę tlenu), a jej krzywa dysocjacji tlenowej ma kształt sigmoidalny (ryc. 7-8). Przyłączenie O2 przez jeden z hemów ułatwia wiązanie kolejnych O2 przez pozostałe grupy hemowe. To kooperatywne wiązanie tlenu z hemoglobiną jest właściwością pozwalającą na wiązanie maksymalnej ilości O2 w płucach i uwalnianie maksymalnej ilości O3 w tkankach (ryc. 7-8). Miarą powinowactwa hemoglobiny do tlenu jest wielkość Pso, odpowiadająca ciśnieniu cząstkowemu tlenu, przy którym występuje 50% nasycenia Oa Wartość P;o jest róŜna dla róŜnych organizmów, przy czym jest ona zawsze większa od wartości pO2 w tkankach badanych organiz* Przyp. tłum.

BIAŁKA; MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 75 20

140 40 60 80 100 120 Ciśnienie cząstkowe tlenu (mm Hg) Utlenowana krew __ opuszczająca płuca

Ryc.

7-8.

Odtlenowana krew powracająca z tkanek

Hemoglobina

1,1 Krzywedysociacjitlenowej hemoglobiny i mioglobiny. Ciśnienie cząstkowe tlenu w krwi tętniczej wynosi ok. 100 mm Hg; wkrwiŜylnej—40 mm Hg; w naczyniach włosowatych — 20 mm Hg; minimum niezbędne dla funkcji cytochromów — 5 mm Hg. Połączenie łańcuchów polipeptydowych w strukturę tetrameryczną (hemoglobina) pozwala na zwiększenie, w porównaniu z pojedynczymi łańcuchami, wydajności dostarczania tlenu. (Zmodyfikowana i reprodukowane za zgodą z: StanburyJ, B,,Wyngaarden J. B., Fredrickson D.S. [red.], The Metabolic Bas/s of Inherited Disease, wyd.4, McGraw-Hill, 1978).

mów, czego dobrym przykładem jest ludzka hemoglobina płodowa (HbF). Wartość P50 dla HbA = 26 mm Hg, podczas gdy dla HbF = 2(1 mm Hg. Ta róŜnica w powinowactwie Hbl i HbA do tlenu umoŜliwia HbF pobieranie tlenu od HbA w obrębie łoŜyska. Po porodzie HbF przestaje właściwie spełniać swoją funkcję poniewaŜ jej duŜe powinowactwo do O2 utrudnia jego oddysocjowywanie w tkankach. Najwcześniej w rozwoju osobniczym człowieka są syntetyzowane łańcuchy £ i e. Pod koniec pierwszego trymestru ciąŜy łańcuch £ zastępuje podjednostka et, a łańcuch e — podjednostka7. Hemoglobina F, pojawiająca się więc w tym okresie Ŝycia płodowego, jest zbudowana według wzoru d2 y . Podjednostka % której synteza rozpoczyna się w trzecim trymestrze ciąŜy, całkowicie zastępuje łańcuch y dopiero kilka tygodni po porodzie. Utlenowamu hemoglobiny towarzyszą zmiany konformacji białka PrzyJaszernu O2 towarzyszy rozerwanie wiązań poprzecznych pomiędzy końcami karboksylowymi wszystkich 4 podjednostek hemoglobiny (ryc. 7-9), co powoduje zmiany w dru-

Ryc. 7-9. Wiązania poprzeczne międ2y podjednostkarni oraz w obrębie podjednostek nieutlenowanej hemoglobiny. Podczas utlenowania te niekowalencyjne, elektrostatyczne wiązania zostają rozerwane, {Zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Stryer L: Biochemistry. wyd. 2, Freeman, 1981). ________________________________

go-, trzecio- i czwartorzędowej strukturze białka. Jedna para podjednostek a/P obraca się w stosunku do drugiej pary a/&\ w wyniku czego następuje zbliŜenie podjednostek tetramem i zwiększenie powinowactwa hemów do tlenu (ryc, 7-10 i 7-11).

cc, S 1 i/

\\

V '

.i \

1 /

/

1

/ 6

s ■~~____________ -■

15° Postać R

Postać T

Rvc. 7-10. W czasie przejścia postaci T w postać R hemoglobiny jedna para podjednostek (a2/f>2) obraca się o 15° w stosunku do drugiej pary (a 1/fl]). PoniewaŜ oś obrotu jest niewspółśrodkowa, para at2/P2 przesuwa się równieŜ nieco w kierunku osi. Na diagramie para a,/^ utrzymująca się w stałej pozycji jest niezaciemniona, a para a2/P: dokonująca obrotu i przesunięcia jest zaciemniona.

Czwartorzędową strukturę częściowo utlenowanej hemoglobiny określa się jak o stanT(ang. taut — napręŜony), a całkowicie utlenowanej hemoglobiny (HbOj) jako stan R (ang. relaxed

76 / ROZDZIAŁ 7

— rozluźniony) (ryc. 7-12). Symbole R i T są równieŜ uŜywane w celu określenia czwartorzędowej struktury enzymów allosterycznych, gdzie forma T wykazuje mniejsze powinowactwo do stibstratu.

Pod jednostka /)t

Utlenowanie hemoglobiny prowadzi do zmian konformacyjnych w bezpośrednim otoczeniu grupy hemowej Podczas utlenowania hemoglobiny atomy Ŝelaza (Mace ok. 0,06 nm poza płaszczyzną hemów w nieutlenowanej hemoglobinie) wsuwają się w płaszczyznę hemów, pociągając za sobą histydynę proksymalną (F8) i połączone z nią reszty aminokwasowe (ryc. 7-13).

Odtlenowanie (posiać T)

Podjednostka a. AspG1(94! TyrC7|«)

Ryc. 7-11. Zmiany oddziaływań w obrębie ot,/p, podczas utlenowania. Przesunięcie zazębiających się obszarów powoduje zmianę miejsc oddziały wań i „przełączanie" jednych wiązań wodorowych na inne. Pozostałe wiązania mają charakter niepolarny. (Reprodukcja za zgodą z: Perutz M. F.: Molecular pathology of human hemoglobin: stereochemical interpretation of abnormal oxygen affinities, Naturę 1971; 232:408). ___________________

Podjednostka f)2

Utlenowani e (postać R)

Postać T

Postać R

Ryc. 7-12. Przejście postaci T w postać R zwiększa prawdopodobieństwo utlenowania kaŜdego z 4 hemów. Przekształcenie to nie następuje z chwilą przyłączenia określonej liczby cząsteczek tlenu, lecz dokonuje się wraz z utlenowaniem kolejnych hemów. Stopniowe przyłączanie tlenu powoduje pękanie (linie cienkie) i osłabianie (linie węŜykowate) wiązań poprzecznych łączących podjednostki w postaci T. Przejście między tymi dwoma postaciami pozostaje pod wpływem róŜnych czynników, takich jak: protony, dwutlenek węgla, chlorki, BPG. Im większe stęŜenie tych czynników, tym więcej tlenu musi zostać związane, aby zapoczątkować przekształcenie. Schemat nie zawiera całkowicie utłenowanej cząsteczki w postaci T oraz całkowicie nieutlenowanej cząsteczki w postaci R, poniewaŜ są one zbyt nietrw'ałe, aby istnieć w znaczącej liczbie. (Zmodyfikowana i przerysowana za zgodą z: Perutz M. F,: Hemoglobin structure and respiratory transport, Sci. Am. [Dec], 1978; 239:92), ___________

BIAŁKA: MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 77 Hlslydyna FB HeliKs F

Odpychania ' przestrzenne I Płaszczyzna nam u

przed szkodliwym wpływem zwiększenia kwasowości krwi, pełni m.in. hemoglobina._QJL-, łączeniu 4 cząsteczek tlenu z hemoglobiny towarzyszy wiązanie 2 protonów. W płucach natomiast zachodzi zjawisko odwrotne, tj. przyłączenie tlenu do hemoglobiny powoduje uwolnienie protonów. Uwolnione-prolony łączą się z wodorowęglanem, tworząc kwas węglowy, który pod wpływem dehydratazy węglanowej przekształca się w CO2, usuwany w procesie oddychania. Stad wiązanie tlenu zwiększa wydychanie CO2. To odwracalne zjawisko nosf nazwę efektu Bohra (ryc. 7-l5)7EfekTBohTa jest właściwością

Wydychania Tkanki 2H C O , "

Cykl

Ryc. 7-13. Podczas utlenowania atom Ŝelaza wsuwa się w płaszczyznę hemu. Razem z atomem źeiaza przemieszcza się histydyna F8 i związane z nią reszty aminokwasowe. (Zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 2. Freeman, 1981).

Po uwolnieniu tlenu w tkankach hemoglobina transportuje dwutlenek węgla i protony do płuc Oprócz transportu tlenu z płuc do tkanek, hemoglobina bierze udział w przenoszeniu COj z tkanek do płuc, skąd jest on usuwany podczas oddychania. Bezpośrednio po odłączeniu tlenu, cząsteczka hemoglobinjL.^dąiŁ_CQs_ w ilości stanowiącej~oJć7l5% CO2 transportowanego . Ponadto z chwilą za"SBsorbtyw"ania

pj COj przez Ićrew dehydrataza węglanowa erytrocytów katalizuje utworzenie kwasu węgiowego, który dysocjuje do wodorowęglanu i protonu na skutek przesunięcia równowagi reakcji w kierunku dysocjacji (ryc. 7-14). Funkcję układu buforowego, zabezpieczającego organizm

40

JD.2H

(Buforujące działania — ------------hemoglobiny) Płuca

kwasów

trlkarboksylowych (Krebsa) Ryc. 7-15. Efekt Bohra. Powstający w tkankach dwutlenek węgla laczy się z wodą, tworząc kwas węglowy, który dysocjuje do protonu i jonu wodorowęglanowego. Nieutlenowana hemoglobina wiąŜe protony i transportuje je do płuc. W płucach, w wyniku przyłączania tlenu, następuje uwalnianie protonów, które łącząc się z jonem wodorowęglanowym tworzą kwas węglowy, przekształcany przez dehydrataze węglanową do dwutlenku węgla usuwanego w procesie oddychania.

charakterystyczną dla tetramerycznej hemoglobiny, 7al1?iB[l ffl jnterakcji hem-hem, czyli HCO.-+ H+ kooperatywności wiązania tlenu. Efektu Bohra nie obserwuje się w przypadku mioglobiny.

co,+ Ryc. 7-14. Tworzenie kwasu węglowego pod wpływem dehydratazy węglanowej i jego dysocjacja do jonu wodorowęglanowego i protonu.

78 / ROZDZIAŁ 7

Rozerwanie wiązań poprzecznych podczas przyłączania tlenu do hemoglobiny w postaci T dostarcza protonów odpowiedzialnych za efekt Bohra Protonv_odpowiedzialne za elekt Bohra powstają w wyniku rozerwania \\ i a&łjl „poprzecznych podczas przyłączania tlenu do postaci T, Sa one głównie uwalniane z atomów N pierścieni imidazolowych C-końcowych reszt histydyny łańcuchów P HC3 (146). Uwolnione pmtnny pye kształcą ją wodorowęglan w kwaś" węglo wy, usuwany pkn m, w naczyniacF )

węglowy, usuway p włosowatych pęcherzyków nłucnych fryc. 7-15). Natomiast podczas odłączania tlenu tworzenie wiązań poprzeczaych, pjaslaci T hemoglobiny wymaga przyłączenia protonów do reszt HC3 łańcuchów p. oiwnrrer protonów w tkankach ułatwia więc tworzenie wiązań poprzecznych na skjJteYprotonacji końcowych/reszt Hisw podjednostkach p. Odtworzenie wiązań poprzecznych sprzyja wiec uwalnianiu łferm z, ufleno'wanej (postajLKLJiamo.globiny. Uogólniając, /większenic stęŜeniajworpntm; powoduje odjaczenSjttnu.JJOticS^gdy zwiększenie stęŜenia tlenu powoduje odłączenie protonów. ZaleŜność tęorjrazuje przesunięcie krzywej dysocjacji tlenu na prawo w wyniku zwiększenia zawartości jonów wodorowych (protonów).

z 1,3-bisfosfoglicerynianu, będącego metabolitem pośrednim glikolizy. BPG wiąŜe się z hemoglobiną w stosunku 1 cząsteczka BPG na tetrameryczną cząsteczkę hemoglobiny, a miejscem wiązania jest przestrzeń między 4 podjednostkami, znajdująca się w centrum cząsteczki hemoglobiny. Rozmiar tej wnęki jest odpowiedni dla BPG tylko w przypadku postaci T, tj. wtedy, kiedy przestrzeń między heliksami H łańcuchów p jest wystarczająco duŜa. BPG przyłącza się za pomocą wiązań poprzecznych, twofzą-ćycn się pomiędzy atomami tlenu BPG i dodatnio naładowanymi resztami Val NA1 (grupy aminowe N-koricowe), Lys EF6 oraz His H21 łańcuchów p (ryc. 7-17). BPG stabilizuje

Ryc. 7-17. Sposób wiązania 2,3-bisfosfogltcerynianu z nieutlenowaną hemoglobiną człowieka. BPG oddziałuje z 3 dodatnio naładowanymi grupami kaŜdego z łańcuchów fi. (Reprodukcja za zgodą z: Arnone A,: X-ray diffraction siudy of binding 2,3-diphosphoglycerate to human deoxyhemoglobin. Naturę 1972; 237:146).

W centralnej wnęce cząsteczki nieutlenowanej hemoglobiny 2,3bisfosfoglicery niań (BPG) tworzy wiązanie poprzeczne, stabilizujące strukturę T W warunkach niedoboru tlenu w tkankach zwiększa się zawartość 2,3-bisfosfogIicerynianu (BPG) (ryc. 7-16). Związek ten tworzy się

oop \\

o Ryc. 7-16. (BPG).

Struktura 2,3-bisfosfoglicerynianu

więc postać T lub nieutlenowaną postać hemoglobiny przez tworzenie wiązań poprzecznych w obrębie łańcuchów p oraz dostarcza dodatkowe wiązania poprzeczne, które muszą ulec zerwaniu przy przechodzeniu postaci T w postać R. Wiązanie BPG z hemoglobiną płodową jest znacznie słabsze niŜ z hemoglobiną Judzi dorosłych, poniewaŜ zamiast His resztą H2T w łańcuchu y hemoglobiny płodowej jest seryna, która nie tworzy wiązań poprzecznych z BPG.

BIAŁKA: MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 79

BPG ma więc mniejszy wpływ na stabilizację formy T w przypadku hemoglobiny płodowej, co powoduje jej większe w porównaniu z hemoglobiną ludzi dorosłych, powinowactwo do tlenu. Przejście postaci T w postać R hemoglobiny i odwrotnie jest wyzwalane przez ruch Ŝelaza do wewnątrz i na zewnątrz płaszczyzny układu porfirynowego. Przejście to jest uruchamiane przez czynniki oddziałujące przestrzennie i elektrostatycznie przy nakładzie energii ok. 12 560 J/mol (3000 cal/mol). Niewielka zmiana pozycji Fe2+ w stosunku do płaszczyzny układu porfirynowego indukuje więc znaczne zmiany w konformacji hemoglobiny, wpływając decydująco na jej funkcje biologiczną w odpowiedzi na sygnały środowiska. ZIDENTYFIKOWANO KILKASET MUTANTÓW HEMOGLOBINY WWIĘKSZOŚCI NIE OBJAWIAJĄCYCH ZABURZEŃ FUNKCJI Mutacje genów kodujących łańcuchy ot lub P mogą wpływać na biologiczną funkcje hemoglobin. PoniŜej opisano kilka, spośród kilkuset znanych (w większości łagodnych), mutantów hemoglobin Judzkich o zmienionej funkcji biologicznej, Stan, w którym w wyniku mutacji następuje zaburzenie funkcji biologicznej hemoglobiny określa się mianem hemoglobino-

pata. W hemoglobinach typu M proksymalna lub dystalna reszta histydyny w podjednostkach ot lub ji jest zastąpiona resztą tyrozyny Zastąpienie proksymalnej lub dystalnej histydyny resztą tyrozyny przyczynia się do stabilizacji Ŝelaza hemowego w formie Fe3+, na skutek tworzenia przez niego trwałego połączenia z anionem fenolanowym Tyr. Obecność hemu w formie Ŝelazowej nie wiąŜącej 02 powoduje met hemoglobinemię. W przypadku wariantów hemoglobin M dotyczących łańcuchów a obserwuje się przesunięcie równowagi przejścia R-T w kierunku formy T, zmniejszenie powniowaćTwa do tlemi i zniesienie efektu BohraTNatomiast w przypadku wariantów dotyczących łańcuchów P efekt Bohra jest zachowany, poniewaŜ nie ulega zakłóceniu przejście R-T. Mutacje, które sprzyjają tworzeniu się postaci R charakteryzują się zwiększeniem powino-

wactwa do tlenu (np. hemoglobina Chesapeake). W hemoglobinie Sj^ęsztŁ Dostarczanie wskutek tego zbyt małej ilości l do tkanek powoduje hipoksje, która protlenu wadzi do policytemii (zwiększenie liczby erytrocytów). gl j^ęs glutaminowego w pozycji 6 łańcucha {> jest zastąpiona resztą waliny Hemoglobina S powstaje w wyniku zastąpieuiśLCjju A2 (ó)p\ tj, reszty 6 w łańcuchu (3 przez ^al. Reszta A2 (Glu lub Val) znajduje się na powierzchni cząsteczki, odpowiadając za jej kontakty z wodą. Zastąpienie polarnego kwasu glutaminowego niepolarną waliną powoduje powstanie na powierzchni łańcucha P „lepkich miejsc". „Lepkie miejsca" występują zarówno w utlenowanej, jak i nieutlenowanej postaci hemoglobiny S; nie ma ich n^ b T glojbinic: AJJ koTei na powierzchni hemoglobiny nieutlenowanej występują miejsca komplementarne do „lepkich miejsc". Są one niedostępne w hemoglobinie utlenowanej (ryc. 7-18). IMieutlenowana hemoglobina S moŜe tworzyć włókna, które zniekształcają erytrocyty „Lepkie miejsca" nieutlenowanej hemoglobinySmogą łączyć się z miejscami komplementarnymi innej cząsteczki nieutlenowanej hemoglobiny. Oddziaływania te powodują polimeryzację nieutlenowanej hemoglobiny S, w wyniku czego powstają długie, wytrącające się agregaty zniekształcające erytrocyty (erytrocyty przybierają kształt sierpowaty), odpowiedzialne za ich liŜę i inne objawy kliniczne. Utrzymanie hemoglobiny S w postaci utlenowanej lub zmniejszenie do minimum jej stęŜenia w postaci nieutlenowanej zapobiegałoby tworzeniu się polimerów, a tym samym sierpowatości krwinek. Jest bowiem wiadomo, Ŝe polimeryzacji ulega postać T hemoglobiny S. Interesujący, chociaŜ nie do zastosowania terapeutycznego, jest fakt, Ŝe forma Ŝelazowa hemoglobiny S (methemoglobina S) nie tworzy polimerów. Podobnie bowiem jak w przypadku methemoglobiny A, jon Ŝelazowy pozostaje w płaszczyźnie układu porfirynowego, stabilizując strukturę R hemoglobiny. ChociaŜ nieutlenowana hemoglobina A zawiera miejsca komplementarne do „lepkich miejsc" występujących w utlenowanej i nieutlenowanej hemoglobinie S, to jej przyłączenie do hemoglobiny S uniemoŜliwia dalsze wydhiŜanie polimerów na skutek braku na jej

80 / ROZDZIAŁ 7 Utleń owa na A

a. a

Nieutlenowana A

U tlen owa na S

Nieutlenowana S

ll ll

e

Nieutlenowana A Nieutlenowana S

Ryc. 7-18. Schemat przedstawiający „lepkie miejsca" (A) w hemoglobinie S i ich „receptory" wnieutlenowanej hemoglobinie A i S. Komplementarność oddziałujących powierzchni powoduje faczenie się n te utleń owa n ej hemoglobiny S w polimery. WydłuŜanie polimerów przerywa nieuttenowana hemoglobina A nie zawierająca „iepkich miejsc". (Zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981).

powierzchni „iepkich miejsc" sprzyjających dalszemu wiązaniu (ryc. 7-18). Przyłączenie nieutlenowanej hemoglobiny A do hemoglobiny S zarówno w formie R, jak i T stanowi barierę do dalszej polimeryzacji.

6,2 nm

RyC-7-19, Proponowana helikaIna struktura włókna utworzonego w wyniku agregacji nieutlenowanej hemoglobiny S, (Reprodukcja za zgodą z: Maugh T. II: A new understanding of sickle celi emerges. Science 1981; 211:265, Copyright © 1981 by the American Associatiort for the Advancement of Science).

W,_wyniku agregacji nieutlenowanej hemoglobiny S tworzą się włókna o helikalnej strukturze, w których kaŜda cząsteczka hemoglobiny oddziałuje z 4 przylegającymi cząsteczkami (ryc. 7-19). Włókna te deformują erytrocyty tak, Ŝe przybierają ońlTEsŜtałt sieTpowaty (ryc. 720). Krwinki te wykazują zwiększoną podatność do hemolizy w czasie przechodzenia przez zatoki śledzionowe. Talasernie są niedokrwistościamj charakteryzującymi się upośledzeniem syntezy łańcuchów cc lub p hemoglobiny W talasemiach zmniejsza się synteza łańcuchów a (a-talasemie) lub łańcuchów p (fi-talasemie) hemoglobiny. Wywołuje to często groźną w skutkach niedokrwistość. Wyniki badań ostatnich lat wniosły duŜy wkład do naszej wiedzy o molekularnych mechanizmach odpowiedzialnych za talasernie.

BIAŁKA: MI0GL0B1NA I HEMOGLOBINA / 81

Ryc. 7-20. Obraz erytrocytu prawidłowego (A) oraz sierpowatego (B)w skaningowym mikroskopie elektronowym. Obserwowane róŜnice strukturalne są wynikiem zmiany w obrębie łańcuchów (i będącej skutkiem mutacji punktowej w DNA. Zamiana T na A powoduje, Ŝe w łańcuchu {J zamiast kwasu glutaminowego znajduje się walina.

PIŚMIENNICTWO Bunn HF, Forget BG: Hemoglobin: Molecular, Genetic, and Ciinical Aspects, Saunders, 1986. Dickerson RE, Geis I: Hemoglobin. Benjamin/Cummjngs, 1983. Embury SH: The ciinical pathology of sickle-ceil disease. Anmt Rcv Med 1986;37:36[. Embury SH, Scharf SJ, Saiki RK, Gholson MA, Golbus M, Arnheim N, Erlich HA: Rapid prenatal diagnosis of sickle celi anemia by a new method of DNA analysis. New Engl J Med 1987;316:ó56. Fermi G, Perutz MF, Shaanan B, Fourme R: The crystal structure of hunian deoxyhemoglobin at 1.74 angstrom resolution. J Mol Biol I984;175: 159.

6 — Biochemia

Friedman JM: Structure, dynamics, and reactivity in hemoglobin. Science 1985;228:1273. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, MuBis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N: Enzymatic amplification of beta-globin genomic: seąuences and restriction site analysis for diagnosis of sickle-cell anemia. Science, 1985;230:1350. Schacter L, Wartti JA, Gordon EM, Prasad A, Klein BL: Altered araount and activity of superoxide dismutase in sickle celi anemia. FASEB J 198S;2:237. Weatherall DJ, Clegg JB, Higgs DR, Wood WG: The hemoglobinopathies. In The Metabolk Basis of InheritedDisease, 6th Ed. Serwer CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (editors). McGraw-Hill, p. 2281, 1989.

8

Enzymy: właściwości ogólne Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE Katalizatory przyspieszają reakcje chemiczne. Podczas reakcji ulegają one zmianom fizycznym, ale po ich zakończeniu powracają do stanu pierwotnego. ChociaŜ są znane przypadki katalizy przez cząsteczki RNA, prawie wszystkie enzymy są katalizatorami białkowymi. Większość reakcji biochemicznych zachodziłaby bardzo wolno, gdyby nie były one katalizowane przez enzymy. W przeciwieństwie do katalizatorów niebiałkowych (H+, OH , jony metali), kaŜdy enzym katalizuje niewielką liczbę reakcji, często tylko jedną. Enzymy są więc swoistymi katalizatorami danych reakcji. W zasadzie wszystkie reakcje biochemiczne są katalizowane przez enzymy.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Enzymy czynią moŜliwym Ŝycie na Ziemi i stąd łączą wiele dziedzin nauk biomedycznych. Pewne choroby (wrodzone wady metabolizmu) są spowodowane genetycznie uwarunkowanymi nieprawidłowościami w syntezie enzymów. Gdy komórki są uszkodzone (np. przez ograniczenie dopływu krwi lub przez zapalenie), wówczas pewne enzymy przechodzą do osocza. Pomiar aktywności takich enzymów w osoczu staje sie integralną częścią diagnozowania waŜnych zaburzeń (np. zawał serca). Enzymologia diagnostyczna jest dziedziną medycyny obejmującą wykorzystanie enzymów w diagnostyce. Enzymy mogą być równieŜ uŜyte w leczeniu.

SYSTEM MIĘDZYNARODOWEJ UNII BIOCHEMICZNEJ (IUB) KLASYFIKUJE ENZYMY WEDŁUG TYPU I MECHANIZMU REAKCJI Początkowo nazwy enzymów tworzono przez dodanie końcówki -aza do nazwy substratów, na które one działają. Enzymy, które hydrolizują skrobię (gr.: amyłori) nazywano amylazami, rozkładające tłuszcze (gr.: lipos) lipazami, a~nydrolizujące białka -—. proteinazarrjUóźniei enzymom, które katalizują podobne reakcje, dawano nazwy wskazujące na typ katalizowanej reakcji chemicznej. Określano je jako dehydrogenązyjOksydazY^dekąrbok^ylazy, acylazy itd". System nomenklaturowy podany przez Międzynarodową Unię Biochemiczną (IUB), mimo Ŝe jest złoŜony, jest niedwuznaczny. Jego podstawową zasadą jest to, Ŝe nazewnictwo i klasyfikacja enzymów na podstawie typu reakcji chemicznej i mechanizmu reakcji moŜe integrować informację z róŜnych obszarów metabolizmu. Główne zasady systemu IUB są następujące: 1. Reakcje i katalizujące je enzymy tworzą 6 klas, a kaŜda z nich ma 4—13 podklas. 2. Nazwa enzymu składa się z 2 części. Pierwsza, zakończona na -aza, wskazuje na typ katalizowanej reakcji, druga — określa substrat lub substraty. 3. Dodatkowa informacja, jeśli jest potrzebna do wyjaśnienia reakcji, moŜe być podana w na wiasach; np. enzym katalizujący reakcję L-jabłczan + NAD+ = pirogronian -I- COj-l+ NADH + H + oznacza się 1.1,1.37 L-jabłczan: NAD+ oksydoreduktaza (dekarboksylująca).

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 83

4. KaŜdy enzym ma numer kodu (EC), który charakteryzuje typ reakcji, czyli klasę (pierwszy człon), podklasę (drugi człon) i pod-podklasę (trzeci człon). Czwarty człon wskazuje na nazwę określonego enzymu. EC 2.7.1.1 oznacza więc klasę 2 (transferaza), podklasę 7 (przenoszenie fosforanu), pod-podklasę 1 (alkohol jako akceptor fosforanu). Ostatnia cyfra wskazuje heksokinazę, czyli 6-fosfotransferaza ATP: D-heksoza, enzym katalizujący przeniesienie fosforanu z ATP na grupę hydroksylową przy 6 węglu glukozy.

WIELE ENZYMÓW DO AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ WYMAGA KOENZYMU

Wiele enzymów wymaga swoistej, termostabilnej, małocząsteczkowej molekuły organicznej zwanej koenzymem, Holoenzym (pełen układ katalityczny) składa się z apoenzymu (część białkowa) i przyłączonego koenzymu. Koenzym moŜe przyłączać się do apoenzymu kowalencyjnie lub niekowalencyjnie. Termin „grupa prostetyczna" oznacza kowalencyjnie przyłączony koenzym. Reakcje, które wymagają koenzymów, obejmują reakcje oksydacyjno-redukcyjne, reakcje przenoszenia grup i izomeryzacji oraz reakcje prowadzące do tworzenia wiązań kowalencyjnych (IUB, klasy I, 2, 5 i 6). Reakcje lityczne, łącznie z reakcjami hydrolitycznymi katalizowanymi przez enzymy trawienne, nie wymagają koenzymów.

KOENZYM MOśE BYĆ ROZPATRYWANY JAKO DRUGI SUBSTRAT Koenzym moŜe być rozpatrywany jako drugi substrat, tj. kosubstrat, z 2 powodów. Po pierwsze, chemiczne zmiany w koenzymie dokładnie równowaŜą zmiany zachodzące w substracie. Na przykład w reakcjach oksydacyjno-redukcyjnych, gdy 1 cząsteczka substratu utlenia się, wówczas 1 cząsteczka koenzymu ulega redukcji (ryc. 8-1). Podobnie w reakcjach transaminacji fosforan pirydoksalu działa jako drugi substrat w 2 kolejnych reakcjach oraz jako przenośnik w przekazywaniu grupy aminowej na róŜne aketokwasy. Drugim powodem podkreślenia roli koenzymu jest to, Ŝe reakcja zjego udziałem moŜe mieć większe podstawowe znaczenie fizjologiczne. Na przykład zdolność mięśnia pra-

r H,C O Plrogronlan

o L-Mleczan

NAD*

NADH* + H+

Ryc. 8-1. Działanie NAD+ jako kosubstratu w reakcji o ksy do red u kej i.

cującego beztlenowo do przemiany pirogronianu w mleczan tkwi nie w samym pirogronianie lub mleczanie. Reakcja słuŜy głównie do utlenienia NADH do NAD+. Bez NAD+ glikoliza nie moŜe dalej przebiegać i ustaje beztlenowa synteza ATP (a tym samym praca). W warunkach beztlenowych redukcja pirogronianu do mleczanu słuŜy do ponownego utlenienia NADH i umoŜliwia biosyntezę ATP. Inne reakcje mogą spełniać równie dobrze taką samą funkcję. Na przykład w bakteriach lub droŜdŜach, rosnących w warunkach beztlenowych, metabolity pochodzące z pirogronianu słuŜą jako utleniacze dla NADH, przy czym same się redukują (tab. 8-1). Tabela 8-1. Mechanizmy beztlenowej regeneracji NAD+

Utleniacz

Produkt zredukowany

Piróg ronian

Mleczan

Form a Ŝycia Mięśnie, bakterie fermentacji mlekowej

Aldehyd octowy Alkohol etylowy DroŜdŜe Fosfodihydroksyaceton

a-Glicerofosfo- Escherichia coli ran

Fruktoza

Mannitol

Bakterie fermentacji pseudomlekowej

Koenzymy działają jako czynniki przenoszące określone grupy funkcyjne

Biochemiczne reakcje przenoszenia grup typu: D-G+A=A-G+D

w których funkcyjna grupa G jest przenoszona z cząsteczki donora D —G na cząsteczkę akceptora A, zazwyczaj wykorzystują koenzym albo

84 / ROZDZIAŁ 8

jako ostateczny akceptor (np. w reakcjach odwodorowania), albo jako pośredni przenośnik grup (np. reakcje transaminacji). Schemat ilustruje drugą koncepcje: A—G D—G CoE Ct

Mimo Ŝe sugeruje to tworzenie 1 kompleksu CoE—G w ciągu całej reakcji, w grę moŜe wchodzić w danej reakcji tworzenie kilku pośrednich CoE—G kompleksów (np. transaminacja). Gdy przenoszona grupą jest wodór, wówczas przyjęto przedstawiać tylko lewą stronę — „polowę reakcji":

nami d. fiamina. ryboflawina i kwas pantotenowy

są waŜnymi składnikami koenzymów reakcji biologicznego utleniania i redukcji, a kwas foliowy i koenzymy kobamidowe biorą udział w przemianach reszt jednowęgl owych. Wiele koenzymów zawiera adeninę, rybozę, fosforan i są one pochodnymi monofosforanu adenozyny (AMP). Przykłady obejmują NAD + i NADP+ (ryc. 8-2).

D—H XCoE CoE—H D

To, Ŝe reakcja ta przedstawia tylko szczególny przypadek ogólnego transferu grupy H ilustrują reakcje zachodzące w nienaruszonych komórkach (tab. 8-1). MoŜna je zapisać następująco: CoE A— H D—H

Koenzymy mogą być klasyfikowane zaleŜnie od grupy, przeniesienie której one ułatwiają Na podstawie powyŜszej koncepcji moŜna sklasyfikować koenzymy następująco: Koenzymy przenoszące inne grupy niŜ H Fosforany cukrów CoASH Pirofosforan tiaminy Fosforan pirydoksalu Koenzymy folia nowe Biotyna Koenzymy kobamidowe (B1;) Kwas liponowy Koenzymy przenoszące H NAD+, NADP+ FMN, FAD Kwas liponowy Koenzym Q Wiele koenzymów jest pochodnymi witamin B i monofosforanu adenozyny Witaminy grupy B tworzą część struktury wielu koenzymów. Witaminy grupy B: nikoty-

NHj +

+

+

Ryc. 8-2. NAD(P) . W NAD , R = H; w NADP , R="OPO1".

Skoro substraty łączą się z enzymami w 3 punktach, enzymy działają jako stereoswoiste katalizatory Większość substratów tworzy z enzymami co najmniej 3 wiązania. Takie „3-punktowe dolą* czenie" moŜe nadawać cząsteczce, skądinąd symetrycznej, asymetrię. Na rycinie 8-3 przedstawiono cząsteczkę substratu w postaci atomu węgla z 3 róŜnymi grupami, które mogą się przyłączyć w 3 punktach do miejsca enzymu. JeŜeli miejsce na enzymie jest dostępne tylko z jednej strony i mogą ze sobą reagować tylko atomy i miejsca komplementarne (uzasadnione przypuszczenia dla istotnych enzymów), cząsteczka substratu moŜe się przyłączyć do enzymu tylko w jeden sposób. Reakcja moŜe ograniczać się do atomów związanych w miejscach 1 i 2,

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 86

Większość enzymów wykazuje absolutną swoistość optyczną dla przynajmniej części swoistych substratów Z wyjątkiem epimeraz (racemaz), które katalizują wewnętrzne przekształcenie izomerów optycznych, ogólnie enzymy wykazują absolutną swoistość optyczną dla przynajmniej części cząs-

Miejsce enzym etyczne Ryc. 8-3. Schemat trzypunktowego przyłączenia się substratu do płaskiego miejsca aktywnego enzymu.

nawet jeśli atomy 1 i 3 są takie same. Jeśli wyobrazimy sobie obrót cząsteczki substratu w przestrzeni, to widać, Ŝe istnieje tylko jedno połoŜenie substratu, w którym moŜe on łączyć się z 3 punktami miejsca planarnego enzymu. W wyniku tego atomy 1 i 3, chociaŜ identyczne, po połączeniu substratu z enzymem stają się róŜne. Zmiana chemiczna moŜe obejmować atom 1, ale nie atom 3 i odwrotnie. To moŜe wyjaśnić, dlaczego katalizowana przez enzym redukcja optycznie nieaktywnej cząsteczki pirogronianu prowadzi do L-, a nie D, L-mleczaffu. WIĘKSZOŚĆ ENZYMÓW KATALIZUJE ALBO SWOISTĄ REAKCJĘ, ALBO, W PEWNYCH PRZYPADKACH, SWOISTY TYP REAKCJI Zdolność enzymu do katalizowania tylko 1 swoistej reakcji i zasadniczo Ŝadnej innej, być moŜe jest jego najwaŜniejszą właściwością.

Szybkość procesów metabolicznych moŜe być zatem regulowana przez zmiany w katalitycznej sprawności odpowiednich enzymów, Niemniej większość enzymów katalizuje ten sam typ reakcji (przenoszenie fosforanu, utlenianie i redukcja, itp.) dla kilku strukturalnie pokrewnych substratów. Reakcje z pokrewnymi substratami zachodzą wówczas, gdy substraty te występują w duŜym stęŜeniu. To, czy w Ŝywych organizmach będą zachodziły wszystkie z moŜliwych reakcji, zaleŜy od względnych stęŜeń alternatywnych substratów w komórce i od względnego powinowactwa enzymu do tych substratów.

teczki substratu. Dlatego enzymy glikolizy i bezpośredniej przemiany tlenowej katalizują przekształcenie fosfocukrów szeregu D-, a nie L. Z kilkoma wyjątkami (np. oksydaza D-aminokwasu nerki), większość enzymów ssaków działa na L-izomery aminokwasów. Swoistość optyczna enzymów moŜe rozciągać się na część lub całość cząsteczki substratu.

Glikozydazy są przykładem obu tych przypadków. Te enzymy, które katalizują hydrolizę wiązań glikozydowych między cukrami a alkoholami, są wysoce swoiste dla części cukrowej i dla typu wiązania (a lub P), ale są stosunkowo nieswoiste dla aglikonu (część alkoholowa). Enzymy wykazują swoistość wyŜszego rzędu dla typu reakcji, które one katalizują Enzymy lityczne działają na określone ugrupowania chemiczne, np. glikozydazy na glikozydy, pepsyna i trypsyna na wiązania peptydowe, a esterazy na estry. Ten fakt tłumaczy moŜliwości rozkładu znacznej ilości róŜnych substratów peptydowych przez nieliczne tylko enzymy trawienne. Wiele proteaz katalizuje równieŜ hydrolizę estrów. ChociaŜ ten rodzaj reakcji ma ograniczone znaczenie fizjologiczne, uŜycie estrów, jako substratów syntetycznych znacznie się przyczyniło do poznania mechanizmu działania proteaz. Pewne enzymy lityczne wykazują większą swoistość. Chymotrypsyna hydrolizuje wiązania peptydowe, w których grupa karboksylowa pochodzi od aminokwasów aromatycznych: fenyloalaniny, tyrozyny lub tryptofanu. Karboksypeptydazy usuwają po 1 aminokwasie od końca karboksylowego, a aminopeptydazy — od końca aminowego łańcucha polipeptydowego. ChociaŜ niektóre oksydoreduktazy wykorzystują albo NAD+ lub NADP+ jako akceptor elektronu, większość z nich uŜywa przede wszystkim jednego lub drugiego. Mówiąc ogólnie, oksydoreduktazy biorące udział w procesach biosyntezy u ssaków (np. synteza kwasu tłuszczowego lub sterolu) wykorzystują jako substan-

86 / ROZDZIAŁ 8 cję redukującą NADPH, natomiast oksydoreduktazy działające w procesach degradacji (np. glikoliza, utlenianie kwasu tłuszczowego) wykorzystują NAD+ jako substancje utlenia-

KATALITYCZNA AKTYWNOŚĆ ENZYMU JEST WYBIÓRCZĄ I CZUŁĄ PRÓBĄ DO ICH DETEKCJI Mała zawartość enzymów w komórkach komplikuje pomiar ich ilości w wyciągach tkankowych lub w płynach ustrojowych. Szczęśliwie aktywność katalityczna enzymu stanowi czułą i swoistą próbę do ich pomiaru. Aby zmierzyć ilość enzymu w próbce ekstraktu tkankowego lub innego płynu biologicznego, oznacza się szybkość reakcji katalizowanej przez enzym obecny w próbce. W odpowiednich warunkach oznaczana szybkość reakcji jest proporcjonalna do ilości obecnego

enzymu. PoniewaŜ trudne jest określenie ilości cząsteczek lub masy obecnego enzymu, wyniki są wyraŜone w jednostkach enzymatycz-

nych. Względne ilości enzymu w róŜnych ekstraktach mogą być wówczas porównywane. Jednostki enzymu wyraŜa się w mikromolach (umol; 10 6 mol), nanomolach (nmol; 10~9 mol) lub pikomolacb. (pmol; 10 1Z mol) reagującego substratu Jub wytwarzanego produktu na minutę. Dehydrogenazy zaleŜne od NAD' mogą być analizowane przez pomiar zmiany absorbancji przy 340 nm, + spowodowanej i nterkon wersją NAD i NADH W reakcjach z udziałem NAD+ lub NADP+ (dehydrogenazy) wykorzystuje się właściwość absorbowania światła o długości fali 340 nm przez NADH lub NADPH (ale nie NAD + lub NADP+) (ryc. 8-4). Gdy NADH jest utleniany do NAD+ (lub odwrotnie) zmienia się gęstość optyczna (OD) przy 340 nm. W określonych warunkach szybkość zmiany w OD zaleŜy bezpośrednio od aktywności enzymu (ryc. 8-5). Krzywą kalibracyjną (ryc. 8-6) wykreśla się, oznaczając zmiany OD względem ilości dodanego enzymu (ryc. 8-5). Ilość enzymu obecnego w nieznanym roztworze moŜna obliczyć znając szybkość zmian w OD przy 340 nm.

A

1. 0 0. 8

I s

i

0. 6 0. 4

1

0. 2

\

NADH /

V

\____

\

1

NAD

400 200 i

250

,

300 350 Długość fali (nm)

Ryc. 8-4. Widma absorpcji NAD ' i NADH Gęstość dotyczy roztworu o stęŜeniu 44 mg/l w kuwecie 1 cm. NADP+ i NAOPH mają widma analogiczne odpowiednio do widm NAD i NADH

0,90 2,0 t,0 Minuty Ryc. 8-5. Oznaczenie 0,85 -

0,80 L dehydrogenazy zaleŜnej od NADH i NADPH. Obserwuje się wielkość zmiany OD (gęstości optycznej) przy 340 nm na skutek przejścia koenzymu zredukowanego w koenzym utleniony. Do kuwety są dodawane: utleniony substrai (S), zredukowany koenzym (NADH) i bufor. Następnie przepuszcza się światło o długości 340 nm. Początkowo OD jest duŜa, poniewaŜ NADH {lub NADPH) absorbuje światło, przy 340 nm. Po dodaniu 0,025 — 0,2 ml standardowego roztworu enzymu OD się zmniejsza.

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 87 0.20

0,10 r

determinują określoną metodę obliczeń. Często dogodnie jest połączyć produkt reakcji z dehydrogenaza, dla której ten produkt jest substratem (ryc. 8-7). CZYSTE ENZYMY SĄ KONIECZNE DO ZROZUMIENIA ICH STRUKTURY, FUNKCJI, MECHANIZMU REAKCJI I REGULACJI ICH AKTYWNOŚCI

0,05 0,10 0,15 Roztwór enzymu (ml)

Ryc. 8-6. Krzywa kalibracyjna do analizy enzymatycznej. Nachylenia prostych z ryc. 8-5 są wykreślone względem ilości enzymu.

Ilościowa analiza wielu enzymów moŜe być uproszczona, sprzęgając reakcje przez nie katalizowane z reakcją katalizowaną przez dehydrogenazę zaleŜną od NAD W powyŜszym przykładzie, aby określić aktywność enzymu, oznaczano szybkość tworzenia produktu (NADH). Enzymy inne niŜ dehydrogenazy mogą być takŜe badane przez pomiar szybkości pojawiania się produktu (lub, rzadziej, szybkości zanikania substratu). Fizykochemiczne właściwości produktu lub substratu Glukoza

[HEKSOKINAZA I *ADP, Mi Glu kozo- 6fosforan , NADP* DEHYDROGENAZA GLUKO2O-6.FOSFORANOWA NADPH + H

ł

6-Fosfool ukonolakton

Ryc. 8-7. Oznaczanie aktywności heksokinazy metodą „sprzęŜoną". Reakcja jest sprzęŜona z reakcją katalizowaną przez dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową. Dehydrogenaza g I u kozo - 6 - f osf ora nowa, glukoza, ATP, Mg2"* i NADP+ są dodawane w nadmiarze. Ilość obecnej heksokinazy determinuje szybkość całej sprzęŜonej reakcji i przede wszystkim szybkość tworzenia NADPH, która moŜe być mierzona przy 340 nm.

Wiedza o reakcjach i chemicznych związkach pośrednich w szlakach metabolicznych i mechanizmach regulacyjnych, które działają na poziomie katalizy, pochodzi w duŜym stopniu z badań oczyszczonych enzymów. Wiarygodna informacja dotycząca kinetyki, k o fakt o rów, miejsc aktywnych, struktury i mechanizmu działania takŜe wymaga bardzo oczyszczonych enzymów. Efektywny przepis oczyszczania enzymu, z dobrą wydajnością na kaŜdym etapie, zwiększa swoistą aktywność enzymu W tabeli 8-2 przedstawiono przebieg typowego oczyszczania enzymu wątroby, z dobrą wydajnością i 490-krotnym oczyszczaniem całkowitym. NaleŜy zwrócić uwagę, jak oblicza się swoistą aktywność i odzysk początkowej aktywności. Celem jest osiągnięcie maksymalnej swoistej aktywności (jednostki enzymu na miligram białka) z moŜliwie najlepszym odzyskiem początkowej aktywności. Oczyszczanie enzymu polega na wyizolowaniu swoistego enzymu z surowego ekstraktu komórkowego, zawierającego wiele innych komponentów. Małe cząsteczki moŜna usunąć przez dializę lub filtrację Ŝelową, kwasy nukleinowe przez strącanie antybiotykiem, np. streptomycyną, itd. Największym problemem jest wydzielanie poŜądanego enzymu z tysięcy chemicznie i fizycznie podobnych białek. Klasyczne metody oczyszczania enzymów obejmują strącanie wybiórcze, chromatografię jonowymienną i filtrację Ŝelową UŜyteczne, klasyczne techniki oczyszczania obejmują strącanie solami o róŜnych stęŜeniach (głównie siarczanem amonu i siarczanem sodu) lub rozpuszczalnikami (aceton lub etanol), róŜnicową denaturację cieplną iub w wyniku zmian pH,1 róŜnicowe wirowanie, filtrację Ŝelową i ele-

88 / ROZDZIAŁ 8 Tabela 8-2, Schemat typowego oczyszczania enzymu Frakcja enzymu

Całkowita

Białko

aktywność

całkowite (nig)

(pU)

Surowy homogenat wątroby Supernatant 100 000xff Osad — 40—50% {NH4)2SO4 Osad — 20—35% aceton Kolumna DEAE, frakcja 80—110 Osad — 43—48% (NH4)2SO4 Pierwsze kryształy Rekrystalizacja

100 000 98 000 90 000 60 000 58 000 52 000 50 000 49 000

ktroforezę. Niezwykle skuteczną do wydajnego i szybkiego oczyszczenia enzymów okazała się selektywna adsorpcja i elucja białek z anionowego jonitu celulozowego— dietyloaminoetylo (DEAE) celulozy i kationowego jonitu — karboksymetylocelulozy (CMC). Szeroko stosowany jest rozdział białek na sitach molekularnych, takich jak Sephadex, które rozdzielają białka na podstawie ich wielkości. Metody te są względnie nieselektywne (z wyjątkiem przypadków stosowania kombinacji kilku takich metod), poniewaŜ nie rozdzielają one pojedynczego białka od wszystkich innych białek. Jest to lepiej osiągane za pomocą chromatografii powinowactwa. Techniki chromatografii powinowactwa wykorzystują unieruchomione Ugandy, które reagują ze swoistymi regionami enzymu Uderzającą cechą chromatografii powinowactwa jest jej zdolność do wybiórczego usuwania jednego określonego białka lub, najwyŜej, małej liczby poszczególnych białek z ich mieszaniny. Technika wykorzystuje unieruchomiony ligand swoiście reagujący z enzymem, który zamierzamy oczyścić. Gdy mieszanina białek jest poddana działaniu tego unieruchomionego ligandu, wówczas białkami, które przyłączą się, są te, które silnie z nim reagują. NiepoŜądane białko wypływa z kolumny i jest odrzucane. Badane białko jest wówczas eluowane z unieruchomionego ligandu. na ogół za pomocą duŜych stęŜeń soli lub przeprowadzając ligand w postać rozpuszczalną. Oczyszczania, dokonane za pomocą techniki chromatografii powinowactwa, są imponujące, często przewyŜszają to, co jest moŜliwe przez sukcesywne stosowanie wielu

10 000 8 000 1 500 250 29 20 12 10

Aktywność

Całkowity

właściwa (pU/mg)

odzysk (%)

10 12,2 60 240 2 000 2 600 4 160 4 900

(100) 98 90 60 58 52 50 49

technik klasycznych. Preferowanymi Ugandami są substraty lub pochodne koenzymów kowaJencyjnie przyłączone do nośnika, takiego jak Sephadex. Przyłączenie moŜe być bezpośrednie lub przez molekularny łącznik, zawierający 3—8 atomów węgla. JeŜeli sposób przyłączenia ligandu uniemoŜliwia jego zdolność do interakcji z enzymem, to mogą pojawić się trudności, których moŜna uniknąć, uŜywając cząsteczek łącznikowych. UŜycie hydrofobowego „Mnkera" moŜe jednak komplikować rozdział przez wprowadzenie elementu chromatografii hydrofobowej (p. poniŜej). Przykłady udanej chromatografii powinowactwa obejmują oczyszczanie wielu róŜnych dehydrogenaz na nośniku z NAD+. ChociaŜ wiele dehydrogenaz moŜe się przyłączać i eluować wspólnie, gdy kolumnę poddaje się działaniu rozpuszczonego NAD+, to kolejne uŜycie kolumn, raczej z substratem (niŜ koenzymem) lub elucja kolumny za pomocą usuwającej mieszaniny trójskładnikowej (ang. abortive ternary mixture) w wielu przypadkach umoŜliwia uzyskanie czystego enzymu. Chromatografia z barwnikiem jako ligandem i chromatografia hydrofobowa wykorzystują zasady analogiczne do zasad chromatografii powinowactwa Chromatografia z barwnikiem jako ligandem na nośnikach, takich jak błękit, zieleń lub czerwień Sepharose i chromatografia z ligandem hydrofobowym na nośniku, takim jak oktyi- lub fenyl-Sepharose są technikami ściśle spokrewnionymi z chromatografią powinowactwa. Pierwsza wykorzystuje jako unieruchomiony ligand barwnik organiczny, który słuŜy jako analog substratu, koenzymu lub allosterycznego efektora. Elucja jest przeprowadzona za

ENZYMY-. WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 89

pomocą gradientu stęŜenia soli. W chromatografii z ligandem hydrofobowym, alkilowy lub arylowy węglowodór jest przyłączony do nośnika, takiego jak Sephadex. Zatrzymywanie białek na nośniku obejmuje hydrofobowe interakcje między łańcuchem alkilowym a regionami hydrofobowymi białka. Białka są nanoszone w roztworach, które zawierają duŜe stęŜenia soH (np. (NH4)2SO4) i są eluowane przy zmniejszającym się gradiencie stęŜenia tej samej soli. Elektroforeza w Ŝelu połiakryłoamidowym wykrywa zanieczyszczenia w preparatach enzymów

Homogenność białka jest najlepiej oceniana przez elektroforezę w Ŝelu połiakryłoamidowym (PAGE) przeprowadzoną w róŜnych warunkach. JeŜeii nałoŜona jest dostateczna ilość próbki, jednowymiarowa PAGE natywnego białka ujawni większe i mniejsze zanieczyszczenia białkowe. W dwuwymiarowej (O'Farrell) PAGE w pierwszym wymiarze, który zawiera mocznik i gradient pH utrzymywany przez polimeryzowane amfolity, zdenaturowane białka rozdzielają sie na zasadzie ich wartości pl przez zrównowaŜenie ich w polu elektrycznym. W drugim wymiarze białka, po zadziałaniu na nie SDS, rozdzielają sie na zasadzie wielkości mas cząsteczkowych ich protomerów (jeŜeli występują). 0 WEWNĄTRZKOMÓRKOWYM ROZMIESZCZENIU ENZYMÓW WNIOSKUJE SIĘ NA PODSTAWIE TECHNIK HISTOCHEMICZNYCH, A TAKśE PRZEZ IZOLOWANIE 1 BADANIE ORGANELLI SUBKOMORKOWYCH

W obrębie komórki bardzo waŜne jest przestrzenne rozmieszczenie i przedziałowość (kompartmentacja) enzymów, substratów i kofaktorów. Na przykład w komórkach wątroby enzymy glikolizy są umiejscowione w cytoplazmie, podczas gdy enzymy cyklu kwasu cytrynowego w mitochondriach. Umiejscowienie enzymów w subkomórkowych organellach moŜe być badane po frakcjonowaniu homogenatu komórkowego za pomocą wirowania z duŜą szybkością. Badana jest wówczas zawartość enzymu w kaŜdej frakcji.

Umiejscowienie poszczególnego enzymu w tkance lub komórce, w stosunkowo nie zmienionym stanie, jest często dokonywane za pomocą metod histochemicznych (histoenzymologia). Na cienkie (2—10 um) zamroŜone skrawki tkanki działa się substratem dla odpowiedniego enzymu. W miejscu, w którym znajduje się enzym, powstaje produkt reakcji przez niego katalizowanej. JeŜeli produkt jest barwny i nierozpuszczalny, to pozostaje on w miejscu powstania i umiejscawia enzym. Histoenzymologia daje obraz względnie fizjologicznego rozmieszczenia enzymów. IZOENZYMY SĄ FIZYCZNIE ODMIENNYMI FORMAMI TEJ SAMEJ AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ

ChociaŜ takie terminy, jak „dehydrogenaza jabłczanowa" lub „glukozo-6-fosfataza" wydają się opisywać pojedynczą jednostkę katalityczną, to obejmują one wszystkie białka, które katalizują odpowiednio utlenianie ja błczanu do szczawiooctanu lub hydrolizę glukozo-6-fosforanu do glukozy i Pr JeŜeli np. techniki oczyszczania enzymów były zastosowane dla dehydrogenazy jabłczanowej z róŜnych źródeł (np. wątroba szczura i Escherichia coli), stało się oczywiste, Ŝe chociaŜ dehydrogenaza jabłczanowa wątroby szczura i E. coli katalizuje tę samą reakcje, ich właściwości fizyczne i chemiczne wykazują znaczne róŜnice. Fizycznie odmienne formy o tej samej aktywności katalitycznej mogą takŜe występować w róŜnych tkankach tego samego organizmu, w róŜnych typach komórek, w subkomórkowych kompartmentach lub w organizmie prokariotycznym, takim jak E. coli. To odkrycie wynika z zastosowania metod rozdziału elektroforetycznego do oddzielenia elektroforetycznie odmiennych postaci określonej aktywności enzymatycznej. Wprawdzie określenie „izozym" (izoenzym) obejmuje wszystkie powyŜsze przykłady fizycznie róŜnych postaci o danej aktywności katalitycznej, w praktyce jednak, a zwłaszcza w medycynie klinicznej, „izozym" ma bardziej ograniczony sens, określając mianowicie fizycznie odmienne i rozdzielające się postacie danego enzymu, występujące w róŜnych typach komórek lub kompartmentach subkomórkowych człowieka. Izoenzymy są powszechne w surowicy i tkankach wszystkich kręgowców, owadów,

90 / ROZDZiAŁ 8

roślin i organizmów jednokomórkowych. Zarówno rodzaj, jak i liczba enzymów jest w równym stopniu róŜna. Znane są izoenzymy szeregu dehydrogenaz, oksydaz, aminotransferaz, fosfataz, transfosforylaz i enzymów proteolitycznych. RóŜne tkanki mogą zawierać róŜne izoenzymy, a te izoenzymy mogą się róŜnić w ich powinowactwie do substratu. MoŜliwość rozdzielenia i identyfikacji izoenzymów ma znaczenie diagnostyczne Medyczne zainteresowanie izoenzymami było stymulowane odkryciem, Ŝe surowica człowieka zawiera kilka izoenzymów rlehydrngenazy mleczaiiowej, 1 ze ich względne proporcje zmieniają się znacznie w pewnych stanach chorobowych. Następnie opisano, jako wynik choroby, wiele dodatkowych przykładów zmian w proporcjach izoenzymów. Izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej surowicy mogą być ujawnione przez poddanie próbki surowicy elektroforezie, zazwyczaj w pH 8,6, uŜywając jako nośnika skrobi, agaru lub Ŝelu poliakryloamidowego. W tym pH izoenzymy mają róŜne ładunki elektryczne i wędrują do 5 odmiennych obszarów elektroforegramu. Zdolność izoenzymów do katalizowania redukcji barwników bezbarwnych do nierozpuszczalnej postaci barwnej wykorzystuje się w celu ich umiejscowienia. W typowym zestawie odczynników do wykrycia izoenzymu dehydrogenazy znajduje się: 1. Zredukowany substrat (np. mleczan). 2. Koenzym (NAD+). 3. Barwnik utleniony (np. sól tetrazolowa błękitu nitrowego [NBT]). 4. Związek pośrednio przenoszący elektrony miedzy NADH a barwnikiem (np. metosiarczan fenazyny [PMS]). 5. Bufor; w razie potrzeby jony aktywujące. Dehydrogenaza mleczan owa katalizuję przeniesienie 2 elektronów f 1 H+ z mleczanu na NAD+ (ryc. 8-8). Reakcja przebiega z dającą się zmierzyć szybkością tylko w obecności dehydrogenazy mleczanowej. Po spryskaniu eiektroforegramu mieszaniną odczynników testowych i inkubacji w temp. 37°C, reakcje przenoszenia elektronów zajdą tylko w tych miejscach, w których znajduje się dehydrogenaza mleczanowa (ryc. 8-9). Względne nasilenie barwy prąŜków moŜna ocenić ilościowo za pomocą fotometru skaningowego (ryc. 8-10). Izoenzym o największym ładunku ujemnym określono jako Ir

Zredukowany NBT (niebieski formazan) DEHYDflOGENAZA MLECZANOWA

O L-Mleezan

H,C

' -----------------------* V

NAD+

O Plrngronlan

NADH+ + H+

Ryc. 8-8. Reakcja dehydrogenazy L-mleczanowej.

Ryc. 8-9. Wykorzystanie reakcji sprzęŜonych do Mleczan SH

S Pirogronian

NAD*

NADH + H*

Zredukowany PMS

Utleniony NBT (bezbarwny)

Utleniony PMS

oznaczania aktywności dehydrogenazy mleczanowej na elektroferogramie.

Izoenzymy są produktami ekspresji ściśle spokrewnionych genów Enzymy oligomeryczne z róŜnymi protomerami mogą występować w kilku postaciach. Często jedna tkanka wytwarza głównie jeden protomer, a inna — drugi protomer. JeŜeli protomery mogą się łączyć w róŜny sposób, aby utworzyć aktywny enzym (np. tetramer), tworzą się izoenzymy o tej aktywności enzymatycznej. Izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej róŜnią się między sobą na poziomie struktury czwartorzędowej. Oligomeryczna cząsteczka dehydrogenazy mleczanowej (m.cz. 130000) składa się z 4 protomerów 2 typów — H i M (mcz. ok. 34000). Tylko cząsteczka tetrameryczna ma aktywność katalityczną. JeŜeli uporządkowanie jest bez znaczenia, to te protomery mogą się ze sobą łączyć w następujących 5 kombinacjach: HHHH HtłHM

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 91

Norma

Wątroba

I

f Ryc. 8-10.Prawidłowy i patologiczny wykres izoenzymów dehydrogenazy mleczanowej w surowicy ludzkiej, izoenzymy LDH rozdzielono na octanie celulozy w pH 8,6 i barwiono na obecność enzymu. Wykres fotometru pokazuje względną zawartość izoenzymów. Wykres A — surowica chorego z zawałem mięśnia sercowego; B — prawidłowa surowica; C — surowica chorego z chorobą wątroby, (Za zgodą Dr Me!virta Blacka, Mr Hugha Millera, St Luke's Hospital, San Francisco), _____________

na przez odmienne loci genetyczne, które ulegają odmiennej ekspresji w róŜnych tkankach, np. w sercu i mięśniach szkieletowych.

HHMM HM MM MMMM

W. celu wyjaśnienia związku miedzy izoenzymami dehydrogenazy mleczanowej, Market wykorzystał znane warunki do rozbicia i ponownego utworzenia struktury czwartorzędowej. Rozszczepienie i rekonstrukcja dehydrogenazy mleczanowej I^ub dehydrogenazy mleczanowej I, nie spowodowały utworzenia się Ŝadnych nowych izoenzymów. Wynika to z faktu, Ŝe składają się one z 1 typu protomeru. Gdy tym samym zabiegom poddano mieszaninę dehydrogenazy Ij i dehydrogenazy mleczanowej I5, wówczas otrzymywano dehydrogenazę mleczanową I2, 13 i I+. Stwierdzone proporcje izoenzymów wskazywałyby na następujący skład podjednostek: Dehydrogenaza mlecza nowa Izoenzym Podjednostki HHHH HHHM HHMM H (vi (VI lvi JVIIVI In lvi

Synteza podjednostek H i M jest kontrolowa-

ILOŚCIOWA ANALIZA PEWNYCH ENZYMÓW OSOCZA MA ZNACZENIE DIAGNOSTYCZNE Pewne enzymy, proenzymy i ich substraty znajdują się stale we krwi krąŜącej zupełnie zdrowych ludzi, pełniąc określone funkcje fizjo-

logiczne. Do takich enzymów osocza naleŜy m.in. lipaza lipo proteinowa, pseudochołinesteraza, proenzymy krzepnięcia krwi i fibrynolizy. Na ogół są one syntetyzowane w wątrobie, ale występują we krwi w takich samych lub większych stęŜeniach niŜ w tkankach. Niefunkcjonalne enzymy osocza, jak sama

nazwa wskazuje, nie pełnią Ŝadnej znanej funkcji fizjologicznej we krwi. Ich substraty często nie występują w osoczu, a same enzymy występują we krwi osób zdrowych w ilościach do miliona razy mniejszych niŜ w tkankach. Występowanie ich w osoczu, w ilościach powyŜej wartości prawidłowych, sugeruje zwiększenie szybkości destrukcji określonych tkanek. Pomiar stęŜenia tych niefunkcjonalnych enzymów osocza moŜe dostarczać lekarzowi cennych informacji przy ustalaniu rozpoznania i rokowaniu. W grupie niefunkcjonalnych enzymów osocza znajdują się enzymy występujące w wydzielinach gruczołów wydzielania zewnętrznego i „prawdziwe" enzymy wewnątrzkomórkowe.

92 / ROZDZIAŁ 8

Enzymy wydzielania zewnętrznego — amylaza trzustkowa, lipaza, fosfataza alkaliczna Ŝółci i fosfataza kwaśna gruczołu krokowego — dyfundują do osocza. Prawdziwe enzymy wewnątrzkomórkowe w warunkach fizjologicznych nie występują w układzie krąŜenia.

Tabela 8-3. Główne enzymy osocza wykorzystywane w diagnostyce klinicznej Wiele enzymów nie jest swoistych dla podanych chorób; szczegóły dotyczące warunków, w których enzymy te wykazują zmienną aktywność, podano w suplemencie Enzym osocza

Małe stęŜenie niefunkcjonalnych enzymów osocza wynika z fizjologicznego rozpadu komórek Małe ilości niefunkcjonalnych enzymów stwierdzane w osoczu pochodzą z rozpadu erytrocytów, leukocytów i innych komórek zachodzącego nawet w warunkach fizjologicznych. Przy szybkim obumieraniu komórek uwalniające się z nich enzymy dostają się do krwi. ChociaŜ ogólnie uwaŜa się, Ŝe zwiększone stęŜenie tych enzymów w osoczu świadczy o martwicy komórek, intensywne ćwiczenia fizyczne równieŜ powodują uwalnianie znacznej ilości enzymów mięśni. StęŜenia niefunkcjonalnych enzymów osocza od wielu lat są wykorzystywane w diagnostyce klinicznej Praktykujący lekarze długo wykorzystywali ilościowe określenie stęŜenia pewnych niefunkcjonalnych enzymów osocza. Tę wartościową diagnostycznie i prognostycznie informację w większości przypadków otrzymuje się za pomocą całkowicie zautomatyzowanego wyposaŜenia. W tabeli 8-3 podano listę głównych enzymów wykorzystywanych w dziedzinie diagnostyki enzymatycznej. Dalsze szczegóły wykorzystania tych enzymów są podane w suplemencie, obejmując omówienie waŜnych pojęć — czułości i swoistości testów diagnostycznych. ENDONUKLEAZY RESTRYKCYJNE DOSTARCZAJĄ NOWEJ METODY W DIAGNOSTYCE CHORÓB GENETYCZNYCH Ogromny postęp w rozpoznawaniu chorób genetycznych dokonał się od wprowadzenia technologii rekombinacji DNA. ChociaŜ od dawna wiedziano, Ŝe wszystkie choroby molekularne są konsekwencją zmienionego DNA, to techniki bezpośredniego badania sekwencji DNA stały się dostępne od niedawna. Rozwój badań hybrydyzacjj fragmentów DNA wskazał drogę do technik o dostatecznej czułości do prenatalnego zbadania zaburzeń dziedzicznych

Aminotransferazy Aminotransferaza asparaginianowa (AspAT lub S60T) Aminotransferaza alaninowa (AIAT lub SGPT) Amylaza Cerutoplazmina

Główna wykorzystanie diagnostyczne Zawał serca Wirusowe zapalenie wątroby

Ostre zapalenie trzustki Zwyrodnienie wątrobowo- soczewko watę {choroba Wilsona) Fosfokinaza kreatynowa Choroby mięśni i zawał serca Transpeptydaza y-gluta- RóŜne choroby wątroby mylowa Dehydrogenaza mlecza- Zawał serca nowa (izoenzymy) Lipaza Ostre zapalenie trzustki Fosfataza kwaśna Fosfataza alkaliczna {izoenzymy)

Rak gruczołu krokowego z przerzutami RóŜne choroby kości, choroby wątroby z utrudnionym odpływem Ŝółci

przez mapowanie DNA, pochodzącego z komórek płodowych w płynie owodniowym, za pomocą enzymu restrykcyjnego. Zasadniczo badania DNA mogą być zastosowane w diagnostyce większości chorób genetycznych. Na przykład do prenatalnego wykrycia talasemii (charakteryzującej się wadą w syntezie podjednostek hemoglobiny; p. rozdz. 7), badaniem wykonanym z uŜyciem części genu dla normalnej podjednostki hemoglobiny moŜna wykryć skrócenie lub brak fragmentu restrykcyjnego, wynikające z delecji w tym genie, jakie ma miejsce w pewnych a-talasemiach i pewnych rzadkich typach |3- i p,5-talasemiach. Alternatywnie, moŜna wykonać badanie z uŜyciem syntetycznego cDNA, który hybrydyzuje z sekwencją fl-globiny, zawierającą nonsensowną mutację obecną w pewnych p-talasemiach, ale

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 93

nie z normalnym genem fi-globiny. Nieobecność osoezowego inhibitora proteazy o^-antytrypsyny jest związana z rozedmą płuc i marskościa. wątroby. Obecność nieaktywnej c^-antytrypsyny wykryto sondą wykrywającą nieaktywny allel, który zawiera punktową mutacje w genie o^-antytrypsyny. Metoda hybrydyzacji moŜe takŜe być uŜyta do wykrycia zmian genetycznych prowadzących do utraty miejsc działania dla endonukleazy restrykcyjnej (p. rozdz, 38). Na przykład mutacja punktowa kodonu dla Glu (GAG) na kodon Val (GTG), charakterystyczna dla niedokrwistości sierpowatej, moŜe być wykryta w genie (ł-globiny, uzyskanym z komórek pochodzących tylko z 10 ml płynu owodniowego, za pomocą endonukleazy restrykcyjnej Mst II lub Sau I. BADANIE PRODUKTÓW TRAWIENIA ENZYMAMI RESTRYKCYJNYMI MOśE UJAWNIĆ HOMOLOGICZNE GENY Z RÓśNYMI SEKWENCJAMI ZASAD

jeŜeli oba geny są identyczne). Potomek, który odziedziczył chromosom kodujący chorobę wykazuje wprawdzie tylko pojedyncze pasmo hybrydyzacji, ale róŜniące się od pasma produkowanego przez prawidłowe chromosomy. Zjawisko RFLP wykorzystuje się do wykrycia cechy niedokrwistości sierpowatej (związanej z Hpa I RFLP) i p-talasemii (związanej z Hind III i Bam HI RFLP). Metodę opartą na RFLP rozwinięto do wykrycia dziecięcej fenyloketonurii (p. rozdz. 32). Skoro RFLP nie powoduje choroby, lecz jest spowodowany zmianami chroinosomaJnymi, umiejscowionymi blisko wadliwego genu, badanie to nie jest niezawodne. RFLP jest punktem wyjścia do badań zmierzających do identyfikacji genu odpowiedzialnego za sprzęŜone z nim choroby. Ten sposób podejścia wykorzystano juŜ w badaniach skriningowych zjawisk mutacyjnych uczestniczących w powstawaniu retinobiastoma i choroby Huntingtona. Następne przykłady wykorzystania enzymów restrykcyjnych w diagnostyce p. rozdz. 36. PIŚMIENNICTWO

Badania DNA mogą być takŜe wykorzystywane do wykrycia sekwencji ściśle sprzęŜonych "z genem, ale nie umiejscowionych w obrębie interesującego genu. Badania takie moŜna rozszerzyć o określenie swoistych chromosomowo zmian (róŜnice w sekwencji między homologicznymi chromosomami). Przez trawienie DNA endonukleazami restrykcyjnymi uzyskuje się róŜne mapy restrykcyjne (wykresy fragmentów DNA) z homologicznych genów, które zawierają jednak róŜne sekwencje zasad. Zjawisko to określa się jako polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (ang. restrietion fragment length polymorphism; skrót — RFLP). W przypadku choroby genetycznej sprzęŜonej z polimorfizmem długości fragmentów restrykcyjnych, nosiciel jej będzie miał 1 chromosom z prawidłowym genem i 1 z genem wadliwym. Gdy fragmenty restrykcyjne poddaje się rozdziałowi, wówczas wykrywa się 2 pasma hyb-iydyzacji (odmienne od pojedynczego pasma,

Methods in Enzymohgy. Over 130 volumes, 1955—present. Advances in Enzymohgy. Issued annually. Boyer PD, Lardy H, Myrbach K (editor): The Enzymes, 3rd ed. 7 vols. Academic Press, 1970-1973. Bergmeyer HH, Bergmeyer J, Grass M: Methods of EnivmkAnalysis. Vol. XI, Antigens and Antibodies. VCH Publishers, 1986. Fersht A: Enzyme Structure and Mechanizm. 2nd ed. Freeman, 1985. Freifelder D: Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry and Moleadar Biology. Freeman, 1982. Kaiser T, Lawrence DS, Rokita SZ: The chemical modification of enzyme specificity. Ann Rev Biochem 1985;54:597. Naąui A: Where are the asymptotes of Michaelis-Menten? Trends Biochem Sci 1986; 1J:64. Scopes R: Protein Purifwation: Principles and Practke. Springer-Verlag, 1982. Tijssen P: Practice and Theory of Enzyme fmmunoassays. Elsevier, 1985.

9

Enzymy: kinetyka Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE W tym rozdziale zostanie omówiony charakter chemiczny katalizy przeprowadzonej przez enzymy oraz charakter interakcji enzym-substrat odpowiedzialny za swoistość reakcji tych biologicznych katalizatorów.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Rozpatrując główne czynniki, tj. stęŜenie enzymu i substratu. temperaturę, pH i inhibitory, które wpływają na aktywność enzymu, 3 ostatnie są szczególnie interesujące w badaniach klinicznych. PoniewaŜ aktywność enzymów zwiększa się wraz ze wzrostem temperatury, szybkość procesów metabolicznych znacznie się zwiększa podczas gorączki. JeŜeli gorączka jest długotrwała, rezultaty mogą być fatalne, częściowo z powodu wyczerpania metabolicznego. ObniŜenie temperatury ciała (hipotermia), a w konsekwencji zmniejszenie aktywności większości enzymów, okazuje się uŜyteczne wówczas, gdy zachodzi potrzeba redukcji całkowitego metabolizmu (np. podczas operacji na otwartym sercu lub transportu narządów przeznaczonych do transplantacji). Zasadniczą regułą biologiczną jest homeostaza, tj. utrzymywanie wewnętrznego środowiska ciała bardzo zbliŜone do jego normalnych warunków. Stosunkowo małe zmiany pH mogą wpływać na aktywność wiciu enzymów lub białek. Większość leków działa przez wpływ na reakcje katalizowane przez enzymy. Wiele leków przypomina naturalne substraty i działa jako inhibitory kompetycyjne aktywności enzymatycznej. Lepsze zrozumienie farmakologii i toksykologii zaleŜy od prawdziwej znajomości zasad hamowania działania enzymów.

TWORZENIE I ZANIK STANÓW PRZEJŚCIOWYCH W CAŁKOWITEJ REAKCJI WIĄśE SIĘ Z DYSKRETNYMI ZMIANAMI W WOLNEJ ENERGII W reakcji zastąpienia grupa Y zastępuje pozostającą grupę X: V + R - XY - R + X

Ta reakcja przebiega w 2 reakcjach połówkowych: 1) tworzenie stanu przejściowego, w którym Y i X są przyłączone do R, i 2) zanik stanu przejściowego i utworzenie Y-R + X

Y+R-X produktów:

R...... Stan przejściowy

Jak we wszystkich reakcjach chemicznych, zmiany w wolnej energii są związane z kaŜdą połówką reakcji. AGp definiuje się jako zmianę w wolnej energii związaną z tworzeniem stanu przejściowego, a AGD jako zmianę w wolnej energii związaną z zanikiem stanu przejściowego do utworzenia produktów:

m

[V- R] [Y] [Y -R -X]

gdzie zmiana w wolnej energii dla całej reakcji — AG jest sumą zmian wolnej energii w obu reakcjach połówkowych: AG= AG + AG F

"

Tak jak dla kaŜdego równania z dwoma członami, nie jest tu moŜliwe wywnioskowanie

ENZYMY: KINETYKA / 95

znaku lub wielkości ani AGF, ani AGD przez zbadanie algebraicznego znaku i wielkości AG. Nie ma wiec moŜliwości prostego wnioskowania na podstawie zmian wolnej energii AG dla całej reakcji o zmianach wolnej energii związanych z tworzeniem i zanikiem stanów przejściowych. Skoro kataliza jest ściśle związana z AG> i AGD, to pociąga za sobą to, Ŝe termodynamika całkowitej reakcji (AG) nie moŜe nam powiedzieć nic o drodze przebiegającej reakcji {tj. jej mechanizmie). Jest to zadanie kinetyki. Profile reakcji ilustrują zmiany wolnej energii związane z tworzeniem i zanikiem stanów przejściowych Profile reakcji na ryc. 9-1 i 9-2 ilustrują zaleŜności między AG, AGp i AG D NaleŜy

Reakcje katalizowane enzymatycznie obejmują stany przejściowe przy niŜszym poziomie energii niŜ reakcje niekatalizowane Na rycinie 9-3 przedstawiono profile reakcji 2 róŜnych stanów przejściowych w tej samej reakcji całkowitej. W obu przypadkach, wielWielkoSfi wolnej energii ■x]' [V ■ - ■ R ■ ■ ■ Xl

Y

AGF

+ R-X

Ryc.

9-3. Profil reakcji dla tworzenia 2 róŜnych sta n ów pr ze jśc i owyc h [Y- R - X ] a i [Y--R - X] b i towarzysząca im wolna energia tworzenia, AGp iAG£

Wielkość wolnej energii r

y---R

AGF Y + R- X AGo<0

A6<0

Y-R + X Ryc. 9-1. Profil reakcji dla reakcji zastąpienia z ujemną całkowitą zmianą w wolnej energii, tj. AG

Wielkość we In ej enerflil AGD AGF>0 AG>0 Y + R-X

Ryc. 9-2. Profil reakcji dla reakcji zastąpienia z dodatnią całkowitą zmianą w wolnej energii, tj. AG>0.

zwrócić uwagę, Ŝe podczas gdy na ryc. 9-1 AG jest ujemna (AG<0), a na ryc. 9-2 AG jest dodatnia (AG > 0), w obu przypadkach AGFjest dodatnia (AG t > 0) i AG D jest ujemna (AGD<0). Dlatego, jak stwierdzono powyŜej, ze znaku i wielkości AG nie moŜna wnioskować o znaku i wielkości ani AGF ani AGD. -

kość wolnej energii tworzenia stanu przejściowego reprezentuje barierę energetyczną dla cafej reakcji. Bariera energetyczna dla reakcji, która przebiega przez stan przejściowy [Y — R-"X]b, jest niŜsza niŜ bariera energetyczna dla reakcji, która przebiega przez stan przejściowy [Y — R— X]a- Katalizatory zmieniają wielkość wolnej energii stanu przejściowego. W powyŜszym przykładzie [Y —R — X]a przedstawia stan przejściowy dla niekatalizowanej reakcji, natomiast [Y •■• R ■*■ X]b przedstawia stan przejściowy dla reakcji katalizowanej. Wszystkie katalizatory, łącznie z enzymami, zmniejszają wolną energię tworzenia stanu przejściowego AGp. Następnie naleŜy zauwaŜyć, Ŝe skoro kataliza nie ma Ŝadnego wpływu na AG, zmiana w wolnej energii dla reakcji całkowitej jest niezaleŜna od katalizy. Skoro stała równowagi dla reakcji chemicznej jest funkcją standardowej zmiany wolnej energii dla reakcji: AG°= -RTIn K eq

to powoduje to, Ŝe enzymy i inne katalizatory nie mają Ŝadnego wpływu na stałą równowagi reakcji.

96 / ROZDZIAŁ 9

ABY REAGOWAĆ, CZĄSTECZKI MUSZĄ SIĘ ZBLIśYĆ DO SIEBIE NA ODLEGŁOŚĆ TWORZONEGO WIĄZANIA Z WYSTARCZAJĄCĄ ENERGIĄ, ABY PRZEKROCZYĆ BARIERY ENERGETYCZNE MIĘDZY STANAMI PRZEJŚCIOWYMI Teoria kinetyczna lub teoria zderzeń dla reakcji chemicznych zawiera 2 kluczowe pojęcia: 1. Aby ze sobą reagować, cząsteczki muszą się zderzać (tj. być jedna obok drugiej w obrębie odległości tworzonego wiązania). 2. W zderzeniu kończącym się reakcją, reagu jące cząsteczki muszą mieć wystarczającą ilość ener gii, aby przekroczyć barierę energetyczną reakcji. Czynniki, które zwiększają częstość zderzeń i energię kinetyczną zwiększają szybkość reakcji JeŜeli cząsteczki mają wystarczającą energię aby reagować, to wszystkie czynniki, które zwiększają częstość zderzeń między cząsteczkami, będą zwiększały szybkość reakcji. Natomiast czynniki, które zmniejszają albo częstość zderzeń, albo energię kinetyczną, będą zmniejszały szybkość reakcji. JeŜeli te same cząsteczki w populacji mają niewystarczającą energię aby reagować, to podwyŜszenie temperatury, która zwiększa energię kinetyczną, będzie zwiększało szybkość reakcji. Te koncepcje przedstawiono Bariera energetyczna

Energia kinetyczna Hyc. 9-4. Bariera energetyczna dla reakcji chemicznych.

na ryc. 9-4. W przypadku A Ŝadna, w B część i w C wszystkie cząsteczki mają wystarczającą energię kinetyczną, aby przekroczyć barierę energetyczną reakcji. W nieobecności katalizy enzymatycznej wieJe reakcji chemicznych zachodzi bardzo wolno w temperaturze Ŝywej komójki. Jednak, nawet w tej temperaturze, cząsteczki są w ruchu i podlegają zderzeniom. Nie reagują one szybko,

poniewaŜ większość ma niewystarczającą energię kinetyczną do przekroczenia bariery energetycznej reakcji. W znacznie wyŜszej temperaturze (i większej energii kinetycznej) reakcja będzie zachodziła duŜo szybciej. To, Ŝe reakcja zachodzi świadczy o tym, Ŝe jest to reakcja samorzutna (AG<0). W niŜszej temperaturze reakcja przebiega samorzutnie, ale wolno; w wyŜszej temperaturze — samorzutnie i szybko. Zadaniem enzymów jest spowodowanie, aby w warunkach panujących w Ŝywych komórkach reakcje samorzutne zachodziły szybko. Wiele reakcji chemicznych waŜnych biologicznie obejmuje tworzenie lub rozpad wiązań kowalencyjnych W reakcji przeniesienia grupy: D-G + A^A-G+D grupa G jest przenoszona z donora D—G na akceptor A. Całkowita reakcja obejmuje zarówno rozbicie wiązania D—G, jak i tworzenie nowego wiązania A—G. Katalizowane enzymatycznie reakcje przeniesienia grupy mogą być przedstawione następująco: D-G AEnz Enz-G G D To uwydatnia 3 A główne cechy katalizowanych enzymatycznie reakcji przenoszenia grup: 1. KaŜda połowa reakcji zawiera zarówno rozbicie, jak i tworzenie wiązania kowalencyj nego. 2. Enzym reaguje zarówno z D—G, jak A. 3. Podczas gdy w całkowitej reakcji enzym działa katalitycznie (tzn. jest wymagany tylko w śladowych ilościach i moŜe być odzyskiwany w postaci nie zmienionej, gdy reakcja jest za kończona), dla kaŜdej polowy reakcji enzym jest stechiometrycznym substratem (tzn. jest on wymagany w stosunku molowym z innymi substratami równymi:!). MoŜna rozwaŜyć wiele dodatkowych reakcji biochemicznych, w których D, A lub oba mogą być nieobecne. Na przykład reakcje izomeryzacji (takie, jak przekształcenie glukozo-6-fosforanu i glukozo-1-fosforanu) mogą być przedstawione jako reakcje, w których zarówno D, jak i A są nieobecne: S ^T

Enz

ENZYMY: KINETYKA / 97

KILKA REAKCJI CZĄSTKOWYCH 1 KOMPLEKSY ENZYM-SUBSTRAT UCZESTNICZĄ W REAKCJACH KATALIZOWANYCH ENZYMATYCZNIE PowyŜsze prezentacje nie podkreślają jeszcze innej kluczowej cechy reakcji katalizowanych enzymatycznie udziału w całkowitej reakcji 2 lub więcej pośrednich form kompleksu EnzS i późniejszego udziału zespołu kolejnych reakcji

połówkowych. Prezentacją reakcji przeniesienia grupy, która podkreśla te cechy, moŜe być Enz

AG

Enz-G D-G

Mała wartość Kd przedstawia zatem ścisły kompleks R-C. ' Jedną waŜną konsekwencją jest to, Ŝe gdy substrat przyłączy się do katalizatora, wówczas zwiększa się stęŜenie substratu w określonym obszarze roztworu wyraźnie powyŜej jego stęŜenia w wolnym roztworze. Dlatego nie ma się dłuŜej do czynienia z homogennym, ale heterogennym roztworem chemicznym. JeŜeli katalizator dla dwucząsteczkowej (dwusubstratowej) reakcji przyłącza oba substraty, stęŜenie miejscowe kaŜdego z nich jest zwiększone o czynnik, który zaleŜy od indywidualnego powinowactwa (wartość Kj) do katalizatora. JeŜeli szybkość całkowitej reakcji dwucząsteczkowej

Enz-G**

A+ B -* A-B

Enz-G

w której Enz-G, Enz-G* i Enz-G** reprezentują kolejne kompleksy EnzS w reakcji całkowitej. Przyłączanie substratów do enzymu zwiększa ich stęŜenie miejscowe i sprowadza je na odległość tworzenia wiązania Aby kaŜda z powyŜszych reakcji zaszła, wszystkie substraty muszą zbliŜyć się do siebie na odległość tworzenia wiązania (lub rozerwania wiązania). Dla homogennego roztworu chemicznego w nieobecności katalizatorów stęŜenia reagujących cząsteczek w roztworze są stałe. Ten warunek nie jest dłuŜej zachowany po wprowadzeniu katalizatora. Katalizator musi mieć powierzchniowe domeny, które przyłączają reagujące cząsteczki. Mimo Ŝe to przyłączenie jest procesem odwracalnym, całkowita stała równowagi dla reakcji przyłączania silniej uprzywilejowuje przyłączenie niŜ wolne formy reagujących cząsteczek. Jakościowo moŜna przedstawić to następująco: Substrat + Katalizator -± Kompleks su b st rat - kata ł izato r Ilościowo moŜna wyrazić ścisłość asocjacji miedzy substratem R a katalizatorem C w formie stałej dysocjacji Kd dla kompleksu R-C lub stałej równowagi dla reakcji: +c [CJ

[R-C] 7 — Biochemia

jest, jak zostanie przedstawione poniŜej, proporcjonalna do stęŜeń obu A i B, przyłączenie obu A i B przez katalizator moŜe powodować ogromne (kilka tysięcy razy) zwiększenie całkowitej szybkości reakcji.

Obszar enzymu związany z przyłączeniem substratu i katalizą jest nazywany „miejscem aktywnym" Kluczową właściwością enzymów jest ich zdolność do przyłączenia jednego lub (coraz częściej) obu substratów w reakcji bimolekularnej z towarzyszącym miejscowym zwiększeniem stęŜenia substratu i wynikającej z tego miejscowej szybkości reakcji. Enzymy są zarówno niezwykle czynnymi, jak i bardzo wybiórczymi katalizatorami. Aby zrozumieć te charakterystyczne właściwości enzymów, naleŜy wprowadzić pojecie „miejsca aktywnego" lub „katalitycznego"*. Ogromna wielkość białek, w stosunku do substratów, prowadzi do koncepcji, Ŝe ograniczony obszar enzymu, „miejsce aktywne", jest związany z katalizą. Początkowo było intrygujące, dlaczego enzymy są tak ogromne, gdy tylko część ich struktury okazuje się być konieczna do przyłączenia substratu i katalizy. Dzisiaj wiadomo, Ŝe z substratem reaguje duŜo większa część cząsteczki białka niŜ to poprzednio przypuszczano. Gdy zwiększa się zapotrze♦ Podczas gdy wiele tekstów zrównuje aktywne i katalityczne miejsca enzymów, w enzymach znajdują się inne „aktywne" miejsca związane raczej z regulacją aktywności enzymu niŜ z pośrednią enzytnologią procesu katalitycznego per se. UŜyto zatem terminu „miejsce katalityczne" aby uniknąć dwuznaczności.

98 / ROZDZIAŁ 9

bowanie na miejsca allosteryczne równej wielkości, wówczas wielkość enzymów nie powinna być dłuŜej niespodzianką. Wiele właściwości enzymów moŜe być zrozumiałych na podstawie sztywnego modelu „zamka i klucza" miejsca aktywnego Model miejsca katalitycznego, zaproponowany przez Emila Fischera, przedstawiał interakcję między substrałem a enzymem na zasadzie analogii „zamka i klucza". Ten model „zamka i klucza" lub sztywny model matrycowy (ryc. 9-5) jest ciągle uŜyteczny w celu zrozumienia pewnych właściwości enzymów, np. uporządkowanego przyłączenia 2 lub więcej substratów (ryc. 9-6) lub krzywej kinetyki prostego nasycenia substratem.

Ryc. 9-5. Przedstawienie tworzenia kompleksu EnzS zgodnie z matrycową hipotezą Fischera.

Ryc. 9-6. Przedstawienie kolejnej adsorpcji koenzymu (CoE) i 2 substratów (S, i Ss) do enzymu według hipotezy matrycowej. Zakłada się, Ŝe koenzym ma grupę niezbędną do przyłączenia pierwszego substratu (S,), który z kolei ułatwia przyłączenie S:

W modelu „indukowanego dopasowania się" miejsca katalitycznego, substrat indukuje konformacyjną zmianę w enzymie, która „tworzy" miejsce katalityczne Niefortunna cechą modelu Fischera jest załoŜenie sztywności miejsca katalitycznego. Bardziej uniwersalnym modelem jest model „indukowanego dopasowania się" Koshlanda. Ten model miał znaczne potwierdzenie doświadczalne. W modelu Fischera załoŜono, Ŝe miejsce katalityczne jest z góry ukształtowane w taki sposób, Ŝe pasuje do substratu. W modelu indukowanego dopasowania się substrat indukuje konformacyjną zmianę w enzymie. Zmiana ta dotyczy ustawienia reszt

aminokwasowych lub innych grup enzymu we właściwym połoŜeniu przestrzennym do związania substratu, katalizy lub obu zjawisk łącznie. W przykładzie z ryc. 9-7 zarówno grupy hydrofobowe (zakreskowane) jak i grupy naładowane elektrycznie (zakropkowane) są zaangaŜowane w przyłączeniu substratu. W katalizie

Ryc. 9-7. Dwuwymiarowe przedstawienie indukowanego dopasowania się przez zmianę konformacyjną w strukturze białka. NaleŜy zwrócić uwagę na odpowiednie pozycje kluczowych reszt aminokwasowych przed przyłączeniem i po przyłączeniu substratu.

bierze udział reszta fosfoseryny (—P) i grupa —SH reszty cysterny. Inne reszty, nie biorąte udziału w Ŝadnym procesie, są reprezentowane przez reszty Lys i Met. W nieobecności substratu i;rupy katalityczne i wiąŜące substrat są od siebie oddalone na odległość kilku wiązań. ZbliŜenie się -ubstratu wywołuje zmianę konformacyjną w biał k u enzymatycznym, ustawiając w odpowiedni sposób grupy uczestniczące w wiązaniu substratu i katalizie. W tym samym czasie zmienia się równieŜ przestrzenne ustawienie innych obszarów — Lys i Met są teraz blisko siebie (ryc. 9-7). Analogi substratów mogą powodować pewne, ale nie wszystkie, zmiany właściwej konformacji (ryc. 9-8). Po przyłączeniu właściwego substratu A wszystkie grupy (przedstawione jako zaciemnione kółka) ustawiają się we właściwym połoŜeniu. Przyłączenie analogu EnzS substratu, który jest

Eni + S B

Ryc. 9-8. Przedstawienie zmian konformacyjnych w białku enzymatycznym po przyłączeniu substratu (A) i nieaktywnych analogów substratu (B, C) {według Koshlanda).

ENZYMY; KINETYKA / 99

zbyt „gruby" (ryc. 9-8B) lub zbyt „chudy" (ryc, 9-8C) indukuje nieprawidłowe ustawienie grup. Ostatnią cechą enzymu jest miejsce pokazane jako małe nacięcie z prawej strony. MoŜna sobie wyobrazić przyłączenie się w tym miejscu cząsteczki regulatorowej i „ściąganie w dół" jednego z ramion polipeptydowych wrazz grupą katalityczną. W takim przypadku moŜe zachodzić przyłączenie substratu, ale nie kataliza. Jak to ilustruje model indukowanego dopasowania się, reszty aminokwasów, które znajdują się w miejscu katalitycznym, mogą być oddalone od siebie w strukturze pierwszorzędowej, ale przestrzennie zbliŜone w strukturze trzeciorzędowej. Katalityczne miejsca Itzozymu, rybonukieazy i wielu innych enzymów znajdują się w bruzdach powierzchni enzymu Lizozym występujący we łzach, śluzie nosowym, plwocinie, tkankach, soku Ŝołądkowym, mleku i białku jaja, katalizuje hydrolizę wiązań P-1,4 kwasu N-acetyloneuraminowego w proteoglikanach i glukozoaminoghk ariach. Jego działanie polega na niszczeniu ścian komórkowych wielu bakterii Gram-dodatnich, przedostających się z powietrza do łez i śluzu nosowego. Lizozym jest zbudowany z jednego łańcucha polipeptydowego, składającego się ze 129 reszt aminokwasowych. PoniewaŜ nie ma koenzymu ani jonu metalu, kataliza, swoistość i trójwymiarowa struktura są określone wyłącznie przez te reszty aminokwasowe. W cząsteczce lizozymu są małe obszary struktury harmonijA) Asp 1011 Trp 62 Trp63

kowej, a-heliksu i szerokie obszary struktury nie uporządkowanej! Cząsteczka ma przebiegającą przez środek bruzdę, w której znajduje się miejsce katalityczne, z 6. „podmiejscami" (ang. subsites) (ryc. 9-9), które przyłącza róŜne substraty lub inhibitory. Reszty aminokwasowe odpowiedzialne za rozbicie wiązania leŜą między miejscami D i E, blisko grup karboksylowych Asp 52, Glu 35. Glu 35 przekazuje protony wiązaniu acetalowemu substratu, podczas gdy ujemnie naładowany Asp 52 stabilizuje powstający jon karboniowy. Katalityczne miejsce rybonukieazy leŜy w obrębie bruzdy podobnej do bruzdy lizozymu, w poprzek której leŜą 2 reszty aminokwasowe — His 12 i His 119. JuŜ wcześniejsze badania chemiczne wskazywały na obecność tych 2 aminokwasów w miejscu katalitycznym enzymu. Obie reszty aminokwasowe znajdują się blisko miejsca wiąŜącego kwas urydylowy (ryc. 9-10).

411

Grupa fosforanowa

Ryc. 9-10. Struktura rybonukieazy określona za pomocą dyfrakcji promieni X. Liczby odpowiadają swoistym resztom aminokwasowym (p. teŜ ryc. 67).

(§) Ser 100 I \

Ala 107 f) Argt14

Asp 52 [ Glu 35 Ala 110 Ser 36

Ryc. 9-9. Schematyczne przedstawienie miejsca katalitycznego w okolicy bruzdy lizozymu. Punkty A—F przedstawiają reszty glikozydowe heksasacharydu. Pewne reszty aminokwasowe, lezące w okolicy bruzdy, są podane wraz z ich numerami w sekwencji lizozymu (według Koshlanda),_____

Wspólny motyw struktury pierwszorzędowej występuje w miejscach katalitycznych licznych enzymów hydrolitycznych Struktury pierwszorzędowe miejsc katalitycznych enzymów hydrolitycznych wykazują wiele podobieństw (tab. 9-1). MoŜe to oznaczać, Ŝe liczba mechanizmów, według których zachodzi rozrywanie wiązań w układach biologicznych, jest stosunkowo mała. W świetle tych podobieństw nie jest zaskakujące to, Ŝe sekwencje aminokwasów blisko miejsc katalitycznych tego samego enzymu, z róŜnych gatunków, wykazują nawet jeszcze większe podobieństwo.

100 / ROZDZIAŁ 9 Tabela 9-1. Sekwencje aminokwasów i sąsiedztwie miejsc katalitycznych kilku proteaz wołu . w stawiono regiony miejsca 30 stronie reszty serylowej (S) i histydylowej (H)* Przedkatalitycznego Sekwencja aminokwasów Enzym Sekwencja aminokwasów wokół seryny wokół histydyny ® (§ Trypsyna

DSC Q D G

Chymotrypsyna A S S C

D

G M G Q D (• >)

Chymotrypsyna B S S C M G D

G

=)

G DAC E G Q D Q >)

G PVV C

s GK

V V S A A ® C Y K

SG

G P LV

K KN

V V T A A ® G G V

TT

G

Q KN

V V T A A ® C G V

TT

c PLV c

G P F V M K SP V L T A A @ C LL Y P G * Reprodukowano za zgodą z: Dayhoff MO (red.) Atlas Sekwencji Białek i Struktury, t. 5, Narodowa Fundacja Badań Biomedycznych, 1972.

Trombina

W OGRANICZONYM ZAKRESIE TEMPERATUR SZYBKOŚĆ REAKCJI KATALIZOWANYCH ENZYMATYCZNIE ZWIĘKSZA SIĘ WRAZ ZE WZROSTEM TEMPERATURY Ma rycinie 9-11 przedstawiono wpływ temperatury na typową reakcję katalizowaną enzymatycznie. Szybkość reakcji początkowo się Optimum temperatury

Temperatura (°C) Ryc. 9-11. Wpływ temperatury da szybkość hipotetycznej reakcji katalizowanej enzymatycznie.

zwiększa, wraz ze wzrostem temperatury, z powodu zwiększenia energii kinetycznej reagujących cząsteczek. Ostatecznie energia kinetyczna enzymu przekracza jednak barierę energetyczną do rozerwania słabych wiązań wodorowych i hydrofobowych, które utrzymują ich strukturę drugo- i trzeciorzędową. W tej temperaturze denaturacji dominuje towarzysząca strąceniu strata aktywności katalitycznej enzymu. Dlatego enzymy wykazują optymalną temperaturę.

Niemniej nie jest to podstawowy parametr, poniewaŜ optymalna temperatura zaleŜy od czasu trwania próby uŜytej do jej określenia, tj. im dłuŜej enzym jest utrzymywany w temperaturze, w której jego struktura jest mało stabilna^ tym bardziej prawdopodobne jest to, Ŝe będzie zdenaturowany. Współczynnik temperatury lub Q1B jest to

czynnik, o który się zwiększa szybkość procesu biologicznego przy wzroście temperatury 0 10°C. Szybkość wielu procesów biologicz nych, np. szybkość skurczów izolowanego ser ca, w przybliŜeniu podwaja się wraz ze wzros tem temperatury o 10°C {QI0 =2). Dla większości enzymów optymalne temperatury są takie same lub wyŜsze od tych, jakie występują w miejscu ich działania, tj. w komórkach. Na przykład enzymy mikroorganizmów przystosowanych do wzrostu w naturalnych gorących źródłach mogą wykazywać optymalną temperaturę blisko temperatury wrzącej wody, pH WPŁYWA NA AKTYWNOŚĆ ENZYMU PRZEZ ZMIANĘ ŁADUNKU GRUPZJON1ZOWANYCH ENZYMU 1 CZĘSTO TAKśE SUBSTRATU Gdy aktywność enzymu zmierzy się w kilku wartościach pH, obserwuje się wówczas, Ŝe optymalna aktywność mieści się na ogói między wartościami pH 5,0—9,0, niemniej kilka enzymów, np. pepsyna, jest aktywnych przy wartościach pH wyraźnie wykraczających poza ten zakres. Kształt krzywych wyraŜających zaleŜność aktywności od pH określają następujące czynniki: 1. Denaturacja enzymu przy małych i duŜych wartościach pH.

ENZYMY: KINETYKA / 101 2. Zmiany w ładunku enzymu i (lub) sub-

stratów. W przypadku enzymu pH moŜe wrjłyr wać na J*ego aktyvjnaś£j^!^x3rirlar\c fltrnktuj; fub^przez zmianę ładunku reszty aminokwasowej, biorącej udział w przyłączaniu substratu lubwkata]izie. Aby to zilustrować, naleŜy wziąć pod uwagę ujemnie naładowany enzym (Enz~) reagujący z dodatnio naładowanym substratem (SH+): SH* Enz >EnzSH

Przy niskim pH Enz~ dąŜy do przyłączenia protonów i traci swój EnzH ładunek ujemny: Enz +

Przy wysokim pH SH + jonizuje i traci swój ładunek dodatni: SH+-S+ H

+

PoniewaŜ, z definicji, jedynymi formami, które będą wchodzić w interakcje są SH+ i Enz , krańcowe wartości pH będą zmniejszały skuteczne stęŜenie Enz~ i SH+, zmniejszając w ten sposób szybkość reakcji fryc. 9-12). Tylko na 100 Enz" Niskie

Ryc. 9-12. pH na aktywność

Wpływ

aktywności, W zaleŜności od ostrości tych zmian aktywność moŜe iub nie moŜe być przywrócona, gdy enzym powróci do swojego optymalnego pH.

JEśELI SUBSTRATY SĄ OBECNE W PRAWIE RÓWNO MOLOWYCH PROPORCJACH,SZYBKOŚĆ REAKCJI JEST PROPORCJONALNA DO STĘśENIA WSZYSTKICH SUBSTRATÓW W duŜych stęŜeniach substratów zarówno liczba cząsteczek mających dostateczną energię, aby reagować, jak i częstość ich zderzeń są duŜe. Ten stan utrzymuje się niezaleŜnie od tego, czy wszystkie cząsteczki, czy tylko ich część ma wystarczającą energię, aby reagować. Biorąc pod uwagę reakcję, w której uczestniczą 2 róŜne cząsteczki A i B: A+B-* AB podwojenie stęŜenia albo A albo B podwoi szybkość reakcji. Podwojenie stęŜenia zarówno A, jak i B zwiększy prawdopodobieństwo zderzenia 4-krotnie. Szybkość reakcji zwiększy się zatem 4-krotnie. Szybkość reakcji jest proporcjonalna do stęŜeń cząstek reagujących. Nawiasy pH kwadratowewysokie ([ ]) uŜyto do oznaczenia stęŜeń molowych*; a oznacza „proporcjonalny do". Określenie szybkości jest następujące:

enzymu.

Szybkość a [cząsteczki reagujące] lub

obszarze zakreskowanym na krzyŜ zarówno Enz, jak i S są we właściwym stanie jonowym i największe stęŜenie Enz i S są odpowiednio naładowane w punkcie X. Enzymy- mogą takie podlegać zmianom w konfqrmacjj_na skutek zmian pH. Grupy mające ładunek, dystalne w stosunku do regionu, w którym przyłącza się substrat, mogą być niezbędne do utrzymania aktywnej struktury trzecio- i czwartorzędowej. JeŜeli zmieni się ładunek elektryczny tych grup, białko moŜe się rozluźnić, stać się bardziej zbite lub dysocjować na podjednostki —wszystko to powoduje stratę

Szybkość a [A] [B] W przypadku gdy wyraŜeniem szybkości jest: Szybkość x [A] [B][B] lub Szybkość? [A] [BY Dla przypadku ogólnego, gdy n cząsteczek A reaguje z m cząsteczkami B nA+mB-AnBm wyraŜeniem szybkości jest: Szybkość oc [A]n[B]m * Ściślej mówiąc, powinny być uŜyte raczej aktywności molowe niŜ stęŜenia molowe.

102 / ROZDZIAŁ 9 STAŁA RÓWNOWAGI JEST STOSUNKIEM STAŁYCH SZYBKOŚCI REAKCJI PRZEBIEGAJĄCEJ DO PRZODU I REAKCJI ODWROTNEJ PoniewaŜ wszystkie reakcje chemiczne są odwracalne, dla reakcji odwrotnej, gdzie AnBra tworzy n cząsteczek A i m cząsteczek B An^n, - nA+mB odpowiednim wyraŜeniem szybkości jest: Szybkość a [AnBm] Odwracalność wyraŜa się podwójnymi strzałkami; nA + mB ^± A„Bm

To wyraŜenie czyta się: ,,n cząsteczek A i m cząsteczek B jest w równowadze z AnBm". Symbol a „proporcjonalny do" moŜna zastąpić znakiem równości, wstawiając stalą proporcjonalności k, charakterystyczną dla danej reakcji. Dla przypadku ogólnego nA + mB j± AnBm

wyraŜeniami szybkości dla reakcji przebiegającej w prawo (szybkośćj) i reakcji w lewo (szybkość_,) są: m Szybkość,= k1[A]"[B] i Szybkość, = k_,rAnBm] Gdy szybkości reakcji przebiegającej w prawo i odwrotnie są równe, mówi sie, Ŝe system jest w stanie równowagi, tj. Szybkość^ Szybkość.,

wtedy

n

4. Stałą równowagi moŜna wyrazić liczbowo, jeśli są znane stęŜenia A, B i \„BW w stanie równowagi.

Standardową zmianę wolnej energii (AG ) dla danej reakcji moŜna obliczyć ze stałej równowagi Związek stałej równowagi z AG" jest następujący: ZiG^-RTInK^,

R jest stałą gazową i T — temperaturą bezwzględną. PoniewaŜ są one znane, znajomość wartości liczbowej K^ umoŜliwia wyliczenie war-

tości AG°. JeŜeli stała równowagi jest większa od 1, reakcja jest spontaniczna, tj. przewaŜa reakcja zachodząca zgodnie z zapisem (od strony lewej do prawej). JeŜeli jest ona mniejsza od 1, to kierunek przebiegu reakcji jest przeciwny, tzn. jest bardziej prawdopodobne, Ŝe reakcja będzie przebiegała od strony prawej do lewej. JednakŜe naleŜy zauwaŜyć, Ŝe chociaŜ stała równowagi reakcji wskazuje kierunek, w którym reakcja zachodzi samorzutnie, to nie wskazuje,

czy będzie ona przebiegać szybko, tj. nie mówi ona nic o wielkości bariery energetycznej dla

reakcji (czyli o AGF; patrz powyŜej). To wypływa z faktu, Ŝe K^ określa AG", która —• co wykazano uprzednio — dotyczy tylko stanu początkowego i końcowego. Szybkość reakcji zaleŜy od wielkości bariery energetycznej, a nie od wartości AG".

Wiele czynników wpływających na szybkość reakcji katalizowanych przez enzymy działa przez zmianę miejscowego stęŜenia substratu.

m

k1[A] [B] =k_1[AnBm] o

[A]"[B] Stosunek kj do k , nazwano stalą równowagi, K^,. NaleŜy zapamiętać następujące waŜne właściwości układu w stanie równowagi: 1. Stała równowagi jest stosunkiem stałych szybkości reakcji ki/k_t. 2, W stanie równowagi szybkości reakcji (nie stałe szybkości reakcji) w obie strony są równe. 3. Równowaga jest stanem dynamicznym.

ChociaŜ w stanie równowagi nie zachodzi Ŝadna zmiana netto w stęŜeniu cząsteczek substratu i produktu, A i B nieustannie przechodzą w A„Bm i odwrotnie.

Enzymy nie wpływają na stałe równowagi reakcji, które katalizują Enzym jest związkiem reagującym, który łączy się z substratem, tworząc kompleks enzym—substrat — EnzS, który rozkłada się, tworząc produkt P i wolny enzym. W najprostszej formie moŜe to być przedstawione następująco k. Enz+ S ^ Podczas gdy wyraŜenia określające szybkość dla reakcji zachodzącej w prawo, odwrotnej i reakcji ogólnej zawierają składnik [Enz], Enz+ S ^ Enz+ P ■ •M Szybkość = k-, [Enz] [S]

ENZYMY: KINETYKA / 103 Szybko4ć_i= k., [Enz] [PJ

V

------- '

to w wyraŜeniu dla całkowitej stałej równowagi [Enz] znosi się. K

= k, _ [En»] [P] = [P] •*" IM [Enz] [S] [S]

StęŜenie enzymu nie ma zatem Ŝadnego wpływu

na stałą równowagi. Mówiąc inaczej, skoro enzymy wpływają na szybkość reakcji, a nie na stałą szybkości, nie mogą one wpływać na K.^, która jest stosunkiem starych szybkości. K^ reakcji jest taka sama bez względu na ta, czy równowaga jest osiągana w wyniku (lub bez) katalizy enzymatycznej (naleŜy sobie przypom-

nieć AG"). Enzymy zmieniają drogę reakcji, ale nie wpływają na początkowe i końcowe równowaŜne stęŜenia substratów i produktów, czynników, które determinują K^i AG°. SZYBKOŚĆ POCZĄTKOWA REAKCJI KATALIZOWANEJ PRZEZ ENZYM JEST WPROST PROPORCJONALNA DO STĘśENIA ENZYMU Szybkość początkowa reakcji jest to szybkość mierzona przed utworzeniem dostatecznej ilości produktu, pozwalającej na zachodzenie reakcji odwrotnej. Szybkość początkowa reakcji katalizowanej przez enzym jest zawsze proporcjonalna do stęŜenia enzymu. NaleŜy jednak zanotować, Ŝe to stwierdzenie odnosi się tylko do szybkości początkowej. W WIELU SYTUACJACH OZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM STĘśENIE SUBSTRATU WPŁYWA NA SZYBKOŚĆ REAKCJI KATALIZOWANEJ ENZYMATYCZNIE Reakcje enzymatyczne są tak rozpatrywane, jeŜeli mają 1 substrat i 1 produkt. Mimo Ŝe istnieje taki przypadek dla pewnych reakcji katalizowanych enzymatycznie, większość reakcji enzymatycznych ma 2 lub więcej substratów i produktów. Uwaga ta jednak nie uniewaŜnia omówienia. JeŜeli zwiększa się stęŜenie substratu [S], a wszystkie inne warunki pozostają nie zmienione, to mierzona szybkość początkowa V; (szyb-

kość mierzona wtedy, kiedy przereagowało bardzo mało substratu) zwiększa się do wartości

-/f r! .

c~

TL

J 2 .

•V

/A!

Ti

. . .

■

I

I

1

Ryc. 9-13. Wpływ stęŜenia substratu na szybkość reakcji katalizowanej enzymatycznie.

maksymalnej — Ym^ i nie przekracza jej (ryc. 9-13). Szybkość reakcji zwiększa się wraz ze zwiększeniem stęŜenia substratu, aŜ do momentu, gdy enzym jest „nasycony"' substratem. Mierzona szybkość początkowa osiąga wartość maksymalną i nie ma na nią wpływu dalsze zwiększanie stęŜenia substratu, poniewaŜ substrat występuje w duŜym nadmiarze molowym w stosunku do enzymu. Na przykład, jeŜeli enzym o masie cząsteczkowej 100 000 działa na substrat o masie cząsteczkowej 100 i oba związki występują w stęŜeniu 1 mg/ml, to 1000 mol. substratu przypada na kaŜdy mol enzymu. Bardziej realistyczne są niŜej podane proporcje wagowe enzymu do substratu: 9

[Enz]=0r1 ng/ml=1(T mol 3

[S]= 0,1 mg/ml=10~ mol

co daje 106 mol więcej substratu w stosunku do enzymu. Nawet jeŜeli [S] zmniejszy się 100-krotnie, substrat jest w dalszym ciągu w 10000-krotnym molowym nadmiarze w stosunku do enzymu. Sytuacje w punktach A, B i C 7. ryc. 9-13 są przedstawione na ryc. 9-14. W punktach A i B tylko część enzymu łączy się z substratem, jakkolwiek jest duŜo więcej cząsteczek substratu niŜ enzymu. Dzieje się tak dlatego, Ŝe stała równowagi dla reakcji Enz+S ^ EnzS (tworzenie kompleksu EnzS) nie jest nieograniczenie duŜa. W punkcie A lub B zwiększenie lub zmniejszenie [S] będzie zwiększać lut) zmniejszać ilość enzymu związanego z S, jako EnzS, i vf będzie zatem zaleŜeć od |S|.

W punkcie C zasadniczo wszystkie cząsteczki enzymu łączą się z substratem tak, Ŝe dalsze zwiększenie [S], chociaŜ zwiększa częstość zde-

104 / ROZDZIAŁ 9

ćT*

.Q

w

Być. 9-14. Przedstawienie enzymu przy maiym (A), duŜym (C)i przy stęŜeniu substratu równym Km (B). Punkty A, B i C odpowiadają punktom z ryc. 9-13. ■ _________________

rŜeń między Enz i S, nie moŜe spowodować zwiększenia szybkości reakcji, skoro nie ma wolnych cząsteczek enzymu, które mogłyby reagować. Przypadek B opisuje sytuację o duŜym znaczeniu teoretycznym, w której dokładnie połowa cząsteczek enzymu jest „wysycona" substratem. Szybkość równa się połowie szybkości maksymalnej (Vmaks/2), która mogłaby być osiągnięta przy danym stęŜeniu enzymu. Równanie Michaelisa-Menten obrazuje wpływ stęŜenia substratu na szybkość wielu reakcji katalizowanych enzymatycznie StęŜenie substratu, które powoduje osiągniecie potowy szybkości maksymalnej, określane wartością Km lub stalą Michaelisa, moŜna oznaczyć doświadczalnie przez graficzne przedstawienie Vj jako funkcji [S] (ryc. 9-13). Km ma wymiary

stęŜenia molowego. Gdy [S] jest prawie równe Km, wówczas V; bardzo reaguje na zmiany [S] i enzym działa z dokładnie połową szybkości maksymalnej. W rzeczywistości wiele enzymów ma wartości K.m zbliŜone do fizjologicznego stęŜenia ich substratów. Równanie Michaelisa-Menten Vl

V.nak..[S] Km + [S]

opisuje zachowanie się wielu enzymów przy zmieniającym się stęŜeniu substratu. Na podstawie równania Michaelisa-Menten zaleŜność początkowej szybkości reakcji katalizowanej przez enzym od [S] i od Kra moŜna przedstawić następująco:

1. Gdy [S] jest znacznie mniejsze od Km (punkt

A na ryc. 9-13 i 9-14). Dodanie [S] do K™ w mianowniku zmienia bardzo niewiele jego wartość, tak Ŝe wyraŜenie [S] moŜna w mianowniku pominąć. PoniewaŜ W^^. i Km są stałe, moŜna zastąpić ich stosunek nową stałą, K: v.

. [S]

[S]' Vj

^

[S]~K[S]

(~ oznacza „prawie równa się"). Innymi słowy, jeŜeli stęŜenie substratu jest znacznie mniejsze od tego, które jest wymagane do uzyskania połowy szybkości maksymalnej (wartość Kra), to szybkość początkowa vt zaleŜy od stęŜenia substratu [S|. 2. Gdy |S| jest znacznie większe od Km (punkt

C na ryc. 9-13 i ryc. 9-14). Dodanie K„ do [S] w mianowniku zmienia wartość mianownika bardzo niewiele, tak Ŝe wyraŜenie Km moŜna w mianowniku pominąć: "maha.

Km+[S]

[S]

Oznacza to, Ŝe jeŜeli stęŜenie substratu [Sj znacznie przewyŜsza wartość K„, to szybkość początkowa Vj jest szybkością maksymalną, 'ntaks.'

3. Gdy ISJ = *Cm (punkt B na ryc. 9-13 i ryc. 914),

' Km+ [S]

2[S]

ENZYMY: KINETYKA / 105

Oznacza to, Ŝe jeŜeli stęŜenie substratu jest równe wartości Krai to szybkość początkowa \-, równa się połowie szybkości maksymalnej. To takŜe wskazuje, jak oznaczyć Km, a mianowicie trzeba określić doświadczalnie stęŜenie substratu, przy którym początkowa szybkość stanowi połowę szybkości maksymalnej. Aby określić wartość Km i Vmaks. równanie Michaeiisa-Menten jest tak przekształcane, aby wykres stanowiła linia prosta PoniewaŜ dla wielu enzymów krzywa nasycenia nie pozwala na łatwe określenie Vm!lk5 (i stąd Kw), kiedy V; jest wykreślone względem [S], wygodniej jest przekształcić równanie Michaelisa-Menten tak, aby uprościć wyznaczenie Km i Ymats.- Równanie Michaeiisa-Menten moŜna odwrócić i przekształcić następująco:

nych odwrotności, tj. odwrotność ¥|(1/Vj) jest wykreślona względem odwrotności [S] (1/[SJ). Z wykresu podwójnych odwrotności lub wykresu Lineweavera-Burka moŜna określić Km (ryc. 915), wykorzystując albo nachylenie krzywej i odcinek na osi y, albo odcinek na ujemnej

C. 9-15. Podwójna odwrotność albo wykres Lineweavera-Burka zaie2ności 1/v względem 1/[S] wykorzystywany do określenia Km i y^k,,,.

Vmakl. [S] V| =

po odwróceniu [SJ [S]

po przekształceniu: 1

Km

1 [S]

Vraak.. [S]

po uproszczeniu: Km

1

1 ■ + ■

vi

VmakB,

[S]

Vmaks. Jest

to równanie linii prostej y =a ■x+b

gdzie:

części osi x. Skoro [S] jest wyraŜone w stęŜeniu molowym, wymiarem Km jest stęŜenie molowe lub liczba mol na litr. Szybkość V; moŜna wyrazić w dowolnych jednostkach, poniewaŜ Kra nie zaleŜy od [EnzJ. Technika podwójnych odwrotności wymaga stosunkowo niewielu punktów dla określenia Km i jest metodą najczęściej uŜywaną do wyznaczenia K„,. Doświadczalnie wykorzystanie równania Linę weavera-Burka do wyznaczenia Km moŜe spowodować nieuzasadnione połoŜenie nacisku na dane otrzymane przy małych stęŜeniach substratu. Dzieje się tak wówczas, gdy stęŜenia substratu, wybrane do badania, róŜnią się stałą przyrostu. Ta niedogodność moŜe być ominięta przez selekcjonowanie odwrotności stęŜeń substratów, które róŜnią sie stałą przyrostu. Innym podejściem do doświadczalnego wyznaczenia Km i Vmaks jest podejście Eadie i Hofstee. Równanie Michaeiisa-Menten moŜe być przekształcone:

y= — z aś x = [S]

JeŜeli y lub l/v, jest wykreślony jako funkcja x lub l/[S], to b jest równe l/VmakSi na osi y, a kąt nachylenia a jest równy K.aJVaiaks.- Ujemny odcinek na osi x moŜna określić przez przyjęcie y = 0. Wtedy x = - — = Km

Taki wykres jest nazwany wykresem podwój-

Aby wyznaczyć Km i Y,,^. wykreśla się Vj/[S] (oś y) wobec \, (oś x). Miejsce przecięcia osi y wyznacza wówczas Vmaks /Km, a miejsce przecięcia osi x Vmaks.. Nachylenie jest - 1/Km. Zarówno podejście Linweavera-Burka i Eadie-Hofstee są uŜyteczne w wybranych przypadkach, natomiast dokładne wyznaczenie K m i Vm!,ks. wymaga opracowania statystycznego.

106 / ROZDZIAŁ 9

Wartości K,,,, oprócz ich uŜyteczności w interpretacji mechanizmów reakcji katalizowanych enzymatycznie, mają duŜe znaczenie praktyczne. Przy stęŜeniu substratu 100-krotnie przewyŜszającym K m, enzym będzie działał w zasadzie z maksymalną szybkością i dlatego maksymalna szybkość (Vmiks) będzie odzwierciedlała ilość obecnego aktywnego enzymu. Taka sytuacja jest ogólnie poŜądana w badaniach enzymów. Wartość Km wskazuje, ile substratu natęŜy uŜyć w celu pomiaru VMkŁ. Technika podwójnych odwrotności znajduje takŜe szerokie zastosowanie w ocenie inhibitorów enzymów. W szczególnych przypadkach Km moŜe być zbliŜona do stałej przyłączania

Powinowactwo enzymu do substratu jest równe odwrotności stałej dysocjacji—Kd kompleksu enzym-substrat (EnzŚ). ■_

Enz + S ;===* EnzS k-.

wtedy k*

W tych warunkach 1/Kro = 1/K^ = powinowactwo. JeŜeli k2 + k_t ^ k_! to 1/K.m zbyt nisko oceni powinowactwo RÓWNANIE HILLA PRZEDSTAWIA WPŁYW STĘśENIA SUBSTRATU NA ENZYMY ALLOSTERYCZNE

Pewne enzymy i inne białka przyłączające ligandy, takie jak hemoglobina, nie działają zgodnie z klasyczną kinetyką nasycenia Michaelisa-Menten. JeŜeli [S] wykreśli się względem Vj, to krzywa nasycenia jest sigmoidalna (ryc. 916). Ogólnie wskazuje to na kooperatywne

Mniejsza tendencja substratu i enzymu do dysocjacji wskazuje na większe powinowactwo enzymu do substratu. Wartość Km enzymu dla jego substratu moŜe równieŜ słuŜyć do pomiaru jego Kd. Jednak, aby to było prawdziwe, załoŜenie dokonane w przekształceniu wyraŜenia Michaelisa-Menten musi być słuszne. Przekształcenie zakłada, Ŝe pierwszy etap reakcji katalizowanej enzymatycznie Enz + S~±EnzS k-i

jest szybki i zawsze w równowadze. Innymi słowy, szybkość dysocjacji EnzS do Enz + S musi być duŜo większa od szybkości dysocjacji enzym + produkt; k2 Enz S

' Enz + P k-2

W wyraŜeniu Michaelisa-Menten [S], które daje Vj = Vmik!./2 wynosi

Ale kiedy

-i >>

0

[S]

8

Ryc. 9-16. Sigmoidalna kinetyka nasycenia.

przyłączenie substratu do licznych miejsc. Przyłączenie w jednym miejscu wpływa na przyłączenie w innych miejscach, jak opisano w rozdz. 7 dla hemoglobiny. W przypadku sigmoidalnej kinetyki nasycenia enzymu substratem, omówione powyŜej metody graficznej oceny stęŜenia substratu, które powoduje osiągnięcie połowy szybkości maksymalnej, są nie wartościowe (brak linii prostych). Aby ocenić sigmoidalna kinetykę nasycenia, moŜna wykorzystać graficzne przedstawienie równania Hilla, równania, które pierwotnie wyprowadzono, aby opisać kooperatywne

ENZYMY: KINETYKA / 107

przyłączenie O2 do hemoglobiny. Opisane w formie linii prostej równanie Hilla jest następujące: V;

log = nlog [S] - log k'

gdzie k' jest stalą złoŜoną. Z równania wynika, Ŝe kiedy [S] jest małe w porównaniu z k', to szybkość reakcji zwiększa się jako n-ta potęga [S]. Na rycinie 9-17 przedstawiono wykres Hilla Log [S]

I Nachylenie ■ n

-3

Ryc. S-17. Graficzna ocena równania Hilla w celu oznaczenia stęŜenia substratu, przy którym szybkość, osiąga potowe szybkości maksymalnej. Stosowana wówczas, gdy kinetyka nasycenia substratem jest sigmoidalna.

danych kinetycznych dla enzymu z kinetyką wiązania kooperatywnego. Wykres Vj/VmaiŁ—vj względem log [S] daje linię prostą o nachyleniu = n, gdzie n jest parametrem empirycznym, którego wartość zaleŜy od liczby miejsc wiąŜących substrat oraz liczby i typu interakcji między tymi miejscami. Kiedy n = 1, miejsca wiązania działają niezaleŜnie jedno od drugiego. JeŜeli n > 1, to miejsca są kooperatywne i przy większej wartości n kooperatywność jest silniejsza i wtedy bardziej „sigmoidalne" są kinetyki nasycenia. JeŜeli n
RÓśNICA MIĘDZY KOM PETYCYJNYMI I NIEKOMPETYCYJNYMI INHIBITORAMI ENZYMÓW POLEGA NA TYM, CZY ZWIĘKSZAJĄCE SIĘ STĘśENIE SUBSTRATU USUWA HAMOWANIE ChociaŜ rozróŜnia się inhibitory aktywności enzymatycznej w zaleŜności od tego, czy hamowanie ustępuje lub nie w wyniku zwiększenia stęŜenia substratu, to jednak wiele inhibitorów nie wykazuje idealnych właściwości czysto kompetycyjnego i niekompetycyjnego hamowania omawianego poniŜej. Innym sposobem klasyfikacji inhibitorów jest podział według ich miejsca działania. Miektóre z nich wiąŜą się z enzymem w tym samym miejscu co substrat (miejsca katalityczne); inne wiąŜą się w innym miejscu (miejsce allosteryczne) z dala od miejsca katalitycznego.

Inhibitory kompetycyjne wykazują ścisłe podobieństwo strukturalne do substratu Klasyczne hamowanie kompetycyjne zachodzi w miejscu wiązania substratu (katalitycznym). Chemiczna struktura inhibitora, analoga substratu (I), ogólnie przypomina strukturę substratu (S). Łączy się on zatem odwracalnie z enzymem, tworząc kompleks enzym-inhibitor (Enzl), a nie kompleks EnzS. Gdy jest obecny zarówno substrat, jak i ten typ inhibitora, wówczas współzawodniczą one ze sobą o te same miejsca wiązania na powierzchni enzymu. Najlepiej zbadanym przypadkiem hamowania kompetycyjnego jest para: malonian (I) i bursztynian (S) w stosunku do dehydrogenazy bursztynianowej. Dehydrogenaza bursztynianowa katalizuje tworzenie fumaranu przez usunięcie po jednym atomie wodoru z kaŜdego atomu ot-węgla bursztynianu (ryc. 9-18).

H H-CCOO-

OOC-Ć-H

H-C-COO

-2H

■-OOC-C-H

IH

DEHYDROGENAZA BURSZTYNIANOWA Bursztyn lan

Fu maran

Ryc. 9-18. Reakcja dehydrogenazy bursztynianowej.

108 / ROZDZIAŁ 9

Malonian ("OOC-CH 2 -COO") moŜe łączyć się z dehydrogenazą, tworząc kompleks EnzI. Maionian nie moŜe ulec odwodorowaniu, gdyŜ nie ma Ŝadnego sposobu, aby usunąć nawet jeden atom H z pojedynczego atomu węgla a bez utworzenia pięcio wartościowe go atomu węgla. Jedyną reakcją, której moŜe podlegać kompleks EnzI jest rozpad z powrotem na wolny enzym i inhibitor. Dla reakcji odwracalnej EnzI tEnz + I

stała równowagi K= =

wynosi [I] [EnzIJ

Działanie inhibitorów kompetycyjnych moŜna zrozumieć w formie następujących reakcji: ■ Enzl (nieaktywny) » Enz + P 'EnzS (aktywny) -> Enz+ p

Enz

Szybkość tworzenia produktu, to co jest głównie mierzone, zaleŜy wyłącznie od stęŜenia EnzS. ZałóŜmy, Ŝe I przyłącza się do enzymu bardzo silnie (Ks = mała liczba). W takiej sytuacji jest mało wolnego enzymu (Enz) dostępnego do połączenia się z S, aby utworzyć EnzS i ewentualnie Enz+P. Szybkość reakcji (tworzenie P) będzie bardzo mała. Z analogicznych powodów równe stęŜenie słabiej wiązanego inhibitora (Kj = większa liczba) nie zmniejszy tak znacznie szybkości katalizowanej reakcji. Przypuśćmy, Ŝe przy stałym stęŜeniu I doda się więcej S. Zwiększy to prawdopodobieństwo, Ŝe Enz będzie raczej łączył się z S niŜ z I. Wzrośnie stosunek EnzS do EnzI, a takŜe szybkość reakcji. Przy dostatecznie duŜym stęŜeniu S, stęŜenie Enzl powinno być znikomo małe. JeŜeli tak jest, to szybkość katalizowanej reakcji będzie taka sama, jak w nieobecności I (ryc. 9-19). Efektywność róŜnych inhibitorów kompetycyjnych jest oceniona przez wykres podwójnych odwrotności 1/v ; względem 1/[S] Rycina 9-19 przedstawia typowy przykład hamowania kompetycyjnego pokazany graficznie w formie wykresu Lineweavera-Burka. Przy stałym stęŜeniu inhibitora mierzono szybkość reakcji (v,) przy róŜnych stęŜeniach S. Linie przeprowadzone przez punkty doświadczalne zbiegają się przy osi y. PoniewaŜ odcinek na osi

Ryc. 9-19. Wykres Linevueavera-Burka klasycznego kompetycyjnego hamowania. NaleŜy zauwaŜyć całkowite zwolnienie hamowania przy duŜym [S] (małe.1/[S]). y odpowiada 1/V mats, to świadczy o tym, Ŝe przy nieograniczenie duŜym stęŜeniu S (1/|S] = O), Vj jest taka sama, jak w nieobecności inhibitora.

Jednak odcinek na osi x (który odpowiada Km) zmienia się wraz ze stęŜeniem inhibitora i staje się większą liczbą {— 1/Kra jest mniejszy niŜ — 1/K^,) w obecności inhibitora. W ten sposób inhibitor kotnpetycyjny zwiększa Km (Kń) sub-

stratu. PoniewaŜ Km jest stęŜeniem substratu, w którym stęŜenie wolnego enzymu jest równe stęŜeniu enzymu występującego jako EnzS, spora ilość wolnego enzymu moŜe się łączyć z inhibitorem. W przypadku prostego hamowania kompetycyjnego miejsce przecięcia na osi x daje się przedstawić

Km moŜe być oznaczone w nieobecności I, a K; określa się wykorzystując powyŜsze równanie. JeŜeli liczba moli dodanego I jest duŜo większa niŜ liczba moli obecnego enzymu, to stęŜenie I moŜna przyjąć jako stęŜenie (znane) dodanego inhibitora. Wartości Ks dla serii inhibitorów (kompetycyjnych) będących analogami substratów wykazują, które z nich są najbardziej efektywne. Przy małych stęŜeniach największy stopień zahamowania będą powodowały inhibitory o najmniejszych wartościach Kj.

Wiele skutecznych klinicznie leków działa jako inhibitory kompetycyjne waŜnych enzymów w komórkach mikroorganizmów i zwierząt.

ENZYMY: KINETYKA / 109

Odwracalne niekompetycyjne inhibitory zmniejszają Vmaki.' ale nie wpływają na Km Jak sama nazwa wskazuje, w tym przypadku nie ma konkurencji między S i I. Inhibitor zazwyczaj nie wykazuje Ŝadnego albo małe podobieństwo do S i moŜna przyjąć, Ŝe wiąŜe się z inną domeną enzymu. Odwracalne niekompetycyjne inhibitory zmniejszają szybkość maksymalną, osiągalną przy danej ilości enzymu (zmniejszają Vraaka), ale zazwyczaj nie wpływają na

Km. PoniewaŜ I i S mogą łączyć się w róŜnych miejscach, jest moŜliwe tworzenie zarówno kompleksów Enzl, jak i EnzIS. PoniewaŜ EnzIS moŜe się rozpaść, tworząc produkt z mniejszą szybkością niŜ EnzS, reakcja moŜe być spowolniona, ale nie zatrzymana. Mogą zachodzić następujące reakcje EnzIS -> Enz +P konkurencyjne: ±1

±1 Enz

JeŜeli S ma takie samo powinowactwo zarówno do Enz, jak i do Enzl (I nie wpływa na powinowactwo Enz do S), to otrzymuje się wyniki przedstawione na ryc. 9-20 w formie wykresu zaleŜności l/vj względem 1/ [S] w obecności i nieobecności inhibitora. (Zakłada się, Ŝe po przyłączeniu I nie ma Ŝadnych waŜnych zmian w konformacji miejsca aktywnego).

jony metali cięŜkich (Ag+, Hg2+), czynniki utleniające itd. PoniewaŜ te inhibitory nie wykazują strukturalnego podobieństwa do substratu, zwiększenie stęŜenia substratu na ogół nie zmniejsza tego hamowania. Obecność jednego lub więcej substratów lub produktów moŜe chronić enzym przed inaktywacją. Omawiana powyŜej analiza kinetyczna moŜe być niewystarczająca do odróŜnienia przedstawionych trucizn od odwracalnych inhibitorów niekompetycyjnych. W kaŜdym razie odwracalne niekompetycyjne hamowanie zdarza się rzadko. Niestety nie jest to zawsze uchwycone, poniewaŜ zarówno odwracalne, jak i nieodwracalne hamowanie niekompetycyjne wykazuje podobną kinetykę. AKTYWNOŚĆ KLUCZOWYCH ENZYMÓW MOśE BYĆ REGULOWANA PRZEZ POZYTYWNE I NEGATYWNE CZĄSTECZKI MODULATOROWE Małe cząsteczkowe modulatory, które zmniejszają aktywność katalityczną, są określane jako modulatory negatywne, a te, które zwiększają aktywność, są nazywane modulatorami pozytywnymi. To zagadnienie jest omawiane w następnych rozdziałach.

PIŚMIENNICTWO

■*

0

_L (Sl Ryc. 9-20. Wykres Lineweavera-Burka odwracalnego nie kom petycyjnego hamowania.

Wiele „trucizn" działa jako nieodwracalne, ni ekom petycyjne inhibitory aktywności enzymatycznej Aktywność enzymatyczną redukują działające na enzymy „trucizny", np. jodoacetamid,

Bender ML, Bergeron RJ, Komiyama M: The Bioorganić Chemistry of Enzymatic CataJysia. Wiley-[nierscience, 1984. Cabral F, Barlow SB; Mechanisms by which mammalian cells aequire resistance to drugs that affect microLubule assembly. FASEB J 1988;3:1593. CechTR: RNA as anenzyme. Sci Amer 1986;255:64. Dugas H, Penny C: Bioorganic Chemistry: A Chemicat ApproachtoEnzyme Action. Springer-Verlag, 1981. Fersbt AR, Leatherbarrow RJ, Wells TNC: Binding energy a.nd catalysis: a lesson from protein engineering of the tyrosyl-tRNA synthetase. Trendu Biochetn Sci 1986;11:321. Freeman RB, Hawkins HC (editors): Tne Enzymology of PosttransiatiOrial ModiftcatiOn ofProteins, Academic Press, 1985. Segel IH: Emyme Kinetks. Wiley, 1975. Walsh CT: Suicide substrates, mechanism-based enzyme inactivators; recent dcvelopments. Amiu Rev Biochem 1984;53:493. Patrz takŜe piśmiennictwo w rozdz. 7.

10

Enzymy: mechanizmy działania

Yictor W, Rodwell, PhD

WPROWADZENIE W rozdziale tym, w celu zilustrowania zasad reakcji enzymatycznych, przedstawiono w szczegółach reakcję katalizowaną przez enzym proteolityczny chymotrypsynę.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Przedmiotem badań mechanizmów działania enzymów są zmiany molekularne towarzyszące przekształceniu substratu w produkt. Rokują one wielką nadzieję na właściwy sposób postępowania podczas leczenia, jak równieŜ opracowywania leków. Wyniki anaiizy rentgenograficznej struktury białek, w połączeniu z danymi odnośnie do mechanizmów katalizy enzymatycznej, juŜ obecnie umoŜliwiają opracowywanie ieków hamujących swoiste enzymy, takie jak reduktaza HMG-CoA, która reguluje biosyntezę cholesterolu. Badania te sugerują równieŜ sposób wykorzystania technik rekombinacji DNA oraz ukierunkowanej mutagenezy w celu zmodyfikowania swoistości i (lub) aktywności katalitycznej enzymu. Techniki te zapewnię ułatwią wprowadzenie enzymów o Ŝądanych właściwościach.

Tyr, Trp) lub z aminokwasów z duŜą grupą niepolarną R (Met). Podobnie jak wiele innych proteaz, chymotrypsyna katalizuje hydrolizę niektórych estrów. ChociaŜ zdolność chymotrypsyny do katalizowania hydrolizy estrów nie jest istotna z fizjologicznego punktu widzenia, umoŜliwia ona badania mechanizmu katalizy enzymatycznej. Zmiany molekularne zachodzące podczas katalizy określane są mianem „intermediary enzymology". Syntetycznym substratem, pozwalającym na kolorymetryczną analizę aktywności chymotrypsyny, jest octan />-nitrofenylu (ryc. 10-1).

Ryc. 10-1. Octan p-mtrofenylu

W wyniku hydrolizy octanu p-nitroienylu uwalnia się/f-nitrofenol, który w środowisku zasadowym przekształca się w Ŝółty anion^-nitrofenolanowy.

MECHANIZM DZIAŁANIA CHYMOTRYPSYNY ILUSTRUJE OGÓLNE CECHY KATALIZY ENZYMATYCZNEJ

KINETYKA REAKCJI „STOP-FLOW" UJAWNIŁA MECHANIZM DZIAŁANIA CHYMOTRYPSYNY

Chymotrypsyna katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, w których grupa karboksylowa pochodzi z aminokwasów aromatycznych (Phe,

Kinetykę reakcji hydrolizy octanu /J-nitrofenylu moŜna badać za pomocą aparatu „stop-tiow". W doświadczeniach „stop-flow" ilość enzymu odpowiada ilości substratu (w przy-

ENZYMY: MECHANIZMY DZIAŁANIA / 111

bliŜeniu równomolowe ilości enzymu i substratu), a oznaczenie dotyczy zdarzeń zachodzących w pierwszych kilku milisekundach po zmieszaniu enzymu i substratu. Aparat „stop-flow" jest wyposaŜony w 2 strzykawki: jedna przeznaczona na chymotrypsynę, a draga na octan />-nitrofenylu. Natychmiastowe zmieszanie enzymu i substratu następuje za pomocą urządzenia mechanicznego, które szybko i równocześnie usuwa zawartość obu strzykawek do jednej, wąskiej probówki. Probówka przesuwa się przez spektrofotometr i wartość absorbancji, jako funkcja czasu, ukazuje się na ekranie oscyloskopowym.

w kategoriach kolejnych etapów katalizy przedstawionych na ryc. 10-3, Wolny etap reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę odpowiada hydrolizie kompleksu chymotrypsyna-octan (CTAc) Z chwilą związania chymotrypsyny w kompleks CT-Ac dalsze uwalnianie anionu p-nitrofenolanowego zaleŜy od regeneracji wolnej chymotrypsyny w wyniku hydrolizy tego kompleksu (ryc. 10-3). Faza szybka uwalniania anionu /7-nitrofenolanowego (ryc. 10-2) odpowiada przekształceniu całej dostępnej chymotrypsyny w kompleks CT-Ac, z równoczesnym uwolnieniem anionu/>-nitrofenolanowego. Następujące po niej dalsze odszczepianie anionu p-nilTO fenol ano wego (PNP) jest uzaleŜnione od wolnego odzyskiwania chymotrypsyny z kompleksu CT-Ac. Uwolniona chymotrypsyna ponownie reaguje z PNP, tworząc kompleks CT-Ac i anion /j-nitrofeno łanowy. Szybkość reakcji w fazie szybkiej (tj. liczba moli uwolnionego anionu jc-nitrofen o łanowego) jest wprost proporcjonalna do liczby moli chymotrypsyny w momencie rozpoczęcia reakcji.

Uwalnianie anionu p-nitrof enolanowego ma charakter dwufazowy Uwalnianie anionu /j-nitrofenolanowego przebiega w 2 wyraźnych fazach (ryc. 10-2): 1)

Faza stacjonarna

Kluczową rolę w reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę odgrywa seryna 195 W kompleksie CT-Ac grupa acylowa jest połączona z bardzo reaktywną resztą seryny, znajdującą się w pozycji 195 chymotrypsyny. Dowodem szczególnej roli i duŜej reaktywności Ser 195 (w porównaniu z pozostałymi 27 resztami serynowymi chymotrypsyny) jest jej reakcja z diizopropylofluorofosforanem (DIPF) (ryc. 10-4). Przyłączenie DIPF do Ser 195 powoduje inaktywację chymotrypsyny. Analogicznie inaktywacji przez DIPF ulega wiele innych proteaz określanych mianem proteaz sery nowych.

i

i Czas (ms)

Ryc. 10-2. Kinetyka uwalniania anionu p-nitrofenolanowego w wyniku hydrolizy octanu /)-nitrofenytu katalizowanej przez chymotrypsynę. Ilość „uwolnionego fenolu" wyliczono na podstawie absorbancji.

w fazie szybkiego uwalniania i 2) następującej po niej fazie wolniejszego uwalniania dalszych anionów />-nitrofen olano wy ch. Dwufazowy charakter uwalniania anionu /7-nitrofenolanowego jest w pełni zrozumiały Fenol

CT + PNP

CT-PNP Szybko

■J t Szybko

Ac

*■ CT-Ac

-^-------- ^ -

CT

Wolne

Ryc. 10-3. Pośrednie etapy hydrolizy octanu p-nitrofenylu katalizowanej przez chymotrypsynę, CT — chymotrypsyna, PNP — octan p-nitrofenyfu; CT-PNP — kompleks: chymotrypsyna-octan p-nitrofenylu; CT-Ac—kompleks: chymotrypsyna-octan (acetylochymotrypsyna);feno!-anionp-nitrofenolanowy: Ac~ — anion octanowy. Tworzenie kompleksów CT-PNP i CT-Ac w stosunku do hydrolizy kompleksu CT-Ac przebiega s^ybko. __________________________________

112 / ROZDZIAŁ 10

V ? Enz-CHjOH +F-P-O ?

y

» Enz—CH, — O— P»=O

P

°

Ryc. 10-4. Reakcja pierwszorzędowej grupy hydroksylowej Ser 195 chymotrypsyny z diizopropylofluorofosforanem (DIPF). __________________________________________________________

W reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę 3 aminokwasy tworzą system przekazywania ładunku W reakcji hydrolizy katalizowanej przez chymotrypsynę szczególną role odgrywają 3 reszty aminokwasowe, które, mimo Ŝe zajmują odległe w stosunku do siebie miejsca w sensie struktury pierwszorzędowej, znajdują się w pozycjach pozwalających na tworzenie między nimi wiązań w sensie struktury trzeciorzędowej. Są to Asp 102, His 57 i Ser 195. Podczas gdy większość naładowanych reszt aminokwasowych jest umiejscowiona na zewnątrz cząsteczki, 3 oddziałujące ze sobą reszty są ukryte w niepolarnym wnętrzu cząsteczki, tworząc układ: Asp 102 — His 57 — Ser 195. Aminokwasem, który ulega acylacji podczas reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę, jest Ser 195. ZbliŜenie anionu octanowego (pochodzącego z octanu /)-nitrofeny)u) do tlenu grupy OH* Ser 195 wyzwala reakcję przeniesienia protonu z Ser 195 poprzez His 57 na Asp 102 (ryc. 10-5), — C — O"--"H-N^N---H — O— Ser u:.

ic 1

Sub- (tj. AG")

9

— C—O—H- •N

N—H

O-Ser

U _0A Ryc. 10-5. Przeniesienie protonu w chymotrypsynie podczasacylacji Ser 195 przezsubstrat (Sub').

Podczas deacylacji intermediatu acylo-Ser 195 (enzym) protony przekazywane są w przeciwnym kierunku. Przypuszcza się, Ŝe analogi* Przyp. tłum.

czna sekwencja zdarzeń ma miejsce podczas hydrolizy fizjologicznych substratów chymotrypsyny, takich jak peptydy. WIELE PROTEAZ WYDZIELA SIĘ W POSTACI NIEAKTYWNYCH PROENZYMÓW, CZYLI ZYMOGENÓW Wiele białek jest syntetyzowanych w postaci nieaktywnych prekursorów określanych jako probiałka. W przypadku gdy białka te są enzymami ich probiałka nazywane są proenzymatni lub zymogenami. Przekształcenie probiałek w aktywne białka następuje w wyniku jednolub kilkustopniowej swoistej proteolizy. Białkami syntetyzowanymi w formie probiałek są np. insulina (probiałko=proinsulina), enzymy trawienne: pepsyna, trypsyna i chymotrypsyna (odpowiednie probiałka = pepsynogen, trypsynogen, chymotrypsynogen), czynniki krzepnięcia krwi i fibrynoiizy (p. rozdz. 58) oraz biatko tkanki łącznej — kolagen (probiałko = prokolagen). Przekształcenie proch ymotry psy ny (pro-CT), 245-aminokwasowego polipeptydu, w aktywną a-chymotrypsynę przebiega przez formę pośrednią znaną jako chymotrypsyna U (7C-CT) {ryc. 10-6). W chymotrypsynie a łańcuchy A, B i C (ryc. 10-6) są połączone ze sobą 2 mostkami disiarczkowymi (ryc. 10-7). Proenzymy umoŜliwiają szybkie uruchomienie aktywnych form w momencie zapotrzebowania fizjologicznego Jaka jest przyczyna syntezy niektórych białek w formie nieaktywnej? Podczas gdy jedne białka są wykorzystywane w organizmie stale, inne (np. enzymy krzepnięcia krwi i fibrynoiizy) tyiko czasami, ale wówczas enzymy te są po-

ENZYMY: MECHANIZMY DZIAŁANIA / 113 1

13

146

13/^415 16_

13

146 /

16

146

149

245

f 149

245

149

245

e

Pro-CT

»CT

tt-CT

Ryo. 10-6. Przekształcenie prochymotrypsyny (pro-CT) w chymotrypsynę n (it-CT) i w pełni aktywną enzymatycznie chymotrypsynę ot (ct-CT).______

S ----S

Ryc. 10-7. Wewnątrzłańcuchowe i rniędzyłańcuchowe wiązania disiarczkowe w chymotrypsynie a («-CT). _______________________________________________________________________________

trzebne natychmiast. Pewne procesy fizjologiczne, takie jak trawienie, są sporadyczne, przy czym często regularne i moŜliwe do przewidzenia (chociaŜ nie jest to regułą u ludzi prymitywnych). Inne natomiast, jak krzepnięcie krwi i fibrynoliza, zachodzą tylko w przypadku zadziałania określonych czynników fizjologicznych lub patologicznych, przy czym do zachowania hemostazy muszą one być skoordynowane w czasie. Ponadto synteza proteaz w formie nieaktywnych prekursorów zabezpiecza tkanki, w których są one wytwarzane (np. trzustkę) przed samotrawieniem. (Samotrawienie moŜe zachodzić w przypadku zapalenia trzustki). Synteza de novo niezbędnych w danym momencie białek, przy załoŜeniu, Ŝe byłaby dostępna odpowiednia pula aminokwasów, mogłaby przebiegać niewystarczająco szybko w stosunku do potrzeb organizmu indukowanych czynnikami chorobotwórczymi, np. utratą krwi. RównieŜ sam proces wydzielania mógłby być zbyt wolny w stosunku do potrzeb.

8 — Biochemia

Aktywacja prochymotrypsyny polega na swoistej proteolizie Przekształcenie probiałek w fizjologicznie czynne białka przebiega według następujących zasad: 1. Przekształcenie polega na swoistej proteo lizie, która moŜe dotyczyć hydrolizy tylko poje dynczego wiązania. 2. Produkty proteolizy mogą zostać rozdzie lone lub pozostać razem w ostatecznym białku. 3. Proces moŜe (lub nie) prowadzić do znacz nej zmiany masy cząsteczkowej. 4. Podstawową konsekwencją swoistej pro teolizy jest nowa konformacja. 5. Jeśli probiałko jest enzymem, to zmiana konformacji powoduje powstawanie miejsca katalitycznego. W przypadku proenzymów wy biórcza proteoliza moŜe być rozpatrywana jako proces, który uruchamia zmiany konformacyjne „tworzące" miejsce katalityczne. Wybiórcza proteoliza prochymotrypsyny (chymotrypsynogenu) umoŜliwia zbliŜenie 3 reszt aminokwasowych tworzących system przekazywania ładunku. W chymotrypsynie a His 57 i Asp 102 znajdują się w łańcuchu B, a Ser 195 — w łańcuchu C (ryc. 10-6).

114 / ROZDZIAŁ 10

WIĄZANIE SUBSTRATU PRZEZ SWOISTE ENZYMY ODBYWA SIĘ W SPOSÓB PRZYPADKOWY LUB UPORZĄDKOWANY Większość enzymów katalizuje reakcje między 2 lub więcej substratami, dostarczając 1 lub więcej produktów. Pewne enzymy wymagają obecności wszystkich substratów równocześnie, inne natomiast wiąŜą najpierw jeden substrat, a następnie katalizują jego reakcję z drugim substratem. Sposób w jaki enzymy wiąŜą sub-

Wiele reakcji, wymagających udziału koenzymów, przebiega za pomocą mechanizmu określanego jako „ping-pong" (enzym występuje na przemian w formie E i Ex) (ryc. 10-9 i 10-10). ChociaŜ pewne koenzymy są często rozpatrywane jako drugi substrat, inne (np. fosforan pirydoksalu) są związane z enzymem kowalencyjnie lub niekowalencyjnie tak silnie, Ŝe ich dysocjacja praktycznie nie występuje (np. difosforan tiaminy). W tych przypadkach kompleks enzym-koenzym jest rozpatrywany jako enzym.

straty moŜe być przypadkowy lub uporządkowany (ryc. 10-8).

RESZTY AMINOKWASOWE W MIEJSCU KATALITYCZNYM MOGĄ FUNKCJONOWAĆ JAKO KATALIZATORY KWASOWO-ZASADOWE

C. 10-8. Przypadkowe i uporządkowane przyłączanie substratów A i B i oddysocjowywanie produktów P i Q od enzymu E.

Z chwilą związania substratu w miejscu katalitycznym naładowane (lub zdolne do naładowania) grupy funkcyjne łańcuchów bocznych aminokwasów, znajdujących się w bliskim otoczeniu, mogą brać udział w katalizie, działając na zasadzie katalizatorów kwasowych lub zasadowych. Istnieją 2 odrębne rodzaje katalizy enzymatycznej kwasowo-zasadowej: ogólna i swoista. Reakcje, których szybkość zmienia się wraz ze zmianą stęŜenia jonów H+ lub H3O+, a jest niezaleŜna od stęŜenia innych kwasów lub zasad znajdujących się w roztworze, uwaŜa się za podporządkowane swoistej katalizie kwasowej

lub zasadowej. Natomiast reakcje, których szybkość jest uzaleŜniona od wszystkich kwasów (donorów protonów) lub zasad (akceptorów protonów) obecnych w roztworze uwaŜa się za podporządkowane ogólnej katalizie kwasowej lub zasadowej.

P EA-

-E'P

'P * >E'

Ryc. 10-9. Ogólny mechanizm „ping-pong" kata lizy enzymatycznej_______________

E-CHO

E-CH,NH,

CHO

Glu

E-CHO Glu

Ryc. 10-10. Mechanizm „ping-pong" w reakcji transaminacjt. ECHO i E-CH2NH2 reprezentują odpowiednio kompleksy enzym-fosforan pirydoksalu i enzym-fosforan pirydoksaminy. (Ala—alanina; Pyr — pirogronian; KG — a-ketoglutaran; Glu — glutaminian). ___

ENZYMY: MECHANIZMY DZIAŁANIA / 115

Ogólną i swoistą katalizę kwasowozasadową pozwala odróŜnić pomiar szybkości reakcji w buforach o róŜnych wartościach pH i stęŜenia JeŜeli przy stałym stęŜeniu buforu szybkość reakcji zmienia się wraz ze zmianą pH roztworu, to reakcję określa się jako swoiście katalizowaną przez zasadę (jeŜeli pH jest powyŜej 7) lub swoiście katalizowaną przez kwas (jeŜeli pH jest poniŜej 7). JeŜeli natomiast przy stałym pH szybkość reakcji zmienia się wraz ze zmianą stęŜenia buforu, to reakcję określa się jako ogólną katalizę zasadową (w przypadku, gdy pH jest powyŜej 7) lub ogólną katalizę kwasową (w przypadku, gdy pH jest poniŜej 7). Przykładem swoistej katalizy kwasowej moŜe być przekształcenie substratu (S) w produkt (P). Przybiega ono w 2 etapach — etapie szybkiego, odwracalnego transferu protonu: S+

oraz następującym po nim wolniejszym i dlatego determinującym szybkość reakcji, etapie zamiany zawierającego proton substratu w produkt: +

SH + H,O-*P+ H 3 0

+

Zwiększenie stęŜenia jonu hydronowego
^ = k'[S] [H30 ] dt

Rozpatrzmy sytuację, w której oprócz opisanej powyŜej swoistej katalizy kwasowej, w buforze, np. imidazolowym, zachodzi równieŜ kataliza poprzez jon imidazolowy. Imidazol, będąc słabym kwasem (pKa ok. 7), jest słabym protonodawcą i powoduje, Ŝe etap

S + Imidazol

+

+

H -* SH + Imidazol

przebiega wolno, determinując szybkość reakcji. Na uwagę zasługuje fakt, Ŝe wraz ze zmianą mechanizmu katalizy kwasowej ze swoistego na ogólny następuje odwrócenie etapów szybkiego i wolnego. Matematyczne przedstawienie szybkości reakcji ogólnie katalizowanej przez kwas jest często bardzo skomplikowane. WIĄZANIE SUBSTRATU I KATALIZĘ MOGĄ UMOśLIWIAĆ JONY METALU Ponad 25% wszystkich enzymów zawiera silnie związany jon metalu, który jest niezbędny do ich aktywności. Funkcje jonów metali w katalizie enzymatycznej bada się za pomocą analizy rentgenograficznej, spektroskopii MRI (magnetic resonance imaging) oraz ESR (electron spin resonance). Wyniki tych badań, w połączeniu ze znajomością tworzenia i rozpadu kompleksów metali i reakcji w obrębie sfer koordynacyjnych jonów metali, pozwalają na określenie funkcji jonów metali w reakcjach katalizowanych przez enzymy. Metsuoenzymy zawierają określoną liczbę funkcyjnych jonów metalu, które nie są usuwane podczas oczyszczania enzymu. Enzymy aktywowane przez metale wiąŜą natomiast metal słabiej, jednak jest on niezbędny do ich funkcji katalitycznej. Powinowactwo określonego enzymu do jonu metalu jest więc podstawą rozróŜnienia między metaloenzymami i enzymami aktywowanymi przez metale. Mechanizmy działania jonów metali zarówno w przypadku metaloenzymów, jak i enzymów aktywowanych przez metale są podobne. W katalizie enzymatycznej funkcjonują trójskładnikowe kompleksy zawierające metal W wyniku połączenia miejsca aktywnego enzymu (Enz), jonu metalu (M) i substratu (S) w stosunku 1:1:1 tworzą się trójskładnikowe kompleksy. MoŜliwe są 4 sposoby połączeń między tymi składnikami: M—Enz—S Enz—S—M Kompleks z mostKompleks z mostkiem kiem utworzonym utworzonym przez przez enzym substrat

M

116 / ROZDZIAŁ 10

Enz—M—S Kompleks z mostkiem Cykliczny kompleks utworzonym przez z mostkiem utworzonym przez metal metal

W przypadku enzymów aktywowanych przez metale mogą się tworzyć kompleksy wszystkich 4 typów. Metaloenzymy nie tworzą natomiast kompleksu typu EnzSM, poniewaŜ silnie związany z enzymem metal stanowi juŜ kompleks EnzM. Wyniki badań pozwalają obecnie na następujące uogólnienia: 1. Większość, ale nie wszystkie, kinaz (fosfotransferaza: ATP) tworzy kompleksy z most kiem przez substrat typu Enz—nukleotyd—M. 2. Fosfotransferazy działające na pirogronian lub fosfoenolopirogronian, enzymy katali zujące inne reakcje fosfoenolopirogronian u oraz karboksylazy tworzą kompleksy z most kiem poprzez metal. 3. Dany enzym moŜe tworzyć róŜne typy kompleksów w zaleŜności od substratu. Kompleksy z mostkiem utworzonym przez enzym (MEnzS)

W kompleksach tego typu metale odgrywają przypuszczalnie ro]ę strukturalną utrzymując aktywną konformację (np. syntetaza glutaminowa) lub tworząc mostek z substratem (np. kinaza pirogronianowa). W kinazie pirogronianowej jon metalu, oprócz funkcji strukturalnej, aktywuje ponadto jeden substrat (ATP), który utrzymuje w określonej pozycji.

Kinaza pirogronianowa ----- ATP

UwaŜa się, Ŝe w reakcjach fo sfo transferu funkcja jonów metali polega na aktywacji atomów fosforu i tworzeniu polifosforanowoadeninowych kompleksów o charakterystycznej konformacji w aktywnych układach czteroskładnikowych. Kompleksy z mostkiem utworzonym przez metal:

Enz—M—S lub Enz

Wyniki badań krystalograficznych i analizy sekwencji aminokwasów wykazały, Ŝe resztą wiąŜącą metal w aktywnym miejscu wielu białek jest His (rip. karboksypeptydaza A, cytochrom c, rubredoksyna. metmioglobina i methemoglobina; p. rozdz. 7), W dwuskładnikowych kompleksach EnzM etapem ograniczającym szybkość wiązania jest często odłączenie wody ze sfery koordynacyjnej jonu metalu. Dla wielu peptydaz aktywacja jonami metalu jest powoJnym, trwającym wiele godzin procesem, prowadzącym do utworzenia aktywnej konfcrrmacji dwuskładnikowego kompleksu. Wiązanie metalu: Szybko

Enz— M
Przekształcenie w aktywną strukturalnie formę (Enz*):

Powstawanie trójskładnikowego kompleksu w przypadku mctalocnzymów polega na przyłączeniu substratu (S) do dwuskładnikowego kompleksu EnzM;

Kreatyna Kompleksy z mostkiem utworzonym przez substrat (EnzSM)

Utworzenie trójskładnikowych kompleksów enzymu, metalu i substratu w przypadku trifosforanów nukleozydów przypisuje się wyparciu przez ATP wody ze sfery koordynacyjnej metalu: ATP

S

+

+ M(HaO)£ ^ATP—M(HaO)|- + 3HaO

a następnie związanie z enzymem; ATP— MfH^O)!"+ Enz^Enz—ATP—WHHjO);-

Enz—M+S Enz—M—S lub

z^

Jony metałi odgrywają róŜnorodne funkcje w katalizie

Jony metali mogą brać udział w kaŜdym z 4 znanych mechanizmów zwiększenia szybkości reakcji chemicznej przez enzymy: 1) ogólnej katalizie kwasowo-zasad owej, 2) katalizie kowalencyjnej, 3) zbliŜeniu reagujących związków oraz 4) indukcji zmian strukturalnych w enzymie lub substracie. Oprócz Ŝelaza, funkcjonującego w hemoproteinach, najczęściej zwią-

ENZYMY: MECHANIZMY DZIAŁANIA / 117

zanymi z katalizą enzymatyczną są Mg-2"1", Mn2"1", Ga2*, chociaŜ w przypadku niektórych enzymów mogą to być równieŜ jony innych metali (np, K+). Jony metali, podobnie jak protony, spełniając funkcję kwasów Lewisa (związków elektrofilowych) mogą. uczestniczyć w tworzeniu pary elektronów wiązania sigma. MoŜna je równieŜ Funkcja jonu metalu Enzym Tabela 10-1. Wybrane przykłady funkcji jonów metaii w mechani2mie działania enzymów* Amoniako-liaza histydynowa

Maskowanie grupy nukleofilowej

Kinazy, liazy, dekarbok- Aktywacja grupy eleksylaza pirogronianowa trof iłowej Dehydrataza węglanowa Aktywacja grupy nukleofilowej Enzymy kobamidowe Metal pełni funkcję nukleoftlu Karboksylaza pirogronia- Usunięcie elektronu TT nowa, karboksypeptydaza, dehydrogenaza alkoholowa Niehemowe białka zaOddawanie etektronu % wierające Ŝelazo Kinaza pirogronianowa, Gromadzenie i ustawiakarboksylaza pirogronia- nie ligandów nowa, kinaza adenylanowa Fosf otrą nsf eraza, izome- Zmiany konformacji raza ksylozowa, hemoproteiny

* Zaadaptowane z: Mildvan AS, Metals in enzyme catalysis, t. 2, str. 456, w The Enzymes, Boyer PD, Lardy H, Myrback K (red.), Academic Press, 1970.

rozpatrywać jako^.superkwasy", poniewaŜ występują w środowisku obojętnym, mają ładunek dodatni powyŜej 1 i mogą tworzyć wiązania pi. Ponadto (w przeciwieństwie do protonów) mogą słuŜyć jako trójwymiarowa matryca do ustawienia grup zasadowych enzymu lub substratu w określonej pozycji. Jony metali, będąc akceptorami elektronów przez wiązania sigma lub pi, mogą aktywować grupy elektrofilowe oraz nukleofilowe (ogólna kataliza kwasowo-zasadowa). Oddając elektrony jony metali mogą z kolei aktywować grupy nukleofilowe lub same funkcjonować jako nukleofile. Poprzez sferę koordynacyjną metale mogą powodować zbliŜenie enzymu i substratu lub w wyniku połączeń chelatowych zmiany konformacyjne w enzymie czy substracie. Ponadto jony metalu mogą „maskować" grupy nukleofilowe zapobiegając w ten sposób reakcji ubocznej, która przebiegałaby prawdopodobnie w ich nieobecności. Wreszcie jony metali poprzez sferę koordynacyjną mogą funkcjonować jako trójwymiarowa matryca utrzymująca reagujące grupy w określonej orientacji przestrzennej, co ma decydujące znaczenie w stereochemicznej kontroli przebiegu katalizowanej przez enzym reakcji (tab. 10-1).

PIŚMIENNICTWO Fersht A: Enzyme Structure and Meckanism, 2nd ed. Freeman, 1985. Freeman RB, Hawkins HC (editors): The Enzymotogy oj'Past-translationalModification ojProteins, Academic Press, 1985. Purith DL (editor): Enzyme kinetics and mechanisms. Parts A and B in: Methods in Enzymołogy. Vol 63, 1979; Vol 64; 1980. Academic Press. Patrz takŜe piśmiennictwo w rozdz, 7 i 8

11

Enzymy: regulacja aktywności Victor W. Rodweii, PhD

WPROWADZENIE W rozdziale tym, na podstawie wybranych przykładów, przedstawiono udział enzymów w regulacji procesów metabolicznych. Przykłady ilustrujące odmienne mechanizmy regulacji metabolizmu zaprezentowano w innych rozdziałach tego podręcznika.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Mechanizmy, za pomocą których komórki i organizmy regulują i koordynują ogólny metabolizm, są przedmiotem zainteresowania badaczy w wielu dziedzinach nauk biomedycznych dotyczących tak róŜnych problemów, jak; nowotwory, choroby serca, starzenie, fizjologia drobnoustrojów, róŜnicowanie, przeobraŜenie, działanie hormonów czy działanie leków. We wszystkich tych przypadkach wykazano istnienie zarówno prawidłowej, jak i nieprawidłowej regulacji enzymatycznej. Nieprawidłowości w regulacji aktywności enzymów (brak indukcji lub represji) stwierdza się np. w wielu komórkach nowotworowych. Potwierdza to ogólnie przyjęte załoŜenie, Ŝe zaburzenia mechanizmów kontrolujących ekspresje genów leŜą u podstaw procesu nowo tworzenia. Niektóre wirusy onkogenne zawierają gen kodujący tyrozyno-swoistą kinaze białek. Ekspresja tego genu w komórkach gospodarza prowadzi do nie mającej miejsca w warunkach prawidłowych fosforylacji wielu białek i enzymów, powodując znaczne zmiany fenotypowe. UwaŜa się, Ŝe zmiany tego typu są główną przyczyną transformacji nowotworowej wywoływanej przez pewne wirusy onkogenne. Innym znamiennym przykładem regulacji enzymatycznej jest działanie leków.

Indukcja enzymów stanowi biochemiczną pod-

stawę interakcji leków, a więc sytuacji, w której podanie jednego leku powoduje znaczne zwiększenie metabolizmu innego leku.

REGULACJA METABOLIZMU ZAPEWNIA HOMEOSTAZĘ Wysunięta przez Claude Bernarda pod koniec XIX w. koncepcja homeostatycznej regulacji środowiska wewnętrznego podkreślała zdolność zwierząt do utrzymania stałości środowiska wewnątrzkomórkowego, mimo zmian zachodzących w środowisku zewnętrznym. ChociaŜ koncepcja ta wyprzedzała współczesną enzymologię, sugerowała ona, Ŝe zmiany środowiska zarówno wewnętrznego, jak i zewnętrznego wpływają na szybkość reakcji katalizowanych przez enzymy. Komórka lub organizm, reagujące w sposób niewystarczający lub nieprawidłowy na bodźce wewnętrzne lub zewnętrzne, mogą być określone jako chore. Wiedza o czynnikach wpływających na szybkość reakcji katalizowanych przez enzymy ma szczególne znaczenie zarówno w zrozumieniu mechanizmów homeostazy w komórkach prawidłowych, jak i poznaniu molekularnych podstaw chorób.

Przepływ metabolitów jest z reguły jednokierunkowy Wszystkie reakcje chemiczne, łącznie z reakcjami katalizowanymi przez enzymy, są do pewnego stopnia odwracalne*. W komórkach Ŝy* Reakcje łatwo odwracalne charakteryzuje mała wartość liczbowa AG. Reakcje o duŜej wartości ujemnej AG, do jakich naleŜy większość przemian biochemicznych, moŜna określić jako nieodwracalne.

ENZYMY; REGULACJA AKTYWNOŚCI / 119

wych jednak reakcje odwracalne zasadniczo nie zachodzą, poniewaŜ produkty jednej reakcji są natychmiast usuwane na skutek włączania ich w następne reakcje katalizowane przez inne enzymy. Przepływ metabolitów w Ŝywej komórce przypomina przepływ wody w instalacji wodociągowej. ChociaŜ woda moŜe płynąć w dowolnym kierunku, w praktyce jej przepływ jest jednokierunkowy. Podobnie przepływ metabolitów w Ŝywych komórkach jest takŜe w znacznym stopniu jednokierunkowy. Stan równowagi, nietypowy dla Ŝycia, komórka osiąga dopiero w chwili śmierci. Jednokierunkowy przepływ metabolitów w Ŝywej komórce pozwala na zachowanie stałości środowiska wewnętrznego (ryc. 11-1). W pełni wykształconej

sorów makrocząsteczek, transport, wydzielanie lub wchłanianie musi ulegać zmianom pod wpływem nawet niewielkich zmian w środowisku komórki, narządu lub całego organizmu. Procesy te muszą być skoordynowane i reagować zarówno na krótkotrwałe zmiany w środowisku zewnętrznym (np. dodanie lub usuniecie składnika pokarmowego), jak równieŜ wydarzenia okresowo zachodzące wewnątrz komórki (np. replikacja DNA). Brak złoŜonych systemów kontroli hormonalnej i nerwowej, a takŜe stosunkowa łatwość prowadzenia badań na poziomie genomu powoduje, Ŝe obecnie najlepiej poznane są szczegóły molekularnych podstaw regulacji u bakterii. ChociaŜ jest oczywiste, Ŝe pozornie podobne zjawiska u bakterii i ssaków znacznie się róŜnią, regulacja procesów metabolicznych u bakterii stanowi podstawę do zrozumienia tej regulacji u człowieka. AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW REGULUJĄ 3 PODSTAWOWE MECHANIZMY

Ryc. 11-1. Schemat homeostazy komórkowej.

komórce średnie stęŜenie metabolitów pozostaje względnie stałe w duŜych przedziałach czasowych*. Zdolność przystosowawczą Ŝywej komórki najlepiej ilustrują jedynie niewielkie zmiany i przesunięcia, za pomocą których organizm zachowuje stałość środowiska wewnętrznego pomimo duŜych róŜnic w pobieraniu pokarmu, wody i soli mineralnych, wykonywaniu pracy, czy temperaturze zewnętrznej. Szybkość reakcji odzwierciedla zmieniające się potrzeby fizjologiczne Aby procesy Ŝyciowe przebiegały w uporządkowany sposób, przepływ metabolitów przez szlaki anaboliczne i kataboliczne musi podlegać regulacji, a szybkość reakcji chemicznych niezbędnych w danym momencie musi odpowiadać potrzebom organizmu ze względu na jego otoczenie. Przebieg wszystkich procesów, takich jak wytwarzanie ATP, biosynteza prekur-

Ogólnie mówiąc, na przepływ węgla przez jakąkolwiek reakcję katalizowaną przez enzym mają wpływ: 1) zmiany bezwzględnej ilości obecnego enzymu, 2) zmiany wielkości puli reagujących związków, innych niŜ enzym oraz 3) zmiany sprawności katalitycznej enzymu. Wszystkie te moŜliwości są wykorzystywane przez większość form Ŝycia. Szybkość syntezy i degradacji determinuje ilość enzymu Bezwzględna ilość danego enzymu jest wypadkową szybkości jego syntezy (ks), oraz szybkości jego degradacji (k^) (ryc. 11-2). Ilość enzymu w komórce moŜe się zwiększyć w wyniku zwiększenia szybkości jego biosyntezy (zwiększenie wartości ks), zmniejszenia szybkości jego degradacji (zmniejszenie wartości kdes) lub obu procesów równocześnie. Podobnie zmniejszenie ilości enzymu moŜe być wynikiem zmniejszenia wartości ks, zwiększenia wartości k^g lub obu Enzym

k, f

) k„.fl

Aminokwasy * Zdarzają się jednak krótkotrwałe zmiany w stęŜeniach metabolitów i enzymów mające ogromne znaczenie fizjologiczne.

Ryc. 11-2. Ilość enzymu jest wypadkową jego syntezy i degradacji.

120 / ROZDZIAŁ 11

wartości równocześnie. We wszystkich formach Ŝycia biosynteza enzymu (białka) z aminokwasów i degradacja enzymu (białka) do aminokwasów są odmiennymi procesami, katalizowanymi przez zupełnie róŜne zestawy enzymów. Dzięki temu regulacja biosyntezy i degradacji enzymu moŜe przebiegać niezaleŜnie.

Synteza enzymów moŜe być uruchamiana w odpowiedzi na pewne indu który

Reakcją komórek na obecność swoistych małocząsteczkowych induktorów jest synteza swoistych enzymów. Na przykład Escherichia coli hodowana na poŜywce zawierającej glukozę nie fermentuje laktozy na skutek braku pgalaktozydazyhyrolizującej laktozę do galaktozy i glukozy. Dodanie do podłoŜa laktozy lub innych p-ga lak to Ŝydów indukuje P-galaktozydazę, dzięki czemu w hodowli moŜe zachodzić fermentacja laktozy. ChociaŜ na ogół induktorami są substraty indukowanych enzymów, mogą być nimi równieŜ związki strukturalnie przypominające substraty, nie będące jednak substratami. Określa się je mianem induktorów gratisowych. Odwrotnie, pewne związki, mimo Ŝe są substratami, nie muszą być induktorami. Często jeden związek indukuje kilka enzymów danego szlaku metabolicznego (np. laktoza indukuje zarówno permeazę p-g a laktozy do wą, jak i P-galaktozydaze). Enzymy, których stęŜenie w komórce jest niezaleŜne od dodanego induktora określa się jako konstytutywne. Ten sam enzym, w zaleŜności od szczepu bakteryjnego, moŜe mieć charakter konstytutywny, ulegać indukcji lub być w ogóle nieobecny. Komórki, w których dany enzym \ub inne białko ulega indukcji, zwykle zawierają bardzo małą, ale dającą się zmierzyć, podstawową ilość tego białka nawet w nieobecności induktora. WraŜliwość komórek na induktory jest uwarunkowana genetycznie. Dlatego teŜ określenia „konstytutywny" czy „ulegający indukcji'1 mają charakter względny, podobnie jak „ciepły" i „zimny", i oznaczają jedynie krańcowe moŜliwości reakcji komórki w obecności induktora. Indukcja enzymów jest zjawiskiem występującym równieŜ u eukariontów. U zwierząt enzymami ulegającymi indukcji są np. 2,3-dioksygenaza tryptofanowa, dehydrataza treoninowa, aminotransferaza tyrozyna :a-ketoglutaran, p-D-fruktofuranozydaza, enzymy cyklu mocz-

nikowego, reduktaza HMG-CoA i cytochrom P-450.

Synteza enzymów moŜe ulegać represji pod wpływem ostatecznego produktu Obecność w środowisku reakcyjnym syntetyzowanego metabolitu moŜe powodować represję dalszej jego syntezy. Małe cząsteczki, takie jak puryny czy aminokwasy, działając na zasadzie korepresorów mogą więc blokować syntezę enzymów biorących udział w ich własnej biosyntezie. Na przykład u Salmonella typhimuriurn w obecności egzogennej histydyny (His) następuje represja syntezy wszystkich enzymów biosyntezy histydyny, a po dodaniu do poŜywki leucyny represji ulega synteza 3 enzymów typowych jedynie dla biosyntezy Leu. Po usunięciu lub wyczerpaniu w podłoŜu konkretnego związku pośredniego dla danej biosyntezy zachodzi proces odwrotny, określony jako derepresja. PowyŜsze przykłady ilustrują charakterystyczną dla szlaków biosyntezy u bakterii represję na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego za pomocą produktu. Zjawiskiem pokrewnym jest represja za pomocą katabolitu. Polega ona na represji syntezy enzymów biorących udział w katabolizmie pod wpływem związków pośrednich, powstających w reakcjach kata bo licznych kataiizowanych przez te enzymy. Zjawisko to po raz pierwszy zaobserwowano w hodowlach E. coli rosnących na poŜywkach zawierających inne (X) niŜ glukoza źródło węgla. Nazwano je „efektem glukozy", dodanie bowiem do podłoŜa glukozy powodowało represję syntezy enzymów związanych z katabolizmem związku X. Z chwilą, kiedy stwierdzono, Ŝe utlenianie składników poŜywienia innych niŜ glukoza wywołuje podobne efekty, wprowadzono termin represji za pomocą katabolitu. Związkiem pośredniczącym w represji katabolicznej jest cAMP. Molekularne mechanizmy indukcji, represji i derepresji przedstawiono w rozdz. 41.

WE WSZYSTKICH FORMACH śYCIA ZACHODZI OBRÓT METABOLICZNY BIAŁEK Procesy syntezy enzymu i jego degradacji określa się mianem obrotu metabolicznego. Obrót metaboliczny białek stwierdzono jako właściwość cechującą wszystkie komórki ssaków na długo zanim zaobserwowano występowanie tego zjawiska u bakterii. O istnieniu przemiany

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI / 121

białek (enzymów) u ludzi wywnioskowano z doświadczeń dotyczących odŜywiania się człowieka przeszło 100 lat temu. Klasyczne juŜ badania Schoenheimera, prowadzone tuŜ przed II wojną światową i w czasie jej trwania, niezbicie dowiodły, Ŝe w czasie Ŝycia człowieka zachodzi ciągła przemiana białek komórkowych. Mierząc szybkość wbudowywania znakowanych' ;N-aminokwasów do białek oraz szybkość ich ubytku z białek, Schoenheimer wykazał, Ŝe w organizmie białka są w stanie „dynamicznej równowagi". Koncepcja ta obejmuje równieŜ inne składniki organizmu, łącznie z lipidami i kwasami nukleinowymi. Degradacja swoistych enzymów jest regulowana Szczegóły degradacji białek ssaków w wyniku proteoiizy zaleŜnej od ATP i ubikwityny oraz niezaleŜnej od ATP przedstawiono w rozdz. 31. WraŜliwość enzymów na proteolityczną degradację jest uzaleŜniona od ich konformacji. Obecność lub brak czynników zmieniających konformację białka, takich jak substraty, koenzymy lub jony metali, wpływa więc na podatność enzymów na proteolizę. StęŜenie substratów, koenzymów i prawdopodobnie jonów w komórce moŜe w ten sposób warunkować szybkość degradacji swoistych enzymów. Koncepcję tę ilustrują dwa enzymy: arginaza i 2,3-dioksygenaza tryptofanowa (pirolaza tryptofanowa).

Regulacja stęŜenia arginazy w wątrobie obejmuje zmianę wartości kj lub kdcg. Zwiększenie stęŜenia arginazy w wątrobie po spoŜyciu pokarmu bogatego w białko jest wynikiem zwiększonej syntezy tego enzymu. Zwiększenie natomiast stęŜenia arginazy w wątrobie zwierząt głodzonych jest skutkiem zmniejszonej degradacji tego enzymu, podczas gdy wartość ks pozostaje nie zmieniona. W przypadku drugiego enzymu zwiększenie stęŜenia 2.3-dioksygenazy tryptofanowej u ssaków obserwuje się po wstrzyknięciu glikokortykoidów lub spoŜyciu tryptofanu. Stwierdzono, Ŝe hormony powodują zwiększenie syntezy tego enzymu (zwiększenie ks), Trp natomiast nie wpływa na wartość IŁ,, ale zmniejsza wartość k^g w wyniku zmniejszenia podatności enzymu na proteolizę. Zwiększenie stęŜenia arginazy w wątrobie, w wyniku zwiększonego spoŜycia azotu w diecie bogatobia&owej (p. rozdz. 31) przypomina indukcję za pomocą substratu u bakterii. Jednak w przypadku 2,3-dioksygenazy tryptofanowej, nawet jeśli tryptofan moŜe działać jako induktor u bakterii (zmienia kj, to u ssaków wpływa on wyłącznie na proces degradacji enzymu (zmniejsza kdpg). Na stęŜenie enzymu w tiankach ssaków mają znaczny wpływ zmiany fizjologiczne, hormonalne lub pokarmowe (tab. 11 -1), ale wiedza o molekularnych podstawach tych zmian jest nadal fragmentaryczna.

Tabela 11-1. Adaptacja wybranych enzymów wątroby szczura do zmian w środowisku*

Enzym



Bodziec

Zmiana

aktywności Metabolizm aminokwasów Arginaza

100—120 Głodzenie lub glikokortykosteroidy Zamiana diety z bogatobiarkowej na matobiałkową

+22

Dehydrataza sery nowa

20

Glukagon lub aminokwasy egzogenne

+ 100

Amoniako-liaza histydynowa

60

Zmiana diety z maiobiałkowej na bogatobiałkowa

+ 20

15

Hormony tarczycy lub dieta bogatowęglowodanowa poprzedzona głodzeniem

+ 10

Hormony tarczycy

+ 10

Glukoza

+ 10

Metabolizm węglowodanów Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa

Dehydrogenaza glicerolo-a-fosforanowa Fruktozobisfosfataza (Fruktozo-1,6-bisfosfataza)

100

122 / ROZDZIAŁU cd. tab. 11-1 Enzym

ti/2

W

Metabolizm lipidów Enzym rozszczepiający cytrynian

Dieta bogatowęglowodanowa i małottuszczowa poprzedzona głodzeniem Głodzenie Dieta beztłuszczowa poprzedzona głodzeniem

Syntetaza kwasów tłuszczowych

Reduktaza HMG-CoA

Bodziec

2—3

Zmiana aktywności

+30

-1 0

+30

Głodzenie lub dieta zawierająca 5% -10 ± 5 cholesterolu Zmiany dobowe + 2do10 Insulina lub hormony tarczycy

Metabolizm puryn i pjrymidyn

Oksydaza ksantynowa Karbamoilotransferaza asparaginianowa

60

Dihydroorotaza

12

Dieta bogatobiatkowa Dieta zawierająca 1% kwasu orotowego

-10

Dieta zawierająca 1% kwasu orotowego

+3

+2

* Dane poza dotyczącymi reduktazy HMG-CoA z: Schimke RT, Doyle D: Control of enzyme levels in animał tissues, Annu, Rev, Biochem. 1970; 39:929.

AKTYWNOŚĆ KATALITYCZNA ENZYMÓW MOśE BYĆ REGULOWANA W ROśNY SPOSÓB

Glikokortykosteroidy powodują zwiększenie stęŜenia aminotransferazy tyrozynowej przez pobudzenie jej syntezy. Stwierdzenie to było pierwszym dowodem istnienia hormonalnej regulacji biosyntezy enzymów u ssaków. Insulina i glukagon — pomijając ich wzajemne antagonistyczne działanie fizjologiczne — niezaleŜnie od siebie zwiększają 4—5-krotnie wartość k s . W działaniu glukagonu pośredniczy prawdopodobnie cAMP, który w hodowlach tkankowych wątroby szczura wywołuje podobne do hormonu skutki.

Zmiana aktywności enzymu moŜe być wynikiem zmiany bezwzględnej ilości enzymu lub obecny enzym moŜe stać się bardziej lub mniej skutecznym katalizatorem. Zmiany aktywności

Regulacja poprzez syntezę niektórych enzymów w formie nieaktywnych prekursorów

KOMPARTMENTACJA ENZYMÓW UŁATWIA REGULACJĘ METABOLIZMU

Regulacja aktywności enzymatycznej moŜe polegać na biosyntezie enzymu w formie nieaktywnego proenzymu. Przekształcenie proenzy,mu w formę aktywną katalitycznie jest wynikiem ograniczonej proteolizy, procesu któremu towarzyszą zmiany konformacyjne odsłaniające lub „tworzące" miejsce katalityczne (p. rozdz. 9). Synteza enzymów w formie nieaktywnych prekursorów jest zjawiskiem charakterystycznym dla enzymów trawiennych oraz czynników krzepnięcia krwi i fibrynolizy (p. rozdz. 58).

Znaczenie kompartmentacji procesów metabolicznych w komórkach eukariotycznych, łącznie z komórkami ssaków, jakkolwiek bardzo waŜne, nie moŜe być przeceniane. Umiejscowienie swoistych procesów metabolicznych w cytozolu lub organellach komórkowych umoŜliwia ich niezaleŜną regulację, Kompartmentacja procesów metabolicznych, charakterystyczna dla wyŜszych form Ŝycia, daje więc moŜliwość bardzo finezyjnej regulacji metabolizmu. Jed-

katalitycznej enzymu, zachodzące bez zmiany jego ilości, określa się jako „wpływ na sprawność katalityczną enzymu".

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI / 123

nocześnie stwarza jednak problem przemieszczania metabolitów przez błony oddzielające poszczególne struktury subkomorkowe. Przenikanie przez te bariery jest moŜliwe dzięki istnieniu mechanizmów zapewniających przemiesz-

czanie w wyniku przekształcania metabolitów w formy przepuszczalne dla błon. Po przejściu przez Honę metabolity są ponownie przekształcane w postać pierwotną. W konsekwencji wymaga to występowania tej samej aktywności katalitycznej w 2 formach, np. cytozolowej 1 mitochondrialnej. Fizyczne rozdzielenie tych 2 form enzymu ułatwia ich niezaleŜną regulację. W rozdziale 18 przedstawiono udział mechaniz mów umoŜliwiających przenikanie przez błony w zachowaniu równowagi puli metabolicznej związków pośrednich cyklu kwasu cytrynowe go i innych związków amfibolicznych.

ENZYMY KATALIZUJĄCE CIĄGI REAKCJI METABOLICZNYCH MOGĄ TWORZYĆ WIELKOCZĄSTECZKOWE KOMPLEKSY Organizacja enzymów katalizujących kolejne reakcje szlaku metabolicznego w wielkocząsteczkowe kompleksy koordynuje działanie enzymów i przepływ metabolitów. Istnienie układów wieloenzymowych zwiększa dostępność związków pośrednich dla enzymów danego szlaku przemian, umoŜliwia bowiem przenoszenie produktów między enzymami bez uprzedniego ustalenia ich równowagi z pulami metabolicznymi. Pozwala to na bardziej precyzyjną kontrolę metabolizmu niŜ miałoby to miejsce w przypadku enzymów nie pozostających w kompleksie. Ponadto zmiany konformacyjne jednego ze składników kompleksu przez interakcje białko-białko mogą być przekazywane innym składnikom tego kompleksu, powodując w ten sposób wzmocnienie skutków regulacji.

STĘśENIE SUBSTRATÓW, KOENZYMÓW, KATIONÓW MOśE REGULOWAĆ AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW

stępnych dla danego enzymu. Jednak nawet

pomiar stęŜenia metabolitu w organellach komórkowych nie odzwierciedla faktycznego stanu rzeczy m.in. wskutek znacznej bliskości wytwarzania i usuwania danego związku. Ponadto istnieją często duŜe róŜnice pomiędzy całkowitym stęŜeniem metabolitu a stęŜeniem metabolitu wolnego, tj. dostępnego dla enzymu. Na przykład, mimo Ŝe całkowite stęŜenie 2,3-bisfosfoglicerynianu w erytrocytach jest bardzo duŜe, to stęŜenie wolnego bisfosfoglicery-nianu jest porównywalne z innymi tkankami. Podobnie dostępność wielu innych metabolitów ulega znacznemu zmniejszeniu w obecności wiąŜących je białek. Jednym z podstawowych załoŜeń teorii kinetyki enzymatycznej Michaelisa-Menten jest to, Ŝe ogólne stęŜenie substratu odpowiada stęŜeniu dostępnego substratu. ZałoŜenie to moŜe się jednak nie sprawdzać w warunkach in vivo, gdzie stęŜenie wolnych substratów często jest tego samego rzędu wielkości co stęŜenie enzymów. Regulatorową rolę mogą spełniać równieŜ jony metali zaangaŜowane w strukturę i funkcję ponad XJĄ wszystkich znanych enzymów (p. rozdz. 10), a szczególnie w przypadku reakcji, w których substratem jest ATP. Największą aktywność obserwuje się zazwyczaj wówczas, gdy w kompleksie ATP-jon metalu stosunek ATP do metalu wynosi ok. 1. Nadmiar metalu lub ATP ma wpływ hamujący. PoniewaŜ difosforany i trifosforany nukleozydów tworzą trwale kompleksy z jonami metali dwuwartościowych, wydaje się, Ŝe wewnątrzkomórkowe stęŜenie nukleotydów moŜe regulować wewnątrzkomórkowe stęŜenie wolnych jonów metali, a tym samym aktywność pewnych enzymów.

AKTYWNOŚĆ OKREŚLONYCH ENZYMÓW REGULUJĄ EFEKTORY ALLOSTERYCZNE

Średnie wewnątrzkomórkowe stęŜenie substratu, koenzymu lub jonu metalu moŜe nie stanowić właściwej podstawy do oceny aktywności enzymu in vivo. Niezbędna jest w tym celu

Aktywność katalityczna pewnych kluczowych w danym szlaku metabolicznym enzymów — enzymów regulatorowych — jest modulowana za pomocą ma łocząs teczko wych efektorów allosterycznych, które na ogół nie wykazują podobieństwa do substratów lub koenzymów danego enzymu. Hamowanie aktywności enzymu szlaku biosyntezy przez końcowy produkt tego szlaku nosi nazwę hamowania

znajomość stęŜeń metabolitów bezpośrednio do-

przez sprzęŜenie zwrotne. W biosyntezie

124 / ROZDZIAŁ 11

związku D ze związku A, katalizowanej przez enzymy Enz1; Enz2 i Enz3 Enz,

B

Enza Enz,

duŜe stęŜenie związku D z reguły hamuje przemianę A w B. Nie zachodzi tu proste „cofanie się" związków pośrednich, ale związek D wiąŜe się z Enzl5 hamując jego aktywność. Związek D działa więc jako ujemny efektor allosteryczny lub inhibitor zwrotny Enz,. W ten sposób hamowanie Enz! przez D na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego reguluje ostatecznie syntezę związku D. Związek D łączy się zwykle z miejscem allosterycznym, oddalonym od miejsca katalitycznego enzymu. Hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne moŜe mieć charakter kompetycyjny, niekompetycyjny, częściowo kompetycyjny lub inny. Hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne najczęściej jest spotykane w przypadku szlaków biosyntezy. Często inhibitorem zwrotnym jest ostatnia mała cząsteczka przed utworzeniem związku wielkocząsteczkowego (np. aminokwasy w szlaku biosyntezy białek, nukleotydy w szlaku biosyntezy kwasów nukleinowych). Zazwyczaj regulacja przez sprzęŜenie zwrotne dotyczy najwcześniejszego, funkcjonalnie nieodwracalnego* etapu charakterystycznego wyłącznie dla danego szlaku biosyntezy; najlepiej poznanym przykładem jest hamowanie karbamoilotransferazy asparaginianowej przez CTP (p. rozdz. 36). Często szlak biosyntezy jest rozgałęziony, tzn. metabolity początkowe są wykorzystywane do biosyntezy 2 lub więcej metabolitów końcowych. Hamowanie na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego w rozgałęzionym szlaku biosyntezy (np. biosyntezy aminokwasów, puryn lub pirymidyn) przedstawia ryc. 11-3. Związki S^ S2 iS3 są prekursorami wszystkich 4 produktów końcowych (A, B, C i D) natomiast związek S4 jest prekursorem produktów B i C, a związek S; prekursorem wyłącznie produktu D. Przekształcenia: S, ----- A

► C

S3

, -

D

* Reakcją przebiegającą praktycznie w jednym kierunku {wznaczeniu termodynamicznym) jest reakcja o duŜej wartości ujemnej AG.

Ryc. 11-3. Hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne w rozgałęzionym szlaku biosyntezy. S-\ — S5 są związkami pośrednimi w biosyntezie ostatecznych produktów A — D. Strzałki proste oznaczają enzymy katalizujące określone przemiany. Strzałki wygięte wskazują hipotetyczne miejsca hamowania przez swoiste produkty końcowe w wyniku sprzęŜenia zwrotnego.

stanowią więc liniowe ciągi reakcji, które jak moŜna się spodziewać, są hamowane na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego przez ich produkty końcowe. Konkretnym przykładem tego zjawiska jest biosynteza nukleotydów (p. rozdz. 36). RóŜnorodne mechanizmy hamowania przez sprzęŜenie zwrotne regulują rozgałęzione szlaki metaboliczne ~ RóŜnorodność mechanizmów hamowania przez sprzęŜenie zwrotne w rozgałęzionych szlakach metabolicznych stanowi dodatkowy poziom regulacji (ryc. 11-4). Na przykład, jeśli produkt B występuje w nadmiarze, to zmniejsza sie zapotrzebowanie na związek S2. Zdolność produktu B do zmniejszenia syntezy S2 jest więc korzystna z biologicznego punktu widzenia. Jeśli jednak nadmiar związku B hamuje tę część szlaku, która dotyczy nie tylko jego własnej

Ryc. 11-4. Regulacja rozgałęzionego szlaku biosyntezy w wyniku hamowania przez sprzęŜenie zwrotne. Dodatkowe, w porównaniu ze schematem przedstawionym na ryc. 11-3, strzałki wygięte, oznaczone liniami ciągłymi, wskazują-róŜnorodno&ć mechanizmów hamowania przez sprzęŜenie zwrotne.

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI / 125

biosyntezy, ale jest wspólna dla biosyntezy związków A, C czy D, to nadmiar związku B potencjalnie mógłby wstrzymać syntezę wszystkich 4 produktów. Istnieją jednak mechanizmy, które zapobiegają takiemu niepoŜądanemu efektowi. W kumulatywnym hamowaniu przez sprzęŜenie zwrotne hamujący wpływ 2 lub więcej produktów końcowych na I enzym regulatorowy jest sumą skutków wywoływanych przez kaŜdy z tych produktów niezaleŜnie. W zgodnym lub wielo wartościowym hamowaniu przez sprzęŜenie zwrotne całkowite zahamowanie ma miejsce tylko wtedy, kiedy jednocześnie 2 lub więcej produktów końcowych jest obecnych w nadmiarze. W kooperatywnym hamowaniu przez sprzęŜenie zwrotne I końcowy produkt występujący w nadmiarze hamuje enzym regulatorowy, ale w obecności 2 lub więcej produktów końcowych stopień hamowania znacznie przewyŜsza sumaryczny efekt kumulatywnego hamowania przez sprzęŜenie zwrotne. Najlepiej poznanym enzymem atlosterycznym jest karbamoiłotransferaza asparaginia nowa Karbamoiłotransferaza asparaginianowa (ATCaza) katalizuje pierwszą reakcję w szlaku biosyntezy pirymidyn {ryc. 11-5). Enzym ten jest hamowany na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego przez trifosforan cytydyny (CTP). W obecności związków rtęci ATCaza staje się niewraŜliwa na CTP, ale zachowuje pełną aktywność syntezy karbamoiioasparaginianu. Sugeruje to, iŜ CTP wiąŜe się z enzymem w innym miejscu (allosterycznym) niŜ kaŜdy z substratów. Cząsteczka ATCazy składa się z 2 podjednostek katalitycznych i 3 lub 4 podjednostek regulatorowych. KaŜda podjednostka katalityczna zawiera 4 miejsca wiązania asparaginianu (substratu), a kaŜda jednostka regulatorowa co najmniej 2 miejsca wiązania CTP (regulatora). Otrzymanie mutantów pozbawionych prawidłowej kontroli zwrotnej przez CTP, a z nich rewertantów z prawidłowymi właściwościami pozwoliło wykazać, Ŝe oba rodzaje podjednostek podlegają niezaleŜnej kontroli genetycznej. Miejsca allosteryczne i katalityczne są przestrzennie odmienne Około 1963 r. Monod zwrócił uwagę na brak strukturalnego podobieństwa pomiędzy inhibi-

0 CH,

■*ii

-o-c. I ♦ i

M

C00

•" v ~

KARBAMOILOTRANSFERAZA ASPARAGIN1AN0WA I

o u o-c *CH,

Kar b ama i I o as p a r ag i n i an

Ryc. 11-5. Reakcja katalizowana przez karbamoilotra nsferazę asparag in ianową.

torem zwrotnym a substratem dla enzymu, którego aktywność podlega regulacji. Skoro efektory nie są izosteryczne, ale allosteryczne („zajmują inną przestrzeń") z substratem zaproponował on, Ŝe enzymy, których aktywność jest regulowana przez efektory allosteryczne (np. inhibitory zwrotne) wiąŜą efektor w miejscu fizycznie odmiennym od miejsca katalitycznego, tj. w miejscu allosterycznym. Enzymy, których aktywność miejsca katalitycznego moŜe być regulowana przez efektory allosteryczne znajdujące się w miejscu atlosterycznym określa się jako enzymy allosteryczne. Istnienie fizycznie odrębnych miejsc allosterycznych w cząsteczce enzymu potwierdzają m.in. następujące fakty: 1. Modyfikacje enzymów za pomocą technik chemicznych lub fizycznych często prowadzą do utraty ich wraŜliwości na efektory allosteryczne. nie zmieniając jednocześnie ich aktywności katalitycznej. Wybiórczą denaturacje miejsc allosterycznych moŜna spowodować działając związkami rtęci, mocznikiem, promieniowaniem X, enzymami proteolitycznymi, roztworami o skrajnych wartościach siły jonowej lub pH, przechowywaniem w temp. 0—5°C, zamraŜaniem lub ogrzewaniem.

126 / ROZDZIAŁ 11

2. Efektory ałlosteryczne, w odróŜnieniu od substratów, często zabezpieczają miejsce katali tyczne przed denaturacją. Wydaje się mało prawdopodobne, aby związanie efektora z miej scem katalitycznym zapobiegało denaturacji, podczas gdy związanie substratu nie. Sugeruje to istnienie drugiego miejsca allosterycznego w innej części cząsteczki enzymu. 3. Enzymy pewnych mutantów komórek ba kteryjnych i ssaków wykazują zmienione właś ciwości regulatorowe, mimo identycznych 2 ty pem dzikim (z którego mutant powstał) właś ciwości katalitycznych. Miejsca ałlosteryczne i katalityczne są zatem odmienne genetycznie. 4. Badania dotyczące wiązania substratów i efektorów aU o sferycznych wykazały, Ŝe wiąŜą się one niezaleŜnie od siebie. 5. W niektórych przypadkach miejsce ałlo steryczne i miejsce katalityczne są umiejscowio ne w odrębnych podjednostkach. Enzymy allosteryczne charakteryzuje sigmoidalny przebieg krzywej kinetyki wiązania substratu Na rycinie 11 -6 przedstawiono zaleŜność szybkości reakcji katalizowanej przez typowy enzym allosteryczny od stęŜenia substratu w obecności i nieobecności inhibitora allosterycznego. W nieobecności inhibitora allosterycznego krzywa nasycenia substratem ma kształt hiperboli, podczas gdy w jego obecności ma kształt

Ryc. 11 -6. Sigmoidalna krzywa wiązania substratu w obecności inhibitora allosterycznego.

sigmoidamy; przy duŜych stęŜeniach substratu krzywa sigmoidalna moŜe się łączyć z krzywą hiperbo liczną. Analogiczną zaleŜność obserwuje się w przypadku krzywych nasycenia O2 dla mioglobiny i hemoglobiny (p. rozdz, 7). Na podstawie analizy kinetyki reakcji wykazano, Ŝe hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne moŜe mieć charakter kompetycyjny, niekompetycyjny, częściowo kompetycyjny lub inny. Jeśli przy duŜych stęŜeniach S aktywność enzymu w obecności i nieobecności inhibitora allosterycznego jest porównywalna, to kinetycznie reakcja odpowiada hamowaniu kompetycyjnemu. Sigmoidalny, a nie hiperboliczny, przebieg krzywej nasycenia substratem uniemoŜliwia jednak w przypadku hamowania allosterycznego określenie charakterystycznych wielkości za pomocą metody stosowanej w przypadku hamowania kompetycyjnego w miejscu katalitycznym, tj. graficznego przedstawienia danych jako liniowej funkcji odwrotności stęŜenia substratu i szybkości reakcji. Przyczyną jest fakt, Ŝe inhibitory ałlosteryczne wiąŜą się w innym miejscu {allosterycznym} niŜ analog substratu. Sigmoidalny charakter krzywej zaleŜności v od S w obecności inhibitorów allosterycznych odzwierciedla zjawisko kooperatywności. Przy małych stęŜeniach S aktywność w obecności inhibitora, w porównaniu z aktywnością w jego nieobecności, jest mała. Jednak, w miarę zwiększania się stęŜenia S, hamowanie się zmniejsza. Wskazuje to na istnienie 2 lub więcej wzajemnie na siebie oddziałujących miejsc wiązania substratu. Obecność cząsteczki substratu w jednym miejscu katalitycznym ułatwia wiązanie drugiej cząsteczki substratu w drugim miejscu. Zjawisko kooperatywności wiązania substratu przedstawiono w rozdz. 7 dotyczącym hemoglobiny. Sigmoidalny przebieg krzywej nasycenia O% jest wynikiem kooperatywnego oddziaływania między miejscami wiąŜącymi O2 umiejscowionymi w róŜnych podjednostkach. W wyniku oddziaływań allosterycznych zmienia się wartość Km lub Vmaka. Odnoszenie określeń „kompetycyjny" lub „niekompetycyjny" z substratem do kinetyki hamowania allosterycznego moŜe wprowadzać w błąd. Słuszniejszym wydaje się podział enzymów podlegających regulacji na 2 grupy, tj. enzymy serii K i enzymy serii V. W-przypadku enzymów allosterycznych serii K kinetyka nasycenia substratem jest kompetycyjna w sensie

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚĆ! / 127

zwiększenia wartości Km (zmniejszenie powinowactwa dp substratu) i braku wpływu na wartość Vmaks. Natomiast w przypadku enzymów allosterycznych serii V efektor allosteryczny zmniejsza wartość Vmai£s. (zmniejszenie sprawności katalitycznej) bez widocznego wpływu na wartość Km. Zmiany wartości Km i Vmai;S. wynikają prawdopodobnie ze zmian konformacyj-nych w miejscu katalitycznym wywołanych związaniem efektora all o sferycznego w miejscu allosterycznym. Dla enzymów allosterycznych serii K skutkiem zmian konformacyjnych moŜe być osłabienie wiązań pomiędzy substratem a resztami amin okwa sowy mi w miejscu wiąŜącym substrat. Odpowiednio dla enzymów allosterycznych serii V pierwotnym skutkiem moŜe być zmiana orientacji przestrzennej reszt katalitycznych, prowadząca do zmniejszenia wartości Vmaks.- Zmiany konformacyjne mogą mieć równieŜ pośredni wpływ na wartości K_m i Vma)(S, Kooperatywne wiązanie substratu ma istotne znaczenie fizjologiczne Fizjologiczne następstwa kooperatywnego wiązania substratu są analogiczne jak w przypadku efektów kooperatywnego wiązania O2 przez hemoglobinę. Przy małym stęŜeniu substratu efektor allosteryczny jest skutecznym inhibitorem. Jego oddziaływanie regulatorowe jest więc najbardziej efektywne w warunkach największego zapotrzebowania, tj. kiedy wewnątrzkomórkowe stęŜenie substratu jest małe. Wraz ze zwiększeniem dostępności substratu ścisła regulacja staje się mniej konieczna. W miarę zwiększania stęŜenia substratu stopień hamowania maleje i w rezultacie powstaje więcej produktu. Podobnie jak w przypadku hemoglobiny, sigmoidalna krzywa nasycenia substratem świadczy o tym, Ŝe względnie małe zmiany stęŜenia substratu powodują duŜe zmiany aktywności. W ten sposób poprzez małe zmiany stęŜenia substratu jest osiągana czuła kontrola aktywności katalitycznej enzymu. Ponadto, analogicznie do zróŜnicowania krzywych nasycenia O2 hemoglobin odmiennych gatunków, sigmoidalne krzywe nasycenia enzymów regulatorowych, pochodzących z róŜnych źródeł, mogą być przesunięte w lewo lub w prawo w zaleŜności od istniejącego in vivo stęŜenia substratu.

REGULACJA NA ZASADZIE SPRZĘśENIA ZWROTNEGO NIE JEST SYNONIMEM HAMOWANIA PRZEZ SPRZĘśENIE ZWROTNE Zarówno w komórkach ssaków, jak i bakterii produkty końcowe, działając na zasadzie „sprzęŜenia zwrotnego", kontrolują swoją syntezę. W wielu przypadkach mechanizm tego zjawiska polega na hamowaniu enzymu katalizującego początkowe etapy biosyntezy. NaleŜy jednak odróŜnić regulację na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego, stanowiącą jedynie określenie fenomenologiczne, od hamowania przez sprzęŜenie zwrotne stanowiącego mechanizm regulacji wielu enzymów bakterii i ssaków. Na przykład cholesterol zawarty w diecie ogranicza syntezę cholesterolu z octanu w tkankach ssaków. Ta regulacja na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego nie polega jednak na hamowaniu przez sprzęŜenie zwrotne enzymu katalizującego pierwsze etapy biosyntezy cholesterolu, ale cholesterol lub jego metabolit powoduje zmniejszenie ekspresji genu kodującego reduktazę HMG-CoA. Cholesterol bezpośrednio nie ma natomiast Ŝadnego wpływu na aktywność reduktazy HMG-CoA. REGULACJA KLUCZOWYCH ENZYMÓW SSAKÓW MOśE POLEGAĆ NA ICH ODWRACALNYCH MODYFIKACJACH KOWALENCYJNYCH Aktywność katalityczna enzymów moŜe być regulowana za pomocą odwracalnych modyfikacji, polegających na przyłączaniu grup fosforanowych (głównie u ssaków) lub nukleotydów (głównie u bakterii). Enzymy ulegające modyfikacjom wpływającym na ich aktywność są określane jako enzymy o wewnątrzcząsteczkowej zmienności (ang. interconvertible enzymes) (ryc. 11-7). Enzymy te występują w 2 formach róŜniących się sprawnością katalityczną. W zaleŜności od rodzaju enzymu formą o większej aktywności katalitycznej moŜe być postać ufosforylowana lub defosforylowana (tab. 11-2). Enzymy mogą mieć wiele miejsc fosfory lacji Fosforylacji ulega swoista reszta Ser lub rzadziej Tyr, z utworzeniem odpowiednio Ofosfoserynowej lub O-fosfo tyrozyn owej po-

128 / ROZDZIAŁ 11 ATP

P-Enz

ADP

NMP-Enz Ryc.

11-7. :

Enz-Ser>O-PO, Regulacja aktywności enzymu w wyniku modyfikacji kowalencyjnej. Strona lewa: fosforylacja. Strona prawa: nukleotydylacja. W przypadku obu procesów trifosforanem nukleozydu (NTP) jest zazwyczaj ATP, Tabela 11-2. Wybrane przykłady enzymów ssaków, których aktywność katalityczną warunkuje fosforylacja-defosforylacja. E — forma defosforylowana, EP — forma ufosforylowana Enzym

Aktywność mała duŜa

Ka r bo ks y I aza a cety I o - Co A

EP E

Syntaza glikogenowa

EP E

Dehydrogenaza pirogronianowa

EP E

Reduktaza HMG-CoA

EP E E EP

Fosforylaza glikogenowa Liaza cytrynianowa Kinaza fosforylazy b

E EP E EP

Kinaza reduktazy HMG-CoA

E EP

chodnej. Mimo Ŝe enzymy mogą zawierać wiele reszt Ser lub Tyr, fosforylacja ma charakter wybiórczy i dotyczy tylko niektórych z nich. Przypuszczalnie reszty te nie wchodzą w skład miejsca katalitycznego, przynajmniej w sensie struktury pierwszorzędowej, ale stanowią następny przykład miejsca allosterycznego. Białkami przekształcającymi są kinazy i fosfatazy białek Fosforylację i defosforylację katalizują odpowiednio kinazy i fosfatazy białek (białka przekształcające — ang. converter proteins), które w pewnych szczególnych przypadkach same mogą ulegać tym modyfikacjom kowalencyjnym (ryc. 11-8, tab. 11-2). Istnieją więc kinazy kinaz białek i fosfatazy kinaz białek katalizujące wewnątrzcząsteczkowe zmiany enzymów odpowiedzialnych za fosforylację innych enzymów. Mniej są" natomiast przekonujące dowody o fosforylacji i defosforyjacji

Ryc. 11-8. Regulacja aktywności enzymu w wyniku modyfikacji kowalencyjnej, polegającej na fosforylacji i defosiorylacjt reszty Ser.

fosfataz, chociaŜ ich aktywność jest równieŜ regulowana. Aktywność zarówno kinaz, jak i fosfataz białek jest kontrolowana przez układ hormonalny i nerwowy, przy czym szczegółowy mechanizm tej regulacji nie jest w wielu przypadkach poznany. Regulacja przez fosforylację i dafosforylację zuŜywa ATP Reakcje przedstawione na ryc. 11-8 przypominają wzajemne przekształcenia glukozy i glukozo-6-fosforanu oraz fruktozo-6-fosforanu i fruktozo-l,6-bisfosforanu (p. rozdz. 19). W wyniku fosforylacji, a następnie defosforylacji 1 mola substratu (enzymu lub cukru) hydrolizie ulcg;i 1 mol ATP. Sugeruje to, Ŝe aktywność kinaz (katalizujących reakcje 1 i 3) i fosfataz (katalizujących reakcje 2 i 4) jest wzajemnie regulowana, bowiem w przeciwnym razie powodowałyby one niekontrolowaną hydrolizę ATP. 1.

Glukoza + ATP -+ ADP + Giukozo-6-P

2.

H,O + Glukozo-6-P -* P\ + Glukoza

Netto:

HaO + ATP -» ADP + P;

3.

Enz-Sar-OH + ATP — ADP + Enz-Ser-O-P

4.

HaO + Enz-Ser-O-P -» P, + Enz Ser-OH

Netto:

HaO + ATP -> ADP + Pf

Modyfikacje kowalencyjne, podobnie jak hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne, regulują przepływ metabolitów Regulacja aktywności enzymów, w wyniku fosforylacji i defosforylacji wykazuje analogie z regulacją na zasadzie hamowania przez sprzę-

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI / 129

Ŝenię zwrotne. Oba mechanizmy regulują przepływ metabolitów w odpowiedzi na sygnały fizjologiczne, nie wywołując zmian w ekspresji genów, obejmując enzymy początkowych etapów szlaków metabolicznych (często biosyntez) oraz działając poprzez zmiany w miejscu allosterycznym, a nie katalitycznym. Jednak hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne dotyczy pojedynczego białka i nie podlega regulacji hormonalnej i nerwowej. Przeciwnie regulacja aktywności enzymów ssaków w wyniku fosforylacji i defosforylacji obejmuje wiele białek oraz ATP lub inne trifosforany nukleozydów, a takŜe jest bezpośrednio kontrolowana przez układ hormonalny i nerwowy.

9 — Biochem in

PIŚMIENNICTWO Crabtree B, Newsholme EA: A systematic approach to describing and analyzing metabolic control systems. Trends Biochem Sci 1987;12:4. Kacser H, Porteus JW: Control of meta boli sm: What Nestler EJ, Greengard P: Protein phosphorylation in the brain. Naturę l983;305:583. Soderling TR; Role of hormones and protein phosphorylation in metabolit regulation. Fed Proc I982;41;2615. Scriver CR et al (editors): The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6th ed. MeGraw-Hill, 1989. Weber G (editor): Advances in Emyme Regulatiots. Pergamon Press, 1963—1990.

■

CZĘSC Bioenergetyka i metabolizm węglowodanów oraz lipidów Bioenergetyka

12

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Bioenergetyka, czyli termodynamika biochemiczna, zajmuje się badaniem zmian energetycznych towarzyszących reakcjom biochemicznym. Dostarcza ona podstawowych reguł wyjaśniających, dlaczego niektóre reakcje mogą zajść, a inne nie mogą. Układy niebiologiczne mogą wykorzystywać energię cieplną do wykonywania pracy. Natomiast układy biologiczne są zasadniczo izotermiczne i uŜywają energię chemiczną do napędzania procesów Ŝyciowych. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Do prawidłowego przebiegu procesów Ŝyciowych jest wymagane odpowiednie „paliwo" dostarczające energii. Znajomość sposobu, w jaki organizm czerpie energie z poŜywienia, jest podstawą zrozumienia prawidłowego odŜywiania i metabolizmu. JeŜeli dostępne rezerwy energetyczne ulegną wyczerpaniu, to dochodzi do śmierci głodowej. Pewne formy wadliwego odŜywiania są związane z brakiem równowagi energetycznej (marazm). Szybkość uwalniania energii, mierzona szybkością metabolizmu, jest regulowana przez hormony tarczycy, której niedoczynność wywołuje chorobę. Wynikiem magazynowania nadmiaru energii jest otyłość, jedna z najbardziej powszechnych chorób społeczeństw zachodnich.

ENERGIA SWOBODNA JEST ENERGIĄ UśYTECZNĄ UKŁADU Zmiana energii swobodnej (AG) jest tą częścią zmiany energii całkowitej układu, która jest wykorzystywana do wykonania pracy, tzn. jest ona energią uŜyteczną, znaną w układach chemicznych jako potencjał chemiczny. Podstawowe prswa termodynamiki dotyczą równieŜ układów biologicznych Pierwsza zasada termodynamiki podaje, Ŝe energia całkowita układu i jego otoczenia jest stała. Jest to równieŜ prawo zachowania energii. Głosi ono, Ŝe w układzie zamkniętym Ŝadna zmiana nie powoduje straty bądź zysku energii. JednakŜe w obrębie tego układu zamkniętego, energia moŜne być przekazywana z jednej części układu do drugiej lub moŜe być przekształcona w inną formę energii. Na przykład w układzie biologicznym energia chemiczna moŜe być przekształcona w energię cieplną, elektryczną, mechaniczną lub energię promieniowania. Druga zasada termodynamiki podaje, Ŝe jeśli proces zachodzi samorzutnie, to musi się zwiększać entropia całkowita układu. Entropia jest miarą nieuporządkowania (bezładu molekularnego) układu. Przybiera ona wartości maksymalne z chwilą osiągnięcia przez układ równowagi. W warunkach stałej temperatury i ciśnienia zaleŜność między zmianą energii swobodnej (AG) układu reagującego a zmianą entropii

132 / ROZDZIAŁ 12

(AS) ujmuje następujące równanie, które łączy 2 zasady termodynamiki: AG = AH - TAS

czenie lub sprzęŜenie z reakcjami oksydacyjnymi. W najprostszej formie ten typ sprzęŜenia moŜna przedstawić tak, jak na ryc. 12-1. ,M 3

gdzie AH oznacza zmianę entalpii (ciepło), a T oznacza temperaturę bezwzględną. W warunkach reakcji biochemicznych, poniewaŜ AH równa się w przybliŜeniu całkowitej zmianie energii wewnętrznej (AE) reakcji, powyŜszą zaleŜność moŜna wyrazić następująco: AG = AE - TAS JeŜeli AG ma znak ujemny, to reakcja zachodzi samorzutnie z utratą energii swobodnej, tzn. jest egzoergiczna. Jeśli wartość AG jest duŜa, to reakcja zachodzi właściwie aŜ do końca i jest zasadniczo nieodwracalna. JeŜeli AG ma wartość dodatnią, to reakcja zachodzi tylko wówczas, gdy energia swobodna moŜe być pobrana z zewnątrz, tzn. reakcja jest endoergiczna. Jeśli wartość AG jest duŜa, to układ jest trwały i charakteryzuje się brakiem lub tylko niewielką skłonnością do reagowania. JeŜeli AG równa się zeru, układ jest w stanie równowagi i nie zachodzą Ŝadne zmiany. Gdy reagenty znajdują się w stęŜeniach 1,0 mol/l, AGC oznacza standardową zmianę energii swobodnej. Dla reakcji biochemicznych jako warunki standardowe przyjęto umownie pH 7,0. Standardową zmianę energii swobodnej w tych standardowych warunkach (tzn. w pH 7,0) oznacza się jako AG0' Standardową zmianę energii swobodnej moŜna obliczyć, znając stałą równowagi K'eq AG°' = -2,303 RT logK'eq

gdzie R jest stałą gazową, a T oznacza temperaturę bezwzględną (p. str. 95), NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe w zaleŜności od stęŜeń róŜnych reagentów wartość AG moŜe być większa lub mniejsza od wartości AG"'. NaleŜy podkreślić, Ŝe w układach reakcji biochemicznych enzym tylko przyspiesza dojście do stanu równowagi i nigdy nie zmienia końcowych stęŜeń reagentów w stanie równowagi. PROCESY ENDOERGICZNE PRZEBIEGAJĄ W SPRZĘśENIU Z PROCESAMI EGZOERGICZNYMI Procesy Ŝyciowe, np. reakcje syntez, skurcz mięśniowy, przewodnictwo nerwowe i aktywny transport, czerpią energię przez chemiczne połą-

4 b Ciepło

fi Ryc. 12-1.

SprzęŜenie reakcji egzoergicznej z en doergiczna.

________

Przemiana metabolitu A w metabolit B zachodzi z uwolnieniem energii swobodnej. Przemiana ta jest sprzęŜona z inną reakcją, która wymaga energii swobodnej do przekształcania metabolitu C w metabolit D. PoniewaŜ część energii uwalnianej w reakcji degradacji jest przekazywana reakcji syntezy w innej postaci niŜ ciepło, nie naleŜy w przypadku tych reakcji uŜywać terminów chemicznych: reakcja egzotermiczna i reakcja endotermiczna. Zamiast nich uŜywa się określeń egzoergiczna lub endoergiczna, aby wskazać, Ŝe procesom towarzyszy odpowiednio strata lub zysk energii swobodnej, niezaleŜnie od formy energii biorącej udział w tych procesach. W praktyce, procesy endoergiczne nie mogą zachodzić samodzielnie, lecz musza być składnikiem sprzęŜonego układu egzoergiczno-endoergicznego, w którym wypadkowa zmiana netto jest egzoergiczna. Reakcje egzoergiczne określa się mianem katabolizm (degradacja lub utlenienie cząsteczek „paliwa"), natomiast reakcja syntez, w wyniku których powstają cząsteczki, określa się jako anabolizm. Wszystkie procesy kataboliczne i anaboliczne nazywa się ogólnie metabolizmem. Jeśli reakcja przedstawiona na ryc. 12-1 przebiega z lewa na prawo, to całemu procesowi musi towarzyszyć utrata energii swobodnej w postaci ciepła. Jeden z moŜliwych mecha-

BIOENERGETYKA / 133

nizmów sprzęŜenia mógłby polegać na uczestnictwie w obu reakcjach wspólnego koniecznego związku pośredniego (I), A+C

I

B+D

W ten sposób są sprzęŜone niektóre reakcje egzoergiczne i endoergiczne w układach biologicznych. NaleŜy uświadomić sobie, Ŝe ten typ układu ma wbudowany mechanizm biologicznej kontroli szybkości procesów oksydacyjnych, poniewaŜ istnienie wspólnego koniecznego związku pośredniego powoduje, Ŝe szybkość zuŜycia produktu szlaku syntezy (D) warunkuje z kolei, przez jego działanie masowe, szybkość, z jaką ulega utlenieniu A. Istotnie, te wzajemne powiązania stanowią podstawę koncepcji kontroli oddechowej, procesu który zabezpiecza organizm przed spalaniem poza kontrolą. Rozwinięciem koncepcji sprzęŜeniowej są reakcje odwodornienia, sprzęŜone za pośrednictwem przenośnika międzyenzymowego z reakcjami uwodornienia (ryc. 12-2).

Alternatywną metodą sprzęgania procesów egEoergicznych z' procesami endoergicznymi jest synteza związku bogatoenergetycznego w reakcji egzoergicznej i włączenie tego nowego związku w reakcję endoergiczną. Tym sposobem następuje przeniesienie energii swobodnej z procesu egzoergicznego do endoergicznego (ryc 12-3). Na rycinie 12-3 — © jest związkiem bogatoenergetycznym, a © jest odpowiadającym mu związkiem małoenergetycznym. Zaletą biologiczną tego mechanizmu jest to, Ŝe ®, w przeciwieństwie do I w poprzednim układzie, nie musi być strukturalną pochodną A, B, C lub D. W ten sposób związek ® moŜe shiŜyć jako przekaźnik energii pochodzącej z wielu reakcji egzoergicznych na równie duŜą liczbę reakcji lub procesów endoergicznych, jak to przedstawiono na ryc. J2-4. PracMy endoMglczne Syntezy

Rnkcja BH;

AH,

«gioergiezne Skurcz mięśni

B

A

Przenośnik Przenośni k-H

Ryc. 12-2. SprzęŜenie reakcji odwodornienia i uwodornienia za pośrednictwem przenośnika międzyenzymowego. Ryc. 12-3. Przeniesienie energii swobodnej z reak cji egzoergicznej do endoergicznej za pośrednict

Transport aktywny

Ryc. 12-4. Przekazanie energii endoergicznym procesom biologicznym przy udziale „uniwersalnego" pośrednika bogatoenergetycznego.

W Ŝywych komórkach najwaŜniejszym boga toenergetycznym związkiem pośrednim hib związkiem przenośnikowym (oznaczonym ~ ©) jest trifosfoadenozyna (ATP). FOSFORANY BOGATOEN ERG ETYCZNE ODGRYWAJĄ KLUCZOWĄ ROLĘ W PRZEJMOWANIU I PRZENOSZENIU ENERGII B

wem bogatoen erg etycznego metabolitu pośred niego. ___________________________

Wszystkie organizmy, w celu podtrzymania procesów Ŝyciowych, mus74 pobierać energię swobodną ze swojego środowiska. Organizmy

134 / ROZDZIAŁ 12

a u to troficzne sprzęgają swój metabolizm z pewnymi procesami egzoergicznymi zachodzącymi w ich otoczeniu, np. rośliny zielone wykorzystują energię słoneczną, a niektóre bakterie autotroficzne wykorzystują reakcję Fe2+ --------------------------------------------------------------------------------------

> Fe3+. Natomiast organizmy heterntroficzne uzyskują energię swobodną przez sprzęŜenie ich metabolizmu z degradacją złoŜonych cząsteczek organicznych występujących w ich środowiskach. We wszystkich tych procesach ATP odgrywa kluczową rolę w przenoszeniu energii swobodnej z procesów egzoergicznych na procesy endoergiczne {ryc. 12-3 i 12-4). ATP jest wyspecjalizowanym nukleotydem zawierającym adeninę, ryboze i 3 grupy fosforanowe (ryc. 12-5). W komórce ATP uczestniczy w reakcjach w postaci kompleksu z Mg2+ (ryc. 12-6).

od dostarczenia energii pochodzącej z procesów utleniań przebiegających w mięśniach. Rola tych związków w bioenergetyce była wyraźnie niedoceniana, aŜ do czasu gdy Lipmann wprowadził pojęcie „fosforanów bogatoenergetycznych" i „fosforanowych wiązań bogatoenergetycznych". Pośrednia wartość energii swobodnej hydrolizy ATP, w porównaniu z innymi fosforanami organicznymi, ma istotne znaczenie bioenergetyczne Standardową energię swobodną hydrolizy niektórych biochemicznie waŜnych fosforanów przedstawiono w tab. 12-1. Na podstawie daTabela 12-1. Standardowa energia swobodna hydrolizy niektórych biochemicznie waŜnych fosł+ foranów organicznych AG" Fosforan organiczny

0i

o-

O-P-O-P-O-P-O-CHS u

»

n

° ° °

l

O

kw HO OH

Ryc. 12-5. Adenozynotrifosforan (ATP).

kj/mof

kcal/mol

Fosfoenolopirogronian Karbamoilofosforan 1,3-Bisfosfogliceryntan (do 3-fosfoglicerynian) Fosfokreatyna

-61,9 -51,4 -49,3

-14 ,8 -12,3 -11,8

-43,1

-10,3

ATP ---------- ► ADP + Pf

-30,5

- 7,3

ADP-----------» AMP + P,

-27,6

- 6,6

Pirofosforan Glukozo-1 -fosforan Fruktozo-6-f osf ora rt

-27,6 -20,9 -15,9 -14,2 -13,8 - 9,2

-

AMP

o~ o-

o~

-0-P-O-P-O-P-O- Adenozyna M II II 0 0 0

Glukozo-6-fosforan Glicerolo-3-fosforan

6,6 5,0 3,8 3,4 3,3 2,2

Ryc. 12-6. Magnezowy kompleks ATP. {Podobnie wygląda kompleks Mg-ADP).

* Pi —fosforan nieorganiczny. + Wartości dla ATP i większości pozostałych związków na podstawie Krebsa i Kornberga (1957).

Znaczenie fosforanów w metabolizmie pośrednim stało się jasne wraz z poznaniem chemicznych szczegółów glikolizy oraz roli ATP, difosfoadenozyny (ADP) i fosforanu nieorganicznego (Pj) w tym procesie (p. str. 213). Przyjęto, Ŝe ATP jest pośrednikiem w przenoszeniu rodników fosforanowych w procesie fosforylacji. Rolę ATP w energetyce biochemicznej sugerowały dane doświadczeń, wskazujących, Ŝe podczas skurczu mięśniowego' rozpada się ATP j fosfokreatyna, a ich ponowna synteza zaleŜy

nych AG°' hydrolizy (oznaczanej w temp. 37°C) moŜna ocenić porównawczo skłonność kaŜdej z grup fosforanowych do przejścia na odpowiedni akceptor. Jak widać z tabeli, wartość — 30,5 kJ/mol dla hydrolizy końcowego fosforanu ATP dzieli wymienione związki na 2 grupy. Jedną grupę stanowią fosforany małoenergetyczne, reprezentowane przez estry fosforanowe uczestniczące w glikohzie, dla których wartość AG°' hydrolizy jest mniejsza niŜ dla ATP, natomiast w drugiej grupie, określanej mianem

BIOENERGETYKA / 135

fosforany bogatoenergetyczne, wartość jest większa niŜ dla ATP. Składniki tej ostatniej grupy, obejmującej ATP i ADP, są zwykle bezwodnikami (np. fosforan-1 w 1,3 -bis fosfo glicery nianie), enolofosforanami (np. fosfoenolopirogroniań) lub fosfoguanidynami (np. fosfokreatyna, fosfoarginina). Środkowa pozycja ATP pozwala mu odgrywać istotną rolę w przenoszeniu energii. Inne biologicznie waŜne „związki bogatoenergetyczne" to estry tioiowe zawierające koenzym A (np. acetylo-CoA), białko przenoszące reszty acylowe kwasów tłuszczowych (ang. acyl carrier protein; ACP), estry aminokwasów uczestniczące w syntezie białek, S-adenozylometionina (aktywny metyl), UDP-Glc (urydynodifosfoghikoza) i PRPP (5-fosforybozylo-l-pirofosforan). Fosforany bogatoenergetyczne oznacza się symbolem ~ ©

W celu zaznaczenia obecności bogatoenergetycznej grupy fosforanowej, Lipmann wprowadził symbol ~®, oznaczający bogatoenergetyczne wiązanie fosforanowe. Symbol ten wskazuje, Ŝe dołączona do tego wiązania grupa, po przeniesieniu na odpowiedni akceptor, przekaŜe większą ilość energii swobodnej. Z tego lub Adenozyno

r Ad en oz yn o- 0 -P M O -

Adenozynotrlfostoran (ATP)

o-

o-

Adeno,2yno - 0 - P - ©/—P II """"T

0

o-

0

lub Adenozyno- (&)—(?) Adenozynodltosforan (ADP)

0 Adenozyno -O - P - 0 ~

h

lub Adenozyno — (ji) Adenozynomonofosforan (AMP)

Ryc. 12-7. Struktura ATP, ADP i AMP ukazująca połoŜenie i liczbę fosforanów bogato en erg etycznych (~).

powodu, niektórzy preferują określenie potencja! przenoszenia grupy zamiast wiązanie bogatoenergetyczne. ATP więc zawiera 2 bogatoenergetyczne grupy fosforanowe, a ADP zawiera 1; natomiast fosforan w AMP (adenozynomonofosforanie) jest typu małoenergetycznego, poniewaŜ jest połączony zwykłym wiązaniem estrowym (ryc, 12-7). FOSFORANY BOGATOENERGETYCZNE DZIAŁAJĄ JAKO OBIEGOWA MONETA ENERGETYCZNA KOMÓRKI

Dzięki swemu połoŜeniu, pośrodku listy standardowych energii swobodnych hydrolizy (tab. 12-1), ATP moŜe być donorem fosforanu bogatoenergetycznego dla związków znajdujących się w tabeli poniŜej ATP. Z tego samego powodu, w obecności odpowiednich enzymów, ADP moŜe być akceptorem fosforanu bogatoenergetycznego od związków znajdujących się w tabeli powyŜej ATP; w reakcji tej powstaje ATP. W istocie, cykl ATP/ADP łączy procesy generujące ~© z procesami zuŜywającymi ~® (ryc. 12-8). W ten sposób ATP jest stale zuŜywany 1 odtwarzany. Zasadniczym źródłem MS są 3 procesy uczestniczące w wychwytywaniu energii, czyli zachowaniu energii: 1. Foforylacja oksydacyjna. Jest to ilościowo największe źródło ~ ® w organizmach tlenowych. Energia swobodna, napędzająca ten proces, pochodzi z utlenian w mitochondriainym łańcuchu oddechowym (p. str. 153). 2. Glikoli/a. W wyniku przemiany do mleczanu z 1 mola glukozy uzyskuje się netto 2 ~©, tworzone w 2 reakcjach katalizowanych odpowiednio przez kinazę fosfogliceryniartową i kinazę pirogronianową (p. ryc. 19-2). 3. Cykl kwasu cytrynowego. Bezpośrednio w cyklu po wstaje jeden ~ ®, na etapie katalizowanym przez syntetazę sukcynylo-CoA (p. ryc. 18-3). Inna grupa związków, fosfageny, stanowi zapasową formę fosforanów boga to energetycznych. NaleŜy do niej fosfokreatyna, występująca w mięśniach kręgowców i w mózgu, oraz fosfoarginina występująca w mięśniach bezkręgowców. W warunkach fizjologicznych fosfageny pozwalają utrzymać stęŜenie ATP w mięśniach w sytuacji, gdy ATP jest szybko zuŜywany, słuŜąc jako źródło energii do skurczu mięśniowego. Odwrotnie, w sytuacji gdy ATP jest pod dostatkiem, zwiększa się stęŜenie fosfage-

136 / ROZDZIAŁ 12

ga toenergetyczny z mitochondriów do sarkolemy i działa jako bufor bogatoenergetyczny. Ten bufor moŜe mieć waŜne znaczenie w mięśniu sercowym, odgrywając rolę natychmiastowej osłony przed skutkami zawału. Gdy ATP działa jako donor fosforanu z utworzeniem związku charakteryzującego się niniejszą energią swobodną hydrolizy (tab. 12-1), grupa fosforanowa przekształca się zawsze w grupę małoenergetyczną, np.

Fosfo1,3-B isfosfog 11 ceryn i a n anolopirogronian Fosforylacja oksydacyjna Sukcynyto -CoA

KINAZA G LICE ROLO W A

Glicerol +Adenozyno-? Glicerolo-n + Adenozyno-® ~®

ATP pozwala sprząc reakcje tertnodynamicznie niekorzystne z reakcjami termodynamicznie korzystnymi Na rycinie 12-1 oraz 12-3 przedstawiono szczegółowo energetykę reakcji sprzęŜonych. Tego rodzaju reakcją jest pierwsza reakcja ciągu glikoli tycznego (p. ryc. 19-2), fosforylacji glukozy do giukozo-6-fosforanu. Jest ona bardzo endoergiczna i nie moŜe przebiegać samodzielnie w warunkach fizjologicznych.

Inne fosfory I acje, aktywacje i procesy endoerglczne

Gl I ce ra to-3-f osf □ ran Gl ukozo-6fosforan Glukoza-1,6blsfosforan

1. Glukoza+ P

Ryc. 12-8. Rola cyklu ATP/ADP w przenoszeniu ■fosforanu bogatoenergetycznego. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe — © nie występuje w stanie wolnym, ale w takiej postaci jest przenoszony we wskazanych reakcjach.

nów słuŜących jako zapas fosforanów bogatoenergetycznych (ryc. 12-9). W mięśniach „czółenko fosfokreatynowe" transportuje fosforan bo-

KINAZA 1 KREATYNOWA

t

C

H3CN CH, COOH Fosfokreatyna

C=MH-«*-

*T ADP

ATP

^Glukozo-6-fosforan +

(AG°'=+13,8kJ/mol) Aby reakcja mogła zajść, musi zostać sprzęŜona z inną reakcją, która jest bardziej egzoergiczna niŜ fosforylacja glukozy endoergiczna. Taką reakcją jest hydroliza końcowego wiązania fosforanowego w ATP, 2. ATP

(AG°'= -30,5 kJ/mol) Gdy (1) i (2) są sprzęŜone w reakcji katalizowanej przez heksokinazę, fosforylacja glukozy przebiega bc/. trudu w bardzo tgzoergicznej reakcji, która w warunkach fizjologicznych jest daleka od równowagi i z tego powodu praktycznie nieodwracalna.

CHi

= -12,6 kJ/mol)

COOH

MEKSOKINAZA

Kfeatyna

Ryc. 12-9. Przenoszenie fosforanu bogatoenergetycznego z fosfokreatyny ń'a ADP i z ATP na kreatynę, „Czółenko fosfokreatynowe".

Glukoza + ATP

---------- ► Gliikozo-6-fosforan+ADP
BIOENERGETYKA / 137

Wiele reakcji „aktywacji" zachodzi w ten sposób.

Kombinacja pąwyŜszych reakcji umoŜliwia obieg fosforanu i przemianę wzajemną nukleotydów adeninowych (ryc. 12-10).

Kinaza adenylanowa umoŜliwia wzajemną przemianę nukleotydów adenino wych Kinaza adenylanowa (miokinaza) jest enzymem występującym w większości komórek. Katalizuje ona przemianę ATP i AMP w ADP:

PIROFOSFATAZA NIEORGANICZNA

KINAZA ADENYLANOWA

ATP +■ AMP «-

- rel="nofollow"> 2 ADP

Reakcja ta spełnia 3 zadania: 1. UmoŜliwia wykorzystanie fosforanu bogatoenergetycznego w ADP do syntezy ATP. 2. UmoŜliwia refosforylację AMP, powstałe go z ATP w róŜnych reakcjach aktywacji. 3. UmoŜliwia zwiększenie stęŜenia AMP wraz ze zmniejszeniem się stęŜenia ATP. AMP działa jako sygnał metaboliczny (allosteryczny) do zwiększenia szybkości reakcji katabolicznych, które z koiei prowadzą do tworzenia większych ilości ATP (p. str. 246). Gdy ATP uczestniczy w reakcjach z utworzeniem AMP, wówczas powstaje pirofosforan nieorganiczny (PPi) Następuje to np. w reakcji aktywacji długołańcuchowych kwasów tłuszczowych: SYNTETAZA ACYLO-CoA

Ryc. 12-10. Cykle fosforanowe i przemiana wzajemna nukieotydów adeninowych.

RównieŜ inne trifosfonukleozydy uczestniczą w przenoszeniu fosforanu bogatoene rgety cz n eg o Przy udziale kinazy difosfonukleozydowej z odpowiednich difosforanów mogą być syntetyzowane trifosfonukleozydy podobne do ATP, ale zawierające inną zasadę niŜ adenina, np.

ATP + HS—CoA + R—COOH AIWP + PP,+ R—CO—SCoA

Reakcji towarzyszy utrata energii swobodnej w postaci ciepła, co gwarantuje przebieg reakcji aktywacji w prawo. Jest ona dodatkowo wspomagana przez hydrohtyczne rozszczepienie PPj (AG°r = — 27,6 kJ/mol), katalizowane przez pirofosfatazę nieorganiczną. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe w wyniku reakcji aktywacji, zachodzącej z utworzeniem pirofosforanu, dochodzi do utraty 2~©, a nie l~®, jak w przypadku reakcji z utworzeniem ADP i Pj. PIROFOSFATAZA NIEORGANICZNA

i + HzO

2P,

KINAZA DIFOSFONUKLEOZYDOWA

ATP+UDP ADP+UTP (u r yd y n ot r if osfo ra n)

ATP+GDP ADP-rGTP (guanuzynotrifosforan)

ATP+CDP

—<■ ADP+CTP (cytydynotrifosforan)

Wszystkie te trifosforany uczestniczą w reakcjach fosforylaeji zachodzących w komórce. Podobnie kinazy monofosfonukleozydowe, swoista dla nukleozydów purynowych i swoiste dla nuk]eozydów pirymidynowych, katalizują reak-

138 / ROZDZIAŁ 12

cje tworzenia disfosfonukleozydów z odpowiednich monofosforanów: SWOISTA KINAZA MONOFOSFO NUKLEOZYDOWA

ATP + Nukleozydo-J < ADP+ Nukleozydo-© ~©

Wynika z tego, Ŝe kinaza adenylanowa jest wyspecjalizowaną kinazą monoiosforanową.

PIŚMIENNICTWO Ernsier L (editor): Bioenergetics. Elsevier, 1984. Harold FM; The Vitat Force: A Study of Bioenergetics. Freeman, 1986. Klotz IM: Introduclion to Biomolecular Energetics. Academic Press, 1986, Krebs HA, Kornberg HL: Energy Transformatwns in Living Matter. Springer, 1957. Lehninger AL: Bioenergetics: The Molecułar Basis of BiologicaJ Energy Transformatwns, 2nd ed, Benjamin, 1971.

■

13

Utleniania biologiczne Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Chemicznie utlenianie definiuje się jako proces usuwania elektronów, natomiast redukcję jako proces przyłączania elektronów; ilustruje to reakcja utlenienia jonu Ŝelazawego w jon Ŝelazowy:

J -+

e~ (elektron) 3+

Fe

Wynika z tego, Ŝe utlenieniu zawsze towarzyszy redukcja biorcy elektronów. Ta reguła utleniania — redukcji obowiązuje równieŜ w układach biologicznych i jest zasadniczym pojęciem pozwalającym zrozumieć istotę utleniań biologicznych. NaleŜy podkreślić fakt, Ŝe wiele utleniań biologicznych moŜe zachodzić bez udziału tlenu cząsteczkowego np. procesy odwodorowania.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE ChociaŜ pewne bakterie (beztlenowce) Ŝyją w nieobecności tlenu, Ŝycie wyŜszych gatunków zwierząt jest bezwzględnie zaleŜne od obecności tlenu. Głównym procesem zuŜywającym tlen jest oddychanie tkankowe, które moŜna określić jako proces kontrolowanej reakcji wodoru z (Jenem i tworzenia wody, w którym komórka uzyskuje energię w postaci ATP. Poza tym tlen cząsteczkowy jest wbudowywany do róŜnych substratów przez enzymy określane mianem oksygenaz; wiele leków, chemicznych zanieczyszczeń środowiska i chemicznych karcynogenów (ksenobiotyków) jest meta boi izowanych przy udziale tej klasy enzymów, określanych jako system cytochromu P-450. Podawanie tlenu chorym z niewydolnością oddechową lub krąŜeniową moŜe uratować im Ŝycie, a sporadyczne podawanie tlenu pod wysokim ciśnieniem (hiperbaria) ma równieŜ zastosowanie kliniczne, aczkolwiek moŜe to prowadzić do wystąpienia toksycznych działań tlenu.

ZMIANY ENERGII SWOBODNEJ W UKŁADACH OKSYDACYJNO-REDUKCYJNYCH MOGĄ BYĆ WYRAśONE JAKO POTENCJAŁ RED.-OKS. W reakcjach obejmujących utlenianie i redukcję wymiana energii swobodnej jest proporcjonalna do skłonności związków reagujących do oddawania lub pobierania elektronów. Stąd teŜ, oprócz wyraŜania zmian energii swobodnej jako AG°' (p. rozdz. 12), moŜliwe jest analogiczne wyraŜenie ich liczbowo jako potencjał oksydoredukcyjny lub red.-oks. układu (Eo')_ Zazwyczaj porównuje się potencjał oksydoredukcyjny układu (Eo) z potencjałem elektrody wodorowej, którego wartość w pH 0 określa się jako 0,0 woltów. Jednak w przypadku układów biologicznych przyjęło się wyraŜanie potencjału oksydoredukcyjnego (Eo'} w pH 7,0, w którym to pH potencjał elektrody wodorowej równa się -0,42 V. W tabeli 13-1 podano potencjały Tabela 13-1. Niektóre potencjały oksydoredukcyjne o specjalnym znaczeniu w układach oksydoredukcyjnych ssaków Układ

EO'[V1

Bursztynian/cc-ketogluiaran H + /H2 NAD+/NADH Liponian/dihydroliponian Acetoocta n/J3- hydroksymaślan Piróg ronian/mleczan Szczawiooctan/jabłczan Flawoproteina -stary Ŝółty enzym; ult./zred. fumaran/bursztynian 3+ 2+ Cytochrom b; Fe /Fe Ubichinon/ubichinol 3+ 2+ Cytochrom c; Fe /Fe 3+ 2+ Cytochrom a; Fe /Fe Tlen/woda

-0,67 -0,42 -0,32 -0,29 -0,27 -0,19 -0,17 -0,12 + 0,03 + 0,08 + 0,10 + 0,22 + 0,29 + 0,82

140 / ROZDZIAŁ 13

oksy do redukcyjne niektórych biologicznych układów oksydoredukcyjnych, szczególnie interesujących w biochemii ssaków. Na podstawie przedstawionych w tabeli wartości potencjałów oksy do redukcyjnych moŜna przewidzieć kierunek przepływu elektronów z jednej pary oksyd o redukcyjnej na drugą. ENZYMY UCZESTNICZĄCE W UTLENIANIU I REDUKCJI OKREŚLA SIĘ MIANEM OKSYDOREDUKTAZ Oksydoreduktazy podzielono na 4 grupy: oksydazy, dehydrogenazy, peroksydazy i oksygenazy. OKSYDAZY UśYWAJĄ TLENU JAKO AKCEPTORA WODORU Oksydazy katalizują oderwanie wodoru z substratu w reakcji, w której tlen jest biorcą wodoru*. Produktem reakcji jest woda lub nadtlenek wodoru (ryc. 13-1).

Ryc. 13-1. Utlenianie metabolitów katalizowane przez oksydazę (A) tworzącą wodę, (B) tworzącą H2O3.

Niektóre oksydazy zawierają miedź Oksydaza cytochromowa jest hemoproteiną szeroko rozpowszechnioną w wielu tkankach roślinnych i zwierzęcych. Jest ona końcowym przenośnikiem elektronów w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym, a zatem jest odpowiedzialna za reakcję, w której elektrony pochodzące z utleniania cząsteczek substratów przez dehydrogenazy są przenoszone na ich * Czasami nazwa „oksydaza" jest uŜywana jako ogólne określenie wszystkich enzymów, które katalizują reakcje wymagające udziału tlenu cząsteczkowego-

końcowy akceptor — tlen. Oksydaza traci aktywność w obecności tlenku węgla, cyjanku lub siarkowodoru. Enzym ten równieŜ nazywano cytochromem a3. Początkowo przypuszczano, Ŝe cytochrom a i cytochrom a3 są związkami niezaleŜnymi, gdyŜ kaŜdy z nich ma inne widmo i róŜne właściwości w odniesieniu do działania tlenku węgla i cyjanku. W późniejszych badaniach wykazano, Ŝe te 2 cytochromy występują w tym samym białku, a kompleks jest znany jako cytochrom aa3. Zawiera on 2 cząsteczki hemu, z których kaŜda ma atom Fe występujący podczas utleniania i redukcji w formie Fe3+ lub Fe2+. Kompleks zawiera równieŜ 2 atomy Cu, kaŜdy z nich związany z jednostką hemową. Fcnolaza (tyrozynaza, oksydaza polifenolowa, oksydaza katecholowa) jest zawierającym miedź enzymem o szerokiej swoistości substratowej. Katalizuje ona przemianę monofenoli lub o-difenoli w 0-chinony. RównieŜ inne enzymy zawierają miedź. Niektóre oksydazy są flawoproteinami Enzymy flawo protein owe zawierają mononukleotyd flawinowy (FMN) lub dinukleotydflawinoadeninowy (FAD) jako grupy prostetyczne. FMN i FAD są wytwarzane w organizmie z witaminy — ryboflawiny (p. rozdz. 53). FMN i FAD są zwykle mocno — ale nie kowalencyjnie — związane z odpowiednim apoenzymem. Enzymy flawoproteinowe, określane mianem meltdoflawoprotein, zawierają jeden lub więcej metali, które są niezbędne do działania enzymu. Do tej grupy oksydaz zalicza się min. oksydazę L-aminokwasową, współdziałający z FMN enzym występujący w nerkach. Enzym ten katalizuje deaminację oksydacyjną naturalnie występujących L-aminokwasów. Szeroko rozpowszechniona jest oksydaza ksantynowa, której aktywność wykryto w mleku, jelicie cienkim, nerce i wątrobie. Zawiera ona molibden i odgrywa waŜną rolę w przemianie zasad purynowych w kwas moczowy (p. str. 425). Ma ona szczególne znaczenie w wątrobie i nerkach ptaków, które wydalają kwas moczowy jako główny azotowy produkt końcowy metabolizmu nie tylko puryn, iecz takŜe katabolizmu białek i aminokwasów. Dehydrogenaza aldehydowa jest enzymem związanym z FAD, występującym wwątrobie ssaków. Jest to tnetaloflawoproteina zawierająca molibden i Ŝelazo niehemowe, a działa na aldehydy i substraty N-heterocykliczne.

UTLENIANIA BIOLOGICZNE / 141 Przenośnik (Uli) (Utl)

8H, (Zred) B (Utl)

Przenośnik(Zred) DEHYDflOGENAZA SPECYFICZNA DLft

DEHYDROGENAZA SPECYFICZNA DLA A

Ryc. 13-2. Utlenianie metabolitów katalizowane przez dehydrogenazy, zachodzące bez udziału łań cucha oddechowego, ________

Interesująca, ze względu na zastosowanie w oznaczaniu stęŜenia glukozy, jest oksydaza glukozowa, FAD-zaJeŜny enzym otrzymywany z grzybów. Mechanizm reakcji oksydoredukcyjnych, katalizowanych przez te enzymy, jest złoŜony. JednakŜe są dowody na to, Ŝe redukcja pierścienia izoalloksazynowego zachodzi w 2 etapach przez pośredni związek semichinonowy (wolny rodnik) (ryc. 13-3). DEHYDROGENAZY NIE MOGĄ UśYWAĆ TLENU JAKO AKCEPTORA WODORÓW Ta klasa obejmuje duŜą liczbę enzymów. Spełniają one 2 zasadnicze funkcje: a. Przenoszą wodory z jednego substratu na

drugi w sprzęŜonej reakcji oksydoredukcyjnej (ryc. 13-2). Te deriydrogenazy są swoiste względem ich substratów, ale często uŜywają tego samego koenzymu lub przenośnika wodorów co inne dehydrogenazy. PoniewaŜ reakcje są odwracaine, właściwości te pozwalają swobodnie przenosić równowaŜniki redukujące wewnątrz komórki. Ten typ reakcji, w której jeden subslrat utlenia się kosztem drugiego, jest uŜyteczny zwłaszcza w nieobecności tlenu umoŜliwia bowiem przebieg procesów oksydacyjnych, b. Jako składniki łańcucha oddechowego transportującego elektrony z substratu na tlen (ryc. 13-4). Niektóre dehydrogenazy są zaleŜne od koenzymów nikotynoamidowych Ta kategoria enzymów obejmuje liczną grupę dehydrogenaz, których koenzymem jest dinukleotyd nikotynoamido-adeninowy (NAD+) lub fosforan dioukleotydu nikotynoamido-adeninowego (NADP+). Niektóre dehydrogenazy mogą uŜywać zarówno NAD+, jak i NADP+NAD+ i NADP+ są wytwarzane w organizmie 2 witaminy —• niacyny (p. ryc. 53-4). Koenzymy te ulegają redukcji przez swoisty substrat dehydrogenazy i reoksydacji przez właściwy akceptor elektronów (ryc. 13-5). Mogą one swobodnie i odwracalnie dysocjować od odpowiednich apoenzymów. Na ogół NAD-zaleŜne dehydrogenazy katalizują reakcje oksydoredukeji w oksydacyjnych

Ryc. 13-3. Redukcja pierścienia izoalloksazynowego w nukleotydach Ilawinowych.

[DEHYDROGENAŹA]

| DEHYPROGENAZAl Przenośnik

j PEHYDROSENAZAI Przenośnik-H,

[OKSYDAZA I Przenośnik

AH 3 (Utl)

A

lUtt)

1 (Zred)

Przenośnik 2 (Utl)

y\przenośnlK-H,

(Zred) ostatecznie przez oksydazę w łańcuchu Ryc. 13-4. Utlenianie metabolitu przez dehydrogenazy oddechowym.

142 / ROZDZIAŁ 13

DEHYDFIOGENAZ A SWOISTA DLA A

CONHj N

Postać A

R

DEHYDROGENAZA SWOISTA DLA B

NAD+ + Ryc. 13-5. Mechanizm utleniania i redukcji koenzymów nikotynoamidowych. Nikotynoamid jest redukowany stereospecyficznie w pozycji 4 przez substrat AH2. Jeden z atomów wodoru zostaje oderwany od substratu jako anion wodorkowy H" (jądro wodoru z 2 elektronami) i przeniesiony na atom węgla w pozycji 4 nikotynoamidu, gdzie moŜe zostać przyłączony w połoŜeniu A lub B w zaleŜności od swoistości dehydrogenazy katalizującej tę reakcję. Drugi atom wodoru z pary wodorów oderwanych od substratu pozostaje w środowisku wolny jako kation wodorowy.

szlakach metabolizmu, np. w glikolizie, cyklu kwasu cytrynowego i mitochondrialnym łańcuchu oddechowym. Z kolei NADP-zaleŜne dehydrogenazy są charakterystyczne dla syntez redukcyjnych, np. pozamitochondrialnej syntezy kwasów tłuszczowych i syntezy steroidów, NADP jest równieŜ koenzymem dehydrogenaz cyklu pentozofosforanowego. Niektóre dehydrogenazy zaleŜne od koenzymu nikotynoamidowego zawierają cynk, np. dehydrogenaza alkoholowa z wątroby i dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa z mięśni szkieletowych; jony cynku nie uczestniczą w reakcji oksydoredukcji.

bursztynianowa, dehydrogenaza acylo-CoA i mitochondrialna dehydrogenaza glicerolo-3-fosfo-

ranowa przenoszą równowaŜniki redukcyjne bezpośrednio z substratu na łańcuch oddechowy (p. ryc. 14-3). Inną rolą dehydrogenaz zaleŜnych od flawin jest udział w odwodorowaniu (przez dehydrogenazę dihydroliponianową) zredukowanego liponianu, związku pośredniego w dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu i a-ketoglutaranu (p. ryc. 14-3). W tym szczególnym przypadku, z powodu niskiego potencjału o ksy do redukcyjnego, flawoproteina (FAD) działa jako przenośnik wodorów ze zredukowanego liponianu na NAD (p. ryc. 195). Flawoproteina przenosząca elektrony jest

Niektóre dehydrogenazy są zaleŜne od ryboflawiny Grupy {lawinowe związane z tymi dehydrogenazami są podobne do FMN i FAD występujących w oksydazach. Zasadniczo są one ściślej związane ze swoimi apoenzymami niŜ koenzymy nikotynoamidowe. Większość dehydrogenaz ryboflawi nowych bierze udział w przenoszeniu elektronów w (lub dn) łańcuchu oddechowym. Dehydrogenaza NADH jest członem

łańcucha oddechowego działającym jako przenośnik elektronów między MADH a składnikami bardziej elektrododatnimi (p. ryc. 14-2). Inne dehydrogenazy, takie jak dehydrogenaza

pośredniczącym przenośnikiem elektronów między dehydrogenaza acylo-CoA a łańcuchem oddechowym (p. ryc. 14-3). Niektóre cytochromy mogą być traktowane jako dehydrogenazy Z wyjątkiem oksydazy cytochromowej (opisanej wcześniej), cytochromy są klasyfikowane jako dehydrogenazy. Ich identyfikację i badanie ułatwia właściwość występowania w stanie zredukowanym charakterystycznych pasm absorpcyjnych, które zanikają po utlenieniu cząsteczki. W łańcuchu oddechowym cytochromy funkcjonują jako przenośniki elektronów między

UTLENIANIA BtOLOGiCZNE / 143

flawoproteinami a oksydazą cytochromową (p. ryc. 14-3-). Cytochromy są hemoproteinami zawierającymi Ŝelazo, w których atom Ŝelaza podczas oksydoredukcji występuje naprzemiennie w postaci Fe3+ lub w postaci Fe2+. W łańcuchu oddechowym występuje kilka róŜnych cytochromów, mianowicie cytochromy b, Ci, c, a i a3 (oksydazą cytochromową). Spośród nich tylko cytochrom c jest rozpuszczalny w wodzie. Cytochromy występują równieŜ poza łańcuchem oddechowym, np. w siateczce endoplazmatycznej {cytochromy P-450 i b5).

PEROKSYDAZY UśYWAJĄ NADTLENKU WODORU LUB NADTLENKÓW ORGANICZNYCH JAKO SUBSTRATÓW Do tej kategorii zalicza się 2 typy enzymów: klasyczne peroksydazy i katalazę. Oba typy występują zarówno u zwierząt, jak i u roślin, Peroksydazy chronią organizm przed szkodliwymi nadtlenkami. Nagromadzenie się nadtlenków moŜe prowadzić do tworzenia wolnych rodników, co z kolei moŜe być przyczyną uszkodzenia błon itp. i jednym z czynników prowadzących do miaŜdŜycy i nowotworów (p. rozdz. 16).-

Peroksydazy redukują nadtlenki, uŜywając wielu róŜnych związków jako akceptorów elektronów Aczkolwiek pierwotnie sądzono, Ŝe są enzymami roślinnymi, peroksydazy znajdują się w mleku, w leukocytach, płytkach krwi i innych tkankach metabolizujących eikozanoidy (p. str. 290). Grupą prostetyczną peroksydaz jest protonem, który przeciwnie niŜ w większości hemoprotein jest luźno związany z apoproteiną. W reakcji katalizowanej przez peroksydaze. nadtlenek wodoru jest redukowany kosztem róŜnych związków, np. askorbinianu, chinonów i cytochromu c, które działają jako biorcy elektronów. Reakcja katalizowana przez peroksydaze jest złoŜona, ale jej ogólny zapis moŜna przedstawić następująco:

go glutationu rozkład H2O2 i nadtlenków lipidów, zapobiegając w ten sposób utlenieniu lipidów błonowych i hemoglobiny przez nadtlenki (p. str. 233).

Katalaza uŜywa nadtlenku wodoru zarówno jako donora, jak i akceptora elektronów Katalaza jest hemoproteiną zawierającą 4 grupy hemowe. Wykazuje ona aktywność peroksydazową oraz dodatkowo moŜe katalizować reakcję, w której jedna cząsteczka H3O2 jest substratem oddającym elektrony, a druga cząsteczka H2Oi jest utleniaczem, czyli akceptorem elektronów. W warunkach in vivo katalaza wykazuje zwykle aktywność peroksydazową. KATALAZA

2 H2O2 2 H2O + O2

Występowanie katalazy stwierdzono we krwi, szpiku kostnym, błonach śluzowych, nerkach i wątrobie. Przyjmuje się, Ŝe rozkłada ona nadtlenek wodoru tworzony w reakcjach oksydaz. W wątrobie oraz wielu innych tkankach wykazano w komórkach obecność peroksysomów, które charakteryzują się duŜą aktywnością oksydaz i katalazy. Ten fakt sugeruje, Ŝe zgrupowanie enzymów wytwarzających H2O2 z enzymem rozkładającym nadtlenek wodoru jest biologicznie korzystne (ryc. 13-6). Poza

AH 2

A

- H2O5 I KATALAZA 2H;O

Ryc. 13-6. Rola katalazy w procesie rozkładu nadtlenku wodoru.

JPEROKSYDAZA

H2O2 2 H2O + A

W erytrocytach i innych tkankach, peroksydaza glutationu, zawierająca selen jako grupę prostetyczną, katalizuje w obecności zredukowane-

enzymami peroksysomalnymi, wytwarzającymi nadtlenek wodoru, źródłem H2O2 mogą być reakcje katalizowane przez mitochondrialny i mikrosomalny układ transportujący elektrony oraz oksydazę ksantynową.

144 / ROZDZIAŁ 13

OKSYGENAZY KATALIZUJĄ BEZPOŚREDNIE PRZENIESIENIE I PRZYŁĄCZENIE TLENU 00 CZĄSTECZKI SUBSTRATU Oksygenazy uczestniczą raczej w syntezie lub degradacji wielu róŜnych typów metabolitów, a nie w procesach dostarczających komórce energii. Enzymy tej grupy katalizują reakcje przyłączenia tlenu do cząsteczki substratu. Reakcja przebiega dwuetapowo: 1) wbudowanie tlenu do centrum katalitycznego enzymu i 2) reakcja redukcji lub przeniesienia związanego z enzymem tlenu do substratu. Oksygenazy moŜna podzielić na 2 podgrupy. Dioksygenazy (transferazy tlenu, prawdziwe oksygenazy) przyłączają do substratu oba atomy tlenu Podstawowa reakcja przebiega następująco: AO2

A + 02

Do tej podgrupy naleŜą enzymy zawierające Ŝelazo, np. dioksygenaza homogentyzynowa (oksydaza, p. str. 369) i dioksygenaza 3-hydroksyantrani łanowa (oksydaza, p. str. 376) z wątroby oraz enzymy wykorzystujące hem, np. dioksygenaza L-trj ptofanowa (pirolaza tryptofanowa, p. str. 376) z wątroby. Monooksygenazy (oksydazy o mieszanej funkcji, hydroksylazy) wbudowują do substratu tylko 1 atom tlenu Drugi atom tlenu ulega redukcji do wody, co wymaga udziału dodatkowego donora elektronów lub kosubstratu A— H + O2 + ZH2

A—OH + H 2 O + Z

Mikrosomalne systemy monooksygenaza-cytochrom P-450 katalizują hydroksylację wielu leków Monooksygenazy te występują w mikrosomach wątroby razem z cytochromem P-450 i cytochromem b 5 . Zarówno NADH, jak i NADPH dostarczają równowaŜników redu kujących do redukcji tych cytochromów (ryc. 13-7), które z kolei są utleniane przez substraty w wieloetapowym procesie enzymatycznym określanym mianem cyklu hydroksylacyjnego (ryc. 13-8). " IHYDHOKSYLAZA [ z+

Lek-H O2+ 2Fe + ZH (P-4S0) (P-450)

Wśród leków metaboiizowanych przez ten układ enzymatyczny znajdują się: benzopiren, aminopiryna, anilina, morfina i benzofetamina. Wiele leków, np. fenobarbital, moŜe wywoły- ■ wać indukcję syntezy enzymów mikrosomalnych i cytochromu P-450. Mitochondrialne układy monooksygenaza-cytochrom P-450 katalizują reakcje hydroksylacji steroidów Te układy enzymatyczne występują w tkankach steroidogenicznych, takich jak kora nadnerczy, jądra, jajniki, łoŜysko. Biorą one udział w biosyntezie hormonów sterośdowych z cholesterolu (hydroksylacja na C22 i C20 w procesie odszczepiania łańcucha bocznego oraz w pozycji l i p i 18). Nerkowe systemy monooksygenaza-cytochrom P-450 katalizują la- i 24-hydroksylacje 25-hydroksychotekalcyferolu, a układ wątrobowy katalizuje hydroksylację w pozycji 26 w procesie biosyntezy kwasów Ŝółciowych.

CN" NADH Amlnooksydaza Itp.

Flawoproleina

■A

Cyt b»-ł*- Desaturaza EfearolioCoA 9 Cvt P-450-^ Hydroksylacja

Flawroprotelna,

NADPHf-* . Feroksydacja lipidów Oksygenaza hem u

Ryc. 13-7. Mikrosomalnyjańcuch przenoszący elektrony. Zaznaczono miejsce hamowania przez cyjanek (CN>.

UTLENIANIA BIOLOGICZNE / 145 SubstratA-H

P-450-A-H I

| REDUKTAZA NADPH-CylP^t50 NADP

+

^

-

A-OH ■ P-450-A-H

Ryc 13-8. Mikrosomalny cykl hydroksylacyjny. Przedstawiony układ jest typowy dla hydroksylaz steroidowych kory nadnerczy. Mikrosomalny system hydroksylacyjny w wątrobie nie wymaga udziału białka Ŝelazosiarkowego (Fe^). Zaznaczono miejsce hamowania przez tlenek węgla (CO). Wewnętrzna błona mitochondriaina

Strona^ wewnętrzna Jabłczan

Strona zewnętrzna lzocytrynlan

Ryc. 13-9. Mitochondnalny układ monooksygenaza-cytochrom PFe2S2białko

450. Hydroksysteroid

Ŝelazosiar-kowe (adrenodoksyna). PoniewaŜ NADP{H) nie moŜe przejść przez bfonę mitochondrialna, źródła równowaŜników redukujących są ograniczone do takich substratów, jak jabłczan i izocytrynian, które mogą być utleniane przez wewnątrzmitochondriat-ne dehydrogenazy współdziałające z NADP.

W korze nadnerczy zawartość mitochondrjlalnego cytochromu P-450 jest 6-krotnie większa od ilości cytochromów łańcucha oddechowego. Układ monooksygenazy zawiera 3 składniki

II) — Bicthcmia

umiejscowione na wewnętrznej powierzchni mitochondrialnej błony wewnętrznej: swoistą względem NADP flawoproteine mającą FAD, białko Fe2S2 (adrenodoksynę) i cytochrom P450 (ryc. 13-9).

WOLNY RODNIK PONADTLENKOWY MOśE BYĆ ODPOWIEDZIALNY ZA TOKSYCZNOŚĆ TLENU Tlen jest substancją potencjalnie toksyczną. Jego toksyczność wiązano dotychczas z tworzeniem H2O:- Ostatnio jednak, uwzględniając łatwość, z jaką tlen w tkankach ulega redukcji do wolnego anionorodnika ponadtlenkowego {C>2~') i występowanie u organizmów tlenowych (ale nie u beztlenowców bezwzględnych) dysmutazy ponadtlenkowej, przypuszcza się, Ŝe toksyczność tlenu wynika z przemiany jego w ponadtlenek. Dotychczas brak jednak bezpośrednich dowodów toksyczności ponadtienku. Ponadtlenek powstaje wówczas, gdy zredukowane flawiny, znajdujące się np. w oksydazie ksantynowej, ulegają jednoetektronowej reoksydacji przez tlen cząsteczkowy. Ponadtlenek powstaje równieŜ z tlenu cząsteczkowego podczas jednoetektronowych utieniań zachodzących w łańcuchu oddechowym:

146 / ROZDZIAŁ 13

Enzym-H2 + O2 --------- * Enzym-H + O2~ + H+

rodników, takich jak O2~" i ograniczają toksyczność tlenu (p. rozdz. 54).

Ponadtlenek moŜe redukować cytochrom c będący w formie utlenionej: 2+

3

lub moŜe być usuwany przez swoisty enzym — dysmutazę ponadtlenkową. DYSMUTAZA PONADTLENKOWĄ 2"

PODSUMOWANIE

Cytc(F« )

Cytc

+2H +

H2O2 + O2

W tej reakcji ponadtlenek działa zarówno jako utleniacz, jak i reduktor. Chemiczne działanie ponadtlenku w tkankach wzmacnia się w wyniku reakcji łańcuchowej wolnych rodników. Przypuszcza się, ŜeO2~' związany z cytochromem P-450, jest związkiem pośrednim w reakcji aktywacji tlenu w procesie hydroksylacji (ryc. 13-8). Wydaje się, Ŝe funkcja dysmutazy ponadtienkowej polega na ochronie organizmów tlenowych przed cytotoksycznym działaniem ponadtlenku. Enzym występuje w wielu róŜnych kompartmentach komórkowych. Enzym cytoplazmatyczny składa się z 2 podjednostek zawierających po jednym jonie Cu2+ i Zn3+, podczas gdy enzym mitochondrialny zawiera Mn2+ podobnie jak enzym bakteryjny. Fakt ten potwierdza hipotezę, Ŝe mitochondria rozwinęły się z Procaryota, które weszły w symbiozę z Protoeucaryota. Dysmutaza występuje we wszystkich głównych tkankach tlenowych. Aczkolwiek przeniesienie zwierząt do atmosfery składającej się w 100% z tlenu powoduje adaptacyjne zwiększenie ilości enzymu, zwłaszcza w płucach, to jednak przedłuŜony pobyt w tej atmosferze prowadzi do uszkodzenia płuc i śmierci. Przeciwutleniacze, np. a-tokoferol (witamina E), działają równieŜ jako wychwytywacze wolnych

*

1. W układach biologicznych, tak jak w che micznych, utlenieniu (utracie elektronów) za wsze towarzyszy redukcja biorcy elektronów. 2. Oksydoreduktazy dzieli się na 4 grupy: oksydazy, dehydrogenazy, peroksydazy i oksygenazy. 3. Oksydazy i dehydrogenazy spełniają róŜne funkcje w metabolizmie, ale obie klasy en zymów odgrywają zasadniczą rolę w oddycha niu. 4. Peroksydazy chronią organizm przed uszkodzeniem przez woine rodniki, a oksygenazy pośredniczą w hydroksylacji leków. PIŚMIENNICTWO Bonnett R: Oxygen activation and tetrapyrroles. Essays Biochem 1981;17:1. Ernster L (editor): Bioenergetics. Elsevier, 1984. Fleisher S, Packer L (editors); Biologica) oxidations, mierosomal, cytochrome P-450, and other hemoprotein systems. In: Methods in Enzymology. Vol 52. Biomembranes, part C. Academic Press, 1978. Friedovich I: Superoxide dismutases. Annu Rev Biochem 1975;44:147. Nicholls DG: Cytochromes and Celi Respiration. Carolina Biological Supply Company, N. Carolina, 1984. Salemme FR: Structure and function of cytochromes c. Annu Rev Biockem 1977;46:299. Tolbert NE: Metabolic pathways in perosisomes and g]yoxysomes. Annu Rev Biochem 1981;5©:133. Tyler DD, Sutton CM: Respiratory enzyme systems in mitochondrial membranes. Page 33 in: Membranę Structure and Function. Vol 5. Biltar EE (editor). Wiley, 1984. White RE, Coon MJ: Oxygen activation by cytochrorae P-450. Annu Rev Biochem 1980;49:315.

Fosforylacja oksydacyjna i mitochondrialne systemy transportujące

14

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Mitochondrion określa się mianem „sifowni" komórki, poniewaŜ wewnątrz tej organelli zachodzi wychwytywanie większości energii pochodzącej z utleniań tkankowych. Mitochondrialny proces wytwarzania bogatoenergetycznego związku (ATP), sprzęŜony z oddychaniem, określa się mianem fosforylacji oksydacyjnej.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Fosforylacja oksydacyjna umoŜliwia organizmom tlenowym związać znacznie większą część dostępnej energii swobodnej substratów oddechowych w porównaniu z organizmami beztlenowymi. Przebieg tego procesu wyjaśnia teoria chemiosmotyczna. Niektóre leki (np. amobarbital) i trucizny (np. cyjanek, tlenek węgla) hamują iaricuch oddechowy i wtórnie fosforylację oksydacyjną, zwykle z fatalnymi następstwami. Obecnie znamy wiele wad dziedzicznych, dotyczących składników mitochondrialnego łańcucha oddechowego i fosforylacji oksydacyjnej. Wady te ujawniają się w postaci iniupatii, encefalopalii, a często i kwasicy mleczanowej.

ŁAŃCUCH ODDECHOWY ZBIERA I UTLENIA RÓWNOWAśNIKI REDUKUJĄCE Cała uŜyteczna energia, uwalniana podczas utleniania kwasów tłuszczowych i aminokwasów, oraz niemal cała energia z utleniania

węglowodanów jest dostępna w obrębie mitochondriów w postaci równowaŜników redukujących ( —H lub elektrony). Mitochondria zawierają zespół katalizatorów, nazwany łańcuchem oddechowym. Zbiera on i przenosi równowaŜniki redukujące, kierując je do ich końcowej reakcji z tlenem, w której powstaje woda. Mitochondria zawierają równieŜ układ enzymatyczny gromadzący uwalnianą energię swobodną w postaci bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego. Poza tym zawierają one układy enzymatyczne warunkujące wytwarzanie większości równowaŜników redukujących zbieranych przez łańcuch oddechowy. Są to enzymy P-oksydacji i cyklu kwasu cytrynowego. Ten ostatni układ jest końcowym szlakiem metabolicznym wspólnym dla utleniania wszystkich głównych składników pokarmowych. Powiązania te przedstawiono na ryc. 14-1.

SKŁADNIKI ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO SĄ UPORZĄDKOWANE W KOLEJNOŚCI WZRASTAJĄCYCH POTENCJAŁÓW RED. OKS. Zasadnicze składniki łańcucha oddechowego przedstawiono na ryc. 14-2. Wodory lub elektrony przepływają stopniowo przez łańcuch oddechowy — od składników bardziej elektroujemnych do bardziej elektrododarniego tlenu. Rozpiętość red.-oks. układu od NAD+/NADH do O2/2H2O wynosi 1,1 V (p. tab. 13-1). Główny łańcuch oddechowy w mitochondriach katalizuje ciąg reakcji, przebiegających od dehydrogenaz, współdziałających z NAD, przez

148 / ROZDZIAŁ 14 POKARM

I Kwasy tłuszczowe

Ttuszcze—.® Glicerol Węgło- -g woda my—* g

ATP p- Oksydacja

. Glukoza itp

1

Łańcuch oddechowy I ADP Białka — i-

. Aminokwasy

Pozamitochondrialne źródła równowaŜników redukujących Ryc. 14-1. Rola mitochondrialnego łańcucha oddechowego w przekształcaniu energii chemicznej poŜywienia w ATP. Utlenianiu większości składników pokarmu towarzyszy wytwarzanie równowaŜników redukujących (2H), które są zbierane przez łartcuch oddechowy w cełu ich utlenienia i sprzęŜonego z tym wytwarzania ATP. Cytochromy

-^l^Substral

Y H+

H+

2H+

Ryc. 14-2. Przenoszenie równowaŜników redukujących w łańcuchu oddechowym. Pro I i na 3-Hyd ro k sy acyl o-Co A 3-Hyd roksymaślan Glutami niań Jabtczan Izocytrynian

Bursztynian Cholina Fp (FAD) FeS

Acyło-CoA \.. -Cyt

■Cytc Cu

Glice ro lo-3-f osf o ran

Sarkozyna Dl metyl og li cyna

Ryc. 14-3. Składniki mitochondrialnego łańcucha oddechowego. FeS uczestniczy w transporcie elektronów, zbierając je z flawoproteiny lub cytochromu b: Cyt — cytochrom, ETF — flawoproteina przenosząca elektrony, FeS — białko Ŝe I a zos i arko we, Fp — flawoproteina, Q — ubichinon.

2H

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 149

OH Forma całkowicie utleniona. oŜyli chfnonowa

Forma zredukowana, czyli chinolowa (hydrochincn)

Forma samlchlronowa (wolny radnik}

Ryc. 14-4. Struktura ubichinonu (Q), n — liczba jednostek izoprenoidowych; waha się ona w granicach 6—10, tj. Q6-io-

flawoproteiny i cytochromy do tlenu cząsteczkowego, Nie wszystkie substraty są związane z łańcuchem oddechowym przez dehydrogenazy współdziałające z NAD; niektóre ze względu na ich bardziej dodatnie potencjały red.-oks. (np. fumaran/bursztynian; P- tab. 13-1) wiąŜą się bezpośrednio z dehydrogenazami będącymi fiawoproteinami, które z kolei są związane z cytochromami łańcucha oddechowego (ryc. 14-3). Poza wspomnianymi przenośnikami w łańcuchu oddechowym znajduje się dodatkowy przenośnik łączący flawoproteiny z cytochromcm b, białkiem o najniŜszym potencjale oksydo/edukcyjnym w Łańcuchu cytochromowym. Ten dodatkowy przenośnik, który na-

flawoproteinami) i 7. cytochromem b. Zarówno siarka, jak i Ŝelazo uczestniczą w jednoelektronowym mechanizmie oksyd o redukcyjnym (ryc. 14-5).

Pr—Cvl-S

zwano ubichinonem lub CoQ (koenzymem Q; p.

ryc. 14-4), występuje w mitochondriach w warunkach tlenowych w utlenionej formie chinonowej, a w warunkach beztlenowych w zredukowanej formie chinolowej, Ubichinon jest składnikiem lipidów mitochondrialnych, zawierających przede wszystkim fosfolipidy, tworzące część struktury błony mitochondrialnej. Struktura koenzymu Q jest bardzo podobna do budowy witamin K i E; podobna jest równieŜ do plastochinonu znajdującego się w chloroplastach. Wszystkie te związki charakteryzują się poliizoprenoidowym fańcuchem bocznym. W mitochondriach koenzym Q występuje w znacznym stechiometrycznym nadmiarze względem pozostałych członów łańcucha oddechowego. Ten fakt sugeruje, Ŝe jest on ruchomy m_ elementem łańcucha oddechowego i Ŝe zbiera on równowaŜniki redukujące z bardziej nieruchomych kompleksów flawoproteinowych i przenosi je na cytochromy. Innym składnikiem, występującym równieŜ w preparatach łańcucha oddechowego jest bial-c (Fe:S; Ŝelazo niehemowe). J l i i (metało-

Ryc, 14-5. Kompleks białka Ŝelazosiarkowego (^6484).®— siarka nietrwała w środowisku kwaśnym, Pr — apoprotein3, Cys — reszta cysteinowa. Niektóre białka Ŝeiazosiarkowe zawierają 2 atomy Ŝelaza i 2 atomy siarki

Na rycinie 14-3 przedstawiono, zgodnie z współczesnymi poglądami, sekwencję zasadniczych składników łańcucha oddechowego. N a elektroujemnym końcu łańcucha dehydrogeńazy katalizują przeniesienie elektronów z substratów na NAD łańcucha. Sposoby tego przenoszenia mogą być dosyć róŜne, a-Ketokwasy — pirogronian i a-ketoglutaran — mają własne kompleksy dehydrogenaz, zawierające liponian 1 FAD, które pośredniczą w przenoszeniu elektronów na NAD łańcucha oddechowego. Inne dehydrogenazy, np. dehydrogenaza h( + )-3-hydroksyacylo-CoA, D(—)-3-hydroksymaśIanowa,

150 / ROZDZIAŁU prolinowa, glutami ni a nowa, jabtczanowa lub izocytrynianowa, przenoszą elektrony bezpośrednio na NAD łańcucha oddechowego. Zredukowany NAD łańcucha oddechowego jest z kolei utleniany przez dehydrogenazę NADH, która jest metalofloawoproteiną. Enzym ten zawiera Fe:S i FMN i jest ściśle związany z łańcuchem oddechowym. Przenosi on równowaŜniki redukujące na koenzym Q. Koenzym Q stanowi w łańcuchu oddechowym równieŜ punkt zbiorczy dla równowaŜników redukujących, pochodzących z innych substratów, które przez flawoproteinowe dehydrogenazy kontaktują się bezpośrednio z łańcuchem oddechowym. Takimi substratami są bursztynian, cholina, giiceróló:5-Fósibran;~sarkozyna, dimetyloglicyna i acylo-CoA (ryc. 14-3). W dehydrogenazach tych substratów część flawinową stanowi FAD. Elekt£o^y_zCoQ przepływają następnie przez. y h H y ^ 7 y T y e n cząsteczkowy. Cytochromy są ułoŜone zgodnie ze wzrastającym potencjałem oksydoredukcyjnym. Znajdujący się na końcu łańcucha cytochrom aa3(oksydaza cytochromowa) odpowiada za ostateczne połączenie równowaŜników redukujących

z tlenem cząsteczkowym. Enzym _ten_zawięra miedź, składnik wielu oksydaz. Oksydaza cytochromowa ma bardzo duŜe powinowactwo do tlenu, co pozwala na funkcjonowanie łańcucha oddechowego z maksymalną szybkością, aŜ do momentu, w którym tkanka zostanie całkowicie pozbawiona tlenu. PoniewaŜ jest to reakcja nieodwracalna (jedyna w łańcuchu), nadaje ona kierunek przemieszczania się równowaŜników redukujących w łańcuchu oddechowym i do sprzęŜonego z nim wytwarzania ATP. Organizacja strukturalna łańcucha oddechowego była przedmiotem wielu hipotez. Istotnym odkryciem było stwierdzenie niemal starych stosunków molowych miedzy składnikami łańcucha oddechowego. Funkcjonalnie i strukturalnie składniki łańcucha oddechowego są zgrupowane w wewnętrznej błonie mitochondrialnej w 4 lipidowo-białkowc

kompleksy

łańcucha

od-

dechowego. PowyŜsze dane wskazują, Ŝe przenośniki mają w błonach określoną orientację przestrzenną. Cytochrom c jest jedynym rozpuszczalnym cytochromem i tak jak koenzym Q wydaje się być bardzo ruchomym składnikiem łańcucha oddechowego łączącym nieruchome kompleksy (ryc, 14-6).

&&

Malonian Kompleks II Bursztynian

Karboksyna TTFA BAL Antymycyna Kompleks II! I

NADH

■

H;S CO* CN * ,'x Kompleks IV I Cyt a Cyt

yt b, FeS. Cyt c,

I

Związki rozprzęgające Plerycydyna A Amobarbltal ^ _ 1 _ ^ R o t e n o n Oligomyoyna" i J ' O ^\ AD P + P ,

ATP

Miejsce sprzęgająca 1

Związki rozprzęgające O ligo mycy na

ADP + P,

ATP Mtejsce sprzęgające 2

ADP + P,

ATP

Miejsce sprzęgające 3

Ryc. 14-6. Proponowane miejsca hamowania (0) tańcucha oddechowego prze* niektóre leki, substancje chemiczne i antybiotyki. Zaznaczono „miejsca sprzęgające", które tworząc gradient protonowy wspierają fosforylację. BAL (dimerkaprol); TTFA jest czynnikiem chelatującym Fe, Kompteks I — oksydo/eduktaza NADH : ubichinon; kompleks tl •— oksydoreduktaza bursztynian : ubichinon; kompleks III —oksydoreduktaza ubichinot: utleniony cytochrom c; kompleks IV — oksydoreduktaza zredukowany cytochrom c: tlen. Inne skróty jak na ryc. 14-3, ____________________________ ____________

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 151

ŁAŃCUCH ODDECHOWY UMOśLIWIA ZMAGAZYNOWANIE ZNACZNEJ CZĘŚCI ENERGII CHEMICZNEJ UTLENIAM BIOLOGICZNYCH ADP jest cząsteczką, która wiąŜe w postaci bogatoenergetycznych fosforanów część energii

swobodnej uwalnianej w procesach katabolicznych. Powstający ATP moŜe z kolei przekazać tę energię swobodną procesom wymagającym energii. Stąd teŜ ATP bywa nazywany „monetą obiegową" komórki (p. ryc. 12-8). Wjęakcjach glikolizy powstają 2 bogatoenergęticznejrugy fosforanowe, co jest równowaŜne ok. 61 kJ/moI glukozy (p. tab. 19-1). Wynika z.tęgo^Ŝe ilość energii wychwytywanej w procesie glikolizy, w reakcjach fosforylacji substratowej, jest mata, jako Ŝe 1 mol glukozy,"ulegając całkowitemu spaieniu dostarcza ok. 2780 kJ. Reakcje cyklu kwasu cytrynowego, końcowego szlaku całkowitego uflemania"glukozy, obejmują 1 .^tap fosforylacii — przekształcenie y sukcynylo-CoA w bursztyniajŁ_co pozwala wytworzyć następne 2 boga to energetyczne wiąza"hia__fosforaiiowe na moTglukozy, Wszystkie wspomniane powyŜej fosfbrylacje zachodzą na po4pjnje_jybstratu. Wyniki badań prowadzonych na nie naruszonych oddychających mitochondriach wykazują, Ŝe utlenieniu substratów J ^ A D k ^ h ^ i " ) ń h oddechowy towarzyszy wbudowanie 3 mol fosforanu nieorganicznego w 3 mol ADP i powstanie w ten sposób 3 mol ATP na kaŜde ]j2 mol zuŜytego O2, tzn. stosuneTt P:O = 3 (ryc. 14-6). JeŜeli natomiast substrat ulega utlenieniu przy udziale dehydrogenazy flawinowej, powstaje tylko 2 mol ATP, a stosunek P:O = 2. Reakcje te są znane jako fosforyiacje oksydacyjne (fosforylacjc na poziomie łańcucha oddechowego). Uwzględniając reakcje odwodorowania w szlaku katabolicznym glukozy zarówno w glikolizie, jak i w cyklu kwasu cytrynowego oraz fosforyiacje substratowe moŜna obliczyć, Ŝe niemal 42% energii swobodnej, pochodzącej ze spalenia glukozy, zostaje związane w postaci bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych. Jest oczywiste, ze to łańcuch oddechowy odpowiada za znaczną część puli tworzonego ATP.

KONTROLA ODDYCHANIA W MITOCHONDRIACH ZABEZPIECZA STAŁE DOSTARCZANIE ATP Szybkość oddychania mitochondriów moŜe być kontrolowana przez stęŜenie ADP. Dzieje się tak, poniewaŜ utlenianie i fosforyłacja są ze sobą ściśle sprzęŜone, tzn. utlenianie w łańcuchu oddechowym nie moŜe zachodzić bez towarzyszącej fosforylacji ADP. Chance i Williams podali 5 czynników, które mogą kontrolować szybkość oddychania w mitochondriach {tab. 14-1). Tabela 14-1. Stany kontroli oddechowej Czynniki ograniczające szybkość oddychania Sta 1 n Sta 2 n Sta 3 n Sta 4 n Sta 5

Brak ADP i substratu Brak tylko substratu Aktywność samego łańcucha oddechowego, gdy wszystkie substraty i ADP są obecne w stęŜeniach wysycających Brak tytko ADP Brak tylko tlenu

n

Zasadniczo większość komórek w okresie spoczynkowym znajduje się w stanie metabolicznym 4, w którym szybkość oddychania zaleŜy od dostępności ADP. W czasie wykonywania pracy następuje przemiana" ATP w ADP, co powoduje zwiększenie szybkości oddychania, a to z kolei prowadzi do uzupełnienia zapasu ATP (ryc. 14-7). NaleŜy dodać, Ŝe w pewnych warunkach szybkość funkcjonowania łańcucha oddechowego moŜe zaleŜeć równieŜ od stęŜenia fosforanu nieorganicznego. Gdy szybkość oddychania się zwiększa (np. podczas pracy), metabolizm komórki zbliŜa się do stanu 3 lnb stanu 5, wówczas łańcuch oddechowy albo osiąga stan wysycenia, albo pO2 zmniejsza się poniŜej Km dla cytochromu ay Niewykluczone, Ŝe sprawność przenośnika ADP/ATP, który ułatwia wejście cytoplazmatycznego ADP do wnętrza mitochondrionu, moŜe być czynnikiem ograniczającym szybkość fosforylacji oksydacyjnej. Proces utleniań biologicznych, w których energia swobodna, powstała w wyniku utleniania składników pokarmowych, staje się dostępna i moŜe być związana, przebiega stopniowo,

152 / ROZDZIAŁ 14

Ciepto

Procesy zuŜywające energię SUBSTHAT

T

\

Ryc. 14-7. Rota ADP w kontroli oddechowej.

wydajnie (40—45%) i podlega kontroli — a nie wybuchowo, nieskutecznie i w sposób niekontrolowany. Pozostała energia swobodna, która nie została związana w formie bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego, uwalnia się w postaci ciepła. Nie znaczy to, Ŝe jest „stracona", gdyŜ dzięki temu układ oddechowy, jako całość, jest dość egzoergiczny, aby być w stanie nierównowagi, co pozwala na ciągły jednokierunkowy przepływ elektronów i stałe zaopatrywanie komórki w ATP. U zwierząt stałocieplnych zapewnia to utrzymanie odpowiedniej temperatury ciała.

WIELE ZNANYCH TRUCIZN TO INHIBITORY ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO Wiele informacji dotyczących łańcucha oddechowego uzyskano po zastosowaniu związków, których przypuszczalne miejsce działania przedstawiono na ryc. 14-6. Do celów opisowych związki te moŜna podzielić na inhibitory łańcucha oddechowego, inhibitory fosforylacji oksydacyjnej i związki rozprzęgające fosforylację oksydacyjną. Inhibitory, które hamują oddychanie przez blokowanie łańcucha oddechowego, działają w 3 miejscach. W miejscu pierwszym działają,. barbiturany (np. amobarbital), antybiotyk pierycydyna A oraz jad rybi — rotenon. Inhibitory te hamują utlenianie substratów.Hofe kontaktują się bezpośrednio z łańcuchem oddechowym przez NAD-zaJeŜne dehydrogenazy, jak np. 3hydroksymaślan.

Dimerkaprol i antymycyna AJiamują łańcuch oddechowy między cytochromem.b a cytochromem c. Klasyczne trucizny, jak H2S, tlenek węgla i cyjanki hamują oksydazę cytócEfomową. Karboksyna i TTFA swoiście hamują przeniesienie równowaŜników redukujących z dehydrogenazy bursztynianowej na koenzym (^ natomiast malonian jest inhibitorem kompetycyjnym dehydrogenazy bursztynianowej. Antybiotyk oUgomycyna całkowicie hamuje utlenianie i fosforylację w nie uszkodzonych mitochondriach. JednakŜe, w obecności .związku rozprzęgającego — di nitrofenolu — zachodzi utlenia,nie_hez. towarzyszącej fosforylacji, co wskazuje, Ŝe oligomycyna nie działa bezpośrednio" na łańcuch oddechowy, lecz na etapie fosforylacji (p. ryc. 14-8). Atraktylozyd hamuje fosforylację oksydacyjną, "która zaleŜy od transportu nukleotydów adeninowych przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Przyjmuje się, Ŝe hamuje on przenośnik nukleotydów adeninowych, odpowiedzialny za transport ADP do wnętrza, a ATP na zewnątrz mitochondrionu (p. ryc. 14-16). Działanie związków rozprzedających polega na „odłączeniu" procesu utleniania w łańcuchu oddechowym od fosforylacji. Wskutek tego oddychanie przebiega w sposób niekontrolowany, poniewaŜ stęŜenie ADP lub P, nie ogranicza juŜ szybkości oddychania. Najczęściej stosowanym związkiem rozprzęgającym jest 2,4-dinitrofenol, ale takŜe inne związki działają w podobny sposób, np. dinitrokrezol, pentachlorofenol i CCCP (m-chlorokarbonyiocyjanidofenylohydrazon). Ten ostatni jest ok. 100-krotnie aktywniejszy od dinitrofenolu.

: FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 153 ADP Stan 4

i \

A"

ADP f

d B "c

i

i

>

S 5

i Stan 3

\ \

(v Związek razprzegąjący

\Stan4

Ollgomycyna ^1 i | Związek 1 \i rozprzęgający \

i

3 Minuty Ryc. 14-8. Kontrola oddechowa w mitochondriach. Doświadczenie A: na wykresie przedstawiono szybkość zuŜycia tlenu w stanie 4, która ulega przyspieszeniu po dodaniu ADP. Gdy cały egzogenny ADP zostanie ufosforylowany do ATP, wówczas szybkość oddychania maleje do wartości w stanie 4. Dodanie związku rozprzedającego, np. dinitrofenolu, uniezaleŜnia oddychanie od fosforylacji. W doświadczeniu B: dodanie oNgomycyny hamuje fosforylację dodanego uprzednio ADP i w związku z tym obserwujemy hamowanie oddychania. Dodanie z kolei związku rozprzedającego zwiększa szybkość zuŜycia tlenu, poniewaŜ uniezaleŜnia oddychanie od fosforylacji.

TEORIA CHEMIOSMOTYCZNA WYJAŚNIA MECHANIZM SPRZĘśENIA UTLENIANIA Z FOSFORYLACJA W ciągu ubiegłych lat przedstawiono wiele hipotez dotyczących sprzęŜenia utleniania z fosforylacją. MoŜna je podzielić na 2 zasadnicze grupy. Hipotezy sprzęŜenia chemicznego postulowały bezpośrednie sprzęŜenie chemiczne na wszystkich etapach procesu, tak, jak ma to miejsce w reakcjach tworzących ATP w glikolizie. JednakŜe hipotezy te odrzucono, poniewaŜ nie udało się nigdy wyizolować bogatoenergetycznych pośredników, które miały łączyć utlenianie z fosfory lacją. Według innych hipotez energia pochodząca z utleniania jest przechowywana w stanach konformacyjnych cząsteczek. Zmiana konformacji miała prowadzić do tworzenia bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych.

Teoria chemiosmotyczna postuluje, Ŝe utlenianie przenośników w łańcuchu oddechowym prowadzi do tworzenia jonów wodorowych, które są wyrzucane na zewnątrz sprzęgającej błony mitochondriałnej. RóŜnica potencjałów elektrochemicznych, wynikająca z asymetrycznego rozmieszczenia jonów wodorowych (protonów, H+), jest zuŜywana następnie do napędzania mechanizmu odpowiedzialnego za tworzenie ATP (ryc 14-9). Łańcuch oddechowy jest pompą protonową Według Mitchella, pierwotnym etapem procesu fosforylacji oksydacyjnej jest przemieszczenie protonów (H +)1n£|^wjiait4£z>iblony sprzęgającej (tzn. wewnętrznej hłoriy mitochondriałnej) napędzane przez utleniania w łańcuchu oddechowym. KaŜdy z kompleksów łańcucha oddechowego I, III i IV (p. ryc. 14-6} działa jako pompa protonowa. Postulował on równieŜ, Ŝe błona jest zasadniczo nieprzepuszczalna dla jonów, a zwłaszcza dla protonów, które gromadzą się na zewnątrz błony, wytwarzając transmembranową róŜnice potencjału elektrochemicznego (AU,H+). Na tę róŜnicę składa się potencjał chemiczny (róŜnica pH) oraz potencjał elektryczny. RóŜnica potencjału elektrochemicznego jes^zuŜywana-przez błonową syntazę ATP (syntaza ATP, transportująca H+), która w obecności ADP i Pj wytwarza ATP (ryc. 14-9). Nie ma tu więc bogatoenergetycznego pośrednika wspólnego dla utleniania i fosforylacji, jak to sugerowano w hipotezie sprzęŜenia chemicznego. Według pierwotnej wersji teorii łańcuch oddechowy jest tak ułoŜony w błonie, Ŝe tworzy 3 pętle utłeniająco-redukcyjne (o/r). Na rycinie 14-10 przedstawiono schematycznie pojedynczą pętlę zawierającą przenośnik wodoru i przenośnik elektronów. JednakŜe ten wymóg trudno było pogodzić w pełni ze znanymi składnikami błonowych kompleksów łańcucha oddechowego, np. kompleks IV nie zawiera przenośnika wodoru. Co więcej, nie jest znana dokładna liczba protonów pompowanych przez kaŜdy kompleks, przypadająca na kaŜdy transportowany elektron. Na rycinie 14-11 przedstawiono cykl Q, wyjaśniający moŜliwy mechanizm pompowania protonów przez kompleks III. Powierzchnię błony wewnętrznej pokrywają Jednostki fosforylujące" odpowiedzialne za biosyntezę ATP (ryc. 14-12). KaŜda z nich składa się z wielu róŜnych białek. Hydrofilowy

154 / ROZDZIAŁ 14

O lig o mycy na

Błona sprzęgająca Ubtahfnon

Cytochrom c

Byc. 14-9. ZałoŜenia teorii

NA

chemiosmotycznej ZEWNĄTRZ dotyczącej fosforytacji + oksydacyjnej. F1( Fo, czynniki białkowe warunkujące fosforylację Syntaza ATP, transportująca H (FiFo), działa jako wtórna pompa protonowa. Pierwotna pompa protonowa funkcjonuje w wyniku sprzęŜenia utleniania z przemieszczeniem protonów z wewnętrznej na zewnętrzną powierzchnię błony. To + przemieszczenie H prowadzą kompleksy łańcucha oddechowego I, III i IV, z których kaŜdy działa jako + pompa protonowa. Związki rozprzęgające, takie jak di nitrofenol, powodują „przeciek" H przez błonę, skutkiem czego jest zanik elektrochemicznego gradientu protonów. Oligomycyna swoiście blokuje + transport H przez Fo. NA ZEWNĄTRZ

BŁONA SPRZĘGAJĄCA

WEWNĄTRZ

Ryc. 14-10. Pętla oksydoredukcyjna (o/r) przemieszczająca protony (teoria criemiosmotyczna).

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 155

CYTOZOL (NA ZEWNĄTRZ)

WEWNĘTRZNA BŁONA MITOCHONDRIALNA

Ryc. 14-11. Pompujący protony cykl koenzymu Q. QH* jest zakotwiczony po obu stronach btony przez przyłączenie się do białka wiąŜącego Q, natomiast CIH2 i Q są ruchome. Cytochromy zaznaczono odpowiednio jako b, c-|.

Jednostki fosforylujące

B : U8Ł0NA - j ZEWNĘTRZNA f BŁONA*--*] WEWNĘTRZNA

rinr

Działanie ultradźwiękami

BŁONA ZEWNĘTRZNA

Cząstki submitochondrialne powstałe z fragmentów błony wewnętrznej Ryc. 14-12. Budowa błon mitochondrialnych. Cząstki submitochondrialne są „przenicowane", tzn, mają odwróconą orientację błony, a więc i odwrócony błonowy gradient protonów. Na ich powierzchni zewnętrznej znajdują się Fi. Taki preparat pozwala prowadzić badania zamkniętych systemów błonowych. * ■■-

* I Jt3>/

156 / ROZDZIAŁ 14 Pj

ATP ADP

Pj + ADP +

Ryc. 14-13. Syntaza ATP, transportująca H (Mitchell).

kompleks tych białek określa się mianem Fj (czynnik sprzęgający I; ang. factor 1); wystaje on w kierunku małriks i wy|fa7il]jei aktywność _syntązyATP (ryc. t4-9).JEtje5tpołąc2.ony przez tzw. szyjkę (ang. stalk) z—błonowym f hydrofobowym) kompleksem-biaŁŁ-owym. Tkanym FD (czynnik sprzęgający wiąŜący oligomycyne), który prawdopodobnie zajmuje całą szerokość błony (ryc. 14-9). Protony przechodzą przez kompleks Fo— F, (syntazę. ATP, transportują£&Ji+), co umoŜliwia syntezę ATP z ADP i Pj. Ciekawe, Ŝe podobne jednostki fosforylujące znaleziono na wewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej bakterii i na zewnętrznej powierzchni błony tylakoidowej chloropiastów. Charakterystyczne, Ŝe błonowy gradient protonów skierowany jest w mitochondriach i bakteriach z zewnątrz do wewnątrz, ale w odwrotnym kierunku w chloroplastach. Mechanizm sprzęŜenia przemieszczania protonów z anizotropowym (wektorowym) układem syntezy ATP nie jest wyjaśniony. Jeden 7. modeli proponowanych przez Mitchella jest przedstawiony na ryc. 14-13. Para protonów atakuje jeden z tlenów P,, tworząc wodę i aktywny Pj, który natychmiast reaguje z ADP, tworząc ATP. Wyniki innych badań wskazują, Ŝe bezpośrednia reakcja syntezy ATP nie jest głównym etapem wymagającym dostarczenia energii — jest nim raczej etap uwalniania ATP z centrum aktywnego syntazy. Niewykluczone, Ŝe wymaga to konformacyjnych zmian cząsteczki Dane doświadczalne potwierdzają teorię chemiosmotyczną 1. Dodanie protonów (kwasu) do środowiska inkubacyjnego zawierającego mitochondria prowadzi do wytwarzania ATP.

2. Fosforylacja oksydacyjna nie zachodzi w układach rozpuszczalnych, w których nie ma moŜliwości występowania wektorowej syntazy ATP, Aby fosforylacja oksydacyjna mogła za chodzić, w układzie inkubacyjnym muszą być zamknięte pęcherzyki błonowe (ryc. 14-9). 3. Składniki łańcucha oddechowego są uło Ŝone w błonie w sposób asymetryczny (poprze czna asymetria), co jest zgodne z wymaganiami teorii chemiosmotycznej. Teoria chemiosmotyczną wyjaśnia zjawisko kontroli oddechowej Powstała wskutek przemieszczania protonów róŜnica potencjałów elektrochemicznych po obu stronach błony hamuje dalsze przenoszenie ~ równowaŜników redukujących przez łańcuch oddechowy dopóty, dopóki nie zostanie ona rozładowana w wyniku wstecznego transportu protonów przez błonę przy udziale wektorowej syntazy ATP. To z kolei zaleŜy od dostępności ADP i Pi. Tłumaczy działanie związków rozprzęgających Te związki (np. dinitrofenol) są amfipatyczne (p. str. 190) i zwiększają przepuszczalność błony mitochondrialnej d!a protonów (ryc. 14-9), zmniejszając w ten sposób potencjał elektrochemiczny i „zwierając" syntazę ATP. Dlatego teŜ w ich obecności utlenianie moŜe przebiegać bez fosforylacji. Tłumaczy istnienie mitochondrialnych układów transportujących na zasadzie wymiany przeciwprądowej Te układy transportujące są konsekwencją wymogu, Ŝe aby utrzymać gradient elektro-

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 157

chemiczny błona sprzęgająca musi być nieprzepuszczalna dla protonów i innych jonów (patrz poniŜej). WZGLĘDNA NIEPRZEPUSZCZALNOŚC WEWNĘTRZNEJ BŁONY MITOCHONDRIAŁNEJ NARZUCA POTRZEBĘ OBECNOŚCI PRZENOŚNIKÓW Systemy transportu wymiennego znajdują się w błonie i katalizują wymianę przeciwprądową anionów z OH~ oraz kationów z H + . KaŜdy z tych systemów jest niezbędny do zachowania równowagi elektrycznej i osmotycznej podczas pobierania i uwalniania zjonizowanych metabolitów. Roz m i eszczen ie c ha rakterystycz nych enzymów, tzw. znacznikowych, w przedziałach rozdzielonych błonami mitochondrialnymi Mitochondria mają błonę zewnętrzną przepuszczalną dla większości metabolitów, błonę wewnętrzną, która jest wybiórczo przepuszczalna i pofałdowana w tzw. grzebienie, oraz macierz .wewnątrz mitochondrionu (ryc. 14-12). Działając na mitochondrion digitoniną moŜna usunąć z niego błonę zewnętrzną, której enzymami znacznikowymi są monoaminooksydaza, syntetaza acyio-CoA, acylotransferaza glicerolo fosforanowa, acylotransferaza lizofosfatydowa i ibsfolipaza A2, W przestrzeni międzybłonowej znajduje się kinaza adenylanowa oraz

CYTOZOL

NAD

GI icerolo-3-fosfo ra n DEHYDROGENAZA GLICEROLO-3-FOSFORANOWA Dlhydroksyacetono fosforan "*■

kinaza kreatynowa. W Wonie wewnętrznej jest nagromadzony fosfolipid — kardiolipina. W macierzy mitochondriainej znajdują się rozpuszczalne enzymy cyklu kwasu cytrynowego i enzymy P-oksydacji kwasów tłuszczowych. Oba procesy wymagają udziału układów transportujących metabolity oraz nukleotydy przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Dehydrogenaza bursztynianowa znajduje się na wewnętrznej powierzchni mitochondriainej błony wewnętrznej, gdzie przenosi równowaŜniki redukujące bezpośrednio na ubichinon łańcucha oddechowego, z pominięciem kompleksu I łańcucha oddechowego. Na powierzchni matryksowej wewnętrznej błony mitochondriainej znajduje się równieŜ dehydrogenaza 3-hydroksymaślanowa. Na zewnętrznej powierzchni błony wewnętrznej zlokalizowana jest dehydrogenaza glicerolo-3-fosforanowa, co pozwala jej uczestniczyć w „mostku" glicerolofosforanowym (układ wahadłowy glicerolofosfuran-dihydroksyaceton, ryc. 14-14).

Utlenianie pozamitochondrialnego NADH odbywa się za pośrednictwem „mostków" substratowych Wewnętrzna błona mitochondrialna nie jest przepuszczalna dla NADH, który jest stale wytwarzany w cytozolu w reakcji szlaku glikolityczncgo, katalizowanej przez dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową (p. ryc. \9-2).JedńakŜe w warunkach tlenowych pozamitochondrialny NADH nie gromadzi się i ulega przypuszczalnie utlenieniu w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym. RozwaŜano kilka mechanizmów, według których ten proces mógłby

WEWNĘTRZNA BŁONA MłTOCHONDRIALNA

GI icerolo-3-f osf oran

FAD

DEHYDROGENAZA GLICEROLO-3-FOSFORANOWA ■Dlhydroksyacetonofosforan

FADH2

t Łańcuch oddechowy

Ryc. 14-14. Mostek glicerolofosf ora nowy {układ wahadłowy glicerolo-3-fosforan : dihydroksyacetonofosforan) transportujący równowaŜniki redukujące z cytozolu do mitochondrionu. PoniewaŜ mitochond rialna dehydrogenaza giicerolo-3-fosforanowa znajduje się na zewnętrznej powierzchni btony wewnętrz nej, układ ten nie wymaga transportu substratów przez błonę.________________________________

158 / ROZDZIAŁ 14 BŁONA

CYTOZOL NAD

ł

MITOCHONDRION

Jabłczan,

^J a b ł c za n Szczawiooctan

OEHYDROG

NADH + H+

Szczawiooc

DEHYDROG a-KG

a-KG

NAD*

Glutaminian AMINOTHANSFERAZA

AMIN0TRANS

Glutaminian

Asp

Asp

Ryc. 14-15. Mostek jabłczanowo-asparaginianowy (układ wahadłowy jabłczan : asparaginian) przenoszący równowaŜniki redukujące z cytozolu do mttochondrionu. 1 — przenośnik a-ketoglutaranowy, 2 — przenośnik glutaminianowo-asparaginianowy (przenoszący z glutaminianem proton, symport).

przebiegać. Jednym z nich jest przenoszenie równowaŜników redukujących przez błonę mitochondriałną za pośrednictwem par substratów sprzęŜonych odpowiednimi dehydrogenazami. Niezbędnym warunkiem przebiegu tego procesu jest obecność swoistej dehydrogenazy po obu stronach wewnętrznej błony mitochondrialnej. Na rycinie 14-14 przedstawiono mechanizm przenoszenia przy uŜyciu „mostka" glicerolofosforano wego. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe w związku z tym procesem zostaną wytworzone tylko 2, a nie 3 mol ATP na atom zuŜytego tlenu, poniewaŜ enzym mitochondrialny jest flawoproteiną związaną z łańcuchem oddechowym bez udziału NAD. U niektórych gatunków aktywność FAD-zaleŜnego enzymu (mitochondrialnego) zmniejsza się po tyreoidektomii i zwiększa po podaniu tyroksyny. ChociaŜ obecność tego układu wahadłowego wykazano w mięśniach skrzydłowych owada i w mięśniu białym i moŜe on mieć znaczenie w wątrobie, to w innych tkankach (np. w mięśniu sercowym) stwierdza się niedobór mitochondrialnej dehydrogenazy glicerolo-3-fosforanowej. Przeto uwaŜa się, Ŝe bardziej uniwersalny jest układ transportujący wykorzystujący jabłczan i dehydrogenazy jabłczanowe, cytoplazmatyczną i mitochondrialną. Ten „mostek" (układ wahadłowy jabłczan : asparaginian) przedstawiono na ryc. 14-15, ZłoŜoność tego układu wynika z nie-

przepuszczalności wewnętrznej błony mitochondrialnej dla szczawiooctanu. Szczawiooctan, kosztem glutaminianu, musi najpierw ulec transaminacji do asparaginianu, z którego po jego przejściu przez błonę mitochondrialną zostanie w cytozolu odtworzony szczawiooctan. Transport jonów w mitochondriach jest procesem wymagającym dostarczenia energii Aktywnie oddychające mitochondnaj wjctórych zachodzi fosforylacja oksydacyjna, utrzymują lub gromadzą kationy, takie jak K+,Na+, Ca2 + i Mg2 + oraz P*. RozprzęŜenie fosforylacji oksydacyjnej za pomocą dinitrofenolu prowadzi do ucieczki jonów z mitochondrionu, ale pobieranie jonów ze środowiska nie jest hamowane przez oligomycynę, co sugeruje, Ŝe energia konieczna do procesu transportu nie pochodzi z bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego, powstającego podczas fosforylacji ADP. Przyjmuje się, Ŝe wymianę kationów napędza pierwotna pompa protonowa. Układy transportujące zabezpieczają równowagę elektryczną i osmotyczną po obydwu stronach błony mitochondrialnej (p. ryc. 14-16) Wewnętrzna błona mitochondrialną swobodnie przepuszcza elektrycznie obojętne małe

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 159

NA ZEWNĄTRZ

Wewnętrzna błona WEWNĄTRZ mltochondrlalna N-

Ety)orraieimłd OH" H3PO4" N-Etyloma!eJmld i Hyd r o teycyn am on lan Pirogronian"

Jabtazan1" _Jabłczan'Cytrynian*-+ H

ł

Jablczarr et-Ketoglutaran1" . ADP 3" ■

ków lub układów transportujących, ułatwiających ich transport przez błonę. Okazuje się, Ŝe aniony monokarboksylowe przenikają przez błonę łatwiej ze względu na mniejszy stopień dysocjacji tych kwasów. UwaŜa się, Ŝe niezdysocjowany i dobrze rozpuszczalny w lipidach kwas jest tym rodzajem cząsteczki, która przechodzi przez błonę lipidową. Transport anionów dikarboksylowych i trikarboksylowych jest ściśle związany z przenoszeniem fosforanu nieorganicznego. Ten ostatni łatwo przechodzi przez błonę jako jon HZPO~, wymieniając się z OH". Pobranie jabłczanu przez przenośnik anionów dikarboksylowych wymaga na wymianę fosforanu nieorganicznego po przeciwnej stronie błony. Pobranie cytrynianu, izocytrynianu, lub ds-akonitanu przez transporter anionów trikarboksylowych wymaga na wymianę jabłczanu. Transport acketoglutaranu równieŜ zachodzi na zasadzie wymiany z jabłczanem. Dzięki uŜyciu mechanizmów wymiany przeciwp radowej (antyport) zostaje więc zachowana równowaga osmotyczna. Transport cytrynianu przez wewnętrzną błonę mitochondrialną zaleŜy nie tylko od przenoszenia jabłczanu, lecz takŜe od transportu fos-

■ATP* Atraktylozyd i

NA ZEWNĄTRZ

Byc. 14-16. Układy przenośnikowe w błonie mitochondrialnej, 1 ~ przenośnik fosforanowy, 2 — sprzęŜony transport (symport) pirogronianu, 3 — przenośnik anionów dikarboksylowych, 4 — przenośnik anionów trikarboksylowych, 5 — przenośnik a-ketoglutaranowy, 6 — przenośnik nukleotydów adeninowych, Zaznaczono miejsca hamowania (0) przez N-etylomaleimid, hydroksycynarnonian i atraktylozyd, W błonie znajdują się równieŜ (nie pokazano) przenośniki: glutaminianowo-asparaginianowy (ryc. 14-15), glutaminowy, ornttynowy i karrtitynowy (ryc. 24-1).

Wewnętrzna ^„a mliocriondrialna F 1

WEWNĄTRZ

} t ATP""

_J

j

cząsteczki, takie jak tlen, woda, CO2 i NH3, oraz kwasy monokarboksylowe, takie jak 3-hydroksymasłowy, acetooctowy i octowy. Długołańcuchowe kwasy tłuszczowe są przenoszone do mitochondriów jako pochodne karnityny (p. ryc. 24-1), a specjalny przenośnik w wewnętrznej bionie rnitochondrialnej umoŜliwia sprzęŜony transport pirogronianu z H+ {kotransport, symport), co jest równoznaczne ze zuŜyciem transmembranowego gradientu protonów. Aniony dikarboksylowe i trikarboksylowe oraz aminokwasy wymagają swoistych przenośni-

0 ) Ryc. 14-17. Współdziałanie przenośnika fosfora"l

nowego (1) z przenośnikiem nukleotydów adeninowych (2) podczas syntezy ATP. Przedstawiony + sprzęŜony transport (symport) H /Pj jest odpowiednikiem przeć i wtrans portu (antyport) Pj/OH~ (ryc. 14-16). Na kaŜdą zsyntetyzowaną w mitochondriach i uwalnianą cząsteczkę ATP, mitochondrion pobiera 3 protony. Natomiast pobiera tylko 2 protony, jeŜeli zsyntetyzowana cząsteczka ATP zostanie zuŜyta wewnątrz mttochondrionu.

160 / ROZDZIAŁ 14

forami nieorganicznego. Przenośnik nukleotydów adeninowych umoŜliwia wymianę ATP z ADP, ale nie z AMP. Pozwala on wyjść cząsteczce ATP z mitochondrionu do pozamitochondrialnych miejsc zuŜywających energię oraz zapewnia powrót ADP do wnętrza mitochondrionu, gdzie słuŜy do syntezy ATP (ryc. 14-17), Na+ moŜe wymieniać się z H + , zuŜywając gradient protonów. UwaŜa się, Ŝe aktywny transport Ca 2h do mitochondriów zachodzi z przemieszczeniem I ładunku (uniport). prawdopodobnie na zasadzie antyportu CaJ + /H+, Uwalnianie wapnia z mitochondriów jest ułatwione przez wymianę z Na+. Jonofory umoŜliwiają swoistym kationom transport przez błonę Jonofory uzyskały taką nazwę ze względu na ich zdolność do kompleksowania swoistych kationów i ułatwiania ich transportu przez błony biologiczne. Ta właściwość jonoforów wynika z ich lipofilowego charakteru, który umoŜliwia penetrację błon lipidowych, takich jak błona mitochondrialna. Za przykład moŜe posłuŜyć walinomycyna umoŜliwiająca przechodzenie K+ przez błonę mitochondriainą. w następstwie czego dochodzi do rozładowania potencjału błonowego między środowiskiem zewnętrznym i wewnętrznym mitochondrionu. Nigerycyna równieŜ działa jako jonofor dla K+, ale na zasadzie wymiany z H + . Prowadzi to do zniesienia transmembranowego gradientu pH. W obecności walinomycyny i nigerycyny, zostaje wyeliminowany zarówno potencjał błonowy, jak i gradient pH i stąd całkowite hamowanie fosforylacji. Klasyczne związki rozprzęgające, takie jak dinitrofenol, są w rzeczywistości jonoforami protonowymi. Transhydrogenaza transportująca H* wytwarza wewnątrzmitochondrialny NADPH Znajdująca się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej energetycznie zaleŜna transhydrogenaza katalizuje przeniesienie H+ z wewnątrzmitochondrialnego NADH na NADP, tworząc NADPH, który jest sprzęŜony z przemieszczeniem protonów ze środowiska zewnętrznego do wnętrza mitochondrionu. Wydaje się, Ŝe

enzym działa jako energetycznie zaleŜny bufor red.-oks. i jako źródło NADPH dla enzymów wewnątrzmitochondrialnych, takich jak dehydrogenaza glutaminianowa i hydroksylazy uczestniczące w syntezie steroidów. Niedoczynność łańcucha oddecho wego

jest przyczyną choroby Niedobory lub brak większości oksydoreduktaz łańcucha oddechowego są przyczyną śmiertelnej miopatii tnitochondrialnej niemowląt i dysfunkcji nerek. MELAS (miopatia mitochondrialna, encefalopatia, kwasica mkczanowa i udar) jest dziedzicznym zespołem chorobowym, wynikającym z niedoboru oksydoreduktazy NADH; ubichinon {kompleks 1) lub oksydazy cytochromowej. Opisano wiek chorób spowodowanych niedoborem któregoś z enzymów mitochondrialnych (Scholte). PIŚMIENNICTWO Boyer PD: The unusual enzymology of ATP synthase. Biochemistry 1987;26:8503. Cross RL: The mechanism and regulation oT ATP synthesis by FrATPases. Annu Rev Biochem 1981;50:<581. Hatefi Y: The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation system. Annu Rev Biochem 1985;54:1015. Hinkle PC, McCarty RE: How cells make ATP. Sci Am (March) 197K;238:104. Mitchcll P: BCeilin's respiratory chain concept and its chemiosmotic consequences. Science 1979;206:1148. Nicholls DG: Bioenergetics: An introduetion to the Chemiosmotic Theory. Academic Press, 1982. Prince RC: Tbe proton pump of cytochrome oxidase. TIBS 1988;13:159. Schohe HR, et al: Defects in oxidative phosphorylation. Biochemical iiwestigations in skeletal muscle and expression of the lesion in other cells. / Inher Metab Dis 1987;I0, Suppl 1:81. Tyler DD: The mitochondrial ATP synthase. Page 117 in: Membranę Structure and Function, Vol. 5. Bittar EE (editor). Wiicy, 1984. Tyler DD, Sutton CM: Mitochondrial transporting systems. Page 181 in: Membranę Structure and Function. Vol 5. Bittar EE (editor). Wiley, 1984.

Węglowodany o znaczeniu fizjologicznym

15

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Węglowodany są szeroko rozpowszechnione w świecie roślinnym i zwierzęcym. Odgrywają one rolę zarówno strukturalną, jak i metaboliczną. W roślinach glukoza jest syntetyzowana z dwutlenku węgla i wody w procesie fotosyntezy i przechowywana jako skrobia lub ulega przekształceniu w błonnik szkieletu roślinnego. Zwierzęta mogą syntetyzować niektóre węglowodany, wykorzystując do tego celu tłuszcz i białka, ale większa część węglowodanów zwierzęcych jest pochodzenia roślinnego.

WĘGLOWODANY SĄ ALDEHYDOWYMI LUB KETONOWYMI POCHODNYMI ALKOHOLI WIELOHYDROKSYLOWYCH Węglowodany klasyfikuje się następująco:

Monosacharydy są to węglowodany, które nie ulegają hydrolizie do form prostszych. Na podstawie liczby atomów węgla moŜna je podzielić na triozy, tetrozy, pentozy, heksozy i hcptozy; oraz na aldozy i ketozy zaleŜnie od obecności grupy aldehydowej lub ketonowej. Przykładami są:

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Znajomość struktury i właściwości węglowodanów fizjologicznie waŜnych jest niezbędna do zrozumienia ich roli w ekonomii organizmu ssaków. Glukoza jest najwaŜniejszym węglowodanem, poniewaŜ większość węglowodanów zawartych w pokarmach wchłania się do krwiobiegu jako glukoza lub jest przekształcana w nią w wątrobie, a w organizmie z glukozy mogą powstać wszystkie inne cukry. Glukoza jest istotnym źródłem energii w tkankach, ssaków (z wyjątkiem przeŜuwaczy) i uniwersalnym „paiiwem" dla płodu. Jest ona przekształcana w inne cukry odgrywające swoiste role, np. glikogen jako spichlerz; ryboza w kwasach nukleinowych; galaktoza w laktozie mleka, w pewnych lipidach złoŜonych oraz w połączeniu z białkami w glikoproteinach i proteoglikanach. Do chorób związanych z zaburzeniami węglowodanów zalicza się cukrzycę, galaktozemic, zaburzenia spichrzania glikogenu i nietolerancję mleka.

Aldoza Triozy

(C3H6O3)

Ketoz

a (C.H.OJ Aldehyd

Tetrozy Pentozy (CBH10Os) Heksozy (C6H12O0)

Dihyd roglicerynowy Erytroza Ryboza Glukoza

ksyaceton Erytruloza Rybuloza Fruktoza

Disacharydy to węglowodany, które podczas hydrolizy rozpadają się na 2 cząsteczki takich samych lub róŜnych monosacharydów. Przykładami są sacharoza, laktoza i maltoza. Oligosacharydy to cząsteczki, które podczas hydrolizy rozpadają się na 3—6 jednostek monosacharydowych. Przykładem moŜe być maltotrioza*.

Polisacharydy w wyniku hydrolizy rozkładają się na ponad 6 cząsteczek monosacharydów. Przykładami polisacharydów, które mogą być liniowe lub rozgałęzio* NaleŜy podkreślić, Ŝe nie jest to trioza, ale trisacharyd zbudowany z 3 reszt a-glukozy.

II — Biochemia

162 / ROZDZIAŁ 15

ne, są skrobie i dekstryny. Niekiedy określa się je jako heksozany lub pentozany, w zaleŜności od rodzaju monosacharydów otrzymywanych w wyniku hydrolizy. GLUKOZA JEST GŁÓWNYM MONOSACHARYDEM Struktura glukozy moŜe być przedstawiona 3 sposobami

ChociaŜ wzór strukturalny w formie prostego łańcucha (aldoheksoza, ryc. 15-1 A) pozwala zrozumieć niektóre właściwości glukozy, to strukturą uprzywilejowaną termo dynamicznie i warunkującą jej pozostałe właściwości chemiczne jest forma cykliczna. W większości przypadków wzór strukturalny glukozy moŜe być przedstawiony jako płaski pierścień narysowany perspektywicznie, jak zaproponował Haworth (ryc. 15-1B). Na podstawie analizy dy0 11

II -H ■c H— -OH 2 C

frakcji promieni rentgenowskich ustalono, Ŝe ten sześcioczłonowy pierścień zawierający 1 atom tlenu, w rzeczywistości istnieje w formie krzesełkowej (ryc. 15-1C). Cukry występują w formie róŜnych rodzajów izomerów

Związki o takim samym wzorze strukturalnym, ale róŜnej konfiguracji przestrzennej są znane jako stereoizomery. Warunkiem powstania izomerów przestrzennych są asymetryczne atomy węgla (atomy węgla połączone z 4 róŜnymi atomami lub grupami). Liczba moŜliwych izomerów danego związku zaleŜy od liczby asymetrycznych atomów węgla (n) i równa się 2n. Glukoza, z 4 asymetrycznymi atomami węgla, ma 16 izomerów. WaŜniejsze rodzaje izomerów glukozy są następujące:

1. Izomery konf iguracyjne D i L. Określenie izomerujako formy D lub jej lustrzanego odbicia jako formy L jest uwarunkowane przestrzennym podobieństwem do macierzystego związku rodziny węglowodanów, trójwęglowego cukru — aldehydu glicerynowego (gliceroza jest nazwą nie wskazaną). Formy L i D tego cukru, wraz z odpowiadającymi im izomerami glukozy, przedstawiono na ryc. 15-2. Ustawie-

H- -OH «C

e

i

C—H I H-C —OH


CH,OH

CHjOH 'CHjOH Aldehyd L-pllcerynowy

J

C-H OH

'C-H t HOS

I H- C-

Aldehyd D-gtfoeryrtowy (D-G!loeroza)

C —H I H- C —OH ( HO—C —H i H-C

I HO—

«C -H I *C —H I 'CHsOH

m

Ć —OH H-C

I

CH,OH a-D-Glutoza L-Glukoza D- Glukoza

Ryc. 15-1. a-D-Glukoza. A — forma łańcuchowa, B — wzór rzutowy Hawortha, C — konformacja krzesełkowa.

Ryc. 15-2. D- i L-lzomery aldehydu glicerynowego i glukozy.

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 163 nie grup — H i -OH wokół atomu węgla (tj. 5 atomu, węgla w glukozie) przylegającego do końcowego węgla pierwszorzędowego alkoholu warunkuje przynaleŜność cukru do szeregu D lub

L. JeŜeli grupa — OH przy tym atomie węgla (atomie odniesienia) znajduje się po stronie prawej (jak przedstawiono na ryc. 15-2), to cukier naleŜy do szeregu D; jeśli grupa — OH znajduje się po stronie lewej, to cukier naleŜy do szeregu L. Większość monosacharydów występujących u ssaków ma konfigurację D, a enzymy warunkujące ich metabolizm są swoiste dla tej konfiguracji. Obecność asymetrycznych atomów węgla nadaje równieŜ cząsteczce aktywność optyczną. Gdy strumień światła spolaryzowanego przechodzi przez roztwór izomeru optycznego, wówczas płaszczyzna polaryzacji przechodzącego światła spolaryzowanego moŜe zostać skręcona w prawo, prawoskrętność (+), lub w lewo, lewoskrętność (—). Związek moŜe być oznaczony D(—), D( + ), L( —) lub L(-t-), co wskazuje na jego pokrewieństwo strukturalne 2 aldehydem Dlub L-gliceryn owym, oraz wskazuje, Ŝe wykazuje on niekoniecznie ten sam kierunek skręca lności optycznej co aldehyd, np. naturalnie występującą formą fruktozy jest D(—) izomer. Mieszanina równych ilości izomerów D i L nie wykazuje Ŝadnej aktywności optycznej, gdyŜ aktywności kaŜdego z izomerów wzajemnie się znoszą. Mieszaninę taką nazywamy racemiczną lub DL-mieszaniną. Związki otrzymywane syntetycznie są z konieczności racemiczne, poniewaŜ kaŜdy z izomerów powstaje z taką samą łatwością. 2. Piranozowe i furanozowe formy pierścieniowe. Podstawą terminologii jest fakt, Ŝe trwale struktury pierścieniowe mono sacharydów są podobne do struktury pierście nia piranu lub furanu (ryc. 15-3). Ketozy mogą równieŜ występować w formach pierścienio wych (np. D-fruktofuranoza lub D-fruktopiranoza) (ryc. 15-4). W przypadku znajdującej się w roztworze glukozy, ponad 99% jej cząsteczek znajduje się w postaci piranozowej; a więc mniej niŜ 1% znajduje się w postaci furanozowej. 3. a i p Ano mery. Struktura pierścieniowa aldozy jest półacetalem, poniewaŜ została utwo rzona w wyniku reakcji grupy aldehydowej z grupą alkoholową (ryc. 15-5). Podobnie pierś cieniowa struktura ketozy jest półketalem. Kry staliczna glukoza jest a-D-glukopiranozą. W roztworze zachowuje się struktura cykliczna, ale pierwszy atom węgla (karbonylowy) staje się

Fu ran

Plran

HOCHj I

HOCH

H

HCOH

OH ■i- D- GI u kołu ranoza

n-OGIukopIranoza

Ryc. 15-3. Postacie pira noŜowa i furanozowa glukozy.

OH

H

a-D-FruktopIranoza

OH

H a - D-

Fru ktof u r an oza

Ryc. 15-4. Postacie pira noŜowa i furanozowa fruktozy.

asymetryczny (anomeryczny atom węgla). Wyni-

kiem tego jest powstanie mieszaniny zawierającej a-glukopiranozę (36%) i P-glukopiranozę (63%) oraz śladowe ilości oc i P anomerów glukofuranozy (1%). Ustalaniu się równowagi w tym układzie towarzyszy zmiana skręcalności optycznej (mutarotacja), w miarę otwierania się

164 / ROZDZIAŁ 15 HOCH,

HOCH HO\OH

H/H

\ HO\OH

H

\OH / H/H

W

OH

H

«r-D-Glukoplranoza (fl-anomer)

OH

/f-OGIukopIranoza (0-anomer) Acykliczna forma aldehydowa

Ryc. 15-S. cc- i DMechanizm

p-stereoizomery glukopiranozy. mutarotacji.

pierścienia pó lace tal owego i jego odtwarzania, wraz ze zmianami połoŜenia grup — H i — OH przy pierwszym atomie węgfa. Pośrednikiem w tym procesie jest przypuszczalnie uwodniona

HOCH, H

prostolańcuchowa cząsteczka acykliczna, aczkolwiek analiza polarograficzna wykazała, Ŝe najwyŜej 0,0025% glukozy istnieje w formie acyklicznej. Rotacja optyczna obserwowana w roztworach glukozy jest prawoskretna; z tego powodu w praktyce klinicznej często uŜywa się nazwy dekstroza zamiast glukoza. 4. Epimery. Izomery róŜniące się konfigu racją — OH i — H przy atomach węgla 2, 3 lub 4 glukozy nazywamy epimerami. NajwaŜniej szymi biologicznie epimerami glukozy są mannoza i galaktoza, utworzone przez epimeryzację odpowiednio przy węglu 2 i 4 (ryc. 15-6). 5. Izomery konstytucyjne — aldoza, ketoza. Fruktoza ma ten sam wzór cząstecz kowy co glukoza, lecz róŜni się wzorem struk turalnym. Przy drugim atomie węgla cząsteczki fruktozy znajduje się potencjalna grupa ketono wa (ryc. 15-7), natomiast glukoza zawiera po tencjalną grupę aldehydową w pozycji 1 (ryc. 15-8). Wiele monosacharydów to związki fizjologicznie waŜne Pochodne trioz powstają w wyniku metabolicznej degradacji glukozy w ciągu glikolitycz-

HOCH

OH a-

D-Galaktoza Ryc. 15-6. Epirneryzacja glukozy H

H a-

D-Mann ola

CH,OH CHiOH i

c=o

CH,OH I

C=O CH,OH Dihydroksyaceton

I HO —C — H H - C - OH i CH,OH D-(Jsyluloza

CHjOH

ć=o I H-C — OH H-C -OH

C=OI HO— C— H H—C —OH H —C—OH CH,OH

CH,OH D-Rybuloza

Ryc. 15-7. Przykłady ketoz o znaczeniu fizjologicznym.

D-Fruktoza

CH3OH i

c=o HO—C—H

H—C —OH I H—C —OH I H—C —OH CHiOH

D-Sedoheptuloza

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU RZJ O LOGICZNYM / 165

CHO H-C-OH CH,OH Aldehyd D-gllcarynowy

"

CHO

*

CHO H-C-OH

HO-Ć-H H-C-OH

H-C-OH

CHjOH D-Treoza

CHiOH D-Erytroza

ł

CHO

CHO

HO-Ć-H HO-Ć-H j

LJA

/*

n v^ w

H -C -OH ĆH3OH

LJ

n

H-C -OH CH.OH D-Ksyloza

D-LIksoza

ł

CHO

H-Ć -OH

CHO

H-C-OH HO-Ć-H

HO-Ć-H H-C-OH

CHO

HO-Ć-H H-Ć-OH H-Ć -OH

H-Ć -OH H-Ć -OH H-C -OH

CHiOH

CHjOH

D-Arablnoza

D-Ryboia

r

1

HO-C-H

H-Ć-OH

HO-C-H

HO-Ć-H

H-Ć-OH

H-Ć-OH

H-C-OH

H-Ć-OH

ĆH,OH

CH,OH

O-Galakloza

D-Mannoza

CH,OH D -Glukoza

Ryc. 15-8. WspółzaleŜności strukturalne szeregu D. D-Treoza nie ma znaczenia fizjologicznego. aldoz Szereg utworzono przez teoretyczne dodawanie jednostki CH2O do grupy -CHO cukru.

nym. Pochodne trioz, tetroz, pentoz i 7-wcglowego cukru (sedoheptulozy) powstają w procesie degradacji glukozy w cyklu pentozofosforanowym. Pentozy są istotnym składnikiem nukleotydów, kwasów nukleinowych i wielu koenzymów (tab. 15-1). 2 heksoz najwaŜniejsze fizjologicznie są; glukoza, galaktoza, fruktoza i mannoza (tab. 15-2). Na rycinie 15-8 przedstawiono strukturę znaczących biochemicznie aldoz, a ryc. 15-7 budowę 5 waŜnych w metabolizmie ketoz. WaŜną rolę odgrywają kwasy karboksylowe pochodne glukozy, takie jak D-glukuronian (uczestniczący w tworzeniu gtukuronidów i występujący jako składnik glikozaminoglikanów) i jego pochodne metaboliczne, L-iduronian (skiadnik glikozaminoglikanów) (ryc, 15-9) i L-gulonian (metabolit szlaku kwasu uronowego; p. ryc. 22-1).

coo-

OH

OH

Ryc. 15-9. a-D-Glukuroman (z lewej) 1 p-L-iduronian (z prawej).

Cukry tworzą glikozydy, reagując z innymi związkami lub między sobą Glikozydy są to związki powstające w wyniku kondensacji między grupą hydroksylową, znajdującą się na anomerycznym atomie węgla monosacharydu lub reszty monosacharydowej, a drugim związkiem, którym moŜe — lecz nie

166 / ROZDZIAŁ 15 Tabela 15-1. Pentozy Cukier

mające znaczenie fizjologiczne

D-Ryboza

Kwasy nukleinowe

Składnik strukturalny kwasów nukleinowych i koenzymów, np. ATP, NAD, NADP, flawoprotein. Metabolit pośredni w cyklu pentozofosforarrowym

D-Rybuloza

Powstaje w procesach metabolicznych

Związek pośredni w cyklu pentozofosforan owym

D-Arabinoza

Guma arabska Gumy śliwkowa i czereśniowa Gumy drzewne proteoglikany, glikozaminoglikany

Składnik glikoprotein

D-Liksoza

Mięsień sercowy

Składnik liksoflawiny izolowanej z mięśnia sercowego człowieka

L-Ksyluloza

Związek pośredni szlaku

<wasu uronowego

Tabela 15-2. Heksozy Cukier

mające znaczenie fizjologiczne

D-Glukoza

Soki owocowe. Hydrolizat skrobi, sacharozy, maltozy i laktozy

„Cukier" organizmu. Przenoszony przez krew. pobierany i wykorzystywany przez tkanki

D- Fruktoza

Soki owocowe. Miód. Hydrolizat sacharozy i inuliny (z bulw karczochów) Hydrolizat laktozy

W wątrobie i jelitach przekształca się w glukozę i tak zuŜywa ją organizm W wątrobie ulega przekształceniu w glukozę i jest metabolizowana. Syntetyzowana w gruczole sutkowym tworzy laktozę mleka. Składnik glikolipidów i glikoprotein Składnik wielu glikoprotein

D-Ksyloza

D-Galaktoza

D-Mannoza

Występowanie

Źródło

Hydrolizat gum i martnozanów roślinnych

musi (w przypadku aglikonu — być inny monosacharyd. JeŜeli drugą grupa jest hydroksyl, to wiązanie O-gliknzydowe jest połączeniem aceta-

lowym, poniewaŜ jest ono wynikiem reakcji

Znaczenie biochemiczne

Znaczenie kliniczne

Składnik głikoprotein

Znaczenie biochemiczne

Pojawia się w moczu w pentozurii wrodzonej

Znaczenie kliniczne

Pojawia się w moczu (giukozuria) w wyniku zwiększenia stęŜenia glukozy we krwi (hiperglikemia) w cukrzycy Dziedziczna nietolerancja fruktozy jest przyczyną akumulacji fruktozy i hipoglikemit Zaburzenia jej metabolizmu prowadzą do galak-

tozemii i zaćmy

między półacetalową grupą hydroksylową a inną grupą — OH. JeŜeli częścią hemiacetalową jest glukoza, to utworzony związek jest glukozydem; jeśli galak-

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 167

HO/CH.OH

OH

H

OH

OH

Ryc, 15-10. Streptomycyna (z lewej) i ouabaina (z prawej).

toza — galaktozydent, itd. JeŜeli drugą grupą jest amina, powstaje wiązanie N-glikozydowe, np. między adeniną a rybozą w takich nukleotydach, jak ATP (p. ryc. 12-5). Glikozydy są składnikami wielu leków i przypraw korzennych oraz tkanek zwierzęcych. Aglikonem moŜe być metanol, glicerol, steroł, fenol lub zasada, np. adenina. Wszystkie glikozydy, waŜne w medycynie ze względu na ich działanie na mięsień sercowy (glikozydy nasercowe), zawierają, jako składnik aglikonowy, steroidy. NaleŜą tu pochodne naparstnicy i strofantusa, takie jak ouabaina będąca inhibitorem Na+/K+-ATPazy błon komórkowych. GUkozydami są niektóre antybiotyki, np. streptomycyna (ryc. 15-10). Deoksycukrom brak atomu tlenu W deoksycukrach grupę hydroksylową przyłączoną do pierścienia zastąpił atom wodoru. Deoksycukry otrzymuje się w wyniku hydrolizy pewnych biologicznie waŜnych związków. Przykładem jest deoksyryboza (ryc. 15-11) występująca w kwasach nukleinowych (DNA).

OH

H

Ryc. 15-11. 2- Deoksy- D-rybofuranoza (anomer ji),

Deoksycukrem jest równieŜ L-fukoza (p. ryc. 15-17), składnik glikoprotein, oraz 2-deoksyglukoza, znany inhibitor metabolizmu glukozy. Aminocukry (heksozoaminy) są składnikami glikoprotein, gangliozydów i glikozaminoglikanów Przykładami aminocukrów występujących w przyrodzie są D-glukozamina (ryc. 15-12), D-galaktozamina i D-mannozamina. Glukozamina jest składnikiem kwasu hialuronowego. Galaktozamina (chondrozamina) jest składnikiem chondroityny (p. rozdz. 54), HOCH

Ryc. 15-12. Giukozamina (2-amino-D-glukopiranoza) (anomer a). Galaktozamina jest 2-amino-D-galaktopiranozą. Zarówno giukozamina, jak i ga laktozamina występują jako N-acetylowe pochod ne w większości węglowodanów złoŜonych, np. w glikoproteinach. ____________

Niektóre antybiotyki (erytromycyna, karbomycyna) zawierają w swojej cząsteczce aminocukry. UwaŜa się, Ŝe aktywność lecznicza związana jest z obecnością aminocukrów w cząsteczkach tych antybiotyków.

168 / ROZDZIAŁ 15

Disacharydy są cukrami złoŜonymi z 2 reszt monosacharydowych połączonych wiązaniem glikozydowym (ryc. 15-13). Nazwę chemiczną

disacharydów tworzy się na podstawie ich monocukrowych składników. WaŜnymi fizjologicznie disacharydami są maltoza, sacharoza, laktoza i trehaloza {tab. 15-3). W wyniku hydrolizy sacharozy powstaje mieszanina zwana „cukrem inwertowanym", gdyŜ powstająca w czasie hydrolizy silnie lewoskręt-

Maltoza

Trehaloza

NAJWAśNIEJSZYMI DISACHARYDAMI SĄ MALTOZA. SACHAROZA I LAKTOZA

A --- \ iOH 1

—o—'

H

OH

H

OH

0-a-0-Glukoplranozylo-(1ł4)-a-D-giukopiranoza H

OH

H

0-a-OGIukoplranozyto-(1-ł1)-«-[>-g!ukoplranozyd

Celobioza

HOCH2

HO

H

OH

OH

H

H

OH

OH

O-/t-D-Fru ktof u ra n ozylo-(2 -• 1 )-a - D-g I u to p I ran ozyd

Laktoza

H

OH

H

OH

O-0-D-GaJal
Ryc. 15-13. Struktura typowych disacharydów. Przedrostek a i p odnosi się do konfiguracji przy anomerycznym atomie węgla(*). JeŜeli węgiel anomeryczny drugiej reszty uczestniczy w tworzeniu wiązania glikozydowego, to ta|ją resztę glikozydową nazywa stę furanozydem lub piranozydem. W odróŜnieniu od większości innych cukrów, cukier nie mający wolnej potencjalnej grupy aldehydowej lub ketonowej na węglu anomerycznym nie wykazuje właściwości redukujących.

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 169 Tabela 15-3. Disacharydy Cukier

Znaczenie kliniczne

Źródło

Maltoza

Produkt trawienia amylazą lub hydrolizy skrobi. Kiełkujące ziarna zbóŜ i słód

Laktoza

Mleko

MoŜe pojawiać się w moczu podczas ciąŜy. Przy niedoborze laktazy, zaburzenie wchłaniania prowadzi do biegunki i wzdęcia

Sacharoza

Cukier trzcinowy i z buraków cukrowych. Sorgo, ananasy, marchew

Przy niedoborze sacharazy, zaburzenie wchłaniania prowadzi do biegunki i wzdęcia

Trehaloza

Grzyby i droŜdŜe. Główny cukier hemolimfy owadów.

na fruktoza powoduje zmianę (inwersję) skręcał no ści optycznej pierwotnie prawoskrętnej sacharozy.

POLISACHARYDY PEŁNIĄ FUNKCJE ZAPASOWE I STRUKTURALNE Do polisacharydów zalicza się następujące waŜne fizjologicznie węglowodany: Skrobia. Ma budowę łańcucha a-glikozydoweg"b. Takie związki, rozpadające się w trakcie hydrolizy tylko na cząsteczki glukozy, są homopolimerami zwanymi glukoza na mi tub glukanatni. Skrobia jest najwaŜniejszym źródłem węglowodanów w poŜywieniu i znajduje się w kaszach, ziemniakach, roślinach strączkowych i innych warzywach. Dwoma głównymi skład-

nikami skrobi s ą: amylo z a (15 20%),two rŜąca nierozgałęzioną strukturę helikoidalną (ryc. 15-14), oraz amylopektyna (80—85%), tworząca łańcuchy rozgałęzione. W tej ostatniej do łańcucha głównego są przyłączone wiązaniem 1 -+ó łańcuchy boczne; jedno odgałęzienie przypada na 24—-30 reszt glukozowych połączonych wiązaniami l-*4. Glikogen (ryc. 15-15). Jest zapasowym polisacharydem organizmów zwierzęcych. Często nazywa się go skrobią zwierzęcą. Ma strukturę bardziej rozgałęzioną niŜ amylopektyna, bowiem jedno odgałęzienie przyłączone do łańcucha głównego wiązaniem a(l -»-6)-glikozydowym przypada na 10—18 reszt a-D-glukopiranozowych połączonych wiązaniami a(l-»4)-glikozydowymi, Inulina. Jest polisacharydem występującym

Ryc. 15-14. Struktura skrobi. A — amyloza o strukturze spiralnego zwoju, B — amylopektyna z rozgałęzieniami przyłączonymi wiązaniami 1 -»6. ____

170 / ROZDZIAŁ 15

REGION ZEWNĘTRZNY

Ryc. 15-15. Cząsteczka glikogenu. A — struktura ogólna, B — powiększona struktura w punkcie rozgałęzienia. Liczby w A oznaczają kolejne etapy wzrostu cząsteczki. R — pierwotna reszta glukozy zawierająca, jako jedyna w cząsteczce glikogenu, redukującą grupę przy Cv Rozgałęzienia są bardziej róŜnorodne niŜ to przedstawiono na tej rycinie: wartość stosunku wiązań 1 -* 4 do wiązań 1 -* 6 waha się w granicach 10—18.

w bulwach i korzeniach dalii, karczochów i mniszka lekarskiego. Ulega ona hydrolizie do fruktozy, jest więc fruktozanem. Ten cukier zapasowy, w odróŜnieniu od skrobi ziemniaków, jest łatwo rozpuszczalny w ciepłej wodzie i bywa uŜywany w badaniach fizjologicznych do określenia szybkości filtracji w kłębuszkach nerkowych. Dekstryny. Są substancjami powstającymi podczas częściowej hydrolizy skrobi. Pierwszymi produktami trawienia skrobi, tworzonymi w wyniku skracania łańcuchów bocznych amylopektyny, są dekstryny graniczne. Błonnik (celuloza). Jest głównym składnikiem podporowym u roślin. Nie rozpuszcza się w po-

pularnych rozpuszczalnikach. Tworzy, zbudowane z jednostek p-D-glukopiranozowych, połączonych wiązaniami P(l-ł4), długie, proste łańcuchy wzmocnione krzyŜowymi wiązaniami wodorowymi. Błonnik nie jest trawiony w przewodzie pokarmowym wielu ssaków, w tym człowieka, z powodu braku hydrolazy działającej na wiązania p. Jest waŜnym składnikiem „objętościowym" poŜywienia. W Ŝołądku przeŜuwaczy i innych trawoŜernych występują mikroorganizmy zdolne rozbić wiązanie p, co pozwala wykorzystać bionnik jako znaczące źródło energetyczne. Chiryna. Jest waŜnym polisacharydem strukturalnym u bezkręgowców. Znajduje się ona np.

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM I 171 C hity na

HOCH2

HOCH, H

HN*CO«CH3

H

N-Acetyloglukozamina

HN»CO*CH3

N-Acełylogiu Kozami na

Kwas hiahironowy

w pancerzach skorupiaków i owadów. Strukturalnie chityna składa się z jednostek N-acetylo-D-glukozaminy, połączonych wiązaniami P(l-*4)-glikozydowymi (ryc. 15-16). Glikozamiaogliksny (mukopohsacharydy). Składają się z łańcuchów węglowodanów złoŜonych, charakteryzujących się zawartością aminocukrów i kwasów uronowych. Po przyłączeniu tych łańcuchów cukrowych do cząsteczki białka powstaje składnik zwany proteoglikanem. Razem z elastyną i kolagenem, elementami strukturalnymi takich tkanek, jak kość, tworzą substancję podstawową, czyli kitową. Znaczna liczba grup — OH i ładunków ujemnych, które przez odpychanie utrzymują w cząsteczce łańcuchy węglowodanowe osobno, powoduje, Ŝe glikozaminoglikany mają właściwość zatrzymywania znacznej ilości wody oraz pęcznienia i dzięki temu zdolność do nadawania właściwości amortyzujących lub poślizgowych innym strukturom. Przykładem są kwas hiałuronowy, siarczan chondroityny i heparyna (ryc. 15-16),

omówienie szczegółowo w rozdz. 57, Glikoproteiny (mukoproteiny). Występują w róŜnych płynach i tkankach, w tym w błonach komórkowych (p. rozdz. 43 i 57). Są to białka złoŜone zawierające w róŜnych ilościach węglowodany, przyłączone jako krótkie lub długie (do 15 jednostek) rozgałęzione lub nierozgałęzione łańcuchy. Łańcuchy takie nazywa się zwykle łańcuchami oligosacharydowymi. Składniki cukrowe obejmują:

HOCH, COO" H

OH Kwas /(-g luku ran owy

N-

Acatylogukozamlna 4-Siarczan chondroltyny

(Uwaga: występuje równieŜ 6-siarczan) HOCH, H HNCOCH3

Heksozy Mannoza (Man)

Galaktoza (Gal)

Acetyloheksozaminy N-Acetyloglukozarnina (GIcNAc)

N-Acetylogalaktozarriina (GaiNAc)

Pentozy Arabinoza (Ara) Ksyloza (Xyi) H OH Metylopentozy Kwas 0L-Fukoza (Fuc; p. ryc, 15-17) glukuronowy Siarczan Nacatylogalaktozaminy Heparyna

H/H

\H

Hy

"O.

H Suttonowana giukozamina

Sulfonowany kwas Iduronowy

Ryc. 15-16. Struktura niektórych polisacharydów złoŜonych.

Kwasy sjałowe Pochodne N-acylowe kwasu neuraminowego, np. kwas N-acetyloneuraminowy (NeuAc; p. ryc. 15-18), główny kwas sjalowy.

Dojrzale glikoproteiny, oprócz kolagenu, nie zawierają glukozy i w przeciwieństwie do gliko/aminoglikanów i proteogiikanow nie zawierają kwasów uronowych. Kwasy sjalowe. Są N- lub O-acylowymi pochodnymi kwasu neuraminowego (ryc. 15-18). Kwas cukrem, NH«SOneuraminowy Hjest 9-węglowym OSĄ1 3~

172 / ROZDZIAŁ 15

JtrsO\H

HO/0

W OH

H

Ryc. 15-17. (i-L Fukoza (6-deoksy-p-L-galaktoza).

COCT

Ac —NH

OH

stanowią węglowodany, które znajdują się w glikoproteinach i gliko lipid ach. Ich obecność na zewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej (glikokaliks) wykazano przy uŜyciu lektyn roślinnych, aglutynin białkowych, które wiąŜą się swoiście z pewnymi resztami glikozylowymi, np. kimkanawalina A jest swoista w stosunku do reszt a-glukozy 1 owych i a-mannozylowych. Glikoforyna. Jest główną integralną glikoproteiną błony ludzkich erytrocytów. Zbudowana ze 130 reszt aminoacylowych tkwi w błonie lipidowej tak, Ŝe zarówno z zewnętrznej, jak i z wewnętrznej (cytoplazmatycznej) powierzchni błony wystają wolne części polipeptydowe. Łańcuchy sacharydowe są przyłączone tylko do części N-końcowej, znajdującej się na zewnątrz powierzchni zewnętrznej błony (p. rozdz, 43).

H

Ryc. 15-18. Struktura kwasu N-acetyloneuraminowego (kwasu sjalowego). Ac = CH3-CO-.

którego strukturę moŜna wyprowadzić, tączac mannozaminę (epimer glukozaminy) z pirogronianem. Kwasy sjalowe są składnikami zarówno glikoprotein jak i gangliozydów. WĘGLOWODANY ZNAJDUJĄ SIĘ W BŁONACH KOMÓRKOWYCH Lipidową strukturę błon komórkowych opisano w rozdz. 16 i 43. Analiza składników błon komórkowych ssaków wykazuje, Ŝe ok. 5%

PIŚMIENNICTWO Advances in Carbohydrate Chemistry. Academic Press, 1945—current. Collins PM (editor); Carbokydrates. Chapman & Hali, 1987. Ferrier RJ, Collins PM; Monosaccharide Chemistry. Penguin Books, 1972. Hughes RC: The comple* carbohydrates of mammalian celi surfaces and their biological roles. Essays Biochem 1975;11:1. Lindahl U, Hook M: Glycosaminoglycans and their binding to biological macromolecules. Annu Rev Biochem 1978;47:385. Pigman WW, Horton D (editors): The Carbohydrates. Vols — 1A and 1B. Academic Press, 1972. Rees DA: Poiysaccharide Shapes. Wiley, 1977. Sharon N: Carbohydrates. Sci Am 1980;245:90

Lipidy o znaczeniu fizjologicznym

16

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Lipidy są heterogenną grupą związków rzeczywiście lub potencjalnie pokrewnych kwasom tłuszczowym. Mają one wspólną cechę, którą jest t) względna nierozpu szcza Iność w wodzie oraz 2) rozpuszczalność w rozpuszczalnikach niepolarnych, takich jak eter, chloroform i benzen. Do lipidów zalicza się wiec thiszcze, oleje, woski i związki pokrewne. Lipidy są waŜnymi składnikami pokarmów nie tylko ze względu na ich duŜą wartość energetyczną, lecz takŜe dlatego, Ŝe w tłuszczach zawartych w naturalnych pokarmach znajdują się -witaminy rozpuszczalne w tłuszczach oraz niezbędne (tzw. egzogenne) kwasy tłuszczowe.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE W organizmie tłuszcze słuŜą jako wydajne źródło energii zarówno bezpośrednio, jak i potencjalnie, gdy odłoŜone są w tkance tłuszczowej. Tłuszcze tkanki podskórnej i gromadzące się wokół pewnych narządów słuŜą jako izolator termiczny, a lipidy niepolarne jako izolatory elektryczne pozwalające na szybkie rozprzestrzenianie się fal depolaryzacyjnych wzdłuŜ mielinowych włókien nerwowych. Zawartość tłuszczów jest wyjątkowo duŜa w tkance nerwowej. Połączenia tłuszczu z białkiem (lipoproteiny) stanowią waŜne składniki komórkowe występujące zarówno w błonie komórkowej, jak i w mitochondriach, a takŜe słuŜą jako środki transportu lipidów w osoczu krwi. Znajomość biochemii lipidów jest konieczna do zrozumienia wielu bieŜących zagadnień biomedycznych, np. otyłości, miaŜdŜycy oraz roli róŜnych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych zarówno w Ŝywieniu, jak i w zdrowiu.

LIPIDY DZIELI SIĘ NA PROSTE I ZŁOśONE Zmodyfikowana klasyfikacja lipidów wg Bloora jest następująca: A. Lipidy proste: estry kwasów tłuszczowych z róŜnymi alkoholami. 1. Thiszcze właściwe — estry kwasów tłu szczowych z glicerolem. Tłuszcze występujące w stanie płynnym nazywa się olejami. 2. Woski — estry kwasów tłuszczowych z długołańcuchowymi alkoholami monohydroksylowymi. B. Lipidy złoŜone: estry kwasów tłuszczowych zawierające, oprócz alkoholu i kwasów tłu szczowych, jeszcze grupy dodatkowe. 1. Fosfolipidy — lipidy zawierające oprócz kwasów tłuszczowych i glicerolu, resztę kwasu fosforowego. Często zawierają one zasadę azo tową i inne podstawniki. a. Glieerofosfolipidy — alkoholem jest glicerol. b. Sfingofosfolipidy — alkoholem jest sfingozyna. 2. Glikolipidy (glikosfingolipidy) — lipidy za wierające kwas tłuszczowy, sfingozynę i wę glowodany, 3. Inne lipidy złoŜone — takie lipidy, jak sulfolipidy i aminolipidy. W tej grupie moŜna umieścić równieŜ lipoproteiny. C. Prckursory i pochodne lipidów: nakŜą tu kwasy tłuszczowe, glicerol, steroidy, alkohole inne niŜ gHcerol i sterole, aldehydy tłuszczowe, związki ketonowe (p, rozdz. 24), węglowodory, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach i hor mony. Ze względu na brak ładunku w cząsteczkach, acylogiicerole (glicerydy), cholesterol i estry cholesterolu określa się mianem lipidów obojętnych.

174 / ROZDZIAŁ 16

KWASY TŁUSZCZOWE SĄ ALIFATYCZNYMI KWASAMI KARBOKSYLOWYMI

CH3(CH2),CH = CH(CHj)7COOH lub

Kwasy tłuszczowe występują głównie w formie zestryfikowanej w naturalnych tłuszczach i olejach, ale w surowicy krwi występują i są transportowane w formie niezestryfikowanej jako wolne kwasy tłuszczowe. Kwasy tłuszczowe występujące w tłuszczach naturalnych są zwykle pochodnymi nierozgałęzionych łańcuchów węglowodorowych i zawierają parzystą liczbę atomów węgla, poniewaŜ są syntetyzowane z jednostek dwuwęglowych. Ich łańcuch moŜe być nasycony (brak wiązań podwójnych) lub nienasycony (z jednym, lub więcej, wiązaniem podwójnym). Nazwy kwasów tłuszczowych wyprowadza się od odpowiednich węglowodorów Według najczęściej uŜywanej nomenklatury nazwę systematyczną kwasu tłuszczowego tworzy się od nazwy węglowodoru o tej samej liczbie atomów węgla przez dodanie końcówki -owy do nazwy węglowodoru (nomenklatura genewska). Tym sposobem nazwa kwasu nasyconego kończy się na -anowy np. oktanowy, a kwasu nienasyconego z wiązaniami podwójnymi na -enowy, np. oktadekenowy (kwas oleinowy). Numerację atomów węgla rozpoczyna się od węgla grupy karboksylowej (węgiel nr 1). Atom węgla przylegający do węgla karboksylowego (nr 2) jest równieŜ znany jako węgiel a. Atom węgla nr 3 jest węglem p, a atom węgla w grupie metylowej znajdującej się na dystalnym końcu łańcucha nazywa się węglem w lub n-atomem węgla. W uŜyciu jest kilka sposobów wskazywania liczby i połoŜenia wiązań podwójnych; np. A9 oznacza wiązanie podwójne między atomami węgla 9 i 10 kwasu tłuszczowego; to9 wskazuje wiązanie podwójne przy węglu 9, licząc od atomu węgla co. Na ryc. 16-1 przedstawiono powszechnie uŜywane sposoby wskazywania liczby atomów węgla, liczby i połoŜenia wiązań podwójnych w cząsteczce kwasu tłuszczowego. U zwierząt dodatkowe wiązania podwójne są wprowadzane tylko miedzy istniejącym wiązaniem podwójnym (np. (o9, ro6 lub ca3) a węglem karboksylowym, wynikiem czego są 3 serie kwasów tłuszczowych, znane odpowiednio jako rodzina o>9, 006 i co3.

a>9,C18:1 lub n-9, 18:1 CH3CH2CH,CH2CH£H2CHJCH2CH = CH(CH2)7COOH n

17

10

9

1

Ryc. 16-1. Kwas oleinowy, n-9 (n minus 9).

Nasycone kwasy tłuszczowe nie zawierają wiązań podwójnych Nasycone kwasy tłuszczowe moŜna traktować jako pochodne kwasu octowego, pierwszego przedstawiciela szeregu. W tabeli 16-1 przedstawiono przykłady kwasów tego szeregu. Inne długołańcuchowe kwasy tłuszczowe z tego szeregu występują przewaŜnie w woskach. Wyodrębniono równieŜ kilka kwasów tłuszczowych o łańcuchu rozgałęzionym zarówno z materiału roślinnego, jak i zwierzęcego. Nienasycone kwasy tłuszczowe zawierają jedno lub więcej wiązań podwójnych (p. tab. 16-2) Kwasy te moŜna podzielić na podgrupy ze względu na ich stopień nienasycenia. A. Kwasy jednonienasycone (monoetenoidy, kwasy monoetenowe) zawierające jedno wiąza nie podwójne. B. Kwasy wielonienasycone (polienoidy, kwa sy polienowe) zawierające więcej wiązań po dwójnych. C. Eikozanoidy. Grupa związków, pochod nych ikoza-(20-C) polienowych kwasów tłusz czowych, obejmująca prostanoidy i leukotrieny (LT). Do prostanoidów zalicza się prostaglandyny (PG), prostacykliny (PGI) i tromboksany (TX). Terminu „prostaglandyny" uŜywa się często nieściśle jako określenia ogólnego obej mującego wszystkie prostanoidy. Prostagiandyny. Odkryto pierwotnie w nasieniu, ale obecnie wiadomo, Ŝe występują praktycznie we wszystkich tkankach ssaków, działając jako miejscowe hormony lokalne; wykazują one istotne aktywności fizjologiczne i farmakologiczne. In vivo są one syntetyzowane z 20-C wielonienasyconych (ikozanowych) kwasów tłuszczowych (np. kwasu arachidonowego). Pierwszy etap biosyntezy polega na cyklizacji środkowej części łańcucha i utworzeniu pierś-

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 175 Tabela 16-1. Nasycone Nazwa zwyczajowa kwasu

kwasy tłuszczowe Liczba atomów węgla

Mrówkowy*

1

Uczestniczy w metabolizmie reszt Ci (mrówczanu)

Octowy

2

Główny produkt końcowy fermentacji węglowodanów u przeŜuwaczy-

Propionowy

3

Końcowy produkt fermentacji węglowodanów u przeŜuwa+ czy

4 56

Wpewnych tłuszczach w mafych ilościach (zwłaszcza w maśle). > Końcowy produkt fermentacji węglowodanów u 1 przeŜuwaczy "

Masłowy Walerianowy Kapronowy Kaprylowy (oktanowy) Kaprynowy (dekanowy) Laury no wy

a 10

^W wielu tłuszczach (łącznie z masłem) w małych > ilościach, zwłaszcza w tłuszczach roślinnych

12

Spermacet, cynamon, nasiona palmy, olej kokosowy, owoc wawrzynu

Mirystynowy

14

Palmitynowy

16

Gałka muszkatołowa, nasiona palmy, olej kokosowy, mirt 1 Powszechnie występujące we wszystkich tłuszczach zwie-f rzęcych i roślinnych

Stearynowy Arachidowy (ikozanowy)

18 20

Olej arachidowy

Behenowy

22

Nasiona

Lig npc ery nowy

24

Cerebrozydy, olej arachidowy

* Tylko kwas mrówkowy, bez pochodnych alkilowych. + RównieŜ w okręŜnicy człowieka.

coo-

Ryc. 16-2. Prostaglandyna E2 (PGE2). Byc. 16-3. Tromboksan A2 (TXA2).

COCr

cienia cyklopentanowego (ryc. 16-2). Pokrewny szereg związków, tj. tromboksaiiy wykryte w płytkach krwi, ma pierścień cyklopentanowy przerwany atomem tlenu (pierścień oksanowy) (ryc. 16-3), Trzy róŜne ikozanowe kwasy tłuszczowe dają początek 3 grupom eikozanoidów z charakterystyczną liczbą wiązań podwójnych w łańcuchach bocznych, np. PGj, PG2, PG> Zmiany dotyczące podstawników przyłączonych do pierścieni są przyczyną istnienia róŜnych typów podstawienia oznakowanych A, B itd. w kaŜdym szeregu prostaglandyn i tromboksanó w. Typ „E" prostagland yn (jak w PGE2) ma grupę ketonową w pozycji 9, natomiast typ „F" ma grupę hydroksylową w tej pozycji. Lcukotrkny są trzecią grupą pochodnych eikozanoidów powstających raczej przez szlak lipooksygenazy niŜ przez cyklizację łańcucha kwasu tłuszczowego (ryc. 16-4). Leu-

176 / ROZDZIAŁ 16 Tabela 16-2. Nienasycone kwasy tłuszczowe występujące w pokarmach i mające znaczenie fizjologiczne Liczba atomów C oraz liczba i pozycja wiązań podwójnych

Szereg

Nazw a zw yczajowa

Na zw a systematyczna

W ystępowanie

Kwas y monoenowe (z 1 podwójn ym wiązaniem) 16:1; 9

w7

Palmitooleinowy

cis - 9 - H eksa de ke n o w y

Niemal we wszystkich tłuszczach

18:1; 9

w9

Oleinowy

cis - 9 - 0 kta d eke n owy

Prawdopodobnie najbardziej rozpowszechniony kwas tłuszczowy w tłuszczach naturalnych

18:1; 9

w9

Ela i dyn owy

frans- 9 • 0 ktadeken o wy

Tłuszcze przeŜuwaczy i utwardzane

22:1;13

u9

Erukowy

c/s-13-Dokozenowy

Oleje rzepakowy i gorczyczny

24:1;15

w9

Nerwonowy

c«-15-Tetrakozenowy

W cerebrozydach

Kwasy drenowe (z 2 podwójnymi wiązaniami) cis,cis-B,12-Oktadekadienowy

18:2; 9, 12

Oleje: kukurydziany, arachidowy, bawełniany, sojowy i wiele innych roślinrfych

Kwasy trienowe (z 3 podwójnymi wiązaniami) 18:3; 6, 9, 12

Y-Linolenowy

6,9,12-Oktadekatrienowy

Niektóre rośliny, np. olej z wiesiołka. Niewielkie ilaści w tłuszczach zwierzęcych

18:3; 9, 12, 15

et-Linolenowy

9,12,15-Oktadekatrienowy Często występuje z kwasem linolowym, zwłaszcza w oleju lnianym

Kwasy tetraenowe {z 4 podwójnymi wiązaniami)

20:4; 5, 8, 11, 14

Arachidonowy 5,8,11,14- Ikozatetraenonowy

Występuje z kwasem linolowym, zwłaszcza w oleju arachidowym; istotny składnik fosfolipidów zwierzęcych

Kwasy pentaenowe (z 5 podwójnymi wiązaniami)

20:5; 5, 8, 11, 14, 17

Timnodonowy

5,8,11,14,17-lkozapentaenowy

Istotny składnik olejów rybich, np. tranu dorszowego

22:5; 7, 10, 13, 16, 19

Klupanodono-

7,10,13,16,19-Dokozapentaenowy

Oleje rybie, fosfolipidy w mózgu

Kwasy heksaenowe {z 6 podwójnymi wiązaniami) 22:6; 4, 7, 10, 13, 16, 19

Cerwonowy

4,7,10,13,19-Dokozaheksaenowy

Oleje rybie, fosfolipidy w mózgu

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 177

COO"

Postać trans (kwas eialdynowy)

Ryc. 16-4. Leukotnen A4 (LTA4).

kotrieny izolowane z leukocytów charakteryzują się obecnością 3 sprzęŜonych wiązań podwójnych. Większość naturalnie występujących nienasyconych kwasów tłuszczowych ma podwójne wiązanie cis Łańcuchy węglowe nasyconych kwasów tłuszczowych po rozciągnięciu w niskich temperaturach przyjmują konformację typu zygzak. W wyŜszych temperaturach niektóre wiązania ulegają rotacji, powodując skrócenie łańcucha, co wyjaśnia, dlaczego błony biologiczne stają się cieńsze wraz ze wzrostem temperatury. Typ izomerii geometrycznego, w jakim występują nienasycone kwasy tłuszczowe, zaleŜy od ustawienia atomów lub grup wokół osi wiązania podwójnego. Jeśli łańcuchy węglowe znajdują się po tej samej stronie wiązania, to wiązanie ma konfigurację cis, jak w kwasie oleinowym; jeśli po przeciwnych stronach — trans, jak w kwasie elaidynowym, sztucznym izomerze kwasu oleinowego (ryc. 16-5). Prawie wszystkie występujące w przyrodzie nienasycone długołańcuchowe kwasy tłuszczowe mają konfiguracje cis; łańcuchy węglowodorowe cząsteczek są „zgięte" w miejscu podwójnego wiązania o 120°. Kwas oleinowy ma więc kształt litery L, natomiast kwas elaidynowy mając podwójne wiązanie trans, pozostaje „prosty". Zwiększenie liczby wiązań podwójnych cis w kwasach tłuszczowych pozwala na róŜnorodność konfiguracji przestrzennych cząsteczki, np. kwas arachidonowy, z 4 wiązaniami podwójnymi cis, moŜe mieć kształt „supła" lub litery „U", To moŜe mieć istotne znaczenie dla molekularnego upakowania w błonie i dla ułoŜenia przestrzennego kwasów tłuszczowych w bardziej złoŜonych cząsteczkach, takich jak fosfolipidy. Obecność wiązań podwójnych trans będzie zmieniać te przestrzenne współzaleŜności. Kwasy tłuszczowe o konfiguracji trans występują w pewnych pokarmach. Większość z nich powstaje jako produkt uboczny podczas wysycania kwasów

coo-

coo-

Ryc. 16-5. Izomery geometryczne kwasu tłusz9 czowego A ,18:1 (kwasy oleinowy i elaidynowy).

tłuszczowych w procesie uwodornienia, czyli „utwardzania" naturalnych olejów w zakładach produkujących margarynę. Dodatkowa niewielka część kwasów tłuszczowych trans pochodzi ze spoŜywanych tłuszczów przeŜuwaczy, u których powstają one w źwaczu w wyniku działania mikroorganizmów. Zarówno fizyczne, jak i fizjologiczne właściwości kwasów tłuszczowych są warunkowane długością i stopniem nienasycenia ich łańcucha Temperatura topnienia kwasów tłuszczo12 — Biochemia

'CH 3 -O-C-R,

wych o parzystej liczbie węgli wzrasta wraz z długością łańcucha i obniŜa się zgodnie z jego nienasyceniem. Triacyłoglicerol, zawierający tylko nasycone kwasy tłuszczowe o 12 atomach węgla lub dłuŜsze, występuje w stanie stałym w temperaturze ciała, natomiast jeŜeli wszystkie 3 reszty kwasów tłuszczowych są 18:2 jest w stanie płynnym do temperatury poniŜej 0°C. O [I

O 11

R»-C-O-CH

O u

*CH, O - C - R , Ryc. 16-6. Trtacyloglicerol.

178 / ROZDZIAŁ 16

W rzeczywistości naturalne acyloglicerole zawierają mieszaninę kwasów tłuszczowych dobraną zgodnie z funkcją lipidu. Lipidy błon, które muszą być płynne w zakresie temperatur środowiska, są bardziej nienasycone niŜ lipidy zapasowe. Lipidy tkanek naraŜonych na schłodzenie, np. u zwierząt podczas snu zimowego lub w kończynach zwierząt, są w wyŜszym stopniu nienasycone. Pewne alkohole i aldehydy występują w naturalnych lipidach Alkohole. Do alkoholi występujących w cząsteczkach lipidów naleŜy glicerol, cholesterol i występujące zwykle w woskach wyŜsze alkohole (np. alkohol cetylowy, Cj6H33OH) oraz dolichol, alkohol poliizoprenoidowy (p. ryc. 16-27).

O 'CH2 -O-C-C,7H» C„H l t -C-O-'ĆH 0 >CHa -0-C — C„H3S Ryc. 16-7. 1,3-Distearynopalmityna.

C„H„-C-O-iCH O a CH,-O-C-C„H 1 , Ryc. 16-8. 1,2-Distearynopalmityna.

Aldehydy tłuszczowe. Kwasy tłuszczowe mogą zostać zredukowane do aldehydów tłuszczowych. Związki te znaleziono w tłuszczach naturalnych w formie wolnej lub związanej. TRIACYLOGLICEROLE (TRIGLICERYDY)* TO GŁÓWNA FORMA ZAPASOWA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Triacyloglicerole są estrami alkoholu — glicerolu z kwasami tłuszczowymi. W naturalnie występujących tłuszczach procent cząsteczek triacyloglicerolu, w których glicerol jest zestryfikowany 3 takimi samymi kwasami, jest bardzo mały. Niemal wszystkie one są acyloglicerolami mieszanymi. Gdyby wszystkie 3 kwasy tłuszczowe oznaczone na ryc. 16-6 jako R, były kwasami stearynowymi, tłuszcz nazywałby się tristearyną, poniewaŜ składałby się z glicerolu zestryfikowanego 3 resztami kwasu stearynowego. Na rycinach 16-7 i 16-8 przedstawiono przykłady acylogliceroli mieszanych.

* Monoglicerydy, diglicerydy i triglicerydy zgodnie z obecną standardową terminologią Międzynarodowej Unii Chemii Czystej i Stosowanej (IUPAC) oraz Międzynarodowej Unii Biochemicznej (IUB) określa się odpowiednio jako "monoacyioglicerole, diacyloglicerole i triacyloglicerole.

Atomy węgla 1 i 3 w cząsteczce glicerolu nie są identyczne Aby jednoznacznie ponumerować atomy węgla glicerolu, stosuje się system -sn- (stereochemiczne numerowanie), np. 1,2-distearoilo--3palmitoilo-OT-glicerol (przedstawiony,wzorem projekcyjnym równieŜ na ryc. 16-9). Nale-

i II HjC-O-C-R, i

O Rs-COI

i i

H'Ć-0-C-R-,

Ryc. 16-9. Triacylo-s/ł-glicerol.

Ŝy podkreślić, Ŝe węgle 1 i 3 cząsteczki glicerolu nie są identyczne, jeŜeli ogląda się trójwymiarowy model cząsteczki. Enzymy bez trudu rozpoznają je i są prawie zawsze swoiste względem jednego lub drugiego węgla, np. glicerol jest zawsze fosforylowany przez glicerokinazę na sn-i dając glicerolo-3-fosforan, a nigdy glicerolo-l-fosforan. W tkankach znaleziono równieŜ częściowe acyloglicerole, tzn. mono- lub diacyloglicerole, w których glicerol jest zestryfikowany 1 lub 2 kwasami tłuszczowymi. Mają one szczególne znaczenie w syntezie i hydrolizie triacylogliceroli.

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 179

FOSFOLIPIDY SĄ GŁÓWNYM SKŁADNIKIEM LłPIDOWYM BŁON Do grupy fósfolipidów zalicza się: 1) kwas fosfatydowy i fosfatydyloglicerol, 2) fosfatydylocholinę, 3) fosfatydyloetanoloaminę, 4) fosfatydyloinozytol, 5) fosfatydyloserynę, 6) lizofosf o lipidy, 7) plazmalogeny i 8) sfingomieliny. Wszystkie te związki są fosf o glicerydami, oprócz sfingomidin, których cząsteczki nie zawierają glicerolu. Mogą one być traktowane jako pochodne kwasu fosfatydowego (ryc. 16-10), w którym fosforan jest zestryfikowany z grupą -OH odpowiedniego alkoholu.

Fosfatydylocholiny (lecytyny) występują w błonach komórkowych Fosfatydylocholiny są to fosf o glicerydy zawierające cholinę (ryc. 16-12). Są one przewaŜającymi ilościowo lipidami błon komórkowych O 1

O

"

CH;.-O-C-R, 3

CH2-O-P-OTCH£-CH2~N~CH3 x

*^^^H

c \-\ ■

Cholina Ryc. 16-12. 3-Fosfatydylocholina.

o II O CHi-O-C-R, II 1 R 2 -C-O-CH I li CH2-O-P~O I Ryc. 16-10. Kwas fosfatydowy

Kwas fosfatydowy jest kluczowym związkiem pośrednim w syntezie triacylogliceroli oraz fosf o glicerydów, ale w tkankach występuje w niewielkich ilościach. Kardiolipina jest istotnym lipidem błon mitochondrialnych Kwas fosfatydowy jest prekursorem fosfatydyloglicerolu, który z kolei w mitochondriach ulega przekształceniu w kardiolipinę (ryc. 16-11).

i stanowią duŜą część zasobów choliny w organizmie, Cholina odgrywa waŜną rolę w przewodnictwie nerwowym oraz jako zapas labilnych grup metylowych. Dipalmitoilolecytyna jest bardzo aktywnym związkiem powierzchniowo czynnym (surfaktant), zmniejszającym napięcie powierzchniowe pomiędzy fazą tkanki płucnej i fazą gazów oddechowych i zapobiegającym sklejaniu się wewnętrznych powierzchni płuc. Brak surfaktantu w płucach wcześniaków jest przyczyną zespołu błon szklistych, którego zasadniczym objawem jest zespól niewydolności oddechowej. Większość fosfolipidów ma nasycony rodnik acylowy w połoŜeniu Cls a rodnik nienasycony w połoŜeniu C2 glicerolu. Fosfatydyloetanoloamina (kefaiina) Kefaliny róŜnią sic od fosfatydylocholiny tylko tym, Ŝe zamiast choliny zawierają etanoloaminę (ryc. 16-13).

■■■ii CH2— O-P—O—CH2 O I<4Ś u i u H-C-OH O O H-C-O-C-Ra

i ■ f

Fosfatydyloglicerol Bisfosfatydyloglicerol (kardiolipina) Ryc. 16-11. Kardiolipina (bisfosfatydyloglicerol}.

180 / ROZDZIAŁ 16

Etanoloamina Ryc. 16-13. 3-Fosfatydytoetanoloamina

Lizofosfolipidy są związkami pośrednimi w metabolizmie fosfoglicerydów Są to fosfoacyloglicerole zawierające w swojej cząsteczce tylko jedną resztę acylową, np. lizolecytyna, uczestnicząca w metabolizmie i przekształcaniu fosfolipidów (ryc. 16-16).

Fosfatydyloinozytol jest prekursorem wtórnych przekaźników Występuje tu stereoizomer ino2ytolu, mioi-

0 IICH2-O-C-R

nozytol (ryc. 16-14). Fosfatydyloinozytoto-4,5-bis-

CH2-O-P-S-CH3-CHi-N-ĆHa | ^

fosforan jest waŜnym składnikiem fosfolipidów błon komórkowych. Po pobudzeniu komórki przez właściwy hormon jest hydrolizowany do diacyloglicerolu i inozytolo-tris-fosforanu. z których kaŜdy działa jako wewnątrzkomórkowy sygnał, czyli drugi posłaniec (p. str. 594).

1

O CH,—O—C—Rt ii I 2 R 2 -C-O- CH Ryc. 16-14. 3-Fosfatydyloinozytol.

Fosfatydyloseryna W większości tkanek występuje fosfatydyloseryna, która zamiast etanoloaminy ma serynę (ryc. 16-15). Wyizolowano równieŜ fosfolipidy zawierające treoninę. OO

Cholina Ryc. 16-16. Lizolecytyna.

Plazmalogeny występują w mózgu i mięśniach Związki te stanowią co najmniej 10% fosfolipidów mózgu i mięśni. Strukturalnie plazmalogeny przypominają fosfatydyloetanolpaminc. ale przy C, zamiast wiązania estrowego, występującego w większości acylogliceroli, mają wiązanie eterowe. Zazwyczaj rodnikiem alkilowym jest nienasycony alkohol (ryc. 16-17). W niektórych przypadkach etanoloamina moŜe być zastąpiona choliną, seryną lub inozytolem.

Rj-C-O-CH

CH2-O-C-R,

{

3

CH2-O-P-i

i

,1 !t .-. Ł:- I ■III : C H 2-O-P- O-C H2-C H-C OO" O

O'

Kwas plazmenowy

Etanoloamina

Ryc. 16-17. Plazmalogen (plazmenyloelanoloamina).

'CHi-O-C-R,

( Seryna Ryc. 16-15. 3-Fosfatydyloseryna^ _____

R J - C - O - CH

V.____________

Sfingomieliny równieŜ występują w układzie nerwowym Sfingomieliny wykryto w duŜych ilościach w mózgu i tkance nerwowej. W wyniku hydrolizy sfingomielin otrzymuje się kwas tłuszczowy, kwas fosforowy, cholinę i złoŜony amirioalkohol — sfingozynę (ryc. 16-18), W lipidach tych nie występuje glicerol. Amidowe połączenie sfingo-

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 181 Ceramid Sfingozyna H

?

H

CH 3 - (CH s ),s-CH=CH-CH-CH-NĆH;

Kwas tłuszczowy Ó Kwas fosforowy

Cholina Ryc. 16-18. Sfingomielina.

zyny z kwasem tłuszczowym nazywa się ceramidem; struktura tego typu występuje równieŜ w glikolipidach (p, poniŜej). GLIKOLIPIDY (GLIKOSFINGOLIPIDY) SĄ ISTOTNYM SKŁADNIKIEM TKANKI NERWOWEJ I BŁON KOMÓRKOWYCH Glikolipidy są szeroko rozpowszechnione w kaŜdej tkance organizmu, zwłaszcza w tkance nerwjowej takiej jak mózg. Znajdują się głównie w zewnętrznej warstwie błony plazmatycznej, z której wystają ich. łańcuchy oligosacharydowe, tworząc sacharydy powierzchni komórki. Głównymi glikolipidami zwierzęcymi są glikosfingolipidy. Zawierają one ceramid i jedną lub więcej cząsteczek cukru. Dwoma najprostszymi glikolipidami są gaiaktozyloceramid i glukozyloceramid. Galaktozyloceramid jest głów-

nym gJikosfingolipidem mózgu i innych tkanek nerwowych, ale we względnie małych ilościach występuje on wszędzie. Zawiera sporo charakterystycznych Ci4 kwasów tłuszczowych. Galaktozyłoceramid (ryc. 16-19) moŜe zostać przekształcony w sulfogalaktozyloceramid (klasyczny sulfoglikozylosfingolipid; dawniej sulfatyd), który występuje obficie w mielinie. Glukozyloceramid jest przewaŜającym prostym glikosflngolipidem tkanek pozanerwowych, aJe w małych ilościach znajduje się równieŜ w mózgu. Bardziej złoŜonymi glikosfmgolipidami są gangliozydy, pochodne glukozyloceramidu. Gangliozyd jest glikosfingolipidem zawierającym dodatkowo jedną lub więcej reszt kwasu sjalowego. Kwas N-acetyloneuraminowy (NeuAc; p. rozdz. 15) jest zasadniczym kwasem sjalowym występującym w tkankach ludzkich. Gangliozydy występują w duŜych stęŜeniach równieŜ w tkance nerwowej. Wydaje się, Ŝe pełnią one funkcje receptorowe i inne. Najprostszym gang-

Sfingazyna A

___

OH O I H II 3—(CH2)12-CH=

CH-CH-CH—N—C- CH(OH) -

GalaWoza

Kwas tłuszczowy, np. kwas cerebronowy

O-CH,

H

OH

Ryc. 16-19. Struktura gaiaktozyloceramidu (galaktocerebrozyd, R = H) i sulfogalaktozyloceramidu (dawniej sulfatyd, R = SO|~).

182 / ROZDZiAŁ 16

liozydem występującym w tkankach jest GM3-Zawiera on ceramid, 1 cząsteczkę glukozy, 1 cząsteczkę galaktozy i 1 cząsteczkę NeuAc. W uŜytym tu skrótowym zapisie gangliozydu: G oznacza gangliozyd, M = monosjalo, a cyfra arabska wskazuje kolejność lokowania się na chromatogramach cienkowarstwowych. Na rycinie 16-20 przedstawiono strukturę GM], bar- Rvc. 16-21. Szkielet (rdzeń) steroidowy. dziej złoŜonego gangliozydu będącego pochodną GM3. G M| jest związkiem dosyć interesująCaramid-Glukoza-Galaklcwa -N-Acetylo- GalaMoza (Acy
Cer-GIc-Gal-GalNAc-Gal I NeuAc Ryc. 16-20. Gangliozyd GM1, monosjaloganglio/yd.

cym biologicznie, jako Ŝe jest on znanym receptorem dla toksyny cholery w jelicie cienkim. Inne gangliozydy mogą zawierać w swojej cząsteczce od jednej do 5 reszt sjalowych, tworzących odpowiednio di-, trisjalogangliozydy itd. STEROIDY PEŁNIĄ WIELE WAśNYCH FUNKCJI FIZJOLOGICZNYCH Cholesterol jest prawdopodobnie najbardziej znanym steroidem ze względu na jego udział w rozwoju miaidiycy. Odgrywa on bardzo waŜną rolę biochemiczną, poniewaŜ jest prekursorem wielu równie waŜnych steroidów, takich jak kwasy Ŝółciowe, hormony kory nadnerczy, hormony płciowe, witaminy D, glikozydy nasercowe, sitosterole w świecie roślin i niektóre alkaloidy. Wszystkie steroidy mają podobny rdzeń cykliczny, przypominający fenantren (pierścienie A, B i C), do którego jest dołączony pierścień cyklopentanu (D). Atomy węgla w rdzeniu steroidowym są numerowane tak, jak pokazano na ryc. 16-21. Przy rozpatrywaniu wzorów strukturalnych steroidów naleŜy zwrócić uwagę, Ŝe prosty pierścień heksagonalny oznacza całkowicie nasycony pierścień 6-węglowy ze wszystkimi wartościowościami wy sycony mi wodorem, chyba

Ŝe zaznaczono inaczej; tzn. nie jest to pierścień benzenowy. We wzorze zaznacza się wszystkie wiązania podwójne. Boczne grupy metylowe przedstawia się w postaci wiązań pojedynczych nie połączonych na dalszym końcu (metyl). Występują one typowo w pozycji 10 i 13 (tworząc 18 i 19 atom węgla), W pozycji 17 występuje zwykle łańcuch boczny (jak w cząsteczce cholesterolu). JeŜeli związek zawiera 1 lub więcej grup hydroksylowych, a Ŝadnej grupy karbonylowej lub karboksylowej, jest sterolem i jego nazwa ma końcówkę — ol. Ze względu na asymetrię cząsteczki steroidu moŜliwe jest istnienie wielu stereoizomerów KaŜdy z pierścieni sześciowęglowych rdzenia steroidowego moŜe istnieć w trójwymiarowej konformacji krzesełkowej lub lódeczkowej (ryc. 16-22).

Konformacja, Krzesełkowa"

Konformaoja .(Maczkowa" Ryc. 16-22. Konformacje stereo izomerów.

W steroidach naturalnych wszystkie pierścienie występują właściwie w formie krzesełkowej, która jest bardziej stabilną konformacją. Poszczególne pierścienie mogą znajdować się względem siebie w konformacji cis lub trans (ryc. 16-23).

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 183

Byc. 16-23. Siereochemta steroidów: (A) konfiguracja trans między wszystkimi sąsiadującymi pierścieniami; (B) konfiguracja cis między pierścieniami A i B.

W naturalnych steroidach sposób połączenia pierścieni A i B moŜe być cis lub trans, natomiast między B i C jest trans, a połączenie CjD jest trans, z wyjątkiem glikozydów nasercowych i jadów wydzielanych przez ropuchy. Wiązania utrzymujące podstawniki nad płaszczyzną pierścieni przedstawia się linią ciągłą (p1), natomiast wiązania łączące grupy znajdujące się pod płaszczyzną pierścieni linią przerywaną (a). W steroidzie "5a, pierścień A przyjmuje zawsze konformację trans względem pierścienia B, natomiast w steroidzie 5P — zawsze cis. Grupy metylowe, przyłączone do atomów węgla Ci0 i Cu, są niezmiennie w konfiguracji p. Cholesterol jest istotnym składnikiem wielu tkanek Cholesterol jest szeroko rozpowszechniony we wszystkich komórkach organizmu, a zwłaszcza w tkance nerwowej. Jest jednym z waŜniejszych składników błon plazmatycznych i lipoprotein surowicy krwi. Występuje zwykle w połączeniu z kwasami tłuszczowymi jako ester cholesterolu. Jest w tłuszczach zwierzęcych, lecz nie ma go w tłuszczach roślinnych. 3-Hydroksy-5,6-cholesten (ryc. 16-24) to nazwa systematyczna cholesterolu. Ergosterol jest prekursorem witaminy D Ergosterol występuje w roślinach i droŜdŜach i jest waŜnym prekursorem witaminy D (ryc. 16-25). Naświetlanie promieniami nadfioletowymi powoduje otwarcie pierścienia B (p. ryc. 54-6) w wyniku czego związek nabywa właściwości przeciwkrzywiczych.

Ryc. 16-24. Cholesterol.

HORyc. 16-25. Ergosterol

Koprosterol znajduje się w kale Koprosterol (koprostanol) powstaje w jelicie w wyniku bakteryjnej redukcji podwójnego wiązania Cs—C6 cholesterolu i jest wydalany w kale. Prekursorem poliprenoidów i cholesterolu jest ten sam związek Poliprenoidy, chociaŜ nie są steroidami, są im pokrewne (p. ryc. 28-3), poniewaŜ są syntetyzowane, podobnie jak cholesterol (ryc. 16-26),

184 / ROZDZIAŁ 16 CH3 I -CH=CCH=CH-

PEROKSYDACJA LIPIDÓW JEST ŹRÓDŁEM WOLNYCH RODNIKÓW IN VIVO

Ryc. 16-26. Jednostka izoprenowa.

z 5-wcglowej jednostki izoprenowej. NaleŜy do nich ubichinon (p.str. 149), składnik mitochondrialnego łańcucha oddechowego, oraz długołańcuchowy alkohol dolichol (ryc. 16-27), który

,OH

Ryc. 16-27. Dolichol — alkohol C95,

uczestniczy w syntezie glikoprotein, przenosząc reszty oligosacharydowe na reszty asparaginy łańcucha poiipeptyd owego (p. rozdz. 57). Grupa roślinnych izoprenoidów obejmuje kauczuk, kamforę, rozpuszczalne w tłuszczach witaminy A, D, E i K oraz P-karoten (prowitaminę A).

H

Peroksydacja (autooksydacja) lipidów naraŜonych na działanie tlenu jest przyczyną nie tylko psucia się Ŝywności (jełczenie), lecz takŜe uszkodzenia tkanek in vivo, które z kolei moŜe być przyczyną odczynów zapalnych, nowotworów, miaŜdŜycy, starzenia się itp. Szkodliwe działania są inicjowane przez wolne rodniki (ROO*, RO*, OH*) powstające podczas tworzenia nadtlenków kwasów tłuszczowych, zawierających wiązania podwójne oddzielone grupą metylenową, a więc takie jak te, które znajdują się w naturalnych wielo nienasyconych kwasach tłuszczowych (ryc. 16-28). Peroksydacja lipidów jest procesem lawinowym, zapewniającym ciągłą dostawę wolnych rodników, które inicjują następne reakcje peroksydacji. Pełny proces moŜe być zapisany następująco: 1. Inicjacja peroksydacji lipidów. Wytwarzanie R' z prekursora. ROOH + metal<«>+

X'+ RH-R* +XH Rozprzestrzenianie peroksydacji lipidów:

ROO'+ RH-ROOH+ R\ ttd.

H

+RH

H

Aldehyd malonowy

Endonad tlenek

WodoronadUenek ROOH

Ryc. 16-28. Peroksydacja tipidów. Reakcje inicjuje światło lub jony metali. Aldehyd matonowy powstaje tylko z kwasów tłuszczowych mających 3 lub więcej wiązań podwójnych. Miarą peroksydacji lipidów jest ilość powstającego aldehydu malonowego oraz etanu lub pentanu powstających odpowiednio z 2 końcowych węgli kwasów u3-tłuszcz owych lub z końcowych 5-węgli kwasów a>6-tłuszczowych.

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 185 3. Zakończenie: ROCT+ ROO°->ROOR+ O, ROCT+ R' .ROOR R*+ R'^RR

dzieiania i identyfikacji lipidów oparte na klasycznych procedurach chemicznych, takich jak krystalizacja, destylacja i ekstrakcja rozpuszczalnikiem. Szczególnie uŜyteczna do rozdziału róŜnych klas lipidów jest chromatografia cienkowarstwowa (TLC), a do rozdziału poszczególnych kwasów tłuszczowych — chromatografia gazowo-cieczowa (GLC; ryc. 16-29). Przed uŜyciem tych technik lipidy ekstrahuje się z tkanek nieodwodnionych układem rozpuszczalników, opartym zwykle na mieszaninie chloroformu z metanolem (2:1).

PoniewaŜ molekularnym prekursorem dla inicjacji procesu jest zazwyczaj wodoronadtlenek ROOH, peroksydacja lipidów jest rozgałęzionym procesem łańcuchowym z potencjalnymi skutkami niszczycielskimi. W celu kontroli i ograniczenia peroksydacji lipidów zarówno ludzie, jak i natura uŜywają związków przeciwutleniających. Propyiogalusan, butylowany hydroksyanizol (BHA) i butylowany hydroksytoluen (BHT) są przeciwutleniaczami uŜyDetektor wanymi jako dodatki (środki konserwujące) do Gaz Ŝywności. Naturalnie występującymi przeciwutleniaczami są witamina E (tokoferol), która jest rozpuszczalna w lipidach, oraz moczan i witamina C, które są rozpuszczalne w wodzie. pKaroten wykazuje właściwości przeciwutleniacza przy małym pOz. Przeciwutleniacze dzielą się na 2 klasy: 1) przeciwutleniacze zapobiegające, które zmniejszają szybkość inicjacji peroksydacji i 2) przeciwutleniacze przerywające proces lawinowy, które utrudniają rozprzestrzenianie peroksydacji. Przeciwutleniacze zapobiegające obejmują katalazę i inne peroksydazy, które reagują PróbKa z ROOH, oraz związki chelatujące jony metali, Rajestrator kreślący takie jak DTPA (dietylenotriaminopentaoctan) i EDTA (etylenodiaminotetraoctan). Przeciwutleniacze przerywające rozprzestrzenianie pe- Ryc. 16-29. Schemat chromatografu gazowo-roksydacji są często fenolami lub aminami cieczowego. Po prawej stronie ryciny przedstaaromatycznymi. In vivo głównymi przeciwut- wiono chromatogram rozdziału cHugołańcuchowych kwasów tłuszczowych (jako estrów metyloleniaczami przerywającymi rozprzestrzenianie wych). są: dysmutaza ponadtlenkowa (p, str. 146), która działa w fazie wodnej, wychwytując wolne Chromatografia gazowo-cieczowa polega na rodniki ponadtknkowe (Oi*), być moŜe moczan oraz witamina E, która działa w fazie fizycznym rozdziale ruchomej fazy gazowej przez adsorpcję na fazie stacjonarnej, zawierajątipidowej, wychwytując rodniki ROO*. Peroksydacja jest katalizowana in vivo rów- cej obojętne ciało stałe, takie jak Ŝel krzemionnieŜ przez związki hemowe i przez lipooksygena- kowy lub obojętne ziarna glinki ogniotrwałej zy znajdujące się w płytkach krwi i leukocytach, pokrytej nielotną cieczą (np. smarem lub olejem silikonowym). W praktyce szklaną lub metaloitp. wą kolumnę napełnia się nieczynnym ciałem stałym, a mieszaninę metylowych estrów kwasów tłuszczowych odparowuje się na jednym DO ROZDZIAŁU I IDENTYFIKACJI końcu kolumny, która na całej swej długości nia LIPIDÓW W MATERIALE BIOLOGICZNYM UśYWA SIĘ METOD temp. 170—225°C(ryc. 16-29). Stale przepływający strumień gazu obojętnego, np, argon lub CHROMATOGRAFICZNYCH hel, powoduje przesuwanie się lotnych estrów Obecnie metody chromatograficzne coraz wewnątrz kolumny. Podobnie jak w przypadku częściej wypierają z uŜycia starsze metody rozinnych rodzajów chromatografu, rozdział parujących estrów kwasów tłuszczowych zaleŜy od róŜnic powinowactwa składników mieszaniny

■——

186 / ROZDZIAŁ 16

gazowej do fazy stacjonarnej. Ga2y silniej przyciągane przez fazę stacjonarną wolniej przesuwają się w kolumnie i dlatego znajdą się na końcu kolumny później od gazów przyciąganych stosunkowo słabiej. Poszczególne estry kwasów tłuszczowych, wydostające się z kolumny, wykrywa się metodami fizycznymi lub chemicznymi i zapisuje automatycznie w postaci pików ukazujących się w róŜnym czasie w zaleŜności od siły, z jaką poszczególne estry kwasów tłuszczowych są zatrzymywane przez fazę stacjonarną (ryc. 16-29). Powierzchnia pod kaŜdym pikiem jest proporcjonalna do stęŜenia poszczególnego składnika mieszaniny. Identyfikację kaŜdego składnika przeprowadza się przez porównanie z wzorcowym chiomatogramem standardowej mieszaniny o znanym składzie. Na drodze strumienia gazu moŜna umieścić, oprócz detektora masy, równieŜ detektor mierzący radioaktywność. W ten sposób moŜna zmierzyć swoistą radioaktywność kaŜdego wydzielonego składnika. Zaletą chromatografii gazówo-cieczowej jest jej niezwykła czułość, która pozwala uŜywać bardzo małych ilości mieszaniny do rozdziału, a takŜe to, Ŝe kolumny chromatograficzne mogą być uŜywane wielokrotnie. Za pomocą tej techniki wykazano w tłuszczach naturalnych obecność wielu dotychczas niewykrytych róŜnych kwasów tłuszczowych. Chromatografię cienko warstwową (TLC)

przeprowadza się na płytkach szklanych pokrytych cienką warstwą adsorbentu, zwykle Ŝelu krzemionkowego. Po osuszeniu adsorbentu, płytki ogrzewa się w cieplarce w standardowej temperaturze przez standardowy czas. Po oziębieniu na „aktywowaną" płytkę nakrapia się mieszaninę lipidów rozpuszczonych we właściwym rozpuszczalniku. Po odparowaniu rozpuszczalnika brzeg płytki, najbliŜszy miejsca naniesienia próbki, zanurza się w odpowiedniej mieszaninie rozpuszczalników i pozostawia w zamkniętym naczyniu do czasu, aŜ czoło rozpuszczalnika znajdzie się blisko górnego brzegu płytki. Płytkę osusza się i miejsce rozdzielonych substancji ustala się przez „zwęglenie" (spryskując powierzchnię płytki kwasem siarkowym, a następnie ogrzewając) lub przez fiuorescencję (z dichlorofluoresceiną), albo po reakcji z parami jodu (ryc. 16-30).

Estry cholesterolu

Trlacylogllcerole

Czoło rozpuszczalnika

m

Kwasy HUSZCZOWB (wolne)

Cholesterol 1,3DlacyloQllcwole 1,2DlacyloBH08role

ii 5P

Monoacytogjlcerole Fosfo lipidy Miejsce naniesienia

Ryc. 16-30. Rozdział głównych klas lipidów przy uŜyciu chromatografii cienkowarstwowej. Właściwym układem rozpuszczalników dla powyŜszego rozdziału była mieszanina heksan : eter etylowy : kwas mrówkowy w stosunku objętościowym 80:20:2.

AMFIPATYCZNE LIPIDY SAMOORIENTUJĄ SIĘ NA GRANICY OLEJ : WODA Tworzą one błony, micele, liposomy i emulsje Lipidy są na ogół nierozpuszczalne w wodzie, gdyŜ przewaŜają w ich cząsteczkach grupy niepolarne (węglowodory). JednakŜe kwasy tłuszczowe, fosfolipidy, sfingolipidy, kwasy Ŝółciowe i, w mniejszym stopniu, cholesterol zawierają grupy polarne. Dlatego część cząsteczki jest hydrofobowa, czyli nierozpuszczalna w wodzie, a inna część jest hydrnfilowa, czyli rozpuszczalna w wodzie. Tego rodzaju cząsteczki określa się jako amtlpatyczne (ryc. 16-31). Ustawiają się one na granicy faz woda: olej w ten sposób, Ŝe ich grupy polarne znajdują się w fazie wodnej, a niepolarne w fazie olejowej. UwaŜa się, Ŝe

podstawową strukturą błon biologicznych jest podwójna warstwa takich polarnych lipidów (p. rozdz. 42). Lipidy polarne znajdujące się w środowisku wodnym w stęŜeniu krytycznym tworzą micele. Przyłączanie się soli kwasów Ŝółciowych do miceli i liposomń w i tworzenie miceli mieszanych z produktami trawienia tłuszczu

LIPIDY O ZNACZENiU FIZJOLOGICZNYM / 187 LIPID AMFIPATYCZNY A

Grupy polarne, czyli hydrofitowa Grupy nie polarna, czyli hydrofobowe

Faza wodna

Faza wodna Faza wodna

OOOOOO L1POSOM (JEDNOWARSTWOWY) .Olej*, czyli laza E

uouuoo Faza wodna PODWÓJNA WAHSTWA LIPIDOWA

EMULSJA OLEJU W WOOZIE D

Faza nie po I ar na

Fala wodna

Przedzi ał wodny

Podwójna warstwa llpldowa

LiPOSOM (WIELOWARSTWOWY)

Ryc. 16-31. Powstawanie błon lipidowych, miceli, emulsji i liposomów z lipidów amftpatycznych, np. fosfolipidów. ____________________________________

ułatwia wchłanianie lipidów z jelita. Liposomy moŜna otrzymać działając ultradźwiękami na amfipatyczne lipidy w środowisku wodnym. Liposomy są utworzone z podwójnej warstwy lipidowej, otaczającej część środowiska wodnego. Potencjalnie, zwłaszcza gdy połączy się je ze swoistymi tkankowo przeciwciałami, mogą być one uŜyteczne klinicznie jako przenośniki leków w krwiobiegu, trafiając do odpowiednich narządów. Emulsje są cząstkami duŜo większymi, powstającymi zwykle z lipidów niepolarnych znajdujących się w środowisku wodnym. Są one stabilizowane przez środki emulgujące, takie jak lipidy polarne (np. lecytyna), które tworzą warstwę powierzchniową oddzielającą główną masę fazy niepolarnej od fazy wodnej (ryc. 16-31).

PIŚMIENNICTWO Christie WW: LipidAnalysis. 2nd ed. Pergamon Press, 1982. Cotgreave 1A et al: Host biochemical defence mechanisms against prooxidants. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1988;28:189. Frankel EN: Chemistry of free radical and singlet oxidation of lipids. Próg Lipid Res 1985;23:197. Gunscone FD, Harwood JL, Padley FB: The Lipid Handbook. Chapraan & Hali, 1986. Gurr AI, James AT: Lipid Biochemistry: An Introduclion. 3rd ed. Wiiey, 1980. Hawthorne JN, Ansell GB (editors): Phospholipids, Elsevier, 1982. Johnson AR, Davenport JB: Biochemistry and Methodołogy of Lipids. Wiley, 1971. Vance DE, Vance JE {editors}: Biochemistry of Lipids and Membranes. Benjamin/Cummings, 1985.

Zarys przemian pośrednich

17

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Losy składników diety po strawieniu i absorpcji składają się na przemiany pośrednie. Stanowią więc one szeroką dziedzinę, która usiłuje nie tylko opisać szlaki metaboliczne indywidualnych cząsteczek, lecz takŜe próbuje zrozumieć współzaleŜności między nimi oraz mechanizmy, które regulują przepływ metabolitów przez te szlaki. Szlaki metaboliczne dzieli się na 3 kategorie (ryc. 17-1): 1. Szlaki anaboliczne prowadzące syntezy związków tworzących strukturę ciała i warsztat metaboliczny. Takim szlakiem

jest synteza białek. Energia swobodna, napędzająca te procesy, pochodzi z drugiej kategorii szlaków. 2. Szlaki kataboliczne dotyczą procesów oksydacyjnych, które uwalniają energię swobodną zwykle w postaci fosforanu bogatoenergetycznego lub równowaŜników redukujących, np. łańcuch oddechowy i fosforylacja oksydacyjna. 3. Szlaki amfiboliczne mają więcej niŜ jedną funkcję i biegną na „skrzyŜowaniu dróg" metabolicznych, działając jako łączniki między ciągami anabolicznymi i katabo licznym, np. cykl kwasu cytrynowego.

Białka, węglowodany, lipidy, kwasy nukleinowe Itp.

Cząsteczki Trawienie pokarmu

Cząsteczki prostsze

Wchłanianie

Szlaki amfl bo Heine

Ryc. 17-1.3 główne kategorie szlaków meta bo licznych. Szlaki kataboliczne uwalniają energię swobodną w formie równowaŜników redukujących (2H) lub fosforanu bogBioenergetycznego (~ P). ta warunkuje przebieg szlaków a na bo licznych. Szlaki amfiboliczne jako łączniki między szlakami 2 pozostałych kategorii.

Inne procesy endoerglczne

Energia działają

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 189

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

wynikającej z nieprawidłowego metabolizmu (choroby metaboliczne), jest cukrzyca.

Znajomość metabolizmu zdrowego zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do pełnego zrozumienia wielu stanów chorobowych. Prawidłowa przemiana obejmuje zmiany metabolizmu i jego adaptację w okresach głodzenia, wysiłku, ciąŜy i laktacji. Zaburzenia metabolizmu mogą być wynikiem np. niedoborów Ŝywieniowych, braku enzymu lub nieprawidłowego wydzielania hormonu. WaŜnym przykładem choroby,

PODSTAWOWE SZLAKI METABOLICZNE PRZETWARZAJĄ GŁÓWNE PRODUKTY TRAWIENIA Podstawowy typ metabolizmu w tkankach jest warunkowany rodzajem diety. Ssaki, takie jak człowiek, muszą przetwarzać wchłaniane w przewodzie pokarmowym produkty trawie-

Pokarmy

Glikogen 3CO,

Glukoza

Gl u kozotosfora Cykl pentnzof osf oran owy

s

-------- -

(3

^ -------»- Rybozofosforan

' Acytoglteerol Trlozofosforany Mleczan Kwasy tłuszczowe Cholesterol

Plrogronian.

Ryc. 17-2. Ogólny schemat metabolizmu węglowodanów i jego główne produkty końcowe.

190 / ROZDZIAŁ 17 Steroidy

Trlacyloglicerol (tłuszcz)

Cholesterol Cti oieslerologeneza Ketogeneza Pokarmy

Związki ketonowe

Ryc. 17-3. Ogólny schemat metabolizmu kwasów tłuszczowych i jego główne produkty końcowe. Związki ketonowe to acetooctan, 3-hydroksymaślan aceton

Białka pokarmów

Białka tkankowe

I

Aminokwasy

Nisbialkowe pochodne azotowe

TFWNSAMINACJA

2CO,

Ryc. 17-4. Ogólny schemat przemiany aminokwasów i jej główne produkty końcowe.

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 191

nia pokarmów — węglowodanów, lipidów i białek. Głównie są to (odpowiednio): glukoza, kwasy tłuszczowe z glicerolem oraz aminokwasy. U przeŜuwaczy (i w mniejszym stopniu u innych trawoŜernych) błonnik diety ulega trawieniu przez symbiotyczne mikroorganizmy do niŜszych kwasów tłuszczowych (octowego, propionowego, masłowego), a tkanki tych zwierząt są przygotowane metabolicznie do zuŜycia niŜszych kwasów tłuszczowych jako zasadniczych substratów. Wszystkie produkty trawienia są przetwarzane we właściwych szlakach metabolicznych do wspólnego produktu — acetylo-CoA, który ulega następnie całkowitemu utlenieniu w cyklu kwasu cytrynowego (p. ryc. 14-1 oraz 17-2, 17-3 i 17-4).

Metabolizm lipidów dotyczy głównie kwasów tłuszczowych i cholesterolu (p,ryc.17-3) Źródłem dlugołańcuchowych kwasów tłuszczowych jest albo synteza de novo z acetylo-CoA pochodzącego z przemiany węglowodanów, albo lipidy z pokarmów. W tkankach kwasy tłuszczowe mogą zostać utlenione do acetylo-CoA (fi-oksydacja) lub ulec estryfikacji do acylogliceroli, które w postaci triacylogliceroli (tłuszcz) stanowią główną rezerwę energetyczną organizmu, Acetylo-CoA, wytwarzany w procesie jł-oksydacji, ma kilka waŜnych przeznaczeń: 1. Tak jak w przypadku acetylo-CoA po chodzącego z przemiany węglowodanów, ulega całkowitemu utlenieniu do CO2 i H2O w cyklu

Metabolizm węglowodanów dotyczy głównie glukozy (p. ryc. 17-2) Glukoza jest metabolizowana we wszystkich komórkach ssaków w procesie glikolizy do pirogronianu i mleczanu. Aby wejść do tego szlaku glukoza musi ulec fosforylacji. Glikoliza moŜe przebiegać w nieobecności tlenu (anaerobowo), ale końcowym produktem jest wtedy tylko mleczan. Tkanki, które mogą zuŜywać tlen (aerobowe), są zdolne do metabolizowania pirogronianu do acetylo-CoA, który z kolei moŜe 'wejść do cyklu kwasu cytrynowego, ulegając całkowitemu utlenieniu do CO3 i H2O z uwolnieniem znacznej ilości energii swobodnej, wykorzystanej do syntezy ATP w procesie zwanym fosforylacją oksydacyjną (p. ryc. 18-2). Glukoza jest więc główną cząsteczką energetyczną wielu tkanek. Uczestniczy ona (i pewne jej metabolity) równieŜ w innych procesach, a mianowicie: i. W przemianie do jej zapasowego polimeru — glikogenu, zwłaszcza w mięśniach szkieletowych i w wątrobie. 2. W cyklu pentozofosforano wy III, który bierze początek od metabolitu pośredniego glikolizy. Cykl jest dostawcą równowaŜników redukujących (2H) do biosyntezy np. kwasów tłuszczowych — oraz jest źródłem rybozy koniecznej w procesach syntez nukleotydów i kwasów nukleinowych. 3. Fosfotriozy uczestniczą w tworzeniu glicerolowej części acylogliceroli (tłuszczu). 4. Pirogronian i metabolity pośrednie cyklu kwasu cytrynowego dostarczają szkieletów węglowych do syntezy aminokwasów, a acetylo-CoA jest jednostką budującą długołaricuchowe kwasy tłuszczowe i cholesterol będący z kolei prekursorem wszystkich steroidów syntetyzowanych w organizmie.

kwasu cytrynowego. Kwasy tłuszczowe są bar dzo wydajnym tkankowym źródłem energetycz nym, dostarczając znacznych ilości energii zaró wno w procesie p-oksydacji, jak i w cyklu kwasu cytrynowego. 2. Są one źródłem atomów węgla dla chole sterolu i innych steroidów. 3. W wątrobie jest z nich wytwarzany acetooctan, macierzysty związek ketonowy*. Zwią zki ketonowe rozpuszczalne w wodzie są alter natywnym paliwem tkankowym, które w pew nych warunkach (np. w głodzeniu) staje się waŜnym źródłem energii. Metabolizm większości aminokwasów wymaga transaminacji (p. ryc. 17-4) Aminokwasy są konieczne do biosyntezy białka. Niektóre z nich muszą być obowiązkowo doprowadzone z poŜywieniem (aminokwasy niezbędne lub egzogenne), poniewaŜ tkanki są niezdolne do ich syntezy. Pozostałe, czyli aminokwasy endogenne, są równieŜ dostarczane z pokarmem, ale mogą być takŜe wytwarzane w organizmie z węglowych związków pośrednich w procesie transaminacji, wykorzystującym azot aminowy z występujących w nadmiarze innych aminokwasów. Po deaminacji aminokwasów nadmiar azotu aminowego jest usuwany jako

* Jako związki ketonowe naleŜy rozumieć nie tylko związki zawierające grupę ketonową (acetooctan, aceton), lecz takŜe P-hydroksymaślan. W tyrn sensie określenie „związki ketonowe" pokrywa się z treścią określenia angielskiego „ketonc bodies" — ciała ketonowe (przyp, wyd.).

192 / ROZDZIAŁ 17

mocznik. Szkielety węglowe powstające w wyniku transaminacji są: 1) utleniane do COi w cyklu kwasu cytrynowego, 2) wykorzystane do syntezy glukozy (glukoneogeneza) lub 3) ulegają przemianie w związki ketonowe. Poza niezbędnym udziałem w syntezie białka, aminokwasy są równieŜ prekursorami wielu innych waŜnych związków, np. puryn, pirymidyn i hormonów, takich jak adrenalina lub tyroksyna. Szlaki metaboliczne mogą być badane na róŜnych poziomach organizacji Dotąd patrzyliśmy na metabolizm zachodzący w całym organizmie. Umiejscowienie szlaków metabolicznych i ich integrację ustala się za pomocą badań na niŜszych poziomach organizacji, a mianowicie: 1. Na poziomie tkanki i narządu — określa się rodzaj substratów wchodzących i metabolitów opuszczających tkanki lub narządy i podaje ogólny opis ich przemian. 2. Na poziomie subkomórkowym — kaŜda struktura subkomórkowa (np. mitochondrium) lub kompartment komórki (np. cytozol) pełni swoiste funkcje biochemiczne.

które tworzą część subkomórkowego zestawu szlaków metabolicznych. KrąŜenie krwi integruje metabolizm na poziomie tkanki i narządu Aminokwasy powstające w procesie trawienia białek pokarmowych oraz glukoza powstająca w wyniku trawienia węglowodanów są wchłaniane z jelita do krwi Ŝyły wrotnej wątroby. To gwarantuje, Ŝe zarówno te metabolity jak i inne rozpuszczalne w wodzie produkty trawienia są początkowo kierowane do wątroby (ryc. 17-5). Podstawową funkcją metaboliczną wątroby jest regulowanie stęŜenia większości metabolitów we krwi, zwłaszcza glukozy i aminokwasów. W przypadku glukozy odbywa się to przez wychwytywanie nadmiaru glukozy i przekształcanie jej w glikogen (gUkogenogeneza) lub w tłuszcz (lipogencza). Pomiędzy posiłkami, w celu uzupełnienia stęŜenia glukozy we krwi, wątroba uwalniają ze zmagazynowanego glikogenu (glikogenoliza) lub, wraz z nerką, przekształca metabolity niecukrowe, takie jak mleczan, glicerol i aminokwasy, w glukozę (glukoneogeneza). Utrzymanie właściwego stęŜenia

anina itn. '#. ■ \'.''. ^

fosforan o^yk.-j ^ S l lSllkogen koW///

5

S^

JELITO CIENKIE

Ryc. 17-S. Transport i los głównych substratów i metabolitów węglowodanowych i amtnofcwasowych. Uwaga: w mięśniu wolna glukoza występuje w niewielkich stęŜeniach, poniewaŜ po wniknięciu do komórki ulega natychmiast fosforylacji. ____ ___

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 193

glukozy we krwi jest konieczne ze względu na pewne tkanki (np. mózg lub erytrocyty), dla których jest ona obligatoryjnym źródłem energii. Do zadań wątroby naleŜy równieŜ syntetyzowanie głównych białek osocza krwi (np. albuminy) oraz deaminatja aminokwasów będących w nadmiarze, i związane z tym tworzenie mocznika. Ten ostatni jest transportowany z krwią do nerek i wydalany. Mięśnie szkieletowe uŜywają glukozy jako paliwa, wytwarzając z niej mleczan i CO2. Magazynują glikogen z przeznaczeniem na źródło energii do skurczu mięśnia oraz syntetyzują białka mięśniowe z aminokwasów osocza. Mięśnie stanowią ok. 50% masy ciała, przeto reprezentują znaczny zapas białek, który moŜe być wykorzystany do zaopatrzenia osocza w aminokwasy, zwłaszcza przy niedoborach pokarmowych. Z lipidów (ryc. 17-6) po strawieniu powstają monoacyloglicerole i kwasy tłuszczowe. W komórkach jelitowych zachodzi resynteza lipidów, które po połączeniu z białkiem są wydzielane w formie lipoprotein, znanych jako ehylomikrony, początkowo do układu chłonnego, a na-

stępnie do krwiobiegu. Wszystkie rozpuszczalne w lipidach hydrofobowe produkty trawienia (np. cholesterol), wchodzą w skład lipoprotein, co ułatwia ich transportowanie miedzy tkankami w środowisku wodnym — osoczu. Triacyloglicerol chylomikronów, w odróŜnieniu od glukozy i aminokwasów, nie jest wychwytywany przez wątrobę. Jest on metabolizowany przez tkanki pozawątrobowe przy udziale Kpazy lipoproteinowej, która hydrolizuje triacyloglicerol, uwalniając kwasy tłuszczowe, które są następnie wbudowywane do lipidów tkankowych lub utleniane jako źródło energii. Innym waŜnym źródłem długołańcuchowych kwasów tłuszczowych jest synteza (lipogeneza) z węglowodanów, głównie w tkance tłuszczowej i w wątrobie. Triacyloglicerol tkanki tłuszczowej stanowi zasadniczą rezerwę energetyczną w organizmie. W następstwie jego hydrolizy (lipolizy) kwasy tłuszczowe są uwalniane do krwiobiegu jako woine kwasy tłuszczowe. Są one wychwytywane przez większość tkanek (ale nie przez mózg i erytrocyty) i estryfikowane do acylogliceroli lub utleniane, jako główne źródło energetyczne do CO2 i H^O. W wątrobie zachodzą 2 szlaki JELITO CIENKIE

Ryc. 17-8. Transport i losy głównych substratów i metabolitów liptdowych: WKT — wolne kwasy

Glukoza

Kwasy ^tłuszczowe

MG — monoacyloglicerol, — lipoproteiny o bardzo malej gęstości. 13 — Biochemia

TG

tłuszczowe, LPL — lipaza lipoproteinowa, — triacyloglicerol, VLDL ____________

194 / ROZDZIAŁ 17

o dodatkowym znaczeniu: 1. NadwyŜka triacyloglicerolu, będąca zarówno wynikiem lipogenezy, jak i podaŜy wolnych kwasów tłuszczowych, jest wydzielana do krwiobiegu w postaci

Na poziomie subkomórkowym: gltkoliza przebiega w cytozolu, a cykl kwasu cytrynowego w mitochondriach Główne funkcje biochemiczne składników subkomórkowych i organelli komórki przedstawiono w tab. 2-4. JednakŜe, większość komórek jest podporządkowana wyspecjalizowanym funkcjom róŜnych tkanek i zmierza do uwydatnienia pewnych szlaków metabolicznych i ograniczenia innych. Rycina 17-7 ilustruje zasadnicze szlaki metaboliczne, ze specjalnym uwzględnieniem umiejscowienia we-

Kpoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL: ang.

very Iow density lipoprotein). Ten triacyloglicerol ulega przemianom podobnym do tych z chylomikronów. 2. Częściowe utlenianie wolnych kwasów thiszczowych pozwala wytwarzać związki ketonowe (ketogeneza). Związki ketonowe są transportowane do tkanek pozawąlrobowych, gdzie są wykorzystywane jako inne waŜne źródło energii.

CYTOZOL Gtikogen , Białko AA

Cykl per loŜof ostoranowy

/

J^ybosom

/ .:-.Siateczka.\śród p I azm a tyczn a /

Glicerofosforan \ G ii cero I

Triacytogliceral

Kwasy tłuszczowa

Ryc. 17-7. Wewnątrzkomórkowe umiejscowienie i integracja gjównych szlaków metabolicznych w Fosfoenolopirogronian

Meczan

\

T Pirogronian

wątrobowej komórce miąŜszowej. AA -> przemiana jednego więcej aminokwasów

— lub

Szczawiooctan

Fumaran

Sukcynylo-CoA

AA

Acetyio-CoA

Cytrynian

a-Ketoglutaran

AA

M1TOCHONDRIUM

egzogennych, AA *+ — przemiana jednego lub więcej aminokwasów endogennych.

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 19S

wnątrzkomórkowego oraz ich integrację w wątrobowej komórce miąŜszowej. Wyraźnie widoczna jest centralna rola mitochondrium. Jest on siedliskiem krzyŜujących się torów metabolicznych węglowodanów, lipidów i aminokwasów. Mieszczą się w nim m.in. enzymy cyklu kwasu cytrynowego, łańcucha oddechowego z syntazą ATP, P-oksydacji kwasów tłuszczowych i ketogenezy. Dodatkowo jest on punktem zbiorczym dla powstających podczas transaminacji szkieletów węglowych aminokwasów przekazywanych następnie do procesu syntezy aminokwasów endogennych. W cytozolu zachodzą: glikohza, cykl pentozo fosforan owy i synteza kwasów tłuszczowych. NaleŜy podkreślić, Ŝe w glukoneogenezie nawet substancje, które są wytwarzane w cytozolu, takie jak mleczan i pirogroniatt, muszą wejść do mitochondrium, aby ulec przemianie w szcza wio octan, nim zostaną przekształcone w glukozę. Błony siateczki śródplazmatycznej zawierają układ enzymatyczny katalizujący biosyntezę acylogliceroli. Rybosomy z kolei są miejscem syntezy białka. NaleŜy zdać sobie sprawę, Ŝe transport metabolitów o róŜnej wielkości, ładunku i rozpuszczalności przez błony oddzielające struktury subkemórkowe wymaga złoŜonych mechanizmów. Niektóre z nich przedstawiono przy opisie błony mitochondrialnej (p. rozdz. 14), a pozostałe w następnych rozdziałach. PRZEPŁYW METABOLITÓW W SZLAKACH METABOLICZNYCH MUSI BYĆ REGULOWANY W SPOSÓB ZHARMONIZOWANY Regulacja całkowitego przepływu metabolitów przez szlak metaboliczny sprowadza się często do kontroli tylko jednej lub prawdopodobnie dwóch kluczowych reakcji ciągu, katalizowanych przez „enzymy regulatorowe". NajwaŜniejsze w kontroli całkowitej szybkości szlaku metabolicznego są czynniki fizykochemiczne kontrolujące szybkość reakcji enzymatycznej, np. stęŜenie substratu (p. rozdz. 10). Natomiast temperatura i pH, czynniki, które mogą wpływać na aktywność enzymatyczną, mają niewielkie znaczenie regulacyjne u kręgowców stałocieplnych ze względu na stałą wartość tych parametrów. (Jednak naleŜy zwrócić uwagę na zmiany pH w przewodzie pokarmowym i ich wpływ na trawienie [p. rozdz. 56]).

Reakcje, które zachodzą w stanie nierównowagi nadają kierunek szlakom metabolicznym i są potencjalnymi punktami ich kontroli W reakcji zachodzącej w stanie równowagi szybkości reakcji w obydwu kierunkach są jednakowe i dlatego nie obserwuje się Ŝadnego przepływu w jakimkolwiek kierunku. Wiele reakcji w szlakach metabolicznych jest „reakcjami równowagi": A «—► B «—* C <—. D

In vivo, w warunkach stanu stacjonarnego (ang. steady state), prawdopodobnie przepływ netto będzie zachodził ze strony lewej na prawą w przypadku ciągłego dostarczania A i ciągłego usuwania D. Taki szlak mógłby funkcjonować, ale kontrola przepływu przez regulację aktywności enzymu nie byłaby tu celowa, gdyŜ zwiększenie aktywności słuŜyłoby tylko do przyspieszenia osiągnięcia stanu równowagi. Zazwyczaj w szlaku metabolicznym jedna albo więcej reakcji zawsze jest w stanie nierównowagi. W reakcjach tych stęŜenia reagentów są dalekie od stanu równowagi, W wyniku dąŜenia do osiągnięcia stanu równowagi powstają duŜe straty energii swobodnej, wydzielanej w postaci ciepła, która nie moŜe być ponownie wykorzystana. Powoduje to, Ŝe tego typu reakcja jest zasadniczo nieodwracalna, np.: Ciepło Reakcja nierównowagi

Taki szlak ma kierunek i zachodzi w nim przepływ metabolitów, ale przy braku kontroli szlak wyczerpuje się sam. Enzymy katalizujące reakcje w warunkach nierównowagi występują zwykle w mniejszych stęŜeniach i podlegają innym mechanizmom kontroli. Przypomina to otwieranie i zamykanie jednokierunkowego" wentyla, stwarzając moŜliwość kontroli przepływu netto. Reakcją powodującą przepływ jest ta pierwsza reakcja w ciągu, która jest wysycona substratem MoŜna ją zidentyfikować jako reakcję nierównowagi, w której K^ enzymu jest znacznie mniejsza od fizjologicznego stęŜenia substratu. Przykładem takiej reakcji powodującej przepływ jest pierwsza reakcja w glikolizie katalizowana przez heksokinaze (p. ryc. 19-2).

196 / ROZDZIAŁ 17

MECHANIZMY ALLOSTERYCZNY I HORMONALNY MAJĄ DUśE ZNACZENIE W METABOLICZNEJ KONTROLI REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Na rycinie 17-8 przedstawiono hipotetyczny szlak metaboliczny A, B, C, D, w którym reakcje A <-> B i C «-» D zachodzą w stanie równowagi, a B -* C jest reakcją „nierównowagi". Przepływ w tym szlaku moŜe być regulowany przez dostępność substratu A, a zaleŜy od dostarczania go z krwi, co z kolei zaleŜy od spoŜycia odpowiedniego pokarmu lub od pewnych kluczowych reakcji, które wytwarzają i uwalniają substraty do krwi. Przykładem tego są 2 reakcje powodujące przepływ — jedna katalizowana przez fosforylazę w wątrobie (p. ryc. 20-1), która dostarcza giukozę do krwi, oraz druga, katalizowana przez lipazę wraŜliwą na hormony (p. ryc. 27-8), która dostarcza

wolne kwasy tłuszczowe. To zaleŜy równieŜ od zdolności substratu A do przenikania przez błonę komórkową. Przepływ moŜe być równieŜ warunkowany przez sprawność usuwania końcowego produktu D i dostępność kosubstratu lub kofaktorów oznaczonych na rycinie jako Xi Y. Enzymy katalizujące reakcje nierównowagi są często białkami allosterycznymi podiegającymi kontroli przez efektory ailosteryczne szybko działające przez sprzęŜenie zwrotne (ang. feed-back) albo przez sprzęŜenie ku przodowi (ang. feed-forward) (p. rozdz. 10). Często końcowy produkt szlaku biosyntezy hamuje aktywność enzymu katalizującego pierwszą reakcję tego szlaku, np. dlugołańcuchowe kwasy tłuszczowe hamują karboksylazę acetylo-CoA. Inne mechanizmy kontroli zaleŜą od działania hormonów reagujących na potrzeby całego organizmu. Są znane róŜne mechanizmy działania hormonów (p. rozdz. 44). Jednym z nich jest kowalenNieaktywny enzym,

+

Ca* /kalmodulinaBtona komórkowa

©

0 Aktywny

[Enzym,]

(Y) •cAMP

Inhibicja ailosteryezna przez ujemne

Aktywacja ailosteryezna sprzęŜenie zwrotne przez dodatnie sprzęŜenie ku przodowi Ryb osom a I na biosynteza nowego białka enzymatycznego lub ©

Jądrowa biosynteza

Indukcja mHNA Represja

Ryc. 17-8. Mechanizmy kontroli reakcji enzymatycznych. Liczby w kółkach wskazują moŜliwe miejsca działania hormonów. CD—zmiany przepuszczalności błony, © — przemiana postaci nieaktywnej w postać aktywną enzymu, ® — zmiana szybkości translacji mRNA na poziomie rybosomu, © — indukcja biosyntezy mRNA. © — represja biosyntezy mRNA. ____________________________________

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 197 cyjna modyfikacja enzymu przez fosforylację lub defosforylację jego cząsteczki. Jest ona szybka

i często zachodzi za pośrednictwem drugiego posłańca — cAMP, który z kolei powoduje przekształcenie enzymu nieaktywnego w enzym aktywny. To przekształcenie jest przeprowadzane albo przez kinazę białek cAMP-zaleŜną, która fosforyzuje enzym, lub przez swoistą fosfatazę, która defosforyluje enzym. Aktywną formą enzymu moŜe być albo jego cząsteczka ufosforylowana, jak w enzymach szlaku degradacji (np. fosforylaza a), albo cząsteczka defosforylowana, jak w enzymach procesów syntez (np. glikogenowa syntaza a). Niektóre enzymy regulatorowe mogą być fosforylowane bez pośrednictwa cAMP i zaleŜnej od cAMP kinazy białek. Te enzymy reagują na inne sygnały metaboliczne, takie jak stosunek [ATP]/[ADP] (np. dehydrogenaza pirogronianowa; ryc. 19-6) lub kinaza białek kontrolowana przez Ca2+/kalmodulinę (np. kinaza fosforylazy; p. ryc. 20-6). Synteza enzymów kontrolujących szybkość szlaku moŜe być regulowana hormonalnie. PoniewaŜ dotyczy to syntezy nowego białka, nie

jest to zmiana szybka, Jęcz jest częstą reakcją na zmianę odŜywiania. Hormony mogą działać jako induktory lub represory syntezy mRNA w jądrze komórkowym lub jako stymulatory translacji w procesie syntezy białka na poziomie rybosomów (p. rozdz. 41 i 44). Znamienną cechą, która ułatwia kontrolę metabolizmu, jest to, Ŝe szlak degradacji substratu nie jest prostym odwróceniem syntezy. Zwykie w grę wchodzą 2 całkowicie oddzielne ciągi, z których kaŜdy podlega oddzielnej regulacji, np. synteza i rozpad glikogenu (ryc. 20-1).

PIŚMIENNICTWO Cohen P: Control ofEnzyme Actinty, 2nd ed. Chapman & Hal), 1983. Hue L, Van de Werve G (editors): Short-Term Regulation of Liver Metabolism. Elsevier/North Holland, 1981. Newsholme EA, Crabtree B: Flus-generating and regulatory steps in metabolic control. Trends Bio-

hm

Newsholme EA, Start C: Regulation in Metabolism, WiJey, 1973.

18

Cykl kwasu cytrynowego. Katabolizm acetylo-CoA Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Cykl kwasu cytrynowego (cykl Krebsa, cykl kwasów trikarboksylowych) jest ciągiem reakcji zachodzących w mitochondriach, w wyniku których reszty acetylowe ulegają katabolizmowi z uwolnieniem równowaŜników wodoro wych. Utlenieniu tych ostatnich towarzyszy uwolnienie przewaŜającej części energii swobo dnej zawartej w spalanych substratach. Reszty acetylowe występują w formie acetylo-CoA (CH3-CO-S-CoA, aktywny octan), estru koen zymu A. Jednym ze składników CoA jest wita mina ... kwas pantotenowy.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Zasadnicza rola cyklu kwasu cytrynowego polega na działaniu jako wspólny szlak końcowy utleniania węglowodanów, lipidów i białek. Wynika to z faktu, Ŝe glukoza, kwasy tłuszczowe oraz niektóre aminokwasy są tnetabolizowane .do acetylo-CoA lub związków po.Średnich cyklu. Cykl odgrywa równieŜ istotną rolę w jlukoneogenezie, tran sam i nacji, deaminacji T lipogenezie. ChociaŜ niektóre z tych procesów zachodzą w wielu tkankach, to jedynym narządem, w którym wszystkie te procesy zachodzą w znaczącym stopniu, jest wątroba. StącfteŜ uwidaczniają się głębokie następstwa wówczas, gdy np. znaczna liczba komórek wątrobowych jest uszkodzonych lub zastąpionych tkanką łączną, jak ma to miejsce w ostrym

kowanych nieprawidłowości enzymów cyklu; tego typu nieprawidłowości są przypuszczalnie nie do pogodzenia z prawidłowym rozwojem organizmu. CYKL KWASU CYTRYNOWEGO DOSTARCZA SUBSTRATU DLA ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO Istotą cyklu jest połączenie czas teczki *acetylo-CoĄ z 4-węglowym dikarboksylowym kwasem szczawiooctowym; czego wynikiem jest powstanie 6-węglowego kwasu trikarboksy(owe-

go — cytrynianu. Następuje po tym ciąg reakcji, w czasie których odłączają się 2 cząsteczki CO2 i odtwarza się szczawiooctan (ryc. 18-1). Szczawiooctan spełnia tu właściwie funkcję katalitycz-

ną, poniewaŜ tylko niewielkie jego ilości są konieczne do ułatwienia przemiany znacznej liczby jednostek acetylowych w CO2. AoatykJ-CoA Co-A

Szczawiooctan

Cytrynian (CJ

zapaleniu lub marskości wątroby. Pośrednim

dowodem, świadczącym o Ŝyciowym znaczeniu cyklu kwasu cytrynowego, jest fakt, Ŝe u ludzi odkryto bardzo niewiele genetycznie uwarun-

Ryc. 18-1. Cykl kwasu cytrynowego. Katalityczna rola szczawiooctanu.

CYKL KWASU CYTRYNOWEGO / 199

Cykl kwasu cytrynowego jest integralni} częścią procesu, w wyniku którego przewaŜająca cześć energii swobodnej, uwalnianej podczas utleniania węglowodanów, lipidów i aminokwasów, staje się dostępna. W wyniku działania w cyklu swoistych dehydrogenaz podczas utleniania acetylo-CoA powstają równowaŜniki re-

Bursztynlan

dukujące w postaci wodpru lub elektron ów^Ta . równowaŜniki redukujące wchodzą patem do łańcucha oddechowego, gdzie w procesie fpsforylacji oksydacyjnej są wytwarzane duŜe ilości ATP
2H

NAD

Sukcynylo-CoA lCA

Fosforylacja ' oksydacyjna

Łańcuch i ---- ? txl
Białka

Lipidy

Flawoproteina Cytoctirom Fosforan bogat o energetyczny Ryc. 18-2. Cykl kwasu cytrynowego: główny szlak katabolizmu acetylo-CoA w organizmach aerobowych. Acetylg-CoA, produkt katabolizmu węglowodanów, białek i lipidów, wchodzi do cyklu.wraz z H2O, ulegając utlenieniu do ĆOZ z jednoczesnym uwolnieniem równowaŜników redukujących (2H). Późniejsze utlenienie 2H w łańcuchu oddechowym jest sprzęŜone z fosforylacją AD P do ATP. KaŜdy obrót cyklu generuje 11 ~ ® pnez fosfory I a cjf oksydacyjną oraz 1.— ® przez fosforylację substratową (konwer sję sukcynylo-CoA do bursztynianu)J ____________________________________________________________________________________________

200 / ROZDZIAŁ 18

e

Stąd teŜ brak (anoksja) lub częściowy niedobór (hipoksja) O2 jest przyczyną całkowitej lub częściowej inhibicji cyklu. Enzymy cyklu kwasu cytrynowego znajdują sic~w macierzy mitochondrialnej albo w formie wolnej, albo przyłączone do wewnętrznej powierzchni wewnętrznej błony mitochondrialnej, co ułatwia przenoszenie równowaŜników redukujących na.odpowiednie enzymy łańcucha oddechowego, umiejscowionego równieŜ w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. REAKCJE CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO UWALNIAJĄ RÓWNOWAśNIKI REDUKUJĄCE I CO a (p. ryc. 18-3) Enzym kondensujący — syntaza cy trynianowa — katalizuje inicjującą cykl kondensację acelylo-CoA ze szczaswfloctąnem* i powstanie cytrynianu przez utworzenie" wiązania wę-gielwęgiel między atomem węgla grupy metylowej acety]o-CoA a atomem węgla grupy karbonylowej szczawiooctanu. Po reakcji kondensacji, w której powstaje cytrylo-CoA, następuje jiyjlroliza wiązania tioestrowego CoA połączona ze znaczną utratą energii swobodnej w postaci ciepła, co zapewnia przebieg reakcji do końca. Acetylo-CoA+Szczawiooctan+H.,0 -> -> Cytrynian+ Co-A

Reakcja jest wraŜliwa na fluorooctan, który w formie fluoroacetylo-CoA kondensuje ze szczawiooctanem, tworząc fluorocytryman. Ten ostatni hamuje akonitazę, powodując akumulację cytrynianu. Wyniki doświadczeń z uŜyciem związków pośrednich znakowanych węglem lłC wskazują, Ŝe akonitaza reaguje z cytrynianem w sposób asymetryczny. Enzym zawsze działa na tę część cząsteczki cytrynianu, która pochodzi ze szczawiooctanu. Fakt ten był zaskakujący, poniewaŜ kwas cytrynowy wydawał się być związkiem symetrycznym. Okazało się (gdy cząsteczkę rozpatruje się w 3 wymiarach), Ŝe 2 grupy — CH2COOH nie są przestrzennie identyczne w odniesieniu do grup —OH i —COOH. Następstwa asymetrycznego działania akonitazy moŜna ocenić, śledząc losy znakowanego acetylo-CoA w cyklu kwasu cytrynowego przedstawionego na ryc. 18-3. MoŜJiwe, Ŝe CŁs-akonitan nie jest koniecznym związkiem pośrednim miedzy cytrynianem a izocytrynianem, lecz w rzeczywistości stanowi boczne odgałęzienie głównego szlaku. Izocytrynian przy udziale dehydrogenazy izocytrynianowej ulega odwodornieniu i powstaje szczawiobursztyńian. Znane są 3 róŜne dehydrogenazy izocy tryniano we. Jedna, swoista względem NAD", znajduje się tylko w chondriach. Pozostałe 2 enzymy są swoiste względem NADP+, jeden z nich znajduje się ? (Irilgi W rytmniii. TTtWia-

nie izocytrynianu związane z łańcuchem odCytrynian ulega przekształceniu w izocyi- dechowym odbywa się niemaJ wyłącznie przy rynian pr2ez enzym akonitazę (hydrataza akoni- udziale enzymu zaleŜnego od NAD+. tanowa), która zawiera Ŝelazo, jakujop Fe2 + , + w formie białka Ŝclazo-siarkowegofFeiSJT^rŜe^ Izocytrynian + NAD .—> *—* miana ta zachodzi w 2 etapach :_dehydratacji do Szczawiobursztyńian <—► (związany z enzymem) i—>txds-akonitanu pozostającego w^pbłączeniu Ŝ en~ + Ketoglutaran + COa+ NADH + H zymem i ponownej rehydratacji do izocytrynianu. Cw-akonitan - — jf fzocytryniarc

7i Cytrynian

związany z enzymemj

* Z okólnika nr 200 Komitetu Wydawców Biochcmical Joumals Recommendations (]975): „Zgodnie ze standardową konwencją biochemiczną końcówka -an (np. palmitynian) oznacza dowolną mieszaninę wolnego kwasu i jego form(y) zjonizowanych(ej) (w zaleŜności od pH), w której nie wyszczególnia się kationów". Tę samą konwencję przyjęto w tej ksiąŜce dla wszystkich kwasów karboksy1 owych.

ksylacji do a-ketoglutaranu w reakcji kąjaj^owąnej takŜe przez dehydrogenazę izocytrynianową. WaŜnym składnikiem tej reakcji jest Mnz+ (lub Mg?.jt)j Wydaje się, Ŝe.s_zczawk>bursztynian pozostaje związany z enzymem jako związek pośredni w ogólnej reakcji. Towstały a-ketogtutaran ulega dekarbo ksylacji oksydacyjnej w sposób analogiczny do dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu (p. ryc. 19-5) — oba substraty są a-ketokwasami. :-Ketoglutaran + NAD* + Co-A -» -* + Sukcynylo-CoA + COa + NADH + H

CYKL KWASU CYTRYNOWEGO / 201

JABŁ.CZANOWA CH 3 ~ COCT NADH + HłSzczawlooctanHJ°

HO—C-COO" CH5-COCT Cytrynian JAKONITAZA]

Fluorocytrynian C—COO JJH-COCT Cis-a. koni tan t

DEHYDROG BURSZTYNIANOWA

HO-CH-COO izocytrynian DEHYDROGENAZA IZOCYTRYNIANOWA1

r

O-C-S-CoA Sukcynylo-CoA K-

p

DEHYDROGENAZY

KETOGLUTARANO

OC a-

Szczawicbursztynian DEHYDROGENAZA IZOCYTRYNIANOWA

Ketoglutaran

DEHYDROGENAZA OWA | Ryc. 18-3. Cykl kwasu cytrynowego (cykl Krebsa). Utlenianie NADH i FADH2 w łańcuchu oddechowym umoŜliwia syntezę ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej, W celu łatwiejszego śledzenia losów acetylo-CoA w cyklu, atomy węgla rodnika acetylowego oznakowano na węglu karboksyiowym {uŜywając znaku [*]) i na węglu metylowym {uŜywając znaku [ •] ) W jednym obrocie zostają uwolnione 2 atomy węgla w postaci CO2, W pierwszym obrocie cyklu le uwolnione atomy nie pochodzą zacetyio-CoA, który bezpośrednio wszedt do cyklu, ale z lej części cząsteczki cytrynianu, która pochodzi ze szczawtooctanu. JednakŜe, po pierwszym pełnym obrocie cyklu, odtworzony szczawiooctan jest juŜ znakowany, stąd teŜ w następnym obrocie cyklu uwolnieniu ulega znakowany CO^. PoniewaŜ bursztynian jest związkiem symetrycznym, a dehydrogenaza bursztyn ianowa nie rozróŜnia 2 grup karboksylowych, na tym etapie dochodzi do „przypadkowości" znakowania, w wyniku czego wszystkie 4 atomy węgla szczawiooctan u okazują się być znakowane po jednym obrocie cyklu. W wyniku glukoneogenezy część węgl i znakowanego szcza wtooctanu moŜe się zna leźć w glukozie i glikogenie (p. ryc 21 -1). Stereochemiczne aspekty cyklu kwasu cytrynowego omówił Grevrl(e (1968). Na rycinie zaznaczono miejsca hamowania (O) przez fluorocytrynian, malonian i arsenin.

202 / ROZDZIAŁ 18

Reakcja katalizowana przez kompleks dehydrogenazy a-ketoglu tara nowej £akŜe__»;^ma-ga obecności identycznych kofaktorów, tj. difosfotiaminy, Ijponianu, NAD+, FAD i "CoA. "Wj ej_wy ni kupo wstaj e sukcynylo-CoA, tioester zawierający wiązanie bogatoenergetyczne. Równowaga tej reakcji jest tak znacznie przesunięta na korzyść tworzenia sukcynylo-CoA, Ŝe naleŜy ją uwaŜać za fizjologicznie jednokierunkową. Tak jak w przypadku utleniania pirogronianu (p, str. 214), reakcję tę hamuje arsenin, powodując nagromadzenie się su.bstratu, ot-ke^ toglutarann. W następnym etapie cyklu sukcynylo-CoA jpstaje przekształcony w bursztyniań pr7«z enzym tiokinazę bursztyn Janową (syntetazę sukcynylo-CoA).

Pierwszą reakcję odwodoraiejH^J^^izuje dehydrogeriaza burszry niannwa. która jest związana_ z wewnętrzną.jowierzchnia:,wawl^4ee&eT Błony mitn^nnHpalinpj

w nńrń?r\ipr\h\ nńj^

zostałych enzymów cyklu, które znajdują się Śt to jedyna reakcja odwodor-y kwasu cytrynowego, w której następuje bezpośrednie przeniesienie wodoru z substratu na flawoproteinę bez udziału NAD + Enzym zawiera FAD i białko Ŝelazo siarkowe (Fe:S). Wynikiem odwodornienia jest powstanie fumaranu. Dane uzyskane z doświadczeń z izotopami wykazały, Ŝe enzym jest stereospecyficzny względem atomów wodoru w połoŜeniu trans na węglach metylenowych bursztynianu. Dodanie malonianu. lub szczawiooctanu hamuje kompetycyjnie dehydrogenazę bursztymanową, powodując nagromadzenie się bursztynianu. Sukcynylo-CoA + Pj + GDP <—• Fumaraza (hydrataza fumaranowa) katalizuje «—» Bursztynian + GTP + CoA reakcję przyłączenia cząsteczki wody do fumaReakcja ta wymaga GDP lub IDP, które ranu, dając jabłezan. w obecności fosforanów nieorganicznych zoFumaran + HaO <—> L-Jabłezan stają przekształcone odpowiednio w GTP lub TYP. W cyklu kwasu cytrynowego jest to jedyny Oprócz swoistości dla L-izomeru jabłezanu, przypadek powstawania bogatoenergetyczncgo fumaraza katalizuje przyłączenie j:jem£ató.w_ mazania fosforanowego na poziomie substratu. wody do podwójnego wiązania fumaranu Występuje on dlatego, Ŝe uwolnienie energii w konfiguracji trans. Jabłezan ulega przekształswbbodnejw reakcji dekarboksylacji oksyda- ceniu przez dehydrogenazę jablczanową w szczacyjnej a-ketoglutaranu jest wystarczające do wlooctan w reakcji wymagającej obecności dodatkowego utworzenia wiązania bogatoener- NAD+. getycznego, oprócz wytwarzania NADH (równowaŜnik 3~®). Przy udziale kioaz^^lifos^ L-Jabłczan + NAD+ Szczawiooctan + + fonukleozydowej (p. str. [37) z GTP lub ITP + NADH + H moŜe powstawać ATP,. m>.: GTP + ADP

GDP+ ATP

W tkankach po za wątrobowych reakcją alternatywną, katalizowaną przez transferazę CoA sukcynylo-CoA: acetooctan (tioforaze), jest przemiana sukcynylo-CoA w bursztynian sprzęŜona z przekształceniem acetooctanu w acetoacetylo-CoA (p, str. 268). W wątrobie stwierdza się równieŜ aktywność deacylazy, która powoduje nieznaczną hydrolizę sukcynylo-CoA do bursztynianu i CoA. 35Ldalszych_przemianach bursztynian ulega odwodornicniu, po którym następuje przyłączenie cząsteczki wody oraz jeszcze jedno odwodornienie prowadzące do odtworzenia szczawiooctanu. Bursztynian + FAD <-^> Fumaran + FADH2

Aczkolwiek równowaga tej reakcji jest znacznie przesuniętajv_stron^ jabłezanu, zachodzi ona jednak w kierunku szczawi o octanu, poniewaŜ związek ten, wraz z drugim produktem reakcji (NADH), jest ciągle usuwany w następnych reakcjach. Enzymy cyklu kwasu cytrynowego, z wyjątkiem dehydrogena^a-TteTo^tutara^no^eji bTJrsZtyaianowcj*,występują równieŜ poza mitochondriarniT ŁhociaŜ katalizują one podobne reakcje, niektóre z enzymów, np. dehydrogenaza jabłezanowa, nie muszą być w rzeczywistości tymi samymi białkami, co enzymy mitochondrialne o tej samej nazwie.

* Powinna być równieŜ wymieniona syntaza cytrynianowa (przyp.

CYKL KWASU CYTRYNOWEGO / 203

KAśDY OBRÓT CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO UMOśLIW IA SYNTEZĘ 12 CZĄSTECZEK ATP W_jvyniku utleniań katalizowanych przez dehydrogenazy cyklu kwasu cytrynowego, zos t a j ą w y t wo r z o n e 3 c z ą s t e c z k i N A D H i 1 F.4DH2 na kaŜdą cząsteczkę acetylo-CoA TĆataboIiźówaną w jednym obrocie cyklu. Te równowaŜniki redukujące są przenoszone do łańcucha oddechowego w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (ryc. 18-2). Podczas wędrówki w łańcuchu, równowaŜniki redukujące z NADH generują 3 boga t o e ne rgety czn e wiązania fos-" foranowe powstające w procesie fostorylaćji oksydacyjnej wskutek fosforylacjf AD? do ATP (p. rozdz. 14). Natomiast FADH, daje tylko 2 bo^tgenerąerycznejffi^zataTT&sfera nowe, gdyŜ przenosi swą siłę redukcyjną na CoQ, omijając w ten sposób pierwsze miejsce fosforylacji oksydacyjnej w łańcuchu oddechowym (p. ryc. 14-6). JDalsze bogatoenc rgety czne wiązanie fosforanowe.-powstaje na poziomie samego cyklu (tj. na poziomie subs trat u) podczas przemiany sukcynylo-CoA w bursztynian. Prz^-kaŜdym obrocie cyklu powstaje więc 12 cząsteczek ATP {tab. 18-1)!

Tabela 18-1. Wytwarzanie ATP przez cykl kwasu cytrynowego __________ —- -----------------Enzym katalizujący reakcję Dehydrogenaza izocytrynianowa Kompleks dehydrogenazy 3-ketoglutaranowej Tiokinaza bursztyn janowa Dehydrogenaza bursztynianowa

Dehydrogenaza ablczanowa

Sposób wytwarzania ~P Utlenianie NADH włańcuchu oddechowym Utlenianie MADH wtańcuchu oddechowym Fosforylacja substratowa Utlenianie FADH2 w łańcuchu oddechowym Utlenianie NADH w łańcuchu oddechowym Zysk

Liczba utworzonych cząsteczek ATP

3

3

1

2

3 12

NIEKTÓRE WITAMINY ODGRYWAJĄ KLUCZOWĄ ROLĘ W CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO Cztery rozpuszczalne witaminy kompleksu B maJ4 określone rok w funkcjonowaniu cyklu kwasu cytrynowego. Są to: I) ryboflawina w formie dinukleotydu flawinoadeninowego_(jFĄD), kofaktor w kompleksie dehydrotzcnazy «-ketoglutarano..weji w dehydrogenazic burszty-nta nowej, 2) niacjTia w formie dinukleotydu nikotyaoa ni i do u dt ni nowego (NAD), koenzym dla 3 dehydrogenaz cyklu: dehydrogenazy i/oe>tryniunowej, kompleksu dehydrugenazy .r-ktitoglutaranowej i dehydrogenazy jaWczanowej, 3) tiamina (witamina B,), jak£ difosfo tiamina, koenzym procesu dekar boksy lacjiw" reakcji dehydrogenazy ot-ketoglutaranowej, 4) kwas pantotenowy, jako C2ęść koenzymu A, kofaktor związany z „aktywnymi" resztami kwasów karboksylowych, takich jak acetylo-CoA i sukcynylo-CoA. CYKL KWASU CYTRYNOWEGO ODGRYWA WĘZŁOWĄ ROLĘ METABOLICZNĄ Niektóre szlaki metaboliczne kończą się na związku pośrednim cyklu kwasu cytrynowego, a inne szlaki wywodzą się z tego cyklu. Dotyczy to takich procesów, jak: glukoneogcneza^ transaminacja, deaminacja i synteza kwasów,.tłuszczowych. Jak widać cykl kwasu cytrynowego odgrywa role zarówno w procesach oksydacyjnych, jak i w procesach syntez, a zatem jest amilbolicztiy. PoniŜej przedstawiono podsumowanie tej dwoistej roli cyklu. Cykl kwasu cytrynowego ma udział w giukoneogenezie, tran sam i nacji i deaminacji Wszystkie waŜniejsze metabolity ryWlu, od „Cytrynianu do szczawiooctanu, są potencjalnie g! ukogennc. gdyŜ mogą zwiększyć wytwarzanie glukozy w wątrobie lub nerce, narządach zawie rających pełny zestaw enzymów niezbędnych do przeprowadzenia glukoneogenezy (p. str. 226). Kluczowym enzymem, umoŜliwiającym przejś cie z cyklu do głównego szlaku glukoneogenezy, jest kar boksy kiiiiizii fosfoenolopirogr omanowa, katalizująca reakcję dekarboksylacji szczawic:octanu do fosfoenolopirogronianu z GTP jajko źródłem fosforanu bogatoenergetycznego (ryc. T8-4). ' -

204 / ROZDZIAŁ 18 Hlstydyna Prollna Hydroksyprollna Seryna Cysta! na Trsonlna Gtloyna

Mleczan

)\

&

,JV f

Pirogronian

Tryptofan.

KARBOKSYLAZA FOSFOENO LOPIHOGRONIANOWA

KARBOKSYLAZA PIHOGHONIANOWA

Fosfeanolo-

plrogrnnlanln "^

Tyrozyna Fenyloalanina

Glutamina f Arglnln. J

Ryc. 18-4. Uczestnictwo cyklu kwasu cytrynowego w transaminacji i glukoneogenezie. Grubsze strzałki wskazują główny szfak glukoneogenezy. Szczawiooctan ł GTP-» -» Fosfoenoloptrogronian + CO3+ GDP

Wprowadzenie do cyklu następuje jako wynik kilku róŜnych reakcji. Jedną z najwaŜniejszych jest tworzenie szczawi o octanu w reakcji karboksylacji pirogronianu katalizowanej przez karboksylazę pirogronianową.

W reakcjach katalizowanych przez truns a mi-

na/y (aminotransferazy) wytwarza się; pirogronian z alaniny, szczawiooctan z asparaginianu oraz a-ketoglutaran z glutaminianu. PoniewaŜ reakcje te są odwracalne, cykl słuŜy równieŜ jako źródło szkieletów węglowych do syntezy aminokwasów endogennych, np.:

ATP + COa + HaO + Pirogronian ■ -» Szcza wiooctan + ADP + P|

Asparaginian + Pirogronian *—> Szczawiooctan + Alanina

Reakcję tę uwaŜa się za waŜną w utrzymaniu odpowiedniego stęŜenia szczawiooctanu dla reakcji kondensacji z acetylo-CoA. JeŜeli nagromadza się acetylo-CoA, to działa on jako allosteryczny aktywator kaiboksylazy pirogronianowej, zapewniając w ten sposób dopływ szczawiooctanu. Mleczan, waŜny substrat glukoneogenezy, wchodzi dó^ cykl u w^wyniku przemiany w pirogronian i szczawiooctan.

Glutaminian + Pirogronian<—»a-Ket oglu taran + Alanina

Inne aminokwasy wspierają glukoneogeneze, poniewaŜ cały ich szkielet węglowy lub jego cześć po deaminacji lub transaminacji zasila cykl kwasu cytrynowego. Przykładami s$ ąląnina, cysteina^glicyjia, hydroksyprolina, seryoa, treońma i^yptofaiir któie ulegaią" prze-

CYKL KWASU CYTRYNOWEGO / 205 ^rmnina

htetyrlyna "

"glutamina i prolina. które"poprzez glutaminian przechodzą w a-ketoglu\ąran; izołeucyna, metionina i walina, które tworzą sukcynylo-CoA; tyt6fcyjia"T"ienyIoai an i n"a. z którjcE powstaje fumaran (p. ryc. 18-4). Substancje tworzące pirogronian mogą ulec całkowitemu utlenieniu dp^CO^jeśli ulegną przekształceniu w acetylo-CoA przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej, lub teŜ mogą trafić do glukoneogenezy przez karboksylację do szczawi o octanu. " Szczególne znaczenie dla przeŜuwaczy ma przemiana propionianu, będącego głównym produktem glikogennym fermentacji węglowodanów w Ŝwaczu przeŜuwaczy, w sukcynylo-CoA poprzez metyloma)onylo-CoA (p. ryc, 21-2). Cykl kwasu cytrynowego uczestniczy w biosyntezie kwasów tłuszczowych (p. ryc. 18-5) Acetylo-CoA, utworzony z pirogronianu w wyniku działania kompleksu dehydrogenazy piróg ronią nowej, stanowi podstawowy element do syntezy długo łańcuch owych kwasów tłuszczowych u nieprzeŜuwaczy. (U przeŜuwaczy acetylo-CoA powstaje bezpośrednio z octanu).

PoniewaŜ dehydrogenaza pirogronian owa jest enzymem mitochóndrialnym, a enzymy katalizujące syntezę kwasów tłuszczowych znajdują się poza mitochondriami. acetylo-CoA musi zostać przetransportowany przez nieprzepuszczalną dla niego błonę mitochondrialną. Dokonuje się to przez utworzenie z acetylo-CoA cytrynianu w cyklu kwasu cytrynowego, następnie przetransportowanie cytrynianu z mitochondrium i w końcu utworzenie acetylo-CoA w cytozolu przez rozszczepienie cytrynianu w reakcji katalizowanej przez enzym Uazę ATP: cytrynianową. Cytrynian + ATP + CoA-» Acetylo-CoA + Szczawiooctan + ADP+ P.

Regulacja cyklu kwasu cytrynowego zaleŜy głównie od podaŜy utlenionych kofaktorów Bez wątpienia w większości tkanek, w których zasadnicza funkcja cyklu kwasu cytrynowego polega na dostarczeniu energii, „kontrola oddechowa" przez łańcuch oddechowy T fosforylację oksydacyjną jest nadrzędnym elementem regulacji aktywności cyklu kwasu cytrynowego. Aktywność cyklu jest więc bezpośrednio Siczawlodan

Glukoza i

- Pirogronian

LIA2A ATP: CYTHYNIANOWA Cytryn łan

Ryc. 18-5. Udział cyklu kwasu DEHYDROGENAZA PIROGRO NIANOWA

cytrynowego w procesie syntezy kwasów tłuszczowych z glukozy {p. teŜ ryc. 23-5). Saczawioocian Cykl kwasu cytrynowego

CO, BŁONA MITOCHONDRIALNĄ

Kwasy tłuszczowe

Acetylo-CoA

206 / ROZDZIAŁ 18

zaleŜna od podaŜy utlenionych kofatetorów dehydrogenaz (np. NAD), ta z kolei, ze względu na sprzęŜenie utleniania z fosforylacją, zaleŜy od dostępności ADP, a w końcu takŜe od szybkości zuŜywania ATP. Szybkość wykonywanej pracy, w wyniku której zuŜywa się ATP, warunkuje zatem zarówno szybkość oddychania, jak i aktywność cyklu kwasu cytrynowego pod warunkiem, Ŝe tlen jest dostępny. Poza tą ogólną lub zgrubną kontrolą, właściwości niektórych enzymów cyklu sugerują, źe regulacja moŜe mieć miejsce na poziomie samego cyklu. W tkance, takiej jak mózg, która jest zaleŜna w znacznym stopniu od węglowodanów dostarczających acetylo-CoA, kontrola cyklu kwasu cytrynowego moŜe zachodzić na etapie dehydrogenazy pirogronianowej. W samym cyklu niektóre enzymy wykazują wraŜliwość na stan energetyczny wyraŜony stosunkiem [ATP]/[ADP] i [NADH]/[N AD+]. I tak syntaza eytrynianowa jest hamowana allosterycznie przez ATP i długołaricuchowe acylo-CoA. Allosteryczna aktywacja przez ADP mitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynianowej zaleŜnej od NAD jest znoszona przez ATP i NADH. Kompleks dehydrogenazy tx-ketoglutaranowej wydaje się być pod analogiczną kontrolą, jak dehydrogenaza pirogronianowa. Dehydrogenaza bursztynianowa jest hamowana przez szczawiooctan, a dostępność szcza wi o octanu,

kontrolowana przez dehydrogenazę jabłezanową,.zalęŜy.od stosunku [NADH]/[NAD], PoniewaŜ wartość Km syntazy cytrynianowej dla szczawiooctanu jest tego samego rzędu, co jego stęŜenie wewnatrzmitochondrialne, to wydaje się, Ŝe stęŜenie szczawiooctanu moŜe odgrywać pewną rolę w regulacji szybkości powstawania cytrynianu. Jak na razie nie rozstrzygnięto, który z powyŜej wymienionych mechanizmów funkcjonuje w warunkach in vivo.

PIŚMIENNICTWO Baldwin JE, Krebs HA: The cvolution of metabolic cydes. Naturę 1981;291:381. Boyer PD (editor): The Enzymes, 3rd ed. Academic Press, 1971. Goodwin TW (editor): The Metabolic Rołes of Citrate. Academic Press, 1968. Greville G"D: Vol 1, p 297, in: Carbohydrate MetaboHsm and hs Disorders. Dickens F, Randle PJ, Whelan WJ (editors). Academic Press, 1968. Kay J, Weitzman PDJ (editors): Kreb's Citric Acid Cyde - Half a Century and Still Turning. Biochemical Society of London, 1987. Lowenstein JM (editor): Citric Acid Cyde: Control and Compartmentalion. Dekker, J969. Lowenstein JM (editor): Citric Acid Cyde. Vol 13 in: Methods in Enzymology. Academic Press, 1969. Srere PA: The enzymology of the formation and breakdown of citrate. Adv Enzymol I975;43:57.

Glikoliza i utlenianie piróg ronianu

19

Peter A, Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Wszystkie tkanki wymagają pewnej minimalnej podaŜy glukozy, ale dla niektórych tkanek (np. dla mózgu i erytrocytów) jest to wymóg zasadniczy. GlikolizaJesL^ównym szlakiem r ^ ? T h i k i h ■Komórkach. Jest to wyjątkowy szlak, poniewaŜ moŜe on przebiegać zarówno w warunkach tlenojłjchjaerobowych), jak i beztlenowych (anaerobowych).

cykl kwasu cytrynowego. Znaczy to, Ŝe wytwarzanie pirogronianu przewyŜsza zdolność jego metabolizowania. W rezultacie prowadzi to do nadmiernego wytwarzania mleczanu i miejscowego zakwaszenia środowiska w guzie, a to z kolei moŜe mieć następstwa w terapii pewnych typów nowotworów. Kwasica mleczanów u moŜe wynikać z wielu przyczyn, włącznie z niedoborem dehydrogenazy pirogronianowej.

GLIKOLIZA MOśE PRZEBIEGAĆ W WARUNKACH BEZTLENOWYCH ZNACZENIE BIOMED/CZNE Glikoliza jest nie tylko podstawową drogą metabolizmu glukozy prowadzącą do wytwa rzania acetylo-CoA i utleniania w-cyklu-kwasu cjffynowcgo. lecz takŜe stanowi główny szlak, metabolizmu fruktozy i galaktozy i y g pokarmowego. Jej zasadnicze znaczenie biomedyczne wynika z faktu, Ŝe glikoliza moŜe dostarczać _&!£■ w BWobecnoścDtoua^cqrpo,T. zwala mięśniom szkieletowym funkcjonować sprawnie przy niedostatecznych procesach aerobowych i co pozwala tkankom z duŜą aktywnością glikolityczną przetrwać epizod Beztlenowy. Odwrotnie, mięsień sercowy, przystosowany do warunków tlenowych, charakteryzuje się względnie mała aktywnością glikolityczną i słabą zdolnością przetrwania w warunJtach niedotlenienia. Znamy niewielką liczbę chorób, w których stwierdzono brak aktywności enzymów glikolizy (np. kinazy pirogronianowej); zasadniczym ich objawem jest niedokrwistość hemolityczna. W szybko rosnących komórkach nowotworowych, glikoliza przebiega ze znacznie większą szybkością niŜ wymaga tego

JuŜ we wczesnym okresie badań nad glikolizą zauwaŜono, Ŝe proces fermentacji w droŜdŜach jest podobny do rozpadu glikogenu w mięśniu. Stwierdzono, Ŝe gdy mięsień kurczy się w środowisku beztlenowym, tzn. takim, z którego usunięto tlen, znika glikogen, a pojawia się mleczan jako główny produkt końcowy. Gdy tlen jest dostępny, czyli istnieją ponownie warunki tlenowe, pojawia.-sje.glikjo.gen, natomiast mleczan .znika. JeŜeli jednak skurcz następuje w warunkach tlenowych, to mleczan się nie gromadzi, a głównym produktem glikolizy jest pirogronian; ten ostatni nie akumuluje się, poniewaŜ jest utleniany dalej do CO2 i wody (ryc. 19-1). Na podstawie tych obserwacji przyjęto rozdział metabolizmu węglowodanów na fazę tlenową i beztlenową. Jednak tego typu zróŜnicowanie jest arbitralne, gdyŜ reakcje w procesie glikolizy, przebiegające zarówno w obecności, jak i przy braku tlenu, są takie same z wyjątkiem ich intensywności oraz produktów końcowych. Je: Ŝeli.tlęnjest dostęnny-tyJko^r-zez-króiki-okres, to jest. ograniczona peoksydacja NADH powstałego w czasie glikolizy. W tych warunkach

208 / ROZDZIAŁ 19 Gllkogen

Ryc. 19-1. Uproszczony schemat glikolizy. Q — zablokowane w warunkach beztlenowych lub przy braku mitochondriów, np. w erytrocytach.

Glukoza + 2 AOP + 2 Pf -* -» 2 L(+)-Ml«aan + 2 ATP + 2 H3O Wszystkie_ enzymy- ■ szlaku -glikojitycznego (ryc. 19-2) znajdują się w pozamitochondrialnej rozpuszczalnej frakcji komórkowej.jK.c^tozplu. Katalizują one reakcje zachodzące podczas przemiany glukozy do pirogronianu i mleczanu następująco: Glukoza wchodzi do szlaku glikołitycznego przez fosforylację do glukozo-6-fosforanu: Za- chodzi to przy udziale enzymu heksokinazy, a w hepatocytach przy udziale glukokinazy, k*torej aktywność jest indukowana i modyfikowana w wyniku zmian odŜywiania. Jak»-dawca P fnsfhranp pnrr^frny jggf AT J* jak W Wielu reakcjach związanych z fosforylacją, regguje-on w formie kompleksu Mg^ATP. \f reakcji zuŜywa sie 1 bogatoenergetyczne wiązanie fosforanowe ATP i powstaje ADP._Reakgji tej towarzyszy znaczna strata energii swobodnej w postaci ciepła i dlatego w warunkach fizjologicznych moŜe być ona traktowana jako reakcja nieodwracalna. Heksokirta7M jp&t .hamawana w SpOsób izosteryczny przez produkt reakcji glultpzo-6-fosforan. Glukoza + ATP-—* -» Glukozo-6-fosforan + ADP

NADH jest utleniany w reakcji redukcji pirogronianu do rn]eczanu,7a_tak utworzony_NAD_.. umoŜliwia dalszy przebieg glikolizy (ryc, 19-1), W ten sposób glikoliza moŜe zachodzić w warunkach beztlenowych, lecz ma to swoją cenę — dochodzi do ograniczenia ilości energii uwalnianej na mol utlenianej glukozy. W konsekwencji, aby wytworzyć tę samą ilość energii, więcej glukozy musi ulec glikolizie w warunkach beztlenowych niŜ w warunkach tlenowych.

CIĄG REAKCJI W GLIKOLIZIE TO GŁÓWMY SZLAK ZUśYCIA GLUKOZY Ogólne równanie glikolizy do mleczanu jest następujące:

r wy stepująca we wszystkich komórkach, z wyjątkiem komórek parenchymalnych wątroby, ma duŜe powinowactwo (mata wartość Km) do jej substratu, tj, glukozy. Jej rola polega na zapewnieniu dostarczenia gluko■ZXjjo_ tkanek. Nawet przy małych stęŜeniach glukozy we krwi, przez fosforylację wszystkich jej cząsteczek wnikających do komórki, jest moŜliwe utrzymywanie duŜego gradientu stęŜenia glukozy między krwią a środowiskiem wewnątrzkomórkowym. Heksokinaza działa zarówno na a, jak i p anomer glukozy i moŜe równieŜ katalizować fosforylację innych heksoz, jednak ze znacznie mniejszą szybkością niŜ fosforylację glukozy. Funkcia ęlukokinazy iest usuwanie glukozy Z krwi po spoŜyciu posiłków. W przeciwieństwie

Ryć. 19-2. Szlak glikolizy. ® ------- PO3 , P, — H0P0| , 9 — hamowanie. * Atomy węgla 1 — 3 fruktozobisfosforanu tworzą hydroksyacetonofosforan, natomiast węgle 4 — 6 tworzą giicera)dehydo-3-fosforan. Przedrostek bis- (jak w fruktozobisiosforanie) wskazuje, Ŝe grupy fosforanowe są odseparowane, natomiast określerile difosforan, np. w difosforanie adenozyny, wskazuje Ŝe są bezpośrednio ze sobą połączone.

GLIKOUZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU / 209 Gtifcogen Glukozo-

1-fosforan

[ HEKSOKINAZA ]

CHjL Q

| GLUKOKINAZA j

J—- 0

_ c Hy

+

Mg'

H

HO\? H

12OMEHA2A FOSFOHEKSOZOWA

Glukoza

^OH

H

y0H

OH ATP

H 0H ADP ■-D-G lu kozo-6-f osf oran

OH it-D- ATP

CHa-O-©

;ł-

V FOSFOFRUKTOKINAZA

cooH-C-OH i

OH

CH,-O-

H D-

MUTA2A

D-F r u kicz o -1.6-b i sf o sf o ran FOSFOGUCERYNIANOWA

Jod oo otan

CHjOH Dlhyd roksy aoeto nofoslo r

FOSFOGLICERYNIANOWA

coo-

ALDEHYDO-3-FOSFORANOWA

FrukJczo-6-łosforan ■

ERAZA

___

2-Fnsfogllcerynian ADP 1,3-Blsfostogl icery n lan

—-5 3-Fos1oglioeryniari

H-Ć-O-® ĆH,OH Fluorek

Mltochondrlalny y: o£ łańcuch

-H;O I ENOLAZA

cooĆ-0-®

3ATP

II

CH, 3ADP + P.

KINA2A PtROGRONIANOWĄ Fosfoenolo piróg ron lan Utlenianie w cyklu kwasu cytrynowego

-A D P NADH+H^

Mg1 ATP Samorzutnie

cooĆ-OH -CH, (Enol) Plrogfonian

Ryc. 19-2 14

Biochemia

cooi

CH3 (Keton) Plrogronlan

NAD +

U

0EHYDH0G6NAZA MLECZANOWA

cooHO-C-H

Ć

g , __

, | \ ■

210 / ROZDZIAŁ 19

do heksokinazy ma ona duŜą wartość Km dła glukozy i działa optymalnie przy stęŜeniu glukozy we krwi wynoszącym powyŜej 5 mmol/1 (p. ryc. 21-5). Jest swoista względem fliulfozy Glukoz o-6-fosforan jest waŜnym związkiem łączącym wiele szlaków metabolicznych (glikoliza, glukoneogeneza, cykl pentozofosforanowy, glikogcneza i glikogenoliza). W glikolizie jest ona przekształcana w fruktozo-6-fosforan przez izomeryzację aldozowo-ketozową przy udziale izomerazy fosfoheksozowej. Przemianie tej ulegaJyIkjDjąjm£nier_glukozó-6-fos...D-Głukozo-6-fosforan <—» *—> a>D-Fruktozo-6-fosforan

Po tej reakcji następuje druga fosforylacja z udziałem ATP, katalizowana przez enzym fosfofruktokinazę (fosfofruktokinazc-1), tworząca fruktozo-l,6-bisibsforan. Fosfofruklokinazajest zarówno enzymem allosterycznym, jak i indukowanym, którego aktywność odgrywa główną rolę w regulacji szybkości glikolizy. Reakcja katalizowana przez fosfofruktokinazę e być uwaŜana za nieodwracalną w warunkach fizjoJogicznych. D-Fruktozo-6-fosforan + ATP > ■ D - F ruktozo-1,6-bisf osforan

Fruktozo-l,6-bisfosforan jest rozszczepiany przcz aldolazę (aldolazę fruktozo-1,6-bisf o sforanową) na 2 fosfotriozy, glicfiraldehydo-3-fosforan i dihydroksyacetonofosforan. D-Fruktozo-1,6-bisfosforan «—► <-^>Gliceraldehydo-3 -fosforan + + Dihydroksyacetonof osforan

Stwierdzono występowanie kilku róŜnych aldolaz; wszystkie zawierają 4 podjednostki. W większości tkanek występuje aldolazą A, natomiast w wątrobie i nerce występuje dodatkowo aldolaza B. ChociaŜ fruktozofosforany występują w komórce głównie w formie furanozowej, to z izomerazą fosfoheksozową, fosfofruktokinazą i aldolaza wiąŜą się w formie łańcuchowej. Gliceraldehydo-3-fosforan oraz dihydroksyacetonofosforan przekształcają się jeden w drugi pod wpływem enzymu izomerazy fosfotriozowej. D -Gliceraldehydo-3-f osforan *—► «—► Dihydroksyacetonofosforan

Następny etap glikolizy to utlenienie gliceraldehydo-^Tosforanu do J^^BisfbsfogUcer^ nianu. Dzięki aktywności izomerazy TosTotriozowej równieŜ dihydroksyacetonofosforan^ przechodząc uprzednio w gliceraldehydo-3-fosforan, jest utleniany do 1,3-bisfosfoglicerynianu, D-Gliceraldehydo-3-fosforan + NAD * + + + Pj.—.1,3-bisfosfoglicerynian +NADH + H

Kn^ym warunkujący utlenianie—dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa —jest zaleŜny od NAD. Strukturalnie składa się on z 4 identycznych polipeptydów (monomerów) tworzących tetramer. KaŜdy polipeptyd zawiera 4 grupy -SH, znajdujące się w resztach cysteiny łańcucha polipeptydowego. Jedna z grup -SH znajduje się w centrum katalitycznym enzymu. Początkowo substrat łączy się z tą resztą SH, tworząc tiohemiacetal, który w wyniku utlenienia ulega przekształceniu w bogatoenergetyczny tioester; wodór oderwany w czasie tego utleniania jest przenoszony na NAD związany z enzymem. Wytworzony NADH nie jest tak mocno związany z enzymem jak NAD. Dlatego teŜ NADH moŜe być łatwo zastępowany przez następną cząsteczkę NAD, W końcu w reakcji fosforolizy, przy udziale nieorganicznego fosforanu (P;), tworzy się" 1,3bisfosfoglicerynian i wolny enzym z odtworzoną grupą -SH (ryc. 19-3). Energia uwalniana w czasie utleniania zostaje zatrzymana najpierw w formie bogatoenergetycznego wiązania siarczkowego, a po jego fosforolizie w formie bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego w pozycji 1 1,3-bisfosfogIicerynianu. Ten_„ bogatoenergetyc2ny fosforan znajdzie się następnie w ATP w wyniku katalizowanej przez kinaze fosfoglicerynianową reakcji zachodzącej w obecności ADP i tworzącej J-fosfoglicery-nian. 1,3-bisfosfoglicerynian-)- ADP «—» <—• 3-fosfoglicerynian+ ATP

PoniewaŜ z cząsteczki glukozy podlegającej glikolizie powstają 2 cząsteczki fosfotrioz, na tym etapie wytwarzają się równieŜ 2 cząsteczki ATP na cząsteczkę glukozy; jest to przykład fosforylacji „na poziomie substratu" (fosforylacja substratowa). W przypadku obecności arseniami, współzawodniczy on w powyŜszych reakcjach z fosforanem nieorganicznym (Pj), tworząc 1-arse-

GLIKOUZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU / 211

H-C-0 H-C-OH

NAD+)

i

S-Enz

CH-O-(P)

H-C-O H

G! fceraldehyd o-3-fosf □ ra n -

H-C-O H CHrO-(PKompleks enzym -substrat HS-Enz

Utlenianie sabstratu przez związany NAtT

nzym

o-® H - C -O H CH,-O-(P) 1,3-Blsfostoglloerynlan

Intefmedlat bogatoeneroełyczny

Hyc-. 19-3. Mechanizm utleniania gliceraldefiydo-3fosforanu. Em ~~ dehydrogenaza gliceraldehydo-3--fosforanu. jest hamowany przez jodooctan wiąŜący się z grupą -SH, W ten sposób jodooctan moŜe hamować glikolizę.

no-3-fosfoglicerynian, który spontanicznie hydrolizuje, dając 3-fosfoglicerynian i ciepło, bez tworzenia ATP. Jest to waŜny przykład zdolności arsenianu do rozprzęgania utleniania i fosforylacji. Powstający w powyŜszych reakcjach 3-jpsfogliceryhian jest przekształcany w 2-fosfoglicerynian przez enzym mutaze fosfoglicerynianową. Prawdopodobnie 2,3-bisfosfoglicerynian (dawniej określany jako difosfoglicerynian, DPG) jest związkiem pośrednim w tej reakcji. 3-Fosfoglicerynian *—f2-Fosfoglr cery niań

Następny etap glikolizy jest katalizowany przez enolazę, którą powoduje odłączenie wod^,_pr_zernieszczenie energii wewnątrz cząsteczki, przejście fosforanu w pozycji 2 w stan bogatoenergetyczny i w rezultacie tego utworzenie fosfoenolopirogronianu. Enoląza, jest

Enzym

hamowana przez fluorki; ta właściwość moŜe być wykorzystana w sytuacji, gdy zachodzi potrzeba zahamowania glikolizy, np. w próbce krwi w celu oznaczenia w niej stęŜenia glukozy. Aktywność enzymu zaleŜy od obecności Mg2 + lub Mn2+. 2-Fosfoglicerynian «-» *-* Fosfoenolopirogronian + H2O

Następnie fosforan bogatoenergetyczny jest przenoszony z fosfoenolopirogronianu na ADP przez enzym kinazę pirogronianową, tworzący na tym etapie 2 cząsteczki ATP na cząsteczkę utlenianej glukozy. Utworzony w tej reakcji enolopirogronian przekształca się spontanicznie w formę ketonową pirogronianu. Jest to kolejna reakcja, której towarzyszy znaczna utrata energii swobodnej w postaci ciepła i musi być ona traktowana jako fizjologicznie nieodwracalna.

212 / ROZDZIAŁ 19 Fosfoenolopirogronian + ADP -* -» Pirogronian + ATP

Teraz stan red.-oks. tkanki jest czynnikiem decydującym, który z 2 moŜliwych szlaków metabolicznych zajdzie. JeŜeli przewaŜają waranki beztlenowe, to uniemoŜliwiona jest reoksydacja NADH w łańcuchu oddcdumym-pczez przeniesienie równowaŜników redukujących na tlen. Pirogrojiiaji ulega redukcji przez NADH rjrprpiwyfiTpi w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanów ą. Opisano izozymy tego "enzymu i ich znaczenie kliniczne (p. str. 82). +

Pirogronian + NADH + H ~ <-.L(+)-Mleczan + NAD*

ca_regulacji glikolizy. Komórki, mające róŜne systemy~enzyriiatyczne, pozwalające na alternatywny przebieg nieodwracalnych reakcji katalizowanych przez wyŜej wymienione enzymy, mają moŜliwość dokonywania w szlaku glikolitycznym przesunięcia metabolitów w kierunku syntezy (glukoneogenezy). Te reakcje oraz regulacja glikolizy i regulacja glukoneogenezy są przedstawione w rozdz. 21. W glikolizie zachodzącej w erytrocytach reakcja kinazy fosfog li cery nia nowej moŜe być ominięta W erytrocytach wie\u gatunków ssaków dochodzi do ominięcia reakcji katalizowanej przez kinazę fosfoglicerynianowa. W tym przypadku energia swobodna wiązania bogatoenergetyczi. nego 1,3-bisfosfoglicerynianu zostaje rozproszona w postaci ciepła (ryc. 19-4). Dodatkowy

Reoksydacja NADH w reakcji powstawania mleczanu, przez odtworzenie NAD+ potrzebnego w następnym cyklu reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową, umoŜliwia przebieg glikolizy w nie------- Glukoza obecności tlenu. Tkanki funkcjonujące w warunH-C-GH kach niedotlenienia wytwarzają więc mleczan (ryc. 19-2). Dotyczy to zwłaszcza mięśni szkieletowych, gdyŜ szybkość wykonywanej przez mięGl fceraldehyd o-3-fosforan śnie pracy nie jest ograniczona przez ich stan NAD* oksygenacji. Nadmierne ilości utworzonego mleczanu moŜna stwierdzić w tkankach oraz we DEHYDROGENAZA GLICERALDEHYOO-3-FOSFORANIOWA krwi i w moczu. W _ervtrocvtach ^ikgjizajjiawet w warunkach tlenowych, kończy się zawsze 'NADH + H* utworzeniem mleczanu, z powodu braku w tych komórkach mitochondriów, które zawieraj4 system enzymatyczny utleniający pirogronian. MUTAZA Jedynie w erytrocytach ssaków ok^90% cał- H-C-OH BISFOSFO kowitego zapotrzebowania energetycznego pokrywa glikolizaJ_Coza mięśniem szkieletowym i erytrocytami, tkankami, które równieŜ czerpią energię głównie z glikolizy i wytwarzają mle- 1.3-BtefoBfoglicerynlan czan, są: mózg, jelito, rdzeń nerki, siatkówka 1 skóra. Wątroba, nerki i serce zwykle pobierają ADP, KINAZA mleczan i utleniają go, ale w warunkach niedoFOSFOGLICEHYNIANOWA tlenienia narządy te mogą wytwarzać mleczan. Glikoliza jest regulowana na 3 etapach obejmujących reakcje „nieodwracalne" ChociaŜ większość reakcji glikoli ty cznych jest odwracalna, to jednak 3 z nich są wyraźnie egzoergiczne i z tego powodu muszą być uwaŜane za rgakcj£jftzjologicznie nieodwracalne. Są to reakcje katalizowane przez heksokinazę (i glukokinazę),"ibsfofruktokinazę 'i kinazę pirogronianowa,. Reakcje te stanowią zasadnicze miejs-

J

COO" H-COH CH2-O(F

Gl I cer o I o-2,3-b I sf osf o ra n

FOSFATAZA 2^-BISFOSFOGUCERYN1AN0WA

3-Fosfogllcerynlan Pfrogronlan

Ryc. 19-4. Szlak 2,3- bisfosfoglicerynianowy w erytrocytach.

GLIKOLIZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU / 213

enzym, imitasa ■faisfosfpglieerynianowa, katalizuje przekształcenie 1.3-bisfosfoglJccryniami w 2.3 - b i stos fbgl u: e ry ni an. Ten ostatni u lega przemianii: do .i-loslosilicciynianu prze/ fosfatazę ~TfośiSgBcerynianową, której aktywność wykazuje cząsteczka mutazy bisfosfoglicerynianowej. W związku z utratą bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego proces glikoiizy, przebiegający z udziałem tych reakcji, nie daje zysku energetycznego w postaci ATP. JednakŜe moŜe to być korzystne dla erytrocytów, poniewaŜ pozwala na przebieg glikolizy nawet w warunkach minimalnego zapotrzebowania na ATP. Poza tym 2,3-bisfosfoglicerynian, występujący w komórce w duŜym stęŜeniu, łączy się 7. hemoglobiną, powodując zmniejszenie jej powinowactwa do tlenu i przesuniecie krzywej dysocjacji oksyhemoglobiny w prawo. W_,Jten sposób w erytrocytach ułatwia on uwalnianie tlenu z oksj hemoglobiny (p. rozdz. 7). UTLENIANIE PIROGRONIANU DO ACETYLO-CoA JEST NIEODWRACALNYM PROCESEM ŁĄCZĄCYM GLIKOLIZĘ Z CYKLEM KWASU CYTRYNOWEGO AUy.piiogroniaajnógł wejść do cyklu kwasu cytrynowego, musi najpierw zostać przetransportowany do wnętrza mitochondrium przez przenośnik pirogronianowy, który umoŜliwia przejście pirogronianu przez wewnętrzną Honę mitochondrialną. W tym procesie transportowi cząsteczki pirogronianu towarzyszy transport 1 protonu (kotransport). Tego typu mechanizm transportu określa się mianem symportu (p. ryc. 14-15). Wewnątrz mitochondrium pirogrogjfrn do acetylo-

;CpA. Reakcja ta jest katalizowana przez kilka róŜnych enzymów, działających kolejno w kompleksie wieloenzymatycznym. Enzymy te określa_sic-zbk>rowo mianem kompleksu dehydrogenazy pirogr omanowej, który jest analogiczny do kompleksu dehydrogenazy a-ketoglutaranowej w cyklu kwasu cytrynowego (p. str. 199). Pirjagnjniarijyilega.4ekarboksylacji do hydroksyetyłowej pochodnej pierścienia tiazolowego difosfoLićtmmy związanej z enzymem, która reaguje z kolei z utlenionym lipoamidem, tworząc acetylolipoamid (ryc. 19-5). W obecności acetylotransfcrazy dihydroliponianowcj acetylolipoamid reaguje z koenzymem A., tworząc acetylo-CoA i zredukowany lipoamid. Gdy

ten ostatni zostanie ponownie utleniony przez flawoprofeinę, w obecności dehydrogęnazy dihydroliponianowej, cykl reakcji jest" zakończony! Ostatecznie zredukowana flawoproteina jest utleniana-pfzezr.:NAD, który z kolei przenosi równowaŜniki redukujące do łańcucha oddechowego. +

Pirogronian + NAD + CoA -• + -» Acetylo-CoA + NADH + H + COa

Kompleks_dshydrogenazy pirogronianowej składa się z szeregu łańcuchów polipeptydowych. kaŜdego z 3 składowych enzymów, ułoŜonych w regularny układ przestrzenny. Ruchy kaŜdego z enzymów są ograniczone, a metabolity pośrednie nie dysocjują swobodnie, lecz pozostają przyłączone do enzymów. Taka organizacja kompleksu enzymatycznego, w którym substraty są przekazywane z jednego enzymu na następny, powoduje zwiększenie szybkości reakcji i uniemoŜliwia przebieg reakcji ubocznych, a w konsekwencji zwiększa wydajność ogólną procesu. NaleŜy zaznaczyć, Ŝe system dehydrogenazy pirogronianowej jest wystarczająco elektroujemny względem łańcucha oddechowego, aby generować zarówno zredukowany koenzym (NADH), jak i dodatkowo bogatoenergetyczne wiązanie tioestrowe w acetylo-CoA. Dehydrogenaza pirogronianowa jest regulowana przez hamowanie produktami końcowymi oraz przez modyfikacje kowalencyjne pehydrogenaza pirogronianowa jest hamowana przez produkty jej reakcji, acetylo-CoA oraz NADH (ryc. 19-6). Jest ona równieŜ regulowana przez ATP-zaleŜną fosforylację, katalizowaną przez kinazę, co prowadzi do zmniejszenia aktywności oraz przez defosforylację przy udziale fosfatazy, co z kolei prowadzi do zwiększenia aktywności dehydrogenazy. Kinaza ulega aktywacji przy zwiększeniu wartości stosunków facetyIo-CoAj/XCoA], [NADHJ/tNAD1-] lub [ATP]/[ADP] Dęhydrogenaza pirogronianowa — a zatem i glikoli/a — jest więc hamowana nie tylko przez potencjał bogatoenergetyczny, lecz takŜe w warunkach, gdy zachodzi utlenianie kwasów tłuszczowych, w czasie którego zwiększają się wartości wyŜej wymienionych stosunków,.. W- -głodzeniu dochodzi do zmniejszenia ilości aktywnej formy enzymu, a po podaniu insuliny obserwuje się

214 / ROZDZIAŁ 19 Dltosfotlamlna w formie karbanionu

S

C=Ć-CH,-CH,- O-®-®

C H -{ C H S ) 4 -C O O -

DEHYDROGENAZA PlROGFIONIANOWA

Oifosforiydroksyetylotiamina DEHYDflOGENAZA P1R0GR0NIAN0WA

DEHYDFIDGENAZA PIROGRONIANOWA

Związek pośredni

ACETYLOTRANSFERAZ O A II CnA-S-C-CHjCKHYDHOLIPONWNOWA

Utleniony lipoamid

O II S -C — CH 3

Aoetytolipoamld

Aeetylo-CoA.

[4

Zredukowany lipoamid

DEHYDROGENAZA DIHYDflOLIPONIANOWA NAD*

NADH

Ryc. 19-5. A. Dekarboksylacja oksydacyjna pirogronianu przez kompleks dehydrogertazy pirogronianowej, B, Kwas liponowy. Kwas li porto wy jest połączony wiązaniem amidowym z resztą lizyny acetylotransferazy będącej składnikiem kompleksu enzymatycznego. _____________________________________________________

zwiększoną aktywność w tkance (ale me w wątrobie).

iwej

Zahamowanie utleniania pirogronianu prowadzi do kwasicy mleczanowej Arsenin i jony rtęciowe, kompleksując grupę — §H kwasu liponowego, hamują dehydrogenazę pirogronianową i, tak jak niedobór tiaminy w diecie, powodują nagromadzenie się pirogronianu. NiedoŜywieni alkoholicy mają 7wykte niedobór darniny i jeŜeli poda się im glukozę, to dochodzi do szybkiego nagromadzania się

pirogronianu i kwasicy mleczanowej, często śmiertelnej. Kwasica mleczanowa, zwłaszcza po obciąŜeniu glukozą, jest jednym z objawów u osób z dziedzicznym niedoborem dehydrogenazy pirogronianowej. Opisano wady genetyczne dotyczące niemal kaŜdego z enzymów metabolizujacych węglowodany; kaŜda z nich jest związana z odpowiednią chorobą u ludzi. Dziedziczny niedobór aldolazy A oraz niedobór kinazy pirogroniano wej w erytrocytach wywołuje niedokrwistość hemolityczną.

GUK0L1ZA I UTLENIANIE PiROGRONIANU / 215 Piróg ronian

B

Piróg ronlan ATP

PDH -a-(Aktywny DEFOSFOEN2YM)

PDHb (nieaktywny FOSFO ENZYM)

Insulina (w tkance tłuszczowej) NAD ł

GcA H,0

Ryc. 19-6. Regulacja dehydrogenazy piróg roni a nowej (PDH). Strzałki faliste dotyczą efektów allo-sterycznych. A — regulacja przez hamowanie produktami końcowymi, B — regulacja przez wzajemną przemianę postaci aktywnej i nieaktywnej enzymu.

Utlenienie cząsteczki glukozy dostarcza 38 mol ATP w warunkach tlenowych i tylko 2 mol ATP w nieobecności tlenu Gdy 1 cząsteczkę glukozy spali się w kalorymetrze do CO2 i wody, uwolni się ok. 2780 kJ ciepła. Gdy utlenianie zachodzi w tkankach, wówczas część tej energii nie jest rozpraszana bezpośrednio w postaci ciepła, lecz zostaje „zachowana" w postaci bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych. KaŜdej _ cząsteczce glukozy utlenionej do CO2 i wody to~warzyszy ^wytworzenie—3fr-vBSg.l-.ATP.—:Zakładając, Ŝe kaŜde wiązanie bogatoenergetyczne odpowiada

30,5 kJ, to energia magazynowana w postaci ATP, przypadająca na cząsteczkę utleniojieL glukozy, wynosi 1159 kJ, czyli stanowi ok. 41,7% całkowitej energii spalania. Większość ATP tworzy się podczas fosforylacji oksydacyjnej wwyniku reoksydacji zredukowanych koenzymów w łańcuchu oddechowym. Pozostały ATP jesMvytwarzany przez fosforvfaj|j^ substratową (p^oŜ3Ŝ~T^rr-W-ta^e^T^ :TpTzed^ stawiono reakcje warunkujące wytwarzanie bogatoenergetycznego fosforanu podczas utleniania glukozy i zysk energetyczny w warunkach tlenowych oraz beztlenowych.

216 / ROZDZIAŁ 19 Tabela 19-1. Wytwarzanie bogatoenergetycznych wiązań fosfo ran owych podczas kata boi iz mu glukozy Reakcja, którą Sposób Liczba ~ (J) Szlak katalizuje: wytwarzania tworzonych na przemian mol glukozy Giikoliza

Dehydrogenaza gliceraldehydo- Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym -3-fosforanowa Kinaza fosfoglicerynianowa Fosforylacja substratowa

2

Kinaza pirogronianowa

2

6

Fosforylacja substratowa

10 ZuŜycie ATP w reakcjach katalizowanych przez heksokinazę i fosfofruktokinazę Zysk

Dekarboksylacja Kompleks dehydrogenazy oksydacyjna pirogronianowej

Cykl kwasu cytrynowego

-2 8

Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym

6

Dehydrogenaza izocytrynianowa Dehydrogenaza a-ketogiutaranowa

Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym Utlenienie 2 NADH w tańcuchu oddechowym

6

Tiokinaza bursztyntanowa Detiydrogenaza bursztynianowa

Fosforylacja substratowa Utlenienie 2 FADH2 w łańcuchu oddechowym

2

Dehydrogenaza jabłczanowa

Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym

6

4

Zysk Ogólny bilans w warunkach tlenowych Ogólny bitans w warunkach beztlenowych

6

30 38

2

' Przyjęto, Ŝe NADH powstający w glikolizie przekazuje wodory do wnętrza mitochondriów przy udziale mostka jabłczanowego (p. ryc. 14-15). Przy uŜyciu mostka fosfoglicerynianowego powstałyby tylko 2 ~ © na mol NADH, stąd całkowity zysk wyniósłby 36 zamiast 38. W kalkulacji pominięto niewielką stratę + ATP (ok, 1 mol ATP) wynikającą z transportu do wnętrza mitochondriów H z pirogronianem oraz ł podobnego transportu H w działającym mostku jabłczanowym

PIŚMIENNICTWO Boitcux A, Hess B: Design of glycolysśs. Phil Trans

R Soc LonOm 3 imO93i5. Blass JP: Disorders of pyriwate metabolism. Neurology 1979;29:280. Boyer PD (editor): The Enzymes, 3rd ed. Vols 5—9. Academic Prcss, 1972. Dickens F, Randle PJ, Whelan WJ (editors): Carbohydrate Mewholism and Its Disorders. 2 vols. Acadcmic Press, 1968.

Greenberg DM {editor): MetaboHc Patkways, 3rd ed, Vol. 1. Academic Press, 1967. Randle PJ, Steiner DF, Whelan WJ (editors): Carbohydrate Metabolism and Its Disorders. Vol 3. Academic Press, 1981. Scriver CR (editor); MetaboHc Basis of Inherited Disease. McGraw HjU, óth ed. 1989. Sols A: Multimodulation of enzymeactivity. Curr Top Celt Reg 1981;19:77. Veneziale CM (editor): The Regulatwn ofCarbohydrate Formation and Utiiizaiion in Mammals. University Park Press, 1981.

Metabolizm glikogenu

20

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Glikogen jest główną formą magazynowania węglowodanów u zwierząt i jest odpowiednikiem skrobi u roślin. Występuje głównie w wątrobie (do 6%) i w mięśniach, gdzie rzadko przekracza 1%. Jednak mięśnie, z powodu duŜej masy, zawierają 3—4-krotnie większy zapas glikogenu niŜ wątroba (tab. 20-1). Glikogen, podobnie jak skrobia, jest rozgałęzionym polimerem ot-glukozy (p. ryc. 15-15). Tabela 20-1. Magazynowanie węglowodanów u przeciętnego dorosłego człowieka (70 kg) w stanie postabsorpcyjnym Glikogen wątroby Glikogen 4,0% = 72 g' 0,7% = 245 g* mięśni Glukoza 0,1% = 10 g" pozakomórkowa

327 g Masa wątroby 1800 g Masa mięśni 35 kg Całkowita objętość 10 I

kogenu i odkładaniem nieprawidłowych postaci glikogenu, co prowadzi do osłabienia mięśni, a nawet zgonu. GLIKOGEN WYSTĘPUJE GŁÓWNIE W MIĘŚNIACH I W WĄTROBIE W szlaku biosyntezy glikogenu bierze udział specjalny aktywny nukleotyd glukozy (p. ryc. 20-1) ' Glukoza jest fosibrylowana do glukozo-6-fosforanu w reakcji, która jest równieŜ pierwszą reakcją szlaku glikolizy z glukozy. Ta reakcja jest katalizowana przez beksokinazę w mięśniu i przez glukakinaze w wątrobie. Glukozo-6-fosforan jest zmieniany w glukozo-1-fosforan w reakcji katalizowanej prze2 fosfoglukomutazę. Sam enzym jest fosforylowany w przebiegu reakcji, a grupa fosforanowa bierze udział w reakcji odwracalnej, w której związkiem pośrednim jest glukozo-l,6-bisfosforan. Enz-P + Glukozo-6 fosforan <-t ♦* Enz + Glukozo-1,6-bisfosforan «■»

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Glikogen mięśni jest łatwo dostępnym źródłem jednostek heksozowych do glikolizy w samym mięśniu. Glikogen wątroby głównie magazynuje i eksportuje jednostki heksozowe w celu utrzymania fizjologicznego stęŜenia glukozy we krwi, zwłaszcza między posiłkami. Po 12—18 h głodzenia wątroba staje się niemal zupełnie pozbawiona glikogenu, podczas gdy glikogenu w mięśniach znacznie ubywa tylko po długotrwałym intensywnym wysiłku. Choroby spichrzania glikogenu są to dziedziczne zaburzenia, charakteryzujące się wadliwą mobilizacją gli-

*+ Enz-P + Glukozo-1-fosforan Następnie glukozo-1-fosforan reaguje z ury.dynotriibsforanem (UTP), aby utworzyć urydyaodifosfoglukozę (UDPGic)* {ryc. 20-2).

* Są równieŜ znane i inne związki będące nukleozydodifosfopochodnymi cukrów, up. UDPGal. Ponadto ten sam cukier moŜe być połączony z róŜnymi nukleotydami, np. glukoza moŜe być przyłączona do urydyny Gak to pokazano powyŜej), aie takŜe do nukleotyd u guanozy nowego, tymidy nowego, adenozyno w ego lub cytydynowego.

218 / ROZDZIAŁ 20 (jednostki

Gllkogen (jednostki glukozylowe 1 -*i i 1 -*6)

SYNTAZA Enzym rozgałęziający GUKOGENOWA Insulina

I

i©

glukozylowe 1-UDP . Prlmer ^ gllkogenu

Q

ł

©

_cAMP ------- ~—*Ą

TRANSFERAZA G L ENZYM ODGAŁĘZIAJĄCY L J KANOWA

Glukagon Adrenalina

ATP

FOSFORYLAZA

U rydyno d ifosf ag I u ko za (UDPGIc) KINAZA K

Wolna glukoza z enzymu odgałęziającego Do gltkollzy I szlaku pentozofosforan ADP oweg o MgI+ USLUKOKINAZA GI u k oz o-1 ATP FOSFOGL UKOMUTA GI u kozo6-łostoran H,0

NUKLEOZYDODH * -

FOSFORANOWA

GLUKOZO-6-FOSFATAZA

ADP

14 Glukoza

Ryc. 20-1. Szlak glikogenogenezy i glikogenolizy w wątrobie. 2 bogatoenergetyczne fosiorany są zuŜywane przy wbudowaniu 1 mola glukozy w glikogen. © — pobudzenie, © — hamowanie. Insulina zmniejsza stęŜenie cAMP jedynie wówczas, gdy było ono uprzednio zwiększone działaniem glukagonu lub adrenaliny, tzn. jest antagonistą ich działania. Glukagon działa na mięsień sercowy, ale nie na mięśnie szkieletowe. "Transferaza glukanowa i enzym odgałęziający wydają się być 2, oddzielnymi aktywnościami tego samego enzymu.

Reakcja pomiędzy glukozo-1-fosforanem i urydynotrifosforanem jest katalizowana przez Uracyl enzym pirofosforylazę UDFGlc.

.CHjOH

H/ł—OH

UTP + Glukozo-1-fosforan « UDPGIc + PP.

IY3H HZ II II HO^rfO-P-O— P-O-CH T^^ I H OH O"

i O"

Następująca potem hydroliza nieorganicznego pirofosforanu pod wpływem nieorganicznej Ryboza pirofosfatazy przesuwa reakcję na prawą stronę równania. Ryc. 20-2. Urydynodifosfoglukoza {UDPGIc).

Glukoza T

Dlfosforan

Urydyna

METABOLIZM GLIKOGENU / 219

Działaniem enzymu syntazy glikogenowej, C, aktywnej, glukozy UDPGlc tworzy wiązanie glikozydowe z C4 końcowej reszty glukozowej glikogenu, uwalniając urydyn od i fosforan (UDP). Aby zainicjować tę reakcję, musi być obecna istniejąca juŜ wcześniej cząsteczka glikogenu, czyli primer. Sam primer (wymawiaj prajmer) glikogenu moŜe być utworzony na szkielecie białkowym, co moŜe być procesem podobnym do syntezy innych glikoprotein (p. rozdz. 57). UDPGlc + (C6)„ -* UDP + (C6)n+1 Glikogen

Glikogen

Częścią mechanizmu rozgałęziania jest odłączenie istniejących juŜ łańcuchów glikogenu Dodawanie reszty glukozy do istniejącego juŜ łańcucha glikogenowego, czyli primera, nastęP.ujej!3._ nieredukującym zewnętrznym końcu cząsteczki tak, Ŝe „gałęzie" „drzewa" glikogenu wydłuŜają sie wraz z sukcesywnym po wsta waniem wiązań I ->4 fryc. 20-3), Gdy łańcuch zostanie przedłuŜony do co najmniej 11 reszt glukozowych, wówczas inny enzym, enzym rozgałęziający (amylo [l-+4i->[l->6]-łransglukozydaza) przenosi część łańcucha I ->4 (długości co najmniej 6 reszt glukozowych) na sąsiedni łańcuch, tworząc wiązanie l-*-6 i ustanawiając w ten sposób punkt rozgałęzienia w cząsteczce. Rozgałęzienia wzrastają poprzez dalsze dodawanie jednostek l-»4 glukozylowych i dalsze rozgałęzienia. Wraz ze zwiększeniem liczby nieredukujących reszt końcowych zwiększa się

w cząsteczce całkowita liczba miejsc zdolnych do reagowania, przyspieszając zarówno glikogenogenezę, jak i glikogenolizę. Działanie enzymu rozgałęziającego badano na Ŝywym organizmie zwierzęcym, podając glukozę znakowaną i4C, a następnie badając glikogen wątroby w odpowiednich odstępach czasu (ryc, 20-3).

GLIKOGENOLIZA NIE JEST ODWRÓCENIEM GLIKOGENOGENEZY, LECZ JEST ODRĘBNYM SZLAKIEM REAKCJI W szlaku degradacji jest zawarty mechanizm odgałęziania (p. ryc. 20-1) Etapem ograniczającym szybkość glikogenolizy jest reakcja katalizowana przez fosforytazę. (Ce ) n + Pj -* (Ce ) n-, + Glukozo-1-fosforan Glikogen

Glikogen

Ten enzym jest swoisty dla fosfor o litycznego rozkładu (fosforolizy) wiązań od-+4 w glikogenie z wytworzeniem glukozo-1-fosforanu. Z najbardziej zewnętrznych łańcuchów cząsteczki glikogenu są usuwane reszty glukozylowe, aŜ do pozostania ok. 4 reszt glukozy po kaŜdej stroaie rozgałęzienia l-*6 (ryc. 20-4). Inny enzym (a-[l->4]->a-[l -*4]-transferaza glukanowa) przenosi jednostkę trisacharydową z jednego rozgałęzienia na inne, odsłaniając punkty rozgałęzienia 1-+6. Hydroli ty czne rozbicie wiązań l->6 wymaga działania swoistego enzymu

o_o Wiązanie giukazydowe 1 -»4 o Reszty glukozy nie znakowane Oło Wiązania glukozydowe 1-*6 • Fteszty glukozy znakowane WC

Ryc. 20-3. Biosynteza glikogenu. Mechanizm rozgałęziania został wyjaśniony przez dodawanie gfukozy znakowanej 14C.

220 / ROZDZIAŁ 20 FOSFORYLAZA

TRANSFEHAZ A GLUKANOWA

ENZYM ODGAŁĘZIAJĄCY

Q_Q r

ł Reszty glukozy połączone wiązaniami (jtukozydowyml Reszty glukozy połączone wiązaniami glukozydawyml 1 -»6

Wiele kowalencyjnych modyfikacji jest spowodowanych działaniem cAMP (3', 5'-cykliczny kwas adenylowy; cykliczny AMP) (p. ryc. 20-5 i str. 594). cAMP jest wewnątrzkomórkowym pośrednikiem" albo drugim posłańcem, przez który działa wiele hormonów. Tworzy się on z ATP pod wpływem enzymu cyklazy adenylanowej, występującej na wewnętrznej powierzchni błony komórkowej. Cyklaza adenylanowa jest aktywowana takimi hormonami, jak adrenalina i noradrenalina, działającymi przez receptory P-ad ren ergi czne w błonie komórkowej, a ponadto w wątrobie glukagonem działającym przez niezaleŜny receptor glukagonu. Fosfodiesteraza rozkłada cAMP i to właśnie aktywność tego enzymu utrzymuje normalnie małe stęŜenie cAMP. Wykazywano, Ŝe insulina zwiększa aktywność tego enzymu w wątrobie, zmniejszając w ten sposób stęŜenie cAMP.

Ryc. 20-4. Etapy glikogenolizy.

odgałęziającego (amy)o-[1 -►ńj-glukozydazy). Po usunięciu rozgałęzienia moŜe postępować dalsze działanie fosforylazy. Wspólne działanie fosforylazy i wspomnianych innych enzymów prowadzi do całkowitego rozkładu glikogenu. Reakcja katalizowana przez fosfoglukomutazę jest odwracalna, wobec czego z glukozo-1-fosforanu moŜe być wytwarzany glukozo-6-fosforau, W wątrobie i w Derce (ale nie w mięśniach) "cTIzym' glukozo-6-fosfataza, który usuwa fosforan z glukozo-6-fosforanu, umoŜliwiając powstającej gJukozie dyfundowanic z komórki do krwi. Jest to końcowy etap glikogenolizy wątrobowej, która odzwierciedla się zwiększeniem stęŜenia glukozy we krwi. CYKLICZNY AMP INTEGRUJE REGULACJĘ GLIKOGENOLIZY I GLIKOGENOGENEZY Główne enzymy kontrolujące metabolizm glikogenu, tj. fosforylaza glikogenowa i syntaza glikogenowa, są regulowane przez złoŜoną serię reakcji, wśród których są zarówno mechanizmy allosteryczne (p. str. 123) jak i modyfikacje kowalencyjne, polegające na odwracalnej fosforylacji i defosforylacji enzymatycznego białka (p. str. 127).

NH,

I

;H

II

" W ■CHj

-O-P»O

■ i ■— n

/S \ \H H/ ■■■■

J ^>.

rtu

OH

Ryc. 20-5. Kwas3',5'-adenylowy (cykliczny AMP, cAMP). ____________ _________________

Fosforylaza wątroby róŜni się od fosforylazy mięsni

W wątrobig fosforylaza istnieje zarówno w postaci aktywnej, jak i nieaktywnej. Aktywna fosforylaza (fosforytaza a) ma jedną z grup hydroksylowych seryny ufosforylowaną przez wytworzone wiązanie estrowe. Działaniem swoistej fosfatazy (fbsfataza-1 białek), enzym ten zostaje unieczynniony, przez przekształcenie go w fosforylazę b, w reakcji polegającej na hydrolitycznym usunięciu fosforanu z reszty seryny. Reaktywacja wymaga refosforylacji z udziałem ATP i swoistego enzymu kinazy fosforylazy.

METABOLIZM GLIKOGENU / 221

Mięśniowa fosforylaza jest immunologicznie i genetycznie odmienna od wątrobowej. Jest dimerem, a kaŜdy monomer zawiera 1 mol fosforanu pirydoksalu. Występuje w..2 postaciach, jako fostoryla/a a, która jest ufosforylowana i aktywna zarówno w obecności, jak 1 nieobecności AMP (jej allosterycznego mody fikatora), oraz fosforylaza b, która jest zdefosforylowana i aktywna jedynie w obecności AMP, co ma miejsce w czasie wysiłku, kiedy stęŜenie AMP się zwiększa. Fosforylaza a jest normalną fizjologicznie aktywną formą enzy mu. Aktywacja mięśniowej fosforylazy odbywa się z udziałem cAMP Fosforylaza w mięśniu jest aktywowana przez adrenalinę (ryc. 20-6)! JednakŜe nie jest to .działanie bezpośrednie, lecz przez eAMP. Zwiększenie stęŜenia cAMP aktywuje cAMP-zaleŜną kinazę białek, enzym o raczej szerokiej swoistości. Ta kinaza katalizuje fosforylację, z udziałem ATP, nieaktywnej kinazy b fosforylazy do aktywnej kinazy a fosforylazy, która z koJei przez kolejną fosforylacje aktywuje fosforyiazę b do fosfory Jazy a. Nieaktywna cAMP-zaleŜna kinaza białek ma 2 pary podjednostek. kaŜda para składa się z podjednostki regulacyjnej (R), która wiąŜe 2 mol cAMP, oraz podjednostki katalitycz nej (C), która ma miejsce aktywne. Połącze nie z cAMP powoduje dysocjację komplek su R 2 C 2 , uwalniając aktywne monomery C (p. str. 596). B,Ca + 4cAMP »2C + 2{R~cAMPt) Nieaktywny Aktywny enzym enzym 2

Ca synchronizuje aktywację fosforylazy ze skurczem mięśnia Glikogenoiiza wjnigśniu^ zwiększa się kilkasetkrotnie bezpośrednio po rozpoczęciu skurczu mięśnia. Przyczynia się do tego szybka aktywacja kinazy fosforylazy przez CaJ~., ten sam sygnał, który inicjuje skurcz. Mięśniowa kinaza fosforylazy ma 4 typy podjednostek: ot, (J, y i 5, w strukturze, którą moŜna, przedstawić jako (apy§)4. Podjednostki a i p mają reszty seryny, które są fosforylowane wskutek działania cAMP-zaleŜnej kinazy białek. Podjednostka p wiąŜe 4 Ca2+ i jest identyczna z białkiem wiąŜącym Ca2+ — kalmoduliną (p. str. 595). Związanie Ca2ł aktywuje katalityczne miejsce

podjednostki y jedynie wówczas, gdy cząsteczka znajduje się w zdefo'sforylowanej konfiguracji b. JednakŜe ufosforylowana postać a jest w pełni aktywna w obecności Ca2 + . Jest waŜne, źe kalmoduiina jest podobna w swojej strukturze do TpC, białka wiąŜącego Ca2+ w mięśniach. Dodatkowa cząsteczka kalmoduliny lub TpC moŜe oddziaływać z kinaza fosforylazy, powodując dalszą aktywację. Aktywacja skurczu mięśnia i glikogenolizy jest więc dokonywana przez to samo białko wiąŜące Ca2+, zapewniając w ten sposób synchronizację tych procesów. Glikogenoiiza w wątrobie moŜe być niezaleŜna od cAMP Pomimo, Ŝe głównym działaniem glukagonu w wątrobie jest powodowanie powstawania cAMP i aktywacja fosforylazy, badania wykazały, Ŝe receptory a, są głównymi pośrednikami pobudzenia glikogenolizy przez aminy katecholowe. Bierze w tym udział niezaleŜna od cAMP mobilizacja Ca3+ z mitochondriów do cytozolu, w następstwie czego następuje pobudzenie wraŜliwej na CV + kalniotfullnę kinazy fostorylary. NiezaleŜną od cAMP glikogenolizę wywołują równieŜ wazopresyna, oksytocyna i angiotensyna II, działające przez wapń albo przez fosfatydyloinozytolobisfosforan, Inaktywacja fosforylazy następuje pod wpływem fosfatazy-1 białek Zarówno fosforylaza a, jak i kinaza a fosforylazy są defosforylowane i inaktywowane przez fosfatazę-1 białek. Fosfataza-ł białek jest hamowana przez białko zwane inhibitorem-1 które jest aktywne jedynie wówczas, gdy zostanie ufosforylowane działaniem cAMP-zaleŜnej kinazy białek, W ten sposób cAMP kontroluje zarówno aktywację, jak i inaktywację fosforylazy (ryc. 20-6). Aktywność syntazy glikogenowej i fosforyłazy są regulowane wspólnie (p. ryc. 20-7) Podobnie jak fosforylaza, syntaza glikogenowa występuje w stanie ufosforylowanym i nie ufosforylowanym. JednakŜe, odmiennie niŜ w przypadku fosforylazy, aktywną formą jest zdefosforylowany enzym (syntaza a glikogenowa), który moŜe być zinaktywowany do syntazy b glikogenowej przez fosforylacje 7 reszt seryny wskutek działania co najmniej 6 róŜnych kinaz białek. Wszystkie 7 miejsc fosforylacji znajduje się na kaŜdej z 4 identycznych podjednostek

Ryc. ZO-6. Kontrola fosforylazy w mięśniu (n = liczba reszt glukozy). Ciąg reakcji ułoŜonych jako kaskada pozwala na zwielokrotnienie (wzmocnienie) sygnału hormonal nego na kaŜdym etapie, _________

B 73

Adrenalina

O N

/t-recepior

□

© Aktywna cyklaza adenytanowa

Nieaktywna cyklazaadenylanowa

G!lkogen|rg

+ |F05FOOIESTERAZA I ATP Nieaktywna KINAZA BIAŁEK ZALEśNA ODcAMP

G!lkogen(B+11

cAMP ----------------------------------------------*■ 5'-AMP

Aktywna KINAZA BIAŁEK ZALEśNA OOeAMP FOSFOHYLAZA a (aktywna)

lnhlbttor-1 (nieaktywny)

ATP-

KALMODULINOWY SKŁADNIK KINAZY FOSFORYLAZY

FOSFATAZA-1

KINAZA a FOSFORYLAZY (aktywna)

KINAZA b FOSFORYLAZY (nieaktywna)

BIAŁEK

FOSFORYLAZA b (nieaktywna)

ADP FOSFATAZA-1 BIAŁEK lnhlbltor-1 ufoeforylowany (aktywny)

Glukozo-1 -fosforan

METABOLIZM GLIKOGENU / 223 Adrenalina /(-receptor Aktywna eyklaza adenylanowa

Nieaktywna eyklaza ---------adenylanowa

O F05F0DIESTERAZA ATP ATP

cAMP SYNTAZA b GLIKOGENOWA (nieaktywna)

0

Nieaktywna KINAZA BIAŁEK ZALEśNA OD CAMP Glu kozo-6-fosforan

KINAZA FOSFATAZA FOSFORYLAZY BIAŁEK

•- 5' A MP SYNTAZAa GLIKOGENOWA (aktywna)

Aktywna KINAZA BIAŁEK ZALEśNA OD cAMP

J

Ca

Gllkogenln] + UDPG

lnhlbltor-1 nieaktywny) KINAZA BIAŁEK ZALEśNA OD KALMODULINY ADP

FOSFATAZA-1 BIAŁEK

lnhlbltor-1 u fosfory Iow any (aktywny)

Ryc. 20-7. Kontrola syntazy glikogenowej w mięśniu (n = liczba reszt glukozy). Ciąg reakcji ułoŜony w kaskadę powoduje wzmocnienie na kaŜdym etapie, pozwalając na to, Ŝe zaledwie nanomolowe ilości hormonu powodują znaczne zmiany stęŜenia glikogenu, GSK — kinaza -3, -4 i -5 syntazy glikogenowej, węŜykowate strzałki — aktywacja allosteryczna.

enzymu. Dwie spośród wspomnianych kinaz białek są zaleŜne od Ca2 + ,/kalmoduliny (jedna z nich to kinaza fosforyiazy). Inna z kinaz to cAMP-zaleŜna kinaza białek, która pozwala na to, aby działanie hormonalne wywierane za pośrednictwem cAMP powodowało hamowanie syntezy glikogenu, zsynchronizowane z aktywa-

cją glikogenolizy. Pozostałe kinazy są znane jako kinaza-3, kinaza-4 i kinaza-5 syntazy glikogenowej. Glu kozo - 6-fo sfora n jest allosterycznym aktywatorem syntazy b glikogenowej, powodującym zmniejszenie Km dla UDP-glukozy i pozwalającym na syntezę glikogenu pod wpływem u fos fory Iow a nego enzymu. Glikogen wywiera

takŜe hamujące działanie na tworzenie siebie samego, a insulina takŜe pobudza wytwarzanie glikogenu w mięśniu przez sprzyjanie defosforylacji i wobec tego aktywacji syntazy b glikogenowej. Defosforylacja syntazy b glikogenowej zwykle odbywa się podczas działania fosfatazy-1 białek, która pozostaje pod kontrolą cAMP-zaleŜnej kinazy białek (ryc. 20-7).

224 / ROZDZIAŁ 20

REGULACJA METABOLIZMU GLfKOGENU JEST EFEKTYWNA DZIĘKI RÓWNOWADZE MIĘDZY AKTYWNOŚCIAMI SYNTAZY GLfKOGENOWEJ I FOSFORYLAZY (p. ryc. 20-8) Syntaza glikogenowa i fosforyiaza są zarówno pod kontrolą substratów (przez allosterię), jak i pod kontrolą hormonalną. Nie tylko fosforylaza jest aktywowana przez zwiększenie stęŜenia cAMP (przez kinazę fosforyiazy), ale w tym samym czasie syntaza glikogenowa jest zamieniana w postać nieaktywną; obydwa skutki osiąga się za pośrednictwem cAMP-za-

Adrenalina (wątroba.

leŜnej kinazy białek. Wobec tego zahamowanie glikogenolizy wzmaga efektywną glikogenogeneze, natomiast zahamowanie glikogenogenezy zwiększa netto glikogenolizę. Istotne dla regulacji metabolizmu glikogenu jest stwierdzenie, Ŝe defosforylacja fosfory]azy a, kinazy fosforyiazy i syntazy b glikogenowej dokonuje się wskutek działania 1 enzymu o szerokiej swoistości — fosfatazy-1 białek. Z kolei fosfataza-1 biatek jest hamowana przez cAMP-zaleŜną kinazę białek poprzez inhibitor-1 (ryc, 20-8). Wobec tego synchronicznie moŜe zostać przerwana glikogenoliza, a wzmoŜona glikogenogeneza i odwrotnie, poniewaŜ kluczem do regulacji obydwóch tych procesów jest aktywność cAMP-zaleŜnej

FOSFODIESfTERAZA

■*» cAMP

-*- 5-AMP

lnhlbllor-1

KINAZABWLEK ZALEśNA OD OAMP

Glukoza (wątroba)

Inhibitor 1 ufosiorylowany

Byc. 20-8. Skoordynowana kontrola glikogenotizy i glikogenogenezy przez kinazy biatek zaleŜne od cAMP. Reakcje, które prowadzą do gtikogenolizy, w rezultacie zwiększenia stęŜenia cAMP/zaznaczono grubymi strzałkami, a te, które są hamowane, zaznaczono przerywanymi strzałkami. Dzieje się odwrotnie, gdy stęŜenie cAMP zmniejsza się w wyniku aktywności f osf od testera zy, co prowadzi do glikogenogenezy.

METABOLIZM GLIKOGENU / 225

kinazy białek. Zarówno kinaza fosforylazy, jak i syntaza glikogenu mogą być odwracalnie fosforyiowane w więcej niŜ 1 miejscu przez odrębne kinazy i fosfatazy. Te wtórne fosforylacje modyfikuj;} wraŜliwość pierwotnych miejsc fosforylacji na fosforylację i defosforylaeję. Jest to znane jako wielomiejscowa fosfory lacja, Głównym czynnikiem, który kontroluje metabolizm glikogenu w wątrobie, jest stęŜenie fosforyłazy a Ten enzym jest nie tylko etapem ograniczającym szybkość glikogenolizy, lecz takŜe jest inhibitorem aktywności fosfatazy-1 białek, przez co kontroluje syntezę glikogenu (ryc. 20-8). Inaktywacja fosforylazy zachodzi jako wynik all o sferycznego hamowania przez glukozę wówczas, gdy jej stęŜenie zwiększa się po posiłku. Aktywacja jest powodowana pr2ez 5'AMP jako reakcja na wyczerpanie się ATP. Podanie insuliny powoduje niezwłoczną inaktywację fosforylazy z następującą aktywacją syntazyglikogenowej. Do osiągnięcia tych działań insuliny niezbędna jest obecność glukozy. Enzymy rozgałęziający i odgałęziający nie są regulowane. CHOROBY SPICHRZANIA GLIKOGENU SĄ DZIEDZICZNE Termin „choroba spichrzania glikogenu" jest ogólną nazwą uŜywaną do opisania grupy zaburzeń dziedzicznych, charakteryzujących się odkładaniem nieprawidłowego rodzaju lub nieprawidłowych ilości glikogenu w tkankach. W typie 1 glikogenozy (choroba von Cierkego) zarówno kpjnórkj wątroby, jak i komórki kanalików krętych nerki są^ w charakterystyczny sposób przeładowane glikogenem. JednakŜe te magazyny glikogenu me są dostępne, co uwidacznia się występowaniem hjgoglikemii i brakiem uwalniania glukozy pod wpływem takich bodźców, jak adrenalina lub glukagon. U chorych tych obserwuje się takŜe ketozę i hiperlip.emiL.co jest charakterystyczne~aTa"Ófgai)izmu pozbawionego węglowodanów. W wątrobie, nerce i w ścianie jelit aktywność glukozo-6-fosfatazy jest skrajnie mała lub w ogóle jej nie ma. Typ II (choroba Pompego) jest zgubny i charakteryzuje się niedoborem lizosomalncj a-l-»4i l-*6-glukozydazy {kwaśnej maltazy), której 15 — Biochemia

funkcją jest degradowanie glikogenu nagromadzającego się w Uziomach. Typ 11.1 (graniczna dekstrynoza; choroba Forbesa albo Coriega) charakteryzuje się brakiem enzymu odgałęziającego, co powoduje nagromadzanie charakterystycznego rozgałęzionego polisacharydu. Tj_pJV (amylopektynoza: choroba Andersena) wynika z nieobecności enzymu rozgałęzi ającego^czego rezultatem jest to, Ŝe gromadzi się polisacharyd mający niewiele punktów rozgałęzienia. Zgon następuje zwykle w pierwszym roku Ŝycia z powodu niedomogi serca lub wątroby. Brak mięśniowej fosforylazy (miofosforylazy) jest przyczyną glikogenozy typu V (glikogenoza z niedoboru miofosforylazy; zespół McArdle'a). Chorzy wykazują zwykle znacznie zmniejszoną tolerancję na wysiłek. ChociaŜ ich mięśnie szkieletowe wykazują nienormalnie duŜą zawartość glikogenu (2,5—4,1%), w krwi tych chorych po wysiłku wykrywa się tylko w niewielkim stęŜeniu mleczan lub teŜ całkowicie go brak. Wśród chorób spichrzenia glikogenu opisano takŜe niedobór fosforyiazy w wątrobie (typ VI; choroba Hersa), niedobór fosfofruktokinazy w mięśniach i w erytrocytach (typ VII; choroba TaruPego) oraz glikogenozę, w której występuje niedobór wątrobowej kinazy fosforylazy (typ VIII). Donoszono równieŜ o niedoborach kinazy adenylanowej i cAMP-zaleŜnej kinazy białek.

PIŚMIENNICTWO Cohen P: Conirol ofEnzyme Acthity, 2nd ed. Chapman & Hali, 1983. Cohen P: Thc role of protein phoaphorylation in the hormonal control of enzyme activity. Eur J Biochem 1985; 151:439. Exton JH: Molecular mechanisms involved in a-adrenergic responses. Mol Cel! Endocrinoi 1981; 23:233. Geddes R: Glycogcn: A metabolic viewpoint. Bioscience Rep 1986;6:415. Hers HO: The control of glycogen metabolism in the liver. Annu Rev Biochem 1976;45:167. Randle PJ, Steiner DF, Whelan WJ (editors): Carbohydrate Metabolism and Its Disorders. Vol 3. Academic Press, !98i. Siriver CR et al (editor): The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6th ed. McGraw-Hill, 1989. Sperlmg t), de Vries A (editors): Inborn Errors of Metabolism in Man. Karger, 1978.

21

Glukoneogeneza i kontrola stęŜenia glukozy we krwi Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE W procesie glukoneogenezy_ uczestniczą wszystkie "mechanizmy ~i s~zlaki odpowiedzialne za przekształcenie związków nie węglowo danowych.w glukozę lub glikogen,_Gtówny_mi_s_ubstratami dla glukoneogeMeŜy są glikogenne aninokwasy, mleczan, glicerolj (istotny u przeŜuwaczy) propionian. Głównymi tkankami. w których odbywJTśię ten proces, są wątroba ingJŁjgdyŜ one właśnie zawierają pełen zestaw niezbędnych do tego enzymów. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Glukoneogeneza zaspokaja zapotrzebowanie organizmu na glukozę wówczas, gdy. węglowodany nie są dostępne w wystarczającej ilości z dostarczanych pokarmów. Ciągłe dostarczanie glukozy jest niezbędne jako źródło energii, zwłaszcza dla układu nerwowego i dla erytrocytów. PoniŜej pewnego krytycznego stęŜenia glukozy we krwi występuje zaburzenie czynności mózgu, które w warunkach cięŜkiej hipoglikemii moŜe prowadzić do śpiączki i zgonu. Glukoza jest takŜe potrzebna w tkance tłuszczowej jako źródło glicerolu glicerydów i prawdopodobnie odgrywa rolę w utrzymaniu odpowiedniego stęŜenia związków pośrednich cyklu cytrynianowego w wielu tkankach. Wiadomo, Ŝe nawet w warunkach, w których tłuszcze mogą pokrywać większość zapotrzebowania energetycznego organizmu, zawsze istnieje pewne podstawowe zapotrzebowanie na glukozę. W dodatku glukoza jest jedynym źródlem.snergii dla mięśnia szkieletowego w warunkach beztlenowych. Jest_ prekursorem cukru mleka_

( ą X i y X ^ J l ^ J ^ ę i pobierana przez płód. EodfiS!^ glukoneogenezy są takŜe usuwane z krwi produkty metabolizmu innych tkanek, np. mleczan wytwarzany przez mięśnie i erytrocyty oraz glkerol, który jest stale wytwarzany przez tkankę tłuszczową. Propionian. główny glikogenny kwas tłuszczowy, wytwarzany podczas trawienia węglowodanów przez przeŜuwacze, jest najwaŜniejszym, substratem glukoneogenezy u tych gatunków. GLUKONEOGENEZA OBEJMUJE REAKCJE GLIKOLIZY, CYKLU CYTRYNIANOWEGO ORAZ NIEKTÓRE REAKCJE SPECJALNE (p. ryc. 21-1) Bariery termodynamiczne zapobiegają prostemu odwróceniu glikolizy Krebs zwracał uwagę na to, Ŝe bariery energetyczne nie pozwalają na proste odwrócenie glikolizy: 1) pomiędzy pirogronianiem a fosfoenolopirogronianem, 2) pomiędzy fruktozo-1,6-bisfosforanem a fruktozo-6-fosforanem. 3} pomiędzy glukozo-6-fosforanem a glukozą: oraz 4) pomiędzy glukozo-1-fosforanem a glikogenem. Wszystkie te reakcje nie są w stanie równowagi, uwalnla}ą~cl:uŜą ilość energii w postaci ciepła i wobec tego są fizjologicznie nieodwracalne. Są one omijane poprzez specjalne reakcje.

Pirogronian i fosfoenolopirogronian. W mitochondriach znajduje się enzym karboksylaza pirogronianowa, który w obecności ATP, jednej z witamin B — biotyny. — oiaz^COi,. przekształca pirogronian w szczawiooctan. Funkcją biotyny jest związanie CO3 na enzymie

GLUKONEOGENEZA I KONTROLA STĘśENIA GLUKOZY WE KRWI / 227

przed przyłączeniem go_do pirogronianu. Drugi :iuj m karLoi^^4ft»z»fo^enolopirogroriiano wa, katalizuje przekształcenkjzczawiogctan.u. do rosibepolopirogroiuanu. W tej reakcji jest niezbedjLy.bogato-energetyczny fosforan w postaci GTP lub-ITP. a uwalnia.si? GO.. Wobec tego, za pomocą tvch 2 enzymów i dehydrogenazy mleczanowej, mliyTan moŜt- hyć ^ ^ p goięrjia^kury i królika W-wa karboksykinaza fosfoeri ol ii)ii rtwwMua.no.wa jest enzymem mi loch ond Halnym i fosfoenolopirogronian jest transportowany do cytozolu w celu przekształcenia go w fruktozo- 1,6-bisfosforan przez odwrócenie glikolizy. U szczura i u myszy len cnzvm jest w cvlo7ohi. a 1 e.. szcza wi noc ran nie dyCuadiĄ]e]a^twQ.iLJJiaQdig.ndriów, Dostępne są natomiast alternatywne środki do osiągnięcia tego samego skutku końcowego; polegają one na przekształceniu szcza wio octan u w związki, które mogą łatwo dyfundować z mitochondriów, i późniejszej rekonwersji do szczawiooctanu w pozamitochondrialnej części komórki. Takim związkiem jest jabłezan, którego tworzenie ze szczawiooctanu w mi loch on dri ach i rekonwersja do szczawiooctanu w pozamitochondrialnym kompartmencie przebiega z udziałem dehydrogenazy jabłezanowej. W_w^trobje_człoi i i i k ^ morskiejj_wołu_teiL enzym jest chojidrjaroi -i Qtazolem. Fruktozo-6-fosforan i fruktozo-1,6-bisfosforan. P£zekszUiceni£_iruklozo-l,ć-bisfosibraiiu ..do. fruktozo-ń-fosforanu konieczrie_ dq_osiagnięcia odwrócenia ^likolizy^ jest katalizowane przez swoisty enzym fruktozJir.lU6-bisfosfąt^S. Jest to kluczowy enzym takŜe z innego punktu widzenia, poniewaŜ jego obecność warunkuje _.to, czy dana tkanka jest /dolna do biosyntezy glikogenu nie tylko z pirogromanu, lecz takŜe z fosfotrioz. Enzym len \vy stępuje, w. wątrobie i w iiertctch, wykazano jego występowanie takŜe w mięśniu szkieletowy ni. U w;iŜa się, ze nie występuje on w mięśniu .serc.uw^KLLW mięśniu"gładkim. Glukozo-6-fosforan i glukoza. jYz_e r k_sztaicenie—gJukjOZOj^fosforanu _w__jgl_ukozę jest _ katalizowane przez inna .aiwrintTi fncfalsizę glukozo-6-fosfatazc. Występuje ona hi i \« nerkąf h ale nie ma jej w mięśniu i w tkance tłuszczowej. Obecność jej podwala tkance na_oddawaiiie„glukQzy do krwi. Glukozo-1 -fosforan i glikogen. Roz-

talizowany przez fosforylaze. Biosynteza glikogenu odbywa się całkiem odmiennym szlaJdem, przez utworzenie urydynodifosfoglukozy i z udziałem syntazy glikogenowej (p. ryc: 20-1). Te kluczowe enzymy pozwalają na to, Ŝe odwrócenie glikolizy odgrywa zasadniczy rolę w glukoneogenezie. ZaleŜności między gluko..neagenezą a flakiem glik o litycznym przedstawiono na ryc. 21-1. Aminokwasy glikogenne po transaminacji lub dcaminacji tworzą albo pirogronian. albo stają się członami cyklu kwasu cytrynowego. Wobec tego powyŜej opisane reakcje są odpowiedzialne za przekształcenie w glukozę lub glikogen zarówno aminokwasów glikogennych, jak i mleczanu. Wiadomo, Ŝe mle-_ cjąn przekształca się w pirogronian i wnika do mitochondriów przed przekształceniem do szczawiooctanu i ewentualnym przekształceniem w glukozę. Propitmian jest głównym źródłem glukozy u przeŜuwaczy i wchodzi do głównego szlaku glukoneogenezy przez cykl kwasu cytrynowego po przekształceniu w sukcynylo-CoA. _Pxapio-niań jest najpierw aktywowany z udziałem ATP i CoA przez odpowiednią syntetazę acylo-CoA. Propionylo-CoA, produkt tej reakcji, uczestniczy w reakcji wiązania -CQ^ katalizowanej przez karboksylazę propionylo-CoA, czego wynikiem jest wytworzenie D^jnelyljQnia=..... lonyb-CoA (ryc. 21-2). Ta reakcja jest analogiczna do reakcji wiązania CO2 do acetylo-CoA przez karboksylazę acetylo-CoA (p. rozdz. 23), w której powstaje pochodna malonylowa, co wymaga udziału jednej z witamin — biotyn^ — jako koenzymu. D-Metylomalonylo-CoA musi być zamieniony w jego stereoizomer L-metylomalonylo-CoA przez racemaze mety-lomalonylo-CoA, zanim nastąpi ostateczna izomeryzacja do sukcynylo-CoA. katalizowana przez izomerazę metylomalonylo-Co A, wymagającą witaminy B12 jako koenzymu. Wynikiem niedoboru witaminy B12 u ludzi i zwierząt jest wydalanie duŜych ilości metylomalonianu (acy-duria metylomalonowa). ChociaŜ przemiana do bursztynianu jest głównym szlakiem metabolicznym propionianu, to jednak moŜe on zapoczątkowywać, w tkance tłuszczowej i gruczole sutkowym, wytwarzanie kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgla. Kwasy tłuszczowe C, 5 i C 17 znajdują się w tłuszczach, zwłaszcza u przeŜuwaczy. Glicerol jest produktem metabolizmu tkanki tłuszczowej i tylko te tkanki, które mają enzym

228 / ROZDZIAŁ 21

J!gLUKOZt>6-f OSFATAZA |j H2O

Glukoza

ATP

oiu i««o-

JGLUKOKINAZAl

o- ^ s ^_

| HEKSOKIKAZA]

Aop

j

-fosforan

J?

t Glikogen AMP FHUKTOZO-1,6B(SFOSFATAZA

rp

FruktozoH|,6-blsfosforan"

\e \

AMP

A

T

e

fFOSFOFRUKTOKINAZA

Gliceroloaldshyd o3- fo sf o ran

ADP Fruktozo- „_^ ___ CAMP - 2.6-btefosforan (glukagon)

FruWozo-^6-blsfosforan e

! cAMP (glukagon)

P-dihydroksyacetor; DEKYDHOGENA2A KADH GLICEROLO-.FOSFORANOWA

1,3-BtetosfogH(»rynlan

ATP 3Foefogllcerynlan

GI!cerolo-3-fosforan KINAZA

ATP

A

2-Fo8fogllo«ynlen cAMP (glukagon; ■ Fosfoenoloplrogronian

|0

Q

/ Alanina

. GDP + CO, Plrogronlan—

L Mleczan

NADH

KARBOKSYU\ZA PtROGRONIANOWA

Cykl kwaau cylrynowago akstoglutaran

-ADP

f

/

Kwasy tłuszczowa Cytrynian

GLUKONEOGENEZA i KONTROLA STĘśENIA GLUKOZY WE KRWI / 229 Hyc. 21 -1. Główne szlaki i regulacja glukoneogenezy i glikolizy w wątrobie. Punkty wejścia giikogennych aminokwasów po ich transaminacji są zaznaczone znaczkami s—* (p. teŜ ryc. 18-7). Kluczowe enzymy glukoneogenezy są obwiedzione podwójną ramką. ATP niezbędny do glukoneogenezy powstaje w procesie utleniania kwasów tłuszczowych o długim łańcuchu węglowym. Propionian ma ilościowe znaczenie jedynie u przeŜuwaczy. WęŜykowatymi strzałkami zaznaczono efekty allosteryczne, a strzałkami z przerywaną linią — kowalencyjną modyfikację przez odwracalną fosforylację. DuŜe stęŜenia alaniny działają jak „sygnał do glukoneogenezy" przez zahamowanie glikolizy na etapie kinazy pirogronianowej. KARBOKSYLAZA I CH3 CoA»SH PROPIONYLOCoA ' H-C-COO" CO-S-Co A D-Mstytomaionylo-CoA RACEMAZA METYLOMALONYLO-CoA IZOMEHAZA coo- METYLOMALONYLO-CoA intermedlaty cyklu kwasu cytrynowego

ĆHj

"**

CH,

Koenzym B„

^OOC-Ć-H CO- S- C oA Sukcynylo-CoA

CO-S-CoA L-Metyfomalonylo-CoA

Ryc. 21-2. Metabolizm propionianu.

aktywujący go, kinazę glicerolową, mogą go zjiŜjttfeewać. Enzym ...tflii, wyTtiagaja6Ł-..AIT, znajduje się poza innymi tkankami takŜe w wątrobie i w nerce. Kinaza Hiceroinwa, ^trilizi^ie, zamianę glicerolu w glicerolo-3-ibsfonia. Łączy się to z etapem triozofosforanów szlaku glikolitycznego, gdyŜ gjicerolo^fosioran moŜe.hyi utleniony __djŁ__dih^droksyacetonofosforan\] przez NAD+ w obecności dehydrogenazy glicerolo-Ś^^^nUffief Wątroba i nerka są zdolne do zamiapy ąliceralii w -glukozc krwi dzięki y ^ y y ^ _ z y ^ i y _ zymów^jkolizy i swoistych enzymów, szlaku glukoneogenezy, fruktozo-ł,6-bisfosfatazy i glukozo-6-fosfatazy (ryc. 21-1).

GLIKOLiZA I GLUKONEOGENEZA DZIELĄ TEN SAM SZLAK. MUSZĄ BYĆ WOBEC TEGO WZAJEMNIE KONTROLOWANE Zmiany w dostępności substratów są albo bezpośrednio, albo pośrednio odpowiedzialne za większość zmian w metabolizmie. Wahania

stęŜeń substratów we krwi, spowodowane zmianami ich dostępności z pokarmów, mogą zmieniać szybkość wydzielania hormonów, które z kolei wpływają na przebieg szlaków metabolicznych, zmieniając często aktywność kluczowych enzymów w taki sposób, Ŝe dąŜą one do skompensowania pierwotnych zmian w dostępności substratu. MoŜna zidentyfikować 3 typy mechanizmów odpowiedzialnych za regulację aktywności enzymów uczestniczących w metabolizmie węglowodanów, a wymienionych w tab. 21-1: 1) zmiany szybkości syntezy enzymu, 2) kowalencyjna modyfikacja przez odwracalną fosforylację oraz 3) efekty allosteryczne.

Indukcja i represja kluczowych enzymów nie jest szybka, ale zachodzi w ciągu kilku godzin W tabeli 21-1 wymieniono niektóre z tych lepiej udokumentowanych zmian aktywności enzymów, co do których wiadomo, Ŝe zachodzą w róŜnych warunkach metabolicznych. Informacja w tej tabeli odnosi się głównie do wątroby. Enzymy tutaj zaangaŜowane katalizują reak-

230 / ROZDZIAŁ 21 Tabela 21-1. Enzymy regulacyjne adaptacyjne u szczura (głównie w wątrobie)

Aktywność przy karmie-

głodze-

niu węglowodanami

niu i w cukrzycy

Induktor

Rep resor

Aktywator

Inhibitor

Enzymy glikogenogenezy, glikolizy utleniania pirogron i anu Układ syntazy glikogenowej

t

1

Insulina

Insulina

Glukokinaza

t

1

Insulina

Glukagon (cAMP)

Fosfofruktokinaza-1

T

I

Insulina

Kinaza pirogronianowa

t

1

Insulina, fruktoza

*AMP, "fruktozo-6-fosforan, *Pj *fruktozo-2,6-bisfosforan Glukagon (cAMP) *Fruktozo-1,6-bisfosforan

Dehydrogenaza pirogron Janowa

I

I

Heksokinaza

CoA, NAD, insulina', ADP, pirogron ian

Glukagon (cAMP), fosforylaza, glikogen *Glukozo-6-fosforan 'Cytrynian (kwasy tłuszczowe, ciała ketonowe), *ATP, glukagon (cAMP) ATP, alanina, glukagon (cAMP), adrenalina Acetylo-CoA, NADH, ATP (kwasy tłuszczowe. ciała ketonowe)

Enzymy glukoneogenezy Karboksylaza pirogron i a nowa

I

T

Karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa Fruktozo-1,6-bisfosfataza

1

I

I

I

Glukozo-6-fosfa-

1

T

taza

Giukokortykoidy, Insulina glukag on, adrenalina {cAMP) Giukokortykoidy, Insulina glukagon, adrenalina (cAMP) Giukokortykoidy, Insulina glukagon, adrenalina (cAMP) Giukokortykoidy,

Insulina

glukagon, adrenalina (cAMP)

Enzymy szlaku pentozofosforanowego i lipogenezy Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa Dehydrogenaza 6-fosfoglukonianowa „Enzym jabłczanowy"

T

1

I

I

I

i

Insulina

Insulina

Insulina

*Acetylo-CoA

*ADP

Glukagon?

Glukagon (cAMP) *Fruktozo-1,6-bisfosforan, *AMP, fruktozo-2,6-bisfosforan

_________________ GLUKONEOGENEZA I KONTROLA STĘśENIA GLUKOZY WE KRWI / 231 cd. tab. 21 -1 Aktywność przy karmieniu węglowa -

głodzeniu i w cu-

Induktor

danami

krzycy

ATP-liaza cytry-

T

1

Insulina

nianowa Karboksylaza acetylo-CoA

t

I

Insulina?

Syntaza kwasu tłuszczowego

T

I

Insulina?

Rep resor

Aktywator

* Cytrynian, insulina

Inhibitor

ADP Długotań cuch owy acylo-CoA, cAMP, glukagon

Ali o sferyczny " W tkance tłuszczowej, ale nie w wątrobie

cje^nie będące w sianie równowagi i moŜna je uwaŜać raczej za fizjologicznie przebiegające :,w jedną stronę" niŜ osiągające stan równowagi. Często wymienione w niej procesy są wzmocnione, poniewaŜ aktywność enzymów katalizujących zmiany w odwrotnym kierunku ulega równoczesnym zmianom (ryc. 21-1). Jest waŜne, aby kluczowe enzymy zaangaŜowane w odpowiedni szlak metaboliczny ulegały w sposób skoordynowany aktywacji lub hamowaniu. W tabeli 21-1 pokazano, Ŝe tak jest rzeczywiście. Wszystkie enzymy uczestniczące w zuŜywaniu glukozy (tj. enzymy glikolizy i lipogenezy) stają się bardziej aktywne wówczas, gdy występuje obfitość glukozy, natomiast w tych warunkach enzymy odpowiedzialne za wytwarzanie glukozy podczas glukoneogenezy wykazują małą aktywność. Wydzielanie insuliny, które jest wraŜliwe na stęŜenie glukozy we krwi, wzmaga biosyntezę enzymów odpowiedzialnych za glikolizę. Podobnie wydzielanie insuliny przeciwdziała pobudzaniu enzym ów; odpowiedzialnych za glukoneogeneze, a zachodzącej jako efekt działania glikokortykosteroidów i cAMP powstającego pod wpływem glukagoiiu. Wszystkim tym działaniom, które mogą być wyjaśnione indukcją lub represją enzymów, moŜna zapobiec działaniem czynników blokujących biosyntezę białka, takich jak puromycyna i etionina. Wykazano, Ŝe jest regulowany mRNA tych enzymów i Ŝe zachodzi modulacja ekspresji ich genów.

Obydwie dchydrogenazy cyklu pentozofosforanowego mogą być zaliczone do enzymów adaptacyjnych, gdyŜ ich aktywność zwiększa się u dobrze odŜywionych zwierząt oraz po podaniu insuliny zwierzęciu z cukrzycą. Aktywność tych enzymów jest mała w cukrzycy i w okresie głodzenia. Podobnie zachowują się „enzym jabłczanowy" i ATP-zaleŜna liaza cytrynianowa, co wskazuje na to, Ŝe te 2 enzymy są raczej zaangaŜowane w lip o genezę niŜ w glukoneogenezę. Kowalencyjna modyfikacja przez odwracalną fosfory iację zachodzi szybko Glukagon, a_3'.imii£jszj:tn,stopniu adrenalina, hamują glikoli/ę, natomiast pobudzają glukoneogenezę w wątrobie przez zwiększenie stęŜenia cAMP, który z kolei aktywuje cAMP-zaleŜną Klnazę białek, doprowadzając do foslbrylacji i inaktywacji kinazy pirogronianowej. Obydwa te hormony wpływają równieŜ na stęŜenie fruktozo-2,6-bisf o sfor an u i w^obec tego na glikolizę i gluk one o genezę w sposób wyjaśniony poniŜej. Aliosteryczna modyfikacja jest równieŜ szybka Znane są przykłady z metabolizmu węglowodanów, ilustrujące allosteryczną regulację enzymu. W procesie glukoneogenezy synteza szczawiooetanu z wodorowęglanu i pirogroniahu, Aktora jest katalizowana przez karboksylazę

232 / ROZDZIAŁ 21

pirogi omanowy, wymaga obecności acetyl o-Co A jako aktywatora allosterycznego. Dodanie acetyl o-Co A powoduje zmianę czwartorzędowej struktury białka, zmniejszając wartość Km dla wodorowęglanu. To działanie ma waŜne następstwa dla samoregulacji przemian pośrednich: gdy powstaje acetylo-CoA z pirogronianu, przez aktywację karboksylazy pirogronianowej, zapewnia on niejako automatycznie dostarczanie szczawiooctanu i wobec tego moŜliwość swojego dalszego utleniania w cyklu kwasu cytrynowego. Aktywacja karboksylazy pirogronianowej i równoczesne hamowanie dehydrogenazy pirogronianowej przez acety-loCoA, powstający z utjeniania kwasów tłuszczowych, pomaga wyjaśnić oszczędzające działanie utleniania kwasów tłuszczowych na utlenianie pirogronianu w wątrobie i pobudzenie glukoneogenezy wątrobowej. Odwrotny stosunek między aktywnością dehydrogenazy pirogronianowej a karboksylazy pirogronianowej zarówno w wątrobie, jak i w nerce zmienia metaboliczne losy pirogronianu wówczas, gdy tkanka przechodzi z utleniania węglowodanów podczas glikolizy na gl ukoneogenezę. Taka zmiana ma miejsce przy przechodzeniu stanu poresorpcyjnego w stan głodu (ryc. 21-1). Zasadniczą rolą utleniania kwasów tłuszczowych w pobudzaniu glukoneogenezy jest dostarczanie ATP, potrzebnego w reakcjach karboksylazy pirogronianowej i kar boksy kinazy fosfoenolopirogronianowej. Innym enzymem, który podlega kontroli na zasadzie hamowania zwrotnego, jestJfosjMruk-. tokinaza (fosfofrukrokinaza-1). Zajmuje ona kluczową pozycję w regulacji glikolizy. Fosfofruktokinaza-1 jest hamowana przez cytrynian i przez ATP, natomiast jest aktywowana przez AMP. AMP działa jak wskaźnik stanu energetycznego komórki. Obecność kinazy adenylanowej w wątrobie i w wielu innych tkankach pozwala na szybkie osiągnięcie równowagi reakcji: 2ADP ATP + AMP Kiedy ATP jest zuŜywany w procesach wymagających energii, czego rezultatem jest powstawanie ADP, wtedy zwiększa się [AMP]. PoniewaŜ w stanic równowagi [ATP] moŜe być 50-krotnie większe od [AMP], małe cząstkowe zmniejszenie [ATP] spowoduje wielokrotne zwiększenie [AMP]. DuŜa zmiana w [AMP] jest zatem wyrazem tego, Ŝe działa ona jako wzmacniacz malej zmiany w [ATP]. Ten mechanizm

pozwala na to, Ŝe aktywność fosfofruktokinazy-1 jest bardzo czuła nawet na małe zmiany w stanie energetycznym komórki i Ŝe kontroluje ona ilość węglowodanów ulegających giikolizie przed wejściem do cyklu kwasu cytrynowego. Zwiększenie stęŜenia AMP moŜe być równieŜ wyjaśnieniem, dlaczego glikoliza zostaje pobudzona w czasie niedotlenienia, gdy [ATP] maleje. Równocześnie AMP aktywuje fosforylazę, wzmagając glikogenolizę. Inhibicja fosfofruktokinazy-1 przez cytrynian i ATP mogłaby być jeszcze jednym wyjaśnieniem oszczędzającego działania utleniania kwasów tłuszczowych na utlenianie glukozy, a takŜe wyjaśnieniem efektu Pasteura; ten ostatni jest zjawiskiem hamowania beztlenowego (anaerobowego) metabolizowania glukozy przez jej aerobowe utlenianie (w cyklu kwasu cytrynowego). Konsekwencją zahamowania aktywności fosfofruktokinazy-1 jest nagromadzenie glukozo-6-fosforanu, który z kolei hamuje dalsze pobieranie glukozy w tkankach po za wątrobowych przez allosteryczne hamowanie heksoldnazy.

Fruktozo-2,6-bisfosforan odgrywa wyjątkową rolę w regulacji glikolizy i glukoneogenezy Najbardziej skutecznym pozytywnym efektom cemall o sferycznym fosfofruktokinazy-1, a inhibitorem fruktozo-1,6-bis fosfatazy w wątrobie, jest fmktozo-2,6-bisfosforan. śnosj^onjha; mowanie fosfolruktokinazy-l przez ATP i powoduje zwiększenie powinowactwa do fruktozo-6-fosforanu. Powoduje trjzo-jjć-Jbisfosfatazy przez zwiększenie wartości K„, dla fruktozo-l,6-bisfosforanu. Jego stęŜenie jest zarówno pod kontrolą substratową (allosteryczną), jak i hormonalną (modyfikacja kowalencyjna) (ryc. 21-3). Fruktozo-2,6-bisfosforan powstaje przez fosforylację fruktozo-6-fo sforami działaniem ?5sfofruktokinazj-2, Zo^samo białko enzymatyczne jest odpowiedzialne równieŜ za jego rozpad, poniewaŜ ma takŜe aktywność fruktozo-lłó-bisfosfatazy. Ten bifunkcyjny enzym jest pod allosteryczną kontrolą fruktozo-6-fósTo7anu7Tćtóregó" zwiększone stęŜenie występująre~przx;pbfitości glukozy, a więc w stanie poposiłkowym pobudza kinazę oraz hamuje fosfatazę. JeŜeli natomiast występuje niedobór glukozy, glukagon pobudza wytwarzanie cAMP, aktywując cAMP-zaleŜną kinazę białek, która z kolei inaktywuje fosfofruktokinazę-2 oraz aktywuje fruktozo-2,6-bisibsfatazę przez fosforylację.

GLUKONEOGENEZA I KONTROLA STĘśENIA GLUKOZY WE KRWI / 233 Glukoza I Glikogan

Ŝe to, Ŝe gobudzeoie glikogenoUzj; glukagonem w_wątrobie prowadzi raczei do uwalniania glukozy niŜ do wzmoŜonej gtikolizy.

Cykle substratowe (daremne) pozwalają na subtelne dostrajanie KINAZA BIAŁEK ZALEśNA 00 cAMP

W wielu punktach kontrolnych glikolizy i metabolizmu glikogenu są zawarte cykle fosforylacji i defosforylacji, np. glukokinaza/glukozo-6-fosfataza; fosfofruktokinaza- l/fruktozo-1,6-bisfosfataza; kinaza pirogronianowa/karboksylaza pirogronianowa/karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa. Gdyby były one pozostawione bez kontroli, wówczas stanowiłyby ilościowo pokaźne cykle daremne, których rezultatem końcowym byłaby jedynie hydroliza ATP. To, Ŝe tak się nie dzieje na wielką skalę, zabezpieczają róŜne mechanizmy kontrolne, dzięki którym jedno ramię cyklu jest hamowane wówczas, gdy przeciwne ulegają pobudzeniu zgodnie z potrzebami tkanki i całego organizmu. JednakŜe w pewnych przypadkach moŜe istnieć korzyść z tego, Ŝe cykl przebiega swobodnie. Na przykład w cyklu foslbfruktokina-zal/fruktozo-1.6-bisfosfataza, zachodzi wzmocnienie efektu allosterycznego modyfikatora fruktozo-2,6-bisfosforan u, powodując większy przepływ metabolitów w którymkolwiek kierunku, niŜ miałoby to miejsce bez udziału cyklu substratowego. To „subtelne dostrajanie" kontroli metabolicznej zachodzi jedynie kosztem utraty pewnej ilości ATP.

Fr u Ktoz o-6-f □ sio ran Glukagon Fru ktozo-1,6-bisf osforan Piróg ronlan Ryc. 21-3. Kontrola gtikolizy i glukoneogenezy w wątrobie przez fnjktozo-2,6-bisfosforan ibifunk-Gy^hy enzym PFK-2/F-2,6-Pazę <6-fosfofrukto-2-kinazę/fruktozo-2,6-bisfosfatazę). PFK — fosfofruktokinaza (S-fosfofrukto-1-kinaza), F-1,6-Paza — fru ktozo-1,6- bisfosfataza. Strzałki węŜykowate oznaczają efekty allosteryczne.

Przy nadmiar/i- glukozy zwiększa sig więc stęŜenie fniktozu-2.(t-hisfostoriinu, pobudzając gUkolize przez aktywację fosfofruktokinazy-1 oraz hamowanie fniktoziMj6-bisfosfatazy. W warunkach niedoboru-^glukozy gkjkoneogeneza jest pobudzana przez zmniejszenie stęŜenia fruktozo-2,6-bisfosforan u, który inaktywujc fosfolr.uktoJunazę-1 oraz znosi hamowanie fruktozo-1.6-bisfostatazy. Ten mechanizm zapewnia tak-

STĘśENIE GLUKOZY KRWI JEST PRECYZYJNIE REGULOWANE W WĄSKICH GRANICACH W stanie poabsorpcyjnym stęŜenie glukozy u ludzi i u wielu ssaków waha się w granicach 4,5- 5,5 mmoi/L Pa.spoŜyc|uposiłku3!ęglmja> Hanowego moŜe się ono zwiększać do 6,5—7,2 jńmoj/L-W czasie głodzenia stęŜenie glukozy zmniejsza się do"ok, JT-PT,? mmol/l. StęŜenie glukozy we krwi ptaków jest znacznie większe (14,0 mmol/l), a u przeŜuwaczy znacznie mniejsze (2,2 u owiec a 3,3 mmol/l u bydła). Te normalnie mniejsze stęŜenia wydają się być związane z faktem, Ŝe u przeŜuwaczy właściwie wszystkie węglowodany pokarmu fermentują do niŜszych (lotnych) kwasów tłuszczowych, które w duŜej mierze zastępują glukozę jako główne metaboliczne źródło energii tkanek w okresie między posiłkami. Gwałtowne zmniej-

234 / ROZDZIAŁ 21

szenie stęŜenia giukozyjwęjawgowoduje drgawki, podobnie~jak™przy przedawkowaniu insuliny, ze względu na bezpośrednie uzaleŜnienie mózgu od dostawy glukozy. JednakŜe znacznie mniejsze stęŜenia glukozy mogą być dobrze tolerowane pod warunkiem, Ŝe pozwoli się na stopniową adaptację; np. szczury zaadaptowane do diety boga to tłuszcz owej zachowują się zupełnie normalnie przy tak małym stęŜeniu glukozy we krwi, jak 1,1 mmol/1. GLUKOZA KRWI POCHODZI Z POKARMÓW, GLUKONEOGENEZY I GLIKOGENOLIZY

Glukoza węglowodanów w spoŜytych pokarmach. Większość węglowodanów po Łtrawie-niu pokarmów~tó glukoza, galąktoza 1 fruktoza. Są one transportowane do wątroby przez Ŝyłę wrotną. G a laktoza i fruktoza są łatwo przekształcane w wątrobie w glukozę (p. rozdz. 22). Glukoza pochodząca z róŜnych związków glukogennych, które ulegają glukoneogenezie (ryc. 18-7 i 21-1). Są to związki 2 kategorii: 1) ulegające bezpośredniemu prze kształceniu w glukozę bez znaczącej recyklizacji, np. niektóre aminokwasy i propionian i 2) związki będące produktami częściowego meta bolizmu glukozy w niektórych tkankach, które po dostaniu się do wątroby i nerek są prze kształcane w glukozę. 1 tak mleczan, powstały z glukozy w mięśniach i erytrocytach, jest transportowany do wątroby i nerek, gdzie jest przekształcany w glukozę. W ten sposób ta ostatnia dostając się do krwi staje się ponownie dostępna dla tkanek do utleniania. Ten proces jest znany jako cykl Cori lub cykl kwasu mle kowego (ryc. 21-4). GUcerol do syntezy triacylogliceroli tkanki tłuszczowej pochodzi z glu kozy krwi. Acyloglicerole tkanki tłuszczowej ciągle ulegają hydrolizie, wytwarzając gjicerol, który nie moŜe być zuŜytkowany przez tkankę tłuszczową i wobec tego dyfunduje do krwi. Jest on ponownie przekształcany w glukozę przez mechanizmy glukoneogenezy w wątrobie i w nerce (ryc. 21-1). Istnieje zatem ciągły cykl, w którym glukoza jest transportowana z wątroby i nerek do tkanki tłuszczowej, a glicerol powraca z tkanki tłuszczowej do wymie nionych narządów, aby ulec resyntezie do glu kozy. Wśród aminokwasów transportowanych

z mięśni do wątroby w czasie głodzenia _p_rgewaŜa alanina! DopfowacTzifoTo do postulowania istnienia cyklu glukozowo-alaninowego. przedstawionego na ryc. 21-4, w wyniku którego glukoza z wątroby przepływa do mięśni L utworzeniem tam pirogronianu ulegającego transaminacji do alaniny. Alanina jest następnie transportowana do wątroby, aby w procesie glukoneogenezy przekształcić się ponownie w glukozę. W ten sposób dokonuje się transport azotu aminowego z mięśni do wątroby oraz wolnej energii z wątroby do mięśni. Energia potrzebna do wątrobowej syntezy glukozy z pirogronianu pochodzi z utleniania kwasów tłuszczowych. Glukoza powstająca z glikogenu, wątroby podczas glikogenolizy, (p. rozdz. 20). Metaboliczne i hormonalne mechanizmy kontroli stęŜenia glukozy we krwi Utrzymywanie stałego stęŜenia glukozy we krwi jest jednym z najbardziej precyzyjnie regulowanych mechanizmów homeostatycznych i to takim, w którym odgrywa rolę zarówno wątroba, jak i tkanki pozawątrobowe, a takŜe wiele hormonów. Przez komórki wątrobowe wydaje się swobodnie przenikać glukoza, podczas gdy komórki tkanek poza wątrobowych są dla niej stosunkowo nieprzenikalne. Wynikiem tego jest, Ŝe przechodzenie przez błony komórkowe jest etapem ograniczającym szybkość pobierania glukozy przez tkanki pozawątrobowe. Po wniknięciu do komórki glukoza jest szybko fosforylowana działaniem heksokinazy. Jest prawdopodobne, Ŝe na pobieranie glukozy przez wątrobę i jej oddawanie z wątroby do krwi bardziej bezpośredni wpływ wywierają aktywności niektórych enzymów i stęŜenia kluczowych związków pośrednich. StęŜenie glukozy we krwi jest jednak waŜnym czynnikiem kontrolującym szybkość pobierania glukozy zarówno przez wątrobę, jak i przez tkanki pozawątrobowe,

Glukokinaza jest waŜnym regulatorem stęŜenia glukozy we krwi po posiłku. NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe heksokinaza jest hamowana działaniem glukozo-6-fosforanu. Ten ostatni metabolit moŜe więc wywierać pewne hamowanie zwrotne na pobieranie glukozy przez tkanki pozawątrobowe zaleŜne od fosfory! o warna glukozy działaniem heksokinazy. Wątroba nie podlega takiemu ograniczeniu, poniewaŜ glukoki nic jest wraŜliwa na działanie gmkozo-6-

Pirogronian .* .i^—i--!-—..«•■>•—--»•»■——ii-»»'.«"i*'

Ryc. 21-4. Cykl kwasu mlekowego (Cori) i cykl ala ni nowo- glukozowy.

236 / ROZDZIAŁ 21 .100 Heksokinaza

■

50 o o GlukoKinaza

0

5

10 15 Glukoza krwi, mmoi/1

20

25

Ryc. 21-5. Zmiany aktywności fosforylującej glukozę heksokinazy i glukokinazy w zaleŜności od zwiększającego się stęŜenia glukozy we krwi. Km heksokinazy dla glukozy wynosi 0,05 mmol/i, a Km glukokinazy 10 mmol/l.

-fosforanu. Glukokinaza, która ma większą wartość Km (mniejsze powinowactwo) dla glukozy niŜ heksokinaza, zwiększa swoją aktywność wraz ze zwiększeniem stęŜenia glukozy w przedziale fizjologicznych stęŜeń tego związku (ryc. 21-5) i wydaje się w swoisty sposób sprzyjać pobieraniu glukozy do wątroby, w przypadku jej duŜego stęŜenia występującego w Ŝyle wrotnej po posiłku węglowodanowym. Brak glukokinazy u przeŜuwaczy, u których niewiele glukozy przechodzi z jelita do krąŜenia wrotnego, wydaje się potwierdzać tę funkcję tego enzymu. Przy prawidłowym stęŜeniu glukozy w krąŜącej krwi (4,5—5,5 mmol/l), wątroba wydaje się być producentem glukozy. JeŜeli jednak stęŜenie gJukozy się zwiększa, to wydalanie glukozy przez wątrobę ustaje, a przy duŜym stęŜeniu pobiera ona glukozę z krwi. Ustalono, Ŝe u szczura szybkość oddawania glukozy przez wątrobę staje się równa szybkości pobierania przy stęŜeniu w Ŝyle wrotnej wątroby równym 8,3 mmol/l.

Insulina odgrywa centralną rolę w regulacji stęŜenia glukozy we krwi. Poza bezpośrednim wpływem hiperglikemii na pobieranie glukozy zarówno przez wątrobę, jak i tkanki obwodowe, zasadniczą rolę w regulacji stęŜenia gJukozy we krwi odgrywa hormon insulina. Wytwarzają ją komórki B wysp trzustkowych, a wydziela się do krwi wskutek bezpośredniej reakcji na hiperglikemię. Jej stęŜenie we krwi zmienia się równolegle ze stęŜeniem

glukozy, a szybkim skutkiem jej podania jest hipoglikemia. Do substancji pobudzających wydzielanie insuliny naleŜą takŜe aminokwasy, wolne kwasy tłuszczowe, ciała ketonowe, glukagon, sekretyna oraz lek tolbutamid. Adrenalina i noradrenalina blokują uwalnianie insuliny. Insulina pobudza natychmiast pobieranie glukozy przez takie tkanki, jak tkanka tłuszczowa i mięśniowa. To działanie jest spowodowane wzmoŜonym transportem przezbłonowym glukozy uwarunkowanym przeniesieniem transportera insulinowego z wnętrza komórki do błony plazmatycznej. Insulina nie ma natomiast bezpośredniego wpływu na penetrację glukozy do komórek wątrobowych. To stwierdzenie jest zgodne z faktem, Ŝe szybkość metabolizmu glukozy w komórkach wątrobowych nie jest ograniczana ich przenikalnością. JednakŜe insulina wpływa pośrednio na pobieranie glukozy przez wątrobę, działając na enzymy kontrolujące glikolizę i glikogenogenezę. Glukagon jest hormonem wytwarzanym przez komórki A wysp trzustkowych. Jego wydzielanie jest pobudzane przez hipoglikemie. Gdy dostanie się do wątroby (przez Ŝyłę wrotną), pobudza glikogenolizę przez aktywację fosforylazy. Większość endogennego giukagonu jest usuwana z krąŜenia przez wątrobę. Odmiennie niŜ adrenalina, glukagon nie ma wpływu na fosforylazę mięśni. Glukagon wzmaga równieŜ glukoneogenezę z aminokwasów i mleczanu. Zarówno glikogenoliza wątrobowa, jak i glukoneogeneza uczestniczą w hiperglikemizującym działaniu glukagonu, którego działania są przeciwne do insuliny. Przedni płat przysadki mózgowej wydziela hormony, które zwiększają stęŜenie glukozy krwi, a więc działają antagonistycznie w stosunku do insuliny. Są to: hormon wzrostu, kortykortofina (ACTH) i zapewne inne czynniki „diabetogenne". Wydzielanie hormonu wzrostu pobudza hipoglikemia. Hormon wzrostu zmniejsza pobieranie glukozy przez niektóre tkanki, np. przez mięśnie. Niektóre z tych działań mogą być nie bezpośrednie, wiadomo bowiem, Ŝe hormon wzrostu mobilizuje z tkanki tłuszczowej wolne kwasy tłuszczowe, które same zmniejszają zuŜycie glukozy. Długotrwałe podawanie hormonu wzrostu prowadzi do cukrzycy. Hormon wzrostu wywołując hiperghkemię, pobudza wydzielanie insuliny, powodując czasami wyczerpanie komórek B (i w konsekwencji cukrzycę).

GLUKONEOGENEZA I KONTROLA STĘśENIA GLUKOZY WE KRWI / 237

Glikokortykosteroidy (11-oksosteroidy) są wydzielane przez korę nadnerczy i są istotne dla metabolizmu węglowodanów. Podanie tych steroidów pobudza glukoneogenezę. Zwiększenie glukoneogenezy jest wynikiem zwiększonego katabolizmu białek w tkankach, zwiększonego pobierania aminokwasów przez wątrobę i zwiększonej aktywności amino tran sfe raz i innych enzymów wątrobowych związanych z glukoneogenezą. Ponadto glikokortykosteroidy hamują zuŜycie glukozy w tkankach pozawątrobowych, działają więc anłagonistycznie w stosunku do insuliny. Adrenalinę wydziela rdzeń nadnerczy* pod wpływem bodźców stresogennych (strach, podniecenie, krwotok, hipoglikemia, hipoksja itd.). Pobudza ona glikogenoiizę w wątrobie i mięśniu wskutek pobudzenia fosforylazy. Brak glukozo-6-fosfatazy w mięśniach sprawia, Ŝe glikogenoliza wiąŜe się z powstawaniem mleczanu, podczas gdy w wątrobie głównym jej produktem jest glukoza, co jest przyczyną zwiększenia stęŜenia glukozy we krwi. Hormony tarczycy powinny być równieŜ rozpatrywane jako wpływające na stęŜenie glukozy we krwi. Istnieją dane doświadczalne przemawiające za tym, Ŝe tyroksyna ma działanie diabetogenne, a usunięcie tarczycy przeciwdziała rozwojowi cukrzycy. ZauwaŜono równieŜ całkowity brak glikogenu w wątrobach zwierząt z tyreotoksykozą. U chorych z nadczynnością tarczycy stęŜenie glukozy we krwi na czczo jest zwiększone, natomiast jest zmniejszone u chorych z niedoczynnością tego narządu. NaleŜy jednak dodać, Ŝe u chorych z nadczynnością tarczycy utylizacja glukozy przez tkanki jest normalna lub zwiększona, natomiast u chorych z hipotyreozą jest zmniejszona. Chorzy z niedoczynnością tarczycy są znacznie bardziej wraŜliwi na hipoglikemiczne działanie insuliny niŜ osoby zdrowe lub chorzy z hipertyreozą. Glukozuria występuje wówczas, gdy jest przekroczony próg nerkowy dla glukozy Kiedy stęŜenie giukozy we krwi zwiększa się do stosunkowo duŜego, wtedy równieŜ nerka działa regulująco na glikemię. Glukoza jest wciąŜ przesączana w kłębuszkach nerkowych, ale normalnie powraca w całości do krwi, ulegając wchłanianiu zwrotnemu w kanalikach nerkowych. Wchłanianie zwrotne glukozy wbrew gradientowi stęŜeń jest energochłonne i wymaga obecności ATP w komórkach kanali-

kowych. Zdolnoić kanalików nerkowych do wchłaniania zwrotnego glukozy jest ograniczona do ok. 350 mg/min. Gdy stęŜenie glukozy we krwi jest zwiększone, ilość przesączanej w kłębuszkach nerkowych glukozy przekracza pojemność resorpcyjną kanalików nerkowych w stosunku do glukozy i wówczas stwierdza się obecność glukozy w moczu, czyli glukozurię. U osób zdrowych glukozuria pojawia się wtedy, kiedy stęŜenie glukozy we krwi Ŝylnej jest większe niŜ 9,5—10mmol/l. To stęŜenie jest nazywane progiem nerkowym dla glukozy. Glukozurię moŜna wywołać u zwierząt doświadczalnych floryzyną, która hamuje układ reabsorbujący w kanaliku. To zjawisko jest znane jako glukozuria nerkowa. Glukozuria pochodzenia nerkowego moŜe być wynikiem wrodzonych wad kanalikowych, moŜe teŜ być nabyta jako wynik procesów chorobowych. Stwierdzenie glukozurii jest często objawem cukrzycy (diabetes mellitus). Niedobór fruktozo-1,6-bisfosfatazy powoduje laktacydozę i hipogtikemię Blokowanie glukoneogenezy przez niedobór tego enzymu nie pozwala na przekształcanie w wątrobie mleczanu i innych substratów glukogennych w glukozę. Ten stan moŜe być kontrolowany przez karmienie pokarmami o duŜej zawartości węglowodanów. MOśNA SIĘ PRZEKONAĆ O ZDOLNOŚCI ORGANIZMU DO ZUśYWANIA GLUKOZY, OZNACZAJĄC JEGO TOLERANCJĘ NA GLUKOZĘ Wskaźnikiem tolerancji glukozy jest przebieg krzywej stęŜenia glukozy we krwi po podaniu określonej ilości glukozy (ryc. 21-6). Diabetes mellitus (cukrzyca, moczówka słodka) charakteryzuje się zmniejszoną tolerancją na glukozę spowodowaną niedostatecznym wydzielaniem insuliny (cukrzyca typu 1 albo cukrzyca insulinozaleŜna; ang.: insulin-dependent diabetes mellitus. IDDM). Charakteryzuje się ona zwiększonym stęŜeniem giukozy we krwi (hipergiikemia) oraz glukozuria (cukromoczem), a mogą jej towarzyszyć zmiany metabolizmu tłuszczu. Tolerancja glukozy jest zmniejszona nie tylko w cukrzycy typu I, lecz takŜe w stanach uszkodzenia wątroby oraz w niektórych zakaŜeniach, w cukrzycy typu II (cukrzycy niezaleŜnej

238 / ROZDZIAŁ 21

moŜe równieŜ wystąpić w nadczynności przysadki lub kory nadnerczy ze względu na antagonizm hormonów tych gruczołów wydzielania wewnętrznego w stosunku do działania insuliny. Insulina zwiększa tolerancję glukozy. Wstrzy-

knięcie insuliny zmniejsza zawartość glukozy we krwi i powoduje zwiększenie jej zuŜywania oraz magazynowania w formie glikogenu w wątrobie i w mięśniach. Nadmiar insuliny moŜe spowodować cięŜką hipnglikemię, prowadzącą do drgawek, a nawet do śmierci, jeŜeli nie poda się szybko glukozy. Zwiększoną tolerancję glukozy obserwuje się w niedoczynności przysadki i kory nadnerczy, co moŜna przypisać zmniejszeniu normalnego antagonistycznego działania kortyzolu w stosunku do insuliny, wskutek czego dochodzi do względnego jej nadmiaru. 1 Czas (h)

2

Ryc. 21-6. Test tolerancji glukozy. Krzywe stęŜenia glukozy we krwi osoby zdrowej i u chorego na cukrzycę po doustnym podaniu 50 g glukozy. ZauwaŜ początkowe duŜe zwiększenie stęŜenia glukozy u chorego na cukrzycę. Kryterium normalności jest powrót stęŜenia glukozy do początkowej wartości w ciągu 2 h.

od insuliny; ang.: non-insulin-dependent diabetes mellitus, NIDDM), której towarzyszy zwykle otyłość i zwiększone stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych po podaniu niektórych leków oraz niekiedy równieŜ w miaŜdŜycy. Cukrzyca

PIŚMIENNICTWO Krebs HA: Gluconeogenesis. Proc R Soc London (Biol) 1964;159:545. Ncwsholme EA, Chaliss RAJ, Crabtrcc B: Substratc cycles: Thcir role in improving sensitivity in mctabolic control. Trmds Biochem Sci 1984;9:277, Newsholme EA, Start C: Regulation in Metabolism. Wiley, 1973. Pagliara AS et al: Hepatic fruL-tose1,6-Diphosphatase deficiency, a cause of laciic acidosis and hypoglycemia in infaticy. ■/ Ciin Invest 1972;51:2l 15. Pilkis SJ, El-Maghrabi MR, Claus TH: Hormonal rcgulation of licpaiic gluconeogenesis and glycolysis. Anrtu Rev Biochem 1988;57:755. Watford M: What is the metabolic fate of dietary glucosc? Trends Biochem Sci 1988;13:329.

Szlak pentozofosforanowy oraz inne szlaki przemiany heksoz

22

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Szlak pentojofosforanowy aie generuje ATP, ale spełnia '2 główne tuli keje: l)j&#miuza NADJffl dk takich redukujących syntez, jak Biosynteza kwasów tłuszczowych i steroidów oraz 2) dostarcza rybozy do biosyntezy nuklcotydówTkwifsow riukieinowych. Glukoza, fruktoza i galaktoza są ilościowo najwaŜniejszymi heksozami wchłanianymi z pfzewodu pokarmowego. Pochodzą one odpowiednio ze skrobi, sacharozy i laktozy zawartych w poŜywieniu. Specjalne szlaki metaboliczne rozwinęły się, zwłaszcza w wątrobie, do przemiany fruktozy i galaktozy w glukozę. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Niedobory pewnych enzymów szlaku pentozofosforanowego są główną przyczyną hemoiizy erytrocytów, występującej w jednym z typów niedokrwistości hemolitycznej Głównym zaangaŜowanym w tym enzymem jest dehydrogenaza glukozo6-fosfora nowa. AŜ u 100 min ludzi na świecie moŜna wykazać genetycznie uwarunkowane małe stęŜenie tego enzymu. Głównymi szlakami metabolicznymi zuŜywanja glukozy są glikoliza i szlak pentozofosforano"włl~- ilościowo mniej znaczące, ale bardzo waŜne dla wydalania obcych organizmowi związków (ksenobiotyków) w postaci glukuronidów jest wytwarzanie kwasu glukuronowego z glukozy w szlaku kwasów uronowych. Zaburzenia tego szlaku są przyczyną samoistnej pentozurii. Całkowity brak jednego z enzymów tego szlaku

u wszystkich naczelnych sprawia, Ŝe kwas askorbinowy (witamina C) jest niezbędnym składnikiem pokarmu dla ludzi, ale nie dla większości ssaków. Niedobory enzymów metabolizmu fruktozy .i galaktozy prowadzą do takich chorób metabolicznych, jak samoistna fruktozuria i galaktozemia Fruktoza bywa uŜywana w Ŝywieniu pozajelitowym, ale w duŜym stęŜeniu moŜe ona powodować uszczuplenie puli nukleotydów adeninowych w wątrobie i martwicę wątroby. SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY WYTWARZA NADPH ORAZ RYBOZĘ Szlak pentozofosforanowy (spięcie heksozomo no fos fora nowe) jest alternatywną drogą utleniania glukozy. Jest to proces wielocykliczny, w którym z 3 cząsteczek glukozo-6-fosforanu powstają 3 cząsteczki CO2 i 3 reszty 5węglowe. Te ostatnie zostają tak przetworzone, Ŝe regenerują się z nich 2 cząsteczki glukozo--6fosforanu i wytwarza się 1 cząsteczka związku pośredniego glikolizy — gliceraldehydo-3-foslbranu. PoniewaŜ z 2 cząsteczek giiceraldehydo-3-fosforanu moŜe regenerować glukozo-6- fosforan, w szlaku pentozofosfora nowym moŜe zachodzić całkowite utlenienie glukozy. +

3(Glukozo-6-fosforan) + 6 NADP -» -> 3 COa + 2 (Glukozo-6-fosforan) + - Gliceraidehydo 3-fosforan + 6 NADPH + + + 6H

240 / ROZDZIAŁ 22

pentozofo sfora nowego akceptorem wodoru jest NAPD, a nie NAD. Sekwencję reakcji szlaku moŜna podzielić na

KOLEJNE REAKCJE SZLAKU PENTOZOFOSFORANOWEGO ZACHODZĄ W CYTOZOLU

2 etapy: oksydacyjny i nieoksydacyjny. W pierw-

szym glukozo-6-fosforan ulega odwodorowanhi i dekafboksylacji, przechodząc w pentoze — rybulozo.-5-fosforan. W drugim etapie rybulozo-5-fosforan ulega przekształceniu z powro-

Enzymy^szlaku pentozofosforanowego, podobnie jak TglikoTizy, znajdują się w cytozolu. Utlenianie, tak jak w glikolizie, odbywa się przez oSwodorowanie, jednakŜęjw przypadku szlaku

HjO V lub Ca" HYDROLAZA GLUKONOLAKTONOWA

f

NADP NADPH+H^ HO-C-H

HO-C-H

H-Ć-

6- f

osi o g lukonolakton

DEHYDROGENAZA GLUKOZO-6-FOSFORANOWA

OH I HO-Ć-H

4

COO" H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH 6-Fosfogtukonlan

Q H-

— NADP1

C-OH I

DEHYDROGENAZA 6FOSFOGLUKDNIANOWA

H-i ---- 1

Mg 1 ; Mn ! ; lub Ca**

CHj-O-l ^D-G lu kozo-6-fosfo ran

NADPH + H+

11

H-C-OH

CH,OH

KETOIZOMERAZA RYBOZO-S-FOSFOflANOWA

CHOH

I

i

C=O H-C-OH H-Ć-OH

c=o H-CH-C-OH i

C-OH H-C-OH H-C-OH i

CH, -O -(P ) Rybulozo-5-fosforan

C H , - 0 - ( F Forma enotlowa i

3-Kato-B-f

oafogl u ko n la n 3-EPIMERAZA HYBUL020-5-F0SF0RAN0WA

*CH2OH i

HO-C-H H^ t^1^ (JM >

H-C-

H-C

O -T - H H^C-OH

Ć

K syl u I o zO-5-f osf o r an

CHj-O-

OH H-C-OH

Rybozo^Si-ftwfora n

Sadoheptu loŜo -7-f osto ra n K

H- C-OH

"CH2-O~®

Gl

lcaraldehydo-3-tosfo ra n

PRPP Ryc. 22-1. Szlak pentozofosforanowy.

P ------ POf,

PRPP — 5-fosforybozylo-i-pirofosforan.

SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 241

"CH.OH

-f

HOJC-H

H-"Ć-OH Sliceraldehyda-

•CHjOH

•3-1o«toran

|THANSALDOLAZA|

H-Ć-OH ~*____ H-Ć-OH H-Ć-OH H-C = O H-ĆCH,-O-® Sadoheplulozo- OH H-Ć-OH

T

7-fosforan

*CHaOH

4

CH, -O-(P)

O C H

H-^t-OH H-iC-OH ł

CH,0H

ć

FruktoiD-6-iosforan

Etyt roz o-4-1o sto r an

HO-C-H H-Ć-OH

CH,-O-
| TRAN8KET0LAZA Tlamlrw- ®j Mg' ł

H-C=O H-C-OH

Ryc. 22-1 cd. Szlak pentozofosforanowy,

CH,-O-® SilcerakJBhydo-3-fosłofan

ćo HO-C-H H-C-OH H-Ć-OH FruKtozo-S-losforan

■

tem_dp5!ukozQ-i-ibsforanu w całej serii reakcji, głównie z udziałem 2 enzymów; transkętotazy UransaMolazy (ryc. 22-1). Etap oksydacyjny wytwarza NADPH Odwodorowanie glukozo-6-fo sforanu do 6fosfoglukonianu zachodzi przez utworzenie 6fosfoglukonolaktonu katalizowane przez dehydrogentizę glukQzo-6-fo$foranową, enzym zaleŜny od NADP. Hydrolizę 6-fosibglukonolaktonu katalizuje hydrolaza glukonol a klonowa Drugi etap oksydacyjny jest katalizowany przez dehydrogenazę 6-fosfoglokonianową, która potrzebuje NADP+ jako akceptora wodoru. Dalej następuje dekarboksyjacja_z_ wy tworzeniem kelopentozy — rybuiozo-5-ibsforanu. Reakcja zachodzi prawdopodobnie w 2 etapach przez związek pośredni 3-keto-6-fosfoglukonian. Etap nieoksydacyjny wytwarza

prekursory rybozy Rybulozo-5-fosforan jest substratem dla 2 róŜnych enzymów, 3-Epimeraza ryhulozo-5-fosforanowa zmienia konfiguracje wokół C3, twol<>

Biochemia

rząc epimer ksylulozo-5-fosforan będący ketopentozą, Ketoizomeraza rybozo-5-fosforanowa zamienia rybulozo-5-fosforan.w odpowiednią aldopentoze, rybozo-5-fosforan. Transketolaza przenosi jednostkę 2-węglową zawierającą węgle 1. i .2 ketozy na aldehydowy węgiel cukru — aldozy. Powoduje ona .zatem zamianę cukcu ketozj w aldozę uboŜszą-o-2-atomy węgla, a równocześnie zamienia cukier aldozę w ketozę bogatszą o 2 atomy węgla. Reakcja wymaga udziału jednej z witamin B — darniny — jako koenzymu w postaci difosforanu tiaminy, a takŜe jonów Mg2:. Przenoszona jednostka 2-weglowa jest prawdopodobnie glikolaldehydem związanym do difosforanu tiaminy, tzn. jest „aktywnym glikolaldehydem". Transketolaza katalizuje więc przeniesienie opisanej jednostici"2*węglowej z ksylulozo-5-fosforanu na ryb ozo-5-fosforan, tworząc 7-węgiową ketozę sedoheptulozo-7-fosforan oraz aldozę gliceraldehydo-3-fosforan. Te 2 produkty wchodzą następnie w inną reakcję, znanąjakotransaldolacja. Transaldolaza umoŜliwia przeniesienie jednostki 3-węglowej „ak-

242 / ROZDZIAŁ 22 Glukozo-6-fosforan -

GI ukozo-6-fosf o ran

Gl ufco zo-6-fosforan

-N AD P*

NADP*

DEHYDROGENAZA GLUKOZO-6-FOSFORANOWA

*■ NADPH

- NADPH

6-Fosfogukonlan

NADP

>■ NADPH + H*

e-Fosfoflukonian

6-Fosfoglukonian

NADP*

- NADP*

ł

NADP*

DEHYDROGENAZA 6-FOSFOGLLJKON1ANOWA »

NADPH + H

+

Ryb u lozo-5-tostoran

NADPH+ H* k

1i ^ CO2

^"

NADPH

* CO, Rybulozb-5-taatoran

COj

Rybulozo-S-fosfcran

C, |3-EPIMERA2A~|

KETOIZOMERAZA

| 3-EPIMERA2AJ

Rybozo-5-f osf o ra n

Ksylulozo-5-fosforan

Ksytu lozo-S-tosf o ran C TRANSKETOLAZA

f

Gllcef aldehyd o-3-fosforan Ci 1 TRANSALDOLAZA

Sedoheptulazo-7-fosforan C,

f Fruktozo-6-fosloran C«

Erytrozo-4-tosforan

TFIANSKETOLAZA Gl I ce r aldehyd o-3-f o sfa ra n Fru ktoz o-6-f osfo ran

ALDOLAZA

IZOMERAZA FOSFOHEKSOZOWA

IZOMEHAZA FOSFOHEKSOZOWA

IZOMERAZA FOSFOTRIOZOWA

, Fruklozo-1,6-btefosforanu FHLTKTOZO-1,6-BISFOSFATAZA /j Fruktozo-6-fosforanu IZOMEHAZA FOSFOHEKSOZOWA

GI ukozo-6-fostoran

Gl ukozo-6-fosforan

Vj Glut
Ryc. 22-2. Schemat przebiegu szlaku pentozof osforan owego i jego połączeń ze szlakiem glikolizy.

SZLAK PEIMTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 243

tywnegodihydroksyacetonu" (węgli l-3)_zketo- dehydrogenazy ghitaminianowej, albo zreduzy, którą1 jest sedoheptulozo-7-fosforan, na al- kowanego glutationu w erytrocytach. Jest pradozę gliceraldehvdo-3-fosforan. aby_utworzyć wdopodobne, Ŝe obecność aktywnej lipogenezy ketozę — fruktozo-6-fosforan i 4-węglową al- albo układu zuŜywającego NADPH pobudza rozkład. glukozy w szlaku pentozofosforanodozę — ery trozo-4-fosforan. Następnie zachodzi dalsza reakcja, znów wym. ZuŜywanie NADPH dostarcza bowiem z udziałem transketolazy, w której ksylulozo-5- NADP, którego stęŜenie jest normalnie bardzo mafe ze względu na nierównowagowy charakter Ti JFuŜy jako da_w_c_a „aktywnego gli pierwszych reakcji szlaku. RównieŜ synteza kolaldehydu". W tym przypadku utworzony uprzednio eryfrozo-4-fosforan jest akcpptnjeay ■ dehydrogenaz glukozo-6-fosforanowej i 6-fosProduktami wymienionej reakcji są fruktozo-6-- foglukonianowej moŜe być indukowana przez insulinę wydzielaną w warunkach związanych fosforan i gIiccraldehydo-_3-fosforan. ze „stanem sytości" (tab. 21-1). Aby glukoza u legia_ całkowitemu utlenieniu do CO, w szlaku pentozofosforanowym, nie- h i Ryboza moŜe być syntetyzowana j bJ ™ tkance enzymów przek sz t nic aj ą c y e h gl i ce ra I dc h y d o - 3 - fo s f oran w g lu - we wszystkich tkankach SzJak pentozo fosforan o wy dostarcza ryhozy j^zo-6-fosforan..Są to enzymy szlaku giikolizy, dz^aja^e.\£o£LwŁQinyjn kierunku, i dodatkowo do syntezy nukleotydów i kwasów nukleinoenzym glukoneogenezy frtiktozo-l,6-bisfosfata- wych (ryc. 22-1). Źródłem jes.t rybozo-5-fas^ foran. który reaguje z ATP, tworząc PRPP Ł-A. Schemat tego szlaku przedstawiono na rye. uŜywany w biosyntezie nukleotydów (p. str. 427). Tkanka mięśniowa ma bardzo niewielkie ilości dehydrogenaz glukozo-6-fo sfora nowej 2 najwaŜniejsze szlaki katabolizmu i 6-fosfoglukonianowej. Mięsień szkieletowy, glukozy mają niewiele ze sobą podobnie jak większość innych tkanek, jest wspólnego jednak zdoiny do syntetyzowania rybozo-5-fosChociaŜ niektóre metabolity są wspólne, np. foranu na potrzeby syntezy nukleotydów. Odglukozo-6-fosforan, to jednak szlak pectozobywa się to przez odwrócenie nie oksydacyjnego i etapu szlaku pentozofo sfora nowego z uŜyciem ^xJ£liJq "DTI^jerue następuje w pierwszych reakcjach fruktozo-6-fosforanu. Oznacza to, Ŝe nie jest Z udziałcin~RKDP. a nieNAD. a CO3, który konieczny kompletny funkcjonujący szlak penw ogóle nicjeśt produktem giikolizy, jest chara- tozofosforano wy, aby tkanka mogła syntetyzokterystycznym pr^ukteatszłafea=--pentozofos- wać fosforany rybozy. Ryboza nie jest znaczącym składnikiem krąfofahowego. ATP nie powstaje w szlaku pentozofos fora nowym, podczas gdy jego generacja Ŝącej krwi. Wobec tego tkanka musi sama jest zasadniczą funkcją giikolizy. Fosforany zaspokajać zapotrzebowanie na ten waŜny prerybozy powstają w szlaku pentozo fosforano- kursor nukleotydów. wym, ale me w glikolizie. RównowaŜniki redukujące są wytwarzane w tych tkankach, które są wyspecjalizowane w syntezach redukujących Oznaczenia aktywności szlaku pentozofosforanowego w róŜnych tkankach wskazują na jego znaczenie metaboliczne. Jest on aktywny w wątrobie, tkance tłuszczowej, korze nadnerczy, w tarczycy, erytrocytach, jądrze i w gruczole sutkowym w okresie laktacji. Brak jest jego _le sutkowym po_ga okresem wn"^ występuje w mięśniu szkielet o wy rn. Wszystkie tkanki, w których ten szlak"jest aktywny, zuŜywają NADPH do syntez redukujących, np. do syntezy kwasów tłuszczowych, steroidów, aminokwasów szlakiem

SZLAK PENTOZOF0SF0RAN0WY WSPOMAGA PEROKSYDAZĘ GLUTATIONOW Ą W OCHRONIE ERYTROCYTÓW PRZED HEMOLIZĄ Szlak pentozofosforanowy w erytrocytach dostarcza NADPH do redukcji utlenionego glutationu (G-S-S-G) do glutationu zredukowanego (2G-SH). Redukcja ta jest katalizowana przez reduktazę gluta tionową. enzym będący flawoproteiną zawierającą FAD. Z kolei zredukowany glutation usuwa H 2 O 2 z erytrocytu w reakcji katalizowanej przez peroksydazę gtutationową, enzym zawierający pierwiastek śladowy selen.

244 / ROZDZIAŁ 22 +

GLUKURONIAN, PREKURSOR PROTEOGLIKANÓW I SPRZĘGNIĘTYCH GLUKURONIDÓW, JEST PRODUKTEM SZLAKU KWASU URONOWEGO

W szlaku-kwasu.JirQn.owJego„.glu;kuronian pQWStaje-z,_glukQzy w wyniku reakcji pokazanych na ryc. 22-3. Glukozo-6-fosforan jest przekształcany w glukozo-1-fosforan, który następnie reaguje z urydynotrifosforanem (UTP), tworząc aktywny nukleotyd — urydynodifosloglukozę (UDPGlcK Ta ostatnia reakcja jest katalizowana przez enzym urydylilotransferazę glukozo-1-fosforanowa (polifosfory!azę UT3F' glukozową). Wszystkie etapy, aŜ do tego miejsca, są identyczne z tymi, które uprzednio opisano jako szlak glikogenogenezy w wątrobie. UDPGlc jest utleniana w dwuetapowym procesie do glukuronianu. Produktem utleniania, które jest katalizowane przez dehydrogenazę UPPglukozową, jest UDP-glukuronian. UDP-gliikuroman jest „aktywną" formą glukuntnianu w reakcji whudowywania glukuronianu w proteoglikany lub dla reakcji, w których glukuronian jest sprzęgany z takimi substratami, jak hormony steroidowe, niektóre leki lub bilirubina (p. ryc. 34-13). W NADPH-zaleŜnej reakcji glukuronian jest redukowany do L-gulonianu {ryc. 22-3). Ten ostatni związek jest bezpośrednim prekursorem askorninianu u zwierząt zdolnych do syntetyzowania tej witaminy. U człowieka i innych naczelnych, jak równieŜ u świnki morskiej, kwas askorbinowy nie moŜe być syntetyzowany ze względu na brak enzymu oksydazy [-oulonolaktonowej. Gulonian jest utleniany do 3-keto-L-gulonianu, który jest dekarboksylowany do pentozy — L-ksylulozy. Związkiem pośrednim szlaku pentozofosforanowego jest D-ksyluloza. W reakcjach przedstawionych na ryc. 22-3 z ketogulonianu powstaje natomiast L-izomer ksylulozy. W celu połączenia tych 2 szlaków niezbędne jest przekształcenie L-ksylulozy do jej izomeru D. Zachodzi ono w wyniku NADPH-zaleŜnej redukcji do ksylitolu, który jest następnie utleniany w reakcji NAD-zaleŜnej do D-ksylulozy, Ten ostatni związek, po przekształceniu do D-ksylulozo-5-fosforanu jest dalej metabolizowany w szlaku pentozofosforanowym.

Poza opisanymi wyŜej głównymi szlakami metabolizmu glukozo-6-fosforanu istnieje szlak,- w którym -glukoza, jest przemieniana w kwas glukuronowy, kwas askorbinowy i pentozy, nazywany szlakiem kwasu uranowego. Jest on takŜe alternatywnym szlakiem utleniania glukozy, ale, podobnie jak szlak pentozofosforanowy, nie prowadzi do wytwarzania ATP.

Przerwanie ciągłości szlaku kwasu uranowego jest powodowane wadami enzymatycznymi i przez niektóre leki W samoistnej pentozurii, rzadkiej chorobie dziedzicznej, pojawiają się w moczu, znaczne ilości L-ksylulozy. Obecnie się uwaŜa, Ŝe przyczyną tego jest brak u chorych z pentozurią enzymu niezbędnego do przeprowadzenia redu-

G-S-S-G + NADPH + H —. 2G-SH + NADP+ REDUKTAZA OLUTATIONOWA FAD

G-S-S-G + 2H,0

2G-SH +

PEROKSYDAZA GLUTATIONOWA SELEN

Ta reakcja jest waŜna, poniewaŜ nagromadzenie H2O2 moŜe skrócić czas Ŝycia erytrocytów, zwiększając szybkość utlenienia hemoglobiny do methemoglobiny. W niektórych populacjach występuje mutacja charakteryzująca się niedoborem dehydrogenazy di!ki>/i>-6-fosforanowej, czego konsekwencją są zaburzenia w wytwarzaniu NADPH. To zaburzenie charakteryzuje się hemolizą erytrocytów wówczas, gdy osobnik z tą wadą jest naraŜona na działanie takich utleniaczy, jak lek przeciwzimniczy — prymachina, kwas acetylosalicylowy lub sulfonamidy, albo spoŜywa pewien gatunek fasoli (Viciafaba — fawizm). Peroksydaza glutationowa jest naturalnym przeciwutleniaczem znajdującym się w wielu tkankach. Oprócz H3O2, działa ona równieŜ na nadtlenki organiczne. Razem z witaminą E jest częścią układu ochronnego przeciw peroksydacji lipidów (p, str. 185). Donoszono o związku między występowaniem niektórych nowotworów a małym stęŜeniem selenu we krwi i (lub) małą aktywnością peroksydazy glutationowej. Oznaczanie aktywności transketolazy we krwi odzwierciedla stopień niedoboru tiaminy. Jedynym stanem, w którym aktywność tego enzymu jest zwiększona jest niedokrwistość złośliwa.

SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 245 3-Keto-L-gulonian

PKOFOSFO HYDRO LAZA UDPGIc

Urydyn od ifosf og iu koza (UOPGlc)

9

O

c-o-

c-o-

HO-C-H Ć=0 H-C-OH HO-Ć-H -

c=o H-C-OH HO-Ć-H L-Kiylulon

Urydynodlfosfoglukuronian

HO-Ć-H HO-C-H H-C-OH HO-Ć-H

*CH;OH

•CHjOH C-Gulonlan

Szczawian

+

C02

Glikolan L-GulonolaMon 4 BLOK U NACZELNYCH ^~ Aldehyd gllkolowy I SWWW MORSKIEJ BLOK D- Ksyl u loŜo -1 -f osf o ran W PENTOZURI! 2-Keto-L-gulonoiakton

t

t

+

NADP

H-C- OH ĆH,OH KsyMol

I

•CHjOH

*CH2OH HO-C-H

BLOK U CZŁOWIEKA i

NADPH + H+

J>

C=O HO-Ć

HO-C H-Ć H O - C - H

H-Ć-OH HEDUKTAZA 0ĆHsOH ATp KSYLULOZOWA

O [2H]

HO-Ć-H D-Ksyjuloza •ĆH,OH

J_

L-Askorbinlan

C

0=Ć 0=Ć HĆ HOĆ-H

AOP ' D-Ksylu L-Dehyd roaekor bl nlan

lozo-5-fosfo ran

Szła

ntozofwfo

Rye. 22-3. Szlak kwasu uranowego. * — losy węgla 1 glukozy, © ------ P03

kcji L-ksylulozy do ksylitolu. Pozajelitowe podanie ksylitoJu moŜe prowadzić do oksalozy, łącznie z odkładaniem się złogów szczawianu wapnia w mózgu i w nerkach. Wynika to z przekształcenia D-ksylulozy do szczawianu, przez kolejne tworzenie ksylulozo-1-fosforanu, aldehydu glikolowego i glikolanu. RóŜne leki wzmagają szybkość wchodzenia glukozy do szlaku kwasu uronowego, np. podanie barbitalu lub chlorobutanolu szczurom powoduje znaczne zwiększenie przekształcania glukozy do glukuronianu, L-gulonianu i askor-

binianu. Donoszono, Ŝe aminofenazon i fenazon zwiększają wydalanie L-ksylulozy u osób z pentozurią.

SPOśYCIE DUśYCH ILOŚCI FRUKTOZY MA GŁĘBOKIE KONSEKWENCJE METABOLICZNE SpoŜycie pokarmów o duŜej zawartości sacharozy jest przyczyną duŜego napływu fruktozy (i glukozy) do Ŝyły wrotnej i wątroby.

246 / ROZDZIAŁ 22 ATP

Gllkogen

Gtu kozo-6-fosf □ ran

i GLUKOZO-6-

tZOMERAZA FOSFOHEKSOZOWA

DEHYDROGENAZA

Ffuktozo-6-fosforan

FflUKTOZO-1,6BISFOSFATAZA

FOSFOFRUKTOKINAZA BLOK PRZY SAMOISTNEJ FRUKTOZURII

t

Fruttozo-I-fosforan

Fru ktozo-1 ,&- blstosf c ran

BLOK PRZY DZIEDZICZNEJ NIETOLERANCJI FRUKTOZY [ALDOLAZA B| Fosto dłhyd roKsyacełon

[ALDOLAZA A | 1ALDOLAZA"B1

IZOMERAZA FOSFOTRIOZOWA

ATP

Gllcer a H ehyd o-3-fosforan

D-Oileeraldenyd

| TRIOZOKINAśA] 2-Fosfagllcerynlan

Plrogronlan Ryc. 22-4. Metabolizm fruktozy, Aldolaza A znajduje się we wszystkich tkankach, z wyjątkiem wątroby, w której występuje jedynie aldotaza B.

Fruktoza znacznie szybciej niŜ glukoza ulega

glikolizie w wątrobie. Jest to spowodowane tym, Ŝe omija ona etap metabolizmu glukozy katalizowany przez fosfofniktokinazę. Na tym etapie zachodzi bowiem kontrola metaboliczna szybkości katabolizmu glukozy. Pozwala to na pobudzenie przez fruktozę szlaków metabolicznych w wątrobie, prowadzących do wzmoŜonej syntezy kwasów tłuszczowych, estryfikacji kwasów tłuszczowych i wydzielania VLDL oraz do

zwiększenia stęŜenia triacylogliceroli w surowicy krwi. Nadmiar glukozy^dostający się do krwiobiegu, pobudza wydzielanie insuliny, co wzmaga wszystkie w. procesy. Fruktoza moŜe być fosforylowana do fruktozo -6-fo sfora mi. Proces ten jest katalizowany przez ten sam enzym - heksokjnazę, który katalizuje fosforylaqe glukozy (lub mannozy) {p. ryc. 22-4), JednakŜe powinowactwo tego enzymu do fruktozy jest bardzo małe w porów-

SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 247

naniu z powinowactwem do glukozy. Dlatego wydaje się mało prawdopodobne, aby to była główna droga zuŜytkowania fruktozy. Inny enzym,^fi]!^ctokinaza^wystcpujący_w wąJrobae_katalizuje przeniesienieTósfbranu z ATP na fruktozę, ale z wytworzeniem fruktozo-1-fhsŁiraiiu. Jego występowanie wykazano równieŜ w nerkachi \y jelitach. Enzym ten nie fosforyluje glukozy. W odróŜnieniu od glukokinazy, na jego aktywność nie wpływa głodzenie ani insulina, co moŜe tłumaczyć, dlaczego fruktoza znika z normalną szybkością z krwi chorych na cukrzycę. K.™ tego enzymu pochodzącego z wątroby dla fruktozy jest bardzo mała, co wskazuje na duŜe powinowactwo enzymu do substratu. Wydaje się, Ŝe to jest wjainie_głó.wria dr-Oga-Jhsfbrjdficji fruktozy. Samoistna fruktozuria_jęst wynikiem braku fruktokinazy watro bovffij.. Fruktozo-1-fosforan jest rozkładany do aldeTryduD-glicerynowego i dihyBrbksyącstonofmforanujyjgalccu^lfFital^riwaripj p^e? aldolazc B, enzym znajdujący się w wątrobie. Ten enzjQL_.. atakuje równieŜ fruktozo-1,6-bisfoslbran. Jego brak jest przyczyną wrodzonej nietolerancji fruktozy. Aldehyd D-gliceryno-: ■ / Y?.kuj.e moŜliwość wejścia do sekwencji reakcji szlaku gl'^gljzj{ dzięki innemu enzymo-wi obecnemu w wątrobie, triokinazie, która katalizuje jego fosforylację do gliccraldehydo-3-foslbranu. Dwie fosfotriozy: dihydroksyacetonolosforan i gliceraldehydo-3-fosforan mogą być katabolizowane w szlaku glikolitycznym albo mogą łączyć się ze sobą pod wpływem aldolazy i być przetworzone w glukozę. To ostatnie jest losem większości fruktozy metabolizowanej w wątrobie. Jedną L konsekwencji wrodzonej nietolerancji fruktozy i innej choroby spowodowanej niedoborem fruktozo-l,6-bisfosfatazy jest indukowana fniVtr>7iiJjiipnpljl<,piiiia, pnmmuy.występowania duŜych zapasów glikogenu.-5^apewne nagromadzanie się fruktozo-1-fosforanu i fruktózo-l,6-bisfosforanu hamuje aktywność fosforylazy wątrobowej przez mechanizmy allosteryczne. JeŜeli zwierzęciu doświadczalnemu usunąć jelito i wątrobę, to przemiana wstrzykniętej fruktozy w glukozę nie zachodzi i zwierzę popada w hipoglikemię, jeśli nie podać mu glukozy. JednakŜe stwierdzono, Ŝe ludzka nerka moŜe przekształcać fruktozę do glukozy i mleczanu. U ludzi, ale nie u szczurów, znaczna ilość fruktozy pochodząca z rozpadu spoŜytej sacha-

rozy jest przemieniana w jelicie do glukozy, zanim dostanie się do krąŜenia wrotnego. Wolna fruktoza znajduje się w płynie nasiennym i jest wydzielana w nader duŜych ilościach do płodowego krąŜenia zwierząt kopytnych 1wielorybów, u których gromadzi się w płynach owodniowym i omoczniowym. Fruktoza i sorbitol uczestniczą w patogenezie zaćmy cukrzycowej

Zarówno fruktoza jak i sorbitol znajdują się w ludzkiej soczewce, w której ich stęŜenie zwiększa się w cukrzycy, i mogą one mieć udział w patogenezie zaćmy cukrzycowej. Szlak sorbitolowy (poliolowy), którego nie ma w wątrobie, jest odpowiedzialny za powstawanie &«ktozy z glukozy (ryc. 22-4). U chorych na cukrzycę jego aktywność się zwiększa, w miarę zwiększania stęŜenia glukozy we krwi, w tkankach, które nie są wraŜliwe na insulinę, tj. w soczewce, nerwach obwodowych i kłębuszkach nerkowych. Glukoza jest redukowana do sorbitolu, przez reduktazę aldozową z udziałem NADPH. Następnie sorbitol jest utleniany do fruktozy przez dehydrogenazę sorbitolową (dehydrogenazę L-iditolową, zwaną takŜe poliolową), w obecności NAD. Sorbitol nie przenika łatwo przez błony komórkowe i dlatego gromadzi się w tkankach, powodując ich uszkodzenie w mechanizmie osmotycznym. Równocześnie zmniejsza się stęŜenie mioinozytolu. U szczurów 2cukrzycą moŜna zapobiec nagromadzaniu się sorbitolu w tkankach, niedoborowi mioinozy tolu i powstawaniu zaćmy cukrzycowej, stosu jąc inhibitor reduktazy aldozowej. Reduktaza aldozową znajduje się w łoŜysku owiec i jest odpowiedzialna za wydzielanie sorbitolu do krwi płodowej. Dehydrogenaza sorbitolowa w wątrobie oraz w wątrobie płodu jest odpowiedzialna za przemianę sorbitolu do fruktozy. Ten szlak jest równieŜ odpowiedzialny 2a występowanie fruktozy w płynie nasiennym. Po doŜylnym podaniu sorbitolu jest on raczej przekształcany do fruktozy niŜ do glukozy. Po doustnym podaniu sorbitolu znaczna jego część nie wchłania się i ulega w jelicie grubym fermentacji pod wpływem bakterii do takich produktów, jak octan i H2. Bóle brzucha spowodowane nietolerancją sorbitolu mogą być wywołane „wolnymi od cukru" środkami słodzącymi zawierającymi sorbitol.

248 / ROZDZIAŁ 22

GALAKTOZA JEST POTRZEBNA DO SYNTEZY LAKTOZY, GLIKOLIPIDÓW, PROTEOGLIKANOW I GLIKOPROTEIN Galaktoza powstaje w jelitach w następstwie hydrolizy disaćnarydu — lalctozy, tj. cukru zawartego w mleku. W wątrobie jest ona łatwo przemieniana w glukozę. Zdolność wątroby do dokonania takiej przemiany moŜe być miernikiem sprawności czynności wątroby i jest podstawą testu tolerancji galaktozy. Szlak przemiany galaktozy w glukozę przedstawiono na ryc. 22-5. W reakcji 1 galaktoza jest fosforylowana przez galaktoklnazę z uŜyciem ATP jako dawcy fosforanu. Produkt tej reakcji galaktozo-1-fosforan reaguje z urydynodifosfoglukozą (UDPGlc), tworząc urydynodtfosfogalaktozę

(UDPGal) i glukozo-1-fosforan. W reakcji tej (reakcja 2), katalizowanej przez urydylilotransferazc galaktozo-1 -fosforanową, galaktoza jest przenoszona na miejsce glukozy zawartej, w UDPGlc. Przemiana galaktozy w glukozę (reakcja 3) jest katalizowana przez epimerazę. Jej produktem jest UDPGlc. Epimeryzacja prawdopodobnie odbywa się przez utlenienie i redukcję na C4, z udziałem NAD jako koenzymu. W końcu (reakcja 4) glukoza jest uwalniana jako glukozo-1-fosforan prawdopodobnie po inkorporacji do glikogenu i następującej potem fo sforo lizie. Reakcja 3 jest swobodnie odwracalna. W ten sposób glukoza moŜe być przemieniana w galaktozę, tak Ŝe obecność gotowej galaktozy nie jest niezbędna w pokarmach. Galaktoza jest potrzebna w organizmie nie tylko przy tworzeniu laktozy, lecz takŜe jako

Galaktoza

ATP

Ni

GALAKTOKINAZA|(2J

Mg'* ADP-*

Gal aktozo-1 fosforan

UDPGlc URYDYLOTRANSFERAZA UDPGal 1-FOSFOGAtAKTOZOWA

5)

Glukozo-1 -fosforan

4EPIMEHA2A IMYDYNODIFOSFOGALAKTOZOWA

UDP

Ł

NAD'

Laktoza

LAKTOZY Glukoza

] FOSFORYLAZA ]

UDPGlc PBOFOSFOHYLAZA UDPGlc

UTP Gllkogen ATP

HEKSOKINAZAI lub

ADP I

Glukoza

GluKOZO-

6LUK0KINAZA

Ryc. 22-5. Szlak przemiany galaktozy w glukozę oraz syntezy laktozy.

SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 249 ■y.

Gllkogen

_

c Gl u kozo-1 -fosforan #*

i

w

ATP

ADP

i

Glukoza ^* "^- Glukozo-6-tostoran

Gllkollza Fruktozo-d-fosforan

Plrogrontan

Cykl kwasu cytrynowego

COŹ+HŹO

— Glutamina

ATP

IAMINOTHANSFERAZA] ■ Glutamin lan

ADP

UTP

^M^Ę

FOSFOGLUKOMUTAZA

Glukozoamlna Acetylo-CoA

ATP

Glukozoamino-1-fosforan

e

ADP

j PJ

Glukozoamlna * I

Glukozoamino-6- ■* fosforan Acetylo-CoA

r+Acetylo- k. N-Acetyio- -glukozoamłno-glukozoamlna 6-fosfaran EPIMERAZA ] N-Acstylomannozcamino-5-fosioran Fosfoenotoplrogronian ■

glukazoamlno-■1 -fosforan UTP

UDP— N-acaty log a! a Kl ozoami n a

Gllkozam! nogi łkany (np, heparyna)

Gllkozam Inogtlkany (kwas hiaiuronowy, gllkoprotelny)

NAO+ I EPIMERAZA I 9-Fosforan kwasu UDPN-aoetylcrieuraminowego -N-aoatylogalaWozoamina

e Kwas slalowy, gangliozydy, gllkoprotalny

- UJsmny

(inhlbujacy) afekt allosteryezny

GtlkozoamlnogJlkany fchonaroltyny), gllkoprotalny

Ryc. 22-6. Zestawienie wzajemnych powiązań w metabolizmie aminocukrów. * Analogiczna do UDPGIc. Inne nukleotydy purynowe lub pirymidynowe mogą być podobnie związane z aminocukrami. Przykładami są tymidynodifosfo{TDP)-glukozoamina oraz TDP-N-acetyloglukozoamina. ____________________

składnik glikolipidów (cerebrozydów), proteoglikanów i glikoprotein. Przy syntezie latriozy w gruczole sutkowym, glukoza ^jest przemieniana w UDPGal pod wpływem opisanych powyŜej enzymów. UDPGal łączy się z glukozą tworząc laktozę. Proces ten jest katalizowany przez syntazę laktozową.

Niedobory enzymatyczne szlaku galaktozowego są przyczyną galaktozemii Niezdolność do metabolizowania galaktozy występuje w galaktozemiach, które mogą być powodowane wrodzoną wadą kaŜdego z enzymów zaznaczonych na ryc. 25-5 cyframi 1, 2, 3, chociaŜ niedobór urydylilotransferazy (2) jest

250 / ROZDZIAŁ 22

najlepiej poznany. Gal a ktoza której stęŜenie we krwi się zwiększa, jest w oku redukowana przez reduktaze aldozową do odpowiedniego poliolu (galaktytolu). Gromadzenie się galaktytolu w rogówce jest przyczyną występowania zaćmy. W przypadku wady ury dylil o tran sfe razy ogóiny stan chorego jesi cięŜki, poniewaŜ nagromadza się galaktozo-1 -fosforan, co pozbawia wątrobę zapasów nieorganicznego fosforanu. Końcowym skutkiem tej wady jest niedoczynność wątroby i zaburzenia umysłowe. Przy wrodzonym niedoborze urydylilotransferazy galaktozo-1-fosforanowej, dotyczącym zarówno wątroby, jak i erytrocytów (reakcja 2), epimeraza (reakcja 3) jest obecna w dostatecznej ilości, tak Ŝe chorzy z tą postacią galaktozemii mogą tworzyć UDPGal z glukozy. Wyjaśnia to, dlaczego u dotkniętych tą wadą dzieci jest moŜliwy normalny wzrost i rozwój, pomimo stosowania diety wolnej od galaktozy w celu zwalczania objawów choroby. Opisano kilka wad genetycznych, które polegają raczej na zmniejszonej ilości transferazy niŜ na jej całkowitym braku. PoniewaŜ enzym normalnie występuje w nadmiarze, zmniejszenie jego aktywności do 50% lub nawet mniejszej nie powoduje klinicznych objawów choroby, która pojawia się jedynie u homozygot. U niektórych chorych niedobór epimerazy dotyczy jedynie erytrocytów, a nie wątroby lub innych tkanek. W tych stanach choroba przebiega bezobjawowo. Glukoza jest prekursorem wszystkich aminocukrów (heksozoamin) (p. ryc. 22-6) Aminocukry są waŜnymi składnikami glikoprntein (p. rozdz. 57), niektórych glikosfingolipidów (np. gangliozydów) (p. rozdz. 16) oraz glukozoaminoglikanów (p. rozdz. 57). Głównymi aminocukrami są glukrwoamina, gnlaklozuamina i mannozoamina (wszystkie są heksozoammami) oraz związek 9-węglowy - kwas sjalowy. Głównym kwasem sjalowym znajdywanym w tkankach człowieka jest kwas N-acetyloneu-

raminowy (NeuAc). Zestawienie relacji po między aminocukrami przedstawiono na ryc. 22-6. NajwaŜniejsze są następujące fakty: 1. Glukozoamina jest głównym ammocukrem. Po wstaje ona jako glukozoam ino- 6 -fosforan z fruktozo-6-fosforanu przy uŜyciu glutaminy jako dawcy grupy aminowej. 2. Aminocukry występują głównie w formie N-acetylowanej. Dawcą grupy acetylowej jest acetylo-CoA. 3. N-Acetylomannozoammo-6-fosforan powstaje przez epimeryzację ghikozoam ino -6 -fosforan u. 4. NeuAc powstaje przez kondensację mannozoamino-6-fosforanu z fosfoenolopirogronianem. S. Galaktozoamina powstaje przez epi meryzację UDP-N-acetyloglukozoaminy (UDPGlcNAc) do UDP-N-acetylogalaktozoaminy (UDPGałNAc). 6, Nukleotydosacharydy są wykorzystywane do biosyntezy glikoprotein i innych złoŜonych związków. WaŜnymi nukleotydami zawierającymi aminocukry są: UDPGlcNAc, UDPGalNAc oraz CMP-NeuAc. PIŚMIENNICTWO Huijing F: Textbook ermrs>: Galaetose metabolism and galactosemia. Trends Biochem Sei James HMeLal: Models forthemetabolicproduction of oxalate from xylitol in humans. Aust. J Exp Biol MedSci 1982;60:!17. Ka.dor PF: The role of aldose reductase in the development of diabetic complications. Med Res Rev 1988;8:325. Macdonald I, Vrana A {editors}: Metabolk Effects of Dietary Carbohydrates. Karger, 1986. Randle PJ, Steiner DF, Whclan WJ (editors): Carbohydrate Metabolizm and Its Disorders. Vol 3. Academic Press, 1981. Sperling O, de Vries A (editors): Inborn Errors of Metabolism in Man. K_arger, 1978. Various authora: In: The Metabolic Basis oflnheńted Dhease, 6th ed. Serwer CR et al (editors). McGraw-Hill. 19S9. Wood T: The Pentose Phosphate Palhwaw Aeademit; Press; 1985.

Biosynteza kwasów tłuszczowych

23

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Podobnie jak przy innych procesach degradacji i syntezy (np. przy glikogenolizie i glikogenogenezie), do niedawna uwaŜano, Ŝe synteza kwasów tłuszczowych (iipogeneza) jest po prostu odwróceniem ich utleniania. Jednak obecnie wydaje się, Ŝe mitochondrialny układ syntezy kwasów tłuszczowych, zawierający pewne modyfikacje szlaku P-oksydacji, jest odpowiedzialny jedynie za przedłuŜanie (elongację) istniejących juŜ kwasów tłuszczowych o średniej długości łańcucha. Natomiast zupełnie odmienny i bardzo aktywny układ pozamitochondrialny jest odpowiedzialny za kompletną syntezę palmitynianu z acetylo-CoA. Aktywny uktad elongacji łańcucha występuje równieŜ w siateczce śródplazmatycznej wątroby. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Istnieje ogromna róŜnorodność między gatunkami zarówno co do rozmieszczenia szlaku lipogenetycznego w róŜnych tkankach, jak i głównych substratów do syntezy kwasów tłuszczowych. V szczura, gatunku, który dostarczył najwięcej wiadomości o lipogenezie. szlak ten jest obficie reprezentowany w tkance tłuszczowej i w wątrobie, podczas gdy u człowieka tkanka tłuszczowa nie jest istotnym miejscem lipogenezy, a wątroba ma stosunkowo małą aktywność. U ptaków Iipogeneza jest ograniczona do wątroby, gdzie jest ona szczególnie istotna w tworzeniu jaj. U większości ssaków pierwotnym substratem do lipogenezy jest glukoza, ale u przeŜuwaczy rolę tę przejmuje octan, który jest głównym związkiem o znaczeniu

energetycznym wytwarzanym zpoŜywienia. PoniewaŜ u człowieka szlak lipogenezy moŜe mieć ograniczone znaczenie, nie jest zaskakujące, Ŝe nie donoszono dotychczas o istotnych chorobach z nim związanych. JednakŜe róŜnorodna jego aktywność u poszczególnych osobników moŜe być w istotny sposób znacząca dla istoty i rozmiarów otyłości. GŁÓWNY SZLAK SYNTEZY KWASÓW TŁUSZCZOWYCH DE NOVO (LIPOGENEZY) WYSTĘPUJE W CYTOZOLU Ten układ występuje w wielu tkankach, łącznie z wątrobą, nerkami, mózgiem, gruczołem sutkowym i tkanką tłuszczową. Do jego funkcjonowania są potrzebne takie kofaktory, jak NADPH, ATP, Mn2 + , biotyna, i HCO7 (jako źródło CO2). Bezpośrednim substratem jest acetylo-CoA, a końcowym produktem jest wolny palmitynian. Te cechy odróŜniają znacząco lipogeneze od p-oksydacji. Wytworzenie malonylo-CoA jest początkowym i kontrolującym etapem w syntezie kwasów tłuszczowych Wodorowęglan, jako źródło CO2, jest potrzebny w początkowej reakcji do karboksylacji acetylo-CoA do malonylo-CoA w obecności ATP i karboksylazy acetylo-CoA. Biotyna, będąca jedną z witamin, jest niezbędna do działania karboksylazy acetylo-CoA (ryc. 23-1). Enzym ten ma zmienną liczbę identycznych podjednostek, w kaŜdej są zawarte: biotyna, karboksylaza biotyny, białko nośnikowe karboksybiotyny, transkarboksylaza, jak równieŜ al-

252 / ROZDZIAŁ 23 ■» - -O O C - CH 2 - CO -S - Co A

CH 3 - CO -S -Co A

Malotiyla-CoA

Aoetyio-CoA Enz-biotyna-COO-

Enz-btotyna

/£♦■ ADP+Pi ATP+HCO," + Era-Wotyna Ryc. 23-1. Biosynteza malonylo-CoA. Enz — karboksytaza acetylo-CoA.

losteryczne miejsce regulatorowe. Jest to wiec białko wieloenzymowe. Reakcja zachodzi w 2 etapach: 1) karboksylacja biotyny (z udziałem ATP, p. ryc. 53-13) oraz 2) przeniesienie karboksylu na acetylo-CoA z wytworzeniem malonylo-CoA. Kompleks syntazy kwasu tłuszczowego jest polipeptydem zawierającym 6 enzymów Wydają się istnieć 2 typy układu syntazy kwasu tłuszczowego znajdującego się w rozpuszczalnej części komórki, U bakterii, roślin i niŜszych form poszczególne enzymy układu są oddzielne, a reszty acylowe występują w połączeniu z białkiem nazywanym białkiem przenoszącym acyl (ACP, ang.: Acyl Carrier Protein). JednakŜe u droŜdŜy, ssaków i ptaków układ syntazy jest kompleksem wieloenzymowym, którego nie moŜna rozdzielić bez utraty aktywności, a ACP jest częścią tego kompleksu. ACP zarówno bakterii, jak i kompleksu wieloenzymowego zawiera witaminę — kwas pantotenowy w postaci 4'-fosfopanteteiny (p. ryc. 53-6). W układzie tym ACP przejmuje rolę CoA. Połączenie wszystkich enzymów określonego szlaku metabolicznego w jedną funkcjonalną jednostkę wieloenzymową sprawia, Ŝe taki szlak jest bardzo wydajny i wolny od interferencji ze strony innych współzawodniczących o substraty procesów, przez co osiąga się, bez konieczności wytwarzania barier przepuszczalności, kompartmentację procesu w komórce. Inną zakta istnienia pojedynczego polipeptydu wieloenzymowego jest to. Ŝe wszystkie enzymy kompleksu są syntetyzowane w sposób skoordynowany. Kompleks syntazy kwasu tłuszczowego jest dimerem (ryc. 23-2). U ssaków obydwa monomery są identyczne, kaŜdy z nich stanowi godny

uwagi pojedynczy polipeptyd, zawierający wszystkie 6 enzymów syntazy kwasu tłuszczowego oraz ACP z grupą — SH 4-fosfopanteteiny. W bezpośrednim sąsiedztwie tej grupy znajduje się inna grupa tiolowa reszty cysteiny, połączonej z syntazą 3-ketoacylową (enzymem kondensującym) drugiego monomeru (ryc. 23-2). PoniewaŜ obydwie grupy sulfhydrylowe uczestniczą w aktywności syntazy, jedynie cały dimer jest aktywny. Na początku inicjująca cząsteczka acetylo-CoA łączy się z grupą — SH cysteiny, co jest katalizowane przez transacylazę acetylową (ryc. 23-3). Malonylo-CoA łączy się z sąsiadującą grupą — SH 4'-fosfopanteteiny naleŜącej do ACP drugiego monomeru, co jest katalizowane przez transacylazę malonylową i wytwarza się aeetylo-(acylo)-malonyloenzym. Niedawne prace wykazały, Ŝe najprawdopodobniej transacylaza acetylową i transacyłaza malonyiowa jest tym samym enzymem (jak to pokazano na ryc. 23-2 i 23-3). Grupa acetylową atakuje grupę metylenową reszty malonylowej w reakcji katalizowanej przez syntazę 3-ketoacylu i uwalnia COa, tworząc 3-ketoacyloenzym (acetoacetyloenzym). To uwalnia grupę — SH cysteiny, związaną dotychczas przez grupę acetylową. Dekarboksylacja pozwala na zajście reakcji do końca dzięki temu, Ŝe działa jako siła pociągająca całą sekwencję reakcji. Powstała grupa 3-ketoacylowa zostaje zredukowana, odwodniona i ponownie zredukowana, aby utworzyć odpowiedni nasycony acyto-S-enzym. Te reakcje są analogiczne do tych, które zachodzą w p-oksydacji, z wyjątkiem tego, Ŝe 3-hydroksykwas jest izomerem D(—) a nie L( +), oraz Ŝe NADPH słuŜy jako dawca wodoru, a nie NADH w obu redukcjach. Nowa cząsteczka malonylo-CoA łączy się z grupą — SH 4'-fosfopanteteiny, wypierając nasyconą resztę acylową na wolną grupę —SH cysteiny. Ta sekwencja reakcji

Podział funkcjonalny

Podział

4'-F osfop a ntetaln a SH

SH

podjednostek

4'-F(»topani8telna

w o

1 5 >

I Ryc. 23-2. Wieloenzymowy kompleks syntazy kwasu tłuszczowego. Kompleks jest dimerem o 2 identycznych monomerach polipeptydowych, 1 i 2, kaŜdy składający się z 6 oddzielnych aktywności enzymatycznych i białka przenoszącego acy I (ang.: AcylCarrier Protein—ACP). Cys-SH —grupa sulf hydry Iowa cysteiny. Grupa -SH 4'-fosfopanteteiny jednego monomeru jest w bliskim sąsiedztwie grupy -SH cysteinylowej reszty syntazy ketoacylowej drugiego monomeru, co sugeruje ułoŜenie „głowa do ogona" obu monomerów w stosunku do siebie. Szczegółowe ułoŜenie sekwencji enzymów w kaŜdym z monomerów jest hipotetyczne (na podstawie danych Tsukamoto). ChociaŜ kaŜdy z monomerów zawiera wszystkie cząstkowe aktywności ciągu reakcji, rzeczywista funkcjonalna jednostka składa się z połowy monomeru współdziałającej z komplementarną polową drugiego monomeru. Wobec tego 2 łańcuchy acylowe są wytwarzane równocześnie.

I c < n IM W W

Acetylo-CoA Matonyio-CoA

Pan — SH HS-c HS -P a n Wisloenzymowy kompleks syntazy kwasu tłuszczowego

Przeniesienie C„ z

CoA (Cj albo cn)

- C l ) - Cys — S~C — O1 3

Aoyto (aoetylo Jmalonylo-enzym

SYNTAZA 3KETOACYLOWA

*co. Cys - SH

O -( a }-Pan— S ~ C — CH2 — C — CH3 3- Kato acylc-enzy m (aceto acetyio-enzy m) NADPH + H+ REDUKTAZA 3KETOACYLOWA NADP+

s-SH O OH I CH,

W

-T2_)-Pan-S~C-CH2-CHD(-)-3-HydroksyacyloB nzym HYDRATAZA Dehydrogenaza izooytrynlanowa

i-SH -(2)- Pan -S ~ C - CH = CH - CH, NADPH t H+

2,3-Nlenasycony acytoenzym REDUKTAZA ENOILOWA

NADP + ^~ H,0 Tloesleraza

V Po 7-Krotnym cyklicznym praejtclu przez eta^

SH "(T>Cy S J-—-^

-( 2 }-Pan-S ~C—CH2 —CHa—CH3 Acyloenzym

PalmKynlan

Ryc. 23-3. Biosynteza kwasów tłuszczowych o dtugim łańcuchu. Szczegóły wskazują, jak dodawanie reszty malonylowej powoduje, Ŝe łańcuch acylowy wydłuŜa się skokowo po 2 atomy węgla Ćys — reszta cysteiny, pan — 4'-fosfopanteteina. Szczegóły budowy dimeru syntazy kwasu tłuszczowego przedstawiono na ryc. 23-2. (J) i (2) przedstawiają poszczególne monomery syntazy kwasu tłuszczowego. 2 łańcuchy acyiowe są syntetyzowane równocześnie na 1 dłmerze przy uŜyciu kaŜdej pary grup SH Cys/pan.

BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH / 255 AcyloglicerolB Estry cholesterolu

ATP + CoA

AMP + PP: Estryfikacja

Palmltynlan.

Paimltollo-CoA SYNTETAZA ACYLO-CoA

Elongacja łańcucha, desaturacja Acylo-CoA

Ryc. 23-4. Los palmitynianu po jego biosyntezie

powtarza się jeszcze 6 razy, za kaŜdym razem włącza się nowa reszta malonylowa, aŜ do powstania ló-węglowego (palmityłowego) rodnika. Jest on uwalniany z kompleksu enzymatycznego działaniem 6. enzymu znajdującego się w kompleksie, tioesterazy (deacylazy). Wolny palmitynian musi zostać zaktywowany do acylo-CoAzanim będzie mógł wejść do jakiegokolwiek innego szlaku metabolicznego. Zazwyczaj jego losem jest estryfikacja do acylogliceroli (ryc. 23-4). W gruczole sutkowym istnieje oddzielna tioesteraza swoista dla reszt acylowych C8, C10 lub C12, które następnie znajdują się w tłuszczu mleka. W gruczole sutkowym przeŜuwaczy ten enzym jest częścią kompleksu syntazy kwasu tłuszczowego. Wydają się istnieć 2 centra aktywności w jednym dimerycznym kompleksie, które działają niezaleŜnie, tworząc równocześnie 2 cząsteczki palmitynianu. PoniŜej przedstawiono sumarycznie równanie całkowitej syntezy palmitynianu z acetylo-CoA i malonylo-CoA: CH,CO-S-CoA + 7HOOC-CH 3 C0-S-CoA t + 14NADPH + 14H+ -> ^CHatCHJ^COOH + 7CO 3 + 6H 2 O + + SCoA-SH + 14NADP

1

Z acetylo-CoA, uŜytego jako cząsteczka inicjująca, tworzą się atomy węgla 15 i 16 palmitynianu. Dodawanie wszystkich następnych jednostek dwuwęglowych odbywa się przez uprzednie tworzenie malonylo-CoA. Jako cząsteczka inicjująca w wątrobie i gruczole sutkowym ssaków moŜe działać butyrylo-CoA. JeŜeli propionylo-CoA działa jako cząsteczka inicjująca, powstają dlugołańcuchowe kwasy

tłuszczowe o nieparzystej liczbie atomów węgla. Występują one zwłaszcza u przeŜuwaczy, u których propionian powstaje pod wpływem działania mikroorganizmów w Ŝwaczu. Głównym źródłem równowaŜników redukujących (NADPH) jest szlak pentozofosforanowy NADPH jest zaangaŜowany, jako koenzym, w redukcję zarówno 3-ketoacylopochodnych, jak i acylowych pochodnych 2,3-nienasyconych. Oksydacyjne reakcje szlaku pentozofosforanowego (p. str. 240) są głównym źródłem wodorów niezbędnych do redukcyjnej syntezy kwasów tłuszczowych. Jest znamienne, Ŝe tkanki, które wykazują aktywny szlak pentozofosforanowy, są takŜe tkankami wyspecjalizowanymi w aktywnej lipogenezie; są to wątroba, tkanka tłuszczowa i gruczoł sutkowy w okresie laktacji. Co więcej, obydwa szlaki metaboliczne znajdują się w pozamitochondrialnej przestrzeni komórki, lak Ŝe nie istnieją błony, ani inne bariery do przenoszenia NADPH/NADP od jednego szlaku do drugiego. Innymi źródłami NADPH jest reakcja, która przekształca jabłczan w pirogronian, katalizowana przez „enzym jabłczanowy" (dehydrogenaza jabłczanowa dekarboksylująca) (ryc. 23-5) oraz pozamitochondrialna reakcja dehydrogenazy izocytrynianowej (prawdopodobnie nie jest to istotne źródło). Acetylo-CoA jest głównym budulcem kwasów tłuszczowych Jest on wytwarzany z węglowodanów przez utlenianie pirogronianu wewnątrz mitochondriów. JednakŜe acetylo-CoA nie przenika swobodnie do kompartmentu pozamitochondrialnego, zasadniczego miejsca syntezy kwasów tłuszczowych. Aktywność pozamitochondrial-

256 / ROZDZIAŁ 23

Glukoza

Glukozo-6fosforan

Fruktozo6-fosforan

Glloeraldeh yd o-3DEHYDROGENAZA 3-FOSFOGUCEHALDEHYDOWA

Cytrynian Strona zewnętrzna

WEWNĘTRZN A BŁONA MITOCHON DRIALNA

A DEHYDR0G6MAZA S PtROGHONIANOWA^ Piróg rc n ian. -:' ; ' - ' '

Cykl kwasu

mmmmK

;y-Vj rsrtmntan

OEHYDROGENAZA IZOCYTRYNtANOWA

Paimltynla

n

Ryc. 23-5. Dostarczanie acetyl o-Co A i NADPH dla lipogenezy. PP — sztak pentozofosforanowy: T— przenośnik trikarboksylanów, K —- przenośnik a-ketoglutaranu.

nej liazy ATP-cytrynianowej, podobnie jak i „enzymu jabłczanowego", zwiększa się w stanie dobrego odŜywienia, zachowując się równolegle do aktywności układu syntetyzującego kwasy tłuszczowe (tab. 21-1). Obecnie uwaŜa się, Ŝe zuŜywanie pirogronianu do lipogenezy odbywa się przez cytrynian. Ten szlak obejmuje

glikolizę, po której następuje oksydacyjna dekarboksylacja do acetylo-CoA wewnątrz mitochondrium i następnie kondensacja ze szczawiooctanem do cytrynianu, jako część szlaku kwasu cytrynowego. Potem następuje tramslokacja cytrynianu do kompartmcntu pozamitochondrialnego, gdzie, w obecności CoA i ATP,

BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH / 257

ulega on rozszczepieniu do acetylo-CoA i szczawiooctanu, co jest katalizowane przez liazę ATP-cytrynianową. Ten aeetylo-CoA jest wówczas dostępny do tworzenia malonylo-CoA i syntezy palmitynianu (ryc. 23-5). Szczawiooctan moŜe tworzyć jablczan pod wpływem działania NADH-zaleŜnej dehydrogenazy jabłczanowej, po czym następuje wytwarzanie NADPH pod wpływem enzymu jabłczanowego. Ten NADPH z kolei staje się dostępny do lipogenezy. Ten szlak jest sposobem przeniesienia równowaŜników redukujących z pozamitochondrialnego NADH na NADP. Inną alternatywą dla jablczanu jest jego przetransportowanie do mitochondrium, gdzie moŜe on przejść ponownie w szczawiooctan. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe przenośnik cytrynianu (trikarboksylanów) ■•' błonie mitochondrialnej wymaga jabłczanu do wymiany z cytrynianem (p. ryc. 14-16). U przeŜuwaczy niemal nie ma liazy ATP-cytrynianowej ani enzymu jabłczanowego, prawdopodobnie dlatego, Ŝe u tych gatunków octan (pochodzący z Ŝwacza) jest głównym źródłem acetylo-CoA. PoniewaŜ octan jest pozamitochondrialnie aktywowany do acetylo-CoA, nie ma potrzeby, aby wnikał on do mitochondriów i tworzył cytrynian przed inkorporacją w długołańcuchowe kwasy tłuszczowe. U tych gatunków, ze względu na brak enzymu jabłczanowego, znacznie większe znaczenie ma wytwarzanie NADPH działaniem pozamitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynia nowej. Elongacja łańcucha kwasów tłuszczowych zachodzi w siateczce śródplazmatycznej Ten szlak (elongacyjny układ mikrosomainy) przekształca acylo-Co A-pochodne kwasów tłuszczowych w pochodne acylowe, mające o 2 atomy węgla więcej, przy uŜyciu malonylo-CoA jako dawcy acetylu oraz NADPH jako czynnika redukującego. Związkami pośrednimi w tym procesie są tioestry CoA. Grupy acylowe, które mogą działać jako cząsteczki inicjujące, obejmują serię nasyconych kwasów tłuszczowych od Clo wzwyŜ, jak równieŜ nienasycone kwasy thiszczowe. Głodzenie w znacznej mierze znosi elongację łańcucha. Eiongacja stearylo-CoA w mózgu przyspiesza się w okresie mielinizacji, aby dostarczyć kwasów tłuszczowych C22 i C24, które występują w sfingolipidach (ryc. 23-6).

0 l + •CH1-»C -S-CoA I 'COOH Malonylo-CoA

Acylo-CoA

SYNTAZA 3-KETOACYLO-CoA

Co A*SH+ ł CO,

R -CH, -O C I -'ICHI -*C - S - CoA 3Koioaoylo-CoA

■NAOPH + REDUKTAZA 3KETOACYLO-CoA

H

O

R-tHj-^H-fCHjJC - S-CoA 3-HydroksyacyloXoA

HYDRATAZA

^CH-Jfi - S-CoA 2,3-N<enasycony ac/lo^CoA NADPH + H + REDUKTAZA 2,3-NSENASYCONYCH ACYLO-CoA NADP*

:-JCH,-?
Ryc. 23-6. Mikrosomalny układ elongacji łańcucha {elongaza).

258 / ROZDZIAŁ 23

STAN ODśYWIENIA REGULUJE LIPOGENEZĘ Wiele zwierząt, łącznie z człowiekiem, przyjmuje pokarm jako oddzielone czasem posiłki i dlatego magazynuje wiele energii pochodzącej z poŜywienia, aby móc ją uŜytkować między posiłkami. Proces lipogenezy dotyczy przekształcenia glukozy i takich związków pośrednich, jak pirogronian, mleczan i acetylo-CoA w tłuszcz, co stanowi anaboliczną fazę tego cyklu. Stan odŜywienia organizmu i tkanki jest głównym czynnikiem kontrolującym szybkość lipogenezy. I tak szybkość ta jest duŜa u dobrze odŜywionego zwierzęcia, którego dieta zawiera duŜo węglowodanów. Zmniejsza się w warunkach ograniczonego dostarczania energetycznego pokarmu, pokarmu boga to tłuszczowego, lub gdy istnieje niedobór insuliny, jak to jest w cukrzycy. Warunki te są związane ze zwiększonym stęŜeniem wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu. Regulacja mobilizacji wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej jest opisana w rozdz. 27. Istnieje odwrotna zaleŜność miedzy wątrobową lipogenezą a stęŜeniem wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy (ryc. 23-7). Największe zahamowanie lipogenezy występuje w zakresie zmian stęŜeń wolnych kwasów tłuszczowych o 0,3—0,8 jamot/ml osocza. StęŜenia te w osoczu krwi zmieniają się o podany zakres podczas przejścia ze stanu sytości w stan 2,0 3,0 głodzenia. 0.5 1J0 WKTw surowicy (fimol/ml)

Ryc. 23-7. Bezpośrednia inhibicja wątrobowej lipogenezy przez wolne kwasy tłuszczowe. Lipo-genezę oceniano oznaczając 3 wbudowywanie trytu H2O do wolnych kwasów tłuszczowych w perfun-dowanej wątrobie. WKT —, wolne kwasy tłuszczowe. (Doświadczenia z laboratorium autora wspólnie z D.L. Toppingiem).

Tłuszcze zawarte w poŜywieniu powodują takŜe zmniejszenie lipogenezy w wątrobie. JeŜeli ich zawartość w poŜywieniu przekracza 10%, to nie ma przekształcania węglowodanów poŜywienia w tłuszcze. Lipogenezą jest większa wówczas, gdy sacharoza zastąpi glukozę w pokarmie, poniewaŜ fruktoza omija etap kontrolny glikoiizy, jakim jest fosforruktokinaza i zalewa szlak lipogenezy (p. ryc. 22-4). LIPOGENEZĄ JEST REGULOWANA POPRZEZ MECHANIZMY KRÓTKOTERMINOWE I DŁUGOTERMINOWE Synteza długołańcuchowa kwasów tłuszczowych w trybie krótkotrwałym jest kontrolowana przez allosteryczne i kowalencyjne modyfikacje enzymów, a w dłuŜszym czasie przez zmiany szybkości syntezy i degradacji odpowiednich enzymów. StęŜenie cytrynianu i acylo-CoA reguluje karboksylazę acetylo-CaA Reakcja ograniczająca szybkość szlaku lipogenezy znajduje się na etapie karboksylazy acetyio-CoA. Ta karboksylaza jest aktywowana przez cytrynian, którego stęŜenie się zwiększa w stanie dobrego odŜywienia i który jest wskaźnikiem obfitego dostarczania acetylo-CoA. JednakŜe jest ona hamowana działaniem cząsteczek acylo-CoA o długim łańcuchu węglowym, co jest przykładem hamowania zwrotnego przez końcowy produkt ca^go ciągu reakcji. Wobec tego, jeŜeli nagromadza się acylo-CoA, poniewaŜ nie jest on dostatecznie szybko estryfikowany, automatycznie zmniejsza się synteza nowych kwasów tłuszczowych. Podobnie, gdy acylo-CoA nagromadza się w wyniku wzmoŜonej lipolizy lub dopływu wolnych kwasów tłuszczowych do tkanki, wówczas równieŜ następuje zahamowanie syntezy nowych cząsteczek kwasu tłuszczowego. Acylo-CoA moŜe równieŜ hamować transporter trikarboksy łanów i wobec lego zapobiegać wychodzeniu cytrynianu z mitochondriów do cytozolu. Dehydrogenaza piróg ronią nowa jest takŜe regulowana przez acylo--CoA Istnieje odwrotna zaleŜność między stęŜeniem wolnych kwasów tłuszczowych, a proporcją aktywnej postaci dehydrogenazy pirogro-

BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH / 259

nianowej do nieaktywnej, co reguluje dostępność ace.tylo-CoA dla lipogenezy. Acylo-CoA powoduje zahamowanie aktywności dehydrogenazy pirogronianowej przez hamowanie wymiennego transportera ATP-ADP wewnętrznej błony mitochondrialnej, co prowadzi do zwiększenia wewnątrzmitochondrialnego stosunku [ATP] / jADP] i w konsekwencji do przekształcenia aktywnej postaci dehydrogenazy pirogronianowej w nieaktywną (p. ryc. 24-4). Ponadto utlenianie acylo-CoA, spowodowane zwiększonym stęŜeniem wolnych kwasów tłuszczowych, moŜe powodować zwiększenie stosunku [acetylo-CoA] / [CoA] oraz [NADH] / [NAD+] w mitochondriach hamując w ten sposób dehydrogenazę pirogronianową. Hormony regulują równieŜ lipogenezę Insulina pobudza lipogenezę za pomocą kilku mechanizmów. Wzmaga transport glukozy do komórki (np. w tkance tłuszczowej) i przez to zwiększa dostępność zarówno pirogronianu do syntezy kwasów tłuszczowych, jak i glicerolo-3-fosforanu do estryfikacji kwasów tłuszczowych. Insulina zmienia nieaktywną postać dehydrogenazy pirogronianowej w aktywną, ale czyni to w tkance tłuszczowej, a nie w wątrobie. Ponadto karboksylaza acetyl o-Co A jest enzymem, który moŜe być regulowany przez odwracalną fosforylację. Insulina aktywuje karboksylazę acetylo-CoA, zapewne przez aktywację fosfatazy białek. TakŜe insulina, przez jej zdolność zmniejszania stęŜenia cAMP w komórce, hamuje lipolizę i przez to zmniejsza stęŜenie acylo-CoA o długim łańcuchu węglowym, będącego inhibitorem lipogenezy. Za pomocą tego samego mechanizmu insulina staje się antagonistą działania glukagonu i adrenaliny, które hamują karboksylazę acetylo-CoA, a więc i lipogenezę, dzięki zwiększeniu stęŜenia cAMP i umoŜliwieniu cAMP-zaleŜnej kinazie białek unieczynnienie enzymu przez fosforylację. Ostatnio opisano AMP-zaleŜną kinazę Watek, która wykrywa stan małej energii w komórce, wykazując wraŜliwość na zwiększone stęŜenie AMP. Ta nowa kinaza takŜe inaktywuje

przez fosforyiacj^ karboksyiaze acetylo-CoA. Ponadto aminy katecholowe hamują ten enzym przez receptory a-adrenergiczne i kinazę białek zaleŜną od Ca2+/kalmoduliny. U przeŜuwaczy octan, a nie glukoza, jest materiałem wyjściowym do lipogenezy. Następstwem tego jest to, Ŝe u tych zwierząt wiele mechanizmów regulacyjnych z udziałem mitochondriów nie ma zastosowania. Zarówno kompleks syntazy kwasu tłuszczowego jak i karboksylaza acetylo-CoA są ezymami adaptacyjnymi Adaptują się one do fizjologicznych potrzeb organizmu przez zwiększenie ich całkowitej ilości w stanie sytości, a zmniejszenie w głodzie, karmieniu tłuszczem i w cukrzycy. Insulina jest waŜnym hormonem powodującym indukcję biosyntezy enzymu, a przeciwdziała temu glukagon. Musi upłynąć kilka dni, aby te działania uwidoczniły się i wzmagały bezpośredni i natychmiastowy efekt wolnych kwasów tłuszczowych oraz takich hormonów, jak insulina i glukagon.

PIŚMIENNICTWO Goodridge AG: Fatty acid synthesis in eukaryotes. Page 143 in: Biochemistry ojLipids andMembranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 1985. Goodridge AG: Dietary regulalion of gene expression: Enzymes involved in carbohydrate and lipid metabolism. Annu Rev Nuir 1987; 7:157. Hardie DG, Carling D, Sim ATR: The AMP-activated protein kinase: a multisubsiratę regulator of lipid metabolism. Trends Biochem Sci 1989; 14; 20. Singh N, Wakil SJ, Stoops JK: On the question of half-or full-site reactivity of animal fatty acid synthetase. J Biol Chem 1984; 259:3605. Tsukamoto Y et al: The architecture of the fatty acid synłhetasecotccia. JBkAChem 1983; 258:15312. Wakil SJ, Stoops JK, Joshi VC: Fatty acid synthesis and its regulation, Annu Rev Biochem 1983; 52:537.

24

Utlenianie kwasów tłuszczowych: Ketogeneza Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Kwasy tłuszczowe są utleniane zarówno do acetylo-CoA, jak i są syntetyzowane z acetylo-CoA. Jakkolwiek materiał wyjściowy jednego procesu jest identyczny z produktem drugiego procesu, a chemiczne etapy pośrednie zaangaŜowane w obydwa procesy są porównywalne, to jednak utlenianie kwasów tłuszczowych nie jest zwyczajnym odwróceniem ich biosyntezy, lecz zupełnie odmiennym procesem, zachodzącym w innym kompartmencie komórki. Oddzielenie utleniania kwasów tłuszczowych od ich biosyntezy umoŜliwia indywidualną kontrolę kaŜdego z tych procesów i ich integrację z potrzebami tkanki. Utlenianie kwasów tłuszczowych zachodzi w mitochondriach. W kaŜdym jego etapie uczestniczy pochodna acylo-CoA i kaŜdy etap jest katalizowany przez oddzielny enzym. Koenzymami tego procesu są NAD i FAD. W wyniku utleniania kwasów tłuszczowych powstaje ATP. W odróŜnieniu od utleniania, biosynteza kwasów tłuszczowych (lipogeneza) odbywa się w cytozolu. Uczestniczą w niej acylowe pochodne związane z wieloenzymowym kompleksem, NADP jako koenzym, i jest potrzebny ATP oraz jon wodorowęglanowy. Utlenianie kwasów tłuszczowych jest procesem aerobowym, wymagającym obecności tlenu.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE WzmoŜone utlenianie kwasów tłuszczowych jest charakterystyczne dla stanu głodzenia i cukrzycy (diabetes mellitits/. Jest ono przyczyną

powstawania ciał ketonowych* w wątrobie (ketoza). Ciała ketonowe są kwasami. JeŜeli są wytwarzane w nadmiarze przez długi czas, jak to ma miejsce w cukrzycy, to mogą być przyczyną kwasicy ketonowej (ketoacidosis), która nie leczona moŜe być zgubna w skutkach. PoniewaŜ glukoneogeneza jest zaleŜna od utleniania kwasów tłuszczowych, kaŜde zmniejszenie ich utleniania prowadzi do hipoglikemii. Taka sytuacja ma miejsce w róŜnych stanach niedoboru karnityny lub enzymów istotnych w utlenianiu kwasów tłuszczowych (np. palmitoilotransferazy karnitynowej), albo pfzy zahamowaniu utleniania kwasów tłuszczowych spowodowanym truciznami (np. hipoglicyną).

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH ZACHODZI W MITOCHONDRIACH Kwasy tłuszczowe są transportowane we krwi jako wolne kwasy tłuszczowe (WKT, FFA) Określenie „wolne kwasy tłuszczowe" (ang. free fatty acids) odnosi się do kwasów tłuszczowych, które występują w stanie niezestryfikowanym. Alternatywnymi skrótami są UFA (ang.

*W języku polskim określenie „ciała ketonowe" (ketone bodies) było wielokrotnie przedmiotem krytyki. Zastąpiono je określeniem „związki ketonowe", mając na myśli 3 substancje, tj. aceton, acetooctan i p-bydroksymaślan. Określenie „ciała ketonowe" pozostawiono na wyraźne Ŝyczenie Tłumacza (przyp. red. i wyd.).

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 261

unesterified fatty acids) lub NEFA (ang. non-estenfię.d fatty acids). W osoczu WKT o dłuŜszym łańcuchu węglowym są związane z albuminą, zaś w komórkach z białkiem wiąŜącym kwasy tłuszczowe albo z białkiem Z. W rzeczywistości kwasy te nigdy nie występują w stanie „wolnym1'. Kwasy tłuszczowe o krótszym łańcuchu są lepiej rozpuszczalne w wodzie i występują w postaci niezjonizowanych kwasów lub anionów kwasu tłuszczowego. Kwasy tłuszczowe muszą być aktywowane, aby mogły być metabolizowane Podobnie jak to ma miejsce z przemianą glukozy, kwasy tłuszczowe muszą najpierw w reakcji z udziałem ATP zostać zamienione w aktywny metabolit, aby mogły reagować z enzymami odpowiedzialnymi za ich dalszy metabolizm. W całym szlaku całkowitej degradacji kwasów tłuszczowych jest to jedyny etap, który wymaga energii zawartej w ATP. W obecności ATP i koenzymu A, enzym — syntetaza acylo-CoA (tiokinaza) — katalizuje przemianę kwasu tłuszczowego, tj. wolnego kwasu tłuszczowego w „aktywny kwas tłuszczowy'*, czyli w acylo-CoA. Reakcja ta jest związana z wydatkiem 1 bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego. SYNTETAZA ACYLO-CoA

Kwas tłuszczowy + ATP + Co A ---------------» - Acylo-CoA + PP, + AMP

Obecność pir o fosfatazy nieorganicznej sprawia, Ŝe aktywacja przebiega do końca dzięki ułatwieniu utraty dodatkowego bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego pirofosforanu. W rzeczywistości w czasie aktywacji kaŜdej cząsteczki kwasu tłuszczowego są wiec wydatkowane 2 bogatoenergetyczne wiązania fosforanowe. PPi + HaO PIR0FOSFATA2A NIEORGANICZNA

Syntetazy acylo-CoA występują w siateczce śródplazmatycznej, w obrębie mitochondriów i na zewnętrznej błonie mitochondrialnej. Opisano kilka syntetaz acylo-CoA. KaŜda z nich jest swoista wobec kwasów tłuszczowych o określonej długości łańcucha.

Kwasy tłuszczowe o długim łańcuchu przenikają przez wewnętrzną błonę mitochondrialną jedynie w połączeniu z karnityną Karnityna (p- hy droksy-y-trimety loaminomaślan), (CH 3 ) 3 N+-CH 2 -CH(OH)-CH 2 -— COO~, jest szeroko rozpowszechniona, a szczególnie obficie występuje w mięśniach. Jest syntetyzowana z iizyny i metioniny w wątrobie i nerkach. Aktywacja niŜszych kwasów tłuszczowych i ich utlenianie moŜe zachodzić w mitochondriach niezaleŜnie od karnityny. W odróŜnieniu od krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych WKT o długim łańcuchu nie wnikają do mitocbondriów i nie są utleniane bez uprzedniego przekształcenia w acylo karnityny. Acylo-CoA + Karnityna --------------------------► PALMITOILOTRANSFERAZA KARNITYMOWA

> Acylo karnityna + CoA

Enzym, palmitoilotransferaza karnitynowa 1, znajdujący się po wewnętrznej stronie zewnętrznej błony mitochondrialnej, katalizuje przekształcenie długołańcuchowych acylo-CoA w acylokarnitynę, która przenika do mitochondriów, przez co kwasy tłuszczowe stają się dostępne dla enzymów szlaku p-oksydacji. Translokaza karnitynoacylokarnitynowa działa jako błonowy wymienny przenośnik karnityny. Transport acy lokami ty ny do wnętrza mitochondriów jest sprzęŜony z przeniesieniem 1 cząsteczki karnityny na zewnątrz. W mitochondrium acylokarnityna reaguje z CoA, w wyniku czego powstają acylo-CoA i wolna karnityna uwalniane do macierzy mitochondriainej. Reakcja ta jest katalizowana przez palm i to i to transfer a «■ ka mity nową II, związaną z wewnętrzną powierzchnią wewnętrznej błony mitochondrialnej (ryc. 24-1). W mitochondriaeh występuje jeszcze inny enzym, acetylotransferaza karnitynowa, katalizujący przenoszenie grup acy 1 owych o krótkim łańcuchu węglowym między CoA a kamityną. Funkcja tego enzymu jest niejasna. Jest moŜliwe, Ŝe ułatwia on transport grup acetyl owych przez błonę mitochondrialną. Acetylo-CoA + Karnityna ACETYLOTRANSFERAZA KARNITYMOWA

Acetylokarnttyna +■ CoA

262 / ROZDZIAŁ 24 CoA

Strona FFA zewnętrzna SYNTETAZA ACYLO-Co/ł

ZEWNĘTRZNA ■-tM BŁONA l.>'£i;.'>j

MITOCHONDFNALNA ■

.

-

.

■

■

-

.

.

:

.

.

:

Acytokarnltyna PALMITOILORANSFERAZA KARNffYNOWAf RANSLOKAZA, WEWNĘTRZNA KARNITYNA-> i ł B Ł O N A , ^. ACYLOMITOCHONDRIALNA RNITYN Strona wewnętrzna

PALMITO1LOTRANSFERAZA RNITY-A l l

Karnityna

A cv I o kar nity na

Acylo-CoA

0-OksydtcJa Ryc. 24-1. Rola karnityny w transporcie długołańcuchowych kwasów tłuszczowych przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Oługołańcuchowy acylo-CoA nie moŜe przenikać przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, ale produkt jego metabolizmu, acylokarnityna, ma tę zdolność.

p-Oksydacja kwasów tłuszczowych polega na kolejnym odczepianiu r uwalnianiu acetyło-CoA W p-oksydacji (ryc. 24-2) odczepiane są od cząsteczek acylo-CoA, począwszy od końca karbonylowego, reszty dwuwęglowe. Łańcuch jest rozrywany pomiędzy atomami węgla a (2) 1 p (3) i stąd nazwa ^-oksydacja. Powstające jednostki dwuwęglowe to cząsteczki acetylo-CoA; tak wiec z palmitoilo-CoA tworzy się S cząsteczek acetylo-CoA. W cyklicznej sekwencji reakcji są wytwarzane NADH i FADH 2 Kilka enzymów, znanych pod zbiorczą nazwą „oksydaza kwasów thiszczowych", znajduje się w macierzy mitochondrialnej w pobliŜu łańcucha oddechowego (który jest umiejscowiony w wewnętrznej Honie mitochondrialnej). Katalizują one utlenianie acyio-CoA do acetylo-CoA, co wiąŜe się z fosforylacją ADP do ATP (ryc. 24-3). Po wniknięciu reszty acylowej przez wewnętrzną błonę mitochondrialną za pośrednictwem uktadu transportującego karnitynę i po odtworzeniu acyio-CoA, następuje oderwanie 2 atomów wodoru od atomów węgla 2 (a) i 3 (p), katalizowane przez dehydrogenazę acylo-CoA. W wyniku tej reakcji powstaje A2-tranj-enoilo-CoA. Koenzymem tej dehydrogenazy jest flawoproteina zawierająca FAD jako grupę pro-

CO-S-CoA Acetylo-CoA Kolejne usuwanie jednostek dwuwęglowych

co-s-coA+a

8 CH3-CO-S-CoA Acetylo-CoA Ryc. 24-2. Ogólny schemat [i-oksydscji kwasów tłuszczowych.

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 263 Kwas tłuszczowy ATP

CoA-SH SYNTETAZA ACYLO-CoA

^ł* AMP-ł- PP, i.

Aoyto-Co* (Aktywny Kwas tłuszczowy)

0

R^CHr *CHrC - S -CoA i (zewnętrzna) strona cytoplazmatyczna

WEWNĘTRZNA BLDNAMITOCHONDHIALNA

TRANSPOHTER KARNITYNOWY

'CH

j -C -

(wewnętrzna) strona mltochoncfrlatna S-CoA

(Flawoprotaina) 2~(P;

DEHYDBOGENAZA] ACYLO-OoA

-»-H,0 Łańcuch Q oddechowy A'-S»n*Enolło-CoA

R-S CH =

CoA H -C -S H,0

HYDRATAZA A"ENOILO-CnA

?H ł

-CoA

RJCH-JCH

3

-C-

S -C o A

3-©

DEHYDROGENAZA L( + )-^KYDROKSYACYLO-CoA «:« »Xatoacylo-CoA

Łańcuch oddechowy

(4)

H,0

R -3

3-KETOACYLOTIOLAZA TIOLAZA

CoA-SH 2CO,

Ryc. 24-3. [J-Oksydacja kwasów tłuszczowych. Długołańcuchowy acylo-CoA przechodzi cyklicznie przez reakcje 2-5, a w kaŜdym cyklu jest odczepiany acetylo-CoA działaniem tiolazy (reakcja 5). Gdy pozostanie reszia acyiowa o długości jedynie 4 atomów węgla, wówczas w reakcji 5 wytwarzają się 2 cząsteczki acetylo-CoA

264 / ROZDZIAŁ 24

stetyczną. Reoksydacja tej grupy prostetycznej przez łańcuch oddechowy wymaga pośrednictwa innej fiawoproteiny nazwanej flawoproteiną przenoszącą elektrony. Wysyccnic podwójnego wiązania i wytworzenie 3-hydroksyacylo-CoA odbywa się przez przyłączenie cząsteczki wody, co katalizowane jest przez enzym hydratazę A2-enoilo-CoA. Pochodna 3-hydroksylowa ulega dalszemu odwodorowaniu na węglu 3 pod wpływem dehydrogenazy L(+)-3-hydroksyacylo-CoA, W wyniku tej reakcji powstaje odpowiedni 3-ketoacylo-CoA. W reakcji tej MAD, a nie FAD jest koenzymem uczestniczącym w odwodorowaniu. W końcu 3-ketoacylo-CoA jest rozrywany w pozycji 2,3 przez tiolazę (3-ketoacylotiolazę aibo poprą wnie: acetyl o trans ferazę acetylo-CoA), katalizującą tiolityczne rozerwanie wiązania z udziałem drugiej cząsteczki CoA. Produktami tej reakcji są acetylo-CoA i acylo-CoA zawierający o 2 atomy węgla mniej niŜ pierwotna cząsteczka acy-loCoA, która uległa utlenieniu. Utworzony w reakcji rozszczepienia acylo-CoA ponownie wchodzi w szlak oksydacyjny rozpoczynający się reakcją 2 (ryc. 24-3), W ten sposób długi łańcuch kwasu tłuszczowego moŜe zostać całkowicie rozłoŜony na acetylo-CoA (jednostki C2), PoniewaŜ acetylo-CoA moŜe być utleniony do CO2 i wody w cyklu kwasu cytrynowego (który takŜe jest umiejscowiony w mitochondriach), kwasy tłuszczowe mogą ulegać całkowitemu utlenieniu.

W wyniku utleniania kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgła powstaje cząsteczka propionylo-CoA Kwasy tłuszczowe o nieparzystej liczbie atomów węgla są utleniane w szlaku p-oksydacji z wytwarzaniem acetylo-CoA, aŜ do pozostania trójwęglowej reszty propionylo-CoA. Ten związek jest przekształcany do sukcynylo-CoA, metabolitu będącego związkiem pośrednim cyklu cytrynianowego (p. teŜ ryc. 21-2). Wobec tego reszta propionylowa z kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgla jest jedynym fragmentem kwasów tłuszczowych, który jest glukogenny.

Utlenianie kwasów tłuszczowych powoduje powstanie wielu cząsteczek ATP Transport elektronów w łańcuchu oddechowym ze zredukowanych fiawoproteiny i NAD

prowadzi do syntezy 5 bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych (p. rozdz. 14) na kaŜdą z pierwszych 7 cząsteczek acetylo-CoA utworzonych przez P-oksydację palmitynianu ( 7 x 5 = 35), W sumie wytwarza się 8 mol acetylo-CoA, z których kaŜdy moŜe dostarczyć 12 wiązań o duŜej energii przez utlenienie w cyklu cytrynianowym. Ogółem powstaje więc 8 x 1 2 = 96 wiązań bogatoenergetycznych pochodzących z utlenienia cząsteczek acetylo-CoA utworzonych w wyniku rozpadu palmitynianu. Po odjęciu 2 wiązań bogatoenergetycznych na początkową aktywację kwasu tłuszczowego zysk netto wynosi 129 wiązań bogatoenergetycznych na mol utlenionego palmitynianu albo 129 x 30,5 = 3935 kJ. Swobodna energia spalania kwasu palmitynowego wynosi 9791 kJ/mol, wobec czego w omawianym procesie przetworzeniu na energię zawartą w bogatoenergetycznych wiązaniach fosforanowych ulega ok. 40% całkowitej energii spalania kwasu tłuszczowego.

Kwasy tłuszczowe o bardzo długim łańcuchu są utleniane w peroksysomach W peroksysomach zachodzi zmodyfikowana forma p-oksydacji. Produktami jej są acetylo-CoA i K2O2 (H2O2 powstaje na etapie działania dehydrogenazy związanej z flawoproteiną). Ten szlak nie jest bezpośrednio powiązany z fosforylacją i wytwarzaniem ATP, ale pomaga utlenić kwasy tłuszczowe o bardzo długim łańcuchu (np. C20) C22). Jest on indukowany przez spoŜycie pokarmów o duŜej zawartości tłuszczu, a takŜe przez leki o działaniu hipolipemicznym, np. klofibrat. Enzymy zawarte w peroksysomach nie atakują kwasów tłuszczowych o krótszym łańcuchu. Sekwencja P-oksydacji kończy się na oktanoilo-CoA. Grupy oktanoilowe i acetylowe są usuwane z peroksysomów w postaci oktanoiloi acctylokamityny, a następnie sa utleniane w mitochondriach.

ot- i (o-OKSYDACJA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH SĄ WYSPECJALIZOWANYMI SZLAKAMI Ilościowo p-oksydacja w mitochondriach jest najwaŜniejszym szlakiem utleniania kwasów tłuszczowych. JednakŜe w mózgu wykryto oc-oksydację, tj. proces usuwania po 1 atomie węgla od karbonylowego końca cząsteczki. Ten

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 265

proces nie wymaga przekształcenia kwasów tłuszczowych w pochodną Co A i nie wiąŜe się z wytwarzaniem bogatoenergetycznych fosforanów. tó-Oksydacja jest normalnie szlakiem o bardzo niewielkim znaczeniu. Uczestniczą w niej układy hydroksylujące zawierające cytochrom P-450 siateczki śródpiazmatycznej. Grupa — CH3 jest przekształcana w grupę — CHjOH, a następnie utleniana do — COOH i w ten sposób powstaje kwas dikarboksylowy. Jest on utleniany przez B-oksydacje zwykle do kwasów adypinowego (C6) i suberynowego (C8), które są wydalane z moczem.

WADLIWE UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH JEST PRZYCZYNĄ CHORÓB METABOLICZNYCH Niedobór karnityny moŜe występować zwłaszcza u noworodków, a szczególnie u wcześniaków. MoŜe on być spowodowany niedostateczną biosyntezą karnityny albo jej utratą przez nerki. Utratę moŜe takŜe spowodować hemodializa lub acyduria spowodowana kwasami organicznymi. Karnityna jest wówczas wydalana po sprzęgnięciu z kwasami organicznymi. W wymienionych stanach zachodzi potrzeba uzupełnienia karnityny, podobna do potrzeby uzupełnienia niedoborów witaminowych w pokarmach. Objawami niedoboru karnityny są: okresowa hipoghkemia, spowodowana zmniejszoną glukoneogenezą (uwarunkowaną zmniejszonym utlenianiem kwasów tłuszczowych), upośledzona ketogeneza w obecności zwiększonego stęŜenia WK.T w osoczu, osłabienie mięśni oraz spichrzanie Jipidów w tkankach miąŜszowych. Leczenie polega na doustnym podawaniu karnityny. Objawy niedoboru karnityny są podobne do zespołu Reye'a, w którym stęŜenie karnityny jest prawidłowe. Przyczyna zespołu Reye'a jest nieznana. Niedobór wątrobowej palmitoilotransferazy karnitynowej jest przyczyną hipoglikemii i małego stęŜenia związków ketonowych w osoczu, podczas gdy niedobór mięśniowej palmitoilotransferazy karnitynowej charakteryzuje się nieprawidłowym utlenianiem kwasów tłuszczowych, co powoduje napadów o występujące osłabienie mięśni i mioglobinurię. Mechanizm działania hipoglikemizującego pochodnych sulfonyl o mocznika (gliburyd i tolbutamid) poJega min. na zmniejszeniu utleniania kwasów tłusz-

czowych uwarunkowanym hamowaniem palmitoilotransferazy karnitynowej. Jamajska choroba wymiotna jest spowodowana spoŜywaniem niedojrzałych owoców drzewa akee, zawierających toksynę hipoglicyn, która inaktywując dehydrogenazę acylo-CoA hamuje P-oksydację i powoduje hipoglikemię. Acyduria dik ar boksytów a charakteryzuje się wydalaniem &>-dikarboksylowych kwasów 0 długości łańcucha Ce do C,o i hipoglikemią. Jest ona spowodowana brakiem mitochondrialnej dehydrogenazy acylo-CoA swoistej dla substratów o średniej długości łańcucha. Brak tego enzymu upośledza p-oksydację, ale wzmaga (o-oksydację kwasów tłuszczowych o długim 1 średnim łańcuchu, które są następnie skracane podczas P-oksydacji do kwasów dikarboksyiowych o średniej długości łańcucha i są wydalane z moczem. Choroba Rei suma jest rzadkim zaburzeniem neurologicznym spowodowanym nagromadzaniem się kwasu fitanowego, powstałego z fitolu, składnika chlorofilu występującego w pokarmach roślinnych. Kwas fitanowy zawiera grupę metylową przy węglu 3, która blokuje p-oksydację. U osób zdrowych początkowa a-oksydacja usuwa grupę metylową. Osoby z chorobą Refsuma mają dziedziczną wadę cc-oksydacji, która jest przyczyną nagromadzania się kwasu fitanowego w tkankach. Zespół Zellwegera {mózgo wo-wątrobo wo-nerkowy) występuje u osób z rzadko stwierdzanym wrodzonym brakiem peroksysomów we wszystkich tkankach. Gromadzą się u nich kwasy polienowe C26—C33w tkance mózgowej, gdyŜ nie ma w tej wadzie zdolności do utleniania kwasów tłuszczowych o długim łańcuchu w peroksysomach.

UTLENIANIE NIENASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH ODBYWA SIĘ W ZMODYFIKOWANYM SZLAKU 8- OKSYDACJI Nienasycone kwasy tłuszczowe związane estrowo z CoA są degradowane przez enzymy uczestniczące normalnie w p-oksydacji, aŜ do etapu powstania A3-cn-acylo-CoA albo A4-cis-acylo-CoA, zaleŜnie od pozycji podwójnego wiązania (ryc. 24-4). Pierwszy z tych związków jest izomeryzowany (izomeraza A3-m -+ A2-trałts-euoilo-CoA) do odpowiedniego etapu A2-trans-enoUo-CoA p-oksydacji, aby następnie

266 / ROZDZIAŁ 24 cis

cis

Ryc. 24-4. Kolejność reakcji zachodzących podczas utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych, np. kwasu finolowego. Kwasy tłuszczowe i A -cis lub kwasy tłuszczowe tworzące A*-as-enoilo-CoA, wchodzą do szlaku w pokazanym miejscu.

:-sLinolalto-CoA 3 cykle /J-oksydacji

3-Acetylo-CoA cis cis

tf-cts-Cć-cis-O l«n o Ilo-Co A IZOMERAZA A'-cfc (albo

as

A1- trans~ó?-cts-D leno Ilo-Co A [etap /J-oksydaejl odpowiadający AMrans-enoilc-CoAi 1 cykl ^-oksydacji Acetylo-CoA cs

'

C-S-CoA O A*//a/7*A4-rfs-Dl8nollo-CoA ^ H + +NA0PH-O

*

DEHYDflOGENAZA ACYLO-CoA . Ał-c/s-Enollo-CoA RE DUKTAZA

C-S-CoA

A^frans-Enollo-CoA IZOMERAZA Ał-c/9{albo A*-irans-ENOILOCoA

O // C-S-CoA

•J 4 cykle ^-oksydacji

4-Aoe(ylo-CoA

ulec hydratacji i dalszemu utlenieniu. KaŜdy A*-c«-acylo-CoA pozostający w tym szlaku, czego przykładem jest przemiana kwasu linolenowego (ryc. 24-4), albo wchodzący w szlak na tym etapie (3-oksydacji jest przekształcany do A2-(fanj-A+-c/.c-dienoilo-CoA przez dehydrogenazę acylo-CoA, Ten związek pośredni jest przekształcany do A3-/rans-enoilo-CoA pod wpływem redukta/y A2-trans-A4-cis-dienoilo-CoA — enzymu zaleŜnego od NADP. Izomeraza A3-c/5-*A;:-ffa«5-enoilo-CoA atakuje równieŜ podwójne wiązanie óP-trcms, powodując powstanie A2-mzns-enoilo-CoA, związku pośredniego P-oksydacji. Mikrosomalna peroksydacja wielonienasyconych kwasów tłuszczowych jest zaleŜna od NADPH NADPH-zaleŜna peroksydacja nienasyconych kwasów thaszczowych jest katalizowana przez enzymy mikrosomalne. Przeciwutleniacze BHT (butylowany hydroksytoluen) i a-tokoferol (witamina E) hamują mikrosomalna peroksydację lipidów. KETOGENEZA ZACHODZI WÓWCZAS, GDY NATĘśENIE UTLENIANIA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH W WĄTROBIE JEST DUśE W pewnych warunkach metabolicznych, związanych z duŜym natęŜeniem utleniania kwasów tłuszczowych, wątroba wytwarza znaczne ilości acetooctanu i D(-)-3-hydroksymaślanii (P-hydroksymaślanu). Acetooctan ulega ciągłej samoistnej dekarboksylacji, dając aceton. Te 3 substancje są znane pod wspólną nazwą ciała ketonowe (nazywane takŜe związkami acetonowymi, lub niewłaściwie „ketonami"*) (ryc. 24-5). Acetooctan i 3-hydroksymaś-

* Termin „ketony" nie powinien byc uŜywany, poniewaŜ 3-hydroksymaśIan nie jest ketonem, a we krwi jest wiele ketonów, które nie są związkami (ciałami) ketonowymi, np. pirogronian, fruktoza.

UTLENIANiE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 267

O II CH,-C-CH,-

COO"

DEHYDHOGENAZA D(-}3-HYDROKSYMAS ŁANOWA

Acetooctan

NAD H + H NAD

ł

CH,-CHCH,COCT DMaHydroksyinaślan Ryc. 24-S. Wzajemne zaleŜności ciał ketonowych. Dehydrogenaza D(-)-3-hydroksymaślanowa jest enzymem mitochondrialnym.

lan są wzajemnie w siebie przekształcane działaniem mitochondrialnego enzymu dehydrogenazy D(-)-3-hydroksymaślanowej. Równowaga tej reakcji jest kontrolowana mitochondrialnym

2COi

stosunkiem [NAD+] do [NADH], tj. stanem red.-oks. Stosunek [3-hydroksymaślan]; [acetooctan] w krwi waha się w granicach 1:1—10:1. StęŜenie całkowite ciał ketonowych we krwi dobrze odŜywionych ssaków normalnie nie przekracza 0,2 mmol/L Jest ono nieco większe u przeŜuwaczy dzięki tworzeniu 3-hydroksymaślanu z kwasu masłowego (produktu fermentacji w Ŝwaczu) w ścianie Ŝwacza. U człowieka utrata ciał ketonowych z moczem wynosi zwykle mniej niŜ 1 mg/24 h. Stany zwiększonego stęŜenia ciał ketonowych we krwi określa się jako ketonemię (hiperketonemię), zaś zwiększone ich wydalanie z moczem jako ketouuric. Oba te stany określa się jako ketozę. Kwasy acetooctowy i 3-hydroksymasłowy są umiarkowanie mocnymi kwasami i są zbuforowane, gdy występują we krwi lub w tkankach. JednakŜe w stanach zwiększonego wydalania nadmiaru obu tych związków dochodzi do utraty kationu buforującego (pomimo zwiększonego wytwarzania amoniaku w nerce). W konsekwencji dochodzi do stopniowego wyczerpania rezerwy alkalicznej i do rozwoju kwasicy ketonowej. Wystąpienie kwasicy ketonowej moŜe być fatalne w skutkach u chorych z niewyrównaną cukrzycą.

2CO,

Ryc. 24-6. Powstanie, zuŜywanie i wydalanie ciał ketonowych. Główny szlak jest zaznaczony ciągłymi strzałkami

268 / ROZDZIAŁ 24

Najprostsza postać ketozy występuje przy głodzeniu, kiedy dochodzi do wyczerpania się zapasów węglowodanowych i do zwiększenia stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych. KaŜdy inny stan, w którym występuje ketoza, nie róŜni się jakościowo od tego modelu metabolicznego, ale ilościowo moŜe być tak nasilony, Ŝe jest przyczyną stanów chorobowych obserwowanych np. w cukrzycy {diabetes mellitus), w zatruciu ciąŜowym u owiec i ketozie u mlecznych krów. Postacie ketozy pozbawione znaczenia chorobowego stwierdza się u osób Ŝywionych dietą o duŜej zawartości tłuszczu oraz po wykonaniu cięŜkiego wysiłku u niektórych osób będących na czczo. In vivo wątroba wydaje się być jedynym narządem u nieprzeŜuwaczy wydzielającym znaczne ilości ciał ketonowych do krwi. Pozawątrobowe tkanki zuŜywają ciała ketonowe jako substraty energetyczne. Pozawątrobowe źródła ciał ketonowych, występujące u przeŜuwaczy w okresie sytości nie mają znaczącego udziału w powstawaniu ketozy u tych gatunków. Wypływ ciał ketonowych z wątroby do tkanek pozawątrobowyeh jest wynikiem aktywnego mechanizmu enzymatycznego pobudzającego wytwarzanie ciał ketonowych w wątrobie oraz małej aktywności w tym narządzie enzymów odpowiedzialnych za ich zuŜytkowanie. Odwrotna sytuacja ma miejsce w tkankach pozawątrobowych (ryc. 24-6). 3-Hvdroksy-3-metyloglutarylo-CoA (HMG-CoA) jest związkiem pośrednim na szlaku ketogenezy w wątrobie Enzymy odpowiedzialne za powstawanie ciał ketonowych są związane głównie z mitochondriami. Pierwotnie sądzono, Ŝe tylko 1 cząsteczka acetooctanu moŜe powstać z końcowych 4 węgli kwasu tłuszczowego podczas jego utleniania. Później, aby wyjaśnić powstawanie większych niŜ równowaŜne ilości acetooctanu z I cząsteczki kwasu tłuszczowego o długim iańcuchu, jak i moŜliwość tworzenia ciał ketonowych 2 kwasu octowego, zaproponowano, Ŝe jednostki C2 powstające w p-oksydacji mogą ze sobą kondensować, tworząc acetooctan. Taki proces moŜe być wynikiem odwrócenia reakcji katalizowanej przez tiolazę, w której 2 cząsteczki acetylo-CoA kondensują tworząc acetoacetylo-CoA. Acetoacetylo-CoA, który jest związkiem wyjściowym do ketogenezy, mógłby więc powstać albo bezpośrednio pod-

czas p-oksydacji, albo jako wynik kondensacji acetylo-CoA (ryc. 24-7). Zaproponowano JLszlalagowstawania acetooctapH ? fgetff"^^lo-CoA.?terwszv"z'nicn"ma bvć prosta deacyla■cjąTDrugrszlak (ryc. 24-8) obejmuje kondensację acetoacetylo-CoA z jeszcze 1 cząsteczką acetylo-CoA i wytworzenie HMG-CoA. Reakcję tę katalizuje syntaza 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-CoA. Obecność w mitochondriach innego enzymu, liazy 3-hydroksy-3-metyloghtfarylo-CoA, umoŜliwia odczepienie acetylo-CoA od HMG-CoA z pozostawieniem wolnego acetooctanu. Atomy węgla odczepione jako cząsteczka acetylo-CoA pochodzą z pierwotnej cząsteczki acetoacetylo-CoA (ryc. 24-8). Obydwa te enzymy muszą być w ntitochondriach, aby zachodziła ketogeneza. Ma to miejsce jedynie w wątrobie i w nabłonku Ŝwacza. Obecnie przewaŜa opinia, Ŝe szlak HMG-CoA jest główną drogą tworzenia ciał ketonowych. ChociaŜ podczas głodu występuje znaczne zwiększenie aktywności liazy HMG-CoA, dane doświadczalne nie sugerują, aby byl to enzym ograniczający szybkość ketogenezy. Acetooctan jest przetwarzany do D(-)-3-hydroksymaślanu przez dehydrogenazę D(-)-3-hydroksymaślanową, która występuje w mitochondriach wielu tkanek, łącznie z wątrobą. D(-)-3-Hydroksymaślan jest ilościowo dominującym ciałem ketonowym występującym we krwi 1 w moczu w ketozie. Ciała ketonowe są wykorzystywane jako materiał energetyczny przez tkanki pozawątrobowe ChociaŜ wątroba jest wyposaŜona w aktywny mechanizm enzymatyczny potrzebny do wytwarzania acetooctanu z acetoacetylo-CoA, to raz powstały acetooctan nie moŜe być w zasadzie w wątrobie ponownie reaktywowany. W cytozolu komórek wątrobowych zachodzi znacznie mniej aktywny proces biosyntezy cholesterolu, dla którego acetoacetylo-Co A jest prekursorem. Wszystko to sprawia, Ŝe w wątrobie przewaŜa powstawanie acetooctanu nad jego utylizacją. W tkankach pozawątrob owych zachodzą 2 reakcje, w których acetooctan jest aktywowa ny do acetoacetylo-Co A. W jednej z nich uczest niczy sukcynylo-CoA i enzym transfera/a bursz tyny ło-CoA-acetoacetylo-Co A. Enzym ten kata lizuje przeniesienie CoA z sukcynylo-CoA na acetooctan z wytworzeniem acetoacetylo-Co A i wolnego bursztynianu.

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 269

CHaC0O" I CH a CO-S-CoA

CH3COCHaCOO Acetooctan

D(-)-3-HydroksymaśIan moŜe być bezpośrednio aktywowany w tkankach pozawątrobowych przez odpowiednią syntetazę; jednakŜe przemiana do acetooctanu z udziałem dehydrogenazy D(-)- 3 -hydro ksym a sianowej i NAD+, z następującą potem aktywacją do acetoacetylo-CoA, jest waŜniejszą drogą dalszej przemiany hydroksymaślanu. Acetoacetylo-CoA powstały w tych reakcjach jest rozszczepiany do acetylo-CoA działaniem tiolazy i utleniany w cyklu kwasu cytrynowego, jak to przedstawiono na ryc. 24-7. Ciała ketonowe są utleniane w tkankach pozawątrobowych proporcjonalnie do ich stęŜenia we krwi. Są one utleniane preferencyjnie przed glukozą i WKT. Kiedy stęŜenie ciał ketonowych we krwi zwiększa się, zwiększa się ich utlenianie, aŜ do stęŜenia ok. 12 mmol/l, w którym wysycają one układy utleniające. Gdy to nastąpi, znaczna ilość pobieranego przez zwierzę tlenu moŜe być zuŜywana do utleniania ciał ketonowych.

Sukcvnylo-CoA CH3COCH3CO-S-CoA ITRANSFCRAZACOAI CHaCOO" i CHaCOO" Bursztynian Acetoa cetylo -CoA

Druga reakcja polega na aktywacji acetooctanu przez ATP w obecności CoA, katalizowana jest przez syntctazę acetoacetjlo-CoA, SYNTETAZA ACETOACETYLO-CoA

CH 3COCH ICOO"+ ATP+ CoA- SH Acetooctan - CH3COCHJCOSCoA+AMP+ A ceto a c et y I o - C o A

FFA ATP-v CoA AMP+ PPt

SYNTETAZA ACYLO-CoA

Acyto-CoA

Ettryflkacja

Tfiacylogilcaro l fosioiipld

^-Oksydacja •[AMrtylo-CoA).

|DEACYLAZA|

"7T" H,0

CoA

SYNTAZA HMG-CoA

ITPLAZAI \ Pula aeetylo-CoA

H,O\ *

3-HydrDk£y-3me!yloglutar^o-CoA (HMG-CoA) LIAZA HMG-CoA

Acetylo-CoA

I kwasu! cytrynowego

2CO,

DEHYDROGENAZA D (-)3-HYDROKEYWASLANOWA

D(-)3My0roksyfna4ian

Rve. 24-7. Szlak ketogenezy w wątrobie. WKT — wolne kwasy tłuszczowe, HMG — 3-hydroksy-3-metylogiuiaryl.

270 / ROZDZIAŁ 24 O

O

CHJ-C-CHJ-C-S -CoA Acetoacetylo-CoA

3 -*C-S

—CoA Awtylo-CoA

HjO

V_______ SYNTAZA HMG-CoA

OH I

O li

CH,- C - CHi —C-S-CoA "Ć H , -* C O O 3-Hyd ro ksy-3-m styl og! u ta rył o-CoA

LSAZA HMG-CoA

H.-C-S — <

i CH 3 - C Acełooctan

CH 3 -C~S —CoA Acetylo-CoA

Byc. 24-8. Powstawanie acetooctanu przez pośrednie wytwarzanie HMG-CoA.

Większość danych doświadczalnych przemawia za tym, Ŝe kctonemia jest powodowana raczej nadmiernym wytwarzaniem ciał ketono-

wych w wątrobie niŜ upośledzonym ich zuŜywaniem przez tkanki pozawątrobowe. Wyniki doświadczeń na szczurach z usuniętą trzustką przemawiają jednak za tym, Ŝe w cięŜkiej cukrzycy ketoza moŜe być pogłębiana zmniejszeniem katabolizowama ciał ketonowych. Przy umiarkowanej ketonemii utrata ciał ketonowych z moczem stanowi zaledwie niewielki procent całkowitego ich wytwarzania i utylizacji. PoniewaŜ ciała ketonowe zachowują się w nerkach podobnie jak związki „progowe" (w rzeczywistości nie istnieje prawdziwy próg nerkowy dla tych metabolitów), przy czym poszczególne gatunki i poszczególni osobnicy wykazują znaczne róŜnice indywidualne; cięŜkość ketozy naleŜy oceniać na podstawie nasilenia ketonemii, a nie ketonurii. Podczas gdy utlenianie acetooctanu i D(-)-3-hydroksymaślanu w tkankach pozawątrobowych przebiega nader sprawnie, utlenianie acetonu in vivo jest raczej trudne.

KETOGENEZA JEST REGULOWANA NA 3 KLUCZOWYCH ETAPACH 1. Pierwsze miejsce kontroli ketogenezy znaj duje się w tkance tłuszczowej. Retoza nie wy stąpi in vivo, jeŜeli nie ma równoczesnego zwięk szenia stęŜenia krąŜących wolnych kwasów tłu szczowych, które pochodzą z lipolizy triacylogliceroli w tkance tłuszczowej. Kwasy tłusz czowe są prekursorami ciał ketonowych w wąt robie. Wątroba zarówno w fazie sytości, jak i w czasie głodzenia ma zdolność wychwytywa nia ok. 30% lub więcej kwasów tłuszczowych z krwi docierającej do tego narządu. Przy duŜych stęŜeniach wolnych kwasów tłuszczo wych we krwi ich napływ do wątroby jest znaczny. Wobec tego dla kontroli ketogenezy znacząca jest rola czynników regulujących mobi lizację wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej (ryc. 24-9). 2. Losy wychwytywanych przez wątrobę wo lnych kwasów tłuszczowych mogą być dwojakie po wstępnej ich aktywacji do acylo-CoA. Mogą one zostać zestryfikowane, głównie do triacylo-

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 271

gliceroli i fosfolipidów, lub teŜ ulegają fi-oksydacji do CO, względnie do związków ketonowych. Wydolność estryfikacji, jako czynnika przeciwketogennego, zaleŜy od dostępności w wątrobie prekursorów glicerolo-3-fosforanu. Jednak w głodzonych perfundowanych wątrobach dostępność glicerolo-3-fosforanu nie jest czynnikiem ograniczającym estryfikację WKT. Nie rozstrzygnięto ostatecznie, czy ta dostępność w wątrobie jest w ogóle czynnikiem ograniczającym szybkość estryfikacji. Nie ma równieŜ pewnych informacji, czy aktywność in vivo enzymów uczestniczących w estryfikacji jest czynnikiem ograniczającym szybkość tego procesu. Wydaje się, Ŝe nim nie jest, gdyŜ nie zdarza się spichrzanie w wątrobie ani wolnych kwasów tłuszczowych, ani związków pośrednich na drodze ich estryfikacji (p. ryc. 26-1). UŜywając perfundowanej wątroby wykazano, Ŝe narząd ten. pochodzący od dobrze kar-

Trlacyloglioerol

©

TKANKA TŁUSZCZOWA

Llpoliza

WKT KREW

WKT

Cykl kwasu cytrynowego Ketogeneza CO, Ciała ketonowe

Ryc. Z4-9. Regulacja ketogenezy. 1-3— 3-węzłowe etapv szlaku metabolizmu wolnych kwasów tłuszczowych (WKT), które dete/minują wielkość ketogenezy. _______ ___________

mionyeh szczurów, estryfikuje znacznie więcej kwasów tłuszczowych znakowanych 14C niŜ wątroba szczurów głodzonych, w której nie zestryfikowany nadmiar wolnych kwasów tłuszczowych jest utleniany do 14CO;, lub 14C-ciał ketonowych. Te wyniki tych badań moŜna wyjaśnić tym, Ŝe aktywność palmitoilotransferazy I kamity nowej, umiejscowionej w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, reguluje wnikanie grup acylowych o długim łańcuchu do wnętrza mitochondriów przed ich fi-oksyda-cją (p. ryc. 24-1). Aktywność tego enzymu jest mała w stanie sytości, gdy utlenianie kwasów tłuszczowych jest małe, natomiast duŜa przy głodzeniu, kiedy zwiększa się utlenianie kwasów tłuszczowych. Malonylo-CoA, początkowy metabolit w biosyntezie kwasów tłuszczowych (p. ryc, 23-1), którego stęŜenie zwiększa się w stanie sytości, jest inhibitorem wymienionej pataitoilotransferazy, przez co ustaje p-oksydacja. W warunkach sytości zachodzi więc aktywna lipogeneza i jest duŜe stęŜenie malonylo-CoA, hamującego palmitoilotransferazę I (ryc. 24-10). Wolne kwasy tłuszczowe, wnikające do wątroby przy ich małym stęŜeniu w osoczu, są niemal w całości estryfikowane do acyl o gliceroli i wydalane z wątroby do krwi w postaci lipoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL), Na początku głodzenia, kiedy stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu się zwiększa, zahamowana zostaje karboksylaza acetylo-CoA i stęŜenie malonylo-CoA się zmniejsza. W następstwie tego procesu odblokowaniu ulega palmiloilotransferaza kani i ty nowa, co pozwala na zwiększenie utleniania acyl o-Co A. Te zdarzenia nasilają się w stanach głodzenia, kiedy zmniejsza się stosunek [insulina] / [glukagon], przez co zwiększa się lipoliza w tkance tłuszczowej, natomiast zahamowaniu ulega karboksylaza acetylo-CoA w wątrobie (p. ryc. 2410). 3. Acetylo-CoA, powstały w procesie P-oksydacji, jest utleniany w cyklu kwasu cytrynowego albo wchodzi w szlak ketogenezy wytwarzający ciała ketonowe. Gdy stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy się zwiększa, wówczas proporcjonalnie więcej kwasów tłuszczowych jest przekształcanych w ciała ketonowe, a mniej jest utlenianych w cyklu cytrynianowym do CO7. Proporcja acetylo-CoA, napływającego do szlaku ketogenezy i szlaku utleniania do CO2, jest tak regulowana, Ŝe całkowita energia swobodna zgromadzona w postaci ATP w wyniku utleniania kwasów

27 2 / ROZDZIAŁ 24

WKT

VLDL

KREW

WĄTROBA

WKF

Węglowodany —»• Acetyto-CoA

ł ^ , , Acylo-CoA

Estryłlkacja --------------------

Acytagllcerole

KARBOKSYLAZA ACETYLD-CoA Insulina Cylosol Glukagon Matonylo-CoA ______

O.

PALMITOILOTRANSFERAZA KARNITYNOWA I .Acylo-CoA [ 0-Oksydacja

Milochondrlum Aootylo-CoA

—

Ketoganeza

Ciała ketonowe Ryc. 24-10. Regulacja utleniania dtugołańcuchowych kwasów tłuszczowych w wątrobie. WKT —wolne kwasy tłuszczowe, VLDL — lipoproteiny o bardzo malej gęstości. Dodatnie (©) i ujemne (©) efekty regulacyjne są przedstawione przerywanymi liniami, a przepływ substratów iiniami ciągłymi. __________

tłuszczowych pozostaje stalą. Całkowitemu utlenieniu 1 mol palmil ynianu towarzyszy wytwarzanie netto 129 mol ATP, gdy proces ten zachodzi poprzez ft-oksydację i wytworzenie CO^ w cyklu kwasu cytrynowego (p. wyŜej). JeŜeli końcowym produktem przemiany palmitynianu jest acetooctan ilość powstałego ATP wynosi tylko 33 moi. Ilość powstającego ATP zmniejsza się nawet do 21 mol, gdy produktem końcowym jest 3-hydroksymaśtan. Ketogeneza moŜe więc być uwaŜana za mechanizm, który umoŜliwia wątrobie utlenienie zwiększających się ilości kwasów thiszczowych w układzie skojarzonych oksydacyj-

nych fosforylacji, bez zwiększenia całkowitego wydatku energetycznego. Wysuwano kilka innych hipotez w celu wyjaśnienia przełączania utleniania kwasów tłuszczowych ze szlaku prowadzącego do CO2 na szlak ketogenezy. Teoretycznie zmniejszenie stęŜenia szczawi o octanu, zwłaszcza w mitochondriach, mogłoby zmniejszać zdolność cyklu kwasu cytrynowego do metaboltzowania acetylo-CoA. Takie zmniejszenie moŜe się zdarzać wtedy, kiedy dochodzi do zwiększenia stosunku [NADH] / [NAD+], spowodowanego intensywniejszą p-oksydacją. Krebs sugerował,

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 273

Ŝe wzmoŜona glukoneogeneza, na szlaku której występuje takŜe szczawiooctan, jest przyczyną zmniejszenia stęŜenia tego związku, co moŜe być powodem cięŜkich postaci ketozy występującej w cukrzycy, a takŜe ketozy u bydła. JednakŜe Utter i Keech wykazali, Ŝe karboksylaza pirogronianowa, katalizująca przemianę pirogronianu w szczawiooctan, jest aktywowana przez acetylo-CoA. Wynika stad, Ŝe w razie występowania znacznych ilości acetyl o-Co A są niezbędne dostatecznie duŜe ilości szczawiooctanu w celu zainicjowania reakcji kondensacji, rozpoczynającej cykl kwasu cytrynowego.

PIŚMIENNICTWO Boyer Pd (editor): The Enzymes, 3rd ed. Vol 16 of Lipid Enzymology. Academic Press, 1983,

1S — Biochemia

Debeer LJ, Mannaerts GP: The mitochondrial and peroxisomal pathways of fatty acid oxidation in rat liver. Diabete Metab (Paris) 1983;9;134. Mayes PA, Laker ME: Regulation of ketogenesis in the liver. Biochem Soc Trans 1981;9:339, McGarry JD, Foster DW: Regulation ofhepatic fatty acid oxidation and ketone body production. Annu Rev Biochem 1980;49:395. Pandę SV, Parvin R: Page 143 in: Carnitine Biosynthesis, Metabolium. and Functions, Frenkel RA, McGarry JD (editors). Academic Prcss, 1980. Schulz H: Oxidation of fatty acids. Page 116 in: Biochemistry ofLipids and Membranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 19S5. Various authors: In: Tke Metabolit- Basia of Inherited Disease, 6th ed. Scriver CR et ul (editors). McGraw-Hill, 1989. Vianey-LiaudCetal: Theinborn errorsofmitochondriai fatty acid osidation. / Inher Metab Dis 1987;1O: Suppl 1:159.

25

Metabolizm nienasyconych kwasów tłuszczowych i eikozanoidów Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE W porównaniu z roślinami tkanki zwierzęce mają ograniczoną zdolność desaturacji kwasów tłuszczowych. Stwarza to konieczność przyjmowania w pokarmie pewnych wielo nienasyconych kwasów tłuszczowych głównie pochodzenia roślinnego. Te egzogenne kwasy tłuszczowe umoŜliwiają powstawanie ikozanowych (C20) kwasów tłuszczowych, z których pochodzą związki znane jako eikozanoidy. NaleŜą do nich prostaglandyny, tromboksany i leukotrieny.

adenylanowej, np. 1) w regulacji agregacji płytek krwi oraz 2) w hamowaniu działania hormonu antydiuretycznego w nerkach. Leukotrieny mają właściwości kurczenia mięśni gładkich, a takŜe właściwości chemotaktyczne, co sugeruje, Ŝe mogą one odgrywać waŜną rolę w reakcjach alergicznych i zapalnych. Mieszaninę leukotrienów zidentyfikowano jako wolno reagującą substancję anafilaksji (SRS-A). Przez zmianę proporcji róŜnych wielo nienasyconych kwasów tłuszczowych w diecie jest moŜliwe wpływanie na typ syntetyzowanych eikozanoidów. Wskazuje to na moŜliwość wpływania na przebieg choroby przez zmiany składu diety.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych w tłuszczu wyznacza jego temperaturę topnienia, a więc i jego płynność. Fosfolipidy błony komórkowej równieŜ zawierają nienasycone kwasy tłuszczowe istotne do utrzymania odpowiedniej płynności błony. DuŜy stosunek stęŜenia wielo nie nasyconych kwasów tłuszczowych do nasyconych (stosunek P:S) w pokarmach jest waŜnym czynnikiem do zmniejszenia stęŜenia cholesterolu w surowicy krwi za pomocą diety i uwaŜa się, Ŝe działa korzystnie w zapobieganiu chorobie niedokrwiennej serca. Prostaglandyny i tromboksany są miejscowymi hormonami, które w miarę potrzeby są szybko syntetyzowane i działają blisko miejsca swojej syntezy, Niesteroidowe Leki przeciwzapalne, takie jak kwas acetylosalicylowy, działają na zasadzie hamowania syntezy prostaglandyn. Prostaglandyny odgrywają fizjologiczną rolę głównie jako modulatory aktywności cyklazy

NIEKTÓRE WfELONIENASYCONE KWASY TŁUSZCZOWE NIE MOGĄ BYĆ SYNTETYZOWANE PRZEZ SSAKI I SĄ NIEZBĘDNYMI SKŁADNIKAMI POKARMU Niektóre długołańcuchowe nienasycone kwasy tłuszczowe, mające znaczenie metaboliczne u ssaków, przedstawiono na ryc. 25-1. (Przegląd nazewnictwa kwasów tłuszczowych omówiono w rozdz. 16). Inne C20 kwasy polienowe, kwasy C22 i C2A moŜna równieŜ znaleźć w tkankach. Mogą one powstawać z kwasów olejowego, linolowego i a-linolenowego przez elongację łańcucha. NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe wszystkie podwójne wiązania w naturalnie występujących kwasach tłuszczowych mają konfigurację cis. Kwasy palmitoolejowy i olejowy nie naleŜą do kwasów egzogennych, poniewaŜ tkanki są

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDÓW / 275

rych wiadomo, Ŝe są niezbędnymi składnikami poŜywienia dla wielu gatunków zwierząt, łącznie z człowiekiem i muszą być dostarczane z pokar mem; nazywa się je przeto egzogennymi kwasa mi tłuszczowymi. Kwas linolowy nie jest syn tetyzowany u człowieka i dlatego musi być COOH dostarczany w gotowej postaci w poŜywieniu. Kwas arachidonowy moŜe być jednakŜe wy twarzany z kwasu linolowego u większości ssaków (p. ryc. 25-4). U zwierząt podwójne wiązanie moŜe być wprowadzane do pozycji A4, COOH A5, A6 i A9 (licząc od końca karboksylowego; p. rozdz. 16), ale nigdy poza pozycję A9. Odmien nie jest u roślin, które są zdolne do wprowadza nia nowych podwójnych wiązań w pozycje As, A9, A12 i A15 i wobec tego mogą syntetyzować egzogenne (niezbędne w pokarmie zwierzęcym) COOH kwasy tłuszczowe.

/WWVW\ COOH 16

9 Kwas palmltoolejowy (a> 7, 16:1 A") Kwas olejowy (w 9,18:1, A")

AAAAAAA/ *Kwas llnolawy {as 6, 18:2,

/WWWWNA 18

15

12

9

Stearoito-CoA + Enzym

'Kwas «-llno(enowy (a» 3, 18:3, £*■*«)

COOH

20

'Kwas arachidonowy (co 6, 20:4,

THANSFERAZA ACYLOWA

CoA-SH

'COO 1t1T

H Kwas elkozapenlaenowy (m 3, 20:5, A**"'

)

Byc. 25-1. Budowa niektórych nienasyconych kwasów tłuszczowych. ChociaŜ atomy węgla są numerowane konwencjonalnie, tzn. od węgla karboksylowego, liczby poprzedzone grecką literą at (np. to7 w kwasie palmitoolejowym) oznaczają pozycje liczoną od odwrotnego końca {końcowej grupy metylowej) cząsteczki. Informacja zawarta w nawiasach wskazuje, Ŝe np. kwas a-linolenowy ma podwójne wiązania począwszy od C3, licząc od końca metylowego, ma 18 atomów węgla i 3 podwójne wiązania oraz Ŝe te podwójne wiązania są umiejscowione przy 9,12 i 15 atomie węgla, licząc od końca karboksylowego. Znak * oznacza, Ŝe dany związek jest „egzogennym kwasem tłuszczowym".

Stearollo-Enzym

HYDROKSYUKZA Cytbs * . NAD

+

Hyd roksyslearoilo-Enzym

HYDRATAZA

Olallo-Enzym

zdolne do wprowadzania podwójnego wiązania w pozycji A9 do odpowiedniego nasyconego kwasu tłuszczowego. Doświadczenia ze znakowanym kwasem palmitynowym wykazały, Ŝe znacznik łatwo pojawia się w kwasie palmitootejowym i olejowym, ale nie ma go w kwasach linolowym, ot-linolenowym ani arachidonowym. Są one jedynymi kwasami tłuszczowymi, o któ-

TRANSFEHAZA ACYLOWA

Oleilo-CoA + Enzym Ryc 9

mikrosomalnej A -desaturazy.

25-2. Uktad

• 276 / ROZDZIAŁ 25

MONONIENASYCONE KWASY TŁUSZCZOWE SĄ SYNTETYZOWANE PRZEZ UKŁAD A9-DESATURAZY UwaŜa się Ŝe wiek tkanek, łącznie z wątrobą, ma zdolność tworzenia mono nienasyconych kwasów tłuszczowych z odpowiednich kwasów nasyconych. Pierwsze podwójne wiązanie jest wprowadzane do nasyconego kwasu tłuszczowego niemal zawsze w pozycji A9. Układ enzymatyczny — A9-desaturaza — (ryc. 25-2) w siateczce śródplazmatycznej katalizuje przekształcenie palmitoilo-CoA w palmitooleilo-CoA albo stearoilo-CoA w oleilo-CoA. Do reakcji jest niezbędny tlen oraz NADH albo NADPH. Enzymy uczestniczące w tej reakcji wydają się być typowymi enzymami układu monooksygenazy zawierającego cytochrom b; (hydroksylaza).

W SYNTEZIE WIELONIENASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH UCZESTNICZĄ UKŁADY ENZYMATYCZNE DESATURAZY 1 ELONGAZY Dodatkowe wiązania podwójne, wprowadzane do istniejących juŜ niononienasyconych kwasów tłuszczowych, zawsze (z wyjątkiem bakterii) są od siebie przedzielone grupą metylenową. U zwierząt dodatkowe wiązania podwójne są zawsze wprowadzane między istniejące podwójne wiązanie a grupę karhoksyIową, ale u roślin mogą być wprowadzane między istniejące wiązanie podwójne i węgiel to (koniec metylowy). PoniewaŜ zwierzęta mają A9-desaturazę, są one zdolne do kompletnej syntezy rodziny a>9 (kwasu olejowego) nienasyconych kwasów tłuszczowych przez kombinację elongacji i desatu-

ELONGAZA

Rodzlna

|

A'-DESATURAZA

A'-DESATURAZA

Kwas olejowy 18:1 -

■ 20:2

20i3 -----------^ 22:3

22:4

A'-DE5ATURAZA

18:2. ELONGAZA \

20:1 ELONGAZA

B_0NGAZA

'

Spichrza nie przy niedoborze kwasów tłuszczowych egzogennych

22:1

Ai 24:1

Rodzina

Kwas lin o Iowy 18:2------ -.—

18:3

-20:3

-20:4

18:4

20:4

20:5

22:5

ELONGAZA

20:2

/e

Kwas a-llnolenowy Rodzina (D 3

18:3

-*- 22:5 •

22:6

--------------------------1

Ryc. 25-3. Biosynteza wielonienasyconych kwasów tłuszczowych rodzin u9, w6 oraz co3. KaŜdy z etapów jest katalizowany przez mikrosomalne układy elongacji albo desaturacji. Ilość wielonienasyconych kwasów tłuszczowych »9 staje się znacząca jedynie wówczas, gdy kwasy linolowy i ot-linolenowy zostają wyłączone z diety. Dzieje się tak dlatego, Ŝe kaŜda z przedstawionych serii współzawodniczy o te same układy enzymatyczne, a powinowactwa zmniejszają się począwszy od mZ aŜ do <»>9. © —■ hamowanie.

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASOW TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDÓW / 277

Llnolelto-CoA (A^-oktadefcadfenolto-CoA) Oj + NADH + H + ,

y-Lfnoteno(to-CoA(4**"-aktadekatrlenollo-CoA)

(Malonyto-CoA, NADPH)

C-S — CoA Arachldonollo-CoA (A""'1*-«lkozatetraenollo-CoA)

Ryc. 25-4. Przemiana kwasu linolowego do arachidonowego. U kotów nie zachodzi ta przemiana, gdyŜ 6 nie mają one A -desaturazy i muszą wobec tego otrzymywać arachidonian z pokarmem. ____________

racji łańcucha (ryc. 25-3). PoniewaŜ jednak nie są one zdolne do syntetyzowania ani kwasu linolowego ((06), ani a-linolenowego (co3), gdyŜ nie mają potrzebnych do tego odpowiednich desaturaz, te kwasy muszą być dostarczone w pokarmach, aby mogła zachodzić synteza innych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych rodziny w6 i o>3. Linolenian moŜe być przemieniony w arachidonian (ryc. 25-4). W szlaku tym dochodzi najpierw do odwodorowania estru kwasu linolowego z CoA i utworzenia Y-linolenianu, po czym następuje dodanie jednostki dwuwęglowej przez przyłączenie malonylo-CoA

w mikrosomalnym układzie elongacyjnym (p. str. 257). W wyniku tych reakcji powstaje ikozatrienian (dihomo-y-linolenian), który przez dalsze odwodorowanie tworzy arachidonian. Układ odwodorowujący jest podobny do tego, który opisano powyŜej dla nasyconych kwasów tłuszczowych. Z powyŜszego wynika, Ŝe przy dostatecznej podaŜy kwasu liściowego kwas arachidonowy przestaje być kwasem egzogennym.

Aktywność układu desaturacji i eiongacji jest znacznie zmniejszona w stanie głodzenia i przy braku insuliny.

278 / ROZDZIAŁ 25

OBJAWY NIEDOBORU WYSTĘPUJĄ WÓWCZAS, GDY BRAK JEST W POKARMACH EGZOGENNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH (EFA) W 1928 r. Evans i Burr zauwaŜyli, Ŝe szczury karmione oczyszczoną dietą bezlipidową, do której dodano witaminę A i D, wykazują zmniejszone tempo wzrostu i upośledzoną reprodukcję. Późniejsze prace wykazały, Ŝe ten zespół niedoboru moŜna wyleczyć przez dodanie do diety kwasów linolowego, a-linolenowego i arachid ono wego. Dalsze objawy zespołu niedoboru egzogennych kwasów tłuszczowych to łuszcząca się skóra, martwica ogona i uszkodzenie układu moczowego, ale choroba nie jest śmiertelna. Leczące ten zespół kwasy tłuszczowe występują w duŜym stęŜeniu w róŜnych olejach roślinnych (p. str. 175), a w niewielkich tylko ilościach w produktach zwierzęcych. Funkcje egzogennych kwasów tłuszczowych wydają się być róŜnorodne, chociaŜ niezbyt dobrze określone, z wyjątkiem znaczenia, jakie mają w tworzeniu prostaglandyn i leukotrienów. Egzogenne kwasy tłuszczowe występują w strukturalnych lipidach komórki i mają znaczenie w utrzymaniu strukturalnej integralności błon mitochondrialnych. Kwas arachidonowy występuje w błonach komórkowych i stanowi 5—15% wszystkich kwasów tłuszczowych w fosfolipidach. Kwas dokozaheksaenowy (DHA: a>3,20:6), który jest syntetyzowany z kwasu a-linolenowego lub otrzymywany bezpośrednio z tłuszczu ryb, występuje w duŜych stęŜeniach w siatkówce, korze mózgu, w jądrach i w spermie. DHA jest przede wszystkim potrzebny do rozwoju mózgu i jest dostarczany poprzez łoŜysko i z mlekiem. Aby spełnić wiele funkcji strukturalnych egzogenne kwasy tłuszczowe występują w fosfolipidach głównie w pozycji 2. W niedoborze egzogennych kwasów tłuszczowych endogenne polienowe kwasy tłuszczowe z rodziny 0)9 zastępują egzogenne kwasy w fosfolipidach w innych złoŜonych lipidach i w błonach. Takim polienowym kwasem tłuszczowym jest kwas Ai'811ikozatrienowy (ryc. 25-3). Oceny stopnia niedoboru egzogennych kwasów tłuszczowych moŜna dokonać, oznaczając stosunek stęŜenia trienów do tetraenów (arachidonianu) w osoczu. U ludzi spoŜywających pokarmy pozbawione egzogennych kwasów tłuszczowych zauwaŜono zmiany skórne oraz upośledzenie transportu

lipidów. Objawów takich nie stwierdzono u dorosłych pozostających na zwykłej diecie. Jednak u dzieci otrzymujących poŜywienie ubogie w tłuszcze obserwowano zmiany skórne, które ustępowały po podaniu linolenianu. Niedobory dające się przypisać brakowi egzogennych kwasów tłuszczowych, łącznie z kwasem a-linolenowym mogą wystąpić takŜe u chorych Ŝywionych przez dłuŜszy czas doŜylnie płynami z małą zawartością egzogennych kwasów tłuszczowych. Temu niedoborowi moŜna zapobiec przez podawanie egzogennych kwasów tłuszczowych w ilości 1—2% całkowitego zapotrzebowania energetycznego. Kwasy tłuszczowe o konfiguracji trans mogą konkurować z kwasami tłuszczowymi cis Śladowe ilości nienasyconych kwasów tłuszczowych o konfiguracji trans powstają w tłuszczach przeŜuwaczy, gdzie występują dzięki działaniu mikroorganizmów znajdujących się w Ŝwaczu. Obecność duŜych ilości trans nienasyconych kwasów tłuszczowych w częściowo uwodorowanych olejach roślinnych (np. wmargarynie) nasuwa wątpliwości odnośnie do bezpieczeństwa ich stosowania jako dodatków pokarmowych. Skutki długotrwałego ich spoŜywania przez ludzi są trudne do ocenienia, chociaŜ juŜ od wielu lat są one składnikami poŜywienia człowieka. W czasie autopsji w tkankach człowieka stwierdza się do 15% nienasyconych kwasów tłuszczowych o konfiguracji trans. Dotychczas nie opisano powaŜnych ujemnych skutków ich występowania. Są one metabolizowane raczej w sposób bardziej podobny do nasyconych kwasów tłuszczowych niŜ do cis nienasyconych. MoŜe to być spowodowane ich podobną prostolań cuch ową konformacją (p. rozdz. 16). Wielonienasycone kwasy tłuszczowe o konfiguracji trans nie mają działania egzogennych kwasów tłuszczowych. Mogą one antagonizować metabolizm tych ostatnich, pogłębiając niedobór egzogennych kwasów tłuszczowych. Nieprawidłowy metabolizm egzogennych kwasów tłuszczowych występujący w niektórych chorobach Poza niedoborem egzogennych kwasów tłuszczowych i zmianami w proporcji zawartości poszczególnych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, spowodowanym długotrwałym wadliwym odŜywianiem, nieprawidłowy metabolizm egzogennych kwasów tłuszczowych

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDÓW / 279

stwierdzono u chorych z torbielowatym włóknieniem trzustki, w acrodermatitis enteropathtca, zespole wątrób owo-nerkowym, zespole Sjógrena-Larssona, wieloukładowym zwyrodnieniu nerwów, chorobie Crohna, marskości wątroby, alkoholizmie oraz zespole Reye'a. DuŜe stęŜenie polienowych kwasów tłuszczowych o bardzo długim łańcuchu węglowym stwierdzono w mózgu chorych z zespołem Zellwegera (p. str. 265). SpoŜywanie pokarmów o duŜym stosunku P;S (wielonienasycone : nasycone kwasy tłuszczowe) zmniejsza stęŜenie cholesterolu surowicy, zwłaszcza cholesterolu LDL. Jest to korzystne z punktu widzenia relacji zachodzącej między stęŜeniem cholesterolu w surowicy a chorobą niedokrwienną serca.

Arachidonian, zwykle pochodzący z pozycji 2 fosfatydylodiacylogliceroli błon plazmatycznych w wyniku działania fosfolipazy A2 (p. ryc. 26-5), jest substratem do syntezy PG2, TXj oraz LT4. Szlaki ich metabolizmu są róŜne. Biosynteza PG i TX2 (prostanoidów) współzawodniczy 0 substrat, tj. arachidonian, z syntezą serii LT4. Te 2 szlaki są znane jako szlaki cyklooksygenazy 1 lipooksygenazy (ryc. 25-5). Istnieją 3 grupy eikozanoidów (kaŜda zawierająca PG, TX i LT) syntetyzowane odpowiednio z 3 egzogennych kwasów tłuszczowych: linolanu, arachidonianu i a-Hnolenianu (ryc. 25-6).

SZLAK CYKLOOKSYGENAZY JEST ODPOWIEDZIALNY ZA BIOSYNTEZĘ PROSTANOIDÓW

EIKOZANOIDY POWSTAJĄ Z C3O-WIEL0NIENASYC0NYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Arachidonian i niektóre inne C10 kwasy tłuszczowe, z wiązaniami podwójnymi poprzedzielanymi grupami metylenowymi, są źródłem powstawania eikozanoidów, fizjologicznie i farma kologicznie czynnych związków znanych jako prostaglandyny (PG), tromboksany (TX) i leukotrieny (LT) (p. rozdz. 16).

Biosynteza prostanoidów (ryc. 25-7), podczas której dochodzi do zuŜycia 2 cząsteczek O2, jest katalizowana przez syntazę endoperoksydu prostaglandyny, wykazującą 2 oddzielne aktywności enzymatyczne, cyklooksygenazy i peroksydazy. Produkt szlaku cyklooksygenazy, endoperoksyd (PGH), jest przemieniany do prostagJandyn D, E i F, a takŜe do tromboksanu (TXA2) i prostacykliny (PGI2). KaŜdy rodzaj komórki RóŜne bodźce, np. anglotensyna II, twadyktntna. adrenalina,

FoEtolipId błonowy

irombina FOSFOLIPAZA A,

KortykoBteroltJy przeciwzapalne Arachidonian UPOKSYGENA2A

Leukotrieny

Prostaglandyny i tromboksany

Kwas acetylosalicylowy

Indomstacyna

Ryc. 25-5, Przemiana kwasu arachidonowego do prostaglandyn i tromboksanów szlakiem cyklooksygenazy oraz do leukotrienów szlakiem I i po k sygenazy. Na rycinie pokazano, dlaczego steroidy, które hamują całkowite wytwarzanie eikozanoidów, są lepszymi czynnikami przeciwzapalnymi niŜ kwas acetylosalicylowy i podobne do niego leki, które hamują tylko szlak cyklooksygenazy. UwaŜa się, Ŝe steroidy przeciwzapalne hamują fosfolipazę Az przez to, Ŝe indukują inhibitorowe białko lipokortynę.

280 / ROZDZIAŁ 26 Pokarm

Llinolan

I-2H

:

Pros!anofdy;

POD, PGE,

y-Unolenian

J+2C COOH 8,11,14Eikozatrienoart (d th omo-y-l in ols n ian)

LTD, GRUPA3 Prostanoidy; PG D,

.

PGE,

Ei kc zatet raanoan

|+2C Oktadekatettaenaan -2H

-COOH

. _-----

TXAj, Leukatrieny

T-2H ot-Linolenian

3

PG13

5 8, 11, 14, 17-Elkozape nlaen o a n

©

LTCS

Dieta c

Ry - 25-6. 3 grupy eikozanoidów i ich biosyntetyczne pochodzenie. PG — prostaglandyna, PGI — prostacykltna, TX — tromboksan, LT — leukotrien, 1 —szlak cyklooksygenazy, 2—szlak Itpotcsygenazy Indeks we frakcji dolnej oznacza całkowitą liczbę podwójnych wiązań w cząsteczce i serię, do której ten związek naleŜy.

wytwarza tylko 1 typ prostanoidu. Kwas acetylosalicylowy hamuje cyklooksygenazę i podobnie działa indometacyna. Aktywność egzogennych kwasów tłuszczowych jest skorelowana z wytwarzaniem prostagłandyn Jakkolwiek istnieje znaczna korelacja między aktywnością poszczególnych egzogennych kwasów tłuszczowych a ich zdolnością do przekształcania się w prostaglandyny nie wydaje się, aby egzogenne kwasy tłuszczowe wywierały wszystkie swoje fizjologiczne efekty przez biosyntezę prostagłandyn. Rola egzogennych

kwasów tłuszczowych w powstawaniu błon nie ma związku z tworzeniem prostagłandyn. Pod wpływem prostagłandyn nie dochodzi do cofania się objawów niedoboru egzogennych kwasów tłuszczowych zaś zespół niedoboru egzogennych kwasów tłuszczowych nie jest spowodowany dhigo trwałym hamowaniem syntezy prostagłandyn. Cyklooksygenaza jest „enzymem samobójczym" „Wyłączenie" syntezy prostagłandyn zachodzi częściowo dzięki godnej uwadze właściwości cyklooksygenazy, mianowicie enzym ten wyka-

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASOW TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDÓW / 281 COOH

Ryc. Przemiana

26-7. kwasu

Kwas acetylosalicylowy Indomalacyna

9

arachidonowego do prostaglandyrt i tromboksanów serii 2. STNTETAZA PROSTACYKLINOWA COOH

SYNTETAZA TROMBOKSANOWA

COOH

PG — prosta-glandyna, TX — tromboksan, PGI — prostacyklina, HHT — hydroksyheptadekatrienoan. * Obydwie te aktywności są związane z jednym enzymem — syntazą endoperoksydów prostaglandyn owych. Podobne przemiany zachodzą z prostaglandynami i tromboksanami serii 1 i 3.

zuje 2dolność katalizowania samozagłady, czyli jest ona „enzymem samobójczym". Inaktywacja raz powstałych prostaglandyn jest szybka. Przyczyną tego jest prawdopodobnie obecność w większości tkanek ssaków dehydrogenazy 15hydroksyprostag landy nowej. Wykazano, Ŝe

zablokowanie tego enzymu sulfasalazyną lub indometacyną moŜe przedłuŜyć biologiczny okres póltrwania prostaglandyn w organizmie. Prostanoidy są substancjami o duŜej aktywności biologicznej Tromboksany są syntetyzowane w płytkach krwi. Przy uwolnieniu powodują skurcz naczyń i agregację płytek. Prostacykliny (PGI2) są wytwarzane przez ściany naczyń krwionośnych i są silnymi inhibitorami agregacji płytek.

Tromboksany i prostacykliny są więc antagonistami. Niewielką zapadalność na choroby serca, występowanie zmniejszonej agregacji płytek i przedłuŜonego czasu krzepnięcia u grenlandzkich Eskimosów przypisuje się duŜemu spoŜyciu olejów rybnych zawierających kwas tłuszczowy 20:5 w3 (EPA albo kwas ikozapentaenowy), który jest wyjściowym związkiem do syntezy serii 3 prostaglandyn (PG3) oraz tromboksanu TX3 (ryc. 25-6). PG3 i TX3 hamują uwalnianie arachidonianu z fostblipidów i tworzenie PG2 oraz TX2. PGI3 ma takie samo silne działanie przedwagregacyjne płytek krwi jak PGI2, natomiast TXA3 jest słabszym czynnikiem agregującym płytki krwi niŜ TXA2. W rezultacie przewaŜa więc działanie hamujące agregację płytek krwi. Ponadto w osoczu Eskimo-

282 / ROZDZIAŁ 25 COOH Gtlcyna

Kwas glutaminowy ' ---------* — + - J ^ ^ COOH

fl

EJ

OH Leukotrlen C, COOH

COOH OH

Leukotrlen E,

NH,1

A o s Leukotrion D, Glleyna

Cystelna

Ryc. 25-8. Przemiana kwasu arachidonowego do feukotrienó w serii 4 szlakiem lipoksygen azy HPETE — hydroperok syeikozatetra enoan, HETE — hydroksyeikozatetraen oan. Niektóre podobne prze miany zachodzą z leukotrien ami serii 3 i 5. 1 — Peroksydaz a, 2 — epoksydohydrol aza leukotrienu A,, 3 — Stransferaza glutationow a; 4 — yglutamylotrans feraza, 5 — dipeptydaz a cysteinyłoglicy nowa.

____

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWAS0W TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDOW / 283

sów stwierdza się małe stęŜenia cholesterolu, triacylogliceroli, LDL i VLDL, natomiast zwiększone stęŜenie lipoprotein o duŜej gęstości (HDL). Taki profil stęŜeń wymienionych lipidów zdaje się przeciwdziałać powstawaniu miaŜdŜycy naczyń i występowaniu zawałów serca. Zaledwie 1 ng/m] niektórych prostaglandyn powoduje skurcz mięśni gładkich u zwierząt. Potencjalnymi wskazaniami do stosowania prostaglandyn m.in. są: zapobieganie zapłodnieniu, sprowokowanie porodu przy ciąŜy donoszonej, przerwanie ciąŜy, złagodzenie bólu u chorych z chorobą wrzodową Ŝołądka, łagodzenie procesów zapalnych, ciśnienia tętniczego krwi, dychawicy oskrzelowej oraz obrzęków błony śluzowej nosa. Prostaglandyny zwiększają stęŜenie cAMP w: płytkach krwi, tarczycy, ciałku Ŝóhym, kościach płodowych, w przysadce gruczołowej i w płucach, natomiast zmniejszają go w komórkach kanalików nerkowych i w tkance tłuszczowej.

pujące potem odczepienie glutaminianu i glicyny powoduje kolejno powstanie leukotrienu D4 i leukotrienu E4.

Leukotrieny są silnymi regulatorami wielu procesów chorobowych Wolno reagująca substancja anafilaksji (SRS-A) jest mieszaniną leukotrienów C4, D4 i E4. Ta mieszanina Jeukotrienów jest 100-1000-krotnie silniejszym czynnikiem kurczącym mięśnie oskrzeli niŜ histamina lub niektóre prostaglandyny. Te leukotrieny, razem z leukotrienem B4, zwiększają przepuszczalność naczyń krwionośnych oraz wywołują chemotaksję i aktywację leukocytów. Wydaje się, Ŝe związki te są więc waŜnymi regulatorami wielu procesów chorobowych przebiegających ze stanami zapalnymi oraz uczestniczą w reakcjach nadwraŜliwości bezpośredniej, takich jak dychawica oskrzelowa. Leukotrieny są aktywne w stosunku do naczyń, zaś 5-lipoksygenazę wykazano w ścianie naczyń tętniczych.

PIŚMIENNICTWO LEUKOTRIENYSĄ SYNTETYZOWANE W SZLAKU LIPOKSYGENAZY Lenkotrieny są rodziną skoniugowanych trienów powstających z kwasów ikozanowych w szlaku lipoksygenazy w leukocytach, komórkach mastocytoma, płytkach krwi i w makrofagach, jako reakcja zarówno na bodźce immunologiczne, jak i nieimmunologiczne. Trzy róŜne lipoksygenazy (dioksygenazy) katalizują przyłączanie tlenu do atomu węgla w pozycjach 5, 12 i 15 kwasu arachidonowego, powodując powstanie hydroperoksydów (HPETE). Jedynie 5-lipoksygenaza bierze udział w powstawaniu leukotrienów. Najpierw powstaje leukotrien A4, który jest metabolizowany albo do leukotrienu B4, albo do leukotrienu C4 (ryc. 25-8). Leukotrien C4 powstaje przez połączenie z glutationem wiązaniem tioeterowym. Nastę-

Hammarstróm S: Leukotrienes. Annu Rev Biochem 1983;52:355. Holman RT: Controi of polyunsaturated acids in tissue lipids. J Am Coli Nutr 1986;5:183. Kinsella JE: Food components with potential therapeutic benefits: The n-3 polyunsaturated fatty acids of fish oils. Food Technology 1986;40:89. Lagarde M, Gualde N, Rigaud M: Metabolicinteractions between eicosanoids in blood and vascular cells. Biochem J 1989;257:313. Moncada S (editor): Prostacyclin, thromboxane and leukotrienes. Br Med Buli I989;39:2O9. Neuringer M, Anderson GJ, Connor WE; The essentiality of a-3 fatty acids for the devdopment and function of the retina and brain. Annu Rev Nutr 1988;8:517. Piper P: Formation and actions of leukotrienes. PhyswlRev 1984;64:744. Smith WL, Borgeat P: The eicosanoids. In: Biochemistry of Lipids and Membranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 1985.

OC £*"

Metabolizm acylogliceroli i sfingolipidów Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Acyloglicerole stanowią większość lipidów organizmu. Triacyloglicerole są głównymi lipidami tłuszczu zapasowego organizmu i zawartego w pokarmach. W dodatku acyloglicerole, zwłaszcza fosfolipidy, są głównym składnikiem błon plazmatycznych i innych błon Ŝywych organizmów. Fosfolipidy biorą takŜe udział w metabolizmie wielu lipidów. Glikosfingolipidy, które zawierają reszty sfingozyny i cukru, jak równieŜ kwasów tłuszczowych, stanowią 5—10% lipidów błon plazmatycznych.

(RDS) u noworodków. Fosfolipidy inozytolowe są prekursorami wtórnych przekaźników działania hormonu, a czynnik aktywujący płytki

krwi jest alkilofosfolipidem, Glikosfmgolipi-dy, występujące w zewnętrznej warstwie błony plazmatycznej z ich oligosacharydowymi łańcuchami wystającymi na zewnątrz, tworzą cześć glikokaliksu powierzchni komórki. UwaŜa się, Ŝe są one waŜne: 1) w komunikowaniu się komórek i kontakcie międzykomórkowym, 2) jako receptory dla toksyn bakteryjnych (np. toksyny, która powoduje cholerę) oraz 3) jako substancje grupowe krwi ABO. Opisano ok. 12 glikolipidowych chorób spichrzeniowych (np.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Rola triacyloglicerolu w transporcie i spichrzaniu lipidów oraz w patogenezie róŜnych chorób, takich jak otyłość, cukrzyca i hiperlipoproteinemie, jest szczegółowo opisana w dalszych rozdziałach. Fosfoglicerole, fosfosfingolipidy i glikosfingolipidy są amfipatycznymi lipidami i dlatego są idealnie dopasowane do tego, aby spełniać funkcję głównych składników lipidowych błon plazmatycznych. Niektóre fosfolipidy spełniają specjalne funkcje, np. dipa1 m i t o i 1 o 1 ecy t y n a (dipa 1 mi toi lof o sf at y d y loch oli na) jest głównym składnikiem surfaktantu płucnego, którego brak u wcześniaków jest przyczyną zespołu niewydolności oddechowej

choroba Gauchera, choroba Tay-Sachsa); są one spowodowane niedoborem glikolipidowych hydrolaz normalnie występujących w lizosomach.

KATABOLIZM ACYLOGLICEROLI NIE JEST ODWRÓCENIEM ICH BIOSYNTEZY Katabolizm triacy logliceroli zaczyna się od hydrolizy Triacyloglicerole muszą zostać zhydrolizowane przez odpowiednią lipaze do ich skład* ników, tj. kwasów tłuszczowych i glicerolu zanim nastąpi dalszy ich katabolizm. Taka hydroliza (lipoliza) zachodzi głównie w tkance

Byc. 26-1. Biosynteza triac^loglicerolu i fosfolipidów. 1 — szlak monoacyloglicerolowy, 2 — szlak glicerolofosf ora nowy, 3 — szlak dihydroksyacetonofosforanowy. Diacy logi icerołotransferazy fosfoetanoloaminowej nie ma w wątrobie.

AOP

NAD*

DEHYDROGENAZA GLICEROLO-3FOSFORANOWA HO-C-H -■ -3-tosforan HZC-OAcylo-CoA (głownie

HjC-OH I HOC-H -

HjC-OH

I

H,C-OH Gllcero!

KINAZA GUCEROLOWA

nasycony) ACYLOTRANSFERAZAI © GLICEROLO--afOSFORANOWA ~* CoA

- Ghfcc iiz.a H,C--O-© Di hydro ksyaoet ono-fosforan Acylo-CoA (zwykle nienasycony) ACYLOTRANSFERAZA

® DIHYDROKSYACETONOFOSFORANOWA NADPH ». H"*

** CoA

O HjCO II

O-C-R,-*-

REDUKTA2A 1-ACYLODIHYDROKSYACETONO -FOSFORANOWA

HO-CH

®

n,—c—o— c— H O

HjC-O-C-H, C=O

H,C-O-® 1-AcvlogllGero]ot-Acylod I hyd rpksy--acetonofosfofan ff (lizofosfatydan) ^Acylo-CoA (flłdwnle nlenasyoony)

HjC-OH

2- U D n oa cy I og I łce ro!

©

ACYLOTRANSFEflAZA 1-ACYLOGLICEROLO-3-FOSFORANOWA

Acylo-CaA ACYLOTRAMSFI

Lipidy eterowe ~^CoA

MpNOACYLOGLICE- i S OLOWA (w jelicie) ■ C hol Ina (otanoloamina)

O-C-R,

O It HjC-

fii-C~O-c-H

II

I

_

O 1,2-DI acyl ogl ioe r o I o1 o sf o ra n FOSFOHYOROLAZA (fosfatydan, kwasFOSFATY0AN0WA fosfatydowy)

H,C-O-® — CTP

Fosfocholma i to sto e t an o lo a m i n a ■

CYTYDYLOTRANSFERAZA FOSFOCHOLINOWA PP,

CDP-crrallna (CDP-etanoloamlna) DlACYLOGLICEROLCh TRANSFERAZAF0SFOCHOLIN0WA CYTYDYLOTRANSF6RAZA l_CTPHjC-O-C-R, Hj-C-O-C-H O

FOSFATYOANOWA_ _

HSC-O-®

-PP,

Chollna (elan o loa mina) Fosfatvdv1ocriolina

Kardioliplna (NOZYTOLOTRANSF ERAZA CDPDIACYLOGLICEHOL OWA

ACYLOTRANSFERAZA H c-o-c-n, DIACYLOGLICEROLOWA? Rj-C-O-C-H ■ M;C-O-®-© ATP

O

ADP

OCytydyna M P llcoro I— CD P-d lacv!og

R,

HjC-O-C>— Inozytol

Hj-C-O-C-H

................

O

-S-

-
l

O

Rj-C-O-C-H

H;C — O-C— R

O

n,-c-o-c-H

H;C-O-

o

Trlacylogltoerot

HjC-o-@-lnoz/tol-® Fo sfalyclylol nozytolo-4-fosforan

inozytot Fostatydylolnozylol (foafatytMoetan oloaml na)

[KINAZA | Seryna

Fosfalydyloelanoloamlna Foafatydyloseryna

ADP ■*'

•

H;C-O-Ć-R, Etan oi oa ml na

R,-C-O-C-H o

H,c-o-@-inozytol®

Fosfatydyło In oŜyto lo-4,5- blsfosfor an

286 / ROZDZIAŁ 26

tłuszczowej. Uwolnione w wyniku lipolizy wolne kwasy tłuszczowe dostają się do osocza, gdzie występują w postaci związanej z albuminą. Następnie wolne kwasy tłuszczowe są wychwytywane przez tkanki i utleniane lub ponownie estryfikowane. Wiele tkanek (łącznie z wątrobą, sercem, nerkami, mięśniami szkieletowymi, płucami, gonadami męskimi, mózgiem i tkanką tłuszczową) ma zdolność utleniania kwasów tłuszczowych o długim łańcuchu węglowym, chociaŜ mózg niezbyt łatwo pobiera je z krwi. ZuŜytkowanie glicerolu zaleŜy od tego, czy dana tkanka ma konieczny do tego aktywujący enzym kinazę glkerolową (ryc. 26-1). Enzym ten wykazano w znacznych ilościach w wątrobie, nerkach, jelitach, brunatnej tkance tłuszczowej i w gruczole sutkowym w okresie laktacji.

KWAS FOSFATYDOWY JEST WSPÓLNYM PREKURSOREM BIOSYNTEZY TRIACYLOGLICEROLI I FOSFOGLICEROLI ChociaŜ reakcję hydrolizy triacyloglicerolj z udziałem lipazy moŜna odwrócić w warunkach laboratoryjnych, nie jest to jednak mechanizm, przez który acyloglicerole są syntetyzowane w tkankach. Zarówno kwasy tłuszczowe, jak i glicerol muszą zostać zaktywowane przez ATP zanim będą mogły być wbudowane do acylogliceroli. Kinaza glicerolowa katalizuje aktywację glicerolu do sn-glicerolo-3-fosforanu. JeŜeli tego enzymu nie ma lub jego aktywność jest mała, jak to ma miejsce w mięśniach lub w tkance tłuszczowej, większość glicerolo-3-fosforanu musi pochodzić ze związku pośredniego glikolizy — dihydroksyacetonofosforantt, który przekształca się w glicerolo-3-fosforan przez redukcję z NADH, katalizowaną przez dehydrogenazę gliceroIo-3-fosforanową (ryc, 26-1).

Biosynteza triacylogliceroli. Kwasy tłuszczowe są aktywowane do acylo-CoA pod wpływem enzymu syntetazy acylo-CoA z udziałem ATP i CoA (p. str. 261). 2 cząsteczki acylo-CoA wiąŜą się z glicerolo-3-fosforanem, tworząc fosfatydan (l,2-diacyloglicerolo-3-fosforan). Reakcja ta przebiega w 2 etapach przez lizofosfatydan i jest katalizowana najpierw przez acylołransferazę gIicerolo-3-fosforanową, a następnie przez acylotransferazę l-acyloglicerolo-3-fosforanową (acylotransferazę lizofosfatydanową). Pod wpływem fosfohydrolazy fos-

fatydanowej fosfatydan jest przekształcany do 1,2-diacyloglicerolu. W błonie śluzowej jelita istnieje szlak monoacyloglicerolowy, w którym monoacyloglicerol jest przekształcany do 1,2diacyloglicerolu pod wpływem acylotransferazy mo no ac>log lice rolo w ej. Następna cząsteczka acylo-CoA wchodzi w reakcję z diacyloglicerolem, tworząc triacyloglicerol. Reakcja ta jest katalizowana przez acylotransferazę diacyloglicerolową. Większość aktywności tych enzymów jest umiejscowiona w siateczce śródplazmatycznej komórek, chociaŜ niektóre z nich znajdują się w mitochondriach, np. acylotransferaza glicerolo-3-fosforanowa. Aktywność fosfohydrolazy fosfatydanowej występuje głównie we frakcji supernatantu pozbawionej struktur subkomórkowych, ale pewne jej ilości są związane z błonami. Dihydroksyacetonofosforan moŜe być acylowany i przemieniany do lizofosfatydanu po redukcji przez NADPH. Ilościowe znaczenie tego szlaku przemiany jest kontrowersyjne. Ten szlak wydaje się być bardziej istotny w peroksysomach, gdzie uczestniczy w syntezie lipidów eterowych.

Biosynteza fosfogliceroli. Te fosfoiipidy są syntetyzowane albo z fosfatydanu, np. fosfatydyJoinozytol, albo z 1,2-diacyloglicerolu, np. fosfatydylocholina i fosfatydyloetanoloamina. W syntezie fosfatydyloinozytolu, cytydynotrifosforan (CTP), bogatoenergetyczny fosforan wytwarzany z udziałem ATP (p, str. 137) reaguje z fosfatydanem, tworząc cyłydynodifosfodiacyloglicerol (CDP-diacyloglicerol). Ostatecznie ten związek reaguje z inozytolem w reakcji katalizowanej przez CDP-diacylogliceroiotransferazę inozytolową, tworząc fosfatydyioinozytol (ryc. 26-1). Przez kolejne fosforylacje fosfatydyloinozytol jest przekształcany najpierw do fosfatydyloinozytolo-4-fosforanu, a następnie do fosfatydyloinozyto!o-4,5-bisfosforanu. Ten ostatni jest rozkładany do diacyloglicerolu i inozytolotrisfosforanu po zadziałaniu na komórkę hormonu, który zwiększa stęŜenie Ca2+, np. wazopresyny. Te 2 produkty odgrywają rolę drugiego przekaźnika w działaniu hormonu. W biosyntezie fosfatydylocholiny i fosfatydyloetanoloaminy (lecytyn i kefalin) cholina lub etanoloamina muszą najpierw zostać przekształcone w „aktywną choiinę" lub „aktywną etanoioaminę". Jest to proces 2-etapowy, w którym zachodzi najpierw reakcja z ATP, z wytworzeniem odpowiednich monofosforanowych pochodnych, a następnie reakcja z CTP

METABOLIZM ACYLOGLICEROLI I SFINGOLIPIDÓW / 287

z wytworzeniem cytydynodifosfocholiny (CDP-choliny), lub cytydynodifosfoetanoloaminy (CDP-etanoloaminy). W takiej postaci cholina lub etanoloamina reagują z 1,2-diacylogiicerolera w ten sposób, Ŝe ufosforylowana zasada (fosfbchoiina albo fosfoetanoloamina) jest przenoszona na 1,2-diacy logi ice roi z wytworzeniem albo fosfatydylocholiny, albo fosfatydyloetanoloaminy. Cytydylotransferaza wydaje się być regulacyjnym enzymem szlaku biosyntezy fosfatydylocholiny. Fosfatydyloseryna powstaje z fosfatydylo-etanolaminy w bezpośredniej reakcji z seryną. Fosfatydyloseryna moŜe odtwarzać fosfatydyloetanoloaminę przez dekarboksylację, W wątrobie występuje alternatywna droga umoŜliwiająca bezpośrednią przemianę fosfatydyloetanoloaminy w fosfatydylocholinę przez kolejne metylacje reszty etanoioaminowej przy uŜyciu S-adenozylometioniny jako dawcy grup metylowych. Z kolei grupa metylowa w metioninie moŜe pochodzić z metylo-H+-fołianu (p. ryc. 53-15). Pomimo tych moŜliwych szlaków wytwarzania choliny. jest ona uwaŜana za egzogenny składnik poŜywienia dla wielu gatunków ssaków, chociaŜ nie ustalono tego dla człowieka. Fosfolipidem występującym w mitochondriachjest kardiolipina (difosfatydyloglicerol, p. str. 179). Powstaje ona z fosfatydyloglicerolu, który jest syntetyzowany z CDP-diacyloglicerolu (ryc. 26-1} oraz glicerolo-3-fosforanu według schematu przedstawionego na ryc. 26-2.

CDP-dlacylogltoeral

Ryc. 26-2. Biosynteza kardioiipiny.

Surfaktant płucny. Jest wydzieliną powierzchniowo aktywną, złoŜoną głównie z lipidu z niewielką ilością białka i węglowodanów. Zapobiega ona zapadaniu się pęcherzyków płucnych. Aktywność surfaktantu jest przypisywana głównie obecności fosfolipidu — dipalmitoilofosfatydylocholinie, który jest syntetyzowany krótko przed porodem u donoszonego dziecka. Niedobór surfaktantu w płucach wielu niedonoszonych noworodków jest przyczyną zespołu niewydolności oddechowej (RDS). Podawanie naturalnego lub sztucznego surfaktantu ma korzystne działanie terapeutyczne.

Biosynteza eterowych fosfolipidów glicerolowych oraz plazmalogenów. Plazmalogenowy diacyloglicerol jest to taki związek, w którym w pozycji 1 (lub 2) glicerolu znajduje się reszta alkenylowa, zawierająca wiązanie aldehydogenne eteru winylowego (CHj - O - CH = CH - R). Prekursorem części glicerolowej jest dihydroksyacetonofosforan (ryc. 26-3), który reaguje z acylo-CoA, tworząc 1-acylodihydroksyacetonofosforan. Następnie zachodzi reakcja wymiany między grupą acylową i alkoholem o długim łańcuchu węglowym z wytworzeniem 1 -alkilodihydroksyacetonofosforanu (mającego wiązanie eterowe). Związek ten w obecności NADPH jest przemieniany w l-alkiloglicerolo-3-fosforan. Po następnej acylacji, w pozycji 2, utworzony l-alkilo-2-acyloglicerolo-3-fosforan (analogiczny do fosfatydanu z ryc. 26-1), jest hydrolizowany z wytworzeniem pochodnej glicerolu pozbawionej reszty fosforanowej. Plazmaiogeny powstają przez desaturację odpowiednich pochodnych z fosfoetanoloamina (ryc. 26-3). Znaczną część fosfolipidów w mitochondriach stanowią plazmaiogeny. Czynnik aktywujący płytki krwi (PAF) jest syntetyzowany z odpowiedniej pochodnej fosfocholinowej, a zidentyfikowano go jako l-alkilo-2-acetylo-i7j-glicerolo-3-fosfocholinę. Jest on wytwarzany przez wiele komórek krwi oraz inne tkanki. Powoduje on agregację płytek krwi w tak małych stęŜeniach, jak 10"11 mol/l. Ma on takŜe właściwości hipotensyjne i wrzodotwórcze. Fosfolipazy pozwalają na degradację oraz przemodelowanie glicerolofosfolipidów Degradacja wielu złoŜonych cząsteczek w tkankach przebiega do całkowitego ich rozłoŜenia, np. białka są rozkładane do aminokwasów. Wobec tego moŜna określić czas ob-

CMP CMP Kardiolrpma sn-Gllcerolo-

HiCOH

Acylo-CoA

ml

H 3 C-O-C-R,

_I

NADPH-fH4 NAOP +

R,-(CH ; I,-OH H

H^C-O-ICH^R,

ACYLO

A

;YLÓ-

I

~

I

|RH>UKTAZA|

SFEHA2AI H,C~O-(p)

HOOC-R, i -Al ki I o g I icero lo-3-f osf o ra n r

DihydrokByaeetonofosforan

1-Acytodl hydro ksyaoetonofosforan

aceton ofoaforati

Acyto-CoA ACYLOTRANSFERA2,

lfRj-C-O-CH 1-Alki!o-2-acy!ogl(cerolo-a-insfoetafwłDamlna

CMP k.

\

CDP-etanoloamlna l O H;C-

J

-

O II

i - i

H^C-O

R,

I

Ł1ACVLC>GLICEROLO -C-O -C -H TRANSFERAZA I HjC-OH IP0SF0HYDR0LA2AI FOSFOETANOLO1-Alkilo-2-acy1oglicerol HjC-0-® 1 - Alkilo-2-acy AM1NOWA -CDP-chollna

log lloeroło-3-tosfof an

DiACYLOGLICEHOLOTFIANSFERAZA FOSFOCHOLINOWA

NADPH, O*

CMP

Alktlodiacylogllcerole

[DESATURAZA I O

HiC-O-CH-CH-ft,

O

H^-O-ICH^-R,

CO

R) COOH

;

V

HUC-O-

HjC-G-ICHA-R! HO-C-H I FOSF0L1PA2A | 1 -Alkarylo-E-aeylogllcorolo- 3-f osf oatanoloamlna, plaŜ mato gen

Cholina 1-Alkilo-2-acylog!icerolo3-fosfocholina

Acetylo-CoA

Cholina i-Aikilo-2-iizoglioerolow 3-fosfcchalina

ACYLOTRANSFERAZA | O

HjC — O-

II i H^-C-O-C-H

Ryc. ?6-3. Biosynteza lipidów eterowych, plazmalogenów i ciynrrika aktywującego płytki {PAF). W szlaku syntezy PAF rfe novo acetylo-CoA jest wbudowywany w etapie*, unikając ostatnich 2 etapów pokazanych tutaj.

Cholina 1 -A Ikllo -2-acety lo g I icef o I a-3-iosf oc hol i na PAF

METABOLIZM ACYLOGLICEROLI I SFINGOLIPiDÓW / 289

o O II

FOSFOLIPAZA A,J

HjC-O-C-fi, I

ij -C-O-C-H HjC-O-(P)-Cf)ollna Fosfatydyloohollna H,0 jFOSFOLIFAZAA; | Acylo-CoA

—0-- C FÓSFOLIPAśAD I — R, R 3 —C--O-C -H O

HjC-0 + P -+ O —I O

H,C-O-C-R 1 HOOH H3 C-O-®CHolina

ZASADA AZOTOWA

FD3FOLIPAZA A,

| FOSFOLIPAZA C | Ryc. 26-5. Miejsca hydfolitycznego działania fos-

folipaz na substrat fosfolipidowy.

Lizofosfatydylocholina (> iz o lecytyna) H,0 ILIZOFOSFOLIPAZA

R, -COOH H2C-OH HO-C-H l

Gl ioery lofosfocho lina HYDROLAZA GUCERYLOFOSFOCHOLtNOWA

HO-C-H

+ Chollna

HjC-O-® src-G I icero I o-3-f o sio ran R yc. 26- 4. Metab oli zm l ustći t yu yl i j Ui oiii i y (l u ^yt y

ny).

rot u (turnover time) dla takich cząsteczek. ChociaŜ fosfolipidy są aktywnie degradowane, kaŜda cześć składowa ich cząsteczki ulega obrotowi (rozpadowi i re syn tezie) z odmienną szybkością, np. czas obrotu grupy fosforanowej jest inny niŜ czas obrotu grupy 1-acylowej, Jest to spowodowane obecnością enzymów, które umoŜliwiają częściową degradację z następującą zaraz po niej resyntezą (ryc. 26-4). Fosfolipaza Aj katalizuje hydrolizę wiązania estrowego w pozycji 2 gl icero lofosfolipid ów z wytworzeniem wolnego kwasu tłuszczowego i lizofosfolipidu, który moŜe zostać ponownie acylowany przez acylo-CoA w obecności acylotransferazy. 19 — Biochemia

Alternatywnie lizofosfolipid (np. lizolecytyna) moŜe być atakowana przez lizofosfoiipazę (fosfolipazę A^, która usuwa pozostałą grupę 1 -acylową, pozostawiając glicerol połączony losfodiestrowo z odpowiednią zasadą. Ten ostatni związek moŜe być rozkładany przez odpowiednią hydrolazę z uwolnieniem glicero-Io-3-fosforanu i zasady. Fosfolipaza Aj działa na wiązanie estrowe w pozycji 1 fosfolipidów (ryc. 26-5). Fosfolipaza C atakuje wiązanie estrowe w pozycji 3, uwalniając 1,2diacylo-glicerol i ufosforylowaną zasadę. Jest to jedna z głównych toksyn wytwarzanych przez bakterie. Fosfolipaza D jest enzymem opisywanym głównie u roślin, a katalizującym odhydrolizo-wanie zasady azotowej od fosfolipidów. Lizo lecytyna moŜe powstawać alternatywną drogą, z udziałem acylotransferazy lecytyna: : cholesterol (LCAT), Ten enzym, występujący w osoczu, a syntetyzowany w wątrobie, katalizuje przeniesienie 1 reszty kwasu tłuszczowego z pozycji 2 lecytyny na cholesterol z wytworzeniem estru cholesterolowego. Enzym ten ma być odpowiedzialny za duŜą ilość estru cholesterolowego zawartego w li po proteinach osocza. Następstwa niedoboru LCAT są dyskutowane na str. 321 A C E T Y LO T B A N S F E R A Z A L ECYT YNA— CHO L EST ERO L

Lecytyna + cholesterol Lizolecytyna + Ester cholesterolowy

Nasycone kwasy tłuszczowe o długim łańcuchu występują przewaŜnie w pozycji 1 fosfolipidów, podczas gdy wielo nienasycone kwasy (np, prekursory prostaglandyn) są wbudowa-

290 / ROZDZIAŁ 26

ne raczej w pozycji 2. Wbudowywanie kwasów tłuszczowych do lecytyny odbywa się przez kompletną syntezę fosfolipidu, przez transacylacje między estrami cholesterolu i lizolecytyną i przez bezpośrednią acylacje lizolecytyny z udziałem acylo-CoA. Wobec tego moŜliwa jest ciągła wymiana kwasów tłuszczowych, zwłaszcza gdy chodzi o wprowadzanie egzogennych kwasów tłuszczowych do cząsteczek fosfolipidów.

sforanem pirydoksalu, aminokwas seryna łączy sie z palmitoilo-CoA, tworząc po odłączeniu CQ2 3-ketosfinganine. Sama sfingozyna powstaje po etapie redukcji, o którym wiadomo Ŝe uczestniczy w nim NADPH jako dawca wodorów. Potem następuje etap oksydacyjny, analogiczny do etapu P-oksydacji z udziałem dehydrogenazy acylo-CoA, w którym uczestniczy enzym będący flawoproteiną. Ceramid (N-acylosfingozyna) powstaje pr2ez połączenie acylo-CoA i sfingozyny (ryc. 26-7).

WSZYSTKIE SFINGOLIPIDY POWSTAJĄ Z CERAMIDU Aminoalkohol sfingozyna (ryc, 26-6) jest syntetyzowany w siateczce śródplazrnatycznej. Po zaktywowaniu, polegającym na połączeniu z foNH3+

Sflngomlellna Acylogllcerol Fosfatydylochnilna

Sflngozyna

-- ^

Acyfo-CoA CH 3-
Ceramid

CoA

, -»■ SfingomWIna

CDP- CMP -oholfna

Ryc. 26-7. Biosynteza ceramidu i sfingomieliny.

Palmltollo-CoA

Grupą acylową często jest reszta długołańcuchowego kwasu nasyconego lub monoenowego. Sfingomieliny są fosfolipidami (p. str. 181) powstającymi w wyniku reakcji ceramidu z CDP-choliną albo z fosfatydylocholiną; pierwsza reakcja jest analogiczna z tą, jaka zachodzi podczas biosyntezy fosiatydy locho liny (ryc. 26-1).

CoA • SH

3-Ketosiinganina ■NADPH+H REDUKTAZA 3KETOSRNGANINOWA NADP +

I I OH NHa + Dlhydrosflngozyrta REDUKTAZA SFINGANINOWA \

I I OH NH3 + Sflngozyna Ryc. 26-6. Biosynteza sfingoz/ny. Fp-flawoproteina.

Glikosfingolipidy są połączeniem ceramidu z jedną lub wieloma resztami cukrowymi W wielu glikosfingolipidach, zwłaszcza w mózgu, jest charakterystyczne występowanie kwasów tłuszczowych C24 (kwasów lignocery-n owego, cerę brono we go i nerwonowego). Kwas lignocerynowy(C23H47COOH) jest w całości syntetyzowany z acetylo-CoA. Kwas cerębronowy jest 2-hydroksypochodną kwasu lignocerynowego i jest z niego syntetyzowany. Kwas nerwonowy (C;3H4;COOH) jest mononienasyconym kwasem i powstaje przez elongację kwasu olejowego. Najprostszymi glikosfingolipidami (cerebrozydami) są galaktozyloceramid (GalCer) i glukozyloceramid (GlcCer). GalCer jest głównym lipidem mieliny, podczas gdy GlcCer jest głównym glikosfingolipidem tkanek pozanerwowych oraz prekursorem większości bardziej

METABOLIZM ACYLOGLICEROLI I SFINGOUPiDÓW / 291 UDPGIc [EPIMERAZA| Acyl-CoA CoA Sfngozyna ^> * »,

UDPGal UDP PAPS f Galaktozyloceramld ( Sulfogalaklozyloceramid Cerami d —^-*- (cerebrazyd) ------------- ^-*(aurtaNdl (sulfatyd)

Ryc. 26-8. Biosynteza galaktozyloceramidu i jego siarczanowej pochodnej, PAPS — „aktywny siarczan' fosfoadenozyno-B-tosfosiarczan. Acylo-CaA

Stingozyna

UOPGIc

CoA

UDPGal

UDP

L

Ceramtd

UDP

Glukozylaceramid (Cer-Glc)

Prosty gangilozyd (mon QS ialogan g I! ozyd)

CerGIcGal

CMP-NeuAc

Cer-GIcGal-GalNAc-Gal --------- Ne!,Ac

(GMI)

CM P

UDP

'— UDPGal

WyŜsze ganfllbzydy [disialo-1 trisialogangllozydy)

UDP

UDP-N-acBtylogalaktazoamina

Cer-GIc-Gal-GalNAc

I

NeuAc

Cer-GIc-Gal I NeuAc

Ryc. 26-9. Biosynteza gangliozydów. NeuAc — kwas N-acetyloneuraminowy

złoŜonych glikosfingolipidów. Epimeraza urydynodifosfogalaktozowa (ryc. 26-8) katalizuje epimeryzację glukozy do galaktozy, przekształcając urydynodifosfoglukozę (UDPGIc) w urydynodifosfogalaktozę (UDPGal). W mózgu reakcja przebiega podobnie do przedstawionej na ryc. 22-5 dla wątroby i gruczołu sutkowego. Galaktozyloceramid powstaje w wyniku reakcji między ceramidem i UDPGal. Sulfagalaktozyloteramid jest rezultatem dalszej reakcji z 3'-fosfoadenozyno-5'-fosfosiarczanem (PAPS; „aktywny siarczan"). PAPS uczestniczy takŜe

w biosyntezie innych suliblipidów, tj. sulfo(galakto)głicerololipidów i estrów siarczanowych steroidów, Gangliozydy są syntetyzowane z ceramidu przez stopniowe przyłączanie zaktywowanych cukrów (np. UDPGIc i UDPGal) oraz kwasu sjalowego, którym zwykle jest kwas N-atetylone u mm i na wy (ryc. 26-9). MoŜe powstawać wiele gangliozydów o coraz większej masie cząsteczkowej. Większość enzymów przenoszących cukry z nukleotydocukrów (glikozylotransferazy) jest umiejscowiona w aparacie Golgiego.

292 / ROZDZIAŁ 26

Glikosfingolipidy są składnikami zewnętrznej warstwy błony plazmatycznej i są waŜnymi strukturami uczestniczącymi w kontakcie międzykomórkowym i komunikowaniu się komórek. Niektóre z nich są antygenami, np. antygen Forssmana i antygeny układu grupowego krwi ABO, Podobne łańcuchy oligosacharydowe występują w glikoproteinadi błon komórkowych. Niektóre gangliozydy funkcjonują jako receptory toksyn bakteryjnych (np. toksyny cholery, która następnie aktywuje cyklazę adenylanową).

FOSFOLIP1DY I SFINGOLIPIDY UCZESTNICZĄ W PATOGENEZIE STWARDNIENIA ROZSIANEGO I LIPIDOZ Pewne choroby charakteryzują się występowaniem nieprawidłowych ilości wspomnianych powyŜej lipidów w tkankach, często w tkance nerwowej. Choroby te moŜna podzielić na 3 grupy: 1) prawdziwe choroby demielinizacyjne, 2) sfmgoiipidozy oraz 3) leu kody strofie. W stwardnieniu rozsianym, które jest chorobą

Tabela 26-1. Zestawienie sfingolipidoz Choroba

Niedobór enzymu

Nagromadzający się lipid

Objawy kliniczne

Cer-GIc-Gal-GalNAc-GaljFuc Izoantygen H

Zwyrodnienie mózgu, przykurczę mięśniowe, gruba skóra

Uogólniona gang- Gurf)-galaktozydaliozydoza

Cer-Glc-Gal(NeuAc)-GalNAc|Gal GM1-Gangliozyd

Niedorozwój umysłowy, powiększenie wątroby, zniekształcenia kośćca

Choroba Tay-Sach- Hekso2oaminidaza A sa

Cer-Glc-Gal(NeuAc)jGalr\!Ac GM2Gangliozyd

Niedorozwój umysłowy, ślepota, osłabienie mięśni

Odmiana choroby Heksozoaminidaza Tay-Sachsa albo A i B choroba Sandhoffa

Cer-GIc-Gal-GalJGalNAc Globozyd plus G^2 gangliozyd

Takie same, jak w chorobie Tay-Sachsa, ale postępujące znacznie szybciej

Choroba Fabry'ego u-Galaktozydaza

Cer-GIc-GalJGal Globotriaozylocefamid

Wykwity skórne, niedoczynność nerek (pefne objawy tylko u osobników męskich, gen recesywny związany z chromosomem X)

Fukozydoza

oc-Fukozydaza

Lipid oia laktozydoceramidowa

Laktozydaza cerami- Cer-Glc|Gal dowa (f}-galaktozy- Laktozydoceramid daza)

Postępujące uszkodzenie mózgu, powiększenie wątroby i Śledziony

Leukodystrofia metach romatyczn a

Ary losu Ifataza A

Cer-GaljOSOj 3Sulfogalaktozyloceramid

Niedorozwój umysłowy, a u dorosłych zaburzenia psychiczne, demielinizacja

Ce^Gal Galaktozyioceramid

Niedorozwój umysłowy, prawie zupełny brak mieliny

Choroba Krabbego p-Galaktozydaza

Choroba Gauchera

p-Glukozydaza

CeriGlic Glukozy loceramid

Powiększona wątroba i śledziona, ubytki osteolityczne kości długich. U dzieci niedorozwój umysłowy

Choroba Miemanna-Picka

Sfingomielinaza

CerjP-cholina Sfingomielina

Powiększona wątroba i śledziona, niedorozwój umysłowy; zgon we wczesnym okresie Ŝycia

Choroba F3fbera

Ceramidaza

AcyljSfingozyna Cera m id

Chrypka, zapalenie skóry, zniekształcenie kośćca, niedorozwój umysfowy, zgon we wczesnym okresie Ŝycia

NeuAc — kwas N-acetyloneu/aminowy, Cer — ceramid; Glc — glukoza, Gal — galaktoza, Fuc — fukoza. Wiązania oznaczone j są miejscami reakcji katalizowanej przez enzym, którego niedobór występuje

METABOLIZM ACYLOGL1CEROLI I SFINGOLIPIDOW / 293

demielinizacyjną, stwierdza się utratę z substancji białej zarówno fosfolipidów (zwłaszcza plazmalogenu etanoloaminowego), jak i sfmgolipidów. Wynikiem tego jest zbliŜenie składu chemicznego substancji białej mózgu do składu substancji szarej. W substancji białej u takich chorych moŜna stwierdzić obecność estrów cholesterolu, chociaŜ normalnie ich tam nie ma, a w płynie mózgów o- rdzeniowym występuje zwiększone stęŜenie fosfolipidów. Sfingoiipidozy są grupą chorób dziedzicznych, często ujawniających się juŜ w dzieciństwie. Choroby te zalicza się do duŜej grupy zaburzeń lizosomalnych. Choroby charakteryzujące się spichrzaniem lipidów mają kilka stałych cech: 1. W róŜnych tkankach stwierdza się spichrzanie złoŜonych lipidów, w których skład wchodzi wspólny składnik —■ ceramid. 2. Szybkość syntezy spichrzanego lipidu jest porównywalna do szybkości u zdrowych osób. 3. Enzymatycznym defektem jest niedobór swoistego hydrolityczneg© enzymu lizosomalnego, niezbędnego do rozkładania na-

gromadzanego lipidu. 4. Stopień niedoboru aktywności enzymu, warunkującego spichrzanie lipidu, jest podobny we wszystkich tkankach chorego z ttj. wadą. Na podstawie tej jednakowej aktywności opracowano metody rozpoznawania, -dzięki którym stało się moŜliwe równieŜ wykrycie heterozygotycznych osób z tymi nieprawidłowościami genetycznymi, odpowiedzialnymi za przenoszenie choroby, a takŜe wykazanie występowania dystrofii sfmgolipidowej

u nienarodzonego płodu. Zestawienie najwaŜniejszych lipidoz przedstawiono w tab. 26-1. Skutkiem licznych postaci niedoboru sulfataz

jest spichrzanie w tkankach sulfogalaktoceramidu, estrów siarczanowych steroidów i proteoglikanów. Jest to spowodowane złoŜonym niedoborem arylosulfataz A, B i C oraz sulfatazy steroidowej.

PIŚMIENNICTWO Boyer PD (editor): The Enzymes, 3rded. Vol 16: Lipid Enzymoiogy. Academic Press, 1983. Brady RO: Sphingolipidoses. Annu Rev Biochem 1978;47:Ó87. Hawthorne JN, Ansell GB (editors): Phosphoiipids. Bfeevier, 1982. Snyder F: Biochemistry of plateletactivating factor. PSEBM 1989; 190:125. Various authors: In: The Metaboik Basis oflnherited Disease, óth ed. Scriver CR et al (editors). McOraw-Hill, 1989. Various authors: Metabolism of triacylglycerols; phospholipid metabolism; ether-linked glyrerolipids; sphingolipids. In: Biochemisiry of Lipids and Hormones. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummiugs, 1985. VanGolde LMG. Batenburg JJ, Robertson B; The pulmonary surfaelant system: biochemical aspects and functional significance. Physiol Rev 1988;68:374. Watts RWE, Gibbs DA: Lysosomal Storage Diseases: Biochemical and Clinical Aspects. Taylor & Francis, London, 1986.

Transport i magazynowanie lipidów Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Tłuszcze wchłonięte z pokarmów i lipidy syntetyzowane przez wątrobę i tkankę tłuszczową muszą być transportowane między róŜnymi tkankami i narządami, aby mogły być zuŜytkowane i magazynowane. PoniewaŜ lipidy są nierozpuszczalne w wodzie, powstaje problem, jak je transportować w środowisku wodnym, jakim jest osocze krwi. Zosta! on rozwiązany dzięki asocjacji niepoiarnych lipidów (triacylogliceroli i estrów cholesterolu) z amfipatycznymi lipidami (fosfolipidami i cholesterolem) oraz z białkami, przez co powstają mieszające się z wodą lipoproteiny. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE U zwierząt wszystkoŜernych, takich jak człowiek, spoŜywających posiłki przedzielone okresami postu, nadmiar energii zostaje zmagazynowany w fazie anabolicznej procesu karmienia, po której następuje okres negatywnej równowagi energetycznej, w czasie którego organizm czerpie potrzebną mu energię ze swoich zapasów węglowodanowych i tłuszczowych. Lipoproteiny pośredniczą między tymi cyklami, transportując lipidy z jelita (w postaci chylomikronów) i z wątroby (w postaci lipoprotein o bardzo małej gęstości — VLDL) do większości tkanek, gdzie są utleniane, lub do tkanki tłuszczowej, gdzie są magazynowane. Z tkanki tłuszczowej tłuszcz jest mobilizowany jako wolne kwasy tłuszczowe (WKT), które, dostając się do krwi, łączą się z albuminami surowicy. Nieprawidłowości przemiany lipidów mogą być spowodowane zaburzeniami syntezy lub utyli-

zacji lipoprotein i mogą powodować róŜne hipolipoproteinemie lub hiperlipoproteinemie. Najbardziej powszechna z nich występuje u chorych na cukrzycę (diabetes melłitus), u których niedobór insuliny jest przyczyną nadmiernej mobilizacji WKT oraz zmniejszonego zuŜytkowywania chylomikronów i VLDL, prowadzących do powstawania hipertriacyloglicerolemii. Większość innych stanów patologicznych dotyczących zaburzeń transportu lipidów jest uwarunkowana dziedzicznymi wadami syntezy części apoproteinowej lipoprotein, kluczowych enzymów ich przemiany lub receptorów lipoprotein. Niektóre z tych wad powodują hipercholesterolemic i przedwczesną miaŜdŜycę (atherosclerosis). Nadmierne spichrzanie tłuszczów jest cechą otyłości, której jedna z postaci jest spowodowana wadliwą termogenezą indukowaną dietą w brunatnej tkance tłuszczowej. LIPIDY SĄ TRANSPORTOWANE W OSOCZU JAKO LIPOPROTEINY Zidentyfikowano 4 główne grupy lipoprotein Przez wyekstrahowanie lipidów osocza odpowiednim rozpuszczalnikiem tłuszczowym i po rozdziale wyciągu na poszczególne klasy lipidów moŜna wykazać w nim obecność triacylogikeroli, fosfolipidów, cholesterolu i estrów cholesterolu oraz niewielkie ilości niezestryfikowanych, długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (wolnych kwasów tłuszczowych), które stanowią mniej niŜ 5% całkowitej ilości kwasów tłuszczowych występujących w osoczu. Ta frakcja wolnych kwasów tłuszczowych (WKT; ang. Free Fatty Acids — FFA) jest najbardziej aktyw-

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 295 Tabela 27-1. Lipidy osocza krwi u człowieka Lipid

Gęstość

mmol/l

_ Miejsce , starlu

Średnio

zakres

Triacyloglicerol + Całkowite fosfolipidy

1,6 3,1

0,9-2,0 1,8-5,8

Całkowity cholesterol Wolny cholesterol (nie-zegtryf i kowany}

5,2

2,8-8,3

1,4

0,7-2,7

Wolne kwasy tłuszczowe (niezestryfikowane)

0,4

0,2-0,6

<0,96

^Lipoproteiny Pre-/Hipoprotalny a-LIpoprotelny

ł

Z catej ilości kwasów tłuszczowych 45% znajduje się w triacyloglicerolach, 35% w fosioiipidach, 15% występuje jako estry cholesterolu, a mniej niŜ 5% to wolne kwasy tłuszczowe * Waha się w zaleŜności od stanu odŜywienia Oznaczone jako fosfor lipidowy

1,006-1,063 iLDL) < 1.006 (VLDL) 1,063-1,21 (HDL)

Chylomlkrony

+

ną metabolicznie frakcją lipidów osocza. StęŜenie głównych klas lipidów osocza krwi przedstawiono w tab. 27-1. Czysty tłuszcz ma gęstość właściwą mniejszą od wody. Wobec tego obserwuje się malejącą gęstCść w miarę zwiększania proporcji lipidu do białka w lipoproteinach (tab. 27-2). Tę cechę fizyczną wykorzystano do rozdziału lipoprotein osocza metodą ultra wirowani a. Szybkość, z jaką kaŜda lipoproleina wznosi się przez roztwór NaCl (gęstość właściwa 1,063) moŜe być wyraŜona w jednostkach flotacji Svedberga (Sf). Jedna jednostka Sf jest równa 10-11 cm/s/ /dyna/g w temp. 26°C, Skład róŜnych frakcji lipoproteinowych otrzymanych metodą wirowania przedstawiono w tab. 27-2. Z tabeli tej wynika, Ŝe róŜne klasy chemiczne lipidów występują w większości frakcji lipoproteinowych w róŜnych ilościach. PoniewaŜ frakcje lipoproteinowe o określonych gęstościach spełniają określone funkcje fizjologiczne, sama analiza chemiczna lipidów osocza (z wyjątkiem WKT), dostarcza tylko niewielu informacji o ich znaczeniu w patofizjologii. Poza zastosowaniem technik polegających na wykorzystaniu róŜnic gęstości, lipoproteiny moŜna rozdzielić na podstawie ich właściwości elektroforę ty cznych na a-, 0- oraz pre-P-li po proteiny (ryc. 27-1) i moŜna je zidentyfikować dokładniej za pomocą immunoelektrofore-

Ryc. 27-1. Elektroforetyczny rozdział lipoprotein

Poza WKT zidentyfikowano 4 główce grupy lipoprotein o waŜnym znaczeniu fizjologicznym oraz diagnostycznym. Są to: 1) chylomikrony, powstające z wchłanianych w jelicie triacylogliceroli, 2) lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL lub pre-P-lipoproteiny), pochodzące z wątroby i spełniające funkcję eksportera triacylogliceroli z tego narządu, 3) lipoproteiny 0małej gęstości (LDL lub P-lipoproteiny), będą ce przedstawicielem końcowych produktów katabolizmu VLDL oraz 4) lipoproteiny o duŜej gęstości (HDL lub a-lipoproteiny), biorące udział w metabolizmie VLDL i chylomi kranów, a takŜe w przemianie cholesterolu. Triacylo glicerol jest głównym lipidem chyJomikronów 1VLDL, podczas gdy cholesterol i fosfolipidy są dominującymi składnikami lipidowymi odpo wiednio LDL i HDL (tab. 27-2). Amfipatyczne lipidy są istotnymi składnikami lipoprotein Typowa iipoproteina — taka jak chyloinikron lub VLDL — składa się z rdzenia lipidowego, zawierającego głównie triacyloglicerole i estry cholesterolu, otoczonego pojedynczą warstwą powierzchniową złoŜoną z cząsteczek amfipatycznyeh fosfolipidów i cholesterolu. Te cząsteczki są tak ułoŜone, Ŝe ich grupy polarne są skierowane na zewnątrz, do środowiska wodnego, tak jak w błonie komórkowej (p. str. 187), Białkowe części lipoprotein są znane jako a po lipoproteiny lub apoproteiny Stanowią one ok. 60% masy niektórych HDL, a zaledwie 1% masy chyl orni kro nów. Niektóre apolipoproteiny są ściśle zintegrowane z częścią lipidową, tak

Tabela 27-2. Skład lipoprotein osocza u człowieka Źródło

Średnica [nm]

Gęstość

S

.

Frakcja

Chylomikrony Lipopfoteiny o bardzo małej gęstości (VLDL) Lipoprotetny o pośredniej gęstości (IDL) Lipoproteiny o małej gęstości (LDL) Lipoproteiny o duŜej gęstości HDLj HDL3 WKT—

Skład Białko [%]

Jelito Wątroba i jelitu VLDL i chylomikrony VLDL Wątroba i jelito. VLDL? Chylomikrony? Tkanka tłuszczowa

90-1000

< 0r95 0.95-

> 400

1-2

30-90 25-30

1,006 1,006-1,019

20-400

7-10 11

20-25

1,019-1,063

12-20 2-

2133

10-20 7,5-10

1,063-1,125 1,125-1,210 >

12

57 99

CałkowiProcent całkowitych lipidów te lipidy [%] Triacy- Fosfoli Estry Choleste Wolne loglice- pidy choleste rol kwasy rol (wolny) rolu tłuszczowe 98-99 90-93 89 79 67 43 1

88 56 29 13 16

8 20 26 28 43

13 0 46 0

3 15 34 48 31 29 0

1,2810

albumina

WKT — wolne kwasy tłuszczowe. VHDL (ang.; very high density lipoproteins) jest niewielką frakcją o gęstości 1,21 -1,25,

18 9

1

10 10 60

11 6 100

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 297 Obwodowa apolipo protein a (np, Apo-C} Jednowarstwowa błona zbudowana głównie

Wolny cholesterol

Fosfotlpld z

Trlacylogllcerol lipidów amflpatycznych

c- 27-2. Uogólniona

budowa lipoproteiny osocza. NaleŜy 'Rdzeft złoŜony ' głć wni e z nie polarnych lipidów

zauwaŜyć podobieństwa Integralna s apoll z bfoną plazmatycz-ną. Niedawne badania wskazują, Ŝe po proteina "V,, {np. niewielkie ilości estrów cholesterolu i apo-B) triacyloglicerolu znajdują się w powierzchniowej warstwie, a małe ilości wolnego cholesterolu występują w warstwie rdzeniowej.

Ŝe nie moŜna ich usunąć z cząstek lipoproteinowych, podczas gdy inne mogą być swobodnie przenoszone do innych lipoprotem (ryc. 27-2), Skład apolipoprotein jest charakterystyczny dla danej lipoproteiny W kaŜdej lipoproteinie występuje 1 lub więcej apolipoprotein (białek lub polipeptydów). Według nomenklatury ABC główną apolipoproteinę HDL (ot-lipoproteiny) określa się jako apolipoproteinę A. Główną apolipoproteina. LDL (P~hpoproteiny) jest apolipopro_tęinajgv. która znajduje się równieŜ w VLDL i w chylomikronach. JednakŜe apo B chylomikronów (B-48) jest mniejsza niŜ apo B pochodząca z LDL lub VLDL (B-100). B-48 jest syntetyzowana w jelicie, natomiast B-100 w wątrobie (u szczura wątroba wydaje się syntetyzować 2arówno B-48, jak i B-100). Apo B-100 jest zapewne najdłuŜszym łańcuchem ze znanych pojedynczych łańcuchów polipeptydowych, złoŜonym z 4536 reszt aminokwasowych. Apo B-48 (mająca wielkość 48% apo B-100) jest syntetyzowana na tym samym mRNA, co apo B-100. Zapewne w jelicie kodon stop, którego nie ma w odpowiednim DNA genomu, jest wprowadzany do RN A w procesie

posttranskrypcyjnej jego obróbki w taki sposób, Ŝe translacja zatrzymuje się na reszcie aminokwasu 2153. Apolipoproteiny C-I, C-II i C-HI są małymi polipeptydami swobodnie dającymi się przenosić między róŜnymi lipoproteinami (tab. 27-3). Węglowodany stanowią ok. 5% masy apo-B i zawierają mannozę, galaktozę, fukozę, glukozę, glukozoaminę oraz kwas sjalowy. Niektóre lipoproteiny są więc takŜe glikoproteinami. W lipoproteinach osocza znaleziono równieŜ inne apolipoproteiny. Jedną z nich jest bogata w argininę apolipoproteina E wyizolowana z VLDL i HDL. Zawiera ona argininę w ilości aŜ 10% wszystkich aminokwasów i stanowi 5—10% wszystkich apolipoprotein VLDL u zdrowych osób. Nadmierne jej ilości stwierdza się u chorych z hiperlipoproteinemia. typu III o szerokim paśmie PVLDL. Apolipoproteiny spełniają róŜne funkcje: 1) są kofaktorami enzymów, np. C-Il jest kofaktorem Jipazy lipoproteinowej, AA acylotransferazy lecytynaxholesterol, 2) mogą działać jako białka przenoszące lipid y, np. apo D w HDL, 3) działają jako Ugandy w interakcjach z receptorami lipoprotein w tkankach, np. apo B-100 i apo E w interakcji z receptorami LDL, apo E z receptorami remnantów, a apo A-I z receptorami HDL,

298 / ROZDZIAŁ 27 Tabela 27-3. Apolipoproteiny lipoprotein osocza człowieka Apo 1 i pop rotei na

Li po proteina

Masa cząsteczkowa {Da)

Dodatkowe uwagi

A-l

HDL, chylomikrony

28000

Aktywator acylotransferazy lecytyna: cholesterol (LCAT)

A-ll

HDL, chylomikrony

17000

Zbudowana z 2 identycznych monomerów połączonych mostkiem disiarczkowym. inhibitor LCAT?

B-100

LDL, VLDL. IDL

550000

Syntetyzowana w wątrobie. Ligand dla receptora LDL

B-48

Chylomikrony, chyiomikrony resztkowe

260000

Syntetyzowana w jelicie

Cl

VLDL, HDL

7 600

MoŜliwe, Ŝe aktywator LCAT

C-ll

VLDL, HDL, chylomikrony

8 800

Aktywator poza wątrobowej lipazy lipo proteinowej

c-m

VLDL, HDL, chylomikrony

8750

Wiele postaci pohmorficznych zaleŜnie od zawartości kwasów sjalowych

D

Subfrakcja HDL

20000

MoŜliwe, ze identyczna z białkiem przenoszącym estry cholesterolu

34 000

Obecna w nadmiarze w (5-VLDL u chorych z hiperlipoproteinemią typu III. Jest to jedyna apolipoproteina znajdująca się w HDL c u zwierząt z hipercholesterolemią wywołaną dietą Ligand dla receptora remnantów chylomikronów w wątrobie i dla receptora LDL

E (bogata w argmi- VLDL, HDL, chylomikrony, chylomikrony resztkowe ne)

WOLNE KWASY TŁUSZCZOWE SĄ BARDZO SZYBKO METABOLIZOWANE Wolne kwasy tłuszczowe (WK.T, FFA, niezestryfikowane kwasy tłuszczowe) osocza pochodzą z lipolizy triacylogliceroii w tkance tłuszczowej albo powstają w wyniku działania lipazy lipoproteinowej w czasie wychwytywania triacylogliceroli osocza prze2 tkanki. W surowicy występują one w połączeniu z albuminą w stęŜe-

niach wahających się miedzy 0,1—2 u.mol/ml osocza. Są to głównie długołańcuchowe kwasy tłuszczowe znajdowane w tkance tłuszczowej (np. palmitynowy, stearynowy, olejowy, palmitoolejowy, hnolowy i inne wielonienasycone kwasy tłuszczowe) oraz w niewielkich ilościach róŜne inne długołań cuch owe kwasy tłuszczowe. Opisano miejsca wiąŜące dla kwasów tłuszczowych na albuminie mające róŜne powinowactwo. W warunkach sytoścL notuje się małe stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy. Zwiększa się ono do ok. 0,5 jimol/ml

w fazie poposiłkowej i do 0,7 ^mol/ml i 0,8 u.mol/ml w stanie całkowitego głodu. W niewyrównanej cukrzycy stęŜenie ich moŜe się zwiększyć do 2 ^mol/ml. StęŜenie WKT zmniejsza się tuŜ po jedzeniu i zwiększa się przed następnym posiłkiem. U takich zwierząt jak przeŜuwacze, odŜywiających się w sposób ciągły i u których zachodzi nieprzerwany napływ składników pokarmowych 7 jelita do krwi, stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu jest małe. Szybkość usuwania wolnych kwasów tłuszczowych z krwi jest wyjątkowo duŜa. Część WKT pobranych przez tkanki jest utleniana i pokrywa w głodzie 25—50% zapotrzebowania energetycznego organizmu. Pozostała część pobranych WKT jest estryfikowana. Iloraz oddechowy (RQ), oznaczony w okresie głodu, wskazuje na to, Ŝe spalaniu ulega znacznie więcej tłuszczów niŜ to wynika z ilości utlenionych wolnych kwasów tłuszczowych. Na t£ róŜnicę składa się utlenianie estrów lipidowych pochodzących z krąŜącej krwi lub obecnych w tkankach. Ostatnie ma szczególnie znaczenie w mieś-

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 299

niach szkieletowych i w sercu, gdzie mogą występować w dość znacznych ilościach zapasy lipidu w komórkach mięśniowych. Obrót (ang. turnover) wolnych kwasów tłuszczowych jest wprost proporcjonalny do stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych. Oznacza to, Ŝe

szybkość wytwarzania wolnych kwasów tłuszczowych w tkance tłuszczowej jest czynnikiem kontrolującym stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu, co z kolei determinuje pobieranie wolnych kwasów tłuszczowych przez inne tkanki. Stan odŜywienia nie wydaje się mieć wielkiego wpływu na frakcje wolnych kwasów tłuszczowych pobieranych przez tkanki, wpływa natomiast na proporcje ilości kwasów tłuszczowych utlenianych w stosunku do estryfikowanych. W stanie głodzenia więcej kwasów tłuszczowych się utlenia niŜ w stanie sytości, W cytozolu komórek większości tkanek stwierdzono obecność białka wiąŜącego kwasy tłuszczowe, czyli białka Z. UwaŜa się, Ŝe rola tego białka w wewnątrzkomórkowym transporcie wolnych kwasów tłuszczowych jest podobna

do roli albumin surowicy w pozakomórkowym transporcie długolańcuchowych kwasów tłuszczowych. TRIACYLOGLICEROLE SĄ TRANSPORTOWANE Z JELITA W CHYLOMI KROWACH, A Z WĄTROBY W LIPOPROTEINACH O BARDZO MAŁEJ GĘSTOŚCI Jak sama nazwa wskazuje, chylomikrony znajdują się w chłonce, czyli limfie (łac: chyluś). Powstają one jedynie w układzie odprowadzającym chlonke z jelita. Są odpowiedzialne za transport wszystkich lipidów zawartych w pokarmach do układu krąŜenia. W chłonce stwierdza się równieŜ mniejsze cząstki lipoproleinowe o nieco większej gęstości, wykazujące fizykochemiczną charakterystykę cząstek VLDL. Skład chemiczny tych mniejszych cząstek przypomina raczej chylomikrony niŜ VLDL, wskazując na to, Ŝe powinno się je uwaŜać raczej za

Światło jelita

Kanalik Ŝółciowy Komórka śrńdblonka

E Włosowate naczynie Krwionośne

Naczynie llmfatyczne prowadzące do przewodu piersiowego

Światło zatoki Ŝylnej

Ryc. 27-3. Tworzenie i wydzielanie (A) chyiomtkronów przez komórki jelita oraz (B) lipoprotein o bardzo małej gęstości przez komórkę wątrobową. RER — szorstka siateczka śródpiazmatyczna, SER — gładka siateczka śródplazmatyczna, G — aparat Golgiego, N —jądro, C — chylomikrony, VLDL— lipoproteiny o bardzo małej gęstości, E —śródbłonek, SD — przestrzeń okotozatokowa {Dissego) zawierająca osocze krwi. Rycina jest schematycznym przedstawieniem zdarzeń, które moŜna zobaczyć w mikroskopie elektronowym. __________________________________________________________________

300 / ROZDZIAŁ 27

małe chylomikrony niŜ za VLDL. Ich wytwarzanie odbywa się nawet w okresie głodzenia, a ich lipidy pochodzą głównie z Ŝółci i z wydzieliny ścian jelita. Ilość wytwarzanych chylomikronów o normalnej wielkości zwiększa się z ilością triacylogliceroli wchłoniętych ze światła jelita. Większość VLDL osocza jest pochodzenia wątrobowego. Są one przenośnikami triacylogliceroli z wątroby do tkanek poza wątrobowych. Istnieje wiele podobieństw w mechanizmie wytwarzania chylomikronów przez komórki jelita i VLDL przez hepatocyty wątroby (ryc. 27-3). Apoiipoproteina B jest syntetyzowana przez rybosomy w szorstkiej siateczce śródplazmatycznej i wbudowywana do lipoprotein w gładkiej siateczce śródplazmatycznej, która jest głównym miejscem syntezy triacylogliceroli. Następnie lipoproteiny przechodzą przez aparat Golgiego. gdzie — jak się sądzi — do lipoproteiny przyłączane są reszty cukrowcowe. Chylomikrony albo VLDL są uwalniane z komórki jelita lub wątroby przez fuzję pęcherzyka wydzielniczego z błoną komórkową (zjawisko to określa się jako odwrotną pinocytozę). Chy-

lomikrony przechodzą do przestrzeni między komórkami jelitowymi, skąd dostają się do układu limfatycznegojelita. VLDL są wydzielane przez komórki miąŜszu wątrobowego do przestrzeni okolozatokowej (Dissego), skąd dostają się do zatok wątrobowych, przenikając przez okienka śródbłonka naczyń. Podobieństwa pomiędzy tymi dwoma procesami i mechanizmami anatomicznymi są uderzające, gdyŜ — pomijając gruczoł sutkowy — jelito i wątroba są jedynymi tkankami, z których są wydzielane lipidy w postaci lipoprotein. Niezdolność cząstek lipidowych o rozmiarach chylomikronów i VLDL do przechodzenia przez komórki śródbłonka naczyń włosowatych, bez uprzedniej hydrolizy, jest prawdopodobnie przyczyną, dla której tłuszcze pokarmowe dostają się do krąŜenia poprzez układ limfatyczny (ductus thoracicus), a nie przez układ Ŝyły wrotnej. ChociaŜ zarówno chylomikrony, jak i VLDL izolowane z krwi zawierają apoli po proteiny C i E, lipoproteiny te i.n statu nascendi zawierają ich bardzo niewiele albo wcale. Wydaje się więc, Ŝe do chylomikronów i VLDL syntetyzowanych de novo przyłączanie polipeptydów apo C r apo

TGidłety. Receptor remnantów ohylomikronu (Apo-E)

Romnant chytomlkronu

Glloerol

Chyjo mikron świeŜo utworzony

JELFTO CIENKIE

27-4. TKANKI POZAWĄTFIOBOWE ILIFAZA LIPOPHOTEINOWAl -Kwasy tłuszczowe

Metaboliczne chylomikronów. A — apolipoproteina A, B-48 — apoiipoproteina B-48, © — apolipoproteina C, E — apolipoproteina E, HDL — lipoproteina o duŜej gęstości, TG — triacylo-giicerol, C — cholesterol i estry cholesterolu, P — fosfolipid. Przedstawiono tytko ilościowo dominujące lipidy. losy

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 301 świeŜo wytworzona VLDL

"KANKI POZAWĄTHOBOWE

Receptor LDL Apo-B-1QO Apo-E Kwasy tłuszczowe Cholesterol WĄTHOBA Receptor LDL

. Kwasy ~ tłuszczowe

I w tkankach pozawąlrobowych (np. w limfocytach, fibro toastach) drogą endocytozy

IDL Jremnant VLDL) Gllcerol TKANKI POZAWĄTROBOWE

Rvc. Z7-5. Metaboliczne losy lipoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL) i biosynteza lipoprotein o małej gęstości (LDL). A — apolipoproteina A, B-100 — apolipoproteina B-100, © — apolipoproteina C, E — apolipoproteina E, HDL— lipoproteina o duŜej gęstości, TG —triacyloglicerol, IDL — lipoproteina o pośredniej gęstości, C — cholesterol i estry cholesterolu, P — fosfolipid. Pokazano jedynie lipidy przewaŜające ilościowo.

E z HDL zachodzi dopiero wówczas, gdy chylomikrony i VLDL znajdują się w układzie krąŜenia (ryc. 27-4 i 27-5). Bardziej szczegółowy opis czynników kontrolujących wątrobowe wydzielanie VLDL podano niŜej. Apo B jest istotna w tworzeniu chylomikronów i VLDL. W a beta li pop rotę ine mii (rzadkiej chorobie) apo B nie jest syntetyzowana; hpoproteiny zawierające tę apolipo proteinę nie są wytwarzane, przez co dochodzi do spichrzania lipidów w jelitach i w wątrobie. KATABOLIZM CHYLOMIKRONOW I LIPOPROTEIN O BARDZO MAŁEJ GĘSTOŚCI JEST SZYBKIM PROCESEM Oczyszczanie krwi z chylomikronów, oznaczane znikaniem znakowanych chylomikronów z krąŜenia, jest szybkie. Biologiczny okres półtrwania tych cząstek jest rzędu minut u ma-

łych zwierząt (np. u szczura) i nieco dłuŜszy u większych zwierząt (np. u człowieka), u których i tak wynosi mniej niŜ 1 h. Większe cząstki są szybciej katabolizowane niŜ małe. JeŜeli podać doŜylnie chylomikrony ze znakowanymi kwasami tłuszczowymi triacyloglicerolu, to ok. 80% znakowanych kwasów stwierdza się w tkance tłuszczowej, sercu i mięśniach, a ok. 20% w wątrobie. PoniewaŜ doświadczenia z perfundowaną wątrobą wykazały, Ŝe wątroba nie metabolizuje w istotnym stopniu chylomikronów ani

VLDL, obecność znakowanych kwasów w wątrobie jest zapewne zjawiskiem wtórnym i pochodzi z przemiany tych lipoprotein w tkankach pozawątrobowych. Triacyloglicerol chylomikronów i VLDL jest hydrolizowany przez lipazę lipoproteinową Istnieje znamienna korelacja między zdolnością tkanek do wbudowywania kwasów tłuszczowych z triacylogliceroli lipoprotein a aktyw-

302 / ROZDZIAŁ 27

nością enzymu lipa/y lipoproteinowej. Ten enzym ic:iL umiejscowiony na ścianach włosowatych naczyń krwionośnych zakotwiczony proteoglikanowym łańcuchem siarczanu heparanu. Jego obecność wykazano w wyciągach z serca, tkanki tłuszczowej, śledziony, płuc, rdzenia nerki, aorty, przepony oraz gruczołu sutkowego w okresie Laktacji. Prawidłowa krew nie zawiera znaczących ilości tego enzymu, jednak po wstrzyknięciu heparyny lipaza li po protein owa zostaje uwolniona do krwiobiegu z jej zakotwiczenia siarczanem heparanu. Procesowi temu towarzyszy klarowanie iipemicznego osocza. Lipaza jest równieŜ uwalniana z wątroby po podaniu duŜych ilości heparyny (lipaza wątrobowa uwalniana heparyną), ale ten enzym ma właściwości odmienne od lipazy lipoprotcinowej i nie reaguje łatwo z chyl om ikro na mi. Do aktywności lipazy lipoproteinowej są potrzebne, jako kofaktory, fosjfolipidy oraz apolipoproteina C-II. Apo C-II ma swoiste miejsce wiązania fosfolipidu, przez które jest ona związana z lipoproteiną. A zatem chylomikrony i VLDL dostarczają enzymowi potrzebnemu do przemiany tych lipoprotein zarówno kofaktorów, jak i substratu. Hydroliza zachodzi wówczas gdy lipoproteiny są przyłączone do enzymu na powierzchni śródblonków. Triacyloglicerol jest hydrolizowany stopniowo poprzez diacy loglicerol do monoacylogiicerolu, który w końcu jest hydrolizowany do glicerolu i wolnego kwasu tłuszczowego. Niewielka ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych wraca do krwiobiegu, gdzie jest wiązana z albuminą, ale znaczna większość z nich jest transportowana do tkanki (ryc. 27-4 i 27-5). Lipaza lipoproteinowa serca ma małą wartość Km dla triacyloglicerolu, podczas gdy Km tego enzymu w tkance tłuszczowej jest 10-krotnie większa. Gdy stęŜenie triacylogliceroli osocza zmniejsza się przy przejściu ze stanu sytości w stan głodu, wówczas sercowy enzym pozostaje nadal wysycony substratem, natomiast wysycenie enzymu w tkance tłuszczowej zmniejsza się, co sprawia, Ŝe następuje intensywniejsze pobieranie kwasów tłuszczowych przez serce niŜ przez tkankę tłuszczową. Podobne odwrócenie kierunku pobierania kwasów tłuszczowych następuje podczas laktacji, w czasie której zmniejsza się aktywność lipazy lipoproteinowej w tkance tłuszczowej, a zwiększa się w gruczole sutkowym, pozwalając na pobieranie długołańcuch owych kwasów tłuszczowych, z triacylogliceroli lipoprotein potrzebnych do syntezy tłuszczu mleka.

W tkance tłuszczowej insulina zwiększa syntezę lipazy lipoproteinowej w adypocytach i jej przemieszczanie do powierzchni luminarnej śródbłonka naczyń włosowatych. Działanie lipazy lipoproteinowej powoduje powstawanie resztkowych lipoprotein (remnantów) Wynikiem działania lipazy lipoproteinowej jest utrata z chylomikronów ok. 90% triacylogliceroli i utrata apo C (która powraca do HDL), ale nie apo E, która pozostaje połączona z powstałymi cząstkami, określonymi jako retnnanty chylomikronów lub chylomikrony resztkowe (od angielskiego „remnant" - pozostałość, resztka). Te cząstki mają średnicę o połowę mniejszą niŜ pierwotne chylomikrony. Na skutek utraty triacylogliceroli są one bogatsze w cholesterol i estry cholesterolu (ryc. 27-4). Podobne zmiany zachodzą w VLDL, które zamieniają się w remnanty VLDL, określane jako IDL (od angielskiej nazwy intermediate-density lipoproteins, czyli lipoproteiny o pośredniej gęstości) (ryc. 27-5). Wątroba jest odpowiedzialna za wychwytywanie remnantów lipoprotein Remnanty chylomikronów są wychwytywane przez wątrobę, a zawarte w nich estry cholesterolu i triacyloglicerole są hydrolizowane i meiabolizowane. Wychwytywanie to wydaje się odbywać za pośrednictwem receptora swoistego dla apo E {ryc. 27-4), Badania z uŜyciem VLDL zawierających znakowaną apo B-100 wykazały, Ŝe VLDL są prekursorami IDL oraz LDL. Tylko 1 cząsteczka apo B-100 występuje w kaŜdej z wymienionych lipoprotein i ta cząsteczka pozostaje nie zmieniona w czasie przekształcania lipoprotein. KaŜda cząstka LDL pochodzi więc od pojedynczej cząstki VLDL (ryc. 27-5). IDL są przekształcane jedną z 2 moŜliwych dróg. Mogą one być wychwytywane bezpośrednio przez wątrobę za pośrednictwem receptorów LDL (wiąŜących apo B-100 i apo E), lub teŜ mogą być przekształcane w LDL. U szczura większość apo B z VLDL pojawia się w wątrobie, a tylko niewielki procent w LDL. MoŜe to być spowodowane faktem, Ŝe u szczura część cząstek VLDL zawiera apo B-48 zamiast apo B-100. JeŜeli wątrobowy receptor dla apo E wyklucza wychwytywanie cząstek zawierających apo B100, ale me cząstek zawierających apo B-48,

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 303

to jest to wytłumaczeniem większego usuwania przez wątrobę szczura I DL i mniejszego wytwarzania LDL u szczurów.

LDL SĄ METABOLIZOWANE ZA POŚREDNICTWEM RECEPTORA LDL Jak to opisano wyŜej, większość LDL powstaje 2 VLDL; istnieją jednak dowody na to, Ŝe pewna ich iJość jest wytwarzana bezpośrednio przez wątrobę. Okres połowicznego znikania z krwi apoproteiny B-100, występującej w LDL, wynosi ok. 2,5 dnia. Badania w hodowli fibroblastów, limfocytów i komórek mięśni gładkich tętnic, a takŜe wątroby wykazały istnięnje_swQisiy_ch miejsc wiąŜących, czyli receptorów LDL, tzw. receptorów B-100 E. Receptor ten tale nazwano, poniewaŜ jest on swoisty dla apo B-100, ale nie dla apo B-48, a w pewnych warunkach wiąŜe lipoproteiny bogate w apo E. W apo B-48 brakuje domeny znajdującej się przy karboksylowym końcu apo B-100, która zawiera ligand dla receptora LDL. W rodzinnej hipercholesterolemii występuje wa-

da tych receptorów. Około 50% LDL ulega degradacji w tkankach pozawątrobowych, a pozostałe 50% w wątrobie. Istnieje dodatnia korelacji między występowaniem miaŜdŜycy naczyń wieńcowych a stęŜeniem LDL w osoczu. Dalsza dyskusja na temat regulacji receptora LDL p. str. 319.

HDL UCZESTNICZĄ ZARÓWNO W METABOLIZMIE TRIACYLOGLICEROLU, JAK I CHOLESTEROLU HDL są syntetyzowane i wydzielane zarówno w wątrobie, jak i w jelicie (ryc. 27-6). JednakŜe HDL nowo wytworzone (świeŜo wydzielone) w jelitach nie zawierają apolipoproteiny C ani E, a jedynie apolipoproteinę A. Apo C i apo E są więc syntetyzowane w wątrobie i przenoszone do jelitowych HDL wówczas, gdy te ostatnie znajdą się w osoczu. Główną funkcją HDL jest działanie jako składowisko dla a po li po protein C i E, które są potrzebne w metabolizmie chylomikronów i VLDL (p, ryc. 27-4 i 27-5).

Nowo wytworzone HDL składają się z dyskoidalnych podwójnych błon fosfolipidowych zawierających apolipoproteinę i wolny cholesterol. Te lipoproteiny są podobne do cz4Stek

znajdujących się w osoczu chorych z niedoborem enzymu acyibtransferazy lecytyna : chole-

sterol (LCAT) oraz w osoczu chorych na Ŝółtaczkę zastoinowij. LCAT oraz jej aktywator — apolipoproteina A-1 wiąŜą się z tym tworem dyskoidalnym. Katalizowana przez LCAT reakcja zamienia fosfolipid i wolny cholesterol znajdujące się na powierzchni HDL w estry cholesterolu i łizolecytynę. Niepołarne estry cholesterolu przemieszczają się do hydrofobowego wnętrza struktury bilamelarnej, a lizolecytyna zostaje przeniesiona na albuminę osocza. Reakcja postępuje dalej i wytwarza niepolarny rdzeń, który rozpycha podwójną błonę cząstek aŜ do ukształtowania się sferycznego pseudomicelarnego HDL, pokrytego błoną złoŜoną z polarnych lipidów i apolipoprotein. Zestryfikowany cholesterol moŜe być przenoszony z HDL do lipoprotein o mniejszej gęstości, np. do chylomikronów, VLDL i LDL, za pośrednictwem białka przenoszącego estry cholesterolu

(apo D), które jest jeszcze jednym składnikiem HDL. Białko przenoszące estry cholesterolu umoŜliwia więc transport estrów cholesterolu HDL do wątroby poprzez resztkowe chylomikrony i VLDL albo przez wychwytywanie LDL w wątrobie. Układ LCAT uczestniczy więc w usunięciu nadmiaru niezestryfikowanego cholesterolu z lipoprotein i z tkanek. Wątroba, a moŜliwe Ŝe i jelita, wydają się być miejscem końcowej degradacji apolipoprotein HDL. Nie jest jasne, czy w tym procesie uczestniczy swoisty receptor dla HDL, czy dla apo A. Zaproponowano istnienie cyklu HDL, odpowiedzialnego za transport cholesterolu z tkanek do wątroby (szczegóły są przedstawione na ryc. 27-6). To wyjaśnia, dlaczego stęŜenie HDLj w osoczu zmienia się odwrotnie proporcjonalnie do stęŜenia chylomikronów i VLDL, a wprost proporcjonalnie do aktywności lipazy lipoproteinowej. StęŜenia HDL (HDL2) są odwrotnie proporcjonalne do częstości występowania miaŜdŜycy naczyń wieńcowych być moŜe dlatego, Ŝe

odzwierciedlają one wydajność usuwania cholesterolu z tkanek. HDL,; znajdują się we krwi zwierząt, u których występuje indukowana dietą hipercholesterolemia. Ta lipoproteina jest szczególnie bogata w cholesterol, a jej jedyną apolipoproteina jest apo E. Jest ona wychwytywana przez wątrobę poprzez receptor remnantów wiąŜący apo E oraz poprzez receptory LDL. To właśnie dlatego te ostatnie bywają czasem oznaczane jako receptory wiąŜące apo B-100 E. Płytki miaŜdŜycowe mają komórki,

304 / ROZDZIAŁ 27

Clttci I Kwasy Ŝółciowe

Dyskoldatna nowe postacie HDL

Dwu warstwa fosiollpidowa

Ryc.

27-6. Metabolizm lipoprotein o duŜej gęstości (HDL). HRHL — lipaza uwalnialna przez heparynę, LCAT— acylotransferaza lecytyna : cholesterol, LPL — lipaza tipoproteinowa, C — cholesterol, CE — estry cholesterolu, PL Chylomlkron y VLDL

— fosfolipid, WKT — wolne kwasy tłuszczowe, A-l — apolipoproteina A-l. Na rycinie przedstawiono rolę 3 enzymów HRHL, LCAT i LPL w postuiowanym cyklu HDL, słuŜącym do transportowania cholesterolu z tkanek do wątroby HDL2, HDL3 — p. tab. 27-2. Poza triacyloglicerolem, HRHL hydrofizuje fosfolipidy na powierzchni HDL2, uwalniając cholesterol, który jest wykorzystywany przez wątrobę. Równocześnie powstają mniejsze cząstki o większej gęstości. Aktywność HRHL zwiększa się pod wpływem aridrogenów, a maleje pod wpływem estrogenów, co moŜe być przyczyną większego stęŜenia HDL2w osoczu kobiet.

które wychwyciły tyle cholesterolu, Ŝe zmieniły się w przeładowane estrami cholesterolu komórki piankowate. Większość tych komórek pochodzi z makrofagów, które pochłonęły nieprawidłowe, bogate w cholesterol lipoprote-

iny, takie jak chemicznie zmodyfikowane LDL lub p-VLDL(p. str. 319). Makrofagi wydzielają zarówno cholesterol (przekazując go odpowiedniemu biorcy, takiemu jak HDL), jak i apo E. Ta apolipoproteina E, po odpowiednim przetwo-

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 305

rŜeniu w obecności LCAT, moŜe być źródłem bogatej w cholesterol HDLC. HDLC mogłaby więc być waŜnym ogniwem w przemieszczaniu cholesterolu z tkanek do wątroby („odwrócony transport cholesterolu"). Wszystkie lipoproteiny osocza są. wzajemnie ze sobą powiązanymi ogniwami jednego lub kilku cykli metabolicznych, a wszystkie razem są odpowiedzialne za złoŜony proces transportu lipidów w osoczu.

WĄTROBA ODGRYWA GŁÓWNĄ ROLĘ W TRANSPORCIE I METABOLIZMIE LIPIDÓW Uprzednio sądzono Ŝe większość przemian lipidów odbywa się w wątrobie. Odkrycie, Ŝe większość tkanek ma zdolność całkowitego utleniania kwasów tłuszczowych oraz nagromadzona z czasem ilość informacji o tym, Ŝe tkanka tłuszczowa jest nadzwyczaj aktywnym metabolicznie narządem, zmusiły do zmodyfikowania tego poglądu o dominującej roli wątroby. JednakŜe koncepcja, przypisująca wątrobie bardzo waŜną i jedyną w swoim rodzaju rolę w przemianie lipidów, pozostaje nadal obowiązująca. Wątroba sprawuje następujące bardzo waŜne funkcje w przemianie lipidów: 1) ułatwia trawienie i wchłanianie lipidów z przewodu pokarmowego, dlatego Ŝe wytwarza Ŝółć zawierającą cholesterol i sole kwasów Ŝółciowych syntetyzowane w wątrobie (p. str. 345), 2) wątroba ma aktywne układy enzymatyczne niezbędne do syntetyzowania i utleniania kwasów tłuszczowych (p. rozdz. 23 i 24), syntetyzowania triacylogliceroli, foslblipidów (p. rozdz. 26) i cholesterolu (rozdz. 27), 3) syntetyzuje lipoproteiny osocza (opisane w tym rozdziale), 4) przekształca kwasy tłuszczowe w ciała ketonowe (ketogeneza) (p. rozdz. 24), 5) odgrywa integrującą rolę w przemianie lipoprotein osocza (patrz ten rozdział).

Istnieje zaleŜność między wydzielaniem VLDL przez wątrobę a składem spoŜytych pokarmów PowyŜej opisano procesy komórkowe uczestniczące w tworzeniu i wydzielaniu VLDL (str. 322). Wątrobowe triacyloglicerole są bezpośrednimi prekursorami triacylogliceroli zawartych w VLDL osocza krwi (ryc. 27-7). Biosynteza triacylogliceroli stanowi bezpośredni bodziec do tworzenia i wydzielania VLDL: Kwasy tłusz20 — Biochemia

czowe uŜyte do syntezy wątrobowych triacylogliceroli pochodzą z 2 moŜliwych źródeł: 1) z syntezy w wątrobie z acetylo-CoA pochodzącego z węglowodanów oraz 2) z kwasów tłuszczowych wychwytywanych z krąŜenia. Pierwsze źródło dominuje w stanie sytości, gdy synteza kwasów tłuszczowych zachodzi intensywnie, a stęŜenie kwasów tłuszczowych wkraŜącej krwi jest małe. PoniewaŜ normalnie w tych warunkach triacyloglicerole nie gromadzą się w wątrobie, naleŜy sądzić, Ŝe są przez nią wydalane w postaci VLDL z taką samą szybkością, z jaką są syntetyzowane. Natomiast w czasie głodzenia, podczas spoŜywania pokarmów bogatych w tłuszcze lub w cukrzycy stęŜenie krąŜących wolnych kwasów tłuszczowych jest zwiększone i więcej kwasów jest wychwytywanych przez wątrobę. W tych warunkach lipogeneza jest zahamowana i wolne kwasy tłuszczowe są głównym źródłem kwasów tłuszczowych zawartych w triacyloglicerolach wątroby oraz VLDL. Mechanizmy enzymatyczne uczestniczące w syntezie triacylogliceroli i fosfolipidów opisano na slr. 286. Czynnikami, które powodują zarówno zwiększenie syntezy triacyloglicerolu, jak i wydzielania VLDL w wątrobie, są: 1) stan sytości, a nie głodzenia, 2) karmienie pokarmami o duŜej zawartości węglowodanów (zwłaszcza, gdy zawierają one sacharozę lub fruktozę), prowadzące do znacznej lipogenezy i estryfikacji kwasów tłuszczowych, 3) duŜe stęŜenie krąŜących we krwi wolnych kwasów tłuszczowych, 4) spoŜywanie etanolu oraz 5) duŜe stęŜenie insuliny, a małe stęŜenie glukagonu, co wzmaga syntezę i estryfikację wolnych kwasów tłuszczowych, a hamuje ich utlenianie.

Brak równowagi między wytwarzaniem triacylogliceroli a ich wydzielaniem jest przyczyną stłuszczenia wątroby (ryc. 27-7) Z rozmaitych powodów lipidy, głównie jako triacyloglicerole, mogą sie nagromadzić w wątrobie. Znaczne ich spichrzenie jest uwaŜane za stan chorobowy. Gdy nagromadzanie się lipidów ma charakter przewlekły, dochodzi do rozwoju zmian włóknistych, przechodzących w marskość (cirrhosis) i upośledzających czynność wątroby. WyróŜnia się 2 główne typy stłuszczenia wątroby: 1. Pierwszy typ jest związany ze zwiększonym stęŜeniem wolnych kwasów tłuszczowych osocza,

spowodowanym mobilizacją tłuszczów z tkanki

306 / ROZDZIAŁ 27 VLDL

HDL

J

Apo-C KREW

' Apo-E*

ŚwiaŜo wytworzona VLDL Kwas orotowy

A po-A Apo-C Apo-E

Reszty glikozylowe Gładka siateczka śródplazmatyczna

Tatra chlorek węgla Puromycyna l n ^ < Etlonlna Syntez a i f§ blatka

Apo-B-100 ■ Apo-C Apo-E

\ f Poiirybosomy

ou Szorstka siateczka śródplazmatyczna

OD świeŜy taft cuch policeptydowy

Karmienie cholesterolem niedobór EFA

Niedobór ofiollny 1,2-Dlaoylogllcerol

CDP-chollna

Fosfochollna

. Chollna

Etanol Acyto-CoA

WKT

_». Utlenianie

Llpogeneza z węglowodanów

Ryc. 27-7. Synteza lipoprotein o bardzo malej gęstości (VLDL) oraz prawdopodobne miejsca działania czynników powodujących spichrzanie triacylogliceroii i stłuszczenie wątroby EFA — egzogenne kwasy tłuszczowe, WKT — wolne kwasy tłuszczowe, HDL — iipoproteiny o duŜej gęstości, ApoA — apolipoproteina A, ApoB — apolipoproteina B, ApoC — apolipoproteina C, ApoE — apolipoproteina E. Zaznaczone szlaki są podstawą dla zdarzeń przedstawionych na ryc. 27-3 B.

tłuszczowej albo z hydrolizą triacylogliceroli lipoprotein lub chylomikronów przez Iipa2ę lipoproteinową tkanek poza wątrobowych. Zwiększone ilości wolnych kwasów tłuszczowych osocza są wychwytywane przez wątrobę i estryfikowane. Wytwarzanie lipoprotein nie

nadąŜa za napływem wolnych kwasów tłuszczowych, co jest przyczyną nagromadzania się triacylogliceroli i stłuszczenia wątroby. Ilość triacyloglicerohi w wątrobie znacznie się zwiększa podczas głodzenia oraz spoŜywania pokarmów o duŜej zawartości tłuszczów.

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 307

W wielu stanach (np. w głodzeniu) jest zaburzona zdolność wydzielania VLDL przez hepatocyty. MoŜe to być spowodowane małym stęŜeniem insuliny i upośledzoną syntezą białka. W niewyrównanej cukrzycy {diabetes mellitus), w zatruciu ciąŜowym u owiec i w ketozie bydła nacieczenie tłuszczami moŜe być tak znaczne, Ŝe powoduje widoczną bladość lub tłuszczowaty wygląd i powiększenie wątroby. 2. Drugi typ stluszczenia wątroby jest zwykle spowodowany metabolicznym blokiem wytwarzania lipoprotein osocza, co pozwala na nagromadzenie się tnacylogliceroli w wątrobie. Teoretycznie to upośledzenie moŜe być spowodowane a) zablokowaniem syntezy apohpoprotein, b} zablokowaniem tworzenia iipoprotein z lipidu i apolipoproteiny, c) niedoborem w dostarczaniu fosfolipidów, które są w lipoproteinach lub d) niewydolnością samego mechanizmu wydzielania. Typem stłuszczenia wątroby, który byt przedmiotem licznych badań u szczura, jest stłuszczenie wywoływane niedoborem choliny i dlatego związek ten bywa nazywany czynnikiem lipotropowym. PoniewaŜ do syntezy choliny są potrzebne labilne grupy metylowe, których dawcą jest metionina w procesie transmetylacji (p. rozdz. 32 i 33), niedobór choliny w rzeczywistości jest spowodowany niedostatkiem grup metylowych tego typu, jaki zawiera metionina. Sugerowano kilka róŜnych mechanizmów, które mogłyby wyjaśnić rolę choliny jako czynnika lipotropowego, m.jn. taki, Ŝe brak choliny powoduje niedobór fosfolipidów niezbędnych do syntezy lipoprotein. Antybiotyk puromycyna hamuje biosyntezę białka i powoduje stłuszczenie wątroby oraz znaczne zmniejszenie stęŜenia VLDL u szczurów. Innymi związkami o podobnym działaniu są: elionina {kwas cc-amino-y-merkaptoetylomasłowy). tetrachlorek węgla, chloroform, fosfor, ołów i arsen. Cholina nie chroni organizmu przed toksycznym działaniem tych czynników, ale wydaje się przyspieszać proces zdrowienia. Jest bardzo prawdopodobne, Ŝe tetrachlorek węgla wpływa równieŜ na sam mechanizm wydzielania lub na łączenie się lipidu z apolipoproteiną. Działanie tetrachlorku węgla nie jest bezpośrednie, ale zaleŜy od przekształcenia jego cząsteczki. Prawdopodobnie polega ono m.in. na tworzeniu wolnych rodników, które uszkadzają lipidy błon siateczki śródplazmatycznej, tworząc nadtlenki lipidowe. Uzupełnienie diety witaminą Ejest czynnikiem ochronnym przeciw

peroksydacji lipidów indukowanej tetrachlorkiem węgla. UwaŜa się Ŝe działanie etioniny polega na zmniejszeniu dostępności ATP. Wynika to z tego, Ŝe etionina, zastępując metioninę w S-adenozylometiomnie, wiąŜe pewną część dostępnej puli adenylanów i zapobiega tworzeniu się ATP. Kwas orotowy takŜe powoduje stłuszczenie wątroby. W tym przypadku VLDL gromadzi sie w aparacie Golgiego. Dlatego uwaŜa się, Ŝe kwas orotowy zaburza glikozylację lipoprotein i hamuje ich uwalnianie, co jest przyczyną znacznego zmniejszenia się w osoczu stęŜenia lipoprotein zawierających apo B. Niedobór witaminy E nasila martwicę wątroby występującą w przebiegu jej stłuszczenia wywołanego brakiem chohny. Podanie witaminy E lub selenu ma ochronne działanie przeciw peroksydacji lipidów. Tłuszczowe nacieczenie wątroby moŜe być spowodowane — poza niedoborem białka — takŜe niedoborem egzogennych kwasów tłuszczowych i witamin (np. kwasu hnolowego, pirydoksyny i kwasu pantotenowego). UwaŜa się Ŝe niedobór egzogennych kwasów tłuszczowych upośledza syntezę fosfolipidów. To sprawia, Ŝe takie substancje, jak cholesterol, które współzawodniczą o niezbędne dla estryfikacji egzogenne kwasy tłuszczowe, mogą takŜe powodować stłuszczenie wątroby. Etanol takŜe powoduje stłuszczenie wątroby Alkoholizm powoduje spichrzenie thiszczów w wątrobie, hiperlipemię i ewentualnie marskość wątroby {cirrhosis hepatis). Dokładny mechanizm długotrwałego działania etanolu jest wciąŜ niepewny. Nie jest jasne, czy w procesie spichrzania thiszczów jakąś rolę odgrywa dodatkowa mobilizacja wolnych kwasów tłuszczowych, chociaŜ wielokrotnie wykazano, Ŝe pojedyncza toksyczna dawka etanolu, podana szczurowi, powoduje zwiększenie stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu. JednakŜe spoŜywanie etanolu przez dłuŜszy okres powoduje spichrzenie kwasów tłuszczowych, w wątrobie, które raczej pochodzą z endogennej syntezy niŜ z mobilizacji z tkanki tłuszczowej. Po spoŜyciu alkoholu nie stwierdza się upośledzenia syntezy białka w wątrobie. Istnieją przekonujące dowody na to, Ŝe utlenianie etanolu w wątrobie wzmaga syntezę triacylogliceroli i hamuje utlenianie kwasów tłuszczowych oraz zmniejsza aktywność cyklu cytrynianowego. Zmniejszenie aktywności tego cyklu jest spowodowane utlenianiem etanolu przez

308 / ROZDZIAŁ 27

dehydrogenazę alkoholową, co prowadzi do nadmiernego wytwarzania NADH. DEHYDROGENAZA ALKOHOLOWA

CH,-CH*-OH Etanol -.--------- , CHj- CHO + NADH + H Aldehyd octowy

+

Powstający w tej reakcji NADH współzawodniczy z równowaŜnikami redukcyjnymi pochodzącymi z utleniania innych substratów o łańcuch oddechowy, hamując w ten sposób utlenianie tych substratów. Zwiększenie stosunku [NADH]/[NAD+] powoduje przesunięcie w lewo równowagi jablczan ^ szcza wio octan, co moŜe zmniejszyć aktywność cyklu cytrynianowego. Sumarycznym skutkiem zahamowania utleniania kwasów tłuszczowych jest wzmoŜenie estryfikacji kwasów tłuszczowych do triacylogliceroli, co wydaje się być przyczyną stłuszczenia wątroby. W wyniku utleniania etanolu powstaje najpierw aldehyd octowy, który jest utleniany w mitochondriach do kwasu octowego przy udziale dehydrogenazy aldehydowej. Innymi skutkami spoŜywania etanolu moŜe być m.in. zwiększona lipogeneza i zwiększona synteza cholesterolu z acetylo-CoA. Zwiększony stosunek [NADH]/[NAD+] powoduje takŜe zwiększenie stosunku [mleczan]/[pirogronian], czego wynikiem jest hiperlaktacydemia, która z kolei jest przyczyną 2mniejszenia zdolności nerek do wydalania kwasu moczowego. Upośledzenie wydalania kwasu moczowego jest prawdopodobnie przyczyną pogorszenia się dny moczanowej po wypiciu alkoholu. ChociaŜ główna droga przemiany etanolu przebiega szlakiem dehydrogenazy alkoholowej, pewna jego ilość jest metabolizowana przez układ mikrosomalny zaleŜny od cytochromu P-450, w którym uczestniczą takŜe NADPH i O2. Aktywność tego układu zwiększa się w przewlekłym alkoholizmie i moŜe być przyczyną zwiększenia metabolicznego usuwania etanolu z krwi w tych warunkach, na co wskazują zwiększone stęŜenia aldehydu octowego i octanu. CH 3 -CH a 0H + NADPH + H Etanol 2HaO -* CH,-CHO Aldehyd octowy

TKANKA TŁUSZCZOWA JEST GŁÓWNYM MAGAZYNEM TRIACYLOGLICEROLI W ORGANIZMIE Zapasy triacylogliceroli w tkance tłuszczowej ulegają ciągle lipolizie (hydrolizie) i reestryfikacji (ryc. 27-8). Te 2 procesy nie są prostym odwróceniem tej samej reakcji. Przebiegają one całkowicie odmiennymi szlakami zawierającymi inne pośrednie związki i inne enzymy. Wiele czynników Ŝywieniowych, metabolicznych i hormonalnych, które regulują przemianę tkanki tłuszczowej działa albo na proces estryfikacji, albo na lipolizę. Wypadkową tych 2 procesów jest wielkość puli wolnych kwasów, tłuszczowych w tkance tłuszczowej. Pula ta determinuje stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych krąŜących w osoczu. PoniewaŜ stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych ma bardzo duŜy wpływ na metabolizm innych tkanek, zwłaszcza wątroby i mięśni, czynniki działające w tkance tłuszczowej i regulujące wypływ z niej wolnych kwasów tłuszczowych, wywierają wpływ sięgający daleko poza samą tkankę tłuszczową. Dostępność glicerolo-3-fosforanu reguluje estryfikację. Lipoliza jest kontrolowana przez lipazę wraŜliwą na hormony W tkance tłuszczowej triacylogltcerol jest syntetyzowany z acylo-CoA i glicerolo-3-fosforanu według mechanizmu przedstawionego na ryc. 26-1. PoniewaŜ w tkance tłuszczowej aktywność enzymu kinazy glicerolowej jest mała, glicero! nie moŜe być wykorzystany w znaczniejszym stopniu do estryfikacji z acylo-CoA. Dlatego pod względem dostarczania glicerolo-3-fosforanu tkanka tłuszczowa jest zaleŜna od glikoiizy i od dostępności glukozy. Triacyloglicerol jest hydrolizowany pod wpływem lipazy wraŜliwej na hormony. Produktami tej reakcji są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. Lipaza ta jest odmienna od lipazy lipoproteinowej, która katalizuje hydrolizę triacylogliceroli zawartych w iipoproteinach przed ich wychwytem przez tkanki pozawątrobowe (p. str. 302). GJicerol, nie mogąc być wykorzystany przez tkankę tłuszczową, przenika do osocza krwi, skąd jest wychwytywany i zuŜytkowywany prze2 takie narządy, jak wątroba i nerka, które mają aktywną kinazę giicerolową. Wolne kwasy tłuszczowe powstające w procesie lipolizy mogą być ponownie przekształcone w tkań-

TRANSPORT I MAGAZYNOWANfE LIPIDÓW / 309

Glukoza

G lice roi

Ryc. 27-8. Metabolizm tkanki tłuszczowej. Upaza wraŜliwa na hormony jest aktywowana przez ACTH, TSH, glukagon, adrenalinę, noradrenalinę i wazopresyne, zaś hamowana przez insulinę, prostag landy nę E, i kwas nikotynowy. Szczegóły powstawania glicerolo-3-fosforanu z produktów pośrednich glikolizy przedstawiono na ryc. 26-1. PPP — szlak pentozofosforanowy, TG — triacyloglicerol, WKT — wolne kwasy tłuszczowe, VLDL — lipoproteina o bardzo małej gęstości.

ce tłuszczowej w acylo-CoA działaniem sycitetazy acylo-CoA i mogą być reestryfikowane z glicerolo-3-fosforanem, tworząc triacyloglicerol. W tkance tłuszczowej istnieje zatem ciągły cykl lipolizy i reestryfikacji. Gdy szybkość reeslryfikacji nie jest dostatecznie duŜa, aby zrównowaŜyć szybkość lipolizy, wówczas dochodzi do nagromadzenia wolnych kwasów tłuszczowych, które przenikają do osocza, gdzie wiąŜą się z albuminą i sa. przyczyną zwiększenia

stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu. Są one najwaŜniejszym źródłem energetycznym dla wielu tkanek. Zwiększony metabolizm glukozy zmniejsza uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych Przy zwiększeniu zuŜycia glukozy przez tkankę tłuszczową zmniejsza się wypływ z niej wolnych kwasów tłuszczowych. Pomimo tego

310 / ROZDZIAŁ 27

utrzymuje się uwalnianie glicerolu. Sugeruje to, Ŝe hamujący wpływ glukozy na uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych nie jest spowodowany zmniejszeniem lipolizy. UwaŜa się, Ŝe jest to spowodowane dostawą glicero-lo-3fosforanu, który nasila procesy estryfikacji wolnych kwasów tłuszczowych po ich uprzednim przekształceniu w acylo-CoA. Glukoza w tkance tłuszczowej moŜe wchodzić w wiele szlaków metabolicznych, łącznie z utlenianiem do CO2 poprzez cykl cytrynianowy, z utlenianiem poprzez szlak pentozofosforanowy, przekształceniem w długołańcuchowe kwasy thiszezowe oraz wytworzeniem acyloglicerolu poprzez glicerolo-3-fbsforan. Gdy zuŜycie glukozy jest duŜe. wówczas większa część pobranej glukozy jest utleniana do CO2 i przetwarzana w kwasy thiszczowe. JeŜeli jednak całkowite zuŜycie glukozy się zmniejsza, większość jej jest przekształcana w glicerolo-3-fosforan, wykorzystywany do estryfikacji z acylo-CoA. Proces ten pomaga-zminimaiizować wypływ wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej. Wolne kwasy tłuszczowe są wychwytywane przez tkanki w wyniku aktywności lipazy lipoprotei nowej W tkance tłuszczowej istnieje więcej niŜ 1 pula wolnych kwasów tłuszczowych. Wykazano, Ŝe pula wolnych kwasów tłuszczowych (ryc. 27-8, pula 1) powstająca w wyniku lipolizy triacylogliceroli, jest tą samą pulą, która dostarcza kwasów tłuszczowych do estryfikacji. Jest to takŜe ta sama pula, z której wolne kwasy tłuszczowe są uwalniane do osocza. JednakŜe kwasy tłuszczowe pobierane z osocza w wyniku działania lipazy lipoproteinowej na triacyloglicerole chylomikronów lub VLDL nie mieszają się z pulą 1, zanim nie zostaną wbudowane w triacyloglicerole, lecz przechodzą przez bardzo małą pulę 2, o bardzo duŜej liczbie obrotów (krótkim okresie półtrwania). HORMONY REGULUJĄ MOBILIZACJĘ TŁUSZCZÓW Insulina zmniejsza uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych Na szybkość uwalniania wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej działa wiele hormonów, które wpływają^albo na szybkość estryfikacji, albo na szybkość lipolizy. Insulina hamuje uwalnianie wolnych kwasów tłuszczo-

wych z tkanki tłuszczowej, czego następstwem jest zmniejszenie stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu. Wzmaga ona lipogenezę i syntezę acyloglicerolu oraz nasila utlenianie glukozy do CO2 w szlaku pentozofosforanowym. Te działania insuliny są zaleŜne od obecności glukozy. W duŜej mierze mogą one być wyjaśnione pobudzającym wpływem insuliny na pobieranie glukozy przez komórki tkanki tłuszczowej. To działanie insuliny polega na spowodowaniu przemieszczania przenośników glukozy z aparatu Golgiego do błony plazmatycznej. Wykazano równieŜ, Ŝe insulina wzmaga aktywność dehydrogenazy pirogronianowej, karhoksylazy acetylo-CoA oraz acylotransferazy glicerolo-3-fosforanowej, wzmacniając przez to skutki wynikające ze wzmoŜonego pobierania glukozy, zwiększające wytwarzanie kwasów tłuszczowych i acylogliceroli. Wiadomo, Ŝe wymienione powyŜej 3 enzymy są regulowane w sposób skoordynowany przez modyfikacje kowalencyjne, tj. przez mechanizm fosforylacji i defosforylacji. Zasadniczym działaniem insuliny w tkance tłuszczowej jest hamowanie aktywności lipazy wraŜliwej na hormony. W wyniku tego działania zmniejsza się uwalnianie nie tylko wolnych kwasów tłuszczowych, lecz takŜe glicerolu. Tkanka tłuszczowa jest znacznie bardziej wraŜliwa na działanie insuliny niŜ wiele innych tkanek, co wskazuje na tkankę tłuszczową jako główne miejsce działania insuliny In vivoDuŜa liczba hormonów ma zdolność pobudzania lipolizy W odróŜnieniu od insuliny, inne hormony przyspieszają uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej i zwiększają stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu dzięki temu, Ŝe zwiększają szybkość hydrolizy spichrzanych triacylogliceroli (ryc. 27-9). Wśród tych hormonów znajdują sie m.in. adrenalina, noradrenalina, glukagon, kortykotrofina (ACTH), <x- oraz p-melanotrofina (MSH), tyreotrofina (TSH), hormon wzrostu (GH) i wazopresyna. Wiele z nich aktywuje lipazę wraŜliwa, na hormony. W celu osiągnięcia optymalnego skutku w wielu 2 tych procesów lipolizy jest potrzebna obecność glikokortykoidów i hormonów tarczycy. Same te hormony nie wzmagają w znaczny sposób lipolizy, ale działają ułatwiająco lub permisywnie w stosunku do innych lipolitycznych czynników wewnątrzwydziel niczych.

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 311

Adrenalina, nnradrenalina

/ ACTH, \ I TSH, ) Nglukagon'

Blokery ■'© \ 0adrenergiczns j^ Hormony--^) \© tarczycy \ CYKUAZA G.TPADENYLANOWA

Hormon WZf08tu

,-

')&

ATP

--—WKT-*-'

WKT + monoacylogllcerol

l"acylog licerolawa b wraŜliwa na hormony ATP

WKT + glicerol

eJ

inhibitory"' ,-"'"*! syntezy ,'' białka / Adenozyna

Metyloksantyrty (np. kofeina} ..©_ FOSFODIESTEFIAZA

cAMP-zaleŜna kJnaza białek cAMP

■Llpaza triacyloglicero Iowa a wraŜliwa na hormony (aktywna)

ADP x

Hormon tarczycy

WKT + diacylaglicerol

insulina, proatag landy na E„ Kwas nikotynowy

Fosfataza lipazy

Insulina Llpaza dlacylogllcerolowa monoacylogHeerolowa

5'AMP ^ Glukokortykoldy

THIACYLO GLICEROL 'Inhibitory

biosynt ezy

białka

Ryc. 27-9. Kontrola lipolizy w tkance tłuszczowej, TSH — tyreotropina, WKT — wolne kwasy tłuszczowe. ZauwaŜ kaskadową sekwencję reakcji zmierzającą do zwielokrotnienia na kaŜdym etapie. Bodziec lipolityczny jest „wyłączony" przez: 1) usunięcie hormonu pobudzającego, 2) działanie fosfatazy lipazy, 3) hamowanie lipazy i cyklazy adenylanowej działaniem duŜych stęŜeń WKT, 4} hamowanie cyklazy adenylanowej dziafaniem adenozyny oraz 5) usunięcie cAMP w reakcji katalizowanej przez fosfod ieste raŜę, ACTH, TSH i glukagon raczej nie mogą aktywować cyklazy adenytanowej in i/ivo, gdyŜ niezbędne do tego stęŜenia hormonu//? vitro są znacznie większe niŜ znajdywane w krąŜeniu Pozytywne (©) i negatywne (G) skutki regulacyjne są zaznaczone przerywanymi liniami, a przepływ substratów ciągłymi liniami.

Te hormony, które szybko pobudzają lipolizę, np. aminy katecholowe, czynią to pobudzając aktywność cyklazy adenylanowej, enzymu, który przemienia ATP w cAMP. Ten mechanizm jest analogiczny do tego, który jest odpowiedzialny za hormonalne pobudzenie glikogenolizy (p. rozdz. 20). cAMP, pobudzając cAMP-zaleŜną kina/ę białek, przekształca nieaktywną, wraŜliwą na hormon, lipazę triacyloglicerolową w aktywną lipazę. Lipoliza jest w duŜej mierze kontrolowana przez ilość cAMP znajdującego się w tkance. Wobec tego procesy, które rozkładają lub chronią przed rozkładem cAMP, mają wpływ na lipolizę. cAMP jest rozkładany do 5'-AMP przez enzym fosfodiesterazę cykli-

cznego 3',5'-nukleotydu. Ten enzym jest hamowany przez metyloksantyny, takie jak kofeina i reoillina. Wiadomo, Ŝe picie kawy zawierającej kofeinę powoduje zwiększenie WKT w osoczu człowieka. Insulina działa antago ni stycznie w stosunku do hormonów Iipolityc2nych. Obecnie się uwaŜa, Ŝe lipolka moŜe być bardziej wraŜliwa na stęŜenie insuliny niŜ proces zuŜywania glukozy i estryfikacja kwasów tłuszczowych. Przeciwlipolityczne działania insuliny, kwasu nikotynowego i prostaglandyny E, mogą być spowodowane hamowaniem syntezy cAMP w miejscu działania cykJazy adenyJanowej. Insulina pobudza takŜe fosfodiesterazę. MoŜliwe mecha-

312 / ROZDZIAŁ 27

niŜmy działania hormonów tarczycy na lipazę polegają na zwiększeniu stęŜenia cAMP, uwarunkowanym ułatwionym przenikaniem bodźca z miejsca na receptorze, umiejscowionego po zewnętrznej stronie błony komórkowej, do miejsca cykJazy adenylanowej umiejscowionej po wewnętrznej stronie błony, a takŜe na hamowaniu aktywności fosfodiesterazy. Pobudzający wpływ hormonu wzrostu na lipolizę jest powolny. ZaleŜy on od syntezy białek uczestniczących w wytwarzaniu cAMP. Glikokortykosteroidy pobudzają lipoiizę poprzez syntezę de now białka lipazy w sposób niezaleŜny od cAMP, co moŜe być hamowane przez insulinę. Te fakty pomagają wyjaśnić rolę przysadki mózgowej i kory nadnerczy w pobudzaniu mobilizacji tłuszczów. Współczulny układ nerwowy, wskutek uwalniania noradrenaliny w tkance tłuszczowej, odgrywa główną rolę w mobilizacji wolnych kwasów tłuszczowych, działając tonizująco na ten proces nawet przy braku wzmoŜonej aktywności nerwowej. Wobec tego wzmoŜoną lipolizę, spowodowaną wieloma czynnikami opisanymi powyŜej, moŜna zredukować lub nawet całkowicie zahamować przez odnerwienie tkanki tłuszczowej, przez blokadę zwojów współczulnych heksametonium lub przez zuboŜenie zapasów noradrenaliny rezerpiną.

„zespół nadmiaru węglowodanów", spowodowany wyjątkowym ograniczeniem zdolności organizmu do usuwania nadmiaru węglowodanów przez lipogenezę. U ptaków lipogeneza jest ograniczona do wątroby, gdzie jest ona bardzo istotna, poniewaŜ dostarcza lipidów potrzebnych do tworzenia jaj pobudzonego przez estrogeny. Ludzka tkanka tłuszczowa nie jest wraŜliwa na działanie większości hormonów lipolitycznych, poza aminami katecholowymi. Dalszymi ciekawostkami są: brak reakcji lipolitycznej na działanie adrenaliny u królika, świnki morskiej, świni i kurczęcia, bardzo znaczne działanie lipolityczne glukagonu u ptaków, przy braku przeciwlipolitycznego działania insuliny oraz brak syntezy acylogliceroiu i glicerolu z glukozy u gołębia. Biorąc pod uwagę głębokie zaburzenie metabolizmu występujące w cukrzycy (które jest spowodowane głównie zwiększonym uwalnianiem wolnych kwasów tłuszczowych z ich magazynów) oraz fakt, Ŝe podanie insuliny w duŜej mierze poprawia le zaburzenia, naleŜy wysnuć wniosek, Ŝe insulina odgrywa pierwszoplanową rolę w regulacji metabolizmu tkanki tłuszczowej.

BRUNATNA TKANKA TŁUSZCZOWA POBUDZA TERMOGENEZĘ U RÓśNYCH BADANYCH GATUNKÓW WYKSZTAŁCIŁY SIĘ ROZMAITE MECHANIZMY SŁUśĄCE SUBTELNEJ KONTROLI METABOLIZMU TKANKI TŁUSZCZOWEJ Tkanka tłuszczowa człowieka nie wydaje się być waŜnym miejscem lipogenezy. Wskazuje na to obserwacja, Ŝe nie ma znaczącego wbudowywania znaczników do długołańcuchowych kwasów tłuszczowych ze znakowanej glukozy lub pirogronianu. Ponadto ATP-zaleŜna liaza cytrynianowa, kluczowy enzym lipogenezy, wydaje się być nieobecna w tkance tłuszczowej, a w wątrobie wykazuje bardzo małą aktywność. Inne enzymy, np. dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa i enzym jabłezanowy, których aktywność u szczura ulega adaptacyjnym zmianom zaleŜnym od zwiększającej się intensywności lipogenezy, nie ulegają podobnym zmianom w tkance tłuszczowej człowieka. W związku z tym sugerowano, Ŝe u człowieka istnieje

Brunatna tkanka tłuszczowa uczestniczy w metabolizmie szczególnie wówczas, gdy jest konieczne wytwarzanie ciepła. Ten fakt tłumaczy, Ŝe ta tkanka jest bardzo aktywna metabolicznie u niektórych gatunków zwierząt w okresie budzenia się ze snu zimowego, u zwierząt naraŜonych na zimno (termogeneza bezdrŜeniowa) oraz przy wytwarzaniu ciepła, u noworodków. ChociaŜ nie jest to pierwszoplanowa tkanka u ludzi, ostatnio wykazano, Ŝe jest aktywna u osób zdrowych, u których wydaje się ona odpowiadać za „termogenezę indukowaną przez

dietę". Ten fakt tłumaczy, dlaczego niektóre osoby mogą Jeść i nie być otyłymi". Godne uwagi jest to, Ŝe ilość brunatnej tkanki tłuszczowej jest mniejsza lub w ogóle brak jej u ludzi otyłych. Brunatną tkankę tłuszczową charakteryzuje dobrze rozwinięte ukrwienie, duŜa zawartość mitochondriów i cytochromów, ale mała aktywność syntazy ATP. Metabolicznie przewaŜa utlenianie zarówno glukozy, jak i kwasów tłuszczowych.

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 313 WEWNĘTRZNA BŁONA MITOCHONDRIALNA

STRONA ZEWNĘTRZNA

Noradrenallna

9

\

cAMP

I

F

°

STRONA WEWNĘTRZNA

KffN

f I ------------------------------ 1 i.

ATP

,

Hl

Ciepło

Laficuch oddechowy Trfaoyfo.

WKT Tarmogsnlna RównowaŜniki

Acyio-CoA -*-j

redukcyjne

C iepło JMuKeotydy purynowe

Transporter karnltynowy

^Oksydacja

Ryc. 27-10. Termogeneza w brunatnej tkance tłuszczowej. Aktywność łańcucha oddechowego wytwarza ciepło, prowadząc równocześnie translokację protonów (p. str. 151). Gdy te protony wracają do kompartmentu wewnątrzmitochondrialnego za pośrednictwem termogeniny, następuje rozproszenie ciepła, zamiast wytwarzania ATP, które zachodzi wówczas, gdy protony powracają za pośrednictwem F^syntazy ATP. JeŜeli brunatna tkanka tłuszczowa ł nie jest pobudzana, to przejście H przez termogeninę jest zahamowane przez nukleotydy purynowe. Pod wpływem noradrenaliny ta inhibicja zostaje zniesiona, gdyŜ są wytwarzane wolne kwasy tłuszczowe (WKT) i acylo-CoA. ZauwaŜ podwójną rolę acylo-CoA, z jednej strony ułatwiają działanie termogeniny, z drugiej zaś dostarczają równowaŜników redukujących dla łańcucha oddechowego. Zaznaczone są pozytywne (©) i negatywne (0) skutki regulacyjne.

Noradrenalina, uwalniana z zakończeń nerwów współczułnycli, jest waŜna do wzmoŜenia lipolizy w brunatnej tkance tłuszczowej. Utlenianie i fosforylacja nie są skojarzone w brunatnej tkance tłuszczowej, czego wyrazem jest brak wpływu dinitrofenolu na zuŜycie tlenu i brak kontroli oddechowej wywieranej przez ADP. Fosforylacje, które zachodzą, mają miejsce na poziomie substratu, np. w reakcji katalizowanej przez tiokinazę bursztynianową oraz w glikolizie. W procesie utleniania wytwarza się więc duŜo ciepła, a tytko niewiele energii swobodnej jest wiązane w postaci ATP. W katego-

riach teorii chemiosmotycznej dzieje się tak, Ŝe gradient stęŜeń protonów, istniejący normalnie po obydwóch stronach wewnętrznej błony mJtochondrialnej skojarzonych mitochondriów, w brunatnej tkance tłuszczowej ulega ciągłej dyssypacji działaniem ciepłotwórczego białka termogeniny, którego mechanizm działania polega na tworzeniu drogi swobodnego przenikania protonów przez błonę. Wyjaśniałoby to pozorny brak efektu związków rozkojarzajacych (ryc. 27-10). PIŚMIENNICTWO Borensztajn J (edilor): Lipoprotein Lipase. Eveuer Publishers, Chicago, 1987. Brewer HB, et al: Apolipoproteins and lipoproteins in human plasma: An overview. Clin Chem 1988;34:B4. Brown Ms, Goldsten JL: Lipoprotein metabolisra in the macrophage: Implication for cholesterol deposition in atherosclerosis. Amtu Rev Biochem 1983;52:223. Eisenberg S: High densiiy lipoprotein metabolism. J Lipid Res 1984;25:1017. Fielding CJ, Fielding PE: Metabolism of cholesterol and lipoproteins. Page 404 in: Biochemiitry of&ptds and Membmnes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 1985. Himms-Hagen J: Brown adipose tissue metabolism and thermogenesis. Ann Rev Nutr I985;5:69. Liber CS: Biochemical and molecular basis of alcohol-induced injor>- to liver and other tissues. New Eng JMed 1988:319:1639. Sparks JD, Sparks CE: Apolipoprotein B and lipoprotein metabolisra, Ath Lipid Res 19S5;21:t.

28

Synteza, transport i wydalanie cholesterolu Pater A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Cholesterol występuje w tkankach oraz w lipoproteinach osocza jako wolny cholesterol albo w połączeniu z kwasami tłuszczowymi o długim łańcuchu węglowym jako estry cholesterolu. Jest on syntetyzowany w wielu tkankach z acetyl o-Co A i ostatecznie wydalany z organizmu z Ŝółcią jako cholesterol lub sole kwasów Ŝółciowych. Cholesterol jest prekursorem wszystkich innych steroidów w organizmie, takich jak: korty kos teroidy, hormony płciowe, kwasy Ŝółciowe i witamina D. Jest typowym produktem metabolizmu zwierzęcego, a więc znajduje się w pokarmach pochodzenia zwierzęcego, takich jak: Ŝółtko jaja, mięso, wątroba i mózg. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Cholesterol jest amfipatycznym lipidem i jako taki jest istotnym strukturalnym składnikiem błon oraz zewnętrznej warstwy Hpoprotein osocza. Ponadto lipoproteiny transportują wolny cholesterol w krąŜącej krwi, gdzie wymienia się on, na zasadzie równowagi, z cholesterolem innych lipoprotein i błon. Cholesterol zestryfikowany jest postacią zapasową cholesterolu znajdującego się w większości tkanek. Jest on transportowany jako „cargo" w rdzeniu Iipoprotein osocza .fCDD jest pośrednikiem w pr^Ł noszeniu cholesterolu i estrów cholesterol u do wielu Tkanek. Wolnycholesterol jest usuwany z tkanek przez fHDJ^ i transportowany do wątroby, gdzie jest przekształcany w kwasy Ŝółciowe. Cholesterol jest głównym składnikiem kamieni Ŝółciowych. JednakŜe najwaŜniej-

sza jego rola w procesach patologicznych polega na uczestniczeniu w powstawaniu miaŜdŜycy {(itherosderosis) Ŝyciowo waŜnych tętnic, stając się przyczyną chorób naczyń mózgowych, tętnic wieńcowych i naczyń obwodowych. Nasilenie miaŜdŜycy naczyń wieńcowych wykazuje dodatnią korelację ze stosunkiem stęŜenia cholesterolu LDL do cholesterolu HDL. CHOLESTEROL POCHODZI MNIEJ WIĘCEJ W TEJ SAMEJ ILOŚCI Z POKARMÓW CO I Z BIOSYNTEZY Około połowa cholesterolu organizmu człowieka pochodzi z syntezy (ok. 500 mg/24 h), pozostała zaś ilość jest dostarczana z pokarmem. Około 50% syntetyzowanego cholesterolu pochodzi z wątroby, 15% z jelit, zaś znaczna część pozostałej ilości syntetyzowanego w organizmie cholesterolu pochodzi ze skóry. Praktycznie wszystkie tkanki zawierające komórki jądrzaste są zdolne do syntetyzowania cholesterolu. Za syntezę jest odpowiedzialna zarówno frakcja mikrosomalna (siateczka śródplazmatyczna), jak i frakcja cytozolowa komórki. Źródłem wszystkich atomów węgla cholesterolu jest acetylo-CoA Biosynteza cholesterolu moŜe być podzielona na 5 etapów. 1. Najpierw następuje synteza mewalonianu, 6węglowego związku powstającego z acetylo-CoA (ryc. 28-1). 2. Następnie dochodzi do wytworzenia jednostki izoprenoidowej z mewalonianu przez utratę COZ (ryc. 28-2). 3. 6 jedno-

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 315

C H 3 -C -S -C o A 2-Acatylo-CoA | TIOLAZA | CoA-SH CH3 ot

O *

CM

Ć - CH ; - C~ S- Co A 0 Acetoacełylo-CoA

o ĆH3-°£!-S-CoA Acetylo-CaA SYNTAZA KMG-CoA

CH, C o A . S H O l

,

O

•

Ol

*

o

:-! |

- OO C-CH; - C-CHj - C - S -Co A I OH 3-Hydrofoy-3-metylaglutaryto-CaA (HMG-CoAJ IREDLKTAZA HMG-CoA Cholesterol Mewastaryna Lowastafyrra c

•

2NADPH+2H1 0 ^ 2 NA DP +

+ C0 A . S H OCH^

-OOC-CH 2 - C - C H . - C H ^ O H I OH Mewalonlan

Ryc. 28-1. Biosynteza mewalonianu. HMG — reszta 3-hydroksy-3-metyloglutarylowa. Reduktaza HMG-CoAjest hamowana przez cholesterol i metabolity grzybów, mewastatynę (Compactin) i lowastatyne (Mevinolin), które działają kompetycyjnie w stosunku do HMG-CoA.

stek izoprenoidowych kondensuje tworząc produkt pośredni — skwalen. 4, Skwalen cyklizuje i powstaje macierzysty steroid — lanosterol. 5. Z lanosterolu powstaje cholesterol w wyniku kilku dalszych reakcji związanych z utratą 3 grup metylowych (ryc. 28-3).

Etap 1. Z acetylo-CoA powstaje HMG-CoA i mewalonian Szlak prowadzący przez HMG-CoA (3-hydroksy-3-metyloglutarylo-CoA) przebiega według tej samej sekwencji reakcji, jaka została opisana w rozdz. 24 przy syntezie ciał ketonowych w mitochondriach. PoniewaŜ synteza cholesterolu jest procesem pozamitochondrialnym, te 2 szlaki przebiegają oddzielnie. Na początku 2 cząsteczki acetylo-CoA kondensują tworząc acetoacetylo-CoA. Reakcję te katalizuje enzym cyto-

zolowy — tiola/a. W wątrobie acetoacetylo-CoA moŜe powstawać alternatywnie w taki sposób, Ŝe acetooctan wytworzony w szlaku ketogenezy wewnątrz mitochondrium (p. rozdz. 24) dyfunduje do cytozolu. gdzie moŜe być aktywowany do acetoacetylo-CoA działaniem syntazy acetoacetylo-CoA. Reakcja ta wymaga obecności ATP i CoA. W wyniku kondensacji acetoacetylo-CoA z kolejną cząsteczką aceiylo-CoA (reakcje te katalizuje syntaza HMG-CoA) powstaje HMG-CoA. HMG-CoA jest przekształcany w mewalonian w 2-etapowej redukcji z udziałem NADPH i mikrosomalnego enzymu reduktazy HMG-CoA. Reakcja ta jest uwaŜana za etap ograniczający szybkość szlaku biosyntezy cholesterolu (ryc. 28-1).

Etap 2. Z mewalonianu powstają aktywne jednostki izoprertoidowe. Mewalonian jest fosforylowany przez ATP z wytworzeniem kilku aktywnych ufosforylowanych związków pośrednich (ryc. 28-2). Przez dekarboksylację powstaje aktywna jednostka izoprenoidowa — izopentenylopiro fosforan. Etap 3. 6 jednostek izoprenoidowych tworzy skwalen. W tym etapie dochodzi do kondensacji 3 cząsteczek izopentenylopirofosforanu z powstaniem pirofosforanu famezylu. Odbywa się to wskutek izomeryzacji izopentenylopirofosforanu, w czasie której dochodzi do przesunięcia wiązania podwójnego i wytworzenia pirofosforanu dimetyloalilu. Z kolei następuje kondensacja z inną cząsteczką izopentenylopiro fosforanu i wytworzenie 10-węglowego związku pośredniego, pirofosforanu geranylu (ryc, 28-2). W wyniku dalszej kondensacji z izopentenylopirofosforanem powstaje pirofosforan farnezylu. 2 cząsteczki pirofosforanu farnezylu kondensują przy końcu piro fosforanowym. W tej reakcji najpierw odszczepia się 1 pirofosforan i powstaje pirofosforan preskwalenu, po czym następuje redukcja z udziałem NADPH i oderwanie pozostałej reszty piro fosforanowej. Produktem tych reakcji jest skwalen. MoŜe istnieć alternatywny szlak zwany „spięciem trans-metyloglutakonylanowym". W tym szlaku jest eliminowana znaczna część (5% w wątrobie w stanie sytości, a do 33% w wątrobie w stanie głodzenia) pirofosforanu dimetyloalilu, który wraca do HMG-CoA przez (rans-3-metyloglutakonylo-CoA. Ten szlak moŜe mieć znaczący wpływ regulacyjny na sumaryczną szybkość syntezy cholesterolu.

316 / ROZDZIAŁ 28 CH3

-ooc

\r

ADP

ATP

OH

CH,

CH,

CH 5

CH :

OH

Mewalonian

OH

\if \ / \

^L_-OOC C KINAZA CH, O MEWALONIANOWA CH2 5-Fosforan mewalonianu ATP

-C PJ

KINAZA FOSFOMEWALONIANOWA

ADP ADP

CH3

CH3

OH

ATP

AA

CH, CH; O-®-® 3-Fosto-5-plrofosłoran rnawalonlanu ~ COj+Pj HMG-CoA

Spięcie trans-matyloglutakonłanowa ^

CH3 I

' ^ ___ C / CH,

H5 CH2 5Plrofosforan mewalonlanu

DEKARBOKSYLAZ A PIROFOSFOMEWA-

^ / \

°

°

Pirofostoran 3,3-dimetyloallilu

IZOMEflAZA IZOPENTENYLODtFOSFORANOWA

'Izopentenylo-IRNA

Piralosforan Izopentenylu

___ JL

_

OS-PRENYLOTRANSFERAZA

CH3

CH3

CH3

CH

CH, CH Pirofosforan geranylu

Hem a CIS-PRENYLOTRANSFERAZA Łańcuch boczny __ ubichlnonu ^—

»Skwalen

Ryc. 28-2. Biosynteza skwa len u, ubichinonu idoMcholu, HMG — reszta 3hydroksy-3meiylo'gluiarylowa: x— cytokinina. Reszta farnezylowa jest obecna w hemie a oksydazy cyto chrom owej. Węgiel zaznaczony * staje się C,, lub C12 w skwatenie. Syntetaza skwalenowa jest enzymem mikrosomainym; wszystkie inne enzymy zaznaczone na schemacie są rozpuszczalnymi białkami cytozolowymi. _________

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 317

CH, O

CH 3 -°C~S-CoAAcetylc-CoA

•

ul

•

T»

O

" OOC -CH!-C -CH3 -CH20H l

CHa~C

=

OH Mewalontan

ca

ol

*

a ^"1

CH — CH;— Jednoalka

H,0

Daamosterol (24-ae hyd r oe ho I astero i)

izoprenoldowa

CH,

*aH "^

^=c"'

H2C

LANOSTEROLOCYKLAZ A O KSY DOSKWALENOW A

HO

Cholesterol

Ryc. 28-3. Biosynteza cholesterolu. Ponumerowane pozycje oznaczają numery atomów węgla pierścienia steroidowego. 'Odnosi się do znakowania skwalenu na ryc. 28-2.

Etap 4. Skwaien jest przekształcany w tanosterol. Skwaien ma budowę przypominającą pierścień steroidowy (ryc. 28-3). Przed zamknięciem pierścienia skwaien jest przekształcany w 2,3-tlenek. Reakcję tę, zachodzącą w siateczce śród plazma ty cznej, katalizuje oksydaza o mieszanej funkcji zwana epoksydazij

skwalenową, W trakcie cykiizacji, katalizowanej przez lanosterolocyklazę 2,3-oksydoskwatenową, grupa metylowa przy C14 zostaje przeniesiona do C]3, a grupa metylowa z C8 na CM.

Etap 5. Lanosterol jest przekształcany do cholesterolu. W tym ostatnim etapie (ryc, 28-3) przejście lanosterolu w cholesterol

318 / ROZDZIAŁ 28

zachodzi w błonach siateczki śródplazmatycznej i obejmuje zmiany w pierścieniu steroidowym oraz w łańcuchu bocznym. Grupa metylowa przy C,4 zostaje utleniona do CO2 i powstaje 14-demetyloianosteroI. Podobnie 2 grupy metylowe przy C4 zostają usunięte, czego wynikiem jest zymosterol. Z zymosterolu tworzy się przez przesunięcie podwójnego wiązania z pozycji pomiędzy Cg i C9 do pozycji pomiędzy C3 a C7, A7>24-cholestadienol. Na tym etapie powstaje, przez dalsze przesunięcie podwójnego wiązania w pierścieniu B do pozycji między C; a Cfi —jak w cholesterolu — des most er o I W końcu, po redukcji podwójnego wiązania w łańcuchu bocznym, powstaje cholesterol. Reakcja ta moŜe zachodzić na kaŜdym etapie biosyntezy cholesterolu. Dokładna kolejność, w jakiej rzeczywiście zachodzą opisane powyŜej etapy, nie jest znana z pewnością. Jest prawdopodobne, Ŝe związki pośrednie od skwalenu do cholesterolu są związane ze swoistym białkiem nośnikowym, znanym jako białko przenoszące skwalen i steroJe. To białko wiąŜe sterole i inne nierozpuszczalne lipidy, umoŜliwiając im wchodzenie w reakcje w wodnej fazie komórki. Ponadto jest prawdopodobne, Ŝe cholesterol, właśnie w formie związanej ze specjalnym białkiem nośnikowym, jest przekształcany w hormony steroidowe i w kwasy Ŝółciowe, a takŜe uczestniczy w tworzeniu błon i lipoprotein. Pirofosforan farnezylu jest związkiem wyjściowym do wytwarzania innych waŜnych związków izoprenoidowych Pirofosforan farnezylu jest kluczowym związkiem, od którego rozgałęziają się szlaki syntezy innych poliizoprenoidów, dolicholu i ubichinonu. Alkohol poliizoprenylowy — dolichol (p. str. 184 i str. 756) powstaje przez dalsze dołączanie, maksymalnie 16 reszt, izopentenylopiro fosforanu, natomiast łańcuch boczny ubichinonu (p. str. 149) przez dołączenie dalszych 3—7 takich jednostek. SYNTEZA CHOLESTEROLU JEST REGULOWANA IMA ETAPIE REDUKTAZY HMG-CoA Synteza cholesterolu jest regulowana blisko początku szlaku na etapie reduktazy HMG-CoA. U_. .głodzonych zwierząt stwierdza się znaczne zmniejszenie aktywności reduktazy

JJMG-CoA, co wyjaśnia fakt zmniejszania syntezy cholesterolu w czasie głodzenia. Istnieje mechanizm sprzęŜenia zwrotnego, dzięki któremu rcduklazŁt IIMG-CoA w wątrobie jest hamowana przez cholesterol — główny produkt szlaku. PoniewaŜ nie udało się wykazać bezpośredniego hamowania enzymu przez cholesterol, wydaje się moŜliwe, Ŝe cholesterol (albo jego metabolit, np. sterol z wprowadzonym dodatkowo tlenem) działa albo przez represję syntezy nowego białka reduktazy, albo przez indukcję syntezy enzymów rozkładających istniejącą reduktazę. Syntezą cholesterolu jest równieŜ hamowana przez cholesterol zawarty w LDL, wychwytywany przez receptory LDL (receptory apo-B-100, E). Istnieją okołodobowe wahania dotyczące zarówno szybkości syntezy cholesterolu, jak i aktywności reduktazy HMG-CoA. Wpływ cholesterolu na aktywność reduktazy moŜe jednak wystąpić szybciej, niŜ to moŜna by wyjaśnić zmianami szybkości syntezy białka. Podanie insuliny lub hormonu tarczycy z wieksza~a~k~tywność reduktazy HMCŁCoA, podczas gdy glukagon i gluko korty kos teroidy ją zmniejszają. HMG-CoA występuje zarówno w postaci aktywnej, jak i nieaktywnej. Te postacie mogą odwracalnie w siebie przechodzić działaniem mechanizmów fosforylacji — defosforylacji. Niektóre z tych mechanizmów mogą być zaleŜne od cAMP i przez to wraŜliwe na glukagon, a moŜliwe, Ŝe i na insulinę (ryc. 28-4). Wpływ zmiennych ilości cholesterolu spoŜytych w pokarmach na endogenne wytwarzanie cholesterolu badano u szczurów. Przy podaŜy jedynie 0,05% cholesterolu w diecie, 70-80% cholesterolu zawartego w wątrobie, jelicie cienkim i nadnerczach pochodziło z biosyntezy w organizmie, natomiast gdy stęŜenie cholesterolu w poŜywieniu zwiększono do 2% jego endogenne wytwarzanie było mniejsze Wydaje się, Ŝe jest hamowana jedynie wątrobowa synteza cholesterolu. Doświadczenia z perfundowaną wątrobą wykazały, Ŝe bogate w cholesterol resztkowe chylomikrony wychwytywane przez wątrobę (p. str. 303) hamują syntezę sterol i. Próby zmniejszenia stęŜenia cholesterolu w osoczu u ludzi przez zmniejszenie podaŜy cholesterolu w pokarmach dają zmienne wyniki. Na ogół zmniejszenie ilości cholesterolu w diecie o 100 mg powoduje zmniejszenie jego stęŜenia w surowicy o ok. 0,13 mmcrt/1.

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 319

AT P

KINAZA REDUKTAZY (nieaktywna)

KINAZA KINAZY REDUKTAZY FOSFATAZY BIAŁEK

e

ADP KINAZA HEDUKTAZY (aktywna)

H,0

ADP

ATP,

— Insulina ?

Glukagon I

HMG-CoA

♦

REDUKTAZ A HMGCoA (aktywna)

J

Cholesterol

Oksy ster ole

FOSFATAZY BIAŁEK

BEDUKTAZA HMG-CoA (nieaktywna)

Utosforylowany f inhlbltor-1 "* cAMP

e Synteza

Ryc. 28-4. MoŜliwe mechanizmy regulacji syntezy cholesterolu przez reduktazę HMG-CoA. Insulina odgrywa dominującą rotę w porównaniu z glukagonem.

WIELE CZYNNIKÓW WPŁYWA NA RÓWNOWAGĘ CHOLESTEROLU W TKANKACH Na poziomie tkanki rozwaŜa się następujące procesy jako stanowiące o równowadze cholesterolu komórkowego {ryc. 28-5). Zwiększenie stęŜenia cholesterolu w komórkach moŜe być spowodowane: 1) pobieraniem przez receptory, np. za pośrednictwem receptora LDL, lipoprotein zawierających cholesterol, 2) pobieraniem przez komórkę lipoprotein zawierających cholesterol bez pośrednictwa receptorów, 3) wychwytywaniem przez błonę komórkową wolnego cholesterolu z lipoprotein bogatych w cholesterol, 4) syntezą cholesterolu oraz 5) hydrolizą estrów cholesterolu przez enzym esteraze cholesterolową.

Zmniejszenie zawartości cholesterolu w komórkach moŜe być spowodowane: 1) wypły-

wem cholesterolu z błon komórkowych do lipoprotein o małym potencjale cholesterolowym, zwłaszcza do HDLj albo do cząstek HDL świeŜo syntetyzowanych de novo (proces ten jest pobudzany przez LCAT-acylotransferazę lecytyna: cholesterol), 2) estryfikacją cholesterolu przez ACAT (acylotransferazę acylo-CoA:cholesterol) oraz 3) zuŜywaniem cholesterolu do syntezy innych steroidów, takich jak hormony lub kwasy Ŝółciowe w wątrobie. Receptor LDL jest intensywnie regulowany Receptory LDL (apo B-100, E) znajdują się na powierzchni komórek we wgłębieniach, które są pokryte od strony cytozolowej błony komórkowej białkiem zwanym klatryną. Receptor jest glikoproteiną przezbłonową, a jej miejsce wiąŜące apo B-100 jest umiejscowione na N-koricu wystającym na zewnątrz komórki.

320 / ROZDZIAŁ 28 BŁONA KOMÓRKOWA

Ftewptcty U3L (Apo-B-100, E) w opfaszczortym zagłębieniu

LDL

HDL Ryc. 28-5. Czynniki wpływające na równowagę cholesterolu na poziomie komórki. C — cholesterol, CE — estry cholesterolu, ACAT — acylotransferaza acylo-CoA : cholesterol, LCAT — acytotransferaza lecytyna : cholesterol, A-l — apolipoproteina A-l, LDL — lipoproteina o małej gęstości, VLDL — lipoproteina o bardzo małej gęstości.

Receptor reaguje z ligandem LDL, tj. apo-B-100. Cząstka LDL w całości jest wchłaniana przez endocytozę. Jest ona następnie rozkładana w Jizosomach, który to rozkład obejmuje zarówno hydrolizę apoproteiny, jak i estrów cholesterolu. Cholesterol jest następnie przemieszczany do cytozolu komórki. Receptory nie są rozkładane, lecz wracają na powierzchnię komórki. Ten napływ cholesterolu do komórki hamuje aktywność reduktazy HMG-CoA i syntezę cholesterolu oraz pobudza aktywność ACAT. Wydaje się, Ŝe liczba receptorów LDL na powierzchni komórki jest regulowana zgodnie z zapotrzebowaniem komórki na cholesterol niezbędny do budowy błon i syntezy hormonów steroidowych. Napływ cholesterolu do komórki zmniejsza więc liczbę receptorów LDL — zjawisko nazywane po angielsku „down reguiation" (ryc. 28-5).

Receptor apo B-100, E jest receptorem LDL o „duŜym powinowactwie" i moŜe być wysycony w większości zaistniałych warunków. Poza tym wydają się istnieć receptory LDL o „małym powinowactwie", jak równieŜ szlak wnikania cholesterolu do komórki za pomocą mechanizmu niereceptorowego, określany jako „szlak oczyszczający" („scavenger pathway"), który nie jest regulowany.

TRANSPORT CHOLESTEROLU MIĘDZY TKANKAMI ODBYWA SIĘ ZA POŚREDNICTWEM LIPOPROTEIN OSOCZA (p. ryc. 28-6) U ludzi stęŜenie całkowitego 'Cholesterolu w osoczu wynosi ok. 5,2 mmo[/l; zwiększa się ono z wiekiem, wykazując duŜą zmienność

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 321

osobniczą. Większość cholesterolu znajduje się w osoczu w posUici ^estryfikowanej. Cholesterol jest transportowany i]ni
trzeba kilku tygodni, aby osiągnął stan równowagi z cholesterolem tkanek. Obrót cholesterolu w wątrobie jest stosunkowo szybki w porównaniu z biologicznym okresem półtrwania cholesterolu w całym organizmie człowieka, który wynosi kilka tygodni. Wolny cholesterol w osoczu i w wątrobie osiąga stan równowagi w ciągu godzin. Estry cholesterolu zawarte w poŜywieniu są hydrolizowane do wolnego cholesterolu, który

KRĄśENIE JELIT OWO-WĄTROBOWE ZYLA WROTNA WĄTROBY

PoŜywlente (0,5 g/24 h) C

? JELITO

t

i

C Kwasy (0,5 g/24 h) Ŝółciowo (0^ g/Z4 h) Kat

Hyc. 28-6. Transport cholesterolu między tkankami u ludzi, C — wolny cholesterol, CE — estry cholesterolu, VLDL — lipoproteiną o bardzo malej gęstości, I DL— lipoproteiną o pośredniej gęstości, LDL — lipoproteiną o malej gęstości, HDL — lipoproteiną o dueej gęstości, ACAT — acylotransferaza acylo-CoA : cholesterol, LCAT ...acy I otrą n sfera za lecytyna : cholesterol, A-l — apotipoproteina A-l, D — apolipoproteina D, LPL — lipaza lipoproteinowa. ____________ Biochemia

322 / ROZDZIAŁ 28

miesza się z wolnym cholesterolem z poŜywienia i cholesterolem Ŝółci, zanim wchłonie się z jelita razem z innymi lipidami. Następnie miesza sie z cholesterolem syntetyzowanym w jelitach i zostaje wbudowany do chylornikronów. Z wchłoniętego w jelitach cholesterolu 80—90% zostaje zestryfikowane z dhigołańc uch owymi kwasami tłuszczowymi w błonie śluzowej jelit. Sterole roślinne (sitosterole) słabo wchłaniają się w przewodzie pokarmowym. Gdy chylomikrony reagują z lipazą lipoprofeinową i powstają resztkowe chylomikrohy, wówczas następuje utrata jedynie ok. 5% estrów cholesterolu. Reszta jest wychwytywana przez wątrobę, gdy resztkowe chyloralkrony reagują- iieceptorem -flEŚLJL—i_ hydrolizowana do wolnego cholesterolu, VLDL powstałe w watro biejr^nśpg rtiuą cholesterol rtn osonzn If-rlna'lc7e u 1iiH?i jpst to głównie wolny cholesterol, gdyŜ aktywność ACAT w wątrobie jest mała. Lstry cholesterolu zawarte w VLDL pochodzą głównie z działania LCAT w osoczu. Większość cholesterolu zawartego w VLDL pozostaje w resztkowych VLD L. które są wychwytywane przez wątrobę albo przetwarzane do LDL. Te ostatnie z kolei wiąŜą się z receptorami LDL wątroby i tkanek po/awątrobowych. LCAT jest odpowiedzialna za powstawanie większości estrów cholesterolu osocza U ludzi aktywność LCAT osocza jest odpowiedzialna praktycznie za obecność wszystkich estrów cholesterolu w osoczu. (Tak nie jest u innych gatunków, takich jak szczur, w którego wątrobie jest znaczna aktywność ACAT, pozwalająca na znaczny eksport estrów cholesterolu w VLDL syntetyzowanych de novo). Aktywność LCAT jest związana z typem HDL zawierającym apo A-L Gdy cholesterol zawarty w HDL zostaje zestryfikowany, wytwarza się gradient stęŜenia wciągający wolny cholesterol z tkanek i z innych lipoprotein do cząstek HDL (ryc. 28-6). W wyniku tych procesów gęstość właściwa HDL się zmniejsza, tworząc tzw. HDL,, o której się sadzi „..Ŝe dostarcza cFolesterolu do wątroby__(ryc- 28-6). HDL spełnia więc waŜną funkcję w odwróconym transporcie cholesterolu, tj. procesie, przez który cholesterol tkanek jest przemieszczany do wątroby.

Białko przenoszące estry cholesterolu ułatwia przenoszenie estrów cholesterolu między lipoproteinami To białko, znajdywane w osoczu ludzi, lecz nie u szczurów, jest takŜe związane HDL i wydaje się być identyczne z apo D. Ułatwia ono przenoszenie estrów cholesterolu z HDL do VLDL, LDL, a w mniejszym stopniu do chylomikronów w wymianie za triacyloghcerol. Znosi ono w ten sposób hamowanie w obrębie HDL aktywności LCAT produktem reakcji katalizowanej przez ten enzym. U ludzi duŜa ilość estrów cholesterolu, utworzonych działaniem LCAT w HDL, trafia do wątroby poprzez resztkowe VLDL (IDL) albo LDL (p. ryc. 28-6). CHOLESTEROL, PRZEZNACZONY DO WYDALENIA Z ORGANIZMU, MUSI WEJŚĆ DO WĄTROBY I BYĆ WYDALONY Z śÓŁCIĄ ALBO JAKO CHOLESTEROL, ALBO JAKO KWASY śÓŁCIOWE (ICH SOLE) W ciągu jednego dnia z organizmu wydala się ok. 1 g cholesterolu. Prawie połowa, po przekształceniu w kwasy Ŝółciowe, wydala się z kałem. Pozostała ilość jest wydalana w postaci obojętnych steroidów. Znaczna część cholesterolu wydalana z Ŝółcią ponownie wchłania się w jelitach. UwaŜa się, Ŝe przynajmniej pewna ilość cholesterolu, który jest prekursorem steroli występujących w kale, pochodzi z błony śluzowej jelita. Koprostanol jest głównym sterolem w kale. Jest on wytwarzany z cholesterolu w dolnych odcinkach jelita pod wpływem działania miejscowej flory bakteryjnej. DuŜa część wydalanych z Ŝółcią soli kwasów Ŝółciowych jest reabsorbowana do krąŜenia wrotnego, a następnie wychwytywana przez wątrobę i ponownie wydalana z Ŝółcią. Zjawisko to jest znane jako krąŜenie jelito wo-wątro bo we. Sole_kw_asów Ŝółciowych lub ich pochodne, które nie zostały wchłonięte w jelitach, są wydalane z kałem. Sole kwasów Ŝółciowych ulegają przemianom pod wpływem bakterii jelitowych, tworząc wtórne kwasy Ŝółciowe. Kwasy Ŝółciowe są wytwarzane z cholesterolu Pierwotne kwasy Ŝółciowe są „syntetyzowane w wątrobie z cholesterolu w kilku etapach pośrednich. Kwas cholowy jest kwasem Ŝółcio-

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 323

NADPH + H

ł

NADP*

e

Cholesterol

}7gHYDROKS Witamina C

Kwas gllkocholowy

śółciowe

OH 7cc- Hyd ro Ksyc h o I estero I

,I+

|12i-HYDROKSY-| I LA7A Oj

NADPH + H

+

2 CoA-SH

Kwas taurocholowy (pbrwotny kwas iótelowy) Kwas lauroi glikochenodeoksycholowy (pierwotne kwasy ióteiowe}

Cholollo-CoA

j^N^N, COOH

rrj

Oekonrugscja 7odehycfrokaylacja

Kwas deoksycholowy (wlórny kwas Ŝófolowy) (pierwotny kwas Ŝółciowy) Dekonlugacja -------------------» 7«-de hyd ro ksylacja

HO

j-^Y]

COO

Kwas lltocholowy (wtOrny kwas śółciowy)

Rye. 28-7. Biosynteza i degradacja kwasów Ŝółciowych. 'Katalizowane przez enzymy bakteryjne.

wym występującym w Ŝółci w największej ilości. Zarówno kwas cholowy, jak i chenodeoksycholowy powstają ze wspólnego prekursora, który sam pochodzi z cholesterolu (ryc. 28-7). 7a-Hydroksylacja cholesterolu jest pierwszą reakcją w szlaku biosyntezy kwasów Ŝółciowych i to właśnie ta reakcja jest etapem ograniczającym nasilenie całego szlaku. Reakcja ta jest

katalizowana przez 7<x-hydroksylazc, która jest enzymem mikrosomalnym. Wymaga ona udziału tlenu, NADPH i cytochromu P-450. Enzym ten wydaje się być typową monooksygenazą, podobnie jak i enzymy dalszych etapów hydroksylacyjnych. Niedobór witaminy C zaburza tworzenie kwasów Ŝółciowych na etapie 7ot-hydroksyłacji, prowadzi do spichrzania choie-

324 / ROZDZIAŁ 28

sterolu i miaŜdŜycy naczyń u świnek morskich chorych na gnilec. Szlak biosyntezy kwasów Ŝółciowych rozgałęzia się we wczesnych stadiach i jedna droga prowadzi do kwasu cholowego, charakteryzującego się obecnością dodatkowej grupy a-OH w pozycji 12, druga zaś do kwasu chenodeoksycholowego. Poza tą róŜnicą, w obydwóch szlakach zachodzą podobne reakcje hydroksylacji i skracania łańcucha bocznego (ryc. 28-7), tak Ŝe powstają typowe struktury kwasów Ŝółcio wyc h z gr up a mi a - O H w p o z ycj a c h 3 i 7 i z całkowicie wysyconym pierścieniem steroid owym. Kwasy Ŝółciowe przechodzą do Ŝółci jako połączenia z glicyną lub z tauryną. UwaŜa się, Ŝe nowo syntetyzowane kwasy Ŝółciowe w komórce wątrobowej występują jako tioestry CoA, tj, jako choloilo-CoA albo chenodeoksycholoilo-CoA (ryc. 28-7). Pochodne CoA powstają przy udziale enzymu aktywującego występującego w mikrosomach wątroby. Inny enzym katalizuje połączenie odpowiednich pochodnych CoA z glicyną lub z tauryną, tworząc kwasy glikocholowy lub glikochenodeoksycholowy oraz taurocholowy lub taurochenodeoksycholowy. Są to tzw. pierwotne kwasy Ŝółciowe. U ludzi stosunek glicyny do tauryny w tych połączeniach wynosi normalnie 3:1. PoniewaŜ Ŝółć zawiera znaczne ilości jonów sodowych i potasowych, a jej pH jest zasadowe, naleŜy przyjąć, Ŝe kwasy Ŝółciowe i ich połączenia występują w postaci soli, diatego niekiedy jest uŜywany termin „sole kwasów Ŝółciowych". Pewna część pierwotnych kwasów Ŝółciowych moŜe podlegać dalszym przemianom w jelicie, dzięki aktywności bakterii jelitowych. Te przemiany mogą obejmować od szczepienie przyłączonej uprzednio glicyny i tauryny oraz grupy 7a-OH. W ten sposób powstają wtórne kwasy Ŝółciowe, kwas deoksycholowy z kwasu cholowego i litocholowy z kwasu chenodeoksycholowego (ryc. 28-7). Prawie wszystkie kwasy Ŝółciowe powracają do wątroby w krąŜeniu jelito wo- wątrobowym ChociaŜ produkty trawienia tłuszczu, łącznie z cholesterolem, zostają wchłonięte w początkowych 100 cm jelita cienkiego, pierwotne i wtórne kwasy Ŝółciowe są wchłaniane wyłącznie w jelicie krętym. W krąŜeniu wrotnym wraca do wątroby ok. 98—99% kwasów Ŝółciowych wydzielonych do światła jelita. Zjawisko to jest

znane jako krąŜenie jelitowo-wątrobowe. JedriafcŜe kwas-łitochołowy, ze względu na jego nierozpuszczałność, nie wchłania się zwrotnie w znaczniejszych ilościach. Niewielka część soli kwasów Ŝółciowych, moŜe tak niewiele jak 500 mg/24 h, unika wchłaniania zwrotnego i jest eliminowana z kałem. Jakkolwiek jest to niewielka ilość, to jednak jest to główna droga eliminacji cholesterolu. KrąŜenie jelitowo-wątrobowe kwasów Ŝółciowych jest tak wydajne, Ŝe kaŜdego dnia stosunkowo mała pula kwasów Ŝółciowych (ok. 3—5 g) moŜe cyklicznie przejść przez jelito 6—10 razy z niewielką tylko ich utratą w kale, wynoszącą nie więcej niŜ 1—2% ilości, która przeszła przez krąŜenie jelitowo-wątrobowe. Jednak kaŜdego dnia taka sama ilość kwasów Ŝółciowych, Jaka została utracona z kałem, jest syntetyzowana w wątrobie

z cholesterolu, tak Ŝe wielkość puli kwasów Ŝółciowych jest stała, nad czym czuwa układ kontrojny oparty na sprzęŜeniu zwrotnym. Synteza kwasów Ŝółciowych jest regulowana na etapie 7tx-hydroksylazy Głównym etapem ograniczającym szybkość biosyntezy kwasów Ŝółciowych jest reakcja katalizowana przez 7a-hydroksylaze, a w biosyn-

tezie cholesterolu jest to etap katalizowany przez reduktaze HMG-CoA (ryc. 28-1). Aktywności tych 2 enzymów często ulegają równoległym zmianom, co sprawia, Ŝe trudno stwierdzić, czy hamowanie syntezy kwasów Ŝółciowych ma miejsce pierwotnie na etapie działania reduktazy HMG-CoA, czy na etapie reakcji 7ot-hydroksylazy. Obydwa enzymy ulegają takim samym okołodobowym zmianom aktywności, jednak pobudzający wpływ karmienia cholesterolem na aktywność 7a-hydroksylazy wydaje się być raczej reakcją na samą aktywność enzymu niŜ wynikiem zwiększonej dostępności substratu. Kwasy Ŝółciowe z pewnością wywierają zwrotny wpływ hamujący na aktywność 7a-hydroksylazy, ale mechanizm tego hamowania nie wydaje się być bezpośrednim działaniem alłosterycznym. Pod tym względem powrót kwasów Ŝółciowych do wątroby, przez krąŜenie jelitowo-wątrobowe, stanowi waŜny czynnik kontroli, który, jeśli zostaje przerwany, prowadzi do aktywacji 7a-hydroksylazy. Niedawne badania wykazały, Ŝe 7a-hydroksylaza (jak równieŜ reduktaza HMG-CoA) moŜe być regulowana przez kowalencyjną fosforylację i defosforylację. W odróŜnieniu od reduktazy HMG-CoA, postać ufosforylowana 7cc-hydroksylazy jest bardziej aktywna.

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 32S

Hipercholesterolemię moŜna leczyć przez przerwanie krąŜenia jelitowo- wątrobowego kwasów Ŝółciowych Znaczne zmniejszenie stęŜenia cholesterolu osocza moŜna osiągnąć za pomocą Ŝywicy cholestyraminy (Questran) lub chirurgicznie przez wyłączenie jelita krętego. Obydwa sposoby powodują zablokowanie wchłaniania zwrotnego kwasów Ŝółciowych. Wówczas, w wyniku zniesienia hamowania zwrotnego, wywieranego przez kwasy Ŝółciowe, przemiana cholesterolu w kwasy Ŝółciowe znacznie się zwiększa w dąŜeniu do utrzymania stałej puli kwasów Ŝółciowych. W następstwie tego zwiększa się liczba receptorów LDL w wątrobie, powodując wzmoŜone wychwytywanie LDL przez hepatocyty i w konsekwencji zmniejszenie stęŜenia cholesterolu w osoczu. StęŜenie cholesterolu w surowicy jest skorelowane z częstością występowania miaŜdŜycy tętnic i z chorobą niedokrwienną serca Spośród lipidów surowicy najczęściej wskazywano na cholesterol jako najbardziej zaangaŜowany w tę zaleŜność. JednakŜe i inne parametry, takie jak stęŜenie triacylogliceroli w surowicy, wykazują podobne koreiacjevChorzy 2 chorobą tętnic mogą mieć jedną z następujących nieprawidłowości: 1) zwiększone stęŜenia VLDL przy prawidłowych stęŜeniach LDL, 2) zwiększone stęŜenie LDL przy prawidłowych stęŜeniach VLDL, 3) zwiększenie stęŜeń obydwu frakcji lipoprotein. Występuje wównieŜ odwrotna zaleŜność między stęŜeniami HDL (HDL2) a chorobą niedokrwienną serca. Niektórzy badacze uwaŜają, Ŝe progn o stycznie najbardziej znaczący jest stosunek cholesterol LDL : HDL. Tę zaleŜność moŜna wyjaśnić, biorąc pod uwagę proponowane role frakcji LDL w transporcie cholesterolu do tkanek, a frakcji HDL, działającej jako czyściciel cholesterolu, w odwrotnym kierunku (w transporcie cholesterolu z tkanek do wątroby). MiaŜdŜyca naczyń charakteryzuje się odkładaniem cholesterolu i estrów cholesterolu z lipoprotein zawierających apo B-100, w tkance łącznej ścian naczyń tętniczych. Chorobom, w których występują długotrwałe zwiększenia stęŜenia VLDL, 1DL lub LDL we krwi (np. cukrzycy, nerczycy lipidowej, hipotyreozie i innych stanach przebiegających z hiperlipidemią), towarzyszy zwykle przedwczesna lub cięŜsza miaŜdŜyca.

Jak wykazują badania doświadczalne, podatność na rozwój miaŜdŜycy zaleŜy od gatunku zwierząt. Króliki, świnia, małpa i człowiek są gatunkami, u których miaŜdŜycę moŜna wywołać karmieniem cholesterolem. Szczur, pies i kot są pod tym względem odporne. Tyroidektomia lub podawanie leków pochodnych tiouracylu umoŜliwia wywołanie miaŜdŜycy u psa i szczura. Małe stęŜenie cholesterolu we krwi jest charakterystyczne dla nadczynności tarczycy. Zmiany w składzie diety odgrywają waŜną rolę w zmniejszaniu stęŜenia cholesterolu w surowicy Czynniki dziedziczne mają największy wpływ na stęŜenie cholesterolu we krwi. Z czynników środowiskowych i pokarmowych, które powodują zmniejszenie stęŜenia cholesterolu we krwi, najkorzystniejszym czynnikiem jest zastąpienie w diecie pewnej ilości nasyconych kwasów tłuszczowych wielontenasyconynii i mononienasyconymi kwasami tłuszczowymi. Naturalnie występujące oleje, które zawierają wielonienasycone kwasy tłuszczowe w duŜych ilościach, to olej słonecznikowy, z nasion bawełny, kukurydzy i soi, zaś olej z oliwek zawiera znaczne ilości mononienasyconych kwasów tłuszczowych. W odróŜnieniu od wymienionych olejów, masło, tłuszcz wołowy i olej kokosowy zawierają duŜe ilości nasyconych kwasów tłuszczowych. Sacharoza i fruktoza mają większy wpływ na zwiększenie stęŜenia lipidów we krwi, zwłaszcza triacylogliceroli, niŜ inne węglowodany. Przyczyna, dla której wielonienasycone kwasy tłuszczowe powodują zmniejszenie stęŜenia cholesterolu wciąŜ nie jest jasna. Wysunięto wiele hipotez w celu wyjaśnienia tego zjawiska, min, przypuszcza się, Ŝe pobudzają one wydalanie cholesterolu do jelita i pobudzają utlenianie choiesteroJu do kwasów Ŝółciowych. Jest całkiem moŜliwe, Ŝe estry cholesterolu z wielontenasyconymi kwasami tłuszczowymi są szybciej metabolizowane przez wątrobę i inne tkanki, co mogłoby zwiększać szybkość ich obrotu i wydalania. Inne dane świadczą o tym, Ŝe działanie to jest głównie spowodowane przemieszczaniem cholesterolu z osocza do tkanek, poniewaŜ wielonienasycone i mononienasycone kwasy tłuszczowe zwiększają liczbę receptorów LDL, przez co zwiększają szybkość katabolizmu LDL, natomiast nasycone kwasy tłuszczowe mają odwrotne działanie na liczbę receptorów LDL. Nasycone kwasy tłuszczowe powodują takŜe powstawanie mniejszych cząstek

326 / ROZDZIAŁ 28

VLDL, które zawierają stosunkowo więcej cholesterolu i są zuŜywane przez tkanki pozawątrobowe z mniejszą szybkością niŜ większe cząstki. Takie zmiany mogą sprzyjać aterogenezie. Styl Ŝycia wpływa na stęŜenie cholesterolu w surowicy Wśród innych czynników, o których się sądzi, Ŝe uczestniczą w powstawaniu choroby niedokrwiennej serca naleŜy wymienić nadciśnienie tętnicze, palenie tytoniu, otyłość, brak ruchu i picie miękkiej wody, a nie twardej. Zwiększenie stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych osocza, pobudzające wydzielanie VLDL przez wątrobę do krwi, jest kolejnym czynnikiem zwiększającym stęŜenie triacylogliceroli i cholesterolu w osoczu. Czynnikami prowadzącymi do większych albo zmieniających się stęŜeń wolnych kwasów tłuszczowych są m.in. stres emocjonalny, nikotyna pochodząca z palenia papierosów, picie kawy i spoŜywanie kilku duŜych posiłków zamiast częstego przyjmowania małych ilości pokarmów. Kobiety w okresie premenopauzalnym wydają się być chronione przed wieloma tymi szkodliwymi czynnikami być moŜe dlatego, Ŝe mają one większe stęŜenie HDL niŜ męŜczyźni i kobiety w okresie pomenopauzalnym. Kiedy dieta zawodzi moŜna stosować leki hipolipemizujące, które zmniejszą stęŜenie cholesterolu w surowicy O wielu lekach wiadomo, Ŝe blokują tworzenie cholesterolu na róŜnych etapach szlaku jego biosyntezy. Wiele z tych leków ma działanie szkodliwe, ale pochodzące z grzybów inhibitory reduktazy HMG-CoA mewastattn i lowastatin zmniejszają stęŜenie cholesterolu LDL, powodując niewiele działań niepoŜądanych. Sitosterol jest czynnikiem zmniejszającym stęŜenie cholesterolu, działającym przez blokowanie wchłaniania cholesterolu z przewodu pokarmowego. śywice, takie jak kolestypol i cholestyramina (Questran), zapobiegają wchłanianiu soli kwasów Ŝółciowych, łącząc się z nimi, przez co zwiększają ich utratę z kałem. Hipolipemizujące działanie klofi bratu i gemfibrozylu polega m.in. na pobudzeniu utleniania napływających do wątroby wolnych kwasów tłuszczowych, a nie na ich estryfikacji, przez co zmniejsza się wydzielanie przez wątrobę VLDL zawierających triacyloglicerol i cholesterol. Ppnadto wymienione leki ułatwiają hydrolizę triacylogliceroli VLDL przez lipazę lipoproteinową. Probucol wydaje się

zwiększać katabolizm LDL w sposób niezaleŜny od receptorów. Kwas nikotynowy zmniejsza napływ do krwi i wątroby WKT, dzięki temu, Ŝe hamuje lipolizę w tkance tłuszczowej, a tym samym wytwarzanie VLDL w wątrobie. Pierwotne zaburzenia lipoprotein osocza (dyslipoproteinemie) są dziedziczne Pewna liczba osób ma wrodzone wady przemiany lipoprotein, prowadzące do stanu hipolipoproteinemii albo hiperlipoproteinemii. Wiele innych osób z takimi chorobami, jak cukrzyca, niedoczynność tarczycy i miaŜdŜyca, ma nieprawidłowe profile lipoprotein o we osocza, które są bardzo podobne do występujących w pierwotnych wrodzonych wadach przemiany lipoprotein. Praktycznie kaŜde z tych pierwotnych zaburzeń jest spowodowane wadą na którymś z etapów tworzenia, transportu albo rozkładania lipoprotein (p. ryc. 27-4, 28-5 i 28-6). Nie wszystkie te zaburzenia są szkodliwe. A. Hipolipoprotsinemie

1. Abetalipoproteinemia. Jest to readka choroba wrodzona charakteryzująca się bra kiem (J-lipoprotein (LDL) w osoczu. Lipidy we krwi występują w bardzo małych stęŜeniach — zwłaszcza acyloglicerole, których praktycz nie nie ma, poniewaŜ nie są syntetyzowane chylomikrony ani VLDL. W tej wadzie dochodzi do spichrzania acyloglicerolu zarówno w ścia nach jelit, jak i w wątrobie. Abetalipoproteine mia jest spowodowana wadą syntezy apolipoproteiny B. 2. Rodzinna hipobetalipoproteinemia. W hipobetalipoproteinemii stęŜenie LDL wy nosi 10—50% stęŜenia prawidłowego, ale two rzenie chylomikronów zachodzi. NaleŜy więc sądzić, Ŝe apo-B jest istotna dla transportu triacylogliceroli. Większość osób z tą wadą jest klinicznie zdrowa i cieszy się długim Ŝyciem. 3. Rodzinny niedobór -/-lipoprotein (choroba wyspy Tangier). U osób homozygotycznych prawie nie ma w osoczu HDL, zaś w tkankach stwierdza się nagromadzenie estrów cholesterolu. Nie ma zaburzenia w tworzeniu chylomikronów, ani wydzielaniu VLDL przez wątrobę. Jednak w obrazie elektro foretycznym nie ma pre-pMipoprotein, ale zamiast tego stwie rdza się szerokie pasmo fi, zawierające endogen ny triacyloglicerol. Dzieje się tak dlatego, Ŝe prawidłowe pasmo pre-p zawiera inne apoJipoproteiny normalnie dostarczane przez HDL.

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 327

U chorych występuje skłonność do rozwinięcia się hipertriacylogiicerolemii, spowodowanej brakiem apo-C-II, która normalnie aktywuje lipaze li po pro lei nową. B. Hiperlipoproteinemie

1. Rodzinny niedobór Hpazy lipoprotetnowej (typ < ) ■ Ten stan charakteryzuje się bardzo powolnym klirensem chylomikronów z krąŜenia, prowadzącym do nienormalnie du Ŝych stęŜeń chylomikronów w osoczu. MoŜe być takŜe zwiększone stęŜenie VLDL, nato miast zmniejszone LDL i HDL. Ten stan jest indukowany spoŜywaniem tłuszczów. MoŜna go skorygować przez zmniejszenie w diecie ilości tłuszczów, a zwiększenie ilości złoŜo nych węglowodanów. Pewna odmiana tej cho roby jest spowodowana niedoborem apo-C-II, potrzebnej jako kofaktor lipazy lipoproteinowej. 2. Rodzinna hipercholesterolemia (typ II) . Chorzy charakteryzują się hiperbetalipoproteinemią (LDL), która jest przyczyną zwiększonego stęŜenia całkowitego cholestero lu. MoŜe takŜe wystąpić tendencja do zwięk szenia stęŜenia VLDL (w typie Ilb). U chorych moŜe wystąpić nieco zwiększone stęŜenie triacyloglkerolu, chociaŜ osocze — w odróŜnieniu od innych typów hiperlipoproteinemii — pozostaje przejrzyste (klarowne). Powszechnym zjawis kiem jest odkładanie się lipidów w tkankach, np. w postaci Ŝółtaków (xanthoma) lub ognisk miaŜdŜycowych (atheroma). Typ II hiperlipo proteinemii moŜe takŜe powstać jako zjawisko wtórne u chorych z niedoczynnością tarczycy. Choroba jest spowodowana zmniejszonym kli rensem LDL z krąŜenia uwarunkowanym wad liwymi receptorami LDL. Wada ta jest związana ze zwiększeniem częstości występowania miaŜ dŜycy. W leczeniu moŜe być przydatne zmniej szenie podaŜy cholesterolu i nasyconych kwa sów tłuszczowych. Inną chorobą wywołującą hipercholesterolemię, ale spowodowaną inną przyczyną, jest choroba Wolmana (choroba spichrzania estrów cholesterolu). Jest ona spowo dowana niedoborem hydrolazy estrów chole sterolu w lizosomach takich komórek, jak fibroblasty, które normalnie metabolizują LDL. 3. Rodzinna hiperlipoproteinemia ty pu III (choroba szerokiego pasma p, choroba upośledzonego usuwania re mnantów, rodzinna dysbetaltpoproteinemia) Ten stan charakteryzuje się za równo zwiększeniem stęŜenia resztkowych chylomikronów, jak i remnantów VLDL; są to

lipoproteiny o gęstości mniejszej niŜ 1,019, a charakteryzujące się w elektroforogramie jako szerokie pasmo p (p-VLDL). Powodują one hipercholesterolemię i hipertriacyloglicerolemię. Występują Ŝóltaki (xanthoma) i miaŜdŜyca zarówno tętnic obwodowych, jak i tętnic wieńcowych. Zalecane jest leczenie, polegające na redukcji masy dała i stosowaniu diety zawierającej złoŜone węglowodany, nienasycone kwasy tłuszczowe oraz mało cholesterolu. Choroba jest spowodowana wadliwym metabolizmem remnantów w wątrobie, uwarunkowanym obecnością nieprawidłowych apo £, które zwykle występują w 3 izoformach: E2, E3 i E4. U chorych z typem III hiperlipoproteinemii występuje tylko forma E2t która nie reaguje z receptorem E. 4. Rodzinna hipertriacyloglioerolemia (typ IV). Ten stan charakteryzuje się duŜymi stęŜeniami endogennie wytwarzanych triacylogliceroli (VLDL). U chorych z tą wadą stęŜenie cholesterolu zwiększa się proporcjonalnie do hipertriacyloglicerolemii. Często występuje nie tolerancja glukozy. Zarówno LDL, jak HDL występują w stęŜeniach poniŜej normy. Ten pro fil lipoproteinowy często jest powiązany z wy stępowaniem choroby niedokrwiennej serca, insulinoniezaleŜnej cukrzycy typu II, otyłości oraz wielu innych stanów, łącznie z alkoholizmem oraz przyjmowaniem gestagenów. Leczenie pier wotnej hiperiipoproteinemii typu IV polega na redukcji masy ciała, zastąpieniu prostych węg lowodanów w diecie węglowodanami złoŜonymi, spoŜywaniu pokarmów zawierających nienasy cone tłuszcze i mało cholesterolu, a takŜe na stosowaniu leków hipolipemizujących. 5. Rodzinna hiperlipoproteinemm ty pu V. Profil lipoproteinowy osocza jest złoŜo ny, gdyŜ występuje zarówno zwiększone stęŜe nie chylomikronów, jak i VLDL, co powoduje zarówno hipertriacyloglicerolemię, jak i hiper cholesterolemię. StęŜenia LDL i HDL są małe. śółtaki są częste, ale występowanie miaŜdŜycy nie jest uderzająco częste. Tolerancja glukozy jest zmniejszona i często związana z występowa niem otyłości i cukrzycy. Przyczyna występowa nia tego stanu, który ma charakter rodzinny, nie jest jasna. Leczenie polega na redukcji masy ciała i stosowaniu w diecie niezbyt duŜej ilości węglowodanów i tłuszczów. Sugerowano, Ŝe dalszą przyczyną hiperlipoproteinemii jest nadmierne wytwarzanie apo B, co moŜe być przyczyną zwiększonego stęŜenia VLDL i LDL w osoczu.

328 / ROZDZIAŁ 28

6. Rodzinna hiperalfalipoproteinemia. Jest to rzadki stan związany ze zwiększonym stęŜeniem HDL, okazujący się być dobroczynny dla zdrowia.

C. Rodzinny niedobór acylotransf erazy lecytyna: cholesterol (LCAT). U osób z tą wadą stęŜenie estrów cholesterolu i Hzolecytyny jest małe, natomiast cholesterolu i lecytyny zwiększone. Osocze często jest mętne. Nieprawidłowości występują takie w lipoproteinach. Jedna z frakcji HDL zawiera dyskowate struktury ułoŜone w stosy lub rulony, które są najwidoczniej świeŜo powstałymi HDL niezdolnymi do pobrania cholesterolu ze względu na nieobecność LCAT. Występuje takŜe nieprawidłowa subfrakcja LDL, lipoproteina X, skądinąd znajdywana jedynie u chorych z cholestazą. VLDL są takŜe nieprawidłowe, wędrujące w elektroforezie z p-lipoproteinami (|3-VLDL). Chorzy z chorobami miąŜszu wątrobowego takŜe wykazują zmniejszenie aktywności LCAT i nieprawidłowości w lipidach surowicy i lipoproteinach.

PIŚMIENNICTWO Bjórkhem I, Akerlund JE: Studies on the link between HMG-CoA reductase and cholesterol 7a-hydroxylase in rat liver, /. Lipid Res 1988;29:136. Brown MS, Goldstein JL: Lipoprotein metabolism in the macrophage: lmplications for cholesterol deposition in atherosclerosis. Annu Rev Biochem 1983;52:223. Fears R, Sabinę JR (editors): Cholesterol 7tt.-Hydroxylase (7v.-Manooxygenase). CRC Press, 1986. Fielding CJ, Fielding PE: Mefabolism of cholesterol and lipoproteins. Page 404 in: Biochemistry of Lipids and Membranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummmgs, 1985. Kane JB, Havel RJ: Treatment of hypercholesterolemia. Annu Rev Med 1986;37:427. Mahley RW, Innerarity TL: Lipoprotein receptors and cholesterol homeostasis. Biockim Biophys Acta 1983;737:197. NIH Publication No 88-2925: Report of the Expert Panel on Detection, Evaltmtian and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults. January, 1988. Rudney H, Sexton RC: Regulation of Cholesterol Biosynthesis, Annu Rev Nutr 1986;6:245.

Integracja metabolizmu i dostarczanie substratów energetycznych do tkanek

29

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Węglowodany i Hpidy spełniają wiele funkcji strukturalnych i metabolicznych. Największy wpływ tych związków na metabolizm i zdrowie polega jednak na tym, Ŝe są głównymi substratami energetycznymi zawartymi w pokarmach. Regulacja dopływu tego źródła energii i sposób, w jaki jest on zintegrowany z innymi tkankowymi substratami energetycznymi, są w centrum zainteresowania badaczy, poniewaŜ wkraczają one w wiele innych procesów metabolicznych i mają związek z chorobami metabolicznymi.

jako wynik zaburzeń równowagi metabolicznej spowodowanej intensywną laktacją {np. charakteryzującą się ketozą u bydła), albo jako wynik zwiększonego zapotrzebowania metabolicznego występującego podczas ciąŜy, a będącego np. przyczyną zatrucia ciąŜowego u owiec. Wszystkie te stany są patologicznymi postaciami zespołu głodzenia, występującego jako powikłanie wielu zespołów klinicznych przebiegających ze zmniejszonym łaknieniem.

NIE WSZYSTKIE Z GŁÓWNYCH SKŁADNIKÓW POKARMOWYCH ULEGAJĄ WZAJEMNYM PRZEKSZTAŁCENIOM (p. ryc. 29-1)

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE W stanie dodatniej równowagi energetycznej znaczna część energii pobranej z pokarmami jest magazynowana jako glikogen albo jako tłuszcze. Jednak w wielu tkankach, nawet w stanie sytości, kwasy tłuszczowe są utleniane preferencyjnie w stosunku do glukozy, co zaznacza się szczególnie w warunkach niedoboru energetycznego lub przy głodzeniu. Ma to na celu zaoszczędzenie glukozy dla tych tkanek (np. dla mózgu i erytrocytów), które potrzebują glukozy w kaŜdych warunkach. Mechanizmy regulacyjne, często za pośrednictwem hormonów, zapewniają więc dostawę źródła energii dla wszystkich tkanek i w kaŜdym czasie, począwszy od stanu sytości aŜ do stanu całkowitego głodu. Załamanie się tych mechanizmów zdarza się jako skutek nierównowagi hormonalnej (np. indukowanej niedoborem insuliny w cukrzycy),

Fakt, Ŝe zwierzęta mogą się stać otłuszczone, gdy karmi sieje dietą o przewadze węglowodanów, wskazuje na łatwość przekształcania węglowodanów w tłuszcze. JednakŜe, jak to juŜ wspomniano, u ludzi istnieją zapewne ograniczone moŜliwości przekształcania glukozy w kwasy tłuszczowe. Najbardziej znaczącą reakcją w tym względzie jest przemiana pirogronianu do acetylo-CoA, poniewaŜ właśnie acetylo-CoA jest materiałem wyjściowym do syntezy długołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Odwrotny proces, tj. przemiana kwasów tłuszczowych w glukozę nie zachodzi, poniewaŜ reakcja katalizowana przez dehydrogeaazę pirogroniaaową jest zasadniczo nieodwracalna, co

zapobiega bezpośredniemu przekształcaniu acetylo-CoA w pirogronian. Ponadto nie moŜe zachodzić przekształcenie (sumarycznie) acetylo-CoA w szczawiooctan, nawet przez cykl

330 / ROZDZIAŁ 29 Tłuszcze

Węglowodany

(

GHkogen v Glukoza /

Trlacylogiieeroi

Seryna

Tryptolan Treonina \ Glioyna Fenyloalanlna Tyrozyna Leucyna^

Hydroksyprollna

Szczaw! ooclan

\

Asparaglnlan Fanyloalanina

Cylrynlan

1

-»- Fu maran

Cykl kwasu cytrynowego

Tyrozyna Izoleucyna

a-Katoglutaran

\ Proplony(o-CoA Sukcyny(o-CoA

t \t Proplonlan

I—

Arginina

Glutami Glutamlnlan

Wallna Węgle m1 -to3 kwasów tłuszczowych o nieparzystej kolbie atomów wf flta

( Ornltyna

Prollna Htstydyna

Metlonlna

\

1 Hydroksyprollna

Ryc. 29-1. I nterkon wersja głównych składników pokarmowych.

cytrynianowy, gdyŜ 1 cząsteczka szczawiooctanu jest niezbędna do kaŜdej reakcji kondensacji z acetylo-CoA, podczas gdy w cyklu regeneruje się tylko 1 cząsteczka szczawiooctanu. Z podobnych powodów nie moŜe zachodzić netto przekształcenie kwasów tłuszczowych o pa-

rzystej liczbie atomów węgla (które wytwarzają acetylo-CoA) w glukozę lub glikogen. jedynie końcowy trójwęglowy fragment kwasu tłuszczowego o nieparzystej liczbie atomów węgla jest glukogenny. Jest nim propionylo-CoA, powstający jako końcowy produkt p-oksydacji

INTEGRACJA METABOLIZMU I DOSTARCZANIE SUBSTRATÓW ENERGETYCZNYCH / 331

tych kwasów. Jest jednak moŜliwe występowanie znakowanych atomów węgla kwasu tłuszczowego w glikogenie po przejściu przez cykl cytrynianowy. Dzieje się tak dlatego, Ŝe szczawiooctan jest związkiem pośrednim zarówno cyklu kwasu cytrynowego, jak i szlaku ghikoneogenezy. Glicerol, będący częścią triacyloglicerolu, moŜe brać udział w tworzeniu glukozy po aktywacji do glicerolo-3-fosforanu. Wiele spośród szkieletów węglowych aminokwasów endogennych moŜe powstać z węglowodanów przez cykl kwasu cytrynowego i transaminację. Przez odwrócenie tych procesów z aminokwasów glikogennych powstają szkielety węglowe, które są albo metabolitami cyklu cytrynianowego, albo ich prekursorami. Są one zatem łatwo przekształcane drogą glukoneogenezy w glukozę i w glikogen. Aminokwasy ketogenne są przemieniane do acetooctanu, który jak i inne ciała ketonowe jest metabolizowany w tkankach pozawątrob owych, tworząc acetylo-CoA. Z tych samych powodów, dla których kwasy tłuszczowe nie mogą być przetwarzane w węglowodany, nie moŜe równieŜ zachodzić przemiana kwasów tłuszczowych do aminokwasów glikogennych. Nie jest równieŜ moŜliwe odwrócenie szlaku rozkładu aminokwasów ketogenhych i innych naleŜących do niezbędnych składników poŜywienia, tzw. aminokwasów egzogennych. Przemiana szkieletów węglowych aminokwasów glikogennych do kwasów tłuszczowych jest moŜliwa albo przez utworzenie pirogronianu i acetylo-CoA, albo przez odwrócenie pozamitochondrialnych reakcji cyklu cytrynianowego od a-ketoglutaranu do cytrynianu, a następnie zadziałanie ATP-zaleŜnej liazy cytrynianowej i wytworzenie acetylo-CoA (p. rozdz. 23), Jednak w większości warunków naturalnych, np. w okresie głodzenia, rozpadowi białek i aminokwasów towarzyszy rozpad tłuszczów. Sumarycznie więc przekształcanie aminokwasów w tłuszcze nie jest procesem ilościowo znaczącym, moŜe z wyjątkiem przypadków, w których zwierzęta są karmione dietą bogatą w białko.

EKONOMIA PRZEMIANY WĘGLOWODANÓW ł LIPIDÓW OBEJMUJE CAŁY ORGANIZM Glukoza jest metaboliczną koniecznością w kaŜdym stanie odŜywienia

Opisano uprzednio wiele szczegółów współzaleŜności między przemianą węglowodanów i tłuszczów w róŜnych tkankach, zwłaszcza łatwe przetwarzanie wielu substancji glukogennych w glukozę i w glikogen przez glukoneogcneze. Glukoneogeneza jest bardzo waŜna, poniewaŜ niektóre tkanki i typy komórek, łącznie z ośrodkowym układem nerwowym i erytrocytami, są znacznie bardziej zaleŜne od ciągłego dostarczania glukozy niŜ inne. Pewien minimalny dopływ glukozy do tkanek pozawątrobowych jest prawdopodobnie niezbędny do utrzymania odpowiednich stęŜeń szczawiooctanu, aby zachować integralność cyklu cytrynianowego. Ponadto glukoza wydaje się być głównym źródłem glicerolo-3-fosforanu w tych tlcankach, które są pozbawione aktywności kinazy glicerolowej. Istnieje zatem pewne minimalne i obligatoryjne utlenianie glukozy w kaŜdych warun-

kach. DuŜe ilości glukozy są takŜe niezbędne do odŜywiania płodu i do syntezy laktozy mleka. Pewne dodatkowe mechanizmy, poza glukoneogeneza, zapewniają dostarczanie glukozy w okresach jej niedoboru. Dzieje się to przez oszczędzanie utleniania glukozy kosztem innych substratów. Preferencyjne zuŜywanie ciał ketonowych i wolnych kwasów tłuszczowych oszczędza glukozę w celu spełnienia przez nią jej istotnych funkcji

Ciała ketonowe i wolne kwasy tłuszczowe powodują oszczędniejsze utlenianie gJukozy w mięśniach, upośledzając: jej wnikanie do komórek, fosforylację do glukozo-6-fosforanu, reakcję katalizowaną przez fosfofruktokinazę i reakcję oksydacyjnej dekarboksylacji pirogronianu. Utlenianie wolnych kwasów tłuszczowych i ciał ketonowych powoduje zwiększenie wewnątrzkomórkowego stęŜenia cytrynianu, który z kolei jest allosterycznym inhibitorem fosfofruktokinazy. Te i inne obserwacje, które wykazały, Ŝe w perfundowanym sercu acetooctan jest utleniany preferencyjnie w stosunku do wolnych kwasów tłuszczowych, uzasadniają wniosek, Ŝe w warunkach niedobo-

332 / ROZDZIAŁ 29

Acyio-CoA

GHcerolo-3-fosforan

//TKANKĄ/ TŁUSZCZOWA

/POZAWATRCIBOWE'//' np. MIĘSIEŃ SESCOWY''

VLDL

łłttłłi

WKT

związki ketonowe

r

■ — «^ i

Acylo-CoA

Glukoza

Gllcerolon3-foeforan

>

2CO3

Glikogen Giukozo-6-fciHtoran Aminokwasy, mleczan

Ryc. 29-2. Metaboliczne zalftŜności między tkanką tłuszczową, wątrobą i tkankami poza wątrobowym i. Zakropkowane przestrzenie przedstawiają obszary działania lipazy lipoproteinowej ściany naczyń włosowatych, WKT — wolne kwasy tłuszczowe, VLDL — Iipoproteiny o bardzo malej gęstości.

INTEGRACJA METABOLIZMU I DOSTARCZANIE SUBSTRATÓW ENERGETYCZNYCH / 333

ru węglowodanów dostępne substraty energetyczne są utleniane w następującej kolejności preferencyjnej: 1) ciała ketonowe (i prawdopodobnie inne krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, np. octan), 2) wolne kwasy tłuszczowe oraz 3) glukoza. Nie oznacza to, Ŝe utlenianie określonego substratu energetycznego całkowicie wyklucza utlenianie jakiegokolwiek innego (ryc. 29-2). Te mechanizmy funkcjonują w sposób bardziej zaznaczony w tych tkankach, które mają znaczną wydolność tlenowej przemiany kwasów tłuszczowych, np. w sercu i we włóknach mięśniowych typu powolnego (czerwonego) niŜ w tkankach z małą wydolnością, np. we włóknach mięśniowych typu szybkiego (białego). Połączenie efektu woinych kwasów tłuszczowych (polegającego na oszczędzaniu zuŜywania glukozy przez serce i mięsień) oraz efektu zaoszczędzonej glukozy (hamowania mobilizacji wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej) nazwano cyklem glukoza-kwasy tłuszczowe.

W CZASIE GŁODZENIA NASTĘPUJE CIĄGŁE DOSTARCZANIE SUBSTRATÓW ENERGETYCZNYCH DLA TKANEK U zwierząt karmionych dietą bogatą w węglowodany jest oszczędzane utlenianie kwasów tłuszczowych. Dzieje się tak dlatego, poniewaŜ jest hamowana lipoliza w tkance tłuszczowej pod wpływem duŜych stęŜeń glukozy i insuliny. Skutkiem tych procesów jest małe stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych (ryc. 29-3). Gdy zwierzę przechodzi ze stanu sytości do stanu głodzenia, wówczas dostępność glukozy z pokarmu się zmniejsza, przez co zostaje uruchomiony glikogen wątroby w celu utrzymania odpowiedniego stęŜenia glukozy we krwi. StęŜenie insuliny we krwi się zmniejsza, natomiast stęŜenie giukagonu się zwiększa. PoniewaŜ zuŜycie glukozy w tkance tłuszczowej zmniejsza się, a działanie insuliny hamujące lipolizę staje się mniejsze, następuje mobilizacja tłuszczów w postaci womych kwasów tłuszczowych i glicerolu. Wolne kwasy tłuszczowe są transportowane do tkanek, gdzie są utleniane ajbo estryfiko-

G utógon osacza

1

"xV/' /\

__

i

c—--N

\\

yf

ć-i ------•£

\ •/ /J

V ? ^-/

Glukoza Krwi

12-24 Godzfny gtodzertta

Ryc. 29-3. Względne zmiany parametrów metabolicznych po rozpoczęciu głodzenia.

334 / ROZDZIAŁ 29

wane. Glicerol, po aktywacji do glicerolo-3-fosforanu, włącza się głównie w wątrobie i w nerkach w pulę węglowodanową. Podczas tej fazy przejściowej od stanu sytości do stanu całkowitego głodzenia, endogenne wytwarzanie glukozy nie nadąŜa za jej zuŜywaniem i utlenianiem, poniewaŜ zapasy glikogenu wątroby zostają wyczerpane. Odzwierciedleniem tych procesów jest zmniejszenie stęŜenia glukozy we krwi oraz mobilizacja tłuszczów, zachodząca z coraz to większą szybkością. Jednak juŜ po kilku godzinach stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych i glukozy stabilizują się na poziomie charakterystycznym dla stanu na czczo (odpowiednio 0,7— 0,8 inmol/1 oraz 3,3—3,9 mmol/1). NaleŜy załoŜyć, Ŝe w tym stadium w całym organizmie zwierzęcia nastąpiło zrównowaŜenie między dostawą glukozy, a zapotrzebowaniem tkanek na jej zuŜytkowanie i utlenianie. Stan taki osiąga się przez zwiększone utlenianie wolnych kwasów tłuszczowych i ciał ketonowych oraz ograniczenie utleniania glukozy do moŜliwego minimum. Ta subtelna równowaga zostaje zaburzona w stanach, w których zapotrzebowanie na glukozę jest zwiększone, lub gdy uŜytkowanie glukozy przez tkanki jest upośledzone. W takich przypadkach dochodzi do dalszej mobilizacji tłuszczów. Dostarczanie węglowodanów przez tkankę tłuszczową w postaci glicerolu jest waŜną funkcją, poniewaŜ jest to jedyne źródło węglowodanów, oprócz glukoneogenezy z białek, w głodującym organizmie dla tych procesów, które muszą zuŜytkowywać glukozę. U człowieka w długotrwałym głodzie zmniejsza się glukoneogeneza z białek wskutek zmniejszonego uwalniania aminokwasów, zwłaszcza alaniny z mięśni. Towarzyszy temu adaptacja mózgu do zastąpienia około polowy utlenianej glukozy utlenianiem ciał ketonowych. Ketoza jest metaboliczną adaptacją do głodzenia Pierwotną funkcją ketogenezy jest usuwanie z wątroby nadmiaru węgli kwasów tłuszczowych w postaci związków, które są łatwo utleniane przez tkanki pozawątrobowe zamiast glukozy. Ketoza jest rezultatem zmniejszonej dostępności węglowodanów. Zwiększenie ketogenezy powoduje (p. ryc. 24-9 i 24-10); 1. Nierównowaga między estryfikacją a lipolizą w tkance tłuszczowej, czego następstwem jest uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych do krąŜenia. Wolne kwasy tłuszczowe są głównym substratem do wytwarzania ciał ketonowych

w wątrobie. Oznacza to, Ŝe wszystkie czynniki metaboliczne i wewnątrzwydzielnicze, wpływające na uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej, wpływają równieŜ na ketogenezę. 2. Podczas wnikania wolnych kwasów tłuszczowych do wątroby równowaga między ich estryfikacją a utlenianiem zaleŜy od palmitoilotransferazy karnitynowej I, której aktywność jest pośrednio zwiększana przez zwiększenie stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych i zwiększenie stosunku [glukagon]: [insulina]. 3. Przy zwiększonym utlenianiu kwasów tłuszczowych większa ich ilość przetwarza się w ciała ketonowe, a mniej tworzy się CO2. Proces ten jest regulowany w taki sposób, Ŝe całkowite wytwarzanie ATP w wątrobie pozostaje stałe. Uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej w stanie głodu moŜe być kontrolowane przez sprzęŜenie zwrotne, polegające na tym, Ŝe ciała ketonowe i woine kwasy tłuszczowe bezpośrednio pobudzają trzustkę do wytwarzania insuliny. W większości przypadków uwalnia się nadmiar wolnych kwasów tłuszczowych w stesunku do zapotrzebowania na ich utlenianie, przez co znaczna ich część jest estryfikowana nawet w czasie głodzenia. PoniewaŜ wątroba wychwytuje i estryfikuje znaczną część kwasów tłuszczowych uwalniających się z tkanki tłuszczowej, moŜna powiedzieć, Ŝe ten narząd odgrywa istotną rolę regulacyjną w usuwaniu nadmiaru wolnych kwasów tłuszczowych z krąŜenia. Gdy podaŜ węglowodanów jest wystarczająca, wówczas większość napływających kwasów tłuszczowych jest estryfikowana w wątrobie i następnie eksportowana z wątroby jako VLDL, które są zuŜytkowywane przez inne tkanki. W przypadku nadmiernego napływu wolnych kwasów tłuszczowych wątroba dysponuje alternatywną drogą ich przemiany, tj. ketogenezą, która pozwala wątrobie kontynuować eksport większości napływających kwasów tłuszczowych w postaci łatwej do zuŜytkowania przez tkanki pozawątrobowe i to w kaŜdym stanie odŜywienia. Większość powyŜszych procesów przedstawiono na ryc. 29-2. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe istnieje cykl węglowodanowy, obejmujący uwalnianie glicerolu z tkanki tłuszczowej i jego przetworzenie w wątrobie do glukozy. Powstała w ten sposób glukoza wraca ponownie do tkanki tłuszczowej, zamykając cykl. Inny cykl, cykl Hpidowy, obejmuje uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych przez tkankę tłuszczową,

INTEGRACJA METABOLIZMU 1 DOSTARCZANIE SUBSTRATOW ENERGETYCZNYCH / 335

ich przetransportowanie do wątroby i estryfikację w tym narządzie oraz powrotny transport powstałych estrów do tkanki tłuszczowej w postaci VLDL. Patologiczna ketoza jest spowodowana zwielokrotnionym działaniem czynników powodujących ketozę głodową Ketoza występująca w głodzie i przy karmieniu tłuszczami jest stosunkowo łagodna, w porównaniu ze stanem spotykanym w niewyrównanej cukrzycy, zatruciu etaŜowym u owiec albo w ketuzie u bydła w okresie laktacji. Główną przyczyną tych stanów jest jeszcze znaczniejsza niedostępność węglowodanów dla tkanek niŜ w łagodnych stanach ketozy. W łagodniejszych postaciach cukrzycy, przy karmieniu tłuszczami i w przewlekłym głodzeniu, glikogen występuje w wątrobie w zmiennych ilościach, natomiast stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych jest mniejsze, co prawdopodobnie jest przyczyny mniej cięŜkiej ketozy występującej w tych stanach. W cukrzycy typu I brak (albo względny brak) insuliny prawdopodobnie wpływa na tkankę tłuszczową bardziej niŜ na jakąkolwiek inną tkankę, z powodu niezwykłej wraŜliwości tej tkanki na ten hormon. Skutkiem tego jest uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych w ilościach powodujących zwiększenie ich stęŜenia w osoczu krwi do wartości przekraczających 2-krotnie prawidłowe stęŜenie na czczo u osób zdrowych. Występuje równieŜ wiele zmian aktywności enzymów w wątrobie, nasilających glukoneogenezę i eksport glukozy do krwi pomimo występowania znacznej hiperglikemh. W ketozie przeŜuwaczy zachodzi intensywne pobieranie glukozy z krwi przez płody bliźniacze lub proces intensywnej laktacji (ryc. 29-2).W rezultacie rozwija się krańcowa hipoglikemia, połączona z niezwykle małą ilością glikogenu

w wątrobie. Ketoza powstająca w tych warunkach bywa bardzo cięŜka. W miarę rozwoju hipoglikemii zmniejsza się wydzielanie insuliny, przez co zmniejsza się nie tylko zuŜywanie glukozy, lecz równocześnie wzmaga się lipoliza w tkance tłuszczowej. Kobiety w ciąŜy często mają łagodną ketozę. W nie leczonej cukrzycy typu I zgon jest spowodowany powikłaniami kwasicy uwarunkowanej długotrwałą utratą zasad, niezbędnych do zobojętnienia kwaśnych związków ketonowych wydalanych z moczem (p. rozdz. 62. Przypadek 8: Cukrzyca przebiegająca z kwasicą ketonową). W zatruciu dąŜowym owiec zgon następuje szybko z powodu cięŜkiej hipoglikemii.

PIŚMIENNICTWO Caprio S et al: Oxidative fuel metabolism during mild nypoglycemia: critical role free fatty acids. Am J Physiol 1989:256:E413. Cohen P: Comroi of Enzyme Activitv, 2nd ed. Chapman & Hali, 1983. Hue L, Van de Werve G (editors): Short-Term Regulation of Liver Metabolism. Elsevier/North Holland, 1981. Knopp RH et al: Lipoprotein metabolism in pregnancy, fat transport to the ferus and the effects of diabetes. Biol Neonate 1986;5O:297. Maycs PA, Laker ME: Regulation of ketogenesis in the liver. Biochem Soc Trans 1981;9:339. McGarry JD, Foster DW. Regulation of hepatic fatty acid oxidation and ketone body produetion. Annu Rev Biochem 1980;49:395. Siess EA, KientschEngel Rl, Wieland OH: Concentration of free oxaloacetate in the mitochondrial compartment of isolated liver cells. Biochem J 1984;218:171. Zorzano A et al: Effects of starvation and exercise on concentrations of citrate, hexose phosphates and glycogen in skeletal muscle and heart; Evidence for selectivc operation of the ghicose-fatty acid cycle. Biochem J 1985;232:585.

CZĘSC Metabolizm białek aminokwasów

Biosynteza aminokwasów, które nie muszą być dostarczane w poŜywieniu

30

Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE Często mówi się o aminokwasach, które muszą być dostarczone w poŜywieniu, jako o „podstawowych" i „niezbędnych", i o aminokwasach niekoniecznie występujących w pokarTabela 30-1. Zapotrzebowanie na aminokwasy u człowieka Aminokwasy, które Aminokwasy, które muszą być dostarczo- nie muszą być dostarne w poŜywieniu czona w poŜywieniu Arginina* Alanina Histydyna* Asparagina Izoieucyna Asparaginian Leucyna Cysteina Lizy na Glutaminian Metionina Glutamina Fenyloalanina Glicyna Treonina Hydroksyprolina" Tryptofan Hydroksylizyna** Walina Prolina Seryna Tyrozyna 'Częściowo niezbędny w poŜywieniu. Syntetyzowany z niedostateczną szybkością, aby podtrzymać rozwój dzieci. "Niekonieczny do syntezy białka, ale tworzący się podczas zmian potranslacyjnych kolagenu. 22 - Biochemia

mie, jako o „nie podstawowych" i „nie niezbędnych" (tab. 30-1). ChociaŜ w sensie Ŝywienia terminy te są poprawne, zaciemniają one podstwową, biologiczną naturę wszystkich 20 aminokwasów. MoŜna udowodnić, Ŝe aminokwasy, których nie trzeba dostarczać w poŜywieniu są waŜniejsze dla komórki od tych, które muszą być dostarczone w poŜywieniu, skoro organizmy (np. człowiek) zatraciły zdolność syntezy ostatniej, ale nie pierwszej grupy. PoniewaŜ ksiąŜka ta kładzie nacisk na procesy metaboliczne tkanek ludzkich, będzie tu omówiona tylko biosynteza aminokwasów, które nie muszą być dostarczone w poŜywieniu, a nie będziemy omawiać tych, które są biosyntetyzowane przez rośliny i mikroorganizmy, i muszą być dostarczone w poŜywieniu.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Znaczenie medyczne materiału zawartego w tym rozdziale wiąŜe się ze stanami niedoboru aminokwasów, które mogą wynikać z faktu, Ŝe konieczne w poŜywieniu aminokwasy nie występują w poŜywieniu lub występują w niedostatecznych ilościach. PoniewaŜ pewne zboŜa są stosunkowo ubogimi źródłami tryptofanu i lizyny, moŜe wystąpić stan dramatycznego niedo-

338 / ROZDZIAŁ 30

boru tych aminokwasów w regionach, w których poŜywienie opiera się na tych zboŜach i nie jest uzupełniane przez takie źródła białka, jak mleko, ryby i mięso. Kwashiorkor i wyniszczenie (ang. marasmus) są endemiczne w pewnych regionach Afryki Zachodniej. Kwashiorkor pojawia się wówczas, gdy dziecko po odjęciu od piersi matki przechodzi na dietę skrobiową ubogą w białko. W wyniszczeniu istnieje niedobór zarówno energetycznego poŜywienia, jak i swoistych aminokwasów. PODCZAS EWOLUCJI ZWIERZĘTA WYśSZE TRACĄ ZDOLNOŚĆ DO BIOSYNTEZY AMINOKWASÓW, KTÓRYCH TWORZENIE WYMAGA DŁUGIEGO CIĄGU REAKCJI Istnienie zapotrzebowania na poŜywienie sugeruje, Ŝe zaleŜność od dostarczania z zewnątrz potrzebnego związku pośredniego moŜe mieć większą wartość do utrzymania się przy Ŝyciu niŜ zdolność do jego biosyntezy. JeŜeli swoisty intermediat występuje w poŜywieniu, to organizm, który moŜe go syntetyzować, rozmnaŜając się przekazuje przyszłym pokoleniom informację genetyczną o ujemnej wartości tej zdolności dla przeŜycia. Zdolność ta dla preeŜy-

Tabela 30-2. Enzymy biorące uctzial w syntezie aminokwasów z amfibolicznych związków pośrednich Liczba enzymów potrzebna do syntezy Aminokwasy, które nie Aminokwasy, które muszą być dostarczone muszą być dostarczone w poŜywieniu Arg1 His Thr Met

Ala Asp Asn=

1

5 (4 wspólne)

Glu

1

Gin' Hyl3 Hyp4 Pro1 Ser Gly= Cys6 Tyr'_

1

59

3

NAD(P)H + H

1

1 3 3 1

2 1

4

!

6

z Glu. z Asp, z Lys. z Pro. z Ser. z Ser. plus S. z Phe.

a 7

Z 12 aminokwasów, które nie muszą być dostarczone w pokarmie (tab. 30-1), 9 tworzy się z amfibolicznych związków pośrednich. Pozostałe 3 (Cys, Tyr, Hyl) tworzą się z aminokwasów, które muszą być w poŜywieniu. Dehydrogenaza glutaminianowa., syntetaza glutaminowa i transaminazy zajmują centralną pozycję w biosyntezie aminokwasów. Wynikiem ich wspólnego działania jest katalizowanie przekształcenia nieorganicznego jonu amonowego w organiczny azot a-aminowy róŜnych aminokwasów. Glutaminian. Redukcyjna aminacja a-ketoglutaranu jest katalizowana przez dehydrogenazę glutaminianową (ryc. NAD(P]30-1). W dodatku do

1 1

17 2

WIĘKSZOŚĆ AMINOKWASÓW, KTÓRE NIE MUSZĄ BYĆ DOSTARCZANE W POśYWIENIU, TWORZY SIĘ Z AMFIBOLICZNYCH ZWIĄZKÓW POŚREDNICH W KRÓTKICH SZLAKACH ANABOL1CZNYCH

w poŜywieniu

7 6 6

Lys 8 Ile 8 (6 wspólnych) Val 1 (7 wspólnych) Leu 3 (7 wspólnych) Phe 10 Trp 5 (8 wspólnych)

1

cia jest ujemna, a nie zerowa, poniewaŜ organizm zuŜywa ATP i środki pokarmowe na syntezę niepotrzebnego DNA. Liczba enzymów wymagana przez komórki prokariotyczne do biosyntezy aminokwasów niezbędnych w poŜywieniu jest ogromna w porównaniu z liczbą enzymów potrzebną do syntezy aminokwasów, które nie muszą być dostarczone w poŜywieniu (tab. 30-2). To sugeruje, Ŝe poŜyteczne dla przeŜycia organizmu jest utrzymanie zdolności wytwarzania „łatwych" aminokwasów, natomiast strata zdolności do syntezy „aminokwasów trudnych".

Ryc.

30-1. NH, '■

Reakcja dehydrogenazy glutaminiano-wej. Redukcyjna aminacja aketoglutaranu przez NHl zachodzi kosztem NAD(P)H.

BIOSYNTEZA AMINOKWASÓW / 339

NH+ O NH. Mg-ATP

Mg-ADP+P;

Ryc. 30-2. Reakcja syntetazy glutaminowej.

tworzenia L-glutaminianu z amfi bo licznego związku pośredniego a-ketoglutaranu, reakcja ta stanowi kluczowy, pierwszy etap w biosyntezie wielu dodatkowych aminokwasów. Glutamina. Biosynteza glutaminy z glutaminianu jest katalizowana przez syntetazę glutaminową (ryc. 30-2). Reakcja wykazuje zarówno podobieństwa, jak i róŜnice w porównaniu z reakcją katalizowaną przez dehydrogenazę glutaminianową. Obie reakcje wbudowują azot nieorganiczny -—jedna w grupę aminową, druga w wiązanie amidowe. Obie reakcje są połączone z reakcjami wysoce egzoergicznymi: w przypadku dehydrogenazy glutaminianowej z utlenieniem NAD(P)H, a w przypadku syntetazy glutaminowej — hydrolizą ATP.

Asparagina. Synteza asparaginy z asparaginianu, katalizowana przez syntetazę asparaginowa (ryc. 30-4), przypomina syntezę glutaminy (ryc. 30-2). Tym niemniej enzym ssaków wykorzystuje jako źródło azotu raczej glutaminę niŜ jon amonowy; syntetaza asparaginowa u ssaków nie przyłącza nieorganicznego azotu, natomiast bakteryjna syntetaza asparaginowa wykorzystuje jon amonowy i wskutek tego przyłącza azot. Tak jak w przypadku innych, reakcji, w których tworzy się PPj: hydroliza PP; do P| przez pirofosfatazę zapewnia, Ŝe reakcja jest silnie uprzywilejowana energetycznie. Mg-ATP

NH,+

NH,+ H,N O

L-Asparaglnlan

L-Asparagina

R —NH3+-

Mg-AMP + PP,

Ryc. 30-4. Reakcja syntetazy asparaginowej. NaleŜy zwrócić uwagę na podobieństwa i róŜnice w porównaniu z reakcją syntetazy glutaminowej (ryc. 30-2).

Alanina i asparaginian. L-alanina powstaje w wyniku transaminacji pirogronianu, natomiat w wyniku transaminacji szczawiooctanu tworzy się L-asparaginian (ryc. 30-3). Przeniesienie grupy a-aminowej glutami niań u na te amfiboliczne związki pośrednie ilustruje zdolność transaminaz do kierowania jonu amonowego, przez glutaminian, w oc-aminowy azot aminokwasów.

Plrogronlan Q GlulubAsp ot-Ketoglutaran lubazczawiooctan

Ryc. 30-3. Tworzenie alaniny przez transami nację pirogronianu. Donorem grupy aminowej moŜe być glutaminian lub asparaginian. Innym produktem jest a-ketoglutaran lub szczaw i oo etan.

Seryna. Seryna tworzy się ze związku pośredniego glikolizy — D-fosfoglicerynianu (ryc. 30-5). Grupa ot-hydroksylowa jest utleniana przez NAD+ do grupy ketonowej, a następnie podlega transaminacji, tworząc fosfoserynę. Ta jest wówczas defosforylowana, dając serynę. Głicyna. Synteza glicyny w tkankach ssaków jest prowadzona kilkoma drogami. Cytozol wątroby zawiera Lransaminazy glicynowe, które katalizują syntezę glicyny z glioksalanu i glutaminianu lub alaniny. W przeciwieństwie do większości reakcji transaminacji, ta silnie uprzywilejowuje syntezę glicyny. Dwoma dodatkowymi waŜnymi szlakami tworzenia glicyny u ssaków jest jej synteza z choliny (ryc. 30-6) i z seryny przez reakcję katalizowaną przez hydroksymetylotransferazę serynową (ryc. 30-7). Prolina. U ssaków i niektórych innych form Ŝycia prolina tworzy się z glutaminianu wskutek odwrócenia reakcji kataboiizmu proliny (ryc. 30-8).

340 / ROZDZIAŁ 30

OKSYDAZA SARKO2YNOWA i

o 3- Fosf o- D-g! loory nlan L--NAD +

9 (P)-O

o

Fosfo hyd ro teyplrog ron lan

DEHYDROGENAZA ALDEHYDU BETAINY

NH,+

Fosfo-L-swyna

OKSYDAZA DIMETYl.OGLlCYNOWA

Ryc. 30-5. Biosynteza seryny. a-AA — a-aminokwasy, a-KA — a-ketokwasy.

Cysteina. Cysteina, której obecność w poŜywieniu nie jest konieczna, tworzy się z metioniny (koniecznej w poŜywieniu) i seryny (niekoniecznej w poŜywieniu). Metionina ulega najpierw przemianie w homocysteinę przez S-adenozylometionine i S-adenozylohomocysteinę (p. rozdz. 32). Przekształcenie homocysteiny i seryny w cysteinę i homoserynę przedstawiono na ryc. 30-9. Tyrozyna. Tyrozyna powstaje z fenyloalaniny w reakcji katalizowanej przez hydroksylazę fenyloalaninową (ryc. 30-10). Podczas gdy fenyloalanina jest aminokwasem niezbędnym w poŜywieniu, tyrozyna nim nie jest — dostarczone poŜywienie powinno zawierać odpowiednie ilości fenyloalaniny. Reakcja jest nieodwracalna, dlatego tyrozyna nie moŜe zastępo-

ICHjO) Formaldahyd i

NHJ Silcyna

Ryc. 30-6. Powstawanie glicyny z cboliny.

wać w poŜywieniu fenyloalaniny. Kompleks hydroksylazy fenyloalaninowej jest oksygenazą o mieszanej funkcji, występuje w wątrobie ssaków, ale nie występuje w innych tkankach.

BIOSYNTEZA AMINOKWASÓW / 341

NH,*

MetytenoH^-follan i

NH +

!

HO ] +/

O L-

Glteyna Seryna

Ryc. 30-7. Reakcja hydroksym etyl otrą nsf era zy serynowej. Reakcja jest łatwo odwracalna. H4-fo)ian — tetrahydrofolian. O

L-GkJtamlnten

L-Glutam/lo-y-eemialoohyd L-Cysteina

Seryna L-Homowryna

A'-Pirolldyno-5-karboksyian

Ryc. 30-9. Przekształcenie homocysteiny i seryny w homoserynę i cysteine. NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe podczas gdy siarka cysteirty pochodzi z transsuifu racji z metioniny, szkieletu węglowego dostarcza seryna.

O

L-Prollna Ryc. 30-8. Biosynteza proliny zglutaminianu przez odwrócenie reakcji katabolizmu proliny.

Reakcja polega na wbudowaniu jednego atomu tlenu w pozycjepara fenylo alaniny, podczas gdy drugi atom jest redukowany z utworzeniem wody (ryc. 30-10). Moc redukcyjną, zawartą

ostatecznie w NADPH, natychmiast dostarcza tctrahydrobiopteryna. przypominająca pterydyne kwasu foliowego. Hydroksyprolina. PoniewaŜ prolina słuŜy jako prekursor hydroksyproliny, prolina i hydroksyprolina naleŜą do rodziny glutaminianu. ChociaŜ w tkankach ssaków występuje zarówno 3-, jak i 4-hydroksyprolina, wszystkie podane niŜej fakty dotyczą tylko Ŝran.s-4-hyclroksyproliny, Hydroksyprolina, podobnie jak hydroksyli2yna, jest prawie wyłącznie związana z kolagenem, białkiem występującym w największej iloś-

342 / ROZDZIAŁ 30 NADP+

NADPH+H+

TetrahydroDmydrablopteryna biopteryna

L-Fanyloalanlna

H

0H

L-Tyroiyna

OH ÓH

Tatra hyd ro bi o ptery n a

Ryc. 30-10. Reakcja hydroksylazy fenyloalaninowej. Biorą udział 2 róŜne enzymy. Enzym II katalizuje redukcję dihydrobiopteryny przez NADPH i enzym I — redukcję O2 do H2O oraz fenyloalaniny do tyrozyny Reakcja ta wiąŜe się z zaburzeniami metabolizmu fenyloalaniny omawianymi w rozdz. 32.

i-Ketoglularan [ "OJ-Bursztyn la n

Ryc. 30-11. Reakcja hydroksylazy prolilowej. Substratem jest peptyd bogaty w prolinę. Podczas przebiegu reakcji tlen cząsteczkowy wbudowuje się zarówno do bursztynianu, jak i do proliny (wykaza13 no wykorzystując izotop tlenu O2).

ci w tkankach ssaków. Kolagen zawiera ok. 1/3 glicyny, 1/3 proliny i hydroksyproliny. Hydroksyprolina, która stanowi wiele reszt aminokwasowych kolagenu, chroni potrójny heliks kolagenu przed trawieniem przez proteazy.

W przeciwieństwie do grup hydroksylowych hydroksylizyny, które słuŜą jako miejsca przyłączenia reszt galaktozyd owych i glukozowych, grupy hydroksylowe hydroksyproliny kolagenu nie są podstawione. Wyjątkową cechą metabolizmu hydroksyproliny i hydroksylizyny jest to, Ŝe jeśli aminokwasy te pochodzą z białka przyjmowanego poŜywienia, to nie są włączane do kolagenu. Nie ma Ŝadnego tRNA zdolnego przyłączyć hydroksyprolinę i hydroksylizynę i wbudować je w wydłuŜający się łańcuch polipeptydowy. Prolina zawarta w pokarmie jest prekursorem hydroksyproliny kolagenu, natomiast lizyna — prekursorem hydroksylizyny kolagenu. Hydroksylacje proliny lub lizyny katalizuje hydroksylaza prolilowa lub hydroksylaza lizylowa, enzymy związane z frakcją mikrosomalną wielu tkanek (skóry, wątroby, płuc, serca, mięśni szkieletowych i zi a minujących ran). Enzymy te są hydroksylazami peptydowymi, poniewaŜ hydroksylacja zachodzi tylko po wbudowaniu proliny i lizyny do polipeptydu. Obie hydroksylazy są oksygenazami o mieszanej funkcji, które wymagają w dodatku do substratu obecności tlenu cząsteczkowego, askorbinianu, Fe2"1" i a-ketoglutaranu. Intensywniej badano hydroksylazę prolilowa, ak okazuje się, Ŝe hydroksylaza lizylowa jest bardzo podobna. Na kaŜdy mol hydroksylowanej proliny, 1 mol oc-ketoglutaranu ulega dekarboksylacji do bursztynianu. Podczas tego procesu 1 atom tlenu cząsteczkowego wbudowuje się w prolinę i 1 w bursztynian (rys. 30-11). Hydroksylizyna. 5-Hydroksylizyna (a,e-diamino-S-hydroksykapronian) występuje w kolagenie, ale nie występuje w większości innych białek ssaków, Hydroksylizyna kolagenu pochodzi bezpośrednio z lizyny, ale nie z hydroksylizyny poŜywienia. Zanim lizyna ulegnie hydroksylacji musi być wbudowana w peptyd. HydroksyJacje peptydu lizylowego katalizuje wówczas hydroksylaza lizylowa, oksydaza o mieszanej funkcji, analogiczna do hydroksylazy prolilowej (ryc. 30-11). 7-Ketokwasy 3 aminokwasów o rozgałęzionych łańcuchach bocznych mogą zastąpić w poŜywieniu człowieka odpowiadające im aminokwasy ChociaŜ leucyna, walina i izoleucyna są dla ludzi i innych wyŜszych zwierząt aminokwasami, które muszą być dostarczone w pokarmie, tkanki ssaków mają transaminazy, które od-

BIOSYNTEZA AMINOKWASÓW / 343

wracalnie katalizują wzajemne przemiany wszystkich 3 aminokwasów i odpowiadających im a-ketokwasów. Dlatego odpowiednie a-ketokwasy mogą zastępować w poŜywieniu odpowiadające im aminokwasy.

byłyby prowadzone w dłuŜszych okresach, jest prawdopodobne, Ŝe ujawniłoby się zapotrzebowanie na histydynę równieŜ u dorosłego człowieka.

Histydyna i arginina są uwaŜane jako aminokwasy częściowo niezbędne w poŜywieniu Arginina, aminokwas który musi być dostarczony w poŜywieniu dla rozwoju człowieka, moŜe być syntetyzowana przez szczury, ale w ilościach niewystarczających do prawidłowego wzrostu. Histydyna, podobnie jak arginina, nie jest całkowicie niezbędna w poŜywieniu. W nieobecności histydyny u dorosłych ludzi i-dorosłych szczurów była utrzymywana przez krótki okres równowaga azotowa. Rosnące zwierzę wymaga jednak w poŜywieniu histydyny. JeŜeli badania

PIŚMIENNICTWO Cardinale GJ, Udenfriend S: Prolyl hydroxylase. Adv Eniymol 1974;41:245. Mercer LP, Dodds SJ, Smith DI: Dispensable, indispensable, and conditionally indispensable amin o acid ratios in the diet. Chapter 1 in Vol. 1 of; Adsorption and Utilization of Amino Acids. Friedman M (editor). CRC Press. 1989. Rosenberg LE. Serwer CR: Disorders of amino acid metabolism. Chapter 11 in: Metaboiic Control and Disease. Bondy PK, Roscnberg LE (editors). Saunders, 1980. Tyler B: Regulation of the assimilation of nitrogen tompounds. Annu Rev Biochem 1978;47:1127.

31

Katabolizm białek i azotu aminokwasów Victor W. Rodwełt, PhD

WPROWADZENIE W tym rozdziale będzie omówiony sposób, w jaki azot jest usuwany z aminokwasów i przekształcany w mocznik oraz problemy medyczne pojawiające się wskutek zaburzeń tych reakcji.

kwasów. Fizjologiczne znaczenie wymiany białka jest wykazane przez jej obecność we wszystkich formach Ŝycia, nawet u bakterii rosnących logarytmicznie w bogatym podłoŜu. ChociaŜ wymiana obejmuje zarówno syntezę, jak i degradację białek, rozdział ten omawia degradację białek i aminokwasów. Syntezę białek opisano w rozdz. 40.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Amoniak, pochodzący głównie z a-aminowego azotu aminokwasów, jest dla ludzi potencjalnie toksyczny. Mechanizmy, które powodują, Ŝe amoniak jest toksyczny, nie są całkowicie poznane. Człowiek usuwa amoniak przez przekształcenie go w nietoksyczny związek chemiczny — mocznik. Prawidłowy przebieg szlaku metabolicznego, który przekształca amoniak w mocznik — cykl mocznikowy —jest istotny do utrzymania zdrowia. W warunkach, w których funkcja wątroby jest powaŜnie zagroŜona, np. u chorych z zaawansowaną marskośdą wątroby (gdzie prawidłowe hepatocyty są zastąpione przez fibrobiasty i kolagen) lub ostrym zapaleniem wątroby — stęŜenie amoniaku we krwi się zwiększa, co w rezultacie powoduje objawy kliniczne. W przypadku nielicznych dzieci urodzonych z brakiem aktywności jednego z enzymów cyklu mocznikowego właściwe leczenie wymaga zrozumienia biochemii syntezy mocznika. WYMIANA BIAŁKA ZACHODZI WE WSZYSTKICH FORMACH śYCIA Białka Ŝywych komórek są stale odnawiane przez wymianę białka, nieprzerwany proces degradacji i następnie resyntezy z wolnych amino-

Klinicyści i dietetycy uŜywają swoistych terminów w celu scharakteryzowania róŜnych stanów bilansu azotowego Swoiste terminy opisują stan metabolizmu azotu u ludzi. Bilans azotowy dotyczy róŜnicy między całkowitym azotem spoŜytym a całkowitym azotem wydalonym. Przyjęcie więcej azotu niŜ wydalenie stanowi dodatni bilans azotowy, stan typowy dla rosnącego dziecka lub kobiety w ciąŜy. W równowadze azotowej, typowej dla dorosłego człowieka, ilość azotu spoŜytego odpowiada ilości azotu wydalonego w kale i moczu. Ujemny bilans azotowy, w którym ilość azotu wydalonego przewyŜsza ilość azotu spoŜytego, charakteryzuje pewnych chorych po operacjach, chorych z zaawansowanym rakiem i osoby, które przyjmują nied o stateczną ilość azotu (np. w kwashiorkor) lub dietę ubogobiałkową. KaŜdego dnia dorośli degradują 1—2% białka ich organizmu Wymiana 1—2% całkowitego białka ciała dziennie u zdrowego człowieka wynika głównie z degradacji białka mięśni. 75—80% uwolnionych aminokwasów jest wówczas ponownie wykorzystywanych do syntezy białka. Azot pozostałych jest katabolizowany do mocznika.

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 345

Degradacja białka (2 0 -3 5g azotu dziennie)

Białko organizmu Ponowne wykorzystanie do syntezy nowego białka (15 - 2B g azotu dziennie) Aminokwasy

Kalabollzm (5 — 7 g azotu dziennie)

Ryc. 31 -1. ZaleŜności ilościowe zachodzące między obrotem białek i aminokwasów.

a szkielety węglowe do amfibolicznych związków pośrednich (ryc. 31-1). W społeczeństwie zachodnim ta dzienna strata wynosi do 30—40 g białka lub 5—7 g azotu.

Szybkość degradacji białka znacznie się róŜni między białkami oraz w róŜnych stanach fizjologicznych Poszczególne białka są degradowane z róŜną szybkością. Średnia szybkość degradacji białka w danej komórce, tkance lub w całym organizmie odzwierciedla średnią wartość dJa róŜnych białek. Szybkość degradacji lub połowicznego rozpadu białek w odpowiednich tkankach odpowiada ich fizjologicznemu wymaganiu. Średnia szybkość degradacji moŜe być niezmiernie duŜa, gdy tkanka ulega powaŜnemu strukturalnemu przekształceniu (np. tkanka macicy podczas ciąŜy lub tkanka ogona kijanki podczas metamorfozy). Degradacja białek mięśni szkieletowych takŜe się zwiększa podczas ostrego głodzenia.

Okres połowicznego rozpadu białek waha się od 30 min do powyŜej 150 h PoniewaŜ in vivo szybkość degradacji białka odpowiada kinetyce reakcji I-rzędu, wraŜliwość enzymu aa degradację jest wyraŜona przez jego okres połowicznego rozpadu — tt„. Jest to czas wymagany do zmniejszenia jego stęŜenia do 50% wartości początkowej. Okres połowicznego rozpadu enzymów wątroby waha się od mniej niŜ 40 min do powyŜej 150 h. Wiele kluczowych enzymów regulatorowych wykazuje krótki okres połowicznego rozpadu. Na przykład t,,2 oksygenazy tryptofanowej i transaminazy tyro-

zynowej wynosi ok. 2 h, a tm reduktazy HMG-CoA moŜe wynosić tylko 30 min. Te wartości wyraźnie kontrastują z okresem połowicznego rozpadu powyŜej 100 h dJa aldolazy, dehydrogenazy mleczanowej i cytochromów. Domeny bogate w Pro, Ser, Asp i Glu, określane jako sekwencje PEST, występują w białkach z krótkim okresem połowicznego rozpadu. W reakcji na potrzeby fizjologiczne szybkość degradacji kluczowych enzymów regulatorowych moŜe być przyspieszona lub opóźniona, zmieniając stęŜenie enzymu i stąd podzielenie metabolitów między róŜne szlaki metaboliczne.

Aminokwasy przyjęte w nadmiarze w stosunku do potrzeb są degradowane, a nie przechowywane Utrzymanie zdrowia typowego zachodniego dorosłego człowieka wymaga 30 — 60 g białka dziennie lub jego równowaŜników w postaci wolnych aminokwasów. Niemniej jakość białka (proporcja niezbędnych aminokwasów w poŜywieniu względem ich proporcji w syntetyzowanych białkach) ma szczególne znaczenie. Nadmiar aminokwasów nie jest magazynowany. Bez względu na ich pochodzenie, te które bezpośrednio nie zostały włączone do nowego białka są szybko degradowane. SpoŜycie nadmiaru aminokwasów nie słuŜy zatem Ŝadnemu poŜytecznemu celowi, który nie moŜe równie dobrze być spełniony i przy niŜszym nakładzie przez węglowodany i lipidy.

PROTEAZY I PEPTYDAZY DEGRADUJĄ BIAŁKA DO AMINOKWASÓW Analogicznie do procesów zachodzących w przewodzie Ŝołądkowo-j elito wy m, proteolityczne trawienie endogennych białek w obrębie komórek wymaga proteaz i peptydaz. Wewnątrzkomórkowe proteazy hydrolizują wewnętrzne wiązania peptydowe białek, tworząc peptydy. Te peptydy są wtedy degradowane do wolnych aminokwasów przez peptydazy. Endopeptydazy przecinają wewnętrzne wiązania w peptydach, tworząc krótsze peptydy, Aminopeptydazy i karboksypeptydazy usuwają wówczas odpowiednio aminokwasy z N- i C-końców peptydów. Ostatecznymi produktami są wolne aminokwasy.

346 / ROZDZIAŁ 31

Białka są degradowane na szlaku ATP-zaleŜnym i ATP-niezaleŜnym Wewnątrzkomórkowe białka komórek eukariotycznych są degradowane w 2 głównych szlakach. Pozakomórkowe, związane z błoną, i długo Ŝyjące białka wewnątrzkomórkowe są degradowane w organeliach komórkowch, nazwanych lizosomami, w procesach ATP-niezaleŜnych. Przeciwnie, degradacja nieprawidłowych i innych krótko Ŝyjących białek wymaga ATP i ubikwityny, i przebiega w cytozolu. Receptory asjaloglikoprotein hepatocytów przyłączają i internalizują glikoproteiny przeznaczone do degradacji Jakie czynniki „wyznaczają" białko do szybkiej degradacji? Dla białek w krąŜeniu (np. pewnych hormonów peptydowych) strata cząsteczki kwasu sjalowego, od końców nieredukujacych ich łańcuchów oligosacharydowych, sygnalizuje ich degradację. Te pozbawione kwasu sjalowego glikoproteiny są rozpoznawane przez asjaloglikoproteinowy receptor hepatocytów i internalizowane. Wówczas są one degradowane w lizosomach przez proteazy zwane katepsynami. Ubikwityna „wyznacza" wiele wewnątrzkomórkowych białek do degradacji Wiele wewnątrzkomórkowych białek jest „wyznaczanych" do degradacji przez ubikwitynę, małocząs teczko we (8,5 kD) białko występujące we wszystkich komórkach eukariotycznych. Pierwszorzędowa struktura ubikwityny jest bardzo konserwatywna. Tylko 3 z 76 reszt aminokwasowych róŜni ubikwitynę droŜdŜową od ludzkiej. Cząsteczki ubikwityny przyłączają

się do białka przeznaczonego do degradacji na drodze reakcji zaleŜnych od ubikwityny. Są one przyłączane w 3-etapowym procesie, kończącym się utworzeniem wiązania izopeptydowego między końcem karboksylowym ubikwityny i g-aminową grupą reszty iizyny w białku (ryc. 31-2). To czy białko zostanie zmodyfikowane przez ubikwitynę zaleŜy od rodzaju aminokwasu obecnego na jego N-końcu. Reakcja z ubikwityną jest opóźniana przez N-końcową resztę metioniny i seryny, a przyspieszana przez resztę kwasu asparaginowego i argininy. ZALEśNIE OD ICH NISZY EKOLOGICZNEJ, ZWIERZĘTA PRZEKSZTAŁCAJĄ AZOT W RÓśNE PRODUKTY KOŃCOWE Zwierzęta przekształcają azot z aminokwasów i innych źródeł w jeden z 3 produktów końcowych: amoniak, kwas moczowy lub mocznik. Który z produktów przewaŜa u róŜnych zwierząt, zaleŜy od dostępności wody w ich specyficznej niszy ekologicznej. Organizmy amonoteliczne, ryby kostnoszkieletowe, wydalają azot jako amoniak. Ich nisza wodna, zmuszająca do ciągłego usuwania wody, ułatwia stałe wydalanie bardzo toksycznego komponentu — amoniaku. Natomiast zwierzęta lądowe przekształcają azot albo w kwas moczowy (urykoteliczny tryb Ŝycia), albo w mocznik (organizmy ureoteliczne). Ptaki, które muszą zarówno zachowywać wodę, jak i utrzymywać małą masę ciała są urykoteliczne. Kwas moczowy, stosunkowo nierozpuszczalny produkt końcowy, jest wówczas wydalany jako półstałe guano. Zwierzęta lądowe, a takŜe człowiek, są ureoteliczne, przekształcające azot w dobrze rozpuszczalny nietoksyczny związek — mocznik. Nie-

o 1.

o

UB—C—O" + E, -SH + ATP -»AMP + PP, + UB—C—S—E1 O

2.

O

UB—C—S—E, + E, -SH -* E, -SH + UB-C—S—E,

O E O H 3. UB—C-^S—E2+ H2N—E— Białko 4 Ej -SH + UB—C—N-e— Białko c. 31-2. Reakcje cząstkowe w przyłączaniu ubikwityny (UB) do białka. 1. Terminalna grupa karboksylowa COOH ubikwityny tworzy wiązanie tioestrowe z grupą -SH enzymu E, w reakcji kierowanej przez przekształcenie ATP wAMPi PP,. 2. Reakcja wymiany tioestru przenosi zaktywowang ubikwitynę na enzym E;. 3. Enzym E3 katalizuje transfer ubikwityny na e-aminowe grupy lizyny docelowego białka.

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 347

zwykle mała toksyczność mocznika jest niejednokrotnie zaciemniona przez zwiększone stęŜenie mocznika we krwi osób z chorobami nerek. To zwiększone stęŜenie mocznika we krwi jest konsekwencją, ale nie przyczyną, chorób nerek. BIOSYNTEZA MOCZNIKA PRZEBIEGA W KILKU ETAPACH Ze względów dydaktycznych omówienie biosyntezy mocznika podzielono na 4 etapy: 1) transaminacja, 2) deaminacja oksydacyjna, 3) transport amoniaku i 4) reakcje cyklu mocznikowego. Rycina 31-3 wiąŜe te zagadnienia w całkowity katabolizm azotu aminokwasowego. ChociaŜ kaŜdy etap odgrywa takŜe rolę w biosyntezie aminokwasów, najpierw zostanie rozpatrzony z perspektywy ich katabolizmu. a-Aminokwas

i-Ketokwas

a-Ketoglutaran

Transami nacja L-G lutami nian NH3

Deamlnacja oksydacyjna Cykl nweanlkowy CO, Mocznik Ryc. 31 -3. Ogólny przepływ azotu w kataboiizmie aminokwasów.

USUNIĘCIE GRUPY < AMINOWEJ JEST WSTĘPNĄ REAKCJĄ KATABOLIZMU AMINOKWASÓW Wolne aminokwasy? pochodzące z egzogennych białek poŜywienia lub z degradacji białek endogennych w procesach opisanych powyŜej, są metabolizowane w identyczny sposób. Ich aaminowy azot jest najpierw usuwany albo przez transaminację albo przez deaminację ok-

sydacyjną. Powstały węglowy „szkielet" jest wówczas degradowany w szlakach, które będą opisane w następnym rozdziale. W tym rozdziale omówiono los samego azotu. Fosforan pirydoksalu jest obecny w miejscu katalitycznym wszystkich transaminaz Fosforan pirydoksalu tworzy istotny część miejsca katalitycznego transaminaz i wielu innych enzymów, których substratami są aminokwasy. We wszystkich reakcjach aminokwasów, zaleŜnych od fosforanu pirydoksalu, wstępnym etapem jest tworzenie związku pośredniego — zasady Schiifa — połączonego z enzymem. Ten związek pośredni, stabilizowany pr2ez interakcję z kationowym regionem miejsca aktywnego, moŜe być przekształcany w sposób, który obejmuje uwolnienie ketokwasu z utworzeniem związanego z enzymem fosforanu pirydoksaminy. Połączona aminowa forma koenzymu moŜe wówczas tworzyć z ketokwasem analogiczny związek pośredni typu zasady Schiffa. Podczas transaminacji przyłączony koenzym słuŜy jako przenośnik grup aminowych. Wobec tego, Ŝe stała równowagi dla większości reakcji transaminacji jest bliska 1, transaminacja jest procesem łatwo odwracalnym. To pozwala Łransaminazom funkcjonować zarówno w kataboiizmie, jak i biosyntezie aminokwasów. Transaminacja kieruje azot ::-aminokwasów do glutaminianu Transaminacja, katalizowana przez transaminazy lub aminotransferazy, obejmuje wzajemne przemiany pary aminokwasów i pary ketokwasów. Są to głównie a-aminokwasy i a-ketokwasy (ryc. 31-4). Dwie transaminazy, transaminaza alanina-pirogronian (transaminaza alaninowa) i transaminaza glu tam i nian-a-ke to glut ara n (transaminaza glutaminianowa), występujące w większości tkanek ssaków, katalizują przeniesienie grup aminowych z większości aminokwasów, tworząc alaninę (z pirogronianu) i glutaminian (z ce-ketoglutaranu) (ryc. 31-5). Transaminazy są swoiste tylko dla, jednej pary -aminokwasów i a-ketokwasów. KaŜda transaminaza jest swoista dla danej pary aminokwasów i ketokwasów jako jednej pary substratów, ale nieswoista

348 / ROZDZIAŁ 31

i hydroksyprolinę. Transaminacja nie jest ograniczona do grup a-aminowych. 8-Aminowa grupa ornityny (ale nie e-aminowa grapa lizyny) łatwo ulega transaminacji, tworząc 7-semialdehyd glutaminianu (p. ryc. 32-3). W pewnych stanach chorobowych stęŜenie transaminaz w surowicy jest zwiększone (p. Suplement).

o

o

Ryc. 31-4. Transaminacja. Reakcję przedstawiono dla dwóch a-aminokwasów i dwóch ot-ketokwasów. Grupy nie ot-aminowe lub karbonylowe równieŜ uczestniczą w transaminacji, chociaŜ stosunkowo rzadko. Reakcja jest łatwo odwracalna ze stalą równowagi równą ok. 1.

Plrogronlan

L-Alanlna

OKSYDAZA L-AMINOKWASOWA RÓWNIEś PRZEKSZTAŁCA 5-AMINOKW ASY W ct-KETO KWASY Tlenowa przemiana wielu aminokwasów w odpowiadające im ketokwasy zachodzi w wątrobie i nerkach ssaków. ChociaŜ prawie cala aktywność w stosunku do a-aminokwasów jest wynikiem wspólnego działania transaminaz i dehydrogenazy L-glutaminianowej, w wątrobie i nerkach ssaków jest równieŜ aktywna oksydaza L- i D-aminokwasowa, enzym bardzo rozpowszechniony u innych zwierząt i drobnoustrojów.

a-Ketoglutaran

a A m l n o k w a s

Oksydazy aminokwasowe są autoutleniającymi się flawoproteinami Zredukowany FMN lub FAD oksydaz aminokwasowych jest ponownie utleniany bezpośrednio przez tlen cząsteczkowy, tworząc nadtlenek wodoru (H2 Oj) bez udziału cytochro-

L-Glutamlnłan a-Ketokwas a-Am ino kwas a-Ketokwas

Ryc. 31-5. Transaminazaalaninowa (gfira) itransamtnaza glutaminianowa (dói).

dla innej pary, którą moŜe tworzyć jakikolwiek aminokwas z odpowiadającym mu ketokwasem. PoniewaŜ alanina jest takŜe substratem w reakcji transaminazy glutaminianowej, cały azot aminowy z aminokwasów, które mogą ulegać transaminacji, moŜe być gromadzony w glutaminianie. Jest to waŜne, poniewaŜ Lglutaminian jest jedynym aminokwasem w komórkach ssaków ulegającym deaminacji oksydacyjnej ze znaczną szybkością. Tworzenie amoniaku z grup tx-aminowych przebiega więc głównie poprzez przemianę w azot a-aminowy Lglutaminianu.

Transaminacja nie jest ograniczona do grup a-aminowych. Substratamj w transaminacji jest większość aminokwasów (ale nie wszystkie). Wyjątki obejmują lizynę, treoninę oraz cykliczne iminokwasy — proline

OKSYDAZA AMINOKWASOWA

Riw|n(ł

O a-lmtnokwas ■HjO

NH„* -*' ■

O

KATALAZA

140, 11O a-Katokwas

C

Ryc. 31-6. Deaminacja oksydacyjna katalizowana przez oksydazę L-aminokwasową (oksydoreduktaza L-a-aminokwas: O2). a-lminokwas w nawia sie nie jest trwałym produktem pośrednim.______

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 349

mów Jub innych przenośników elektronów (ryc. 31-6). Kata luz a, która powszechnie występuje w tkankach, szczególnie w wątrobie, rozkłada toksyczny H2O2 do O2 i H^O. ChociaŜ reakcje oksydazy a min o kwasowej są odwracalne, w nieobecności katalazy a-ketokwasowy produkt jest nieenzymatycznie dekarboksylowany przez H2O2 z utworzeniem kwasu karboksylowego uboŜszego o jeden atom węgla. Niemniej jest wątpliwe, czy ta dekarboksylacja zachodzi w jakimś duŜym stopniu w nie uszkodzonych tkankach ludzkich. W reakcji oksydazy aminokwasowej (ryc. 31-6) aminokwas jest najpierw odwodorowany przez flawoproteine oksyda2y, tworząc a-iminokwas. Ten spontanicznie przyłącza cząsteczkę wody i rozkłada się na odpowiedni a-ketokwas z utratą oc-iminowego azotu w postaci jonu amonowego.

DEHYDROGENAZA LGLUTAMINIANOWA ZAJMUJE CENTRALNĄ POZYCJĘ W METABOLIZMIE AZOTU Grupy aminowe większości aminokwasów w wyniku transaminacji są ostatecznie przenoszone*na a-ketoglu taran z utworzeniem L-glutaminianu (ryc. 31 -3). Uwolnienie azotu aminowego jako amoniaku jest katalizowane przez dchydrogenazę L-glutaminianową, enzym o duŜej aktywności, rozpowszechniony w wielu tkankach ssaków (ryc. 31-7). Dehydrogenaza glutaminianowa wątroby jest enzymem regulatorowym, na którego aktywność wpływają allosteryczne modyfikatory, takie jak ATP, GTP i NADH, które hamują enzym i ADP, który go aktywuje. Pewne hormony mają wpływ na aktywność dehydrogenazy glutaminia nowej in vuro. NAD(P}+

L-Glutamlnlan

a-KefogJutarari

Ryc. 31-7. Reakcja katalizowana przez dehydf rogenazę L-gtutaminianową. NAD(P) oznacza, + Ŝe kosubstratem moŜe być albo NAD , albo NADP+. Reakcja jest odwracalna, ale stalą równowagi uprzywilejowuje tworzenie giutaminianu.

Dehydrogenaza ^lutaminianowa wykorzystuje jako kosubstratNAD+ lubNADP +. Reakcja jest odwracalna i przebiega zarówno w kataboJizmie, jak i biosyntezie aminokwasów. Jej zadaniem jest nie tylko oddzielenie azotu od giutaminianu i wbudowanie go do mocznika (kataboiizm), lecz takŜe katalizowanie aminacji a-ketoglutaranu przez wolny amoniak (p. rozdz. 30).

AMONIAK WE KRWI POCHODZI TAKśE Z AMONIAKU UTWORZONEGO PRZEZ BAKTERIE JELITOWE Amoniak* wchłania się z jelita do krwi Ŝyły wrotnej, w której stęŜenie amoniaku jest większe niŜ we krwi krąŜenia ogólnego. W warunkach prawidłowych wątroba szybko usuwa amoniak z krwi Ŝyły wrotnej, tak Ŝe krew opuszczająca wątrobę (i w rzeczywistości cała krew obwodowa) jest faktycznie pozbawiona amoniaku. Jest to waŜne, skoro nawet znikome ilości amoniaku są toksyczne dla ośrodkowego układu nerwowego. Przy powaŜnym upośledzeniu funkcji wątroby lub rozwinięciu obocznyeh połączeń między Ŝyłami wrotną i krąŜenia duŜego (jak to moŜe zachodzić w marskości wątroby), krew wrotna moŜe ominąć wątrobę, przez co stęŜenie amoniaku we krwi krąŜenia ogólnego moŜe się wówczas zwiększyć do poziomu toksycznego.

Zatrucie amoniakiem jest groźne dla Ŝycia Do objawów zatrucia amoniakiem naleŜą drgawki, bełkotliwa mowa, upośledzenie ostrości widzenia, a w cięŜkich przypadkach śpiączka i zgon. Objawy te przypominają symptomy zespołu śpiączki wątrobowej, które występują wówczas, gdy stęŜenie amoniaku we krwi i prawdopodobnie w mózgu jest zwiększone. UwaŜa się, Ŝe zatrucie amoniakiem jest czynnikiem etiologicznym śpiączki wątrobowej. Zatem leczenie jej polega na stosowaniu metod zmniejszających stęŜenie amoniaku we krwi.

* Obecny w fizjologicznym pH prawie wyłącznie jako jon amonowy ^

350 / ROZDZIAŁ 31

TWORZENIE I WYDALANIE AMONIAKU PRZEZ NERKI UTRZYMUJE RÓWNOWAGĘ KWASOWO-ZASAD OWĄ Zawartość amoniaku we krwi Ŝyl nerkowych przewyŜsza jego stęŜenie w tętnicach nerkowych wskazując, Ŝe nerki wytwarzają amoniak, który przechodzi do krwi. JednakŜe wydalanie do moczu amoniaku wytwarzanego przez komórki kanalików nerkowych stanowi najwaŜniejszy aspekt metabolizmu amoniaku nerkowego. Wytwarzanie amoniaku, waŜny mechanizm kanalików nerkowych w regulacji równowagi kwasów o-zasad owej i zatrzymywania kationów, znacznie się zwiększa w kwasicy metabolicznej i maleje w zasadowicy. Ten amoniak nie pochodzi z mocznika, lecz z wewnątrzkomórkowych aminokwasów, zwłaszcza glutaminy. Uwalnianie amoniaku jest katalizowane przez nerkową glutaminazę (ryc. 31-8). ChociaŜ amoniak moŜe być wydalany jako sole amonowe — szczególnie w kwasicy metabolicznej — większość jego jest wydalana w postaci mocznika, głównego składnika azotowego moczu. Amoniak, stale produkowany w tkankach, ale obecny tylko w śladowych ilościach we krwi obwodowej (100 — 200 u.g/1), jest szybko usuwany z krąŜenia przez wątrobę i przekształcany w glutaminian, glutaminę lub w mocznik.

Syntetaza glutaminowa przekształca amoniak w nietoksyczną glutaminę do transportu między tkankami O usuwaniu amoniaku przez dehydrogenaze glutaminianową wspomniano powyŜej. Tworzenie glutaminy jest katalizowane przez syntetazę glutaminową (ryc. 31-9), enzym mitochondrialny, występujący w największych ilościach w tkance nerkowej. Synteza wiązania amidowego glutaminy dokonuje się kosztem hydrolizy ATP do ADP i P ; . Reakcja jest dlatego silnie uprzywilejowana w kierunku syntezy glutaminy.

II C II O O LGlutamlnlan

„u,

Mg-ATP SYNTETAZA GLUTAMINOWA Mg-AOP NH* H^

L-Glutamirta

RYC. 31-9. Reakcja katalizowana przez syntetazę glutaminową. Reakcja silnie uprzywilejowuje syntezę glutaminy.

L-Glutamlnlari

Ryc. 31 -8. Reakcja katalizowana przez glutaminaze zachodzi w zasadzie nieodwracalnie w kierunku tworzenia glutaminianu i HH^. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe usuwany jest azot amidowy, a nie azot s-aminowy.

Glutaminaza i asparaginaza uwalniają amoniak z glutaminy i asparaginy Uwalnianie azotu amidowego glutaminy w formie amoniaku zachodzi w wyniku hydrolitycznego usunięcia amoniaku, katalizowanego przez glutaminazę (ryc. 31-8). W reakcji katalizowanej przez glutaminazę, w odróŜnieniu od reakcji katalizowanej przez syntetazę glutaminową, nie biorą udziału nukleotydy adeninowe. Glutaminaza sprzyja tworzeniu glutaminianu, nie ma natomiast wpływu na syntezę glutaminy. Syntetaza glutaminowa i glutaminaza kataiizują wzajemną przemianę wolnego jonu amonowego i glutaminy (ryc. 31-10) w sposób przypominający wzajemną przemianę glukozy i glukozo-6-fosforanu katalizowaną przez glukokinazę i glukozo-6-fosfataze (p. rozdz. 18). Reakcja, analogiczna do reakcji katalizowanej przez glu-

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 351 Glu

Glu + Mg-ATP

Mg-ADP + P:

N \ i.'

Jon amonowy

Glutamina

H,0 Ryc. 31 -10. Wzajemna przemiana amoniaku i glutaminy katalizowana przez syntetaze glutaminową i glutaminazę, Obie reakcje przebiegają w kierunkach wskazanych strzałkami. Glutaminaza katalizuje wyłącznie deamidację glutaminy, natomiast syntetaza glutaminowa — wyłącznie syntezę glutaminy z glutarninianu. Glu — glutaminian.

taminazę, jest katalizowana przez L-asparaginazę zwierząt, roślin i bakterii. Zarówno asparaginaza, jak i glutaminaza były badane jako czynniki przedwnowotworowe, gdyŜ pewne nowotwory wykazują nieprawidłowo duŜe zapotrzebowanie na glutaminę i asparaginę. Wątroba przekształca amoniak w mocznik Podczas gdy w mózgu głównym mechanizmem usuwania amoniaku jest tworzenie glutaminy, w wątrobie najwaŜniejszym szlakiem jest tworzenie mocznika. Tkanka mózgowa moŜe tworzyć mocznik, chociaŜ to nie odgrywa większej roli w usuwaniu amoniaku. Tworzenie glutaminy w mózgu musi być w nim poprzedzone przez syntezę glutarninianu, poniewaŜ jego ilość dostarczana przez krew jest niewystarczająca w obecności duŜego stęŜenia amoniaku we krwi. Bezpośrednim prekursorem glutarninianu jest a-ketoglutaran, W ten sposób tworzenie glutaminy z amoniaku mogłoby szybko pozbawić cykl kwasu cytrynowego związków pośrednich, chyba Ŝe mogą one być zastąpione przez związki pośrednie powstałe przez przyłączenie CO2, tj. szczawiooctan powstały z przekształcenia pirogronianu (p. rozdz. 18). W mózgu rzeczywiście zachodzi w duŜym stopniu wbudowywanie CO2 w aminokwasy, prawdopodobnie w cyklu kwasu cytrynowego, i po wniknięciu amoniaku więcej szczawi o octanu włącza się w syntezę glutaminy (a nie asparaginianu) przez a-ketoglutaran.

MIĘDZYNARZĄDOWA WYMIANA UTRZYMUJE STAŁE STĘśENIE KRĄśĄCYCH AMINOKWASÓW Utrzymanie stanu stacjonarnego stęŜeń aminokwasów w osoczu między posiłkami zaleŜy od równowagi netto między aminokwasami uwolnionymi z endogennych zapasów białkowych i wykorzystanymi przez róŜne tkanki. Mięśnie wytwarzają więcej niŜ 50% całkowitej puli wolnych aminokwasów, podczas gdy wątroba jest miejscem enzymów cyklu mocznikowego niezbędnych do usuwania odpadków azotowych. Dlatego mięśnie i wątroba odgrywają główną rolę w określeniu stęŜenia krąŜących aminokwasów i ich wymianie. Mięśnie. Alanina i glutamina odpowiadają za ok. 50% całkowitego azotu ot-a mi no kwasowego uwolnionego z tkanki mięśniowej. Natomiast mięśnie stale wychwytują z krąŜema małe ilości seryny, cysteiny i glutaminianu. Wątroba i jelito. Wątroba i jelito (tkanki trzewne) nieprzerwanie pobierają z osocza znaczne ilości alaniny i glutaminy, główne aminokwasy uwalniane przez mięśnie. Wątroba jest najwaŜniejszym miejscem wychwytywania alaniny, zaś jelito — glutaminy. W jelicie większość grup aminowych glutaminy uwalnia się z tej tkanki jako alanina lub wolny amoniak. Seryna jest takŜe wychwytywana przez te same tkanki trzewne, jak równieŜ przez mięśnie. Nerki. Nerki są głównym źródłem uwalniania seryny; ponadto uwalniają one małe, ale znaczące, ilości alaniny. Nerki pobierają z krąŜenia glutaminę, prolinę i glicynę. W ten sposób istnieje dość ścisła zgodność między uwalnianiem większości aminokwasów z mięśni szkieletowych i ich wychwytywaniem przez tkanki trzewne. Mózg. Wychwytywanie waliny przez mózg przewyŜsza pobieranie wszystkich innych aminokwasów przez ten narząd. Zdolność mózgu szczura do utleniania aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (leucyna, izoleucyna i walina) jest co najmniej 4-krotnie większa niŜ mięśni i wątroby. ChociaŜ w stanie poresorpcyjnym znaczne ilości tych aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu są uwalniane z mięśni, nie są one pobierane przez wątrobę i dlatego istnieje moŜliwość, Ŝe mózg jest głównym miejscem ich wykorzystania.

352 / ROZDZIAŁ 31

ZłoŜony układ wymiany międzyn a rządowej charakteryzuje stan po resor pcyjny Rycina 3 1 - 1 1 podsumowuje stan poresorpcyjny. Wolne aminokwasy, szczególnie alanina i glutamina, są uwalniane do krąŜenia z mięśni.

Wątroba

Ryc. 31-11, Międzyn a rząd owa wymiana aminokwasów w stanie poresorpcyjnym. Wykazano kluczową role alaniny wśród aminokwasów uwolnionych z mięśni i jelita t wychwytywanych przez wątrobę. (Reprodukowano za zgodą z: Felig P.: Metabolizm aminokwasów u człowieka. Annu. Rev. Biochem, 1975; 44:937, Copyright 1975 przez Annual Reviews. Inc).

Alanina, która okazuje się być środkiem transportu azotu w osoczu, jest wychwytywana głównie przez wątrobę. Glutamina jest pobierana przez jelito i nerki, które przekształcają znaczną jej cześć w alaninę. Glutamina słuŜy takŜe jako źródło amoniaku do wydalania przez nerki. Nerki stanowią główne źródło seryny wychwytywanej przez takie tkanki jak wątroba i mięśnie. Aminokwasy o rozgałęzionym łańcuchu, zwłaszcza walina, są uwalniane przez mięśnie i pobierane głównie przez mózg. Alanina słuŜy jako kluczowy prekursor glukozy pochodzenia biaikowego, tj. kluczowy aminokwas glukoneogeniczny (ryc. 31-12). W wątrobie szybkość syntezy glukozy z alaniny i seryny jest duŜo większa niŜ obserwowana w przypadku wszystkich innych aminokwasów. Zdolność wątroby do glukoneogenezy z alaniny jest ogromna, aie nie osiągnie ona nasycenia, aŜ stęŜenie alaniny nie będzie równe 9 mmol/1, tj. 20—30-krotności jej poziomu fizjologicznego. Przewaga alaniny nad innymi a-aminokwasami wychwytywanymi z mięśni odzwierciedla jej syntezę w mięśniu przez łransaminację pirogronianu.

MIĘSIEŃ

WĄTROBA

Gfukoza

iPlrogronian _Mocznik Alanina Aminokwasy

Alanina

Ryc. 31-12. Cykl glukoza-alanina. Alanina jest syntetyzowana w mięśniach, przez transami nację pochodzącego z glukozy pirogronianu, uwalniana do krwtobiegu i wychwytywana przez wątrobę. W wątrobie szkielet węglowy alaniny jest przekształcany w glukozę, która uwalniana do krwiobiegu jest wychwytywana przez mięSnie i wykorzystywana do resyntezy alaniny. (Reprodukowano za zgodą z: Felig P,: Metabolizm aminokwasów u człowieka. Ann u. Rev. Biochem. 1975; 44:938, Copyright 1975 przez Annual Reviews. Inc).

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 353 -Ala

Ryc. 31-13. Miedzy aminokwasów zaraz

narządowa wymiana po posiłku.

Między narządowa wymiana rozgałęzionych aminokwasów

Mocznik tworzy się z amoniaku, dwutlenku węgla i 60%

następuje po Mięsień

posiłku Po przyjęciu boga to białkowego posiłku, tkanki trzewne uwalniają aminokwasy, głównie z łańcuchem rozgałęzionym (ryc. 31-13), natomiast mięśnie szkieletowe równieŜ głównie je wychwytują. Aminokwasy te po przyjęciu pokarmu są takŜe utleniane w mięśniach i prawdopodobnie słuŜą jako główne donory grup aminowych w transaminacji pirogronianu do alaniny. Aminokwasy o rozgałęzionym łańcuchu odgrywają specjalną rolę w metabolizmie azotu zarówno na czczo, kiedy dostarczają mózgowi źródła energii, jak i po posiłku, kiedy są wychwytywane głównie przez mięśnie i zachowane przez wątrobę. W mięśniach wydają się one stanowić waŜne źródło energii oraz azotu. MOCZNIK JEST GŁÓWNYM KOŃCOWYM PRODUKTEM KATABOLIZMU AZOTU U LUDZI Umiarkowanie aktywny męŜczyzna, spoŜywający dziennie ok. 300 g węglowodanów, 100 g tłuszczowi lOOgbiałka, musi wydalać ok. 16,5 g azotu w ciągu doby, przy czym 95% tej ilości jest wydalane przez nerki i pozostaie 5% z kalem. Głównym szlakiem wydalania azotu u ludzi jest mocznik syntetyzowany w wątrobie, uwalniany do krwi i wydalany przez nerki. U ludzi pozostających na diecie spoŜywanej w państwach zachodnich, mocznik stanowi 80—90% wydalanego azotu. 23 — Biochemia

Wątroba

asparaginianu w reakcjach cyklu mocznikowego Na rycinie 31-14 przedstawiono reakcje i związki pośrednie w biosyntezie 1 mola mocznika z 1 mola jonu amonowego, dwutlenku węgla (aktywowanego przez Mg2+ i ATP) oraz a-aminowego azotu asparaginianu. Cały proces wymaga 3 moli ATP (2 z nich są przekształcane do ADP + Pi, a 1 w AMP + PP() i sukcesywnego udziału 5 enzymów katalizujących reakcje ponumerowane na ryc. 31-14. Z 6 aminokwasów, uczestniczących w syntezie mocznika, 1 (N-acetyloglutaminian) działa jako aktywator enzymu, a nie jako związek pośredni. Pozostałe 5 — asparaginian, arginina, ornityna, cytrulina i argininobursztynian—wszystkie działają jako nośniki atomów, z których ostatecznie powstaje mocznik. Dwa z nich (asparaginian i arginina) występują w białkach, podczas gdy pozostałe 3 (ornityna, cytrulina i argininobursztynian) nie wchodzą w skład białek. Główną funkcją metaboliczną tych 3 ostatnich aminokwasów u ssaków jest udział w syntezie mocznika. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe wytwarzanie mocznika jest częściowo procesem cyklicznym. Ornityna wykorzystana w reakcji 2 jest regenerowana w reakcji 5. W ten sposób podczas syntezy mocznika nie ma Ŝadnych strat lub zysków ornityny, cytruliny, argininobursztynianu lub argininy; natomiast zuŜywa się jon amonowy, CO2, ATP i asparaginian.

354 / ROZDZIAŁ 31

2Mg-ATP

2M9-ADP + P,

HC-COOOOC-CH

TRANSKAflBAMOILAZA ORNfTYNOWA

Fu maran

coo CH Z -NH C QY\ SYNTETAZA AHGININOBURSZTYNIANOWA

Mg-ATP

COO" Arglnlnobursztynmn

coo-

AMP + Mg-PP,

COO" -CH C O O " LAsparagl rtian

Ryc. 31-14. Reakcje i produkty pośrednie biosyntezy mocznika. Grupy aminowe biorące udział w tworzeniu mocznika zaciemniono. * Enzymy mitochondrialne.

Synteza karbamoiłofosforanu z jonu amonowego i dwutlenku węgla wymaga 2 cząsteczek ATP Tworzenie karbamoiłofosforanu jest katalizowane przez syntetazę karbamoilofosforanową, enzym występujący w mitochondriach wątroby wszystkich organizmów ureotelicznych, łącznie z człowiekiem. 2 mole ATP, ulegające w czasie tej reakcji hydrolizie, dostarczają siły napędowej do syntezy 2 wiązań kowalencyjnych w karbamoilofosforanie — wiązania amidowego i mieszanego wiązania między kwasem karbo-

ksylowym a bezwodnikiem kwasu fosforowego. Oprócz Mg2 + wymagany jest kwas dwukarboksylowy. preferencyjnie N-acetyloglutaminian. Jego obecność powoduje głęboką zmianę konformacyjnij w strukturze syntetazy karbamoilofosforanowej, w wyniku której pewne grupy suifhydrylowe zostają wyeksponowane, inne schowane, a ponadto wpływa on na powinowactwo enzymu do ATP. Syntetaza karbamoilofosforanowa działa w połączeniu z mitochondrialną dehydrogenazą glutaminianową, przenosząc azot z glutaminia-

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 355

nu (i tym samym ze wszystkich aminokwasów; p. ryc. 31-3) na karbamoilofosforan i w końcu na mocznik. Podczas gdy stalą równowagi reakcji katalizowanej przez dehydrogenaze glutaminianową sprzyja raczej tworzeniu glutaminianu — niŜ amoniaku, to usuwanie amoniaku przez syntetazę karbamoilofosforanową i utlenianie a-ketoglutaranu przez enzymy cyklu kwasu cytrynowego w mitochondriach powodują uprzywilejowanie katabolizmu glutaminianu. Działanie to zwiększa obecność ATP. który, oprócz tego Ŝe jest substratem w syntezie karbamoilofosforami, pobudza jednokierunkowo aktywność dehydrogenazy glutaminianowej w stronę tworzenia amoniaku. Kondensacja karbamoilofosforanu z ornityną tworzy cytrulinę Utworzenie cytruliny +P( wskutek przeniesienia reszty karb amo ii owej z karbamoilofosforanu na ornitynę katalizuje transkarbamoilaza L-ornitynowa z mitochondriów wątroby. Reakcja jest bardzo swoista dla ornityny i równowaga reakcji przechyla się znacznie w stronę syntezy cytruliny (ryc. 31-14). Kondensacja cytruliny z asparaginianem tworzy arguiinobursztynian W reakcji katalizowanej przez syntetazę argininobursztynianową asparaginian i cytrulina łączą się razem przez grupę aminową asparaginianu. Reakcja wymaga ATP i jej równowaga przechyla się znacznie w stronę syntezy argininobursztynianu (ryc. 31-14). Rozszczepienie argininobursztynianu tworzy argininę i fumaran Odwracalne rozszczepienie argininobursztynianu do argininy i fumaranu katalizuje argininobursztynaza, enzym wątroby i nerek ssaków. Reakcja przebiega na zasadzie eliminacji trans. Utworzony fumaran moŜe w reakcjach katalizowanych przez fumarazę i dehydrogenaze jablczanową przekształcić się w szczawiooctan, który ulega trans animacji, regenerując asparaginian. Rozszczepienie argininy uwalnia mocznik i odtwarza ornitynę Reakcja ta zamyka cykl mocznikowy i regeneruje ornitynę, substrat dla reakcji 2. Hydrolityczne rozszczepienie grupy guanidynowej argininy katalizuje arginaza występująca w wąt-

robie wszystkich organizmów ureotelicznych. Mniejsze ilości arginazy występują takŜe w tkance nerkowej, mózgu, gruczołach sutkowych, tkance jąder i skórze. Co2+ lub Mn2+ aktywują arginazę wątroby ssaków. Ornityną i lizyna są potencjalnymi inhibitorami kompetycyjnymi argininy.

ZNANE ZABURZENIA METABOLICZNE SĄ ZWIĄZANE Z KAśDĄ REAKCJĄ CYKLU MOCZNIKOWEGO Szybkość syntezy mocznika ograniczają reakcje katalizowane przez syntetazę karbamoilofosforanową (reakcja 1), transkarbamoilazę ornitynową (reakcja 2) i arginazę (reakcja 5) (ryc. 31-14). PoniewaŜ cykl mocznikowy przekształca toksyczny amoniak w nietoksyczny mocznik, wszystkie zaburzenia syntezy mocznika powodują zatrucie amoniakiem. NajcięŜsze zatrucia występują w przypadkach, gdy blok metaboliczny dotyczy reakcji 1 lub 2 poniewaŜ w wyniku syntezy cytruliny występuje pewnego stopnia kowalencyjne wiązanie amoniaku z węglem. Klinicznymi objawami wspólnymi dla wszystkich zaburzeń cyklu mocznikowego są: wymioty w wieku niemowlęcym, unikanie pokarmów bogatobiałkowych, ataksja przerywana, nerwowość, letarg i opóźniony rozwój umysłowy. Objawy kliniczne i leczenie wszystkich 5 omówionych poniŜej zaburzeń są podobne. Znaczną poprawę obserwuje się przy spoŜywaniu pokarmów o małej zawartości białka, co moŜe w duŜym stopniu zapobiec uszkodzeniu mózgu. Aby uniknąć gwałtownego zwiększenia stęŜenia amoniaku we krwi, poŜywienie naleŜy rozłoŜyć na częste, niewielkie posiłki. Hiperamonemia typu I. Opisano ok. 24 przypadków niedoboru syntetazy karbamoilofosforanowej (reakcja 1, ryc. 31-14). Jest to prawdopodobnie zaburzenie rodzinne. Hiperamonemia typu I I . Zaburzenie to

jest związane z chromosomem X i powoduje je niedobór transkarbamoilazy ornitynowej (reakcja 2, ryc. 31-14). U matek takŜe występuje hiperamonemia i niechęć do pokarmów bogatobiałkowych. Stałym objawem jest zwiększone stęŜenie glutaminy we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym i moczu. Przypuszczalnie odzwierciedlą to zwiększoną syntezę glutaminy przez syntćjaSe glutaminową spowodowaną zwiększony natęŜeniem amoniaku w tkankach.

356 / ROZDZIAŁ 31

Cytrułinemia. To rzadkie zaburzenie jest prawdopodobnie dziedziczone jako cecha recesywna. Znaczne ilości (1—2 g na dobę) cytruliny wydalają się z moczeni i zarówno w osoczu, jak i w płynie mózgowo-rdzeniowym stęŜenie cytruliny jest znacznie zwiększone. U 1 chorego zaobserwowano całkowity brak aktywności syntctazy argminobursztynianowej (reakcja 3, ryc. 31-14). U innego Kmdla cytmliny była 25 razy większa od wartości prawidłowej. Sugeruje to mutację powodującą znaczną, ale nie ,,letalną", modyfikację miejsca katalitycznego syntetazy. Cytrulina (i argininobursztynian; p. niŜej) moŜe słuŜyć jako nośnik azotu, skoro zawiera ona azot przeznaczony do syntezy mocznika. Podawanie argininy zwiększa u tych chorych wydalanie cytruliny. Podobnie podawanie benzoesanu nasila wbudowywanie azotu amoniaku w hipuran przez glicyne fp. ryc. 33-1).

Acyduria argininobursztynianowa. Ta rzadka, recesywnie dziedziczna choroba, charakteryzująca się zwiększonym stęŜeniem argininobursztynianu we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym i moczu, często wiąŜe się z występowaniem łamliwych, rosnących kępkami włosów (trichorrhexis nodosa). ChociaŜ są znane zarówno wczesne, jak i późniejsze początki choroby, pojawia się ona zawsze w 2 roku Ŝycia i zazwyczaj kończy się zgonem w dzieciństwie. Acyduria argininobursztynianowa jest skutkiem braku aktywności argininobursztynazy (reakcja 4, ryc, 31-14). Hodowane fibroblasty skóry zdrowych ludzi zawierają ten enzym, natomiast nie stwierdza się jego obecności w fibroblastach chorych z acydemią argininobursztynianowa.. Argininobursztynaza nie występuje równieŜ w mózgu, wątrobie, nerkach i erytrocytach chorych z tym zaburzeniem. ChociaŜ moŜna je łatwo zdiagnozować. na podstawie dwuwymiarowej chromatografii bibułowej moczu, po wybarwieniu pojawiają się nieprawidłowe plamki z powodu tendencji argininobursztynianu do tworzenia cyklicznych bezwodników, to potwierdzeniem rozpoznania jest pomiar erytrocytarnego stęŜenia argininobursztynazy. W celu wczesnego wykrycia zaburzenia,

ten test moŜna przeprowadzić na krwi z pępowiny. PoniewaŜ argininobursztynaza jest obecna w komórkach z płynu owodniowego, moŜliwa jest równieŜ diagnoza przez nakłucia owodni. Z powodów opisanych przy omawianiu cytrulinemii, podawanie argininy i benzoesanu sprzyja znacznemu wydalaniu azotu równieŜ u tych chorych. Hiperargininetnia. To zaburzenie w syntezie mocznika charakteryzuje sie zwiększonym stęŜeniem argininy we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym, małym stęŜeniem arginazy w erytrocycie (reakcja 5, ryc. 31-14) i składem aminokwasów w moczu przypominającym lizyno-cystynurię. Prawdopodobnie skład ten odzwierciedla współzawodnictwo argininy z Hzyną i cysty ną w reabsorpcji w kanaliku nerkowym. U chorych z hiperargininemią ubogobiałkowa dieta zmniejsza stęŜenie amoniaku w osoczu i powoduje zanik profilu aminoacydurii, obserwowanej w lizyno-cystynurii.

PIŚMIENNICTWO Adams E, Frank L: Metabolism of proline and the hydroxyprolines. Annu Rev Biochem 19K0;49:1005. Batshaw ML et al: Treatment of inbom errors of urea synthesis: Actwation of alternative pathways of waste nitrogen synthesis and escretion, JV Engl J Med 1982;3«i:1387. Felig P: Amino acid metabolism in man. Annu Rev Biochem 1975;44:933. Msall M et al: Neurologie outeome in chiidren with inborn errors of urea synthesis: Outeome of urea-cydeenzymopathies. NEnglJMed 1984;3Jft]500. Rosenberg LE, Scriver CR: Disorders of amino acid metabolism. Chapter 11 in: Metabotic Contro! and Disease. Bondy PK, Rosenberg LE (cditors). Saunders, 1980. Stanbury JB et al: The Mctabolk Basis oj htherited Disease, 5th ed. McGraw-Hill, 1983. Torchinsky YM: Tran sami na tion: Its discovery, biologicai and clinical aspects (1937-1987). Trends Biochem Sci 1987:12:115. Wellner D, Meister A: A s«rvey of inborn errors of amino acid metabolism and transport in man. Annu Rev Biochem 19S1;5O:911.

Katabolizm szkieletów węglowych aminokwasów

32

Victor W. Rodweil, PhD

WPROWADZENIE Ten rozdział dotyczy przekształcenia szkieletów węglowych, pospolitych L-aminokwasów w amfiboliczne związki pośrednie oraz chorób metabolicznych lub „wrodzonych wad metabolizmu" skojarzonych z tymi szlakami metabolicznymi.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Historycznie niektóre zaburzenia w metabolizmie aminokwasów odegrały kluczową rolę w wyjaśnieniu szlaków, w których u zdrowego człowieka aminokwasy ulegają przemianie. Choroby te naleŜą do rzadkości i wydaje się mało prawdopodobne, aby miała z nimi do czynienia, większość lekarzy praktyków. Zaburzenia te jednak stary się groźnym wyzwaniem dla psychiatry, pediatry, konsultanta z genetyki albo biochemika. Wykrywa się je najczęściej u dzieci. Niejednokrotnie są przyczyną śmierci we wczesnym wieku i nie leczone powodują często nieodwracalne uszkodzenia mózgu. Istotne jest wczesne ich rozpoznanie i natychmiastowe, jeŜeli to moŜliwe, podjęcie właściwego leczenia. Niektóre enzymy związane z wadami metabolizmu aminokwasów dają się wykryć w hodowli komórek płynu owodniowego, wobec tego moŜliwa jest diagnostyka prenatalna przez nakłucie o wodni. Obecne leczenie polega przede wszystkim na stosowaniu diety ubogiej w aminokwasy, których katabolizm jest uszkodzony. Technologia rekombinacji DNA moŜe ewentualnie dostarczyć środka korygującego wady genetyczne w wyniku „terapii genowej". Te zaburzenia metaboliczne są wyrazem mu-

tacji genetycznych powodujących wytwarzanie białek o zmodyfikowanych strukturach pierwszorzędowych. Podczas gdy niektóre zmiany w sekwencji aminokwasowej enzymów mają tylko niewielki wpływ albo nawet nie okazują Ŝadnego wpływu, inne mogą głęboko naruszać strukturę trzeciorzędową centrów katalitycznych lub regulatorowych. Zmodyfikowany lub zmutowany enzym moŜe mieć zmienioną skuteczność katalityczną (mała wartość Vmai(S, bądź duŜa Km), albo zaburzoną zdolność wiązania allosterycznego regulatora jego aktywności. RóŜnorodne mutacje mogą wywoływać te samą chorobę, np, jakaś mutacja, która znacznie zmniejsza funkcję katalityczną liazy argininobursztynianowej (p. ryc. 31-14), wywoła wadę metaboliczną znaną jako kwasica (acydemia) argininobursztynianowa. Jest jednak wielce nieprawdopodobne, aby wszystkie przypadki tej kwasicy reprezentowały tę samą zmianę struktury pierwszorzędowej liazy argininobursztynianowej. Na poziomie cząsteczek są to odrębne choroby molekularne. Niektóre znane zaburzenia metabolizmu aminokwasów omówiono w tym rozdziale. Po inne przykłady Czytelnik powinien sięgnąć do waŜniejszych publikacji przeglądowych, które specjalizują się w tym zagadnieniu, np. Scriver i wsp. The Mełabolic Basie of Inherited Disease, wyd. 6, 1989.

AMINOKWASY SĄ PRZEMIENIANE W SUBSTRATY DO BIOSYNTEZY WĘGLOWODANÓW I LIPIDÓW Prace badawcze z okresu 1920—1940 dotyczące odŜywiania, potwierdzone przez doświadczenia przeprowadzone w latach 1940—1950,

358 / ROZDZIAŁ 32

Ac8ioacetyto-CoA

Asparagmtan

Lys Phe Trp Tyr

Asn

Tabela 32-1. Losy szkieletów węglowych powszechnie występujących L- a -aminokwasów Aminokwasy przekształcone w amfiboliczne związki pośrednie tworzące glikogen i tłuszcza glikogen tłuszcze (aminokwasy (aminokwasy (aminokwasy i ketogenne} glukogenne) ketogenne) Ala

Hyp

Arg Asp

Met Pro Ser Thr Val

Cys

Glu Glv His

Leu

Ile Lys

Phe Trp Tyr

z uŜyciem aminokwasów znakowanych izotopowo, podtrzymały pogląd, o wzajemnej przekształca Iności atomów węgla tłuszczu, węglowodanu i białka oraz ustaliły, Ŝe kaŜdy amino-

Ryc. 32-1. Amfiboliczne produkty pośrednie powstające ze szkieletu węglowego aminokwasów.

kwas moŜe być przemieniany bąóŜ w węglowodan (13 aminokwasów), tłuszcz (1 aminokwas), bądź w oba typy tych związków (5 aminokwasów) (tab. 32-1). Rycina 32-1 przedstawia przebieg owych wzajemnych przekształceń.

REAKCJĄ WSTĘPNĄ DLA WIELU AMINOKWASÓW JEST USUNIĘCIE AZOTU (-AMINOWEGO Usunięcie azotu ac zazwyczaj (ale nie zawsze, przykładem: prolina, hydroksyprolina, lizyna) obejmuje transaminację. A20t ten, jak tylko zostanie usunięty, moŜe być wykorzystany w procesach anabolicznych (np. w biosyntezie białka) Jub przekształcony w mocznik i wydalony. Pozostający szkielet węglowy, wolny od azotu, w większości przypadków jest utlenionym węglowodorem, ulegającym degradacji do ainfibolicznych związków pośrednich w reak-

KATAB0L1ZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 359

H.O

CT

|ASPARAGINAZA I COO" LAsparaglna

PYR

ALA

H - C - l AMINOTRANSFERAZ/ COO L-Asparaginian

PYR

NH.

ALA

CH;

AMINOTRANSFBWA L-Giulamlnlan

V COO" LGlutamlna

GLUTAMINAZA

Szczawiooctan

c=o I COO" a-

CHj,

H,o

C-0

cocr

Ketag tu taran

coo -

Ryc, 32-2. Katabolizm L-asparaginy (góra) i L-glutaminy (dól) w amfiboliczne związki pośrednie. PYR — pirogronian, ALA — L-alanina. Zaciemnienie grup funkcyjnych na tej rycinie i następnych uwydatnia części cząsteczek ulegające przemianie chemicznej.

cjach podobnych do tych, przy udziale których inne utlenione węglowodory są katabolizowane. Deamidacja asparaginy dostarcza asparaginianu, który ulega transami nacji, tworząc szczawiooctan Wszystkie 4 węgle asparaginy i asparaginianu przekształcają się w szczawiooctan przy udziale asparaginazy i aminotransferazy (ryc. 32-2, góra). Nie jest znana wada metaboliczna związana z tym krótkim szlakiem kata bo licznym. Wada w transaminacji moŜe mieć konsekwencje, które nie są do pogodzenia z Ŝyciem, poniewaŜ aminotransferazy spełniają centralne funkcje zarówno w anabolizmie, jak i w katabolizmie. Deamidacja glutaminy dostarcza glutaminianu, który ulega transami nacji, tworząc a-ketoglutaran Katabolizm glutaminy i glutaminianu przebiega podobnie jak asparaginy i asparaginianu, ale z powstaniem ct-ketogmtaranu (2-oksoglutaranu*) (ryc. 32-2. dól). Wprawdzie zarówno glut a mi niań, jak i asparaginian są substratami dla tej samej aminotransferazy, deamidację asparaginy i glutaminy katalizują odrębne enzymy: glutaminaza i asparaginaza. Przyp. tłum.

Prawdopodobnie z powodów podanych powyŜej dla asparaginy i asparaginianu nie są znane wady metaboliczne szlaku katabolicznego glutamina—glutaminian. Wszystkie 5 atomów węgla proliny tworzą -j-ketoglutaran Prolina utlenia się do dehydroproliny, która po przyłączeniu cząsteczki wody tworzy y-semialdehyd glutaminianu. Ulega on utlenieniu do glutaminianu i transaminacji do ot-ketoglutaranu (ryc. 32-3, na lewo). Opisano 2 genetycznie odrębne hiperprolinemie, obie jako wyraźnie autosomalne cechy recesywne. Pomimo opóźnienia w rozwoju umysłowym w połowie znanych przypadków, Ŝaden typ nie zagraŜa Ŝyciu. Hiperprolinemia typu I. Miejscem bloku metabolicznego w tej hipcrprolinemii jest dehydrogenaza prolinowa (ryc. 32-3). W przeciwieństwie do hiperprolinemii typu II, brak tu uszkodzenia katabolizmu hydroksyproliny. Heterozygoty typu I wykazują tylko łagodną hiperprolinemię. Model zwierzęcy, mysz Pro/Re, ma tylko 10% aktywności dehydrogenazy prolinowej prawidłowej wątroby, Hiperprolinemia typu I I . Blok metaboli-

czny jest umiejscowiony w dehydrogenazie, która katalizuje utlenianie 7-semialdehydu glutaminianu do glutaminianu (ryc. 32-3). Enzym ten funkcjonuje w katabolizmie hydroksy proliny (p. niŜej). Okazuje on zatem wpływ zarówno na

360 / ROZDZIAŁ 32 REAKCJA NIEENZYMATYCZNA

DEHYDROGENAZA PROLINOWA

L-Ornltyna NH/ a-Keloglutaran AMINOTHANSFERAZA

y-Se ml aldehyd L-glutamlnlanu

NAD"1 0EHYDH0GENA2A SEMIALDEHYDO-L-GLUT AMINOWA

NADH+H+

CH

L-Glutammlan i

^Pyr

AMIŃOTRANSFEHAZA| (

^Ala O n-Ketoglutaran

Ryc. 32-3. Katabolizm proliriy (na lewo) 1 L-argininy (na prawo) w a-ketoglularan. Cyfry w kółkach zaznaczają miejsca wad metabolicznych. 1 — hiperprolinemia typu I, 2 — hiperprolinemia typu II, 3 — hiperargininemia (p. rozdz. 31),

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 361

katabolizm proliny, jak i hydroksyproliny, a mocz zawiera A^pirolinoO-hydroksy^-karboksytan, kataboiit hydroksyproliny (p. ryc. 32-12). Heterozygoty typu II, niepodobnie do heterozygot typu I, nie wykazują Ŝadnej hiperprolinemii. Arginaza przekształca argininę w ornitynę, która, ulegając transaminacji na węglu s, tworzy oc-ketoglutaran Wprawdzie arginina i histydyna równieŜ tworzą a-ketoglutaran, najpierw z tych 6-węglowych aminokwasów muszą zostać usunięte: 1 atom węgla oraz 2 (histydyna) lub 3 (arginina) atomy azotu. W przypadku argininy proces ten wymaga tylko 1 etapu; hydroli ty czne go usunięcia grupy guanidynowej. katalizowanego przez arginazę. Produkt reakcji, ornityna, ulega wtedy transaminacji na grupie 5-amitiowej, tworząc y-semialdehyd glutaminianu, który przekształca się w a-ketoglutaran w sposób opisany powyŜej dla proliny (ryc. 32-3).

AMONIAKOLIAZA HISTYDYNOWĄ

HYDRATAZA UR0KAN1AN0WA (UROKANAZA)

Hiperargininemię, zaburzenie metaboliczne spowodowane niedoborem arginazy, omówiono w rozdz. 31 wraz z wadami metabolicznymi cyklu mocznikowego, Katabolizm histydyny ostatecznie dostarcza oc-ketoglutaranu W przypadku histydyny usuniecie zbędnego atomu węgla oraz azotu wymaga 4 reakcji (ryc. 32-4). Deaminacja histydyny wytwarza urokanian. Przekształcenie urokanianu w 4-imidazoIono-5-propioaian, katalizowane przez urokanazę, obejmuje zarówno przyłączenie cząsteczki wody, jak i wewnątrzcząsteczkowa reakcję oksydoredukcyjną. Wprawdzie 4-imidazolono-5-propionian moŜe sie włączyć w dodatkowe szlaki metaboliczne, jego przekształcenie w a-ketoglutaran obejmuje hydrolizę do Nformiminoglutaminianu, a następnie przeniesienie grupy formiminowej na węgiel ot tetrahydrofolianu, z utworzeniem N5-fonniminotetrahydrofolianu. U chorych z niedoborem kwasu foliowego zachodzi częściowe lub całkowite zablokowanie tej oslatniej reakcji i N-formiminoglutaminian (Figlu) jest wydala-

O

o

N- Fo rm Im inog! utam i n ia n (Figlu) H,folian FORM1MINOTRANS FEH AZA GLUTAM1NIAN0WA N°-Formi(nino H,folian

4

a

L-G lutami niań

[AMINOTRANFERAZAJ Rvc. 32-4. Katabolizm L-histydyny w a-ketogfutaran. Reakcja katalizowana przez amonia-koliazę histydynową (Inaczej: histydaza — nazwa nie zatecana) reprezentuje miejsce prawdopodobnej wady metabolicznej w histydynemii.

V

■O

4

6

a-Kato gluta ran

362 / ROZDZIAŁ 32

ny w moczu. To stało się podstawą testu na niedobór kwasu foliowego. Polega on na wykrywaniu w moczu N-formiminoglutaminianu po wprowadzeniu duŜej dawki histydyny. Histydynemia jest dziedziczona jako autosomalna cecha recesywna. Ponad polowa dotkniętych nią osób jest opóźniona w rozwoju umysłowym i wykazuje charakterystyczną wadę wymowy. W uzupełnieniu do zwiększonych zawartości histydyny we krwi i w moczu zwiększa się wydalanie imidazolopirogronianu (który w barwnej próbie z chlorkiem Ŝelazowym moŜe być pomylony z fenylopirogronianem i stać się przyczyną błędnego rozpoznania fenyloketonurii). Metaboliczną wadą w histydynemii jest niedostateczna aktywność w wątrobie amoniako-liazy histydynowej (inaczej: histydazy — nazwa nie zalecana), co uszkadza przekształcanie histydyny w urokanian (ryc. 32-4). Sprzyja to transami nacji do imidazolopirogronianu. W moczu wydala się nadmiar imidazolopirogronianu, a takŜe produktów jego redukcji, tj. imidazolooctanu oraz imidazolomleczanu. Wydatne zwiększenie wydalania histydyny cechuje prawidłową ciąŜę. Jest to odzwierciedleniem zmian w czynności nerek. 6 AMINOKWASÓW TWORZY PIROGRON1AN Wszystkie atomy węgla glicyny, alaniny, cysteiny i seryny — ale tylko 2 atomy węgla treoniny — formują pirogronian, który moŜe być następnie przekształcony w acetylo-CoA. L-Treonina

I

Glicyna I L-Sery na Cysty na

I

L-

i

L- Alanina -• Pirogronian*-L-Cystei na

I

Acetylo-CoA

Katabolizm glicyny przebiega z udziałem rozszczepiającego ją systemu Wprawdzie glicyna moŜe utworzyć pirogronian w wyniku przekształcenia w serynę (ryc. 32-5), główny szlak katabo]izmu glicyny u kręgowców obejmuje przekształcenie w CO2, NH + i Ns, N'°-metylenotetrahydrofolian, katalizo-

H^Folian

m

Mety ten oH41o!lan

Gil cyna

O L-Seryna

Ryc. 32-5. Łatwo odwracalna reakcja hydroksymetylotransferazy serynowej. H4 foilan — tetrahydrololian.

wane przez kompleks syntazy glicynowej. Ta odwracalna reakcja (ryc. 32-6) pod niektórymi względami przypomina przemianę pirogronianu w acetylo-CoA przy udziale enzymów kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej. Oba kompleksy stanowią makromolekularne agregaty w mitochondriach wątroby. Reakcje systemu rozszczepiającego glicynę są prawdopodobnie główną drogą nie tylko w katabolizmie glicyny, lecz takŜe seryny u ludzi i wielu innych kręgowców. Glicynuria. To rzadko występujące zaburzenie charakteryzuje się nadmiernym wydalaniem glicyny w moczu i tendencją do tworzenia szczawianowych kamieni nerkowych. Wydaje się ona być cechą dominującą, prawdopodobnie sprzęŜoną z chromosomem X. Przy prawidłowych stęŜeniach glicyny w osoczu, wydalanie tego aminokwasu w moczu sięga 8,1—13,5 mmol/24 h (600—1000 mg/24 h), wobec czego glicynurię przypisuje się niewydolności wchłaniania zwrotnego (Inaczej: reabsorpcji) glicyny w kanalikach nerkowych.

Pierwotna hiperoksaluria. Charakteryzuje się ciągłym, wzmoŜonym wydalaniem w moczu szczawianów, niewspółmiernym do ich pobierania w poŜywieniu. W następstwie postępującej obustronnie szczawiano-wapniowej kamicy moczowej, wapnicy nerek {nephrocakinosis) i nawracającego zakaŜenia dróg moczowych dochodzi w dzieciństwie lub we wczesnej młodości do zgonu z powodu niewydolności nerek lub nadciśnienia. Nadmiar szczawianów najwidoczniej pochodzi z glicyny, która moŜe ulec deaminacji do glioksylanu, prekursora szczawianu. Wada metaboliczna jest zaburzeniem przemiany glioksyjanu związanym z zaburzeniem w katabolizmie glioksylanu, którego nadmiar utlenia się do szczawianu.

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 363 H.Follan

,O~ + NAD

PLP

■*-

NH4+ + NAOH + H+

SYNTAZA GLICYNOWA

o Gllcyna Ryc. 32-6. Odwracalne przesunięcie glicyny przez mitochondrialny kompleks syntazy glicynowej. PLP — fosforan pirydoksalu.

NH ■

HX

HO

T o

O

NH L-Alanina

L-Seryna

c

' -c-°" DEHYDRATAśA 1 SERYNOWA

Ryc. 32-7. Przemiana alaniny i seryny w pirogronian. Reakcje katalizowane zarówno przez aminotransferazę alaninową, jak i dehydratazę serynową wymagającą fosforanu pirydoksalu. Reakcja katalizowana przez dehydratazę serynowg przebiega z usunięciem cząsteczki H2O z seryny, tworząc nienasycony aminokwas. Ten jest przeorganizowany w cc-iminokwas, który samorzutnie hydrolizuje do pirogronianu i amoniaku. Glu — glutami niań, oc-KG — a-ketoglutaran.

Tran sam i nacja alaniny dostarcza pirogronianu Pirogronian utworzony w wyniku transaminacji alaniny (ryc. 32-7) moŜe być dekarboksylowany do acetylo-CoA, w reakcji katalizowanej przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej. Prawdopodobnie, z przyczyn wymienionych przy katabolizmie glutaminianu i asparaginianu, nie wykryto Ŝadnego metabolicznego zaburzenia w katabolizmie a-alaniny. Katabolizm seryny przebiega poprzez jej przekształcenie w glicynę Przemiana seryny w pirogronian, katalizowana przez dehydratazę serynową, enzym z fosforanem pirydoksalu, obejmuje usunięcie cząsteczki wody i hydrolityczną stratę amoniaku z intermediatu aminokwasu (ryc. 32-7). Wprawdzie w wątrobie szczura i świnki morskiej przekształcenie seryny w pirogronian katalizuje dehydrataza serynową, u człowieka i wielu innych kręgowców seryna rozpada się głównie do glicyny oraz N5,N1(1-metylenotetrahydro foliami. Reakcję początkową katalizuje hydroksymetylotransferaza serynowa (ryc. 32-5). Dalszy katabolizm seryny pokrywa się z katabolizmem glicyny {ryc. 32-6).

Reduktaza cystynowa redukuje cystynę do cysteiny Siarka, podobnie jak węgiel i azot, ulega ciągłej recyklizacji w biosferze w wyniku zespolonych aktywności metabolicznych organizmów prokariotycznych i eukariotycznych. Ssaki uczestniczą w tym cyklu przez katabolizm organicznych związków siarki w nieorganiczne. Na przykład człowiek wydala 20—30 mmol siarki na dobę, przewaŜnie w postaci nieorganicznych siarczanów. Głównym katabolicznym przeznaczeniem cystyny u ssaków jest jej przekształcanie w cysteinę, katalizowane przez reduktazę cystynowa (ryc. 32-8). Katabolizm cystyny łączy się następnie z katabolizmem cysteiny. Przekształcenie cysteiny w pirogronian moŜe obejmować wstępną reakcję utleniania Katabolizm cysteiny odbywa się w 2 szlakach: bezpośredniego utleniania (suliinian cysteiny) i szlaku transaminacji (3-merkaptopirogronian). Przekształcanie cystyny w sulfinian cysteiny (ryc. 32-9) jest katalizowane przez dioksygenazę cysteinową, enzym wymagający Fe2+ i NAD(P)H. Dalszy katabolizm cysteinosulfinianu obejmuje prawdopodobnie transami-

364 / ROZDZIAŁ 32

1

&

N

REDUKTAZA CYSTYNOWA!

! CH, ł

O "

ł

NADH + H

NAD L-

i

II

II O

Cyslyna Ryc. 32-8. Reakcja

L-Cystelna

katalizowana przez reduktaze cystynowa

+

NH3

T O Cystelna [O] DIOKSYGENAZA \ CYSTEINOWA a-K eto kwas

{(-Aminokwas

J

AMiNOTRANSFERAZA

L-Cysteinosulfinlfln

9

C II O

0

H,C'^C' " a-Aminokwas

Plrogronian

0-Sufflnylopirooronlan [SWHKOTHANSFE DESULFINAZA

h 2"

3-Markaptoptrcgranian (tło piróg ronlan)

2H HXS

NADH H

C DEKYDROGENAZA MLEC2AN0WA

+

NAD

3

1

HS

C

3-Merkaptomleczan

A

Plrogronlan

Ryc. 32-9. Katabolizm L-cysteiny na szlaku bezpośredniego utlenienia (cysteinosulfinian) (na lewo) oraz na szlaku transaminacji (3-merkaptopirogronian) (naprawo), p-sulfinylopirogronian jest przypuszczalnym związkiem pośrednim. Utlenienie siarczynu, utworzonego w ostatniej reakcji na szlaku bezpośredniego utleniania, jest katalizowane przez oksydazę siarczynową, st-KA — a-ketokwas, a-AA — a-aminokwas.

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 365

nację do [ł-sulfinylopirogronianu, chociaŜ ten katabolit powinien być jeszcze wyizolowany. Przekształcenie p-sulfinylopir ogromami wpirogronian i suMInian moŜe nie być katalizowane enzymatycznie. Desulfinacja zachodzi niezwykle szybko, nawet w nieobecności katalizy enzymatycznej. Wstępna transaminacja cysterny dostarcza 3-merkaptopirogronianu Swoiste aminotransferazy: cysteinowa oraz glutaminianowa bądź asparaginianowa z wątroby i nerek ssaków katalizują odwracalną transaminację cysteiny w 3-merkaptopirogronian (tiolopirogronian) (ryc. 32-9). Cząsteczka 3-merkaptopirogronianu moŜe następnie zostać zredukowana przez dehydrogenazę L-mleczanową. Produkt, 3-merkaptomleczan, prawidłowy składnik moczu ludzkiego w postaci jego mieszanego disiarczku z cysteiną, wydala się w zwiększonych ilościach z moczem chorych Ł

nia atomu siarki*^ tworząc pirogronian i H2S (ryc. 32-9). W tabeli 32-2 podsumowano znane zaburzenia katabolizmu aminokwasów siarkowych.

Cystynuria (cystyno-lizynuria) W tej dziedzicznej chorobie metabolicznej wydalanie cystyny z moczem przewyŜsza 20—30-krotnie wartości prawidłowe. Towarzyszy temu równieŜ znaczne zwiększenie wydalania lizyny, argininy i ornityny, co sugeruje upośledzenie mechanizmów wchłaniania zwrotnego w nerkach tych 4 aminokwasów. „Cystynuria" jest więc nazwą niewłaściwą. Cystyno-lizynuria moŜe być teraz preferowanym terminem opisowym tej choroby. Z powodu względnej nierozpuszczalności cystyny, u chorych z cystynuria wytrąca się ona w kanalikach nerkowych i tworzy kamienie cystynowe. Gdyby nie moŜliwość takiego powikłania, cystynuria byłaby zupełnie nieszkodliwą wadą.

disulfidurią merkaptomleczano-cysteinową. Al-

ternatywnie, 3-merkaptopirogronian ulega desulfuracji (odsiarczaniu, ij. reakcji odszczepie-

Przyp. tlura.

Tabela 32-2. Wrodzone wady w metabolizmie aminokwasów zawierających siai Nazwa Wada Hornocystynuria 1 Homocystyrturia II Homocystynuria III

f)-syntaza cystati on inowa 5 T0 Reduktaza N ,N -mety len otetra hydrofolianowa s Mała aktywność transmetylazy N -metylotetrahydrofoliano-homocystei nowej wskutek niezdolności do syntezy merylokobalaminy

kę

Odsyłacze

Ryc 30-9, reakcja 1

s

Homocystyrturia IV

Mała aktywność transmetylazy N -metylotetrahycirofoliano-homocysteinowej wskutek zaburzenia wchłaniania kobalamirsy w jelicie

Hipermeiioninemia

Adenozylotransferaza metioninowa wątroby*

Ryc. 32-22

Cysta tionimiria

y-Liaza cystationinowa (cystationaza)

Ryc. 30-9, reakcja 2

Sulftturia (sulfocysieinuria) Cysrynoza Disulfidurią 3-merkaptopirogroniano-cysteinowa

Oksydaza siarczynowa Ryc. 32-9, legenda 2Laburzenie funkcjonowania lizosomów Siarkotransferaza 3-merkaptopirogro- Ryc. 32-9 nianowa

Syndrom niedostatecznej absorp- Niewydolność wchłaniania metioniny cji metioniny z jelita MoŜe równieŜ występować w cystationirturii, tyrozynemii i nietolerancji na fruktozę.

366 / ROZDZIAŁ 32

wstawać kosztem cysteiny, zmniejsza skłonność do tworzenia kryształów cystyny i kamieni.

C H 2 -$ -S - C H 2 HCNH3+

CH2

COO-

HCNH,'

Cystynoza (choroba spichrzania cys-

ćoo(Cystelna)

(Homocysteina}

Ryc. 32-10. Mieszany disiarczek cysieiny i homocysteiny.

Mieszany disiarczek L-cysteiny i L-homocysteiny (ryc. 32-10), występujący w moczu chorych z cystynurią, jest nieco lepiej rozpuszczalny niŜ cystyna. Rozległość, w jakiej on moŜe poHO

tyny). W cystynozie, która jest równieŜ chorobą dziedziczną, kryształy cystyny odkładają się w wielu tkankach i narządach (szczególnie w układzie siateczko w o-śródbłonko wy m). Towarzyszy jej zazwyczaj uogólniona aminoaeyduria. Inne czynności nerek są równieŜ przewaŜnie uszkodzone, a chorzy zwykle umierają we wczesnym wieku z wszystkimi objawami ostrej niewydolności nerek. Homocystynurie. Częstotliwość występowania tych wrodzonych wad katabolizmu metioniny ocenia się na ok. 1/160000 urodzeń. Homocystyna (do 2,22 mmol/24 h = 300 mg/24 h),

^H +

Treonina

LALDOLAZA

O

^H3+

ROZSZCZEPIENIE GLICYNY

TREONINOWA

CH3

CO 2 + NH4 + +Metylen o-

(P- W- 32-

Aldefryd octowy

H4fo1lan

O

FAD

Gllcyna

EHYDROGENAZA ALDEHYDOWA

HYDROKSYME7YLOTHANSFERAZA SEHYNOWA H 4 Foi l an * /

Mg-ATP

H2C HO L-Seryna (p. ryc. 32-7)

Mg-ADP

DEHYDHATAZA NH4- SEHYNOWA

NADH+H i-CoA

NAD"

O Aoetyto-CoA

O

CO, CoA«SH Pircgronian DEHYDBOGENAZA PIROGHONIANOWA

Ryc. 32-11. Przemiana treoniny i glicyny w serynę, pirogronian i acetylo-CoA, fB — formylo[5-10]tetrahydrofolian

10

-Hłfolian

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 367

w niektórych przypadkach wraz z S-adenozylometioniną jest wydalana z moczem, a stęŜenie metioniny w osoczu się zwiększa. Homocystynuria powoduje przynajmniej 4 wady metaboliczne (tab. 32-2). Kliniczne objawy towarzyszące homocystynurii typu I to: zakrzepica, osteoporoza (zrzeszotnienie kości), zwichnięcie soczewek w oczach oraz często opóźniony rozwój umysłowy. Znane są 2 postacie tej choroby, tj. wraŜliwa i niewraŜliwa na witaminę Bfi. Zmianom chorobowym zapobiega stosowanie diety z matą zawartością metioniny, a duŜą — cysteiny, jeŜeli zostało rozpoczęte odpowiednio wcześnie. Inne typy homocystynurii odzwierciedlają wady w cyklu remetylacji (tab. 32-2).

DEHYDROGENAZA HYDROKSYPROLINOWA

L-A'-P iro II no -3-hyd roksy-5-karbo ksyl an

Aldolaza treoninowa inicjuje katabolizm treoniny Przy udziale aldolazy treoninowej treonina rozszczepia się do glicyny oraz aldehydu octowego, który tworzy następnie acetylo-CoA (ryc. 32-11). Katabolizm glicyny omówiono powyŜej. Katabolizm hydroksyproliny przypomina katabolizm proliny Cząsteczka 4-hydroksy-L-proliny przekształca się w pirogronian i glioksylan (ryc, 32-12), Mitochondrialna dehydrogenaza katalizuje przekształcenie hydroksyproliny w L-A1-piro!ino-3-hydroksy-5-karboksylan. Pozostaje on w nieenzymatycznej równowadze z Y-semialdehydem 7-hydroksy-L-glutaminianu, utworzonym po dodaniu cząsteczki wody. Semialdehyd utlenia się do odpowiedniego kwasu karboksylowego, e ry tro-y- hy dr oksy- L-glutaminianu i ulega transaminacji do a-ket0-7-hydro ksyglutaranu. Rozszczepienie typu aldolowego dostarcza glioksylanu oraz pirogronianu.

REAKCJA NIEENZYMATYCZNA

OH 4

y-Semlaldehyd y-hydroksy-L-gtutaminianu

NAD1 [2) [DEHYDROGENAZA

c^ cr

cHf

11

n

o

o

Erylro-y-hyd ro kay- L-glutamlnian a-

KA [AM1NOTRANSFERAZA|

Hiperhydroksyprolinemia. Charakteryzuje się duŜym stęŜeniem 4-hydroksy pro liny w osoczu. Miejscem zaburzenia metabolicznego tej autosomalnej cechy recesywnej jest dehydrogenaza 4-hydroksy pro linowa (ryc. 32-12). W przeciwieństwie do hiperprolinemii typu II, nie towarzyszy temu uszkodzenie katabolizmu

c

k'°-

o

i

«-Keło-y-hydrokByglutaran ALDOLAZA

Ryc. 32-12. Związki pośrednie w katabolizmie Lhydroksyproliny, st-KA — a-ketokwas, a-AA — aaminokwas. Cyfry w kółku reprezentują miejsca wad metabolicznych: 1 — hiperhydroksyprolinemia, 2 — hiperhydroksyprolinemia typu II.

II

o

Glioksylan

M,

O Pirogronian

368 / ROZDZIAŁ 32

proliny, poniewaŜ zaatakowany enzym funkcjonuje jedynie w katabolizmie hydroksyproliny. Stan ten nie ma Ŝadnego wpływu na metabolizm kolagenu i, podobnie do hiperproHnemii, wydaje się być nieszkodliwy.

nianowa — nazwa nie zalecana), metaloproteina zawierająca Ŝelazo, otwiera pierścień aromatyczny. Pierścień benzenowy homogentyzynianu zostaje rozerwany, formując maleiloacetooctan w reakcji oksydacyjnej katalizowanej przez 1,2-dioksygenazę homogentyzymanową wątroby ssaków.

12 AMINOKWASÓW TWORZY ACETYLO CoA

Izomeryzacja z następczą hydrolizą tworzy fumaran oraz acetooctan. Prze-

Wszystkie aminokwasy tworzące pirogronian (alanina, cysteina, cystyna, glicyna, hydroksyprolina, seryna i treonina) dostarczają acetylo-CoA (przypomnij dehydrogenazę pirogronianową). Ponadto 5 aminokwasów formuje acetylo-CoA bez wstępnego wytwarzania pirogronianu. Te obejmują fenytoalaninę, tyrozynę, tryptofan, lizyne i leucynę.

kształcenie maleiloacetooctanu w fumaryloacetooctan, czyli izomeryzację cis w trans, katalizuje izomeraza cis, trans maleiloacetooctanowa. W wyniku hydrolizy fumaryloacetooctanu, przy udziale hydrol azy fumaryloacetooctanowej (inaczej: fumaryloacetoacetazy), powstaje fumaran i acetooctan. Acetooctan moŜe następnie przekształcić się w acetylo-CoA i octan w reakcji, którą katalizuje acylotransferaza acetylo-CoA (inaczej: p-ketotiolaza — nazwa nie zalecana) (p. rozdz. 23).

5 kolejnych reakcji przekształca tyrozynę w fumaran i acetooctan Kilka związków pośrednich metabolizmu tyrozyny (ryc. 32-13) odkryto podczas badania choroby genetycznej u ludzi — alkaptonurii. Chorzy z alkaptonurią wydzielają homogentyzynian w moczu i wiele poŜytecznych informacji uzyskano przez ich odŜywianie prekursorami homogentyzynianu.

Transaminacja tyrozyny dostarcza p-hydroksyfenylopirogronianu. Transaminację tyrozyny do p-hydroksyfenylopirogronianu katalizuje aminotransferaza tyrozynowa (aminotransferaza tyrozyna: a-ke togi u taran), tj. ulegający indukcji enzym wątroby ssaków.

Dioksygenaza4-hydroksyfenylopirogronianowa (inaczej: hydroksylaza p-hydroksyfenylopirogronianowa). metaloproteina zawierająca miedź, utlenia p-hydroksyfenylopirogronian do homogentyzynianu. ChociaŜ ta reakcja (ryc. 32-13) wydaje się obejmować hydroksylację /7-hydroksyfenylopirogronianu w połoŜeniu orto, z towarzyszącą oksydacyjną utratą węgla karboksy 1 owego, w rzeczywistości polega ona na wędrówce łańcucha bocznego. Hydroksylacja pierścienia i wędrówka łańcucha bocznego zachodzi w sposób zgrany. Ze względu na to, Ŝe fizjologicznym czynnikiem redukującym jest askorbinian, chorzy z gnilcem (szkorbutem) wydalają niecałkowicie utlenione produkty metabolizmu tyrozyny. Enzym 1,2-dioksygenaza homogentyzynianowa (inaczej: oksydaza homogentyzy-

Kilka zaburzeń metabolicznych charakteryzuje się tyrozynemią, tyrozynurią i fenyloacydurią Tyrozynemią typu I (tyrozynoza). W tyrozynozie nagromadzenie metabolitów niekorzystnie wpływa na aktywność kilku enzymów i systemy transportu. Patofizjologia jest zatem złoŜona. Wada metaboliczna tkwi przypuszczalnie w hydrolazie fumaryloacetooctanowej (ryc. 32-15) i prawdopodobnie równieŜ w hydrolazie maleiloacetooctanowej. Znane są zarówno ostre, jak i przewlekłe postacie tyrozynozy. W ostrej tyrozynozie u niemowiąt występuje biegunka, wymioty, „zapach przypominający kapustę" oraz brak prawidłowego rozwoju i wzrostu. Zgon z powodu niewydolności wątroby, w przypadku nie leczonej ostrej tyrozynozy, następuje w ciągu 6—8 miesięcy, W tyrozynemii przewlekłej podobne, ale łagodniejsze, objawy prowadzą do zgonu w wieku 10 lat. W osoczu zwiększa się stęŜenie tyrozyny (0,33—0,67 mmol/l = 6—12 mg/dl) jak równieŜ dodatkowych aminokwasów, szczególnie metioniny. Leczenie obejmuje dietę z małą zawartością tyrozyny i fenyloalaniny, a niekiedy takŜe metioniny.

Tyrozynemia typu II (zespół Richnera-Hanharta). Prawdopodobnym umiejscowieniem wady metabolicznej w tyrozynemii typu II jest aminotransferaza tyrozynowa wątroby (ryc. 32-13). Klinicznie stwierdzone zmiany obejmują: zwiększone stęŜenie tyrozyny w osoczu (0,22—0,27 nunol/l=4—5 mg/dl)

DIOKSYGENAZA < FEMYLOPIHOGRON1ANOWA Giutaiinn

[O)

V 1,2DIOKSYGENAZA

(O!

Askorbinian, 'CO,

XH, g CH, Tc^ M AMINOTRANSFERAZA TYROZYNOWA

**c U

o

Homogantyzynlan

o

2 O"

MX II I ł-HYOROKSY-l RONLANOWA 1

p-

o Maldloacetoodan (przepisano)

IZOMERAZA Cis. trans MALEILOACETOOCTANDWA

O

II O

Fumaryloacetooctan

CD

O

tnOMOGENTYZYNIANOWA

~ CoA O Aoełylo-CoA

O

Fumaran

\

X

r; N

Maleiloacetaoctan

H;O

O

o c

+ Aoetoootan

-

O .T

FUMARYL ACYLOTRAMSFEHAZA ACETYLO-CoA

!J

O Octan

Hyc. 32-13. Związki pośrednie w katabolizmie tyrozyny. Wszystkie reakcje, oprócz katalizowanej przez acylotrartsferaze acetylo-CoA, omówiono w tekście. Ponumerowano atomy węgla związków pośrednich, aby Czytelnik mógł śledzić ostateczny los kaŜdego z nich (p. teŜ ryc. 32-15). ot-KG— a-ketoglutaran, G)u — glutaminian, PJ.P — fosioran pirydoksatu. Cyfry w kółkach reprezentują prawdopodobne miejsca wad metabolicznych: 1 — tyrozynemta typu II, 2 — tyrozynemia noworodków, 3 — alkaptonuria, 4 — tyrozynemia typu I lub tyrozynoza. __________________________

I -z. o

s

370 / ROZDZIAŁ 32

uszkodzenia narządu wzroku i skóry oraz umiarkowane opóźnienie rozwoju umysłowego. Tyrozyna jest jedynym aminokwasem, którego stęŜenie w osoczu ulega zwiększeniu. Jednak tzw. klirens nerkowy i wchłanianie zwrotne tyrozyny pozostają w granicach prawidłowych. Metabolitami występującymi w osoczu są: ^hydroksyfenylopirogronian, />-hydro ksyfenylomleczan, /?-hydroksyfenylooctan, N-acetylotyrozyna i tyramina (ryc. 32-14).

Tyrozynemia noworodków (neonatałna). Jak sądzi się, zaburzenie to jest wynikiem względnego niedoboru hydroksylazy p-hydroksyfenytopirogronianowej (ryc. 32-13). Zwiększają się stęŜenia tyrozyny i (enyloalaniny we krwi, a w moczu — tyrozyny, />-hydroksyfeny-

looctanu, N-acetylotyrozyny i tyraminy. Leczenie polega na stosowaniu diety ubogiej w białko. Alkaptonuria. To wrodzone zaburzenie metaboliczne, odnotowane juŜ w XVI stuleciu, scharakteryzowano w 1859 r. Choroba ma duŜe znaczenie historyczne, stała się bowiem podstawą idei Garroda dotyczących zaburzeń metabolicznych. Najbardziej charakterystycznym objawem klinicznym alkaptonuni jest ciemnienie moczu przechowywanego na powietrzu. W późniejszym stadium choroby następuje uogólniona pigmentacja tkanki łącznej (ochronoza) i pewna postać zapalenia stawów. Wadą metaboliczną jest brak 1,2-dioksygenazy homogentyzynianowej (ryc. 32-13). Substrat, homo-

AMINOTHANSFERAZA TYHOZYNDWA

DEKARBOKSYLAZA TYROZYNOWA

OH p-Hyd ro ksyfenyl oplfogranian

-NADH + H-

OKSYOAZA TYHAMINOWA

DEHYDROGENAZA I

DEHYDROGENAZA

NADH+H

OH N-Acety] o-L-ty rozyn a

OH p-Hyd ro ksyfenylooctan

p-Hyctfoksyfenyfom leozan

p

Ryc. 32-14. Alternatywne katabolity tyrozyny; p-hydroksyfenyloacetaldehyd tworzy sie jako związek pośredni podczas utleniania tyraminy do p-hydroksyfenylooctanu.

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 371

gentyzynian, przechodzi do moczu, w którym w obecności powietrza utlenia się do ciemnobrązowego barwnika. Opisano ponad 600 przypadków alkaptonurii. Częstość jej występowania szacuje się na 2—5/1000 000 urodzonych dzieci. Alkaptonuria dziedziczy się jako autosomalna cecha recesywna. Dotychczas nie jest dostępne Ŝadne diagnostyczne postępowanie w celu wykrycia heterozygot. Mechanizm ochronozy obejmuje utlenianie homogentyzynianu prze2 lakkazę (inaczej: oksydazę polifenolową — nazwa nie zalecana), tworzącą octan benzochinonu, który polimeryzuje i wiąŜe się z wielkocząs teczkami tkanki łącznej.

Liczne zaburzenia metaboliczne cechują szlaki katabolizmu fenyloalaniny Główne zaburzenia metaboliczne z uszkodzoną zdolnością przekształcania fenyloalaniny w tyrozynę (p. ryc. 30-12) mogą być sklasyfikowane w 3 obszerne grupy: wady w 4-monooksygenazie fenyloalaninowej (hiperfenyloalaninemia typu I lub klasyczna fenyloketonuria), wady w reduktazie dihydrobiopterynowej (hiperfenyloalaninemia typu II i III) oraz wady w biosyntezie dihydrobiopteryny (hiperfenyloalaninemia typu IV i V). Zidentyfikowano jeszcze dodatkowe typy (tab. 32-3). Główną konsekwencją nie leczonej hiperfeityloalaninemii typu I (klasycznej fenyloketonurii;

Octan banzochinonu

Hydroksylacja fenyloalaniny tworzy tyrozynę Fenyloalanina jest najpierw przekształcana w tyrozynę przez 4-monooksygenazę fenyloalaninową (inaczej: hydroksylaza fenyloalaninowa) (p. ryc. 30-10). Wzór znakowania w amfibolicznych produktach, fumaranie i acetooctanie(ryc. 32-15), jest więc taki sam jak w przypadku tyrozyny (ryc. 32-13).

r H"

"ĆOO-

Fumaran

,ĆH,-COO-

+ CH, CH,

Aeetooctan Dwutlenek węgla

Ryc. 32-15. Ostateczne losy kaŜdego węgla fenytoalaniny. Obraz znakowania izotopowego w ostatecznych katabolitach lenyloalaniny (i tyrozyny).

skrót — PKU) jest niedorozwój umysłowy. Dodatkowe kliniczne objawy obejmują ataki padaczkowe, psychozy, wyprysk oraz zapach „mysi". Mogą one jednakŜe nie pojawić się w przypadku wczesnego rozpoznania i podjęcia właściwego leczenia. Ze względu na to, Ŝe dostępność modeli zwierzęcych i bezzwłoczna interwencja dietetyczna mogą zapobiec inaczej nieuniknionemu opóźnieniu w rozwoju umysłowym, fenyloketonuria słuŜyła jako model w badaniach takiego niedorozwoju związanego z chorobami metabolicznymi. W klasycznej fenyloketonurii, dziedzicznym zaburzeniu o częstotliwości występowania 1/10000 urodzonych dzieci, stęŜenie komponentu I, tj. 4-monooksydazy fenyloalaninowej wątroby (p. ryc. 30-10) stanowi w przybliŜeniu średnio 25% normy i enzym ten jest niewraŜliwy na regulację poprzez fenyloalaninę. Ze względu na uniemoŜliwione przekształcenie fenyloalaniny w tyrozynę, u chorych wytwarzane są alternatywne kata'CO, bolity(ryc. 32-16). Zaliczają się do nich: fenylopirogronian (z deaminacji fenyloalaniny), fenylomleczan (z redukcji fenylopirogronianu) i fenylooctan (z dekarboksylacji i utlenienia fenylopirogronianu). DuŜa część fenylooctanu wydala się z moczem w postaci fenyloacetyl o glutaminy. Tabela 32-4 ilustruje chemiczny obraz krwi i moczu chorego z fenyloketonuria. Wprawdzie fenylopirogronian moŜna oznaczyć za pomocą prostego biochemicznego testu plamkowego, ostateczne rozpoznanie wymaga wykrycia zwiększonego stęŜenia fenyloalaniny w osoczu. Pogorszeniu sprawności umysłowej dzieci dotkniętych fenyloketonuria daje się zapobiec, jeŜeli spoŜywa się pokarmy z bardzo małą zawartością fenyloaianiny. Przestrzegania diety moŜna zaprzestać w wieku 6 lat, kiedy to duŜe

372 / ROZDZIAŁ 32 Tabela 32-3. Hiperfenyloalaninemie" Wada

Przypadek

Typ

Leczenie Dieta z matą zawartością feny loalaniny

Brak 4-monooksygenazy lenyloalaninowej Niedobór 4-monooksygenazy fenyloalaninowej Opóźnienie w dojrzewaniu 4-monooksygenazy lenyloalaninowej

śadne, albo czasem leczenie dietetyczne Jak w typie II

Niedobór reduktazy dihydropterydy nowej

Niedobór lub brak reduktazy d i hy d ro pteryd y n o w e j

Dopa, 5-hydroksytryptofan, karbidopa

V

Anormalna funkcja dihydrobiopteryny

Wada w syntezie dihydrobio- Dopa, 5-hydroksytryptofan, pteryny karbidopa

VI

Uporczywa hiperfenyłoalaninemia i tyrozynemia

? Katabolizm tyrozyny

Zmniejszone pobieranie fenyloa taniny

VII

Przejściowa neonatalna tyrozynemia

Zahamowanie dioksygenazy 4 - hyd roksy f en y I o p i rog ro nianowej

Witamina C

VIII

Dziedziczna tyrozynemia

Niedobór: dioksygenazy 4-hydro- Dieta z małą zawartością ksyfenyiopirog ronią tyrozyny nowej cytoplazmatycznej aminoiransferazy tyrozynowej fumaryloacetoacetazy Dieta z małą zawartością tyrozyny oraz wstrzykiwanie glutationu

Fenyloketonuria Uporczywa hiperfenyloalamnemia Przejściowa łagodna hiperfenyłoalaninemia IV

* Zmodyfikowano i reprodukowano za zgodą z: Tourian A, Sidbury JB: Phenytketonuria and hyperphenylalaninemia; s. 273 w: Stanbury JB i wsp. (redaktorzy); The Metabolic Basis of tnherited Disease, wyd. 5, McGraw-Hill, 1983.

Tabela 32-4, Metabolity fenyloalaniny, które gromadzą się w osoczu i moczu chorych na fenytoketonurię Metabolit

Fenyloalanina Fenylopirogronian Fenyiomleczan Fenylooctan Fenyloacetyloglutamina

Osocze mmol/l (mg/ctl)

Mocz mmol/l (mg/dl)

prawidłowe

chory na feny loketonu ric

prawidłowy

chory na fenyloketonurie

0,06-0,12 (1-2)

0,91-3,82 (15-63) 0,18-1,08 (0,3-1,8)

1,82 (30) 5,22-7,83 (200-300)

18,2-66,6 (300-1000) 18,2-133,3 (300-2000) 17,6-33,3 (290-550) zwiększenie 52,7 (2400)

■p

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 373 Fen y to a cety I og I utam i n a +

NH3 LFenyloalanina ot-Ketoglutaran

CONH, Ryc. 32-16. Alternatywne szlaki katabolizmu fenyloalaniny w fenyloketonurii Reakcje zachodzą równieŜ w wątrobie osób zdrowych, lecz mają znikome znaczenie w obecności funkcjonującej hydroksylazyfenyloalaninowej. Glu — glutaminian, Gin—glutamina.

stęŜenia fenyloalaniny i jej pochodnych przestają być groźne dla mózgu. Wprawdzie zawartość fenyloalaniny w osoczu oznacza się za pomocą zautomatyzowanej mikrometody, w której na jedno oznaczenie potrzeba zaledwie 20 ul krwi, nieprawidłowe duŜe stęŜenia fenyloalaniny we krwi noworodków mogą wystąpić dopiero w 3. lub 4. dniu Ŝycia, a nie bezpośrednio po urodzeniu. Co więcej, u dzieci urodzonych przedwcześnie próba daje niekiedy wynik fałszywie dodatni mi skutek opóźnionego dojrzewania enzymów uczestniczących w katabolizmie fenyioalaniny. UŜyteczny, ale mniej wiarygodny, masowy test polega na wykryciu w moczu zwiększonego

stęŜenia fenylopirojjronianu na podstawie reakcji z chlorkiem Ŝelazowym. Podawanie fenyloalaniny chorym na fenyloketonurię mogłoby spowodować przedłuŜające się zwiększenie zawartości tego aminokwasu we krwi, dowodzące zmniejszonej tolerancji na fenyl o alaninę. JednakŜe u rodziców dzieci chorych na fenyloketonurię takŜe stwierdzono nieprawidłowo małą tolerancję na wstrzykniętą fenyloałaninę i duŜe stęŜenie fenyloalaniny na czczo. Defektywny gen odpowiedzialny za fenyloketonurię moŜe być w ten sposób wykryty biochemicznie u fenotypowo prawidłowych rodziców heterozygotycznych. śaden azot lizyny nie uczestniczy w transami nacji Ssaki przekształcają nietknięty szkielet L-lizyny w a-aminoadypinian i cc-ketoadypinian (ryc. 32-17) poprzez sacharopinę (ryc. 32-18), produkt pośredni w biosyntezie lizyny u grzybów. Cząsteczka L-lizyny kondensuje najpierw z a-ketoglutaranem, tworząc zasadę Schiffa. Ta ulega redukcji do sacharopiny przez dehydrogenazę, a następnie utlenieniu przez drugą oksydoreduktazę. W wyniku przyłączenia cząsteczki wody tworzy się L-glutaminian i 5-semialdehyd L-a-aminoadypinianu. Czysty wynik tego ciągu reakcji jest równowaŜny usunięciu atomu azotu w pozycji e z lizyny wskutek transaminacji. Niezbędnymi koenzymami jednak w tej reakcji są NAD+ i NADH. Dalszy katabolizm a-aminoadypinianu obejmuje transaminację do a-ketoadypinianu, prawdopodobnie z następującą oksydacyjną dekarboksylacją do glutarylo-CoA. Podczas gdy lizyna jest zarówno glikogenna, jak i ketogenna, natura kolejnych katabolitów glutarylo-CoA u ssaków pozostaje nieznana. Dwie rzadko występujące nieprawidłowości metaboliczne wynikają z zaburzonego przekształcenia L-lizyny i a-ketoglutaranu w sacharopinę (ryc. 32-18). HjC-NH3+

C coo-

COO"

COO

coo-

c=o ćoo-

L-Lizyna a-Aminoadypinian

C lCH) a-Ketoadypinian

Ryc. 32-17. Przemiana L-lizyny w a-aminoadypinian i a-ketoadypinian. Wielokrotne strzatki reprezentują wielokrotne reakcje.

a-Ketoglutaran

O; „.

C

■

NAOH+H+ NAD+"O"

NH+

„CK

CH:

DEHYDROGENAZA S^CHAROPINOWA TWORZĄCA L-LIZYNĘ

■ T L-LIzyna C^ -CH' NAD+ NADH+H+

CH

P" Sacharopina

-CH'^ -

- Q NH*

? CH, i

D

NH

EHYOROGENAZA SACHAROPINOWA TWORZĄCA LGLUTAMINIAN

CH^

n-

L-ot-Am inoadypinian

L-B-arninoadyplniianu

° A CoA*SH

Glu

\^r P2

|AMINOIRANSFERAZAl

-CO, +H»O

CH

a-Ketoadyplnian

co,

Glu(afylo-CoA

Ryc. 32-18. Katabolizm L-lizyny. (a-KG —a-ketoglutaran, Glu^glutaminian, PLP — fosforan pirydoksalu). Cyfry w kotkach wskazują prawdopodobne miejsca wad metabolicznych: 1 — okresowa hiperlizynemia z hiperamonemią i 2 uporczywa hiperlizynemia bez hiperamonemii. __________

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 375

Okresowa hiperlizynemia z towarzyszącą hiperamonemią. W okresowej hiperlizynemii spoŜycie prawidłowych ilości białka wywołuje hiperlizynemię. Hiperamonemią powstaje wtedy w wyniku kompetycyjnego zahamowania aktywności arginazy wątroby przez zwiększenie stęŜenia lizyny w tkankach. Terapia płynami oraz ograniczenie pobierania łizyny łagodzi zarówno hiperamonemię, jak i jej objawy kliniczne. Przeciwnie, stosowanie obciąŜenia lizyną przyspiesza wystąpienie przełomu i śpiączki.

Nawracająca hiperlizynemia bez hiperamonemii. Niektórzy chorzy są opóźnieni w rozwoju umysłowym. Nie towarzyszy temu Ŝadna hiperamonemią, nawet jako reakcja na obciąŜenie lizyną. Katabolity lizyny mogą lub nie mogą nagromadzać się w płynach biologicznych. UwaŜa się, Ŝe nawracająca hiperlizynemia dziedziczy się jako autosomalna cecha recesywna. Oprócz uszkodzenia przekształcenia lizyny i a-ketoglutaranu w sacharopine, niektórzy chorzy wydają się mieć dodatkową wadę przekształcania sacharopiny w L-glutaminian 16-semialdehyd a-amiaoadypinianu (ryc. 32-18). Katabolizm tryptofanu inicjuje 2,3dioksygenaza tryptofanowa, metaloproteina zawierająca Ŝelazoporf i rynę Połączenia atomów węgla zarówno łańcucha bocznego, jak i pierścienia aromatycznego mogą ulegać kompletnej degradacji do amfibolicznych związków pośrednich na szlaku kinureninowo-antranilanowyin (ryc. 32-19) o waŜnym znaczeniu nie tylko w rozkładzie tryptofanu, lecz takŜe w przekształcaniu tego aminokwasu w nikorynainid (amid nikotynianu). Enzym 2,3-dioksygi'naza tryptofanowa (inaczej: oksygenaza tryptofanowa lub pirolaza tryptofanowa — nazwy nie zalecane) katalizuje rozszczepienie pierścienia indolowego z wbudowaniem 2 atomów tlenu cząsteczkowego, co wytwarza N-formylokinureninę. Ta 2,3-dioksygenaza, Ŝelazoporfirynowa metaloproteina, jest indukowana w wątrobie przez kortykosteroidy nadnerczy oraz tryptofan. Znaczna porcja nowo syntetyzowanego enzymu występujewpostaci utajonej, wymagającej aktywacji. Tryptofan równieŜ stabilizuje go na degradację proteolityczną. Pochodne kwasu nikotynowego, włączając NADPH, hamują 2,3-dioksygenazę tryptofanowa na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego.

Hydrolityczne usunięcie grupy formylowej z N-formy)okinureniny, katalizowane przez forFnamidazę (inaczej: formylazę kinureninową — nazwa nie zalecana) wątroby ssaków dostarcza kinureniny (ryc. 32-19). Enzym ten katalizuje podobne reakcje z róŜnymi formyloaminami aromatycznymi. Kinurenina moŜe ulec dezaminacji w wyniku transaminacji grupy aminowej bocznego łańcucha do ketoglutaranu. Powstała pochodna ketonowa, 2-amino-3-hydroksybenzoilopirogronian, traci cząsteczkę wody i spontaniczne zamknięcie pierścienia tworzy kwas kinurenowy, produkt uboczny, który nie powstaje w głównym szlaku katabolizmu tryptofanu (ryc. 32-19). Dalszy metabolizm kinureniny obejmuje przekształcenie jej w 3-hydroksykimireninę, a następnie w 3-hydroksyantraniian. Hydroksylacja wymaga tlenu cząsteczkowego w reakcji zaleŜnej od NADPH, przypominającej hydroksylację fenyloalaniny (p. rozdz. 30). Alternatywny metabolit tryptofanu, ksanturenian, nagromadza słę przy niedoborze witaminy B6 Kinurenina i hydroksykinurenina są przekształcane w hydroksyantranilan prze2 kinureninazę, enzym z fosforanem pirydoksalu. Niedobór witaminy B6 powoduje częściową niewydolność w katabolizmie tych pochodnych kinureninowych, które przedostają się do róŜnych tkanek pozawątrobowych, gdzie są przekształcane w ksanturenian (ryc. 32-20). Ten nienormalny metabolit występuje w moczu w przypadku niewystarczającego przyswajania z poŜywienia witaminy Bf). OdŜywianie nadmiarem tryptofanu wywołuje wydalanie ksanturenianu przy niedoborze witaminy Bć. U wielu zwierząt przekształcanie tryptofanu w kwas nikotynowy powoduje, Ŝe dostarczanie tej witaminy w poŜywieniu staje się zbyteczne. Tryptofan moŜe całkowicie zastąpić tę witaminę u szczurów, królików, psów i świń; u człowieka i innych zwierząt tryptofan zwiększa wydalanie z moczem pochodnych kwasu nikotynowego (np. N-metylonikotynamidu). W przypadku niedoboru witaminy Be synteza NAD + i NADP+ moŜe być upośledzona w wyniku niedostatecznej przemiany tryptofanu w kwas nikotynowy do wytwarzania nukleotydów pirydynowych. Synteza tych nukleotydów przebiega prawidłowo przy dostarczeniu odpowiedniej ilości kwasu nikotynowego, nawet w nieobecności witaminy B6.

+

NH3

NH3+

Mrćwcian

Oz

L-Klnurenlna

V 2.3-DIOKSYGENAZA TRYPTOFANOWA (Indukowana)

FORMAMIDAZA

L-Tryptofan

N-Formylo- L-klnurenina

-i IjjjHBBjjjjfl

*

■

H3C HjO

A

*

O,

O ,

KINUREN1NAZA

VNADPH + H +

V

3-MONOOKSYGENAZA KINURENINOWA

3.4-DIOKSTGENAZA 3HYDROKSYANTHANILOWA

NH3+

2-Akro lei lo-3-am in of u m aran

OH 3-L-Hydroksyk In u roni na

V

T NADH+H+

CO;

A __

o-^-

CH, HaC

°1\O

""NHJ

1

Serr (aldehyd 2-amlnocfaicte-mukonlanu

i

no

1 NH,*

CH2

I

Szozawlokrotonian

-CH; a-Ketoadypinlan

NAD+

a-Ketoadypin!an (przepisano)

NAD(P) <

NADIP)H + H +

A ___ ! + H jO (p. ryc, 34-18)

Ryc. 32-19. Katabolizm tryptofanu. PLP — fosforan pirydoksalu.

KATABOLIZM AMINOKWASÓW / 377

Metionlna

SZKIELETÓW WĘGLOWYCH S - C OCM, , n-

i-' Ket oglu tara n

CO, - AcCoA Izoleuoyna--------------- ». Proplonylo-CoA

O"

-CO, Walina Metylo ma lo nyl □- CoA

I

HO

Sukcynylo-CoA Ryc. 32-21. Ogólny metabolizm metioniny, izoleucyny i waliny Ksanturenian

Ryc. 32-20. Powstawanie kwasu ksanturenowego w sianie niedoboru witaminy B6. Przekształcenie metabolitu tryptofanu 3-hydroksykinureniny w 3-hydroksyantranilan jest upośledzone (p. ryc. 32-19). DuŜa jej część przekształca się zatem w ksanturenian.

To, co następuje w dalszym tekście, dotyczy tylko przekształcenia metioniny oraz izoleucyny w propionylo-CoA, a waliny — w metylomalonylo-CoA. Reakcje prowadzące do propionylo-CoA przez metyl omal onylo-Co A do sukcynylo-CoA omówiono w rozdz. 23, w związku z katabolizmem propionianu i kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgia.

CHbroba Hartniipa, dziedziczne zaburzenie metabolizmu tryptofanu, charakteryzuje się wysypką skórną przypominającą pelagrę, nawracającą ataksją móŜdŜkową i upośledzeniem urny sto wy m. Mocz zawiera zwiększone iiości indolooctami (a-N [ind o lo-3-acetyl o] glutaminy) oraz tryptofanu.

Atomy węgla metioniny tworzą propionylo-CoA poprzez homocysteinę, cystationinę i ,ketoglutaran Cząsteczka L-metioniny kondensuje najpierw z ATP, tworząc S-adenozylometioninę*, „aktywną metioninę" (ryc. 32-22). Aktywowana grupa S-metylowa moŜe być przenoszona na róŜne akceptory. Usunięcie grupy metylowej wytwarza S-adenozylohomocysteinę. Hydroliza wiązania S-C dostarcza L-homocysteiny oraz adenozyny. Homocysteina łączy się następnie z seryną, tworząc cystationinę (ryc. 32-23). W wyniku hydrol i tycznego rozszczepienia cystationiny powstaje L-homoseryna i cysteina, tak Ŝe ostatecznym wynikiem jest przekształcenie homocysteiny w homoserynę, a seryny w cysteinc. Te 2 reakcje uczestniczą zatem

METIONINA, 1ZOLEUCYNA I WALINA SĄ KATABOLIZOWANE DO SUKCYNYLO-CoA Wprawdzie sukcynylo-Co A (bursztynylo-CoA) jest amfibolicznym produktem końcowym katabolizmu metioniny, izoleucyny i waliny, w rzeczywistości przemianie ulega tylko część ich szkieletu węglowego (ryc. 32-21). W tworzeniu sukcynylo-CoA uczestniczą tylko 4 /s atomów węgla waliny, 3/s tych atomów metioniny i jedynie ich polowa w przypadku izoleucyny. Atomy węgla karboksylowego wszystkich 3 aminokwasów tworzą. CO2. Końcowe 2 atomy węgla izoleucyny formują acetylo-CoA, a grupa metylowa metioniny jest usuwana w całości jako taka.

* Związkami, których grupy metylowe pochodzą z S-adenozylometioniny są: betainy, cholina, kreatyna, epinefryna, melatonina, sarkozyna, aminokwasy N-melylowane oraz wiele alkaloidów pochodzenia roślinnego.

378 / ROZDZIAŁ 32

coo -

COO <-H3N-C-H

■13N-Ć-H HSO

+ rr,

CHS CHS •■S------ CH

ADENOZYLOTRANSFEHAZA L-METIONINOWA

Adenina

t CH

HO

OH S-Ade n ozylo-L- rnatlo n I n a (, aktywna metlonina")

L-Metionina Ryc. 32-22. Utworzenie S-adenozy!ometioninY. ~ CH3 reprezentuje duŜy potencja) transferu „aktywnej metioniny".

równieŜ w biosyntezie cysteiny z seryny (p. rozdz. 30). Homoserynę przekształca w a-ketomaślan y-liaza cyst a ti o ni nowa (inaczej: deaminaza homoserynowa — nazwa nie zalecana) (ryc. 32-24), Przekształcenie a-ketomaślanu w prflpionylo-CoA przebiega na sposób oksydacyjnej karboksylacji a-ketokwasów (np. pirogronianu. a-ket o glut ara mi) w celu utworzenia pochodnych acylo-CoA. Metaboliczne zaburzenia katabolizmu metioniny przedstawia tab. 32-2. 2 POCZĄTKOWE REAKCJE KATABOLICZNE SĄ WSPÓLNE DLA WSZYSTKICH 3 ROZGAŁĘZIONYCH AMINOKWASÓW Katabolizm leucyny, waliny oraz izoleucyny obejmuje początkowo te same reakcje. Następnie szkielet kaŜdego aminokwasu wchodzi na swój własny unikatowy szlak prowadzący do amfibolicznych związków pośrednich (ryc. 32-25 i 32-26). Charakter tych amfibolicznych produktów końcowych określa, czy dany aminokwas jest glukogenny (walina), ketogenny (leucyna) lub dwojaki (izoleucyna). Wiele z tych reakcji dokładnie przypomina reakcje katabolizIDU kwasów tłuszczowych o łańcuchach prostych i

rozgałęzionych. Numery reakcji w dalszym tekście odpowiadają numeracji reakcji na ryc. 32-26 — 32-29.

Ten sam enzym wydaje się katalizować transaminację wszystkich 3 aminokwasów rozgałęzionych Za odwracalną transaminację (reakcja 1, ryc. 32-26) wszystkich 3 rozgałęzionych aminokwasów przypuszczalnie odpowiada jedna aminotransferaza. Ze względu na odwracalność owej reakcji dobowe zapotrzebowanie na te aminokwasy w poŜywieniu mogą pokryć odpowiednie a-ke tok wąsy. Oksydacyjna dekarboksylacja rozgałęzionych 3-ketokwasów jest analogiczna do przekształcenia pirogronianu w acetylo-CoA Dehydrogenaza a-ketokwasu o łańcuchu rozgałęzionym (reakcja 2, ryc. 32-26), wewnątrzmitochondrialny kompleks wieloenzymowy, katalizuje oksydacyjną dekarboksylację a-ketoizokaproniami (z leucyny), ct-keto-|3-metylowalerianianu (z izoleucyny) i a-ketoizowalerianianu (z waliny). Podjednostki kompleksu dehydrogenazy a-ketokwasu są analogiczne do kompleksów dehydrogenazy pirogronianu: dekarhoksylaza a-ketokwasu, transacylaza i dehydrogenaza dihydrolipoilowa. Tak, jak w przypadku dehydrogenazy pirogronianowej, kompleks jest inaktywowany, kiedy ulega fosforylacji przez ATP i kinazę białek. NiezaleŜna od Ca2+ fosfataza fosfoproteinowa katalizuje jego defosforylację i towarzyszącą temu reaktywację. Stan fosforylacji moŜe w ten sposób regulować katabolizm aminokwasów rozgałęzionych. Kinazę białek hamują: ADP, produkty a-ketokwasów o łańcuchu rozgałęzionym,' czynniki hipolipemiczne, jak klofibrat i dichlorooctan, a takŜe tloestry koenzymu A (np. acetoacetylo-

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 379 +

NH3

HO

,cr

c

II O

I

II

H O

L-Metionina ATP

L-Hornoseryna

H3O S-Aden ozy I o-L-metionl n a ^Akceptor

'CH]

II o

Nfc CH,-Akoeptor S-

Aden ozy lo-L-h om ocystei n a

H3C

\ W

lenozyna

H CT

o

T . 1

UL lit ||

-

1^ L-Homocysteina

7

H3CV CYSTATIONtNOWA +

•H,0

NH3 L-

-

0

Seryna

/ -H 2 O i

S

+

\ ►NH4 >

(

Cystationina NHn

CH

2

II

11

0

a-Ketorna4fan

9 KtH3+ L-Cysteina

NH„ a-Kelomaślan (p.ryc. 31-24)

Ryć. 32-24. Przekształcenie L-homoseryny wa-ketomaślan katalizowane przez y-liazę cystationinową (inaczej: deaminazę homoserynową — nazwa nie zalecana).

-CoA). Spośród cx-ketokwasów o łańcuchu rozgałęzionym najpotęŜniejszym inhibitorem jest a-ketoizokapronian(a-ketoteucyna). "CH 2 ^

^S-CoA

Proplonylo-CoA

Ryc. 32-23. Przekształcenie mationiny w propionylo-CoA.

Odwodorowanie rozgałęzionych tioestrów acylo-CoA jest analogiczne do reakcji w katabolizmie kwasu tłuszczowego Reakcja 3 jest analogiczna do odwodorowania tioestrów acylo-CoA o prostym łańcuchu w katabolizmie kwasów tłuszczowych. Wpraw-

380 / ROZDZIAŁ 32 Ryc. 32-25. Kataboiizm aminokwasów o łańcuchach rozgałęzionych Reakcje 1 -3 są wspólne dla wszystkich 3 aminokwasów. Pogrubione linie przecinające strzałki zaznaczają miejsca bloków metabolicznych w 2 chorobach rzadko występujących u ludzi. Przy 2 — choroba z moczem o zapachu syropu klonowego, wada w metabolizmie 3 aminokwasów; przy 3 — kwasica izowaferianowa, wada w kataboiizmte leucyny.

Lsucyna, wal i na, izoleueyna

© Odpowiednie a-ketokwasy

COj + odpowiednie tioealry acylo-CoA

T<

Odpowiednie a-, 0-nienasycone tloestry acylo-CoA Val / Sukcynylo-CoA

Leu Propionylo-CoA + acetylo-CoA p-Hyd ro ksy-P-metylo g lu ta ry lo-CoA

Ryc. 32-26. Analogiczne pierwsze 3 reakcje w katabolizmie leucyny, waliny oraz izoleucyny. ZauwaŜ analogię w reakcjach 2 i 3 do katabolizmu kwasów tłuszczowych. Ta analogia jest kontynuowana, jak wykazanow następnych rycinach. a-KA — ot-ketokwas, a-AA — a-aminokwas.

CH,

,CH H3C

I

O

L-Leuoyna

aKetokwas

CH3

CH3

H3C.

0 -CH

H3C

O

L-l Zole u cyn a

L-Wallna -*- «-Ketokwas

x-Ke!okwas

O.

^*- a-Arnlnokwas

- a-Aminokwas

O

V

II

"N- ŁI -''■

a- K et o iz □ ka p r o n i a n -

CoA*SH

x- Keto
CoA.SH

CH3

o

H3C Izowaterylo^CoA

H3C

S-CoA

CH:i

■12H] O

I

CH3 a-Metylo butyrylo-Co A [2H]

\* Ln 5 — t.oA ^-Metylo kroto nylo- CoA Izowalerianian ■CoA.SH

■S~CoA CH3 MetaakrylNo-CoA

TyaWo-CoA

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 381

dzie pojedynczy enzym moŜe katalizować odwodorowanie wszystkich 3 rozgałęzionych tioestrów acylo-CoA, pośredni dowód implikuje konieczność przynajmniej 2 enzymów, W acytlemii i/o walerianowej, po spoŜyciu pokarmów bogatych w białko, nagromadza się we krwi izowalerianian (produkt deacylacji izowalerylo-CoA). Nie dochodzi w niej do zwiększenia ilości innych rozgałęzionych a-ketokwasów. 3 reakcje są swoiste dla katabolizmu leucyny

leucyny) przekształconej w acetooctan. To wbudowanie CO2 (reakcja 4L, ryc. 32-27) wymaga obecności biotynylo-CO2 i tworzy (ł-metyloglutakonylo-CoA.

Reakcja 5L, uwodnienie p-metytoglutakonylo-CoA. Produkt, p-hydroksy-p-metyloglutarylo-CoA, jest prekursorem zarówno związków ketonowych (reakcja 6L, ryc. 32-27), jak i mewalonianu, a stąd cholesterolu oraz innych poliizoprenoidów (p. rozdz. 29).

Reakcja 6L, rozszczepienie p-hydro-

Reakcja 4L, karboksylacja |i-metylokrotonylo-CoA. Kluczowym spostrzeŜeniem, które doprowadziło do wyjaśnienia ketogcnnego działania leucyny, było odkrycie, Ŝe 1 mol CO2 był „umocowany" (tj. związany kowalencyjnie) z kaŜdym molem grupy izopropylowej (z terminalnej grupy izopropylowej

ksy-p-metyloglutaryia-CoA. Rozszczepienie f3-hydroksy-P-metylogrutarylo-CoA na acetylo-CoA i acetooctan zachodzi w mitochondriach wątroby, nerek i serca. To tłumaczy silne ketogenne działanie leucyny, poniewaŜ oprócz 1 mola acetooctanu powstającego z 1 mola leucyny moŜe się utworzyć lji mola

0-Metylokro1onylo-CoA ■ Biotynylo*CD

. Blotyna

Mg-ADP+Pi

Mg-ATP

o ^-MetytoglutakonylchCoA

rHi OH

C

0-Hyd ro ksy-^rnety lo g I utaryio-C oA

9

O 'O'

O r* 1 r

CH.

CH Acetoootan

AcetyloCoA

Ryc. 32-27. Katabolizm fi-rnetylokrotonylo-CoA pochodzącego z L-leucyny. * Atomy węgia pochodzące z CO,.

382 / ROZDZIAŁ 32

związków ketonowych z pozostałego produktu, acetylo-CoA (p. rozdz. 29).

o li

4 reakcje są swoiste dla katabolizmu wafiny

CH3 MetakryliloCoA

Reakcja 4V. uwodnienie metyloakrylilo-CoA. Reakcję tę, która z dość duŜą szybkością zachodzi nieenzymatycznie, katalizuje hydrataza enoilo-CoA, hydrolaza o szerokiej swoistości dla tioestrów L-p-hydro ksyacy-loCoA mających 4—9 atomów węgla.

HO

Reakcja 5V, deacylacja [l-hydroksyizobutyrylo-CoA. Tioester Co A nie jest substratem dla następnej reakcji (reakcja 6V, ryc. 32-28), wobec tego musi on najpierw ulec deacylacji do p-hydroksyizomaślanu (reakcja 5V. ryc. 32-28) przy udziale deacylazy, dla której drugim substratera jest jedynie P-hydroksypropionylo-CoA.

I CH3 ^Hydroksylzobutyryto-CoA

Reakcja 6V, utlenienie (>-hydroksy-

I CH-, /I-Hyd ro ksyizo m as I an

izomaślanu. Odwracalne, zaleŜne od NAD"*", utlenienie pierwszo rzędowej grupy alkoholowej p-hydroksyizomaślanu do aldehydowej (reakcja 6V, ryc. 32-28) tworzy semialdehyd metylomalonianu.

NADH + H +

Reakcja 7V, los semialdehydu mety-

O

O

I! II lomalonianu. Przypuszczalnym przeznaczeHC, niem semialdehydu metylomalonianu jest trans■CH I aminacja i przekształcenie do sukcynylo-CoA. CH3 Transaminacja tworzy a-aminoizomaślan, praSemialdehyd widłowy aminokwas moczu (reakcja 7V, ryc, metylom alanian u 32-28). Drugie główne przeznaczenie obejmuje oksydacyjną acylację do metylomalonylo-CoA COASH oraz izomeryzację do sukcynylo-CoA (reakcje NADI 8V i 9V, ryc. 32-28). Izomeryzacja (reakcja 9V, H,C. ryc. 32-28) wymaga obecności koenzymu ade■CH ' S - C o A nozynokobalaminy i jest katalizowana przez mutazę metylomaionylo-CoA. Ta reakcja ma CoAS" I I CH3 CH3 duŜe znaczenie nie tylko w katabolizmie waliny Metylomalonylo-CoA lecz takŜe dla propionylo-CoA, katabolitu izoKOENZYM B1( leucyny (ryc. 32-29). Przy niedoborze kobalaminy (witaminy B|2) aktywność ulega uszkodzeO niu. To powoduje „Ŝywieniową wadę metaboliczną" u przeŜuwaczy, wykorzystujących proI pionian (z fermentacji w Ŝwaczu) jako źródło I energii. Przegrupowanie do sukcynylo-CoA odbywa się wskutek wewnątrzcząsteczkowego HSC S-CoA przesunięcia grupy karboksylo-CoA.

3 reakcje są swoiste dla katabolizmu izoleucyny Badania nad odŜywianiem zwierząt zidentyfikowały początkowo izoleucynę jako glukogenną i w niewielkim stopniu ketogenną. Syn-

-AA aKA NH3I

O

0-Aminolzomaślan

Sukcynylo-CoA

Ryc. 32-28. Dalszy katabolizm metakry!ilo-CoA utworzonego z L-waliny (p. ryc. 32-26). a-KA — »-ketokwas, s-AA — a-aminokwas.

KATABOLiZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 383

Reakcja 61, tioliza s-metyloacetoace-

Acetylo-CoA »

CH3 Tyglilo-CoA Propionylo-CoA

Ryc. 32-29. Dalszy katabolizm tyglilo-CoA powstałego z L-izoleucyny.

H,C

S~CoA

s-Metyl o-0 -hyd ro teybutyrylo-CoA

[2H]

O li

CH3 a ■ M ety I o actrtoa cety I o-Co A

tezę glikogenu z izoleucyny potwierdzono później posługując się D2O. Zastosowanie znakowanych l4C-intermediatów oraz skrawków wątroby dowiodło, Ŝe szkielet izoleucyny ulega rozszczepieniu na acetylo-CoA i propionylo-CoA (ryc. 32-29).

Reakcja 41, uwodnienie tyglilo-CoA. Reakcję tę, podobnie jak analogiczna w katabolizmie waliny (reakcja 4V, ryc. 32-28) katalizuje hydrataza enoilo-CoA (inaczej: krotonaza — nazwa nie zalecana). Reakcja 51, od wodorowa nie ::-mety lo-p-hydroksybutyrylo-CoA. Jest ona analogiczna do reakcji 5V w katabolizmie waliny (ryc. 32-28).

tylo-CoA. Rozszczepienie tiolityczne wiązania łączącego węgle 2. i 3. w cząsteczce a-metyloacetylo-CoA przypomina tiolizę acetoacetylo-CoA przez acetyl o tran sferazę acetylo-CoA (inaczej: (3-ketotioIazę). Produkty: acetylo-CoA (ketogenny) i propionylo-CoA (glukogenny) nadają izoleucynie właściwości ketogenne i glukogenne. Kilka zaburzeń metabolicznych wiąŜe się ze szlakiem katabolicznym aminokwasów o łańcuchu rozgałęzionym Hiperwalinemia. Ta rzadko występująca choroba metaboliczna, charakteryzująca sie zwiększonym stęŜeniem w osoczu waliny (ale nie leucyny lub izoleucyny) jest wyrazem niezdolności do przeprowadzenia transami nacji waliny do a-ketoizowalerianianu (reakcja 1, ryc. 32-26). Transaminacja leucyny oraz izoleucyny pozostaje nieuszkodzona.

Choroba „moczu o zapachu syropu klonowego" (ketonuria łańcuchów rozgałęzionych). Najbardziej charakterystyczną właściwością tej dziedzicznej choroby (występującej z częstotliwością 5—10/1 000 000 urodzeń) jest zapach moczu przypominający zapach syropu klonowego lub przypalonego cukru. Zawartość leucyny, izoleucyny, waliny oraz ich oc-ketok wąsów w osoczu i w moczu jest znacznie zwiększona. W moczu są równieŜ obecne mniejsze ilości ct-hydrok syk wąsów o łańcuchu rozgałęzionym, utworzonych w wyniku redukcji a-ketokwasów. Choroba uwidacznia sie pod koniec pierwszego tygodnia Ŝycia pozamacicznego. Oprócz opisanych wyŜej zaburzeń biochemicznych niemowie z trudem daje się karmić, moŜe wymiotować i być w letargu. Rozpoznanie przed pierwszym tygodniem Ŝycia jest moŜliwe tylko za pomocą analizy enzymatycznej. Rozległe uszkodzenia mózgu występują u dzieci przeŜywających. Dzieci nie leczone umierają zwykle pod koniec pierwszego roku Ŝycia. Wada biochemiczna polega na braku lub znacznym zmniejszeniu aktywności dekarboksylazy a-ketokwasowej, która katalizuje przemiany wszystkich 3 a-ketokwasów o łańcuchu rozgałęzionym do CO2 oraz tioestrów acylo-CoA (reakcja 2, ryc. 32-26). Mechanizm zatrucia pozostaje nieznany. Rozpoczęcie leczenia w pierwszym tygodniu Ŝycia moŜe w znacznym stopniu zapobiec stra-

384 / ROZDZIAŁ 32

szliwym skutkom tej choroby. Pokarmy białkowe zastępuje się mieszaniną oczyszczonych aminokwasów, spośród których eliminuje się leucynę, izoleucynę I walinę. JeŜeli tylko stęŜenie tych aminokwasów w osoczu zmniejszy się poniŜej poziomu prawidłowego, chorzy powracają do diety w postaci mleka oraz innych pokarmów w ilościach pokrywających, lecz nie przekraczających, zapotrzebowanie na aminokwasy o łańcuchach rozgałęzionych. Nie ma Ŝadnych kryteriów, kiedy — jeŜeli w ogóle jest to moŜliwe — moŜna złagodzić ograniczenia Ŝywieniowe.

oraz kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgla) obejmuje zaleŜną od biotyny karboksylację do metylomalonylo-CoA. Metylomalonylo-CoA powstaje równieŜ z waliny bezpośrednio (tj. bez uprzedniego utworzenia propionylo-CoA). W reakcji zaleŜnej od koenzymu witaminy Bi3 metylomalonylo-CoA izomeryzuje następnie do sukcynylo-CoA. Chorzy z niedoborem witaminy B^ wydalają z moczem metylomalonian. Ta acyduria metylomalonianowa ustępuje po podaniu wystarczających ilości witaminy B]2.

Nawracająca ketonuria łańcuchów

karboksylazy propionylo-CoA charakteryzuje się duŜym stęŜeniem propionianu w surowicy. Leczenie polega na przestrzeganiu diety małobiałkowej i stosowaniu środków przeciwdziałających kwasicy metabolicznej. Acyduria metylomaionowa. Znane są 2 postacie. Jedna reaguje na farmakologiczne stęŜenie witaminy B]2. Typ drugi wymaga leczenia za pomocą masywnych dawek witaminy B^ (1 g na dobę).

rozgałęzionych. Ta odmiana choroby „moczu o zapachu syropu klonowego", jest zapewne konsekwencją mniej groźnej strukturalnej modyfikacji dekarboksylazy oc-ketokwasowej. PoniewaŜ chorzy mają upośledzoną, niemniej jednak wyraźną zdolność do katabolizmu leucyny, waliny oraz izoieucyny, objawy choroby „moczu o zapachu syropu klonowego" występują w późniejszym okresie Ŝycia i tylko przejściowo. W przypadku terapii Ŝywieniowej rokowania dla tych chorych są pomyślni ej s ze. Choroba, .moczu o zapachu syropu klonowego" oraz nawracająca ketonuria rozgałęzionych łańcuchów odzwierciedlają mutacje powodujące róŜne zmiany w strukturze pierwszorzedowej tego samego enzymu. Prawdopodobnie szeroki zakres aktywności, od otwartej choroby przez objawy nawracające do wartości prawidłowych, zdarza się u poszczególnych chorych. Acydemia izowalerianowa. Istotnymi zmianami są: woń „serowa" oddechu i płynów ustrojowych, wymioty, kwasica i śpiączka wywołana nadmiernym spoŜyciem białka. Uszkodzonym enzymem jest dehydrogenaza izowalerylo-CoA (reakcja 3, ryc. 32-26). W ten sposób nagromadza się izowalerylo-CoA, który hydrolizuje do izowalerianianu i wydala z moczem oraz potem. Zaburzenia w katabolizmie metylomalonylo-CoA odzwierciedlają niewydolność w przemianie witaminy B12 do jej koenzymu Przekształcenie w amfiboliczne intermediaty propionylo-CoA (pochodzącego z izoieucyny, metioniny, łańcucha bocznego cholesterolu

Acydamia propionianowa. Niedobór

PIŚMIENNICTWO Cooper AJL; Biochermstry of the sulfur-containing amino acids. Annu Rev Biochem 1983;52:187. Paxton R, Harris RA: Isolation of rabbit liver branched chain a-ketoacid dehydrogenase and regulation by phosphorylation. J Blol Chem 1982;257:14433. Paxton R, Harris RA: Regulation of branched-chain a-ketoacid dehydrogenase kinase. Arch Biochem Biophys 1984;231:48. Rosenberg LE, Serwer CR: Disorders of amino acid naetabolisin. Chapter 11 in: Metaboiic Control and Bueme. Bondy PK, Rosenberg LE (editors). Saunders, 1980. Scriver CR et al (editors): The Metabołic Basis oj Inherited Disease, 6th ed. McGraw-HM, 1989. Wellner D, Meister A: A survey of inborn errors of amino acid metabolismand transport in man. Annu Rev Biochem (981:50:911.

Przemiana aminokwasów w wyspecjalizowane produkty

33

Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE Aminokwasy stanowią główne źródło azotu dla zwierząt i słuŜą jako prekursory dla innych składników azotowych. Większość z nich to związki nieami no kwasowe, wobec czego omówienie ich zbiega się ze szlakami metabolicznymi przedstawionymi w innych rozdziałach tego podręcznika. Fizjologicznie waŜne produkty pochodzące z aminokwasów to: hem, puryny, pirymidyny, hormony i neuroprzekaźniki (neur o transmitery), włączając biologicznie aktywne" peptydy. Ponadto wiele białek zawiera aminokwasy, które zostały zmodyfikowane w celu wypełnienia swoistych funkcji, np. związania wapnia lub poprzecznego połączenia, i w ten sposób reszty aminokwasowe w tych białkach słuŜą jako prekursory dla owych zmodyfikowanych reszt. Występują takŜe małe peptydy lub cząsteczki peptydopodobne nie syntetyzowane na rybosomach, które wykonują swoiste czynności w komórce.

GLICYNA UCZESTNICZY W BIOSYNTEZIE HEMU, PURYN, POŁĄCZEŃ GL1CYNOWYCH IKREATYNY Synteza hemu. Atomy węgla ot i azotu glicyny są wykorzystywane w syntezie porfirynowej części hemoglobiny (p. rozdz. 34), Atom azotu w pierścieniu pirolowym pochodzi z azotu glicyny, a przylegający atom węgla — z węgla

O"

Mg-ATP Mg-ADP + P,

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Histamina, biologicznie aktywna amina, utworzona w wyniku dekarboksylacji histydyny, odgrywa główną rolę w reakcjach alergicznych. Swoiste neuroprzekaźniki pochodzące z aminokwasów obejmują: y-aminomaśian z giutaminianu, 5-hydroksytryptaminę (serotoninę) z tryptofanu oraz dopaminę, noradrenaiinę i adrenalinę z tyrozyny. Wiele leków stosowanych w leczeniu stanów neurologicznych i psychiatrycznych wpływa na metabolizm wymienionych wyŜej neuroprzekaźników. 25 — Biochemia

CoA-SH

Hipuran Ryc.

33-1. Biosynteza hipuranu

386 / ROZDZIAŁ 33

ot glicyny. Węgiel a jest równieŜ źródłem atomów mostków metylenowych łączących pierścienie pirolowe. Zaburzenia metabolizmu hemu są omówione w rozdz. 34.

Synteza nukleotydów purvnowych. Cała cząsteczka glicyny tworzy pozycje 4, 5 i 7 w szkielecie purynowym (p. rozdz. 36).

Tworzenie połączeń glicynowych. Glicyna wiąŜe się z kwasem cholowym w kwas Ŝółciowy glikocholowy. Z benzoesanem glicyna tworzy hipuran (ryc. 33-1). Zdolność wątroby do ilościowej przemiany benzoesanu w hipuran wykorzystywano dawniej jako próbę czynnościową wątroby. Synteza kreatyny. Sarkozyna (N-metyloglicyna), składnik kreatyny, pochodzi z glicyny i S-adenozylometioniny.

Ergotloneina

-cHrNH'+ NH

CH;

o Karnozyna

-ALANINA JEST GŁÓWNYM AMINOKWASEM OSOCZA Alanina wraz z glicyna stanowi znaczną część azotu aminowego w osoczu ludzkim. Alanina jest równieŜ głównym składnikiem ścian komórek bakteryjnych, częściowo jako D-izomer: 39—50% u Streptococcus faecalis i 67% u Staphylococcus aureus.

Anse ry na

O. NH

SSAKI TWORZĄ |i-ALAI\HNĘ Z URACYLU I KATABOLIZUJĄ JĄ PRZEZ SEMIALDEHYD MALONIANU W tkankach znajduje się niewiele wolnej Palaniny, znacznie więcej występuje w postaci palanylowych dipeptydów oraz koenzymu A (p. ryc. 18-6). Wprawdzie mikroorganizmy wytwarzają palaninę przez dekarboksylację p-asparaginianu, fi-alanina tkanek ssaków pochodzi głównie z katabolizmu uracylu, karnozyny i anseryny (ryc. 33-2). Katabolizm p-alaniny u ssaków obejmuje transaminację do semialdehydu malonianu, który utlenia się do octanu i dalej do CO2. W rzadko występującym zaburzeniu metabolicznym, jakim jest hiper-p aiartinemia dochodzi do zwiększenia stęŜenia P-alaniny w płynach ustrojowych oraz w tkankach. StęŜenia tauryny i P-aminoizomaślanu są równieŜ zwiększone.

I CH O Homo kar n ozyn a Ryc. 33-2. Związki spokrewnione z histydyną. Prostokąty ujmują komponenty nie pochodzące z histydyny.

KARNOZYNA JEST DIPEPTYDEM (3-ALANYLOWYM P-Alanina występuje głównie jako karnozyna, dipeptyd ludzkich mięśni szkieletowych (ryc. 33-2). Ściśle spokrewniony dipeptyd (3-alanyJowy, anse ry na (N-metylokarnozyna, ryc. 33-2), występuje obficie u gatunków, u których mięśnie szkieletowe odznaczają się szybką czynnością skurczową (kończyny królika, mięśnie

PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY / 387

piersiowe ptaków). Brak jej w mięśniach człowieka. W ten sposób moŜe on spełniać funkcje fizjologiczne odrębne od karnozyny. P-Alanylo-imidazol buforuje pH mięśnia szkieletowego kurczącego się beztlenowo. Karnozyna i a n sery na wzmagają aktywność ATPazy miozynowej in vitro. Oba dipeptydy chelatują równieŜ miedź i pobudzają pobieranie związków miedzi. Dipeptydy p-alanylowe są syntetyzowane i degradowane na krótkich szlakach Karnozyna powstaje z p-alaniny i L-histydyny w reakcji wymagającej ATP, katalizowanej przez syntetazę karnozyny: ATP + L-Histydyna + [3-Alanina > -» AMP + PP + Karnozyna

Anseryna powstaje z karnozyny (donorem grupy metylowej jest S-adenozylometionina) w reakcji katalizowanej przez N-metylotransferazę karnozynową: S-Adenozylometionina + Karnozyna -» -» S-Adenozyiohomocysteina + Anseryna

Ogólna reakcja obejmuje związany z enzymem p-alanyloadenyian. Karnozyna jest hydrolizowana do p-alaniny i L-histydyny przez występujący w surowicy metaloenzym związany z cynkiem—dipeptydazę aminoacylohistydynową (inaczej: karnozynaza

lub hydrolaza karnozynową — nazwy nie zaleca-

z chorobą Hartnupa reakcja histydynemii jest prawidłowa, jeŜeli Icarnozyna znajduje się w pokarmie, ale jest osłabiona po podaniu L-histydyny. Homokarnozyna jest dipeptydem ośrodkowego układu nerwowego Fizjologiczna funkcja homokarnozyny (y-aminobutyrylo-L-histydyny; ryc. 33-2), dipeptydu ośrodkowego układu nerwowego, spokrewnionego strukturalnie i metabolicznie z karnozyną, nie jest znana. Ten dipeptyd y-aminomaślanu i L-histydyny występuje w tkance mózgu ludzkiego, gdzie jego stęŜenie zmienia się wraz z badanym obszarem. Biosynteza homokarnozyny w ludzkim mózgu wydaje się być katalizowana przez syntetazę homo karnozynową. Dipeptydaza aminoacylohistydynową surowicy nie hydrolizuje jednak homokarnozyny. FOSFORYLOWANE RESZTY SERYLOWE I TREONYLOWE WYSTĘPUJĄ W WIELU BIAŁKACH DuŜo cząsteczek seryny w fosfoproteinach występuje w postaci O-fosfoseryny. Sery na uczestniczy w syntezie sfingozyny (p. rozdz. 26) oraz puryn I pirymidyn. Węgiel jest źródłem grup metylowych tyminy (i choliny) oraz atomów węgla w pozycjach 2 i 8 rdzenia purynowego (p. rozdz. 36). Treonina nie ulega tran sam i nacji, wobec czego D-izomer i ot-ketokwas nie są wykorzystywane przez ssaki. W niektórych białkach treonina występuje jako O- fosfo treonina.

ne) . Niedobór tego enzymu w surowicy to zaburze-

nie dziedziczne, prawdopodobnie autosomalne, recesywne, charakteryzujące się uporczywą karnozynurią i sporadycznie równieŜ hiperkarnozynemią. Karnozynuria utrzymuje się nawet po wyłączeniu karnozyny z poŜywienia. Reakcja na dietę karnozynową ułatwia rozpoznanie choroby Hartnupa Tkanka nerki i enterocyty jelitowe pobierają karnozynę i i p-alaninę za pomocą nośników błonowych, które rozróŜniają jeden substrat od drugiego i oba od innych dipeptydów. Zdolność do zróŜnicowanego pobierania P-alaniny od karnozyny znalazła zastosowanie do zidentyfikowania choroby Hartnupa, dziedzicznego zaburzenia w transporcie niektórych obojętnych a-aminokwasów (p. rozdz. 32). U osób

S-ADENOZYLOMETIONINA STANOWI GŁÓWNE ŹRÓDŁO GRUP METYLOWYCH W BIOSYNTEZIE Metioninę, jako donora grup metylowych, omówiono w rozdz. 32. W postaci S-adenozylometioniny jest ona głównym źródłem grup metylowych w organizmie, które mogą być wykorzystywane zarówno w postaci nie naruszonej, jak i po utlenieniu. Węgiel grupy metylowej moŜe takŜe posłuŜyć do utworzenia reszty jednowęglowej, łączącej się z glicyną w procesie syntezy seryny, Metionina funkcjonuje jako Sadenozylometionina w charakterze prekursora dla 1,3^diaminopropanu, części poliamin sperminy i spermidyny (p. niŜej).

388 / ROZDZIAŁ 33

SIARCZAN ZAWARTY W MOCZU POCHODZI GŁÓWNIE Z CYSTEINY Siarczan zawarty w moczu powstaje niemal całkowicie z utlenienia cysteiny. Siarka metioniny (jako homocysteiny) jest przenoszona na serynę (p. ryc. 30-9) i w ten sposób przyczynia się pośrednio do puli siarczanów zawartych w moczu (tj. za pośrednictwem cysteiny). LCysteina słuŜy jako prekursor tioetanoloaminowcj części koenzymu A oraz tauryny, która sprzęga się z kwasami Ŝółciowymi, formując np. kwas taurocholowy.

DEKARBOKSYLACJA HISTYDYNY TWORZY HISTAMINĘ Histamina pochodzi z histydyry w wyniku jej dekarboksylacji katalizowanej w tkankach ssaków przez dekarboksylazę [.-aminokwasów aromatycznych. Enzym ten powoduje równieŜ dekarboksylacje cząsteczek: dopa, 5-hydroksytryptofanu, fenyloalaniny, tyrozyny i tryptofanu (p. niŜej). Dekarboksylację hamują oc-m etyl oaminok wąsy, które w ten sposób znalazły zastosowanie w klinice jako czynniki obniŜające ciśnienie krwi. Odmienny enzym, dekar-

boksylaza histydynowa, występujący w większości tkanek, katalizuje dekarboksylację histydyny. Do związków histydynowych występujących w organizmie naleŜą: ergotioneina, w erytrocytach i w wątrobie, karnozyna i anseryna (ryc. 33-2). Prawdopodobnie z anseryny pochodzi 1-metylohistydyna występująca w moczu ludzkim. W nim zidentyfikowano takŜe 3-metylohistydynę w ilości 3,2 mmol/1 (= ok. 50 mg/dl). Pojawia się ona w niezwykle małych iiościach w moczu chorych na chorobę Wilsona (p. rozdz. 58).

ARGININA PRZEZ ORNITYNĘ JEST PREKURSOREM PO LI AM IN Arginina słuŜy jako dawca grupy formamidynowej w syntezie: kreatyny u Naczelnych (p. ryc. 33-10) oraz streptomycyny u Streptomyc.es. Inne jej przeznaczenia obejmują przekształcanie, przez ornitynę, w putrescynę, sperminę i spermidynę (ryc. 33-3) oraz biosyntezę fosforanu argininy (funkcjonalnego analogu fosforanu kreatyny) w mięśniach bezkręgowców. W uzupełnieniu do jej roli w biosyntezie mocznika (p. rozdz. 31), ornityna_(z metioniną) stanowi prekursor występujących powszechnie

JBiałka|

I Prollnal

y-Śemialdehyd glutamimanu

Putrescyna, sperm idyna spermlna

Glutamin ian

Ryc. 33-3. Metabolizm argininy, ornityny i proliny. W tkankach ssaków zachodzą wszystkie reakcje zaznaczone strzałkami ciągłymi. Synteza putrescyny i sperminy przebiega zarówno u 'ssaków, jak i u bakterii. Fosforan ornityny występuje w mięśniach bezkręgowców, gdzie funkcjonuje jako fosfagen analogiczny do fosforanu kreatyny w tkankach ssaków.______________________________

PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY / 389 A'

B

\ t'

H, CH^

r"* LJ "^^ "1"

CH^

1,3-Oiaminopropan (A)

r* Ul

i* W

Kl

H3*

Spermidyna A

B

A ,1, ______

1,4-Diaminobutan (B) (pulrescyna)

Spermina

J

^c< - N H ;

1,5-Diaminopenian (kadaweryna} Ryc. 33-4. Struktury naturalnych poliamin ZauwaŜ, Ŝe spermidyna i spermina są polimerami diaminopropanu (A) i diaminobutanu (B). Diaminopentan {kadaweryna) równieŜ występuje w tkankach ssaków.

u ssaków (i bakterii) pojiamin: sperm idy ny i sp^n^ny (ryc. 33-4). Zdrowi ludzie biosyntetyzujt) w przybliŜeniu 0,5 mmol sperminy dziennie. Farmakologiczne dawki poliamin obniŜają temperaturę i ciśnienie. Spermidyna i spermina biorą udział w róŜnorodnych procesach fizjologicznych, które laczy wspólna nić — ścisłe powiązanie z proliferacją i wzrostem komórkowym. One są czynnikami wzrostu w hodowlach komórek ssaków i bakterii uczestniczących w stabilizacji nie naruszonych komórek, organelii subkomórkowych oraz błon. W konsekwencji ich mnogich ładunków dodatnich poliaminy asocjuja. chętnie z polianionami, np. DNA i RNA, i są zaangaŜowane w takie fundamentalne procesy, jak stymulacja biosyntezy DNA i RNA, stabilizacja DNA oraz upakowanie DNA w bakteriofagu. Poliaminy mają takŜe róŜnorodny wpływ na syntezę białka i działają jako inhibitory enzymów, włączając kinazy białek. Wprawdzie obecnie nie jest moŜliwe wytłumaczenie (w precyzyjnych określeniach mechanistycznych) sposobu oddziaływania poliamin na jakieś swoiste procesy metaboliczne, istotna ich natura w metabolizmie ssaków została przekonywająco udokumentowana przez doświadczenie następującego typu. Początkowa reakcja w biosyntezie poliamin jest katalizowana przez dekarboksylazę ornitynową (ryc. 33-5). Doda-

nie do hodowli komórek ssaków inhibitorów aktywności dekarboksylazy ornitynowej (np. L-metyloornityny lub difluorometyloornityny) wyzwala nadprodukcję dekarboksylazy ornitynowej. To sugeruje istotną rolę fizjologiczną tego enzymu, którego jedyną znaną funkcją jest biosynteza poliamin. Biosynteza poliamin jest waŜna dla wzrostu komórek i tkanek Na rycinie 33-5 podsumowano biosyntezę poliamin w tkankach ssaków. ZauwaŜ, Ŝe część putrescynowa spermidyny i sperminy pochodzi z L-ornityny, a fragment diaminopropanowy z L-metioniny przez uformowania związku pośredniego S-adenozylometioniny. Dekarboksylaza orni ty no w a i de kar boksy laza S-adenozylometioninowa są to indukowane enzymy z krótkimi okresami półtrwania. Przeciwnie, syntazy sperminowe i spermidynowe nie są enzymami ani indukowanymi, ani niezwykle łabilnymi. Spośród enzymów biosyntezy poliamin u ssaków 2 (dekarboksylaza ornitynową i dekarboksylaza S-adenozylometioninowa) budzą zainteresowanie ze względu na regulację ich obu, jak równieŜ moŜliwość ich wykorzystania w chemioterapii kierowanej enzymatycznie. Biologiczny okres półtrwania dekarboksylazy ornitynowej (w przybliŜeniu 10 min) jest krótszy od

390 / ROZDZIAŁ 33

Metionina + Mg-ATP

. Mg-PP;

CH, OEKAfIBOKSYLAZA OHNITYNOWA

OHOH

S-Aden ozy lometion in a

OEKARBOKSYLAZA S-ADENOZYLOMETIONINOWA

coo~

Dekarboksylowana Sadenozylamettonlna SYNTAZA SPERMIDYNOWA

OHOH MetylotloadencTyna

Spennldyna Da karbo ksylowan a SadenozylometloninaSYNTAZA SPEHMINOWA Melylotloadenozyna

Spermina

Ryc. 33-5. Związki pośrecTnie i enzymy uczestniczące w biosyntezie spermidyny i sperminy. Grupy metylenowe podano w postaci skrótowej, aby ułatwić uwidocznienie całości procesu.

PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY / 391

biologicznego okresu półtrwania jakiegokolwiek innego znanego enzymu ssaków, a jej aktywność szybko i gwałtownie reaguje na wiele bodźców. Zwiększenie aktywności dekarboksylazy ornitynowej 10—200-krotne następuje szybko po podaniu hodowanym komórkom ssaków hormonu wzrostu, kortykojteroidów, testosteronu lub naskórkowego czynnika wzrostu, Poliaminy wprowadzone do hodowli komórkowej pobudzają syntezę białka o nazwie antyzym (ang. antizyme), które wiąŜe się z dekarboksylazą ornitynową i hamuje jej funkcje. Aktywność dekarboksylazy ornitynowej wydaje się być kontrolowana w wyniku oddziaływania białko-białko, przypominającego regulację aktywności trypsyny przez białkowe inhibitory trypsyny. Difluorometyloornityna, „samobójczy inhibitor" dekarboksytazy ornitynowej, była wykorzystywana do wyizolowania linii komórkowych mutantów, które wytwarzają w nadmiernych ilościach dekarboksylazę ornitynową i hamują replikację komórki przez chemioterapię kierowaną enzymatycznie.. Dekarboksylaza S-adenozylometioninowa, jedyny znany enzym eukariotyczny ze związanym pirogronianem jako niezbędnym kofaktorem (dekarboksylazy zwykle zawierają fosforan pirydoksalu, którego brak w dekarboksylazie S-adenozylometioninowej), ma krótki biologiczny okres póttrwania (1—2 h) i reaguje na promotory wzrostu komórkowego w sposób jakościowo podobny do karboksylazy ornitynowej. Zarówno jednak szybkość, jak i rozległość są mniej dramatyczne. Dekarboksylaza Sadenozylometioninowa (ryc. 33-5) ulega zahamowaniu przez dekarboksylowaną S-adenozylometionine i jest aktywowana przez putrescyne. Produkty katabolizmu poliamin są wydalane z moczem Na rycinie 33-6 przedstawiono katabolizm poliamin w tkankach ssaków. Enzym, oksy^daza poliaminowa, występujący w peroksysomach wątroby i utlenia sperminę do spermidyny, a następnie sperm idy nę do putrescyny, Obie części diaminopropanowe są przekształcane w aldehyd P-aminopropionowy. Następnie putrescyna jest częściowo utleniana do MHj iCC^przez mechanizmy, które pozostają do wyjaśnienia. Jednak główne części putrescyny i spermidyny są wydalane z moczem w postaci koniugatów (związków sprzęŜonych), przede wszystkim jako pochodne acetyl owe.

HA

+

NH3 Aldehyd fi-amInoproplonlanu

Aldehyd 0-aminopropionianu

Puirsscyna

NH+ +CO3 Ryc. 33-6. Katabolizm poliamin. Aby ułatwić przedstawienie procesu struktury podano w -formie skrótowej. ___ _____________________

Z TRYPTOFANU WYTWARZA SIĘ SEROTONINA Drugi szlak metabolizmu tryptofanu obejmuje jego hydroksylację do 5-hydroksytryptofanu. Utlenienie tryptofanu do pochodnej hydroksylowej przebiega analogicznie do przemiany fenyloalaniny w tyrozynę (ryc. 30-10), a 4-monooksygenaza fenyloalaninowa katalizuje równieŜ hydroksylację tryptofanu. W wyniku dekarboksylacji 5-hydroksy tryptofanu powstaje 5-hydroksytryptamina (serotonina) (ryc. 33-7), waŜny czynnik zwęŜający naczynia krwionośne i stymulator skurczu mięśni gładkich.

392 / ROZDZIAŁ 33

O, > Wydalane jako koniugaty

5-Hydroksytryptofan 5-Hydroksytryptamina

5-Hydroksyindolo-3-octan

Wydalany Melatonina w postaci sprzęŜonej (N-acetylo-5-meioKsyserotonlna)

Wydalany w postaci sprzęŜonej

Ryc. 33-7. Biosynteza i metabolizm melatoniny. [NH*] — przez transami nację, MAO — oksydaza aminowa (oksydaza monoaminowa — nazwa nie zalecana).

Dekarboksylaza 5-hydroksytryptofanowa, która wytwarza serotonine z hydroksytryptofanu, występuje w nerkach (psa i świnki morskiej), w wątrobie i Ŝołądku. Szeroko rozpowszechniona dekarboksylaza aromatycznych amino-

kwasów moŜe równieŜ katalizować dekarboksylacje 5-hydroksytryptofanu. Większość serotoniny jest w wyriiku oksydacyjnej deaminacji przemieniana do 5-hydroksyindolooctanu. Katalizuje tę reakcję oksydaza

PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY / 393

aminowa (inaczej: oksydaza monoaminowa — nazwa' nie zalecana) (ryc. 33-7). Do inhibitorów tego enzymu naleŜy iproniazyd. Pobudzenie psychiczne, wywołane przez podanie tego leku, jest przypisywane jego zdolności przedłuŜania pobudzającego działania serotoniny przez hamowanie aktywności oksydazy aminowej. W prawidłowym moczu ludzkim wydala się dziennie 10,52—42,06 umol (2—8 mg) 5-hydroksyindolooctanu.

Zwiększone wytwarzanie serotoniny zachodzi w złośliwym rakowiaku Znacznie zwiększone wytwarzanie serotoniny występuje w złośliwym rakowiaku (argentaffinoma), chorobie charakteryzującej się szerokim rozprzestrzenieniem się komórek nowotworowych wytwarzających serotoninę w tkance srebrochłonnej jamy brzusznej. Rakowiak jest rozpatrywanyjako zaburzenie metabolizmu tryptofanu, w którym, znacznie większa niŜ zwykle, część puli tego aminokwasu ulega przemianie na szlaku hydroksyjndolowym. W warunkach prawidłowych tylko 1% tryptofanu przekształca się w serotoninę, ale u chorego na rakowiaka przemianie tej ulega nawet 60% tryptotanu. Takie przesunięcie metabolizmu znacznie zmniejsza wytwarzanie kwasu nikotynowego z tryptofanu, co w konsekwencji moŜe spowodować wystąpienie objawów pelagry, a takŜe uiemnego bilansu azotowego. Innymi metabolitami serotoniny, zidentyfikowanymi w moczu chorych na rakowiaka, są; 5-hydroksyindoloaceturan (połączenie glicyny z 5-hydroksyindołooctanem) oraz N-acetyl o sero toni na sprzęŜona z kwasem glukuronowym.

Melatonina wytwarza się podczas N-acetyiacji serotoniny Melatonina powstaje z serotoniny w wyniku N-acetylacji z następczą metylacją grupy 5-hydroksylowej (ryc. 33-7). Proces ten zachodzi w tkance szyszynki. W uzupełnieniu do metylacji N-acetyloseryny, zachodzi równieŜ bezpośrednia metylacją serotoniny oraz jej metabolitu — 5-hydroksyindolooctanu (ryc. 33-7). Serotonina i 5-metyloksytryptarnina są przekształcane w odpowiednie kwasy pod wpływem oksydazy aminowej. Z krwiobiegu melatonina jest wychwytywana przez wszystkie tkanki, włączając mózg, ale ulega szybkiej przemianie w wyniku hydroksylacji w pozycji 6, z następczym sprzęŜeniem z siarczanem (70%)

i kwasem glukumnowym (6%). Część puli melatoniny przekształca się w związki nieindolowe.

Metabolity tryptofanu są wydalane z moczem i kałem Tryptofan moŜe ulegać przemianie w kilka pochodnych indolowycfi (33-7). Produktami końcowymi tych przekształceń, pojawiającymi się w moczu, są przede wszystkim: 5-hydroksyindolooctan, główny końcowy produkt szlaku prowadzącego od hydroksytryptofanu do serotoniny, oraz indolo-3-octan, powstający w wyniku dekarboksyiacji i utlenienia indolopirogronianu, ketokwasu pochodzącego z tryptofanu. Nerki i wątroba ssaków oraz bakterie z kału ludzkiego dekarboksylują tryptofan do tryptaminy, która moŜe być dalej utleniania do indolooctanu. Chorzy z fenyloketonurią wydalają zwiększone ilości indolooctanu (oraz indolomleczanu, powstającego w wyniku redukcji indolopirogronianu).

MELANINY SĄ POLIMERAMI KATABOLITÓW TRYPTOFANU Biosynteza melaniny jest skomplikowana wskutek wydłuŜonych i rozgałęzionych szlaków biosyntezy złoŜonych chemicznych struktur heteropolimerów mekniny, a takŜe ich nierozpuszczalności, co utrudnia określenie ich struktury. Melaniny są syntetyzowane w melanosomach — cząstkach związanych z błonami w obrębie melanocytów. Sądzi się, Ŝe powstający polimer eumelaniny wychwytuje wolne rodniki i ulega częściowej degradacji przez H2O2, wytwarzany podczas procesu autooksydacji. Feomelaniny i eumelaniny wchodzą w kompleks z białkami macierzy melanosomalnej, wytwarzając melanoproteinę. Na rycinie 33-8 przedstawiono znane związki pośrednie oraz reakcje w biosyntezie eumelaniny i feomdaniny. Reakcję początkową katalizuje monooksygenaza monofenolowa (inaczej: tyrozynaza — nazwa nie zalecana), enzym zaleŜny od miedzi. Reakcja katalizowana przez ten enzym ulega zaburzeniu w oezno-skórnym albinizmie tyrozynazo-ujemnym (p. niŜej).

Związek pośredni benzoliazyny

TH1CHOCHROMY MONOOKSYGENAZA MONOFENOLOWA p

(3,4- d i hyd ro ksyfen yloalan fn a) OKSYDAZA KATECHOLOWA

zredukowany "\

Dopachinon

MELANINY TYPU MIESZANEGO

Ryc. 33-8. Poznane związki pośrednie i reakcje w biosyntezie eumeianin i feomelanin. Polimery melaniny zawierają zarówno eumelaninę, jak r feomelaninę w zmiennych proporcjach. Strzałki kreskowane wskazują, które związki pośrednie przyczyniają się do syntezy eumelanin w róŜnych proporcjach. Cyfry w kółkach wskazują na prawdopodobne regulatorowe reakcje szlaku biosyntetycznego. Reakcja 1, katalizowana przez monooksygenazę monoienolową i oksyda2ę katecholową (ogółem: tyrozynazę), jest wadliwa (niepełna) w ty rozynazo- ujemnym albinizmie oczno-skórnym.

PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY / 395

Kilka wad w biosyntezie melaniny moŜe spowodować albinizm Termin „albinizm" obejmuje wiele objawów klinicznych, charakteryzujących hipomelanozę powstającą z dziedzicznych wad komórek barwnikowych (melanocytów oczu j skóry). Jest znane kilka poŜytecznych modeli albinizmu u gryzoni. Objawy kliniczne, wspólne dla wszystkich 10

S-Adefiozylohomocystaina

jr- H, • bioptaryna 3-MONOOKSYGENAZA TYROZYNOWA

H. ■ bloptaryna

postaci albinizmu oczno-skórnego, obejmują

osłabione zabarwienie skóry i oczu. Wszystkie 10 postaci moŜna zróŜnicować na podstawie ich właściwości klinicznych, biochemicznych, ultraslrukturalnych i genetycznych. U albinosów tyrozynazo-ujemnych (inaczej:

tyrozynazo-negatywnych) jest całkowity brak widocznego barwnika. Cebulki włosów u tych chorych nie są zdolne do przekształcenia in vitro dodanej tyrozyny w barwnik, a ich melanocyty zawierają bezbarwne melanosomy. Albinosi tyrozyn a/ o -doda tui (inaczej: tyrozynazo-pozytywni) mają nieco barwnika, chociaŜ moŜe być on niewidoczny u „białych" niemowląt. Barwa włosów waha się od białoŜółtej do jiisnobrązowej i bywają zabarwione znamiona. Melanocyty cebulek włosów mogą zawierać lekko zabarwione melanosomy, które przekształcają ta vitro tyrozynę w czarną eumelanine. Bielaetwo oczne zdarza się albo jako cecha autosomalna recesywna, albo sprzęŜona z chromosomem X. Melanocyty u albinosówz bielactwem ocznym u heterozygot sprzęŜonych z chromosomem X (ale nie u autosomalnych recesywnych) zawierają makromelanosomy. Siatkówki oczu u heterozygot Ŝeńskich z bielactwem ocznym sprzęŜonym z chromosomem X (odmiana Nettleship) wykazują mozaikowy wzór rozmieszczenia barwnika związany z przypadkową inaktywacją chromosomu X. Precyzyjne zaburzenia metaboliczne, prowadzące do hipomelanozy w bielactwie ocznym, pozostają nieznane. Aibinoidyzm oczno-skórny jest dziedziczony

jako autosomalna cecha recesywna, U chorych, poza rzadkimi wyjątkami, nie występuje oczopląs, światłowstręt i zmniejszona ostrość widzenia. Z TYROZYNY WYTWARZA SIĘ ADRENALINA I NORADRENALINA Tyrozyna jest prekursorem adrenaliny i noradrenąliny,-iŁtóre"ś^Tcyiw"afŜane w komórkach pochodzenia nerwowego. ChociaŜ DOPA jest

TRANSFERAZA NDopamlna

METYLOFENYLO ETANOLOAMINOWA

OH Adrenalina

Ryc. 33-9. Przemiana tyrozyny w adrenalinę i noradrenalinę w komórkach nerwowych i nadnerczy. PLP — fosforan pirydoksalu.

396 / ROZDZIAŁ 33 NH, H,N+ =

(Nerki) TflANSAMIDYNAZA AGRININO-GLI CYNOWA

+

I

r

HNCH,.COO "

H,N-CH2-COO'

Ornltyna

Glikocyjamina (guanidynooctan) (i. aktywnej met (Wątroba) i o ni ny') ATP S-AdanozyloMETYLOTRANSFERAZA metionlna

Glicyna

ćooL-Arginlna

ADP

homocystelna REAKCJA NIEENZYMATYCZNA W MIĘŚNIU HN=C CH;

r

HN;

Pi+HsO

tC

N

CH-, Kreatynina Ryc.

CH3

33-10. Biosynteza

Fosforan kreatyny

kreatyny i kreatyniny.

Bursztyn lan

[A MIN OT R ANSF ERAZ A ]

DEKARBOKSYLAZA L-GLUTAMINIANOWA

a-AA

cooy-HydroKsymaS!an CHS

cooDEHYDROGENAZA MLECZANOWA

a-Ketoglutaran

DEHYDflOGENAZA SEMIALDEHYDU BURSZTYNIANOWEGO

cooSemlaldehyd bursztyn łanu

Ryc. 33-11. Metabolizm y-aninomaślanu. a-KA — a-ketokwasy, a-AA — ^-aminokwasy, PLP — fosforan pirydoksalu.

PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY / 397

związkiem pośrednim w powstawaniu zarówno melańiny ■ w melanocytach, jak i adrenaliny w komórkach neuronowych, odmienne enzymy przeprowadzają reakcje hydroksylacji w róŜnych typach komórkowych. Enzym 3-raonooksygenaza tyrozynowa (inaczej: hydroksylaza tyrozyny nazwa nic zalecana) tworzy cząsteczkę DOPA w komórkach neuronalnych i nadnerczy na szlakach wiodących do wyprodukowania noradrenaliny (ryc. 33-9). Dekarboksylaza DOPA, enzym zaleŜny od fosforan u pirydoksal u, wytwarza dopaminę. Ta ostatnia ulega dalszej hydroksylacji przez p-monooksydazę dopaminową (inaczej: p-oksydazę dopaminową — nazwa nie zalecana), enzym zaleŜny od miedzi, który wydaje się wykorzystywać witaminę C, aby wytworzyć noradrenaline. W rdzeniu nadnerczy N-metylotransferaza fenyloetanoloaminowa posługuje się S-adenozylometioniną do metylacji pierwszorzędowej aminy noradrenaliny, w celu utworzenia adrenaliny (ryc. 33-9). Tyrozyna jest równieŜjirekursorem hormosyny (p. rozdz. 47).

WYDALANA KREATYNINA JEST ODZWIERCIEDLENIEM MASY MIĘŚNIOWEJ Kreatyna występuje w mięśniach, mózgu i krwi zarówno jako fosfokreatyna, jak i w stanie wolnym. Śladowe ilości kreatyny są równieŜ w prawidłowym moczu. Kreatynina, bezwodnik kreatyny, jest wytwarzana w znacznej mierze w mięśniu w wyniku nieodwracalnego nieenzymatycznego odwodnienia fosfokreatyny (ryc. 33-10). Wydalanie dobowe kreatyniny w moczu przez daną osobę jest w znacznym stopniu stałe, nie zmienia się z clnia na dzień oraz pozostaje proporcjonalne do masy mięśni. W biosyntezie kreatyny uczestniczą bezpośrednio 3 aminokwasy, tj. glicyna, arginina i metionina. Pierwszą reakcją jest tran sam idy nacja, tj. przeniesienie grupy amidynowej z argininy na glicynę z utworzeniem guanidynooctanu (glikocyjaminy). Zachodzi ona w nerce, a nie w wątrobie ani w mięśniu sercowym. Synteza kreatyny kończy się w wątrobie reakcją metylacji glikocyjaminy przy udziale „aktywnej metioniny" {ryc. 33-10).

UTWORZONY Z GLUTAMINIANU yAMINOMAŚLAN ULEGA PRZEMIANIE DO SEMIALDEHYDU BURSZTYNIANU Cząsteczka y- amin o mas łanu (GABA) powstaje w wyniku dekarboksylacji L-glutaminianu, w reakcji katalizowanej przez enzym zaleŜny ód fosforanu pirydoksalu, dek ar boksy lazę Lglu ta minia nową (ryc. 33-11). Ta dekarboksylaza znajduje się w tkankach ośrodkowego układu nerwowego, głównie w substancji szarej. Dwie kolejne, mniej waŜne, reakcje równieŜ przekształcają putresycynę w y-aminomaślan. Jedna obejmuje deaminację przez fyksydarzę aminową (oksydazę diaminową — nazwa nie zalecana), druga wykorzystuje N-acetylowane produkty pośrednie. Względne znaczenie tych 3 szlaków biosyntezy y-aminomaślanu zmienia się wśród tkanek i wraz ze stadium rozwojowym. Na przykład arnityna (ryc. 33-5) jest skutecznie przekształcana w y-aminomaślan w tkance embrionalnej siatkówki kury oraz w zakończeniach nerwowych dojrzałego mózgu. Katabolizm y-aminomaślanu (ryc. 33-11) obejniuje transaminację katalizowaną przez aminotransferazę y-aminoma sianową do semialdebydu bursztynianu. Semialdehyd bursztynianu moŜe być redukowany do y-hydroksymaślanu w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę L-mleczanową lub utleniany do produktu pośredniego cyklu cytrynian owego, bursztynianu, a następnie do CO2 i H2O. Wraz z anionami innych aminokwasów y-aminomaśian jest sfabo transportowany przez komórkowe błony plazmatyczne. StęŜenia y-aminomaślan u w moczu zmieniają się bezpośrednio z jego stęŜeniami w surowicy. Wprawdzie wada biochemiczna nie została sprecyzowana, moŜe być jednak wynikiem upośledzonej transaminacji y-aminomaślanu do semialdehydu bursztynianu.

PIŚMIENNICTWO Scriver CR et al (editors): The Metabolic Basis of Inherited Diseasa, 6th ed. McGraw-Hill, I9S9. Tabor CW, Tabor H: Polyamines. Annu Rev Biochem 19S4;53:749.

34

Porfiryny i barwniki Ŝółciowe Robert K. Murray, MD, PhD

WPROWADZENIE W rozdziale tym omówiono biochemię porfiryn i barwników Ŝółciowych. Te 2 zagadnienia są ze sobą ściśle powiązane, poniewaŜ hem jest syntetyzowany z porfiryn i Ŝelaza, a produktami jego degradacji są barwniki Ŝółciowe i Ŝelazo.

styczną właściwością porfiryn jest tworzenie kompleksów z jonami metali, które łączą się z atomami azotu pierścieni pirolowych. Przykładami są takie Ŝelazo porfiryny, jak hem hemoglobiny oraz porfiryna zawierająca magnez, tj. chlorofil, barwnik roślin zielonych biorący udział w fotosyntezie. W przyrodzie metaloporfiryny występują w postaci sprzęŜonej z białkami, tworząc liczne

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Znajomość biochemii porfiryn i hemu stanowi podstawę do zrozumienia róŜnorodnych funkcji hemoprotein w organizmie (udział w transporcie tlenu, transporcie elektronów, metabolizmie leków itd.). Grupą chorób spowodowanych zaburzeniami w biosyntezie porfiryn są porfirie. ChociaŜ nie naleŜą one do powszechnych, spotyka się je u pacjentów dermatologów, hepatologów i psychiatrów. Znacznie bardziej powszechnymi, z klinicznego punktu widzenia, są Ŝółtaczki spowodowane zwiększonym stęŜeniem bilirubiny w osoczu. Większa zawartość bilirubiny w osoczu, będąca wynikiem zwiększonego wytwarzania lub niewydolności wydalania bilirubiny, jest obserwowana w przypadku licznych chorób — od wirusowego zapalenia wątroby do nowotworów trzustki.

HC

XH N H Plrol

H

c .ĆH IV H ?HC—C

HNN

C=CH & H

H

•

t

Porfifyna

METALOPORFIRYNY SĄ ZWIĄZKAMI WAśNYMI W PRZYRODZIE Porfiryny są związkami cyklicznymi, zbudowanymi z 4 pierścieni pirolowych połączonych mostkami metinowymi (ryć 34-1). Charaktery-

(C„HltN.) Ryc. 34-1. Cząsteczka porfiryny Pierścienie oznaczono cyframi rzymskimi I, II, III, IV, a pozycje podstawników w pierścieniach pirolowych cyframi arabskimi 1. 2, 3, 4, 5, 6, 7, S. Mostki metinowe (-HC=) określono jako a, 3, y, 6,

PORHRYNY I BARWNIK! śÓŁCIOWE / 399

związki odgrywające istotną rolę w procesach biologicznych. NaleŜą do nich: Hemoglobiny- Są to Ŝelazo po rfiryny związane z białkiem globiną. Mają zdolność odwracalnego wiązania tlenu. SłuŜą jako środek transportu tlenu we krwi (p. rozdz. 7). Strukturę hemu przedstawiono na ryc, 7-2. Erytrokruoryny. Są to białka Ŝelazoporfirynowe występujące we krwi i w płynach tkankowych niektórych bezkręgowców. Funkcja ich odpowiada funkcji hemoglobin. Mioglobiny. Są to białka oddechowe występujące w komórkach mięśni kręgowców i bezkręgowców. Cząsteczka mioglobiny przypomina podjednostkę hemoglobiny. Cytochromy. Są to białka biorące udział w transporcie elektronów w reakcjach utleniaj ąco-red u kujących. WaŜnym przykładem jest cytochrom c o masie cząsteczkowej ok. 13 000 i jednym atomie Ŝelaza na cząsteczkę, Katalazy. Są to enzymy Ŝelazo porfiry no we rozkładające nadtlenek wodoru; niektóre z nich 1

2

6

5 Ryc. 34-2.

A

P

P

A

Uroporfiryna III.

A

P

t A

A

k __

A

P A

P M Koproporfiryny po raz pierwszy wyizolowano z kału, ale znajdują sie one takŜe w moczu

P

i

Uroporfiryny wykryto po raz pierwszy w moczu, ale nie jest to Jedyne miejsce Ich występowania

Uroporfiryna III M

P M

[

P

Naturalne porf iryny zawierają łańcuchy boczne podstawione do szkieletu porf i nowego Porfiryny występujące w przyrodzie są związkami, w których 8 atomów wodoru porfiny, oznaczonych na ryc. 34-1, jest podstawionych róŜnymi łańcuchami bocznymi. W celu prostego przedstawienia tych podstawień Fischer zaproponował uproszczony wzór, w którym mostki metinowe są pominięte, a kaŜdy pierścień pirolu ma postać klamry z zaznaczonymi pozycjami łańcuchów bocznych numerowanymi jak na ryc. 34-2. Na rycinach 34-2—34-4 przedstawiono róŜne porfiryny (A [octan] = — CH2COOH; P [propionian]= -CH 2 -CH 2COOH; M [metyl] = -CH3; V [winyl] = -CH = CH2). Przedstawione na ryc. 34-2 ułoŜenie podstawników A i P w uroporfirynie jest asymetryczne (w pierścieniu IV kolejność ułoŜenia łańcuchów kwasu octowego i propionowego jest odwrócona), Porfiryny z tym typem asymetrii podstawników są określone jako porfiryny typu III. Porfiryny z całkowicie symetrycznym ułoŜeniem podstawników są natomiast określane jako porfiryny typu L W przyrodzie występują

P

A

Uroporfiryna I

M

2,3 Dioksyyenaza tryptofanowa. Enzym Ŝelazo porfiry nowy katalizujący utlenianie tryptofanu do formy loki nureniny.

*

P

P

otrzymano w postaci krystalicznej. W roślinach aktywność katalazy jest bardzo mała, ale podobne funkcje pełni enzym Ŝelazo porfiry no wy - peroksydaza.

M

Koproporfiryna I

Ryc. 34-3. Uroporfiryny i koproporf iryny.

P

M

Koproporfiryna III

400 / ROZDZIAŁ 34 M

V

M

M 1V

M

I

P

P

V

M

Protoporfiryna lii (IX) {macierzysta porfiry na dla

Ryc. 34-4. Przyuczenie Ŝelaza

V

(FERRECHELATAZAJ

M

1 i

P M Hem hemu) (grupa prosietyczna hemoglabiny) do protoporfiryny z utworzeniem hemu.

porfiryny typu I i Ul, przy czym porfiryny typu III są znacznie bardziej rozpowszechnione i istotne, poniewaŜ naleŜy do nich hem (ryc. 34-3). Hem i jego bezpośredni prekursor — protoporfiryna IX (ryc. 34-4) są porfirynami typu III (tj. grupy metylowe rozmieszczone są asymetrycznie, jak w koproporfirynie typu III). JednakŜe zalicza sieje czasami do szeregu IX, gdyŜ były oznaczone jako dziewiąte w serii izomerów postulowanych przez Hansa Fishera, pioniera w dziedzinie badań chemii porfiryn.

UKŁAD PORFIRYNOWY HEMU JEST SYNTETYZOWANY Z SUKCYNYLO-CoA I GLICYNY Syntezę porfiryn w Ŝywych komórkach przeanalizowano na przykładzie hemu, Ŝelazoprotoporfiryny hemoglobiny. Dwoma związkami wyjściowymi są: sukeynylo-CoA, pochodzący z cykiu kwasu cytrynowego zachodzącego w mitochondriach i glicyna. Niezbędny jest równieŜ fosforan pirydokśalu, który „aktywuje" glicyne. Produktem reakcji kondensacji sukcynylo-CoA i glicyny jest kwas a-amino-fS-ketoadypinowy, który natychmiast jest dekarboksylowanydo kwasu 8-ami no lewul ino wego (ALA) (ryc. 34-5). Etap ten katalizuje syntaza ALA, która jest enzymem kontrolującym nasilenie biosyntezy

porfiryn w wątrobie ssaków. Syjiteza^ALA, zachodzi w rmtochcndriach, W cy_tozolu, przy udziale syntazy porfobilinogen owej, kondensują 2 cząsteczki ALA, tworząc porfobilinogen (PBG) i 2 cząsteczki wody (ryc. 34-5). Syntaza porfobilinogen owa jest enzymem zawierającym cynk, a hamuje ją ołów. Kondensacja 4 cząsteczek PBG prowadzi do utworzenia tetrapirolu, tj. porfiryny (ryc. 34-6).

X?_4,„CZftsteczki. kondensują liniowo, tworząc łańcuchowy tetrapirol - hydroksymetylenobilan. Reakcję katalizuje syntaza u roporfiry no genowa I, znana równieŜ jako deaminaza porfobilinogcnowa. Hydroksymetylenobilan ulega samorzutnej cyklizacji do uroporfirynogemi I (lewa strona ryc. 34-6) lub jest przekształcany w uroporfirynogen III pod wpływem syntazy uroporfirynogenowej I i kosyntazy uroporfirynogenowej III (prawa strona ryc. 34-6). W warunkach fizjologicznych powstaje prawie wyłącznie izomer uroporfirynogen u typu III, ale w niektórych porfiriach (omawianych poniŜej) tworzą się równieŜ izomery porfiry no genów typu I. W uroporfirynogenach pierścienie pirolowe są połączone mostkami metylenowymi (— CH2 —), które nie tworzą układu sprzęŜonych wiązań podwójnych. Dlatego teŜ związki te (jak wszystkie porfirynogeny) są bezbarwne. Porfirynogeny łatwo utleniają się do odpowiednich porfiryn. Reakcje utleniania katalizuje światło i utworzone porfiryny. Uroporfirynogen III przekształca się w koproporfirynogen III w wyniku dekarbokśylacji łańcuchów kwasu octowego do grup metylowych^ Reakcję katalizuje dekarboksylaza jiroporfirynogenowa, która przekształca równieŜ~uroporfirynogen I w kopro porfiry no gen I (ryc, 34-7). Koproporfirynogen III wnika do mitochondriów, gdzie powstaje protoporfirynogen nT,"a następnie protoporfirynaJII^Wydaje się,

Ŝe ta przemiana zacfiocIzT w kilku etapach. Znajdująca się w mitochondriach oksydaza koproporfirynogenowa katalizuje dekarboksylację i utlenianie 2 łańcuchów kwasu propionowego z utworzeniem protoporfirynogęnu. Substratem dla tego enzymu jest wyłącznie koproporfirynogen typu III, co mogłoby tłumaczyć brak naturalnego występowania p roto porfiryny

PORFIRYNY I BARWNIKI śÓŁCIOWE / 401 COOH CHj CHJ

Sukcynylo-CoA („aktywny" bursztyn tan)

C=O ; S-CoA

+ Glicyna

U CH,

CoA-SH

1

C=O H-C-l

Fosforan plrydoksalu

f i JH-

COOH

COOH

SYNTAZA 5-AMINOLEWULIMANOWA

SYNTAZA ^AMINOLEWULINiANOWA

CO,

CH, c=o -♦-H-C-NH, H

a-Ami n oa-Aminolewulinlan (ALA)

I

i.C~NH, COOH

COOH CH, t COOH CH,

COOH

i

COOH CH,

J_ SYNTAZA P0RF08ILIN0GENOWA

CH,

ŃH,

ĆH*

CH,

ć-- C

I

CH

NH,

NH

2 cząsteczKI jarnlnolewullnlanu

Porto bili nogen (prekursor plrolu)

Ryc. 34-5. Biosynteza porfobilinogenu. Syntaza 8-aminolewulinianowa znajduje się w mitochondriach, podczas gdy syntaza porfobilinogenowa w cytozolu.

typu I. Utlenianie protoporfirynogenu do protoporfiryny katalizuje inny enzym mitochondrialny — oksydaza protoporfirynogenowa. W wątrobie ssaków warunkiem przekształcenia koproporfirynogenu w protoporfirynę jest obecność tlenu cząsteczkowego. Tworzenie hemu polega na wbudowaniu Fe do protoporfiryny Końcowy.eLąp syntezy_hemu,p.olega-na wbudowaniu jonu Ŝelazawego do protoporfiryny w reakcji katalizowanej przez syntazę hemową, czyli fcrrechelatazę, umiejscowioną w mitocbondriach (ryc. 34-4). Zestawienie etapów biosyntezy pochodnych porfiryny z PBG przedstawiono na ryc. 34-8. Biosynteza hemu zachodzi w większości tkanek ssaków, z wyjątkiem dojrzałych erytrocytów, które nie zawierają mitochondriów. Opisane powyŜej porfirynogeny są bezbarwne i, w porównaniu z odpowiadającymi im barwnymi porfirynami, zawierają 6 dodatkowych atomów wodoru. Wiadomo obecnie, Ŝe te zredukowane porfiryny (porfirynogeny), 26 -

Biochemia

a nie odpowiadające im porfiryny, są związkami pośrednimi w biosyntezie protoporfiryn i hemu.

Kluczowym enzymem regulującym biosyntezę hemu jest syntaza ALA Reakcją ograniczającą syntezę hemu jest kondensacja sukcynylo-CoA i glicyny 2 utworzeniem ALA, katalizowana przez syntazę kwasu 5-aminolewulinowego (syntaza ALA) (ryc, 34-5). Syntaza ALA jest enzymem podlegającym regulacji. UwaŜa się, Ŝe hem, przypuszczalnie przez cząsteczkę aporepresora, dzialajako_ ujemny regulator; . . gromadzenia sfę syntazy ALA. Mechanizm represji i derepresji przedstawiono schematycznie na ryc. 34-9. MoŜliwe, Ŝe na tym etapie ma miejsce równieŜ hamowanie na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego, lecz główny wpływ regulujący hemu polega na tym, Ŝe sz^bkość^agromadząnia się syntazy ALA znacznie się zwiększa w nieobecności hemu, a maleje w jego obecności. Syntazę ALA Z wątroby ssaków charakteryzuje szybki obrót metaboliczny (okres póltrwania wynosi ok. 1 h) właściwy

A cząsteczki porfociiinogenu SYNTAZA UROPORFI4NH, RYNOGENOWA Hyd roksy metylen o b ila SYNTA2A UR0PORFIRYNOGENOWA I KOSYNTAZA UROPORFIRYNOGENOWA lll

SAMORZUTN A CYKL1ZACJA

n (łańcuchowy tetrapirol) Uroporflrynagan typu i

Uroporflrynogen typu II!

Ryc. 34-6. Przekształcenie porfobilinogenu w uroporfirynogeny.

„

A

l—

1

r mIV ni

p A

Pi—,

Wk ------ ,P

■L

4CO3

IV

u

Uroporfirynogen I

M

II lll

|DEKARBOKSYLAZA | UROPORFIRYUOGENOWA

Ko pro porfiry nogen I

TT

I

M

M

iv P IM A Uroporflrynogen lll

4COj

Koproporfirynogen lll

Ryc. 34-7. Dekarboksylacja uroporfirynogenów do koproporfirynogenów w cytozolu. A — octan, M — metyl, P — propionian.

PORFIRYNy I BARWNIKI śÓŁCIOWE / 403 Porto bil ino gen SYNTAZA UROPORFłRYNDGENOWA I

Światło

Hyd ro ksymety len obi! an KOSYNTAZA UROPORFIRYNOGENOWA II! SYNTAZA UHOPORFIRYNOGENOWA I ■-»„ SAMORZUTNIE

s \

6HUroporfiryna -oUmpoffirynogen

Uroporfirynogen I

Światło

Uroporftryna 1

DEKARBOKSYLAZA URO PO RFIR YNO GEN OWA

6H

4CO5 Koproporfiiyna -^-^— Koproporfirynogen Koproporfirynogen IM Światło I

^

» Koproparflryna Światłe |

OKSYDAZA KOPROPORFiRYNOGENOWA

Protoporfirynogen III Lub światło In vltro OKSYDAZA PROTOPORFIRYNOGENOWA

Protoporfiryna I Fe!

FERRECHELATAZA

Hem

Ryc. 34-8. Eiapy biosyntezy pochodnych porfiryny z porfobilinogenu.

dla enzymów katalizujących reakcje ograniczające tempo przemian. Wiele ksenobiotyków (p. rozdz. 60) powoduje znaczne zwiększenie stęŜenia syntazy ALA w wątrobie człowieka. Większość tych związków jest metabolizowana w wątrobie przy udziale swoistej hemoproteiny, tj. cytochromu P-450. Metabolizm ksenobiotyków pociąga za sobą zwiększone wykorzystanie hemu przez cytochrom P-450, powodując zmniejszenie wewnątrzkomórkowego stęŜenia hemu, co z kolei wpływa na derepresję syntazy ALA i przyspieszenie syntezy hemu zgodnie z zapotrzebowaniem komórki. Indukcja syntazy ALA w wątrobie zaleŜy od wielu innych czynników. Glukoza zapobiega indukcji syntazy ALA, Ŝelazo w postaci kom-

pleksów chelatowych działa synergicznie na indukcję syntazy ALA w wątrobie, a steroidy ułatwiają derepresję syntazy ALA wywołaną in vivo lekami. Podanie hematyny zapobiega natomiast derepresji syntazy ALA, jak równieŜ innych hemoprotein w wątrobie, wywołanej in vivo lekami. Znaczenie niektórych z tych mechanizmów regulacyjnych omówiono w części poświęconej chorobom sklasyfikowanym jako porfirie.

404 / ROZD2IAŁ 34

PORFIRYNY SĄ BARWNE ł FLUORYZUJĄ

Hemoproteiny 11

Białka Hem ------------------.

a.

presor

FEHRECHELATAZA

Protoportlryna It! OKSYDAZA PROTOPOfr 7. FIRYNOGENOWA Protoporf rynogen |]| OKSYDAZA r.OPROPOR-6 FIRYNOGENOWA Kaproporfitynoflen III DEKARBOKSYLAZA UROIs PORFIRYNOGENOWA Uroporfirynogen Uli KOSYNTAZA imDPORFl-, RYNOGENOWA III Hyctraksymetylanobi la n SYNTAZA UROPORFI-a RYNOGENOWA I

Porfirynogeny są bezbarwne, podczas gdy porfiryny są barwne, W badaniach porfiryn i ich pochodnych duŜe znaczenie mają charakterystyczne widma pochłaniania zarówno w świetle widzialnym, jak i nadfioletowym. Przykładem moŜe być krzywa absorpcji roztworu porfiryny w 5% kwasie solnym (ryc. 34-10). Na szczególną uwagę zasługuje wyraźne pochłanianie w paśmie o długości ok. 400 nm, charaktery styczne dla pierścienia porfirynowego niezaleŜnie od rodzaju łańcuchów bocznych porfiryn. To pasmo pochłaniania jest określone mianem pasma Soreta od nazwiska jego odkrywcy. Porfiryny rozpuszczone w mocnych kwasach nieorganicznych lub rozpuszczalnikach organicznych i naświetlone światłem UV wykazują silną czerwoną fluorescencję. Jest ona tak charakterystyczna, Ŝe jest często wykorzystywana do wykrywania małych ilości wolnych porfiryn. Absorpcja i fiuorescencja porfiryn są spowodowane obecnością wiązań podwójnych. Jak juŜ wspomniano, redukcja (w wyniku przyłączenia wodoru) mostków metinowych (—HC=) do metylenowych (— CH2 —) prowadzi do powstania bezbarwnych związków zwanych porfirynogenami.

Porfiryny i ich prekursory wykrywa stę za pomocą spektrofotometrii Porfobilmogen

SYNTAZA PORFO2 BILINOGENOWA ALA

SYNTAZA ALA

Wykrywanie obecności koproporfiryn i uroporfiryn jest istotne z klinicznego punktu widzenia, gdyŜ związki te są wydalane w zwiększonych ilościach w przypadku porfirii. Obecne w moczu i kale związki moŜna rozdzielić za pomocą ekstrakcji odpowiednią mieszaniną rozpuszczalników, a następnie zidentyfikować

Sukcynylo-CoA + Glteyna

Ryc.34-9. Metabolity pośrednie, enzymy i regulacja syntezy hemu. Numeracja enzymów zgodna z numeracją w tab, 34-1. Brak enzymów 2-8 powoduje porfirie. Regulacja syntezy hemu odbywa się na poziomie symazy ALA za pomocą mechanizmu represja-de represja przez łiem i jego hipotetyczny aporepresor. Linie przerywane wskazują negatywną (—) regulację przez represję.

Ryc. 34-10. Widmo absorpcji hematoporfiryny (0,01% roztwór w 5% HCt)

Ą

/

3

/

" J

f

\ \

1

\ 300

400

A / ^ s

500

V

600

Długość fali (nm)

700

PORFIRYNY I BARWNIKI śÓŁCIOWE / 405

i oznaczyć ilościowo metodami spektrofotometrycznymf. Stosując odpowiednie testy kolorymetryczne moŜna równieŜ oznaczyć w moczu ALA i PBG. PORFIRIE SĄ CHOROBAMI GENETYCZNYMI ZWIĄZANYMI Z METABOLIZMEM HEMU Porfiife.naleŜa. do grupy chorób wrodzonych związanych zjabujrzejjiamilnetarjolizmu hemu, wynikających z mutacji genów odpowiedzialnych za syntezę enzymów uczestniczących w biosyntezie hemu. ChociaŜ nie występują one powszechnie, naleŜy je brać pod uwagę, a szczególnie w pewnych okolicznościach (np. w diagnostyce róŜnicowej ostrego brzucha lub róŜnorodnych zaburzeń o charakterze neuropsychicznym), aby uniknąć niewłaściwego postępowania z chorymi. Przypuszcza się, Ŝe król Jer2y III chorował na porfirię mieszaną, która mogła być przyczyną jego okresowych odosobnień na zamku Windsor i pewnych jego poglądów odnośnie do amerykańskich kolonistów. TakŜe nadwraŜliwość skóry na światło (powodująca aktywność nocną) i cięŜkie zniekształcenia występujące u niektórych ofiar wrodzonej porfirii erytropoetycznej sugerowały, Ŝe osoby te mogły być prototypami wilkołaków. Biochemia tkwi u podstaw przyczyn, rozpoznawania i leczenia porfirii Biorąc pod uwagę zmniejszenie aktywności kaŜdego z enzymów 3--8 na ryc. 34-9 (p. tab. 34-1) wyróŜnia się 6 typów porfirii. Oznaczenie aktywności 1 lub kilku z tych enzymów w odpowiednim materiale (np. erytrocytach) jest podstawą diagnostyki porfirii. Dotychczas nie stwierdzono przypadków z małą aktywnością enzymu 1 (syntaza ALA), a zmniejszenie aktywności enzymu 2 (syntaza porfobilinogenowa) jest zjawiskiem obserwowanym bardzo rzadko. Porfirię dziedziczy się autosomalnie dominująco, z wyjątkiem wrodzonej porfirii erytropoetyc2nej, którą dziedziczy się w sposób recesywny. Nieprawidłowości w genach odpowiedzialnych za syntezę enzymów biorących udział w biosyntezie hemu określa się technikami rekombinacji DNA. Podobnie, jak w przypadku większości chorób wrodzonych, kliniczne objawy porfirii są wynikiem nagromadzenia metabolitów poprzedzających blok enzymatyczny lub braku metabo-

litów występujących za blokiem enzymatycznym. Jeśli wada metaboliczna dotyczy początkowych etapów biosyntezy hemu, tj. poprzedzających tworzenie porfiry no genów (np. enzymu 3 na ryc. 34-9, porfiria ostra przerywana) następuje nagromadzenie ALA i PBG w tkankach i płynach ustrojowych (ryc. 34-11). Zarówno kaŜdy z tych związków, jak i oba razem oddziałują toksycznie na nerwy brzuszne i ośrodkowy układ nerwowy, powodując bóle brzucha i objawy neuropsychiczne charakterystyczne dla tego typu porfirii. Biochemicznym podłoŜem tych objawów jest prawdopodobnie hamujący wpływ ALA na aktywność ATPazy w tkance nerwowej i (lub) wychwytywanie ALA przez mózg, powodujące w bliŜej nie wyjaśniony sposób poraŜenie przewodnictwa. Blok enzymatyczny występujący w późniejszych etapach szlaku powoduje nagromadzenie porfirynogenów określonych na ryc. 34-9 i 34-1!. Produkty ich utlenienia, czyli odpowiednie porfiryny, powodują nadwraŜliwość skóry na światło widzialne o długości fali ok. 400 nm. Porfiryny eksponowane na światło o tej długości fali przechodzą w stan wzbudzenia i reagują z tlenem cząsteczkowym, wytwarzając rodnikowe formy tlenu, które uszkadzają lizosomy i inne organelle komórkowe. Uwolnione enzymy powodują zmiany w skórze, aŜ do powstawania blizn. Innym kryterium klasyfikacji porfirii moŜe być rodzaj tkanki lub komórki, w których występują nieprawidłowości metaboliczne. Są to przede wszystkim tkanki i komórki szczególnie aktywne w syntezie hemu, takie jak szpik kostny syntetyzujący znaczne ilości hemoglobiny w ciągu doby oraz wątroba bardzo aktywnie syntetyzująca cytochrom P-450. Zgodnie z tą klasyfikacją wyróŜnia się porfirię eryrropoetyczne, wątrobowe oraz erytropoeryczno-wąrrobowe (postacie mieszane). Typy porfirii naleŜące do kaŜdej z tych klas przedstawiono w tab. 34-1. Przyczyny ujawniania się w przypadku określonej porfirii zaburzeń metabolicznych, głównie w jednym typie tkanek, nie są do końca wyjaśnione. Przypuszcza się, Ŝe wynika to z róŜnej aktywności enzymów syntezy hemu w róŜnych tkankach i komórkach. Jak juŜ wspomniano, syntaza ALA jest kluczowym enzymem regulującym szlak biosyntezy hemu. ChociaŜ enzym ten nie jest bezpośrednią przyczyną 6 omawianych typów porfirii, jego regulacja stanowi podstawę zrozumie-

406 / ROZDZIAŁ 34 Tabela 34-1. Główne objawy porfirii ■Wada enzymatyczna

Porfiria

typ i (klasa)

Wyniki testów

objawy kliniczne

laboratoryjnych

3. Syntaza uroporfirynogenowa 1

Porfiria ostra przerywana (wątrobowa)

Bóle brzucha PBG w moczu Zaburzenia neuropsy- Uroporfiryna w moczu chiczne Brak + nadwraŜliwości skóry na światfo

4. Kosyntaza uroporfirynogenow3 IM

Wrodzona porfiria erytropoetyczna (erytropoetyczna)

NadwraŜliwość skóry na światło

Uroporfiryna w moczu + PBG w moczu

5. Dekarboksylaza uroporfirynogenowa

Porfiria skórna późna (wątrobowa)

NadwraŜliwość skóry na światło

Uroporfiryna w moczu + PBG w moczu

6, Oksydaza koproporfirynogenowa

Koproporfiria wrodzona (wątrobowa)

NadwraŜliwość skóry na światło Bóle brzucha Zaburzenia neuropsy-chiczne

PBG w moczu + Uroporfiryna w moczu + Koproporfiryna w kale +

7. Oksydaza protoporfirynogenowa

Porfiria mieszana (wątrobowa)

NadwraŜliwość skóry na światło Bóle brzucha Zaburzenia neuropsy-chiczne

PBG w moczu + Uroporfiryna w moczu + P rato porfiry na w kale +

8. Ferrechelataza

Protoporfiria erytropoetyczna (erytropoetyczno-wątrobowa)

NadwraŜliwość skóry na światło

P rato porfiry na w kale + P rato porfiry na w erytrocytach +

+

Tabela zawiera wyniki badań biochemicznych typowych dla ostrych stanów porfirii. W okresie utajenia wyniki niektórych oznaczeń mogą być prawidłowe. * Numeracja enzymów odpowiada numeracji na ryc. 34-9. Mutacja W DMA

Nieprawidłowoścl w obrębie enzymńw syntezy hemu

Nagromadzanie ALA oraz RBG I (lub) zmniejszenie stęŜenia hemu w komórkach i płynach ustrojowych

Nagromadzenie porfirynogenow w skórze i tkankach

Zaburzenia neuropaycniozne

Samorzutne utienianie porfirynogenow do porfiryrr

NadwraŜliwaścskorynaiwiatło

Ryc. 34-11. Biochemiczne podstawy głównych objawów klinicznych porfiru

PORFIRYNY I BARWNIKI śÓŁCIOWE / 407

nia tych chorób. Syntaza ALA ulega zarówno indukcji,'jak i represji, a jej aktywność w pewnych warunkach moŜe się znacznie zwiększyć (aŜ do 50 razy). Wiele leków (np. barbiturany, gryzeofulwina) indukuje syntaze ALA. Mechanizm tej indukcji w większości przypadków polega na indukcji cytochromu P-450 (p. rozdz. 60), a zwiększone zapotrzebowanie na hem powoduje derepresję (indukcję) syntazy ALA. U chorych z porfirią zwiększenie aktywności syntazy ALA prowadzi do zwiększenia stęŜenia potencjalnie szkodliwych prekursorów hemu poprzedzających blok metaboliczny. Przyjmowanie leków, które indukują cytoehrom P-450 (induktory mik roso mai ne), moŜe więc wywołać napad porfirii. Podstawą rozpoznania swoistej postaci porfirii są; wywiad dotyczący samego chorego i wywiad rodzinny, badania przedmiotowe chorego i odpowiednie testy laboratoryjne. Główne dane, dotyczące 6 postaci porfirii, przedstawiono w tab. 34-1. Zatrucie ołowiem moŜe równieŜ wpływać na metabolizm hemu w wyniku wiązania ołowiu z grupami SH takich enzymów, jak ferrechelataza czy syntaza porfobilinogenowa. Powoduje to zwiększenie zawartości protoporfiryny w erytrocytach oraz ALA i koproporfiryny w moczu. NaleŜy mieć nadzieję, Ŝe w przyszłości moŜliwe będzie leczenie porfirii na poziomie genu. Tymczasem leczenie ma charakter objawowy. Chorzy powinni unikać środków znieczulających oraz leków, w tym równieŜ alkoholu, które indukują cytochrom P-450. Przyjmowanie duŜych ilości pokarmu bogatego w węglowodany (obciąŜenie glukozą) lub podawanie hematyny (wodorotlenek hemu) moŜe powodować represję syntazy ALA, a tym samym zmniejszać tworzenie szkodliwych prekursorów hemu. W przypadku chorych z wraŜliwością skóry na światło korzystne jest stosowanie {3-karotenu; związek ten zmniejsza wytwarzanie wolnych rodników, zmniejszając tym samym nadwraŜliwość skóry na światło. Pomocne mogą być równieŜ ekrany słoneczne eliminujące zakres światła widzialnego.

PRODUKTEM KATABOLIZMU HEMU JEST BILIRUBINA U dorosłego człowieka fizjologicznie w ciągu godziny rozpada się 1—2xlO9 erytrocytów. W ciągu dnia osoba o masie ciała 70 kg metabo-

iizuje ok. 6 g hemoglobiny. C_zejć_ białkowa —jilobina — moŜe być ponownie wykorzystana jako taka lub w formie jej składowych aminokwasów, a ŜeUzo_hęm.Qwe jest włączane w ogólna pule Ŝelaza w organizmie, równieŜ w celu ponownego wykorzystania. Natomiast pozbawiona Ŝelaza cześć porfirynowa hemu jest degradowana, głównie w komórkach siateczkowo-śródbłonkowych wątroby, śledziony i szpiku kostnego. Katabolizm hemu, pochodzącego ze wszystkich hemoprotein, jzachodzi we frakcji raikrosomalnej komórek siateczkowo-śródbłonkowych przez złoŜony układ enzymatyczny, określany mianem oksygenazy hemowej. Działanie oksygenazy hemowej poprzedza zwykle utlenienie Ŝelaza w hemie do formy Ŝelazowej l z utworzeniem heminy oraz luźne połączenie z"albuminą do methemalbuminy. Oksygenaza Uemawa jest indukowana pod wpływem subsuatu i jest sprzęŜona z mi krosom alnym łańcuchem przenoszenia elektronów. Jak przedstawiono na ryc. 34-12, w obecności NADPH hemina ulega redukcji, po czym — równieŜ przy udziale NADPH — do wiązania a-metinowego między I i II pierścieniem pirolowym porfiryny przyłącza się grupa hydroksylowa, a jon Ŝelazawy jest ponownie utleniany do jonu Ŝelazowego. W konsekwencji w obecności tlenu uwalnia się jon Ŝelazowy i odłącza się tlenek węgla, a w wyniku rozerwania pierścienia tetrapirolowego powstaje równomolarna ilość biliwerdyny lX-a. Hem pełni w tej reakcji funkcję katalizatora. U ptaków i płazów zielona biliwerdyna IX-tx wydala się; u_ ssaków reduktaza bili werdy nowa ^Hjjki^ip mostek m et ino w. y .miedzy pierścieniami pirolowymi III i IVdo grupy metylenowej, tworząc bilirubinę IX ^- barwnik Ŝółty (ryc. 34-12). Ocenia się, Ŝe 1 g hemoglobiny dostarcza 59,9 jrniol ( = 35 mg) bilirubiny. Dobowe wytwarzanie bilirubiny u człowieka wynosi ok. 427,5—598,5 urnol < = 250—350 mg). Chemiczne przekształcenie hemu do bilirubiny przez komórki siateczkowo-śródbłonkowe moŜna obserwować in vivo na przykładzie krwiaka, w którym purpurowa barwa hemu przechodzi powoli w Ŝółte zabarwienie bilirubiny. Dalszy metabolizm bilirubiny zachodzi głównie w wątrobie. MoŜna w nim wyróŜnić 3 procesy: 1) wychwytywanie bilirubiny przez komórki miąŜszowe wątroby, 2) sprzęganie bilirubiny w siateczce śródplazmatycznej gładkiej i 3)

%/■

408 / ROZDZIAŁ 34 Hen-

HN

i

l

Hemina

t

|Ji 11

p^

HN

-N

H

/= p

p

rf HN

i

■NADPH

-t Bilirubina IXa

-NADP

p

nr?

HN NADPVi

^J NADPH ^

I

HŃ H V

\

Fea+ (ponownie wykorzystywany) i CO (wydychany)

n ■NADPH

r

Ji _

HN m \ = /

NADP

I

— i

r

Biliwerdyna IX —a ■Ny

m Bvc. 34-12, Schemat mikrosomalnego układu oksygertazy hemowej (zmodyfikowany wg Schmida R., McDonougha A. F. w: The Porphyrins. Dolphin D. [red.]. Academic Press, 1978).

wydalanie sprzęŜonej bilirubiny w Ŝółci. KaŜdy z tych procesów będzie rozpatrywany oddzielnie. Bilirubina jest wychwytywana przez wątrobę SJaifeo~tozpti szczał na w osoczu i wodzie bilirubina wiąŜe się z białkami osocza, a głównie z albuminą. KaŜda cząsteczka albuminy ma 1 miejsce o duŜym i 1 miejsce o małym powinowactwie do bilirubiny. W przeliczeniu na 1000

ml osocza ok. 427,5 umol( = 250 mg) bilirubiny wiąŜe się silnie z albuminą w miejscu jej duŜego powinowactwa do bilirubiny. Nadmiar bilrrubiny wiąŜe się tylko luźno i tym samym łatwo ulega odłączeniu i dyfuzji do tkanek. Niektóre związki, takie jak antybiotyki i leki, współzawodniczą z bilirubiną o miejsce o duŜym powinowactwie w albuminie. Związki te mogą zatem wypierać bilirubinę z połączenia z albuminą, odgrywając duŜą rolę kliniczną.

PORFIRYNY I BARWNIKI śÓŁCIOWE / 409

W^ wątrobie bilirubina odłącza się od al- Tworzenie diglukuronidu bilirubiny przebiebuminy ,i przy udziale nieswoistego układu^' ga w pobliŜu bieguna Ŝółciowego hepatocytu przenośnikowego przenika przez biegun naczy- (otaczającego kanalik Ŝółciowy) przy udziale niowy hepalocytu do wnętrza komórki. Ten UDPglukuronozylotransferazy lub enzymu kaukład ułatwiający transport charakteryzuje się talizującego przekształcenie 2 cząsteczek monoduŜą wydajnością i nawet w warunkach patolo- glukuronidu bilirubiny w 1 cząsteczkę diglukugicznych nie ogranicza szybkości i przemian ronidu bilirubiny i 1 cząsteczkę niesprzęŜonej bilirubiny. bilirubiny (ryc. 34-14). Dalszą charakterystykę PoniewaŜ układ ułatwiający transport umoŜ- układu sprzęgania bilirubiny przedstawiono liwia utrzymanie równowagi bilirubiny po obu w czcści poświęconej wrodzonym zaburzeniom stronach bieguna naczyniowego hepatocytu, sprzęgania bilirubiny. bilans wychwytywania bilirubiny zaleŜy od jej Aktywność UDPglukuronozylotransferazy usuwania w wyniku dalszych etapów szlaku jest indukowana przez wiele stosowanych w klimetabolicznego. nice leków jak fenobarbital. Sprzęganie bilirubiny zachodzi w wątrobie w \y^{rnhif w wyniku przyłączenia grup polarnych, bilirubina .przekształcą się w postać rri7pns7r;7tiir^] w \yp/ł-rig i '"jfdziela się do Ŝółci. rozpuszczalności w wodzie,

czyli zwiększenia polarności bilirubiny, dgkonuje się w wyniku sprzęgania i przebiega, przynajmniej początkowo, w siateczce śródplazmaf. F r 7 V udziale swoistycn enzy_ y j g E J . F y y mów. U ssaków większość bilirubiny wydala się dp Ŝółci w postaci diglukur""idn h^nNny (ryc. 34-13)! Tworzenie' pośredniego monoglukuronidir bilirubiny jest katalizowane przez urydynodifosfoglukuronozylotransferazę (U DPglukuronozylotransferazę), enzym występujący w siateczce śródplazmatycznej gładkiej w prawdopodobnie więcej niŜ jednej postaci. Reakcję przedstawiono na ryc. 34-14. Zachodzi ona przede wszystkim w wątrobie, ale takŜe w nerkach i błonie śluzowej jelita. Nieprawidłowe stęŜenie sprzęŜonej bilirubiny w surowicy człowieka jest głównie związane z obecnością monoglukuronidów.

Bilirubina wydziela się do Ŝółci Wydzielanie sprzęŜonej bilirubiny do Ŝółci przebiega wbrew gradientowi stęŜeń na zasadzie transportu aktywnego, który prawdopodobnie spełnia funkcję regulującą dla całego metabolizmu bilirubiny w wątrobie. Transport sprzęŜonej bilirubiny do Ŝółci jest indukowany przez te same leki, które indukują proces sprzęgania bilirubiny. Układy sprzęgania i wydzielania bilirubiny stanowią więc skoordynowaną jednostkę funkcjonalną. W warunkach fizjologicznych praktycznie cala (> 97%) bilirubina wydzielana do Ŝółci jest w postaci sprzęŜonej. Znaczne ilości bilirubiny niesprzęŜonej w Ŝółci moŜna znaleźć jedynie po fototerapii. Wątroba dysponuje wieloma układami wydzielającymi do Ŝółci produkty metabolizmu związków występujących naturalnie oraz preparatów farmaceutycznych. Niektóre z nich są wspólne z układem wydzialającym diglukuronid bilirubiny, podczas gdy inne działają niezaleŜnie.

o -OOC
C-0 -C|CH;O)4COO-

M H

H

M H

H

Ryc. 34-13. Struktura digiukuronidu bilirubiny (bilirubina sprzęŜona, bezpośrednia). Kwas glukuronowy wiąŜe się estrowo z 2 resztami kwasu propionowego, tworząc acyloglukuronid.

410 / ROZDZIAŁ 34 DEHYDflOGENAZA LIDPlto UDP-glukoza.

■♦■ Kwas UDP-glukuronowy 2NADł

2NADH +2H

UOP-GLUKURONOZYLOTflANSFERAZA Monog I uku ro ni d bilirubiny

Kwas UDP-glukuronowy

UDP

Bilirubina

Kwas UD P-glu kuro nawy

ł

UDP-GLUKURONOZYLO TRANSFERAZA Dlglukuronid bilirubiny

+ Monoglukuronid bilirubiny 2 cząsteczki monogiukurortWu bilirubiny

GLUKURONOZYLO TRANSFERAZA GLUKURON1DU BILIRUBINY

UDP

Oiglukuronid bilirubiny

+

Bilirubina

Ryc. 34-14. SprzęŜenie bilirubiny z kwasem glukuronowym. Donor gtukuronianu, kwas UDP-gfukuronowy, tworzy się z UOP-glukozy

SprzęŜona bilirubina jest redukowana do urobilinogenu przez bakterie jelitowe W miarę, jak sprzęŜona bilirubina dociera do jelita krętego i jelita grubego, swoiste enzymy bakteryjne (p-glukuronidazy) usuwają kwas glukuronowy, a flora bakteryjna kału redukuje barwnik do bezbarwnych związków tetrapirolowych, zwanych urobilinogenami (ryc. 34-15). W jelicie kretyni oraz w jelicie grubym pewna część urobilinogenów wchłania się i ponownie wydala z wątroby, stanowiąc krąŜenie jelitowo--

kach nieprawidłowych, zwłaszcza przy wytwarzaniu nadmiernej ilości barwników Ŝółcio.wych Jub w przypadku choroby wątroby upośledzającej krąŜenie jęli to wo-watro bo we, następuje wydalanie urobilinogenu równieŜ z moczem. W warunkach fizjologicznych większość bezbarwnych urobilinogenów. powstałych w ókręŜnicy pod wpływem flory bakteryjnej występującej w kale, utlenia się do urobilin (związków barwnych) i wydala z kalem (ryc. 34-15). Utlenianie pozostałych urobilinogenów powoduje ciemnienie kału na powietrzu.

wątrobowe barwników Ŝółciowych. W warunM

H,C N NH H

OH M

M

HN \=\ CHj

P M

Sterkobllinogen (L-u robi lin ogan)

Ryc. 34-15. Struktura niektórych barwników

PORFIRYNY I BARWNIKI śÓŁCIOWE / 411

HIPERBILIRUBINEMIA WYWOŁUJE śÓŁTACZKĘ Zwiększenie stęŜenia bilirubiny we krwi powyŜej 17 umol/1 (=1 mg/dl) nazywamy hiperbilirubinemią. Hiperbilirubinemia moŜe być wynikiem wytwarzania większej ilości bilirubiny niŜ wydala zdrowa wątroba lub teŜ skutkiem niewydolności uszkodzonej wątroby do wydalania bilirubiny powstającej w ilościach prawidłowych. Przyczyną liiperbilirubinemii, jeśli nie stwierdza się uszkodzenia wątroby, moŜe być równieŜ zaczopowanie przewodów Ŝółciowych wątroby, uniemoŜliwiające wydalanie Ŝółci. We wszystkich tych przypadkach bilirubina gromadzi się we krwi i po przekroczeniu pewnego stęŜenia dyfunduje do tkanek, powodując ich zaŜółcenie. Zjawisko to określa się mianem Ŝółtaczki. Oznaczenie stęŜenia bilirubiny w surowicy ma ogromne znaczenie w badaniach klinicznych Ŝółtaczek. Van den Bergh jako pierwszy wprowadził metodę ilościowego pomiaru zawartości bilirubiny w surowicy, wykorzystując test Ehrlicha na bilirubinę w moczu. Test Fhrlicha polega na reakcji diazowanego kwasu sulfanilowego (odczynnik diazowy Ehrlicha) i bilirubiny z utworzeniem czerwono-purpurowego związku arowego. W oryginalnej metodzie Ehrlicha do rozpuszczenia zarówno bilirubiny, jak i odczynnika diazowego wykorzystywano metanol. Przypadkowe pominięcie przez Van den Bergha metanolu podczas oznaczania barwników Ŝółciowych w Ŝółci doprowadziło do wykrycia, Ŝe reakcja barwna zachodzi „bezpośrednio". Postać bilirubiny reagującą w nieobecności metanolu określono jako „bezpośrednią". Następnie stwierdzono, Ŝe taka sama reakcja zachodzi takŜe w surowicy chorych z Ŝółtaczką mechaniczną. Niemniej dodawanie metanolu było nadal konieczne przy oznaczaniu bilirubiny w surowicy prawidłowej oraz bilirubiny występującej w zwiększonej ilości w surowicy chorych z Ŝółtaczką hemolityczną, u których nie stwierdzono niedroŜności przewodów Ŝółciowych. Postać bilirubiny, którą moŜna było oznaczyć jedynie po dodaniu metanolu, określono jako „pośrednią". Obecnie wiadomo, Ŝe bilirubina pośrednia jest bilirubiną „wolną" (niesprzęŜona.), która przechodzi do tiepatócytów z komórek siateczkowo-śró~dbłoukowych, gdzie powstaje w wyniku rozpadu układu porfirynowego hemu. PoniewaŜ ta bilirubina nie rozpuszcza się w wodzie,

reakcja z odczynnikiem diazowym wymaga obecności metanolu. W wątrobie bilirubina wolna łączy się z kwasem glukuronowym i w postaci sprzęŜonej, jako glukuronid bilirubiny, wydziela się do Ŝółci. Bilirubina sprzęŜona, jako rozpuszczalna w wodzie, reaguje bezpośrednio z odczynnikiem diazowym, a więc „bilirubina bezpośrednia" Van den Bergha odpowiada bilirubinie sprzęŜonej (glukuronid bilirubiny). W zaleŜności od typu bilirubiny występującej w osoczu, tj. bilirubiny niesprzęŜonej lub bilirubiny sprzęŜonej, hiperbilirubinemie moŜna sklasyfikować odpowiednio jako hiperbilirubinemie retencyjną (miąŜszową) oraz hiperbilirubinemie zwrotną (zastoinową), w której następuje wtórne wchłanianie się barwnika do krwi. Tylko bilirubina niesprzęŜona moŜe przenikać pr/c/ barierę krew-mózg do ośrodkowego układu nerwowego; a zatem encefalopatia spowodowana hiperbilirubinemia (kemicterus) moŜe wystąpić wyłącznie w przypadku retencji bilirubiny, czyli niesprzęŜonej hiperbilirubinemii. Tylko sprzęŜona bilirubina moŜe pojawić się w moczu. Zgodnie z tym Ŝółtaczka z obecnością barwników Ŝółciowych w moczu występuje tylko w przypadku hiperbilirubinemii sprzęŜonej (zwrotnej), a. Ŝółtaczka bez barwników Ŝółciowych w moczu w przypadku nadmiaru bilirubiny niesprzęŜonej. Hiperbilirubinemia niesprzęŜona Ze względu na duŜą wydajność metabolizowania bilirubiny w wątrobie, nawet w przypadku znacznej hemolizy, hiperbilirubinemia niesprzęŜona jest zazwyczaj niewielka < 68,4 umol/1 (= <4 mg/dl). JednakŜe upośledzenie metabolizowania bilirubiny, na skutek wady nabytej bądź wrodzonej nieprawidłowości, moŜe spowodować wystąpienie hiperbilirubinemii. Najczęściej spotykanymi przyczynami hiperbilirubinemii niesprzęŜonej są:

„śółtaczka fizjologiczna" noworodków. Ten przejściowy stan jest najczęstszą przyczyną hiperbilirubinemii niesprzęŜonej. Jest ona wynikiem nadmiernej hemolizy i niedojrzałości układu wątrobowego do wychwytywania, sprzęgania i wydzielania bilirubiny. Zmniejszona jest nie tylko aktywność UDPglukuronozylotransferazy, ale przypuszczalnie równieŜ synteza substratu dla tego enzymu, czyli kwasu UDPgiukuronowego. Ze względu na fakt, Ŝe zwiększone stęŜenie bilirubiny jest spowodowane przez bilirubinemię niesprzęŜona, moŜe ona przenikać przez barierę krew-mózg,

412 / ROZDZIAŁ 34

gdy jej zawartość w osoczu przekroczy ilość silnie wiązaną przez albuminę 340 — 428 jimol/1 (= 20 — 25 mg/dl). Następstwem toksycznego działania bilirubiny jest kernicterus, Ŝółtaczka jąder podstawnych mózgu, powodująca upośledzenie umysłowe. Skuteczne jest podawanie fen o bar bi tal u, ze względu na jego zdolność indukowania układu metabolizującego bilirubinę niesprzęŜoną. Ponadto fototerapia światłem widzialnym (przez niewyjaśniony dotychczas mechanizm) pobudza wydzielanie przez wątrobę bilirubiny niesprzęŜonej w wyniku przekształcenia pewnej ilości bilirubiny w inne pochodne wydalane w Ŝółci, takie jak fragmenty maleimidowe i izomery geometryczne.

Zespół Criglera-Najjara, typ I; wrodzona Ŝółtaczka niehemolityczna. Zespół Criglera-Najjara typu I jest rzadkim zaburzeniem dziedziczonym jako cecha recesywna autosomalna, ujawniającym się u człowieka na skutek wady metabolicznej w sprzęganiu bilirubiny. Charakteryzuje się on cięŜką Ŝółtaczką wrodzoną z powodu braku aktywności UDPglukuronozylotransferazy w wątrobie. Choroba /. vykle kończy się zgonem w ciągu pierwszych 15 miesięcy Ŝycia, chociaŜ istnieją doniesienia o nastolatkach, u których choroba nie ujawniła się aŜ do okresu dojrzewania płciowego. Dzieci te poddawano fototerapii powodującej pewne zmniejszenie stęŜenia bilirubiny w osoczu. Fenobarbital nie wpływa na tworzenie glukuronidów bilirubiny u chorych z zespołem Criglera-Najjara typu I. U chorych nie leczonych stęŜenie bilirubiny w surowicy przewyŜsza zwykle 340 umol/1 ( = 20 mg/dl). Zespół Criglera-Najjara, typ I I . Wydaje

się, Ŝe to zaburzenie wrodzone wynika z lŜejszej wady genetycznej w systemie sprzęgania bilirubiny i ma znacznie łagodniejszy przebieg. StęŜenie bilirubiny w surowicy nie przekracza zazwyczaj 340 |omol/l ( = 20 mg/dl), niemniej cała bilirubina jest gromadzona w postaci niesprzęŜonej. W Ŝółci chorych stwierdza się monoglukuronid bilirubiny, co pozwala przypuszczać, Ŝe wada genetyczna dotyczy UDPglukuronozylotransferazy wątrobowej, która dołącza drugą resztę glukuronianu do monoglukuronidu bilirubiny. Chorzy z tym zespołem reagują na podawanie duŜych dawek fenobarbitalu. Zespół Gilberta. Zespół Gilberta stanowi niejednorodną grupę zaburzeń, z których większość uwaŜa się obecnie za wynik hemolizy wyrównawczej związanej z'hiperbilirubinemią niesprzęŜoną. Stwierdza się takŜe nieprawid-

łowości klirensu wątrobowego bilirubiny, będące wynikiem upośledzenia wychwytywania bilirubiny przez komórki miąŜszowe wątroby, jak równieŜ zmniejszoną aktywność UDPglukuronozylotransferazy bilirubiny.

Hiperbilirubinemia toksyczna. Hiperbiiirubinemia niesprzęŜoną moŜe być wynikiem zaburzenia czynności wątroby, wywołanego przez takie toksyny, jak: chloroform, arsfenamina. tetrachlorek węgla, acetaminofen, wirus zapalenia wątroby, marskość lub zatrucie grzybami z rodzaju Amanita, ChociaŜ większość z tych nabytych zaburzeń jest skutkiem uszkodzenia komórek miąŜszowych wątroby, towarzyszy im często niedroŜność przewodów Ŝółciowych w obrębie wątroby powodująca występowanie hiperbilirubinemii sprzęŜonej, Htperbilirubinemię sprzęŜoną moŜna wykryć badając mocz PoniewaŜ bilirubina sprzęŜona jest rozpuszczalna w wodzie, moŜna ją wykryć w moczu chorych z hiperbilirubinemia sprzęŜoną; dlatego teŜ mówi się o nich często, Ŝe mają Ŝółtaczkę z wydalaniem barwników Ŝółciowych z moczeni (z cholurią). Najczęściej spotykanymi przyczynami hiperbilirubinemii sprzęŜonej są:

Przewlekła Ŝółtaczka samoistna (zespół Dubina-Johnsona). To zaburzenie, dziedziczone jako cecha autosomalna recesywna, charakteryzuje się hiperbilirubinemia sprzęŜoną w dzieciństwie lub u dorosłego człowieka. Hiperbilirubinemia jest wynikiem upośledzenia wydzielania wątrobowego bilirubiny sprzęŜonej do Ŝółci. Wada ta nie ogranicza się do bilirubiny, ale dotyczy takŜe wydzielania estrogenów i związków stosowanych w testach klinicznych, takich jak barwnik bromosulfoftaleina. Cechą znamienną u chorych z zespołem Dubina-Johnsona jest obecność w hepatocytach środkowego obszaru zrazika nietypowego, dotychczas nie zidentyfikowanego pigmentu.

NiedroŜność przewodów Ŝółciowych. Hiperbilirubinemię sprzęŜoną wywołuje takŜe zablokowanie przewodów Ŝółciowych wątrobowych lub przewodu Ŝółciowego wspólnego. UwaŜa się, Ŝe przechodzenie barwników Ŝółciowych z krwi do komórek wątroby przebiega prawidłowo, lecz nie są one wydzielane. Konsekwencją tego zaburzenia jest wchłanianie bilirubiny sprzęŜonej do Ŝył wątrobowych i naczyń chłonnych. Wszystkie postacie poza wątrób owych Ŝółtaczek mechanicznych (zaporowych, zastoino-

PORHRYNY 1 BARWNIKI śÓŁCIOWE / 413 Tabela 34-2. Wyniki analizy biochemicznej pacjentów zdrowych oraz z trzema róŜnymi rodzajami ł Ŝółtaczek Stan zdrowia Prawidłowy

Niedokrwistość hemolityczna Zapalenie wątroby

śółtaczka mechaniczna

Surowica bilirubina Bezpośrednia: 1,7-6,8 umol/l

Mocz urobilinogen

Mocz bilirubina

Kał urobilinogen

Brak 67,48-472,4 umol/24 h (40280 mg/24 h)

0-6,75

(0,1 -0,4 mg/dl) nmol/24h (0-4 Pośrednia: 3,4-12 mg/24 h) umol/l (0,2-0,7 mg/dl) Zwiększenie stęŜenia pośredniej Zwiększenie stęŜenia Zwiększenie bezpośredniej i pośredniej Zwiększenie

Brak

Zwiększenie

Występowanie

Zmniejszenie

Zwiększenie stęŜenia bezpośredniej

Występowanie

Ilości śladowe lub brak

Brak * Najczęściej występującą przyczyną Ŝółtaczki mechanicznej (pozawątrobowej) jest rak głowy trzustki oraz kamienie w przewodach Ŝółciowych

wych) oraz niektóre postacie Ŝółtaczki miąŜszowej (postacie cholestatyczne) charakteryzujące się hiperbittrubinemią sprzęŜoną, określa się mianem Ŝółtaczki cholestatycznej. Występowanie urobilinogenu w moczu jest wskaźnikiem klinicznym Zazwyczaj w moczu znajduje się jedynie śladowe ilości urobilinogenu. W przypadku

liwa) powoduje równieŜ zwiększenie urobilinogenu w moczu. W tabeli 34-2 podsumowano wyniki analizy biochemicznej chorych z róŜnymi rodzajami Ŝółtaczek: niedokrwistością hem o lityczną (przyczyna przedwątrobowa), zapaleniem wątroby (przyczyna wątrobowa) i zaczopowaniem przewodu Ŝółciowego wspólnego (przyczyna za wątrobowa).

całkowitego /a czopów ani a przewodu Ŝółciowe-

go nie stwierdza się w ogóle urobilinogenu w moczu, poniewaŜ bilirubina, z której powstaje, nie przedostaje się do jelita, gdzie mogłaby być przekształcona w urobilinogen, W takim przypadku obecność w moczu bilirubiny, przy braku urobilitiogenu, wskazuje na Ŝółtaczkę mechaniczną śródwątrobową lub pozawąlrobową. W Ŝółtaczce hemolitycznej zwiększone wytwarzanie bilirubiny prowadzi do zwiększonego wytwarzania urobilinogenu, który pojawia się w moczu w duŜych ilościach. W moczu chorego na Ŝółtaczkę hemolityczna. bilirubina zazwyczaj nie występuje (niesprzęŜona bilirubina nie przenika bowiem do moczu), tak Ŝe zwiększenie wydalania urobilinogenu i brak bilirubiny w moczu sugerują występowanie Ŝółtaczki hemolitycz-

nej. WzmoŜony, z jakichkolwiek przyczyn, proces niszczenia krwinek (np. niedokrwistość złoś-

PIŚMIENNICTWO Billett,HH, Porphyrias; Inbornerrorsinhemeproduetion. Hosp Pract 1988; 41:60. Goldberg A et al: Porphyrin metabolism and Ibe porphyrias. In: Oxford Textbook of Medianę. 2nd ed- Weatherall DJ et al (editors). Oxford University Press, 1987. Kappas A, Sassa S, Anderson KE: The porphyrias. In:'-The Metabolu■ Basis of Inherited Disease, 5th et. Sta^ury JB et al (editors). McGraw-Hill, 1983. Meyer UA, Porphyrias. In: Harrison's Principles of Internat Medii-me, l l t h ed. Braunwald E et al (editors). McGraw-Hill, 1987. Wolkoff AW, Chowdliury JR, Arias IM. Hereditary jiiundice a.nd disorders of bilirubin metabolism. In: The MetaboJic Basis of btheriied Disease, 5th ed, Stanbury JB et al (editors). McGraw-Hill, 1983.

CZĘŚĆ IV Budowa, czynność i replikacja makrocząsteczek informacyjnych Nukleotydy

35

Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE Nukleotydy biorą udział w róŜnych procesach biochemicznych. Najlepiej jest poznana rola nukleotydów purynowych i pirymidynowych* jako monomerycznych prekursorów RNA i DNA, Jednak rybonukleotydy purynowe to takŜe wszechobecne źródła duŜej energii (ATP), sygnały regulatorowe (cykliczny AMP [cAMP] i cykliczny GMP [cGMP]), a takŜe komponenty koenzymów FAD, NAD+ oraz NADP+, a S-adenozy lornet ionina jest donorem grup metylowych. Nukleotydy pirymidy no we, oprócz tego, Ŝe stanowią monomeryczne prekursory syntezy kwasów nukleinowych, są takŜe półproduktami o duŜej energii, takimi jak UDP-glukoza i UDP-galaktoza, biorącymi udział w metabolizmie węglowodanów, oraz CDP-acyloglicerol w syntezie tłuszczów.

koenzymów (AMP), akceptorami oksydacyjnej fosforylacji (ADP). allosterycznymi regulatorami aktywności enzymatycznej i „wtórnymi przekaźnikami" (cAMP, cGMP). Syntetyczne analogi naturalnie występujących nukłeotydów są stosowane w chemioterapii nowotworów jako inhibitory enzymów i mogą zastąpić w kwasach nukleinowych naturalnie występujące nukleotydy. W terapii zmierzającej do zahamowania wzrostu komórek rakowych lub niektórych wirusów często stosowano analogi zasad nukleozydów lub nukleotydów, które hamują syntezę DNA lub RNA. Do związków tych naleŜą: 5-fluorouracyl, 5'-jodo-2'-deoksyurydyna, 6-tioguanina, 6-merkaptopuryna, 6-azaurydyna i arabinozyd cytozyny (p. niŜej). Allopurynol, analog puryny, jest szeroko stosowany w leczeniu dny.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

HETEROCYKLICZNE ZASADY NUKLEOTYDÓW SĄ POCHODNYMI PURYNY I PIRYMIDYNY

Heterocykliczne zasady purynowe i pirymidynowe są macierzystymi cząsteczkami nukleozydów i nukleotydów. Nukleotydy są wszechobecne w Ŝywych komórkach, gdzie spełniają liczne, kluczowe funkcje, np.: wbudowywanie w kwasy nukleinowe ich rybozowych (RNA) lub deoksyrybozowych (DNA) postaci, przenoszenie energii (ATP); są one częściami

Zasady purynowe i pirymidy nowe (puryny i pirymidyny) nukleotydów powstają przez podstawienie atomów w aromatycznym pierścieniu macierzystych heterocykli puryny i pirymidyny (ryc. 35-1). NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe kierunek, w którym atomy ó-członowego pierścienia są oznaczone, jest odwrotny w purynie (przeciwny

416 / ROZDZIAŁ 35

ruchom wskazówek zegara) i inny w pirymidynie (zgodny ze wskazówkami zegara). JednakŜe

II .CH

atom 5 (węgiel) jest tak samo oznaczony w obu związkach, Puryny i pirymidyny są płaskimi cząsteczkami — jest to właściwość o duŜym znaczeniu dla struktury kwasu nukleinowego (p. rozdz. 38).

Puryna Pirymldyna Ryc. 35-1. Struktura puryny i pirymidyny, pozycje atomów ponumerowano zgodnie z systemem międzynarodowym. NH,

Cytozyna (2-oksy-4am In op iry m Idyn a)

Tym In a (2,4-dioKsy-5-metyloplrymldyna)

Uracyl (2,4-d loksypl ry m i dyna)

Ryc. 35-2. 3 główne zasady pirymidynowe występujące w nukleotydach. NH,

Terminy „główne" i „pomniejsze" zasady odnoszą się do ich względnej obfitości, a nie do znaczenia fizjologicznego PoniewaŜ w komórkach niektóre puryny i pirymidyny występują w znacznie większej ilości niŜ inne, zwyczajowo rozróŜnia się puryny i pirymidyny główne i drugorzędne. Jednak ze względu na to, Ŝe te dodatkowe puryny i pirymidyny odgrywają takŜe kluczowe role w metabolizmie, to rozróŜnienie polega jedynie na ich względnej ilości, a nie na ich względnym znaczeniu fizjologicznym. Głównymi purynami i pirymidynami kwasów nukleinowych zarówno u prokariontów, jak i eukariontów są: puryny — adenina i guanina oraz pirymidyny cytozyna, tymi na i uracyl (ryc. 35-2 i 35-3). Puryny, hipoksantyna i ksantyna (ryc. 35-3), są metabolitami adeniny i guaniny, a człowiek wydala utlenioną purynę — kwas moczowy — jako końcowy produkt katabolizmu purynowego. Dodatkowe zasady są obecne w DNA i transferowym RNA (tRNA) zarówno u prokariontów jak i eukariontów. Inne, których funkcje są słabo poznane, znajdują się jedynie w kwasach nukleinowych bakterii i wirusów. Na przykład bakteryjny i ludzki DNA zawiera 5-metyIocyfozynę, a fagowy DNA 5-hydroksymetylocy-

tozynę (ryc. 35-4). Drugorzędne zasady mRNA HjN Adenina (6amlnopuryna)

~NT

NH

Guanina (2- am In o-6-o ksypu ryn

komórek ssaków to N^-metyloadenina, Nfi, N6-dimetyloadenina i N7-metyioguanina (ryc. 35-5).

a)

CHZOH

Hipoksantyna (6-oksypuryna)

Ksantyna (2,6-dloksypuryna)

Ryc. 35-3. Główne zasady purynowe nukleotydów.

5-Metyloeytozyna

5-Hyd roksy mety tocyi ozy na

Ryc. 35-4. Struktura 2 rzadkich, naturalnie występujących, zasad pirymidynowych.

NUKLEOTYDY / 417

N',N*-DI metyloaden in a

N'-Metylog u an in a

Ryc. 35-5. Struktura 2 rzadkich, naturalnie występujących, zasad purynowych.

Metylowane puryny i pirymidyny mają właściwości farmakologiczne Metylowane puryny roślinne o właściwościach farmakologicznych zawierają: kawa (kofeina czyli 1,3,7-trimetyloksantyna), herbata (teofilina, czyli 1,3-dimetyloksantyna) i kakao (teobromina, czyli 3,7-dimetyloksantyna) (ryc. 35-6).

Tym In a (laktam) NH

Kofeina (1,3,7-lrimetylo-ksantyna) Taoftllna (1,3-dlmelyloksantyna) Adenina (laktam) O

Adenina (laktym)

OH(laktym) Guanina

H3C

H,N

Guanina (laktam)

Ryc. 35-7. Postacie tautomeryczne cytozyny, tyminy, adeniny i guaniny; wskazano postacie dominujące.

Teobromina (3,7-dlmetyloksantyna)

Ryc. 35-6. Metylowane ksaniyny zawarte w poŜywieniu.

Puryny i pirymidyny wykazują tautomeryzm typu keto-enol Puryny i pirymidyny istnieją w formie laktymowej (—OH) lub laktamowej ( = 0) (ryc. 35-7). W warunkach fizjologicznych główną 27 — Biochemia

formą tautomeryczną guaniny i tyminy jest forma laktamowa. W rozdziale 39 i 41 omówiono znaczenie tautomeryzmu laktam/laktym w parowaniu zasad i mutagenezie. MAŁA ROZPUSZCZALNOŚĆ ZASAD PURYNOW YCH W KWAŚNYM pH STANOWI PROBLEM MEDYCZNY W obojętnym pH najmniej rozpuszczalnymi zasadami są guanina i hipoksantyna, jednak guanina w warunkach fizjologicznych nie występuje w ludzkim moczu. ChociaŜ sole kwasu

418 / ROZDZIAŁ 35

moczowego (moczący) są względnie rozpuszczalne w wodzie w obojętnym pH, kwas moczowy jest nierozpuszczalny w roztworach o niskim pH (np. w moczu). Ks anty na i kwas moczowy mogą występować jako składniki kamieni moczowych. WOLNE PURYNY I PIRYMIDYNY WYSTĘPUJĄ W ZNACZNIE MNIEJSZEJ ILOŚCI NIś ODPOWIADAJĄCE IM NUKLEOZYDY I NUKLEOTYDY Nukleozydy (ryc. 35-8) składają się z cukru (zwykle D-rybozy lub 2-deoksy-D-rybozy) dołączonego do puryny lub pirymidyny przez względnie labilne w środowisku kwaśnym wiązanie P-N-glikozydowe przy Ne (puryna) lub N1 (pirymidyna). Głównymi ryb o nukleo Ŝydami są: adenozyna (D-ryboza związana z N9 adeniny), guanozyna (D-ryboza związana zN' guaniny), cytydyna (D-ryboza związana z N1 cytozyny) i urydyna (D-ryboza związana z N1 uracylu). 2'-Deoksyrybonukleozydy składają się z 2-deoksy-D-rybozy związanej z pozycjami opisanymi wyŜej równieŜ przez wiązanie [i-N-glikozydowe. OH

OH ,

Elementy przestrzenne przeszkadzają rotacji wokół wiązania N-glikozydowego i w naturalnie występujących nukleozydach dominuje konformacja anty (ryc. 35-9). Jak wskazano w rozdz. 38, postać anty jest istotna do uplasowania komplementarnych zasad purynowych i pirymidynowych w dwupasmowym DNA. Jednak powszechnie stosowane przedstawianie D-rybozy nakazuje prezentowanie nukleozydów i nukleo ty d ów, w tym i innych rozdziałach, w mniej popularnej konformacji syn. Nukleotydy są fosforylowanymi nukleozydami Mononukleotydy są to nukleozydy mające pojedynczy fosforan zamiast grup hydroksylowych cukru (na ogół rybozy lub 2r-deoksyrybozy(ryc. 35-10). Na przykład adenozynomonofosforiin (AMP lub adenylan) jest złoŜony z adeniny, rybozy i fosforanu. Jedynymi cukrami, związanymi zwykle z uracylem i tyminą, są odpowiednio D-ryboza i 2'-deoksy-D-ryboza. W tabeli 35-1 przedstawiono zaleŜności między głównymi purynami i pirymidynami a odpowiadającymi im monofosforanami 5-oksy-^ i 5'-deoksyrybonukleozydów. DNA jest polimerem złoŜonym z dTMP, dCMP, dAMP

Cytydyna Ryc. 35-8.

Struktura rybonukleozyctów

OH

OH

Guanozyna

NUKLEOTYDY / 419

OH Ryc. 35-9. syn i anty

OH

Konformacje adenozyny

HO

Anty OH

OH

OH Ryc. 35-10. Struktura kwasu adenylowego (AMP) (po lewej strome) i kwasu 2-deoksyadenylowego; dAMP (po prawej stronie).

Tabela 35-1. Główne zasady, nukleozydy i nukleotydy Zasada Adenina (A) Guanina (G) Cytozyna (C) U racy I (U) Zasada Adenina (A) Guanina (G) Cytozyna (C) Tymina (T)

Rybonukleozyd Adenozyna Gua noŜyna Cy ty dyn a Urydyna Deo k sy ry bon u k I eozy d Deoksyadenozyna Deoksyguanozyna Deoksycytydyna Tymidyna

Rybonukleotyd (5'-monofosforan) Adenozyno-5'-monofosforan (AMP) Gua noŜyno-5'-monof osf ora n (GMP) Cytydyno-5'-monofosforan (CMP) Urydyno-5'-monofosforan (UMP) Deoksyrybonukleotyd (5'-monofosforan) Oeoksyadenozyno-5'-monofosforan (dAMP) Deoksyguanozyno-5'-monofosforan (dGMP) Deoksycytydyno-5'-monofosforan (dCMP) Tymidyno-5-moriofosforan (dTMP)

420 / ROZDZIAŁ 35

i dGMP, a RNA polimerem złoŜonym z UMP, CMP, AMP i GMP. Od powyŜszych struktur nukleozydów są wyjątki. Na przykład w tRNA ryboza jest czasami związana z 5 atomem uracylu przez wiązanie węgiel-węgiel, a nie jak zwykle przez wiązanie N-do-C. Ta nietypowa cząsteczka jest pseudourydyną (f). tRNA zawiera dodatkowe nietypowe nukleotydy, np. TMP, czyli rymine związaną z rybozomonofosforanem (ryc. 35-11). TMP tworzy się po syntezie tRNA na drodze metylacji UMP przez S-adenozylometioninę. Podobnie kwas pseudourydynowy (^MP) tworzy się przez przegrupowanie w kwasie urydyłowym po syntezie cząsteczki tRNA. Pozycję reszty fosforanowej w nukleotydzie oznacza się numerem atomu ze znakiem „prim". Na przykład adenozyna z resztą fosforanową związana z 3 atomem węgla cukru rybozy to adenozyno-3'-monofosforan. Znak „prim" odróŜnia atomy cukru od atomów puryn lub pirymidyn, które nie są nim oznaczane (ryc. 35-12). A, G, C, T i U oznaczają odpowiednio nukleozydy adeniny, guaniny, cytozyny, tyminy i uracylu. Przedrostek d wskazuje, Ŝe cukrem jest 2'-deoksy-D-ryboza. Skrót ,,MP" (monofosforan) dodaje się do skrótu oznaczającego nukleotyd. Oznaczenie 5' jest pomijane, gdy fosforan jest zestryfikowany z węglem 5' rybozy lub 2'-deoksyrybozy, np. guanozyno-5'-monofosforan ma skrót GMP. Dodatkowe reszty fosforowe są związane z cukrem mononukleotydu przez wiązanie typu bezwodnika kwasowego, tworząc di- i trifosforany nukleozydów, takie jak ADP (adenozynodifosforan) i GTP (guanozynotrifosforan) (ryc. 35-13). Warto przypomnieć, Ŝe kwasowe

NH

Ryc. 35-12. Adenozyno-3'-monofosforan (po lewej stron/e) i 2'-deoksyadenozyno-5'-monofosforan (po prawej stronie).

bezwodniki mają wysoki potencjał przenoszenia grupy i Ŝe AG0 dla hydrolizy ATP do ADP wynosi 30 kJ/mol ( = 7 kcal/mol). Trifosforany nukleozydów uczestniczą w tworzeniu wiązań kowalencyjnych PoniewaŜ wszystkie trifosforany puryn i pirymidyn mają wysoki potencjał przenoszenia grupy, uczestniczą one w licznych reakcjach, w których tworzą się wiązania kowalencyjne. Czołowym przykładem jest polimeryzacja głównych trifosforanów w trakcie syntezy DNA lub RNA. W dodatku swoiste di- i trifosforany nukleozydów spełniają swoiste funkcje fizjologiczne w róŜnych tkankach i róŜnych Ŝywych organizmach.

Pochodne adenozyny. ADP i ATP są odpowiednio substratami i produktami dla fosforylacji oksydacyjnej, a ATP jest głównym

!

OH

OM

03P

OH

f

Ryc. 35-11. Kwas urydylowy (UMP) (po lewej stronie) i kwas tymidylowy (TMP) (po prawej stronie).

NUKLEOTYDY / 421

O" O O-/ HO-P-O-P-O-P II

O

I

O

Adenina Ftyboza HO

OH

M

"

AaenozynoS'-

O

monofo5foran

(AMP)

r

Adenazyno-5 difosforan (ADP) Adenozyn o-5'tr[fosforan (ATP)

Ryc 35-13. Adenozyna, jej monofosforan, difosforan i ATP,

wewnątrzkomórkowym przenośnikiem wolnej energii. Średnie wewnątrzkomórkowe stęŜenie ATP, występującego w największych ilościach wolnego mikleotydu komórek ssaków, wynosi ok. 1 mmol. - Cykliczny AMP (cAMP, czyli adenozyno3', 5'-mo no fosforan), wytworzony z ATFw reakcji katalizowanej przez cyklazę adenylanową

(ryc. 35-14), pośredniczy w wielu procesach wewnątrzkomórkowych. Aktywność cyklazy adenylanowej jest regulowana przez złoŜone interakcje, a w wielu z nich biorą udział receptory hormonów (p. rozdz. 44). Wewnątrzkomórkowe stęŜenia cAMP (ok. 1 u.mol) są o ok. 3 rzędy wielkości mniejsze od stęŜeń ATP. Hydroliza cAMP, katalizowana przez fosfodiesterazę cAMP (ryc. 35-14) prowadzi "do" wytworzenia 5'.-ĄM|\_ " Włączanie reszty siarczanowej w wiązanie estrowe w takich związkach, jak siarczany proteoglikanów (p. rozdz. 43), wymaga najpierw „aktywacji" reszty siarczanowej w reakcji z ATP prowadzącej do powstania adenozyno-3'-fosfo-5'-fosfosiarczatm (PAPS, czyli fosfoadenozynofosfosiarczanu) (ryc. 35-15). PAPS jest teŜ substratem w reakcji wiązania siarczanów. S-Adenozylunietionina (ryc 35-16). Postać aktywnej metioniny słuŜy jako donor grup metylowych w reakcjach metylacji i jako źródło propylaminy do syntezy poliamin (p. rozdz. 33). AMP-P-P

ATP

ATP

CYKLAZA ADENYLANOWA -pp,

ADP

(ATP) J Adenina-Hyboza- © -O -S03 " N

Ryo. 35-15. Powstawanie adenozyno-3'-fosfo-5'-fosfosiarczanu.

N

NH2

O-------- CH,

-o-p=o

N

Ć r>

O H Cykliczny 3',5'~AMP

H,0 FOSFODIESTERA2A

cooCH -CH,-CH 3

AMP Ryc. 35-14. Powstawanie cAMP z ATP z udziałem cyklazy adenyfanowej i hydroliza cAMP przez fosfodiesterazę cAMP.

i

+

NH3+

l\ HO

Metionina

/ OH

Adenozyna

Ryc. 35-16. S-Adenozylometionina.

422 / ROZDZIAŁ 35

Pochodne gua noŜyny, Utlenianie a-ketoglutaranu do sukcynylo-CoA wymaga fosforylacji GDP do GTP. GTP jest konieczny do aktywacji cyklazy adenylanowej przez niektóre hormony i słuŜy zarówno jako allosteryczny regulator, jak i źródło energii do syntezy białek na polisomach. GTP odgrywa zatem waŜntj rolę w utrzymaniu środowiska wewnętrznego. Cykliczny GMP (cGMP, czyli guanozyno-3\5'-monofosforan) (ryc. 35-17) jest takŜe sygnałem wewnątrzkomórkowym, czyli wtórnym przenośnikiem (messenger) zewnątrzkomórkowych zmian, cGMP jest tworzony z GTP przez cyklazę guanylanową. Podobnie jak cyklaza adenylanowa, cyklaza guanylanowa jest regulowana przez róŜne efektory, z hormonami włącznie. Podobnie jak cAMP, cGMP jest takŜe katabolizowany przez fosfodiesterazę do jego 5'-monofosforanu, GMP.

takŜe przez deaminację AMP, a reakcja przebiegająca w tkance mięśniowej stanowi część cyklu nukleotydów purynowych (ryc. 35-18). Aminacja IMP, odtwarzająca AMP, wymaga amoniaku pochodzącego z asparaginianu. Defosforylacja IMP daje nukleozyd inozynowy (rybonukleozyd hipoksantyny), związek pośredni reakcji rezerwowej cyklu purynowego (p. rozdz. 36). Pochodne uracylu. Pochodne UDP-cukier biorą udział w epimeryzacji cukru (np. wewnętrzne przekształcenie glukozo- i gaiaktozo-1-fosforanu), a UDP-glukoza jest donorem glikozylu w biosyntezie glikogenu i disacharydów glikozydowych. Związki UDP-cukry biorą takŜe udział w biosyntezie oligosacharydów glikoprotein i proteoglikanów (p. rozdz. 55). Wreszcie UDP-kwas glukuronowy jest donorem kwasu giukuronowego w reakcjach koTabela 35-2. Wiele koenzymów i związków pokrewnych jest pochodnymi adenozyno-monofosforanu NH,

RAdsnozyna D-Ryboza

Ryc. 35-17. Cykliczny 3',5'-guanozynomonofosforan (cykliczny GMP, cGMP)

Pochodne hipoksantyny. Rybonukleotyd ksantyny (IMP, czyli i noŜy niań) jest prekursorem wszystkich rybonukleotydów purynowych syntetyzowanych de noro. IMP powstaje

*• AMP I IAZA ADFNV|_OBURSZTYNtANOWA

R'

R"

n

Aktywna metionina Metionina* Adenylany amino- Aminokwas kwasów Aktywny siarczan

H

H

0

H

H

1

3', 5'-Cykliczny AMP

Koenzym

R

H

H

PO^-

NAD" NADP +

.. ••

H

H

2

PO*-

H

2

FAD

..

H

H

2

CoA SH

..

GTP

Ryc. 35-18. Cykl nukieotydów purynowych.

1

H

Zastępuje resztę fosforanową. R jest pochodną witaminy B.

H

PO=" 2

NUKLEOTYDY / 423

niugacji, takich jak tworzenie glukuromdu bilirubiny (p. rozdz. 34).

Pochodne cytozyny. CTP jest potrzebny do biosyntezy w tkankach zwierzęcych niektórych fosfoglicerydów. Reakcje obejmujące ceramid i CDP-cholinę są odpowiedzialne za syntezę sfingomieliny i innych podstawionych sfmgozydów. Opisano cykliczne nukleotydy pochodne cytydyny, analogiczne do takich pochodnych adenozyny i guanozyny.

Wiele koenzymów jest pochodnymi nukleotydów Liczne koenzymy zawierają nukleotydy oraz związki podobne do nukleotydów purynowych i pirymidy nowych (tab. 35-2).

HO 5-J od o-2-d eoksyu ry dyn a SH

SYNTETYCZNE ANALOGI NUKLEOTYDÓW MAJĄ ZASTOSOWANIE W MEDYCYNIE KLINICZNEJ Syntetyczne analogi puryn i pirymidyn, nukleozydów i nukleotydów są szeroko stosowane w medycynie doświadczalnej i klinicznej. Zwykle stosuje się je w celu wyjaśnienia roli nukleotydów jako komponentów kwasów nukleinowych niezbędnych dia wzrostu i podziału komórek. Aby komórka mogła się podzielić, musi być zreplikowany DNA. Wszystkie prekursory DNA — prawidłowe deoksyry bo nukleotydy puryn i pirymidyn — muszą być zatem dostępne. Jednym z najbardziej waŜnych składników farmakopei onkologicznej jest grupa syntetycznych analogów puryn i pirymidyn i ich nukleozydów. W podejściu farmakologicznym uŜywa się analogu, w którym została zamieniona albo heterocykliczna struktura pierścienia albo cząsteczka cukru tak, aby uzyskać działanie toksyczne, gdy analog jest wbudowany w swoiste składniki komórki. Wiele z tych działań odzwierciedlają 2 procesy: 1) zahamowanie przez lek swoistych enzymów niezbędnych do syntezy kwasów nukleinowych lub 2) wbudowanie metabolitów leku w kwasy nukleinowe, gdzie zaburzają one parowanie zasad niezbędne do prawidłowego przenoszenia informacji. Jako przykład moŜna podać 5-fluoro- lub 5-jodo pochodne uracylu lub deoksyurydyny, które spełniają funkcję odpowiednio analogu tyminy i tymidyny (ryc. 35-19). Zarówno 6-tioguanina, jak i ó-merkaptopuryna, w których grupy hydroksylowe w pozycji 6 za-

6-Merkaptopuryna

Ryc. 35-19. Syntetyczne analogi pirymidyn {u góry) i syntetyczne analogi puryn (u dołu). ____

stępują grupy tiolowe, mają szerokie zastosowanie kliniczne. Analogi takie jak 5- lub ó-azaurydyna, 5- lub 6-azacytydyna i 8-nzaguanina (ryc. 35-20), w których heterocykliczny atom węgla w pierścieniu zastąpiono atomem azotu mają równieŜ zastosowanie kliniczne. Purynowy analog 4-hydroksypirazolopirymidyna (allopurynol), stosowany w leczeniu hiperurykemii i w skazie moczanowej, hamuje > HO

H

OH

6-Azaurydyna

8-Azaguanina

Ryc. 35-20. 6-azaurydyna i 8-azaguanina.

H 5Fluorouracyl

6-Tioguanina

424 / ROZDZIAŁ 35 0 0 0 II II II B-R-0 — P—0-P-0-P-0Allopurynol (laktym)

I o-

I I oo-

Maelerzysty trlfosforan nukleozydu 0 0 0 II II II B-R-0-P-O-P-CH^-p-O1 I I

o-

o-

o-

Pochodna ^^met/lenowa

HO

H

Arabinozylocytozyna

B II0

0 II H || B—R—0—P—O—P—N-P—0

I o-

I o-

I o-

Pochodna

Ryc. 35-Z2. Syntetyczne pochodne trifosforanów nukleozydów niezdolne do hydrol i tycz n eg o oddzielenia końcowej reszty fosforanowej. B — zasada purynowa lub pirymidynowa, R — ryboza lub deoksyryboza. Pokazano macierzysty trifosforan nukteozydu ulegający hydrolizie {u góry) oraz nie ulegające hydrolizie p,7-metyleno (środek) i p,7-imino (dóf) pochodne.

Azatiopryna Rye. 35-21. 4-Hydroksypirazoiopirymidyna (allopurynol). arabinozylocytozyna (cytarabina) iazatiopryna.

de novo biosyntezę puryny i oksydaze ksantynową. Nukleozydy zawierające jako cząsteczkę cukrową arabinozę zamiast rybozy, np. cytarabina (arabinozylocytozyna, Ara-C) są stosowane w chemioterapii nowotworów i zakaŜeniach wirusowych (ryc. 35-21). Azatiopryna, która jest katabolizowana do 6-merkaptopuryny, ma zastosowanie w transplantacji narządów dla supresji reakcji immunologicznego odrzucenia przeszczepu. Między licznymi analogami nukleozydów, mających aktywność przeciwwirusową, 5-jododeoksyurydyna (patrz wyŜej) jest skutecznym lekiem sto-

sowanym miejscowo w opryszczkowym zapaleniu rogówki — zakaŜenie rogówki przez wirus opryszczki. Liczne analogi rybonukleotydów puryn i pirymidynr z nieu legającym i hydrolizie grupami di- i trifosforanowymi, zostały zsyntetyzowane do uŜytku in vitro. Analogi te pozwalają badaczowi oznaczyć, czy dane biochemiczne skutki działania di- i trifosfonukteozydów wymagają hydrolizy albo czy skutki przez nie wywołane polegają na zajęciu swoistych miejsc wiąŜących nukleotydy w cząsteczkach enzymów lub białek regulatorowych. Na rycinie 35-22 przedstawiono nieulegające hydrolizie analogi GTP.

PIŚMIENNICTWO Mainwanng WIP, Parrish JH, Pickering JD. Mann NH; Nucleic Acid Biochemistry and Molecular Biology. Blackwell Scientific Publications. !982.

Metabolizm nukleotydów

*%/*

purynowych

36

i pirymidynowych Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE W rozdziale tym omówiono trawienie, biosyntezę i kataboiizm nukleotydów purynowych i pirymidynowych oraz wybrane choroby związane z wadami genetycznymi w tych procesach.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE A«i nukleotydy dostarczane z poŜywieniem, ani ich macierzyste zasady purynowe i pirymidynowe nie są wbudowywane zarówno w kwasy nukleinowe tkanek ludzkich, jak i w pochodne puryn i pirymidyn, np. w ATP, NAD + albo koenzyn A. Nawet jeśli dostarczone poŜywienie jest bogate w nukleoproteiny, organizm ludzki buduje składniki kwasów nukleinowych tkanek z amfi bo licznych związków pośrednich. Ta synteza de novo pozwala na wbudowanie do DNA analogów puryn i pirymidyn, mających potencjał leków przcciwnowotworowych. Stopień syntezy oksy- i deoksyrybonukleotydów purynowych i pirymidynowych jest precyzyjnie regulowany przez mechanizmy, które zapewniają wytworzenie tych związków w odpowiednich ilościach i w czasie odpowiednim do zmiennego zapotrzebowania fizjologicznego. Te mechanizmy obejmują szlaki awaryjne typu „salvage" (reakcje rezerwowe) dla reutytizacji zasad purynowych i pirymidynowych uzyskanych in vivo przez degradację kwasów nukleinowych. Choroby ludzi, związane z nieprawidłowościami metabolizmu puryn i pirymidyn, obejmują skazę moczanową, zespół Lescha-Nyhana, niedobór deaminazy adenozynowej i niedobór fosforylazy nukleozydowej puryn.

PURYNY I PIRYMIDYNY NIE SĄ NIEZBĘDNE W LUDZKIM POśYWIENIU Podczas gdy zwierzęta przyjmują kwasy nukleinowe i nukleotydy z poŜywieniem, przeŜycie nie zaleŜy od wchłaniania i zuŜytkowania tych związków, poniewaŜ człowiek i większość kręgowców łatwo syntetyzują de novo nukleotydy purynowe i pirymidynowe z ich amfi bo licznych związków pośrednich. Organizm ludzki przemienia większość puryn uzyskanych z pobranych nukleoprotein w kwas moczowy (ryc. 36-1). Niewiele (lub wcale) puryn i pirymidyn pobranych z poŜywieniem jest wbudowanych do kwasów nukleinowych tkanek, natomiast związki podane pozajelitowe są wbudowywane, dlatego wbudowywanie wstrzykniętej [3H] tymidyny bezpośrednio do nowo syntetyzowanego DNA stanowi szeroko uŜywaną technikę oznaczania stopnia syntezy DNA zarówno in vivo, jak i in ritro.

ENZYMY PRZEWODU POKARMOWEGO DEGRADUJĄ POBRANE KWASY NUKLEINOWE DO PURYN I PIRYMIDYN Kwasy nukleinowe, wyzwolone ze strawionych nukleoprotein przez proteolizę w przewodzie pokarmowym, są degradowane do mononukleotydów przez rybonukleazy, deoksyrybonukleazy i polinukleotydazy, Nukleotydazy i fosfatazy hydrolizują mononukleotydy do nukleozydów, które są albo absorbowane albo dalej degradowane do zasad purynowych i pirymidynowych przez fosforylazy jelitowe. Zasady

426 / ROZDZIAŁ 36

OH OH Adenozyna DEAMINAZA ADENOZYNOWA

HOH2C C

H

nf"

T L> HOH.C

H

-

OH OH Guanozyna -P FOSFORYLAZA NUKLEOZYDOWA PURYN

Hybozo-1-fosforan

Rybozo-1fosforan

FOSFORYLA2A NUKLEOZYOOWĄ PUHYN OKSYDAZA KSANTYNOWA

Hipoksantyna

Ksantyna

Guanina

H„0 + 0, H,0

V

OKSYDAEA KSANTYNOWA

Kwas moczowy

RYC. 36-1. Wytwarzanie kwasu moczowego z nulOeozydów purynowych przez zasady purynowe — hipoksantynę, ksantynę i guaninę. Deoksyrybonukleozydy purynowe są degradowane przez ten sam szlak metaboliczny i enzymy, które znajdują się w błonie śluzowej przewodu pokarmowego ssaków.

METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I P1RYMIDYNOWYCH / 427

purynowe, utlenione do kwasu moczowego (ryc. 36-1), mogą być absorbowane, a następnie wydalane z moczem. ZWIERZĘTA TWORZĄ NUKLEOTYDY Z AM FI BO LICZNYCH ZWIĄZKÓW POŚREDNICH Człowiek i inne ssaki syntetyzują nukleotydy purynowe z amfibolicznych związków pośrednich w ilościach wystarczających zarówno do syntezy kwasów nukleinowych, jak i do dodatkowych czynności wymienionych w rozdz. 35. U niektórych kręgowców biosynteza nukleotydów słuŜy dodatkowym celom. ChociaŜ ssaki i inne zwierzęta ureoteliczne wydalają odpady azotowe w postaci mocznika, zwierzęta urykoteliczne (ptaki, gady, plaŜy) wydalają odpady azotowe jako kwas moczowy. PoniewaŜ reakcje syntezy de novo nukleotydu purynowego są analogiczne u organizmów ureotelicznych i urykotelicznych, Ŝywe organizmy urykoteliczne muszą przeto syntetyzować nukleotydy purynowe w względnie większym stopniu. Inozynomonofosforan (IMP), macierzysty mononukleotyd purynowy, tworzy się z amfibolicznych związków pośrednich Na długo zanim poznano detale wydłuŜonej drogi biosyntezy IMP, badania przy uŜyciu znaczników izotopowych pozwoliły na zidentyfikowanie źródła kaŜdego z atomów w zasadzie purynowej (ryc. 36-2). Te wczesne badania izotopowe utorowały drogę do odkrycia reakcji i związków pośrednich omawianych niŜej. W teGlutamina Gllcyna

Ns-Formylo. tetrahytirofolian

N'.N"Metenylotetrahydrofolian

Ryc. 36-2. Pochodzenie atomów azotu i węgla w pierścieniu purynowym. Atomy 4, 5 i 7 (przyciemnione) pochodzą z glicyny.

kście podanym niŜej cyfry arabskie poszczególnych akapitów odpowiadają ponumerowanym reakcjom na ryc. 36-3, a cyfry rzymskie związków odpowiadają strukturom związków pośrednich z tej ryciny. Przeniesienie pirofosforanu z ATP do C-l D-rybozo-5-fosforanu (I) tworzy 5-fosforybozylo-I-pirofosforan, PRPP (II), takŜe związek pośredni dla NAD + , NADP + i biosyntezy nukleotydu pirymidynowego. Przekształcenie PRPP (II) i glutaminy do 5-fosfo-P-D-rybozyloaminy (III) obejmuje wy rugowanie pirofosforanu przez azot amidowy glutaminy z inwersją konfiguracji przy C-l. Kształtuje to wiązanie P-N-glikozydowe koń cowego nukleotydu. Kondensacja glicyny ze związkiem (III) daje glicynoamidorybozylo-S-fosforan (IV) I wnosi 3 atomy, które ostatecznie staną się atomami C-4, C-5 i N-7 puryny. Przeniesienie na związek (4) grupy formylowej z N5,NIO-metenylotetrahydrofolianu (N5N10-metenylo-THF) tworzy formyloglicynoamidorybozylo-5-fosforan (V) i dodaje C-8 do przyszłej zasady purynowej. Dodanie do związku (V) grupy amido wej pochodzącej z glutaminy daje formyloglicynoamidorybozyJo-5-fosforan (VI) i wnosi atom N, który stanie się N-3 w pierścieniu purynowym. Eliminacja cząsteczki wody, której towa rzyszy zamknięcie pierścienia imidazolowego. w y t wa rza ami no i mi da zo lory boŜy lo-5-fosforan (VII). Początkową reakcją, która wymaga ATP, jest przeniesienie grupy fosforanowej z ATP do oksogrupy związku (VI). Atak nukleofilowy przez przyległy azot grupy aminowej przemiesz cza P., czemu towarzyszy zamknięcie pierścienia imidazolowego. Dodanie do związku (VII) CO2, reakcja, która nie potrzebuje ani ATP, ani biotyny, daje a m i noimidazo lok a rbo k sy lo-ry boŜy lo-5-fosfora n (VIII). Dodany węgiel stanie się atomem C-6 puryny. Reakcja 8 i 9 przypomina przekształ cenie orni ty ny w argininę w cyklu moczniko wym (ryc. 31-13). Kondensacja asparaginianu ze związkiem (VIII) tworzy aminuimidazolobursztynylokarboksyamidorybozylo-S-fosforan (IX) i wprowadza N-l do pierścienia purynowe go. Grupa bursztynowa w związku (IX) od dziela się jako fumaran, dając aminoimidazolokarboksyamidorybozylo-5-fosforan(X).

) —O-CHj ATP AMP SYNTETATAZA PRPP

NH,

OH OH a-O) —O —CH, Glutamina Rybozo-5-f DS1CP ran

4

NH N",NM-MetenyloH lolian H tallan

©-O-CHj Glutamin tan

(I) AMIDOTRANSFERAZA GLLTTAMYLO-PRPP

FOHMYLOTRANSFERAZA OH OH

OH OH PRPP

5-F osf o-0-D-rybozyioa mina

(II)

(III)

Gllcynoamldorybozylo-5-feaforan ()V)

H

-ooc

L ^ C ^^ R-5Fomiylogłlcynaiiildorybozylo-5-fosłoran (V) Glutamina ATP Asparaglnlan

I CH2

Glutamin i an -

-ooc coo-

-ooc

I CH

CO,

H3O

Fumaran HC

f

I -OOC

~

®

ooc

R-5-®

+

ATP, Mg= Zamknięcie pierścienia

H,O

i m idazo I □ bu rszty ny to karb □ ksyamldorybozyio-5-fosto ra n (IX) LtAZA ADENYLDBURSZTYNWNOWA O N'°-Formylt>-H,folian H 4foltan

II

Amlno im id azo lo kar bo ksy lanorybozy to-5-fosf o ran (VIII)

Cl| FORMYLOTRANSFERAśA]

II

CH

H

( X I )

HN

N

Formyloolteynamldynorybozylo-5-fostoran (VI)

Aminoimidazo lory boŜy io-5-fosioran (VII) O

II

H,0 HN' Zamkniecie pierścienia

1

II

CH

Inozynomonotostoran (IUP) (XII)

Amlnoimidazoto kafbo -ksyam i a ory bozylo-5-f o s f a ran

R-5-® Amidolmldazolokarbo ksyam i d o ryb ozylo -5-f osf □ r a r.

Ryc. 36-3. Szlak de novo biosyntezy puryn z 5-łosłory-boŜy i ATP. (Objaśnienie patrz w tekście). ®— PO^" lub

METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH / 429

Formylowanie związku (X) przez N10-formylo-THF daje amidoimidazolokarnoksyamidorybozylo-5-fosforan (XI). Nowy węgiel bę dzie stanowi! C-2 w szkielecie puryny. Zamknięcie pierścienia związku (XI) daje pierwszy nukleotyd purynowy, kwas inozynowy (XII) (monofosforan inozyny, czyli IMP). Wielofunkcjonalne polipeptydy powstałe przez fuzje genów katalizują liczne reakcje w biosyntezie nukleotydów purynowych U prokariontów kaŜda reakcja pokazana na ryc. 36-3 jest katalizowana przez róŜny polipeptyd. JednakŜe u eukariontów fuzja genów data w wyniku ewolucji pojedyncze polipeptydy z licznymi funkcjami katalitycznymi. Taka ewolucja niesie 2 główne korzyści. Pierwsza dotyczy skatalizowania metabolitów. Bliskość miejsc katalitycznych sąsiadujących aktywności zapewnia fizyczną bliskość danego produktu do miejsca aktywności katalitycznej, dla którego jest on substratem. Druga korzyść wynika z tego, Ŝe fuzja genów zapewnia wytwarzanie jednakowych iiości róŜnych aktywności katalitycz-

ooc-c-c-cooH, I

GTP, Mg2

nych. Na rycinie 36-3 przedstawiono, jak 3 wielofunkcjonalne polipeptydy u eukariontów katalizują więcej niŜ ] reakcję. Są to syntaza 5' fosfory boŜy loami noimidazolo wa (kata lizuje reakcję 3,4 i 6), syntaza 5'-fosfory boŜy loaminoimid azolo bursztyny lok ar boksy a mi do wa (k a t a J i Ŝuje reakcję 7 i 8) i syntaza IMP (katalizuje reakcję 10 i 11). Leki, które interferują z metabolizmem tetrahydrofolianu (THF) mogą blokować biosyntezę nukleotydu pury nowego Dwa atomy węgla, włączone podczas reakcji 4 i 10, które stają się atomami 8 i 2 pierścienia purynowego, pochodzą z N5,N10-metenylo-THF i NJ0-formylo-THF. N5,N'°-metenylo-THF jest tworzony przez utlenienie NS,N10-metyleno-THF. JednakŜe raz zsyntetyzowany N 5 ,N 10 -metenylo-THF jest zaangaŜowany w syntezę puryn albo bezpośrednio, albo po przekształceniu do N10-formylo-THF. Zahamowanie syntezy tych związków tetrahydrofolianowych moŜe zatem hamować syntezę puryn de novo.

-ooc-c-c-cooH H "OOCC = C —COO"

H2O

J_

R-5-®

LIAZA ADENYLOBUHSZTYNIANOWA

SYNTETAZA ADENYLOBURSZTYNWNOWA

Inozynomon otfosforan (IMP]

Ad Adenyloburs2t>nian (AMPs}

NAD*

-N

i

Ksantozy no mo nofoaforan (XMP)

R-S-(£> Guanozynomonotosforan (GMP)

Ryc. 36-4. Przekształcenie IMP w AMP i GMP.

e n ozyno mo notorforan (AMP)

430 / ROZDZIAŁ 36

Utlenianie i aminacja IMP daje AMP iGMP Na rycinie 36-4 są naszkicowane reakcje i związki pośrednie, przez które IMP jest zamieniane do AMP i GMP; cyfry arabskie odnoszą się do tych reakcji. Dodanie asparaginianu do IMP daje adenylobursztynian. Reakcja ta, katalizowana przez syntetazę adenylobursztynianową, z grub sza przypomina reakcje 8, ale wymaga ona swoiście GTP; wymóg ten stwarza potencjalne miejsce do regulacji syntezy nukleotydu adeniny (p. niŜej). Odłączenie fumaranu daje adenozyno-5'monofosforan (AMP). Reakcja ta jest katali zowana przez liazę adenylobursztynianową, ten sam enzym, który katalizuje reakcję 9. Utlenienie IMP przez NAD+, katalizo wane przez dehydrogenaze IMP, daje ksantozynomonofosforan (XMP). Wprowadzenie grupy aminowej, po chodzącej z grupy amidowej glutaminy, biegnie analogicznie do reakcji 5. Niektóre analogi glutaminy hamują biogenezę nukleotydu purynowego Liczne anty metabolity, będące analogami glutaminy, są efektywnymi inhibitorami biosyntezy nukleotydu purynowego. Azaseryna (Odiazoacetylo-L-seryna) jest antagonistą glutaminy, szczególnie w reakcji 5. Diazonorleucyna [(6-diazo-5-okso)-L-norleucyna] blokuje reakcje 2, a 6-merkaptopuryna, oprócz innych działań, hamuje reakcje I 3 i l4.Kwasmikofenolowy swoiście hamuje reakcje 14. Przekształcenie AMP i GMP do ich dii trifosforanów zachodzi stopniowo Przekształcenie AMP i GMP do odpowiednich im di- i trifosforanów nukleozydów zachodzi w 2 etapach {ryc. 36-5). Sukcesywne przeniesienie grup fosforowych z ATP jest katalizowane odpowiednio przez kinazę nukleozydomonofosforanową i kina/ę nukleozydod ifosforano wą. Enzym, który fosforyluje adenylan, jest takŜe nazywany miokinazą.

Monofoeioran

ATP ADP ATP ADP V ^^ Dlfosforari V ^» Trifosforan

Ryc. 36-5. Przekształcenie monofosforanu nukleozydu do di- i trifosforanu

PURYNY I ICH NUKLEOZYDY MOGĄ BYĆ PRZEMIENIANE BEZPOŚREDNIO DO MONONUKLEOTYDOW PRZEZ REAKCJE TYPU „SALVAGE" Przekształcenie wolnych puryn i nukleozydów purynowych wprost w mononukleotydy przez reakcję typu ,.salvage" (reakcja rezerwowa) wymaga znacznie mniej energii niŜ synteza nukleotydów de novo. Ilościowo waŜniejszym mechanizmem jest fosfory boŜy lacj a wolnej puryny (Pu) przez PRPP, dająca 5'-mononukleotyd (Pu-RP). Pu + PP-RP -. PP, + Pu-RP

Fosforybozylację zasady purynowej katalizują 2 enzymy zaleŜne od PRPP: fosforybozylotransferaza adeninowa, która zamienia adeninę w AMP (ryc. 36-6), i fosforybozylotransferaza hipoksantynowo-guaninowa, która katalizuje dodanie PRPP do hipoksantyny lub guaniny, w wyniku czego powstaje IMP lub GMP (ryc. 36-7).

r*

PRPP

C rys v

P

J

H FOSFORYBOZYLOTRANSFERAZA ADENINOWA

AMP Ryc. 36-6. Fosfory boŜy I a ej a adeniny jest katalizowana przez fosforybozylotransferazę adeninową.

Drugi mechanizm typu „salvage" obejmuje bezpośrednią fosforylację rybonukleozydu purynowego (PuR) przez ATP PuR + ATP -* ADP + PuR-P

Kinaza adenozynowa katalizuje fosforylację adenozyny i deoksyadenozyny do AMP lub dAMP, podczas gdy kinaza deoksycytydynowa

METABOLIZM NUKLEOTYDOW PURYNOWYCH 1 PIRYMIDYNOWYCH / 431

PflPP

Dostępność PRPP jest głównym determinantom nasilenia biosyntezy nukleotydów purynowych Synteza de novo IMP zuŜywa 6 mol równowaŜników ATP + glicynę, glutaminę, metenylo-THF i asparaginian. Aby uzyskać wydajne zuŜytkowanie zasobów, jest zatem konieczne, aby komórki regulowały de novo biosyntezę

PP

N

■CV

'O-jP-OCH

Hipoksantyna FOSFORYBOZYLOTHANSFERAZA HIPOKSANTTNOWO-GUANINOWA

HO HO IMP

puryn. Głównym detcrminantcm nasilenia syntezy de novo nukleozydów purynowych jest stęŜe-

nie PRPP. To stęŜenie z kolei jest determinowane przez względną szybkość syntezy PRPP, jego zuŜytkowanie i degradację. Stopień syntezy PRPP zaleŜy zarówno od dostępności rybozo-5-fosforanu, jak i od aktywności syntetazy PRPP. Aktywność syntetazy PRPP jest wraŜliwa na stęŜenie fosforanu i rybonukleotydów purynowych, które działają jako regulatory allosteryczne (ryc. 36-8). ZuŜytkowanie PRPP Rybozo-5-f osfo ran

0

GMP

Hyc. 36-7. Fos fory boŜy la c;a hipoksantyny t guaniny prowadzi do utworzenia odpowiednio IMP i GMP. Obie reakcje są katalizowane przez fosfory boŜy I otrą nsfe raŜę tiipoksantynowo-guaninową.'

PRPP

5-Fosforybazyloaml na

fosforyluje deoksycytydynę, de o ksy adenozynę i 2'-deoksyguanoŜynę odpowiednio do dCMP, dAMP i dGMP. BIOSYNTEZA WĄTROBOWYCH NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH JEST DOKŁADNIE REGULOWANA

IMP

ADP GDP

Wątroba ssaków, główne miejsce syntezy de noro nukleotydów purynowych, dostarcza zasad purynowych i ich nukleozydów, które tworzą rezerwę do zuŜytkowania w tkankach niezdolnych do ich syntezy de novo. Na przykład w tkance mózgowej jest małe stęŜenie amidotransfera2y PRPP, a tkanka mózgowa człowieka przynajmniej częściowo zaleŜy od egzogennych puryn. Erytrocyty i granulocyty obojetnochłonne nie mogą syntetyzować 5-fosforybozyloaminy i dlatego muszą korzystać z egzogennych puryn do syntezy nukleotydów purynowych. Jednak krąŜące limfocyty mają pewną zdolność do syntezy puryn cle novo.

AMP ATP GTP

Ryc. 36-8. Kontrola nasilenia syntezy de novo nukleotydów purynowych. Linie ciągłe przedstawiają ciąg reakcji chemicznych, a linie przerywane ilustrują zahamowanie (Q) przez sprzęŜenie zwrotne przez końcowe produkty szlaku. Reakcje ® i © są katalizowane odpowiednio przez syntetazę PRPP i amid otrą nsierazę glutamino-PRPP.

432 / ROZDZIAŁ 36

odzwierciedla głównie aktywność reakcji rezerwowych (typu „salvage") dia hipoksantyny i guaniny, a tylko wtórnie stopień syntezy puryn de noro. Ten wniosek wynika z obserwacji, Ŝe stęŜenie PRPP w erytrocytach i fibroblastach w hodowlach pochodzących od męŜczyzn z wrodzonym niedoborem fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej było wielokrotnie zwiększone. AMP i GMP regulują przez sprzęŜenie zwrotne amidotransferazę glutamylo-PRPP Amidotransferaza glutamylo-PRPF (reakcja 2, ryc. 36-3), pierwszy enzym wyłącznie zaangaŜowany w syntezie puryn de navo, jest wraŜliwa na zwrotne zahamowanie przez nukleotydy purynowe, szczególnie AMP i GMP, które hamują, współzawodnicząc z PRPP (ryc. 36-8). Jednak regulacja syntezy puryn de novo przez amidotransferazę ma prawdopodobnie mniejsze znaczenie fizjologiczne niŜ regulacja syntetazy PRPP. SprzęŜenie zwrotne AMP i GMP reguluje ich syntezę z IMP Dwa mechanizmy regulują przekształcanie IMP do GMP i AMP (ryc, 36-9). AMP przez sprzęŜenie zwrotne reguluje syntetaze adenylobursztynianową, a GMP przez sprzęŜenie zwrotne hamuje dehydrogenazę IMP. Co więcej, prze-

kształcenie IMP w adenylobursztynian na drodze do syntezy AMP wymaga GMP, a przekształcenie ksantynianu (XMP) w GMP wymaga ATP. Wzajemna regulacja między przemianami w metabolizmie IMP słuŜy więc osłabieniu syntezy jednego nukleotydu purynowego wówczas, gdy zachodzi niedobór drugiego nukleotydu. Fosfory boŜy łotra n sferaza h ipo k sa ntyn owo -guaninowa, która przemienia hipoksantynę i guaninę odpowiednio do IMP i GMP (ryc. 36-7), jest takŜe hamowana przez te same nukleotydy. REDUKCJA NDP DAJE dNDP Redukcja deoksyrybonukleotynów puryn i pirymidyn przy węglu 2'rybozy odpowiedniego difosforanu rybonukleotydu (NDP) jest katalizowana przez kompleks reduktazy rybonukleotydowej (ryc. 36-10). System ten działa jedynie w komórkach, które aktywnie syntetyzują DNA przed podziałem komórek. Redukcja wymaga tioredoksyny (białkowy kofaktor), reduktazy tioredok synowej (flawoprotema) i NADPH. U niektórych bakterii, ale nie u ssaków, reakcja ta wymaga takŜe kobalaminy (witaminy B12). Zredukowana tioredoksyna, uzyskana z utlenionej tioredoksyny w reakcji katalizowanej przez NADPH: reduktaza tioredoksynowa, jest bezpośrednim czynnikiem redukującym NDP (ryc. 36-10).

REDUKTAZA HYBO NUKLEOTYOOWA □ifoaforan rybonukieozydu 0 (fosforan 2 -deoksyrybonukleozydu

Tioredoksyna Tloredoksyna u Kanion a zredukowana

IMPRyc. 36-9. Regulacja przemiany IMP do nukleotydów adenozyny i guanozyny. Linie ciągłe przedstawiają ciąg reakcji che/nicznych. a linie przerywane regulację zarówno przez dodatnie (©), jak i ujemne (0) sprzęŜenie zwrotne.

NADP

NADPH + H+

Ryc. 36-10. Redukcja difosforanów rybonukleozydudodifosforanów2'-deoksyrybonukleozydów.

METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH / 433 CDP

-*■

-** 2'dCDP-

3(=)R

ATP Kwas moczowy !*, tO] + H2O ^

-»-—».-

UDP-

LJHYKA2A

CO. fi

b GDP-

*>2'dGD

H

H

Alantoina

ADP

Ryc. 36-11. Regulacja redukcji purynowych i pirym i d y n o w y c h ry b o n u k l e o t y d ó w d o o d p o w i e d n i c h 2'-cieoksyrybonukleotydów. Linie ciągle przedstawiają ciąg reakcji chemicznych, a linie przerywane ujemne (Q) lub dodatnie (©) sprzęŜenie zwrotne.

Redukcja difosforaaów rybonukleozydów (NDP) do difosforanów deoksyrybonukieozydów podlega złoŜonej regulacji (ryc. 36-11), w wyniku której uzyskuje sie zrównowaŜone wytwarzanie deoksyrybonukleotydów dla syntezy DNA.

ORGANIZM LUDZKI KATALIZUJE PURYNY DO KWASU MOCZOWEGO Podczas gdy niŜsze naczelne i inne ssaki katabolizują kwas moczowy, przez hydrolizę katalizowaną urykazą, dalej do końcowego rozpuszczalnego w wodzie produktu alantoiny (ryc. 36-12), końcowym produktem katabolizmu puryn w organizmie ludzkim jest kwas moc2owy. Gady, ptaki i plaŜy, które podobnie jak człowiek nie mają urykazy, wydalają kwas moczowy i guanine jako produkty końcowe katabolizmu zarówno puryn, jak i białka. Guanina i hipoksantyna tworzą kwas moczowy z ksantyny w reakcji katalizowanej przez guanazę i oksyda/ę ksantynową wątroby, jelita — Biochemia

R y c , 3 6 - 1 2 . P rz e k s z t a ł c e n i e kw a s u m o c z o w e g o w aia mó mę.

cienkiego i nerek (ryc. 35-1). Oksydaza ksantynowa jest potencjalnym miejscem farmakologicznej interwencji u chorych z hiperurykemią i skazą moczanową (por, niŜej).

TWORZENIE WIĄZANIA P-NGLIKOZYDOWEGO WYSTĘPUJE W PÓ2NYCH ETAPACH BIOSYNTEZY NUKLEOTYDÓW PIRYMIDYNOWYCH Synteza de novo nukleozydów pirymidynowych i purynowych obejmuje róŜne wspólne prekursory: PRPP, glutaminę, CO2, asparaginian. a dla nukleotydu tymidyny pochodne tctrahydrotolianu. Uderzająca róŜnica między tymi procesami biosyntezy polega na tym, Ŝe podczas, gdy fosforan rybozy jest integralną częścią najwcześniejszego prekursora w syntezie nukleotydu purynowego (p. ryc. 36-3), przyłączeni? cząsteczki fosforanu rybozy do N-3 zasady pi rym idy nowej zachodzi w późnej fazie biosyntezy (ryc. 36-13). Cyfry arabskie w akapitach poniŜej odpowiadają numerom reakcji na ryc. 36-13. (1) Synteza pierścienia pirymidynowego zaczyna się od utworzenia karbamoilofosforanu z glutaminy, ATP, CO2 w reakcji katalizowanej przez cytoplazmatyczną syntaze karbamoilofosfuranową. Przeciwnie, syntaza karbamoilowa, biorąca udział w syntezie mocznika, jest en-

434 / ROZDZIA Ł 36

CO; + Glutamina + ATP SYNTETAZA KARBAMOILOFOSFORANOWA

°

-n-c

4

T "a" Karbamoilofosforan (CAP)

KARBAMOILOTHANSFERAZA ASPARAGINIANOWA

DIHYDROOROTAZA

o-c.

H H COO"

T

H Kwas karbamoiloasparaginowy (CAA)

Kwas asparaginowv

COO" Kwaa dlhydroorotowy (DHOH) +

NAD DEHYDROGENAZA DIHYDROOROTANOWA ł

NADH + H -

PRPP

CO,

DEKARBOKSYU\ZA OROTYDYNO-5-FOSFOHANOWA

FOSFOHYBOZYLOTRANSFERAZA OROTANOWA OMP

UDP(Dlfosforan REDUKTAZA HYBONUKLEOTYDOWA

UTP

dUMP i

ATP

1

^- N ,N °-Metyleno Glutamina

SYNTETAZA TYMIDYLłNOWA

H,follan H,tollan

Ryc. 36-13. Szlak biosyntezy nukleotydów pirymidynowych.

COO'

Kwas orotowy (OA)

METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH / 435

zymem mitochondrialnym. Ta kompartmentacja zabezpiecza niezaleŜną dostawę fosforanu karbamoilu dla tych procesów. Kondensacja karbamoilofosforanu z asparaginianem tworzy karbamoiloasparaginian w reakcji katalizowanej przez karbamoilotransferazę asparaginianową. Zamkniecie pierścienia przez utratę wo dy, katalizowane przez dihydroorotazę, prowa dzi do utworzenia kwasu dihydroorotowego. Odjęcie wodorów od atomów węgla 5 i 6 przez NAD + wprowadza wiązanie podwój ne, tworząc kwas octowy. Ta reakcja jest katali zowana przez mitochondrialny enzym dehydrogenazę dihydruorotanową Wszystkie inne en zymy biorące udział w syntezie de novo pirymidyn są enzymami cytoplazmatycznymi. Dodanie cząsteczki rybozofosfo ran owej z PRPP tworzy wiązanie p-N-glikozydowe z po wstaniem orotydynomonufosforanu (OMP). Re akcję tę, analogiczną do reakcji lrans-rybozylacji na ryc. 36-7, katalizuje fosforybozylotransferaza orotanowa. Podczas dekarboksylacji orotanu po wstaje lirydynomonofosforan (UMP) — pierw szy rzeczywisty rybonukleotyd pirymidynowy. (7 i 8) Po przeniesieniu reszty fosforanowej z ATP tworzy się UDP i UTP w reakcjach analogicznych do reakcji fosforylacji monofosfbranów nukleozydów purynowych (ryc. 36-5). (9) UTP jest aminowany do CTP przy udziale glutaminy i ATP. Redukcja difosforanów rybonukleotydów (NDP) do odpowiednich dNTP zachodzi w reakcjach analogicznych do reakcji dla nukleotydów purynowych (p. ryc. 36-10 i 36-11). dUMP moŜe przyjąć resztę fosforano wą z ATP, tworząc dUTP (nie pokazano). Alternatywnie, poniewaŜ dUMP jest substratem dla dTMP, dUDP jest defosforylowany do dUMP. Metylacja dUMP przy C-5 przez N10-metyleno-TNF, katalizowana przez syntetazę tymidylanową, powoduje utworzenie tjmidylanu (tymidynomonofosforan, dTMP). Przeciwnowotworowy lek metotreksat blokuje redukcję dihydrofolianu

. Reakcja 12 na ryc. 36-13 jest jedyną reakcją w biosyntezie nukleotydu pirymidyny, która wymaga pochodnej tetrahydrofolianu. Podczas procesu przeniesienia reszta metylenowa N5, NIO-metyJeno-THF jest redukowana do reszty

metylowej, a nośnik tetrahydrofolianowy jest utleniany do dihydrofoUanu. Aby zaszła dalsza synteza, dihydrofolian musi być zredukowany do tetrahydrofolianu w reakcji katalizowanej przez reduktazę dihydrofolianową. W związku z tym komórki dzielące się, które muszą wytwarzać TMP i dihydrofolian, są szczególnie wraŜliwe na inhibitory reduktazy dihydrofolianowej. Jednym z takich inhibitorów jest metotreksat (ametopteryna) szeroko stosowany lek przeciwnowotworowy.

RYBO-IDEOKSYRYBONUKLEOTYDY URACYLU I CYTOZYNY SĄ SUBSTRATAMI W REAKCJI REZERWOWEJ PIRYMIDYNY Podczas gdy komórki ssaków nie maja efektywnej drogi do zachowania rezerw wolnych zasad pirymidynowych, reakcje rezerwowe przemieniają rybonukleozydy pirymidynowe, urydynę i cytydynę, oraz deok syry bonu kle ozydy, tymidynę i deok sycy ty dynę, w odpowiednie nukleotydy(ryc. 36-14). 2'-Deoksycytydynajest fosforylowana przez kinazę deoksycytydynową, enzym, który takŜe fosforyluje deoksyguanozy-

ATP ADP

Urydyna-

-••U MP KINAZA UHYDYNOWOCYTYDYMOWA

Cytydyna Tym idy na

-diMp

ATP

AD?

KINAZATYMIDYNOWA I ATP ADP

DeoksycylyOyna.

-dCMP

|KINAZA DEOKSYCYTYDYNOWĄ] Ryc. 36-14. Reakcje kinaz nukleozydów pirymidynowych odpowiedzialne za tworzenie monofosforanów nukleozydów pirymidynowych.

436 / ROZDZIAŁ 36

nę i deoksy adenozynę. Fosfory boŜy łotra nsferaza orotanowa (reakcja 5, ryc. 36-13), enzym biorący udział w syntezie de novo nukleotydów pirymidyny, moŜe syntetyzować OMP z kwasu orotowego.

ANALOGI PIRYMIDYNY SĄSUBSTRATAMI DLA NIEKTÓRYCH ENZYMÓW SYNTEZY NUKLEOTYDU Pl RYM I DYMOWEGO Podczas gdy fosforybozylotransferaza orotonianowa nie moŜe uŜywać normalnych zasad pirymidynowych jako substratów, katalizuje ona jednak przekształcenie allopurynolu (4-hydroksypirazolopiramidyna) do nukleotydu, w którym rybo zofosfo ran jest dołączony do N-l pierścienia pirymidy nowego allopurynolu. TakŜe lek przeciwnowotworowy 5-fIuorouracyl jest fosfory boŜy Iow any przez fosfory boŜy łotr ansferazę orotanowa.

KATABOLIZM PłRYMIDYN WYTWARZA PRODUKTY ROZPUSZCZALNE W WODZIE K atabolizm pirymidyn. który zachodzi głównie w wątrobie, prowadzi do wytworzenia łatwo rozpuszczalnych produktów końcowych (ryc. 36-15). Kontrastuje to z katabolizmem puryn, w wyniku którego powstaje bardzo słabo rozpuszczalny kwas moczowy i moczan sodu. Uwolnienie CO2 (wydalonego przez oddychanie) z węgla (C2) rdzenia pirymidyny Teprezentuje główny szlak dla katabolizmu uracylu, cytozyny i tyminy. P-Alanina j p-aminoizomaślan są końcowymi produktami katabolizmu cytozyny, uracylu i tyminy. Wydalanie (3-aminoizomaślanu zwiększa się w białaczce i po ekspozycji promieniami X z powodu zwiększonego niszczenia komórek i ich DNA. Nieprawidłowe duŜe wydalanie p-aminoizomaślanu, spowodowane recesywną ekspresją genu, zachodzi u hetcrozygotycznego potomstwa (heterozygot), skądinąd zdrowych osobników. Około 25% badanych osób, z pochodzenia Chińczyków i Japończyków, stale wydala duŜe ilości P-aminoizomasianu. ChociaŜ wiemy mało, jak organizm ludzki degraduje p-aminoizomaślan, nerka śwjni metabolizuje go przez transaminację do semialdehydu metylomalonianu. Po utlenieniu do propionianu ten

semialdehyd tworzy sukcynylo-CoA (p. ryc. 21-2).

Pseudourydyna jest wydalana w stanie nie zmienionym PoniewaŜ Ŝaden z enzymów u ludzi nie katalizuje hydrolizy lub fosforolizy pseudourydyny, ten niezwykły nukleotyd, który po raz pierwszy wykryto w moczu ludzi, u osób zdrowych jest wydalany z moczem w stanie nie zmienionym.

BIOSYNTEZA NUKLEOTYDÓW PIRYMIDYNOWYCH JEST REGULOWANA ZARÓWNO NA POZIOMIE EKSPRESJI GENU, JAK I AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ Dwa pierwsze enzymy biorące udział w biosyntezie nukleotydów pirymidy nowych są wraŜliwe na regulację allosteryczną. Co do regulacji przez ekspresję genu, 3 pierwsze i 2 ostatnie enzymy są regulowane przez skoordynowaną represję i derepresję. Syntetaza karhamoilofosforano w a jest hamowana przez UTP C nukleotydy purynowe, a aktywowana przez PRPP (ryc. 36-16). Karbamoilotransferaza asparagiiiianowa jest bardzo wraŜliwa na hamujące działanie CTP. Właściwości allosteryczne karbamoilotransferazy asparaginianowej u prokariontów stanowią klasyczny obiekt badań allosterii.

ZRÓWNOWAśONE WYTWARZANIE PREKURSORÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH WYMAGA SKOORDYNOWANEJ KONTROLI BIOSYNTEZY NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH Biosynteza pirymidyny i biosynteza puryn biegnie równolegle, jeśli weźmie się pod uwagę stosunki molowe; sugeruje to skoordynowaną kontrole obu tych procesów, Syntetaza PRPP (reakcja 1, ryc. 36-3), enzym, który katalizuje reakcję wytwarzania podstawowego prekursora obu procesów, podlega zahamowaniu przez sprzęŜenie zwrotne zarówno przez nukleotydy purynowe, jak i pirymidy no we oraz aktywacji przez PRPP. Są więc liczne miejsca, w których zachodzi krzyŜowa regulacja między syntezą nukleotydów purynowych i pirymidyn owych.

METABOLIZM NUKLEOTYDOW PURYNOWYCH I PtRYMIDYNOWYCH I 437

Tymlna

-~. +

NADPH + H

Di hyd roty mina Dihydrouracyl

COO' 0-llretdopropionian N-k a r ba m o ilo-^-al a n I n a H5N i

J O'

^Alanina

H,Nł - CH, - CH2 - COO" ^

H HZO

/

^-Ureidolzomaślan (N- Garbarń o Ho-0-am ino Izomaślan)

H3N+ -CH;,-CH— COO CH3 ^-Aminoizomaślan

Ryc. 36-15. Rozkład pirymidyn.

SKAZA MOCZANOWA JEST ZABURZENIEM KATABOLiZMU PURYNOWEGO Tak jak dla. kaŜdego słabego kwasu względne proporcje niezdysocjowanego kwasu (kwas moczowy) i jego sprzęŜonej zasady (moczan sodu) zaleŜą od pH. W fizjologicznych wartościach pH musimy rozwaŜyć jedynie dysocjację pierw-

szego protonu z kwasu moczowego (pK = 5,75) poniewaŜ drugi proton (pK=]0,3) dysocjuje przy wartościach pH znacznie wyŜszych od pH jakiegokolwiek płynu ustrojowego. W płynach ustrojowych występuje więc kwas moczowy i jego sól monosodowa. W hiperurykemii stęŜenie moczanu sodu w surowicy przewyŜsza granice rozpuszczalności. Kryształy moczanu sodu mogą się zatem tworzyć w tkankach miękkich

438 / ROZDZIAŁ 36 NuKleotycfy purynowe-------„

natomiast kwas moczowy występuje w płynie kanalikowym kanalików nerkowych znajdujących się za odcinkiem kanalików zakwaszających mocz. Powstawanie kamieni złoŜonych z kwasu moczowego moŜna więc zahamować przez alkalizację moczu.

PRPP ------

,

ATP + Rybozo-5-toaforan Asparaginian

©

O

ATP + COj + Glutamina

UDP

TDP "TMP-

dUDP

Ryc. 36-16. Kontrola syntezy nukleotydu pirymidynowego. Linie ciągłe ilustrują ciąg reakcji chemicznej. Linie przerywane pokazują pozytywną (©) i negatywną (©) regulację przez sprzęŜenie zwrotne. • —CTP

i stawach w postaci depozytów, określanych jak~o "guzki dnawe. Proces ten wywołuje ostrą reakcję zapalną, ostre (moczanowe) zapalenie stawów, które moŜe przejść w przewlekłe (moczanowe) zapalenie stawów.

Podczas gdy mocz o pH 5 moŜe być wysycony moczanami do stęŜenia 892 umol/1 ( =1 5 mg/dl), w moczu o pH 7 rozpuszcza się 8922-11896 umol/I (=150—200 mg/dl) moczanów. W moczu prawidłowym, o pH najczęściej niŜszym od 5,75, przewaŜa kwas moczowy. W odcinkach kanalików nerkowych proksymalnie połoŜonych w stosunku do kanalika dystalnego i zbiorczego (gdzie głównie zachodzi zakwaszenie moczu) w moczu występuje moczan sodu,

Metody izotopowe pozwalają zmierzyć ogólnoustrojowa, pulę moczanów Po doŜylnym podaniu (1!N)-kwasu moczowego osobom zdrowym i chorym na skazę moczanową, stopień rozcieńczenia izotopu uŜywa się do wyliczenia ogól noust rojowej wymienialnej puli moczanów. Pula ta u zdrowych męŜczyzn wynosi 7,08 mmol (=1200 mg), a u zdrowych dorosłych kobiet 3,54 mmol ( = 600 mg), natomiast u chorych ze skazą moczanową bez guzków dnawych 11,8—23,6 mmol ( = 2000-^000 mg), a nawet 182,9 mmol ( = 31 000 mg) u chorych z cięŜką skazą moczanową z guzkami dnawymi. Moczan sodu jest aktywnie reabsorbowany i częściowo wydzielany w kanaliku proksymalnym. W pętli nefronu zachodzi dalsze wydzielane moczanów do światła nefronu, natomiast w kanaliku krętym dystalnym zachodzi ponowne, chociaŜ tylko częściowe, jego wchłanianie zwrotne. Wydalanie netto kwasu moczowego z moczem u zdrowego człowieka wynosi 2,36— —3,54 mmoł/24 h (= 400—600 mg/24 h). Wiele związków farmakologicznych i naturalnie występujących wpływa na wchłanianie nerkowe i wydalanie moczanu sodu. Na przykład kwas acetylosalicylowy w duŜych dawkach hamuje kompetycyjnie zarówno wydzielanie moczanów przez kanaliki nerkowe, jak i jego wchłanianie zwrotne.

Kryształy moczanowe mają znaczenie diagnostyczne w skazie moczanowej W skazie moczanowej znaczenie diagnostyczne ma uwidocznienie w granulocytach obojętnochłonnych w płynie stawowym, w świetle spolaryzowanym i w mikroskopie świetlnym, iglastych, intensywnie świecących podwójnie załamujących światło kryształów moczanu sodu. Kryształy mają barwę Ŝółtą, gdy ich długa oś jest równoległa, lub niebieską, gdy oś jest prostopadła do płaszczyzny światła spolaryzowanego.

_______________ METABOLIZM NUKLEOTYD&W PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH / 439 Tabela 36-1. Dziedziczne zaburzenia metabolizmu purynowego i towarzyszące im nieprawidłowości enzymatyczne Zaburzenie kliniczne

Uszkodzony enzym

Dna Syntetaza PRPP

Charakter uszkodzenia

Typ dziedziczności

Mad aktywność (zwię- Nadmierne wytwarzanie i nadmier- SprzęŜony z chromone wydalanie pufyn kszenie Vmaks.) somem X recesywny

Syntetaza PRPP

Oporność na zaha- Nadmierne wytwarzanie i nadmier- SprzęŜony z chromomowanie w reakcji ne wydalanie puryn somem X recesywny sprzęŜenia zwrotnego

Syntetaza PRPP

Mała Km dla rybozo- Nadmierne wytwarzanie i nadmier- Prawdopodobnie sprzęne wydalanie puryn Ŝony z chromosomem ■5-fosforanu X recesywny

Dna

Dna

Dna

Częściowy niedobór

Nadmierne wytwarzanie i nadmier- SprzęŜony z chromone wydalanie puryn somem X tecesywny

Zupełny niedobór

Nadmierne wytwarzanie i nadmier- SprzęŜony z chromone wydalanie puryn; poraŜenie mó- somem X recesywny ŜdŜkowe i samookaleczenia

HGPRTaza* Zespół Lescha-Ny-

hana

Charaktery styka zaburzenia klinicznego

HGPRTaza

Niedobór immuCięŜki niedobór nologiczny Deaminaza adenozynowa

Niedobór immunologiczny zfozony Autosomalny recesy(komórki T i B), deoksyadenozy- wny nuria

CięŜki niedobór Niedobór immunologiczny Fosforylaza nukieozydowa puryn

Niedobór komórek T, inozynuria, Autosomalny recesydeoksyinozynuria, guanoiynuria, wny deoksygua noŜyn uria, hipourykemia

Kamica~nerkowa

Zupełny niedobór

Kamica nerkowa 2,8-dihydroksyadeninowa

Zupełny niedobór

Kamica nerkowa ksantynowa, hi- Autosomalny recesypourykemia wny

Ksantynuria

Fosforybozylotransferaza adeninowa Oksydaza ksantynowa

Autosomalny recesywny

* HGPRTaza = ło sf o ry boŜy I otrą n sferaza hipoksantynowo-guaninowa.

ZABURZENIA W METABOLIZMIE PURYN OBEJMUJĄ CHOROBY PRZEBIEGAJĄCE Z HIPERURYKEMIĄ LUB HIPOURYKEMIĄ

Tabela 36-2. Klasyfikacja chorych z hipemrykemią

Zaburzenia w metabolizmie puryn (tab. 36-1) obejmują choroby przebiegające z hiperurykemią lub hipourj kemią oraz choroby charakteryzujące się niedoborem immunologicznym. Hiperurykemie mogą być dalej klasyfikowane na podstawie wydalania z moczem prawidłowych lub nadmiernych (ponad 3,54 mmol/ 24 h = 600 mg/24 h) ilości moczanów (tab. 36-2). Niektóre zaburzenia są spowodowane swoistymi niedoborami enzymatycznymi. W innych hiperurykemia jest zjawiskiem wtórnym, np.

II. Nadmierne wydalanie moczanów z powodu nadmiernego wytwarzania A Wtórna zmiana towarzysząca innym chorobom, np nowotwory, łuszczyca B Znane niedobory enzymatyczne odpowiedzialne za nadmierne wytwarzanie 1 Nieprawidłowości syntezy PRPP 2. Niedobory fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej 3. Niedobory g!ukozo-6-fosfatazy C. Uszkodzenia nieznane

I. Prawidłowe wydalanie moczanów; upośledzone wydalanie nerkowe odpowiedzialne za zwiększone stęŜenie moczanów w surowicy

440 / ROZDZIAŁ 36

spowodowanym nowotworem lub łuszczycą, charakteryzującymi się wzmoŜonym obrotem tkankowym. Zespół Lescha-Nyhana jest przejawem całkowitego braku fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-gua ni nowej Zespół Lescha-Nyhana jest następstwem braku aktywnej fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-gua ninowej (HGPRTazy), enzymu „rezerwowego1' szlaku syntezy puryn (ryc. 36-7). To zaburzenie recesywne, dziedzicznie sprzęŜone z chromosomem X, charakteryzuje uszkodzenie ośrodkowego układu nerwowego, przebiegające z choreoatetozą i zwiększonym napięciem mięśniowym, znaczną hiperurykemią z nadmiernego wytwarzania, połączoną często z kamicą moczanową i zespoiem samookaleczenia. Mniej szkodliwym mutacjom, w wyniku których powstaje częściowy niedobór HGPRTazy, towarzyszy u męŜczyzn znaczna hiperurykemia, przebiegająca bez wyraźnych objawów klinicznych. Nadmierne wytwarzanie puryn w niedoborze HGPRTazy jest wyrazem oszczędzania PRPP w szlaku rezerwowym syntezy puryn z następującym zwiększeniem wewnątrzkomórkowego stęŜenia PRPP. Chorobę von Gierkego charakteryzuje nadmierne wytwarzanie puryn i hiperurykemia Nadmierne wytwarzanie puryn i hiperurykeO ^ ^ t gluko^ ^ ^ ^ g zo- ó-fosfatazy) są zjawiskami wtórnymi w odnięsjeniudo wzmoŜonego wytwarzania rybozo-5-fcsforanu, prekursora PRPP. Współtowarzysząca kwasica mleczanowa podwyŜsza jedynak nerkowy próg wydalania moczanów, przyczyniając się do gromadzenia moczanów w całym organizmie. Hipourykemie powstają w wyniku nadmiernego wydalania lub zmniejszonego wytwarzania kwasu moczowego Psy daimatyriskie, które niekompletnie reabsorbują kwas moczowy, wydalają moczany i kwas moczowy w nadmiarze w stosunku do ich stęŜenia w surowicy. Podobne wady obserwuje się u ludzi z hipourykemią.

Hipourykemia towarzyszy niedoborowi oksydazy ksanty nowej Hipourykemią i wzmoŜone wydalanie hipoksanfyny i ksantyny jest związane z niedoborem oksydazy ksantynowej, spowodowanym albo wadą genetyczną, albo cięŜkim uszkodzeniem wątroby. W powaŜnym niedoborze oksydazy ksantynowej u chorych "moŜe wystąpić zwiększona ksantynuria i kamica ksantynowa.

Wady genetyczne powodują niedobór deaminazy adenozynowej i fosforylazy nukleozydowej puryn Niedobór deaminazy adenozynowej jest zwią-

zany z cięŜkim złoŜonym niedoborem immunologicznym, chorobą, w której zarówno limfocyty pochodzenia grasiczego (komórki T), jak i pochodzenia szpikowego (komórki B) są nieliczne i wykazują zaburzenia czynności. Niedobór fosforyiazy nukleozydowej puryn jest zwią-

zany z powaŜnym niedoborem limfocytów pochodzenia grasiczego przy prawidłowej czynności komórek B. Oba zaburzenia są autosomalne i recesywne. Zaburzenia immunologiczne wynikają ?e spichrzenia dGTP i dATP, które hamują allosterycznie reduktazę rybonukleotydową i przez to pozbawiają komórki prekursorów DNA, szczególnie dCTP. Niedobór puryn u ludzi występuje rzadko Stany niedoboru purynowego u łudzi są-ograniczone do sytuacji przypisywanych przede wszystkim niedoborom kwasu foliowegoj być moŜe witaminy B12, gdy ta ostatnia powoduje wtórny niedobór pochodnych folianów. NADMIERNE WYTWARZANIE KATABOLITÓW PIRYMIDYNOWYCH JEST RZADKO ZWIĄZANE ZE ZNACZĄCYMI KLINICZNIE NIEPRAWIDŁOWOŚCIAMI Produkty-katabołizmu pirymidyny, odwrotnie niŜ puryny, są rozpuszczalne "wwodzie. Dlatego nawet w przypadku, gdy zachodzi nadmierne wytwarzanie pirymidyny rzadko pojawiają się wykrywalne klinicznie nieprawidłowości (tab. 36-3). W hiperurykemii, której towarzyszy nadmierne wytwarzanie PRPP, zachodzi nadmierne wytwarzanie nukleotydów pirymidynowych i zwiększone wydalanie fi-alaniny. PoniewaŜ do syntezy tymidylanu jest

METABOLIZM NUKLEOTYDOW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH / 441 Tabela 36-3. Wrodzone zaburzenia metabolizmu pirymidyn i towarzyszące im nieprawidłowości enzymatyczne Zaburzenie kliniczne

Uszkodzony enzym

Cechy zaburzeń klinicznych

Typ dziedziczności

Acyduria p-amino- Transami naza izomaślanowa

Autosomalny recesywny

Orotoacyduria typu I

Brak objawów, częste zaburzenie u ludów Wschodu Fosfory bozylotransfera - Kryształy kwasu orotowego w moczu ;a orotowa i dekarbok- i niedokrwistość megaioblastyczna. sylaza o roty dyl a nowa Niedobór immunologiczny Remisja po podaniu doustnym urydyny

Autosomalny ręce sywny

Orotoacyduria typu II

Dekarboksylaza oroty- Orotydynuria i acyduria orotowa, nie- Autosomalny ręcedokrwistość megaioblastyczna Re- sywny dylanowd misja po podaniu doustnym urydyny

Niedobór karbamoi- Karbamoilotransferaza Nietolerancja białek, encefalopatia SprzęŜony z chrowątrobowa i acyduria orotowa o lek- mosomem X recesyiotransferazy ornity- ornitynowa wny kim nasileniu nowej

potrzebny N5,N10-metyleno-THF, zaburzenia w metabolizmie folianów i witaminy B12 powodują niedobory dTMP (w przypadku niedoboru witaminy B, 2 przez mechanizm pośredni). Acyduria P-aminomaślanowa była omówiona poprzednio w związku z katabolizmem pirymidyn. Acyduria orotowa, która towarzyszy zespołowi Reye'», jest prawdopodobnie procesem wtórnym, wynikającym z niezdolności silnie uszkodzonych mitochondriów do zuŜytkowania karbamoilofosforanu, który moŜe wówczas być dostępny do nadmiernego wytwarzania cytozolowego kwasu orotowego.

Niedoborowi enzymu cyklu mocznikowego towarzyszy wzmoŜone wydalanie prekursorów pirymidyny WzmoŜone wydalanie kwasu orotowego, uracylu i urydyny opisano u chorych z niedoborem wątrobowego mitochondriałnego enzymu

Chorzy na orotoacydurię są pi rym idy nowy mi auksotrofami, reagującymi na nukleozydy pirymidynowe w poŜywieniu W częściej występującym typie I tej choroby stwierdza się niedobór zarówno fosfory boŜy lo-

Leki mogą eliminować acydurię orotowa Analogpuryny allopurynol(p. ryc. 35-21) jest inhibitorem oksydazy ksantynowej stosowanej w leczeniu skazy moczanowej, Allopurynol, substrat fosfory boŜy 1 o transferazy orotanowej (reakcja 5, ryc, 36-13) hamuje kompetytywnie fosfory boŜy lację naturalnego substratu kwasu orotowego. Ponadto powstający produkt nukleotydowy hamuje dekarboksylazę orotydylanową (reakcja 6, ryc. 36-13) wy twarzając orotoacydurię lub orotydynurię. PoniewaŜ szlak biosyntezy de novo nukleotydu pi rym idy nowego przystosowuje się do takiego hamowania, organizm ludzki jest tylko przejściowo pozbawiony nukieotydów pirymidynowych we wczesnym okresie leczenia. 6-A/aury dyna, po przekształceniu do 6-azaurydylanu, kompelytywnie hamuje dekarboksy-

transferazy orotanowej, jak i dekarboksylazy

orotydy łanowej (reakcja 6, ryc. 36-13). Głównym wydalanym nieprawidłowym produktem jest kwas orotowy. Oba typy chorych są auksotrofami, którzy reeagują na podaną urydynę. Znacznie zwiększona aktywność karbamoilotransferazy asparagi niań owej i dihydroorotazy u chorych z orotoacyduria typu I powraca do normy po doustnym podaniu urydyny.

karbamoilotransferazy ornitynowej. Nagroma-

dzony fosforan karbamoilu, substrat tego enzymu, przechodzi do cytozolu, gdzie jest uŜyty do syntezy nukleotydów pirymidynowych. Powstająca w wyniku tego słaba acyduria orotowa wzmaga się wówczas, gdy chorzy spoŜywają poŜywienie z duŜą zawartością azotu.

442 / ROZDZIAŁ 36

lazę orotydylanową (reakcja 6, ryc. 36-13) silnie wzmagając wydalanie kwasu orotowego i orotydyny. PIŚMIENNICTWO Ames BN, Cathcarl R, Sthwiers E, Hochstein P: Uric acid provides an anlioxidant defense in huraans against oxidant- and radical-caused aging and cancer: A hypoLhesis. Proc Nati Acad Sci USA 19S1; 78:6858. Benkovic SJ: The transfomiylase enzymes in de novo purine biosynthesis. Trends Biochem Sci 1984;9:320.

Holmgren A: Thioredoxin. Annu Rev Biochem 1985; 54:237. Joties M: Pyrimidine nucleotide biosynthesis in animal cells. Annu Rev Biochem 1980; 49:253. Martin DW Jr, Gelfand EW: Biochemistry of diseases of immunodevelopment. Annu Rev Biochem 1981; 50:845. Schinke RT: Methotrexate resistance and gene amplification. Mechanisras and implications. Cancer 1986; 57:1912. Seegmiller JE: Overview of the possible relation of defects in purine metabolism to imraune deficiency. Ann NY Acad Sci 1985; 45:9. Stanbury JB et al (editors): The Metaboiic Basis of Inherited Disease, 5th ed. McGraw-Hill, 1983.

Struktura i funkcja kwasów nukleinowych

37

Dary! K. Granner. MD

WPROWADZENIE Odkrycie, Ŝe informacja genetyczna jest zakodowana wzdłuŜ cząsteczki polimeru, złoŜonej z 4 rodzajów jednostek monomerycznych, jest wielkim osiągnięciem naukowym tego stulecia. Ta cząsteczka polimeru, DNA, jest chemiczną podstawą dziedziczności. Składa się ona z genów, podstawowych jednostek informacji genetycznej. Geny kontrolują syntezę róŜnych typów RJSA, większość z nich bierze udział w syntezie białek. Geny nie działają autonomicznie; ich replikatja i funkcja są kontrolowane przez słabo jeszcze poznane sprzęŜenia zwrotne, w których same produkty genów odgrywają krytyczną rolę. Wiedza o strukturze i funkcji kwasów nukleinowych jest podstawowa do zrozumienia genetyki i stanowi podstawę do dalszych badań.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Chemiczna podstawa dziedziczności i chorób genetycznych jest zawarta w strukturze DNA. Główny szlak informacyjny (tj. kierowanie przez DNA syntezą RNA, który z kolei kieruje syntezą białek) został juŜ wyjaśniony. Wiedza ta została uŜyta dla sprecyzowania fizjologii komórkowej i patofizjologii chorób na poziomie molekularnym.

DNA ZAWIERA INFORMACJĘ GENETYCZNĄ Fakt, Ŝe DNA zawiera informację genetyczną wykazali po raz pierwszy w 1944 r. w serii doświadczeń Avery, MacLeod i McCarty. Za-

obserwowali oni, Ŝe genetyczna determinacja otoczki swoistych pneumokoków moŜe być przeniesiona do innych pneumokoków o wyraźnie odmiennym typie otoczki przez wprowadzenie oczyszczonego DNA od pierwszych do drugich. Autorzy ci określili czynnik, który dokonuje tej zmiany, jako „czynnik transformujący" (później wykazano, Ŝe był to DNA). W późniejszym okresie ten typ manipulacji genetycznej stal się pospolity. Podobne doświadczenia wykonano ostatnio posługując się droŜdŜami, hodowanymi w kulturach komórkami ssaków i zarodkami owadów oraz gryzoni jako biorców, a klonowanym DNA jako dawcą informacji genetycznej.

DNA składa się z 4 deoksynukleotydów Chemiczną naturę jednostek deoksynukJeotydowych DNA — deoksyadenylan, deoksyguanylan, deoksycytydylan i tymidylan — opisano w rozdz. 35. Te monomeryczne jednostki DNA są utrzymane w postaci polimeru przez mostki 3', 5'-fosfodiestrowe, tworząc w ten sposób pojedyncze pasmo przedstawione na ryc. 37-1. Treść informacyjna DNA (kod genetyczny) iest zawarta w'"seTiwencji, w której te monomery - deoksyrybonukleotydy purynowe i pirymidynowe — są zorganizowane. Cząsteczka polimeru DNA, jak to pokazano, jest polarna; na jednym końcu ma grupę 5'-hydroksylową lub fosforanową, a na drugim grupę 3'-fosforanową lub hydroksylową. Znaczenie tej popularności zostanie wyjaśnione w dalszej części rozdziahi. PoniewaŜ informacja genetyczna jest zawarta w kolejno ułoŜonych jednostkach monomerycznych w cząsteczkach polimeru, musi istnieć mechanizm reprodukowania, czyli replikowania tej swoistej informacji mającej bardzo duŜy

/ ROZDZIAŁ 37

H \. yl H 3'

H

Ryc. 37-1. Segment jednego pasma cząsteczki DNA, w której zasady purynowe i pi rym idy no we: adenina (A), tymina (T), cytozyna (C) i guartina (G) są połączone przez fosfod iestro we wiązania (szkielet) między resztami 2'-deoksyrybozylowymi związanymi z zasadami przez wiązanie N-glikozydowe. Zwróć uwagę, Ŝe szkielet wiązań fosfod i estrowych wykazuje polarność (tj, ukierunkowanie).

stopień wierności. Ten wymóg, razem z danymi uzyskanymi za pomocą dyfrakcji promieni X przez cząsteczkę DNA, i spostrzeŜenia Chargaffa, Ŝe w cząsteczkach DNA stęŜenie nukleotydów deoksy a de noŜy nowych (A) równa się stęŜeniu nukleotydów tymidynowych (T) iA^JJ^ji stj^eniejiukleotydów deoksyguanozynowych (G) równa się stęŜeniu nukleotydów deoksycytydynowych (C) (G = C) pozwoliły zaproponować we wczesnych latach 50. model dwupasmowej cząsteczki DNA. Propozycję taką przedstawili Watson,~Crick i Wilkins. Model, który ci uczeni zaproponowali, przedstawiono na ryc. 37-2. 2 pasma prawoskrętnej dwupasmowej cząsteczki są utrzymane przez wiązania wodorowe między zasadami purynowymi a pi rym idy no wy mi odpowiadających sobie cząsteczek linijnych. Wytworzenie par między nukleotydami purynowymi a pirymidyno-

wymi naprzeciwległych pasmach jest bardzo swoiste i zaleŜy od wiązań wodorowych A i T oraz G i C (ryc. 37-3). W dwupasmowej cząsteczce ograniczenia narzucone przez moŜliwość rotacji wokół wiązania fosfodiestrowego, uprzywilejowana konfiguracja antywiązania glikozydowego (p. ryc. 35-9) oraz dominujące tautomery (p. ryc. 35-4) 4 zasad (A, G, T i C) pozwalają tylko na sparowanie A wyłącznie z T i G wyłącznie z C, jak to przedstawiono na ryc. 37-3, Takie ograniczenie w parowaniu zasad wyjaśnia wcześniejszą obserwację, Ŝe w_dwupasmowej cząsteczce DNA ilość A równa się ilości T, a ilość G równa się ilości C. 2 pasma, z których kaŜde jest polarne, w dwupasmowej cząsteczce są przeciwległe; tj. jedno pasmo biegnie w kierunku 5' do 3', a drugie w kierunku 3' do 5'. Jest to analogiczne do 2 równoległych ulic, z których

STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH / 44S 3,4 nm 2,0 nm

Rowek mniejszy I większy

nm Ryc. 37-2. Model Watsona-Cricka dwupasmowej helikalnej struktury postaci B DNA. Na lewo: Schemat struktury. Strzałka pozioma pokazuje szerokość (średnicę) podwójnego heliksu (2,0 nm), a strzałka pionowa długość jednego petnego zwoju heliksu (3,4 nm). Centralna oś podwójnego heiiksu jest pokazana jako pionowa linia. Krótkie strzałki wskazują polarność przeciwległych pasm. (A — adenina, C — cytozyna; G — guanina; T — tymina; P — fosforan, S — cukier [deoksyryboza]). Na prawo: Model przestrzenny struktury DNA. (Zdjęcie wg James D, Watson, Molecutar Biology of the Gene, 3rd ed. Copyright © 1976, 1970, 1965, by W. A. Benjamin, Inc, Menlo Park, CalifJ. ______________________

kaŜda jest jednokierunkowa, ale ruch na nich biegnie w odwrotnych kierunkach. W dwupasmowych cząsteczkach DNA informacja genetyczną mieści się w sekwencji nukleotydów na jednym paśmie, nazywanym pasmem matrycowym; przeciwległe do niego pasmo jest pasmem kodującym, poniewaŜ odpowiada ono transkryptowi RNA, który z kolei koduje białko. Na rycinie 37-3 przedstawiono, jak 3 wiązania wodorowe utrzymują nukleotyd deoksyguanozynowy z nukleotydem deoksycytydynowym, podczas gdy druga para, para A-T. jest połączona 2 wiązaniami wodorowymi. Wiązanie G^T jest więc mocniejsze o ok. 50%. Z powoduiej dodatkowej siły wiązali, a takŜe z powodu interakcji typu „stacking" regiony DNA o duŜej liczbie wiązań G-C są bardziej oporne na denaturację, czyli „topnienie", niŜ regiony o duŜej liczbie wiązań A-T.

DNA istnieje w postaci kilku dwupasmowych helikalnych struktur Dotychczas opisano 6 postaci cząsteczek DNA (A do E i Z), ale większość z nich znaleziono tylko w rygorystycznych warunkach doświadczalnych. Postacie te odróŜnia; 1) liczba par zasad, które zajmują kaŜdy zwój heliksu, 2) nachylenie, czyli kąt między kaŜdą parą zasad, 3) średnica heliksu cząsteczki i 4) kierunek skrętu (prawy lub lewy) podwójnego heliksu (tab. 37-1). Niektóre z tych postaci ulegają przekształceniu wewnętrznemu przez zmianę takich warunków, jak stęŜenie soli i hydratacja. MoŜliwe, źe takie przekształcenie wewnętrzne moŜe się zdarzać in vivo. Posfoć B, powszechnie dominująca postać DNA w warunkach fizjologicznych (małe stęŜenie soli, duŜy stopień hydratacji), ma wielkość skoku 3.4 nm na kaŜdy zwój (ryc. 37-2). W ob-

446 / ROZDZIAŁ 37 CH3 O-. N

N„

Cukier O Tymidyna

Adenozyna

Ryc. 37-3. Wzajemne parowanie między deoksyadenozyna. i tymidyna. obejmuje wytworzenie 2 wiązań wodorowych 3 takie wiązania tworzą się między deoksycytydyną i deoksyguanoŜyną. Linie przerywane przedstawiają wiązania wodorowe. W DNA cząsteczką cukrową jest 2-deoksyryboza, podczas gdy w RNA — D-ryboza.

rębie kaŜdego zwoju mieści się lOpar zasad (pz) (liczba ta moŜe się zmieniać między 10,0-—10,6 pz na kaŜdy zwój), kaŜda z płaskich zasad uktada się jedna nad drugą,, przypominając 2 skręcające się stosy monet przyłoŜonych bok <Jb boku. Na kaŜdym poziomie 2 stosy są złączone wiązaniami wodorowymi między dwoma monetami z 2 przeciwległych stosów, a takŜe utrzymywane przez 2 prawoskrętne wstęgi owiTabela 37-1. Cechy niektórych struktur DNA Typ Kierunek skrętu

Liczba Odległość par między Średnica zasad sąsiednią heliksu na 1 zwój parą zasad

A

Prawy

11

0,256 nm

2,3 nm

B Z

Prawy Lewy

10 12

Cr,338 nm 0,371 nm

1,9 nm 1,8 nm

jające 2 stosy i reprezentujące szkielet fosfodiesTrówy. Odmianą tej podstawowej struktury jest postać A, której powstaniu sprzyja środowisko nieco niniej uwodnione i o większej liczbie jonów Na+ i K + . Ta prawoskrętna struktura zajmuje więcej miejsca niŜ postać B, ma więcej par zasad na 1 skręt i przypomina strukturę dwupasmowego RNA i podwójnego hybrydu DNA-RNA. Postacie C—E są takŜe prawoskrętne, obserwuje się je w bardzo swoistych warunkach doświadczalnych i sądzi się, Ŝe nie istnieją one in vivo. Formy Z-DNA są podwójnymi lewoskrętnymi heliksami, w których szkielet fosfodiestrowy biegnie zygzakiem („zigzag1") wzdłuŜ cząsteczki -- stąd nazwa Z-DNA. Z-DNA jest najmniej skręcony (12 pzna 1 zwój), jego heliks ma najmniejszą znaną średnicę i jedynie 1 rowek (p. niŜej). Z-DNA egzystują jako sekwencje powtarzających się naprzemiennych deoksynukleotydów purynowych i pirymidy nowych (GC lub AC). lecz wymagają one takŜe warunków stabilizujących. Do warunków stabilizujących zalicza się m.in.: 1) obecność duŜego stęŜenia soli lub swoistych kationów, takich jak spermina lub spermidyna, 2) duŜy stopień ujemnego skręcenia DNA (p. rozdz. 38), 3) wiązanie białek swoistych dla Z-DNA i 4) zmetylowanie pozycji przy C5 niektórych nukleotydów deoksycytydynowych w sekwencji naprzemiennej. Z-DNA moŜe powodować skutki regulatorowe zarówno~w obszarze proksymalnym, jak i dystalnym w stosunku do swego połoŜenia. Niektóre białka, które wiąŜą się w mniejszym rowku B-DNAj prawdopodobnie nie mogą się wiązać z postacią Z. W dodatku odwrócenie (rewersja) gostaci Z do postaci B-DNA, zdarzem.6,. które moŜe zajść w następstwie utraty grup metylowych z 5-metylodeoksycytydyny, zachodzi prawdopodobnie wskutek róŜnic w skręca 1ności DNA w obszarze dystalnym do aktualnego miejsca zajmowanego przez Z-DNA, Jak to będzie omawiane niŜej, torsyjne skręcanie i rozkręcanie, jak. teŜ metylacja deoksycytydyny mogą wpływać na aktywność genów. Istnienie Z-DNA wykazano w chromosomach muszki owocowej {Drosophila), posługując się przeciwciałami, które rozpoznają i wiąŜą się do Z-DNA. Ludzki DNA -ma- regiony, rozproszone w obrębie genomu, stanowiące potencjalne odcinki do utworzenia postaci ZDNA; mogą równieŜ istnieć warunki stabilizujące tę postać.

STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH / 447

Denaturacja (topnienie) DNA jest uŜywana do analizy jego struktury Dwupasmowa struktura DNA w roztworze moŜe być "stopiona przez podwyŜszenie temperatury lub zmniejszenie stęŜenia solj_ W tym procesie nie tylko 1 pasmu zasad odrywają się od siebie, lecz takŜe same zasady zmieniają płaszczyznę wzajemnego połoŜenia, podczas gdy są one stale jeszcze związane, jako polimer, szkieletem wiązań fosfodiestrowych. Takiej denaturacji cząsteczki DNA towarzyszy zwiększenie optycznej wartości absorpcji zasad purynowych i pirymidynowych; zjawisko to określa się jako efekt hiperchromiczny denaturacji.

Dwupasmowa cząsteczka DNA, dzięki efektowi typu ,,stacking" (oddziaływania między sąsiadującymi parami zasad) i dzięki wiązaniom wodorowym między zasadami, tworzy sztywne twory paJeczkowe; w roztworze ma duŜą lepkość, która zmniejsza się po deoaturacji. Podczas denaturacji pasma danej cząsteczki DNA oddzielaja^_się od siebie w pewnym przedztał^Lejn2e_ralury. Punkt środkowy przejścia temperatury nazywa się temperaturą topnieniu.

czyli T m. ffiactoieJjŁjialeŜy od składu zasad .. stęŜenia soli w roztworze. ONA 0 duŜej liczbie par G-C, które mają 3 wiązania wodorowe, topią się w wyŜszej temperaturze niŜ DNA .o duŜej liczbie par A-T, które mają 2 wiązania wodorowe. Dziesięciokrotne zwięk szenie stęŜenia jednowartościowych kationów powoduje zwiększenie wartości Tm o 16,6°C. Formamid, który jest często uŜywany w do świadczeniach z rekombinowanym DNA, des tabilizuje wiązania wodorowe między zasadami 1 przez to zmniejsza wartość Tm. Pozwala to na oddzielenie pasm DNA albo hybrydów DNA-RNA w znacznie niŜszej temperaturze i mini malizuje pęknięcia pasm, które zachodzą w wy sokich temperaturach. Cząsteczka DNA ma rowki Szczegółowe badanie modelu DNA, przedstawione na ryc. 37-2, ujawnia rowek większy i rowek mniejszy wijące się wzdłuŜ cząsteczki równolegle do szkieletu fosfodiestrowego. Białka mogą oddziaływać swoiście z eksponowanymi atomami nuklcotydów (zwykle przez wiązania wodorowe) w obrębie tych rowków i przez to rozpoznawać i wiązać ze swoistymi sekwencjami nukleotydowymi, bez rozrywania sparowanych zasad w dwupasmowej cząsteczce DNA. Jak to omawiano w rozdz. 39 i 41, białka

regulatorowe przez takie oddziaływanie mogą kontrolować ekspresję swoistych genów. DNA istnieje w postaciach zrelaksowanej i silnie skręconej (postać kłębka) W niektórych organizmach, takich jak _bak_Ieikl._w bakteriofagach i licznych wirusach zwierzęcych typu DNA końce cząsteczek DNA wiąŜą się, tworząc zamkniętą cząsteczkę kolistą

nie mającą końca. To oczywiście nie zaburza polarności cząsteczek, ale eliminuje wolne 3' i 5' grupy hydroksylowe i fosforowe, „Zamknięte cząsteczki koliste istnieją w postaci zrelaksowanej (rozluźnione) i w postaci bardzo skręconej. Nadmierne skręcenia są wprowadzone wow"fiźas, gdy zamknięta kolista cząsteczka jest skręcona wokół swej własnej osi, lub teŜ gdy jest skręcona cząsteczka linijna dwupasmowego DNA, której końce są zakotwiczone. Ten proces, wymagający energii, wprowadza napięcia do cząsteczki; czym większa iiczba „superskrętów" tym większe napięcie, czyli torsja (przetestuj to na gumowej taśmie). Ujemne siinejzwoie tworzą się wówczas, gdy cząsteczka prawoskrętnego dwupasmowego heliksu, znajdowana w B-DNA, jest skręcona w kierunku odmiennym od kierunku wskazówek zegara. Taki DNA nazywa się rozwiniętym. Energia potrzebna do uzyskania tego stanu jest w pewnym sensie zmagazynowana w superskretach. Przejście zatem do innej postaci, które wymaga energii, jest ułatwione przez rozkręcenie. Jednym z takich przejść jest oddzielenie pasm, co jest niezbędne do replikacji DNA i transkrypcji. DNA w postaci superskrętów jest zatem preferowaną postacią istniejącą w układach biologicznych. Enzymy, które katalizują topologiczne zmiany DNA są nazywane topoizomerazami. Topoizomerazy mogą wprowadzać rozluźnienie albo superskręty w cząsteczce DNA. Najlepiej scharakteryzowaną topoizomerazą jest giraza bakteryjna, która wprowadza negatywne superskręty w DNA przy uŜyciu ATP jako źródła energii. DNA SŁUśY JAKO MATRYCA DO REPLIKACJI I TRANSKRYPCJI Informacja genetyczna zmagazynowana w sekwencji nukleotydowej DNA słuŜy 2 celom. Jest ona źródiem informacji do syntezy wszystkich cząsteczek białkowych komórki i organiz-

448 / ROZDZIAŁ 37

mu oraz dostarcza informacji dziedziczonej przez komórki potomne i potomstwo. Obie te funkcje stawiają wymóg, Ŝe DNA musi słuŜyć jako_matryca w pierwszym przypadku do transkrypcji informacji na RNA, a w drugim do replikacji informacji dla 2 potomnych .cząs teczek DNA. -——— IComplementarność w dwupasmowym modelu DNA Watsona i Cricka silnie sugeruje, Ŝe replikacjii DNA zachodzi w sposób semikonserdwupasmowej

STARE

NOWE

STARE

ddŜ]I~i~aT

p macierzystej cząsteczki DNA oddŜ]eIa~5ię~aaT ~s"węgo_ komplementarnego pasma w czasie replik acjj, wówczas kaŜde z nich słuŜy jako matryca, na której syntetyzuje się nowe pasmo komplementarne (ryc. 37-4). Dwie wytworzone na nowo dwupasmowe siostrzane cząsteczki DNA* kaŜda zawierająca 1 paSDSP Osompłemen tarnc..a.nie identyczne) z macierzystej dwupasmn.wej.cząstęczki DN A, są następnie sortowane rmpjlm/ 7 *ifrtoouif komórki frvc 37~51 K.riLŜtiTi z komórek potomnych zawiera cząsteczki DNA z informacją identyczną z tą, jaką miała cząsteczka macierzysta. Półzachowawczy (sem i konserwatywny) charakter replikacji DNA^ wykazali jednoznacznie u bakterii Escherichid~~ćdtł~ Meselson i Stahl w klasycznym doświadczeniu, stosując cięŜki izotop azotu i techniki wirowania równowaŜnego. Pod względem chemicznym DNA E. coli jest identyczny z DNA człowieka, choć oczywiście sekwencje nukleotydów róŜnią się, a ludzka komórka zawiera 1000 razy więcej DNA niŜ bakteria. Chemia replikacji DNA u prokariontów, takich jak E. coli, jest identyczna z chemią replikacji u eukariontów z ludzkimi włącznie, mimo, Ŝe enzymy prowadzące reakcje syntezy DNA są róŜne. Wszelkie spostrzeŜenia odnośnie do natury chemicznych reakcji kwasów nukleinowych u prokariontów bardzo prawdopodobnie stosują się teŜ do eukariontów. Istotnie, doświadczenia Meselsona i Stahla. wykonane na komórkach ssaków, dały wyniki porównywalne do tych, jakie otrzymano przy uŜyciu E. coli. RNA RÓśNI SIĘ OD DNA POD WZGLĘDEM WŁAŚCIWOŚCI CHEMICZNYCH Kwas rybo nukleino wy (RNA) jest polimerem złoŜonym z rybo nukleotydów pury nowych i pirym idy nowych, połączonych między sobą

STARE

NOWE

NOWE

Ryc. 37-4. Dwupasmowa struktura DNA i funkcja matrycowa kaŜdego starego pasma, na której jest syntetyzowane nowe komplementarne pasmo (zaciemnione). (Wg James D. Watson Molecular Biology of the Gene. 3rd ed. Copyright © 1976, 1970, 1965, by W. A. Beniamin, Inc, Menlo Park, Calif)

STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH

Oryginalna cząsteczka macierzysta

Drugie pokolenie Pierwsze pokoleń id cząsteczek siostrzanych cząsteczek stost rŜanych Konserwatywny

Sarn (konserwatywny .. (

Ryc. 37-5. Oczekiwane rozmieszczenie pasm macierzystych DNA w przypadku sem i konserwatywnego i konserwatywnego mechanizmu replikacji. Pasma macierzyste są oznaczone jako linie pełne, pasma syntetyzowane od nowa jako Finie otwarte Mechanizm repiikacji DNA jest semikonserwatywny. (Przerysowane i zreprodukowane za zgodą z: Lehninger A. L: Biochemistry, 2nd ed. Worth, 1975).

prz&z 3', 5; wiązania fosfodiestrowe^.aaalo.giczne da.lych, które występują w DNA (ryc. 37-6). RNA, chociaŜ ma wiele wspólnych cech z DNA, ma teŜ swoiste róŜnice: 1. W RNA cząsteczką cukru,,/ którą są związane losforany oraz zasady purynuwe i piryP"^ygfl»fi*i^t.rybyza, a nie 2-deoksyryboza jak _w_DNA. Komponenty pirymidynowe w RNA róŜnią się od tych, które występują w DNA. ChociaŜ RNĄ^zawiera rybonukleotydy adeniny, guaniny i cytozyny, to nie zawiera ty miny ,_z wyjąt kiem rzadkiego przypadku wymienionego poni Ŝej. Zamiast tynuny RNA zawiera rybonukleotjd uracylu. RNA występuje jako pasmo pojedyncze, ppdczas_.gdy DNA występuje jako clwupasmowjLcząsteczka helikalna. JednakŜe w okreś lonych sekwencjach, zawierających komplemen tarne zasady o odwrotnej polarności, pojedyn cze pasmo RNA, jak to przedstawiono na ryc. 37-7, jest zdolne do zawinięcia się na nim saaiym, tak jak spinka do włosów, przyjmując w ten sposób cechy struktury dwupasmowej. 29 — Biochemia

4.._PoniewaŜ cząsteczka RNA jest pojedynczym pasmem komplementarnym tylko do 1 z 2 pasm genu, iJość guaniny nie musi się równać ilości cytozyny, ani ilość adeniny nie musi się równać ilości uracylu. 5. RNA moŜe być hydrolizowany przez odczyn zasadowy do 2\ f cyklicznych dicstrów mononukieotydów, związków, które nie powstają po działaniu aa DNA alkaliami, poniewaŜ DNA nie ma grup 2'-hydroksylowych. Labilność RNA w stosunku do środowiska zasadowego jest uŜyteczna zarówno dla diagnostyki, jak i dla analizy. Informacja w pojedynczym paśmie RNA jest zawarta w sekwencji nukleotydów puiynowych i pirymidynowych („struktura pierwszorzędowa") w obrębie tego polimeru. Sekwencja £a jest komplementarna do matrycowego pasma genu, z którego była przepisana. Ze względu na tę komplementamość, cząsteczka RNA moŜe się swoiście wiązać według reguły parowania zasad do jej matrycowego pasma DNA; nie będzie się ona wiązała („hybrydyzowała") z drugim (kodującym) pasmem tego genu. Sekwencja cząste-

450 / ROZDZIAŁ 37

NH2

Ryc. 37-6. Segment cząsteczki kwasu rybonukleinowego (RNA), w której zasady purynowe i pirymidynowe — adenina (A), uracyl (U), cytozyna (C) i guanina (G) są utrzymywane razem przez wiązania fosfod i estrowe między resztami rybozylowymi związanymi z zasadami wiązaniami N-glikozydowymi. Zwróć uwagę, Ŝe polimer wykazuje polarność oznaczoną przez reszty fosforanowe związane w pozycji 3' i 5'.

czijiJŁNA (z wyjątkiem U, które zastępuje T) jest taka sama, jak kodującego pasma genu (ryc. 37-8). Prawie wszystkie rodzaje z licznych rodzajów RNA są związane z niektórymi aspektami syntezy białek Cząsteczki cytoplazmatycznego RNA, które słuŜą jako matryce do syntezy białek (tj. te, które przenoszą informacje z DNA do ośrodków syntetyzujących białko) są nazwane informacyjnym RNA lub mRNA (ang. messenger

RNA). Liczne inne cząsteczki cytoplazmatycznego RNA (rybosomalny RNA, czyli rRNA)

odgrywają rolę strukturalną przez co biorą udział w tworzeniu rybosomów (system organelli do syntezy białek) alboFsłuŜą jako cząsteczki łącznika (tRNA) do translacji informacyj-

nego RNA (mRNAj na swoistą sekwencję spo! i mery zo wanych aminokwasów. Znaczna część RNA syntetyzowanego na matrycy DNA w komórkach eukariotycznych, w tym równieŜ w komórkach ssaków, jest degradowana w obrębie jądra i nigdy nie słuŜy

jako jednostka strukturalna lub informacyjna w cytoplazmie komórkowej. W komórkach ludzkich istnieją drobnocząsteczkowe jądrowe RNA (smali nuclear RNA,

sriRNA), które nie są bezpośrednio włączone w proces syntezy białek, ale odgrywają rolę w przekształcaniu (processing) RNA i budowie komórkowej. Te stosunkowo małe cząsteczki zawierają 90—300 nukleotydów (tab. 37-3). Materiałem genetycznym niektórych wirusów zwierzęcych i roślinnych jest RNA, a nie DNA. Choć niektóre wirusy RNA nigdy nie

STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH /,

Pętla

C —G C —G Szypuła G —C A—U A—U A —U U G U G C C G-C U —A U —A U C U —A C — G G-C

Ryc. 37-7. Schematyczny obraz dru go rzędowej struktury cząsteczki jednopasmowego R MA, w której wytworzyła się szypuła i pętla {struktura spinki do wtosów) wskutek wewnątrzcząsteczkowego parowania zasad.

mają przepisanej swojej informacji na cząsteczki DNA, liczne zwierzęce wirusy RNA — zwłaszcza retrowirusy (np. wirus HIV, czyli AIDS) - są przepisane przez RNA-zaleŜną polimęrazę DNA, tj. tzw. odwrotną transkryptązc na DNA, w wyniku tego powstaje dwupasmowa, kopia DNA genomu RNA. W licznych przypadkach powstający dwupasmowy przepisany DNA jest włączony (integrowany) w genom gospodarza i następnie słuŜy jako matryca do ekspresji genów, z której takŜe mogą być przepisane wirusowe genomy RNA.

RNA jest zorganizowany w kilka unikatowych struktur We wszystkich organizmach prokariotycznych i eukariotycznych istnieją 3 główne klasy RNA: informacyjny RNA (mRNA), transferowy RNA (tRN A) i rybosomalny RNA (rRNA). KaŜda z tych klas róŜni się od innych wielkością, funkcją i ogólną stabilnością. Informacyjny RNA (mRNA). Ta klasa RNA jest najbardziej heterogenna odnośnie do wielkości i stabilności. Wszystkie cząsteczki tej klasy funkcjonują jako przenośniki informacji z genu do ośrodków syntetyzujących białko, gdzie kaŜda z nich słuŜy jako matryca, na której poiimeryzują"arńmokwasy w swoistej sekwencji, aby utworzyć swoistą cząsteczkę białkową jako końcowy produkt genu (ryc. 37-9). Informacyjny RNA, zwłaszcza u eukarion-tów, ma niektóre charakterystyczne cechy chemiczne. Koniec 5' cząsteczki mRNA jest opatrzony „czapeczką" („kapturkiem", ang. cap) z.kjŜonąz tritosforanu 7-metyloguanozyny, który jest przyłączony do przyległego 2'-O-metylorybomikleozydu do jego grupy 5'-hydroksylowej przez 3 reszty fosforanowe (ryc. 37-10). Cząsteczki mRNA zawierają często wewnętrzne ó-metyloadenylany i inne nietylowane nukleotydy 2'-O-rybozy.,,Czapeczka" prawdopodob ywarolę w rorpo/nanin mRNA przez nie ądpry a tAkŜ&pomagaw-stabilizacji mRNA poprzez 5^egzonukleaz. „Maszyneria" syntetyzująca białko rozpoczyna translacje mRNA na białko od końca 5 r , czyli końca z „czapeczką", metylo-wanych nukleotydów. Drugi koniec większości mRNA, koniec 3 -hydroksylowy, ma dołączony polimer zbudowany z 200—250 nukleotydów adenylowych. Swoista funkcja tego „ogona" poli(A) na 3'-hydroksylowym końcu cząsteczek mRNA nie jest w pełni poznana, ale wydaje się, Ŝe y niw swoistyrfi mRNA-Chroniąc ppjpd g^kiem

Pasma DNA: Kodujące — 5'-TGG A A T T G T G A G C G G A T A A C A A T T T C A C A C A G G A A A C A G C T A T G A C C A T G - 3 ' Matryco we-- 3 - A C C T T A A C A C T C G C C T A T T G T T A A A G T G T G T C C T T T G T C G A T A C T G G T A C - 5 ' Tran skrypt RNA

1

5

pAU UGUGA6CGGAU A A C A A U U U C A C A C A G G A A A C A a C U A U G A C C A U B

3'

Ryc. 37-8. WspółzaleŜności między sekwencjami transkryptu RNA i jego genu, w którym pokazano kodujące i niekodujące (matrycowe) pasma oraz ich polarność. Transkrypt RNA o polarności 5' do 3' jest komplementarny do pasma matrycowego o poiarności 3' do 5'. Zwróć uwagę, Ŝe sekwencja w transkrypcje RNA i jego poiarność jest taka sama, jak pasma kodującego, z wyjątkiem U w transkrypcie zastępującym T w genie. _____ _____ ___________________________

452 / ROZDZIAŁ 37 DNA

mRNA . 3'

5'. Synteza białek na matrycy mRNA Rybosom

Ryc. 37-9. Ekspresja informacji genetycznej DNA w formie transkryptu mRNA Ten ostatni jest następnie przepisany (translacja) przez rybosomy na cząsteczkę swoistego białka

H,N NH,

Ryc. 37-10. Struktura „czapeczki" dołączonej do końca 5' większości cząsteczek eukariotycznego informacyjnego RNA. Trifosforan 7-metyloguanozyny jest związany z końcem 5' mRNA, który zwykle zawiera nukleotyd purynowyzmetyiowany w pozycji 2 rybozy (nukleotyd 2-0-metylopuryny).

O'

STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEiNOWYCH / 453

Niektóre cząsteczki mRNA, włączając^? to niektóre mRNA histonów, nie mają poli(A). Ogon poli(A) moŜe tworzyć wiązania na zasadzie parowania zasad z polimerami oligodeoksytymidyny, związanej ze stałym podłoŜem, np. celulozą, i dzięki temu moŜe być uŜyty do oddzielenia cząsteczek mRNA od innych rodzajów RNA. Cząsteczki mRNA cytoplazmy komórek ssakówrwłączając komórki ludzkie, nie są produktami bezpośrednio syntetyzowanymi na matrycy DNA, ale.sa_ tworzone przez przeksztai■cenkuz.prekursorowej cząsteczki przed wejściem do cytoplazmy. W jądrach ssaków bezpośrednie produkty transkrypcji genów stanowią wigc 4. klasę cząsteczek RNA. Te jądrowe cząsteczki RNA są bardzo heterogenne co do wielkości i są całkiem duŜe. Cząsteczki jądrowegojięteragennegp fiNAihnRNA) mają masę cząsteczkową powyŜej 107, podczas gdy masa cząsteczkowa (MW) cząsteczek mRNA jest na ogól mniejsza niŜ 2 x 106. Jak to przedstawiono w rozdz. 39, cząsteczki hnRNA podiegaja_gbróbce do cząsteczek mRNA. kflóre następnie wnikają do cytoplazmy i słuŜą jako matryce do syntezy białek. RNA transferowy (tRNA). Cząsteczki tRNAskladająsięzok. 75nukleotydów.S.a_aaę j (p. rozdz. 39). Cząsteczki p kd li i l b tRNA sluŜą_JąJ^ft.iaeaM-kt-do translacji in.lbr-iriacjL, zawartej w sekw-encji^ nukleotydow inRNA na swoiste aminokwasy. W kaŜdej komórce istnieje przynajmniej 20 rodzajów cząsteczek tRNA i przynajmniej 1 (a często kilka) odpowiada kaŜdemu z 20 aminokwasów potrzebnych do syntezy białka. ChociaŜ kaŜda swoista cząsteczka tRNA róŜni się od innych sekwencją nukleotydową, to cząsteczki tRNA jako klasa mają wiele wspólnych cech. Struktura pjerwszorzędowa, tj. sekwencja nukleotydową, wszystkich cząsteczek tRNA pozwala na sfałdowanie ich, a wewnątrzcząs teczko wa kompletne ntarność zasad pozwala wytworzyć drugorzędową strukturę, która jest podobna do .liścia koniczyny (ryc. 37-11). Wszystkie cząsteczki tRNA zawierają 4 główne ramiona. Kumie akceptorowe składa sie z szyputy utworzonej ze sparowanych zasad, która kończy się sekwencją CCA (5'-3'). Aminokwasy wiąŜą się swoimi grupami karboksylowymi przez wiązanie estrowe do grupy 3'-hydroksylowej reszty adenozylowej. Inne ramiona mają „szypuły ze sparowanych zasad i pętle zasad nie

T

Ramię - "* receptorowe •

5'P

Region wiązań wodorowych pomiędzy param! zasad

ię dodatkowe

U \T__?/i— Alkilowa na puryna JM ■■, Ramię antykodonowe Ryc. 37-11. Typowy acylo-tRNA, w którym aminokwas (aa) jest związany 3'-końcową sekwencją CCA, Oznaczono antykodon oraz ramiona T f C i dihydrouracylowe (DHU), jak równieŜ pozycję wewnątrecziisteczkowych wiązań wodorowych między parami zasad. (Wg James D. Watson, Molecular Biology of tha Gene, 3rd ed. Copyright © 1976, 1970, 1965, by W. A. Benjamtn, Inc, Menlo Park, Calif.)

sparowanych (ryc. 37-7). Ramię antykodonowe przy końcu szypuly o sparowanych zasadach rozpoznaje tryplet nukleotydow, czyli kodon (omówiono w rozdz. 40) matrycy mRNA. Ma ono sekwencję nukleotydow komplementarnych do kodonu i jest odpowiedzialne za swoistość tRNA. Ramię D zostało tak nazwane dzięki obecności zasady dihydrourydyny, a ramię T f C ze względu na obecność sekwencji T, pseudonrydyny i C. podatkowe ramie jest najbardziej zmienną cecną tRNA i stanowi podstawę do klasyfikacji cząsteczek tRNA. Klasa ljtŁKA (_ok. 75% wszystkich tRŃA) ma dodatkowe ramię długości 3 —5 pz. Klasa 2 tRNA ma dodatkowe ramię długości 13—21 pz i często strukturę typu szypuła-pętla. Drugorzędową strukturę cząsteczek tRNA utrzymują sparowane zasady w tych ramio-

454 / ROZDZIAŁ 37 Tabela 37-2. Części składowe rybosomów ssaków Komponent

40 S pod jednostka 60 S podjednostka

Białko

Masa cząsteczkowa

Liczba

1,4* 106 2,8 x 10s

35 50

RNA Masa

Wielkość

Masa cząsteczkowa

Liczba zasad

7 x 1 05 1x-|0 6

18 S 5 S 5,8 S 28 S

7x10! 35000 45000 1,6*10fl

1900 120 160

4700

Podjednostki rybosomalne są określone stosownie do ich szybkości sedymentacji w jednostkach Svedberga (40 S lub 60 S). W tabeli przedstawiono całkowitą masę cząsteczkową kaŜdej z nich. Pokazano równieŜ: liczbę unikatowych białek i ich całkowitą masę cząsteczkową, składowe RNA kaŜdej podjednostki, ich wielkość (w jednostkach Svedberga), masę cząsteczkową i liczbę zasad.

nach, stanowiąc stałą cechę tRNA. Ramię akceptorowe ma 7 pz, ramiona T f C i antykodonowe — 5 pz, a ramię D3 (lub 4) pz. ChociaŜ tRNA są trwale u prokariontów, u eukariontów są one nieco mniej trwałe. Odwrotnie jest z mRNA, który jest nietrwały u prokariontów, ale na ogół trwały w organizmach eukariotycznych.

Rybosomalny RNA (rRNA). Rybosom jest iiukleoproteinowa sH^^lurfl flylppla7matyczną, iiójra funkcjonuje jako „maszyneria" do syntezy białek na matrycach mRNA. Na rybosomacb cząsteczki mRNA i tRNA współdziałają w procesie translacji na swoiste cząsteczki białek informacji przepisanej uprzednio z genu. Składowe komponenty rybosomu ssaków, który ma masę cząsteczkową ok. 4,2 x \06 i szybkość sedymentacyjną 80 S (jednostek Svedberga) przedstawiono w tab. 37-2. Rybosom ssaków zawiera 2 główne podjednostki nukleoproteinowe, większą o masie cząsteczkowej 2,8 x 10s (60S) i podjednostkę mniejszą o masie cząsteczkowej 1.4 x 106 (40S). Podjednostka 60S zawiera 5S rybosomalny RNA {rRNA), 5,8S rRNA i 28S rRNA; znajduje się tam takŜe ponad 50 swoistych polipeptydów. Mniejsza podjednostka, czyli podjednostka 40S, zawiera pojedynczą cząsteczkę 18S rRNA oraz ok. 30 łańcuchów poiipeptydowych. Wszystkie cząsteczki rybosomalnego RNA, z wyjątkiem 5S rRNA, pochodzą z przekształcenia na terenie jądra pojedynczej prekursorowej cząsteczki 45S RNA (p. rozdz. 40). Cząsteczka 5S rRNA ma takŜe swoją własną cząsteczkę prekursorową, która jest niezaleŜnie przepisywana. Cząsteczki

rybosomalnego RNA, w duŜym stopniu zmetylowane, są na terenie jąderka upakowane wraz ze swoistymi białkami rybosomalnymi. W cytoplazmie rybosomy są dość trwale i zdolne do wejścia w wiele cykli transiacyjnych. Funkcje RNA w rybosomie ^ j ^ ^ j g

y

nie są w pełni poznane, lecz są one niezbędne do uformowania struktury rybosomu i zdają się mieć kluczową rolę w wiązaniu mRNA do rybosomów i w jego translacji. Mało cząsteczkowe trwałe RNA. W komórkach eukariotycznych znajdują się w duŜej ilości dyskretne, ewolucyjnie zachowywane, małocząstęczkowe, trwałe rodzaje RNA. Większość tych cząsteczek egzystuje w postaci rybonukleoprotein i są one rozmieszczone w jądrze, w cytoplazmie albo w obu tych częściach komórki. Mają one od 90—300 nukleotydów Tabela 37-3. Niektóre rodzaje mat o cząsteczkowych, trwałych RNA występujących w komórkach ssaków Nazwa

Długość (nukleotydów)

U1 U2 U3 U4 U5 U6

165 188 216 139 118 106

Liczba cząstecze k w komórce U10 6 5*10= 3* 105 1 * 10s 2* 10B 3*10 !

4,5 S 7S 7-2 7-3

91-95 280 290 300

3*10* 5*10= 1*10E 2*10s

Umiejscowienie N u kleopi azma/ hn R N A Nukleoplazma Jądro Nukleoplazma Nukleoplazma Ziarnistości perictiromatynowe Jądro i cytoplazma Jądro i cytoplazma Jądro i cytoplazma Jądro

STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW N U KLE IM OWYCH / 455

i występują w komórce w liczbie 100000- -1000000 kopii. Małe jądrowe

PIŚMIENNICTWO

cząsteczki rybonukleoprotein,

lluni T: DNA Makes RNA Miiko Protein. Ełsewier, 1983. Rich A et al: The chemistry and biology of lefthanded Z-DNA. Anrtu Rev Biochem 1984;53:847. Turner Pr Con trolli ng roi es for snurps. Naturę !985;31ó:105. Wa(son JD: The Doubk Helix. Atheneum, 1986. Watson JD, Crick FHC: Molecular structure of nucleic acids. Naturę 1953;171:737. Zieve GW: Two groups of smali stable RNAs. Celi

często nazywane ,,sniirps" mogą mieć znaczenie w regulacji genów. Cząsteczka U7 wydaje się odgrywać rolę w wytworzeniu prawidłowego końca 3' w histonowym mRNA. Cząsteczki U4 i U6 mogą być potrzebne przy obróbce poli(A), a cząsteczka Ul jest włączona w wycinanie intronu i obróbkę mRNA (p. rozdz. 39). W tabeli 37-3 przedstawiono niektóre cechy małocząsteczkowych trwałych RNA.

1981;25:296.

38

Organizacja i replikacja DNA Dary/ K. Granner, MD

WPROWADZENIE W organizmach prokariotycznyćh DNA jest na ogół nie związany z białkami innymi niŜ te, które są związane z replikacja i transkrypcją DNA, W organizmach eukariotycznych duŜa część DNA jest pokryta róŜnymi białkami. Białka te i DNA tworzą chromatynę, złoŜoną strukturę, która umoŜliwia liczne konfiguracje cząsteczki DNA i takie rodzaje kontroli, które są unikatowe dla organizmu eukariotycznego. Informacja genetyczna DNA chromosomu moŜe być przekazywana przez wierną replikację (DNA), lub teŜ moŜe podlegać wymianie w licznych procesach, takich jak „crossing over", rekombinacja i konwersja. Procesy te zabezpieczają zdolność do adaptacji i warunkują róŜnorodność organizmu, aie mogą takŜe prowadzić do powstania procesu chorobowego. Rephkacja DNA, proces bardzo złoŜony i uporządkowany, postępuje zgodnie z pokrnością 5' do 3' typową dla syntezy RNA opisanej w innych rozdziałach. W komórkach eukariotycznych replikacja DNA w chromosomach zaczyna się w licznych miejscach i postępuje jednocześnie w obu kierunkach. Do syntezy i naprawy DNA, procesów postępujących według reguły parowania zasad Watsona i Cricka, potrzebne są liczne enzymy.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Mgtacje są wynikiem zmian w sekwencji zasad DNA. Mutacje mogą nastąpić w wyniku nieprawidłowej replikacji, przefitie|SZ£d Łab iiaprawy DNA i zachodzą z częstością ok. 1 na kaŜdych 106 podziałów komórkowych. W wyniku mutacji, które zachodzą w kodujących lub regulatorowych regionach DNA, powstaje nie-

prawidłowy produkt genu^ Mutacja w obrębie komórki rozrodczej będzie przeniesiona na potomstwo (jest to tzw. pionowe przeniesienie choroby dziedzicznej). Liczne czynniki, obejmujące wirusy, związki chemiczne, promieniowanie nadfioletowe i promieniowanie jonizujące zwiększają tempo mutacji. Mutacje dotyczą komórek somatycznych i są. przenoszone na następne generacje komórek w obrębie organizmu. Jest oczywiste, Ŝe wiele chorób i prawdopodobnie większość nowotworów złośliwych powstaje wskutek horyzontalnej transmisji mutacji.

CHROMATYNA JEST MATERIAŁEM CHROMOSOMALNYM Z JĄDER KOMÓREK ORGANIZMÓW EUKARIOTYCZNYCH * _ak)a.da. się z bardzo długich dwupasmow-ych cząsteczek DNA i prawie równej masy małych białek zasadowych, zwanych htstonunik jak równieŜ z mniejszej ilości niehistonowych (większość z nich są to białka kwaśne i większe niŜ histony) uiiaiejiklŚsiRNA. Badania chromatyny przy zastosowaniu mikro-

* Tak daleko, jak to jest moŜliwe, dyskusja w tym rozdziale oraz w rozdz. 39, 40 i 41 będzie się odnosiła do ssaków, które naleŜą oczywiście do wyŜszych organizmów eukariotycznych. W pewnych przypadkach będzie konieczne odnosić się do spostrzeŜeń poczynionych na organizmach prokariotycznych, takich jak bakterie i wirusy. W tych przypadkach będą to takŜe informacje, które mogą być ekstrapolowane na ssaki. Podział materiału przedstawionege w rozdz, 37—41 jest cokolwiek arbitralny, a opisane procesy nie powinny być odbierane jako procesy niezintegrowane i wzajemnie niezaleŜne.

ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 457

skopu elektronowego wykazafy zbite, kuliste cząsteczki, zwane nukleosomami, które mają ok. 10 nm średnicy i są powiązane pasmami DNA (ryc. 38-1). ----.""

Ryc. 38-1. Zdjęcie z mikroskopu elektronowego nukleosomów przywiązanych do nici kwasu nuk(einowego (DNA), (Biały odcinek odpowiada 2,5 nm.) (Reprodukowane za zgodą z: Oudet P, Gross-Beliard M., Chambon P.: Electron microscopic and biochemical evidence that chromaiin structure is a repeating unit Celt 1975; 4:281)

Histony są najbardziej obfitymi białkami chromatyny Jlistony-^są nieco heterogenne, składają się z wielu blisko spokrewnionych białek. Wśród histonów najsłabiej związane z chromałyrtą są histony HI i dlatego są łatwo usuwane roztworem soli, w wyniku czego chromatyna staje się rozpuszczalna. Wyizolowany rdzeń nukleo.somów zawiera 4 klasy histonów: H2A, H2B, H3 i H4. Struktura słabo lizy no-bogatych histonów — H2A i H2B — jest w znacznym stopniu zachowywana (konserwowana) między gatunkami, podczas gdy struktura arginino-bogatych histonów — H3 i H4 — jest ściśle zachowywana między gatunkami. Takie silne zachowywanie nasuwa wniosek, Ŝe czynność histonów jest identyczna we wszystkich komórkach eukanotycznych i Ŝe cała cząsteczka (histonu) jest włączona swoiście w pełnienie takiej funkcji. 2/3 końca C cząsteczek histonów ma zwykły skład aminokwasów, natomiast1 /3 koń-

ca N ma większość aminokwasów zasadowych. Wymienione 4 histony rdzenia nuklcosoniu podlegają 5 rodzajom modyfikacji w reakcjach kowalencyjnych: acety lacji, metylacji, fos fory lacji, ADP-ryboŜylaćji i związaniu .kowalencyjnemu (wyłącznie histonu H2A) z jądrowym białkiem ubikwityną. Te modyfikacje histonów zapewne odgrywają pewną mało jeszcze poznaną rolę w strukturze ehromatyny i w jej czynności. Histony usunięte z ehromatyny oddziaływają wzajemnie w bardzo swoisty sposób.Jrj3JJ34, agregują, tworząc tetramer zawierający po 2 czą5iecAi kaŜdego z nich (H3/H4)2, podczas gdy H2A i H2B tworzą, dimery (H2A-H2B) i wyŜsze kompleksy oligomerów (H2A-H2B)n. W małym stęŜeniu soli tetramer H3-H4 nie asocjuje z dimerem lub oligomerem H2A-H2B, a Hl nie łączy się wprost z innymi histonami w roztworze. NukJeosom jest strukturą zawierającą h i stan i DNA Gdy tetramer H3-H4 i dimer H2A-H2B są zmieszane z czystym dwupasmowym DNA, wówczas obserwuje się ten sam wzór dyfrakcji promieni X, jak w świeŜo izolowanej chromatynie. Badania w mikroskopie elektronowym potwierdzają obecność zrekonstruowanych nukleosomów. Rekonstrukcja nukleosomów z DNA i histonów H2A, H2B, H3 i H4 nie zaleŜy od tego, czy róŜne te komponenty pochodzą z tych samych komórek. Do rekonstrukcji rdzenia nukleosomu nie są potrzebne ani histonHl, ani białka niehistonowe. W nukleosomie DNA jest dodatkowo nawinięty, jako lewoskrętny heliks, na powierzchni podobnego do dysku oktameru histonów, składającego się z tetrameru H3-H4 (H3/H4)2 zajmującego część centralną nukleosomu i 2 dimerów H2A-H2B (ryc. 38-2). Histony rdzenia nukleosomu oddziaływają z DNA na wewnętrznej powierzchni superzwoju. Sam tetramer (H3/H4)2 narzuca DNA właściwości podobne do tych, jakie ma cały nukleosom; tetramer odgrywa przeto główną rolę w tworzeniu nukleosomu. Dodanie 2 dimerów H2A-H2B stabilizuje pierwotną cząsteczkę i wiąŜe silnie 2 dodatkowe półskoki spirali DNA, uprzednio jedynie luźno związane do tetrameru (H3/H4)3.1,75 saperhelikalnego zwoju DNA owija się więc wokół powierzchni oktameru histonu, chroniąc 146 par zasad DNA i tworząc rdzeń aukleosotnti (ryc. 38-2). Gdy DNA owija się wokół powierzchni oktameru

458 / ROZDZIAŁ 38

-H1 O klamer 148 par zasad historio wychronionych (1,75 zwoju superbelikalnego} + H1 166 par zasad (2 skręty superhetikalne) chronione □raz eksponowany (niechroniony) DNA łącznikowy

Ryc. 38-2. Model struktury nukleosomu {nalewo) i części rdzennej nukleosomu (na prawo), w których DNA jest owinięte wokół powierzchni płaskiego cylindra białkowego składającego się z 2 cząsteczek kaŜdego z histonów H2A, H2B, H3 i H4. Histon H1 (obszar zaciemniony) powoduje zwiększenie liczby chronionych par zasad. (Reprodukowano za zgodą z: Laskey R. A., Earnshaw W. C: Nucleosome assembly. Nawre 1980, 286:763).

histonu, tworząc nukleohiston, kolejność kontaktu cząsteczki DNA z histonami zachodzi w następującym porządku: H2A—H2B—H4—H3—H3—H4—H2B—H2A

Histon Hl wiąŜe się. z DNA wówczas, gdy cząsteczka DNA wchodzi i wychodzi z rdzenia nukleosomu w taki sposób, Ŝe łączy 2 zwoje superspirali DNA długości 166 par zasad, tworząc nukleosom (ryc. 38-2). Formowanie nukleosomów jest prawdopodobnie wspomagane przez kwaśne białko jądrowe nukleoplazminc. Mocne zasadowe histony mogą wiązać silnie kwaśny DNA przez tworzenie mostków typu soli. Oczywiście takie nieswoiste oddziaływania histonów z DNA byłyby destrukcyjne dla tworzenia nukleosomów i funkcji chromatyny. Niikleoplazmina jest pentamerem kwaśnego białka, które nie wiąŜe się ani z DNA, ani z chromatyną, ale moŜe oddziaływać odwracalnie z oktamerem histonowym w taki sposób, Ŝe histony nie mogą przylegać nieswoiście do ujemnie naładowanych powierzchni, takich jak DNA. Wydaje się zatem, Ŝe nukjeopiazmina utrzymuje w iadrze środowisko jonowe, prowadza^e_(io-siw)isiego_oddziaływariv& histonów i DNA oraz tworzenia nukleosomów. Gdy zostaje .utworzona. struktura~~ńukleosomu, nukleoplazmina zostaje uwolniona z histołłów. Nukieosomy wykazują preferencję do pewnych regionów na szczególnych cząsteczkach DNA, ale podstawa takiego nieprzypad-

kowego rozmieszczenia nukleosomów, zwanego fazowaniem, nie jest znana. Prawdopodobnie jest to związane ze względną fizyczną giętkością pewnych sekwencji nukleotydowych, które są zdolne do przyjęcia formy załamanej (kinking) w obrębie superspirali. Dalsze upakowanie nukleosomów w jądrach jest zaleŜne od interakcji histonów Hl z dwupasmową cząsteczką DNA wiąŜącą nukieosomy. Topologia oddziaływania dwupasmowego DNA z histonami Hl, z wytwarzaniem regionów przerywników między nukleosomami, nie jest bliŜej poznana.

STRUKTURY WYśSZEGO RZĘDU DECYDUJĄ O UPAKOWANIU CHROMATYNY Chromatyną badana za pomocą mikroskopu elektronowego wykazuje, oprócz struktury samych nukleosomów, 2 struktury wyŜszego rzędu: nić chromatynową 10 nm i 25- 30 nm. Struktura podobna do dysku nukleosomu ma średnicę 10 nm i wysokość 5 nm. Nić 10 nm składa się z nukleosomów ułoŜonych w taki sposób, Ŝe ich brzegi się spotykają, a ich płaskie powierzchnie leŜą równolegle do osi nici (ryc. 38-3). Nić 10 nm jest prawdopodobnie dodatkowo skręcona, tworząc 30 nm nić chromatynową o 6—7 nukleosomach na 1 skok (ryc. 38-3). KaŜdy zwój superspirali jest względnie płaski, a powierzchnie nukleosomów następujących po Oś włókna Włókno 30 nm

Ryc. 38-3. Włć kro 10 nm

Proponowana struktura 30 nm włókna chromatyny, składającego się z 10 nm' włókna nukleosomatnego dodatkowo skręconego. Oś 30 nm włókna jest prostopadła do płaszczyzny papieru.

ORGANIZACJA I REFLIKACJA DNA / 459

sobie skrętów są prawie równolegle jedna względem drugiej. Histony Hl wydają się stabilizować nić 30 nm, ale ich pozycja i pozycja przerywnika DNA o róŜnej długości nie zostały jeszcze zdefiniowane. Jest moŜliwe, Ŝe nukleosomy mogą tworzyć róŜne upakowane struktury. Aby wytworzyć chromosom mitotyczny 30 nm nić musi ulec dalszemu, ok. 100-krotnemu, upakowaniu swojej długości (p. niŜej). W chromosomach interfazowycti nici chromatyny są zorganizowane w pętle lub jlomeny ,p długości 30000 100 000 par zasad zakotwiczone w jądrze w strukturze szkieletowej (lub macierzy podporowej). W obrębie tych domen niektóre sekwencje DNA mogą być umiejscowione w sposób nieprzypadkowy. Sugeruje się, Ŝe kaŜda wypętlona domena chromatyny odpowiada oddzielnej funkcji genetycznej zawierając zarówno kodujące, jak i niekodujące regiony genu. NIEKTÓRE REGIONY CHROMATYNY SĄ „AKTYWNE"; INNE REGIONY SĄ „NIEAKTYWNE" Ogólnie kaŜda komórka indywidualnego organizmu wielokomórkowego zawiera tę samą informację genetyczną w postaci takich samych sekwencji DNA. Zatem róŜnice między róŜnymi rodzajami komórek w obrębie jednego organizmu mogą być wytłumaczone zróŜnicowaną ekspresją wspólnej informacji genetycznej. Chromatyna zawierająca geny aktywne (tj. chromatyna aktywna transkrypcyjnie) róŜni się pod wieloma względami od regionów nieaktywnych. Struktura nukleosomalna aktywnej chromatyny jest zmieniona lub w bardzo aktywnych regionach jest jej brak. DNA w aktywnej chromaty_nie zawiera obszerne regiony (długości ok. TOOOOO par zasad), które są wraŜliwe na trawienie iiuklca/ą. taką jak DNaza I. WraŜliwość regionów chromatyny na DNazę I, które są aktywnie transkrybowane, odzwierciedla raczej tylko potencjał dla transkrypcji niŜ samą transkrypcję, a w wielu systemach jest skorelowana ze względnym brakiem 5'-metylodeoksycytydyny w DNA. W obrębie duŜych regionów aktywnej chromatyny" istnieją krótkie odcinki o 100—300 nukleotydach, które wykazują nawet większą {20-krotną) wraŜliwość na DNazę I. Te miejsca nadwraŜliwe prawdopodobnie wynikają z konformacji strukturalnej, która sprzyja dostępno-

Jdnukkazy-DN A, Regiony te są zwykle umiejscowione bezpośrednio przed aktywnym genem i w regionach tych struktura nukleosomalna jest przerwana w wyniku związania białek niehistonowych (p. rozdz. 39 i 41). Wydaje się, Ŝe w wielu przypadkach, gdy gen jest zdolny do transkrypcji, musi on mieć nadwraŜliwe miejsce w chromatynie w regionie bezpośrednio poprzedzającym gen. Białka biorące udział w transkrypcji oraz białka zaangaŜowane w utrzymaniu dostępu do matrycowego pasma DNA biorą udział w powstawaniu miejsc nadwraŜ-liwych. Miejsca nadwraŜliwe często dostarczają pierwszej wskazówki odnośnie do obecności i umiejscowienia elementu kontrolującego transkrypcję. Chromatyna nieaktywna transkrypcyjnie jest w interiazle gęsto upakowana, co moŜna stwierdzić przy uŜyciu mikroskopu elektronowego. Nazywa sieją heterochromatyną. Chromatyna aktywna" transkrypcyjnie wybarwia się jako substancja mniej gęsta i określa się ją jako euchromatyne. Euchromatyna replikuje się zwykle wcześniej w cyklu komórkowym ssaków niŜ heterochromatyną (p. niŜej). Są 2 typy heterochromatyny: konstytutywna i fakultatywna, Heterochromatyną konstytutywna jest zawsze upakowana, a "więc jest nieaktywna. Heterochromatyne konstytutywną znajduje się w regionach w pobliŜu centromeru i w końcach chromosomów (w telomerach). He ter ochrom atyoa fakultatywna jest niekiedy skondensowana, ale kiedy indziej jest aktywnie przepisywana, a. więc nieskondensowana i mająca wygląd euchromatyny. Spośród 2 Ŝeńskich chromosomów X u ssaków 1 chromosom jest prawie całkowicie nieaktywny transkrypcyjnie i jest chromosomem heterochromatycznym. JednakŜe heterochromatyczny chromosom X ulega dekondensacji w okresie gametogenezy j staje się aktywnym transkrypcyjnie we wczesnej embriogenezie; tak więc jest to chromosom o fakultatywnej heterochromatynie. Niektóre komórki insektów, np. Chironomus, zawierają chromosomy olbrzymie, które uległy replikacji w 10 cyklach, ale siostrzane chromatydy nie oddzieliły się. Kopie DNA leŜą jedna obok drugiej w precyzyjnym układzie i w rezultacie tworzą chromosom prąŜkowany, zawierający regiony chromatyny skondensowanej i jasne prąŜki chromatyny bardziej rozproszonej. Transkrypcyjnie aktywne regiony tych chromosomów politenicznych o silnie rozluźnionej budowie tworzą „pufy" zawierające enzymy

460 / ROZDZIAŁ 38

Bp-

Ryc. 38-4. Korelacja między aktywnością polimerazy RNA klasy II a syntezą RNA. U larwy Chironomus tentans wiele genów aktywuje się pod wpływem szoku cieplnego (39X, 30 min). A: Rozmieszczenie RNA polimerazy B (zwanej takŜe klasą II) w izolowanym IV chromosomie ślinianki. Enzym uwidoczniono przez immunofluorescencję, stosując przeciwciało przeciw pohmerazie. Swoiste prąŜki w chromosomie IV oznaczono symbolami 5C i BR3; pufy pokazuje strzałka, B: Auto radiogram 3 chromosomu IV po inkubacji z H-urydyną w celu wyznakowania RNA. Zwróć uwagę na zgodność fiuorescencji z obecnością radioaktywnego RNA (punkty). Odcinek skali =7 \im (Reprodukowano za zgodą z: Sass H.: RNA polymerase B in potytene chromosomes. Celi 1982; 28:274. Copyright © 1982 by the Massachusetts Instituteof Technology).

odpowiedzialne za transkrypcję; są to miejsca, gdzie przebiega synteza RNA (ryc. 38-4).

DNA JEST ZORGANIZOWANY W POSTACI CHROMOSOMÓW W met a fazie chromosomy ssaków wykazują 2-osiową symetrie z identycznymi siostrzanymi chromatydami połączonymi w centromerze, którego względne połoŜenie jest charakterystyczną cechą danego chromosomu {ryc. 38-5). KaŜda siostrzana diromatyda zawiera cząsteczkę dwupasmowego DNA, W czasie Lnterfazy upako-

Ryc. 38-5. Dwie siostrzane chromatydy ludzkiego chromosomu Nr12. * 27,850. (Reprodukowanoza zgodą z: DuPraw E. J.: DNA and Chromosomes. Holt, Rinehart, and Winston, 1970).

wanie cząsteczki DNA jest mniej zbite niŜ w skondensowanym chromosomie metafazowym. Chromosomy metafazowe są nieaktywne transkrypcyjnie. Ludzki geno m haploidalny skiada się z 3,5 x 10° par zasad, czyli par nukleotydów i ok. 1,7 x 107 nukleosomów. Zatem kaŜda z 23 chromatyd w ludzkim genomie haploidalnym zawiera średnio 1,5 x 10B nukleotydów w jednej dwupasmowej cząsteczce DNA. Długość kaŜdej cząsteczki DNA musi być zredukowana ok. 8000 razy, aby się wytworzyła struktura skondensowanego chromosomu interfazowego! W chromosomach, metafazowych 25— 30 nm nici chro-matynowe są takŜe sfałdowane w upetlone domeny, których proksymalne końce są zakotwiczone do niehistonowego białkowego rusztowania. Stopień upakowania kaŜdego rzędu struktury DNA jest podsumowany w tab. 38-1. Upakowanie nukleoprotein w obrębie chromatyd nie jest przypadkowe, o czym świadczy charakterystyczny wzór po wybarwieniu chro-

ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 461 Tabela 38-1. Współczynniki upakowania kaŜdego rodzaju struktur DNA Współczynnik Postać w chrnmatynie upakowania 1,0

„Nagi" dwupasmowy heliks

1-10

DNA 10 nm nić nukleosomalna 25—30 nm nić chromatynowa zawierająca superhelikalne nukleosomy Skondensowane pętle chromosomów rnetafazowych

40-60 8000

mosomów swoistymi barwnikami, takimi jak kwinakryna lub barwnik Giemsy (ryc. 38-6). Wzór wybarwiania (prąŜkowania) całego zestawu chromosomów od osobnika do osobnika w obrębie jednego gatunku jest wysoce powtarzalny; niemniej róŜni się on znacznie od innych, nawet blisko spokrewnionych, gatunków. Upakowanie nukleoprotein w chromosomach wyŜszych organizmów eukariotycznych musi być w jakiś sposób zaleŜne od gatunkowo swoistych cech cząsteczek DNA.

WIĘKSZA CZĘŚĆ GENOMU SSAKÓW NIE JEST TRAlMSKRYBOWANA Genom haploidaJny kaŜdej komórki ludzkiej składa się z 3,5 x 10a par zasad DNA podzielonych na 23 chromosomy. Cały genom haploidalny składa się z DNA wystarczającego na zakodowanie ok. 1,5 min par genów. JednakŜe badania nad tempem mutacji i złoŜonością genomów organizmów wyŜszych wybitnie sugerują, Ŝe u ludzi występuje tylko ok. 100000 rodzajów podstawowych białek. To nasuwa wniosek, Ŝe większość DNA nie jest DNA kodującym, czyli zawarta w nim informacja nie jest nigdy tłumaczona na sekwencje aminokwasów cząsteczki białkowej. Z pewnością pewien nadmiar sekwencji DNA słuŜy do regulacji ekspresji genów w czasie rozwoju, róŜnicowania i adaptacji do środowiska. Pewien nadmiar tworzą sekwencje wtrącone, które rozdzielają kodujące regiony genu, ale większość nadmiaru sekwencji składa się z wielu rodzin sekwencji powtarzających, którym nie przypisuje się jeszcze jasno określonych funkcji. DNA eukariotycznego genomu moŜe być

i 10

\7

11

*

14

16 ■

*

19

20

21 t* •>«

17

4% 22 Ryc. 38-6. Ludzki kariotyp (człowieka z normalnym zestawem 46 XY), w którym chromosomy wybawiono barwnikiem wg metody Giemsy i ułoŜono stosownie do Konwencji Paryskiej (Dzięki uprzejmości H. Ławce i F. Conte),

462 / ROZDZIAŁ 38

podzielony na róŜne „klasy sekwencji". S4 to: sekwencje unikatowe, czyli niepowtarzające DNA i sekwencje DNA powtarzające, W genomie haploidalnym unikatowe sekwencje DNA zawierają zwykle pojedyncze kopie genów kodujących białka. Sekwencje powtarzające DNA w genomic haploidalnym zawierają sekwencje, które zmieniają się odnośnie do liczby kopii od 2 aŜ do 107 kopii na 1 komórkę. Ponad połowę DNA w organizmach eukariotycznych stanowią sekwencje unikatowe, czyli niepowtarząjące Dane szacunkowe (jak równieŜ rozmieszczenie powtarzających DNA) są oparte na licznych technikach hybrydyzacji DNA-RNA. Podobne techniki są stosowane do określenia liczby aktywnych genów w populacji unikatowych sekwencji DNA. W droŜdŜach, niŜszym organizmie eukariotycznym. występuje ekspresja ok. 4 000 genów. W typowych tkankach wyŜszych organizmów eukariotycznych (np. wątroba i nerka ssaków), ekspresji ulega 10 000-15 000 genów. Regiony kodujące są często przerywane sekwencjami wtrąconymi Kodujące regiony DNA, z których transkrypty ostatecznie pojawiają się w cytoplazmie jako pojedyncze cząsteczki mRNA, są zwykle poprzerywane w gen omie duŜymi sekwencjami wtrąconymi niekodującego DNA. Wskutek tego pierwotne transkrypty DNA-hnRNA zawierają niekodujące sekwencje RNA, które muszą być usunięte w takim procesie, w którym takŜe zachodzi wzajemne połączenie odpowiednich segmentów kodujących z wytworzeniem dojrzałego mRNA. Większość sekwencji kodujących pojedynczy mRNA jest poprzerywanych w genomie (a zatem i w pierwotnym transkrypcie) przynajmniej przez 1, a w niektórych przypadkach aŜ przez 50 niekodujących sekwencji wtrąconych (introny). W większości przypadków introny są znacznie dłuŜsze niŜ przyległe regiony kodujące (eksony). Obróbkę pierwotnego transkryptu, która obejmuje zabranie in tron ów i połączenie przyległych eksonów, opisano szczegółowo w rozdz. 39. Funkcja sekwencji wtrąconych, czyli iDtronów nie jest jasna. Mogą one słuŜyć do rozdzielenia domen funkcjonalnych (eksonów) zakodowanej informacji w takiej postaci, która pozwala, aby rearanŜacje genetyczne przez rekombinację

przebiegały szybciej niŜ w przypadku, gdyby wszystkie regiony kodujące dla danej funkcji genetycznej były w postaci ciągłej. Takie zwiększone tempo rearanŜacji genetycznej funkcjonalnych domen moŜe prowadzić do szybkiej ewolucji funkcji biologicznych. W ludzkim DNA przynajmniej 20—30% genomu składa się z sekwencji powtarzających Powtarzające sekwencje DNA mogą być ogólnie sklasyfikowane jako umiarkowanie powtarzające i często powtarzające. Często powtarzające sekwencje składają się z odcinków o długości 5—500 par zasad, powtórzonych wiele razy w postaci tandemu. Sekwencje te są zwykle zgrupowane w centromerach i telomerach chromosomu i występują w ok. 1—10 min kopii w genomie haploidalnym. Sekwencje te są transkrypcyjnie nieaktywne i mogą odgrywać w chromosomie rolę strukturalną. Umiarkowanie powtarzające sekwencje, które występują w genomie w liczbie mniejszej niŜ 106 kopii na genom haploidalny, nie są zgrupowane, lecz rozproszone wśród sekwencji unikatowych i są klasyfikowane jako krótkie lub długie. Długie sekwencje rozproszone mają długość 5000—7000 par zasad i występują w genomie haploidatnym w liczbie 1000—100000 kopii. Te długie rozproszone sekwencje są otoczone z kaŜdego końca przez sekwencje powtórzone wprost (ang, direct repeats) o 30O—600 parach zasad (ryc. 38-7), które bardzo przypominają długie końcowe sekwencje powtarzające (ang. long terminal repeats, LTR) występujące na końcach zintegrowanych DNA retrowirusów, W wielu przypadkach te długie sekwencje rozproszone

Dtugie rozproszone sekwencja powtarzające (5 - 7tyslęcypar zasad) abc a'b'c'

abc a'b'c*

Sekwencje powtarzająceproste (300 -60G par zasad)

Ryc. 38-7. Obraz długich rozproszonych sekwencji powtarzających z końcowymi krótkimi prostymi sekwencjami powtarzającymi (abc) i ich sekwencjami komplementarnymi (a'b'c').

ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 463

są transkrybowane przez potimerazę U i zawierają „czapeczki metylacyjne" nieodróŜnialne od tych zawartych w mRNA. Krótkie sekwencje powtarzające tworzą rodzi-

ny spokrewnionych, ale indywidualnie róŜnych, sekwencji o długości od kilku do kilkuset par nukleotydów. Krótkie sekwencje powtarzające są aktywnie przepisywane albo jako integralne składowe intronów, albo jako dyskretne elementy przepisywane przez DNA-zaleŜną polimerazę RNA III (p. rozdz. 39). Wśród krótkich rozproszonych sekwencji powtarzających w genomie ludzkim rodzina Alu występuje w 500 000 kopii na genom haploidalny i stanowi przynajmniej 3—6% ludzkiego genomu. Składowe ludzkiej rodziny Alu i ich spokrewnione analogi u innych zwierząt są przepisywane jako integralne komponenty hnRNA lub jako dyskretne cząsteczki RNA, zawierające dobrze poznane 4,5S RNA i 7S RNA. Jednostki naleŜące do tych szczególnych rodzin są bardzo konserwatywne w obrębie gatunków, jak równieŜ w obrębie gatunków ssaków. Struktury krótkich sekwencji powtarzających, włączając w to rodzinę Alu, przypominają końcowe sekwencje powtarzające retrowirusów i mogą być elementami przemieszczającymi się, zdolnymi do „przeskakiwania" z róŜnych miejsc do innych w obrębie genomu (p. niŜej).

MATERIAŁ GENETYCZNY MOśE PODLEGAĆ ZMIANOM I MOśE ULEGAĆ REARANśACJI Zmiany sekwencji zasad purynowych i pirymidynowych w genie spowodowane zamianą, ubytkiem lub insercją jednej lub więcej zasad mogą prowadzić do zmienionego produktu genu, którym to produktem w większości przypadków jest białko. Taka zmiana materiału genetycznego daje mutację, której następstwa będą omawiane dokładnie w rozdz. 40. Rekombinacja chrom os o ma I na jest jedną z dróg rearanŜacji materiału genetycznego Organizmy prokariotyczne i eukariotyczne wykazują zdolność wymiany informacji genetycznej między podobnymi, czyli homologicznymi, chromosomami. Zdarzenie wymiany, czyli rekombinacja, zachodzi przede wszystkim w okresie mejozy w komórkach ssaków i wymaga równoległego ustawienia homologicznych

Ryc. 38-8. Proces rekombinacji (crossing over) między homologicznymi chromosomami prowadzący do powstania rekombinantów chromosomowych.

chromosomów, co prawie zawsze zachodzi z wielką precyzją. Na rycinie 38-8 pokazano, jak przebiega proces ,,crossing-over". Wynikiem tego procesu jest równa i wzajemna wymiana informacji genetycznej między homologicznymi chromosomami. Jeśli homologiczne chromosomy mają róŜne allele łych samych genów, crossing-over moŜe spowodować zauwaŜalne i dziedziczne róŜnice w sprzęŜeniu genów. W rzadkich przypadkach, gdy ułoŜenie homologicznych chromosomów nie jest dokładne, crossing-over lub zdarzenie rękombinacyjne powodują nierówną wymianę informacji. Jeden z chromosomów moŜe otrzymać mniej materiału genetycznego, a zatem moŜe mieć delecje, podczas gdy drugi

464 / ROZDZIAŁ 38

LEPORE

Ryc. 38-9. Proces nierównowaŜnej rekombinacji w regionie genomu ssaków generujących geny strukturalne dia hemoglobiny i powstawanie nierównowaŜnych produktów rekombinacji 8-6 Lepore i 0-5 Lepore. Przykłady pokazują miejsca regionów, w których zaszła rekombinacja, (Reprodukowane za zgodą S z: Clegg J, B., Weetherall D, J.: |3 Thalassemia: Time for a reappraisal? Lancet 1974; 2:133).

partner pary chromosomów otrzymuje więcej materiału genetycznego w postaci dołączenia lub podwojenia (ryc. 38-8), Nierówny crossing-over występuje u ludzi, na co wskazuje obecność hemoglobin typu Lepore lub anty-Lepore. Nierówny crossing-over oddziałuje na tandemową organizację powtarzających DNA czy to będą np. spokrewnione geny globiny, jak na ryc, 38-9, czy bardziej liczne powtarzające sekwencje DNA. Nierówny crossing-over, powtarzający w wyniku „poślizgu", powoduje zwiększenie lub zmniejszenie liczby kopii rodziny sekwencji powtarzających i moŜe mieć udział w ekspansji i utrwalaniu wariantów w obrębie tego uporządkowanego obszaru. Niektóre wirusy mogą być włączone w chromosomy Niektóre wirusy bakteryjne (bakteriofagi) są zdolne do rekombinacji z DNA bakteryjnego gospodarza w taki sposób, Ŝe informacja genetyczna bakteriofaga zostaje wbudowana linijnie do genetycznej informacji gospodarza. Ta integracja, która jest formą rekombinacji, zachodzi w mechanizmie pokazanym schematycznie na ryc. 38-10, Struktura kolistego genomu bakteriofaga zostaje przerwana, podobnie jak cząsteczka DNA gospodarza; odpowiednie końce są ponownie spojone z zachowaniem polarności. W celu uproszczenia, DNA bakteriofaga jest pokazany jako cząsteczka wyciągnięta („linijna") w postaci zintegrowanej w cząsteczce bakteryjnego DNA; często pozostaje ona równieŜ jako zamknięte koło. Miejsce, w którym genom bakteriofaga integruje, czyli rekombinu-

je, 7. genomem bakteryjnym jest wybrane przez 2 mechanizmy. Jeśli bakteriofag zawiera sekwencje DNA homologiczne do sekwencji cząsteczki DNA gospodarza, to moŜe zajść zdarzenie rękombinacyjne analogiczne do zdarzenia, jakie zachodzi między homologicznymi chromosomami. JednakŜe niektóre bakteriofagi syntetyzują białka, które wiąŜą swoiste miejsca

I

I

I

=t

ć. 38-10. Integracja kołowego genomu (zawierającego geny A, B i C) z cząsteczką DNA gospodarza (zawierającą geny 1 i 2) i następujące uboŜenie genów.

ORGANIZACJA I BEPLIKACJA DNA / 465

w chromosomach bakteryjnych z niehomologicznymi miejscami określonej cząsteczki DNA bakteriofaga. Integracja taka zachodzi w określonym miejscu i nazywa się „miejscowo swoista". Liczne wirusy zwierzęce, zwłaszcza wirusy onkogenne, albo bezpośrednio, albo w przypadku wirusów RNA przez transkrypty DNA, mogą być integrowane w chromosomy komórek ssaków. Integracja DNA wirusów zwierzęcych do genomu zwierzęcego na ogół nie jest „miejscowo swoista". Transpozycja moŜe wytwarzać „przekształcone geny" W komórkach eukariotycznych małe elementy DNA, które na pewno nie są wirusami, mają zdolność do transpozycji, czyli opuszczania i włączania się w obręb genomu gospodarza, w taki sposób, Ŝe funkcja sąsiadujących sekwencji DNA zostaje naruszona. Te ruchome (mobilne) elementy, są czasami nazywane „skaczącym DNA", mogą nieść ze sobą flankujące odcinki DNA i przeto mogą głęboko wpływać na procesy ewolucji. Jak wspomniano wyŜej, rodzina Alu średnio powtarzających sekwencji DNA ma charakterystyczne cechy strukturalne, podobne do odcinków końcowych retrowirusów, które u tych ostatnich s4 odpowiedzialne za włączanie i opuszczanie genomu ssaków. Bezpośrednim dowodem na transpozycję innych małych elementów DNA w genomie człowieka było odkrycie „przekształconych genów" dla cząstek i mm un o globuliny, cząsteczek a-globiny i wielu innych. Te przekształcone geny składają się z sekwencji DNA identycznych lub prawie identycznych do tych, jakie znajdują się w informacyjnym RNA kodującym produkt odpowiedniego genu, W takich sekwencjach DNA, nietranskrybowany region 5', region kodujący bez intronu i 3' sekwencja (poli)A są ułoŜone w sposób ciągły. Takie szczególne ułoŜenie sekwencji DNA musiało powstać przez wsteczną traskrypcję przekształconej cząsteczki informacyjnego RNA, z której zostały zabrane regiony intronowe i dodany szlak (poIi)A. Jedynym poznanym mechanizmem, który mógł być uŜyty do integracji odwrotnego transkryptu do genomu jest zdarzenie typu transpozycji. Istotnie, takie „przekształcone geny" mają krótkie końcowe sekwencje powtarzające przy kaŜdym ze swych końców, podobnie jak sekwencje, które uległy transpozycji u niŜszych organizmów. Niektóre z tych przekształconych genów 30 — Biochemia

w trakcie ewolucji zostały przypadkowo zmienione tak, Ŝe obecnie mają nonsensowne kodony, które uniemoŜliwiają ekspresję tych genów (p. rozdz. 40). Geny takie określa się nazwą „pseudogeny". Konwersja genu powoduje rearanŜację Oprócz nierównego ,,crossing-over" i transpozycji, trzeci mechanizm moŜe wpływać na gwałtowne zmiany w materiale genetycznym. Podobne do siebie sekwencje na homologicznych lub niehomologicznych chromosomach mogą przypadkowo wytwarzać miedzy sobą sparowane struktury dwupasmowe i eliminować wszystkie sekwencje niesparowane. Proces ten moŜe prowadzić do przypadkowego utrwalenia w rodzinie sekwencji powtarzających jednego lub drugiego wariantu i przez to powodować, Ŝe sekwencje składowe rodzin powtarzającego DNA stają się jednolite. Ten ostatni proces nazywany jest konwersją genu.

W diploidalnych organizmach eukariotycznych, takich jak ludzie, komórki, które przeszły przez fazę S, zawierają tetraploidalną ilość DNA. Występuje ona w postaci siostrzanych chromatyd w kaŜdej parze chromosomów. KaŜda z tych siostrzanych chromatyd zawiera identyczną informację genetyczną, poniewaŜ kaŜda z nich jest produktem semikonserwatywnej replikacji oryginalnej macierzystej cząsteczki DNA tego chromosomu. Między tymi genetycznie identycznymi siostrzanymi chromały dam i zachodzi crossing-over. Oczywiście takie wymiany siostrzanych chromatyd (ryc. 38-11) nie

mają konsekwencji genetycznych tak długo, jak długo wymiana jest wynikiem równego crossing-over. W komórkach ssaków w czasie prawidłowego rozwoju lub róŜnicowania zachodzą niektóre interesujące rearanŜację genów. Na przykład u myszy geny VL i CL dla pojedynczej cząsteczki immunoglobuliny (p. rozdz. 41) są w germinalnej linii DNA oddalone od siebie. W DNA komórek zróŜnicowanych wytwarzających immunogiobulinę (komórki plazmatyczne) te same geny VL i CL fizycznie zbliŜyły się do siebie w obrębie genomu i utworzyły 1 jednostkę transkrypcyjną. Jednak nawet wówczas taka rearanŜacja DNA w czasie róŜnicowania nie spowodowała ciągłego ułoŜenia genów VL i CL w cząsteczce DNA. Zamiast tego w cząsteczce DNA są zawarte rozproszone, czyli wtrącone, sekwencje o długości ok. 1200 par zasad w miej-

466 / ROZDZIAŁ 38

Ryc, 38-11. Wymiany siostrzanych chromatyd między ludzkimi chromosomami Wymiany wykryło przez barwienie wg Giemsy chromosomów komórek, które miały 2 cykie replikacji w obecności bromodeoksyurydyny. Strzałki pokazują niektóre regiony wymian (Dzięki uprzejmości S Wolff i J. Sodycote).

scu lub sąsiedztwie połączenia regionów V i C. Te wtrącone sekwencje są przepisane na RNA wraz z genami VL i CL, a sekwencje wtrącone zostają usunięte z RNA w czasie jego przekształceń w obrębie jądra (p. rozdz. 39 i 49). SYNTEZA I REPLIKACJA DNA SĄ ŚCIŚLE KONTROLOWANE adaniem., replikacji DNA jest dostarczenie potomstwu mformagi genetycznej zawartej w"cząsteczćemaderzyslej. Repiikacja DNA musi więc być kompletna i przeprowadzona z duŜym stopniem wierności, aby utrzymać stabilność genetyczną w obrębie organizmów i

gatunków. Proces replikacji DNA jest złoŜony i obejmuje wiele funkcji komórkowych i wiele procesów weryfikacyjnych, gwarantujących wierność replikacji. Arthur Kornberg dokonał pierwszych obserwacji enzymologicznej repli-

kacji DNA u Escherichia coli, a następnie opisał występowanie w tym organizmie enzymu, nazwanego obecnie polimerazą DNA I. Ten enzym ma liczne aktywności katalityczne, złoŜoną strukturę i powinowactwo do trifosforanów 4deoksyrybonukleozydów adeniny, guaniny, cytozyny i tyminy. Reakcja polimeryzacji katalizowana przez polimerazę DNA I u £ colt słuŜyła jako prototypowa reakcja dla wszystkich polimeraz DNA zarówno u organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych, choć obecnie wiadomo, Ŝe główna rola tej polimerazy polega raczej na zachowaniu wierności i udziale w procesach naprawczych niŜ na replikacji DNA. Inicjacja syntezy DNA wymaga zapoczątkowania przez RNA Inicjacja syniezy pNA (ryc. 38-12) wymaga zapoczątkowania przez krótkie fragmenty RNA. o długości ok. 10—200 nukleotydów.

■

Dołączanie pierwszego dNTP Ryc. 38-12. Inicjacja syntezy DNA na primerze RNA i następujące dołączenie drugiego trifosforanu deoksyrybonukleotydu

_ ri" H N* ft/> - ^ /W

0

DołączanledrugtegodNTP

0

'

■

*H OH

H

468 / ROZDZIAŁ 38

Proces zapoczątkowania obejmuje atak nukleofilowy grupy 3'-hydroksylowej primera j
czki DNA, stosownie do reguły zaproponowanej pierwotnie przez Watsona i Cricka (ryc. 38-13). Gdy w odpowiednim miejscu .na matrycy jest; umiejscowiona cząsteczka monofos-fJ ks vrv bonukleozy du adeniny, włącza

się trifosforan tymidyny w rosnącym nowym p^mSy- a jego reszta cc-tostóranowa będzie atakowana pr?e7 grupę .1'-hydroksyl ową monofbsforami deoksyrybonukleraydujwięŜo dodanego do polimeru. Przez ten stopniowy proces ęasmo matrycowe dyktuje, który trifosforan deoksyrybonukleozydu jest komplementarny i prze? wiązania wodorowe utrzymuje go w miejscu, podczas gdy grupa 3'-hydroksyiowa rosnącego pasma atakuje i powoduje inkorporację nowego nukleotydu do polimeru. Te fragmenty DNA, które zostają dołączone do cząsteczki inicjującego RNA, zostały wykryte przez Okazaki i nazywane są obecnie fragmentami Okazaki (ryc. 38-14). U ssaków, gdy powstanie wiele fragmentów Okazaki, kompleks replikacyjny zaczyna usuwać primery RNA i uzupełniać ubytki powstałe przez ich usunięcie odpowiednimi deoksynukleotydami, dobieranymi przez

Prlmar RNA

Rosnący polimer DNA

Dołączanie TTP

Ryc. 38-13. Synteza DNA inicjowana przez primer RNA ilustrująca funkcję matrycową komplementarnego pasma macierzystego DNA.

ORGANIZACJA i REPL1KACJA DNA / 469 OMA matrycowy 3' ; 5' Primer RNA

Nowo syntetyzowane pasmo ONA

lOpz

10 pz 100 pz -----------H h—H

Fragmenty Okazak! Ryc. 38-14. Nieciągła polimeryzacja deoksyrybonukleozydów i tworzenie fragmentów OkazakL

parowanie zasad, a następnie łączenia fragmentów nowo zsyntetyzowanych. DNA przez enzymy zwane iiga/ami DNA. Proces replikacji jest polarny Jak juŜ wspomniano, cząsteczki DNA są dwupasmowe i 2 pasma są przeciwrównoległe, tj. biegną w przeciwnych kierunkach. Replikacja..X>NA u prokariontów i eukariontów zachodzi równocześnie na obu pasmach. Jednak w Ŝadnym organizmie nie ma enzymu zdolnego polimeryzować DNA w kierunku 3' do 5' tak, Ŝe oba nowo replikujące pasma DNA nie mogą wydłuŜać się równocześnie w tym samym kierunku. Niemniej len sam enzym prowadzi replikacle obu pasm w tym samym czasie.JEajfc dyngsy-enzym-replikuje Jedno pjtsnio („pasmo wLadące-")_w_spasób ciągły w kierunku 5' do 3'. tj. w tym samym kierunku replikacji. Taki sam enzym prowadzi implikację siostrzanego pasma Gipftsmfi.opóźnione") w sposób nieciągly polimeryzując nukleotydy w krótkich odcinkach 150—250 nukleotydów znowu w kierunku 5' do 3', ale w tym samym czasie synteza biegnie w kierunku tylnego końca poprzedzającego primera RNA, a nie w kierunku mozreplikowanej części cząsteczki. Taki proces połowicznej

nietiąglej syntezy DNA jest pokazany schematycznie na ryc. 3&-15. W jądrowym genomie ssaków większość primerów RNA jest usuwanych w trakcie procesu replikacji, podczas gdy w replikacji mitochondrialnego genomu mak odcinki RNA pozostają jako integralna część zamkniętych kołowych struktur DNA. Polimeryzacja i naprawianie DNA wymaga licznych enzymów W komórkach ssaków istnieje klasa polimeraz DNA, zwana polimerazą et, która znajduje się w jądrze i jest odpowiedzialna za replłkację chromosomów. 1 cząsteczka polimerazy a jest zdolna polimeryzować 100 nukleotydów na sekundę; jest to tempo 10-krotnie mniejsze niŜ tempo polimeryzacji deoksynukleotydów przez bakteryjną polimerazę DNA. To zmniejszenie tempa polimeryzacji moŜe być wynikiem oddziaływań nukleosomów. Nie wiadomo, jak polimeraza DNA pokonuje nukleosomy w procesie replikacji DNA. Jednak po zreplikowaniu DNA budujące się nukleosomy są rozmieszczone przypadkowo na kaŜdej z nici siostrzanych. Nowo zsyntetyzowane rdzenie histonów, w postaci oktameru, dołączają się do drugiego

Początek repllkacjl

1

3'

-5' -3

51

Ogólny kierunek replikacji Ryc. 38-15. Proces pótciągtej i jednoczesnej repltkacji obu pasm dwupasmowego DNA.

470 / ROZDZIAŁ 38 Początek replikacji

.Bańka replikaoyjna" Białka

rozwijające u nasady widełek repllkacyjnych

Kierunki reputacji

Ryc. 38-16. Powstawanie „baniek replikacyjnych" w procesie syntezy DNA. Przedstawiono replikację w obu kierunkach i proponowane pozycje białek rozwijających w widełkach replikacyjnych.

pasma w miarę posuwania się widełek replikacyjnych. Poiimeraza o mniejszej masie cząsteczkowej, tzw. poiimeraza p\ występuje takŜe w jądrach komórek ssaków, ale nie jest odpowiedzialna za zwykłą replikację DMA. MoŜe ona słuŜyć w procesach naprawczych DNA (p. niŜej). Mitochondrialna poiimeraza DNA, poiimeraza 7, jest odpowiedzialna za replikację miJochondrialnego genomu, innej cząsteczki DNA, która istnieje w postaci kolistej. Cały genom ssaków replikuje się w ciągu 9 h — okres potrzebny do utworzenia tetraploidalnego genomu z genomu diploidalnego w replikującej komórce. Proces ten wymaga obecności licznych miejsc zapoczątkowania re-

plikacji DNA, które tworzą zgrupowania zawierające ok. 100 takich jednostek replikacyjnych. Replikacja przebiega w obu kierunkach wzdłuŜ chromosomu i oba pasma są replikowane jednocześnie. Taki proces replikacji wytwarza „ba-

wodorowe swoich zasad nukleotydów wiąŜe wprowadzane trifosforany deoksynukleozydów. Oddzielenie dwupasmowego heliksu DNA osiąga się przez cząsteczki białka, które stabilizują strukturę je d no pasmową w miarę posuwania się widełek replikacyjnych. Te białka stabilizujące wiąŜą się stechiometrycŜnie"~do_ pojedynczych pasm, nie zaburzając jednocześnie zdolności nukleotydów do pełnienia ich funkcji matrycowych (ryc. 38-17). Aby uzyskać oddzielenie pasm, opróc2 rozdzielenia 2 pasm podwójnego heliksu, musi zachodzić proces rozkręcenia cząsteczki (raz na kaŜde 10 par nukleotydów). Biorąc pod uwagę czas, w którym musi zajść replikacja DNA, proces rozkręcenia musi zachodzić segmentami. We wszy-

ńki replikacyjne" (ryc. 38-16).

Liczne miejsca, które słuŜą jako początki replikacji DNA w komórkach eukariotycznych, są słabo określone, wyjątek stanowią niektóre wirusy zwierzęce i droŜdŜe. Jest jasne, Ŝe inicjacja jest regulowana zarówno w przestrzeni, jak i czasie, poniewaŜ zgrupowania przyległych miejsc rozpoczynają replikację w sposób zsynchronizowany. Sugeruje się, Ŝe funkcjonalne domeny chroma tyny replikują jako pełne jednostki, co nasuwa wniosek, Ŝe początki replikacji są umiejscowione swoiście w odniesieniu do jednostek transkrypcji. W czasie replikacji DNA*2,pasma muszą być od siebie oddzielone, aby kaŜde z nich mogło słuŜyć jako matryca, która poprzez wiązania

Ryc. 38-17. Hipotetyczny schemat działania białka wiąŜącego jednopasmowe sekwencje DNA w re gionie widełek replikacyjnych. Po związaniu jednopasmowych regionów matrycy i ułatwieniu replika cji białko podlega recyklizacji. (Dzięki uprzejmości B. Albertsa). ______

ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 471

stkich organizmach istnieją liczne obrotowe widełki ,,swivels" rozproszone w cząsteczkach DNA. Mechanizm funkcji „swivels" polega na działaniu swoistych enzymów, które wprowadzają przerwy w 1 paśmie rozkręcającego się podwójnego heliksu, co umoŜliwia postępowaniau>rocesu rozkręcania heliksu. Przerwy są szybko-ponownie spajane bez nakładu energii, ponjewiti. tworzy się jednocześnie wysokoenergetyczne, .wiązanie kowalencyjne między przerwanym wiązaniem fosfodiestrowym a enzymem wykazującym aktywność przerywania I spajania pasma (ang. nicking-sealing enzyme). finzymy takie są nazwane topoizomerazami DNA. Proces ten jest przedstawiony schematyStopień 1

cznie na ryc. 38-15: i porównany do ATP-zaleŜnego procesu spajania prowadzonego przez ligazy DNA. Topoizomerazy są takŜe zdolne do rozkręcania superzwinietęgo DNA. Superzwinięty DNA jest strukturą wyŜszego rzędu kolistych cząsteczek DNA skręconych wokół środka, jak to pokazano na ryc. 38-19. W jednym gatunku wirusów zwierzęcych £re.trowirusy) istnieje klasa enzymów zdolnych do syntezy jednopasmowej, a następnie dwupasmowej cząsteczki DNA z jednopasmowej matrycy RNA. Ta polimeraza, RNA-zaleŜna polimeraza DNA, czyli „odwrotna transkryptaza" syntetyzuje najpierw hybrydową cząsteczkę DNA-RNA, wykorzystując genom RNA jako

Topolzomeraza I DNA

Ligaza DNA E + ATP = E (AMP-Enzym)

Nacięcie O 3' pojedynczego pasma przez M enzym

Istniej E}ce nacięcie Jednego pasma

Sioplen 2

Tworzenie wiązania wysokoenergetycznego

Stopień 3

Naprawione nacięcie

Naprawione nacięcie

Ryc. 38-18. Porównanie 2 typów reakcji naprawiania nacięć w DMA Ciąg reakcji po stronie prawej jest katalizowany DNA ligazą; reakcje po stronie lewej topoizomerazą I DNA. (Nieco zmodyfikowane i zreprodukowane za zgodą Lehninger A. L: Biochemistry. 2nd ed, Worth, 1975)._________________

472 / ROZDZIAŁ 38

Mitcza

Ryc. 38-20. Cyk) komórkowy w komórkach ssaków. Faza syntezy DNA (faza S) jest oddzielona od mitozy przez przerwę Gf (gap 1) i przerwę G2 (gap 2). Strzałka wskazuje kierunek progresji cyklu.

Ryc. 38-19. Superzwoje DNA. Lewoskrętny solenoidalny superzwój (na lewo) i forma odwrócona, prawoskrętny wewnętrznie zwinięty superzwój powstający po usunięciu cylindrycznego rdzenia. Takie przekształcenie jest analogiczne do tego, które zachodzi po rozerwaniu nukleosomów w wyniku ekstrakcji histonów z chromatyny duŜymi stęŜeniami soli.

matrycę. Swoisty enzym, RNaza H degraduje pasmo RNA, a pozostałe pasmo DNA słuŜy z kolei jako matryca do utworzenia dwupasmowej cząsteczki DNA zawierającej informacje istniejącą pierwotnie w genomie RNA zwierzęcego wirusa. Synteza DNA zachodzi w czasie fazy S cyklu komórkowego W komórkach zwierzęcych, włączając takŜe komórki ludzkie, replikacja DNA genomu zachodzi tylko w określonym czasie Ŝycia komórki. C2as ten jest nazwany okresem syntezy albo fazą g. Okres ten jest zwykle czasowo oddzielony od fazy mitotycznej przez okresy, w których nie zachodzi synteza DNA określanych jako przerwa 1 (ang. gapi - - Gi) i przerwa 2 (ang. gap2 — G:), które mają miejsce odpowiednio przed i po fazie S (ryc. 38-20). Komórka reguluje syntezę swego DNA, głównie przez dopuszczenie procesu syntezy tylko

w określonych czasach, a synteza DNA zachodzi głównie w komórkach przygotowujących się do podziału w procesie mitozy. Regulacja wejścia komórki w fazę S obejmuje cykliczne nukleotydy purynowe i prawdopodobnie substraty do syntezy DNA, ale mechanizm ten nie jest znany. Liczne wirusy wywołujące nowotwory (onkowirusy) są zdolne zmienić lub przerwać ograniczenia, które zwykie kontrolują wejście komórki ssaków z fazy Gi do fazy S. Ten mechanizm takŜe nie jest poznany, ale prawdopodobnie obejmuje fosforylację swoistych cząsteczek białek gospodarza, W czasie fazy S komórki ssaków zawierają większe ilości polimerazy a DNA niŜ w niesyntetyzujących fazach cyklu komórkowego. Dalej, enzymy, które są odpowiedzialne za wytworzenie substratów do syntezy DNA, tj. trifo-s fora nów deoksyrybonukleozydów, zwiększają takŜe swoją aktywność, która zmniejsza się po fazie syntezy, aŜ do ponownego pojawienia sie sygnału do ponowienia syntezy DNA. W czasie fazy S jądrowy DNA jest replikowany kompletnie raz i tylko raz. Wydaje się, Ŝe raz zreplikowanachromatyna jest tak „naznaczona", Ŝe jej dalsza replikacja jest niemoŜliwa do momentu, aŜ przejdzie ona ponownie przez okres mitozy. Sugeruje się, Ŝe metylacja DNA moŜe słuŜyć jako taki kowalencyjnie związany znacznik. Zwykle dana para chromosomów replikuje równocześnie i w określonej części fazy S w kaŜ-

ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 473

dym cyklu replikacyjnym. W obrębie chromosomu zgrupowania jednostek replikacyjnych są replikowane w sposób skoordynowany. Natura sygnałów, klóre regulują syntezę DNA na tych poziomach, nie jest znana, ale regulacja wydaje się być wewnętrzną właściwością kaŜdego indywidualnego chromosomu. Uszkodzony DNA jest naprawiany przez enzymy Utrzymanie integralności informacji w cząsteczkach DNA jest problemem o największym znaczeniu dla przeŜycia poszczególnego organizmu, jak i przeŜycia gatunków. Stąd moŜna wyciągnąć wniosek Ŝe gatunki, które przeŜyły, wytworzyły w procesie ewolucji mechanizm do naprawiania uszkodzeń DNA, zachodzących w wyniku błędów replikacyjnych lub ujemnych wpływów środowiskowych. Określono, Ŝe uszkodzenia w czasie replikacji DNA lub indukowane środowiskowo powodują średnio 6 zmian nukleotydów na rok w komórkach linii rozrodczej jednego osobnika. Przypuszczalnie przynajmniej taka sama liczba zmian nukleotydowych, czyli mutacji, musi zachodzić w ciągu roku równieŜ w komórkach somatycznych. Jak to opisano w rozdz. 37, główna odpowiedzialność za wierność replikacji leŜy w swoistym parowaniu zasad nukleotydów. Odpowiednie parowanie zaleŜy od obecności preferowanych postaci tautomerycznych nukleotydów purynowych i p i rym idy nowych (p. ryc. 35-7), ale równowaga, w której jeden tautomer jest bardziej stabilny niŜ inny, wynosi tylko 104 lub 10s na korzyść tautomeru o większej stabilności. ChociaŜ wielkość ta nie jest wystarczająco korzystna, aby zapewnić wymaganą wierność, faworyzowanie wybranych tautomerów, a zatem odpowiednie parowanie zasad, moŜe być zapewnione przez 2-krotne monitorowanie procesu parowania 2asad. Takie podwójne monitorowanie zachodzi zarówno w systemach bakteryjnych, jak i systemach komórek ssaków: po raz pierwszy w trakcie włączania trifosforanów deoksyrybonukleozydów, a później przez ponowną kontrolę i mechanizm wymagający energii, który usuwa wszystkie nieprawidłowe zasady, które mogą się pojawić w nowo wytworzonym paśmie. Ten podwójny proces monitorowania nie pozwala na powstanie błędów z nieodpowiedniego parowania zasad z powodu obecności niefaworyzowanych tautomerów z częstością większą niŜ raz na kaŜde 108 —101 ° par zasad. U E, coli cząsteczką

odpowiedzialną za taki mechanizm monitorowania jest aktywność egzonukleazowa 3'-»5' „wbudowana"' w polimerazę DNA, ale polimerazy DNA ssaków nie mają takich korekcyjnych właściwości nukleazowych. Taką funkcję naprawczą sprawują inne enzymy. Uszkodzenia DNA, wywołane przez czynniki środowiskowe, fizyczne i chemiczne, mogą być sklasyfikowane jako 4 typy (lab. 38-2). Uszkodzone regiony DNA mogą być naprawione, wymienione przez rekombinację lub zachowane. Zachowanie regionów uszkodzonych prowadzi do mutacji i jest potencjalną przyczyną śmierci komórki. Proces naprawy i wymiany korzysta z faktu powielenia informacji w dwupasmowej heliksalnej strukturze DNA. Uszkodzony region w jednym paśmie moŜe być przywrócony do swej postaci oryginalnej na podstawie komplementarnej informacji zachowanej w paśmie nie uszkodzonym. Kluczem do wszystkich procesów naprawczych i rekombinacyjnych jest początkowe rozpoznanie uszkodzenia i albo naprawienie go w czasie tego rozpoznania, albo oznakowanie go do naprawienia w przyszłości. Depurynacja DNA, która zachodzi spontanicznie dzięki termolabilności wią-zania N-glikozydowego puryn, zachodzi z prędkością 5000—10000 na komórkę na dobę w temp. 37°C. Swoiste enzymy rozpoznają miejsca depurynowane i zaTabefa 38-2. Rodzaje uszkodzeń DNA I. Zmiana 1 zasady A. Depurynacja B. Deaminacja cytozyny do uracylu C. Deaminacja adeniny do hipoksantyny D. Alkilacja zasady E. Insercjo lub delecja nukleotydu F. Inkorporacja analogu zasady II. Zmiana 2 zasad A, Powstanie dimeru tymina-tymina induko wane promieniowaniem nadfioletowym B. Wiązanie poprzeczne dwufunkcyjnym czynnikiem alkilującym III. Pęknięcie łańcucha A. Promienie jonizujące B. Rozpad wiązań losfodiestrowych pod wpływem radioaktywności [V. Wiązania poprzeczne A. Między zasadami tego samego pasma lub pasm przeciwległych B. Między DNA i cząsteczkami białka (np. histony)

474 / ROZDZIAŁ 38

stępują je odpowiednimi purynami bezpośrednio bez przerwania wiązań fosfodiestrowych. WDNA zasady, cytozyny i adeniny ulegają spontanicznej deaminacji z wytworzeniem odpowiednio uracylu i hipbicsantyny, PoniewaŜ ani uracyl ani hipoksantyna w warunkach prawidłowych nic występują w DNA, nie jest zaskoczeniem, Ŝe swoiste N-glikozydazy mogą rozpoznawać te nieprawidłowe zasady i usuwać je z DNA. Takie usunięcie zasad stanowi oznakowanie miejsca wady i pozwala endonukleazie apurynowej lub apirymidynowej naciąć odpo-

wiednio szkielet pasma w pobliŜu uszkodzenia. Następnie kolejne działania egzonukleazy, naprawczej polimerazy DNA i ligazy przywracają DNA jego stan oryginalny (ryc. 38-21). Ta seria zdarzeń ma nazwę naprawa przez wydęcie.

W podobnych seriach procesów, obejmujących pierwotnie rozpoznane uszkodzenia, mogą być usuwane z DNA alkilowane zasady i analogi zasad, a cząsteczka DNA jest przywracana do jej pierwotnej treści informacyjnej. Naprawa insercji lub delecji nukleotydowych zachodzi zwykle przez mechanizmy rekombinacyjne z równoczesną replikacją lub bez replikacji. Promieniowanie nadfioletowe indukuje wy-

tworzenie dimerów pjrymidyna-pirymidyna. głównie dimerów 2 przyległych tymin w tym samym paśmie (ryc. 38-22). Istnieją 2 mechanizRyc. 38-22. Dimer tym i na-tymi na utworzony po-

D-Ryboza

A T CG G CT t ł A T C C G A T 1 1 1 1 1 1 1 1 1 M I M A T A G C C G A G T G G C T A i

Energia cieplna

H3C D-ftyboza

A T C G G C T U A T C C G A T

1 1 1 1 1 1 ! 1 1 1 1 1 1 1 1 T A G C C G A G T A G G C T A

przez wiązania typu cyklobutanu między po-toŜonymi w sąsiedztwie resztami tyminy DNA.

DNA-GLIKOZYDAZA URACYLOWA A T C G G C T U A T C C G A T

M M I I !

1 1 M 1 M

T A G C C G A G T A G G C T A NUKLEAZY

A T C G G CT C C G A T M I

II

II

MM I

T A G C C G A G T

A G G C T A i

POLIMERAZA DNA + LIGAZA DNA

A T C G G C T U A T C C G A T

II M II II M I M II T A G C C G A G T A G G C T A Ryc. 38-21. Naprawa ONA przez wycinanie. En zym DNA-glikozydaza uracylowa usuwa uracyl powstały podczas spontanicznej deaminacji cyto zyny w DNA. Endonukleaza przecina wiązanie fosfodiestrowe w pobliŜu miejsca uszkodzenia; następ nie, po usunięciu przez endonukleazę kilku zasad, ubytek jest uzupełniony dzięki.działaniu polimerazy naprawczej i pasmo jest ponownie spojone przez ligazę (Dzięki uprzejmości B. Albertsa) _______

my usunięcia lub naprawienia takich Jirnerów tymina-tymina. Jeden z nich to mechanizm typu naprawa przez wycięcie, analogiczny do opisanego wyŜej, a drugi mechanizm p_ol_ega na fotoreaktywacji światłem widzialnym swoistego

enzymu, który bezpośrednio in situ przekształca wytworzony dimer do 2 monomerów. Pęknięcia w pojedynczym paśmie, indukowane przez promienie jonizujące, mogą być naprawiane przez bezpośrednie spojenie lub przez rekombinację. Mechanizmy odpowiedzialne za naprawę wiązań „poprzecznych" między zasadami przeciwległych pasm dwupasmowego heliksu DNA lub między DNA i cząsteczkami białek są słabo poznane. Uszkodzenia wywołane promieniami jonizującymi i przez alkilacje są zwykle naprawiane przez wycięcie i resynteze krótkich odcinków. Uszkodzenia promieniowaniem nadfioletowym i poprzeczne wiązania miedzy pasmami sa naprawiane przez wycięcie i resynteze większych

ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 475

odetrtk&w DNA^W komórkach ssaków replikacja naprawcza moŜe być obserwowana jako nieprogramu warta synteza DNA, tj. inkorpora

cja prekursorów DNA (radioaktywnej tymidyny) do DNA w okresie, w którym komórka nie jest w fazie S. — Zwiększonej aktywności typu wycięcie—naprawa, jako reakcji na czynniki uszkadzające ONA, towarzyszy w komórkach ssaków zwiększona aktywność enzymu polimerazy poli (ADP-rybozy). Enzym ten do ADP-rybozylacji chroma ty ny wymaga koenzymu NAD+. Dodajejjn głównie cząsteczkę mono(ADP-rybozy), nie, w pewnym stopniu takŜe homopolimerowy łańcuch ADP-rybozy. Nie jest jasne, jaką funkcję w procesie wycięcia—naprawy pełni polimeraza poli{ADP-rybozy} lub jej produkt (ADP-ryboza). Istnieje czasowa zaleŜność między zwiększoną aktywnością naprawczą i zwiększeniem aktywności swoistego enzymu. W dodatku zahamowanie enzymu swoistymi inhibitorami zapobiega spojeniu złamanych nici DNA. Zwiększenie aktywności polimerazy poli (ADP-rybozy) wydaje się być reakcją na fragmentację DNA w jądrze. Taka fragmentacja moŜe być indukowana pierwotnie przez czynniki fizyczne, takie jak promieniowanie X, lub wtórnie przez mechanizmy nacinające DNA jako reakcja na inne czynniki chemiczne lub fizyczne, takie jak promieniowanie nadfioletowe lub związki alkilujące. Aktywność polimerazy jest dostatecznie duŜa, aby zmniejszyć ilość wewnątrzkomórkowego NAD+ w następstwie uszkodzeń DNA czynnikami środowiskowymi. Skóra pergaminowa ta barwnikowa {xeroder-

ma pigmentosum) jest aulosomalną, recesywną chorobą genetyczną. Kliniczne objawy obejmują znaczną wraŜliwość na promieniowanie słoneczne (nadfioletowe) z następującym powstawaniem mnogich nowotworów skóry i przedwczesną śmiercią. Wrodzona wada dotyczy naprawy uszkodzonego DNA. Komórki osób chorych na xewderma pigmentosum, hodowane w kulturach, wykazują mafą aktywność w procesie rozbijania dimeru tyminy na drodze fotoreaktywacji. Jednak w tej chorobie procesy naprawcze DNA są bardzo złoŜone; istnieje przynajmniej 7 grup komplementacji genetycznej.

JWkomórkach pochodzących z większości, jeśli nie wszystkich, grup komplementacyjnych xeroderma pigmentosum, w reakcji na ekspozycję na światło nadfioletowe spostrzega się nieprawidłową przejściową lub ilościową reakcję ze strony polimerazy połi(ADP-rybozy). Wydaje się, Ŝe nieprawidłowa reakcja przynajmniej w jednej grupie komplementacji jest spowodowana niezdolnością do nacięcia pasma DNA w miejscu uszkodzenia, poniewaŜ dodanie deoksyrybonukleazy do wadliwych permeabilizowanych komórek prowadzi do prawidłowego lub prawie prawidłowego zwiększenia aktywności polimerazy poli{ADP-rybozy). U chorych z ataxia teleangiectasia, autosomalnej, recesywnej choroby u ludzi powodującej ataksję móŜdŜkową i nowotwory układu limforetykularnego (chłoniakosiateczkowego), istnieje wzmoŜona wraŜliwość na uszkodzenia promieniami X. Chorzy z niedokr wist ością Fanconiego, autosomalną niedokrwistością recesywną, charakteryzują się takŜe wzmoŜoną zapadalnością na nowotwory i niestabilnością chromosomalną, wykazują prawdopodobnie wadliwą naprawę uszkodzeń wywołanych wiązaniami tzw. poprzecznymi. Wszystkim tym 3 zespołom klinicznym towarzyszy zwiększona zapadalność na nowotwory. Jest moŜliwe, Ŝe w przyszłości zostaną odkryte u ludzi inne choroby wynikające z zaburzeń zdolności naprawy DNA.

PIŚMIENNICTWO Kornberg, A: / Bied Chem 1988; 263:1. lgo-Kemenes T, Horz W, Zachau HG: Chromatin. Annu Re\ Biochem 1982; 51:89. Jelinek WR, Schmid CW: Repetitive seąuences in eukaryotic DNA and their cxpression. Annu Rev Biochem 1982; 51:813. McGhcc JD, Felsenfeld G: Nucleosome structure. Annu Rev Biochem 1980; 49:1115. Sancar A, Sancar G: DNA repair enzymes. Annu Rev Biochem 1988: 57:29. Campbell JL: Eucaryotjc DNA replication. Annu Rev Biochem 1986; 55:733. Gross DS, Garrard WT; Annu Rev Biochem 1988; 57:159.

39

Synteza, przekształcanie i metabolizm RNA Dary/ K, Granner, MD

WPROWADZENIE I ZNACZENIE DLA BIOMEDYCYNY Transkrypcja cząsteczki RNA z DNA jest bardzo złoŜonym procesem, w który jest włączony jeden z enzymów z grupy polimeraz RNA oraz liczne towarzyszące białka. Podstawowe etapy, konieczne do syntezy pierwotnego transkryptu, to inicjacja, elongacja i terminacja. Najlepiej znany jest etap inicjacji. Zidentyfikowano liczne regiony DNA (na ogół umiejscowione „pod prąd", czyli na lewo od miejsca inicjacji) oraz czynniki białkowe, które wiąŜą się do tych sekwencji i regulują inicjację transkrypcji. Ten proces jest najlepiej poznany u prokariontów i wirusów, ale w ostatnich latach dokonano znacznego postępu w poznaniu procesu transkrypcji w komórkach ssaków. Niektóre RNA, a zwłaszcza mRNA mają bardzo róŜny okres przeŜycia w komórce. WaŜne jest poznanie podstawowych zasad metabolizmu RNA, poniewaŜ modulacja tego procesu powoduje zmiany w stopniu syntezy białek i w następstwie zmiany metaboliczne. Jest to sposób, w jaki wszystkie organizmy adaptują się do zmian w środowisku, a takŜe sposób, w jaki powstają i utrzymują się zróŜnicowane struktury i funkcje komórki u wyŜszych organizmów wielokomórkowych. Cząsteczki RNA syntetyzowane w komórkach ssaków są często bardzo róŜne od tych, które są wytwarzane w organizmach prokariotycznych. Odnosi się to zwłaszcza do transkryptów kodujących mRN A. mRJ^Aji,oxgaiiizmów ptók^aoi^czrj^ch moŜe ulegać translacji w takiej "postaci,~w jakiej został ^syntetyzowany, podczas" gdy w komórkach, „śs&JŁp w większość RNA jest syntetyzowana jako cząsteczki prekur-

sajowe, które ulegają przekształceniom .(„obróbce") w dojrzały, aktywny RNA. Błędne przekształcenie i składanie transkryptów mRNA jest przyczyną takich chorób, jak niektóre typy talasemii (p. rozdz. 42).

RNA JEST SYNTETYZOWANY NA MATRYCY DNA PRZEZ POLIMERAZĘ RNA Proces syntezy RNA (transkrypcji RNA) na matrycy DNA najlepiej scharakteryzowano w organizmach prokariotycznych. Mimo Ŝe w komórkach ssaków synteza RNA i przekształcanie transkryptów RNA są róŜne niŜ w organizmach prokariotycznych, proces syntszy—RNĄj jako taki, jest całkiem podobny w tych 2 klasach organizmów. Dlatego teŜ opissyntezy RNA w organizmach prokariotycznych odnosi się do organizmów eukariotycznych, mimo Ŝe enzymy biorące udział w tym procesie i sygnały regulatorowe są róŜne. Sekwencja rybonukleotydów w cząsteczce RNA jest komplementarna do sekwencji deoksyrybonukleotydów 1 pasma w dwupasmowej cząsteczce DNA (p. ryc. 37-8). Pasrnov które ulega transkrypcji na cząsteczkę RN.A nazywa się matrycowym pasmem DNA. Drugie pasmo DNA często określa się jako pasmo kodujące danego genu. Jest ono tak nazwane poniewaŜ, 7 wyjątkiem tego, Ŝe ma T zamiast U, odpowiada ono dokładnie sekwencji pierwotnego transkryptu, w którym zawarty jest kod dla Białka - produktu danego genu. W przypadku dwupasmowej cząsteczki DNA, zawierającej liczne geny, pasmo matrycowe dla kaŜdego z genów niekoniecznie jest tym samym pasmem

S Y N TE ZA , P R ZEK S ZTA ŁC A N IE I M E TABO L I ZM R N A / 47 7

Gen A

Gen B

Gen C

Tran skrypt RNA

Gen □ P

5 P-P-P

Pasma matrycowe Ryc. 39-1. Na rycinie tej pokazano, ze geny mogą być transkrybowane z obu pasm DNA. Strzałki wskazują kierunek transkrypcji {poiarność}. Zwróć uwagę, Ŝe pasmo matrycowe jest zawsze odczytywane w kierunku 3'-5'. Pasmo przeciwległe jest zwane kodującym, poniewaŜ jest ono identyczne (z wyjątkiem zami any T na U) do t ra nskryp tu mRNA (pierwotny transkrypt w komórkach eukariotycznych), który koduje białkowy produkt genu.

w dwupasmowym heliksie DNA (ryc. 39-1). Dan£;paspłe-wtiwupasmowej cząsteczce DNA moŜe więc słuŜyć jako pasmo matrycowe dla niektórych genów i jako pasmo kodujące dla innych genów. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe sekwencja nukleotydów transkryptu DNA będzie taka sama (z wyjątkiem U, która zastępuje T) jak w paśmie kodującym. Informacja na paśmie matrycowym jest odczytywana w kierunku 3' do 5'. ----- -«*. DNA-zaleŜna polimeraza RNA jest enzymem odpowiedzialnym za polimeryzację rybonukjeotydjów-6 sekwencji kornplcmentarnej do pasma m^ixyco.w£gtLgenu (p. ryc. 39-2 i 39-3). Enzym przyjaczajsic do swoistego miejscajEgjnotpta, na_p_a^nie_jn,atrycowym. Następuje po tym itucjiiiaą^syntfiZŁRHA w_.mmkcie startui.pioees p_ostęj3iyc.dalej, aŜ osiągnie sekwencje teimjnacyjne (ryc. 39-3). Jednostka transkrypcji jest to regifin_I2NA rozciągający się między promotorern_£i lermmatorL-m. Produkt RNA, który jest syBtetyztąyany wjąenmku 5"" do 3r, nazywamy piamaiłuym trangkr^p^i iAT^roani^maJ-h prn-

kariotycznych moŜe on reprezentować produkt kodowany przez kilka przyległych do siebie genów; w komórkach ssaków jest to zwykle produkt pojedynczego genu. Knike.5' pierwotnego transkryptu RNA i dojrzałego cytoplazmatycznego RNA są identyczne. Miejsce startu transkrypcji odpowiada więc imWeotydowi końca 5' roRNA Pierwotne transkryply generowane KNA 11 są szybko opatrzone 7-melyloguanozylotrifosforanem (p. ryc. 37-10) --^czaggczka" któiajutrzymujesię ryc. 37-10)

^g

i pojawia się na końcu 5' dojrzałego cytoplazmatycznego mRNA. Te ,.czapeczki metylacyjne" są przypuszczalnie potrzebne do przekształceń (obróbki): pierwotnego transkryptu do

Kompleks RNAP Ryc. 39-2. Polimeraza FINA (RNAP) katalizuje polimeryzację rybonukleotydów na sekwencje RNA, które są komplementarne do pasma matrycowego genu Transkrypt RNA ma tę samą poiarność (5' do 3'), co kodujące pasmo DNA, ale zawiera U zamiast T. RNAP z Escherichia coli składa się z kompleksu 2 a podjednostek i 2 [} podjednostek (P i p") tworzących kompleks rdzeniowy. Holoenzym zawiera podjednostkę 6 w momencie, gdy kompleks znajduje się w sąsiedztwie miejsca startu (ok. 10 pz), a następnie transkrypcja postępuje jedynie przy uŜyciu kompleksu rdzeniowego. „Bańka" transkrypcyjna obejmuje obszar 17 nukleotydów stopionego DNA (zdenaturowanego DNA), a cały kompleks pokrywa 30-75 pz w zaleŜności od konłormacji RNAP.

mRNA, do translacji mRNA i do ochrony mRNA przed atakiem egŜonukieoiitycznym w kierunku 5 : -* 3'. RN.Ą.(RHAJEXba-

kterii Escherichia coli występuje ja k& cząsteczka rfoŜoiiLi z 4 podjedtiostek. 2 z nich są identyczne Ipodjednostki a), a 2 są podobne co do wielkości, ale nie identyczne (podjednostka p i P') (ryc. 39-2). RNAP zawiera takŜe 2 atomy cynku. Rdzeń polimerazy RNA posługuje się swoistym czynnikiem białkowym (czynnik sigma [o]), który pomaga rdzeniowi enzymu dołączyć się mocniej do swoistej sekwencji deoksyrybonukleotydowej regionu promotora. Bakterie zawierają wiele czynników o, ?. których kaŜdy działa jako białko regulatorowe, które modyfikuje swoistość rozpoznania promotora polimerazy RNA. Pojawianie się róŜnych czynników a jest w systemach prokariotycznych skorelowane w czasie z róŜnymi programami ekspresji genów, takimi jak rozwój bakteriofagów, sporulacja i reakcje na szok cieplny.

478 / ROZDZIAŁ 39 Negatywne czynniki kontrolne: represory Pozytywne czynniki kontrolne: aktywatory Holoenzym pollmerazy RNA

Rdzeń pollmerazy □

2. Inicjaoja nici HNA pppApX

+ATP+XTP Uwolnienie sigma wiązanie nusA

4. Termlnacja transkrypcji nici RNA I uwolnienie enzymu a Elongacja nici RNA PPPA Czynniki sigma Czynniki term i nacji CzynnlW antyierrnlnaojt XTP

Ryc. 39-3. Cykl transkrypcyjny u bakterii. Transkrypcję RNA bakteryjnego przedstawiono w 4 etapach: 1. Wiązanie z matrycą. Polimeraza RNA (RNAP) wiąŜe się z DNA i lokalizuje promotor. Z. Inicjacja nici. Holoenzym RNAP (rdzeń+czynniki 6) katalizuje przyłączenie pierwszego nukleotydu (zwykle ATP lub GTP) do drugiego trifosforanu rybonukleozydu z wytworzeniem dinukleotydu, 3. Elongacja nici. Kolejne reszty nukleotydowe są dołączane do 3'-OH końca powstającej cząsteczki RNA; czynnik 5 dysocjuje od holoenzymu, gdy nić RNA osiągnie długość ok. 10 zasad. 4. Terminacja nici i uwolnienie enzymu. Ukończona nić RNA i RNAP są uwolnione z matrycy. Regeneruje się hoioenzym RNAP, który odnajduje promotor i cykl rozpoczyna się od nowa. {Zreprod u kowano z niewielkimi modyfikacjami z: M, Chamberiin, The Enzymes, vol. XV, 1982). ■ _____

SYNTEZA RNA OBEJMUJE INICJACJĘ, ELONGACJĘ ITERMINACJĘ Proces syntezy RNA pokazany na ryc. 39-3 obejmuje najpierw związanie cząsteczki hoi.opoHtnerazy RNA do matrycy w miejscu promotorowym. Po.związaniu następuje zmiana konformacji RNAP, a następnie pierwszy nukleotyd (zwykle purynowy) wiąŜe się z miejscem inicjacji p podjednostki enzymu. W obecności 4 nukleÓtydow"RNAP przemieszcza się do drugiej zasady na matrycy, tworzy się wiązanie fosfodiestrowe, a tworzący sie łańcuch RNA jest

teraz związany w miejscu polimeryzacji na ~(J podjednostce RNAP. (Nasuwa się analogia "do" miejsc A i P na rybosomie; p. ryc. 40-7 i 40-8). Inicjacja tworzenia cząsteczki RNA przy jej końcu 5' następuje z oddzieleniem czynnika-cr, a elongacja cząsteczki RNA biegnie przeciwrównolegje do jej matrycy w kierunku od 5'do jJTEnzym polimeryzuje rybonukleotydy według swoistej sekwencji dyktowanej przez pasmo matrycowe i reguły parowania zasad według Watsona-Cricka. W trakcie reakcji polimeryzacji uwalnia się pirofosforan. Zarówno u prokariontów, jak i u eukariontów rybonukleotyd

SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA / 479

puiynaw.y-4es.t .zw.ykk pierwszym, który ulega polimeryzacji w cząsteczce RNA. Wmiarę^k4iompl£kjLelongacyjny. zawierający rdzeń poliinerazy RNA. przemieszcza się wzdluz cząsteczkiJD2Ś&. jnusi nastąpić rozwinięcie heliksu DNA, aby udostępnić miejsca do odpowiedniego parowania zasad do mikleotydów ua paśmie matrycowym. Odcinek rozwijającego się DNA ma stalą wielkość w okresie transkrypcji, która wynosi ok. 17 par zasad na cząsteczkę polimerazy. Wydaje się więc, Ŝe wielkość regionu rozwiniętego DNA jest dyktowana przez polimerazę i jest niezaleŜna od sekwencji DNA w obrębie kompleksu. Sugeruje to, Ŝe polimęraza^RNA.jesi.zwi^zana z aktywnością typu rozwijającego (ang, ,,unwindase"). która otwiera heliks DNA. Fakt, Ŝe podwójny heliks musi ulec rozwinięciu, i Ŝe pasma oddzielają się przynajmniej przejściowo w okresie transkrypcji nasuwa wniosek, Ŝe

w komórkach eukariotycznych struktura nukleosomów ulega rozerwaniu. Termmacja syntezy cząsteczki RNA jesl-wyznaczona przez sekwencję na paśmie matrycowym cząsteczki DNA, ta sekwencja sygnalna jest rozpoznana przez białko terminacji nazwane czynnikiem rho [p]. Po ukończeniu syntezy cząsteczki RNA rdzeń enzymu (polimerazy) oddziela się od matrycy DNA. W obecności innego czynnika enzym rozpoznaje promotor i synteza nowej cząsteczki RNA zaczyna się ponownie. To samo pasmo matrycowe genu moŜe przepisywać jednocześnie więcej niŜ 1 cząsteczka polimerazy RNA, ale proces ten jest sfazowany i rozmieszczony w taki sposób, Ŝe w danym momencie ulega transkrypcji inna część sekwencji RNA. Na rycinie 39-4 przedstawiono zdjęcie przebiegu syntezy RNA z mikroskopu elektronowego-

/%^:

Ryc. 39-4. Fotografia z mikroskopu elektronowego ficznych kopii genów rybosomalnego RNA u płazów w trakcie transkrypcji. Powiększenie ok 6000 x. ZauwaŜ, Ŝe długość transkryptów zwiększa sie, w miarę jak cząsteczki polimerazy RNA posuwają się wzdłuŜ poszczególnych genów rybosomalnego RNA. Proksymainy, początkowy region transkrybowanego genu ma zatem krótkie przymocowane do genu transkrypty, podczas gdy znacznie dłuŜsze transkrypty są związane z dystalnym końcem genu. Strzałki pokazują kierunek (5' do 3) transkrypcji, począwszy od miejsca inicjacji do miejsca terminacji. (Reprodukowano za zgodą z: Miller O. L. Jr, Beatty B. R,: Portrait of a gene. J. Celi Physiol. 1969, 74 [Suppl. 1]: 225),

480 / ROZDZIAŁ 39

KOMÓRKI SSAKÓW ZAWIERAJĄ LICZNE DNA-ZALEśNE POLIMERAZY RNA Właściwości polimeraz ssaków przedstawiono w tab. 39-1. KaŜda z tych DNA-zaleŜnych polimeraz RNA jest odpowiedzialna za transkrypcję róŜnych klas genów. Masa cząsteczTabela39-1. Mianownictwo zwierzęcych DNA-zaleŜnych polimeraz RNA Klasa WraŜliwość na 3-amanitynę Główny enzymu produkt I (A) rRNA NiewraŜliwa II (B) WraŜliwa na matę stęŜenia (10" 8 do 10- a mo!/l)

hnRNA(mRNA)

III
tRNAi5SRNA

kowa (MW) polimeraz RNA dla 3 głównych klas eukariotycznego RNA waha się w granicach 500000 — 600 000. Wszystkie z tych polimeraz mają podstawową organizację podjed-nostek strukturalnych, podobną do bakteryjnej polimerazy RNA. Wszystkie mają 2 duŜe pod-jednostki i kilka mniejszych podjednostek. Współczesne badania z zastosowaniem klonowania i sekwencjonowania DNA wskazują, Ŝe eukariotyczne polimerazy RNA wykazują duŜe podobieństwo aminokwasów z prokariotycznymi polimerazami RNA. Funkcje kaŜdej z podjednostek nie są jeszcze poznane. Niektóre mogą mieć funkcje regulatorowe, słuŜące polimerazie w rozpoznawaniu swoistych sekwencji, takich jak sygnały promotorowe i sygnały terminacyjne. a-Amanityna, toksyna grzyba Amanita phalloides jest swoistym inhibitorem eukariotycznej nukleoplazmatycznej DNA-zaleŜnej polimerazy RNA (polimeraza RNA II); toksyna ta okazała się potęŜnym narzędziem badawczym (tab. 39-1).

NIEKTÓRE SEKWENCJE DNA SĄ WAśNYMI SYGNAŁAMI TRANSKRYPCJI Analiza sekwencyjna DNA swoistych genów, uzyskana za pomocą technologii rekombinacji DNA, umoŜliwia rozpoznanie licznych sekwencji waŜnych w procesie transkrypcji genów. Na podstawie badań licznych genów bakteryjnych moŜliwe było zbudowanie zgodnych modeli

sekwencji sygnalnych dla inicjacji i terminacji. Kwestia .jak RNAP znajduje właściwe miejsce dla inicjacji transkrypcji?" nie jest kwestią błahą, jeśli weźmie się pod uwagę złoŜoność genomu. Esckerichia coli ma ok. 2 x 103 miejsc inicjacji transkrypcji w DNA o ok. 4x 10" par zasad. Sytuacja jest jeszcze bardziej złoŜona u ludzi, gdzie ok. 105 miejsc inicjacji transkrypcji jest rozproszonych wśród 3 x 109 par zasad DNA. RNAP moŜe wiązać się z wieloma regionami DNA, ale przeszukuje ona sekweecje nt^Az prędkością ok. 103pz/s, a2.domo.jnen.lu, gdy rozpozna pewne swoiste regiony w.D.N.A. z którymi wiąŜe się z duŜym powinowactwem. Region taki jest nazywany promotorem, a związanie RNAP z promotorem zapewnia dokładną inicjację transkrypcji. Promotory bakteryjne mają długość ok. 40 nukleotydów (40 par zasad, czyli 4 zwoje podwójnego heliksu DNA); jest to region dostatecznie mały, aby być pokrytym przez cząsteczkę holopolimerazy RNA E. coli. Na tym obszarze promotora są 2 krótkie konserwowane sekwencje. Około 35 par zasad w górę od miejsca startu transkrypcji znajduje się sekwencja o 8 parach nukleotydów 5-TGTTGACA-3' przedstawiona na ryc. 39-5. Bardziej proksymalnie do miejsca startu transkrypcji, ok. 10 nukleotydów w górę, jest sekwencja o 6 parach nukleotydów bogata w AT "(5r-TATAAT-3r). Ta ostatnia sekwencja ma niską temperaturę topnienia, poniewaŜ brak jest w niej par nukleotydów GC. Wskutek tego sekwencja TATA, czyli ramka Pribnowa, ułatwia dysocjację między pasmem kodującyrrn rnckodującyfHTw;' nuklgpiydjowej promojhura bezpośrednio „w 3óJ\'_na kodującym paśmie. Inne bakterie mają odmienne kombinacje (ramki), ale na ogół mają 2 komponenty promotora; mają one tendencje zajmować tę samą pozycję względem miejsca startu transkrypcji i we wszystkich przypadkach sekwencje między ramkami nie są do siebie podobne. U E. coli transkrypcyjne rho-zaleŜne sygnały terminacji mają równieŜ wyraźne sekwencje zgodne, jak to przedstawiono na ryc. 39-6. Zachowawczo zgodna (konsensus) sekwencja, która ma długość 40 par nukleotydów zawiera przerwaną, odjwrjjceB<j~sdLaKQCJ£^Q^Łóxzojia, ia p.tjlępjię^ gar zasad ĄT. rę jak postępuje transkrypcja przez ten od-

SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA / 481 Miejsce Gtartu transkrypcji Tran skrybo wany region genu Pasmo kodujące 5' Pasmo matrycowe 3'

TGTTGACA

__

TATAAT

z

DNA ■*■ +1

Region —35

Region — K

Produkt

51 PPP-

•——transkrypcji (RNA)

Ryc. 39-5. Promotory bakteryjne, takie jak pokazany na tej rycinie promotor E. coli. mają 2 wspólne regiony wysoko konserwowanych sekwencji nukleotydowych. Regiony te są umiejscowione 35 i 10 pz w górę (w kierunku 5' pasma kodującego) od miejsca startu transkrypcji, które oznaczono symbolem +1. Wszystkie nukleotydy w górę od miejsca inicjacji transkrypcji określa się umownie za pomocą liczb ujemnych. Elementy sekwencji regulatorowych DNA {ramka TATA, itp.) są takŜe umownie podawane w kierunku 5'do 3', tak jak w paśmie kodującym. Jednak te elementy funkcjonują tytko na dwupasmowym DNA,

Kierunek transkrypcji Pasmo kodujące Pasmo matrycowe-

AGCCCGC TCGGGCG

GCGGGCT TTTTTTTTCGCCCGA AAAAAAAA-

Pasmo kodujące Pasmo matrycowe-

AAAAAAAA-

DNA

DNA

UUUUUU

Tran skrypt RNA

Ryc. 39-6. Bakteryjny sygnał terminacji transkrypcji w genie zawiera odwróconą sekwencję powtarzającą się (2 pola objęte ramką) podzieloną łącznikiem, po której następuje ciąg bogaty w pary AT {rycina ugory). Sekwencja powtarzająca odwrócona po transkrypcji na RNA moŜe generować strukturę drugorzędową (dwuniciową) w transkrypcje RNA, jak to pokazano w dolnej części ryciny.

powtórzony układ sekwencji pt moŜe wyJwo,Ezyć wswnątrzcząsteczJcową strukturę petlową, jak to przedstawiono na ryc. 39-6. Transkrypcja biegnie dalej do regionu AT w końcu genu i tam za pomocą czynnika białkowego kończącego transkrypcję, zwanego czynnikiem rho (p), polimeraza RNA zatrzymuje się i dysoćjuje. a pierwotny iranskrypt oddziela się od DNA. 31 — Biochemia

W komórkach ssaków sygnały transkrypcyjne są, co nie jest zaskoczeniem, bardziej złoŜone Jest jasne, Ŝe sygnaiy (sekwencje sygnalne) w DNA, które kontrolują transkrypcję w komórkach eukariotycznych, są róŜnego rodzaju. Dwa fypy sekwencji sygnalnych są umiejscowione w proksymalnym regionie do promotora. Jedna z nich określa na cząsteczce DNA miejs-

482 / ROZDZIAŁ 39

+1 Region kodujący tk

Ryc. 39-7. Sygnalne elementy transkrypcji i regulatorowe czynniki białkowe wiąŜące DNAwgeniekinazy tymidynowej (tk) DNA-zaleŜna poiimeraza II RNA wiąŜe się z regionem w dół od regionu ramki TATA (który wiąŜe czynnik trans^rypcyjny TFIID) i inicjuje transkrypcję od pojedynczego określonego nukleotydu. Częstość tego zdarzenia zwiększa się wówczas, gdy są obecne elementy c/5 połoŜone w górę (na lewo) oć początku genu (ramki GC i CAAT). Te elementy sygnalne wiąŜą odpowiednio czynniki transkrypcyjne Sp1 i CTF i mogą funkcjonować, w połoŜeniu o odwróconej polarności (strzałki). ty, grŁ>ML.ma_gif .iaiY};f: tramaltrypija, irmg determinują tak-i^esto ten pr^tlt^ ">■* Taj"^ Na

przykład w genie kinazy tymidynowej wirusa Herpes simplex, który do ekspresji genów po sługuje się czynnikami transkrypcyjnymi po chodzącymi od gospodarza, którym jest komór ka ssaków, znajduje się unikatowe miejsce star tu transkrypcji; dokładność transkrypcji z tego miejsca startu zaleŜy od sekwencji nukleotydowej — umiejscowionej fó nnkięatydńw w £Órę od miejsca startu (ryc. 39-7). Region ten ma sekwencje IATAAAAG i wykazuje znaczną homologię do czynnościowo spokrewnionej ra mki Pribnowa (TATAAT), która u prokariontów jest umiejscowiona ok. 10 par zasad w górę od punktu startu mRNA. Polimeraza RNA \S prawdopodobnie wiąŜe się do DNA w regionie ramki TATA i następnie zaczyna transkrypcję pasma matrycowego w miejscu odległym o 32 nukleotydy w dół (na prawo'). Ramka TATA wydaję E

g

mi&jsca startu, określają, jak często ma zacho dzić, zdarzenie transkrypcyjne. Mutacje w tych regionach zmniejszają częstość startu transkry pcji 10—20 razj. l.c.dcmenty DNA nazywają się ramkamipC i CAAT, poniewaŜ występują tam tego typu sekwencje (tab. 39-2), Jak przed stawiono na ryc. 39-7, j^aŜday tych ramek wi^Ŝe unikatowe białki^-Sp^w-pfzypadkoii&fflii GC i Clf lalbó^CTEPB, NF1, NFY) j^_przypadku" ramki CAAT. Częstość inicjacji transkrypcji jestnastcpslw"ern ruiń7inhni!^-" Ttje.nVi' białkami _g ONA, podczas gdy oddziaływanie białko-DNA z famicą '1A'1 A"zapewma_wisni0Ść jnic-" ^ N A określa sie jako elementy ^ ^ ^ j y o aktywności cis, poniewaŜ są one umiejscowione na tej samej cząsteczce DNA, na której mieści się

Ta ba la 39-2. Niektóre elementy transkrypcji i czynniki, które się z nimi wiąŜą, i które znaleziono w genach ssaków, przepisywane przez polimerazę RNA II. Sekwencje DNA tych elementów podano w nawiasach. Mała litera n oznacza kaŜdy z nukieotydów Element TATA box (TATAAT) CAAT box (CCAAT) TGG(n)6.7GCCAA GC box (GGGCGG) Ig oktamer (ATTTCGAT) Element wstrząsu cieplnego (Cnn GAAnn TTCnnG)

Czynnik TFIID Białka wiąŜące CAAT NF1 (czynnik jądiowy) Sp1

NFXB (czynnik b genu łańcucha^, tmmunoglobuliny) Czynnik transkrypcyjny wstrząsu cieplnego

gen podlegający regulacji. Czynniki białkowe określa się jako czynniki typu trans, poniewaŜ pochodzą one od genów umiejscowionych prawdopodobnie na innych chromosomach. Elementy umiejscowione w górę od genu (na lewo od genu) odpowiadają za wierność i częstość inicjacji i podlegają rygorystycznym wymaganiom zarówno co do ich pozycji, jak i orientacji. Zmiany w pojedynczych zasadach mają dramatyczny wpływ na ich funkcję. Krytyczna jest odległość tych elementów od miejsca startu i w zasadzie nie są one aktywne, jeśli zostanie odwrócona ich orientacja normalnie biegnąca w kierunku 5' do 3' (ryc. 39-8). Trzecia kłasa sekwp.ncii noisLiiD^zmacniania lub inicjacji transkrypcji eukariolycznych genów. Elementy te są nazywane w zaleŜności od skut: ku. jaki wywołują elementarni (enhancers) lub tłumiącymi (silencers) t pcję. Elementy te znaleziono w róŜnych miejs-

SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA / 483

Ekspresja regulowana

Inne elementy regulatorowe

Sekwencje wzmacniające ( +)I

wyciszające (-)

Ekspresja podstawowa j

HHh

Elementy w górę od genu (ramka CAAT) ttp.

Elementy bliŜsze genu (ramka TATA)

+1 Gen strukturalny V/ ------------

1 ukturalny j

Ryc. 39-8. Schematyczny diagram pokazujący transkrypcyjne regiony kontrolne hipotetycznego eukariotycznego genu klasy II (dającego jako produkt mRNA}. Taki gen moŜe być podzielony na region strukturalny i regulatorowy, a miejsce graniczne tych regionów jest zdefiniowane jako miejsce startu transkrypcji (+1 -w-*). Gen strukturalny zawiera sekwencję DNA, która jest transkrybowana na mRNA, który ostatecznie ulega translacji na białko. Region regulatorowy składa się z 2 elementów zapewniających podstawową ekspresje genu Komponent proksymalny, zwykle ramka TATA, kieruje polimerazę II RNA na odpowiednie miejsce (co zapewnia wierność transkrypcji). Inny komponent, element połoŜony w górę, określa częstość inicjacji. Spośród tych elementów najlepiej jest poznane białko CAAT, ale występują inne sekwencje (Sp1, NF1, AP1, itp.), które mogą być uŜyte w róŜnych genach. W regulowanej ekspresji biorą udział elementy, które wzmacniają (enhancers) lub wyciszają (silencers) ekspresję oraz elementy, które pośredniczą w reakcji na róŜne sygnały, jak hormony, szok cieplny, metale i związki chemiczne. Swoista tkankowo ekspresja jest zapewniona takŜe przez swoiste sekwencje tego typu. Jest moŜliwe, Ŝe te 2 regiony regulatorowe nakładają się funkcjonalnie (pokazuje to linia łącząca). ZaleŜności funkcjonalne od orientacji wszystkich tych elementów pokazują strzałki wewnątrz prostokątów. Na przykład element proksymalny musi mieć orientację 5' do 3'. Elementy połoŜone w górę od elementów proksymalnych najlepiej funkcjonują w orientacji 5' do 3', ale niektóre z nich mogą mieć odwróconą orientację (odwróconą polarność). Linie przerywane pokazują, Ŝe niektóre elementy nie są uplasowane na stałe w stosunku do miejsca startu transkrypcji. Istotnie, niektóre elementy odpowiedzialne za regulowaną ekspresję mogą być umiejscowione jako elementy rozproszone wśród elementów uplasowanych w górę od genu lub mogą być one umiejscowione w dół od miejsca startu transkrypcji (np. w obrębie intronów).

cach zarówno w górę, jak i w dół od miejsca startu transkrypcji. W odróŜnieniu od elementów leŜących proksymalnie i w górę od promotora, sekwencje wzmacniające i tłumiące mogą wywierać swój wpływ takŜe wówczas, gdy są umiejscowione w odległości setek lub tysięcy zasad od jednostek transkrypcyjnych umiejscowionych na tym samym chromosomie (cis sprzęŜonych). Jest zaskakujące, Ŝe sekwencje wzmacniające i tłumiące są aktywne niezaleŜnie od ich orientacji (polarności). Elementy reakcji hormonalnej (dla steroidów,

T3, TRH, cAMP, prolaktyny itp.) działają jako sekwencje wzmacniające lub tłumiące, albo w sprzęŜeniu z nimi (p. rozdz. 44). Inne procesy wzmacniają lub tłumią ekspresję genu, np. reakcje na wstrząs cieplny, metale (Cd 2+ i Zn2+) i niektóre toksyczne związki chemiczne (np. dioksyna), działając przez swoiste elementy regulatorowe. Tkankowo swoista ekspresja genów, np. gen albuminy w wątrobie, zachodzi takŜe przez swoiste sekwencje DNA. Wspólną cechą tych podstawowych i regulatorowych elementów jest to, Ŝe zawsze zachodzi

interakcja swoistych białek z sekwencjami DNA. Wiele takich czynników zidentyfikowano (tab. 39-2), a wielki wysiłek badawczy poświęca się analizie wpływu oddziaływań białko-DNA na transkrypcję genu. Sygnały terminacji transkrypcji dla eukarioty-

cznej polimerazy RNA klasy II są słabo poznane. Jednak wydaje się, Ŝe sygnały terminacji znajdują się daleko w dół (na prawo) od sekwencji kodujących genów eukariotycznych. Na przykład sygnał dla terminacji transkrypcji mysiej P-globiny występuje w licznych miejscach 1000 do 2000 zasad od miejsca, w którym jest dodawana sekwencja (ogon) poli (A). Niewiele wiadomo o procesie terminacji ani o tym, czy w proces ten są włączone swoiste czynniki terminacji podobne do bakteryjnego czynnika p. Wiadomo jednak, Ŝe koniec 3' mRNA jest syntetyzowany_w_jakxesie potranskrypcyjnym TwyHajejię pr^biegać w 7 fflzftch. Pn przejściu pomńerazy RNA klasy II regionu jednostki transkrypcyjnej kodującego 3' końcowy fragment trańskryptu, endonukłeaza RNA przecina pierwotny transkrypt w miejscu ok. 15 zasad

4-84 / ROZDZIAŁ 39

.w kierunku 3' od sekwencji AAUAAA, która wydaje się być sygnałem do przecięcia transkryptów eukariotycznych. Wreszcie nowo utworzony koniec 3' jest poliadenylawany w nirkieóplazmie, jak to opisano niŜej.

ELEMENTY DNA TYPU CIS W GENACH KLASY III SĄ UMIEJSCOWIONE WEWNĄTRZ GENU polimcraza RNA klasy III, która odpowiada za transkrypcję genów tRNA geńÓW inałocząsteczkowych RNA (p;- rozdz. 37) rozpoznaje promotor, który jest umiesz czony wewnątrz genu, który ma ulec ekspresji, a nie w górę od punktu startu transkrypcji. W przypadku eukariotycznych genów tRNA są wewnętrzne oddzielne bloki (A i B) sekwencji, które działają jako promotor wewnątrzgenowy. Sekwencje w obrębie bloków A i B w dojrzalej cząsteczce tRNA znajdują się w regionach dob rze konserwowanych i biorą udział w wytworze niu odpowiednio pętli DHU i pętli TłC (ryc. 37-11). Dzięki manipulacji strukturą genów tRNA wykazano, Ŝe optymalna odległość dla funkcji promotora między blokami A i B wynosi 30 — 40 par zasad, i Ŝe punkt startu transkrypcji znajduje się między 10— 16 parą zasad.w górę od bloku A. Dla genu 5S RNA, który takŜe jest przepisywany przez polimerazę RNA klasy III, istnieje swoisty transkrypcyjny czynnik biał kowy, który prawdopodobnie, przez interakcję z cząsteczką RNA polimerazy klasy III, umoŜ liwia dopasowanie jej miejsca katalitycznego do punktu startu transkrypcji na DNA. Podobny mechanizm, wykorzystujący swoiste czynniki transkrypcyjne o aktywności trans, moŜe być włączony w transkrypcję genu tRNA.

ZANIM CZĄSTECZKI RNA STANĄ SIĘ CZĄSTECZKAMI AKTYWNYMI CZYNNOŚCIOWO. CZĘSTO SĄ PRZEKSZTAŁCANE W organizmach prokariotycznych pierwotne transkrypty genów kodujących mRN A są uŜyte jako matryce do translacji nawet przed ukończeniem transkrypcji. Dzieje się tak prawdopodobnie dlatego, Ŝe miejsce transkrypcji nie jest ograniczone do obszaru jądra, jak to ma miejsce w organizmach eukariotycznych. Zatem w ko-

mórkach prokariotycznych transkr ypcja i translacja są ze sobą sprzęŜone. W konsekwencji prókariotyczne mRNA podlegają niewielkim modyfikacjom i przekształceniom przed rozpoczęciem swojej czynności w procesie syntezy białek. Prókariotyczne cząsteczki rRNA i tRNA są przepisywane w postaci jednostek znacznie dłuŜszych niŜ ich cząsteczka końcowa. W istocie liczne jednostki transkrypcji tRNA zawierają więcej niŜ 1 cząsteczkę. Zatem w organizmach prokariotycznych do wytworzenia dojrzałych czynnościowo cząsteczek jest niezbędne przekształcenie prekursorowych cząsteczek rRNA i tRNA. Prawie wszystkie pierwotne transkrypty eukariotyczne RNA podlegają duŜym przekształceniom w okresie między czasem, w którym zostają zsyntetyzowane a czasem, w którym słuŜą swojej funkcji końcowej; przekształceniom podlegają zarówno mRNA, jak i cząsteczki strukturalne, takie jak rRNA, 5S RNA albo tRNAjfoces.. przekształcenia /ach ody i głównie w obre-bk jądra. Proces ten obejmuje dodanie czapeczki metylacj jnej, reakcje nuklcolitycznc i reakcje łączenia (ligacji), dodanie niikleotydów końcowych i modyfikacje nukleozydów. Jednak wiadomo, Ŝe w komórkach ssaków 50-—70% jądrowego RNA, włączając w to RNA, które otrzymały czapeczki w końcach 5', nie znajduje się w cytoplazmatycznym mRNA. Ten jądrowy ubytek RNA jest znacząco większy niŜ naleŜałoby tego oczekiwać jedynie jako wyniku utraty samych sekwencji wtrąconych (patrz niŜej). Dokładna rola widocznego nadmiaru transkryptów w jądrze komórek ssaków nie jest znana.

KODUJĄCE CZĘŚCI (EKSOIUY) WIĘKSZOŚCI GENÓW EUKARIOTYCZNYCH SĄ POPRZEDZIELANE INTRONAMI W wyniku postępu w technice klonowania i sekwencjonowania DNA stało się oczywiste, Ŝe między porcjami wielu^enów kodującyi arnioakwast (eEsony) są rozproszone długie sekwencje DNA, które nie niosą informacji genetycznej ostatecznie przetłumaczonej na sekwencję aminokwasów w cząsteczce białkowej (p. rozdz, 38). W rzeczywistości te sekwencje przerywają kodujące regiony genów struktura!nych. JTerTrtn|cone sekwencje (introny).znajdują się w-wtększości, ale nie we wszystkich genach

SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA f 4«S

wyŜszych organizmów eukariotycznych. Pierwotne transkryp ty genów strukturalnych zawienija.RNA komplementarny do sekwencji wtrąconych. Icdnakickwcncjc mtronowe w RNA są ^.wycięte z tTgij^Tr^, g ftrsru™ transkryptu. sa. jijdra tidpowicdntET5fet!«l»«*j4iilCZ£me (ligacja) zanim pows, tająca cząsteczka mRJ\A pojawi się w cytoplazmic, gdzie będzie słuŜyła do translacji (ryc. 39-9 i 39-101. Wyjaśniono mechanizmy, przez które introny są usuwane z pierwotnego transkryptu na terenie jądra, mechanizmy spajania eksonów z wytworzeniem „dojrzalej" cząsteczki mRNA i mechanizmy transportu cząsteczki mRNA do cytoplazmy. Mimo Ŝe sekwencje nukleotydów w intronach róŜnych eukariotycznych transkryptów, a nawet te w obrębie pojedynczego

transkryptu, są bardzo heterogenne, w kaŜdym z 2 połączeń ekson-intron (miejsce spojenia) sekwencje są dobrze konserwowane (sekwencje konsensus pokazane są na ryc. 39-10). Swoista struktura, zwana spiiceosomem, bierze udz w przekształceniu pierwotnego transkryptu na mRNA. Spliceosomy składają się zpierwotnego transkryptu, 4 małocząs teczko wy ch RNA (Ul, U2, U5 i U4/U6) i nieokreślonej liczby biatek. Cząsteczka Ul snRNAjest komplementarna do sekwencji konsensus w miejscu składania 5', U2 do miejsca rozgałęzienia, a U5 do miejsca składania 3'. Te cząsteczki snRNA wnoszą prawdopodobnie aktywność katalityczną. Obecnie odkryto, Ŝe w procesie usuwania sekwencji intronowych z pre-mRNA tworzy sie niezwykła cząsteczka RNA i przypominająca

Two rzen ie stru ktu ry

Nacięcie przy koficu 3' Intronu

Cap—[

Ugacja ekaonu 1 do Kań ca S'eksonu Z Enzymatyczne strawtenre [ntronii

G-G

Ryc. 39-9. Przekształcanie pierwotnego transkryptu (hnRNA) w mRNA. W tym hipotetycznym transkrypcie lewy koniec intronu jest przecięty (|) i intron tworzy pętlę (lasso) między swoim końcem 5' i A przy końcu 3' w obrębie sekwencji konsensus UACUAAC. Następuje wówczas nacięcie prawego końca intronu (O). Powoduje to uwolnienie pętli, która jest strawiona enzymatycznie, a ekson 1 ulega połączeniu z eksonem 2 przez reszty G.

Sekwencja kon UAAGU IntronRyc. 39-10. Sekwencje konsensus w miejscu połączenia.

-»l Ekson 3'

486 / ROZDZIAŁ 39

lasso. Okazuje się, Ŝe koniec 5' sekwencji wtrąconej, łączy się przez wiązanie fosfodiestrowe 2r—-5' z resztą nukleotydu adenylowego 28-37 nukleotydów w górę (na lewo) od końca 3' sekwencji wtrąconej (intronu). Proces ten i omawiana struktura jest schematycznie przedstawiona na ryc. 39-9. Wydaje się, Ŝe rozwiązano tajemnicę wzajemnych relacji hnRNA i odpowiadającego mu dojrzałego mRNA w komórkach eukariotycznych. Cza^leczkiJinRNA są pierwotnymi transkryptami oraz produktami swoich wczesnych przeTĆśztaloent^ó "dodaniu czapeczek i sekwencji poli(A) oraz zabraniu części odpowiadającej mtronom, cząsteczki te są transportowane do cytoplazmy jako dojrzałe cząsteczki mRNA. Przekształcanie cząsteczek hnRNA moŜe potencjalnie shiŜyiTSo regulacji ekspresji genów. Wykazano, Ŝe alternatywne wzory składania RNA mogą być przedmiotem kontroli rozwoju embrionalnego. MoŜna podać liczne przykłady, ale 3 z nich określają istotę zagadnienia. Na przykład cytoplazmatyczne mRNA dla a-amylazy w śliniance szczura i wątrobie szczura róŜnią się sekwencjami 5', podczas gdy pozostała część mRNA genów zawierających region kodujący i miejsce dodania sekwencji poli(A) są identyczne. Dalsza analiza wykazała, Ŝe chociaŜ pierwotne transkrypty są duŜe i nakładające się, róŜne miejsca składania są uŜyte do połączenia 2 róŜnych czapeczek i sekwencji liderowych do takiego samego trzonu mRNA. W dodatku alternatywne wzory składania DNA są uŜyte do wytworzenia 2 róŜnych mRNA kodujących cięŜki łańcuch immunog] obu liny —jeden, który koduje cięŜki łańcuch białkowy związany z błoną i drugi, który koduje cięŜki łańcuch białka ulegający wydzielaniu (p. rozdz. 41). Składanie (spajanie) RNA jest zwykle niezbędne w celu wytworzenia cząsteczek informacyjnego RNA, a wymóg składania jest dodatkowym mechanizmem zróŜnicowanej regulacji ekspresji genu. Przynajmniej 1 postać p-talasemii, choroby, w której gen p-globiny jest silnie wytłumiony, pojawia się w wyniku zmiany nukleotydów w miej scu połączenia ekson-intron, co wyklucza usunięcie intronu i przez to prowadzi do zmniejszonej syntezy łańcucha p lub ją wyklucza. Jest to konsekwencja przerwania normalnej ramki odczytu w mRNA. Jest oczywiste, Ŝe wada w podstawowym procesie, jakim jest składanie RNA, zmniejsza dokładność, jaką musi mieć proces składania RNA-RNA.

RNA MOśE DZIAŁAĆ JAKO CZYNNIK KATALITYCZNY Jako dodatek do katalitycznej aktywności wnoszonej przez snRNA w kształtowaniu cząsteczki mRNA, przynajmniej 3 inne reakcje przekształcenia RNA są katalizowane przez RNA. Obserwacje, przeprowadzone na organellach roślin, droŜdŜy, wirusów i komórek wyŜszych eukariontów, wykazują, Ŝe RNA moŜe działać jako enzym. Odkrycie to zrewolucjonizowało nasze pojęcia o działaniu enzymów i początkach Ŝycia.

INFORMACYJNY RNA (mRNA) JEST MODYFIKOWANY NA KOŃCACH 5' i 3' Jak wspomniano wyŜej, cząsteczki mRNA ssaków mają strukturę zwaną czapeczką na końcu 5' i większość z nich ma sekwencję (ogon) poli(A) w końcu 3'. Struktura czapeczki jest dodana do końca 5' nowo przepisywanego prekursora mRNA w jądrze przed transportem cząsteczki mRNA do cytoplazmy. Sekwencja poli(A)(gdy występuje) jest dodana albo w jądrze, albo w cytoplazmie. Wtórne metylacje cząsteczek mRNA w obrębie grup 2'-hydroksylowych i atomu N6 reszt adenylanowych występują po pojawieniu się cząsteczki mRNA w cytoplazmie. Czapeczka 5' transkryptu RNA jest niezbędna do wytworzenia kompleksu rybo nukleoprotei nowego, do reakcji składania, i moŜe być włączona w transport mRNA oraz rozpoczęcie translacji, a takŜe osłania koniec 5' mRNA przed atakiem egzonukleaz działających w kierunku 5'—*3r. Rola sekwencji poli(A) jest nieznana, ale wydaje się, Ŝe polega ona na osłonie końca 3' RNA przed atakiem cgzonukleazy działającej w kierunku 3'-+ 5'. W Ŝadnym przypadku występowanie lub brak sekwencji poli(A) nie determinuje, czy prekursorowa cząsteczka obecna w jądrze pojawi się w cytoplazmie, poniewaŜ nie wszystkie cząsteczki hnRNA zawierające sekwencję poli{A) wchodzą w skład cytoplazmatycznego mRNA, ani nie wszystkie cytoplazmatyczne cząsteczki mRNA zawierają sekwencję poli(A) (histony są najlepiej zauwaŜalnym przykładem). W komórkach ssaków reakcje cytoplazmatyczne mogą dodawać i usuwać reszty adenylanowe z sekwencji poli(A); procesy te są związane ze zmianą stabilności mRNA.

SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA / 487

Wielkość cząsteczek cytoplazmatycznego mRNA, nawet po usunięciu sekwencji poli(A), jest znacznie większa, często 2—3 razy, od wielkości wymaganej do kodowania swoistych białek, dla których stanowią one matrycę. Dodatkowe nukleotydy występują w regionach nie ulegających translacji (niekodujących) zarówno po stronie 5', jak i 3' regionu kodującego; najdłuŜsze sekwencje nie ulegające translacji znajdują się zwykle przy końcu 3'. Właściwa rola tych sekwencji nie jest znana, ale są one włączone w przekształcanie RNA, transport, degradację i translację. Transportujący RNA (tRNA) jest znacznie modyfikowany Czas teczki _tRNA, jak to opisano w rozdz. 37 i 40,~sIuŜą jako cząsteczki adaptacyjne do translacji mRNA na sekwencje aminokwasów jw^KSEacnTCźąsteczki tRNA zawierają liczne modyfikacje zasad podstawowych A, U, G i C. Niektóre" z nich są to proste metylowane pochodne, a niektóre mają przekształcone wiązania glikozydowe. Cząsteczki tRNA u prokariontów i u eukariontów są przepisywane w pośtaclduŜych cząsteczek prekursorowych, zawierających często więcej niŜ 1 tRNA i wtedy podlegają przekształceniom nukleolitycznym i zmniejszeniu wielkości; proces jest katalizowany przez swoistą klasę rybonukleaz. W dodatku geny niektórych cząsteczek tRNA mają, bardzo blisko części odpowiadającej pętli antyk odonowej, pojedynczy intron o długości 10-—40 nukieotydów. Te introny w genach tRNA są przepisywane; dlatego teŜ przekształcanie prekursorowych transkryptów wielu cząsteczek tRNA musi obejmować usunięcie intr.ouów i odpowiednie rlp^-nie rpginn^ antyjcodoiiowego tak, aby powstała aktywna cząsteczka adaptacyjna do syntezy białek. Enzymy nukleolityczne, przekształcające prekursory tRNA, rozpoznają najpewniej 3-wy miarową strukturę, a nie tylko sekwencję liniową RNA. Dzięki temu ten układ enzymatyczny przekształca tylko te cząsteczki, które są zdolne do sfaldowania w produkty mające właściwości czynnościowe. Dalsze modyfikacje cząsteczek tRNA obejmują alkilację nukieotydów i dołączenie charakterystycznej końcówki C-C-A przy końcu 3' cząsteczki. Ta końcówka C-C-A jest miejscem przyłączenia swoistego aminokwasu, który ma wejść w reakcję polimeryzacji podczas syntezy białka. Metylacja prekursorów tRNA u ssa-

ków zachodzi prawdopodobnie w jądrze, podczas gdy o"9cTęcie i dołączenie C-C-A są czynnościami cytoplazmatycznymi, poniewaŜ końcówki te mają szybszy metabolizm niŜ same cząsteczki tRNA. W cytoplazmie komórek ssaków są enzymy niezbędne do dołączenia aminokwasów do reszt C-C-A. Rybosomalny RNA (rRNA) jest syntetyzowany jako duŜa cząsteczka prekursorowa W komórkach ssaków 2 większe cząsteczki rRNA i 1 mniejsza cząsteczka rRNA są przepisane jako część pojedynczej duŜej cząsteczki prekursorowej (ryc. 39-11). Cząsteczka prekursorowa jest następnie na terenie jąderka przekształcana, w wyniku czego powstają składowe RNA dla podjednostek rybosomów znajdujących się w cytoplazmie. Geny rRNA są umiejscowione w jąderkach komórek ssaków. W kaŜdej komórce znajdują się setki kopii tych genów. Geny rRNA są przepisywane jako jednostki, z których kaŜda koduje (w kierunku 5'-*3') 18S, 5,_8S i 28S rybosomalny RNA. Pierwotny transkrypt j?st cząsteczką o masie 45S silnie z me ty 1 owa ną nartę renie jąderka. Prekursorów a cząsteczka 45S, dająca ewentualnie segment 28S, zawiera 65 grup metylowych w rybozach i 5 grup metylowych w zasadach. Metylowane są tylko te części prekursora, które ewentualnie staną się stabilnymi cząsteczkami rRNA. Cząsteczka prekursorowa 45S jest przekształcana nukleolitycznie, ale sygnały do tego przekształcania są zupełnie inne niŜ te, które znajdują się w hnRNA. Stąd przekształcanie nukleolityczne zachodzi na drodze mechanizmu swoistego i odmiennego od tego, który jest odpowiedzialny za przekształcenie hnRNA do mRNA. Jak przedstawiono na ryc. 39-11 prawie połowa oryginalnego pierwotnego transkryptu jest degradowana. W czasie przekształcania rRNA zachodzi dalsza metylacja i ewentualnie na terenie jad erek łańcuchy 28S łączą się z białkami rybosomalnymi i tworzą większą podjednostkę rybosomalną o masie 60S. Cząsteczka 5,8S rRNA powstaje takŜe z prekursorowego .Rhl A 45S na terenie jąderka i staje się integralną częścią podjednostki rybosomalnej. Mniejsze rybosomalne podjednostki (40S) tworzą się przez połączenie odpowiednich białek rybosomalnych z cząsteczką 18S rRNA.

488 / ROZDZIAŁ 39

|5.es Ryc. obraz

39-11.

Schematyczny

28S

przekształcania rybosomalnego RNA, Końcowe produkty są pokazane jako zaczernione pałeczki. Seria złoŜonych procesów potranskrypcyjnych, obejmujących przekształcanie przy uŜyciu auto- i egzonukleolitycznych, swoistych dla RNA, rybonukleaz generuje rR NA klas 18S, 5,8S i 28. Cząsteczki 5,8S i 28S są związane ze sobą wiązaniami wodorowymi. Na ryc. 39-4 pokazano fotografię z mikroskopu elektronowego rybosomalnych genów w trakcie transkrypcji.

KWASY NUKLEINOWE SĄ TRAWIONE PRZEZ SWOISTE NUKLEAZY Od wielu lat są znane enzymy zdolne do rozkładu kwasów nukleinowych. Enzymy te są klasyfikowane w róŜny sposób. Te, które są swoiste w.stosunku do kwasu_de.Qksyjpy.bonukkinowego nazywa sie deoksyryhonukLeazami, a te, które swoiście Tiydrolizują kwasy rybonukleinowe są rybonukleazami, W obrębie kaŜdej

z tych klas znajdują się enzymy zdolne do rozszczepienia wewnętrznych wiązań fosfodiestrowych, w wyniku czego powstają końcówki 3'-hydroksylowe i 5'-fosforanowe albo 5'-hydroksylowe i 3'-fosforanowe. Enzymy te nazywa się endonukleazami. Niektóre z nich zdolne są do hydrolizy obu pasm dwupasmowej cząsteczki, podczas gdy inne mogą przecinać pojedyncze pasma kwasów nukleinowych. Niektóre nukleazy mogą hydrolizować tylko niesparowa-

SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA / 489

ne pojedyncze pasma, podczas gdy inne mają zdolność' hydrolizowania pojedynczych pasm pozostających w strukturze dwupasmowej cząsteczki. Istnieją klasy endonukleaz. _które rozpoznają swoiste sekwencje w DNA; większość z nich to endonukleazj restrykcyjne, które obecnie stały się waŜnym narzędziem w genetyce molekularnej i naukach medycznych. W tabeli 42.1 przedstawiono listę niektórych obecnie znanych endonukleaz restrykcyjnych. Niektóre nukleazy są zdolne hydrolizować nukleotyd tylko wówczas, gdy znajduje się on na końcu cząsteczki; są to egzonukieazy. Egzonukleazy działają tlkoWjectayjiJeruK y ją y j y j J . 3' aipo a -» 5 j. u bakterii eg^ortuiOeaza 3'-» 5' jest mtegraTną"ćzęścią replikacyjnej maszynerii DNA, gdzie słuŜy do odcięcia świeŜo dodanego deoksynukleotydu w przypadku błędnego parowania zasad.

REGULACJA ROZPADU STANOWI JESZCZE INNY MECHANIZM REGULUJĄCY ILOŚĆ INFORMACYJNEGO RNA ChociaŜ w komórkach ssaków większość mRNA jest bardzo stabilna (okresy półtrwania wynoszą godziny) obrót innych jest bardzo szybki (okresy póhrwania 10 — 30 min). W aiektórych przepadkach stabilność mRNA podlega regulacji. Ma to waŜne implikacje, poniewaŜ zwykle mamy do czynienia z prostą zaleŜnością między iJością mRNA a przetłumaczeniem tego mRNA na kodowane przez niego białko. Zmiany w stabilności swoistych mRNA mogą mieć przeto duŜe wpływy na procesy biologiczne. Informacyjne RNA egzystują w cytopiazmie jako cząsteczki rybonukleoproteinowe (RNP).

Czapeczka ----

5'NCS

O

Niektóre z białek ehronią mRNA przed trawieniem przez- Hukleazy, podczas gdy inne mogą w pewnych warunkach pobudzać atak nukleazowy. Sądzi się, Ŝe mRNA są stabilizowane łub destabilizowane przez interakcje białek z ich róŜnymi strukturami i sekwencjami. Niektóre efektory, np. honnony, mogą regulować stabilność mRNA przez zwiększanie lub zmniejszanie ilości tych biaiek. Obecnie wiadomo, Ŝe końce cząsteczek mRNA odpowiadają za stabilność mRNA (p. ryc. 39-12). Struktura, zwana czapeczką, w końcu 5r cukariotycznego mRNA zapobiega atakowi 5' egzonukleaz, a sekwencja poli (A) zapobiega "aktywności 3' egzonukieaz. Zakłada się, Ŝe w cząsteczkach mRNA mających te struktury pojedynczy atak endonukleolityczny pozwala na atak egzonukieaz i strawienie całej cząsteczki. Sądzi się, Ŝe inne struktury (sekwencje) w obrębie 5' niekodujących sekwencji (5' NCS), w obrębie regionu kodującego i w obrębie 3'NCS mogą pobudzać albo zapobiegać temu początkowemu działaniu endonukleaz (ryc. 39—12). W celu ilustracji podano kilka przykładów. Usunięcie 5'NCS powoduje 3 — 5-krotne przedłuŜenie okresu półtrwania c-myc mRNA. Skrócenie kodującego regionu histonowego mRNA powoduje przedłuŜenie okresu półtrwaoia. Rodzaj autoregulacji stabilności mRNA pośrednio obejmuje region kodujący. Wolna tubulina wiąŜe się z pierwszymi 4 aminokwasami powstającego łańcucha tubuliny, w miarę jak ten wyłania się z rybosomu. Powoduje to aktywację RNazy związanej z rybosomem, która następnie trawi mRNA tubuiiny. Struktury przy końcu 3', łącznie z sekwencją poli(X7 wymagają tub osłabiają stabilność swoistych mRNA. Brak sekwencji poli(A) jest związany z szybkim rozkładem mRNA, a zabranie

Sekwencja Kodujące

3'NCS

--- A-A-A-A-A"

AUUUA

Ryc. 39-12. Struktura typowego eukariotycznego mRNA pokazująca elementy biorące udział w regulacji stabilności mRNA. Typowy eukariotyczny mRNA ma 5' niefcoduja.ee sekwencje (5' noncoding sequences, 5' NCS), region kodujący i 3' NCS. Prawie wszystkie eukariotyczne mRNA mają czapeczkę zmodyfikowanych nukleotydów (cap) w końcu 5' i większość ma w końcu 3' trakt („ogon") sekwencji poliadenylowych. Czapeczka u końca 5' i ogon poli (A) u końca 3' chronią mRNA przed atakiem egzonukieaz.

490 / ROZDZIAŁ 39

poli(A) z niektórych RNA powoduje ich destabilizację. Histonowe mRNA nie mają sekwencji poli(A), ale przy końcu 3' mają sekwencję, która moŜe tworzyć strukturę pętli z szypułą i ta struktura wydaje się być odpowiedzialna za oporność na atak egzonukleolityczny. mRNA histonu H4jest np, degradowany od końca 3' do 5', ale tylko wówczas, gdy zajdzie pojedyncze przecięcie endonukleolityczne w odległości ok. 9 nukleotydów do końca 3', w rejonie zdolnym wytworzyć strukturę pętli z szypułą. Struktury typu pętla z szypulą w obrębie 3* niekodujących sekwencji końca 3' są takŜe krytyczne dla regulacji jonami Ŝelaza mRNA kodującego receptor transferyny. Struktury pętla-szypuła są równieŜ związane ze stabilnością mRNA u bakterii, co sugeruje, Ŝe mechanizm ten jest szeroko wykorzystywany. Inne sekwencje końca 3' pewnych eukariotycznychmRNA biorą udział w destabilizacji tych cząsteczek. Szczególnie interesujące są regiony bogate w sekwencje AU, z których wiele zawiera sekwencje (motyw) AUUUA. Sekwencje takie znajdują się w mRNA, które mają krótki okres półtrwania i obejmują mRNA dla wielu onkogenów i cytokin. WaŜność tego regionu uwypukla doświadczenie, w którym sekwencja odpowiadająca regionowi niekodującemu 3' krótko Ŝyjącego mRNA,czynnika stymulującego kolonie (CSF), który zawiera motyw AU U U A, byta dodana do końca 3' mRNA P-globiny. Zamiast uzyskania duŜej stabilności taki hybrydowy mRNA |3-globiny stal się krótko Ŝyjącym mRNA, CO jest cechą charakterystyczną mRNA CSF. Z tych kilku cytowanych przykładów jasno wynika, Ŝe liczne mechanizmy

uczestniczą w regulacji stabilności mRNA, podobnie jak liczne mechanizmy biorą udział w regulacji syntezy mRNA CSF. Skoordynowana regulacja tych 2 procesów daje komórce znaczną zdolność adaptacyjną.

PIŚMIENNICTWO Breathnach R, Chambon P: Organization and eipression of eucaryotic split genes coding for proteina. Annu Rev Biochem 1981;5O:349. Dynan WS, Tjian R: Control of eucaryotic mRNA synthesis by seąuence specific DNA binding proteins. Naturę (Łondon) 1985i3I6:774. Maniatis T, Read R; The role of smali nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splieing. Naturę (London) 1987:315:671. McClure WR: Protein-nucleic acid interactions in transcription: A molecular analysis. Annu Rev Biochem 1985;54:171. McKnight S, Tjian R: Transcriptional selectivity of viral genes ia mammalian cells. Celi 1986; 46:795. Nevins JR: The pathway of eukaryotic mRNA formation. Annu Rev Biochem 1983,52:44J. Pacigett RAet al: Splicingof messenger RNA precursors. Annu Rev Biochem 1986;55:1119. Ross J: The turnover of messenger RNA. Sci Ani 1989;260:48. Ruskin B et al: Excision of an intact intron as a novel lariat structure during pre-mRNA splicing in vitro. Cel! 1984;38:317. Sentenec A: Eucaryotic RNA polymerases. Crit Rev Biol 1985;18:31. Shapiro DJ et al: Regulation of mRNA stability in eukaryotic cells. Bioessays 1987;6:221, Sliarp PA; On the origin of RN A splicing and introns. Celi 1985;42:397.

■

Synteza białek i kod genetyczny

40

Dary! K. Granner, MD

WPROWADZENIE Litery A, G, T i C odpowiadają nukleotydom występującym w DNA. Są one zorganizowane w 3 literowy kod zwany kodonem, a zbiór tych kodonów obejmuje kod genetyczny. Linijny szereg kodonów (gen) określa syntezę róŜnych cząsteczek RNA, z których większość jest włączona w syntezę białek. Synteza białek zachodzi w 3 głównych etapach: inicjacji, elongacji i termin acji. Proces ten przypomina replikację DNA i generalną zasadę transkrypcji i faktycznie przebiega z zachowaniem polarności 5'—3'.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Zrozumienie syntezy białek i wyjaśnienie mutacji było niemoŜliwe zanim nie został wyjaśniony kod genetyczny. Kod genetyczny stanowi podstawę do wyjaśnienia, w jaki sposób wady w białkach mogą wywoływać choroby genetyczne oraz w diagnostyce i w pewnych przypadkach leczenia tych chorób. Ponadto patofizjologia wielu zakaŜeń wirusowych jest związana ze zdolnością wirusów do przerywania syntezy białek gospodarza.

INFORMACJA GENETYCZNA PRZEPŁYWA Z DNA DO RNA ł DO BIAŁEK Informacja genetyczna zawarta w sekwencji nuktetsdytów DNA jest przepisywana w jądrze komórkowym na swoistą sekwencję nukleotydów w cząsteczce RNA. Sekwencja nukJeotydc-w w transkrypcie RNA jest komplementarna

do sekwencji nukleotydów w kodującym paśmie odpowiedniego genu, stosownie do reguły parowania zasad. Wiele róŜnych klas RNA bierze udział w kierowaniu syntezą białek. U prokariontów zachodzi linijna współzaleŜność między genem a informacyjnym RNA (mRNA) przepisywanym z genu i produktem nohpeptydowym. Sytuacja ta jest bardziej sTcompIikowana w komórkach wyŜszych organizmów eukariotycznych, w których pierwotny transkrypt, heterogenny jądrowy RNA (hnRNA), jest znacznie dłuŜszy niŜ dojrzały mRNA. DuŜa cząsteczka hnRNA zawiera kodujące regiony (eksony), które będą tworzyły dojrzały mRNA, oraz długie sekwencje wtrącone (introny), które oddzielają eksony. hnRNA podlega przekształceniom na terenie jądra i introny, które często stanowią większą część hnRNA niŜ eksony, zostają usunięte. Eksony są w tym procesie łączone i tworzą dojrzały mRNA, który jest transportowany do cy toplazmy, gdzie ulega translacji na białko. Komórka musi mieć niezbędny mechanizm do dokładnego i wydajnego przetłumaczenia informacji z nukleotydowej sekwencji mRNA na sekwencję aminokwasów odpowiedniego swoistego białka. Wyjaśnienie i zrozumienie tego procesu, zwanego translacją, było moŜliwe po złamaniu kodu genetycznego. JuŜ we wczesnym okresie badań było wiadomo, Ŝe cząsteczki mRNA jako takie nie mają powinowactwa do aminokwasów, a zatem translacja informacji zawartej w sekwencji nukleotydów mRNA na sekwencję aminokwasów w białku wymaga pośredniczącej cząsteczki adaptacyjnej. Taka cząsteczka adaptacyjna musi z jednej strony rozpoznać sekwencję nukleotydową, a z drugiej swoisty aminokwas. Za pomocą takiej cząsteczki

492 / ROZDZIAŁ 40

adaptacyjnej komórka moŜe wprowadzić aminokwas w odpowiednią pozycję sekwencji białkowej dyktowanej sekwencją nukleotydów swoistego mRNA, Istotnie funkcjonalne grupy aminokwasów nie kontaktują się bezpośrednio z matrycą mRNA.

SEKWENCJA NUKLEOTYDÓW CZĄSTECZKI mRNA SKŁADA SIĘ Z SERII KODONÓW, KTÓRE ODPOWIADAJĄ KAśDEMU AMINOKWASOWI Cząsteczki adaptacyjne, biorące udział w translacji kodbnow na sekwencje aminokwasów w białku, sa cząsteczkami ti (tRNA). Ryfeosom jest składnikiem komórki, na którym oddziaTują~ze~roba-róŜGe wspomniane elementy funkcjonalne, aby złoŜyć cząsteczkę białka. Liczne rybosomy mogą zbierać się w zespoły biorące udział równocześnie w procesie tłumaczenia pojedynczej cząsteczki mRNA; zespoły takie nazywamy poiisoniami. Polisomy przyłączone do błon cytoplazmy tworzą szorstką siateczkę środplazmałyczną, która słuŜy dla syntezy integralnych białek błon wewnętrznych i białek, które będą wydzielone z komórki. Struktury polisomalne znajdują się takŜe w cytoplazmie w postaci wolnej; zachodzi na nich synteza tych białek, które pozostaną w obrębie komórki. Do syntezy zestawu białek, komórkowych potrzeba 20 róŜnych aminokwasów, dlatego musi być przynajmniej 20 oddzielnych kodonówj które obejmują kod genetyczny. PoniewaŜ w mRNA występują tylko 4 róŜne mikleotydy. na kaŜdy kodon musi przypadać więcej niŜ 1 nukleotyd purynowy lub pi rym idy no wy. Kodony, z których kaŜdy składałby się z 2 flufcleotydów, dałyby tylko 16 (4') swoistych kodonów, podczas gdy kodony o 3 nukleotydach dałyby 64 (43) swoistych kodonów. W wyniku pierwszych spostrzeŜeń Matthaei i Nirenberga wiemy obecnie, Ŝe kaŜdy z kodonów ma sekwencję 3 aukJcotydów, czyli kod składa się z tripletów niikjegfrflów. Złamanie kodu genetycznego w duŜej mierze zaleŜało od chemicznej syntezy polimerów nukleotydowych, a zwłaszcza tripletów nukleotydowych.

KOD GENETYCZNY JEST ZDEGENEROWANY, JEDNOZNACZNY, NIENAKŁADAJĄCY SIĘ, BEZPRZESTANKOWY I UNIWERSALNY Trzy spośród kodonów nie kodują swoistego aminokwasu; nazwano le Kodonami nonsensownymi. Przynajmniej 2 z tych nonsensownych kodonów są uŜywane w komórce jako sygnały terminach'. Określają one, gdzie naleŜy zatrzymać polimeryzację aminokwasów w cząsteczce białkowej. PózostałyćTi 61 kodonów koduje 20 aminokwasów. W kodzie genetycznym występuje zatem ląjfeff&ilgffJtfiłjjC;tztl-i Ŝe |igzne j^ n! sam aminokwas, iiadanie kodu genetycznego wskazuje, Ŝe 64 moŜliwe kodony mogą być zgrupowane w 16 rodzin. Rodzinę tworzą takie kodony, które mają. te same pierwsze 2 zasady (tab. 40-1). KaŜda rodzina zajmuje pojedynczą kolumnę między Imiami poziomymi, np. kodony CCN, gdzie Ń moŜe być U, C, A i G, definiują rodzinę umiejscowioną w 2 kolumnie 2 przedziału od góry. W niektórych rodzinach wszystkie 4 kodony kodują ten sam aminokwas, podobnie jak członkowie rodziny CC opisani wyŜej. Odnosi się to do rodzin niemieszanych. Kodonów niemieszanych jest 8 wśród 16 rodzin kodonów (tab. 40-1). Te rodziny kodonów, które kodują więcej niŜ 1 aminokwas, określa się jako rodziny mieszane. W 6 rodzinach, spośród rodzin mieszanych, kodony zawierające pirymidynę (U lub C) w 3 pozycji kodują 1 aminokwas, podczas gdy kodony zawierające w 3 pozycji purynę (A lub G) kodują inny aminokwas albo stanowią sygnał lerminacji łańcucha (tab. 40-1). Pozostałe 2 rodziny — rodzina UG i rodzina AU — nie wykazują Ŝadnego z tych wzorów i są unikatowymi. Na ogół więc 3 nukleotyd w kodonie jest mniej waŜny niŜ pozostałe 2 w określeniu swoistego aminokwasu, jaki musi być wbudowany do białka i zjawisko to odpowiada głównie za degenerację kodu. Jednak dla kaŜdego swoistego kodonu wskazuje się tylko pojedynczy aminokwas; z rzadkimi wyjątkami kod genetyczny jest jednoznaczny, ti. dany swoisty kodiiiujesIriEZjpisany dopryedjaiGzegojimino diiijIriEZjpisany dopryedjaiGzegojimino kwasu. RozróŜnienie między _dwuznąc_znoscią a degeneracją jest waŜnyni,. godnym podkreślenia, pojęciem. Jednoznaczny, ale zdegeneFswafty-kodjaoŜe być objaśniony w kategoriach molekularnych.

SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY / 493 Tabela 40-1. Kod genetyczny kodony w informacyjnym RNA)" Pierwszy

Drugi

nukleotyd

nukleotyd

U

C

A

G

U

C

Phe Pne Leu Leu Leu

Trzeci nukieotyd

A

G

Ser

Tyr

Cys

U

Ser Ser

Ser

TVr Term Term

Cys Term' Trp

C A G

Pro

His

Arg

U

Leu Leu Leu

Pro Pro Pro

His Gin Gin

Arg Arg Arg

C A

G

Ile

Thr

Asn

Ser

U

de Ile" Met

Thr Thr Thr

Asn Lys Lys

Ser Arg* Arg"

C

Val

Ala

Asp

Gly

U

Val Val Val

Ala Ala Ala

Asp Glu Glu

Gly Gly Gly

C A G

nukleotyd w antykodonie, który rozpoznaje 3. zasadę (w kierunku 3') kodonu, moŜe być mniej dyskryminującym (rodziny mieszane) albo niedyskryminującym (rodziny niemieszane), a mimo to jest w stanie wprowadzić odpowiedni, aktualnie potrzebny, aminokwas. Zjawisko to zmniejsza rygor parowania między 3 zasadą kodonu a komplementarnym nukleotydem w antykodonie i objaśnia je hipoteza tolerancji („wobble" hypothesis). Zjueltcznymi wyjątkami dany swoisty kodon będzie wprowadza! tylko 1 swoisty aminokwas, chociaŜ .dany swoisty aminokwas moŜe być rozpoznany przez więcej niŜ 1 kodon. "Jak "to wyjaśnimy niŜej odczytywanie kodu genetycznego w trakcie procesu synt^^y jj d ł d j h i

A G

* Określenia pierwszy, drugi i trzeci nukleotyd odnoszą się do indywid ualn ych nukleotydó w w kodonie tripletowym. U — nukleotyd urydyny; C — nukleotyd cytydyny, A — nukleotyd adeniny; G — nukleotyd guaniny; Met — kodon inicjujący łańcuch peptydowy; Term — kodon kończący łańcuch. AUG — triplet kodujący Met, słuŜy jako kodon inicjujący w komórkach ssaków. (Skróty aminokwasów są objaśnione w rozdz. 3). ** W mitochondriacb ssaków AUA koduje Met a UGA — Trp; kodony AGA I AGG słuŜą J3ko sygnały kończące łańcuch.

Rozpoznanie swoistych kodonów w mRNA przez adaptacyjne cząsteczki tRNA jest zaleŜne od ich regionu antykodonowego i reguł swoistego parowania zasad. KaŜda cząsteczka tRNA zawiera swoistą sekwencję komplementarną do kodonu, którą nazywa się antyk odo nem. Dla danego kodonn_jw~ -riRNA lylko pojedynczy roĆTźaj cząsteczki tRNA ma odpowiedni anty kod on. PoniewaŜ kaŜda cząsteczka tRNA moŜe być obarczona tylko 1 swoistym aminokwasem, dlaiego kaŜdy kodon określa tylko 1 aminokwas. Jednak niektóre cząsteczki tRNA mogą uŜywać antykodonu do rozpoznawania więcej niŜ 1 kodonu. Jak moŜna zaobserwować na przykładzie niemieszanych rodzin kodonów,

g ^^y nie obejmuje Ŝadnych nakładających się kodonów. Kod genetyczny jest wiec kodem nienakłaeJającym się. Od momentu, od którego zacznie się odczytywanie od swoistego kodonu nie ma znaków przestankowych między kodonami 1 przekaz informacji jest odczytywany z ciągłej sekwencji triplctów nukleotydowych, aŜ do cza su gdy osiągnie się kodon nonsensowny. Dotychczas sądzono, Ŝe kod genetyczny jest uniwersalny. Obecnie wykazano, Ŝe grupa cząsteczek tRNA w mitochondriach (które zawierają oddzielny i róŜniący się od cytoplazmatycznego mechanizm translacyjny) u niŜszych i wyŜszych eukariontów, z człowiekiem włącznie, odczytuje 4 kodony w sposób inny niŜ cząsteczki tRNA w cytoplazmie nawet tych samych komórek. Jak to wynika z tab. 40-1, kodon AUA jest odczytywany jako Met, a UGA koduje Trp w mitochondriach u ssaków. Te 2 kodony mieszczą się w 2 rodzinach kodonów określonych jako unikatowe: w rodzinie UG i rodzinie AU. Oczywiście w celu zmniejszenia liczby cząsteczek tRNA, niezbędnych do trans lacji kodu genetycznego, mitochondria były zdolne przekształcić rodzinę UG i rodzinę AU do prostych typów mieszanych. Ponadto kodo ny AGA i AGG są odczytywane jako sygnały stop, czyli kodony terminacji łańcucha, a nie jako kodony Arg. W wyniku tego mitochondria potrzebują jedynie 22 rodzaje cząsteczek tRNA, aby odczytać swój kod genetyczny, podczas gdy system translacji w cytoplazmie ma pełny ze staw 31 rodzajów cząsteczek tRNA. Oprócz

tego wyjątku kod genetyczny jest uniwersalny. Częstość, z jaką jest uŜywany kodon kaŜdego aminokwasu, róŜni się znacznie między gatun kami i w obrębie róŜnych tkanek tego samego gatunku. Zestawienia częstości uŜywania kodo-

494 / ROZDZIAŁ 40

nów stają się coraz dokładniejsze w miarę jak coraz więcej genów jest sekwencjonowanych. Ma to duŜe znaczenie, poniewaŜ badacze potrzebują odtworzyć strukturę mRNA na podstawie dedukcji sekwencji aminokwasów w części białka w celu uzyskania, na drodze syntezy, sondy oligonukleotydowej niezbędnej do rozpoczęcia procesu klonowania rekombinacyjnego DNA.

DLA KAśDEGO Z 20 AMINOKWASÓW ISTNIEJE PRZYNAJMNIEJ 1 RODZAJ TRANSFEROWEGO RNA (tRNA) Cząsteczki tRNA mają zadziwiająco podobne funkcje i trójwymiarowe struktury. Funkcja cząsteczek rRNA jako adaptatorów wymaga obarczenia kaŜdego swoistego tRNA swoistym aminokwasem. PoniewaŜ nie ma powinowactwa kwasów nukleinowych do swoistych grup funkcyjnych aminokwasów, rozpoznania musi dokonać cząsteczka białka zdolna do rozpoznania swoistej cząsteczki tRNA i swoistego aminokwasu. Dla tych swoistych funkcji rozpoznawczych i dla właściwego dołączenia 20 aminokwasów do swoistych cząsteczek tRNA jest konieczne przynajmniej 20 swoistych enzymów. Proces^ rozpoznania i dołączenia aminokwasu (proces oTiarczenla tRNA} przebiega w 2 etapach dla kaŜdego enzymu swoistego dla kaŜdego z 20 aminokwasów. Enzymy te są nazwane syntetazami aminoacyla-tRNA...Tworzą one aktywny kompleks pośredni aminoacylo-AMP-enzym, który przedstawiono na ryc. 40-1. Swoisty kompleks aminoacylo-ĄMP-enzym rozpoznaje następnie swoisty tRNA, do którego dołącza resztę aminoacylową przy po-

zycji 3'-hydroksylowej końcowej adenozyny. Aminokwas pozostaje przyłączony do swoistegtrtRNĄ wiązaniem estrowym do czasu, aŜ będzie uŜyty do polimeryzacji w swoistej pozycji w trakcie tworzenia prekursora polipeptydowe^~ go cząsteczki białkowej. Na tym etapie naszych rozwaŜań musimy powrócić do waŜnych regionów cząsteczki tRNA opisanych w rozdz. 37 (i zilustrowanych na ryc. 37-11). Ramię tymidyna-pseudourydyna-cytydyna (T?Ć) jest włączone w proces wiązania aminoacylo-tRNA do powierzchni rybosomu w miejscu syntezy białka. Ramię D jest jednym z miejsc istotnych do właściwego rozpoznania danego rodzaju tRNA przez właściwą mu syntetazę aminoacylo-tRNA. Ramię akceptorowe, umiejscowione przy końcu 3'^hydroksyloadenozylowym jest miejscem.dołączenia swoistego aminokwasu. Region antykodonowy składa się z JLoukleotydów i jest rozpoznawany przez 3-liteiawy kodon w mRNA (ryc. 40-2). Sekwencja ta, odczytywana w pętli antykodonowej w kierunku 3' do 5', składa się z: dowolnej zasady zmodyfikowanej puryny-X-Y-Z—pirymidyny-pLrymidyny—5'. Zwróć uwagę, Ŝe kierunek odczytu antykodonu jest 3' do 5', podczas gdy kod genetyczny w tab. 40-1 jest odczytywany w kierunku 5' do 3', poniewaŜ kodon mRNA i pętla antykodonu w tRNA są przeciwrownoJegłe pod względem komplementamości. Degeneracja kodu genetycznego odnosi się głównie do ostatniego nukleotydu w triplecie kodonowym, co sugeruje, Ŝe parowanie zasad między tym ostatnim nukkoiydem a odpowiadającym mu nukleotydem w antykodonie nie jest precyzyjne. Jak to przedstawiono wyŜej, zjawisko to objaśnia hipoteza tolerancji; w tym

ATP

HOOC-HC-R

OH Enzym (Enz} SYNTETAZA AMINOACYLO-tRNA Aminokwas (AA)

AMP + Enz

Enz— Adenina — Ryhoza-O—P— 0-C— CH-R NH.

EnZnAMP-AA (aktywowany aminokwas) tRNA Kompleks amlnoacyla-AMP-enzym

tR NA -A A

Aminoacylo-tRNA

Ryc. 40-1. Tworzenie aminoacylo-tRNA. Dwustopniowa reakcja przy udziale enzymu syntetazy aminoacylo-tRNA prowadzi do utworrenia aminoacylo-tRNA. Pierwsza reakcja obejmuje utworzenie kompleksu AMP-aminokwas-enzym. Taki zaktywowany aminokwas jest przenoszony następnie na odpowiednią cząsteczkę tRNA. AMP i enzym uwalniają się i enzym moŜe być ponownie uŜyty w reakcji.

SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY / 495

mRNA

5'

kodon

nie odgrywa roli w rozpoznaniu kodonu. Jak to zanotowano wyŜej reszta aminoacylowa nigdy nie kontaktuje się bezpośrednio z matrycą mRNA zawierającą kodony.

MUTACJA POWSTAJE W WYNIKU PEWNYCH TYPÓW ZMIAN, KTÓRE ZACHODZĄ W SEKWENCJI NUKLEOTYDÓW

i)Ramieantytw<Jonowe 2)RamięT^C

3) Ftamlą O

Ryc. 40-2. Rozpoznanie kodonu przez antykodon Jednym z kodonów dla fenyloalaniny jest U-U-U. tRNA obarczony fenyloalaniną (Phe) ma komplementarną sekwencję A-AA, która na zasadzie parowania zasad tworzy kompleks z kodonem. Region antykodonowy zwykle składa się z sekwencji 7 nukleotydów w kolejności od 3' do 5': nukleotydu zmiennego (N), zmodyfikowanej puryny (Pu*), X, Y, Z i 2 pirymidyn (Py).

swoistym miejscu parowania nukleotydu do nukleotydu kodon i antykodon są w stanie „rozchwiania". Na przykład 2 kodony dla argininy A-G-A i A-G-G mogą się wiązać z tym samym antykodonem mającym uracyl przy swoim końcu 5'. Podobnie 3 kodony dla glicyny, G-G-U, G-G-C i G-G-A, mogą tworzyć pary zasad z 1 kodonem C-C-I. „I" jest nukleotydem inozyny, inną jeszcze szczególną zasadą pojawiającą się w cząsteczkach tRNA. Rozpoznanie kodonu przez cząsteczkę tRNA nie zaieŜy od aminokwasu, który jest związany przy końcu 3'-hydroksylowym. Wykazano to w pomysłowym doświadczeniu przez obarczenie tRNA swoistego dla cysteiny (tRNAcys) cysteiną radioaktywną. Na drodze chemicznej reszta cysteinylowa została następnie zmieniona tak, aby uzyskać cząsteczkę tRNA swoistą dla cysteiny, ale obarczoną alaniną. Chemiczna transformacja reszty cysteinylowej do alanilowej nie zmieniła części antykodonowej cysteinoswoistej cząsteczki tRNA. Gdy taki alanilo-tRNA^s został uŜyty do translacji hemoglobinowego mRNA, wówczas radioaktywna alanina została wbudowana w normalne miejsce cysteinowe w cząsteczce białka hemoglobinowego. Doświadczenie to wykazało, Ŝe pochodna

ChociaŜ początkowa zmiana moŜe nie zachodzić w kodującym paśmie dwupasmowej cząsteczki DNA w danym genie, to po replikacji siostrzane cząsteczki DNA, zawierające mutacje w paśmie kodującym, będą się segregować i pojawią się w populacji organizmów.

Niektóre mutacje zachodzą na drodze podstawienia zasad Zmiany w pojedynczej zasadzie (mutacje punktowe) mogą być typu tranzycji lub iranswersji. W pierwszym przypadku dana pirymidyna jest zamieniona na inną pirimidynę lub dana puryna jest zamieniona na inną purynę. Transwersje są to zmiany puryny na 1 z 2 pirymidyn albo zamiany pirymidyny na 1 z 2 puryn, jak to przedstawiono na ryc. 40-3.

Tranzyoje Transwersje Ryc. 40-3. Schematyczne przedstawienie mutacji typu tranzycji i transwersji. __________

Jeśli sekwencja nukleotydowa genu zawierająca mutację ulega transkrypcji na cząsteczkę RNA, to cząsteczka RNA będzie miała zmianę w postaci komplementarnej zasady w miejscu odpowiadającym tej mutacji. Zmiany pojedynczej zasady w cząsteczkach mRNA mogą powodować róŜne skutki, jeŜeli ulegną translacji na białko: 1. MoŜe nie wystąpić Ŝaden wykrywalny sku-

tek, poniewaŜ kod jest zdegenerowany. Będzie to tym bardziej prawdopodobne, gdy zmieniona zasada w cząsteczce mRNA jest 3. nukleotydem kodonu. Zgodnie z hipoteza, toleran-

496 / ROZDZIAŁ 40

cji, translacja kodonu jest mało wraŜliwa na zmianę w pozycji 3. Skutek typu mutacji sensu (missense) zajdzie wówczas, gdy odmienny aminokwas zostanie wbudowany w odpowiednie miejsce w cząsteczce białka. Taki blednie dobrany aminokwas, czyli mutacja sensu, w zaleŜnoś ci od umiejscowienia w swoistym białku moŜe być akceptowalny, częściowo akceptowalny lub nie akceptowalny w odniesieniu do funkcji tej cząsteczki białkowej. Ze szczegółowej ana lizy kodu genetycznego moŜna wyciągnąć wnio sek, Ŝe większość zmian w pojedynczej zasa dzie prowadzi do zastąpienia 1 aminokwasu przez inny aminokwas mający raczej podobne grupy funkcjonalne. Jest to bardzo skuteczny mechanizm, który zapobiega drastycznym zmianom w fizycznych właściwościach cząste czki białkowej. Jeśli zachodzi błędny akcep towalny skutek, to powstająca cząsteczka biał kowa moŜe nie być odróŜniana od normalnej cząsteczki. Jeśli zachodzi błąd nie akceptowal ny, cząsteczka białkowa nie będzie zdolna spra wować przypisanej jej funkcji. Kodon typu nonsens moŜe się pojawiać i powodować przedwczesną terminację w proce sie wbudowywania aminokwasów do łańcucha peptydowego, w wyniku czego zostaje wytwo rzony tylko fragment zamierzonej cząsteczki

Hb Milwaukee

(Glutamlnlan)

Hb Bristol Asparaglnlan

białkowej. Jest duŜe prawdopodobieństwo, Ŝe przedwcześnie ukończona cząsteczka białka lub fragment peptydu nte będą spełniały przypisanej im funkcji. Cząsteczka hemoglobiny moŜe być uŜyta do wykazania skutków zmian w pojedynczej zasadzie w strukturalnym genie hemoglobiny Niektóre mutacje nie powodują widocznego skutku. Brak skutku wynikającego ze zmiany w pojedynczej zasadzie moŜe być wykazany tylko przez sekwencjonowanie nukleotydów w cząsteczkach mRNA lub w genach hemoglobiny u duŜej liczby osób mających normalne cząsteczki hemoglobiny. JednakŜe moŜna dedukować, Ŝe kodon waliny w pozycji 67 łańcucha P hemoglobiny nie jest identyczny u wszystkich osób mających normalny łańcuch b1 hemoglobiny. Hemoglobina typu Milwaukee ma w pozycji 67 kwas glutaminowy; hemoglobina typu Bristol ma w tej pozycji kwas asparaginowy. Aby wyjaśnić zmiany aminokwasu zmianami w pojedynczej reszcie kodonu dla aminokwasu 67, naleŜy wnioskować, Ŝe mRNA kodujący hemoglobinę typu Bristol zawiera! kodon G-U-U lub G-U-C zanim wystąpiła zmiana do G-A-U lub G-A-C, kodonów kodujących kwas asparaginowy (ryc. 40-4). Jednak mRNA kodujący

Hb A (normalna)

HbSydney /HS7 Alanina

Walfna GAU

•+ -------------

GUU

----- * -

GAC

-* ------------

GUC

----- +- GCC

G A A -* ---------------

GUA

----- +~ GCA

GAG

GUG

----- »- GCG

** --------------

GCU

Ryc, 40-4. W warunkach prawidłowych walina w pozycji 67 iańcucha p hemoglobiny A moŜe być kodowana jednym z 4 kodonów pokazanych w prostokącie. W hemoglobinie patologicznej typu Milwaukee aminokwas w pozycji 67 łańcucha P zawiera gfutaminian kodowany przez G A A lub G A G — kaŜdy z tych kodonów moŜe powstać z jednostopniowejtranswersji kodonów waliny G- U A lub G-U-G. Podobnie alanina, obecna w pozycji 67 łańcucha hemoglobiny typu Sydney, mogła powstać-w wyniku jed nos to pni owej tranzycji jeefnego z 4 kodonów waliny. Jednak reszta asparaginianu w pozycji 67 hemoglobiny typu 8ristol mogła powstać w wyniku jednostopniowej transwersji jedynie z kodonów waliny G-U-U lub G U C .

SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY / 497

hemoglobinę typu Milwaukee powinien mieć mniej w 2 rodzinach Japończyków. Ta hemow pozycji 67 kodon G-U-A lub G-U-G, aby globina ma asparagtne, która zastąpiła łizynę zmiana w pojedynczym nukieotydzie mogła w pozycji 61 łańcucha p. Odpowiadająca temu spowodować pojawienie się kodonów kwasu transwersja mogła być albo A-A-A lub A-A-G glutaminowego G-A-A lub G-A-G. Hemoglo- zamieniona albo na A-A-U lub na A-A-C. bina typu Sydney, która zawiera alaninę w po- Zastąpienie swoistej lizyny asparaginą pozornie zycji 67, mogła powstać przez zmianę pojedyn- nie zmienia normalnej funkcji łańcucha P u tych czego nukleotydu w którymkolwiek z 4 kodo- osobników. nów waliny (G-U-U, G-U-C, G-U-A lub G-UCzęściowo akceptowalne mutacje -G), co dało kodony alaniny odpowiednio: G- sensu. Najlepszym przykładem częściowo akC-U, G-C-C, G-C-A lub G-C-G. ceptowalnej mutacji sensu (ryc. 40-5, środek) jest hemoglobina S (hemoglobina występująca Podstawienie aminokwasów w niedokrwistości sierpowatej), w której norpowoduje mutacje sensu malnie występujący aminokwas w 6 pozycji Akceptowalne mutacje sensu. Przy- łańcucha p-globiny — kwas glutaminowy został kładem akceptowalnej mutacji sensu (ryc. 40-5, zastąpiony wahną. Odpowiadająca temu zmia-' u góry) w strukturalnym genie łańcucha P he- na pojedynczego nukleotydu w kodonie kwasu moglobiny moŜe być wykryta obecność zmie- glutaminowego G-A-A lub G-A-G byłaby Gnionej hemoglobiny, o odmiennych właściwoś- U-A lub G-U-G w kodonach waliny. Jest ciach elektrofbretycznych, która występuje oczywiste, Ŝe te mutacje sensu zaburzają norw erytrocytach z pozoru zdrowego osobnika. malne funkcje i prowadzą do niedokrwistości Hemoglobinę typu Hikari znaleziono przynaj- sierpowatej, jeŜeli zmutowany gen jest obecny

Cząsteczka białka Akceptowalna mutacja sensu

1

AAA

HbA, łańcuch £

1

Hb S łańcuch fi

Nleakoeplo walna mutacja sensu

T

lub

AAG

IX!

61 hzyna

Hb Hikari łańcuch fi

Częściowa akceptowalna mutacja sensu

Kodony

Aminokwas

Hb A łańcuch j

AAU

lub

AAC

Afiparaglna

GAA

lub

GAG

Wallna

GUA

lub

GUG

Ct W \

lub

CAC

T 58Histydyna

Hb M (Boston), łańcuch a

i I

W

, I

\0 lub UAC Tyrozyna

Ryc. 40-5. Przykłady 3 typów mutacji sensu, w wyniku których powstają patologiczne łańcuchy hemoglobiny. Wskazano zmiany w aminokwasach i moŜliwe zmiany w odpowiadających im kodonach. Mutacja w łańcuchu p hemoglobiny Hikari ma prawidłowe właściwości fizjologiczne, ale róŜni się pod względem ruchliwości elektroforetycznej. Hemoglobina S ma mutację w łańcuchu p i zachowuje częściową funkcję; hemoglobina S wiąŜe tlen, ale w postaci odtlenowanej wytrąca się. Hemoglobina M Boston zawiera mutację w łańcuchu a, umoŜliwia utlenienie jonu Ŝelazawego hemu do jonu Ŝelazowego, przez to w ogóle nie moŜe wiązać tlenu. ________________________________ 32

Biochemia

498 / ROZDZIAŁ 40

w stanie homozygotyc2nym. Zmiana kwasu glutaminowego na wahnę moŜe być rozpatrywana jako częściowo akceptowana, poniewaŜ hemoglobina S moŜe wiązać i oddawać tlen, chociaŜ proces ten nie jest zupełnie normalny.

Nie akceptowane mutacje sensu. Nie akceptowana mutacja sensu (ryc. 40-5, dól) w genie hemoglobiny daje niefunkcjonalną cząsteczkę hemoglobiny. Na przykład mutacje występujące w hemoglobinie M generują cząsteczki, które umoŜliwiają utlenienie Ŝelaza Fei + reszty hemowej do Fe3+, w wyniku czego powstaje methemoglobina, Methemogłobina nie moŜe transportować tlenu (p. rozdz. 7). Mutacje typu przesunięcia ramki odczytu powstają w wyniku delecji lub insercji nukfeotydów w genie i w ten sposób wytwarzają zmienione sekwencje nukleotydowe w cząsteczkach mRNA W wyniku delecji pojedynczego nukleotydu w kodującym paśmie genu powstaje zmieniona ramka odczytu w mRNA. „Maszyneria" uczestnicząca w translacji mRNA nie rozpoznaje brakującej zasady, poniewaŜ w trakcie odczytywania kodonów nie ma znaków przestankowych. W wyniku tego powstaje głęboka zmiana w sekwencji spolimeryzowanycb aminokwasów, jak to przedstawiono w przykładzie 1, na ryc. 40-6. Zmieniona ramka odczytu daje w rezultacie zniekształconą translację mRNA na całym obszarze dystalnym od miejsca delecji pojedynczego nukleotydu. Nie tylko jest zniekształcona sekwencja aminokwasów na obszarze dystalnym od tej deJecji, ale odczytywanie informacji moŜe takŜe ujawnić nonsensowny kodon i w ten sposób moŜe zajść synteza zniekształconego i przedwcześnie ukończonego polipeptydu w jego końcu karboksylowym (przykład 3, ryc. 40-6). Jeśli delecji w genie ulegną 3 nukleotydy albo wielokrotność 3, to odpowiadający informacyjny RNA, gdy ulegnie translacji, da białko, w którym brak będzie odpowiedniej liczby aminokwasów (przykład 2, ryc. 40-6). PoniewaŜ ramkę odczytu stanowi triplet, faza odczytu nie zostanie zmieniona dla tych kodonów, które leŜą dystalnie od miejsca delecji. Jeśli jednak zachodzi delecja 1 lub 2 nukleotydów tuŜ przed albo w obrębie normalnego kodonu terminacji {kodonu nonsensownego),, to moŜe dojść do zaburzeń w odczytaniu sygnału normalnej terminacji. Taka delecja moŜe prowadzić do od-

czytywania ponad sygnałem terminacji do momentu, aŜ znajdzie się następny inny kodon nonsensowny (przykład 1, ryc. 40-6). Doskonałym przykładem takiego zjawiska są dyskusje poświęcone hemoglobino patiom. Insercje 1, 2 lub niewiel o krotności 3 nukleotydów do genu dają w wyniku mRNA, w którym ramka odczytu jest zmieniona w czasie translacji i zachodzi taki sam skutek, jak w przypadku delecji. MoŜe to być a) zniekształcona sekwencja aminokwasowa dystalna od miejsca insercji, b) generacja kodonu noosensowego w miejscu insercji 1ub w części dystalnej albo teŜ niemoŜność rozpoznawania sygnału terminacyjnego (reading through). Jeśli po delecji w genie nastąpi insercją (lub odwrotnie), to taka insercja ponownie ustawi prawidłowo ramkę odczytu (przykład 4, ryc. 40-6). Przy translacji odpowiedniego mRNA uzyska się zniekształconą sekwencję aminokwasową między insercją a delecja, W obszarze po przywróceniu ramki odczytu sekwencja aminokwasową będzie prawidłowa. MoŜna sobie wyobrazić, Ŝe róŜne kombinacje delecji i insercji albo delecje i insercje dadzą informację dla białka, którego-część będzie nieprawidłowa, ale ta część otoczona będzie przez normalną sekwencję aminokwasów. Takie zjawisko wykazano w sposób przekonujący u bakteriofaga T4; odkrycie to dostarczyło waŜnego dowodu, Ŝe ramkę odczytu stanowi triplet. Mutacje supresorowe redukują skutki mutacji sensu, mutacji nonsensowych i przesuniecie ramki odczytu PowyŜsza dyskusja na temat zmienionych produktów białkowych w wyniku mutacji genów jest oparta na normalnie funkcjonujących cząsteczkach tRNA. W organizmach prokariotycznych i niŜszych organizmach eukariotycznych odkryto jednak cząsteczki tRNA, które funkcjonują nieprawidłowo i które same są wynikiem mutacji. Niektóre z tych nieprawidłowych cząsteczek tRNA są zdolne do supresji skutków mutacji w odległych genach strukturalnych. Te supresorowe cząsteczki tRNA, zwykle powstałe w wyniku zmian w ich regionach antykodonowych, są zdolne do supresji mutacji sensu, mutacji nonsensownych i mutacji z przesunięcia ramki odczytu. PoniewaŜ jednak cząsteczki supresorowego tRNA nie są zdolne rozróŜnić kodon prawidłowy od kodonu powstałego w wyniku mutacji genu, ich obecność w komórce prowadzi zwykle do zmniejszonej

SYNTEZA BIAŁEK i KOD GENETYCZNY / 499

Stan normalny | Typ

dziki

mRNA

;

UAG UUUG AUG

Poiłpeptyd

GCC

UCU

UGC

A AA

GGC

UAU

AG U

AGU

Met ---- Ala ------Ser ----- Cys ------ Lys------ Gly------ Tyr------Ser ------ Ser

UAG... STOP

Przykład 1

mRNA

UAG

UUUG

Pollpeptyd

AG.

AUG Met-

Ala

Sekwencja zniekształcona Przykład 2

| D8lec]a(-3) | mRNA

UAG

UUUG

Pollpeptyd

AUG

GCC UCU — Ser ■Al — a-

Met

AAA — Lys—

GGC

Gly

UAU

AGU

---- Tyr --- Ser

AGU UAG... - S e r STOP

—

Przyfcteda

I Inaercja (+1} | mRNA

UAG

UUUG

Pollpeptyd

AUG

GCC

AGG

Met—

CUA

UAG

-Leu

STOP

UAG

UUAG...

AlaSekwencja zniekształcona

Przykt*d4 Insercja ) Deleoja (—1]

mRNA Pollpeptyd

UAG

UUUG

AUG

GCC -

Met- A l a -

UCU -

UUG

Ser-

AGU

UAG...

-Leu ---- Gin ----- Arg ------ Tyr----- Ser ------ Ser

CAA

AGG

UAU

AGU

STOP

SakwencjE zniekształcona

Ryc. 40-6. Wpływ delecji i insercji w genie na sekwencję nukleotydów w transkrypcje mRNA i na sekwencję aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym uzyskanym z mRNA. Strzałki pokazują miejsca delecji i insercji, a liczby w owalach odpowiadają liczbie usuniętych lub włączonych reszt nukleotydowych.

Ŝywotaości komórki. Na przykład cząsteczki tRNA tłumiące mutacje nonsensowne mogą tłumić prawidłowe sygnały terminacji i umoŜliwiać translację mimo obecności kodonu „stop" („read-through") wówczas, gdy nie jest to poŜądane. Cząsteczki supresorowego tRNA typu przesunięcia ramki odczytu mogą odczyty-

wać kodon prawidłowy i składową część przyległego kodonu, dając w len sposób przesunięcie ramki takŜe wówczas, gdy nie jest to potrzebne. Cząsteczki supresorowego tRNA mogą istnieć w komórkach ssaków poniewaŜ u tych ostatnich zachodzi zjawisko transkrypcji „read-through".

500 / ROZDZIAŁ 40

Proces syntezy białek, podobnie jak replikacja DNA i transkrypcja genu, moŜe być podzielony na 3 fazy: inicjację, elongację i terminację W rozdziale 39 opisano ogólne cechy strukturalne rybosomów i proces ich montowania. Te twory ziarniste słuŜą jako „maszyneria", na której sekwencja nukleotydów mRNA jest tłumaczona na sekwencję aminokwasów w określonym białku. Translacja mRNA zaczyna się blisko końca 5' od tworzenia odpowiedniego końca aminowego cząsteczki białkowej. Informacja jest czytana w kierunku od 5' do 3' i kończy się utworzeniem końca karboksylowego białka. Ponownie występuje tutaj pojęcie polarności. Jak to opisano w rozdz. 39, transkrypcja genu na odpowiedni mRNA albo jego prekursor prowadzi najpierw do utworzenia końca 5' cząsteczki RNA. U prokariontów pozwala to na rozpoczęcie translacji mRNA zanim zostanie ukończona transkrypcja genu. W organizmach eukariotycznych proces transkrypcji zachodzi w jądrze komórkowym, a translacja mRNA zachodzi w cytoplazmie. Wyklucza to jednoczesną transkrypcję i translację w organizmach eukariotycznych i umoŜliwia proces przekształcenia niezbędny do wytworzenia dojrzałego mRNA z pierwotnego transkryptu — hnRNA. Inicjacja obejmuje złoŜone struktury i białka (p. ryc. 40-7) Jak to opisano w rozdz. 39 końce 5' w większości cząsteczek mRNA w organizmach eukariotycznych są opatrzone czapeczką metylacyjną. Ta metyloguanozylotrifosforanowa czapeczka ułatwia wiązanie cząsteczek mRNA do podjednostki 40S rybosomu. Zanim zostanie ona związana z 40S rybosomera, ulega modyfikacji dzięki działaniu kilku białek zdolnych do wiązania się z mRNA: eIF-4A, eIF-4B, eIF-4E i eIF-4F. Obecność kompleksu eIF-4F wiąŜącego czapeczkę, a składającego się z 4 polipeptydów (24 kd, 46 kd, 73 kd i 220 kd) jest niezbędna do inicjacji syntezy białka na mRNA opatrzonym czapeczką charakterystyczną dla organizmów eukariotycznych. Pierwszy kodon,

który ulega translacji, to zazwyczaj A-U-G. 18S rybosomainy RNA (rRNA) podjednostki rybosomalnej 40S wiąŜe się z regionem mRNA, który poprzedza pierwszy kodon ulegający translacji. To wiązanie mRNA do podjednostki rybosomalnej 40S wymaga obecności czynnika białkowego, czynnika inicjacji 3 (IF-3). ^7 W następnym etapie aminoacylo-tRNA, odpowiadający pierwszemu kodonowi, wchodzi w reakcję z GTP i czynnikiem inicjacyjnym 2 (IF-2), tworząc kompleks. Kompleks ten w obecności czynnika inicjacji 1 (IF-1) dołącza anty_koilQn_tRNA do 1 kodonujoRNA, tworzac-kampieks iniciacyjny z podjednostką 40S rybosomu. Po uwolnieniu czynników inicjacyjnych (IF-l, IF-2 i IF-3) dołącza się podjednostką rybosomalna 60S i GTP ulega hydrolizie, W ten sposób zostaje ukończone formowanie rybosomu SOS. Kompletny rybosom zawiera 2 miejsca dla cząsteczek tRNA. Miejsce peptydylowe (miejsce P) zawiera cząsteczkę peptydylo-tRNA związaną z właściwym kodonem mRNA. Miejsce aminoacylowe (miejsce A) obejmuje aminoacylo-tRNA związany z odpowiadającym nTu kodonem na mRNA. W momencie tworzenia kompleksu inicjacyjnego na \\ kodonie, cząsteczka aminoacylo-tRNA wchodzi w miejsce P, pozostawiając wolne miejsce A. Ramka odczytu zostaje więc zdefiniowana popr2ez związanie tRNA do 1. kodonu mRNA. kodonu, który ulegnie translacji. Rozpoznanie tego 1. kodonu inicjującego jest oczywiście zaleŜne od drugorzędowej struktury cząsteczki mRNA, a ponadto u prokariontów i być moŜe eukariontów obejmuje swoistą sekwencję nukleotydów komplementarnych do segmentu 16S (18S) rybosomalnego RNA. U prokariontów w inicjację syntezy większości, jeśli nie wszystkich, cząsteczek białkowych jest włączony swoisty aminoacylo-tRNA. U prokariontów większość białek jest inicjowana N-formylometionylo-tRNA. Mimo Ŝe metionina występuje jako N-końcowy aminokwas w wielu białkach eukariotycznych, u tych ostatnich metionylo-tRNA nie jest formylowany. U prokariontów N-formylowanie cząsteczki

Ryc. 40-7. Schematyczna ilustracja inicjacji syntezy białka na matrycy mRNA zawierającej czapeczkę metylacyjną na końcu 5' i sekwencję poii(A) na końcu 3'. IF-1, IF-2 i IF-3 przedstawiają odpowiednio czynnik inicjujący 1, 2 i 3, a struktura podobna do szpilki do włosów z symbolem Met na jednym końcu ilustruje metionylo-tRNA, Miejsce P i miejsce A są odpowiednio miejscem wiąŜącym peptydylo-iRNA i aminoacylo-tRNA na rybosomie.

SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY / 501 3' Ogon polt(A) ■nHh"

Kodon Inicjujący 5' Czapeczka Gm TP-8' C= AUG

+ V

J tyDoMmu

mHNA

1F-3

l3' IAl n

J 5'

GTF

— Ił IM

•GTP

'

Met

R yc. 40- 7. Podjsdnoslka rybosomu

A ■

+ IF-2 + IM G^P-fi*

Miejsce P

J

502 / ROZDZIAŁ 40

metionylowej tRNA jawi się jako wiązanie peptydowe błędnie rozpoznawane przez miejsce P rybosomu. U prokariontów istnieje takŜe enzym zdolny do usuwania N-końcowej reszty formylowej lub N-końcowej reszty metionylowej (albo obu) 2 cząsteczek białkowych, w wielu przypadkach nawet przed ukończeniem syntezy cząsteczki białkowej. Elongacja następuje przez przemieszczenie (p. ryc. 40-8) W kompletnym rybosomie SOS, utworzonym w procesie inicjacji, miejsce A pozostaje wolne. Związanie odpowiedniego aminoacyio-tRNA w miejscu A wymaga rozpoznania odpowiedniego kodonu. Czynnik elongacyjny 1 (EF-1) tworzy kompleks z GTP i wchodzącym aminoacylo-tRNA (ryc. 40-8). Kompleks ten pozwala na wejście aminoacylo-tRNA na miejsce A z jednoczesnym uwolnieniem EF-l-GDP i fosforanu. Jak przedstawiono na ryc. 40-8, EF-l-GDP ulega recyklizacji do EF-l-GTP przy udziale innych rozpuszczalnych czynników białkowych i GTP. Grupa a-aminowa nowego aminoacylo-tRNA w miejscu A dokonuje nukleofilowego ataku na zestryfikowaną grupę karboksylową peptydylo-tRNA, zajmującego miejsce P. Reakcja ta jest katalizowana komponentem białkowym podjednostki rybosomalnej 60S — peptydylotransferazą. PoniewaŜ aminokwas aminoacylo-tRNA jest juŜ „zaktywowany", dla tej reakcji nie jest wymagane dalsze źródło energii. W wyniku tej reakcji zachodzi przyłączenie rosnącego łańcucha peptydowego do tRNA w miejscu A. Po usunięciu reszty peptydowej z tRNA w miejscu P, oswobodzony tRNA szybko dysocjuje i opuszcza miejsce P. Nowo utworzony peptydylo-tRNA ulega przemieszczeniu z miejsca A do pustego miejsca P przy udziale czynnika elongacji 2 (EF-2) i GTP. W procesie przemieszczania GTP jest hydrolizowany do GDP i fosforanu. Przemieszczenie nowo utworzonego peptydylo-tRNA i odpowiedniego kodonu na miejsce P uwalnia miejsce A dla następnego cyklu rozpoznania kodonu przez aminoacylo-tRNA i dla elongacji. Związanie reszty aminoacylowej przez cząsteczkę tRNA wymaga hydrolizy ATP do AMP, równowaŜnej hydrolizie 2 ATP do 2 ADP oraz fosforanów. Wejściu aminoacylo-tRNA na miejsce A towarzyszy hydroliza jednego GTP do GDP. Podobnie przemieszczenie nowo

utworzonego peptydylo-tRNA z miejsca A do miejsca P przez EF-2 powoduje hydrolizę GTP do GDP i fosforanu. W sumie zapotrzebowanie energetyczne na wytworzenie 1 wiązania peptydowego obejmuje równowaŜnik energii powstałej z hydrolizy 2 cząsteczek ATP do ADP i 2 cząsteczek GTP do GDP, czyli hydrolizy 4 bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych. Terminacja następuje w momencie, gdy zostaje rozpoznany kodon nonsensowny (p. ryc. 40-9) Po licznych cyklach elongacji, powodujących spolimeryzowanie aminokwasów w cząsteczkę białkową, w miejscu A pojawia się nonsensowny terminujący kodon mRNA. W warunkach prawidłowych nie istnieje tRNA zawierający antykodon zdolny do rozpoznania takiego sygnału terminacji. W komórce istnieją czynniki uwalniające zdolne do rozpoznania sygnału terminacji w miejscu A (ryc. 40-9). Czynnik uwalniający, w połączeniu z GTP i transferazą peptydyiową, powoduje hydrolizę wiązania między peptydem a tRNA zajmującym miejsce P. W wyniku tej hydrolizy z miejsca P uwalnia się białko i tRNA. W następstwie hydrolizy i uwolnienia białka oraz tRNA rybosom SOS dysocjuje do podjednostek 40S i 60S, które następnie wchodzą ponownie do cyklu. Czynniki uwalniające są zatem białkami, które hydrolizują wiązanie peptydylo-tRNA w momencie, gdy nonsensowny kodon zajmuje miejsce A. W procesie translacji tej samej cząsteczki mRNA moŜe brać udział jednocześnie wiele rybosomów. PoniewaŜ rybosomy mają stosunkowo duŜy wymiar cząsteczki, wiąŜą się z mRNA w odległości nie mniejszej niŜ 80 nukleotydów. Liczne rybosomy związane z tą samą cząsteczką mRNA tworzą polirybosom albo „polisom". W systemie nierestrykcyjnym liczba rybosomów związanych z mRNA (a zatem wielkość polirybosomów) jest skorelowana dodatnio z długością cząsteczki mRNA. Oczywiście masa cząsteczki mRNA jest całkiem mała w porównaniu do masy pojedynczego rybosomu. Pojedynczy rybosom ssaków jest zdolny do wytworzenia ok. 100 wiązań peptydowych w kaŜdej minucie. Polirybosomy aktywnie syntetyzujące białka mogą egzystować jako wolne ziarenka w cytoplazmie komórkowej albo mogą być przyczepione do błoniastych struktur cytoplazmatycznych określanych jako siateczka

3' (AL

1

GDP

3'(A)„

Ryc. 40-8. Schemat procesu elongacji pepiydu w trakcie syntezy białka. (Wale kóika, oznaczone n-1, n, n+1 itd., oznaczają reszty aminokwasowe w nowo powstającej cząsteczce białkowej. EF-1 i EF-2 przedstawiają odpowiednio czynnik elongacyjny 1 i 2. Miejsca peptydyio-tRNA i aminoacylo-tRNA na rybosomie są odpowiednio oznaczane jako miejsce P i A.

504 / ROZDZIAŁ 40 Kodon termlnacyjrty (nonsensowny)

m

G TP-5

60P +

tRNA

Ryc. 40-9. Schemat ilustrujący proces terminacji syntezy bi3tka. Miejsca peptydylo-tRNA i amtnoacylo-tRNA są oznaczone odpowiednio jako miejsce P i A. Hydroliza kompleksu peptydylo-tRNA jest oznaczona jako wejście H2O. Symbole N i C oznaczają odpowiednio aminokwasy na końcu NH3 i karboksylowym i ilustrują polarność syntezy białka

SYNTEZA BIAŁEK i KOD GENETYCZNY / 505

śródplazmatyczna. Doczepienie ziarnistości polirybosomalnych do siateczki śród plazma ty cznej jest odpowiedzialne za jej „szorstki" wygląd, co łatwo zaobserwować w mikroskopie elektronowym. Białka syntetyzowane na polirybosomach przyczepionych do siateczki są wydzielane do wnętrza cystern pomiędzy listkami szorstkiej siateczki śródplazmatycznej, a następnie eksportowane dalej. Niektóre z produktów białkowych szorstkiej stateczki śródplazmatycznej są upakowywane jako cząsteczki zymogenu w obrębie aparatu Golgiego w ceiu ewentualnego dalszego ich eksportu (p. rozdz. 42). Cząsteczki polirybosomalne, które znajdują się w cytosolu w stanie wolnym, są odpowiedzialne za syntezę białek potrzebnych dla funkcji wewnątrzkomórkowych. ZłoŜona maszyneria syntezy białka moŜe być wykorzystana w reakcjach obronnych organizmu, inicjowanych zagroŜeniem Środowiskowym, lub moŜe stać się częścią mechanizmu chorobowego Ferrytyna, białko wiąŜące Ŝelazo, zapobiega osiągnięciu toksycznego stęŜenia zjonizowanego Ŝelaza (Fe2+) w obrębie komórek. śelazo pobudza syntezę ferrytyny przez aktywację 1 lub.więcej białek cytoplazmatycznych, które następnie mogą się wiązać ze swoistym regionem sekwencji nie ulegających translacji przy końcu 5' mRNA ferrytyny. Interakcja białko-mRNA aktywuje ferrytynowy mRNA i powoduje jego translację. Taki mechanizm zapewnia szybką kontrolę syntezy białka, usuwając Fe 2+ — cząsteczkę potencjalnie toksyczną. Maszyneria syntezy białka moŜe być takŜe modyfikowana w procesie, który jest szkodliwy dla komórki. Wirusy replikują, wykorzystując procesy komórki gospodarza łącznie z procesami syntezy białka. Niektóre cząsteczki wirusowego mRNA ulegają translacji znacznie wydajniej niŜ cząsteczki komórki gospodarza (np. mengońrm, wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego). Inne, np. reowirus i wirus opryszczkowego zapalenia jamy ustnej, replikują w sposób nadmierny i ich mRNA współzawodniczą z cząsteczkami mRNA komórki gospodarza o ograniczoną ilość czynników translacji. Inne wirusy hamują syntezę białek komórki gospodarza, uniemoŜliwiając wytworzenie połączeń mRNA z rybosomem 40S. Wirus polio osiąga to przez aktywację proteaz komórkowych, które degradują 220 kd składnik kom-

pleksu wiąŜącego czapeczkę z eIF-4F opisanego wyŜej. POTRANSLACYJNA MODYFIKACJA MA WPŁYW NA AKTYWNOŚĆ WIELU BIAŁEK Niektóre wirusy zwierzęce, m.in. wirus polio (wirus typu RNA), syntetyzują długie, policysŁronowe białka na 1 długiej cząsteczce mRNA. Cząsteczki takich białek są następnie przecinane w określonych miejscach, w wyniku czego powstaje wiele swoistych białek, koniecznych do funkcji wirusowych. W komórkach zwierzęcych wiele białek jest syntetyzowanych na 1 matrycy mRNA jako cząsteczka prekursorowa, która następnie musi być zmodyfikowana tak, aby powstało aktywne białko. Przykładem i prototypem jest insulina, która jest białkiem małocząsteczkowym mającym dwa łańcuchy polipeptydowe zawierające międzycząsteczkowe i wewnątrzcząsteczkowe mostki disiarczkowe. Cząsteczka insuliny jest syntetyzowana jako jednołaricuchowy prekursor, czyli prohormon, który fałduje się, umoŜliwiając powstanie mostków disiarczkowych. Następnie swoista proteaza wycina segment, który łączy 2 łańcuchy tworząc funkcjonalną cząsteczkę insuliny (p. ryc. 52-3). Wiele innych peptydów jest syntetyzowanych jako proproteiny, które, zanim osiągną biologiczną aktywność, wymagają modyfikacji. Liczne potranslacyjne modyfikacje obejmują usunięcie reszt aminokwasowych z końca aminowego, co zachodzi przez działanie swoistych aminopeptydaz. Kolagen, białko występujące w wielkiej ilości w przestrzeniach pozakomórkowych u wyŜszych eukariontów, jest syntetyzowany jako prokolagen. 3 cząsteczki polipeptydu prokolagenu, często nie mające identycznej sekwencji, układają się podłuŜnie, a proces ten zaleŜy od obecności swoistych peptydów na końcu aminowym. Następnie swoiste enzymy przeprowadzają hydroksylację i oksydację swoistych reszt aminokwasowych w obrębie cząsteczek prokolagenu w celu wytworzenia wiązań poprzecznych powodujących większą stabilność. Peptydy w końcu aminowym są odcięte od cząsteczki i w ten sposób tworzy się produkt końcowy — mocna, nierozpuszczalna cząsteczka kolagenu (p. rozdz. 58). Znane są równieŜ inne potranslacyjne modyfikacje białek. Na przykład częste są modyfikacje przez acetylację, fosforylację i glikozylację.

506 / ROZDZIAŁ 40

WIELE ANTYBIOTYKÓW DZIAŁA SKUTECZNIE, PONIEWAś HAMUJĄ ONE WYBIÓRCZO SYNTEZĘ BIAŁKA BAKTERII Rybosomy bakterii i rybosomy w mitochondriach komórek wyŜszych organizmów eukariotycznych róŜnią się od rybosomów opisanych w rozdz. 37. Rybosom bakteryjny jest mniejszy (TOS, a nie SOS) i ma róŜny, nieco uproszczony, zestaw cząsteczek RNA i białek. Te róŜnice wykorzystano do celów klinicznych, poniewaŜ wiele skutecznie działających antybiotyków oddziaływuje swoiście z białkami prokariotycznych rybosomów, hamując syntezę białek. W wyniku takiego oddziaływania zachodzi za-

hamowanie wzrostu lub śmierć bakterii. Większość najbardziej skutecznych antybiotyków tej klasy (np. tetracykliny, linkomycyna, erytromycyna i chloramfenikol) nie oddziaływuje ze swoistymi białkami eukariotycznych cząsteczek rybosomalnych i przez to nie są one toksyczne dla eukariontów. Inne antybiotyki hamują syntezę białka na wszystkich rybosomach (puromycyna) albo na rybosomach komórek eukariotycznych (cykloheksymid). Puromycyna, której strukturę przedstawiono na ryc. 40-10 jest strukturalnym analogiem tyrozynylo-tRNA. Puromycyna jest wbudowywana przez miejsca A na rybosomie do karbok syk o licowego peptydu, ale proces ten powoduje przedwczesne uwolnienie polipepty-

OCH,

O" tRNA- 0-P- O-CH^O.

NO

Rvc. 40-10. Porównanie struktury antybiotyku puromycyny (góra) i 3' końcowej części tyrozylo-tRNA (cfół).

SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY / 507

du. Puromycyna, jako analog tyrozynylo-tRNA, skutecznie hamuje syntezę białka zarówno u prókariontów, jak i eukariontów. Toksyna błonicy, egzotoksyna Carynebacterium diphteriae, wprowadzona ze swoistym fagiem lizogenicznym katalizuje ADP rybozyiację czynnika EF-2 w komórkach ssaków.Ta modyfikacja inaktywuje EF-2 i przez to hamuje swoiście syntezę białka w komórkach ssaków. Liczne zwierzęta {np. myszy) są oporne na toksynę błoniczą. Oporność ta wynika z niezdolności toksyny błoniczej do przejścia przez btonę komórkową, a nie z niewraŜliwości mysiego EF-2 na ADP rybozylację przez NAD w reakcji katalizowanej toksyną błoniczą. Liczne z tych związków, a zwłaszcza puromycyna i cykloheksymid, są klinicznie bezuŜyteczne, ale były uŜyteczne w celu wyjaśniania roli syntezy białka w regulacji procesów metabolicznych, zwłaszcza indukcji enzymów przez hormony.

PIŚMIENNICTWO BanerjeeAK: 5-Terminalcapstnictureineucaryotic messenger ribonucleic acids. Microbiot Rev 1980;44:175.

Barrell BG et al: Different pattern of codon recognition by mammalian mitochonrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci USA 77:3164. Caskey CT: Peptide chain tennination. Trends Biochem Sci 1980;5;234. Drakę JW, BaltzRHiThebiochemistry ofmutagenesis. Annu Rev Biochem 1976;45:1I. Forget BG: Molecular genetics of human hemoglobin synthesis. Ann Int Med 1979;91:605. Kozak M: Comparison of initiation of protein synthesis in procaryotes, eucaryotes and organelles. Microbiol Rev 1983;47:1. Maitra U, Stringer EA, Chaudhuri, A: Initiation factors in protein biosynthesis. Annu Rev Biochem 1982;51:869, Pelletier J, Sonenberg N: Internal initiation of translationofeukaryoticmRNAdirectedby asequence derived from picornavirus mRNA. Naturę (Londonj 1988;334:320. Schlessinger D; Genetic and antibiotic modification of protein synthesis. Annu Rev Genet 1974;8:135. Schneider RJ, Sfienk T: Impact of virus infectioo on host celi protein synthesis. Annu Rev Biochem 1987^56:317. Shatkin AJ: mRNA cap binding proteins: Essential factors for initiating translation. Cel! 1985;4©:223. Wool I: The structure and function of eukaryotic ribosomes. Annu Rev Biochem 1979;48:719.

41

Regulacja ekspresji genu Daryl K. Granner, MD

WPROWADZENIE Organizmy przystosowują się do zmian środowiskowych przez zmianę ekspresji genów. Proces zmian ekspresji genów zbadano szczegółowo u bakterii i wirusów; na ogól polega on na interakcji swoistych białek mających zdolność wiązania z róŜnymi regionami DNA w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca startu transkrypcji. Taka interakcja białek moŜe mieć pozytywny lub negatywny wpływ na transkrypcję. Komórki eukariotyczne stosują tę podstawową regułę regulacji transkrypcji, ale wykorzystują równieŜ inne mechanizmy. Takie procesy jak: wzmacnianie/wyciszanie, ekspresja tkankowoswoista, regulacja za pomocą hormonów, metali i związków chemicznych, amplifikacja genów, rearanŜacja genów oraz modyfikacje potranskrypcyjne są takŜe uŜywane do kontroli ekspresji genów.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Liczne z mechanizmów kontroli ekspresji genu są wykorzystywane jako reakcje na hormony i C2ynniki terapeutyczne. Zrozumienie tych procesów moŜe prowadzić do opracowania związków, które hamują czynność lub zatrzymują wzrost organizmów chorobotwórczych.

REGULOWANA EKSPRESJA GENÓW JEST NIEZBĘDNA DO PROCESU ROZWOJU, RÓśNICOWANIA I ADAPTACJI Informacja genetyczna, występująca w kaŜdej komórce somatycznej ^organizmów wielokomórkowych, jest praktycznie identyczna. Wyjątek stanowią nieliczne rodzaje komórek,

które mają amplifikowane lub przegrupowane geny do wykonywania swoistych funkcji komórkowych. Ekspresja informacji genetycznej musi być regulowana w czasie ontogenezy i róŜnicowania organizmu i jego komórkowych komponentów. Aby organizm mógł adaptować się do środowiska i magazynować energię i substraty odŜywcze, ekspresja informacji genetycznej musi być równieŜ wraŜliwa na sygnały zewnętrzne. W miarę ewolucji organizmów pojawiały się coraz to bardziej skomplikowane mechanizmy regulacyjne, które dawały organizmowi i jego komórkom moŜliwość takiej reakcji, która umoŜliwiała przeŜycie w złoŜonym środowisku. Komórki ssaków mają ok. 1000 razy więcej informacji niŜ bakteria Escherichia coli. Znaczna część tej dodatkowej informacji genetycznej prawdopodobnie słuŜy regulacji ekspresji genów w czasie róŜnicowania tkanek i takim procesom biologicznym w organizmie wielokomórkowym, które zapewniają organizmowi jego przetrwanie w złoŜonych czynnikach środowiskowych. W uproszczeniu są 2 typy regulacji genu: regulacja pozytywna ii regulacja negatywna (tab.

41-1). Gdy ekspresja informacji genetycznej ilościowo sie zwiększa, dzięki obecności swoistego elementu regulatorowego, wówczas regulacja jest pozytywna; gdy ekspresja informacji genetycznej jest zmniejszona pod wpływem swoTabela 41-1. Wpływ regulacji pozytywnej i negatywnej na ekspresję genów Wskaźnik ekspresji genu Regulacja negatywna Jest regulator

Zmniejszenie

Brak regulatora Zwiększenie

Regulacja pozytywna Zwiększenie Zmniejszenie

REGULACJA EKSPRESJI GENU / SOS

istego elementu regulatorowego, wówczas regulacja jest negatywna. Czynnik lub cząsteczka, które pośfedniczą w regulacji negatywnej są negatywnym regulatorem, a czynniki pośredniczące w regulacji pozytywnej są regulatorami pozytywnymi. JednakŜe podwójna regulacja negatywna moŜe działać jako regulacja pozytywna. Elektor, który hamuje funkcję regulatora negatywnego, ujawnia się wiec jako regulator pozytywny. Wiele regulowanych systemów, które działają jak systemy indukowane, jest w rzeczywistości systemami ulegającymi derepresji na poziomie molekularnym. (Opis tych. zjawisk podano w rozdz. 11).

W SYSTEMACH BIOLOGICZNYCH ISTNIEJĄ 3 TYPY CZASOWEJ REAKCJI NA SYGNAŁ REGULATOROWY Takie 3 typy reakcji przedstawiono schematycznie na ryc. 41-1 jako stopień ekspresji genu w reakcji na sygnał indukujący w skali czasu. Reakcja typu A charakteryzuje się wzmoŜoną ekspresją genu, która zaleŜy od stałej obecności sygnału indukującego. Gdy sygnał indukujący jest usunięty, wówczas stopień ekspresji genu zmniejsza się do wartości podstawowej, ale ekspresja ta ponownie się zwiększa wskutek

c/t genu

1 Typ A

1 i Czas

-fleganaracjaCzas Sygnał » T yp C

Czas Sygnał

Ryc, 41-1. Schemat aktywacji genu jako reakcja na swoiste sygnały reguiatorowe, takie jak hormon.

510 / ROZDZIAŁ 41

reakcji na ponowne pojawienie się swoistego sygnału. Ten typ reakcji często obserwuje się u wielu wyŜszych organizmów po ekspozycji na takie czynniki indukujące, jak hormony steroidowe (p. rozdz. 45). Reakcja typu B wykazuje wzmoŜony przejściowy stopień ekspresji genu, nawet jako reakcja na stale trwający sygnał regulatorowy. Gdy ustaje sygnał regulatorowy i komórka powraca do stanu prawidłowego, wówczas moŜe mieć miejsce druga przejściowa reakcja na następny sygnał regulatorowy. Zjawisko reakcja-odczula nie-regeneracja cechuje mechanizm działania środków farmakologicznych, ale jest takŜe cechą wielu procesów zachodzących w warunkach naturalnych. Ten typ reakcji zachodzi zwykle w procesie rozwoju organizmu, gdy jest potrzebny tylko w okresie przejściowym produkt określonego genu, mimo trwałej obecności sygnału. Reakcja typu C na sygnał regulatorowy obejmuje zwiększony stopień ekspresji genu, który trwa nieskończenie nawet po usunięciu, sygnału. W takim systemie sygnał działa jak mechanizm spustowy. Gdy raz ekspresja genu w komórce zostaje zainicjowana, wówczas ekspresja ta nie moŜe być zakończona nawet w komórkach potomnych; jest to zatem zmiana nieodwracalna i dziedziczna (w sensie komórkowym).

Organizmy prokariotyczne stanowią modele do badań regulacji ekspresji genów w komórkach ssaków W ciągu ostatnich 20 lat wraz ze zrozumieniem, jak przepływa informacja z genu za pośrednictwem informacyjnego RNA do swoistej cząsteczki białkowej, rozwinęła się szczegółowa wiedza o regulacji ekspresji genów w komórkach prokariotycznych. Większość szczegółowej wiedzy o molekularnych mechanizmach regulacji ograniczała się aŜ do współczesnych lat do prokariontów i niŜszych eukariontów. Było to moŜliwe dzięki zaawansowanej analizie genetycznej, dostępnej przede wszystkim u tych prymitywnych organizmów. Współczesne postępy w technologii rekombinacji DNA pozwoliły na rozpoczęcie bardziej wyszukanej analizy ekspresji genu u ssaków. W tym rozdziale początkowa dyskusja będzie się koncentrowała na systemach prokariotycznych. Nie będą dyskutowane bardziej zaawansowane badania genetyczne, ale raczej będzie dyskutowany problem, który moŜe być nazwany fizjologią ekspresji genu. Jednak prawie

wszystkie wnioski dotyczące tej Fizjologii uzyskano z badań genetycznych. Zanim wyjaśnimy fizjologię ekspresji genu, muszą być zdefiniowane niektóre specjalistyczne terminy genetyczne uŜywane w systemach prokariotycznych. Cystrun jest najmniejszą jednostką ekspresji genetycznej. Jak to opisano w rozdz. 11 niektóre enzymy i inne cząsteczki białkowe są złoŜone z 2 lub więcej nieidentycznych podjednostek. Koncepcja „1 gen — 1 enzym" nie jest więc juŜ obecnie zasadna. Cystron jest jednostką genetyczną kodującą strukturę podjednostki cząsteczki białkowej działającej jako najmniejsza jednostka ekspresji genetycznej. Idea 1 gen — 1 enzym moŜe być obecnie uwaŜana jako koncepcja 1 cystron — 1 podjednostka. Gen indukowalny jest to gen, którego ekspresja zwiększa się w wyniku reakcji na swoisty sygnał regulatorowy — indtiktor. Ekspresja niektórych genów jest konstytutywna, co oznacza, Ŝe ekspresja ich utrzymuje się na stałym poziomie i nie podlega regulacji. W wyniku mutacji niektóre produkty genów indukowalnych są syntetyzowane w sposób konstytutywny. Mutację, w której wyniku następuje ekspresja konstytutywna genu, który ijprzednio był genem regulowanym, nazywamy mutacją konstytutywną.

ANALIZA METABOLIZMU LAKTOZY U E. COLI DOPROWADZIŁA DO SFORMUŁOWANIA HIPOTEZY OPERONU W 1961 r. Francois Jacob i Jacąues Monod opisali w swojej klasycznej pracy model operonu. Ich hipoteza w duŜej mierze opierała się na obserwacjach regulacji metabolizmu laktozy przez bakterie jelitowe Escherichia coli. Mechanizm molekularny odpowiedzialny za regulację genów biorących udział w metabolizmie laktozy naleŜy obecnie do najlepiej poznanych mechanizmów regulacyjnych w kaŜdym organizmie. JiGalaktozydaza hydrolizuje p-galaktozyd laktozy do galaktozy i glukozy (ryc. 41-2). Gen strukturalny p-galaktozydazy (gen lac Z) występuje łącznie z genem odpowiedzialnym za przenikanie galaktozy do komórki (Y) i z genem acetylazy galaktozydowej (A), której funkcja nie jest dobrze poznana. Geny strukturalne dla tych 3 enzymów są fizycznie połączone i stanowią operon lac. przedstawiony na ryc. 41-3.

REGULACJA EKSPRESJI GENU / S11 Wiązanie /f-gllkozydowe /f-GALAKTOZYDAZA

H I I H HO

HO '

H

H HO H

H HO CH,OH

OH

CH3OH

H;O

Laktoza Galafctoza

Glukoza

Ryc. 41-2. Hydroliza laktozy do galaktozy i glukozy przez p-galaktozydazę.__________________ Miejsce s

Operator pen Y gen A

promotora' Operon lac

Ryc. 41 -3. ZaleŜności przestrzenne połoŜenia genów strukturalnych i regulatorowych operonu lac. Gen Z koduje Pgataktozydaze, gen Y — permeaze, a gen A — acetylazę. Gen „i" koduje białko represora operonu lac.

Takie genetyczne uszeregowanie genów strukturalnych i ich genów regulatorowych zapewnia skoordynowaną ekspresję 3 enzymów włączonych w metabolizm laktozy. KaŜdy z tych sprzęŜonych genów jest przepisywany na wielką cząsteczkę mRNA, która zawiera iiczne i niezaleŜne kodony startu translacji (AUG) i zatrzymania translacji (UAA) dla kaŜdego cystronu. Taki typ cząsteczki mRNA nazywa się policystronowym mRNA. Po licy strono we mRNA występują głównie w organizmach prokariotycznych. Gdy bakterie E. coli zostają eksponowane na laktozę lub swoisty analog laktozy, wówczas ekspresja aktywności p-galaktozydazy, permeazy galaktozydowej i acetylazy gal aitozyd owej zwiększa się 10—100-krotnie. Jest to reakcja typu A przedstawiona na ryc. 41-1. Po usunięciu sygnału, tj. induktora, nasilenie syntezy tych 3 enzymów-sie zmniejsza. PoniewaŜ u bakterii nie zachodzi znaczący rozpad tych enzymów, stęŜenie fS-galaktozydazy oraz pozostałych 2 enzymów pozostaje takie samo, aŜ nie zostanie zmniejszone przez podział komórkowy. Gdy bakterie E. coli są eksponowane zarówno na laktozę, jak i na glukozę, jako źródła

węgla, to najpierw metabolizują glukozę, następnie chwilowo ograniczają wzrost do czasu, aŜ geny operonu lac zostają indukowane i umoŜliwią metabolizm laktozy. ChociaŜ laktoza jest obecna od początku fazy wzrostowej bakterii, komórka nie indukuje enzymów niezbędnych do katabolizmu laktozy, zanim nie wyczerpie się glukoza. Fenomen ten początkowo przypisywano represji operonu laktozowego przez pewne katabolity glukozy; stąd zjawisko to nazwano represją kataboliczną. Obecnie wiadomo, Ŝe „represja kataboliczną" w istocie powstaje za pośrednictwem białka — catabolite gene activator protein (CAP) w połączeniu z cyklicznym AMP {cAMP; p. str. 221). Ekspresja wielu układów indukowalnych enzymów lub operonów u E. coli i innych prokariontów jest wraŜliwa na represję kataboliczną, co będzie opisane poniŜej. Fizjologia indukcji operonu lac jest dobrze poznana na poziomie molekularnym (ryc. 41-4). Ekspresja normalnego genu i operonu lac jest konstytutywna; jest to ekspresja na stałym poziomie, w wyniku której tworzą się podjednostki represora lac. Cząsteczka represora lac składa się z 4 identycznych podjednostek

512 / ROZDZIAŁ 41

Operator Promotor Gen Y

Gen Z

Gen A

A.

RNA

Poiimeraza RNA nie moŜe przepisać operatora lub dystainych genów (Z,Y/i)

P odj ednos t k l • • represora • • Represor (tetratrar} CAP-AMP

Obecny Induktor brak glukozy

Poiimeraz Nieak tywn y ^^ represor • łt.

Induktory

Białko /t-galaktozydazy

Białko permeazy

Siatko acetyl azy

Ryc.41 -4. Mechanizm represji i derepresji operonu laktozy. Gdy brak jest induktora (A) produkty genu „i", które są syntetyzowane konstytutywnie tworzą cząsteczkę represora, która wiąŜe się z locus operatora i zapobiega związaniu polimerazy RNA z locus promotora, uniemoŜliwiając następującą transkrypcję strukturalnych genów Z, Y i A. Gdy induktor jest obecny (B), wówczas konstytutywnie działający gen „i" wytwarza cząsteczki represora, które są inaktywowane przez induktor i przez to nie mogą wiązać się z locus operatora, W obecności cAMP i wiąŜącego go białka (CAP) poiimeraza RNA moŜe przepisać strukturalne geny Z, Y i A, a pot i cy stron owa cząsteczka mRNA moŜe ulec translacji na odpowiadające im cząsteczki białkowe f)-galaktozydazy, permeazy i acetylazy, umoŜliwiając katabolizm laktozy.

o m.cz. 38 000. Cząsteczka białka represorowego - - produkt genu „i" — ma duŜe powinowactwo (Kd ok. \0~lz mol/l) do locus operatora. Locus operatora jest to region dwupasmowego DNA o długości 27 par zasad, mający 2-osiową symetrię rotacyjną (pokazaną jako ciągłe linie wokół kropkowanej osi) w regionie obejmującym 21 par zasad, jak to przedstawiono poniŜej:

grubionymi literami na pokazanej wyŜej sekwencji). W kaŜdym czasie tylko 2 podjednostki represora wiąŜą sie z operatorem, a w obrębie regionu długości 17 par zasad przynajmniej 1 zasada kaŜdej pary zasad jest włączona w proces rozpoznania i wiązania represora lac. Wiązanie zachodzi głównie w większym rowku bez rozerwania dwupasmowej, opartej na sparowanych zasadach, struktury DNA operatora. Locus operatora jest połoŜony między miejscem 5'AAT TGTGAGC G GATAACAATT promotora, w którym wiąŜe się DNA-zaleŜna 3' TTA ACACTCG C CTATTGTTAA poiimeraza RNA w momencie rozpoczynania * Najmniejsza długość operatora dla represora transkrypcji, a miejscem inicjacji transkrypcji lac, która warunkuje jeszcze skuteczne działa- genu Z, czyli strukturalnego genu p-galaktozynie, wynosi 17 par zasad (zaznaczonych po- 'dazy (ryc. 41-3). Po związaniu się w locus

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 513

operatora cząsteczka represora uniemoŜliwia transkrypcję locus operatora, jak równieŜ dystalnych strukturalnych genów Z, Y i A. Cząsteczka represora działa wiec tu jako negatywny regulator; w jej obecności (i w nieobecności induktora, p. niŜej) jest uniemoŜliwiona ekspresja genów Z, Y i A. W kaŜdej komórce na 1 operator przypada normalnie 20—40 cząsteczek tetramerowego represora. Analog laktozy, który jest zdolny indukować operon lac, ale jednocześnie sam nie słuŜy jako substrat do |t-galaktozydazy, stanowi przykład induktora poronnego. Dodanie laktozy lub induktora poronnego do bakterii, rosnących na źle uŜytkowanym źródle węgla (np. takim jak btirsztynian), powoduje szybką indukcję enzymów operonu lac. Małe ilości induktora poronnego lub laktozy są zdolne do wniknięcia do komórki nawet w nieobecności permeazy. Zarówno te cząsteczki represora, które są związane z loci operatora, jak równieŜ te, które występują w stanie wolnym w eytozolu mają duŜe powinowactwo do induktora. Związanie induktora z cząsteczką represora skompleksowaną z operatorem powoduje zmiany konformacyjne w strukturze represora i prowadzi do dysocjacji jego od DNA. Jeśli DNA-zaleŜna polimeraza RNA była juŜ wcześniej dołączona do kodującego pasma w miejscu promotorowym, to transkrypcja zajdzie. Polimeraza generuje policystronowy RNA, którego koniec 5' jest komplementarny do pasma matrycowego operatora. W ten sposób induktor wywołuje derepresję operonu iac i pozwala na transkrypcję strukturalnych genów [S-galaktozydazy, permeazy galaktozydowej i acetylazy galaktozydowej. Translacja policystronowego mRNA moŜe zachodzić nawet wtedy, zanim zakończy się transkrypcja. Derepresja operonu lac pozwala komórce na syntezę enzymów niezbędnych do katabolizy laktozy jako źródła energii. Aby polimeraza RNA mogła związać się z miejscem promotorowym, musi być obecne białko CAP (catabolite gene activator protein), z którym jest związany cAMP. Odpowiedni mechanizm pozwala na gromadzenie przez bakterię cAMP tylko wówczas, gdy jest ona pozbawiona źródła węgla. W obecności glukozy lub glicerolu, w stęŜeniach zapewniających wzrost bakterii, będzie niedostatek cAMP do związania się z białkiem CAP. W obecności glukozy i glicerolu brak jest więc białka CAP wysyconego cAMP i DNA-zaleŜna polimeraza RNA nie moŜe zainicjować transkrypcji operonu lac. W obecności kom33

Biochemia

pleksu CAP-cAMP, który wiąŜe się do DNA w górę od miejsca promo torowego, transkrypcja moŜe zachodzić (ryc. 41-4). Regulator CAP-cAMP działa więc jako pozytywny regulator, poniewaŜ jego obecność jest wymagana do ekspresji genu. Operon lac podlega zarówno pozytywnej, jak i negatywnej regulacji. Gdy gen „i" jest zmutowany w ten sposób, Ŝe jego produkt - represor lac - nie jest zdolny do związania się z DNA operatora, wówczas w organizmie zajdzie konstytutywna ekspresja operatora lac. Odwrotnie, gdy w organizmie zajdzie mutacja genu „i", uniemoŜliwiająca związanie induktora z represorem, organizm taki pozostanie w stanie represji nawet w obecności cząsteczki induktora, poniewaŜ induktor nie moŜe związać represora w locus operatora w celu derepresji operonu. Bakterie wytwarzające w locus operatora takie mutacje, które nie pozwalają na związanie przez sekwencje operatora normalnej cząsteczki represorowej, będą wykazywały konstytutywną ekspresję genów operonu lac. Przełącznik genetyczny u bakteriofaga lambda (X) stanowi wzorzec dla interakcji białko-DNA w komórkach eukariotycznych Niektóre bakterie stanowią źródło wirusów, które istnieją w stanie uśpienia w chromosomie bakteryjnym lub mogą replikować w bakterii i doprowadzać do lizy i zabicia bakteryjnego gospodarza. Niektóre bakterie E. coli wytwaP-giobiny; w wyniku tych mutacji powstaje — bakteriofaga X. Podczas zakaŜenia wraŜliwych E. coli wirusem X, ten ostatni wstrzykuje do komórki bakteryjnej linijny, dwupasmowy genom DNA o długości 45 000 par zasad (ryc. 41-5). W zaleŜności od stanu odŜywczego komórki bakteryjnej DNA X albo integruje się z genomem gospodarza (szlak lizogeniczny) i pozostaje tam w stanie uśpienia do czasu aktywacji (p. niŜej), albo teŜ zaczyna replikować się do czasu wytworzenia ok. 100 kopii kompletnego, opakowanego w białko wirusa, który w tym momencie powoduje liŜę swego gospodarza (szlak lityczny). Nowo utworzone cząsteczki wirusa mogą następnie zakaŜać inne wraŜliwe bakterie. Wirus X,, po integracji z genomem gospodarza pozostaje w stanie uśpienia do momentu, aŜ lizogeniczny bakteryjny gospodarz będzie eksponowany na czynniki uszkadzające DNA, W reakcji na taki bodziec uszka-

514 / ROZDZIAŁ 41

Promieniowanie nadfioletowe

Byc. 41-5. ZakaŜenie bakterii E. coli fagiem lambda zaczyna się wówczas, gdy cząsteczka wirusa przyczepia się do komórki bakteryjnej (1) i wstrzykuje swój DNA (linia pogrubiona) do komórki (2). ZakaŜenie moŜe biec dalej 2 drogami w zaleŜności od tego, które z 2 zestawów genów wirusa zostają włączone (uaktywnione). Droga hzogeniczna prowadzi do integracji wirusowego DNA z chromosomem bakteryjnym (4, 5), gdzie wirusowy DNA ulega biernej replikacji wraz z podziałem komórki bakteryjnej. Drzemiący wirus nazywamy profagiem, a komórkę, która go wytwarza, nazywamy lizogenem. W alternatywnej drodze zakaŜenia litycznego wirusowy DNA replikuje samodzielnie (6) i steruje syntezą białek wirusowych (7) Wytwarza się ok. 100 nowych caąsteczek wirusowych. NamnaŜające się wirusy doprowadzają do lizy lub rozsadzenia komórki (8). Profag moŜe być „wyind u kowany" takim czynnikiem, jak promieniowanie nadfioletowe (9). Czynnik indukujący przerzuca przełącznik tak, Ŝe inny zespół genów ulega włączeniu Wirusowy DNA wypetla się z chromosomu (10) i replikuje; wirus wchodzi na drogę lityczną. (Reprodukowane za zgodą z: Ptashne M., Johnson A. D., Pabo C. O.: A genetic switch in a bacterial virus. Sci. Am. /Nov/ 1982; 247:128).

dzający uśpiony bakteriofag zostaje „indukowany" i geny jego własnego genomu, niezbędne do wycięcia go z chromosomu gospodarza, niezbędne do replikacji jego DNA do syntezy białek otoczki i enzymów litycznych, zaczynają być przepisywane i następnie ulegają translacji.

To zdarzenie działa jak spust (trigger) lub reakcja typu C (ryc. 41-1); tzn. gdy bakteriofag A. raz zaangaŜuje się w proces indukcji, wówczas nie ma powrotu do stanu wyjściowego zanim komórka nie ulegnie lizie, a zreplikowany bakteriofag nie zostanie uwolniony. Ten przełącz-

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 515 Gm rsprssora B

RNAraprasora --*"-" 0R3

Gen ero

0R2

ORI

J 1111 u j t ] i N i u 11 Ji h i u i N u u i J i ji 1111 y 111 ■ i L n 111111 iii f 11111 n

Promotor repraaora

Promotor ero

i l i l i l l i i l i l i

i l ł

X ero RNA

1

Ryc. 41-6. Prawy operator (OR) jest pokazany w tej serii rycin z uwidocznieniem coraz większych szczegółów. Operator jest regionem wirusowego DNA o długości ok. 80 par zasad ( = pz) (A). Po jego lewej stronie leŜy gen kodujący represor X., po jego prawej stronie gen ero. Gdy region operatora powiększymy (B), uwidaczniają się jego 3 podregiony OR1, OR2 i OR3r z których kaŜdy ma długość 17 pz. Są to miejsca sygnalne, do których moŜe wiązać się zarówno represor, jak i białko ero. W miejscach tych nakładają się 2 promotory: sekwencje zasad, do których wiąŜe się polimeraza RNA w celu przepisania genu na mRNA (linie faliste), który następnie ulega przetłumaczeniu na białko. Fragment ryciny (C) przedstawia w powiększeniu miejsce 0R1 wraz z sekwencją zasad. ZauwaŜ, ze w tym regionie chromosomu X oba pasma DNA słuŜą jako matryca dla transkrypcji {p. rozdz. 39). (Reprodukowano za zgodą z : Ptashne M., Johnson A. D., Pabo C. O,: A genetic switch in a bacterial virus. Sci. Am. /Nov/ 1982; 247:128).

nik ze stanu uśpienia albo ze stanu profaga do zakaŜenia litycznego jest dobrze poznany na poziomie genetycznym i molekularnym i będzie opisany szczegółowo. Zjawisko przełączenia w bakteriofagi! X zachodzi w obrębie jego dwupasmowej cząsteczki DNA, określanej jako „prawy operator" (OR) 0 długości 80 par zasad (ryc. 41-6A), Prawy operator jest ograniczony ze strony lewej przez gen strukturalny represorał , , a z prawej strony przez gen strukturalny kodujący białko regula torowe zwane ero. JeŜeli bakteriofag X jest w stanie profaga, to jest w stanie zintegrowa nym z genomem gospodarza, jedynym genem wirusa X, który ulega ekspresji, jest gen represorowy. Gdy bakteriofag znajduje się w sta nie wzrostu litycznego, wówczas gen represorowy nie ulega ekspresji, ale w stanie ekspresji jest gen ero oraz wieie innych genów wirusa X. Gdy gen represorowy jest włączony, wówczas ero jest wyłączony, a gdy gen ero jest włączony, wówczas gen represorowy jest wyłączony. Jak widać te 2 geny regulują wzajemnie swoją ekspresję 1 ostatecznie decydują o wyborze litycznego lub lizogenicznego wzrostu baktenofaga X. Decyzja o transkrypcji genu represorowego lub transkryp cji genu ero jest przykładem przełącznika mole kularnego. Region operatorowy moŜe być podzielony na 3 podregiony, kaŜdy składający się z 17 par

zasad o podobnej, ale nie identycznej sekwencji DNA, złączonych jedna z drugą (ryc. 41-6B). KaŜdy z tych 3 podregionów, OR1, OR2 i OR3 moŜe wiązać białko represorowe lub białko ero głównie przez kontakt między represorem a dwupasmowym heliksem DNA w obrębie rowka większego. Region DNA między genami ero a represorem zawiera takŜe 2 sekwencje promotorowe, które kierują wiązaniem polimerazy RNA o swoistej orientacji wówczas, gdy polimeraza rozpoczyna transkrypcję przyległych genów. Jeden promotor zawiaduje polimeraza RNA tak, aby przepisywała ona w kierunku na prawo, a więc przepisywała gen ero i inne geny dystalne, podczas gdy inny promotor zawiaduje transkrypcją genu represorowego w kierunku na lewo (ryc. 41-6B). Produkt genu represorowego, białko represorowe o 236 aminokwasach, istnieje jako cząsteczka o 2 domenach, w których domena końca aminowego wiąŜe się do DNA operatora, a domena końca karboksylowego pobudza związanie jednego białka represorowego z drugim białkiem, w wyniku czego powstaje dimer. Cząsteczki represorowe w postaci dimerii wiąŜą się z DNA operatora znacznie silniej niŜ postać monomeryczna (ryc. 41-7A-C). Produkt genu ero, 66 aminokwasowe białko ero ma pojedynczą domenę, ale takŜe wiąŜe się z DNA operatora znacznie silniej jako dimer

516 / ROZDZIAŁ 41

(ryc. 41-7D). Oczywiście pojedyncza domena białka ero pośredniczy zarówno w wiązaniu operatora, jak i dimeryzacji. W bakterii lizogenicznej, tj. zawierającej profaga X., dimer represora K wiąŜe sie preferencyjnic do OR) i w czasie tego procesu, przez działanie kooperatywne, wzmacnia (rzędu 10-krotnie) wiązanie się innego dimeru represora do OR2 (ryc. 41-8). Powinowactwo represora do regionu O R 3 jest najmniejsze z wszystkich

3 podregionów operatora. Związanie represora z ORI powoduje 2 główne skutki. Zajęcie podregionu OR1 przez represor blokuje wiązanie polimerazy RNA do prawego promotora, co

zapobiega ekspresji genu ero. Po wlóre, jak to wspomniano wyŜej, dimer represora związany z OR1 wzmacnia wiązanie dimeru represora do OR2 . Związanie represora do OR2 wywiera dodatkowy waŜny skutek w postaci wzmocnienia wiązania polimerazy RNA do lewostron-

ero

Byc. 41 -7. Schematyczne struktury molekularne cl (represor I pokazany w Ar B i C) oraz białka ero. Białko represora X jest łańcuchem polipeptydowym o 236 aminokwasach. Łańcuch ulega sfałdowaniu na 2 podstruktury o kształcie hantli (cięŜarków gimnastycznych): domenę w końcu aminowym (NH2) i domenę w końcu karboksylowym (COOH). Te 2 domeny są połączone fragmentem łańcucha polipeptydowego wraŜliwego na przecięcie proteazami (2 strzałki na ryc. A). Cząsteczki pojedynczego represora (monomery) mają tendencję do asocjowania i utworzenia formy dimeru (B); dimer moŜe dysocjować, dając ponownie monomery. Forma dimeru jest utrzymywana głównie dzięki kontaktowi domen w końcu karboksylowym (zakreskowane). Dimery represora wiąŜą się (t mogą opuszczać) z miejscami sygnalnymi w regionie operatora; ich największe powinowactwo jest do miejsca OR1 (C). Kontakt z DNA zachodzi przez domenę aminoterminalną cząsteczki represora (zacieniowane). Białko ero ma pojedynczą domenę odpowiadającą za dimeryzację i inne miejsca promujące wiązanie dimerów do operatora, zwłaszcza do OR3. (Reprodukowano za zgodą z : Ptashne M., Johnson A. D., Pabo C. O.: A genetic switch in a bacterial virus. Sci. Am. /Nov/ 1982; 247:128).

Ryc. 41 -8. Konfiguracja przełącznika w 4 etapach cyklu Ŝyciowego bakteriofaga X. Droga lizogeniczna (w której wirus pozostaje w stanie drzemania jako profag) zostaje wybrana wówczas, gdy dimer represora wiąŜe się z OR1, przez co umoŜliwia związanie OR2 przez inny dimer. W stanie profaga (góra) dimery represora związane z OR1 i OR2 zapobiegają związaniu się polimerazy RNA z prawym promotorem i blokują syntezę białka ero (kontrola negatywna). Cząsteczki represora wzmagają takŜe wiązanie polimerazy do lewego promotora (kontrola pozytywna), w wyniku czego gen represorowy ulega transkrypcji na RNA (linia falista) i syntetyzuje się więcej cząsteczek represora, utrzymując stan lizogeniczny. Indukcja profaga następuje po aktywacji proteazy recA przez promieniowanie nadfioletowe, która hydrolizuje monomery represora. Zostaje przez to przesunięta równowaga między wolnymi monomerami, wolnymi dimerami i związanymi dimerami, a dimery opuszczają miejsce operatora, Polimeraza nie ma warunków do wiązania się z lewym promotorem, w wyniku czego nie jest dłuŜej syntetyzowany represor. W miarę postępu indukcji wszystkie /oc/operatora są opróŜnione z cząsteczek represora, dzięki czemu potimeraza moŜe się wiązać do prawego promotora i zaczyna syntetyzować się białko ero. W czasie wczesnego wzrostu litycznego pojedynczy dimer ero wiąŜe się do OR3 — miejscem, do którego białko ero ma największe powinowactwo. Poiimeraza RNA nie moŜe teraz wiązać się do lewego promotora, ale udostępniony pozostaje prawy promotor. Polimeraza wiąŜe się do prawego promotora i gen ero oraz inne wczesne geny lityczne ulegają transkrypcji. Następuje wzrost lityczny. (Reprodukowano za zgodą z : Ptashne M., Johnson A, D,, Pabo C O.: A genetic switch in a bacterial virus, Sci. Am. /Nov/ 1982; 247:128).

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 517

nego promotora, który nakłada się z podregionem C>R2,i przez to wzmaga transkrypcję i następnie ekspresję genu represorowego. To wzmocnienie transkrypcji zachodzi przypuszczalnie przez bezpośrednie działanie białko-biatko pomiędzy polimerazą RNA związaną z promotorem a represorem związanym z OR2. Represor X, jest wiec zarówno negatywnym regulatorem zapobiegającym transkrypcji genu ero,

transkrypcję swego własnego genu represoro~ wego. To podwójne działanie represora jest odpowiedzialne za stabilny stan uśpionego bakteriofaga X; represor nie tylko zapobiega ekspresji genów niezbędnych do lizy, lecz takŜe pobudza ekspresję samego siebie, aby stabilizować ten stan zróŜnicowania. W przypadku, gdy stęŜenie białka represora jest bardzo duŜe, wówczas represor moŜe się wiązać do OR3 i przez to zmniejszyć transkrypcję genu represorowego

jak i pozytywnym regulatorem wzmacniającym Profag

OR3

0=2

O„1

Fciimeraza RNA Indukcja (1] Pollmeraza RNA

indukcja (2)

Polimerazą RNA

\ W W W VT 0*3 Wczesny wzrost lityczny

0,2

Promotor represora

0R1 Promotor ero Polimeraza HNA

\ V > . \\ Vv. W W W W W 0=3 Promotor ropresora

Ryc. 41 -8.

0H2

0„1 Promotor ero

518 / ROZDZIAŁ 41

z lewostronnego promotora do czasu, aŜ stęŜenie represora się zmniejszy i represor oddysocjuje od OR3. Gdy sygnał uszkadzający DNA, taki jak promieniowanie nadfioletowe, zaatakuje lizogeniczną bakterię-gospodarza, wówczas są wytwarzane jednopasmowe fragmenty DNA. które aktywują swoiste proteazy kodowane przez gen bakteryjny nazwany genem recA(ryc. 41-8). Aktywowana proteaza recA hydrolizuje tę część białka represorowego, która wiąŜe domenę cząsteczki przy końcu aminowym z domeną przy końcu karboksylowym. Takie ścięcie domen represora powoduje dysocjację di mero w represora, co z kolei powoduje dysocjację cząsteczek represora z OR2 i ewentualnie z OR1. MoŜna przewidzieć skutki usunięcia represora z OR1 i z OR2. Polimeraza RNA natychmiast uzyskuje dostęp do prawego promotora i rozpoczyna transkrypcję genu ero, a wzmacniające działanie represora w podregionie OR2 na transkrypcję w kierunku lewym się zatraca (ryc. 41-8). Białko ero. uzyskane z nowo przepisywanego genu ero, wiąŜe się z regionem operatora jako dimery, ale kolejność jego preferencji jest odwrotna niŜ białka represorowego (ryc. 41-8). Białko ero, wiąŜe się najsilniej do OR3, ale nie ma skutku współdziałania białka ero w podregionie OR3 na wiązanie białka ero do OR2. Przy zwiększających się stęŜeniach ero białko będzie się wiązało do OR2 i ewentualnie do ORI. Zajęcie podregionu OR3 przez białko ero natychmiast wyłącza transkrypcję z lewego promotora a zatem zapobiega dalszej ekspresji genu represorowego. W ten sposób przełącznik działa w pełni skutecznie: gen ero jest teraz w stanie ekspresji, a gen represorowy jest w pełni wyłączony. Zdarzenie to jest nieodwracalne i ekspresja innych genów A, moŜe mieć miejsce jako część cyklu litycznego. Gdy stęŜenie represora ero osiąga duŜą wartość, wówczas białko ero zajmie ewentualnie podregionORl, przez co spowoduje wyłączenie własnego genu; proces ten jest niezbędny do oddziaływania na końcowe etapy cyklu litycznego. Trójwymiarową strukturę białka ero i białka represora X poznano dzięki krystalografii przy uŜyciu promieni X, a modele wiązania tych białek i skutki opisanych wyŜej zdarzeń genetycznych i molekularnych zostały zaproponowane i przetestowane. Dotychczas system ten przedstawia najlepiej poznane zdarzenia molekularne związane z regulacją genu.

REGULACJA GENU U PROKARIONTÓW I EUKARIONTÓW RÓśNI SIĘ W WIELU WAśNYCH ASPEKTACH Oprócz regulacji transkrypcji, komórki eukariotyczne stosują róŜne mechanizmy w celu regulacji ekspresji genu (p. tab. 41-2). W komórkach eukariotycznych błona jądrowa fizycznie Tabela 41 -2. W komórkach eukariotycznych ekspresja genu jest regulowana przez transkrypcję i innymi etrogami Inna metody regulacji Amplifikacja genu RearanŜacja genu Przekształcanie RNA Alternatywne składanie mRNA Transport mRNA z jądra do cytoplazmy Regulacja stabilności mRNA

rozdziela proces transkrypcji genu od procesu translacji, poniewaŜ rybosomy znajdują się jedynie w cytoplazmie. W_proces ekspresji genów eukariotycznych włącza się znacznie więcej etapów, zwłaszcza dotyczących przekształceń RNA, niŜ w proces ekspresji genów prokariotycznych; te etapy mogą stanowić dodatkowe miejsca na wpływy czynników regulujących w porównaniu z prokariontami. Etapy przekształcania RNA w komórkach eukariotycznych obejmują modyfikację końca 5' pierwotnego transkryptu. dodanie łańcucha poliadenylowego do końca 3' transkryptów oraz wycięcie regionów intronowych do generowania połączonych eksonów w dojrzałej cząsteczce mRNA. Dotychczasowa analiza ekspresji genu eukariotycznego dostarczyła dowodu, Ŝe regulacja zachodzi na poziomie transkrypcji, przekształceń jądrowego RNA i stabilności mRNA, Wykazano takŜe, Ŝe zachodzi amplifikacja i rearanŜacja genów, co ma wpływ na ekspresję genów. Dzięki pojawieniu się technologii rekombinacji (czyli inŜynierii genetycznej) DNA, w obecnych latach poczyniono znaczny postęp w zrozumieniu ekspresji genów eukariotycznych. Jednak wobec faktu, Ŝe większość organizmów eukariotycznych zawiera znacznie więcej informacji genetycznej niŜ organizmy prokariotyczne, i Ŝe manipulacja genami u tych pierwszych jest ograniczona, molekularne aspekty regulacji

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 519

genów eukariotycznych są znacznie mniej poznane niŜ przykłady dyskutowane uprzednio w tym rozdziale, W następnych podrozdziałach opisano krótko kilka róŜnych typów regulacji genów eukariotycznych. Geny eukariotyczne mogą być amplif ikowane podczas rozwoju osobniczego i podczas odczynu na związki chemiczne W, okresie wczesnego rozwoju organizmów wielokomórkowych pojawia się gwałtowne zapotrzebowanie na swoiste cząsteczki, takie jak rybosomalny RNA i informacyjny. RNA, do syntezy biatek, z których tworzą się takie tkanki, jak osłonka jajowa. Jednym ze sposobów, które mogą wzmóc syntezę takich cząsteczek, jesl: zwiększenie liczby genów dostępnych do "transkrypcji tych cząsteczek. Wśród powtarzających sekwencji DNA znajdują się setki kopii genów rybosomalnego RNA i tRNA. Geny te preegzystują w postaci licznych kopii w materiale genetycznym gamet i w ten sposób są przenoszone z pokolenia na pokolenie w wielkiej liczbie kopii. W niektórych szczególnych organizmach, takich jak muszka owocowa (Drosaphila) w czasie oogenezy zachodzi amplifikacja juŜ uprzednio niewielu istniejących genów, np. tych, które kodują białka chorionu (osłonki jajowej). Następnie takie amplifikowane geny, które powstają prawdopodobnie w procesie powtarzającej inicjacji w czasie syntezy DNA (złoŜone banieczki replikacyjne), dostarczają licznych miejsc do transkrypcji genów (ryc. 38-15 i 41-9). Geny

s36

$38

nleampllf I kowane

Ryc. 41-9. Schematycina ilustracja ampltfikacji genów s36 i s38 białka chorionu. (Reprodukowano za zgodą z: Chisholm R: Gene amplificatton during development. Trends B/ochem. Sci. 1982; 7:161).

W ostatnich latach było moŜliwe pobudzenie do amplifikacji określonych genów w komórkach ssaków hodowanych w kulturach. W niektórych przypadkach było moŜliwe uzyskanie kilkuset kopii swoistych genów podczas ekspozycji komórek na zwiększane dawki wybranych związków chemicznych, U chorych otrzymujących metotreksat, w ceiu leczenia nowotworu, obserwowano rozwój oporności na lek w komórkach nowotworowych wskutek zwiększenia liczby genów kodujących reduktazę dihydrofolianową, która jest włączona w metabolizm metotreksatu. Podobna amplifikacja genów zachodzi spontanicznie in vivo, tj. bez dodanego z zewnątrz czynnika wybiórczego, a nie zamierzone dodatkowe cykle replikacji mogą zostać „zamroŜone" w genomie pod wprywem presji odpowiednich czynników wybiórczych. Utworzenie aktywnych genów immunoglobuliny obejmuje wybiórczą rearanŜację DNA Jedną z najbardziej interesujących i złoŜonych kwestii, podnoszonych w obecnej dekadzie przez biologów, jest problem genetycznych i molekularnych podstaw róŜnorodności przeciwciał (p. rozdz. 55). Postępy immunologii wykazały niezbicie, Ŝe komórki układu obronności humoralnej podlegają róŜnicowaniu, wytwarzają przeciwciała o takiej samej swoistości, ale o róŜnych funkcjach efektorowych. W ciągu ostatnich lat wiele laboratoriów znacznie się przyczyniło do zrozumienia podstaw róŜnorodności przeciwciał i regulacji ekspresji genów immunoglobulinowych w czasie rozwoju i róŜnicowania. Jak to opisano w rozdz. 39, sekwencje kodujące, odpowiedzialne za powstawanie swoistych cząsteczek białkowych, nie występują w jednym bloku u ssaków. Jako pierwsze rozpoznano kodujące segmenty zmiennej i stałej domeny lekkiego łańcucha immunoglobuliny znajdujące się w oddzielnych miejscach w obrębie genomu. Jak to opisano szczegółowo w rozdz. 55 cząsteczki immunoglobuliny są złoŜone z 2 typów łańcuchów polipeptydowych: łańcucha lekkiego (L, light) i cięŜkiego (H, heavy) (p. ryc. 55-6). KaŜdy z łańcuchów L i H jest podzielony na region zmienny (V) N-końcowy i region stały (C) przy końcu karboksylowym. Regiony V są odpowiedzialne za rozpoznanie antygenu (obcych cząsteczek), a regiony stałe za funkcje etektorowe, które determinują, jak cząsteczka przeciwciała potraktuje antygen.

520 / ROZDZIAŁ 41

Są znane 3 niesprzęŜone rodziny genów odpowiedzialnych za strukturę cząsteczki immunoglobuliny. 2 rodziny są odpowiedzialne za łańcuchy lekkie (łańcuchy \ i X ) oraz jedna rodzina za syntezę cięŜkich łańcuchów. KaŜdy łańcuch lekki jest kodowany przez 3 oddzielne segmenty: segment zmienny {Vi), łączący (JL) i stały (CL)- Haploidalny genom ssaków zawiera ponad 500 segmentów V,,, 5 lub 6 segmentów JL i przypuszczalnie 10 lub 20 segmentów C L. W czasie róŜnicowania łim-

foidalnej komórki B segment VL jest przeniesiony z odległego miejsca tego samego chromosomu na pozycję bliŜszą tego regionu genomu, który zawiera segmenty JL i CL. Taka rearanŜacja DNA umoŜliwia następnie transkrypcję segmentów VL, JL i CL w postaci pojedynczego prekursora mRNA, który następnie ulega przekształceniu, dając mRNA dla swoistego łańcucha lekkiego przeciwciała. Przez rearanŜację róŜnych segmentów VL, JL i CL w obrębie genomu układ odpornościowy moŜe dawać

C H1 Zawias C H2 C H3

C„3 Cl

C..2b

*C2a C

jimRNA

2b mRNA LVDJ

Byc. 41-10. Zdarzenie rekombinacyjne prowadzące do powstania genu kodującego cięŜki łańcuch immunoglobuliny (y 2b). A: DNA Unii zarodkowej przed rearanŜacją. Istnieje zespół przynajmniej 50 genów (z których kaŜdy ma krótką sekwencję liderową) kodujących część zmiennego (V) regionu, zespół segmentów D kodujących głównie 3, region hiperzmienny i w pewnej odległości od niego 4 segmenty J, które uzupełniają sekwencję kodującą regionu V. Segmenty J leŜą w odległości ok. 8000 zasad od genu Cn, który jest umiejscowiony na początku zespołu genów kodujących region C łańcucha H immunoglobuliny. Sekwencje C są poprzerywane sekwencjami niekodującymir dając serię eksonów odpowiadających domenom oraz zawiasie w sekwencji aminokwasowej regionu C, B: W trakcie pierwszego zdarzenia translokacyjnego kaŜdy z segmentów V, D i J ulega rekombinacji, dając kompletny łańcuch n jednostki transkrypcyjnej. Tran skrypt jest kopią pokazanego na rycinie genu, ale sekwencje niekodujące (introny) są usuwane w procesie składania, który prowadzi do wytworzenia ciągłej kodującej sekwencji umRNA. C: Drugie zdarzenie translokacyjne, zwane przełączeniem cięŜkiego łańcucha, usuwa segmenty genów C\i, Cy3i Cyl i umieszcza segment V-D-J i części intronu J-C41 w pobliŜu genu Cy2b. Po transkrypcji introny są usuwane w trakcie składania mRNA, co prowadzi do uzyskania ciągłej, kodującej sekwencji w y2b mRNA. (Reprodukowano za zgodą z: Molgaard H. V,: Assembly ot immunoglobulin heavy chain genes. Naturę 1980; 286:659)

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 521

niezmiernie róŜnorodną bibliotekę (miliony) cząsteczek immunoglobulin swoistych antygenowo. Taka rearanŜacja DNA jest określana jako łączenie V-J łańcucha lekkiego. Łańcuch cięŜki jest kodowany przez 4 segmenty genowe: VH, D (diversity), JH i segment DNA kodujący CH. Region zmienny łańcucha cięŜkiego powstaje przez połączenie segmentów VH z segmentem D oraz JH- Powstały region DNA VH-D-JH jest następnie dołączony do jednego z 8 genów CH- Te geny CH (C,,, Q, CT3, G,l, CY2b, C72a i CE) determinują klasę lub podklasę cząsteczki immunoglobulin — IgM, IgG, IgA itd. (p. rozdz. 55). Przykład takiej rearanŜaeji i procesów przekształcających, w wyniku których powstaje gen kodujący cięŜki łańcuch Cy2b, przedstawiono na ryc. 41-10.

W PROCES ROZWOJU I RÓśNICOWANIA SA WŁĄCZONE RÓśNE WPŁYWY NA STRUKTURĘ CHROMATYNY Większość DNA w komórkach prokariotycznych jest zorganizowana w postaci genów i matryce te mogą być stale przepisywane. W komórkach ssaków sytuacja ta jest bardzo odmienna. Tutaj stosunkowo mała część całkowitego DNA jest zorganizowana w postaci genów i przyległych do nich regionów regulatorowych. Nieznana jest funkcja nadmiaru DNA (jest to jeden z powodów, dla którego jest tak duŜe zainteresowanie sekwencjonowaniem całego genomu ludzkiego). Dodatkowy poziom kontroli znajduje się na poziomie struktury chromatyny. Jak to podano w rozdz. 38 istnieją duŜe regiony chromatyny, które są nieaktywne tran skry pcyj nie, podczas gdy inne regiony są aktywne lub potencjalnie aktywne. Z nielicznymi wyjątkami kaŜda komórka zawiera ten sam zestaw genów (z wyjątkiem komórek wytwarzających przeciwciała). Rozwój wyspecjalizowanych narządów, tkanek i komórek oraz ich funkcji w organizmie zaieŜy od zróŜnicowanej ekspresji genów. Taką zróŜnicowaną ekspresję osiąga się m.in. przez udostępnienie do transkrypcji róŜnych regionów chromatyny w komórkach róŜnych tkanek. Na przykład DNA zawierający zespół genów P-globiny występuje w „aktywnej" chroma ty nie w retykulocycie, natomiast w komórce mięśniowej jest w chromatynie „nieaktywnej". Mechanizmy, które determinują chromatynę

„aktywną" lub „nieaktywną" nie są znane, ale prawdopodobnie proces ten polega na interakcji białko-DNA. Ponadto, jak to opisano w rozdz, 38, istnieją dowody, Ŝe metylacja reszty deoksycytydynowej (w obrębie sekwencji 5' -"CpG-3') w DNA moŜe wpływać na ogólne zmiany w chromatynie, takie, które wykluczają jej aktywną transkrypcję. Na przykład w wątrobie myszy mogą ulegać ekspresji tyiko niemetylowane geny rybosomalne; są takŜe dowody, Ŝe wiele wirusów zwierzęcych nie ulega transkrypcji, gdy ich DNA jest metylowany. JednakŜe nie jest moŜliwe uogólnienie poglądu, Ŝe metylowany DNA nie jest aktywny trans kry pcyj nie i Ŝe cała nieaktywna chromatyna jest metylowana, albo Ŝe aktywny DNA nie jest metylowany. DNA eukariotyczny, który znajduje się w „aktywnym" regionie chromatyny, moŜe być przepisywany. Podobnie jak w komórkach prokariotycznych promotor narzuca miejsce, w kórym polimeraza RNA rozpocznie transkrypcję, aJe ten promotor nie moŜe być często zdefiniowany jako obszar -35 i -10, zwłaszcza w komórkach ssaków (p. rozdz. 39). W komórkach eukariotycznych takŜe czynniki typu trans na ogół pochodzą z innych chromosomów (a więc działają w systemie trans), podczas gdy sprawa ta jest dyskusyjna w przypadku komórek prokariotycznych zawierających pojedynczy chromosom. Dodatkową złoŜoność wnoszą elementy/czynniki, które wzmagają lub wyciszają transkrypcje, które określają ekspresję swoistą tkankowo i które modulują działanie wielu cząsteczek efektorowych.

NIEKTÓRE ELEMENTY DNA WZMACNIAJĄ LUB WYCISZAJĄ TRANSKRYPCJĘ GENÓW EUKARIOTYCZNYCH Oprócz prostych zmian w chromatynie, które wpływają na aktywność transkrypcyjną, gromadzą się dowody, Ŝe w obrębie DNA znajdują się elementy, które ułatwiają lub wzmacniają inicjację transkrypcji w obszarze promotora. Na przykład u wirusa naczelnych (SV40) jest region połoŜony ok. 200 pz w górę od promotora genów wczesnych; region ten, złoŜony z 2 identycznych tandemowych sekwencji o długości 72 pz, moŜe silnie wzmagać transkrypcję genów in vivo. KaŜdy z tych elementów o 72 pz moŜe być podzielony na grupy mniejszych elementów; tak

S22 / ROZDZIAŁ 41

więc niektóre elementy wzmacniające transkrypcję mają bardzo złoŜoną budowę. Elementy wzmacniające transkrypcję (enhancer) róŜnią się od promotora pod względem 2 znaczących cech. .Mogą one wywierać pozytywny wpływ na transkrypcję nawci wówczas, gdy są oddzielone od promotora przez tysiące par zasad, działają one bez względu na polarność, a takŜe są aktywne, jeŜeli znajdują się w górę (5P) lub w dól (3') od promotora. Sekwencje, wzmacniające mają charakter ogólny; mogą one pobudzać kaŜdy promotor, który znajdzie się w ich sąsiedztwie. Element wzmacniający virusa SV40 moŜe np. wywierać wpływ na transkrypcje genu P-globiny przez 200-krotne zwiększenie transkrypcji genu w komórkach zawierającego w obrębie tego samego plazmidu zarówno sekwencję wzmacniającą, jak i gen P-globiny (p. niŜej oraz ryc. 41-11), Element wzmacniający transkrypcje nie wydaje się wytwarzać produktów, które działają na promotor, poniewaŜ jest on aktywny tylko wówczas, gdy istnieje w obrębie tej samej cząsteczki DNA, gdzie istnieje promotor (czyli znajduje się w połoŜeniu cis do promotora). Obecnie wyizolowano białka wiąŜące sekwencje wzmacniające, co powinno pomóc w wyjaśnieniu mechanizmu działania tych elementów. Sekwencje wzmacniające wydają się wnosić nadwraŜliwość na nukleazę w obrębie tych regionów, w których one się znajdują (p. rozdz. 38). Podsumowanie właściwości sekwencji wzmacniających przedstawiono w tab. 41-3. Tabela 41-3. Podsumowanie właściwości sekwencji wzmacniających transkrypcję (enhancer) Właściwości sekwencji wzmacniających Działają wówczas, gdy są umiejscowione w duŜej odległości od promotora Działają wówczas, gdy są umiejscowione w górę (na lewo) lub w dół (na prawo) od promotora Działają wówczas, gdy są zorientowane w obu kierunkach Działają przez promotory herero logiczne Działają przez związanie 1 lub więcej białek

Zidentyfikowano takŜe elementy działające w układzie cis, które zmniejszają lub wyciszają ekspresję swoistych genów. Tylko nieliczne takie elementy zostały zbadane tak, Ŝe niemoŜliwe są uogólnienia co do ich mechanizmu działama.

Element odpowiadający A

Promotor

Uer strukturalr

SV40

$ globlna

P globlna

SV40

fi globlna

fi globlna

Bd

D-

GRE

CAT

Ryc. 41-11. Schematyczne objaśnienie działania sekwencji wzmacniających transkrypcję {enhancer) i innych regulujących elementów działających w układzie cis. W tym modelu gen chimeryczny składa się z genu reportera (genu strukturalnego), który koduje białko, łatwe do oznaczenia, promotora, który zapewnia inicjację transkrypcji oraz domniemanego elementu regulatorowego. Przykłady A i B ilustrują fakt, Ŝe sekwencje wzmacniające transkrypcję (np. SV40) mogą działać w obu orientacjach i na promotor heterologiczny. Przykład C pokazuje, Ŝe regulatorowy element meta I ot i o ne iny — mt (który pod wpływem kadmu lub cynku indukuje transkrypcję endogennego genu mt i syntezę białka wiąŜącego metal) moŜe działać przez promotor kinazy tymidynowej (łk) w procesie wzmocnienia transkrypcji genu ludzkiego hormonu wzrostu (hGH). Konstrukty uzyskane metodą inŜynierii genetycznej wprowadzono do przedjądrza męskiego jednokomórkowych embrionów myszy, które umieszczano w macicy matki zastępczej i uzyskiwano zwierzęta transgeniczne. Wśród potomstwa uzyskanego w tych warunkach było takie, które na podanie jonów cynku w wodzie do picia reagowało zwiększeniem stęŜenia hormonu wzrostu w wątrobie. W takim przypadku te zwierzęta transgeniczne reagowały na duŜe stęŜenie hormonu wzrostu podwojeniem wzrostu w porównaniu do swego normalnego rodzeństwa w miocie. Przykład D pokazuje, Ŝe element reakcji na glikokortykosteroidy (GRE) będzie działai przez promotor homologiczny (gen PEPCK) lub heterologiczny i Ŝe promotor genu PEPCK zawiera takŜe element, który działa zarówno jako enhancer na poziomie podstawowym, jak i jako element odpowiadający na cykliczny AMP (CRE).

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 523

Swoista tkanko w o ekspresja moŜe być wynikiem działania sekwencji wzmacniających lub wyciszających Poznano obecnie wiele genów, które wytworzyły elementy wzmacniające umiejscowione w róŜnych miejscach w stosunku do regionów kodujących. Oprócz tego, Ŝe elementy wzmacniające wzmagają transkrypcję genów, niektóre z nich mają zdolność wzmacniania transkrypcji swoistej tkankowe Na przykład element wzmacniający, związany -Ł genami immunoglobuliny i umiejscowiony miedzy regionem J i C, wzmaga ekspresje tych genów w sposób wybiórczy w komórkach limfbidalnych. Elementy wzmacniające związane z genami enzymów trzustkowych sti zdolne do wzmocnienia transkrypcji nawet w stosunku do niespokrewnionych, ale fizycznie sprzęŜonych, genów w sposób swoisty w komórkach trzustkowych myszy, do których specjalnie spreparowane konstrukty genu były wprowadzone metodą mikrochirurgii na poziomie pojedynczej komórki embrionalnej. UŜycie ta-

szenie ekspresji genu reporterowego, jeśli DNA będzie zawierał element reagujący na hormon lub jony metalu (ryc. 41-12). Umiejscowienie elementu moŜe być ustalone przez uŜywanie do konstrukcji coraz to krótszych fragmentów DNA, delecje lub mutacje punktowe (ryc. 41-13).

kiego zwierzęcia transgenicznego okazało sie

I TRANSFEKCJA PRZY UśYCIU DNA STRĄCONEGO CaHPO,

bardzo uŜyteczne w badaniach nad swoistą tkankowo ekspresją genów. Na przykład, gdy DNA zawierający element wzmacniający swoisty dla komórek P trzustkowych (naleŜący do genu insulinowego) sprzęŜono w wektorze z duŜym antygenem T wirusa polioma, konstrukcja taka powodowała u myszy transgenicznych powstanie nowotworów wywodzących się z komórek p\ Nowotwory nie rozwijały się w Ŝadnej innej tkance. Swoista tkankowo ekspresja genu moŜe być Ŝalem indukowana za pośrednictwem elementów wzmacniających lub elementów do nich podobnych. Geny chimeryczne są uŜywane do badania elementów wzmacniających i innych elementów regulatorowych Przez złączenie regionów DNA podejrzanych o sekwencje regularowe z róŜnymi genami reporterowymi (geny fuzyjne lub geny chimeryczne)

(p. ryc. 41-11,41-12) moŜna oznaczyć te regiony w sąsiedztwie genów strukturalnych, które mają wpływ na ich ekspresję. Fragmenty DNA, które są podejrzane o funkcje elementów regulatorowych, są wiązane do odpowiedniego genu reporterowego i wprowadzone do komórki gospodarza (ryc. 41-11). Podstawowa ekspresja genu reporterowego będzie się zwiększała, jeśli fragment DNA zawiera sekwencję wzmacniającą. Dodanie do poŜywki kultur hormonu lub metalu cięŜkiego będzie powodowało zwięk-

Taka strategia z uŜyciem transfekowanych komórek w hodowli lub zwierząt transgenicznych

umoŜliwiła identyfikację dziesiątków sekwencji Promotor testowany

Gen reportera wy

J3'

5'L

CAT GEN FUZYJNY: PHOMOTOR PEPCK REGULUJĄCY GEN CAT

PEPCK

Podzielenie i ponowne wysiania Kontrola Hormony ZBlOR PO 24 h OZNACZENIE .AKTYWNOŚCI CAT Identyfikacja elementów kontrolnych

Ryc. 41-12. UŜycie genów fuzyjnych do określenia regulatorowych elementów DNA. Fragment DNA, uwaŜany za nośnik jednego lub więcej elementów regulatorowych, jest włączony w wektor plazmido wy, który zawiera odpowiedni gen reporterowy kodujący bakteryjny enzym — aminotransferazę chloramienikotu {CAT). Komórki ssaków nie za wierają CAT, zatem wykrycie tej aktywności w eks traktach komórkowych oznacza, Ŝe komórki zostały skutecznie zakaŜone plazmidem. Zwiększenie ak tywności CAT ponad poziom podstawowy, np. po dodaniu hormonu glikokortykosteroidowegoozna cza, Ŝe region DNA, uŜyty jako insert zawiera aktywny element reakcji na hormon glikokortykosteroidowy {GRE). Mogą być przygotowane inserty zawierające coraz to krótsze fragmenty DNA, regiony z wewnętrznymi delecjami lub regiony z mutacjami punktowymi. Takie inserty mogą pre cyzyjnie określać elementy regulatorowe odpowia dające na sygnały. ________________________

524 / ROZDZIAŁ 41 KONSTRUKTY GENÓW FUZYJNYCH Hormon:

INDUKCJA Tabela 41-4. Przykłady białek regulatorowych CAT transkrypcji, które zawierają róŜne motywy strukA B C turaine wiąŜące DNA o * +■

o

o

o

♦ Motyw wiąŜący Hel rks- skręt- heliks

i

i

i

ii

-1000

i

r

Ssaki Palec cynkowy (Zinc finger)

-500 Pozycja nuklaotydu -I—l --- 1—£±-< --- 1 -- r-

O—-i HRE A HRE C

E. cali

Fag + o

S1- CAT}

Organizm

E. coli DroŜdŜe Drosophita Xenopus Ssaki

Białko regulatorowe Represor lac CAP Represory ero, X, tryptofanowyi434 Białka homeo box ? białka po u Białko genu 32 Gal 4 Serertdrpity, Hunchback TFIIIA Rodzina receptorów steroidowych, Sp1

Ryc. 41-13. HRE B Podejście gen fuzyjny-iransfekcja W celu zlokalizowania (A, B i C) elementów reakcji na Zamek leucynowy DroŜdŜe GCN4 hormon. Gen fuzyjny, zbudowany tak, jak to (Leucine zipper) Ssaki C/EBP, Fos, pokazano na ryc. 41-12, wprowadzono na drodze Jun/Ap1, c-myc, transfekcji do komórek biorców. Analizując mon-myc, l-myc ment utraty reakcji na odpowiedni hormon (przez oznaczenie aktywności CAT) w miarę delecji końca 5' moŜna zlokalizować elementy reakcji na swoisty hormon. Wiązanie musi wykazywać duŜe powino

o cechach wzmacniających, wyciszających, elementów swoistych tkankowo, elementów reagujących na hormony, jony metali, związki chemiczne itd. Aktywność genów w kaŜdym momencie przejawia się jako oddziaływanie tych licznych elementów DNA funkcjonujących w układzie cis z odpowiadającymi im czynnikami typu trans. Wyzwaniem dla nauki jest problem poznania, jak one działają. KILKA MOTYWÓW STRUKTURY POŚREDNICZY W WIĄZANIU BIAŁEK REGULATOROWYCH DO DNA Swoistość kontroli transkrypcji wymaga, aby białka regulatorowe wiązały się z duŜym powinowactwem do odpowiednich regionów DNA. Wiadomo, Ŝe 2a wiele z tych swoistych o& działywań białko-DNA są odpowiedzialne 3 unikatowe motywy w strukurze białka: heliks-skręt-heJiks, palec cynkowy i zamek kucynowy. Przykłady białek zawierających te motywy są przedstawione w tab. 41-4. Porównanie aktywności wiąŜącej białek, które zawierają te motywy, prowadzi do licznych waŜnych uogólnień. Oto one:

wactwo do swoistego miejsca w DNA i małe powinowactwo do innych regionów DNA. Małe regiony białka wchodzą w bezpośre dni kontakt z DNA; pozostała cześć białka moŜe zapewniać odpowiednią informację od nośnie do rozpoznania regionu DNA, albo teŜ moŜe być wciągnięta w dimeryzację monome rów białka wiąŜącego. Oddziaływania białko-DNA są utrzymy wane przez wiązania wodorowe i siły Van der Waalsa. Motywy, które znajdują się w tych białkach są unikatowe; obecność ich w białku o nieznanej funkcji moŜe nasuwać przypuszczenie, Ŝe białko to wiąŜe sie z DNA. Białka z motywami heliks-skręt-heliks lub zamek leucynowy tworzą symetryczne dimery, a odpowiadające im miejsca wiąŜące w DNA są symetrycznymi palindromami. W przypadku białek mających motyw palec cynkowy miejsce wiąŜące powtarza się 2—9 razy. Cechy te po zwalają na kooperatywne współdziałanie mię dzy miejscami wiązania i zwiększają stopień i powinowactwo wiązania. Motyw heliks-skręt-heliks (hefix-turn-helix) Motyw heliks-skręt-heliks jest pierwszym motywem, który opisano i który był najlepiej

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 525

•* Oś symetrii podwójnej

Ryć. 41-14. Schematyczna ilustracja trójwymiarowej struktury białka ero i jego wiązania do DNA przez motyw heliks-skręt-heliks. Monomer ero składa się z 3 przeciwrównolegtych płaszczyzn [JJ^ — ft3) J3he1iksówa (a, a3). Motyw heiika skręt- heliks powstaje wskutek tego, Ŝe heliksy 013 i a2 są utrzymane pod kąterii 90 urie/-skręt 4 aminokwasów, Heliks a3 białka ero stanowi powierzchnię rozpoznającą DNA (przyciemnione). 2 monomery asocjują poprzez przeć i wrów no ległe płaszczyzny fo z wytworzeniem dimeru, który ma 2-krotną symetrię (na prawo). Dimer ero wiąŜe się do DNA przez swoje 1x3 heliksy, z których kaŜdy kontaktuje się z ok. 5 pz na tej samej powierzchni rowka większego DNA. Odległość między 2 porównywalnymi punktami na 2 heliksach na DNA wynosi 34 A, co odpowiada odległości 1 kompletnego zwoju podwójnej spirali DNA. (Dzięki uprzejmości Dr Brian Mathews).

zbadany. Analiza trójwymiarowej struktury -wyjawiła, Ŝe kaŜdy z monomerów srzeciwrównoległych płaszczyzn 41-14). pjmer powstaje przez związanie przeciw równo ległych płaszczy? 11 fSj. Skręty atjTwbrzą powierzchnię rozpozmijącą DNA, a reszta cząsteczki wydaje się być włączona w stabilizację tych struktur. Średnia średnica skrętu 7 wynosi 120 nm, co odpowiada w przybliŜeniu szerokości większego rowka DNA w formie B. Domena kaŜdego monomeru ero, rozpoznająca DNA, oddziaływuje z 5 pz, a miejsca wiąŜące dimer obejmują 340 nm, co pozwala na dopasowanie kolejnych półskrętów w rowku większym na tej samej powierzchni (ryc. 41-14). Analiza za pomocą promieni X represora X, czyli CRP (białko receptora cyklicznego AMP u Escherichia coli), represora tryptofanu i represora faga 434 potwierdza dimeryczną strukturę heliks-skręt-heliks.

Motyw „palec cynkowy" (zinc finger) Drugim poznanym motywem wiąŜącym DNA był motyw „palec cynkowy". Było wiadomym, Ŝe białko TFIIIA, które jest pozytywnym regulatorem transkrypcji genu 5S RNA, wymaga do swej aktywności jonów cynkowych. Analiza strukturalna i biofizyczna wykazały, Ŝe kaŜda cząsteczka TFIIIA ma 9 jonów cynkowych w powtarzającym się skoordynowanym kompleksie, utworzonym przez blisko rozmieszczone reszty cysteina-cysteina, po których następuje sekwencja 12-13 aminokwasów, a następnie para histydyna-histydyaa (ryc. 41-15). W niektórych przypadkach, mianowicie w przypadku rodziny receptorów steroidowych i tarczycowych, dublet his-his jest zastąpiony przez drugą parę cys-cys. Białko zawierające palec cynkowy wydaje się leŜeć na jednej płaszczyźnie heliksu DNA, a jego następujące po sobie palce

526 / ROZDZIAŁ 41

się, Ŝe struktura^, ta .umoŜliwia połączenie, na wzór zamka błyskawicznego, i utworzenie mocnego kompleksu dimerowego przez 2 identyczne monomery, lub teŜ wytworzenie heterodimeHTfnp. białka Fos i Jun tworzące beterodimer API {ryc. 41-16). Taka interakcja białko-białko moŜe słuŜyć do wzmocnienia wiązania oddzielnych domen białka, wiąŜących DNA z sekwencjami docelowymi w DNA (ryc. 41-16). , Palce cynkowe" Cys- Cys

. Palce cynkowa" Cys-Hls

Ryc. 41 -15. „Palce cynkowe" (zinc finger) stano wią serie powtarzalnych domen (2-9), z których kaŜda osadza się w postaci tetraedralnej konfor macji na atomie cynku. W przypadku TFII1A koor dynację zapewnia para reszt cysteiny (C) oddzielo nej przez 12-13 aminokwasów od pary reszt histydyny (H). W,,palcach cynkowych" innych białek drugą parę takŜe stanowią reszty C. „Palce cyn kowe" wiąŜą się w rowku większym, przy.czym przyległe palce wchodzą w kontakt z 5 pz wzdłuŜ tej samej płaszczyzny hetiksu DNA _______ , ^ „ ^ _

są ułoŜone naprzemiennie w obrębie 1 skrętu w duŜym rowku. Podobnie jak w przypadku domeny rozpoznającej, w białku typu heliks-skręt-heliks kaŜdy palec cynkowy białka TFIIIA kontaktuje ok. 5 pz DNA. Znaczenie tego motywu dla funkcji hormonów steroidowych podkreśla „doświadczenie przyrody". Mutacja pojedynczego aminokwasu w 1 z 2 palców cynkowych białka receptora kalcytriolu powoduje oporność na działanie tego hormonu i pojawienie się klinicznego zespołu krzywicy (rozdz. 48). Motyw zamek leucynowy (leucine zipper) Szczegółowa analiza sekwencji o 30 aminokwasach w końcowym karboksyJowym regionie białka C/EBP. wiąŜącego nukleotydową sekwencję wzmacniającą w DNA (enhancer), pozwoliła na ujawnienie nowej struktury. Jak to przedstawiono na ryc. 41-16 region tego białka tworzy a hdiks, w którym reszty leucynyjajmują cyklicznie powtarzające się miejsca co aminokwasów. Organizacja taka obejmuje helikalnych skrętów i 4 powtarzające się leucyny. Podobne struktury znaleziono w wielu innych białkach związanych z regulacją trans krypcji w komórkach ssaków i droŜdŜy. Sądzi

Domeny tych białek regulatorowych, wiąŜące DNA i mające funkcje transaktywacji, są oddzielne i nie oddziałują wzajemnie ze sobą Związanie białka do DNA wywołuje zmianę ogólnej konformacji DNA, co pozwala związanemu białku aktywować transkrypcję, lub teŜ te 2 funkcje mogą być obsłuŜone przez oddzielne i niezaleŜne domeny. Doświadczenia z wymianą domen sugerują tę ostatnią moŜliwość. Genowy produkt GALI bierze udział w metabolizmie galaktozy u droŜdŜy. Gen ten jest pozytywnie regulowany przez białka GAL4, które wiąŜą się do sekwencji aktywatorowej (UAS), połoŜonej w górę od genu, przez domenę przy końcu aminowym GAL4. Koniec białka GAM, o długości 73 aminokwasów, który ma zdolność wiązania DNA, usunięto i zastąpiono wiąŜącą DNA domeną białka lex A z E. coli. W wyniku tego powstała częsteczka, która nie wiązała się do GALI sekwencji aktywatorowej UAS i oczywiście, która nie aktywowała genu GALI (ryc. 41-17). Jeśli jednak do regionu promotora genu GAL wprowadzono operator lex A, to powstałe w wyniku tego zabiegu białko hybrydowe wiązało się do tego promotora (w obrębie operatora lex A) i aktywowało transkrypcję GALI. Doświadczenie to, które powtarzano wielokrotnie (włączając takŜe białka fuzyjne z glukokortykoidowym receptorem lex A, które to białka aktywowały w układzie trans geny reagujące na glukokortykoidy), dostarcza solidnego dowodu, Ŝe region końca karboksylowego białka GAL4 powoduje aktywację transkrypcji. Domeny wiąŜące DNA i mające funkcje transaktywacji są więc niezaleŜne i nie oddziałujące wzajemnie. Regiony przy końcu karboksylowym mają duŜą koncentrację ujemnie naładowanych aminokwasów. Domeny te, często określane jako „kwaśne plamy" albo „ujemne węzły", prawdopodobnie oddziałują z dodatnio naładowanymi regionami niektórych komponentów kompleksu transkrypcyjnego.

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 527

NH,

NH„

Ryc. 41-16. Motyw „zamka ieucynowego" (leucinezipper). Rycina po stronie lewej {A) pokazuje analizę helikainego kota karboksylowej części białka C/EBR wiąŜącego DNA. Sekwencja aminokwasów jest pokazana jako wiązanie koniec do końca biegnąca w dół (pod płaszczyznę papieru) wzdłuŜ osi a-heliksu. Koło heiikalne składa się z 7 szprych, które odpowiadają 7 aminokwasom obejmującym kaŜdy z 2 skrętów a-heliksu. ZauwaŜ, Ŝe reszty leucyny (L) pojawiają się w co 7. pozycji. Inne białka mające „zamki leucynowe" mają podobny układ helikainego koła. Schematyczny model domeny wiąŜącej DNA białka C/EBP jest pokazany po stronie prawej (B). 2 identyczne łańcuchy polipeptydowe C/EBP są trzymane w formie dimeru przez domenę „zamka Ieucynowego" kaŜdego z polipeptydów (oznaczonych na rycinie jako "prostokąty z doczepionymi owalami). Taka struktura jest najwidoczniej wymagana aby utrzymać domeny wiąŜące DNA kaŜdego polipeptydu (zaczernione prostokąty) w odpowiedniej konformacji niezbędnej do związania z DNA. (Rycina dzięki uprzejmości Stevena McKinght).

Alternatywne przekształcanie RNA stanowi inny mechanizm kontrolny

Komórki eukariotyczne, oprócz wpływania na wydajność promotora, wykorzystują do kontroli ekspresji genów alternatywne przekształcanie RNA. Ma to miejsce w odniesieniu do alternatywnych promotorów, miejsc granicznych intron-ekson lub miejsc poliadenylacji. Czasami powoduje to heterogennośc transkryptów w komórce, ale znacznie częściej ten sam pierwotny transkrypt jest przekształcany odmiennie w róŜnych tkankach. Kilka przykładów kaŜdego z tych typów regulacji przedstawiono poniŜej. UŜycie naprzemiennych miejsc startu transkrypcji daje w rezultacie róŜne eksony przy końcu 5' w mRNA, odpowiadającym amylazie i lekkiemu łańcuchowi miozyn u myszy, glukokinazy u szczurów oraz alkoholowej dehydrogenazy i aktyny u Drosophila. Wybór alternatywnego miejsca poliadenylacji w pierwotnym

transkrypcje cięŜkiego łańcucha immunoglobuliny u daje w wyniku cząsteczki mRNA albo o długości 2700 zasad (u^), albo o długości 2400 zasad (u.^. W wyniku tego powstają białka o róŜnych regionach przy końcu karboksylowym, przy czym białko jara pozostaje umocowane do błony komórkowej limfocytu B, a immunoglobulina ujest wydzielana. Alternatywne składanie i przekształcanie powoduje wytworze-

nie 7 unikatowych mRNA a-tropomiozyny w 7 róŜnych tkankach. Nie jest jasne, w jaki sposób zapadają decyzje odnośnie do przekształceń i składania RNA, ani teŜ czy te etapy mogą być regulowane. Regulacja stabilności informacyjnego RNA stanowi inny mechanizm kontrolny

Stabilność cząsteczek informacyjnego RNA w cytoplazmie moŜe w sposób oczywisty wpływać na poziom ekspresji genu w kierunku

528 / ROZDZIAŁ 41 GAL4 Aktywny

Ryc. 41 -17. Doświadczenie z wymianą domen wykazujące, Ŝe funkcje wiązania białka do DNA i aktywacji transkrypcji egzystują jako funkcje oddzielne. Promotor genu GAL1 zawiera połoŜoną na lewo sekwencję aktywującą {UAS), która wiąŜe regulatorowe białko GAL4 {przykład A). Oddziaływanie GAL4 z tą sekwencją powoduje pobudzenie transkrypcji genu GALI. Białko fuzyjne, w którym zabrana została domena GAL4 u końca aminowego i podstawiona regionem wiąŜącym DNA białka lexA E. coli, nie stymuluje transkrypcji genu GAL1, poniewaŜ domena lexA nie moŜe związać się z UAS {przykład B), Białko fuzyjne lexA-GAL4 wzmaga transkrypcję genu GAL1 wówczas, gdy do regionu promotora GAL1 wstawi się sekwencję operatora lexA (przykład C). _______________________________________* _____

pozytywnym lub negatywnym. Zakładając stały stopień transkrypcji, stabilizacja mRNA będzie prowadziła do zwiększenia akumulacji mRNA i odwrotnie. W poprzednim rozdziale omawiano mechanizmy biorące udział w regulacji stabilności mRNA. KaŜdy z tych mechanizmów jest potencjalnym miejscem kontroli, na które mogą oddziaływać hormony i inne efektory. Niektóre hormony wpływają na syntezę i degradację swoistych cząsteczek mRNA. Na przykład estradiol przedłuŜa okres półtrwania mRNA witelogeniny od kilku godzin do ponad 200 godzin. Zjawisko to, w powiązaniu z faktem, Ŝe estrogeny zwiększają stopień transkrypcji tego genu rzędu 4—6 razy, powoduje dramatyczne zwiększenie ilości mRNA witeiogeniny.

PIŚMIENNICTWO Breitbart RE, Andreadis A, Wadal-Ginard B: Alternative splicing: A ubiquitous mechanism for the

generation of multiple protein isoforms from single genes. Annu Rev Biochent 1987;56:467. Jacob F, Monod J: Genetic regulatory mechanisms in protein synthesis. J Mol Biol 1961;3»3TS. Klug A, Rhodes D: „Zinc fingers": A novel protein motif for nucleic acid recognition. Trends Biochem Sci 1987;12. Landschulz WH, Johnson PF, McKnight SL: The leucine zipper: A hypothetical structure common to a new elass of DNA binding proteins. Science 1989;240:1759. McKnight S, Tjian R: Transcriptional selectivity of viral genes in mammalian oells. Celi 1986;46:795. Ptasne M: Gene regulation by proteins acting nearby and ai a distance. Naturę (London) 1986;322:697. Ptasne M: A genetic switch. Celi Press and Blackwell Scientific Publications, 1986. Shimizu A, Honjo T: Immunoglobulin c)ass switching. Cdi 1984;3fe801. Schlief R; DNA binding by proteins. Science 1988;241:1182. Struh) K: ftomoters, activator proteins and the mechanism of transcriptional initiation in yeast. Cel! 1987;49:295. Wu R, Bah! CP, Narang SA: Lactose operator-repressor interaction. Curr Top Celi Reg 1978;13:137.

Technologia rekombinacji DNA Dary/ K. Granner, MD

WPROWADZENIE Technologia rekombinacji DNA, nazywana często inŜynierią genetyczną, dokonała rewolucji w biologii. Wykazuje ona coraz to większy wpływ na medycynę kliniczną. Na podstawie analizy rodowodów i badania białek włączonych w proces chorobowy zgromadzono duŜą wiedzę o ludzkich chorobach genetycznych, ale w wielu przypadkach, w których swoista wada genetyczna jest nieznana, podejście takie nie moŜe być zastosowane. Nowa technologia pokonuje te ograniczenia, czerpiąc bezpośrednio informację z cząsteczki DNA. Rozdział ten ma za zadanie naświetlenie tego dość złoŜonego zagadnienia. Przedstawia on podstawowe koncepcje technologii rekombinacji DNA, zastosowanie jej w medycynie klinicznej oraz słownik. Aby ten rozdział był moŜliwie wyczerpujący znajdą się w nim pewne powtórzenia dyskutowane juŜ w innych rozdziałach.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Poznanie technologii rekombinacji DNA jest waŜne z wielu względów. 3. Eksplozja informacji, dotycząca tej dziedziny jest zdumiewająca. Aby zrozumieć i móc śledzić tę dziedzinę naleŜy docenić jej podstawowe koncepcje. 2. Obecnie mamy racjonalne podejście do zrozumienia molekularnej podstawy licznych chorób (np. rodzinna hipercholesteroiemia, niedokrwistość sierpowata, t&i&semk, fibrosis cystica, dystrofia mięśniowa). 3. Stosując technikę rekombinacji DNA moŜna wyprodukować białka człowieka w duŜych ilościach, niezbędnych dla lecznictwa (np. insulina, hormon wzrostu, aktywator plazminogenu). 4. W ten sposób moŜna uzyskać białka do szczepionek (np. zapalenia J4 - Biochemia

wątroby typu B) i do testów diagnostycznych (np. test do wykrywania AIDS). 5. Technologia rekombinacji DNA jest stosowana w diagnostyce aktualnie występujących chorób i do przewidywania ryzyka rozwoju określonej choroby. 6. Specjalne techniki doprowadziły do znaczącego postępu w medycynie sądowej. 7. MoŜe być opracowane leczenie genowe'niedokrwistości sierpowa tej, talasemii, niedoboru deaminazy adenozynowej i innych chorób.

WYJAŚNIENIE PODSTAWOWYCH CECH DNA DOPROWADZIŁO DO TECHNOLOGII REKOMBINACJI DNA DNA jest złoŜonym biopolimerem zorganizowanym w podwójny hsliks Podstawowym elementem organizacji jest sekwencja zasad purynowych (adeniny [A] lub guaniny [G]) oraz pirymidynowych (cytozyny [C] lub tyminy (Tj). Zasady te są dołączone w pozycji C-1' do cukru deoksyrybozy, a zasady połączone są razem poprzez wiązanie fosfodiestrowe, łączące cząsteczki cukru w pozycjach 3' i 5' (p. ryc. 37-1), Naprzemienne grupy deoksyrybozy i fosforanowe tworzą szkielet podwójnego heliksu (p. ryc. 37-2). Te wiązania 3'-5' określają takŜe orientację danego pasma w cząsteczce DNA, a poniewaŜ 2 pasma biegną w przeciwnych kierunkach określa się je jako przeciwrównoległe.

Parowanie zasad jest jednym z najbardziej podstawowych pojęć w odniesieniu do struktury i funkcji DNA Adenina i tymina, podobnie jak guanina i cytozyna, dzięki wiązaniom wodorowym zawsze występują jako pary (p. ryc. 37-3). Mówimy,

530 / ROZDZIAŁ 42

Ŝe pary te są komplementarne i Ŝe zawartość guaniny we fragmencie dwupasmowego DNA będzie zawsze równa zawartości cytozyny w tym fragmencie; podobnie zawartość tyminy 1 adeniny jest równieŜ jednakowa. Sparowanie zasad i oddziaływania hydrofobowe miedzy zasadami utrzymują razem 2 pasma DNA. Te wzajemne oddziaływania mogą być zmniejszo ne przez ogrzanie DNA prowadzące do denaturacji. Reguły parowania zasad przewidują, Ŝe 2 komplementarne pasma DNA mogą po renaturacji ponownie łączyć się dokładnie nukleotyd w nukleotyd; zjawisko to zachodzi wów czas, gdy temperatura roztworu jest powoli obniŜana do normalnej temperatury. Faktycz nie stopień sparowania zasad (albo sparowania błędnego) moŜe być oznaczany na podstawie temperatury potrzebnej do procesu denaturacji-renaturacji. Segmenty DNA o duŜym stop niu prawidłowego sparowania wymagają wło Ŝenia większej energii (ciepła), aby uzyskać denaturację, albo teŜ mówiąc inaczej ściśle Sparowany segment wytrzyma wyŜszą tempera turę zanim pasma ulegną rozdzielaniu. Reakcja ta jest uŜyta do określenia znacznych róŜnic między 2 sekwencjami DNA i stanowi podstawę hybrydyzacji, która jest zasadniczym elementem procesów opisanych niŜej. KaŜdy ludzki genom haploidalny zawiera ok. 3 x KF par zasad (pz). Jeśli długość przeciętnego genu wynosi 3 x 103 pz (3 kilozasady [kz]), cały genom składałby się z 106 genów, zakładając, Ŝe nie ma nakładania się genów i Ŝe transkrypcja przebiega tylko w jednym kierunku. Sądzi się, Ŝe u człowieka jest tylko ok. 10s genów, a tylko 10% DNA koduje białka. Funkcja pozostałych 90% ludzkiego genomu nie jest jeszcze dokład nie określona. Dwupasmowy helikalny DNA jest upakowany w bardziej zbite struktury za pomocą białek, głównie białek zasadowych zwanych histonami. Ta kondensacja moŜe odgrywać rolę regulatora i z pewnością słuŜy praktycznym celom. Gdyby DNA występujący w jądrze komórki byl linijnie rozciągnięty, zajmowałby ok. 1 m długości. Białka chromosomalne powodują skondensowanie tak długich cząsteczek DNA w taki sposób, Ŝe DNA zostaje upakowany w jądrze w objętości kilku jim3. Geny są zorganizowanymi elementami DNA Geny prokariotyczne zwykle składają się z małego regionu regulatorowego (100—500 pz)

i d uŜego segmentu kodującego białko (500—10 000 pz). Często kilka genów jest kontrolowanych przez pojedynczą jednostkę regulatorową. Większość genów ssaków ma bardziej złoŜoną strukturę, w której regiony kodujące są poprzerywane regionami niekodującymi; te ostatnie są usuwane w trakcie przekształcania pierwotnego transkryptu RNA w dojrzały informacyjny RNA (mRNA, messenger RNA). Regiony kodujące (czyli regiony, które pojawiają się w dojrzałym RNA) są nazywane eksonami, a regiony niekoduja.ee, które są wtrącane między eksony nazywają sie intronami (ryc. 42-1). lntrony są zawsze usuwane z prekursorowych cząsteczek RNA przed ich przemieszczeniem do cytoplazmy. Proces, w trakcie którego introny są usuwane z prekursorowego RNA, a eksony są łączone razem,) nazywamy składaniem jtN_A (RNA splicing). Nieprawidłowe przekształcanie pierwotnego transkryptu w dojrzały mRNA moŜe prowadzić u ludzi do stanów chorobowych (p. niŜej); podkreśla to znaczenie potranskrypcyjnego przekształcania RNA. Regiony regulatorowe swoistych genów eukariotycznych są zwykle umiejscowione w DNA,-który ogranicza miejsce inicjacji transkrypcji od końca^ (5' flankujące sekwencje DNA). Czasami takie sekwencje są znajdywane w obrębie samego _ge"fiu albo w regionie, który flankuje komec 3' genu. W komórkach ssaków kaŜdy gen ma swój własny region regulatorowy. Liczne geny eukariotyczne (i niektóre wirusy, które replikują wTcomórkach ssaków) mają specjaJne^egiony, zwane sekwencjami wzmacniającymi (enhancer), które powodują nasilenie stopnia transkrypcji. Niektóre geny mają takŜe sekwencje DNA zwane sekwencjami wyciszającymi (silencers), które zmniejszają transkrypcję. Geny ssaków są złoŜonymi strukturami o wielu komponentach. Geny są przepisywane na RNA Przepływ informacji zachodzi na ogół od DNA do mRNA i dalej do białka, tak jak to przedstawiono na ryc. 42-1 i co opisano dokładniej w rozdz. 41. Jest to proces ściśle kontrolowany, obejmujący wiele złoŜonych etapów, z których kaŜdy bez wątpienia jest regulowany przez 1 lub więcej enzymów albo innych czynników; nieprawidłowa funkcja jakiegokolwiek z tych etapów moŜe wywołać stan chorobowy.

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI

. Ftegion regulatorowy

Miejsce dodania poll(A)

Miejsce startu transkrypcji

Podstawowy region promotora

ł

Ekaon

r

5 Ftegion nleko dujący

Ekson

Intron

3' Region niekodujący

Transkrypcja JĄDRO Pierwotny iransKrypt RNA

PPP-J Modyfikacja

końców 5'l 3' \A—A

Tran skrypt zmodyfikowany

Ogon poli(A) Usunięcie intronów i składania aksonów

Czapeczka

-AAA—A

Przekształcony Jądrowy mFtNA

CYTOPLAZM A mRNA

i

_ Transport przez błono________ jądrową

-AAA—A Translacja

Białko

COOH

Ryc._42r1. Organizacja jednostki transkrypcyjnej w organizmach eukariotycznych i szlak ekspresji eukariotycznego genu. Geny eukariotyczne mają regiony strukturalne i regulatorowe. Region strukturalny składa sie z DNA kodującego i niekodujacych sekwencji DNA u końców 5' i 3'. Region kodujący dzieli się na 2 części: 1) eksony, które ewentualnie staną się dojrzałym mRNA i 2) introny, które są usuwane z pierwotnego transkryptu w trakcie iego przekształcenia. Region strukturalny jest ograniczony przy końcu 5' przez miejsce inicjacji transkrypcji, a przy końcu 3' przez miejsce dodania poli (A) lub miejsce terminacji. Region promotora, który zawiera swoiste sekwencje DNA oddziałujące z róŜnymi czynnikami białkowymi regulującymi transkrypcję, jest opisany szczegółowo w rozdz. 39 i 41. Transkrypt pierwotny ma specjalną strukturę, „czapeczkę" przy swym końcu 5' i sekwencje (A)n przy końcu 3'. Transkrypt ten jest przekształcany w celu usunięcia intronów, a dojrzały mRNA jest następnie transportowany do cytoplazmy, gdzie ulega przettumaczeniu na białko. ________________________________________. ^ _ _ _ _____

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA OBEJMUJE IZOLOWANIE ł MANIPULACJĘ DNA W CELU UZYSKANIA CZĄSTECZEK CHIMERYCZNYCH Izolowanie i manipulacja PNA, włączając w to spajanie typu koniec do końca sekwencji Z; róŜnych odległych źródeł, w celu uzyskania cząsteczek chimerycznych -{np. cząsteczek zawierających sekwencje zarówno Judzkich, jak

i bakteryjnych DNA w sposób niezaleŜny od organizacji sekwencji), jest podstawa techniki inŜynierii genetycznej. Obejmuje ona liczne, unikatowe metody i odczynniki. Enzymy restrykcyjne przecinają łańcuchy DNA w swoistych miejscach Niektóre endonukleazy, czyli enzymy, które przecinają DNA w swoistych sekwencjach w obrębie cząsteczki (w odróŜnieniu od egzonukleaz,

532 / ROZDZIAŁ 42

które trawią cząsteczki DNA od- końców), są pod stawowym i narzędziami w inŜynierii genetycznej. Enzymy te pierwotnie nazwano-enzymami restrykcyjnymi, poniewaŜicŁułbecaość-w-Łianej bakterii ograniczała wzrost pewnych wirusów bakteryjnychj zwanych bakteriofagami. Ęnzy-_ myrestrykcyjne przecinają DNA na krótkie Tcawałki wmiejscsich_sw,Qistych sekwencji, w odróŜnieniu do większości metod enzymatycznych, chemicznych lub fizycznych. Jt.tóre przecinają DNA w miejscach dowolnych. Te.enzymy-obronng.(dotychczas wykryto ich ponad 200) chroni^JDNA^bakteni gospodarza przed-DNA obcych organizmów (głównie zakaźnych fagów). Enzymy te występują jednak w tych komórkach, które mają towarzyszący enzym zdolny do mctylowania DNA gospodarza, który_tp proces /mienia DNA gospodarza w substrat nieodpowiedni do trawienia enzymem restrykcyjnym. Swoiste dla określonych miejsc DNA metylazy i enzymy restrykcyjne występują zawsze w bakteriach jako pary. Nazwy enzymów restrykcyjnych pochodzą od nazwy bakterii, z której /ustały wyizolowane. Na przykład Eco Rl jest enzymem restrykcyjnym z Escherichia coli, a Bam HI pochodzi z Bacilius amyłoliąuefaciens (tab. 42-1). Pierwsze 3 litery w nazwie enzymu restrykcyjnego składają się z pierwszej litery nazwy rodzaju (E) i pierwszych 2 liter nazwy gatunku (co). Symbol ten moŜe być uzupełniony określeniem szczepu (R) i cyfrą rzymską (I) w celu wskazania kolejności, w jakiej enzymy zostały odkryte (np. Eco RI, Eco RII). ^KaŜdy enzym restrykcyjny rozpoznaje i przecina sekwencję o długości 4 7 pz w.dwu£asmow_y.ni DNA. Takie przecięcia DNA dają vv wyniku tępe końce (Kpa 1) lub końce nakładające się, czyli końce lepkie (Bam HI), zaleŜnie od mechanizmu cięcia; jakim posługuje się enzym (ryc. 42-2). Końce lepkie sa szczeflólnif* UTrytPrftnii **' 1-T-irnrtriilr "ji h)'hrvriff'"vch. czyli chimerycznych, cząsteczek DNA (p. niŜej). Jeśli w obrębie danej cząsteczkiDNA nukleotydy są rozmieszczone przypadkowo, moŜna wyliczyć jak często dany enzym będzie przecinał całą cząsteczkę DNA, DJa_Jcajd£gajiii£Jsca_w_czas-teczce-DNAsą 4 moŜliwości (A, C, G lub T); ztitpm enTiym restrykcyjny. Vt"<-" T>7poznaje sekwencje o d h i Z ł ^ i ^ i )N A sreilr^fl r.n

p

inny enzym, który rozpoznaje sekwencję o_6_pz będzie przecinał raz co 4096 pz (46), f)any fragmeaL.DNA będzie miał charakterystyczne linijnc ułoŜenie mirjtjr. Hprjjj (jp t]iS7nvcli en-

Tabala 42-1. Wybrane endonukleazy restrykcyjne i ich swoiste sekwencje* Endonukleaza

Przecinane sekwencje

Pochodzenie bakteryjne

1 Bam Hl

G G A T C C T A

Bgl II

A 1

A T

T C

T A

1

A T

C T

T A

Eco Rl

G

G

A

i Eco Rll

C Bacillus amyloliqueG G faciens H

c 1

C T Bacillus globigii

G A

T

T C Escherichia coli A G RY13 T

C C T G G G A C

G C

Escherichia coli R245

T i

Kind III

A A G C T T Haemophilus T T C G A A enzae Rd

Hha I

G C G i

T

C

C G C G

T

influ-

Haemophilus' haemolyticus

T i

Hpa i

G T

A C Haemophilus parainA C A A T T G fiuenzae

Mst II

C C T \l

T

G G Szczep Microcoieus

fA G G A N C C Pst I

C T

G C

r

G Providencia stuanii A G A C G T C 164

i

ri Tag I

T c G A A G C T

Thermus aquaticus YTI

T * A adenina; C cytozyna; G guanina; T tymina. Strzałki pokazują miejsce przecięcia; w zaleŜności od miejsca przecięcia tworzą się lepkie końce (np. Bam HI) lub tępe końce (np. Hpa I). Długość rozpoznawalnych sekwencji wynosi 4 pz {Taq I), 5 pz (Eco Rll), 6 pz (Eco Rl) lub 7 pz (Mst II). Umowny zapis sekwencji: pasmo górne w kierunku : 5' do 3', pasmo dolne 3' do 5 , czyli o odwrotnej polarności Zwróć uwagę, Ŝe większość rozpoznawalnych sekwencji jest sekwencjarni palindromowymi (tj. odczytywane są tak samo w odwrotnych kierunkach na 2 pasmach). Reszty N oznaczają, Ŝe moŜe występować tu jakikolwiek nukleotyd.

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI ONA / 533 A. Lepkie, czyli nierówna końce —G

----- GGATCC —

GATCC-

BamHI

—CCTAG

■CCTAGG —

G-

B. Tępń końce ------- GTTAAC

—

Hpal

— GTT

AACTTG-

---- CAATTG — — CAA

---- "\ Ryc. 42-2. Wynik trawienia endonukleazą restrykcyjną. Trawienie endonukleazą restrykcyjną daje fragmenty DNA z końcami lepkimi, łączącymi się ze sobą (A), lub z końcami tępymi (B). Jest to waŜna okoliczność do opracowania strategii klonowania.________________________________________

zjmówy-copozwala na konstrukcję map restrykcyjnych. Gdy DNA jest trawiony danym enzymem, wówczas końce wszystkich fragmentów DNA będą miały tę samą sekwencję. Uzyskane fragmenty mogą być wyizolowane przez elektroforezę" na Ŝelu z agarozy lub poliakrylamidu (przenoszenie fragmentów DNA jest dyskuto-

wane niŜej); jest to podstawowy etap w procesie klonowania i główne zastosowanie enzymów restrykcyjnych. Inne enzymy działające na DNA i RNA są waŜną częścią technologii rekombinacji DNA. Liczne z tych enzymów są podane w tym i następnych rozdziałach (tab. 42-2).

Tabela 42-2. Enzymy stosowane w badaniach techniką rekombinacji DNA* Enzym

Reakcja

Podstawowe zastosowanie Usuwanie grup 5'-PO4 przed znakowaniem kinazą dla uniknięcia samospojenia

Fosfataza alkaliczna

Defosforyluje końce 5' DNA i RNA

Nukleaza BAL 31

Degraduje zarówno 3', jak i 5' końce Progresywne skracanie cząsteczek DNA DNA

Ligaza DNA

Katalizuje wiązania między cząsteczkaSkładanie cząsteczek DNA mi DNA

Polimeraza DNA I

Syntetyzuje dwupasmowy DNA z jedSynteza dwupasmowego cDNA; nick nopasmowego DNA translation

DNaza I

W odpowiednich warunkach przecina Nick translation; mapowanie miejsc 1 pasmo w DNA nad wraŜliwych

Egzonukleaza III

Usuwa nukleotydy od końców 3' DNA

Sekwencjonowanie DNA; mapowanie interakcji DNA-biatko

Egzonukleaza X Usuwa nukleotydy z końców 5' DNA Sekwencjonowanie DNA Kinaza polinukleotydo- Przenosi końcowy fosforan (pozycja y) H wa z ATP do grup 5'-OH DNA lub RNA Znakowanie DNA lub RNA P

Odwrotna transkryptaSyntetyzuje DNA ną_matn/C¥JlNA___ Synieza cDNA z mRNA; mapowanie za końca 5' RNA Degraduje jednopasmowy DNA Usuwanie struktur „spinka do włosów" Nukleaza Sl w syntezie cDNA; mapowanie RNA (zarówno końca 5' jak 3') Dodaje nukleotydy do końców 3' DNA Dodawanie ogonów monopolimeroTransferaza terminalna wych 'Adaptowano za zgodą z: Emery AEH: Str. 41 w; Introduction to Recombinant DNA. Wiley, 1984.

534 / ROZDZIAŁ 42

W celu uzyskania chimerycznych cząsteczek DNA stosuje się trawienie i ponowne spajanie DNA TedmoJogia spajania DNA przez lepkie końce jest łatwa, ale często są wymagane specjalne techniki, aby pokonać problemy nieodłączne dla tego podejścia. Lepkie końce wektora mogą się łączyć ponownie same ze sobą bez włączenia do wektora fragmentów DNA, które zamierzaliśmy wprowadzić. Fragmenty DNA mogą takŜe łączyć sie przez lepkie końce, dając w ten sposób tandemowe, Ueterogenne inserty. Lepkie końce mogą być równieŜ niedostępne albo mogą występować w nieodpowiednim połoŜeniu. Aby ominąć te problemy stosuje się enzym, który. daje., te.pe~ko.nce,, do których dodaje się końcówki, stosując enzym fjgjaze. JeŜeli dodaje się do końców 3' wektora poli d(G), a poli d(C) do końców 3' obcego DNA, to 2 cząsteczki mogą się łączyć kaŜda ze sobą, omijając wyŜej wymienione problemy. Ta procedura, nazwana dodawaniem ogonów homopoiimerów, tworzy miejsce restrykcyjne dla enzymu Sma 1, umoŜliwiając w ten sposób łatwe odzyskanie fragmentu. W niektórych przypadkach do tępych końców DNA wiąŜe się łączniki syntetycznych oligonukleotydów, zawierających sekwencję dla enzymu restrykcyjnego, który nam odpowiada. Bezpośrednie związanie tępych końców uzyskuje się enzymem bakteriofagowym — ligazą T4 DNA. Ta technika, chociaŜ trudniejsza niŜ wiązanie końców lepkich, ma te wyŜszość, Ŝe moŜna łączyć jakiekolwiek pary na końcach fragmentu. Wadą tej techniki jest brak kontroli nad orientacją insertu lub nad liczbą spojonych cząsteczek, a takŜe trudności w odzyskaniu insertu. Chimeryczny DNA namnaŜa się przez klonowanie Klon jest to duŜa populacja identycznych cząsteczek, bakterii lub komórek, które pochodzą od

wspólnego przodka. Klonowanie pozwala na wyprodukowanie duŜej liczby identycznych cząsteczek DNA, które następnie mogą być scharakteryzowane albo uŜyte do innych celów. Technika ta oparta jest na fakcie, Ŝe chimeryczne, czyli hybrydowe, cząsteczki DNA mogą posłuŜyć do konstrukcji wektorów klonujących, którymi są zwykle plazmidy bakteryjne, fagi albo kosmidy; konstrukcje takie podlegają replikacji w komórce gospodarza pod "kontrolą swoich własnych systemów. W ten sposób chimeryczny DNA jest namnaŜany (amphfikowa-

ny). Ogólną procedurę przygotowania wektorów klonujących przedstawiono na ryc. 42-3. Bakteryjne plazmidy są to małe, kołowe cząsteczki dwupasmowego DNA, których naturalną funkcją jest nadawanie komórce gospodarza Oporności na antybiotyki. Plazmidy mają wiele właściwości, które są niezwykle uŜyteczne do konstrukcji wektorów klonujących. Istnieją one jako pojedyncze lub liczne kopie w obrębie bakterii i replikują niezaleŜnie od bakteryjnego DNA. Znane są kompletne sekwencje DNA licznych plazmidów; dzięki temu dostępne są precyzyjne miejsca przecięć enzymami restrykcyjnymi dla insercji obcego DNA. Plazmidy są mniejsze niŜ chromosom gospodarza (bakterii) i przeto moŜna je łatwo oddzielić od bakteryjnego DNA, a Ŝądany fragment DNA moŜna łatwo uzyskać przez przecięcie plazmidu enzymem swoistym dla miejsca restrykcyjnego, w które włączono oryginalny odcinek DNA. Fagi zawierają zwykle cząsteczki linijnego DNA, do których moŜe być włączony obcy DNA w licznych miejscach restrykcyjnych. Chimeryczny DNA otrzymuje się po przejściu faga przez jego cykl lityczny i po uzyskaniu dojrzałych zakaźnych cząsteczek fagowych. WyŜszość wektorów fagowych polega na tym, Ŝe podczas gdy plazmidy mogą przyjąć fragmenty DNA o długości 6—10 kz, fragmenty przyjmowane przez fagi mogą mieć długość 10—20 kz; ograniczenie to narzuca ilość DNA, która moŜe być upakowana w główkę faga. Jeszcze dłuŜsze fragmenty DNA mogą być klonowane w kosmidach, które mają kombinację najlepszych cech plazmidów i fagów. Kosmidy są to plazmidy, które mają sekwencję DNA, tzw. miejsca cos, niezbędne do upakowania X DNA do cząsteczki faga. Wektory te rosną w postaci plazmidów w bakteriach, ale poniewaŜ zabiera się z nich większą część niepotrzebnego DNA, więcej chimerycznego DNA moŜe być upakowane do główki cząsteczki. Wcale nierzadkie są kosmidy, które niosą inserty chimerycznego DNA o długości 35—50 kz. Porównanie tych wektorów p. tab. 42-3. Insercja DNA do funkcjonalnego regionu Tabela 42-3. Pospolite wektory do klonowania Wektor Plazmid pBR322 Charon X 4A Kosmidy

Wielkość insertu DNA 0,01-10 kz 10-20 kz 35-50 kz

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 535

Restrykcyjn a endonukteaza Eco Hl

Kałowy plazmidowy DNA

Unijny plazmidowy DNA z lapktml końoaml

I Restrykcyjna endonukleaza Eco Rl

AATT TTAA Fragmenty ludzkiego DNA przecięte endonukleazą restrykcyjny zawierające lepkie końca

Cząsteczka plazmidowego DNA z inserlem ludzkiego DNA (rakom blnantowa cząsteczka DNIA)

Ryc'42-3. UŜycie nukleaz restrykcyjnych w celu uzyskania nowych rekombinacyjnych, czyli chimerycz nych, cząsteczek DNA Plazmidowy DNA, po wprowadzeniu z powrotem do komórki bakteryjnej (w procesie zwanym transformacją), replikuje się nie tylko sam, ale replikuje równieŜ fizycznie połączony insert nowego DNA. PoniewaŜ ponowne połączenie lepkich końców —jak to pokazano — regeneruje tę samą sekwencję DNA, rozpoznawaną przez pierwotnie uŜyty enzym restrykcyjny, sklonowany insert DNA moŜe być ponownie precyzyjnie wycięty z kołowego plazmidowego rekombinata tą samą endonukleazą. Jeśli, jako źródło DNA ludzkiego, uŜyje się mieszaniny wszystkich fragmentów DNA uzyskanych przez trawienie caiego ludzkiego DNA pojedynczą nukleazą restrykcyjną moŜna uzyskać miliony róŜnych typów cząsteczek rękombinacyjnego DNA, a kaŜdy z typów będzie czysty (jednorodny) w swoim bakteryjnym klonie. (Zmodyfikowano i reprodukowano za zgodą z: Cohen S. N.: The maniputation of genes. Sci. AM (Juty) 1975; 233:34). _______ _____________________

moŜe interferować z czynnością tego regionu, naleŜy więc uwaŜać, aby nie nastąpiło przerwanie podstawowych funkcji wektora. Tę koncepcję wykorzystuje się jednak w technice selekcji. Popularny wektor plazmidowy pBR322 ma geny oporności zarówno dla tetracykliny (tet), jak równieŜ ampicyliny (amp). Pojedyncze miejsce dla enzymu restrykcyjnego Pst I w obrębie genu oporności na ampicylinę jest uŜywane zwykle jako miejsce insercji dla fragmentu obcego DNA. Oprócz uzyskania lepkich końców (tab. 42-1 i ryc. 42-2), włączony w to miejsce obcy DNA przerywa gen oporności na am-

picylinę i sprawia, Ŝe bakteria nosząca taki plazmid staje się wraŜliwa na ampicylinę (ryc. 42-4). Rodzicielski plazmid, który dostarcza oporności na 2 antybiotyki moŜe więc być tatwo oddzielony od chimerycznego plazmidu, który jest oporny jedynie na tetracyklinę. Dodatkowym potwierdzeniem faktu, Ŝe insercja miała miejsce, moŜe być oszacowanie wielkości plazmidowego DNA uzyskane z domniemanego rekombinantu podczas elektroforezy na Ŝelu agarozowym, poniewaŜ cząsteczka chimerycznego DNA jest dłuŜsza niŜ DNA wektora gospodarza.

536 / ROZDZIAŁ 42 Gen oporności na tetracyklinę

Gen oporności na ampicylinę

Następnie włączyć Insert DNA po Pst I

PBR322 - gospodarz

pBR32E — cząsteczka chimeryczna

Ryc. 42-4. Metoda przesiewu rekombinantów w celu uzyskania włączonych fragmentów DNA. Do plazmidu pBR322 w unikatowe miejsce Pst I włączono fragment obcego DNA. To wstawienie przerwało gen kodujący białko wnoszące oporność bakterii gospodarza na ampicylinę. Skutkiem tego .ptazmid chimeryczny nie jest w stanie przeŜyć po wysianiu na poŜywkę zawierającą ten antybiotyk. Do odróŜnienia klonów plazmidowych, które zawierają insert, moŜe być zatem zastosowana zróŜnicowana wraŜliwość na tetracyklinę i ampicylinę.

Klony rekombinantów genomu danego organizmu tworzą jego bibliotekę Zastosowanie kombinacji enzymów restrykcyjnych, i róŜnych wektorów do klonowania pozwala na upakowanie w wektorach całego genomu danego organizmu. Zbiór takich róŜnych klonów rekombinantów nazywa się biblioteką. Biblioteka genomowajestprzygptpwana z całkowiiego DNA-linti konioiTioweJJub tkanki. Biblioteka cDNA reprezentuje zbiór mRNA wdanej tkance. Biłjlioiejyjięnomowe uzyskuje się dzięki częściowemu trawieniu całkowitego DNA enzymami restrykcyjnymi, które tną DNA często, tzn. na krótkie odcinki (np. Sau IIIA). PoŜądane jest uzyskanie raczej duŜych fragmentów, tak aby większość genów była pozostawiona w stanie nie naruszonym. Do konstrukcji takich bibliotek preferowane są wektory fago we, poniewaŜ fagi akceptują duŜe fragmenty DNA (do 20 kz). Ostatecznym celem jest uzyskanie pełnej biblioteki. Liczba fragmentów, niezbędnych dla osiągnięcia tego celu, jest odwrotnie skorelowana z rozmiarem fragmentów i zaleŜna wprost od rozmiaru genomu (tab. 42-4). Biblioteka genomu ludzkiego, która

zawiera 10 6 rekombinacyjnych fragmentów o duŜej długości, ma 99% szansę być biblioteką kompletną. Wobec tego szansę na znalezienie pojedynczej kopii genu są bardzo duŜe. Biblioteki cDNA przygotowuje się izolując najpierw populację cząsteczek mRNA z tkanki, ąjiastejpnie kopiując te cząsteczki na dwupasmowy DNA, stosując (koiejno) odwrotną 'Efanskryptazę i DNA polimerazę. Z przyczyn technicznych rzadko, uzyskuje .się kopie cDNA o pełnej długości, tak Ŝe są zwykle klonowane mniejsze fragmenty DNA. jUaajydj są często preferowane jako wektory do sporządzania bibliotek cDNA, poniewaŜ są one wygodniejsze w..pracy niŜ fagi lub kosmidy, chociaŜ wektory z róŜnych fagów X mają szczególne zalety do klonowania DNA (p. niŜej). Wektorów którym jest aktualnie syntetyzowane białko Ipjz"ezr"gerr3^iEowaaz6ny ieehn ologią rekombinacji DNA, nazywa się wektftrem ekspresyjnym. Takie wektory są obecnie powszechnie stosowane w celu wykrycia swoistych cząsteczek cDNA w bibliotekach i do produkcji białek technikami inŜynierii genetycznej. Wektory te są tak konstruowane, aby zawierały

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 537 Tabela 42-4. Skład pełnych bibliotek genomowych* Źródło

Pełna biblioteka genomowa

E coli DroŜdŜe Drosophila

1 500 Iragmentów 4 500 Iragmentów 50 000 fragmentów 800 000 fragmentów

Ssaki

* Liczba przypadkowych fragmentów (unikatowych klonów), które powinna zawierać biblioteka zapewniająca, Ŝe jest reprezentowany kaŜdy pojedynczy gen, jest odwrotnie proporcjonalna do średniej wielkości Iragmentów uŜytych do sporządzenia biblioteki i wprost proporcjonalna do liczby genów w organizmie. Liczby podane w tabeli przedstawiają liczbę fragmentów (niezaleŜnych klonów) niezbędnych do uzyskania 99% pewności znalezienia danej sekwencji DNA w bibliotece rekombinacyjnego DNA o średniej wielkości insertu 2x1(r nukleotydów. RóŜnice wynikają ze zmienności stopnia złoŜoności genomu między organizmami. Liczba niezbędnych klonów jest wyliczona z wzoru: N=In (1 - P) ln(1 — f) gdzie P jest Ŝądanym prawdopodobieństwem, a f frakcją całkowitego genomu zawartą w pojedynczym-klonie, W przypadku genomowej biblioteki 9 ssaków, przedstawionej wyŜej, przyjmując 3x10 nukfeotydów jako wielkość genomu haploidalnego, równanie to ma postać jak niŜej: N = In (1—0,99) ln

1

s

< —[ 3x10 J

WyŜszość, jaką przedstawia biblioteka zioŜona z duŜych fragmentów DNA. jest oczywista, gdy rozwiąŜe się to równanie biorąc wielkość fragmen3 4 tów 5 x 10 nukleotydów zamiast 2 x 10 nukleotydów.

bardzo aktywne promotory indukcyjne, odpowiednie i będące w fazie kodony inicjacyjne dla translacji, sygnały zarówno do transkrypcji, jak i terminacji translacji oraz, jeśli potrzeba, odpowiednie sygnały do przekształcania białka. Niektóre wektory ekspresyjne zawierają nawet geny inhibitorów proteazy, aby w ten sposób uzyskać zwiększone ilości końcowego produktu. Wektor X gt 11 jest powszechnie uŜywany do konstrukcji bibliotek, poniewaŜ akceptuje większe cząsteczki cDNA, które są replikowane i tłumaczone na białka; w tym stanie rzeczy

biblioteki rekombjnacyjne w wektorze X gtll mogą być przesiewane zarówno sondami cDNA, jak i sondami przeciwciał. Biblioteki stosowane do przesiewu sondami w celu wykrycia swoistych genów i cząsteczek cDNA RóŜnorodne cząsteczki mogą być uŜyte jako „sondy" do poszukiwania swoistych genów lub cząsteczek cDNA w bibliotekach lub do ilościowego określenia DNA i RNA rozdzielonych podczas elektroforezy na róŜnych Ŝelach^^SaŁ^fiUfll sf nii "fViłi fra-gmentv DNA liiIT RNA znakowane przy uŜyciu nukleotydu zawierąjąfTfjfliM?p Ałiv sonda była uŜyteczna i skuteczna musi ona rozpoznawać komplementarną sekwencję. W celu przeszukiwania biblioteki cDNA w odniesieniu do długich fragmentów cDNA lub przeszukiwania biblioteki genomowej w odniesieniu do sekwencji komplementarnej kodującego regionu genu mogą być uŜyte cDNA syntetyzowane na swoistych mRNA jako matrycach. Popularną techniką wyszukiw&nia._.swaislycii genów jest wzięcie krótkiej sekwencji aminokwasowej i, stosując zestawienie kodonów dla tej sekwencji (p, rozdz. 40), sporządzenie sondy oligonukłeotydowej, która wykryje odpowiadający fragment DNA w bibliotece genomowej. Jeśli sekwencje sondy komplementarnej dokładnie pasują do sekwencji poszukiwanych, to sondy "o długości 15—20 nukleotydów będą z nimi hybrydyzowały. Sondy cDNA są stosowane do wykrywania fragmentów DNA metodą Southerna i do wykrywania ilościowego RNA.jnetodą Northern. Techniki „blotting" i hybrydyzacji pozwalają na uwidocznienie swoistych fragmentów TJwadocznienie swoistych fragmentów DNA i RNA spośród wielu tysięcy „kontaminujących" cząsteczek wymaga uŜycia kilku technik, które określa się zbiorczym terminem przeniesienie plam (błot transfer), Na rycinie 42-5 przedstawiono procedury przeniesienia plam metodą-Soitfherita (DNA), metodą Northern (RNA) i Western (białko). (Pierwsza technika uzyskała nazwę od badacza, który ją opracował, a inne nazwy wzięły się z laboratoryjnego Ŝargonu i zostały zaakceptowane). Te metody są uŜyteczne do oznaczenia liczby kopii genu w danej tkance albo określenia, czy gen ma duŜe zmiany strukturalne (delecje, insercje lub rearanŜacje). W pewnych przypadkach, jeśli jest

538 / ROZDZIAŁ 42 Southarn

Northe r

Western Białko y^

nn j Ŝelowa

\

IcDNA* OOD

i IcOfJA* CJC3 E=l

1

W

Przeniesienie na bibułę

------

Autoradlogram

Przeciwciało* sondę

Dodać

|

Ryc. 42-5. Technika przenoszenia plam. W technice Southerna, czyli przenoszenia DNA, wyizolowany z linii komórkowej lub tkanki DNA trawi się jednym lub wieloma enzymami restrykcyjnymi. Mieszaninę inkubacyjną nanosi się do studzienek w Ŝelu agarozowym lub poliakrylamidowym i eksponuje_na pole elektryczne prądu stałego. DNA dzięki ładunkowi ujemnemu wędruje w kierunku katody; małe fragmenty wędrują najszybciej. Po odpowiednim czasie DNA denaturuje się łagodną alkatizacją i przenosi na bkmę nitrocelulozową (filtr) w postaci dokładnej repliki układu prąŜków na Ŝelu techniką przenoszenia plam (blotting) opracowaną przez Southerna. DNA wiąŜe się z bibułą przez wygrzewanie i następnie bibułę eksponuje na znakowaną sondę cDNA, która hybrydyzuje z komplementarnymi fragmentami DNA związanego z filtrem. Po dokładnym przemyciu bibułę eksponuje się na film rentgenowski, który po wywołaniu ujawnia swoiste prąŜki odpowiadające fragmentom DNA, które rozpoznały sekwencje cDNA sondy. Koncepcja techniki przenoszenia plam RNA, czyli metoda Northern jest podobna. Przed przeniesieniem RNA jest poddany elektroforezie. Technika przeniesienia wymaga nieco odmiennego postępowania niŜ przeniesienie DNA, aby przede wszystkim zapewnić pozostawienie nietkniętych cząsteczek RNA; ogólnie metoda ta jest nieco trudniejsza. Przenoszenie plam białek, czyli technika Western, polega na elektroforezie i przeniesieniu białek na filtr nitrocelulozowy, a następnie uŜycie jako sondy swoistego przeciwciała lub innych sond molekularnych.

zmieniona swoista zasada, w wyniku czego zmienia się miejsce restrykcyjne, metody te mogą wykryć mutację punktową. Techniki przeniesienia plamy typu Northern i Western są stosowane do określenia wielkości i ilości swoistych cząsteczek RNA i białek. Hybrydyzacja kolonii lub hyhrydyzacja płyt-

kowa jest metodą za pomocą której identyfikuje się i oczyszcza swoiste klony. Bakterie są hodowane w postaci kolonii na płytce agarowej, którą następnie pokrywa się nitrocelulozową bibułą filtracyjną. Komórki z kaŜdej kolonii przylepiają się do filtru i są do niego trwale ufiksowane przez podgrzanie, co jednocześnie z działaniem NaOH, doprowadza takŜe do iizy komórek i denaturacji DNA, a następnie po-

zwoli na jego hybrydyzację z sondą. Sondę radioaktywną dodaje się do filtru i po przemyciu kompleks hybrydowy jest lokalizowany przez ekspozycję filtru na kliszę fotograficzną. Po zidentyfikowaniu plamy na auto radio gramie z kolonią, ta ostatnia moŜe być wyodrębniona z płytki. Podobna strategia jest stosowana do identyfikacji fragmentów DNA w bibliotekach fagowych. Kolejne etapy tej procedury dają w wyniku wyizolowany klon (kolonie bakteryjne) lub kolonię pochodzącą z indywidualnego faga. Wszystkie metody hybrydyzacji, omawiane w tej części, zaleŜą od swoistych właściwości parowania zasad komplementarnych pasm kwasów nukleinowych opisanych wyŜej. Do-

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 539

kładne sparowanie daje łatwo hybrydę oporną na wysokie temperatury w trakcie reakcji hybrydyzowania i przemywania. Kompleksy takie tworzą się równieŜ w małych stęŜeniach soli. Parowanie zasad, przebiegające z mniejszą dokładnością, nie toleruje takich ostrych warunków, tj. podwyŜszonych temperatur i małych stęŜeń soli; w takim przypadku hybrydyzacja albo nie zachodzi albo hybrydy zostają rozerwane w czasie przemywania. Rodziny genów, mających pewien stopień homologii, mogą być wykryte przez zmianę ostrości warunków hybrydyzacji i przemywania. To podejście pozwala takŜe na między gatunkowe porównania danego genu. Do analizy cząsteczek rekombinacyjnego DNA stosuje się sekwencjonowanie DNA Segmenty cząsteczek swoistego DNA, uzyskane techniką rekombinacyjnego DNA, mogą być analizowane odnośnie do ich. sekwencji

Reakcja:

ddATP

ddTTP

ddCTP

nukleotydowej. Metoda ta zaleŜy od istnienia duŜej liczby identycznych cząsteczek DNA, Wymóg len moŜe być spełniony przez klonowanie danego fragmentu, stosując wyŜej opisane techniki. Enzymatyczna metoda (metoda Sangera) sekwencjonowania DNA wykorzystuje swoiste dideoksynukleotydy, które kończą syntezę pasma DNA w miejscu swoistego nukleotydu w trakcie syntezy pasma na oczyszczonej matrycy kwasu nukleinowego. Reakcje są tak dobrane, Ŝe uzyskuje się populację fragmentów DNA reprezentujących zatrzymanie syntezy na kaŜdym nukleotydzie. Wprowadzając radioaktywny znacznik w miejsce naprzeciw miejsca terminacji moŜna uzyskać oddzielne fragmenty, które są segregowane pod względem wielkości za pomocą elektroforezy na Ŝelu poliakryiamidowym. Po sporządzeniu autoradiogramu kaŜdy z fragmentów da pasmo na kliszy rentgenowskiej. Pasma te, czytane po kolei, dają sekwencję DNA (p. ryc. 42-6). Obecnie jest opracowana metoda półautomatycznego sek-

Sekwencja oryginalnego pasma 1

ddGTP -

* -A-G-T-C-T-T-G-G-A-G-C-T-3 S

i _

11

3 t _

1 1

i

I

<

1

I

1

I

1

i

.. •

1

t

1

*

1 A T Zasada kończąca

1

A G T C T T G G A G C T

Ryc. 42-6. Sekwencjonowanie DNA metodą opracowaną przez Sangera. Drabinkowy układ prąŜków na Ŝelu od dotu do góry przedstawia stopniowo wydłuŜające fragmenty pasma oryginalnego DNA. Wiedząc, która ze swoistych reakcji dideoksynukleotydowych została wykonana w celu uzyskania mieszaniny fragmentów, moŜna oznaczyć sekwencję nukieotydów od znakowanego końca w kierunku końca nieznakowanego na podstawie „odczytywania" Ŝelu. Reguły parowania zasad wg Watsona-Cricka (A-T, G-C) dyktują sekwencję drugiego (komplementarnego) pasma. ______________________________

540 / ROZDZIAŁ 42

Sekwencja docelowa

VW

wencjonowania DNA. Inna metoda (Maxama i Gilberta) wykorzystuje metody chemicznego przecinania DNA w miejscu swoistych nukleotydów.

vAW

Synteza oligonukleotydów jest

START CYKL1

CYKL 2 VSA/

V\A> CYKL 3

W\A

vw*

wv

^AA/

WV

nTrffl

obecnie metodą rutynową Rutynową metodą laboratoryjną jest zautomatyzowana synteza chemiczna umiarkowanie długich (~100 nukleotydów) oligonukleotydów o precyzyjnej Ŝądanej sekwencji. KaŜdy cykl syntezy zajmuje kilka minut, tak Ŝe synteza całej cząsteczki moŜe być wykonana w ciągu godzin w zaleŜności od jej długości. Takie oligonukleotydy są obecnie konieczne do sekwencjonowania DNA, przeszukiwania bibliotek., określania przesunięć w mobilności DNA, polimerazowej reakcji łańcuchowej (p. niŜej) i licznych innych zastosowań. Poiimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR) pozwała na amplifikację sekwencji DNA Poiimerazowa reakcja łańcuchowa jest metodą słuŜącą do amplifikacji okreslonycrrsekwencji DNA. Swoistość tej reakcji jest oparta na uŜyciu 2 primerów oligonukieotydowych, które hybrydyzują do komplementarnych sekwencji połoŜonych na przeciwległych pasmach DNA i flankujących interesującą nas sekwencję docelowy (ryc. 42-7), Próbką DNA jest najpierw podgrzewana, aby..rozdziełić 1 pasińa, następnie sekwencje primerów wiajj&jjicj DNA i kaŜde z pasm jest kopiowane przez polimerazę DNA p_ocząwszy od miejsca pnmera. KaŜde z 2 pasm D.NA słuŜy jako matryca do syntezy nowego DNA, począwszy od 2 primerów. Powtarzane cykle denaturacji cieplnej, łączenia primerów do ich sekwencji komplementarnych i wydłuŜenie sekwencji primerów przez polimerazę DNA dają ostatecznie eksponencjalną amplifikację Ryc. 42-7. UŜycie polimerazowej reakcji łańcuchowej do amplifikacji swoistych sekwencji genowych. Dwupasmowy DNA jest podgrzewany w celu rozdzielenia na pojedyncze pasma. Pasma te wiąŜą 2 określone primery, które są komplementarne do swoistych sekwencji na przeciwległych pasmach, i które określają fragment przeznaczony do amplifikacji. Polimeraza DNA wydłuŜa primery w obu kierunkach i syntetyzuje 2 pasma komplementarne do 2 pasm oryginalnych. Cykl ten powtarza się wielokrotnie, dając zamplifikowany produkt o określonej długości sekwencji.

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 541

segmentów DNA o określonej długości. Na. _ rób ^u ludzi. Dwiejechniki pozwalają uzyskać początku , .stosowania reakcji PCR uŜywano ten cel: hybrydyzacja komórek somatycznych połimerazy DNA z E. coli; polimeraza była oraz hybrydyzacja in situ. Hybrydyzacja in situ niszczona przez kaŜdy cykl denaturacji cieplnej. jest najprostszą i najbardziej bezpośrednią proPodstawienie stabilnej termicznie polimerazy cedurą, w której radioaktywna sonda jest dodaD..NĄ z Thermus aguaticus, organizmu, który wana do rozproszonych na powierzchni szkiełŜyje i replikuje się w temp. 70-80°C, ominęło ka mikroskopowego chromosomów metafazoproblem wraŜliwości enzymu na temperaturę wycja,. Dokładne miejsce hybrydyzacji określa i pozwoliło na automatyzację reakcji PCR, się przez nałoŜenie na szkiełko emulsji fotoponiewaŜ reakcja prowadzona tą polimerazą graficznej i po ekspozycji porównanie rozmieszmoŜe przebiegać w temp. 70°C. Pozwoliło to czenia ziaren w obszarach strukturalnych chrotakŜe zwiększyć swoistość i wydajność DNA. mosomów. Pozwala to często na umiejscowieMoŜna uzyskać zamplifikowane sekwencje nie genu w określonym prąŜku lub regionie DNA krótkie, np. 50—100 pz oraz długie o 2,5 chromosomu. Niektóre z genów Judzkich, kpz. 20 cykli w reakcji PCR daje amplifikację umiejscowione za pomocą tej metody, przedrzędu ~1G6, a 30 cykli rzędu ~109. Reakcja stawiono w tab. 42-5. PCR pozwala na amplifikację i analizę DNA W tabeli tej przedstawiono jedynie wybrane z pojedynczej komórki, cebulki włosowej lub próbki, poniewaŜ dotychczas zmapowano juŜ .nasienia. Oczywiste jest zastosowanie reakcji setki genów. Mapa genomu ludzkiego będzie PCR w medycynie sądowej. Metoda PCR jest kompletowana w nadchodzących latach; isttakŜe stosowana do: 1) wykrywania czynników nieją takŜe zamierzenia zsekwencjonowania cazakaźnych, zwłaszcza latentnych wirusów, 2) łego genomu ludzkiego. Z dotychczasowych prenatalnej diagnostyki genetycznej, 3) wykry- badań wyłaniają się następujące wnioski: 1. wania polimorfizmu alleli, 4) precyzyjnego usta- Geny, które kodują białka o podobnych funkclania typu tkanek do transplantacji i 5) do jach, mogą być umiejscowione na oddzielnych badań nad ewolucją, stosując archeologiczne chromosomach (a- i P-globiny). 2. Geny, które próbki DNA. Równie liczne są zastosowania stanowią część rodziny, mogą takŜe mieścić się techniki PCR do problematyki badań podsta- w oddzielnych chromosomach (hormon wzroswowych i z pewnością pojawią się nowe moŜ- tu i prolaktyna). 3. Geny odpowiedzialne za liwości zastosowania tej metody. wiele chorób dziedzicznych, wywołanych niedoborem swoistych białek, włączając w to równieŜ choroby związane z chromosomem X, są umiejPRAKTYCZNE ZASTOSOWANIE scowione w miejscach swoistych. MoŜe najTECHNOLOGII REKOMBINACJI DNA ciekawszy jest fakt, Ŝe dzięki dostępności okreśSTALE SIĘ ZWIĘKSZA lonych sklonowanych fragmentów restrykcyjnych było moŜliwe umiejscowienie chromosoWyizolowanie swoistego genu z całego geno- malne wielu zaburzeń o nieznanym niedoborze mu wymaga takich technik, które umoŜliwiają białkowym, np. pląsa wica Huntingtona — wyróŜnienie jednej milionowej części. Identyfi- chromosom 4; mukowiscydoza — chromosom kacja obszaru regulatorowego, który moŜe mieć 7; torbielowatość nerek u dorosłych — chromodługość tylko 10 pz, wymaga czułości wyróŜ- som 16; dystrofia mięśniowa typu Duchenne niającej 1 część z 3xlO8; taka choroba, jak — chromosom X. Z chwilą umiejscowienia niedokrwistość sierpowata jest spowodowana wady do regionu DNA, który ma cechy budowy przez mutację pojedynczej zasady, co wymaga genu (ryc. 42-1) moŜna skonstruować gen synprecyzji rzędu 1—3 x 105. Technologia rekom- tetyczny i uzy^.ać jego ekspresję w odpowiedbinacji DNA jest dostatecznie skuteczna, aby nim wektorze oraz określić jego funkcję albo sprostać tym wymogom. moŜna zsyntetyzować domniemany peptyd na podstawie dedukcji z układu otwartej ramki Mapowanie genów pozwala odczytu w obrębie regionu kodującego. Przena umiejscowienie swoistych genów ciwciała przeciwko takiemu peptydowi moŜna w określonych chromosomach uŜyć w celu zbadania, czy taki peptyd ulega Umiejscowienie genów unioŜliwia.sp.orządze- ekspresji u zdrowych osobników i czy jest nie mapy ludzkiego genomu, Pozwala to na nieobecny u osobników z określonym zespołem uzyskanie uŜytecznych informacji w opisie chogenetycznym.

542 / ROZDZIAŁ 42 Tabela 42-5. Umiejscowienie genów u człowieka* Gen

Insulina Prolaktyna

Chromosom

Choroba

11p15 6p23-q12

Hormon wzrostowy a-Globina

17q21 -qter 16p12-pter

Niedobór hormonu wzrostu a-Ta I asem i a

P-Globina

11q12 20g13-qter

p-Talasemia, niedok-rwtstość sierpowata Niedobór deaminazy adenozynowej

12q24

Fenyloketonuria

Deaminaza adenozynowa

Hydroksylaza fenyloalaniny Fosfory boŜy 1 otrą nsferaza hipoksantynowo-guaninowa Segment G8 DNA

Xq26-q27

Zespół Lescha-Nyhana Pląsawica Huntingtona

* Tabela ta przedstawia chromosomalne umiejscowienie niektórych genów i chorób związanych z niedoborem lub nieprawidłowym wytwarzaniem produktów genowych. Omawiany chromosom jest wskazany przez pierwszą podkreśloną cyfrę lub literę. Inne cyfry i litery odnoszą się do szczegółowego umiejscowienia podanego w: McKusick VA: Mendeiian Inheritance in Man, 6 th ed. Johns Hopkins Univ. Press, 1983.

Określone białka mogą być produkowane do celów badawczych 1 diagnostycznych Praktycznym celem badań nad rekombinacyjnym DNA jest uzyskanie materiałów do zastosowań w biomedycynie. Ta technologia ma 2 określone zalety: 1, MoŜe ona dostarczyć duŜych ilości materiału, które nie byłyby moŜ liwe do otrzymania zwykłymi metodami oczysz czania (np. interferon, aktywator plazminogenu). 2. MoŜe ona dostarczać ludzkiego materia łu (np, insulina, hormon wzrostu). Korzyści w obu tych przypadkach są oczywiste. ChociaŜ pierwotnym celem jest dostarczenie produktów, na ogół białek, do leczenia (insulina) lub diag nostyki (test do wykrywania AIDS) chorób ludzi i zwierząt lub do celów zapobiegania (szczepionka przeciwko wirusowi zapalenia wą troby B), są takŜe inne realne i potencjalne zastosowania o wartości rynkowej, zwłaszcza w rolnictwie. Przykładem tego ostatniego za stosowania są usiłowania uzyskania, na drodze inŜynierii genetycznej, roślin, które są bardziej oporne na ekstremalne warunki suszy lub tem peratury albo bardziej wydolne w asymilacji azotu.

Technologia rekombinacji DNA ma zastosowanie w molekularnej analizie chorób

Naturalna zmienność genowa. W warunkach naturalnych, podobnie jak w większości ludzkich struktur, występuje normalna zmienność sekwencji DNA, .Zmienność w sekwencji ,UNA,£zyn polimorfizm. zachodzi z częstością 1 na kaŜdych 500 nukleotydów, czyli ok. 107 razy na genom. Nie ulega wątpliwości, Ŝe zmienność polega na delecjach i insercjadi DNA oraz podstawieniach pojedynczych zasad. U zdrowych ludzi zmiany te zachodzą zwykle w niekodujących regionach DNA lub w miejscach, które nie wywołują zmian w funkcji kodowanego białka. Polimorfizm struktury DNA moŜe mieć związek z niektórymi chorobami i moŜe być uŜyty do poszukiwania swoistego genu odpowiedzialnego za chorobę, jak to opisano niŜej. Polimorfizm ma takŜe róŜne zastosowania w medycynie sądowej.

Zmienność genowa powodująca chorobę. Genetyka klasyczna uczy, Ŝe większość chorób genetycznych jest spowodowana mutacjami punktowymi, w wyniku których dochodzi do syntezy uszkodzonych białek. Podejście to jest nadal prawdziwe, choć naleŜy tu zaznaczyć, Ŝe choroba genetyczna moŜe być takŜe wynikiem dezorganizacji jakiegokolwiek etapu

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 543

przemian opisanych w początkowych ustępach tego rózdziałuT "ilustrowanych na ryc. 42-1. Zagadnienie to dobrze ilustrują badania nad genem fi-globiny. Gen ten jest umiejscowiony w zespole genów na chromosomie 11 (ryc. 42-8), \ 5'-

G,

A7

a jego bardziej szczegółową wersję przedstawiono na ryc. 42-9. Nieprawidłowe wytwarzanie pglobiny prowadzi do wielu chorób i jest spowodowane róŜnorodnymi uszkodzeniami w obrębie genu i w jego otoczeniu (tab. 42-6).

t(3

D D D

-B

■3'

Hemoglobino patia 10 kz

0°-Talasemla

Hemoglobina Lepore

Ryc. 42-8. Schematyczny obraz zespołu genów p-globiny i niektórych zaburzeń genetycznych. Gen figlobiny jest umiejscowiony w chromosomie 11 w ścisłym powiązaniu z 2 genami y-globiny i genem 8globiny. Rodzina genów pjest ułoŜona w kolejności 5'- £-Gy-Ay- f p-S-p-3'. Locus 5 ulega ekspresji we wczesnym okresie płodowym (c^ £2). Geny y ulegają ekspresji w Ŝyciu płodowym, dając hemoglobinę płodową (HbF, a2y2)- Hemoglobina osobników dorosłych składa się z HbA(OjP2) li>b HbA2 (o^Sj). Gen f p jest pseudogenem, który wykazuje homologię sekwencji z p, ale zawiera mutacje, które zapobiegają jego ekspresji. Delecje (czarne paski) w obrębie (ocus p powodują powstanie §-talasemii (niedobór lub brak [P°] P-globiny), Delecja genów 5 i P jest przyczyn ą powstania hemoglobiny Lepore (w której obecna jest tylko hemoglobina a). Inwersja (AyŚP)° w tym regionie (pasek niezaciemniony z napisem „Inwersja") niszczy funkcje genu i takŜe powoduje talasemie (typ III). KaŜdy z typów talasemii ma tendencję do występowania w pewnych populacjach, np. delecja (Ay5(ł)° i inwersja pojawiają się u osób z Indii, Znacznie więcej delecji zmapowano w tym regionie chromosomu i kaŜdej z nich towarzyszy pewien typ talasemii.

00

00 0

TT T

AA

AA

O

Ryc. 42-9. Mutacje w genie p-giobiny powodujące taiasemie, Gen P-globiny pokazany jest w orientacji 5' r do 3', Pola zakreskowane ilustrują regiony 5 i 3' nie ulegające translacji. Czytając w kierunku od 5' do 3' — pola zaciemnione są eksonami 1 -3, a przestrzenie niezacienione intronami 1 i 2, Mutacje dotyczące kontroli transkrypcji ( #) są umiejscowione w regionie DNA flankującym gen od końca 5'. Wskazano przykładowo zidentyfikowane mutacje nonsensowne (A), mutacje dotyczące przekształceń RNA (O) i przecinania RNA (O)- W niektórych regionach znaleziono liczne mutacje. Oznaczono je klamrami (,!,).

S44 / ROZDZIAŁ 42 Tabela biny Zmiana

6. Zmiany Uszkodzona funkcja

Mutacje Fałdowanie białka punktowe Kontrola transkrypcji Mutacje typu przesunięcia ramki odczytu i nonsensowne Przekształcanie RNA Delecje Wytwarzanie mRNA

RearanŜacje

1

w genie p-

Choroba Niedokrwistość sierpowata P-Talasemia p-Talasemia

p-Talasemia p°-Ta lasem i a Hemoglobina Lepore Wytwarzanie mRNA P-Talasemia typ III

Mutacje punktowe. Klasycznym przykładem jest choroba zwana niedokrwistością sierpowata, która jest spowodowana mutacją pojedynczej zasady w całym genomie złoŜonym z 3 x l O 9 pz; jest to substytucja T przez A w DNA, która następnie powoduje zmianę A na U w mRNA odpowiadającą ć.kodonowi w genie p-globiny (ryc. 7-20). Zmieniony kodem określa inny aminokwas (walinę zamiast kwasu glutaminowego), co powoduje nieprawidłowości strukturalne C7ąstcczki fi-glohiny. Inne mutacje punktowe w obrębie genu P-globiny i jego otoczeniu powodują zmniejszenie, a w niektórych przypadkach zatrzymanie wytwarzania rzają takiego łagodnego („temperate") wirusa p-talasemia. Talasemie charakteryzują się wadami w syntezie podjednostek hemoglobiny, a (ł-talasemia powstaje wówczas, gdy jest niedostateczne wytwarzanie p-globiny. Na rycinie 42-9 przedstawiano mutacje punktowe, które mogą wpływać na wytwarzanie normalnego mRNA (a zatem normalnego białka), a które są uwikłane w powstawanie p-talasemii.

Delecje, insercje i rearanŜacje DNA. Badania bakterii, wirusów, droŜdŜy i muszki owocowej wskazują, Ŝe fragmenty DNA mogą w obrębie genomu przemieszczać się z jednego miejsca na drugie. Delecja krytycznego frag■mentu DNA, rearanŜacja DNA w obrębie genu albo insercja fragmentu DNA do kodującego lub regulatorowego regionu mogą wywoływaćtakie zmiany w ekspresji genu, które prowadzą do choroby. Molekularna anafiza p-talasemii dostarcza znowu licznych przykładów takich

procesów, a zwłaszcza delecji, które są przyczyną choroby (ryc. 42-8). Zespół genów globiny wydaje się być szczególnie podatny na tego typu uszkodzenie. Delecje w zespole genów ccglobiny, umiejscowionym na chromosomie 16, powodują powstanie ct-talasemii. Istnieją silne związki etniczne z licznymi typami tych delecji, tak Ŝe północni Europejczycy, Filipiń-czycy, rasa czarna i ludzie zamieszkali w rejonie Morza Śródziemnego mają róŜne typy uszkodzeń, a wszystkie z nich powodują brak hemoglobiny A i a-talasemię. Podobna analiza moŜe być wykonana dla licznych innych chorób. Mutacje punktowe są zwykle określane na drodze sekwencjonowania danego genu, choć przypadkowo, gdy mutacja niszczy albo stwarza nowe miejsce restrykcyjne, technika analizy fragmentów restrykcyjnych moŜe być uŜyta do wykazania uszkodzenia. Delecje lub insercje DNA, większe niŜ 50 pz, często są wykrywane techniką „blotting" według Southerna. Analiza rodowodu. Niedokrwistość sierpowata ponownie dostarcza doskonałego przykładu jak technologia rekombinacji DNA moŜe być zastosowana do badań nad chorobą u człowieka. Podstawienie T przez A w paśmie matrycowym DNA genu P-globiny zmienia sekwencję w regionie, który odpowiada 6 kodonowi z sekwencją

1

CCTG A G G GA C G

CDC C

pasmo kodujące pasmo matrycowe

na sekwencję pasmo kodujące C C T G T G G G G pasmo matrycowe A C@C C

i .niszczy miejsce rozpoznania enzymu restrykcyjnego Mst II (CCTNAGG; wskazane przez małą strzałkę pionową; tab.42-1). Inne miejsca dla Mst II, umiejscowione w kierunku 5' i 3' od miejsca omawianego (ryc. 42-10), nie są objęte mutacją, a zatem będą przecięte. W wyniku tego inkubacja z enzymem restrykcyjnym DNA od osobników normalnych (AA), heterozygot (AS) i homozygot (SS) da 3 róŜne wzory prąŜków uzyskanych metodą Southerna (ryc. 42-10). Przykład ten ilustruje jak moŜna ustalić rodowód DNA, stosując zasady omówione w tym rozdziale. Analiza rodowodu jest stosowana w odniesieniu do licznych chorób genetycznych i jest najbardziej uŜyteczna w przypadku chorób

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 54S A Miejsca restrykcyjne Mst tl w obrębie I wokot genu /f-globlny Prawidłowy (A)

5

:

3' 1,15 kz

0,2 kb

Niedokrwlsto&ć slerpowata (S)

5-

1.35 kz

B. Analiza rodowodu

nWielkość fragmentu

- 1,35 pz

- 1,15 pz

AS

AS

SS

AA

AS

Fenotyp

Ryc. 42-10. Analiza rodowodu niedokrwistości sierpowatej. Górny fragment ryciny (A) pokazuje pierwszą część genu (3-globiny i miejsce restrykcyjne Mst II (f) w genie p-globiny prawidłowym (A) i genie w niedokrwistości sierpowatej (S), U osób zdrowych trawienie ONA enzymem restrykcyjnym Mst II daje fragmenty o długości 1,15 kz i 0r2 kz. Zamiany T na A, jakie zachodzą u chorych na niedokrwistość sierpowatą, usuwają jedno z 3 miejsc restrykcyjnych w obrębie genu fś-globiny, w wyniku czego po trawieniu Mst 11 powstaje tylko pojedynczy fragment o diugości 1,35 kz, Te róŜnice w długości fragmentów są łatwo wykrywalne techniką Southerna (B). (Na tej rycinie fragment 0,2 kz wyszedł pozazel). Analiza rodowodu pokazuje 3 moŜliwości: AA — osoba zdrowa (O); AS — heterozygota {o, |J); SS — homozygota (■) Podejście to pozwala na prenatalną diagnozę niedokrwistości sierpowatej lub nosicieli tej choroby («£) __________________^ _ _ _ ^ _________________________________

spowodowanych delecjami i insercjami lub rzadziej w przypadku zmian w miejscu restrykcyjnym, jak to podano na przykładach cytowanych w tym ustępie. Analiza taka jest ułatwiona przez zastosowanie reakcji PCR, która moŜe dostarczyć dostatecznej ilości DNA dla takiej analizy. .15

Biocheimj

Diagnostyka prenatalna, Diagnostyka prenatalna jest moŜliwa w przypadku, gdy jest znana wada genetyczna i gdy jest dostępna swoista sonda molekularna. DNA uzyskany z "niewielkiej ilości (np. 10 ml) płynu owodniowego (albo z biopsji kosmówek) moŜe być

546 / ROZDZIAŁ 42

uŜyty do aaalizy metodą Southerna. Piód, mający wzór restrykcyjny AA (ryc. 42-10), nie jest chory na niedokrwistość sierpowatą, ani nie jest jej nosicielem. U płodu mającego wzór SS rozwinie się niedokrwistość sierpowatą. Obecnie są dostępne sondy do tego typu analizy dla wielu chorób genetycznych.

Polimorfizm długości, fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Przytaczane wyŜej róŜnice w sekwencjach DNA mogą wynikać ze zmienności miejsc restrykcyjnych, w wyniku czego fragmenty restrykcyjne mają róŜne długości. Wrodzone róŜnice wzoru restrykcyjnego (np. zmienność w DNA zachodząca w ogólnej populacji w stopniu większym niŜ 1 %) są znane jako polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych, czyli RFLP (restrietion fragment length polymorphism). RFLP powstałe w wyniku zmian w pojedynczej zasadzie (np. niedokrwfstość sierpowatą) albo w wyniku delecji lub insercji DNA w obrębie fragmentu restrykcyjnego (np. talasemie) są uŜytecznym narzędziem diagnostycznym, Polimorfizm taki znaleziono w znanych genetycznych loci, a takŜe w obrębie sekwencji, których funkcja nie jest znana; tak więc polimorfizm RFLP moŜe prowadzić do zniszczenia funkcji genu, lub teŜ nie mieć Ŝadnych konsekwencji biologicznych. Polimorfizmy RFLP są dziedziczne i segregują się według wzoru Mendla. Polimorfizm RFLP (dotychczas poznano prawie 350) jest głównie uŜywany w celu określenia chorób dziedzicznych, w których nie znamy ubytku funkcji. RFLP moŜe być uŜyty do ustalenia Nienaruszony 5' DNA

grap sprzęŜeń, które następnie, w procesie zwanym kroczenie po chromosomie, moŜe ewentualnie określić locus związany z chorobą. W metodzie kroczenia po chromosomie (ryc. 42-11) fragment przedstawiający 1 z końców długiego odcinka DNA jest uŜytydo izolowania innego fragmentu, który pokrywa się z pierwszym, ale wychodzi poza jego obręb. Kierunek tego wyjścia jest określany przez mapowanie restrykcyjne i proces ten jest powtarzany stopniowo, aŜ uzyska się sekwencję stanowiącą przedmiot zainteresowania. Choroby sprzęŜone z chromosomem X są szczególnie odpowiednie do tego typu podejścia, poniewaŜ ekspresji ulega tylko 1 allel. Dzięki temu ok. 20% wszystkich zdefiniowanych RFLP jest umiejscowionych w obrębie chromosomu X i prawie kompletna mapa sprzęŜeń na tym chromosomie została opracowana. Stosując technikę RFLP znaleziono gen dystroiii mięśniowej typu Duchenne sprzęŜony z chromosomem X. Podobnie wadę w pląsawicy Huntingtona umiejscowiono w końcowym regionie krótkiego ramienia chromosomu 4, a wada wywołująca torbielowatość nerek jest sprzęŜona z locus a-globiny w chromosomie 16. Terapia genowa. Choroby wywołane niedoborem produktu genowego (tab. 42-5) mogą być odpowiednie do leczenia zastępczego. Strategia takiego leczenia polega na sklonowaniu genu (np. genu, który koduje deaminazę adenozyny) w wektorze, który moŜe być pobrany przez komórkę gospodarza i włączony do genomu. Komórki prekursorowe szpiku kostnego są —3'

Fragmenty

Sonda początkowa

c. 42-11. Technika kroczenia po chromosomie. Zamiar polega na izolowaniu genu X z duŜego odcinka DNA. Dokładne połoŜenie tego genu nie jest znane, ale jest dostępna sonda (• —) komplementarna do fragmentu DNA (na rycinie pokazano sondę do końca 5'), jak równieŜ dostępna jest biblioteka zawierająca serię nakładających się fragmentów DNA. W celu uproszczenia pokazano tylko 5 takich fragmentów. Początkowo sonda będzie hybrydyzowała tylko z klonami zawierającymi fragment 1, który moŜna następnie wyizolować i uŜyć'jako sondę do wykrycia fragmentów 2. Tę procedurę powtarza się aŜ do hybrydyzacji fragmentu 4 z fragmentem 5, który zawiera całą sekwencję genu X.

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 547

przydatne do tego celu, poniewaŜ komórki takie mogą zasiedlić szpik i tam się namnaŜać. Wprowadzony gen moŜe zacząć kierować ekspresją swego białkowego produktu i w ten sposób naprawiać ubytek w komórce gospodarza. Takie zastąpienie genu w komórce somatycznej oczywiście nie moŜe być przekazane potomstwu. Opracowano inne strategie do zmiany linii komórek rozrodczych, ale strategie te zbadano jedynie na zwierzętach doświadczalnych. Pewien odsetek genów wstrzykniętych do zapłodnionego jaja myszy moŜe być włączony do genomu i moŜna go znaleźć zarówno w komórkach somatycznych, jak i komórkach rozrodczych. Takie zwierzęta transgeniczne okazały się bardzo uŜyteczne w analizie swoistych tkankowo wpływów na ekspresję genów oraz wpływu nadmiernego wytwarzania produktów genowych (np. hormonu wzrostu lub onkogenów) oraz w poszukiwaniu genów związanych z rozwojem osobniczym, procesem, który dotychczas było trudno badać. Podejście z uŜyciem metody transgenicznej zastosowano współcześnie w celu skorygowania wad genetycznych u myszy. Do zapłodnionych jaj, uzyskanych od myszy z genetycznym hipogonadyzmem, wstrzykiwano DNA zawierający kodującą sekwencję prekursora białkowego hormonu uwalniającego gonadotropine (GnRH). Gen ten ulegał ekspresji i podlegał prawidłowej regulacji w podwzgórzu pewnej liczby myszy, a zwierzęta te były pod wszystkimi względami prawidłowe. Ich potomstwo nie wykazywało niedoboru GnRH. Jest to zatem dowód na somatyczną ekspresję transgenu i na jego egzystencję w komórkach rozrodczych.

SŁOWNICZEK Auta radiografia. Wykrywanie cząsteczek radioaktywnych (np. DNA, RNA, białko) przez uwidocznienie ich elektów na filmie fotograficznym. Baktertofag. Wirus, który zakaŜa bakterię. Biblioteka. Zbiór sklonowanych fragmentów, które reprezentują cały genom. Biblioteki mogą być albo genomowe (w których są reprezentowane zarówno introny, ;ak i eksony oraz inne sekwencje DNA) lub biblioteka cDNA {w której są reprezentowane jedynie eksony}. cDNA. Cząsteczka jedno pasmowego DNA, która jest komplementarna do cząsteczki mRNA i jest na niej syntetyzowana przy uŜyciu odwrotnej transkryptazy Chimeryczna cząsteczka. Cząsteczka (np. DNA, RNA, białko) zawierająca sekwencje uzys-

kane z 2 róŜnych rodzajów sekwencji (np. 2 róŜnych genów. . Endonukleaza. Enzym, który przecina wewnętrzne wiązania DNA lub RNA Ekson. Sekwencja w genie, która jest reprezentowana (ulega ekspresji) w cząsteczce mRNA. Egzonukłeaza. Enzym, który odcina nukleotydy w DNA lub RNA od końca 3' lub 5'. Hybrydyzacja. Swoista reasocjacja komplementarnych pasm kwasów nukleinowych (DNA z DNA, DNA z RNA lub RNA z RNA) łnsert. Dodatkowa sekwencja w DNA na ogół wprowadzona technikami rekombinacji DNA. Intron. Sekwencja w genie, która jest przepisana na RNA, ale wycięta i usunięta przed translacja, w trakcie przekształcania pierwotnego transkryptu. Klon. DuŜa liczba komórek lub cząsteczek, które są identyczne z pojedynczą macierzystą komórką lub cząsteczką. Kosmid. Plazmid, do którego włączono sekwencje DNA bakteriofaga X, które są niezbędne d/a upakowania DNA (miejsca cos); pozwala to na upakowanie in vitm plazmidowego DNA. Lepkie końce DNA. Komplementarne pojedyncze pasma DNA wystające na przeciwległych końcach dwupasmowej cząsteczki DNA lub wystające z końców róŜnych dwupasmowych cząsteczek (p. takŜe tępe końce). Ligacja. Katalizowane enzymatycznie łączenie przez wiązania fosfod i estrowe 2 odcinków DNA lub RNA; odpowiednimi enzymami są ligazy DNA i RNA. Nick translation. Technika znakowania DNA oparta na zdolności polimerazy DNA z £. coli do degradowania pasma DNA, które zostało nacięte, i do następującej resyntezy tego pasma; jeśli zastosuje się radioaktywne trifosforany nukleozydów, to nowo syntetyzowane pasmo będzie wyznakowane i będzie mogło być uŜyte |ako radioaktywna sonda. Northern błot. Metoda przenoszenia RNA z Ŝełu agarozowego na błonę (filtr) nitrocelulozową, na której cząsteczki RNA mogą być wykryte odpowiednią sondą. Oligonukleotyd. Krótka zdefiniowana sekwencja nukleotydów, połączonych typowym wiązaniem fosfod i estrowym. Odwrotna transkrypcja. Synteza DNA na matrycy RNA katalizowana odwrotną transkryptazą Palindrom. Sekwencja dwupasmowego DNA. która jest taka sama, gdy 2 pasma są czytane w przeciwnych kierunkach. Plazmid. Mała, pozachromosomalna, kołowa cząsteczka DNA, która replikuje niezaleŜnie od DNA gospodarza. Polimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR). Enzymatyczna metoda wielokrotnego kopiowania dwupasmowego DNA, które moŜe stanowić np. sekwencję określonego genu.

548 / ROZDZIAŁ 42 Pseudogen. Nieaktywny segment DNA powstały wskutek mutacji aktywnego genu macierzystego. Rekombinacyjny DNA. Zmieniony DNA, powstały w wyniku msercji sekwencji deoksynukłeotydowych (które uprzednio nie były obecne), do określonej cząsteczki DNA na drodze reakcji enzymatycznych lub chemicznych. Restrykcyjny enzym. Endonukfeaza, która przecina oba pasma DNA w bardzo swoistych miejscach określonych sekwencją zasad. Sonda. Cząsteczka uŜyta do wykrywania obecności swoistego fragmentu DNA lub RNA, np. w kolonii bakteryjnej, sformowana z biblioteki genetycznej lub w czasie analizy technikami przenoszenia plam; zwykłe uŜywanymi sondami są cząsteczki cDNA, syntetyczne oligodeoksynukleotydy o określonej sekwencji i przeciwciała przeciwko swoistym białkom. Southern błot. Metoda przenoszenia DNA z Ŝelu agarozowego na błonę (filtr) nitrocelulozową, na której DNA moŜe być wykryty przy uŜyciu odpowiedniej sondy (np. komplementarnego DNA lub RNA). Spinka do włosów (hairpin). Dwupasmowy odcinek utworzony dzięki sparowaniu zasad między sąsiednimi komplementarnymi sekwencjami pojedynczego łańcucha DNA lub RNA. Splicing (składanie RNA). Usuwanie intronów z RNA z jednoczesnym łączeniem eksonów. Sygnał. Znak pozwalający na obserwację końcowego produktu, gdy np. swoiste sekwencje DNA lub RNA są wykrywane metodą autoradiografii lub inną metodą. W cełu uzyskania sygnału stosowana jest zwykle hybrydyzacja z komplementarnym radioaktywnym polinukleotydem (np. technika Southerna lub technika Northern). Tandem. Liczne kopie tej samej sekwencji {np. DNA), które leŜą przyległe jedna do drugiej. Terminalna transferaza. Enzym, który dodaje nukleotydy jednego typu (np. reszty deoksyadenonukteotydylowe) do końca 3' pasm DNA. Tępe końce. 2 pasma DNA, mające końce zrównane z sobą (p. lepkie końce). Transkrypcja. Synteza RNA na matrycy DNA.

Transgeniczny. Termin opisujący wprowadzenie nowego DNA do komórek rozrodczych przez wstrzyknięcie do jądra komórki jajowej. Translacja. Synteza białka na matrycy mRNA. Wektor. Plazmid lub bakteriofag, do którego moŜe być wprowadzony obcy DNA w celu sklonowania. Western błot. Metoda przenoszenia białka na błonę (filtr) nitrocelulozową, na której białko to moŜe być wykryte odpowiednią sondą, np. przeciwciałem. PIŚMIENNICTWO Beaudet AL: Bibliography of cloned human and other selected DNAs. Am J Hunt Genet 1985; 37:386. Berger SL, Kimmel AR: Guide to Moleculor Cłoning Techniques, Vol 152, Methods in Enzymology, Academic Press, New York, 1987. DNA inmedtcine. Lance* 1984; 2:853,908,966,1022, 1086, 1138, 1194, 1257, 1329, 1380, 1440. Gusetla JF: Recombinant DNA techniąues in the diagnosis and treatment of inherited disorders. J Clin Invest 1986; 77:1723. Kan YW et al: Pages 275—283 in: Thalossemia: Recent Advance$ in Detectian and Treatmettt. Cao A, Carcassi U, Rowley P (edttors). AR Liss, 1982. Lewin B: Genes III. Wiley, 1987. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J: Molecuhr Cloning, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. Martin JB, Gusella JF: Huntington's disease: Pathogenesis and management. N Engl 3 Med 1986: 315:1267. Orkin SH et al: Improved detection of the sickle mutation by DNA analysis: Application to prenatal diagnosis. N Engł J Med 1982; 307:32. Watson JD, Tooze J, Kurtz DT: Recombinant DNA: A Short Course. Freeman, 1983. Weatherall DJ: The New Genetics and Clinicai Practice, 2nd ed. Oxford Univ Press, 1986. Yuan R: Structure and mechanism of multifunctional restriction endonucleases. Annu Rev Biockem 1981; 50:285.

CZĘŚĆ V Biochemia zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej komunikacji Btony: struktura, organizacja i funkcja

43

Daryl K. Granner, MD

WPROWADZENIE Błony są strukturami o bardzo duŜej lepkości, chociaŜ wciąŜ jeszcze plastycznymi. Błony plazmatyczne tworzą zamknięte obszary wokół komórkowej cytoplazmy, oddzielając jedną komórkę od drugiej, umoŜliwiając tym samym ich indywidualizacje. Błony plazmatyczne charakteryzują się wybiórczą przepuszczalnością i działają jako bariery, dzięki którym moŜliwe jest istnienie róŜnic w składzie wnętrza i zewnętrznego otoczenia komórki. Wybiórcza przepuszczalność uwarunkowana jest istnieniem kanałów i pomp dla jonów i substratów, a takŜe obecnością specyficznych Veccptorów dla odbioru sygnałów, np. hormonów. Błony plazmatyczne wymieniają takŜe składniki ze Środowiskiem pozakomórkowym w procesach egzocytozy i endocytozy, zaś specjalne przestrzenie w strukturze błon — złącza szczelinowe — umoŜliwiają wymianę materiału między przylegającymi komórkami. Dzięki istnieniu błon moŜliwe jest takŜe powstawanie wyspecjalizowanych odrębnych obszarów (kompartmentów) wewnątrz komórek. Takie wewnątrzkomórkowe błony otaczają wiele morfologicznie odrębnych struktur (organelli), np. mitochondria, siateczkę śródplazmatyczną, siateczkę sarkoplazmatyczną, aparat

Golgiego, ziarnistości wy dziel nicze, lizosomy i błonę jądrową. Błony, lokalizując enzymy działają jako integralne elementy w stymulacji sprzęŜenia pobudzenie — odpowiedź oraz są miejscami transdukcji energii np. w procesach fotosyntezy i oksydacyjnej fosforyiacji.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Większe zmiany w strukturze błon mogą zakłócić równowagę wodną i przepływ jonów, a tym samym kaŜdy z procesów zachodzących wewnątrz komórki. Specyficzne niedostatki lub zmiany określonych składników błon prowadzą do wielu chorób. Przykładami tego są m.in.: nieobecność w lizosomach kwaśnej maltazy, wywołująca chorobę związaną z gromadzeniem glikogenu typu II; brak przenośnika jodkowego wywołujący wrodzone powiększenie tarczycy (p, ryc. 47-2); zaburzenie w endocytozie lipoprotein o małej gęstości, będące przyczyną hipercholesterolemii i wczesnego rozwoju choroby naczyń wieńcowych. Prawidłowy stan błon gwarantuje normalne funkcjonowanie komórek.

550 / ROZDZIAŁ 43

UTRZYMYWANIE NORMALNEGO ŚRODOWISKA WOKÓŁ I WEWNĄTRZ KOMÓRKI JEST WYMOGIEM PODST AWOWYM śycie powstało w środowisku wodnym; reakcje enzymatyczne, procesy komórkowe, subkomórkowe i inne rozpoczęły się w tym ośrodku. Skoro większość ssaków Ŝyje w środowisku gazowym, to w jaki sposób utrzymywane jest środowisko wodne? To zadanie, dzięki zatrzymaniu i kompartmentyzacji wody w organizmie, spełniają właśnie błony komórkowe. Woda w organizmie jest kompartmentyzowana Woda stanowi ok. 56% beztłuszczowej masy ciała ludzkiego i rozmieszczona jest w dwóch duŜych obszarach.

Płyn wewnątrzkomórkowy lub śródkomórkowy (ICF — intracellular fluid). Ten obszar obejmuje -f całkowitej ilości wody i stanowi środowisko dla; 1) wytwarzania, magazynowania i wykorzystania energii; 2) procesów samonaprawczych; 3) replikacji i 4) wykonywania określonych funkcji.

Płyn zewnątrzkomórkowy lub pozakomórkowy (ECF — extracellular fluid). Ten obszar zawiera ok. y ogól no ustrój owej ilości wody rozdzielonej między osoczem krwi a kompartmentem śródmiąŜszowym. Płyn pozakomórkowy jest układem dostawczym. Tą drogą dostarczane są do komórek składniki odŜywcze (np. glukoza, kwasy tłuszczowe, aminokwasy), tlen, róŜne jony, w tym pierwiastki śladowe i wiele związków regulujących (hormonów), które koordynują funkcje znacznie oddalonych od siebie komórek. Płyn pozakomórkowy usuwa dwutlenek węgla, substancje odpadowe, składniki toksyczne i produkty detoksykacji z bezpośredniego środowiska komórkowego. Skład jonowy środowiska śród kom orkowego róŜni się znacznie od składu jonowego środowiska pozakomórkowego Jak pokazano w tab. 43-1 środowisko wewnętrzne komórki jest bogate w K + i Mg2+, a podstawowym anionem jest jon fosforanowy. Płyn pozakomórkowy charakteryzuje się duŜą zawartością Na+ i Ca2+, a podstawowym anionem jest tu jon chlorkowy Cl~. NaleŜy zwrócić uwagę na stęŜenie glukozy,' które jest większe w płynie pozakomórkowym niŜ wewnątrz ko-

Tabela 43-1. Porównanie średniego stęŜenia róŜnych substancji wewnątrz i na zewnątrz komórek zwierzęcych Substancja Płyn pozaPłyn śród komórkowy komórkowy Na + K

+

140 mmol/l

10 mmol/l

4 mmol/l

140 mmol/l

Ca 2 + (zjonizowany)

2,5 mmol/l

0,1 mmol/l

Mg2

1.5 mmol/l 100 mmol/l

30 mmol/l 4 mmoi/l

27 mmol/l

10 mmol/l

2 mmol/i

60 mmol/l

ciHCO3

Białka Glukoza

70 g/l* 5,5 mmol/l

160 g/l 0-1 mmol/l

* Dotyczy stęŜenia białka w osoczu. W płynie śródmiąŜszowym stęŜenie białka jest < 20 g/l (przyp tłum.}.

mórki. StęŜenie białek, odwrotnie niŜ glukozy, jest większe wewnątrz komórek niŜ w płynie pozakomórkowym. Skąd taka róŜnica? Przypuszcza się, Ŝe pierwotne morze, w którym powstało Ŝycie, było bogate w K+ i Mg2 + . Z tego teŜ wynika, Ŝe reakcje enzymatyczne i inne procesy biologiczne zachodzą najlepiej w tym właśnie środowisku i od tego czasu istnieje to wysokie stęŜenie tych jonów wewnątrz komórek. Komórki były naraŜone na znaczną selekcję w okresie, kiedy morze stopniowo zmieniało swój skład i stało się bogate w Na+ i Ca2+. Do wytworzenia całkowicie nowego zestawu procesów biochemicznych i nowej maszynerii fizjologicznej konieczne byłyby ogromne zmiany; zamiast tego komórki wytworzyły bariery — błony z wbudowanymi w nie pompami, aby zachować wewnętrzne mi kro środowisko. BŁONY SĄ ZŁOśONYMI STRUKTURAMI ZBUDOWANYMI Z LIPIDÓW, BIAŁEK I WĘGLOWODANÓW RóŜne błony wewnątrz komórki i między komórkami zbudowane są z róŜnych składników, jak to wykazuje stosunek białek do lipidów (ryc. 43-1). RóŜnice te nie są zaskakujące, jeŜeli bierze się pod uwagę bardzo zróŜnicowane

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 551

lo,23

Kwasy tłuszczowe

85

. Mlellna 0, Komórki

R,-C-O-'CH,

wątroby

I

o-

myszy

I >>CH,-0-

Pręciki siatkówki wołu

P-0-Rj

■0

Erytrocyty ludzkie

1.1

Ameba

1.3

Komórki HeLa

Gllcerol

Alkohol

Ryc. 43-2. Fosfogliceryd z umiejscowieniem kwasów tłuszczowych (R1 i R2), glicerolu i fosforylowanego alkoholu. W kwasie fosfatydowym R3 jest wodorem.

1.5

Zewnętrzna błona mltochondrlalna

1.1

Siateczka śródplazmatyczna

2,0

Wewnętrzna błona mltochondrialna

3,2 i

0

i

1 2 3 Stosunek białek do lipidów

i

4

Ryc:43-1. Stosunek białek do lipidów w róŜnych błonach. Białka występują w jednakowych iloś ciach lub przewyŜszają ilości lipidów niemal we wszystkich błonach. Wyjątkowym odstępstwem jest mielina, elektryczny izolator występujący w wielu włóknach nerwowych.

funkcje tych Won. Są one asymetrycznymi zamkniętymi strukturami warstwowymi mającymi powierzchnie zewnętrzne i wewnętrzne. Te warstwowe struktury są niekowalencyjnymi zbiorami stabilnymi i aktywnymi biochemicznie. W błonach zakotwiczone są określone cząsteczki białek, i tu właśnie pełnią specyficzne funkcje charakterystyczne dla organelli, komórek, czy teŜ organizmu. Podstawowymi lipidami błon komórek zwierzęcych są fosfolipidy, glikosfingolipidy i cholesterol Fosfolipidy. Spośród dwóch głównych grup fosfolipidów występujących w błonach fosfoglicerydy występują częściej. Składają się

one ze szkieletu glicerolowego, do którego przyłączone są dwa kwasy tłuszczowe wiązaniem

estrowym i jeden fosforylowany alkohol (ryc. 43-2). Wymienione kwasy tłuszczowe są zwykle cząsteczkami o jednakowej liczbie atomów węgla. Najczęściej występują w nich 14- lub 16-węglowe łańcuchy. Kwasy te nie są rozgałęzione i mogą występować zarówno w postaci nasyconej, jak i nienasyconej. Najprostszym fosfoglicerydem jest kwas fosfatydowy, który jest l,2-diacyloglicero-3-fosforanem. Jest to podstawowy związek pośredni w tworzeniu się wszystkich innych fosfolipidów (p. rozdz. 25). W innych fosfolipidach fosforan w pozycji 3 jest estryfikowany alkoholem, takim jak etanoloamina, cholina. seryna, glicerol lub inozytol (p. str. 173). Druga klasa fosfolipidów to sfingomieliny, które mają szkielet sfingozynowy, a nie glicerolowy. Kwas tłuszczowy przyłączony jest wiązaniem amidowym do grupy aminowej sfingozyny. Pierwszorzędowa grupa hydroksylowa sfingozyny jest estryfikowana przez fosfocholinę. Sfingomieliny, co odzwierciedla ich nazwa, są głównymi składnikami osłonek mielinowych. Glikosfingolipidy. Są lipidami zawierającymi składnik węglowodanowy. Są nimi cerebrozydy i gangliozydy, będące równieŜ pochodnymi sfingozyny. Cerebrozydy i gangliozydy róŜnią się od sfingomielin podstawnikiem przyłączonym do pierwszorzędowej grupy hydroksylowej sfingozyny. W sfingomielin ach fosfocholina jest przyłączona do grupy alkoholowej. Cerebrozyd zawiera w tym miejscu pojedynczą resztę heksozy będącą glukozą lub galaktozą. Gangliozyd zawiera łańcuch 3 lub więcej węglowodanów, z których przynajmniej jeden jest kwasem sjalowym przyłączonym do pierwszorzędowego alkoholu, jakim jest sfingozyna.

552 / ROZDZIAŁ 43

Sterole. Najczęściej występującym w błonach sterolem jest cholesterol, który występuje niemal wyłącznie w błonach plazmatycznych komórek zwierzęcych, lecz moŜe występować takŜe, choć w mniejszych ilościach, w mitochondriach, aparacie Golgiego i w błonach jądrowych. Cholesterol występuje zwykle w większej ilości w zewnętrznej stronie błon plazmatycznych. Wchodzi on między fosfolipidy błon kierując swoją grupę hydroksylową w stronę fazy wodnej, a pozostałą część cząsteczki w stronę dwuwarstwy. W temperaturach powyŜej przejścia fazowego (patrz dyskusja o modelu płynnej mozaiki, poniŜej), jego sztywny pierścień sterolowy oddziałuje z łańcuchami acylowymi fosfolipidów, limitując ich ruchliwość i tym samym zmniejszając płynność błon. Z drugiej strony, gdy temperatury zbliŜają się do temperatury przejścia fazowego, interakcja cholesterolu z łańcuchami acylowymi interferuje z ich wyrównywaniem (jeden wobec drugiego); to zjawisko zmniejsza temperaturę, w której ciecz przechodzi w Ŝel, co obserwuje się przy utrzymywaniu błon w niŜszych temperaturach.

byłyby nierozpuszczalne w oleju, a rozpuszczalne w wodzie. Amfipatyczne lipidy błonowe mają polarne główki i niepolarne ogony, jak to przedstawiono na ryc. 43-3. Nasycone kwasy tłuszczowe tworzą proste ogony, podczas gdy nienasycone kwasy tłuszczowe, które zwykle występują w błonach w postaci cis. tworzą skręcone ogony. Im więcej skrętów jest w ogonie, tym mniej gęsto upakowane stają się błony i tym bardziej są one ciekłe. Detergenty są amfipatycznymi cząsteczkami waŜnymi zarówno w biochemii, jak i w gospodarstwie domowym. Ich struktura cząsteczkowa jest podobna do struktury fosfolipidów. Lipidy błon ułoŜone są dwuwarstwowo Amfipatyczny charakter fosfolipidów sugeruje, Ŝe obydwa regiony tych cząsteczek mają niezgodne rozpuszczalności; jednak w takich rozpuszczalnikach jak woda fosfolipidy organizują się w postać „zadowalającą" termodynamicznie oba regiony, Micella (ryc. 43-4) to właśnie

Błony są amf ipatyczne Wszystkie podstawowe lipidy występujące w błonach zawierają zarówno regiony hydrofobowe, jak i hydrofilowe, i dlatego nazywane sa amfipatycznymi. Gdyby hydrofobowe regiony były oddzielone od reszty cząsteczki, byłyby one nierozpuszczalne w wodzie, ale rozpuszczalne w oleju. Odwrotnie, gdyby hydrofilowe regiony były oddzielone od reszty cząsteczki, Polarna główka Niepolarne węglowodorowe ogony

S S

Ryc. 43-3. Schematyczne przedstawienie fosfolipidu bądź innego lipidu błon Polarna grupa główki jest hydrofitowa, a węglowodorowy łańcuch jest hydrofobowy lub lipofilowy. Kwasy tłuszczowe w ogonach są nasycone (S) lub nienasycone (U). Kwasy S są przyłączone do glicerolu przy węglu 1, a kwasy U przy węglu 2.

Ryc. 43-4. Schematyczny przekrój micelli. Polarne grupy główki znajdują się w wodzie, podczas gdy hydrofobowe węglowodorowe ogony otoczone są innymi węglowodorami i dlatego chronione są przed wodą. Micelie są strukturami sferycznymi.

taka struktura: hydrofobowe regiony są osłonięte od wody, podczas gdy hydrofilowe grupy polarne ulokowane są w środowisku wodnym.

Lipidowa dwu warstwa. Jak wykazali to biisko 60 lat temu Gorter i Grendel; warstwa bimolekularna, czy teŜ podwójna, moŜe spełniać termodynamiczne wymagania amfipatycz-

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 553

nych cząsteczek w środowisku wodnym. Dwuwarstwar istnieje jako arkusz, w którym hydrofobowe regiony fosfo lipid ów są chronione przed środowiskiem wodnym, podczas gdy hydrofilowe regiony są zanurzone w wodzie (ryc. 43-5). Tylko regiony hydrofitowe albo naroŜa Roztwór wodny

cze*

mu Ul

hydrofobo-

hydratu owa Roztwór wodny Ryc. 43-5. Schemat poprzecznego cięcia przez dwuwarstwę błony utworzonej z cząsteczek fosfolipidowych. Ogony nienasyconych kwasów tłuszczowych są załamane i wymagając więcej miejsca oddalają od siebie polarne główki ułatwiając tym samym moŜliwość przemieszczeń. To jest przyczyną większej „płynności" błony, (Rycina nieznacznie zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Stryer L, Biochemistry, wyd, 2, Freeman, 1981),

dwuwarstwowego arkusza są eksponowane na niesprzyjające środowisko, lecz nawet te eksponowane naroŜa mogą być eliminowane dzięki załamaniu „arkusza" w celu stworzenia zamkniętego pęcherzyka bez naroŜy. Zamknięta dwuwarstwa stanowi jedną z najbardziej istotnych właściwości błon. Jest ona nierozpuszczalna dla większości rozpuszczalnych w wodzie cząsteczek, gdyŜ byłyby one nierozpuszczalne w hydrofobowym wnętrzu dwuwarstwy.

Natychmiast pojawiają się dwie kwestie. Pierwsza, ile materiału biologicznego rozpuszcza się w tłuszczach i tym samym moŜe łatwo przedostać się do komórki? Gazy, takie jak tlen, dwutlenek węgla i azot, jako matę cząsteczki reagujące w niewielkim stopniu z rozpuszczalnikami łatwo dyfundują przez hydrofobowe regiony błony. Łatwo przechodzą przez dwuwarstwy pochodne lipidów, np. hormony steroidowe. Organiczne cząsteczki nie będące elektrolitami cechują się szybkością dyfuzji zaleŜną od współczynników podziału w układzie olej—woda (ryc. 43-6); im większa jest zdolność cząsteczki do rozpuszczania się w oleju, tym większa jest szybkość dyfuzji przez błony. Druga kwestia dotyczy cząsteczek, które nie są rozpuszczalne w tłuszczach. W jaki sposób ukształtowują się przezbłonowe gradienty stęŜeń dla cząsteczek nierozpuszczalnych w tłuszczach? Odpowiedź na to pytanie związana jest z występowaniem w błonach białek, są one bowiem takŜe cząsteczkami amfipatycznymi, które mogą być wbudowane w odpowiednie regiony amfipatyczne lipidowej dwuwarstwy. Białka tworzą kanały dla ruchu jonów i małych cząsteczek, a takŜe słuŜą jako przenośniki dla większych cząsteczek, które w inny sposób nie mogłyby przejść przez dwuwarstwe. Proces ten opisano poniŜej. Białka błon są związane z lipidową dwuwarstwa Fosfolipidy błon działają jako rozpuszczalniki dla białek membranowych, tworząc środowisko, w którym białka te mogą pełnić swoje funkcje. Spośród 20 aminokwasów tworzących pierwszorzędową strukturę białek grupy funkcyjne związane z a atomem węgla są silnie

Tryptolan I-

Kr"

10""

Glukoza oza \

Indol

Mocznik Gllcerol

Wi

10=

10" 10-* 10" 10Wspdłczynnlk przanlkalnoiol (cm/s) Mała----------------------------- > DuŜa PrzenikalnoBc

Y 43-6. Współczynniki przenikałności dla wody, niektórych jonów i innych małych cząsteczek w liptdowych dwuwarstwach błon. Cząsteczki, które szybko przechodzą przez określoną błonę, określa się jako mające wysoki współczynnik przenikania. (Według: Stryer L, Biochemistry wyd., 2. Freeman, 1981, nieznacznie zmodyfikowana, za zezwoleniem).

554 / ROZDZIAŁ 43

hydrofobowe w 6 przypadkach, słabo hydrofobowe w kilku przypadkach, a w pozostałych aminokwasach nawet hydrofilowe. Jak to opisano w rozdz. 6, oc-helikalna struktura białek minimalizuje hydrofllowy charakter wiązań peptydowych. Tym samym białka mogą mieć charakter amfipatyczny i tworzą integralną część błony, gdzie hydrofilowe regiony wystają zarówno do wnętrza, jak i na zewnątrz, przy czym hydrofobowe regiony przenikają przez hydrofobowe wnętrze dwuwarstwy. W istocie, te części białek membranowych, które przenikają btony, mają znaczącą ilość hydrofobowych aminokwasów i duŜą zawartość struktur a-helikalnych lub składających się w arkusze p. Liczba róŜnych białek w błonie wynosi 6—8 w siateczce sarkoplazmatycznej, a ponad 100 w błonach plazm a tycz nych. W ich skład wchodzą: enzymy, białka transportujące, białka strukturalne, antygeny zgodności tkankowej i receptory dla róŜnych cząsteczek. PoniewaŜ kaŜda błona ma róŜny skład białek, nie moŜe istnieć takie pojęcie jak typowa struktura błon. Enzymatyczne właściwości kilku róŜnych błon przedstawiono w tab. 43-2. Tabela 43-2. Enzymatyczne markery w róŜnych błonach* Enzymy Błony Błona piazmatyczna

Siateczka śródplazmatyczna

5'nukleotydaza Cyklaza adenylanowa Na7K + ATPaza G1 u kozo - 6 - f osf ataza

Aparat Golgiego

Galaktozylotransferaza

Wewnętrzne btony mitochondrialne

Syntaza ATP

' Błony zawierają wiele białek. Niektóre z nich mają aktywność enzymatyczną, niektóre zlokalizowane są wyłącznie w określonych błonach i dlatego mogą być uŜyte jako markery śledzenia stopnia oczyszczania błon.

Błony i ich składniki są dynamicznymi struk-

turami. Lipidy i białka w błonach cechują się szybkościami obrotu metabolicznego podobnymi do tych, jakie występują w innych obszarach komórki. RóŜne lipidy mają róŜne szybkości obrotu metabolicznego. RównieŜ róŜne białka membranowe cechują się znacznym zróŜnicowaniem szybkości obrotu metabolicznego. Błona sama w sobie moŜe przekształcić się

szybciej niŜ kaŜdy z jej składników. Ten problem jest dyskutowany z większymi szczegółami w rozdziale poświęconym endocytozie. WaŜną cechą błon jest asymetria Asymetria jest częściowo spowodowana nieregularnym rozmieszczeniem białek w błonach. Asymetria typu wewnątrz—zewnątrz jest takŜe spowodowana zewnętrzną lokalizacją węglowodanów przyłączonych do białek membranowych. Dodatkowo, specyficzne enzymy są zlokalizowane wyłącznie po stronie zewnętrznej lub wewnętrznej błon, jak np. w błonach mitochondrialnych i plazmatycznych. Istnieją równieŜ regionalne asymetrie w błonach. Niektóre, np. występujące na kosmkowym biegunie komórek śluzówkowych, są widoczne niemal makroskopowo. Inne, takie jak w złączach szczelinowych, w złączach zwartych i w synapsach, pojawiają się w mniejszych regionach błon i generują odpowiednio mniejsze lokalne asymetrie. Istnieje równieŜ asymetria poprzeczna (wewnątrz—zewnątrz) fosfolipidów. Zawierające cholinę fosfolipidy (fosfatydylocho)ina i sfingomielina) zlokalizowane są przede wszystkim w zewnętrznej molekularnej warstwie: aminofosfolipidy (fosfatydyloseryna i etanol o a mi na) zaś w warstwie wewnętrznej. Cholesterol zasadniczo występuje w większych ilościach w warstwie zewnętrznej niŜ w wewnętrznej. Oczywiście, jeŜeli taka asymetria w ogóle istnieje, to ruchliwość poprzeczna fosfolipidów membranowych (flip-flop) powinna być ograniczona. W rzeczywistości, fosfolipidy w syntetycznych dwuwarstwach cechują się niezwykle powolną szybkością procesu flip-flop; okres półtrwania tej asymetrii moŜe wynosić dni lub tygodnie. Jednak, gdy określone białka membranowe, takie jak białko błony plazmatycznej erytrocytów, glikoforyna, są sztucznie wbudowane do syntetycznej dwuwarstwy, częstość procesu flip-flop fosfolipidów moŜe wzrosnąć nawet 100-krotnie. Mechanizmy rządzące asymetrią lipidów nie są znane. Enzymy związane z syntezą fosfolipidów zlokalizowane są po cytoplazmatycznej stronie błon pęcherzyków mik roso mai nych. Przypuszcza się więc, Ŝe istnieją translokazy, które przenoszą określone fosfolipidy z wewnętrznej warstwy do zewnętrznej. RównieŜ specyficzne białka, które w sposób preferencyjny wiąŜą określone fosfolipidy, mogą występować w dwóch arkuszach, co prowadzi do asy met-

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 555

rycznego rozmieszczenia cząsteczek lipidowych. Istnieją integralne i powierzchniowe białka membranowe Większość białek membranowych to integralne składniki błon (współdziałają one z fosfolipidami) i w rzeczywistości wszystkie z tych, które były dokładnie badane, zajmują 5—10 nm w poprzek dwuwarstwy. Te integralne białka są zwykle globularne i amfipatyczne. Składają się one z 2 hydrofilowych końców rozdzielonych hydrofobowym regionem, który przecina hydrofobowe wnętrze dwuwarstwy. Im lepiej poznaje się strukturę integralnych białek: membranowych, tym bardziej oczywisty staje się fakt, Ŝe niektóre z nich (szczególnie cząsteczki transportujące) mogą przenikać przez dwuwarstwę wiele razy, co przedstawiono na ryc. 43-9, Integralne białka są asymetrycznie wbudowane w dwuwarstwę błony (ryc. 43-7). Niektóre białka uzyskały swą asymetryczną orientację w błonie w czasie ich wbudowywania

do dwuwarstwy lipidowej. Hydrofilowe zewnętrzne regiony amfipatycznego białka, które zostały zsyntetyzowane wewnątrz komórki, muszą przeniknąć przez hydrofobowe wnętrze błony, aby znaleźć się na zewnątrz niej. Na przykład ankiry na, białko peryferyjne, jest związana z integralnym białkiem ,,band III" błony erytrocytów. Spektryna, cyt o szkielet owa struktura wewnątrz erytrocytu, jest związana z ankiryną, przez co odgrywa waŜną rolę w utrzymaniu jego dwuwklęsłego kształtu. Cząsteczki immunoglobulin w błonach plazmatycznych limfocytów są integralnymi białkami membranowymi i mogą być uwolnione dzięki zrzuceniu z siebie małych fragmentów błon. Wiele cząsteczek receptorów hormonalnych to białka integralne, zaś specyficzne hormony polipeptydowe, które wiązane są przez te cząsteczki receptorowe, mogą przez to być uznane za białka peryferyjne. Białka peryferyjne, takie jak hormony peptydowe, mogą nawet organizować rozmieszczenie białek integralnych, jak np. ich receptory w płaszczyźnie dwuwarstwy (patrz poniŜej).

Łańcuchy węglowodanowe

Biatka integralne

Białka peryferyjne

Lipid

Ryc. 43-7. Model płynnej mozaiki opisujący strukturę błon. Błona składa się zdwucząsteczkowej warstwy lipidów z białkami, które albo są wbudowane do niej, albo związane są z jej cytoplszmatyczną powierzchnią. Integralne białka błon są silnie zakotwiczone w warstwie lipidowej. Niektóre z tych białek przenikają błony całkowicie wystając jak gdyby z obu stron~dw u warstwy i nazywane są białkami transmembranowymi, podczas gdy inne białka zakotwiczone są w zewnętrznej lub wewnętrznej warstwie lipidowej dwuwarstwy. Luźno związane z wewnętrzną powierzchnią błony są biatka peryferyjne. Wiele z tych białek i tłuszczów ma wystające na zewnątrz łańcuchy oligosacharydowe. (Według: Junqueira L C, Carbeiro J., Long J. A.: Basie Histology, wyd, 5, Appletan i Lange, 1986, za zezwoleniem), _________

S56 / ROZDZIAŁ 43

SZTUCZNE BŁONY MOGĄ BYĆ UśYTE DO BADANIA FUNKCJI BŁON Sztuczne systemy błonowe mogą być przygotowane róŜnymi metodami. Systemy te zasadniczo składają się z jednego lub więcej fosfohpidów pochodzenia naturalnego lub syntetycznych, które mogą być spreparowane (np. przez łagodną sonifikację) w postaci sferycznych pęcherzyków, w których lipidy tworzą dwuwarstwę. Takie pęcherzyki otoczone dwuwarstwą lipidów nazywamy liposomami. Niektóre z zalet stosowania sztucznych systemów membranowych w badaniach funkcji błon opisano poniŜej. Skład lipidów błon moŜna zmienić, co pozwala na systematyczne badania wpływu zmiennego składu lipidów na określone funkcje błon. Dla przykładu, pęcherzyki mogą być utworzone wyłącznie z fosfatydylocholiny lub, alternatywnie, z określonej mieszaniny róŜnych fosfolipidów. glikolipidów i cholesterolu. Ro dzaje kwasów tłuszczowych uŜytych lipidów mogą równieŜ być zmieniane dzięki zastosowa niu syntetycznych lipidów o znanym składzie, co umoŜliwia systematyczne badanie wpływu składu kwasów tłuszczowych na określone fun kcje błon (np. transport). Oczyszczone białka membranowe lub en zymy mogą być wbudowywanc do pęcherzyków w celu wyjaśnienia, jakie czynniki (np. specyfi czne lipidy lub pomocnicze białka) są wymaga ne przez białka, aby przywrócić ich funkcję. Badania oczyszczonych białek, np. Ca2+/ATP-azy siateczki sarkoplazmatycznej, w określo nych przypadkach sugerowały, Ŝe do regenera cji pompy jonowej są wymagane tylko pojedyn cze białko i pojedynczy lipid. Środowisko tych systemów moŜe być do kładnie kontrolowane i systematycznie zmienia ne (np. stęŜenie jonowe). Systemy te mogą być równieŜ eksponowane na róŜne znane ligandy, jeŜeli, dla przykładu, liposomy zawierają specy ficzne receptory białkowe. Gdy sporządza się liposomy, moŜna „na ładować"' je określonymi substancjami, np. le kami lub izolowanymi genami. Istnieje duŜe zainteresowanie badaniami nad uŜyciem liposomów do dystrybucji leków do określonych tkanek. Gdyby niektóre składniki (np. przeciw ciała wobec określonych cząsteczek zlokalizo wanych na powierzchni komórki) mogły być wbudowane do liposomów w taki sposób, aby liposomy te trafiały do określonych tkanek lub

nowotworów, efekt terapeutyczny mógłby być istotny. DNA zamknięty wewnątrz liposomów staje się mniej wraŜliwy na ataki nukleaz; to podejście moŜe być uŜyteczne w terapii genowej.

FUNKCJONALNIE BŁONY SĄ DWUWYMIAROWYMI ROZTWORAMI INTEGRALNYCH GLOBULARNYCH BIAŁEK ROZPUSZCZONYCH W CIEKŁEJ FOSFOLIPIDOWEJ MACIERZY Ten model płynnej mozaiki dotyczący struktury bion został zaproponowany w 1972 r. przez Singera i Nicolsona (ryc. 43-7). Wcześniejszym potwierdzeniem tego modelu była szybka i przypadkowa redystrybucja gatunkowo specyficznych integralnych białek w błonie plazmatycznej komórki będącej między gatunkową hybrydą utworzoną przez sztuczną fuzję dwóch róŜnych komórek rodzicielskich. Później wykazano, Ŝe fosfolipidy równieŜ ulegają szybkiej redystrybucji w płaszczyźnie błony. Dyfuzja ta, nazywana dyfuzją translacyjną (boczną),*moŜe być bardzo szybka; w rzeczywistości, jedna cząsteczka fosfolipidu moŜe w płaszczyźnie błony przemieszczać się o kilka mikrometrów na sekundę. Zmiany fazowe, a tym samym konsystencja błon, są ściśle zaleŜne od składu lipidów tworzą-

cych je. W lipidowej dwuwarslwie łańcuchy hydrofobowe kwasów tłuszczowych mogą być bardzo wyrównane lub uporządkowane dla zabezpieczenia stosunkowo sztywnej struktury. Gdy temperatura wzrośnie, hydrofobowe łańcuchy boczne przechodzą ze stanu uporządkowanego do stanu nieuporządkowanego uzyskując cieczopodobną lub ciekłą konsystencję. Temperatura, w której struktura przechodzi z uporządkowanej w nieuporządkowaną, nosi nazwę temperatury przejścia fazowego. DłuŜsze i bardziej nasycone łańcuchy kwasów tłuszczowych cechują się wyŜszymi temperaturami przejścia fazowego, tzn. wymagają wyŜszych temperatur do zmiany struktury na ciekłą. Nienasycone wiązania, które istnieją w konfiguracji cis, powodują upłynnianie dwuwarstwy przez zmniejszenie zwartości upakowania łańcuchów bocznych bez zmniejszania ich hydrofobowości (ryc. 43-3). Fosfolipidy błon komórkowych zwykle zawierają przynajmniej 1 nienasycony kwas tłuszczowy z przynajmniej 1 wiązaniem podwójnym typu cis.

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 557 Cholesterol działa takŜe jako cząsteczka regulacyjna w błonach, wytwarzając stany pośredniej

TWORZENIE SIĘ BŁON

płynności. JeŜeli acylowy łańcuch boczny występuje w fazie nieuporządkowanej, cholesterol będzie wywierał wpływ kondensujący; jeŜeli zaś acylowy łańcuch boczny będzie uporządkowany lub w krystalicznej fazie, cholesterol wprowadzi nieu po rząd kowanie. Przy duŜych wartościach stosunku cholesterol/fosfolipid, temperatury przejścia fazowego są niewyznaczalne. Płynność Won w istotnym stopniu determinuje ich funkcje. JeŜeli płynność ta wzrasta, zwiększa się równieŜ ich przepuszczalność dla wody i małych hydrofilowych cząsteczek. Ze wzrostem płynności błon zwiększa się takŜe mobilność boczna integralnych białek. JeŜeli aktywna część białka integralnego odpowiedzialna za określone funkcje znajduje się wyłącznie w jego regionach hydrofilowych, to zmiana płynności lipidów będzie prawdopodobnie miała jedynie niewielki wpływ na aktywność tego białka; jeŜeli jednak białko to uczestniczy w funkcji transportowej, a biorące udział w transporcie składniki przenikają przez błonę, to zjawiska zachodzące w fazie tipidowej mogą w istotny sposób wpływać na szybkość transportu. Wyjątkowo dobrym przykładem zmian funkcji wywołanych zmianami w płynności jest receptor insulinowy (p. rozdz. 52). Gdy stęŜenie nienasyconych kwasów tłuszczowych w błonie wzrasta (przy hodowli komórkowej w poŜywce bogatej w takie cząsteczki) zwiększa się równieŜ płynność błony. To zmienia receptor do tego stopnia, Ŝe wiąŜe on więcej insuliny. Stan ciekłości i stan mobilności bocznej moŜe w pewnych warunkach być ograniczony do określonych regionów w błonie. Przykładem są interakcje białko-białko, zachodzące w płaszczyźnie błony, które powodują, Ŝe integralne białka tworzą sztywną macierz w przeciwieństwie do częściej spotykanych sytuacji, gdzie lipidy działają jako macierz. Złącza szczelinowe, złącza zwarte i regiony zawierające bakteriorodopsynę szkarłatnych błon halobakterii są dobrymi przykładami koegzystencji przylegających do siebie róŜnych macierzy. Niektóre z oddziaływań białko-białko w płaszczyźnie błony mogą następować za pośrednictwem peryferyjnych białek wiąŜących, takich jak przeciwciała lub lektyny, które znane są ze zdolności do umiejscawiania się na powierzchni błon. W taki sposób peryferyjne białka, dzięki zdolności do specyficznych przyłączeń, mogą ograniczać ruchliwość białek integralnych w błonie.

Oceniając tworzenie błon trzeba wziąć pod uwagę zarówno lipidy, jak i białka. Omówienie tych pierwszych będzie krótkie, gdyŜ niewiele wiadomo o tym, w jaki sposób lipidy są wbudowywane w błony. Więcej uwagi poświęcimy natomiast wbudowywaniu białek w błony siateczki śródplazmatycznej (ER), aparatu Golgiego (GA) i powierzchni komórek (błony plazmatyczne) zwierzęcych. Zostaną omówione takŜe inne problemy, które pojawiły się przy ocenie biosyntezy innych błon (np. mitochondriów). DuŜe znaczenie ma fakt, Ŝe sekwencja specyficznych aminokwasów (lub mannozo-6-fosforanu w przypadku lizosomów) ukierunkowuje wiele białek do jedynej w swoim rodzaju lokalizacji w komórce. Zlokalizowanie takich białek w odpowiednich organellach następuje za pośrednictwem sygnału. Wyjaśnienie sekwencji docelowych ułatwiła w znaczącym stopniu technologia rekombinacji DNA. UmoŜliwia ona takŜe wprowadzenie do białek lub wycięcie z nich określonych sekwencji. Cząsteczki cDNA dla tak zmienionych białek mogą być wbudowane do odpowiednich komórek drogą transfekcji; zmiany w komórkowym rozmieszczeniu są potem wykrywane za pomocą fluoryzujących przeciwciał lub innymi technikami. Wydzielane białka zwykle przed opuszczeniem komórki przechodzą od siateczki śródplazmatycznej (ER) do aparatu Golgiego (GA), a stąd do błony plazmatycznej (PM) (ER -» GA -*PM). Ten fakt uzasadnia omawianie niektórych aspektów ich biosyntezy. Jest oczywiste, Ŝe tego rodzaju białka powinny zawierać specyficzne sekwencje oznaczające, Ŝe są one zdolne do sekrecji, lub alternatywnie białka te muszą wykazywać brak sygnałów sprawiających, Ŝe inne białka stają się rezydentami membran. Wydaje się, Ŝe dane pozwalające odróŜnić te dwie moŜliwości będą niedługo dostępne.

Asymetria błon powstaje w czasie ich tworzenia Aparat Golgiego i pęcherzyki siateczki śródplazmatycznej (ER) wykazują poprzeczną asymetrię zarówno lipidów, jak i białek, a asymetrie te powstają w czasie fuzji z błonami plazmatycznymi. Wnętrze pęcherzyka po fuzji staje się zewnętrzną stroną błony plazmatycznej, a cytoplazmatyczna strona pęcherzyka pozostaje cytoplazmatyczną stroną błony (ryc. 43-8). Poprzeczna asymetria w błonach istnieje w pę-

558 / ROZDZIAŁ 43 Białka błonowe

Zewnętrzna powierzchnia

Błona plazmatyczna pech

Cytoplazma

Białka Integralna Błona pęcherzyka

Ryc. 43-8. Zlewanie się pęcherzyków z błoną plazmatyczną zachowuje orientację kaŜdego białka integralnego zakotwiczonego w dwuwarstwie pęcherzyków. Początkowo N-koniec białka skierowany jest do wnętrza pęcherzyka. Po fuzji N-koniec znajduje się na zewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej. Fakt, Ŝe orientacja białka nie została odwrócona, wynika ze spostrzeŜenia, Ŝe drugi koniec cząsteczki, Ckoniec, jest zawsze zanurzony w cytoplazmie. Światło pęcherzyka i przestrzeń pozakomórkowa są topologicznie równowaŜne względem opisanego przekształcenia. (Wedtug: Lodish H. F., Rothman J. E.: The assembfy of celi membranes; Sci. Am. 1979, 240, 43, za zezwoleniem).

cherzykach ER zanim zleją się one z błoną plazmatyczną, dlatego teŜ głównym problemem montaŜu błon jest sposób, w jaki integralne białka mogą być wbudowywane asymetrycznie w lipidową dwuwarstwe siateczki śródplazmatycznej. " Główną klasą lipidów w błonach są fosfolipidy. Enzymy odpowiedzialne za syntezę

fosfolipidów zlokalizowane są na powierzchni cytoplazmatycznej cystern siateczki śródplazmatycznej. Skoro fosfolipidy zlokalizowane są po tej stronie siateczki, wbudowywują się one prawdopodobnie samorzutnie w term ody namicznie stabilne dwucząsteczkowe warstwy, powodując rozrastanie się błony i promując tym samym odłączenie się od niej pęcherzyków lipi-

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 559 N

N N

N Cytocfirom b, Pod jednostka POWIERZCHNIA POZACYTOPLftZMATYCZNA

RoŜna przenośniki (np. glukozy Neuramidaza wirusa grypy Receptor as]aloglikcp'otemowy Receptor transteryny część niezmienna łańcucha HLA—DR

C Receptory i i IGF-1

receptora acetylocholiny Rodopsyna wolowa

Raca oto r LDL CięŜki taflCUCtl HLA-A Hemaglutynina indukowana wirusem grypy

Ryc. 43-9. RóŜnorodność mechanizmów insercji białek do błon. Ta schematyczna reprezentacja przedstawiająca wiele moŜliwych orientacji pokazuje część peptydu wewnątrz błony jako a-heliksy), a inne jego części jako linie. N to NH2-koniec, a Cto COOH-koniec. (Według: Wickner W. T., Lodish H. F.: Multiple mechanisms of protein insertion into and across membranes. Science 1985, 230, 400. Copyright (C) 1985 by the American Association for ihe Advancement of Sciences, za zezwoleniem).

dowych. Ten proces określa się jako formowanie błon. Takie pęcherzyki lipidowe rozpoczynają swoją wędrówkę i zlewają się z innymi błonami, takimi jak błony aparatu Goigiego. które z kolei mogą zlewać się z błonami plazmatycznymi. Białka cytoplazmy, które wychwytują fosfolipidy z jednej błony i przenoszą je do innej nazywane są białkami wymiany fosfolipidowej.

Prawdopodobnie wpływają one na specyficzny skład lipidów w róŜnych błonach. RóŜnorodność dróg, jakimi białka są wbudowywane w błony, pokazano na ryc, 43-9. Modele kaŜdego z tych typów wbudowywania nie będą przedstawione w tym opracowaniu, zostaną natomiast omówione w zarysie problemy dotyczące wbudowywania białek w błony siateczki śródplazma ty cznej i aparatu Golgiego, a takŜe w błony plazmatyezne.

Hipoteza „sygnałowa" opisuje montaŜ błon Hipotezę sygnałową zaproponowali Sabatini i Blobel. Wykazali oni, Ŝe białka syntetyzowane na związanych z błoną polirybosomach (np.

białka sekrecyjne, niektóre integralne białka błon plazmatycznych, błon aparatu Golgiego, błon siateczki śródplazmatycznej) miały na

N-końcu wydłuŜenie peptydowe, tzw. peptyd sygnałowy, który był odpowiedzialny za ich wiązanie z błonami siateczki. Białka, których synteza przebiegała w całości na wolnych polirybosomach (np, białka cytozolowe, zewnętrzne białka wewnętrznej strony błon plazma tycznych, mitochondrialne białka kodowane przez jądrowy DNA, białka peroksysomalne) nie mają tego sygnałowego peptydu. WaŜnym aspektem tej hipotezy jest zasygnalizowanie, iŜ wszystkie cytoplazmatyczne rybosomy mają tę samą strukturę i Ŝe róŜnice między rybosomami związanymi z błoną a wolnymi zaleŜą wyłącznie od wyŜej omówionych białek, które mają sygnałowe peptydy. Wiele doświadczeń potwierdziło tę oryginalną hipotezę. Przebieg syntezy wielu białek membranowych na polirybosomach związanych z błonami potwierdza, Ŝe hipoteza sygnałowa odgrywa istotną rolę w koncepcji tworzenia błon. Niektóre właściwości peptydów sygnałowych zostały podsumowane w tab. 43-3. Rycina 43-10 przedstawia podstawowe cechy hipotezy sygnałowej w odniesieniu do przenikania białek sekrecyjnych przez błonę ER. Cząsteczki mRNAdla takich białek mają zakodowane informacje dla sygnałowego peptydu lokalizując go przy N-końcu. Białko wbudowuje sie

560 / ROZDZIAŁ 43 Tabela 43-3. Niektóre właściwości peptydów sygnałowych Zwykte, ale nie zawsze, zlokalizowane są przy N-końcu Zawierają ok. 12—25 aminokwasów Metionina jest zwykle N-końcowym aminokwasem Zawierają centralny pęk hydrofobowych aminokwasów Zawierają co najmniej 1 dodatnio naładowany aminokwas połoŜony blisko N-końca Zwykle odszczepiają przy C-końcu resztę Ala przy udziale sygnałowej peptydazy

w błonę równolegle z translacją jego mRNA na polisomach. Proces ten nazywamy insercją kotranslacyjną Gdy sygnałowa sekwencja białka wynurza się z rybosomu, jest ona rozpoznawana przez cząsteczkę rozpoznającą sygnał (SRP — signal recognition particle), która blokuje dalszą translacje wtedy, gdy zostało spolimery-

zowanych ok. 70 aminokwasów (40 schowane w duŜym rybosomalnym kompleksie, a 30 wystaje na zewnątrz). Cząsteczka SRP zawiera 6 białek i jest związana z 7S RNA, który jest ściśle spokrewniony Z sekwencją rodziny Alu często powtarzającą się w DNA (p. rozdz. 38). Blok SRP nie jest uwalniany dopóki kompleks SRP-sekwencja glówna-rybosom jest związany z tzw. ,.białkiem dokowym" będącym receptorem dla SRP na siateczce śródplazmatycznej. K.otranskcyjna insercja tego białka do siateczki rozpoczyna się wtedy w tym właśnie miejscu. Proces wydłuŜania się pozostałej części cząsteczki białka kieruje powstające białko w całą szerokość lipidowej dwuwarstwy, gdyŜ rybosomy pozostają przyłączone do retikulum. W ten sposób powstaje szorstka strona siateczki śródplazmatycznej (ribosome studded ER). Rybosomy pozostają przyłączone do niej w czasie syntezy białek membranowych, ale są uwalniane i rozpadają się na podjednostki, gdy

Peptyd sygnałowy SRP

Receptor ryb os o mowy

Receptor sygnałowy

Ryc. 43-10. Schemat hipotezy sygnałowej dla transportu białek wydzielniczych przez błony siateczki śródplazmatycznej. Rybosomy syntetyzujące białko przemieszczają się wzdłuŜ informacyjnego RNA ustalając sekwencję aminokwasów w białku (informacyjny RMA oznaczony jest linią między 5' a 3'). Kodon AUG oznacza stan informacji dla białka. Linia poprzecznie kreskowana, występująca po AUG, reprezentuje kodony dla sygnałowej sekwencji. W miarę rozrastania się białka i jego wystawania poza duŜą rybosomalną podjednostkę sygnalna sekwencja jest eksponowana i wiąŜe się z cząsteczką rozpoznającą sygnał (SRP — signai recognition particle}. Translacja jest blokowana dopóki kompleks nie zwiąŜe się z „białkiem dokowym" oznaczonym czarnym słupkiem na błonie siateczki śródplazmatycznej. Jest tam takŜe receptor (nie zaczerniony słupek) dla samego rybosomu. Interakcja rybosomu i powiększającego się łańcucha peptydowego z błoną siateczki śródplazmatycznej powoduje otwarcie porów, przez które białko jest transportowane do wewnętrznej przestrzeni śródpiazmatycznej siateczki. W czasie transportu sygnałowa sekwencja większości białek zostaje usunięta przez enzym zwany sygnałową peptydazą. Kompletne białko jest albo uwolnione przez rybosom, który potem rozpada się na swoje dwie składowe, tj, małą i duŜą podjednostkę rybosomu. Koniec biafka znajduje się wewnątrz siateczki śródplazmatycznej. (Według: Newly madę proteins zip through the celi; Science 1980, 207, 154. Copyright © 1980 by the American Association for the Advancement of Science, nieznacznie zmodyfikowana, za zezwoleniem).

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 561

synteza białka jest zakończona, ©łowna sekwencja jest nacinana przez peptydazę sygnałową, a węglowodan zostaje przyłączony w momencie, gdy wcześniej zsyntetyzowana część białka wchodzi do wnętrza siateczki. Integralne białka membranowe siateczki śródplazmatycznej, takie jak cytochrom P-450, nie przenikają całkowicie przez błonę. Zamiast tego rezydują one w błonie siateczki mając nienaruszony peptyd sygnałowy. Najwidoczniej ich przejściu przez tę błonę zapobiega sekwencja aminokwasów zwana sygnałem stop. Wydzielane białka przenikają całkowicie przez membranową dwuwarstwę i są wyrzucane do światła siateczki. Składniki węglowodanowe są przyłączone (zwykle przez dolichoio-pirofosfo-oligosacharydy, p. rozdz. 57) dopiero wtedy, gdy białka przechodzą przez wewnętrzną cześć błony siateczki śródplazmatycznej. Proces ten nosi nazwę kotranslacyjnej glikozylacji. To jest przyczyną, Ŝe białka wydzielnicze znajdujemy w świetle aparatu Golgiego, gdzie ich węglowodanowe łańcuchy są modyfikowane przed wydzieleniem. Istnieją powaŜne dowody, Ŝe główna sekwencja wiodąca uczestniczy w procesie insercji białek do błon siateczki. Zmutowane białka zawierające zmienioną sekwencję wiodącą, w której hydrofobowy aminokwas zastąpiony jest aminokwasem hydrofilowym, nie są wbudowywane w błony siateczki. Białka niemembranowe, jak hemoglobina, do których sygnałowe sekwencje zostały włączone metodami inŜynierii genetycznej, mogą być wbudowywane do błon, a nawet wydzielane. Białka mogą być wbudowywane do błon siateczki endoplazmatycznej w róŜny sposób Mechanizmy związane z insercją białek do błon obejmują: Kotranslacyjną insercję za pośrednictwem sygnału stop — np. cytochrom P-450 (p. wyŜej). Syntezę na wolnych polirybosomach i póź niejsze przyłączenie do błony siateczki śródplaz matycznej — np. cytochrom b5. Zatrzymywanie w obrębie siateczki endo plazmatycznej przez specyficzne sekwencje aminokwasowe. Ostatnie badania wykazały, Ŝe wiele białek ma sekwencję KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) na C-końcu. Ta sekwencja powodu je, Ŝe będą one przyłączone do wewnętrznej ściany cysterny siateczki śródplazmatycznej względnie luźno. 36 - Biochemia

■ 4. Niektóre biajka przeznaczone dla błon siateczki śródplazmatycznej mogą przejść do aparatu Golgiego drogą transportu pęcherzykowego, a potem powrócić do siateczki, aby być do niej wbudowane. PowyŜsza lista wskazuje, Ŝe w biosyntezę białek błony siateczki jest włączonych wiele zróŜnicowanych mechanizmów; podobna sytuacja prawdopodobnie występuje i w innych błonach (np. mitochondrialnych i plazmatycznych). Sekwencje docelowe zostały zidentyfikowane jedynie dla kilku z wymienionych wyŜej mechanizmów (np. sekwencje KDEL). Wykazano, Ŝe obrót lipidów w błonach siateczki śródplazmatycznej wątroby szczura jest generalnie znacznie szybszy niŜ obrót białek, co oznacza, Ŝe obrót lipidów i obrót białek są od siebie niezaleŜne. RównieŜ szybkość obrotu białek tych błon jest zmienna w szerokim zakresie, niektóre wykazują szybkie (godziny), inne powolne (dni) obroty. Dlatego teŜ poszczególne lipidy i białka błon siateczki są wbudowane w nie w sposób względnie niezaleŜny od siebie; jest to zjawisko charakterystyczne dla większości błon. Białka przemieszczają się przez komórkowe obszary do właściwych błon Schemat ilustrujący moŜliwy przepływ białek membranowych drogą ER -» GA -» PM pokazany jest na ryc. 43-11. Poziome strzałki określają etapy transportu, które mogą być niezaleŜne od sygnałów docelowych. Przepływ określonych białek membranowych z siateczki do błony plaŜmatycznej (opisywany jako przepływ masowy, gdyŜ nie jest on wybiórczy), moŜe zachodzić bez Ŝadnych sekwencji docelowych uczestniczących w tym procesie. Z drugiej strony insercją stałych białek membranowych do siateczki śródplazmatycznej i aparatu Golgiego moŜe zaleŜeć od specyficznych sygnałów (np. KDEL lub sekwencji stop dla siateczki). Podobnie transport do Hzosomów i do pęcherzyków wydzielniczych moŜe takŜe następować za pośrednictwem sygnałów (mannozo-6-fosforan w przypadku określonych enzymów lizosomalnych). Podstawowy mechanizm umoŜliwiający dotarcie białka syntetyzowanego na związanych z błonami polirybosomach do struktur aparatu Golgiego lub błony plazmatycznej drogą przepływu masowego oparty jest na transporcie pęcherzykowym. Nie wiadomo dziś, w jaki sposób białka syntetyzowane na szorstkiej stronie

562 / ROZDZIAŁ 43 Lizosomy

Siateczka Śród plazma. tycz na

Ap. Go Ig lego -cis {powierz ohnla tworząca)

O

Ap. Goiglego strefa przejściowa

O

Ap.GoIglagc -trans (powierzchnia

dojrzewająca) -ty

Powierzchnia komórki

O Pęcfterzykl wydztałnlcze

Ryc. 43-11. Przepływ białek błonowych z siateczki śródplazmatycznej na powierzchnię komórki. Poziome strzałki oznaczają etapy, które zostały uznane za niezaleŜne od sygnałów i dlatego reprezentują one przepływ masowy. Otwarte pionowe strzałki w kolejnych kwadratach wskazują na retencję białek, które znajdują się w błonach zaznaczonych organelli. Otwarte pionowe strzałki poza narysowanymi prostokątami wskazują na uwarunkowany sygnałem transport do lizosomów i do zapasowych ziarnistości sekrecyjnych (Według Pfeffer i Rothman, 1987).

siateczki są wbudowywane do odpowiednich pęcherzyków. Pęcherzyki uczestniczące w przepływie masowym wydają się być wolne od klatryny, podczas gdy te pęcherzyki, które związane są z docelowym transportem białek do lizosomów i do pęcherzyków wydziel ni czy ch, wydają się być pokryte tym białkiem. Nie zostało jeszcze potwierdzone istnienie specyficznych sekwencji, które kodują sygnały wskazujące ich przeznaczenie dla aparatu Golgiego lub błony plazmatycznej. Wydaje się prawdopodobne, Ŝe niektóre białka przeznaczone do wbudowania do błony plazm a tycz nej drogą transportu pęcherzykowego mogą nie zawierać specyficznych sygnałów i Ŝe ich ostateczne przeznaczenie wynika z braku innej moŜliwości. Nie wyjaśniono równieŜ dotychczas, czy pojedyncze pęcherzyki (łatwo widoczne w mikroskopie elektronowym) zawierają tylko jedno białko czy wiele białek. Aparat Golgiego pełni dwie waŜne roie w syntezie błon; 1) uczestniczy w modyfikowaniu łańcuchów oligosacharyd owych błon i innych N-wiązanych glikoprotein (rozdz. 57); 2) bierze udział w sortowaniu róŜnych białek zgodnie z ich wewnątrzkomórkowym przeznaczeniem. Wszystkie składowe aparatu Golgiego uczestniczą w pierwszym punkcie, podczas gdy powierzchnia dojrzewania trans aparatu Golgiego uczestniczy szczególnie w drugim punkcie i jest bardzo bogata w pęcherzyki. Określone białka wewnętrznej strony błony plazmatycznej mogą być syntetyzowane na wolnych rybosomach, a dopiero potem zostają wbudowane w błony siateczki. Ostatnie osiągnięcia wykorzystujące system in vitro do badania transpor-

tu pęcherzykowego i losów transportowanych przez nie białek powinny wyjaśnić wiele problemów z tym związanych. Mitochondrialne białka syntetyzowane są w mitochondriach i poza nimi * Mitochondria zawierają wiele białek. Określone białka (np. niektóre białka integralne błon) są syntetyzowane w mitochondriach przy uŜyciu mitochondrialnego układu syntezy białek. Jednak większość białek syntetyzowana jest na zewnątrz mitochondriów i muszą one być przeniesione do środka. Szczególnie dobrym układem dla badań mechanizmów importu takich białek mitochondrialnych okazały się komórki droŜdŜy. Największe osiągnięcia zarejestrowano w badaniach nad białkami występującymi w mitochondrialnej macierzy (np. podjednostki FjATP-azy). Te białka są syntetyzowane na wolnych polirybosomach. Kolejno przechodzą one przez zewnętrzne i wewnętrzne błony mitochondriów, aby dotrzeć do celu. Przypuszcza się, Ŝe muszą one być w formie niep o fałdowanej, aby przejść przez te błony. ATP musi być obecny, aby mógł nastąpić import białek. Nie jest jeszcze jasne, czy ATP wpływa na potencjał elektryczny, czy na siły protonomotoryczne działające w poprzek błony wewnętrznej, czy teŜ odgrywa on jakąś rolę w rozwijaniu się importowanego biatka. Wykazano, Ŝe te białka zawierają sekwencję sygnałową, o długości do 70 aminokwasów, która musi zawierać takŜe określone dodatnio naładowane aminokwasy. Ta sekwencja jest równoznaczna sygnałowi peptydowemu, kierującemu te białka do macierzy;

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 563

gdy to wydłuŜenie peptydowe zostanie odcięte, białka te nie będą miały moŜliwości wnikania. Na powierzchni zewnętrznej błony mitochondrialnej istnieją prawdopodobnie receptory dla importowanych białek. Presekwencja moŜe być odszczepiona przez metaloproteazy występujące w macierzy. Niektóre inne białka mitochondrialne nie zawierają presekwencji, co sugeruje istnienie wielu mechanizmów i dróg wykorzystywanych przez białka w celu wniknięcia do mitochondriów. Szczególnymi przypadkami są lizosomy i inne organelle Jak napisano w rozdz. 57, określone hydrolazy przeznaczone dla lizosomów zawierają reszty mannozo-6-fosforanu, który znakuje je w szczególnym celu. Coraz więcej dowodów potwierdza istnienie swoistych sekwencji dla znakowania białek przeznaczonych dla innych organelli, takich jak jądra i peroksysomy; problem ten jest przedmiotem intensywnych badań. Niektóre z poznanych sekwencji lub sygnałów, które doprowadzają róŜne białka do ich właściwych wewnątrzkomórkowych lokalizacji, przedstawiono w tab. 43-4. Tabela 43-4. Sekwencje lub związki, które kierują białka do określonych organelli Sekwencja lub związek

Docelowe organelle

Sekwencja peptydu sygnałowego Sekwencja KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) Sekwencja N-końcowa (70-resztowy fragment)

Błony siateczki Luminaina strona błon siateczki Mitochondrium

Krótkie sekwencje za- Jądro sadowych aminokwasów Mannozo-6-fosforan

Lizosomy

WYBIÓRCZOŚC BŁON OKREŚLA ICH WYSPECJALIZOWANE FUNKCJE JeŜeli błona plazmatyczna jest względnie nieprzepuszczalna, to w jaki sposób większość cząsteczek dostaje się do komórki? W jaki sposób zapewniona jest wybiórczość tego przenikania? Odpowiedzi na te pytania są waŜne dla zrozumienia, jak komórki dostosowują się do stale zmieniającego się środowiska zewnątrz-

komórkowego. Aby złoŜone biologiczne procesy mogły być koordynowane, wielokomórkowe organizmy muszą takŜe mieć środki dla komunikowania się między przylegającymi i odległymi komórkami. Te sygnały muszą dotrzeć do błony i przejść przez nią, lub teŜ muszą powstać jako konsekwencja pewnych interakcji z błoną. Niektóre z głównych mechanizmów wykorzystywanych do tych celów przedstawiono w tab. 43-5. Tabela 43-5. Przenoszenie materiału i informacji przez błony Ruch małych cząsteczek przez błony Dyfuzja (bierna i ułatwiona) Aktywny transport Ruch duŜych cząsteczek przez błony Endocytoza Egzocytoza Transmisja sygnałów przez błony Receptory powierzchni komórek Transdukcja sygnałów (np. glukagon -»cAMP) InPrnalizacjasygnału (sprzęŜonazendocytozą, np. receptor LDL) Ruch do wewnątrzkomórkowych receptorów {hormony steroidowe; rodzaj dyfuzji) Międzykomórkowy kontakt i komunikacja

Niektóre małe cząsteczki przechodzą przez błony Cząsteczki mogą biernie przenikać przez dwuwarstwę zgodnie z elektrochemicznym gradientem w wyniku prostej lub ułatwionej dyfuzji. To spontaniczne przemieszczanie w kierunku równowagi kontrastuje z aktywnym transportem, który wymaga energii, gdyŜ ruchy są przeciwne do elektrochemicznego gradientu. Na rycinie 43-12 przedstawiono schemat tych zjawisk. Bierna dyfuzja. Jak opisano powyŜej, niektóre substancje rozpuszczone, takie jak gazy, mogą wnikać do komórki dyfundując zgodnie z elektrochemicznym gradientem przez błonę, co nie wymaga energii metabolicznej. Prosta dyfuzja przez błonę jest ograniczona termiczną „agitacją" danej molekuły, a takŜe przez gradient stęŜeń w poprzek membrany i przez rozpuszczalność substancji rozpuszczanej (współczynnik przenikania, ryc. 43-6) w hydrofobowym wnętrzu dwuwarstwy błony. Rozpu-

564 / ROZDZIAŁ 43 Transportowana \ Białko Kanałowe Btatko nośnikowe

/^

n

Gradient elektrochemiczny

Dwuwarstwa llpidowa

/ V Prosta dyfuzja

\

Dyfuzja ułatwiona

Transport bierny

Transport aktywny

Ryc. 43-12. Wiele małych nie naładowanych cząsteczek przechodzi swobodnie przez lipidową dwuwarstwę. Naładowane cząsteczki, większe nie naładowane cząsteczki i niektóre małe nie naładowane cząsteczki przenoszone są przez kanały i pory lub przez specyficzne białka transportowe. Bierny transport następuje zawsze zgodnie z gradientem elektrochemicznym w kierunku równowagi. Aktywny transport zachodzi w kierunku przeciwnym do elektrochemicznego gradientu i wymaga wydatkowania energii, podczas gdy transport bierny nie wymaga energii. {Według: Alberts B. i wsp.; Moleculw Biology of the Celi. Garland, 1983, za zezwoleniem).

szczalność jest odwrotnie proporcjonalna do ilości wiązań wodorowych, które muszą zostać rozenvane, aby umoŜliwić substancji rozpuszczonej, znajdującej się w zewnętrznej fazie wodnej, wbudowanie się w,hydrofobową dwuwarstwę. Elektrolity, jako słabo rozpuszczalne w lipidach, nie tworzą wiązań wodorowych z wodą, ale tworzą otoczki z wody dla hydratacji na drodze elektrostatycznej interakcji. Wielkość tej otoczki jest wprost proporcjonalna do gęstości ładunku jonu. Jony z duŜą gęstością ładunku mają większą otoczkę hydratacyjną i przez to mniejszą szybkość dyfuzji. Na+ np. ma większą gęstość ładunku niŜ K+. Uwodniony jon sodu jest więc większy niŜ uwodniony jon potasu i dlatego potas przenika łatwiej przez błony. W naturalnych błonach, w przeciwieństwie do syntetycznych dwuwarstw membranowych, istnieją przezbłonowe kanały, będące strukturami przypominającymi pory, które zbudowane są z białek tworzących szlaki wybiórczego przewodzenia jonowego. Kanary przewodzenia ka-

tionowego mają średnicę otworów 5—8 nm i są ujemnie naładowane wewnątrz kanału. Przepuszczalność kanału zaleŜy od wielkości jonu, wielkości jego hydratacji i od wartości gęstości ładunku jonu. Wykazano istnienie specyficznych kanałów dla jonów Na + , K+ i Ca2+. Błony komórek nerwowych zawierają dobrze zbadane kanały jonowe, które odpowiedzialne są za potencjały czynnościowe powstające w poprzek błony. Aktywność niektórych z tych kanałów jest kontrolowana przez neurotransmitery; dlatego teŜ aktywność kanałów moŜe być regulowana. Jeden jon moŜe regulować aktywność kanału innego jonu. Dla przykładu, spadek stęŜenia jonu Ca2+ w płynie pozakomórkowym powoduje wzrost przepuszczalności błon i wzrost dyfuzji jonów Na+. To depolaryzuje błony i wyzwala bodziec nerwowy. Zjawisko to moŜe tłumaczyć pojawienie się zdrętwienia, mrowienia i skurczów mięśni, tak charakterystycznych dla stanów chorobowych przebiegających z niskimi stęŜeniami jonów wapnia w surowicy.

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 565

Kanały są otwarte tylko przez krótki okres, co znaczy, Ŝe są bramkowane. Bramki mogą otwierać się lub zamykać. W kanałach bramkowanych ligandami określona cząsteczka wiąŜe się z receptorem i otwiera kanał. Kanały bramkowane napięciem otwierają sie (lub zamykają) w odpowiedzi na zmianę potencjału błonowego. Niektóre drobnoustroje są zdolne do syntezy małych organicznych cząsteczek, zwanych jonoforami, które funkcjonują na zasadzie ruchu posuwisto-zwrotnego, „wahadłowego" (zasada „czółenka") w celu przemieszczania jonów przez błonę. Jonofory te zawierają hydrofilowe centra, które wiąŜą okreśJone jony i jednocześnie są otoczone przez peryferyjne regiony hydrofobowe; taka struktura pozwala cząsteczkom rozpuszczać się dobrze w błonach i dyfundować przez nie. Inne cząsteczki, jak np. dobrze zbadany polipeptyd gramicydyna, zdolne są do tworzenia kanałów. Toksyny bakteryjne, takie jak toksyna błonicy, i aktywne składniki dopełniacza, mogą wytworzyć duŜe pory w błonie komórkowej, dzięki czemu moŜliwe staje się przejście makromolekuł bezpośrednio do płynu śródkomórkowego. Podsumowując, czysta dyfuzja substancji zaleŜy od: 1) jej gradientu stęŜeń w poprzek błony (substancje rozpuszczane przemieszczają się w kierunku od duŜych do małych stęŜeń); 2) pola elektrycznego w poprzek błony (substancje rozpuszczane przemieszczają się w kierunku roztworu mającego przeciwny ładunek); 3) współczynnika przepuszczalności danej substancji przez błonę; 4) gradientu ciśnienia hyd-

rostatycznego w poprzek błony (wzrost ciśnienia spowoduje wzrost szybkości i częstości zetknięć cząsteczki z błoną); 5) temperatury (podwyŜszenie temperatury spowoduje wzrost ruchliwości cząsteczek, co zwiększa częstotliwość kolizji między nimi a błoną).

UŁATWIONA DYFUZJA I AKTYWNY TRANSPORT Systemy transportowe moŜna opisać w sensie funkcjonalnym na podstawie liczby przenoszonych cząsteczek oraz na podstawie kierunku ruchu (ryc. 43-13), lub teŜ uwzględniając, czy odbywa się on w kierunku uzyskania równowagi, czy odwrotnie. System uniportowy powoduje dwukierunkowy ruch określonej cząsteczki. W systemach kotransportowych przeniesienie jednej substancji rozpuszczonej zaleŜy od stechiometrycznych równoległych lub kolejno po sobie następujących przeniesień innych substancji rozpuszczonych. Symport opisuje ruchy takich substancji rozpuszczonych w tym samym kierunku. Przykładem są transporty proton-węglowodan w bakteriach oraz Na "'"-węglowodan (glukoza, mannoza, galaktoza, ksyloza i arabinoza), a takŜe Na+-aminokwasowe transporty w komórkach ssaków. Antyportowe systemy odpowiedzialne są za ruch dwóch cząsteczek w przeciwnych kierunkach (np. Na+ do środka i Ca2+ na zewnątrz). Cząsteczki, które nie mogą w sposób samorzutny swobodnie być przenoszone przez Iipidową dwuwarstwę błon,

JDwuwarstwa Hpldowa

Unlport

Symport

Antyport

Kotransport

c. 43-13. Schematyczne przedstawienie rodzajów systemów transportowych, Transportery mogą być klasyfikowane uwzględniając kierunek ich ruchu, lub teŜ fakt, czy przemieszczana jest jedna czy więcej specyficznych cząsteczek. (Według: Alberts B. i wsp.; Molecular Biology of łhe Celi. Garland, 1983, za zezwoleniem).

566 / ROZDZIAŁ 43

czynią to przez asocjację z białkami transportującymi. W to zjawisko włączone są dwa procesy: ułatwiona dyfuzja i aktywny transport, a takŜe bardzo specyficzne systemy transportowe. Ułatwiona dyfuzja i aktywny transport mają wiele cech wspólnych. Oba przebiegają z udziałem białek, transportujących i oba wykazują specyficzność dla jonów, węglowodanów i aminokwasów. Badania mutacji w komórkach bakteryjnych i zwierzęcych (włączywszy takie, które dotyczą chorób u ludzi) potwierdziły te przypuszczenia. Ułatwiona dyfuzja i aktywny transport przypominają reakcje substrat-enzym z wyjątkiem występowania kowalencyjnej interakcji. Podobieństwa są następujące: 1) istnieje specyficzne miejsce wiązania dla substancji rozpuszczonej; 2) białko transportujące jest wysycane, dlatego teŜ istnieją maksymalne szybkości transportu (Vmas; p. ryc. 43-14); 3) istnieje stała wiązania (Km) dla substancji rozDyfuzja .

bierna

2 L

Dyfuzja za pośrednictwem nośnika

czas gdy aktywny transport przebiega zwykle w jednym kierunku; 2) aktywny transport zwykle zachodzi w kierunku przeciwnym do pola elektrycznego lub chemicznego gradientu, dlatego teŜ wymaga energii. Ułatwiona dyfuzja. Niektóre substancje rozpuszczone dyfundują zgodnie z gradientem elektrochemicznym przez błonę znacznie szybciej niŜ moŜna oczekiwać na podstawie ich wielkości, ładunku lub wartości współczynnika podziału. Ta ułatwiona dyfuzja cechuje się odmiennymi właściwościami od tych, które znane są dla prostej dyfuzji. Szybkość ułatwionej dyfuzji będącej systemem miiportowym moŜe osiągnąć stan nasycenia; oznacza to, Ŝe liczba miejsc biorących udział w dyfuzji określonej substancji rozpuszczonej jest wielkością skończoną. Wiele systemów ułatwionej dyfuzji cechuje się stereo specyficznością, jednak podobnie jak prosta dyfuzja nie wymagają one energii metabolicznej. Jak opisano wcześniej, zewnętrzno-wewnętrzna asymetria białek membranowych jest wielkością stałą, a ruchliwość białek w poprzek (raczej niŜ do) błony jest nieczęsta; dlatego poprzeczna ruchliwość specyficznych białek transportujących nie jest prawdopodobnie uwarunkowana procesami ułatwionej dyfuzji, z wyjątkiem tych, które uczestniczą w jonoforach mikroorganizmów, co opisano wcześniej. Mechanizm „ping-pong" (ryc. 43-15) tłumaczy ułatwioną dyfuzję. W tym modelu białko

StęŜenie substancji rozpuszczonej Ryc. 43-14. Porównanie kinetyki dyfuzji z udziałem transportera (ułatwionej) z bierną dyfuzją. Szybkość ruchu wiej ostatniej jest wprost proporcjonalna do stęŜenia substancji rozpuszczonej, podczas gdy proces wykazuje cechy nasycenia, gdy uczestniczy w nim transporter. Vm3X oznacza maksymalną szybkość. StęŜenie w połowie maksymalnej szybkości jest zgodne ze stałą wiązania (Km ) Transportera dla substancji rozpuszczonej.

puszczonej i dlatego cały system moŜe być opisany przez Km (p. ryc. 43-14); 4) struktural nie podobne inhibitory kompetycyjne blokują transport. P Zasadnicze róŜnice są następujące: 1) ułatwiona dyfuzja moŜe być dwukierunkowa, pod-

transportujące istnieje w dwu podstawowych konformacjach. W stanie ,,pong" jest ono eksponowane na duŜe stęŜenia substancji rozpuszczonej i cząsteczki tej substancji przyłączają się do specyficznych miejsc w białku transportującym. Transport zachodzi wtedy, gdy zmiana /konformacyjna wystawi białko transportujące w stronę niŜszych stęŜeń substancji rozpuszczonej (stan „ping"). Proces ten jest całkowicie odwracalny i rzeczywisty przepływ w poprzek błony zaleŜy od gradientu stęŜenia. Szybkość, z którą substancja rozpuszczona wchodzi do komórki na zasadzie ułatwionej dyfuzji, wyznaczona jest następującymi czynnikami: 1) gradientem stęŜenia w poprzek błony; 2) ilością białka transportującego (jest to główny czynnik kontrolny); 3) szybkością oddziaływania między substancją rozpuszczoną a białkiem transportującym; 4) szybkością zmiany konformacyjnej obu stanów białka, naładowanego substancją rozpuszczoną i uwolnionego od substancji rozpuszczonej.

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 567

oo Ryc, 43-15. Model „ping-pong" ułatwionej dyfuzji. Białko transportujące (zakreskowane struktury) w dwuwarstwie lipidowej ascocjuje z substancją rozpuszczoną w wysokich stęŜeniach na jednej stronie btony. Następnie dochodzi do konformacyjnej zmiany („pong" do „ping") i substancja rozpuszczona jest rozładowana od strony nowej równowagi Pusty przenośnik powraca wtedy do swojej oryginalnej konformacji („ping" do „pong"), aby zamknąć cykl przemiany.

Hormony regulują ułatwioną dyfuzję przez zmiany w liczbie dostępnych białek transportujących. Insulina zwiększa transport glukozy w tkance tłuszczowej i w mięśniach czerpiąc białka transportujące z zapasów wewnątrzkomórkowych (p. ryc. 52-9). Insulina zwiększa takŜe transport aminokwasów w wątrobie i innych tkankach. Jedną z koordynowanych akcji hormonów glikokortykoidowych jest wzmoŜenie transportu aminokwasów do wątroby, gdzie słuŜą one jako substraty dla procesu glukoneogenezy. Hormony wzrostu zwiększają transport aminokwasów do wszystkich komórek, a estrogeny do tych, które znajdują sie w macicy. Istnieje co najmniej 5 róŜnych układów transportujących dla aminokwasów w komórkach zwierzęcych. KaŜdy z nich jest swoisty dla grupy blisko spokrewnionych aminokwasów, a większość z nich działa w systemie symportu Na+ (ryc. 43-13).

STRONA WEWNĘTRZNA

STRONA ZEWNĘTRZNA

ATP

+

+

Transport aktywny. Proces aktywnego

Ryc 43-16. Stechiometria pompy Na /K -ATP-+ aza. Ta pompa przenosi 3 jony !Ma z wnętrza komórki na jej zewnętrzną stronę i wprowadza + 2 jony K z zewnętrznej strony do jej wnętrza na kaŜdą cząsteczkę ATPhydrolizowartądo AD P przez związaną z błoną ATP-azę. Strofantyna i inne glikozydy nasercowe hamują działanie tej pompy przez oddziaływanie na zewnątrzkomórkową powierzchnię błony (dzięki uprzejmości R. Post).

transportu róŜni się od dyfuzji tym, Ŝe cząsteczki przenoszone są niezgodnie z równowagą termodynamiczną; dlatego teŜ wymagana jest tu energia. Jej źródłem moŜe być hydroliza. ATP, ruch elektronów lub światło. Utrzymywanie gradientów elektrochemicznych w układach biologicznych jest tak waŜne, Ŝe pochłania to ok. 30—40% energii wydatkowanej w komórce. W zasadzie komórki utrzymują wewnątrz niskie stęŜenie Na+ i wysokie stęŜenie K4 (tab. 43-1), wraz z ujemnym potencjałem elektrycznym wewnątrz. Pompą, która utrzymuje te gradienty, jest A PT-aza, która jest aktywowana przez Na+ i K+ (ryc. 43-16). ATP-aza ta jest

integralnym białkiem membranowym i do uaktywnienia wymaga fosfolipidów. Ma ona katalityczne centra zarówno dla ATP, jak i dla Na+ po cytoplazmatycznej stronie błony, ale miejsce wiązania K f zlokalizowane jest po zewnętrznej stronie błony komórkowej. Strofantyna lub inne giikozydy naparstnicy hamują tę ATP-azę przez wiązanie do zewnątrzkomorkowych domen. Zjawisko to moŜe być antagonizowane przez zewnątrzkomórkowy K+.

568 / ROZDZIAŁ 43 Przewodzenie bodźców nerwowych zachodzi w górę i w dół błony Błona utworzona na powierzchni komórek neuronalnych utrzymuje róŜnicę potencjałów elektrycznych miedzy wnętrzem a „zewnętrzem" (napięcie elektryczne) i jest elektrycznie wzbudzalna. Gdy zostanie pobudzona bodźcem chemicznym, za pośrednictwem specyficznego synaptycznego receptora błonowego (patrz dyskusja o przenoszeniu biochemicznych sygnałów, poniŜej), otwory w błonie otwierają się, aby umoŜHwić szybkie wnikanie Na+ lub CaJ+ (połączone lub nie połączone z wypływem K+), Prowadzi to do szybkiego zaniku istniejącego gradientu napięcia, dzięki czemu ten odcinek błony ulega depolaryzacji. Pompy jonowe w Wonie jednak szybko odtwarzają to napięcie. Gdy duŜe powierzchnie błony ulegają w ten sposób depolaryzacji, to zaburzenia elektrochemiczne przemieszczają się w sposób podobny do fali wzdłuŜ błony generując impuls nerwowy. Osłonki mielinowe wytworzone przez komórki Schwanna pokrywają włókna nerwowe tworząc elektryczny izolator, który otacza większość nerwu i znacznie przyspiesza propagację fali (sygnału) umoŜliwiając wypływ lub napływ jonów tylko w miejscach błony nie pokrytych izolatorem. Osłona mtelinowa zbudowana jest z fosfolipidów, głównie z sfingomieliny i cholesterolu, a takŜe z białka i glikosfin go lipidów. Związanych jest z nią zaledwie kilka białek integralnych lub peryferyjnych; to one powodują utrzymywanie się razem wielu membranowych dwuwarstw tworzących hydrofobową izolacyjną strukturę, nieprzepuszczalną dla jonów i wody. Ntektóre choroby, jak stwardnienie rozsiane czy zespół Guillain-Barre, charakteryzują się demielinizacją i zaburzeniami przewodzenia nerwowego. Istnieje kilka mechanizmów transportu glukozy W tym rozdziale zostanie omówionych kilka mechanizmów transportu glukozy. Aby mogła być ona wykorzystana jako źródło energii, musi wniknąć do komórki. W adypocytach i w mięśniach glukoza wnika do komórek za pośrednictwem specyficznego systemu transportowego, który wspomagany jest przez insulinę. Zmiany w transporcie są przede wszystkim spowodowane zmianami Vma:i (prawdopodobnie spowodowane przez większą liczbę1 lub przez bardziej aktywne przenośniki), ale moŜna takŜe zaobserwować zmiany w K„. Transport glukozy moŜ-

na rozpatrywać w róŜnym ujęciu. Jego zasady opisano wyŜej. Glukoza i Na+ wiąŜą się w róŜnych miejscach na przenośniku glukozowym. Na+ przenika do komórki zgodnie z elektrochemicznym gradientem i pociąga glukozę za sobą (ryc. 43-17), Dlatego im wyŜszy jest graSWIATŁO JELITA

Glukoza PŁYN POZAKOM0HK0WY Ryc. 43-17. Przezkomórkowy ruch glukozy w komórkach jelita Glukoza przechodzi za jonem Na* przez luminalną błonę komórek nabłonkowych. Gradient Na*, który napędza ten aymport, wy twarza się przez wymianę Na+/K+, zachodzącą na błonie podstawowej w stronę przestrzeni pO2akomórkowej. Glukoza występująca w wysokich stę Ŝeniach wewnątrz komórki przemieszcza się zgod nie z gradientem stęŜeń do płynu poza komórkowe go na drodze ułatwionej dyfuzji (mechanizm uniportu). _____ _____________

dient Na+, tym więcej glukozy wnika do komórki, natomiast gdy stęŜenie Na+ w płynie pozakomórkowym jest małe, dokomórkowy transport glukozy zatrzymuje się. Dła utrzymania duŜego gradientu Na+, symport Na+-glukoza zaleŜny jest od gradientów generowanych przez pompę Na+/K+, która utrzymuje małe wewnątrzkomórkowe stęŜenie Na + . Podobne mechanizmy obserwuje się przy transporcie innych węglowodanów, a takŜe aminokwasów. Przezkomórkowy transport węglowodanów wymaga jeszcze jednego dodatkowego składnika: uniportu, który pozwala glukozie zgromadzonej wewnątrz komórki przemieszczać się przez inne błony w kierunku nowej

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 569

równowagi; zachodzi to np. w jelicie i w komórkach nerki. Komórki transportują przez błony plazmatyczne takŜe makromolekuły Endocytoza jest procesem, dzięki któremu komórki pobierają duŜe cząsteczki. Niektóre z nich (np. polisacharydy, białka i polinukleotydy) mogą być źródłami składników odŜywczych. Endocytoza stanowi mechanizm regulujący zawartość niektórych składników membranowych, czego najlepszym dowodem są receptory hormonów. Jest ona procesem pozwalającym na poznanie większej liczby szczegółów dotyczących funkcjonowania komórki. DNA jednego typu komórki moŜe być uŜyty w procesie transfekcji innej komórki i zmienić tym samym jej funkcje lub jej fenotyp. W tych doświadczeniach często uŜywany jest specyficzny gen, co pozwala na unikatową drogę badania i analizowania procesów regulowanych przez niego. Transfekcja DNA zaleŜy od endocytozy; endocytoza jest odpowiedzialna za wniknięcie

DNA do komórki. W takich doświadczeniach zwykle wykorzystuje się fosforan wapnia, gdyŜ CaJ+ pobudza endocytozę i wytrąca DNA, co ułatwia jego endocytozę. Zarówno endocytoza, jak i egzocytoza wymagają utworzenia się pęcherzyków z błony plazmatycznej lub z błoną plazmatyczną. Endocytoza. Wszystkie komórki eukariotyczne w sposób ciągły trawią części swoich bfon. Endocytarne pęcherzyki powstają w momentach uwypuklania się do wewnątrz segmentów błony plazmatycznej, co powoduje zamknięcie w nich niewielkiej objętości płynu zewnątrzkomórkowego i występujących w nim składników. Pęcherzyki takie odrywają się od błony, następuje fuzja membran plazmatycznych i otwór po pęcherzyku w miejscu pierwotnego dośrodkowego wpukienia zasklepia się (ryc. 43-18). Pęcherzyk taki zlewa się z innymi strukturami membranowymi, co wyjaśnia transport zawartości pęcherzyka do innych obszarów komórki, lub nawet poza nią. Większość pęcherzyków endocytarnych zlewa się z pierwo-

Ryc, 43-18. Dwa typy endocytozy. Endocytarny pęcherzyk (V) tworzy się w wyniku wpuklenia określonej partii błony plazmatycznej w kierunku cytoplazmy. Endocytoza dotycząca płynów (A) jest przypadkowa i nieukierunkowana. Endocytoza, w której pośredniczy receptor (B) jest wybiórcza i zachodzi w ciołkach (CP) pokrytych klatryną (postrzępiona otoczka). Wybiórczość tę zapewnia receptor (czarne kwadraty), który jest specyficzny dla wielu cząsteczek. W tym ostatnim procesie powstają otulone pęcherzyki (CV).

570 / ROZDZIAŁ 43

tnymi lizosomami, tworząc lizosomy wtórne, które zawierają enzymy hydrolityczne i tym samym są wyspecjalizowanymi strukturami wykorzystywanymi śród komórkowe Składniki makromolekularne są trawione i powstają aminokwasy, proste cukry i nukleotydy, które z kolei dyfundują poza pęcherzyki do cytoplazmy, gdzie mogą być ponownie uŜyte. Endocytoza wymaga: 1) energii, zwykle pochodzącej z hydrolizy ATP; 2) Ca2+ w płynie zewnątrzkomórkowym i 3) kurczliwych elementów w komórce (prawdopodobnie układów mikrofilamentowych). Istnieją dwa zasadnicze typy endocytozy. Fagocytoza zachodzi tylko w wyspecjalizowanych komórkach, takich jak makrofagi i granulocyty. Fagocytoza związana jest z wchłonięciem duŜych cząsteczek, jak wirusy, bakterie, komórki i resztki komórek. Makrofagi są niezwykle aktywne w tym procesie i mogą wchłonąć substancje, stanowiące nawet 25% swojej objętości na godzinę. Działając w ten sposób makrofag moŜe zuŜyć 3% swoich błon płazmatycznych w kaŜdej minucie lub całą swoją błonę w ciągu 30 min. Pinocyroza jest właściwością wszystkich komórek i pozwala na pobieranie przez komórkę płynów i ich zawartości. Tutaj takŜe wyróŜniamy dwa typy. Pinocytoza płynnej fazy jest niewybiórczym procesem, w którym pobranie substancji rozpuszczonej przez tworzenie małych pęcherzyków jest wprost proporcjonalne do stęŜenia tej substancji w płynie pozakomórkowym otaczającym komórkę uczestniczącą w tym procesie. Tworzenie się tych pęcherzyków jest niezwykle aktywnym procesem. Fibroblasty np. zuŜywają swoją błonę plazmatyczną 3 razy szybciej niŜ makrofagi. Proces ten zachodzi szybciej niŜ wytwarzanie nowych błon. PoniewaŜ w procesie pinocytozy całkowita powierzchnia i objętość komórek tylko niewiele sie zmieniają, błony muszą się odtwarzać na drodze egzocytozy lub przez recyklizację tak szybko, jak szybko są usuwane przez endocytozę. Drugi etap pinocytozy, pinocytoza absorpcyjna, jest wybiórczym procesem, w którym uczestniczy receptor odpowiedzialny przede wszystkim za pobieranie ma kro molekuł, dla których istnieje skończona liczba miejsc wiąŜących na błonie plazmatycznej. Receptory te cechujące się wysokim powinowactwem, pozwalają na wybiórczą koncentrację tigandów z medium, minimalizując pobieranie płynów lub rozpuszczonych nie związanych makromolekuł, a takŜe

w znacznym stopniu zwiększają szybkość wnikania specyficznych molekuł do komórki. Pęcherzyki powstające w czasie pinocytozy absorpcyjnej powstają z wpukleń (dołków) błony, które pokryte są od strony cytoplazmatycznej materiałem filamentarnym. W wielu układach tym materiałem filamentarnym jest klatryna; jest ona prawdopodobnie peryferyjnym białkiem membranowym. Pokryte dołki mogą stanowić nawet 2% powierzchni niektórych komórek. Na przykład lipoproteiny o małej gęstości (LDL) i ich receptor (p. rozdz. 26} wnikają poprzez pokryte dołki zawierające receptor LDL. Te endocytarne pęcherzyki, zawierające LDL i jego receptor, zlewają się z lizosomami w komórce. Receptor jest uwalniany i ponownie przemieszczany do zewnętrznej błony komórkowej, natomiast apolipoproteina LDL jest degradowana, a estry cholesterolowe są metabolizowane. Synteza receptorów LDL jest regulowana dru go rzędowymi lub trzeciorzędowymi następstwami pinocytozy, tj. przez produkty metabolizmu, takie jak cholesterol, uwolnione w czasie degradacji LDL. Defekty w budowie receptora LDL lub w jego wnikaniu do komórki są waŜne z medycznego punktn widzenia i zostały omówione w rozdz. 26. Inne makromolekuły, w tym wiele hormonów, związane są z procesem absorpcyjnej pinocytozy i tworzą receptosomy jako pęcherzyki, które omijają lizosomy i dostarczają swoją zawartość do innych wewnątrzkomórkowych obszarów, takich jak aparat Golgiego. Absorpcyjna pinocytoza zewnątrzkomórkowych glikoprotein wymaga, aby miały one specyficzny węglowodanowy sygnał rozpoznawczy. Te sygnały rozpoznawcze związane są z membranowymi cząsteczkami receptorów, które odgrywają rolę analogiczną do tej, jaką odgrywa receptor LDL. Receptor galaktozylowy na powierzchni hepatocytów jest pomocny w absorpcyjnej pinocytozie asjaloglikoprotein z krąŜącej krwi. Kwaśne hydrolazy pobierane na drodze absorpcyjnej pinocytozy przez fibroblasty są rozpoznawane dzięki występowaniu w nich mannozo-6-fosforanu. Prawdopodobnie reszta ma nnoz o-6-fosforan owa odgrywa takŜe waŜną rolę w wewnątrzkomórkowym transporcie kwaśnych hydrolaz do lizosomów, w których są one syntetyzowane (p. rozdz. 57). Nie jest całkowicie wyjaśniony proces endocytozy za pośrednictwem receptorów w przypadkach wirusów: zapalenia wątroby (uszka-

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 571

Endocytoza

Egzocytaza

Ryc. 43-19. Porównanie mechanizmów endocytozy i egzocytozy. Egzocytoza wymaga kontaktu dwu wewnętrznych powierzchni (cytoplazmatyczna strona) monowarstwy, podczas gdy endocytoza jest wynikiem kontaktu dwóch zewnętrznych powierzchni monowarstwy.

dzających hepatocyty) czy poliomyelitis (uszkadzających neurony motoryczne) i AIDS. Toksyczność Ŝelaza takŜe rozpoczyna się znacznym jego pobieraniem przez komórki na drodze endocytozy. Egzocytoza. Większość komórek uwalnia makromolekuły do środowiska na drodze egzocytozy. Proces ten występuje takŜe w zjawisku remodelowania błon, gdy składniki syntetyzowane w aparacie Golgiego są przenoszone w pęcherzykach do błonplazmatycznych. Sygnałem dla egzocytozy jest często hormon, który, gdy zwiąŜe się Z receptorem powierzchniowym komórki, wywołuje lokalne i przemijające zmiany w stęŜeniu Ca3+. Jony wapnia z kolei uruchamiają- egzocytozę. Rycina 43-19 przedstawia porównanie mechanizmów egzocytozy i endocytozy. Cząsteczki uwalniane przez egzocytoze moŜna zaliczyć do 3 grup: 1) mogą one przyłączać się do powierzchni komórki i stać się peryferyjnymi białkami, np. antygeny; 2) stają się one częścią zewnątrzkomórkowej macierzy, np. kolagen i glikozaminoglikany; 3) mogą one przejść do płynu zewnątrzkomórkowego i być sygnałem dla innych komórek. Insulina, parathormon i katecholaminy znajdują się w ziarnistościach i są poddane obróbce w komórkach, a po zadziałaniu określonego bodźca zostają uwolnione (p, rozdz. 48, 50 i 52). Niektóre sygnały są przenoszone w poprzek błon Sygnały biochemiczne specyficzne, takie jak neurotransmitery, hormony i immunoglobuliny, wiąŜą się ze swoistymi receptorami (białka integralne) znajdującymi się po zewnętrznej stronie błony plazmatycznej, przekazując następnie informacje poprzez tę błonę do cytoplazmy. Mechanizm ten wymaga wytworzenia szeregu sygnałów, m.in. cyklicznych nukleoty-

dów, wapnia, fosfozytydów i diacyloglicerolu. Szczegółowo mechanizm ten omówiono w rozdz. 45. Informacja moŜe być przekazana przez kontakty międzykomórkowe Istnieje wiele miejsc międzykomórkowych kontaktów w organizmie metazoicznym. Wymaga to kontaktu między błonami plazmatycznymi indywidualnych komórek. Komórki blisko ze sobą sąsiadujące wytworzyły w tym celu wyspecjalizowane regiony na swoich błonach. Złącza szczelinowe pośredniczą i regulują przechodzenie jonów i małych cząsteczek przez wąskie i hydrofilowe wnętrze kanalików, łączących cytoplazmę przylegających komórek. To właśnie jest przyczyna, Ŝe jony i małe cząsteczki mogą przenikać z jednej komórki do drugiej w sposób kontrolowany.

PIŚMIENNICTWO Blobel G et al: Tramlocation of proteins across membranes: The signal hypothesis and beyond, Symp Soc Exp Biol 1979;33:9. Dautry-Varsat A, Lodish HF: How receptors bring proteins and particles into cells. Sci Am (May) 1984;250:52. Dawidowicz EA: Dynamics of membranę lipid metabolism and turnover. Annu Rev Biochem 1987;56:43. Ellers M, Schatz G: Protein Unfolding and the Energetics of Protein Translocation across Biological Membranes. Celi 1988;52:481. Goldstein J et al: Receptor-mediated endocytosis. Annu Rev Cel! Biol 1985;1:1. Lodish HF: Transport of secretory and membranę glycoproteins from the rough endoplasmic reticulum to the Golgi: A rale-limiting step in protein maturation and secretion. J Biol Chem 1988;263:2107.

572 / ROZDZIAŁ 43 Matlin, KS: The sorting of proteins to the plasma membranę in epithelia! cells. J Celi Biol 1986; 103:2565. Pfeffer SR, Rothman JE: Biosyntnetic protein transport and sorting by the endoplasmic reticulum and Golgi. Annu Rev Biochcm 1987;56:829. Roise D, Schatz G: Mitochondriai preseąuences. J Biol Chem 19 88; 263:4 509. Singer SJ, Nicolson GL: The fluid tnosaic model of the structure of oell membranes. Science 1972;175:720.

•

Stahl P, Schwartz AL: Receptor-mediated endocytosis. J. Clin lnvest 1986;77:657. Stein WD: Transport and Diffusion Across Celi Membranes. Academic Press, 1986. UnwinN, HendersonR: Thestructuresof proteinsin biological membranes, Sci Am (Feb) 1984;25(h78. Walter P, Gilmore R, Blobel G: Protein translocation across the endoplasmic reticulum. Celi 1984;38:5. Wickner WT, Lodish HF: Multiple mechanisms of protein insertion into and across membranes. Science 1985;230:400.

Charakterystyka układów hormonalnych

44

Dary/ K. Granner, MD

WPROWADZENIE Celem tego rozdziału jest dostarczenie informacji o zmieniającej się istocie układu wewnątrzwydzielniczego i definicjach kilku podstawowych koncepcji, które przewijać się będą w kolejnych podrozdziałach.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Postęp, jaki dokonał się w zakresie badań nad funkcjonowaniem układu wewnątrzwy dziel niczego — umoŜliwiający odpowiedzi na pytania, dlaczego niektóre gruczoły endokrynne znajdują się w sąsiedztwie drugich, w jaki sposób wytwarzane są hormony, jak równieŜ koncepcje o występowaniu komórek docelowych, receptorów oraz kontroli wydzielania hormonów opartej na mechanizmach sprzęŜenia zwrotnego — ma bezpośrednie implikacje kliniczne. Obecnie moŜna dokładnie określić przyczyny niektórych chorób układu wewnątrz wydziel niczego. Wiele z nich spowodowanych jest defektami receptorowymi, chociaŜ zapewne i inne przyczyny tych chorób zostaną wkrótce zidentyfikowane.

WYSPECJALIZOWANE TKANKI ORGANIZMÓW WIELOKOMÓRKOWYCH POTRZEBUJĄ ZŁOśONEJ KOORDYNACJI Cechą charakterystyczną ustrojów wielokomórkowych jest występowanie róŜnorodnych tkanek pełniących swoiste funkcje, niezbędne

dla przeŜycia tych organizmów. Konieczne są równieŜ mechanizmy dla "komunikacji śródkomórkowej, zapewniające koordynację procesów adaptacyjnych na zmiany środowiska zewnętrznego i wewnętrznego. Rozwinęły się dwa ogólne układy spełniające le czynności. Są nimi: układ nerwowy, przekazujący sygnały lub informacje za pośrednictwem niezmieniającego się systemu strukturalnego oraz układ wewnątrz wy dzielniczy, wydzielający róŜne hormony w swoistych gruczołach, przenoszone jako sygnały do komórek przylegających lub do tkanek oddalonych od tych gruczołów. Obecnie wiadomo, Ŝe występuje zadziwiająca zbieŜność w działaniu tych systemów regulatorowych. Regulacja nerwowa jest bardzo waŜna. I tak np. epinefryna (adrenalina) jest wytwarzana i wydzielana przez komórki pozazwojowe rdzenia nadnerczy, zaś wazopresyna jest syntetyzowana w podwzgórzu i transportowana aksonami do przysadki nerwowej (tylnej części przysadki mózgowej), gdzie jest wydzielana do krwiobiegu. Wiele neuroprzekaźntków (katecholaminy, dopamina, acetylocholina itd.) jest podobnych do hormonów, jeśli uwzględni się ich syntezę, uwalnianie, transport i mechanizm działania. I tak np. aminy katecholowe są neuroprzekaźnikami dla jednej tkanki zaś hormonami dla innych tkanek. Innym takim przykładem jest fakt wykrycia niedawno pewnych metabolitów steroidów nadnerczowych będących modulatorami receptorów y-amino-maślanowych (GABA) w mózgu, o działaniu podobnym do barbituranów. W końcu naleŜy wspomnieć, Ŝe niedawno znaleziono w mózgu wiele hormonów tj. insulinę, ACTH, wazoaktywny polipeptyd jelitowy (VIP), somatostatynę, hormon uwalniający tyreotropinę (TRH) oraz cho-

574 / ROZDZIAŁ 44

lecystokininę. Do wyjaśnienia pozostaje, czy wszystkie wymienione hormony syntetyzowane są w mózgu i czy działają tam jako neuromodulatory lub neuroprzekaźniki. Skoro w mózgu wykryto swoiste receptory dla wielu z wymienionych hormonów, moŜliwe jest, Ŝe działają one w mózgu. Pojecie „hormon" pochodzi od greckiego słowa, oznaczającego „pobudzić do działania". Według klasycznej definicji pod pojęciem hormonu naleŜy rozumieć substancję, syntetyzowaną w jednej tkance i przenoszoną krwią do innego narządu, w którym rozwija swoje działanie. Ta definicja hormonu wykazuje zbyt mały zakres, wiadomo bowiem, Ŝe hormony mogą działać równieŜ na przylegające komórki w określonej tkance (działanie to określa się jako parakrynne), a nawet na komórki, w których są syntetyzowane (działanie to określa się jako autokrynne).

CECHĄ ZNAMIENNĄ UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO JEST JEGO RÓśNORODNOŚĆ Jedną z najbardziej znamiennych cech układu wewnątrzwydzielniczego jest to, Ŝe zabezpiecza ustrój w liczne sposoby rozwiązywania problemów. Celem tego podrozdziału jest krótkie przedyskutowanie wybranych przykładów najlepiej ilustrujących róŜnorodność układu wewnątrzwydzielniczego . Gruczoły wewnątrzwydzielnicze są przewaŜnie pochodzenia nabłonkowego i rozmieszczone strategicznie Gruczoły wydzielania wewnętrznego są najczęściej pochodzenia nabłonkowego. Szczególnymi wyjątkami od tej reguły są: komórki Leydiga wywodzące się z tkanki łącznej gonady męskiej a wytwarzające testosteron, komórki ziarniste jajnika, produkujące estrogeny oraz komórki sekrecyjne przysadki nerwowej, wywodzące się z komórek nerwowych. Grzebień nerwowy (neural crest) ma być embriologicznym zaląŜkiem licznych rodzajów komórek endokrynnych. Jeśli to jest prawdą, łatwo sobie wytłumaczyć związek między ośrodkowym układem nerwowym a układem wewnątrzwydzielniczym. Skoro tkanka wywodząca się z grzebienia nerwowego moŜe się pojawić w kaŜdym narządzie, łatwo sobie wytłumaczyć wy-

twarzanie niektórych hormonów w mózgu i tkankach wywodzących się przewaŜnie z jelita środkowego pierwotnego lub z przedniej części prajelita. Tłumaczy to równieŜ zespoły ektopowej syntezy hormonów, w których zachodzi wytwarzanie hormonów przez „niewłaściwą" tkankę (np. wytwarzanie parathormonu lub ACTH przez komórki raka płuc). Ogólnie biorąc, zespoły te dotyczą raczej ograniczonej liczby hormonów peptydowych, natomiast licznych i róŜnorodnych tkanek. O ile powszechnie uwaŜano, Ŝe zespoły te są wyrazem aktywacji „milczących" genów w obrębie określonej komórki, obecnie wydaje się, Ŝe zespoły te są wyrazem aktywacji „uśpionych" komórek wykazujących wspólnych przodków w obrębie tkanki. Inny dziwny przykład to zespoły wielogruczolakowatości wewnątrz w ydzielniczej (mul-

tiple endocrine neoplasia syndromes — MEN), w których stwierdza się rodzinne występowanie nowotworów w kilku gruczołach wewnątrzwydzielniczych równocześnie. Cechą tych zespołów jest nadmiernie wytwarzanie hormonów peptydowych lub amin katecholowych często przez jedną i tę samą tkankę. Komórki wytwarzające hormony nie są rozmieszczone przypadkowo. Występują one w róŜnych tkankach dla określonych celów. Lokalne występowanie wysokich stęŜeń hormonów (tj. wyŜszych od występujących w osoczu krwi) jest potrzebne dla swoistych procesów biologicznych. Dla przykładu naleŜy podać, Ŝe miejscowe stęŜenie testosteronu, niezbędne w procesie sperma to genezy, jest wyŜsze od występującego w osoczu krwi. Tym faktem naleŜy tłumaczyć występowanie komórek Leydiga wytwarzających testosteron tuŜ obok n a sień io wodo w. Do powstania ciałka Ŝółtego potrzebne jest bardzo duŜe miejscowe stęŜenie estrogenów. Tłumaczy to bliskie połoŜenie komórek ziarnistych pęcherzyka jajnikowego (Graafa) w stosunku do ciałka Ŝółtego. Gros działania insuliny i glukagonu polega na regulacji wytwarzania glukozy w wątrobie (w procesie glukoneogenezy — przyp- tłumacza); dlatego istnieje bliskie powiązanie wysp trzustkowych z krąŜeniem wrotnym wątroby. Kortyzoi, który jest niezbędny w duŜych stęŜeniach w rdzeniu nadnerczy do indukcji N-metylo-transferazy fenyloetanoloaminowej (jest to enzym określający wydajność biosyntezy katecholamin), dociera tam drogą wrotnego układu naczyniowego, biorącego swój początek w korze nadnerczy. Istnieje ścisły związek między

CHARAKTERYSTYKA UKŁADÓW HORMONALNYCH / 575

podwzgórzem a przednią częścią przysadki mózgowej (przysadka gruczołowa), co sprawia, Ŝe wysokie stęŜenia bardzo iabilnych hormonów uwalniających podwzgorza docierają łatwo do narządu docelowego, tj. do przysadki gruczołowej za pośrednictwem swoistego wrotnego układu naczyniowego. W końcu naleŜy wspomnieć o wyjątkowym rozmieszczeniu swoistych komórek wysp trzustkowych wobec siebie. Wytwarzając miejscowo wysokie stęŜenia somatostatyny, polipeptydu trzustkowego, glukagonu i insuliny, sekrecja kaŜdego z tych hormonów wpływa na wydzielanie pozostałych hormonów.

kształcanie) tej cząsteczki prekursorowej jest tkankowo swoista '(p. rozdz. 46). Przykładem moŜe najbardziej drastycznym występowania duŜego prekursora hormonalnego jest tyreoglobulina. Jest to duŜa cząsteczka białkowa (masa cząsteczkowa wynosi 660000 D) występująca w pęcherzykach gruczołu tarczowego. Wśród 5000 aminokwasów cząsteczki tyreoglobuliny znajduje się 120 reszt tyrozylowych, z których tylko nieliczne ulegają jodowaniu w procesie biosyntezy hormonów tarczycowych (p. rozdz. 47). Cała cząsteczka tyreoglobuliny musi ulec degradacji, aby uwolnić zaledwie kilka cząsteczek tetrajodo- (T4) lub trijodotyroniny (T3).

Biosynteza hormonów i modyfikacja tej biosyntezy są harmonijnie zgrane ze swoistymi zadaniami czynnościowymi tych hormonów Istnieje wielka róŜnorodność w zakresie struktury chemicznej oraz w mechanizmach biosyntezy i przemian po syntetycznych w odniesieniu do poszczególnych aktywnych hormonów. I tak hormony mogą powstawać z prekursorów lipidowych, przez modyfikację struktury aminokwasu tyrozyny, lub teŜ drogą syntezy białek prostych lub złoŜonych (np. glikoprotein). Hormony mogą być syntetyzowane i wydzielane w swej ostatecznej postaci. Do takich hormonów naleŜą aldosteron, hydrokortyzon, trijodotyronina (T3), estradiol i aminy katecholowe. Inne hormony muszą ulec obróbce w obrębie komórki, zanim zostaną wydzielone lub zanim nabędą pełnej aktywności biologicznej. Takimi przykładami są: insulina, która jest syntetyzowana jako proinsulina (jest ona prototypem białek prekursorowych) oraz hormon przytarczyc — parathormon (PTH). Ten ostatni wywodzi się z co najmniej dwóch prekursorów peptydowych (prepro- i pro-PTH), z których powstaje w pełni aktywna postać hormonu — przez odcięcie dwóch polipeptydów. Opis białek prekursorowych, ich syntezy i śródkomórkowej obróbki do końcowego produktu przedstawiono w rozdz. 43. Jeszcze bardziej złoŜonym przykładem jest proopiomelanokortyna (POMC), składająca się z 285 aminokwasów, a będąca produktem pojedynczego genu. POMC ulega rozpadowi z wytworzeniem takich hormonów, jak ACTH, P-lipotropiny, fS-endorfiny, ot-melanotropiny (cc-MSH) i P-melanotropiny (P-MSH) oraz innych hormonów poiipeptydowych dotychczas jeszcze nie zidentyfikowanych. Obróbka (prze-

Niektóre hormony ulegają konwersji do cząsteczek bardziej aktywnych w tkankach obwodo-

wych. Konwersja moŜe zachodzić w narządzie docelowym, np. konwersja T4 do T3 zachodzi w wątrobie i przysadce mózgowej, zaś testosteronu do dihydrotestosteronu w drugorzędowych tkankach płciowych. Konwersja obwodowa moŜe zachodzić równieŜ w tkankach niedocelowych. I tak dehydroepiandrosteron jest wytwarzany w nadnerczach, natomiast ulega konwersji do androstendionu w wątrobie. Ten ostatni metabolit moŜe ulec dalszej konwersji do testosteronu, estronu lub estradiolu w adypocytaeh, wątrobie lub skórze. Konwersja nieaktywnego hormonu w hormon czynny moŜe zachodzić zarówno w tkankach docelowych jak i niedocelowych. Przykładem tego jest konwersja witaminy D3 skóry do 25-hydroksycholekalcyferolu w wątrobie oraz przekształcanie tego ostatniego metabolitu do 1,25-dihydroksycholekalcyferolu w nerkach (p. rozdz. 48). Hormony wydzielane przez bardzo róŜne tkanki i wykazujące róŜne komórki docelowe mogą wykazywać podobieństwo strukturalne. I tak np. hormony glikoproteinowe przysadki gruczołowej (tyrcotropina — TSH, folitropina — FSH, lutropina — LH) lub łoŜyska (gonadotropina kosmówkowa — HCG) są heterodimerami składającymi się z podjednostek a i p, przy czym podjednostka a jest identyczna we wszystkich wymienionych hormonach.

576 / ROZDZIAŁ 44

DOCELOWYM NARZĄDEM HORMONÓW MOśE BYĆ WIĘCEJ NIś JEDNA TKANKA: KONCEPCJA NARZĄDU DOCELOWEGO (TARCZOWEGO) U człowieka występuje ok. 200 rodzajów zróŜnicowanych komórek. Tylko niektóre z nich wytwarzają hormony. Występujące u człowieka 75 bilionów (75 x 10t2) komórek to komórki docelowe dla jednego lub więcej z ok. 50 znanych hormonów. Hormon moŜe mieć tylko jedną tkankę docelową, tub teŜ moŜe oddziaływać na kilka tkanek równocześnie. Klasyczna definicja jako tkankę docelową określa taką, która charakteryzuje się unikalną reakcją biochemiczną lub fizjologiczną na bodziec hormonalny, np. tarczyca jest swoistym narządem docelowym dla TSH; TSH zwiększa liczbę i wielkość komórek gronek tarczycowych i pobudza wszystkie etapy enzymatyczne związane z biosyntezą hormonów tarczycowych, W odróŜnieniu od TSH insulina działa na wiele tkanek. Pobudza wychwyt glukozy i jej utlenianie w mięśniach, Hpogenezę w tkance tłuszczowej, transport aminokwasów do hepatocytów i limfocytów oraz syntezę białek w wątrobie i mięśniach, Ŝeby wymienić jedynie kilka efektów tego hormonu. Ostatnio, po zidentyfikowaniu swoistych receptorów hormonalnych na powierzchni komórek lub w obrębie komórek, definicja narządu lub tkanki docelowej została poszerzona. Obejmuje ona jakąkolwiek tkankę, wykazującą zdolność wiązania hormonu przez swoisty receptor, niezaleŜnie od występowania lub niewystępowania klasycznego efektu biochemicznego lub fizjologicznego dla danego hormonu (np. wiązanie insuliny przez komórki śródbłonkowe). Ta definicja takŜe nie jest idealna, ma ona jednak wartość heurystyczną, uzmysławia bowiem, Ŝe nie wszystkie efekty działania hormonów zostały wyjaśnione. Ogólna odpowiedź na określony hormon zaleŜy zarówno od jego stęŜenia we krwi, jak i od narządu docelowego. Z kolei stęŜenie miejscowe hormonu w narządzie docelowym zaleŜy od: 1) nasilenia syntezy i wydzielania hormonu, 2) odległości dzielącej narząd wydzielania wewnętrznego od narządu docelowego, 3) stałej wiązania lub dysocjacji hormonu ze swoistymi białkami nośnikowymi osocza (jeśli takie występują), 4) szybkości konwersji nieaktywnego lub słabo aktywnego prekursora w aktywny hormon, oraz 5) szybkości oczyszczania

krwi z danego hormonu poprzez jego wydalanie z ustroju lub biodegradację (procesy te zachodzą głównie w wątrobie i nerkach). Odpowiedź tkanki docelowej na bodziec hormonalny zaleŜy z kolei od 1) względnej aktywności i (lub) stopnia wysycenia hormonem swoistych receptorów hormonalnych błon komórkowych, cytoplazmatycznych lub jądrowych oraz 2) poreceptorowej amplifikacji lub supresji sygnału hormonalnego. Zmiany wymienionych czynników mogą wpływać na nasilenie reakcji indukowanej hormonem w narządzie docelowym i naleŜy je uwzględnić rozpatrując działanie klasycznych pętli sprzęŜenia zwrotnego.

WYSTĘPOWANIE ZARÓWNO UJEMNEGO, JAK I DODATNIEGO SPRZĘśENIA ZWROTNEGO JEST MECHANIZMEM KONTROLUJĄCYM Utrzymywanie się fizjologicznych stęŜeń hormonów we krwi jest wynikiem działania róŜnorodnych mechanizmów homeostatycznych na linii gruczoł wydzielania wewnętrznego — narząd docelowy, W mechanizmach tych często pośredniczy jeden lub więcej gruczołów. Powszechnie występuje kontrola sekrecji hormonów na zasadzie ujemnego sprzęŜenia zwrotnego, szczególnie w takich układach jak; podwzgórze-przysadka mózgowa-gruczoł docelowy. Przykład takiego sprzęŜenia zwrotnego przedstawia ryc. 44-1. Jak widać na rycinie, podwzgórzowy hormon uwalniający pobudza syntezę i uwalnianie hormonu przedniego płata przysadki mózgowej, który z kolei stymuluje wytwarzanie hormonu w narządzie docelowym. Wysokie stęŜenia hormonu tego ostatniego hamują syntezę i działanie hormonu podwzgórzowego, i odwrotnie, małe stęŜenia pobudzają układ na poziomie podwzgórza. Wyjątkową cechą tego szczególnego układu jest to, Ŝe synteza hormonu przysadki gruczołowej moŜe się zmniejszyć w następstwie działania tzw. krótkiej pętli sprzęŜenia zwrotnego. Działanie takiego systemu zapewnia precyzyjną kontrolę stęŜenia hormonu w osoczu. Pokazuje on, Ŝe w obrębie jednego układu wewnątrz wy dzielniczego istnieje wiele hormonów i wiele tkanek docelowych. Istnienie takich „pętli" kontroli wydzielania hormonów wykazano dla nadnerczy, tarczycy oraz gonady męskiej i Ŝeńskiej. W innych przypadkach regulacja mechaniz-

CHARAKTERYSTYKA UKŁADÓW HORMONALNYCH / 577 e

Hormon ' uwalniający

e (PRZEDNI

PODWZGÓRZE PŁAT PRZYSADKI

MÓZGOWEJ)

Krotka pętla

t

Ryc. 44-1. Przykład układu kontrolnego opartego na zasadzie ujemnego sprzęŜenia zwrotnego, regulującego czynność tarczycy, nadnerczy, NARZĄD DOCELOWY

jajników i gonady męskiej.

mem ujemnego sprzęŜenia zwrotnego jest realizowana za pośrednictwem zmiany stęŜenia określonych metabolitów lub substratów powstałych w następstwie działania hormonu na komórkę docelową. I tak np. wzrost stęŜenia glukozy w osoczu krwi, czyli hiperglikemia, pobudza uwalnianie insuliny, która z kolei nasila pobór i utylizację glukozy przez liczne tkanki; w następstwie tych procesów stęŜenie glukozy normalizuje się, dzięki czemu uwalnianie insuliny maleje, W określonych warunkach chorobowych uwalnianie insuliny do krwi moŜe być nadmierne, co moŜe być przyczyną wystąpienia hipoglikemii. Odpowiedzią fizjologiczną na taki groźny dla Ŝycia stan jest uwalnianie amin katecholowych, hormonu wzrostu, glukagonu, ACTH, wazopresyny i angiotensyny II, tj. hormonów zwiększających stęŜenie glukozy we krwi. Jak widać, rozwinęła się złoŜona sieć mechanizmów regulujących stęŜenie krytycznego metabolitu (w omawianym przypadku glukozy) niezbędnego dla czynności mózgu. W innych przypadkach hormony działają na zasadzie dodatniego sprzęŜenia zwrotnego. I tak na przykład estrogeny i progesteron są potrzebne do wystąpienia wzrostu sekrecji LH, indukującego owulację oraz powstanie ciałka Ŝółtego, jak równieŜ dalszą syntezę wymienionych hormonów steroidowych. W wielu przy37

padkach pętie sprzęŜenia zwrotnego nie zostały jeszcze określone,' najczęściej dlatego, Ŝe nieznane są końcowe produkty działania hormonu. Liczne zjawiska patofizj o logiczne, takie jak wstrząs, uraz, hipoglikemia, ból i stres wpływają na czynność osi podwzgórze-przysadka--narząd docelowy poprzez oddziaływanie na wyŜsze ośrodki mózgowe. Wymienione czynniki pobudzające wykazują znaczny wpływ na przemianę amin katecholowych i hormonu wzrostu, jak równieŜ na czynność kory nadnerczy, tarczycy i gonad, chociaŜ jeszcze słabo poznano poszczególne ogniwa działania tych czynników. W chorobach wydzielania wewnętrznego oraz przemiany materii wspomniane mechanizmy sprzęŜenia zwrotnego ulegają zaburzeniu. W celu wykrycia zaburzeń tych układów uŜywa się testów diagnostycznych odróŜniających stany fizjologiczne od chorobowych. RECEPTORY HORMONALNE ODGRYWAJĄ GŁÓWNĄ ROLĘ Receptory wykazują zdolność precyzyjnego odróŜniania cząsteczek Rycina 44-2 pokazuje główne zasady działania hormonalnego układu komunikacji. StęŜenie hormonów w płynie pozakomórkowym jest zwykle bardzo małe i waha się w granicach od 1O"1S do 10~e mol/l. Są to stęŜenia znacznie niŜsze w porównaniu do stęŜeń licznych, strukturalnie podobnych do hormonów cząsteczek (substancje steroidowe, aminokwasy, peptydy, białka) i innych substancji krąŜących we krwi. StęŜenia tych ostatnich wahają się od tO~5 do 10"3 mol/l. Dlatego teŜ komórki docelowe muszą odróŜnić nie tylko róŜne hormony obecne we krwi w małych stęŜeniach, ale równieŜ rozpoznać je wśród cząsteczek występujących w 106 do I09-krotnie większym stęŜeniu. Ten wysoki stopień dyskryminacji poszczególnych cząsteczek zapewniają struktury komórkowe zwane receptorami. Hormony rozpoczynają swoje działanie biologiczne wiąŜąc się ze swoistym receptorem komórkowym. KaŜdy skuteczny układ kontroli musi jednak równieŜ obejmować-mechanizmy hamujące efekty hormonalne. Zachodzą one zwykle w ten sposób, Ŝe efektor odłącza się od receptora. Pod pojęciem komórki docelowej naleŜy rozumieć komórkę wykazującą zdolność wiązania

578 / ROZDZIAŁ 44

□ o

A

/ RóŜnorodność cząsteczek w płynie pozakomórkowym

w

2

— v— 3

■ l_J

--- Hormon 2

— Rodzaje komórek

4

1

Ryc. 44-2. Swoistość i wybiórczość receptorów hormonalnych. W płynie pozakomórkowym znajduje się wiele róŜnorodnych cząsteczek, lecz tylko kilka z nich jest rozpoznawanych przez receptory hormonalne. Receptory te muszą je rozpoznać wśród innych cząsteczek występujących w wysokich stęŜeniach. Komórka moŜe mieć tylko jeden rodzaj receptora, lub teŜ receptory dla kilku hormonów.

określonego hormonu przez swoisty receptor. Zjawisko interakcji między hormonem a jego receptorami moŜna określić ilościowo, uŜywając ligandów radioaktywnych, wykazujących właściwości wiązania hormonów. W badaniach zjawiska wymienionej interakcji waŜne są następujące elementy; 1) radioaktywność nie moŜe zmienić aktywności biologicznej ligandu, 2) wiązanie musi mieć charakter swoisty, tj. znakowany ligand musi zostać wyparty przez nieznakowanego agoniśtę lub antagonistę, 3} wiązanie musi być „wysycalne" oraz 4) wiązanie powinno zachodzić w zakresie stęŜeń wywołujących spodziewaną odpowiedź biologiczną. W obrębie receptora występuje zarówno domena rozpoznająca, jak i sygnalizacyjna Wszystkie receptory, zarówno dla hormonów polipeptydowych, jak i steroidowych, mają przynajmniej dwie domeny czynnościowe. Domena rozpoznająca wiąŜe hormon, zaś drugi obszar receptora wytwarza sygnał łączący proces rozpoznawania hormonu z jakąś czynnością śródkomórkową. Proces wiązania hormonu dowodzi, Ŝe pewien obszar jego cząsteczki wykazuje strukturę komplementarną do określonego obszaru cząsteczki receptora. Stopień tej kom-

plementarnośd określa siłę wiązania hormonu z receptorem wyraŜoną współczynnikiem powinowactwa (K) (affinity of binding). JeŜeli natywny hormon wykazuje wartość K umownie określoną jako 1, inne cząsteczki naturalne wykazywać będą wartości K od 0 do 1. W rzeczywistości absolutne wartości powinowactwa poszczególnych cząsteczek do receptora mogą się róŜnić 1012-krotnie. Syntetyzowano nawet Ugandy o względnej wartości K>1. Te ostatnie uŜywane są w badaniach róŜnych aspektów biologii receptora. Proces trans du kej i sygnału odbywa się najczęściej dwiema drogami. Cząsteczki hormonu białkowego lub polipeptydowego, lub teŜ amin katecholowych łącząc się z receptorami zlokalizowanymi w błonie plazmatycznej wyzwalają sygnał regulujący róŜne czynności środkom orkowe, najczęściej poprzez zmianę aktywności jakiegoś enzymu. Hormony steroidowe oraz tarczycy wiąŜą się z receptorami śródkomórkowymi, zaś powstały w ten sposób kompleks hormon-receptor sam jest sygnałem {patrz niŜej)Dotychczas poznano sekwencję ami no kwasową wymienionych dwóch domen dla wielu receptorów wiąŜących hormony polipeptydowe, W celu uzyskania zmiany siły wiązania

CHARAKTERYSTYKA UKŁADÓW HORMONALNYCH / 579

hormonu do receptora oraz aktywności biologicznej hormonu dokonano syntezy jego analogów róŜniących się od natywnego hormonu określonymi podstawnikami aminokwasowymi. Receptory hormonów steroidowych mają wiele domen czynnościowych; jedna z nich wiąŜe się z hormonem, druga z określonym obszarem łańcucha DNA, trzecia pobudza (lub teŜ hamuje) proces transkrypcji genu, zaś czwarta moŜe określać powinowactwa (high affmity binding) do DNA. Podwójna funkcja receptora, tj, zdolność wiązania hormonu i inicjacja określonej czynności środkom orkowej leŜy u podstawy tzw. sprzęŜenia receptorowo-efektorowego (receptor-effector coupling) stanowiącego pierwszy etap amplifikacji odpowiedzi hormonalnej. Ta cecha odróŜnia receptor komórki docelowej od białek nośnikowych osocza, które wprawdzie wiąŜą hormony, lecz nie indukują określonego sygnału hormonalnego. Receptory i białka transportowe (nośnikowe) wykazują działania wzajemnie się uzupełniające WaŜne jest odróŜnienie wiązania hormonów przez receptory od łączenia się hormonów z róŜnymi białkami transportowymi (nośnikowymi). Tabela 44-1. Porównanie receptorów hormonalnych z białkami nośnikowymi hormonów w osoczu krwi Białka nośniCecha StęŜenie

Receptory

kowa hormo-

nów w osoczu Bardzo małe Bardzo duŜe (tysiące na (miliardy/fil) jedną komór-

Tabela 44-1 przedstawia kilka cech tych dwóch rodzajów białek. Na jedną komórkę przypada tysiące cząsteczek receptorowych wiąŜących określony iigand (hormon), wykazujących wysokie powinowactwo i wysoką swoistość. Receptory mogą rozpoznać i wyselekcjonować swoiste cząsteczki przy gradiencie stęŜenia rzędu 10* lub 107. Ponadto wiązanie hormonu przez receptory jest wysycalne przy fizjologicznych stęŜeniach tego hormonu. Interakcje zachodzące między hormonem a receptorem są zaleŜne od siły jonowej, temperatury i pH roztworu. Te ostatnie cechy są róŜne, choć charakterystyczne dla poszczególnych hormonów i ich receptorów. U podstawy wiązania hormonu przez swoisty receptor leŜą mechanizmy hydrofobowe i elektrostatyczne, przez co wiązanie to jest szybko odwracalne, z wyjątkiem określonych przypadków. KrąŜące we krwi hydrofobowe steroidy i hormony tarczycy związane są ze swoistymi białkami transportowymi (nośnikowymi). Ilość białek nośnikowych jest znacznie większa niŜ liczba śródkomórkowych białek receptorowych dla tych hormonów; odznaczają się one jednak słabszym powinowactwem i mniejszą swoistością w porównaniu do receptorów. Białka nośnikowe, wiąŜąc określony hormon, stanowią rodzaj puli rezerwowej dla tego hormonu; kompleks białko nośnikowe-hormon nie ulega bowiem ani metabolizacji, ani teŜ wydaleniu z ustroju. Tylko frakcja hormonu wolnego, nie związanego z białkami nośnikowymi, wykazuje aktywność biologiczną. Hormony peptydowe i białkowe nie mają białek nośnikowych w osoczu krwi, przez co wykazują znacznie krótszy okres półtrwania (wynoszący sekundy lub minuty) niŜ hormony steroidowe (których okres półtrwania wynosi kilka godzin).

kę)

Powinowactwo Bardzo duŜe

Swoistość wiązania Wysycenie przy stęŜeniach fizjologicznych Odwracał ność wiązania Zdolność wywoanta sygnału dla komórki

Małe

mol/l)

mol/l)

DuŜa

Mała

Tak

Nie

Tak

Tak

Tak

Nie

Zatezność między liczbą receptorów związanych z hormonem a jego działaniem biologicznym jest złoŜona Jak widać na ryc. 44-3A, stęŜenia hormonu wykazują często proporcjonalność do nasilenia swoistego działania biologicznego. Dotyczy to głównie hormonów steroidowych, ale równieŜ niektórych hormonów peptydowych. Jest to zjawisko zaskakujące, uwzględniając liczne etapy dzielące proces wiązania hormonu przez receptor od wystąpienia złoŜonej reakcji na ten hormon, na którą się składają m.in. indukcja enzymatyczna, rozpad komórki i transport ami-

580 / ROZDZfAŁ 44 A. Nie ma receptor ów zapasowych

B. Są receptory zapasowe

IM-, 50-

=

100-, Wiązanie ■ Efekn

50-

i ir

. --- 1 ------- r

6 _

......... Efekt2

-log stęŜenia hormonu

10

9 8 7 — log stęŜenia hormonu

Ryc. 44-3. Porównanie wiązania hormonu z jego działaniem bioiogiczym w nieobecności (A) lub obecności (B, efekt 2) receptorów zapasowych. W niektórych przypadkach efekt biologiczny jest ściśle sprzęŜony z wiązaniem hormonu przez określoną tkankę, podczas gdy w innych przypadkach efekt biologiczny wykazuje zjawisko „zapasowych receptorów" (porównaj efekt 1 z efektem 2 na rycinie B).

nokwasów. W innych przypadkach stwierdza się znamienna dysocjacje między liczbą receptorów zajętych przez hormon a biologicznymi skutkami jego działania, rj. obserwuje się maksymalny efekt biologiczny hormonu wtedy, kiedy tylko maty odsetek receptorów jest związanych przez hormon (p. ryc. 44-3B, efekt 2). Receptory bezpośrednio nie uczestniczące w reakcji biologicznej na hormon określane są jako receptory zapasowe (spare receptors). Obecność receptorów zapasowych obserwuje się w reakcjach wywołanych przez wiele hormonów peptydowych. Sądzi się, Ŝe te receptory zwiększają wraŜliwość komórki docelowej na małe stęŜenia hormonu oraz, Ŝe stanowią rezerwuar receptorów. Koncepcja występowania receptorów zapasowych ma charakter operacyjny i zaleŜy od tego, który aspekt odpowiedzi hormonalnej jest badany oraz jaka tkanka w niej bierze udział. Przykładem tego jest występowanie wspaniałej zgodności zachodzącej między wiązaniem LH i wytwarzaniem cAMP przez komórki ziarniste pęcherzyków jajnika (przy aktywacji cyklazy adenylanowej przez jakikolwiek hormon zwykle nie stwierdza się receptorów zapasowych); natomiast steroidogeneza, która jest cAMP-zaleŜna, zachodzi w tych komórkach wtedy, kiedy mniej niŜ 1 % wszystkich receptorów jest związanych przez hormon (porównaj efekt !*z efektem 2 przedstawionym na ryc. 44-3B). Transkrypcja genu

dla karboksykinazy fosfoenolopirogronianowej ulega supresji, jeśli liczba receptorów insulinowych na hepatocytach związanych z tym hormonem jest znacznie mniejsza niŜ 1%, podczas gdy w tymocytach stwierdza się wysoce znamienną korelację między liczbą receptorów związanych przez insulinę a nasileniem transportu aminokwasów. Innym przykładem dysocjacji zachodzącej między liczbą związanych przez hormon receptorów a efektami biologicznymi danego hormonu jest wpływ amin katecholowych na skurcz mięśni, lipolizę i transport jonów. Przyjmuje się, Ŝe wymienione reakcje końcowe odzwierciedlają działanie kaskadowe lubuwielokrorniające tych hormonów. Opisano występowanie zmiennej czułości poszczególnych reakcji na hormon w obrębie jednej i tej samej komórki. Przy wzrastającej liczbie związanych przez hormon receptorów insulinowych adypocytów w pierwszej kolejności wzrasta lipogeneza, a w następnej utlenianie glukozy, transport aminokwasów i synteza białek. Liczba receptorów hormonalnych komórki moŜe się zwiększać (upregułation) lub zmniejszać (down regułation) Liczbę receptorów na powierzchni komórki lub występujących w jej obrębie cechuje stan dynamiczny; podlega on regulacjom fizjologicznym i moŜe się zmieniać w stanach chorobo-

CHARAKTERYSTYKA UKŁADÓW HORMONALNYCH / 581

wych lub pod wpływem zabiegów ieczniczych. Najwięcej wiadomo o receptorach błony plazma tycznej. W błonie komórkowej regulacji podlega zarówno liczba receptorów hormonalnych, jak i powinowactwo hormonów do tych receptorów. Zmiany te mogą być szybkie i w znamiennym stopniu wpłynjjć na nasilenie reakcji komórki na działanie hormonu. Na przykład ekspozycja komórek na agonistów (3adrenergicznych przez minuty lub godziny sprawia, Ŝe stosowanie większego stęŜenia agonisty nie tylko nie nasila aktywacji cyklazy adenylanowej, lecz nawet moŜe być przyczyną całkowitej utraty jej aktywności biologicznej. Ten proces odczulania (desensytyzacji) komórki na hormon odbywa się dwoma mechanizmami. Pierwszy polega na utracie receptorów z błony plazma ty cznej. To zmniejszanie się liczby receptorów (down regulation) polega na śródkomórkowej sekwestracji receptorów, tj. na oddzieleniu ich od innych składowych układu odpowiedzi hormonalnej, w tym równieŜ na oddzieleniu podjednostki regulacyjnej cyklazy adenylanowej od jej podjednostki katalitycznej (p. rozdz. 45). Usunięcie agonisty ze środowiska powoduje ponowne pojawienie się receptorów na powierzchni komórki oraz przywraca wraŜliwość komórki na dany hormon. Drugi mechanizmt>dczulania na hormon polega na kowalencyjnej modyfikacji receptora poprzez fosforyla-

A. Nie ma receptorów zapasowych

cję. Ten zaleŜny qd cAMP proces nie zmienia liczby receptorów, ani teŜ nie powoduje ich translokacji. Doświadczenia nad rekonstytucja, receptora wykazały, Ŝe fosforylowany receptor nie jest zdolny aktywować cyklazę, tak Ŝe dochodzi do rozkojarzenia funkcji wiązania hormonu oraz procesu aktywacji komórki. Zjawisko fizjologicznej adaptacji komórek drogą zmniejszania liczby receptorów (down regulation) obserwuje się między innymi po zadziałaniu insuliny, glukagonu, tyreoliberyny (TRH), hormonu wzrostu, LH, FSH i amin katecholowych. Kilka hormonów, takich jak angiotensyna II i prolaktyna, wykazuje odwrotny wpływ na liczbę swoich receptorów, tj. hormony te zwiększają liczbę receptorów (zjawisko to określa się jako up regulation). Taka zmiana liczby receptorów moŜe zachodzić w krótkim czasie (w ciągu minut lub godzin) i najpewniej stanowi waŜny mechanizm regulacji odpowiedzi biologicznej. Sposób w jaki utrata receptorów wpływa na odpowiedź biologiczną indukowaną hormonem, zaleŜy od obecności lub nieobecności receptorów zapasowych. Rycina 44-4 przedstawia wpływ utraty Liczby receptorów do f wartości normalnej na przebieg krzywej odzwierciedlającej zaleŜność efektu biologicznego od stęŜenia hormonu w obecności i nieobecności receptorów zapasowych. W nieobecności

B. Są receptory zapasowe

r 10

r S

— log (stęŜeńte hormonu)

8

7

— log (slęzenle hormon u) — Prawidłowa liczba receptorów - - tkrotne zmniejszenie liczby receptorów Ryc. 44-4. Wpływ 5-krotnego zmniejszenia liczby receptorów na efekt biologiczny układu nie mającego {A) i mającego (B) receptory zapasowe. _____________________________________

582 / ROZDZIAŁ 44

receptorów zapasowych maksymalna odpowiedź na działanie hormonu wynosi 20% wartości obserwowanej przy normalnej liczbie receptorów (część A ryc. 44-4) (efekt odpowiada wartości Vmax). W obecności receptorów zapasowych {część B ryc. 44-4) uzyskuje się maksymalna reakcję, lecz przy stęŜeniu hormonu pięciokrotnie większym od pierwotnego stęŜenia skutecznego (efekt analogiczny do efektu Receptory są białkami Najwięcej informacji uzyskano na temat receptora acetylocholi nowego, który łatwo oczyścić i który występuje we względnie duŜych ilościach w narządzie elektrycznym węgorza Torpedo całifomica. Receptor składa się z czterech podjednostek o konfiguracji a.%, p, y, 8. Dwie jednostki et wiąŜą acetylochohnę. UŜywając techniki mutagenezy określonych regionów receptora udało się wykazać, który obszar podjednostki a uczestniczy w formowaniu przezblonowego kanału jonowego, pełniącego główną czynność receptora acetylocholinowego. Inne receptory występują w bardzo małej liczbie, stąd teŜ proces ich oczyszczania i charakteryzowania jest trudny. Jednak dzięki technice rekombinacji DNA, istnieje dzisiaj moŜliwość uzyskania ilości receptorów wystarczającej do badań. Ten fakt sprawił, Ŝe stały się one przedmiotem intensywnych studiów. I tak receptor insulinowy jest heterotetramerem (a2, p2), w którym podjednostki połączone są ze sobą licznymi wiązaniami dwusiarczkowymi. Podjednostka zewnątrz błon owa a łączy się z insuliną, podczas gdy pedjednostka p1, sprzęgająca zewnętrzną i wewnętrzną warstwę błony, przekazuje sygnał do komórki, najpewniej za pośrednictwem komponentu cytoplazmatycznego tego polipeptydu, będącego kinazą tyrozynową. Podobną strukturę wykazują receptory dla insulinopodobnego czynnika wzrostowego I (lgF-1), nabłonkowego czynnika wzrostowego (ECF) oraz lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) (p. ryc. 52-12). Receptory dla innych hormonów polipeptydowych zostały słabiej scharakteryzowane. Przyjmuje się jednak, Ŝe i one składają sie z podstawowego komponentu białkowego, wraŜliwego na działanie róŜnych peptydaz i enzymów proteolitycznych. W wielu przypadkach proces wiązania hormonu przez receptor wymaga obecności wiązań dwusiarczkowych, fosfolipidu i komponentu węglowodanowego.

Receptory hormonów steroidowych są równieŜ białkami. W ostatnich latach poznano funkcję tych cząsteczek, zaś obecnie zaczynamy poznawać ich strukturę. Dobrym przykładem jest receptor glukokortykoidowy (ryc. 49-6). Ma on kilka domen funkcyjnych: 1) domenę wiąŜącą hormon, zlokalizowaną w C-koricowym odcinku, 2) przylegającą do niej domenę wiąŜącą DNA, 3) obszar rozpoznający, połoŜony w N-końcowej części cząsteczki, niezbędny do wiązania odcinka łańcucha DNA i zawierającego większość domen antygenowych cząsteczki oraz 4) jedną lub więcej domen aktywujących lub hamujących transkrypcję genu. Istnienie wymienionych domen funkcyjnych potwierdzono w badaniach receptorów syntetyzowanych metodami inŜynierii genetycznej za pomocą swoistego dla danego receptora cDNA. Wydaje się, Ŝe róŜne typy receptorów steroidowych mają taką samą ogólną strukturę (opisaną wyŜej) i odznaczają się znaczną homologią w zakresie sekwencji aminokwasowej w wyŜej opisanych domenach. Występuje równieŜ godna uwagi homologią między wymienioną klasą receptorów a onkogenem \-erb A. Nieprawidłowości w strukturze receptorów hormonalnych uczestniczą w patogenezie róŜnych chorób Wyjaśnienie roli receptorów w działaniu hormonów było punktem wyjścia do badań nad rolą nieprawidłowości w zakresie jego funkcji w patogenezie pewnych chorób. Tabela 44-2

przedstawia 3 ogóme grupy defektów receptorowych. W pierwszej przyczyną choroby są przeciwciała skierowane przeciwko swoistemu receptorowi hormonalnemu. Przeciwciała naleŜące do klasy IgG mogą blokować wiązanie się hormonu ze swoim receptorem (taką sytuację spotyka się w acanthosis nigricans przebiegającej z insulin o opornością oraz w astmie oskrzelowej), mogą naśladować działanie właściwego hormonu (przykładem tego jest choroba Gravesa-Basedowa) lub przyspieszać obrót metaboliczny receptora (na przykład w myasthenia gravis).

W drugiej grupie nie stwierdza się wiązania hormonu z receptorem. Nie jest jasne, czy przyczyną tego zjawiska jest brak odpowiednich receptorów, lub teŜ receptor jest obecny, lecz wykazuje określony defekt. Trudności w tym zakresie wynikają stąd, Ŝe wykrywanie większości receptorów oparte jest na określaniu ich powinowactwa do hormonów.

CHARAKTERYSTYKA UKŁADÓW HORMONALNYCH / 583 Tabela 44-2. Choroby receptorowe ' Choroba

Receptor

Przyczyna choroby

Choroba Gravesa-Basedowa (nadczynność tarczycy) Acanthosis nigricans z odpornością na insulinę

Dla TSH

Przeciwciało pobudza receptor TSH

Dla insuliny

Przeciwciało blokuje wiązanie insuliny do receptora

Myasthenia gravis

Dla acetytocholiny

Przeciwciało nasila obrót metaboliczny receptora acety I oc hol i nowego

Astma

Adrenergiczny

Przeciwciało blokuje wiązanie neurotransmitera do receptora

Moczówka prosta nerkowopo-c Dla ADH ho dna, wrodzona

Niedobór receptora

Zespół femtnizujących jąder

Dla androgenów

Rzekoma niedoczynność przytarczyc Krzywica typu II oporna na witaminę D

Dta PTH

Niedobór receptora Niedobór receptora i

Dla kalcytriolu (1,25/OH/2D3)

Niedobór receptora

Otyłość

Dla insuliny

Cukrzyca typu II (insulinoniezaleŜna-NIDDM)

Dla insuliny

ObniŜone wiązanie przez receptor ObniŜone wiązanie przez receptor

Trzecia grupa obejmuje choroby spowodowano-nieprawidłową regulacją liczby i powinowactwa receptorów. Chorzy z otyłością lub chorzy na cukrzyce typu II i z otyłością często wykazują objawy nietolerancji glukozy i oporność na insulinę pomimo występowania podwyŜszonych stęŜeń tego hormonu w osoczu. Chorzy ci wykazują mniejszą liczbę receptorów insulinowych (indukowanych zjawiskiem down-regulation) w komórkach docelowych dla tego hormonu, tj. w adypocytach, hepatocytach i komórkach mięśni szkieletowych. W miarę zmniejszania masy ciała u chorych tych obserwuje się obniŜanie się stęŜenia insuliny w osoczu krwi, wzrost liczby receptorów insulinowych w komórkach docelowych dla tego hormonu, poprawę wraŜliwości na insulinę oraz zmniejszanie się nietolerancji węglowodanów. Nowsze badania w dziedzinie biologii molekularnej sugerują, Ŝe nieprawidłowości w zakresie sprzęŜenia zachodzącego między receptorem dla czynnika wzrostowego a reakcją komórki efektorowej mogą być przyczyną niekontrolowanego wzrostu komórek nowotworowych (złośliwych). Przykłady te są ilustracją wielu

>

hormonu hormonu

chorób indukowanych nieprawidłową funkcją receptora.

PIŚMIENNICTWO Ginsberg BH: Synthesis and regulation of receptors for polypeptide honnones, Pages 59—97 in: Biologicai Regulation and Dewlopment. Vol 3B, Yamamoto K (editor). Plenum Press, 1985. Granner DK, Lee F: The multiple endocrine neoplasia syndromes. Chapter 76 in: Comprekensive Textbook of'Oncology. Moosa AR, Robson MC, Schimpff SC (editors). Williams & Wilkins, 1984. Mishina M et al: Expression of functional acetylcholine receptor frotn cloned cDNAs. Naturę 1984;307:604. Roth J, Taylor Sl: Receptors for peptide hormones: Alterations in disease of humans. Annu Rev Physiol 1982;44:639. Roth i et al: The evolutionary origins of hormones, neurotransmitters, and othcr ejttracellular messengers. N Eng! J Med 1982;306:523. Sibley DR, Lefkowitz RJ: Motet ul ar mech ani sms of receptor desensitization using the p-adrenergic recepto r-coupled adenylate cyclase system as a model. Nautre 1985;317:124.

45

Działanie hormonów Dsryl K. Granner, MD

WPROWADZENIE Działanie hormonu na poziomie komórkowym zaczyna się od połączenia go ze swoistym receptorem. Klasyfikacja hormonów moŜe być oparta na lokalizacji receptorów dla tych hormonów lub teŜ na tym, jaki rodzaj sygnału lub wtórnego przekaźnika pośredniczy w działaniu hormonu na poziomie komórki. Dotychczas poznano dokładnie liczne rodzaje wtórnego przekaźnika, lecz dla wielu hormonów nie zdefiniowano jeszcze środkom orkowego sygnału. Znaczne są postępy w zakresie wyjaśnienia mechanizmu działania hormonów w obrębie komórki, szczególnie w odniesieniu do wpływu tych substancji na ekspresję swoistych genów.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Racjonalna diagnostyka i terapia określonej choroby opierają się na znajomości jej patofizjologii oraz moŜliwości ilościowej analizy tej ostatniej. Choroby układu wewnątrzwydzielniczego, najczęściej spowodowane nadmiernym lub niedostatecznym wytwarzaniem określonego hormonu, są bardzo dobrymi przykładami zastosowania wyników badań nauk podstawowych w medycynie klinicznej. Znając ogólne mechanizmy działania hormonów oraz rozumiejąc fizjologiczne i biochemiczne skutki działania kaŜdego z nich, moŜna rozpoznać chorobę endokrynną, będącą następstwem zaburzonej równowagi hormonalnej oraz skutecznie ją leczyć.

KLASYFIKACJA HORMONÓW MOśE BYĆ OPARTA NA RÓśNYCH PODSTAWACH Hormony moŜna sklasyfikować na podstawie ich struktury chemicznej lub rozpuszczalności w róŜnych środowiskach, lokalizacji receptora hormonalnego lub rodzaju sygnału pośredniczącego działanie hormonu w obrębie komórki. Tabela 45-1 przedstawia klasyfikację hormonów opartą na ostatnich dwóch cechach, zaś tab. 45-2 ogólne cechy kaŜdej z dwóch grup wymienionych w pierwszej tabeli. Hormony grupy I mają właściwości lipofilne i są, z wyjątkiem Ty i T4, pochodnymi cholesterolu. Po wydzieleniu do krwi, zostają one związane przez białka nośnikowe (transportowe), przez co odpada problem ich rozpuszczalności i wydłuŜa się ich okres półtrwania w osoczu krwi. Cząsteczki tych hormonów, nie związanych z białkami nośnikowymi, łatwo przechodzą przez błony plazmatyczne wszystkich komórek, łącząc się po drodze z receptorami cytoplazmatycznymi lub jądrowymi w komórkach docelowych. Przyjmuje się, Ŝe kompleks z!oŜony z hormonu i jego receptora spełnia rolę śródkomórkowego przekaźnika dla tej grupy hormonów. Druga duŜa grupa składa się z hormonów rozpuszczalnych w wodzie wiąŜących się z receptorami błony plazma tycz nej komórki docelowej. Hormony, wiąŜące się z błoną plazmatyczną komórek, komunikują się z śródkomórkowymi procesami metabolicznymi za pośrednictwem cząsteczek, określanych jako drogie przekaźniki (second messenger — sam hormon określany jest jako pierwszy przekaźnik). Te ostatnie powstają w wyniku interakcji hormonu z receptorem. Koncepcja drugiego przekaźnika

DZIAŁANIE HORMONÓW / 585 Tabela 45-1. Klasyfikacja hormonów oparta na mechanizmie ich działarjia Grupa I. Hormony wiąŜące się z receptorami śródfcomórkowymi Estrogeny Kaicytriol [1-25(OH),D3] Glukokortykoidy Androgeny Minera lokortykoidy Hormony tarczycy {Ta i Tt) Progestyny Grupa II. Hormony wiąŜące się z receptorami powierzchni komórkowej A. Drugim przekaźnikiem jest cAMP Parathormon Hormon adrenokortykotropowy {ACTH) Opioidy Angiotensyna II Hormon antydiuretyczny (ADH) Acetyl ochot i na Glukagon Folitropina (FSH) Kortykoliberyna (CRH) Gonadotropina kosmówkowa (hCG) Kalcytonina Lipotropina (LPH) Katecholaminy a-adrenergiczne Lutropina (LH) Somatostatyna Melanotropina (MSH) Katecholaminy p-adrenergiczne Tyreotropina (TSH) B. Drugim przekaźnikiem jest cGMP Przedsionkowy czynnik natriuretyczny (ANF) C. Drugim przekaźnikiem są jon wapniowy lub (i) fosfatydyloinozytydy: Katecholaminy c^-adrenergiczne Cholecystokinina G astry na Substancja P Tyreoliberyna (TRH) Wazopresyna D. Przekaźnik śród komórko wy jest nieznany Somatomammotropina kosmówkowa (CS) Hormon wzrostu (GH) Insulina Czynniki wzrostowe insulinopodobne (IGF-I, IGF-II) Prolaktyna

pochodzi z obserwacji Sutherlanda, który wykazał, Ŝe epinefryna, wiąŜąc się z błoną plazmatyczną erytrocytów gołębia, zwiększa stęŜenie śródkomórkowcgo eAMP. W serii kolejnych doświadczeń wykazano, Ŝe cAMP bierze udział w działaniu biologicznym licznych hormonów. Hormony, dla których udowodniono w sposób jednoznaczny taki mechanizm działania, zestawione są w grupie HA tab. 45-1. Jak dotychczas tylko dla przedsionkowego hormonu natriuretycznego (ANF) drugim przekaźnikiem jest cGMP. Zapewne do tej grupy (grupa IIB tab. 45-1) dołączą i inne hormony. Okazało się, Ŝe dta wiehi hormonów, dla których za drugi przekaźnik uwaŜano cAMP, w rzeczywistości są nimi jony wapniowe lub (i) metabolity złoŜonych fosfoinozytydów. Hormony te zestawiono w pkt. IIC tab. 45-1. Dotychczas nie zidentyfikowano drugiego przekaźnika dla grupy

Acetylochoiina (receptor rnuskarynowy) Oksytocyna Gonadoliberyna Angiotensyna II

Nerwowy czynnik wzrostowy (NGP) Naskórkowy czynnik wzrostowy (EGF) Fibrobiastyczny czynnik wzrostowy (FGF) Czynnik wzrostowy pochodzenia (PDGF)

płytkowego

IID, tj. dla bardzo ciekawej klasy hormonów. Nie będzie zaskoczeniem, jeśli się okaŜe, Ŝe działanie tej grupy hormonów zaleŜy od wielu mediatorów lub róŜnych mechanizmów. Kilka hormonów moŜna zaliczyć do więcej niŜ jednej grupy. Podana klasyfikacja hormonów zapewne ulegnie zmianie w miarę uzyskania nowych informacji. HORMONY GRUPY I MAJĄ RECEPTORY ZLOKALIZOWANE SRÓDKOMÓRKOWO ORAZ WPŁYWAJĄ NA EKSPRESJĘ GENÓW Ogólne zasady działania hormonów tej grupy przedstawia ryc. 45-1. Te lipofilne cząsteczki przenikają przez błony plazmatyczne wszystkich komórek, wiąŜą się natomiast tylko ze

586 / ROZDZIAŁ 45 8LONA KOMÓRKOWA

JĄDRO KOMÓRKOWE

A + Receptor U „Aktywacja'

Kompleks hormon —receptor Sekwencja odpowiedzi hormonalnej (HRE)

DNA (chromatyna)

mHNA Translacja Swoiste białko t Odpowleći metaboliczna

Ryc. 45-1. Hormon steroidowy lub tarczycy wiąŜe się ze śródkomórkowym receptorem wywotując zmianę konformacyjną. Następnie kompleks ten wiąŜe się do swoistego fragmentu nici DNA, tj. do sekwencji odpowiedzi hormonalnej (hormone response element); w wyniku tej interakcji dochodzi do aktywacji lub supresji ograniczonej liczby genów.

swoistym receptorem wysokiego powinowactwa w komórkach docelowych. Kompleks złoŜony z hormonu i receptora ulega następnie „aktywacji" (zaleŜnej od temperatury i siły jonowej środowiska), w wyniku której zmienia się jego wielkość, konformacja oraz ładunek powierzchniowy. W wyniku takich zmian kompleks staje się zdolny do wiązania się z chromatyną. Dla zrozumienia istoty sprawy nie ma większego znaczenia, czy proces wiązania hormonu z receptorem i aktywacja kompleksu zachodzą w cytoplazmie czy w jądrze komórkowym (problem ten jest przedmiotem dyskusji). Kompleks hormon-receptor wiąŜe się ze swoistym fragmentem DNA określanym jako ,,element (lub sekwencja) odpowiedzi hormonalnej" {„hormone response element"), aktywując lub inaktywując określone r geny. Wpływając w sposób selektywny na transkrypcję określonego genu i produkcje odpowiadającego mu

mRNA, zmienia stęŜenia swoistych białek oraz procesy metaboliczne. Skutek biologiczny kaŜdego hormonu jest wysoce swoisty. Ogólnie biorąc hormony zmieniają mniej niŜ 1% białek i mRNA w komórce docelowej. Przedmiotem dalszej dyskusji będzie głównie działanie steroidów i hormonów tarczycy na poziomie jądra komórkowego, poniewaŜ zostało ono zupełnie dobrze poznane. Opisano równieŜ bezpośredni wpływ wymienionych hormonów na róŜne organella subkomórkowe i błony. PrzewaŜają dowody, Ŝe hormony steroidowe wpływają głównie na transkrypcję genów, chociaŜ mogą one, podobnie jak liczne hormony innych grup (omawiane niŜej), oddziaływać na „dowolny etap" szlaku informacyjnego przedstawionego na ryc. 45-2. ChociaŜ biochemia procesu transkrypcji genu w komórkach u ssaków nie została jeszcze dobrze poznana, moŜna przyjąć ogólny model wymagań strukturalnych, niezbędnych

DZIAŁANIE HORMONÓW / 587 Tabela 45-2. Cechy ogólne poszczególnych kłas hormonów

Grupa 1

Grupa II

Rodzaj hormo- Hormony steroinu dowe, jodotyro-

Transkrypcja

Homnony polipeptydowe, białkowe lub glikoproteinowe, aminy katechdowe Hydrofilne

niny, kalcytriol Rozpuszczalność Związanezbiaikami przenośnikowymi Osoczowy okres półtrwanta Lokalizacja receptora Charakter drugiego przekaźnika

GEN

Lipofiłne

TRANSKRYPT r

Degradacja

JĄDRO KOMÓRKOWE Procesy modyfikujące Degradacja mRNA

Tak

Nie Transport

Długi (godziny do Krótki (minuty) dni) Śród kom orkowa

W błonie plazmatycznej cAMP, Ca!+, metabolity złoŜonych fosfoinozytydów i inne

Kompleks recep-

tor-hormon

Sekwencja odpowiedz hormonalnej (HRE)

Fragment pro motorowy (PE) ■

CYTO PLAZMA

Translacja

aktywny z± nieaktywny mRNA

BIAŁKO

Ryc. 45-2. „Szlak informacyjny". Hormony mogą oddziaływać na kaŜdy z wymienionych etapów szlaku informacyjnego.

Gen i

—\

5' -------5

■ ▲•O 1

------

f-

■ -. '. ' . * " ■ ■

j ___________ / / / / / / /

1 Miejsce Inicjacji transkrypcji __ I L _ i . Miejsce (erminacii transkrypcji Regulatorowy fragment nici DNA Ryc.

Strukturalny fragment nici DNA

45-3. Wymagania strukturalne niezbędne dla procesu hormonalnej regulacji transkrypcji genu.

dia regulacji transkrypcji genu przez hormon steroidowy lub hormony tarczycy {ryc. 45-3). Geny te muszą się znajdować w obszarach „otwartej", trans kry pcyj nie aktywnej chromatyny oznaczonej na ryc. 45-1 jako wystająca bańka podatnej na trawiące działanie DNA-zy. Dotychczas przebadane geny wykazują przynajmniej dwa oddzielne odcinki regulatorowe („obszary kontrolujące"), zlokalizowane w sekwencji DNA przylegającej bezpośrednio do końca 5' regionu inicjacji transkrypcji (ryc. 45-3). Pierwszy z nich, tzw. element promotorowy (PE — promotor element) ma charakter nieswoisty (generyczny), gdyŜ występuje w ta-

kiej samej lub innej postaci we wszystkich genach. Ten element określa miejsce wiązania się poliraerazy RNA II do DNA i tym samym dokładność inicjacji transkrypcji (p. rozdz. 41). Drugim fragmentem, poznanym w wielu genach regulowanych przez hormony steroidowe jest tzw. sekwencja odpowiedzi hormonalnej

(HRE — hormone response element). Jest ona umiejscowiona nieco dalej od końca 5' niŜ odcinek promotorowy (PE) i moŜe się składać z kilku oddzielnych fragmentów. HRE najpewniej moduluje częstość inicjacji transkrypcji i jest mniej zaleŜny od połoŜenia i orientacji przestrzennej. Pod tym względem jest podobny

588 / ROZDZIAŁ 45 do fragmentów wzmacniających transkrypcje

(enhancer elements) występujących w innych genach (p. rozdz. 41). Ogólnie mówiąc HRE zlokalizowany jest w paśmie DNA przed fragmentem inicjacji transkrypcji i oddzielony od tego ostatniego przez kilkaset nukleotydów. Dokładne połoŜenie HRE jest róŜne dla poszczególnych genów. W niektórych przypadkach zlokalizowany jest w obrębie samego genu. Geny kontrolowane przez kilka hormonów mają odpowiadającą im liczbowo HRE. RównieŜ transkrypcja indukowana hormonami pepty do wy mi odbywa się poprzez odpowiedni HRE, chociaŜ początek inicjacji tego procesu róŜni sie od wyŜej opisanego dla hormonów steroidowych, np. wiele hormonów, dla których drugim przekaźnikiem jest cAMP, oddziałuje na transkrypcję. W tych przypadkach czynnikiem przenoszącym sygnał (podobnym do kompleksu receptor—hormon steroidowy lub hormon tarczycy) jest specjalne białko, określane jako „białko wiąŜące sekwencję HRE powstałe pod wpływem cAMP" (cAMP response element binding protein) (CREB). W tabeli 45-3 podano sekwencje konsensus DNA dla kilku HRE. Fragment HRE odznacza się tym, Ŝe wiąŜe się lepiej z kompleksem hormon—receptor niŜ otaczające go fragmenty nici DNA lub DNA pochodzące z innego źródła. W wyŜej opisanych przypadkach potwierdzono występowanie tego rodzaju swoistego wiązania. HRE musi równieŜ inicjować odpowiedź na działanie hormonu. Domniemana sekwencja regulatorowego DNA moŜe być sprzęŜona z genami reporterowymi dla realizacji takiego działania. Normalnie te geny fuzyjne (fusion genes) zawierają geny reporterowe, na które hormony zwykle nie mają wpływu. Często geny te nie ulegają normalnej ekspresji w badanych tkankach. Wśród powszechnie stosowanych genów reporterowych naleŜy wymienić geny dla: globiny, kinazy tymidynowej, bakteryjnej acetylotransferazy chloramfenikolowej i lucyferazy. JeŜeli po transfekcji genu fuzyjnego do komórki docelowej hormon wykazuje działanie regulujące transkrypcję genu reporterowego, wówczas moŜna twierdzić, Ŝe HRE został zdefiniowany. Posługując się taką techniką moŜna określić wpływ zmian połoŜenia, orientacji i podstawienia zasad w łańcuchu DNA na działanie HRE. Przedmiotem intensywnych badań jest mechanizm wpływu interakcji kompleksu hormon-receptor z HRE na proces transkrypcji. Inicjacja transkryptu jest prawdopodobnym mechanizmem kontroli

Tabela 45-3. Sekwencje DNA dla kilku HRE

Hormon/ Elektor

HRE

Sekwencja DNA*

Glukokortykoidy

GRE

GGTACAnnnTGTTCf

Progestyny

PRE

_ " _

M i nerałokorty ko -

MRE

— " . __

Androgeny

ARE

— " —

Estrogeny

ERE

AGGTCAnnnTGTCCT

Hormony tarczy-

TRE

GATCAnnnnnTGACC'

idy

cy

Kwas retinolowy RRE cAMP

1

CRE TGAC GTCA

* Litery oznaczają trifosłorany nukleotydów, „n" oznacza, Ŝe w tym połoŜeniu moŜe być uŜyty którykolwiek z czterech nukteotydów. Strzałki skierowane w przeciwnych kierunkach wskazują na występowanie nieco niedoskonałej, odwróconej sekwencji palindromowej w wielu HRE; w niektórych przypadkach te ostatnie określa sie jako „sekwencję połowicznie wiąŜącą" (haIf-binding sites"), poniewaŜ kaŜdy z nich wiąŜe jeden monomer receptora. HRE oznaczone jako GRE, PRE, MRE i ARE wykazują taką samą sekwencję zasad w nici DNA, Swoistość moŜe być uwarunkowana Śród kom orkowym stęŜeniem receptora hormonalnego lub sekwencją DNA flankującą nie występującą w sekwencji konsensus. Druga grupa HRE dotyczy hormonów tarczycy, estrogenów i kwasu retinotowego. Te HRE są bardzo do siebie podobne róŜniąc się fragmentem dzielącym połówki palindromowe. Wszystkie te H R t mają sekwencję konsensus, z wyjątkiem HRE dla hormonów tarczycy. Jego sekwencja odpowiada TRE dla genu hormonu wzrostu. Receptor kwasu retinolowego moŜe wiązać się z taką samą sekwencją jak receptor hormonów tarczycy. Hormony peptydowe, działające 2a pośrednictwem zmiany stęŜenia śródkomórkowegocAMP, oddziaływują na proces transkrypcji za pośrednictwem CRE.

tego procesu, chociaŜ moŜliwy jest równieŜ jego wpływ na proces elongacji i terminacji. Przypuszcza sie, Ŝe istnieją sekwencje DNA kontrolujące proces transkrypcji, połoŜone w pewnym oddaleniu od końca 5* sekwencji sygnałowej lub w dół za końcem 3*, albo w obrębie genu, albo teŜ poza nim. Mogą równieŜ występować mechanizmy regulacji typu trans (tj. przez inne chromosomy).

DZIAŁANIE HORMONÓW / 589

HORMONY GRUPY (I (HORMONY PEPTYDOWE) MAJĄ RECEPTORY UMIEJSCOWIONE W BŁONIE PLAZMATYCZNEJ I DZIAŁAJĄ ZA POŚREDNICTWEM PRZEKAŹNIKÓW ŚRÓDKOMÓRKOWYCH Największa liczba hormonów: a) jest rozpuszczalna w wodzie, b) nie wiąŜe się z białkami nośnikowymi (przez co wykazują krótki półokres trwania w osoczu) oraz c) zapoczątkowuje odpowiedź hormonalną wiąŜąc się z receptorem zlokalizowanym w błonie plazmatycznej (tab. 45-1 i 45-2). W mechanizmie działania tych hormonów biorą udział śródkomórkowe przekaźniki. Wiełe hormonów działa za pośrednictwem cAMP jako drugiego przekaźnika cAMP (cykliczny AMP, kwas 3', 5'-adenylowy — p. str. 215) jest wszędobylskim nukleotydem powstałym z ATP pod wpływem działania cyklazy adenylanowej. Odgrywa on decydującą rolę w działaniu licznych hormonów. Pod wpływem tych ostatnich (tab. 45-4) śródkomórkowe stęŜenie cAMP zwiększa się tub zmniejsza, przy czym efekt ten moŜe być róŜny w róŜnych tkankach. I tak epinefryna powoduje duŜy wzrost stęŜenia cAMP w mięśniach szkieletowych, natomiast względnie małe zmiany stęŜenia tego nukleotydu w wątrobie.

Tabela 45-4. Subklasyfikacja hormonów grupy 1I.A (p. tab. 45-1) Hormony pobudza- Hormony hamujące jące oykiazę adeny- cyklazę adenylanolanową (Hs) wą (Hj) ACTH ADH

Substancje j3-adrenergiczne Kalcytonina CRH (kortykoliberyna) FSH (folitropina) Gtukagon bCG (gonadorropina kos mówko wa, ludzka) LH (lutropina) LPH (lipotropirta) MSH (melanotropina) PTH (parathormon) TSH (tyreotropina)

Acetylochoiina Substancje ctj-adrenergiczne Angiotensyna II Opioidy Somatostatyna

Odwrotny wpływ na stęŜenie cAMP wykazuje glukagon (wywołując znaczny wzrost jego stęŜenia w wątrobie zaś mały wzrost w mięśniach szkieletowych). Tkanki reagujące na kilka hormonów tej samej grupy posiadają niepowtarzalne receptory sprzęŜone zjedna i tą samą cząsteczką cyklazy adenylanowej. Najlepszym tego przykładem jest adypocyt, w którym dochodzi do aktywacji cyklazy adenylanowej i wzrostu stęŜenia cAMP pod wpływem takich hormonów jak epinefryna. ACTH, TSH, glukagon, MSH iwazopresyna (ADH). Maksymalne efekty działania kilku hormonów działających równocześnie na komórkę docelową nie mają charakteru addycyjnego. Ponadto działania niszczące jeden rodzaj receptora nie mają wpływu na odpowiedź komórki indukowaną innymi hormonami.

Układ cyklazy adenylanowej. Składowe tego układu, występującego w komórkach ssaków, przedstawia ryc. 45-4. Interakcja hormonu ze swoim receptorem jest przyczyną aktywacji lub inaktywacji cyklazy adenylanowej. W procesie tym pośredniczą przynajmniej dwa białka regulatorowe GTP-zaleŜne oznaczone jako Gs (białko pobudzające) i Gi (białko hamujące). KaŜde z tych białek składa się z trzech podjednostek a, p i y. Cyklaza adenylanowa, umiejscowiona na wewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej, katalizuje powstawanie cAMP z ATP w obecności jonów magnezowych (p. ryc. 34-14). To co pierwotnie uwaŜano za jedno białko z dwiema domenami funkcyjnymi w rzeczywistości jest nadzwyczaj złoŜonym układem. W ciągu ostatnich 15 lat dzięki licznym badaniom ustalono biochemiczną niepowtarzalność receptora hormonalnego oraz GTP-zaJeŜne domeny regulatorowe i katalityczne kompleksu cyklazy adenylanowej przedstawionej na ryc. 45-4. Przedstawiony na rycinie model wyjaśnia, w jaki sposób róŜne hormony peptydowe mogą pobudzać (s) lub hamować (i) wytwarzanie cAMP (tab. 45-4). Dwa równoległe układy, jeden pobudzający (s) i jeden hamujący (i) umiejscowione są na pojedynczej cząsteczce katalitycznej (c). KaŜdy z nich składa się z receptora R s lub Rj oraz z kompleksu regulatorowego Gs i Gi. Białka regulatorowe Gs i Gj są trimerami z podjednostek a, p i y. Podjednostki p i y białka Gs wydają się być identyczne z występującymi w białku G;. Podjednostka a białka Gs (określana jako as) wykazuje masę cząsteczkową równą 45 000 i ró-

590 / ROZDZIAŁ 45

CYTOPU\Z ATP

cAMP

Ryc. 45-4. Sygnał indukowany przez kompleks hormon-receptor przekazywany jest za pośrednictwem kompleksu białka regulatorowego Gs (pobudzającego) lub Gj (hamującego) na układ cyklazy adenylanowej (C), przez co dochodzi do stymulacji (s) lub hamowania (i) produkcji cAMPzATP. (Według: Gilman A, G.-. G proteins aoddual control of adenylatecyclase. Celi 1984r36,577. Copyright © the Massachusetts Institute of Technology, za zezwoleniem).

Ŝni się od podjednostki a białka G, (określanego jako oij) o masie cząsteczkowej 41 000. Połączenie się hormonu z Rs lub Ri indukuje aktywację białka G, wyraŜającą się wiązaniem GTP do podjednostki x(proceg Jen jest zaleŜny od jonów Mg 2+ ) oraz od szczepieniem podjednostek P i y od podjednostki a zgodnie z równaniem GTP «PY H a-GTP + Py GTP-aza

Podjednostka Og posiada wewnętrzną aktywność GTP-azową, zaś jej aktywna postać cts-GTP ulega inaktywacji przez hydrolizę GTP do GDP. Z kolei odnowieniu ulega trimeryczna postać kompleksu Gs. Toksyna cholery, znana jako nieodwracalny aktywator cyklazy, powoduje ADP rybozylacje podjednostki os przez co inaktywacji ulega CTP-aza, zaś podjednostka ots zachowuje swoją postać aktywną. Podjednostka

ott takŜe wykazuje aktywność GTP-azową, jednakŜe GDP nie odszczepia się swobodnie od

kompleksu Oj-GDP. Reaktywacja podjednostki Oj odbywa się na drodze wymiany GDP na GTP. Toksyna krztuśca aktywuje cyklazę adenylanową w sposób nieodwracalny poprzez ADP rybozyiację podjednostki aif przez co uniemoŜliwia aktywacje tej ostatniej. Fluorek sodu,

będący innym nieodwracalnym aktywatorem cyklazy, przypuszczalnie działa na podjednostkę ots lub a*, poniewaŜ wpływa w sposób podobny na kompleksy regulatorowe Gs i Q. Nie określono dotychczas właściwej roli wymienionych podjednostek ot, p1 i y. Zbadano dwie moŜliwości. Podjednostki as i a-, w sposób niekompetycyjny reagują z cyklazą adenylanową (C), wywołując przeciwne efekty. Skutek netto byłby zaleŜny od stosunku aktywnej postaci as do aktywnej postaci OL,. Niestety aktywna postać a, wykazuje słabe działanie hamujące na C w układach izolowanych. Stąd bardziej prawdopodobne wydaje się, Ŝe podjednostka P kompleksu Gj hamuje podjednostkę a s . W tym modelu podjednostka <*„ wiąŜąc podjednostkę (J, spełniłaby rolę antyinhibitora cyklazy

DZIAŁANIE HORMONÓW / 591

adenylanowej t jako taka nie wykazałaby Ŝadnego bezpośredniego działania. Wiele składowych układu cyklazy zostało juŜ oczyszczonych, w tym równieŜ jej podjednostka katalityczna. Obecnie nie ulega juŜ wątpliwości, Ŝe istnieje cala rodzina białek G. Transducyna, będąca białkiem sprzęgającym impuls świetlny z fotoaktywacją w obrębie siatkówki, jest podobna do białka G cyklazy adenylanowej. Takie samo podobieństwo wykazują produkty onkogenów ras. Niepowtarzalne białko, określane jako Go, wyizolowane zostało z tkanki mózgowej. Inne, słabiej scharakteryzowane białka tej rodziny, wydają się odgrywać rolę w przezbłonowym transporcie wapnia i potasu oraz w przemianie fosfoinozytydów. Znaczenie tych składników podkreśla niŜej opisane „doświadczenie przyrody". Rzekoma iiiedoczynność przytarczyc jest zespołem chorobowym charakteryzującym się hipokalcemią i hiperfosfatemią, tj. głównymi objawami niedoczynności przytarczyc oraz innymi wrodzonymi defektami. Osoby dotknięte tym zespołem nie wykazują jednak upośledzonej czynności przytarczyc. Wydzielają one duŜe ilości biologicznie aktywnego PTH. Niektórzy z tych chorych wykazują jednak oporność narządu docelowego na PTH o charakterze defektu poreceptorowego. Chorzy ci wykazują częściowy niedobór białka G (prawdopodobnie tylko niedobór podjednostki as), przez co dochodzi do niewystępowania sprzęŜenia pomiędzy wiązaniem PTH z receptorem a pobudzeniem cyklazy adenylanowej. U innych chorych PTH indukuje powstawanie cAMP, natomiast brak jest odpowiedzi na ten drugi sygnał w obrębie komórki. Stąd nie jest zaskoczeniem, Ŝe chorzy z rzekomą niedoczynnością przytarczyc często wykazują równieŜ upośledzoną reakcję na inne hormony, takie jak TSH, glukagon i związki padrenergiczne (dla których cAMP jest drugim przekaźnikiem). Kinaza białek. W komórkach prokariotyc2nych cAMP wiąŜe się ze swoistym białkiem określanym jako kata bo liczne białko regulatorowe (catabolite regulatory protein — CRP). Białko to wiąŜe się bezpośrednio z DNA i wpływa na ekspresję genów. Analogia z opisanym wyŜej mechanizmem działania steroidów jest oczywista. W komórkach eukariotycznych cAMP wiąŜe się z kinazą białek, będącą cząsteczką heterotetrameryczną, złoŜoną z dwóch podjednostek regulatorowych (R) i dwóch podjednostek katalitycznych (C).

Reakcję wiązania cAMP przedstawia następujące równanie: 4cAMP+ R2Ca i± R2- (4cAMP) + 2C

Kompleks R2C2 nie wykazuje aktywności enzymatycznej, lecz po związaniu się R z cAMP dochodzi do odłączenia się R od C, przez co aktywacji ulega C (ryc. 45-5). Aktywna podjednostka C katalizuje przenoszenie reszty fosforanowej z ATP{Mg2+) na serynę lub treoninę całego szeregu białek. Miejscem fosforylacji jest zwykle sekwencja -Arg-Arg-X-Ser- i -Lys-Arg-S-S-Ser- gdzie w miejscu X moŜe występować dowolny aminokwas. Pierwotnie wyróŜniano kinazy białek cAMP-załeŜne i cAMP-niezaleŜne. Jak widać w tab. 45-5, problem ten star^się znacznie bardziej złoŜony po wykazaniu, Ŝe fosforylacja białek stanowi waŜny mechanizm regulatorowy. Wymienione w tabeli kinazy są niepowtarzalnymi cząsteczkami róŜniącymi się liczbą podjednostek wchodzących w ich skład, masą cząsteczkową, autofosforylacją, wartością Km dla ATP i swoistością substratową. W największych szczegółach przebadano cAMP-zaleŜną kinazę białek I i II. Kinazy te wykazują taką samą podjednostkę C, lecz skłaTabela 45-5. Oczyszczone kinazy białek Reagujące (wraŜliwe) na hormony Kinaza zaleŜna od Ca/kalmoduliny Kinaza zaleŜna od Ca/fosfolipidu Kinaza II kazeiny Kinaza typu I i II zaleŜna od cAMP Kinaza zaleŜna od cGMP Kinaza tyrozynowa zaleŜna od naskórkowego czynnika wzrostowego Kinaza zaleŜna od cyklicznego nukleotydu owadów Kinaza tyrozynowa zaleŜna od insuliny Kinaza lekkich łańcuchów miozyny Kinaza fosforylazy Kinaza dehydrogenazy pirogronianowej Nie wiadomo, czy reagują na hormony elF-2-a-kinaza zaleŜna od dsRNA e)F-2-akinaza zaleŜna od hemtny Kinaza I aktywowana przez proteazę Kinaza rod o psy ny Wirusowa kinaza tyrozynowa typu I, l( i 1(1 Kinazy mogące reagować na hormony Kinaza I kazeiny Kinaza II aktywowana przez proteazę

592 / ROZDZIAŁ 45 Nieaktywna kinaza białek

ATP

Białko Hormon ■

Cyklaza Hecepior

adenylanowa regulatorowe

GTP-za lezne

(•) | FOSFODIESTERAZA

BŁONA KOMÓRKOWA Aktywna kinaza

bUtofc ' 1+

N

Mg -ATP Blarko

Fosfoprotalna

Fosfataza

" Elekty flzjoloBlczne

Ryc. 45-5. Hormonalna regulacja procesów komórkowych pośredniczonych kinazami biafek zaleŜnymi od cAMP. cAMP (•) powstały w wyniku działania cyklazy adenylanowej wiąŜe się z podjednostką regulatorową (R) cAMP-zaleŜnej kinazy białek. Wynikiem tej reakcji jest uwalnianie i aktywacja podjednostki katalitycznej (C). (Za pozwoleniem J. Corbin).

dają się z róŜnych podjednostek R. Pierwotnie odróŜniano je na podstawie odmiennego ładunku powierzchniowego i wynikających stąd szybkości elucji z kolumny uŜywając chromatografii jonowymiennej (typ I jest bardziej kwaśny i ulega elucji przy niŜszych stęŜeniach soli niŜ typ II). Większość tkanek wykazuje obecność obu postaci kinaz, natomiast istnieją znaczne róŜnice międzygatunkowe i między narządowe w odniesieniu do rozmieszczenia tych izozymów. Ostatnie badania sugerują, Ŝe typ I róŜni się od typu II reakcją na róŜne kombinacje analogów cAMP. Takie badania mogą być poŜyteczne przy określaniu izozymu pośredniczącego w swoistej reakcji biologicznej. Istnieją równieŜ fakty, dowodzące, Ŝe stymulacja hormonalna swoiście podwyŜsza aktywność albo kinazy typu I albo typu II. Wiele innych kinaz białek uczestniczy w mechanizmie działania hormonów. Rolę tych kinaz przedstawiono na ryc. 45-6 i w dalszych częściach niniejszego rozdziału, (śinazy zaleŜne od naskórkowego hormonu wzrostowego lub in-

suliny są niepowtarzalne dlatego, Ŝe aktywność enzymatyczna zlokalizowana jest w obrębie receptora i Ŝe aktywacja kinazy zaleŜna jest od połączenia się hormonu z receptorem (p. rozdz. 52). Inną wyróŜniającą cechą jest to, Ŝe kinazy te preferencyjnie katalizują fosibrylację reszt tyrozynowych, podczas gdy fosforylacja tyrozyny nie jest często spotykana w komórkach ssaków. Rola jaką odgrywają te kinazy białek, fosforylujące tyrozynę, a występujące w obrębie receptora, w mechanizmie działania hormonów nie jest jasna. MoŜliwe, Ŝe hormon zapoczątkowuje kaskadę fosforylacji oraz Ŝe jeden lub więcej produktów tej kaskady są środkomórkowymi przekaźnikami. Fosfoproteiny. Zakłada się, Ŝe działanie cAMP w komórkach eukariotycznych odbywa się za pośrednictwem fosforylacji lub defosforylacji białek. Kontrola efektów działania cAMP, obejmujących tak róŜnorodne procesy, jak steroidogeneza, wydzielanie, transport jonów, przemiana węglowodanów i tłuszczów, indukcja enzymatyczna, regulacja genów,

DZIAŁANIE HORMONÓW / 593

Wieloczynnościowa Kinaza kalmoduliny

Ryc. 45-6. Interakcja pewnych hormonów z receptorem powoduje aktywację fosfolipazy C. W procesie tym uczestniczy swoiste białko G, które równieŜ moŜe aktywować kanał wapniowy. W wyniku działania 11 fosfolipazy C powstaje IP=, który uwalnia jony Ca ' " ze środkom orkowych magazynów oraz diacyloglrcerol (DAG), aktywujący kinazę białek C. W tym schemacie aktywowana kinaza białek C katalizuje fosforylację 2+ swoistych substratów, które z kolei zmieniają procesy fizjologiczne. Podobnie, równieŜ kompleks Ca kalmodulina (Cam) moŜe aktywować swoiste kinazy. W wyniku tych działań substraty ulegają modyfikacjom, co z kolei zmienia reakcje fizjologiczne.

wzrost komórek i ich replikacja, mogłaby być zaleŜna od swoistej kinazy białek, swoistej fosfatazy lub od swoistych substratów fosforylacji. W niektórych przypadkach zidentyfikowano fosfoproteinę, uczestniczącą w określonym szlaku metabolicznym. Fosfoproteiny uczestniczące w większości procesów wymienionych wyŜej niestety nie są dotychczas znane. Wymienione substraty mogą być pomocne w określaniu tkanki docelowej i zapewne determinują nasilenia reakcji w obrębie określonej komórki. Wiele białek moŜe ulec fosforylacji, w tym kazeina, histony i protamina. Takie fosforylacje mogą jednak być tylko zjawiskiem wtórnym, chociaŜ mogą być uŜyteczne przy oznaczaniu aktywno— Biochemia

ści kinazy białek. Do niedawna, jedynymi działaniami cAMP, które bliŜej zdefiniowano, były jego działania poza jądrem komórkowym. Opisany zostai wpływ cAMP na transkrypcję kilku genów. Wydaje się, Ŝe w tych przypadkach cAMP działa za pośrednictwem białka CREB opisanego wyŜej. Fosfodiesterazy. Działanie hormonów wywołujące podwyŜszenie środkomórkowego stęŜenia cAMP moŜe zostać zakończone kilkoma sposobami, w tym poprzez hydrolizę cAMP katalizowaną przez fosfodiesterazy. Obecność tych enzymów hydrolitycznych zapewnia szybki obrót sygnału (tj. cAMP) i tym samym szybkie zakończenie procesu biologicznego in-

594 / ROZDZIAŁ 45

dukowanego bodźcem hormonalnym, skoro tylko ten ostatni przestaje działać. Fosfodiesterazy cAMP występują w postaciach, charakteryzujących się niską lub wysoką wartością Km i podlegają zarówno regulacjom hormonalnym, jak i przez takie śródkomórkowe przekaźniki jak jony wapnia (prawdopodobnie działające poprzez kalmodulinę). Inhibitory fosfodiesterazy, w tym szczególnie metylowane pochodne ksantyny (takie jak kofeina), podwyŜszają śródkomórkowe stęŜenie cAMP i wywołują efekty podobne do hormonów lub wydłuŜają działanie tych ostatnich.

Fosfatazy fosfoprotein. Inny sposób kontroli działania hormonu polega na regulacji reakcji defosforylacji białka. Same fosfatazy fosfoprotein podlegają regulacji przez procesy fosforylacji i defosforylacji oraz przez inne róŜnorodne czynniki. Najwięcej wiadomo o roli fosfatazy w regulacji przemiany glikogenu mięśni szkieletowych. W tkance tej opisane zostały dwa rodzaje fosfataz fosfoprotein owych. Typ I preferencyjnie defosforyluje podjednostkę P kinazy fosforylazowej, zaś typ II — defosforyluje podjednostkę a. Aktywność fosfatazy typu I regulują dwa ciepłooporne inhibitory białkowe. Inhibitor-1 jest fosforylowany i aktywowany przez kinazę białek cAMP-zaleŜną, podczas gdy inhibitor-2 (który wydaje się być podjednostką inaktywowanej fosfatazy) ulega takŜe fosforylacji być moŜe przez kinazę-3 syntazy glikogenowej. W wyniku fosforylacji inhibitora-2 dochodzi teŜ do aktywacji fosfatazy. Pewne fosfatazy mogą atakować swoiste ugrupowania chemiczne, np. mogą występować fosfatazy odszczepiajacc^grupę fosforanową od reszty tyrozynowej.

Pozakomdrkowy cAMP. Pewne ilości cAMP opuszczają komórki i mogą być łatwo wykrywane w płynach pozakomórkowych. Tak np. w wyniku działania glukagonu na wątrobę lub wazopresyny i PTH na nerki moŜna stwierdzić podwyŜszone stęŜenia cAMP w osoczu krwi lub w moczu. Fakt ten leŜy u podstawy testów diagnostycznych mających na celu określenie reaktywności narządów docelowych na ww. hormony. U ssaków pozakomórkowy cAMP ma znikomą aktywność, lub teŜ nie ma Ŝadnej aktywności biologicznej. Jest on natomiast nadzwyczaj waŜnym przekaźnikiem śródkomórkowym u niŜszych eukariontów i prokariontów.

Jeden hormon uŜywa cGMP jako drugiego pośrednika Cykliczny GMP powstaje z GTP pod wpływem cyklazy guanyianowej występującej w postaci rozpuszczalnej i związanej z błoną komórkową. KaŜdy z tych izozymów wykazuje niepowtarzalne właściwości kinetyczne, fizykochemiczne i antygenowe. Przez pewien czas cGMP uwaŜano za czynnościowego antagonistę cAMP. Obecnie wydaje się, Ŝe cGMP zajmuje wyjątkową pozycję w mechanizmie działania hormonów. Atriopeptyny, rodzina peptydów wytwarzanych przez kardiomiocyty przedsionków, wywołują natriurezę, diureze i rozszerzenie naczyń oraz hamują sekrecje aldosteronu. Te peptydy (np. przedsionkowy czynnik na- * triuretyczny) wiąŜą się i aktywują cyidazę gnanylanową, związaną z błoną plazma tyczną.. W wyniku tej reakcji wzrasta stęŜenie cGMP, w niektórych przypadkach aŜ 50-krotnie. Przypuszcza się, Ŝe wyŜej wymienione efekty atriopeptyn są spowodowane wzrostem generacji cGMP. Inne fakty wskazują na udział cGMP w procesie wazodylatacji. Wiele związków, wśród których znajdują się nitroprusydek, nitrogliceryna, azotyn sodu i azydek sodu, powodują rozkurcz miocytów naczyniowych i są bardzo silnymi lekami rozszerzającymi naczynia krwionośne. Związki te zwiększają stęŜenie cGMP aktywując rozpuszczalną postać cyklazy guanyianowej. Efekt ten nasilają i wydłuŜają w czasie inhibitory fosfodiesterazy cGMP. Uwalniające się zwiększone ilości cGMP aktywują cGMP-zaleŜną kinazę białek, która z kolei katalizuje fosforykcję szeregu białek miocytów naczyniowych, w tym równieŜ łańcuchów lekkich miozyny. Przypuszczalnie proces ten uczestniczy w relaksacji miocytów i wazodylataWiele hormonów działa za pośrednictwem jonów wapnia lub fosfoinozytydów Jon wapniowy jest waŜnym regulatorem: a) róŜnych procesów komórkowych w tym procesu skurczu mięśnia, b) sprzęŜenia zachodzącego między bodźcem sekrecyjnym a sekrecją, c) układu krzepnięcia krwi, d) aktywności enzymów i pobudliwości komórkowej. Jest on równieŜ śródkomórkowym przekaźnikiem w mechanizmie działania hormonów. Przemiana wapnia. StęŜenie wapnia ogólnego w płynie pozakomórk owym wynosi ok, 2,5 mmol/1. Podlega on bardzo ścisłej kontroli

DZIAŁANIE HORMONÓW / 595


teczkowej 17000, iiomologiczne w swej strukturze i czynności do tropiny C będącej białkiem mięśni. Kalmodulina wykazuje 4 miejsca wiąŜące CaJ+, po wysyceniu których dochodzi do znaczącej zmiany konformacyjnej, tak Ŝe większość cząsteczki przybiera strukturę a-heliksu. Ta zmiana konformacyjna związana jest przypuszczalnie ze zdolnością kalmoduliny do aktywowania lub inaktywowania enzymów. Interakcja jonów wapnia z kalmodulina (w wyniku czego dochodzi do zmiany aktywności tej ostatniej) jest koncepcyjnie podobna do wiązania cAMP z kinazą białek, przez co ulega ona aktywacji. Kalmodulina jest często tylko jedną z licznych podjednostek wielu kompleksów białkowych. Uczestniczy ona szczególnie w regulacji aktywności róŜnych kinaz i enzymów syntezy i rozkładu cyklicznych nukleotydów. Częściową listę enzymów regulowanych bezpośrednio lub pośrednio zmianami stęŜenia Ca2+ (najpewniej za pośrednictwem kalmoduliny) przedstawia tab. 45-6. ;

Tabela 45-6. Enzymy regulowane przez Ca' /kalmodulinę i+

Cyklaza adenyianowa Ca za!eŜna kinaza białek 2+

Kinaza białek. Ca /fosfotipidowo-zaleŜna Fosfodiesteraza cyklicznego nukfeotydu Dehydrogenaza gliceroto-3-fosf ora nowa Syntaza glikogenowa Cyklaza guanylanowa Kinaza miozyny NAD-kinaza Fosfoiipaza A2 Kinaza fosforytazy Fosfataza 2B fosfoproteinowa Karboksylaza pirogronianowa Dehydrogenaza pirogronianowa Kinaza pirogronianowa

Oprócz działania na enzymy i transport jonów Ca2+ kalmodulina reguluje aktywność licznych elementów strukturalnych komórki. Wśród nich naleŜy wymienić kompleks aktyna-miozyna mięśni gładkich (znajdujący się pod kontrolą P-adrenergiczną) oraz róŜne procesy, w których biorą udział mikrofilamenty w nie kurczących się komórkach (ruchliwość komórek, zmiany konformacyjne, mitozę, uwalnianie ziarnistości i endocytozę).

596 / ROZDZiAŁ 45

Jony wapnia są mediatorami działania hormonów Za udziałem jonów wapnia w mechanizmie działania hormonów przemawiają następujące obserwacje: 1) działanie wielu hormonów ulega osłabieniu w środowisku pozbawionym Ca2 + lub w stanach zuboŜenia komórek w wapń, 2) działanie hormonów moŜna naśladować uŜywając substancji zwiększających stęŜenie wapnia śródkomórkowego np. jonoforu wapnia A 23187 oraz 3) działanie hormonów ma wpływ na napływ wapnia do komórki lub przemieszczenie Ca2+ w obrębie komórki. Procesy te badano w pewnych szczegółach w przysadce mózgowej, mięśniówce gładkiej, płytkach i śliniankach. Najwięcej jednak wiadomo o udziale Ca2+ w mechanizmie działania wazopresyny i katecholamin a-adrenergicznych dotyczącego regulacji przemiany glikogenu w wątrobie. Pokazano to na ryc, 19-5 i 19-7. Dodanie do izolowanych hepatocytów agonistów at-adrenergkznych lub wazopresyny wywołuje 3-krotny wzrost stęŜenia CaJ+ w cytoplazmie (od 0,2 do 0,6 umol/J w ciągu kitka sekund). Zmiana ta wyprzedza i jest równa wzrostowi aktywności fosforylazy a, zaś stęŜenia hormonów potrzebnych do wywołania wymienionych efektów są porównywalne. Efekt działania Ca2+ ulega zahamowaniu przez ctt-antagonistów, zaś usunięciu hormonu ze środowiska towarzyszy szybki spadek stęŜenia Ca2 + w cytoplazmie i aktywności fosforylazy a. Źródłem jonów Ca2 + są depozyty tego jonu w organellach śród komórkowych. Są one wystarczające do wywołania pierwszych efektów działania hormonów.^Przy dłuŜszym działaniu hormonów potrzebny jest zwiększony napływ Ca2 + do komórki lub hamowanie wypływu tego jonu z komórki za pośrednictwem pompy wapniowej. Aktywność tej ostatniej moŜe zaleŜeć od wzrostów cAMP towarzyszących ww. zmianom stęŜenia Ca2+. Aktywacja fosforylazy jest wynikiem konwersji fosforylazy b do fosforylazy a przez enzym — kinazę fosforylazy b. Enzym ten zawiera kalmodulinę w swej podjednostce 8, zaś jego aktywność wzrasta przy wzroście stęŜenia Ca2 + z 0,1—1 (imol/1, tj. w zakresie stęŜeń, przy których hormony zwiększają stęŜenia Ca ł+ w wątrobie. SprzęŜenie występujące między śródkomórkowym stęŜeniem Ca2 + i aktywacją fosforylazy nie podlega juŜ wątpliwości. Aktywność wielu enzymów o znaczeniu krytycznym dla pewnych szlaków metabolicznych

regulowana jest przez zmiany stęŜenia Ca3 + lub (i) fosforylację tych enzymów. Wśród takich enzymów wymienić naleŜy m.in. syntazę glikogenową, kinazę piróg ronią nową, karboksylazę pirogronianową, dehydrogenazę glicerolo-6-fosforanową oraz dehydrogenazę pirogronianową. Nie jest pewne, czy kalmodulina bezpośrednio uczestniczy w regulacji wymienionych enzymów, czy tez uczestniczą w niej niedawno odkryte kinazy białek, zaleŜne od Ca3+/kalmoduliny lub Ca^/fosfolipidu. Przemiana fosfotnozytydu odgrywa rolę w działaniu hormonów zaleŜnych a+ od Ca Musi istnieć sygnał zapewniający komunikację między receptorem hormonalnym błony komórkowej a śródkomórkowymi rezerwuarami wapnia. Najlepszymi kandydatami na taki sygnał wydają się być produkty przemiany fosfoinozytydu. Receptory dla acety locho liny, hormonu antydiuretycznego i katecholamin oc,-adrenergtcznych, występujące na powierzchni błony plazmatycznej, po połączeniu się ze swoimi swoistymi ligandami, są potęŜnymi aktywatorami fosfolipazy. Proces wiązania się hormonu z receptorem oraz aktywacja fosfolipazy C są ze sobą sprzęŜone przez unikatowe białko G (ryc. 45-6). Fosfolipaza C katalizuje hydrolizę fosfatydyloinozytoio-4,5-bisfosforanu do trifosforanu inozytolu i 1,2-diacyloglicerolu (ryc. 45-7). Choć sam diacyloglicerol moŜe aktywować kinazę białek C, aktywność tego enzymu zaleŜy jednak równieŜ od obecności wolnych jonów wapnia. Trifosforan inozytoiu jest efektywnym uwalniaczem wapnia ze śródkomórkowych magazynów, takich jak siateczka sarkoplazmatyczna i mitochondria. Tak więc hydroliza fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanu jest przyczyną aktywacji kinazy białek C i wzrostu stęŜenia Ca2 + w cytoplazmie. W obecności ACTH i cAMP w korze nadnerczy, angiotensyny, jonów K"1", serotoniny, ACTH i dibutyrylo-cAMP w warstwie kłębkowatej nadnerczy, LH w jajnikach oraz LH i cAMP w komórkach Leydiga gonady męskiej, w wymienionych tkankach stwierdza się zwiększone ilości kwasu fosfatydowego, fosfoinozytolu i polifosfoinozytydów. MoŜna by przytoczyć kilka innych przykładów. Na ryc. 45-6 przedstawiono rolę jaką odgrywają jony Ca2+ i produkty rozpadu fosfoinozytydu w mechanizmie działania hormonów. W tym schemacie aktywna kinaza białek

DZIAŁANIE HORMONÓW / 597

R R, OH I I I 1,2-Diacy log lice roi (DAG)

Fosfaiydy tol nozyto to-4,5-blstosf oran (PIP,)

I nozytob-1,4.5-trisf osf o ran

Ryc. 45-7. Fosfolipaza C rozkłada fosfatydyloinozytylo-bisfosforan (PIPa) do diacytoglicerolu i inozytolo-bts-fosforanu. Ri jest zazwyczaj stearynianem, zaś Rj-arachidonianem. IP3 moŜe ulec defosforylacji {do nieaktywnego inozytolo-1,4-bisfosforanu (1-1,4P2) lub "fosforyIacji (do potencjalnie aktywnego 1,3,4,5-tetra fosforan u inozytolu 1-1, 3, 4, 5-P4). ___

C katalizuje fosforylację swoistych substratów, które następnie zmieniają procesy fizjologiczne. Podobnie kompleks Ca2+-kalmodulina (Cam) moŜe aktywować swoiste kinazy. Te ostatnie z kolei modyfikują substraty, przez co zmieniają reakcje fizjologiczne. Dla niektórych hormonów śród kom orkowy przekaźnik jest nieznany DuŜa grupa waŜnych hormonów nie ma zidentyfikowanego przekaźnika śródkomórkowego. Jest dziwne, Ŝe hormony te tworzą duŜe grupy. Do jednej naleŜą insulina, czynniki insulinopodobne (IGF-I i IGF-II) i wiele róŜnych hormonów, mających wspólnego przodka. Druga grupa składa się z białek kodowanych przez rodzinę genu hormonu wzrostowego (hormon wzrostu, prolaktyna, somatomammotropina kosmówkowa); są one wyraźnie ze sobą spokrewnione (p. rozdz. 46). Podział na wymienione dwie grupy nie jest ostry, skoro w wieiu działaniach hormonu wzrostu bierze udział IGF-I. Oksytocyna jest hormonem nie zaliczanym do Ŝadnej z wymienionych dwóch grup. WłoŜono wiele wysiłku, by znaleźć śródkomórkowy mediator działania insuliny. Wśród kandydatów na taki mediator proponowano m.in. cAMP, cGMP, H2O2, Ca2+ i samą insulinę. W wyciągach tkankowych znaleziono róŜne substancje pośredniczące, będące pochodnymi peptydów lub fosfolipidów, lecz dotych-

czas nie zostały one oczyszczone i scharakteryzowane. Niedawna obserwacja, Ŝe receptor insulinowy wykazuje wewnętrzną aktywność kinazy tyrozynowej zapoczątkowała badania, mające na celu znalezienie układu fosforylacji, mogącego wyjaśnić działanie insuliny. Nie jest to obserwacja odosobniona, skoro receptor dla naskórkowego czynnika wzrostowego jest równieŜ kinazą tyrozynową. W rzeczywistości ten ostatni fakt był punktem wyjścia dla badań nad receptorem insulinowym. W końcu naleŜy wspomnieć, Ŝe czynnik wzrostowy pochodzenia płytkowego jest równieŜ kinazą tyrozynową, bardzo przypominającą v-sb i c-sis, tj. produkty onkogenów swoistych wirusów i komórek. Pobudzenie komórek docelowych dla hormonu wzrostowego pochodzenia płytkowego, tj. fibroblastów, komórek glejowych lub komórek mięśni gładkich, jest przyczyną powstawania kilku produktów genowych, uczestniczących w replikacji wymienionych komórek. Prawdopodobne wydaje się, Ŝe ta duŜa grupa hormonów posługuje się róŜnymi mechanizmami sygnalizacji śródkomórkowej. Wydaje się, Ŝe tradycyjne przekaźniki nie odgrywają tu określonej roli. PIŚMIENNICTWO Andersen JE: Theeffectof steroid hontiones on gene transcription. In: Biahgical Reguiation and Deveh-

598 / ROZDZIAŁ 45 pment. Ooldbergcr RF, Yamamoto KR (editors). Vol 3B: Hormone Aclion. Plenum Press, 1985. Blackmore PF, Eston JH: Mechanisms involved in the actions of calcium dependent hormones. In: Biockemical Action of the Hormones. Vol 12. Lit* wack G (editor). Academic Press, 1985. Beato, M: Gene regulation by steroid hormones. Celi 1989;56:335.

Enhancers and eukaryotic gene espression. In: Current Communications in Mokcular Biology. Oluzman Y, Shenk T (editors). Cold Spring Harbor Press, 1983. Gilman A: G proteins and dual control of adenylate cyclase. Celi 1984;36:577. Rasmussen H: The calcium messenger system. (2 parts.) N Engl J Med 1986;314:J094, 1164.

P

■■

1

Przysadka mózgowa i hormony podwzgórza

46

Daryl K. Granner, MD

WPROWADZENIE

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Przedni płat przysadki mózgowej (przysadka gruczołowa) wydziela, pod kontrolą hormonów podwzgórzowych, grupę hormonów (hormony tropowe), regulujących wzrost i czynność innych gruczołów wydzielania wewnętrznego lub wpływających na reakcje metaboliczne innych tkanek docelowych. Tylny płat przysadki mózgowej wytwarza hormony regulujące równowagę wodną oraz wytrysk mieka z gruczołu sutkowego w czasie laktacji.

Utrata czynności przedniego płata przysadki mózgowej (panhypopituitarismus) jest przyczyną zaniku tarczycy, kory nadnerczy i gonad. Wtórne skutki niedoboru hormonów gruczołów będących narządami docelowymi dla hormonów tropowych przysadki dotykają większości narządów i tkanek oraz wiele ogólnych procesów, takich jak przemiana białek, tłuszczów, węglowodanów oraz wodno-elektrolitowa. Utrata czynności tylnego płata przysadki jest przyczyną moczówki prostej wyraŜającej się niezdolnością nerek do zagęszczania moczu.

Skróty uŜywane w tym rozdziale ACTH korADH CG

CLIP płata CRH CS

FSH GAP GH

— hormon kortykotropowy,

GnRH

tykotropina — hormon antydiuretyczny, wazo presy na — gonadotropina kosmówkowa

IGF 1,-11

— peptyd

pośredniego

przysadki podobny do kortykotropiny — hormon uwalniający kortykotropinę, kortykoliberyna — somatomammotropina kosmówkowa, laktogen łoŜyskowy — folitropina — peptyd związany z GnRH — hormon wzrostu (somatotrapina)

GH RH lub GRH — hormon uwalniający hormon wzrostu, somatoliberyna GHRIH — hormon hamujący uwalnianie hormonu W2rostu, somatostatyna ___________

LM

LPH MSH NGF

PO MC PRIH lub PIH PRL

SRIN T3 T

TRH TSH VIP

— hormon uwalniający gonadotropine, gonadohberyna — czynnik wzrostowy insulinopodobny 1 i II — lutropina — lipotropina — melanotropina, hormon pobudzający melanocyty — czynnik wzrostu nerwów — rodzina peptydów proopiomeianokortyny — hormon hamujący uwalnianie protakiyny, prolaktostatyna — prolaktyna — hormon hamujący uwalnianie somatotropiny, somatostatyna — trijodotyronina — tyroksyna, tetrajodotyronina — hormon uwalniający tyreotroptnę, tyreoliberyna — tyreotropina — wazoaktywny peptyd jelitowy

600 / ROZDZIAŁ 46

HORMONY PODWZGÓRZOWE REGULUJĄ CZYNNOŚĆ PRZEDNIEGO PŁATA PRZYSADKI MÓZGOWEJ Uwalnianie (a w niektórych przypadkach równieŜ wytwarzanie) kaŜdego z hormonów wymienionych w tab. 46-1 znajduje się pod

ciągłą kontrolą przynajmniej jednego hormonu podwzgórzowego. Hormony podwzgórzowe uwalniają się z zakończeń podwzgórzowych włókien nerwowych do przestrzeni okołowłośniczkowej układu podwzgórzowego, po czym dostają się przez łodygę do przysadki gruczołowej za pośrednictwem specjalnego krąŜenia

Tabela 46-1. Hormony osi podwzgórze-przysadka-narząd docelowy tworzą integralne pętle sprzęŜenia zwrotnego* Hormon przysadki Hormon Hormon podwzgówydzielany Skrót gruczołowej, na który przez docelowy gruczoł rzowy działa hormon pod- endOkrynny wzgórzowy** Hydrokortyzon

TRH

ACTH (LPH, MSH, endorfiny) TSH (PRL)

Gonadotiberyna

GnRH (LHRH, FSRH)

LH, FSH

Androgeny, progestyny

Somatoliberyna

GHRH.GRH

GH

IGF-1; inne?

Somatostatyna

GHRIH.SHIH

GH (TSH, FSH,ACTH)

IGF-I, T3 i T4; inne?-

PRL

Neurohormony (?)

Korty koi ibery na

CRH

Tyreoliberyna

Prolaktostatyna, dopa- PRIH lub PIH mina i GAP

estrogeny,

* Ogólny schemat sprzęŜenia zwrotnego dla kaŜdego układu moŜna sporządzić wstawiając odpowiedni hormon podwzgórzowy, przysadkowy i gruczołu efektorowego na odpowiednie miejsce ryc. 44-1. ** Hormon podwzgórzowy wykazuje wtórne lub słabsze działanie na hormon ujęty w nawiasach.

Tabela 46-2. Struktura hormonów uwalniających (liberyn) podwzgórza Hormon

Struktura

TRH

(pyro)Glu-His-Pro-NH2

Somatostatyna

Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NHZ {pyro)Głu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 HO \ HO—L /-\-CH2CHjNHi Peptyd związany z GnRH (GAP) Ser-GIn-Glu-Pro-Pro-ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-A)a-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-lle-Ala-NH2 Tyr-Ala-Asp-A)a-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Vai-Leu-Gly-Gih-Leu-Ser-Ala-Afg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-lle-Met-Ser-Arg-GIn-GIn-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2

GnRH PRIH Owcza korty kotibery na Ludzka somatoliberyna

PRZYSADKA MÓZGOWA I HORMONY POD WZGÓRZA / 601

wrotnego, łączącego podwzgórze z przednim płatem przysadki. Strukturę kilku hormonów podwzgórzowych przedstawiono w tab 46-2. Hormony podwzgórzowe uwalniane są pulsacyjnie (epizodycznie), zaś izolowane komórki docelowe przysadki gruczołowej reagują lepiej na pulsacyjną niŜ ciągłą ekspozycję tych hormonów (podwzgórzowych). Uwalnianie hitropiny (LH) i folitropiny (FSH) jest regulowane przez wspólny hormon uwalniający — gonadoliberynę (GnRH). Z kolei wydzielanie tej ostatniej jest zaleŜne od stęŜenia krąŜących we krwi hormonów gonadalnych docierających do podwzgórza (patrz pętla sprzęŜenia zwrotnego przedstawiona na ryc. 44-1). Podobne pętle sprzęŜenia zwrotnego istnieją dla wszystkich układów podwzgórze-przysadka-gruczoły docelowe. Uwalnianie ACTH jest głównie kontrolowane kortykolifaeryną (CRH), chociaŜ i inne hormony, takie jak ADH, aminy katecholowe. VIP i angiotensyna II wpływają na jej wydzielanie. Z kolei uwalnianie CRH jest zaleŜne od stęŜenia koityzolu we krwi, glukokortykoidu, wydzielanego przez nadnercza. Uwalnianie tyreotropiny (TSH) zaleŜne jest głównie od tyreoliberyny (TRH), zaś wydzielanie tej ostatniej regulowane jest przez hormony tarczycy — T3 (trijodotyroninęjr i T4 (tyroksynę). Hamujący wpływ na uwalnianie TSH wykazuje jednak równieŜ somatostatyna. Uwalnianie i produkcja hormonu wzrostu (GH) znajdują się pod stałą kontrolą podwzgórzowego hormonu pobudzającego oraz hormonu hamującego wydzielanie GH. Ponadto regulacja wydzielania GH znajduje się pod wpływem obwodowej pętli sprzęŜenia zwrotnego. IGF-I (somatomedyna C), który jest pośrednikiem niektórych efektów GH, pobudza uwalnianie somatostatyny, hamującej uwalnianie somatoliberyny (GHRH). Regulacja syntezy i uwalniania prolaktyny znajdują się pod stałą kontrolą hamujących czynników podwzgórzowych. Jest to wyjątkowy hormon, wydzielanie którego zaleŜy od współdziałania czynników nerwowych (np. draŜnienie brodawki piersiowej) realizowanych przez neuroprzekaźniki oraz od neurohormonów. Dopamina hamuje syntezę (hamując transkrypcję genu dla prolaktyny) i uwalnianie prolaktyny, lecz nie jest jedynym czynnikiem odpowiedzialnym za hamowanie wydzielania tego hormonu. Ostatnio odkryto neuropeptyd złoŜony z 56 aminokwasów wykazujący działanie podobne zarówno do GnRH, jak i prolaktostatyny (PRIH)

— stąd określany jest jako peptyd związany z GnRH (GAP). GAP jest potęŜnym inhibitorem uwalniania prolaktyny i być moŜe jest tym hormonem, którego dotychczas nie udało się zidentyfikować. Występowanie GAP tłumaczy dziwny związek zachodzący pomiędzy sekrecją GnRH i prolaktyny, szczególnie u niekórych gatunków zwierząt. Wiele hormonów podwzgórzowych, w tym szczególnie tyreoliberyna (TRH), kortykoliberyna (CRH) i somatostatyna występuje równieŜ w innych obszarach mózgu i w wielu tkankach obwodowych. Pierwotnie uwaŜano, Ŝe działanie pobudzające hormonów uwalniających podwzgórza na przysadkę mózgową odbywa się za pośrednictwem cAMP, Nowsze badania sugerują udział w tym procesie mechanizmu wapniowo-fosiolipidowego, podobnego do opisanego wyŜej. Na temat, czy hormony uwalniające wpływają równieŜ na syntezę odpowiedniego hormonu w przysadce mózgowej, istnieją rozbieŜne opinie, chociaŜ ostatnio wykazano, Ŝe GHRH pobudka transkrypcję genu kodującego GH i TRH transkrypcję genu prolaktyny. PRZEDNI PŁAT PRZYSADKI MÓZGOWEJ WYTWARZA DUśĄ LICZBĘ HORMONÓW POBUDZAJĄCYCH RÓśNORODNE PROCESY FIZJOLOGICZNE I BIOCHEMICZNE W TKANKACH DOCELOWYCH (TARCZOWYCH) Tradycyjnie hormony przedniego płata przysadki mózgowej omawiano oddzielnie. Uwzględniając wyniki nowszych badań dotyczących syntezy tych hormonów oraz śródkomórkowych mediatorów ich działania (tab, 45-1) hormony przysadki gruczołowej moŜna podzielić na trzy grupy: pierwsza z nich obejmuje hormon wzrostu, prolaktynę i somatomammotropinę kosmówkową, druga — hormony glikoproteinowe oraz trzecia — rodzinę hormonów pochodnych proopiomei ano korty ny. Hormon wzrostu, prolaktyna i somatomammotropina kosmówkową tworzą jedną grupę hormonów Hormon wzrostu (GH), prolaktyna (PRL) i somatomammotropina kosmówkową (CS, laktogen łoŜyskowy) tworzą rodzinę hormonów białkowych wykazujących bardzo podobną se-

602 / ROZDZIAŁ 46 Mron Ekson

1

3'

Rvc. 46-1. Schemat struktury genu tudzkiego hormonu wzrostu (z uwzględnieniem takiej samej skali dla wszystkich jego składowych). Gen wykazuje długość ok. 45 kb i składa się z 5 eksonow i 4 intronów. Obszary zakreskowane oznaczają niekodujące sekwencje eksonu 1 i 5. Strzałki oznaczają kierunek transkrypcji. __________________________________________________

kwencję aminokwasową. Liczba aminokwasów GH, CS i PRL waha się u róŜnych gatunków zwierząt od 190 do 199. KaŜdy z tych hormonów zawiera jedną tylko resztę tryptofanową (w połoŜeniu 85 w GH i CS, zaś w połoŜeniu 91 w PRL) oraz dwa homologiczne wiązania dwusiarczkowe. Homologia między składem aminokwasowym ludzkiego GH i CS wynosi aŜ 85%, zaś pomiędzy ludzkim GH a ludzką prolaktyną 35%. Ta homologia aminokwasową sprawia, Ŝe wymienione trzy hormony wykazują wspólne determinanty antygenowe, co nie jest zaskoczeniem oraz, Ŝe wszystkie one pobudzają wzrost i wykazują działanie laktogenne. Są one wytwarzane w swoistych tkankach, tj. GH i PRL wytwarzane są w przysadce gruczołowej, zaś CS w komórkach syncytium trofoblastycznego łoŜyska. KaŜdy z tych hormonów podlega odmiennej regulacji (p. tab. 46-1). Na podstawie uderzających podobieństw, wiele lat temu przypuszczano, Ŝe wymienione hormony powstały przez duplikację wspólnego genu-przodka. UŜywając techniki rekombinacji genetycznej wykazano jednak, Ŝe istnieją, liczne geny dla GH i CS \i naczelnych i u ludzi, natomiast tylko pojedynczy gen kodujący PRL, będący pięciokrotnie większy od genu GH i CS. Ponadto stwierdzono, Ŝe ludzki laktogen łoŜyskowy jest odmianą ludzkiego hormonu wzrostu oraz, Ŝe geny dla GH i CS umiejscowione są u człowieka na chromosomie 17, podczas gdy dla PRL — na chromosomie 6. Istnieje znaczna rozbieŜność ewolucyjna wymienionych genów. I tak tkanki szczura i bydta mają pojedynczą kopię GH i PRL w genornie haploidalnym, zaś człowiek — pojedynczy gen dla PRL. Człowiek ma jeden czynny gen dla GH (GH-N) i jego wariantu (GH-V), zaś dwa geny dla CS, które ulegają ekspresji (CS-A i CS-B) i jeden nie ulegający ekspresji (CS-L). Wiele gatunków małp ma przynajmniej 4 geny rodziny GH-CS. Sekwencja kodująca dla wszystkich tych genów

zawarta jest w 5 eksonach poprzedzielanych 4 intronami (ryc. 46-1). Geny te wykazują wysoką homologię w regionach flankujących 5' końce oraz w zakresie sekwencji kodujących (homologia ta wynosi ok. 95% w obszarze kodującym), róŜnią się natomiast sekwencją na końcach 3'. Miejsca przekształcenia i składania (splicingu) są w wysokim stopniu zachowane, pomimo Ŝe introny genu PRL są znacznie dłuŜsze. Rodzina ludzkiego genu GH-CS jest umiejscowiona w okolicy q 22-24 drugiego ramienia chromosomu 17. Na rycinie 46-2 przedstawiono wzajemne usytuowanie kaŜdego z tych genów wobec siebie począwszy od końca 5' do końca 3'. Geny ulegają transkrypcji począwszy od końca 5' w kierunku do 3. Gen dla GH-N oddzielony jest od genu CS-B sekwencją o wielkości ok. 45 kb. hGH-N hCS-L

hCS-A

hGH-V hCS-B

Ryc. 46-2. Umiejscowienie i polarność rodziny genów na chromosomie 17 dla ludzkiego GH i CS. Przedstawiona jest lokalizacja genów tudzkiego GH i CS w stosunku do końców 5' i 3' pasma DNA. Strzałki oznaczają kierunek transkrypcji. ____

Sekwencja genu GH-N koduje sekwencję aminokwasową GH krąŜącego we krwi. Gen ten jest wraŜliwy na DNA-zc I, co dowodzi, Ŝe jest zlokalizowany w obszarze „aktywnej chromatyny". Gen GH-V, jeśli ulega ekspresji, koduje białko róŜniące się 13 aminokwasami od GH zakodowanego w sekwencji GH-N. Gen GH-V jest oporny na działanie DNA-zy I, co wskazuje na to, Ŝe zapewne nie jest aktywny. Obecność genu GH-V stwierdza się u chorych wykazujących brak genu GH-N (tj. u chorych

PRZYSADKA MÓZGOWA I HORMONY PODWZGÓRZA / 603

z dziedzicznym niedoborem GH). PoniewaŜ u chorych tych występuje zupełny brak GH, naleŜy przypuszczać, Ŝe gen GH-V jest nieaktywny, lub teŜ produkuje cząsteczki hormonu wzrostu pozbawione aktywności biologicznej. Fakt, Ŝe chorzy d wytwarzają przeciwciała anty-GH po podaniu egzogennego GH sugeruje, Ŝe ich układ immunologiczny nigdy nie zetknął się przedtem z tym antygenem {białkiem hormonalnym). Ekspresję genów CS-A i CS-B stwierdza się w łoŜysku; nie stwierdza się natomiast ekspresji genu CS-L (jest to gen „niemy"). Hormon wzrostu (GH) Synteza i budowa. Hormon wzrostu jest syntetyzowany w komórkach somatotropowych przysadki gruczołowej, tj. w podgrupie komórek kwasochłonnych. Komórki te stanowią najliczniejszą grupę komórek przysadki mózgowej. StęŜenie GH w przysadce wynosi 5—15 mg/g tkanki, tj. stęŜenie to jest znacznie wyŜsze niŜ innych hormonów przysadkowych (wyraŜające się w ug na gram tkanki przysadkowej). U wszystkich ssaków GH składa się z pojedynczego łańcucha polipeptydowego o masie cząsteczkowej ok. 22 000. Ogólną strukturę ludzkiego GH, złoŜonego z 191 aminokwasów, przedstawia ryc. 46-3. Pomimo Ŝe istnieje duŜe podobieństwo w sekwencji aminokwasowej między GH róŜnych gatunków, tylko ludzki GH oraz GH uzyskany od naczelnych są aktywne u człowieka. Obecnie dostępny jest dla celów leczniczych GH uzyskany metodą rekombinacji DNA.

Ludzki hormon wzrostu

Działanie fizjologiczne i biochemiczne. Hormon wzrostu jest niezbędny dla wzrostu w okresie pourodzeniowym i dla prawidłowej przemiany węglowodanowej, lipidowej, azotowej i mineralnej. Wpływ GH na wzrost następuje za pośrednictwem IGF-I kodowanego przez gen naleŜący do rodziny czynników wzrostowych insulinopodobnych. Czynnik ten określano pierwotnie jako czynnik sulfatacji (sulfation factor), poniewaŜ pobudza wbudowywanie siarczanów do tkanki chrzestnej. Z kolei określano go jako somatomedynę C. Pod względem struktury jest podobny do proinsuiiny (p. rozdz. 52 i ryc. 52-5). Innym polipeptydem bardzo podobnym lub nawet identycznym pod względem aktywności biologicznej do IGF-I jest polipeptyd IGF-II, określany u szczura jako czynnik pobudzający rozrost (MSA — multiplication stimulating activity). Zarówno IGF-I, jak i IGF-II wiąŜą się z receptorami błonowymi. MoŜna je odróŜnić od siebie uŜywając swoistych metod radioimmunologicznych. IGF-I składa się z 70, zaś IGF-II z 67 aminokwasów. StęŜenie IGF-II w osoczu jest dwukrotnie wyŜsze od stęŜenia IGF-I, pomimo Ŝe efekt biologiczny GH wykazuje bardziej bezpośrednią korelację ze stęŜeniem IGF-I. Chorzy z niedoborem IGF-I, lecz prawidłowym stęŜeniem IGH-II (tj. osoby z karłowatością z niedoboru GH i Pigmeje, p. tab. 46-3) wykazują upośledzony wzrost. GH wykazuje kilka działań 1. Synteza białka. GH wzmaga transport aminokwasów do komórek mięśni oraz nasila

Prolaktyna owcza

Ryc. 46-3. Porównanie ogólnej struktury ludzkiego hormonu wzrostu (po stronie lewej) ze strukturą prolaktyny owczej (po stronie prawej). Hormon wzrostu wykazuje wiązanie dwusiarczkowe między aminokwasami w pozycjach 53 i 165 oraz 182 i 189, w prolaktynie wiązania dwusiarczkowe występują między aminokwasami w pozycji 4 i 11, 58 i 173 oraz 190 i 198.

604 / ROZDZIAŁ 46 Tabela 46-3. Zachowanie się hormonu wzrostu (GH), insulinopodobnego czynnika wzrostowego I (IGF-I) i II (IGF-I!) w karłowatości StęŜenie w osoczu

Karłowatość z niedoboru GH Pigmeje Karłowatość typu

Reakcja na egzo-

GH

IGF-I

IGF-II

genne podanie GH

Małe Prawidłowe

Małe Małe Małe

Małe lub prawidłowe Prawidłowe

Dodatnia Ujemna Ujemna

DuŜe

Larona

syntezę białka (mechanizmem nie związanym z transportem aminokwasowym). Zwierzęta, którym podawano GH, wykazują dodatni bilans azotowy, wyraŜający się ogólnym wzrostem syntezy białka, obniŜeniem stęŜenia w osoczu aminokwasów i mocznika oraz spadkiem wydalania aminokwasów i mocznika z moczem. Zmianom tym towarzyszą wzmoŜona synteza RNA i DNA w niektórych tkankach. Pod tym względem efekty GH są podobne do występujących po podaniu insuliny. Przemiana węglowodanów. Ogólnie mó wiąc, GH wykazuje antagonistyczne działania w stosunku do insuliny. Występująca po poda niu GH hiperglikemia jest wynikiem zarówno zmniejszonej utylizacji glukozy przez tkanki obwodowe, jak i wzmoŜonego wytwarzania glukozy w wątrobie w procesie zwanym glukoneogenezą. W wątrobie GH zwiększa zawartość glikogenu najpewniej drogą stymulacji glukoneogenezy z aminokwasów. MoŜe równieŜ wy stąpić upośledzenie glikolizy na kilku etapach. W mechanizmie spad_ku glikolizy w miocytach moŜe równieŜ uczestniczyć wzmoŜona mobili zacja kwasów tłuszczowych z zapasów triacyloglicerolu. Długotrwałe podawanie GH moŜe być przyczyną cukrzycy. Przemiana lipidów. GH pobudza uwal nianie wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu z tkanki tłuszczowej, podnosi stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych we krwi oraz zwiększa utlenianie wolnych kwasów tłuszczowych w wą trobie. W warunkach niedoboru insuliny (wy stępującego np. u chorych na cukrzycę) moŜe równieŜ pojawić się nasilona ketogeneza. W patomechanizmie wymienionych skutków działa nia GH na przemianę lipidów i węglowodanów prawdopodobnie nie bierze udziału IGF-1. Przemiana elektrolitowa GH, a bardziej prawdopodobnie IGF-I sprzyjają powstawaniu dodatniego bilansu wapniowego, magnezowe-

Małe

go i fosforanowego oraz retencji w ustroju Na+, K+ i Cl". Wpływ GH lub IGF-I na gospodarkę wapniowo-fosforanową jest następstwem oddziaływania tych hormonów na kości (pobudzają one wzrost kości długich na poziomie jej nasady u dzieci oraz wzrost akralny i apozycyjny kości u dorosłych). U dzieci GH pobudza ponadto tworzenie się tkanki chrzestnej. 5. Efekty prolaktynopodobne. GH, wiąŜąc się z receptorami laktogenowymi, wykazuje wiele efektów podobnych do występujących po podaniu prolaktyny (pobudza gruczoł sutkowy, laktogenezę oraz wytwarzanie mleczka w wolu gołębi).

Patofizjologia hormonu wzrostu. Niedobór GH spowodowany ogólną niedoczynnością przysadki gruczołowej (panhypopituitarismus) !ub wybiórczym niedoborem tego hormonu jest przyczyną powaŜnych następstw u dzieci, poniewaŜ dzieci te nie osiągają odpowiedniego wzrostu. Skutki metaboliczne niedoboru GH są mniej kłopotliwe. RóŜne rodzaje karłowatości pomagają zrozumieć znaczenie róŜnych faz działania GH (tab. 46-3). Karty z niedoborem GH reagują w sposób normalny na podawanie egzogennego GH. Opisano dwa rodzaje oporności narządów docelowych na działanie GH. Karły typu Larona wykazują nadmierne ilości GH-N, lecz ich hepatoeyty pozbawione są receptorów dla GH. U Pigmejów występuje defekt poreceptorowy, przez co wypada działanie GH, w którym pośredniczy IGF-I. Nadmiar GH, najczęściej spowodowany gruczolakiem kwasochłonnym przysadki, jest powodem gigantyzmu, jeśli nie doszło jeszcze do zamknięcia szpar nasadowych. U takich chorych obserwuje się przyspieszony wzrost kości długich. Akromcgalia jest następstwern nadmiernego uwalniania się GH w fazie Ŝycia, kiedy doszło juŜ do zamknięcia szpar nasadowych

PRZYSADKA MÓZGOWA I HORMONY PODWZGORZA / 605

kości, czyli po ukończeniu wzrostu kości długich. Akralny wzrost kości jest przyczyną typowych zmian twarzy (wystająca szczęka dolna, powiększenie nosa), występowania powiększonych dłoni, sLóp i czaszki. Wśród innych anomalii naleŜy wymienić powiększenie narządów trzewiowych, zgrubienie skóry oraz wiele zaburzeń metabolicznych, w tym cukrzycę. Znajomość regulacji wydzielania GH jest podstawą racjonalnego stosowania testów uŜywanych w diagnostyce wymienionych stanów chorobowych. U chorych z niedoborem GH nie stwierdza się wzrostu stęŜenia tego hormonu w osoczu krwi po stosowaniu bodźca hipoglikemicznego, po podaniu argininy lub 1-dopa. U chorych z gigantyzmem lub akromegalią, spowodowanych nadmierną sekrecją GH przez gruczolak, nie obserwuje się supresji stęŜenia GH w osoczu po podaniu glukozy. Prolaktyna (PRL, hormon laktotropowy, mammotropina, hormon luteotropowy)

Synteza i struktura. PRL jest hormonem białkowym o masie cząsteczkowej ok. 23 000. Ogólna jej struktura jest podobna do pokazanej dla GH na ryc. 46-3. Wydzielana jest przez kwasochłonne komórki laktotropowe przysadki gruczołowej. Liczba i wielkość tych komórek powiększają się gwałtownie w czasie ciąŜy. Podobieństwa strukturalne i czynnościowe między GH, PRL i CS zostały przedstawione wyŜej.

Rola fizjologiczna i biochemiczna prolaktyny. Prolaktyna uczestniczy w inicjacji i podtrzymywaniu laktacji u ssaków. Przy stęŜeniach fizjologicznych prolaktyna działa tylko na gruczoły sutkowe odpowiednio przygotowane hormonami gonadalnymi. Przy nadmiernych stęŜeniach prolaktyna stymuluje wzrost gruczołów sutkowych równieŜ u kobiet pozbawionych jajników oraz u męŜczyzn. U gryzoni PRL jest zdolna do podtrzymywania ciałka Ŝółtego — stąd określenie hormon łuteotropowy. Cząsteczki podobne do PRL wydają się uczestniczyć w procesie adaptacji ryb słonowodnych do warunków słodko wodnych, w procesie linienia gadów oraz w wytwarzaniu mleczka w wolu ptaków. Nieznany jest śródkomórkowy mediator działania PRL. Miał nim być polipeptyd, lecz nie zostało to potwierdzone.

Patofizjologia prolaktyny. Guzy wydzielające prolaktynę są przyczyną braku miesiączki (amenorrhoea) i mlekotoku (galactorrhoea) u kobiet. U męŜczyzn nadmierna sekre-

cja PRL moŜe być przyczyną ginekomastii (powiększenie sutków) i impotencji. Somatomammotropina kosmówkowa (CS, laktogen łoŜyskowy) U człowieka trzeci człon rodziny GH-PRL-CS nie wykazuje określonej czynności. W testach biologicznych CS wykazuje działanie laktotropowe i luteotropowe oraz efekty metaboliczne jakościowo podobne do opisanych dla hormonu wzrostu — hamuje utylizację glukozy przez komórki, pobudza uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu, wzmaga zatrzymywanie azotu i wapnia w ustroju (pomimo wzrostu wydalania wapnia z moczem) oraz zmniejsza wydalanie fosforu i potasu z moczem. Hormony glikoprotemowe tworzą drugą grupę hormonów przysadki gruczołowej Najbardziej złoŜonymi hormonami białkowymi dotychczas odkrytymi są hormony glikoproteinowe przysadki gruczołowej i łoŜyska tj. hormon tyreotropowy (tyreotropina — TSH), hormon luteotropowy (lutropina—LH), hormon pobudzający pęcherzyki jajnikowe Graafa (folitropina — FSH) oraz gonadotropina kosmówkowa (CG). Hormony te wpływają na róŜne procesy biologiczne, pomimo Ŝe wykazują znaczące podobieństwa strukturalne. Ta klasa hormonów występuje u wszystkich ssaków. Cząsteczki tych hormonów reagują podobnie jak inne hormony peptydowe lub białkowe z receptorami błony komórkowej i aktywują cyklazę adenylanową, tj. ich przekaźnikiem śródkomórkowym jest cAMP. KaŜdy z tych hormonów składa się z dwóch podjednostek a i p, połączonych ze sobą niekowalencyjnie. Podjednostki a są identyczne dla wszystkich tych hormonów w obrębie jednego gatunku i istnieją znaczne podobieństwa strukturalne między poszczególnymi gatunkami. Aktywność biologiczna tych hormonów zdeterminowana jest przez podjednostkę p. Sama podjednostka p nie jest aktywna biologicznie, zaś rozpoznanie swoistego receptora przez hormon zaleŜne jest od interakcji określonych obszarów obu jego podjednostek. Cząsteczki hybrydowe między wymienionymi hormonami są w pełni aktywne. 1 tak cząsteczka hybrydowa składająca się z TSHa LHp wykazuje aktywność lutropiny, zaś cząsteczka złoŜona z podjednostki a ludzkiej tyreotropiny (hTSHa) i podjednostki P mysiej tyreotropiny (mTSHp) wykazu-

606 / ROZDZIAŁ 46

je aktywność tyreotropową (u myszy). Wynika z tego, Ŝe międzygatunkowe róŜnice między podjednostkami a i P nie mają wpływu na wiązanie niekowalencyjne pomiędzy nimi, ani teŜ na aktywność biologiczną domeny podjednostki p. KaŜda podjednostka jest syntetyzowana na matrycy swoistych sekwencji mRNA oddzielnych genów. Przypuszcza się, Ŝe wszystkie hormony tej grupy pochodzą od wspólnego przodka genowego, który rozpada się na dwie cząsteczki a i p oraz, Ŝe ta ostatnia uległa dalszej ewolucji, stając się źródłem oddzielnych hormonów. Wiele wiadomo o strukturze tych cząsteczek, np. karboksykońcowy pentapeptyd podjednostki a jest istotny dla wiązania z receptorem, lecz nie dla połączenia się tej podjednostki z podjednostka p. Cechą odróŜniającą hormony grupy glikoproteinowej od hormonów pozostałych grup, jest glikozylacja. W kaŜdym hormonie glikoproteinowym podjednostka a zawiera dwie cząsteczki oligosacharydów związanych z asparaginą, zaś podjednostka p albo 1, albo 2 takie cząsteczki. Glikozylacja moŜe być potrzebna w procesie interakcji podjednostki a i podjednostki p. Podjednostka a zawiera 5, zaś podjednostka p 6 mostków S-S. Wolne podjednostki a moŜna znaleźć w przysadce i w łoŜysku. Ten fakt oraz obserwacja, Ŝe translacja podjednostek a i p odbywa się na matrycy oddzielnych mRNA, potwierdzają koncepcję, Ŝe synteza jednej podjednostki jest niezaleŜna od drugiej oraz, Ŝe podjednostka P jest składową decydującą o syntezie całej cząsteczki hormonu. Wszystkie hormony tej grupy syntetyzowane są jako preprohormony i poddawane potranslacyjnej obróbce w obrębie komórki, dzięki czemu powstaje hormon glikozylowany,

Gonadotropiny (FSH, LHr hCG). Hormony te odpowiedzialne są za gametogenezę i steroidogenezę w gonadach. KaŜdy z tych hormonów jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej ok. 25 000. 1. Hormon dojrzewania pęcherzyków (foli-

tropina — FSH). Hormon ten wiąŜe się z receptorami błon plazmatycznych komórek docelowych tj. komórek pęcherzyków jajnikowych (Graafa) oraz komórek Sertolego gonady męskiej. W następstwie wiązania się z receptorem dochodzi do aktywacji cyklazy adenytanowej i wzrostu syntezy cAMP. Efekty działania FSH opisane są w większych szczegółach w rozdziale 51.

2. Hormon luteinizujący (lutropina — LH). LH wiąŜe się ze swoistymi receptorami błon plazmatycznych pobudzając produkcję progesteronu w komórkach ciałka Ŝółtego oraz testosteronu w komórkach Leydiga, Sródkomórkowym mediatorem działania LH jest cAMP, Nukleotyd ten wykazuje działanie podobne do LH, pobudzając konwersję octanów do skwalenu (jest to prekursor syntezy cholesterolu), oraz konwersję cholesterolu do 2ac-hydroksycholesterolu — niezbędnego metabolitu w szlaku syntezy progesteronu i testosteronu. Działanie LH jest bardziej szczegółowo opisane w rozdziale 51. Istnieje ścisłe sprzęŜenie między wiązaniem LH z receptorem a powstawaniem cAMP; steroidogeneza występuje jednak tylko wtedy, kiedy doszło do małych wzrostów cAMP. Dowodzi to obecności receptorów „zapasowych" w tym procesie (p, ryc. 43-3). Długotrwała ekspozycja komórek docelowych na LH jest przyczyną spadającej ich wraŜliwości na ten hormon uwarunkowanej prawdopodobnie zmniejszeniem się liczby receptorów („down regulation"). Zjawisko to moŜe być wykorzystywane jako sposób kontroli urodzeń.. 3. Ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG). Hormon ten jest glikoproteiną syntety zowaną w komórkach syncytium trofoblastu łoŜyska. Jest on dimerem złoŜonym z podjed nostek a i p (J est to struktura typowa dla tej gnipy hormonów) najbardziej podobnym do LH. Jego stęŜenie we krwi oraz wydalanie z moczeni wzrastają juŜ krótko po implantacji zapłodnionego jaja (patrz wyŜej). Stąd oznacza nie hCG wykorzystywane jest w wielu testach wykrywania ciąŜy.

Hormon tyreotropowy (TSH). TSH jest glikoproteiną o strukturze dimerycznej a|3 i masie cząsteczkowej ok. 30 000. Podobnie jak inne hormony tej klasy, TSH, wiąŜąc się z receptorami błon plazmatycznych, aktywuje cykiazę adenylanową i wzmaga syntezę cAMP, Wzrost tego ostatniego odpowiedzialny jest za udział TSH w biosyntezie hormonów tarczycy. Mniej pewne jest działanie troficzne TSH na tarczycę. MoŜna wymienić wiele przykładów „ostrego" wpływu TSH na czynność tarczycy. Efekt następuje w ciągu minut i wyraŜa się aktywacją wszystkich faz biosyntezy T3 i T4, tj. procesu koncentracji jodków w tarczycy, wbudowywania jodu do pierścienia tyrozyny, sprzęgania jodotyrozyn i hydrolizy tyreoglobuliny, TSH wykazuje równieŜ działanie przewlekłe na tarczycę. Skutki tego działania występują po kilku

PRZYSADKA MÓZGOWA I HORMONY POD WZGÓRZA / 607

dniach stosowania TSH i wyraŜają się wzrostem syntezy białek, fosfolipidów, kwasów nukleinowych oraz wielkości i liczby komórek tarczycy. Skutki metaboliczne długotrwałego stosowania TSH są następstwem syntezy i działania hormonów tarczycy. Peptydy rodziny proopiomelanokortyny (POMC) są wynikłem złoŜonego procesu przekształcania Rodzina POMC składa się z peptydów działających jako hormony (ACTH, LPH, MSH), neuroprzekaźniki lub neuromodulatory (endorfiny). Prekursorem POMC jest cząsteczka złoŜona z ok. 285 aminokwasów, ulegająca róŜnym procesom w róŜnych obszarach przysadki.

Rozmieszczenie, przekształcenie i skutki działania produktów genu POMC. Ekspresja genu POMC odbywa sie w przednim i pośrodkowym płacie przysadki mózgowej. Najbardziej stała sekwencja u róŜnych gatunków umiejscowiona jest we fragmencie N-końcowym oraz w obszarze sekwencji ACTH i p-endorfin. Zarówno POMC, jak i jego produkty stwierdza się równieŜ w kilku innych tkankach kręgowców, np. w mózgu, łoŜysku, przewodzie Ŝołądkowo-j elito wy m, w przewodach-układu płciowego, w płucach i limfocytach. Są one raczej wynikiem ekspresji genów w wymienionych narządach, a nie ich absorpcji z osocza. Podobne peptydy stwierdzono równieŜ u wielu gatunków niekręgowców. Proces przekształcania POMC w przednim płacie przysadki róŜni się od występującego w płacie pośrodkowym. Płat pośrodkowy ma charakter szczątkowy u dorosłych ludzi, lecz .

... 1

i

jest aktywny u ludzkich płodów, kobiet cięŜarnych w późnej fazie ciąŜy oraz u wielu gatunków zwierząt. Proces przekształcania POMC w tkankach obwodowych (w przewodzie pokarmowym, łoŜysku, w drogach płciowych męŜczyzn) jest podobny do występującego w płacie pośrodkowym. Istnieją trzy główne grupy hormonów pochodnych POMC. Pierwsza obejmuje ACTH, z której moŜe powstać oc-MSH oraz peptyd kortykotropinopodobny pośredniego płata przysadki (CLIP). Druga grupa składa się z p-lipotropiny (fi-LPH), z której mogą powstać y-LPH, p-MSH i P-endorfiny i z tych ostatnich endorfiny a t y. Trzecia grupa składa się z duŜego N-końcowego peptydu, z którego powstaje y-MSH. RóŜnorodność wymienionych produktów POMC spowodowana jest występowaniem licznych ugrupowań złoŜonych z dwóch aminokwasów zasadowych, będących potencjainymi miejscami działania enzymów trypsynopodobnych. KaŜdy z wymienionych peptydów wyprzedzają reszty Lys-Arg, Arg-Lys, Arg-Arg lub Lys-Lys. Po translacji segment prohormonu ulega rozszczepieniu, po czym następuje modyfikacja cząsteczki drogą glikozylacji, acetylacji i fosforylacji. Kolejny rozpad zachodzi między sekwencją ACTH i P-LPH, w wyniku którego powstaje ACTH na końcu N, zaś P-LPH na końcu C (ryc. 46-4). Proces ten zachodzi zarówno w przednim jak i pośrednim płacie przysadki. Po odszczepieniu sekwencji ACTH^JJ, w przednim płacie nie zachodzi juŜ więcej Ŝadna istotna dalsza obróbka tego hormonu. W płacie pośrednim ACTH!.39 ulega rozpadowi do a-MSH1.13 i CLIP]8.39, zaś 0-LPH41_,M do 7-LPH42.101 i [J-endor-4-i34. zaś p-MSHg^oiPOwstajez Y-LPH.

ACTH (1-39)

0-LPH (42-134]

,.: a-MSH (1-13)

CLIP (1839)

7-LPH (42-101) I

0-Endorflna

(104-134) II 0-MSH (84-101) 7-Endorfina 1104-118) 1

■

■

■ »

■

I

1

(104-117)

Ryc. 46-4. Produkty rozpadu proopiomelanokortyny (POMC), MSH — hormon pobudzający melartocyty, CLIP — peptyd kortykotropinopodobny pośredniego płata przysadki mózgowej, LPH — lipoiropina.

608 / ROZDZIAŁ 46

Wymienione peptydy ulegają znacznym dodatkowym modyfikacjom. Znaczna część N-końcowego peptydu i ACTH 1.39 ulega glikozylacji wprzednim płacie przysadki mózgowej. MSH występuje przewaŜnie w postaci N-acetylowanej i C-amidowanej. a-MSH deacetylowana wykazuje mniejszą aktywność. p-Endorfina ulega szybkiej acetylacji w płacie pośrednim. W odróŜnieniu od a-MSH acetylowana p-endorfina jest około 1000-krotnie mniej aktywna od postaci nieacetylowanej, moŜliwe wiec, Ŝe Pendorfina jest nieaktywna w przysadce mózgowej. W podwzgórzu cząsteczki te ulegają acetylacji i dlatego są widocznie aktywne. p-Endorfina utega równieŜ modyfikacji na końcu C, stając się źródłem endorfiny a i y (ryc. 46-4). Wymienione 3 endorfiny (a, p, y) są głównymi endorfinami pośredniego płata przysadki mózgowej u gryzoni. DuŜy fragment N-końcowy najprawdopodobniej takŜe zostaje pocięty, stając się źródłem y-MSH w przysadce szczurzej i bydlęcej. Mało jest jednak wiadomo o tym Nkońcowym fragmencie. Informacje o strukturze wymienionych hormonów uzyskano głównie w badaniach przysadek pochodzących od gryzoni. Wydaje się jednak, Ŝe ogólny schemat powstawania wymienionych hormonów dotyczy równieŜ innych gatunków. Dodać jednak naleŜy, Ŝe dotychczas nie uzyskano dokładnych informacji o funkcji większości peptydów pochodnych POMC. Działanie i regulacja swoistych peptydów 1. Struktura i mechanizm działania hormonu adrenokortykotropowęgo (kortykotropiny — ACTH). ACTH, feędący łańcuchem polipeptydowym złoŜonym z 39 aminokwasów (ryc. 46-5), jest regulatorem wzrostu i czynności kory nadnerczy. N-końcowa sekwencja 24 aminokwasów jest niezbędna dla wystąpienia pełnej aktywności biologicznej i jest ona taka sama u róŜnych gatunków. W odróŜnieniu od niej Ckońcowa sekwencja aminokwasowa wykazuje duŜą zmienność międzygatunkową. Do testów diagnostycznych uŜywany jest syntetyczny analog ACTH,.^. ACTH wzmaga syntezę i uwalnianie steroidów nadnerczowych, stymulując konwersję cholesterolu do pregnenolonu. Ten etap steroidogenezy polega na konwersji C37-steroidów do C^-steroidów przez odszczepienia 6-węglowego łańcucha bocznego. Skorb pregnenolon jest prekursorem dla wszystkich steroidów nadner-

I

£

3

4

5

6

7

9

9

10

II

Sekwencja stała, niezbędna do wywołania palnej aktywnofcl biologiczne) 24

23

22

21

20

19

18

1?

16 **"^?

25

Sakwa reja zmienna, niepotrzebna do wywołania Gly) _ aktywności blologlczrej

30

31

Ryc. 46-5. Budowa (ACTH).

32

33

3*

ludzkiej

35

38

37

kortykotropiny

czowych (p. ryc. 49-3), po długotrwałym podawaniu ACTH obserwuje się nadmierną syntezę gluko- i mineralokortykoidów, jak równieŜ dehydroepiandrosteronu (prekursora androgenów), W warunkach fizjologicznych udział ACTH w regulacji minerałokortykoidów i androgenów jest minimalny. ACTH pobudza wzrost nadnerczy (jest to efekt troficzny) pobudzając syntezę białek i RNA. ACTH, podobnie jak inne hormony peptydowe, wiąŜe się z receptorem błon plazmatycznych. JuŜ po kilku sekundach interakcji ACTH z receptorem obserwuje się znaczny wzrost stęŜenia śródkomórkowego cAMP. Analogi cAMP potrafią naśladować działanie ACTH, lecz w procesie tym udział biorą równieŜ jony wapnia. 2. Patofizjologia ACTH. Nadmierne wytwarzanie ACTH przez guz przysadki lub pozaprzysadkowy jest przyczyną zespołu Cushinga. Słabe działanie melanotropowe ACTH oraz towarzyszące sekrecji ACTH uwalnianie P- lub ot-MSH są przyczyną hiperpigmentacji skóry. Skutki metaboliczne nadmiernego wydzielania steroidów nadnerczowych wyraŜają się 1) ujemnym bilansem azotowym, potasowym i fosforowym, 2) retencją sodu objawiającą się nadciśnieniem tętniczym lub/i obrzękami, 3) nietolerancją węglowodanową lub jawną cukrzycą, 4) podwyŜszonym stęŜeniem kwasów tłuszczowych w osoczu oraz 5) spadkiem liczby eozynofilów i limfocytów, natomiast wzrostem leukocytów wielojądrzastych. Chorzy z zespołem Cushinga charakteryzują się zanikiem mięśni szkieletowych oraz swoistym rozmieszczeniem się tkanki tłuszczowej określanym jako otyłość tułowiową. Przy wypadaniu produkcji ACTH spowodowanej guzem, zakaŜeniem lub zawa-

PRZYSADKA MÓZGOWA [ HORMONY PODWZGORZA / 609

lem przysadki mózgowej objawy kliniczne są przeciwstawne do występujących w nadprodukcji ACTH.

P-lipotropina (P-LPH). Hormon ten składa się z C-końcowego 91 aminokwasowego polipeptydu POMC (ryc. 46-4). p-LPH zawiera sekwencję aminokwasową p-MSH, y-LPH, Met-enkefaliny i p-endorfiny. Z wymienionych hormonów w ludzkiej przysadce mózgowej stwierdzono y-LPH, p-LPH i p-endorfinę, nie wykryto natomiast p-MSH. p-LPH znajduje się tylko w przysadce mózgowej, poniewaŜ w innych tkankach ulega ona szybkiej konwersji do y-LPH i p-endorfiny, fkLPH składa się z polipeptydu złoŜonego z 7 aminokwasów (p-LPH 47.53), identycznego do sekwencji ACTH4.10. P-LPH pobudza lipolizę i mobilizację tkanki tłuszczowej, chociaŜ jej rola fizjologiczna jest niewielka. Najpewniej słuŜy ona tylko za prekursora P-endorfiny. Endo rf iny . p -end o r fin y skład aj ą się z C-końcowej sekwencji 31 aminokwasów pLPH (ryc. 46-4). Endorfina ot i y są pochodnymi endorfiny p, od której zostało odszczepio-nych 15 lub 14 aminokwasów od fragmentu Ckońcowego. Peptydy te występują w przysadce mózgowej, gdzie ulegają acetylacji (patrz wyŜej) i przez to inaktywacji biologicznej. W innych miejscach (np. w neuronach ośrodkowego układu nerwowego) nie ulegają biochemicznej modyfikacji i dlatego spełniają role neuroprzekainików lub neuromodulatorów. W ośrodkowym układzie nerwowym endorfiny wiąŜą się tymi samymi receptorami co opiaty morfinowe, dzięki czemu mogą uczestniczyć w kontroli percepcji bólu. Wykazują one 18—30-krotnie silniejsze działanie przeciwbólowe niŜ morfina (uwzględniając masę cząsteczkową tych substancji). Sekwencja aminokwasowa enkefaliny występuje w cząsteczce POMC, lecz nie jest ona wyprzedzana aminokwasami dwu zasadowymi, przez co widocznie nie ulega odszczepieniu i ekspresji.

Hormon pobudzający melanocyty (melanotropina, MSH). U niektórych gatunków zwierząt MSH pobudza melanogenezę, powodując rozproszenie śródkomórkowych ziarnistości melaniny, prze2 co dochodzi do ściemnienia skóry. W obrębie cząsteczki POMC zawarte są 3 róŜniące się od siebie cząsteczki MSH określane jako oc, P i y. Dwie z nich (a i p) wydzielane są przez niektóre inne gatunki zwierząt (poza człowiekiem). U ludzi, krąŜąca we krwi melanotropina zawarta jest w obrębie

większych cząsteczek a lub P-LPH. a-MSH wykazuje sekwencję aminokwasowa identyczną z sekwencją ACTHI_B, lecz jest acetylowana na końcu N cząsteczki. ot-MSH i CLIP występują najczęściej u zwierząt z dobrze rozwiniętym płatem pośrednim przysadki. Nie stwierdza się ich u ludzi w Ŝyciu pozapłodowym. Chorzy z niedoborem glukokortykoidów (choroba Addisona) wykazują nadmierną pigmentację skóry, spowodowaną nadmierną aktywnością MSH. MoŜe być ona spowodowana nadmiernym wydzielaniem ACTH (prekursora a-MSH), lub, co jest bardziej prawdopodobne, współwystępującą zwiększoną sekrecją pi y-LPH, wykazujących aktywność MSH.

TYLNY PŁAT PRZYSADKI MÓZGOWEJ ZAWIERA DWA AKTYWNE HORMONY — WAZOPRESYNĘ I OKSYTOCYNĘ Wazopresyna, której nazwa wywodzi się stąd, Ŝe hormon ten podany w dawkach farmakologicznych podnosi ciśnienie tętnicze, określana jest równieŜ jako hormon antydiuretyczny (ADH). Ta ostatnia nazwa jest bardziej właściwa, poniewaŜ główne działanie fizjologiczne tego hormonu polega na pobudzaniu resorpcji wody w dystalnych kanalikach nerkowych. Drugim hormonem przysadki nerwowej jest oksytocyna. Hormon ten ma przyspieszać poród wywołując skurcze mięśni gładkich macicy. Ta fizjologiczna rola oksy tocyny jest jednak kwestionowana. Ma ona raczej uczestniczyć w wydzielaniu mleka przez gruczoł sutkowy. Wymienione dwa hormony wytwarzane są przez podwzgórze, skąd transportowane są aksoplazmą do zakończeń nerwowych tyinej części przysadki mózgowej. Pod wpływem odpowiednich bodźców hormony te są uwalniane do krwi, Celem takiego systemu regulacji wydzielania tych hormonów jest najpewniej uniknięcie bariery, dzielącej krew od tkanki mózgowej. ADH jest syntetyzowana głównie w jądrach nadwzrokowych (nuclei supraoptici), zaś oksytocyna w jądrach przykomorowych (nucłei paraventriculares). KaŜdy z tych hormonów transportowany jest aksonami wraz ze swoistymi białkami nośnikowymi, zwanymi neurotlzynami. Zarówno neurofizyna I, jak i II syntetyzowane są z oksytocyna i adiuretyną jako części jednego białka (czasem określonego jako propresofizyna), kodowanego przez pojedyn-

610 / ROZDZIAŁ 46

czy gen, Neurofizyna I i II są unikatowymi białkami o masie cząsteczkowej 19 000 (neurofizyna I) i 21 000 (neurofizyna II). ADH i oksytocyna wydzielane są oddzielnie do krąŜenia wraz ze swoimi neurofizynami. We krwi krąŜą jako polipeptydy wolne, nie związane z białkami osocza. Wykazują one bardzo krótki okres półtrwania, wynoszący 2—4 minuty. Struktura ADH i oksytocyny pokazana jest poniŜej. Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cvs-Pro-Arg-Gly-NH2 A rg i n i no wazo p res y na Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NHa Liz y no wazop resy na Cys-Tyr-lle-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-G1y-NHa Oksytocyna

KaŜdy z tych hormonów jest nonapeptydem zawierającym cząsteczki cysterny w pozycjach 1 i 6 połączone ze sobą mostkiem dwusiarczkowym. Większość zwierząt wytwarza argininowazopresynę. U świń i spokrewnionych z nimi gatunków zwierząt w miejscu argininy w pozycji 8 występuje lizyna. Podobieństwo strukturalne miedzy ADH i oksytocyna tłumaczy, dlaczego hormony te wywołują pewne wspólne efekty biologiczne. Głównym miejscem inaktywacji tych peptydów jest wątroba, chociaŜ znaczne ilości ADH wydzielane są przez nerki. Oksytocyna Regulacja sekrećji. DraŜnienie brodawek piersiowych jest głównym bodźcem uwalniającym oksytocynę. Drugorzędnymi bodźcami są rozdęcie pochwy i macicy. Wiele czynników pobudzających uwalnianie proiaktyny uwalnia równieŜ oksytocynę. Sugerowano nawet, Ŝe fragment oksytocyny jest czynnikiem uwalniającym prolaktynę. Estrogeny pobudzają, zaś progesteron hamuje syntezę oksytocyny i neurofizyny I.

Mechanizm działania. Mechanizm działania oksytocyny jest nieznany. Powoduje ona skurcz mięśniówki macicy, przez co uŜywana jest, w dawkach farmakologicznych, do zapoczątkowania porodu u kobiet. Jest ciekawe, Ŝe po zniszczeniu powrózka podwzgórzowo-przysadkowego u zwierząt cięŜarnych nie zawsze obserwuje się zaburzenia przy urodzeniu poto-

mstwa. Główne działanie oksytocyny wydaje się jednak polegać na obkurczeniu komórek mięśniowo-nabłonkowych otaczających pęcherzyki sutkowe. W wyniku takiego działania mleko zawarte w przewodach pęcherzykowych ulega transportowi do brodawki sutkowej i wytryskowi. Receptory dla oksytocyny występują w błonach komórkowych zarówno macicy, jak i sutków. Liczba ich ulega wzrostowi pod wpływem estrogenów, zaś zmniejszeniu pod wpływem progesteronu. Wzrost stęŜenia estrogenów, natomiast spadek progesteronu bezpośrednio przed rozwiązaniem ciąŜy, dobrze tłumaczą występowanie zjawiska laktacji tuŜ przed porodem. Pochodne progesteronu są powszechnie stosowanymi substancjami hamującymi laktacje u kobiet po porodzie. Wydaje się, Ŝe oksytocyna i neurofizyna I wytwarzane są równieŜ w jajnikach, gdzie oksytocyna moŜe hamować steroidogenezę. Strukturami niezbędnymi dla działania oksytocyny są: N-końcowa grupa — NH2 cysteiny, grupa fenolowa tyrozyny, grupy karboksyamidowe asparaginy, glutaminy i glicynamidu oraz mostek dwusiarczkowy. Przez delecje i substytucję wymienionych grup wytworzono liczne analogi oksytocyny, np. po usunięciu Nkoricowej grupy aminowej cystyny (w pozycji 1} powstała w ten sposób dea mi no oksytocyna wykazuje 4—5 krotnie większe działanie antydiuretyczne od oksytocyny. Hormon antydiuretyczny (ADH, wazopresyna) Regulacja sekrećji. Bodźce nerwowe, stymulujące uwalnianie ADH, ulegają aktywacji przez wiele róŜnorodnych czynników. NajwaŜniejszym bodźcem fizjologicznym dla uwalniania ADH jest wzrost molalności osocza. W uwalnianiu ADH biorą udział osmoreceptory umiejscowione w podwzgórzu oraz baroreceptory, zlokalizowane w sercu i w innych obszarach układu naczyniowego. Rozcieńczenie krwi, obniŜając molalność osocza, wywiera odwrotny (hamujący) wpływ na wydzielanie ADH. Wśród innych bodźców wydzielania ADH wymienić naleŜy: stresy fizyczne i psychiczne oraz leki, takie jak acetylocholma, nikotyna i morfina. Wymienione bodźce pobudzają głównie syntezę ADH i neurofizyny II, nie wpływają natomiast na uwalnianie zapasów tego hormonu. Epinefryna oraz leki zwiększające objętość osocza hamują sekrecję ADH. Podobne działanie ma etanol.

PRZYSADKA MÓZGOWA I HORMONY PODWZGORZA / 611

Mechanizm działania. NajwaŜniejszymi komórkami docelowymi dla ADH w stanach fizjologicznych są komórki dystalnych kanalików krętych i zbiorczych nerki. Kanaliki te przechodzą przez rdzeń nerki, którego płyn śródmiąŜszowy wykazuje do 4-krotnie wyŜszą molalność niŜ osocze. Komórki tych kanalików są względnie nieprzepuszczalne dla wody, tak Ŝe w nieobecności ADH nie dochodzi do zagęszczenia moczu, co w konsekwencji zwiększa dobową objętość moczu powyŜej 2 1. ADH zwiększa przepuszczalność komórek kanalikowych dla wody i umoŜliwia wyrównanie molalności moczu zawartego w kanalikach z hiperosmolalnym płynem śródmiąŜszowym. W wyniku tego procesu dobowa objętość moczu zmniejsza się do 0,5—1,01. Receptory ADH występują w luminalnych błonach ptezmatycznych komórek kanalikowych. Receptor dla ADH, po połączeniu się z hormonem, aktywuje uyklazę adenylanową, zaś pozostały cAMP pełni funkcję mediatora śródkomórkowego ADH w komórkach nerkowych. To działanie fizjologiczne uzasadnia określenie „hormon antydiuretyczny". cAMP oraz inhibitory ibsfodiesterazy np. kofeina, wykazują działanie podobne do ADH. W badaniach in vivo, wzrost stęŜenia wapnia w płynie opłukującym luminalną powierzchnię komórek kanalikowych, hamuje efekt ADH na przezcewkowy ruch wody, najpewniej poprzez hamowanie cyklazy adenylanowej. Wzrost stęŜenia Ca2+ nie hamuje jednak samego działania cAMP. Obserwacja ta choć częściowo tłumaczy patomechanizm wydalania zwiększonych ilości moczu u chorych z hiperkalcemią. Patofizjologia. Nieprawidłowości w sekrecji lub działaniu ADH mogą być przyczyną moczówki prostej, charakteryzującej się wydalaniem wzmoŜonych ilości rozcieńczonego moczu. Moczówka prosta typu ośrodkowego spowodowana jest niedoborem ADH, uwarunkowanym zniszczeniem drogi podwzgórzowo-przysadkowej (występującym przy złamaniach kości podstawy czaszki), guzem mb infekcją przysadki mózgowej, lub dziedzicznym defektem syntezy tego hormonu. W moczówce prostej nerkowopochodnej (w postaci dziedzicznej), wydzielanie ADH jest prawidłowe, natomiast receptor dla tego hormonu jest uszkodzony (p. tab. 43-2). Dziedziczny defekt receptora ADH naleŜy odróŜnić od defektu nabytego, występującego w nabytej moczówce prostej norko w o pochodnej, spowodowanej najczęściej po-

dawaniem farmakologicznych dawek soli litu chorym z psychozą maniakalno-depresyjną. Nieadekwatne w stosunku do aktualnej osmolalności osocza, wzmoŜone wydzielanie ADH występuje u chorych z róŜnymi guzami (ektopowe nadmierne wydzielanie ADH przez nowotwór), zwykle z nowotworami płuc lub u chorych z zakaŜeniami płuc, chorobami mózgu lub niedoczynnością tarczycy. Przymiotnik „nieadekwatne" oznacza, Ŝe występuje normalna lub nawet wzmoŜona sekrecja ADH u osób wykazujących hipoosmolalność osocza. W następstwie, u takich chorych stwierdza się stałą lub postępującą hiponatremię spowodowaną rozcieńczeniem osocza oraz wydzielaniem moczu hipertonicznego.

PIŚMIENNICTWO Hormony przedniego płata przysadki Douglass J, Civeili O, Herbert E: Polyprotein gene expression: Generation ofdiversityof neuroendocrine peptides. Annu Rev Biochem 1984;53:665. Frantz AG: Prolactin. N Engl J Med 1978;298:201. Krieger DT: The multiple faces of pro-opiomelanocortin, a prototype precursor molecule. Clin Res 1983;3:342. Nikolics K et al: A prolactin-inhibiting factor with the precursor for human gonad otropin-releasing hormone. Naturę 1986;316:511, Pierce JG, Parsons TF: Glycoprotein hormones: Structure and function. Annu Rev Biochem 198!; 50:465. Seeburg P: The human growth hormone gene family: Structure and evolution of the chromosomal locus. Nucletc Acids Res 1983;11:3939.

Hormony tylnego płata przysadki Chord IT: The posterior pituitary gland. Clin Endocrinol 1975;4:89. Robertson GL: Regulation of vasopressin function in health and disease. Recent Próg Norm Res 1977; 33:333.

Hormony podwzgórza Imura H et al; Effect of CNS peptides on hypothalamic regulation of pituitary secretion. Adv Biochem Psychopharmacoi 1981;28:557. Labrie F et al: Mechanism of action of hypothalamic hormones in the adenohypophysis. Annu Rev Physiol 1979;41:555. Reichlin S; Systems for the study of regulation of neuropeptide secretion. In: Neurosecretion and Brain Peptides: ImpUcationsfor Brain Function and Neurological Disease, Martin JB, Reichlin S, Bick KL (editors). Raven Press, 1981.

47

Hormony tarczycy Daryl K. Granner, MD

WPROWADZENIE Hormony tarczycy regulują ekspresję genów, róŜnicowanie tkanek i ogólny rozwój. Gruczoł tarczowy wytwarza dwa jodowane aminokwasy: a^^-trijodotyroninę (T3) i 3,5,3' ,5'-tetrajodotyroninę (T4, tyroksyna). Ich znaczenie w regulacji przemiany materii, rozwoju i róŜnicowaniu tkanek poznano juŜ dawno. Hormony te, których strukturę przedstawiono na ryc. 47-1, regulują ekspresję genów przy pomocy mechanizmów podobnych do występujących przy hormonach steroidowych.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Choroby tarczycy naleŜą do najczęściej występujących endokrynopatii. Zarówno diagnostyka jak i leczenie tyreopatii są ściśle oparte na znajomości fizjologii i biochemii hormonów tarczycy. Dostępność radioizotopów jodu w istotnym stopniu pomogła wyjaśnić jego fizjologię i biochemię. Radioaktywny jod, gromadząc się w tarczycy, jest szeroko wykorzystywany w diagnostyce i terapii zaburzeń jej

Skróty uŜywane w tym rozdziale DIT

- dijodotyrozyna — monojodotyrozyna — trijodotyronina — tyroksyna, tetrajodotyronina TBG — globulina wiąŜąca tyroksynę TBPA — frakcja prealbumin wiąŜących tyroksynę TRH — hormon pobudzający tyreotropinę, tyreoliberyna TSH — tyreotropina TSI — immunoglobuliny klasy IgG pobudzające tarczycę MIT T3 T4

funkcji. Radioaktywny jod kryje w sobie równieŜ potencjalne ryzyko wywołania raka tarczycy, jeśli gruczoł ten przez dłuŜszy czas jest eksponowany na działanie radioizotopu (np. po wybuchach nuklearnych). Niebezpieczeństwo to dotyczy szczególnie niemowląt i młodzieŜy, u których komórki tarczycy dzielą się jeszcze aktywnie.

BIOSYNTEZA HORMONÓW TARCZYCY ZWIĄZANA JEST Z TYREOGLOBULINĄ I PRZEMIANĄ JODKÓW Hormony tarczycy odróŜniają się od innych hormonów tym, Ŝe dla ich aktywności biologicznej potrzebny jest pierwiastek śladowy jod. W większej części świata jod występuje w niewielkich ilościach w ziemi, co sprawia, Ŝe jego zawartość w środkach spoŜywczych jest mała. Ten fakt tłumaczy, dlaczego rozwinął się złoŜony mechanizm zatrzymywania tego istotnego pierwiastka śladowego w ustroju i przekształcenia go w postać nadającą się do wbudowywania do związków organicznych. W tym samym czasie tarczyca musi syntetyzować tyroninę i synteza ta zachodzi w tyreoglobulinie. Procesy te zostaną omówione oddzielnie, chociaŜ przebiegają równolegle.

Tyreoglobulina jest białkiem złoŜonym Biosynteza. Tyreoglobulina jest prekursorem T* i T3. Jest to duŜe białko jodowane i glikozylowane o masie cząsteczkowej 660 000 przy czym węglowodany stanowią 8—10%, zaś jod 0,2—1% całej masy tyreoglobuliny. Zawartość jodu w cząsteczce tyreoglobuliny zaleŜna jest od zawartości tego pierwiastka w poŜywieniu. Tyreoglobulina składa się z dwóch podjednostek.

HORMONY TARCZYCY I 613

ści luminalnej i magazynowana w pozakomórkowym koloidzie "pęcherzykowym. Ze światła

pęcherzyków tyreoglobulina ponownie dostaje się do komórek pęcherzykowych. Przemieszczając się od powierzchni luminalnej do bazal3-M o no) od o tyrozyna (MIT) nej komórek pęcherzykowych tyreoglobuliny ulega hydrolizie do aktywnych hormonów T3 I i T4. Wszystkie wymienione etapy biosyntezy CH,CH-COOH nasilają się pod wpływem TSH. Hormon ten ( l u b cAMP) stymuluje równieŜ transkrypcje genu kodującego tyreoglobutinę. NH, Hydroliza. Tyreoglobulina jest zapasową 3,5-Dljodotyrozyna (DIT) postacią T3 i T4 w koloidzie. W normalnej tarczycy zapasy dla tych hormonów wystarczają na kilka tygodni. W ciągu zaledwie kilku CH,CH-COOH minut po zadziałaniu TSH (lub cAMP) stwierdza się znaczny wzrost mikrokosmków na NH, szczytowej (apikalnej) dłonie komórek pęche3,5,3',5' rzykowych. W procesie tym, zaleŜnym od mikrotubul, tyreoglobulina jest wychwytywana -Tetrajodotyronlna (tyroksyna, TJ przez mikrokosmki i przemieszczana do komóI I rek pęcherzykowych mechanizmem pinocy tozy. Te fagosomy zlewają się z lizosomami two-CH 2 CH-COOH rząc fagolizosomy, w których zachodzi hydro2 __/ | liza tyreoglobuliny do aminokwasów, w tym NH23,5j3'równieŜ do jodotyronin, pod wpływem róŜnych Trljodotyronina (T3) proteaz kwaśnych i peptydaz. Powstałe T4 i T3 wydalane są z bazalnego bieguna komórek I I pęcherzykowych do krwi, najpewniej za pośrednictwem transportu ułatwionego. Stosunek T4:T3 we krwi tarczycy jest mniejszy niŜ w tyreoglobulinie, co sugeruje, Ŝe zachodzi określona, wybiórcza dejodynacja T4 w tym narządzie endokrynnyrn. Dziennie wydzielanych jest ok, 50 (j.g jodu pod postacią hormonów tarczycy. 3,3',5'-Trl]odolyronlna {odwrotna T,, rTJ Przy średnim wychwycie jodu przez tarczycę (wynoszącym 25—30% jodu spoŜytego z pokarRyc. 47-1. Struktura chemiczna hormonów tarczycy i związków pokrewnych. mami) zapotrzebowanie na ten pierwiastek wynosi 150—200 (ig/d. Jak o tym wspomniano juŜ wyŜej, większość Zawiera ona 115 reszt tyrozynowych, z których jodu zawartego w tyre o globulinie nie występuje kaŜda jest potencjalnym miejscem jodowania. w postaci jodotyronin, lecz (ok. 70%) pod Około 70% jodu cząsteczki tyreoglobulinowej postacią nieaktywnej MIT i DIT. Te ostatnie występuje w postaci nieaktywnych prekurso- dwa aminokwasy są uwalniane w wyniku hydrów, tj. monojodotyrozyny (MIT) i dijodotyrozy- rolizy tyreoglobuliny. Jod zawarty w MIT i DIT ny {DIT), zaś 30% w postaci reszt jodo ty ronino- zostaje „odzyskany" dzięki enzymowi — dejowych T4 i T3. Przy dostatecznej podaŜy jodu dynazie. Enzym ten, który jest zaleŜny od stosunek T4 i T3 wynosi 7:1. W stanach niedoboru NADPH, występuje równieŜ w nerkach i wątjodu ten stosunek ulega zmniejszeniu, podobnie robie. Jod uwolniony z MIT i DIT stanowi jak stosunek DIT:MIT. Przyczyna syntezy waŜną pulę tego pierwiastka w obrębie tarczycy duŜej cząsteczki tyreoglobuliny, złoŜonej z ok. i róŜni się od anionu I~ wchodzącego do 5 000 aminokwasów, po to by wytworzyć tarczycy z krwi. W stanie równowagi ilość jodu zaledwie kilka tylko cząsteczek zmodyfikowa- wchodzącego do tarczycy jest równa ilości tego nego dipeptydu, wydaje się tkwić w tym, Ŝe pierwiastka opuszczającego ten gruczoł. JeŜeli sprzęgania reszt tyrozylowych i organifikacja jodu wymagają znacznej konformacji cząsteczki tyreoglobuliny. Tyreoglobulina jest syntetyzowana w części bazalnej komórek pęcherzyków tarczycowych skąd transportowana jest do czę-

CH,CH-COOH

HO

I NH,

"A

,-

'L,

*=*

614 / ROZDZIAŁ 47

jedna trzecia część jodu tyre o globulin owego i DIT, są dostępne ponownej biosyntezie w obopuszcza tarczycę (pod postacią T4 i T3),pozos- rębie tego gruczołu. Przemiana jodków składa tale dwie trzecie, pochodzące z dejodynacji MIT się z kilku odrębnych etapów (p. ryc. 47-2). I-

ŚWIATŁO PĘCHERZYKA TARCZYCOWEGO

PRZESTR MIT MIT. DIT, DIT Sprzęganie'

Ryc. 47-2. Schemat przemiany anionu jodkowego I w pęcherzyku tarczycowym Przedstawiono komórkę pęcherzyka tarczycowego zwróconą u góry do światła pęcherzyka (przestrzeń zakropkowana), zaś na dole do przestrzeni pozakomórkowej (śródmiązszowej). Aniony ! wchodzą do komórki za pomocą pompy lub dyfuzji biernej. Synteza hormonów tarczycy zachodzi w świetle pęcherzyka; jest ona reakcją wieloetapową. W wielu jej etapach udział bierze peroksydaza. Uwolnienie hormonów tarczycy z tyreoglobuliny zachodzi przez hydrolizę. Tgb — tyreoglobulina, MIT — monojodotyrozyna, DIT — dijodotyrozyna, Ta — trijodotyronina, T, — tetrajodotyronina. Gwiazdka oznacza miejsca występowania dztśdzicznych defektów enzymatycznych, będących przyczyną wrodzonego wola przebiegającego często z niedoczynnością tarczycy.

HORMONY TARCZYCY / 615

1. Zagęszczanie jodków (I )w tarczycy. Gruczoł tarczowy, podobnie jak wiele innych narządów lub tkanek typu nabłonkowego (np. gruczoł sutkowy, kosmówka, ślinianki, Ŝołądek) wykazują zdolność zagęszczania I", wbrew obecności znacznego gradientu elektrochemicznego. Jest to energochłonny proces sprzęŜony z pompą zaleŜną od Na+/K+ ATP-azy. Aktywność tarczycowej pompy I~ moŜna oddzielić od kolejnych etapów biosyntezy hormonów tarczycy stosując inhibitory procesu organifikacji I~, będące pochodnymi tiomocznika (ryc. 47-3). Iloraz ze stęŜenia jodu w tarczycy (T) do stęŜenia tego pierwiastka we krwi (S) (iloraz T:S) jest odzwierciedleniem aktywności wymienionej pompy lub mechanizmu zagęszczającego I~. Aktywność tej pompy wyraŜona ilorazem T/S jest kontrolowana głównie przez TSH i wahać się moŜe od 500 u zwierząt przewlekle stymulowanych TSH, do 5 lub mniej u zwierząt pozbawionych przysadki mózgowej. U ludzi spoŜywających dietę o normalnej zawartości jodu iloraz T:S wynosi ok. 25. Tylko bardzo mała ilość jodków wnika do tarczycy na zasadzie dyfuzji. Anion I", który nie ulega organifikacji do MIT lub DIT (ok. 10%) opuszcza tarczycę w ten sam sposób. Mechanizm transportu I~ do tarczycy hamują dwie grupy związków. Pierwszą grupę tworzą nadchlorany (ClOl), nadreniany (ReOi), nadtechnecjany (TeO'i), tj. aniony o podobnej częściowo swoistej objętości do anionu I~. Aniony te działają konkurencyjnie do I~ w odniesieniu do przenośnika jodkowego i ulegają zagęszczaniu przez tarczycę. Radioaktywny TeO^. jest powszechnie stosowany w badaniach transportu anionu I" u ludzi. Linearny anion rodankowy (SCN~) jest przedstawicielem drugiej grupy związków będących kompetycyjnymi inhibitorami transportu I~, lecz nie ulegającymi zagęszczeniu w tarczycy. Te inhibitory trans-

portu I~ pozwalają ujawnić występowanie szybkiej dyfuzji wymienialnego I z tarczycy i wykorzystywane są w diagnostyce defektów procesu organifikacji jodu w tarczycy. Po podaniu inhibitora transportu I~ w stęŜeniu hamującym koncentracje I~, ilość zgromadzonego w tarczycy I ' (mierzonego z reguły przy uŜyciu izotopu 131I) opuszczającego ten gruczoł jest miarą frakcji jodu niezwiązanego, tj. jodu, który nie uległ organifikacji. U chorych z częściowym defektem w zakresie organifikacji jodu ilość 131I uwalniającego się z tarczycy po podaniu nadchloranów jest większa niŜ u osób zdrowych. 2. Utlenianie l ~ . Tarczyca jest jedyną tkanką wykazującą zdolność utleniania anionu I~ do wyŜszej wartościowości. Jest to niezbędny etap w procesie organifikacji I" i biosyntezy hormonów tarczycy. Tśn etap wymaga obecno ści peroksydazy, zawierającej hem i występuje na luminalnej powierzchni komórek pęcherzy ków tarczycowych. Peroksydaza tarczycowa jest białkiem tetramerycznym o masie cząsteczkowej 60 000. Do procesu utlenienia enzym ten wymaga nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru (HjCb) wytwarzany jest przez enzym zaleŜny od NADPH, przypominający reduktaze cytochromu C. Utlenianie I~, i co za tym idzie, jego wbudowywanie do MIT i DIT, hamuje wiele związków. Do najwaŜniejszych z nich, z punktu widzenia klinicznego, naleŜą leki będące pochodnymi tiomocznika. Niektóre z nich przedstawiono na ryc. 47-3. Są one znane jako „leki przeciwtarczycowe7', poniewaŜ działają one hamująco na ten etap biosyntezy hormonów tarczycy. 3. Jodowanie tyrozyny. Utleniony anion I~ reaguje z resztami tyrozylowymi tyreoglobuliny; w reakcji tej uczestniczy prawdopodob nie tyreoperoksydaza. Najpierw ulega jodowa niu węgiel w pozycji 3, a następnie węgiel w pozycji 5 pierścienia aromatycznego tyrozy-

I N-C H

NH2

I NH,

y H

Tio/noeznik

Tlouracyl

H N—

V f

>»

N—C

S=C

,CH N-C—C3H7 H

PropylotlouracyJ

Ryc. 47-3. Leki przeciwtarczycowe, pochodne tiomocznika.

CH

s=<( N—CH CH3

616 / ROZDZIAŁ 47

ny. W wyniku tych reakcji powstaje MIT iub DIT. Reakcja ta, czasami określana jako organifikacja jodu, zachodzi w ciągu sekund w świetle pęcherzyka tarczycowego. Po organifikacji jod niełatwo opuszcza tarczyce. Wolna tyrozyna moŜe ulec jodowaniu, lecz nie zostaje wbudowywana do białek, poniewaŜ Ŝaden tRNA nie rozpoznaje jodowanej tyrozyny.

4. Sprzęganie jodotyrozyn. Sprzęganie dwóch cząsteczek DIT w celu wytworzenia T4) lub jednej cząsteczki DIT z jedną cząsteczką MIT, w celu wytworzenia Tj, zachodzi w obrębie cząsteczki tyreo globu liny. Nie wyklucza się, Ŝe równieŜ wolna cząsteczka MIT względnie DIT ulega sprzęganiu ze związaną w tyreoglobulinę cząsteczkę DIT. PoniewaŜ nie znaleziono dotychczas oddzielnego enzymu sprzęgającego, a proces ma charakter reakcji,utleniania, przyjmuje się, Ŝe reakcję tę katalizuje tyreoperoksydaza (patrz pkt 2), pobudzając tworzenie się wolnych rodników jodotyrozynowych. Taką hipotezę potwierdza m.in. to, Ŝe te same leki, które hamują utlenianie I~, hamują równieŜ proces sprzęgania. Powstałe hormony tarczycy stanowią integralną część tyreoglobuliny tak długo, jak długo ta ostatnia nie ulega degradacji. Hydrolizę tyreoglobuliny pobudza TSH, natomiast hamuje I". Ten ostatni fakt jest czasami wykorzystywany w leczeniu nadczynności tarczycy za pomocą jodku potasowego.

HORMONY TARCZYCY ULEGAJĄ ZWIĄZANIU PRZEZ BIAŁKA NOŚNIKOWE W OSOCZU A NASTĘPNIE PRZEMIANIE Połowa do \ ogóinoustrojowego T4 i T3 znajduje się poza tarczycą i większość tych hormonów jest związanych przez dwa swoiste białka wiąŜące, tj.przez globulinę wiąŜącą tyroksynę

(thyroxine binding globulin —TBG) oraz prcalhumine wiąŜącą tyroksynę (thyroxine binding prealbumin — TBPA). Pod względem ilościowym waŜniejsza z nich jest TBG, będąca glikoproteiną o masie cząsteczkowej 50000. Wykazuje ona 100-krotnie większe powinowactwo do T4 i T3 niŜ TBPA. Jej pojemność wiązania tych hormonów wynosi 20 ug na 100 ml osocza. W warunkach prawidłowych TBG wiąŜe niekowalencyjnie prawie całą ilość T4 i T3 występującą w osoczu (p. tab. 47-1). Niewielka pod względem ilościowym frakcja T4i T3 nie związana z białkami nośnikowymi odpowiedzialna jest za aktywność biologiczną tych hormonów. Pomimo Ŝe ogólne slęŜenia T4 i T3 znacznie się od siebie róŜnią, stęŜenie wolnej (nie związanej z białkami nośnikowymi) T3 jest zbliŜone do stęŜenia wolnej T4, chociaŜ okres póltrwania T4 jest 4-krotnie dłuŜszy od T3. StęŜenie TBG zaleŜne jest od wielu czynników regulacyjnych co ma istotne znaczenie dla badań czynności tarczycy, w których oznacza się najczęściej całkowite stęŜenie T4i T3 a nie stęŜenie frakcji wolnej tych hormonów. Biosynteza TBG zachodzi w wątrobie i wzrasta pod wpływem estrogenów (np. u kobiet cięŜarnych lub zaŜywających doustne leki antykoncepcyjne). Spadek syntezy TBG obserwuje się po leczeniu androgenami lub glikokortykoidami oraz w przebiegu pewnych chorób wątroby. Zdarzają się równieŜ genetycznie uwarunkowana nadprodukcja lub niedobory TBG. We wszystkich tych stanach obserwuje się zmienione ogólne stęŜenia T4i T^, natomiast nie zmienione stęŜenia wolnej frakcji (nie związanej z białkami nośnikowymi) tych hormonów. Fenytoina i kwas salicylowy są lekami kompetycyjnie wiąŜącymi się z TBG (przez co wypierają T4 i T3 z TBG). W następstwie działania tych leków dochodzi do spadku ogólnego stęŜenia tych hormonów we krwi, przy czym stęŜenie frakcji

Tabela 47-1. Charakterystyka T. i T, występujących w osoczu krwi Całkowite stęŜenie hormonu nmol/l (Kg/dl)

T3

103 (8) 2,29 ' (0,15)

Okres półtrwania (w dniach)

StęŜenie wolnego hormonu (nie związanego z białkiem) jako % stęŜania całkowitego

w ng/dl

w molach

0,03

-2,24 -

3,0x10~ -

0,3

0,4

11

6,5

11

1,5

0,6x10"

HORMONY TARCZYCY / 617

nie związanej z TBG (stęŜenie wolnej T4 i T3) nie ulega zmianie. Ten fakt naleŜy uwzględnić przy interpretacji wyników testów diagnostycznych. W procesie pozatarczycowego odjodowania T4 ulega konwersji do T3. Skoro w komórkach docelowych T3 wykazuje dziesięciokrotnie silniejsze powinowactwo do receptora niŜ T4, uwaŜa się, Ŝe T3 jest głównym, metabolicznie aktywnym hormonem tarczycy. Około 80% krąŜącej we krwi T4 ulega w tkankach obwodowych konwersji do T3 lub odwrotnej T3 (rTj), Ta konwersja jest źródłem większości Tj powstającej w ustroju. Odwrotna T3 jest bardzo słabym agonistą T3 powstającym we względnie większych ilościach w przewlekłych chorobach, w stanach głodzenia węglowodanowego i u płodów. Propylotiouracyl i propranolol zmniejszają konwersje T4 do T3. Inne mechanizmy przemiany hormonów tarczycy polegają na ich całkowitym odjodowaniu oraz inaktywacji poprzez deaminację i dekarboksylację. W wyniku glukuronidacji lub sulfatacji zachodzącej w wątrobie, powstają cząsteczki bardziej hydrofilne, wydalane z Ŝółcią, po czym ponownie resorbowane z przewodu pokarmowego, odjodowane w nerkach i wydalone z moczem pod postacią glukuronidów.

HORMONY TARCZYCY DZIAŁAJĄ NA POZIOMIE JĄDRA KOMÓRKOWEGO Hormony tarczycy wiąŜą się ze swoistymi receptorami wysokiego powinowactwa zlokalizowanymi w jądrze komórkowym komórek docelowych. T3 wykazuje 10-krotnie silniejsze powinowactwo do tych receptorów niŜ T4. Pytanie, czy cała aktywność biologiczna hormonów tarczycy pośredniczona jest przez T3, jest przedmiotem spornym, poniewaŜ zarówno T4, jak i T3 są hormonami aktywnymi. Hormony tarczycy wiąŜą się z białkiem cytoplazmy wykazującym słabe powinowactwo do Tj i T4. Białko to jest zapewne róŜne od białka receptorowego jąder komórkowych. Wiązanie hormonów tarczycy przez białka cytoplazmatyczne ma najpewniej na celu „trzymanie" tych hormonów w sąsiedztwie swoistych receptorów jądrowych. Ogólna funkcja hormonów tarczycy polega na stymulacji konsumpcji tlenu. Według hipotezy Edelmana i współpracowników znaczna ilość energii zuŜytkowana przez komórkę wykorzystywana jest do napędzania pompy Na ł/K+-

-ATP-azowej. Hormony tarczycy nasilają czynność tej pompy poprzez zwiększanie liczby jednostek pompujących. Skoro wszystkie komórki mają taką pompę i faktycznie reagują na hormony tarczycy, uwaŜa się, Ŝe podstawowy mechanizm ich działania polega na zwiększaniu utylizacji ATP i związanej z nią wzmoŜonej konsumpcji tlenu w procesie fosforylacji oksydacyjnej. Innym waŜnym skutkiem działania T4 i T3 jest wzrost syntezy białka oraz dodatni bilans azotowy. Hormony tarczycy, podobnie jak hormony steroidowe, pobudzają lub hamują syntezę białka nasilając lub obniŜając transkrypcję odpowiednich genów (p. ryc. 45-1). W przypadku T3 i T4 czynnikiem działającym w układzie trans jest kompleks jecepiora z hormonem tarczycowym zawsze umiejscowionym w jądrze komórkowym. Element odpowiedzi hormonalnej, działający w układzie cis oraz wiąŜący się z tym kompleksem, składa się z następującej centralnej sekwencji DNA GATCAnnnnnn TGACC (p. tab. 45-3). Między tymi dwiema kłasami hormonów uczestniczących w procesie wzrostu, tj. między hormonami tarczycy a samym hormonem wzrostu (somatotropiną), istnieje ciekawa współpraca. T3 i glukokortykoidy nasilają transkrypcję genu kodującego hormon wzrostu, przez co wzrasta biosynteza GH. Ten fakt wyjaśnia klasyczną obserwacje braku GH w przysadkach mózgowych zwierząt z niedoborem Tj. Wyjaśnia on równieŜ, chociaŜ tylko częściowo, anabohczne działanie tego ostatniego hormonu. Bardzo duŜe stęŜenia T., są przyczyną spadku syntezy białka oraz wystąpienia ujemnego bilansu azotowego. Hormony tarczycy są znanymi, waŜnymi modulatorami procesów rozwojowych. Jest to najlepiej widoczne w metamorfozie płazów. I tak hormony tarczycy są potrzebne w procesie przekształcenia się kijanki w Ŝabę. W procesie tym dochodzi do resorpcji ogonka, proliferacji zawiązków kończyn, konwersji syntezy hemoglobiny płodowej na hemoglobinę typu dorosłego, pobudzenia enzymów cyklu mocznikowego (syntetazy karbamoilofosforanowej), przez co dochodzi do wydalania mocznika zamiast NHt oraz do zmian naskórka. Wymienione zmiany są zapewne wynikiem regulacji ekspresji swoistych genów przez te hormony. Hormony tarczycy są potrzebne do normalnego rozwoju człowieka. Niedoczynność tarczycy występująca w Ŝyciu płodowym lub u noworodków jest

618 / ROZDZIAŁ 47

przyczyną matołectwa (kretynizmu); jest to stan chorobowy charakteryzujący się licznymi defektami wrodzonymi oraz cięŜkim nieodwracalnym niedorozwojem umysłowym. PATOFIZJOLOGIA WIELU CHORÓB TARCZYCY WYKAZUJE ZWIĄZEK Z SEKRECJĄ TSH, T 3 iT, Wole oznacza powiększoną tarczycę Wolem określa się jakiekolwiek powiększenie tarczycy. Wole proste jest wyrazem mechanizmu kompensacyjnego spowodowanego niedostatecznym wytwarzaniem hormonów tarczycy. Wspólnym mianownikiem dla wszystkich tych stanów jest podwyŜszony poziom TSH w surowicy krwi. Wśród przyczyn wola prostego naleŜy wymienić niedobór jodków w poŜywieniu, nadmierną podaŜ jodków u osób z uszkodzonym mechanizmem autoregulacji syntezy hormonów tarczycy oraz róŜnorodne dziedziczne zaburzenia biosyntezy hormonów tarczycy. Wśród tych ostatnich moŜna wymienić:)) zaburzenia w zakresie transportu anionów I~, 2) zaburzenia procesu jodowania lub 3) sprzęgania, 4) niedobór dejodynazy oraz 5) biosyntezę nieprawidłowych białek jodowanych. Występowanie częściowych zaburzeń na poziomie poszczególnych etapów biosyntezy hormonów tarczycy moŜe być przyczyna występowania wola prostego u osób dorosłych. CięŜkie zaburzenia natomiast są przyczyną nied oczy nnośti tarczycy. Leczenie wola prostego polega na podawaniu egzogennych hormonów tarczycy. Suplementacja lub restrykcja podaŜy I są właściwym postępowaniem tylko w określonych rodzajach wola. Niedostateczna ilość wolnej T, lub T4 jest powodem niedoczynności tarczycy Taką sytuację spotyka się w pierwotnej niedoczynności tarczycy, lecz moŜe ona być równieŜ spowodowana chorobą przysadki mózgowej lub podwzgórza. W niedoczynności tarczycy stwierdza się obniŜenie podstawowej przemiany materii oraz aktywności innych procesów zaleŜnych od hormonów tarczycy. Głównymi objawami niedoczynności tarczycy są: zwolnienie czynności serca, nadciśnienie rozkurczowe, ogólne spowolnienie, senność, zaparcia, nadwraŜliwość na zimno, sucha skóra, łamliwość włosów oraz bladoŜółta cera. Obec-

ność innych objawów zaleŜna jest od wieku, w którym choroba się rozwinęła. Niedoczynność tarczycy, pojawiająca się w późnym dzieciństwie, przejawia się niskim wzrostem, nte ma tu jednak upośledzenia umysłowego. RóŜne rodzaje etiologiczne niedoczynności tarczycy leczy się podawaniem egzogennych hormonów tego gruczołu. Nadczynność tarczycy (tyreotoksykoza) spowodowana jest nadmiernym wytwarzaniem hormonów tarczycy Wiele jest przyczyn nadczynności tarczycy. W USA w większości przypadków przyczyną nadczynności tarczycy jest choroba Gravesa. Jest ona spowodowana wytwarzaniem immutioglobulin klasy IgG pobudzających receptory tyre-

otropinowe (thyroid stimulating immunoglobulins — TSI) (p. tab. 43-2). Są one przyczyną powiększania się tarczycy i nadmiernej, niekontrolowanej biosyntezy T3 i T4, spowodowane nie wy stąpieniem sprzęŜenia zwrotnego między TSI a wytwarzaniem hormonów tarczycy. Objawy chorobowe dotyczą wielu układów. Wśród nich naleŜy wymienić tachykardię, wysoką amplitudę ciśnienia skurczowo-rozkurczowego, nerwowość, bezsenność, chudnięcie pomimo wzmoŜonego apetytu, osłabienie, nadmierne pocenie się, nietolerancję ciepła oraz zaróŜowioną, wilgotną skórę. Leczenie nadczynności tarczycy spowodowanej chorobą Gravesa polega na stosowaniu leków blokujących biosyntezę hormonów tarczycy, niszczeniu miąŜszu tarczycowego za pomocą radioaktywnego jodu (ŁilI) lub równoczesnym stosowaniu obu sposobów terapii. Czasami usuwa się tarczycę chirurgicznie. PIŚMIENNICTWO Chopra U et al: Pathways of metabolism of thyroid hormones. Recent Próg Horm Res 1978;34:531. Larsen PR: Thyroid-pituitary iateraction: Feedback regulation of thyrotropin secretion by thyroid hormones. N Engl J Med 1982;396:23. Oppenheimer JH: Thyroid hormone action at the nuciear level. Ann Intern Med 1985;102:374. Robins J et al: Thyrosine transport proteins of plamsa: Molecular properties and biosynthesis. Recent Próg Horm Res 1978;34:477. Samuels H: Regulation of gene expression by thyroid hormone. J Clin Invest 1988;81:957.

Hormony regulujące przemianę wapniową

48

Dary/ K. Granner, MD

WPROWADZENIE Jony wapniowe są regulatorami licznych waŜnych procesów fizjologicznych i biochemicznych. Wśród nich naleŜy wymienić pobudliwość nerwowo-mięśniową, krzepnięcie krwi, procesy sekrecyjne, integralność morfologiczną błon, transport przez błony plazmatyczne, reakcje enzymatyczne, uwalnianie hormonów i neuroprzekaźników oraz śródkomorkowe działanie licz-

nych hormonów. Ponadto właściwe stęŜenia Ca2+ iPOJ~wpłyniepozakomórkowymiokostnej^potrzebne są w procesie mineralizacji kości. Do prawidłowego przebiegu wymienionych procesów stęŜenie CaI+ w osoczu musi być utrzymywane w wąskich granicach. Treścią tego rozdziału jest wyjaśnienie mechanizmów zabezpieczających izokalcemię.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Odchylenia stęŜenia wapnia zjonizowanego od wartości prawidłowej mogą być przyczyną licznych zaburzeń i są groźne dla Ŝycia. AŜ 3% chorych hospitalizowanych wykazuje zaburzenia homeostazy wapniowej.

WAPŃ WYSTĘPUJE W KOŚCIACH I PŁYNIE P0ZAK0MÓRKOWYM Zawartość wapnia w ustroju wynosi ok. 1 kg. Z tej ilości 99% znajduje się w kościach, gdzie wraz z fosforanami tworzy kryształki hydroksyapatytu, stanowiące nieorganiczny składnik struktury kości. Kość jest tkanką dynamiczną, ulegającą ciągłej przebudowie pod wpływem zmieniających się obciąŜeń. W stanie równo-

wagi nasilenie osteogenezy (nowotworŜenia kości) jest równa nasileniu osteolizy (resorpcji kości). Większość wapnia występującego w kościach nie jest swobodnie wymienialna z wapniem płynu pozakomórkowego (ECF). Tak więc oprócz funkcji mechanicznej kości są wielkim rezerwuarem wapnia. Około 1% wapnia występującego w kościach stanowi pulę wapnia wymienialnego. Ta pula tworzy wraz z drobną częścią wapnia przestrzeni podokostnowej (wynoszącą 1 % wapnia całkowitego tej przestrzeni) tak zwaną wymienialną pulę Ca*+. Hormony omawiane w tym rozdziale regulują stęŜenie wapnia w płynie pozakomorkowym oddziaływując na transport wapnia poprzez błonę oddzielającą przestrzeń wodną pozakomórkową systemową od przestrzeni wodnej kostnej (jest to przestrzeń otaczająca osteocyty i umiejscowiona pod warstwą osteoblastów i osteoklastów — przyp. tłumacza). Transport ten pobudza głównie parathormon, chociaŜ uczestniczy w nim równieŜ kalcytriol (1,25-dihydroksycholekalcyferol). Obecny w osoczu wapń występuje w trzech postaciach: l)jako wapń w kompleksach z kwasami organicznymi, 2) związany z białkami i 3) /jonizowany. Około 6% wapnia całkowitego osocza jest związanych (skompleksowanych) z anionami cytrynianowymi, fosforanowymi lub innymi. Pozostały wapń występuje w postaci związanej z białkami (głównie albuminami) lub zjonizowanej, nie związanej z białkami (po 47% wapnia całkowitego). StęŜenie wapnia zjonizowanego (Ca2+) u większości ssaków, ptaków i ryb słodkowodnych utrzymywane jest w stęŜeniach od 1,1 do 1,3 mmol/1 i stanowi biologicznie aktywną frakcję tego pierwiastka. Ustrój człowieka wykazuje niewielką tolerancję na znaczniejsze odchylenia stęŜenia Ca2+ od

620 / ROZDZIAŁ 48

wymienionych wartości. W razie spadku stęŜenia wapnia zjonizowanego zwierzę wykazuje wzmoŜoną pobudliwość nerwowo-mięśniową i mogą wystąpić drgawki tęŜyczkowe. Znaczne wzrosty stęŜenia wapnia w osoczu mogą być przyczyną śmierci spowodowanej poraŜeniem mięśni i śpiączką. StęŜenie wapnia zjonizowanego w osoczu wraz ze stęŜeniem towarzyszącego mu anionu fosforanowego znajduje się blisko ich iloczynu rozpuszczainości. Dlatego wydaje się, Ŝe wiązanie wapnia z białkami moŜe zapobiec wytrącaniu się wapnia z roztworu i powstawaniu ektopowych zwapnień (kalcyfikacji). Zmiany stęŜenia białek w osoczu krwi (głównie uwarunkowane zmianą stęŜenia albumin, a w mniejszym stopniu zmianą stęŜenia globulin, które równieŜ wiąŜą wapń) są powodem równolegle przebiegających zmian stęŜenia wapnia całkowitego. Np. spadek stęŜenia albumin o 10 g/J jest powodem obniŜenia się poziomu wapnia całkowitego o ok. 0,2 mmol/1 (0,8 mg/dl). Zmianę przeciwną obserwuje się w razie wzrostu stęŜenia albumin. Wiązanie wapnia przez białka osocza jest zaleŜne od pH. I tak kwasica zwiększa stęŜenia wapnia zjonizowanego, natomiast zasadowica, zwiększając wiązanie wapnia przez białka osocza, jest przyczyną spadku stęŜenia Ca2+. Spadek stęŜenia Ca2 + jest prawdopodobnie przyczyną wystąpienia zdrętwieli i mrowień u chorych z zespołem hiperwentyJacyjnym, charakteryzującym się zasadowica oddechową. W HOMEOSTAZIE WAPNIOWEJ UCZESTNICZĄ Gł,0WNIE DWA HORMONY Pa rat hormon (PTH) jest polipeptydem jednołańcuchowym złoŜonym z 84 aminokwasów Hormon ten (o masie cząsteczkowej 9500) nie zawiera w swojej strukturze węglowodanów lub innych cząsteczek związanych z nim kowalencyjnie (ryc. 48-1). Pełna aktywność biologiczna związana jest z N-końcowym fragmentem hormonu. N-końcowy fragment, składający się z 34 aminokwasów (PTHj -„), wykazuje pełną aktywność biologiczną. Fragment PTH3;_34 jest głównie odpowiedzialny za wiązanie się z receptorem. PTH powstaje z cząsteczki prekursorowej złoŜonej z U 5 aminokwasów (ryc 48-1). Bezpośrednim prekursorem PTH jest proPTH, róŜ-

niący się od natywnego hormonu obecnością bardzo zasadowego heksapeptydu na N-końcu. Znaczenie czynnościowe tego heksapeptydu jest niejasne. Pierwotnym produktem transkrypcji genu kodującego ten hormon jest preproPTH, będący bezpośrednim prekursorem proPTH. PreproPTH róŜni się od proPTH obecnością dodatkowego łańcucha polipeptyd owego na N-końcu, złoŜonego z 25-aminokwasów. Ten dodatkowy polipeptyd ma charakter hydrofobowy, podobnie jak sekwencje liderowe lub sygnalne innych białek sekrecyjnych. Szczegółową sekwencję aminokwasową preproPTH, prePTH i PTH przedstawiono na ryc. 48-1. Sekwencję zjawisk związanych z przekształceniem preprohormonu PTH do PTH,^ przedstawiono na ryc. 48-2. PreproPTH ulega transferowi do cystern siateczki endoplazmatycznej podczas trwającej jeszcze translacji mRNA (kodującego PTH) na rybosomach. Podczas tego transferu, fragment sygnalny prepropeptydu, złoŜony z 25 aminokwasów, uiega odszczepieniu, dzięki czemu powstaje proPTH, Następnie ten ostatni ulega przemieszczeniu do aparatu Golgiego, gdzie zachodzi enzymatyczne odszczepienie heksapeptydu na N-końcu. W wyniku tej reakcji powstaje ostateczna „dojrzała" cząsteczka PTH. Cząsteczki PTH zlokalizowane w pęcherzykach sekrecyjnych uwalniających się z aparatu Golgiego mogą ulec I) magazynowaniu w puli „zapasowej", 2) degradacji lub 3) wydzielaniu do krwi. Synteza, sekrecja i przemiana PTH są regulowane Regulacja syntezy. Na szybkość syntezy i degradacji proPTH nie ma wpływu stęŜenie Ca2+ w środowisku, pomimo Ŝe synteza i wydzielanie PTH znamiennie wzrastają przy obniŜonych stęŜeniach zjonizowanego wapnia. Rzeczywiście aŜ 80—90% powstaiego w obrębie komórek lub w układach doświadczalnych proPTH nie ulega przekształceniu do PTH. Z powyŜszego faktu naleŜy wnioskować, Ŝe większość powstałego proPTH jest szybko rozkładana. Później wykryto, Ŝe nasilenie degradacji proPTH zmniejsza się przy niskich stęŜeniach Ca2+, natomiast wzrasta, jeśli stęŜenia Ca2 + są wysokie. Sugeruje to, Ŝe zmiany stęŜenia Ca2+ wpływają na syntezę PTH oddziałując na szybkość degradacji proPTH a nie jego syntezę. Nieustająca i stała synteza proPTH (synteza konstytutywna) znajduje swoje odzwierciedlenie w stęŜeniach mRNA kodującego

HORMONY REGULUJĄCE PRZEMIANĘ WAPNIOWĄ / 621 -Sekwencja sygnalna (prei Lysf AlaISer(MB«Met) - NH,

Sekwencja

Ryc. 1,

48-

Sakwencja warunkująca patną aktywność Struktura bydlęcego pre-proPTH. Strzałki wskazują na działania enzymów rozszczepiających hormon w obrębie przytarczyc (strzałki oznaczone jako [1-5]) lub w obrębie (strzałki oznaczone jako [4-5]) po jego wydzielaniu do krwi.

miejsca wątroby Do

Fragment C—końcowy

ValfLeur Ile TLysfAiatLyslPralGIfl - C

OH

fragmentu biologicznie aktywnego (PTH,_M) przyłączona jest sekwencja aminokwasów, nie mająca wpływu na aktywność hormonu i jego wiązanie z receptorem. {Według J. F. Habener: Recent advances in parathyroid hormone research. Clin. Biochem. 1981, 14, 223, w niewielkiej modyfikacji i za zezwofeniem).

PTH, które nie zmieniają się pomimo zaocznych wahań stęŜenia Ca2 + w płynie pozakomórkowym. Wydaje się, Ŝe zwiększenie syntezy PTH jest moŜliwe jedynie poprzez przerost lub rozrost komórek głównych przytarczyc, wytwarzających ten hormon.

Regulacja przemiany PTH. Degradacja PTH rozpoczyna się ok. 20 min po syntezie proPTH i nie ma na nią wpływu stęŜenie Ca2+. Występuje ona po wbudowaniu hormonu do pęcherzyków sekrecyjnych. Nowo powstały PTH moŜe zostać natychmiast wydzielony do krwi lub teŜ zmagazynowany w pęcherzykach sekrecyjnych, a dopiero później wydzielony. Proces rozkładu rozpoczyna się w chwili wejścia

pęcherzyków sekrecyjnych do przedziału (kompartmentu) zapasowego. W wyniku proteolitycznej degradacji powstają swoiste produkty rozpadu (ryc. 48-1, 48-2), we krwi zaś stwierdza się duŜe stęŜenia Ckońcowych fragmentów cząsteczki PTH. Te fragmenty, o masie cząsteczkowej ok. 7000, składają się z odcinka PTH37.S4 i w mniejszym stopniu odcinka PTH34.N4 łańcucha polipeptydowego tego hormonu. Większość nowo powstałego PTH ulega rozkładowi. Na 2 mole wydzielonych C-końcowych fragmentów przypada 1 mol natywnego PTH. Tak więc większość krąŜącego we krwi PTH składa sie z fragmentów C-końcowych. Dotychczas nie stwier-

622 / ROZDZIAŁ 48 Pre (31)

PTH 84

16) 1

Siateczka sródplazmatyczna szorstka komórek głównych przytarczyc

Synteza stalą

LSS 84

(6)

Aparat Gol g lego komórek głównych przytarozyc

1

1 84

1

1

11

84 1

Paeksztatcante

MafeeteŜ.Ca"* + r DuŜeatęz.Ca^ ł Ziarnistości sekrecyjne Upakoutywa nie" -I-Ł komórek głównych przytarczye Degradacja [komórki Kupftera w wątrobie) CAMP Małe 2 etę; Ca

36 37 •Fragmenty krąŜące we krwi

Wydzielanie

Ryc. 48-2. Prekursory i produkty rozpadu PTH oraz umiejscowienie tych procesów w przytarczycach i w wątrobie. Liczby podane w nawiasie wskazują ilość aminokwasów tworzących fragment pre(31) i pro(6). ____________________________________

dzono Ŝadnych efektów biologicznych induko wanych tymi fragmentami. Wydaje się, Ŝe wy dłuŜają one okres półtrwania PTH w krąŜeniu. W przytarczycach stwierdzono występowanie licznych enzymów proteolitycznych, w tym ró wnieŜ katepsyny B i D. Katepsyna B rozkłada cząsteczkę PTH na dwa fragmenty, tj. PTH1_36 i PTH37_S4. Fragment PTH37_84 nie ulega dal dji f f

37S4

3784

szej degradacji, natoiflfast fragment j^ ulega szybkiemu rozpadowi do di- i tripeptydów. We krwi krąŜącej nigdy nie stwierdzono obecności proPTH, natomiast stwierdzono małe (jeśli w ogóle) ilości PTH,.^ uwolnione z przytarczyc do krwi. Identyfikację preproPTH przeprowadzono drogą rozszyfrowania sekwencji genu kodującego syntezę PTH. Większość rozkładu proteolitycznego PTH odbywa się w samych komórkach przytarczycowych. W licznych badaniach wykazano jednak, Ŝe raz wydzielony do krwi PTH ulega rozkładowi proteolitycznemu w licznych tkankach. Dotychczas nie określono ilościowego udziału poszczególnych tkanek pozaprzytarczycowych w procesie proteolitycznego rozkładu PTH. Nie jest równieŜ jasne, czy enzymy proteolityczne, rozkładające PTH w samych przytarczycach są

identyczne z proteazami tkanek pozaprzytarczycowych, rozkładającymi ten hormon, oraz czy sposób degradacji oraz fragmenty rozpadu PTH w tych tkankach są identyczne z występującymi w przytarczycach. W przemianie wydzielonego przez przytarczyce PTH uczestniczą takie narządy, jak wątroba i nerki. Po hepatektomii we krwi krąŜącej nie stwierdzono fragmentów PTH34.Mi PTH37.144 co sugeruje, Ŝe wątroba jest głównym miejscem ich powstawania. Rola nerek moŜe polegać na usuwaniu tych fragmentów z ustroju. Głównym miejscem proteoJizy PTH na obwodzie (poza przytarczycami) są komórki Kupffera, przylegające do śródzatokowych dróg wątroby. Endopeptydaza, zapoczątkowująca rozpad PTH na fragmenty N- i C-końcowe umiejscowiona jest na powierzchni tych komórek (podobnych do makrofagów), będącej w stałym kontakcie z osoczem krwi. Enzym ten, będący równieŜ katepsyna B, rozszczepia łańcuch polipeptydowy PTH między resztą aminokwasową w pozycji 36 i 37. Podobnie jak w przytarczycach, fragment C-końcowy dostaje się do krwi krąŜącej, natomiast fragment N-końcowy ulega szybkiej dalszej degradacji.

HORMONY REGULUJĄCE PRZEMIANĘ WAPNIOWĄ / 623

Regulacja sekrecji. Istnieje odwrotna zaleŜność miedzy wydzielaniem czy stęŜeniem PTH a stęŜeniem wapnia zjonizowanego i magnezu w surowicy krwi. StęŜenie PTH w surowicy obniŜa się liniowo w miarę wzrostu kalcemii od 1 mmol/1 (4 mg/dl) do 2,62 mmol/1 (10,5 mg/dl). Obecność biologicznie aktywnego PTH w surowicy krwi u chorych z kalcemią 3=2,62 mmol/1 (10,5 mg/dl) wskazuje na obecność nadczynności przytarczyc.

Istnieje liniowa zaleŜność między ilością uwalnianego PTH a stęŜeniem cAMP w komórkach przytarczyc. W procesie tym najpewniej uczestniczą, jony Ca2ł~, za czym przemawia występowanie odwrotnej zaleŜności między śródkomórkowym stęŜeniem wapnia i cAMP. Udział Ca2+, w tym procesie moŜe polegać na znanym oddziaływaniu tego jonu na tbsfodiesterazę (w którym pośredniczy kinaza białek zaleŜna od Ca:+ kalmoduliny) lub na hamowaniu kinazy adenylanowej. Fosforany nie wykazują Ŝadnego bezpośredniego wpływu na wydzielanie PTH. Przytarczyce mają względnie niewielkie ilości ziarnistości zapasowych zawierających PTH. Wystarczają one do podtrzymania maksymalnego wydzielania tego hormonu zaledwie przez 1,5 godziny. Cecha ta odróŜnia przytarczyce od wysp Langerhansa trzustki, zawierających zapasy insuliny wystarczające na kilka dni, oraz od tarczycy, której zapasy hormonów wystarczają na kilka tygodni. Dlatego teŜ PTH musi być nieustannie syntetyzowany i wydzielany. W mechanizmie działania PTH uczestniczy receptor błonowy PTH wiąŜe się z białkowym receptorem błonowym o masie cząsteczkowej 70 000. Receptor ten, występujący w komórkach kości, wydaje się być identyczny z receptorem obecnym w nerkach. Nie stwierdzono obecności tego receptora w komórkach nieefektorowych (nietarczowych) dla tego hormonu. Interakcja hormonu z receptorem uruchamia następującą typową reakcję kaskadową; aktywacja cyklazy adenylanowej — wzrost stęŜenia śródkomórkowego cAMP-*wzrost stęŜenia śródkomórkowego wapnia -» fosforylacja swoistych białek śródkomórkowych przez kinazy -> aktywacja śródkomórkowych enzymów lub białek, będących końcowymi pośrednikami efektów biologicznych hormonu. Zespół reakcji indukowanych PTH, podobnie jak licznymi innymi hormonami peptydowymi lub białkowymi, jest przyczyną wy-

stąpienia zjawiska zmniejszenia liczby recepto-

rów (down regulation of receptor number) będącego przyczyną spadku wraŜliwości komórek

tarczowych na ten hormon. W mechanizmie tym mogą uczestniczyć procesy toczące się z udziałem cAMP w podanej wyŜej kaskadzie. Główne znaczenie biologiczne PTH polega na udziale tego hormonu w homeostazie wapniowej Główną rolę PTH w homeostazie wapniowej podkreśla obserwacja, Ŝe hormon ten pojawił się dopiero u zwierząt morskich próbujących dostosować się do Ŝycia w warunkach lądowych. Utrzymywanie się bilansu wapniowego w granicach fizjologicznych zaleŜy od długotrwałych skutków działania PTH na wchłanianie jelitowe wapnia za'pośrednictwem kalcytriolu. JeŜeli w wyniku dłuŜszego niedoboru wapnia w poŜywieniu wchłanianie Ca2+ w jelitach jest niedostateczne, wówczas zostaje uruchomiony złoŜony mechanizm regulacyjny, w którym uczestniczy równieŜ PTH. PTH przywraca normalne stęŜenie wapnia w płynie pozakomórkowym działając bezpośrednio na kości i nerki oraz pośrednio równieŜ na błonę śluzową jelit (PTH pobudzając syntezę kalcytriok w nerkach pobudza wchłanianie Ca w jelitach). PTH 1) nasila rozpuszczanie kości (osteolizę), oddziaływując zarówno na jej część organiczną, jak i nieorganiczną, przy czym uwolnione Ca2+ dostają się do przestrzeni wodnej pozakomórkowej, 2) zmniejsza wydalanie wapnia przez nerki, czyli klirens nerkowy tego jonu, przez co wzrasta stęŜenie wapnia w płynie pozakomórkowym oraz 3) nasila skuteczność wchłaniania wapnia przez jelita, pobudzając syntezę kalcytriolu w nerkach. Działanie PTH na nerki występuje najszybciej, lecz skutek biologiczny tego hormonu jest największy w kościach. PTH zapobiega więc wystąpieniu hipokalcemii w razie niedoboru tego jonu w pokarmach, jednak kosztem zuboŜenia masy kostnej. PTH wpływa równieŜ na homeostazę fosforanową Anionem wiąŜącym się z kationem wapnia jest zwykle anion fosforanowy, za czym przemawia fakt, Ŝe kryształki hydroksyapatytu, występujące w kościach składają się z fosforanu wapnia. W razie występowania osteolizy indukowanej przez PTH, wraz z wapniem uwalniają się równieŜ fosforany. PTH zwiększa równieŜ nerkowy klirens fosforanów. Działanie

624 / ROZDZIAŁ 48

netto PTH na kości wyraŜa się więc wzrostem stęŜenia wapnia, natomiast spadkiem stęŜenia fosforanów w płynie poza komórkowym. Dzięki takiemu działaniu PTH nie dochodzi, co jest waŜne, do przesycenia osocza w wapń i fosforany.

Patofizjologia Niedobór PTH jest przyczyną niedoczy nności przytarczyc. Głównymi markerami tego stanu chorobowego są spadek stęŜenia wapnia zjonizowanego oraz wzrost stęŜenia fosforanów nieorganicznych w surowicy krwi. Wśród objawów chorobowych naleŜy wymienić nadwraŜliwość nerwowo-mięśniową wyraŜającą się skurczami spastycznymi mięśni lub tęŜyczką. CięŜka i nagle występująca hipokalcemia (hipokalcemia ostra) moŜe być przyczyną: poraŜenia mięśni oddechowych z powodu kurczu tęŜcowego, kurczu głośni (laryngospasmus), cięŜkich drgawek a nawet śmierci. Przewlekła hipokalcemia jest przyczyną zmian skórnych, zaćmy oraz zwapnień jąder podstawy mózgu. Niedoczynność przytarczyc jest zwykle spowodowana niezamierzonym chirurgicznym usunięciem przytarczyc (w czasie strumektomii) lub uszkodzeniem tych gruczołów w czasie zabiegu chirurgicznego na szyi (wówczas mówimy o wtórnej niedoczynności przytarczyc). Czasami jest ona wynikiem uszkodzenia tych gruczołów przez proces autoimmunologiczny (wówczas mówimy o

pierwotnej niedoczynności przytarczyc). Rzekoma niedoczynność przytarczyc (pseudo-

hypoparathyreoidismuś) została omówiona w rozdz. 45. To dziedziczne zaburzenie charakteryzuje się syntezą prawidłowego PTH, natomiast opornością narządów docelowych na działanie tego hormonu. Skutki biochemiczne tego zaburzenia są identyczne z występującymi w klasycznej niedoczynności tarczycy. Chorobie towarzyszą zwykle róŜne nieprawidłowości rozwojowe takie jak niski wzrost, skrócenie kości śródręcza i śródstopia oraz niedorozwój umysłowy. Istnieje kilka postaci rzekomej niedoczynności przytarczyc spowodowanych: 1) niedoborem białka regulatorowego Gs cyklazy adenylanowej i 2) defektem biochemicznym na etapie działania PTH, połoŜonym za cAMP. Nadczynność przytarczyc (hyperparathyreoidismus) charakteryzuje się nadmierną produkcją PTH najczęściej przez gruczolak przytarczyc. Przyczyną tego stanu chorobowego moŜe być równieŜ rozrost (hyperplasia) przytarczyc, lub teŜ ektopowe wytwarzanie PTH przez nowo-

twór złośliwy. Głównymi objawami biochemicznymi nadczynności przytarczyc są podwyŜszone stęŜenie wapnia zjonizowanego i PTH oraz obniŜone stęŜenie fosforanów nieorganicznych w surowicy krwi. Długotrwająca (przewlekła) nadczynność przytarczyc charakteryzuje się rozległą resorpcją kości oraz róŜnymi zaburzeniami ze strony nerek, takimi jak kamica nerkowa i zwapnienie nerek, częste, nawrotowe stany zapalne dróg moczowych oraz (w cięŜkich przypadkach) niewydolność nerek. Wtórna nadczynność* przytarczyc {hyperpara-

thyreoidismus secundarius) charakteryzuje się rozrostem (hiperplazją) przytarczyc i zwiększoną sekrecją PTH. MoŜe ona występować u chorych z postępującą niewydolnością nerek, U takich chorych wtórna nadczynność przytarczyc spowodowana jest przypuszczalnie upośledzoną konwersją 25-OH-D3 do l,25(OH)rD3przez uszkodzony miąŜsz nerkowy. W wyniku niedoboru 1,25(OH)2-D3 dochodzi do niedostatecznego wchłaniania wapnia z przewodu pokarmowego, co w konsekwencji jest przyczyną wtórnej nadczynności przytarczyc. Ta ostatnia jest mechanizmem kompensacyjnym, mającym na celu utrzymywanie stęŜenia wapnia w płynie pozakomórkowym w granicach prawidłowych.

KALCYTRIOL (1,26(OH)2-D,) DZIAŁA NA KILKU POZIOMACH HOMEOSTAZY WAPNIOWEJ Rys historyczny. Krzywica, będąca chorobą dziecięcą, charakteryzującą się niedostateczną mineralizacją oraz okaleczającymi deformacjami kości, występowała epidemicznie w Ameryce Północnej i Europie Zachodniej jeszcze na początku bieŜącego stulecia. Wyniki wielu badań wskazywały na to, Ŝe choroba ta spowodowana jest niedoborem jakiegoś składnika w poŜywieniu. Po odkryciu, Ŝe powstawaniu krzywicy moŜna zapobiec przez zaŜywanie tranu, otrzymywanego z wątroby dorsza, oraz po wykazaniu, Ŝe aktywnym składnikiem w tym tranie nie jest witamina A, aktywny czynnik (występujący w tym tranie), zapobiegający powstawaniu krzywicy, określono jako witamina D. Prawie w tym samym czasie wykazano, Ŝe powstawaniu choroby moŜna zapobiec przez naświetlanie skóry promieniami ultrafioletowymi — sztucznymi lub słonecznymi. Następnie wykazano, Ŝe u dorosłych występuje odpowied-

HORMONY REGULUJĄCE PRZEMIANĘ WAPNIOWĄ / 625

nik krzywicy, określany jako ostcomalacja. charakteryzujący się upośledzoną mineralizacją kości oraz reagujący równieŜ na podawanie witaminy D. Punktami wyjścia dla kolejnych postępów w tej dziedzinie była obserwacja, Ŝe chorzy z chorobami wątroby i nerek nie reagują w sposób normalny na podawanie witaminy D. Badania nad struktura, i funkcją witaminy D w ciągu ostatnich 50 lat nabrały duŜego rozmachu, szczególnie w ostatnich kilku latach.

Główna rola biologiczna kalcytriolu polega na pobudzaniu wchłaniania wapnia i fosforanów w przewodzie pokarmowym Kalcytriol jest jedynym hormonem pobudzającym transport wapnia ze światła przewodu

pokarmowego przez warstwę nabłonka jelitowego wbrew występującemu gradientowi stęŜenia Ca2+. PoniewaŜ synteza kalcy triołu podlega określonym regulacjom (ryc. 48-3), konieczny jest subtelny mechanizm kontroli stęŜenia Ca2+ w piynie pozakomorkowym, działający w warunkach znacznych wahań zawartości wapnia w poŜywieniu. Mechanizm ten zapewnia utrzymywanie stęŜenia wapnia i fosforanów na poziomie potrzebnym do tworzenia się kryształków hydroksyapatytu na włóknach kolagenowych kości. W stanach niedoboru witaminy D (ściśle mówiąc niedoboru kalcytriolu) nowotworzenie kości ulega zwolnieniu, zaś proces remodelacji kości jest zaburzony. Procesy te są regulowane głównie przez PTH, działający na komórki kostne, chociaŜ dla prawidłowego ich

Światło słoneczne

7-Dehydrocholealerol -

•*• Witamina D!

-»■ Prowltamlna D,-

25- Hydroksylazs Inne

WĄTROBA

metaóol.ty

1,24,25(OH)3-D3

--------- 25-Hydroksyoriolekalcyterol (2SOH-D3)

HO"' 7- Dehyd rochoiesiercl

Witamina D,

1,25(OH},-D3(kalcytrio!)

Ryc. 48-3. Powstawanie i hydroksylacja witaminy D. Proces 25-hydroksylacji odbywa się w wątrobie, zaś dalsze hydroksylacje w nerkach. W nerkach powstaje zarówno 24,25(OH)a-D3, jak i 1,25 (0H)±-D3. Na rycinie pokazano równieŜ strukturę 7-dehydrocholesteroiu, witaminy D^i 1,25 (OH)2~D3 (kalcytriolu). (Według Ganong W. F,: fteview of Medical Physiology. Wyd. 4 Appleton and Lange, 1989, za zezwoleniem). 40 -- Biochemia

626 / ROZDZIAŁ 48

przebiegu potrzebne są małe stęŜenia kalcytriolu. Kalcytriol nasila równieŜ działanie PTH w nerkach, tj. wchłanianie zwrotne wapnia w kanalikach nerkowych. W syntezie i przemianie kalcytriolu uczestniczy kilka tkanek. Procesy te są ściśle regulowane Biosynteza. Kalcytriol wykazuje wszelkie cechy hormonu. Jest on produktem serii reakcji enzymatycznych, wymagających transportu cząsteczek prekursorowych do kilku róŜnych tkanek (ryc. 48-3). Aktywna cząsteczka kalcytriolu jest transportowana do innych narządów, gdzie uczynnią procesy biologiczne w sposób podobny jak inne hormony steroidowe. Skóra. W pokarmach (tran rybi, Ŝółtko jaj) zawarte są niewielkie ilości witaminy D, Większość witaminy D, która jest wykorzys tana do syntezy kalcytriolu, wytwarzana jest z 7-dehydrocholesterolu w komórkach Malpighiego.skóry. Jest ona wprost proporcjonalna do intensywności promieniowania ultrafioletowe go i odwrotnie proporcjonalna do stopnia pigmentacji skóry. W miarę starzenia się zawar tości 7-dehydrocholesterolu w naskórku zmnie jsza się, co wydaje się być przyczyną ujemnego bilansu wapniowego w starszym wieku. Wątroba. Swoiste białko przenośniko we, określone jako białko wiąŜące witaminę D (D-binding protein), wiąŜe witaminę D3 i jej metabolity, przenosząc je ze skóry i jelit do wątroby, gdzie ulegają 25-hydroksylacji, tj. pie rwszej niezbędnej reakcji syntezy kalcytriolu. 25-hydroksylacja odbywa sie w siateczce endoplazmatycznej. W reakcji tej potrzebny jest magnez, NADPH, tlen cząsteczkowy oraz bliŜej nie scharakteryzowany czynnik cytoplazmatyczny. W reakcji tej uczestniczą reduktaza cytochromu P-450 zaleŜna od NADPH oraz cytochrom P-450. Reakcja ta nie podlega regulacji 1 odbywa się w mniejszym nasileniu równieŜ w nerkach i jelicie cienkim. Następnie 25-OH-D3 dostaje się do krąŜenia, gdzie jest glówym metabolitem witaminy występującym w osoczu. Po związaniu się z białkiem wiąŜącym witaminę D, 25-OH-Dj transportowany jest do nerek. Nerki. 25-OH-D3 jest słabym agonistą kalcytriolu. Dla pełnej aktywności 25-OH-D3 niezbędna jest jego hydroksylacja przy węglu C[. Zachodzi ona w mitochondriach komórek proksymalnego kanalika krępego przy udziale trzyskładnikowej reakcji monooksygenazowej wymagającej obecności NADPH, Mg2+, tlenu

cząsteczkowego i przynajmniej trzech enzymów tj.: 1) nerkowej reduktazy ferredoksynowej będącej flawoproteiną, 2) nerkowej ferredoksyny (będącej białkiem Ŝelazo siarkowym) oraz 3) cytochromu P-450, Ten układ wytwarza l,25(OH)rD3, który jest najbardziej aktywnym naturalnym metabolitem witaminy D. 4. Inne tkanki. ŁoŜysko zawiera la-hydroksylazę i dlatego moŜe być waŜnym Źródłem kalcytriolu pochodzenia pozanerkowego. Podobną aktywność enzymatyczną stwierdzono w wielu róŜnych tkankach, w tym równieŜ w kościach. Znaczenie fizjologiczne poza nerkowej biosyntezy kalcytriolu wydaje się być niewielkie, skoro u niecięŜarnych i pozbawionych nerek zwierząt w surowicy stwierdza się niewielkie ilości tego hormonu.

Regulacja syntezy i przemiany. Podobnie jak w przypadku innych hormonów synteza kalcytriolu regulowana jest mechanizmami opartymi na sprzęŜeniu zwrotnym (ryc. 48-3, tab. 48-1). U zwierząt normalnych podawanie diety Tabela 48-1. Regulacja aktywności 1a-hydi>oksylazy Główne czynniki regulujące

Drugorzedowe czynniki regulujące

Hipokalcemia

(|)

PTH

(1)

Estrogeny Androgeny Progesteron Insulina Hormon wzrostu Pro 1 akty na Hormony tarczycy

Hipofosfatemia (f) Kalcytriol (J

ubogo wapni owej oraz hipokalcemia wybitnie wzmagają aktywność lct-hydroksylazy. Zjawisko to wymaga obecności PTH, wydzielanie którego wzrasta pod wpływem hipokalcemii. Mechanizm działania PTH w tym zakresie nie został dotychczas wyjaśniony. Wiadomo tylko, Ŝe hormon ten zwiększa aktywność lot-hydroksylazy zarówno u zwierząt z niedoborem witaminy D, jak i u zwierząt leczonych tą witaminą. Podawanie diety ubogofosforowej oraz hipofosfatemia równieŜ pobudzają aktywność la-hydroksylazy, chociaŜ wymienione czynniki są słabszymi bodźcami od hipokalcemii. Sam kalcytriol jest waŜnym regulatorem własnej syntezy. DuŜe stęŜenia kalcytriolu hamują nerkową la-hydroksylazę, natomiast pobudzają 24-hydroksylazę katalizującą powstawanie

HORMONY REGULUJĄCE PRZEMIANĘ WAPNIOWĄ / 627

24,25(OH)rD3, tj. pozornie nieaktywnego produktu ubocznego. Estrogeny, progestyny i androgeny znacznie zwiększają aktywność la-hydroksylazy u ptaków w okresie nośności. Niejasna jest rola wymienionych hormonów, podobnie jak i insuliny, hormonu wzrostu i prolaktyny, w regulacji biosyntezy kalcytriolu u ssaków. Podstawowa struktura cząsteczki sterolowej moŜe zostać zmodyfikowana alternatywnymi szlakami metabolicznymi, tj. przez hydroksylację w pozycji 1,23,24,25 i 26 oraz powstawanie licznych laktonów. Zidentyfikowano dotychczas przeszło 20 metabolitów, lecz nie udowodniono, aby którykolwiek wykazywał aktywność biologiczną. Kalcytriol działa na poziomie komórkowym w podobny sposób jak inne hormony steroidowe UŜywając radioaktywnego kalcytriolu wykazano jego występowanie w jądrach komórkowych komórek kosmków i krypt jelitowych,. osteoblastów i komórek dystalnego kanalika nerkowego. Ponadto stwierdzono nagromadzanie się tego hormonu w jądrach komórkowych komórek, pierwotnie nie uwaŜanych za komórki docelowe dla tego hormonu. Wśród nich naleŜy wymienić komórki warstwy Malpighiego skóry, komórki wysp trzustkowych, niektóre komórki mózgu, przysadki mózgowej, jajników, gonady męskiej, łoŜyska, macicy, gruczołu sutkowego i grasicy oraz komórki prekursorowe układu białokrwinkowego. Kalcytriol wiąŜe się równieŜ z komórkami przytarczyc, co sugeruje, Ŝe moŜe on uczestniczyć w przemianie PTH.

Receptor kalcytriolowy. Receptor kalcytriolowy naleŜy do rodziny receptorów steroidowych (patrz ryc, 49-7), Domena tego receptora wiąŜąca kalcytriol wykazuje wysokie powinowactwo i małą wydajność. Wiązanie kalcytriolu przez receptor osiąga stan wysycenia, wysycanie jest swoiste i odwracalne. Receptor wykazuje motyw „palca cynkowego" podobny do innych receptorów steroidowych. wiąŜących się z odpowiednią domeną DNA jądrowego.

Produkty genowe zaleŜne od kalcytriolu. Od kilku lat wiadomo, Ŝe odpowiedź jelit na kalcytriol związana jest z syntezą RNA i białka. Obserwacja, Ŝe receptor kalcytriolowy wiąŜe się z chromatyną jądrową, sugeruje, Ŝe kalcytriol pobudza transkrypcję genową oraz powstawanie swoistego mRNA. Potwierdza to

praca, w której doniesiono o indukcji przez kalcytriol mRNA kodującego białko wiąŜące wapń (CBP — calcium binding protein). W cytoplazmie występuje kilka białek wykazujących duŜe powinowactwo do Ca2+. Jedna grupa tych białek jest zaleŜna od kalcytriolu i obejmuje białka o róŜnej masie cząsteczkowej, antygenowości i umiejscowieniu tkankowym (jelito, skóra, kości). Najlepiej przebadano CBP pochodzenia jelitowego. Nie wykazano obecności CBP w jelitach szczurów z niedoborem witaminy D. Ponadto stwierdzono, Ŝe stęŜenie CBP jest zaleŜne od ilości kalcytriolu związanego z jądrem.

Wpływ kalcytriolu na błonę śluzową

jelita. Transfer jonów Ca2+ lub PO43~ przez błonę śluzową jelita obejmuje następujące etapy: 1) wychwyt tych jonów przez rąbek szczoteczkowy i błonę mikrokosmków, 2) transport przez błonę plazmatyczną komórek błony śluzowej oraz 3) wypływ przez błonę podstawnoboczną do płynu pozakomorkowego. Jest pewne, Ŝe kalcytriol wpływa pobudzająco na jeden lub nawet kilka z wymienionych etapów, chociaŜ dokładny mechanizm jego działania nie został jeszcze poznany. UwaŜano, Ŝe w wymienionych procesach aktywnie uczestniczy CBP, dopóty nie wykazano, Ŝe translokacja jonów Ca2+ zachodzi w ciągu 1 - 2 godzin po podaniu kalcytriolu, tj. znacznie wcześniej niŜ wzrasta stęŜenie CBP. Wydaje się, Ŝe CBP, wiąŜąc Ca2+, chroni komórki błony śluzowej przed nadmiernym napływem tych jonów. Wielu badaczy zajmuje się poszukiwaniem innych białek uczestniczących w transporcie jonów Ca2+, podczas gdy inni sądzą, Ŝe w procesie transferu tego jonu, przynajmniej w pierwszej fazie wzrostu napływu Ca2+, uczestniczą zmiany błonowe. W procesie tym mają uczestniczyć metabolity polifosfoinozytydów. Patofizjologia. Krzywica występująca w dzieciństwie charakteryzuje się występowaniem niskich stęŜeń wapnia i fosforu w osoczu krwi, ubogą mineralizacją kości oraz zniekształceniami szkieletu kostnego. Jest ona najczęściej spowodowana niedoborem witaminy D. WyróŜnia się dwie postacie krzywicy zaleŜnej od witaminy D. Typ I jest defektem genetycznym dziedziczącym się recesywnie chromosomem autosomalnym i charakteryzuje się upośledzoną konwersją 25-OH-D3 do kalcytriolu. Typ II jest defektem dziedziczącym się recesywnie genem autosomalnym i charakteryzuje się pojedynczą zamianą aminokwasową w obrębie sekwencji

628 / ROZDZIAŁ 48

jednej domeny „palca cynkowego" receptora, wiąŜącej się z odpowiednią sekwencją DNA, W wyniku takiej zamiany receptor jest nieczynny. Niedobór witaminy D u dorosłych jest przyczyną osteomalacji. Charakteryzuje się ona obniŜonym wchłanianiem wapnia i fosforu w jelitach oraz matym stęŜeniem tych jonów w płynie pozakomórkowym. W konsekwencji tych zmian mineralizacja osteoidu jest upośledzona, sprawiając, Ŝe kości wykazują zmniejszoną twardość. Przy znacznym zaniku lub uszkodzeniu miąŜszu nerkowego produkcja kalcytriolu jest obniŜona, co w konsekwencji jest przyczyną zmniejszonego wchłaniania wapnia z przewodu pokarmowego i wystąpienia hipokalcemii. Ta ostatnia jest pTzyczyną wzrostu sekrecji PTH, będącego wyrazem mechanizmu kompensacyjnego zwiększającego stęŜenie Ca2+ w płynie pozakomórkowym (jako następstwo działania osteolitycznego PTH). Wzrost obrotu kostnego oraz zmiany strukturalne kości występujące u takich chorych znane są pod pojęciem osteodystrofii nerkowej. Wczesne leczenie witaminą D moŜe zahamować ten proces.

ROLA KALCYTONINY (CT) W HOMEOSTAZIE WAPNIOWEJ U CZŁOWIEKA NIE JEST JASNA CT jest polipeptydem zawierającym 32 aminokwasy, wytwarzanym przez komórki C, głównie tarczycy (rzadziej przytarczyc i grasicy)

oraz przez podobne komórki umiejscowione w gruczole skrzelopochodnym (głandula uhimobranchialiś) innych gatunków. Komórki te wywodzą się z grzebienia nerwowego (crista neuralis) i wykazują biochemiczne podobieństwo do komórek występujących w wielu róŜnych gruczołach wydzielania wewnętrznego. Cała cząsteczka, włącznie z pcllą 7-aminokwasową na N-końcu utworzoną przez mostek Cys-Cys, jest niezbędna dla wystąpienia pełnej aktywności biologicznej. Między CT poszczególnych gatunków istnieją znaczne róŜnice w sekwencji aminokwasowej (np, ludzka i świńska CT mają tylko 14 wspólnych aminokwasów na łączną liczbę 32), Pomimo tego CT jednego gatunku jest czynna u innych gatunków i odwrotnie. Najsilniej działająca CT została wyizolowana z łososia. Historia CT jest wyjątkowa. W ciągu 7 lat (1962—1968) CT została wykryta, wyizolowana, poznano jej sekwencję aminokwasową oraz dokonano jej syntezy. Pomimo tego jej rola fizjologiczna u człowieka nie jest pewna.

PIŚMIENNICTWO De Luca HF, Schnoes HK: Vitamin D: Recent advances. Anmt Rev Biochem 1983;52:411. Norman AW, Roth J, Orci L: The vitamin D endocrine system: Steroid metaboUsm, hormone receptors, and biological rcsponsc (calcium binding). Endocr Rev 1982;3:331. Potts JT Jr, Kronenberg HM, Rosenblatt M: Parathyroid hormone: Chemistry, biosynthcsis and modę of action. Ad\ Protein Chem 1982;35:323.

Hormony kory nadnerczy

49

Dary! K. Ganner, MD

WPROWADZENIE Kora nadnerczy wytwarza kilkadziesiąt róŜnych związków steroid owych, z których zaledwie kilka wykazuje aktywność biologiczną. MoŜna je zaszeregować do trzech grup: glukokortykoidów, mineralokortykoidów i androgenów. Działanie tych hormonów rozpoczyna się od wiązania swoistego receptora śródkomórkowego, po czym powstały kompleks hormon-receptor wiąŜe się ze swoistymi fragmentami DNA indukując ekspresję genową. Ta ostatnia wyraŜa się syntezą małej liczby białek, które z kolei wpływają na róŜne procesy metaboliczne, np. glukoneogenezę i równowagę sodową i potasową. m

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Hormony kory nadnerczy, w tym szczególnie glukokortykoidy, stanowią istotne ogniwo Skróty uŜywane w tym rozdziale ACTH ADH CBG

— hormon kortykotropowy, kortykou opina — hormon antydiuretyczny, wazopresyna — globulina wiąŜąca kortykosteroidy

CRH

— hormon uwalniający kortykotropinę, kortykoliberyna DHEA — dehydroepiandrosteron OOC — deoksykortykosteron GH —■ hormon wzrostu, somatotropina 3|-OHSD — dehydrogenaza 3P-hydroksysteroid owa PEPCK — karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa POMC — pro-opiomelanokortyna PTH — parat hormon TBG — globulina wiąŜąca hormony tarczycy

w procesie przystosowywania do silnego stresu, Mineralokortykoidy są potrzebne do utrzymania normalnej równowagi sodowej i potasowej. W medycynie znalazły zastosowanie syntetyczne analogi obu klas ke^rtykoidów. Szczególnie liczne analogi glukokortykoidów wykazują silne działanie przeciwzapalne. Nadmiernie duŜe lub małe stęŜenia któregokolwiek hormonu wymienionych klas są przyczyną powaŜnych powikłań, czasami groźnych dla Ŝycia. Dzięki badaniu wrodzonych zaburzeń enzymatycznych, moŜna było poznać poszczególne etapy steroidogenezy i dało to moŜliwość poznania sprawności sekrecyjnej kory nadnerczy w odniesieniu do poszczególnych hormonów.

KORA NADNERCZY WYTWARZA 3 KLASY HORMONÓW W obrębie kory nadnerczy osoby dorosłej wyróŜnia się 3 oddzielne warstwy. Warstwę podtorebkową określa się jako warstwę kłębkowatą (Ŝona głomerulosa). Wytwarza ona minera lokortyk o steroidy. Pod nią znajduje się warstwa pasmowata fzona fascicularis), która wraz z warstwą siatkowatą (Ŝona reticularis), wytwarza glukokortykoidy i androgeny. 2 kory nadnerczy wyizolowano i wykrystalizowano około 50 steroidów. Większość z nich jest związkami pośrednimi w steroidogenezie. Tylko niewiele steroidów nadnerczy wydzielanych jest w duŜych ilościach i wykazuje znamienną aktywność biologiczną. Kora nadnerczy wytwarza trzy klasy hormonów steroidowych, przy czym u podstawy takiej klasyfikacji leŜy głównie ich działanie biologiczne. Granice między tymi klasami hormonów nie są ostre, skoro hormony jednej klasy mogą wykazywać równieŜ działanie hormonów pozostałych klas. I tak wszystkie naturalne glukokortykoidy wykazują równieŜ działanie mineralo-

630 / ROZDZIAŁ 49

kortykoidowe i odwrotnie. Ten fakt stał się zrozumiały w chwili wykrycia, faktu powszechnego występowania ..elementów odpowiedzi hormonalnej'1 pośredniczących w działaniu tych hormonów (i progestynów) na poziomie genów (tab. 45-3). Glukokortykoidy są 2l-węglowymi steroidami wykazującymi liczne efekty biologiczne, wśród których najwaŜniejszy jest stymulujący wpływ na glukoneogenezę. Kortyzol jest najwaŜniejszym glukokortykoidem u człowieka i wytwarzany jest w warstwie pasmowatej kory nadnerczy. Kurtykostcron syntetyzowany zarówno w warstwie pasmowatej jak i kłębkowatej, jest głównym glukokortykoidem u gryzoni, natomiast u ludzi występuje w mniejszych ilościach. Mineralokortykoidy są równieŜ 2l-węglowymi steroidami. Główne ich działanie polega na stymulacji retencji sodu i wydzielaniu K^ i H+, szczególnie w nerkach. Aldosteron jest silniej działającym hormonem tej klasy hormonów. Wytwarzany jest wyłącznie w warstwie kłębkowatej kory nadnerczy. W warstwie pasmowatej i siatkowatej kory nadnerczy wytwarzany jest w duŜych ilościach prekursor androgenów — dehydroepiandrosteron oraz słaby androgen — androstendion. Te steroidy ulegają przekształceniu do silniej działających androgenów w tkankach pozanadnerczowych i mogą być przyczyną stanów chorobowych u osób z niedoborem niektórych enzymów uczestniczących w steroidogenezie. W normalnych nadnerczach powstają tylko niewielkie ilości estrogenów. W niektórych ro dzajach raków nadnerczy synteza ich moŜe wzrastać. ^, Audrogeny pochodzenia nadnerczowego są waŜnymi prekursorami estrogenów (powstają-

cych prze2 aromatyzację androgenów w tkankach obwodowych) u kobiet w okresie pomenopauzalnym.

SWOISTE NAZEWNICTWO OKREŚLA STRUKTURĘ CHEMICZNĄ STEROIDÓW Wspólną cechą wszystkich steroidów jest struktura 17-węglowego cykl open tan operhydrofenantrenu, złoŜona z 4 pierścieni oznaczonych literami A, B, C i D (ryc. 49-1). Dodatkowe atomy węgla mogą być dołączone w pozycjach 10 i 13 lub w pozycji CJ7 w postaci łańcucha bocznego. Hormony steroidowe oraz ich prekursory i metabolity róŜnią się liczbą i rodzajem podstawionych grup, liczbą i umiejscowieniem podwójnych wiązań oraz konfiguracją stereochemiczną. Zaproponowano bardzo precyzyjne nazewnictwo dla tych chemicznych struktur. Asymetryczne atomy węgla (na ryc. 49-1 są one zacienione) warunkują występowanie stereoizomerti. Kątowe grupy metylowe (C19 i Clg) przyłączone do węgli C10 i CtJ zwrócone są do przodu układu pierścieniowego i stanowią punkt odniesienia. Podstawniki leŜące w tej samej płaszczyźnie co C19 i C18 oznacza się przedrostkami cis lub p i zaznacza się na rycinach ciągłą linią. Podstawniki leŜące za płaszczyzną układu pierścieniowego określa się przedrostkami trans lub a i rysuje się linią przerywaną. Wiązania podwójne zaznacza się trójkątami z podaniem numeru pierwszego węgla, od którego ono się zaczyna (np. A3—A4 oznacza podwójne wiązanie między atomami węgla Cj i C4). Hormony steroidowe posiadające jedną kątową grupę metylową i 18 atomów

(OH) Pierścień cyMopentano-pe r hyd r ofenan tre n o wy

Ryc. 49-1. Cechy strukturalne związków steroidowych

Numeracja atomów węgla. Asymetryczna atomy węgla

są zaclan lowana

HORMONY KORY NADNERCZY / 631

węgla określa się jako estrany, posiadające dwie kątowe grupy metylowe i 19 atomów węgla — jako androstany, zaś hormony posiadające dwie kątowe grupy metylowe oraz boczny łańcuch dwuwęglowy przy C,7 —jako pregnany (łączna liczba atomów węgla w pregnanach wynosi 21). Ta informacja (ryc. 49-2) wraz z glosariuszem podanym w tab. 49-1 pozwala zrozumieć nazwy chemiczne hormonów naturalnych i syntetycznych przedstawionych w tab. 49-2.

W BIOSYNTEZIE HORMONÓW STEROIDOWYCH NADNERCZY UCZESTNICZY WIELE ENZYMÓW Wszystkie hormony steroidowe nadnercza są syntetyzowane w większości z cholesterolu pochodzącego z osocza. Tylko małe ilości cholesterolu pochodzą z syntezy in situ wychodzącej z acetyloCoA i prowadzącej poprzez mewalonian do skwalenu. Większość cholesterolu występującego w nadnerczach jest estryfikowana i magazynowana w kropelkach tłuszczowych

cytoplazmy. W razie stymulacji nadnerczy przez ACTH (lub cAMP) dochodzi do aktywacji esterazy, powstały zaś wolny cholesterol (nieestryfikowany) ulega przemieszczeniu do mitochondriów, gdzie enzym rozszczepiający łańcuch boczny zawierający cytochrom P-450 (P-450SOC)

przekształca cholesterol w pregnenolon. Proces odszczepienia łańcucha bocznego związany jest z podwójną hydroksylacją, najpierw przy węglu C22, a następnie przy C20. Dopiero potem dochodzi do odszczepienia 6-węglowego łańcucha, tj. izokaproaldehydu i powstania 21-węglowego steroidu (ryc. 49-2). Białko zaleŜne od ACTH być moŜe wiąŜe i aktywuje cholesterol lub P-450SOC. Bardzo skutecznym inhibitorem P-450sa; i biosyntezy steroidowej jest aminoglutetimid. Wszystkie steroidy powstające u ssaków wytwarzane są z cholesterolu via pregnenolon za pośrednictwem szeregu reakcji zachodzących w mitochondriach lub siateczce śródplazmatycznej komórek nadnerczy. Istotną rolę w tych reakcjach odgrywają hydroksylazy wymagające obecności cząsteczkowego tlenu i NADPH. Ponadto na pewnych etapach biosyntezy po-

Odazczep lenie bocznego łańcucha cholesterolu

HO

+

C-C-C -C Pregnenolon + aldehyd tzokapronowy

Cholesterol

Podstawowe struktury hormonów steroidowych

HO Testosteron Związki Kortyzol 170-Estradiol

andrastanowe (C19)

Progesteron

Związki pregnanowe (C:i)

Związki eatranawe (C19)

Ryc. 49-2. Odszc2epienie łańcucha bocznego cholesterolu oraz podstawowe struktury hormonów steroidowych. _________________________________________ ^ _ _ ________^ ^ — ________

632 / ROZDZIAŁ 49 Tabela 49-1. Nazewnictwo steroidów Przedrostek Końcówka HydrofcsyDihydroksy-

- ol dio!

Okso-Cis

- on

Cecha chemiczna

Alkohole Ketony (np. dion = 2 grupy ketonowe) UłoŜenie dwóch grup w

Trans-ot-

tej samej płaszczyźnie co Cig UłoŜenie dwóch grup w

P - Deoksy izo- lub epi-

płaszczyźnie przeciwległej do C19 Podstawnik w połoŜeniu trans

DehydroDihydroAllo-

w stosunku do grupy metylowej Podstawnik w połoŜeniu cis w stosunku do grupy metylowej Cig Związek pozbawiony grupy hydroksylowej Występowanie izomerii przy wiązaniach C—C, C—OH lub C—H np. androsteron (5a) versus isoandrosteron (5p) Odjecie dwóch atomów wodoru z wytworzeniem podwójnego wiązania Dołączenie dwóch atomów wodoru do jednego wiązania podwójnego Konfiguracja trans pierścieni A i B

Tabela 49-2. Nazwy potoczne i chemiczne niektórych steroidów Nazwa potoczna Nazwa chemiczna Aldosteron Androstendion Cholesterol Dehydroepiandrosteron (DHEA) Deksametazon 11-Deoksykortykosteron (DOC) 11-Deoksykortyzol {związek S) Estradiol Estriol Estron Etiochofanolon Sa-Fluorokortyzoi Kortykosteron (związek B) Kortyzol (związek F) Kortyzon (związek E) Prednizoion Prednizon Pregnandiol Pregnantriol Pregnenolon Progesteron Testosteron Triamcynolon

1ip,21-Dihydroksy-3,20-diokso-4-pregnen-l8-al 4-Androsten-3,17-dion 5-Cholesten-3p-ol 3|)-Hydroksy-5-androsten-17-on 9a- Fluoro-16ot-metylo-11 p,17ac,21 -trifiydroksypregna-1,4-dien-3,20-dion 21 -Hydroksy-4-pregnen-3r20-dion 17,21 -Dihydroksy-4-pregnen-3,20-dion 1,3,5(10)-Estratrien-3,17p-diol 1.3.5(10)-Estratrien-3.16a,17p-triol 3-Hydroksy-t,3,5(10)-estratrien-3-ol-17-on 33Hydroksy-5p-androstan-17-on 9ot- Fluoro-11 p,17a,21 -trihydroksypregn-4-en-3,20-dion 11p,21-Dihydroksy-4-pregnen-3,20-dion 11 (3,17a,21 -Trihydroksy-4-pregnen-3,20-dion 1 7a,21 - D ihydroksy-4-pręg nen-3,11,20-trion 11 p,17a,21 -Trihydroksypreg na-1,4-dien-3,20-dion 17x,21 -Dihydroksypregna-1,4-dien-3,11,20-trion y 5p-Pregnan-3=t,20a-diol 5p-Pregnan-3%17a,20a-triof 3p-Hydroksy-5-pregnen-20-on 4-Pregnen-3,20-dion 17p-Hydroksy-4-androsten-3-on 9a-Fluoro-11p,16a,17a,21 -tetrahydroksypregna-1,4-dien-3,20-dion

HORMONY KORY NADNERCZY / 633 trzebne są dehydrogenazy, jedna izomeraza i lia-

za. Stwiendza się pewną swoistość komórkową w steroidogenezie, np. 18-hydroksylaza oraz dehydrogenaza I8-hydroksysteroidowa, potrzebne w biosyntezie aldosteronu, występują tylko w komórkach kłebkowych nadnerczy, przez co synteza tego mineralokortykoidu

ograniczona jest tylko do tej warstwy nadnerczy. Schemat szlaków syntezy 3 głównych klas steroidowych nadnerczy przedstawia ryc. 49-3. W prostokątach podano nazwę enzymów, zaś zacieniowaniem zaznaczono zmianę chemiczną, jaką dany enzym powoduje.

A ' -A n d ro s t e n -3 -1 7 - d i o n

11 -DBOksykortykosteron

11-Daoksykartyzoi

11fl-HYDROKSYLAZA

Kortykosts ron

Kortyzol

18-HYDHOKSYLAZA 18HYDROKSYDEHYDROGENAZA

Aldosleron

Ryc. 49-3. Szlaki uczestniczące w syntezie 3 gtównych klas steroidów nadnerczowych. Enzymy katalizujące zmianę struktury zaznaczoną zacieniowaniem umieszczono w prostokątach. (Według Harding B. W., w: DeGroot L. J. (red.): Endocfinology, tom 2, Grune and Stratton, 1979, w niewielkiej modyfikacji, za zezwoleniem).

634 / ROZDZIAŁ 49 Synteza mineralokortykoidów odbywa się w warstwie kłębkowatej nadnerczy Synteza aldosteronu odbywa się szlakiem mineralokortykoidowym w warstwie kłębkowatej nadnerczy. Pregnenolon ulega przekształceniu do progesteronu przy udziale dwóch enzymów zlokalizowanych w siateczce śródplazmatycznej gładkiej, tj. dehydrogenazy 3 p-hydroksysteroidowej (3 P-OHSD) i A'-4-izomerazy. Po hydroksylacji progesteronu w pozycji C21 powstaje 11-deoksykortykosteron (DOC), który jest aktywnym mineralokortykoidem (zatrzymującym sód). Przez kolejną hydroksylacje w pozycji Cn powstaje kortykosteron, który wykazuje aktywność glukokortykoidową i słabą aktywność mineralokortykoidową (wynoszącą ok. 5% aktywności aldosteronu). U niektórych gatunków zwierząt, np. u gryzoni, kortykosteron jest najsilniejszym glukokortykoidem. Hydroksylacja w pozycji C21 jest potrzebna dla wystąpienia zarówno aktywności mineralo-, jak i glukokortykoidowej. Większość steroidów z grupą hydroksylową w pozycji C17 wykazuje większą aktywność glukokortykoidową i mniejsze działanie mineralokortykoidowe. W siateczce śródplazmatycznej gładkiej komórek warstwy kłębkowatej nadnerczy brak jest 17 at-hydroksylazy, natomiast występuje enzym mitochondrialny — 18-hydroksylaza. W wyniku działania 18-hydroksylazy na kortykosteron powstaje 18-hydroksykortykosteron, który, po przekształceniu grupy alkoholowej w pozycji C18 na aldehydową, tworzy aldosteron. Jednorazowe rozmieszczenie enzymów w warstwie kłębkowatej oraz odrębny mechanizrn regulacji jej czynności (patrz niŜej) były punktem wyjścia sugestii niektórych badaczy, dopatrujących się nie tylko w całych nadnerczach występowania dwóch odrębnych gruczołów wydzielania wewnętrznego (tj. kory i rdzenia nadnerczy), ale równieŜ dwóch odrębnych gruczołów wydzielania wewnętrznego w samej korze nadnerczy.

Synteza glukokortykoidów. Synteza kortyzolu wymaga obecności trzech rodzajów hydroksylaz działających w kolejności w pozycjach CJ7, C2] i Cir Pierwsze dwie reakcje zachodzą szybko, podczas gdy hydroksylacja przy C21, przebiega względnie wolno. W razie wystąpienia najpierw hydroksylacji w pozycji C21, dochodzi do zahamowania 17 a-hydroksylazy, przez co aktywacji ulega szlak mineralokortykoidowy (wytwarzany jest kortykosteron lub aldosteron, zaleŜnie od rodzaju komó-

rek nadnerczowych). 17 a-hydroksylaza jest enzymem występującym w siateczce śródpiazmatycznej gładkiej oraz działającym albo na progesteron, albo—częściej — na pregnenolon. 17 a-hydroksyprogesteron, ulegając hydroksylacji w pozycji C21, tworzy 11-deoksykortyzol, który po kolejnej hydroksylacji w pozycji Cn tworzy kortyzol. Ten ostatni jest najsilniejszym naturalnym hormonem glukokortykoidowym u człowieka. 21-Hydroksytaza jest enzymem występującym w siateczce śródplazinatycznej gładkiej, natomiast 11 p-hydroksylaza jest enzymem mitochondrialnym. Tak więc steroidogeneza charakteryzuje się powtarzającym się transportem substratów steroidowych do i z mitochondriów komórek warstwy pasmowatej i siatkowatej (ryc. 49-4). Pęcherzyki Oclan magazynujące

MITOCHONDRIUM

Kortyzol i Cholestero

VI 11-Daoksy-

Pregnenolon

SIATECZKA ŚHODPLAZMATYCZNA

Cholesterol

ł9 17«l-Hy(lraksyprogBstBron

Ryć. 49-4. Subkomórkowa kompartmentaiizacja biosyntezy glukokortykoidów. Steroidogeneza w nadnerczach związana jest z kursowaniem prekursorów między mitochondriami a siateczką śródptazmatyczną. Enzymami uczestniczącymi w biosyntezie są: 1) CM.M liaza, 2} dehydrogenaza 3p-hydroksysteroidowa i A°* izomeraza, 3) 17a-hydroksylaza, 4) 21 -hydroksylaza i 5) 1ip-hydroksylaza. (Według: Harding B. W.; w: DeGroot L. J. (red.): Endocrinoiogy, tom 2, Grune and Stratton, 1979, w niewielkiej modyfikacji, za zezwoleniem).

Synteza androgenów. NajwaŜniejszym androgenem lub prekursorem androgenów powstających w korze nadnerczy jestdehydroepiandrosteron (DHEA). Większość 17-hydroksypregnenolonu ulega dalszym przekształceniom

HORMONY KORY NADNERCZY / 635

w szlaku glukokortykoidowym, zaś tylko mata jego ilość ulega działaniu 17, 20-liazy odszczepiającej dwuwęglowy łańcuch boczny C20— C2V Enzym ten występuje w nadnerczach i gonadach i działa wyłącznie na cząsteczki steroidowe zawierające grupę cc-hydroksylową w pozycji C 17 . W razie braku jednej z hydrolaz i zahamowania biosyntezy glukokortykoidów (patr2 niŜej — zespół nadnerczowo-płciowy), wytwarzanie androgenów w nadnerczach znacznie się nasila. Większość DHEA ulega szybkiej sulfatacji odbywającej się w połowie w nadnerczach, a w pozostałej części w wątrobie. Siarczan DHEA jest biologicznie nieaktywny, lecz ulega reaktywacji po usunięciu grupy siarczanowej. DHEA jest rzeczywistym prohormonem, poniewaŜ przekształca się w silniejszy androgen — audrnstendion {DHEA jest słabym androgenem) pod wpływem 3 p-OHSD i A5-4-izomerazy. Małe ilości androstendionu powstają równieŜ w nadnerczach pod wpływem działania liazy na 17-hydroksyprogesteron. Przez redukcję androstendionu w pozycji CI7 powstaje testosteron — najsilniejszy androgen nadnerczowy. Małe ilości testosteronu powstają właśnie w ten sposób w nadnerczach, większość natomiast powstaje drogą konwersji w innych tkankach. Z krwi Ŝylnej nadnerczy moŜna równieŜ wyizolować niewielkie ilości innych steroidów, w tym 11-deoksy korty kos tero n, progesteron, pregnenolon, 17 a-hydroksyprogesteron oraz bard2o niewielkie ilości estradiolu (powstającego drogą aromatyzacji testosteronu). Ilości tych steroidów powstałe w nadnerczach nie dorównują jednak ilościom tych hormonów wytwarzanych w innych gruczołach. WYDZIELANIE, TRANSPORT I PRZEMIANA STEROIDOWYCH HORMONÓW NADNERCZOWYCH WPŁYWAJĄ NA ICH DOSTĘPNOŚĆ BIOLOGICZNĄ Sekrecja hormonów steroidowych Tylko niewielkie ilości, jeśli w ogóle, hormonów steroidowych ulegają magazynowaniu w komórkach nadnerczy (lub gonad). Z reguły hormony te są uwalniane do osocza natychmiast po ich syntezie. Uwalnianie kortyzolu charakteryzuje się określoną periodycznością, zaleŜną od rytmu dobowego wydzielania ACTH.

Transport w osoczu Glukokortykoidy. W osoczu krwi kortyzol krąŜy pod postacią wolną i związaną z białkiem. Głównym białkiem osocza wiąŜącym ten hormon jest a-globulina, zwana transkortyną lub globuliną wiąŜącą kortykosteroidy (CBG — cortic o steroid binding globulin). CBG syntetyzowana jest w wątrobie, podobnie jak globulina wiąŜąca hormony tarczycy (TBG). Nasilenie tej syntezy wzmagają estrogeny. CBG wiąŜe większość kortyzolu osocza, jeśli stęŜenie tego hormonu znajduje się w granicach normy. Znacznie mniejsze ilości kortyzolu związane są z albuminami. RóŜnice w zakresie powinowactwa pozwalają określić okres biologicznego półtrwania róŜnych glukokortykoidów. Kortyzoi wiąŜe się mocno z CBG, jego okres półtrwania wynosi 1,5-2 h, KortykEfsteron wiąŜe się słabiej z CBG, przez co jego okres półtrwania wynosi mniej niŜ 1 h. CBG wiąŜe nie tylko glukokortykoidy. I tak deoksy korty kosteron i progesteron wykazują dostateczne powinowactwo do CBG, by konkurować z kortyzolem o miejsca wiązania. Ilość kortyzolu nie związanego, a więc wolnego, stanowi ok. 8% stęŜenia kortyzolu całkowitego w osoczu krwi i stanowi biologicznie aktywną frakcję tego hormonu.

Mtneralokortykoidy. Aldosteron, będący najsilniejszym naturalnym mineralokortykoidem, nie ma swoistego białka transportowego w osoczu, lecz tworzy słabe wiązanie z albuminami. Korty kosteron i 11-deok sy korty kosteron (są to steroidy wykazujące działanie mineralokortykoidowe) wiąŜą się z CBG. Te fakty pozwalają zrozumieć mechanizm działania aldosteronu (patrz niŜej). Przemiana i szybkość wydalania zaleŜą od obecności lub nieobecności białek nośnikowych Glukokortykoidy. Kortyzoi i jego metabolity stanowią ok. 80% występujących w osoczu 17-hydroksykortykoidów. Pozostałe 20% to kortyzon i 11 -deoksy korty zol. Około połowa krąŜącego we krwi kortyzolu (podobnie jak kortyzonu i 11-deoksy korty zolu) krąŜy we krwi pod postacią metabolitów dihydro- lub tetrahydro, powstałych drogą redukcji podwójnego wiązania w pierścieniu A (pod wpływem hydrogenaz zaleŜnych od NADPH) oraz grupy ketonowej w pozycji C3 (pod wpływem odwracalnej reakcji dehydrogenazowej). Znaczne ilości wszystkich wymienionych związków ulegają dalszej modyfikacji tworząc w pozycji C3

636 / ROZDZIAŁ 49

koniugaty z kwasem glukuronowym (glukuronidy) lub w mniejszym stopniu z kwasem siarkowym. Wymienione modyfikacje strukturalne zachodzą głównie w wątrobie, sprawiając, Ŝe lipofiina cząsteczka steroidowa staje się rozpuszczalna w wodzie i moŜe być wydalana z ustroju. U człowieka większość koniugatów steroidowych. wydzielanych, z Ŝółcią do światła jelita, jest wchłaniana do krwi i ponownie wychwytywana przez wątrobę, tworząc tzw. krąŜenie jelit owo-wątrobowe. Około 70% koniugatów steroidowych zostaje wydalona z moczem, 20% z kałem, a pozostałe 10% przez skórę.

Mineralokortykoidy. Aldosteron krąŜący we krwi ulega bardzo szybko klirensowaniu przez wątrobę, co nie jest dziwne, poniewaŜ hormon ten nie wiąŜe się z białkami nośnikowymi osocza. W wątrobie wytwarzane są 3-glukuronidy tetrahydroaldosteronu, które następnie wydalane są z moczem. Androgeny. Androgeny wydalane są jako 17-keto-związki. Wśród nich znajduje się siarczan DHEA, androstendion i jego metabolity. Testosteron, wydzielany w małych ilościach przez nadnercza, nie jest 17-keto-związkiem, lecz wątroba przekształca ok. 50% testosteronu w androsteron i etiocholanolon, które są 17-ketostero idami.

ISTNIEJĄ RÓśNORODNE MECHANIZMY REGULACJI SYNTEZY HORMONÓW STEROIDOWYCH, NADNERCZY Hormony glukokortykoidowe Sekrecja kortyzolu jest zaleŜna od ACTH. Z kolei wydzielanie ACTH jest kontrolowane przez hormon uwalniający kortykotropinę (CRH) (zwany równieŜ kortykoliberyną). Wydzielanie tych hormonów odbywa się na zasadzie ujemnego sprzęŜenia zwrotnego (p. ryc. 44-1 i tab. 46-1). Hormony minera I oko rtykoidowe Regulacja wydzielania aldosteronu w komórkach kłębkowatych kory nadnerczy jest zupełnie odmienna od regulacji sekrecji kortyzolu. Głównymi regulatorami sekrecji aldosteronu są układ reninowo-angiotensynowy oraz potas. W tej regulacji uczestniczą sód, ACTH i mechanizmy nerwowe.

Układ reninowo-angiotensynowy. Układ ten uczestniczy w regulacji ciśnienia tętniczego i przemiany elektrolitowej. Głównym hormonem w tych procesach jest angiotensyna II, oktapeptyd powstający z angiotensynogenu (ryc. 49-5). Synteza angiotensynogemi, będącego oyglobuliną, następuje w wątrobie. Jest on substratem dla reniny — enzymu wytwarzanego w komórkach tętniczki doprowadzającej kłęb uszka nerkowego. Lokalizacja tych komórek sprawia, Ŝe są one szczególnie wraŜliwe na zmiany ciśnienia tętniczego. Wiele regulatorów fizjologicznych wpływa na uwalnianie reniny za pośrednictwem haroreceptorów nerkowych (tab. 49-3). Komórki przyklębuszkowe Tabela 49-3. Czynniki wpływające na uwalnianie reniny Czynniki pobudzające

Czynniki hamujące

ObniŜane ciśnienie tętnicze PodwyŜszone ciśnienie tętnicze Zmiany pozycji ciała z Zmiana pozycji ciała z poziomej na pionową pionowej na poziomą ZuboŜenie ustroju w sód

ObciąŜenie solą

Związki p-adrenergiczne

Antagoniści p-adrenergicz-ni

Prostaglandyrty

Inhibitory prostaglandyn Potas Wazopresyna Angiotensyna II

są równieŜ wraŜliwe na zmiany stęŜenia Na+ i CI~ w płynie kanalikowym. Tak więc czynniki powodujące obniŜenie efektywnej objętości krwi krąŜącej (odwodnienie, spadek ciśnienia tętniczego, utrata płynów ustrojowych lub krwi) lub obniŜające stęŜenie NaCl w płynie kanalikowym pobudzają uwalnianie reniny. Nerwy współczulne nerek, ze swoimi zakończeniami w komórkach przykłębuszkowych pośredniczą w oddziaływaniu ośrodkowego układu nerwowego lub pozycji ciała na uwalnianie reniny. W tym mechanizmie regulacji biorą udział receptory p-adrenergiczne. Renina, działając na substrat — angiotensynogen, uwalnia dekapeptyd, zwany angiotensyną I. Syntezę angiotensynogenu w wątrobie wzmagają glukokortykoidy i estrogeny. Nadciśnienie tętnicze patogenetycznie powiązane z tymi hormonami, moŜe być przynajmniej częściowo spowodowane wzrostem stęŜenia an-

HORMONY KORY NADNERCZY / 637 Anglolensynogen

Angiotensyna I

Asp-ArgValTyr-lle-His-Pro-Phe-HisLeu-Leu (-400dalszych A i aminokwasów)

Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-PheHi5-Leu

ENZYM PRZEKSZTAŁCAJĄCY ANGIOTENSYNĘ 1 (KONWERTAZA}

Angiotensyna II

AspArg-ValTvr-lle-HiiPro-Phe

[AMINOPEPTYPAZA| Angiotensyna III

Arg-Va]-Tyr-lle His-ProPhe

ANGIOTENSYNAZY

P rod ukty deg radacj i

Ryc. 49-5. Powstawanie i przemiana angiotensyn. Strzałki wskazują na miejsca działania enzymów rozszczepiających.

giotensynogenu. PoniewaŜ stęŜenie krąŜącego angiotensynogenu jest bliskie wartości Kmw reakcji z reniną, małe jego zmiany mogą mieć znamienny wpływ na powstawanie angiotensyny II. Enzym przekształcający angiotensyitę (konwcrtaza) jest glikoproteiną występującą w płucach, komórkach śródbłonkowych i osoczu krwi. Katalizuje on odszczepienie dipeptydu od C-końca dekapeptydu angiotensyny I w wyniku czego powstaje oktapeptyd — angiotensyna II. Reakcja ta nie wydaje się mieć charakteru reakcji regulowanej. RóŜne analogi nonapeptydowe angiotensyny I i inne związki są kompetycyjnymi inhibitorami enzymu przekształcającego i stosowane są w leczeniu nadciśnienia tętniczego reninozaleŜnego. Enzym przekształcający rozkłada równieŜ bradykininę, będącą silnym czynnikiem rozszerzającym naczynia. Tak więc enzym ten podwyŜsza ciśnienie tętnicze krwi dwiema odmiennymi drogami. Angiotensyna II podnosi ciśnienie tętnicze krwi działając kurcząco na letniczki. Jest ona silną substancją wazoaktywną. Hamuje ona uwalnianie reniny z komórek przykłębuszkowych i jest silnym stymulatorem syntezy aldo-

steronu. Pomimo Ŝe angiotensyna II działa bezpośrednio stymulująco na nadnercza, nie ma ona wpływu na syntezę kortyzolu. U niektórych gatunków angiotensyna II ulega przekształceniu do angiotensyny III, będącej des-Asp^heptapeptydem, pobudzającym syntezę aldosteronu równie silnie jak angiotensyna II (ryc. 49-5). U człowieka stęŜenie angiotensyny II w osoczu jest 4-krotnie wyŜsze od angiotensyny III, co sugeruje, Ŝe większość efektów biologicznych spowodowanych jest oktapeptydem — angiotensyna II. Zarówno angiotensyna II jak i III są szybko rozkładane przez angioteasynazy. Angiotensyna II wiąŜe się ze swoistym receptorem komórek warstwy kłębkowatej nadnerczy. Kompleks hormon-receptor nie aktywuje cyklazy adenylanowej co sugeruje, Ŝe cAMP nie pośredniczy w działaniu hormonu na poziomie komórkowym. Efekty angiotensyny II, polegające na stymulacji konwersji cholesterolu do pregnenolonu i kortykosteronu do 18-hydroksykortykosteronu i aldosteronu, wydają się zachodzić przy udziale zmian śródkomórkowego stęŜenia wapnia i metabolitów fosfolipidowych podobnie jak to'opisano w rozdz. 45.

638 / ROZDZIAŁ 49

Potas. Wydzielanie aldosteronu jest wraźliwe na zmiany stęŜenia potasu w osoczu, Wzrost stęŜenia K + o zaledwie 0,1 mmol/1 pobudza sekrecję aldosteronu i odwrotnie, spadek kalemii obniŜa zarówno syntezę, jak i wydzielanie tego hormonu. Potas oddziałuje na te same etapy biosyntezy aldosteronu co angiotensyna II, chociaŜ mechanizm jego działania jest niejasny. Jon potasu, podobnie jak angiotensyna II, nie wpływa na biosyntezę kortyzolu. Inne stymulatory. W określonych warankach ACTH i sód mogą uczestniczyć w produkcji aldosteronu u człowieka.

ry nadnerczy tylko mineralokortykoidami jest niewystarczające; glukokortykoidy mają znaczenie decydujące o przeŜyciu. W odróŜnieniu od człowieka, u szczurów podawanie mineralokortykoidów jako leczenie substytucyjne w niewydolności kory nadnerczy jest zupełnie wystarczające. Zarówno nadmiernie podwyŜszone, jak i obniŜone stęŜenia obu klas hormonów, spowodowane procesem chorobowym lub postepowaniem leczniczym, są przyczyną powaŜnych powikłań związanych z efektami metabolicznymi tych hormonów.

HORMONY STEROIDOWE WYWOŁUJĄ LICZNE I RÓśNORODNE EFEKTY METABOLICZNE

Glukokortykoidy wpływają na podstawową przemianę materii, mechanizmy odpornościowe i ciśnienie tętnicze krwi oraz uczestniczą w reakcjach ustroju na stres

Wypadnięcie czynności kory nadnerczy kończy się śmiercią, jeśli nie rozpoczęto dostatecznie wcześnie leczenia substytucyjnego. U człowieka leczenie substytucyjne niewydolności ko-

Szczegółowy opis metabolicznych efektów hormonów glukokortykoidowych moŜna zna leźć w standardowych podręcznikach fizjologii, Krótkie zestawienie tych efektów znajduje się w tab, 49-4,

Tabala 49-4. Efekty biologiczne glukokortykoidów I. Wpływ na pośrednią przemianę materii 1. Wzrost wytwarzania glukozy w wątrobie spowodowany: a. Zwiększonym napływem aminokwasów (substratów glukoneogenetycznych) z tkanek obwodowych b. Wzrostem glukoneogenezy uwarunkowanym aktywacją kluczowych enzymów tego procesu c. Maksymalizacją innych kluczowych reakcji (uwarunkowanych permisyjnym działaniem glukokortykoidów) 2. Wzrost odkładania się glikogertu w wątrobie poprzez aktywacje syntazy glikogenowej Wzrost I i po I i zy (w kończynach); mogą stymulować lipogenezę w innych miejscach (twarz, tułów) szczególnie wtedy, gdy ich stęŜenie w osoczu jest wyŜsze od fizjologicznego Stymulacja przemiany białek i RNA. Przy fizjologicznych stęŜeniach glukokortykoidów jest to dziaianie anaboliczne, natomiast przy stęŜeniach wyŜszych od fizjologicznych — działanie kataboliczne II. Działanie na mechanizmy odpornościowe:

Redukcja reakcji immunologicznych. Hormony te powodują rozpad limfocytów, który jest gatunkowo i komórkowo swoisty Supresja reakcji zapalnych przez: a. Zmniejszanie liczby krąŜących leukocytów i migracji leukocytów tkankowych b. Hamowanie proliferacji fibroblastów c. Stymulację powstawania lipokortyn, które hamując fosfolipazę A2, zmniejszają syntezę bardzo silnych substancji zapalnych, tj. prostaglandyn i leukotrien III. Inne efekty glukokortykoidów Są niezbędne do utrzymania prawidłowego ciśnienia tętniczego oraz prawidłowej objętości minutowej serca (rzutu serca) Są niezbędne do utrzymania prawidłowej równowagi wodnoelektrolitowej najpewniej poprzez hamowanie uwalniania ADH (przez co wpływają na wydalanie H2O przez nerki) i stymulację syntezy angiotensynogenu (przez co wpływają na retencję Na w nerkach). Te efekty glukokor tykoidów pośrednio oddziałują na ciśnienie tętnicze krwi Są niezbędne, wraz z hormonami rdzenia nadnerczy, w reakcji ustroju na stres

HORMONY KORY NADNERCZY / 639 Hormony mineralokortykoidowe wpływają na równowagę elekrolitową i transport jonów Hormony mineralokortykoidowe działają w nerkach pobudzając aktywny transport Na + w kanalikach krętych dystalnych i zbiorczych. Efektem „netto" ich działania jest retencja sodu. Hormony te pobudzają równieŜ w nerkach sekrecje jonów K+, H+ i NH^i wpływają na transport jonów w innych tkankach nabłonkowych, w tym w gruczołach potowych, błonie śluzowej jelit i śliniankach. Działanie mineralokortykoidowe aldosteromi jest 30—50 razy silniejsze niŜ deoksykortykosteronu (DOC) i 1000-krotnie silniejsze niŜ kortyzolu lub kortykosteronu. Jako najsilniejszy naturalny rnineralokortykoid, aldosteron jest głównym hormonem regulacji gospodarki sodowej i potasowej u człowieka. Kortyzol, choć wykazuje znacznie słabsze działanie minerał ot rop owe, wywiera równieŜ znamienny wpływ na retencję Na+ i wydalanie K+ przez to, Ŝe wytwarzany jest w znacznie większych ilościach niŜ aldosteron. Mniejsze znaczenie w regulacji gospodarki Na+ i K+ ma DOC, poniewaŜ jego wytwarzanie jest bardzo małe. Do wystąpienia skutków działania aldosteronu potrzebna jest synteza białek i RNA, co sugeruje, Ŝe w mechanizmie działania tego hormonu uczestniczą swoiste produkty genowe. MECHANIZMY DZIAŁANIA HORMONÓW STEROIDOWYCH NADNERCZY SĄ DO SIEBIE PODOBNE Hormony glukokortykoidowe rozpoczynają swoje działanie w komórkach docelowych reagując ze swoistym receptorem. Ten etap jest niezbędny, by mogły one wniknąć do jądra komórkowego i związać się z DNA. Na ogół stwierdza sie wysoką dodatnią korelację między wielkością powinowactwa hormonu z receptorem a nasileniem określonego efektu biologicznego. Dotyczy to szerokiej skali aktywności tych hormonów. 1 tak steroid wykazujący 10-krotnie słabsze powinowactwo do receptora niŜ np. kortyzol wywołuje odpowiednio mniejsze działanie biologiczne przy określonym stęŜeniu tych steroidów. W mechanizmie działania hormonów steroidowych na ogół nie uczestniczą „receptory zapasowe". Biologiczne działanie hormonu steroidowego

zaleŜy zarówno od jego zdolności wiązania się z receptorem, jak równieŜ od stęŜenia wolnego hormonu (nie związanego z białkiem transportowym) w osoczu. Kortyzol, kortykosteron i aldosteron — wszystkie te hormony wykazują silne powinowactwo do receptora glukokortykoidowego, niemniej jednak w warunkach fizjologicznych głównym hormonem wiąŜącym się z receptorem glukokortykoidowym jest kortyzol, poniewaŜ jego stęŜenie w osoczu krwi jest najwyŜsze. W pewnych stanach chorobowych (np. w niedoborze 17 a-hydroksylazy) kortykosteron jest głównym glukokortykoidem, W odróŜnieniu od niego, aldosteron nigdy nie osiąga stęŜenia w surowicy potrzebnego do wystąpienia efektów glukokortykoidowych. Domeny czynnościowe receptora glukokortykoidowego zostały rozszyfrowane Liczne badania biochemiczne, immunologiczne i genetyczne doprowadziły do poznania struktury receptora glukokortykoidowego przedstawionego schematycznie na ryc. 49-6. N-końcowa połówka receptora zawiera większość domen antygenowych oraz obszar modulujący czynność promotorową (frans-aktywację). C-końcowa połowa receptora zawiera domenę wiąŜącą DNA i hormon. Domena wiąŜąca DNA znajduje się bliŜej środka cząsteczki, podczas gdy domena wiąŜąca hormon zlokalizowana jest blisko C-końca. Obie te domeny są niezbędne w Ŝrans-aktywacji procesu transkrypcji genu. Dla dimeryzacji dwóch cząsteczek receptora potrzebna jest pewna sekwencja aminokwasowa na C-końcu, Sądzi się, Ŝe reakcja dimeryzacji jest potrzebna przy wiązaniu się receptora do kaŜdej z dwóch „połówek" elementu odpowiedzi na glukokortykoidy (GRE) (p. strzałki w tab. 45-3). Wydaje się, Ŝe do procesu wniknięcia receptora do jądra komórkowego (czyli dla jego lokalizacji w Jądrze") potrzebne są dwa oddzielne obszary. Sekwencja aminokwasowa receptora, ustalona na podstawie analizy odpowiadającego mu cDNA, wykazała występowanie dwóch obszarów obfitujących w reszty Cys-Lys-Arg w obrębie domeny wiąŜącej DNA. Porównując te obszary z innymi białkami wiąŜącymi DNA (szczególnie TFIIIA), moŜna zakładać występowanie struktury białka, posiadającego dwa „palce" (przy czym kaŜdy z nich ma w środku atom cynku), które wiąŜą się z jednym skrętem pasma DNA. Jest to jedna z postaci interakcji

640 / ROZDZIAŁ 49

Domena zmienna

□omana wiąŜąca ONA

m.

Domena wiąŜąca hormon

■cooh trans— aktywacja Translokacja Jądrowa Dimeryzacja Antygenowość Homologia z on kog snem

v—»rt~ A

Ryc. 49-6. Schemat struktury fudzkiego receptora gfikokortykoidowego złoŜonego z 777 aminokwasów. W obrębie receptora moŜna wyróŜnić domeny antygenowe wiąŜące DNA oraz wiąŜące hormon. Pokazano równieŜ inne domeny oraz homologię z onkogenem v-erb-A.

białek z DNA omawianych w rozdz. 41. Ta obserwacja jak równieŜ wynik innych badań, w których wykazano, Ŝe C-końcowa połówka receptora ghikokortykoidowego jest bardzo podobna do onkogenu v-erb-A oraz Ŝe domeny tego onkogenu wiąŜące DNA są homologiczne z analogicznymi domenami receptora glukokortykoidowego, estrogenowego i progesteronowego, doprowadziły do wykrycia nadrodziny steroid o wo-tarczy co wego receptora hormonalnego.

Nadrodzina steroid owo-tarczyco wego receptora hormonalnego. Hormony steroidowe i tarczycy regulują wiele procesów uczestniczących w rozwoju, róŜnicowaniu, wzroście, reprodukcji i adaptacji ustroju do zmian środowiskowych. W ostatnich latach stało się jasne, Ŝe wspólny mechanizm mógłby wyjaśnić działanie tych hormonów na poziomie molekularnym (p. rozdz. 45). W tym mechanizmie istotnym ogniwem są receptory hormonalne. PoniewaŜ występowanie tych ostatnich w ustroju nie jest obfite, analiza strukturalna receptorów stała się moŜliwa dopiero po wyizolowaniu klonów cDNA dla kaŜdego z nich. Najpierw poznano strukturę receptora glukokortykoidowego, estrogenowego i progesteronowego. Stwierdzenie homologii w zakresie domen wiąŜących DNA dla tych hormonów, jak równieŜ wykazanie znacznego podobieństwa tych domen do \-erb-A — białka onkogennego, wiąŜącego DNA, były punktem wyjścia dla hipotezy, Ŝe wymienione receptory mogą naleŜeć do nadrodziny genowej (supergene family). JeŜeli tak, oczywista stała się kolejna hipoteza, Ŝe z bibliotek cDNA powinno się

wyizolować inne receptory, uŜywając sond na wspólny obszar (domenę DNA) w warunkach zredukowanej hybrydyzacji (p. rozdz. 42). Okazało się, Ŝe hipoteza ta była słuszna. Jak to pokazano na ryc. 49-7, określone zostały struktury dla wszystkich receptorów steroidowych, równieŜ dla kilku receptorów, których dotychczas nie zidentyfikowano. Uderzająca jest dla tych receptorów homologia domen wiąŜących DNA oraz fakt występowania ogólnej wspólnej organizacji. Omawiane receptory róŜnią się znacznie długością, głównie połówki N-końcowego fragmentu cząsteczki. Ta obserwacja znacznie przyspieszyła zrozumienie mechanizmu transkrypcji genów regulowanych przez te hormony. Działanie hormonów glukokortykoidowych polega przewaŜnie na regulacji ekspresji genów Ogólne mechanizmy działania hormonów glukokortykoidowych zostały opisane w rozdz. 45 i przedstawione na ryc. 45-1. Liczne dowody potwierdzają słuszność koncepcji, Ŝe ta klasa hormonów wywiera wpływ na swoiste białka komórkowe, oddziaływując na ilość „krytycznych" białek, najczęściej enzymów, w obrębie komórki. Zwykle gfukokortykoidy realizują swoje działanie poprzez regulację szybkości transkrypcji swoistych genów w komórkach docelowych, choć mogą wpływać równieŜ na inne etapy „szlaku informacyjnego" (p. ryc. 45-2). Regulacja transkrypcji polega na tym, Ŝe kompleks steroid-receptor wiąŜe się ze swoistymi sekwencjami DNA, połoŜonymi w sąsiedztwie miejsca inicjacji transkrypcji i, Ŝe te obszary

HORMONY KORY NADNERCZY / 641 Domeny

Zmienne

Ugand

DNA

421

496 528

Receptor 777 GlukoKortykoidowy 984

Mlnsralokortykoldowy 567

934

633 680

V90< 185

Progestynowy

551 595

250 311

Estrogenów/ 1 24

89

427

192

Dla wiła miny D

162

169 232

4S6 TĄ dla hormonów tarczycy

8S

153 198

462 Ola kwasu retlnol owego

291

358

421

639 V-erf>-A

Ryc. 49-7. Schematyczne porównania nadrodziny steroidowo-tarczycowego receptora hormonalnego. Sekwencje w obrębie ludzkich receptorów (v-erb-A jest pochodzenia ptasiego) zostały tak przedstawione, by ich domeny wiąŜące DNA i wykazujące największe podobieństwo w sekwencji aminokwasowej znajdowały się jedna nad drugą Liczby w obrębie za kres kowanego pola oznaczają procentowe podobieństwo danej domeny do odpowiedniej domeny receptora glukokortykoidowego. Liczby nad pionowymi liniami, odgraniczającymi poszczególne domeny, oznaczają pozycje aminokwasów. N-kotfcowy aminokwas oznaczono jako 1. Wyizolowano wiele innych podobnych cząsteczek, lecz nie określono ich czynności ani ich ligandów. ____________ _______________________

DNA nadają reakcji na hormon cech swoistości. W jaki sposób interakcja kompleksu steroid-receptor z DNA pobudza lub hamuje transkrypcję, na czym polega swoistość tkankowa tej interakcji oraz dlaczego w jednych tkankach hormon pobudza, zaś w innych hamuje transkrypcję określonego genu — oto kilka tylko pytań, na które dotychczas brak odpowiedzi. Krótki opis mechanizmu wpływu hormonów glukokortykoidowych na transkrypcję DNA wirusa wywołującego guz sutka u mys2y jest najlepszą ilustracją stanu wiedzy na temat działania hormonów steroidowych. Model wirusa wywołującego guz sutka jest bardzo uŜyteczny, poniewaŜ wpływ steroidów jest szybki i wyrazisty i dogłębnie zbadano biologię molekularną tego wirusa. Kompleks glukokortykoid-recep4i

Biochemia

tor wiąŜe się wybiórczo i swoiście z sekwencją DNA określoną jako glukokortykoidowy obszar (element) regulatorowy (GRE ■— glucocorticoid regulatory element). Obszar ten zlokalizowany jest o kilkaset zasad w górę w stosunku do miejsca inicjacji transkrypcji. W bliskim sąsiedztwie GRE znajdują się sekwencje bardzo podobne do sekwencji konsensus GGTACAnnnTGTCT zlokalizowanej we fragmencie regulatorowym genów regulowanych przez glukokortykoidy. Glukokortykoidowy obszar regulatorowy połączony z receptorem nasila inicjację transkrypcji genomu wirusa wywołującego guz sutka u myszy oraz wykazuje równieŜ działanie aktywujące na heterologiczne promotory. Ten element działający w układzie cis jest czynny równieŜ wówczas, kiedy zostanie przesunięty do innych obszarów DNA połoŜonych

442 / ROZDZIAŁ 49 -

GRE \

Promotor MTV

( GRE

Promotor MTV

r Genom MTV

p

Promotor MTV

—

Genom MTV

Genom MTV

GRE\ -

GRE\

Promotor hetero logiczny

GRE\

Promotor hetero logiczny

r

Genom MTV

r Gen hetero logiczny

Ryc. 49-8. GRE jest wzmacniaczem procesu transkrypcji. Wirus (typ dziki) wywołujący guz sutka u myszy (MTV) zawiera: obszar w paśmie DNA, które ulega skopiowaniu do jednostki transkrypcyjnej (genom MTV), promotor i GRE. GRE oddzielony jest normalnie od 5'-końcowego miejsca startowego transkrypcji przez ok. 200 zasad, choć moŜe działać w obu kierunkach GRE moŜe równieŜ ulec ttenslokacji w dół od miejsca startowego transkrypcji. Działa on równieŜ w heterologicznych układach promotorowych i kodujących. Te fakty dowodzą, Ŝe GRE i inne obszary regulatorowe wyizolowane z róŜnych genów działają jako wzmacniacze transkrypcji. _________________ ____ " ____

w dół lub w górę łańcucha i pracuje w obu kierunkach. Pod tym względem glukokortykoidowy obszar regulatorowy spełnia rolę wzmacniacza procesu transkrypcji. Występowanie tych cech wykazano równieŜ w kilku innych genach regulowanych przez glukokortykoidy. Są one zestawione na ryc. 49-8. Wydaje się, Ŝe niektóre geny regulowane przez glukokortykoidy wymagają obecności dodatkowego białka wiąŜącego DNA oraz odpowiadającego mu obszaru DNA. Główne działanie glukokortykoidów polega na kontroli nasilenia procesu transkrypcji genu, lecz nie jest to ich działanie jedyne. Dzięki moŜliwości mierzenia nasilenia róŜnych procesów wykazano, Ŝe glukokortykoidy regulują równieŜ szybkość degradacji swoistych mRNA (np. mRNA kodującego hormon wzrostu i karboksykinazę fosfoenolopirogronianową) oraz obróbkę potranslacyjną (np. róŜnych białek wirusa wywołującego guz sutka u myszy). Glukokortykoidy i inne klasy hormonów steroidowych mogą działać na kaŜdym etapie „szlaku informacyjnego" począwszy od DNA, a kończywszy na końcowym białku (p. ryc. 45-2), przy czym nasilenie tego działania moŜe być róŜne i zaleŜne od danego układu.

Ogólne zasady działania hormonu m ineralokorty koidowego (aldosteronu) są podobne do opisanych dla innych hormonów steroidowych (ryc. 45-1, Z, 3. i tab. 45-3) ChociaŜ wyizolowano swoiste produkty genowe, do wystąpienia efektów działania aldosteronu potrzebna jest synteza białek i RNA. Przyjmuje się, Ŝe swoiste białka uczestniczą w transporcie jonów indukowanym aldosteronem. Receptory o wysokim powinowactwie do ałdosteronu (K d ~1 nmol/l) stwierdzono w cytoplazmie i jądrach komórek docelowych Obecność takich receptorów stwierdzono w nerkach, śliniankach przyusznych i jelicie grubym oraz w innych komórkach, których nie uwaŜano za komórki docelowe dla aldosteronu (komórki hipokampa i serca). Te receptory wykazują podobne powinowactwo do aldosteronu, kortyzolu i kortykosteronu i określone zostały jako receptory typu I w celu odróŜnienia ich od klasycznych receptorów glukokortykoidowych (typu II). Uwzględniając fakt, Ŝe stęŜenie aldosteronu

HORMONY KORY NADNERCZY / 643

w osoczu krwi jest znacznie mniejsze od stęŜenia kortyzolu i kortykosteronu, moŜna by przypuszczać, Ŝe receptory typu I zostaną zajęte głównie przez te dwa ostatnie steroidy, przez co działanie aldostoonu byłoby niewielkie. NaleŜy jednak przypomnieć, Ŝe DOC i kortykosteron są chciwie wiązane przez globulinę wiąŜącą kortykosteroidy, tj. przez białko transportowe dla glukokortykoidów, podczas gdy aldosteron nie ma swoistego białka nośnikowego. Ten fakt sprawia, Ŝe efektywne stęŜenie wolnego (nie związanego z białkiem) aldosteronu w osoczu krwi jest wyŜsze od odpowiedniego stęŜenia zarówno kortykosteronu, jak i DOC Dlatego teŜ aldosteron łatwo wnika do komórek co daje mu przewagę w konkurencji o wiązanie z receptorami typu I in vivo. WaŜne dla ustroju działanie aldosteronu zabezpiecza dodatkowy mechanizm stanowiący rodzaj wentyla bezpieczeństwa. Receptor występujący w tkankach docelowych dla mineralokortykoidów wykazuje bezwzględną selektywność dla aldosteronu dzięki obecności enzymu dehydrogenazy 11 p-hydroksysteroidowej. Enzym ten przekształca kortyzol i kortykosteron do odpowiednich 11 pmetabolitów, lecz nie działa na aldosteron. Metabolity te nie wiąŜą się z receptorami typu I, sprawiając, Ŝe aldosteron ma do niego swobodny dostęp. Aldosteron działa głównie na transport jonów Działanie aldosteronu na transport sodowy na poziomie molekularnym nie zostało wyjaśnione. Niemniej wyniki kilku badań -uzasadniają następującą hipotezę. Jony Na+ występujące w płynie zawartym w świetle kanalików nerkowych wnikają biernie do komórek kanalikowych od strony luminalnej za pośrednictwem kanałów sodowych. Z kolei jony Na+ przechodzą do płynu śródmiąŜszowego za pośrednictwem Na+/K+ zaleŜnej pompy ATP-azowej umiejscowionej na biegunie podstawnobocznym komórek kanalikowych. Energię dla tego procesu dostarcza ATP. Aldosteron zwiększa liczbę kanałów sodowych w błonie komórkowej luminalnego bieguna komórek kanalikowych, co zapewne jest przyczyną wzrostu środkom orkowego stęŜenia Na+. Aldosteron zwiększa równieŜ aktywność kilku enzymów mitochondrialnych, przez co nasila powstawanie ATP niezbędnego do napędzania pompy Na+/K+ umiejscowionej w błonie komórkowej po dstawnob ocznego bieguna

komórek kanalikowych. Skutkiem działania aldosteronu jest wzrost ilorazu NADH:NAD oraz aktywności kilku enzymów mitochondrialnych, w tym syntazy cytrynianowej. Wzrost aktywności syntazy cytrynianowej jest wynikiem rzeczywistej indukcji (pośredniczonej opisaną wyŜej transkrypcją genu) i okresowy wzrost tego białka wykazuje wysoką korelację z działaniem aldosteronu na transport Na+. Nie wykazano bezpośredniego wpływu aldosteronu na pompę sodową. Tak więc wydaje się, Ŝe hormon ten zwiększa śródkomórkowe stęŜenia Na+ oraz stymuluje powstawanie związków wysokoenergetycznych niezbędnych przy wypompowywaniu tego jonu do płynu śródmiąŜszowego. Inne mechanizmy wydają się uczestniczyć w transporcie jonów K+ i H+, a wśród nich róŜne białka regulowane przez aldosteron*. PATOFIZJOLOGIA KORY NADNERCZY Zaburzenia spowodowane nadmiarem lub niedoborem glukokortykoidów Pierwotna niewydolność nadnerczy (choroba Addisona) charakteryzuje się hipoglikemią, niezwykłą nadwraŜliwością na insulinę, nietolerancją stresu, jadłowstrętem, chudnięciem, nudnościami i znacznym osłabieniem. Chorzy na chorobę Addisona wykazują niskie ciśnienie tętnicze, obniŜone przesączanie kłębuszkowe oraz zmniejszoną zdolność do wydalania ładunku wodnego. W wywiadach często podają „nałogowe" zjadanie soli. W surowicy krwi stwierdza się małe stęŜenie Na+, natomiast duŜe stęŜenie K+; ponadto obserwuje się wzrost liczby limfocytów i komórek eozynofdnych. U chorych takich stwierdza się nadmierną pigmentację skóry i błon śluzowych, uwarunkowaną wyrównawczym wzrostem sekrecji ACTH i produktów transkrypcji genu proopiomelanokortyny (POMC). Wtórna niewydolność kory nadnerczy uwa-

runkowana jest niedoborem ACTH spowodowanym zawałem przysadki gruczołowej lub jej zniszczeniem przez nowotwór lub zakaŜenie. Charakteryzuje się podobnymi aberracjami metabolicznymi co pierwotna niewydolność kory * Mechanizm działania aldosteronu na komórki nabłonkowe gruczołów potowych, ślinianek i przewodu pokarmowego jest podobny do podanego dla komórek kanalików nerkowych {przyp. tłum.).

644 / ROZDZIAŁ 49

nadnerczy, róŜni się od niej jednak nieobecnością hiperpigmentacji skóry i błon śluzowych. Nadmiar glukokortykoidów, powszechnie określany jako zespół Cushinga, zwykle spowodowany jest podawaniem farmakologicznych dawek tych steroidów. MoŜe on być równieŜ uwarunkowany nadmiernym wydzielaniem ACTH przez gruczolaka przysadki mózgowej, nadmierne wydzielanie glukokortykoidów przez gruczolaka lub raka nadnerczy lub ektopową sekrecję ACTH przez nowotwór. Dla chorych z zespołem Cushinga charakterystyczne jest zniknięcie dobowego rytmu wydzielania ACTH i kortyzolu. Wykazują oni obecność hiperglikemii lub cechy nietolerancji glukozy (lub obydwie anomalie metaboliczne) spowodowanej wzmoŜoną gluk one o genezą. Ze wzmoŜoną glukoneogenezą powiązany jest cięŜki katabofizm białek przejawiający się ścieńczeniem skóry, zanikiem mięśni szkieletowych, osteoporozą, zanikiem tkanki limfoidalnej. Ogólnie mówiąc u chorych tych stwierdza się ujemny bilans azotowy. Stwierdza się teŜ charakterystyczne rozmieszczenie tkanki tłuszczowej, tj. otyłość typu tułowiowego z obecnością typowego „garbu bawolego". Oporność na infekcje, reakcje zapalne oraz gojenie się ran są upośledzone. Wiele objawów, takich jak hipernatremia, hipokalemia, zasadowica, obrzęki i nadciśnienie, spowodowanych jest efektami minerał okortykoidowymi kortyzolu. Zaburzenia związane z nadmiarem mineralokortykoidów

Małe gruczolaki komórek warstwy kiębkowatej nadnerczy są przyczyną pierwotnego aldosteronizmu (zespołu Conna). Do klasycznych objawów tego zespołu naleŜą: nadciśnienie tętnicze, hipokalemia, hipernatremia i zasadowica nieoddechowa. U chorych z aldosteronizmem pierwotnym nie stwierdza się objawów nadmiaru hormonów glukokortykoid owych, stwierdza się natomiast małą aktywność reninową osocza oraz małe stęŜenia angiotensyny II. ZwęŜenie tętnicy nerkowej z następczym spadkiem ciśnienia perfuzyjnego w nerkach moŜe być przyczyną przerostu i zwiększonej funkcji komórek przykłębuszkowych, przejawiających się duŜą aktywnością reninową osocza oraz podwyŜszonymi stęŜeniami angiotensyny II. Ta ostatnia jest przyczyną wtórnego aidosteronizmu, który jest podobny do postaci pierwotnej, róŜniąc się od tej ostatniej wysokimi stęŜeniami reniny i angiotensyny II w osoczu.

Wrodzony rozrost (hyperplasia) nadnerczy spowodowany jest niedoborem enzymatycznym

Zmniejszenie ilości enzymów uczestniczących w steroidogenezie jest przyczyną niedoboru jej produktów końcowych, akumulacji metabolitów pośrednich oraz nadmiernej syntezy steroidów szlakami alternatywnymi. Wspólną cechą większości tych zespołów, które powstają juŜ w Ŝyciu zarodkowym in utero, jest niedobór kortyzolu, nadmierne wydzielanie ACTH oraz rozrost nadnerczy. Stąd określenie wrodzony rozrost nadnerczy. Inną wspólną cechą tych zespołów jest nadprodukcja androgenów nadnerczowych. Ta ostatnia jest przyczyną przyspieszonego wzrostu, wirylizacji oraz występowania obojnaczych narządów płciowych. Ten fakt tłumaczy alternatywne określenie tego schorzenia jako zespół nadnerczowo-płciowy. W 90% przypadków wrodzony rozrost nadnerczy spowodowany jest dwiema postaciami niedoboru 21-hydroksy!azy, tj. niedoborem częściowym będącym przyczyną tylko wirylizacji oraz niedobór całkowity przebiegający z utratą soli przez nerki. Pozostałe przypadki uwarunkowane są niedoborem 11 (S-hydrnksyla/y. Opisano tylko pojedyncze przypadki niedoborów innych enzymów (dehydrogenazy 3 p-hydroksysteroidowej, 17a-hydroksylazy, desmolazy cholesterolowej, 18-hydroksylazy, 18-dehydrogenazy). Niedobór I8-hydroksylazy i 18-dehyd-

rogenazy są przyczyną tylko niedostatecznej biosyntezy aldosteronu i nie przebiegają z rozrostem nadnerczy. Niedobór desmolazy cholesterolowej uniemoŜliwia biosyntezę któregokolwiek steroidu. Dlatego teŜ defekt ten jest zwykle nie do pogodzenia z Ŝyciem pozamacicznym. PIŚMIENNICTWO Beanto M: Gene regulation by steroid hormones. Celt I989;56:335. Evans R: The steroid and thyroid hormone receptor superfamily: Science 1988;240:889. Granner DK: The role of glucocorticoid hormones as biotogical amplifiers. In: Glucocorticoid Hormone Action. Baxter JD, Rousseau GG (editors). Springer-Verlag, 1979. Gustafsson et al: Biochemistry, molecutar biology and physiology of the glucocorticoid receptor. Endocrine Rev 1987;8:185. MorrisDJ: The metabolism and mcchanismof action of action of aldosterone. Endocr Rev 1981;2:234. Yamamoto KR: Steroid receptor-regulated transcrip(ion of specific genes and gene networks. Ann Rev Genet 1985;19:209.

Hormony rdzenia nadnerczy

50

Dary! K. Granner, MD

WPROWADZENIE Układ współczulnonadnerczowy składa się z przywspókzulnego układu nerwowego z nerwami cholinergicznymi przed- i zazwojowymi, ze współczulnego układu nerwowego z cholinergicznymi nerwami przedzwojowymi i adrenergtcznynii nerwami zazwojowymi oraz z rdzenia nadnerczy. Ten ostatni stanowi w rzeczywistości wydłuŜenie współczulnego ukiadu nerwowego, poniewaŜ zakończenia włókien przędz woj owych nerwu trzewnego unerwiają komórki chromochłonne wytwarzające hormony katecholaminowe, tj. dopaminę, noradrenalinę (norepinefrynę) i adrenalinę (epinefrynę). Rdzeń nadnerczy jest więc wyspecjalizowanym zwojem bez wypustek aksonalnych. Jego komórki syntetyzują, magazynują i uwalniają substancje działające w miejscach oddalonych od rdzenia. Oznacza to, Ŝe rdzeń nadnerczy działa jako narząd wewnątrzwydzielniczy. Jest on doskonałym przykładem ścisłego powiązania układu nerwowego z układem endokrynnym, jak to zasygnalizowano w rozdz. 45.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Hormony układu współczulnonadnerczowego, choć nie są niezbędne do Ŝycia, są jednak potrzebne w procesie adaptacji do ostrego i przewlekłego stresu. Adrenalina, noradrenalina i dopamina są głównymi składowymi reakcji na silny stres. Reakcja ta składa się z licznych, zintegrowanych procesów przystosowawczych w narządach waŜnych dla Ŝycia (w mózgu, mięśniach, układzie sercowoplucnym i w wątrobie), kosztem narządów mniej uczestniczących (skóry, układu Ŝołądkowo-jelitowego, tkanki limfoidalnej) w tej reakcji. Aminy katecho-

Skróty uŜywane w tym rozdziale COMT - - O-Metylotransferaza katecholowa DBH - — p -Hydroksv4aza dopaminowa (f3-oksydaza dopaminowa} MAO - - Oksydaza monoaminowa P N M T - - N - Metyl otrą nsferaza fenyloetanoloamtnowa VMA - - Kwas waniltnomigdatowy

lowe nie są jedynymi hormonami ułatwiającymi przezwycięŜenie stresu. Wspomagają je glukokortykoidy, hormon wzrostu, wazopresyna, angiotensyna II i glukagon.

HORMONY KATECHOLAMINOWE SĄ 3,4-DIHYDROKSY-POCHODNYMI FENY LOETYLOAM INY * Dopamina, noradrenalina i adrenalina syntetyzowane są w komórkach chromochłonnych rdzenia nadnerczy. Nazwa tych komórek pochodzi stąd, Ŝe zawierają one ziarnistości barwiące się na kolor czerwono brunatny przy ekspozycji na dwuchromian potasu. Skupiska takich komórek znajdują się równieŜ w sercu, wątrobie, nerkach, gonadach, neuronach adrenergicznych zazwojowego układu współczulnego oraz w ośrodkowym układzie nerwowym. Głównym produktem rdzenia nadnerczy jest adrenalina. Związek ten stanowi 80% wszystkich katecholamin zawartych w rdzeniu. Nie jest ona syntetyzowana w innych tkankach połoŜonych poza rdzeniem nadnerczy. W odróŜnieniu od adrenaliny, większość noradrenaliny zawarta w narządach mających unerwienie współczuł ne syntetyzowana jest insitu (ok. 80% całej zawartości), pozostała zaś ilość wytwarza-

646 / ROZDZIAŁ 50

ł

HYDROKSYLAZA TVROZYNOWA

(4-MONOOKSYGENAZA

H

I

HO

HI

C— C—IMH, MONOFENOLOWA)

H

H.

Dopamtna

I HO-

/I-HYDROKSYLAZA DOPAMINOWA (JS - OKSYDAZA DOPAMINOWA)

HO

H

I I

\

C— C

U

No rad ren ati na CH,

I

C —C—NH

I I

H

H

Adrenalina

Ryc. 50-1. Biosynteza katecholamin. PNMT — N-mety łotra nsferaza fenyloetanoloaminowa. (Według Goldfien A.: The adrertal medulla, w: Greenspan F. S., Forsharn P. H, (red): Basie and Clinical Endocrinoiogy. Wyd. 2, Appleton and Lange, 1986, w modyfikacji, za zezwoleniem).

na jest w innych zakończeniach nerwowych, skąd dociera do komórek docelowych drogą krwi. Adrenalina i noradrenalina mogą być syntetyzowane i magazynowane przez komórki rdzenia nadnerczy i innych tkanek chromochkmnych. Konwersja tyrozyny do adrenaliny obejmuje następujące kolejne reakcje: 1) hydroksylację pierścienia benzenowego, 2) dekarboksylację i 3) hydroksylację łańcucha bocznego oraz 4) N-metylację. Szlak biosyntezy katecholamin i udział w niej poszczególnych enzymów przedstawiono na ryc. 50-1, na ryc. 50-2 zaś przedstawiono schemat ich biosyntezy w komórce c hromochło nnej, Hydroksylaza tyrozynowa jest enzymem decydującym o wydajności biosyntezy katecholamin Tyrozyna jest bezpośrednim prekursorem katecholamin, zaś hydroksylaza tyrozynowa (4-monooksygenaza monofenolowa) jest enzymem krytycznym w biosyntezie tych związków, decydującym o jej nasileniu. Hydroksylaza tyrozynowa występuje tylko w tkankach wytwarzających katecholaminy i to w postaci bądź rozpuszczonej, bądź związanej z ziarnistościami. Działa ona jako oksydoreduktaza z tetrahydropterydynąjako koenzymem, przekształcając L-tyrozynę do L-dihydroksyfenyloalaniny (L-dopa). Jako enzym decydujący o nasileniu biosyntezy katecholamin, hydroksylaza tyrozynowa podlega róŜnym regulacjom. NajwaŜniejszym mechanizmem jest hamowanie jej aktywności przez same katecholaminy (hamowanie mechanizmem sprzęŜenia zwrotnego), które współzawodniczą z hydroksylaza o koenzym pterydynowy tworząc z tym ostatnim zasadę Schiffa. Hydroksylazę tyrozynowa hamuje kompetycyjnie równieŜ cały szereg pochodnych tyrozyny, w tym a-metyl o tyrozyna. Związek ten stosowany jest sporadycznie w leczeniu stanu chorobowego przebiegającego z nadmiarem katecholamin u chorych z guzem chromochłonnym, chociaŜ znane są inne, bardziej skuteczne związki obciąŜone mniej licznymi objawami ubocznego działania. Trzecia grupa związków hamuje hydroksylazę tyrozynowa, chelatując Ŝelazo, będące kofaktorem tego enzymu. Przykładem takiego związku jest a, a'-dipirydyl. Katecholaminy nie przenikają przez barierę krew-mózg; oznacza to, Ŝe muszą one być syntetyzowane na miejscu, tj. w samym mózgu. W określonych chorobach ośrodkowego ukła-

HORMONY RDZENIA NADNERCZY / 647 PŁYN POZAKOMORKOWY

Komórka chromochłonna

PŁYN POZAKOMORKOWY

Tyrozyna EINE

+

DBH ATP Chromogranina A związki 0-adre-© nerglczne I chaiinergiczne 0 związki K-adfenarglczne

Wapfi

Ryc. 50-2. Schemat biosyntezy katechoiamin w komórce chromochtonnej. TH — hydroksylaza tyrozynowa, DD — dekarboksylaza dopa, PNMT—N-metylotransferazafenyloetanoloa/ninowa, DBH — (J-hydroksylazadopaminowa, ATP-— adenozynotrifosforan. Biosynteza katecholamin odbywa się w cytoplazmie i w róŜnych ziarnistościach komórki rdzenia nadnerczy. Niektóre ziarnistości zawierają adrenalinę (epineirynę) (E), inne noradrenaiinę, zaś jeszcze inne — obydwa hormony. Po stymulacji cała zawartość ziarnistości jest uwalniana do płynj pozakomórkowego.

du nerwowego, np. w chorobie Parkinsona stwierdza sie lokalne upośledzenie syntezy dopaminy. W odróŜnieniu od dopaminy, L-dopa, będąca prekursorem dopaminy, bardzo łatwo przenika przez barierę krew-niózg, dzięki czemu jest "waŜnym lekiem stosowanym w terapii choroby Parkinsona. Dekarboksylaza dopa jest obecna we wszystkich tkankach Ten rozpuszczony w cytoplazmie enzym wymaga obecności fosforanu pirydoksalu w procesie konwersji L-dopa do 3,4-dihydroksyfenylo etyloaminy (dopaminy). Związki strukturalnie podobne do L-dopa, np. L-metylodopa, są kom petycyjnym i inhibitorami tej reakcji. Chlorowcowe związki tworzą z L-dopa zasadę Schiffa oraz hamują reakcję dekarboksylacji, a-Metylodopa oraz spokrewnione z nią związki, takie jak 3-hydroksytyramina (pochodna tyraminy), a-metyl o tyrozyna i metaraminol są skutecznymi lekami stosowanymi w niektórych postaciach etiologicznych nadciśnienia tętniczego(i-Hydroksylaza dopaminowa (Poksydaza dopaminowa) (DBH) katalizuje konwersję dopaminy do noradrenaliny DBH jest oksydaza o mieszanej funkcji. Nośnikiem elektronów dla tego enzymu jest askor-

binian, zaś jego modulatorem fumaran. W centrum aktywnym tego enzymu znajduje się miedź. DBH występuje prawdopodobnie w specjalnej frakcji subkomórkowej komórek rdzenia nadnerczy, tj. w ziarnistościach wydzielniczych. Tak więc konwersja dopaminy do noradrenaliny zachodzi w tej strukturze śródkomórkowej. DBH jest uwalniana z rdzenia nadnerczy i zakończeń nerwowych wraz z noradrenaliną. W odróŜnieniu od noradrenaliny nie moŜe ona ponownie wrócić do zakończeń nerwowych na zasadzie powrotnego wychwytu. N-Metylotransferaza fenyloetanoloaminy (PNMT) katalizuje powstawanie adrenaliny Enzym ten, rozpuszczony w cytoplazmie, katalizuje N-metylację noradrenaliny, dzięki czemu powstaje adrenalina. Reakcja ta zachodzi w komórkach rdzenia nadnerczy syntetyzujących ten hormon. Skoro PNMT jest enzymem rozpuszczalnym, przyjmuje się, Ŝe reakcja konwersji noradrenaliny do adrenaliny zachodzi w cytoplazmie. Syntezę PNMT indukują hormony glukokortykoidowe, docierające z kory do rdzenia nadnerczy śródnadnerczowym układem wrotnym. Układ ten sprawia, Ŝe stęŜenia steroidów we krwi rdzenia są 100-krotnie wyŜsze niŜ we krwi obwodowej. Wydaje się, Ŝe tak duŜe stęŜenie glukokortykoidów w rdzeniu nadnerczy jest niezbędne do indukcji PNMT.

648 / ROZDZIAŁ 50

KATECHOLAMINY SĄ MAGAZYNOWE I UWALNIANE

KATECHOLAMINY ULEGAJĄ SZYBKIEJ METABOLIZACJI

Magazynowanie w ziarnistościach chromochłonnych

Bardzo niewielkie ilości adrenaliny (mniej niŜ 5%) są wydalane z moczem. Katecholaminy ulegają szybkiej metabolizacji pod wpływem Ometylotransferazy katecholowej i oksydazy monoaminowej. W wyniku działania tych enzymów powstają nieaktywne metabolity O-metyiowane oraz produkty deaminacji katecholamin (ryc. 50-3). Większość katecholamin jest substratem dla obu wymienionych enzymów, zaś reakcje metylacji i oksydacji mogą zachodzić w dowolnej kolejności. O-Metylotrartsferaza katecholowa (COMT) jest enzymem cytozolowym występującym w wielu tkankach. Katalizuje ona przyłączenie grupy metylowej do pierścienia benzenowego zwykle w pozycji 3 (meta) róŜnych katecholamin. Do reakcji tej potrzebne są kation dwuwartościowy oraz adenozylometionina jako donor grupy metylowej. Produktami tej reakcji są, zaleŜnie od wyjściowego substratu, kwas homowanilinowy, normętanefryna i metanefryna. Oksydazamonoaminowa (MAO) jest oksydoreduktazą katalizującą deaminację monoamin. Występuje ona w licznych tkankach, lecz największe jej stęŜenie jest w wątrobie, Ŝołądku, nerkach i jelitach. Opisano co najmniej 2 izozymy MAO. Izozym MAO-A, występujący w tkance nerwowej, katalizuje deaminację serotoniny, adrenaliny i noradrenaliny. Izozym MAO-B spotykany jest w tkankach nienerwowych i wykazuje największą aktywność w stosunku do 2-fenyloetyloaminy i benzyloaminy. Dopamina i tyramina ulegają metabolizacji pod wpływem obu izozymów. Wiele badań poświęcono zaleŜności między zaburzeniami psychicznymi o podłoŜu afektywnym a wzrostem lub spadkiem aktywności tych izozymów. Inhibitory MAO znalazły zastosowanie w leczeniu nadciśnienia tętniczego i depresji, ich zastosowanie ograniczają jednak powaŜne interakcje zachodzące ze środkami spoŜywczymi i lekami zawierającymi aminy sympatykomimetyczne. Pochodne O-raetyłowe katecholamin ulegają dalszym przemianom, tj. koniugacji z kwasem glukuronowym lub siarkowym. Liczba wytwarzanych metabolitów katecholamin jest ogromna. Wśród nich dwie grupy metabolitów mają znaczenie diagnostyczne, poniewaŜ wydalane są z moczem w ilościach dających się zmierzyć. Do pierwszej grupy nale-

Komórki rdzenia nadnerczy zawierają chromochłonne ziarnistości. Są to struktury śródkomórkowe zdolne do biosyntezy, wychwytu, magazynowania i wydzielania katecholamin. Ziarnistości te zawierają oprócz katecholamin wiele innych substancji, takich jak ATP-Mg2+, Ca2+, DBH i białko — chromagraninę A. Katecholaminy wchodzą do tych ziarnistości ATP-zaleŜnym mechanizmem transportowym i wiąŜą ten nukleotyd w stosunku 4; I (stosunek hormonu do ATP). Noradrenalina, magazynowana w tych ziarnistościach, moŜe je opuścić, by następnie ulec N-metylacji. Tak powstała adrenalina wchodzi do nowej populacji ziarnistości.

Uwalnianie katacholamin jest zaleŜne od jonów Caa+ Pobudzenie nerwów rdzenia nadnerczy powoduje zlanie się błon ziarnistości zapasowych z błoną plazmatyczną, co jest przyczyną egzocytozy i tym samym uwalniania noradrenaliny i adrenaliny. Proces ten jest zaleŜny od Ca2+, i jak większość zjawisk związanych z egzocytozą, jest pobudzany przez związki cholinergiczne i |3-adrenergiczne, natomiast hamowany przez związki a-adrenergiczne (ryc. 50-2). Katecholaminy i ATP są uwalniane w tych samych proporcjach, w jakich występują w ziarnistościach. Wraz z nimi uwalniane są równieŜ inne składniki wymienionych ziarnistości, takie jak DBH, jony wapnia i chromagranina. Powrotny wychwyt katecholamin przez zakończenia nerwowe jest waŜnym mechanizmem oszczędzania tych hormonów i szybkiego przerwania hormonalnej i neuroprzekaźnikowej ich czynności. W odróŜnieniu od nerwów współczulnych, rdzeń nadnerczy nie dysponuje mechanizmem powrotnego wychwytu i magazynowania raz wydzielonych katecholamin. Uwolniona z nadnerczy adrenalina dostaje się do wątroby i mięśni szkieletowych, gdzie ulega szybkiej metabolizacji. Tylko bardzo małe ilości noradrenaliny nadnerczowej docierają do tkanek obwodowych. We krwi katecholaminy krąŜą jako luźno związane z albuminami. Ich okres biologicznego półtrwania jest niezwykle krótki (wynosi 10—30 s).

HORMONY RDZENIA NADNERCZY / 649 Kwas difiydroksyfenyloocłowy

3- Metoksytyramlna

, CHaO

OH

Kwas hamowań III nowy

Kwas 3-metoksy-4-hy(Jrok l d t

Ryc. 50-3. Przemiana katecholamin przy udziale O-metylotransferazy kaiecholowej (COMT) i oksydazy monoaminowe) (MAO). (Według: Goldfien A.: The adrenal medulla, w: Greenspan F. S. i Forsham P. H. (red.): Basie andCiinical Endocrinotogy. wyd, 2,Appleton and Lange, 1986, reprodukcja za zezwoleniem).

Ŝą mełanefryny, do których naleŜą metoksypochodne adrenaliny i noradrenaliny. Do drugiej grupy metabolitów zalicza sie produkt deaminacji O-metylowanej pochodnej adrenaliny i noradrenaliny, ij, kwas 3-metoksy*4-hydroksymigdalowy (określany równieŜ jako kwas wanilino-migdalowy — VMA) (ryc. 50-3).

U 95% chorych z guzem chromochłonnym ilość wydalanych z moczem metanefryn i VMA jesl wzmoŜona. Oznaczanie wymienionych metabolitów cechuje sie znakomitą precyzją diagnostyczną, szczególnie wtedy, kiedy równolegle oznacza się katecholaminy w osoczu lub w moczu.

SYNTEZA KATECHOLAMIN JEST REGULOWANA BODŹCAMI NERWOWYMI Pobudzenie nerwu trzewnego, którego włókna przedzwojowe docierają do rdzenia nadnerczy, wywołuje uwalnianie się (mechanizmem egzocytozy) katecholamin, nośnikowych białek

zawartych w ziarnistościach sekrecyjnych oraz DBH. Stymulacja ta regulowana jest przez podwzgórze i pień mózgowy, chociaŜ nieznana jest dokładna pętla sprzęŜenia zwrotnego. Pobudzenie nerwu trzewnego wzmaga równieŜ syntezę katecholamin. Ostry stres zwiększa syntezę noradrenaliny, nie wpływając na ilość hydroksylazy tyrozynowej, chociaŜ aktywność jej wzrasta. Hydroksyłaza tyrozynowa jest substratem dla cAMP-zaleŜnej kinazy białek, co sugeruje, Ŝe wzrost aktywności hydroksylazy występujący po stymulacji nerwowej spowodowany jest jej fosforylacją. Przewlekły stres, któremu towarzyszy aktywacja układu wspólczulnego, indukuje syntezę hydroksylazy tyrozyaowej, przez co ilość tego enzymu wzrasta. Doniesiono równieŜ o podobnej indukcji syntezy DBH. Indukcja wymienionych dwóch enzymów szlaku biosyntezy katecholamin jest wyrazem mechanizmów adaptacyjnych na stres fizjologiczny i zaleŜy od czynników nerwowych (indukujących syntezę hydroksylazy tyrozynowej i DBH) i endokrynnych (indukujących PNMT).

650 / ROZDZIAŁ 50 KLASYFIKACJA KATECHOLAMIN MOśE BYĆ OPARTA NA MECHANIZMIE ICH DZIAŁANIA Mechanizm działania katecholamin przyciąga! uwagę badaczy przez blisko jedno stulecie. Rzeczywiście, wiele ogólnych koncepcji dotyczących biologii receptorów i działania hormonów bierze swój początek w badaniach nad mechanizmem działania katecholamin. Katecholaminy działają za pośrednictwem dwóch większych klas receptorów. Są one określane jako receptory a-adrenergiczne i P-adrenergiczne, przy czym kaŜda z nich obejmuje dwie podklasy, tj. a, i a2, i pt i P2. Klasyfikacja ta oparta jest na sile wiązania się róŜnych agonistów lub antagonistów do wymienionych receptorów. Adrenalina wiąŜe się i aktywuje zarówno receptory a, jak i p. Jej efekt biologiczny w tkankach zawierających obydwie klasy receptorów zaleŜeć będzie od powinowactwa tego hormonu do poszczególnych rodzajów receptorów. Noradrenalina w stęŜeniach fizjologicznych wiąŜe się głównie z a-receptorami. Struktura receptora padrenergicznego jest znana Klonowanie genu i cDNA dla receptora Padrenergicznego ssaków ujawniło kilka niespodziewanych cech. Po pierwsze wskazano, Ŝe gen nie zawiera intronów, naleŜy więc do grupy genów ssaków (do takich genów naleŜą geny

histonów i interferonów) nie posiadających tych struktur. Po drugie receptor fi-adrenergiczny wykazuje bliską homologię 2 rodopsyną (przynajmniej w zakresie trzech fragmentów peptydowych), tj. z białkiem, zapoczątkowującym konwersję bodźca świetlnego w reakcję wzrokową. Inne podobieństwa dyskutowane są w dalszej części rozdziału. Trzy receptory adrenergiczne naleŜące do wymienionych wyŜej podgrup sprzęŜone są z układem cyklazy adenylanowej Hormony wiąŜące się z receptorami Px i P2 aktywują cyklazę adenylanową, natomiast hormony wiąŜące receptor a2 ją hamują (ryc. 45-4 i tab. 45-4). Po związaniu hormonu przez receptor dochodzi do przyłączenia białka G, które wiąŜe sic z kolei z GTP. W wyniku tych reakcji dochodzi albo do stymulacji (jeśli związaniu uległo białko Gs) albo do hamowania (w razie wiązania białka Gj przez kompleks hormon-receptor) cyklazy adenylanowej, tj. do stymulacji lub hamowania syntezy cAMP. Reakcja zatrzymuje się w chwili hydrolizy GTP 'przez GTP-azę połączoną z podjednostką a receptora (p. ryc. 45-4). Receptory ax są sprzęŜone z procesami zmieniającymi śródkomórkowe stęŜenia wapnia lub (i) modyfikującymi przemianę fosfatydyloinozytydów (p. rozdz. 45). W tej reakcji uczestniczy odrębny kompleks zawierający białko G.

Tabela 50-1. Skutki biochemiczne i fizjologiczne stymulacji poszczególnych typów receptorów adrenerl gicznych ** Receptory ^1

Receptory -i2

Receptory [■'.,

Wzrost glikogenolizy Rozkurcz mięśni gładkich Stymulacja lipolizy Skurcz mięśni gładkich Ŝołądka i jelit Skurcz Wzrost liczby i siły skurnaczyń krwionośnych czu mięśnia sercowego mięśni gładkich niei dróg moczowo-płcio- których łoŜysk n a czyn i o wych wych Hamowanie: lipolizy uwalniania reniny agregacji płytek sekrecji insuliny

Receptory p2 Wzrost glukoneogenezy wątrobie Wzrost glikogenol izy w wątrobie Wzrost gfikogenolizy w mięśniach Wzrost uwalniania: insuliny glukagonu reniny Rozkurcz mięśni gładkich oskrzeli naczyń krwionośnych dróg moczowo-płciowych Ŝołądka i jelit

HORMONY RDZENIA NADNERCZY / 651 ISTNIEJE CZYNNOŚCIOWE PODOBIEŃSTWO MIĘDZY RECEPTOREM KATECHOLAMINOWYM A UKŁADEM REAKCJI WZROKOWEJ

Stymulacja rodopsyny przez światło indukuje wiązanie jej z transducyną, tj. kompleksem zawierającym białko G, którego podjednostka a takŜe wiąŜe się z GTP. Z kolei aktywowane białko G pobudza fosfodiesteraze. hydrolizującą cGMP. W wyniku tej reakcji zostają zamknięte kanały jonowe zlokalizowane w błonie komórek pręcikowych siatkówki, co wyzwala reakcję wzrokową. Reakcja kończy się w chwili hydrolizy przez GTP-azę (połączoną z podjednostka a receptora) związanego z nią GTP. Zestawienie niektórych efektów biochemicznych i fizjologicznych zapoczątkowanych pobudzeniem poszczególnego typu receptora adrenergicznego zawiera tab. 50-1. Aktywacja fosfoprotein przez cAMP-zaleŜną kinazę białek (p, ryc. 45-5) jest przyczyną wielu efektów biochemicznych wywołanych przez adrenalinę. GUZY CHROMOCHŁONNE WYWODZĄ SIĘ Z RDZENIA NADNERCZY Guzów tych zwykle nie wykrywa się do chwili, kiedy nie wytwarzają i wydzielają ad-

renaliny lub norad/enaliny w ilościach wywołujących cięŜki zespół nadciśnienia tętniczego. W guzach chromochłonnych stosunek noradrenaliny do adrenaliny jest często podwyŜszony. Ten fakt moŜe tłumaczyć róŜnice w obrazie klinicznym występujące między poszczególnymi chorymi, noradrenalina jest bowiem głównie przyczyną nadciśnienia tętniczego, zaś adrenalina — wzmoŜonej przemiany materii.

PIŚMIENNICTWO Cryer PE: Diseases of the adrenal medulla and sympathetic nervous system. Pages 511-550 in: Endocrinology and Metabolism. Felig P et al (ediLors). McGraw-Hill, 1981, Dixon RAF et al: Cloning of the gene and cDNA for mammalian f5-adrenergic receptor and homology with rhodopsin. Naturę (London) 1986;321:75. Exton JH; Mechanisms involved in a-adrenergic phenomena: Role of caicium ion in actions of ca tech olani mes in Kver and other tissues. Am J Physiol 1980;238:E3. Kaupp UB: Mechanism of photoreception in vertebrate vision. Trends Biochem Sci 1986^11:43. Sibley DR, Lefkowitz RJ: Molecular mechanisms of receptor desensitization using the P-adrenergic receptor-coupled adenylate cyclase system as a model. Naturę (London) 1985;317:124. Stiles GL, Caron MG, Lefkowitz RKL: The p-adrenergic receptor: Biochemical mechanisms ofphysiological reguiation. Physiol Rev 1984;64:66).

51

Hormony gonadalne Dary/ K. Granner, MD

WPROWADZENIE Gonady są narządem o podwójnej czynności, tj. wytwarzającym komórki rozrodcze oraz hormony płciowe. Te dwie funkcje realizowane są w bliskim sąsiedztwie anatomicznym, wysokie stęŜenia hormonów płciowych sa bowiem nie-

Skróty uŜywane w tym rozdziale ACTH ABP CBG DHEA DHT E2 FSH

-

GnRH hCG hCS

—

LH MIF

—

3H-OHSD — 17P-OHSD— PL SHBG TBG TEBG

—

hormon adrenokortykotropowy, kortykotropina białko wiąŜące androgeny globulina wiąŜąca kortykosteroidy dehydroepiandrosteron dihydrotestosteron estradiol folitropina (hormon pobudzający pertherzyki Graafa) hormon uwalniający gonadotropiny, gonadoliberyna ludzka gonadotropina kosmówkowa Iud2ka somatomammotropina kosmówkowa lutropina czynnik hamujący przewody Mullera d eh yd rog en aza 3 p - hyd roksy steroidowa dehydrogenaza 17{i-hydroksysteroidowa laktogen łoŜyskowy globulina wiąŜąca hormony płciowe globulina wiąŜąca hormony tarczycy globulina wiąŜąca testosteron i estrogeny

zbędne w miejscu powstawania komórek rozrodczych. Jajniki wytwarzają komórki jajowe i hormony steroidowe — estrogeny i progesteron, gonady męskie (jądra) wytwarzają plemniki i testosteron. Gonady wytwarzają, podobnie jak nadnercza, bardzo liczne steroidy, z których tylko kilka wykazuje aktywność hormonalną. Produkcja tych hormonów podlega ścisłej regulacji na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego, w których uczestniczą przysadka mózgowa i podwzgórze. Hormony gonadalne działają za pośrednictwem mechanizmu jądrowego, podobnego do opisanego dla steroidowych hormonów nadnerczowych.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Prawidłowe funkcjonowanie gonad ma ogromne znaczenie dla procesu reprodukcji i, co za tym idzie, dla przetrwania gatunku. I odwrotnie — zrozumienie fizjologii i biochemii endokrynologicznej związanej z procesem reprodukcji stanowi podstawę wielu metod antykoncepcyjnych. Ponadto hormony gonadalne wykazują równieŜ inne waŜne działanie, np. działają anabolicznie i są niezbędne dla utrzymania prawidłowego stanu skóry, kości i mięśni.

JĄDRA WYTWARZAJĄ TESTOSTERON (MĘSKI HORMON PŁCIOWY) I PLEMNIKI (MĘSKIE KOMÓRKI ROZRODCZE) Te funkcje realizowane są przez trzy typy wyspecjalizowanych komórek; 1) sperm a t ogonie i bardziej zróŜnicowane komórki rozrodcze, umiejscowione w kanalikach krętych, 2) komórki Leydiga (określone równieŜ jako komórki

HORMONY GONADALNE / 653

śródmiąŜszowe) rozrzucone w tkance łącznej (zlokalizowanej pomiędzy kanalikami krętymi zawierającymi nabłonki plemnik o twórcze) i wytwarzające testosteron pod wpływem stymulacji LH oraz 3) komórki Sertolego wytwarzające błonę podstawną dla nabłonka plemnikotwórczego w kanalikach krętych oraz środowisko dia prawidłowego róŜnicowania i dojrzewania komórek rozrodczych. Spermatogenezę pobudzają przysadkowa fblitropina (FSH) i lutropina (LH). Wymaga ona środowiska sprzyjającego zróŜnicowaniu komórek rozrodczych oraz stęŜenia testosteronu znacznie wyŜszego od występującego w krąŜeniu systemowym. Ten warunek jest spełniony, poniewaŜ komórki Leydiga (wytwarzające testosteron) znajdują się w bliskości nabłonka plemnikotwórczego kanalików krętych. Pomimo udziału licznych enzymów w syntezie steroidów gonadalnych, enzym odszczepiający łańcuch boczny cholesterolu oraz dehydrogenaza 3|hydroksysteroidowa są enzymami katalizującymi krytyczne etapy tej syntezy Androgeny gonady męskiej wytwarzane są przez komórki Leydiga zlokalizowane w tkance śródmiąŜszowej. Bezpośrednim prekursorem steroidów gonadalnych jest, podobnie jak i steroidów nadnerczowych, cholesterol. Etapem krytycznym, decydującym o nasileniu syntezy androgenów gonadalnych, jest odszczepienie łańcucha bocznego cholesterolu. Proces konwersji cholesterolu do pregnenolonu jest taki sam zarówno w nadnerczach, jądrach, jak i jajnikach. W ostatnich dwóch narządach proces ten pobudzany jest przez LH a nie przez ACTH. Konwersja pregnenolonu do testosteronu wymaga działania 5 enzymów. Są nimi: 1) dehydrogenaza 30-hydroksysteroidowa (3j3-OHSD), 2) A5'4 izomeraza, 3) 17a-hydroksylaza, 4) C^^-liaza i 5) dehydrogenaza 170-hydroksysteroidowa (17p-OHSD). Ten szlak biosyntezy testosteronu określony jako szlak progesteronowy (Jub szlak A4) przedstawiony jest po prawej stronie ryc. 51-1. Konwersja pregnenolonu do testosteronu moŜe się równieŜ odbyć szlakiem dehydroepiandrosteronowym (zwanym równieŜ szlakiem A5) przedstawionym po lewej stronie ryc. 51-1. W jądrach ludzkich szlak A4 jest szlakiem preferowanym. PoniewaŜ jądra ludzkie są rzadko dostępne do badań,

większość informacji dotyczących szlaków biosyntezy męskich hormonów gonadalnych uzyskano na materiale zwierzęcym. MoŜliwe jest występowanie znacznych róŜnic międzygatunkowych w tym zakresie. Wymienionych 5 enzymów jest zlokalizowanych we frakcji mikrosomamej jąder szczurzych. Stwierdza się bliskie czynnościowe sprzęŜenie między aktywnością 3p-OHSD i ASA-izomerazy oraz między aktywnością 17a-hydroksylazy i C]7.2O-liazy. Te pary enzymów pokazane są na ryc. 51-J przedstawiającej ogólną sekwencję poszczególnych reakcji oraz na ryc. 51-2, ilustrującej przykładowo schemat biosyntezy androgenów w błonach mikrosomalnych jądra szczura. Ta druga rycina pokazuje, w jaki sposób poszczególne substraty biosyntezy testosteronu wchodzą do przestrzeni mikrosomalnej oraz, w jaki sposób przechodzą z jednego etapu sziaku A* do następnego. Skoro występują 4 potencjalne substraty wobec tylko jednej 3JJ-OHSD, moŜliwe są liczne szlaki alternatywne. Tak więc o rodzaju szlaku biosyntezy androgenów decyduje prawdopodobne stęŜenie substratu znajdującego się w sąsiedztwie poszczególnych enzymów uczestniczących w tym procesie. Wiązanie w błonach mikrosomalnych moŜe wywołać taki gradient.

Dihydrotestosteron (DHT) powstaje z testosteronu przez redukcję pierścienia A szkieletu steroidowego przez Ba-reduktazę. Jądra ludzkie wytwarzają ok. 50 i00 jig DHT na dobi, lecz większość DHT pochodzi z konwersji w tkankach obwodowych (p. niŜej). Jądra wytwarzają równieŜ małe, choć znaczące ilości 170-estradiolu (E2), będącego Ŝeńskim hormonem płciowym, choć większość E 2 wytwarzana przez męŜczyznę pochodzi z aromatyzacji testosteronu i androstendionu przez tkanki obwodowe. Przyjmuje się, Ŝe w produkcji E2 uczestniczą komórki Leydiga i Sertolego oraz nabłonek plemnikotwórczy w kanalikach krętych. Znaczenie E2 u męŜczyzny nie zostało dotychczas określone, choć wydaje się, Ŝe moŜe uczestniczyć w regulacji wydzielania FSH. Występowanie zbyt wysokich stęŜeń E2 oraz zmian ilorazu stęŜenia wolnego E2 do wolnego testosteronu wiąŜe się z pojawieniem gmekomastii (powiększeniem gruczołu sutkowego u męŜczyzn) w okresie pokwitania oraz w okresie po pokwitaniu, szczególnie u osób starszych oraz chorych z przewlekłą chorobą miąŜszu wątrobowego lub z nadczynnością tarczycy.

654 / ROZDZIAŁ 51 C=0

„oJCDr

Progesteron iii

~

Prag nano ton ii 17a-HYDR0KSYU\ZA

171-HYDHOKSYLAZA

i

i i UJ

CH3

i

LBo„

i

TEROIDC

i 1i7a-Hydrokaypregneno]on i

C^-LIAZA

ł

o

I I

IX

t

O »

^

Dehyd roe p i a n d r oste ro n

—

A DEHYDHOGENAZA 170HYDROKSYSTER0ID0WA

LU

DEHYDROt

J T

ii

C^-LIAZA

i1

(

17ct - Hy d ro ksy p rog estero n

—XiJ~^ Androstendlon

DEHYDROGENAZA 170HYDROKSYSTEROIDOWA

T j

^

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

A*-AndroEtendlol

Testosteron

5

Rvo. 51 -1. Szlaki biosyntezy testosteronu Szlak po stronie lewej określany jest jako szlak A lub szlak dehydroepiandrosteronowy, zaś szlak przedstawiony po stronie prawej — jako szlak A* lub szlak progesteron owy.

HORMONY GONADALNE / 655 Trzy warstwy stateczki śródplazmatycznej 17a- Hydroksyprogesleron

Pregnenolon

A

i* Ryc. 51-2. Przykładowy schemat biosyntezy Warstwy hydrofobowe

androgenu w błonie mikrosomalnej jąder. Przebieg błony jest horyzontalny,

prawdopodobnie tak jak w komórce. W preparatach mikrosomalnych błony te tworzą pęcherzyki. A — androstendion, T — testosteron. (Według; DeGroot L. J.: Endocrinology, tom 3, Grune and Stratton, 1979, za zezwoleniem), _________________________________________________

Produkcja hormonalna jąder jest w znaczącym stopniu zaleŜna od wieku. Testosteron jest głównym hormonem u płodu i nąworodka szczurzego, lecz juŜ krótko po urodzeniu jądra wytwarzają tylko androsteron. Zdolność syntetyzowania testosteronu przez jądro zostaje przywrócona w okresie pokwitania, po czym utrzymuje się przez całe Ŝycie. Podobne obserwacje poczyniono u innych gatunków zwierząt i wydaje się, Ŝe równieŜ u człowieka występują zmiany syntezy androgenów przez jądra zaleŜne od wieku. Testosteron wiąŜe się ze swoistym białkiem osocza U większości ssaków, w tym i u człowieka, w osoczu krwi stwierdza się p-głobulinę wiąŜącą

Tabela 51-1. Wiązanie hormonów do globuliny wiąŜącej hormony płciowe (SHBG) Steroidy ulegające wiązaniu

Testosteron 17 p-Estradiol D i hy d rotestoste ro n Inne 17 fS-hydroksysteroidy Estron

Steroidy nie wiąŜące się Androgeny koniugowane 17 a-Testosteron Dehydroepiandrosteron Kortyzol Progesteron

testosteron, odznaczającą się swoistością, lub teŜ wysokim powinowactwem i ograniczoną pojemnością (tab. 51-1). Białko to, zwykle określane jako globulina wiąŜąca hormony płciowe (SHBG — sex-hormone binding globulin) lub globulina wiąŜąca testosteron i estrogeny (TEBG — testosterone-estrogen-binding globulin) wytwarzane jest w wątrobie. Jego synteza wzrasta pod wpływem estrogenów (u kobiet stęŜenie SHBG w surowicy krwi jest 2-krotnie wyŜsze niŜ u męŜczyzn) oraz u chorych z pewnymi chorobami wątroby lub z nadczynnością tarczycy, natomiast ulega obniŜeniu pod wpływem androgenów, w miarę starzenia się oraz w niedoczynności tarczycy. Wiele z wymienionych czynników wpływa równieŜ na wytwarzanie CBG (p. rozdz. 44) i TBG (p. rozdz. 47). PoniewaŜ SHBG i albuminy wiąŜą 97—99% krąŜącego we krwi testosteronu, tyiko drobna frakcja tego hormonu występuje w surowicy w postaci wolnej (biologicznie aktywnej). Główna funkcja SHBG wydaje się polegać na ograniczaniu stęŜenia wolnego testosteronu w surowicy krwi. Testosteron wykazuje większe powinowactwo do SHBG niŜ estradiol (tab. 51-2). Dlatego teŜ zmiana stęŜenia SHBG powoduje większe zmiany stęŜenia wolnego testosteronu niŜ wolnego estradiolu. Wzrost stęŜenia SHBG w surowicy, występujący u osób starych ora2 chorych z marskością wątroby lub (i) nadczyn-

656 / ROZDZIAŁ 51

nością tarczycy, jest przyczyną wzrostu ilorazu stęŜenia wolnego E3 i stęŜenia wolnego testosteronu oraz stwierdzanych u nich objawów estrogenizacji. We krwi Ŝylnej jąder stwierdza się obecność licznych steroidów. Testosteron jest jednak głównym steroidem wytwarzanym przez jądra osób dorosłych. Dobowe wytwarzanie testosteronu wynosi u zdrowych osób dorosłych ok. 5 mg. Podobnie jak inne steroidy testosteron uwalniany jest do przestrzeni pozakomorkowej natychmiast po jego syntezie. Wiele metabolitów testosteronu jest nieaktywnych, podczas gdy inne np. dihydrotestosteron i estradiol wykazują zwiększoną lub zróŜnicowaną aktywność

Tabela 51-2. PrzybliŜone powinowactwa steroidów do białek wiąŜących surowicy* SHBG" 5

Estradiol Estron Androstendion Testosteron Dihydrotestosteron Progesteron Kortyzol

CBG" >1O

>10

>100

2 1

>100 >100

>100 >100

2 3

Według Stiteri P.K., Febres F.: Ovarian hormone synthesis, circulation and mechanism of action, str. 1401; w: Endocrinology, tom 3, pod redakcją DeGroot L.J., Grune and Stratton, 1979, w adaptacji autora rozdziału. Powinowactwo wyraŜone jest jako Kd ilości x molowej 10".

Szlaki metaboliczne. Przemiana testosteronu odbywa się dwoma szlakami. W jednym z nich zachodzi oksydacja w pozycji 17, w drugim natomiast redukcja podwójnego wiązania pierścienia A oraz grupy ketonowej w pozycji 3. Przemiana pierwszym szlakiem zachodzi w licznych tkankach w tym i w wątrobie; produktami tego szlaku są 17-ketosteroidy, które są zwykle nieaktywne lub mniej aktywne od hormonu macierzystego. Przemiana drugim szlakiem jest mniej skuteczna i zachodzi głównie w tkankach docelowych; jest on źródłem silnego metabolitu — DHT.

Metabolity testosteronu. NajwaŜniejszym metabolitem testosteronu jest DHT. W wielu tkankach, w tym w pęcherzykach nasiennych, gruczole fokowym, zewnętrznych narządach płciowych i w niektórych obszarach skóry DHT jest aktywną postacią hormonu. StęŜenie DHT u dorosłego męŜczyzny stanowi 1/10 stęŜenia testosteronu. W ciągu doby po-

wstaje ok. 400 ug DHT, natomiast ok. 5 mg testosteronu. Reakcję konwersji testosteronu do DHT katalizuje NADPH-zaleŜna 5-oc-reduktaza (p. niŜej). Testosteron moŜe więc być uznany za prbhormon, poniewaŜ ulega przekształceniu do znacznie silniej działającego związku (dihydrotestosteronu) i większość tej konwersji odbywa się poza jądrami. Maty odsetek testosteronu ulega takŜe konwersji do estradioiu poprzez aromatyzację, tj. reakcję, która jest szczególnie waŜna w mózgu, gdzie hormony te są pomocne w kształtowaniu zachowania płciowego zwierzęcia. Inny silny androgen, androstandiol, wytwarzany jest równieŜ z testosteronu.

OH

15a-Reclulctazal

Testosteron

CWhytJrotestosteron (DHT)

HORMONY GONADALNE / 657

Główne metabolity I7-ketosteroidowe — androsteroff i ctiucholannlon — ulegają koniugacji z kwasem glukuronowym lub siarkowym tworząc rozpuszczalne w wodzie glukuronidy iub siarczany, łatwo wydalane z ustroju. WIELE HORMONÓW UCZESTNICZY W REGULACJI HORMONALNEJ JĄDER LH pobudza steroidogenezę w jądrach LH pobudza steroidogenezę i wytwarzanie testosteronu, wiąŜąc się z receptorami błony plazmatycznej komórek Leydiga (podobny receptor dla LH stwierdza się w komórkach ciałka Ŝółtego jajnika) oraz pobudzając cyklazę adenylanową i, co za tym idzie, zwiększając śródkomórkowe stęŜenie cAMP. W wyniku takiego działania nasila się reakcja odszczepienia łańcucha bocznego od cząsteczki cholesterolu. Tak wiec istnieje podobieństwo między działaniem LH na jądro i ACTH na nadnercza. Testosteron jest ogniwem mechanizmu sprzęŜenia zwrotnego działającym hamująco na uwalnianie lub (i) syntezę GnRH w podwzgórzu (ryc. 51-3). Spermatogeneza regulowana jest przez FSH i testosteron FSH wiąŜąc się z komórkami Sertolego pobudza syntezę biafka wiąŜącego androgeny (ABP — androgen binding protein). ABP jest glikoproteiną wiąŜącą testosteron. ABP róŜni się od śródkomórkowego receptora androgeno-

wego, natomiast jest homologiczny do SHBG. ABP wydzielane jest do światła kanalików krętych. W procesie tym testosteron, wytwarzany przez komórki Leydiga, zostaje przeniesiony do miejsca spermatogenezy, gdzie obecny jest w bardzo duŜym stęŜeniu. Jest to krytyczny etap spermatogenezy, poniewaŜ normalne stęŜenia testosteronu we krwi obwodowej lub osiągalne przy leczeniu substytucyjnym są niewystarczające dla tego procesu. Androgeny wpływają, na kilka złoŜonych procesów fizjologicznych Androgeny, głównie testosteron i DHT, uczestniczą w: 1) róŜnicowaniu pici, 2) spermatogenezie, 3) rozwoju drugorzędowych cech płciowych i struktur godowych, 4) przemianach, anabolicznych i regulacji genowej oraz 5) kształtowaniu się męskiego profilu behawioralnego (ryc. 51-3). Liczne tkanki docelowe, uczestniczące w tych procesach^ dzieli się na takie, które reagują na testosteron, i pozostałe, reagujące na DHT, Klasycznymi narządami docelowymi dla DHT (wykazującymi teŜ największą aktywność 5-cc-reduktazy) są: gruczoł krokowy, pęcherzyki nasienne, zewnętrzne narządy płciowe oraz skóra okolicy narządów płciowych. Wśród narządów docelowych testosteronu naleŜy wymienić: embrionalne struktury wywodzące się z przewodu Wolffa, spermatogonie, mięśnie szkieletowe, kości, nerki i mózg. Dotychczas nie znaleziono swoistego androgenu uczestniczącego w regulacji pozostałych licznych procesów wymienionych wyŜej.

LH

Regulacja wydzielania gonadolroplny

J

Spemnatofleneza

)

Regulacja aktywności genu ) RóŜnicowanie płciowe przewodu Wotffa I Zewnętrzna wlryllzacja Dojrzewanie pici owe w o kresie po kwi lania Regulacja aktywności ganu KOMÓRKA DOCELOWA

Ryc. 51-3. Mechanizm działania androgenów LH — lutropina, T — testosteron, DHT — dihydrotestosteron, R — receptor androgenowy. (Według: WilsonJ. D. i wsp.:Theendocrinecontro! of małe phenotypic development; Aust J. Biol. Sci. 1983, 36, 101, w modyfikacji autora rozdziału, za zezwoleniem). 42 — Biochemia

658 / ROZDZIAŁ 51

Androgeny działają za pośrednictwem mechanizmu jądrowego, podobnego do opisanego dla steroidów nadnerczowych Aktualną koncepcję działania androgenów przedstawia ryc. 51-3. Wolny testosteron wnika przez błonę plazmatyczna. do wnętrza komórek na zasadzie dyfuzji biernej lub ułatwionej. Komórki docelowe zatrzymują testosteron najpewniej dlatego, Ŝe hormon wiąŜe się ze swoistym receptorem śródkomórkowym. Większość zatrzymanego hormonu stwierdza się w jądrach komórkowych, pomimo znacznych róŜnic występujących w tym zakresie między tkankami. Cytoplazma licznych (chociaŜ nie wszystkich) komórek docelowych zawiera enzym — 5a-reduktazę — przekształcający testosteron w DHT. Jest sprawą sporną, czy istnieją dwa odrębne receptory dla testosteronu i DHT. Przy załoŜeniu, Ŝe istnieje tylko jeden rodzaj receptora, powinowactwo jego do DHT jest wyŜsze od powinowactwa do testosteronu. Pojedyncza mutacja genu u myszy jest przyczyną utraty powinowactwa receptora zarówno do DHT, jak i do testosteronu, co sugeruje, Ŝe mamy do czynienia tylko z jednym rodzajem białka receptorowego. RóŜnice powinowactwa, związane ze zdolnością tkanek docelowych do konwersji testosteronu do DHT, najpewniej decydują o tym, czy aktywny jest kompleks testosteron-receptor, czy teŜ kompleks DHT-receptor. Lokalizacja kompleksu testosteron/DHT-receptor

w jądrze komórkowym jest procesem niezbędnym do wystąpienia działania androgenowego. Wiązanie kompleksu receptor-steroid przez chromatynę jądrową wydaje się wyprzedzać pewien etap aktywacji, zaś swoistość reakcji zapewnia „element odpowiedzi androgenowej". Podobnie jak inne steroidy (i niektóre hormony peptydowe), kompleks testosteron/DHT-receptor aktywuje swoiste geny. Produkty biał-

kowe tych genów są pośrednikami licznych, jeśli nie wszystkich, efektów działania wymienionych hormonów. Testosteron pobudza syntezę białek w drugorzędowych męskich narządach płciowych. Działaniu temu towarzyszy zwykle wzrost ogólnokomórkowego RNA, w tym mRNA, tRNA i rRNA. Innym bardziej swoistym przykładem działania testosteronu jest wpływ tego hormonu na syntezę ABP. Hormon ten zwiększa tempo transkrypcji genu kodującego ABP, co wyraŜa się wzrostem ilości mRNA kodującego to białko. Innym, dobrze przebadanym przykładem, jest aa„— globulina, będąca głównym białkiem wydalanym z moczem u szczurów płci męskiej. Tempo syntezy a2ji globuliny jest proporcjonalne do iloścrkodującego ją mRNA. Z kolei ilość tego ostatniego zaleŜna jest od tempa transkrypcji genu « globuliny. Wszystkie wymienione etapy syn tezy cc2ji ■— globuliny pobudzają androgeny. Nerka jest waŜnym narządem docelowym dla androgenów. Androgeny powodują ogólne powiększenie się tego narządu oraz indukują syn-

KOMÓRKA DOCELOWA KOMÓRKA LEYDIÓA

5a-REDUKTAZA|

Niedobory enzymatyczna w zakresie: odszczeplanla łańcucha bocznego cholesterolu 17a—hydro ksylazy konwersji C„ do C la redukcji grupy ketonowej w pozycji 17 oksydacji pierścienia A do A'-3-ketosteroldow

Niedobór 5a—reduktazy

Zaburzenia receptorowe

Oporność u chorych wykazujących obecność receptora (R + )

Ryc. 51-4. Przyczyny oporności na androgeny Na rycinie pokazano 4 defekty, dla których zidentyfikowano występowanie mutacji. T — testosteron, DHT — dihydrotestosteron, R — receptor androgenowy (Według: Wilson J. D. i wsp.: The endocrine controt of małe phenotypic development; Aust. J. Biol. Sci. 1983, 36, 101, w modyfikacji autora rozdziału, za zezwoleniem).

HORMONY GONADALNE / 659

tezę licznych enzymów u róŜnych gatunków zwierząt,' W kilku narządach docelowych androgeny pobudzają podział komórek. Działanie to jest mało zrozumiałe. Testosteron lub DHT wraz z estradiolem wydają się uczestniczyć w ekstensywnym i niekontrolowanym dzieleniu się komórek gruczołu krokowego stając się przyczyną łagodnego przerostu tego narządu, występującego aŜ u 75% męŜczyzn po 60 rŜ. PATOFIZJOLOGIA MĘSKIEGO UKŁADU ROZRODCZEGO ZWIĄZANA JEST Z DEFEKTAMI HORMONALNYMI Stan chorobowy spowodowany brakiem testosteronu określa się jako hipogonadyzm. Jeśli pojawi się on przed pokwitaniem, wówczas aie dochodzi do rozwoju dru go rzędowych cech płciowych, natomiast jego występowanie u dorosłych powoduje zanik tych ostatnich. Pierwotny hipogoimdyzm charakteryzuje się pierwotnym uszkodzeniem jąder przez proces chorobowy, natomiast hipogonadyzm wtórny jest następstwem upośledzonego wydzielania gonadotropin. Występowanie przypadków izolowanych niedoborów enzymatycznych w szlaku biosyntezy androgenów by to pomocne w określaniu znaczenia poszczególnych jej etapów dla produkcji i działania tych hormonów. Na rycinie 51-4 pokazane są szczeble działania androgenów począwszy od biosyntezy testosteronu do działania poreceptorowego zarówno tego hormonu, jak i DHT. Opisano co najmniej 5 dokładnie zdefiniowanych defektów biosyntezy testosteronu. Ponadto znany jest niedobór 5<x-reduktazy. W wielu przypadkach wykrywa się albo brak receptora DHT, albo testosteron owego, albo teŜ receptor ten jest w jakimś stopniu nienormalny. W końcu w wielu przypadkach wszystkie oznaczalne parametry, w tym równieŜ receptory, są prawidłowe, mimo występowania cech feminizacji o zmiennym nasileniu. W tych ostatnich przypadkach zawsze stwierdza się męski genotyp. Nasilenie klinicznych objawów jest zaleŜne od nasilenia występującego defektu biochemicznego. U chorych z całkowitym brakiem jakiegoś enzymu biosyntezy androgenów stwierdza się fenotyp Ŝeński pomimo występowania genotypu męskiego XY. W odróŜnieniu od niedoboru całkowitego, w niedoborach najła-

godniejszych stwierdza się tylko aberrację w zakresie lokalizacji cewki moczowej. U osobników z genotypem męskim, wykazujących całkowity brak czynnościowo sprawnych receptorów androgenowych, stwierdza się obecność jąder oraz produkcję testosteronu, pomimo występowania całkowitej feminizacji zewnętrznych narządów płciowych (jest to tzw. zespół femiuiŜujących jąder). Jest interesujące, Ŝe nie zidentyfikowano niedoboru w zakresie syntezy lub działania estrogenów, porównywalnego do ww. niedoboru androgenów. JAJNIKI WYTWARZAJĄ śEŃSKIE HORMONY PŁCIOWE (ESTROGENY I PROGESTYNY) ORAZ śEŃSKIE KOMÓRKI ROZRODCZE (KOMÓRKI JAJOWE) Biosynteza i przemiana hormonów jajnikowych są podobne do opisanych dla hormonów męskich Estrogeny tworzą rodzinę hormonów syntetyzowanych w róŜnorodnych tkankach. Głównym estrogenem pochodzenia jajnikowego jest 17 p-estradiol. U innych gatunków zwierząt estrogenem wytwarzanym w większych ilościach w licznych tkankach jest estron. W ciąŜy w łoŜysku wy twa rŜany jest we względnie duŜych ilościach estriol. Ogólny szlak biosyntezy estrogenów oraz lokalizacja subkomórkowa enzymów uczestniczących we wczesnych jej etapach są identyczne z biosyntezą androgenów. Cechy róŜniące biosyntezę estrogenów od androgenów przedstawione są na ryc. 51-5. Estrogeny wytwarzane są drogą aromatyzacji androgenów. W tym złoŜonym procesie występują trzy hydroksylacje z udziałem O 2 i NADPH. Przyjmuje się, Ŝe kompleks enzymatyczny, określany jako aromataza, zawiera oksydazę P-450 o mieszanej funkcji. Jeśli substratem dla tego kompleksu enzymatycznego jest testosteron, produkowany jest estradiol, natomiast jeśli substratem tym jest androstendion — wytwarzany jest estron. Trudne było zdefiniowanie komórek wytwarzających poszczególne steroidy jajnikowe. Obecnie wydaje się, Ŝe w ich syntezie uczestniczą dwa rodzaje komórek. Te komórki są głównym źródłem androstendionu (jest to główny androgen wytwarzany w jajnikach) oraz 17a-hydroksyprogesteronu. Z tego ostatniego steroidu komórki ziarniste wytwarzają estradiol. Proges-

660 / ROZDZIAŁ 51

Cholesterol -

Dehydroepiandrosternn

ł

17«-Hydroteypraononoton-

Pregnenolo

Androstendlon n

17« - Hyd ro ksy p rogester o n -

Inne .» metabolity

Progesteron 170-Eslradiol (E,)

Estron (E,

Inne metabolity

OH

-0H

Kta-Hydrotcsylaza

Estriol Ryc. 51 -5. Biosynteza estrogenów. (Według: Ganong W. F.: Review of Medicsl Physfology, wyd. 13, Appleton and Lange, 1987, w nieznacznej modyfikacji autora rozdziału, za zezwoleniem).

teron jest wytwarzany i wydzielany przez komórki ciałka Ŝółtego, które produkują równieŜ nieco estradiolu. Znamienne ilości estrogenów powstają w tkankach obwodowych drogą aromatyzacji androgenów. U męŜczyzn aromatyzacja testosteronu przez tkanki obwodowe jest źródłem 80% wytwarzanego u nich estradiolu. U kobiet waŜnym substratem dla estrogenów są androgeny nadnerczowe. W dąŜy 50% wytworzonego E2 jest wynikiem aromatyzacji ańdrogenów nadnerczowych. W końcu konwersja androstendiomi w estron jest głównym źródłem estrogenów u kobiet po menopauzie. Aktywność aromatazową stwierdza się w komórkach tłuszczowych oraz w wątrobie,'skórze i w innych tkankach. Nadmierna aktywność tego enzymu wydaje się uczestniczyć w patogenezie zespołu

estrogenizacji występującego u osób starych oraz w takich chorobach, jak marskość wątroby, nadczynność tarczycy i otyłość. Estrogeny i progestyny są w róŜnym stopniu związane z białkami transportowymi osocza Estrogeny związane są z SHBG, zaś progestyny z CBG. Estradiol wiąŜe się z SHBG 5-krotnie słabiej niŜ testosteron lub DHT. W odróŜnieniu od wymienionych steroidów progesteron i kortyzol wykazują małe powinowactwo do tego białka nośnikowego (p. tab. 51-2). Progesteron i kortyzol wykazują prawie takie samo powinowactwo do CBG. Z kolei globulina wiąŜąca kortykoidy (CBG) wykazuje małe powinowactwo do estradiolu i jeszcze mniejsze do testosteronu, DHT lub estronu.

HORMONY GONADALNE / 661

OH

170-Estradlol

Proaesteron

Octan

Wymienione białka nośnikowe nie odgrywają widocznej roli w mechanizmie działania tych hormonów na poziomie komórkowym (podobnie jak w działaniu innych hormonów steroidowych), poniewaŜ prawdopodobnie tylko wolny, nie związany z białkami hormon wykazuje aktywność biologiczną. Białka nośnikowe spełniają rolę krąŜącego rezerwuaru dla wymienionych hormonów. PoniewaŜ wykazują one względnie wielką pojemność wiązania, stanowią one zapewne rodzaj buforu chroniącego ustrój przed nagłymi zmianami stęŜenia hormonów w osoczu krwi. Wielkość klirensu metabolicznego wymienionych steroidów jest odwrotnie proporcjonalna do ich powinowactwa do SHBG. Ten fakt tłumaczy szybsze klirensowanie estronu niŜ estradiolu, oraz szybsze klirensowanie tego ostatniego niŜ testosteronu i DHT. Koniugaty wymienionych hormonów (p. niŜej) nie ulegają wiązaniu ani przez SHBG, ani teŜ przez CBG. W dalszej części rozdziału omawiane są czynniki regulujące produkcję SHBG. Wielkość sekrecji steroidów jajnikowych ulega znacznym wahaniom zaleŜnym od fazy cyklu miesiączkowego i jest proporcjonalna do ich produkcji w jajnikach. Wymienione hormony nie są magazynowane, ulegają one wydzielaniu natychmiast po ich biosyntezie. Estrogeny i progestyny są aktywnie metabolizowane przez wątrobę Estrogeny. Wątroba przekształca estradiol i estron w estrioi poprzez szlaki metaboliczne przedstawione na ryc. 51-5. Estradiol, estron i estrioi są substratami dla enzymów wątrobowych katalizujących powstawanie pochodnych glukuronidowych lub siarczanowych. Poszczególne gatunki zwierząt róŜnią się aktywnością wymienionych enzymów sprzęgających. I tak np. gryzonie wykazują tak aktywne układy

Cholesterol

^^u^V

Progesteron

HO' Sól sodowa glukuronidu-20-pregnandlolu

Ryc. 51-6. Biosynte2a progesteronu i główne szlaki jego przemiany. Stwierdza się równieŜ inne metabolity, (Według: Ganong W. F.: Review of Medical Physiology, wyd. 13, Appleton and Lange, 1987, w niewielkiej modyfikacji autora rozdziału, za zezwoleniem).

662 / ROZDZIAŁ 51

enzymów metabolizujących, Ŝe estrogeny ulegają prawie całkowitej metabolizacji w wątrobie i po doustnym ich podaniu nie wykazują praktycznie Ŝadnej aktywności. U naczelnych te układy enzymatyczne są mniej aktywne, więc doustnie podane estrogeny są bardziej skuteczne. Steroidy sprzęŜone (z kwasem glukuronowym lub siarkowym) są rozpuszczalne w wodzie i nie wiąŜą się z białkami transportowymi (nośnikowymi); ten fakt tłumaczy, dlaczego są szybko wydalane z Ŝółcią, kałem i moczem. Progestyny. PoniewaŜ wątroba aktywnie metabolizuje progesteron do kilku związków, doustnie podany hormon nie wykazuje działania

biologicznego. Głównym metabolitem progestynowym znajdowanym w moczu ludzkim jest sól sodowa glukuronidu-20-pregnandioiu (ryc. 51-6). Określone steroidy syntetyczne, np. pochodne 17 ct-hydroksyprogesteronu i 17 a-alkilopochodne 19-nortestosteronu, wykazują aktywność progestynową i nie są metabolizowane w wątrobie. Ten fakt tłumaczy, dlaczego związki te są szeroko stosowane jako doustne leki antykoncepcyjne.

GŁÓWNĄ FUNKCJĄ HORMONÓW JAJNIKOWYCH JEST ICH UDZIAŁ W DOJRZEWANIU I PODTRZYMYWANIU CZYNNOŚCI UKŁADU ROZRODCZEGO KOBIETY Hormony te przygotowują strukturalne determinanty Ŝeńskiego układu rozrodczego (patrz niŜej) do reprodukcji: 1) wpływając na dojrzewanie pierwotnych komórek rozrodczych i 2) powstawanie tkanek pozwalających na implantację blastocytu oraz 3) zabezpieczając hormonalny zegar dla procesu jajeczkowania, 4) zapewniając środowisko niezbędne dla podtrzymywania ciąŜy i 5) wpływając na poród i laktację. Estrogeny pobudzają rozwój tkanek uczestniczących w procesie reprodukcji. Ogólnie mówiąc, hormony te wpływają na wielkość i liczbę komórek, pobudzając syntezę białek, rRNA, tRNA, mRNA i DNA. Pod wpływem estrogenów dochodzi do: 1) proliferacji i róŜnicowania nabłonka pochwowego, 2) proliferacji endometrium, przerostu i wydłuŜenia jego gruczołów, 3) rozwoju rytmicznej aktywności skurczowej myometrium oraz 4) proliferacji przewodów gruczołu sutkowego. Ponadto estradiol wykazuje działanie anaboliczne na kości i chrząstki, dzięki czemu pobudza wzrost. W końcu, est-

rogeny, działając na obwodowe naczynia krwionośne, wywołują ich rozszerzenie i rozproszenie ciepła. Progestyny hamują działanie proliferacyjne estrogenów na nabłonek pochwowy i przekształcają nabłonek macicy z postaci proliferacyjnej w sekrecyjną (co wyraŜa się wzrostem wielkości i funkcji gruczołów wydziel niczych oraz wzrostem zawartości glikogenu). W ten sposób nabłonek macicy przygotowuje się do zagnieŜdŜenia zapłodnionej komórki jajowej. Ponadto progestyny wzmagają rozwój zrazikowych obszarów gruczołów sutkowych, po uprzedniej stymulacji rozwoju przewodów tych gruczołów przez estrogeny. Progestyny zmniejszają przepływ krwi przez naczynia obwodowe, dzięki czemu zmniejszają utratę ciepła. Ten fakt tłumaczy wzrost temperatury ciała w fazie lutealnej cyklu miesiączkowego, tj. w fazie, w której hormony te są wytwarzane. Ten wzrost temperatury ciała, zwykle wynoszący 0,5°C, wykorzystywany jest jako oznaka jajeczkowania. Ogólnie rzecz biorąc, progestyny wymagają, dla wywołania swego efektu biologicznego, wyprzedzającego lub równoczesnego działania estrogenów. Jest to, być moŜe, uwarunkowane tym, Ŝe estrogeny pobudzają powstawanie receptorów progesteronowych. Wymienione dwie klasy hormonów często działają synergistycznie, chociaŜ mogą być równieŜ antagonistami. Liczba pierwotnych komórek jajowych (oogonie) w ludzkim jajniku jest największa w 5 miesiącu ciąŜy i wynosi ok, 6—7 min, spadając do ok. 2 min w okresie porodu. Na początku pokwitania wynosi ona tylko 100 000—200 000. Z wymienionych liczb oogonii zaledwie 400—500 ulega ostatecznie przekształceniu do dojrzałych oocytów. Pozostała ilość ulega zanikowi w procesie, którego mechanizm nie jest jasny, chociaŜ sugeruje się udział w nim androgenów pochodzenia jajnikowego. Dojrzewanie pęcherzyków jajnikowych rozpoczyna się juŜ w niemowlęctwie. W okresie przedpokwitaniowym jajniki stopniowo powiększają się przez to, Ŝe wzrasta objętość pęcherzyków (dzięki rozrostowi komórek ziarnistych) oraz narasta ilość tkanki po zanikłych atretycznych pęcherzykach jajnikowych oraz ilość tkanki zrębowej rdzenia, zawierającej komórki śródmiąŜszowe i osłonko we wytwarzające steroidy. StęŜenia hormonów płciowych w osoczu krwi są małe w dzieciństwie, chociaŜ wzrastają one po podaniu egzogennych gonadotropin.

HORMONY GONAPALNE / 663

Cykl miesiączkowy zaleŜy od złoŜonej interakcji trzech gruczołów endokrynnych Hormony determinują częstość występowania owulacji i parzenia się. Gatunki monoestryczne jajeczkują i parzą się raz w roku, natomiast gatunki poliestryczne powtarzają taki cykl kilka razy w roku. Naczelne maja. cykle miesiączkowe ze złuszczaniem się endometrium błony śluzowej macicy na końcu kaŜdego cyklu zaś parzenie się nie jest ściśle skojarzone z owulacją. Cykl miesiączkowy u kobiety jest wynikiem złoŜonej interakcji podwzgórza, przysadki mózgowej i jajnika. Normalna długość jednego

NaleŜy więc sądzić, Ŝe niedojrzały jajnik ma zdolność 'syntetyzowania estrogenów. UwaŜa się, Ŝe te małe stęŜenia hormonów płciowych hamują syntezę gonadotropin w okresie przedpokwitaniowym u dziewcząt oraz Ŝe w okresie pokwitania układ podwzgórzowo-przysadkowy staje się mniej wraŜliwy na supresyjne działanie tych hormonów. W okresie pokwitania pulsacyjne wydzielanie GnRH stymuluje wydzielanie lutropiny. Z kolei ta ostatnia powoduje gwałtowny wzrost produkcji hormonów jajnikowych. Folitropina (FSH), będąca głównym stymulatorem sekrecji estrogenów, pobudza dojrzewanie jednego pęcherzyka jajnikowego, po którym następuje jajeczkowanie.

cyklu waha się od 25 do 35 dni (średnio wynosi 28

Faza luleafna

Faza folikularna

36.8-1

Podstawowa temperatura ciała

°C 36,6-r 36.4 20

2.0 170-HydroKsyprogesteron 1.0-

170-Estradloi

200 P9/mL

Progesteron (ng/rnl)

17-HydroKsyprogesteron

100 0

Gonadotroplny (mlU) IRP-hMG/ml

25 27 1

3

5

7

9 11 13 (5 17 19 21 23 25 27 1

3

5

Dni cyklu

Ryc. 51-7. Zmiany hormonalne i czynnościowe zachodzące podczas typowego cyklu miesiączkowego u kobiety. M — miesiączka, IRP — hMG — międzynarodowy preparat referencyjny dla gonadotropin. (Według: Midgley H. R.: w: Hafezy E. S. E., Evans T.N. (red,): Human Reproduction, Harper and Row, 1973, za zezwoleniem).

664 / ROZDZIAŁ 51 dni). Cały cykl miesiączkowy daje się podzielić na fazę folikularną (pęcherzykową), lutealną i miesiączkowanie (ryc. 51-7). Faza folikularną

(pęcherzykowa). Z przyczyn niewyjaśnionych jeden pęcherzyk jajnika zaczyna się powiększać, głównie pod wpływem FSH. W pierwszym tygodniu fazy pęcherzykowej stęŜenia E, są małe. lecz wzrastają w miarę wzrostu pęcherzyka. Szczytowe stęŜenie E2 stwierdza się w 24 godziny przed szczytowym stęŜeniem LH (i FSH). E2 uczula przysadkę mózgową na działanie GnRH. Uwalnianie LH moŜe być wynikiem reakcji na wysokie stęŜenie E2 (jest to rodzaj „dodatniego sprzęŜenia"), lub teŜ następstwem nagłego spadku stęŜenia tego hormonu (ze stęŜenia szczytowego). Ciągłe podawanie wysokich dawek estrogenów (jako doustne leki antykoncepcyjne) hamuje uwalnianie LH i FSH oraz działanie GnRH na przysadkę mózgową. StęŜenia progesteronu w osoczu krwi są bardzo małe w fazie folikularnej. Szczytowe stęŜenie LH zwiastuje koniec tej fazy i wyprzedza jajeczkowanie 0 16—18 h. Faza lutealną. Po owulacji komórki ziarniste pękniętego pęcherzyka ulegają luteinizacji 1 tworzą ciałko Ŝółte. tj. strukturę rozpoczynają cą w krótkim czasie produkcję progesteronu i w mniejszym stopniu równieŜ estradiolu. Stę Ŝenie estradiolu osiąga najwyŜszy poziom w po łowie fazy lutealnej (mowa tylko o stęŜeniu E2 w fazie lutealnej), po czym stopniowo spada do bardzo małych wartości. Głównym hormonem fazy lutealnej cyklu miesiączkowego jest proges teron, który, jak to zaznaczono wyŜej, jest potrzebny do przygotowania i podtrzymywania czynności sekrecyjnej endometrium, stanowią cego źródło substratów energetycznych dla za gnieŜdŜonego blastocytu we wczesnej fazie jego rozwoju. Lutropina jest niezbędna do podtrzy mywania funkcji ciałka Ŝółtego we wczesnej fazie jego występowania. Źródłem LH przez 10 pierwszych dni trwania fazy lutealnej jest przy sadka mózgowa. Jeśli nastąpi implantacja za płodnionej komórki jajowej (między 22 a 24 dniem normalnego cyklu), funkcję przysadko wej lutropiny przejmuje gonadotropina kosmówkowa (hCG), tj. hormon o bardzo podob nej strukturze do LH, wytwarzany przez komó rki cytotrofoblastu zagnieŜdŜonego zarodka. HCG pobudza syntezę progesteronu przez ciał ko Ŝółte, do chwili wytwarzania tego ostatniego w duŜych ilościach przez łoŜysko. Jeśli implan tacja nie nastąpi i komórki cytotrofoblastu nie

wytworzą hCG, ciałko Ŝółte zanika i pojawia stę miesiączka. Po złuszczeniu endometrium rozpoczyna się nowy cykl miesiączkowy. Czas trwania fazy lutealnej wynosi zawsze 14 + 2 dni. Zmiany w czasie trwania jednego cyklu miesiączkowego uwarunkowane są prawie zawsze zmienionym czasem trwania fazy folikularnej (pęcherzykowej). CiąŜa pobudza syntezę hormonów łoŜyskowych ZagnieŜdŜony blastocyt wytwarza trofoblast, który z kolei przekształca się w łoŜysko. ŁoŜysko jest pośrednikiem w przekazywaniu substratów energetycznych z krąŜenia matki do płodu oraz jest miejscem produkcji wielu hormonów.

Ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG). Główną funkcją hCG, będącej hormonem glikoproteinowym (strukturalne podobieństwa pomiędzy hCG i LH są omówione w rozdz. 46), jest podtrzymywanie czynności ciałka Ŝółtego do chwili wytworzenia przez łoŜysko progesteronu w ilościach potrzebnych do podtrzymywania ciąŜy. Obecność hCG we krwi moŜna wykazać juŜ kilka dni po implantacji zapłodnionej komórki jajowej, co zostało wykorzystane w testach diagnostycznych dla wykazania wczesnej dąŜy. Szczytowe stęŜenia hCG stwierdza się w połowie pierwszego trymestru, po czym obserwuje się stopniowe obniŜenie się stęŜenia tego hormonu do końca ciąŜy. Zmiany stęŜenia hCG i innych hormonów zachodzące w ciąŜy przedstawiono na ryc. 51-8. Progestyny. Ciałko Ŝółte jest głównym źródłem progesteronu w pierwszych 6—8 tygodniach trwania ciąŜy, po czym rolę jego przejmuje łoŜysko. Pomimo Ŝe ciałko Ŝółte nie przerywa swej funkcji, ilość progesteronu wytwarzanego przez łoŜysko w późnej fazie ciąŜy jest 30—40-krotnie większa niŜ produkowana przez ciałko Ŝółte. ŁoŜysko nie wytwarza cholesterolu, co oznacza, Ŝe- jest ono zaleŜne od dostawy tego lipidu przez matkę. Estrogeny. W miarę trwania ciąŜy stwierdza się stopniowy wzrost stęŜenia w osoczu krwi estradiolu, estronu i estriolu. W największych ilościach wy twarzany jest estriol; jest to odzwierciedlenie wielu funkcji jednostki płodowo-łoŜys-

kowej. Nadnercza płodu wytwarzają DHEA i siarczan DHEA, które w wątrobie płodu ulegają przekształceniu do 16cc-hydroksy-pochodnych. W łoŜysku te ostatnie ulegają przekształceniu do estriolu. Z kolei estriol dostaje się

HORMONY GONADALNE / 665 Dobowe wydalanie

I

-36 -33 -30

-100

-27 -24 "'*> 18 50-

-50

-15 -12 -9 -6 -3

100-

42-

70

140 Oni ciąŜy

210

2B0

Ryc. 51-8. StęŜenia hormonów podczas prawidłowej ciąŜy: hCG — ludzka gonadotropina kosmówkowa, hCS — ludzka somatomammotropina kosmówkowa (dane wzięte od kilku autorów, wg Ganong W, F.; Revhw of Medical Physiology, wyd. 13, Appleton and Lange, 1987). _____________________________

poprzez łoŜysko i krąŜenie matki do wątroby, gdzie ulega koniugacji do glukuronidów i wydakniu z moczem (patrz ryc. 51-9). Oznaczenie dobowego wydalania estriolu wykorzystane jest do oceny wielu procesów zachodzących w układzie matka — płód. Inna interesująca wymiana substratów między płodem a matką jest potrzebna dla syntezy kortyzolu przez nadnercza płodu. Nadnercza płodowe nie posiadają kompleksu enzymatycznego złoŜonego z dehydrogenazy 3 P-hydroksysteroidowej i As'4-izomerazy i dlatego zaleŜne są od dostawy łoŜyskowego progesteronu niezbędnego do syntezy kortyzolu (ryc. 51-9).

Laktogen łoŜyskowy. ŁoŜysko wytwarza hormon określany jako laktogen łoŜyskowy (PL). PL bywa równieŜ określany jako somato-

mammotropina lub łoŜyskowy hormon wzrostu, poniewaŜ wykazuje właściwości biologiczne prolaktyny i hormonu wzrostu. Genetyczne relacje zachodzące między tymi hormonami omówione zostały w rozdz. 46. Rola fizjologiczna PL jest niepewna, skoro kobiety nie posiadające tego hormonu wykazują normalny przebieg ciąŜy i rodzą normalne dzieci. Nieznany jest mechanizm wyzwalający poród Czas trwania ciąŜy jest ściśle określony dla poszczególnych gatunków zwierząt. Nieznane są jednak czynniki odpowiedzialne za zakończenie ciąŜy. Podejrzewa się tu udział hormonów, chociaŜ nie zostało to udowodnione. Prawdopodobnie chodzi o estrogeny i progestyny,

666 / ROZDZIAŁ 51 PLOD

c

ŁOśYSKO

MATKA

Kortyzol

Kortyzol

Progesteron —. Nadnercza

Pregnenolon DHEA ■ Siarczan DHEA

+

"ł

Estriol (E3) DHEA siarczan DHEA

Wątroba

Glukuronld

Glukuronld eslrłolu

t 16a-Hydreksy-DHEA Nerki

»- 1&r-Hydraksy-DHEA----- 1

DHEA

Glukuronld estrlolu

w moczu

Wątroba

Ryo. 51-9. Przemiana steroidów w jednostce matczy no-płodowej. DHEA — dehydroepiandrosteron.

poniewaŜ wpływają one na kurczliwość macicy. Są równieŜ dowody na to, Ŝe katecholaminy uczestniczą w procesie indukcji porodu. PoniewaŜ oksytocyna zwiększa kurczliwość macicy, wykorzystywana jest jako lek wspomagający poród. Dodać jeditsk naleŜy, Ŝe podanie egzogennej oksytocyny nie inicjuje porodu, jeśli ciąŜa nie dobiega końca. Przy końcu ciąŜy liczba receptorów oksytocynowych w macicy jest stokrotnie większa niŜ na początku ciąŜy. WzmoŜona ilość estrogenów przy końcu ciąŜy być moŜe zwiększa liczbę receptorów oksytocynowych (p. rozdz. 46). Po raz rozpoczętym porodzie dochodzi do rozszerzenia szyjki macicy, wyzwalającego odruch nerwowy, pobudzający uwalnianie się oksytocyny. Ta ostatnia z kolei nasila skurcze macicy. W tym procesie waŜną role mogą odgrywać równieŜ czynniki mechaniczne, tj. nasilenie rozciągania szyjki macicy lub siła działająca na mięsień macicy. Po porodzie dochodzi do gwałtownych zmian w środowisku hormonalnym zarówno matki, jak i płodu, zas po wydaleniu łoŜyska we krwi matki stwierdza się szybki spadek stęŜenia pro-

gesteronu (określanego jako pregnandiol) i estriolu (ryc. 51-8). Estradiol i progesteron pobudzają rozwój gruczołu sutkowego, zaś prolaktyna laktację RóŜnicowanie i czynność gruczołu sutkowego regulowane sa harmonijnym współdziałaniem wielu hormonów. Proces ten zapoczątkowują Ŝeńskie hormony płciowe, estrogeny bowiem pobudzają wzrost przewodów, zaś progestyny proliferację zrazików sutkowych. Pewien wzrost tkanki gruczołowej i tłuszczowej gruczohi sutkowego ma miejsce w okresie pokwitania. Znaczny rozwój gruczołu sutkowego występuje w ciąŜy, kiedy tkanka gruczołowa eksponowana jest na duŜe stęŜenia estradiolu i progesteronu. Dla całkowitego róŜnicowania się gruczołu sutkowego (przebadanego przewaŜnie na eksplantach szczurzych tego gruczołu) potrzebne są ponadto prolaktyna, glukokortykoidy, insulina lub peptyd wzrostowy oraz nie zidentyfikowany jeszcze czynnik surowicy krwi. Z wymienionych hormonów tylko stęŜenie pro-

HORMONY GONADALNE / 667

laktyny ulega dramatycznym zmianom. Wzrasta ono Ŝ wartości wyjściowej mniejszej niŜ 2 ng/ml do powyŜej 200 ng/ml w późnej fazie ciąŜy. Wpływ wymienionych hormonów na syntezę białek mleka, w tym na laktoalbuminę, laktoglobulinę i kazeinę, zosta! szczegółowo przebadany. Hormony te pobudzają syntezę białek zwiększając ilość swoistych mRNA. Przynajmniej w odniesieniu do kazeiny wzrost ten jest skutkiem wzrostu transkrypcji genowej i stabilizacji mRNA. Progesteron, niezbędny dla róŜnicowania się zrazików gruczołu sutkowego, hamuje produkcję i wydzielanie mleka w zaawansowanej ciąŜy. Laktacja rozpoczyna się w chwili nagłego obniŜenia się stęŜenia tego hormonu po porodzie. RównieŜ stęŜenie prolaktyny w osoczu obniŜa się szybko po porodzie, sekrecja tego hormonu ulega jednak stymulacji podczas kaŜdego aktu ssania brodawki sutkowej (p. rozdz. 46) podtrzymując przez to proces laktacji. W razie zakazu karmienia piersią, laktacja stopniowo zanika. MoŜna ją równieŜ szybko zakończyć podając pozajelitowo duŜe dawki androgenu, zanim rozpoczęto karmienie piersią. Ssanie brodawki piersiowej stymuluje równieŜ uwalnianie się oksytocyny z tylnego płata przysadki nerwowej. Oksytocyna obkurcza komórki mięśniowo-nabłonkowe otaczające przewody zrazikowe, wyciskając w ten sposób mleko z gruczołu sutkowego. Regulację syntezy i wydzielania oksytocyny przedyskutowano w rozdz. 46. Koniec menopauzy charakteryzuje się zanikiem produkcji estrogenów jajnikowych

Kobiety Ŝyjące na zachodniej półkuli przestają miesiączkować średnio w 53 rŜ. Ten okres pokrywa się z zanikiem wszystkich pęcherzyków jajnikowych i syntezy estrogenów jajnikowych. Nie ma alternatywnego źródła progesteronu, natomiast pokaźne ilości słabego estrogenu, tj. estronu, powstają przez aromatyzację androstendionu (ryc. 51 -5). StęŜenia estronu w osoczu są jednak zbyt mak, by zahamować sekrecję gonadotropin przysadkowych. Ten fakt tłumaczy występowanie bardzo duŜych stęŜeń FSH i LH w osoczu, tak charakterystycznych dla pierwszych lat pomenopauzalnych. Kobiety po menopauzie są naraŜone na dwa zjawiska związane z katabolizmem tkankowym indukowanym estrogenopenią. Estron nie zawsze jest w stanie zapobiec zanikowi

drugorzędowych cech płciowych, w tym szczególnie nabłonka dolnych dróg moczowych i pochwy. Ponadto waŜnym problemem zdrowotnym u osób starszych jest osteoporoza; kobiety z cięŜkim zanikiem masy kostnej wykazują niŜsze od normalnych stęŜenia estronu w osoczu krwi. Syntetycznych agonistów i antagonistów uŜywa się zarówno dla promocji, jak i zahamowania zapłodnienia oraz dla zahamowania wzrostu guzów

Estrogeny. Wiele związków syntetycznych wykazuje aktywność estrogenową oraz jedną lub kilka korzystnych cech farmakologicznych. Większość modyfikacji, vw strukturze estrogenów wprowadzono po to, by zmniejszyć przemianę tych hormonów w wątrobie oraz, by skuteczne było doustne ich podawanie. Jednym z pierwszych takich związków był dietylostylbestrol. Innymi przykładami takich steroidów o zmodyfikowanej strukturze są 17a-etynyloestradiol i mestranol, uŜywane jako doustne teki antykoncepcyjne.

Dletylostylbestrol

Dokonano syntezy licznych związków wykazujących aktywność antyestrogenową. Kilka z nich znalazło zastosowanie kliniczne. Działanie większości tych antagonistów polega na tym, Ŝe wiąŜą się one kompetycyjnie ze śródkomórkowym receptorem estradiolowym (p. niŜej).

I7a-Etynyloestrad(ol

668 / ROZDZIAŁ 51 CH3

CH3O

Octan

r-C=CH

--OAc

Mesiranol

Cytrynian kiomifenu (Clomid) wykazuje szczególne powinowactwo do receptorów estrogenowych podwzgórza. Początkowo związek ten stosowano jako lek hamujący płodność, podczas gdy obecnie uŜywany jest do celów przeciwnych, tj. jako lek zwiększający płodność. Klomifen działa kompetycyjnie w stosunku do estradiolu, jeśli chodzi o wiązanie z receptorami estrogenowymi podwzgórza. W wyniku takiego działania dochodzi do odblokowania sekrecji GnRH oraz wtórnie do nadmiernego wydzielania się LH i FSH przez przysadkę mózgową. W następstwie działania kiomifenu dochodzi do równoczesnego dojrzewania licznych pęcherzyków jajnikowych oraz, co za tym idzie, do częstego rozwoju ciąŜy mnogiej. Nafoksydyna — związek niesteroidowy — oraz tamoksyfen, łącząc się z receptorami estrogenowymi, tworzą z chromatyną bardzo trwałe kompleksy. UniemoŜliwia to recyrkulację receptorów, przez co dochodzi do blokowania działania estradiolu na długi czas. Wymienionych antagonistów uŜywa się w leczeniu estrogenozaleŜnego raka piersi.

^ Cytry nian klomtf enu

Progestyny. Trudne byio wytworzenie związków wykazujących aktywność progesty-nową, lecz pozbawionych działania estrogeno-wego lub androgenowego. 17 a-alkilopochodne 19-nortestosteronu (np. noretyndron) u większości kobiet wykazują minimalną aktywność androgenową. Są one uŜywane jako doustne leki antykoncepcyjne. Inną silną progestyną jest octan medroksyprogesteronu (Provera). Med-

medroksyproossleronu

OH

■— CsCH

Noretyndron

roksyprogesteron hamuje występowanie jajeczkowania przez kilka miesięcy, jeśli zostanie podany domięśniowo pod postacią depót. PoniewaŜ progestyny hamują wzrost komórek ww. związek jest częściej uŜywany w leczeniu dobrze zróŜnicowanego raka endometrium (błona śluzowa macicy). Estrogeny i progestyny działają poprzez regulację ekspresji genów Działanie wymienionych hormonów polega na ich wiązaniu się ze swoistymi receptorami śródkomórkowymi. Te ostatnie, wiąŜąc się z określonymi obszarami chromatyny lub(i) DNA jądrowego, oddziałują na tempo transkrypcji swoistych genów. Wiele informacji dostarczyły wyniki badań nad wpływem estradiolu i progesteronu na transkrypcję genów kodujących białko jaj ptasich, w tym szczególnie owalbuminy i konalbuminy. Dokładny mechanizm działania tych hormonów w procesie transkrypcji genów jest wciąŜ przedmiotem intensywnych badań. Receptory estrogenów© i progesteronowe naleŜą do jednej rodziny genowej Sekwencję aminokwasową receptorów estrogenowych (ER) i progesteron owych (PR) rekonstruowano na podstawie sekwencji odpowiadających im cDNA. Receptory te naleŜą do

HORMONY GONADALNE / 669

rodziny genowej receptorów steroidowych i hormonów tgrczycy, omawianych w rozdz. 49. Jak to przedstawiono na ryc. 49-3. kaŜdy receptor ma kilka domen czynnościowych. Steroidy wiąŜą się z miejscami ligandowymi C-koricowego obszaru cząsteczki receptorowej. To indukuje zmianę konformacyjną umoŜliwiającą wiązanie się receptora z DNA. Domena ER, wiąŜąca się z DNA, rozpoznaje sekwencję AGGTCAnnnTGCCCT (jest to sekwencja odpowiedzi estrogenowej — ERE — estrogen response element), natomiast domena PR — sekwencję GGTACAnnnTGTTCT (jest to sekwencja odpowiedzi progesteron owej — PRE — progesterone response element). Interakcja receptora z DNA umoŜliwia róŜnym działającym w konfiguracji trans domenom kaŜdego receptora oddziaływanie na geny przylegające do obszarów odpowiedzi hormonalnej. WzmoŜona (lub zmniejszona) aktywność swoistych genów wyraŜa się zmienionym tempem syntezy swoistych białek, co przejawia się zmianą reakcji metabolicznych. Cechy szczególne. Na uwagę zasługuje kilka faktów, dotyczących mechanizmu działania omawianych hormonów: 1) receptory wiąŜące hormony płciowe odznaczają się pewną nieswoistością, i tak progesteron wiąŜe się z receptorem androgenowym, przez co wykazuje słabe działanie androgenowe, natomiast kilka androgenow wiąŜe się z receptorami estrogenowymi, przez co mogą naśladować działanie tych ostatnich na macicę; jak to pokazano na ryc. 49-3, centralne sekwencje obszarów odpowiedzi hormonalnej dla omawianych hormonów wykazują znaczne podobieństwo. Ten fakt tłumaczy, dlaczego niektóre hormony wykazują działanie mieszane, tj. androgenowe, jak i progestynowe lub estrogenowe; 2) estrogeny zwiększają liczbę zarówno receptorów estrogenowych, jak i progesteronowych; 3) wydaje się, Ŝe progesteron przyspiesza tempo obrotu własnego receptora; 4) tak zwane słabe estrogeny, np. estriol, podawane często działają jak estrogeny silne.

NIEKTÓRE ZABURZENIA śEŃSKIEGO UKŁADU ROZRODCZEGO WYKAZUJĄ ZWIĄZEK Z ANOMALIAMI HORMONALNYMI Omawianie wszystkich zaburzeń Ŝeńskiego układu rozrodczego przekracza ramy tego roz-

działu. ToteŜ tylkp wybrane przykłady tych zaburzeń są przedmiotem bliŜszego omówienia. Pierwotny hipogonadyzm jest następstwem procesu chorobowego bezpośrednio uszkadzającego jajniki. W następstwie tego uszkodzenia upośledzeniu ulega proces jajeczkowania lub(i) czynność endokrynna gonady Ŝeńskiej. Hipogonadyzm wtórny spowodowany jest wypadnięciem gonadotropinowej czynności przysadki mózgowej. Dysgeneza gonad (zespół Turnera) jest często spotykanym zaburzeniem genetycznym, charakteryzującym się kariotypem XO, występowaniem Ŝeńskich narządów płciowych zarówno zewnętrznych, jak i wewnętrznych oraz nieprawidłowościami rozwojowymi i opóźnionym pokwitaniem. Wiele zespołów spowodowanych jest nieprawidłowościami w zakresie ilości hormonów. Najczęściej występuje zespól policystycznych jajników (zespół Steina-LeventhaEa), w którym na

skutek nadprodukcji androgenow pojawiają się takie objawy jak hirsutyzm, otyłość, nieregularne miesiączkowanie OTaz zmniejszona płodność. Rzadko występujące guzy złoŜone z komórek Leydiga oraz jądrzaki (arrhenoblastoma) wytwarzają testosteron. Guzy określone jako ziarniszczaki (granulosa celi tumor) lub otoczkowiaki (thecoma) produkują estrony, zaś śródjajnikowe guzy złoŜone z komórek nadnerczy

(intraovarian adrenal rest tumor) — kortyzol. Przetrwała tkanka trofoblastyczna jest przyczyną łagodnego zaśniadu graniastego (mola hydatidosa) mogącego ulec transformacji do złośliwego nabłoniaka kosmówkowego (choriocarcinoma). Ostatnie dwa nowotwory wytwarzają ogromne ilości hCG. Oznaczanie radioimmunologiczne hCG wykorzystywane jest w diagnostyce wymienionych dwóch rodzajów niebezpiecznych guzów oraz monitorowaniu skuteczności ich leczenia.

PIŚMIENNICTWO Ogólne Huggins C: Two principles in endocrine therapy of cancer. Hormonedcpnval and hormone interference. Ccmcer Res 1965,25:1163. O'MalLey BW: Steroid hormone action in eucaryotic cells. / Clin Inrest 1984;74:307. Wilson JD et al: The endocrioe control of małe phenotypic development, Aust J Bioł Sci 1983;36:101.

670 / ROZDZIAŁ 51 Hormony jąder Chang C et al: Structural analysis of complementary DNA and amino acid seąuences of human and rat androgen receptors. Proc Nail Acad Sci USA 198835:7211. Hali PF; Testicular hormones: Synthesis and control. Pages 1511 — 1520 in: Endocrinołogy, Vol 3. DeGroot LJ (editor). Grune & Stratton, 1979. Wilson J; Metabolism of testicular androgens. Chap 25, pp 491—508, in: Handbook of Endocrinołogy. Section 7: Endocrinołogy, Vol 5: Małe Reproductive System, Hamilton DW, Greep RP (editors). American Physiological Society, Washington DC, 1975.

Hormony jajników Green S et al: Human estrogen receptor DNA: Sequence, expression and homology to N-erb-A, Naturę (London) 1986;320:134. Siitcri PK, Fcbrcs F: Ovarian hormone synlhesis, circulation and mechanisms of action. Pages 1401—1417 iu: Endocrinołogy, Vol 3. DeGroot LJ (editor). Grune & Stratton, 1979. Toft D, Górski J: A receptor molecule for estrogens. Proc Natł Acad Sci USA 1966;55:1574.

Hormony trzustki i Ŝołądkowo-jelitowe

52

Dary/ K. Granner, MD

WPROWADZENIE Trzustka stanowi strukturę, zawierającą dwa róŜne narządy. Część zrazikowa trzustki wykazuje czynność zewnątrzwydzielnkzą (egzokrynną); wydziela ona do światła dwunastnicy enzymy i jony potrzebne w procesach trawienia pokarmów. Na część wewnątrz wy dzieiniczą (endokryimą) trzustki składają się wyspy Langerhansa. Masa 1—2 min wysp występujących w trzustce stanowi 1—2% całej masy tego narztfdu. Wyspy 2awierają kilka rodzajów komórek wymienionych w tab. 52-1. Tabela 52- . Rodzaje komórek występujących w wyspach Langerhansa Procentowy udział komóHormon Nazwa komórek rek w struktu- wytwarzany rze wysp A (luba) Ok. 25% Glukagon B (lub |3) Ok. 70% Insulina D (lub 8) F

Mniej niŜ 5% Śladowy

Somatostatyna Polipeptyd trzustkowy

Wyspy trzustkowe wydzielają przynajmniej 4 hormony, tj. insulinę, glukagon, somatostatynę i polipeptyd trzustkowy. Wymienione hormony uwalniane są do Ŝyły trzustkowej wpadającej do Ŝyły wrotnej. Taki układ anatomiczny jest korzystny z punktu widzenia fizjologicznego, albowiem wątroba jest głównym miejscem działania insuliny i glukagonu. Ostatnie dwa hormony, choć uczestniczą głównie w przemianie węglowodanów, wykazują równieŜ wpływ na

Skróty uŜywane w tym rozdziale ACTH — hormon ad reno korty kotropo wy, adrenokortykotropina EGF — naskórkowy czynnik wzrostowy FGf — czynnik wzrostowy fibroblastów GIP — Ŝołądkowy polipeptyd hamujący IGF — czynnik wzrostowy LDŁ — lipoproteiny o małej gęstości — cukrzyca tnsulinozaleŜna IDDM NIDDM — cukrzyca insulinoniezaleŜna PDGF czynnik wzrostowy pochodzenia płytkowego PEPCK — karboksykinaza fosfoenoi opirogronią nowa PGF2 — prostaglandyna F2 PP — polipeptyd trzustkowy VLDL — lipoproteiny 0 bardzo małej gęstości

wiele innych procesów. Somatostatyna, po raz pierwszy wykryta w podwzgórzu, gdzie hamuje wydzielanie hormonu wzrostu, występuje w wyŜszych stęŜeniach w wyspach niŜ podwzgórzu. W trzustce hormon ten uczestniczy w lokalnej regulacji sekrecji insuliny i glukagonu. Polipeptyd trzustkowy wywiera wpływ na wydzielanie soków przez przewód pokarmowy. Przewód pokarmowy wydziela wiele hormonów, zapewne więcej niŜ jakikolwiek inny pojedynczy narząd. Do funkcji przewodu pokarmowego naleŜą: a) dostarczanie pokarmów do miejsca ich trawienia, b) stworzenie właściwego środowiska (odpowiednie pH i stęŜenie jonów, obecność właściwych enzymów) niezbędnego dla procesów trawienia, c) wchłanianie produktów trawienia przez błonę śluzową jelit, przeniesienie ich do przestrzeni pozakomórkowej a stamtąd do krąŜenia, skąd dostają się do komórek obwodowych oraz d) wydalanie z ustroju pro-

672 / ROZDZIAŁ 52

duktów odpadowych. We wszytkich tych funkcjach uczestniczą hormony przewodu pokarmowego.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Insulina jest pod wieloma względami modelowym hormonem, który jako pierwszy uzyskano w stanie oczyszczonym i krystalicznym oraz syntetyzowano metodami chemicznymi i biologii molekularnej. Badania nad jego biosyntezą dostarczyły podstaw dla koncepcji o występowaniu prohormonów (propeptydów). Insulina posiada waŜne implikacje medyczne. Około 5% populacji w krajach rozwiniętych cierpi na cukrzyce, zaś dalsze 5% ludzi jest potencjalnie naraŜonych na rozwijanie się tej choroby. Cukrzyca jest skutkiem niedostatecznego działania insuliny spowodowanego niedoborem tego hormonu, lub teŜ opornością tkanek na ten hormon. Działanie glukagonu nasila cukrzyce, jeśli jego działanie nie jest hamowane mechanizmami wyrównawczymi. Opisano wiele zespołów chorobowych spowodowanych nadmiarem hormonów wydzielanych przez przewód pokarmowy. Diagnostyka tych zespołów chorobowych moŜe być trudna z dwóch powodów: po pierwsze lekarz często nie jest obeznany z symptomatologią tych zespołów oraz, po drugie, objawy chorobowe podawane przez chorego lub stwierdzane przez lekarza mogą dotyczyć równocześnie wielu narządów. Hormony przewodu pokarmowego są przedmiotem zainteresowania równieŜ z innego powodu, mianowicie^ wykazują one bliski związek z neuropeptydamf.

HORMONAMI TRZUSTKI SĄ: INSULINA, G LUK AGO IM, SOWIATOSTATYNA I POLIPEPTYD TRZUSTKOWY StęŜenie glukozy we krwi jest regulatorem produkcji insuliny Rys historyczny. W latach sześćdziesiątych ubiegłego stulecia Langerhans zidentyfikował wyspy trzustkowe, chociaŜ nie rozumiał jeszcze ich funkcji, podobnie jak von Mering i Minkowski. Ci ostatni badacze wykazali w 1889 r„ Ŝe pankreatektomia jest przyczyną cukrzycy. Występowanie związku przyczynowego między czynnością wysp trzustkowych

a cukrzycą sugerowali w 1909 r. Mayer oraz wl917r. Sharpey-Schaffer. Taki związek został jednak udowodniony dopiero w 1921 r. przez Bantinga i Besta. Ci ostatni badacze uŜyli kwaśnego etanolu do ekstrakcji czynnika wyspowego, który wykazywał silne działanie hipoglikemiczne. Czynnik ten nazwali insuliną. Szybko przekonano się, Ŝe wyspy trzustkowe bydła i świń zawierają insulinę, aktywną równieŜ u człowieka. W ciągu roku insulina znalazła szerokie zastosowanie w leczeniu cukrzycy. Okazała się ona lekiem ratującym Ŝycie tych chorych. Fakt dysponowania duŜymi ilościami insuliny bydlęcej i świńskiej miał ogromny wpływ na dalsze badania biomedyczne dotyczące tego hormonu. Insulina była: 1) pierwszym białkiem dla którego udowodniono działanie hormonalne, 2) pierwszym białkiem uzyskanym w postaci krystalicznej (Abel, 1926), 3) pierwszym białkiem, dla którego określono sekwencję aminokwasową (Sanger i wsp., 1955), 4) pierwszym białkiem syntetyzowanym metodami chemicznymi (Du i wsp., Zahn, Katsoyanis — 1964), 5) pierwszym białkiem dla którego wykazano, Ŝe produkowane jest pod postacią cząsteczki prekursorowej (Steiner i wsp. — 1967) oraz 6) pierwszym białkiem uzyskanym technologią rekombinacji genetycznej do celów handlowych. Pomimo tych licznych „pierwszych" pozycji o mechanizmie działania tego hormonu na poziomie molekularnym wiadomo znacznie mniej niŜ w przypadku innych hormonów.

insulina jest polipeptydem heterodimerycznym Insulina jest polipeptydem składającym się z 2 łańcuchów, tj. z łańcucha A i B połączonych ze sobą mostkami dwusiarczkowymi w pozycjach A7 i B7 oraz A20 i B19. Trzeci, śródłańcuchowy mostek dwusiarczkowy łączy aminokwasy A6 z Ali. U większości gatunków zwierząt wymienione 3 mostki dwusiarczkowe są niezmienne, zaś łańcuchy A i B składają się z 21 (łańcuch A) lub 30 (łańcuch B) aminokwasów. Kowalencyjna struktura insuliny ludzkiej (o masie cząsteczkowej 5 734) przedstawiona jest na ryc. 52-1. Dla porównania w tab. 52-2 przedstawiono podstawniki aminokwasowe dla insulin róŜnych gatunków zwierząt (w porównaniu do insuliny ludzkiej). Występowanie odmiennych aminokwasów dotyczy zarówno łańcucha A, jak i B, a szczególnie pozycji 8, 9 i 10 łańcucha A. Dowodzi to, Ŝe ten obszar sekwen-

HORMONY TRZUSTKI I śOŁADKOWO-JELITOWE / 673 Łańcuch A

n

Gly-Ile-Val-Glu-GlnCvs-Cvs-Thr-Ser-Ile- j 8 9 1 0 11 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 18 1 9 / Cvs-Ser-Leu-Tvr-GlnLeu-Glu-Asn-Tvr-Cvs- S S Asn 1 2 3 4 5 6 t 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 13 19 I 21 ŁańcuchS Li-Val-Cys-C

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cvs-Glv-Ser-His-Leu-V3l-Glu-Ala-Leu-Tvr-Leu-Val-Ćys-Gly-Glu-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 - Arg -G ly-Ph e-Pt) e-Ty r -Th r- Pro- Lys-Th r 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Ryc. 52-1. Kowalencyjna struktura insuliny (Według: Ganong W, F.: Review of MedicaiPhysiotogy, wyd. 13, Appleion and Lancje, 1987. ŁA zezwoleniem).

Tabela 52-2. RóŜnice w strukturze insuliny pomiędzy poszczególnymi gatunkami ssaków Gatunek

RóŜnice w sekwencji aminokwasowej w stosunku do insuliny ludzkiej Łańcuch A Aminokwas w pozycji 8 9 10

Łańcuch B Aminokwas w pozycji 30

Thr

Thr — Ser — Ile Thr —Ser —Ile

Ala

Thr —Ser —Ile

Ser

Ala — Ser — Val

Ala

koza Owca

Ala — Gly — Val

Ala

Koń Wieloryb

Thr

Ala

Ala — Ser —Thr

Ala

cji aminokwasowej nie jest krytyczny dla występowania działania biologicznego. Istnieje kilka niezmiennych pozycji i sekwencji w strukturze

insuliny. S$ nimi: 1) połoŜenie wymienionych 3 mostków dwusiarczkowych, 2) występowanie reszt hydrofobowych w obszarze C-koricowym łańcucha B oraz 3) niezmienność sekwencji aminokwasowej w obszarze N- i C-końcowym łańcucha A. Przez modyfikację chemiczną i wprowadzenie swoistych aminokwasów do wymienionych obszarów struktury insuliny 4 ■;

Biochemia

Łańcuch A

ńcuoriB

Człowiek Świnia, pies, olbrotowiec (kas2alot) Królik Krowa,

G l y — Ile

określono determinanty aktywności biologicznej tego hormonu (ryc. 52-2). Hydrofobowy C-końcowy obszar łańcucha B uczestniczy równieŜ w procesie dimeryzacji insuliny.

Ryc. 52-2. Obszar cząsteczki insuliny niezbędny dla jej aktywności biologicznej. Struktura schema tyczna insuliny uzyskana badaniem krystalograficz nym. Pole zakreskowane oznacza obszary ciaste czki insuliny, od których najbardziej zaleŜy aktyw ność biologiczna tego hormonu. Reszty w pozycji B24 i B25 są najbardziej podatne na mutacje wpływające na aktywność biologiczną insuliny. N-końce łańcuchów A i B zaznaczono znakiem ( + ), zaś C-końce — znakiem {-), Według: Tager H, S.: Abnormal products of the human insulin gene; Diabetes, 1984, 33,693, przerysowane za zezwole niem autora pracy). ___________ _________

674 / ROZDZIAŁ 52

Istnieje duŜe podobieństwo pomiędzy insuliną ludzką, świńską i bydlęcą (tab. 52-2) Insulina świńska róŜni się od insuliny ludzkiej tylko jednym aminokwasem (w miejsce treoniny w pozycji B30 występuje alanina). Insulina bydlęca róŜni się od ludzkiej obecnością alaniny na miejscu treoniny w pozycji B30, alaniny na miejscu treoniny w pozycji A8 oraz waliny na miejscu izoleucyny w pozycji A10. Wymienione modyfikacje nie mają wpływu na aktywność biologiczną insuliny i w bardzo niewielkim stopniu zmieniają jej antygenowość. Pomimo Ŝe wszyscy chorzy leczeni insuliną heterologiczną wykazują obecność krąŜących przeciwciał anty insulin owych (o bardzo małych mianach), tylko u niewielu z nich miano ich jest tak duŜe, Ŝe ma znaczenie kliniczne. Insulina świńska i bydlęca były standardowymi lekami stosowanymi w leczeniu cukrzycy do chwili wyproduko-

wania insuliny ludzkiej technologią rekombinacji DNA. Pomimo występowania znacznej zmienności w strukturze pierwotnej aktywność biologiczna dla wszystkich rodzajów insulin (niezaleŜnie od gatunku) wynosi 25—30 IU/mg suchego hormonu. Insulina tworzy bardzo ciekawe struktury kompleksowe. Cynk, występujący w duŜych stęŜeniach w komórkach B, tworzy kompleksy z insuliną i proinsuliną. Cząsteczki insulin wszystkich kręgowców tworzą izologiczne dimery dzięki wiązaniom wodorowym między grupami peptydowymi dwóch monomerów w pozycjach B24 i B26, zaś przy duŜych stęŜeniach insuliny dimery ulegają przekszałceniu do heksamerów, zawierających po dwa atomy cynku kaŜdy. Ta struktura wyŜszego rzędu umoŜliwiła badania struktury krystalicznej insuliny. W stęŜeniach fizjologicznych insulina występuje prawdopodobnie pod postacią monomeryczną.

Byc. 52-3. Struktura ludzkiej proinsuliny. insulina i peptyd C połączone są ze sobą w dwóch miejscach za pośrednictwem łączników di peptyd owych. Po zadziałaniu enzymu trypsyn o podobne go {jasne strzałki) i kilku kolejnych reakcjach katalizowanych przez enzymy karboksypeptydazopodobne (ciemne strzałki) powstają heterodimeryczna cząsteczka insuliny oraz peptyd C.

HORMONY TRZUSTKI I śOŁĄDKOWO-JELITOWE / 675

Insulina jest produkowana pod postacią cząsteczki prekursorowej Insulina jest syntetyzowana jako preprohormon (o masie cząsteczkowej 11 500) i jest prototypem dla peptydów powstających drogą przekształcenia większych cząsteczek prekursorowych. 23-aminokwasowa hydrofobowa sekwencja pre- lub prowadząca (liderowa) naprowadza cząsteczkę do cystern siateczki śródplazmatycznej, po czym ulega od szczepieniu. W wyniku tej reakcji powstaje proinsulina o masie cząsteczkowej 9000, wykazująca zmiany konformacyjne niezbędne dla wytworzenia właściwych mostków dwusiarczkowych. Jak widać na ryc. 52-3, cząsteczka proinsuliny 2aczyna się od łańcucha B na N-końcu, połączonego za pośrednictwem polipeptydu C z łańcuchem A. Proinsulina ulega kilku procesom rozszczepieniowym, swoistym dla określonych pozycji łańcucha polipeptyd owego, w wyniku których powstają równowaŜne ilości insuliny i peptydu C. Te procesy enzymatycznego rozszczepienia proinsuliny są przedstawione na ryc. 52-3. (nne hormony komórek wyspowych są równieŜ wytwarzane pod postacią cząsteczek prekursorowych Synteza innych hormonów wyspowych takŜe wymaga potranslacyjnego przekształcenia enzymatycznego cząsteczek prekursorowych o wyŜszej masie cząsteczkowej. Na rycinie 52-4 znajduje się porównanie schematycznej struktury polipeptydu trzustkowego, glukagonu i somatostatyny ze strukturą insuliny. Przy rozszczepieniu wymienionych prohormonów uczestniczy kilka kombinacji enzymów endoproteolitycznych(trypsynopodobnych)iegzoproteolitycznych (podobnych do karboksypeptydazy B), poniewaŜ sekwencja aminokwasowa aktywnego hormonu moŜe się znajdować na C-końcu cząsteczki prekursorowej (so mato s taty na), na N-końcu (polipeptyd trzustkowy), na obu końcach (insulina) lub w środkowym fragmencie (glukagon) prekursora. Synteza insuliny i powstawanie ziarnistości wydzielniczych odbywają się w organellach subkomórkowych ProinsuJina jest syntetyzowana na siateczce śródplazmatycznej szorstkiej. Enzymatyczne odcięcie polipeptydu prowadzącego, czyli lidera (presegmentu), utworzenie wiązań dwusiarczkowych oraz proces załamania odbywają się w cysternach siateczki śródplazmatycznej (ryc.

Polipeptyd trzustkowy

Insulina

Somatostatyna

Glukagon Ryc. 52-4. Schemat struktury prekursorów wy twarzanych przez 4 główne rodziny komórek wysp trzustkowych. Odcinki prekursorów odpowiadają ce właściwym hormonom wymienionym na rycinie oznaczono jako czarne prostokąty. Segmenty polipeptydowe nie stanowiące części hormonu przed stawiono jako Finie. Reszty aminokwasów dwuzasadowych (argininy lub lizyny) odpowiadające miejscom działania enzymów przekształcających prohormon w hormon zaznaczono czarnymi punk tami. NaleŜy zwrócić uwagę na to, Ŝe strukturę proinsuliny przedstawiono w postaci wyprostowa nej nie wykazującej wiązań dwusiarczkowych. Struktura proinsuliny ma następującą sekwencję; Łańcuch B — peptyd C — łańcuch A. (Wedtug: Taylor H. S.: Abnormal products of the human insulin gene; Diabetns 1984, 33, 693, za zezwole niem). _____ _____________________

52-3). Z kolei proinsulina zostaje przeniesiona do aparatu Golgiego, gdzie rozpoczyna się proces proteolizy i upakowania hormonu do ziarnistości wydzielniczych. Dalszy proces dojrzewania ziarnistości odbywa się w czasie ich wędrówki przez cytoplazmę do błony cytoplazmatycznej. Zarówno proinsulina, jak i insulina, łącząc się z cynkiem, tworzą heksamery. PoniewaŜ 95% proinsuliny ulega przekształceniu do insuliny, kryształki tego ostatniego hormonu są determinantami cech morfologicznych ziarnistości wydzielniczych. W obrębie ziarnistości znajdują się równowaŜnikowe stęŜenia peptydu C (w stosunku do stęŜenia insuliny); te ostatnie nie tworzą jednak struktur krystalicznych. Po zadziałaniu swoistego bodźca ziarnistość wydzielnicza zlewa się z błoną pkzmatyczną i wyrzuca swoją zawartość do przestrzeni pozakomórkowej. Proces ten określany jest jako emiocytoza.

676 / ROZDZIAŁ 52

Właściwości proinsuliny i peptydu C róŜnią się od właściwości insuliny Proinsuliny wykazują zmienną dhigość łańcucha polipeptydowego składającego się z 78 do 86 aminokwasów. Zmienność ta uwarunkowana jest zmienną dhigością polipeptydu C. Proinsulina wykazuje taką samą rozpuszczalność oraz taki sam punkt izoelektryczny co insulina. Tworzy ona równieŜ heksamery z kryształkami cynku i silnie wiąŜe przeciwciała antyinsulinowe. Proinsulina wykazuje aktywność biologiczną mniejszą niŜ 5% aktywności insuliny, co sugeruje, Ŝe większość miejsc aktywnych insuliny jest zablokowana w cząsteczce proinsuliny. W pewnych okolicznościach (u chorych z guzami wysp trzustkowych) równolegle z insuliną wydzielaniu ulegają większe niŜ zwykle ilości proinsuliny. PoniewaŜ okres półtrwania proinsuiiny jest znamiennie dłuŜszy od insuliny, zaś proinsulina daje silna reakcję krzyŜową z surowicą anty insulin ową, metody radioimmu no logicznego oznaczania „insuliny" mogą okazyjnie dostarczyć wyników zawyŜonych w stosunku do rzeczywistej aktywności biologicznej „insuliny" zawartej w osoczu. Dla peptydu C nie udowodniono Ŝadnej aktywności biologicznej. Wykazuje on odrębne W stosunku do insuliny i proinsuliny własności antygenowe. Przez oznaczanie peptydu C metodą immunologiczną moŜliwe jest odróŜnienie insuliny endogennej od egzogennej (po podaniu

insuliny egzogennej nie stwierdza się obecności peptydu C w osoczu — przyp- tłumacza) oraz ilościowe określenie insuliny endogennej u osób wykazujących obecność w surowicy krwi przeciwciał anty insulinowych (obecność przeciwciał antyinsuli nowych w surowicy uniemoŜliwia oznaczanie insuliny metodą immunologiczną). Istnieją znaczne róŜnice w sekwencji aminokwasowej peptydu C pomiędzy poszczególnymi gatunkami. Ten fakt potwierdza słuszność twierdzenia, Ŝe peptyd C prawdopodobnie nie posiada Ŝadnej aktywności biologicznej. Peptydy insu I i nopodobne teŜ mają swoje prekursory Struktura cząsteczki prekursorowej nie jest wyjątkowa dla insuliny. Podobną strukturę wykazują blisko spokrewnione z nią peptydy, tj. relaksyna i czynniki wzrostowe insulinopodobne (ryc. 52-5). Wszystkie te hormony wykazują znaczną homologię w obszarach łańcucha B i A połoŜonych na końcach N- i C- cząsteczki prekursorowej. Obszary te są ze sobą połączone przez segment łączący. W prekursorze relaksyny i insuliny (p. ryc. 52-3) segment łączący związany jest na obu końcach przez dwa aminokwasy zasadowe. Po połączeniu się łańcucha B z łańcuchem A przez wiązania dwusiarczkowe, ten segment zostaje wycięty przez enzymy proteolityczne, przy czym powstaje hormon dwułaricuchowy. Czynniki wzrostowe insulino-

Ryc. 52-5. Schemat struktury prekursorów peptydów spokrewnionych z insuliną. Obszary homologiczne relaksyny, insuliny oraz czynnika wzrostowego insulinopodobnego (IGF) przedstawiono jako czarne prostokąty. Sekwencję aminokwasów^ łączącą łańcuch B z łańcuchem A relaksyny lub insuliny oznaczono prostokątami białymi. Te sekwencje ulegają „wyctęciu"(w miejscach zaznaczonych strzałkami) przy przekształceniu prohormonu do właściwego dwuiańcuchowego hormonu. Sekwencję aminokwasową czynnika wzrostowego insulinopodobnego, która odpowiada wymienionym peptydom łączącym insuliny i relaksyny, lecz nie ulega „wycięciu" enzymatycznemu, zaznaczono prostokątem kropkowanym. Dlatego czynnik wzrostowy insulinopoflobny jest hormonem jednołańcuchowym. (Według: Tager H. S.: Abnormal products of The human insuiin gene; Diabetes 1984, 33, 693, za zezwoleniem).

HORMONY TRZUSTKI I śOŁĄDKOWO-JELITOWE / 677

podobne, chociaŜ wykazują znaczną homologię z insuliną i relaksyną w zakresie struktury pierwszorzędowej, nie mają zasadowego dipeptydu na końcach segmentu łączącego, co sprawia, Ŝe są niepodatne na rozszczepienie przez odpowiednie enzymy proteolityczne i są hormonami jednołańcuchowymi. Wyizolowano ludzki gen insuliny Ludzki gen insulinowy zlokalizowany jest na krótkim ramieniu chromosomu 11 (ryc. 52-6). U większości ssaków stwierdza się ekspresję tylko pojedynczego genu insulinowego, wykazującego podobną organizację jak gen ludzki.

1i

■

Ryc. 52-6. Schemat struktury ludzkiego genu insulinowego. Skośnie zakreskowane obszary odpowiadają sekwencjom nie ulegającym transkrypcji do odpowiednich sekwencji mRNA. Białe poia odpowiadają sekwencjom intronów, zaś pola kropkowane — sekwencjom kodującym. Litery L, B, C i A oznaczają sekwencje kodujące peptyd liderow y {sygnalny) L, łańcuch B, peptyd C i łańcuch A. NaleŜy zwrócić uwagę na to, Ŝe sekwencję kodującą peptyd C rozdziela sekwencja intronu. Schemat struktury odpowiada rzeczywistej skali. (Według: Tager H. S.: Abnormal proctucts of the human insulin gene; Diabetes 1984, 33, 693, za zezwoleniem).

W odróŜnieniu od nich szczury i myszy mają dwa nieallelowe geny insulinowe. KaŜdy z nich koduje swoistą proinsulinę, ulegającą przekształceniu do aktywnej cząsteczki insulinowej. Synteza ludzkiej insuliny w bakteryjnych układach ekspresyjnych, uŜywając technologii rekombinacji DNA, jest znakomitym źródłem insuliny dla chorych na cukrzycę.

insuliny. Progowe stęŜenie glukozy, przy którym dochodzi do pobudzenia sekrecji insuliny, wynosi 4,4—5,5 mmol/1 (80—100 mg/dl), zaś maksymalne wydzielanie tego hormonu występuje przy glikemii wynoszącej 16,7—27,8 mmol/1 (300—500 mg/dl). Zaproponowano dwie róŜne hipotezy tłumaczące regulację sekrecji insuliny przez glukozę. Według jednej hipotezy glukoza wiąŜe się z receptorem umiejscowionym prawdopodobnie w błonie plazmatycznej komórek B, aktywując w ten sposób mechanizm uwalniania insuliny. Druga hipoteza zakłada, Ŝe czynnikiem regulującym sekrecję insuliny są środkomórkowe metabolity lub tempo ich przepływu przez określony szlak metaboliczny, np. przez cykl penlozofosforanowy, cykl kwasów trikarboksylowych lub przez szlak glflrólityczny. Istnieją dane doświadczalne dowodzące słuszności obu hipotez.

Czynniki hormonalne. Liczne hormony wpływają na uwalnianie insuliny. Agoniści oc-adrenergiczni, głównie adrenalina, hamują uwalnianie insuliny nawet wtedy, kiedy proces ten był pobudzany glukozą. Agoniści P-adrenergiczni pobudzają uwalnianie insuliny prawdopodobnie poprzez zwiększanie stęŜenia śródkomórkowego cAMP (patrz niŜej). Przewlekła ekspozycja na duŜe stęŜenia hormonu wzrostu, kortyzolu, laktogenu łoŜyskowego, estrogenów i progestyn równieŜ zwiększa sekrecję insuliny. Nie jest więc zaskoczeniem, Ŝe wydzielanie insuliny znacznie wzrasta w późnych stadiach ciąŜy.

Czynniki farmakologiczne. Wiele leków pobudza wydzielanie insuliny, lecz najczęściej uŜywane w lecznictwie są pochodne sulfonylomocznika. Leki, takie jak tolbutamid, pobudzają uwalnianie insuliny w inny sposób niŜ opisany wyŜej dla glukozy. Znalazły one szerokie zastosowanie w leczeniu cukrzycy typu II (insulinoniezaleŜnej).

Wydzielanie insuliny jest precyzyjnie — CH3 regulowane SO 2 — NH— C—NHLudzka trzustka wydziela 40—50 jednostek insuliny dziennie. Stanowi to ok. 15% hormonu O magazynowanego w tym gruczole. Sekrecja H3C Tolbutarnid insuliny jest procesem energochłonnym, w któInsulina jest szybko rym uczestniczy układ mikrokanalików i mikrofilamentów komórek B wysp trzustkowych. metabolizowana W odróŜnieniu od czynników wzrostowych W uwalnianiu insuliny biorą udział liczne meinsulinopodobnych insulina nie ma białek transdiatory. Glukoza. Wzrost stęŜenia glukozy w osoczu portowych w osoczu krwi. Ten fakt tłumaczy jest najwaŜniejszym regulatorem wydzielania

678 / ROZDZIAŁ 52

krótki okres półtrwania insuliny wynoszący w normalnych warunkach mniej niŜ j—5 min. Głównymi narządami uczestniczącymi w przemianie insuliny są wątroba, nerki i łoŜysko. 50% insuliny zawartej we krwi ulega klirensowaniu przez wątrobę po jednorazowym jej przejściu przez ten narząd. Za przemianę insuliny odpowiedzialne są mechanizmy, w których uczestniczą dwa układy enzymatyczne. Pierwszy

z nich zawiera proteazę występującą w wielu tkankach, natomiast w najwyŜszym stęŜeniu w ww. narządach. Proteazę tę oczyszczono z mięśni szkieletowych. Wykazano, Ŝe jest ona zaleŜna od grup sulfhydrylowych i aktywna przy fizjologicznym pH. Drugi układ enzymaty-

jest omawiany bardziej szczegółowo w dalszych częściach tego rozdziału. Wielomocz (poliuria). wzmoŜone pragnienie (polidypsja) oraz utrata masy ciała pomimo adekwatnego odŜywiania kalorycznego są głównymi objawami niedoboru insuliny. Jak wytłuma-

czyć taki stan rzeczy? U osób zdrowych stęŜenie glukozy w osoczu krwi rzadko przekracza 6,7 mmol/1 (120 mg/dl). Z reguły znacznie wyŜsze stęŜenia spotykane są u chorych, u których działanie insuliny jest niedostateczne (ryc. 52-8).

-

■

40 0

czny zawiera transhydrogenaze glutationowo-in-

sulinową. Enzym ten redukuje wiązania dwusiarczkowe, po czym powstałe w ten sposób łańcuchy A i B ulegają szybkiej degradacji. Nie wyjaśniono, który z wymienionych mechanizmów jest bardziej aktywny w warunkach fizjologicznycb, ani teŜ, czy wymienione procesy są regulowane. Główną rolę insuliny w przemianie węglowodanowej, tłuszczowej i białkowej moŜna najlepiej ocenić badając skutki niedoboru insuliny u ludzi Głównym objawem cukrzycy jest hipergliktmia. Jest ona spowodowana: 1) upośledzonym napływem glukozy do komórek, 2) upośledzonym zuŜytkowaniem (utylizacją) glukozy przez róŜne tkanki i 3) wzmoŜonym wytwarzaniem glukozy w wątrobie (w procesie zwanym glukoneogenezą) (ryc. 52-7). KaŜdy z tych procesó W

Niedobór Insuliny nadmiar glukagonu)

ł

Wzrósł lipolizy

ł WzmoŜon Upośledzony wychwyt glukozy przez y katabollzm komórki białek -Wzrost stęŜenia aminokwasów we krwi, utrata związków azotowych z moczem

Wzrost stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych, ketogenezy, ketonu rl i ketonernil

Odwód nie-" nie, kwasica

+ Hlpergllkemla, gllkozurla, d! uraza osmotyczna. utrata elektrolitów

Ryc. 52-7. Patofizjologia niedoboru insuliny. (Dzięki uprzejmości R. J. Havela).

20 0 n

s"^

— 1

,

1

,

Insulina i

i

i

200 400 600 800 StęŜenie glukozy w przestrzeni pozakomórkowej (mg/dl)

Ryc. 52-8. Wnikanie glukozy do komórek mięśniowych.

Po przekroczeniu określonego stęŜenia glukozy we krwi zwykle stęŜenia 10 mmol/1 (180 mg/dl), zostaje przekroczony górny próg reabsorpcji tego cukru w kanalikach nerkowych, co sprawia, Ŝe glukoza wydalana jest z moczem (obecność glukozy w moczu określa się jako glukozuric). W wyniku diurezy osmotycznej zwiększa się objętość wydalonego moczu, zaś współwystępująca translokacja układu transportowego glukozy jest zaleŜna od temperatury i energochłonna, a niezaleŜna od syntezy białka (ryc. 52-9). Komórka wątrobowa stanowi godny uwagi wyjątek w podanym schemacie działania insuliny.

Insulina nie zwiększa napływu glukozy do hepatocytów na zasadzie dyfuzji ułatwionej, natomiast pośrednio nasila taki napływ indukując syntezę glukokinazy — enzymu przekształcającego śródkomórkową glukozę do glukozo-6-fosforanu. Ta szybka fosforylacja sprawia, Ŝe stęŜenie wolnej glukozy w hepatocytach jest bardzo małe, co sprzyja napływowi tego cukru do komórek wątrobowych na zasadzie prostej dyfuzji zgodnie z gradientem stęŜenia przez błonę komórkową.

HORMONY TRZUSTKI i śOŁĄDKOWO-JELITOWE / 679 Dysocjacja

© Transport U Kłady — t ran sportowe glukozy

© Połączenie

Błona plazmatyczn a

Rya. 52-9. Translokacja transporterów glukozowych przez insulinę (Według: Karnieti E, i wsp.: Insulin-stimulated translocation of glucose transport systems in the isolated adipose celi; J. Biol. Chem. 1981, 256, 4772, za zezwoleniem, dzięki uprze/mości S. Curshman).

Insulina wzmaga równieŜ napływ do komórek, szczególnie mięśniowych, aminokwasów, potasu, jonów wapniowych, nukleozydów i fosforanów nieorganicznych. To działanie insuliny jest niezaleŜne od jej wpływu na dokomórkowy transport glukozy.

Wpływ na utylizację glukozy. Insulina wpływa na śród komórkowe zuŜytkowanie glukozy za pośrednictwem wielu mechanizmów omawianych niŜej. Przekształco rta >w energię Glukoza (w procesie glikolizy) w spoŜytych 'Przekształcana pokarmach w tłuszcze ► Przekształcana w glikogen

U zdrowego człowieka około połowa spoŜytej glukozy jest pf Ŝekształcana w energię w szlaku glikolkycznym, zaś dalsza połowa zostaje zmagazynowana pod postacią tłuszczów i glikogenu. Glikoliza zmniejsza się, jeśli nie ma insuliny, równocześnie zahamowane zostają anaboliczne procesy glikogenogenezy i lipogenezy. Rzeczywiście u chorego na cukrzycę z niedoborem insuliny zaledwie 5% spoŜytej glukozy ulega konwersji do tłuszczów. Insulina nasila procesy glikolityczne zwiększając aktywność i stęŜenie kilku głównych enzymów tego szlaku metabolicznego w tym glukokinazy, fosfofruktokinazy i kinazy pirogronianowej. Wzrost glikolizy nasila utylizację glukozy, przez co pośrednio zmniejsza napływ glukozy do osocza. Insulina obniŜa równieŜ aktywność glukozo-6-fosfatazy, enzymu występującego w wątrobie, lecz nieobecnego w mięśniach. PoniewaŜ glukozo-6-fosfo ran nie jest w stanie przejść przez barierę błony plazmatyczaej, dochodzi, w wyniku hamującego działania insuliny na glukozo-6-fo sfatazę, do zatrzymania glukozy w obrębie komórek wątrobowych. Insulina pobudza lipogeneze w tkance tłuszczowej 1) dostarczając acetylo-CoA i NADPH niezbędnych do syntezy kwasów tłuszczowych, 2) podtrzymując normalną aktywność karboksylazy acetylo-CoA katalizującej konwersję acetylo-CoA do malonylo-CoA oraz 3) dostarczając glicerolu niezbędnego do syntezy triglicerydów. W niedoborze insuliny aktywność wszystkich wymienionych enzymów jest obniŜona, przez co spada nasilenie lipogenezy. Inną przyczyną obniŜonej lipogenezy w stanach niedoboru insuliny są wolne kwasy tłuszczowe uwalniane w duŜych ilościach przez kilka hormonów, normalnie blokowanych przez insulinę. Wzrost stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych jest przyczyną hamowania ich własnej syntezy mechanizmem sprzęŜenia zwrotnego (poprzez hamowanie karboksylazy acetylo-CoA). Efekt netto insuliny na tkankę tłuszczową ma więc charakter anaboliczny. Wpływ insuliny na utylizację glukozy obejmuje jeszcze inny proces anaboliczny. W wątrobie i mięśniach szkieletowych insulina pobudza konwersję glukozy do glukozo-6-fosforanu, ulegającego z kolei izomeryzacji do glukozo-t-fosforanu i wbudowaniu do glikogenu przez syntazę glikogenową. Ta ostatnia jest aktywowana przez insulinę. Ten wpływ insuliny jest pośredni i ma dwoisty charakter. Insulina obniŜa śródkomórkowe stęŜenie cAMP aktywując

680 / ROZDZIAŁ 52

fosfodiesterazę. PoniewaŜ cAMP-zaleŜna fosforylacja powoduje inaktywację syntazy glikogenowej, małe stęŜenia wymienionego nukleotydu sprawiają, Ŝe enzym ten występuje w postaci aktywnej. Insulina aktywuje równieŜ fosfatazę katalizującą defosforylację syntazy glikogenowej, przez co dochodzi do aktywacji tego enzymu. W końcu insulina hamuje fosforylazę za pośrednictwem mechanizmu opisanego wyŜej, a realizowanego przy udziale cAMP i fosfatazy. W wyniku tego procesu dochodzi do spadku uwalniania glukozy z glikogenu. Efekt netto działania insuliny na przemianę glikogenową ma więc charakter anaboliczny.

Wpływ insuliny na produkcję glukozy (glukoneogenezę). Wpływ insuliny na transport glukozy, glikolizę i glikogenogenezę realizowany jest w ciągu sekund lub minut, poniewaŜ polega na aktywacji lub inaktywacji enzymów drogą ich fosforylacji lub defosforyłacji. DłuŜej trwający wpływ na glikemię wywiera insulina poprzez hamowanie glukoneogenezy. W procesie tworzenia glukozy z prekursorów nieweglowodanowych uczestniczą: enzymy pobudzane przez glukagon (działający za pośrednictwem cAMP), hormony glukokortykosteroidowe oraz, w mniejszym stopniu, związki ai p-adrenergiczne, angiotensyna II i wazopresyna. Insulina działa hamująco na enzymy stymulowane przez glukagon. Głównym enzymem glukoneogenetycznym jest karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa (PEPCK) przekształcająca szczawiooctan w fosfoenolopirogronian. Nowsze badania wykazały, Ŝe insulina zmniejsza stęŜenie tego enzymu, wybiórczo hamując transkrypcję mRNA kodującego PEPCK (patrz niŜej).-s

Wpływ na przemianę glukozy. Skutkiem wszystkich wyŜej wymienionych działań insuliny jest spadek stęŜenia glukozy we krwi. W tym działaniu insulina samotnie przeciwdziała wielu hormonom, wykazującym działanie hiperglikemiczne. Działanie tych hormonów jest niewątpliwie wyrazem bardzo waŜnego mechanizmu wyrównawczego, umoŜliwiającego uniknięcie potencjalnie śmiertelnych skutków działania długotrwałej hipoglikemii na mózg.

Wpływ na przemianę tłuszczową. Działanie lip o genetyczne insuliny przedyskutowano przy omawianiu wpływu tego hormonu na utyiizację glukozy. Insulina jest równieŜ potęŜnym inhibitorem lipolizy w wątrobie i tkance tłuszczowej, przez co wykazuje równieŜ pośrednio działanie anaboliczne. Działanie to

jest częściowo wynikiem hamującego działania insuliny na powstawanie cAMP w tkankach (stęŜenie tego nukleotydu w tych tkankach podwyŜszają glukagon i adrenalina) oraz na aktywność lipazy wraŜliwej na działanie hormonów nasilających lipolizę. Ten hamujący wpływ spowodowany jest prawdopodobnie aktywacją fosfatazy powodującej defosforylacje, i tym samym inaktywacje lipazy lub kinazy białek cAMP-zaleŜnej. Dlatego teŜ insulina zmniejsza stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych we krwi krąŜącej. To działanie insuliny pośrednio wpływa równieŜ na przemianę węglowodanów, bowiem wolne kwasy tłuszczowe hamują glikolizę na róŜnych etapach szlaku glikolitycznego oraz pobudzają glukoneogenezę. To wszystko tłumaczy, dlaczego niemoŜliwe jest omawianie regulacji metabolicznej w kontekście tylko jednego hormonu lub jednego metabolitu. Regulacja jest złoŜonym procesem, w którym aktywność określonego szlaku metabolicznego jest wynikiem interakcji licznych hormonów i metabolitów. U chorych z niedoborem insuliny wzrasta aktywność lipazy, będąca przyczyną wz/ostu lipolizy i stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu krwi i w wątrobie. U chorych tych wzrasta równieŜ stęŜenie glukagonu, tj. hormonu pobudzającego uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych. Glukagon działa antagonistycznie w stosunku do insuliny, tak Ŝe stan metaboliczny chorego na cukrzyce jest odzwierciedleniem względnych stęŜeń glukagonu i insuliny. Część wolnych kwasów tłuszczowych ulega metabolizacji do acetylo-CoA (jest to odwrócenie lipogenezy), a następnie do CO2 i wody w cyklu kwasów trikarboksyłowych (w cyklu kwasu cytrynowego). U chorych z niedoborem insuliny proces ten szybko przekracza „pojemność" tego cyklu, przez co acetylo-CoA ulega konwersji do acetoaoetylo-CoA, i kolejno do kwasu acetooctowego i p-hydroksymasłowego. Insulina odwraca ten ostatni proces. Insulina w sposób wyrazisty wpływa na powstawanie i klirens VLDL i LDL. StęŜenia tych frakcji fipidowych, a w ich następstwie równieŜ stęŜenie cholesterolu, często ulegają podwyŜszeniu u chorych z niedostatecznie kontrolowaną cukrzycą, W tym defekcie ma tkwić przyczyna przyspieszonego rozwoju miaŜdŜycy, stanowiącego powaŜny problem u wielu chorych na cukrzycę. O mechanizmach działania insuliny moŜna sobie wyrobić pogląd, śledząc ryc. 52-10, od-

HORMONY TRZUSTKI I ŹOŁĄDKOWO-JELITOWE / 681 Tłuszcze (tfcanka

tłuszczowa)

Glukoza

""" rrrn

Glukozo-6-fosforan ^ . Shunt I heKsozo; -monofosfo! ranowy /

T

Obecność glukozy w moczu (glikozuria)

ł

\ \ ,

y

T

i

Fosforan trlozy ■*- Aminokwasy Fosfoenolopir ogronian I i i ł PI rogron

"' *S WzmoŜona llpollza

Ac yl o-C oA

// Trlacylogllceroi

ian

<■

Wolne Kwasy tłuszczowe (osocze)

I

:awloc WzmoŜona gllkogenollza

------ » Upośledzania glikollzy, syntezy gllkogenu i utylizacji aoetylo-CoA

T

■■^ WzmoŜona glukoneogsneza

Acetyio*•*. CoA

Szcza wio octan Cykl kwasu cytrynowego

Ketokwasy (hlperKetonacnia)

Ketokwasy w moczu (keton uria) Cylrynian

r

a-Ketoglutaran

Amlnolwasy

Bye. 52-10. W cięŜkim niedoborze insuliny dochodzi do nasilenia lipolizy. Znajduje to swoje odzwierciedlenie we wzroście stęŜenia triacytoglicerolu (triglicerydów) we krwi (hiperlipidemia). Małe ilości acetylo-CoA są metabolizowane w cyklu kwasu cytrynowego (cyklu kwasów trikarboksylowych), pozostała zaś część ulega konwersji do ketokwasów wyraŜającej się ketonemią i ketonurią. PoniewaŜ glikoliza jest zahamowana, powstały w wyniku glikogenolizy glukozo-6-fosforan (G-6-P) ulega przekształceniu do gfukozy. Proces ten, wraz ze wzmoŜoną glukoneogenezą, jest przyczyną hiperglikemii. WzmoŜona glukoneogeneza spowodowana jest zwiększonym napływem aminokwasów (pochodzących z katabolizmu białkowego) oraz wzrostem aktywności karboksykinazy fosioenolopirogronianowej (PEPCK), Wszystkie wymienione procesy ulegają odwróceniu pod wpływem insuliny.

zwierciedlającą kierunki zmian kilku krytycznych szlaków metabolicznych uwarunkowanych nieobecnością tego hormonu.

Wpływ na przemianę białek. Insulina generalnie wykazuje wpływ anaboliczny na przemianę białek pobudzając ich syntezę i hamując degradację. Insulina pobudza pobieranie aminokwasów obojętnych przez mięśnie, przy czym działanie to nie jest sprzęŜone z pobiera-

niem glukozy, ani teŜ z wbudowywaniem tych aminokwasów do białek. Przyjmuje się, Ŝe wpływ insuliny na syntezę białek w mięśniach szkieletowych i w mięśniu sercowym realizowany jest na poziomie translacji mRNA. W ostatnich latach wykazano, Ŝe insulina wpływa na syntezę swoistych białek powodując zmiany odpowiednich mRNA. Działanie insuliny, które moŜe ostatecznie tłumaczyć wpływ

682 / ROZDZIAŁ 52

tego hormonu na aktywność lub ilość swoistych białek, jest przedmiotem dyskusji dalszej części tego rozdziału.

Wpływ na podziały komórkowe. Insulina pobudza mnoŜenie się licznych komórek w hodowlach oraz moŜe uczestniczyć w regulacji wzrostu in vivo. W badaniach dotyczących regulacji procesów wzrostowych najczęściej uŜywa się hodowli fibroblastów. W takich komórkach insulina nasila działanie czynnika wzrostowego fibroblastów (FGF), czynnika wzrostowego pochodzenia płytkowego (PDGF), naskórkowego czynnika wzrostowego (EGF), estrów forbolowych pobudzających nowotwory, prostaglandyny F^PGF^), wazoprcsyny i analogów cAM P. pobudzając progresję cyklu komórkowego zatrzymanego w fazie G,. Nowa frapująca dziedzina badań dotyczy aktywności kinazy tyrozynowej. Receptor insulinowy, podobnie jak receptor dla peptydów pobudzających wzrost, w tym równieŜ dla

PDGF i EGF, wykazuje aktywność kinazy tyrozynowej. Interesujący jest fakt, Ŝe co najmniej 10 produktów onkogenów, spośród których wiele jest podejrzanych o działanie pobudzające podział złośliwych komórek nowotworowych, jest równieŜ kinazami tyrozynowymi. Komórki ssaków zawierają analogi tych onkogenów (protoonkogeny), które mogą uczestniczyć w podziale normalnych komórek. Za słusznością takiego poglądu przemawiają niedawne obserwacje, Ŝe dodanie PDGF lub komórek z zatrzymaniem wzrostu (uwarunkowanym niedoborem insuliny) do hodowli normalnych komórek nasila ekspresję co najmniej 2 produktów p roto onkogenów, tj. c-fos i c-myc. Działanie insuliny zostało wyjaśnione Działanie insuliny rozpoczyna się z chwilą wiązania się tego hormonu ze swoistym receptorem glikoproteinowym umiejscowionym na powierzchni komórek docelowych. Skutki działania tego hormonu (ryc. 52-11) mogą wystąpić

Insulina Transpo rt gluKozy Wzrost i replikac|a

komórek

Sygnał (sygnały) przBZ błon owy (przez błonowe) Foaforylaeja — dełostorylacja białek Aktywacja I hamowanie enzymów

Ryc. 52-11. Relacja między receptorem insulinowym a działaniem insuliny. Insulina wiąŜe się ze swoim receptorem błonowym wyzwalając jeden lub więcej sygnałów przezblonowych. Ten sygnał (lub te sygnały) moduluje (modulują) bardzo róŜnorodne zjawiska śród kom orkowe.

HORMONY TRZUSTKI I śOŁĄDKOWO-JELITOWE / 683

w ciągu sekund lub minut (wpływ insuliny na transport', fosforylację białek, aktywację lub hamowanie enzymów, syntezę RNA) lub po kilku godzinach (synteza białek i DNA, wzrost komórek). B^cejstojLinsulinc-wy przebadano szczegółowo, uŜywając technik biochemicznych i rekombinacji DNA, Jest on heterodimerem złoŜonym z .dwóchi rjodjednostek. określanych jako a i p, o konfiguracji oti-p^ połączonych ze sobą wiązaniami -dwusiarczkowymi (ryc. 52-12). Obydwie pod jednostki są obficie glikozylowane, zaś odszczepienie od nich kwasu sjalowego i galaktozy zmniejsza wiązanie insuliny i aktywność tego hormonu. K.aida z wymienionych podjednostek glikoproteinowych wykazuje wyjątkową strukturę i czynność. Ppdjednostka cc (o masie cząsteczkowej 135 000) połoŜona jest całkowicie pozakomÓĘkgwjp, ^iaŜe ona insulinę prawdopodobnie przez domenę bogatą w cysteinę. Podjednos^aJ} (o masie cząsteczkowej 95 000) jest białkiem przezbłonowym, pełniącym drugą waŜną funkcję receptora (p. rozdz. 45), tj. przekaźnika sygnału. Część cyloplazmatyczna lej podjcdnostki wykazuje aktywność kinazy tyrozynowej oraz posiada obszar o właściwościach autofosforylujących. Obydwa te obszary uczestniczą w transdukcji sygnału i działaniu insuliny (p. niŜej). Na rycinie 52-12 przed-

LOL

EGF

stawiono uderzające podobieństwa miedzy 3 receptorami wykazującymi róŜne funkcje. Rzeczywiście kilka obszarów podjednostki p wykazuje homologię w zakresie sekwencji aminokwasowej z receptorem EGF. Receptor insulinowy ulega nieustannej syntezie i degradacji i wykazuje okres półtrwania wynoszący 7—12 h. Receptor jest syntetyzowany w siateczce śródplazmatycznej szorstkiej jako jednołańcuchowy peptyd, po czym ulega szybkiej glikozylacji w aparacie Golgiego. Prekursor ludzkiego receptora insulinowego składa się z 1 382 aminokwasów. Jego masa cząsteczkowa wynosi 190 000. Ulega on rozszczepieniu z wytworzeniem „dojrzałych" podjednostek a i p. Gen kodujący ludzki receptor insulinowy zlokalizowany jest na chromosomie 19. Receptory insulinowe występują na powierzchni większości komórek ssaków, w ilości do 20 000 na jedną komórkę, często równieŜ na komórkach, których nie uwaŜa się za typowe komórki docelowe dla tego hormonu. Insulina wywiera wpływ na wiele dobrze poznanych procesów metabolicznych i uczestniczy w procesach wzrostu i rephkacji komórek (patrz wyŜej), w organogenezie i róŜnicowaniu tkanek u płodów oraz w procesach naprawczych i regeneracyjnych. Struktura receptora insulinowego oraz zdolność róŜnych insulin do wiązania się z rece-

łnsuima NH, NH,

FRAGMENT RECEPTORA POŁOśONY POZAKOMORKOWO

COOH

CYTOPLAZMATYCZNY FRAGMENT RECEPTORA

)

O

OO H

Ryc. 52-12. Schemat struktury receptorów LDL, EGF i insulinowego. N-koniec kaŜdego z tych receptorów znajduje się w po z a kom orko wo połoŜonej części cząsteczki. Prostokąty oznaczają sekwencje aminokwasowe bogate w cysteinę, wiąŜące hormon. KaŜdy receptor posiada krótką domenę (złoŜoną z ok. 25 aminokwasów) przenikającą błonę plazmatyczną (zaznaczoną jako pole zakreskowane) oraz domenę śródkomórkową o zmiennej długości. Receptor EGF i insulinowy wykazują aktywność kinazy tyrozynowej związanej z domeną cytoplazmatyczną (zaznaczoną kółeczkami) oraz miejsca autofosforyfacji połoŜone w tym obszarze receptora. Receptor insulinowy jest heterodimerem. Jego podjednostki związane są ze sobą przez wiązania dwusiarczkowe (zaznaczone jako kreski poziome), ________________________

684 / ROZDZIAŁ 52

ptorem i wywołania reakcji biologicznych są praktycznie identyczne we wszystkich komórkach i u wszystkich gatunków zwierząt. Dodać jednak naleŜy, Ŝe insulina świńska jest 10—20-krotnie bardziej skuteczna niŜ proinsulina świńska, zaś ta ostatnia jest 10—20-krotnie bardziej efektywna niŜ insulina świnki morskiej nawet u tego gatunku zwierząt. Sugeruje to oczywiście bardziej konserwatywny charakter struktury receptora insulinowego niŜ samej insuliny. W chwili wiązania się insuliny z receptorem zachodzą następujące zjawiska: 1) dochodzi do zmian konformacyjnych receptora, 2) receptory łączą się ze sobą tworząc mikroagregaty, 3) receptor ulega internalizacji oraz 4) wyzwolony zostaje jeden lub kilka sygnałów. Znaczenie zmian konformacyjnych jest nieznane, zaś internalizacja receptora jest zapewne wyrazem działania mechanizmu regulującego stęŜenie i obrót receptorów. W stanach przebiegających z duŜym stęŜeniem insuliny w osoczu krwi, np. w otyłości lub akromegalii, liczba receptorów insulinowych jest obniŜona, zaś tkanki docelowe (tarczowe) są mniej czułe na działanie insuliny. Ten proces zmniejszenia się liczby receptorów (down reguł a ti on) jest spowodowany ich internalizacją, tj. procesem, w którym kompleksy złoŜone z insuliny i receptora wnikają do komórki na zasadzie endocytozy, pod postacią pęcherzyków pokrytych białkami klatrynowyrai (p. rozdz, 41). Proces „down regulation" częściowo tłumaczy oporność na insulinę występującą w otyłości i cukrzycy typu II. Dotychczas nie oRreślono śródkomórkowego (śródkomórk owych) przekaźnika (przekaźników) działania insuliny Pomimo Ŝe mechanizm działania insuliny jest przedmiotem badań od 60 lat, w dalszym ciągu nie wyjaśniono pewnych krytycznych jego elementów, takich jak istoty śródkomórkowego sygnału tego hormonu. Pod tym względem insulina nie jest wyjątkiem, nie zidentyfikowano bowiem równieŜ śródkomórk owych pośredników dla wieiu innych hormonów (p. tab. 45-1). Zaproponowano cały szereg róŜnych cząsteczek jako drugiego przekaźnika działania insuliny. Wśród nich naleŜy wymienić samą insulinę, wapń, cykliczne nukleotydy (cAMP, cGMP), H2O2, peptydy pochodzenia'błonowego, błonowe glikany ibsfoinozytoiowe, jedno wartościowe kationy oraz kinazę tyrozynową (tj. sam

receptor insuliny). śadna z tych cząsteczek nie wytrzymała rygorów sprawdzających. Aktualnie zainteresowanie koncentruje się na obserwacji, Ŝe sam receptor insuliny jest enzymem insulino wraŜliwym, poniewaŜ ulega auto fosfory lacj i w chwili związania się z insuliną. Funkcję fosforylacji przypisuje się podjednostce p, która działa jak kinaza białek przenosząc resztę y-fosforanową ATP na resztę tyrozylową podjednostek p (ryc. 52-12). Insulina zwiększa Vmax tej reakcji enzymatycznej, Fosforylacja tyrozyny jest zjawiskiem niezwykłym w komórkach ssaków (fosfo tyrozyna stanowi zaledwie 0,03% fosforylowanych aminokwasów normalnej komórki) i moŜliwe, Ŝe nie jest to przypadkiem, Ŝe receptory EGF, PDGF i IGF-I wykazują równieŜ aktywność kinazy tyrozynowej. UwaŜa się, Ŝe aktywność kinazy tyrozynowej stanowi istotny czynnik w działaniu licznych produktów onkogenów wirusowych. Relację tej kinazy tyrozynowej do komórkowych analogów wykazujących podobne właściwości pobudzające wzrost zarówno złośliwych komórek nowotworowych, jak i komórek normalnych omówiono wyŜej. W miarę poznawania struktury ujawniono występowanie homologii wysokiego stopnia między receptorami i onkogenami, np. między receptorem EGF a onkogenem erb-B, między receptorem PDGF a onkogenem v-sis oraz między receptorem insulinowym a onkogenem v-ros. Nie udowodniono, by kinaza tyrozynową uczestniczyła w transdukcji sygnału. Jej udział w tym procesie mógłby polegać na fosforylacji swoistego białka rozpoczynającego działanie insuliny, na inicjacji kaskady fosforylacji-defosforylacji, na indukowaniu zmiany niektórych właściwości błony komórkowej lub na tworzeniu produktu związanego z błoną komórkową, np. glikanu fosfoinozytolowego. Reakcje fosforylacji i defosforylacji białek uczestniczą w niektórych działaniach insuliny Wieie skutków metabolicznych insuliny, szczególnie te, które następują szybko, są wynikiem reakcji fosforylacji i defosforylacji białek, zmieniających z kolei aktywność enzymatyczną tych ostatnich. Listę enzymów podlegających takim reakcjom przedstawia tab. 52-3. W niektórych przypadkach insulina zmniejsza stęŜenie środkom orkowe cAMP (aktywując fosfodiesterazę cAMP), w wyniku czego zmniejsza się aktywność cAMP-zaleŜnej kinazy białek.

HORMONY TRZUSTKI ! ZOŁĄDKOWO-JELITOWE / 686 Tabela 52-3. Enzymy, których stopień fosforylacji i aktywności utega zmianie pod wpływem insuliny* Enzym

Zmiana aktywności

MoŜliw y mechanizm

Wzrost Spadek

Fosforylacja SprzęŜenie receptora z podjednostkami C

Syntaza glikogenowa

Wzrost

Defosforylacja

Kinaza fosforylazowa

Spadek

Defosforylacja

Fosfory laza

Spadek

Defosforylacja

Dehydrogenaza pirogronianowa Kinaza pirogronianowa

Wzrost Wzrost

Defosforylacja Defosforylacja

6-Fosfofrukto-2-kinaza Fru ktozo - 2,6 - b isf osf ata za

Wzrost Spadek

Defosforytacja Defosforylacja

Ka r b oksy) aza acety 1 o - C o A

Wzrost

Fosforylacja

Reduktaza hydroksy mety logi uta ryf o- CoA

Wzrost

Defosforylacja

Lipaza triacylogticerolowa

Spadek

Defosforylacja

Przemiana cAMP F osłod testera za {niska wartość K ) Kinaza białek (cAMP-zalezna) Przemiana glikogenu

Glikoliza i glukoneogeneza

Przemiana lipidowa

Inne Kineza tyrozyn owa (receptor insulinowy)

Fosforylacja

* Według Denton R.M. i współ.: Apartial viewof themechanism of insulin action; Diabetologia 1981, 21, 347, w modyfikacji autora rozdziału, za pozwoleniem.

Przykładami takiego działania są syntaza glikogenowa i fosforylaza. W innych przypadkach działanie insuliny jest niezaleŜne od cAMP i polega na aktywacji (jak w przypadku receptora insulinowego, w którym insulina aktywuje kinaze tyrozynową stanowiącą część łańcucha P tego receptora) lub hamowaniu innych kinaz białek (p. tab. 45-5), lub teŜ, co zdarza się częściej, na stymulacji fosfataz fosfoprotein. Defosforylacja zwiększa aktywność licznych enzymów kluczowych (tab. 52-3). Te modyfikacje kowaiencyjne umoŜliwiają prawie natychmiastowe zmiany aktywności enzymów. Insulina wpływa na proces translacji mRIMA Wiadomo, Ŝe insulina wpływa na aktywność lub ilość co najmniej 50 białek występujących w róŜnych tkankach, przy czym wiele jej efektów jest wynikiem modyfikacji kowalencyjnej

struktury tych białek. Insulinie przypisuje się równieŜ rolę w procesie translacji mRNA, głównie na podstawie wyników badań nad rybo somalnym białkiem S6 stanowiącym składową rybosomalnej podjednostki 40S. Taki mechanizm działania dotyczy wpływu insuliny na syntezę białek w wątrobie, mięśniach szkieletowych i w mięśniu sercowym. WaŜnym działaniem insuliny jest jej wpływ na ekspresję genów Dotychczas omawiane przykłady działania insuliny zachodzą w błonie plazmatycznej lub w cytopiaztnie. Insulina wpływa takŜe na swoiste procesy w jądrach komórkowych, przypuszczalnie za pośrednictwem śród komórkowego mediatora. Enzym — karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa (PEPCK) katalizuje główny etap glukoneogenezy decydujący o tempie tego procesu. Insulina hamuje syntezę PEPCK i, co

686 / ROZDZIAŁ 52

za tym idzie, równieŜ glukoneogeneze. Nowsze badania wykazały, Ŝe tempo transkrypcji genu PEPCK zmniejsza się w ciągu kilku minut po dodaniu insuliny do hodowli komórek wątrobiaka(ryc. 52-13). Hamowanie 0.5

procesu trans-

3,0

100

Tabela 52-4. Informacyjne RNA regufowane przez insulinę Enzymy śród komórkowe A m i n ot ra n sf e ra za tyrozynowa* Karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa* Syntaza kwasów tłuszczowych Kinaza pirogronianowa* Dehydrogenaza glicerolo-3-fosf ora nowa* Detiydrogenaza 1 -gliceraldehydowa* Glukokinaza Białka sekrecyjrte i enzymy Albuminy* Adypsyna* Amylaza* a^-Globułina Hormon wzrostu* Białka uczestniczące w reprodukcji Albumina jaja kurzego Kazeina*

1.0

1.5 2.0 2.5 Czas po dodaniu Insuliny (h)

Ryc. 52-13. Wptyw insuliny na transkrypcję swoistych genów. Dodanie insuliny do hodowli komórek wątrobiaka H411E powoduje szybki spadek tempa transkrypcji genu PEPCK, W wyniku takiego działania stwierdza sie spadek ilości pierwotnego transkryptu w jądrze komórkowym oraz dojrzałego mRNA kodującego PEPCK, Tempo syntezy PEPCK spada po obniŜeniu się ilości cyloplazmatycznego mRNA kodującego PEPCK. (Według Sasaki K. i wsp.: Multihormonal regulation of phosphoenolpyruwate carboxykinase gene transcription; J. Biol. Chern. 1984, 259, 15242, za pozwoleniem).

krypcji jest przyczyn£Vpadku ilości pierwotnego transkryptu oraz dojrzałego mRNA kodującego PEPCK (mRNAPEPCK), co w następstwie prowadzi do zmniejszonego tempa syntezy PEPCK. To działanie insuliny zachodzi przy fizjologicznych stęŜeniach tego hormonu w surowicy (10~ 12 do 10~9 mol/l). Pośredniczy w nim receptor insulinowy. Działanie to wydaje się być spowodowane zmniejszonym nasileniem inicjacji transkrypcji mRNAPEPCK. Pomimo Ŝe badania nad regulacją syntezy PEPCK byty pierwszymi, w których udowodniono wpływ insuliny na proces transkrypcji genu, nie są one juŜ jedynymi tego rodzaju. Rzeczywiście wydaje się, Ŝe jeden z waŜniejszych mechanizmów działania insuliny polega na regulacji syntezy mRNA, Insulina wpływa na wiele swoistych mRNA, choć wiele mRNA będących pod wpływem tego hormonu a wy-

Białka strukturalne 8-Krystalina Inne białka 33 Wątroby (g , itd.) Tkanki tłuszczowej Mięśnia sercowego Mięśni szkieletowych * Insulina reguluje tempo transkrypcji swoistych mRNA,

stepujących w wątrobie, tkance tłuszczowej, mięśniach szkieletowych i w mięśniu sercowym, nie zostało jeszcze zidentyfikowanych (tab. 52-4). W kilku przypadkach wiadomo, Ŝe hormon ten wpływa na transkrypcję genu. Insulina wpływa na syntezę: 1) enzymów nie opuszczających komórek, 2) enzymów i białek wydzielanych przez komórkę oraz 3) białek strukturalnych (tab, 52-4). Wymienione skutki działania insuliny występują w licznych narządach i tkankach oraz u wielu gatunków zwierząt. W chwili obecnej wpływ insuliny na regulację transkrypcji swoistych mRNA jest dobrze udokumentowany. Znaczenie tego mechanizmu działania insuliny modulującego aktywność enzymów jest równowaŜne działaniu tego hormonu mechanizmem fosforylacji/defosforylacji. Wpływ insuliny na proces transkrypcji genu moŜna tłumaczyć jej działaniem na embriogenezę oraz róŜnicowanie, wzrost i replikację komórek.

HORMONY TRZUSTKI I śOŁĄDKOWO-JELITOWE / 687

Rola patofizjofogiczna insuliny jest najbardziej wyraŜona w cukrzycy Niedobór insuliny lub oporność na działanie tego hormonu są przyczyną cukrzycy. Około 90% chorych na cukrzycę cierpi na cukrzycę insulinoniezaleŜną (typ H) (non-insulin dependent diabetes metlitus — NIDDM). U pozostałych 10% stwierdza się cukrzycę insulinozaleŜną (typ I) (insulin dependent diabetes mellitus — IDDM). Omówione wyŜej zaburzenia metaboliczne dotyczą głównie cukrzycy typu I. Określone, rzadkie sytuacje ilustrują istotne cechy działania insuliny. Nieliczni chorzy wytwarzają przeciwciała skierowane przeciwko własnym receptorom insulinowym. Przeciwciała te uniemoŜliwiają wiązanie się insuliny ze swoim receptorem, co sprawia Ŝe u takich chorych rozwija się zespół cięŜkiej oporności na insulinę (p. tab. 44-2), Guzy wywodzące się z komórek B wysp Langerhansa są przyczyną hiperinsulinizrnu oraz zespołu charakteryzującego się cięŜką hipoglikemią. Rola insuliny (a moŜe równieŜ IGF-I lub IGF-II) w organogenezie i rozwoju jest widoczna na przykładzie rzadkich przypadków leprechaunizmu (krasnoludkowatuści). Zespół ten charakteryzuje się małą masą urodzeniową, zmniejszoną masą mięśniową i zmniejszoną podskórną tkanką tłuszczową, twarzą elfową oraz opornością na insulinę przy występowaniu znacznie podwyŜszonych stęŜeń biologicznie aktywnego hormonu w osoczu. Dzieci takie umierają we wczesnym dzieciństwie. Wiele osób dotkniętych leprechaunizmem wykazuje brak receptorów in-

sulinowych lub obecność receptorów uszkodzonych.

CZYNNIKI WZROSTOWE INSULINOPODOBNE (IGF-I I IGF-II) NIE SĄ HORMONAMI TRZUSTKOWYMI, LECZ WYKAZUJĄ PODOBIEŃSTWO STRUKTURALNE I CZYNNOŚCIOWE DO INSULINY Trudno oddzielić wpływ insuliny na wzrost i podziały komórkowe od podobnych efektów IGF-I i IGF-II. Rzeczywiście moŜe występować interakcja insuliny z wymienionymi czynnikami wzrostowymi w tych procesach. O strukturalnym podobieństwie wymienionych białek wspomniano juŜ wyŜej (p. ryc. 52-5). Bardziej szczegółowe porównanie tych hormonów przedstawia tab. 52-5. IGF-I i IGF-II są peptydami jedtiołańcuchowymi złoŜonymi z 70 (IGF-I) lub 67 (IGF-II) aminokwasów. Istnieje 62 procentowa homologia pomiędzy IGF-I i IGF-II, zaś 50% reszt aminokwasowych zawartych w tych hormonach jest identycznych z insuliną. Cząsteczki te mają wyjątkowe domeny antygenowe. Regulacja sekrecji tych hormonów jest róŜna (tab. 52-5). Insulina jest hormonem silniej oddziałującym na metabolizm, zaś czynniki wzrostowe insulinopodobne bardziej pobudzają wzrost. KaŜdy hormon posiada swoisty dla niego receptor. Receptor dla IGF-I, podobnie jak receptor insulinowy, jest heterodimerem o strukturze a2 -P 2 i jest kinazą tyrozynową.

Tabela 52-5. Porównanie insuliny z czynnikami wzrostowymi insuiinopodobnymi (dzięki uprzejmości C.R. Kahn) Insulina IGF-I IGF-łl Inne nazwy

—

Liczba aminokwasów Miejsce produkcji

51

Somatomedyna C

70

Czynnik stymulujący aktywność mnoŜenia się komórek (MSA) 67

Komórki B wysp trzustkowych

Wątroba i inne tkanki

RóŜne tkanki

Regulacja stęŜenia we krwi przez

Glukozę

Hormon wzrostu, stan odŜywiania

Nieznany czynnik

StęŜenie w osoczu

0,3-2 ng/ml

Rząd wielkości ng/ml

Rząd wielkości ng/ml

Białka wiąŜące w osoczu Główna rola fizjologiczna

Nieobecne Kontrola przemiany materii

Obecne Wzrost kości i chrząstek

Obecne Nieznana (moŜe uczestniczy w rozwoju zarodka)

688 / ROZDZIAŁ 52

W odróŜnieniu od receptora dla IGF-I, receptor dla IGF-II jest polipeptydem jednołańcuchowym o masie cząsteczkowej 260 000 i nie jest kinazą tyrozynową. Jest on bardzo podobny, jeŜeli nie identyczny, z receptorem dia mannozo-6-fbsforanu. Występuje pewne krzyŜowe wiązanie między wymienionymi hormonami i ich receptorami, co sprawia, Ŝe jeden hormon wykazuje pewną aktywność biologiczną równieŜ drugiego hormonu (tab. 52-6). Ogólnie mówiąc, aktywność pobudzająca wzrost wymienionych hormonów koreluje najlepiej z wielkością ich powinowactwa do receptorów IGF-I lub IGF-II. Tabela 52-6. Powinowactwo insuliny, IGF-I i IGF-II do róŜnych receptorów Hormon

Receptor insulinowy

IGF-I

IGF-II

Insulina

DuŜe

Małe

Prawie Ŝadne

IGF-I

Umiarkowane

DuŜe

Umiarkowane

IGF-II

Prawie Ŝadne

Małe

DuŜe

GLUKAGON JEST ANTAGONISTĄ INSULINY Po podaniu pierwszych handlowo dostępnych preparatów insulinowych obserwowano najpierw wzrost giikeaui a dopiero potem jej spadek. Zwiększenie glikemii było spowodowane zanieczyszczeniem tych preparatów glukagonem. Był on drugim hormonem odkrytym w komórkach wysp trzustkowych. Glukagon jest równieŜ syntetyzowany pod postacią cząsteczki prekursorowej Glukagon jest syntetyzowany głównie przez komórki A wysp trzustkowych. Jest on polipeptydem jednołań cuch owym (o masie cząsteczkowej 3485) złoŜonym z 29 aminokwasów (ryc. 52-E4). Glukagon jest produkowany pod postacią znacznie większej cząsteczki prekursorowej o masie cząsteczkowej 9000. Wyizolowano równieŜ cząsteczki większe, lecz nie ustalono, czy są one rzeczywistymi prekursorami glukagonu, czy teŜ peptydami blisko z nim spokrewnionymi. Zaledwie 30-40% występującego

w osoczu „glukagonu" immunoreaktywnego jest glukagonem trzustkowym. Pozostałą ilość stanowią cząsteczki większe, biologicznie nieaktywne. Glukagon trzustkowy ma pewne wspólne właściwości immunologiczne i fizjologiczne z enteroglukagonem — peptydem wyekstrahowanym z błony śluzowej dwunastnicy. 14 z 27 reszt aminokwasowych sekretyny jest identycznych z glukagonem. Glukagon krąŜy w osoczu w postaci wolnej. PoniewaŜ nie wiąŜe się z białkami transportowymi, jego okres półtrwania jest krótki (wynosi ok. 5 min). Glukagon ulega inaktywacji w wątrobie zawierającej enzym odszczepiający pierwsze dwa N-końcowe aminokwasy między Ser2 i Gin3. PoniewaŜ wątroba jest pierwszym narządem, do którego dociera glukagon po jego wydzielaniu i w którym hormon ten ulega inaktywacji, stęŜenie jego we krwi wrotnej jest znacznie wyŜsze niŜ w krąŜeniu obwodowym. Glukoza hamuje wydzielanie glukagonu. Ten fakt podkreśla przeciwstawne role metaboliczne' insuliny i glukagonu Nie jest jasne, czy glukoza hamuje bezpośrednio sekrecje glukagonu, czy teŜ pośrednikami takiego działania są insulina lub IGF-I. Te ostatnie dwa hormony hamują bezpośrednio wydzielanie glukagonu. Na sekrecję glukagonu wpływa wiele innych substancji, takich jak aminokwasy, kwasy tłuszczowe i związki ketonowe, hormony przewodu pokarmowego oraz neuroprzekaźniki. Działanie ogólne glukagonu jest przeciwstawne do działania insuliny O ile insulina sprzyja magazynowaniu energii, pobudzając glikogenogenezę, lipogenezę i syntezę białek, o tyle glukagon powoduje szybką mobilizację potencjalnych źródeł energetycznych, tj. glikogenolizę i lipolizę. Glukagon jest równieŜ hormonem najsilniej pobudzającym glukoneogenezę i ma działanie ketogenne. Wątroba jest najwaŜniejszym narządem docelowym glukagonu. Glukagon wiąŜe się ze swoistymi receptorami błony plazm a ty cznej hepatocytów, aktywując cyklazę adenylanową. Powstały cAMP, aktywując fosforylazę, nasila tempo rozpadu glikogenu, równocześnie zaś hamuje syntazę glikogenową, i co za tym idzie, powstawanie glikogenu (p. rozdz. 45). To dzia-

HORMONY TRZUSTKI I śOŁĄDKOWO-JELITOWE / 689

lanie wykazuje pewną swoistość hormonalną i tkankową. I tak glukagon nie wywiera Ŝadnego wpływu na glikogenolizę w mięśniach, podczas gdy adrenalina jest pod tym względem aktywna zarówno w mięśniach, jak i w wątrobie. Zwiększone stęŜenie cAMP w komórkach wątrobowych pobudza konwersję aminokwasów w glukozę indukując syntezę licznych enzymów szlaku glukoneogenetycznego. Głównym enzymem tego 'szlaku jest PEPCK. Glukagon, za pośrednictwem cAMP, zwiększa tempo transkrypcji mRNA genu kodującego PEPCK, i tym samym syntezę PEPCK. Jest to działanie Tabela 52-7. Indukcja lufa represja enzymów przez insulinę lub glukagon* Indukcja enzymów przez wysoki iloraz insulino -glukagonowy (l/G) oraz ich represja przez niski iloraz I/G Glukokinaza Enzym rozszczepiający cytrynian Karboksylaza acetylo-CoA Reduktaza HMG-CoA Kinaza pirogronianowa 6-Fosfofrukto-1 -kinaza 6-Fqsfo1rukto-2-kinaza (fruktozo-2,6-bisfos1ataza) Indukcja enzymów przez niski iloraz l/G i ich represja przez wysoki iloraz l/G Glukozo-6-fosfataza Karboksykinaza fosioenolopirogronianowa (PEPCK) Fruktozo-1,6-bisfosfataza * Według: Karam J, H., Salber P. R., Forsham P. H.: Pancreatic hormones and diabetic mellitus; w: Basie and Ctinical Endocrino/ogy. Wyd. II, pod redakcją Greenspan F. S., Forsham P. H., Appleton and Lange, 1986, w niewielkiej modyfikacji, za pozwoleniem.

diametralnie róŜne od insuliny, która hamuje transkrypcję genu kodującego PEPCK. Inne przykłady przedstawione są w tab. 52-7. Skutkiem działania glukagonu w wątrobie jest zwiększone wytwarzanie glukozy. PoniewaŜ większość powstałej glukozy opuszcza wątrobę, w osoczu krwi stwierdza się wzrost stęŜenia tego cukru po podaniu glukagonu. Glukagon jest silnym czynnikiem lipolitycznym. PodwyŜsza on stęŜenie cAMP w adypocytach, przez co aktywuje lipazę wraŜliwą na działanie hormonów. Uwolnione pod wpływem lipazy kwasy tłuszczowe mogą zostać przekształcone do związków ketonowych, tj. acetooctanu i p-hydroksymaślanu. Jest to waŜny aspekt przemiany materii u chorych na cukrzycę, poniewaŜ stęŜenia glukacgnu w osoczu krwi są zawsze podwyŜszone w stanach niedoboru insuliny. SOMATOSTATYNA HAMUJE WYDZIELANIE HORMONU WZROSTU (GH) Somatostatyna została po raz pierwszy wyizolowana z pod wzgórza jako czynnik hamujący sekrecję hormonu wzrostu. Jest to cykliczny peptyd syntetyzowany w komórkach D wysp trzustkowych pod postacią duŜego prohormonu o masie cząsteczkowej 11 500. Tempo transkrypcji genu prosomatostatynowego znacznie się zwiększa pod wpływem cAMP. Prohormon ulega najpierw przekształceniu do peptydu złoŜonego z 28 aminokwasów, a następnie do cząsteczki o masie cząsteczkowej 1640 składającej się z 14 aminokwasów (ryc. 52-14). Wszystkie postacie prekursorowe somatostatyny wykazują aktywność biologiczną.

]

aiukaoon

10

NHj-His-Ser-Gbi-Gly-Trir — Phe— Thr-Ser-Asp-Tyr — 1 1

»

Ser — Lys — Tyr — Leu — Asp — Ser — Arg — Ang — Ala — Gin — 81

23

Asp — Phe — Val — Gtn — Trp — Leu — Met — Asn — Thr — COOH

1

Somatostatyna

ID

NH2— Ala — Gly — Cys— Lys— Asn — Phe— Phe— Trp — tys — Thr11

14

Phe - Thr - Ser - Cys - COOH Ryc. S2-14. Sekwencje aminokwasowe glukagonu i somatostatyny. 44 — Bi ochemia

690 / ROZDZIAŁ 52

Oprócz podwzgórza i wysp trzustkowych somatostatyna występuje w licznych tkankach przewodu pokarmowego (gdzie przypuszczalnie spełnia róŜnorodne funkcje) oraz w licznych obszarach ośrodkowego układu nerwowego, gdzie moŜe być neuroprzekaźnikiem. Somatostatyna hamuje wydzielanie innych hormonów wysp trzustkowych dzięki działaniu parakrynnemu. Hormon ten, podany w dawkach farmakologicznych wyraźnie zmniejsza nasilenie ketozy indukowanej niedoborem insuliny. Zjawisko spowodowane jest zapewne blokowaniem przez somatostatynę sekrecji glukagonu, towarzyszącej insulinopenii. Hormon ten zmniejsza równieŜ napływ substancji odŜywczych do tkanek: a) opóźniając opróŜnianie się Ŝołądka, 2) zmniejszając sekrecję gastryny i tym samym równieŜ kwasu solnego, 3) zmniejszając wydzielanie przez trzustkę enzymów trawiennych, 4) obniŜając perfuzję naczyń trzewnych oraz 5) zwalniając absorpcję glukozy w przewodzie pokarmowym. Mało jest informacji na temat biochemicznego i molekularnego działania tego hormonu. NIEZNANA JEST CZYNNOŚĆ POLIPEPTYDU TRZUSTKOWEGO Polipeptyd trzustkowy o masie cząsteczkowej ok, 4200 składa się z 36 aminokwasów. Niedawno stwierdzono, Ŝe jest wytwarzany przez komórki F wysp trzustkowych. U człowieka sekrecję tego hormonu pobudzają posiłek białkowy, głodzenie, aktywność fizyczna oraz ostra hipoglikemia, natomiast hamują ją somatostatyna i glukoza podana doŜylnie. Czynność polipeptydu trzustkowego jest nieznana, choć sugeruje się, Ŝe hormon ten wpływa na zawartość glikogenu w wątrobie i sekrecję soków Ŝołądkowo-jelitowych. HORMONY ZOŁĄDKOWO-JELITOWE Rozwój endokrynologii, jako samodzielnej dyscypliny naukowej, rozpoczął się od wykrycia hormonu zołądkowo-jelitowego W roku 1902 Bayliss i Starling, perfundując odnerwioną pętlę jelita czczego psa kwasem solnym, zaobserwowali wzrost wydzielania soku trzustkowego. Podobnego zjawiska nie stwierdzili po doŜylnym podaniu kwasu sol-

nego, natomiast obserwowali go po doŜylnym podaniu wyciągu uzyskanego z błony śluzowej jelitowej. Badacze ci przypuszczali, Ŝe „sekretyna" uwalniana pod wpływem jakiegoś bodźca z błony śluzowej górnego odcinka jelit dostaje się drogą krwi do trzustki, gdzie pobudza czynność egzokrynną tego gruczołu. Bayliss i Starling byli pierwszymi badaczami, którzy uŜyli określenia „hormon", zaś sekretyna była pierwszym hormonem, którego czynność została zidentyfikowana. Pomimo Ŝe czynność sekretyny poznano juŜ w 1902 r., potrzeba było dalszych 60 lat dla określenia struktury chemicznej tego hormonu. Przyczyna takiego stanu rzeczy jest obecnie znana: mianowicie rodziny blisko ze sobą spokrewnionych peptydów Ŝołądkowo-jelitowych wykazują znaczne podobieństwa strukturalne i czynnościowe i większość tych peptydów występuje pod licznymi postaciami. Wśród waŜniejszych hormonów Ŝołądkowo-jelitowych tylko sekretyna występuje w jednej postaci. Występowanie wielu postaci molekularnych peptydów Ŝołądkowo-jelitowych zarówno w tkankach przewodu pokarmowego*, jak i we krwi krąŜącej stało na przeszkodzie w ustaleniu liczby i struktury tych cząsteczek. Przy rozwiązywaniu tych trudności pomocna była koncepcja o występowaniu prekursorów hormonalnych. Wykazano, Ŝe heterogenność poszczególnych postaci określonego hormonu zaleŜy od tkanki, w której zachodzi synteza hormonu. Wprowadzone niedawno techniki izolacyjne okazały się pomocne przy określaniu róŜnic między poszczególnymi prekursorami jednego i tego samego hormonu. Hormony zołądkowo-jelito we wykazują kilka szczególnych cech Z tkanek przewodu pokarmowego wyizolowano więcej niŜ tuzin peptydów wykazujących wyjątkowe działanie (tab. 52-8). Szczególną cechą tej grupy hormonów jest to, Ŝe wiele z nich spełnia kryteria klasycznych hormonów, podczas gdy inne wykazują działania parakrynne lub działają jako neuroprzekaźniki lub neuromodulatory. Inną szczególną cechą hormonów Ŝołądkowo-jelitowych jest to, Ŝe nie są one wytwarzane w jednym konkretnym gruczole, jak klasyczne hormony, lecz przez liczne komórki rozrzucone w całym przewodzie pokarmowym. Jest to widoczne w tab. 52-8. PoniewaŜ liczne hormony Ŝołądkowo-jelito-

HORMONY TRZUSTKI I 2OŁĄDKOWO-JELITOWE / 691 Tabela 52-8- Hormony Ŝołądkowo-jelitowe Hormon Miejsce syntezy

Główne działania

Gastryna

Antrum Ŝołądka, dwunast- Stymulacja sekrecji kwasu solnego i pepsyny nica

Cholecystokinina (CCK)

Dwunastnica, jelito czcze

Sekrety na

Dwunastnica, jełito czcze

Stymulacja sekrecji amylazy trzustkowej Stymulacja sekrecji wodorowęglanów z sokiem trzustkowym Wzmaga sekrecję insuliny, indukowaną bodźcem glukozowym, hamuje wydzielanie soku Ŝołądkowego

śołądkowy peptyd harnu- Jelito cienkie iący (GIP) Wazoaktywny peptyd jeli- Trzustka towy (VIP)

Rozkurcz mięśni gładkich, pobudza wydzielanie wodorowęglanów z sokiem trzustkowym

Motyli na

Zapoczątkowuje aktywność motoryczną jelit pomiędzy okresami trawiennymi

Jelito cienkie

śołądek, dwunastnica, trzu- Liczne efekty hamujące stka Hamuje wydzielanie wodorowęglanów i białka Polipeptyd trzustkowy (PP) Trzustka z sokiem trzustkowym Somatostatyna

Enkefaliny

śołądek, dwunastnica, pę- Efekty opioidowopodobne cherzyk Ŝółciowy

Substancja P Cały przewód pokarmowy Immunoreaktywność bom- śołądek, dwunastnica bezynopodobna (BLI)

Działanie fizjologiczne jest niepewne

Neurcjtensyna Enteroglukagon

Działanie fizjologiczne jest nieznane Działanie fizjologiczne jest nieznane

Jelito kręte Trzustka, jelito cienkie

Pobudza wydzielanie gastryny i CCK

we występują w nerwach unerwiających tkanki przewodu pokarmowego, nie jest zaskoczeniem, Ŝe większość z nich występuje równieŜ w ośrodkowym układzie nerwowym.

wspólną cechą tych ostatnich hormonów jest bardzo krótki okres ich trwania, co sugeruje, Ŝe nie odgrywają one roli fizjologicznej w osoczu krwi.

Istnieją „rodziny" hormonów Ŝołądkowo-jelitowych Uwzględniając sekwencję aminokwas owa. oraz podobieństwa czynnościowe, liczne hormony Ŝołądkowo-jelitowe moŜna zakwalifikować do jednej z niŜej podanych dwóch „rodzin". Pierwsza z nich — rodzina gastrynowa — obejmuje gastrynę i CCK, zaś druga — rodzina sekretynowa — sekretynę, glukagon, GIP, VIP i glicentynę (ta ostatnia wykazuje działanie podobne do glukagonu, choć jest odmiennym peptydem). Neurokrynne peptydy — neurotensyna, peptydy podobne do bombezyny, substancja P i somatostatyna — nie wykazują podobieństwa strukturalnego do Ŝadnego z hormonów Ŝołądkowo-jelitowych, W końcu inną

Względnie mało wiadomo o mechanizmie działania hormonów Ŝołądkowo-jelitowych Dane o mechanizmie działania peptydowych hormonów Ŝołądkowo-jelitowych ukazały się znacznie później niŜ innych hormonów. Było to niewątpliwie spowodowane potrzebą skatalogowania i określenia fizjologicznego działania tych hormonów. Godnym uwagi wyjątkiem od powyŜszego stwierdzenia jest hormonalna regulacja sekrecji enzymów przez komórki główne pęcherzyków trzustkowych. Zidentyfikowano 6 róŜnych klas receptorów w komórkach pęcherzyków trzustkowych. Są nimi receptory dla: 1) muskarynowych związków cholinergicznych, 2) hormonów rodziny

692 / ROZDZIAŁ 52

gastrynowo-cholecystokininowej, 3) bombezyny i pokrewnych peptydów, 4) hormonów rodziny fizaleminowej i substancji P, 5) sekretyny i VIP oraz 6) toksyny przecinkowca cholery. Hormony receptorów klasy 1—4 działają za pośrednictwem mechanizmu wapniowo-fosfoinozytydowego, zaś hormony klasy 5 i 6 — za pośrednictwem cAMP.

PIŚMIENNICTWO Cohen P: The role of protein phosphorylation in neural and hormonal control of oellular activity. Naturę 1982;296:613.

Docherty K, Steiner D: Post-translational proteolysis in polypeptide hormone biosynthesis. Anrtu Rev Physiol 1982;44:625. Granner DK, Andreone T: Insulin modulation of gene expression. In: Diabetes and Metabolism Reviews. Vol I, DeFronzo R (editor). Wiley, 1985. Kahn CR: The molecular mechanism of insulin action. Annu Rev Med 1985;36:429. Kono T: Action of insulin on glucose transport and cAMP phosphodiesterase in fat cells: Involvement of two distinct molecular mechanisms. Recent Próg Horm Res 1983;30:519. Ullrich A et al: Human insulin receptor and its relationship to the tyrosine kinase family of oncogenes. Naturę ]985;313:756. Unger RH, Orct L: Glucagon and the A celi. (2 parts.) N EnglJMed 1981;3O4:1518,1975.

.

CZĘŚĆ VI Zagadnienia wybrane Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w wodzie

53

Peter A. Mayes, PhD, DSc

vi.

WPROWADZENIE Witaminy są organicznymi środkami odŜywczymi niezbędnymi w małych ilościach do róŜnorodnych funkcji biochemicznych. W zasadzie związki te nie są syntetyzowane przez ustrój i dlatego muszą być dostarczanez poŜywieniem. Pierwszymi odkrytymi witaminami byty rozpuszczalna w tłuszczach witamina A oraz rozpuszczalna w wodzie witamina B. W miarę poznawania następnych witamin okazało się, Ŝe są one rozpuszczalne albo w wodzie, albo w tłuszczach. Ta właściwość (rozpuszczalność w wodzie 1ub w tłuszczach) stała się podstawą klasyfikacji witamin. Wszystkie witaminy rozpuszczalne w wodzie naleŜą (z wyjątkiem witaminy C) do grupy witaminy B. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach, wykryte później niŜ witamina A, oznaczono dalszymi literami alfabetu (np. witamina D, E, K). Oprócz wspólnej cechy fizycznej, tj. rozpuszczalności w wodzie, witaminy tej grupy mają bardzo mało wspólnego z chemicznego punktu widzenia.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Brak lub względny niedobór witamin w poŜywieniu są przyczyną charakterystycznych stanów niedoborowych i chorób. Rzadko spotyka się niedobór jednej tylko witaminy grupy B, poniewaŜ dieta niedoborowa jest przyczyną wicloe/yiinikowych stanów niedoborowych. Nie-

mniej niedobór określonej witaminy charakteryzuje się swoistym zespołem objawów. Wśród objawów chorobowych spowodowanych niedoborem witamin rozpuszczalnych w wodzie naleŜy wymienić: a) chorobę beri-beri (niedobór tiaminy), b) zajady, zapalenie języka, łojotok i światłowstręt (niedobór ryboflawiny), c) pelagrę (niedobór niacyny), d) zapalenie nerwów obwodowych (niedobór pirydoksyny), e) niedokrwistość megaloblastyczną, acydurię merylomalonową i niedokrwistość złośliwą (niedobór kobalamin), f) niedokrwistość megaloblas-

tyczna, (niedobór kwasu foliowego), oraz g) szkorbut (gnilec — niedobór kwasu askorbinowego). Niedoboru witamin moŜna uniknąć spoŜywając róŜnorodne środki spoŜywcze w dostatecznych ilościach.

WITAMINY KOMPLEKSU B SĄ KOFAKTORAMI REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Do witamin kompleksu B istotnych w Ŝywieniu człowieka naleŜą: 1) tiamina (witamina Bj), 2) rybofiawina (witamina B2), 3) niacyna (kwas nikotynowy, amid kwasu nikotynowego) (witamina B3), 4) kwas pantotenowy (witamina Bs), 5) witamina B6 (pirydoksyna, pirydoksal, pirydoksamina), 6) biotyna, 7) witamina B!2 (kobalamina) oraz 8) kwas foliowy (kwas pteroiloglutaminowy). PoniewaŜ witaminy tej grupy są rozpuszczał-

694 / ROZDZIAŁ 53

ne w wodzie, nadmiar ich jest wydalany z moczem. Tylko rzadko kumulują się w ustroju osiągając stęŜenia toksyczne. Z tych teŜ przyczyn ich magazynowanie w ustroju jest ograniczone (z wyjątkiem kobalamin), co sprawia, Ŝe muszą one być dostarczane regularnie.

TIAMINA Tiamina składa się z pochodnej pirymidynowej i tiazolowej. Są one ze sobą połączone przez grupę metylenową (ryc. 53-1).

NH,

H

O"

i

0"

-o-p-o-p-o-II o

c-s II o *C-CH,-Ń*

C=C-CHi-CH3-OH CH3 2,5-Dlmelylo6-tilryml(!yna 4-Metylo-S-rrydrokay-etylotlazol

Ryc. 53-1. Tiamina. W cząsteczce difosforanu tiaminy w miejscu grupy -OH znajduje się pirofos-foran (u góry).

Difosforan tiaminy jest aktywną postacią tiaminy Konwersję tiaminy do aktywnego difosforanu tiaminy (pirofosforanu tiaminy) katalizuje ATP-zaleŜna difosfotransferaza tiaminowa występująca w tkance Mózgowej i wątrobowej (ryc. 53-1). Difosforan tiaminy jest koenzymem w reakcjach enzymatycznych przenoszących aktywną grupę aldehydową Występują dwa rodzaje takich reakcji: pierwsza z nich jest reakcją dekarboksylacji oksydacyjnej a-ketokwasów (np. a-ketoglutaranu i pirogronianu lub cc-ketoanalogów leucyny, izoleucyny i waHny), zaś druga reakcją katalizowaną przez transketolazę (np. w szlaku pentozowo-fosforanowym). Wszystkie te reakcje ulegają zahamowaniu przy niedoborze tiaminy. W kaŜdej z tych reakcji difosforan tiaminy dostarcza reaktywnego atomu węgla w* pierścieniu tiazolowym, przyjmujący postać karboanionu, który następnie moŜe się połączyć z grupą karbonylo-

wą np. pirogronianu (ryc. 19-5). Tak powstały związek addycyjny ulega dekarboksylacji, usuwającej CCV Reakcja ta jest katalizowana przez kompleks wieloenzymatyczny określany jako kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (szczegóły — p. rozdz. 19). Dekarboksylacja oksydacyjna a-ketoglutaranu do sukcynylo-CoA i C02 (p. rozdz. 18) jest katalizowana przez kompleks enzymatyczny, który jest strukturalnie podobny do kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej. RównieŜ w tej reakcji difosforan tiaminy dostarcza stabilnego karboanionu. reagującego z atomem węgla znajdującego się w pozycji a a~keto-glutaranu. Difosforan tiaminy uczestniczy równieŜ w dekarboksylacji oksydacyjnej kwasów ot-ketokarboksylowych pochodnych aminokwasów rozgałęzionych (rozdz. 32). Rola difosforanu tiaminy jako koenzymu w reakcjach katalizowanych przez transketolazę jest podobna do opisanej wyŜej w reakcjach dekarboksylacji. Brak tiaminy jest przyczyną choroby beri-beri i pokrewnych zespołów niedoborowych U chorych z niedoborem tiaminy dochodzi do zablokowania lub znacznego ograniczenia reakcji zaleŜnych od difosforanu tiaminy i.do akumulacji substratów tych reakcji, tj. pirogronianu, pentoz i pochodnych cc-ketokarboksylowych aminokwasów rozgałęzionych (leucyny, izoleucyny i waliny). Tiamina występuje prawie we wszystkich roślinach, a takŜe prawie we wszystkich pokarmach pochodzenia zwierzęcego, choć w niewielkich ilościach. Nierafinowane ziarna zbóŜ są dobrym źródłem tej witaminy. Choroba beri-beri jest spowodowana spoŜywaniem diety bogato węglowodan owej i ubogotiaminowej, np. złoŜonej z polerowanego ryŜu lub innych wysoce rafinowanych pokarmów (takich jak cukier i jasna mąka) jako głównych środków spoŜywczych. Wczesnymi objawami tej choroby są obwodowa neuropatia, wyczerpanie i brak apetytu. Z kolei ten ostatni jest przyczyną obrzęków oraz zmian zwyrodnieniowych w układzie sercowo-naczyniowym i nerwowym oraz mięśniach. Niedobór tiaminy jest równieŜ przyczyną encefalopatii Wernickego. Występuje ona często u alkoholików, spoŜywających mało innych pokarmów. Pewna surowa ryba zawiera termolabilny enzym (tiaminazę) rozkładający tiaminę. Nie odgrywa ona jednak większej roli w normalnym Ŝywieniu człowieka.

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 695

łYBOFLAWINA Ryboflawina składa się z pierścienia izoalokzyny połączonego z cukrem alkoholowym rybitolem (p. ryc. 53-2). Jest to substancja barwna i fluoryzująca oraz względnie oporna na ciepło, lecz rozkładająca się pod wpływem światła.

Aktywnymi postaciami ryboflawiny są: mononukleotyd f lawinowy (FMN) oraz dinukleotyd flawinowy (FAD) FMN powstaje drogą ATP-zaleŜnej fósforylacji ryboflawiny (ryc. 53-2). FAD jest wynikiem dalszej reakcji FMN z ATP, w której AMP (pochodzący z cząsteczki ATP) ulega przeniesieniu na FMN (ryc. 53-3). FMN i FAD są grupami prostetycznymt enzymów a ksydo redukcyjnych Enzymy te są znane jako flawoproteiny. Grupy prostetyczne wiązane są zwykle silnie, chociaŜ nie kowakncyjnie ze swoimi apoproteinami. Wiele enzymów flawoproteinowych zawiera jeden lub więcej metali,""rap. molibden i Ŝelazo, będących istotnymi kofaktorami. Enzymy te są znane jako metaloflawoprotonry. Enzymy flawoproteinowe są szeroko rozpowszechnione. Ich przedstawicielami jest kilka waŜnych oksydoreduktaz uczestniczących w metabolizmie ssaków. Wśród nich wymienić naleŜy oksydazę a- aminokwasu w ą uczestniczącą w deaminacji aminokwasów, oksydazę ksantynową biorąca udział w degradacji puryn,

'

D-Rybllol

H,C

H,C

dehydrogenazę aldehydową, uczestniczącą w degradacji aldehydów, mitochondrialną dehydrogenazę gh'ceroIo-3-fosforanową, przenoszącą ró-

Fiawina

wnowaŜniki redukujące z cytoplazmy do mitoRyc. 53-2. Ryboflawina. W cząsteczce fosforanu ryboflawiny (mononukleotyd flawtnowy — FMN) miejsce grupy -OH zajmuje fosforan.

chondriów, dehydrogenazę sukcynyJową cykiu kwasu cytrynowego, dehydrogenazę acylo-ĆoA, flawoproteinę przenoszącą elektrony uczestni1

D-Rybilol

NH J Pl rafo sfo ran

Fiawina

Ryc. 63-3. Dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD).

696 / ROZDZIAŁ 53

czącą w utlenianiu kwasów tłuszczowych, dehydrogenazę dihydrolipoilową, uczestniczącą w dekarboksyłacji oksydacyjnej pirogronianu i a-ketoglutaranu oraz dehydrogenazę NADH będącą waŜną składową łańcucha oddechowego w mitochondriach. Aktywność wszystkich tych enzymów jest upośledzona w niedoborze ryboflawiny. W roli koenzymów pierścień izoaloksazynowy flawoprotein ulega odwracalnej redukcji tworząc zredukowaną postać FMNH 2 iFADH2 (p. ryc. 13-3). Brak ryboflawiny jest przyczyną niegroźnego zespołu niedoborowego Uwzględniając wielokierunkowe funkcje metaboliczne ryboflawiny jest zaskoczeniem, Ŝe niedobór tej witaminy nie prowadzi do powaŜnych stanów groźnych dla Ŝycia. Niemniej w stanach jej niedoboru stwierdza się róŜnorodne objawy chorobowe, w tym zapalenie kącików ust, pękanie i złuszczanie się warg, zapalenie języka, tojotok i światłowstręt. Ryboflawina wytwarzana jest przez rośliny i drobnoustroje, lecz nie przez ssaki. DroŜdŜe, wątroba i nerki są dobrymi źródłami tej witaminy. Ulega ona wchłanianiu w jelitach za pośrednictwem reakcji fosforylacji-defosforylacji zachodzącej w błonie śluzowej. Hormony (hormony tarczycy i ACTH), leki (chloropromazyna jest inhibitorem kompetycyjnym) i czynniki pokarmowe wpływają na konwersję ryboflawiny do jej postaci kofaktorowych. PoniewaŜ ryboflawina jest światłoczuła, niedobór jej moŜe wystąpić u noworodków z hiperbilirubinemią poddanych fototerajfifc NfACYNA Niacyna jest nazwą generyczną (zwyczajową) dla kwasu nikotynowego i amidu kwasu nikotynowego. Obydwa te związki mogą być źródłem witaminy w poŜywieniu. Kwas nikotynowy jest kwasem monokarboksylowym pochodnym pirydyny (ryc. 53-4).

Aktywnymi postaciami niacyny są amid kwasu nikotynowego, dinukleotyd adeninowy (NAD) oraz fosforan dinukleotydu nikotynamido-+ adeninowego (NADP ) Nikotynian jest postacią niacyny potrzebną do syntezy NAD+ i NADP+ przez enzymy występujące w cytoplazmie większości komórek. Dlatego teŜ amid kwasu nikotynowego zawarty w pokarmach wpierw musi ulec deamidacji do nikotynianu (ryc. 53-4). W cytoplazmie nikotynian ulega najpierw konwersji do dezamido-NAD+ w reakcji z 5-fosforybozylo-l-pirofosforanem (PRPP), a następnie adenylacji z ATP. Następnie grupa amidowa glutaminy ulega przeniesieniu na resztę nikotynianu dezamido-NAD. W wyniku tej reakcji powstaje NAD+. Ten ostatni moŜe ulec fosforylacji do NADP+. +

+

NAD i NADP są koenzymami licznych enzymów oksydoredukcyjnych Nukleotydy nikotynamidowe odgrywają waŜną rolę jako koenzymy wielu dehydrogenaz występujących zarówno w cytoplazmie (np. dehydrogenaza mleczanów a), jak i w mitochondriach (np. dehydrogenaza jabłczanowa). Są one waŜnymi ogniwami licznych szlaków metabolicznych, wpływających na przemianę węglowodanów, tłuszczów i aminokwasów. Ogólnie moŜna powiedzieć, Ŝe dehydrogenazy współdziałające z koenzymem NAD katalizują reakcje oksydoredukcyjne w szlakach oksydacyjnych (np, w cyklu kwasu cytrynowego), natomiast debydrogenazy lub reduktazy współdziałające z koenzymem NADP+ występują często w szlakach metabolicznych związanych z syntezą redukcyjną (np. szlak pentozofosforanowy). Mechanizm oksydoredukcji polega na odwracalnej addycji hybrydowego jonu H~ do pierścienia pirydynowego oraz generacji wolnego jonu wodorowego (H +) (p. ryc. 13-5). Na przykład: +

+

NAD + AH2 <— NADH + H + A

+

Ryc. 53-4. Synteza i rozkład dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD ). W fosforanie dinuk+ ieotydu nikotynamtdoadeninowego (NADP ) grupa 2'-hydroksylowa reszty adenozynowej jest fosforylowana. U człowieka, lecz nie u kota, całe zapotrzebowanie na niacynę moŜe być pokrywane przez tryptofan, jeśli dostarczany jest w dostatecznych ilościach z pokarmami. Normalnie z tego źródła pochodzi f-niacyny. PRPP — 5-fosforybozylo-l -pirofosforan, QPRT — fosforybozylotransferaza chinolinianowa, PLP — fosforan pirydoksalu.

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 697

-

NMcotynamid

-Poktrmy

\

N—motylami Ikotyn amid (główny metabolit w

moczu)

Mononukleotyd nikotynianu (NMN)

0 ^ PPi

PRPP

O Chlnolinian

NH, Aldehyd 2-amino-3karboksymukanawy

OH 3 - Hyd roksyantran II an PLP Kilka etapów (p. fyc. 32-19)

CHi-CH-COO" NH,

Adenina

D—Ryboza

HAD* P o karrr

698 / ROZDZIAŁ 53

Brak niacynyjest przyczyną zespołu niedoborowego określanego jako pelagra Objawami tego zespołu chorobowego są: utrata wagi, zaburzenia trawienia, zapalenie skóry, depresja i demencja. Niacyna występuje w wielu pokarmach pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Przy ocenie „wartości niacynowej" pokarmów naleŜy uwzględnić fakt, Ŝe aminokwas egzogenny (niezbędny) tryptofan moŜe ulec przekształceniu do NAD+ (p. ryc. 53-4). Z kaŜdych 60 mg tryptofanu moŜe powstać 1 mg równowaŜnika niaeynowego. Dlatego teŜ dla wywołania stanu niedoboru niacyny spoŜyte pokarmy muszą być ubogie zarówno w niacynę, jak i w tryptofan.

Takie warunki występują u ludzi, dla których głównym poŜywieniem jest kukurydza. Oni właśnie są naraŜeni na wystąpienie pelagry. W kukurydzy niacyna jest obecna, lecz w postaci związanej jako niacytyna, niedostępna dla przemiany u człowieka. Tylko przez wstępną obróbkę tych pokarmów zasadami moŜna uwolnić biologicznie aktywną niacynę. Ludzie, dla których głównym poŜywieniem jest sorgo (proso afrykańskie), są równieŜ naraŜeni na rozwój pelagry z powodu duŜej w nim zawartości leucyny. Mechanizm niedoboru niacyny u osób spoŜywających głównie sorgo polega na tym, Ŝe zawarte w nich duŜe ilości leucyny hamują fosforybozylotransferazę ehinolinianową. tj. głó-

wny enzym konwersji tryptofanu do NAD (patrz ryc. 53-4). NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe fosforan pirydoksalu, będący aktywną postacią witaminy Bs, jest kofaktorem w szlaku syntezy NAD4" z tryptofanu (p. r,yc. 53-4), co sprawia, Ŝe niedobór witaminy B6 moŜe nasilić niedobór niacyny. Innymi przyczynami pelagry mogą być: podawanie leków takich jak izoniazyd, zespół rakowiaka złośliwego, w którym tryptofan ulega przekształceniu w serotoninę, oraz choroba Hartnupów, w której wchłanianie tryptofanu jest upośledzone. Kwas nikotynowy (lecz nie amid kwasu nikotynowego) stosowano w celach leczniczych dla obniŜenia stęŜenia cholesterolu w osoczu krwi. Mechanizm takiego działania kwasu nikotynowego polega na hamowaniu napływu wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej, co jest powodem spadku syntezy lipoprotein zawierających cholesterol, tj. VLDL, 1DL i LDL.

KWAS PANTOTENOWY Kwas pantotenowy jest wynikiem połączenia się kwasu pantoinowego z P-alaniną (ryc. 53-5). Kwas pantoinowy 0-Alanina

HaC OH

II H

0 ' II

O II

HO-CH, -C-CHC-N-CH,-CH,-C-OH Ryc. 53-5, Kwas pantotenowy.

Aktywnymi postaciami kwasu pantotenowego są koenzym A (CoA) oraz białko przenoszące grupy acylowe (ACP) Kwas pantotenowy wchłania się szybko w jelitach, po czym ulega fosforylacji przez ATP. W wyniku tej reakcji powstaje 4'-fosfopantotenian (ryc. 53-6). Przez przyłączenie cysteiny po jej dekarboksylacji czyli przez przyłączenie tioetanolaminy powstaje 4'-fosfopanteteina, będąca grupą czynną zarówno CoA, jak i ACP. Podobnie jak aktywne koenzymy będące pochodnymi wielu innych witamin rozpuszczalnych w wodzie, tak i CoA zawiera nukleotyd adeninowy. Tak więc 4'-fosfopanteteina ulega adenylacji przez ATP, przy czym powstaje defosfo-CoA. Ostatnia fosforylacja przez ATP polega na przyłączeniu reszty fosforanowej do grupy 3'-hydroksylowej rybozy. W wyniku tej reakcji powstaje CoA (ryc. 53-6). Grupa tiolowa działa jako przenośnik grup acylowych zarówno w CoA, jak i ACP CoA jest przenośnikiem grup acylowych w reakcjach cyklu kwasu cytrynowego, utleniania i syntezy kwasów tłuszczowych (patrz str. 251 i 261) oraz w reakcjach acetylacji (np. leków) i syntezy cholesterolu. ACP uczestniczy w reakcjach syntezy kwasów tłuszczowych. Powszechnym zwyczajem jest skrótowe przedstawianie struktury wolnej (zredukowanej) postaci CoA jako CoA-SH, dla podkreślenia, Ŝe grupa SH jest grupą reaktywną. Niedobór kwasu pantotenowego występuje rzadko Przyczyną tego jest fakt obfitego występowania kwasu pantotenowego w pokarmach, szczególnie w tkankach pochodzenia zwierzęcego,

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 699 ATP

ADP

Pantotenlan

H3C OH O i I II H CH,-C-CH —C-NCH5-CH5 —COO" O H,C 0 = P —O" I 4-Fosfoparrtotenian ATP ■ Cystę I na

ADP + P, H-.C I

OH I

O II

O II

H

H

COO~ I

CH!-C-CH-C-N-CHi,-CH!-C-N-CH-CH!-SH 0 H3C = P-0~ 1

4—Rwtopantołenylocystslna

H,C OH O 0 I I I l u II H C H 2 - C - C H- C - N - C H 2 - C H 2 - C - N - C H s- C H j- S H O H,C

4 - Foaf opantste I na -

= P —O"

I

O

ACP

ATP

r PP

V H CH

/■

ATP AOP

0-Alanina

Merkaploetanoamlna

Dotosfokoanzym A

OH OH Kwas

pantolnowy PlrofoHaC

OH

Adenina II H

O

II

CH

sforan

Ry b ozo -3-fosforan

Koenzym A Ryc. 53-6.

Synteza koenzymu A z kwasu pantotenowego. ACP —

białko

transportujące grupy acylowe.

700 / ROZDZIAŁ 53

w niepolerowanych ziarnach zbóŜ oraz w roślinach strączkowych. Niemniej opisano zespół palących nóg u jeńców wojennych, który ma być spowodowany niedoborem kwasu pantotenowego. Zespół ten charakteryzuje się zmniejszoną sprawnością procesów acetylacji występującą u tych chorych,

c— HOi H3CI

H CHjOH

H Plrydoksal -ATP

WITAMINA Bs Witamina B6 składa się z trzech blisko ze sobą spokrewnionych pochodnych pirydyny, tj. piry-

Kłnaza plrydoksalowa

(toksyny, pirydoksalu i pirydoksaminy (ryc. 53-7)

ADP

oraz fosforanów wymienionych związków.

,p

CH^OH

HO - t f ^ s p H3C-^+^

C- H CH

2 0H

H

°

-rr^>|-CHjOH

H3C

N

N

H

H

Pirydoksyna

Plrydoksal OH

H C—L+^J N H Pirydoksamina

Ryc. 53-7. Naturalne postacie witaminy Bg

Y II

n

o1

^^>— ^MjłJ . r

HO-r H C -1 ^.+<J

Un

o-

H Fosforan plrydoksaly

Ryc. S3-8. Fosforylacja pirydoksalu przez kinazę pirydoksalową. w wyniku której powstaje pirydoksalu. Am 1 n ot ra n sTeraza

H

y

R—C— COOH

s 1 ^^

Aldolaza --------- ^*s ig (reonlnowa II C - H

------ Dekarboksylaza

Z wymienionych związków pirydoksyna, fosforan pirydoksalu oraz fosforan pirydoksaminy są głównymi przedstawicielami witaminy B6 Ryc. 53-9. Wiązania kowalencyjne sc-aminokwaktóre mogą stać się reaktywne po związaniu zawartymi w poŜywieniu. Wszystkie trzy wy- su, z enzymami swoiście współdziałającymi z fosfora mienione związki wykazują taką samą aktywność nem pirydoksalu. _____ biologiczną.

Ryc. 53-10. Rola koenzymu fosforanu pirydoksalu w procesie transaminacji a-aminokwasu. W pierwszej fazie dochodzi do wytworzenia ot-ketokwasu (pochodnego a-aminokwasu) oraz kompleksu fosforan pirydoksaminy — apoenzym, po czym zachodzi odwrotna reakcja, tj. aminacja nowego at-ketokwasu (jako substratu) NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe fosforan pirydoksalu wiąŜe się ze swoim apoenzymem za pośrednictwem zasady Schiffa (utworzonej przez grupę e-aminową reszty lizyny apoenzymu i grupę aldehydową pirydoksalu) oraz wiązania jonowego (utworzonego przez grupę fosforanową koenzymu z apo"enzymem). Grupa ac-aminowa aminokwasu substratowego wypiera grupę e-aminową lizyny tworząc nową zasadę Schiffa.

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 701 Fosforan plrydoksalu apoenzym

N-Apoenzym

n

• ^.r. — rncr

a—Aminokwas (jako subslral)

a—Aminokwas (jako produkt)

a—Ketokwas (Jako produkt)

CH Fosforan plrydo — ksamlny — enzym

702 / ROZDZIAŁ 53

Aktywną postacią witaminy Be jest fosforan pirydoksalu Wszystkie postacie witaminy B6 ulegają wchłanianiu w jelitach chociaŜ pewna ilość estrów fosforanowych wymienionych związków ulega rozkładowi hydro litycznemu w procesie trawienia pokarmów. Główną postacią witaminy Bfi w osoczu krwi jest fosforan pirydoksalu. Większość tkanek zawiera enzym — kinazę pirydoksalową — katalizującą fosforylację (za pomocą ATP) niefosforylowanej postaci tej witaminy do odpowiednich estrów fosforanowych (ryc. 53-8). ChociaŜ fosforan pirydoksalu jest głównym koenzymem reprezentującym aktywność witaminy Bń, taką samą funkcję moŜe równieŜ spełniać fosforan pirydoksaminy.

i jajka. MoŜliwą przyczyną niedoboru witaminy B6 u dzieci moŜe być karmienie ich piersią przez matki, których zapasy witaminy BB ulegty wyczerpaniu w następstwie długotrwałego zaŜywania doustnych leków antykoncepcyjnych. RównieŜ alkoholicy mogą wykazywać niedobór witaminy B6 spowodowany przemianą etanolu do aldehydu octowego, stymulującego hydrolizę fosforanu pirydoksalu lub pirydoksaminy. Niedobór witaminy B6 moŜe być równieŜ spowodowany izoniazydem — szeroko stosowanym lekiem przeciwgruźliczym — tworzącym hydrazon z pirydoksalem (ryc. 53-11). H O

Fosforan pirydoksalu jest koenzymem dła kilku enzymów przemiany aminokwasowej Tworząc zasadę Schiffa (powstałą przez połączenie się grupy aldehydowej z grupą aminową a-aminokwasu) (ryc. 53-9) fosforan pirydoksalu moŜe ułatwić wystąpienie zmian w zakresie pozostałych trzech wiązań węgla a-aminowego, tj. moŜe umoŜliwić a) transami nację, b) dekarboksylację (p. ryc. 33-9) lub teŜ c) aktywność aldolazową (ryc. 32-11). Rolę fosforanu pirydoksalu w procesie transaminacji przedstawia ryc. 53-10.

C H ,

Izonlkotynlan hydrazyny Reakcja spontaniczna HO CH3

Fosforan pirydoksalu uczestniczy równieŜ w glikogenolizie Koenzym ten jest integralną częścią mechanizmu działania fosforylazy, enzymu biorącego udział w rozkładzie gjikogenu (str. 220). W działaniu tym koenzym-ten na początku równieŜ tworzy zasadę Schiffa z grupą e-arainową jednej reszty lizynowej fosforylazy, która jednak nie ulega zmianie przez czas trwania fosforolizy wiązania glikozydowego 1 ->4, w wyniku której powstaje glukozo-1-fosforan. Fosforylaza mięśni szkieletowych zawiera 70—80% ogólnoustrojowej ilości witaminy Ba. Niedobór witaminy B6 moŜe wystąpić u kobiet w czasie laktacji, u alkoholików oraz podczas leczenia izoniazydem Izolowany niedobór witaminy B6 spotyka się rzadko. Niedobór taki jest zwykle częścią niedoboru wielowitaminowego witamin grupy B. Dobrymi źródłami tej witaminy są: wątroba, makrela, owoc awokado, banan, mięso, jarzyny

«*>c-,-=.-O« \=/

II

H

I

\_J/

Hydrazon pirydoksalu Ryc. 53-11. Powstawanie hydrazonu pirydoksalu (szybko wydalanego z moczem) z pirydoksalu i izonikotynianu hydrazyny (izoniazydu).

BIOTYNA Biotyna jest pochodną imidazolową zawartą w licznych naturalnych środkach Ŝywnościowych (ryc. 53-12). PoniewaŜ znaczną część O

II

H-N I H-CI HSC,

Ryc. 53-12. Biotyna.

N-H -C-H

I „CH(CHjhCOOH

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 703

zapotrzebowania człowieku na biotynę pokrywa synteza tej witaminy przez drobnoustroje

jelitowe, niedobór jej nie jest spowodowany niedostateczną podaŜą tej witaminy w pokarmach, lecz defektami w zakresie jej wykorzystania. Biotyna jest koenzymem karboksylaz Biotyna jest składową swoistych enzymów, złoŜonych z wielu podjednostek (tab. 53-1), katalizujących reakcje karboksyjacji. Jon karboksylowy ulega przyłączeniu do atomu N1 w pierścieniu biotyny, przez co powstaje aktywny związek pośredni karboksybiotyna-enzym

(ryc. 53-13). Ten etap wymaga obecności Enzym Rola Tabela 53-1. Enzymy biotynozaiezne występujące u zwierząt Karboksylaza piro- Katalizuje pierwszą reakcje w szlaku metabolicznym przegronianowa kształcającym prekursory trójwęglowe w glukozę (glukoneogeneza) Karboksylaza acetyle-CoA

Dostarcza reszty octanowe do syntezy kwasów tłuszczowych katalizując powstawanie malonylo-CoA

Karboksylaza pro- Przekształca propionian do bursztyn ian u, który następnie pionylo-CoA wchodzi do cyklu kwasu cytrynowego Karboksylaza fi-me- KataboMzm leucyny i pewnych tylokrotonylo-CoA związków izoprenoidowych

HCO;, ATP, Mg2 + i acetylo-CoA (jako efektora allosterycznego). Z kolei aktywowana grupa karboksylowa ulega przeniesieniu na substrat reakcji np. na pirogronian. SpoŜywanie surowych jaj moŜe być przyczyną niedoboru biotyny Białko jaj zawiera termolabilne białko — awidynę — mocno wiąŜące biotynę, uniemoŜliwiając wchłanianie tej witaminy przez jelita, co z kolei moŜe być przyczyną jej niedoboru. Wśród objawów niedoboru biotyny naleŜy wymienić depresję, halucynacje, bóle mięśniowe i zapalenie skóry. Brak enzymu — syntazy bolokarboksylazowej — katalizującego przyłączenia biotyny do reszty lizyny apoenzymu karboksylazowego, moŜe być równieŜ przyczyną objawów niedoboru? witaminy B6 oraz gromadzenia się w ustroju substratów enzymów biotynozaleŜnych. Substraty te moŜna wykryć w moczu. Wśród tych ostatnich naleŜy wymienić mleczan, (J-metylokrotonian, p-hydroksyizowalerian oraz p-hydroksypropionian. U niektórych dzieci z niedoborem ww. enzymu występują choroby związane z niedoborami immunologicznymi. WITAMINA B 12 Witamina B12 wykazuje złoŜoną strukturę pierścieniową (pierścień korynowy), podobną do pierścienia porfiry nowego, w środku której znajduje się jon kobaltu {ryc, 53-14). Wytwarzana jest wyłącznie przez drobnoustroje. Tak więc nie występuje ona w roślinach, jeśli nie są

o II O-P-Cf o

o II

I

HW

P,

HC —

ATP+HCOa" ADP Bezwodnik kwasu wę g I owo-f osf □ ro weg o

y

HCH

"NH

l

«^ »

HC------- CH HCH

NH — CH -----I HC(CHj), Blotyna enzym

0=C li'

i c =o

|ENZYM - NH|

HC-ICHJU

c=o Kompleks karboksyblotyna — enzym

IENZYM - NH|

Ryc. 53-13. Powstawanie kompleksu karboksybiotyna-enzym. Udział tego kompleksu w procesie karboksylacji pirogronianu — p. ryc. 21 -1.

704 / R 0ZD21AŁ 53 (W Ui-CONH, CH a

trobie, co jest zjawiskiem wyjątkowym dla witaminy rozpuszczalnej w wodzie, w postaci związanej z transkobalaminą.

1"*

—CH2

CONH3

\l/\

Aktywnymi koenzymami witaminy B,a są metylokobalamina i deoksyadenozylokobalamina Z krwi kobalamina zostaje uwolniona i przeniesiona do cytoplazmy jako hydroksykobalamina. W cytoplazmie następuje jej konwersja do metylokobalaminy, albo teŜ witamina wnika do mitochondriów, gdzie ulega konwersji do 5'-deoksy adenozy lokobal aminy.

Deoksykobalamina jest koenzymem w procesie konwersji metylomalonyloCoA do sukcynylo-CoA (ryc. 53-15) Jest to główna reakcja w szlaku konwersji propionianu do metabolitu cyklu, kwasu cytrynowego. Dlatego teŜ reakcja ta ma znaczenie dla procesu glukoneogenezy. Jest ona szczególnie waŜna u przeŜuwaczy, poniewaŜ propionian jest głównym produktem fermentacji, zapoczątkowanej przez drobnoustroje w Ŝwaczu,

H3C

A

V

'

^

H3C

Ryo. 53-14. Witamina B12 (kobalamina). R — moŜe być róŜne warunkując powstawanie poszczegól-: nych postaci witaminy, np. przy R = CN powstaje cyjanokobalamina, przy R = OH — hydroksykobar lamina. przy R = 5 -deoksyadenozylo — 5'-deoksyadenozylokabałamina, zaś przy R = CH3— metylokobalamina.

zanieczyszczone drobnoustrojami. U zwierząt witamina B]2 jest magazynowana w wątrobie, gdzie występuje pod postacią metylokobalaminy, adenozylokobalaminy i hydroksykobalaminy. Wątroba jest więc dobrym źródłem witaminy B12, podobnie jak droŜdŜe. Preparaty handlowe zawierają cyjanokobalaminc. Do wchłaniania witaminy B,a w jelitach niezbędny jest czynnik wewnętrzny W procesie wchłaniania witaminy B12 pośredniczą receptory umiejscowione w nabłonku jelita biodrowego. Etapem wstępnym i niezbędnym w tym procesie jest wiązanie witaminy B12 przez czynnik wewnętrzny wydzielany przez komórki okładzinowe Ŝołądka. Po absorpcji, witamina B12 ulega związaniu przez białko osocza, zwane transkobataminą if, i przeniesieniu do tkanek. Witamina ta jest magazynowana w wą-

Metylokobalamina jest koenzymem w sprzęŜonej konwersji homocysteiny do metioniny oraz metylotetrahydrofolianu do tetrahy* drofolianu (ryc. 53-15) W tej reakcji grupa metylowa, związana z kobalamina, zostaje przeniesiona na homocysteine, przez co powstaje metionina, po czym kobalamina zabiera grupę metylową z N5-metylotetrafolianu. W wyniku tej ostatniej reakcji powstaje tetrahy drofolian. Korzyściami tej reakcji są: tworzenie zapasów metioniny oraz udostępnienie tetrahydrofolianu do syntez puryn i pirymidyn oraz kwasów nukleinowych. Niedobór witaminy B1a jest przyczyną niedokrwistości megaloblastycznej Blok wchłaniania witaminy B12 spowodowany brakiem czynnika wewnętrznego (np. gastrektomią), jest przyczyną niedokrwistości złośliwej.

Na niedobór witaminy B12 naraŜeni są równieŜ jarosze, poniewaŜ witamina ta zawarta jest tylko w pokarmach pochodzenia zwierzęcego lub w pokarmach roślinnych zanieczyszczonych drobnoustrojami. Niedobór taki jest przyczyną upośledzenia reakcji katalizowanej przez syntazę metioninową. Niedokrwistośc jest następstwem upośledzonej syntezy DNA, co znajduje

STRUKTURA 1 FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 705 SH 1

- ■ '

1 H —C —NH3+

•

r

H — C — NH COCr

cocr Homocystelna

Metlonlna SYNTAZA METIONINOW A

f

Matyl oko balami na

Metyla-tetralolian

■

"-s

B,,

Tetfafolian

Hyd ra ksyKo ba lam i na 12

CH, H-C-COO" I c _ S - CoA

CH2-COO"

B

i2 ----------------- H — C —H" Deoksyad»nozyloko bałam Ina -- I ------------------------------------------- C - S — CoA

MUTAZA METYLO- j MALONYLO-CoA L— M etylom alonylc — CoA

Su kcy nylo—CoA

Ryc. 53-15. Dwie waŜne reakcje katalizowane przez enzymy zaleŜne od koenzymu B12-

swoje odbicie w strukturze jąder erytroblastów. Z kolei upośledzona synteza DNA jest spowodowana zmniejszoną produkcją zasad purynowych i pirymidynowych uwarunkowaną niedoborem tetrahydrofolianu. Ten ostatni jest następstwem zablokowania roli folianu jako donora grup metylowych (folian jest wyłapywany do syntezy metylotetrahydrofolianu; proces ten określany jest jako „pułapka folianowa") (p. ryc. 53-15). W niedoborze witaminy B)3 moŜe wystąpić homocystynuria i acyduria metylomalonowa. Zaburzenia neurologiczne, występujące w niedoborze witaminy B12, mogą być następstwem względnego niedoboru metioniny. Opisano cztery rodzaje wrodzonych zaburzeń przemiany kobalaminy. Dwa z nich dotyczą, tylko syntezy deoksyadenozylokobalaminy, w pozostałych dwóch chorzy nie są zdolni do syntezy albo deoksyadenozylokobalaminy, albo metylokobalaminy.

Kwas foliowy albo folian składa się z zasady pterydynowej, połączonej z jedną cząsteczką kwasu p- ani ino benzoesów ego (PABA) i kwasu glutaminowego (ryc. 53-16). Zwierzęta pozbaPABA

O

COCT Kwas

OH PtwytJyna

glutaminowy Reszta ptera iłowa (kwas pierolnowy)

Kwas foliowy Ryc. 53-16. Struktura i numeracja atomów kwasu foliowego.

KWAS FOLIOWY Folacyna jest nazwą klasy związków, do których naleŜą kwas foliowy i pokrewne substancje wykazujące aktywność biochemiczną kwasu foliowego. 45 —

wionę są zdolności syntezy PABA oraz połączenia glutaminianu z kwasem pteroinowym, co sprawia, Ŝe są one zaleŜne od dostawy folianu z pokarmami. Głównymi źródłami folianu są droŜdŜe, wątroba i jarzyny liściaste. W roś-

706 / ROZDZIAŁ 53

linach kwas foliowy występuje jako koniugat wieloglutaminianowy. Jego łańcuch polipeptydowy składa się z 7 reszt glutami ni ano wy ch połączonych ze sobą w pozycji y. Głównym folianem wątroby jest koniugat pentaglutamylowy. Aktywną postacią foliami jest tetrahydrofolian (H 4-folian) Pochodne folianu zawarte w pokarmach są rozszczepiane do mo no glutamyl o folianu pod wpływem swoistych enzymów jelitowych, a dopiero następnie absorbowane. Większość tego związku ulega redukcji do tetrahydrofolianu w komórkach jelitowych (ryc. 53-17) przy udziale reduktazy folianowej oraz NADPH jako donora równowaŜników redukujących. Aktywnymi koenzymami w tkankach są prawdopodobnie poliglutaminiany tetrahydrofolianowe.

H

NADPH + H

+

REDUKTAZA FOLIANOWA +

NADP

I HN

*Y

Tfyrnetoprym Metotreksal

g

Tetrahydrofolian (H«-folian) , jest nośnikiem aktywnych grup' jednowęglowych Grupami jedno węglowy mi przenoszonymi przez H4-folian, a odznaczającymi się róŜnym stopniem utlenienia są: grupa metylowa, metylenowa, metenylowa, fonnylowa i formiminowa. Wszystkie one mogą ulec przekształceniu z jednej postaci w drugą (ryc. 53-18). Seryna jest głównym źródłem grup jednowęglowych, mianowicie grupy metylenowej. Po przeniesieniu jej na H4-folian powstają glicyna i N5-, Nl6-metyleDO-H4-fołian, odgrywający główną rolę w przemianie grup jednowęglowych. MoŜe on ulec redukcji do Ns-metylo-H4-folianu, odgrywającego waŜną rolę w metylacji homocysteiny do metioniny. W reakcji tej uczestniczy metylokobalamina jako kofaktor (patrz ryc. 53-15). Grupa metylenowa N!, N10-metyleno-H4-folianu moŜe równieŜ ulec utlenieniu. W wyniku takiej reakcji powstaje N!, N10-metenylo-H4-folian, który moŜe ulec hydratacji do N10-formylo-H4-folianu lub N5-formylo-H4-foliaiui. Ten ostatni jest równieŜ znany jako kwas fnlinowy. Jest on postacią trwałą, nadającą się do doustnego podawania, zredukowanego folianu. H4-folian aktywnie uczestniczy w przemianie htstydyny. Produktem jej rozpadu jest kwas formiminoglutaminowy (Figlu), którego grupa formiminowa moŜe ulec przeniesieniu na H4-folian tworząc N5-formimino-H4-folian. W niedoborze folianu stwierdza się nadmierne powstawanie Figlu po doustnym obciąŜeniu histydyną.

HN

OH Kwas to I Iowy

OH

Kwas dihydrafotlowy

Kwas tetrahydrolollowy Ryc. 53-17. Redukcja przez reduktazę folianową kwasu foliowego do dthydrofołiowego i kwasu dihydrofoliowego do tetrahydrofoli owego. Trymetoprym jest swoistym inhibitorem reduktazy folianowej bakterii Gram-ujemnych, natomiast ma tylko mały wpływ na ten enzym u ssaków. Dlatego uŜywany jest jako lekprzeciwbakteryjny. Metotreksat {ametopteryna) wiąŜe się silniej z wymienionym enzymem i stosowany jest jako lek przeciwnowotworowy. ___________ j__________________

Niedobór folianu jest przyczyną niedokrwistosci megaloblastycznej Przyczyna* niedokrwistości u chorych z niedoborem folianu jest podobna do występującej w niedoborze witaminy B1Z. Ns, Ni0-metyleno-H4-folian jest źródłem grup metylowych niezbędnych do syntezy tymidylanu. ten ostatni z kolei jest prekursorem niezbędnym w syntezie DNA i erytropoezie (ryc. 53-19). Równolegle

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 707 Homocystelna

Metlonlna

Niedobór witaminy B„

NADH + H+

Seryna Gllcyna

NAD*

J

Fosforan plrydoksalu

| 1 N?

t

H ■■ 1

N , Ń*-m»tyteno-H4tollan

H,-tollan

NADP+

-O ■ATP

-ADP + P,

NADPH

Synteza DNA

J

Niedobń; witaminy B,, iub tolianu

Mrówczan

-H S O

NH4

H

N

N' ^C H ; .

CH2

N10-mat9nylo-H,-follan N'-form Imlno- ^-lol lan 1D

N -Tormylo-H,-follan ^L - glutam lnlan Niedobór fólianu H4 -foHan N-)o rm im Inog I uta ml n lan (Figlu)

p. ryc 33-3 L-Hlstydyna NMormyto-H^follan (kwas toIInowy)

Ryc. 53-18. tnterkonwersje grup jednowęgiowych przyiączonych do tetrahydrofolianu.

7 0 8 / R OZ D Z I AŁ 5 3 Seryna

H,-folian V

Metotreksat

HEDUKTAZA I ^^F F 0 L W N OW A | ^ 7 \ H

iT YNfK

H,C-

H" Dlhydrofollan

, N1B-rrtetyleno-H,-fołian

SYNTAZA TYMIDYLANOWA

O •

ii/ y-daoksyurydylan (dUMP)

OH H 2- dao ksytymi dyl an (dTMP}

Ryc. 53-19. Transfer grupy metylenowej z N5, N10-metyleno-H4 -folianu do deoksyurydylanu, W wyniku tej reakcji powstaje deoksytymidylan i dihydrofolian (H 2 -fo(ian).

z redukcją grupy metylenowej do metylowej zachodzi oksydacja H4-folianu do dihydrofolianu. Ten ostatni musi ulec redukcji do H4-foliami, by mógł ponownie uczestniczyć w ww. reakcji. Ten fakt tłumaczy szczególną wraŜliwość komórek syntetyzujących tymidyłan (niezbędny do syntezy DNA) na inhibitory reduktazy folianowej, takie jak metotreksat (ryc. 53-17 i 53-19). KWAS ASKORBINOWY (WITAMINA C) Struktura kwasu askorbinowego (ryc. 53-20) przypomina strukturę glukozy, z której powstaje witamina C u większości ssaków (ryc. 22-3). U niektórych naczelnych natomiast, w tym i u człowieka oraz u licznych gatunków zwierząt (np. u świnki morskiej, niektórych gatunków nietoperzy, ptaków, ryb i bezkręgowców), brak oksyda^y L-gulonolaktonowej uniemoŜliwia taką syntezę.

Aktywną witaminą C jest sam kwas askorbinowy, który jest donorem równowaŜników redukujących w pewnych kluczowych reakcjach Kiedy kwas askorbinowy działa jako donor równowaŜników redukujących, sam ulega utlenieniu do kwasu dehydro a skór binowego. Ten ostatni moŜe być źródłem witaminy C. Kwas askorbinowy jest substancją redukującą o potencjale wodorowym wynoszącym +0,08 V, przez co jest zdolny do redukcji takich związków, jak tlen cząsteczkowy, azotany i cytochrom a i c. Mechanizm-działania kwasu askorbinowego w wieJu reakcjach nie został jeszcze wyjaśniony. Z lepiej udokumentowanych procesów wymagających obecności kwasu askorbinowego wymienić naleŜy następujące: Hydroksylację proliny w syntezie kolagenu (p. rozdz. 59 i ryc. 30-i i), ___ . __ Degradację tyrozyny — utlenienie p-hydroksyfenylopirogFoniaaw do homogentyzynianu wymaga obecności witaminy C, dla utrzymy wania miedzi w postaci zredukowanej, tj. w for-

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 709 Enzym — oksydaza L —gulonolaktonowa — nie występuje u

C=O

[2H]

naczelnych, świnkt morskiej Ud. HO-C-H I CH2OH CH2OH

Kwas askorbinowy

Kwas dehydroaskorbinowy

Gulonolakton Ryc. 53-20. Kwas askorbinowy, jego pochodzenie u nienaczelnych i jego utlenienie do kwasu dehydroaskorb i nowego. Po jonizacji jest źródłem anionu askorbinianowego.

mie maksymalnie aktywnej (ryc. 32-13). Kolejny etap przemiany fenyloalaniny jest katalizowany przez 1,2-dioksygenazę homogentyzynianową, tj. przez enzym zawierający jon Ŝelazawy i wymagający równieŜ obecności kwasu askorbinowego. 3. Syntezę adrenaliny z tyrozyny na etapie działania p-hydroksylazy dopaminowej. 4. łania 7 ahydroksyiazy. Syntezę steroidów w korze nadnerczy. Ko ra nadnerczy zawiera duŜe ilości witaminy C, które szybko znikają w razie pobudzenia gru czołu hormonem ad renokortyko tropowym. Przyczyna tego zjawiska nie jest jasna, chociaŜ wiadomo, Ŝe w steroid o genezie występuje kilka etapów o charakterze redukcyjnym. Wchłanianie Ŝelaza w przewodzie pokar mowym. Ulega ono znacznemu nasileniu w obe cności witaminy C. Działanie antyoksydacyjoe. Rozpuszczal na w wodzie witamina C moŜe działać jako antyoksydant i hamować powstawanie nitrozoamin w czasie procesu trawienia. Niedobór witaminy C jest przyczyną gnilca (szkorbutu) Szkorbut jest klasycznym zespołem chorobowym wywołanym niedoborem witaminy C. Jest on spowodowany upośledzoną syntezą kolagenu, przejawiającą się krwawieniami podskór-

nymi i do innych narząHów, osłabieniem mięśni, obrzękiem dziąseł oraz chwiejącymi się zębami. Zespól ten ulega wyleczeniu po dłuŜszym spoŜywaniu świeŜych owoców i świeŜych jarzyn. Normalne zapasy ustrojowe pokrywają zapotrzebowanie na witaminę C na okres 3-4 miesięcy, co sprawia, Ŝe objawy gnilca pojawiają się dopiero po kilku miesiącach spoŜywania pokarmów pozbawionych kwasu askorbinowego.

PIŚMIENNICTWO Bekovic SJ: On the mechanism of action of folate and biopterin-requiring enzymes. Annu Rev Biochem , 1980:49:227. Olson RE et a! (editors); Present Knowledge in Nutrition, 5th ed. The Nutrition Foundation, Inc, 1984. Passmore R, Eastwood, MA: Human Nutrition and Dietetks, Churchill Liyingstone, 1986. Rivlin RS: Hormones, drugs aad riboflavin. Nutr Rev 1979;37:241. Rosenberg L: Disorders of propionate, methylmalonate, and cobalamin metabolism.^agcs 474-497 in: The Metabołic Basis of Inherited Disease, 5th ed. Stanbury JB et al (editors). McGraw-Hill, 1983. Rubin RH, Swartz MN: Trimethroprim-sulfamethoxazolc. Af Engl J Med 1980;303:426. Sebrell WH Jr: History of pellagra. FedProc 1981;40t 1520. Seetharam B, Alpers DH: Absorption and transport of cobalamin (vitamin B^). Annu Rev Nutr 1982; 2:343.

54

Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w tłuszczach Peter A. Mayes, PhD, Dsc

WPROWADZENIE H, C

Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach (lipidach) są cząsteczkami apolarnymi, hydrofobowymi, pochodnymi izoprenu (ryc. 54-1). Nie są one syntetyzowane w dostatecznej ilości w ustroju człowieka, dlatego teŜ muszą być dostarczane z pokarmami. Warunkiem sprawnego wchłaniania tych witamin z przewodu pokarmowego jest prawidłowe wchłanianie tłuszczów. Po absorpcji witaminy te transportowane są we krwi, podobnie jak inne apolarne lipidy, za pośrednictwem lipo protein lub swoistych białek nośnikowych. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach spełniają róŜnorodne funkcje np. witamina A uczestniczy w procesie widzenia, witamina D — w przemianie wapniowej i fosforanowej, witamina E jest antyoksydantem, zaś witamrrła K uczestniczy w procesie krzepnięcia krwi. Pomimo Ŝe witaminę D (cholekalcyferol) kiedyś zaklasyfikowano do tej grupy związków, w rzeczywistości nie jest witaminą, tęcz hormonem.

I C

CH;

H Ryc. 54-1. Dwa sposoby przedstawienia jednostki izop ren owej.

czyna kurzej ślepoty (hemeralopia) i suchości spojówek (xerophtalmia), niedobór witaminy D — krzywicy u dzieci i osteomalacji u dorosłych, niedobór witaminy E — objawów neurologicznych i niedokrwistości (u dzieci), niedobór witaminy K (spotykany jest bardzo rzadko u dorosłych) — krwawień i krwotoków u noworodków. Ze względu na moŜliwość magazynowania w ustroju nadmiaru witamin rozpuszczalnych w tłuszczach mogą wystąpić objawy zatrucia, np. po przedawkowaniu witaminy A lub D. Niektórym witaminom, np. witaminie A i p-karotenowi (jest to prowitamina A) przypisuje się właściwości zapobiegające rozwojowi raka.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE WITAMINA A Ze względu na swój charakter lipidowy, zaburzenia w zakresie trawienia i wchłaniania tłuszczów, manifestujące się wydalaniem stolców tłuszczowych (steatorrkea) mogą być przyczyną niedoboru witamin rozpuszczalnych w tłuszczach. Wśród przyczyn tych zaburzeń wymienić naleŜy m.in. stany upośledzonego wytwarzania lub wydalania Ŝółci. Niedebór tych witamin w pokarmach jest przyczyną wypadnięcia ich funkcji. I tak niedobór witaminy A jest przy-

i

Witamina A lub retinol jest związkiem poliizoprenoidowym posiadającym pierścień cykloheksenowy (ryc. 54-2). Witamina A jest nazwą zwyczajową odnoszącą się do związków pochodzenia zwierzęcego, wykazujących aktywność biologiczną witaminy A. NaleŜą do nich retinol, kwas rcttnolnwy oraz retinal. TyJko retinol wykazuje pełną aktywność witaminy A, pozostałe dwa związki wykazują niektóre, choć

STRUKTURA t FUNKCJA WiTAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH / 711 CH3

CH3

CH3

A nie jest całkowita, (ł-karoten wykazuje tylko £ aktywności retinolu (tj. 1 ug retinolu jest równowaŜny 6 wg P-karotenu). CH2OH

CH3 Ryc.

54-2. Retinol

{witamina A).

nie wszystkie, jej właściwości biologiczne. Pod pojęciem retinoidów naleŜy rozumieć naturalne postacie oraz analogi syntetyczne retinolu. Prowitaminą witaminy A jest (karoten W jarzynach witamina A występuje pod postacią prowitaminy tj. p-karot«nu. Jest to Ŝóhy barwnik złoŜony z dwóch cząsteczek retinalu połączonych ze sobą za pośrednictwem grup aldehydowych umiejscowionych na końcu łańcucha węglowego tych związków (ryc. 54-3). PoniewaŜ konwersja p-karotenu do witaminy

Trawienie witaminy A towarzyszy trawieniu lipidów, po czym witamina A ulega transformacjom w błonie śluzowej jelit Estry retinolu rozpuszczone w tłuszczach pokarmowych ulegają zawieszeniu w kroplach Ŝółci i hydrolizie w świetle jelita, a następnie dopiero wchłaniane są przez nabłonek jelitowy. SpoŜyty P-karoten moŜe ulec rozszczepieniu oksydacyjnemu przez dioksygenazę p-karotenov/ą (ryc. 54-3). W procesie rozszczepienia potrzebny jest tlen cząsteczkowy. Proces ten nasila obecność soli kwasów ąółciowych. W następstwie rozszczepienia p-karotenu powstają dwie cząsteczki aldehydu retinowego (retinalu). W błonie śluzowej jelita retinal zostaje zredukowany do retinolu przez swoistą reduktazę retina-

ftetlnol (witamina A)

Ryc. 54Karoten i rozpad (aldehydu

3. |.ijego do retinalu

DIOKSYGENAZA 0-KAROTENOWA

Aldehyd retinowy (retinal, witamina A,)

CH3

retinowego). Na rycinie pokazano równieŜ redukcję retinalu da retinolu oraz utlenienie retinalu do kwasu retinojowego.

712 / ROZDZIAŁ 54

Retinol, retinal i kwas retinojowy — kaŜdy z tych związków wykazuje swoiste funkcje biologiczne Retinol moŜe ulec przekształceniu do retinalu i odwrotnie pod wpływem dehydrogenaz lub reduktaz, występujących w wielu tkankach i wymagających obecności NAD lub NADP. Nale-

Iową. W reakcji tej donorem atomów wodorowych jest NADPH. Mała część retinalu jest utleniana do kwasu retinojowego. Większość retinolu jest estryfikowana i wbudowywana do chylomikronów limfy (p. str. 299), skąd dostają się do krwi krąŜącej. Chylomikrony ulegają degradacji do chylomikronów resztkowych. Te ostatnie, zawierające retinol, są wychwytywane przez hepatocyty. Karotenoidy mogą ominąć ww. procesy przemiany i dostać sie bezpośrednio do chylomikronów. Witamina A jest magazynowana w wątrobie i po uwolnieniu do krwi ulega związaniu przez białka transportujące W wątrobie witamina A jest magazynowana w lipocytach pod postacią estru prawdopodobnie w kompleksach lipoglikoproteinowych. Przed uwolnieniem do krwi i dostaniem sie do innych tkanek, estry witaminy A ulegają hydrolizie, zaś uwolniony retinol związaniu przez apo-bialko wiąŜące retinol (apo-retinol binding protein — RBP). Powstałe holo-RBP zostaje przekształcone w aparacie Golgiego, a następnie uwoinione do osocza. Kwas retinojowy przenoszony jest we krwi przez albuminy. Po dostaniu się do wnętrza komórek innych niŜ hepatocyty retinol zostaje związany przez tzw. komórkowe białko wiąŜące retinol (cellular reti-

nol binding protein — CRBP).

Ŝy dodać, Ŝe raz powstały kwas retinojowy nie moŜe powtórnie przekształcić się w retinal lub

retinol. Ten fakt sprawia, Ŝe kwas retinojoWy wpływa na wzrost i róŜnicowanie komórek, lecz nie moŜe zastąpić retinalu w procesie widzenia ani retinolu w zakresie działania na układ rozrodczy.

Retinol działa jak hormon steroidowy Po związaniu przez CRBP retinol przemieszcza się do jądra komórkowego i zostaje związany przez białka jądrowe. W jądrze komórkowym retinol prawdopodobnie uczestniczy w kontroli ekspresji pewnych genów. Pod tym wzglę-

dem witamina A zachowuje się podobnie jak hormony steroidowe. Udział witaminy w kontroli ekspresji genów wydaje się tłumaczyć jej niezbędność w procesie fizjologicznej reprodukcji. Retinal jest składową barwnika wzrokowego — rodopsyny Rodopsyna występuje w pręcikach (komórkach pręcikowych) siatkówki odpowiedzialnych za widzenie w słabym świetle. 11-cw-Reti-

Objawy toksyczności spowodowane witaminą

nal będący izomerem całkowicie-fr-ans-retf^alu

A występują w chwili przekroczenia całkowite* go wysycenia RBP i eksponowania komórek na retinol wolny, nie związany białkiem nośniko wym. iv

ulega swoistemu związaniu przez białko zwane opsyną tworząc rodopsynę (ryc. 54-4). Przy ekspozycji rodopsyny na światło, barwnik traci barwę ulegając rozpadowi do całko wicie- trans-

hY

HoOopsyna 3 11

(foton światła)

Ryc. 54-4. W pręcikach siatkówki oka 11 -c/s-retinal, powstały z całkowicie- trans- retinal u, łączy się z opsyną tworząc rodopsynę Absorpcja fotonu przez rodopsynę jest powodem utraty jej zabarwienia i rozpadu doopsyny i całkowicie- trans-retinalu. Dla podtrzymania cyklu tych reakcji niezbędny jest retinal.

STRUKTURA 1 FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH / 713

-retinalu i opsyny. Reakcji tej towarzyszy zmiana konftirmacyjna indukująca otwarcie kanału wapniowego w pręcikach. WzmoŜony napływ jonów wapnia do pręcika wyzwala impuls nerwowy umoŜliwiający percepcję światła przez mózg. Kwas retinojowy uczestniczy w syntezie glikoprotein To działanie moŜ« częściowo tłumaczyć pobudzający wpływ ' kwasu retinojowego na wzrost i róŜnicowanie tkanek. Sugerowano, Ŝe fosforan retinoilowy spełnia funkcję przenośnika oligosacharydów przez lipidową dwuwarstwę błon komórkowych. Proces ten ma być enzymatyczną trans-cis izomeracją podobną do opisanej wyŜej trans-cis izomeracji rodopsyny. Nie do odparcia dowodem na to, Ŝe kwas retinojowy uczestniczy w syntezie glikoprotein jest fakt akumulacji w stanach niedoboru witaminy A nienormalnie nisko cząsteczkowych intermediatów oligosacharydowo-lipidowych (p. rozdz. 57). Brak witaminy A wywołuje charakterystyczne objawy niedoborowe Sa one spowodowane upośledzeniem funkcjonowania róŜnych mechanizmów komórkowych, w których uczestniczą retinoidy. Jednym z pierwszych objawów niedoboru witaminy A jest upośledzone widzenie nocne, które pojawia się przy prawie całkowitym wyczerpaniu się zapasów witaminy A w wątrobie. Dalsze zubo-

Ch,

Ŝenie w witaminę^A jest przyczyną Iceratyzacji nabłonka oka, dróg oddechowych, układu Ŝołądkowo-jelitowego i dróg moczowo-płciowych oraz zmniejszenia wydzielania śluzu. Suchość spojówek (xerophtalmia) i rogówki prowadzi nieuchronnie do ślepoty. Przyczyną niedoboru witaminy A jest głównie spoŜywanie pokarmów pozbawionych tej witaminy, a szczególnie niespoŜywanie jarzyn zawierających prowitaminę A, tj. (3-karoten Zarówno retinoidy, jak i karotenoidy wykazują działanie przeciwnowotwo ro we Wiele nowotworów u człowieka wywodzi się z komórek nabłonkowych. RóŜnicowanie tych ostatnich zaleŜne jest (jd_ retinoidów. Niektóre badania epidemiologiczne wykazały występowanie odwrotnej zaleŜności między zawartością witaminy A w pokarmach a ryzykiem wystąpienia raka. Ponadto w niektórych doświadczeniach wykazano, Ŝe podawanie retinoidów zmniejsza aktywność niektórych karcynogenów. p-karoten jest antyoksydantem, MoŜe on odgrywać rolę w wychwytywaniu wolnych rodników nadtlenkowych w tkankach, w których występuje małe ciśnienie cząstkowe tlenu. Mechanizm działania 0-karotenu jako antyoksydantu polega na stabilizacji wolnych, organicznych rodników nadtlenkowych w jego sprzęŜonej alkilowej strukturze (ryc. 54-5). PoniewaŜ (3-karoten jest skuteczny przy małych stęŜeniach tlenu, uzupełnia on anty oksydacyjne właściwo-

CH

ROO*

CH,

CH,

Ryc. 54-5. Powstawanie rezonansowo stabilnego rodnika z atomem węgla w centrum z rodnika nadtlenkowego (ROO*) i p-karotenu. (Według: Burton G, W., Ingold K. U.: An unusual type of lipid antioxidant; Science 1984, 224, 569 Copyright (0 1984 by Tne American Association for the Actvancement of Science. Niewielka modyfikacja, za zezwoleniem).

714 / ROZDZIAŁ 54

ści witaminy E, działającej przy duŜych stęŜeniach tlenu (p. str. 185). Anty oksydacyjne właściwości obu wymienionych witamin rozpuszczalnych w tłuszczach mogą być odpowiedzialne za ich działanie przeciwnowotworowe. WITAMINA D Witamina jest prohormonem steroidowym. Jej przedstawicielem jest grupa steroidów występujących głównie u zwierząt, choć równieŜ w roślinach i droŜdŜach. W wyniku przemian biochemicznych z tych steroidów powstaje hormon — kalcytrioL, odgrywający główną rolę w przemianie wapniowej i fosforanowej (p.

str .623). Witaminy D powstają z prowitamin srgosterolu i 7-dehydrochoiesterolu w wyniku działania światła słonecznego Ergwstcrol występuje w rośtinach, natomiast 7-dehydrocholesterol u zwierząt. Ergosterol ró-

Ŝni się od 7-dehydrocholesterolu tylko łańcuchem bocznym (który jest nienasycony) oraz dodatkową grupą metylową (ryc. 54-6). Pierścień B obu związków ulega rozszczepieniu pod wpływem promieni ultrafioletowych światła słonecznego. Synteza ergokalcyferolti (witaminy D2) odbywa się w roślinach, natomiast cholekalcyferolu (witaminy D3) w skórze zwierząt eksponowanej na działanie promieni słonecznych. Obydwie witaminy wykazują taką samą aktywność biologiczną i są produktami wyjściowymi do syntezy D2-kalcytriolu, lub teŜ D3-kalcytriolu. W dalszej części rozdziału zostanie opisany tylko D3-kalcytriol, W syntezie kałcytriolu uczestniczą zarówno wątroba, jak i nerki Witamina D3 (lub Dj) zawarta w pokarmach, jest wchłaniana w jelitach, po czym dostaje się do krwi, gdzie ulega związaniu przez swoiste białko nośnikowe. Z krwi witamina D jest wychwytywana przez wątrobę, gdzie ulega hydrcksylacji w pozycji 25. Enzymem katalizującym tę reakcję jest 25-hydroksylaza witaminy

CH3

CH3 CH3

H—C—CH = CH —C —CH CH,| \ CH3

Ergokalcytero l (witamina D,)

trgosterol (rośliny)

— CHj — CH? — CH N CH3

H-C-CHjCH, CH

Fotoliza 7 - Dehyd rocholestaro I (zwierzęta)

Cholekalcyfero l (witamina D,)

Ryc. 54-6. Ergosterol i 7-dehydrochoiesterol oraz konwersja tych związków przez fotolize do ergokalcyferolu lub cholekalcyferolu.

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH / 71fi CH3

/

CH3

H-C- CH;- CHj- CH2 - »C^-0H CH3 25 -

25-HYDRO KSYLAZA WĄTROBOWA Hydf oksyoho tekatcyferol [25-hydroksy-witamina O)

Cholekalcyfer ol (witamina D3i 24- HYDROKSYLAZA NERKOWA. KOSTNA ŁOśYSKOWA, JELITOWA, CHRZESTNA

1a-HYDROKSYLAZA NERKOWA, KOSTNA LUB ŁOśYSKOWA

HO

OH i

CH3 H—C-(

OH, - CH2 CH3

HO

CH,

\ CH3 24,23 - Dl hyd roksyoho lekaloyfero I (24,25-dlhydroksy-witamlna O,)

1,25 - D Ihydroksyc h o lekaloyferol (1.25-dltiydroksywHamlraa DJ

Ryc. 54-7. Cholekalcyferol moŜe utec hydroksylacji w pozycji C26 przez enzym występujący w wątrobie. 25-hydroksychoiekalcyferol ulega dalszej metabolizacji do 1a,25-dihydroksycholekalcyferolu lub do 24,25-dihydroksycholekalcyferolu, Czynniki pobudzające syntezę ta,25-dihydroksycholekalcyfero)u hamują syntezę 24,25-dihydroksycholekalcyferolu i odwrotnie.

D3, występująca w siateczce śródplazmatycznej hepatocytów. Jest ona enzymem decydującym o szybkości produkcji aktywnych metabolitów witaminy D w szlaku syntezy tych związków (ryc. 54-7). 25-hydroksy-Dj jest główną postacią zapasową tej witaminy w wątrobie. Znaczna część 25-hydroksy-D;, podlega krąŜeniu jelitowo-wątrobowemu, co sprawia, Ŝe zaburzenia tego procesu mogą być przyczyną niedoboru witaminy D. W kanalikach nerkowych, kościach i w łoŜysku 25-hydroksy-D3 ulega dalszej hydroksylacji w pozycji 1 przez enzym mitochondrialny - l-hydroksylazę 25-hydroksy-D,. W wyniku tej reakcji powstaje 1 a, 25-dihydroksy-D3 (kalcytriol) — będący najsilniej działającym metabolitem witaminy O. Regulatorami syntezy tego hormonu są: samo stęŜenie tego metabolitu, jak równieŜ stęŜenie PTH i fosforanów w surowicy krwi.

25-hydroksy-D3 moŜe ulec hydroksylacji równieŜ w pozycji 24 przez enzym mitochondrial-

ny obecny w kanalikach nerkowych, chrząstkach, jelitach i łoŜysku. StęŜenie w surowicy krwi powstającego w tej reakcji 24, 25-dihydroksy-D3 wykazuje ujemną korelacje ze stęŜeniem 1,25-dihydroksy-Dj. Dalsze szczegóły dotyczące regulacji i roli kalcytriolu w przemianie wapniowej i fosforanowej zostały podane w rozdz. 48. Niedobór witaminy D jest przyczyną krzywicy i osteomalacji Krzywica występuje u dzieci, zaś osteomalacja u dorosłych, nie eksponowanych na działanie promieni słonecznych lub Ŝywionych pokarmami nie zawierającymi dostatecznej ilości witaminy D. Niedobór witaminy D jest przyczyną rozmickania kości spowodowanego brakiem wapnia i fosforanów. Rybi oJej, Ŝółtko jaj oraz wątroba są dobrymi źródłami tej witaminy.

716 / ROZDZIAŁ 54

WITAMINA E (TOKOFEROL)

Witamina E jest bardzo waŜnym naturalnym antyoksydantem

Istnieje kilka tokoferoli występujących w przyrodzie. Wszystkie one są izoprenoidowymi pochodnymi 6-hydroksychromanów lub tokoli (ryc. 54-8). Najczęściej spotykanym w przyrodzie tokoferolemjest D-a-tokoferol. Wykazuje on największą aktywność biologiczną wśród tokoferoli. Inne tokoferole odgrywające znaczenie w Ŝywieniu człowieka zestawione są w tab. 54-t.

Wydaje się, Ŝe witamina E stanowi pierwszą linię obrony przed peroksydacją wielonienasyconych kwasów tłuszczowych zawartych w fos-

Proces aktywnego wchłaniania tłuszczów sprzyja absorpcji witaminy E w jelitach Upośledzenie wchłaniania tłuszczów jest przyczyną niedoboru witaminy E, poniewaŜ jest ona

rozpuszczona w tłuszczach, a uwalniana i absorbowana z przewodu pokarmowego w trakcie trawienia lipidów. We krwi witamina E jest transportowana za pośrednictwem lipoprotein.

Początkowo znajduje się w chylomikronach, z którymi dociera do tkanek posiadających lipazę lipo proteinową. Do wątroby dociera w chylomikronach resztkowych (w remnantach chylomikronów). Z wątroby witamina E wydostaje się wraz z cząsteczkami lipoprotein o bardzo małej gęstości. Jest ona magazynowana w tkance tłuszczowej. Tabela 54-1. Naturalnie występujące tokoferole, wykazujące znaczenie w Ŝywieniu Tokoferol człowieka Podstawniki 5,7,8 -Tr i mety I oto koi 5,8-Dimetylotokol 7,8- Dimetylot okol 8Metylotokol

folipidach błon komórkowych i organelli subkomórkowych. Fosfolipidy błon mitochondrialnych, siateczki śródplazmatycznej i błon plazmatycznych wykazują powinowactwo do cc-tokoferolu i wydaje się, ze witamina ta ulega koncentracji w tych strukturach. Tokoferole działają jako antyoksydanty (przeciwutleniacze) przerywając reakcje łańcuchowe generujące wolne rodniki. Działanie to polega na transferze wodoru fenolowego na wolny rodnik nadtlenkowy peroksydowanego, wielonienasyconego kwasu tłuszczowego (ryc. 54-9 oraz str. 184). Z kolei powstały wolny rodnik fenoksy- reaguje z dalszym wolnym rodnikiem nadtlenkowym. Tak więc a-tokoferol nie jest łatwo wciągany do reakcji odwracalnej oksydacji; pierścień chromanu i łańcuch boczny ulegają utlenieniu do związku nie będącego wolnym rodnikiem. Jest on pokazany na ryc. 54-10. Ten produkt oksydacji łączy się z kwasem glukuronowym za pośrednictwem grupy hydroksylowej w pozycji 2 i wydalaniu z Ŝółcią. W odróŜnieniu od innych witamin np. niacyny, witaminy B12 i folianu, tokoferol po wypełnieniu swojej funkcji nie u\ega recyrkulacji. Dlatego teŜ musi być zastąpiony przez nowy tokoferol, by spełnić swoje zadanie biologiczne w komórce. Antyoksydacyjne działanie tokoferolu jest najbardziej skuteczne przy wysokich stęŜeniach tlenu, dlatego nie jest zaskoczeniem, Ŝe witamina ta wykazuje tendencję do gromadzenia się w strukturach lipidowych, eksponowanych na największe ciśnienia cząstkowe tlenu, tj. w błonach krwinek czerwonych oraz w błonach komórkowych dróg oddechowych.

i CH,

CH,
Ryo. 54-8. a-Tokoferol.

-CHlCH^-CH-CHj

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH / 717 ROOH + TocO* ROO* + TocOH ■ ROO' * Nieaktywny pi wolnego rodr

TocO' ■

nika

Ryc. 54-9. Aktywność antyoksydacyjna tokoferolu przerywająca łańcuch generacji rodników nadtlenkowych (ROO*)._________________________ : CH3 OH

)—I?

CH3 O-

4 ^ CH3

CH,~ ^

spowodowana obniŜoną syntezą hemoglobiny lub skróceniem okresu Ŝycia krwinek czerwonych. Zapotrzebowanie na witaminę E wzrasta przy wzroście spoŜycia wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. ZaŜywanie olejów mineralnych, ekspozycja na czysty tlen (np. w namiotach tlenowych) oraz choroby przebiegające z upośledzonym wchłanianiem tłuszczów w jelitach mogą być przyczyną niedoboru witaminy E i wystąpienia zaburzeń neurologicznych. Witamina E ulega rozkładowi pod wpływem gotowania lub innych procesów obróbki środków spoŜywczych, miedzy innymi zamraŜania w bardzo niskiej temperaturze. Dobrymi źródłami witaminy E są: kiełkujące ziarna pszenicy, olej z nasion słonecznika, krokosza, kukurydzy lub soi. Choć oleje uzyskane z wątróbek rybich są bogate w witaminę A i D, to jednak zawierają niewielkie ilości witaminy E.

Ryc. 54-10. Produkt oksydacji a-tokoferolu. Podana numeracja informuje o połoŜeniu oznaczonych atomów w związku macierzystym.

WITAMINA K Witamina E i selen działają synergistycznie. KaŜdy z tych czynników zmniejsza zapotrzebowanie ustroju na czynnik drugi Peroksydaza glutationowa, której integralnym składnikiem jest selen (p. str. 243), stanowi drugą linię obrony przed nadtlenkami zanim dojdzie do ich propagacji w reakcjach łańcuchowych, niszczących błony i inne struktury komórkowe. Tak więc tokoferol i selen uzupełniają się wzajemnie w reakcjach niszczących nadtlenki lipidowe, przy czym jeden z nich zmniejsza zapotrzebowanie na drugi. Ponadto selen jest niezbędny do prawidłowej czynności trzustki. Ta ostatnia z kolei jest potrzebna w procesie trawienia i wchłaniania lipidów, w tym równieŜ tokoferolu. Odwrotnie, witamina E zmniejsza zapotrzebowanie na selen, zapobiegając utracie tego pierwiastka przez ustrój oraz utrzymując go w postaci aktywnej.

Witaminy naleŜące do grupy K są poliizoprenoidowymi pochodnymi naftochinonu (ryc. 54-11). Menachinon (=menadion) będący związkiem macierzystym witamin grupy K (ryc. 54-12)

Niedobór witaminy E moŜe być przyczyną niedokrwistości u noworodków U cięŜarnych lub karmiących matek oraz u noworodków moŜe zachodzić potrzeba suplementacji pokarmów witaminą E w celu zapobiegania niedokrwistości spowodowanej niedoborem tej witaminy. Niedokrwistość moŜe być

nie występuje w przyrodzie. Po jego podaniu in vivo ulega alkilacji do jednego ze związków pochodnych menachinonu (witamina K2). Filochinon (witamina K,) jest główną postacią witaminy K. występującą w roślinach, Menachinon-7 jest jedną z poliizoprenoi ci owych, nienasyconych pochodnych witaminy K występujących w tkankach zwierzęcych i syntetyzowanych przez bakterie w jelitach.

Jednostka Izopranoldowa 2-Metylo-1.4-n aftoeh ino n

Ryc. 54-11. Pochodna naftochinonu oraz jednostka izoprenoidowa. W witaminach grupy K podstawniki R są poliizoprenoidami.

718 / ROZDZIAŁ 54

Menadion (witamina K,)

CHS

CH,

= C-CH I -(CH 3 -CH 1 -CH-CH J ) 3 -H O

Fllochlnon (witamina K,, filonatfłon, msflton) O CH3 CH3(CH] CH=CCH1J n-H

Menaehlnon-n (witamina K^ n = 6,7 lub 9) Ryc. 54-12. Postacie witaminy K występujące w przyrodzie.

Niezaburzone wchłanianie tłuszczów jest warunkiem prawidłowego wchłaniania witaminy K Upośledzone wchłanianie tłuszczów jest najczęstszą przyczyną niedoboru witaminy K. Występujące w przyrodzie pochodne witaminy K ulegają wchłanianiu tylko w obecności kwasów Ŝółciowych i podobnie jak inne lipidy dostają sie do krwi krąŜącej w chylomikronach za pośrednictwem rt&szyń limfatycznych. Menachinon (menadion), jako związek rozpuszczalny w wodzie ulega wchłanianiu nawet przy braku kwasów Ŝółciowych, dostając się bezpo-

średnio do Ŝyły wrotnej. ChociaŜ witamina K jest początkowo magazynowana w wątrobie, stęŜenie jej w tym narządzie szybko obniŜa się, bowiem gromadzenie się witaminy K w wątrobie jest ograniczone. Witamina K jest niezbędna w biosyntezie osoczowych czynników krzepnięcia Udowodniono, Ŝe witamina K uczestniczy w utrzymywaniu prawidłowych stęŜeń II, VII, IX i X czynnika krzepnięcia krwi. Wszystkie te

czynniki są syntetyzowane w wątrobie w postaci nieaktywnych białek prekursorowych (p. rozdz. 58).

Witamina K jest kofaktorem karboksylazy katalizującej powstawanie reszt y-kar boksy gluta mi niań owych w białkach prekursorowych Powstawanie biologicznie aktywnych czynników krzepnięcia krwi związane jest z potranslacyjnym przekształceniem reszt glutaminianowych (Glu) białek prekursorowych do reszt ykarboksyglutaminianowych (Gla) przez swoistą karboksylazę zaleŜną od witaminy K (ryc. 5413). Protrombma (drugi czynnik krzepnięcia krwi) zawiera 10 takich reszt, pozwalających na chelatowanie jonów wapniowych. Proces ten cha-

rakteryzuje się swoistą interakcją białek, jonów wapniowych i fosfolipidów, niezbędną dla wystąpienia ich efektu biologicznego (ryc. 54-14).

cocr COn CH2

"OOC COO"

\/ CH WITAMINA K CH;,

I

— C —CH —N — — C —CH —N — II H (I O ' o R y c. 5 4 -1 3 . K a rb o k s yl a cj a re s zt y gl u t o m i ni a n o - wej, katalizowanej przez

witaminę K.

H

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH / 719 Glu

Gla

V CH -C-CH-N-

I

I

"

Ryc. 54-14. Chelatowanie jonów wapnia przez resztę 7-karboksylog lulamy Iową występującą w białkowych czynnikach krzepnięcia.

W kilku tkankach zidentyfikowano występowanie równieŜ innych białek zawierających reszty Gla zaleŜne od witaminy K. „Cykl witaminy K" pozwala regenerować zredukowaną postać witaminy K W reakcji katalizowanej w siateczce śródplazmatycznej przez karboksylazę zaleŜną od witaminy K niezbędna jest obecność tlenu cząsteczkowego, dwutlenku węgla (a nie HCOy), oraz postaci hydrochinomiwej (zredukowanej) witaminy K. W siateczce endoplazmatycznej hepatocytów występuje tzw. cykl witaminy K (ryc. 54-15), w którym produkt reakcji karboksylacji — 2,3-epoksyd — ulega najpierw konwersji do postaci chinonowej witaminy K. Reakcja ta jest katalizowana przez reduktazę 2,3-epoksydową działającą w obecności niezidentyfikowanego jeszcze reduktora ditiolowego. Reakcja ta jest wraŜliwa na hamujące działanie anty koagulantów grupy 4-hydroksydikumarynowej (dikuma-

rolowej) takich jak warfaryna (ryc. 54-16). Kolejna redukcja postaci chŜnonowej do hydrochinonowej przez NADH zamyka cykl witaminy K. W ten sposób regeneruje się biologicznie aktywna postać witaminy K. WaŜnym wskazaniem do stosowania witaminy K (jako antidotum) jest zatrucie lekami pochodnymi dikumarolu. Postać chinonowa witaminy K, omijając etap działania reduktazy epoksydowej, jest potencjalnym źródłem aktywnej, hydrochinonowej postaci tej witaminy. Skaza krwotoczna noworodków jest spowodowana niedoborem witaminy K Witamina K występuje w roślinach i tkankach zwierzęcych uŜywanych jako pokarm oraz syntetyzowana jest przez mikroflorę jelitową.

SH

SH

Warfaryna Dl ku maro I

Ryc. 54-15. Aktywności metaboliczne wątroby powiązane z witaminą K. Na rycinie pokazane jest miejsce działania anty koagulantów typu dtkumarolu. Szczegóły niektórych reakcji nie są jeszcze znane. 1 — monooksygenaza, 2 — karboksylaza, 3 — reduktaza 2,3-epoksydowa, 4 — reduktaza. (Według: SuttieJ. W. The metabolic roleof vitamin K; Fed. Proc. 1980, 39, 2730, modyfikacja, za zezwoleniem).

Ryc. 54-16. Dikumarol (bis-hydroksykumaryno-3,3' - mety leno - bis - hydroksyk umaryna)

Te fakty sprawiają, Ŝe u dorosłych nie spotyka się stanów niedoboru witaminy K. Na wystąpienie niedoboru tej witaminy są jednak naraŜone noworodki, poniewaŜ łoŜysko nie transportuje dostatecznie skutecznie witaminy K z krąŜenia matki do płodu i przewód pokarmowy u płodów jest sterylny bezpośrednio po urodzeniu. U zdrowych noworodków stęŜenie witaminy K w osoczu krwi spada bezpośrednio po porodzie, lecz wraca do normy z chwilą rozpoczęcia wchłaniania pokarmów. W razie zbyt duŜego spadku stęŜenia protrombiny moŜe wystąpić skaza krwotoczna.

720 / ROZDZIAŁ 54

Niedobór witaminy K. moŜe wystąpić w stanach wadliwego wchłaniania tłuszczów spowodowanych upośledzoną czynnością egzokrynną trzustki, zaburzeniami wytwarzania i wydalania Ŝółci, atrofią błony śluzowej jelit lub innymi chorobami charakteryzującymi się wydalaniem stolców tłuszczowych. Ponadto przyczyną niedoboru witaminy K moŜe być wyjałowienie

Goodman DS: Vitamin A and retinoids in heatth and disease. N Engl J Med 1984;310:1023. Norman AW, Roth J, Orci L: The vitamin D endocrine system. Endocr Rev 1982;3:331. Olson RE et al (editors): Present Knowiedge in Nutrition, 5th ed, The Nutrition Foundation, Inc, Washington, DC, 1984. Passmore R, Eastwood MA: Human Nutrition and Dietetics, Churchi!! Ljvingstone, 1986, Scott, ML: Advances in our understanding of vitamin E. Fed Proc 198O;39:273Ó. Sokol RJ: Vitamin E deficiency and neurologie disease. Annu Rev Nutr 1988;8:351. SpornMB, Roberts AB: Role of retinoids indifferentiation and carcinogenesis. Cancer Res 1983; 43:3034. SuttieJW: The metabolic role ofvitamin K. Fed Proc 1980;39:2730. Whitlon DS, et al: Mechanism of coumarin action: Significane of vitamin K epoxide reductase inhibition. Biochemistry 1978;17:1371.

przewodu pokarmowego przez antybiotyki, jeśli

podaŜ tej witaminy w pokarmach jest niedostateczna.

PIŚMIENNICTWO Adams JS, et al: Vitamin-D synthesis and metaboiism after ultraviolet irradiation of norma! and vitamin-D-deficient subjects. JV Engl Med l982;30ó:722.

--■■

i

śywienie

55

Peter A. Mayes, PhD, DSc

■

WPROWADZENIE

są bardziej powszechne, np. niedobory białkowe (choroba kwashioijkor), witaminowe (xe-

Nauka o Ŝywieniu bada jakościowe i ilościowe zapotrzebowanie na pokarmy niezbędne dla podtrzymania dobrego stanu zdrowia. Praktycznie biorąc znane są wszystkie składniki pokarmowe potrzebne do Ŝycia, moŜliwe jest bowiem utrzymywanie przy Ŝyciu zarówno zwierząt, jak i człowieka podając im pokarmy chemicznie dokładnie określone. Występują natomiast znaczne kontrowersje dotyczące zapotrzebowania ilościowego na poszczególne składniki pokarmowe szczególnie w odniesieniu do wiek~u, pici i stylu Ŝycia. Biochemia przemiany materii, przedstawiona w początkowych rozdziałach tego podręcznika, dostarczyła wiele danych pomocnych dla zrozumienia nowoczesnych koncepcji Ŝywieniowych. W szczególności w poprzednich dwóch rozdziałach opisano role biochemiczne witamin rozpuszczalnych w wodzie i tłuszczach.

rophtahnia jako następstwo niedoboru witaminy A), składników mineralnych (niedokrwistość spowodowana niedoborem Ŝelaza) lub kaloryczne (spowodowane głodzeniem energetycznym). Przyczyną niedoborów Ŝywieniowych moŜe być równieŜ wadliwe wchłanianie pokarmów (malabsorption) np. wadliwe wchłanianie witaminy B12 i folianu jest przyczyną niedokrwistości megaloblastycznej. ChociaŜ otyłość kojarzono zawsze z przejadaniem się w społeczeństwach bardziej rozwiniętych, coraz większą uwagę zwraca się ostatnio na wpływ nadmiernego pobierania określonego składnika pokarmowego na rozwój takich chorób jak miaŜdŜyca i choroba wieńcowa serca, rak piersi i jelita grubego, choroby naczyń mózgowych oraz wylew krwi do mózgu oraz marskość wątroby.

ZAPOTRZEBOWANIA śYWIENIOWE MOśNA DZISIAJ USTALIĆ ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Klinicznie jawne niedobory Ŝywieniowe są rzadko spotykane w populacjach bardziej zasobnych, chociaŜ pewien stopień niedoborów Ŝywieniowych moŜe wystąpić wśród ludzi biednych lub starych, u osób o szczególnych zapotrzebowaniach Ŝywieniowych, np. u dzieci w okresie wzrostu, kobiet cięŜarnych lub karmiących, u osób chorych lub będących w okresie rekonwalescencji oraz u alkoholików. Czasami takie niedobory są wynikiem własnego wyboru np. u jaroszów lub teŜ są Spowodowane koniecznością stosowania u niektórych chorych ograniczonej diety lub Ŝywienia pozajelitowego. W populacjach biednych niedobory Ŝywieniowe 46

l i i . -■■■.::: i

W tabeli 55-1 zestawiono istotne dla Ŝycia składniki pokarmowe.

ENERGIA JEST POTRZEBNA PRZY REALIZACJI WSZYSTKICH CZYNNOŚCI USTROJOWYCH Ustrój ssaków potrzebuje dostawy środków odŜywczych w ilościach niezbędnych do pokrycia wydatków energetycznych związanych z wytworzeniem związków wysokoenergetycznych (głównie ATP) oraz równowaŜników redukujących (ZH), uczestniczących we wszystkich funkcjach ustrojowych (p. ryc. 17-1).

722 / ROZDZIAŁ 55 Tabela 55-1. Istotne (egzogenne) składniki pokarmowe Człowiek

Wybrane cechy róŜniące człowieka od innych gatunków

Aminokwasy

Histydyna*, izoleucyna, leucyna, metionina (cysteina"*), fenyloalanina (tyrozyna**"), treonina, tryptofan, walina

Arginina** jest niezbędna dla szczurów w okresie wzrostu. Glicyna jest niezbędna dla kurcząt, zaś tauryna dla kotów. U przeŜuwaczy większość aminokwasów naleŜy do aminokwasów endogennych. U innych zwierząt trawoŜemych z obfitą mikroflorą w przewodzie pokarmowym zapotrzebowanie na aminokwasy egzogenne jest mniejsze

Kwasy tłuszczowe

Kwas linolowy (kwas ara- U kotów kwas arachidonowy jest kwasem egzogenchidonowy""), kwas ot-li- nym nolenowy**"

Witaminy Rozpuszczalne w wodzie

Rozpuszczalne w tłuszczach Składniki mineralne Makromineralne

Kwas askorbinowy (C), biotyna, kobalamina (B^), kwas foliowy, kwas pantotenowy, pirydoksyna (B6), ryboflawina (Bs), tiamina (B.) Witamina A, D* K .....

Większość ssaków potrafi syntetyzować witaminę C z wyjątkiem naczelnych, świnek morskich i owocowego nietoperza indyjskiego; u przeŜuwaczy witaminy rozpuszczalne w wodzie nie naleŜą do istotnych (egzogennych) składników pokarmowych. Zapotrzebowanie na te witaminy jest mniejsze u innych zwierząt trawoŜemych wykazujących obfitą kolonizację jelit mikroorganizmami

E, Większość gatunków potrafi wykorzystać (3-karoten

jako źródło witaminy A (retinol), natomiast koty muszą otrzymać retinol

Wapń, chlorki, magnez, fosfor, potas, sód

Śladowe (mikroele- Chrom, miedź, jod, Ŝelazo, Wykazano, Ŝe krzem, wanad, nikiel, arsen, fluorki mangan, molibden, selen, i cyna są składnikami niezbędnymi dla niektórych menty) gatunków i być moŜe są równieŜ niezbędne dla cynk człowieka; kobalt jest niezbędny do syntezy kobalaminy przez mikroorganizmy przeŜuwacza Włókna

Niezbędne dla pełnego zdrowia

Woda

Najbardziej krytyczny składnik pokarmów

Energia

Zmienny udział węglowodanów, tłuszczów i białek w bilansie energetycznym

i

' Niezbędny u niemowląt i prawdopodobnie równieŜ u dzieci i dorosłych, ** MoŜe być częściowo niezbędna u niemowląt. *** Cystę i na, tyrozyna i kwas arachidonowy zmniejszają zapotrzebowanie odpowiednio na metioni-nę, fenyloalaninę i kwas linolowy. **" Niektórzy badacze uwaŜają, Ŝe kwas linoienowy nie naleŜy do niezbędnych składników pokarmowych. ***** Jest wytwarzana przez mikroorganizmy jelitowe, dlatego trudno ustalić wielkość zapotrzebowa nia w pokarmach, " ......... Ekspozycja skóry na światło zmniejsza zapotrzebowanie na witaminę D.

śYWIENIE / 723

Węglowodany i tłuszcze są głównymi źródłami energetycznymi zawartymi w pokarmach Składnikami pokarmowymi dostarczającymi energię są głównie tłuszcze i węglowodany, zaś w mniejszym stopniu białka. Udział poszczególnych składników pokarmowych w bilansie energetycznym wykazuje znaczne wahania zaleŜne

Tabela 55-2. Ciepło spalania w bombie kalorymetrycznej oraz wartość energetyczna podstawowych składników pokarmowych uzyskana przez utlenianie w ustroju człowieka Wartość energetyczna w kcal/g (kJ/g) Ciepło Energia Standarspalania uzyskana dowe w bombie przez współkaloryme- utlenianie czyntrycznej w ustroju niki mno(H> człowieka Ŝenia * 5,4 (22,6) 4,1 (17,2)" 4 (17) 9,3 (38,9) 9,3 (38,9) 9(38)

Białka Tłuszcze Węglowo4,1 (17,2) dany 7,1 (29,7) Etanol

4,1 (17,2) 7,1 (29,7)

od rodzaju populacji badanej. SpoŜycie alkoholu moŜe stanowić znaczną część całodziennego poboru kalorycznego. Utrzymywanie się stałej masy ciała w warunkach nie zmieniającego się zapotrzebowarna energetycznego dowodzi, Ŝe wartość kaloryczna dostarczonych pokarmów jest wystarczająca dla bieŜących potrzeb. Wartości kaloryczne głównych składników pokarmowych podane są w tab. 55-2. Dwa fakty wynikające z tabeli są godne zanotowania: wysoka wartość kaioryczna tłuszczu (w przeliczeniu na 1 g) w porównaniu do wartości kalorycznej węglowodanów i białek oraz wysoka wartość kaloryczna alkoholu. Zalecane zapotrzebowanie energetyczne dla wybranych populacji ludzkich zestawiono w tabeli 55-3. Wiele czynników ma wpływ na wydatek energetyczny W warunkach wyrównanego bilansu energety-

4(17) 7 (29)

Zaadaptowane wg Davidson S. i wsp.: Human Nutrition and Dietetics, Wyd. 7, Churchill Livingstone, 1979. * Standardowe współczynniki mnoŜenia uzyskano przez zaokrąglenie wartości ciepła spalania w bombie kalorymetrycznej z uwzględnieniem wydajności absorpcji. '" Wartości dotyczą utleniania białek z uwzględnieniem poprawki związanej z utratą grup aminowych z moczem.

cznego pobór energetyczny jest równy jego wydatkowi. Wydatek energetyczny moŜe się znacznie róŜnić zaleŜnie od wielu czynników. MoŜna go określić umieszczając np. zwierzęta w izolowanej komorze i mierząc wydatek energetyczny związany z utratą ciepła i określając wartość energetyczną produktów wydalanych przez ustrój. Znacznie wygodniejsze jest dokonanie pomiaru ilości zuŜytkowanego tlenu, bowiem w większości warunków konsumpcja I ] tlenu odpowiada ok. 4;83 kcal (20 kJ). Indywidualny wydatek energetyczny poszczególnego człowieka determinują głównie cztery czynniki: 1. Podstawowa przemiana materii. Jest to

ilość energii wydatkowanej na podtrzymywanie

Tabela 55-3. Zalecane normy dla męŜczyzn i kobiet dotyczące poboru energii*

Wiek (lata)

MęŜczyźni Kobiety cięŜarne karmiące

Masa ciała (kg)

Zapotrzebowanie energetyczne

(funty)

23-50

70

154

23-50

55

120


( MJ )

średnie

wahania

2900 2200 +300 +500

2300-3100 1600-2400

12,1 9,2

* Dane wzięte z pracy Recommended DietaryAllowances, wyd. 10, Foodand Nutrition Board, National Research Councii-National Academy of Sciences, 1989.

724 / ROZDZIAŁ 55

podstawowych czynności fizjologicznych w warunkach standardowych (osoba nie powinna spać, powinna przebywać w ciepłym pomieszczeniu, zaś pomiary wydatku energetycznego naleŜy przeprowadzić 12 godzin po ostatnim posiłku). Podstawowa przemiana materii jest proporcjonalna do beztłuszczowej masy ciała oraz do powierzchni ciała. Jest ona większa u męŜczyzn niŜ u kobiet, u małych dzieci, u osób gorączkujących oraz u chorych z nadczynnością tarczycy. Jest natomiast obniŜona w niedoczynności tarczycy oraz w stanach głodzenia kalorycznego. Działanie termogeniczne pokarmów. Okre ślane jest równieŜ jako specyficzne dynamiczne działanie pokarmów. Stanowi ono 5-10% cał kowitego wydatku energetycznego. Jest to ilość energii wydatkowanej na trawienie oraz stymu lacje metabolizmu pod wpływem nowych substratów. Aktywność fizyczna. Jest to największa zmienna w wydatku energetycznym. MoŜe ona wzrosnąć dziesięciokrotnie przy maksymalnym wysiłku u atletów w porównaniu z wydatkiem energetycznym w spoczynku. Temperatura otoczenia. Przy niskiej tem peraturze otoczenia wydatek energetyczny wzrasta z powodu wzmoŜonej termogenezy spowodowanej drŜeniem z zimna, zaś u zwierząt w następstwie aktywacji termogenezy w brunat nej tkance tłuszczowej (p. str. 313). Przy tem peraturach otoczenia wyŜszych od temperatury krwi dodatkowa energia jest wydatkowana na chłodzenie. BIAŁKA SA ŹRÓDŁEM SWOISTYCH AMINOKWASÓW I AZOTU POTRZEBNEGO DO SYNTEZY PODSTAWOWYCH ZWIĄZKÓW AZOTOWYCH W warunkach prawidłowych białka pokrywają zapotrzebowanie na azot aminokwasowy oraz na same aminokwasy. Białka zawarte w pokarmach są trawione do aminokwasów, które dostają się do krwi. Ustrój człowieka potrzebuje 20 róŜnych aminokwasów do syntezy swoistych białek i innych, związków azotowych, takich jak zasady purynowe i pirymidynowe oraz hem.

Aminokwasy niezbędne (egzogenne) są aminokwasami jakich ustrój nie potrafi syntetyzować. Dlatego teŜ muszą być dostarczane z pokarmami Do aminokwasów niezbędnych dla człowieka naleŜą: histydyna, izoleucyna, leucyna, lizyna, metionina, fenyloalanina, treonina, tryptofan i walina (tab. 55-1). Dwa dalsze aminokwasy, cysteina i tyrozyna, mogą powstać z aminokwasów egzogennych, tj. metioniny (z niej powstaje cysteina) i fenyloalaniny (z której powstaje tyrozyna). Przy niedostatecznej ich podaŜy, obecność cysteiny i tyrozyny w pokarmach zmniejsza zapotrzebowanie na metioninę i fenyl o alaninę. Przy dostatecznej podaŜy aminokwasów egzogennych, pozostałe aminokwasy (endogenne), potrzebne do syntezy białek lub innych procesów metabolicznych, mogą powstać drogą transaminacji i innych procesów (p. str. 348). Utrzymanie wyrównanego bilansu białkowego wymaga ciągłego spoŜywania białka (p. równieŜ rozdz. 31) Zwierzę znajdujące się w stanie równowagi metabolicznej wymaga ciągłego pobierania białka celem pokrycia bieŜących strat w zakresie aminokwasów egzogennych i azotu aminowego spowodowanych obrotem metabolicznym. Człowiek traci związki azotowe z moczem, kałem, śliną, ze złuszczającym się naskórkiem, włosami i paznokciami. Zapotrzebowanie na białko i aminokwasy egzogenne u człowieka zestawiono w tab. 55-4. Jeśli zapotrzebowanie obliczyć na podstawie masy ciała, wówczas u niemowląt i dzieci naleŜy uwzględnić dodatkowe ilości białka na wzrost. Zapotrzebowanie na białko wzrasta u kobiet cięŜarnych lub karmiących piersią, u chorych w okresie Tegeneracji tkanek po doznanym urazie, u chorych w okresie rekonwalescencji oraz przy wykonywaniu zwiększonego wysiiku fizycznego. W większości przypadków spoŜycie pokarmów, których wartość kaloryczna w 12% pokrywana jest przez białka, naleŜy uwaŜać za adekwatne. Stopień wykorzystania białek determinuje wielkość zapotrzebowania na ten składnik pokarmowy Wielkość zapotrzebowania na białko determinowana jest 3 czynnikami, tj. jakością białka, wartością kaloryczną spoŜytych pokarmów oraz aktywnością fizyczną.

śYWIENIE / 725 Tabala 55-4. Szacunkowe zapotrzebowanie na białka i aminokwasy oraz spoŜycie u ludzi* SpoŜycie Zapotrzebowanie (mg/kg (g/etobę) masy ciała/dzien)

Białka pochodzenia zwierzęcego

Niemowlęta (46 miesięcy)

Dzieci (1216 lat)

1100

1000

Dorośli 800

Dorośli (70 kg) zalecana 56

SpoŜycie w USA przez dorosłych 101 71

pochodzenia roślinnego

30

Aminokwasy egzogenne

(3-4 miesiące)

Histydyna

28

?

10

0,7*3

?

Izoleucyna Leucyna

70

28

10

42

14

0,70 0,98

5,3

161

Uzyna Metionina (i cysteina)

103

44

12

22

13

0,84 0,91

6,7

58

Fenyloalanina (i tyrozyna)

125

22

14

0,98

4,7

Treonina

87

28

Tryptofan

17

3,3

Walina

93

25

8,2 2,1

7

0,49

4,1

3,5

0,25

1,2

10

0,70

5,7

* Dane wzięte z pracy Recommended Dietary ASIowances, wyd, 10, Food and Nutrion Board. National Research Council-National Academy of Sciences, 1989. ** Dane wzięte; pracy Munro H. N., Crim M.; Theproteinsandamino acid. W: Goodhart R. S.r Shils M. E.: Modern Nutrition in Health and Disease. Wyd. 6, Lea and Febiger, 1980.

Jakość białka. Jakość białka ocenia się porównując zawartość aminokwasów egzogennych w spoŜytych pokarmach z zawartością tych składników w pokarmach gwarantujących dobry stan odŜywiania. Im bardziej podobne są porównane wartości, tym wyŜsza jest jakość białka. Jajka i mleko zawierają białka o wysokiej jakości, które są w pełni wykorzystywane przez ustrój. Są białkami referencyjnymi w stosunku do białek innego pochodzenia przy ocenie wartości biologicznej tych ostatnich. Białka zawarte w mięsie są białkiem o wysokiej jakości. W odróŜnieniu od nich wiele białek zawartych w roślinach uŜywanych jako główne artykuły Ŝywnościowe wykazuje względny niedobór określonych aminokwasów egzogennych, np.

kukurydza jest uboga w tryptofan i lizynę, pszenica w lizynę, zaś niektóre rodzaje fasoli w metioninę. Przy spoŜywaniu pokarmów mieszanych niedobór określonego aminokwasu egzogennego w jednym rodzaju białka moŜe być wyrównywany obfitym występowaniem tego aminokwasu w drugim rodzaju białka. Takie białka określa się jako białka komplementarne (uzupełniające się), np. równoczesne spoŜywanie białka pszenicy i fasoli zapewnia zadowalającą jakość pobieranych aminokwasów. W takich sytuacjach łączna ilość spoŜywanych białek musi być większa by pokryć zapotrzebowanie na ten składnik pokarmowy. Aminokwasy, nie wykorzystane do syntezy nowych białek i niepotrzebne do innych bieŜących syntez, nie są

726 / ROZDZIAŁ 55

magazynowane, lecz są rozkładane, zaś azot wydalany jest z ustroju pod postacią mocznika lub innych związków.

Wartość kaloryczna pokarmów. Energia pochodząca z oksydacji tłuszczów i węglowodanów wpływa na zapotrzebowanie białkowe, poniewaŜ oszczędza białka jako źródła energii. Aby właściwie i w pełni wykorzystać drogocenne białka wysokiej jakości i maksymalnie zmniejszyć zapotrzebowanie na nie, trzeba podawać niebialkowe źródła energii. Wśród nich powinny się znajdować węglowodany, aby oszczędzić białka wykorzystywane w procesie glukoneogenezy.

Aktywność fizyczna. Aktywność fizyczna wzmaga retencję azotu pochodzącego z rozpadu białek zawartych w pokarmach. NiedoŜywienie białkowe i kaloryczne są przyczyną uwiądu (marazmu) i kwashiorkoru NiedoŜywienie białkowo-kaloryczne obejmuje wiele zaburzeń związanych z głodzeniem i nieprawidłowym odŜywianiem się. Charakteryzuje się ono nie tylko niedoborem białek, lecz i innych składników pokarmowych, takich jak witaminy i składniki mineralne. W cięŜkiej postaci występuje ono u dzieci w okresie wzrostu, najczęściej w gospodarczo zacofanych krajach Azji, Afryki i Ameryki Południowej, WyróŜnia się dwie ekstremalne postacie niedoŜywienia białkowo-kaloryczne go: marazm (uwiąd) i kwashiorknr (p. rozdz. 62). W marazmie stwierdza się ogólne wycieńczenie spowodowane niedoborem zarówno kalorycznym, jak i białkowym. Kwashiofkor charakteryzuje się obrzękiem i niedoborem zarówno ilościowym, jak i jakościowym białek, natomiast pobór ener-

gii moŜe być wystarczający. Często spotyka się postacie pośrednie. ZAPOTRZEBOWANIE NA GLUKOZĘ MOGĄ POKRYWAĆ RÓśN E POSTACI E WĘG LOWODANÓW Liczne tkanki potrzebują glukozy dla swoich przemian. Nie musi ona być dostarczana jako taka z pokarmami, poniewaŜ moŜe powstać z rozpadu innych węglowodanów pokarmowych, np. przez trawienie skrobi w przewodzie pokarmowym lub przez konwersję fruktozy lub galaktozy w wątrobie (p. str. 246). Glukoza powstaje równieŜ z gliccrolu (będącego produk-

tem rozpadu triglicerydów) oraz z aminokwasów glukogennych (w procesie glukoneogenezy). Choć zaleca się pobieranie 50—100 g węglowodanów na dobę, aby uniknąć ketozy i zaniku musy mięśniowej, zrównowaŜona dieta powinna zawierać więcej węglowodanów, by zmniejszyć ilość tłuszczów jako źródła energii. Główne artykuły Ŝywnościowe zawierające węglowodany opisano w rozdz, 15. WŁÓKNA SĄ NIEZBĘDNE DLA UTRZYMANIA DOBREGO ZDROWIA Przez włókna zawarte w pokarmach naleŜy rozumieć składniki błon komórkowych komórek roślinnych, które nie są rozkładane przez własne enzymy zwierząt. Do takich składników zalicza się celulozę, hemicelulozę, ligninę, gumy, pektyny i pentozany. U zwierząt trawoŜernych, takich jak przeŜuwacze, włókna (głównie celuloza) są głównym źródłem energii po ich rozłoŜeniu przez mikroorganizmy do octanu, propionianu i maślanu. Te ostatnie są wchłaniane i dostają się do krąŜenia wrotnego. Fermentacja zachodząca w jelicie grubym moŜe pokryć pewną część zapotrzebowania energetycznego równieŜ u człowieka (ok. 2—7% przy spoŜywaniu pokarmów o małej zawartości włókien). W tym procesie powstają równieŜ gazy, takie jak metan (CH4.), dwutlenek węgla (CO2) oraz wodór (H2), U człowieka duŜa zawartość włókien w pokarmach wywiera korzystny wpływ na konsystencję stolca. Włókna, zatrzymując wodę przy przechodzeniu treści pokarmowej przez jelita, zwiększają masę kałową i sprawiają, Ŝe ma ona luźniejszą konsystencję. Przy spoŜywaniu pokarmów o duŜej zawartości włókien stwierdza się mniej szą częstość występowania uchyłkowatości jelit, raka jelita grubego,, chorób serca, naczyń i cukrzycy. Włókna trudniej rozpuszczalne, takie jak celuloza i lignina, występujące w otrębach pszenicy, wykazują korzystny wpływ na czynność jelita grubego, natomiast bardziej rozpuszczalne włókna roślin strączkowych i owoców, tj. gumy i pektyny, zmniejszają stęŜenie cholesterolu we krwi, najpewniej dzięki wiązaniu kwasów Ŝółciowych i cholesterolu zawartego w pokarmach. Ponadto włókna rozpuszczalne zwalniają opróŜnianie się Ŝołądka, opóźniają występowania i zmniejszają nasilenie wzrostu glikemii poposiłkowej i, co za tym idzie,

śYWIENIE / 727

zmniejszają wydzielanie insuliny. To zjawisko jest korzystne dla chorych na cukrzycę oraz chorych przestrzegających określonej diety, pozwala ono bowiem uniknąć gwałtownego spadku glikemii, pobudzającego apetyt.

LIPIDY SĄ NIEZBĘDNE JAKO NOŚNIKI WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH ORAZ ŹRÓDŁO EGZOGENNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Choć lipidy często zapewniają znaczną część dobowego zapotrzebowania energetycznego, nie jest to ich istotna funkcja. Oprócz tego, Ŝe poprawiają one smak potraw oraz wywołują uczucie sytości, spełniają one dwie istotne funkcje w Ŝywieniu ssaków. Są nośnikiem dla witamin rozpuszczalnych w tłuszczach oraz dostarczają egzogennych, wielonienasyconyeh kwasów tłuszczowych, których ustrój nie potrafi syntetyzować. Trzy wielonienasycowe kwasy tłuszczowe uwaŜa się za niezbędne w diecie przynajmniej niektórych zwierząt. Są to kwas linolowy (OD 6, 18:2), kwas a-linolenowy {© 3, 18:3) i kwas arachidonowy (w 6, 20j4), Kwasy te występują w lipidach pokarmów pochodzenia roślinnego i zwierzęcego (p. tab. 16-2). Omówienie przemiany tych kwasów — p. równieŜ rozdz. 25. U człowieka kwas arachidonowy moŜe powstać z kwasu linolowego, dlatego teŜ przy duŜej podaŜy tego ostatniego z pokarmami, kwas arachidonowy nic jest niezbędnym składnikiem pokarmowym. Przedmiotem dyskusji jest, czy kwas a-linolenowy jest rzeczywiście kwasem niezbędnym (egzogennym) u człowieka (p. str. 276). Niedobór kwasu linolowego spotyka się rzadko. MoŜe on wystąpić u dzieci karmionych mlekiem odtłuszczonym oraz u chorych, u których stosuje się Ŝywienie doŜylne pozbawione tłuszczów. Podstawową funkcją niezbędnych (egzogennych) kwasów tłuszczowych jest to, Ŝe są prekursorami leukotrienów, prostaglandyn i tromboksanów (p. ryc. 25-6) działających jako „hormony miejscowe". Dieta, w której 1—2% całodobowego zapotrzebowania energetycznego jest pokrywane egzogennym kwasami tłuszczowymi, zapobiega wystąpieniu klinicznych objawów ich niedoboru.

Istnieje pewna zaleŜność miedzy konsumpcją tłuszczów a występowaniem niektórych chorób W licznych badaniach wykazano występowanie dodatniej korelacji między częstością występowania choroby wieńcowej serca a stęŜeniem cholesterolu w surowicy krwi oraz ilością spoŜywanych tłuszczów, w tym szczególnie nasyconych kwasów tłuszczowych (p. rozdz. 28). Ponadto stwierdzono związek między duŜym spoŜyciem tłuszczów a występowaniem raka piersi i jeiita grubego. Głównymi źródłami nasyconych kwasów tłuszczowych dla człowieka są mięso przeŜuwaczy, przetwory mleczne i utwardzona margaryna. Cholesterol występuje tylko w pokarmach pochodzenia zwierzęcego, w tym szczególnie w Ŝółtku jaa*.

WITAMINY SPEŁNIAJĄ RÓśNORODNE FUNKCJE BIOLOGICZNE Witaminy są organicznymi środkami odŜywczymi, niezbędnymi w niewielkich ilościach w róŜnorodnych procesach biochemicznych, Z reguły związki te nie są syntetyzowane przez człowieka, dlatego muszą być dostarczane z pokarmami. Zapotrzebowanie dzienne na poszczególne witaminy u człowieka wyraŜa się w miligramach, a nawet mikrogramach. Witaminy dzieli się na dwie duŜe grupy, tj. na witaminy rozpuszczanie w wodzie (szczegółowo scharakteryzowane w rozdz. 53) oraz witaminy rozpuszczalne w tłuszczach (opisane bardziej szczegółowo w rozdz. 54). Do witamin rozpuszczalnych w wodzie zalicza się kompleks witamin grupy B (tiamina, ryboflawina, niacyna, kwas pantotenowy, witamina B6, biotyna, witamina B12 i kwas foliowy) oraz kwas askorbinowy (witamina C). Witaminy rozpuszczalne w wodzie po wchłonięciu przez jelita dostają się do krąŜenia wrotnego. Nadmiar ich jest wydalany z moczem. Większość witamin tej grupy nie jest magazynowana w ustroju w większych ilościach, co sprawia, Ŝe muszą one być ciągle dostarczane z pokarmami. Wyjątkami od reguły są kwas askorbinowy (zapasy ustrojowe wystarczają na ok, 3 miesiące), kwas foliowy (pewne ilości tej witaminy są magazynowane w wątrobie) oraz witamina B12 (zapasy tej witaminy w wątrobie wystarczają na pokrycie zapotrzebowania na kilka lat). Nadmierna podaŜ witamin rozpuszczalnych w

728 / ROZDZIAŁ 55

trawione, następnie wchłaniane w jelitach oraz wbudowywane do chylomikronów. Te ostatnie, po dostaniu się do krwi drogami limfatycznymi, są częściowo rozkładane przez tkanki obwodowe. Powstałe remnanty cnylomikro nowe są wychwytywane przez wątrobę. Wątroba jest głównym magazynem witamin A, D i K zaś tkanka tłuszczowa głównym magazynem wita-

wodzie jest na ogól dobrze tolerowana. Wyjątkami od reguły są niacyna (podana pod postacią kwasu nikotynowego), kwas askorbinowy i pirydoksyna (witamina B6), których nadmiar moŜe być przyczyną objawów ubocznych. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach (wita-

mina A, D, E i K) zawarte są w tłuszczach pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Są one

Tabela 56-5. Zespoły chorobowe podatne na podawanie witamin. Przykłady swoistych defektów zaburzonego metabolizmu kofaktorów witaminowych ulegających korekcji przy podawaniu zwykle bardzo duŜych dawek witamin" Witamina

Choroba

Defekt biochemiczny

Biotyna Witamina B|:

Kwasica propionowa Acyduria metylomalonowa

Karboksylaza propionylo-CoA Tworzenie koenzymu kobamidowego Transport kwasu foliowego

Kwas foliowy

Upośledzenie wchłaniania folianu

Niacyna

Choroba Hartnupów

Pirydoksyna (witamina B6)

Drgawki noworodków Cystationinuria Homocystynuria

Tiamina

Hiperalaninemia Kwasica mlecza Dehydrogenaza pirogronianowa nowa reaktywna na podanie tiaminy

Transport tryptofanu Dekarboksylaza kwasu glutaminowego (?) Cystationinaza Syntaza cystationi nowa

"Według: Herman R. H., Stifel F. B., Greene H. L: Vitamin-deficient state and other related disease. W: Disorders of the Gastrointestinal Tract: Disorders of the Liver. Nutritionai Disorders. Grune and Stratton, 1976.

Tabela 55-6. Charakterystyka „istotnych" (niezbędnych) ma kro minerałów Funkcje Metabolizm* Choroba z nie- Choroba lub Nazwa doboru lub obobjawy wyjawy spowowołane naddowane niemiarem** doborem 1

Wapń

Źródła***

2

3

4

5

6

Składnik kości i zębów; regulacja czynności nerwów i mięśni

Wchłanianie wymaga obecności białka wiąŜącego wapń. Regulacja przemiany Ca przez paratłionrton, kalcytoninę, witaminę D itd.

U dzieci krzywica. U dorosłych — osteomalacja. MoŜe uczestniczyć w patogenezie osteoporozy

Objawy toksyczności spowodowane nadmiernym wchłanianiem Ca z przewodu pokarmowego spowodowane przedawkowaniem witaminy D, nadczynnością przytarczyc lub hiperkalcemią idiopatyczną

Produkty mleczne, fasola, jarzyny liściaste

śYWIENIE / 729 ad. tab. 55-6 1

Fosfor

■

2

3

Składnik kości. zębów, ATP, fosforylowanych metabolitów pośrednich, kwasów nukleinowych

Nieznana jest kontrola wchłaniania z przewodu pokarmowego (wit. D?). StęŜenia w surowicy są regulowane resorpcją zwrotną w kanalikach nerkowych Regulowany przez aldosteron

t Sód

Potas

Chlorki

Główny kation płynu pozakomórkowego. Uczestniczy w regulacji wolemii, równowagi kwas owo zasadowej, czynności nerwów i mięśni. Składnik Na+/K+—ATP-azy Główny kation płynu śród komórkowego. Udział w czynności nerwów. + + mięśni, Na /K — ATP-azy

Udział w przemianie wodnej i elektrolitowej. w powstawaniu kwasu solnego w soku Ŝołądkowym

Magnez

Składnik kości, kof aktor enzymów {kinaz, itd.)

4

U dzieci: krzywica. U dorosłych: osteomalacja

5

6

Niski iloraz Ca:P Pokarmy bojest przyczyną gate w fosfor. wtórnej nad- przyprawy czynnoścś przytarczyc i moŜe być przyczyną utraty masy kostnej

Przy normalnej diecie brak objawów. RóŜne objawy zaleŜne od przyczyny chorobowej lub czynnika wywołującego niedobór

Nadciśnienie tę- Sól kuchenna. tnicze (u osób sól dodana do wraŜliwych na pokarmów sód) *•*

TakŜe regulowa- Niedobór spony przez aldoste- wodowany choron robą podstawową lub stosowaniem leków moczopędnych. Objawy: osłabienie lub poraŜenie mięśni, splątanie Podawanie pokarmów bezsolnych niemowlętom, wymioty, podawanie leków moczopędnych, tubulopatie nerkowe Niedobór wtórny spowodowany wadliwym wchłanianiem, biegunkami, alkoholiz-

Zatrzymanie Jarzyny, owoczynności serca, ce, orzechy małe owrzodzenia jelit

Sól kuchenna

Zanik odruchów Liściaste, zielogłębokich, de- ne jarzyny (zapresja oddycha- wierające chlonia rofil)

mem

* Na ogól wchłanianie składników mineralnych wymaga białek transportowych. Wchłanianie rzadko jest całkowite. Wpływ mają tu inne składniki pokarmowe (np. szczawiany i fitany chelatują kationy dwuwartościowe). Transport i magazynowanie składników mineralnych takŜe wymagają swoistych białek. Wydalane są z kałem (nie wchłonięte składniki pokarmowe), moczem, potem lub Ŝółcią. ** Nadmierny pobór składników pokarmowych wywołuje objawy toksyczne. Jeśli nie są one specjalnie wymienione w tej rubryce, wówczas charakteryzują się nudnosctami, biegunkami i drazliwością. *** Zapotrzebowanie na składniki mineralne pokrywane jest przez spoŜywanie odpowiednich ilości produktów zboŜowych (ziarna zbóŜ, niepolerowane), warzyw strączkowych, zielonych i liściastych jarzyn, mięsa oraz produktów mlecznych.

730 / ROZDZIAŁ 55

miny E. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach nie są wydalane z moczem. Przy nadmiernej ich podaŜy mogą wystąpić objawy zatrucia (szczególnie po nadmiernej podaŜy witaminy A i D). W tabeli 55-5 zestawiono choroby spowodowane upośledzonym metabolizmem kofaktorów witaminowych, podatne na leczenie swoistymi witaminami. Zmniejszona dostępność witamin, spowodowana niedoborami pokarmowymi lub innymi czynnikami, np. zaburzeniami wchłaniania jelitowego, jest przyczyną swoistych zespołów niedoborowych (p. teŜ rozdz. 53 i 54).

Składniki mineralne są niezbędne zarówno w czynnościach fizjologicznych, jak i w procesach bioch em iczn ych Składniki mineralne moŜna arbitralnie podzielić na: I) makrom morały (niezbędne w ilościach większych niŜ 100 mg/d i 2) mikromineraty (pierwiastki śladowe), na które zapotrzebowanie dobowe jest mniejsze niŜ 100 mg. W tabeli 55-6 zestawiono właściwości makrominerałów, zaś w tab. 56-7 — właściwości elementów śladowych.

Tabala 55-7. Charakterystyka „istotnych" (niezbędnych) mikrominerałów (elementów śladowych) Nazwa

Funkcje

Metabolizm*

1

2

3

Chrom

Kobalt

Miedź Jod śelazo Mangan

Chrom trójwartościowy, składnik „czynnika tolerancji glukozy" Potrzebny tylko jako składnik witaminy B12 Składnik oksydaz, oksydazy cytochromu c, itd. Składnik "tyroksyny i trijodotyroniny Składnik enzymów hemowych, hemoglobiny, cytochromów itd. Kofaktor hydrolaz, dekarboksylaz i transferaz. Potrzebny w syntezie glikoprotein i proteoglikanów

Jak witaminy B1S Transportowana przez albuminy, związana przez cerulopiazminę Magazynowany w tarczycy jako tyreoglobulina Transportowane przez transfaryny, magazynowanie — jako ferrytyna lub hemosyderyna. Utrata Ŝelaza jest spowodowana krwawieniami i złuszczaniem się nabłonków

Choroba z niedo- Choroba lub obboru lub objawy jawy wywołane spowodowane nadmiarem" niedoborem 4 Objawy nietolerancji glukozy. Niedobór spowodowany Ŝywieniem pozajelitowym Objawy niedoboru witaminy B12 Niedokrwistość niedobarwliwa, mikrocytam a. Niedobór wywołany wadliwym Ŝywieniem. Zespół Menkesa U dzieci: matołectwo. U dorosłych: wole i niedoczynność tarczycy, obrzęk śluzowaty Niedokrwistość syderopeniczna, mikrocytarna Nieznaneuczłowieka

5 Rzadko spotykane Choroba Wilsona Nadczynność tarczycy, wole Syderoza, wrodzona hemochfomatoza Inhalacja par manganu wywołuje objawy psychozy i parki nson i zm

Źródła"

6 Pokarmy pochodzenia zwierzęcego Sól jodowana, ryby i skorupiaki morskie śelazne naczynie do gotowania mięsa

śYWIENIE / 731

cd. tab. 55-7

Molibden

Składnik oksydaz (np. oksydazy ksantynowej)

Selen

Składnik peroksyda- Działa synergistycz- Niewielki niedobór zy glutationowej niez witaminą Eja- powstaje przy Ŝywieniu potrawami ko antyoksydant wyrosłymi na gle• bach ubogich w selen. Niedobór jest najczęściej spowodowany Ŝywieniem pozajelitowym i wadliwym Ŝywieniem białkowo-kalorycznym

Podawany w megadawkach wywołuje wypada nie włosów, stany zapalne skóry, drazliwość

Cynk

Kofaktor licznych enzymów (dehydrogenazy mleczanowej, fosfatazy zasadowej, anhydrazy węglanowej)

Hipogonadyzm, zaburzenia wzrostu, upośledzone gojenie się ran, zaburzenia czucia smaku i węchu Niedobór wywołany Ŝywieniem pozajelitowym lub przez acrodermałitis enteropathica

PodraŜnienie przewodu Ŝołądkowojelitowego, wymioty

Fluor*

Zwiększa twardość kości i zębów

Próchnica zębów, Fluoroza zębów osteopcroza?

Objawy niedoboru mogą być spowodowane Ŝywieniem pozajelitowym

Woda pitna

" Nadmierny pobór mikroelementów wywołuje objawy toksyczne. Jeśli nie są one specjalnie wymieniane w tej rubryce, wówczas charakteryzują się nudnościami, biegunkami i draŜliwością " Zapotrzebowanie na mikroelementy pokrywane jest przez spoŜywanie odpowiedniej ilości produktów zboŜowych (ziarna zbóŜ niepolerowane), warzyw strączkowych, zielonych i liściastych jarzyn, mięsa i produktów mlecznych. "* Fluor jest niezbędny dla wzrostu u szczurów. Pomimo, ze nie udowodniono jednoznacznie, ze jest niezbędny równieŜ dla człowieka, pierwiastek ten odgrywa określoną rolę w zapobieganiu próchnicy zębów.

ZALECANE NORMY śYWIENIOWE Komisja śywienia i śywności Narodowej Rady do Spraw Badań Naukowych (Food and Nutritional Board of the Natiooal Research Council) opublikowała listę dobowego zapotrzebowania na niezbędne składniki pokarmowe jako Zalecane Normy śywieniowe (Recom-

mended Dietary Allowances) {tab. 55-8). Normy te dotyczą większości osób określonej populacji Ŝyjących w zwykłych warunkach środowiskowych. Nie dotyczą one zapotrzebowania dla osób wymagających uzupełniającego lub specjalnego Ŝywienia z powodu choroby. Dieta

powinna zawierać róŜnorodne potrawy, zapew-

niające pokrycie zapotrzebowania na dobrze znane i mniej dokładnie zdefiniowane składniki pokarmowe. W tabeli 55-8 podane jest dobowe zapotrzebowanie na białka, 10 witamin i 6 składników mineralnych. Mało jest jeszcze danych, by dokładnie sprecyzować zapotrzebowanie na pozostałe witaminy i składniki mineralne. Pomimo tego w tab. 55-9 podano zapotrzebowanie na te składniki, które wydaje się być zarówno bezpieczne, jak i wystarczające. Aby uniknąć stanów niedoborowych, trzeba pokryć zapotrzebowanie na wszystkie niezbędne składniki pokarmowe. Przyczynami niespeł-

732 / ROZDZIAŁ 55 Tabela 55-8. Zalecane normy Ŝywnościowe (poprawki z r). Zabezpieczają one utrzymame dobrego 198S Witaminy rozpuszczalne w Waga Wzrost Białka (0) Wiek tłuszczach

(lata) kg

0,0-0,5 0,5-1.0 1-3 46 7-10

Dzieci

11-14 15-18 19-24 25-50 51 + 11-14 15-18 19-24 25-50 51 +

MęŜczyźni

Kobiety

69 13 20 28 45 66 72 79 77 46 56 58 63 65

ft

cm

cale

13 20

BO 71

24

29 44 62 99 14S 160 174 170 101 120 128 138 143

90 112 132

35 44 52

157 176

52 69 70 70 68

28

177 176 173 157 163 164 163 160

Wlt. Wit. D Wit. E A lwV (mg a TE)— WRE) ' 375 7,5 10 3 375 4 6 400 10 10 77 500 10 700 1000 10 10 10 1000 10 10 1000 10 10 1000 10 55

B2 64 65 64 63

13 ;A 16 24 28 45 59 56 63 63 46 44 46 50 50

Wit. K

da! 5 10 15 20 30

Wrt.C (mg)

Tiamina (mg)

30 3&

0,3 0.4

40 45 45 50 60 60 60 60

0,7 0,9 1,0

45 65 70 80 80

IOOO

800 800 800 800 800

10 10 10 55

B8 88 8

45 56 60 65 65

60 60 60 60 60

1.3 1,5 1,5 1.5 1,2 1,1 1,1 1,1 1,11.0

Kobiety cięŜarne

60

800

10

10

65

70

1.5

Kobiety karmiące piersią

65

1300

10

12

65

35

1,6

* RównowaŜnik retinolu 1 równowaŜnik retrnolu - 1 v& retinolu lub 6 fig p-karotenu •' Jako chnlekalcyferol. 10 lig cholekalcyferolu = 400 IU witaminy D ** RównowaŜnik ot-tokoferolu. 1 mg atokoferolu = 1 TE ■• 1 NE (równowaŜnik niacyny) jest równy 1 mg niacyny lub 60 mg tryptofanu zawartego w pokarmach

niania tego warunku są najczęściej ignorancja lub złe warunki ekonomiczne. Z drugiej strony występują pewne choroby społeczne spowodowane nadmiernym spoŜywaniem niektórych składników pokarmowych. I tak otyłość jest najczęściej spowodowana nadmiernym poborem pokarmów energetycznych. Sprzyja ona powsta-

ja powstawaniu miaŜdŜycy i choroby wieńcowej

waniu cukrzycy insulinoniezaleŜnej. Nadmierne spoŜywanie tłuszczów, a szczególnie tłuszczów zawierających nasycone kwasy tłuszczowe, sprzy-

Wiele organizacji na całym świecie zajmowało się badaniem składu róŜnorodnych diet i wydawało zalecenia mające na celu poprawę od-

serca. RównieŜ częstość występowania raka piersi, jelita grubego i gruczołu krokowego wykazuje dodatnią korelację z ilością spoŜywanych tłuszczów. Nadmierne spoŜywanie soli zwiększa częstość występowania wylewów krwi do mózgu i nadciśnienia tętniczego.

Tabela 55-9. Dobowe zapotrzebowanie na wybrane witaminy i składniki mineralne. Podane ilości są zarówno wystarczające, jak i bezpieczne. wnam Wiek (lata)

Bio-

ny

Pierwiastki śladowe

pannowy

Mied*

Mangan

Fluorki

(n»9)

(me)

(mg)

Chrom (mg)

Elektrolity Molibden

ę.

d-9)

Sód (mg) 115-350 250 750

Potas

Chlorki

(mg)

(mg)

(mg) Nitimowlęta

0-0,5 0.5 1

10 15

2 3

0,4-0,6 0.6-0.7

0,3-0,6 0,6-1,0

0.1-0,5 0,2-1,0

0,01-0,04 0,02-0,06

15-30 20-40

Dzieci

1-3 4-6

20 25 30

3 3-4 4-6 47

0,7-1.0 1,0-1,5 1,0-2.0 1,5-2,5

1,0-1,5 1,5-2,0 2,0-3.0 2,0-5,0

0,5-1.5 1,0-2,5 1,5 2.5 1,5-2,5

0,02-0,08 0,03-0,12 0,05 0.2 0,05-0,2

25-EO 30-75 60-150 75-250

350-925 276-700 425-1275 400 1200

326 »7S 550-1650 S00 1500 450-1350 775-2325 700-2100 młodzieŜ 7-10 500 1800 1000-3000 925-2775 > 11 30-100 900-2700 1525-4575 14004-7 Dorośli 30-100 1,5-3,0 2,0-5,0 1,5-4,0 0,05-0,2 75-250 1100-3300 1875-6625 4200 17005100 Tir,-3 i 55-9 wzięto z: Recommended DietaryAllowances Wyd.iO.Foodand Nutrition Board, National Research Council-Natianal Academy of Science, 1989

śYWIENIE / 733 stanu odŜywienia dla większości zdrowych mieszkańców Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Składniki mineralne

Witaminy rozpuszczalna w wodzie RybOf lawina (mg)

Niaeyna (mg NE)*"*

Wił. B, (mg)

F o lian Wit.B 1t 9)

Wapń (mg)

Fosfor (mg)

Magnez (mg)

śelazo (m6)

Cynk (mg)

Jod (|.g>

Selen Cug)

0.4 0,5

5 6

0,3 0,6

25 35

0,3 0,5

400 600

300 500

40 60

6 10

5 B

40 50

10 15

0.8 1,1 1,2

S 12 13

1,0 1,1 1,4

50 75

0.7 1,0 1.4

800

• oo

80 120 170

10 10 10

10 10 10

70 90 120

800

800 800 800

20 20 30

1.5 1,8 1.7 1,7 1,4

17 20 19 19 1B

1,7/' 2,0 2,0 2,0 2,0

150 200 200 200 200

2,0 2.0 2,0 2.0 2,0

1200 1200 1200 800 800

1200 1200 1200 800 800

270 400 350 350 350

12 12 10 10 10

15 15 15 15 15

150 150 150 150 150

40 50 70 70 70

1,3 1,3 1,3 1,3 1.2

1B 16 15 15 13

1,4 1,5 1,6 1,6 1,5

150 iao 180 180 180

2,0 2.0 2,0 2,0 2,0

1200 1200 1200 800 800

1200 1200 1200 800 800

280 300 280 280 280

15 15 15 15 10 '

12 12 12 12

(i 12

150 150 150 150 150

45 50 56 55 55

1.6

17

2,2

400

2,2

1200

1200

320

30

16

175

65

i.B

20

2,1

280

2,6

1200

1200

3B6

15

19

200

75

aoo

Ŝywiania się człowieka. Zalecenia te moŜna podsumować w sposób następujący: 1. Przy występowaniu nadwagi naleŜy zmniejszać wartość kaloryczną diety, aby osiąg nąć prawidłową masę ciała. NaleŜy stopniowo zmniejszać ilość spoŜywa nych tłuszczów zastępując je węglowodanami. Większość węglowodanów naleŜy spoŜy wać pod postacią wielocukrów, a nie cukrów prostych. Większość spoŜywanych tłuszczów po winny stanowić kwasy tłuszczowe wielo- i jednonienasycone, natomiast mniejszą część nasy cone kwasy tłuszczowe. NaleŜy zmniejszyć spoŜycie cholesterolu i soli. 6, NaleŜy zwiększać zawartość włókien w diecie.

PIŚMIENNICTWO Cummings JH: Dietary Fibrę. Brit Med Bul! 1981;37:65. Forbes JM: Metabolic aspects of the regulation of voluntary food intake and appetite. Nutr Res Rev 1988;1:145. Kritchevsky D: Dietary Fiber. Annu Rev Nutr 1988;8:3O1. Nestle M: Nutrition in Clinical Practice. Jones Medical Publications, 1985. Nielsen FH: Nutritional significance of uitratrace elements. Nutr Rev !988;46:337. Olson RE et al (editors): Present Knowłedge in Nutrition. 5th ed. The Nutrition Foundation Inc, Washington, DC, 1984. Passmore R, Eastwood MA: Human Nutrition and Dietetics, 8th ed. Churchill Livingstone, 1986, Woo R, Daniets-liush R, Horton, ES: Regulation of energy balance. Annu Rev Nutr 1985;5:411.

56

Trawienie i wchłanianie Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Większość spoŜywanych potraw nie moŜe być wchłaniana z przewodu pokarmowego bez uprzedniego trawienia do mniejszych cząsteczek. Proces dezintegracji naturalnych środków spoŜywczych do postaci wchłanialnych w przewodzie pokarmowym nazywa się trawieniem. Zmiany chemiczne związane z trawieniem zachodzą w wyniku działania enzymów hydroHtycznych zawartych w sokach trawiennych przewodu pokarmowego, katalizujących hydrolizę białek do aminokwasów, skrobi do monosacharydów i triacylogliceroli do monoacylogliceroli, glicerolu i kwasów tłuszczowych. W przebiegu tych procesów trawiennych składniki mineralne i witaminy zawarte w środkach spoŜywczych stają się bardziej przyswajalne. Dokładne omówienie struktury i funkcji hormonów Ŝołądkowo-jelitowych przedstawiono w rozdz. 52. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Zaburzenia wprocesach trawiennych są przyczyną niektórych stanów chorobowych takich jak owrzodzenie Ŝołądka spowodowane kwasem solnym soku Ŝołądkowego albo brak HC] będący przyczyną achlorhydrii. Nieprawidłowe wydzielanie Ŝółci jest przyczyną powstawania kamieni Ŝółciowych i moŜe spowodować zaburzenia w trawieniu tłuszczów. Wadliwe wchłanianie składników pokarmowych, spowodowane bardzo licznymi defektami, często jest przyczyną niedoborów pokarmowych. I tak np. upośledzone wchłanianie witaminy B12 i folianów jest przyczyną niedokrwistości, wapnia i magnezu — tęŜyczki, witaminy D — krzywicy

u dzieci i osteomaiacji u dorosłych. W zespole wadliwego wchłaniania występują ww. i inne jeszcze zaburzenia. Niedobór laktazy jest przyczyną nietolerancji mleka, zaś zaburzenia wchłaniania aminokwasów obojętnych — choroby Hartnupów. PROCES TRAWIENIA ROZPOCZYNA SIĘ W JAMIE USTNEJ Ślina wydzielana przez ślinianki składa się w 99,5% z wody. Sprawia ona, Ŝe pokarmy stają się lepkie i śliskie, co jest waŜne w procesie Ŝucia i połykania. Dodanie wody do suchych pokarmów umoŜliwia rozpuszczanie niektórych składników pokarmowych i rozpoczęcie trawienia przez hydrolazy. Przez Ŝucie pokarmy ulegają rozdrobnieniu, dzięki czemu wzrasta ich rozpuszczalność i powierzchnia oraz podatność na działanie enzymów. Ślina jest równieŜ płynem, z którym są wydalane niektóre Jęki (np. etanol i morfina), nieorganiczne jony, takie jak K+, Ca2+, HCOj i rodanki (SCN") oraz jod i immunoglobułiny (IgA). pH śliny wynosi najczęściej 6,8, chociaŜ moŜe być wyŜsze i niŜsze od pH obojętnego. Ślina zawiera amylazę i lipazę Amylaza zawarta w ślinie wykazuje zdolność rozkładania skrobi i gŚkogenu do maltozy. Proces ten nie ma jednak większego znaczenia dla ustroju, poniewaŜ pokarmy przebywają w jamie ustnej krótko, a amylaza śliny ulega inaktywacjj przy pH 4,0 lub niŜszym, co oznacza, Ŝe jest nieczynna w kwaśnej treści Ŝołądkowej. U licznych zwierząt amylaza w ogóle nie występuje w ślinie. Gruczoły Ebnera, połoŜone na grzbiecie języka, wytwarzają lipazę ,Językową".

TRAWIENIE I WCHŁANIANIE / 735

TRAWIENIE BIAŁEK ROZPOCZYNA SIĘ W śOŁĄDKU Błona śluzowa Ŝołądka wydziela sok Ŝołądkowy. Jest on płynem przejrzystym o zabarwieniu lekko Ŝółtawym i pH ok. 1,0, zawierającym 0,2—0,5% HC1. Zawartość wody w soku Ŝołądkowym wynosi 97—99%. Pozostałe składniki to: mucyna, sole nieorganiczne, enzymy trawienne (pepsyna yrennina) i lipaza. Kwas solny denaturuje białka i zabija bakterie Źródłem kwasu solnego są komórki okładzinowe błony śluzowej Ŝołądka. Jest on wynikiem reakcji przedstawionych na ryc. 56-1. Proces ten jest podobny do transportu chlorkowego opisanego dla krwinek czerwonych. Istnieje równieŜ pewne podobieństwo do mechanizmu wydzielania HT przez komórki kanalików nerkowych, w którym źródłem jonów H+ jest kwas węglowy (H2CO?) powstały z CO2 i H2O w wyniku działania anhydrazy węglanowej. Wydalanie zasadowego moczu po spoŜyciu pokarmów jest wynikiem powstawania wodorowęglanu w procesie wydzielania kwasu solnego. Wydzielanie H+ do światła Ŝołądka jest aktywnym procesem, w którym uczestniczy błonowa H+/K+-ATP-aza. Enzym ten, w odróŜnieniu od Na+/K.+-ATP-azy jest niewraŜliwy na ouabainę. Komórki okładzinowe Ŝołądka zawierają liczne mitochondria potrzebne do produkcji ATP napędza-

Osocze

jącego H+/K+-ATC-azę. Jon HCO^ przenika do osocza, zaś miejsce jego zajmuje Cl . Wydzielanie tego ostatniego do światła Ŝołądka jest sprzęŜone z wydzielaniem H+. W następstwie kontaktu z kwasem solnym, białka ulegają denaturacji, tj. dochodzi do utraty struktury trzeciorzędowej w wyniku rozerwania wiązań wodorowych. W wyniku tego procesu łańcuchy polipeptydowe ulegają „wyprostowaniu" stając się bardziej dostępne na działanie enzymów proteolitycznych (proteaz). Niskie pH treści Ŝołądkowej wywiera ponadto działanie bakteriobójcze na mikroorganizmy zawarte w treści Ŝołądkowej. Pepsyna rozpoczyna trawienie białek Trawienie białek jesti^łówną funkcją Ŝołądka. Pepsyna wytwarzana jest przez komórki główne pod postacią nieczynnego zymogenu-pepsynogemi. Ten ostatni ulega aktywacji pod wpływem jonów wodorowych. W procesie tym zostaje odszczepiony protekcyjnie działający polipeptyd odsłaniając aktywną pepsynę. Z kolei aktywna pepsyna szybko aktywuje dalsze cząsteczki pepsynogenu (proces ten określa się jako autokatalizę). Pepsyna rozkłada zdenaturowane białko do proteoz, a następnie do peptonów. które są duŜymi polipeptydami. Pepsyna jest endopeptydazą rozkładającą wiązanie peptydowe znajdujące się w obrębie głównej struktury polipeptyd owej, a nie wiązania peptydu przylegającego do C- lub N-końców. Te

J

Komórki okładzinowe

światło Ŝołądka

cr

y

+

Ryc. 56-1. Wytwarzanie kwasu solnego w Ŝołądku. ©, H . K -ATP-a;a.

736 / ROZDZIAŁ 56

ostatnie wiązania są atakowane przez egzopeptydazy. Pepsyna hydrolizuje wiązania peptydowe utworzone przez aminokwasy aromatyczne (np. przez tyrozynę) lub dikarboksylowe (np. przez glutaminian). Ren ni na (chymozyna) wywołuje koagulację mleka Enzym ten jest waŜny dia procesów trwawiennych u niemowląt, zapobiega on bowiem szybkiemu przedostawaniu się mleka z Ŝołądka do jelit. W obecności wapnia rennina przekształca w sposób nieodwracalny kazeinę do parakazeiny, na którą działa z kolei pepsyna. Rennina nie występuje w Ŝołądku osób dorosłych. Stosuje się ją w produkcji sera. Lipazy kontynuują trawienie triacylogliceroli Temperatura panująca w Ŝołądku jest istotna dla procesu przekształcania tłuszczów stałych, zawartych w pokarmach do postaci płynnej. Temu procesowi towarzyszy powstawanie emulsji tłuszczowych. Proces ten wspomagają ruchy perystaltyczne Ŝołądka. Sok Ŝołądkowy zawiera lipazę „Ŝołądkowa"' katalizującą hydrolizę triacylogliceroli złoŜonych z kwasów tłuszczowych o krótkich lub dłuŜszych łańcuchach. Ponadto lipaza ślinowa moŜe kontynuować swoje działanie w Ŝołądku pomimo niskiegio pH treści Ŝołądkowej dzięki obecności emulsji tłuszczowych. PoniewaŜ czas przebywania pokarmów w Ŝołądku wynosi 2—4 h, moŜe tu zostać strawione aŜ 30% spoŜytych triacylogliceroli. Lipaza ślinowa działa silniej na triacyloglicerole zawierające kwasy tłuszczowe o krótszych łańcuchach i jest bardziej swoista dla wiązania estrów w pozycji m-3 niŜ I. Tłuszcze występujące w mleku zawierają kwasy tłuszczowe o krótkich lub średnio długich łańcuchach, estryfikowane przewaŜnie w pozycji sn-3. Dlatego teŜ wydaje się, Ŝe tłuszcze zawarte w mleku są szczególnie dobrym substratem dla lipazy ślinowej. Uwolnione pod jej wpływem krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe przedostają się poprzez ścianę Ŝołądka do Ŝyły wrotnej, podczas gdy długołańcuchowe kwasy tłuszczowe rozpuszczają się w kroplach tłuszczowych zawieszonych w treści Ŝołądkowej i transportowane są do dwunastnicy.

PROCES TRAWIENIA JEST KONTYNUOWANY W JELITACH Zawartość Ŝołądka, czyli miazga pokarmowa, przedostaje się małymi porcjami w sposób nieciągły poprzez „zastawkę" odźwiernikową do światła dwunastnicy. Sekrecja zasadowego soku trzustkowego i zasadowej Ŝółci jest przyczyną neutralizacji miazgi Ŝołądkowej i przesunięcia jej pH w kierunku zasadowym. To przesunięcie pH w kierunku zasadowym jest niezbędne dla aktywności enzymów soku trzustkowego i jelitowego. Równocześnie przy takim pH dochodzi do zahamowania aktywności pepsyny. śółć tworzy zawiesinę, zobojętnia miazgę Ŝołądkową i jest wydzieliną, za pośrednictwem której zostają wydalone cholesterol i barwniki Ŝółciowe Oprócz wielu innych funkcji w pośredniej przemianie materii wątroba jest miejscem produkcji Ŝółci odgrywającej waŜną rolę w procesie trawienia pokarmów. Pęcherzyk Ŝółciowy magazynuje Ŝółć wytwarzaną w okresach między posiłkami. W czasie trawienia pokarmów pęcherzyk Ŝółciowy obkurcza się szybko dostarczając Ŝółć przez przewód Ŝółciowy wspólny, do światła dwunastnicy. Sok trzustkowy zostaje wymieszany z Ŝółcią tuŜ przed jego dostaniem się do dwunastnicy. A. Skład Ŝółci. Skład Ŝółci zawartej w prze wodach Ŝółciowych śródwątrobowych róŜni się od składu Ŝółci w pęcherzyku Ŝółciowym. Jak widać w tab. 56-1 ta ostatnia jest bardziej zagęszczona. B. Właściwości Ŝółci

1. Tworzenie zawiesin. Sole kwasów Ŝółciowych wykazują zdolność zmniejszania napięcia powierzchniowego. Dzięki tej właściwości kwasów Ŝółciowych tłuszcze ulegają zawieszeniu (tworzą emulsję)^' zaś kwasy tłuszczowe i nierozpuszczalne w wodzie mydła — rozpuszczeniu. Obecność Ŝółci w świetle jelit w istotnym stopniu wspomaga zarówno trawienie, jak i wchłanianie tłuszczów oraz witamin rozpuszczalnych w tłuszczach (witaminy A, D, E i K). W razie upośledzenia trawienia tłuszczów równieŜ trawienie innych składników pokarmowych zostaje upośledzone; tłuszcze bowiem, tworząc warstwę na spoŜytych pokarmach, uniemoŜliwiają trawienie ich przez enzymy. W tych warunkach drobnoustroje jelito we, ata-

TRAWIENIE I WCHŁANIANIE / 737 Tabela 56-1 Skład Ŝółci wątrobowej i pęcherzykowej śółć wątrobowa natywna procentowa procentowa zawarzawartość tość w stow całej sunku do Ŝółci wszystkich składników

śółć pęcherzykowa procentowa zawartość w ca-lej Ŝółci

stałych Woda

97,00

85,92

2,52

— —

Kwasy Ŝółciowe

1,93

36,9

9,14

Mu cyna i barwiki Ŝółciowe

0,53

21,3

2,98

Cholesterol

0,06

2,4

0,26

Kwasy tłuszczowe estryfikowane i nieestryfikowane

0,14

5,6

0,32

Sole nieorganiczne

0,84

33,3

0,65

1,01

_

1,04

—

6,9-7,7

Składniki stałe

Gęstość

PH

7,1-7,3

14,08

kując nie strawione pokarmy, są przyczyną wystąpienia procesów gnilnych i tworzenia się gazów. Zobojętnienie treści Ŝołądkowej. Oprócz zdolności tworzenia zawiesin, Ŝółć wy kazując pH nieco wyŜsze niŜ 7,0, neutralizuje kwaśną miazgę Ŝołądkową, przygotowując ją do trawienia w jelicie. Wydalanie cholesterolu. śółć jest waŜną wydzieliną, z którą wydaiane są nie tylko cholesterol i kwasy Ŝółciowe, lecz takŜe liczne leki, toksyny, barwniki Ŝółciowe oraz róŜnorod ne substancje nieorganiczne, takie jak miedz, cynk i rtęć. Ograniczona rozpuszczalność cho lesterolu w Ŝółci jest przyczyną tworze nia się kamieni Ŝółciowych. Wolny chole sterol jest praktycznie nierozpuszczalny w wo dzie; dlatego teŜ w Ŝółci występuje w micelach złoŜonych z fosfatydylocholiny i soli kwasów Ŝółciowych (p. str. 187). W rzeczywistości rów nieŜ fosfatydylocholina (główny fosfolipid Ŝó łci) jest nierozpuszczalna w Ŝółci, ulega ona jednak rozpuszczeniu dzięki soi om kwasów 47

Ŝółciowych tworząc z nimi micele. Tak więc duŜe ilości cholesterolu zawarte w Ŝółci człowieka ulegają solubilizacji dzięki rozpuszczalnym w wodzie micelom i transportowi przez drogi Ŝółciowe do światła jelit. Aktualna rozpuszczalność cholesterolu w Ŝółci zaleŜy jednak od stosunku stęŜenia soli kwasów Ŝółciowych do stęŜenia fosfatydylocholiny i do stęŜenia cholesterolu. Rozpuszczalność ta zaleŜy równieŜ od zawartości wody w Ŝółci. Ten fakt jest szczególnie waŜny dla rozcieńczonej Ŝółci wątrobowej. UŜywając układu trójkątnych współrzędnych (ryc. 56-2) Redinger i Smali byli w stanie określić maksymalną rozpuszczalność cholesterolu w Ŝółci pęcherzykowej. W podanym układzie kaŜdy punkt (determinowany trzema zmiennymi) znajdujący^ię ponad krzywą ABC dotyczy Ŝółci przesyconej cholesterolem lub w której dochodzi do wytrącenia tego lipidu. Przyjmuje się, Ŝe uchorych z kamicą Ŝółciową w pewnym okresie ich Ŝycia wytwarzana jest Ŝółć przesycona cholesterolem. W pewnym momencie, pod wpływem sprzyjających czynników, stanowiących jakby jądro krystalizacyjne (np. infekcja bakteryjna) dochodzi do wytrącenia kryształków cholesterolu. Jeśli tak powstałe kryształki nie zostają szybko wydzielone z Ŝółcią do światła jelita, mogą. one rosnąć, tworząc kamienie Ŝółciowe. Kiedy oznaczono aktywność głównych enzymów syntetyzujących kwasy Ŝółciowe w wątrobie u chorych z kamicą Ŝółciową, stwierdzono małą ich aktywność, natomiast zwiększone wytwarzanie cholesterolu przez hepatocyty z następczym wzrostem stęŜenia tego lipidu w wątrobie. Wydaje się, Ŝe spadek aktywności 7a-hydroksylazy jest przyczyną zmniejszenia się pufi kwasów Ŝółciowych w krąŜeniu jejitowo-wątrobowym, będącego dla wątroby sygnałem zapoczątkowującym wzrost syntezy cholesterolu. Skutkiem wzmoŜonej syntezy cholesterolu przez hepatocyty jest przesycenie Ŝółci tym steroidem, który nie jest w stanie rozpuścić się całkowicie w micelach złoŜonych z fosfatydylocholiny i soli kwasów Ŝółciowych. Podane informacje dotyczące rozpuszczalności cholesterolu wykorzystano w próbach klinicznych mających na celu zapobieganie powstawaniu nowych kamieni Ŝółciowych lub rozpuszczanie juŜ wytworzonych. Kwas chenodeoksycholowy wydaje się być lekiem przydatnym w leczeniu zachowawczym bezobjawowych i bezcieniowych kamieni Ŝółciowych zlokalizowanych w pęcherzyku Ŝółciowym. Ten kwas

738 / ROZDZiAŁ 56 60

40 -Procent soli kwasów śółciowych

Ryc. 56-2. Metoda głównych składników Ŝółciowych, foscholesterol) w układzie trójkątnych KaŜdy w procentach łącznej

prezentacji trzech Ŝółci {sole kwasów fatydylocholina i współrzędnych składnik wyraŜony jest Ilości soli kwasów Dwie lub więcej faz (kryształki cholesterolu płyn mioelamy)

Ŝółciowych, fosfatydylocholiny i cholesterolu wyraŜonej w molach. Linia ABC przedstawia maksymalną rozpuszczalność cholesterolu w roztworach o zmiennej zawartości soli kwasów Ŝółciowych i fosfatydylocholiny. Punkt P oznacza normalny skład Ŝółci, przy którym zawartość cholesterolu wynosi 5%, fosfatydylocholiny 15% i soli kwasów Ŝółciowych 80%. Znajduje się on w obrębie strefy pojedynczej fazy płynu micelarnego. śółć o składzie wyznaczonym punktami znajdującymi się powyŜej linii ABC zawiera nadmiar cholesterolu w postaci roztworu przesyconego lub wytrąconej (jako kryształki lub płynne kryształki). (Według: Redinger R. N., Smali D. M.: Bile composition, bile salt metabolism, and gallstones; Arch. intern. Med. 1972, 130, 620. Copyright © 1972, American Medical Association, za zgodą).

Ŝółciowy wywiera bowiem swoiste działanie hamujące na reduktaze hydroksymetyloglutarylo-CoA, przez co zmniejsza syntezę cholesterolu w wątrobie.-vi. 5. Przemiana barwników Ŝółciowych. Powstawanie barwników Ŝółciowych z hemoglobiny zostało przedstawione w rozdz. 34. Sok trzustkowy zawiera enzymy atakujące wszystkie główne składniki pokarmowe Sok trzustkowy jest wodnistym, nielepkim płynem podobnym do śliny pod względem zawartości wody, zawierającym trochę białka i inne składniki organiczne i nieorganiczne, w tym głównie Na + , K+, HCO^" i chlorki oraz małe ilości Ca2 + , Zn2 + , HPOJ" i SO*". pH soku trzustkowego jest zdecydowanie zasadowe, waha się od 7,5 do 8,0 lub jest nawet wyŜsze. Sok trzustkowy zawiera liczne enzymy. Niektóre z nich wydzielane są jako zymogeny.

Tr yp s yna, ch ymo tr yp s yn a i elastaza są endopeptydazami. Aktywność proteolityczna soku trzustkowego uwarunkowana jest obecnością 3 endopeptydaz, tj. trypsyny, chymotrypsyny i elastazy. Działają one na białka i polipeptydy treści Ŝołądkowej. W wyniku ich działania powstają polipeptydy i (lub) peptydy. Trypsyna działa swoiście na wiązania peptydowe utworzone przez aminokwasy zasadowe, zaś chymotrypsyna na wiązania peptydowe utworzone przez aminokwasj pozbawione ładunku elektrycznego (np. aminokwasy aromatyczne). Wbrew swojej nazwie elastaza działa na wiele wiązań peptydowych utworzonych przez małe aminokwasy, np, glicynę, alaninę i serynę. Wszystkie 3 wymienione enzymy sa, wydzielane pod postacią zymogenów. Konwersja trypsynogenu do trypsyny katalizowana jest przez enzym proteolityczny błony śluzowej jelita — enterokinaze. Ta ostatnia, działając na wiązanie peptydowe utworzone przez lizynę odszczepia mały polipeptyd od zymogenu. W wyniku tego dzia-

TRAWIENIE I WCHŁANIANIE / 739

lania cząsteczka trypsyny rozprostowuje się, co jest równoznaczne z odsłonięciem jej aktywności proteolitycznej. Powstała aktywna postać trypsyny działa nie tylko na dalsze cząsteczki trypsynogenu, lecz równieŜ na inne zymogeny soku trzustkowego, przekształcając je w aktywne enzymy. I tak pod jej wpływem chymotrypsynogen ulega przekształceniu do chjmotrypsyny, proelastaza do elastazy i prokarboksypeptydaza do karboksyjpeptydazy.

Karboksypeptydaza jest egzopeptydazą. Powstałe pod wpływem endopeptydaz polipeptydy ulegają dalszemu rozkładowi hydrolitycznemu przez egzopeptydazę karboksypeptydazę. Enzym ten działa na C-końcowe wiązania peptydowe uwalniając pojedyncze aminokwasy.

Amylaza rozkłada skrobię i glikogen. Aktywność amylolityczna soku trzustkowego uwarunkowana jest obecnością oc-amylazy trzustkowej. Działanie jej jest podobne do amylazy ślinowej. Rozkłada ona skrobię i glikogen do maltozy, maltotriozy (składającej się z 3 reszt ot-glukozowych połączonych ze sobą wiązaniami w połoŜeniu 1 -»4), rozgałęzionych a-dekstryn (rozgałęzienia uwarunkowane są wiązaniami między dwoma cząsteczkami glukozy w połoŜeniu 1-^6), nierozgałęzionych oligosacharydów4 glukozy.

Lipaza rozkłada pierwszorzędowe wiązanie esterowe triacylogliceroli. Lipaza trzustkowa działa na granicy fazy wodnej i tłuszczowej kropelek tłuszczowych, utworzonych w przewodzie pokarmowym przez mechaniczne wytrząsanie treści pokarmowej w obecności produktów działania lipazy ślinowej i Ŝołądkowej, soli kwasów Ŝółciowych, kolipazy (jest to białko obecne w soku trzustkowym), fosfolipidów i fosfolipazy A2 {występującej równieŜ w soku trzustkowym). Zarówno fosfolipaza Aj, jak i kolipaza wydzielane są w postaci proenzymów (zymogenów). Do ich aktywacji konieczna jest hydroliza swoistego wiązania peptydowego przez trypsynę. Aktywność fosfolipazy A2 zaleŜna jest od obecności jonów wapnia. Ograniczona hydroliza wiązania estrowego w pozycji 2 fosfolipidu przez fosfolipazę A2 (p. ryc. 25-5) sprawia, Ŝe lipaza zostaje związana przez substrat na granicy faz oraz Ŝe zachodzi szybka hydroliza triacyloglicerolu. Kolipaza, wiąŜąc się z fazą graniczną złoŜoną z soli kwasów Ŝółciowych, triacyloglicerolu i wody, stanowi jakby kotwicę wysokiego powinowactwa dla lipazy. W wyniku całkowitej

hydrolizy triacyloglicerolu powstają glicerol i kwasy tłuszczowe. NaleŜy jednak dodać, Ŝe odszczepienie drugiego i trzeciego kwasu tłuszczowego od cząsteczki triacyloglicerolu jest coraz trudniejsze. Działanie hydrolityczne lipazy trzustkowej jest prawie swoiste dla pierwszorzędowych wiązań estrowych, tj. dla wiązania estrowego w pozycji 1 i 3 triacylogliceroli. W czasie trawienia tłuszczów faza wodna lub „micelarna" zawiera micele o kształcie dysków i liposomy złoŜone z soli kwasów Ŝółciowych nasycone produktami hpolizy (p. ryc. 15-34). Ze względu na trudności hydrolizy drugorzcdowego wiązania estrowego w cząsteczce triacyloglicerolu, wydaje się, Ŝe dochodzi najpierw do odszczepienia kwasów tłuszczowych w pozycji 1 i 3 i powstania 2-monoacyl o glicerolu. PoniewaŜ kwas tłuszczowy tego ostatniego związku związany jest z glicerolem drugorzędowym wiązaniem estrowym, musi on ulec, przed ostatecznym odszczepieniem się od glicerolu, izomeracji z wytworzeniem pier wszo rzędowego wiązania estrowego. Proces izomeracji jest jednak procesem powolnym. Ten fakt sprawia, Ŝe 2-monnglicerole są głównymi produktami końcowymi trawienia triacylogliceroli oraz Ŝe mniej niŜ \U spoŜytych tłuszczów jest całkowicie rozkładana do glicerolu i kwasów tłuszczowych (ryc. 56-3).

Estry cholesterolowe są rozkładane przez swoistą hydrolazę. W warunkach panujących w świetle jelita estry cholesterolowe ulegają rozkładowi przez hydrolazę estrów cholesterolowych (esteraze cholesterolową). Tak więc w jelitach wchłaniany jest wolny (nieestryfikowany) cholesterol.

Rybonukleaza (RNA-za) i deoksyrybonukleaza (DNA-za) warunkują trawienie kwasów nukleinowych zawartych w pokarmach (p. rozdz. 38 i 39).

Fosfolipaza A3 katalizuje hydrolizę drugorzędowego wiązania estrowego glicerolofosfolipidów zarówno pochodzenia Ŝółciowego, jak i pokarmowego. W wyniku działania fosfolipazy A2 powstają lizofosfolipidy. Enzymy soku jelitowego kończą proces trawienia Sok jelitowy, wydzielany przez gruczoły dwunastnicze (Brunnera) i jelitowe (Lieberkuhna), zawiera enzymy trawienne. Wśród nich naleŜy wymienić następujące: 1. Aminopeptydazę (Jest to egzopeptydaza atakująca N-końcowe wiązania peptydowe po-

740 / ROZDZIAŁ 56 ŚWIATŁ O JELITA

Absorpcja z micel; z so!i złoŜonych

kwasów

Ŝółciowych

|---I-----Aeyl I ----Aeyl Chyiomlkrony

*-Gliceroi

Ryc. 56-3. Trawienie i wchłanianie triacylogliceroli. FA — długołań cuch owe kwasy tłuszczowe, (Według: Mattson F. H., Volpenheim R. A.: The digestion and absorption of triglycerides; J. Biol. Chem., 1964, 239, 2772 w modyfikacji autora rozdziału). ___

Hpeptydów i oligopeptydów) i dipeptydazy (wykazują róŜną swoistogg, niektóre z nich znajdują się w obrębie nabłonka jelitowego rozkładając dipeptydy do wolnych aminokwasów). Swoiste disacharydazy i oligosacharydazy, np. a-glukozydazę zwaną równieŜ maltazą (en zymy te katalizują odszczepienie pojedynczych reszt cukrowych oligosacharydów i disacharydów wykazujących wiązanie ot (1 -» 4) glikozydowe, rozpoczynając to działanie od nieredukującego końca), izotnaltazę czyb' a -dekstrynazę (hydrolizującą wiązania 1 -» 6 glikozydowe a dekstryn), p-galaktozydazę czyli laktazę (odszczepia galaktozę od laktozy), sacharazę (hydrolizującą sacharozę) i trehalazę (hydroliŜującą trehaioze). Fosfatazę (usuwającą resztę fosforanową z organicznych związków fosforanowych np. heksozofosforanów, glicerofosforanów i nukleotydów powstałych w wyniku trawienia kwa-

sów nukleinowych zawartych w pokarmach przez nukleazy), Polinukleotydazy (rozkładające kwasy nu kleinowe do nukleotydów). Nukleozydazy (określane równieŜ jako fosforylazy nukleozydowe —■ katalizują fosforolizę nukleozydow do wolnych zasad purynowych lub pirymidynowych i pentozofosforanów). Fosfolipazę (enzym'ten, zawarty w soku jelitowym, rozkłada foslblipidy do glicerolu, kwasów tłuszczowych, kwasu fosforowego oraz zasady, takiej jak cholina).

Większość produktów trawienia ulega asymilacji Końcowym skutkiem działania opisanych wyŜej enzymów trawiennych jest rozłoŜenie składników pokarmowych zawartych w poŜywieniu do postaci, w której mogą być wchłaniane i przyswajane. Końcowymi produktami tra-

TRAWIENIE 1 WCHŁANIANIE / 7*1

wiema węglowodanów są monosacharydy (głównie glukoza), białek ~ aminokwasy, triacylogliceroli — kwasy tłuszczowe, glicerol i monoglicerole, zaś kwasów nukleinowych — zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy i pentozy. Polisacharydy błon komórkowych komórek roślinnych oraz ligniny zawarte w poŜywieniu

nie są trawione przez enzymy ssaków. Tworzą one tzw. włókna pokarmowe i stanowią większość nie strawionych resztek pokarmowych. Włókna, oprócz tego Ŝe tworzą masę kałową, spełniają inne waŜne funkcje (p. rozdz. 55). W tabeli 56-2 zestawiono waŜniejsze procesy trawienne.

Tabela 56-2. Zestawienie procesów trawiennych Enzym

Miejsce i bodziec w ydzielania

Sposób akt yw ac ji i optymalne warunki działania

Siinianki: wydzielają ślinę

Arnylaza śli-

Konieczna

w następstwie odruchu wyzwolonego obecnością pokarmu w jamie ustnej

nowa

ność chlorków, pH

Gruczoły jeŜyka

obec-

Substrat

Produkty działania Bfizymu

Skrobią, ^gli-

Maltoza, 1:6-glu-

kogen

kozydy (oligosacharydy) i maltotrioza

6,6-6,8 Lipaza „języ-

pH 2,0-7,5 optymalne

Wiązanie est-

Kwasy tłuszczo-

kowa"

pH 4,0-4,5

rowe pierwszorzedowe w pozycji sn-3, utworzone przez kwasy tłuszczowe krótkofańcuchowe

we i 2,3-diacyloglicerole

Gruczoły Ŝołądka: komórki

Pepsyna A

Konwersja pepsyno-

Białka

Peptydy

gtówne i okładzinowe wydzielają sok Ŝołądkowy pod wpływem bodźca odruchowego lub gastryny

(dno Ŝołądka) Pepsyna B (część odźwiernikowa) Rennina

genu do aktywnej pepsyny przez kwas solny, pH 1,0-2,0 Do aktywacji potrzebne są Ca1+, pH 4,0

Kazeina mleka

Wytrącanie kazeiny

Trypsyna

Konwersja irypsyno-

Białka

Potipeptydy

genu do aktywnej trypsyny przez enterokinazę jefitową przy pH 5,2-6,0. Auto kata lityczna aktywacja przy pH 7,9

Peptydy

Di peptydy

Chymotrypsy-

Wydzielana jako chy-

Białka

Te same jak przy

na

motrypsy nogen, Ulega konwersji do aktywnej chymotrypsyny przer trypsynę, pH8,0

Peptydy

irypsynie, silniej wytrąca kazeinę mleka

Trzustka: obecność kwaśnej treści Ŝołądkowej w świetle dwunastnicy pobudza: 1) wydzielanie sekretyny przez błonę śluzową dwunastnicy, sekretyna z kolei stymuluje wydzielanie soku trzustkowego oraz 2) wydzielanie cholecystokininy stymulującej sekrecję enzymów trzustkowych

742 / ROZDZIAŁ 56 H tab. 56-2 Enzym

Miejsce i bodziec wydzielania

Sposób aktywacji i optymalne warunki działania

enzymu

Wydzielana pod po-

Białka

Poli peptydy

Peptydy

Dipeptydy

Karboksypep-

stacią proelastazy. ulega aktywacji przez trypsynę Wydzielana jako pro-

C-końcowe

Niskocząsteczko-

tydaza

karboksypeptydaza. aktywowana przez trypsynę

po li peptydy

we peptydy, wolne aminokwasy

Amylaza

pH 7,1

Skrobia,

Maltoza,

glikogen

-glukozydy (oligosacharydy) i maltotrioza

Aktywo wa n e przez

Pierwszorzę-

Kwasy tłuszczo-

sole kwasów Ŝółciowych, fosfolipidy i kolipazę, pH 8,0 Rybonuklea-

dowe wiązania estrowe triacylogliceroli Kwasy rybo-

we, monoacyloglicerole, diacyloglicerole, glicerol Nukleotydj'

za Deoksyrybo-

nukleinowe Kwasy deok-

Nukleotydy

nukleaza

syrybonukleinowe Estry chole-

Wotny choleste-

Lipaza

pęcherzyk

Produkty działania

Elastaza

trzustkowa

Wątroba i

Substrat

Hydrolaza es-

Aktywowana przez

trów cholesterolowych

sole kwasów Ŝółciowych

sterolowe

Fosfolipaza

Wydzielana

Fosfolipidy

Aj

proenzym aktywowany przez trypsynę iCa2+

(Sole

jako

1:6-

rol i kwasy tłuszczowe Kwasy tłuszczowe, lizofosfolipi-

dy

kwa-

Tłuszcze oraz

Koniugaty kwa-

Ŝółciowy. Cholecystokinina, hormon btony śluzowej jelita a prawdopodobnie równieŜ gastryna i sekrety na, pobudzają pęcherzyk Ŝółciowy i wydzielanie Ŝółci przez wątrobę

sów Ŝółciowych i zasady)

kwaśna miazga pokarmowa po neutralizacji

sów Ŝółciowych z kwasami tłuszczowymi, delikatna zawiesina obojętnych mice li złoŜonych z soli kwasów Ŝółciowych i tłuszczów oraz lip osom ów

Jelito cienkie. Sok wy-

Aminopepty-

N-końcowe

Peptydy niskoczą-

twarzany przez gruczoły Brunnera dwunastnicy i gruczoły Lieberkiihna

daza

po li peptydy

steczkowe. Wolne aminokwasy

Dipeptydazy

Dipeptydy

Aminokwasy

Sacharoza

Fruktoza, glukoza

i

Sacharaza

pH 5,0-7,0

TRAWIENIE I WCHŁANIANIE / 743 cd. tab. 56-2 Miejsce i bodziec wydzielania

t

Enzym

Sposób aktywacji i optymalne warunki działania

Substrat

Produkty działania enzymu

Maltaza

pH 5,8-6,2

Maltoza

Glukoza

Laktaza

pH 5,4-6,0

Laktoza

Glukoza, galaktoza Glukoza

pH8,6

Trehaloza Fosforany organiczne

Izomaltaza lub 1 ^-glukozy daza

1:6 glukozydy

Glukoza

Polirtukleotydaza

Kwas nuklei4|A nowy -

Nukleotydy

Nukleozydazy (fosforylazy nukleozydowe)

Nukteozydy Zasady purynopurynowe i we i pirymidynopirymidyno-we we, fosforan pentozy

Trehalaza Fosfataza

W CHŁANIANIE Z PRZEWODU

POKARMOWEGO POLEGA NA TRANSPORCIE SKŁADNIKÓW POKARMOWYCH DO KRĄśENIA WROTNEGO LUB NACZYŃ LIMFATYCZNYCH Wchłanianie pokarmów w Ŝołądku jest niewielkie, choć moŜliwa jest absorpcja znacznych ii ości etanolu. Jelito cienkie jest głównym narządem trawiennym i wchłaniającym. W trakcie przechodzenia przez nie ok. 90% pokarmów jest wchłanianych z wodą. W jelicie grubym wchłanianie wody jest znaczniejsze, co sprawia, Ŝe pierwotnie płynna zawartość jelita cienkiego w okręŜnicy nabiera konsystencji stałej. WyróŜnia się dwa szlaki wchłaniania składników pokarmowych z jelita cienkiego, leden z nich prowadzi do krąŜenia wrotnego wątroby, do którego dostają się składniki pokarmowe rozpuszczalne w wodzie, zaś drugi szlak przez naczynia limfatyczne i przewód piersiowy do krąŜenia ogólnego. Drugim szlakiem transportowane są składniki pokarmowe rozpuszczalne w tłuszczach.

Wolny fosforan

Węglowodany wchłaniane są w postaci monosacharyd ów Produkty trawienia węglowodanów wchłaniane są z jelita czczego do krąŜenia wrotnego w postaci monosacharydów, w tym głównie heksoz (glukozy, fruktozy, mannozy i galaktozy) i pentoz (rybozy). Oligosacharydy (produkty hydrolizy skrobi, zawierające 3—10 jednostek monosacharydowych) i disacharydy ulegają dalszej hydrolizie przez odpowiednie enzymy rąbka szczoteczkowego błony śluzowej jelita cienkiego, w tym równieŜ przez amylazę trzustkową adsorbowaną przez śluzówke jelitową. W świetle jelita stwierdza się tylko niewielką aktywność disacharydazową. Większą wykazują małe „węzły71 z rąbkiem szczoteczkowym komórek nabłonkowych jelita. Wchłanianie monosacharydów odbywa się dwoma sposobami — drogą aktywnego transportu (w obecności gradientu stęŜeń) oraz dyfuzji prostej. Wchłanianie niektórych cukrów odbywa się w jeszcze bardziej złoŜony sposób. Do aktywnego transportu niezbędna jest następująca konfiguracja cząsteczki cukru: konfiguracja grupy hydroksylowej przy węglu drugim powinna być identyczna z występującą w glukozie, musi być obecny pierścień piranozowy oraz przy węglu w pozycji piątej musi występować

744 / ROZDZIAŁ 56 grupa metylowa lub pochodna grupy metylowej (grupa metylowa podstawiona). Wchłanianie fruktozy jest wolniejsze od glukozy i galaktozy. i odbywa się na zasadzie dyfuzji prostej zgodnie z gradientem stęŜeń. W warunkach fizjologicznych we krwi stwierdza się niewielkie ilości fruktozy oprócz tej, która jest pochodzenia pokarmowego. Pompa sodowa nasila aktywne wchłaniania glukozy Rąbek szczoteczkowy enterocytów zawiera kilka układów transportowych. Niektóre z nich są podobne do układów występujących w rąbku szczoteczkowym komórek kanalikowych neironów wyspecjalizowanych w resorpcji zwrotnej róŜnych aminokwasów i cukrów. Przypuszcza się, Ŝe istnieje przenośnik wiąŜący w róŜnych miejscach glukozę i przenoszący obydwie te substancje przez błonę plazmatyczną enterocytów. Zarówno glukoza, jak i Na+ mogą być uwalniane do cytoplazmy, umoŜliwiając w ten sposób przenośnikowi ciągłe powtarzanie swej czynności transportowej. Jony Na+ transportowane są zgodnie z gradientem ich stęŜeń umoŜliwiając równocześnie przenośnikowi transport glukozy w kierunku przeciwnym do gradientu jej stęŜeń. Wolna energia potrzebna do transportu aktywnego pochodzi z rozpadu hydrolitycznego ATP współdziałającego z pompą sodową wyrzucającą jony Na u na zewnątrz komórki. W miejsce jonów Na+ do komórki wchodzą jony K+ (p. ryc. 56-4). Aktywny transport glukozy hamują oiiabaina, będąca glikozydem nasercowym a równocześnie inhibitorem pompy sodowej^oraz floryzyna, będąca znanym inhibitorem rćsbrpcji zwrotnej glukozy w kanalikach nerkowych. Stosunek wchłanianego sodu do glukozy moŜe się zmienić lecz zawsze odpowiada aktywności dwóch przenośników pracujących równolegle. Dla jednego z nich stosunek wchłanianego Na do glukozy wynosi 1:1, zaś dla drugiego 3:1. Występuje równieŜ przenośnik glukozy niezaleŜny od Na+. Proces hydrolizy polisacharydów, oligosacharydów i disacharydów jest procesem szybkim. Dlatego teŜ mechanizmy wchłaniania glukozy i fruktozy ulegają szybkiemu nasyceniu. Rzucającym się w oczy wyjątkiem jest hydroliza laktozy, przebiegająca o połowę wolniej niŜ hydroliza sacharozy. Ten fakt tłumaczy, dlaczego hydroliza laktozy nie prowadzi do wysycenia mechanizmów transportowych glukozy i galaktozy.

Białko przenoSnlka

Glukoza

Rąbek szczoteczkowy

Nabłonek jelitowy

Da naczyń włosowatych

Ryc. 56-4. Tiansportglukozyprzez nabłonek jel> towy. Aktywny transport glukozy jest sprzęŜony + + z pompą Na /K (1) lub z układem niezaleŜnym od + jonów Na (2). Proces dyfuzji przedstawia szlak (3).

Defekty enzymów uczestniczących w trawieniu węglowodanów są przyczyną swoistych zaburzeń Niedobór laktazy. Nietolerancja laktozy, disacharydu występującego w mleku, moŜe być spowodowana niedoborem laktazy. Zespół niedoboru laktazy naleŜy odróŜnić od zespołu nietolerancji mleka spowodowanego nadwraŜliwością na białka zawarte w mleku, w tym zwykle na pMaktoglobulinę. Objawy przedmiotowe i podmiotowe występujące w wymienionych zespołach są takie same. Wśród tych objawów naleŜy wymienić bóle kolkowe brzucha, biegunki i wzdęcia. Objawy te spowodowane są z jednej strony obecnością laktozy w świetle jelita oraz z drugiej zaś strony fermentacją tego dwucukru przez mikroorganizmy jelitowe. Osmotycznie czynna laktoza, gromadząca się w świetle jelita, jest przyczyną biegunek osmoty-

TRAWIENIE I WCHŁANIANIE / 74S

cznych. Ponadto iaktoza nie wchłonięta przez jelito staje się substratem dla bakterii jelitowych, W wyniku fermentacji bakteryjnej powstają gazy oraz metabolity laktozy draŜniące jelito. WyróŜnia się trzy typy niedoboru laktazy: Dziedziczny niedobór laktazy. Ten typ występuje względnie rzadko i charakteryzu je się występowaniem objawów nietolerancji laktozy krótko po,, urodzeniu. Po karmieniu dziecka dietą bezlalctozową wszystkie objawy nietolerancji znikają. Cechą charakterystyczną tego typu niedoboru jest obecność laktozy w moczu. Laktozuria spowodowana jest uszko dzeniem nabłonka jelitowego przez laktozę i wtórnym przedostaniem się tego disacharydu przez uszkodzoną błonę śluzową jelita do krwi. Wtórny niedobór laktazy. Spowodo wany jest pierwotną chorobą jelit i wtórnym niedoborem laktazy, przez co dochodzi do upośledzonego trawienia laktozy. Choroba ob jawia się nietolerancją mleka. Jest to typ niedo boru laktazy nierzadko występujący w sprue rodzimej i tropikalnej, kwashiorkor, zapaleniu jelita grubego oraz w zapaleniu Ŝołądka i jelit. MoŜe on wystąpić równieŜ po operacji wykona nej z powodu wrzodu trawiennego. Pierwotny niedobór laktazy. Jest to względnie często występujący zespół, szczegól nie wśród populacji kolorowych. PoniewaŜ ob jawy chorobowe tego zespołu występują nie w dzieciństwie, lecz dopiero u osób dorosłych, przyjmuje się, Ŝe jest on spowodowany po stępującym zanikiem aktywności laktazowej u osób do tego predysponowanych.

Niedobór sacharazy. Stwierdzono występowanie dziedzicznego niedoboru zarówno sacharazy, jak i izomaltazy. Te dwa rodzaje niedoboru występują równocześnie, poniewaŜ sacharaza i izomaltaza tworzą wspólny kompleks enzymatyczny. Objawy niedoboru wymienionych disacharydaz występują juŜ we wczesnym dzieciństwie i są takie same jak w niedoborze laktazy. Disacharyduria. U niektórych chorych z niedoborem disacharydaz moŜna stwierdzić wzmoŜone wydalanie disacharydów z moczu. U takich osób oraz u chorych z chorobą jelit (np. sprue) dobowe wydalanie disacharydów z moczem moŜe wynosić 300 mg lub więcej.

Wadliwe wchłanianie monosacharydów. Znany jest wrodzony zespół w którym stwierdza się powolne wchłanianie glukozy i galaktozy, spowodowane defektem mechanizmu

transportowego dla tych cukrów. PoniewaŜ fruktoza nie jest transportowana tym mechanizmem przenośnikowym, wchłanianie jej jest normalne w tym zespole.

Produkty trawienia lipidów wchłaniane są z miceli utworzonych przez sole kwasów Ŝółciowych 2-Monoacyloglicerole, kwasy tłuszczowe i niewielkie ilości 1-monoacylogiiceroli opuszczają fazę olejową zawiesiny tłuszczowej i dyfunduja do miceli mieszanych i liposomów złoŜonych z soli kwasów Ŝółciowych, fosfatydylocholiny i cholesterolu pochodzenia Ŝółciowego (ryc. 56-2). PoniewaŜ micele są rozpuszczalne w wodzie, umoŜliwiają one dostanie się produktów trawienia tłuszczów do rąbka szczoteczkowego komórek błony śluzowej jelita, a następnie do wnętrza enterocytów. Sole kwasów Ŝółciowych docierają do jelita biodrowego, gdzie są wchłaniane i przechodzą do krąŜenia jelitowo-wątrobowego (p. rozdz. 27). Fosfolipidy pochodzenia pokarmowego i Ŝółciowego (np. fosfatydylocholina) są rozkładane do kwasów tłuszczowych i lizofosfolipidów pod wpływem trzustkowej fosfolipazy A2 i resorbowane przez nabłonek jelitowy. Estry cholesterolowe ulegają hydrolizie pod wpływem hydrolazy estrów cholesterolowych pochodzenia trzustkowego. Uwolniony pod jej wpływem wolny cholesterol wraz z większością cholesterolu zawartego w Ŝółci przedostaje się do rąbka szczoteczkowego po uprzednim wniknięciu do miceli. W warunkach fizjologicznych ponad 98% lipidów zawartych w pokarmach jest wchłanianych w jelitach. W obrębie ściany jelit 1-monoacyloglicerole ulegają dalszej hydrolizie do wolnego gticerolu i kwasu tłuszczowego pod wpływem lipazy róŜniącej się od Iipa2y trzustkowej. 2-Monoacyloglicerole ulegają rekonwersji do triacylogliceroli szlakiem monoacyloglicerolowym (ryc. 56-3). Proces resyntezy triacylogliceroli z kwasów tłuszczowych wymaga „aktywacji" tych ostatnich. Synteza triacylogliceroli w błonie śluzowej jelita przebiega podobnie jak w innych tkankach (p. str. 284). Wchłonięte lizofosfolipidy oraz większość wchłoniętego cholesterolu jest takŜe reacylowana przez acylo-CoA, w wyniku czego powstają fosfolipidy i estry cholesterolowe. Uwolniony w świetle jelita w procesie lipolizy glicerol nie ulega reutylizacji, lecz jest bezpośrednio wchłaniany do krąŜenia wrotnego. Na-

746 / ROZDZIAŁ 56

tomiast glicerol uwolniony w obrębie komórek jelitowych moŜe bye wykorzystany do resyntezy triacylogliceroli po uprzedniej aktywacji przez ATP do glicerolo-3-fosforanu. Tak więc długołańcuchowe kwasy tłuszczowe wchłonięte przez komórki błony jelita mogą być uŜyte do resyntezy triacylogliceroli.

Trtacyloglicerole, powstałe w enterocytach, przewaŜnie nie dostają się do krąŜenia wrotnego. Większość wchłoniętych lipidów, w tym równieŜ tbsfolipidy, estry cholesterolowe, wolny cholesterol i witaminy rozpuszczalne w tłuszczach tworzą chylomikrony. Te ostatnie tworzą limfę (tj. płyn o wyglądzie mleka), transportowaną naczyniami chłonnymi jamy brzusznej do przewodu piersiowego, a następnie dopiero do krąŜenia systemowego (p. równieŜ ryc. 26-3). Większość wchłoniętych kwasów tłuszczowych, złoŜonych z 10 lub więcej atomów węgla, niezaleŜnie od tego, w jakiej postaci zostały reabsorbowane, występuje jako estry w limfie przewodu piersiowego. Kwasy tłuszczowe krótkołańcuchowe, zawierające mniej niŜ 10—12 atomów węgla, transportowane są krwią Ŝyły wrotnej w postaci nieestryfikowanej (jako „wolne" kwasy tłuszczowe). śaden ze steroli pochodzenia roślinnego (czyli fitosteroli) z wyjątkiem aktywowanego crgosterolu (czyli prowitaminy D) nie ulega reabsorpcji w jelitach. Chyluria jest stanem chorobowym charakteryzującym się wydalaniem przez chorego „mlecznego" moczu. Jest ona spowodowana przetoką limfatyczną, tj. połączeniem układu naczyń limfatycznych jelit z układem moczowym. Podobną anomShą jest chylothora* charakteryzujący się gromadzeniem się limfy w jamie opłucnowej. Jest on spowodowany nieprawidłowym połączeniem naczyń limfatycznych jamy brzusznej z jamą Opłucnową. Dzięki .podaniu w pokarmach triacylogliceroli zawierających krótkołaricuchowe kwasy tłuszczowe (złoŜone z mniej niŜ 12 atomów węgla) w miejsce

kwasów tłuszczowych długołańcuchowych, moŜna spowodować zniknięcie chylurii. Podobne postępowanie u chorych z chyiothorax jest przyczyną przejaśnienia się płynu opłucnowego. Wymienione zmiany chylurii lub płynu w jamie opłucnowej spowodowane są wniknięciem krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych bezpośrednio do krąŜenia wrotnego, a nie do chylomikronów limfy.

Produktami trawienia białek ulegającymi wchłanianiu w jelitach są aminokwasy W stanach fizjologicznych białka pokarmowe zostają prawie całkowicie rozłoŜone do aminokwasów. Te ostatnie z kolei są szybko wchłaniane przez jelito do krąŜenia wrotnego. MoŜliwa jest jednak hydroliza niektórych produktów trawienia białek, tj. dipeptydów w obrębie ściany jelitowej. NaleŜy dodać, Ŝe karmienie zwierząt pełnowartościową mieszaniną aminokwasów pozwala na normalne podtrzymanie ich Ŝycia. Izomery (L), lecz nie (D) aminokwasów transportowane są aktywnie przez ścianę jelita od bieguna luminalnego do surowicówkowego. W transporcie tym ma uczestniczyć witamina B<j (fosforan pirydoksalu). Aktywny transport L-aminokwasów zaleŜny jest od dostawy energii, czego dowodem jest fakt, Ŝe 2,4-dinitrofenol, substancja rozprzęgająca fosforylację oksydacyjną, hamuje ten transport (p. str. 152). Aminokwasy są transportowane przez rąbek szczoteczkowy przez liczne przenośniki, z których wiele jest podobnych do przenośnika glukozowego zaleŜnego od Na+ (ryc. 56-4). Wśród przenośników zaleŜnych od Na+ naleŜy wymienić przenośnik dla aminokwasów obojętnych, przenośnik dla fenyloalaniny lub metioniny oraz swoisty przenośnik dla iminokwasów takich jak prolina i hydroksyproiina. Scharakteryzowano równieŜ przenośniki niezaleŜne od Na + , transportujące aminokwasy lipofilne i obojętne (np. leucynę i fenyloalaninę) oraz aminokwasy zasadowe (np. lizynę).

Aspekty kliniczne. Chorzy wykazujący reakcję immunologiczną na niektóre spoŜyte białka wchłaniają je bez uprzedniego ich trawienia, strawione białka bowiem nie są immunogenne. Za moŜliwością przenikania niestrawionych białek przez błonę śluzową jelit przemawia fakt przedostania się przeciwciał zawartych w siarze z przewodu pokamiowego noworodka do krąŜenia. Istnieje coraz więcej dowodów popierających hipotezę, Ŝe sprue rodzima (nietropikalna) spowodowana jest defektem umiejscowionym w samych komórkach błony śluzowej jelit, W wyniku tego defektu polipeptydy powstałe po trawieniu glutenu (głównego białka zawartego w pszenicy) przez pepsynę i trypsynę wywierają nie tylko miejscowo szkodliwy wpływ na błonę śluzową jelit, lecz po wchłonięciu do krwi są przyczyną powstawania przeciwciał przeciwglu-

TRAWIENIE I WCHŁANIANIE / 747 Tabela 56-3. Miejsce wchłaniania poszczególnych składników pokarmowych Miejsce wchłaniania Składnik pokarmowy Jelito czc2e

*

Jelito kretę

Glukoza i inne monosacharydy, niektóre disacharydy M o n oacy 1 og 1 i c ero le. kwasy tłuszczowe, glicerol, cholesterol Aminokwasy, peptydy Witaminy, foiian Elektrolity, Ŝelazo. wapń, woda Kwasy Ŝółciowe Witamina B-|2 Elektrolity Woda

ten owych. Udowodniono, Ŝe u chorych na rodzimą sprue we krwi krąŜącej bardzo często stwierdza się przeciwciała przeciwglutenowe lub skierowane przeciw frakcjom rozpadu tego białka. Czynnikiem szkodliwym glutenu jest polipeptyd złoŜony z zaledwie 6 lub 7 aminokwasów. Sprue rodzima u dorosłych jest niewątpliwie analogiem celiakii (choroby trzewnej) występującej u dzieci. Dowodzi ona moŜliwości przenikania przez błonę śluzową jelita do krwi fragmentów białkowych większych niŜ aminokwasy. Przenikanie takie zachodzi jednak tylko w określonych warunkach chorobowych. W tabeli 56-3 zestawiono miejsce wchłaniania niektórych waŜniejszych składników pokarmowych w jelitach, zaś w tab. 56-4 objawy lub zespoły chorobowe spowodowane wadliwym ich wchłanianiem.

Tabela 56-4. Objawy lub zespoły chorobowe spowodowane wadliwym wchłanianiem poszczególnych składników pokarmowych Objawy lub zespół Wadliwe wchłaniachorobowy nie składnika pokarmowego śelazo, witamina B,^ folian Produkty trawienia białka Wapń, magnez, witamina D Wapń, produkty trawienia białek, witamina D

Niedokrwistość Obrzęki TęŜyczka Osteo poroŜa

Nietolerancja mleka ** Krwawienia, siniaki, łamliwość naczyń Stolce tłuszczowe (steatorrhea)

v

Chorba Hartnupów (dełekt przenośnika jelitowego dla aminokwasów obojętnych)

Aminokwasy obojętne

Laktoza

Witamina K Lipidy i witaminy rozpuszczalne w tłuszczach

propionowy i masłowy. W wyniku rozkładu bakteryjnego fosfatydylocholiny mogą powstać cholina oraz spokrewnione z nią aminy toksyczne (np. neuryna).

0 H3C-N-CH,-CH3OH CHj

Neuryn

Cholina

BAKTERIE JELITA GRUBEGO SĄ PRZYCZYNĄ PROCESÓW GNILNYCH I FERMENTACYJNYCH Większość spoŜytych pokarmów jest wchłaniana w jelicie cienkim. Tutaj teŜ wchłania się większość wody, co sprawia, Ŝe początkowo półpłynna treść jelitowa przybiera konsystencję bardziej stałą. W czasie wchłaniania poszczególnych składników pokarmowych obserwuje sie Ŝywą aktywność flory bakteryjnej jelit. Uczestniczy ona w procesach gnilnych i fermentacyjnych, podczas których powstają m.in. gazy (takie jak dwutlenek węgla, metan, wodór, azot i siarkowodór) oraz kwas octowy, mlekowy,

NCH

Wiele aminokwasów ulega dekarboksylacji pod wpływem bakterii jelitowych z wytworzeniem toksycznych amin (tj, ptomain). DEKAHBOKSYLAZA BAKTERYJNA R-C-NHj H COj Jedna z ptomain

W wyniku takich reakcji dekarboksylacji powstają: kadaweryna z lizyny, agmatyna z argininy, tyramina z tyrozyny, putrescyna z ornityny i histamina z histydyny. Niektóre z wy-

748 I ROZDZIAŁ 56

mienionych amin wykazują silne działanie wazopresyjne. Tryptofan w wyniku szeregu reakcji jest źródłem indolu i metyloindolu (skatolu), tj. substancji odpowiedzialnych za zapach kału.

z zaawansowaną chorobą miąŜszu wątrobowego lub wystąpienie u tych chorych krwawienia do światła przewodu pokarmowego mogą być przyczyną zatrucia amoniakiem. RównieŜ u takich chorych podawanie neomycyny ma działanie lecznicze.

Indol Skatol CH3

Aminokwasy zawierające siarkę zostają przekształcone w merkaptany, takie jak metyloi etylomerkaptan oraz siarkowodór. CH3SH CH^SH Etylomerkaptan Metyiomerkaptan !2H] CH3SH -~CH, Mety!omerkaptan

Bakterie jelitowe spełniają równieŜ funkcje poŜyteczne dla człowieka Fiora jelitowa moŜe stanowić aŜ 25% suchej masy kałowej. U zwierząt trawoŜernych, u których pokarmy składają się głównie z celulozy, bakterie jelitowe lub występujące w Ŝwaczu odgrywają istotną rolę w procesie trawienia, rozkładają one bowiem polisacharydy do wchłanialnych monosacharydów. Ponadto bakterie te, Ŝyjące w symbiozie z gospodarzem, uczestniczą w syntezie aminokwasów egzogennych i witamin. ChociaŜ rola jelitowej flory bakteryjnej u człowieka jest znacznie mniejsza niŜ u zwierząt trawoŜernych, niemniej jest ona poŜyteczna, poniewaŜ wytwarza pewne witaminy, szczególnie witaminę K i Bł2 oraz niektóre inne witaminy grupy B.

PIŚMIENNICTWO

Metan 1 siarkowodór

Jelito grube jest źródłem znacznej ilości amoniaku powstającego w wyniku działania bakterii na substraty azotowe. Powstały amoniak dostaje się do krąŜenia wrotnego i następnie do wątroby, gdzie jest szybko usuwany z krwi. W chorobach wątrobydetoksykacyjna rola tego narządu w stosunku do amoniaku ulega upośledzeniu, co

jest przyczyną dostania się NH3 do krąŜenia ogólnego, w którym moŜe osiągnąć stęŜenia toksyczne. Sądzi się, Ŝe amoniak uczestniczy w patogenezie śpiączki wątrobowej u niektórych chorych. Wykazano, Ŝe podanie neomycyny, antybiotyku hamującego rozwój jelitowej flory bakteryjnej, znamiennie obniŜa stęŜenie we krwi amoniaku pochodzenia jelitowego. Stosowanie diety wysokobiałkowej u chorych

Bórgstrom B: The miceliar hypothesis of fat absorption: Must it be revisited? Scand J Gastroenterol 1985;20;389. Gardncr M; Gastromtestinal absorption of intact proteins. Annu Rev Nurt 1988;8:329. Gargouri Y et al: Kinetic assay of human gastric lipase on short- and long-chain triacyiglycerol emulsions. Gastroenterology 198ó;91:919. Foltmann B; Gastric proteinases. Essays Biockem 1981;17: Nelson GJ, Ackman RG: Absorption and transport of fat in mammals with emphasis on N-3 poiyunsaturated fatty arids. Lipids 1988:23:1005. Steven BR, Kaunitz JD, Wright EM: Intestinai transport of amino acids and sugars. Annu Rev Pftysiol 1984;4fi:4l7. Tso P: Gastrointestinal digesśon and absorption of lipid. Adv Lipid Res 1985;21:143. Wolfe MM, Soli AH; The physiology of gastric acid secretion. New Engi J Med 1988;319:1707,

Glikoproteiny i proteoglikany

57

Robert K. Murray, MD, PhD ■

WPROWADZENIE Glikoproteiny są białkami, w których łańcuchy oligosacharydowe (glikanowe) przyłączone są kowalencyjnie do rdzenia polipeptydowego, Glikozoaminoglikany są polisacharydami złoŜonymi z powtarzających się jednostek disacharydowych. Jednostka disacharydowa składa się z aminocukru (glukozoaminy lub galaktozoaminy, która dodatkowo moŜe być siarczanowa) oraz kwasu uranowego (gJukuronowego lub idunonowego). W przeszłości glikozoaminoglikany określano terminem „mukopolisacharydy". Obecnie wiadomo, Ŝe występują one zwykle jako kowalencyjnie związane z białkiem i określane są terminem proteoglikanów. Glikokoniugaty lub kompleksy węglowodanowe to dwa zamienne określenia, uŜywane do opisywania makrocząsteczek zawierających jeden lub więcej łańcuchów węglowodanowych kowalencyjnie związanych z białkiem lub lipidami. Do tej grupy makrocząsteczek zalicza się: glikoproteiny, proteoglikany i giikolipidy.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Białka osocza, z wyjątkiem albumin, są glikoproteinami. Wiele białek błon komórkowych (p. rozdz. 45) zawiera znaczne ilości węglowodanów. TakŜe niektóre substancje grupowe krwi (p. rozdz. 60) są glikoproteinami, podczas gdy inne są glikolipidamt. Niektóre hormony (np. gonadotropina kosmówkowa) to takŜe glikoproteiny. Nowotwory coraz częściej rozpoznawane są jako zaburzenia wynikające z nieprawidłowej regulacji genetycznej (p. rozdz. 61). Główny

problem w nowotworach to przerzuty. Powstają one wskutek odrywwjia się komórek nowotworowych od tkanek, z których pochodzą (np. płuc) i dostają się z krwią do róŜnych narządów i tkanek ustroju (np. mózgu), gdzie w warunkach niekontrolowanych rozrastają się, wywołując katastrofalne następstwa. Onkolodzy sądzą, Ŝe do powstawania przerzutów przyczyniają się w znacznej części zmiany w strukturze ghkokoniugatów powierzchni komórek nowotworowych. Ponadto niektóre choroby (mukopolisacharydozy) są wynikiem zmniejszonej aktywności specyficznych enzymów lizosomalnych, degradujących poszczególne typy glikozoaminoglikanów; w wyniku spadku ich aktywności dochodzi do gromadzenia się jednego lub więcej typów glikozoaminoglikanów, co wywołuje róŜne objawy; przykładem moŜe być zespół Hurler.

POWSZECHNIE WYSTĘPUJĄCYM GLIKOPROTEINOM PRZYPISUJE SIĘ LICZNE FUNKCJE Glikoproteiny występują w większości organizmów, od bakterii do człowieka. Wchodzą takŜe w skład większości wirusów zwierzęcych. Nad niektórymi z nich prowadzono intensywne badania, poniewaŜ były w części przydatne do śledzenia procesów biosyntezy. Do glikoprotein zaliczanych jest wiele białek o odmiennych funkcjach (tab. 57-1); zawartość składnika węglowodanowego waha się od 1% do ponad 85% całkowitej ich masy. Mimo intensywnych badań nad funkcjami glikoprotein wciąŜ niejasna jest dokładna rola łańcuchów oligosacharydowych. Niektóre z nich przedstawione są w tab. 57-2.

750 / ROZDZIAŁ 57 Tabeła 57-1, Niektóre funkcje białek pełnione przez glikoproteiny Białka strukturalne: Ściany komórkowej Kolagen, elastyna Fibryny Białka macierzy kości Substancje o właściwościach smaru i ochronnych: Mucyny Wydzieliny śluzowe Białka transportujące: Witaminy Lipidy Minerały i pierwiastki śladowe Białka o właściwościach immunologicznych: Immunoglobuliny Antygeny zgodności tkankowej Składniki dopełniacza Interferony Hormony: Gonadotropina kosmówkowa Tyreotropina (TSH) Enzymy: Proteazy Nukieazy Glikozydazy Hydrolazy Czynniki krzepnięcia Substancje uczestniczące w interakcji ko mórek lub procesach rozpoznania biologicz nego: IJJ, Komórka — komórka Komórka — wirus Komórka — bakteria Receptory hormonów Substancje entyzamroŜeniowe u ryb antarktycznych Lektyny

ŁAŃCUCHY OLIGOSACHARYDOWE ZAWIERAJĄ INFORMACJĘ BIOLOGICZNĄ Między sach ary darni moŜe być tworzona ogromna liczba wiązań glikozyd owych. Na przykład 3 róŜne heksozy mogą łączyć się ze sobą, tworząc ponad 1000 róŜnych trisachary-

Tabela 57-2. Niektóre funkcje łańcuchów oltgosacharydowych glikoprotein* Modulują własności fizykochemiczne, np. rozpuszczalność, lepkość, ładunek i denaturację Ochraniają przed proteolizą zarówno zewnątrz-, jak i śródkomórkową Wpływają na proteolityczną obróbkę białek prekursorowych do mniejszych cząsteczek Wykazują aktywność biologiczną, np. hCG Wpływają na proces wbudowywania do błon, wewnątrzkomórkową migrację, przepuszczalność i wydzielanie Wpływają na rozwój embrionalny i róŜnicowanie Odpowiedzialne są w duŜej części za umiejscowienie się przerzutów nowotworowych * Zaadaptowano z; Schachter H.: Biosynthetic controls that determine the branching and heterogenity of protein-bound oligosaccharides; Bfochem. Celt Bioi 1986, 64, 163.

dów. Konfiguracja przestrzenna cukrów w łańcuchach oligosacbarydowych zmienia się w zaleŜności od rodzaju wiązań i moŜliwości oddziaływania z innymi makrocząsteczkami, znajdującymi się w sąsiedztwie oligosacharydów. Przyjmuje się ogólnie, Ŝe łańcuchy oligosacharydowe kodują znaczną ilość informacji biologicznej, która zaleŜy od składu cukrowego, ich sekwencji i konfiguracji przestrzennej. Dowodem na to są niektóre leki i toksyny, które działają ze specyficznymi łańcuchami oligosacharydów glikokoniugatów powierzchni komórek {jak np. toksyna cholery oddziałuje z gangliozydami Gml; p. rozdz. 16). Ponadto, reszty mannozo-6-fosforanu skierowują nowo syntetyzowane enzymy lizosomalne do wnętrza lizosomów (p. poniŜej).

DOSTĘPNE SĄ TECHNIKI DO WYKRYWANIA, OCZYSZCZANIA I STRUKTURALNEJ ANALIZY GLIKOPROTEIN Wykrywanie Glikoproteiny mogą być wykrywane w róŜnych złoŜonych układach (np. błon komórkowych) metodą elektroforezy Ŝelowej w obecności SDS (SDS-PAGE; p. rozdz. 3) i wybarwiane kwasem nad jodowym i odczynnikiem

Schiffa (PAS), bowiem PAS wywołuje reakcję barwną z grupą aldehydową cukrów. Mogą być one równieŜ wykrywane techniką SPS-PAGE-

GLIKOPROTEINY I PROTEOGLIKANY / 751

-radioautografii, opartej na pomiarze stopnia wbudowywania się odpowiedniego radioaktywnego cukru do komórek. Oczyszczanie i analiza strukturalna Przed przystąpieniem do analizy strukturalnej glikoprotein konieczne jest oddzielenie ich od innych makrocząsteczek. MoŜna to osiągnąć stosując konwencjonalne metody oczyszczania białek. Najcenniejszą techniką stosowaną do oczyszczania glikoprotein okazała się chromatografia powinowactwa, wykorzystująca lektyny do specyficznego wiązania się z pewnymi glikoproteinami (p. poniŜej). Ich skład węglowodanowy oznacza się następnie po hydrolizie kwaśnej, stosując chromatografię gazową z detekcją w postaci spektrometrii masowej (GLC-MS). W przeszłości stosowano róŜne metody pozwalające określić szczegółową strukturę ich łańcuchów oligosacharydowych. Obecnie sto-

suje się GLC-MS^ połączoną z wysokorozdzielczą spektrometrią NMR, co umoŜliwia często całkowite oznaczanie struktury (tzn. składu cukrowego, rodzaj wiązań i ich anomerycznej konfiguracji) łańcuchów glikanowych większości glikokoniugatów. Szczegółowe dane dotyczące wiązań między cukrami w glikoproteinach (co wykracza poza zakres tego rozdziału) są bardzo waŜne w oznaczaniu struktury i funkcji tych makrocząsteczek. SIEDEM DOMINUJĄCYCH CUKRÓW W LUDZKICH GLIKOPROTEINACH ChociaŜ znanych jest ok. 200 naturalnie występujących monosacharydów, to tylko 7 powszechnie występuje w'łańcuchach oligosacharydowych glikoprotein (tab. 57-3). Większość tych cukrów omówiono w rozdz. 14. Kwas

Tabela 57-3. NajwaŜniejsze cukry występujące w ludzkich glikoproteinach. Struktury większości wymienionych cukrów są przedstawione w rozdz. 15. Cukier

Typ

Ga laktoza

Heksoza

Gat

UDP-Gal

Glukoza

Heksoza

Glc

UDP-Glc

Mannoza

Heksoza

Man

GDP-Man

NeuAc

CMP-NeuAc

Występuje często jako terminalny cukier w 0- i N-wiązanych glikoproteinach. Znane są takŜe inne typy kwasów sjalowych, ale w organizmie ludzkim głównie występuje NeuAc

GDP-Fuc

Występuje na zewnątrz łańcuchów 0- i N-wiązanych glikoprotein, lub teŜ moŜe być wiązana do reszty GIcNAc poiączonej N-glikozydowo z Asn

Kwas N-acety- Kwas sjalowy foneuraminowy

Fukoza

UŜywany skrót

Deoksyheksoza Fuc

Alukleotydowy cukier

Uwagi

Występuje w N-wiązanych glikoproteirtach często jako przedostatni cukier wiązany do NeuAc oraz w rdzeniu trisacharydowym proteoglikanów Występuje podczas syntezy N-wiązanych glikoprotein, ale nieobecna w dojrzałych glikoproteinach Główny cukier N-wiązanych glikoprotein

N-acetylogala- Aminoheksoza ktozoamina

GalNAc

UDP-GatNAc

Obecna w 0- i N-wiązanych glikoproteinach

N-acetyloglu- Aminoheksoza kozoamina

GIcNAc

UDP-GIcNAc

Cukier połączony jest z azotem Asn łańcucha polipeptydowego N-wiązanych glikoprotein ale moŜe równieŜ występować w innych pozycjach łańcucha oligosacharydowego tych białek

752 / ROZDZIAŁ 57

N-acetyloneuraminowy (NeuAc) jest terminalnym cukrem łańcucha oligosacharydowego i zwykle przyłączony jest do reszty galaktozy (Gal) lub N-acety!ogaJaktozoaminy. inne przedstawione w tabeli cukry moŜna znaleźć w bardziej wewnętrznych pozycjach.

nej cząsteczki odpowiedniego nukleotydu (np. UMP, GMP lub CMP), powstałego z cukru nukleotydowego. Ten mechanizm zapewnia odpowiednie stęŜenie kaŜdego cukru nukleotydowego wewnątrz aparatu Golgiego. UMP jest tworzony z UDP-Gal w poniŜszej reakcji: a ALAKTOZYLOTRANSFERAZA

CUKRY NUKLEOTYDOWE DZIAŁAJĄ JAKO CUKRY DONOROWE W WIELU REAKCJACH BIOSYNTEZY Pierwszym odkrytym cukrem nukleotydowym była urydynodifosfoglukoza (UDP-Glc). Typowe cukry nukieotydowe biorące udział w biosyntezie glikoprotein są wymienione w tab. 57-3. Nie wiadomo, dlaczego niektóre pochodzą z UDP, a inne z guanozynotrifosforanu (GTP) lub cytydynomonofosforanu (CMP). Te nukleotydy są wykorzystywane w wielu, ale nie we wszystkich reakcjach glikozylacji zachodzących w procesie biosyntezy glikoprotein. (p. poniŜej). Hydrofobowe wiązanie między grupami fosforanowymi a cukrami jest typowym wiązaniem wysokoenergetycznym i ma wysoki potencjał przenoszenia, grup. Zaktywciwane cukry mogą być przenoszone do odpowiednich akceptorów pod warunkiem, Ŝe dostępne są swoiste transferazy. Cukry nukieotydowe są tworzone w cytoplazmie z odpowiednich nukleotydów trifosforanowych. Tworzenie u rydynod i fosforanu galaktozy przebiega w dwóch następujących reakcjach.

białko -. białko-Gal + UDP NUKUEOZYDOD1FOSFOFOSFATAZA

UDP-+UMP+P,

EGZOG LI KOZYDAZY I EN DOG LI KOZYDAZY SĄ UśYTECZNE W BADANIACH GLIKOPROTEIN Pewne glikozydazy o określonej specyfice okazały się uŜyteczne w badaniach aspektów funkcjonalnych i strukturalnych glikoprotein (tab. 57-4). Enzymy te działają albo w zewnętrzTabela 57-4. Niektóre glikozydazy uŜywane do badań struktury i funkcji glikoprotein. Enzymy róŜnego pochodzenia są często specyficzne dla pewnych typów wiązań gtikozydowych, jak teŜ dla ich anomerycznej konfiguracji. Miejsca działania endoglikozydazy F i H pokazane są na ryc. 57-4. F działa na wiązanie glikozydowe łańcuchów oligosacharydowych typu zarówno wysokomannozowego, jak i kompleksowego, podczas gdy H działa tylko na typ pierwszy. Enzymy

PIROFOSFORYLAZA u nr-GLUKOZOWA

UTP-f Glukozo-1 -fosforan * + pirofosforan

UDP-Gal

UDP-GIC +

EPIMiRAZA UDP-Glc

Neuraminidaza Galaktozy da za Endogfikozydaza F Endoglikozydaza H

Typ Egzoglikozydaza Egzoglikozydaza Endoglikozydaza Endoglikozydaza

UDP-Glc<->UDP-Gal

PoniewaŜ większość reakcji glikozylacji zachodzi wewnątrz aparatu Golgiego, systemy przekaźników (permutaz i systemy transportu) transportują cukry nukieotydowe przez błonę aparatu Golgiego. Znane są układy transportujące UDP-Gal, GDP-Man i CMP-MeuAc do cystern aparatu Golgiego. pziałają one na zasadzie anty portu; tzn. dopływowi jednego cukru nukleotydowego towarzyszy odpływ jed-

nej (egzoglikozydazy), albo w wewnętrznej (endoglikozydazy) pozycji iańcucha oligosacharydowego. Przykładami egzoglikozydaz są neuraminidaza i galaktozydaza; uŜyte po kolei powodują usunięcie końcowej reszty NeuAc oraz przedostatniej reszty Gal z większości glikoprotein. Endoglikozydazy F i H są przykładami drugiej grupy enzymów; enzymy te rozrywają łańcuch oligosacharydowy w określonych miej-

GLIKOPROTEINY i PROTEOGUKANY / 7S3

scach występowania reszt GlcNac, w pobliŜu tańcucha^ polipeptydowego (tzn. w wewnętrznych pozycjach) i dlatego teŜ są uŜyteczne w badaniach strukturalnych duŜych łańcuchów oligosacharydowych. Trawienie glikoprotein jedną lub kilkoma z wymienionych glikozydaz wykorzystuje się do badań pewnych procesów biologicznych związanych z usunięciem specyficznych cukrów. Doświadczenia prowadzone przez Ashwella i wsp. na początku lat siedemdziesiątych wykazały, Ŝe odsłonięcie reszt Gal, na skutek działa-' nia neuraminidazy, prowadzi do szybkiego zanikania ceruloplazminy w surowicy. Kolejne prace wykazały, Ŝe na powierzchni komórek wątrobowych znajduje się receptor rozpoznający resztę galaktozylową wieJu desjalizowanych białek osocza (tzn. nie zawierających NeuAc), który zarazem prowadzi do ich endocytozy. Te prace jasno pokazały, Ŝe poszczególne cukry mogą odgrywać główną rolę w spełnianiu przynajmniej jednej biologicznej właściwości (determinują czas przebywania w krwiobiegu) głównych glikoprotein.

LEKTYNY MOGĄ BYĆ UśYWANE DO OCZYSZCZANIA I BADANIA FUNKCJI GLIKOPROTEIN Lektyny są białkami pochodzenia roślinnego, które wiąŜą jeden lub więcej specyficznych cukrów. Ich rola w roślinach jest wciąŜ badana. Wiele lektyn zostało oczyszczonych i więcej niŜ 40 z nich jest dostępna w handlu (tab. 57-5). Lektyny znalazły liczne zastosowanie w badaniach biochemicznych, miedzy innymi:

Tabela 67-5.Trzy iektyny i cukry, z którymi one oddziałują. W większości przypadków lektyny wykazują specyficzność w stosunku do anornerycznej konfiguracji wiązania glikozydowego (a i {'•): to nie jest pokazane w tabeli. Lektyna

Stosowany skrót

Konkanawali-

Con A

Cukier Man i Glc

na

Lektyna sojo-

—

Gal i GalNA

wa

Agtutynina kiełków pszenicy 4S — Biochemia

WGA

GIcNAc i NeuAc

1. W oczyszczaniu i analizie glikoprotein. Lektyny, takie jak* konkanawalina A (Con A), mogą wiązać się kowalencyjnie z podłoŜem obojętnym, takim jak sefaroza. Takie związane cząsteczki sefaroza-Con A mogą być uŜyteczne do oczyszczania glikoprotein, zawierających łańcuchy oligosacharydowe, reagujące z Con A, Jako narzędzie do badań powierzchni ko mórek. PoniewaŜ lektyny rozpoznają specyficz ne cukry, wiec mogą być uŜywane do badań ogólnych reszt cukrowych znajdujących się na powierzchni komórek. Lektyn uŜywano w licz nych badaniach porównawczych glikoprotein powierzchni komórek nowotworowych i prawi dłowych (p. rozdz. 61). Badania te wykazały, Ŝe do spowodowania aglutynacji komórek nowo tworowych w porównaniu z normalnymi po trzebne są mniejsze ilości pewnych lektyn, co sugeruje, Ŝe organizacja i struktura licznych glikoprotein powierzchni komórek nowotworo wych jest inna niŜ ta, którą moŜna spotkać na powierzchni komórek normalnych. Do wytwarzania mutantów komórkowych pozbawionych pewnych enzymów, uczestniczą cych w syntezie oligosacharydów. Okazuje się bowiem, Ŝe jeśh prowadzi się hodowie tkan kowe komórek ssaków w odpowiednim stęŜeniu niektórych lektyn (np. Con A), to większość z nich obumiera, a tylko kilka opornych przeŜy wa. Wykryto, Ŝe takie komórki często pozba wione są pewnych enzymów, które uczestniczą w syntezie oligosacharydów. Przypuszcza się więc, Ŝe komórki są oporne dlatego, Ŝe nie wytwarzają jednej lub więcej powierzchniowych glikoprotein zdolnych do wiązania się z uŜytymi do tego celu lektynami. UŜycie takich mutan tów komórkowych ma istotne znaczenie w wy jaśnianiu licznych aspektów biosyntezy gliko protein.

ISTNIEJĄ 4 GŁÓWNE KLASY GLIKOPROTEIN Na podstawie rodzaju wiązania między łańcuchem polipeptydowym a łańcuchem oligosacharydowym glikoproteiny mogą być podzielone na 4 klasy: 1) zawierające wiązanie między Ser lub Thr a GalNAc (ryc. 57-1), 2) proteoglikany zawierające wiązanie między Ser a Xyi, 3) kolagen zawierający wiązanie między hydroksylizyną (Hyl) a Gal i 4) glikoproteiny zawierające wiązanie między Asn a GIcNAc. W klasach 1, 2 i 3 odpowiednie aminokwasy

754 / ROZDZIAŁ 57 CH2OH

sekwencja jest glikozylowana i to, czy do niej dojdzie, zaleŜy od konformacji przestrzennej białka występującego w siateczce śródplazmatycznej.

Występowanie i struktura łańcuchów oligosscharydowych 0-wiązanych glikoprotein. Wiele glikoprotein tej klasy wykryto w mucynach. O-glikozydowe wiązania występują równieŜ w glikoproteinach krąŜących lub związanych z błonami. Ponadto wykazano, Ŝe GalNAc jest cukrem najczęściej bezpośrednio wiązanym do reszt Ser iub Thr (ryc, 57-1) i zwykle reszta Gal lub NeuAc jest do niej przyłączona. Struktury dwóch typowych łańcuchów oHgosacharydowych tej klasy pokazano na ryc. 57-2. Poznano równieŜ wiele innych odmian.

Ryc. 57-1. Wiązanie N-acetylogalaktozoaminy do seryny i N-aceiyloglukozoaminy do asparaginy,

przyłączone są do reszt cukrowych przez wiązanie O-glikozydowe (tzn. w wiązaniu bierze udział grupa OH ze strony łańcucha aminokwas owego i reszta cukrowa). Natomiast w czwartej klasie występuje wiązanie N-glikozydowe (tzn. w wiązaniu bierze udział N grupy amidowej asparaginy i reszta cukrowa). Klasy 2 i 3 występują stosunkowo rzadko, dlatego teŜ określenia O-wiązane glikoproteiny często uŜywa się, podobnie jak tutaj, do opisywania glikoprotein klasy l^JCtasa 4 określana jest terminem N-wiązane "glikoproteiny. Znane są równieŜ inne mniejsze klasy. Liczba łańcuchów oligosacharydowych przyłączonych do jednego łańcucha polipeptydowego moŜe zmieniać się od 1 do 30 lub więcej, a liczba reszt cukrowych tworzących jeden łańcuch oligosacharydowy waha się od 2 lub 3 do bardzo wielu. Ponadto, niektóre glikoproteiny zawierają łańcuchy oligosacharydowe zarówno O-, jak i N-wiązane. O-wiązane glikoproteiny zawierają tripeptydową sekwencję Asn-Y-Ser (Thr) Większość połączeń O-glikozydowych występuje przy wolnych grupach OH reszt Ser i Thr polipeptydu z tripeptydową sekwencją Asn-Y-Ser (Thr), gdzie Y jest dowolnym aminokwasem, innym niŜ asparaginian. Ta specyficzna

NeuAc

°2'6

GalNAc

■ Ser(Thr)

GalNAc •Ser(Thr) NeuAc

Ryc. 57-2. Struktury dwóch O-wiązanych oligosacharydów występujących w (A) mucynach śli-nianek podszczękowych i (B) fetuinie oraz sjalo-glikoproteinie bfon ludzkich erytrocytów. (Według; LennarŜ W. J.: The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans; Plenum Press, 1980, za zezwoleniem)

Biosynteza O-wiązanych glikoprotein. Polipeptydowe łańcuchy tych i innych glikoprotein są kodowane przei mRNA; poniewaŜ większość glikoprotein to integralne białka błonowe lub białka sekrecyjne, toteŜ ogólnie moŜna powiedzieć, Ŝe ulegają one translacji na polirybosomach związanych z błonami (p. rozdz. 40). Łańcuchy oligosacharydowe typu O-glikozydowo wiązanych glikoprotein są wytwarzane przez stopniowe dodawanie cukrów pochodzących z cukrów nukleotydowych, takich jak UDP-GalNAc, UDP-Gal i CMP-NeuAc. Enzymy katalizujące ten typ reakcji są glikozyiotransferazami glikoproteinowymi związanymi

GLIKOPROTEINY I PROTEOGLIKANY / 755

z błonami. Synteza kaŜdego takiego enzymu jest kontrolowana przez jeden specyficzny gen. Ogólnie moŜna powiedzieć, Ŝe synteza jednego specyficznego typu wiązania wymaga aktywności odpowiednio specyficznej transferazy (tzn. obowiązuje załoŜenie „jedno wiązanie — jedna glikozylotransferaza"). Enzymy katalizujące dodawanie wewnętrznych reszt cukrowych znajdują się w siateczce śródplazmatycznej i dodawanie pierwszych cukrów następuje podczas translacji (tzn. występuje kotranslacyjna modyfikacja białka). Natomiast enzymy dodające końcowy cukier (taki jak NeuAc) znajdują się w aparacie Golgiego. N-wiązane glikoproteiny zawierają wiązanie Asn-GIcNAc Ta klasa wyróŜnia się obecnością wiązania Asn-GIcNAc (ryc. 57-1). Jest ona główną klasą glikoprotein, dobrze zbadaną, dzięki łatwej dostępności do tkanek, w których występuje (np. białka osocza). NaleŜą do niej zarówno glikoproteiny, będące integralnymi białkami błonowymi jak teŜ białkami krąŜącymi (osoczowymi). Główne róŜnice między nimi, jak równieŜ poprzednimi klasami, poza rodzajem aminokwasu, do którego są przyłączone łańcuchy oligo-

Kwas sjalowy

sacharydowe (głównie Asn zamiast Ser), dotyczą ich biosyntezy.

Klasy IV-wiązanych glikoprotein i ich struktury. Znane są 3 główne klasy N-wiązanych glikoprotein: kompleksowe, hybrydowe i wysokomannozowe (ryc. 57-3). Częścią wspólną w tej klasie jest pentasacharyd (Man)3 (GlcNAc)2, wyróŜniony linią przerywaną na ryc. 57-3, jak równieŜ na ryc. 57-4. RóŜnią się one między sobą jedynie zewnętrznymi rozgałęzieniami. Obecność wspólnego pentasacharydu dowodzi, Ŝe wszystkie 3 klasy mają wspólny ogólny mechanizm biosyntezy. Glikoproteiny typu kompleksowego zwykle zawierają końcową resztę NeuAc oraz charakterystyczne reszty Gal i GlcNAc, które często są składnikami laktozoaminy (obecność powtarzającego się fragmentu laktozoaminy (Galp>4GlcNAc P l-3)n jest charakterystyczna dla czwartej klasy glikoprotein, tzw. klasy polUaktozoaminowej; klasa ta jest waŜna, poniewaŜ do niej naleŜą substancje grupowe krwi I/i. Większość oligosacharydów typu kompleksowego zawiera 2, 3 lub 4 zewnętrzne rozgałęzienia (ryc. 57-3), chociaŜ opisano takŜe struktury zawierające 5 rozgałęzień. Rozgałęzienia oligosacharydów są często nazywane

Kwas sjatowy O2,3lub6

a2,3 Iub6

l 6 Man (31,4 aUl

Man

GtcŃAc

±GlcNAc-

GlcNAc

Man

Man

.1.3^

^ .6

GtcNAc

Man

Man

Man

Man

a1>X

Man Man

*

Man-« p •-■■■ GicNAc i01,4

J -------------- »-Man i 01,4 GIcNAe I 01,4

±Fuc

Man

«1,2|

■ GlcNAc

Man

aUl Man

Man

X^V6 Man 101,4

GlcNAc |01,4

GlcNAc |01,4

GlcNAc

GlcNAc

^ GlcNAc

L ---- !------------ 1 --------Asn

Asn

Asn Wysoko man noŜowe Hybrydowe

Kompleksowe

Ryc. 57-3. Struktury głównych typów asparaginowiązanych oligosacharydów. WyróŜniony obszar jest rdzeniem pentasacharydowym, powszechnie występującym we wszystkich N-wiązanych glikoproteinach. (Według: Kornfeld R., Kornfeld S: Assembly óf asparagine-linked oligosaccharides^mw. Rev. Biochetn. 1985, 54, 631, za zezwoleniem). ________ - ___________________________________________ \

756 / ROZDZIAŁ 57 Endogllkozydaza F ' 04 04 * Man ------ GIcNAc —j- GIcNAc —*—

Asn Man-a3 Enduglikozydaza H Ryc. 57-4. Schematyczny diagram podstawowego rdzenia peniasacharydowego wszystkich Nwiązanych oligosacłiarydów, do którego mogą być przyłączone róŜne łańcuchy oligosacharydowe. Wskazane są równieŜ miejsca działania endoglikozydaz F i H.

antenami i struktury takie określa się jako bi-, tri-, tetra- i pentaantenowe. W typie kompleksowym glikoprotein występuje ogromna liczba łańcuchów oligosacharydowych, a struktura przedstawiona na ryc. 57-3 jest jedną z wielu. Inne łańcuchy kompleksowe mogą być zakończone Gal lub Fuc. Łańcuchy oligosacharydowe typu wysokoman noŜowego zawierają dodatkowo 2—6 reszt Man przyłączonych do rdzenia pentasacharydowego. Makrocząsteczki typu hybrydowego mają cechy charakterystyczne dla obu tych typów.

Przegląd procesów związany 2 biosyntezą N-wiązanych giikoprotein. Leloir i wsp. opisali występowanie oligosacharydu związanego z difosibdolicholem (aligosacharydo-P-P-DoI), który pełni główną rolę w biosyntezie N-wiązanych glikoprotein. Ogólną strukturę łańcucha oligosacharydowe go tego związku moŜna przedstawić następującym wzorem (Glc)3(ManyGJcNAs)rR. gdzie R = P-P-Dol. W pierwszym etapie biosyntezy cukry najpierw przyłączone są do difosfodolicholu, a później łańcuchy oligosacharydowe są przenoszone w całości do odpowiednich reszt Asn, będących akceptorami apoglikoprotein podczas syntezy

na polirybosomach związanych z błonami. Łańcuchy oligosacharydowe typu kompleksowego powstają na skutek usunięcia reszt Glc i 6 Man, tworząc rdzeń pentasacharydu (Man)3(GlcNAc)2 (ryc. 57-4). Następnie określone glikozylotransferazy, zlokalizowane najczęściej w aparacie Golgiego, przenoszą charakterystyczne dla łańcucha kompleksowego cukry (GIcNAc, Gal, NeuAc) na odpowiedni akceptor. Natomiast łańcuchy wysokomannozowe powstają przez przyłączanie reszt Gal lub usuwanie pewnych peryferyjnych reszt Man. Proces, w wyniku którego łańcuchy głikanowe N-wiązanych glikoprotein są najpierw częściowo usuwane, a potem przebudowywane, określa się jako proces przekształcania (obróbki) oUgosacharydów. Początkowe etapy biosyntezy N- i O-wiązanych glikoprotein znacznie róŜnią się między sobą. I tak w biosyntezie N-wiązanych glikoprotein uczestniczy oligosacharyd-P-P-Dol, natomiast nie uczestniczy on w biosyntezie O-wiązanych glikoprotein. W procesie tym moŜna wyróŜnić dwa etapy: 1) tworzenie i przeniesienie oligosacharydu-P-P-dolicholu, 2) obróbka łańcuchów oligosacharydowych.

1. Tworzenie i przeniesienie związków typu oligosacharyd-P-dolichol- poliizoprenol występuje zarówno w tkankach eukariotycznych, jak i u bakterii. Ten nośnik prekursorowych jednostek oligosacharydowych bierze udział w syntezie błon komórkowych bakterii, jak równieŜ w biosyntezie Nwiązanych glikoprotein. W tkankach eukariotycznych do syntezy wykorzystywany jest dolichol, związek naleŜący do rodziny poliizoprenoii. Dolichol, obok gumy, jest najdłuŜszym naturalnie występującym węglowodorem: składa się on z 17—20 powtarzających się pojedynczych podjednostek izoprenoidowych (ryc. 57-5).

i H I HO-CH,-CH,-CCH,-

I

CH, I ■CHiCH=;C-CHj

CH,

I CH,~CH=C-CHj

CH,

Ryc. 57-6. Struktura dolicholu. Fosforan w fosforanie dolicholu połączony jest z grupą alkoholową, po lewej stronie cząsteczki. Fragment objęty klamrą jest częścią izoprenu (n = 17—20 jednostek izoprenoidowych).

GLIKOPROTEINY I PROTEOGLIKANY / 757

W biosyntezie oligosacharydu-P-P-dolicholu bierze udział fosfodolichol (Dol-P), który powstaje w reakcji dolicliotu z ATP (nośnik fosforanu), katalizowanej przez kinazę dolicholową. GkNAc-difosfo-doUchol (GlcNAc-P-P-Dol) jest głównym lipidem, spełniającym rolę akceptora dla innych cukrów tworzących oligosacharyd-P-P-Dol. Jest on syntetyzowany na błonach szorstkiej siateczki śródpiazmatycznej z Dol-P i UDP-GlcNAc w następujących reakcjach: Dol-P : UDP-GIcNAc GIcNAc-P-P-Dol+UMP

Reakcja ta jest pierwszym etapem tworzenia oligosacharydu-P-P-Dol. Kolejne reakcje przedstawione są na ryc. 57-6. Dalsze etapy tworzenia się oligosacharydu-P-P-dolicholu przebiegają następująco: a. Druga reszta GlcNAc zostaje przeniesiona na pierwszą, przy czym UDP-GlcNAc jest jej nośnikiem.

b. Następnie przyłączonych zostaje 5 reszt Man, pochodzących z GDP-Man. c. W końcu przyłączone zostają 4 kolejne reszty Man, pochodzące z Dol-P-Man. DoJ-P-Man powstaje w następującej reakcji: Dol-P + GDP-Man <-> Dol-P-Man + GDP

d. Biosyntezę oligosacharydu prekursorowego kończą 3 reszty glukozy przeniesione z Dol-P-Glc. Dol-P-Glc powstaje w reakcji podobnej do wyŜej przedstawionej z lą róŜnicą, Ŝe Dol-P i UDP-Glc są substratami. NaleŜy zwrócić uwagę na to, Ŝe pierwsze 7 cukrów (2 reszty GlcNAc i 5 reszt Man) pochodzi z cukrów nukleotyd owych, podczas gdy 7 ostatnich cukrów W resziy Man i 3 reszty Glc) jest przenoszonycn^z cukrów dolicholowych. Rezultatem powyŜszych reakcji jest związek przedstawiony na ryc. 57-7. Jego wzór sumaryczny moŜna podać jako (Glc)3(Man)9 (GlcNAc)2-P-P-Dol.

UDPGIcNAc Dol-P ■>*---------Tunlkamycyna -UMP M-M

GlcNAc-P-P-Dol UDPGtaNAc

M M-M

M-tG!cNAc)s~P-P-Doi

UDP G-G-G-M-M-M GlcNAc-

,P-Dol

Gl GDP-M M-P-Dol iG-P-Dol GDP" M-GIcNAc-GIcNAc-P-P-

{Ml.-(GlcNAc),-P-P-Dol P-Dol

Dol M

M-P-Dol M-(GlcNAc)i-P-P-Dol

(GOP-M),

M-M-M

Ryc. 57-8. Szlak biosyntezy dolicholo-P-P-oligosachsrydu. Rodzaje powstałych specyficznych wiązań sa pokazane na ryc. 57-7. MoŜna zauwaŜyć, Ŝe zewnętrzne resay mannozy pochodzą z GDP-mannozy, podczas gdy większość reszt mannozy i glukozy pochodzi z dolicholo-P-rnannozy i doticholo-P-glukozy. UDP-urydynod(fosforan;Ool—dolichol; P—fosforan; UMP — urydynomonofosforan,GDP — guanozynomonofosforan; M — mannoza; G — glukoza. __________________________________________

758 / ROZDZIAŁ 57 Bi.2 Man ■ Man ^■Man

Man 1.3

Ma n j SiS iUGlc NAc —* Glc NAc -P -P -Do llc h ol •a 1,3

_L2*Ma»^Man£H*Man

Ryc. 57-7. Struktura dolicholo-P-oligosacharydu. {Według: Lennarz W, J.; Glycoproteins and Proteoglycans; Plenum Press, 1980, za zezwoleniem).

Oligosacharydy związane z difosfodolicholem są przenoszone w całości na nowo zsyntetyzowane białko związane z błoną szorstkiej siateczki śródplazmatycznej. by wytworzyć Nglikozydowe wiązanie z jedną lub kilkoma specyficznymi resztami Asn łańcucha polipeptydowego. Reakcja jest katalizowana przez „transferazę oligosacharydową", która jest enzymem związanym z błoną wewnętrzną siateczki. Transferaza ta moŜe rozpoznać i przenieść kaŜdy lipid o strukturze R-(GlcNAc)2-P-P-Dol. Glikozylacja zachodzi na resztach Asn tripeptydowej sekwencji Asn-X-Ser/Tłir, gdzie X jest dowolnym aminokwasem, innym niŜ reszty proiiny i kwasu asp ara gin owego. Uprzywilejowanymi miejscami do glikozylacjijest tripeptyd wykazujący konformację przestrzenną p. Tylko ok. \'i reszt Asn ulega glikozylacji i białka podatne na ten proces moŜna podzielić na dwie grupy: sekrecyjne i integralne błonowe. Białka cytoplazmy stosunkowo rzadko ulegają glikozylacji. Na ryc. 57-8 przedstawiono reakcję przeniesienia oraz późniejszy proces gliksj^lacji N-wiązanych glikoprotein, jak równieŜ lokalizację tych ostatnich w strukturach subkomórkowycłi. Drugim produktem reakcji katalizowanej przez transferazę oligosacharydową jest dolicholo-P-P, który pod wpływem fosfatazy ulega konwersji do dolicholo-P, Dolicholo-P moŜe ponownie słuŜyć jako akceptor w syntezie innej czą steczki o I ig osa c h a ry do- P- P-dolich o lu. 2. Przekształcanie (obróbka) łańcuchów otigosacharydowych.

a. Wcześniejsza faza. Na rycinie 57-8 pokazane są róŜne typy reakcji biorących udział w tym procesie. Reakcję 1 katalizuje transferaza oligosacharydową (p. poniŜej), W reakcji 2 i 3 kolejno usuwane są: przez glukozydazę I końcowa reszta Glc oraz przez glukozydazę II dwie reszty Glc. W przypadku glikoprotein typu wysoko ma nnozowego proces ten moŜe być za-

The Biochemisłry of ________

trzymany na tym etapie, lub teŜ mogą dodatkowo zostać usunięte 4 reszty Man. Natomiast łańcuchy typu kompleksowego tworzone są w dalszych etapach. Mianowicie 4 zewnętrzne reszty Man są usuwane w reakcjach 4 i 5 przez róŜne mannozydazy. W reakcji 5, katalizowanej przez GlcNAc-transferazę I, reszta GlcNAc jest dodawana do jednej Man. Działanie kolejnego enzymu, mannozydazy (ot-mannozydazy II aparatu Golgiego) umoŜliwia przebieg reakcji 7, w wyniku której dochodzi do redukcji reszt Man w rdzeniu do 3 reszt (ryc. 57-4). Na rycinie 57-8 reakcje I i II przedstawiają dodatkowy waŜny szlak metaboliczny przekształcania oligosacharydów. Przedstawiona jest tutaj synteza jednostek oligosacharydowych enzymów Hzosomalnych, które po uzyskaniu specyficznego markera kierowane są do lizosomów. W reakcji I reszta GlcNAc-1-P jest przenoszona na grupę OH przy węglu 6 jednej lub więcej reszt Man tych enzymów. Reakcja ta, przedstawiona niŜej, jest katalizowana przez GlcNAc-fosfotransferazę. Nośnikiem GlcNAc jest UDP-GlcNAc, zaś produktem reakcji UMP. | Glc-NAC-FOSFOTRAMSFERAZA |

UDP-GtellAc+Man-BialkoiGIcNAc-i-P-e-Man-Białko+UMP

W reakcji II reszta GlcNAc jest usuwana pod wpływem fosfodiesterazy, pozostawiając fosforylowane reszty Man w pozycji 6 Man. j FOSFODIESTEHAZA | GlcNAc-1-P-6-Man-Białko i P-6-Man-Białko+GlcNAc

Receptor dla Man-6-P zlokalizowany w aparacie Golgiego wiąŜe resztę Man-6-P i kieruje ją potem do lizosomów. Fibroblasty pochodzące od pacjentów, u których stwierdza się chorobę

GUKOPROTEINY I PROTEOGLIKANY / 759 SZORSTKIE RETIKULUM S ROD PLAZM ATYCZ NE'

Ryc. 57-8. Schematyczny szlak biosyntezy oligosacharydów. Reakcje są katalizowane przez następujące enzymy: 1 — oligosacłiarylotransferaza, 2 — a-glukozydaza I, 3 — a-glukozydaza II, 4 — ct1,2-mannozydaza, I. N-acetyloglukozoaminylofosfotransferaza, II. N-acetyio-glukozoamino-1-fosfodiestero-s-N-acetyloglukozoaminidaza siateczki śródplazmatycznej, 5 — a-mannozydaza I aparatu Golgiego, 6 — N-acetyloglukozoaminylotransferaza I, 7 — %- ma n noŜy baza II aparatu Golgiego, 8 — N-acetylologlukozoaminylotransferaza II, 9 — fu kozy I otrą n sfer aza, 10 — galaktozylotransferaza, 11 —sjalilotransferaza, ■— N-acetyloglukozoamina, O — mannoza, A — glukoza, A — fukoza, • — gaiaktoza, ♦ — kwas sjalowy. (Według: Kornfeld R.. Kornfeld S.: Assembly of asoaragine-Nnked oligosaccharides; Annu. Rev. Biochem. 1985, 54, 631, za zezwoleniem). ____ ________________________

wtrętów komórkowych (I-cell disease) (p. poniŜej) mają receptory dla fosfomannoŜowych oligosacharydów, lecz wykazują duŜy niedobór GlcNAc-fbsfotransferazy. b. Późniejsza faza. Łańcuchy oligosacharydowe typu kompleksowego tworzą się dzięki przyłączaniu dodatkowych cukrów do jednostek oligosacharydowych powstałych w reakcji

7. W reakcji 8 druga reszta GlcNAc jest dodawana do zewnętrznej reszty Man innych rozgałęzień biantenowej struktury pokazanej na ryc. 57-8: enzymem katalizującym ten etap jest GlcNAc-transferaza II. Natomiast w reakcjach 9, 10, i 11 katalizowanych przez fukozylo-, gaiaktozylo- i sjalilotransferazy kolejno dodawane są reszty Fuc, Gal i NeuAc.

760 / ROZDZIAŁ 57

S u bk om orko we miejsca. Głównymi miejscami, w których zachodzi proces glikozylacji, są siateczka śródplazmatyczna i aparat Golgiego, co pokazano na ryc. 57-8. Łańcuchy oligosacharydowe są przyłączone w szorstkiej siateczce śródplazmatycznej i jest to zjawisko zarówno ko-, jak i potranslacyjne. W siateczce śródplazmatycznej zachodzi równieŜ odcinanie reszt GIc oraz niektórych peryferyjnych reszt Man. Aparat Goigiego składa się ze specyficznych cystern, mianowicie: cis, środkowych i trans, które mogą być rozdzielone za pomocą odpowiedniego wirowania. Glikoproteiny powstałe w siateczce śródplazmatycznej przenoszone są potem do cystern cis Golgiego. Wiele róŜnych badań potwierdziło, Ŝe enzymy uczestniczące w procesie syntezy glikoprotein wykazują swoistą lokalizację w cysternach Golgiego. Jak wynika z ryc. 57-8 oc-mannozydaza I aparatu Golgiego (katalizująca reakcje 5) znajduje się głównie w rejonie cis aparatu Golgiego, podczas gdy GlcNAc-transferaza (katalizująca reakcję 6) okazała się być obecna w rejonie środkowym aparatu Golgiego. Natomiast fukozylo-, galaktozyio- i sjalilotransferazy (katalizujące reakcje 9, 10 i 11) obecne są w rejonie trans aparatu Golgiego. W regulację procesu glikozylacji glikoprotein wciągniętych jest wiele enzymów i kolejność działania tych enzymów Jest oczywiste, Ŝe glikozylacja glikoprotein jest procesem złoŜonym, w którym bierze udział wiele enzymów. Udowodniono, Ŝe w tym złoŜonym procesie uczestniczy 7 glikozylotransferaz, ale teoretycznie moŜe występować wiele innych. Znane są liczne rodzaje innych glikozylotransferaz (np. sjalilotransferazy). Pierwsze etapy biosyntezy N-wiązanych glikoprotein (tzn. tworzenie i przenoszenie oligosacharydów) są kontrolowane przez następujące czynniki: 1) obecność odpowiednich miejsc akceptorowych na białku, 2) odpowiednie stęŜenie Dol-P w tkankach i 3) aktywność transferazy oligosacharydowej. Proces przekształcania łańcuchów oligosacharydowych równieŜ podlega kontroli. Tymi czynnikami kontrolującymi są: 1) aktywność w komórkach róŜnych hydrolaz i transferaz biorących udział w syntezie róŜnych typów łańcuchów oligosacharydowych (np. typu kompleksowego czy wysokomannozowego); oczywiście, jeśli swoista transferaza nie występuje

w tkance, to odpowiednie wiązanie cukrów nie powstaje; 2) niektóre z enzymów mogą działać dopiero po uprzednim działaniu innych enzymów, np. działanie GlcNAc-transferazy I (ryc, 57-8) umoŜliwia następną reakcję katalizowaną przez oc-mannozydazę II aparatu Golgiego; 3) aktywności róŜnych transferaz zmieniają się w czasie cyklu Ŝyciowego organizmów, co częściowo wyjaśnia fakt tworzenia róŜnych łańcuchów oligosacharydowych podczas kolejnych etapów tego cyklu; 4) fakt, Ŝe poszczególne glikozyl o transferazy mają róŜną wewnątrzkomórkową lokalizację sprawia, Ŝe pełnią one waŜną rolę w regulacji procesów biosyntezy glikoprotein, np. jeśli syntetyzujące sie białko ma być integralnym białkiem błonowym siateczki śródplazmatycznej (np. HMG-CoA), to nigdy nie jest transportowane w rejonie aparatu Golgiego, gdzie mogłoby napotkać enzymy przekształcające białka znajdujące się w tym rejonie; zgodnie z tym nie jest zaskoczeniem, Ŝe reduktaza HMG-CoA jest glikoproteiną wysokomannozową; 5) inny waŜny czynnik to konformacja przestrzenna białka. Badania biosyntezy glikoprotein przez spokrewnione wirusy wykazały, Ŝe zawierają one róŜne typy łańcuchów oligosacharydowych, kiedy były hodowane w tej samej komórce; ten fakt moŜna by najlepiej wytłumaczyć tym, Ŝe białka mają róŜną konformację przestrzenną, która decyduje o miejscach glikozylacji; 6) profile enzymów uczestniczących w procesie przekształcania jednostek oligosacharydowych wykazują znaczne róŜnice między gatunkowe; jednostki oligosacharydowe wirusa Sindbis, w zaleŜności od komórki gospodarza, w której były hodowane, mogą być typem wysokomannozowym lub kompleksowym; 7) interesujące są równieŜ badania aktywności enzymów róŜnych typów komórek nowotworowych; są dowody, Ŝe komórki nowotworowe syntetyzują róŜne łańcuchy oligosacharydowe (np. często mają więcej rozgałęzień) w porównaniu do komórek kontrolnych. Interesująca wydaje się korelacja między aktywnością specyficznych enzymów uczestniczących w przekształceniach potranslacyjnych a zdolnością nowotworów do tworzenia przerzutów (p. rozdz. 61). Wiele substancji hamuje proces glikozyiacji Znane są liczne związki, które hamują róŜne etapy przekształcania glikoprotein. Przykładami takich związków mogą być: tunikamycyna,

GUKOPROTEINy I PROTEOGUKANY / 761 Tabela 57-6. Trzy inhibitory enzymów uczestniczących . w procesie glikozylacji glikoprotein i miejsca ich działania Inhibitor Miejsce działania Tunikamycyna Inhibitor enzymu katalizującego dodawanie reszty GIcNAc do Dolichol-P w pierwszym etapie biosyntezy oligosacharydu-P-P-dolicholu Deoksynojirimycyoa Inhibitor glikozydazy i i II Swainsomria Inhibitor mannozydazy II

deoksynojirimycytia i swainsonina. W tabeli 57-6 przedstawiono działanie tych inhibitorów. Związki te mogą być uŜywane jako czynniki hamujące róŜne etapy biosyntezy glikoprotein, jak równieŜ do badania skutków tego hamowania. Na przykład, jeśli komórki są hodowane w obecności tunikamycyny, to proces syntezy N-wiązanych glikoprotein nie nastąpi. Działanie tych inhibitorów w pewnych przypadkach wzmaga wraŜliwość białek na proteolizę. Okazało się, Ŝe hamowanie glikozylacji przez róŜne inhibitory nie wpływa w sposób stały na sekwencję normalnie wydzielanych białek.

CHOROBA WTRĘTÓW KOMÓRKOWYCH (I -CELL DISEASE) JEST WYNIKIEM NIEMOśNOŚCI UMIESZCZENIA ENZYMÓW L1Z0S0MALNYCH W LIZOSOMACH Jak to wyjaśniono powyŜej, Man-6-P jest chemicznym markerem kierującym enzymy li2osomalne do lizosomów. Badania hodowli fibroblastów pochodzących od pacjentów, u których rozpoznano chorobę wtrętów komórkowych (l-cell disease), wykazały istotną rolę tego markera w tym procesie chorobowym. Okazało się bowiem, Ŝe fibroblasty zmienione chorobowo mają małe stęŜenie prawie wszystkich enzymów lizosomalnych, a lizosomy gromadzą duŜe ilości nie zdegradowanych róŜnych makrocząsteczek. JednakŜe w surowicy pacjentów z tym schorzeniem stwierdza się znacznie zwiększone stęŜenie tych enzymów, co sugeruje, Ŝe enzymy lizosomalne są syntetyzowane, ale nie mogą dostać się do wewnątrzkomórkowych miejsc przeznaczenia. Dodanie do hodowli fib-

roblastów pochodzących od pacjentów, u których rozpoznano wymieniona chorobę, enzymów lizosomalnych otrzymanych od zdrowych osobników wykazało, Ŝe komórki mają zdolność wychwytywania egzogennych enzymów lizosomalnych, co dowodzi, Ŝe posiadają normalne receptory dla enzymów lizosomalnych. Badania te sugerują, Ŝe enzymy lizosomalne chorych z chorobą wtrętów komórkowych najprawdopodobnej nie mają markera rozpoznającego, a enzymy lizosomalne zdrowych osobników mają go. Fibroblasty pacjentów z chorobą wtrętów komórkowych, mimo Ŝe mają receptory dla fosfomannozowych oligosacharydów, nie są w stanie umieścić tego markera na jednostkach wielomannoŜowych hydrola2 lizosomalnych, gdyŜ nie mają GlcNAc-fosfotransferazy uczestniczącej w "f^tn procesie. Te badania biochemiczne nie tylko wyjaśniły patogenezę opisywanej choroby, ale równieŜ przyczyniły się do poszerzenia wiedzy na temat transportu nowo syntetyzowanych białek do specyficznych organelli, w tym przypadku do lizosomów.

PROTEOGLIKANY I GLIKOZOAMINOGLIKANY Glikozoaminogłikany występujące w proteoglikanach zbudowane są z powtarzających się jednostek disacharydowych

Proteoglikany są białkami złoŜonymi, zawierającymi kowalencyjnie przyłączone glikozoaminoglikany (GAG). Białka kowalencyjnie wiąŜące GAG nazywane są rdzeniami białkowymi; wyizolowanie tych makrocząsteczek w formie nie zdegradowanej sprawia wiele trudności, ale wprowadzenie nowoczesnej techniki inŜynierii genetycznej do badań nad proteoglikanami dostarcza coraz to waŜniejszych informacji na temat ich struktury. Ilość składnika cukrowego przypadająca na łańcuch polipeptydowy w proteoglikanach jest znacznie większa niŜ w glikoproteinach, sięga aŜ 95% ich całkowitej masy. Znanych jest 7 rodzajów GAG: kwas hialuronowy, siarczan chondroityny, siarczan keratanu I i II, heparyna, siarczan heparanu i siarczan dermatanu. GAG są nierozgalęzionymi polisacharydami złoŜonymi z powtarzających się jednostek disacharydowych, gdzie jednym ze składników jest zawsze aminocukier (stąd nazwa GAG), tj. D-glukozoamina lub D-galaktozoa-

762 / ROZDZIAŁ 57

mina, drugim zaś (wyjątkiem jest siarczan keratanu) kwas uronowy, tj. kwas D-glukuronowy (GlcUA) lub jego epimer, kwas L-iduronowy (IdUA). Z wyjątkiem kwasu hialuronowego, wszystkie GAG zawierają grupę siarczanową, w postaci albo O-estrowej, albo N-siarczanowej (jak w heparynie i siarczanie heparanu). Kwas hialuronowy jest jedynym wyjątkiem, bowiem brak jednoznacznych dowodów na temat kowalencyjnego połączenia tego kwasu z białkiem, co wynika z powyŜszej definicji proteoglikanów. W przeszłości napotykano wiele trudności związanych z wyodrębnieniem tych złoŜonych makrocząsteczek. JednakŜe są one waŜnymi składnikami substancji podstawowej tkanki łącznej, pełniącymi wiele istotnych biologicznych funkcji, co więcej, w róŜnych stanach chorobowych, w których dochodzi do przebudowy tkanki, zachodzą równolegle zmiany w proteoglikanach. Nic dziwnego, Ŝe związki te są przedmiotem wzrastającego zainteresowania. Biosynteza proteoglikanów obejmuje przyłączenie glikozoaminoglikanów do rdzenia białkowego, wydłuŜenie i zakończenie łańcuchów

Przyłączenie do rdzenia białkowego. Znane są 3 typy wiązania między GAG a rdzeniem białkowym. O-gHkozydowe wiązanie między ksylozą (Xyl) a seryną (Ser), które występuje tylko i wyłącznie w proteogtikanach. Powstaje ono przez przeniesienie reszty Xyl z LJDP-ksylozy na Ser. Następnie dwie reszty Gal są dodawane do reszty Xyl, tworząc charakterystyczny trisacharyd Gal-Gal-Xyl-Ser: Dalszy wzrost łańcuchów GAG zachodzi na końcowej reszcie Gal. O-glikozydowe wiązanie tworzone między GalNAc a Ser (Thr), występujące w siarczanie keratanu II. Powstaje ono dzięki przeniesieniu GalNAc z UDP-GlcNAc na Ser (lub Thr) łańcucha poiipeptydowego. N-glikozydowe wiązanie między GLcNAc a azotem amidowym Asn, które jest charak terystyczne dla N-wiązanych glik o protein. W syntezie tego wiązania uczestniczy oligosacharyd-P-P-Dol, co zostało opisane powyŜej. Synteza rdzenia białkowego, jak teŜ powstawanie niektórych wiązań, zachodzi w siateczce śródplazmatycznej. Natomiast większość późniejszych etapów biosyntezy łańcucha GAG i ich modyfikacje następują w aparacie Golgiego.

WydłuŜanie łańcucha. Do syntezy łańcuchów GAG wykorzystywane są odpowiednie cukry nukleotydowe i wysoce specyficzne glikozylotransferazy, znajdujące się w aparacie Golgiego. Obowiązuje nadal zasada , jedno wiązanie—jeden enzym", podobnie jak dla pewnych typów wiązań występujących w glikoproteinach. Enzymy biorące udział w procesie wydłuŜania łańcucha są zdolne do wiernej reprodukcji złoŜonych GAG.

Zakończenie (terminacja) łańcuchowa. Jest ono wynikiem: 1) siarczanowania określonych pozycji pewnych cukrów, 2) wydłuŜenia łańcuchów GAG daleko poza błonami, gdzie zachodzi kataliza.

Dalsze modyfikacje. Po utworzeniu łańcuchów GAG, zachodzą liczne chemiczne modyfikacje, polegające na wprowadzeniu grupy siarczanowej do określonej pozycji GalNAc oraz na epimeryzacji reszt GlcUA do IdUA. Proces siarczanowania, katalizowany przez odpowiednie sulfotransferazy, przebiega przy udziale 3'-fosfoadenozyno-5'-fosfosiarczanu (PAPS, aktywny siarczan), będącego nośnikiem grupy siarczanowej. Sulfotransferazy znajdujące się w aparacie Golgjego są enzymami wysoce specyficznymi, katalizującymi siarczanowanie cukrów w róŜnych pozycjach (np. przy węg\u w pozycji 2, 3, 4 i 6). Epimeryzację reszt kwasu glukuronowego do iduronowego katalizują epimerazy. Poszczególne rodzaje glikozoaminoglikanów wykazują subtelne róŜnice w strukturze oraz charakterystyczne rozmieszczenie Siedem wymienionych wyŜej GAG róŜni się między sobą następującymi właściwościami: składem aminocukrowym, występowaniem kwasu glukuronowego lub iduronowego, typem wiązania między składnikami jednostek disacharydowych, długością jaricucha, występowaniem lub nie grup siarczanowych, składem aminokwasowym rdzeni białkowych, typem wiązania między rdzeniem białkowym a GAG, rozmieszczeniem w poszczególnych tkankach i strukturach subkomorkowych oraz funkcjami biologicznymi. PoniŜej omówiono krótko strukturę GAG (ryc. 57-9), ich połączenia z rdzeniem białkowym lub innymi białkami oraz ich' rozmieszczenie w tkankach. Charakterystyczne właś-' ciwości tych 7 GAG wymienione są w tab. 57-7.

GL1K0PR0TE1NY I PROTEOGLIKANY / 763 Kwas hialu ronowy Siarczany chondroityny

G , cUA £* GalNAc

i

.Ga, £11 Gat Ą Xy( JL. Ser

4- lub 6-Siarczan Siarczany keratanu 1 i ii

"5-* GlcNAc—-* Asn (Siarczan keratanu I) GlcNAc ^Gal ^GlcNAc

6-Siarczan

+

f Heparyna I siarczan heparan u

6-Siarczan I —* W UA — GlcN —• GlcUA -^ GlcNAc -^ GlcUA ^* Gaf -^ Gal -^ X Y I — Ser

1

I

2-Slarczan Siarczan ćermatanu

6-Siarczan ""GalNAc-^-* Thr ISer)[Siarczan | keratanu I!) Gal-NeuAc

SO3- or Ac

—> IdUA —> GalNAc —- GlcUA —- GalNAc — GlcUA —* Gal —' Gal ^ Xy1 — Ser

I

I

3-Siarczan 4-Siarczan Ryc. 57-9. Struktury proteoglikanów i glikozoaminoglikanów. GlcUA — kwas D-glukuronowy; IdUA — kwas L-iduronowy: GlcN — D-glukozoamina; GaIN — D-galaktozoamina; Ac — acetyl; Gal — galaktoza; Xyl — ksyloza; Ser — L-seryna; Thr — L-treonina; Asn — asparagina; Man — mannoza; NeuAc — kwas N-acetyloneuraminowy. Przedstawione wzory tych makrocząsteczek obrazują jedynie skład jakościowy, nie odzwierciedlając w petni ich struktury. śadna z wymienionych struktur nie oddaje wiernie wszystkich moŜliwości podstawienia dodatkowej grupy, np. w heparynie większość reszt kwasu iduronowego zawiera w pozycji 2 grupę siarczanową, natomiast w siarczanie dermatanu tylko niektóre reszty^ tego kwasu są podstawione siarczanem. W siarczanie chondroityny, dermatanu, heparanu i heparynie pokazano równieŜ charakterystyczny obszar wiąŜący GAG-i z rdzeniem białkowym {-Gal-Gal-Xy)-). {Według; Lennarz W. J.: The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans, Plenum Press, 1980, zmodyfikowane, za zezwoleniem).

Tabela B7-7. Główne właściwości glikozoaminoglikanów GAG

Cukry

HA

GIcNac, GlcUA

CS

GalNAc, GlcUA

KSI

Siarczan —

Wiązanie do białka

Występowanie

brak dowodów

Płyn stawowy, ciałko szkliste, luźna tkanka łączna

f lub 6' GalNAc

Xyl-Ser; łączy się z HA przez białka

Chrząstka, kość, rogówka

GlcNAc, Gal

6' GlcNAc, 6'Gal

GIcNAc-Asn

Rogówka

KS II

GlcNAc, Gal

jak w KS 1

GalNAc-Thr

Luźna tkanka łączna

Heparyna

GlcN, IdUA

N GlcN, 6rGlcN, 2'ldUA

Ser

Mastocyty

Siarczan heparanu

GlcN, GlcUA

N GlcN, 6'GlcN

Xyl-Ser

Fibroblasty skóry, ściana aorty

Siarczan dermatanu

GalNAc, idUA (GlcUa)

4'GalNAc 2'ldUA

Xyl-Ser

Powszechnie występujący

764 / ROZDZIAŁ 57

Kwas hialuronowy. Kwas hialuronowy jest nierozgałęzionym łańcuchem polisacharydowym, złoŜonym z powtarzających się jednostek disacharydowych, zawierających GlcUA i GlcNAc. W przeciwieństwie do innych GAG nie tworzy on kowalencyjnego wiązania z białkami. Występuje on w komórkach bakteryjnych, jak równieŜ powszechnie w róŜnych tkankach zwierzęcych i ludzkich (np. w płynie stawowym, ciałku szklistym oka i w luźnej tkance łącznej). Siarczany chondroityny (chondroityno-4-siarczan i chondroityno-6-siarczan). Proteoglikany powstałe w wyniku Oglikozydowego wiązania Xyl-Ser-O- z siarczanem chondroityny są głównymi składnikami

chrząstki. Jednostki disacharydowe siarczanu chondroityny i kwasu hialuronowego są bardzo podobne, zawierają GlcUA, z tą jednak róŜnicą, Ŝe siarczan chondroityny zawiera GałNAc zamiast GlcNAc. Ponadto, reszta GalNAc jest podstawiona w pozycji 4 tub 6 siarczanem. W przybliŜeniu 1 grupa siarczanowa przypada na 1 jednostkę disacharydową. KaŜdy łańcuch tego GAG złoŜony jest z ok. 40 jednostek disacharydowych, a jego masa wynosi 20 000. Wiele takich łańcuchów jest przyłączonych do pojedynczego łańcucha polipeptydowego, tworząc proteoglikany o duŜej masie cząsteczkowej (np. w chrząstce nosa masa cząsteczkowa proteoglikanu w przybliŜeniu wynosi 2,5 x 106). Siarczany chondroityny łączą się bardzo silnie z kwasem hialuronowym za pośrednictwem 2 „białek wiąŜących", które wiąŜą się hydrofobowo zarówno z kwasem hialuronowym, jak i rdzeniami białkowymi, tworząc w tkance łącznej bardzo duŜe makrocząsteczki, nazywane agregatami (p. ryc. 57-10 i 57-11). Ryc. 57-11. Schematyczne przedstawienie agregatu proteoglikanu. (Według: Lennarz W J.: The

Kwas hialuronowy Siatka wiąŜące Siarczan keratanu rczan chondroityny Rdzeń białkowy

Podjednostk!

Ryo. 57-10. Obraz elektronomikroskopowy agregatu proteoglikanu średniej wielkości, w którym podjednostka (monomer) proteoglikanu i -filamemy rdzenia są znacznie powiększone. {Według: Rosenberg L, Hellman W., Klein-Schmidt A, K.: Electron microscopic studies of proteogiycan aggregates from bovinearticularcartilage; J. Biol. Chem. 1975; 250; 1877, za zezwoleniem).

Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans; Plenum Press, 1980, za zezwoleniem).

GLIK0PR0TE1NY I PROTEOGLIKANY / 785

Siarczany keratanu I i II. Jak przed-

Siarczan dermatanu. Powszechnie wystę-

stawiono na ryc, 57-9 składają się z powtarzających jednostek disacharydowych Gal-Gk NAc. Mogą one zawierać grupę siarczanową w pozycji 6 GlcNAc lub czasem Gal. Typ 1 tego GAG występuje przede wszystkim w rogówce, typ II, obok siarczanu chondroityny i kwasu hialuronowego, w luźnej tkance łącznej. Typ I i II róŜnią się sposobem wiązania z białkiem (ryc, 57-9). Heparyna. Powtarzająca się jednostka disacharydowa złoŜona jest z glukozoaminy (GlcN) i kwasu gtukuronowego lub iduronowego (ryc. 57-12). Większość grup aminowych GlcN jest N-siarczanowana, a nieliczne acetylowane. Ponadto, GlcN w pozycji 6 zawiera cstrowo związaną grupę siarczanową. W heparynie ok. 90% kwasu uranowego to IdUA. W pierwszym etapie biosyntezy GAG powstający łańcuch zawiera kwas glukuronowy, aie w wyniku procesu epimeryzacji z udziałem 5-epimerazy 90% reszt GlcUA zostaje przekształconych do reszt IdUA. Cząsteczka białka proteoglikanu heparyny jest wyjątkowa, składa się bowiem wyłącznie z reszt seryny i glicyny. Przeciętnie */a reszt seryny jest połączonych z łańcuchem GAG, tworząc proteoglikan o masie cząsteczkowej 5000—15 000 lub czasem większy. Heparyna występuje w 2iarnistościach komórek tucznych, a takŜe w wątrobie, w płucach i skórze. Siarczan heparanu. Występuje jako proteoglikan zarówno na powierzchniach komór* kowych. jak i pozakomórkowo. Zawiera on GlcNAc z mniej licznymi resztami siarczanowymi niŜ heparyna i w odróŜnieniu od heparyny głównym kwasem uranowym jest GlcUA. Reszta GlcNAc moŜe być podstawiona kilkoma grupami siarczanowymi.

puje w tkankach zwierzęcych. Strukturalnie jest podobny do siarczanów chondroityny i siarczanu heparanu. Jego struktura jest podobna do siarczanu chondroityny z tą jednak róŜnicą, Ŝe w miejscu GlcUA związanego z GatNAc wiązaniem 0-1,3 znajduje się IdUA związany z GlcNAc wiązaniem a-1,3. Synteza IdUa odbywa się podobnie jak w heparynie czy siarczanie heparanu, tj. przez 5-epimeryzację. GlcUA. PoniewaŜ proces ten jest regulowany przez stopień siarczanowania, w przypadku niecałkowitego siarczanowania siarczan dermatanu składa się zarówno z disacharydu: IdUA-GalNAc, jak i GlcUA-GalNAc.

GlcN

IdUA

GlcN

IdUA

Niedobory enzymów degradujących

glikozoaminoglikany glikopyoteiny są przyczyną mukopolisacharydoz i mukołipidoz

Zarówno egzo-, jak i endoglikozydazy degradują GAG. Podobnie jak i inne biomakroezijsteczki, GAG podlegają procesom metabolicznym, zarówno syntezy, jak i degradacji. Ich pótokres przemiany, w tkankach dojrzałych, jest stosunkowo krótki, rzędu kilku dni do paru tygodni. Poznanie szlaku degradacji glikoprotein, proteoglikanów i GAG w znacznym stopniu przyczyniło się do wykrycia wrodzonych wad metabolicznych, wynikających z niedoboru specyficznych enzymów. Do tych odkryć znacznie przyczyniły się badania dotyczące 2 grup chorób: mukopolisacłiarydoz i mukołipidoz. Początkowo sądzono, Ŝe mukolipidozy są wynikiem tylko zaburzeń w metabolizmie mukopolisacharydów (GAG) lub glikosfingoiipidów, dopóki nie wykazano, Ŝe równieŜ degradacja łańcuchów oligosacharydowych glikoprotein moŜe

GlcN

GlcUA

GlcNAc

Ryc. 57-12. Struktura heparyny. Fragment polimeru przedstawia charakterystyczne strukturalne cechy typowej heparyny. JednakŜe na tej rycinie została przedstawiona wybrana sekwencja róŜnie pod stawionych powtarzających się jednostek disacharydowych. Dodatkowo mogą równieŜ występować w pozycji 3 niesiarczanowane bądź siarczanowane reszty glukozoaminy. (Według: Undahl U. i wsp.: Structure and biosynthests of heparin like polisaccharides; Ferf. Proc. 1977, 36, 19, za zezwoleniem; zmodyfikowana). _____________________________

766 / ROZDZIAŁ 57

być upośledzona. Wszystkie schorzenia tej grupy, z jednym wyjątkiem, wykazują wspólne cechy: tj. niedobór aktywności enzymu degradującego (zwykle zlokalizowanego w lizosomach), rezultatem czego jest nagromadzenie się substratu w róŜnych tkankach. Nagromadzenie się substratu moŜe być przyczyną powiększenia narządu, zaburzeń w strukturze kości, skóry, upośledzenia umysłowego i innych anomalii zaleŜnych od nasilenia niedoboru enzymu i rozmieszczenia substratów w tkankach. Wyjątkiem jest choroba wtrętów komórkowych, która polega na niemoŜności umiejscowienia enzymów lizosmnalnych w lizosomach, co opisano wcześniej w tym rozdziale. Tabela 57-8 przedstawia biochemiczne defekty występujące w tych schorzeniach i związane z nimi zaburzenia. W większości przedstawionych w tabeli mukolipidoz w moczu stwierdza się wzrost zawartości frakcji glikoprotein, spowodowany blokiem metabolicznym. Endoglikozydazy, egzoglikozydazy i sulfatazy uczestniczą w procesie degradacji łańcuchów polisacharydowych GAG. Hialuronidaza jest szeroko rozpowszechnioną endoglikozydazą, rozszczepiającą wiązanie heksozoamidynowe. Działając na kwas łualuronowy generuje ona tetrasacharyd o strukturze (GlcUA-pi,3-GlcNAc-pi,4)2. Ponadto degraduje ona równieŜ siarczan chondroityny. Do tej pory nie została opisana jednostka chorobowa spowodowana niedoborem tego enzymu. Tetrasacharyd powstały w wyniku działania hialuronidazy moŜe być dalej degradowany przez pglukuronidazę i p-N-acetyloheksozoaminidaP-glukouronidaza jeSt egzoglikozydazą, która usuwa GlcUA i ldUA z nie redukującego końca tetrasacharydu lub długich polisacharydów. Substratami dla niej są: siarczan dermatanu, siarczan heparanu, siarczan chondroityny i kwas hialuronowy. Wrodzony niedobór tego enzymu u ludzi jest przyczyną wydzielania z moczem pierwszych trzech wymienionych GAG, z wyjątkiem kwasu hialuronowego. Przypuszcza się, Ŝe tetrasacharyd powstały w wyniku trawienia kwasu hialuronowego hialuronidazą jest dalej metabolizowany w innym szlaku. p-D-acetyloheksozoaminida2a jest egzoglikozydazą, obecną w większości tkanek ssaków. Katalizuje ona reakcję hydrol i tycznego odszczepienia GlcNAc i GalNAc połączonych wiązaniem p-gh'kozydowym z nie redukującym końcem polisacharydów. Substratami dla tego

enzymu są: gangliozydy, siarczany chondroityny, kwas hialuronowy, siarczan dermatanu i siarczany keratanu I i II. Znane są dwa izoenzymy p-D -acety lohek sozoaminidazy: A i B. lzoenzym A składa się z 2 róŜnych podjednostek cc i P, natomiast izoenzym B tylko z podjednostki p. Zaburzenia w strukurze tych izoenzymów są przyczyną niektórych schorzeń, np. w chorobie Taya-Sachsa wadliwa jest podjednostka a, więc izoenzym A jest nieaktywny. W chorobie Sandhoffa z kolei wadliwa jest podjednostka p, co wywołuje niedobór obu izoenzymów A i B. Oba te schorzenia powodują zwykle zgon niemowlęcia, gdyŜ dochodzi do znacznego gromadzenia gangliozydów GM2 w mózgu. Wymienione choroby są raczej klasyfikowane jako sfingolipidozy (p. tab. 25-1), a nie mukopolisacharydozy, gdyŜ powstają głównie w wyniku zaburzeń procesów degradacji gangliozydów, P-galaktozydaza (egzoglikozydazą) występuje w kilku postaciach w tkankach zwierzęcych. Siarczan chondroityny i siarczan keratanu zawierają resztę P-galaktozydową, która moŜe być substratem dla kwaśnej galaktozydazy. Niedobór kwaśnej galaktozydazy jest przyczyną gromadzenia się siarczanu keratanu i fragmentów glikoprotein, włącznie z gangliozydami GM, (p. rozdz. 26). oc-L-iduronidaza jest lizosomalną egzoglikozydazą, usuwającą IdUa z nie redukującego końca łańcucha polisacharydowego. Niedobór tego enzymu obserwuje się w zespole Hurler. Sulfataza iduronianowa jest specyficznym enzymem katalizującym odszczepianśe grupy siarczanowej w pozycji C2 reszty IdUA na nie redukującym końcu heparyny, siarczanu heparanu i siarczanu dermatanu. Dziedziczny niedobór tego enzymu stwierdza się w zespole Huntera. Aktywności wymienionych enzymów oraz innych przedstawionych w tab. 57-8 mogą być oznaczone w fibrobiastaoh skóry, leukocytach, komórkach owodni, a czasem równieŜ w surowicy. Badania stwierdzające wzrost ilości GAG w moczu mają równieŜ zastosowanie diagnostyczne.

Proteoglikany spełniają liczne funkcja Ogólne uwagi. Jak wykazano powyŜej, proteoglikany w znacznym stopniu są złoŜonymi makrocząsteczkami, występującymi we wszystkich tkankach organizmu, głównie w pozakomórkowej macierzy lub w substancji pod-

Tabela 57-8. Biochemiczne defekty i diagnostyczne i mukolipidozach oraz związane z nimi zaburzenia *

Nazwa

Stosowane skróty

GLIKOPROTEINY 1 PROTEOGLIKANY / 767 testy stosowane w mukopolisacharydozach

Enzymatyczny defekt

Wykrywane metabolity w moczu

M u kopo 1 i sachary dozy Zespól Hurler, Scheiego Hurler/Scheiego

MPSI

Niedobór a-L-iduronidazy

DS, HS

Zespół Huntera

MPS II

Niedobór sulfatazy iduronianowej

DS, HS

Zespół Sanfilippo A

MPS IM A

Niedobór N-sulfatazy HS (sulfamidazy)

HS

Zespół Sanfilippo B

MPS Ml B

Niedobór a-N-acetyloglukozoaminidazy

HS

Zespół Sanfilippo C

MPS III C

Niedobór acetyl otrą nsfe razy

HS

Zespół Morguio

MPS IV

Niedobór N-acetylogalaktozb* 6-sulfatazy

KS

Zespół Morquio podobny

—

Niedobór p-galaktozydazy

KS

Zespół Morteaux-Lamy

MPS VI

Niedobór N-acetylogalaktozoamino-4-sulfatazy {ary losu Ifatazy B)

DS

Zespól niedoboru p-glukurontdazy

MPS VII

Niedobór fl-glukuronidazy

DS, HS(Ŝ)

Zespoły dotychczasowo bezimienne

MPS VIII

Niedobór N-acetylog!ukozoamino-6-sulfatazy

HS, KS

Niedobór sjalidazy (neuraminidazy) Niedobór N-acetyloglukozoaminofosfotra nsfe razy (kwaśne hydrolazy wykazują brak reszt fosfomannozowych)

GF

(i)

Mukolipidozy i podobne do nich zaburzenia Sjalidoza

ML !

Choroba wtrętów komórkowych (l-cell disease)

ML I I

Poltdystrofia pseudohurlerowska

ML Hl

Jak w ML 1) ale niedobór jest całkowity

GF

ZłoŜony niedobór sulfataz

—

Niedobór sulfatazy A i innych enzymów

DS, HS

Mannozydaza

—

Niedobór a-mannozydazy

GF

Fukozydaza

—

Niedobór a-L-fukozydazy

GF

GF

MPS — mukopolisacha/ydoza; ML — mukolipidoza; DS — siarczan dermatanu; KS —siarczan keratanu; HS — siarczan heparanu; GF — fragment glikoprotein. * Zmodyfikowano za zgodą DiNatale P., Neyfeld E. F.: The biochemicai diagnosis of mucopolisaccharidoses, mucolipidosisand relateddisorders. W. PerspectivesininheritedMetaboiic diseases. Vol2.Barra B i wsp. (red,): Editiones Ermes Milan 1979), Większość ww, enzymów moŜe być oznaczana w fibroblastach, leukocytach, tkankach, w komórkach płynu owodniowego oraz surowicy.

768 / ROZDZIAŁ 57

stawowej tkanki łącznej. Ponadto, niektóre z nich mogą łączyć się z innymi składnikami macierzy, np. z kolagenem czy elastyną, co jest istotne dla utrzymania właściwej struktury organizacji tkanki łącznej. Ponadto niektóre proteoglikany oddziałują z pewnymi białkami adhezyjnymi, takimi jak fibronek tyna czy laminina (p. rozdz. 59). GAG obecne w proteoglikanach są polianionaim. dlatego teŜ wiąŜą polikationy i kationy, takie jak Na* i K+. Dzięki tym ostatnim dochodzi do hydratacji tkanki łącznej i nadania jej odpowiedniego napięcia. Przy stosunkowo niskich stęŜeniach GAG wykazują skłonności do Ŝelowania. Ich długie łańcuchy polisacharydowe oraz właściwości Ŝelujące sprawiają, Ŝe działają one w poza komórkowej macierzy jak sito, uniemoŜliwiając przedostanie się duŜych makrocząsteczek, natomiast ułatwiają przenikanie małym cząsteczkom. Ponadto, dzięki swej rozciągniętej strukturze i występowaniu często w postaci wielkocząsteczkowych agregatów proteoglikany zajmują względnie duŜą objętość macierzy w stosunku do innych białek.

Niektóre funkcje specyficznych GAG i (lub) proteoglikanów. Kwas hialuronowy w szczególnie duŜym stęŜeniu występuje w tkankach embrionalnych. Sądzi się, Ŝe pełni on waŜną rolę w migracji komórek podczas morfogenezy i w procesach naprawczych. Jego zdolność do zatrzymywania wody w pozakomórkowej macierzy sprawia, Ŝe ta ostatnia ulega zwiotczeniu, co moŜe mieć znaczenie dla wymienionych procesów. DuŜe stęŜenie kwasu hialuronowego i siarczanów chondroityny w chrząstce zapewnia tej tkance utrzymanie właściwej spręŜystości i wytrzymałości. Siarczan chondrcityny występuje w miejscach wapnienia w kościach śródchrzęstnych. Obecność jego stwierdza się równieŜ w obrębie neuronów, gdzie moŜe tworzyć śródkomórkowy szkielet umoŜliwiający utrzymanie stałego kształtu tych komórek. Zarówno siarczan keratanu I, jak i siarczan riermatanu występują w rogówce. Umiejscowione są między włóknami kolagenowymi. Podstawową ich funkcją jest zapewnienie rogówce wysokiej przezroczystości. W przypadku uszkodzenia powierzchni rogówki stwierdza się zmiany w składzie proteoglikanów, które zanikają w przypadku wygojenia się wymienionych uszkodzeń. Siarczan dermatanu obecny w twardówce odpowiedzialny jest za utrzymanie właściwego kształtu gałek ocznych. Heparyna jest waŜnym anty koagulantem. Łą-

czy się ona z IX i X czynnikiem krzepnięcia. Najistotniejsze jest jednak jej oddziaływanie z osoczową antytrombiną III. Wiązanie się heparyny z tym białkiem osoczowym w stosunku 1:1 znacznie przyspiesza zdolność antytrombiny III do inaktywacji proteaz serynowych, w szczególności trombiny. Ponadto, wiązanie się heparyny do reszt lizyny antytrombiny III powoduje zmiany konfonnacyjne, które sprzyjają łączeniu się z proteazami serynowymi. Heparyna moŜe równieŜ wiązać się specyficznie z lipazą lipoproteinową, obecną w naczyniach włosowatych, przyczyniając się do uwalniania tego enzymu do krwiobiegu. Pewne proteoglikany (np. siarczan heparanu) wbudowane są w błonę plazmatyczną komórek, a ich rdzenie białkowe zapewniają tym błonom odpowiednie napręŜenie. Ponadto, na powierzchni komórki mogą one działać jak receptory i uczestniczyć we wzroście komórek i oddziaływaniach komórka-komórka. W hodowlach komórkowych siarczan heparanu uczestniczy w procesie łączenia się komórek do substratów. Te proteoglikany znaleziono równieŜ w błonach podstawnych kłębuszków nerkowych,, razem z kolagenem typu IV i laminina (p. rozdz. 59), gdzie determinują selektywnośc filtracji kłębuszkowej cząsteczek zaleŜną od ładunku. Obecność proteoglikanów stwierdzono równieŜ w wewnątrzkomórkowych organellach, jak np. w jądrze komórkowym. Ich funkcja w tej strukturze subkomórkowej nie została jednak wyjaśniona. Ich obecność wykazano równieŜ w ziarmstościach. spichrzeniowych łab wydzielniczych, np. w ziarnis teściach chromochlonnych komórek rdzenia nadnerczy. Przypuszczano, Ŝe proteoglikany odgrywają pewną rolę w uwalnianiu zawartości tych ziarnistości. RóŜne Funkcje GAG zestawiono w tab. 57-9.

Udział w patogenezie waŜnych chorób i w procesie starzenia. Kwas hialuronowy umoŜliwia migrację komórek nowotworowych przez macierz pozakomórkową. Komórki nowotworowe mogą poWdzać fibroblasty do wzmoŜonej syntezy GAG, co być moŜe jest powodem ich łatwego rozprzestrzeniania się. Ponadto, niektóre komórki nowotworowe zawierają stosunkowo niewielkie ilości siarczanu heparanu, który najczęściej występuje w postaci związanej z błoną komórkową, co z kolei powoduje zanik zdolności adhezyjnych tych komórek. W skład śródbłottka (intimy) ściany naczyń wchodzą: proteogiikany zawierające kwas bia(uronowy, siarczan chondroityny, siarczan der-

GLIKOPROTEINY I PROTEOGLIKANY / 769 Tabela 57-9. Niektóre funkcje GAG i (lub) proteoglikanów*. Strukturalne składniki poza komórkowej (EC) macierzy Specyficzne oddziaływania z kolagenem, elastyną, fibronektyną, lamininą i innymi białkami macierzy Jako polianionowe substancje wiąŜą polikationy i kationy Uczestniczą w kształtowaniu charakterystycznego napięcia róŜnych tkanek Działają jak sita w EC macierzy Ułatwiają migrację komórek (HA) Odgrywają istotną rolę w spręŜystości i wytrzymałości chrząstki (HA i CS)

W róŜnych postaciach zapalenia stawów proteoglikany mogą ' działać jak autoantygeny, uczestnicząc w patogenezie tych schorzeń. Wiadomo równieŜ, Ŝe wraz z wiekiem zmniejsza sie zawartość w chrząstce siarczanu chondroityny. natomiast wzrasta ilość siarczanu keratanu i kwasu hialuronowego. Zmiany te mogą przyczyniać się do rozwoju zmian zwyrodnieniowych u ludzi starych. Wraz z wiekiem obserwuje się takŜe zmiany w zawartości niektórych GAG w skórze, co moŜe wyjaśnić jej charakterystyczne zmiany starcze. <

PIŚMIENNICTWO

Zapewniają przezroczystość rogówce (KS I i DS) Strukturalna rola w twardówce (DS) Antykoagulacyjne właściwości (heparyna) Składniki plazmatycznych błon komórkowych, gdzie mogą działać jak receptory i uczestniczyć w adhezji komórek i oddziaływaniach komórka-komórka (np. HS) Składniki pęcherzyków synaptycznych i innych (HS) Determinują selektywność filtracji kłębuszkowej zaleŜną od ładunku (HS) * Stosowane skróty: HA— kwas hialuronowy; CS — siarczan chondroityny; KS I — siarczan keratanu I; DS — siarczan dermatanu; HS — siarczan heparanu.

mataou i siarczan heparanu. Z wymienionych proteoglikanów siarczan dermatanu wiąŜe osobowe lipoproteiny niskiej gęstości. Co więcej, jest on głównym GAG syntetyzowanym przez miocyty naczyniowe. PoniewaŜ są to komórki, które w procesie miaŜdŜycowym bardzo łatwo proliferują, uwaŜa się, Ŝe siarczan dermatanu moŜe pełnić istotną rolę w rozwoju blaszki miaŜdŜycowej.

49 — Biochemia

Buckwalter JA, Rosenber&^C: Electron microscopic studies of cartilage proteoglycans. J Biol Chem 1982;257;9830. DiNatale P, Neufeld EF: The biochemical diagnosis of mucopolysaccharidoses, mucolipidosis and related disorders. In; Perspectives in Inkerited Metabo* lic Diseases. Vol 2. Barra B et al (editors). Editiones Ennes (Milaa), 1979. Hóok M et al: Cell-surface glycosaminoglycans, Annu Rev Biochem 1984;53:847. Jagues LB: Heparin: an old drug with a new paradigm. Saence 1979;206:528. Kornfeld R, Kornfeld Sr Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. Annu Rey Biochem 1985;54:631. Kornfeld S, Sly WS: Lysosomal storage defects. Hosp Prąd (Aug) 1985;20:71. Lennarz WJ: The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans. Plenum Press, 1980. Poole AR; Proteoglycans in health and disease: structures and functions. Biockem J 1986;236:1. Poole AR et al: Proteogiycans from bovine nasal cartilage: Immunochemical studies of link protein. J. Biol Chem 198O;255:9295. Schachter H: Biosynthetic controls that determine the branching and heterogeneity of protein-bound oligosacchartdes. Biochem Celi Biol 1986;64:163,

58

Białka osocza, immunoglobuliny i czynniki krzepnięcia Elizabeth J. Harfenist, PhD, Robert K. Murray. MD PhD

WPROWADZENIE Krew krąŜy w zamkniętym układzie naczyń krwionośnych. Zawiera ona elementy morfotyczne — czerwone i białe krwinki oraz płytki krwi — zawieszone w płynnym środowisku osocza. Jak zostanie to omówione poniŜej, krew — a w szczególności osocze — spełnia wiele funkcji niezwykle istotnych dla zachowania zdrowia. Faza płynna krwi pozostała po jej skrzepnięciu nosi nazwę surowicy. Nie ma ona w swym składzie czynników krzepnięcia, w tym fibrynogenu, które prawidłowo występują w osoczu, lecz zuŜywają się podczas procesu krzepnięcia. Surowica zawiera pewne produkty degradacji czynników krzepnięcia, które powstają w tym procesie, a zwykle nie występują w osoczu.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Niezwykle istotna rola jaką spełnia krew w utrzymaniu homeostazy oraz łatwość, z jaką moŜe być ona uzyskiwana do analiz sprawiły, Ŝe badania jej składników nabrały szczególnego znaczenia w rozwoju biochemii i biochemii klinicznej. Hemoglobina, albuminy, immunoglobuliny oraz róŜne czynniki krzepnięcia są

jednymi z najczęściej badanych białek. Zaburzenia w stęŜeniu poszczególnych białek osocza występują w wielu chorobach i mogą być monitorowane metodami elektroforetycznymi. Zmiany aktywności pewnych enzymów w osoczu mają przydatność diagnostyczną w wielu stanach patologicznych {p. Dodatek). Zaburzenia krzepnięcia stanowią powaŜny problem medyczny, a zakrzepica w naczyniach wieńcowych

lub mózgowych jest główną przyczyną zgonów w wielu rejonach świata. Racjonalne postępowanie w tych stanach patologicznych wymaga zrozumienia podstaw krzepnięcia krwi i fibry nolizy.

KREW SPEŁNIA WIELE FUNKCJI Funkcje krwi — z wyjątkiem swoistych dla elementów komórkowych, jak transport tlenu i odporność komórkowo-zaleŜna — spełniane są przez osocze i jego składniki. Zostały one wymienione w tab. 58-1. Tabela 58-1. Główne funkcje krwi 1

Oddychanie — transport tlenu z płuc do tkanek, oraz dwutlenku węgla z tkanek do płuc OdŜywianie — transport wchłoniętych sub stancji odŜywczych Wydalanie — transport zbędnych metaboli tów do nerek, płuc, skóry i jelit w celu ich usunięcia Utrzymywanie prawidłowej równowagi kwasowo-zasadowej w organizmie Regulacja gospodarki wodnej przez wpływ krwi na wymianę wodną między płynem tkan kowym i jego pulą krąŜącą Regulacja temperatury ustrojowej poprzez dystrybucję energii cieplnej w organizmie Obrona przed zakaŜeniem za pośrednictwem białych krwinek i krąŜących przeciwciał Transport hormonów i regulacja metabolizmu

9. Transport metabolitów 10. Krzepnięcie

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 771

Osocze składa się z wody, elektrolitów, metabolitów, składników pokarmowych, białek i hormonów. Zawartość wody i elektrolitów jest praktycznie taka sama jak we wszystkich płynach pozak om orkowych. Oznaczanie stęŜenia Na, K, Ca i Cl w surowicy oraz ciśnienia cząstkowego dwutlenku węgla i pH krwi (p. Dodatek) oddają nieocenione usługi w procesie leczenia wielu chorych. Osocze zawiera bardzo złoŜoną mieszaninę białek StęŜenie białka całkowitego w osoczu ludzkim wynosi ok. 70—75 g/l {7,0—7,5 g/dl). Stanowią one główną część stałych składników osocza, BiaJka osocza są bardzo złoŜoną mieszaniną, zawierającą nie tylko białka proste, lecz równieŜ złoŜone, takie jak glikoproteiny i wiele rodzajów lipoprotein. W osoczu krwi człowieka znajduje się tysiące przeciwciał, chociaŜ zawartość poszczególnych ich rodzajów w warunkach prawidłowych jest zwykle stosunkowo mała. Względne rozmiary i masy cząsteczkowe kilku spośród białek osocza przedstawiono na ryc. 58-1.

Albumina 69,000 10 nm

Skaia

Hemoglobina 64,450

Na+ Cl" Glukoza

■jr-GlobuNna 156,000

0,-Globullna 90,000

o,-Li po protein a 200,000 /(,-Li po proteina 1,300,000

Fibrynoge n 340,000

Ryc. 58-1. Względne wymiary i masy cząsteczkowe białek krwi (Oncley).

Rozdziału poszczególnych białek z mieszaniny dokonuje się często za pomocą róŜnych rozpuszczalników i (lub) elektrolitów w celu usunięcia róŜnych frakcji białkowych zgodnie z ich charakterystyczną rozpuszczalnością. Na zasadzie tej bazują tzw. metody wysalania, które znalazły pewne zastosowanie w oznaczaniu frakcji białkowych w laboratorium klinicznym. Stosując róŜne stęŜenia siarczanu sodowego lub siarczanu amonowego moŜna rozdzielić białka osocza na 3 główne grupy — fibrynogen, albuminy i globuliny.

Powszechnie uŜywaną metodą analizy białek osocza jest elektroforeza. W róŜnych jej rodzajach stosuje sie odmienne nośniki. W laboratoriach klinicznych szeroko stosowany jest octan celulozy, który pozwala na rozdzielenie białek osocza na 5 frakcji—albuminy, alfa2, p i y-globuliny (ryc. 58-2). Wybarwione paski octanu celulozy (lub innego nośnika) określa się jako elektroforegram. StęŜenie kaŜdej spośród 5 frakcji moŜna wygodnie określić posługując się densytometrem. Tabela 7 Dodatku przedstawia główne białka osocza stwierdzone we frakcjach a,, oc2 i y. W Dodatku wymieniono takŜe wiele schorzeń, w których stęŜenia albumin, globulin i fibrynogenu ulegają zmianie. StęŜenie białka w osoczu jest istotne dla rozmieszczenia płynu między krwią a tkankami Osocze krwi zgodnie z definicją jest płynem wewnątrznaczyniowym. W części tętniczej układu krąŜenia, wewnątrznaczyniowe ciśnienie hydrostatyczne wytwarzane przez serce i duŜe naczynia jest o 20—25 mmHg wyŜsze niŜ w tkankach. Ciśnieniu hydrostatycznemu przeciwstawia się wewnątrznaczyniowe ciśnienie koloidoosmotyczne generowane przez białka osocza. Przeciwdziała ono nadmiernemu przemieszczaniu płynu z wewnątrz do pozanaczyniowej przestrzeni. Gdy stęŜenie białka w osoczu znacznie się zmniejsza (np, w cięŜkim niedoŜywieniu białkowym), płyn nie jest wciągany z powrotem do łoŜyska naczyniowego, lecz gromadzi się w przestrzeni pozanaczyniowej, co prowadzi do powstania obrzęków. Spośród wielu przyczyn tego stanu jedną jest niedobór białka. Białka osocza badano bardzo dokładnie Ze względu na dość duŜą łatwość uzyskiwania, białka osocza były szeroko badane zarówno u ludzi, jak u zwierząt. Istotne informacje

772 / ROZDZIAŁ 58

Ryc. S8-2. Technika elektroforezy strefowej na octanie celulozy: A— matą ilość surowicy lub innego płynu nanosi się na pasek z octanu celulozy, B — przeprowadzany jest rozdział elektroforetyczny białek zawartych w próbce w elektrolitowym środowisku buforu, C — po zabarwieniu rozdzielone pasma białkowe uwidaczniają się w charakterystycznych dla nich miejscach, D — za pomocą pomiarów densytometrycznych rozdział elektroforetyczny na octanie celulozy przekształcany jest do diagramu, na którym odpowiednie charakterystyczne „piki" symbolizują; albuminy, a.,-globuliny, 0(2-globuliny, (J-globuliny i y-gfobuliny. {Według: Stites D. P., Stobo J. D.,Wells J.V.: BasieandC/imca//mmuno/ogy,\/vyd.6rApp\etonand Lange, 1987, za zezwoleniem).

uzyskano na temat biosyntezy, metabolizmu, struktury i funkcji głównych biatek osocza. Przedmiotem wielu badań były równieŜ zmiany w ich stęŜeniu i metabolizmie w wielu stanach chorobowych. W ostatnich latach sklonowano oraz zbadano struktury genów dla wielu białek osocza. Uzyskanie przeciwciał swoistych dla poszczególnych białek^osocza znacznie ułatwiło ich analizę dzięki moŜliwościom precypitacji oraz wyizolowania czystych białek ze złoŜonej mieszaniny występującej w tkankach lub w osoczu. Zastosowanie izotopów promieniotwórczych z kotei pozwoliło poznać ich szlaki biosyntezy oraz szybkość metabolizmu w osoczu. Na podstawie badań białek osocza wyłania się 6 następujących uogólnień:

1. Większość białek osocza syntetyzowana jest w wątrobie. Stwierdzono to badając zwierzęta po wykonanej doświadczalnie hepatektomii oraz stosując perfundowane preparaty wyizolowanej wątroby, jej skrawki, homogenaty iub systemy translacji uŜywając mRNA ekstrahowanego z wątroby. y-Globuliny syntetyzowane sa przez komórki piazmatyczne, a pewne białka osocza jeszcze w innych miejscach, np. w komórkach śródbłonka.

2. Białka osocza są syntetyzowane głównie przez polirybosomy związane z błonami. Przed wejściem do osocza przechodzą głównym szlakiem wydzieiniczym komórki, obejmującym szorstką i gładką siateczkę śródplazmatyczną, aparat Golgiego oraz błony cytoplazmatyczne. Większość spośród białek osocza jest syntetyzowana jako prebiałka mające peptydy sygnałowe na N-końcu (p. rozdz. 43). Podlegają one następnie wielu modyfikacjom potranslacyjnym (proteoliza. glikozylacja, fosforylacja itd.) podczas transportu przez komórkę. Czas przemieszczenia z miejsca syntezy do osocza waha się od 30 min do wielu godzin w zaleŜności od rodzaju białka. 3. Prawie wszystkie białka osocza są glikoproteinami. Zawierają one łańcuchy oligosacharydowe połączone przez atomy N i (lub) O (p. rozdz. 57). Wyjątkiem jest albumina, która nie zawiera reszt cukrowych. Łańcuchy oligosacharydowe pełnią wiele funk cji (p. tab. 57-2). Usunięcie końcowej reszty kwasu sjalowego z pewnych białek osocza (np. ceruloplazminy) poprzez działanie neuraminidazy moŜe znacznie skrócić ich okres potrwa nia w osoczu (p. rozdz. 57).

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 773

4. Wiele białek osocza wykazuje polimorfizm. Polimorfizm jest cechą mendlowską lub monogenowę występującą w populacji w co najmniej dwóch fenotypach, z częstością więk szą niŜ 1—2% (Vogel i Motulsky, 1986). Sub stancje grupowe krwi układu ABO (rozdz. 63) są najlepiej znanym przykładem polimorfizmu u ludzi. Polimorfizm ludzkich białek osocza stwierdza się w przypadku np. o^-antytrypsyny, haptoglobiny, trans|eryny, ceruloplazminy i immunoglobulin. Forniy polimorficzne tych bia łek najczęściej wykrywano po raz pierwszy metodą elektroforezy na Ŝelu skrobiowym, gdzie kaŜda postać wykazuje charakterystyczną ruchliwość. Analiza polimorfizmu białek osocza jest przedmiotem badań genetycznych i antropologicznych, a w pewnych przypadkach (np. arantytrypsyna, p. niŜej) wzbudza takŜe zainteresowanie klinicystów. 5. KaŜde białko osocza ma charakte rystyczny okres półtrwania w układzie krąŜenia. Okres półtrwania białek osocza mo Ŝe być oznaczony przez oznakowanie wyizolo wanego, oczyszczonego białka za pomocą l31I w warunkach zapobiegających jego denaturacji. Izotop ten łączy się kowalencyjnie z resztami tyrozyny w cząsteczce białka. Nie związany (31I oddziela się następnie od znakowanego białka i określa jego aktywność właściwą (dpm/mg białka). Znaną ilość aktywnego białka podaje się dorosłej osobie, a następnie pobiera się próbki krwi w określonych odstępach czasu i określa ich radioaktywność. Uzyskane warto ści wykreśla się jako funkcję czasu i oznacza okres półtrwania (czas obniŜenia radioaktyw ności od wartości szczytowej do połowy tej wartości), po odliczeniu czasu koniecznego do zrównowaŜenia (wymieszanie się) stęŜenia po dawanego białka między krwią a przestrzenią pozanaczyniową. Okresy półtrwania uzyskane dla albumin i haptoglobin u zdrowych osób dorosłych wynoszą odpowiednio 20 i 5 dni. W pewnych schorzeniach okres półtrwania bia łek moŜe się znacznie zmienić. Dla przykładu, w chorobie Crohna {ilettis regionalis) dotyczącej układu pokarmowego, 2naczna ilość białek oso cza, głównie albumin, moŜe być bezpowrotnie tracona poprzez wydzielanie do światła jelita przez zmienioną zapalnie błonę śluzową. Pac jenci dotknięci tym schorzeniem cechują się gastroenteropałią z utraty białka, a okres pół trwania podanej doŜylnie jodowanej albuminy moŜe obniŜyć się do ok. 1 dnia.

6. StęŜenie niektórych białek w osoczu wzrasta podczas ostrych stanów zapalnych łub wtórnie w następstwie pewnych rodzajów uszkodzeń tkanek. Do białek tych, zwanych białkami ostrej fazy (lub reaktantami) zalicza się; białko C-reaktywne (CRP, zwane tak ze względu na reaktywność z polisacharydem pneumokoków), o^arttytrypsynę, haptoglobinę, ocrkwaśną glikoproteinę oraz fibrynogen. Wzrost stęŜenia tych białek waha się od 50% do ponad 1000-krotnego w przypadku CRP, Ich poziom jest równieŜ zazwyczaj podwyŜszony podczas przewlekłych procesów zapalnych oraz u pacjentów z nowotworami złośliwymi. UwaŜa się, Ŝe białka te pełnią rolę w odpowiedzi organizmu na proces zapalny. Dla przykładu białko C-reaktywne moŜe aktywować drogę\lasyczną dopełniacza, a o^-antytrypsyna zdolna jest do neutralizacji pewnych proteaz uwalnianych podczas ostrego stanu zapalnego. Ostatnio wykonane badania wskazują, Ŝe interleukina 1 (IL-1), polipeptyd uwalniany z jednojądrzastych komórek fagocytujących, jest głównym, lecz nie jedynym stymulatorem syntezy większości białek ostrej fazy przez hepatocyty. Inne cząsteczki, m.in. IL-6, są równieŜ włączone w ten proces i podobnie jak IL-1 wydają się działać na poziomie transkrypcji genu. Następne podrozdziały przedstawiają podstawowe informacje dotyczące 6 spośród głównych białek ludzkiego osocza włącznie z immunoglobulinami. Lipoproteiny przedstawiono w rozdz. 27. Albumina jest głównym białkiem ludzkiego osocza Jest to główne białko ludzkiego osocza (ok. 45 g/1) o masie cząsteczkowej ok. 69000. Stanowi ok. 60% wszystkich białek osocza. Około 40% albumin znajduje się w osoczu, pozostałe 60% w przestrzeni poza komórkowej. Wątroba wytwarza ok. 12 g albumin na dobę, co stanowi ok. 25% całkowitej syntezy białek w tym narządzie, a połowę tych, które są wydzielane. Początkowo albumina syntetyzowana jest jako preprobiałko. Peptyd sygnałowy ulega usunięciu podczas przemieszczenia do cystern szorstkiej siateczki śródplazmatycznej, a następnie zostaje odcięty heksapeptyd na N-końcu podczas dalszej wędrówki szlakiem wydzielniczym. Synteza albumin zmniejsza się w róŜnych chorobach, szczególnie tych, które dotyczą wątroby (p. Dodatek-Białka). Osocze pacjentów z chorobami wątroby często cechuje się obniŜonym

774 / ROZDZIAŁ 58

ilorazem stęŜenia albumin do globulin (obniŜony stosunek A:G). Synteza albumin zmniejsza się stosunkowo wcześnie w warunkach wadliwego Ŝywienia białkowego, m.in. w kwashiorkor. Dojrzała albumina iudzka składa się z 1 łańcucha polipeptydowego zbudowanego z 585 reszt ami no kwasowych i zawiera 17 mostków dwusiarczkowych. Stosując proteazy moŜna podzielić albuminę na 3 domeny, spełniające odmienne funkcje. Albumina ma kształt elipsoidalny, co oznacza, Ŝe nie zwiększa lepkości osocza w tak znacznym stopniu jak cząsteczki o wydłuŜonym kształcie, np. fibrynogen. Ze względu na stosunkowo małą masę cząsteczkową (ok. 69 000) i duŜe stęŜenie, albumina wydaje się odpowiadać za ok. 75—80% ciśnienia onkotycznego ludzkiego osocza. Badania elektro foretyczne wykazały, Ŝe osocze pewnych osób pozbawione jest albuminy, co określa się terminem analbuminemii. Jedną z przyczyn tego stanu jest mutacja zaburzająca proces przycinania i składania („splicing"). Osoby z analbuminemią cechują się jedynie umiarkowanego stopnia obrzękami, mimo iŜ albumina jest głównym czynnikiem decydującym o ciśnieniu onkotycznym osocza. UwaŜa się, Ŝe wzrost stęŜenia innych białek osocza kompensuje skutki braku albumin. Inną istotną funkcją albumin jest ich zdolność do wiązania róŜnych ligandów. NaleŜą do

nich wolne kwasy tłuszczowe (WKT), wapń, pewne hormony steroidowe, bilirubina oraz część tryptofanu obecnego w osoczu. Ponadto albumina wiąŜe ok. 10% miedzi występującej w osoczu, reszta pouczona jest 7 ceruloplazminą(p. niŜej). Wiele leków, m.in. sulfonamidy. penicylina G, dikumarol, aspiryna, związanych jest z albuminą; ma to istotne implikacje farmakologiczne. Preparaty ludzkiej albuminy stosowane są w leczeniu wstrząsu krwotocznego oraz oparzeń.

A. Hb -> Nerka (m. cz. 65 000)

B.

Hb

+

Haptoglobina wiąŜe pozakrwinkową hemoglobinę, zapobiegając przedostawaniu się wolnej hemoglobiny do nerek Haptoglobina (Hp) jest osoczową glikoproteiną, która wiąŜe pozakrwinkową hemoglobinę (Hb) w zwarty niekowalencyjny kompleks (Hb-Hp). Hp zawarta w 1 1 moŜe związać 400—1 800 mg Hb. Około 10% Hb degradowanej kaŜdego dnia uwalniane jest do krąŜenia, stąd określana jest jako pozakrwinkową. Pozostałe 90% obecne w starych uszkodzonych krwinkach czerwonych katabolizowane jest w komórkach układu histic>cytaniego. Masa cząsteczkowa Hb wynosi ok. 65 000, a najprostszej formy polimorficznej Hp (Hp-1-1) u ludzi — ok. 90000. Powstały kompleks Hb-Hp osiąga masę cząsteczkową 155000. Wolna Hb przechodzi przez kłębuszki nerkowe i wnika do cewek, gdzie ma skłonność do precypitacji (moŜe to nastąpić w następstwie masywnego przetoczenia krwi niezgodnej grupowo z przekroczenia pojemności wiąŜącej Hp względem Hb) (p. ryc. 58-3). Kompleks Hb-Hp jest zbyt duŜy, by przenikać przez kłębuszki nerkowe. Funkcja Hp wydaje się polegać na zapobieganiu utracie wolnej Hb przez nerki. Chroni ona cenne atomy Ŝelaza, obecne w Hb, przed utratą z organizmu. Ludzka Hp występuje w trzech formach polimorficznych, znanych jako Hp 1-1, HP 2-1 i Hp 2-2, Hp 1-1 wędruje w elektroforezie na Ŝelu skrobiowym jako pojedyncze pasmo, podczas gdy Hp 2-1 i Hp 2-2 wykazują bardziej złoŜony profil pasm. Dwa geny, oznaczane jako Hp-1 i Hp-2, kodują te trzy fenotypy, gdzie Hp 2-1 jest fenotypem heterozygotycznym. Nie wykazano istotnych z punktu widzenia funkcji róŜnic między wspomnianymi formami Hp. StęŜenie Hp w osoczu ludzkim jest zmienne i ma pewną wartość diagnostyczną. Małe stęŜenia Hp stwierdza się u pacjentów z niednkr wist ości ami hemolirycznymi. Wyjaśnia to obserwację,

■ Wydalanie w moczu lub precypitacja w kanalikach nerkowych; Ŝelazo jesi tracone z organizmu

Hp

Kompleks Hp:Hbx -+>

aOO) j Nerka

[)Ti. ez. 155 000]

Katabotizowany przez komórki wątroby; Ŝelazo jest zatrzymane w ustroju i wtórnie wykorzystywane

Byc. 53-3. RóŜne losy wolnej hemoglobiny i kompleksu hemoglobma-haptoglobina.

BIAŁKA OSOCZA, IMIWJNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 775

Ŝe okres półtrwania Hp wynosi ok. 5 dni, podczas gdy w przypadku kompleksu Hb-Hp, szybko usuwanego z osocza przez hepatocyty, nie przekracza 90 min. Gdy Hp związana jest z Hb, eliminacja z osocza przebiega 80 razy szybciej niŜ zwykle. Zgodnie z tym stęŜenie Hp zmniejsza się szybko w sytuacjach, gdy Hb jest stale uwalniana z erytrocytów, co występuje w niedokrwistościach hemolitycznych. Hp naleŜy do białek ostrej Ęazy i jej stęŜenie zwiększa się w wielu stanach zapalnych. Pewne białka osocza wiąŜą hem, lecz nie Hb. Hemopeksyna jest P,-globuliną, która wiąŜe wolny hem. Albumina łączy się z methemem (hem Ŝelazowy), tworząc methemalbumine, a następnie przekazuje methem hemopeksynie. Transferyna, przemieszczając Ŝelazo z prądem krwi do miejsc, gdzie jest ono potrzebne, odgrywa główną rolę w metabolizmie Ŝelaza Transferyna (Tf) jest p,-globuliną o masie cząsteczkowej ok. 80 000. Jest to glikoproteina syntetyzowana przez wątrobę. Wykazano obecność ponad 20 polimorficznych form tego białka. Tf odgrywa główną rolę w ustrojowej gospodarce Ŝelazem, poniewaŜ transportuje je (2 mole Fe trójwartościowego na 1 mol Tf) w układzig krąŜenia do miejsc, gdzie jest ono potrzebne, m.in. z jelita do szpiku i innych narządów. śelazo jest niezwykle waŜne dla organizmu ludzkiego, poniewaŜ wchodzi w skład wielu hemoprotein, takich jak hemoglobina, mioglobina i cytochromy. śelazo dostarczane jest w diecie, a jego wchłanianie jako Ŝelaza dwuwartościowego jest ściśle kontrolowane na poziomie błony śluzowej jelita, W warunkach prawidłowych organizm strzeŜe zawartości Ŝelaza niezwykle gorliwie. Stąd teŜ jego dobowa utrata u zdrowego dorosłego męŜczyzny wynosi ok. 1 mg i zostaje uzupełniona Ŝelazem pokarmowym. Dorosłe kobiety są bardziej podatne na niedobór Ŝelaza w związku z moŜliwością nadmiernej utraty krwi podczas miesiączki. Zawartość Ŝelaza Tf w innych przedziałach organizmu przedstawiono w tab. 58-2. Okofo 20 ml krwinek czerwonych jest poddana procesom katabolicznym, dziennie uwalniając ok. 25 mg Ŝelaza. Wolne Ŝelazo jest toksyczne, lecz w powiązaniu z Tf jego potencjalna toksyczność zostaje zmniejszona, a ponadto zostaje ono skierowane do miejsc w organizmie, gdzie jest niezbędne- Na powierzchni wielu komórek występują receptory dla Tf. Białko wiąŜe

Tabela 58-2. Roz/nieszczenie Ŝelaza w organizmie dorosłego męŜczyzny o masie 70 kg 3-4 mg Transferyna 2500 mg Hb w erytrocytach 300 mg Mioglobina i róŜne enzymy śelazo zapasowe (ferrytyna i 1000 mg hemosyderyna) 7 mg/d Wchłanianie Straty 1 mg/d W przypadku organizmu dorosłej kobiety o zbliŜonej masie ciała ilości zmagazynowanego Ŝelaza są ogólnie mniejsze (np.: 100-400 mg), natomiast straty większe (np.; 1,6-2,0 mg/d).

się z tymi receptorami i ulega internalizacji na zasadzie endocytozy sterowanej receptorem (por. losy LDL, rozdz. 27). W kwaśnym pH wewnątrz iizosomów następuje dysocjacja Ŝelaza od białka. W przeciwieństwie jednak do białkowej części LDL, apoTf nie ulega degradacji w obrębie Iizosomów. Pozostaje ono związane z receptorem, powraca do błony cytoplazmatycznej, oddziela się od receptora, przenika następnie do osocza, pobiera kolejną porcję Ŝelaza i znów dostarcza je do potrzebujących komórek.

Problemy metabolizmu Ŝelaza. Metabolizm Ŝelaza jest szczególnie waŜny u kobiet, ze względów wyŜej przedstawionych. RównieŜ w ciąŜy naleŜy uwzględnić zapotrzebowanie Ŝelaza wzrastającego płodu. U starszych ludzi odŜywiających się skromnie (herbata, grzanki) moŜe takŜe dojść do niedoboru Ŝelaza. Niedokrwistość z niedoboru Ŝelaza zaleŜna od niedostatecznego wchłaniania, nieprawidłowego wykorzystania lub nadmiernej jego utraty jest jednym z najczęściej spotykanych stanów chorobowych obserwowanych w praktyce lekarskiej. StęŜenie Tf wynosi ok. 3,0 g/l (300 mg/dl). Ta ilość Tf moŜe wiązać ok. 3 mg Ŝelaza/l osocza, co określa się mianem całkowitej zdolności wiązania Ŝelaza przez osocze. Prawidłowo, jedynie l /a transferyny jest wysycana Ŝelazem. W niedokrwistości z niedoboru Ŝelaza białko jest w mniejszym stopniu wy sycone Ŝelazem, podczas gdy w warunkach spichrzania nadmiaru Ŝelaza w organizmie (np. hemochromatoza) znacznie przekracza 1/i. Ferrytyna. Ferrytyna jest kolejnym białkiem istotnym z punktu widzenia metabolizmu

776 / ROZDZIAŁ 58

Ŝelaza. W warunkach prawidłowych gromadzi ono Ŝelazo, skąd moŜe ono być pobierane w razie potrzeby. W przypadku nadmiaru Ŝelaza (np. hemochromatoza) ustrojowe zapasy Ŝelaza znacznie wzrastają i zdecydowanie więcej ferrytyny stwierdza się w tkankach, głównie w wątrobie i śledzionie. Ferrytyna zawiera ok. 23% Ŝelaza oraz apoferrytynę (część białkowa nie zawierająca Ŝelaza) i ma masę cząsteczkową ok. 440 000. Ferrytyna zbudowana jest z 24 podjednostek o masie cząsteczkowej i 8 500, które otaczają 3000—4000 atomów Ŝelazowych występujących w postaci micelarnej. Prawidłowo stęŜenie ferrytyny w osoczu krwi jest niskie; u chorych z nadmiarem Ŝelaza znacznie wzrasta; stęŜenie ferrytyny w osoczu moŜna w sposób wygodny oznaczyć metodami radioimmunologicznymi. Parametr ten moŜe być dobrym wskaźnikiem stanu ustrojowych zapasów Ŝelaza. Hemosyderyna. Hemosyderyna jest cząsteczką słabo poznaną; wydaje się, Ŝe moŜe to być częściowo zdegradowana postać ferrytyny. lecz wciąŜ zawierająca Ŝelazo. MoŜna ją wykryć barwieniami histologicznymi (np, błękitem pruskim) na obecność Ŝelaza, a jej obecność dowodzi nadmiernego gromadzenia Ŝelaza.

Pierwotna hemochromatoza. Pierwotna hemochromatoza jest chorobą genetyczną charakteryzujący się nadmiernym gromadzeniem Ŝelaza w tkankach, co prowadzi do ich uszkodzenia. Wydaje się, Ŝe przyczyna leŜy w nadmiernym wchłanianiu Ŝelaza z błony śluzowej jeiila, chociaŜ niewiele wiadomo na temat molekularnego podłoŜa tej nieprawidłowości. Narządami legającymi uszkodzeniu są najczęściej: wątroba, skóra i jelita; u chorych rozwija się zwykie marskość wątroby, moŜe ponadto wystąpić nadmierna pigmentacja skóry oraz cukrzyca (cukrzyca brązowa). Okresowe upusty krwi (flebotomia) pozwalają na utrzymanie kontroli nad schorzeniem. Tabela 58-3 przedstawia badania laboratoryjne przydatne w diagnostyce nieprawidłowości w zakresie gospodarki Ŝelazem. Patrz równieŜ Dodatek — Ŝelazo, surowica, zdolność wiązania Ŝelaza. Ceruloplazmina łączy się z miedzią i uczestniczy w patogenezie chbroby Wiisona, będącej stanem zatrucia miedzią Ceruloplazmina jest a^-globuliną o masie cząsteczkowej ok. 160 000. występujący w osoczu

Tabela 58-3. Wartościowe testy laboratoryjne słuŜące do oceny pacjentów z zaburzeniami metabolizmu Ŝelaza Liczba erytrocytów i poziom hemogiobiny Określenie stęŜenia Ŝelaza w osoczu, całkowitej zdolności wiązania Ŝelaz3 (TiBC) i odsetka wysycenia transferyny Określenie stęŜenia ferryiyny w osoczu metodą radioimmunologicŜną Barwienie wycinków tkankowych za pomocą błękitu pruskiego Ocena ilości Ŝelaza (|ig/g) w bioptacie tkankowym

w stęŜeniu ok. 300 mg/3 (30 mg/dl). Zs względu na zawartość miedzi jej zabarwienie jest niebieskie. Zawiera 90% miedzi zawartej w osoczu. KaŜda cząsteczka ceruloplazminy wiąŜe 6 atomów miedzi w sposób bardzo mocny, co sprawia, Ŝe pierwiastek ten nie jest łatwo wymienialny. Albumina przenosi pozostałe 10% miedzi osocza. Siła, z jaką albumina wiąŜe miedź, jest jednak mniejsza w porównaniu z ceruloplazminą. W konsekwencji albumina łatwiej oddaje miedź tkankom niŜ ceruloplazmina i wydaje się być bardziej istotna w procesie transportu miedzi w organizmie człowieka. Ceruloplazmina wykazuje ponadto aktywność oksydazową, jednak znaczenie tego faktu nie jest jasne. StęŜenie ceruloplazminy w osoczu zmniejsza się w chorobach wątroby. Ceruloplazmina wykazuje szczególny związek z chorobą Wiisona (zwyrodnienie wątrobowo-soczewkowe), chociaŜ wydaje się mało prawdopodobne, aby pierwotny defekt w tym schorzeniu dotyczył nieprawidłowości tego białka. Choroba Wiisona jest wrodzonym stanem, w którym miedź nie moŜe być wydalana z Ŝółcią, prawdopodobnie z powodu defektu lizosomów niezdolnych do wydalenia miedzi pochodzącej z rozpadu cerulopiazminy (ryc. 58-^j. W konsekwencji miedź sukcesywnie gromadzi się w organizmie, szczególnie w wątrobie, mózgu, nerkach oraz krwinkach czerwonych. Przyczyny choroby naleŜy upatrywać w niezdolności organizmu do zachowania zerowego bilansu gospodarki miedzi, prowadzącej do zatrucia tym pierwiastkiem. Wzrost zawartości miedzi w komórkach wątroby hamuje wiązanie się miedzi z apoceruloptezminą, co prowadzi do zmniejszenia' stęŜenia tego białka w osoczu (poniŜej 200 mg/I). W. miarę gromadzenia miedzi rozwija się niedoicrwis-

____________ BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 777 A. Stan prawidłowy: Cu -* śółć Cu + ApoceruloplaŜrnlna -» Osoczowa ceruloplazmlna 6. Choroba Wllsona: i Spadek wydalania miedzi z zótclą i Gromadzenie miedzi w wątrobie

i Zahamowani jej wiązania się z ap oceniło plaŜ miną -> Mata stęŜenie ceruloplazminy w osoczu

Ryc. 58-4. Schematyczne przedstawienie losów miedzi w (a) prawidłowej wątrobie i (b) wątrobie pacjenta z chorobą ^ilsona. Wydalanie miedzi do Ŝółci jest upośledzone w chorobie Wtlsona na skutek defektu w wydalaniu przez lizosomy miedzi pochodzącej z katabolizmu ceruloplazminy.

tość hemolityczna, przewlekle schorzenie wątroby oraz zespól objawów neurologicznych zaleŜny od gromadzenia się miedzi w zwojach podstawy i innych ośrodkach mózgu. Częstym objawem klinicznym jest pierścień Kaysera-Fleischera, przybierający barwę zieloną lub złotą i występujący u podstawy rogówki, jako wyraz odkładania się miedzi w błonie Descemeta. W przypadku podejrzenia choroby Wilsona konieczna jest biopsja wątroby; wartość diagnostyczną ma zawartość miedzi w wątrobie przekraczająca 250 ug/g suchej masy z równoczesnym zmniejszeniem stęŜenia ceruloplazminy w osoczu poniŜej 200 mg/l. Leczenie polega na stosowaniu diety niskomiedziowej i rozwaŜnym podawaniu D-penicylaminy, która chelatuje miedź i prowadzi do jej wydalenia z moczem, a tym samym ustrój pozbawiony jest nadmiaru tego pierwiastka. Miedź jest metalem-kofaktorem wielu waŜnych enzymów, takich jak oksydaza cytochromowa, tyrozynaza i miedzi o zaleŜna dysmutaza ponadtlenkowa. W ustroju dorosłego człowieka znajduje się 100—150 mg miedzi, głównie w kościach, wątrobie i mięśniach. Wchłanianie miedzi zachodzi w górnym odcinku jelita cienkiego i wynosi 2—4 mg dziennie. Miedź przenoszona jest do wątroby w połączeniu z albuminą, wychwytywana przez komórki wątrobowe i częściowo wydalana do Ŝółci. MoŜe równieŜ pozostać w wątrobie połączona z ceruloplazminą, syntetyzowaną w tym narządzie. Niedobór miedzi. Niedobór miedzi jest stosunkowo rzadki i powoduje niedokrwistość". Zespól Menkensa (choroba „kręconych" lub „stalowych" włosów) jest innym zaburzeniem w metabolizmie miedzi o charakterze dziedzicznym, związanym z chromosomem X. Dotyczy dzieci pici męskiej, prowadząc do fatalnych następstw. Chłopcy dotknięci tym schorzeniem

mają łamliwe kręcone włosy, cechują się nieprawidłowym rozwojem fizycznym, opóźnieniem rozwoju umysłowego i rozległymi tętniakami. Wykazano, Ŝe u podłoŜa tej patologii leŜy nieprawidłowe wchłanianie miedzi w jelicie, chociaŜ biochemiczna natura tego defektu nie została jeszcze poznana. U chorych stwierdza się małe stęŜenie miedzi i ceruloplazminy we krwi. Niedobór y. -antyproteinazy (o^antytrypsyny) związany jest z rozedmą płuc i pewną postacią choroby wątroby G^-Antyproteinaza, zwana dawniej otj-antytrypsyną (ctj-AT) jest białkiem o masie cząsteczkowej ok. 45 000 stanowiącym główny składnik frakcji a! globulin osocza. Syntetyzowana jest w wątrobie i pełni funkcje najwaŜniejszego inhibitora proteaz (Pi) w osoczu człowieka. Hamuje aktywność trypsyny, elastazy i pewnych

proteaz poprzez tworzenie kompleksów z nimi. Białko to jest wysoce polimorficzne; rozdział elektroforetyczny pozwala na wyodrębnienie poszczególnych jej postaci. Głównym genotypem jest MM, odpowiadający fenotypowi PiM. Zainteresowanie kliniczne o^-AT dotyczy dwóch aspektów. Niedobór tego białka odgrywa rolę w pewnych przypadkach rozedmy płac (ok. 5%). Dotyczy to głównie osobników z genotypem ZZ, wytwarzających PiZ w znacznie mniejszej ilości w porównaniu z PiM, W przypadku niedoboru otj-AT, wzrost ilości granulocytów w obrębie pluć (występujący np. w zapaleniu płuc) i wydzielanych przez nie enzymów proteolitycznych nie napotyka bariery antyproteazowej (otA-AT) prowadząc tym samym do uszkodzenia tkanki płucnej, głównie przez takie proteazy, jak elastaza (ryc. 58-5). Szczególne zainteresowanie wzbudza metionina

778 / ROZDZIAŁ 58 A-Aktywnaelasta2a + a -AT -> Kompleks nieaktywne] elastazy ->Brak proteolizy w płucach-* Brak uszkodzenia z a,-AT tkanek B. Aktywna elastazał J.iub brak a,-AT->Aktywna elastaza-* Proteollza w płucach-* Uszkodzenie tkanek Ryc. 58-5. Schemat ilustrujący (a) prawidłową inaktywację elastyny przez 2,-AT i (b) sytuację, gdy ilość 3,-AT jest zmniejszona, co prowadzi do proteolizy wskutek działania elastazy z następczym uszkodzeniem tkanek.

(reszta aminokwasowa w pozycji 358), uczestnicząca w wiązaniu ctj- AT z proteazami. Palenie tytoniu sprawia, Ŝe aminokwas ten zostaje utleniony do sulfotlenku metioniny, co inaktywuje go i tym samym prowadzi do utraty właściwości antyproteazowych c^-AT. Szczególne spustoszenie stwierdza się u pacjentów z fenotypem Pi ZZ, który odznacza się niskim poziomem e^-AT juŜ w normalnych warunkach. Dalsze zmniejszanie aktywności ot,-AT będące następstwem palenia tytoniu powoduje wzmoŜoną destrukcję proteolityczną tkanki płucnej, przyspieszając tym samym rozwój rozedmy płuc. DoŜylne podanie a,-AT moŜe być pomocne w leczeniu pacjentów z rozedmą płuc zaleŜną od niedoboru c^-AT. Dzięki technikom inŜynierii genetycznej czynione są próby zastąpienia metioniny 358 przez aminokwas niepodatny na utlenianie (p. rozdz. 42). Powstałe „mutanty" o^-AT mogłyby wykazywać ochronne działanie przed proteazami przez znacznie dłuŜszy okres niŜ natywna a,-AT. Niedobór a,-AT moŜe być równieŜ przyczyną jednego z typów marskości wątroby (choroba wątroby z niedoboru o^-AT). W tej sytuacji cząsteczki a r AT typu ZZ gromadzą się w cząsteczkach siateczki śródplazmatycznej, prawdopodobnie wsku^ftk niemoŜności ich wydzielania przez te komórki. Nie wiadomo dotąd, w jaki sposób prowadzi to do powstania marskości wątroby (w następstwie gromadzenia się duŜych ilości kolagenu będącego przyczyną włóknienia). IMMUNOGLOBULINY OSOCZA ODGRYWAJĄ WAśNA ROLĘ W MECHANIZMACH OBRONNYCH ORGANIZMU Układ immunologiczny organizmu składa się z 2 głównych składników, limfocytów B i limfocytów T. Limfocyty B wywodzą się głównie z komórek szpiku kostnego u wyŜszych zwierząt lub z torebki Fabrycjusza u ptaków. Limfocyty te pochodzą z grasicy. Limfocyty B odpowie-

dzialne są za syntezę krąŜących przeciwciał zwanych immunoglobulinami. Limfocyty T zaangaŜowane są w liczne reakcje immunologiczne typu komórkowego, takie jak odrzucanie przeszczepu, reakcje nadwraŜliwości czy obronne przed komórkami nowotworowymi i wirusami. W podrozdziale tym omówiono wyłącznie immunoglobuliny osocza, które powstają głównie w komórkach plazma tycznych, wyspecjalizowa-

nej linii komórkowej wywodzącej się z limfocytów B, które syntetyzują i wydzielają immunoglobuliny do osocza. Wszystkie immunogłobułinv zawierają co najmniej 2 łańcuchy lekkie i 2 łańcuchy cięŜkie Wszystkie cząsteczki immunoglobulin składają się z 2 identycznych łańcuchów lekkich (L) o masie cząsteczkowej 23 000 i 2 identycznych łańcuchów cięŜkich (H) o masie cząsteczkowej 53 000—75 000 połączonych w tetramer (C2H2) przez mostki dwusiarczkowe (ryc. 58-6). W kaŜdym z łańcuchów moŜna wyróŜnić swoiste domeny, regiony o strukturalnym i funkcjonalnym znaczeniu. Potowa łańcucha lekkiego w kierunku końca karboksylowego zwana jest regionem stałym (CL), podczas gdy połowa N-końcowa określana jest jako region zmienny (VL) łańcucha lekkiego. Około J ,U łańcucha cięŜkiego fragmentu C-końcowego odpowiada regionowi zmiennemu (VH), a pozostałe 75% tego łańcucha określa się mianem regionów stałych (CH-1, CH-2, CH-3) łańcucha H. Część cząsteczki immunoglobuliny, która wiąŜe swoisty antygen, utworzona jest* przez fragmenty Ckońcowe (regiony zmienne) obydwu łańcuchów (H i L), tj. domeny VH i VL. Domeny łańcuchów peptydowych nie występują w formie liniowej, lecz tworzą regiony-globularne z odpowiednią strukturą drugo- i trzeciorzędową w celu wiązania swoistych antygenów. Jak przedstawiono na ryc. 58-6, trawienie cząsteczki immunoglobuliny pr2ez papainę prowadzi do powstania dwóch fragmentów wiąŜących antygen (Fab) i jednego fragmentu zdolnego do krystalizacji (Fc). Miejsce, w którym

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 779 Fab

Fc

TLJ Pepsyna apalna CH2

CH3

Ryc. 58-6. Uproszczony model cząsteczki ludzkiego przeciwciała z klasy IgG, prezentujący czteroiańcuchowa, strukturę podstawową i domeny. V — oznacza region zmienny, C — region stały. Strzałka pionowa — region zawiasowy. Grube linie oznaczają mostki dwusiarczkowe. (Według: Stites D. P., Stobo J. D„ Wells J. V., (red): Basie and Clinkai immunology, wyd. 6, Appleton and Lange, 1987)._______

paRaina rozszczepia cząsteczkę immunoglobuliny, tzn. przestrzeń między domenami CH-1 i CH-2, nosi nazwę regionu zawiasowego. Wszystkie łańcuchy (ełckie są typu kappa lub lambda Na podstawie róŜnic w strukturze regionów CL (tab. 58-4) łańcuchy lekkie dzieli się na typ kappa (x) oraz lambda {X). Cząsteczka immiinoglobuliny zawiera 2 łańcuchy lekkie tego samego typu, nigdy ich kombinację. U człowieka łańcuch typu x występuje częściej w cząsteczkach immunoglobulin niŜ X. Pięć typów łańcuchów cięŜkich określa przynaleŜność immunoglobuliny do określonej klasy U człowieka stwierdza się 5 klas łańcuchów cięŜkich, wyróŜniających się odmienną budową regionów CH (tab. 58-4). Łańcuchy te, oznaczane jako y, a, |i, 5 i e róŜnią się masą cząsteczkową, która waha się od 50000 do 70000 (tab. 58-4). ChociaŜ zwykle występują 3 domeny CH, łańcuchy \v i e mają ich po 4. Rodzaj łańcucha cięŜkiego określa przynaleŜność immunoglobuliny do określonej klasy, a przez to rodzaj pełnionej funkcji. RozróŜnia się 5 klas immuno-

globulin: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE. Jak przedstawiono w tab. 58-4, w obrębie kaŜdej z klas łańcuchów cięŜkich, na podstawie subtelnych róŜnic w strukturze regionów CH, moŜna wyróŜnić podklasy. Nie ma dwóch identycznych regionów zmiennych Regiony zmienne w cząsteczkach immunoglobulin składają się z domen VL i VH i cechują się znaczną heterogennością, W rzeczywistości nie stwierdzono 2 identycznych pod względem sekwencji aminokwasowej regionów zmiennych w cząsteczkach immunoglobulin uzyskanych od róŜnych osób. ZauwaŜa się jednak pewne podobieństwa w strukturze tych regionów u róŜnych osób, wśród których na podstawie stopnia homologii sekwencji aminokwasowej moŜna wyróŜnić 3 główne grupy: grupę VK dla łańcuchów lekkich typux, grupę VL dla łańcuchów lekkich typu k i grupę VH dla łańcuchów cięŜkich. MoŜna ponadto wyróŜnić podgrupy w obrębie wymienionych 3 grup. Reasumując, w obrębie regionów zmiennych występują miejsca względnie niezmienne w poszczególnych grupach i podgrupach. Porównując regiony zmienne w róŜnych łańcuchach

780 / ROZDZIAŁ 58 Tabela 58- Właściwości łańcuchów ludzkich immunogiobulin* 4. Łańcuchy H

Cecha 7 IgG Klasy, w których dane łańcuchy występują Podklasy lub 1 2, 3 4 podtvov Odmiany al- Gm (1)-{25) lotypowe

a IgA

Masa cząste- 5 0 0 0 0 " " czkowa (przybliŜona) Podgrupy regionów V

55 000

1 2

IgM

Łańcuchy L 5 IgD

S

IgE

Y. Wszystkie klasy

X Wszystkie

Składnik sekrecyjny SC IgA

Łańcuch J J IgA, łgM

klasy 12 3 4

1 2

NIW 70 000 62 000 70 000

23 000

23 000

70 000

15 000

VKI-VKIV

VHI-VHIV

Węglowodany (przeciętny udział procentowy)

4

10

15

18

18

0

0

16

8

Ilość otigosacharydów

1

2 lub 3

5

7

5

0

0

1

i

" Według: Stattes D. P., Stobo J. D., Wells J. V. (red.); Basie and Clinical Immunology, wyd 6 Appleton and Lange, 1987. *• Poprzednio lnv(1)-(3). ••* 60 000 dla T3. Obszary nadzmienne łańcucha lekkiego,

Obszary nadzmienne łańcucha cięŜkiego Wewnątrzłańcuchawe wiązania dwuslarczkowe

Ryc. 58-7. Schematyczny model cząsteczki IgG, prezentujący prawdopodobne połoŜenie obszarów nadzmiennych w obrębie łańcuchów cięŜkich i lekkich. (Według: Stites D. P„ Stobo J. D„ Wells J. W (red): Basie and Clinical immunoiogy, wyd. 6. Appleton and Lange, 1987, za zezwoleniem, zmodyfikowana).

lekkich tej samej grupy i podgrupy stwierdza się występowanie regionów nadzmiennych porozrzucanych między względnie niezmiennymi sekwencjami (determinującymi przynaleŜność do podgrupy (ryc. 58-7). Łańcuchy lekkie mają 3 regiony nadzmienne (w VL), a łańcuchy cięŜkie -4(wVH). Regiony stałe określają funkcje efektorowe immunoglobulin swoiste dla klasy Regiony stale cząsteczek immunoglobulin, szczególnie CH_2 i CH_, (oraz CHA w IgM i IgE), które tworzą fragmenty Fc, odpowiadają za funkcje efektorowe róŜnych cząsteczek immunoglobulin, swoiste dla poszczególnych klas (tab. 58-5). Niektóre immuno globu liny, jak IgG, występują jedynie w podstawowej strukturze tetramerycznej, podczas gdy inne, jak IgA czy IgM, mogą występować jako wyŜsze polimery złoŜone z 2, 3 (IgA) lub 5 (IgM) jednostek tetramerycznych (ryc. 58-8).

BIAŁKA OSOCZA, 1MMUNOGLOBINY 1 CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 781 Tabela 58-5. Właściwości ludzkich immunoglobulin IgG

IgA

IgM

IgD

IgE

7

a

\i

8

s

y1,72,73,74

al, a2

H1,H2

Typ łańcucha L Skład cząsteczkowy

xi X

xi X

V. i A

Y^

a2L/* lub

Stała sedymentacji fS)

6-7

7

19

7-8

150 000

160 000" 400 000*""

900 000

180 000

Klasa łańcucha H Podklasa łańcucha H

Masa cząsteczkowa (przybliŜona)

Y

Szybka y do|3

Szybka 7 do (3

Wiązanie dopełniacza (klasyczne)

+

0

10 000

+

Liza anty bakteryjna Aktywność przeciwwirusowa

X

8

190 000 ■

Ruchliwość elektroforetyczna (przeciętna)

StęŜenie w surowicy (przybliŜone) mg/i Penetracja przez łoŜysko Aktywność reaginowa

Y. i

5aL,

Szybk a 7

Szybka y

++++

0

0

2000

1200

30

0,5

0

0

0

0

?

0

0

0

++++

+

+

+++

?

?

++ +

+

?

?

+

* Według Stites D.P., Stobo J.D., Welts J.V. (red.): Basie and Ctinicat tmmunology, wyd. 6. Appleton i Lange, 1987. " Dla monornerycznych surowiczych IgA **" Łańcuch J **" Składnik sekrecyjny SC ***** Dla sekrecyjnej IgA

W limfocycie B lub w komórce plarmatycznej łańcuchy L i H syntetyzowane są jako oddzielne cząsteczki i następnie łączone w cząsteczkę immunoglobuliny, która wykazuje budowę glikoproteiny (tab. 58-4). Łańcuchy lekkie i cięŜkie są produktami wielu genów KaŜdy łańcuch lekki jest produktem co najmniej 3 oddzielnych genów strukturalnych: genu regionu zmiennego (VL), genu regionu łączącego (J) (nie mającego związku z łańcuchem J w IgA lub IgM) oraz genu regionu stałego (CV), KaŜdy łańcuch cięŜki jest produktem co najmniej 4 róŜnych genów: genu regionu zmiennego (VH), genu regionu nadzmiennego („róŜnorodności" D), genu regionu łączącego (J) oraz genu regionu stałego (CH). Nie ma tu zastosowania klasyczna koncepcja „jeden gen — jedno białko". Mechanizmy molekularne odpowiedzialne za tworzenie pojedynczego łań-

cucha immunoglobuliny z wielu genów strukturalnych przedstawiono w rozdz. 38 i 41. RóŜnorodność przeciwciał zaleŜy od rearanŜacji genów KaŜdy człowiek zdolny jest do wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko 1 milionowi róŜnych antygenów. Wydaje się, Ŝe powstawanie tak ogromnej liczby róŜnorodnych przeciwciał zaleŜy od tworzenia kombinacji róŜnych genów strukturalnych uczestniczących w syntezie kaŜdego łańcucha immunoglobuliny oraz od duŜej częstości mutacji somatycznych w rearanŜowanych genach VH i VL. Podczas odpowiedzi immunologicznej dochodzi do zmiany klasy tworzonych przeciwciał („elass switching" — „przełączenie") W większości przypadków odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego dochodzi do

782 / ROZDZIAŁ 58 Składnik sekreoyjny

A. IgA w

C. l(jM (pan ta mer)

B. Sekrecyjna IgA (dimer)

Ryc. 58-8. Wysoce schematyczne przedstawienie polimerycznych ludzkich immunoglobulin, Łańcuchy polipeptydowe są reprezentowane przez grube linie; wiązania dwusiarczkowe łączące róŜne łańcuchy polipeptydowe są przedstawione za pomocą cienkich linii (Według: Stites D P., Stobo J D., Weils J. W. (red): Basie and Clinica! Immunology wyd. 6, Appleton and Lange, 1987, za zezwoleniem).

tworzenia przeciwciał o identycznej swoistości, lecz róŜniących się przynaleŜnością klasową i zjawisko to następuje w ścisłym porządku chronologicznym w odpowiedzi na podanie immunogenu (immunizującego antygenu). Jeden z typów łańcucha lekkiego immunoglobuliny moŜe się połączyć z antygenowo swoistym łańcuchem u., tworząc swoistą cząsteczkę IgM. Następnie, ten sam antygenowo swoisty łańcuch lekki łączy się z łańcuchem y o identycznym regionie V„, tworząc cząsteczkę IgG

o identycznej specyficzności wobec antygenu jak początkowo wytwarzana IgM. Ten sam łańcuch lekki moŜe równieŜ łączyć się z łańcuchem cięŜkim a, zawierającym identyczny region VH, aby utworzyć cząsteczkę IgA cechującą się taką samą swoistością wobec antygenu. Te 3 klasy (IgM, IgG i IgA) cząsteczek immunoglobulin przeciwko temu samemu antygenowi mają identyczną domenę zmienną zarówno w łańcuchu lekkim, jak i cięŜkim. Mówimy więc, Ŝe mają one wspólny idiotyp. RóŜne klasy

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLQBIWV I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 783

izotypów determinowane są przez regiony CH połączone z tym samym swoistym antygenowo regionem VH. Jeden z genetycznych aspektów mechanizmów regulatorowych, odpowiedzialnych za zmianę genu kodującego CH („switching") przedstawiono w rozdz. 41. Przyczyną schorzeń moŜe być zarówno nadmierna, jak i niedostateczna synteza tmmunoglobulin Zaburzenia w zakresie immu no globulin obejmują wzmoŜoną syntezę swoistych klas imm u no globu lin lub nawet swoistych cząsteczek immunoglobulin, przy czym to ostatnie zjawisko zachodzi w przypadku klonalnego rozrostu nowotworowego komórek plazma tycznych określanego mianem szpiczaka. Hipogammaglobulinemie mogą być ograniczone wyłącznie do jednej klasy immimoglobulin (np. EgA lub IgG) lub mogą dotyczyć niedostatecznego wytwarzania wszystkich ich klas (IgA, IgD, IgE, IgG oraz IgM). Nieprawidłowe stęŜenia immunoglobulin są prawie bez wyjątku spowodowane nieprawidłową szybkością ich syntezy lub wydzielania, indukowaną licznymi czynnikami. W HEMOSTAZIE UCZESTNICZĄ ŚCfANY NACZYŃ. PŁYTKI KRWI ORAZ CZYNNIKI OSOCZOWE BIORĄCE UDZIAŁ ZARÓWNO W KRZEPNIĘCIU KRWI, JAK I W ROZPUSZCZANIU SKRZEPU Cztery etapy hemostazy He most a za jest procesem zatrzymywania krwawienia, które następuje po naruszeniu integralności ściany naczyniowej. Obejmuje ona powstawanie skrzepu i polega na współdziałaniu elementów ściany naczyniowej, płytek krwi i białek osocza, które powoduje zarówno krzepnięcie krwi, jak i liŜę powstałego skrzepu. Istnieją cztery etapy hemostazy: Pierwszym z nich jest obfcurczanie się uszkodzonego naczynia, z jednoczesnym zmniej szeniem się przepływu krwi w odcinku dystalnym w stosunku do miejsca uszkodzenia. Na drugą fazę składa się formowanie luźnego, przejściowego czopu płytkowego w miejscu uszkodzenia. Płytki przylegają do włókien kolagenu w miejscu uszkodzenia ściany naczyniowej i podlegają aktywacji przez trombinę (mechanizm aktywacji płytek opisano po niŜej), powstałą w kaskadowej reakcji krzep-

nięcia w tym samym miejscu lub przez ADP uwolniony z innych zaktywowanych juŜ płytek. Podczas aktywacji płytki zmieniają swój kształt i w obecności flbrynogenu ulegają agregacji z utworzeniem czopu płytkowego. Trzeci etap hemostazy polega na utworze niu sieci fibryny lub skrzepu, który zatrzymuje w swoim obrębie czop płytkowy (biały skrzep) i (lub) erytrocyty (czerwony skrzep) formując ostatecznie bardziej trwałą skrzepline. W czwartej fazie dochodzi do częściowego lub całkowitego rozpuszczenia skrzepu przez plazminę. W warunkach prawidłowej hemosta zy istnieje stabilny, dynamiczny stan równo wagi, w którym skrzepliny są stale tworzone i rozpuszczane. Istnieją trzy rodzaje skrzepów RozróŜnia się następujące rodzaje skrzepów: Biały skrzep złoŜony z płytek i fibryny jest stosunkowo ubogi w erytrocyty. Powstaje on w miejscu uszkodzenia lub patologicznej zmia ny ściany naczyniowej, szczególnie w miejscach, gdzie przepływ krwi jest szybki (k-inice). Drugim rodzajem skrzepu jest czerwony skrzep, który początkowo składa się z krwinek czerwonych i fibryny. Czerwony skrzep mor fologicznie przypomina skrzepline powstałą w probówce i moŜe formować się in vivo w ob szarach o zwolnionym przepływie krwi lub z jej zastojem, ze współistniejącym lub nie uszkodze niem naczyniowym, albo teŜ moŜe on być formowany w miejscu zranienia lub zmiany naczyniowej w połączeniu z tworzącym się pierwotnie czopem płytkowym. Trzecim rodzajem skrzepu są rozsiane złogi fibryny zlokalizowane w bardzo małych naczy niach i kapilarach. Poszczególne 3 rodzaje skrzepu zawierają fibrynę w zmiennych proporcjach. W pierwszej kolejności zostanie przedstawiony proces krzepnięcia prowadzący do powstania fibryny. Następnie opisane zostaną krótko pewne aspekty udziału płytek i ściany naczyń krwionośnych w całościowo ujętym procesie krzepnięcia. To oddzielenie czynników krzepnięcia i płytek jest sztuczne, jako Ŝe jedne i drugie pełnią wzajemnie współzaleŜne i bardzo zbliŜone funkcje w procesie krzepnięcia; takie postępowanie jednakŜe ułatwia opis całości toczących się procesów.

784 / ROZDZIAŁ 58

Wynikiem działania zarówno szlaku wewnątrzpochodnego, jak i zewnątrzpochodnego jest powstanie włóknika Dwa szlaki prowadzą do uformowania czopu fibrynowego; zewnątrzpochodny i wewnątrzpochodny. Tworzenie sie czerwonego skrzepu w miejscu o zwolnionym przepływie krwi lub w odpowiedzi na istnienie patologicznej zmiany w obrębie ściany nitczyniowej bez uszkodzenia okolicznych tkanek jest wynikiem aktywacji szlaku wewnątrzpochodnego. W powstaniu czopu fibrynowego w odpowiedzi na uszkodzenie tkanki uczestniczy szlak zewnątrz pochodny. Obydwa szlaki zbiegają się we wspólnym, końcowym etapie obejmującym aktywacje pro trombiny do trombiny i katalizowane przez powstały enzym rozszczepienia fibrynogenu z utworzeniem czopu fibrynowego. Szlaki zewnątrzpochodny i wewnątrzpochodny, jak równieŜ wspólny etap końcowy są skomplikowane i bierze w nich udział wiele róŜnych białek {ryc. 58-9, tab. 58-6). Ogólnie, jak przedstawiono w tab. 58-7, białka te mogą być zaklasyfikowane do 4 grup: l)zymogenów, obejmujących sery nowo -zaleŜne proteazy, które ulegają aktywacji podczas procesu krzepnięcia; 2) kofaktorów; 3) fibrynogcnu i 4) transglutamina/y, która stabilizuje skrzep fibry no wy. Szlak wewnątrzpochodny prowadzi do aktywacji czynnika X Szlak wewnątrzpochodny (ryc. 58-9) obejmuje czynniki XII, Xl, IX, VIII i X, jak równieŜ UJEM&fE NAŁADOWANA POWIERZCHNIA

Tabela 58-6. Numeryczny system nazewnictwa czynników krzepnięcia krwi. Liczebniki wskazują kolejność, w jakiej czynniki osoczowe były odkrywane i nie mają związku z kolejnością, w jakiej one działają Czynnik

Nazwa(y) zwyczajowa(e)

1

Fibrynogen \ Czynniki te są zwykle

II

f określane za pomocą / wichchnazw zwyczajoProtrombina j V

III

Fosfolipidy płytkowej

Niesazwyk.

1 le określane | jako czynniki Jony wapnia / krzepnięcia Proakceleryna, czynnik chwiejny, akcelerator (Ac-)-globuliny Prokonwertyna, akcelerator konwersji protrombiny (SPCA), kotromboplastyna Czynnik antyhemofiiowy A, globulina antyhemofiłowa (AHG) Czynnik antyhemolitowy B, czynnik Christmasa, os oczowy składni ktromboplastyny Czynnik Stuarta-Pro we ra

IV V VII

vm IX

X XI

Czynnik poprzedzający tromboplastynę osoczową (PTA) Czynnik Hagemana Czynnik stabilizujący fibrynę (FSF), fibrynoligaza

XII

XIII

Uszka^ "\^_dzenle f^ tkanki g2| ak Czynnik tKankowy \ zewnątrzpochodny x

■—vii

Szlak wewnątrz-.* pochodny

J Sponlanloznła

2el flbrynowy Rozpuszczalne monomery flbryny

Końcowy, wspólny etap krzepnięcia Fibfynogen

u sieciowa rta fibry na

Ryc. 58-9. Szlaki krzepnięcia krwi; wewnątrzpochodny i zewnątrzpochodny, prowadzące do powstania nierozpuszczalnego skrzepu fibryny. HMK — wielkocząsteczkowy kininogen, PL — fosfolipidy. "

* Bfady-

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 7SS Tabela 58-7. Funkcje osoczowych czynników krzepnięcia 1. Zymogeny proteaz serynowych Czynnik XII Łączy się z odsłoniętymi cząsteczkami kolagenu w miejscu uszkodzenia ściany naczyniowej; aktywowany przez wielkocząsteczkowy kininogen i kalikretnę f Czynnik XI Aktywowany jest przez czynnik Wie Czynnik IX Aktywowany jest przez czynnik Xla w obecności jonów wapnia Czynnik VII Aktywowany przez trombinę w obecności jonów wapnia Czynnik X Uczynniany na powierzchni zaktywowanych ptytek przez kompleks czynników (jony wapnia, czynniki VIMa i tXa), jak równieŜ przez czynnik VIla w obecności czynnika tkankowego i jonów wapnia Czynnik Uczynniany na powierzchni zaktywowanych płytek przez kompleks protrombtnowy (jony wapnia, czynnik Va i Xa) (czynniki II, VII, IX i X są zymogenami zawierającymi reszty karboksyglutaminianowe) 2. Kota który Czynnik V!ll Aktywowany przez trombinę, czynnik Vltla jest kofaktorem w reakcji aktywacji czynnika X przez czynnik iXa Czynnik V Aktywowany przez trombinę; czynnik Va jest kofaktorem w reakcji aktywacji protrombiny przez czynnik Xa 3, Fibrynogen Czynnik I

Rozszczepiany przez trombinę z utworzeniem skrzepu fibrynowego

4. Tiolowo-zaleŜna transglutaminaza Czynnik XIII Aktywowany przez trombinę w obecności jonów wapnia stabilizuje skrzep fibrynowy na zasadzie tworzenia krzyŜowych wiązań kowalencyjnych 50 — Biochemia

prekalikreinę, wysokocząsteczkowy kininogen, jony wapnia i fosfolipidy płytek krwi. Ostatecznie doprowadza on do powstania czynnika Xa (według przyjętej konwencji zaktywowane czynniki krzepnięcia oznacza się za pomocą przyrostka „a"). Szlak ten rozpoczyna się „fazą kontaktu", w trakcie której prekalikreina, wysokocząsteczkowy kininogen, czynniki XII i XI są eksponowane na działanie ujemnie naładowanej powierzchni aktywującej. Prawdopodobnie to właśnie kolagen, znajdujący się na odsłoniętej powierzchni ściany naczynia spełnia in vivo rolę wspomnianej powierzchni aktywującej, podczas gdy szkło lub kaolin w warunkach laboratoryjnych in vitro stymulują szlak wewnątrzpochodny. W chwili, gdy czynniki uczestniczące w fazie kontaktu zostanl* zgromadzone na powierzchni aktywującej, czynnik XII ulega aktywacji do czynnika XIIa w reakcji proteolizy katalizowanej przez kalikreinę. Powstały pod wpływem kalikreiny czynnik XIIa działa na prekalikreinę uwalniając kolejne cząsteczki kalikreiny, tworząc tym samym układ wzajemnej, zwrotnej aktywacji. Utworzony czynnik XIIa aktywuje czynnik XI do XIa oraz uwalnia bradykininę (nonapeptyd o działaniu rozszerzającym naczynia krwionośne) z wysokocząsteczkowego kininogenu. Czynnik XIa w obecności jonów wapnia aktywuje czynnik IX (masa cząsteczkowa 55 000, będący zymogenem zawierającym zaleŜne od obecności witaminy K reszty ykarboksyglutaminianowe) do proteazy serynowej — czynnika IXa. Czynnik ten rozkłada wiązanie między arginmą i izoleucyną (Arg-Ile) w cząsteczce czynnika X (masa cząsteczkowa 56 000), tworząc dwułańcuchową proteazę serynową — czynnik Xa. Ostatnia reakcja wymaga do swego przebiegu udziału zespołu składników określanych łącznie jako kompleks aktywny, zlokalizowany na powierzchni zaktywowanych płytek i składający się z jonów wapnia, czynników VHIa, IXa i X, NaleŜy nadmienić, iŜ we wszystkich reakcjach, w których biorą udział zymogeny zawierające reszty Gla na N-końcach cząsteczek (c2ynniki II, VII, IX i X) reszty te są miejscami o wysokim powinowactwie dla jonów wapnia. Przed zgromadzeniem czynników kompleksu aktywnego na trombocytach, płytki muszą ulec aktywacji, aby mogły wyeksponować kwaśne (anionowe) fosfolipidy, tj. fosfatydyloserynę i fosfatydyloinozytol, które zwykle znajdują się na wewnętrznej powierzchni błony komórkowej nie ^aktywowanego trombocytu.

786 / ROZDZIAŁ 58

Czynnik VIII (masa cząsteczkowa 330000) jest glikoproteiną nie będącą prekursorem proteazy, lecz kofaktorem słuŜącym jako receptor dla czynników IXa i X na powierzchni płytek krwi. Czynnik. VIII jest aktywowany przez niewielkie ilości trombiny, tworząc czynnik VIIIa, podlegający następnie unieczynnieniu na drodze dalszego rozszczepienia przez trombinę. Szlak zewnątrzpochodny równieŜ prowadzi do uczynnienia czynnika X, choć w odmienny sposób Czynnik Xa zajmuje w układzie krzepnięcia miejsce, gdzie zbiegają się oba szlaki; zewnątrzpochodny i wewnątrzpochodny (ryc. 58-9), rozpoczynając wspólny, końcowy etap krzepnięcia krwi. Szlak zewnątrzpochodny obejmuje czynnik tkankowy, czynnik VII, X i jony wapniowe, prowadząc do powstania czynnika Xa. Szlak ten jest aktywowany w miejscu uszkodzenia tkanki w chwili uwolnienia czynnika tkankowego (obficie występującego w łoŜysku, tkance płucnej i mózgu) (ryc. 58-9), który działa jako kofaktor w katalizowanej przez czynnik VIIa reakcji aktywacji czynnika X. Czynnik VIIa

rozszczepia to samo wiązanie między argininą i izoleucyną (Arg-Ile) w cząsteczce czynnika X, które jest rozszczepiane przez kompleks aktywnych czynników szlaku wewnątrzpochodnego. Czynnik VII (masa cząsteczkowa 53 000), będący glikoproteiną syntetyzowaną w wątrobie, zawiera reszty glutaminianowe i jest zymogenem o stosunkowo wysokiej endogennej aktywności; aktywność ta wzrasta w wyniku konwersji do aktywnej proteazy serynowej, tj. czynnika VIIa, przez trombinę lub czynnik Xa. Aktywacja czynnika X stanowi waŜne sprzęŜenie

szlaku wewnątrzpochodnego z zewnątrzpochodnym.

Końcowy wspólny etap krzepnięcia obejmuje aktywacje protrombiny do trombiny Podczas końcowego, wspólnego etapu krzepnięcia, czynnik Xa, powstający zarówno na szlaku wewnątrzpochodnym, jak i zewnątrzpochodnym, aktywuje protrombinę do trombiny (czynnik Ha), która następnie przekształca fibrynogen w fibrynę (ryc. 58-9). Aktywacja protrombiny, podobnie jak uczynnienie czynnika X, zachodzi na powierzchni zaktywowanych płytek i wymaga obecności kompleksu protrombinazy składającego się z płytkowych, anionowych fosfolipidów, jonów wapnia, czynnika Va, czynnika Xa i protrombiny.

Czynnik V (masa cząsteczkowa 330000), glikoproteiną pod wieloma względami zbliŜona do czynnika VIII i ceruloplazminy, jest syntetyzowany w wątrobie, śledzionie i nerkach, i obecny zarówno w płytkach krwi, jak i osoczu. Działa on jako kofaktor w sposób podobny do czynnika VIII w kompleksie aktywnym. PD aktywacji do czynnika Va, zachodzącej pod wpływem niewielkich ilości trombiny, wiąŜe się on ze specyficznymi receptorami błony komórkowej płytek (ryc. 58-10), tworząc kompleks z czynnikiem Xa i protrombiną. Następnie czynnik ten podlega inaktywacji wskutek dalszego działania trombiny, tym samym zapewniając ograniczenie konwersji protrombiny do trombiny. Protrombiną (masa cząsteczkowa 72 000, ryc. 58-1)) jest jednołańcuchową glikoproteiną syntetyzowaną w wątrobie. Region N-koricowy protrombiny (1 na ryc, 58-11) zawiera 10 reszt

Pretrombina

COO C32+ Ca2+

Btona Komórkowa płytki

Ryc. 58-10. Schematyczne przedstawienie wiązania się czynników Va, Xa, jonów wapnia i protrombiny z błoną komórkową zaktywowąnej płytki. Miejsca rozszczepienia cząsteczki protrombiny przez czynnik Xa są zaznaczone przez dwie strzałki. Część cząsteczki protrombiny, z której następnie powstaje trombina, jest oznaczona jako pretrombina. __________________________________________________

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 787 >

Gla „ 1

2

:

rI

-SS

I B

A|

X. Frełromblna (przed rozszczepieniem przez czynnik Xa) Trombina (po rozszczepieniu przez czynnik Xa)

j i

Ryc. 58-11. Schematyczne przedstawienie protrombiny fragment N-końcowy znajduje sie po lewej stronie; obszar 1 zawiera wszystkie 10 reszt y-karboksygIutaminianowych Zaznaczono miejsca, w których cząsteczka jest rozszczepiana pod wpływem czynnika Xa, jak równieŜ produkty jej degradacji. Pozycja katalitycznie aktywnej seryny oznaczona jest za pomocą trójkącika. Łańcuchy A i B aktywnej trombiny (zacienione) są wzajemnie połączone za pomocą mostków dwusiarczkowych,___________________ F-1-2

y-karboksyglutaminianowych (Gla), zaś serynowo-zaleŜne miejsce aktywne tej proteazy (zaznaczone czarnym trójkątem), umiejscowione jest na C-końcu cząsteczki. Po połączeniu z kompleksem czynników Va i Xa na powierzchni płytki, cząsteczka protrombiny ulega rozszczepieniu w dwóch miejscach przez czynnik Xa, co prowadzi do utworzenia aktywnej, dwułańcuchowej cząsteczki trombiny, która jest następnie uwalniana z powierzchni płytki. Łańcuchy A i B trombiny są ze sobą połączone wiązaniem dwusiarczkowym. Protrombina moŜe być równieŜ uczynniona przez koagulazę gronkowcową na drodze prostej modyfikacji konformacyjnej, nie obejmującej rozszczepienia cząsteczki. Przekształcenie fibrynogenu do fibryny jest katalizowane przez trombinę Fibrynogen (czynnik I, masa cząsteczkowa 340000, ryc. 58-9 i tab. 58-7) jest rozpuszczalną

glikoproteiną osoczową o długości 47,5 nm, która składa się z trzech róŜniących się między sobą łańcuchów polipeptydowycłi (A a B p, y)2, kowalencyjnie połączonych ze sobą wiązaniami dwusiarczkowymi. Łańcuchy B p i y zawierają przyłączony do asparaginy kompleks oligosacharydowy. Wszystkie 3 łańcuchy są syntetyzowane w wątrobie; 3 odpowiedzialne za ich syntezę geny strukturalne są zlokalizowane na tym samym chromosomie, a ich ekspresja u ludzi podlega koordynacyjnej regulacji. Regiony N-końcowe 6 łańcuchów są utrzymywane w bliskim wzajemnym sąsiedztwie przez pewną liczbę wiązań dwusiarczkowych, podczas gdy regiony C-końcowe są od siebie znacznie oddalone, wskutek czego cząsteczka ma wydłuŜony i asymetryczny kształt (ryc. 58-12). Odcinki A i B znajdujące się w regionach N-końcowych łańcuchów A a i B p1, określane odpowiednio jako fibrynopeprydy A (FPA) i fibrynopeptydy

Łańcuch Aa

Łańcuch B/f Łańcuch y

0

■47.5 nm-

Ryc. 58-12. Schematyczne przedstawienie (bez zachowania proporcji) cząsteczki fibrynogenu, eks ponujące pary łańcuchów Aa, Bp i y połączonych przez wiązania dwusiarczkowe. FPA—fibrynopeptyd A, FPB — fibrynopeptyd B. ___________________________________________________________

788 / ROZDZIAŁ 58

B (FFB), mają nadmiar ładunków ujemnych spowodowanych obecnością reszt asparaginianowych i glutaminianowych, jak równieŜ nietypowego O-siarczanu tyrozyny w FPB. Wspomniane ładunki ujemne mają swój wpływ na rozpuszczalność fibrynogenu w osoczu, jak równieŜ zapobiegają agregacji jego cząsteczek dzięki elektrostatycznemu odpychaniu. Trombina (masa cząsteczkowa 34000) jest proteaza serynową występującą w osoczu i hydrolizującą 4 wiązania arginina-glicyna (Arg-Gly) zlokalizowane między fibrynopeptydami oraz odcinkami a i (! łańcuchów AaiB Pfibrynogenu(ryc. 58-13A). Uwolnienie fibrynopeptydów przez trombinę wyzwala monomery fibryny, mające strukturę podjednostkową (a, p, y)2. PoniewaŜ FPA i FPB zawierają odpowiednio tylko 16 i 14 reszt aminokwasowych, cząsteczka fibryny zachowuje 98% reszt obecnych w fibrynogenie. Usunięcie fibrynopeptydów odsłania miejsca wiązce, które umoŜliwiają cząsteczkom monomerów fibryny spontaniczną agregację w niestabilny kompleks tworzący z kolei nierozpuszczalny skrzep fibrynowy. Uformowany, nierozpuszczalny polimer

fibryny zatrzymuje w swoim obrębie płytki, erytrocyty i inne składniki tworząc białe lub czerwone skrzepy. Utworzony początkowy skrzep fibrynowy jest raczej słaby i utrzymywany w całości jedynie przez niekowalencyjne połączenia monomerów fibryny. Trombina, poza konwersją fibrynogenu do fibryny, przekształca równieŜ czynnik XIII do czynnika XIJIa Czynnik ten jest bardzo swoistą transglutaminazą, która kowalencyjnie łączy cząsteczki fibryny na zasadzie tworzenia wiązań peptydowych między grupami y-karboksylowymi y-karboksyglutaminianu i e-aminowymi reszt lizyny (ryc, 58-13B). W ten sposób powstaje bardziej stabilny skrzep fibrynowy o zwiększonej odporności na proteolizę. StęŜenie krąŜącej trombiny wymaga precyzyjnej kontroli wobec moŜliwości powstawania groźnych zakrzepów W warunkach fizjologicznej hemostazy stęŜenie aktywnej trombiny musi podlegać dokładnej kontroli, aby nie tworzyły się groźne zakrzepy. Cel ten osiągany jest w dwojaki sposób. Trombina krąŜy w postaci nieaktywnego preluirsora

Trombina

Arg —*— Gly Flbrynopeptyd (A lub B)

Łańcuch fibryny (a lub 0)

Fibryna — CH;, — CH;> — CH;. — CHj — NH3 Reszta lizyny

NHJ

J

N —C —CH ? —CH;— Fibryna Reszta glutaminy 1

Czynnik Xllia (transglutamlnaza)

O II Fibryna — CH2 — CH2 — CH2 — CH2 — NH — C — CH2 — CHj — Fibryna

Ryc. 58-13. Tworzenie się skrzepu fibrynowego: A — indukowane przez trombtnę rozszczepienie wiązań Arg-Gly (arginina-glicyna) łańcuchów Aa i Bp fibrynogenu z powstaniem fibfynopeptydów (lewostronnie) oraz łańcuchów cc i p monomerów fibryny (prawostronnej). B — usieciowanie cząsteczek fibry fty przez aktywowany czynnik XIII (czynnik Xll(a).

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 789

— protrombiny, która podlega uczynnieniu na drodze kaskady reakcji enzymatycznych, podczas których nieaktywne zymogeny są przekształcane do aktywnych enzymów, co w konsekwencji prowadzi do konwersji protrombiny w trombinę (ryc. 58-9). Na kaŜdym etapie wspomnianej kaskady mechanizm ujemnego sprzęŜenia zwrotnego zapewnia istnienie precyzyjnej równowagi między aktywacją a hamowaniem. StęŜenie czynnika XII yv osoczu wynosi ok. 30 ug/ml, natomiast fibrynogenu — 3 mg/ml, podczas gdy poziomy innych czynników kolejno działających w kaskadzie wykazują stały wzrost, co jednoznacznie wskazuje na występowanie mechanizmu zwielokrotnienia w obrębie kaskady. Drugi sposób kontroli aktywności trombiny polega na unieczynnianiu wszelkich tworzących się jej cząsteczek przez krąŜące inhibitory, z których najwaŜniejsza jest antytrombina III (p. poniŜej). Aktywność antytrombiny III, waŜnego inhibitora trombiny, zwiększa antykoagulant — heparyna W warunkach fizjologicznych w osoczu istnieją 4 naturalne inhibitory trombiny. NajwaŜniejszym z nich jest antytrombina III, której udział w całkowitej aktywności antytrombinowej wynosi 75%. Antytrombina III moŜe równieŜ hamować aktywność czynników IXa, Xa, Xla i XIIa. a2-Makroglobulina ma największy udział w pozostałej aktywności antytrombinowej osocza, wraz z kotaktoran heparyny II i 01,-antytrypsyną (oCj-antyproteinazą) wykazującymi mniejsza aktywność hamującą w warunkach fizjologicznych. Endogenna aktywność antytrombiny III znacznie zwiększa się w obecności kwaśnych proteoglikanów, takich jak heparyna (p. rozdz. 57). WiąŜą się one ze swoistymi miejscami kationowymi w obrębie cząsteczki antytrombiny III, indukując zmianę jej konformacji, ułatwiając tym samym jej wiązanie się z trombiną i innymi substratami. Mechanizm ten leŜy u podstaw stosowania heparyny w medycynie klinicznej w celu zahamowania krzepnięcia. Ponadto heparyna stosowana w małych dawkach ma zdolność wyścielania śródbłonka naczyń krwionośnych, przez co prawdopodobnie zmniejsza aktywację szlaku wewnatrzpochodnego. Antykoagulacyjne działanie heparyny moŜe zostać zniesione przez działające przeciwstawnie silnie kationowe polipeptydy, jak pro tam i na, która mocno wiąŜąc się z z heparyną osłabia jej łączenie się

z antytrombina IH^Osoby z wrodzonymi niedoborami antyirombiny IIJ wykazują predyspozycje do częstego tworzenia rozległych zakrzepów, co potwierdza fizjologiczne znaczenie antytrombiny III oraz wskazuje na fakt, iŜ układ krzepnięcia u ludzi jest w warunkach fizjologicznych układem dynamicznym. ■

Anty koagulanty pochodne kumaryny hamują zaleŜną od witaminy K karboksylację czynników II, VII, IX oraz X Antykoagulanty kumarynowe (np.: dikumaroi) są lekami hamującymi zaleŜną od obecności witaminy K karboksylację reszt glutaminianowych do y-karboksyglutaminianowych w regionach N-końcowyeh czymjjków II, VII, IX i X. Czynniki te, powstające w wątrobie, do spełnienia swej roli w procesie krzepnięcia wymagają obecności jonów wapnia. Te ostatnie zostają związane przez reszty y-karboksyglutaminianowe, z kolei uzaleŜnione od karboksylacji reszt glutaminianowych wymienionych czynników krzepnięcia. Pochodne kumaryny hamują redukcję pochodnych chinonowych witaminy K do aktywnych jej form hydrochinonowych. W tym przypadku podanie witaminy K pozwala ominąć indukowaną kumaryną inhibicję i umoŜliwia powstanie czynników zawierających reszty Y-karboksyglutaminianowe. Odwrócenie inhibicji kumarynowej przez witaminę K trwa 12—14 h, podczas gdy wyeliminowanie efektów działania heparyny przez pro taminę jest prawie natychmiastowe. Hemofilia A jest spowodowana genetycznie uwarunkowanym niedoborem czynnika VIII U ludzi spotyka się wiele wrodzonych niedoborów w obrębie układu krzepnięcia. Najbardziej rozpowszechniony jest niedobór czynnika VIII wywołujący hemofilię A. Choroba ta, dziedzicząca się z chromosomem X, miała duŜe znaczenie w historii rodów królewskich w Europie. Hemofilia B jest spowodowana niedoborem czynnika IX i wykazuje niemalŜe identyczny obraz kliniczny jak hemofilia A. Obydwa stany chorobowe moŜna jednak zróŜnicować za pomocą swoistych testów laboratoryjnych. Gen ludzkiego czynnika VIII, poddany klonowaniu, okazał się być jednym z największych do tej pory poznanych, zawiera bowiem 186 kb i 26 eksonów. Wykryto wiele rozmaitych typów uszkodzeń, przejawiających się zmniejszoną ak-

790 / ROZDZIAŁ 58

tywnością czynnika VIII. Obejmują one częściowe delecje i punktowe mutacje prowadzące do przedwczesnego zakończenia tworzenia łańcucha polipeptydowego. Obecnie moŜliwa jest diagnostyka prenatalna polegająca na ocenie DNA z pobranych komórek kosmówki. W ostatnich latach leczenie pacjentów z hemofilią A obejmowało podawanie krioprecypitatów (wzbogaconych w czynnik VIII) otrzymywanych od indywidualnych dawców lub liofilizowanych koncentratów czynnika VIII przygotowywanych z puli osocza pochodzącego nawet od 5000 dawców. W niedalekiej przyszłości czynnik VIII będzie wytwarzany techniką rekombinacji DNA. Być moŜe metoda ta pokryje zapotrzebowanie wszystkich pacjentów z hemofilią A. Problem ten nabrał znaczenia z chwilą pojawienia się u wielu pacjentów z hemofilią AIDS jako konsekwencji terapii substytucyjnej z wykorzystaniem koncentratów liofilizowanego czynnika VIII, przygotowanych z wielu próbek osocza; czynnik VIII otrzymany metodą rekombinacji DNA jest całkowicie bezpieczny w zastosowaniu klinicznym. Skrzepy fibrynowe są rozpuszczane przez plazminę Jak stwierdzono powyŜej, układ krzepnięcia prawidłowo jest w stanie dynamicznej równowagi, w której skrzepy fibryny są stale tworzone i jednocześnie rozpuszczane. Plazmina— proteaza serynowa, odpowiedzialna w głównej mierze za degradację fibryny i fibrynogenu, krąŜy w osoczu w formie nieaktywnego zymogenu — plazminogenu (masa cząsteczkowa 90 000). Jeśli nawet niewielki*Uości plazminy powstają we krwi krąŜącej, w warunkach fizjologicznych podlegają one natychmiastowej inaktywacji przez szybko działający inhibitor plazminy — atj-antyplazminę. Plazminogen łączy się zarówno z fibrynogenem, jak i fibryną, i w ten sposób zostaje włączony w skfad skrzepu w trakcie jego tworzenia się. Plazmina powstająca w czasie jej związania z fibryną jest chroniona przed działaniem a2-an ty plazminy i pozostaje aktywna. RóŜnego rodzaju aktywatory plazminogenu występują w większości tkanek organizmu, rozszczepiając to samo wiązanie w cząsteczce plazminogenu — między argininą i waliną (Arg-Val) i tworząc tym samym dwułańcuchową proteazę serynowa — plazminę (ryc. 58-14) Tkankowy aktywator plazminogenu (TPA) jest

proteazą serynowa uwalnianą ze śródbłonka naczyniowego do krąŜenia w warunkach uszko-

Aktywatory plaŜ mtn □ gen u I-Val —i

NH:

\ -pArg

rtiy—vai

PLAZMINOGEN

r

s-S—'

coo

I --S PLAZMINA

Ryc. 58-14. Aktywacja plazminogenu coo To samo wiązanie Arg-Val (argininawalina) jest rozszczepiane przez wszystkie aktywatory plazminogenu, z utworzeniem dwulańcuchowej cząsteczki plazminy. Trójkącik oznacza resztę serynowa miejsca aktywnego. Dwa łańcuchy plazminy są połączone ze sobą za pomocą mostka dwusiarczkowego.

dzenia tkanki lub stresu, a następnie, jeśli nie zwiąŜe się z fibryną, podlega katalitycznej inak tywacji. Po połączeniu z fibryną TPA rozszczepia plazminogen w obrębie skrzepu z wytworzeniem plazminy, która z kolei rozkłada fibrynę z uwal nianiem rozpuszczalnych produktów jej degra dacji, co ostatecznie prowadzi do rozpuszczenia skrzepu. Zarówno plazmina, jak i aktywator plazminogenu, nie mogąc pozostać związane z produktami degradacji fibryny, są uwalniane do osocza, gdzie podlegają unieczynnieniu przez ich naturalne inhibitory. Prourokinaza jest pre kursorem kolejnego aktywatora piazminogenu — urokinitzy, która nie ma tak duŜej swoistości dla fibryny jak poprzedni aktywator. Urokinaza jest wydzielana przez pewne komórki nabłon kowe wyścielające przewody wydzielnicze (np. kanaliki nerkowe) i prawdopodobnie bierze udział w rozpuszczaniu fibryny odkładającej się w tych przewodach. , TPA otrzymany techniką rekombinacji DNA badany jest pod kątem jego przydatności w leczeniu zakrzepów wieńcowych W chwili obecnej inny aktywator plazminogenu streptokinaza —-jest wykorzystywany w lecznictwie jako czynnik fibrynolityczny. JednakŜe jest on mniej wybiórczy niŜ TPA, .poniewaŜ aktywuje zarówno plazminogen w osoczu (gdzie moŜe on następnie degradować krąŜący tlbrynogen), jak równieŜ plazminogen związany ze

BIAŁKA OSOCZA, iMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 791

skrzepem fibrynowym. Ilość plazminy powstałej pod wpływem dawek terapeutycznych streptokinazy moŜe przekroczyć zdolność neutralizacji przez krąŜącą a 2 -antyplazminę, powodując w konsekwencji degradację zarówno fibrynogenu, jak i fibryny, z następczymi krwawieniami często obserwowanymi w trakcie terapii fibry nolitycznej. Istnieje znaczne zainteresowanie wykorzystaniem terapeutycznym TPA otrzymanego metodą rekombinacji DNA z racji jego swoistości dla degradowanej fibryny i moŜliwości przywracania droŜności tętnicom wieńcowym, objętym uprzednio zakrzepem. Pod warunkiem odpowiednio wczesnego podania (przed wystąpieniem nieodwracalnych uszkodzeń mięśnia sercowego), TPA moŜe znacznie obniŜyć współczynnik umieralności z powodu uszkodzenia mięśnia sercowego, będącego konsekwencją zakrzepicy wieńcowej. Dotychczas, w wielu próbach klinicznych, TPA wywoływał czasem krwawienia, tak więc pozostaje nadal pytanie, czy okaŜe się on korzystniejszym lekiem w terapii ostrej zakrzepicy wieńcowej od o wiele tańszej s trep toki nazy. Istnieje kilka stanów patologicznych, między innymi choroba nowotworowa i wstrząs, w których obserwuje się wzrost poziomu aktywatorów plazminogenu. Ponadto aktywność antyplazminy, na którą składają się arantytrypsyna i otj-antyplazmma moŜe być zaburzona w pewnych stanach chorobowych, jak chociaŜby w marskości wątroby. PoniewaŜ pewne substancje pochodzenia bakteryjnego, jak na przykład streptokinaza, mają zdolność aktywowania plazminogenu, mogą one być odpowiedzialne za powstawanie rozległej skazy krwotocznej obserwowanej czasami u pacjentów z uogólnionymi infekcjami bakteryjnymi. Aktywacja płytek związana jest ze stymulacją metabolizmu poi ifosf oi nozytydów Płytki podlegają kolejno 3 procesom, zapewniającym ciągłość hemostazy: 1) adhezji do odsłoniętych włókien kolagenu w ścianie naczyniowej, 2) uwolnieniu zawartości ich ziarnistości oraz 3) agregacji. Adhezja płytek do kolagenu odbywa się z udziałem czynnika von Willebranda, glikoproteiny wydzielanej przez komórki śródbłonka do osocza. Białko to działa jak „most bezpieczeństwa" rozpięty między glikoproteiną powierzchni płytek a włóknami kolagenu w ścianie naczyń krwionośnych. Czynnik ten zapobiega

więc oderwaniu sięiplytek od ścian naczyń pod wpływem sił „strzygących" prądu krwi. Aktywacja płytek. Prawidłowe płytki znajdują się w stanie nie pobudzonym. Podczas krzepnięcia zaangaŜowane w ten proces trombocyty podlegają aktywacji. Aktywacja jest złoŜonym zjawiskiem, które obejmuje zmiany kształtu płytek, zwiększoną ich ruchliwość, uwalnianie zawartości ich ziarnistości oraz agregację. Trombina, utworzona w wyniku kaskady krzepnięcia, inicjuje aktywację płytek in vivo na drodze interakcji ze swoim receptorem na powierzchni błony cytoplazmatycznej trombocytów (ryc. 58-15). Kolejne zjawiska prowadzące do aktywacji płytek są przykładem sygnalizacji przez Mono w ej, w trakcie której chemiczny sygnał zawarty w przestrzeni poza komórkowej powoduje powstanie cząsteczek efektorowych we wnętrzu komórki. Na przykład trombina działa jako pozakomórkowy przekaźnik chemiczny (stymulant lub agonista). Oddziaływanie trombiny z iej receptorem wzmaga aktywność fosfolipazy C błony komórkowej. Enzym ten hy drolizuj e fosfaty dy loinozy tolo-4,5-bisfosforan (PIPj jest polifosfoinozytydem), prowadząc do powstania 2 wewnątrzkomórkowych cząsteczek efektorowych — diacyloglicerolu (DAG) oraz inozytolo-tri fosforanu (IPj). Hydroliza PIP2 uczestniczy równieŜ w mechanizmie działania wielu hormonów (p. rozdz. 45) i leków. DAG pobudza kinazę białek C, która z kolei fosforyluje białko płytkowe o masie cząsteczkowej 47 000. Fosforylacja tego białka powoduje uwolnienie zawartości róŜnego typu ziarnistości płytkowych (lizosomy, ziarnistości gęste i ziarnistości ot). ADP uwolniony z ziarnistości gęstych moŜe równieŜ aktywować płytki, co przejawia się uczynnieniem dodatkowych krwinek płytkowych w otoczeniu. Ponadto ADP ma zdolność modyfikacji powierzchni płytki, co pozwala cząsteczkom fibrynogenu (utworzonym w kaskadzie krzepnięcia) na przyczepienie się do kompleksu glikoprotein (GPIIb oraz GPIIIa) na powierzchni trombocytu. Następnie cząsteczki fibry nogenu łączą ze sobą sąsiadujące płytki tworząc agregat płytkowy. 1P3 powoduje napływ jonów wapniowych do cytoplazmy i współdziałając z kalmoduliną oraz kinazą lekkich łańcuchów miozyny prowadzi do fosforylacji lekkich łańcuchów miozyny. Łańcuchy te następnie współdziałając z aktyną powodują przesunięcie i zmiany kształtu płytki. Aktywacja płytkowej fosfolipazy A2 przez zwiększone stęŜenie jonów wapnia jest przy-

792 / ROZDZIAŁ 58 Prostacyklina

^ TxAa

Trombina

+©+

0

I r^

ADP

I

©

Bfona komórkowa

Fosforylacja Watka o m. ra. 47 000 --'

Fosfarylacja lekkiego łaficucha Aktyna

Uwolnienie zawartości ziarnistości płytki (lizosomalnych. gęstych i łącznie z ADP

Agregacja Aktynomiozyna \ Przesunięcie, zmiana kształtu

Ryc. 58-15. Schematyczne przedstawienie aktywacji płytki. Środowisko zewnątrz kom orkowe* biona komórkowa i środowisko wewnątrzkomórkowe są przedstawione kolejno od góry do dołu. GP — gliko3 3 proteina, R\ R , R , R* — róŜne receptory, AC — cykłaza adenylanowa, PLAS — fosfolipaza A2, PL — fosfolipidy, PLC - fosfolipaza C, PtPs — fosfatydyloinozytofo-4,5 bisfosforan, cAMP — cykliczny adenozynomonofosforan, PKC — kinaza białek C, TxA; — tromboksan A^, IP3 — inozytolo-trifosforan, DAG — diacyloglicerol.

czyną uwolnienia kwasu arachidonowego z płytkowych fosfolipidów i powstania tromboksanu Aj (rozdz. 25), który z kolei ma zdolność dalszej aktywacji fosfoti^azy C, ułatwiając płytkową agregację. Uczynnione płytki, poza formowaniem c/opu płytkowego, są niezbędne, dzięki swoim fosfolipidom, do aktywacji czynników X i II w kaskadzie krzepnięcia (ryc. 58-9), Ściany naczyń krwionośnych syntetyzują prostacyklinę oraz inne substancje wpływające na krzepnięcie krwi i tworzenie zakrzepów Komórki śródbłonka ścian naczyń krwionośnych wnoszą istotny wkład do ogólnej regulacji krzepnięcia i powstawania zakrzepów. Jak opisano w rozdz. 25, komórki te wytwarzają prostacykliny (PGI2), które są silnymi inhibitorami płytkowej agregacji, antagonizując działanie tromboksanów. Prostacykliny działają prawdopodobnie na zasadzie pobudzania aktywno-

ści cyklazy adenylanowej na powierzchni błon płytek. Pojawiające się w następstwie tego zwię\

kszenie stęŜenia wewnątrzpłytkowego cAMP przeciwdziała stymulowanemu przez IP3 wzrostowi stęŜenia wewnątrzkomórkowych jonów wapnia, i tym samym hamuje aktywację płytek (ryc. 58-15). Komórki śródbłonka spełniają teŜ inne funkcje w regulacji powstawania skrzepu. Na przykład metabolizują ADP, znosząc jego działanie agregujące płytki. Ponadto, wytwarzają one równieŜ siarczan Iieparanu. który wiąŜe niektóre czynniki krzepnięcia, a takŜe produkują aktywatory plazminogenu, które mogą wspomagać rozpuszczanie skrzepów. Analiza mechanizmów inkorporacji aterogennych lipoprotein, jak LDL, przez monocyty, komórki śródbłonka i mięśniówki gładkiej tętnic, wraz z precyzyjną oceną mechanizmów powstawania uszkodzeń wywoływanych przez lipoproteiny w obrębie tych komórek, są przedmiotem intensywnych badań w celu wyjaśnienia mechanizmów powstawania miaŜdŜycy (rozdz. 28).

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 793 Tabela 58-8. Główne cechy hemostazy i krzepnięcia

LABORATORYJNE TESTY OCENY KRZEPNIĘCIA KRWI

Naczynia krwionośne, płytki i czynniki osoczowe krzepnięcia są łącznie zaangaŜowane w całości procesu Wewnątrzpochodny układ krzepnięcia jest aktywowany przez odsłonięty kolagen na powierzchni naczyń krwionośnych

Układ zewnątrzpochodny i wewnątrzpochodny prowadzą do powstania czynnika Xa, natomiast finalizują swoje działanie w końcowej, wspólnej fazie krzepnięcia, w której powstaje fibryna z fibrynogenu pod działaniem trombiny

Obecnie dostępnych jest wiele róŜnorodnych testów laboratoryjnych słuŜących do oceny 4 etapów hemostazy opisanych powyŜej. Obejmują one oznaczanie liczby płytek, czasu krwawienia, czasu częściowej tromboplastyny (PTT), czasu protrombinowego (PT), czasu trombinowego, stęŜenia fibrynogenu, trwałości skrzepu fibrynowego oraz ilości produktów rozpadu fibryny. Szersze informacje na temat wymienionych badań znajdzie Czytelnik w podręcznikach fizjologii lub hematologii. Podstawowe dane dotyczące hemostazy i krzepnięcia zebrano w tab. 58-8.

Wiele czynników krzepnięcia istnieje w postaci zymogenów proteaz serynowych; zymogeny te podlegają aktywacji na drodze proteotizy.

PIŚMIENNICTWO

Układ zewnątrz pochodny jest aktywowany przez czynnik tkankowy uwotniony w trakcie uszkodzenia tkanki

Istnieją genetycznie uwarunkowane niedobory lub zmiany struktury czynników krzepnięcia, manifestujące się wieloma chorobami krwotocznymi, jak chociaŜby hemofilia A W osoczu występują inhibitory czynników krzepnięcia (np. antytrombina III), które biorą udział w regulacji krzepnięcia Wiele kluczowych reakcji w układzie krzepnięcia odbywa się na powierzchni płytek; płytki podlegają aktywacji wskutek działania trombiny, kolagenu i ADP, a ich agregacja jest zaleŜna od interakcji z fibrynogenem Całość procesów krzepnięcia stanowi kaskadę, w ramach której następuje znaczne zwielokrotnienie działania Dla aktywacji czynników II, Vii, IX i X konieczna jest zaleŜna od obecności witaminy K karboksylacja pewnych reszt glutaminianowych z utworzeniem reszt gamma-karboksyglutaminianowych (Gla); reszty te wiąŜą jony wapnia, będące waŜnymi uczestnikami procesu krzepnięcia Ściany naczyń krwionośnych wytwarzają prostacyklinę, która hamuje aktywację i agregację płytek; w ścianie naczyń krwionośnych odbywa się takŜe synteza innych związków, które biorą udział w regulacji krzepnięcia Skrzepy powstają z fibryny, wzmacnianej przez formowanie wiązań krzyŜowych, katalizowane przez transglutaminazę, skrzepy fibrynowe są rozpuszczane przez plazminę powstającą z plazminogenu

Bloorn AL,Thomas DP (edkors): Haemostasis and Thrombosis, 2nd ed. ChurchiU Livingstone, 1987, Colman RW, Hirsh J, Marder VJ, Salzman EW (editors): Hemostasis and Thrombosis, 2nd ed. JB Lippincott Co, 1987. Dugaiczyk A, Law SW, Dennison OE: Nuclcotide seąuenee and the encoded amjno acids of human serum albumin raRNA. Proc Natl Acad Sci USA 1982; 79:71. Gitschier J et al: Characterization of the human factor VIII gene. Namre (London) 1984; 312:326. Handin RI. Chapter 54, Bleeding and thrombosis, p 266, in: Harrison's Principks of Interna! Medicine 11 th ed. Braunwald, E, Isselbachcr, KJ, Petersdorf RG et al (editors). McGraw-Hill, 1987. Mariani G (editor): Pathophysiology ofPlasma Protein Metabolizm, Plenum Press, 1984. McK.ee PA: Hemostasis and disorders of blood coagulation, in; The Metabolic Basis of Inherited Disease, 5th ed. Stanbury JB et al (editors). McGraw-Hill, 1983. Reed RG, Peters T Jr. Chapter 14, Plasma proteins, pp 435-464, in: Clinicat Biochemistry Reviews, Vol 3. Goldberg DM (editor). John Wiley & Sons, 1982. Ruffner DE, and Dugaiczyk A: Splicing mutation in human hereditary analbuminemia. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85:2125. Stamatoyannopoulos G, Nienhuis AW. Leder P, Majerus PW (editors): The Mo/ecular Basis of Blood Diseases. WB Saunders, 1987, Stites DP, Stobo JD, Wells JV: Basie & Clinkal Immunology, 6th ed. Appleton & Lange, 1987, Vogel F, Motulsky AG. Human Genetics, 2nd ed. Springer-Verlag, 1986.

59

Białka kurczliwe i strukturalne Victor W. Rodwell, PhD, Robert K. Murray, MD, PhD, Frederick W. Keetey, PhD

WPROWADZENIE Cząsteczki białek mogą pełnić funkcję nie tylko katalizatorów. W poprzednich rozdziałach opisano funkcje regulacyjne, przekazywania sygnałów i funkcje rozpoznawcze cząsteczek białkowych. Spełniają one równieŜ waŜne funkcje przetworników i elementów strukturalnych. W tym rozdziale dokonano przeglądu niektórych z tych ostatnich funkcji zaleŜnych od włóknistej struktury cząsteczek białkowych.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Rozwój naszej wiedzy o molekularnych podstawach głównych chorób genetycznych białek strukturalnych nabrał nowego rozpędu w 1986 r. wraz z pomyślnym klonowaniem genu dystrofii mięśniowej typu Diu-fcuinc'a. Było to osiągnięcie wielce obiecujące dla dokładnego rozpoznawania i ewentualnie leczenia tej choroby (p. przypadek nr 6, rozdz. 62). Podczas gdy wiele molekularnych schorzeń białek powstaje na skutek mutacji w genach, w których dane białko jest zakodowane (np. hemoglobina), białka poddane modyfikacji potranslacyjnej dostarczają dodatkowych moŜliwości powstawania chorób z defektu genetycznego. Na przykład wie\e chorób u ludzi wynika z genetycznych defektów w przetwarzaniu prekursorów kolagenu (osteogenesis imperfecta, zespół Ehlersa-Danlosa i Marfana). Defekty kolagenu mogą powstawać równieŜ na skutek zahamowania potranslacyjnej modyfikacji przez brak kofaktora, takiego jak kwas askorbinowy (witamina C), niezbędnego dla hydroksylacji związanych z białkiem reszt prolilowych i lizylowych do hydroksy-

proliny i hydroksylizyny. Takimi właśnie zaburzeniami moŜna tłumaczyć objawy kliniczne pod postacią osłabienia tkanki łącznej typowe dla klasycznego szkorbutu (gnilca).

MIĘSIEŃ PRZETWARZA ENERGIĘ CHEMICZNĄ W MECHANICZNĄ Mięśnie naleŜą do głównych przetworników biochemicznych (maszyn), które przetwarzają energię potencjalną (chemiczną) w kinetyczną (mechaniczną). Mięśnie, najobfitsza tkanka ciała ludzkiego, stanowią mniej niŜ 25% masy ciała przy urodzeniu, więcej niŜ 40% u młodych dorosłych i mniej niŜ 30% w starości. Efektywny przetwornik chemiezno-mechaniczny musi spełniać kilka warunków: 1. Musi mieć zapewniony stały dopływ energii. W mięśniach kręgowców energia chemiczna dostarczana jest w postaci ATP i fosfokreatyny. 2. W przypadku mięśnia musi być zapewniony sposób regulacji aktywności mechanicznej — tj. szybkości, czasu trwania i siły skurczu. 3. Maszyna musi być podłączona do operatora, którego rolę spełnia w układach biologicznych system nerwowy. 4. Musiiyć zapewniona moŜliwość powrotu maszyny do jej pierwotnego stanu. Mięsień jest maszyną ciągnącą, a nie pchającą. Dlatego mięsień musi mieć antagonistę w postaci grupy innych mięśni lub innych sił, jak grawitacja lub napięcie elementów spręŜystych. U kręgowców powyŜsze warunki spełniane są przez 3 rodzaje mięśni: mięśnie szkieletowe, mięsień sercowy i mięśnie gładkie. Zarówno mięśnie szkieletowe, jak i mięsień sercowy wykazują w obrazie mikroskopowym poprzeczne praŜ-

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 795 kowanie; mięśnie gładkie prąŜkowania nie mają.

Podczas gdy mięśnie szkieletowe są sterowane (kontrolowane) w sposób świadomy, regulacja czynności mięśnia sercowego i mięśni gładkich odbywa się niezaleŜnie od naszej woli.

Sarkoplazma komórek mięśniowych zawiera ATP, fosfokreatynę i enzymy glikolityczne Mięsień poprzecznie prąŜkowany sktada się z wielojądrzastych komórek (włókien) otoczonych pobudliwą na bodźce elektryczne btoną sarkolemmą. Pojedyncze włókno (komórka) mięśniowe, które moŜe rozciągać się na całą długość mięśnia, zawiera pęczki złoŜone z wielu równolegle ułoŜonych miofibryli, zanurzonych w wewnątrzkomórkowym płynie, sarkoplazmie. Płyn ten zawiera glikogen, związki wysokoenergetyczne ATP i fosfokreatynę oraz enzymy glikolityczne. Sarkomer jest czynnościową jednostką mięśnia Sarkomer wielokrotnie powtarza się wzdłuŜ długiej osi fibrylico 1500 — 2300 nm(ryc. 59-1).

Oglądając miofibryje pod mikroskopem moŜna zaobserwować naprzemiennie występujące ciemne i jasne prąŜki (prąŜki A i prąŜki I). Środek prąŜka A (strefa H) jest jaśniejszy niŜ jego reszta. PrąŜek I przedzielony jest w środku linią Z (ryc. 59-2). PrąŜkowanie mięśni dowolnych (szkieletowych) i mięśnia sercowego spowodowane jest wysokim stopniem organizacji ich struktury. Większość komórek ułoŜonych jest tak, Ŝe ich sarkomery tworzą równoległe szeregi (ryc. 59-1). Białkiem grubych filamentów jest miozyna Badanie poprzecznych przekrojów miofibryli za pomocą mikroskopu elektronowego wykazuje, Ŝe kaŜda z nich zbudowana jest z 2 typów podłuŜnych filamentów. Jeden z tych typów (grube filamenty) ograniczony do prąŜka A, zawiera głównie białko miozynę. Filamenty te mają średnice ok. 16 nm i na przekrojach poprzecznych tworzą układ heksagonalny (ryc. 59-2).

Mięsień

PrąŜek PrąŜek

Linia

Prąiek

Miofjbryla Z- Sarkomer-Z

Ryc. 59-1. Struktura mięśnia szkieletowego. (Rycina wykonana przez Sylwię Colard Keene, według Bloom W., Fawcett D. W,: A Textbook of Histology, Saunders, 1975, za zezwoleniem).

796 / ROZDZIAŁ 59 Strefa H

__ A -------

A. Rozkurczony PrąŜek I ' yy*r*„ *

PrąŜek A ,• ,-a.,-./-.,/.,/,

Linia Z ,•—a^

\'.,Sf>'.*4*S...S«*.-S:«, *.*/'/ «W*/ '//

VA&x&AyZ&ttZZffl%&%&Z69%Pfl££&S!g%6i

- 2300 nm

a-Aktynina Filamenty aktyny; średnica 6 nm

Filament mlozyny o średnicy 16 nm

Przekroje poprzeczne B. Skurczony Filament • cienki

Filamenł Średnica 16 nm gruby L——

Średnica 6 nm

1500 nm -- '

Ryc. 59-2. UłoŜenie filamentów w mięśniu poprzecznie prąŜkowanym A — wrozkurczu, B — w skurczu.

Cienkie f ilamenty zawierają aktynę, tropomiozynę i troponinę Filamenty drugiego typu (cienkie) leŜą w prąŜku I, ale rozciągają się równieŜ na prąŜek A, z wyjątkiem jego strefy H (ryc, 59-2). Cienkie filamenty zawierają białka aktynę, tropomiozynę i troponine. W obrębie prąŜka A cienkie filameniy ułoŜone są wokół fiiamentów grubych tworząc wtórny układ heksagonalny. KaŜdy z cienkich filamentów leŜy symetrycznie między 3 grubymi, a kaŜdy z grubych filamentów otoczony jest przez 6 cienkich (ryc. 59-2). Grube i cienkie filamenty współdziałają przez poprzeczne mostki, które co 14 nm wystają z filamentów grubych. Jak to pokazano na ryc. 59-2, mostki poprzeczne l,ub „groty strzał" leŜące na 2 końcach filamentów skierowane są przeciwnie. Bieguny filamentu oddzielone są

odcinkiem o długości 150 nm (prąŜek M) wolnym od poprzecznych mostków. Zachodzące na siebie f i lamenty ślizgają się po sobie w czasie skurczu mięśnia W czasie skurczu mięśnia długość grubych i cienkich filamentów nie-imienia się, natomiast strefa H i prąŜek I się skracają. Tak więc układy zachodzących na siebie filamentów muszą przesuwać się w stosunku do siebie (ślizgać się po sobie) w czasie skurczu mięśnia. Mostki poprzeczne generują i podtrzymują napięcie. Napięcie gene-

rowane w czasie skurczu mięśnia jest proporcjonalne do stopnia zachodzenia na siebie grubych i cienkich filamentów, a więc do ilości tworzonych mostków poprzecznych. KaŜdy mostek poprzeczny połączony jest z grubym filaraentem nitkowatym odcinkiem, który moŜe odginać się

BIAŁKA KURCZLIWE i STRUKTURALNE / 797

od grubego filamentu dostosowując ułoŜenie mostka do wielkości przestrzeni miedzy filamentami.

powtarzającą sięcojtaŜde 35,5 nm. Ani aktyna G, ani F nie maja Ŝadnej aktywności katalitycznej.

Głównymi białkami mięśnia są aktyna i miozyna Masa świeŜego mięśnia składa się w 70% z wody i w ponad 20% z białek. Aktyna i miozyna są dwoma głównymi białkami mięś-

WaŜne funkcje pełnią (stery dodatkowe białka W mięśniu poprzecznie prąŜkowanym znajdują się 4 inne białka mające mały udział w jego masie, ale pełniące waŜne funkcje. Tropomiosyna jest nitkowatą cząsteczką składającą się z 2 łańcuchów cc i p, przyłączoną do aktyny F w rowku między dwoma polimerami (ryc.

nia. Globularny mononjcr aktyny (G-aktyna) ma

masę cząsteczkową 43^000 i stanowi 25% masy białek mięśnia. W fizjologicznym zakresie siły jonowej i w obecności magnezu aktyna G polimeryzuje niekowalencyjnie tworząc nierozpuszczalny, podwójnie spiralny (podwójny heliks) filament zwany aktyna F (ryc. 59-3). Nitka aktyny F ma średnicę 6—7 nm i strukturę

59-3). Troponuozyna występuje we wszystkich

mięśniach i strukturach podobnych do mięśni. Układ trnponiny występuje tylko w mięśniach poprzecznie prąŜkowanych i składa się z 3 osobnych białek. Troponina ^fTpT) łączy się z tro-

Aktyna G

O

o

CD Aktyna F

Tropom bzy na

35.5 nm

Troponina

Uformowany cienki filament

Ryc. 69-3. Schematyczna prezentacja cienkiego filamentu pokazująca przestrzenną konfigurację 3 głów nych składników biatkowych: aktyny, tropomiozyny i troponiny. _____________________________

798 / ROZDZIAŁ 59

OD), 0.0 PAPA! NA

| HMM

HMM S-2

TRYPSYNA

LMM

85 nm

Ryc. 59-4. Diagram cząsteczki miozyny pokazujący 2 zwmięte ze sobą heliksy (część nitkowata), główkę (G), lekkie łaricuchy (L) i efekt trawienia przez trypsynę i papainę. HMM — cięŜka meromiozyna; LMM — lekka meromiozyna; S-1 — podjęcinostka 1; S-2 — podjednostka 2,

pomiozyną oraz z dwoma pozostałymi składnikami troponiny (ryc. 59-3). Troponina I (Tpl) hamuje interakcję między aktyną F i miozyną, a takŜe łączy się z' pozostałymi składnikami troponiny. Troponina C (TpC) jest białkiem wiąŜącym wapń o pierwszo- i drugorzędowej strukturze i funkcji analogicznej do szeroko w przyrodzie występującego białka, kalninduliny. Oba te białka mają masę cząsteczkową 17 000 i wiąŜą po 4 jony wapnia na cząsteczkę. Cienki filamcnt mięśnia poprzecznie prąŜkowanego składa się z aktyny F, tropomiozyny i 3 składników troponiny: TpC, Tpl oraz TpT (ryc. 59-3). Układ trop o mi ozyna-troponina powtarza się co 38,5 nm. Miozyna stanowi 55% masy białek mięśnia i tworzy grube filamenty. Jest ona asymetrycznym heksaniercm o masie cząsteczkowej 450 000. Miozyna ma część nitkowatą, składającą się z 2 zwiniętych ze sobą heliksów, z których kaŜdy na jednym końcu ma globularną główkę

(ryc. 59-4). Heksamer składa się z jednej pary łańcuchów cięŜkich (m.cz. 200 000) oraz z 2 par łańcuchów lekkich (m.cz. 15 000—27 000). Miozyna mięśnia szkieletowego hydrolizuje ATP (wykazuje aktywność ATP-azową) i łączy się z nierozpuszczalną cząsteczką aktyny F. Wiele nauczyliśmy się dokonując częściowego trawienia miozyny Trawienie miozyny fcrypsyną powoduje jej rozpad na 2 fragmenty (meromiozyny). Lekka meromiozyna (LMM) składa się z zagregowanych, nierozpuszczalnych nitek tworzących heliks ot (ryc. 59-14). LMM nie wykazuje aktywności ATP-azowej i nie wiąŜe się z aktyną F. CięŜka meromiozyna (HMM) jest białkiem rozpuszczalnym o masie cząsteczkowej 340 000, posiadającym zarówno fragment włókienkowy, jak i globularny (ryc. 54-14). HMM wykazuje aktywność ATP-azową i wiąŜe się z aktyną F. W wyniku trawienia HMM papainą powstają

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 799

Ryc. 59-5, „Dekorowanie" filamentów aktyny podjednostkami S-miozyny tworzącymi „groty strzał" (dzięki uprzejmości Profesor James Spudich, Uniwersytet Stanford).________ |**_ ________________

2 fragmenty określane jako S-l i S-2. Fragment S-2 ma charakter włókienkowy. Nie wykazuje on aktywności ATP-azowej, ani teŜ nie wiąŜe się z aktyną F. S-l o masie cząsteczkowej 115000 wykazuje aktywność ATP-azową. a przy braku ATP wiąŜe się z aktyną F i „dekoruje" ją „grotami strzał"

(ryc. 59-5). Aczkolwiek zarówno S-l, jak i HMM wykazują aktywność ATP-azową, dodanie do nich aktyny F /większa ją 100 do 200

razy. Jak to będzie omówione poniŜej, aktyną F bardzo zwiększa szybkość, z jaką produkty ATP-azy, ADP i Pi; są od niej odłączane. W ten sposób, chociaŜ aktyną F nie wpływa bezpośrednio na etap samej hydrolizy, dzięki zdolności do ułatwiania odłączania produktów ATP-azy znacznie zwiększa ona całkowitą szybkość katalizy.

wek miozyny z aktyną F. Biochemiczny cykl skurczu mięśnia składa się z 5 etapów (ryc. 59-16): 1) główka miozyny moŜe sama hydrolizować ATP do ADP + P; , ale nie moŜe odłączyć produktów hydrolizy. W ten sposób sama hydroliza ATP przez główkę miozyny ma charakter raczej stechiometryczny niŜ katalityczny; 2) główka miozyny zawierająca ADP i P: moŜe swobodnie obracać się pod duŜym kątem, co umoŜliwia jej odnalezienie aktyny F i związanie się z nią pod kątem ok. 90 stopni w stosunku do długiej osi grubego filamentu; 3) interakcja ułatwia odszczepienie ADP i P: od kompleksu aktyna-miozyna; poniewaŜ ustawienie wiązań aktomiozyny pod kątem 45 stopni jest konformacją o najwyŜszej energii, miozyna zmienia swój kąt z 90 stopni do ok. 45 stopni przez pociąganie aktyny (o 10—15 nm) w kierunku

ct-Aktynina jest białkiem linii Z, do którego przyłączone są końce cząsteczek aktyny F cienkich filamentów (ryc. 59-2).

środka sarkomeru; 4) nowa cząsteczka ATP wiąŜe się z kompleksem miozyna-aktyną F. Miozyna-ATP ma małe powinowactwo do ak-

Energii do skurczu dostarcza zaleŜna od ATP dysocjacja główek miozyny od cienkich filamentów

tyny, wobec czego głów ka miozyny (ATP) 5) oddziela się od niej. Ten ostatni etap decyduje rozkurczu, procesie, który w oczywisty sposób zaleŜy od wiązania ATP z kompleksem aktyna-

W jaki sposób hydroliza ATP powoduje powstanie makroskopowego ruchu? Skurcz mięśnia polega na cyklicznym przyłączaniu do i odłączaniu główek miozyny od filamentów aktyny F.

Przyłączenie powoduje zmianę interakcji aktyna-miozyna tak, Ŝe fiłamenty aktyny i miozyny przesuwają się w stosunku do siebie. Pośrednim źródłem energii jest hydroliza ATP. Jest ona bardzo przyspieszana przez związanie głó-

-miozyna. ATP jest ponownie hydrolizowany przez główkę miozyny, bez odszczepienia ADP P, i w ten sposób cykl się powtarza. Jasne jest, Ŝe ATP powoduje odszczepienie główki miozyny od cienkiego filamentu i dostarcza energii skurczu. Wydajność energetyczna tego skurczu wynosi ok. 50%; dla porównania — wydajność silnika spalinowego wynosi mniej niŜ 20%.

800 / ROZDZIAŁ 59 z+

Ca odgrywa główną rotę w regulacji skurczu mięśni PowyŜej został opisany ogólny mechanizm skurczu mięśni pochodzących z róŜnych źródeł. Mięśnie pochodzące z róŜnych organizmów, a w danym organizmie z róŜnych narządów, mogą mieć róŜne mechanizmy molekularne odpowiedzialne za regulację ich skurczu i rozkurczu. We wszystkich układach rolę głównego regulatora odgrywa Ca2+. Istnieją 2 główne mechanizmy skurczu mięśni: oparty na aktynie i oparty na miozynie.

Aktyna

ATP-miozyna

H,0

ADP-P.-miozyna

W mięśniach poprzecznie prąŜkowanych występuje regulacja oparta na aktynie U kręgowców oparta na aktynie regulacja

f

Aktyna

występuje w mięśniach szkieletowych i w mięśniu sercowym, z których oba są poprzecznie prąŜ-

Aktyn a—m iozyn a AOP-P,

kowane. W opisanym powyŜej ogólnym mechanizmie jedynym czynnikiem ograniczającym w cyklu skurczu mięśnia moŜe być ATP. Układ kurczliwy mięśnia szkieletowego pozostaje zahamowany w spoczynku mięśnia, a jego rozhamowanie powoduje aktywację skurczu. In-

Ryc. 59-6. Hydroliza ATP jest źródłem napędu cyklicznego fączenia i rozłączania aktyny i miozyny w 5 reakcjach opisanych w tekście. (Według: Stryer L Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981, za zezwoleniem, zmodyfikowana).

hibitorem w mięśniu poprzecznie prąŜkowanym

jest układ troponiny związanej z tropomiozyną i aktyną F cienkiego filamentu (ryc. 59-3). W mięśniu poprzecznie prąŜkowanym regulacja skurczu (lub ATP-azy jako biochemicznego wskaźnika skurczu) moŜe się odbywać pod warunkiem obecności, wraz z filamentami nktyny i miozyny, układu tropomiozyną-troponina. Jak to opisano powyŜej, tropomiozyną leŜy w rowku aktyny F, a z kompleksem aktyna F-tropomiozyna związane są 3 składniki troponiny — TpT, Tpl brąz TpC. Tpl zapobiega przyłączaniu główek miozyny do ich miejsc wiązania na aktynie F aibo przez zmianę konformacji aktyny F, albo przez przesunięcie tropomiozyny do pozycji, w której blokuje ona bezpośrednio miejsca wiązania główek miozyny na aktynie F. Oba mechanizmy zapobiegają aktywacji ATP-azy, która zaleŜy od wiązania główek miozyny z aktyną F. Stąd system Tpl blokuje drugi etap cyklu skurczu przedstawionego na ryc. 59-6. Tłumaczy to stan hamowania układów kurczliwych w mięśniu znajdującym się w stanie spoczynku. 2

Ca * pośredniczy w aktywacji skurczu mięśnia StęŜenie Ca2 + w sarkoplazmie mięśnia wynosi w spoczynku J0"7— 10"8 mol/l. Wapń jest

magazynowany w siateczce sarkoplazmatycznej, sieci drobnych błoniastych pęcherzyków, przez aktywny układ transportujący wspomagany przez wiąŜące Ca2+ białko, kalsekwestryne. Komórka mięśniowa jest otoczona -pobud-

liwą błoną, która ma poprzeczne kanaliki (T), pozostające w ścisłej łączności z siateczką sarkoplazmatyczną. Gdy błona komórkowa zostaje pobudzona np. przez depolaryzację Wony post synaptycznej płytki motorycznej, Ca2 + jest gwałtownie uwalniany z siateczki sarkoplazmatycznej do sarkoplazmy. StęŜenie Ca2 + w sarkoplazmie gwałtownie rośnie do 10 "5 mol/l. Miejsca wiązania Ca2* na TpC cienkich filamentów zostają przez niego szybko zajęte. TpC-4Ca2+ reaguje z Tpl oraz TpT zmieniając ich interakcję z tropomiozyną. W wyniku tego tropomiozyną po prostu usuwa się z drogi główek miozyny lub zmienia konformację aktyny F tak, Ŝe główki miozyny zawierające ADP i P| mogą z nią reagować rozpoczynając tym samym cykl skurczu. Rozkurcz zachodzi gtly: 1) stęŜenie Ca2 + w sarkoplazmie spada poniŜej 10~7 mol/l na skutek ponownego wyłapywania go przez energozaleŜną pompę Ca2+ siateczki sarkoplazmatycznej;2) TpC-4Ca2+traci swójCa2+;3) troponina hamuje dalszą interakcję główek miozyny z aktyną F oraz 4) główka miozyny odłącza się od aktyny F, co zapoczątkowuje rozkurcz. W ten sposób Ca2+ kontroluje (reguluje) skurcz mięśnia poprzez aliosteryczny mechanizm, w

którym uczestniczą TpC, Tpl, TpT, tropomiozyną i aktyna F.

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 801 Wapń pochodzi z płynu pozakomórkowego

W mięśniu sercowym pozakomórkowy jest niezbędny dla aktywacji skurczu. Podczas gdy usunięcie Ca2 + z płynu pozakomórkowego powoduje natychmiastowe ustanie skurczów izolowanych komórek mięśnia sercowego, mięsień szkieletowy moŜe się kurczyć bez obecności pozakomórkowego Ca2+ w ciągu wielu godzin. Utrata ATP z sarjtoplazmy pociąga za sobą 2 zasadnicze skutki: 1) pompa wapniowa siateczki sarkoplazraatyczncj nie moŜe utrzymywać ruskiego stęŜenia Ca2* w sarkoplazmie, wobec tego ułatwiona jest interakcja główek miozyny z aktyną F; 2) nie moŜe zachodzić zaleŜne od ATP odszczepianie główek miozyny od aktyny F, wobec czego występuje sztywność pośmiertna {„rigor mortis"). Skurcz mięśnia, podlegający precyzyjnej regulacji przez układ nerwowy, polega na delikatnej dynamicznej równowadze między przyłączeniem główek miozyny do aktyny F i odłączaniem ich od niej. 1

Ca* reguluje skurcz równieŜ w mięśniach gładkich

Podczas gdy wszystkie rodzaje mięśni zawierają aktynę, miozynę i tropomiozyne, tylko poprzecznie prąŜkowane mięśnie kręgowców zawierają układ troponiny. Tak więc mechanizmy

regulujące skurcz w róŜnych układach kurczliwych muszą być róŜne. Mięśnie gładkie mają strukturę molekularną podobną do mięśni poprzecznie prąŜkowanych, jednakŜe ich sarkomery nie są uporządkowane w sposób tworzący poprzeczne prąŜki. Podobnie jak mięśnie szkieletowe, mięśnie gładkie zawierają cząsteczki a-aktyniny i tropomiozyny. Nie zawierają one układu troponiny, a ich lekkie łańcuchy miozyny róŜnią się od lekkich łańcuchów w mięśniach poprzecznie prąŜkowanych. JednakŜe, podobnie jak w mięśniach poprzecznie prąŜkowanych, ich skurcz jest regulowany przez Ca2+, Skurcz mięśni gładkich inicjowany jest przez fosforylację lekkiego łańcucha P miozyny

Gdy miozyna mięśnia gładkiego wiąŜe się z aktyną F przy nieobecności innych białek mięśniowych, takich jak tropomiozyna, aktywność ATP-azowa jest nie wy kry walna. Ta nieobecność aktywności ATP-azowej róŜni się dia31

Biochemia

metralnie od sytuacji w mięśniach poprzecznie prąŜkowanych, gdzie aktomiozyna ma duŜą aktywność ATP-azową. Miozyna mięśnia gładkiego zawiera lekki łańcuch (lekki łańcuch P), który zapobiega wiązaniu główek miozyny z aktyną F, Fosforylowany lekki łańcuch pozwala na aktywację ATP-azy miozyny. Fosforylacja łańcucha P zapoczątkowuje skurczowy cykl przyłączania i odłączania (główek miozyny). Lekki łańcuch P miozyny jest fosforylowany przez swoją kinazę 2ł aktywowaną przez 4Ca -kalmodułinę

Sarkoplazma mięśni gładkich zawiera zaleŜną od wapnia kinazę lekkiego łańcucha. Aktywacja

kinazy lekkiego łańcucha zachodzi przez wiązanie 4Ca2+-kahnoduliny z podjednostką kinazy o masie cząsteczkowej ffl5 000 (ryc. 59-7). Aktywowana przez 4Ca3+-kalmoduline kinaza fosforyluje lekki łańcuch P, co znosi hamowanie interakcji miozyna-aktyną F. Rozpoczyna to cykl skurczu. Mięsień gładki rozkurcza się, gdy a+ stęŜenie Ca spada poniŜej 10'"* mol/l

Rozkurcz mięśnia gładkiego zachodzi, gdy: 1) stęŜenie Ca3+ w sarkoplazmie spada poniŜej 10~7 mol/l; wapń dysocjuje od kahnoduliny, która z kolei dysocjuje od kinazy lekkiego łańcucha miozyny; 2) co powoduje jej inaktywację; 3) Ŝadne nowe fosforany nie są przyłączane do lekkiego łańcucha P, a te, które juŜ były przyłączone, są odłączane przez stale aktywną, niezaleŜną od wapnia fosfatazę lekkiego łańcucha; 4) defosforylowany lekki łańcuch miozyny ponownie blokuje wiązanie główek miozyny z aktyną F oraz aktywność ATP-azową; 5) główka miozyny oddziela się od aktyny F w obecności ATP, ale nie moŜe się do niego przyłączyć w obecności defosforylowanego lekkiego łańcucha P; wobec tego zachodzi rozkurcz. Tabela 59-1 podsumowuje i porównuje regulację interakcji aktyną-miozyna (aktywacja ATP-azy miozyny) w mięśniach poprzecznie prąŜkowanych i gładkich. Kinaza lekkiego łańcucha miozyny nie jest bezpośrednio aktywowana przez cAMP. JednakŜe kinaza białek aktywowana przez cAMP (p. rozdz. 45) moŜe fosforylować kinazę lekkiego łańcucha miozyny (ale nie sam lekki łańcuch). Fosforylowana kinaza lekkiego łańcucha miozyny wykazuje znacząco niŜsze powinowactwo do Ca2+-kalmoduliny, wobec czego

802 / ROZDZIAŁ 59 Kinaza miozynowa (nieaktywna) ;

Kalmodulina

1

T0~ mol/l Ca *, 7

Ca2+ • Kalmodulina

I+

10~ mol/l Ca

ATP 1

Ca *' KALMODULiNA — KIMAZA MIOZYNOWA (AKTYWNA)

pb-Mlozyna (hamuje Interakcje miozyna—aktyna)

ADP

H2POf — pL — rniozyna (nie hamuje interakcji miozyn a — aklyna)

21

Ryc. 59-7. Regulacja skurczu mięśnia gładkiego przez Ca . (Według: Adelsiein R. S.; Regulation and kinetics of actin-myosin interaction; Annu. Rev. Biochem 1980, 49, 921).

jest mniej wraŜliwa na aktywację. W wyniku tego zwiększenie stęŜenia cAMP tłumi odpowiedź skurczową mięśnia gładkiego na dany wzrost stęŜenia Ca2+ w sarkoplazmie. Ten molekularny mechanizm moŜe tłumaczyć rozkurczający wptyw pobudzenia P-receptorów na mięsień gładki. Fenotiazyny wiąŜą kalmodulinę i rozkurczają mięśnie gładkie Fenotiazyny, będące szeroko uŜywanymi lekami antypsychotycznymi, wiąŜą się z kalmodulina i zapobiegają jej wiązaniu z enzymami zaleŜnymi od wapnia. Rozkurczają one równieŜ mięśnie gładkie. Mięśnie porzecznie prąŜkowane mięczaków, takich jak przegrzebek, wykazują regulację skurczu opartą na miozynie. Podobnie jak miozyna i aktyna F mięśni gładkich,'te białka przegrzebka nie wykazują aktywności ATP-azowej, co

wynika z hamujących właściwości „regulatorowego" lekkiego łańcucha miozyny tego gatunku. Usunięcie hamowania interakcji aktyna-miozyna przegrzebka zachodzi, gdy Ca2+ wiąŜe się bezpośrednio ze specyficznym miejscem na cząsteczce miozyny. ZaleŜność tej regulacji od Ca2+ nie wymaga kowalencyjnej modyfikacji miozyny ani obecności osobnych białek, jak kalmodulina lub TpC. ,' Fosforylacja odgrywa główną rolę w skurczu mięśnia gładkiego Jak to opisano powyŜej, fosforylacja lekkiego łańcucha miozyny mięśnia gładkiego usuwa jego hamujący wpływ na interakcję miozyny z aktyną F, a tym samym zapoczątkowuje skurcz. Fosforan przyłączony do lekkiego łańcucha miozyny moŜe chelatować z Ca2+ związanym z kompleksem tropomiozyna-TpC-aktyna, co moŜe prowadzić do zwiększenia szyb-

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 803 Tabela 59-1. Interakcje między aktyną a miozyną w mięśniu poprzecznie prąŜkowanym i gładkim* Mięsień prąŜkowany Białka filamentów mięśnia

Aktyną Miozyna (heksamer) Tropomiozyna Troponina (Tpl, TpT, TpC)

Mięsień gładki i komórki inne niŜ mięśniowe Aktyną 1 Miozyna (heksamer) Tropomiozyna

Spontaniczna interakcja aktyny F i sa- Tak mej miozyny {spontaniczna aktywacja ATP-azy miozyr^y przez aktynę F)

Nie

Inhibitor interakcji aktyny F 2 miozyną Układ troponiny (Tpl) (inhibitor zaleŜnej od aktyny F aktywacji ATP-azy)

Niefosforylowany łańcuch lekki P miozyny

Skurcz aktywowany przez a+ Bezpośredni efekt Ca =+

Efekt Ca związanego z białkiem

2

Caa+ i+

4Ca związane z TpC 2+

TpC-4Ca znosi hamowanie interakcji aktyny F z miozyną (pozwala na aktywację ATP-azy przez aktynę F)

Ca + 2 4 Ca "^iwiązane z kalmodułiną a+

Kalmodulina-4Ca aktywuje kinazę lekkiego łańcucha fosforylująca lekki łańcuch P miozyny. Fosforylowany łańcuch P przestaje hamować interakcję aktyny F z miozyną (umoŜliwia aktywację ATP-azy przez aktynę F)

* Łańcuchy lekkie miozyny mięśni poprzecznie prąŜkowanych róŜnią się od łańcuchów lekkich miozyny mięśni gładkich.

kości tworzenia poprzecznych mostków miedzy główkami miozyny i aktyną. Fosforylacja cięŜkich łańcuchów miozyny jest prawdopodobnie warunkiem ich układania się w grube diamenty w mięśniach szkieletowych, mięśniach gładkich i w komórkach niemięśniowych. Tpl i peptydowy składnik pompy wapniowej siateczki sarkopiazmatycznej mogą być fosforylowane przez kinazę białek zaleŜną od cAMP. Istnieje pewna korelacja między fosforylacja Tpl a zwiększoną siłą skurczu wywołaną w mięśniu sercowym przez katecholaminy. JednakŜe mechanizm dodatniego efektu inotropowego katecholamin polega przede wszystkim na zwiększonej aktywacji kanałów wapniowych. Zapasy ATP w mięśniu odnawiane są przez wiele mechanizmów ATP. który jest stałym źródłem energii dla cyklu skurczowego mięśnia, moŜe być generowany w toku glikolizy, fosforylacji oksydacyjnej, przez fosfokreatynę lub tworzony z 2 cząsteczek ADP (ryc. 59-8). Zapasy ATP w mięśniu

szkieletowym szybko się wyczerpują i są w stanie dostarczyć energię prawdopodobnie na mniej niŜ 1 s skurczu. W powolnych komórkach mięśni szkieletowych obfitujących w zapasy O: w mioglobinie, oksydacyjna fosforylacja jest głównym źródłem regeneracji ATP. „Szybkie" komórki mięśni szkieletowych regenerują ATP głównie na drodze glikolizy. Fosforan kreatyny stanowi główną rezerwę energii Fosfagen (fosforan kreatyny) zapobiega gwałtownemu wyczerpaniu ATP dostarczając łatwo dostępnego, bogatego energetycznie fosforanu, który jest potrzebny do tworzenia ATP z ADP. Fosfokreatyna jest tworzona z ATP i kreatyny w czasie rozkurczu mięśnia, kiedy zapotrzebowanie na ATP nie jest tak duŜe. Fosforylacja kreatyny następuje przez fosfokinazę kreatynową (CK), enzym specyficzny dla mięśni. W klinice jej oznaczanie jest wykorzystywane dla rozpoznawania ostrych i przewlekłych schorzeń mięśni.

804 / ROZDZIAŁ 59 Glikogen mięśnia.

Fosfok reatyna

FOSFOKINA2A KREATYNOWA

\ FOSFORYLAZA MIĘŚNIOWA

iy

,^-ADP

Kreaiyna -"^

Glukoza "*~

~~"\

J GUKOLIZA

|\ ^_ Skurcz mięśnia

TP «H^ FOSFOflYLACJA OKSYDACYJNA

MIO2YNY

AMP-^— ^

Ryc. 59-8. Źródła ATP w sercu

Mięsień szkieletowy zawiera duŜe zapasy glikogen u Sarkoplazma mięśnia szkieletowego zawiera, duŜe zapasy glikogenu zawartego w granulkach znajdujących się blisko prąŜka I. Oddzielanie glukozy od glikogenu zaleŜy od specyficznej mięśniowej fosforylazy glikogenu (p. rozdz. 20). Aby powstał podlegający glikolizie glukozo-6-fosforan, fosforylaza b glikogenu w mięśniu szkieletowym musi być przekształcona w aktywną fosforylazę a na drodze fosforylacji przez kinazę fosforylazową b (p. rozdz. 20). Ca2 + ułatwia aktywację kinaąy fosforylazowej b, równieŜ na drodze fosforylacji. Tak więc Ca2+ nie tylko aktywuje skurcz mięśnia, ale równieŜ toruje drogę produkcji potrzebnej energii. Fosforylaza b nie występuje w mięśniach w chorobie McArdla (chorobie spichrzania glikogenu). Mięsień generuje ATP na drodze fosforyłacji oksydacyjnej Synteza ATP na drodze fosłbrylacji oksydacyjnej wymaga dostawy tlenu. Mięśnie o duŜym zapotrzebowaniu na tlen w wyniku długo utrzymującego się skurczu (np. dla utrzymania postawy ciała), magazynują tlen w mioglobinie (p. rozdz. 7). Dzięki cząsteczce hemu, z którym tlen się wiąŜe, mięśnie zawierające mioglobinę są czerwone. W tabeli 59-2 porównano niektóre właściwości szybkich (białych) i powolnych (czerwonych) komórek mięśni szkieletowych.

V

ADP + Pj / " ^A D P

Kl >JAZA ADENYLA MOWA MIĘŚNIA

Tabela 59-2. Właściwości szybkich i powolnych mięśni szkieletowych Mięśnie Mięśnie szybkie powolne Aktywność ATP-azy miozyny ZuŜycie energii Kolor Mioglobina Szybkość skurczu Czas trwania skur-

DuŜa

Mała

DuŜe Biały Brak DuŜa Krótki

Małe Czerwony Obecna Mata Długi

czu

Miokinaza przekształca adenino-, mono-, di- i trifosforany Enzym miokinaza katalizuje tworzenie jednej cząsteczki ATP i jednej cząsteczki AMP z dwóch cząsteczek ADP. Reakcja ta (ryc. 59-8) jest związana z hydrolizą*ATP przez ATP-azę miozyny w czasie skurczu mięśnia. Deaminacja adeniny przez pracujący mięsień prowadzi do uwolnienia amoniaku Bezpośrednim źródłem amoniaku w mięśniu szkieletowym jest AMP deaminowany do IMP przez deaminazę adenylanowa. IMP moŜe być z powrotem przekształcany w AMP na-drodze

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 805

reakcji z uŜyciem asparaginianu, katalizowanych przez syntazę adenylosukcynylową i adenylosukcynazę (p. rozdz. 36). MIĘŚNIE SZKIELETOWE STANOWIĄ GŁÓWNĄ REZERWĘ BIAŁKA USTROJU U ludzi białka mięśni szkieletowych stanowią główną nietłuszczo*ą rezerwę zmagazynowanej energii. Tłumaczy to, szczególnie u dorosłych, bardzo duŜe straty masy mięśniowej w wyniku długotrwałego kalorycznego niedoŜywienia. Badanie rozpadu białek tkankowych in vivo jest trudne, gdyŜ aminokwasy pochodzące z wewnątrzkomórkowego rozpadu białek mogą być w znacznym stopniu uŜyte do budowy innych białek w komórce lub przetransportowane do innych narządów, gdzie zostają włączone do reakcji anabolicznych. JednakŜe aktyna i miozyna są po ich zsyntetyzowaniu metylowane z utworzeniem peptydyJo-3-metylohistydyny. W czasie wewnątrzkomórkowego rozpadu aktyny i miozyny 3-metylohistydyna jest wydzielana i wydalana z moczem. Wydalanie metylowanego aminokwasu stanowi wiarygodny wskaźnik szybkości rozpadu białek miofibrylarnych u ludzi. W mięśniach zachodzi aktywna degradacja pewnych aminokwasów i synteza innych. U ssaków mięsień okazuje się być głównym miejscem katabolizmu aminokwasów o rozgałęzionych łańcuchach. Mięsień utlenia leucynę do CO2 i przekształca węglowe szkielety asparaginianu, asparaginy, glutaminianu, izoleucyny i waliny w amfiboliczne produkty pośrednie cyklu kwasów trik ar boksy lo wy ch. Zdolność mięśnia do rozkładania aminokwasów o rozgałęzionych łańcuchach wzrasta 3—5-krotnie w czasie głodowania i w cukrzycy. Mięsień syntetyzuje równieŜ i uwalnia duŜe ilości alaniny i glutaminy. Związki te są syntetyzowane dzięki grupom aminowym uzyskanym z rozpadu aminokwasów o rozgałęzionych łańcuchach, a aminowy azot jest przenoszony na ct-ketoglu taran lub pirogronian na drodze transami nacji. Glikoliza egzogennej glukozy dostarcza prawie całego pirogronianu potrzebnego do syntezy alaniny. Reakcje te stanowią tzw. cykl glukozowo-alaninowy, w którym alanina z mięśnia jest uŜywana w glukoneogenezie wątrobowej dostarczając jednocześnie do wątroby grupy aminowe usuwane następnie jako mocznik.

CYTOSZKIELETY PEŁNIĄ WIELE FUNKCJI KOMÓRKOWYCH Komórki niemięśniowe wykonują pracę mechaniczną, włączając w to samodzielne przemieszczanie, morfogenezę, dzielenie się, wewnątrzkomórkowy transport, endocytozę, egzocytoze i zmianę kształtu komórki. Te funkcje komórkowe są pełnione przez rozległą sieć nitkowatych struktur stanowiących cytoszkielet. Cytoplazma komórkowa nie jest, jak to kiedyś myślano, woreczkiem płynu. W zasadzie wszystkie komórki eukariotyczne zawierają 3 typy struktur nitkowatych: filamenty aktyny (o średnicy 7—9,5 nm), mikrołubule (25 nm) i pośrednie

filamenty (10—12 nm). KaŜdy z tych typów filamentów róŜni się biochemicznie i w obrazach elektro nowo-mikroskopowych. Komórki niemięśniowe zawierają aktynę Białko aktyna G izolowane z komórek niemięśniowych ma masę cząsteczkową ok. 43 000 i zawiera reszty N-metylhistydylowe. W obecności wapnia i chlorku potasu ta aktyna spontanicznie polimeryzuje tworząc podwójne heliksy filamentów aktyny F, takie, jakie występują w mięśniach. W komórkach niemięśniowych występują co najmniej 2 typy aktyny: aktyna p i aktyna y. Oba typy mogą współistnieć w tej samej komórce, a nawet współpolimeryzować, tworząc wspólny filament. Aktyna tworzy W cytoplazmie komórkowej 7—9,5 nm mikrofilamenty, które często występują w pęczkach tworzących sieć. Pęczki mikro filamentów występują wyraźnie tuŜ pod błoną komórki w stanie spoczynku i są określane jako włókna napięciowe. Te włókna napięciowe są „dekorowane" podjednostkami S-l miozyny, co uwidacznia ich charakter podwójnego heliksu (ryc. 59-9), Włókna napięciowe znikają, gdy wzrasta ruchliwość komórki lub w czasie złośliwej transformacji komórki przez związki chemiczne lub pod wpływem onkogennych wirusów. Mikrowypustki komórkowe zawierają filamenty aktyny Mikro filamenty są równieŜ ciasno upakowane w postaci gęstej siatki pod prowadzącą krawędzią poruszającej się komórki (ryc. 59-10), Mikro filamenty aktyny występują we wszystkich mi kro wy pustkach komórkowych, takich jak filopodia i mikrokosmki. Na przykład mikrokosmki komórek błony śluzowej jelit

806 / ROZDZIAŁ 59

Ryc. 59-9. Replika liofilizowanego cytoszkieietu eksponowanego przed zamroŜeniem na podjednostkę 1 (S-1) rniozyny. Prawie wszystkie filamenty w wydłuŜonych pęczkach i wiele wplecionych między nie filamentów uległo pogrubieniu i przekształceniu w podobne do łin podwójne heliksy (patrz fragment w kółku). JednakŜe niektóre filamenty poruszające się samodzielnie między pęczkami, a będące prawdopodobnie filamentami pośrednimi, nie przyłączyły podjednostki S-1 (strzałka). Powiększenie 70000x, w kółku 200 000 x. (Według: Heuser J. E., Kirschner M. W.: Filament organization revealed in platinum replicas of freeze-dried cytoskeletons; J. Celi Biol. 1980, 86, 212, za zezwoleniem).

(enterocytów) zawierają 20—30 mikrofilamentów ułoŜonych równolegle do ich długiej osi (ryc. 59-11). W podstawie mikrokosmków znajdują się filamenty miozyny mogące ściągać centrycznie filamenty aktyny wystające do mikrokosmka. W procesie skurczu (kosmka) nie zachodzą Ŝadne zmiany długości filamentów aktyny lub miozyny. Musi on być wobec tego powodowany przez przesuwanie się filamentów w stosunku do siebie, jak to ma miejsce w mięśniu. Podobnie jak w mięśniu gładkim, aktywacja interakcji aktyna-miozyna, a tym samym skurczu, zachodzi na drodze fosforylacji lekkiego łańcucha miozyny. Zarówno aktyna, jak i miozyna znajdują się między biegunami wrzecionka a chromosomami oraz wzdłuŜ rowka podziału w telofazie mitozy. Mikrofilamenty aktyny są równieŜ związane z innymi białkami komórek niemięśniowych. a-Aktynina znajduje się w tych miejscach błon komórkowych, do których przyczepione są mikrofilamenty, np. w końcach mikrokosmków. Geodom, rodzaj rusztowania otaczającego jąd-

ra komórek eukariotycznych, składa się z aktyny, a-aktyniny i tropomiozyny. a-Aktynina rozciąga się równieŜ wzdłuŜ samych mikrofilamentów aktyny. Miozyna równieŜ moŜe występować między włókienkami aktyny, jednakŜe utworzone przez nią filamenty są krótsze i cieńsze niŜ w mięśniu i wydają się odgrywać jakąś rolę w utrzymywaniu włókienkowatego charakteru aktyny. Tropomiozyna uczestniczy w formowaniu geodomów otaczających jądra komórkowe. Tropomiozyna ułoŜona wzdłuŜ mi kro filamentów aktyny zdaje się odgrywajp rolę elementu raczej strukturalnego niŜ ruchowego. Poza mieś ni owa aktyna regulowana jest przez wyspecjalizowane białka Regulacja czynności pozamię śni owej aktyny zaleŜy od wielu wyspecjalizowanych białek. Profilina zapobiega polimeryzacji aktyny G nawet w obecności odpowiednich stęŜeń magnezu i chlorku potasu. Filamina ułatwia tworzenie sieci mikro filamentów aktyny. Tropomiozyna ułatwia tworzenie pęczków aktywnych-włókien

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 807

r

Ryc. 59-10. Trzy średnio silnie powiększone obrazy krawędzi prowadzących lub lameMipodiów fibroblastów utrwalonych w całości (A), ekstrahowanych trytonem przed utrwaleniem (8) lub ekstrahowanych trytonem po utrwaleniu (C). W A błona komórkowa jest nienaruszona, a struktury wewnętrzne nie są widoczne. W B błona komórkowa została usunięta, co uwidoczniło leŜącą pod nią pajęczynę „kędzierzawych" filamentów. W innych doświadczeniach te filamenty by)y „dekorowane" podjednostkami S-1, jednakŜe były one znacznie bardziej zagęszczone i znacznie bardziej intensywnie zachodzify na siebie niŜ aktyna w innych rejonach komórki. W C błona komórkowa równieŜ została usunięta, jednakŜe dopiero po utrwaleniu komórki aldehydem. Delikatna siatka leŜących pod nią filamentów wygląda po chemicznym utrwaleniu mniej subtelnie. A— powiększenie 140 000 x. B i C — powiększenie 115000x. (Według: Heuser J. E., Kirschner M. W.: Filament organization revealed in platinum replicas oi freeze-dried cytoskeletons; J. Celi Biot. 1980, 86, 212, za zezwoleniem)

SOS / ROZDZIAŁ 59 Linia Z

Filament aktyny

Filament aktyny Mikrokosmek

Mięsień

Filament miozyny

Ryc. 59-11. Mikrokosmki są maleńkimi wyrostkami cytoplazmatycznymi wyrastającymi z komórek nabłonkowych wyściełających jelito cienkie, a ogromnie powiększającymi powierzchnię absorpcji składników odŜywczych. Mikrokosmki zawierają filamenty zarówno aktyny, jak i miozyny. PoniewaŜ mogą się one kurczyć, stanowią przekonujący przykład niemięśniowego ruchu powodowanego przez ślizganie się po sobie filamentów aktyny i miozyny. Jak to pokazano w A, pęczki filamentów aktyny wystają w kaŜdym mikrokosmku ku górze, a filamenty miozyny zlokalizowane są u jego podstawy. W B ułoŜenie filamentów aktyny spowodowane zostało potraktowaniem mikrokosmków izolowanymi główkami miozyny, zwanymi cięŜką meromiozyną. „Główki" zachowują zdolność wiązania się zlilamentami aktyny. Gdy „główki" występują w komórkach mięśniowych, tworzą one „groty" strzał związane z filamentami aktyny. Góy gfówki dodano do mikrokosmków, utworzyły one z aktyną kompleksy, w których „groty strzał" skierowane by(y od koniuszka kosmka ku jego podstawie. Filamenty aktyny kosmków są zatem analogiczne do układu filamentów aktyny w komórkach mięśniowych. (Według: Lazarides E., Revel J. P.: The molecular basis of celt movement; Set. Arn. {May) 1979; 240, 100, za zezwoleniem). __________

Ryc. 59-12. Pojedyncze komórki hodowli tkankowej. Delikatna pierzasta struktura na dole po stronie prawej stanowi krawędź prowadzącą lub lamellipodium komórki. Komórkę poruszającą się RO podłoŜu i rozciągającą swoją krawędź „prowadzącą do uformowania nowych połączeń pokazano pod skośnym kątem. (Według: Lazarides E„ Revei J. P.: The molecular basis of celi movement; Sci. Am. (May) 197,9; 240, 100, za zezwoleniem)

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 809

napięciowych. oc-Aktynina ułatwia przyczepianie mikrofilamentów aktyny do błon, podłoŜa i innych organelli komórkowych. Cytochalazyna, naturalnie występujący peptyd, rozbija mikrofilamenty i zapobiega ich polimeryzacji. Ta reakcja słuŜy jako diagnostyczny test na obecność lub czynność mikrofilamentów. Aktualny ruch komórki jest kierowany przez jej krawędź prowadzącą lub lamellipodiwn, która

zawiera palcowate**wyrostki nazywane filopodiami. Prowadząca krawędź przyczepia się do podłoŜa przez filopodia, a następnie komórka wydaje się podciągać swoją tylną część. Następnie krawędź prowadząca odrywa się i odgina z powrotem ponad wierzch komórki, a nowe filopodia przyczepiają się do podłoŜa (ryc. 5912).

Mikrotubule zawierają a- i p-tubulinę Mikrotubule, integralny składnik szkieletu komórkowego, składają się z kanalików cytoplazmatycznych o średnicy 25 nm i nieokreślonej długości. Mikrotubule są potrzebne do tworzenia i funkcji wrzerionka mitotycznego i wobec tego są obecne we wszystkich komórkach eukariotycznych, Mikrotubułe pełnią równieŜ dodatkowe funkcje. Są one odpowiedzialne za -wewnątrzkomórkowe przesuwanie endoi egzocytotycznych pęcherzyków. Stanowią one jeden z głównych komórkowych komponentów rzęsek i ilagclii. Są one równieŜ głównym składnikiem białkowym aksonów i dendrylów. w któ-

rych utrzymują'one strukturę i uczestniczą w aksoplazmatycznym transporcie wzdłuŜ wypustek komórkowych. Mikrotubule są cylindrami zbudowanymi z 13 podłuŜnie ułoŜonych pro to fi lamentów, z których kaŜdy składa sie z drmerów a-tubuliny i |ł-tubuliny (ryc. 59-13). a-Tubulina (m.cz. 53 000) i p-tubuhna (m.cz. 55 000) są bardzo do siebie podobnymi cząsteczkami białkowymi. Dimery tubuliny układają się w protofilamenty, najpierw płaszczyznowo, a potem w cylindry, jak to pokazano na ryc. 59-14. Do ułoŜenia tubuliny w mikrotubule potrzebne są 2 cząsteczki GTP na jeden dimer. Dwa białka nazywane białkami o duŜej masie cząsteczkowej (HMW) i białka Tau ułatwiają formowanie mikrotubul, ale nie są do tego ^ezbędne. Kalmodulina i fosforylacje mogą równieŜ pełnić jakieś funkcje w formowaniu mikrotubul. Mikrotuble „rosną" w określonym kierunku od specyficznych miejsc (centrioJi) komórki. Na kaŜdej chromatydzie chromosomu (p. rozdz. 37) znajduje się kinetochor słuŜący jako miejsce początku wzrostu mikrotubuli. Wiek nieprawidłowości segregacji chromosomów wynika z nieprawidłowej struktury i funkcji kinetochoru. Centrosom, znajdujący się w środku biegunów mitozy, równieŜ moŜe być ośrodkiem tworzenia mikrotubuli. Ruch chromosomów w czasie anafazy mitozy zaleŜy od mikrotubuli, jednakŜe jego mechanizm nie został jeszcze określony.

Ryc. 59-13. DuŜe powiększenie mikrotubuli, która została rozłamana i głęboko wytrawiona po gwałtownym zamroŜeniu. Lewa cześć pola pokazuje zewnętrzną powierzchnię mikrotubuli, na której widoczne są podłuŜne prąŜki guzków leŜących 55 nm od siebie. Mogą one reprezentować protofi lamenty mikrotubuli. Po stronie prawej rozłamanie spowodowało otwarcie mikrotubuli, co uwidacznia jej wewnętrzne ściany. Wykazują one charakterystyczne skośne prąŜki ułoŜone co 40 nm. Siateczkowanie otaczające mikrotubule jest uwaŜane za niespolimeryzowaną tubulinę i białka związane z mikrotubulą. (Według: HeuzerJ. E., Kirschner M. W.: Filament organization revealed in ptatinum replicas of freeze-dried cytoskeletons; J. Celi BiolA 980, 86, 212, za zezwoleniem). _________________________________

810 / ROZDZIAŁ 59

Hyc. 59-14. W pracowni budowa mikrotubuli rozpoczyna się od 2 globularnych cząsteczek białek, ottubuliny i p-tubuliny (w rzeczywistości są one prawdopodobnie bardziej owalne niŜ na schemacie). Tubuliny tworzą dimery albo podwójne cząsteczki. Jeśli stęŜenie dimerów jest wystarczająco duŜe, łączą się one ze sobą tworząc róŜne struktury pośrednie, jak podwójne pierścienie, spirale i połączone pierścienie; zaleŜnie od warunków, równowaga sprzyja tworzeniu izolowanych dimerów lub struktur pośrednich. Następne etapy są dobrze poznane. Wydaje się, Ŝe pierścienie lubspirate otwierają się i tworzą nitki liniowo ułoŜonych dimerów zwane protof i lamentami. Układają się one bok do boku tworząc płytkę (A); czasami końce protof i lamentów zakrzywiają sie. Gdy płytka staje się dostatecznie szeroka, tworzy ona rurkę, jak to pokazano w (B). Rurka jest przedłuŜana przez dodawanie dimerów głównie do jednego końca (C). (Według: Dustin P,: Microtubules; Sci. AmA98Q,243, 67, za zezwoteniem).

Wiele alkaloidów blokuje tworzenie mikrotubul Ą Pewne alkaloidy mog& zapobiegać tworzeniu mikrotubul. NaleŜą do nich kolchicyna i jej pochodna demekolcyna (uŜywana jako lek w dnawym zapaleniu stawów), winblastyna (alkaloid Vinca uŜywany jako lek przeciwrakowy) i gryzeofulwina (czynnik przeciwgrzybiczy). Komórkowe flagelle i rzęski są mikrotubułami wyspecjalizowanymi w funkcji ruchu U podstawy flagę!li i rzęsek komórek eukariotycznych znajduje się struktura zwana dałem podstawowym. Jest ona identyczna z centriolem i słuŜy jako ośrodek formowania we flagellach i rzęskach 9-dubletowego układu mikrotubul. Te mikrotubularne struktury są wyspecjalizowane w funkcji ruchu. KaŜdy składnik dubletu ma wspólną ze swoim partnerem ścianę składającą się z 3 protofilamentów, a dubiety są

połączone giętkim białkiem, neksyoą Ruch następuje na skutek przesuwania się dubletów w stosunku do siebie, co powoduje falowe odkształcenie rzęski. Do jednego z dubletów przyłączone jest duŜe białko, dyneina, mająca ATP-azę konieczną dla ślizgowego ruchu dubletów mikrotubul. Filamenty pośrednie róŜnią się od mikrof i lamentów fmikrotubul W komórkach istnieje włókienkowy układ filamentów o period yczności osiowej 21 nm i średnicy 8—10 nm róŜniący się od mikrofilamentów (o średnicy 6 nm) i mikrotubul (o średnicy 23 nm). Istnieje 6 głównych klas tych filamentów mających wspólną determinantę antygenową i mających średnice o wielkościach pośrednich pomiędzy mikrofilamentami aktyny i mikrotubulami. KaŜdy filament pośredni skiada się z podjednostek róŜniących się biochemicznie i immunologicznie. Filamenty pośrednie

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 811 Tabela 59-3. Klasy filamentów pośrednich i ich rozmieszczenie

Białka

Masa cząsteczkowa

(tvs.)

Średnica (nm)

Rozmieszczenie Komórki nabłonkowe (nigdy pochodzenia mezencfiymalnego) Mięśnie (prąŜki Z) Komórki mezenchymalne i niemezenchymalne, tj. mięśnie, komórki gleju, komórki nabłonkowe Neurony Komórki gleju

Keratyn a typu 1 i II {tonofilamenty) Desmina Wimentyna f

40-65 (głównie białka 10-20) 50-55 52

8 10

Neurof i lament

200, 1 50, 70 51

10

Filamenty gleju

zdają się stanowić względnie stałe składniki szkieletu komórkowego rie podlegające szybkiemu tworzeniu i rozpadowi i nie znikające w czasie mitozy, jak się to dzieje z aktyną i wielu diamentami mikrotubinarnymi. Tabela 59-3 podsumowuje niektóre właściwości i rozmieszczenie filamentów pośrednich. Istnieją 2 typy keratyn, I i II, zawierające 10—20 róŜnych polipeptytlów róŜniących się od siebie i od 4 innych klas białek filamentów pośrednich — desminy, wimentyny, neurofilamentu i filamentu gleju. Te ostatnie 4 klasy są w wysokim stopniu homologiczne. Filament keratyny zawiera co najmniej 2 róŜne polipeptydy keratynowe, podczas gdy 4 pozostałe klasy filamentów pośrednich są homopolimerami. KaŜdy z filamentów pośrednich składa się z 4 domen o kształcie a-heliksu oddzielonych od siebie obszarami o strukturze pofałdowanej kartki i oflankowanych z obu końców domenami niehelikalnymi. Niehelikalne końcowe domeny są zaangaŜowane w łączenie koniec do końca proto filament ów oraz w interakcję bok do boku między protofibryłami. Końce mikrofibrylarnych keratyn mogą być połączone poprzecznymi mostkami dwusiarczkowymi, co powoduje powstanie filamentów nierozpuszczalnych, jak np. w wełnie. KOLAGEN JEST NAJBARDZIEJ ROZPOWSZECHNIONYM W ŚWIECIE BIAŁKIEM ZWIERZĘCYM Kolagen, główny składnik większości tkanek łącznych, stanowi ok. 25% białka ssaków. Zapewnia on zewnątrzkomórkowe rusztowanie wszystkich zwierząt metazoalnych i występuje w praktycznie kaŜdej tkance. W tkankach ssa-

*

10 10

ków zidentyfikowano ponad 10 róŜnych typów kolagenu. ChociaŜ mektóre z nich stanowią tylko znikomy procent całości, mogą one odgrywać waŜną rolę w kształtowaniu się fizycznych właściwości tkanek. Wszystkie typy kolagenu mają strukturę potrójnego heliksu. KaŜda podjednostka polipeptydowa lub łańcuch a tworzy lewoskrętny łteliks o 3 resztach na jeden skręt fryc. 59-15). Trzy 67 nrn Fibry la

300 nm '

Cząsteczka

•' \ \ 1.4 om Potrójny Łańcuch a

Sekwencja aminokwasów - G l y - X - Y - G l y - X- Y - G l y - X- Y Ryc. 59-15. Właściwości molekularnej struktury kolagenu od pierwotnej sekwencji do fibrylli. (Według: Eyre D. R.: Collagen: Molecular ciiversity in the bodys protein scaffold; Sc/ence1980, 207, 1315. Copyright © 1980 American Assoctation of the Advancement of Science, za zezwoleniem, nieznacznie zmodyfikowana).

812 / ROZDZIAŁ 59

takie łańcuchy i zostają następnie zwinięte w prawoskrętny superhcliks^itóry tworzy pałeczkowatą cząsteczkę o średnicy 1,4 nm i o długości ok. 30 nm. Uderzającą cechą kolagenu jest występowanie reszt glicynowych w kaŜdej trzeciej pozycji części helikalnej łańcucha a. Jest to potrzebne, poniewaŜ glicyna jest jedynym aminokwasem dostatecznie małym, aby mógł się zmieścić w ograniczonej przestrzeni centralnego rdzenia potrójnego heliksu. Ta powtarzająca się struktura określana jako (Gly-X-Y) jest bezwzględnym warunkiem formowania potrójnego heliksu. Mimo Ŝe X i Y mogą być jakimkolwiek aminokwasem, ok. 100 pozycji X jest zajętych przez prolinę i ok. 100 pozycji Y przez hydroksyproline. Hydroksyprolina jest tworzona przez pptraaslacyjną hydroksylach reszt prolino^^ckzMdazaiuujcii'w.iiperjt.ydzk. a katalizowaną przez enzym hydroksylaze prołilową. którego kofaktorami są kwas askorbinowy (witamina C) i a-ketoglutaran. Lizynaj^pozycii Y moŜe być potranslacyjnie zmieniana w hydroksylizyne dzięki działaniu hydroksylazy lizylowej, enzymu o podobnych kofaktorach. Niektóre z tych hydroksylizyn mogą być równieŜ modyfikowane przez dodanie galaktozy lub galaktozylo-glukozy z utworzeniem wiązania O-glikozydowego. Jest to miejsce glikozytecji wyjątkowe dla kolagenu. Typy kolagenu tworzące długie, pałeczkowate włókienka powstają przez boczne połączenie jednost£k_potrójnego heliksu w taki sposób, Ŝe kaŜda z nich jest przesunięta w stosunku do sąsiadki o nieco mniej niŜ jedna czwartą swojej długości (ryc. 59-15). To ułoŜenie jest odpowiedzialne za prąŜkowani tych włókien w tkankach łącznych. Włókna kolagenu są dalej stabilizowane przez tworzenie kowalencyjnych mostków poprzecznych zarówno wewnątrz potrójnych heliksów, jak i między nimi. Te poprzeczne mostki powstają dzięki działaniu oksyjiazx^t lowcj, enzymu zaleŜnego od miedzi, który oksydacyjnie deaminuje grupy e-aminowe niektórych reszt lizynowych i hydroksylizynowych. w wyniku czego powstają reaktywne aldehydy. Takie aldehydy mogą tworzyć produkty kondensacji z innymi aldehydami pochodzącymi z lizyny lub hydroksylizyny lub tworzyć zasady Schiffa z grupami s-aminowymi nieutlenionych lizyn lub hydroksylizyn. W wyniku tych reakcji powstają po dalszych chemicznych przekształceniach stabilne kowalencyjne jnostkXj)ojHZ££zn.e_w*Ŝne dla odporności włókien na rozciąganie.

Pewne formy kolagenu nie tworzą włókien prąŜkowanych (tab. 59-4). Te kolageny charakteryzuje na poziomie molekularnym przerywanie potrójnego heliksu odcinkami białkowymi pozbawionymi sekwencji Gly-X-Y. Odcinki pozbawione sekwencji Gly-X-Y powodują powstawanie obszarów o strukturze globularnej, rozmieszczonych w strukturze potrójnego heliksu. Najlepiej scharakteryzowanym przykładem kolagenu o przerywanych potrójnych hełiksach jest kolagen typu IV, stanowiący waŜny składnik błon podstawowych, w których tworzy on drobną siatkę. Kolagen przechodzi rozległe potranslacyjne modyfikacje Zanim nowo zsyntetyzowany kolagen stanie się częścią dojrzałego pozakomórkowego włókna kolagenowego, musi on przejść rozległą modyfikację potransłacyjną (tab. 59-5). Jak większość białek wydzielanych z komórki, kolagen jest syntetyzowany na rybosomach w prekursorowej formie preprokolagenu zawierającego sekwencję sygnałową lub prowadzącą (lider) kierującą łańcuch polipeptydowy do pęcherzykowej części siateczki sarkoplazmatycznej. Po wejściu do siateczki sarkoplazmatycznej ta prowadząca sekwencja (lider) jest enzymatycznie odszczepiana. W tymŜe miejscu zachodzi hydroksylacja reszt proliny i lizyny oraz glikozylacja hydroksylizyn cząsteczki prokolagenu. Cząsteczka prokolagenu zawiera zarówno na N-, jak i C-końcu peptydy wydłuŜające o m.cz. 20000—35000. śadnego z nich nie ma w dojrzałym kolagenie. Oba te peptydy wydłuŜające zawierają reszty cysteiny. Podczas gdy N-koń"cowy propeptyd tworzy jedynie śródłańcuchowe wiązania dwusiarczkowe, propeptydy C-~końcowe tworzą zarówno śród-, jak i międzyłancuchówe wiązania dwusiarczkowe. Tworzenie tych wiązań dwusiarczku wy cli pomaga w ułoŜeniu 3 cząsteczek kolagenu tak, Ŝe tworzą potrójny heliks, którego zwijanie* rozpoczyna się od Ckońca. Po uformowaniu potrójnego heliksu Ŝadna dalsza hydroksylacja proliny lub lizyny więcej nie zachodzi. Po wydzieleniu z komórki przez aparat Goigiego, wydłuŜające peptydy są usuwane z Ni C-końców prze2 zewnątrzkomórkowe enzymy zwane a mino proteina/ą i kar boksy protein azą prokoiagenową. Oddzielanie tych peptydów" moŜe zachodzić w kryptach lub załamaniach błony komórkowej. Gdy tylko propeptydy zostaaą usunięte, potrójne heliksy cząsteczek ko-

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 813 Tabela 59-4. Niektóre przykłady róŜnych genetycznie kolagenów kręgowców. U zwierząt wyŜszych występuje co najmniej 10 róŜnych rodzajów cząsteczek zawierających 12 róŜniących się między sobą łańcuchów Typ

Wzór

cząsteczki [od (1)1,0(2

Natywn y polimer

Rozmi eszcze n ie tkankowe

WyróŜniające cechy

Włókna

Skóra, ścięgna, kości, zę- Mata zawartość hydroksylizyny; bina, powiezie mało miejsc glikozylacji hydroksyl izyny; szerokie włókna

Włókna

Chrząstka, jądro galare- DuŜa zawartość hydroksylizyny; towate, notochord, ciało obficie glikozylowane; włókna szkliste zwykle cieńsze niŜ w typie I

[0(1(111)],

Włókna

Skóra (głównie płodowa), macica, naczynia krwionośne; ogólnie włókna „retikuliny"

DuŜa zawartość hydroksyproliny; niska zawartość riydroksylizyny; mało miejsc gltkozylacji hydroksylizyny; międzyłartcuchowjtg wiązania dwusiarczkowe między cysteinami

oraz

Drobna siatka

Kłębuszki nerkowe, torebka soczewki, błona Descemeta, błony podstawowe wszystkich komórek nabionkowych i śródbłonkowych

Bardzo wysoka zawartość hydroksylizyny; prawie całkowicie glikozylowane; niska zawartość alaniny; zachowuje przedłuŜenia prokolagenu

Drobne włókna

Szeroko rozpowszech- DuŜa zawartość hydroksylizyny; nione w: Wonie podstaw- obficie glikozylowane; niska zanej naczyń krwionośnych wartość alaniny i komórek mięśni giadkich; egzoszkielecie fibroblastów i w innych komórkach mezenchymalnych

IV

łańcuchy i 0(3(V); zmienna stechiometria

Zmodyfikowane i reprodukowane za pozwoleniem z; Eyre DR; Collagen: Muscle ditfersity in the body's protein scaffold; Science, 1980; 207: 1315. Copyright 1980 by the American Association for the Advancement of Science.

Tabela 59-5. Kolejność i miejsce obróbki prekursora fibrylarnego kolagenu Obróbka wewnątrzkomórkowa Oddzielenie peptydów sygnalnych Hydroksylacja reszt Y-prol iłowych i niektórych reszt hydroksyl i Ŝyłowych Formowanie wewnątrzłańcuchowych i zew natrzłań cuch owych wiązań S-S w peptydach wydłuŜających Formowanie potrójnego heliksu

Obróbka zewnątrzkomórkowa Oddzielenie peptydów wydłuŜających od ter minalnych grup aminowych i karboksylowych UłoŜenie włókien kolagenowych z przesunię ciem o ',„ długości Oksydacyjna deaminacja grup s-aminowych reszt lizylowych i hydroksylizylowych do al dehydów Tworzenie wewnątrz- i międzyłańcuchowych połączeń poprzecznych za pośrednictwem zasa dy Schiffa i produktów kondensacji aldolowej

814 / ROZDZIAŁ 59

lagenu, zawierające ok. 1000 aminokwasów w Jednym łańcuchu, spontanicznie układają się we włókna kolagenowe. Są one dalej stabilizowane przez tworzenie, dzięki działaniu oksydazy lizylowej, zewnątrz- i wewnątrzłańeuchowych mostków poprzecznych.

Te same komórki, które wydzielają kolagen, wydzielają, równieŜ fibronektynę. wielką glikoproteinę występującą na powierzchni komórek, w macierzy zewnątrzkomorkowej oraz we krwi. Fibronektyna wiąŜąc się z agregującymi włóknami prokolagenu zmienia kinetykę formowania włókien w macierzy okołokomórkowej. Z fibronektyną i prokolagenem tej macierzy związane są równieŜ proteoglikany, takie jak siarczan heparyny i siarczan chondroityny (p. rozdz. 57). Małoczą steczko wy kolagen typu IX, pochodzący z chrząstki, zawiera przyłączone do niego łańcuchy proteoglikanu. Tego rodzaju interakcja moŜe regulować tworzenie włókien kolagenowych i określać ich ułoŜenie w tkankach. Wiele chorób genetycznych wynika z nieprawidłowego tworzenia włókien, stabilizacji heliksu lub nieprawidłowego tworzenia mostków poprzecznych kolagenu Choroby wrodzone będące wynikiem zaburzeń kolagenu stanowią wzrastającą ilość odmian co najmniej 4 róŜnych typów zespołów: osteogenesis imperfecta, zespół Mariana, zespołu Ehlersa-Danlosa oraz zespołu Menkesa (kręco-

nych włosów). KaŜdy z tych zespołów ma kilka odmian. Początkowo choroby te były definiowane na podstawie podobnych fenotypów. Jed-

nakŜe w miarę poznawania struktury i funkcji kolagenu stało się jasne, Ŝe podobne defekty molekuiarne mogą powodować występowanie róŜnych zespołów klinicznych i odwrotnie, te same zespoły mogą być wynikiem róŜnych defektów molekularnych. W zasadzie defekty te dotyczą tworzenia włókien, stabilizacji potrójnego heliksu lub tworzenia mostków poprze-

cznych kolagenu. Defekty obejmują mutacje powodujące niewielką lub brak syntezy łańcuchów prokolagenu, produkcję skróconych włókien prokolagenu, nadmiernie wydłuŜonych włókien prokolagenu oraz defekty poddających je obróbce enzymów (tj. hydroksylazy lizynowej lub N-proteinazy pro kolagenowej). Dotychczas rozpoznano tylko defekty cząsteczek prokolagenu typu I i III. W zespole Menkesa występują zaburzenia metabolizmu miedzi (p. rozdz. 58), a tym samym wtórnie zaburzenia funkcji oksydazy lizynowej i defekty tworzonych przez nią mostków poprzecznych. W tabeli 59-6 podsumowano główne cechy 4 powyŜszych zespołów, a ryc. 59-16 pokazuje, jak w trzech z nich zmieniona jest struktura prokolagenu typu I. ELASTYNA NADAJE ROZCIĄGLIWOŚĆ I SPRĘśYSTOŚĆ PŁUCOM, NACZYNIOM KRWIONOŚNYM 1 POWIĘZIOWI Elastyna jest białkiem tkanki łącznej odpowiedzialnym za rozciągliwość i spręŜystość tkanek. ChociaŜ nie jest ona tak szeroko rozpowszechniona jak kolagen, występuje w duŜych ilościach w niektórych tkankach, w których te

Tabela 59-6. Ogólne cechy 4 dziedzicznych chorób kolagenu Choroba

Objawy kliniczne

Przyczyny biochemiczne*

Osteogenesis imperfecta (ró Ŝne typy) Zespół Ehlersa-Danlosa (róŜ ne typy)

Nadmierna łamliwość kości

Zespół Marfana

Zaburzenia w kośćcu, oczach Mutacja genu dla prokolagenu v 2(1} i układzie sercowo-naczyniowym powodująca wydłuŜenie łańcuchów prokolagenu Kręcone włosy, opóźnienia Niedobór oksydazy lizylowej na skuwzrostu tek zaburzeń metabolizmu miedzi

4. Zespół Menkesa

Nadmierna ruchliwość stawów, nienormalności skóry

* Podano tylko niektóre najlepiej znane przyczyny tych chorób.

RóŜne nieprawidłowości genów kodujących prokofagen *1(l) Zmiany genów dla kolagenu ai (III), niedobór N-proteinazy prokolagenu i hydroksylazy lizylowej

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 815 (EDS V I I ) i.ManjM

Ryc. 59-16. PrzybliŜona lokalizacja mutacji w strukturze prokolagenu typu I. EDS — zespół Ehlersa-s s Danlosa; MS zespół Marfana; 01 —osteogenesis imperfecta. Pro«l i proa2 , skrócone łańcuchy proa; x L pro«2 , słabo określone mutacje zmieniające strukturę łańcuchów proa; proa2 , wydłuŜone łańcuchy proa; cx prooc2 , mutacja zmieniająca strukturę propeptydów C łańcuchów proa. (Według: Prockup D. J., Kivirik-ko K. L: Heritable diseases of collagen; N. Engl. J. Med. 1984, 311, 376, za>Zezwoleniem).

fizyczne cechy są szczególnie potrzebne, tj. w płucach, duŜych naczyniach tętniczych i niektórych spręŜystych powięziach. W mniejszych ilościach elastyna znajduje się równieŜ w skórze, chrząstce ucha i w wielu innych tkankach. W przeciwieństwie do kolagenu, elastyna wydaje się występować w jednym tylko typie genetycznym, choć róŜnicowa obróbka hnKNA elastyny powoduje powstawanie jej odmian (p. rozdz. 39).

Elastyna jest syntetyzowana jako rozpuszczalny monomer o m.cz. 70 000, zwany tropoelastyną. Niektóre z reszt prolinowych tropoelastyny są hydroksylowane do hydroksyproliny przez hydroksylazę prolilową. Hydroksylizyna i glikozylowana hydroksylizyna w tropoelastynie nie występują. W przeciwieństwie do kolagenu tropoelastyną nie jest wytwarzana w postaci pro-i nie zawiera peptydów wydłuŜających. Ponadto elastyna nie ma powtórzeń sekwencji Gly-X-Y, struktury potrójnego heiiksu lub reszt węglowodanowych. Po wydzieleniu z komórki pewne reszty lizylowe tropoelastyny ulegają oksydacyjnej deaminacji do aldehydów przez oksydaze lizylową, enzym zaangaŜowany w ten proces równieŜ i w kolagenie. JednakŜe główne połączenia poprzeczne formowane w elastynie są desmozynami, które powstają z kondensacji 3 pochodzących z lizyny aldehydów z nie zmodyfikowaną lizyną. Powstaje wówczas wyjątkowe dla elastyny czterofunkcyjne połączenie poprzeczne. W swojej zewnątrzkomórkowej, dojrzałej postaci elastyna jest wysoce nierozpuszczalna i sta-

bilna i wykazuje bardzo mały obrót. Elastyna

występuje w wielu odmianach bezładnych zwojów, które pozwalają tkance na rozciąganie i powrót do wyjściowego kształtu w czasie peł-

nienia jej funkcji fizjologicznych. W tabeli 59-7 podsumowano główne róŜnice miedzy kolagenem i elastyną. Kolagen

Elastyna

Wiele róŜnych typów Jeden typ genetyczny genetycznych Tabela 59-7. Główne róŜnice pomiędzy kolagenem a elastyrtą Potrójny heliks Nie ma potrójnego heiiksu; bezładne zwoje umoŜliwiające rozciąganie. Powtarzana struktura Brak struktury
Nie zawiera węglowodanów Wewnątrzcząsteczkowe poprzeczne połączenia desmozynowe

Obecność peptydów wydłuŜających w czasie Nie ma w czasie biosyntezy peptydów wydłuŜabiosyntezy jących

816 / ROZDZIAŁ 59

PIŚMIENNICTWO Adelstein RS, Eisenberg R: Regulation and kinetics of actino-myosin ATP interaction. Annu Rev Biochem 1980:49:921. Barany M, Barany K: Phosphorylation of the myofibrillar proteins. Annu Rev Physiol 1980;42:275. Caplan A: Cartilage. Sci Am (Oct) 1984;250:84. Eyre DR el al: Cross-linking in collagen and elastin. Annu Rev Biochem 1984:53:717. Fuchs E, Hanukoglu 1: Unraveling the structure of intermediate filaments. Celi 1983:34:332. Hcuser JE, Kirschner MW: Filament organization revealed in platinum replicas of freez-dried cytoskeletons. J Celi Bioł, J980;86:212.

Kleinman HK, Klebe RJ, Martin GR: Role of collagenous rnatrices in the adhesion and growth of cells. J Celi Biol m\WA12. Lazarides E: Intermediate filaments: A chemically heterogeneous. dcvelopmentally regulated class of proteins. Annu Rev Biochem 1981;51:219. Lazarides E, Revel JP: The molecular basis of celi moveraent. Sci am (May) 1979;240:100. Prockop DJ, Kivirikko KI: Heritable diseases ot' collagen. N Engl J Med 1984;311:376. Rosenbloom J: Elastin: relation of protein and gene structure to disease. Lab Invest 1984;5]:605, Sandberg LB, Soskel NT, Leslie JG: Elastin structure, biosynthesis, and relation to disease states, N Engl

--

,

Metabolizm ksenobiotyków Robert K. Murray, MD. Phb

WPROWADZENIE Człowiek jest coraz bardziej naraŜony na działanie związków obcych, egzogennych (ksenobiotyków) takich jak leki, środki konserwujące pokarmy lub zanieczyszczenia środowiska zewnętrznego itd. Ilustruje to najlepiej następujący cytat Rachela Carsona (Ŝył w latach 1907—1964): „Fabryka Ŝycia została skonfrontowana z atakiem chemicznym podobnym do ataku z uŜyciem nieznanej dotychczas broni lub przez klub jaskiniowców". Carson był jednym z pierwszych, którzy dostrzegli niebezpieczeństwo groŜące bytowi człowieka ze strony róŜnorodnych zanieczyszczeń środowiska lub wynikających z naduŜycia bogactw ziemskich. Jest to prawdopodobnie najbardziej pilny problem do rozwiązania przez współczesnego człowieka. Nierozwiązanie tego problemu w sposób solidny i uczciwy grozi zagładą wszelkiej biochemii na ziemi. Poznanie mechanizmu działania ksenobiotyków na poziomie komórkowym stanowi podstawę prawidłowego przeciwdziałania atakowi chemicznemu.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Znajomość przemiany ksenobiotyków stanowi podstawę racjonalnej farmakologii, toksykologii, badań nad patomechanizmem powstawania nowotworów lub uzaleŜnień od łęków. Cechą wspólną wszystkich wymienionych dziedzin jest podawanie ksenobiotyków lub ekspozycja człowieka na te substancje.

52

ffiocberoia

CZŁOWIEK STYKA SIĘ Z LICZNYMI KSENOBIOTYKAMI, KTÓRE MUSZĄ ULEC PRZEMIANt£ZANIM ZOSTANĄ WYDALONE Z USTROJU Ksenobiotyk (greckie słowo xenos oznacza obcy) jest substancją obcą dla człowieka. Wśród głównych grup ksenobiotyków dających znaczenie medyczne wymienić naleŜy leki, kancerogeny chemiczne i róŜne związki znajdujące się w otaczającym nas środowisku (np. wielochlorowcowe pochodne bifenylu — PCB, niektóre insektycydy itd.) Większość wymienionych grup związków ulega przemianie (tj. przekształceniom chemicznym) w ustroju człowieka, w tym giównie w wątrobie. Tylko rzadko ksenobiotyk wydalany jest w postaci niezmienionej. Przemianę ksenobiotyków moŜna podzielić na dwie fazy. W fazie pierwszej główną reakcją jest hydroksylacja katalizowana przez jeden z enzymów zaliczanych do monooksygenaz lub cytochromów P-450. Innymi rodzajami reakcji zachodzących w fazie pierwszej są redukcja i hydroliza. W fazie drugiej związki hydroksyl o wane lub zmienione w inny sposób w fazie pierwszej, ulegają przekształceniu przez swoiste enzymy do róŜnych metabolitów polarnych poprzez sprzęganie z kwasem glukuronowym, siarkowym lub octowym, glutationem lub pewnymi aminokwasami, lub teŜ poprzez merylację. Głównym celem obu faz przemiany ksenobiotyków jest zwiększenie ich rozpuszczalności w wodzie (czyli zwiększenie ich poiarności), dzięki czemu ułatwione jest ich wydalanie z ustroju. Bardzo silnie hydrofobowe ksenobiotyki mogłyby przebywać w tkance tłuszczowej nieograniczenie długo, gdyby nie zostały przekształcone do postaci bardziej polarnych.

818 / ROZDZIAŁ 60

W określonych przypadkach w wyniku reakcji zachodzących w fazie pierwszej, pewne ksenobiotyki ulegają konwersji ze związków biologicznie nieaktywnych do aktywnych. W takich przypadkach pierwotny ksenobiotyk określany jest jako prekursor lękowy (pro-fck) lub prokancerogen. W innych przypadkach, w dodatkowych reakcjach zachodzących w fazie pierwszej (np. dalsze hydroksylacje) aktywne związki ulegają konwersji do postaci mniej aktywnych lub nieaktywnych zanim ulegają procesowi sprzęgania. W jeszcze innych przypadkach, w wyniku samego procesu sprzęgania aktywne metabolity fazy pierwszej ulegają przekształceniu do związków mniej aktywnych lub nieaktywnych oraz wydalaniu z moczem lub Ŝółcią. Tylko w bardzo rzadkich przypadkach w wyniku procesu sprzęgania aktywność ksenobiotyku moŜe wzrosnąć. Pojęcie „detoksykacja" (odtruwanie) uŜywane jest czasem dla określenia licznych reakcji uczestniczących w przemianie ksenobiotyków. Jest to termin niewłaściwy, poniewaŜ, jak to wykazano wyŜej, w reakcjach, którym poddawane są ksenobiotyki, mogą powstać związki biologicznie bardziej aktywne, a nawet toksyczne.

CYTOCHROM P-450 KATALIZUJE HYDROKSYLACJĘ KSENOBIOTYKÓW W PIERWSZEJ FAZIE ICH PRZEMIANY Hydroksylacja jest główną reakcją zachodzącą w fazie pierwszej. Jest ona katalizowana przez enzymy określane jako monooksygenazy lub enzymy grupy cytaphromu P-450. Reakcje katalizowaną przez monooksygenazę (lub enzymy grupy cytochromu P-450) przedstawia następujące równanie. +

H ^ R—OH + H2O + NAOP (1)

RH oznacza szeroki zestaw związków, np. leki, kancerogeny i polutanty (np. PCB) oraz określone związki endogenne, np. steroidy. W wielu przypadkach nie poznano jeszcze endogennych substratów dla enzymów grupy cytochromu P-450, wydaje się jednak nieprawdopodobne, by enzymy te powstały tylko po to, by reagować ze związkami egzogennymi. W rozdziale tym nie będzie przedstawiony złoŜony mechanizm działania enzymów tej grupy. Wspomnieć jednak trzeba, Ŝe w reakcji katalizowanej przez oma-

wiane enzymy jeden atom tlenu wchodzi do R—OH, zaś drugi do wody (patrz wyŜej reakcja (1)). Dwoisty los tlenu w tej reakcji tłumaczy, dlaczego uczestniczące w niej monooksygenazy określano dawniej jako oksydazy o funkcji mieszanej (mixed function oxidases). Reakcję katalizowaną przez cytochrom P-450 moŜna przedstawić następującym równaniem: Postać zredukowana Postać utleniona cytochromu P-450 cytochromu P-450 (2) R—OH + HjO RH + Oj

t

Głównymi monooksygenazami siateczki śródpiazmatycznej są enzymy grupy cytochromu P-450. Nazwa cytochrom P-450 jest historycznie uzasadniona następującym faktem. Enzym ten odkryto, kiedy preparaty mikrosomów poddanych chemicznej redukcji, a następnie ekspozycji na działanie tlenku węgla, wykazały szczytową absorpcję światła przy 450 nm. Enzym ten jest niezwykle waŜny, wykazano bowiem, Ŝe ok. 50% leków zaŜywanych przez chorych jest metabolizowanych przez enzymy grupy cytrochromu P-450. Te same enzymy działają na kancerogeny i polutanty.

WaŜne cechy enzymów grupy cytrochromu P-450 Wśród nich wymienić naleŜy następujące: Podobnie jak hemoglobina, enzymy tej grupy są hemoproteinami. Największe stęŜenia tych enzymów stwier dza się w siateczce śródpiazmatycznej (we frakcji mikrosomalnej) wątroby. W błonach tych en zymy te stanowią w przybliŜeniu 20% ogólnej zawartości w nich białka. Enzymy te występują równieŜ w innych tkankach. I tak w nadnerczach ich obecność stwierdza się zarówno w mitochondriach, jak i w siateczce śródpiazmatycz nej. RóŜnorodne hydrolazy występujące w tym gruczole odgrywają waŜną rolę w biosyntezie steroidów (p. rozdz, 49). i W siateczce śródpiazmatycznej hepatocytów stwierdza się co najmniej 6 blisko ze sobą spokrewnionych rodzajów cytochromu P-450, odznaczających się szeroką i nakładającą się na siebie, swoistością substratową. Działają one na róŜnorodne leki, kancerogeny i inne ksenobio tyki oprócz endogennych związków (np. okreś lone steroidy). W ostatnich latach wyizolowano i szczegółowo scharakteryzowano geny kodują ce wymienione rodzaje cytochromu P-450. W reakcjach katalizowanych przez cyto-

METABOLIZM KSENOBIOTYKÓW / 819

chromy P-450 uczestniczy NADPH, a nie NADH. "Enzym redukujący cytochrom P-450 i współdziałający z NADPH określany jest jako reduktaza NADPH: cytochrom P-450. Składnikami układu cytochromu P-450 są równieŜ lipidy. Preferowanym lipidem jest fosfatydylochoLina, która jest głównym lipidem błon siateczki endoplazmatycznej. Syntezę większości rodzajów cytrochromu P-450 moŜna indukować podawaniem okreś lonych związków, i tak podawanie fenobarbitalu i wielu innych leków przez zaledwie 4—5 dni powoduje przerost siateczki śródplazmatycznej gładkiej oraz 3—4-krotny wzrost ilości cytrochromu P-450. Mechanizm indukcji został dogłębnie przebadany i polega m.in. na wzroś cie transkrypcji mRNA kodującego cytochrom P-450. MoŜliwość indukcji tego enzymu ma waŜne implikacje kliniczne, poniewaŜ stanowi jeden z mechanizmów interakcji zachodzącej między lekami. O interakcji mówimy wówczas, kiedy efekty działania jednego leku ulegają zmianie w wyniku uprzedniego lub równoczesnego stosowania innego leku. Dla przykładu przyjmijmy, Ŝe chory pobiera dikumarol w celu zmniejszenia krzepliwości krwi. Lek ten jest metabolizowąny przez układ cytochromu P-450. Następnie okazuje się, Ŝe chory wymaga stosowania fenobarbitalu z powodu pewnego rodzaju padaczki. Zgodnie z oczekiwaniami po 5 dniach stosowania fenobarbitalu stęŜenie cytochromu P-450 w hepatocytach wzrosło 3-—4-krotnie, co oznacza, Ŝe dikumarol ulega szybciej metabolizacji oraz, Ŝe zmniejszyło się jego działanie przeciwkrzepliwe. Aby więc uzyskać właściwy efekt przeciwkrzepliwy dawkę podawanego dikumarolu naleŜy zwiększyć. Dalszy problem powstaje wtedy, kiedy pacjent przestaje zaŜywać fenobarbital, lecz kontynuuje zaŜywanie dikumarolu w zwiększonej dawce. U takiego chorego mogą wystąpić objawy skazy krwotocznej spowodowanej przedawkowaniem dikumaroiu i nagłym spadkiem stęŜenia cytochromu P-450 (inaktywującego ten lek). 7. Jeden rodzaj cytochromu P-450 wykazuje maksymalną absorpcję światła nie przy długości 450 nm, lecz 448 nm. Cytochrom ten określany jest jako cytochrom P-448. Jest on względnie swoisty dla przemiany policyklicznych aroma tycznych węglowodorów (PAH) i spokrewnio nych z nimi związków. Z tego powodu enzym ten określany jest jako hydroksylaza węglowodo rów aromatycznych (AHH — aromatic hydro-

carbon hydroxylase). Enzym ten odgrywa waŜną rolę w przemianie policyklicznych węglowodorów aromatycznych oraz w kancerogenezie indukowanej przez te związki, np. enzym ten uczestniczy w konwersji nieaktywnych PAH (prokancerogenów) wdychiwanych w czasie palenia papierosów do aktywnych kancerogenów (powstających przez hydroksylację prokancerogenów). Palacze wykazują wyŜsze stęŜenia AHH w niektórych komórkach niŜ osoby niepalące. W niektórych pracach doniesiono o występowaniu wzmoŜonej aktywności AHH w łoŜysku kobiet palących. Ten fakt moŜe sprawić, Ŝe płody tych kobiet mogą być eksponowane na działanie zwiększonych ilości PAH (niektóre z nich mogą być bardzo szkodliwe). PROCESY SPRZĘGANIA PRZYGOTOWUJĄ KSENOBIOTYK1 DO WYDALANIA Z USTROJU ODBYWAJĄCEGO SIĘ W DRUGIEJ FAZIE ICH PRZEMIANY W reakcjach fazy pierwszej ksenobiotyki ulegają zwykle konwersji do związków bardziej polarnych w wyniku ich hydroksylacji. W reakcjach fazy drugiej hydroksyl owa ne pochodne ulegają sprzęganiu z kwasem glukuronowym, siarczanami lub glutationem. W wyniku tych reakcji związki te stają się jeszcze bardziej rozpuszczalne w wodzie i mogą ewentualnie zostać wydalone z moczem lub Ŝółcią. Istnieje co najmniej pięć rodzajów reakcji zachodzących w drugiej fazie przemiany ksenobiotyków Glukuronidacja. Proces ghikuronidacji bilirubiny został przedstawiony w rozdziale 34. Reakcje glukuronidacji ksenobiotyków są w zasadzie podobne do podanych dla bilirubiny. Donorem reszty gluktironylowej jest kwas UDP-glukuronowy, zaś enzymami katalizującymi reakcje glukuronidacji — transferazy glukuronylowe występujące zarówno w siateczce śródplazmatycznej, jak i w cytoplazmie. Wiek związków, takich jak 2-acetyloaminofluoren (jest to kancerogen), anilina, kwas benzoesowy, meprobamat, fenol i wiele steroidów wydalanych jest pod postacią glukuronidów. Reszta glukuronidowa moŜe ulec związaniu przez tlen, azot lub grupę siarkową danego substratu. Glukuronidacja jest prawdopodobnie najczęściej spotykaną reakcją sprzęgania.

820 / ROZDZIAŁ 60

Sprzęganie z siarczanem (sulfatacja). Niektóre alkohole, aminy aromatyczne i fenole ulegają sprzęganiu z siarczanem. Nośnikiem reszty siarczanowej jest 3'-fosfoadenozyno-5'-fosfosiarczan (PAPS) (p. rozdz. 26) zwany równieŜ aktywnym siarczanem.

Sprzęganie z glutationem. Glutation (y-glutamylo-cysteinylo-glicyna) jest tripeptydem składającym się z kwasu glutaminowego, cysteiny i glicyny (p. ryc. 4-4). Powszechnie uŜywanym skrótem dla glutationu jest GSH. Reszta sulfhydrylowa SH cysteiny jest aktywną grupą wymienionego peptydu. Liczne potencjalnie toksyczne elektrolitowe kstnobiotyki (jak np. pewne kancerogeny) ulegają sprzęganiu z nukleofilowym GSH zgodnie z reakcją R + GSH-* R—S—G

gdzie R oznacza elektrofilowy ksenobiotyk. Enzymy katalizujące ww. reakcję określone są jako S-transferazy glutationowe. Występują one w duŜych stęŜeniach w cytozolu hepatocytów zaś w mniejszych w innych tkankach. W tkankach człowieka stwierdza się róŜnorodne Stransferazy glutationowe. Odznaczają się one odmiennymi swotstościami substratowymi i moŜna je rozdzielić metodą elektroforetyczną lub innymi technikami. Gdyby potencjalnie toksyczny ksenobiotyk nie uległ sprzęganiu z GŚH, mógłby się swobodnie połączyć kowatencyjnie z DNA, RNA lub białkami komórkowymi, stając się przyczyną powaŜnego uszkodzenia komórki. GSH jest więc waŜnym ogniwem mechanizmu obronnego przed określonymi związkami toksycznymi, np. niektórymi lekami lub kancerogenami. JeŜeli stęŜenie GSH w takich narządach jak wątroba ulega obniŜeniu (np. przez podanie szczurom pewnych związków wiąŜących GSH), wówczas narząd taki wykazuje zwiększoną wraŜliwość na toksyczne działanie róŜnych związków chemicznych normalnie inaktywowanych przez GSH. Koniugaty glutationowe ulegają jeszcze dalszym przemianom zanim wydalane są z ustroju. Dochodzi bowiem do odszczepienia przez swoiste enzymy grup glutamylowej i glicynylowej glutationu oraz połączenia grupy aminowej pozostającej reszty cysteinyłowej z grupą acetylową (donorem grupy acetylowej jest acetylo-CoA). W wyniku tych reakcji powstaje kwas merkapturowy — koniugat Ł-acetylocysteiny. Glutation spełnia jeszcze inne waŜne funkcje w komórkach ludzkich, oprócz udziału w prze-

mianie ksenobiotyków. Wśród nich wymienić naleŜy następujące: Glutation uczestniczy w rozkładzie poten cjalnie toksycznego nadtlenku wodom. Reakcja

ta jest katalizowana przez peroksydazę glutationową (p. rozdz. 21). Glutation jest waŜną środkom orkową substancją redukującą, pozwalającą utrzymać istotne grupy SH enzymów w postaci zreduko wanej. Kiedy GSH działa jako substancja redu kująca, jej grupa SH ulega utlenieniu i tworzy wiązanie dwusiarczkowe z drugą cząsteczką glutationu zgodnie z reakcją: GSH GSH G

-S—G

Produkt tej reakcji G—S—S—G jest glutationem utlenionym. Z kolei G—S—S—G moŜe ulec redukcji do GSH przez reduktazę glutationową w reakcji, w której uczestniczy NADPH. Przedstawia ją następujące równanie: G—S—S—G + NADPH + H+-2GSH + NADP

Reakcja ta jest szczególnie waŜna w "krwinkach czerwonych. JeŜeli stęŜenie NADPH w tych komórkach jest niskie, jak to ma miejsce przy niedoborze dehydrogenazy G—6—P (p. rozdz. 21), regeneracja zredukowanego GSH jest niedostateczna. W następstwie niskiego stęŜenia GSH w krwinkach czerwonych wzrasta stęŜenie nadtlenków. Te ostatnie, działając utleniająco na lipidy błon erytrocytarnych, mogą spowodować hemolizę krwinek czerwonych. 3. GSH uczestniczy jako substancja przenośnikowa w przezbłonowym transporcie amino-

kwasów w nerkach w tzw. cyklu y-glutamylowym. Pierwsza reakcja tego cyklu przedstawia się następująco: Aminokwas -GSH - -Glutamylo-pochodna aminokwasu + Cysteiny logi icy na

Reakcja ta jest pomocna w przezbłonowym transporcie pewnych aminokwasów. Z kolei aminokwas ulega odszczepieniu od kompleksu z GSH, po czym zachodzi resyntęza GSH z cysteinyloglicyny. Enzym, który katalizuje ww, reakcję nazywa się 7-glutamylotransferazą (GGT). Enzym ten występuje w błonach plazmatycznych komórek kanaiikowych.nefronów oraz w siateczce plazmatycznej hepatocytów. Oznaczanie tego enzymu ma znaczenie diagnostyczne, ulega on bowiem uwolnieniu z hepato-

METABOLIZM KSENOBIOTYKOW / 821

cytów do krwi w róŜnych chorobach wątroby i dróg Ŝółciowych (patrz Dodatek pod hasłem: y- Gl u tamy 1 o transpep ty daza). Inne reakcje. Wśród innych reakcji fazy drugiej przemiany ksenobiotyków najwaŜniejsze są reakcje acetyłacji i metylacji. Reakcje acetyłacji ilustruje równanie: X + Acetyf o-Co A -»Acety Io-X+Co A gdzie X oznacza ksenobiotyk. Podobnie jak w innych reakcjach acetyłacji donorem aktywnego octanu jest acetylo-CoA. Reakcje te są katalizowane przez acetylotransferazy występujące w cytoplazmie komórek róŜnych tkanek, a szczególnie wątroby. Izottiazyd — lek uŜywany w leczeniu gruźlicy — ulega acetyłacji. PoniewaŜ istnieją polimorficzne postacie acetylotransferaz, wśród Judzi wyróŜnia się osobników odznaczających niską lub duŜą wydajnością procesu acetyłacji. W konsekwencji osobnicy o niskiej wydajności acetyłacji odznaczają się małym klirensem leków, takich jak izoniazyd, przez co są bardziej naraŜeni na toksyczne ich działanie. Mała liczba ksenobiotyków ulega metylacji przez metyl o tran sterazy. Donorem grupy metylowej w tych reakcjach jest S-adenozylometionina(p. ryc. 31-22).

NA AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW PRZEMIANY KSENOBIOTYKÓW WPŁYW MAJĄ WIEK, PŁEĆ I INNE CZYNNIKI RóŜne czynniki wpływają na aktywność enzymów metabolizujących ksenobiotyki. Wśród nich wymienić naleŜy następujące: Aktywność tych enzymów róŜni się istot nie u poszczególnych gatunków zwierząt. Ozna cza to, Ŝe toksyczność lub kancerogenność określonego ksenobiotyku u jednego gatunku wcale nie oznacza, Ŝe jest równie toksyczny lub rakotwórczy u drugiego gatunku. Występują znaczne róŜnice (genetycznie uwarunkowane) w zakresie aktywności wymie nionych enzymów między osobnikami tego sa mego gatunku. Aktywność enzymów przemiany ksenobio tyków zaleŜna jest od wieku i pici. ZaŜywanie róŜnych ksenobiotyków, takich jak fenobarbital, PCB lub pewne węglowodory, jest przyczyną indukcji enzymów. WaŜna jest

więc informacja o-zaŜywaniu przez daną osobę związków indukujących syntezę enzymów przemiany ksenobiotyków. Informacja ta jest istotna dla oceny efektów biochemicznych ksenobiotyków. 5. Metabolity niektórych ksenobiotyków mogą hamować aktywność enzymów metabolizujących te związki. PowyŜsze fakty tłumaczą występowanie znacznych róŜnic gatunkowych lub między osobnikami tego samego gatunku w zakresie reakcji na ksenobiotyki (np. na leki i substancje toksyczne lub czynniki rakotwórcze).

REAKCJE NA KSENOBIOTYKI MOGĄ MIEĆ CHARAKTER FARMAKOLOGICZNY, TOKSYCZNY, IMMUNOLOGICZNY I RAKOTWÓRCZY W ustroju ksenobiotyki ulegają przemianie w reakcjach przedstawionych wyŜej. JeŜeli ksenobiotyk jest lekiem, moŜe on ulec aktywacji w wyniku reakcji fazy pierwszej. JeŜeli zaś lek był farmakologicznie aktywny bez uprzedniej metabolizacji, aktywność jego moŜe ulec zmniejszeniu lub całkowitemu zniesieniu w następstwie reakcji fazy pierwszej. Ocena efektów działania leków jest przedmiotem badań farmakologicznych. Na tym miejscu ma być wyeksponowany fakt, Ŝe leki działają za pośrednictwem mechanizmów biochemicznych. Niektóre ksenobiotyki są niezwykle toksyczne nawet przy niskich stęŜeniach w płynach ustrojowych (np. cyjanki). Z drugiej strony istnieje kiłka ksenobiotyków, w tym równieŜ leków, które nie są toksyczne nawet wtedy, kiedy podane zostały w duŜych ilościach. Efekty toksyczne ksenobiotyków są niezwykle róŜnorodne. Wśród nich omówione zostaną bardzo krótko tylko trzy ogólne rodzaje toksyczności związane z przemianą ksenobiotyków (ryc. 60-1). Pierwszy z nich to uszkodzenie komórek przez ksenobiotyki. MoŜe ono być na tyle cięŜkie, Ŝe kończy się śmiercią komórek. Istnieje wiele mechanizmów, za pośrednictwem których ksenobiotyki uszkadzają komórki. Wśród nich wymienić naleŜy kowalencyjne wiązanie się reaktywnych postaci ksenobiotyków, powstałych w wyniku ich przemiany, z makrocząsteczkami komórkowymi. Tymi ostatnimi mogą być DNA, RNA i białka. JeŜeli tymi makrocząsteczkami są białka lub enzymy niezwykle waŜne

822 / ROZDZIAŁ 60 Transferaza glutationowa

Ksenobiotyk

lub hydrolaza epoksydowe

Reaktywne metabolity

Nietoksyczne metabolity

Kowalencyjne wiązanie się z makrocząsteczkami

. 1

! Uszkodzenie komórak toksyczne

Hapten

Mutacja

Wytwarzanie przeciwciał

Rak

1

Immunologiczne uszkodzenie komórek

Ryc. 60-1. Uproszczony schemat przedstawiający, w jaki sposób metabolizm ksenobiotyku prowadzi do uszkodzenia toksycznego lub immunologicznego komórek, lub teŜ do powstawania raka. W tych przypadkach konwersję ksenobiotyku do reaktywnego metabolitu katalizują enzymy grupy cytochromu P-450, zaś przekształcenie reaktywnego metabolitu (np. epoksydu) do metabolitu nieaktywnego — -S-transferaza glutalionowa aibo hydrolaza epoksydowa.

dla funkcji komórki, decydujących o jej przeŜyciu, np. enzymy fosforylacji oksydacyjnej lub białka regulujące przepuszczalność błony plazmatycznej, wówczas łatwo wytłumaczyć szybkie wystąpienie objawów toksycznych spowodownych ksenobiotykiem. Po drugie, reaktywny ksenobiotyk wiąŜąc się z białkami moŜe zmienić ich strukturę i antygenowość. Mówi się wówczas, Ŝe ksenobiotyk działa jako hapten. Oznacza to, Ŝe sam ksenobiotyk, jako mała cząsteczka, nie stymuluje powstawania przeciwciał (wiąŜących ten ksenobiotyk). JeŜeli jednak wytworzone zostały takie przeciwciała (dzięki połączeniu się ksenobiotyku z białkami), wówczas wiąŜą się one ze swoim antygenem. W wyniku róŜnych mechanizmów immunologicznych zachodzących pomiędzy tymi przeciwciałami a ksenobiotykiem związanym przez makrocząsteczki komórkowe, dochodzi do powaŜnych zaburzeń normalnych procesów biochemicznych komórki. Po trzecie, chemiczne kancerogeny po ich aktywacji mogą połączyć się z DNA. UwaŜa się, Ŝe taka reakcja moŜe mieć duŜe znaczenie w kancerogenezie chemicznej (p. rozdz. 61). Niektóre związki chemiczne
Ŝe są pośrednio działającymi kancerogenami). Aktywność tych monooksygenaz i innych enzymów przemiany ksenobiotyków występujących w siateczce śródplazmatycznej decydują o tym, czy takie związki stają się kancerogenami czy teŜ ulegają „detoksykacji". Inne związki chemiczne (np. substancje alkilujące) mogą bezpośrednio reagować z DNA, bez uprzedniej aktywacji w obrębie komórki (są to kancerogeny bezpośrednio działające). Enzym określany jako hydrolaza epoksydowa jest przedmiotem zainteresowania ze względu na to, Ŝe moŜe mieć działanie ochronne w stosunku do niektórych kancerogenów. Produktami monooksygenaz działającymi na niektóre prokancerogeny są epoksydy. Epoksydy są wysoce reaktywne i dlatego wykazują działanie mutagenne i (lub) kancerogenne. Hydrolaza epoksydowa, podobnie jak cytochrom P-450, występuje w błonach siateczki śródplazmatycznej. Przekształca ona epoksydy do znacznie mniej reaktywnych dihydrodioli. Reakcję tę przedstawia następujące równanie:

I

I—C—C—

+ H2O -* \/ O Epoksyd

I

I

OH OH Dihydrodiol

METABOLIZM KSENOBIOTYKÓW / 823 PIŚMIENNICTWO

Nebert DW, Gonzalez FJ: P450 genes: structure, evolution and regulation. Annu Rev Biochem 1987; Katzung BG (editor): Basie & Clinica} Pharmacołogy. 56:945. 4th cd. Appleton & Lange, 1989. Nebert DW, Gonzalez FJ:P450 genes and evolutionaIClaassen CD, Amdur MO, Doull J (editors): Casoi-etf ry geneties. Hosp Pract (March) 1987; 22:63. & DouWs Toxicology, 3rd ed, Macmillan, 1986.

61

Rak, onkogeny i czynniki wzrostowe Robert K. Munay, MD, PhD

WPROWADZENIE

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Komórki nowotoworowe cechują się 3 właściwościami: 1) zmniejszoną lub nie opanowaną kontrolą wzrostu; 2) inwazyjnością wobec tkanek, w których są zlokalizowane oraz 3) rozprzestrzenianiem się i zdolnością do wywoływania przerzutów w innych częściach organizmu. W tym rozdziale zostaną omówione niektóre biochemiczne aspekty procesu nowotworowego. Głównymi kwestiami wymagającymi wyjaśnienia w terminach biochemicznych są niekontrolowany wzrost komórek nowotworowych i ich zdolność do inwazji i tworzenia przerzutów. Prawdopodobnie struktura i właściwości regulacyjne genów, kontrolujących wzrost i interakcje między komórkami, nie są normalne w komórkach nowotworowych. Ograniczone są informacje o tym^w jaki sposób jest kontrolowany wzrost komórek, zarówno prawidłowych, jak i nowotworowych, a wiedza o specyficznych genach uczestniczących w regulacji wzrostu jest jeszcze bardzo uboga. Jak dotychczas niewiele wiadomo o biochemicznych podstawach tworzenia przerzutów, dlatego teŜ temat ten zostanie przedstawiony skrótowo. Przynajmniej niektóre typy nowotworów (np. niektóre typy białaczek) mogą być traktowane jako przykłady nienormalnego róŜnicowania. Zdumiewająco mato wiadomo o molekularnych podstawach róŜnicowania. Jednak wielu badaczy tej dziedziny wiedzy przypuszcza, Ŝe dalsze badania nad onkogenami i czynnikami wzrostowymi rzucą światło na naturę zaburzonej kontroli wzrostu i róŜnicowania, a takŜe na oddziaływania międzykomórkowe wywołane przez komórki nowotworowe. Dlatego teŜ oba te tematy będą przedyskutowane w szczegółach.

Nowotwory są drugą z przyczyn zgonów w USA, po chorobach serca i naczyń. Rozwijają się u ludzi bez względu na ich wiek. Chorobą moŜe być objętych wiele narządów. Częstość pojawiania się nowotworów rośnie z wiekiem tak, Ŝe ludzie Ŝyjący dłuŜej częściej są. na nie naraŜeni. NiezaleŜnie od indywidualnych cierpień, ekonomiczne straty ponoszone przez społeczeństwo są ogromne.

W LECZENIU CHORYCH Z NOWOTWORAMI BARDZO WAśNE SĄ TESTY LABORATORYJNE Biochemiczne testy laboratoryjne pomagają w leczeniu chorych na nowotwór. Wiele nowotworów związanych jest z nieprawidłowym wytwarzaniem enzymów, białek i hormonów, których stęŜenie moŜna mierzyć w osoczu lub surowicy krwi (p. dyskusja nad rozwojem choroby nowotworowej, poniŜej). Związki te określa się jako markery nowotworowe. Pomiary stęŜeń niektórych markerów nowotworowych są dziś integralną częścią leczenia niektórych typów nowotworów (tab. 61-1). Zastosowanie markerów nowotworowych w diagnostyce i leczeniu nowotworów przedstawiono w tab. 61-2. Z badań nad markerami nowotworowymi wynikają 3 główne wnioski (Mclntire, 1984): 1) Ŝaden pojedynczy marker nie jest uŜyteczny w ocenie wszystkich typów nowotworów lub u wszystkich chorych z danym rodzajem nowotworu; dlatego poŜyteczne jest teŜ oznaczanie wielu markerów nowotworowych; 2) markery

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 825 Tabela 61-1. Klinicznie uŜyteczne markery nowotworowe*. Związany z nim nowotwór OkręŜnica, płuca, piersi, Antygen rakowo-płodowy trzustka (CEA) Wątroba, komórki Alła-fetoproteina (AFP) płciowe

PRZYCZYNĄ NOWOTWORÓW MOGĄ BYĆ CZYNNIKI FIZYCZNE, CHEMICZNE I BIOLOGICZNE

Marker

Ludzka gonadotropinźr kosmówkowa (hCG)' Kalcytonina (CT)

Trofoblast, komórki płciowe Tarczyca, rak rdzeniasty

Kwaśna fosfataza gruczołu krokowego (PAP) Gruczoł krokowy * Według Mclntire K.R.: Tumor Markers: How useful arethey? Hosp. Pract. (Dec) 1984; 19,55, za zezwoleniem. Tabela 61-Z. Zastosowanie markerów nowotworowych* Wykrywanie: skrining u osób nie wykazujących objawów Diagnostyka: rozróŜnianie nowotworów złośliwych od łagodnych postaci Monitorowanie: śledzenie skuteczności leczenia i ocena nawrotu nowotworu Klasyfikacja: wybór terapii i przewidywanie reakcji nowotworu (rokowanie) Stadia: ocena zaawansowania choroby Lokalizacja: scyntygrafia po podaniu znakowanych pierwiastkami radioaktywnymi przeciwciał Leczenie: wprowadzenie cytotoksycznych czynników do komórek zawierających markery " Według Mclntire K.R.; Tumor Markers: How useful arethey?Wosp. Pract. (Dec) 1984,19,55, za zezwoleniem.

są czasami wykrywalne dopiero w zaawansowanych stadiach choroby nowotworowej, a rzadziej w początkowych stadiach jej rozwoju, gdzie ich uŜyteczność byłaby większa; 3) oceniając zastosowanie markerów przedstawionych w tab. 61-2 moŜna stwierdzić, Ŝe najbardziej uŜyteczne są one w monitorowaniu skuteczności leczenia i przy wczesnym wykrywaniu nawrotów.

Czynniki wywołujące nowotwory naleŜą do 3 wielkich grup: energia promieniowania, związki chemiczne i wirusy.

Energia promieniowania moŜe być rakotwórcza Promieniowanie ultrafioletowe, promieniowanie X i promieniowanie y są mutagenne i rakotwórcze. Promieniowanie ultrafioletowe moŜe wywołać powstawanie dimerów. LeŜące blisko siebie zasady azotowe mogą na drodze eliminacji być przyczyną powstawania miejsc apurynowych i apiryrnidynowych. Mogą nastąpić pęknięcia w pojedynczym lub podwójnym łańcuchu, a nawet sieciowanie (crosslinking). Uszkodzenia DNA uwaŜa się za główny czynnik w mechanizmie powstawania nowotworów wywołanych energią promieniowania, ale szczegóły nie są jeszcze znane. Mechanizmy naprawy DNA omówiono w rozdz. 38. NiezaleŜnie od bezpośrednich wpływów na DNA promieniowanie X i promieniowanie y mogą spowodować powstawanie wolnych rodników w tkankach. Powstające w wyniku tego oddziaływania wolne rodniki *OH, nadtlenki i inne rodniki mogą oddziaływać z DNA i innymi makromolekularni, prowadząc do uszkodzeń molekularnych i być moŜe w ten sposób uczestniczą w kancerogenezie wywołanej energią promieniowania.

Wiele związków chemicznych jest rakotwórczych Wiele związków chemicznych ma właściwości rakotwórcze (tab. 61-3); strukturę trzech najszerzej badanych pokazano na ryc. 61-1. Większość związków ujętych w tab. 61-3 testowano na gryzoniach i innych zwierzętach. Jednak wiele substancji chemicznych jest związanych z powstawaniem nowotworów u człowieka. Zakłada się, Ŝe niemal 80% nowotworów u ludzi wywołanych jest czynnikami środowiskowymi. NaraŜenie na te związki moŜe być związane z charakterem pracy zawodowej (np. benzen,

azbest), dietą (np. aflatoksyna Bv która jest wytwarzana przez pleśń Aspergillus fłavus i czasem znajdowana jako zanieczyszczenie orzeszków ziemnych lub innych produktów spoŜywczych), stylem Ŝycia (np. palenie papierosów) lub z innymi drogami (np. niektóre substancje

826 / ROZDZIAŁ 61 Tabela 61-3. Wybrane chemiczne Klasa kancerogeny

kancerogenem, a końcowy związek, który reaguje ze składnikami komórkowymi, np. z DNA, jest ostatecznym kancerogenem. Sekwencja wydarzeń jest następująca:

Związek Poiicykliczne aro- Benzo[a]piren, matyczne węglo- benzo-antracen wodory

dimetylo-

Prokaneerogen . Bliski kancerogen A■ ■ > Bliski kancerogen B-*Ostateczny kancerogen

Aromatyczne ami- 2-Acetylami nof I uoren, (MAB) ny N-metylo-4-amino-azobsnzen Dimetylonitrozoamina, dietylonitrozoamina Czynniki slkilujące (np. cyRóŜne leki klofosfamid), dietylostilbestrol Naturalnie wystęDaktynomycyna, pujące związki aflatoksyna B, Nieorganiczne Arsen, azbest, beryl, kadm związki chrom Nitrozoaminy

lecznicze stosowane w terapii mogą być rakotwórcze). W tym rozdziale zostaną przedstawione tylko niektóre waŜne uogólnienia, które wynikają z badań nad chemiczną kancerogenezą. Struktura. Rakotwórcze mogą być zarówno cząsteczki organiczne, jak i nieorganiczne (tab. 61-3). Rozmaitość tych związków wskazuje, Ŝe nie mają one jednej wspólnej cechy strukturalnej, która odpowiedzialna jest za te ich właściwości. Działanie. Najdokładniej zostały zbadane rakotwórcze związki organiczne. Niektóre, takie jak gaz musztardowy i p-propioJakton, oddziałują bezpośrednio z molekułą docelową (bezpośrednie kancęn>geny), inne wymagają uprzedniego metabóhzowania, aby stały się rakotwórcze (prokancerogeny) (p, rozdz. 60). Proces, w którym w wyniku jednej lub wielu enzymatycznych reakcji prokancerogeny zamieniają się w kancerogeny, nosi nazwę aktywacji metabolicznej. KaŜdy związek pośredni utworzony w wyniku przemian jest bliskim

—\

Benzo[i]piren

Prokancerogen sam w sobie nie jest związkiem reaktywnym chemicznie, podczas gdy kancerogen ostateczny jest zwykle bardzo reaktywny. Co najmniej 2 reakcje chemiczne są niezbędne w celu przekształcenia prokancerogenu, jakim jest 2-acetylo-amino-fIuoren (2-AAF), w kancerogen ostateczny, jakim jest siarczanowy ester N-hydroksy-AAF. WaŜnym uogólnieniem jest, Ŝe ostateczny kancerogen jest zwykle związkiem elektrofilowym (tzn. cząsteczki są ubogie w elektrony), który łatwo atakuje nukleofilowe (bogate w elektrony) grupy w DNA, RNA i w białkach.

Metabolizm chemicznych kancerogenów. Metabolizm pro kancerogen ów i innych ksenobiotyków związany jest z udziałem monooksygenaz i transferaz (p. rozdz. 60). Enzymy odpowiedzialne za metaboliczną aktywację prokancerogenów są z reguły określonymi rodzajami cytochromu P-450 zlokalizowanymi w siateczce śródplazmatycznej. Są to te same enzymy, które uczestniczą w przemianie innych ksenobiotyków, takich jak leki czy zanieczyszczenia środowiska (np. PCB). Poiicykliczne aromatyczne węglowodory są związkami, które wzbudzają duŜe zainteresowanie w chemicznej kancerogenezie. Specyficzna monooksygenaza uczestnicząca w ich metabolizmie nazywa się cytochromem P-448 lub hydroksylazą aromatycznych węglowodorów. Aktywność enzymów metabolizujących chemiczne kancerogeny jest uzaleŜniona od wielu czynników, takich jak przynaleŜność gatunkowa, uwarunkowania genetyczne, wiek lub płeć. Zmiany w aktywności tych enzymów pomagają wyjaśnić występowa-

/=V

2 - Acetam in of I u a ren

COCH3

N-Metyla-4-am i n oazo Den zen

Ryc. 61-1. Struktura trzech waŜnych stosowanych w doświadczeniach kancerogenów

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 827

nie znacznych czasem róŜnic w aktywności kancerogennej wielu związków chemicznych testowanych u róŜnych gatunków lub osobników tego samego gatunku. Wiele z wyŜej wymienionych zagadnień jest szczegółowo omówionych w rozdz. 60.

Wiązania kowalencyjne. Gdy chemiczne kancerogeny są podawane zwierzętom lub wprowadzane do kultur komórkowych (co moŜna wykazać za pomocą radioaktywnych kancerogenów), kancerogeny te lub ich pochodne wiąŜą się zwykle kowalencyjnie z komórkowymi makromolekularni, w tym z DNA, RNA i białkami. Chemiczna natura adduktów powstałych przez interakcję ostatecznych kancerogenów z molekułami, z którymi docelowo mają się związać, została juŜ wyjaśniona. Największe zainteresowania wywołały produkty powstałe z udziałem DNA. Wykazano, Ŝe kancerogeny oddziałują z purynami i pirymidynami lub z grupami fosfodiestrowymi DNA. Najczęściej atakowaną cząsteczką jest guanina, a róŜne kancerogeny są dołączane do atomów N2, N3, N7, O6 oraz O8 tej zasady azotowej. Uszkodzenia DNA. Kowalencyjne oddziaływania bezpośrednich lub pośrednich kancerogenów z DNA mogą być przyczyną wielu rodzajów uszkodzeń: wiek z nich moŜe być naprawionych, jak opisano to w rozdz. 38. NiezaleŜnie od istnienia systemów naprawczych określone modyfikacje w DNA spowodowane chemicznymi kancero genami istnieją przez stosunkowo długi czas. Nie moŜna wykluczyć, Ŝe te długo trwające nie naprawione uszkodzenia odgrywają szczególną rolę w generowaniu mutacji istotnych w procesie kancerogenezy. Mutageny. Większość chemicznych kancerogenów jest mutagenami. Wykazano to dzięki zastosowaniu testu Amesa (p, niŜej) i innych testów. Na poziomic molekularnym tranzycje, transwersje i inne typy mutacji (p. rozdz. 38 i 40) moŜna wywołać przez ekspozycję niektórych bakterii na ostateczne kancerogeny. ZałoŜono, Ŝe niektóre typy nowotworów spowodowane są mutacjami zachodzącymi w głównych procesach regulacyjnych w komórkach somatycznych. Bezpośrednie dowody prawdziwości tego twierdzenia są dziś dostępne (p. dyskusja o onkogenach, poniŜej). Badanie właściwości rakotwórczych związków chemicznych z uŜyciem zwierząt jest czasochłonne i drogie, dlatego teŜ opracowano testy skriningowe do określania potencjalnej rako-

twórczości związków chemicznych. Wiele z nich opiera się na wykazaniu właściwości mutagennych chemicznych kancerogenów.Takie badania są znacznie szybsze i mniej kosztowne niŜ badania dotyczące wykrywania nowotworów u zwierząt. śaden z tych testów nie jest idealny, poniewaŜ ostatecznym dowodem rakotwórczości kaŜdego kancerogenu jest wykazanie, Ŝe wywołuje on nowotwory u zwierząt. Jedynie test Amesa, oparty na określaniu mutagenności, okazał się przydatny w wykrywaniu potencjalnych kanoerogenów. W teście tym stosuje się specjalnie skonstruowany szczep Salmonella typhimurium, który cechuje się obecnością mutacji (His") w genie, który koduje jeden z enzymów biorących udział w syntezie histydyny. Dzięki temu taki szczep Salmonella nie moŜe syntetyzować histydyny, trz%ba ją więc dodawać do poŜywki, aby komórki mogły rosnąć. JeŜeli kancerogen wywoła w miejscu odpowiedzialnym za mutację His~ kolejną mutację, to moŜe ona odtworzyć właściwą sekwencję zamieniając to miejsce na His+. Potomstwo takiej bakterii z mutacją rewersyjną moŜe teraz syntetyzować histydynę i rosnąć na poŜywce pozbawionej tego aminokwasu. Takie bakterie moŜna łatwo wykryć, a ich kolonie policzyć na płytkach agarowych. Jednym z problemów stosowania bakterii w testach wykrywania mutagenności związków jest fakt, Ŝe nie zawierają one całego spektrum monooksj genaz, które występują u wyŜszych organizmów. Dlatego teŜ, jeŜeli jakiś związek chemiczny wymaga aktywowania, aby nabył właściwości mutagennych lub rakotwórczych, wówczas nie moŜna tego wykazać przy uŜyciu wymienionych bakterii. Ames przezwycięŜył te trudność inkubując związki, które miały być testowane w postmitochondrialnym supernatancie komórek wątroby szczura (tj. we frakcji S-9, którą otrzymuje się jako supernatant wirując homogenat komórek wątroby przy 9000 g przez określony czas). Frakcja S-9 zawiera większość róŜnych monooksygenaz i innych enzymów potrzebnych do aktywacji potencjalnych mutagenów i kancerogenów. Za pomocą testu Amesa moŜna zidentyfikować ok. 90% znanych kancerogenów. Dziś metoda ta naleŜy do rutynowych testów stosowanych do testowania nowo syntetyzowanych związków chemicznych, szczególnie gdy przewiduje się ich handlowe przeznaczenie lub szerokie zastosowanie w przemyśle. Związki, które dają dodatnią reakcje, powinny być poddane

828 / ROZDZIAŁ 61

dalszym testom, w tym testom na rakotwórczość u zwierząt. Inicjacja i promocja. W niektórych narządach, takich jak skóra czy wątroba, wykazano, Ŝe kancerogeneza moŜe przebiegać w co najmniej 2 etapach. Klasycznym przykładem jest skóra. Dwie identyczne powierzchnie skóry określonej grupy myszy powleka się jednokrotnie benzo[s]pirenem. JeŜeli te określone powierzchnie skóry nie są dodatkowo poddane działaniu innych czynników, nowotwory skóry nie rozwijają się (ryc. 61-2). JeŜeli jednak po za-

B

ł1

C

łP j ł _J_

P

P

P

P

P

1

ł t JL

Nio ma nowotworu

Nowotwór

Nie ma nowotworu

Czas

Ryc. 61-2. Schematyczna prezentacja etapów inicjacji i promocji w chemicznej kancerogenezie skóry. A — jednorazowa aplikacja inicjatora (np. benzo[a]pirenu) naniesionego na skórę określonej iiczby myszy. B — po naniesieniu inicjatora stosuje się wiele aplikacji promotora {np. oleju krotonowego) w okresach np. tygodniowych, C — najpierw nanosi sie promotor, a potem inicjator. Niezłośliwe nowotwory skóry (brodawczaki) mogą pojawić się w okresie ok. 100 dni; złośliwe nowotwory (raki) wymagają rocznego okresu. WyŜej opisane doświadczenie zostało przeprowadzone w wielu innych wariantach, jecłnak wszystkie potwierdziły zasadniczą tezę inicjacji i promocji. I — inicjator, P — promotor.

stosowaniu benzo[a]pirenu zostanie kilkakrotnie naniesiony na te powierzchnię olej krotonowy, rozwija się stopniowo wiele nowotworów. Naniesienie na skórę jedynie oleju krotonowego (tzn. bez uprzedniego naniesienia benzo[a]pirenu) nie wywołuje nowotworów skóry. Wykonano wiele innych badań będących wariantami tego doświadczenia i wyciągnięto następujące wnioski: I) stadium kancerogenezy wywołane stosowaniem benzo[a]pirenu nazywane jest inicjacją; wydaje się, Ŝe jest ona osiągana szybko i jest nieodwracalna; przypuszcza sie, Ŝe stadium to związane jest z nieodwracalną modyfikacją DNA, wywołując jedną lub więcej muta-

cji. Dlatego benzo[cc]piren nazywany jest czynnikiem inicjującym; 2) drugie stadium kancerogenezy (trwające miesiące lub lata) jest rezultatem stosowania oleju krotonowego i nazywane jest promocją; olej krotonowy jest więc czynnikiem promocyjnym lub promotorem. Promotory nie są zdolne do wywołania inicjacji; 3) większość kancerogenów moŜe działać zarówno jako czynniki inicjujące, jak i promocyjne. DuŜa liczba związków chemicznych, włączając fenobarbital i sacharynę, moŜe działać jako promotory w róŜnych narządach. Aktywny składnik oleju krotonowego jest mieszaniną estrów forbołu. Najaktywniejszym estrem forbolu jest octan 12-0-tetradekanoy!oforbolu (TPA), który wywołuje wiele efektów. Najbardziej interesującym odkryciem było wykazanie, Ŝe kinaza białek C moŜe być receptorem dla TPA. Stymulacja aktywności tego enzymu wywołana interakcją z TPA moŜe spowodować fosforylację wielu białek błonowych, co z kolei moŜe prowadzić do zmian w transporcie i w innych funkcjach komórki. Ta waŜna obserwacja tłumaczy ścisły związek zachodzący między niektórymi promotorami nowotworowymi a procesami transmembranowej sygnalizacji (p. dyskusja o czynnikach wzrostowych, poniŜej). Wiele promotorów nowotworowych działa przez wywołanie zmian w ekspresji genowej. Szczegółowy mechanizm wyjaśniający sposób, w jaki promotory wpływają na transformację komórki będącej w stadium inicjacji w komórkę nowotworową, nie został jeszcze wyjaśniony. Główną ma kro molekułą w procesie kancerogenezy jest DNA DNA jest krytyczną makromolekułą docelową w procesie kancerogenezy. Następujące fakty potwierdzają ten wniosek: 1) komórki nowotworowe rodzą komórki nowotworowe, tj. zasadnicze zmiany odpowiedzialne za cechy nowotworowe przekazywane są z komórek matczynych na komórki pptomne; 2) zarówno promieniowanie, jak i chemiczne kancerogeny są zdolne do wywołania zmian mutacyjnych w DNA; 3) wiele komórek nowotworowych ma nieprawidłowe chromosomy; 4) doświadczenia opisujące transfekcję (p. poniŜej), wskazują, Ŝe oczyszczony DNA z komórek nowotworowych {onkogeny) moŜe transformować prawidłowe komórki w komórki nowotworowe lub potencjalnie nowotworowe. W kancerogenezie mogą jednak takŜe odgrywać role czynniki epjgenetyczne.

RAK, ONKOGENY 1 CZYNNIKI WZROSTOWE / 829

Niektóre DNA i RNA wirusy są rakotwórcze Onkogenne wirusy zawierają DNA lub RNA jako swój genom (tab. 61-4). Tu zostanie opisanych jedynie kilka najwaŜniejszych cech przedstawiciela tych dwóch klas. Tabela 61 -4. Niektóre waŜne wirusy nowotworowe Klasa

*

Przedstawiciele

DNA wirusy P a po va wirusy

Adenowirusy Wirusy herpes Hepadnawirus

Wirus poty oma SV40 wirus Wirus brodawczaka Adenowirusy 72, 18131 Wirus Epstein-Barr, Wirus herpes-simplex łyp 2 Wirus hepatitis B

RNA wirusy Retrowirus typ C

Retrowirus typ B

Wirusy mięsaka mysiego i białaczki, wirusy mięsaka ptasiego i białaczki, wirusy ludzkiej białaczki komórekT Wirus nowotworu gruczołu piersiowego myszy

Wirus polyoma i wirusy SV40 odegrały waŜną rolę w kształtowaniu się współczesnych poglądów na temat wirusowej onkogenezy. Oba są małymi wirusami (zawierają genom ok. 5 kb), a ich koliste genomy kodują tylko ok. 5—-6 białek. W określonych warunkach infekcja odpowiednich komórek tymi wirusami moŜe prowadzić do transformacji nowotworowej. W procesie tym uczestniczą specyficzne białka wirusowe. W przypadku SV40 białka te (często nazywane antygenami, poniewaŜ wykryto je metodami immunologicznymi) znane są jako T (duŜe T) oraz t (małe t), a w przypadku wirusa polyoma nazywa się je T, mid-T oraz t. Litera T odnosi się do faktu, Ŝe białka te po raz pierwszy wykryto w nowotworach (tumor). Sposób, w jaki białka te powodują transformację nowotworową, jest stale jeszcze badany; antygeny T wiąŜą się silnie z DNA i wywołują zmiany w ekspresji genowej. Białka te wywierają wiele kooperatywnych zjawisk, co sugeruje, Ŝe zmiany te muszą dotyczyć więcej niŜ jednej reakcji lub procesów, aby wywołać transformację.

Niektóre odmiany adenowirusów są zdolne do transformacji określonych komórek zwierzęcych. DuŜe zainteresowanie wywołał wirus Epsteina-Barr, gdyŜ jest on związany z chłoniakiem Burkitta i rakiem jamy nosowo-gardłowej u ludzi. Wirus opryszczki (herpes simplex) typu 2 uczestniczy w patogenezie raka szyjki macicy, a wirus zapalenia wątroby (hepatitbi) B moŜe być odpowiedzialny za niektóre przypadki raka wątroby u ludzi. Ze względu na fakt, Ŝe większa część wiedzy o onkogenach w ostatnich latach pochodzi z badań nad wirusami RNA, w dalszej dyskusji nad onkogenami często będzie o nich mowa.

W WYNIKU TRANSFORMACJI NOWOTWOROWEJ ZACHODZĄ ZMIANY ZARÓWNO MORFOLOGICZNE, JAK I BIOCHEMICZNE Gdy hodowle komórek zakaŜone są pewnymi onkogennymt wirusami, mogą one ulec transformacji nowotworowej. Najbardziej istotne zmiany morfologiczne i biochemiczne zachodzą przy transformacji opisanej w tab, 61-5. Zmiany te obejmują kształt komórki, ruchliwość, przyczepialność do ścianek naczynia hodowlanego, wzrost i wiele procesów biochemicznych. Są one interpretowane jako zmiany pierwotne powodujące przekształcenia ze stanu normalnego do stanu nowotworowego lub jako zmiany wtórne indukowane przez te pierwsze. Właściwość zrównania transformacji w przybliŜeniu z nabywaniem cech nowotworowych ma niezwykłą wagę w badaniach nad nowotworami. Jednak poszukiwanie zmian w komórkach powszechnie uznawanych za transformacje niekoniecznie oznacza, Ŝe takie komórki będą wykazywały takie same biologiczne właściwości jak komórki nowotworowe in vivo; muszą one bowiem wywołać nowotwór, gdy zostaną wprowadzone do odpowiedniego zwierzęcego organizmu biorcy.

ONKOGENY ODGRYWAJĄ ISTOTNĄ ROLĘ W KANCEROGENEZIE Onkogeny są genami zdolnymi do wywołania nowotworów. Ich odkrycie wywarto ogromny wpływ na badania podstawowych mechanizmów związanych z kancerogenezą. Onkogeny początkowo uznano za specyficzne geny wiru-

830 / ROZDZIAŁ 61 Tabela 61 -5. Niektóre zmiany wykazywane przez komórki w hodowlach sugerujące transformację nowotworową (np. po infekcji wirusem onkogennym). NajwaŜniejszym testem, dowodzącym zeztośliwienia komórek, jest zdolność komórek do wywołania nowotworu w warunkach in vivo Zmiany morfologiczne: transformowane komórki mają często znacznie bardziej zaokrąglone kształty niŜ komórki kontrolne Zwiększona gęstość komórek (utrata zdolności do hamowania wzrostu przez kontakt komórek): transformowane komórki często tworzą wielowarstwy, podczas gdy komórki kontrolne rosną w jednej warstwie Utrata przyczepia)ności: komórki transformowane mogą rosnąć bez przyczepiania się do powierzchni naczynia hodowlanego, a często mogą rosnąć w agarze Utrata zdolności zahamowania ruchu komórki wywołanego kontaktem z inną komórką: transformowane komórki rosną jedna na drugiej, podczas gdy prawidłowe zatrzymują swój ruch w momencie kontaktu między sobą Zmiana wielu procesów biochemicznych, w tym nasilenie glikolizy, zmiany na powierzchni komórek (np. zmiany w składzie glikoprotein lub glikosfingolipidów), a takŜe wydzielanie niektórych protęaz Zmiany w strukturach cytoszkieletowych, takich jak filamenty aktyny. Zmniejszone zapotrzebowanie na czynniki wzrostowe i często zwiększone wydzielanie pewnych czynników wzrostowych do otaczającego środowiska

sów wywołujących .{\pwotwory odpowiedzialnych za proces transformacji (wirusowe onkoge«¥). Onkogeny wirusa mięsaka Rousa. Analiza onkogenu wirusa mięsaka Rousa i produktu działania tego genu była szczególnie waŜna. Genom tego retrowirusa zawiera 4 geny o nazwach gag, poi, env i src. Zostało to pokazane schematycznie poi poniŜej. 9*9

env

src

Gen gag koduje grupę specyficznych antygenów wirusa, poi jest odpowiedzialny za odwrotną transkryptazę charakterystyczną dla retro-wirusów, zaś env za określone glikoproteiny otoczki wirusa. Wykazano,' Ŝe produktem genu src jest kina/a białkowo-tyrozynowa odpowie-

dzialna za transformację. Odkrycie to miało fundamentalne znaczenie. PozwoJiło bowiem na odkrycie specyficznego mechanizmu biochemicznego (tj. nienormalnej fosforylacji szeregu białek) mogącego wyjaśnić, przynajmniej częściowo, w jaki sposób wirus nowotworowy moŜe spowodować efekty plejotropowe w transformacji. Te krytyczne białka komórkowe, których nienormalna fosforylacja prawdopodobnie prowadzi do transformacji, są stale jeszcze badane. Jednym z nich jest winkulina, białko znalezione w obszarach kontaktu jednej komórki z drugą w foci (w skupiskach komórkowych). Nienormalna fosforylacja win ku liny w foci pomogła wytłumaczyć zaokrąglanie się komórek i ich mniejszą adhezję do podłoŜa i do siebie samych, co obserwuje się w procesie transformacji (tab. 61-5). Niektóre enzymy gliko liryczne wydają się być białkami docelowymi dla src kinazy bialkowo-tyrozynowej; wyjaśnia to, dlaczego transformowane komórki często wykazują zwiększoną szybkość glikolizy. Produkt działania src mógłby równieŜ katalizować fosforylację fosfatydyloinozytolu do fosfatydyloinozytolo mono- i di-fosforanu. Gdy fosfatydyloinozytolo-4,5-difosforan jest hydrolizo wany przez fosfolipaze C, wyzwalają się 2 wtórne związki: trifosforan inozytolu i diacyloglicerol (p, rozdz. 45). Pierwszy z tych związków uczestniczy w uwalnianiu wapnia z wewnątrzkomórkowych miejsc jego spichrzania (tj. z siateczki śródplazmatycznej). Diacyloglicerol pobudza aktywność związanej z błoną plazmatyczną kinazy białek C, która z kolei fosforyluje szereg białek, z których niektóre mogą być składnikami pomp jono wych. W szczególności zaproponowano, Ŝe łagodna alkalizacja komórki wywołana aktywacją systemu antyportowego Na+/H+ (p. rozdz. 42) moŜe odgrywać rolę w stymulowaniu mitozy. Dlatego teŜ produkt działania src moŜe oddziaływać na duŜą liczbę procesów komórkowych przez jego zdolność do fosfory Iowa nia szeregu białek i enzymów, jak równieŜ przez stymulowanie przebiegu syntezy poltfosfoinozytydów.

Kinazy btałkowo-tyrozynowe w komórce normalnej i transformowanej. Obserwacja, Ŝe wirus mięsaka Rousa zawiera kinazę białkowo-tyrozynowa wpłynęła znacznie na badania nad fosforyJacją tyrozyny. Obecnie wiadomo, Ŝe szereg normalnych komórek cechuje się aktywnością kinaz białko w o-tyrozynowych. Ilość fosfotyrozyny w większości nor-

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 831

malnych komórek jest mała, lecz zwykle zwiększa się w. komórkach transformowanych wirusem onkogennym zawierającym kinazę białkowo-tyrozyn ową, chociaŜ jego ilość jest stale jeszcze względnie mała i wynosi ok. I % całkowitej ilości fosfoaminokwasów (przede wszystkim fosfoseryny, fosfotreoniny i fosfotyrozyny). Niektóre receptory (np. naskórkowego czynnika wzrostowego, insuliny i czynnika wzrostowego płytek krwi), występujące zarówno w normalnych,, jak i transformowanych komórkach, wykazują aktywność kinaz białkowo-tyrozyn owych, która jest stymulowana po interakcji z jej Ugandami (p. dyskusja o czynnikach wzrostowych, poniŜej). Dlatego aktywności kinaz białkowo-tyrozyn owych odgrywają tak waŜną rolę w normalnych i transformowanych komórkach.

Onkogeny innych retro wiru sów. Do onkogenów wirusa mięsaka Rousa moŜna dodać ok. 20 następnych poznanych onkogenów innych retrowirusów. Prawie poiowa produktów działania tych onkogenów wirusowych to kinazy białek, najczęściej typu tyrozynowego. Niektóre onkogeny wirusowe wymienione są w tab. 61-6, razem z ich produktami. Podczas gdy niektóre z umieszczonych w wykazie kodują, kinazy białek, pozostałe kodują róŜne inne białka cechujące się interesującymi właściwościami biologicznymi. Produkt genu erb-B wiru-

sa ptasiej erytroblastozy jest skróconą postacią receptora dla naskórkowego czynnika wzrostowego, a produkt onkogenu sis wirusa mięsaka małpy (simian sarcoma virus — ssv) jest skróconym łańcuchem B czynnika wzrostowego płytek krwi. Produkt wirusowego onkogenu (fms) wyizolowanego z jednego z wirusów kociego mięsaka jest czynnikiem stymulującym formowanie kolonii przez makrofagi. Z drugiej strony produkt onkogenu myc wykryty w wirusach białaczki mielocytowej kurcząt jest białkiem wiąŜącym się z DNA, które moŜe kontrolować proces mitozy. Produkt onkogenu ras wirusa mięsaka mysiego wiąŜe GTP, ma aktywność GTP-azy i wydaje się być spokrewniony z białkami, które regulują aktywność waŜnego enzymu błon plazmatycznych jakim jest cyklaza adenylanowa (p. rozdŜ^S). Protoonkogeny. Głównym problemem podnoszonym przy odkryciu wirusowych onkogenów jest ich pochodzenie. Dzięki technice hybrydyzacji kwasów nukleinowych (p. rozdz, 36) wykazano, Ŝe normalne komórki mają sekwencje DNA podobne, jeŜeli nie identyczne, do tych jakie występują w wirusowych onkogenach. Widocznie wirusy wbudowywują geny komórkowe do swoich genomów w czasie przechodzenia przez komórki. Przechowywanie takich genów w ich genomach wskazuje, Ŝe muszą one wiązać się z pewnymi korzyściami dla tak

Tabela 61-6. Wybrane onkogeny retrowirusów Onkogen

Retro wirus

Pochodzenie

Produkt onkogenu

Lokalizacja s u

b komo rko wa Wirus białaczki mysiej AbeJsona Wirus ptasiej erytroblastozy

Mysz

Kinaza białkowo-tyrozyn owa Skrócony receptor EGF

Błona plazmatyczna Błona plazmatyczna

fes

Wirus kociego mięsaka

Kot

Kinaza biafkowo-tyrozyn owa

Błona plazmatyczna

fos

Mysz Kurczę

? Białko wiąŜące DNA

Jądro

myc

Wirus mięsaka myszy Wirus 29 białaczki mielocytowej

sis

Wirus mięsaka małpy

Małpa

Skrócony PDGF Oańcuch B)

Błony (wydzielanie?)

src

Wirus mięsaka Rousa

Kurczę

Kinaza biafkowo-tyrozyn owa

Błona plazmatyczna

abl

erb-B

Kurczę

Jądro

Tyr-tyrozyna; EGF - naskórkowy czynnik wzrostowy; PDGF - czynnik wzrostowy płytek krwi Według Franks L.M., Teich N.M. (red.): Introduction to the Cellularand Motacular Biology of Cancer. Oxford Univ. Press, 1986, za zezwoleniem, zmodyfikowane.

S32 / ROZDZIAŁ 61

ukształtowanego wirusa, prawdopodobnie związanymi ze zmienionymi właściwościami wzrostu transformowanych komórek. Fakt stwierdzenia sekwencji homologicznych w licznych rodzajach komórek eukariotycznych sugeruje, Ŝe były one waŜnymi składnikami normalnych komórek. Dodatkowo cząsteczki mRNA i białka powstałe z tych normalnych sekwencji wykryto na róŜnych etapach ich rozwoju lub ich cyklu Ŝyciowego. Takie geny, obecne w normalnych komórkach, zostały uznane za protoonkogeny, przy czym zakłada się, Ŝe ich produkty odgrywają waŜną rolę w normalnym róŜnicowaniu i w innych procesach komórkowych.

przypadku regulacja ich ekspresji moŜe nie być prawidłowa w komórkach nowotworowych. Skróty uŜywane do określenia onkogenów komórkowych i wirusowych. Skróty c-onc (cellular oncogene, np. c-raś) uŜywane są dla zaznaczenia, Ŝe onkogen obecny jest w komórce nowotworowej. Potencjalne onkogeny, obecne w prawidłowych komórkach, tj. ich proto-onkogen — mogą w sposób prosty być nazwane odpowiednio c-onc protoonkogenami (np. c-ras proto-onkogen). Podobnie wirusowe onkogeny oznaczane są jako \-onc (viral oncogene, np. v-ras), a ich pro to-onkogeny jako v-onc proto-onkogen (np. v-ras proto-onkogen).

Onkogeny z komórek nowotworowych. Doświadczenia, w których uŜyto DNA wyizolowanego z nowotworów, takŜe dostarczyły dowodów na istnienie onkogenów. Metoda uŜyta do wykrywania takich komórkowych onkogenów nosi nazwę transferu genu lub transfekcji DNA. W metodzie tej wykorzystuje się fakt posiadania przez określone geny obecne w nowotworach zdolności do transformacji „normalnych" komórek w hodowlach. DNA izoluje się z komórek nowotworowych i dodaje do komórek biorców w hodowli, będących często linia mysich fibroblastów znanych jako komórki linii NIH/3T3. DNA z komórek nowotworowych jest wytrącany fosforanem wapnia (w celu ułatwienia endocytozy) i dodany do komórek N1H/3T3 w hodowli komórkowej. Komórki obserwuje się pod mikroskopem przez okres 1—2 tygodni, tj. czas potrzebny do wytworzenia kolonii komórek transformowanych. JeŜeli transformacja zachodzi, komórki NIH/3T3 zmieniają swój kształt — z płaskich do zaokrąglonych postaci, które rosną w charakterystycznych koloniach. Procedurę tę powtarza się kilkakrotnie, przy czym uŜywa się DNA z komórek transformowanych, co prowadzi do zmniejszenia się ilości DNA nie uczestniczącego w transformacji, lecz który przeniesiono w wyniku transfekcji. Onkogenny DNA moŜna identyfikować (np. metodą southern blotting, uŜywając odpowiedniej sondy dla danego specyficznego genu — p. rozdz. 36). Tą metodą zidentyfikowano w przybliŜeniu ok, 20 onkogenów, z których wiele odnosi się do onkogenu ras wirusa miesaka mysiego. Takie komórkowe onkogeny są albo identyczne z normalnymi genami, albo wykazują bardzo niewielkie róŜnice strukturalne w stosunku do swoich normalnych odpowiedników (p. niŜej). W pierwszym

Protoonkogeny są aktywowane do onkogenów w róŜny sposób Zostanie tu omówionych 5 mechanizmów, które zmieniają ekspresję lub strukturę protoonkogenów, a tym samym uczestniczą w ich przemianie w onkogeny. Upraszczając, proces, w którym transkrypcja jest wzmoŜona (od zera lub względnie niewielkiego poziomu), określany jest mianem aktywacji. Znajomość mechanizmów związanych z aktywacją jest istotna dla zrozumienia współczesnych poglądów dotyczących kancerogenezy. Insercja promotora. Niektóre retrowirusy nie mają onkogenów (np. wirus małpiej białaczki), ale zdolne są do wywołania nowotworu po dłuŜszym czasie — miesiącach raczej niŜ dniach—w porównaniu do tych, które mają onkogeny. Podobnie jak przy innych retrowirusach, gdy te wirusy zakaŜają komórki, kopia DNA (cDNA) tworzona z ich genomu RNA syntetyzowana jest dzięki odwrotnej trans kry ptazie, a cDN A jest wbudowywany do genomu gospodarza. Ten zintegrowany dwuniciowy cDNA nazywa się prowirusem. Kopie cDNA retrowirusów są oflankowane na obu końcach przez sekwencje nazywane LTR (long terminal repeat), podobnie jak niektóre transpozony („jumping genes") znalezione w bakteriach i w roślinach (p. rozdz. 39). Sekwencje LTR okazały się istotne w mechanizmie prowirusowej intergracji, gdyŜ mogą one działać jako promotory transkrypcji (p. rozdz. 40). W następstwie infekcji limfocytów B kurcząt przez pewne wirusy białaczki ptasiej prowirusy zostają wbudowane w pobliŜu genu myc. Gen myc jest aktywowany przez przylegającą powyŜej niego sekwencję LTR działającą jako promotor. W wyniku tej aktywacji dochodzi zarówno do

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 833 A

Prowirus LTR myc

LTR

i

myc

myc mRNA Ryc. 61-3. Schematyczne przedstawienie, w jaki sposób insercja promotora moŜe aktywować protoonkogen. A — normalny chromosom kurczęcia mający nieaktywny gen myc. 8 — wirus białaczki ptasiej jest integrowany w chromosomie w postaci prowirusowej, przylegającej do genu myc. Znajdująca stę z jego prawej strony dtuga końcowa powtarzalna sekwencja (LTR — long terminal repeat), zawierająca silny promotor, leŜy bezpośrednio powyŜej genu myc i aktywuje ten gen, wynikiem czego jest transkrypcja myc mRNA. Dla uproszczenia, na rycinie jest przedstawiona tylko jedna nić DNA, inne szczegóły zostały opuszczone.

myc

LTR

Prcwirus I i LTR

myc

— myc mRNA Ryc. 61-4. Schemat pokazujący, w jaki sposób insercja sekwencji wspomagających moŜe aktywować protoonkogen. A— normalny chromosom kurczęcia zawierający nieaktywny gen myc. B — wirus małpiej białaczki został zintegrowany w chromosomie w jego prowirusowej postaci, przylegając do genu myc. Jednak w tym przypadku miejsce integracji jest tuŜ poniŜej genu myc i nie moŜe ono działać jako promotor (fyc. 61 -6), Zamiast tego, określona prowirusowa sekwencja działa jako czynnik wspomagający prowadząc do aktywacji połoŜonego wyŜej genu myc i do jego transkrypcji. Dla uproszczenia na rycinie został przedstawiony tylko jeden łańcuch DNA, inne szczegóły zostały pominięte.

transkrypcji, w której powstaje myc mRNA, jak i do jego translacji z wytworzeniem odpowiedniego produktu (ryc. 61-3). Rezultatem tych procesów jest nowotwór komórek B, chociaŜ dokładna rola produktów genu myc w tym procesie nie jest jasna. Podobne zjawiska zachodzą po infekcji róŜnych komórek innymi retrowirusami.

Insercja sekwencji wzmacniających transkrypcję. W niektórych przypadkach prowirus jest wbudowany poniŜej genu myc, lub teŜ powyŜej niego, lecz w postaci odwróconej; pomimo tego gen myc zostaje aktywowany (ryc. 61-4). Taka aktywacja nie moŜe być związana z insercja promotora, gdyŜ sekwencja promotora musi się znajdować powyŜej genu, którego 53

Biochemia

transkrypcje wzmaga i być ustawiona we wiaściwym kierunku 5' do V, Zamiast tego, uczestniczą w tym procesie sekwencje wzmacniające (p. rozdz. 40 i 42) obecne w sekwencjach LTR omawianych retro wirusów. Opisane powyŜej 2 mechanizmy, insercje promotora i sekwencji wzmacniających transkrypcje, działają wspólnie w procesie wirusowej kancerogenezy. Prawdopodobnie biorą w niej udział takŜe inne protoonkogeny niŜ myc.

Transłokacje

chromosomalne.

Jak

wspomniano wyŜej, wiele komórek nowotworowych cechuje się nieprawidłowościami chromosomowymi. Jednym z typów zmian chromosomowych w komórkach nowotworowych jest

834 / ROZDZIAŁ 61

translokacja. Podstawą translokacji jest fakt, Ŝe fragment jednego chromosomu moŜe zostać oderwany i potem przyłączony do drugiego chromosomu. JeŜeli drugi chromosom oddaje materiał pierwszemu, jest to translokacja wzajemna (reciprocal). Charakterystyczne translokacje stwierdza się w wielu komórkach nowotworowych. Przykładem klinicznie waŜnej translokacji jest chromosom Philadelphia, który stwierdza się w przewlekłej białaczce szpikowej. Translokacja obejmuje tu chromosomy 9 i 22.

Chłoniak Burkitta jest szybko rosnącym nowotworem rozwijającym się z ludzkich limfocytów B. W niektórych przypadkach tego nowotworu wykryto wzajemną translokację genów (ryc. 61-5). Wyjaśniła ona mechanizmy aktywacji potencjalnych onkogenów komórkowych. W procesie tym uczestniczą chromosomy 8 i 14. Segment chromosomu 8, który odłamuje się i przechodzi do chromosomu 14, zawiera gen myc. Jak pokazano na ryc. 61-6, transpozycja przesuwa uprzednio nieaktywny gen myc pod

-ł-Pęknięcia

14

14

-Geny cięŜkiego łańcucha H -Pęknięcie

■myc

Ryc. 61-5. Schemat obustronnej translokacjj występującej w chloniakach Burkitta, Chromosomami uczestniczącymi w tym procesie są chromosomy 8 i 14. Segment znajdujący się na końcu ramienia q chromosomu 8 odłamuje się i przemieszcza do chromosomu 14. Odwrotny proces przemieszcza mały fragment z ramienia q chromosomu 14 na chromosom 8. Gen myc zawarty jest w małym fragmencie chromosomu 8, który został przeniesiony do chromosomu 14; jest on umieszczony bezpośrednio przy genach przepisujących cięŜkie iańcuchy immunoglobuiin i sam przez to ulega aktywacji, ____________

Geny cięŜkiego łańcucha H

mRNA

Geny cięŜkiego łańcucha H

myc

mRJMA

R yc. 61-6. S c hem at pr z eds t a w i a, w j ak i s pos ób t rans l ok ac j a z wi ą zan a z c hl o ni ak i em B urk it t a m oŜe ak t yw o w a ć pr ot o onk og e n my c . A — m ał y I r a gm en t c h r om o s om u 14 t u Ŝ p r z e d t r an s l ok ac j a . P ok a z a n y s egm ent z awi era ge n y k oduj ąc e regi on y c i ę Ŝk i c h ł ańc uc hów i m m unogl obul i n. B — w w yni k u t ra ns l ok ac j i upr zed ni o ni e ak t ywn y gen f ny c zn al a zł s i ę p od w pł yw em s ek we nc j i ws p om agaj ąc yc h w g eni e k oduj ąc ym ci ęŜk i e ł ańc uch y immunogl obul i n i s t ał si ę przez t o ak t ywn y, c o powoduj e t ransk r ypc j ę. Dl a upros zc zeni a na r yc i ni e zos t ał pr ze ds t a wi on y t yl k o j eden z d w óc h ł ańc uc hó w D N A , i nne s zc z egół y zos t ał y' po m i ni ęt e.

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 835

wpływ sekwencji wzmacniających transkrypcję genów kodujących cięŜkie łańcuchy immunoglobulin. Taka translokacja powoduje aktywację transkrypcji genu myc. Widocznie synteza znacznie zwiększonych ilości białka wiąŜącego DNA, kodowanego przez gen myc, „napędza" lub „zmusza" komórki do przekształceń w kierunku złośliwie ni a, być moŜe wpływając na regulacje mitozy. Mechanizm ten jest podobny do insercji sekwencji wzmacniających transkrypcję z tym wyjątkiem, Ŝe raczej chromosomalna translokacja niŜ integracja prowirusa sprawia, Ŝe protoonkogen (np. myc) dostaje się pod wpływem sekwencji wzmacniających transkrypcję. Amplifikacja genu. Amplifikacja niektórych genów (p. rozdz. 39) została wykryta w wielu nowotworach. Jedną z metod stymulacji amplifikacji genów w nowotworach jest podanie leku przeciwnowotworowego metotreksatu, który jest inhibitorem enzymu reduktazy dihydrofolianowej. Komórki nowotworowe mogą stać się odporne na działanie tego leku. Podstawą tego zjawiska jest fakt, Ŝe gen reduktazy dihydrofolianowej ulega amplifikacji, co powoduje wzrost aktywności tego enzymu (aŜ do 400 razy). Te zwielokrotnione kopie genów, których długość dochodzi nawet do 1000 kb lub więcej moŜna wykryć jako homogennie barwiące się regiony w określonych chromosomach. Alternatywnie są one wykrywane jako chromosomopodobne twory określane jako chromosomy DM (double-minute), które są minichromosomami pozbawionymi centromerów. Ta ścisła zaleŜność homogennie barwiących się regionów od obecności chromosomów DM jest stale jeszcze przedmiotem badań. Istnieją dowody sugerujące, Ŝe zwiększone ilości produktów określonych onkogenów (takich jak c-ras) wytworzone przez amplifikację genów mogą odgrywać rolę w przekształcaniu komórek nowotworowych w komórki bardziej złośliwe (p. dyskusja o progresji nowotworów, poniŜej). Mutacje punktowe. Onkogen v-ras został wykryty w pewnych retro wirusach mysich i szczurzych. Jego produkt, białko p21 o m.cz. 21000 jest pokrewne białkom G, które modulują aktywność cyklazy adenylanowej (p. powyŜej i rozdz. 45) i dlatego odgrywają główną rolę w odpowiedzi komórkowej na wiele hormonów i leków. Analiza sekwencji DNA c-ras proto-onkogenu z normalnych komórek ludzkich i z c-ras onkogenu z raka pęcherza ludzkiego wykazała, Ŝe róŜnią się one tylko jedną zasadą,

co powoduje zmianę jednego aminokwasu w pozycji 12 białka p21. Ten intrygujący wynik został potwierdzony analizą c-ras genów innych ludzkich nowotworów. W kaŜdym przypadku wynik był zgodny; geny izolowane z nowotworów wykazywały tylko jedną mutację punktową w porównaniu do c-ras proto-onkogenów z prawidłowych komórek. Pozycja mutacji czasem się zmienia, tak Ŝe obserwowano równieŜ podstawienie innych aminokwasów. Mutacje w białku p21 wpływają na jego konformację i zmniejszają jego aktywność jako GTP-azy. Mniejsza aktywność GTP-azy moŜe być spowodowana przewlekłą stymulacją aktywności cyklazy adenylanowej, która normalnie jest niewielka, gdy GDP powstaje z GTP (p. rozdz. 45). To pobudzenie aktywności cyklazy adenylanowej moŜe spowodować wiefe zmian w metabolizmie komórki wywołanych zwiększoną ilością cAMP wpływającego na aktywność wielu zaleŜnych od cAMP kinaz białek. Te zjawiska mogą towarzyszyć przechylaniu się równowagi metabolizmu komórkowego w kierunku stanu sprzyjającemu transformacji lub jej podtrzymywaniu.

Uwagi ogólne o aktywacji onkogenów. Z 5 mechanizmów opisanych powyŜej 4 pierwsze (insercja promotora, insercja sekwencji wzmacniających transkrypcję, translokacja chromosomu i amplifikacja genowa) wymagają zwiększenia ilości produktu danego onkogenu, co związane jest ze zwiększoną transkrypcją, lecz nie jest związane ze zmianami w strukturze produktu wytworzonego przez onkogen. Dlatego teŜ, być moŜe, zwiększona ilość produktu onkogenu moŜe być wystarczająca do pchnięcia komórki w kierunku zezłośliwienia. Piąty mechanizm, mutacja punktowa, wymaga zmiany w strukturze produktu powstałego z onkogenu, lecz niekoniecznie związany jest ze zmianą ilości tego produktu. Te fakty wskazują, Ŝe obecność strukturalnie nienormalnego białka pełniącego funkcję głównego regulatora w komórce moŜe być wystarczającą przyczyną przesunięcia równowagi w kierunku procesu nowotworowego. Oceniając rolę onkogenów w patogenezie nowotworów, naleŜy przypomnieć, Ŝe onkogeny wyizolowano jedynie z ok. 15% ludzkich nowotworów. Jest prawdopodobne, Ŝe ich aktywacja w co najmniej kilku przypadkach moŜe być jedynie wtórnym zjawiskiem, związanym z transformacją, a nie czynnikiem przyczynowym. Ich udział w chemicznie indukowanych nowotworach doświadczalnych jest dziedziną,

836 / ROZDZIAŁ 61

która dopiero się rozwija. Ostatnio wykazano jednak, Ŝe aktywacja c-ras w raku gruczołu piersiowego szczura wywołanego nitrozometyiomocznikiem jest związana w oczywisty sposób ze swoistą mutacją G-*A, co wskazuje, Ŝe onkogeny prawdopodobnie uczestniczą w chemicznej kancerogenezie. PoniewaŜ w badaniach tych uŜyto jedynie pojedynczej dawki nitrozometylomocznika (bez Ŝadnego promotora) wydaje się, Ŝe opisana wyŜej mutacja moŜe być

waŜnym czynnikiem chemicznej kancerogenezy na etapie jej inicjacji. Potwierdzenie prawdopodobnego udziału onkogenów w zjawiskach inicjacji, promocji, progresji nowotworowej i w powstawaniu przerzutów wymaga jeszcze wielu badań.

Mechanizmy działania onkogenów. PoniŜej opisano 3 mechanizmy, za pośrednictwem których produkty onkogenów mogą stymulować wzrost (ryc. 61-7): 1) mogą one działać S1S

Czynnik wzrostowy

Płyn zewn ątrz ko m ń rkowy

erb-B

Błona plazm styczna

Dyla plaŜ ma

Prostaglandyny Leukotrieny

Ca1*

DNA Jądro

Białka związane z DNA

t myc

Ryc. 61-7. Schemat przedstawia mechanizmy, w wyniku działania których produkty określonych onkogenów mogą zmienić metabolizm komórkowy i tym samym stymulować wzrost. Cykliczny AM P moŜe wpływać na wieie procesów komórkowych aktywując zaleŜne od cAMP kinazy białek. Kinaza białkowo-tyrozy nowa i kinaza C białek mogą wpływać na aktywność wielu białek docelowych. Jony wapnia wywierają wiele elektów komórkowych podobnie jak prostaglandyny i leukotrieny wytworzone z kwasu arachidonowego. R — receptor, G — białko G, AC — cyklaza adenylanowa, cAMP — cykliczny AMP. Pl — fosfatydyioinozytol, PKC — kinaza C białek, PTK — kinaza białkowo-tyrozynowa, IP a — inozytolo-trifosforan, DAG — diacyfoglicerol, ER — siateczka śródplazmatyczna.

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 837 na główne wewnątrzkomórkowe szlaki metaboliczne uczestniczące w kontroli wzrostu, uniezaleŜ-

niając je od egzogennego czynnika stymulującego. Odpowiednimi przykładami (opisanymi powyŜej) są: produkt src działający jako kinaza białko w o-tyrozy nowa, produkt rai- działający jako stymulator aktywności cykłazy adenylanowej i produkt myc działający jako białko wiąŜące DNA. KaŜdy z nich moŜe wpływać na kontroJę mitozy, zaś pierwsze dwa przez zjawiska związane z fosfory lacją głównych białek regulacyjnych; trzeba przyznać, Ŝe wiedza o wzroście komórki jest niedostateczna, szczególnie w zakresie molekularnych aspektów regulacji mitozy, nawet w komórkach prawidłowych; 2) produkty onkogeuów mogą imitować działanie polipeptydowego czynnika wzrostowego lub 3) imitować swoisty receptor związany z jakimś czyn-

nikiem wzrostowym (p. poniŜej). Badane sa takŜe inne mechanizmy pobudzania wzrostu przez onkogeny.

POLIPEPTYDpWE CZYNNIKI WZROSTOWE SĄ MITOGENNE Badania naci czynnikami wzrostowymi naleŜą do jednej z najszybciej rozwijających się dziedzin we współczesnych naukach biomedycznych. Wyizolowano i częściowo scharakteryzowano wiele róŜnych czynników (tab. 61-7). Do niedawna tylko niewielkie ilości większości czynników wzrostowych były dostępne dla badań. Dziś jednak geny dla większości czynników wzrostowych zostały sklonowane, potwierdzając ich róŜnorodność i umoŜliwiając uzyskiwanie ich w ilościach praktycznie uŜytecznych dzięki technice rekombinacji DNA. Znane dziś czynniki wzrostowe działają na wiele róŜnych rodzajów komórek, ną.na komórki krwi, układ nerwowy, tkanki mezehchymalne i nabłonkowe. Wywołują efekt mitogenny w komórkach docelowych, chociaŜ do wykazania takiego działania muszą być spełnione specjalne wa-

Tabela 61-7. Niektóre polipeptydowe czynniki wzrostowe* Czynnik wzrostowy Pochodzenie

Funkcja

Naskórkowy czynnik wzrostowy <EGF)

Slinianki myszy

Stymuluje wzrost wielu naskórkowych i nabłonkowych komórek

Erytro poety na

Nerka, mocz

Reguluje rozwój macierzystych komórek erytrocytów

Insulinopodobne czynniki wzrostowe 1 i II (IGF-I i IGF-II)

Surowica

Stymulują wbudowywanie siarczanu do chrząstki, są mitogenne dla chondrocytów i wywołują insulinopodobne efekty w wielu komórkach

lnterleukina-1 (IL-1)

Płyn po hodowlany (conditioned media)

Stymuluje produkcję IL-2

lnterleukina-2 (IL-2)

Płyn pohodowlany (conditioned media)

Stymuluje wzrost komórek T

Czynnik wzrostowy komórek nerwowych (NGF)

Mysie slinianki

Tropowe efekty na sympatyczne i niektóre sensoryczne neurony

Czynnik wzrostowy płytek krwi (POGF)

Płytki krwi

Stymuluje wzrost komórek mezynchymalnych i glejowych

Transformujący czynnik wzrostowy {TGF-<x)

Płyn pohodowlany {conditioned media) komórek transformowanych tub nowotworowych

Jest podobny do EGF

Transformujący czynnik wzrostowy (TGF-J3)

Nerka, płytki

Wywiera zarówno stymulujący, jak i hamujący wpływ na niektóre komórki

* Według: Franks L (W., Teich N. M, {red.): tntroduction to the celtuiarandMolecutarBiology otCancst, Oxford Univ, Press, 1986, za zezwoleniem, zmodyfikowane.

838 / ROZDZIAŁ 61

nmki, jak np. pozbawienie komórek w hodowli surowicy, aby stały się „spokojne" (nieruchome) przed eksponowaniem ich na czynnik wzrostowy. Czynnik wzrostowy płytek krwi (PDGF) uwolniony z ziarnistości płytek odgrywa prawdopodobnie rolę w normalnym gojeniu się ran. RóŜne czynniki wzrostowe wydają się odgrywać główną rolę w regulacji róŜnicowania się komórek macierzystych układu krwiotwórczego w kierunku róŜnego rodzaju dojrzałych komórek tego układu. Istnieją takŜe czynniki hamujące wzrost (np. transformujący czynnik wzrostowy TGF-P moŜe hamować wzrost określonych komórek). Dlatego teŜ przewlekła ekspozycja na zwiększające się ilości czynnika wzrostowego lub na malejące ilości czynnika hamującego wzrost moŜe zmienić równowagę wzrostu komórkowego. Czynniki wzrostowe działają endokrynnie, parakrynnie lub autokrynnie Czynniki wzrostowe mogą działać 3 ogólnymi drogami (p. takŜe rozdz. 44): 1) ich efekty mogą być endokrynne, tj. podobne do działania hormonów; mogą one być syntetyzowane gdziekolwiek w organizmie i przemieszczać się drogą krąŜenia do komórek docelowych; 2) mogą one być syntetyzowane w określonych komórkach, po czym są wydzielane i działają na komórki sąsiednie; jednak komórki syntetyzujące takie czynniki wzrostowe nie są przez nie atakowane, poniewaŜ brakuje w nich odpowiednich receptorów; ten rodzaj działania nosi nazwę parakrynnego; 3) niektóre czynniki wzrostowe mogą działać na te same komórki, które je syntetyzują. Ten trzeci rodzaj działania nosi nazwę autokrynnego. Dla przykładu czynnik wzrostowy jest wydzielany, a potem przyłączany do tej samej komórki, w której powstał, przy załoŜeniu, Ŝe posiada ona odpowiednie receptory. Jest równieŜ moŜliwe, Ŝe pewna ilość takiego czynnika nie jest w ogóle wydzielana, działając bezpośrednio w obrębie komórki. Czynniki wzrostowe wpływają na mitozę dzięki przezbłonowej transdukcji sygnałów Stosunkowo niewiele wiadomo o tym, jak czynniki wzrostowe działają na poziomie molekularnym. Podobnie jak hormony polipeptydowe (p, rozdz. 45), muszą one przekazać posłanie poprzez błonę plazmatyczną do wnętrza komórki (przezbłotiowa transdukcja sygnału). W przy-

padku czynników wzrostowych posłanie to będzie oddziaływało na jeden lub więcej procesów związanych z mitozą. Większość czynników wzrostowych posiada receptory białkowe o wysokim powinowactwie w błonach plazmatycznych komórek odbierających posianie. Geny receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i insuliny zostały sklonowane, opracowano takŜe modele ich struktury. Mają one krótkie segmenty przezbłonowe oraz zewnętrzne i cytoplazmatyczne domeny o róŜnych długościach. Ugandy wiąŜą się do zewnętrznych domen. Wiele receptorów (np. dla EGF, insuliny czy PDGF) ma aktywność kinaz białkowo-tyrozynowych, przypominających produkt genu-src (p. wyŜej). Ta aktywność kinazy zlokalizowana w cytoplazmatycznych domenach powoduje autofosforylację białka receptorowego i takŜe fosforyluje inne białka docelowe. Kompleksy receptor-ligand ulegają endocytozie w opłaszczonych pęcherzykach (p. receptor LDL, rozdz. 27); nie wyjaśniono jeszcze, czy receptory te ponownie wracają do powierzchni komórki. Szczegółowa sekwencja wydarzeń związana z przezbłonowym przekazywaniem sygnałów jest stale jeszcze badana i jest róŜna dla róŜnych czynników. Zostanie ona opisana na przykładzie PDGF. Po ekspozycji komórek na PDGF, pobudzana jest fosfolipaza, po czym następuje hydroliza fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanu z wytworzeniem inozytolo-trisfosforanu i diacyloglicerolu (p, \-src, powyŜej i ryc. 44-7). Te dwa wtórne przekaźniki mogą odpowiednio spowodować wewnątrzkomórkowe uwolnienie jonów wapnia i stymulować aktywność kinazy białek C przez co oddziałują na wiele reakcji komórkowych. Kolejna hydroliza diacyloglicerolu przez fosfolipazę A2 uwalniając kwas arachidonowy moŜe równieŜ spowodować produkcję prostaglandyn i leukotrienów, które same przez się mogą wywołać wiele efektów biologicznych (p. rozdz. 24). Eksponowanie komórek na PDGF moŜe wywołać szybką (minuty do 1-2 godzin) aktywację niektórych komórkowych proto-onkogenów (np. c-myc i c-fos). Wydaje się prawdopodobne, Ŝe aktywacja genów, niezaleŜnie od tego, czy są to geny normalne czy protoonkogeny, uczestniczy w mechanizmie działania większości czynników wzrostowych.

RAK, ONKOGENY I CZYNNIK) WZROSTOWE / 839

Istnieją róŜne rodzaje interakcji między czynnikami wzrostowymi a onkogenami Produkty róŜnych onkogenów są albo czynnikami wzrostowymi, albo częściami receptorów dla czynników wzrostowych (tab. 61-6). Łańcuch B czynnika PDGF zawiera 109 aminokwasów. Wydaje się prawdopodobne, Ŝe łańcuch B jest biologicznie aktywny jako homodimer bez udziału łańcucha A. Odkrycie, Ŝe v-sis koduje 100 ze 109 aminokwasów łańcucha B czynnika PDGF ujawniało występowanie bezpośredniej zaleŜności między onkogenami a czynnikami wzrostowymi. To takŜe sugeruje, Ŝe autokrynna stymulacja przez PDGF — stanowiąc ciągły bodziec mitogenny — moŜe być waŜnym czynnikiem w mechanizmie transformacji komórek przez v~sis. Rzeczywiście, wiele komórek nowotworowych hodowanych w kulturach, wykazuje zdolność wydzielania czynników wzrostowych do otaczającego je środowiska, a takŜe ma receptory dla tych cząsteczek. Analiza sekwencyjna v-erb-B wykazała, Ŝe koduje on skróconą postać receptora dla EGF, w którym znaczna cześć zewnętrznych domen została pominięta, lecz zachowana została aktywność kinazy białkowo-tyrozynowej. Sugeruje to, Ŝe nienormalna postać receptora EGF kodowana przez \-erb-B moŜe być stale aktywna} jeśli obecna jest w komórkach, symulując obecność receptora związanego ze swoim czynnikiem wzrostowym. Jak w przypadku autokrynnej stymulacji wywołanej przez czynnik PDGF, moŜe to stanowić ciągły mitogenny sygnał „przeprowadzający" komórkę do stanu transformowanego. Transformujący czynnik wzrostowy (TGF-P) początkowo uwaŜano za pozytywny czynnik wzrostowy, gdyŜ zmuszał on fibroblasty do zachowywania się w taki sposób, jak gdyby były one transformowane. Obecnie wiadomo, Ŝe TGF-P hamuje wzrost większości komórek z wyjątkiem fibroblastów. Hamuje on równieŜ wzrost komórek nerki małpiej syntetyzujących ten hormon. TGF-fS moŜe aktywować gen sis w fibroblastach. Nie wiadomo jeszcze, w jaki sposób wywołuje on efekt hamujący na inne komórki. Jak zaraz się dowiemy, istnieją inne dowody na to, Ŝe określone geny kodują produkty, które opóźniają wzrost komórki oraz, Ŝe istnieją geny hamujące powstawanie nowotworów. Tak więc kontrola wzrostu komórki jest bardzo złoŜona. Uczestniczą w niej bowiem

zarówno pozytywny jak i negatywne czynniki regulujące. W PEWNYCH RODZAJACH NOWOTWORÓW WAśNA JEST UTRATA GENÓW HAMUJĄCYCH WZROST (ANTY-ONKOGENÓW) Ostatnio uznano, Ŝe geny inne niŜ onkogeny odgrywają istotną rolę w wywoływaniu co najmniej kilku rodzajów nowotworów. Są to geny hamujące wzrost (growth suppresor genes). Geny te działają w odmienny sposób niŜ onkogeny, gdyŜ utrata tych genów supresorowych powodu-

je zanik określonych mechanizmów kontroli wzrostu. WaŜnym modelem dla zrozumienia działania takich genów jest siatkówczak (retinoblastoma). Retinoblasty są prekursorami komórek czopków siatkówki będących fotoreceptorowymi komórkami siatkówki. Cytologiczne analizy chromosomów ludzkiego siatkowczaka wykazały, Ŝe często obserwuje się w nim brak długiego ramienia chromosomu 13. To sugeruje, Ŝe doszło do utraty genu o istotnym znaczeniu w tej części chromosomu 13. Gen ten nazywano genem Rb. Przypuszcza się, Ŝe produkt tego genu wykazuje właściwości hamowania wzrostu w normalnych komórkach. Właśnie tego genu brak w siatkówczaku. Genetyczne badania wykazały, Ŝe do tego, aby powstał nowotwór, muszą zostać inaktywowanc obie kopie genu Rb.

Ostatnio okazało się, Ŝe być moŜe istnieje dość znaczna liczba genów, których produkty działają jako ujemne regulatory wzrostu komórki i obie kopie tych genów muszą być inaktywowane, aby powstał nowotwór. Takie geny hamujące wzrost nazywa się takŜe anty-onkogenami lub genami hamującymi wzrost nowotworu

(tumor-suppressing genes). Utratę anty-onkogenów uznano juŜ za istotny czynnik w patogenezie jednego z rodzajów nowotworów gruczołu piersiowego, nowotworu Wilmsa w nerce i raka drobnokomórkowego płuc. Ostatnio udało się sklonować normalny gen Rb, dzięki czemu będzie moŜliwa dokładna analiza produktu tego genu. Inne badania sugerują, Ŝe produkt genu Rb zlokalizowany jest w jądrze i Ŝe moŜe on działać jako czynnik modulujący ekspresję genów. Poszukiwanie anty-onkogenów i identyfikacja sposobów ich działania jest wielkim osiągnięciem współczesnych badań nad rakiem. Z terapeutycznego punktu widzenia pojawia się

840 / ROZDZIAŁ 61

podniecająca moŜliwość, Ŝe wprowadzenie normalnych chromosomów kodujących czynniki hamujące wzrost do określonych komórek nowotworowych mogłoby skorygować ich zmienioną szybkość wzrostu.

Tabela 61-8. Zmiany biochemiczne często wykrywane w szybko rosnących komórkach nowotworowych Zwiększona aktywność reduktazy nukleotydowej Zwiększona synteza RNA i DNA Zmniejszony katabolizm pirymidyn Nasilona glikoliza tlenowa i

ZŁOSLIWIENIE KOMÓREK NOWOTWOROWYCH WYDAJE SIĘ POSTĘPOWAĆ JeŜeli komórka raz stanie się komórką nowotworową, to skład i zachowanie się jej i komórek z niej powstałych nie jest cechą stałą. Zamiast tego nasila sie tendencja do zlośliwienia komórek. Przejawia się to wzrostem liczby nienormalnych kariotypów, nasileniem szybkości wzrostu, wzrastającą inwazyjnością i tworzeniem przerzutów. Zjawisko progresji znajduje swoje odbicie w niezwykłej niestabilności genomu komórek nowotworowych. MoŜe ono być związane z aktywacją dodatkowych onkogenów. Komórki ze zwiększoną szybkością wzrostu korzystają ze szczególnych przywilejów. WaŜne jest rozróŜnienie profilów biochemicznych komórek, które dopiero co zostały transformowane, od tych, które cechuje szybki wzrost, a które są juŜ wysoce złośliwymi komórkami nowotworowymi. Pierwsze mogą wykazywać kilka róŜnic w porównaniu z normalnymi komórkami niezaleŜnie od ich zasadniczych zmian prowadzących do powstania nowotworu (np. aktywacja jednego lub kilku onkogenów) oraz cechy zwykle związane z transformacją (tab. 61-5). Analiza takich komórek moŜe ujawnić główne biochemiczne zmiany wywołujące transformację. Biochemiczne profile wysoce zezłośliwionych komórek mogą być całkowicie odmienne od komórek normalnych. Opisano wiele zmian w profilach enzymatycznych i innych parametrach biochemicznych (tab. 61-8), przy czym niektóre z nich są wtórne, 2wiązane z szybkim wzrostem, inne zaś są prawdopodobnie związane z niestabilnością chromosomów. Szybko rosnące komórki wykazują tendencje do maksymalizowania procesów anabo licznych

związanych ze wzrostem (np. synteza DNA i RNA) i zmniejszania funkcji kata boi icznych (np. katabolizm pirymidyn), a takŜe nie wykazują swoistych funkcji cechujących ich normalnych przodków. Innymi słowami wszystkie procesy toczące się w takich komórkach dotyczą prawie wyłącznie wzrostu. Wykazują one takŜe zmiany biochemiczne, świadczące o zmienionej

anaerobowa Zmiany w profilach izoenzymów, często zbliŜone do profilu płodowego Synteza białek pfodowych (np. antygen rakowo- płodowy) Utrata zróŜnicowanych funkcji biochemicznych (np. zmniejszona synteza wyspecjalizowanych białek) Nieodpowiednia synteza określonych czynników wzrostowych i hormonów

regulacji genów, np. syntetyzują niektóre białka płodowe (niektóre z nich mogą być uŜyte jako markery nowotworowe, p. tab. 61-1), czynniki wzrostowe lub hormony. Wydaje się nieprawdopodobne, Ŝe analizy takich komórelr mogą ujawnić pierwotne główne zmiany odpowiedzialne za transformację, częściowo dlatego, Ŝe są one zamaskowane przez współwystepujące liczne zmiany wtórne, związane z progresją. Pomimo tego jednak, znajomość biochemicznych profilów takich komórek jest niezwykle uŜyteczna przy wyborze chemioterapii, gdyŜ jest to dokładnie ten typ komórek, które chcieliby zwalczać onkolodzy.

NAJBARDZIEJ NIEBEZPIECZNĄ CECHĄ KOMÓREK NOWOTWOROWYCH JEST ZDOLNOŚĆ DO TWORZENIA PRZERZUTÓW Przerzutami określa cię rozsianie komórek nowotworowych z miejsca ich pierwotnego powstania do innych tkanek, gdzie mogą one rosnąć jako wtórne nowotwory. Przerzuty są największym problemem w chorobie nowotworowej. Analiza powstawania przerzutów u ludzi jest bardzo złoŜonym procesem, a wiedza o biochemicznych podstawach tego zjawiska jest bardzo ograniczona. PoniewaŜ proces ten jest wyrazem upośledzonych interakcji między komórkami, wiele uwagi poświęcono badaniu biochemii powierzchni komórek prawidłowych

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 841 Tabela 61 -9. Niektóre zmiany wykryte na powierzchni komórek nowotworowych* Zmiany przepuszczalności Zmiany właściwości transportowych Zmniejszona adhezja Zwiększona zdolność do aglutynacji przez wiele lektyn Zmiany aktywności yielu enzymów (np. określone proteazy) Zmiany ładunku powierzchniowego Pojawienie się nowych antygenów Utrata określonych antygenów Zmiany w otigosacharydowych łańcuchach określonych glikoprotein Zmiany w składnikach glikolipidów * Według Robbins J.C., Nicolson G.L.: Surfaces of normal and adepted calls; w: Cancer: A Comprehensive Treatise. Vol 4. Becker Ff (red.). Plenum Press, 1975, za zezwoleniem.

i nowotworowych. Udokumentowano występowanie wielu zmian zachodzących na powierzchniach komórek nowotworowych (tab. 61-9), chociaŜ nie wszystkie z nich są bezpośrednio związane z procesem powstawania przerzutów. Obecnie prowadzi się wiele prac zmierzających do opracowania odpowiedniego modelu zwierzęcego, przydatnego do badań nad zjawiskiem powstawania przerzutów. Wykonano takŜe wiele badań, aby wykazać prawdopodobną rolę wielu proteaz (np. kolagenazy typu 4) i wielu glikoprotein i glikosfingolipidów powierzchni komórek w procesie powstawania przerzutów. Dla przykładu, istnieje prawdopodobieństwo, Ŝe zmiany w łańcuchach oligosacharydowych glikoprotein komórkowych (będące

następstwem zrriian aktywności określonych glikozylotransferaz glikoproteinowych) mogą mieć kliniczne znaczenie w pojawianiu się przerzutów. Wyjaśnienie mechanizmów biochemicznych związanych z powstawaniem przerzutów moŜe być podstawą racjonalnego opracowania skuteczniejszych form terapii przeciw nowotworowej.

PIŚMIENNICTWO Barbacid M: Oncogenes and human cancer: Cause or conseąuence? Carcinogenesis 1986;7:1037. Bishop JM: The molecular genetics of cancer. Science 1987; 235:305. Croce CM, Klein G: Chromosme translocations and human cancer. Sci Am (March) 1985; 252:54. Darnell J, Lodish H, Baltimore D: Molecular Celi Biology. Scientific American Books, 1986. Feldman M, Eisenbach L: What makes a tumor celi metastatic? Sci Am (Nov) J988;259:60. Franks LM, Teich N: Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer. Oxford Univ Press, 1986. Hunter T, Cooper JA: Protein-tyrosine kinases. Annu Rev Biochem 1985;54:897. Massague J: The transforming growth factors. Trends Biochem Sci 1985;10:237. Mclntire KR: Tumor markers: How useful are they? Hosp Prąci (Dec) 1984;19:55. Nicolson GL: Celi surface molecules and tumor metastasis: Regulation of raetaslatic phenotypic diversity. Exp Celi Res 1984;150:3. Pitot HC: Fundamentals of Oncology. 3rd ed, Marcel Dekker, 1986. Sporn MB, Roberts AB: Autocrine growth factors and cancer. Naturę 1985;3I3:745. Tannock IF, Hill R (editors): The Basie Science of Oncology. Pergamon Press, 1987. Weinberg, RA: Finding the anti-oncogene. Sci Am (Sept) 1988; 259:44.

62

Biochemia a choroby Robert K. Murray, MD, PhD

WPROWADZENIE W rozdziale 1 wyraŜono opinię, Ŝe znajomość biochemii jest waŜna nie tylko dla zrozumienia stanu i podtrzymywania zdrowia, ale równieŜ dla zrozumienia skutecznego leczenia chorób. Inaczej mówiąc, znajomość biochemii oferuje racjonalne podejście oparte na podstawach doświadczalnych (a nie na dogmatach) do problemów zdrowia i choroby. W dotychczasowym tekście niniejszego podręcznika przewijały się liczne zaburzenia biochemiczne będące przyczyną utraty zdrowia i powstawania choroby. Z konieczności pojawiały się one w sposób przypadkowy, a nie uporządkowany. Celem niniejszego rozdziału są: Ponowne silne podkreślenie znaczenia po trzeby precyzyjnego określenia nieprawidłowości biochemicznych prowadzących do utraty zdro wia lub rozwoju cfeęroby. Tylko znajomość tych zaburzeń moŜe być podstawą racjonalnej terapii. Zwięzłe przedyskutowanie przyczyn cho roby z biochemicznego punktu widzenia oraz podkreślenie, Ŝe przyczyny te uszkadzają struk turę pewnych biologicznie bardzo waŜnych cząs teczek (np. DNA) lub teŜ reakcje biochemiczne i procesy, w których te cząsteczki uczestniczą. Przedstawienie kilku waŜnych zagadnień dotyczących biochemicznych aspektów chorób w ogóle, w tym w szczególności chorób genetycz nie uwarunkowanych. Ilustracja praktycznego zastosowania bio chemii w medycynie przez przedstawienie wy branych historii chorób dotyczących głównych kategorii chorób. Wypełnianie luki dzielącej naukę bioche mii klasycznej z praktycznym jej wykorzy staniem dla dobra chorych.

WYJAŚNIENIE PODSTAW BIOCHEMICZNYCH STANÓW ZDROWIA I CHOROBOWYCH STANOWI PODSTAWĘ RACJONALNEJ TERAPII Wyjaśnienie podstaw biochemicznych stanów zdrowia i stanów chorobowych jest przewaŜnie podstawą racjonalnego leczenia. Z tekstu niniejszego rozdziału powinno wynikać, Ŝe utrzymywanie stanu zdrowia zaleŜne jest od dostatecznej podaŜy wody, kalorii, witamin, pewnych składników mineralnych, aminokwasów i kwasów tłuszczowych. Dla przykładu naleŜy przypomnieć, Ŝe poznanie fundamentalnej roli witamin w przemianie materii oraz następstw ich niedoboru zapoczątkowało racjonalną terapię szkorbutu - witaminą C, krzywicy - witaminą D, zaś choroby beri-beri - tiaminą. Te przykłady dobitnie ilustrują, Ŝe dla racjonalnej i skutecznej terapii chorób niezbędna jest znajomość przyczyny i mechanizmów ich powstawania. Przyznać jednak trzeba, Ŝe do dzisiaj nieznane są przyczyny takich chorób, jak choroba Alzheimera, miaŜdŜyca i schizofrenia. Dlatego teŜ, w tych stanach chorobowych leczenie jest zwykle objawowe i empiryczne, a więc nie mające na celu korekty występującej anomalii biochemicznej. Dlatego teŜ leczenie tych chorób jest przewaŜnie mało skuteczne. Skutki ekonomiczne i ludzkie takiej niewiedzy są ogromne. Podkreślić jednak naleŜy, Ŝe nawet znajomość istoty choroby na poziomie molekularnym nie zawsze pozwala na skuteczne jej leczenie albo z powodów technicznych, albo teŜ niemoŜności pełnej korekty występujących anomalii biochemicznych. Przykładem tego jest niedokrwistośc sierpowata. W chorobie tej nie udało się jeszcze

BIOCHEMIA A CHOROBY / 843

skorygować występującego defektu genetycznego. Szybki postęp w zakresie terapii genowej zapewne sprawi, Ŝe twierdzenie o nieuleczalności defektu genetycznego warunkującego niedokrwistość sierpowatą lub inne choroby genetyczne juŜ niedługo będzie historią.

WSZYSTKIE CHOROBY ODZNACZAJĄ SIĘ OKREŚLONYMI ZABURZENIAMI BIOCHEMICZNYMI W tabeli 1-1 przedstawiono główne przyczyny chorób. Jak wiemy, Ŝycie na ziemi zaleŜne jest od reakcji biochemicznych. Ustanie tych reakcji prowadzi do śmierci. Zdrowie zaleŜne jest od regulacji tysięcy reakcji biochemicznych przebiegających harmonijnie w komórkach i procesów czuwających nad stałością wewnętrznego środowiska (w odniesieniu do stęŜenia H+, molalności i składu elektrolitowego płynów ustrojowych itd.). Choroba charakteryzuje się zaburzeniami elementów strukturalnych (np. sekwencji nukleotydów w nici DNA u chorych z chorobami uwarunkowanymi genetycznie), ilością pewnych biocząsteczek albo teŜ zaburzeniami przebiegu reakcji lub procesów biochemicznych. Zaburzenia te, o charakterze przejściowym lub stałym, wywołane są przez czynniki przyczynowe wymienione w tab. 1-1. Prowadzą one często do powaŜnych zmian środowiska wewnętrznego. Zmianom tym mogą przeciwdziałać mechanizmy wyrównawcze, skuteczne tylko przez określony czas. Opisy przypadków chorobowych podanych w dalszej części rozdziału ilustrują róŜne aspekty jednej choroby powstałej pod wpływem jednej z przyczyn wymienionych w tab. 1-1. PowyŜsze spojrzenie na chorobę jest z konieczności znacznym uproszczeniem. Dopatruje się ono przyczyny choroby w anomaliach strukturalnych i czynnościowych komórek, narządów i układów powstałych w następstwie mechanizmów biochemicznych. Chory natomiast przeŜywa chorobę będącą nie tylko wynikiem określonych zaburzeń biochemicznych, lecz odbiciem zmian jego bycia, czynników kulturowych i innych. Lekarz musi leczyć całego chorego, uwzględniając czynniki socjalne, psychologiczne, kulturowe, ekonomiczne i inne. Jego postępowanie powinno być jednak zawsze oparte na rzetelnej wiedzy biochemicznej, fizjologicznej i znajomości mechanizmów chorobowych.

ROZPATRUJĄC CHOROBĘ Z PUNKTU WIDZENIA BIOCHEMICZNEGO NALEśY UWZGLĘDNIĆ SZEŚĆ ASPEKTÓW W tym akapicie przedstawione zostaną ogólne zagadnienia, które są waŜne przy rozpatrywaniu biochemicznych aspektów chorób. Wiele chorób jest genetycznie uwarunkowanych. Zagadnienie to jest tak waŜne, Ŝe zostanie omówione oddzielnie w dal szej części rozdziału. W chorobach zaburzona jest struk

tura, funkcja lub teŜ ilość wszystkich rodzajów biocząsteczek występują cych w komórkach, Zagadnienie to jest krótko przedstawione1** tab. 62-1 na podstawie kilku przykładów. Biocząsteczki mogą być do tknięte pierwotnie lub wtórnie. W chorobach genetycznych pierwotny defekt znajduje się w DNA, zaś zmiany struktury, funkcji i ilości biocząsteczek są zjawiskami wtórnymi. Zaburzenia biochemiczne będące przyczyną choroby mogą się rozwijać szybko lub wolno. Niektóre choroby roz wijają się szybko, np. śmierć moŜe wystąpić w ciągu minut lub krócej po masywnej zakrzepicy naczyń wieńcowych (patrz niŜej przypadek nr 4). Dowodzi to, Ŝe niektóre tkanki (szczególnie tkanka mózgowa i mięsień sercowy) są bardzo wraŜliwe na brak tlenu i substratów energodajnych (np. glukozy dla tkanki mózgowej). Najlepszym przykładem za leŜności człowieka od tlenu jest fakt, Ŝe cyjanek (hamujący oksydazę cytochromową) zabija go w ciągu kilku minut. Masywna utrata wody i elektrolitów występująca u chorych zakaŜo nych przecinkowcami cholery (patrz niŜej przypadek nr 3) zagraŜa Ŝyciu juŜ w kilka godzin od wystąpienia choroby. Ogólnie mó wiąc, nagłe i znaczne zmiany w stęŜeniach i rozmieszczeniu pewnych elektrolitów (np. po tasu) są niebezpieczne ze względu na znaczną wraŜliwość min. mięśnia sercowego na takie zmiany. RównieŜ znaczne zmiany pH płynów ustrojowych tolerowane są przez ustrój tylko przez krótki okres. Z drugiej strony potrzebne są lata zanim namagazynowane biocząsteczki (nie rozkładane z powodu braku enzymów łizosomalnych) uszkodzą czynność określonych komó rek i narządów. Tego przykładem jest względnie wolne nagromadzanie się sfingomieliny w ko mórkach wątroby i śledziony występujące w ła godnych postaciach choroby Niemanna-Picka.

844 / ROZDZIAŁ 62 Tabela 62-1. Przykłady udziału róŜnych biocząsteczek w patogenezie chorób

B i ocząsteczka

Zmiana dotyczy

Choroba

Podstawowa przyczyna

DNA

Struktury

Hemoglobinopatia HbS

Mutacja

RNA

Struktury

Określone typy ta łase mi i

Mutacja będąca przyczyną wadliwego „splicingu" mRNA

Białko

Struktury {czynności}

HbS

Mutacja

Lipidy {GMJ

Ilości (wzrost)

Choroba Taya-Sachsa

Mutacja będąca przyczyną nieprawidłowej heksozoaminidazy A

Wielocukier (glikogen)

Ilości (wzrost)

Choroba spichrzenia glikogenu

Mutacja genu kodującego enzym rozkładający glikogen (fosforylaza)

GAG {siarczan dermatanu i heparanu)

Ilości {wzrost)

Zespół Hurler

Mutacja będąca przyczyną nieprawidłowej i d u ron i d azy

Chlorki (Cl")

StęŜenia (wzrost)

Mukowiscydoza

Mutacja dotycząca białka błonowego uczestniczącego w transporcie cr

Woda

ilości (spadek)

Cholera

Infekcja Jelita cienkiego przez przecinkowiec cholery

w

pocie

Tabela 62-2- Udziat głównych organelli śród kom orkowych w róŜnych chorobach

Organełlum

Mechanizm

Choroba(y)

Jądro

Większość chorób genetycz- Mutacje DNA nych

Mitochondrium

Wiele chorób w tym wrodzona Mutacje mttochondrialne DNA wpływające na strukturę neurooatia nerwu wzrokowe- białek (np. dehydrogenazy NADH) kodowanych przez go Lebera i miopatie mito- genom mitochondrialny chondriatne

Siateczka Objawy toksyczne spowodo- Enzymy siateczki śródplazmatycznej, takie jak cytochrom śródplazmaty- wane związkami chemicznymi P-450, atakują róŜne substancje chemiczne, przekształnp. CCI4 cając je w postacie toksyczne czna Aparat Golgiego

„l-cell" disease

Brak fosfotransferazy GIcNAc w aparacie Golgiego jest powodem nieprawidłowego transportu enzymów lizosomalnych i wydzielania tych enzymów przez dotknięte komórki

Błona plazmatyczna

Przerzuty komórek nowotwo- Zmiany w zakresie oligosacharydów glikoprotein błon rowych plazmatycznych mają odgrywać waŜną rolę w powstawaniu przerzutów

Lizosomy

Choroby spichrzeniowe lizo- ObniŜona aktywność {spowodowana mutacjami) hydrolaz lizosomalnych jest przyczyną spichrzenia róŜnych biosomalne cząsteczek

produkcja peroksysomów i mała aktywność pewPeroksysomy Zespół Zeilwegera (zespól mózgowo-wątrobowo-nerkowy) nych enzymów peroksysomalnych, np. acylotrartsferazy d i h y d ro ksy a ceto n of o sio ra n o wej i inne

BIOCHEMIA A CHOROBY

PowyŜsze przykłady uzasadniają kliniczny podział chorób na ostre i przewlekłe.

4. Choroby mogą być spowodowane niedoborem lub nadmiarem pewnych biocząsteczek. To twierdzenie moŜna najlepiej zilustrować rozpatrując stany niedoboru i nadmiaru witaminy A (p. rozdz. 54). Niedobór tej witaminy jest przyczyną kurzej ślepoty (niedowidzenia nocnego). Z drugiej strony nadmiar witaminy A moŜe^być przyczyną wystąpienia ostrych i przewlekłych objawów toksycznych. Podobnie niedobór witaminy D jest przyczyną krzywicy, zaś jej nadmiar niebezpiecznej hiperkalcemii. Mówiąc o niedoborach pokarmowych wskazane jest rozróŜnienie niedoborów pierwotnych (spowodowanych podawaniem diety niedoborowej) od wtórnych. Przyczynami niedoborów wtórnych mogą być: 1) wadliwe wchłanianie pokarmów z przewodu pokarmowego, 2) zwiększone zapotrzebowanie, 3) niedostateczne zuŜytkowanie lub 4) wzmoŜone wydalanie z ustroju pewnych składników pokarmowych. Liczne choroby lub stany chorobowe mogą być

/ 845

przyczyną jednego lub kilku rodzajów ww. niedoborów pokarmowych. Prawie kaŜde organellum sutakomo r ko w e u c ze s t n i c zy w p a t o g e n e z ie

określonej choroby. Twierdzenie to ilust ruje tab. 62-2. W tabeli tej podane są organella komórkowe uczestniczące w patogenezie po szczególnych chorób. RóŜne mechanizmy biochemiczne mogą być przyczyną podobnych: 1) zmian chorobowych, 2) objawów klinicznych oraz 3) zmian wyników badań laborato ryjnych. Ustrój dysponuje raczej ograniczoną liczbą sposobów reakcji na czynniki patogenne podane w tab. 1-1. Te sposoby reakcji określa się ogólnie jako procesy chorobowe (tab. 62-3). Procesy te mogą jedęt^k być wywołane przez liczne i róŜnorodne czynniki chorobotwórcze, np. bardzo liczne i róŜnorodne rodzaje bakterii i wirusów mogą być przyczyną ostrych i prze wlekłych stanów zapalnych. Podobnie powięk szenie wątroby (hepatomegatia) moŜe być spo wodowane spichrzeniem glukozyloceramidu,

Tabela 62-3. Główne procesy chorobowe będące reakcją ustroju na czynniki chorobotwórcze Proces chorobowy

Przykładowa choroba

Przykładowa biocząsteczka uczestnicząca w procesie chorobowym

Zapalenie pluć

Mediatory zapalenia (prostaglandyny leukotrieny)

Zm i a ny z wy rod n ie n i o we RóŜne czynniki ctiemtczne

Stłuszc2enie wątroby

Etanol

Powiększenie określonego Spichrzanie określonego narządu (np. wątroby) związku

Choroba Gauchera

Glukozy loceramid

Zmiany zapalne ostre ub przewlekłe

Przyczyna choroby

Infekcje bakteryjne lub wirusowe

Zmiany zanikowe (zmniejszenie wielkości)

Niedokrwienie narządu

Zanik nerki

Niedostateczna podaŜ składników odŜywczych zawartych we krwi

Niedokrwistość

Niedobór witamin i pierwiastków śladowych

Niedokrwistość syderopeniczna

śelazo

Zmiany nowotworowe

Naświetlania promieniami X

RóŜne białaczki

Uszkodzenie przez promienie X DNA

Obumarcie komórek

Niedostateczna podaŜ krwi

Zawał mięśnia sercowego

Brak tlenu

Włóknienie („librosis")

Często występuje po obumarciu komórek

Marskość wątroby

Gromadzenie się kolagenu

Tworzenie się Kamieni

DuŜe, miejscowe stęŜenie określonego związku

Kwas moczowy Tworzenie się kamieni nerkowych u chorych z dną

846 / ROZDZIAŁ 62

lecz znacznie częściej uwarunkowane jest niewydolnością krąŜenia lub przerzutami nowotworowymi. Marskość wątroby moŜe być spowodowana naduŜyciem etanolu, spichrzeniem miedzi (choroba Wilsona) lub Ŝelaza (hemochromatoza pierwotna lub wtórna) lub teŜ niedoborem otj-antytrypsyny. Ponadto róŜnorodne wrodzone błędy metaboliczne mogą spowodować niedorozwoje umysłowe, zaś wiele czynników moŜe wywołać ketozę. Innym przykładem tego, Ŝe róŜne zaburzenia biochemiczne mogą prowadzić do podobnego efektu końcowego, jest lokalne wytrącanie się określonych składników po przekroczeniu ich rozpuszczalności w płynach ustrojowych. Przekroczenie punktu rozpuszczalności tych składników moŜe być spowodowane nadmiernym ich wytwarzaniem lub (i) upośledzonym wydalaniem z ustroju. Końcowym efektem wytrącania się pewnych składników moŜe być np. kamień. Przyczynami kamicy nerkowej mogą być: szczawian wapniowy, fosforan magnezowo-amonowy, kwas moczowy i cystyna. Powodem wytrącenia się wymienionych związków są jednak odmienne mechanizmy biochemiczne. Reasumując naleŜy powiedzieć, Ŝe róŜnorodne przyczyny biochemiczne mogą wywołać podobne zmiany chorobowe (np. marskość wątroby), podobne objawy kliniczne (np. upośledzenie umysłowe) lub podobne odchylenia w zakresie badań laboratoryjnych (np. ketozę). Pomimo tego moŜliwe jest. opierając się na wywiadach, wynikach badania fizykalnego i wynikach odpowiednich badań laboratoryjnych określenie czynnika wywołującego określoną chorobę lub objaw chorobowy. WCIĄGU NASTĘPNEJ DEKADY NAJPEWNIEJ ZOSTANIE WYJAŚNIONE MOLEKULARNE PODŁOśE WIĘKSZOŚCI CHORÓB GENETYCZNYCH Ponad 3000 chorób ma podłoŜe genetyczne. Choroby genetyczne stanowią 10% wszystkich dzieci hospitalizowanych w wielu szpitalach. RównieŜ wiele chorób przewlekłych występujących u dorosłych (np. cukrzyca i miaŜdŜyca) wykazuje istotny udział komponentu genetycznego. Wprowadzenie techniki rekombinacji genetycznej oraz metod sekwencjo no wani a DNA zrewolucjonizowały genetykę, w tym genetykę lekarską w szczególności. Przewiduje się, Ŝe dzięki tym technikom moŜliwe będzie wyjaś-

nienie do roku 2000 molekularnego podłoŜa większości chorób genetycznych. Główne klasy chorób genetycznych to zaburzenia chromosomalne, jednogenowe i zaburzenia wieloczynnikowe Choroby genetycznie uwarunkowane moŜna podzielić na 3 klasy, a mianowicie na: 1) choroby chromosomalne, 2) choroby jednogenowe (dziedziczące się wg praw Mendla) i 3) wieloczynnikowe, w których uczestniczy wiele genów (choroby wielogenowe). Choroby chromosomalne nie zostaną omówione szczegółowo. Są one uwarunkowane brakiem lub nadmiarem chromosomów, delecją części chromosomu lub translokacją. Najlepiej poznaną chorobą chromosomalną jest trisomia 21 (zespół Downa). Choroby te moŜna rozpoznać przez badanie kariotypu (określenie liczby chromosomów) u chorego. Wykazano, Ŝe translokacje chromosomalne odgrywają waŜną rolę w aktywacji onkogenów (rozdz. 61). Choroby jednogenowe spowodowane są mutacją jednego genu. Mogą one dziedziczyć się 1) dominujące genem autosomalnym, 2) recesywnie genem autosomalnym lub teŜ są 3) sprzęŜone z chromosomem X. Określenie „dominująco" oznacza, Ŝe choroba występuje równieŜ wówczas, kiedy z pary chromosomów tylko jeden chromosom dotknięty jest mutacją (czyli choroba występuje nawet u heterozygot). Określenie „recesywnie" oznacza, Ŝe choroba występuje tylko u homozygot (obydwa chromosomy jednej pary muszą być dotknięte mutacją). Określenie „sprzęŜony z chromosomem X" oznacza, Ŝe mutacja występuje na chromosomie płciowym X. PoniewaŜ kobiety posiadają dwa chromosomy X, mogą one być heterozygotami, albo teŜ homozygotami w odniesieniu do zmutowanego genu. Tak więc u kobiet dziedziczenie sprzęŜone z chromosomem X moŜe mieć charakter dominujący lub recesywny. Z cfrugiej strony, męŜczyźni posiadają tylko jeden chromosom X, co oznacza, Ŝe zawsze chorują, jeŜeli mutacja dotyczy tego właśnie genu. KaŜda z wymienionych trzech klas chorób genetycznych dziedziczy się wg własnego charakterystycznego sposobu dziedziczenia. Na tym miejscu naleŜy sięgnąć po podręcznik genetyki lekarskiej, w celu uzyskania szczegółowych danych w tym.zakresie. Choroby genetyczne wieloczynnikowe spowodowane są działaniem kilku genów. Dziedziczenie tych chorób nie odbywa się wg klasycznych

BIOCHEMIA A CHOROBY / 847 Tabsla 62-4. Przykłady wszystkich trzech klas chorób genetycznych Klasa

Przykład

Wada chromosomalna

Wada jednogenowa *

Uwagi

Trisomia 21 (zespół Downa)

Częstość występowania wśród noworodków w miarę wzrostu wieku matki

Przewlekła białaczka szpikowa H i perchoiesterolemia rodzinna

Obecność chromosomu Philadefphta Dziedziczy się genem autosomalnym jako cecha dominująca, mutacja dotyczy genu kodującego receptor dla LDL

Wada jednogenowa

Pląsawica Huntingtona Dziedziczy się genem autosomalnym jako cecha dominująca, rozpoznanie prenatalne wady jest juŜ moŜliwe

Wada jednogenowa

Mukowiscydoza

Wada jednogenowa

Hemoglobinopatia HbS Dziedziczy się genem autosomalnym jak cecha recesywna. Mutacja dotyczy zamiany Gtu na Val w pozycji 6 łańcucha f) globiny

Wada jednogenowa

Fenyloketonuria

Dziedziczy się genem autosomalnym jako cecha recesywna. Wada spowodowana jest mutacją genu kodującego hydroksylazę fenyloalaninową

Wada jednogenowa

Dystrolia mięśni typu Duchenne'a

Dziedziczy się genem X; wada dotyczy syntezy dystrofiny

Wada jednogenowa

Hemofilia

Dziedziczy się genem X. Wada dotyczy syntezy czynnika VIII krzepnięcia (AHG)

Wada wielogenowa

Choroba niedokrwien- PodłoŜe genetyczne choroby jest złoŜone; badania polimorfizmu DNA kodującego lipoproteiny zapowiana serca dają moŜliwość wykrywania osobników genetycznie predysponowanych

Wada wielogenowa

Samoistne nadciśnienie Sugerowana jest równieŜ teoria dopatrująca się przyczyny choroby w mutacji jednogenowej tętnicze

Dziedziczy się genem autosomalnym jako cecha ręcesywna, większość chorych wykazuje delecję reszty fenyloalaninowej w białku błonowym regulującym transport jonu chlorkowego^

praw Mendla. O tej klasie chorób genetycznych wiadomo mniej niŜ o chorobach innych klas, chociaŜ odgrywają one coraz większe znaczenie w powstawaniu społecznych chorób wieka dorosłego, do których zalicza się niewydolność naczyń wieńcowych oraz nadciśnienie tętnicze. W tabeli 62-4 podano kilka waŜnych przykładów chorób genetycznych dla kaŜdej z wymienionych trzech klas. Mutacje genomu mitochondHalnego mogą być równieŜ przyczyną choroby Ludzki mitochondrialny DNA liczy w przybliŜeniu 16,5 kilozasad i koduje 13 białek, przy czym wszystkie one są składnikami procesu fosforylacji oksydacyjnej. Mitochondrialny DNA róŜni się od DNA jądrowego trzema cechami: 1) przekazywany jest przez matkę,

2) zawiera mało intronów i 3) jego kod genetyczny róŜni się nieco od kodu DNA jądrowego. Ponadto odznacza się duŜą częstością występowania mutacji oraz polimorfizmem. Stwierdzono, Ŝe mutacje mitochondrialnego DNA uczestniczą w patogenezie niektórych miopatii mitochondrialnych oraz we wrodzonej neuropatii nerwu wzrokowego Lebera (LHON). Miopatie mitochondrialne charakteryzują się osłabieniem mięśni szkieletowych, zmianami biochemicznymi mitochondriów oraz obecnością w bioptatach mięśniowych „nierównych" (poszarpanych) włókien czerwonych („ragged red fibers"), zaś LHON — szybko postępującą, obustronną utratą widzenia centralnego, spowodowaną zwyrodnieniem siatkówki i nerwu wzrokowego. W miopatiach mitochondrialnych stwierdzono występowanie róŜnych delecji

848 / ROZDZIAŁ 62

w mitochondrialnym DNA. Wykazano równieŜ, Ŝe przyczyną LHON jest tranzycja G na A w pozycji 11778 getiomu mitochondrialnego, w wyniku której dochodzi do zmiany struktury podjednostki 4 dehydrogenazy NADH. Choroby genetyczne wywołują zmiany wpływające na strukturę DNA, RNA lub białek oraz na czynność komórek Mutacja genu strukturalnego moŜe być przyczyną zmiany struktury kodowanego przez niego białka, niezaleŜnie od tego, czy białkiem tym jest enzym, czy białko pozbawione działania katalitycznego. JeŜeli białkiem tym jest enzym, występująca mutacja moŜe być przyczyną wrodzonej wady metabolicznej. Koncepcję wrodzo-

nej wady metabolicznej po raz pierwszy zaproponował angielski klinicysta — Sir Archibald Garrod w pierwszych latach bieŜącego stulecia, opierając się na wynikach badań alkaptonurii, bielactwa (albinizmu), cystynurii i pentozurii. Wrodzona wada metaboliczna jest zaburzeniem genetycznym, w którym dotknięty jest swoisty enzym. Ten ostatni jest przyczyną bloku metabolicznego, który moŜe mieć następstwa chorobowe. Wyjaśnia to następujący przykład. PoniŜsze równania odzwierciedlają prawidłowy przebieg reakcji enzymatycznej oraz sytuację występującą w bloku metabolicznym:

T

E*

Wzrost fenyloalaniny II—> Spadek syntezy tyrozyny

Z równania tego wynika, Ŝe chorzy na PKU syntetyzują mało tyrozyny oraz charakteryzują się wzrostem stęŜenia w osoczu krwi i w moczu fenyloalaniny i kwasu fenylopirogronowego oraz innych metabolitów fenyloalaniny. Niedobór tyrozyny (jest ona prekursorem melaniny) jest przyczyną jasnej karnacji skóry. Dokładny patomechanizm objawów klinicznych występujących w PKU nie jest jasny, chociaŜ przypuszcza się, Ŝe jest spowodowany niedoborem tyrozyny, niezbędnej do syntezy białek i neuroprzekaźników w ośrodkowym układzie nerwowym, lub teŜ hamującym wpływem wysokich stęŜeń fenyloaiartiny na przezbłonowy transport innych aminokwasów w neurocytach. Krytycznymi momentami bloku enzymatycznego są: a) zmiana wydajności szlaku metabolicznego spowodowana niedostateczną syntezą odpowiedniego produktu lub (i) b) nagromadzenie się substratu znajdującego się przed blokiem Lub niefizjologicznych jego metabolitów oraz c) zmiany regulacji mechanizmu sprzęŜenia zwrotnego

(o ile mutacja dotyczy miejsca allosterycznego enzymu). Wszystkie wymienione skutki bloku enzymatycznego mogą mieć działanie patogenne. WaŜne jest równieŜ zrozumienie, dlaczego niektóre wrodzone wady metaboliczne są nie-

Wzrost X, Y T

Wzrost kwasu feny-I o p i rog r o n o weg o

E*

Sytuacja Wzrost S I)-» Spadek P normalna *V Blok

S oznacza substrat, P — produkt reakcji katalizowanej przez enzym prawidłowy, E, E* — enzym zmutowany, zaś X i Y — alternatywne produkty substratu S. Jak widać, blok enzymatyczny moŜe być przyczyną: 1) zmniejszonej produkcji związku P, 2) nagromadzenia się substratu S znajdującego się przed blokiem oraz 3) wzmoŜonego wytwarzania i gromadzenia się metabolitów alternatywnych X lub Y substratu S. Wszystkie wymienione trzy skutki bloku enzymatycznego mogą mieć znaczenie patologiczne. W fenyloketonurii (PKU) (p. rozdz. 32) enzymem zmutowanym (Ex) jest hydroksylaza fenyloalaninowa. W wyniku- bloku enzymatycznego dochodzi do zmian metabolicznych przedstawionych niŜej podanym równaniem:

szkodliwe. Dotyczą one najczęściej końcowych etapów metabolizmu. W tych wadach ani niedobór określonego produktu, ani teŜ nagromadzenie się pewnego substratu (prekursora) reakcji katalizowanej przez zmutowany enzym nie mają szkodliwego wpływu na czynność komórek. Taka sytuacja ma miejsce u chorych z pentozurią. Z drugiej strony właściwie nieznane są wrodzone wady cyklu kwasu cytrynowego, odgrywającego główną rolęAv metabolizmie ustrojowym. Występowanie takiej wady mogłoby mieć zgubny wpływ na komórki i kończyć się śmiercią juŜ na bardzo wczesnym etapie rozwojowym. JeŜeli mutacja dotyczy genu strukturalnego dla białka meenzymatycznego, wówczas w wielu

przypadkach syntetyzowane jest biatko zmutowane. Zamiana nawet jednego aminokwasu w sekwencji ani i no kwasowej (taka sytuacja zachodzi w hemoglobinopatii HbS) moŜe mieć zgubne skutki chorobowe (p. rozdz. 7). Zmuto-

BIOCHEMIA A CHOROBY / 849 wane białka mogą wykazywać nieprawidłową

cd. tab. 62-5

czynność (np. pewne zmutowane hemoglobiny), mogą ulec agregacji (np. hemoglobina HbS) lub

Skutki wrodzonych wad meta bo licznych na poziomie komórek lub narządów Niedobór produkcji reakcji katalizowanej przez zmutowany enzym (niedobór melaniny w bielactwie) Nagromadzenie toksycznych prekursorów reakcji enzymatycznej katalizowanej przez zmutowany enzym (np. fenyloałaniny i ketokwasów pochodnych fenyloałaniny u chorych z PKU)

teŜ mogą przenikać bardzo wolno poprzez komó-

rki (np, arantytrypsyna). Tabela 62-5 przedstawia róŜne poziomy manifestacji zmian patologicznych występujących w chorobach genetycznych. Pokazane w tabeli poziomy nie wykluczają się nawzajem, wiadomo bowiem, Ŝe wszystkie choroby genetyczne zaleŜne są od zmian strukturalnych DNA.

Tabela 62-6. „Poziomy" manifestacji zmian patologicznych w chorobach genetycznych. Wszystkie choroby genetyczne spowodowane są zmianami DNA. Jest jednak poŜyteczne uwzględnienie „poziomu" manifestacji zmian patologicznych tych chorób. Jak widać w tabeli, niektóre choroby przejawiają się na dwóch poziomach i większość defektów w zakresie biosyntezy białek nieenzymatycznych wpływa na czynność narządów. Leczenie chorób genetycznych polega na oddziaływaniu na wymienione „poziomy" manifestacji poszczególnych defektów DNA Zmiany DNA jądrowego (róŜne rodzaje mutacji). Zmiany DNA mitochondHalnego (róŜne rodzaje mutacji) RNA Zmieniony „splicing" (pewne przypadki talasemii) Białka a. Zmutowane enzymy: obniŜona aktyw ność enzymatyczna, brak enzymu, wzmo Ŝona aktywność enzymatyczna (rzadko spotykana wada) b. Zmienione biatka nieenzymatyczne; Białka uczestniczące w transporcie róŜnych związków (anafbuminemia, hemogłobtnopatia HbS) Białka o działaniu ochronnym (agammaglobulinemia, afibrynogenemia) Białka strukturalne (zmiany strukturalne kolagenu w róŜnych chorobach tkanki łącznej) Hormony białkowe (niedobór tyreoglobuliny w pewnych postaciach wola rodzinnego) Białka kurczliwe (niedobór lub brak dystrofiny w dystrofii mięśni typu Duchenne'aDMD) Białko receptorowe (niedobór lub brak receptorów LDL w rodzinnej hipercholesterole-

Zaburzona regulacja mechanizmu sprzęŜenia zwrotnego (wzmoŜona synteza metabolitów szlaku porf irynogenezy u chorych z porfirią ostrą przerywaną) Zmieniona czynność błon (brak receptorów LDL w rodzinnejsłsjpercholesierolemii, upośledzone wchłanianie zwrotne cysty ny w kanalikach nerkowych u chorych na cystynurię) Zmienione rozmieszczenie w przedziałach sub kom orkowych (obniŜona aktywność fosfotransferazy Glc-NAc jest przyczyną niewłaściwego ukierunkowania sekrecji enzymów lizosomalnych w chorobie „I-celi disease" Zmiany architektury komórek i tkanek Zmiany kształtu komórek (krwinki czerwone kształtu sierpa w hemoglobin opatii HbS) Zmiany liczby organełli subkomórkowych (spadek biogenezy peroksysomów w zespole Zeilwegera) Zmieniona ilość poza kom orkowej matrix (zmieniony kolagen w chorobach kolagenowych)

W celu uniknięcia trwałych szkód niezbędne jest wczesne rozpoznanie pewnych wrodzonych wad metabolicznych Co naleŜy zrobić przy podejrzeniu występowania wrodzonej wady metabolicznej? Odpowiedź na to pytanie jest waŜna, gdyŜ w niektórych wadach metabolicznych zachodzi konieczność natychmiastowego rozpoczęcia leczenia w celu uniknięcia trwałych szkód (np. u chorych na PKU lub galaktozemię). W tabeli 62-6 podano kilka praktycznych wskazówek w tym zakresie. W tabeli 62-7 zestawiono materiały biologiczne, jakie naleŜy badać oraz testy, jakie naleŜy

850 / ROZDZIAŁ 62 Tabela 62-6. Praktyczne wskazówki w rozpoznawaniu wrodzonej wady metabolicznej Zebranie dokładnego wywiadu dotyczącego występowania w rodzinie chorób genetycznych Wykonanie testów skriningowych w celu wykrycia „patologicznych" składników w płynach ustrojowych (np. oznaczenie kwasu fenylopirogronowego przy podejrzeniu PKU) Wykluczenie innych przyczyn choroby u noworodka (stany zapalne, choroby sercowo-naczyniowe) Stwierdzenie w wywiadach upośledzonego rozwoju fizycznego i umysłowego Stwierdzenie powiększenia niektórych narządów (np, hepatomegalii w chorobie Gauchera lub Niemanna-Picka) Obecność niezwykłego zapachu powietrza wydechowego lub moczu (np. u chorych z „chorobą syropu klonowego") Stwierdzenie małego stęŜenia glukozy we krwi (np. u chorych z glikogenozą) ObniŜone pH krwi (np. spowodowane nagromadzeniem się kwasów organicznych u chorych z „chorobą syropu klonowego")

wykonać u osób, a szczególnie płodów podejrzanych o wrodzoną wadę metaboliczną. Pobieranie kosmków kosmówki oraz wykonanie amniocentezy dla zbadania komórek owodni odnosi się tylko do płodów. NIEKTÓRE CHOROBY GENETYCZNE MOśNA SKUTECZNIE LECZYĆ Ogólnie mówiąc przy leczeniu chorób genetycznych wykorzystuje się jedną z następujących czterech strategii: 1) próbuje się korygować skutki metaboliczne danej wady metabolicznej

podając brakujący produkt lub ograniczając dostępność substratu reakcji enzymatycznej katalizowanej przez zmutowany enzym, 2) podejmuje się próbę substytucji lub aktywacji niedoborowego enzymu względnie substytucji brakującego białka, 3) próbuje się wydalić z ustroju nagromadzony związek lub 4) korygować występującą anomalię genetyczną. W tabeli 62-8

podano przykłady dla kaŜdej z wymienionych czterech strategii. Niektóre z wymienionych metod są bardzo skuteczne w określonych wadach metabolicznych, np. dietetyczne leczenie fenyloketonurii i galaktozemii, leczenie substytucyjne w hemofilii

Tabela 62-7. Główne testy uŜywane w diagnostyce chorób genetycznych Materiały biologiczne poddane badaniom: Osocze, krwinki czerwone, leukocyty, fibroblasty, mocz, bioptaty z dotkniętych narządów, kosmówka (kosmki), komórki owodni Testy ogólne; StęŜenie glukozy we krwi i w moczu, pH krwi, stęŜenie amoniaku we krwi, stęŜenie aminokwasów w osoczu i wydalanie tych związków z moczem, określenie kwasów organicznych w moczu, testy barwne na obecność róŜnych metabolitów we krwi i moczu Testy swoiste: Oznaczanie produktów (małe stęŜenie) lub prekursorów (duŜe stęŜenie) reakcji enzymatycznej (np, fenyloalaniny lub kwasu fenylopirogronowego w PKU) katalizowanej przez zmutowany enzym Oznaczanie aktywności zmutowanych enzymów w erytrocytach, krwinkach białych, lub bioptatach tkankowych Elektroforetyczne badanie białek (np, dla wykrycia HbS) Analiza metodą Southern blotting polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (restrietion fragment iength polymorphism-RFLP) lub innych anomalii struktury łańcuchów DNA wywołujących specyficzne choroby (np, hemoglobinopatta HbS, pląsawica Huntingtona, dystrofia mięśni typu Duchenne'a itd.) lub sprzęŜonych z tymi chorobami Identyfikacja dotychczas nieznanych metabolitów w moczu i osoczu metodą GLC-MS (gazowa wysokosprawna chromatografia cieczowa—spektrometria masowa)

i agammaglobulinemii lub usuwanie z ustroju nadmiaru Ŝełaza u chorych na hemochromatozę przez okresowe upusty krwi. Niestety próby substytucji brakującego enzymu najczęściej zostały uwieńczone tylko niewielkim sukcesem. Powodami takiego stanwrzeczy są: a) trudności w uzyskaniu dobrego materiału pochodzenia ludzkiego, z którego moŜna by wyizolować dostateczne ilości brakującego enzymu (w niektórych wadach do tego celu uŜywano łoŜyska). trudności w dostarczaniu brakującego en zymu do właściwego narządu docelowego oraz trudności w utrzymywaniu enzymu w stanie aktywnym w określonej tkance, jeśli jenzym ten ulega szybkiej degradacji. Wymienione trudno ści są szczególnie duŜe, jeŜeli narządem docelo wym dla brakującego enzymu jest mózg. W tych

BIOCHEMIA A CHOROBY / 8S1 Tabela 62-8. Główne metody dostępne w leczeniu chorób genetycznych. Podzielono je na 4 klasy: 1) próby korekcji skutków metabolicznych występującej wady przez podawanie brakującego produktu lub ograniczenie dostępności substratu dla reakcji katalizowanej przez zmutowany enzym, 2) substytucja lub aktywacja brakującego enzymu lub substytucja brakującego białka nieenzymatycznego, 3) usuwanie z ustroju nagromadzonego związku lub 4) korekcja anomalii genetycznej. (Według Stanbury i wsp.: Matabolic Basis of Inherited Diseases, wyd. 5. McGraw Hill, 1983). Klasa postępowania leczniczego 11

Zasada

44

Leczenie lub komentarz

Substytucja brakującego produktu

Wole rodzinne

Podawanie l-tyroksyny

Ograniczenie substratu

Fenyloketonuria

Substytucja zmutowanego białka Substytucja brakującego białka

Choroba Gauchera Hemofilia

Dieta uboga w fenyloalaninę Iniekcje p-glukozydazy

Aktywacja zmutowanego enzymu przez podawanie ilości jego kofaktora

Acyduria metyiomalonowa

22 33

Choroba

DoŜylne podawanie czynnika VII! (AHG) ^""Podawanie witaminy B12

Podawanie Aktywacja zmutowanego enzymu przez Zespól Crigglera-fenobarbitalu Najjara indukcję Transplantacja wątroby Zastąpienie chorego narządu będącego Galaktozemia* nosicielem wady przez narząd zdrowy Wprowadzenie enzymu do komórek so- Wiele moŜliwych kan- Metoda ma jak dotychczas charakter eksperymatycznych lub rozrodczych za pośred- dydatów mentalny nictwem terapii genowej (np. uŜywając wektora retrowirusowego) * Leczeniem pierwszego rzutu jest podawanie niemowlętom diety ubogiej w laktozę, jeśli rozpoznanie ustalono wcześnie.

przypadkach enzym musi być podany w postaci pokonującej barierę krew-mózg. Pomimo licznych prób dostarczania do narządów docelowych enzymów, DNA lub innych cząsteczek w postaci liposomów jak dotychczas nie zanotowano spektakularnych sukcesów. Dzięki ogromnym postępom na polu rekombinacji DNA (p. rozdz. 42) strategii czwartej, tj. korekcji anomalii genetycznej poświęcono wiele prac doświadczalnych i zasugerowano nowe rozwiązania. Ttrupia genowa mogłaby polegać na: 1) substytucji genowej, 2) korekcji nieprawidłowego genu lub 3) wzmocnieniu nieprawidłowego genu. Substytucja genowa (1) polegałaby na usunięciu całego zmutowanego genu i wprowadzeniu na jego miejsce genu prawidłowego, zaś korekcja genu na naprawie jedynie zmutowanego odcinka genu. śadna z wymienionych dwóch metod nie doczekała się jeszcze praktycznego rozwiązania. Metoda trzecia polega na wprowadzeniu do komórki obcego materiału genetycznego w celu wyrównania niedoboru produktu spowodowanego genem zmutowanym, np. jest juŜ moŜliwe

wprowadzenie normalnego genu do zmutowanej komórki (drogą transfekcji, mikroiniekcji lub za pomocą wektora wirusowego) oraz spowodowanie jego ekspresji. NaleŜy jednak zauwaŜyć, Ŝe taka komórka zawiera zarówno gen zmutowany, jak i gen obcy. Ponadto obcy gen wprowadzony w przypadkowe miejsce chromosomu moŜe przerwać (przez mutagenezę insercyjną) ekspresję pewnych genów gospodarza i nie podlega normalnym mechanizmom regulacyjnym. UŜyto wiele pomysłowych metod w celu umieszczenia genu we właściwym dla niego miejscu w komórce. Wiele uwagi poświęcono wektorom retrowirusowym w celu naprawienia wady genetycznej w komórkach szpiku kostnego, tj. w komórkach, z którymi łatwo manipulować zarówno in vivo, jak in vitro. Realna jest równieŜ metoda łransgeniczna, lecz równieŜ w tej metodzie występuje problem precyzji insercji materiału genetycznego oraz wiek innych problemów technicznych i etycznych. Pomimo tych trudności terapia genowa leŜy w centrum badań medycznych i rokuje szybki postęp.

852 / ROZDZtAŁ 62

OPIS PRZYPADKÓW Wprowadzenie W następnych podrozdziałach przedstawiono opis 8 przypadków, pr2y czym kaŜdy z nich dotyczy jednaj z 8 przyczyn chorób wymienionych w tab. 1-1. Przewodnią ideą tych opisów jest przedstawienie znaczenia znajomości biochemii dla zrozumienia istoty chorób występujących u przedstawionych chorych. Listę przyczyn chorób podaną w tab. 1-1 moŜna b\ rozszerzyć np. o przyczyny „nowotworowe" lub „psychologiczne". Z drugiej strony przyczyn} nowotworów moŜna by omówić w punkcie ,.przyczyny fizyczne" (np. nowotwory wywołane napromieniowaniem promieniami X), „przyczyny biologiczne" (uwzględniając rolę wirusów onkogennych w patogenezie niektórych nowotworów) iub równieŜ w punkcie „prz\czyny chemiczne" (ok. 80% nowotworów występujących u człowieka jest pochodzenia „chemicznego"). Ponadto w ostatnich latach wykazano u niektórych chorych genetyczne uwarunkowanie schizofrenii i psychozy maniakalnej, co moŜe mieć znaczenie dla klasyfikacji przyczyn wymienionych chorób. Większość opisanych przypadków dotyczy chorób często lub względnie często spotykanych. Tylko dwa z nich (przypadek I i 7) dotyczą chorób względnie rzadko występujących. Pomimo tego te ostatnie przypadki zostały włączone do niniejszego podrozdziału, poniewaŜ pięknie ilustrują a) przyczynę choroby, do której zostały zaszeregowane oraz b) dwa biologiczne zjawiska, tj. znaczenie naprawy DNA i przeciwciał jako mechanizmów ochronnych. Do opisu,kaŜdego przypadku dołączono schematyczny diagram podsumowujący mechanizmy biochemiczne uczestniczące w patogenezie przedstawionych chorób. Przypadek 1. Skóra pergaminowa barwnikowa {xeroderma pigmentosum) (ryc. 62-1). Klasyfikacja. Przyczyna fizyczna, ekspozycja na światło ultrafioletowe. Wywiady i badanie fizyczne. Do Kliniki Dermatologicznej został przyjęty 12-letni chłopiec z powodu guza skóry na prawym policzku. Chłopiec ten ciągle unikał ekspozycji na promienie słoneczne z powodu tworzenia się pęcherzy na skórze. Na skórze stwierdzono nieregularnie rozrzucone obszary przebarwienia i lekkiego zaniku. Uwzględniając obecność guza skóry w tak młodym wieku, unikanie słońca w wywiadach oraz występowanie ww, pozostałych łago-

Ekspozycja na promienie ultrafioletowe (UV) jeal przyczyną tworzenia się dlmerćw tymlny w komórkach skóry (keratynocytach)

Dimery tyminy nie ulegają , wycięciu" lub nateŜylej naprawie z powodu genetycznie uwarunkowanego defeklu (np. zmutowanej endonukleazy) w zakresie korekcji uszkodzeń DNA indukowanych promieniami UV

Utrzymywanie się uszkodzonego DNA; je^o replikacja prowadzi do syntezy DNA wykazującego mutację

Zmutowany DNA pośredniczy w karcynogenezle (być moŜe przez aktywację onkogertów)

Powslawanle licznych guzów nowotworowych skóry

Ryc. 62-1. Zestawienie mechanizmów uczestniczących w powstawaniu skóry pergaminowej barwnikowej.

dniejszych zmian skórnych, dermatolog postawił wstępną diagnozę xeroderma pigmentosum. Badania laboratoryjne. Badanie histologiczne wyciętego guza wykazało obecność raka łuskowatego (jest to często spotykana postać raka skóry u starszych ludzi, a nie u chłopca w tak młodym wieku). Pobrano fragment skóry w celu uzyskania fibroblastów. W laboratorium naukowym szpitaia specjalizującego się w radiobiologii załoŜono hodowlę fibroblastów chorego dziecka oraz osoby zdrowej w celu określenia zawartości dimerów tyminy po naświetlaniu promieniami UV. Zarówno fibroblasty chorego, jak i osoby zdrowej poddano działaniu światła UV pobierając próbki komórek w odstępach 8-godzinnych do 32 godziny po naświetlaniu. Z pobranych próbek zrobiono wyciągi DNA oznaczając w nich zawartość dimerów tyminy. Po 32%odzinach po naświetlaniu w komórkach osoby zdrowej stwierdzono zaledwie 24%, zaś w komórkach chorego chłopca aŜ 95% dimerów powstałych pod wpływem promieni UV. Ten wynik potwierdził słuszność rozpoznania xeroderma pigmentosum. Komentarz. Skóra pergaminowa barwnikowa (xeroderma pigmentosum — XP) jest względnie rzadką chorobą dziedziczącą się recesywnie genem autosomalnym. Choroba charakteryzuje się upośledzeniem mechanizmów naprawy uszkodzeń DNA indukowanych promieniami

BIOCHEMIA A CHOROBY / 853

UV. Główny defekt DNA indukowany promieniami UV polega na powstawaniu dimerów tyminy. Te ostatnie są wynikiem wiązań kowalencyjnych miedzy węglami tyminy w pozycji 5 i 5 oraz 6 i 6 dwóch przylegających do siebie łańcuchów DNA. Mogą one ulec likwidacji przez endonukleazę. Jedną z przyczyn XP wydaje się być defekt tego enzymu. Szczegółowe badania wykazały, Ŝe występują róŜne podgrupy XP oraz, Ŝe* nie określono dokładnie enzymów uczestniczących w naprawie DNA uszkodzonego przez promienie UV. W razie nienaprawienia defektu DNA indukowanego przez naświetlanie promieniami UV powstają mutacje DNA mogące być przyczyną raka skóry. U chorych na XP juŜ od młodych lat stwierdza się róŜne postacie raka skóry. Rodziców chłopca pouczono, Ŝe dziecko wymagać będzie monitorowania lekarskiego przez całe Ŝycie z powodu moŜliwości tworzenia się nowych raków skóry. Ponadto rodzicom radzono, by dziecko w dalszym ciągu unikało słońca i stosowało na skórę właściwe maści chroniące przed działaniem promieni słonecznych. ChociaŜ XP jest rzadką chorobą, istnienie róŜnych mechanizmów naprawy uszkodzeń DNA indukowanych promieniami UV lub czynnikami chemicznymi ma wielkie znaczenie ochronne dla człowieka (chroni przed powstawaniem nowotworów skóry). W razie braku takich mechanizmów Ŝyciu na ziemskiej planecie groziłoby jeszcze więcej niŜ dotychczas niebezpieczeństw. Wykazano bowiem, Ŝe chorzy na XP mają

1000-krotnie większe prawdopodobieństwo zachorowania na raka skóry niŜ osoby zdrowe. Przypadek 2. Kwashiorkor (ryc.62-2). Klasyfikacja. Przyczyna: wadliwe odŜywianie, niedobór białka.

Wywiady i badania fizyczne. W jednym z krajów rozwijających się do ambulatorium przyszpitalnego matka przyniosła swoją 2-letnią córkę. Matka dziecka miała 4 dzieci, przy czym najmłodsze miało roczek i było karmione piersią. Rodzina Ŝyła w zrujnowanym szałasie w odległości kilku mil poza miastem, zaś ojciec dziecka z wielkim trudem tylko okazyjnie zna- lazł zatrudnienie. Głównym poŜywieniem rodziny była kaszka bogatowęglowodanowa, natomiast ubogobiałkowa. W ciągu ostatnich dwóch lat rodzinę tylkótfcardzo rzadko stać było na kupno mleka i mięsa. Matka podawała, Ŝe w czasie ostatniego miesiąca córka wykazywała słaby apetyt, miała okresowe biegunki i stała się draŜliwa i apatyczna. Przy badaniu stwierdzono, Ŝe dziecko wykazuje niedowagę i mały wzrost w stosunku do swojego wieku. Było one blade, draŜliwe i słabe. Obwód ramienia (mierzony w połowie kości ramieniowej) był znacznie obniŜony, co pośrednio dowodziło wadliwego Ŝywienia białkowo-kalorycznego (PEM) dziecka. Skóra była łuszcząca się, zaś włosy suche i łamliwe. Brzuch był wzdęty, wątroba zaś umiarkowanie powiększona. Ponadto stwierdzono uogólnione obrzęki. Lekarz dyŜurny postawił rozpoznanie kwashiorkor i biegunki.

Dieta ubogobiałkowa, wysokowęglowodanowa

Niedobór aminokwasów

Wystarczająca iiość prekursorów syntezy tłuszczów u chorych z niedostateczną syntezą białek

Niedostateczna synteza Hb, tran sfery ny, albumin Stłuszczenię wątroby Występująca hlpoalbumlnsmia uczestniczy w powstawaniu __________obrzęków ________

Umiarkowana riepatomegalia

Wodobrzusze

Ryc. 62-2. Mechanizmy uczestniczące w powstawaniu kwaahiorkor.

854 / ROZDZIAŁ 62

Badania laboratoryjne. Ze względu na ograniczone moŜliwości techniczne wykonano tylko kilka badań laboratoryjnych. StęŜenie Hb wynosiło 60 g/l (wartości prawidłowe 130—150 g/l), zaś stęŜenie białka ogólnego 44 g/l (wartości prawidłowe 60—80 g/l) i albumin 20 g/l (wartości prawidłowe 35—55 g/l). Po siew stolca ujawnił obecność bez tlenowca Gram- ujem neLeczenie. W większości przypadków nie zaleca się leczenia w szpitalu chorych z objawami wadliwego Ŝywienia białko w o-kalorycznego (PEM) ze względu na ryzyko zakaŜenia szpitalną florą bakteryjną. Uwzględniając jednak ogólne osłabienie dziecka oraz obecność uogólnionych obrzęków, dziecko przyjęto na oddział. Ze względu na biegunki podano odpowiedni antybiotyk o szerokim widmie działania. Równocześnie rozpoczęto karmienie dziecka małymi, lecz często podawanymi dawkami roztworu izotonicznego glukozy z chlorkiem sodowym zawierającego i inne skadniki minerajne. Po dwóch dniach dziecku podawano w odstępach czterogodzinnych dietę wysokokaloryczną opartą na mleku z dodatkiem, w okresie późniejszym, preparatu wielowitami nowego i brakujących składników mineralnych. Stan dziecka uległ stałej poprawie i po 10 dniach zostało wypisane ze szpitala. Matkę poinformowano, by raz w tygodniu zgłosiła się wraz z dzieckiem do kliniki, gdzie specjalista od Ŝywienia udzielał porad, jak poprawić jakość diety. W czasie cotygodniowej wizyty dziecko mierzono i waŜono oraz dokonano pomiaru obwodu ramienia. Ponadto w czasie kaŜdej wizyty matka otrzymywała bezpłatnie kartony z mlekiem sproszkowanym. Dyskusja. Zespół PEM jest najczęściej spotykanym zaburzeniem Ŝywieniowym w świecie. Oszacowano, Ŝe około miliard ludzi w świecie cierpi na PEM o róŜnym nasileniu. Kwashiorkor znajduje się na jednym końcu tego zespołu chorobowego i charakteryzuje się głównie nie* doŜywieniem białkowym. Na drugim końcu znajduje się zespól ogólnego wyniszczenia (marazm, marasmus) spowodowanego przewaŜnie Ŝywieniem ubogo kalorycznym. Granica między kwashiorkor i wyniszczeniem nie jest ostra, bowiem spotykane są postacie pośrednie określane jako kwashiorkor wyniszczający. Główne róŜnice między kwashiorkor i marazmem zostały wypunktowane w tab. 62-9. Objawami głównymi kwashiorkor są obrzęki, hipoalbuminemia i stłuszczenie wątroby.

Tabela 62-9. RóŜnice między kwashiorkor i marazmem (wyniszczeniem) Kwashiorkor Marazm Obrzęki

Są

Nie ma

Hipoalbuminemia Jest, moŜe być Umiarkowaznacznego stop- na nia Stłuszczenie wą- Jest Nie ma troby StęŜenie insuliny w osoczu StęŜenie adrenaliny Zaniki mięśni szkieletowych

DuŜe

Małe

Prawidłowe lub małe

Wysokie

Nieobecny lub umiarkowany

MoŜe być bardzo znaczny

Zawartość tłusz- Zmniejszona czów w ustroju

Krańcowo niska lub brak

Kwashiorkor jest terminem uŜywanym przez członków szczepu Ga w Gawie dla okjeślenia „choroby występującej u starszego rodzeństwa po urodzeniu kolejnego dziecka". Występuje ona u dziecka po odstawieniu go od piersi i rozpoczęciu karmienia pokarmami ubogobiałkowymi i boga to węglowodanowymi. Zmiany włosów i na skórze oraz stłuszczenie wątroby występujące u chorych na kwashiorkor spowodowane są głównie niedoborem białkowym. U chorych tych stwierdza się często niedobory witamin i składników mineralnych. RównieŜ hormony są istotnym ogniwem w patogenezie PEM. Dieta wysoko węglowodanów a jest przyczyną występowania w kwashiorkor podwyŜszonego stęŜenia we krwi insuliny, zaś małego stęŜenia adrenaliny i kortyzolu. W odróŜnieniu od kwashiorkor w marazmie stwierdza się niskie stęŜenie insuliny i wysokie stęŜenie kortyzolu. Takie zmiany hormonalne sprzyjają katabolizmowi białek, głównie mięśni i są przyczyną znaczniejszych zaników mięśniowych u chorych z wyniszczeniem niŜ z kwashiorkor. Ponadto dzięki niskim stęŜeniom adrenaliny w kwashiorkor nie dochodzi do tak duŜej mobilizacji tłuszczów z tkanki tłuszczowej jak w marazmie. Dieta ubogobiałkowa jest przyczyną spadku syntezy białek osocza, w tym szczególnie albumin i transferyny oraz zmniejszonej syntezy hemoglobiny. W następstwie niedostatecznej syntezy białek w wątrobie oraz podaŜy węglowodanów w ilościach wystarczających rów-

BIOCHEMIA A CHOROBY / 855

nieŜ do syntezy lipidów, dochodzi do akumulacji triglicerydów w hepatocytach oraz co za tym idzie, do stłuszczenia wątroby. W PEM upośledzona jest równieŜ funkcja układu immunologicznego, szczególnie czynność limfocytów T. Ten defekt jest przyczyną duŜej podatności tych chorych na zakaŜenia (np. wywołujące biegunkę). Z kolei infekcje pogarszają istniejącą sytuacje metaboliczną, nasilają katabolizm ustrojowy (np. wywołując gorączkę). Rozwojowi kwashiorkor moŜna całkowicie zapobiec podając dzieciom jakościowo i ilościowo wywaŜoną dietę zawierającą dostateczne ilości białka i egzogennych aminokwasów. Przypadek 3. Cholera (ryc. 62-3). Klasyfikacja. Przyczyna choroby — biologiczna, bakteryjna.

ZakaŜenie przecinkowcem cholery

Uwalnianie enterotoksyny (zawierającej podjednostki A„ ^ i B) do światła jelita cienkiego

Wiązanie się enteraloksyny z gangllozydem GM, za pośrednictwem swoich podjednostek

Uwalnianie się podjednoelki A, przechodzącej przez btony plazmatyozne enterocytów

Podjednostka A, katalizuje ADP-rybozylację białka G, błony plazmatyczne), pKez co białko to traci swoją aktywnoSt GTP-azową

Wywiady i badanie fizyczne. 21-letnia studentka, pracująca w jednym z krajów rozwijających się, nagle zaczęła wydalać wodniste stolce prawie w sposób ciągły. Wkrótce do biegunek dołączyły się wymioty, co stało się przyczyną gwałtownego pogorszenia ogólnego stanu chorej i skierowania jej do miejscowego szpitala wiejskiego. Przy przyjęciu chora wykazała sinicę oraz obniŜoną spręŜystość skóry, obniŜone ciśnienie tętnicze (70/56 mm Hg, wartość normalna 120/80 mm Hg) oraz przyspieszone i słabo napięte tętno. Lekarz dyŜurny rozpoznał cholerę, pobrał próbkę stolca na posiew i natychmiast rozpoczął leczenie. Leczenie. Polegało na doŜylnym podawaniu roztworu sporządzonego w szpitalu, a zawierającego 5 g NaCl, 4 g NaHCO3 i lg KC1 w jednym litrze apirogennej wody destylowanej. Roztwór ten podawano początkowo szybko w ilości 100 ml/kg mc/h do chwili normalizacji ciśnienia tętniczego i uzyskania dobrze wypełnionego tętna. Równocześnie chorej podawano tetracyklinę. Począwszy od drugiego dnia chora była juŜ zdolna do doustnego pobierania płynu zalecanego przez Światową Organizację Zdrowia do nawodnienia (ORS — orał rehydration solution). Składa się on z 20 gglukozy, 3,5 g NaCl, 2,5 g NaHCOs i ],5 g KG rozpuszczonych w 1 litrze wody pitnej. Począwszy od czwartego dnia do chwili przyjęcia do szpitala chorej włączono pokarmy stałe. Chora szybko wracała do zdrowia i została wypisana ze szpitala w 7 dniu po przyjęciu. Dyskusja. Cholera jest powaŜną chorobą zakaźną występującą endemicznie w niektórych krajach Azji i innych częściach globu ziems-

Przewlekła stymulacja cyklazy a de n/1 an owej

Wzrosl stęŜenia cAMP w enterocyiaeh Wony Śluzowej

cAMP aktywują jedną lub więcej cAMP-zaleŜnych kinaz białek, przez co dochodzi do zmiany funkcji systemów Iran sportowych enterocytów przez fosforylację pewnych białek transportowych

Masywna utrata ze stolcem Janów + + Na , Cr, HCO; K I wody

Ryc. 62-3. Mechanizmy uczestniczące w patogenezie biegunek spowodowanych cholerą.

kiego. Wywołuje ją przecinkowiec cholery {Vibrio cholerne), wydzielający enterotoksynę, Enterotoksyna składa się z jednej podjednostki A (złoŜonej z peptydów Ai i A2 połączonych ze sobą wiązaniem d wusiarczkowym) oraz z 5 podjednostek B. Jej masa cząsteczkowa wynosi w przybliŜeniu 84 000. W jelicie cienkim enterotoksyna wiąŜe się za pośrednictwem podjednostek B z gangliozydem GMr (strukturę GMi przedstawia ryc. 15-20), występującym w błonie plazmatycznej enterocytów błony śluzowej. Następnie odłącza się podjednostka A, po czym peptyd A| przenika przez błonę plazmatyczną do jej wewnętrznej powierzchni. Peptyd ten katalizuje ADP-rybozylację (donorem jest NAD) białka regulatorowego G51 przez co hamuje jego aktywność GTP-azową i utrwala

856 / ROZDZIAŁ 62

jego postać aktywną. W ten sposób cyktaza adenylanowa ulega przewlekłej aktywacji (p. rozdz. 46). W wyniku ciągłej aktywacji cyklazy adenylanowej wzrasta śródkomórkowe stęŜenie cA MP. Ten o statni z kolei akty w uje kin azę białek fosforylującą jedną lub więcej białek błonowych uczestniczących w transporcie aktywnym. Konsekwencją wymienionego łańcucha zdarzeń jest zahamowanie wchłaniania NaCl przez enterocyty (za pośrednictwem obojętnego kosystemu transportującego NaCl) oraz wydzielania jonów Ci do światła jelita cienkiego. Wymienione zjawiska są przyczyną masywnego wydzielania Na i wody do światła jelita i wodnistych stolców charakterystycznych dla cholery. Struktura histologiczna jelita cienkiego pozostaje zadziwiająco nienaru szo na po mimo strai nie tylko Na i wody. ale równieŜ Cl, HCO^ i K. Utrata tych składników jest przyczyną ogromnych strat płynów ustrojowych, hipowolemii, k w a s i c y n i e o d d e c h o w e j i z u b o Ŝ en i a u st r o j u w potas występujący w cięŜkich przypadkach cholery. Wymienione zmiany mogą być przyczyna zgonu, jeŜeli właściwe leczenie substytucyjne (opisane wyŜej) nie zostało rozpoczęte natychmiast. Wykrycie i łatwa dostępność właściw y ch p ły n ó w zastęp czy ch (n p . pły n u O R S ) w bardzo znacznym stopniu poprawiły wyniki leczenia cholery. NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe istotnym składnikiem płynu ORS jest glukoza. ChociaŜ toksyna choleryczna hamuje wchłanianie NaCl przez enterocyty jelitowe, nie ma ona wpływu na dokomórkowy transport Na ułatwiony przez glukozę. P rzypadek 4. Za w ał serca (r y c. 6 2 -4 ). Klasyfikacj a. P rzy czy n a ch o ro b y — b rak tlenu, ■*">

Zmiany rriiaidzycowe w obrębie naczyri wieńcowych (najczęściej uwarunkowane wielogenowo)

Powstanie duŜego zakrzepu w obrębie letnicy wieńcowej

Pozbawienie mienia sercowego napływu krwi (niedokrwienie mięśnia sercowego)

Przesunięcie przemian w kierunku glikotizy beztlenowej, spadek syntezy ATP, zuboŜenie puli nukleotydów

Wzrost stęŜenia w kardiocytach MftDH z powodu braku fnsforylacji oksydatywfiej

Gromadzenie się kwasu mlekowego i innych metabolitów powodujących wzrost molainości ptynu śród kom orkowego oraz zmianę przepuszczalności błon komórkowych

Spadek pH w kardiotitlocytach

Narastająca nieskuteczność skurczów mięśnia sercowego

Zaprzestanie kurczenia SIĘ mięśnia sercowego

Aktywacja fosfolipaz błon komórkowych, degradacja + białek przez prateazy, napływ Ca do komórek

Śmierć dotkniętych chorobą obszarów mięśnia sercowego

Wywiady i badanie fizyczne. Na Oddział Nagłej Pomocy lokalnego szpitala został przyjęty 46-letni człowiek interesu z powodu trwających od dwóch godzin silnych bólów zamostk owych. Uprzednio chory ten był juŜ raz hospitalizowany w celu leczenia „małego" zawału serca (MI). Pomimo tego nie przestał palić papierosów. Jego ciśnienie tętnicze wynosiło 150/90 mm Hg {dla jego grupy wiekowej normalne ciśnienie tętnicze wynosi ! 40/80 mm Hg), zaś jego tętno 60 uderzeń na minutę. Skóra chorego była zlana potem. U pacjenta nie stwierdzono objawów niewydolności serca. Podejrzewając zawał serca choremu podano morfinę w celu zmniejszenia bólów j stanu lękowego, po czym przeniesiono go na oddział kardiologiczny, gdzie natychmiast rozpoczęto ciągłe monitorowanie EKG.

Ryc. 62-4. Mechanizmy uczestniczące w powstawaniu ostrego zawału mięśnia sercowego u osób dorosłych. Strzałki poniŜej prostokątów nie zawsze wskazują na występowanie ścisłego przyczynowego powiązania . zjawisk wymienionych w obrębie prostokątów.

Badania laboratoryjne. W pierwszym EKG stwierdzono uniesienie odcinka ST w pewnych odprowadzeniach oraz inne zmiany wskazujące na obecność przezściennego zawahi przedniej ściany lewej komory serca. Cztery godziny od wystąpienia bólów, a następnie w regularnych odstępach czasowych pobierano próbki krwi do oznaczenia izozymu MB fosfokinazy kreatynowej (CK). W czwartej godzinie

BIOCHEMIA A CHOROBY / 857

aktywność tego izozymu była lekko podwyŜszona, zaś w 12 godzinie 4-krotnie wyŜsza niŜ normalnie. StęŜenie cholesterolu było umiarkowanie podwyŜszone (6,5 mmol/I), zaś triglicerydów normalne. Leczenie. DyŜurujący kardiolog, po uwzględnieniu wszystkich aspektów choroby, w tym szczególnie faktu stwierdzenia cech przezściennego zawału ściany przedniej mięśnia sercowego w 4 godziny po wystąpieniu pierwszych objawów zadecydował o podawaniu streptokinazy (SK) za pośrednictwem cewnika do naczyń wieńcowych. Po 12 godzinach bóle w klatce piersiowej zaczęły ustępować i chory czuł się coraz lepiej. Dziesięć dni później pacjent został wypisany do domu z zaleceniem dalszego nadzoru przez lekarza domowego i rozpoczęcia leczenia obniŜającego stęŜenie cholesterolu we krwi (poprzez stosowanie diety ubogiej w nasycone kwasy tłuszczowe i inhibitora reduktazy HMG-CoA) oraz zaprzestania palenia papierosów. Dyskusja. Pelnościenny zawał mięśnia sercowego (MI) spowodowany jest najczęściej przez skrzep linę zamykającą lub prawie zamykającą światło naczynia wieńcowego, połoŜoną w bliskim sąsiedztwie z blaszką miaŜdŜycową. Najczęściej rozpoznanie moŜna postawić na pods"tawie wywiadów, wyniku badania EKG oraz seryjnych wyników oznaczenia izozymu MB fosfokinazy kreatynowej (CK) (p. Dodatek). CeJem leczenia MI jest zapobieganie śmierci spowodowanej zaburzeniami rytmu przez podawanie odpowiednich leków oraz zmniejszenie obszaru objętego zawałem. W opisanym przypadku podjęto decyzję podawania streptokinazy do naczyń wieńcowych w celu ograniczenia obszaru zawałowego i rozpuszczenia skrzepimy (p. rozdz. 58). Enzym ten jest znacznie tańszy od tkankowego aktywatora plazminogenu (TPA) wykazując przy tym prawie taką samą skuteczność jak TPA. Dla terapii długofalowej przepisano lek obniŜający stęŜenie cholesterolu w osoczu, mianowicie inhibitor reduktazy HMG-CoA. W tym miejscu tylko bardzo krótko omówione zostaną przyczyny zmian miaŜdŜycowych tętnic wieńcowych, które były przyczyną powstania skrzepliny zamykającej światło naczynia. Po szczegóły na ten temat naleŜy sięgnąć do podręcznika patologii. Rozwojowi miaŜdŜycy sprzyjają wysokie stęŜenia LDL i małe stęŜenia HDL w surowicy, nieznane jeszcze czynniki genetyczne oraz róŜnorodne czynniki ryzyka,

takie jak nadciśnienie tętnicze, duŜe stęŜenie cholesterolu w surowicy oraz palenie papierosów. Opisany w tym podrozdziale chory wykazywał podwyŜszone stęŜenie cholesterolu oraz był nałogowym palaczem. Na początku uszkodzeniu ulega błona wewnętrzna naczynia (intima), w której gromadzą się makrofagi, lipoproteiny osoczowe, glukoza mi nogi i kany i sole wapnia tworząc zmiany określane jako pasma tłuszczowe (fatty streaks). Na luminalnej powierzchni tych zmian mogą się gromadzić płytki krwi i fibryna. Do tych zmian błony wewnętrznej naczynia wrastają monoklonalne miocyty naczyniowe przyciągane przez czynniki wzrostowe, uwalniane przez makrofagi i trombocyty. Te ostatnie uwalniają „płytkowy czynnik wzrostowy ". Tak tworzy jsię zmiana naczyniowa określana jako blaszka błony wewnętrznej (intimal plaque). Krwotoki do blaszki lub (i) zmiany zapalne sprawiają, Ŝe przerwana zostaje ciągłość nabłonka pokrywającego blaszkę i odsłonięciu ulegają jej składowe. Do tych ostatnich przylegają płytki tworząc początek skrzepliny (p. rozdz. 58). JeŜeli skrzeplina zamyka światło naczynia w 90%, wówczas ustaje krąŜenie przez dotknięte naczynie i krew włośniczkowa bardzo szybko zostaje pozbawiona tlenu. Normalna przemiana mięśnia sercowego ma charakter tlenowy i większość ATP wytwarzana jest w czasie fosforylacji oksydacyjnej. W razie wystąpienia anoksji spowodowanej niedokrwieniem dochodzi do przestawienia się przemiany materii mięśnia sercowego na glikoli* ę beztlenową. Wytwarza ona zaledwie '/n> ATP powstającego w procesie fosforylacji oksydacyjnej. W obszarze niedokrwionym dochodzi nie tylko do przestawienia się metabolizmu na glikolizę beztlenową, ale równieŜ do spadku substratów energodajnyeh oraz oczyszczania tkanek z końcowych produktów przemiany materii. Z kolei gromadzenie się metabolitów w obrębie komórek jest przyczyną wzrostu molalności płynu śródkomórkowego, co prowadzi do obrzęku komórek i zmian przepuszczalności błon komórkowych. Następstwami zawału serca są: utrttta ATP, nagromadzenie się kwasu mlekowego z następczą cięŜką kwasicą metaboliczną oraz znaczna redukcja siły skurczowej kardiomiocytów. W takich warunkach metabolicznych całkowicie ustaje synteza makrocząsteczek i nukleotydów. Gromadzenie się w komórkach mleczanów i jonów H+ hamuje glikolizę na poziomie działania dehydrogenazy gliceroaldehydofosforanowej i jest

852 / ROZDZIAŁ 62

przyczyną niedoboru utlenionej postaci NAD normalnie regenerowanego w procesie fosforylacji oksydacyjnej. W miarę obniŜenia się stęŜenia ATP wzrasta przynajmniej na początku stęŜenie ADP. Z kolei ADP ulega konwersji do AMP przez mięśniową kinazę adenylanową, po czym AMP jest przedmiotem dalszego rozkładu do adenozyny przez deaminazę adenozynową. W końcu adenozyna ulega przekształcaniu do inozyny i innych produktów katabolizmu puryn. Wszystkie wymienione reakcje w bardzo znacznym stopniu zmniejszają pulę mikleotydów adeninowych stanowiących główny składnik normalnej przemiany komórkowej. Wykazano, Ŝe po cięŜkim niedokrwieniu mięśnia sercowego psa trwającym 40 minut zawartość w nim ATP spada do 10% v*artośd prawidłowej. Wyczerpanie się puli nukleotydów adeninowych odbywa się w tym samym czasie, w którym rozwija się nieodwracalne uszkodzenie komórek, co niekoniecznie oznacza przyczynowy związek między tymi zjawiskami. W chwili obecnej nie ustalono jeszcze, które z zaburzeń metabolicznych skazuje komórki .na umieranie. Wśród takich zaburzeń wymienia się wyczerpanie się zasobów ATP, aktywację śródkomórkowych fosfolipaz (są one przyczyną uszkodzenia błon komórkowych), aktywację proteaz oraz wzrost śródkomórkowego stęŜenia Ca2 + , Ogólnie mówiąc, im wcześniej podjęto próby przywrócenia perfuzji niedokrwionego mięśnia sercowego, tym lepiej. W 6 godzin po niedokrwieniu mięśnia sercowego prawdopodobnie dochodzi do nieodwracalnego jego uszkodzenia. Dodać jednak naleŜy, Ŝe juŜ po 1-godzinnym całkowitym niedpkrwieniu niektóre komórki ulegają nieodwracalnemu uszkodzeniu. Z tego wynika, Ŝe rozpoczęcie leczenia streptokinazą musi być moŜliwie wczesne. Przedmiotem duŜego zainteresowania biochemików i klinicytów są równieŜ zjawiska biochemiczne występujące po reperfuzji (spowodowanej np. podaniem streptokinazy) uprzednio medokrwionego obszaru mięśnia sercowego. Reperfuzja moŜe być równieŜ przyczyną śmierci komórek spowodowanej tzw, szkodą reperftizyjną (reperfusion injury). Jak o tym juŜ wspomniano, niedokrwienie uszkadza błony plazm atyczne (będące miejscem działania róŜnych pomp jonowych), przez co dochodzi do głębokich zmian ich przepuszczalności i potencjału błonowego. W następstwie tych zmian w czasie reperfuzji nasila się napływ róŜnych związków do komórek, m.in. jonów Ca2 + . Wzrost śród-

komórkowego stęŜenia Cai+ wywołuje spustoszenie i dezorganizację wnętrza komórek poprzez aktywację lub hamowanie róŜnych enzymów w sposób nieuporządkowany. Wiele faktów sugeruje, Ŝe w powstawaniu szkody reperfuzyjnej uczestniczą równieŜ wolne rodniki, tj. wysoce reaktywne, częściowo zredukowane metabolity tlenu, takie jak rodniki nadtlenkowe (O2) i hydroksylowe (OH). Szczególnie reaktywne są rodniki OH. Mogą je wytwarzać komórki mięśnia sercowego lub krąŜące we krwi leukocyty wielojądrzaste (PMNL). Rodniki te uszkadzają komórki, wywołując peroksydację lipidów, przerywając łańcuchy DNA i utleniając grupy SH białek. Anion nadtlenkowy powstaje przez przeniesienie pojedynczego elektronu na cząsteczkę O2 zgodnie z równaniem: O2 + e" —*■ O2

Generacja rodników O2 nie ma miejsca w reakcjach katalizowanych przez cytochrom P-450, oksydazę ksantynową oraz oksydazę NADPH, występujące w leukocytach wielojądrzastych. Enzym—dyzmutaza nadtlenkowa (SOD)—katalizuje następującą reakcję: O; + O" 2 + 2H + -► H 2 O 2 + O 2

Jak widać enzym ten likwiduje aniony nadtlenkowe przekształcając je do mniej toksycznego nadtlenku wodoru (wody utlenionej). Przeprowadzono doświadczenia, które miały odpowiedzieć na pytanie, czy podawanie dysmutazy ponadtlenkowej podczas reperfuzji chroni mięsień sercowy przed szkodą reperfuzyjną. Niestety, wyniki tych badań nie były jednoznaczne. Tak więc do wyjaśnienia pozostaje rola anionów ponadtlenkowych w patogenezie szkody reperfuzyjnej. Niemniej przedmiotem wielkiego zainteresowania jest obecnie rola wolnych rodników w licznych rodzajach uszkodzeń komórek oraz w patogenezie»chorób. Przypadek 5. Ostre zatrucie etanolem (ryc. 62-5). Klasyfikacja. Przyczyna choroby—chemiczna.

Wywiady i badanie fizyczne. Na oddział intensywnej opieki lekarskiej przyjęty został 52-letni chory w śpiączce. Miesiąc wcześniej zmarła Ŝona chorego. Po jej śmierci chory stał się coraz bardziej depresyjny. Przed śmiercią Ŝony naleŜał do umiarkowanych alkoholików. Konsumpcja alkoholu wzrosła jednak znacznie

BIOCHEMIA A CHOROBY / 859

Etanol ■

ADH MEOS Wnika do błon komórkowych

Zwiększa płynność błon

Aldehyd octowy

Tworzy adctukty z białkami i kwasami nukleinowymi

Pojawianie się objawów toksycznego działania, głównie ze strony mdzgu

Konwersja do kwasu octowego

AOH

Wzrost stosunku NAD H/N AO Wzrost stosunku mleczan/pirogronian Spadek g i uKaneogenezy Spadek spalania w/asów tłuszczowych Hamowanie dehydrogenazy glicei-ofosforanowej prowa dzące do wzrostu glicerofostoranu _________

Konwersja do acelyio-CoA

Wzrost syntezy kwasów tłuszczowych

Stłu szczenię wątroby

Ryc. 62-5. Mechanizmy uczestniczące w patogenezie toksyczności etanolowej

w ciągu ostatnich kilku tygodni. Ponadto chory odŜywia! się siabo. Jego córka, męŜatka, wpadła w niedzielę rano do domu ojca, znajdując go nieprzytomnego w saloniku na leŜance. Na stole saloniku znajdowały się dwie puste butelki po whisky. Przy badaniu chorego nie udało się go wybudzić, jego oddechy były głębokie i głośne, zaś w powietrzu wydechowym czuć było alkohol. Temperatura ciała wynosiła 35,5°C (normalna ciepłota ciała mierzona w odbytnicy nie przekracza 37,43C). Rozpoznanie przy przyjęciu chorego brzmiało: śpiączka spowodowana nadmiernym spoŜyciem etanolu.

Badania laboratoryjne. Wśród waŜnych wyników badań laboratoryjnych wykonanych we krwi chorego wymienić naleŜy następujące: stęŜenie etanolu 108,6 mmol/1 (500 mg/dl), stęŜenie glukozy 2,7 mmoi/1 (norma 3,6—6,1 mmol/1), stęŜenie mleczanów 8,0 mmol/1 (norma 0,5—2,2 mmol/1), oraz pH — 7,21 (norma 7,40). Wyniki tych badań potwierdziły rozpoznanie ustalone przy przyjęciu. Zatruciu etanolem towarzyszyła kwasica metaboliczna. Leczenie. Ze względu na wysokie stęŜenie etanolu we krwi oraz śpiączkę leczenie rozpoczęto od natychmiastowej hemodializy. Pozwala ona na bezpośrednią eliminację etanolu z ustroju, chociaŜ stosowana jest tylko w cięŜ-

kich zatruciach etanolem. W omawianym przypadku stęŜenie etanolu we krwi szybko spadło i jeszcze tego samego dnia chory odzyskał świadomość. Po zakończeniu hemodializy choremu zastosowano doŜylny wlew z 5% roztworu glukozy w celu zwalczania występującej u niego hipoglikemń. Chory bardzo szybko odzyskał zdrowie. Skierowano go jednak na konsultację psychiatryczną. Dyskusja. NaduŜywanie alkoholu jest duŜym problemem słuŜby zdrowia w większości społeczeństw. Przedstawiony przypadek dotyczy ostrych, toksycznych efektów spoŜycia nadmiernej ilości alkoholu. Innym problemem, związanym z naduŜywaniem etanolu, które wykazuje wiele aspektów biochemicznych, lecz nie będzie przedmiotem dyskusji, jest poalkoholowa marskość wątroby. Rozwija się ona u osób spoŜywających duŜe dawki etanolu (tj. 80 g absolutnego etanolu na dobę) przez więcej niŜ 10 lat. Z biochemicznego punktu widzenia, głównym problemem, jaki pojawił się u opisanego chorego, była odpowiedź na pytanie, w jaki sposób etanol wywołuje tak róŜne efekty toksyczne, jak kwasica mleczanowa i hipoglikemia oraz śpiączka? Problemem klinicznym było, jak optymalnie leczyć chorego.

860 / ROZDZIAŁ 62

Przemiana etanolu przedstawiona została w rozdz. 27. Odbywa się ona głównie w wątrobie dwoma szlakami, W głównym szlaku uczestniczą dehydrogenaza alkoholowa i dehyd-rogenaza acetaldehydowa przekształcająca etanol poprzez aldehyd octowy w kwas octowy. Z kolei ten ostatni ulega konwersji do acetylo--CoA. W obu reakcjach powstaje NADH + i H+. Tak wiec duŜe spoŜycie alkoholu moŜe w znacznym stopniu zmienić śródkomdrkowy iloraz NADH/NAD. Ten z kolei moŜe wpłynąć na wartość K licznych i waŜnych reakcji metabolicznych, w których uczestniczą te dwa kofaktory. Wysokie stęŜenie NADH sprzyja powstawaniu mleczanu z pirogronianu, co tłumaczy obecność kwasicy mleczanowej w zatruciu alkoholowym. Konsekwencją tych reakcji jest spadek stęŜenia pirogronianu (jest on niezbędny w reakcji katalizowanej przez kar-boksylazę pirogronianową) oraz zahamowanie glukoneogenezy. W cięŜkich zatruciach etanolem, w których doszło do wyczerpania się zapasów glikogenu i praktycznie nie zachodzi glikogenoliza, pojawia się hipoglikemia. W drugim szlaku przemiany etanolu uczestniczy mik-rosomalny cytochrom 450 (mikrosomalny układ utleniania etanolu — microsomal ethanol oxidi-zing system — MEOS) równieŜ wytwarzający aldehyd octowy. Aldehyd octowy jest wysoce reaktywnym związkiem tworzącym addukty z białkami, kwasami nukleinowymi i innymi cząsteczkami. Wydaje się prawdopodobne, Ŝe objawy toksyczne etanolu spowodowane są zdolnością wiązania się tego związku z innymi cząsteczkami. Etanol wykazuje równieŜ zdolność wnikania do Manjbiologicznych, wywołując ich ekspansje oraz zwiększając ich „płynność". JeŜeli błony te naleŜą do pobudliwych, etanol zmienia ich potencjał czynnościowy, zaburza i przezbłonowy transport oraz wpływa na uwalnianie neuroprzekaźników. Wszystko to działa depresyjnie na czynność mózgu. JeŜeli wymienione zmiany toksyczne są dostatecznie duŜe, mogą one spowodować śpiączkę, a nawet śmierć (uwarunkowaną poraŜeniem ośrodków oddechowych). Przypadek 6. Dystrofia mięśni typu Duchenne'a (ryc. 62-6). Klasyfikacja. Przyczyna genetyczna.

Wywiady i badanie fizyczne. Do szpitala dziecięcego przyniesiono 4-letniego chłopca. Jego matka była bardzo zmartwiona tym, Ŝe dziecko poruszało się dziwnie, często przewracało się i miało trudności przy chodzeniu po

Delecja części genu strukturalnego ctyslrofiny, zlokalizowanego w chromosomie X

ObniŜona synteza mRNA kodującego dystrofinę

Małe stęŜenie lub brak dystrofiny w komórkach mięśniowych

Zmiany skurczu I rozkurczu komórek mięśniowych (dokładny mechanizm nie jest znany)

Postępujące osłabienie mięśni szkieletowych, zwykle kończące się zgonem

Ryc. 62-6. Mechanizmy uczestniczące w powstawaniu dystrofii mięśni typu Duchenne'a.

schodach. Dziecko nie miało rodzeństwa, lecz brat matki zmarł w 19 roku Ŝycia z powodu dystrofii mięśni. Przy badaniu lekarz stwierdził osłabienie siły mięśni i obręczy barkowej"i miednicznej oraz lekkie powiększenie mięśni łydek. Uwzględniając osłabienie siły mięśniowej oraz rozmieszczenie dotkniętych mięśni pediatra postawił wstępne rozpoznanie dystrofii mięśni typu Duchenne'a (dystrophia musculomm m. Duchenne — DMD).

Badania laboratoryjne i inne testy diagnostyczne. Aktywność fosfokinazy kreatynowej była znacznie podwyŜszona. Wynik badania etektromiograficznego potwierdził rozpoznanie dystrofii mięśni, podczas gdy przewodnictwo nerwowe było prawidłowe. W bioptacie z mięśnia łydkowego stwierdzono ogniskową martwicę oraz pewne odchylenia wielkości włókien mięśniowych. UŜywając sondy cDNA dla dystrofmy wykazano, posługując się metodą Southern blotting, brak genu kodującego to białko. Ponadto w bioptacie mięśnia wykazano brak dystrofiny uŜywając metody elektroforezy dwukierunkowej. Dyskusja. Wywiad rodzinny, typowa topografia osłabienia mięśni, podwyŜszona aktywność fosfokinazy kreatynowej (CK) w surowicy krwi, wynik badania elektromiograficznego, obecność w bioptacie nieprawidłowego genu kodującego dystrofinę — wszystko potwierdziło wstępne rozpoznanie DMD postawione przez pediatre.BMD jest cięŜką chorobą zwyrodnieniową mięśni związaną z chromosomem X.

BIOCHEMIA A CHOROBY / 861

Częstość jej występowania ocenia się na I przypadek na 3500 Ŝywo urodzonych chłopców. Dotyczy ona chłopców w młodym wieku objawiając się najpierw utratą siły mięśni proksymalnych (dosiebnych), kaczkowatym chodem, trudnościami w stawaniu oraz w końcu bardzo znacznym osłabieniem. Liczne badania pozwoliły zlokalizować defekt w środkowym odcinku krótkiego ramienia chromosomu X oraz zidentyfikować segment DNA, który ulega delecji u chorych na DMD. UŜywając metody odwrotnej transkrypcji uzyskano za pomocą transkryptu mRNA, liczącego 14 kilozasad, a kodującego dystrofine u zdrowych, osób dorosłych i u płodów, odpowiadający mu cDNA. Ten ostatni sklonowano i uzyskano białko — dystrofinę o masie cząsteczkowej ok. 400 000, wykazujące kształt pręcików oraz składające się z 3 685 aminokwasów. W bioptatach mięśniowych pochodzących od chorych na DMD oraz od szczurów z dystrofią mięśni sprzęŜoną z chromosomem X (mdx), poddanych elektroforezie Ŝelowej, nie stwierdzono obecności dystrofiny. W celu umiejscowienia dystrofiny w mięśniach wytworzono przeciwciała antydystrofinowe. Za ich pomocą wykazano, Ŝe dystrofina występuje w sarkolemie (błonie komórkowej miocytów) osób zdrowych, zaś jest nieobecna lub występuje w niewielkiej ilości w sarkolemie miocytów chorych na DMD. Niedobór dystrofiny wydaje się równieŜ uczestniczyć w etiologii dystrofii mięśni Beckera, będącej inną, łagodniejszą postacią dystrofii mięśni, najpewniej odmianą alieliczną DMD. Dystrofina wydaje się posiadać 4 domeny, Dwie z nich są podobne do domen występujących w ct-aktyninie i jedna do domeny spektryny. Spektryna jest białkiem błonowym cytoszkieletu, ułatwiającym krwinkom czerwonym zmianę kształtu przy przechodzeniu przez naczynia włosowate. Per analogiam spekulowano, Ŝe dystrofina moŜe umoŜliwiać komórkom mięśniowym kurczenie lub rozkurczenie się za pośrednictwem zmian błonowych, lub teŜ, Ŝe moŜe uczestniczyć w stabilizacji sarkolemy (błony plazmatycznej miocytów). Dalsze badania wykazały, Ŝe gen kodujący dystrofine jest największym genem znanym u człowieka. Ten fakt ułatwia wyjaśnienie obserwacji, Ŝe u ok. ' < chorych, DMD spowodowana jest nowymi mutacjami. Podjęto juŜ próby wytwarzania dystrofiny technologią rekombinacji DNA w celu ewentualnego podania tego białka chorym na

DMD. W diagnostyce prenatalnej oznaczanie dystrofiny jest bezcelowe, ekspresja tego białka występuje bowiem tylko w komórkach mięśniowych, a nie w komórkach owodniowych lub kosmówkowych. Dostępność cDNA kodującego dystrofmę ułatwia jednak prenatalną diagnostykę DMD w bioptatach kosmówki lub komórkach owodni uzyskanych drogą amnio-centezy. Oznaczenie dystrofiny ułatwi klasyfikację róŜnych postaci DMD na takie, w których dystrofina odgrywa rolę oraz inne,w których nie odgrywa Ŝadnej roli. Udowodnienie udziału dystrofiny w powstawaniu DMD naleŜy zaliczyć do jednego z największych osiągnięć bio- ' logii molekularnej w patologii ludzkiej. Leczenie. Do chwili obecnej nie ma skutecznego leczenia DMD. Stad teŜ terapia tej choroby ma charakter objawowy. Dziecko zachęcano do wykonywania ćwiczeń i regularnego zgłaszania się do specjalistycznej kliniki dla chorych na dystrofię mięśni celem moŜliwie szybkiego leczenia powikłań mogących pojawić się u takich chorych. Matce poradzono, by sięgnęła po poradę genetyczną. NaleŜy wyrazić nadzieję, Ŝe postępy w zakresie przyczyn choroby przyczynią się do bardziej swoistej i skutecznej terapii juŜ w najbliŜszej przyszłości. Przypadek 7. Agammaglobulinemia sprzęŜona z chromosomem X (ryc. 62-7). Klasyfikacja. Przyczyna immunologiczna, genetyczna.

Wywiady i badanie fizyczne. Do szpitala dziecięcego skierowano 3-letniego chłopca z powodu podwyŜszonej temperatury, bólów

Nie poznana jeszcze zmiana DNA w chromosomie X, będąca przyczyną braku lub znacznego upośledzenia transkrypcji kodu dla łańcuchów H I L immunoglobutin

Brak lub znacznie zmniejszone stęŜenie Irrmunoglobutln w osoczu krąŜącym

Zmniejszona odporność na zakaŜenia pewnymi rodzajami bakterii

W wywiadach częste występowania zakaŜeń bakteryjnych

Ryc. 62-7. Mechanizmy uczestniczące w powstawaniu agammaglobulinemii sprzęŜonej z chromosomem X.

862 / ROZDZIAŁ 62

w klatce piersiowej i trudności oddychania. Lekarz domowy rozpoznał prawidłowo zapalenie pluć. PoniewaŜ uprzednio u starszego brata dziecka rozpoznano agammaglobulinemię sprzęŜoną z chromosomemX, u lekarza kierującego zrodziła się myśl, Ŝe występujące u młodszego brata zapalenie płuc mogło być spowodowane brakiem syntezy gammaglobulin. Badania laboratoryjne. Badaniem elektroforę tycznym białek surowicy wykazano prawidłowe stęŜenia albumin i globulin a i P, natomiast śladowe ilości y-globulin. Liczba limfocytów B we krwi była niezwykle niska (wynosiła ok. 1% wartości prawidłowej), natomiast limfocytów T — prawidłowa. W bioptacie węzła limfatycznego wykazano brak komórek plazmatycznych. Inne wskaźniki układu immunologicznego, np. składniki dopełniacza, były prawidłowe. W plwocinie wykryto obecność paciorkowca zapalenia płuc (Streptococcus pneumoniae). Dyskusja. Zaburzenia układu immunologicznego mogą dotyczyć limfocytów B (wytwarzających immunoglobuliny) lub T (warunkujących odporność komórkowozaleŜną). W tym podręczniku dyskutowano jedynie humoralny układ immunologiczny (rozdz. 58). Przypadek przedstawiony w tym podrozdziale zademonstrowano ze względu na dramatyczną utratę odporności anty bakteryjnej (przeciwko pneumokokom) występującej przy bardzo znacznym spadku stęŜenia immunoglobulin osoczowych. Fenotypowo była to anomalia immunologiczna, chociaŜ jej przyczyną był defekt genetyczny. Wywiady rodzinne, obecność tylko kilku krąŜących limfocytów B, bardzo znaczna redukcja stęŜenia krąŜących immunoglobulin we krwi oraz brak komórek plazmatycznych — to wszystko potwierdziło rozpoznanie wstępne lekarza domowego, Ŝe chodzi o agammaglobulinemię sprzęŜoną z chromosomem X. Agammaglobulinemia sprzęŜona z chromosomem X dotyczy chłopców w młodym wieku (podobnie jak DMD, przypadek 6) i jest raczej bardzo rzadkim schorzeniem, bo stwierdzonym i opisanym u zaledwie 200 chorych. Dokładny charakter defektu nie jest znany, chociaŜ wiadomo, Ŝe jest on sprzęŜony z chromosomem X. ChociaŜ we krwi krąŜącej znajdowało się zaledwie kilka limfocytów B, w szpiku kostnym liczba prolimfocytów B (limfoblastów) była normalna. Jest rzeczą interesującą, Ŝe po fuzji limfocytów B, pochodzących od chorych zragammaglobułinemią, z komórkami szpiczakowymi myszy, po-

wstałe komórki hybrydowe wydzielają łańcuchy cięŜkie (H) i lekkie (L) ludzkich immunoglobulin. Dowodzi to obecności w limfocytach B genów strukturalnych dla łańcuchów H i L, które z jakichś powodów nie ulegają ekspresji. Przypadek 8. Cukrzyca typu I z kwasicą ketonową (ryc. 62-8). Klasyfikacja. Przyczyna choroby — niedobór hormonu, brak insuliny.

Wywiady i badanie fizyczne. Do szpitala dziecięcego przyjęto 14-letnią dziewczynę w stanie śpiączki. Matka podawała, Ŝe córka czuła się dobrze jeszcze dwa tygodnie przed przyjęciem, kiedy to zachorowała na wrzodziejące zapalenie gardła i miała umiarkowaną gorączkę. Od tego czasu córka straciła apetyt i czuła się ogólnie źle. Kilka dni przed przyjęciem skarŜyła się na nadmierne pragnienie oraz potrzebę kilkakrotnego wstawania w nocy, aby oddać mocz. Lekarz domowy wyjechałz miasta, zaś matka ociągała się z kontaktowaniem się z innym lekarzem. W dniu przyjęcia dziecko zaczęło wymiotować, było śpiące i trudne do obudzenia. Ten stan był przyczyną zgłoszenia się z dzieckiem na oddział nagłych przypadków chorobowych. Przy badaniu stwierdzono, Ŝe dziecko jest odwodnione, wykazuje zimną skórę ora2 pogłębiony oddech (oddech Kmsmaula). Ponadto powietrze wydechowe miało zapach owoców. Ciśnienie tętnicze wynosiło 90/60, zaś tętno 115 uderzeń na minutę. Dziecka nie udało się obudzić. DyŜurujący internista rozpoznał cukrzycę insulinozaleŜną (cukrzycę typu I) powikłaną kwasicą ketonową ze śpiączką. Wyniki badań laboratoryjnych zestawiono poniŜej: A. Badania osocza krwi Glikemia 35 mmol/l (norma: 3,6-6,1 mmol/i) p-Hydroksymaślan 13 mmol/l (norma: < 0,25 mmo!/l) Acetooctan 2,8 mmol/l (norma: < 0,2 mmol/l) Wodorowęglany 5 mmol/l (norma: 24-28 mmol/l) Mocznik 12 mmol/l (norma: 2,9-8,9 mmol/l) + StęŜenie H we krwi tętniczej 89 mmol/l {= pH 7,05), (norma 34,7-45,5 nmol/l = pH 7,45-7,35} Potas 5,8 mmol/l (norma: 3,5-5,0 mmol/l) Kreatynina 160 jimol/i (norma 60-132 jimol/l).

8. Mocz Glukoza + + + + Ciała ketonowe ++ + +

Wyniki badań laboratoryjnych potwierdziły więc rozpoznanie wstępne.

BIOCHEMIA A CHOROBY / 863

Genetycznie uwarunkowana podatność na infek^s wirusowe z następującym auł o immunologicznym uszkodzeniem komórek 0 wysp trzustki

Zmniejszona synteza Insuliny przez komórki p trzustki

Liczne następstwa

Przemiana węglowodanowa Spadek poboru glukozy przez niektóre komórki Wzrost glukoneogenezy Wzrost glikogenolizy

Przemiana tłuszczowa Wzrost lipolizy Wzrost utleniania kwasów tłuszczowych Wzrost produkcji związków ketonowych

Przemiana białkowa Spadek synlezy białek Wzrost katabolizmu białkowego

Przemiana wodna ł potasowa i H Spadek napływu K+ do komórek Utrata wody s powód owa na diurezą osmotyczną (glikozurią) Kwasica spowodowana wzmoŜoną produkcją ciał ketonowych

Ryć. 62-8. Mechanizmy uczestniczące w powstawaniu kwasicy ketonowej u chorych na cukrzyce insulinozaleŜną.

Leczenie. W leczeniu kwasicy ketonowej u chorych na cukrzycę (DKA) najwaŜniejsze znaczenie ma doŜylne podawanie insuliny i roztwofu fizjologicznego chlorku sodu. Chorej po-

dawano doŜylnie insulinę w ilości 10 IU na godzinę wraz z 0,9% roztworem Nad Nie podano natomiast glukozy do chwili obniŜenia się glikemii poniŜej 13,8 mmol/1 (250 mg/dl). Podawano równieŜ bardzo ostroŜnie chlorek potasu, określając co godzinę kaliemię. Stałe monitorowanie stęŜenia potasu w osoczu krwi jest niezwykle waŜne w leczeniu DKA, zaburzenia bowiem bilansu potasowego są główną przyczyną zgonu u tych chorych. Podawanie wodorowęglanu nie jest stosowane rutynowo i zarezerwowane tylko dla przypadków bardzo cięŜkiej kwasicy ketonowej w przebiegu cukrzycy. Dyskusja. Dotychczas nie wyjaśniono dokładnie przyczyny cukrzycy typu I (insulinozaleŜnej). Jest ona najprawdopodobniej skutkiem następującego łańcucha zjawisk. Chorzy z tym typem cukrzycy wykazują genetycznie uwarunkowaną podatność sprzyjającą infekcjom wiruso-

wym. Infekcja oraz wywołana przez nią reakcja zapalna najpewniej zmieniają antygenowość błon komórek beta wysp trzustkowych inicjując

i limfocyty T. Proces ten jest przyczyną rozległej destrukcji komórek p i powstania cukrzycy insulinozaleŜnej. Być moŜe czynnikiem zapoczątkowującym cukrzycę u chorej była wirusowa infekcja przebyta kilka tygodni wcześniej pod postacią wrzodziejącego zapalenia gardła. Znaczna hiperglikemia, glikozuria, ketonemia i ketonuria potwierdziły rozpoznanie DKA. Niskie pH krwi świadczyło o cięŜkiej kwasicy spowodowanej wzmoŜoną produkcją kwasu acetooctowego i betahydroksymasłowego. Niskie stęŜenie wodorowęglanów i niskie ciśnienie cząstkowe dwutlenku węgla (pCO2) potwierdziły występowanie kwasicy metabolicznej częściowo wyrównanej oddechowo (hiperwentylacją). Lekko podwyŜszone stęŜenia kreatyniny i mocznika w surowicy krwi mogły być spowodowane nieco upośledzoną czynnością nerek (uwarunkowaną hipoperfuzją nerek jako następstwo hipowolemii), odwodnieniem oraz zwiększonym katabolizmem białek. W DKA często stwierdza się wzrost stęŜenia potasu w osoczu krwi, spowodowany zmniejszonym poborem tego elektrolitu przez komórki (uwarunkowanym brakiem insuliny).

proces autoimmunologiczny, w którym uczest-

Tak więc obraz kliniczny DKA jest odzwierciedleniem zaburzeń gospodarki węglowodanowej, tipidowej i białkowej spowodowanych gwał-

niczą zarówno przeciwciała cytotoksyczne, jak

townym spadkiem stęŜenia insuliny we krwi.

864 / ROZDZIAŁ 62 Przyczyny zaburzeń przemiany potasowej, wodnej i jonu H' występujące w DKA zestawione w ryc. 62-8, Wzrost molalności osocza uwarun-

kowany hiperglikemią równieŜ uczestniczy w powstawaniu śpiączki pojawiającej się w cięŜkiej DKA. Jest jasne, Ŝe racjonalne leczenie DKA zaleŜy od dogłębnej znajomości mechanizmów działania insuliny.

PIŚMIENNICTWO Connor JM, Ferguson-Smith MA: Essential Medical Geneńcs, 2nd ed. Blackwell Sci Pubi, 1987. Friedmann, T: Progress toward human gene therapy. Science 1989;244;1275. Halliwell B (editor): Oxygen Radicals and Tissue Injury. Proceedings of an Upjohn Symposium, 1988. Harding, AE; The mitochondrial genome— breaking ttemagicdrcle.JV£Mg//Medl989;320:L341.(.This

^

issue contains 3 other articles on mitochondrial DNA and human diseases.) Jennings RB, Reimer KA: Pathobiology of acute myocardial ischemia. Hosp Praa (Jan) 1989:24:89. Koenig M, Monaco AP. Kunkel LM: The complete seąuence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein. Celi 1988;53:219. Lieber CS: Biochemical and molecular basis of alcohol-induced injury io iiver and other tissues. New Robbins SL, Kumar V: Basie Palhotogy, 4th ed. WB SaundersCo, 1987. Rubin E, Farber, JL (editors): Pathology, lst ed. JB Lippincolt Co, 1988. Scriver CR, et at (editor): In: The Metabotic Basis of Inherited Disease. 6th cd. McGraw Hill Book Co, 1989. The Merck Manuał, 15th ed. Merck, Sharp & Dohme, 19S7. Toruń B, Viteri FE: In: Modern Mutrition in Health and Disease. 7th ed, Shils ME, Young VR (editors). Lea & Febiger, 1988. Vogel F, Motulsky AG: Human Cenetics, 2nd ed. Springer-Verlag, 1986. Weatheralt DJ: The New Genetics and Clinicał Practke, 2nd ed. Oxford Unrv Press, 1985.

Erytrocyty i leukocyty

63

Robert K. Murray, MD, PhD

i

WPROWADZENIE Krew składa się z osocza i róŜnych rodzajów komórek. Niektóre białka osocza opisane są w rozdz. 58. W niniejszym rozdziale omówione zostaną głównie biochemiczne cechy krwinek czerwonych (ery trocytów) ijednej grupy krwinek białych (leukocytów), a mianowicie granulocytów oboje, tnochłonnych (neutrofili). Krwinki białe dzielą się na 3 grupy: granulocyty, monocyty i limfocyty. Granulocyty (zwane równieŜ leukocytami o wielopostaciowym jądrze, poniewaŜ ich jądro jest wieiopłatowe) zawierają liczne lizosemy i ziarnistości (pęcherzyki wydzielnicze) i dzielą się na 3 klasy. Krwinki naleŜące do tych klas (granulocyty obojętnochłonne — neutrofile, granulocyty zasadochlonne — bazofile i granulocyty kwasochlonne — eozynofile) róŜnią się między sobą budową i powinowactwem ziarnistości do barwników. Granulocyty obojętnochionne fagocytują bakterie i odgrywają główną rolę w ostrych procesach zapalnych. Granulocyty zasadocMonne, które przypominają komórki tuczne (mastocyty), zawierają histaminę i heparynę oraz biorą udział w niektórych rodzajach nadwraŜliwości. Granulocyty kwasochłonne uczestniczą w reakcjach alergicznych i odpowiedzi ustroju na zakaŜenia pasoŜytnicze. Monocyty są prekursorami makrofagów, które podobnie jak granulocyty obojętnochłonne biorą udział w fagocytozie. Limfocyty dzielą się na limfocyty B i T. Limfocyty B wytwarzają przeciwciała (p. rozdz. 58). Limfocyty T odgrywają rolę w róŜnych formach odporności komórkowozaleŜnej, takich jak zabijanie komórek zakaŜonych wirusami t niektórych komórek nowotworowych. Szczegóły tych zjawisk moŜna znaleźć w podręcznikach immunologii. Granulocyty obojętnochłonne i limfocyty stanowią 55 — Bfodicoiia

dominujące ilościowo grupy krwinek białych obecnych we krwi w warunkach prawidłowych. Udział płytek krwi w fefzepnięciu został omówiony w rozdz. 58 i nie będzie przedstawiony w niniejszym rozdziale. RóŜnicowanie komórek krwi z komórki pnia (macierzystej komórki multipotencjalnej) jest waŜnym zagadnieniem, które jest tylko skrótowo omówione w niniejszym rozdziale. Bardziej szczegółowe przedstawienie moŜe Czytelnik znaleźć w podręcznikach histologii, biologii komórkowej lub hematologii.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Komórki krwi są intensywnie badane, poniewaŜ moŜna je łatwo uzyskać, pełnią liczne funkcje biologiczne i biorą udział w wielu procesach chorobowych. Budowa i czynność hemoglobiny (Hb), porfirie, Ŝółtaczka i aspekty gospodarki Ŝelazem zostały omówione w poprzednich rozdziałach. Zmniejszenie liczby krwinek czerwonych i zawartej w nich Hb jest przyczyną niedokrwistości (anemii): waŜnej i niejednolitej grupy schorzeń, przy czym niektóre rodzaje niedokrwistości są często spotykane w praktyce klinicznej. Wiele układów grupowych krwi obecnych w błonie erytrocytów i innych komórek krwi ma szczególnie istotne znaczenie w przetaczaniu krwi i przeszczepianiu tkanek. Tabela 63-1 zawiera przyczyny licznych, waŜnych chorób dotyczących krwinek czerwonych; niektóre z nich są omówione w tym rozdziale, a pozostałe przedstawione w innych częściach ksiąŜki. Zapaleniem moŜe być objęty kaŜdy narząd organizmu. Granulocyty obojętnochłonne odgrywają główną rolę w ostrym zapaleniu, a inne leukocyty, np. limfocyty od-

866 / ROZDZIAŁ 63 Tabela 63-1. Zestawienie przyczyn wybranych waŜnych chorób dotyczących erytrocytów Choroba Wyłączna tub główna przyczyna Niedokrwistość z niedoboru Ŝela- Niedostateczna podaŜ lub nadmierna utrata Ŝelaza za Nadmierna podaŜ utleniaczy (róŜne związki chemiczne lub leki) Methemoglobinemia Genetycznie uwarunkowany niedobór układu zaleŜnej od NADH reduktazy methemoglobiny Niedokrwistość sierpowata

Zmiana kodonu 6 odpowiedzialnego za syntezę łańcucha p-hemoglobiny, tj. zastąpienie trypletu GAG przez GTG, co powoduje zastąpienie reszty waliny resztą kwasu glutaminowego

K-Talasemie

Mutacje genów syntezy a-globiny, głównie nierównomierne crossing-over lub duŜe oderwania, a rzadziej obecność kodu nonsensownego lub mutacje zmiany fazy odczylu

p-Talasemie

Rozliczne mutacje genu syntezy (3-globiny, w tym oderwania, kod nonsensowny, mutacje, zmiany fazy odczytu i inne zmiany budowy genu (np. miejsce „splicingu", mutacje genu pro motorów eg o)

NiedokrwistOŚci megaloblastyczne Niedobór witaminy B^ Niedobór kwasu foliowego Dziedziczna sferocytoza

Zmniejszone wchłanianie witaminy B^ wywołane niedoborem czynnika wewnętrznego wydzielanego przez komórki okładzinowe Ŝołądka Zmniejszona podaŜ, upośledzone wchłanianie lub zwiększone-zapotrzebowanie (np. w ciąŜy) folianów

Niedobór dehydrogenazy g lukozo - 6 -fosforan u

RóŜnorodne mutacje genu dla G6PD, sprzęŜonego z chromosomem X; najczęściej mutacje punktowe

Niedobór kinazy pirogronianowej (PK)

Prawdopodobnie róŜnorodne mutacje genu odpowiadającego za syntezę izoenzymu erytrocytarnego (R) PK

Niedobór ilościowy lub zaburzona budowa spektryny

grywają rolę w zapaleniach przewlekłych. Białaczki, określane jako złośliwe nowotwory tkanek wytwarzających krew, mogą dotyczyć komórek prckursorowych kaŜdej głównej grupy krwinek białych. Najczęściej spotykanymi ich rodzajami są ostre i przewlekłe białaczki szpikowe, dotyczące komórek prekursorowych granulocytów obojętnochłonnych oraz ostre i przewlekle białaczki iimfatyczne. ZłoŜona chemioterapia oparta na stosowaniu kombinacji róŜnych czynników chemioterapeutycznych, z których kaŜdy działa na jeden lub wiele biochemicznych punktów uchwytu, jest znacznie skuteczniejsza w leczeniu wielu typów białaczek. Zrozumienie roli krwinek czerwonych i białych w stanach zdrowia r choroby wymaga wiedzy o licznych podstawowych aspektach ich metabolizmu.

ERYTROCYT CECHUJE SIĘ UPROSZCZONĄ BUDOWĄ I FUNKCJĄ Główne czynności erytrocytów są względnie proste i obejmują dostarczanie tlenu do tkanek i pomocy w wydalaniu dwutlenku węgla oraz protonów wytwarzanych ix metabolizmie tkankowym. Tak więc ma on znacznie uproszczoną strukturę niŜ większość komórek ludzkiego organizmu, a zbudowany jest z błony komórkowej, która otacza roztwór Hb (białko to stanowi 95% wszystkich białek wewnątrzkomórkowych erytrocytu). Erytrocyt nie ma takich organelli komórkowych, jak mitochondria, lizosomy lub aparat Golgiego. Ludzkie krwinki czerwone, podobnie jak erytrocyty większości zwierząt, pozbawione są jądra komórkowego. Nie są one jednak metaboiieznie obojętne. ATP

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 867

jest syntetyzowany w procesie glikolizy i stanowi to waŜny proces, który ułatwia krwince utrzymanie kształtu dwuwklęsłego, a takŜe ułatwia regulację transportu jonów (np. przy udziale Na+/Kł"-ATP-azy i białek wymiany anionów,

p. dalej) oraz ułatwia transport wody z i do komórki. Dwuwklęsly kształt zwiększa stosunek powierzchni do objętości krwinki i w ten sposób sprzyja wymianie gazów. Krwinka czerwona zawiera składniki cjjfoszkieletu (p. niŜej), które odgrywają waŜną rolę w utrzymaniu kształtu erytrocytu. Około 2 min erytrocytów dostaje się do krąŜenia w kaŜdej sekundzie Prawidłowa liczba erytrocytów u dorosłych, mę-

Ŝczyzn wynosi 4,6—6,2 mln/ul (4,6—6,2 • 10lz/l), a odpowiednia wartość dla kobiet wynosi 4,2—5,4 mln/ul (4,2—5,4-1012/0- Całkowita liczba erytrocytów krąŜących wynosi ok. 2,5 x 1013. Prawidłowa zawartość Hb we krwi męŜczyzn wynosi 14—18 g/dl (8,7—11,2 mmol/1), a dla kobiet wartość ta wynosi 12—-16 g/dl (7,5—9,5 mmol/1). Wartość hematokrytowa, tj.

względny stosunek objętości krwinek czerwonych do krwi pełnej wynosi dla męŜczyzn 42—52% (0,42—0,521/1), a dla kobiet 37-^7% (0,37—0,47 1/1). Czas Ŝycia prawidłowego erytrocytu wynosi 120 dni, co oznacza, Ŝe codziennie jest wymieniane nieco mniej niŜ 1% całej liczby krwinek (200 bln dziennie lub 2 min na sekundę). Pojawiające się w krąŜeniu nowe erytrocyty zawierają jeszcze rybosomy i składniki siateczki śródplazmatycznej. Kwas rybonukleinowy (RNA) rybosomów moŜna wykryć za pomocą odpowiedniego barwienia (np. błękitem krezolowym), a komórki te określa się jako retykulocyty. W warunkach prawidłowych stanowią one ok. 1% wszystkich erytrocytów. Czas Ŝycia krwinek czerwonych moŜe ulec dramatycznemu skróceniu w róŜnych rodzajach niedokrwistośri hemolitycznych. Liczba retyku-

locytów jest wtedy znacznie zwiększona, poniewaŜ szpik próbuje wyrównać szybki rozpad

Multipotencjalna , komórka pnia '

DFUC

""*

krwinek przez wzrpst wydzielania nowych, młodych krwinek do krąŜenia. Erytropoetyna reguluje wytwarzanie erytrocytów Ludzka erytropoetyna (Epo) jest glikoproteiną zbudowaną z 166 reszt aminokwasowych (masa cząsteczkowa ok. 34000). Jej stęŜenie w osoczu oznacza się metodami radioimmunologicznymi. Jest ona głównym czynnikiem regulującym u człowieka tworzenie krwinek czerwonych. Wyodrębniono cDNA kodujący Epo i określono jego sekwencje. Epo jest wytwarzana głównie przez nerki i uwalniana, w odpowiedzi na niedobór tlenu, do strumienia krwi, którym dostaje się do szpiku kostnego. Tam dochodzi do oddziaływania Epo z komórkami prekursorowymi krwinek czerwonych przez swoisty receptor. Receptor ten jest białkiem śródbłonowym zbudowanym z 2 podjednostek i licznych składników niebiałkowych. MoŜe być on kinazą tyrozynową, ale nie zostało to ostatecznie ustalone. Nie zostały równieŜ zidentyfikowane związki biorące udział w dalszym przekazywaniu sygnału receptorowego oraz swoiste geny w komórkach docelowych. Epo działa na komórkę prekursorową krwinek czerwonych znaną jako jednostka erytroidalna rozrastająca się (burst fonning unit - erythroid; BFU-E) powodując jej proliferację i róŜnicowanie. Dodatkowo, Epo działa na dalszy prekursor erytrocytów znany jako jednostka erytroidalna tworząca kolonie (colony forming unit - erythroid; CFU-E) takŜe powodując jego proliferację i róŜnicowanie się. Do tego działania Epo wymaga współdziałania z innymi czynnikami (np. interleukina 3 i podobnymi do insuliny czynnikami wzrostu, p. ryc. 63-1). Uzyskanie cDNA dla Epo umoŜliwiło produkcję znacznych ilości tego hormonu i wykorzystanie go do badań i celów leczniczych. Uprzednio wyodrębniono jedynie bardzo małe ilości tego białka z moczu. Głównym zastosowaniem rekombinowanej Epo (rEpo) jest leczenie niektó-

r CrU C

*"

r

r

r

r °^" ""'° ____ ■» Dodała krwinka erytrocytu ^^ czerwona

Ryc. 63-1. Znacznie uproszczony schemat róŜnicowania się komórek pnia do krwinek czerwonych, BFUE=burst forming unit - erythroid; CFU-E=colony forming unit - erythroid; Epo=erytropoetyna; GMCSF=czynnik pobudzający granulocyty i makrofagi; IL-3=interleukina 3.

868 / ROZDZIAŁ 63

rych rodzajów niedokrwistości, takich jak niedokrwistość spowodowana niewydolnością nerek.

WIELE CZYNNIKÓW WZROSTU REGULUJE WYTWARZANIE LEUKOCYTÓW W ostatnich latach wykryto, poza Epo, duŜą liczbę hentopoetycznych czynników wzrostu. Badania te rozszerzyły wiedzę o róŜnicowaniu się komórek krwi, dostarczyły czynników, które mogą być uŜyteczne w leczeniu i pomagają zrozumieć nieprawidłowy wzrost komórek krwi (np. zachodzący w białaczkach). Podobnie jak Epo, większość wyodrębnionych czynników jest glikoproteinami, są one bardzo aktywne in vivo oraz in vitro, oddziałują z komórkami docelowymi przez swoiste receptory błony komórkowej oraz układ wewnątrzkomórkowego przenoszenia sygnału receptorowego zmieniając ekspresje genów. Docelowe działanie na ekspresję genową powoduje róŜnicowanie się komórek. Wiele z nich uzyskano drogą klonowania, co pozwoliło na ich produkcję we względnie duŜych ilościach. Dwa z tych czynników są szczególnie interesujące; czynnik pobudzający tworzenie kolonii granulocytów (granulocyte colony-stimulating factor. G-CSF) i czynnik pobudzający tworzenie kolonii grsinuloc ytowo-makrofagowych (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; GM-CSF). G-CSF jest względnie swoistym czynnikiem działającym na granulocyty obojetnochłonne. GM-CSF działa na róŜne komórki progenitorowe i pobudza granuiocyty obojętnochłoBąe, makrofagi i granulocyty kwasochłonne. Zmniejszone wytwarzanie granulocytów obojętnochłonnych określa się jako neutropcnię. Występuje ona szczególnie często u pacjentów leczonych chemioterapeutykami lub u osób po przeszczepie szpiku. U takich pacjentów mogą występować niebezpieczne zakaŜenia. G-CSF podaje się takim chorym w celu stymulacji wytwarzania granulocytow obojętni (chłonnych. Niektóre badania wskazują, Ŝe jest on skuteczny. Jednym z czynników wymagających rozwaŜenia jest podawanie GCSF pacjentom, u których wystąpiła neutropenia spowodowana leczeniem białaczki. Podawany czynnik G-CSF moŜe pobudzać wzrost komórek białaczkowych. Ostatnie badania wskazują, Ŝe zjawisko tonie występuje, jeŜeli dawki G-CSF są małe, mimo to nadzór nad chorymi musi być wzmoŜony.

ERYTROCYT MA WYJĄTKOWY, ALE WZGLĘDNIE PROSTY METABOLIZM W tabeli 63-2 przedstawiono róŜne aspekty metabolizmu erytrocytu, a wiele z nich omówiono w innych rozdziałach.

Erytrocyt ma w błonie komórkowej układ przenoszący glukozę Stopień wnikania glukozy do erytrocytów jest znacznie większy niŜ wynikałoby to z prostej dyfuzji. Jest to raczej przykład ułatwionej dyfuzji (p. rozdz. 43). Swoiste białko biorące udział w tym procesie nazywane jest przenośnikiem glukozy lub permeazą glukozową. Niektóre jego właściwości zestawiono w tab. 63-3. Szczególnie waŜny jest proces wnikania glukozy do erytrocytów, poniewaŜ stanowi główne źródło energii dla tych komórek. Z tkanek wyodrębniono 5 odmiennych, chociaŜ zbliŜonych do siebie rodzajów białek przenoszących glukozę. W przeciwieństwie do białka z erytrocytów, niektóre z nich wykazują zaleŜność od insuliny (np. białka obecne w mięśniach i tkane? tłuszczowej). Szczególnie te ostatnie budzą duŜe zainteresowanie, poniewaŜ upośledzenie przemieszczania tych białek ze skupisk wewnątrzkomórkowych do błony komórkowej komórek mięśni szkieletowych moŜe tłumaczyć mechanizm oporności na insulinę stwierdzany u chorych z cukrzycą niezaleŜną od insuliny (p. rozdz. 52).

W retykulocytach zachodzi synteza białek Dojrzały erytrocyt nie ma zdolności syntezy białek. Czynne w tym procesie są natomiast retykulocyty. Po wejściu do krąŜenia, tracą one organelle wewnątrzkomórkowe (rybosomy, mitochondria itp.) i w ciągu 24 h, stając się młodymi erytrocytami, tracą zdolność do syntezy białek. Wyciąg z retykulocytów królika (uzyskanych przez podanie zwierzęciu fenylohydrazyny, która powoduje cięŜka niedokrwistość hcmolityczną, co prowadzi do prawie całkowitego zastąpienia erytrocytów przez retykulocyty) jest powszechnie uŜywany jako układ syntezy białek in vitro. Endogenny mRNA, obecny w retykulocytach, zostaje rozłoŜony za pomocą nukleazy, której aktywność jest później zahamowana przez dodanie jonów wapniowych. Układ ten następnie jest programowany przez dodanie oczyszczonego mRNA lub wy-

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 869 Tabela 63-2. Zestawienie istotnych aspektów metabolizmu erytrocytu . Erytrocyt pozostaje w silnej zaleŜności od glukozy jako źródła energii; błona komórkowa erytrocytów zawiera białka transportujące glukozę o wysokim powinowactwie do glukozy Glikoliza, w wyniku której powstają mleczany, jest źródłem powstawania ATP ATP nie powstaje w wyniku losforylacji oksydacyjnej, poniewaŜ erytrocyt nie ma mitochondriów Erytrocyt ma zespół układów transportujących, co pozwala mu utrzymywać równowagę wodno- elektrolitową Wytwarzanie 2,3-bisfbsfoglicerynianu w reakcjach ściśle związanych z glikoliza jest waŜnym czynnikiem regulującym zdolność Hb do przenoszenia tlenu W erytrocycie zachodzą przemiany cyklu pentozo-fosforanowego (ok. 5-10% całkowitej ilości wchłoniętej glukozy jest w ten sposób metabolizowane), który wytwarza NADPH. Częstą chorobą jest niedokrwistość hemolityczna wywołana niedoborem aktywności dehydrogenazy glukoz o-6-fosforanowej W metabolizmie erytrocytu istotną rolę odgrywa zredukowany glutation (GSH), częściowo przeciwdziałający aktywności potencjalnie toksycznych nadtlenków. Krwinka czerwona moŜe wytwarzać GSH przez redukcję utlenionego glutationu (GSSG), a proces ten wymaga NADPH śelazo w Hb musi pozostawać w postaci Ŝelazawej; jony Ŝelazowe są redukowane do Ŝelazawych w wyniku działania zaleŜnego od NAOH układu reduktazy methemoglobiny przy udziale reduktazy cytochromu t>5 i cytochromu b5 Wytwarzanie glikogenu, kwasów tłuszczowych, białek i kwasów nukleinowych nie zachodzi w krwince czerwonej, choć niektóre lipidy (np. cholesterol) obecne w błonie komórkowej erytrocytu mogą ulegać wymianie z analogicznymi lipidami osocza Erytrocyt zawiera liczne enzymy metabolizmu nukleotydów (np. deaminazę adenozynową, nukleotydazę pirymidynową i kinazę adenylanową); niedobór tych enzymów moŜe być przyczyną niektórych postaci niedokrwistości hemolitycznej Kiedy erytrocyt kończy swoje Ŝycie, globina jest rozkładana do aminokwasów, które są powtórnie zuŜywane przez organizm, Ŝelazo zostaje uwolnione z hemu i powtórnie zuŜytkowane, a składowe czteropirolowe hemu ulegają przekształceniu w bilirubinę, która jest głównie wydalana drogą jelit za pośrednictwem Ŝółci Tabela 63-3. Niektóre właściwości biaika transportującego glukozę zawartego w błonie komórkowej erytrocytów Stanowi ok. 2% białek błony komórkowej krwinki czerwonej Cechuje się swoistością w stosunku do glukozy i D-heksoz (L-heksozy nie są przenoszone) Przy fizjologicznym stęŜeniu glukozy we krwi {ok. 5mmol/l) białko transportujące pracuje w stanie ok. 75% jego Vmajt; moŜe ulegać wysyceniu i moŜe być hamowane przez niektóre analogi strukturalne glukozy Dotychczas wyodrębniono 5 róŜnych białek transportujących glukozę obecnych w tkankach ssaków, białko erytrocytów jest jednym z nich Białko nie jest zaleŜne od insuliny w przeciwieństwie do analogicznych białek transportujących obecnych w mięśniach lub tkance tłuszczowej Ustalono pełny skład aminokwasowy (492 reszt aminokwasowych) białka transportującego Białko ma zdolność przenoszenia glukozy równieŜ jeŜeli jest umieszczone w sztucznych liposomach Szacuje się, Ŝe zawiera ono 12 przezbłonowych fragmentów o budowie helikalnej Działanie białka transportującego polega na wytwarzaniu bramkowanych kanałów w błonie komórkowej, które umoŜliwiają przemieszczanie się glukozy; kanały zaleŜą konformacyjnie od obecności glukozy i mogą zmieniać się szybko (ok. 900 razy na sekundę)

870 / ROZDZIAŁ 63

ciągu z całych komórek zawierającego mRNA, a radioaktywne białka są syntetyzowane w obecności 3SS-L-metioniny lub innych aminokwasów znakowanych izotopami radioaktywnymi. Wytwarzane w tym układzie białka radioaktywne są rozdzielane za pomocą elektroforezy SDSPAGE i wykrywane autoradiograficznie. Dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza i glutation chronią krwinki czerwone przed obciąŜeniem i uszkodzeniem tlenowym. W trakcie przemian zarówno w komórkach krwi, jak i w większości innych tkanek powstaje wiele si\nych utleniaczy. NaleŜą do nich anion ponadtlenkowy O?, nadtlenek wodoru (H2O3), rodniki nadtlenkowe (ROO") i rodnik hydroksylowy (OH"). Ostatni z nich jest szczególnie aktywną cząsteczką i moŜe reagować z białkami, kwasami nukleinowymi, lipidami i innymi cząsteczkami, co prowadzi do zmian strukturalnych i uszkodzenia tkanek. Reakcje zestawione w tab. 63-4 odgrywają istotną rolę w wytwarzaniu i unieczynnianiu utleniaczy. Zostaną one po kolei omówione. Ponadtlenki (reakcja 1) są wytwarzane w erytrocytach w wyniku autooksydacji Hb do met Hb (ok. 3% Hb w ludzkich erytrocytach ulega autooksydacji w ciągu doby). W pozostałych tkankach są one wytwarzane w wyniku działania takich enzymów, jak reduktaza cytochromu P-450 i oksydaza ksantynowa. Granulocyty

Tabela 63-4. ReakcjŚtnajace znaczenie w

obojętnochłonne pobudzone przez kontakt z bakteriami ulegają eksplozji oddechowe] (patrz niŜej) i wytwarzają ponadtlenki w reakcji katalizowanej przez oksydazę NADPH (reakcja 2). Ponadtlenek samoistnie ulega przekształceniu w H2O2 i O2, a reakcja ta moŜe zostać bardzo przyspieszona w wyniku działania enzymu dysmutazy nadtlenkowej (reakcja 3), Nadtlenek wodoru ulega dalszym przemianom. Enzym katala/a, występujący w wielu rodzajach komórek, katalizuje rozpad nadtlenku wodoru do H2O i O2 (reakcja 4), Granulocyty obojętnochłonne zawierają wyjątkowy enzym — mieloperoksydazę, dzięki której z HZO2 i halogenków powstają kwasy podhalogenawe (reakcja 5). To zagadnienie zostanie omówione poniŜej. Zawierający selen enzym peroksydaza glutationowa (p. rozdz. 22) moŜe f5wn1eŜ"działać na zredukowany glutation (GSH) i H2O2, w wyniku cz£go po_wstaje utleniony glutation^XGSSG]ULH<>Q (reakcja 6). Wspomniany enzym moŜe uŜytkować takŜe nadtlenki jako substraty. OH' i OH" mogą powstawać w nieenzymatycznej reakcji katalizowanej przez jony Fe2+ (reakcja Fentona, reakcja 7). O2 i H2O2 są substratami w katalizowanej przez Ŝelazo reakcji Habera-Weissa (reakcja 8), w wyniku której równieŜ powstają OH' i OH". Ponadtlenek moŜe uwalniać jony Ŝelazowe z ferrytyny. Tak więc, produkcja OH" moŜe być jednym z mechanizmów uszkadzających tkanki w stanach nadmiaru Ŝelaza (np. w hemosyderozie).

obciąŜeniu tlenowym komórek krwi i tkanek

(1) Powstawanie ponadtlenków (jako produktów róŜnych reakcji) (2) NADPH-oksydaza

02 +

(3) Dysmutaza ponadtlenkowa

+ 0i + < 32+2H -» H2O2 + O2

(4) Katalaza

H2O2

(5) Mieloperoksydaza

H2O2 +■ X- + H + -* HOX + H 2 0 (X=CI ", Br, SCIM-)

(6) Peroksydaza glutationowa (selenozaleŜna)

2GSH + R-O-OH -» GSSG + H 2 O + ROH

(7) Reakcja Fentona

Fe2+ -+ H2O -> Fe3+ + OH- + OH"

(8) Katalizowana przez Ŝelazo reakcja Ha-

O2 + ł

H 2O 2 -> O 2+ OH- + OH"

bera-Weissa Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa (G6PD)

G6P +

NADP + -» 6-fosfoglukonian + NADPH + H

0)

(10) Reduktaza glutationowa

B - Cli

2O2 + NADPH -» 20; + NADP< + H

+

-* 2H 2O + O 2

GSSG + NADPH + H + -> 2GSH + NADP+

+

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 871

Związki i reakcje chemiczne mogące uwalniać loksyczrie postacie tlenu są określane jako proutleniacze. Z drugiej strony, związki i reakcje chemiczne usuwające te postacie tlenu, „zmiatające" je, zmniejszające ich tworzenie lub przeciwdziałające ich działaniu określane są jako przeciwu tleni acze (antyoksydanty). Zalicza się do nich takie 2wiązki chemiczne, jak NADPH, GSH, kwas askorbinowy i witaminę E. W prawidłowej komórce występuje równowaga między proutleniaczami a przeciwu tleni aczami. Równowaga ta moŜe być zaburzona na rzecz proutleniaczy, kiedy powstawanie toksycznych postaci tlenu znacznie wzrośnie (np. po wprowadzeniu niektórych związków chemicznych lub leków) lub gdy zawartość aniyoksydantów znacznie się zmniejszy (np. po unieczynnieniu enzytnów biorących udział w usuwaniu toksycznych postaci tlenu lub w warunkach obniŜonej zawartości wymienionych przedwutleniaczy). Stan taki nazywamy obciąŜeniem (stresem) tlenowym i jeŜeli jest on nasilony lub trwa dłuŜej, moŜe być przyczyną powaŜnych uszkodzeń komórki. Postacie tlenu są obecnie uwaŜane za waŜny czynnik powodujący uszkodzenie komórek (np, w wyniku podawania róŜnych trujących substancji chemicznych lub niedokrwienia) niekiedy prowadzący do śmierci komórki. Pośrednim dowodem takiego działania tlenu jest ochronne oddziaływanie dysmutazy ponadtlenkowej lub katalazy w zapobieganiu uszkodzenia komórek w stanach wyŜej opisanych. Niedobór dehydrogenazy glukozo-6fosforanowej jest częstą w niektórych obszarach i waŜną przyczyną niedokrwistości hemolttycznej NADPH, który powstaje w cyklu pentozowo-fosforanowym w reakcji katalizowanej przez dehydrogennzę glukozo-6-fosforattową (tab. 63-4, reakcja 9) enzym, którego synteza dziedziczy się w sprzęŜeniu z chromosomem X, odgrywa główną rolę w utrzymaniu równowagi czynników redukujących w krwince czerwonej i innych komórkach, takich jak hepatocyty. PoniewaŜ cykl pentozowo-fosforanowy jest wyłączną drogą powstawania NADPH w erytrocycie, jest ona bardzo podatna na uszkodzenia wywołane przez utleniacze, jeŜeli dochodzi do upośledzenia cyklu pentozowo-fosforanowego (np. w wyniku niedoboru enzymów). Jedną z funkcji

NADPH,jest, redukowanie GSSG do GSH. Reakcja katalizowana jest przez reduktazę gluTationową (reakcja 10). Niedobór aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosfo ran owej w wyniku mutacji jest bardzo częsty w niektórych częściach świata (np. w Afryce równikowej, okolicach Morza Śródziemnego, niektórych częściach Azji, u Murzynów w Ameryce Północnej). Jest on najczęściej spotykaną enzymopatią, czyli chorobą spowodowaną przez zmiany enzymów. Wykazano ponad 300 genetycznie uwarunkowanych odmian wspomnianego enzymu. Obecność nieprawidłowych odmian dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej stwierdza się co najmniej u 100 min ludzi. Powoduje to chorobę określaną jako niedokrwistość hemotityczną. SpoŜywanie bobu (Kica faba) przez osoby z niedoborem aktywnego enzymu powoduje wystąpienie napadów niedokrwistości hemolitycznej (najprawdopodobniej dlatego, Ŝe bób zawiera silne utleniacze). Ponadto liczne leki (np. przeciwzimniczy lek prymachina — Primaquine) (tzw. niedokrwistość hemolityczna uwarunkowana prymachina) lub sulfonamidy oraz inne czynniki chemiczne (np. naftalen) mogą wywoływać napady, poniewaŜ ich zaŜycie powoduje wytwarzanie H2O2 lub O~^. W warunkach prawidłowych H2O2 jest rozkładany przez katalazę i peroksydazę glutationową (tab. 63-4, reakcje 4 i 6). Ostatnia z tych reakcji prowadzi do powstania GSSG. GSH jest regenerowany z GSSG w wyniku działania enzymu reduktazy glutationowej, której działanie zaleŜy od dostępności NADPH (reakcja 10). Krwinki czerwone osób, u których występuje niedobór aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, nie mogą wytwarzać dostatecznych ilości NADPH do regeneracji GSH z GSSG. To z kolei upośledza zdolność krwinek do unieczynniania H2OZ i rodników tlenowych. Związki te mogą powodować utlenienie krytycznych grup SH w białkach i prawdopodobnie powodować peroksydację Lipidów błony krwinki czerwonej, co prowadzi do lizy krwinek. Utlenienie niektórych grup SH w Hb powoduje wytrącanie się tego białka wewnątrz erytrocytów i tworzenie się ciałek Heinza, które stwierdza sie po wybarwieniu na purpurowo za pomocą fioletu krezylowego. Obecność ciałek Heinza wskazuje, Ŝe krwinki czerwone znajdują się w stanie obciąŜenia (stresu) tlenowego. Rycina 63-2 zestawia łańcuch przyczynowy zaburzeń występujących u chorych na niedokrwistość hemolityczna.

872 / ROZDZIAŁ 63

Met hemoglobin a nie bierze udziału w przenoszeniu tlenu Jony Ŝelazawe z Hb są podatne na utlenienie przez ponadtlenki i inne utleniacze, w wyniku czego powstaje metHb, która nie posiada zdolności przenoszenia tlenu, W warunkach prawidłowych tylko bardzo mała ilość metHb znajduje się we krwi, poniewaŜ krwinka czerwona ma skuteczny układ redukujący jony Ŝelazowe Fe3 k do Ŝelazawych Fe^+ (układ reduktazy NADH-cytochrom b; met hemoglobina) Układ ten składa się z NADH (wytwarzanego w procesie glikolizy), flawofstpteiny nazwanej reduktazą cytochromu b; (zwanej takŜe reduktazą metHb) i cytochromu b;. Jony Ŝelazowe Fes + metHb są redukowane do Ŝelazawych Fe2 + w wyniku działania zredukowanego cytochromu bj!

na spoŜyciem licznych leków lub związków chemicznych. śaden z rodzajów met hemoglobinemii nie występuje często, ale lekarz powinien być świadomy moŜliwości pojawienia się u chorego tego schorzenia. Wrodzona postać methemoglobinemii zwykle jest wynikiem niedoboru aktywności reduktazy methemoglobinowej, co jest przekazywane jako cecha autosomalna recesywna. Niektóre rodzaje nieprawidłowych hemoglobin (HbM) mogą stanowić rzadką przyczynę methemoglobinemii. W HbM mutacje prowadzą do zmian w składzie reszt aminokwasowych biorących udział w połączeniu z hemem, co zmienia powinowactwo Hb do tlenu i ułatwia proces utleniania. ZaŜycie wielu leków (np. sulfonamidów) lub substancji chemicznych (np. aniliny) moŜe stanowić przyczynę nabytej methemoglobinemii. Sinica (niebieskosine zabarwienie skóry i błon śluzowych spowodowane wzrostem zawartości nieutlenowanej Hb we krwi tętniczej lub w omawianym przypadku wzrostem zawartości metHb we krwi) jest zwykle dominującym objawem, a jest ona wyraźna, jeŜeli ponad 10% Hb występuje w postaci metHb. Rozpoznanie opiera się na spektroskopowym badaniu krwi, które uwidacznia typowe widmo absorpcyjne metHb. Dodatkowo, próbki krwi zawierającej metHb nie mogą być w pełni utlenowane przez przepuszczany przez nie tlen, w przeciwieństwie do nieutlenowanej prawidłowej krwi. Obecność nieprawidłowej Hb moŜna wykazać za pomocą elektroforezy. W leczeniu lekkich postaci methemoglobinemii wywołanych niedoborem enzymu stosuje się błękit metylenowy lub kwas askorbinowy (czynniki redukujące). Ostra nasilona methemoglobinemia (wywołana spoŜyciem związków chemicznych) powinna być leczona doŜylnymi podawaniami błękitu metylenowego.

Zredukowany cytochrom b; jest następnie regenerowany w wyniku działania reduktazy cytochromu b ;:

O BŁONIE LUDZKICH ERYTROCYTÓW WIADOMO WIĘCEJ NIś O BŁONIE ZEWNĘTRZNEJ INNYCH KOMÓREK ORGANIZMU CZŁOWIEKA

Mutacje genu kodującego G6PD

ObniŜona aktywność G6PD

ObniŜona zawarto&ć NADPH ObniŜona regeneracja GSH z GSSG przez reduktazę glutationowa (Która wymaga udziatu NADPH) Utlenianie grup SH Hb (tworzenie ciatek Heinza) i biatek błony w wyniku zmniejszonej zawartości GSH i wzrosiu zawartości wewnątrzkomórkowych utleniaczy (np. 0^, co prowadzi do zmiany struktury ttony I wzrosiu podatności na strawienie przez makrotagi (moŜliwe Jest równieŜ uszkodzenie lipidfiw błony przez nadtlenki) Hemoliza

Rvc. 63-2. Podsumowanie prawdopodobnych zjawisk powodujących niedokrwistość hemolityczną w wyniku niedoboru aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD),

+

Cyt b, „,, + NADH^Cyt b5 M + NAD+ + H

Methemoglobinemia moŜe być wrodzona lub nabyta f Methemoglobinemia moŜe być podzielona na wrodzoną i nabytą. Ta ostatnia jest spowodowa-

Do badania błony krwinek czerwonych stosuje się róŜne metody biochemiczne (p. rozdz. 43). NaleŜy do nich rozdział białek błony za pomocą elektroforezy SDS-PAGE z zastosowaniem swoistych enzymów (proteinazy, glikozydazy i in.), aby zlokalizować białka i gliko-

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 873 Tabela 63-5. Zestawienie biochemicznej charakterystyki błony komórkowej krwinek czerwonych Błona jest dwuwarstwowa i składa się w 50% z lipidów i 50% z białek Główną grupę lipidów stanowią fosiolipidy i cholesterol; głównymi fosfolipidami są fosfatydylocholina (PC), etanoloamina (PE) i fosfatydyloseryna (PS) oraz sfingomielina (Sph) Fosfolipidy zawierające cholinę: PC i Sph przewaŜają w zewnętrznej warstwie błony, a fosfolipidy zawierające aminokwasy (PE i PS) w wewnętrznej warstwie błony Glikosfingolipidy (G^Ls) (obojętne GSLs, gangliozydy i związki złoŜone, w tym związki grupowe krwi ABO) stanowią oft. 5-10% wszystkich lipidów Rozdział za pomocą SDS-PAGE elektroforezy wykazuje, ze błona zawiera ok. 10 głównych białek i ponad 100 białek pomniejszych Główne białka błony (w tym spektryna, ankiryna, białko wymiany anionów, aktyna i białko 4.1) zostały intensywnie przebadane; ustalono ich rozmieszczenie (integralne lub peryferyjne białko), budowę oraz funkcję Wiele z białek błony to glikoproteiny (np. glikoferyny) zawierające łańcuchy o!?(fbsacłiarydowe związane za pomocą 0- i (lub) IM-wiązania i umieszczone na zewnętrznej powierzchni błony

proteiny w błonach, a takŜe róŜne techniki badania zawartości i rozmieszczenia poszczególnych lipidów. Stosuje się takŜe techniki morfologiczne (np. mikroskopia elektronowa, mikroskopia elektronowa mroŜeniowego przełomu struktur biologicznych — freeze-fracture electron microscopy) oraz inne metody (np. uŜycie przeciwciał skierowanych przeciwko określonym składnikom) Rozpad erytrocytów w określonych warunkach prowadzi do powstania cieni krwinek o naturalnym układzie błony komórkowej. Zmiana warunków Sizy powoduje powstanie cieni krwinek mających cytozolową stron? błony umieszczoną na zewnątrz (odwrócone cienie krwinek). Oba rodzaje cieni są przydatne w analizie rozmieszczenia swoistych białek i lipidów błony komórkowej. W ostatnich, latach otrzymano cDNA dla wielu białek błony, co pozwoliło na określenie ich składu aminokwasowego i budowy, W sumie znacznie więcej wiadomo o błonie krwinek czerwonych niŜ o jakiejkolwiek błonie innych komórek organizmu człowieka (tab. 63-5), Za pomocą SDS-PAGE rozdziela się białka błony erytrocytów Zastosowanie elektroforezy SDS-PAGE pozwala na wyodrębnienie ok. 10 głównych białek obecnych w błonie krwinek czerwonych (ryc. 63-3). Wiele z nich okazało się być glikoproteinami, co wykazano za pomocą reakcji PAS (kwas nadjodowy — odczynnik Schiffa)

Spektryna Ankiryna .

, d

Białko wymiany / , anionów!

AKlyna S G9PD 6 7 Glob Ina

i

iH z —

Barwienie błękitem Coomasste

■ Glikoforyny

Barwienie metodą PAS

Ryc. 63-3. Diagram głównych biatek błony ludz kich krwinek czerwonych po rozdziale za pomocą SDS-PAGE. Białka wybarwiające się błękitem Co omassie przedstawiają dwa lewe słupki, prawy słupek przedstawia białka wybarwiające się kwa sem nadjodowym i odczynnikiem Schiffa. (Wed ług: Beck W. S., Tepper R.).: Hemolyticanemiaslll. Membranę disorders; w: Beck W. S. (red.): Hematoiogy. The MIT Press 1991, wyd, 5, za zezwole niem). _____________________________

J

874 / ROZDZIAŁ 63

(p. rozdz. 57). Białka określa się zgodnie z szybkością migracji elektroforetycznej, a najwolniej przesuwające się (a więc białko o największej masie cząsteczkowej) nazwane zostało białkiem pasma I lub spektryną. Wyodrębniono wszystkie główne białka, większość z nich została zidentyfikowana, a takŜe poczyniono znaczny postęp w zrozumieniu ich czynności biologicz-

nych (tab. 63-6). Ustalono równieŜ skład aminokwasowy i sekwencję wielu białek. Poza tym ustalono, które z białek są integralnymi, a które peryferyjnymi białkami błony komórkowej, które białka znajdują się na zewnętrznej powierzchni, a które są umiejscowione na powierzchni cytoplazmatycznej lub zajmują całą szerokość błony (ryc. 63-4). Za pomocą czułych

Tabela 83-6. Główne białka błony komórkowej erytrocytu* Numar pasma** 1

2 2.1 2.2 2.3 2.6 3 4.1 5 6 7 8

Białko

Białko

PrzybliŜona

integralne {1) lub peryferyjna (P)

masa cząsteczkowa

Spektryną (a) Spektryną (J3) Ankiryna Ankiryna Ankiryna Ankiryna Białko wymiany anionów Nie nazwane Aktyna Dehydrogenaza gliceraldehydo-6-fosforanowa Tropom i ozyna Nie nazwane Glikoforyny A, B, C

P P P P P P 1 P P P P P 1

240 000 220 000 210 000 195 000 175 000 145 000 100 000 80 000 43 000 35 000 . -29 000 23 000 31 000, 23 000, 28 000

* Dane zaadaptowane z pracy: Lux SE, Becker PS: Disorders of the red celi membranę skeleton: Hereditary spherocytosis and hefeditary elliptocytosis; w. The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver CR i in. (red.), wydanie 6, McGraw-Hill, 1989. "* Numer pasma odnosi się do szybkości migracji w elektroforezie SDS-PAGE (p. ryc. 63-3). Glikoforyny są wykrywane za pomocą barwienia metodą PAS (kwas nadjodowy — odczynnik Schiffa). Liczne inne składniki pominięto w tabeli. Natywna spektryną ma budowę x$7 Oddziaływanie spektryny z ankiryna l Wątkiem 3

OddZfatywsme aktyny i spektryny z białkiem 4.1

Zewnętrzna strona błony

,Glikoforyna Dwuwarstwowa Wana ---------lip Id owa—

Wewnętrzna strona btony

Spektryna

Połączenie cząsteczek spektryny

Ryc. 63-4. Diagram oddziaływań białek cytoszkieietu międzysobąizinnymi integralnymi białkami błony krwinki czerwonej. (Według: Beck W. S., Tepper R. i: Hemolytic anemias III: Membranę disorders; w: Beck W. S. (red): Hematology. The MiT Press 1991, wyd. 5, za zezwoleniem).

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 875

metod barwienia lub dwukierunkowej elektroforezy w błonie krwinek czerwonych moŜna zidentyfikować wiele pomniejszych składników. Jednym z tych składników jest opisane uprzednio białko przenoszące glukozę. Głównymi integralnymi białkami błony komórkowej są białka wymiany anionów i glikoforyny Białko wymiany *anionów (pasmo 3) jest przezbłonową glikoproteiną. której C-koniec znajduje się na zewnętrznej powierzchni błony, a N-koniec na powierzchni cytoplazmatycznej błony. Jest ono przykładem wielokrotnie p rzeźbiono w ego (multipass) białka, które rozciąga się miedzy powierzchniami błony co najmniej 10 razy. Występuje ono prawdopodobnie w postaci dimeru. który tworzy kanał pozwalający na przemieszczenia i wymianę chlorków na wodorowęglany. Dwutlenek węgla wytwarzany w tkankach wnika do krwrnek czerwonych w postaci wodorowęglanów, które ulegają wymianie na chlorki w płucach, gdzie dwutlenek węgla jest wydalany z powietrzem wydychanym. N-koniec białka wiąŜe wiele innych białek, w tym Hb, białka 4.1 i 4.2, ankirynę i wiele enzymów glikolitycznych. Wykazano, Ŝe oczyszczone białko pasma 3, dodane do pęcherzyków lipidowych in vitro spełnia swoją czynność transportową w tym zrekonstruowanym układzie. Glikoforyny A, B i C są równieŜ białkami przezbłonowymi, ale rozciągają się między powierzchniami błony tylko raz (białka jednokrotnie przezbłonowe single-pass). Główną glikoforyną jest glikoforyna A; zbudowana jest z 131 reszt aminokwasowych i silnie glikozylowana (ok. 60% całej masy cząsteczkowej stanowią węglowodany). Jej N-koniec zawiera 16 łańcuchów oligosacharyd owych (15 z nich to Oglikany), które są wystawione na zewnątrz, ponad powierzchnię erytrocytu. W tym białku zawartych jest ok. 90% kwasów sjalowych błony krwinki czerwonej. Odcinek śródbłonowy białka (23 reszty aminokwasowe) ma strukturę heliksu a. Odcinek C- końcowy sięga cyt o plazmy i wiąŜe białko 4.1, które z kolei wiąŜe spektrynę. Polimorfizm omawianego białka leŜy u podstaw systemu grup krwi MN (p. dalej). Glikoforyna A zawiera miejsca wiąŜące wirusy grypy oraz zarodźce sierpowate (Plasmodium falciparum), pasoŜyty wywołujące zimnicę. Co ciekawe, brak glikoforyny A nie wydaje się zaburzać czynności erytrocytów.

Spektryna, ankiryna i inne peryferyjne białka błony wspomagają utrzymanie kształtu i elastyczności erytrocytu Krwinka czerwona musi mieć zdolność do przeciskania się przez wąskie obszary mikrokraŜenia podczas niezliczonych przemieszczeń w całym ciele; szczególnie istotnym w tym aspekcie miejscem są naczynia zatokowe śledziony. Aby krwinka czerwona mogła łatwo i odwracalnie zmieniać swój kształt, jej błona komórkowa nrasi być płynna i elastyczna; musi takŜe zachowywać kształt dwuwklęsły, poniewaŜ to ułatwia wymianę gazową. Lipidy błony komórkowej pozwalają na zachowanie płynności błony. Do wewnętrznej strony błony komórkowej krwinki czerwonej przyczepione są liczne peryferyjne białka cytfóŜkieletu (tab. 63-6), które odgrywają waŜną rolę w utrzymywaniu kształtu dwu wklęsłego i elastyczności krwinki. Zostaną one poniŜej omówione. Spektryna jest głównym białkiem cytoszkieletu. Składa się ona z 2 polipeptydów: spektryny 1 (czyli łańcucha cc) i spektryny 2 (łańcucha fi). Łańcuchy te, mierzące ok. 100 nm długości, są ułoŜone nierównolegle i luźno ze sobą skręcone, tworząc dimer. Obydwa łańcuchy zbudowane są z 106 reszt aminokwasowych skręconych w postaci ot-heliksu i połączone fragmentami nieheliksowymi. Dimer spektryny łączy się z innym dimerem spektryny tworząc uporządkowany liniowy tetramer. Cały kształt białka umoŜliwia jego elastyczność, co z kolei udziela się całej błonie krwinki. W spektrynie zidentyfikowano co najmniej 4 miejsca wiąŜące: 1) dla wzajemnego połączenia, 2) dla ankiryny (pasmo 2.1 itp.), 3) dla aktyny (pasmo 5) i 4) dla białka 4.1. Ankiryna jest białkiem o kształcie piramidy, które wiąŜe spektrynę, z kolei ankiryna ściśle łączy się z pasmem 3 zabezpieczając w ten sposób związanie spektryny z błoną komórkową. Ankiryna jest wraŜliwa na działanie proteolityczne, co jest powodem powstawania pasm 2.2, 2.3 i 2.6, które pochodzą z pasma 2.1. Aktyna (pasma 5) występuje w krwinkach czerwonych w postaci krótkich, podwójnych helikalnych segmentów F-aktyny. Końcowy odcinek spektryny wiąŜe się z aktyną. Aktyna wiąŜe się takŜe z białkiem 4.1. Białko 4.1 jest białkiem globularnym ściśle związanym z końcowym odcinkiem spektryny w pobliŜu miejsca, w którym spektryna wiąŜe aktynę. Tak więc białko 4.1 jest częścią trzyskładnikowego zespołu; białko 4.1 — spekt-

876 / ROZDZIAŁ 63

ryna-aktyna. Białko 4.1 wiąŜe się równieŜ z integralnymi białkami: glikoforyną A i C, w ten sposób takŜe włączonymi do wspomnianego zespołu białek. Co więcej, białko 4.1 moŜe oddziaływać z niektórymi fosfolipidami błony i w ten sposób dochodzi do połączenia dwuwarstwowe] błony lipidowej z cytoszkieletem.

Niektóre inne białka (4.9, addukcyna, tropomiozyna) takŜe biorą udział w strukturach cytoszkieletu. Zaburzenia Mości i struktury spektryn są przyczyną dziedzicznej sferocytozy i eliptocytozy Dziedziczna sferocytoza (HS) jest genetycznie uwarunkowaną chorobą, przenoszoną jako cecha autosomalna dominująca. Dotyczy ona ok. I na 5000 mieszkańców Ameryki Północnej. Choroba charakteryzuje się obecnością we krwi obwodowej sferocytów (kulistych krwinek czerwonych, w których stosunek powierzchni do objętości jest obniŜony). Towarzyszy temu niedokrwistość hemolityczna i powiększenie śledziony. Sferocyty nie są tak podatne jak krwinki prawidłowe na odkształcenia i są niszczone w śledzionie, co znacznie skraca ich czas Ŝycia w krąŜeniu. Dziedziczna sferocytoza moŜe być wyleczona wycięciem śledziony, poniewaŜ przy braku śledziony sferocyty mogą dłuŜej pozostawać w krąŜeniu. Sferocyty są znacznie bardziej podatne na rozpad w warunkach obniŜonego ciśnienia osmo-

tycznego (osmolizę) niŜ prawidłowe krwinki czerwone. Jest to wykorzystywane w teście oporności osmotycznej. w którym krwinki czerwone są poddawane iwitro działaniu obniŜających się stęŜeń chlorku sodowego. Fizjologicznie stęŜenie chlorku sodowego wynosi 0,85 g/dl (0,85%). Kiedy prawidłowe krwinki czerwone poddaje się działaniu roztworu chlorku sodowego o stęŜeniu 0,50 g/dl (0,50%) tylko mała część krwinek ulega hemolizie, podczas gdy to samo stęŜenie chlorku sodowego powoduje rozpad ok. 50% sferocytów. Wyjaśnia się to faktem, Ŝe sferocyty będące komórkami kulistymi nie mają moŜliwości zwiększenia swej objętości przy wchłonięciu pewnej ilości wody, toteŜ ulegają rozpadowi po poddaniu ich działaniu lekko obniŜonego ciśnienia osmotycznego. Przyczyną dziedzicznej sferocytozy (ryc. 63-5) jest niedobór ilościowy spektryny lub nieprawidłowości jej budowy,' co prowadzi do upośledzenia zdolności wiązania do innych białek, z którymi w warunkach prawidłowych

Mutacje DNA wpływające na Ilość lub budowę spektryny względnie Innych biatek cytoszkieletu (np. ankiryny) Osiabierife oddziaływań pomiędzy peryferyjnymi I integralnymi białkami błony komórkowa) krwinki czerwone]

I Osfabfenie struktury błony komórkowej krwinki czerwonej

Osiągnięcie przez krwinkę czerwoną ksztatlu kulistego i niszczenie takich krwinek w śledzionie

Miedokrwistość henno! I tycz na

Ryc. 63-5. Zestawienie przyczyn wywołujących dziedziczną sferocytozę.

oddziałuje. Prowadzi to do osłabienia błony i nadaje kulisty kształt krwinkom. Nieprawidłowości dotyczące innych białek {np. ankiryny) biorą udział w niektórych postaciach dziedzicznej sferocytozy. Dziedziczna eliprocytoza jest genetycznie

uwarunkowaną chorobą zbliŜoną do dziedzicznej sferocytozy, a róŜnicą jest eliptyczny, zbliŜony do dysku kształt krwinek czerwonych, który moŜna stwierdzić pod mikroskopem. Przyczyną tego schorzenia jest równieŜ nieprawidłowość spektryny, a w niektórych przypadkach stwierdza się zaburzenia pasma 4.1. i glikoforyny C. WIELE JEST UKŁADÓW KRWI, W TYM UKŁADY ABO, Rh I MN Poznano co najmniej 21 układów grupowych krwi. Najlepiej znane z nich są układy ABO, Rh (Rhesus) i MN. Określenie grupa krwi oznacza system antygenów krwinki czerwonej (substancji grupowych krwi) określony przez genetyczny locus ze zmienną liczbą alleli (np. antygeny A, B i 0 w układzie grupowym ABO). Określenie typ krwi (blood type) odnosi się do fenotypu antygenowego zwykle rozpoznawanego przy uŜyciu właściwych przeciwciał. Do przetaczania krwi niezbędne jest poznanie podstaw układów grupowych ABO i Rh. Zainteresowanie grupami krwi dotyczy zagadnień biochemicznych, genetycznych, immunologicznych, antropologicznych, połoŜniczych, patologicznych i medyczno-sądowych. W niniejszym opracowaniu krótko omówione zostaną główne cechy układu ABO i wspomniana natura biochemiczna ukła-

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 877

dów Rh i MN. Z biochemicznego punktu widzenia istotne jest wyodrębnienie i określenie budowy substancji grupowych ABO, określenie dróg ich biosyntezy i ustalenie charakteru produktów genów A, B i 0. Układ grupowy ABO ma ogromne znaczenie w przetaczaniu krwi Układ ABO został opisany po raz pierwszy przez Landsteinera^v 1900 r. podczas badania podstaw zgodności i niezgodności przetaczanej krwi ludzkiej. Błony krwinek czerwonych większości ludzi zawierają substancje układu grup krwi grupy A, B, AB lub 0. Osoby grupy A mają w osoczu krwi przeciwciała skierowane przeciwko grupie B, tak więc ich osocze aglutynuje (zlepia) krwinki osób grupy B lub AB. Osoby grupy krwi B mają przeciwciała skierowane przeciwko A w osoczu krwi i one aglutynują krwinki grupy A i AB. Osoby z grupą krwi AB nie mają w osoczu ani przeciwciał anty-A, ani przeciwciał anty-B i są dlatego określane jako uniwersalni biorcy. Osoby z grupą krwi 0 nie mają w krwinkach czerwonych ani substancji A, ani B i dlatego są określane jako uniwersalni dawcy. Wyjaśnienie tych zjawisk łączy się z faktem, Ŝe organizm zwykle nie wytwarza przeciwciał przeciwko własnym składnikom, tak więc osoby z grupą krwi A nie wytwarzają przeciwciał przeciwko substancji grupowej A, ale wytwarzają przeciwciała skierowane przeciwko obcym substancjom grupowym krwi, tj. substancji B prawdopodobnie w wyniku podobieństwa strukturalnego tej substancji do związków obecnych w niektórych mikroorganizmach, z którymi organizm człowieka styka się we wczesnych okresach Ŝycia. PoniewaŜ osoby z grupą krwi 0 nie mają w krwinkach ani substancji A, ani B, mają w osoczu przeciwciała przeciwko obu tym substancjom. PowyŜszy opis jest uproszczony, poniewaŜ występują dwie podgrupy w ramach grupy A. tj. AA i A2. Geny odpowiedzialne za wytwarzanie substancji układu ABO są zlokalizowane w długim ramieniu chromosomu 9. WyróŜniono trzy allele, dwa z nich są równocenne (kodominujące) (A i B), a pozostały jest recesywny (0). Daje to ostatecznie cztery moŜliwe fenotypy: A, B. AB iO.

Substancje grupowe są glikosfingolipidami i glikoproteinami mającymi wspólne łańcuchy oligosacharydowe Substancje ABO są złoŜonymi oligosacharydarni obecnymi w większości komórek organizmu i występują w wielu wydzielinach. Oligosacharydy, które determinują swoistą naturę substancji ABO na powierzchni błon krwinek czerwonych, występują przede wszystkim w postaci głikosfingolipidów, podczas gdy w płynach ustrojowych te same oligosacharydy występują w postaci glikoprotein. Ich obecność w płynach ustrojowych jest zdeterminowana przez gen oznaczony jako Se (od angielskiego słowa secretor — wydzielacz), który koduje swoistą transferazę fukozylową (Fuc), występującą w narządach wydzielniczych, takich jak gruczoły wydzielania zewnętrznego, ale która nie jest czynna w krwinkach czerwonych. Osoby o genotypie SeSe lub Scse wydzielają antygen A lub B (względnie obydwa), podczas gdy osoby o genotypie sese nie wydzielają substancji A lub B, ale ich krwinki czerwone mają na swej powierzchni antygeny A i B. Substancja H jest biosyntetycznym prekursorem zarówno substancji A, jaki B Substancje ABO zostały wyodrębnione, określono teŜ ich budowę. Rycina 63-6 przedstawia uproszczoną wersję (tylko nie dające się zredukować fragmenty końcowe) substancji układu ABO. NaleŜy przede wszystkim zwrócić uwagę na strukturę substancji H, poniewaŜ jest ona prekursorem zarówno substancji A i B, jak i stanowi substancję grupową krwi stwierdzaną u osób z grupą krwi 0. Substancja H powstaje w wyniku działania transferazy fwkozylowej, która katalizuje przyłączenie fukozy występującej na końcu łańcucha oligosacharyd owego do reszty galaktozy za pomocą wiązania a 1,2 w następującej reakcji: GDP-Fuc -Gal-cc-R -Fuc-a1F2-Gal-p-R + GDP Prekursor

Substancja H

Wymienioną transferazę fukozyiową koduje gen H. Allel h w locus H koduje nieaktywną transferazę fukozyiową, tak więc osoby z genotypem hh nie mogą wytwarzać substancji H. Osoby z genotypem hh — mają krwinki czerwone grupy 0, mimo Ŝe posiadają enzymy niezbędne do wytwarzania substancji A lub B (p. niŜej).

878 / ROZDZIAŁ 63 Fucal -> 2GafB1 -» 2GalNAcra — R

Fucal -»2GalB1 -»3GalNAca —R Substancja H (lub O)

Substancja B GalNAc Substancja A 2GalB! -» 3GalNAca— R

Ryc. 63-6. Schematyczne przedstawienie struktury substancji grupowych krwi H, A i B. Substancja H jest długim łańcuchem oligosacharydowym typu kompleksowego, przyłączonym do ceramidu, kiedy substancje grupowe są glikosfingolipidami, lub teŜ do łańcucha polipeptydowego białek poprzez resztę seryny, jeśli substancje grupowe są glikoproteinami MoŜna zauwaŜyć, ze struktury substancji grupowych krwi są dwuantenowe; tzn mają 2 rozgałęzienia, które mogą się rozwidlać (czego nie pokazano) w punkcie połączenia GalNAca-R; na rycinie tej pokazano tylko jedną z moŜliwości tego rozwidlenia. KaŜda z substancji H, A, B zawiera 2 odpowiednio krótkie łańcuchy oiigosacharydowe, pokazane powyŜej. Substancja AB zawiera jeden typ łańcucha A i jeden typ łańcucha B.

GEN A KODUJE TRANSFERAZĘ GalNAc, GEN B — TRANSFERAZĘ Gal A GEN 0— NIECZYNNY PRODUKT W porównaniu z substancją H (ryc, 63-6) substancja A zawiera dodatkowo GalNAc, a substancja B zawiera Gal przyłączoną jak pokazano na rycinie. Przeciwciała przeciwko A są skierowane przeciwko dodatkowej reszcie GalNAc, która znajduje się w substancji A. Przeciwciała skierowane przeciwko B są skierowane przeciwko dodatkowej reszcie Gal obecnej w substancji B. Reszta cukrowcowa GalNAc jest immunodominującym ctfłfcrem (tj. jedynym determinującym swoistość przeciwciał skierowanych przeciwko substancjom grupowym krwi) dla grupy A, podczas gdy Gal jest immunodominującym cukrem dla substancji B, W świetle tych stwierdzeń strukturalnych nie jest zaskakujące, Ŝe substancja A moŜe być syntetyzowana in vitro z substancji 0 w reakcji katalizowanej przez transferazę GalNAc, dla której dawcą cukru jest UDP-GalNAc, Podobnie substancja grupy krwi B moŜe być wytworzona z substancji 0 w reakcji katalizowanej przez transferazę Gal z uŜyciem UDP-Gal. NaleŜy więc przyjąć, Ŝe gen grupy krwi A koduje syntezę transferazy GalNAc, która przyłącza resztę GalNAc do substancji 0. Podobnie produktem genu grupy krwi B jest transfera/a Gal przytaczająca Gal do substancji 0. Osoby mające grupę krwi AB posiadają obydwa enzymy i dwa łańcuchy oligosacharydowe, jeden zakoń-

czony GalNAc, a drugi Gal (ryc. 63-6). Osoby z grupą krwi 0 wytwarzają jedynie nieaktywne białko enzymatyczne, które moŜna wykryć za pomocą metod immunologicznych. Ich substancją grupową krwi w układzie ABO jest substancja H. W 1990 r. ustalono za pomocą kodowania i technologii określania sekwencji róŜnice między produktami glukozylotransferaz, tj. produktami genów A, B i 0. RóŜnica 4 nukleotydów jest wystarczająca, aby zróŜnicować swoistość glukozylotransferazy A i B. Z drugiej strony, allel 0 cechuje się mutacją pojedynczej pary zasad powodującą zmianę fazy odczytu oraz produkcję białka pozbawionego enzymatycznej aktywności transferazy. Czynnik Rh (antygen D) jest integralnym białkiem błony komórkowej krwinek czerwonych i moŜe powodować powaŜne problemy transfuzjo logiczne Układ grupowy Rh jest złoŜony i ani jego genetyczna ani biochemiczna natura nie została w pełni poznana. Jest on zdeterminowany przez 3 powiązane ze sobą geny umiejscowione na chromosomie 1. Produkty tych alleli zostały określone jako C lub c, E lub e oraz D lub d, ale biochemicznie produkty te nie zostały zidentyfikowane. Największe znaczenie i zainteresowanie budzi antygen D (Rha), który jest nazywany czynnikiem Rh. Jest on integralnym białkiem błony komórkowej krwinek czerwonych o ma-

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 879

sie cząsteczkowej ok. 30 000. Jego interakcje z fosfolipidami błony mogą mieć znaczenie dla ;ego antygenowości. Około 15% osób rasy kaukaskiej nie ma tego antygenu i są one określane jako Rh-ujemne. JeŜeli takiej osobie zostanie przetoczona krew Rh-dodatnia, będzie wytwarzać przeciwciała skierowane przeciwko antygenowi D {Rh0). WaŜne jest więc, aby osoby te otrzymywały transfuzje krwi Rh-ujemnej, a szczególnie *jest to istotne dla kobiet w wieku prokreacyjnym, które mogą zajść w dąŜę. JeŜeli taka kobieta w wyniku niedopatrzenia otrzyma krew Rh-dodatnią, w jej krwi obecne będą przeciwciała przeciwko antygenowi D (Rho). Z kolei jeŜeli jej dziecko będzie Rhdodatnie przeciwciała te mogą wywołać liŜę krwinek dziecka, co określane jest jako hemolityezna choroba noworodków. Po porodzie lub po poronieniu kobieta Rh-ujemna powinna rutynowo otrzymać Rho (D) immunogłobuUnę, która skutecznie przeciwdziała tworzeniu przeciwciał przez matkę skierowanych przeciwko antygenom Rho (D), na które była naraŜona. Układ grupowy MNSs dotyczy polimorficznych postaci glikoforyn Ai B Układ grupowy MN jest rozpoznawany za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko polimorficznym formom glikoforyny A. Na poziomie genowym obecne są dwa rownocenne allele: M i N z trzema moŜliwymi genotypami M/M, M/N i N/N. Z koiei moŜliwe są 3 fenotypy: M, MN, N. ChociaŜ glikoforyna A zawiera znaczną ilość węglowodanów, polimorfizm nie dotyczy części oligosacharydowej, a jedynie reszt aminokwasowych w N-końcu łańcucha polipeptydowego. RóŜnice przedstawiają się następująco: reszta 1 Ser Leu

reszta 5 Gly Glu

Układ Ss jest podklasą układu grupowego MN i dotyczy polimorfizmu glikoforyny B. Formy S i s róŜnią się jedną reszta amino-kwasową. Układ MNSs nie ma duŜego znaczenia w transfuzjologii, ale jest przydatny w badaniach dziedziczenia jako układ genów ściśle powiązanych na jednym chromosomie.

NIEDOKRWISTOŚCI HEMOLITYCZNE MOGĄ BYĆ WYWOŁANE PRZEZ CZYNNIKI WYSTĘPUJĄCE NA ZEWNĄTRZ KOMÓRKI, W BŁONIE KOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZ ERYTROCYTU Zcwnątrzkomórkowe przyczyny niedokrwistości hemolitycznych obejmują hipersplenizm, tj. stan, w którym śledziona jest powiększona z róŜnych przyczyn i powoduje niszczenie krwinek czerwonych. Przyczyny immunologiczne (np. reakcje poprzetoczeniowe, obecność w osoczu ciepłych lub zimnych przeciwciał, które powodują liŜę krwinek czerwonych i nadwraŜliwość na dopełniacz\(pwnieŜ zaliczają się do przyczyn zewnątrzkomorkowych, tak jak trucizny uwalniane przez niektóre mikroorganizmy, np. bakterie z rodzaju Ciostridium, Niektóre węŜe posiadają w jadzie substancje powodujące liŜę krwinek w wyniku działania na błonę komórkową (np. przez aktywację fosfolipaz lub proteinaz). Przyczyny umiejscowione w błonie komórkowej dotyczą nieprawidłowej budowy białek. NajwaŜniejszą przyczyną jest dziedziczna sferocytoza i dziedziczna eliptocytoza, głównie spowodowana przez nieprawidłowości spektryny (p. wyŜej). Przyczyny niedokrwistości hemolitycznych zlokalizowane wewnątrz erytrocytu obejmują hemoglobinopatie i enzymopatie. NajwaŜniejszą hemoglobinopatią jest niedokrwistość sierpowa ta. Najczęściej występującymi enzym opatiami są nieprawidłowości cyklu pentozowo-fosforanowego, szczególnie glikolizy. PrzewaŜający w populacjach niektórych części świata niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej stanowi przyczynę niedokrwistości hemolitycznej (p. wyŜej). Niedobór kjnazy pirogroniatiowej nie jest częsty, ale jest drugim co do częstości występowania niedoborem enzymatycznym powodującym niedokrwistość hemolityczną z powodu upośledzenia glikolizy. Powoduje to zmniejszone tworzenie ATP, co upośledza w róŜny sposób integralność błony krwinek czerwonych. Badania laboratoryjne pomocne w rozpoznawaniu niedokrwistości hemolitycznych zestawiono w tab. 63-7.

880 / ROZDZIAŁ 63 Tabeła 63-7. Badania laboratoryjne pomocne w rozpoznawaniu niedokrwistości hemolitycznej Badania ogólne

Badania swoiste

Wzrost stęŜenia we Elektroforeza Hb (np. wykrycie HbS), krwi nieskoniugowanej (pośredniej) bilioznaczanie aktywnośrubiny; ci enzymów krwinki skrócenie czasu Ŝycia czerwonej (np. dehydkrwinek czerwonych rogenazy giukozo-6-mierzone jako czas fosforanowej lub kiŜycia podanych donazy pirogronianowej); Ŝylnie autologiczzmniejszona oporność nych krwinek czerosmotyczna (np. w dziewonych znakowadzicznej sferocytozie), s1 nych Cr; odczyn Coombsa; zimretikulocytoza; ne aglutyniny hemoglobinemia; Bezpośredni odczyn Coombsa wykrywa obecmałe stęŜenie haptoność przeciwciał na globiny w osoczu krwinkach czerwonych podczas gdy pośredni odczyn Coombsa wykrywa obecność krąŜących przeciwciał przeciwko antygenom krwinek czerwonych

forylacja oksydacyjna (z powodu względnie małej liczby mitochondriów) oraz wysoka zawartość enzymów lizosomalnych. Wiele z tych enzymów, zestawionych w tab. 63-4, bierze udział takŜe w tlenowym metabolizmie granulocytów obojętnochłonnych (p. niŜej). Tabela 63-9 zestawia czynności biologiczne niektórych białek, które są względnie swoiste dla granulocytów obojętnochłonnych. Granuiocyty obojętnochłonne są głównymi obrońcami organizmu przed zakaŜeniami bakteryjnymi Granuiocyty obojętnochłonne są ruchliwymi komórkami Ŝernymi, które odgrywają główną rolę w stanach ostrych zapaleń. Wniknięcie bakterii do tkanek wywołuje zespół zjawisk, które zbiorczo określa się jako ostra odpowiedź zapalna. NaieŜą do nich: 1) wzrost przepuszczalności naczyń, 2) wnikanie uczynnionych (aktywowanych) granulocytów obojetnochłonnych do tkanek, 3) aktywacja płytek krwi, 4) samoistne ustąpienie tych zjawisk, jeŜeli wnikające mikroorganizmy zostaną pokonane^ Wiele czynników jest uwalnianych z komórek i białek osocza podczas ostrego zapalenia, a czynniki te sumarycznie powodują wzrost przepuszczalności ściany naczyniowej, którego

GRANULOCYTY OBOJĘTNOCHŁONNE ODZNACZAJĄ SIĘ AKTYWNYM METABOLIZMEM I ZAWIERAJĄ WIELE WYJĄTKOWYCH ENZYMÓW I BIAŁEK Główne cechy biochemiczne granulocytów obojętnochłonnych zestawiono w tab. 63-8. Dominującymi w nich zjawiskami są aktywna glikoliza tlenowa, aktywne przemiany cyklu pentozowo-fosforanowego, umiarkowana fos-

Tabela 63-8. Zestawienie głównych cech biochemicznych granulocytów obojetnochłonnych

wynikiem jest obrzęk tkanek (tab. 63-10). W stanach ostrego zapalenia granuiocyty obojętnochłonne pochodzą z krwi krąŜącej, skąd przechodzą do tkanek, aby pomóc w eliminowaniu obcych mikroorganizmów. Granuiocyty obojętnochłonne są przyciągane do tkanek przez czynniki chemo taktyczne, do których naleŜą fragmenty dopełniacza C5a, małe peptydy pochodzenia bakteryjnego (np. N-formylo-metionylo-leucylo-fenyloalanina) i liczne leukotrieny. Aby dotrzeć do tkanek, krąŜący we krwi granulocyt obojętnochłonny musi przeniknąć przez ścianę naczynia włosowatego. W tym celu granulocyty układają się wzdłuŜ ścian naczynia (ulegają marginalizacji), a*następnie przylegają

do komórek śródbłonka naczyń włosowatych.

Aktywna glikoliza Aktywny

cykl

pentozowo-fosforan

o

wy

Umiarkowana fosforylacja oksydacyjna Liczne lizosomy bogate w enzymy degradujące Obecność licznych unikalnych enzymów (np. mieloperoksydaza i układ NADPH-oksydazy) oraz białek Zawierają CD11/CD18 integryny w błonie cytoplazmatycznej

Integryny pośredniczą w przyleganiu granulocytów obojetnochłonnych do komórek śródbłonka Przyleganie granulocytów obojetnochłonnych do komórek śródbłonka wymaga udziału swoistych białek adhezyjnych (integryn) znaj-

dujących się na powierzchni granulocytów oraz swoistych białek receptorowych na powierzchni komórek śródbłonka.

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 881 Tabela 63-9. Wybrane waŜne enzymy i białka granulocytów obojetnochłonnych. Ekspresja tych cząsteczek jest badana podczas róŜnych okresów róŜnicowania się prawidłowych granulocytów obojetnochłonnych lub odpowiadających im komórek białaczkowych. W badaniach uŜywane są współczesne techniki biologii molekularnej (np. pomiar swoistego mRNA). Dla większości enzymów i białek wyodrębniono cDNA i określono jego sekwencje, a na tej podstawie ustalono sekwencje reszt aminokwasowych białek, ustalono lokalizację genu w chromosomie, jego budowę i układ aksonów i intronów. Niektóre waŜne proteazy granulocytów obojetnochłonnych zestawiono w tab. 63-12. Enzym lub białko Mieloperoksydaza (MPO) NADPH-oksydaza

Reakcja katalizowana lub czynność biologiczna

Komentarz

H2O2 + X (halogenek) + H -» HOX + H2O +

2O2 + NADPH - 202+ NADP + H

+

Odpowiedzialna za zielony kolor ropy Główny składnik eksplozji oddechowej. Dziedziczny niedobór moŜe by<± przyczyną nawracających zakaŜeń

Lizozym

Hydrolizuje wiązanie pomiędzy kwa- Występuje w duŜych ilościach w maksem N-acetylomuramtdowym i N-ace- rofagach **> tylo-D-glukozaminą znajdujące się w ścianie komórkowej bakterii

Defenzyny

Laktoferyna

Zasadowe peptydy antybiotykowe Zabijają bakterie przez uszkadzanie ich zbudowane z 29-30 reszt aminokwa- ściany komórkowej sowych Białko wiąŜące Ŝelazo MoŜe hamować wzrost wielu bakterii przez wiązanie Ŝelaza oraz brać udział w regulacji proliferacji komórek szpikowych

CD11b/CD,8*

Cząsteczki adhezyjne (natęŜą do integryn)

Niedobór przyczyną upośledzonej adhezji leukocytów

Receptory d ■ Fc frag- WiąŜe fragmenty Fc immunoglobuliny WiąŜe kompleksy antygen-przeciwcia;t ło do komórek szpikowych i limfoidalIgG mentów lgG nych, nasila fagocytozę i inne formy reakcji komórkowej * CD-C(US16T of differentiation (antygen róŜnicowania). Jest to określenie ujednoliconego systemu nazewnictwa powierzchniowych markerów leukocytów. Swoiste białka powierzchniowe (markery), które róŜnicują poszczególne linie iub stadia zróŜnicowania leukocytów i są rozpoznawane za pomocą grupy przeciwciał mOnoklonalnych są zaliczane do antygenów róŜnicowania. Układ ten jest szczególnie pomocny w klasyfikowaniu podtypów limfocytów. Wiele antygenów róŜnicowania bierze udział w interakcjach komórka-komórka, adhezji i przekazywaniu sygnałów przez błony komórkowe. Tabela 63-10. Źródła wazoaktywnych cząsteczek biorących udział w ostrym zapaleniu Białka osocza Granulocyty Komórki tuczne Płytki krwi krwi obojetnochłonne Histamina

Serotonina

Czynnik aktywujący płytki (PAF) Eikozanoidy (róŜne prostaglandyny i ieukotrieny)

Intcgryny są nadrodziną białek powierzchniowych obecnych w róŜnorodnych komórkach. Biorą one udział w przyleganiu komórek do komórek oraz komórek do składników

C3a, C4a ł C5a układu dopełniacza Bradykinina i produkty rozpadu fibryny z układu krzepnięcia

substancji pozakomórkowej. Integryny są heterodimerami zbudowanymi z połączonych niekowalencyjnie podjednostek a i p. Podjednostki zawierają zewnątrzkomórkowe, śródbłonowe

882 / ROZDZIAŁ 63

i wewnątrzkomórkowe segmenty. Zewnątr/komórkowe segmenty wiąŜą róŜne iigandy, takie jak białka substancji po Ŝakom orkowej i białka powierzchni innych komórek. Ligandy te często zawierają sekwencje Arg-Gly-Asp (R-G-D). Wewnątrzkomórkowe segmenty wiąŜą się do róŜnych składników cyt o szkieletu, takich jak aktyna lub winkulina. Integryny są białkami, które łączą składniki występujące na zewnątrz komórek ze składnikami ich wnętrza, a przez to pomagają integrować odpowiedź komórki na zmieniające się warunki otaczającego środowiska. Początkowo wyróŜniono 3 podrodziny integryn. Integryny wchodzące w skład poszczególnych podrodzin róŜnią się podjednostką y., a zawierają wspólną dla kaŜdej podrodziny podjednostkę p\ Z czasem wyróŜniono więcej niŜ 3 rodzaje podjednostek P, co sprawiło, Ŝe klasyfikacja integryn stała się bardziej złoŜona. Niektóre integryny swoiście związane z czynnością granulocytów obojętnochlonnych są zestawione w tab. 63-11, Niedobór podjednostki p2 (zwanej takŜe CD18) w LFA-1 i dwóch pokrewnych integrynach: Mac-] (CDllbCDlS) i pl50.95 (CDllcCD18) stwierdzono w granulocytach obojętnochłonnych i makrofagach; powoduje to upośledzenie adhezji (przylegania) leukocytów

— chorobę charakteryzującą się nawracającymi

zakaŜeniami bakteryjnymi i grzybicami. Wśród róŜnych skutków wymienionego niedoboru, upośledzone jest przyleganie białych krwinek do komórek śródbłonka, tak więc mniejsza liczba granulocytów obojętnochłonnych moŜe wnikać do tkanek, aby zwalczać zakaŜenie. Po przeniknięciu przez ścianę małych naczyń, granulocyty obojętnochłonne migrując w kierunku największego stęŜenia czynników chemotaktycznych, napotykają wnikające bakterie i próbują je zaatakować oraz zniszczyć. Granulocyty obojętnochłonne muszą być w stanie aktywacji, aby uruchomić ciąg procesów metabolicznych biorących udział w fagocytozie i zabijaniu bakterii. Aktywacja granulocytów obojętnochłonnych jest podobna do aktywacji płytek krwi i wymaga hydrolizy bisfosforanu f osf atydyloi nozytoi u Mechanizmy biorące udział w aktywacji płytek krwi są omówione w rozdz. 58 (p. ryc. 58-9). Proces ten obejmuje oddziaływanie bodźca (np. trombiny) na receptor, aktywację białek G, pobudzenie aktywności fosfolipazy C i uwalnianie trifosforanu inozytolu i diacylglicerydu z bisfosforanu fosfatydyloinozytonu. Związki te, biorące udział w przenoszeniu 7/gnału, powodują wzrost wewnątrzkomórkię 'ego Ca2 +

Tabela 63-11. Przykłady integryn, które odgrywają waŜną rolę w czynności granulocytów obojętnochłonnych, innych leukocytów oraz płytek krwi Integryna Komórka Podjednostki Ugand Czelność VLA-1 VLA-5

Leukocyty, inne komórki Leukocyty, inne komórki

«, P,

Kolagen, laminina

ae,P,

Fibronektyna

Adhezja komórek do substancji poza kom orkowej Adhezja komórek do substancji poza kom orkowej Adhezja komórek do substancji poza kom orkowej

VUA-6

Leukocyty, inne komórki

LFA-1 (CD11aCD18) Glikoproteina Ifb/llla

Leukocyty

«l.Pa

ICAM-1, ICAWI-2

Płytki krwi

%, Ps

Fibrynogen.łibronekty- Adhezja i agregacja na. czynnik von Wille płytek krwi branda

Laminina

Adnezja krwinek białych

LFA-1 — lymphocyte funetion-associated antigen 1 (antygen-1 związany z czynnością limfocytów); VLA —very late antigen (bardzo późny antygen), CD — ciuster of differentiation (antygen róŜnicowania); ICAM — intercellular adhesion molecule (międzykomórkowa cząsteczka przylegania). Niedobór LFA-1 i zbliŜonych integryn stwierdzono u chorych z upośledzoną adhezja, leukocytów. Niedobór zespołu glikoprotein llb/llla wykazano w trombastenii Glanzmanna, chorobie cechującej się krwawieniami, prawidłową liczbą płytek krwi, ale nieprawidłową kurczliwością skrzepu Obserwacje te wskazują jak istotne Jest poznanie adhezyjnych białek powierzchni komórek w wyjaśnieniu przyczyn licznych chorób.

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 833

i aktywację kinazy białek C. Dodatkowo aktywacja fosfolipazy A2 wytwarza kwas arachidonowy, który jest produktem wyjściowym dla wielu biologicznie czynnych eikozanoidów. Proces aktywacji granulocytów obojetnochłonnych jest wyraźnie podobny. Są one pobudzone przez bakterie, wiązanie czynników chemotaktycznych lub kompleksy antygen-przeciwciało za pośrednictwem swoistych receptorów. Wytworzony w procesie aktywacji wzrost stęŜenia wewnątrzkomórkowych jonów Ca2+ wpływa na wiele procesów zachodzących w granulocytach obojetnochłonnych, takich jak łączenie się mikrotubul oraz układ aktyna-miozyna. Procesy te biorą udział, odpowiednio, w wydzielaniu zawartości ziarnistości oraz w ruchliwości komórek, co pozwala granulocytom obojętnochłonnym odszukiwać mikroorganizmy, które wtargnęły do ustroju. Aktywowane granulocyty obojętnochłonne są w tym stanie gotowe, aby zniszczyć mikroorganizmy za pomocą mechanizmów, które obejmują produkcję czynnych postaci tlenu. Eksplozja oddechowa komórek fagocytujących zachodzi przy udziale IMADPH-oksydazy i pomaga zabijać bakterie Kiedy granulocyty obojętnochłonne lub inne komórki fagocytujące wchłoną bakterie, wykazują szybki wzrost zuŜycia tlenu znany jako eksplozja tlenowa. Zjawisko to odzwierciedla szybkie zuŜywanie tlenu (następujące po 15 — 60 s) i wytwarzanie duŜych ilości czynnych pochodnych tlenowych, takich jak O2 , H2O2, OH' i OCI ~ (jon podchlorawy). Niektóre z tych produktów są potencjalnymi czynnikami bakteriobójczymi. Łańcuch przenoszenia elektronów odpowiedzialny za wybuch tlenowy zawiera wiele składników, w tym flawoproteinę NADPH:O2oksydoreduktazę (często zwaną NADPH-oksydazą) i cvtochrom typu b (nazywany cytochromem bssgz powodu charakterystycznej długości spektralnej w odróŜnieniu od cytoghromu bM5, którego potencjał oksydoredukcyjny wynosi 245 mV i jest najniŜszy ze wszystkich cytochromów b, co daje mu zdolność redukowania tlenu do ponadtlenków). Ten system katalizuje jednoełektronową redukcję tlenu do anionu ponadtlenkowego (p. tab. 63-4 pod NADPH-oksydaza). Oksydoreduktaza jest redukowana przez NADPH, a cytochrom b wykonuje jednoelektronową redukcję tlenu do postaci ponadtlenkowej.

Układ ten jest umiejscowiony w błonach plaŜmatycznych granulocytów obojętnochionnych i innych komórek fagocytujących. NADPH jest wytwarzany w cyklu pentozowo-fosforanowym, którego aktywność wzrasta znacznie podczas fagocytozy. W powyŜej wymienionej reakcji następuje spontaniczne wytwarzanie (w procesie spontanicznej dysmutacji) nadtlenku wodoru z dwóch cząsteczek ponadtlenku: + O 2 ~ + 2H

Oz J

Jonponadtlenkowyjest wydalany na zewnątrz komórki lub do fagolizosomów, w których znajdują się wchłonięte bakterie. Zabijanie bakterii w fagolizosomach zaleŜy-od połączonego działania podwyŜszonego pH, jonu ponadtlenkowego i dalszych pochodnych tlenowych (H2O2, OH' i HOC1 czyli kwas podchlorawy, p. niŜej) oraz działania wielu bakteriobójczych peptydów (de-fensyn) i innych białek (np. katepsyny G i kilku białek kationowych) obecnych w komórkach fagocytujących. KaŜdy ponadtlenek, który dostanie się do cytozolu komórki fagocytującej ulega przekształceniu w H2O2 w wyniku działania dysmutazy ponadtlenkowej, która katalizuje tę samą reakcję dysmutacji, jaka zachodzi spontanicznie, co opisano powyŜej. Z kolei H2O2 jest zuŜywana przez mieloperoksydazę (p. niŜej) lub zuŜywana w wyniku działania peroksydazy glutationowej lub katalazy. NADPH-oksydaza występuje w postaci nieczynnej w spoczynkowych komórkach fagocytujących i ulega aktywacji po kontakcie róŜnych ligandów (fragmenty C5a dopełniacza, peptydy chemotaktyczne itp.) z receptorami błony plazmatycznej. Zjawiska wynikłe z aktywacji układu oksydazy są przedmiotem wielu badań, chociaŜ stale nie są w pełni poznane i są zbliŜone do uprzednio opisanego procesu aktywacji granulocytów obojętnochłonnych, czego moŜna oczekiwać wobec faktu, Ŝe wybuch oddechowy jest integralną częścią procesu aktywacji. W zjawiskach tych biorą udział białka G, aktywacja fosfolipazy C i tworzenie inozytoio-l,4,5-trisfosforanu. Ostatni z wymienionych związków bierze udział w krótkotrwałym wzroście stęŜenia Ca2~, który jest istotnym elementem wywoływania eksplozji oddechowej. Wytwarzany jest równieŜ diacyloglycerol, który powoduje przemieszczenie kinazy białek C do błon plazmatycznych z cytoplazmy. Tam enzym ten katalizuje fosforylację róŜnych białek, które są prawdopo-

884 / R OZDZIAŁ 63

dobnie składnikami układu oksydazy. PowyŜszy obraz jest bardziej złoŜony na co wskazują dane o podwójnej drodze aktywacji takŜe obejmującej przenoszenie sygnału niezaleŜne od Ca2 + . Dodatkowo wykryto dwa polipeprydy cytoplazmatyczne jako waŜne składniki pełnego układu N ADPH-oksydazy. Są one włączone do błon plazmatycznych podczas aktywacji i tworzą czynny układ enzymatyczny. Mutacje genów składników układu NADPH-oksydazy powodują przewlekłą chorobę ziarntczą Znaczenie układu NADPH-oksydazy jasno zostało ukazane w obserwacjach upośledzonej eksplozji oddechowej, jaka zachodzi w przewlekłej chorobie ziarniczej, rzadkim schorzeniu cechującym się nawracającymi zakaŜeniami i uogólnionymi ziarniniakami (przewlekłymi zmianami zapalnymi) skóry, płuc i węzłów chłonnych. Ziarniniaki są formą odgraniczenia bakterii, które nie mogą być zabite z powodu dziedzicznego niedoboru układu NADPH-oksydazy. Większość chorych to męŜczyźni, poniewaŜ choroba jest dziedziczona w sprzęŜeniu z chromosomem X. Podstawowymi przyczynami choroby są mutacje genu dla cytochromu b. U innych pacjentów choroba występuje w postaci autosomalnej recesywnej, a mutacje dotyczą genów warunkujących budowę dwóch polipeptydów biorących udział w aktywacji granulocytów obojętnochłonnych. Niektórzy pacjenci dobrze reagują na podawanie y-interferonu, który powoduje wzrost ilości cytochromu b przez wpływ na transkrypcję właściwych genów. Prawdo pod o tSrte przyczyny wywołujące przewlekłą chorobę ziarniczą są przedstawione na ryc. 63-7. Mutacje genów składników białkowych (tj. cytochromu b,,, zwanego takŜe bj,,} i dwćcn cytozolowych polipeptydow układu NADPH-oksydary Zmniejszone wytwarzanie jonu po nad tlenkowego i innych aktywnych pochodnych tlenowych

Zmniejszone zabijanie wybranych bakterii

Nawracające zakaŜenia i tworzenie w tkankach ziarniniaków w celu ograniczenia bakterii, które przeŜyty

Ryc. 63-7. Uproszczony schemat kolejności zja wisk leŜących u podstaw przewlekłej choroby ziar niczej. _________

Granulocyty obojetnochłonne zawierają mieloperoksydazę, która katalizuje wytwarzanie utleniaczy zawierających chlor Enzym mieloneroksydaza, obecny w duŜych ilościach w zianiistościach granulocytów obojętnochłonnych i odpowiedzialny za zielony kolor ropy, działa na H2O3 i powoduje powstanie jonu podchlorawego: +

Mieloperoksydaza

H2O2 + X +_H j ------ —---- z --. HOX +H a O <X = Cl , Br , I lub SCN ; HOCI = kwas podchlorawy)

H2O; uŜywany jako substrat reakcji jest wytwarzany przez układ NADPH-oksydazy. Cl" jest najczęściej wykorzystywanym chlorowcem, poniewaŜ jest on obecny w stosunkowo duŜych stęŜeniach w osoczu i płynach ustrojowych. HOCI, czyli czynny składnik płynnych środków wybielających stosowanych w gospodarstwie domowym, jest silnym utleniaczem i jest silnie bakteriobójczy. Kiedy zostaje podany do niezmienionych tkanek, jego potencjalnie uszkadzające działanie jest osłabione przede wszystkim przez łączenie się z pierwszo rzędowym i i drugorzędowymi aminami obecnymi w granulocytach obojętnochłonnych i tkankach, w wyniku czego powstają róŜne produkty połączenia chlorku z azotem (N-Cl). NaleŜą do nich chloraminy, które takŜe, chociaŜ słabiej niŜ uprzednio wymienione substancje, działają bakteriobójczo (np. są stosowane w odkaŜaniu ran) nie powodując przy tym uszkodzenia tkanek, Proteinazy granulocytów obojętnochłonnych mogą powodować powaŜne uszkodzenia tkanek, jeŜeli ich działanie nie jest kontrolowane Granulocyty obojętnochłonne zawierają liczne proteazy (tab. 63-12), które mają zdolność do hydrolizy elastyny, róŜnych typów kolagenu i innych białek obecnych w substancji pozakomórkowej. Działanie takie, jeŜeli nie jest ograniczane, moŜe powodować powaŜne uszkodzenia tkanek. Większość tych proteaz to enzymy lizosomalne występujące w prawidłowych granulocytach obojętnochłonnych głównie w postaci nieaktywnej. Małe ilości enzymów są uwalniane do prawidłowych tkanek, ale ilość ta znacznie wzrasta w stanach zapalnych. Aktywność elastazy i innych proteaz jest w stanach prawidłowych ograniczana przez liczne antyproteazy (takŜe zestawione w tab. 63-12), które

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 885 Tabela 63-12. Proteazy granulocytów obojętnochłonnych oraz antyproteazy osocza krwi i tkanek Proteazy Antyproteazy Elastaza OCT -Antyproteaz a tX2Kolagenaza śelatyn a za

Makroglobulina Wydzielniczy inhibitor leukoproteaz

Aktywator plaz- o, -^ntyc h ym otry psy n a mmogenu lnhibitor-1 aktywatora plazminogenu Tkankowy inhibitor metaloproteaz Tabela zawiera wybrane waŜne proteazy granulocytów oboje, tnochlonnych i niektóre białka, które hamują ich działanie. Większość wymienionych proteaz występuje wewnątrz granulocytów obojetnochłonnych w postaci prekursorowej. Aktywator plazminogenu nie jest proteazą, ale jest wymieniony, poniewaŜ aktywuje plazmtnę, która jest proteazą. Wymienione proteazy mogą rozkładać wiele białek substancji poza kom orkowej powodując w ten sposób uszkodzenie tkanek. Sumaryczna równowaga proteaz i antyproteaz moŜe zostać zaburzona w wyniku zmienionej aktywacji prekursorów proteaz lub inaktywacji antyproteaz. Ostatnie z wymienionych zjawisk moŜe zachodzić na drodze proteolitycznej degradacji antyproteaz lub ich chemicznej modyfikacji, np. palenie tytoniu powoduje utlenianie reszty metioninowej w pozycji 358 w ai-antyproteazie.

występują w osoczu krwi i pozakomórkowym płynie tkankowym. KaŜda z antyproteaz moŜe hamować proteazę lub proteazy przez łączenie się z enzymem w niekowalencyjny kompleks. W rozdziale 58 wykazano, Ŝe dziedziczny niedobór <Xi-antyproteazy powoduje niekontrolowaną aktywność enzymatyczną elastazy, która degraduje tkankę płucną i w ten sposób staje sie przyczyną rozedmy tego narządu. a2-Makroglobulina jest wielkocząsteczkowym (masa cząsteczkowa ok. 725 000) białkiem osocza krwi, które odgrywa istotną rolę w ochronie ustroju przed nadmiarem proteaz. Ma ona zdolność łączenia się z enzymami i w ten sposób inaktywuje wiele proteaz. Wzrost ilości utleniaczy zawierających chlor, wytwarzanych w stanach zapalnych, zaburza równowagę proteazy-antyproteazy na korzyść enzymów. Przykładowo, wiele proteaz wymienionych w tab. 63-12 jest aktywowanych przez HOC1, podczas gdy liczne antyproteazy są inaktywowane przez ten związek. Dodatkowo, tkankowy inhibitor metaloproteaz i ot ranty-

chymotrypsyna mogą być hydrolizowane przez aktywną elastazę, a ai-antyproteaza moŜe być hydroiizowana przez aktywną kolagenazę i Ŝelatynazę. W większości przypadków zostaje ustalona właściwa równowaga proteaz i antyproteaz, chociaŜ w takich stanach, jak niedobór ot]-antyproteazy lub nagromadzenia znacznej liczby granulocytów obojetnochłonnych w tkankach z powodu niedostatecznego ich odpływu moŜe dojść do znacznego uszkodzenia tkanek w wyniku działania nie ograniczanej aktywności proteaz. i

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA MA WYRAŹNY WPŁYW NA ROZWÓJ HEMATOLOGII *♦ Technologia rekombinacji DNA wywiera istotny wpływ na wiele aspektów hematologii. Podstawy etiologiczne talasemii (p. rozdz. 42) i wiele zaburzeń krzepnięcia (p. rozdz. 58) zostało w znacznym stopniu wyjaśnionych za pomocą klonowania lub określania sekwencji. Badania onkogenów i translokacji chromosomalnych posunęły do przodu zrozumienie mechanizmów białaczek (p rozdz, 61). Jak wspomniano powyŜej, techniki klonowania dostarczyły leczniczych ilości erytropoetyny i innych czynników wzrostowych. Niedobór deatninazy adenozynowej, który szczególnie dotyczy limfocytów, jest pierwszą chorobą leczoną za pomocą terapii genowej. Podobnie jak inne dziedziny biologii i medycyny, hematologia ulega i ulegać będzie dalszej rewolucji dzięki tyra zadziwiającym technologiom.

PODSUMOWANIE Erytrocyt ma prostą budowę i funkcje. Składa się przede wszystkim ze stęŜonego roztworu hemoglobiny otoczonego przez błonę komórkową. Wytwarzanie erytrocytów jest regulowane przez erytropoetynę, natomiast leukocytów przez inne czynniki wzrostowe (np. czynniki pobudzające tworzenie kolonii granulocytów oraz makrofagów). Erytrocyt zawiera cały arsenał enzymów cytoplazmatycznych, takich jak dysmutaza, kataiaza, peroksydaza glutationowa, aby eliminować silne utleniacze powstające podczas jego metabolizmu. Genetycznie uwarunkowany niedobór aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, która warunkuje pro-

8S6 / ROZDZIAŁ 63

dukcję NADPH, jest waŜną przyczyną niedokrwistości hemolitycznej. Methemoglobina nie ma zdolności przenoszenia tlenu. Znane są zarówno dziedziczne, jak i nabyte przyczyny tej choroby. Istotne informacje uzyskano o białkach i lipidach budujących błonę komórkową erytrocytów. Liczne białka cy to szkieletu, takie jak spektryna, ankiryna i aktyna, oddziałują ze swoistymi białkami integralnymi błony i pomagają utrzymać krwince dwuwklesły kształt i podatność na odkształcenia. Niedobór spektryny powoduje dziedziczną sferocy toze, jedną z istotnych przyczyn niedokrwistości hemolitycznej. Substancje grupowe układu ABO są złoŜonymi glikosfingo lipidami występującymi w błonie krwinek; immunodominującym cukrem substancji A jest N-acetylogaiaktozamina, a substancji B — galaktoza. Antygeny układu Rh są integralnymi białkami Wony komórkowej, a substancje grupowe układu MN są polimorficznymi postaciami glikoforyuy A. Granulocyty obojętnochlonne odgrywają główną rolę w mechanizmach obronnych ustroju. Integryny obecne na powierzchni komórek determinują swoiste oddziaływanie róŜnych komórek i składników tkankowych. Leukocyty ulegają aktywacji w wyniku kontaktu z bakteriami oraz działania innych bodźców. NADPH-oksydaza odgrywa główną rolę w procesie aktywacji (eksplozja oddechowa). Mutacje enzymów i związanych z nimi białek są przyczyną przewlekłej choroby ziarniczej. Proteazy granulocytów obojętnochłonnych mogą rozkładać wiele białek tkankowych; w warunkach prawidłowych są pod kontrolą arsenału antyproteaz. Jednak ten nWfchamzm hamujący moŜe być złamany w wielu okolicznościach, co prowadzi do rozległych uszkodzeń tkanek. Zastosowanie technologii rekombinacji DNA zrewolucjonizowało badania w hematologii.

PIŚMIENNICTWO Baggiolini M, Wymann MP: Turning on the respiratory burst. Trends Biochem Sci 1990;15:69. Beck WS (editor). Hematołogy, 5th ed. MIT Press, 1991. Junqueira LC, Carneiro J, Kelley RO: Chapiers 12 and 13 in: Basie Histology, 6th ed. Appleton & Lange, 1989. Krantz SB: Erythropoietin. Blood 1991;77:419. Lienhard GE et al: How cells absorb glucose. Sci Am (Jan) 1991;266:86. Lubbert M, Herrmann F, Koeffler HP: Expression and regulation of myeloid-specific genes in normal and leukemie myeloid cells, Blood 1991;77:909. Lux SE, Becker PS: Disorders of the red celi membranę skcleton: Hereditary spherocytosis and hereditary elliptocytosis. Chapter 95 in: The Metaboiic Basis of Inherited Disease, 6th ed. Scriver CR et al (editors}. McGraw-Hill, 1989. Luzzato L, Mehta A: Glucose-6-phosphate dehydrogenasc deficiency. Chapter 91 in: The Metaboiic Basis of Inherited Disease, 6th ed. Serwer CR et al {editors}. McGraw-Hill, 1989. Rapaport ST: Introduction to Hentatohgy, 2nd ed. Lippincott, 1987. Segal AW: The eleetron transport chain *of the microbicidal oxidase of phagocytic cells and its involvement in the molecularpathology of chronić granulomatous disease. JClin Invest 1989:83:1785. Smith RM, Curnutte JT: Molecular basis of chronić granulomatous disease. Blood 1991;77:673. Spitznagell JK: Antibiotic protcins of huraan neutrophils. J Clin Imest 1990;86:138I. Weatherall DJ et al: The hemoglobinopathies. Chapter 93 in: The Metaboiic Basis of Inherited Disease. 6th ed. Scriver CR et al (editors). McGraw-Hill, 1989. Yamamoto F et al: Molecular genetic basis of the histoblood group ABO system. Naturę 1990;345:229.

PodłoŜe biochemiczne niektórych schorzeń neuropsychiatrycznych

64

Robert K. Murray, MD, PhD

WPROWADZENIE Rozdział ten nie stanowi systematycznego opisu takich zagadnień, jak mechanizm neurotransmisji, cechy neuro transmiter ów, właściwości synaps, ani szczegółów, takich jak kanały jonowe w mózgu. Tematy te są dobrze przedstawione w wielu podręcznikach neurofizjologii, biologii molekularnej i neuro farmakologii. Niektóre z nich są wymienione w piśmiennictwie na końcu tego rozdziału. Zakładamy, Ŝe czytelnik ma pewną znajomość podstawowych pojęć neuro fizjologii i neuro anatomii. Zamiast tego przedyskutujemy 8 schorzeń {lub grup schorzeń) neuropsychiatrycznych: miastenię, chorobę Huntingtona, udary mózgu, choroby spowodowane mutacjami mitochondrialnego DNA, zespół łamliwego chromosomu X i inne schorzenia związane z powtórzeniem trypletowym, chorobę Parkinsona, chorobę Alzheimera i schizofrenię. Współczesne osiągnięcia biochemiczne, komórkowe i genetyczne rzuciły na te schorzenia pewne światło i w niektórych przypadkach stwarzają szansę na nowe sposoby leczenia. Jedne z tych schorzeń są bardziej pospolite, inne mniej, ale wszystkie dają nam cenny wgląd w biochemię mózgu i otwierają nowe perspektywy.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Główne dwa wyzwania, przed którymi staje współczesna biologia to określenie mechanizmów zaangaŜowanych w rozwój i róŜnicowanie i odkrycie działania układu nerwowego. Metody badawcze, które umoŜliwiła technologia rekombinowanego DNA, odgrywają waŜną rolę w obu tych zagadnieniach. Klinicznie choroby

neuropsychiatryczne są^waŜne m.in. dlatego, Ŝe są często przewlekłe (np. schizofrenia) i wyniszczające (np. udary, choroba Huntingtona, choroba Alzheimera i schizofrenia), poniewaŜ mogą niszczyć funkcje intelektualne. Badania neurobiologiczne nie tylko pozwalają nam na lepsze zrozumienie naszej własnej natury, ale takŜe dostarczają racjonalnej podstawy skutecznej terapii wielu schorzeń prowadzących do kompletnego inwalidztwa. Według amerykańskiej Narodowej Fundacji Badań Mózgu koszta bezpośrednie schorzeń mózgu (choroby psychiatryczne i neurologiczne, alkoholizm i narkomanie) wynoszą ponad 401 mld dolarów rocznie. Koszt jednej tylko choroby, otępienia, czyli demencji (której najwaŜniejszym przykładem jest choroba Alzheimera), przewyŜsza koszt leczenia raka i choroby wieńcowej serca. Koszta bezpośrednie w wysokości 401 mld dolarów stanowiły */? całkowitych wydatków słuŜby zdrowia w USA w 1991 r. Obliczono teŜ, Ŝe koszta pośrednie (np. utrata zarobków, system ścigania zbrodni) przewyŜszają koszta bezpośrednie. Na kaŜde 100 dolarów wydanych na opiekę nad pacjentem z chorobą Alzheimera Stany Zjednoczone inwestowały tylko 50 centów na badania nad tym problemem, a w innych krajach nakłady na badania są z pewnością niŜsze.

ABY ZROZUMIEĆ MIASTENIĘ, TRZEBA ZROZUMIEĆ ZJAWISKA ZACHODZĄCE W ZŁĄCZU NERW0WO-M1ĘŚNI0WYM Miastenia (myasthenia gravis) charakteryzuje się nawracającymi epizodami słabości mięśnio-

wej, głównie dotyczącej mięśni unerwianych

888 / ROZDZIAŁ 64

przez nerwy czaszkowe. Stan chorego poprawia podawanie leków, które hamują acetylochoiinesterazo (patrz niŜej) i fakt ten jest wykorzystany w rozpoznaniu i leczeniu. W miastenii z powodów, które nic są jasne, organizm wytwarza autoprzeci wdała skierowane przeciw receptorowi cholinergicznemu (AChR) w płytce nerwowo-mięśniowej; przeciwciała te powodują zniszczenie receptorów i prowadzą do znacznego zmniejszenia ich liczby. Tak więc, aby zrozumieć tę chorobę, trzeba koniecznie poznać podstawowe fakty dotyczące przekaźrrictwa nerwowo-mięśniowego. Schemat złącza nerwowo-mięśniowego i niektórych zachodzących w nim zjawisk przedstawia ryc. 64-1, Złącze to składa się z pojedynczego zakończenia nerwowego oddzielonego od obszaru pos[synaptycznego szczeliną synaptyczną. Płytka motoryczna jest wyspecjalizowaną

Zakończenie nerwowe

Btena presynaptyezna

Ryc. 64-1- Schematyczne przedstawienie niektórych wydarzeń w złączu necwowo-mięśniowym. Część zakończenia nerwowego ukazano leŜącą w ścisłym przyłoŜeniu do mięśniowej płytki końcowej. Cały proces, w którym acetylocholina pobudza receptor, moŜe być traktowany jako zachodzący w sześciu etapach (patrz tekst). AcCoA — acetyloCoA, ACh — acetyl och ot i na; AChRs — receptory acetylocholinowe; Ac — octan

częścią błony mięśniowej biorącej udział w złączu. Wyraźnie widać fałdy złącza; zawierają one duŜo receptorów cholinergicznych w bezpośredniej bliskości zakończenia nerwowego. MoŜna uwaŜać, Ŝe wszystkie zjawiska w złączu zachodzą w 6 etapach (ryc. 64-1). 1. Synteza acetyl och o liny zachodzi w cytoplazmie zakończenia nerwowego, w którym znajduje się enzym acetylotransferaza cho li no wa, katalizująca reakcję Acetyio - Co A ■:- Chol i na -> Acetylocholina+ + CoA

Zsyntetyzowana acetylocholina zostaje wbudowana do małych, związanych z błoną ziarnistości zwanych pęcherzykami synaptycz nymi i w nich składowana. Szczegóły tego proce su nie są dobrze poznane. Uwalnianie acetylocholiny z tych pęche rzyków do szczeliny synaptycznej jest następ nym etapem. Dochodzi do tego w procesie egzocytozy, w którym następuje fuzja pęcherzy ka z błoną pre&ynaptyczną. W stanie spoczyn kowym pojedyncze kwanty {ok. 10 000 cząs teczek neurotransmitera, prawdopodobnie od powiadające zawartości jednego pęcherzyka sy naptycznego) są uwamiane spontanicznie, w wyniku czego powstają niewielkie miniaturo we potencjały płytki końcowej (MEPP). Kiedy zakończenie nerwowe zostaje zdepoiaryzowane w wyniku dotarcia doń impulsu nerwowego, otwierają się zaleŜne od napięcia kanały wap niowe, co pozwala na napływ jonów wapnia z przestrzeni synaptycznej do zakończenia ner wowego. Te jony wapniowe pełnią zasadniczą rolę w procesie egzocytozy, w którym acetylochoiina (zawartość ok. 200 pęcherzyków) zo staje uwolniona do przestrzeni synaptycznej. Uwolniona acetyl och oiina szybko dy fun duje przez szczelinę synaptyczną do jej recep torów w fałdach złącza, £iedy dwie cząsteczki acetylocholiny połączą się z receptorem, ten ulega zmianie konformacyjnej, otwierając kanał receptorowy pozwalający na przepływ jonów przez błonę, W wyniku tego dochodzi do na pływu jonu Na+. co prowadzi do depolaryzacji błony mięśniowej i powstania potencjału płyt kowego. Potencjał ten depolaryzuje z kolei sąsiednią błonę mięśniową i w ten sposób powstają i zostają przenoszone wzdłuŜ włókna potencjały czynnościowe, powodujące skurcz mięśni (p. rozdz. 59). Gdy kanał się zamyka, cząsteczka acetylocholiny oddysocjowuje i zo-

PODŁOśE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYChHATRYCZNYCH / 889

staje zhydrolizowana przez acetyiocholinesterazę, która katalizuje reakcję Acety tocholina HxO-> Octan +- Cholina

Ten waŜny enzym znajduje się w duŜych ilościach w błonie podstawnej przestrzeni synaptycznej. 6. Cholina jest odzyskiwana przez zakończenie nerwowe dziękiunechanizmowi aktywnego transportu, i tam moŜe być ponownie uŜyta do syntezy acetylocholiny. Receptor cholinergiczny złącza nerwowo-mięśniowego jest kanałem jonowym sterowanym przez neurotransmiter Receptor cholinergiczny w złączu nerwowo-mięśniowym intensywnie badano ze względu na rolę, jaką gra w przekaznictwie nerwowo-mięsniowym. Niektóre waŜne właściwości tego receptora są wyliczone w tab. 64-1. Jak tam

Tabela 64-1. Niektóre własności receptora acetylocholinowego złącza nerwowo-mięśniowego" Receptor w złączu: Jest receptorem nikotynowym {tzn, agonistą tego receptora jest nikotyna) Jest błonową glikoproteiną o masie cząsteczkowej -275 000 Zawiera 5 podjednostek, ma skład Tylko podjednostka a wiąŜe acety I ochot i nę z duŜym powinowactwem Dwie cząsteczki acetylocholiny muszą się związać, aby otworzyć kanał jonowy, który umoŜliwia prze+ + pływ jonów Na i K ; receptor jest więc kanałem jonowym regulowanym (bramkowanym) przez transmiter Jad węŜa a-bungarotoksyna wiąŜe się silnie do podjednostki % i moŜe być uŜyta do znakowania receptora albo jako ligand o duŜym powinowactwie do oczyszczania go Autoprzeciwciata przeciw receptorowi są podejrzane o powodowanie miastenii • Według: Kandełl E.R.. Schwarz J.H., Jessel T.M. (red,): Principles of Neural Scisnce. wyd. 3, Elsevier, 1991. " Przedstawiony skład dotyczy receptora płodowego U dorosłych pojedyncza podjednostka y jest zastąpiona przez podjednostke s KaŜdy typ podjednostki jest kodowany przez osobny gen.

wspomniano, jest on błonową glikoproteiną składającą się z 5 podjednostek, z których 2 (podjednostki a) są identyczne. cDNA dla róŜnych podjednostek został sklonowany i dla kaŜdego z tych cDNA wydedukowano strukturę aminokwasową podjednostki. Fakt, Ŝe abungarotoksyna wiąŜe się mocno z tym białkiem został wykorzystany w wielu badaniach, takich jak pomiar liczby receptorów w próbkach normalnego i chorego mięśnia (p. niŜej). Rozmieszczenie białek w błonie komórkowej przedstawia ryc. 64-2. Jak pokazano, wszystkie 5 podjednostek przechodzi przez błonę i bierze udział w tworzeniu kanału jonowego, W nieobecności acetylocholiny kanał jest zamknięty. Kiedy dwie cząsteczki neurotransmitera wiąŜą się do receptora, kaŜda dpyednej podjednostki a, białko ulega zmianie konformacyjnej, która powoduje otwarcie się kanału na czas ok. jednej milisekundy. W tym czasie napływa do mięśnia Na+, a wypływa zeń K+. Jak wspomniano wyŜej, to właśnie napływ Na+ powoduje depolaryzację błony mięśniowej i generuje potencjał płytki końcowej. PoniewaŜ obecność lub nieobecność acetylocholiny powoduje otwieranie i zamykanie kanału, receptor choiinergiczny określa się jako kanał jonowy regulowany („bramkowany") neurotransmiterem (w odróŜnieniu od dwóch innych typów kanałów regulowanych — kanałów zaleŜnych od potencjału [napięciowo-zaleŜnych] oraz regulowanych mechanicznie). W miastenii autoprzeciwciała uszkadzają receptory cholinergiczne i zmniejszają ich liczbę Badania elektrofizjologiczne (np. elektromiografia) wskazują, Ŝe nienormalność w miastenii dotyczy płytki końcowej, a nie błony presynaptycznej. W rzeczy samej, w tej chorobie dochodzi do normalnego uwalniania się acetylocholiny. W przeciwieństwie do tego badania, w których uŜywa się znakowanej bungarotoksyny dla pomiaru liczby receptorów cholinergicznych w próbkach mięśni, wykazały silny ich spadek u pacjentów cierpiących na miastenię. Wiele danych sugeruje udział zaburzeń układu immunologicznego w patogenezie miastenii. Obserwuje się np. często hiperpiazję grasicy i tkanek limfoidalnych, nie są teŜ rzadkie guzy grasicy. Około 10% pacjentów cierpi na inne schorzenia autoimmunologkzne. Jest interesujące, Ŝe niekiedy chorobą moŜe być dotknięty płód chorej matki in utero, co sugeruje przenika-

890 / ROZDZIAŁ 64

Acetytocholina nie związana: kanał zamknięty

B, Dwie cząsteczki acetytochollny związane: kanał otwarty

f

O Na'

V

7

;. 64-2. Struktura receptora dla acetylocholiny (ACh) w złączu nerwowo-mięśniowym. A — Trójwymiarowy model nikotynowego, aktywowanego przez acetylochotinę, kanału jonowego, oparty na f modelu Karlina i wsp. Kompleks receptor-kanał składa się z wielu podjednostek. Po jednej cząsteczce acetylocholiny łączy się do kaŜdej podjednostki a. przed otwarciem kanału. Wszystkie podjednostki biorą udział w tworzeniu pory. B — Kiedy dwie cząsteczki acetylocholiny przyłączą się do części podjednostek a wystawionych na powierzchni błony, receptor-kanał zmienia konformację otwierając pory w części + + receptora zanurzonego w dwuwarstwie lipidowej. Przez otwarty kanał przepływają Na i K zgodnie z ich własnymi gradientami stęŜeń. (Według: Kandel E. R., Schwartz J. H,, Jessel T. M. (red.): Principles of Neural Science, wyd. 3. Elsevier, 1991, za zezwoleniem).

nie przez łoŜysko jakiegoś czynnika, np. autoprzeciwcial. Wiele wyjaśniającym odkryciem było stwierdzenie, Ŝe wstrzykniecie oczyszczonego receptora cholinergicznego (otrzymanego z organu elektrycznego węgorza elektrycznego) królikom powoduje wystąpienie we krwi prze-

ciwciał skierowanych przeciw receptorowi i chorobę przypominającą miastenię. Wykazano następnie, Ŝe auto przeciwciała skierowane przeciw receptorowi moŜna wykazać takŜe u człowieka cierpiącego na miastenię; są one obecne u prawie 100% pacjentów z cięŜką

PODŁOśE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 891

postacią choroby. Auto przeciwciała przyczepiają się do receptorów cholinergicznych w złączu nerwowo-mięśniowym i uszkadzają je, co powoduje tzw. liŜę ogniskową (p. ryc. 64-3). Uszkodzone receptory podlegają endocytozie, która przyspiesza ich obrót (tworzenie i ginięcie) i zmniejsza liczbę. Obecność układu dopełniacza (p. rozdz. 58) odgrywa istotną rolę w tym typie uszkodzeń komórkowych. Nie zostało dotąd dostatecznie jwyjaśnione, co jest pierwotną przyczyną powstawania autoprzeciwciał. Tworzenie przeciwciał przeciw receptorom acetylocholinowyrn obecnym w złączu nerwawo-mięśntowyrn

Uszkodzenie receptorów (lokalna liza) przez auloprzeciwciata, powodujące usieciowanie i endccytozę

czeniu miastenii,- Di izopropyl ofluorofosforan (DFP) jest przykładem nieodwracalnego inhibitora cholinesterazy; tworzy on kowalentne wiązanie z resztą serynowa. w aktywnym centrum cholinesterazy (zob. omówienie proteaz serynowych w rozdz, 10). DFP jest trującym „gazem nerwowym" i jest teŜ uŜywany jako środek owadobójczy. Lecząc miastenię często trzeba dodatkowo stłumić nienormalną odpowiedź immunologiczną powodującą miastenię. Zazwyczaj uŜywa się w tym celu kortykosteroidów. ale powaŜniejsze przypadki wymagają zastosowania cyt o toksycznych leków immunosupresyjnych, takich jak azatiopryna. Korzystne mogą być skutki usunięcia grasicy. Plazmafereza moŜe przejściowo obniŜyć poziom autoptfŁeeiwciął w osoczu.

i

Silne zmniejszenie liczby receptorów

I Objawy kliniczne, zwłaszcza epizody słabości mięśni unerwianych przez nerwy czaszkowe

Ryc. 64-3. Schemat powstawania miastenii. Powody początkowego tworzenia przeciwciał skierowanych przeciw receptorom nie są jasne.

Inhibitory chotinesterazy zwiększają ilość acetylocholiny w złączu nerwowo-mięśniowym, pozwalając na leczenie miastenii Leki hamujące acetylocholinesterazę, enzym zaangaŜowany w niszczenie acetylocholiny, skutecznie zwiększają stęŜenie tego neurotransmitera przy płytce nerw owo-mięśniowej i przedłuŜają czas jego działania. Leki tego typu są podstawą leczenia miastenii. Istnieją 2 typy inhibitorów cholinesterazy: odwracalne i nieodwracalne. Zarówno krótko działające, jak i stosunkowo długo działające inhibitory są uŜyteczne w miastenii. Te pierwsze znalazły szczególnie zastosowanie w diagnostyce. Diagnozę stawia się na podstawie wywiadów, objawów klinicznych i pewnych testów laboratoryjnych (np. elektromiografii, pomiaru krąŜących autoprzeciwciał). Test diagnostyczny polega na podaniu odpowiedniej ilośri krótko działającego edrofoniiun (Tensilon). JeŜeli pacjent cierpi na miastenię, powinno to spowodować szybkie, choć krótkotrwałe, zwiększenie siły mięśni. Pirydostygmina i neostygmina są skutecznymi, dhiŜej działającymi lekami, szeroko uŜywanymi w le-

CHOROBA HUNTINGTONA JEST PRZENOSZONA DZIEDZICZNIE Choroba Huntingtona, zwana teŜ pląsawicą Huntingtona, charakteryzuje się krótkimi, mimowolnymi ruchami (pląsawicą) i postępującym pogarszaniem wyŜszych czynności nerwowych. Zaczyna się zazwyczaj między 35 a 50 rŜ., nieubłaganie się pogłębia, i prowadzi do śmierci średnio w 15 lat po wystąpieniu pierwszych objawów. Choroba jest dziedziczona jako cecha autosomalna dominująca z całkowitą penetracją; zagroŜonych jest 50% dzieci rodziców dotkniętych tą chorobą. Jest ona wyjątkowo stresująca, poniewaŜ do niedawna dzieci tych chorych nie mogły przewidzieć, czy zostaną nią dotknięte i czy nie przekaŜą jej swojemu potomstwu. Neurony w ciele prąŜkowanym (jądro ogoniaste i skorupa) są najbardziej dotknięte przez chorobę Huntingtona. Wiele z nich ginie i zostaje częściowo zastąpionych przez komórki glejowe (glejoza). Śmierć komórek dotyka jedne typy neuronów bardziej niŜ inne; interneurony zazwyczaj nie są naruszane. Obserwuje się spadki poziomu pewnych neurotransmiterow (np. kwasu y-aminomasłowego [GABA] i acetylocholiny), niektórych enzymów zaangaŜowanych w ich syntezę (np. dekarboksylazy glutaminianowej i acetyl o transfe razy cholinowej), niektórych neuropeptydów (np. substancji P, diolecystokininy i metenkefaliny) i pewnych receptorów (np. dopaminowych, cholinergicznych i serotoninowych). Wykazano równieŜ wzr«st stęŜeń innych przedstawicieli tych 4 klas

892 / ROZDZIAŁ 64

molekuł, np. dopaminy i noradrenaliny, somatostatyny i neurotensyny. Te rozmaite zmiany mają prawdopodobnie charakter wtórny, odzwierciedlający uszkodzenia komórek i śmierć komórkową wynikłą z defektów genetycznych, ale są waŜne z tego powodu, Ŝe stanowią podstawę biochemiczną objawów, na które cierpi pacjent. Gen choroby Huntingtona został zlokalizowany na krótkim ramieniu chromosomu 4, ale dotychczas nie został wyizolowany W 1983 r. Gusella i współpracownicy opisaii występowanie RFLP ściśle związanego z genem odpowiedzialnym za chorobę Huntingtona. Była to jedna z pierwszych prac wykorzystujących RFLP w badaniach sprzęŜeń genetycznych i jej sukces dał olbrzymi napęd do tego typu badań. Badane przypadki obejmowały bardzo rozległą rodzinę (ok. 5000 osób) Ŝyjącą w okolicy jeziora Maracaibo w Wenezueli. Około 300 członków tej rodziny cierpiało na chorobę Huntingtona, UŜyto baterii 12 świeŜo udostępnionych sond DNA. Przy olbrzymim szczęściu (jeŜeli się uwzględni względnie niewielką liczbę sond i rozmiar ludzkiego genomu), stwierdzono, Ŝe jedna z tych sond, G8, wykryła dwa pohmorfizmy (RFLP) bardzo ściśle związane z genami kodującymi chorobę Huntingtona (w granicach ok. 3—5 cM). Te dwa polimorfizmy spowodowały rozpoznanie 4 kombinacji alleli, czyli haplotypów (A, B, C i D); haplotyp C dla G8 pojawiał się u członków wenezuelskiej rodziny dotkniętych chorobą. G8 pochodził 2 rekombinowanego bakteriofaga z biblioteki genomu ludzkiego. Zastosowanie hybrydyzacji komórek somatycznych oraz hybrydyzacji in situ wykazało, Ŝe wykryty locus znajdował się bardzo blisko końca krótkiego ramienia chromosomu 4. Niestety, sekwencje DNA blisko telomeru przy końcu chromosomu wydają się zawierać powtórzenia DNA i inne sekwencje trudne do interpretacji. Mimo tego, do końca 1989 r. sklonowano koniec chromosomu 4, w którym znajduje się locus choroby Huntingtona. JednakŜe, dalsze dowody wykazały wówczas, i& locus ten w rzeczywistości znajduje się kilka milionów par zasad bardziej proksymalnie (tzn. w kierunku od końca chromosomu) niŜ pierwotnie sądzono. Nie został on nigdy precyzyjnie określony w tym sensie, Ŝe nie udało się określić regionu ograniczającego, definiującego dystalny koniec genu (w przeciwieństwie do przypadku

genu mukowiscydozy). Tak więc obecnie liczne laboratoria klonują i sekwencjonują rejon chromosomu, w którym przypuszcza się, Ŝe tkwi poszukiwany gen. Powinien on być zidentyfikowany w najbliŜszej przyszłości. JeŜeli uda się teŜ wydedukowac, jakie białko wytwarza normalny gen, powinno to wyjaśnić mechanizm prowadzący do śmierci neuronalnej w ciele prąŜkowanym pacjentów z chorobą Huntingtona (patrz niŜej) i doprowadzić do bardziej racjonalnych metod jej leczenia. Mimo rozczarowania, Ŝe gen choroby Huntingtona wciąŜ nie został zidentyfikowany, opisane wyŜej badania umoŜliwiły, przy uŜyciu odpowiednich sond DNA, informowanie członków dotkniętych rodzin — jeŜeli zechcą to wiedzieć — czy rozwinie się u nich choroba Huntingtona (testowanie przedobjawowe) i zaoferować diagnozę prenatalną. Obecnie nie ma Ŝadnej swoistej terapii choroby Huntingtona, moŜna tylko słuŜyć doradztwem genetycznym, pomocą psychologiczną i leczeniem objawowym. Ekscytotoksyny mogą wywoływać śmierć neuronów w chorobie Huntingtona przez ich działanie na podtyp NMDA receptora glutamin łanowego Choroba Huntingtona charakteryzuje się wymieraniem pewnych neuronów (p. wyŜej). Bez wyjaśnienia natury produktu genu zaangaŜowanego w chorobie Huntingtona (enzymu, receptora itp.) trudno o pewność, jak proces ten zachodzi. Jedna z hipotez zakłada, Ŝe jest on powodowany przez pewne substancje chemiczne (ekscytotoksyny), które mogą być egzogenne lub endogenne (normalne produkty metaboliczne). Aby w pełni zrozumieć tę koncepcję, trzeba coś wiedzieć o receptorach glutaminianowych. Glut;) minian i aspara ginian są pobudzającymi aminokwasami w mózgu; glutaminian moŜe być odpowiedzialny za ok. ^75% neurotransmisji pobudzającej w mózgu. Przez stosowanie odpowiednich agonistów i antagonistów podzieiono receptory giutaminianowe na 5 klas: 1) NMDA (N-metylo-D-asparaginian); 2) AMPA (kwas a-amino-3-hydroksy-5 -metyl o-4-izoksazolopropionowy); 3) kainowe (związek izolowany z glonów morskich); 4) L-AP+ (syntetyczny agonista) i 5) metabotropowy. Pierwsze 4 receptory są kanałami kationowymi, podczas gdy receptor metabotropowy jest związany z wewnątrzkomórkowym wytwarzaniem diacy-

PODŁOśE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 893

loglicerolu i trisfosforanu inozytolu na szlaku polifosfoinozytydowym (p. rozdz. 45). Szczególnie interesujące było odkrycie, Ŝe iniekcja kwasu kainowego do prąŜkowia szczurów powoduje śmierć neuronów, ale oszczędza komórki glejowe i aksony. Kwas kainowy działa powodując nadmierne uwalnianie glutaminianu. Faktycznie, inkubacja neuronów ze stosunkowo niskimi stęŜeniami giutaminianu moŜe powodować śmiejt neuronów: jest to zaleŜne od obecności Ca2+ w środowisku inkubacyjnym. Iniekcja chinolinianu, metabolitu tryptofanu, który stymuluje receptor NMDA, równieŜ powoduje śmierć neuronów, oszczędzając interneurony, w podobny sposób jak w chorobie Huntingtona. Tak działające związki chemiczne nazywamy ekscy to toksynami. ChociaŜ do chwili identyfikacji produktu wadliwego genu nie moŜna wyznaczyć dokładnie łańcucha zdarzeń, szczególnie zaangaŜowany w uszkodzenia i śmierć neuronów obserwowane w chorobie Huntingtona wydaje się być receptor NMDA. Receptor ten (ryc. 64-4) jest złoŜony, poniewaŜ zawiera co najmniej 5 róŜnych miejsc wiąŜących (miejsce wiąŜące transmiter — glutaminian, miejsce regulatoro-

we wiąŜące glicynę, zakŜne od potencjału miejsce wiąŜące Mg2 +, miejsce wiąŜące fencyklidynę oraz miejsce wiąŜące Zn2+). Kanał otwiera się, kiedy jest związany zagonistą, takim jak glutaminian, a po otwarciu zezwala na napływ Ca2 + i Na+ do komórki. JeŜeli receptor NMDA jest stymulowany przewlekle (np. w wyniku nadmiaru glutaminianu uwalnianego przez neurony w wyniku depolaryzacji ich błony plazmatycznej), prowadzi to do akumulacji Ca2 + , który w wysokich stęŜeniach jest toksyczny dla komórki i moŜe spowodować śmierć komórki w sposób podobny do opisanego dla zawału serca (przypadek 4 w rozdz. 62). Co więcej, napływowi Ca2 + towarzyszy napływ Nar, powodujący osmotyczne pęcznienie i uszkodzenie komórki. Odkrycia te ustają implikacje terapeutyczne, poniewaŜ dzięki nim moŜna częściowo blokować receptory NMDA, uŜywając leków takich jak dekstrorfan, zmniejszając w ten sposób liczbę ginących komórek. Receptor NMDA jest interesujący równieŜ z innych względów. Sądzi się, Ŝe odgrywa on istotną rolę w długotrwałym wzmocnieniu, co powoduje zwiększoną wydajność synaptyczną w hipokampie i innych obszarach mózgu i moŜe Błona

Wnętrze

Otoczenie

^pęcpoooo ■■l'

!:

■ ■ '■ ' ■

ÓOO Ryc. 64-4. Schematyczne przedstawienie receptora NMDA i punktów uchwytu róŜnych czynników na 2+ + receptorze. Receptor NM DA kontrotuje kanai kationowy przepuszczalny dla Ca i Na i jest kontrolowany ił + przez Mg w sposób zaleŜny od potencjału. Przed wjonem jest K . Kana! receptora NMDA jest blokowany przez PCP i MK801, a cały kompleks jest regulowany w dwóch miejscach regulatorowych przez, glicyne 2+ iZn . AP5 jest kompetytywnym antagonistą w miejscu wiązania NMDA. PCP — fencyklidyna (Wediug: Cooper J B., Bloom F. £., Roth R. H.: The Biochemical Basis of Neuropharmacology, wyd. 6, Oxford University Press, za zezwo(eniem). __

894 I ROZDZIAŁ 64

być związane ze zjawiskami pamięci i uczenia. UwaŜa się równieŜ, Ŝe aktywacja tego receptora moŜe inicjować drgawki; ponadto powtarzane drgawki mogą wywołać śmierć neuronów prawdopodobnie związaną z uwalnianiem ekscytotoksyn. Proponowany schemat niektórych wydarzeń związanych z wywołaniem choroby Huntingtona przedstawia ryc. 64-5. Mutacja lub rnulacje jednego genu (genu Huntlngtona) w krótkim ramieniu chromosomu A

Zmiana struktury hipotetycznego produktu białkowego (np, enzymu, blatka strukturalnego, receptora)

Uwolnienie etecytotoksyn [np. nadmiar glutaminlanu) powodujące nadmierne pobudzenie receptora NMDĄ wewnątrzkomórkowe nagromadzenie toksycznych ilości Ca/ i Śmierć neuronów w prązkowlu i gdzie indzie]

Objawy choroby Huntingtona (pląsawlca, postępujące pogorszenie stanu neurologicznego)

Ryc. 64-5. Przypuszczalny schemat niektórych zjawisk zaangaŜowanych w wywoływanie choroby Huntingtona.

EKSCYTOCYNY I INNE MECHANIZMY BIOCHEMICZNE SĄ ZAANGAśOWANE W USZKODZENIA MÓZGU SPOWODOWANE UDAREM Przy udarze mózgu pojawiają się lokalne uszkodzenia wywołans,zmniejszonym przepływem krwi. Skutki tego mogą być zabójcze (np. trwała utrata przytomności, paraliŜ, ślepota, utrata mowy), w zaleŜności od umiejscowienia i wielkości dotkniętego udarem obszaru. Udary są trzecią główną przyczyną śmierci w USA i dotykają ok. 500000 Amerykanów rocznie. Podobnie jak w przypadku choroby Alzheimera, ekonomiczne koszty związane z opieką medyczną nad pacjentami z udarem są olbrzymie. Aby opracować odpowiednie metody leczenia udarów, trzeba koniecznie zrozumieć podstawowe mechanizmy zaangaŜowane w uszkodzenia okolic mózgu dotkniętych udarem. Omówimy tu kilka waŜnych punktów. Większość udarów jest powodowanych zakrzepami w tętnicach mózgowych. Zmniejsza to podaŜ tlenu i glukozy, substancji podstawowych dla przemiany materii w mózgu, bez

których trwałe uszkodzenie komórek rozwija się szybko (poniŜej godziny). WyróŜniamy trzy kolejne etapy w rozwoju uszkodzenia mózgu powodowane zakrzepem mózgowym. Indukcja. Niedotlenienie (ischemia) powo duje depolaryzację Won neuronalnych, powo dującą uwalnianie glutaminianu Podobnie jak w przypadku choroby Huntingtona, powoduje to nadmierne pobudzenie receptorów NMDA na przylegających neuronach, prowadzące do nienormalnie wysokiego napływu Ca2+ i Na+ i wynikające stąd uszkodzenie komórki lub jej śmierć. Co więcej, glutaminian pobudza recep tory AMPA/kainowe (prowadząc do dodat kowego napływu Na + ) i receptory metabotropowe, powodując wewnątrzkomórkowe tworzenie się trisfosforanu inozytolu i diacyloglicerolu. Amplifikacja. Dalsze nagromadzanie się Caz+ w komórce zachodzi przez następujące mechanizmy: a) zwiększone stęŜenie wewnątrz komórkowego Na+ aktywuje transporter Na+/Ca2+, b) sterowane potencjałem kanały Ca2+ są aktywowane w wyniku depolaryzacji i c) trisfosforan inozytolu uwalnia Ca2+ z*siateczki śródplazmatycznej do cytoplazmy. Wszyst kie te trzy mechanizmy prowadzą do podwyŜ szenia wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2+, co powoduje dodatkowe uwalnianie się gluta minianu, pobudzającego w dalszym ciągu sąsie dnie neurony. Ekspresja. DuŜe stęŜenia wewnątrzkomó rkowego Ca2 + aktywują wapni owo-zaleŜne nukleazy, proteazy i fosfolipazy. Degradacja fosfolipidów moŜe teŜ prowadzić do tworzenia czynnika aktywującego płytki (PAF) i uwal niania kwasu arachidonowego, którego meta bolizm prowadzi do tworzenia eikozanoidow; oba te typy lipidów mogą wywoływać skurcz naczyń, pogarszając efekt zakrzepu. W dodatku metabolizm eikozanoidow prowadzi do tworze nia wolnych rodników tlenowych, które powo dują trwałe nadtlenkowe ^uszkodzenia lipidów błon neuronalnych. PoniewaŜ glutaminian od grywa pierwszoplanową rolę w tej sekwencji wydarzeń, cały proces nazwano kaskadą glutaminianową. Wiele innych czynników jest jednak równieŜ zaangaŜowanych w ischemicznym uszkodzeniu mózgu. Leczenie udaru ma na celu ograniczenie uszkodzeń wywołanych zakrzepem. Wprowadzono doświadczalne terapie mające na celu zminimalizowanie efektów biochemicznych kaskady glutaminianowej (tab, 64-2). Podobnie

PODŁOśE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 895 Tabela 64-2. Niektóre terapie doświadczalne testowane w celu ograniczenia kaskady glutaminianowej rozwijającej się w czasie udaru mózgu. (Trzy etapy kaskady opisano w tekście).' Etap kaskady Indukcja

Problem biochemiczny

Nadmierne uwalnianie gl u - Hamowanie syntezy glutaminianu przez metioninową tamirtianu sulfoksyminę. ObniŜenie temperatury ciała, jeŜeli pacjent gorączkuje: obniŜa to metabolizm mózgu i moŜe zahamować uwalnianie glutaminianu Aktywacja receptorów NMDA

Ampliftkacj

a Ekspresja

Podejście lecznicze

Antagoniści receptorów NMDA, tacy jak dekstrorfan, CGS 19755 i MK-801

1+ Napływ Ca przez kanały Pochodne dihydropirydyny (np. nimodypina) w celu I+ Ca regulowane potenc- zablokowania tych kanałów jałem Tworzenie wolnych rodni- Leki hamujące wolne rodniki (np. 21 -aminosteroidy) ków

Według: Zivin J.A., Choi D.W.: Stroke Therapy. Sci. Am. {lipiec) 1991, 26%, 56.

jak w przypadku zakrzepu w tętnicy wieńcowej (p. rozdz. 58) wczesne leczenie trombolityczne

moŜe przywrócić przepływ krwi. Prowadzi się wiele zakrojonych na duŜą skalę prób klinicznych z tPA. Do leczenia udaru tPA moŜe być odpowiedniejsza niŜ streptokinaza, poniewaŜ ta ostatnia moŜe łatwiej wywoływać krwotoki, które mogą być katastrofalne dla mózgu. Zapobieganie obejmuje równieŜ przeciwdziałanie czynnikom ryzyka, takim jak nadciśnienie, cukrzyca, palenie tytoniu i hiperlipidemia. Podawanie małych dawek aspiryny wydaje się zmniejszać ryzyko udaru u pacjentów cierpiących na przejściowe ataki niedotlenienia.

MUTACJE MITOCHONDRIALNEGO DNA POWODUJĄ PEWNE MIOPATIE ł SCHORZENIA NEUROLOGICZNE Mitochondria ludzkie zawierają 2—10 kopii niewielkich pierścieniowych dwuniciowych molekuł DNA, które składają się na ok. 1% całkowitego DNA w komórce (ryc. 64-6 i tab. 64-3). Istotną cechą ludzkiego mitochondrialnego (mt) DNA jest to, Ŝe jest ono dziedziczone na drodze matczynej, niemendlowskiej dziedzicz-

ności, poniewaŜ wszystkie mitochondria są dostarczane przez jajo w czasie tworzenia zygoty. Stąd przy chorobach powstałych w wyniku mutacji mtDNA, chora matka teoretycznie powinna przekazać chorobę wszystkim dzieciom, ale tylko córki będą dalej przenosiły chorobę. JednakŜe, w niektórych przypadkach (p. niŜej)

Tabela 64-3. Niektóre gtówne cechy struktury i funkcji ludzkiego mitochondrialnego DNA* Jest pierścieniowy, dwuniciowy i zawiera łańcuch cięŜki (H) i lekki (L) Zawiera 16 569 par zasad, ich sekwencja jest w pełni poznana Koduje 13 (z ogólnej liczby — 67) podjednostek białkowych łańcucha oddechowego; 7 podjednostek dehydrogenazy NADH {kom pleks I) cytochrom b kompleksu III 3 podjednostki oksydazy cytochromowej (kom pleks IV) 2 podjednostki syntazy ATP Koduje duŜy (16s) i mały (12s) mitochondrialny rybosomalny RNA Koduje 22 molekuły mitochondrialnego tRNA Jego kod genetyczny róŜni się nieco od kodu standardowego: UGA (standardowy kodon stopu) jest czytany jako Trp AGA i AGG (standardowe kodony dla Arg) są czytane jako kodony stopu Zawiera bardzo niewiele sekwencji nie tłumaczonych Wysoka częstotliwość mutacji (5-10 razy większa niŜ w DNA jądrowym) Porównania sekwencji mtDNA dostarczają dowodów O ewolucyjnym pochodzeniu naczelnych i innych gatunków * Według: Harding A.E.: Neurological disease and mitochondrial genes; Trends ^ 14:132

896 / ROZDZIAŁ 64

ubytki w mtDNA mogą zachodzić w czasie oogenezy i nie są dziedziczone po matce. Wykazano obecnie, Ŝe wiele chorób powstaje w wyniku mutacji mtDNA (tab. 64-4), Jedna ich Tabela 64-4. Niektóre miopatie mitochondrialne i choroby spowodowane mutacjami genów mitochondrialnych* Kosmate Choroba Mutacja** czerwone włókna M łopat i a oczna

Tak

Deleeje

KSS

Tak

Delecje, duplikacje

MERRF

Tak

Mutacja punktowa w lizynowym tRNA (pozycja 8344

MELAS

Tak

Mutacja punktowa w leucyrtowym tRNA (pozycja 3423}

LHON

Nie

Mutacja punktowa w reduktazie NADH-CoE Q (pozycja 11 778)

Matczyny RP (jedna rodzina)

Nie

-O ,-

CD 75 (U (O

(0 ■— »~O O.

O 3 *~ -* N E

5 fe <£> -3; ^r °W

S ;-< ^Z C1

>■ o — » :-„,

a a n c tT^-

Mutacja punktowa w podjednostce 6 hT-ATPazy (pozycja 8993)

* Według: Harding A. E.: Neurological disease and mrtochondrial genes; Tr&nds Neurosci. 1991,14,132. ** W wymienionych chorobach mogą teŜ występować dalsze mutacje. Występowanie mutacji w róŜnych typach tRNA wydaje się korelować z proliferacją mitochondriów obserwowaną w niektórych z tych chorób, podczas gdy mutacje w enzymach łańcucha oddechowego nie wykazują takiej korelacji. Miopatia oczna charakteryzuje się postępującą zewnętrzną oftalmoplegią {PEO), ujawniającą się zazwyczaj w dzieciństwie. KSS—zespół Kearns-Sayre'a, charakteryzuje się PEO, retinopatią pigmentową t zaburzeniami przewodnictwa sercowego pojawiającymi się w dzieciństwie. MERRF — padaczka miokfonalna z kosmatymi czerwonymi włóknami, charakteryzuje się mioklonusem, padaczką i ataksją występującymi w dzieciństwie lub w okresie dojrzałości. MELAS encefa I opatia mitochondrialna z kwasicą mleczanową i epizodami udaropodobnymi, charakteryzuje się okresowymi wymiotami, proksymalną słabością kończyn i epizodami przypominającymi udar; wy stępuje w okresie pokwitania lub później, LHON dziedziczna wzrokowa neuropatra Lebera, charak teryzuje się ostrą lub podostrą utratą wzroku u męŜ czyzn około 20 roku Ŝycia. Matczyny RP — matczyne pigmentowe zapalenie siatkówki, pojawiło się w jed nej rodzinie wraz z otępieniem, drgawkami, ataksją i słabością mięśniową.

<

CL'

CD

rs,

-c o U O. i

w 0=

« g

&5.238S

U>

o

c O ■=

o U O Z O "S *Q-

CC =

PODŁOśE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 897

grupa składa się z miopatii mitochondrialnych, Tabela 64-5. Testy laboratoryjne słuŜące do rozcharakteryzujących się obecnością mitochond- poznawania chorób powodowanych przez mutacje riów o nienormalnym kształcie i wymiarach mtDNA w mięśniach szkieletowych. Te nienormalne Obecność czerwonych kosmatych włókien w próbmitochondria powodują, Ŝe włókna mięśniowe kach pobranych z mięśni (nie w przypadku LHON*) przybierają postać kosmatych czerwonych włó- Badania róŜnych enzymów łańcucha oddechowekien (ragged red fibers), które moŜna wykryć go przy biopsji mięśni barwionych metodą Gomoriego lub innymi technikami. Pierwsze 4 jedno- Analiza mtDNA (np. z mięśni i, w niektórych stki chorobowe, wymienione w tabeli 64-4 są przypadkach, 2 ieukocytów) dziedziczna wzrokowa neuropatia przykładami miopatii mitochondrialnych, W miopatii ocznej (ocular miopathy) głównie dotknięte są mięśnie odpowiedzialne za ruchy Wiele dalszych punktów dotyczących chorób oczu; powoduje to postępującą zewnętrzną oftal- wynikających z mutacji mtDNA zasługuje na moplegię (progressive external ophthalmople- skomentowanie. %( gia, POE), która równieŜ występuje, wraz z inDNA u pacjentów cierpiących na te cho inymi nieprawidłowościami, w zespole Kearnsa- roby moŜe się składać z mieszaniny zmutowaSayre'a. Padaczka mioklonafna z kosmatymi nego i normalnego DNA (heteroplazmia) lub 'czerwonymi włóknami (myoclonus epilepsy with całkowicie zmutowanego DNA (homo plazm i a) tfSgged red fibers, MERRF) i encefa I opatia Ilość zmutowanego DNA w zasadzie jest skore fftitochondrialna z kwasicą mleczanową i epizo- lowana ze stopniem choroby. dami udaropodobnymi (mitochondrial encephaWiększość polipeptydów mitochondrial lomyopathy with lactacidosis and stroke-like nych (~54/67) jest kodowanych przez geny episodes, MELAS) mogą być klasyfikowane jądrowe i wobec tego mutacje tych ostatnich jako encefalomiopatie mitochondrialne, ponie*LHON mogą równieŜ zaburzać strukturę i waŜ w ich przebiegu mózg jest zazwyczaj rów- Lebera funkcje nieŜ powaŜnie dotknięty. Dwa inne schorzenia mitocłiondriów. Przy pewnych wymienione w tab. 64-4, dziedziczna wzrokowa schorzeniach neuropatia Lebera (Leber's hereditary optic myo- (np. LHON) oddziaływania między genami pathy, LHON) i macierzyńskie pigmentowe jądrowymi i mitochondrialnymi mogą być waŜ zapalenie siatkówki (maternal retinitis pigmen- ne dla określenia fenotypu. tosa) są chorobami wynikającymi z mutacji W jaki sposób mutacje mitochondrialne mtDNA, ale nie są miopatiami mitochondrial- powodują swoiste efekty tkankowe? Na przy nymi, poniewaŜ uszkodzenia niekoniecznie do- kład, dlaczego nerw wzrokowy jest tak wybiór tyczą mięśni. czo dotykany przez LHON? Prawdopodobnie U wielu pacjentów z POE (łącznie z cier- odpowiedź kryje się w charakterystyce fizjo piącymi na zespół Kearnsa-Sayre'a) stwierdzo- logicznej zaatakowanej tkanki; moŜna podej no detecje w mtDNA; u pacjentów z zespołem rzewać, Ŝe aktywność reduktazy NADH-koenKearnsa-Sayre'a stwierdzono równieŜ duplika- zymu Q (która jest zaburzona w LHON) jest cje (podwojenia). Stopień delecji często był szczególnie waŜna właśnie dla tkanki nerwu skorelowany z natęŜeniem POE. Delecje te wzrokowego. Co ciekawe, przewlekłe podawa wydają się powstawać w czasie oogenezy i stąd nie nie azydku sodowego (który hamuje oksydazę są dziedziczone po matce. Co więcej, nie muszą cytochromu c u pewnych ssaków wywołuje one występować we wszystkich komórkach, np. neuropatię podobną do LHON. moŜe ich nie być w leukocytach. Z drugiej Przypuszczano, Ŝe anomalie mtDNA wy strony, pacjenci z zespołami MERRF, MELAS, stępują u pewnych pacjentów z chorobą ParkinLHON i z rodzinnym przenoszonym przez sona i mogą przyczyniać się do starzenia. matkę pigmentowym zapaleniem siatkówki wykazują specyficzne mutacje punktowe (tab. 64-4). W odróŜnieniu od delecji, takie mutacje punktowe są zwykle dziedziczone od matki. Testy laboratoryjne wykorzystywane w rozpoznawaniu chorób spowodowanych mutacjami mtDNA są wymienione w tab. 64-5. '•i

898 / ROZDZIAŁ 64

ZESPÓŁ ŁAMLIWEGO X, RDZENIOWO OPUSZKOWA ATROFIA MIĘŚNIOWA I DYSTROFIA MIOTONICZNA SĄ POWODOWANE PRZEZ MUTACJĘ POWTÓRZENIA TRYPLETOWEGO Zespól łamliwego X jest recesywną chorobą związaną z chromosomem X, charakteryzującą się łagodnym lub umiarkowanym niedorozwojem umysłowym oraz wielką głową, uszami i jądrami. Występuje on u jednego na 1250 męŜczyzn w Ameryce Północnej i odpowiada częściowo za to, Ŝe męŜczyźni stanowią większy niŜ kobiety odsetek pacjentów umieszczonych w domach opieki dla niedorozwiniętych. Zespól wykazuje pewne niezwykle cechy genetyczne jak na chorobę związaną z chromosomem X, a mianowicie 20—50% męŜczyzn dotkniętych tą chorobą nie wykazuje jej objawów. Ci bezobjawowi nosiciele mogą przenieść wadliwy gen na swoje córki, które równieŜ nie wykazują objawów choroby. JednakŜe w trzecim pokoleniu zarówno męskie, jak i Ŝeńskie potomstwo tych córek moŜe wykazywać objawy choroby. Sugeruje to, Ŝe pewne zmiany genu nastąpiły u córek, co umoŜliwiło wystąpienie choroby u dzieci. MoŜe to być związane ze zwiększeniem wymiaru genu przez mutację powtórzenia trypletu (patrz niŜej) lub przez matczyne wdrukowanie genomowe (zdefiniowanie poniŜej), w którym to procesie zachodzi nadmierne metylowanie, powodujące inaktywację pewnych genów w łamliwym odcinku chromosomu X. Po zespole Downa, zespół łamliwego X jest główną przyczyną niedorozwoju umysłowegc?
liwym miejscu chromosomu. UmoŜliwiło to pozycyjne klonowanie genu. Gen został nazwany FMR-1 i zawiera silnie polimorficzne powtórzenia CGC, będące miejscem zwielokrotnienia trypletu (>200 powtórzeń u osoby chorej) powodujące łamliwość chromosomu. UwaŜa się, Ŝe ten gen właśnie jest odpowiedzialny za zespół łamliwego X, ale nie jest to całkiem pewne, poniewaŜ do tej pory nie moŜna przewidzieć jego funkcji z sekwencji aminokwasów. Zidentyfikowanie zaangaŜowanych białek i ustalenie, jak zmiany ich funkcji wpływają na charakterystykę fenotypu, byłoby bardzo interesujące. Metylacja wyspy CpG blisko odcinka promotorowego (metylacja inaktywuje pewne geny) moŜe pomóc w wyjaśnieniu, dlaczego u osób chorych obserwuje się niski poziom mRNA dla tego genu. Jak wspomniano wyŜej, istnieją pewne dowody na to, Ŝe metylacja moŜe zachodzić na matczynym chromosomie X, w obszarze łamliwym X, a to moŜe wyjaśnić nienormalne dziedziczenie zespołu. JeŜeli tak jest w istocie, byłby to przypadek wdrukowania genomowego (genomic imprinting), zjawiska w którym wkład ojca i matki potomstwa jest zróŜnicowany. Dwie inne choroby neurologiczne są powodowane przez mutacje powtórzenia trypletowego. Są to rdzeniowo-opuszkowa atrofia mięśniowa (spinał bulbar muscular atrophy, SBM A) i dystrofia miotoniczna (myotonic dystrophy, DM). SBMA jest to zaleŜna od chromosomu X choroba recesywną, charakteryzująca się narastającą słabością mięśniową kończyn górnych i dolnych. Uszkodzonym genem jest gen receptora androgenowego (AR), a zwielokrotnianym trypletem jest CAG. Receptor androgenowy znajduje się w wysokich stęŜeniach w rdzeniowych i opuszkowych motoneuronach, które są obiektami zaatakowanymi w SBMA. Przypuszcza się, Ŝe defekt receptora androgenowego jest przyczyną słabości mięśniowej w tym schorzeniu. DM jest chorobą dziedziczoną przez autosomalny gen dominujący i charakteryzuje się miotonia (tzn. zmniejszonym rozkurczem mięśni po długotrwałym skurczu) i innymi cechami. ZaangaŜowany w DM gen został nazwany MT-PK (miotoninowa kinaza białek) i koduje kinazę białek najprawdopodobniej zaangaŜowaną w przekazywanie sygnałów. W komórkach pacjentów cierpiących na DM obserwowano nieprawidłową fosforylację białek. Zwielokrotnionym trypletem jest GCT. Niektóre cechy molekularne tych 3 schorzeń są pod-

PODŁOśE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 899

Tabela 646. Choroba"

Niektóre cechy molekularne trzech chorób spowodowanych amplifikacją trypletową Lokalizacja na chromosomie

SMBA Xq 11-12 Zespół łamli- Xq27 19q13.2-13.3 wego X DM

G e n"

Zwielokrotniany tryplet

Liczba try płotów u osób normalnych

AR

CAG

11-31

FMR-1

CGG

5-54

MT-PK

GCT

30

5-

Liczba trypietów związanych z chorobą 40-52 >200 >100

"Według: Caskey i wsp.: Triplet repeat mutations in human diseases; Science 1992, 256, 784 "SBMA — rdzeniowo-opuszkowa atrolia mięśniowa; DM — dystrofia miotoniczna; AR — receptor androgenowy, MT-PK — miotoninowa kinaza białek

sumowane w tab. 64-6. Wszystkie powtórzenia trypletowe występujące w tych schorzeniach są bogate w CG i silnie polimorficzne u osobników normalnych. Fenotypowo osobnicy normalni będący heterozy go turni pod względem tych chorób wykazują allele premutacyjne, w których ilość powtórzeń jest znamiennie większa niŜ u osób zdrowych, ale mniejsza niŜ u chorych. UŜycie odpowiednich technik biologii molekularnej (np. Southern blotting, łańcuchowa reakcja polimerazy [PCR], hybrydyzacja i sondy dla wykrycia zwielokrotnionych sekwencji) ułatwia diagnozowanie tych chorób i zastąpi techniki cytogenetyczne i inne stosowane dotycficzas. To poprawi diagnostykę prenatalną oraz identyfikację bezobjawowych nosicieli, któ-

rzy mogą przenosić choroby na swoje potomstwo. Mechanizmy zaangaŜowane w zwielokratnianie trypietów są obecnie intensywnie badane. Poszukiwania komputerowe wykazały, Ŝe powtarzania trypletów są całkiem częste w genomie ludzkim. Jest więc zupełnie moŜliwe, Ŝe ten nowy typ mutacji okaŜe się przyczyną jeszcze innych chorób.

OBJAWY CHOROBY PARKINSONA ODZWIERCIEDLAJĄ DEFICYT DOPAMINY W ISTOCIE CZARNEJ I CIELE PRĄśKOWANYM Choroba Parkinsona charakteryzuje się drŜeniami, bradykinezją (spowolnieniem i ubogością ruchów), sztywnością i niestabilnością postawy. Pojawia się rzadko przed 40 rŜ. Ocenia się, Ŝe cierpi na nią 1% osób powyŜej 50 rŜ., a w Stanach Zjednoczonych jest nią dotkniętych ponad milion łudzi. Omówiony zespól objawów nazywamy parkinsonizmem. choroba Parkinso-

na jest tylko jedną z przyczyn parkinsonizmu (patrz niŜej). Główną cechą patologiczną choroby Parkinsona jest degeneracja pigmentowanych komórek

w istocie czarnej. W warunkach fizjologicznych komórki te syntetyzują dopaminę i wykorzystują ją jako neurotransmiter, i stąd nazywane są komórkami dopaminergicznymi. Neurony dopaminergiczne znajdują się w róŜnych obszarach mózgu, w tym w strukturach nigrostriatalnych, mezolimbicznych, mezokortykalnych i guzowo-przysadkowych. Rycina 64-7 ilustruje całość procesu, w którym dopamina bierze udział jako neurotransmiter. Podobnie jak w przypadku acetylocholiny moŜna go wygodnie podzielić na 6 etapów. Podobny proces jest włączony w działanie innych neurotransmiterów (np. noradrenaliny i adrenaliny), chociaŜ czasami niektóre etapy istotnie się róŜnią. L Synteza dopaminy, rozpoczynająca się od tyrozyny, obejmuje kilka reakcji enzymatycznych. Reakcją ograniczającą szybkość syntezy jest reakcja katalizowana przez hydroksylazę tyrozynową. 2. Magazynowanie dopaminy w pęcherzy kach synaptycznych jest następnym etapem. Wnikanie do nich dopaminy jest napędzane przez gradient pH powstały w wyniku obecno ści pewnego białka, występującego w błonie pęcherzyka i pompującego protony do jego wnętrza kosztem energii uzyskiwanej z ATP. Uwalnianie dopaminy jest związane z egzocytozą. Mechanizm jest podobny do mechaniz mu opisanego dla acetylocholiny. Wiązanie dopaminy do receptorów postsynaptycznych jest następnym etapem. Amina dochodzi do receptora dyfundując przez szczeli nę synaptyczną. Jak opiszemy później w tym rozdziale, istnieje co najmniej 5 klas receptorów

900 / ROZDZIAŁ 64

L-OOPA \/* aromatycznych X aminokwasów

Produkty utleniania dopaminy

Antagoniści receptora do parni nowego

Ryc. 64-7. Schematyczny diagram przedstawiający uwalnianie dopaminy z neuronu w istocie czarnej i pokazujący miejsca działania leków, które łagodzą lub wywołują parkinsonizm. Sześć etapów wymienionych w tekście jest umieszczonych na rycinie, ale nie numerowanych. Pokazano równieŜ miejsca działania leków uŜywanych w leczeniu parkinsonizmu (L-dopa, deprenil, amantadyna i agoniści receptora dopaminowego, np. bromokryptyna). Ogólnie leki te zwiększają miejscowe stęŜenie dopaminy, przeciwdziałając skutkom jej małego stęŜenia w parkinsonizmie. Pokazane są równieŜ miejsca działania niektórych leków, które indukują parkinsonizm, zmniejszając stęŜenie dopaminy lub rywalizując z nią (rezerpina i antagoniści receptora dopaminergjcznego, tacy jak liczne neuroleptyki). (Według: Sweeney P.: New concepts in Parkinson's disease; Hosp, Pract. (April) 1991, 26, 84, za zezwoleniem).

dopaminowych. Powodują one swoje efekty działając pobudzająco lub hamująco na cyklazę adenyjanową lub, przynajmniej w jednym wypadku, działając na inny system wtórnych przekaźników (tj. na fbsfolipazę C i cykl polifosfoinozytydów). 5. Wychwyt zwrotny dopaminy (ryc. 64-7) zachodzi w wyniku działania transportera o wy-

sokiej aktywności, uŜywającego ATP, obecnego w błonie pre synaptycznej. Odzyskana tak dopamina moŜe być z powrotem inkorporowana do pęcherzyków synaptycznych i ponownie uŜyta jako neurotransmiter. 6. Rozkład dopaminy moŜe zachodzić bądź w szczdinie synaptycznej, bądź, po wychwycie zwrotnym, wewnątrz zakończenia presynapty-

PODŁOśE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 901

cznego. Monoaminooksydaza B (MAO-B) znajduje się *na zewnętrznej błonie mitochondriów w zakończeniu presynaptycznym, a takŜe w szczelinie synaptycznej. MAO-B i MAO-A róŜnią się od siebie preferencją do róŜnych substratów oraz wraŜliwością na róŜne inhibitory. Oba enzymy mogą działać na dopaminę tworząc 3,4-dihydroksyfenyIoacetaldehyd (DOPAC), ten zaś jest dalej konwertowany do kwasu homo w anilinowego (HVA) działaniem katecholo-O-metylotransferazy (COMT) (p. ryc. 50-3). Fakt ten ma istotne znaczenie dla badań nad schizofrenią, gdyŜ poziom kwasu homowanilinowego w ptynie mózgowo-rdzeniowym moŜe być wykorzystany do śledzenia metabolizmu dopaminy w mózgu. Deprenil działa jako inhibitor MAO-B, podczas gdy klorgilina jest swoistym inhibitorem enzymu typu A. Rycina 64-7 ukazuje równieŜ miejsca działania wielu leków uŜywanych w terapii parkinsonizmu i wielu (patrz niŜej) powodujących parkinsonizm jako niepoŜądany efekt uboczny; kaŜdy z 6 etapów omówionych powyŜej moŜe być punktem działania róŜnych leków. Proces degeneracyjny, o którym tu mowa, powoduje znaczny spadek syntezy dopaminy i wynikający stąd spadek jej poziomu w istocie czarnej i ciele prąŜkowanym (jądro ogoniaste i skorupa). ObniŜenie poziomu dopaminy podnosi stosunek acetylocholina/dopamina w komórkach systemu nigrostriatalnego, poniewaŜ poziomy acetyl och oliny nie są tak silnie naruszone. Tak powstała nierównowaga wnosi istotny wkład w róŜne zaburzenia motoryczne obserwowane w chorobie Parkinsona, Nie jest jasne, dlaczego komórki dopaminergiczne w istocie czarnej ulegają zniszczeniu. Nie ma dowodu na istotny czynnik genetyczny w chorobie Parkinsona. Po części uszkodzenia komórek mogą odzwierciedlać proces starzenia, poniewaŜ istota czarna traci ok. 13% swoich komórek w ciągu kaŜdego dziesięciolecia, począwszy od 25 rŜ. Ocenia się, Ŝe objawy choroby Parkinsona pojawiają się wówczas, kiedy poziom dopaminy w systemie nigrostriatalnym spadnie o 80%. ZakaŜenia wirusowe mogą powodować parkinsonizm, ale dzisiaj sądzi się, Ŝe jest to przyczyna stosunkowo mało waŜna. Mn2+ powodował parkinsonizm u górników naraŜonych na wysokie poziomy tego metalu. Leki (np. rezerpina lub neuroleptyki-antypsychotyki) są waŜnymi przyczynami parkinsonizmu, który moŜe się cofnąć przy zaniechaniu

kuracji. Jak pokazano na ryc. 64-7, rezerpina obniŜa stęŜenie dopaminy przez hamowanie magazynowania dopaminy w zakończeniach presynaptycznych, a wiele neuroleptyków blokuje receptor dopaminowy. Niezwykła pochodna aminokwasowa, p-N-inetylaniino-1 .-alanina (BMAA), obecna w nasionach sagowców, moŜe powodować parkinsonizm i moŜe być odpowiedzialna za częste występowanie tej choroby na wyspie Guam, której wielu mieszkańców uŜywa nasion sagowca jako codziennego poŜywienia. BMAA jest więc neurotoksyną. W ostatnich latach szczególnie zainteresowano się 1-metylo-4-fenylo-1,3,4,6-terrahydropirydyną (MPTP) jako przyczyną ostrego parkinsonizmu u narkomanów stosujących narkotyki doŜylnie. Związek ten jest produktem ubocznym przy syntezie meperydyny („heroiny ulicznej") i skaŜa preparaty meperydyny syntetyzowane nielegalnie. MPTP jest zmieniana przez monoaminooksydazę typu B do jonu l-metylo-4-fenylo-pirydoni o nowego (MPP+), który jest właściwym czynnikiem neurotoksycznym. MPP+ jest pobierany przez system wychwytu zwrotnego dopaminy komórek dopaminergicznych istoty czarnej i powoduje ich uszkodzenia. Ze względu na swoją naturę wolnego rodnika MPP+ moŜe powodować uszkodzenia oksydacyjne (p. rozdz. 63). Na dodatek sama dopamina moŜe być teŜ utleniana do potencjalnie szkodliwych rodników. Wiedza zdobyta w badaniach tych neurotoksyn skłania do pytania, jak wiele neurotoksyn moŜe współuczestniczyć w wywoływaniu choroby Parkinsona. L-Dopa przechodzi przez barierę krewmózg i jest przekształcana w mózgu w dopaminę; to stanowi podstawę terapii substytucyjnej w chorobie Parkinsona Kiedy w latach 60 okazało się, Ŝe w parkinsonizmie poziomy dopaminy w systemie nigrostriatalnym są obniŜone, rozpoczęła się nowa era leczenia choroby Parkinsona. WyróŜnia się 3 róŜne sposoby leczenia. Terapia antycholintrgjczna była głównym leczeniem zanim nie zdobyto wiedzy dotyczącej niskiego poziomu dopaminy, a do dziś dnia jest stosowana przy leczeniu pewnych pacjentów. Podawanie prekursorów dopaminy przy wraca poziom dopaminy do prawie normal nego. Sama dopamina nie przechodzi przez barie rę krew-mózg i wobec tego nie moŜe być efek tywnie uŜywana. Lekiem z wyboru jest L-dopa

902 / ROZDZIAŁ 64

(L- 3,4-di hydroksy fenyl o alanina), która przechodzi przez barierę krew-mózg i następnie jest przekształcana w dopamine przez enzym dopa-dekarboksyłazę (zwany takŜe dekarboksylazą aromatycznych aminokwasów; ryc. 64-7). Większość podawanej L-dopa jest jednakŜe Hekarboksylowana w tkankach obwodowych i tylko ok. 1% podanej dawki dochodzi do mózgu. Nie moŜna stosować wyŜszych dawek L-dopa, poniewaŜ powodują one cięŜkie nudności i wymioty. Rozwiązaniem jest podawanie L-dopa wraz z karbidopą, związkiem hamującym aktywność obwodowej dopadekarboksylazy, ale nie przechodzącym przez barierę krew-mózg i wobec tego nie hamującym przekształcenia L-dopa w dopamine w mózgu. Dieta wysoko białkowa dostarcza aminokwasów, które współzawodniczą z L-dopa o wychwyt przez komórki błony śluzowej jelita; dieta niskobiałkowa osłabia ten efekt. L-dopa stalą się podstawą leczenia pacjentów z chorobą Parkinsona od czasu jej wprowadzenia w latach 60. Obecnie rozpoznanie choroby Parkinsona wymaga wykazania korzystnej odpowiedzi na L-dopa, podczas gdy wielu pacjentów z innymi rodzajami parkinsonizmu nie bardzo reaguje na ten lek. JednakŜe po upływie ok. 5 lat efekty L-dopa słabną i konieczna jest terapia alternatywna. 3. Agoniści receptora dop amin owego po podaniu naśladują efekty dopaminy (ryc. 64-7). Korzystne efekty uzyskiwano po bromokryptynie. Inne leki mogą być uŜyteczne w leczeniu choroby Parkinsona, jeŜeli wpływają na metabolizm dopaminy lub wywierają działanie ochronne na tkankę nerwową Nasza wiedza o obniŜeniu poziomu dopaminy oraz o mechanizmie uszkadzania istoty czarnej przez neurotoksyny umoŜliwiła wprowadzenie dalszych leków do leczenia choroby Parkinsona. Lek przeciw wirusowy amantadyna powoduje uwalnianie dopaminy z presynaptycznych zakończeń neuronów dopaminergicznych, zwiększając w ten sposób stęŜenie neurotransmitera w szczelinie synaptycznej (ryc. 64-7). Mazindol hamuje wychwyt dopaminy, w ten sposób równieŜ zwiększając stęŜenie dopaminy przy błonie post synaptycznej. DuŜym zainteresowaniem cieszy się obecnie deprenil (selegilina). Jego wcześniejsze podawanie zapobiega rozwijaniu się parkinsonizmu u zwierząt po podaniu MPTP, co sugeruje, Ŝe deprenil moŜe

mieć działanie neuroprotekcyjne, zmniejszając

zniszczenia komórki spowodowane uszkodzeniem oksydacyjnym. Zgodnie z tym, próby kliniczne wykazały, Ŝe deprenil opóźnia występowanie inwalidztwa w przebiegu choroby Parkinsona. Deprenil hamuje MAO-B (ryc. 64-7) hamując w ten sposób degradację dopaminy i zwiększając jej stęŜenie. Obecnie prowadzi się próby kliniczne z zastosowaniem Ćleprenilu i witaminy E (a-tokoferolu), uŜytej jako przeciwutleniaeza.

Chirurgiczne sposoby leczenia choroby Parkinsona obejmują podawanie zmielonych autoprzeszczepów nadnerczowych do jądra ogonias-

tego lub skorupy; rdzeń nadnercza syntetyzuje róŜne katecholaminy, między nimi i dopaminę. Bada się równieŜ implantacje tkanek płodowych,

zawierających embrionalne komórki nigralne. Skuteczność tych dwóch sposobów moŜe być mniejsza niŜ na to wskazywały początkowe wyniki. Inną metodą jest wstrzykiwanie flbroblastów zmodyfikowanych genetycznie tak, Ŝe produkują duŜe ilości hydroksylazy tyrozyno wej, enzymu regulującego szybkość syjitezy na drodze metabolicznej prowadzącej do dopaminy. ODKŁADANIE SIĘ BIAŁKA AMYLOIDOWEGO fi JEST ZWIĄZANE Z WYSTĘPOWANIEM PEWNYCH PRZYPADKÓW CHOROBY ALZHEIMERA Choroba Alzheimera jest nieuleczalnym schorzeniem neuropsychiatrycznym, w którym następuje postępujące uszkodzenie funkcji po-

znawczych, czemu zwykle towarzyszą zaburzenia afektu i zachowania. Około 2 młn ludzi w USA cierpi na chorobę Alzheimera, a jej częstość występowania zapewne będzie się zwiększać, poniewaŜ coraz więcej ludzi Ŝyje dłuŜej. Niektóre przypadki wydają się mieć przyczyny rodzinne (genetyczne), ale większość jest sporadyczna. Choroba Alzheimera jest najczęstszą przyczyną otępienia (demencji), które moŜna zdefiniować jako postępujący spadek sprawności intelektualnej powstały z przyczyn organicznych, który w istotny sposób zaburza aktywność osobniczą. Choroba Alzaheimera kładzie się olbrzymim cięŜarem na rodzinę chorego i na system opieki zdrowotnej poniewaŜ, wcześniej czy później, większość pacjentów nie potrafi zadbać o siebie. Koszty ekonomiczne choroby

PODŁOśE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 903

Ałzheimera w USA ocenia się na ok. 40 mld dolarów rocznie. Zazwyczaj choroba pojawia się powyŜej 65 rŜ., aie moŜe teŜ pojawić się nawet niedługo po czterdziestce. Czas przeŜycia waha się od 2 do 20 lat. Pierwszym objawem jest często utrata pamięci. Choroba z reguły posuwa się nieubłaganie, w stanach końcowych pacjenci są całkowicie niedołęŜni. Zasadniczy obraz patologiczny wskazuje na proces degeneracyjńy charakteryzujący się utratą komórek w pewnych obszarach mózgu (np. w korze i hipokampie). Na poziomie mikroskopowym probierzem choroby Alzheimera są tarczki amytoidowe otoczone przez komórki nerwowe zawierające splątki neuroflbrylarne (podwójne helikalne filamenty utworzone z hiperufo sforylowanych form białek tau, związanych z mikrotubulami). Obecnie prowadzi się intensywne badania, aby ustalić przyczynę choroby Alzheimera. W ostatnich czasach, jak się wydaje, dokonano znacznego postępu. Zainteresowanie zogniskowało się zwłaszcza na białku amyloidowym P (ApP), głównym składniku tarczek obserwowanych w chorobie Alzheimera. Określenie amylnid odnosi się do róŜnorodnej grupy pozakomórkowych złogów białkowych, spotykanych w rozmaitych chorobach. Białka amyloidowe barwią się zazwyczaj jodem na niebiesko, jak skrobia, skąd pochodzi ich nazwa (amyloidowy = skrobiopodobny). Jedna z hipotez (hipoteza kaskady amyloidowej) zakłada, Ŝe odkładanie się ApP jest powodem zmian patologicznych obserwowanych w mózgach ofiar choroby Alzheimera i Ŝe inne zmiany, takie jak splątki neuroflbrylarne i zmiany naczyniowe, mają charakter wtórny. ApP pochodzi z większego białka prekursorowego, nazwanego prekursorowym białkiem amytoidowym (APP), którego gen jest zlokalizowany na chromosomie 21, niedaleko miejsca, które jest dotknięte przy zespole Downa (trisomia 21). Te osoby z zespołem Downa, które doŜywają 50 lat, często cierpią na chorobę Alzheimera. APP jest białkiem przezbłonowym składającym się z ok. 770 aminokwasów, ApP jest peptydem złoŜonym z 39—42 aminokwasów, powstałym z hydrolitycznego rozcięcia przy końcu węglowym APP. Tworzy ono nierozpuszczalne złogi pozakomórkowe. Wydaje się, Ŝe APP moŜe być rozcięte przez co najmniej 2 róŜne proteazy. Pierwsza, nazwana sekretazą, generuje rozpuszczalny fragment zawie-

693 APP

Ryc. 64-8. Diagram hipotezy kaskady amyloidowej. Prekursorowe białko amyloidu (APP) moŜe być przekształcone dwoma róŜnymi sposobami. W pierwszym bierze udział sekretaza, która wytwarza peptydy nie zawierające całej cząsteczki ApP, rozpuszczalne i nie wytrącające się, a więc nie produkujące amyloidu. W drugiej drodze uczestniczy endosomalna-lizosomatna proteaza (proteazy?} i zostaje wytworzone białko amyloidowe fj {ApP) lub peptydy je zawierające. Wytrącają się one tworząc amyloid Przypuszcza się, Ŝe prowadzi to do tworzenia się splątków neurofibrylarnych i śmierci komórki. W modelu tym precypitacja amyloidu wyprzedza tworzenie się splątków i prowadzi do ich powstawania. (Według: Hardy J. A., Higgins G. A.,; Alzheimer's disease: The amyloid cascade hypothesis; Ścierce 1992, 256, 184. Copyright © American Association for the Advancement Science, 1992, za zezwoleniem).

rający tylko część ApP (ryc. 64-8). Druga, proteaza lizozomalna, tworzy fragment zawierający pełną sekwencję ApP. Przypuszcza się, Ŝe ten właśnie fragment strąca się poza komórką i prowadzi do powstania splątków neurofibrylarnych i innych histopatologicznych objawów choroby Alzheimera. Mutacje zakończenia węglowego APP wykryto u niektórych chorych na chorobę Alzheimera (np. w kodonie 693 u pacjentów z dziedziczną, wcześnie występującą formą choroby i w kodonie 717 u pacjentów z rodzinną chorobą Alzheimera). Sądzi się, Ŝe te mutacje powodują

904/ ROZDZIAŁ 64

tworzenie się fragmentów zawierających Obecnie bada się ich znaczenie; mogą one np. chronić fragmenty zawierające ApP przed niszczeniem proteolitycznym, w ten sposób zwiększając odkładanie APP. Druga cześć hipotezy kaskady amyloidowej dotyczącej przyczyn choroby Alzheimera zakłada, Ŝe ApP lub fragmenty zawierające APP są pośrednio lub bezpośrednio neurotoksyczne. Istnieją dowody, Ŝe wystawienie neuronów na działanie APP moŜe podnieść ich wewnątrzkomórkowe stęŜenie Ca2+. Niektóre kinazy białek, łącznie z tymi, które powodują fosforylację białek tau, są regulowane przez poziom Ca2 + . Stąd wzrost poziomu Ca2+ moŜe prowadzić do hiperfosforylacji białek tau i tworzenia sparowanych helikalnych diamentów obecnych w splątkach neurofibrylarnych. Rycina 64-9 przedstawia przypuszczalny schemat moŜliwej sekwencji zdarzeń w pewnych przypadkach choroby Alzheimera. Wartością dobrej hipotezy często nie jest to, czy jest ona prawdziwa czy nie, ale czy pobudza do dalszych badań. Wydaje się pewne, Ŝe ze Mutacja (w pewnych przypadkach) genu kodującego APP, zło kalkowanego na chromosomie 21

Proteoiiza APP. prowadząca do powstania nieprawidłowych fraomentow zawierających A/(P

Odkładanie się AjSP lub fragmentów zawierających AfiP, prowadząca do zwiększenia zawartości wewnątrz 141 komórkowego Ca w neuronie

Zwiększone stęŜenie Ca!+ powoduje aktywacje klnaz białek fosforylujących białko tau związane z mikratubułami, co powoduje tworzenie sparowanych helikalnych włókien występujących w splątkach neufofibrylarnyoh

Ryc. 64-9. Przypuszczalny schemat moŜliwej sekwencji zdarzeń związanych z powstawaniem pewnych przypadków choroby Alzheimera. Mutacje w genie kodującym APP stwierdzono tylko w niewielkiej liczbie przypadków. Schemat jest zarysem jednego z obecnych kierunków badań i ulegnie zmianom w miarę napływania dalszych wyników. RównieŜ inne mechanizmy prawdopodobnie są odpowiedzialne za wiele przypadków. JednakŜe wiarygodne teorie muszą wyjaśniać tworzenie tarczek i splątków neurofibrylarnych. APP — prekursorowe białko amyloidu, ApT — białko amyloidowe p. (Według: Hardy J. A., Higgjns G. A.: Alzheimer's diseaae: The amyloid cascade hypothesis; Science 1992, 256, 184, za zezwoleniem).

względu na rozpowszechnienie i katastrofalne konsekwencje choroby Alzheimera, hipoteza amyloidowa będzie poddana intensywnemu sprawdzaniu doświadczalnemu. Głównym punktem, który wciąŜ pozostaje do ustalenia, jest pytanie, czy odkładanie się ApP jest czynnikiem pierwotnym w chorobie Alzheimera, czy jest to zjawisko pochodne w stosunku do innych, na razie nie znanych procesów? Istnieją i inne hipotezy na temat przyczyn choroby Alzheimera. Proponowano na przykład, Ŝe jest ona powodowana przez zakaŜenie powolnie działającym wirusem, chociaŜ Ŝadnego takiego wirusa nie wyizolowano w sposób powtarzalny. Inny kierunek badań wytyczyło odkrycie, Ŝe tarczki u pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera często wykazują zwiększone stęŜenie glinu. Proponowano wobec tego, Ŝe jedną z przyczyn choroby Alzheimera moŜe być spoŜywanie zwiększonych ilości glinu w diecie. Tu znów pojawia się pytanie, czy zwiększony wychwyt glinu do tarczek jest zjawiskiem pierwotnym czy wtórnym, to znaczy czy podniesiony poziom glinu moŜe wywoływać chorobę Alzheimera u pewnych osobników, czy teŜ zwiększone ilości głinu w tarczkach odzwierciedlają jego zwiększone pobieranie przez komórki uszkodzone przez jakiś inny proces? Odpowiedź na to pytanie nie jest jasna. Mózgi pacjentów zmarłych na chorobę Alzheimera często wykazują obniŜenie aktywności acetylotransferazy cholinowej i poziomu ace ty locho liny Poziomy innych neurotransmiterów są teŜ często obniŜone. Zmiany te wydają się być wtórne, powodowane uszkodzeniami komórek, a nie pierwotnymi zdarzeniami inicjującymi rozwój choroby Alzheimera. Istnieją wielkie nadzieje, Ŝe badania nad mechanizmami zaangaŜowanymi w powstawanie choroby Alzheimera doprowadzą do opracowania lepszych testów diagnostycznych i skutecznej terapii. Na przykład związki, które mogą hamować tworzenie A0P lub utrzymywać je w formie rozpuszczalnej mogą mieć znaczenie terapeutyczne. Obecnie ostateczne, pewne rozpoznanie choroby Alzheimera jest moŜliwe często jedynie na sekcji, po znalezieniu charakterystycznych tarczek w preparatach z mózgu. Jeden z testów, obecnie w fazie opracowywania, opiera się na pomiarze ilości APP w płynie ntózgowo-rdzeniowym (CSF) przy uŜyciu swoistych przeciwciał monoklonalnych. Donoszono bowiem, Ŝe poziomy APP są znacznie niŜsze (około trzykrotnie) w CSF pacjentów z chorobą

PODŁOśE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 9OB

Alzheimera niŜ u osób zdrowych. Obecnie nie istnieje Ŝadna swoista terapia choroby Alzheimera, chociaŜ w końcu moŜliwa moŜe się okazać farmakologiczna modyfikacja odkładania App w tkankach. Wykazano, Ŝe w niektórych obszarach mózgu pacjentów z chorobą Alzheimera występuje niedobór mózgowego czynnika wzrostu nerwów. Obecnie bada się, czy nie wywiera on korzystnego wpływu u zwierząt z degeneracjami peuronalnymi wywołanymi chirurgicznie. Obecnie opieka nad chorymi na chorobę Alzheimera koncentruje się nad leczeniem moŜliwych komplikacji zdrowotnych i prawidłowym odŜywianiu. WaŜną rolę odgrywa poradnictwo rodzinne, ale pacjenci najczęściej znajdują najlepsze warunki w domach opieki.

PRZYCZYNY SCHIZOFRENII MOGĄ BYĆ ZWIĄZANE Z CZYNNIKAMI GENETYCZNYMI, ROZWOJOWYMI I DOPAMINERGICZNYMI Schorzenia schizofreniczne są zaburzeniami umysłowymi, zazwyczaj charakteryzującymi się objawami psychotycznymi, odzwierciedlającymi zaburzenia myślenia, uczuć i zachowania. Istotne jest (p. niŜej) rozróŜnienie miedzy „objawami pozytywnymi" (np. halucynacje, omamy, zachowania dziwaczne) a „negatywnymi" (izolacja społeczna, stępienie emocji ttp.). Istnieje wiele podtypów schizofrenii, np. zdezorganizowana (hebefreniczna), katatoniczna i paranoidalna. Dla prostoty będziemy uŜywać terminu schizofrenia mówiąc o całej grupie schorzeń. Schizofrenia występuje na całym świecie i dotyka ok. 1% populacji północnoamerykańskiej. Rozpoczyna się zazwyczaj ok. 45 rŜ., ale często występuje u nastolatków i ma tendencję do przebiegu przewlekłego. Stanowi ona powaŜny problem medyczny, często z niszczącymi konsekwencjami dla ofiar i ich rodzin; nawet obecnie, kiedy istnieją względnie skuteczne metody terapii farmakologicznej, schizofrenicy zajmują ok. 20% wszystkich łóŜek szpitalnych. Przyczyna lub przyczyny schizofrenii są nieznane. Postulowano róŜne czynniki psychologiczne, społeczne, rozwojowe, środowiskowe, anatomiczne, genetyczne, biochemiczne i inne. RozwaŜymy tutaj, dlaczego tak trudno jest określić podstawy genetyczne schizofrenii, wskaŜemy na strukturalne anomalie mózgu schizofreników, które trzeba brać pod uwagę, i przedyskutujemy teorię dopaminową schizofrenii.

Badania sprzęŜenia genetycznego w schizofrenii są trudne z powodu braku powtarzalności wyników RóŜnorodne podejścia (np, wywiady rodzinne, analiza pokrewieństwa, badania nad adoptowanymi oraz nad bliźniętami mono- i dizygotycznymt) wskazują na istotny czynnik genetyczny w schizofrenii. Na przykład u dzieci, których oboje rodzice byli schizofrenikami, istnieje 39% prawdopodobieństwa zapadnięcia na tę chorobę. Zgodność miedzy bliźniętami homozygotycznymi wynosi 47%. JednakŜe badania te nie odpowiedziały na pytanie, czy schizofrenia jest chorobą monogeniczną, poligeniczną czy wieloczynnikową. JeŜeli prawdziwa jest jedna z dwóch ostatnich moŜliwości, szukanie genetycznych podstaw schizofrenii będzie oczywiście bardziej złoŜone. Wysiłki zmierzające do określenia sprzęŜenia genów prawdopodobnie zaangaŜowanych w schizofrenii z określonym chromosomem doprowadziły do sprzecznych wyników. Doniesienie o obecności „miejsca podatności" na schizofrenię nie zastało potwierdzone w innych badaniach. Sprzeczne wyniki przyniosły takŜe badania sprzęŜeń genetycznych innych waŜnych schorzeń psychicznych (np. choroba afektywna jedno- i dwubiegunowa). Niektóre moŜliwe wyjaśnienia tego stanu rzeczy podaje tab. 64-7. Tabela 64-7. Niektóre powody trudności w lokalizacji genów odpowiedzialnych za schizofrenię (większość' punktów odnosi się równieŜ do innych schorzeń psychiatrycznych, takich jak choroba afektywna jedno- i dwubiegunowa)* Schizofrenia moŜe mieć kilka przyczyn genetycznych (heterogenność genetyczna) Dla zwiększenia efektywności analizy sprzęŜeń potrzebne są duŜe, wielopokoleniowe rodziny Rozmycie kryteriów diagnostycznych w róŜnych krajach powoduje, m.in., fałszywe diagnozowanie krewnych Stosowanie nieodpowiedniej metodyki statystycznej (np. niewłaściwe stosowanie punktów Lod) UŜywanie do analizy biochemicznej {np, na dopaminę) próbek pobieranych pośmiertnie, zachowanych w róŜnym stopniu Wcześniejsze leczenia (np. neuroleptykami) moŜe zmienić profil biochemiczny analizowanych próbek mózgu * Według: Barnes D.M.: Troubles encountered in gene linkage land; Science 1989, 243, 313

906 / ROZDZIAŁ 64

Fakt, Ŝe choroba pojawia się w rodzinie, nie musi koniecznie oznaczać, Ŝe ma ona podłoŜe genetyczne. Na przykład zła interakcja psychologiczna między członkami rodziny moŜe doprowadzić do wytworzenia anormalnych wzorców zachowania. Najlepszym rozwiązaniem tych problemów przez analizę sprzęŜeniową jest znalezienie i dogłębne przeanalizowanie duŜych rodzin wielopokoleniowych, u których występuje wspólny defekt genetyczny i podobne objawy. W przypadku schizofrenii, dopóki nie ustali się jasnych sprzęŜeń, prawdopodobnie wybierze się do badań i przeanalizuje wiele genów-kandydatów (np. kodujących receptory dopaminowe i enzymy uczestniczące w metabolizmie katecholamin), w poszukiwaniu mutacji mogących odgrywać rolę w tej chorobie. W mózgu schizofreników moŜna wykazać anomalie strukturalne prawdopodobnie o naturze rozwojowej Anomalie strukturalne w środkowym płacie czołowym (zawój przyhipokampalny, hipokamp i ciało migdałowate) zaobserwowano w mózgach wielu schizofreników. Obszary te są zaangaŜowane w scalanie i obróbkę informacji płynących z kory asocjacyjnej. Tak na przykład występowanie zmienionej orientacji komórek piramidalnych hipokampa moŜe odzwierciedlać wadliwy wzorzec migracji neuronów. Prawdopodobnie obserwowane zjawisko jest wynikiem anomalii genetycznej, która dotyczy cząsteczek biorących udział w migracji lub adhezji komórek. Z kolei zmieniona orientacja komórek moŜe, jako efekt wtórny, zaburzać róŜne parametry neurochemięgne. Przypuszczenie, Ŝe mózgi wielu schizofreników wykazują anomalie strukturalne podkreśla fakt częstego występowania powiększenia komór, chociaŜ stopień tego powiększenia często nie jest na tyle znaczny, aby stanowił cechę diagnostyczną. Hipoteza dopaminowa schizofrenii została zmodyfikowana na podstawie nowych obserwacji Na brak biochemicznych teorii schizofrenii nie moŜna się uskarŜać. W róŜnych okresach za związki zaangaŜowane w etiologii schizofrenii uwaŜano acetylocholinę, kwas y-aminomasłowy (GABA), noradrenalinę, opioidy, peptydy i inne molekuły. JednakŜe w ciągu ostatnich 30 lat najwięcej uwagi poświęcono dopaminie. Było to uwarunkowane sukcesem wprowadzenia leków neuroleptycznych (antypsychotyków) we

wczesnych latach 50. do leczenia róŜnych psychoz, w tym schizofrenii. Zaobserwowano wówczas, Ŝe wielu schizofreników leczonych neuroleptykami zapada na parkinsonizm. To sugerowało, Ŝe neuroleptyki działają obniŜając poziom dopaminy (p. omówienie choroby Parkinsona). Obserwację tę i inne odkrycia potwierdzające udział dopaminy w schizofrenii podsumowuje tab. 64-8. Oryginalna hipoteza doTabela 64-8. Obserwacje popierające dopaminową hipotezę schizofrenii* Leki neuroieptyczne (antypsychotyki) często wywołują parkinsonizm, co sugeruje, Ŝe obniŜają poziom dopaminy Pierwotnym działaniem neuroleptyków zdaje się być obniŜenie aktywności dopaminowej w mezolimbicznych neuronach dopaminowych Liczne inne leki {np. L-dopa, amfetamina) wpływające na metaboli2im dopaminy (dopaminomimetyki) wywołują oznaki i objawy schizofrenii Przewlekłe podawanie neuroleptyków prowadzi do spadku poziomu kwasu homowanilinowegow płynie mózgowo-rdzeniowym, co ogólnie jest skorelowane z pozytywną odpowiedzią na leczenie Siła działania antypsychotycznego większości neuroleptyków jest skorelowana z siłą ich wiązania do receptorów D2 Analiza próbek pobranych pośmiertnie i uŜycie przyŜyciowe tomografii komputerowej wskazuje, Ŝe gęstość receptorów D2 w mózgu schizofreników jest podniesiona Objawy negatywne schizofrenii mogą być Ŝwiązane z niską aktywnością dopaminowa w korze przedczotowej * Według: Seeman P.; Dopamine receptors and the dopamine hypothests of schizophrenia; Synapsę 19877, 1:133 i Davis K.L i wsp.: Dopamine in schizophrenia: A review and reconceptualization; Am. J. Psychiatr. 1991, 148:144

paminowa schizofrenii postulowała, Ŝe schizofrenia jest objawem hiperdopamtnergii, gdy, przez porównanie, choroba Parkinsona jest objawem hipodopaminergii. Obserwacje biochemiczne dotyczące roli dopaminy w schizofrenii moŜna ogólnie podzielić na trzy kategorie. Pomiary ilości dopaminy w próbkach móz gu. Wielu badaczy doniosło o wzrostach, ale obserwowano znaczny rozrzut wyników. Pomiary metabolitów dopaminy w mózgu i płynach ustrojowych. Szczególną uwagę zwra-

PODŁOśE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 907

cano na kwas homowanilinowy, główny metabolit dopaminy u człowieka. Zwiększenie stęŜenia tego metabolitu obserwowano w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów cierpiących na schizofrenię, a jego ilość zmniejszała się gdy pacjent reagował na terapię lekami. Tu jednak równieŜ obserwowano znaczny rozrzut wyników. 3. Pomiary receptorów dopaminowych (D).

Tabela 64-9. Niektóre właściwości receptorów dopaminowych. Często donosi się o nowych receptorach, izolowanych z uŜyciem odpowiednich sond i bibliotek genomowych lub cDNA* Istnieje co najmniej 5 róŜnych większych klas (D1D5),z pod typami tworzonymi przez alternatywne rozcięcia Są to białka błonowe; przynajmniej niektóre z nich są glikozyiowane

Najbardziej stałym wynikiem była obserwacja, Ŝe ilość receptorów D2 (p. niŜej) wydaje się być zwiększona w mózgu schizofreników, zwłaszcza u tych, którzy jeszcze nie byli traktowani lekami. Co więcej, badania wykazały, Ŝe siła działania antjpsychotycznego większości głównych neuroleptyków jest skorelowana z ich zdolnoś-

Większość ma 7 domen przezbłonowych i pętle w cytoplazmie

cią do rywalizacji z dopaminą in vitro o receptory

Co najmniej jeden podtyp. (wywodzący się z receptora Dl) jest sprzęŜony Fiosfolipazą C

D2. Powodami rozrzutów omówionych wyŜej wyników moŜe po części być uŜywanie tkanek pobranych pośmiertnie oraz fakt, Ŝe większość schizofreników jest leczonych neuroleptykami, które same przez się (tzn. niezaleŜnie od schizofrenii) mogą zmieniać poziom róŜnych receptorów j enzymów w mózgu. Wyniki uzyskane z receptorami D2 zogniskowały zainteresowanie na receptorach dopaminowych. Głównie dzięki klonowaniu genów wyróŜniono do dziś 5 klas tych receptorów {tab. 64-9). Wszystkie one są białkami przezbłonowymi, co najmniej niektóre są glikoproteinami i większość z nich jest związana z białkami G. Receptory D2, D3 i D4 wydają się być wzajemnie podobne. Poza znaczeniem receptora D2 omówionym powyŜej, najciekawszym odkryciem było, Ŝe receptor D4 wykazuje 5 polimorficznych wariantów. Jest to pierwszy z rodziny receptorów katecholaminowych, który wykazał zmienność polimorficzną w populacji ludzkiej. Głównym pytaniem jest, czy moŜe istnieć korelacja między jednym z tych wariantów a podatnością na schizofrenię lub na działanie leków? JuŜ obecnie wiadomo, Ŝe nietypowy neuroleptyk klozapina (która nie powoduje parkinsonizmu ani późnych dyskinez, powaŜnych niepoŜądanych elektów ubocznych większości neuroleptyków) wykazuje dziesięciokrotnie większe powinowactwo do receptora D4 niŜ do D2. Ze względu na pewne niespójności wyników omówionych powyŜej, oryginalna hipoteza dopaminowa została przeformułowana tak, Ŝe postuluje ona nieprawidłową, choć niekoniecznie nadmierną aktywność dopaminergiczną w schizofrenii. W niektórych obszarach mózgu aktywność dopaminergiczna moŜe być wysoka,

Większość jest sprzęŜonych z białkami G Niektóre są pozytywnie sprzęŜone z cyklaza. adenylanową (np. Dl), co najmniej jeden (D2) jest sprzęŜony negatywnie

Przynajmniej niektóre podtypy są regulowane w drodze fosforylacji Dla wielu neuroleptyków siła ich powinowactwa do receptora D2 odpowiada ich sile w leczeniu schizofrenii RóŜne receptory wykazują odmienne rozmieszczenie anatomiczne Receptor D4 wiąŜe nietypowy neuroleptyk kiozapinę z powinowactwem 10 razy większym niz receptor D2 Odkryto 5 róŜnych podtypów receptora D4. Jest to pierwszy przedstawiciel rodziny receptorów katecholaminowych wykazujący zmienność polimorficzną w populacji ludzkiej * Według: Strange P.G.: Interesting times for dopaminereceptors; TrendsNeurosci. 1991,14: 43 i iversen L: Which D4 do you have? Naturę 1992, 358, 109

a w innych niska. Pogląd ten podtrzymują obserwacje, Ŝe w korze przedczołowej schizofreników moŜna obserwować obniŜoną aktywność dopaminergiczną, prawdopodobnie skorelowaną z negatywnymi objawami tego schorzenia. Inne badania wykazują, Ŝe jeśli neurony dopaminowe kory przedczołowej w warunkach fizjologicznych normalnie hamują aktywność podkorowych neuronów dopaminowych, obniŜenie poziomu dopaminy w korze przedczołowej moŜe doprowadzić do zwiększenia aktywności podkorowych neuronów dopaminowych. NaleŜy równieŜ pamiętać, Ŝe inne neurotransmitery mogą takŜe odgrywać rolę w schizofrenii, albo same przez się, albo przez interakcję z systemem dopaminergicznym.

908 / ROZDZIAŁ 64

PowyŜsza dyskusja ilustruje fakt, Ŝe biochemia schizofrenii jest złoŜona. Wykazanie ewidentnych mutacji grających rolę przyczynową w schizofrenii — jeŜeli takie istnieją — pomogłoby wyjaśnić role swoistych białek (np, receptorów, enzymów) w powstaniu i przebiegu tej choroby.

ZNANE SĄ JUś TECHNIKI, ZA POMOCĄ KTÓRYCH MOśNA WYJAŚNIĆ PODSTAWY MOLEKULARNE WIELU SCHORZEŃ NEUROPSYCHIATRYCZNYCH Zastosowanie technologii rekombinowanego DNA umoŜliwiło ustalenie podłoŜa molekularnego kaŜdej choroby o podłoŜu genetycznym. Badania nad mukowiscydozą wykazały, Ŝe moŜna z powodzeniem przeszukiwać stosunkowo wielkie obszary DNA, by znaleźć nieprawidłowe geny. Prawdopodobnie w tym dziesięcioleciu uda sie określić podstawę molekularną większości schorzeń neuropsychiatrycznych pochodzenia genetycznego. JuŜ obecnie poczyniono znaczne postępy co do chorób nie dyskutowanych w tym rozdziale. Wykazano na przykład, Ŝe mutacje genu kodującego rodopsynę są przyczyną barwnikowego zapalenia siatkówki (retinitis pigmemosa), stosunkowo częstej choroby powodującej ślepotę, a bada się obecnie wiele innych genów podejrzewanych o wywoływanie chorób okulistycznych (np. gen kodujący białko wiąŜące GTP, transducynę, gen kodujący fosfodiesterazę cGMP oraz peryferynę — białko uwaŜane za konieczne^dja zachowania kształtu zewnętrznego segmentu błon tarczowych pręcików i czopków). Rozpoczyna się terapia genetyczna chorób neurologicznych. W przypadku guzów mózgu proponuje się wstrzykiwanie do nieoperowalnych guzów, przy uŜyciu aparatów stereotaktycznych pod kontrolą MRI (obrazowania przy uŜyciu rezonansu magnetycznego), fibroblastów mysich zawierających wektor retrowirusa zawierający gen kodujący kinazę tytnidynową z wirusa opryszczki. Ten retrowirus miałby zaatakować komórki sąsiadujące z guzem, wprowadzić do nich gen kinazy tymidynowej i w ten sposób uczynić te komórki guzowe wraŜliwymi na lek przeciwwirusowy, gancyklowir, który nie wpływa na komórki zdrowe. Tego rodzaju podejście zostało nazwane „chirurgią molekularną".

PODSUMOWANIE Receptory acetylocholinowe w złączu mięśniowo-nerwowym są kanałami jonowymi regulowanymi (bramkowanymi) przez neurotransmiter. W miastenii tworzą się autoprzeciwciała przeciw tym receptorom i niszczą wieie z nich. Objawia się to epizodycznymi napadami słabości mięśniowej. Leki hamujące esterazę cholinową są skuteczne, ale często trzeba zahamować nieprawidłową aktywność immunologiczną stosując odpowiednie środki. Gen choroby Huntingtona jest umieszczony na krótkim ramieniu chromosomu 4, ale natura kodowanego przezeń produktu nie została jeszcze wyjaśniona. JednakŜe, uŜywając odpowiednich sond, moŜna przewidzieć, u których członków rodzin, w których występuje ta przypadłość, rozwinie się pląsawica. Badania mechanizmu uszkodzeń i śmierci komórkowej w chorobie Huntingtona i udarze mózgu wykazały, Ŝe jednym z głównych czynników jest pobudzenie receptorów glutaminianowych typu NMDA. Wyjaśnienie tego i innych mechanizmów uszkodzenia komórek mózgowych powinno doprowadzić do postępu w leczeniu tych schorzeń neuropsychiatrycznych, których cechą są uszkodzenia komórkowe. Poznano juŜ sekwencję ludzkiego mtDNA i wiadomo, Ŝe jest on odpowiedzialny za kodowanie mitochondrialnych rybosomalnych RNA, mitochondrialnych transferowych RNA i za kodowanie 13 peptydów łańcucha oddechowego. Opisano róŜne delecje, multiplikacje i mutacje punktowe mtDNA i wykazano, Ŝe powodują one róŜne mi opatie i choroby neurologiczne. Choroby mitochondrialne są dziedziczone po matce. Nowe mutacje, polegające na powtórzeniach obejmujących trypiety bogate w CG, są przyczyną zespołu łamliwego chromosomu X, atrofii rdzeniowo -opuszkowej i dystrofii miotonicznej. UŜycie technik wykrywających takie mutacje ułatwi rozpoznawanie tych i pokrewnych schorzeń. Choroba Parkinsona jest powodowana przez degenerację komórek istoty czarnej, co powoduje niedobór dopaminy w układzie nigrostriatalnym. Skutecznym lekiem jest L-dopa. Korzystnymi wydają się równieŜ leki takie, jak deprenil, które mają działanie neuroprotekeyjne. Tarczki amyloidowe i splątki neuro fibry larne

PODŁOśE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 909

są zasadniczymi cechami choroby Alzheimera. Hipoteza kaskady amyloidowej zakłada, źe odkładanie białka amyloidowego % pochodzącego z białka prekursorowego amyloidu, jest procesem zapoczątkowującym chorobę, i Ŝe białko amyloidowe |ł lub jego fragmenty mają właściwości neurotoksyczne, prowadzące do powstawania splątków neurofilamentów i innych objawów. U niektórych pacjentów z chorobą Alzheimera wykryto mutacje genów kodujących białko prekursorowe amyloidu. Potrzebne są jednak dalsze dowody, aby ocenić poprawność tej hipotezy. Wprowadzenie leków neuroleptycznych do Jęczenia psychoz doprowadziło do zdobycia dowodów wskazujących na rolę dopaminy w powodowaniu schizofrenii. Liczne informacje popierają ten pogląd, ale dopaminowa hipoteza schizofrenii pozostaje na razie nie dowiedziona. Klonowanie receptorów dopaminowych doprowadziło do wykrycia 5 klas receptorów, wśród których podtyp EW ma wiele odmian polimorficznych.

PIŚMIENNICTWO Barnes DM: Troubles encountered in gene linkage land. Science 1989;243:313. [Dyskusja problemu trudności powtórzenia danych uzyskanych w pracach na temat sprzęŜenia genetycznego 4 róŜnych chorób psychicznych.] Cooper JR, Bioom FE, Roth RH. The Biochemkal Basis of Neuropharrwcołogy, 6th ed. Oxford Univ Press, 1991. Culver KW et ai: In vivo gene transfer wiih retroviral-producer oells for treatment of experimental brain tumors. Science 1992; 256:1550. Davis KL et al: Dopamine in schizophrenia: A review and reconceptualizauon. Am J Psychiatr 1991;]4ffcl474, Ganong WF: Review of Medkai Physiology, 15th ed. Apleton & Lange, 199J. Goldman HH (editor): Reviev of Generał Psychiatry, 3rd ed. Appleton & Lange, 1992. Goldstein M, Deutch AY: Dopaminergjc mechanisms in

the pathogenesis of schizophrenia. Fed Am Soc Exp BiolJ 1992;6:24f3. Gusella JF: Huntington's disease. Chapter 3 in: Advances in Human Genetks, Vol 20. Harris H, Hirschhorn K (edttors). Plenum Press, 1991. Hardy JA, Higgjns GA: Alzheimer's disease: The amyloid cascade hypotheśs. Science 1992; 25&184. Hoffinan M: Unraveliing the genetics of fragHe X syndrome. Science J991;252:100. Horn JP: The heroic age of neurophysiology. Hosp Pract (My) 1992;27:65. [Pierwszy z serii 6 artykułów na temat podstaw fizjologicznych zaburzeń przekaznictwa nerwowo-mięśniowego.] Humphries P, Kenna P, Farear GJ: On the molecular genetics of retinitis pigmeniosa. Science 1992:256:804, Iversen L; Which D4 do you have? Naturę 1992;3Sa-!09. Kandel ER, Schwartz JH, Jessell TM: Prmcipłes ofNeural Science, 3rd ed. Elsevier, 1991. Kapłan HI, Sadock BJ ^editors): Comprehensive Textbook of Psychiatry. 5thM. Vol 1. Wiltiams & Wilkins, 1989. Levitan IB, Kaczmarek LK: The Neuron: Celt and Mokcular Biohgy. Oxford Univ Press, 1991. Marun JB: Molecular genetic studies in the neuropsychiatric disorders. Trends Neurosci 1989;1Ł13O. Marx J: Alzheimer's debatę boils over. Science 1992;257:1336. Peariman AL, Collins RC: Neurobiołogy of Disease. Oxford Univ Press, 1990. Roberts L: Huntington's gene: So near, yet so far. Science 1990;247:ó24. Seeman P: Dopamine receptors and the dopamine hypolhesis of schizophienia. Synapsę 1987;1:133. Stone R: Molecular „surgery" for brain tumors. Science 1992^56:1513. Strauge PG: Interesting times for dopamine receptors. Trends Neurosci 1991; 14:43. Sweeney PJ: New concepts in Parkinson's disease. Hosp Pract (Aprit) 1991:26:84. Van Tol HM et al: Multiple dopamine D4 receptor variants in the human population. Naturę 1992^58:149. Wallace DC: Mitochoudrial DNA mutations and neuiomuscular disease. Trends Genet 1989;5S. Wright AF: New insighfs into genetic cye disease. Trends Genet 1992;&85. Zivin JA, Choi DW: Stroke therapy. Sci Am (My) 1991:265:56.

Dodatek1

SKŁADNIKI CHEMICZNE KRWI I PŁYNÓW USTROJOWYCH Znaczenie wartości liczbowych dla wyraŜenia wyników badań laboratoryjnych Wynik wydany przez laboratorium kliniczne, po oznaczeniu stęŜenia lub ilości substancji w określonym materiale, jest wartością najlepszą, moŜliwą do uzyskania przy uŜyciu określonej metody oraz określonych odczynników i przyrządów, przez personel techniczny obeznany z obróbką materiahi biologicznego. Dokładność określa stopień zgodności wyni ku otrzymanego z wartością prawdziwą (z wia domym stęŜeniem w próbce kontrolnej). Precy zja określa powtarzalność wyniku analitycz nego i wyraŜa się rozrzutem wielu wyników pomiarów otrzymanych w tej samej próbce (w tym samym materiale i tą samą metodą). Wiary godność jest miarą zgodności dokładności i pre cyzji. ^ Precyzja nie ma charakteru absolutnego, lecz podlega wahaniom, uwarunkowanym złoŜonością uŜytej metody analitycznej, stabilnością odczynników, dokładnością sporządzania pierwotnego wzorca, złoŜonością aparatury oraz wprawą personelu technicznego. KaŜde laboratorium powinno zbierać dane dotyczące precyzji (powtarzalności), nadające się do opracowania statystycznego, tj, do obliczania odchylenia standardowego (SD) od średniej, uzyskanej przy powtarzanym oznaczaniu tego samego parametru w tej samej próbce materiału i tą samą metodą, np. precyzja oznaczania stęŜenia cholesterolu w dobrym laboratorium powinna * Reprodukcja z: Krupp M.A., Schroeder S.A., Ticrney L.M. Jr: Current Medical Diagnosis and Treatment. Appieton and latige, 1987.

wynosić: wartość średnia ± 0,1293 mmol/l (± 5 mg/dl). 95% granice ufności wynoszą + 2 SD lub ± 0,2586 mmol/l (10 mg/dl). Tak więc kaŜdą wartość naleŜy uwaŜać za „dokładną", jeśii wahanie nie przekracza 0,5172 mmol/l ( = 20 mg/dl). JeŜeli wynik oznaczenia stęŜenia cholesterolu brzmi 5,17 mmol/l ( = 200 mg/dl), to wartość prawdziwa leŜy między 4,91 mmol/l ( = 190 mg/dl) a 5,43 mmol/l (=210 mg/dl). Przy oznaczaniu stęŜenia potasu w surowicy z wariancją 1 SD wynoszącą 0,1 mmol/l, wyniki oznaczeń uzyskane dla tej samej próbki mogą się róŜnić o ± 0,2 mmol/l. JeŜeli średnie stęŜenie potasu w danej próbce wynosiło 5,5 mmol/l, wartości mogą się wahać od 5,3 mmoJ/1 do 5,7 mmol/l. Oznacza to, Ŝe jeśli wynik wynosi 5,3 mmol/l lub 5,7 mmol/l, to mieści się jeszcze w granicach precyzji metody. Laboratorium powinno dostarczyć lekarzowi wartości zmienności dla określonego oznaczenia. Pozwalają one określić, czy wynik podany róŜni się znamiennie od drugiego wyniku uzyskanego u tego samego chorego. Interpretacja testów laboratoryjnych Jako wartości prawidłowe określa się takie, które mieszczą się w granicach dwóch odchyleń standardowych od wartości średniej ustalonej dla „normalnej" populacji. Ten zakres normy obejmuje 95% populacji. Wartość „prawidłowa" zaleŜy od wielu czynników. Oznacza to, Ŝe wiele czynników moŜe być przyczyną róŜnych zakresów „normy". Ten fakt sprawia, Ŝe wartości mieszczące się w granicach normy w danych warunkach, mogą znajdować się poza granicami ufności 95%, określonymi w innych warunkach. Wśród tych czynników wymienić naleŜy: wiek, rasę, środowisko zewnętrzne, pozycje ciała, rytmy dzienno-nocne lub inne zmiany cykliczne, czas jaki upłynął po ostatnim posiłku (stan na

DODATEK / 911

czczo lub po posiłku), rodzaj spoŜytych pokarmów, leki oraz nasilenie wykonanego wysiłku fizycznego.

Wartości „normalne" lub „referencyjne" zaleŜne są od metody oznaczania danego parametru, pracowni. wykonującej badanie oraz od warunków pobierania i przechowywania materiahi biologicznego przeznaczonego do badań. Zakresy wartości prawidłowych powinny być jasno podane przez poszczególne laboratoria. Jest to niezbędne dfa prawidłowej interpretacji wyników badań laboratoryjnych. Interpretację wyniku naleŜy zawsze przeprowadzić w kontekście ze stanem chorego, np. małe stęŜenie moŜe być spowodowane niedoborem danej substancji, lub teŜ jej rozcieńczeniem (np. małe stęŜenie sodu). Nieprawidłowe stęŜenie określonej substancji we krwi moŜe być spowodowane chorobą lub podaniem leku. I tak np. podwyŜszone stęŜenie kwasu moczowego w surowicy moŜe być spowodowane dną, lecz moŜe być równieŜ wynikiem stosowania hydrochlorotiazydu, lub leków przeciwnowotworowych. Poleca się czytelnikowi zaznajomienie się z listą leków wpływających na wynik testów chemicznych. Na wynik testu chemicznego ma wpływ sposób pobierania materiału biologicznego. Wśród przyczyn błędnych wyników wymienić naleŜy: niedokładne zbieranie dobowego moczu, zmiany stęŜenia określonej substancji w przypadkowo zebranych próbkach moczu, hemolizę krwi, dodanie do krwi niewłaściwego anty koagulantu lub uŜycie brudnego szkła lub zanieczyszczonej aparatury. Uwaga. W razie otrzymania nieprawidłowego wyniku, najpierw naleŜy wykluczyć wszystkie moŜliwe źródła błędu mogące warunkować taki wynik, a dopiero potem przystąpić do leczenia opartego na prawidłowej interpretacji danej aberracji biochemicznej. Medycyna laboratoryjna jest oddzielną specjalnością. NaleŜy zasięgnąć porady specjalistów tej dziedziny, jeśli wynik badania biochemicznego jest albo niezwykły albo wątpliwy. Wpływ posiłków i pozycji ciała na stęŜenia składników krwi. Posiłki. Większość wartości „normalnych" ustalono dla próbek pobranych na czczo, tj. 8—12 godzin po ostatnim posiłku. Zezwala się jednak na picie wody z kilkoma wyjątkami. Wyniki kilku testów chemicznych ulegają zmianie, jeśli krew pobrano 3—4 godziny po

śniadaniu (w porównaniu z wynikami uzyskanymi na czczo*). JeŜeli krew pobrano 3—-4 godziny po obiedzie, wzrasta prawdopodobieństwo uzyskania wyników odbiegających od tych, jakie otrzymano w próbkach pobranych na czczo, np. aktywność AspAT moŜe być wyŜsza o 31%, zaś dehydrogenazy mkczanowej mniejsza o 5%; mniejsze odchylenia dotyczą innych składników krwi. Celem otrzymania wartościowych wyników oznaczenia triglicerydów w surowicy zachodzi konieczność wstrzymania się od pokarmów przez 10—14 godzin przed pobraniem krwi do badań. Pozycja ciała. U osoby przebywającej w pozycji leŜącej przez kilka godzin objętość krąŜącego osocza jest o 12—15% wyŜsza niŜ u osoby chodzącej lub stojącej przez około godzinę. Z faktu tego^wynika, Ŝe wyniki oznaczeń biochemicznych wykonanych we krwi pobranej u osób leŜących przez około godzinę są około 10% niŜsze niŜ u osób chodzących. Pośrednie wyniki uzyskuje się, jeśli krew pobrano od osób siedzących. WaŜność testów laboratoryjnych* Wartość kliniczna testu biochemicznego zaleŜy od jego swoistości i czułości oraz od częstości występowania choroby w populacji, w której jest ten test wykonywany. Czułość określa częstość występowania dodatnich wyników danego testu u wszystkich osób chorujących na tę samą chorobę. Test na fenyloketonurię jest wysoce czuły, poniewaŜ wypada on dodatnio u wszystkich chorych dotkniętych tym defektem (100% czułość). W odróŜnieniu od testu na fenyloketonurię oznaczanie antygenu rakowo-płodowego (CEA) wykazuje małą czułość, wypada ono bowiem dodatnio tylko u 72% chorych z zaawansowanym rakiem jelita grubego, zaś zaledwie u 20% chorych z rakiem okręŜnicy we wczesnym stadium. Czułość testów we wczesnych stadiach róŜnych chorób jest na ogół mniejsza niŜ w stadiach, kiedy choroba jest juŜ w pełni rozwinięta. * Ten akapit jest skróconą wersją artykułu napisanego przez Krieg A.F., Gambino R., Galen R.S.: Why are dinical laboratory tests perfonned? When are they valid. JAMA 1975, 233, 76. Przedruk z Journal of the American Medical Association. Copyright 1975. American Medical Association. Patrz równieŜ: Galen R.S., Gambino S.R.: Beyond Normality: The Predictive Value and Efficiency of Medical Diagnosis, Wiley, 1975.

912 / DODATEK

Swoistość oznacza odsetek ujemnych wyników określonego testu wśród populacji nie cierpiącej na określoną chorobę. I tak np. test na fenyloketonurię jest wysoce swoisty, bowiem aŜ 99,9% zdrowych osób wykazuje wynik ujemny. W odróŜnieniu od tego testu test na CEA (w celu wykrycia raka okręŜnicy) wykazuje zmienną swoistość, mianowicie 3% osób niepalących wykazuje fałszywie dodatni wynik (swoistość testu wynosi 97%), podczas gdy aŜ u 20% palaczy stwierdza się fałszywie dodatni test (swoistość testu wynosi więc tylko 80%). Innym przykładem zmiany swoistości testu indukowanej lekami lub ciąŜą jest występowanie podwyŜszonego stęŜenia tyroksyny całkowitej w surowicy (podobnego do występującego w nadczynności tarczycy) u kobiet cięŜarnych lub zaŜywających doustne leki antykoncepcyjne, pomimo obecności eutyreozy. U takich chorych swoistość tego testu jest bardzo niska, w porównaniu do swoistości tego samego testu dla populacji kobiet niecięŜarnych lub nie zaŜywających doustnych leków antykoncepcyjnych. Wartość przepowiadająca dodatniego testu określa odsetek prawdziwie dodatnich wyników w stosunku do sumy prawdziwie dodatnich wyników i fałszywie dodatnich wyników (inaczej mówiąc wartość ta określa prawdopodobieństwo występowania choroby, jeśli test wypada dodatnio) — patrz niŜej wzór. Wartość ta jest ściśle związana z częstością występowania choroby. W grupie chorych przebywających na oddziale urologicznym częstość występowania choroby nerek jest większa niŜ w ogólnej populacji, przez co stęŜenie kreatyniny w surowicy będzie miało większą wartość przepowiadającą dla wymienionej grupy chorych niŜ dla ogólnej populacji. Definicje wyraŜono wzorami: Wyniki prawdziwie dodatnie 'Wyniki fałszywie ujemne e+ Wyniki fałszywie dodatnie Wartość przepowiadająca Wyniki prawdziwie dodatnie Wyniki prawdziwie dodatnie ł Wyniki fałszywia dodatnie

Przed zleceniem wykonania testu naleŜy się zastanowić, czy jego czułość, swoistość oraz wartość przepowiadająca są wystarczające, by dostarczyć uŜytecznej informacji. Pod pojęciem

„informacja uŜyteczna" naleŜy rozumieć, Ŝe wynik testu ma wpływ na rozpoznanie, rokowanie lub leczenie, przyczynia się do lepszego zrozumienia procesu chorobowego oraz chory odnosi inną korzyść z wykonania takiego testu. Jednostki Sl {układ międzynarodowych jednostek — Systeme International d'Unites) Międzynarodowa organizacja, określona ja* ko „Ogólna Konferencja Wag i Miar" (Generał Conference of Weights and Measures) opracowała swoisty system miar. Adaptację tego układu zaleciła, tytułem próby, „Komisja Ilości i Jednostek" (Commission on Quantities and Units), będąca Sekcją Chemii Klinicznej Międzynarodowej Unii Chemii Teoretycznej i Stosowanej (Section on Clinical Chemistry, International Union of Pure and Applied Chemistry). Jednostki SI uŜywane są w kilku krajach Europy i naleŜy się liczyć z całkowitym przechodzeniem na ten układ, jeśli okaŜe się, Ŝe jest uŜyteczny w rozumieniu mechanizmów fizjologicznych. Dla uŜytku klinicznego wybrano 8 mierealnych własności materii. Są nimi: długość — jednostką długości jest metr (m), masa — jednostką masy jest kilogram (kg), ilość substancji —jednostką ilości substancji jest mol (mol), czas — jednostką czasu jest sekunda (s), temperatura — jednostką temperatury jest Kelvin (K), natęŜenie prądu elektrycznego — jednostką jest amper (A), natęŜenie światła — jednostką światła jest kandela (cd), aktywność enzymatyczna —jednostką aktywności jest katal (kat) (w nawiasach podano autoryzowane skróty dla podanych jednostek). Pochodnymi wymieni o nych* własności są: stęŜenie masy: kilogram/1 (kg/l), ułamek (frakcja) masy: kilogram/kilogram (kg/kg), ułamek (frakcja) objętości: litr/litr (1/1), objętość: metr sześcienny (m3), dla potrzeb klinicznych jednostką objętości jest litr (1), stęŜenie substancji: mol/litr (mol/l), molalność: mol/kilogram (mol/kg), ułamek (frakcja) mola: mol/mol (mol/mol), ciśnienie: paskal (Pa) = niuton/m2

DODATEK / 913

Nazwy i symbole dla wielokrotności liczby 10: Liczba Nazwa 10" tera giga 109 mega I O6 IO3 kilo hekto IO2 10' deka io-12 decy 10" centy 10"3 mili io-6 mikro io-» nano piko femto 10" atto

Symbol T G Vi

k h da d

c

m

u n P f

a

Określenie „na", na przykład „na sekundę", pisze się często uŜywając ujemnego wykładnika. Tak wiec zamiast „na sekundę" pisze się ■ 8 1, zamiast „na metr kwadratowy" —■ • mr1, zamiast „na kilogram" — ■ kg"1. Przykład: cm/s = cm • s~1; g/m2 = g ■ m~2 itd. Przewidując, Ŝe układ SI zostanie zaakceptowany w USA w następnych kilku latach, w dalszej części niniejszego rozdziału wartości prawidłowe dla poszczególnych parametrów podSno zarówno w jednostkach układu SI, jak i tradycyjnych (w nawiasach). Wartości normalne dla rutynowo oznaczonych parametrów biochemicznych* Czytelnik powinien zasięgnąć konsultacji szpitalnego laboratorium biochemicznego, celem uzyskania informacji dotyczących zaleceń jakie naleŜy realizować przy pobieraniu próbek krwi !ub zbieraniu moczu przeznaczonych do badań biochemicznych (naleŜy dowiedzieć się, czy do badań potrzebna jest krew całkowita, osocze, surowica lub jakiego antykoagulantu naleŜy uŜywać itd.). Albuminy Patrz Białka

* Wartości podane w tym podrozdziale wzięto z wielu źródeł. Mogą one ulec zmianie w zaleŜności od uŜytej metody analitycznej i pracowni wykonującej dane oznaczenie. Biochemia

Aminotransferazy (aktywnodć w surowicy) Normalna aktywność zaleŜna jest od uŜytej meto d y i wyno si d la Asp AT ( AST, SGOT/6—25 IU/1 (przy oznaczeniu w temp. 30°C), 10—40 IU/1 (przy uŜyciu SMA i w temperaturze 37°C) oraz 0—41 IU/1 (przy uŜyciu SMAC i w temp. 37°C). Dla A1AT (ALT, SGPT) normalna aktywność wynosi 3—26 IU/1 (przy oznaczeniu w temp. 30°C) oraz od 0—45 IU/1 (przy uŜyciu SMAC i w temp. 37°C). A. Informacja patofizjologiczna. Aminotransferaza asparaginianowa (AspAT, AST, SGOT) i alaninowa (A1AT, ALT, SGPT) oraz i dehydrogenaza mleczanowa są enzymami śródkomórkowymi uczestniczącymi w przemianie aminokwasów i węglowodanów. DuŜe stęŜenia tych enzymów wystcpuj|"w mięśniach szkieleto wych, wątrobie i mózgu. Wzrost aktywności tych enzymów w surowicy krwi wskazuje na martwicę lub uszkodzenie wymienionych narzą dów. B. Interpretacja 1. Aktywność duŜą stwierdza się w zawa le mięśnia sercowego (głównie Asp AT), ostrym zakaźnym (wirusowym) zapaleniu wątroby (głównie A1AT), w marskości wątroby (wzrost AspAT jest zwykle wyŜszy niŜ AJAT) oraz w pierwotnym lub przerzutowym nowotworze wątroby. Wysoką aktywność stwierdza się rów nieŜ w wysiękach jam surowiczych o etiologii nowotworowej. Wzrost aktywności AspAT stwierdza się równieŜ w dystrofiach mięśni, w zapaleniu skóry i mięśni (dermatomyositis) oraz w mioglobimirii napadowej. 2. Małą aktywność aminotransferaz stwierdza się w niedoborze witaminy B6 (spowo dowanym powtarzanymi hemodializami), w niewydolności nerek i w ciąŜy. Amoniak (stęŜenie we krwi) Wartości prawidłowe (określone metodą Conwaya) dla krwi całkowitej: 5,9—65 umol/1 (10—UOug/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Amoniak obecny we krwi pochodzi z dwóch głównych źródeł: 1) w jelicie grubym w następstwie działania gnilnego bakterii na podłoŜa azotowe uwolnione zostają znaczne ilości amoniaku; 2) w procesie przemiany białkowej uwalnia się amoniak. Amoniak dostający się do krąŜenia wrotnego lub systemowego ulega szybkiej konwersji do mocznika w wątrobie. W niewydolno-

914 / DODATEK

ści wątroby stęŜenie amoniaku we krwi moŜe być wysokie, szczególnie wtedy, kiedy spoŜycie białka jest wysokie lub doszło do krwawienia do światła przewodu pokarmowego. B. Interpretacja. StęŜenie amoniaku we krwi jest wysokie u chorych z niewydolnością wątroby ktb z zespoleniem portokawalnym, szczególnie wtedy, kiedy spoŜycie białka jest wysokie lub doszło do krwawienia do światła przewodu pokarmowego. Amylaza (aktywność w surowicy)

Wartości prawidłowe mogą się wahać w zaleŜności od metody oznaczania enzymu. Wahają się od 0,8 do 3,2 IU/1 (80—180 jednostek Somogyi/dl). Jedna jednostka Somogyi odpowiada ilości enzymu, pod wpływem której powstaje 1 mg cukru redukującego z rozpadu skrobi przy pH 7,2. A. Informacja patofizjologiczna. W wa runkach fizjologicznych w surowicy krwi obec ne są tylko niewielkie ilości amylazy ślinowej i trzustkowej o masie cząsteczkowej ok. 50000. W stanach zapalnych trzustki lub przy zamknię ciu światła dróg trzustkowych znaczne ilości enzymu dostają się do krwi, skąd wydalane są przez nerki, B. Interpretacja

PodwyŜszoną aktywność amylazy stwierdza się w ostrym zapaleniu i w cystach rzekomych trzustki, przy zamknięciu przewo dów trzustkowych przez nowotwór, kamień, zwęŜenie lub skurcz zwieracza (wywołany poda niem morfiny) oraz w śwince. Sporadycznie aktywność amylazy moŜe być podwyŜszona w niewydolności nert!łf? kwasicy cukrzycowej i w stanie zapalnym trzustki wywołanym drąŜą cym wrzodem trawiennym Ŝołądka. Bardzo rzadko połączenie się amylazy z immunoglobuliną tworzy kompleks o masie cząsteczkowej przynajmniej 160 000 nie ulegający przesączeniu w kłębuszkach nerkowych. Jest on powodem wzrostu aktywności amylazy we krwi (makroamylazemia). Małą aktywność amylazy w surowicy stwierdza się w ostrym i przewlekłym zapaleniu wątroby w niewydolności trzustki i sporadycz nie w ciąŜy. Amylazę moŜna równieŜ określić w moczu. Jej aktywność w moczu wzrasta w tych samych stanach chorobowych, w których stwierdza się wzrost aktywności tego enzymu w surowicy krwi.

Azot mocznikowy i mocznik, stęŜenie we krwi, osoczu lub surowicy

Wartości prawidłowe: azot mocznikowy we krwi 2,9—8,9 mmol/I (8—25 mg/dl), mocznik we krwi 3,5—9 mmoi/l (21 -53 mg/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Mo cznik, jako produkt końcowy przemiany biał kowej, jest wydalany przez nerki. StęŜenie mo cznika w przesączu kłębuszkowym jest takie samo jak w osoczu krwi. Wchłanianie zwrotne mocznika w kanalikach nerkowych jest odwrot nie proporcjonalne do ilości wypływającego moczu. Ten fakt sprawia, Ŝe mocznik jest mniej uŜytecznym wskaźnikiem przesączania kłębuszkowego od kreatyniny, która nie ulega reabsorpcji w kanalikach nerkowych. StęŜenie azotu mocznikowego we krwi jest proporcjonalne do ilości spoŜytego białka i odwrotnie proporcjo nalne do jego wydalania z moczem. B. Interpretacja

1. Wzrost stęŜenia azotu mocznikowego stwierdza się: a. w niewydolności nerek spowodowanej ostrym lub przewlekłym stanem zapalnym, ostrą niezapalną niewydolnością (martwica ka nalików nerkowych) lub obstrukcją dróg mo czowych. b. w stanach wzmoŜonej przemiany azoto wej, której towarzyszy spadek ukrwienia i nie wydolność wydalnicza nerek (stany odwodnie nia, krwawienia do światła przewodu pokar mowego — w tym ostatnim przypadku mamy do czynienia ze wzrostem wchłaniania amino kwasów pochodzących ze strawionych białek krwi oraz z hipoperfuzją nerek). c. w stanach chorobowych przebiegających ze spadkiem ukrwienia nerek (wstrząs, niewy dolność nadnerczy i czasami niewydolność zastoinowa serca). 2. Małe stęŜenia azotu mocznikowego stwierdza się w niewydolności wątroby, nerczycy niepowikłanej niewydolnością nerek oraz w wyniszczeniu (kacheksji). i

Białka (stęŜenie w surowicy lub osoczu) w tym równieŜ fibrynogen

Wartości prawidłowe: p. niŜej — Interpretacja.

A. Informacja patofizjologiczna. StęŜenie białka determinuje ciśnienie koloidowo-osmotyczne (onkotyczne) osocza. StęŜenie białka w osoczu zaleŜne jest od stanu odŜywiania, czynności wątroby i nerek, występowania chorób, takich jak szpiczak lub wady metaboliczne.

DODATEK / 915

Zmiany stęŜenia poszczególnych frakcji białkowych mogą być swoiste dla określonych chorób. B. Interpretacja

1. Całkowite stęŜenie białka w surowicy. Wartości normalne 60—80 g/l (6—8 g/dl). StęŜenie frakcji albumin i globulinowych - patrz niŜej i tab. 1.

Tabela 3. Niektóre białka występujące w poszczególnych frakcjach elektroforeiycznych globulin Frakcja globulin

Białka zawarte w danej frakcji

«1

Globuliny wiąŜące tyroksyne, transkortyna, glikoproteina, lipoproteina, antytrypsyna Haptoglobina, glikoproteina, makroglobulina, ceruloplazmina Transferyna, lipoproteina, giikoproteina yG, yD, yM, yE, yA

a2P '■!

Tabela 1. Frakcje elelftroloretyczne białek surowicy krwi ■

ra °'

a

Albuminy a,-Globuliny ctj-Gtobuliny P-Globuliny y-Globuliny

StęŜanie wyraŜone w % całkowitego stęŜenia białka 52-68 2,4-4,4 6,1-10,1 8,5-14,5 10-21

2. StęŜenie albumin w surowicy lub osoczu .Wartości prawidłowe: 33—55 g/l (3,3—5,5 g/dl). a. Wzrost stęŜenia albumin stwierdza się w stanach odwodnienia, we wstrząsie, w sta nach przebiegających z zagęszczeniem krwi oraz po doŜylnym podaniu stęŜonych roztworów albumin. b. ObniŜone stęŜenie albumin występuje w stanach wadliwego Ŝywienia, w zespole wad liwego wchłaniania, w ostrym lub przewlekłym zapaleniu kłebuszków nerkowych, w zespole nerczycowym, w ostrej lub przewlekłej niewy dolności wątroby, w chorobach nowotworo wych i białaczkach. 3. StęŜenie globulin w surowicy lub osoczu krwi. Wartości prawidłowe 20—36 g/l {2—3,6 g/dl) — p. tab. 2, 3.

a. StęŜenia podwyŜszone stwierdza się w chorobach wątroby (wirusowe zapalenie wątroby, marskość zanikowa lub Ŝółciowa wątroby, hemochromatoza), toczniu trzewnym, szpiczaku, chorobach limfoproliferacyjnych, sarko-

idozie, w ostrych i przewlekłych chorobach zakaźnych, szczególnie w ziarnicy wenerycznej pachwin, tyfusie, leiszni^niozie, schistosomatozie i malarii.

b. ObniŜone stęŜenie globulin stwierdza się w stanach wadliwego odŜywiania, w agammaglobulinemii wrodzonej, hipogammaglobulinemii nabytej i w białaczce limfatycznej.

4. StęŜenie f ibrynogenu w osoczu. Wartości normalne: 2—6 g/l (= 0,2—0,6 g/dl). a. WzmoŜone stęŜenia fibrynogenu wy stępuj ą w zapaleniu kłebuszków nerek, nerczycy (czasami) oraz chorobach zakaźnych. b. ObniŜone stęŜenia fibrynogenu stwier dza sie w rozlanym wykrzepianiu śródnaczyniowym—DIC (moŜe wystąpić przy odklejeniu się łoŜyska, w zatorach spowodowanych płynem owodniowym, w przerzutach rakowych gruczo łu krokowego lub innych narządów, w białacz ce), w ostrej i przewlekłej niewydolności wątro by oraz we wrodzonej fibrynogenopenii. Bilirubina (stęŜenie w surowicy) Wartości prawidłowe: bilirubina całkowita 3,5—20,4 umol/1 (0,2—1,2 mg/dl). Bilirubina sprzęŜona (glukuronidy bilirubiny) 1,7—6,8 umol/1 (0,1—-0,4 mg/dl), bilirubina wolna (nie sprzęŜona z kwasem glukuronowym 3,4—11,9 umol/1 (0,2—0,7 mg/dl).

A. Informacja patofizjologiczna. BiliTabela 2. StęŜenie immunoglobulin oznaczone metodą immunoelektroforezy IgA

0,9-4,5 g/l (90-450 mg/dl)

IgG

7,0-15 g/l (700-1500 mg/dl)

IgM

0,4-2,5 g/1 (40-250 mg/dl)

IgD

0,003-0,4 g/l (0,3-40 mg/dl)

IgE

0,00006-0,0016 g/l (0,006-0,16 mg/dl)

rubina, powstająca z rozkładu hemoglobiny, ulega w wątrobie sprzęŜeniu z kwasem glukuronowym tworząc diglukuronid. Ten ostatni ulega wydalaniu z Ŝółcią. StęŜenie bilirubiny w surowicy wzrasta w niewydolności wątroby, przy obstrukcji dróg Ŝółciowych oraz w razie wystąpienia znacznej hemolizy krwinek czerwonych. Tylko rzadko przyczyną hiperbilirubinemii są anomalie enzymów uczestniczących

916 / DODATEK

w przemianie bilirubiny (np. transferaza glukuronylowa). B. Interpretacja 1. StęŜenie bilirubiny bezpośredniej (sprzęŜo nej) i pośredniej (wolnej, niesprzęŜonej) wzrasta w ostrym i przewlekłym zapaleniu wątroby, w razie zamknięcia światła dróg Ŝółciowych (przewodzików Ŝółciowych, przewodu wątro bowego lub Ŝółciowego wspólnego), w następst wie reakcji toksycznych spowodowanych leka mi, chemikaliami lub toksynami oraz w ze społach Dubina-Johnsona i Rotora. 2. StęŜenie bilirubiny pośredniej wzrasta w niedokrwistościacb bemolitycznych lub w na stępstwie reakcji hemol i tycznych, przy braku lub niedoborze transferazy glukuronylowej wy stępującej w chorobie Gilberta lub w zespole Criglera-Najjara. 3. StęŜenie zarówno bilirubiny bezpośredniej, jak i całkowitej moŜe znacznie wzrosnąć u osób zdrowych i chorych na Ŝółtaczkę w następstwie głodzenia przez 24—48 godzin (czasami nawet tylko przez 12 godzin) lub długotrwałego gło dzenia kalorycznego. Ceruloplazmina i miedź (w surowicy krwi) Wartości prawidłowe: ceruloplazmina 1,7—2,9 umol/1 f25—43 mg/dl); miedź 16—31 umol/1 (100—200 ng/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Oko ło 5% miedzi występującej w surowicy związane jest luźno z albuminami, zaś 95% z ceruloplazminą. Ta ostatnia jest oksydazą o zabarwieniu niebieskim, występującą w frakcji a2-globulin. W chorobie Wilsona stęŜenie miedzi i aktyw ność ceruloplazminy^w surowicy są małe, natomiast wydalanie miedzi z moczem wyso kie. B. Interpretacja 1. Wzrost aktywności ceruioplazminy i stęŜenia miedzi w surowicy krwi stwierdza się w ciąŜy, nadczynności tarczycy, infekcjach, niedokrwistości aplastycznej, ostrej białaczce, chorobie Hodgkina, marskości wątroby oraz u kobiet zaŜywających doustne leki antykoncepcyjne.

2- ObniŜenie aktywności ceruloplazminy i stęŜenia miedzi w surowicy stwierdza się w chorobie Wilsona (towarzyszy jej wzmoŜone wydalanie miedzi z moczem), w zespole wadliwego wchłaniania i w nerczycy oraz w niedoborze miedzi, spowodowanyTm całkowitym odŜywianiem pozajelitowym.

Chlorki (stęŜenie w surowicy lub osoczu) Wartości prawidłowe: 96—106 mmol/l. A. Informacja patofizjologiczna. Cl jest głównym nieorganicznym anionem płynu pozakomórkowego. Odgrywa waŜną rolę w utrzymywaniu równowagi kwasowo-zasadowej, chociaŜ nie wykazuje własności buforujących. Przy utracie chlorków pod postacią HC1 lub NH4C1 rozwija się zasadowica, natomiast przy zatrzymywaniu Cl" w ustroju lub jego podaniu powstaje kwasica. Chlorki (wraz z sodem) odgrywają waŜną roJę w regulacji osmolainości (molalności) płynów ustrojowych. B. Interpretacja Hiperchloremię stwierdza się w niewy dolności nerek (jeŜeli spoŜywanie Cl przekracza jego wydalanie), w nerczycy (czasami), kwasicy kanalikowej, w nadczynności przytarczyc (cza sami), zespoleniu moczowodowo-esiczym (do chodzi do wchłaniania przez jelito chlorków zawartych w moczu), odwodnieniu (w niedobo rze wody) oraz nadmiernym podawaniu roz tworu soli Fizjologicznej, Hipochloremia występuje przy utracie soku Ŝołądkowego i jelitowego (wymioty, bie gunki, odsysanie soku Ŝołądkowego lub jelito wego), w niewydolności nerek (utrata Cl ~ przez nerki), przy nadmiernym stosowaniu diuretyków, w przewlekłej kwasicy oddechowej (spo wodowanej rozedmą płuc), kwasicy cukrzyco wej, przy nadmiernym poceniu się, w niewydol ności nadnerczy (dochodzi do utraty NaCl przez nerki), nadczynności kory nadnerczy (wy wołującej przewlekłą utratę K"*) oraz w zasadowicy metabolicznej (spowodowanej zaŜywa niem NaHCOj lub niedoborem K+). Cholesterol (stęŜenie w surowicy lub osoczu) Wartości prawidłowe: 3,9—7,2 mmol/l ( = 150—280 mg/dl), p. tab. 4. A. Informacja patofizjologiczna. Stę Ŝenie cholesterolu w surowicy krwi zaleŜy od wielu procesów metabolicznych, zaleŜnych od czynników genetycznych, Ŝywienia, czynności narządów wewnątrzwydzielniczych oraz integ ralności czynnościowej Ŝyciowo waŜnych narzą dów takich jak wątroba i nerki. Przemiana cholesterolu jest ściśle związana z przemianą iipidów. B. Interpretacja 1. Wzrost stęŜania cholesterolu w surowicy krwi stwierdza się w hipercholesterolemii

DODATEK / 917 Tabela 4. StęŜenie w surowicy krwi cholesterolu całkowitego (C), tri gliceryd ów (TG), cholesterolu frakcji LDL (lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL-C) i HDL (lipoproteiny o wysokiej gęstości) (HDL-C) w populacji USA* C mmol/l HDL-C Wiek TG LDL-C (mg/dl) mmol/l (mg/dl) mmol/l (mg/dl) g/i górna granica kobiety męŜczyźni (mg/dl) wartości prawidłowych <29

30-39 40-49 >49

3,1,0-6,20 (120-240) 3,62-6,98 (140-270)

0,1-1,4 (10-140) 0,1-1,4 (10-150)

4,40 (170) 4.91 (190)

3,88-8,01 (150-310) 4,13-8,53 (160-330)

0,1-1,6 (10-160) 0,1-16 (10-190)

4,91 (190) 5,43 (210)

1,16+0,31 (45 + 12)

1,42+0,31 (55±12)

vi,

Według Krupp i wsp.: Physician's Handbook. Wyd. 21, Lange, 1985, za zezwoleniem

rodzinnej (xanthomatosis), niedoczynności tarczycy, słabo wyrównanej cukrzycy, zespole nerczycowym, przewlekłym zapaleniu wątroby, marskości Ŝółciowej wątroby, Ŝółtaczce zastoinowej, hipoproteinemii (samoistnej, lub spowodowanej zespołem nerczycowym względnie przewlekłym zapaleniem wątroby) i w biperlipidemii (samoistnej; rodzinnej). 2. Spadek stęŜenia cholesterolu w surowicy krwi stwierdza się w ostrym zapaleniu wątroby i w chorobie Gauchera, MoŜe równieŜ występowaów nadczynności tarczycy, w ostrych infekcjach, niedokrwistości, wadliwym odŜywianiu się oraz w niedoborze apolipoproteiny. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) w surowicy, w płynach surowiczych, płynie mózgowo-rdzeniowym lub moczu Wartości prawidłowe mogą być róŜne zaleŜnie od metod oznaczania. Surowica; 55—140 IU/1 (aktywność oznaczona w temp. 3Q!1C), 100—225 IU/1 (aktywność oznaczona przy uŜyciu SMA w temp. 3TC) lub 60—200 IU/J (aktywność oznaczona przy uŜyciu SMAC w temp, 37°C). Płyn z jam surowiczych: aktywność jest mniejsza niŜ w surowicy. Płyn mózgowo-rdzeniowy; 15—73 jednostek (wg Wróblewskiego) lub 6,3—30 IU/1. Mocz: aktywność jest mniejsza niŜ 8300 jednostek/8 godzin (Wróblewski).

A. Informacja patofizjologiczna. LDH katalizuje konwersję mleczanu do pirogronianu

(w obecności NAD+) i odwrotnie pirogronianu do mleczanu (w obecności NADH). Jest enzymem występującym we wszystkich komórkach i płynach ustrojowych. B. Interpretacja Aktywność LDH wzrasta we wszystkich stanach chorobowych przebiegających z martwicą tkanek, w tym szczególnie w ostrym uszkodzeniu mięśnia sercowego, krwinek czerwonych, nerek, mięśni szkieletowych, wątroby, płuc i skóry. Znaczne wzrosty aktywności LDH obserwuje się w niedokrwistościach hemolitycznych, w niedokrwistościach spowodowanych niedoborem witaminy B: 2 lub kwasu foliowego oraz w policytemii prawdziwej. Wzrost aktywności LDH w pierwszych 3—4 dniach z następczym spadkiem w kolejnych 5—7 dniach choroby moŜe być dowodem potwierdzającym rozpoznanie zawaha serca po uprzednim wykluczeniu zawału płuc, choroby nowotworowej i niedokrwistości megalobiastycznej. ChociaŜ aktywność LDH jest podwyŜszona w ostrej fazie zakaźnego (wirusowego) zapalenia wątroby, w zapaleniu przewlekrym tego narządu jest tylko rzadko duŜa. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) — izoenzymy (aktywność w surowicy) Wartości prawidłowe: p. tab. 5 A. Informacja patofizjologiczna. LDH surowicy składa się z 5 izoenzymów będących tetramerami złoŜonymi z dwóch rodzajów podjednostek - H i M. Poszczególne izoenzymy

918 / DODATEK Tabela 5. Izoenzymydehydrogenazy mleczanowej (LDH). Rozdział elektroforetyczny Udział procentowy w Izoenzym

ogólnej aktywności

LDH surowicy (w nawiasach podano zakres wahań) Najszybcie j wędrujący

Najwolniej wędrujący

28 (15-30) 2(a2)

3(P)

36 (22-55) 23 (15-30)

4(Ti) 5(TI)

6 (0-15) 6 (0-15)

róŜnią się między sobą kinetyką enzymatyczną, ruchliwością elektroforetyczną, chromatograficznie i immunologicznie. Przy rozdziale elektroforetycznym ww. izoenzymy wykazują ruchliwość globulin a]S a2, |3, y1 i y2. Izoenzymy LDH oznacza się zwykle liczbami 1 fizoenzym 0 największej ruchliwości elektroforetycznej) 2, 3, 4 i 5 (izoenzym o najmniejszej ruchliwości elektroforę ty cznej). Izoenzym LDH-1 występu je w duŜym stęŜeniu w mięśniu sercowym (jest to tetramer HHHH), w krwinkach czerwonych 1 korze nerek, zaś izoenzym LDH-5 w mięśniach szkieletowych (jest to tetramer MMMM) i wąt robie. B. Interpretacja. W zawale serca izoenzymy wędrujące z globulinami a są podwyŜszone, szczególnie izoenzym LDH-1, co sprawia, Ŝe iloraz LDH-l/LDH-2 jest wyŜszy od jedności. Podobny wzrost tego izoenzymu obserwuje się w zawale kory nerek oraz w niedokrwistościach hemolitycznych. Względny wzrost aktywności izoenzymów LDH-5 i LDH-4 stwierdza się w ostrym zapaleniu wątroby, w ostrym uszkodzeniu mięśni szkieletowych, w zapaleniu skóry i mięśni (dermatomyositis) oraz w dystrofiach mięśniowych. Fibrynogen Patrz Białka Fosfataza kwaśna (FK) Wartości prawidłowe mogą się róŜnić w zaleŜności od metody oznaczania enzymu. Normalna aktywność wynosi 36—175 nmol/s/1 lub 0,1—0,63 jednostek Sigma.

A. Informacja patofizjólogiczna. Fosfatazy aktywne przy pH 4,9 występują w duŜych

stęŜeniach w gruczole krokowym, krwinkach czerwonych, płytkach krwi, w komórkach siateczko wo-śród błonko wy ch, wątrobie, śledzionie i nerkach. Wiele izoenzymów FK stwierdzono w wymienionych narządach, komórkach i w surowicy, wykazujących róŜną, aktywność wobec róŜnych sub strato w. B. Interpretacja. U chorych z rakiem sterczą aktywność frakcji sterczowej fosfatazy kwaśnej w surowicy moŜe być podwyŜszona, szczególnie wtedy, kiedy nowotwór sięga poza torebkę gruczołu lub występują przerzuty. Obmacywanie sterczą moŜe być równieŜ przyczyną wzrostu (chociaŜ przejściowego) aktywności FK w surowicy. Wzrost całkowitej aktywności FK w surowicy stwierdza sie w chorobie Gauchera, w guzach złośliwych kości, w chorobach nerek, miąŜszu wątrobowego i dróg Ŝółciowych, układu siateczkowo-śródbłonkowego oraz w chorobach zakrzepowo-zatorowych. Gorączka moŜe być przyczyną rzekomego wzrostu FK. Fosfataza zasadowa (FZ) (aktywność w surowicy) Wartości prawidłowe zaieŜne są od metody uŜytej do oznaczania tego enzymu. Przy uŜyciu metody Besseya-Lowryłego u dzieci wartości prawidłowe wynoszą 2,8—6,7 jednostek, natomiast u dorosłych 0,8—2,3 jednostek. Przy uŜyciu metody Kinga-Armstronga prawidłowa aktywność FZ oznaczona w temp. 30°C wynosi 24—71 IU/1 (5—13 jednostek tradycyjnych, przy uŜyciu SMA i przy temp. 37°C — 30-85 IU/1, zaś przy uŜyciu SMAC i przy temp. 37°C — 30—115 IU/1. A. Informacja patofizjólogiczna. FZ obecna jest w duŜych stęŜeniach w kościach, Ŝółci i łoŜysku. Występująca we krwi FZ jest mieszaniną izoenzymów, dotychczas bliŜej nie poznanych. MoŜna je rozdzielić elektroforetycznie. Izoenzym wątrobowy FZ wędruje szyb ciej niŜ izoenzym kostny i łoŜyskowy. Te dwa ostatnie wykazują taką samą ruchliwość elektroforetyczną. B. Interpretacja PodwyŜszoną aktywność FZ stwierdza się: a. U dzieci (w okresie wzrostu kości), b. W chorobach kości przebiegających ze wzmoŜoną aktywnością osteoblastów (nadczynność przytarczyc, krzywica u dzieci i osteomalacja u dorosłych, nowotworowe choroby kości, takie jak: pierwotny mięsak kości lub przerzuty nowotworowe do kości, choroba Pa-

DODATEK / 919

geta, sarkoidoza Boecka i zwapnienia pozakostne występujące np. w myositis ossificans). c. W obturacji dróg Ŝółciowych spowodowa nej kamicą, zwęŜeniem lub nowotworem. d. W polekowym uszkodzeniu wątroby wy wołanym chloropromazyną Jub metylotestosteronem oraz e. W ciąŜy. 2. ObniŜoną aktywność FZ w surowicy obserwuje się w niedpczynności tarczycy oraz u dzieci z opóźnionym wzrostem. Fosfokinaza krsatynowa (CPK, CK) (aktywność w surowicy) Wartości prawidłowe zaleŜne są od metody oznaczania CPK i wahają się od 10 do 50 IU/1 (przy oznaczaniu enzymu w temp. 37°C). B. Informacja patofizjologiczna. CPK katalizuje rozpad fosfokreatyny w obecności ADP. Produktami tej reakcji są kreatyna i ATP. Mięśnie szkieletowe i mięsień sercowy oraz mózg są bogate w CPK. B. Interpretacja WzmoŜoną aktywność enzymu stwier dza się w uszkodzeniach mięśni, np. w zawale serca, w urazach mięśni, w dystrofiach mięśni, w zapaleniu wielomięśniowym {połymyositiś) i po cięŜkich ćwiczeniach fizycznych (jogging), w niedoczynności tarczycy i zawale mózgu. Po wystąpieniu zawału serca obserwuje się szybki wzrost aktywności CPK (3—5 godzin od po czątku zawału) utrzymujący się przez okres krótszy (2—3 dni) niŜ wzrost AspAT lub LDH. NiepodwyŜszoną a ktywność CPK stwierdza się w zawale płuc i chorobach miąŜszu wątrobowego. Fosfokinaza kreatynowa — izoenzymy (aktywność w surowicy) Patrz tab. 6. A. Informacja patofizjologiczna. Obec na w surowicy krwi CPK składa się z trzech izoenzymów dających się rozdzielić elektroforetycznie. Mięśnie szkieletowe charakteryzują się izoenzymem MM, mięsień sercowy — izoenzymem MB, zaś mózg izoenzymem BB. B. Interpretacja. Wzrost aktywności izoenzymu CPK-MM stwierdza się w urazach mięśni szkieletowych przy uszkodzeniu mięśnia sercowego lub mózgu, w chorobach mięśni (dystrofia mięśni, niedoczynność tarczycy, za palenie skóry i mięśni, zapalenie wielomięśniowe) oraz w rabdomiolizie lub po cięŜkich ćwiczeniach gimnastycznych. Wzrost aktywno-

Tabeta 6. Izoenzymy kinazy fosfokreatynowej (określone e lekt rof o rety cz n i e) Normalna aktywność Izoenzym wyraŜona jako % aktywności ogólnej CPK (CK) w surowicy Frakcja najszybciej wędrująca Frakcja 1,BB Frakcja 2,MB Najwolniej wędrująca frakcja Frakcja 3,MM

0 0-3 97-100

ści izoenzymu CPK-MB obserwuje się w 2—4 godzin po wystąpieniu zawału mięśnia sercowego. Wzrost taki utrzymuje się do 72 godzin i moŜe się wydłuŜyć w razie rozszerzenia się strefy martwiczej mięśnia sercowego. Wzrost aktywności tego izoenzymu stwierdza się teŜ w rozległej rabdomiolizie lub po urazach mięśni szkieletowych, w cięŜkich chorobach mięśni, w zespole Reye'a i gorączce gór skalistych. Aktywność izoenzymu CPK-BB jest czasami podwyŜszona we wstrząsie, w niektórych rodzajach raków (szczególnie w raku owsianokomórkowym, raku jajników, piersi i gruczołu krokowego) oraz w zarośnięciu dróg Ŝółciowych. Fosfor nieorganiczny (stęŜenia w surowicy krwi) Wartości prawidłowe: u dzieci 1,3—2,3 mmol/1 (4,7 mg/dl), u dorosłych 1—1,5 mmol/1 (3—4,5 mg/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Na stęŜenie fosforu nieorganicznego w surowicy krwi wpływ mają: paraihormon, witamina D i jej aktywne metabolity, wchłanianie fosforanów w jelitach, czynność wydainicza nerek, przemiana kostna i Ŝywienie. B. Interpretacja Wzrost stęŜenia fosforu nieorganicz nego stwierdza się w niewydolności nerek, nie doczynności przytarczyc i hiperwitaminozie D. Małe stęŜenie fosforanów nieorganicz nych w surowicy stwierdza się w nadczynności przytarczyc, hipowitaminózie D (krzywica, osteomalacja) i w zespole wadliwego wchłaniania (biegunki), przy zaŜywaniu związków wiąŜą cych fosforany w przewodzie pokarmowym (wodorotlenek glinu), przy głodzeniu, w krań cowym wyniszczeniu, w przewlekłym alkoholiz mie (szczególnie przebiegającym z uszkodzę-

920 / DODATEK

niem miąŜszu wątrobowego), w hiperalimentacji z uŜyciem płynów bez- lub ubogofosforanowych, przy doŜylnym podawaniu duŜych ilości węglowodanów, w tubulopatiach nerkowych, przy stosowaniu diuretyków tiazydowych, w zaburzeniach gospodarki kwasowo-zasadowej {w kwasicy cukrzycowej ketonowej szczególnie w okresie jej cofania się) oraz w hipofosfatemii genetycznie uwarunkowanej. Czasami hipofosfatemię stwierdza się w ciąŜy i w niedoczynności tarczycy. Globulina wiąŜąca tyroksynę (TBG) (stęŜenie w surowicy)

Wartości prawidłowe (określone metodą radio immunologiczną): 0,02—0,048 g/l (2—4.8 mg/di). A. Informacja patofizjologiczna. TBG

jest głównym białkiem transportowym T4 i T3 w osoczu krwi. Zmianom stęŜenia TBG towarzyszą równolegle zmiany stęŜenia wolnej tyroksyny, tak Ŝe stęŜenia tej ostatniej są odpowiednie do stanu fizjologicznego ustroju, co zapewnia stan eutyreozy. Wrodzone anomalie w zakresie TBG dziedziczą się najpewniej genem na chromosomie X. B. Interpretacja

DuŜe stęŜenie TBG występuje w ciąŜy, w zakaźnym (wirusowym) zapaleniu wątroby i we wrodzonym wzroście stęŜenia tego białka. ObniŜone stęŜenie TBG stwierdza się w stanach chorobowych przebiegających z nis kim stęŜeniem białek (globulin) w surowicy (zespół nerczycowy, marskość wątroby), w ak tywnej akromegalii, w niedoborze estrogenów oraz we wrodzonym<wjedoborze TBG. Glukoza (stęŜenie w surowicy lub osoczu krwi)

Wartości prawidłowe oznaczone na czczo: 3,6—6,1 mmol/1 (65—111 mg/dl). Wartości te dotyczą glukozy „prawdziwej1" oznaczonej swoistą metodą enzymatyczną. A. Informacja patof izjologiczna. W wa runkach prawidłowych stęŜenie glukozy w su rowicy jest dokładnie regulowane tak, by była ona dostępna tkankom jako źródło energii oraz by nie uległa wydalaniu z moczem. Zarów no hiper-, jak i hipoglikemia są nieswoistymi objawami zaburzonej przemiany węglowoda nowej. B. Interpretacja

1. Hiperglikemie stwierdza się w cukrzycy, nad czynności tarczycy, w nadczynności

przysadki mózgowej w zakresie sekrecji ACTH i hormonu wzrostu i w nadczynności glukokortykoidowej. Mniej regularnie wzrost stęŜenia glukozy we krwi obserwuje się w guzie chromochłonnym, w nadczynności mineralokortykotdowej i w chorobach wątroby, 2. Hipoglikemia występuje w hiperinsulinizmie, niewydolności nadnerczy i przysadki gruczołowej oraz w niewydolności miąŜszu wątrobowego (w ostrym Ŝółtym zaniku wątroby). MoŜe ona mieć równieŜ charakter czynnościowy (reaktywny) lub być spowodowana lekami o działaniu hipoglikemicznym. Immunoglobuliny

Patrz Białka Kreatyna (dobowe wydalanie z moczem)

Wartości prawidłowe: p. tab. 7. A. Informacja patof izjologiczna. Kre atyna jest waŜnym składnikiem mięśni, mózgu i krwi. Jej pochodna fosforanowa — fosfokreatyna — stanowi związek fosforanowy o wy sokiej energii. W warunkach fizjologicznych ilość wydaJonej z moczem kreatyny jest niewiel ka, wzrasta ona natomiast w stanach wzmoŜo nego katabolizmu ustrojowego oraz w dystrofiach mięśni. B. Interpretacja

Wzrost wydalania kreatyny z moczem stwierdza się w dystrofiach mięśni (np. w po stępującej dystrofii mięśni, miotonii zanikowej, w cięŜkiej miastenii), w zanikach mięśniowych (spowodowanych np. chorobą Heinego i Medina, występujących w stwardnieniu zanikowym bocznym lub zapaleniu mięśni), w głodzeniu i stanach wyniszczenia, w nadczynności tar czycy i chorobach przebiegających z gorączką. Zmniejszone wydalanie kreatyny z moczem obserwuje się w niedoczynności tar czycy, amiotonii wrodzonej i niewydolności nerek. > Kreatynina (stęŜenie w surowicy lub osoczu krwi)

Wartości prawidłowe: 62—132 umol/1 (0,7—1,5 mg/dl). A. Informacja patof izjologiczna. Kreatynina po przesączaniu w klębuszkach nerkowych i wydzielaniu przez kanaliki, nerkowe wydalana jest z moczem. Jej klirens nerkowy jest o ok. 20% wyŜszy od klirensu inuiiny. Klirens kreatyniny jest większy od klirensu

DODATEK / 921 Tabela 7. Dobowe wydalanie z moczem kreatyny i kreatyniny. Wartości'prawidłowe Kreatyna Kreatynina Noworodek

0,034 mmol/kg (4,5 mg/kg)

0,088 mmol/kg (10 mg/kg)

Niemowlęta 1-7 miesięcy

0,061 mmol/kg (8.1 mg/kg)

Dziecko w wieku 2-3 lat 4-4Vs lat

0,060 mmol/kg (7,9 mg/kg) 0,034 mmol/kg (4,5 mg/kg)

0,111 mmol/kg 12,8 mg/kg 0,107 mmot/kg (12,1 mg/kg)

9-9% lat

0,019 mmol/kg (2,5 mg/kg)

0,160 mmol/kg (18,1 mg/kg)

11-14 lat

0,020 mmol/kg (2,7 mg/kg) 0-0,382 mmol (0-50 mg) 0-0,763 mmol (0-100 mg)

0,178 mmol/kg (20,1 mg/kg)

Dorosły męŜczyzna Dorosła kobieta

inulinowego z powodu wydzielania tego metabolitu przez kanaliki nerkowe. NaleŜy wyjaśnić, Ŝe reakcji Jaffego (jest ona najczęściej uŜywana do oznaczania kreatyniny) oznacza się oprócz kreatyniny równieŜ chromogeny nie będące kreatyniną. Te ostatnie nie są jednak wydaJane z moczem, co sprawia, Ŝe ilość kreatyniny wydalanej z moczeni jest przypadkowo o ok. 20% mniejsza od sumy nieswoistych chromogenów i kreatyniny docierających do nerek. W ten sposób kJirens nerkowy kreatyniny i inuiiny są wielkościami porównywalnymi. Dla celów klinicznych khrens nerkowy kreatyniny moŜna przyjąć za miarę wielkości przesączania kłębuszkowego, z wyjątkiem przypadków, w których stwierdza się zaawansowaną niewydolność nerek. W tym ostatnim przypadku kJirens kreatyniny jest wyŜszy od kJirensu inuliny w następstwie wydzielania jej przez kanaliki nerkowe, lnulina jest wydalana przez nerki tylko drogą przesączania kłębuszkowego nawet u chorych z mocznicą. B. Interpretacja. Wzrost kreatyninemii stwierdza się w ostrej i przewlekłej niewydolności nerek, przy obstrukcji dróg moczowych lub w uszkodzeniach nerek spowodowanych niektórymi lekami. Niektóre substancje (acetooctan, aceton, {J-hydroksymaślan, a-ketoglutaran, pirogronian, glukoza, bilirubina, hemoglobina, mocznik i kwas moczowy) mogą reagować z zasadowym roztworem pikrynianu (reak-

0,129 mmol/kg (14,6 mg/kg)

T£221 mmot/kg (25 mg/kg) 0,186 mmol/kg (21 mg/kg)

cja Jaffego) stając się przyczyną fałszywie zawyŜonych stęŜeń kreatyniny. StęŜenia kreatyniny niŜsze niŜ 62 umol/1 (0,7 mg/dl) nie mają Ŝadnego znaczenia. Kreatynina (wydalanie z moczem) Patrz tab. 7. Kwas moczowy (stęŜenie w surowicy i w osoczu) Wartości prawidłowe: męŜczyźni —180—539 umol/1 (3—9 mg/dl), kobiety — 150-450 nmoi/1 (2,5—7,5 mg/dl). A. Informacja patoftzjofogiczna. Kwas moczowy, jako produkt końcowy przemiany purynowej, wydalany jest przez nerki. Dna jest defektem metabolicznym uwarunkowanym ge netycznie, charakteryzującym się podwyŜszo nym stęŜeniem kwasu moczowego w surowicy lub osoczu krwi, wzrostem ogólnej puli kwasu moczowego w ustroju oraz odkładaniem się tego metabolitu w tkankach. Wzrost stęŜenia kwasu moczowego w surowicy moŜe być rów nieŜ spowodowany zwiększonym katabolizmem purynowym (dyskrazje krwi, terapia far makologiczna białaczek), stosowaniem diuretyków ttazydowych lub niewydolnością nerek. B. Interpretacja 1. Hiperurykemię stwierdza się w skazie dnawej, w stanach przedrzucawkowych i rzu-

922 / DODATEK

cawkowych, w białaczkach, policytemii, po chemioterapii lub stosowaniu innych metod leczenia białaczek, w niewydolności nerek, w glikogenozie typu I, w zespole Lescha-Nyhana (jest spowodowany niedoborem fos fory boŜy lotransferazy hipoksantynoguaninowej) oraz w zespole Downa. Częstość występowania hiperurykemii jest większa u Filipińczyków niŜ u białych. 2. Hipourykemię stwierdza się sporadycznie w ostrym zapaleniu wątroby, po stosowaniu alopurynolu lub probenecydu. Oznaczanie wydalania kwasu moczowego z moczem ma równieŜ wartość diagnostyczną w niektórych stanach chorobowych, np. u chorych z dną.

Kwas moczowy (wydalanie z moczem) Wartości prawidłowe: 2,1—3,6 mmol/24 godziny (350—600 mg/dobe) u osób przebywających na diecie bezpurynowej. Prawidłowy iloraz U„/Ukiim (U, — dobowe wydalanie kwasu moczowego z moczem, UŁrełi — dobowe wydalanie kreatyniny z moczem wyraŜone w mmol) wynosi dla dorosłych 0,21—0,59, maksymalnie 0,75 (u osób będących na diecie bezpurynowej). A. Uwaga. Zarówno przed, jak i w czasie zbierania dobowego moczu przeznaczonego do oznaczania kwasu moczowego dieta nie powin na zawierać pokarmów bogato pury nowych. Wykonanie duŜego wysiłku fizycznego moŜe zwiększyć urykozurię. B. I nf ormacja patof i zjo logiczna. Zmiany wydalania kwasu moczowego z mo czem mogą być uwarunkowane jego nadprodu kcją (wówczas stwierdza się hiperurykozurię) lub upośledzonym jego wydalaniem z moczem (wówczas stwierdza się hipourykozurię).

C. Interpretacja Hiperurykozurię stwierdza się u ok. 25—30% chorych na dnę uwarunkowaną nad produkcją puryn. WzmoŜoną syntezę zasad pury nowych i zwiększone wydalanie kwasu moczowego z moczem stwierdza się w zespołach mieloproliferacyjnych. Hiperurykozuria wystę puje równieŜ w zespole Lesha-Nyhana (spowo dowanego niedoborem f osfory boŜy łotr ansferazy hipoksantyno-guaninowej) oraz w niektó rych przypadkach glikogenozy (choroba spichrzeniowa glikogenu). Zmniejszone wydalanie kwasu moczowego z moczem stwierdza się w niewy dolności nerek, w niektórych przypadkach gli kogenozy typu I oraz we wszystkich defektach

metabolicznych przebiegających z kwasicą mleczanową lub [J-hydroksymaślanową. RównieŜ podawanie salicylanów w dawkach mniejszych niŜ 2—3 g/d moŜe być przyczyną zatrzymywania kwasu moczowego w ustroju.

Lipaza (aktywność w surowicy krwi) Wartości prawidłowe: 0,2—1,5 jednostek.

A. Informacja patofizjologiczna. We krwi krąŜącej stwierdza sie tyiko małą aktywność enzymów lipolitycznych. Aktywność lipazy trzustkowej wzrasta w ostrym zapaleniu trzustiki, przy czym wzrost ten utrzymuje się dłuŜej niŜ amylazy. B. Interpretacja. Aktywność lipazy w su rowicy wzrasta w ostrym lub przewlekłym, zaostrzonym zapaleniu trzustki oraz przy za mknięciu światła przewodu trzustkowego przez kamień lub nowotwór.

Lipidy Patrz Cholesterol i Triglicerydy

Magnez (stęŜenie w surowicy krwi) Wartości prawidłowe: 0,75—1,25 mmol/1 (1,8—3 mg/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Ma gnez jest elektrolitem głównie śródkomórkowym. Jego stęŜenie w płynie pozakomórkowym wpływa na pobudliwość i reakcję nerwowo-mięśniową, Ogólnoustrojowy niedobór mag nezu moŜe przebiegać z prawidłowym lub nie wiele zmienionym stęŜeniem Mg w płynie poza komórkowym. Małym stęŜeniom magnezu w surowicy krwi mogą towarzyszyć: tęŜyczka, ogólne osłabienie, zaburzenia orientacji i sen ność.

B. Interpretacja Hipermagnezemię stwierdza się w nie wydolności nerek oraz po nadmiernym poda waniu (pozajelitowym) soli magnezowych. Hipomagnezemia występuje u chorych z przewlekłymi biegunkami, w głodzeniu, w przewlekłym alkoholizmie, niewydolności wątroby, przy nadmiernym wydalaniu Mg przez nerki uwarunkowanym podawaniem feków moczopędnych oraz przy niedostatecznej podaŜy Mg chorym Ŝywionym pozajelitowo. StęŜenie Mg moŜe być obniŜone u chorych z hipokalcemią. W ostatnim przypadku hipo magnezemia moŜe być przyczyną oporności hipokalcemii na leczenie duŜymi dawkami wita miny D i soli wapniowych u chorych z niedoczynnością przytarczyc.

DODATEK / 923

Miedź Patrz Ceruloplazmina Mocznik Patrz Azot mocznikowy Potas (stęŜenie w surowicy lub osoczu krwi) Wartości prawidłowe: 3,5—5,0 mmol/1 A. Informacja patofizjologiczna. Stę Ŝenie potasu w osoczu jest determinatorem pobudliwości nerwowo-mięśniowej i mięśnio wej. Zarówno duŜe, jak i małe stęŜenia K w su rowicy upośledzają kurczliwość mięśni. B. Interpretacja Hiperkalemię stwierdza się w niewydol ności nerek (szczególnie u chorych z hiperkatabolizmem białkowym), niewydolności nad nerczy (szczególnie w hipoaldosteronizmie), hipoaldosteronizmie hiporeninowym, u chorych zaŜywających spironolaktony lub leczonych szybkim doŜylnym wlewem soli potasowych, triamterenem lub fenoforminą. Hipokalemię stwierdza się: a. Przy niedostatecznym poborze potasu (np. w głodzeniu). b. W upośledzonym wchłanianiu K w przewodzje pokarmowym (biegunki, wymioty, ze spół wadliwego wchłaniania, zaŜywanie Ŝywicy polistyrenowej). c. Przy nadmiernej utracie potasu przez nerki (pierwotny lub wtórny hiperaldosteronizm, po dawanie mineralokortykoidów, zasad o wica metaboliczna, podawanie diuretyków tiazydowych, tiazydopodobnych i rtęciowych, defekty kanalikowe nerek takie jak zespól de Toni-Debre-Fanconiego i kwasica kanalikowa, tera pia antybiotykami wydalanymi przez nerki jako aniony np. karbenicylina i tikarcylina, leczenie fenotiazynami, amfoterycyną B i lekami zawie rającymi duŜo sodu, stosowanie tetracyklin rozłoŜonych. d. W nieprawidłowej redystrybucji potasu między przestrzenią wodną śród- i pozakomórkową. (poraŜenie okresowe rodzinne, podawa nie testosteronu). Sód (stęŜenie w surowicy lub osoczu krwi) Wartości prawidłowe: 136—145 mmol/1. A.

Informacja patofizjologiczna. Na 155 mEq kationów występujących w osoczu 140 stanowią j ony Na+. Sód wraz z towarzyszącymi mu anionami tworzą większość osmotycznie

aktywnych substancji osocza, decydujących 0 ruchu wody pomiędzy przestrzenią poza1 śródkomórkową. Utrata sodu przez ustrój lub jego wnikanie z przestrzeni wodnej pozakomórkowej do śródkomórkowej są przyczyną zmnie jszenia objętości płynu pozakom orkowego, co z kolei wpływa na czynność układu krąŜenia, nerek i układu nerwowego. B. Interpretacja Hipernatremia występuje przy niedo borze wody, tj. w stanach odwodnienia, w ura zach lub chorobach ośrodkowego układu ner wowego, w stanach przebiegających z nadmier ną sekrecją aldosteronu lub kortykosteronu, Hiponatremię stwierdza się w niewydo lności nadnerczy, niewydolności nerek, szcze gólnie przy niedostatecznej podaŜy sodu, w kwasicy kanalikowej, urazach lub oparze niach (dochodzi do przemieszczenia sodu do komórek), przy duŜych utratach sodu przez przewód pokarmowy (ostre i przewlekłe bie gunki, przetoki jelitowe, niedroŜność jelit) oraz przy obfitych potach (jeŜeli wyrównanie strat było niedostateczne). U niektórych chorych z obrzękami sercowo- lub nerkowopochodnymi stęŜenie sodu w osoczu jest niskie, pomimo prawidłowej ilości o gó Ino u strój owego Na. Ta paradoksalna sytuacja moŜe być uwarunkowa na zwiększoną retencją wody (spowodowaną zwiększoną sekrecją wazopresyny) lub (i) prze mieszczeniem sodu pozakomórkowego do prze strzeni śródkomórkowej. Hiperglikemia spora dycznie moŜe być przyczyną przechodzenia wody śródkomórkowej do przestrzeni pozakomórkowej wywołując hiponatremię z rozcień czenia. W końcu hiponatremia moŜe być artefaktem (wówczas mówimy o hiponatremii rzekomej) spowodowanej hiperlipemią lub hiperproteinemią. W tych przypadkach miejsce części wody zajmują lipidy lub białka, przez co dochodzi do „rozcieńczenia" sodu zawartego w wodzie osoczowej o wartość wynikającą ze wzrostu lipemii czy proteinemii. W tych przypadkach stęŜenie sodu przeliczone na 1000 ml wody jest „prawidłowe". Przy oznaczaniu sodu jonoselektywną elektrodą stęŜenie Na w surowicach hiperlipemicznych lub hiperproteinemicznych jest prawidłowe, podczas gdy jest obniŜone przy uŜyciu metody fotometrii płomieniowej. Przy wzroście glikemii o kaŜde 5,6 mmol/1 (100 mg/dl) powyŜej 11,1 mmol/1 (200 mg/dl) dochodzi do obniŜenia się natremii o 1,6 mmol/1. Efekt ten jest następstwem przemiesz-

924 / DODATEK

czenia wody śródkomórkowej do przestrzeni pozakomórk owej. TBG Patrz Globulina wiąŜąca tyroksynę TIBC — całkowita zdolność białek surowicy do wiązania Ŝelaza — (total iron binding capacity) i stopień wysycenia transferyny Wartości prawidłowe: 45—73 (imol/l (250—410 ng/dl). Saturacja transferyny Ŝelazem: 20—55%. A. Informacja patofizjologiczna. W surowicy krwi Ŝelazo przenoszone jest białkiem zwanym transferyną (lub syderofiliną). W warunkach prawidłowych zaledwie 30—40% całkowitej pojemności transferyny do wiązania Ŝelaza jest wykorzystane (stąd mówimy o procencie wysycenia transferyny Ŝelazem). Procent saturacji transferyny oblicza się wg wzoru TIBC xl00. B. Interpretacja wyników oznaczeń TIBC Wzrost TIBC stwierdza się w niedokrwistości syderopenicznej, u kobiet zaŜywają cych doustne leki antykoncepcyjne, w późnej ciąŜy i u niemowląt oraz sporadycznie równieŜ w zapaleniu wątroby. Niskie TIBC obserwuje się w stanach chorobo wych przebiegających z hipop rotein emią (nerczyca, głodzenie, nowotwory), w prze wlekłych stanach zapalnych i w hemochromałozie (in d u k o w an ej liczn y mi tr an sfu zja mi k rw i lub talasemią). **<■ C. Interpretacja wyników ozaczeń odsetka saturacji transferyny Ŝelazem. Zwiększoną saturację stwierdza się w stanach chorobowych przebiegających z nad miarem Ŝelaza w ustroju (zatrucie Ŝelazem, niedokrwistości hemolityczne, talasemią, hemochromatoza, niedobór pirydoksyny, zespół nerczycowy i sporadycznie zapalenie miąŜszu wątrobowego). ObniŜoną saturację transferyny Ŝela zem obserwuje się w stanach chorobowych przebiegających z niedoborem Ŝelaza, w prze wlekłych infekcjach, w nowotworach i później ciąŜy. Transaminazy -r Patrz Aminotransferazy

Transferyną Patrz TIBC Transpeptydaza tub transferaza -glutamylowa (y-GT) (aktywność w surowicy krwi) Wartości prawidłowe (przy oznaczaniu enzymu w temp. 30°C): męŜczyźni <30 mli/ml, kobiety <25 mU/ml, młodzieŜ <50 mU/ml. A. Informacja patof Izjologiczna. y-GT jest niezwykle czułym wskaźnikiem choroby wątroby. Aktywność tego enzymu jest często podwyŜszona u osób wykazujących prawidłową aktywność aminotransferaz i fosfatazy zasadowej. Enzym ten uwaŜa się za bardziej swoisty od wymienionych dwóch enzymów w celu wykrywania poalkoholowego uszkodzenia wątroby. y-GT występuje w wątrobie, nerkach i trzustce. Katalizuje ona przemieszczenie N-końcowe-go kwasu glutaminowego z jednego peptydu na drugi peptyd lub na L-aminokwasy. Ulega on indukcji pod wpływem etanolu. B. Interpretacja. Aktywność tego enzymu jest podwyŜszona w ostrym zakaźnym (wiruso wym) lub toksycznym uszkodzeniu wątroby, w przewlekłym lub podostrym zapaleniu wątro by, marskości wątroby, w zastoju Ŝółci uwarun kowanym przeszkodą śród- lub pozawątrobową dróg Ŝółciowych, w nowotworach pierwo tnych lub wtórnych wątroby oraz w alkoholo wym uszkodzeniu wątroby. Sporadyczny wzrost aktywności y-GT stwierdza się w zastoinowej niewydolności krąŜenia i rzadko, w po nekrotycznej fazie zawału mięśnia ser cowego, w zapaleniu i w raku trzustki. Triglicerydy (stęŜenie w surowicy krwi) Wartości prawidłowe: 1,65 g/l (165 mg/dl), p. równieŜ tab. 4. A. Informacja patofizjologiczna. Triglicerydy zawarte w pokarmach ulegają hydrolizie w świetle jeiita cienkiego, następnie wchłanianiu i resyntezie przez enterocyty błony śluzowej, a w końcu wydzieianiu do naczyń iimfatycznych pod postacią chylomikronów. Triglicerydy zawarte w chylomi kro pach krwi ulegają klirensowaniu przez lipaze lipoproteinową tkanek (głównie tkanki tłuszczowej). Powstałe pod jej wpływem produkty rozpadu ulegają wchłanianiu przez komórki i magazynowaniu. Wolne kwasy tłuszczowe pochodzące głównie z tkanki tłuszczowej są prekursorami endogennych trigHcerydów wytwarzanych przez wąt-

DODATEK / 925

robę. W surowicy krwi endogenne triglicerydy transportowane są z frakcją p-lipoprotein, tworząc tzw, lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL). Do oznaczenia stęŜenia triglicerydów we krwi naleŜy uŜywać próbki krwi pobranej 10—12 godzin po spoŜyciu ostatniego posiłku. B. Interpretacja. Interpretacje stęŜenia triglicerydów, cholesterolu, cholesterolu frakcji lipoproteinowych (frakcji VLDL, LDL i HDL) naleŜy przeprowadzić^łącznie. Zaburzenia w relacjach zachodzących między wymienionymi lipidami mogą mieć charakter pierwotny lub wtórny. 1. Wzrost stęŜenia triglicerydów stwier dza stę w: a. Hiperlipoproteinemiach pierwotnych tj. w hiperlipoproteinemii typu I, hiper- beta -lipoproteinemii typu Ilb, hiperiipoproteinemii typu III (jest to wzrost VLDL o ruchliwości elektro forę ty cznej beta-lipoprotein), hiperlipoprotei nemii typu IV (hiperlipemia endogenna) oraz w hiperlipoproteinemii typu V (hiperlipoproteinemia mieszana). b. Hiperlipoproteinemiach wtórnych wystę pujących w niedoczynności tarczycy, cukrzycy, zespole nerczycowym, przewlekłym alkoholiz mie przebiegającym ze sthiszczeniem wątroby, Ŝółtaczce zastoinowej, u kobiet zaŜywających doustne leki antykoncepcyjne oraz po zadziała niu stresu. 2. Małe stęŜenie triglicerydów stwierdza się w hipolipoproteinemiach; a. Pierwotnych (choroba wyspy Tanger wy wołana niedoborem a-lipoprotein, abetalipoproteinemia oraz kilka rzadkich i słabo po znanych zespołów) oraz b. Wtórnych (spowodowanych wadliwym odŜywianiem się, wadliwym wchłanianiem po karmów w jeiitach lub sporadycznie chorobą miąŜszu wątrobowego). Trijodotyronina (T 3) wychwyt przez białka surowicy. Określenie wychwytu T3 przez Ŝywicę jonowymienną (RT3U), określenie globuliny wiąŜącej tyroksynę — TBG Prawidłowe wartości RT3U, wyraŜające wychwyt 12S J-T3 przez Ŝywicę jonowo wymienną, wahają się od 25 do 36%. Przez oznaczanie RT3U dla surowicy badanej oraz dla zlewek surowiczych pochodzących od osób zdrowych moŜliwe jest oznaczenie TBG metodą pośrednią. Iloraz złoŜony z wartości RT3U oznaczonej dla surowicy badanej do wartości RT3U zlewek

surowiczych określany jest dalej jako „iloraz RT3U". Normaine wartości dla tego ilorazu wahają się od 0,85 do 1,15. A. Informacja patofizjologiczna. U chorych na nadc2ynność tarczycy typu T4 liczba miejsc TBG zablokowanych przez endogenną T4 jest większa niŜ u osób zdrowych. W niedoczynności tarczycy zachodzi sytuacja odwrotna, tj. liczba miejsc TBG zablokowanych przez ten hormon jest mniejsza niŜ u ludzi zdrowych. Trijodotyronina znakowana USI, dodana do zawiesiny złoŜonej z surowicy badanej i Ŝywicy jonowowymiennej {względnie węgla aktywnego lub talku) w pierwszej kolejności wysyca wolne jeszcze miejsca wiązania na TBG surowicy badanej, zaś pozostałe cząsteczki mI-T3 (nie związane przez TBj^f) ulegają związaniu przez Ŝywicę lub inna substancję wiąŜącą. Po rozdzieleniu substancji wiąŜącej (Ŝywica, talk, węgiel aktywny) od surowicy, oznacza się radioaktywność tej pierwszej wyraŜając ją w % ogólnej radioaktywności dodanej do surowicy badanej (jest to tzw. wartość RT3U). PoniewaŜ Ŝywica (lub węgiel, talk itd.) wiąŜe U!I-Tj nie wiązaną z TBG, aktywność tej Ŝywicy jest tym większa, im bardziej wysycona jest TBG endogennym hormonem tarczycy (taka sytuacja zachodzi w nadczynności tarczycy) i odwrotnie, radioaktywność związku wiąŜącego ' 25I-T3 jest tym mniejsza, im słabiej wysycona jest TBG hormonami tarczycy. B. Interpretacja 1. Wzrost wartości RT,U ora2 ilorazu RT 3U stwierdza się przy duŜym wysyceniu TBG hormonem tarczycy, tj. w nadczynności tarczycy, akromegalii, zespole nerczycowym, w cięŜkiej marskości wątroby oraz we wrodzo nym niedoborze TBG. 2. Zmniejszenie wartości RT^U i ilorazu RT 3 U stwierdza się przy małym wysyceniu TBG endogennymi hormonami tarczycy, tj. w niedoczynności tarczycy, w ciąŜy, u noworod ków, w zakaźnym (wirusowym) zapaleniu wąt roby oraz we wrodzonej nadprodukcji TBG. Tyroksyna (T4) całkowita (TT4) (stęŜenie w surowicy krwi) StęŜenie prawidłowe oznaczone metodą radioimmu no logiczną wynoszą; 65—156 nrnol/1 (5—12 ng/dl), zaś metodą radiokompetycyjną 51—142 nmol/1 (4—11 ug/dl).

A. Informacja patofizjologiczna. Całkowite stęŜenie tyroksyny w surowicy krwi niekoniecznie odzwierciedla efekt biologiczny

926 / DODATEK

tego hormonu. StęŜenia tyroksyny mogą się zmieniać zaleŜnie od zmian stęŜenia białek transportujących tyroksyny (globuliny wiąŜącej T4 i prealbumin), stanów fizjologicznych (ciąŜy) i chorobowych oraz pod wpływem niektórych leków. Prawidłowa interpretacja ogólnego stęŜenia T4 zaleŜna jest od znajomości stęŜenia białek transportujących ten hormon, lub teŜ wychwytu trijodotyroniny (T3) przez erytrocyty lub Ŝywicę wymienną (p. niŜej). Tylko stęŜenia wolnej T4 i T3 są determinantami efektu biologicznego tych hormonów. B. Interpretacja Wzrost TT4 stwierdza się w nadczynno ści tarczycy, w stanach chorobowych przebiega jących ze wzrostem stęŜenia białek transpor tujących dla tego hormonu (TBG) oraz czasami w fazie aktywnej zapalenia tarczycy i akromegalii. StęŜenie TT^ jest obniŜone w niedoczynności tarczycy (pierwotnej lub wtórnej) oraz w stanach chorobowych przebiegających i cha rakteryzujących się niskimi stęŜeniami białek wiąŜących T4. Tyroksyna wolna (fT 4 ) (stęŜenie w surowicy krwi) Wartości prawidłowe: 0,01—0,03 nmol/1 (0,8—2,4 ng/dl). StęŜenie tyroksyny wolnej moŜna określić, znając stęŜenie całkowite tyroksyny oraz wychwyt T3 przez Ŝywicę. A. Informacja patofizjologiczna. Ak tywność metaboliczna T4 zaleŜna jest od stęŜe nia wolnej tyroksyny. Większość T4 ulega kon wersji do T 3 w tkankach obwodowych (T 3 wydzielana jest równiaj przez tarczycę). Zarów no T 4 , jak i T 3 są biologicznie aktywnymi hormonami. B. Interpretacja PodwyŜszone stęŜenie fT4 stwierdza się w nadczynności tarczycy oraz w aktywnej fazie zapalenia tego gruczołu. Małe stęŜenia fT4 obserwuje się w nie ci oczy nn ości tarczycy. Wapń (stęŜenie w surowicy) Wartości prawidłowe dla stęŜenia wapnia całkowitego: 2,1—2,6mmol/l (8,4—10,4mg/dl), dla stęŜenia wapnia zjonizowanego: 1,05—1,3 mmol/ł (4,2—5,2 mg/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Prawidłowe stęŜenie wapnia w ..surowicy krwi i innych płynych ustrojowych jest wynikiem precyzyjnej regulacji endokrynnej i nerkowej oraz

zaleŜna od czynników Ŝołądkowo-jelitowych i Ŝywieniowych. PoniewaŜ znaczna część wapnia w surowicy krwi związana jest z białkami, a szczególnie albuminami, dokładne określenie znaczenia klinicznego wyniku kalcemii ogólnej nie jest moŜliwe przed oznaczeniem proteinemii lub albuminemii. B. Interpretacja Hiperkalcemię stwierdza się; w nad czynności przytarczyc, w nowotworach złoś liwych wydzielających PTH-podobną substan cję, przy zatruciu witaminą D, w „milk-alkali syndrome", w rozległej osteolizie spowodowa nej szpiczakiem lub przerzutami nowotworowy mi do kości, w chorobie Pageta, w sarkoidozie Boecka, po dłuŜszej immobilizacji ciała oraz w hipokalcjurii rodzinnej. Sporadycznie hiper kalcemię stwierdza się w nadczynności tarczycy lub po stosowaniu leków tiazydowych. Hipokalcemię obserwuje się w niedoczynności przytarczyc, w niedoborze witaminy D (u dzieci z krzywicą oraz u dorosłych z osteomalacją), w niewydolności nerek, w hipoproteinemii, w zespole wadliwego wchłaniania (sprue, zapalenie jelita krętego, celiakia, niewydolność trzustki), w cięŜkim zapaleniu trzustki przebie gającym z martwicą oraz w rzekomej niedoczynności przytarczyc. Diagnostyczną wartość ma równieŜ oznaczanie kalcjurii przynajmniej w niektórych chorobach, np. w nadczynności przytarczyc. Wodorowęglany (stęŜenie w surowicy lub osoczu krwi) Wartości prawidłowe: 24—28 mmol/1. A. Informacja patofizjologiczna. Wodorowęglanowy układ buforowy jest jednym z najwaŜniejszych układów buforowych ustroju czuwających nad normalnym pH płynów ustrojowych. Określenie stęŜenia wodorowęglanów i pH we krwi tętniczej stanowi podstawę oceny stanu równowagi kwasowo-zasadowej. B. Interpretacja t 1. Wzrost stęŜenia HCO~ stwierdza się: a. W zasadowicy metabolicznej (pH krwi jest podwyŜszone) spowodowanej zaŜywaniem du Ŝych ilości wodorowęglanu sodowego, długo trwałymi wymiotami lub niedoborem potasu w ustroju. b. W kwasicy oddechowej (pH krwi jest obniŜona) uwarunkowanej niedostatecznym wydalaniem przez płuca dwutlenku węgla, czyli wzrostem pCO2 krwi (rozedma płuc, uszkodze nie warstwy surfaktantu pęcherzyków płuc-

DODATEK / 927

nych, niewydolność krąŜenia przebiegająca z zastojem w phacach, zaburzenia wentylacji płuc o róŜnej etiologii np. po podaniu nadmiernej ilości leków uspokajających lub narkotycznych) lub niedostatecznym oddychaniu sztucznym. 2. ObniŜenie stęŜenia HCO~ stwierdza sie:

a. W kwasicy metabolicznej (pH krwi tęt niczej jest obniŜonej spowodowanej kwasicą ketonową u chorych na cukrzyce, kwasicę nileczanową, głodzeniem, uporczywymi biegunka mi, niewydolnością nerek, zaŜywaniem nadmie rnych ilości substancji zakwaszających, zatru ciem metanolem lub salicylanami. b. W zasadowicy oddechowej (pH krwi tęt niczej jest podwyŜszone) spowodowanej hiperwentylacją (pCO2 jest obniŜone). Wychwyt trijodotyroniny Patrz Trijodotyronina śelazo (stęŜenie w surowicy krwi) Wartości prawidłowe: 9—31,3 u.mol/1. A. Informacja patofizjologiczna. StęŜe nie Ŝelaza w surowicy podlega wahaniom dzienno-nocnym, przy czym największe stęŜenie stwierdza się w godzinach rannych. Dlatego teŜ oznaczanie syderemii naleŜy wykonać w prób kach krwi pobranych rano na czczo. Wiele czynników wpływa na stęŜenie Ŝelaza w surowi cy. Wśród nich wymienić naleŜy: stopień wchła niania Fe przez nabłonek jelitowy, 2apasy Ŝela za w jelitach, wątrobie, śledzionie i szpiku kostnym, nasilenie rozpadu lub utraty hemo globiny oraz synteza hemoglobiny de novo. B. Interpretacja Hipersyderemię stwierdza się w hemochromatozie, hemosyderozie (spowodowanej li cznymi transfuzjami krwi lub podawaniem du Ŝych ilości Ŝelaza), w chorobach przebiegają cych ze wzmoŜoną hemolizą, w niedokrwistośd złośliwej i w niedokrwistościach hipoplastycznych. Często stęŜenie Ŝelaza w surowicy jest podwyŜszone w wirusowym zapaleniu wątroby. Rzekomą hipersyderemię stwierdza się u cho rych u których podawano Ŝelazo doŜylnie 2—3 miesiące przed pobraniem krwi do oznaczania Fe. Htposyderemię stwierdza się w niedo borze Ŝelaza, w infekcjach, nerczycy, przewle kłej niewydolności nerek oraz w okresach wzmoŜonej hematopoezy (np. po podaniu erytropoetyny).

PRAWIDŁOWE.WARTOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH Skróty: /B/ — krew, /P/ — osocze, /S/ — surowica, /U/ — mocz

GŁÓWNE SKŁADNIKI CHEMICZNE KRWI, OSOCZA LUB SUROWICY Aceton i acetooctan: (S) 3-20 mg/l. Adrenalina — p. Epinefryna. Albuminy: (S) 35-55 g/l. Aminotransferazy: Amin otrą nsferaza asparaginianowa (AspAT, AST, SGOT). Wartości prawidłowe zaleŜą od metody oznaczania. ($J 6 — 25 IU/1 w temp. 3CTC; SMA, 10-40 IU/1 w temp. 37°C; SMAC 0-41 IU/I w temp. 37X. Amin otrą nsferaza alaninowa (AIAT, ALT, SGPT). Wartości prawidłowe zaleŜą od metody oznaczania. (S) 3-26 tU/l w temp. 30°C; SMAC 0-45 IU/I w temp. 37°C. Amoniak: (B)<65^moi/I (<110ng/dl) (metoda dyfuzyjna). Amylaza: (S) 80-180 jednostek/dl (Somogyi). Wartości zaleŜne od metody oznaczania. jAntytrypsyna: (S)>1,80 g/l Azot mocznika: (S lub P) 2,9-8,9 mmol/l (8-25 mg/di) Białka całkowite: (S) 60-80 g/l (6-8 g/dl) Bilirubina: (S) całkowita 3,5-20,4 umol/l (0,2-1,2 mg/dl), estryfikowana < 7 u.mol/1 (0,4 mg/dl), wolna<12 umol/l (0,7 mg/dl). Ceruloplazmina: (S) 1,7-2,9 umol/l (25-43 mg/dl). Ciśnienie cząsteczkowe dwutlenku węgla we krwi tętniczej: 4,7-6 kPa {35-45 mm Hg) Ciśnienie cząstkowe tlenu — p. Tlen. Chlorki: (S lub P) 96-106 mmol/l. Cholesterol — całkowity: (S lub P) 3,9-6,85 mmol/l (150-265 mg/dl)(p. Lipidy — frakcje). Wartości zaleŜne od wieku Cholestarol-estry: (S) 65-75% cholesterolu całkowitego. COa całkowity: (S lub P) 24-29 mmol/l. Cynk: (S) 7,65-22,95 u.mol/1 (50-150 ug/dt). Cyjanokobalamina: (S) 148 pmol/l (200 pg/ml). Dwutlensk węgla całkowity — p. C0 2 całkowity, Epinefryna (adrenalina): (P) <550 pmol/l (<100 pg/ml) w pozycji leŜącej. Ferrytyna: (S) dorosłe kobiety 20-120 \ig/\; męŜczyźni 30-300 |j.g/l, dzieci do lat 15, 7-140 ng/l. Fibrynogen: (P) 2-6 g/l (0,2-0,6 g/dl).

928 / DODATEK Fosfataza kwaśna: (S) 1 - 5 jednostek Kinga-Armstronga = 0,1-0,63 jednostek Besseya-Lowry'ego. Fosfataza zasadowa: (S) Dorośli 5-13 jednostek Kinga-Armstronga, 0,8-2,3 jednostek Bessę ya-Lowry'ego; SMA 30-85 IU/I w temp. e C 37 C; SMAC 30-115 IU/I w temp. 37 C. Fosfokinaza kreatynowa (CPK, CK): (5) 1050 IU/I w temp. 37°C. Fosfokinaza kreatynowa-izoenzymy — p. lab. 6. Fosfor nieorganiczny: (S, na czczo) 1-1.5 mmol/l (3-4,5 mg/dl). Gęstość względna: (B) 1,056 (wartość zaleŜna od stęŜenia hemoglobiny i białek osocza krwi). (S) 1,0254-1,0288 {wartość zaleŜna od stęŜenia białka w surowicy). Globuliny: (S) 20-36 g/l (2-3,6 g/dl). Glukoza: (S lub P) 3,6-6,1 mmol/l (65-110 mg/dl). Haptoglobiny: (S) 0,4-1,1 g/l, [3-Karoten: {S na czczo) 0,9-5,58 umol/l {50-300 ug/dl). Kortyzol: (P) 138-650 nmol/l (5-25 ug/dl) o godzinie ósmej rano, <275 nmol/l (<10 Ug/dl) o godzinie ósmej wieczorem. Kwas askorbinow y: (P) 23-85 umol/l (0,4-1,5 mg/dl). Kwas foliow y: (S) 4,5-45 nmol/l (2-20 mg/ml), w krwinkach czerwonych: > 318 nmol/l (>140ng/ml). Kwas moczowy: (S lub P) męŜczyźni 180-540 umol/l (3-9 mg/dl), kobiety 150-450 umof/l (2,5-7,5 mg/dl). Lipaza: (S) <150 U/l. Lipidy całkowite: (S) 4,5-10 g/l (450-1000 mg/dl). Lipidy, frakcje: (S lub P), poŜądane stęŜenia cholesterol frakcji HDL; >1,04 mmol/l(>40 mg/dl). •** cholesterol frakcji LDL: <4,68 mmol/l (<180 mg/dl) cholesterol frakcji VLDL <1,04 mmol/l (<40 mg/di), w celu przekształcenia stęŜenia wyraŜonego w mg/dl na mmol/l, naleŜy wartość pierwszą pomnoŜyć przez 0,026. Miedź: (S lub P) 16-37 umol/i (100-200jig/6l). Mocznik: p. Azot mocznika. Norepinef ryna (noradrenalina): (P, pozycja leŜąca) <3 nmol/l ( <500 pg/ml). Osmolalność (molalnosć): (S) 280-296 mmol/kg H20 (280-296 mosm/kg H2O). P„C03 {B, krew tętnicza) — p. Ciśnienie cząstkowe dwutlenku węgla we krwi tętniczej. PBOa — p. Hen. pH: (B, krew tętnicza) 7,35-7,45 (45-35 nmol H+/I). Pirogronian: (B) 70-114 umol/t (0,6-1 mg/dt). Potas (S lub P) 3,5-5,0 mmol/l.

Saturacja krwi tlenem - p. Tlen. Sód: (S lub P) 136-145 mmol/l. TIBC{S—całko wita zdolność surowicy dowiązania Fe) 44,7-73,4 nmol/l (250-410 ng,/dl). Tlen: całkowita pojemność krwi do wiązania tlenu (B) 16-24 vot.%. Wartość zaleŜna jest od stęŜenia hemoglobiny. Zawartość we krwi tętniczej 15-23 vol.% (wartość jest zaleŜna od stęŜenia hemoglobiny). Wysycenie hemoglobiny tlenem w krwi tętniczej, 94-100% całkowitej pojemności. Ciśnienie cząstkowe tlenu w krwi tętniczej Pa0s10,67-13,33 kPa (80-100 mm Hg) na poziomie morza. Wartość zaleŜna od wieku. Transferyna: (S) 23-45 umol/1 (200-400 mg/dl). Transferyna (S): % wysycenia Ŝelazem, 20-55%. Trfglicerydy: {S) <1,9 mmol/l (<165 mg/dl). Wapń: (S) 2,1-2,6 mmol/l (8,5-10,3 mg/dl). Wartość zaleŜna od stęŜenia albumin w surowicy. Wapń zjonizowany: (S) 1,05-1,3 mmol/l {4,25-5,25 mg/dl). Witamina A: (S) 0,53-2,1 j^mol/t (15-60 ug/dl). Witamina Bia: (S): >148pmol/t (> 200 pg/ml). Witamina C — p. Kwas askorbinowy. Witamina D: (S): cholekalcyferol (wit. D3) 1,3-47 nmol/l (0,5-18 ng/ml), 25-hydroksycholekalcyferol 19,4-137 nmol/i {8-55 ng/ml), 1,25-dihydroksycholekalcyferol62~155pmol/l (26-66 pg/ml), 24,25-dihydroksycholekalcyferol 2,4-12 nmol/l (1-5 ng/ml). Wodorowęglany: (S) 24-28 mmol/l. Zdolność wiązania Ŝelaza przez surowicę — p. TIBC. śelazo: (S) 9-31,3 umol/l (50175 ug/dl).

Hormony w surowicy lub osoczu krwi W określonych stanach klinicznych zachodzi potrzeba oznaczania niŜej podanych hormonów. W sprawie wartości prawidłowych dla tych hormonów naleŜy zasięgnąć konsultacji laboratorium szpital neg«. Przysadka mózgowa Hormon wzrostu (GH) Hormon tyreotropowy (TSH) Folitropina (hormon pobudzający pęcherzyki Graafa) (FSH) Lutropina (hormon luteotfopowy) (LH) Kortykotroptna (ACTH) Pro I aktyn a Somatomedyna C {wytwarzana jest przez wątrobę i inne tkanki pod wpływem GH) Hormon antydiuretyczny (ADH, wazopresyna)

DODATEK / 929 Nadnercza: Aldosterori (wartości prawidłowe 56-250pmol/l), stęŜenie wzrasta w pozycji pionowej. Kortyzol Deoksykortyzol Dopamina Epinefryna (adrenalina) Norepinefryna (noradrenalina) Patrz równieŜ; Inne testy laboratoryjne Tarczyca: Tyroksyna wolna (fTJ _ Tyroksyna całkowita (TT,) Globulina wiąŜąca tyroksyne {TBG} Trijodotyronina (T3) Odwrotna trijodotyronina (rT3) Wychwyt trijodotyronin przez Ŝywicę (RT3U) Kalcytonina Przytarczyce: Wartości prawidłowe zaleŜne są od rodzaju przeciwciał anty-PTH uŜyte do oznaczania. StęŜenie PTH w surowicy wykazuje korelację ze stęŜeniem wapnia w surowicy. Wyspy Langerhansa trzustki: Insulina Peptyd C Glukagon śołądek: G astry na Nerki: Aktywność reninowa Erytropoetyna Gonady: Testosteron wolny (nie związany z białkami transportowymi) Testosteron całkowity Estradiol (Ej) Progesteron ŁoŜysko: Estriol (E3) Gonadotropina łoŜyskowa

INNE TESTY LABORATORYJNE W odpowiednich stanach klinicznych zachodzi potrzeba oznaczania niŜej podanych związków.

— Biochemia

W sprawie zakresu wartości prawidłowych dla tych związków naleŜy zwrócić się do laboratorium szpitalnego. Hormony nadnerczy i ich metabolity Katechoiaminy 11,17- Hydroksykortykoidy 17-Ketosteroidy Metanefryna Kwas wanilinomigdałowy (VMA) Zawartość tłuszczów w kale Ołów Porfiryny Kwas delta-amino-lewulinowy Ko pro porfiryny Uroporfiryny Porfobilinogen Urobilinogen Urobilinogen w kale

PIŚMIENNICTWO Friedman RB et al: Effects of diseases on dinical laboratory tests. Clin Chem 1980;26(Suppl 4):1D. HanstenPD, Lybecker LA: Drug effects on laboratory tests. In: Basie & Clinicat Pharmacology, 2nd ed. Katzung BG (editor). Lange, 19S4. Lippert H, Lehmann HP: SI Units in Medicine: An Introduction to the International System of Units WitkConversion TablesandNormal Ranges. Urban & Schwarzenberg, 1978. Lundberg GD, Iverson C, Radulescu G (editors): New read this: The SI units are here. (Editorial). JAMA 1986;255:2329. Powsner EK: SI ąuantities and units for American medicine. JAMA 1984;252;1737. Scully RE et al: Nonnal reference laboratory values: Case records of the Massachusetts Generał Hospital. N Engt J Med 1986;314:39. Sonnenwirth AC, Jarett L: Gradwohfs Laboratory Metkods and Diagnosis, 8th ed. Vols 1 and 2. Mosby, 1980.

Skróty spotykane w biochemii

0

jednostka(i) Angstroma (10~10 m, 0,1 nm) aminokwas a-aminokwas hormon a dren o korty kot rop owy, adrenokortykotropina, kortykotr opina pochodna acylowa koenzymu A (np. butyrylo-CoA) dehydrogenaza alkoholowa hormon antydiuretyczny (wazopresyna) globulina antyhemofilowa (przeciwhemofilowa) alanina adenozynomonofosforan arginina asparagina kwas asparaginowy adenozyn ot r i f osf ora n dimerkaptopropanol (British anti-lewisite) cykliczny 3',5'-adenozynomonofosforan, cykliczny AMP globulina wiąŜąca kortykosteroidy karbobenzoksy m-chlorokarbonylocyjanofenylohydrazon cholecystokinina (pankreozymina) ceramid cykliczny 3',5'-guanozynomonofosforan, cykliczny GMP iniojącja łańcucha cytydynomonofosforan, 5'-fosforybozylocytozyna wolny koenzym A. Nukleotyd zawierający kwas pantotenowy i uczestniczący w przemianie kwasów tłuszczowych, związków ketonowych, octanu i aminokwasów

II

acetylo-CoA, aktywny octan. Postać, w jakiej octan jest aktywowany, by mógł

A (A) AA

a-AA ACTH Acyl-CoA ADH ADH AHG Ala AMP Arg Asn Asp ATP BAL

CAMP CB6 CBZ

CCCP CCK (PZ) Cer

cGMP Cl CMP

CoA-SH

CPK (CK) CRH (CRF) CRP CTP Cys D

Da( witamina) D3( witamina) 1,25/OH/a-D3 dA dC

dG

DNA DNP

uczestniczyć w róŜnych reakcjach fosfokinaza kreatynowa kortykoliberyna białko C-reaktywne cytydynotrifosforan cysiei na prawoskretny ergokalcyferol cholekalcyferol 1,25-dihydroksycholekalcyferoi deoksyadenozyna deoksycytgzyna deoksygua noŜyna kwas deoksyrybonukleinowy dinitrofenol

^

SKRÓTY SPOTYKANE W BIOCHEMII / 931 Dopa DPG DPN dT dTMP dUMP E E.C. EDTA Enz Eq eu FAD FADHa FDA FFA Figlu FMN FP FSF FSH FSHRH (FSHRF) g g Gal GalNAc GDP GFR GH GKRH(GHRF) GHRIH GLC Glc GIcNAc GlcUA Gin Olu Gly GMP GnRH GTP Hb hCG hCS HDL H2folate H^folate His HMG-Co A

ICD IDL IDP IF Ile IMP INH ITP

W) — Iłincłiemia

3,4-dihydroksyfenyloalanina * difosfoglicerynian (nazwa bardziej prawidłowa — bisfosfoglicerynian) nukleotyd difosfopirydynowy (skrót najczęściej uŜywany NAD) deoksytymidyna d eo ksy ty m id y n o mo n of osf of o ra n deoksyurydynomonofosforan enzym (lub Enz) układ numeracji enzymów ustalony przez IUB kwas etylenodiaminotetraoctowy. Odczynnik uŜywany do chelatowania metali dwuwartościowych enzym (równieŜ uŜywany skrót E) równowaŜnik jednostka enzymatyczna dinukleotyd flawinoadeninowy (postać utleniona) dinukteotyd flawinoadeninowy (postać zredukowana) Food and Drug Administration wolne kwasy tłuszczowe kwas formiminoglutaminowy mononukleotyd flawinowy flawoproteina czynnik stabilizujący fibrynę folitropina foliliberyna, hormon uwainiający FSH gram (y) przyspieszenie ziemskie (grawitacja) ga laktoza N-acetylogalaktozamina guanozynodifosforan przesączanie kłębuszkowe hormon wzrostu somatoliberyna somatostatyna, hormon hamujący uwalnianie hormonu wzrostu chromatografia gazowo-cieczowa glukoza N-acetyloglukozoamina kwas glukuronowy glutamina kwas glutaminowy glicyna guanozynomo nofosf o ra n gortadoliberyna g u a noŜy n ot ri f osf o ra n hemoglobina ludzka gonadotropina kosmówkowa ludzka somatomammotropina kosmówkowa lipoproteiny o wysokiej gęstości dihydrofolian tetrahydrofolian htstydyna fi-hydroksy-p-metyloglutarylo-CoA hydroksylizyna hydroksyprolina dehydrogenaza izocytrynianowa lipoproteiny o pośredniej gęstości inozynodifosforan czynnik inicjacji (w syntezie białek) izoteucyna inozynomonofosłoran, rybonukleotyd hipoksantyny hydrazyd kwasu i zo ni koty nowego (izoniazyd) inozynotrifosforan

932 / SKRÓTY SPOTYKANE W BIOCHEMII ITyr IU IUB ct-KA kcal ex-KG kJ Km L LCAT LDH LDL Leu LH LHRA (LHRF) LLF LTH Lys M MAO NICH MCHC W1CV Met mol MRF MRH MRIH mRNA MSH MW (MAD IUADH + NADP NADPH NDP NeuAc NTP OA OD P; PCV Pho PIH (PIF) PL PLP PPi PRH (PRF) PRIH (PRIF) PRL

Pro PRPP PTA PTC RBC RDA RE RNA

monojodotyrozyna dijodotyrozyna jednostka (i) międzynarodowa (e) Międzynarodowa Unia Biochemii a-ketokwas kilokaioria a-ketoglutaran kilodzul stęŜenie substratu, przy którym reakcja chemiczna wykazuje połowę maksymalnej szybkości (stała Michaeiisa) lewoskrętny acylotransferaza lecytyna-cholesterol dehydrogenaza mleczanowa lipoproteiny o niskiej gęstości leucyna lutropina, hormon luteinizujący luliberyna, hormon uwalniający lutropinę czynnik Laki-Lorand hormon luteotropowy lizyna molarny oksydaza monoaminowa średnia zawartość hemoglobiny w krwince czerwonej średnie stęŜenie hemoglobiny w krwince czerwonej średnia objętość krwinki czerwonej metionina mol (e) czynnik uwalniający melanotropinę hormon uwalniający melanotropinę hormon hamujący uwalnianie melanotropiny informacyjny RNA hormon melanotropowy, melanotropina masa cząsteczkowa dinukleotyd nikotynamidoacfeninowy— postać utleniona dinukleotyd nikotynamidoadeninowy — postać zredukowana fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego — postać utleniona fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego — postać zredukowana jakikolwiek difosforan nukleozydu kwas N-acetyloneuraminowy jakikorWiek trifosforan nukleozydu kwas szczawiowooctowy gęstość optyczna fosforan nieorganiczny (orto-fosforan) wartość hematokrytowa fenyloalanina prolaktostatyna, hormon hamujący uwalnianie prolaktyny pirydoksal , fosforan pirydoksalu nieorganiczny pirofosforan prolaktoliberyna, hormon uwalniający proiaktynę prolaktostatyna, hormon hamujący uwalnianie prolaktyny prolaktyna prolina 5-fosforybozylo-i -pirofosforan czynnik krzepnięcia XI, czynnik przeciwhemofilowy C czynnik krzepnięcia IX, czynnik przeciwhemofilowy B krwinka czerwona zalecane normy Ŝywieniowe równowaŜniki retinotu kwas rybonukleinowy

SKRÓTY SPOTYKANE W BIOCHEMII / 933 RQ rRNA ■ S(Sf)units SDA SDS S«r SGOT SGPT SH SLR SPCA SRIH (SRIF) sRIMA STP T3 T4 TEBG TG Thr TLC TmCa TmG TPN TRH (TRF) Tris tRIMA Trp TSH Tvr UDP UDPGal UDPGIc UDPGIcUA UDPGIuc UMP UTP Vma, Val VHDL VMA Vol%

(

współczynnik oddechowy -t rybosomalny RNA jednostki flotacji Svedberga działanie swoisto dynamiczne sól sodowa siarczanu dodecylu seryna aminotransferaza glutaminowo-szczawiowooctowa aminotransferaza gl utamin owo-pirogronia nowa grupa s u (f hydry I owa Streptococcus actis R czynnik krzepnięcia VII somatostatyna, czynnik hamujący uwalnianie hormonu wzrostu rozpuszczalny RNA, bardziej uŜywany termin to tRIMA temperatura standardowa (273 K) i ciśnienie standardowe {760 mm Hg) trijodotyronina tetrajodotyronina, tyroksyna globulina wiąŜąca hormony płciowe (testosteron i estrogeny) triacyloglicerole (dawniej określane jako triglicerydy) treonina J^, chromatografia cienkowarstwowa maksymalne wchłanianie wapnia przez kanaliki nerkowe maksymalne wchłanianie glukozy przez kanaliki nerkowe nukleotyd trifosfopirydyny (obecnie określany jako NADP) tyreoliberyna, hormon uwalniający tyreotropine Tris/hydroksymetylo/aminometan, substancja często uŜywana jako bufor transferowy RNA (patrz sRNA) tryptofan tyreotropina tyrozyna difosforan urydyny urydynodifosfoga laktoza urydynodifosfoglukoza kwas urydynodifosfoglukuronowy kwas urydynodifosfogiukuronowy monofosforan urydyny, urydyno-5'-fosforan, kwas urydylowy urydynotrifosforan maksymalna szybkość walina lipoproteiny o bardzo wysokiej gęstości kwas wanilinomigdatowy % objętościowy

SKOROWIDZ / 935

Skorowidz Abetalipoproteinemia 301, 326 Acanthosis nigricans 582 Acetoacylokoenzym A 299 Aceton 266 — stęŜenie we krwi 927 Acetooctan 266, 269, 368 stęŜenie we krwi 927 — synteza 270 2-Aoetylaminofluoren 826 Acetylo-(acylo)-tnalonyloenzym 252 Acetylo-CoA patrz: Acetylokoenzym A Acelylocholina 585, 589 Acctylocholinesteraza 888 N-Acetylogalaktozamitia 171,751 N-Acetylogłukc-zamina 171, 751 N-Acetyloglukozoamina 751 Acctyloheksozaminy 171 p-iJ-Acetyloheksozoaminidaza 766 Acetylokoenzym A (Acetylo-CoA) 189, 190. 194. 198, 199, 204, 205, 213, 255, 256 — powstawanie z aminokwasów 368 Acetylotransferaza dihydrol ipon i a nowa 213, 214 karnitynowa 261 niedobór 767 Achlorhydria 734 ACP 698 ACTH patrz: Kortykotropina Acydemia, izowalerianowa 381, 384 propiomanowa 384 Acyduria 851 argininobursztynianowa 356 di kar boksy Iowa 265 metylom a I on owa 227, 384, 728 orotowa 441 Acyloglicerol(e) 189, 284 kalabolizm 284 Acylotransferaza, 1 -acyloglicerolo-3-fosforanowa 286 acylo-CoA: cholesterol 319 - diacyloglicerolowa 286 glicerolo-3-fosforanowa 286, 310 — lecytyna: cholesterol (LCAT) 289, 303, 319, 322 — niedobór rodzinny 328 Adenina 416, 419 Adenowirusy 829 Adenozy]o-5r-monofo5foran 430 5-Adenozylometionina 387, 421 Adenozyna 418, 419 konformacje 419 pochodne 420 Adenozyno-5'-di fosforan 421 Adenozyno-3r-fosfo-5'-fosfosiarczan421 Adenozyno-3'-monofosforan 420 Adenozyno- 5 '-monofosforan 421 Adenozyno-5'-trifosforan 421

Adenozynodifosforan (ADP) 135, 151 — a kontrola oddychania 152 Adenozynomonofosforan (AMP) 135 Adenozynomonofosforan cykliczny (cAMP) 197,220,421 AdenozynotTifosforan (ATP) 133, 134, 151wytwarzanie 203 — źródła w sercu 804 Adenylobursztynian 430 ADH patrz: Wazopresyna ADP patrz: Adenozynodi fosforan Adrenalina 220, 231, 237, 259, 397 biosynteza 395 stęŜenie we krwi 927 Aflatoksyna B, 826 Aglikon 166 Aglutynina kiełków pszenicy 753 AHG 784 AHH 819 Akcelerator konwersji protrombiny 784 ds-Akonitan 199-201 Akonitaza 200, 201 Akromegalia 604 Aktyna 797, 805, 875

s-Aktynina 806 Aktywator plazminogenu tkankowy 790 Aktywność optyczna cząsteczki 163 Alanina 39, 204 biosynteza 339 transaminacja 363 a-Alanina 386 p-Alanina 43 - biosynteza 386 Albmizm oczno-skómy, tyrozynazo-dodatni 395 tyrozynazo-ujemny 393, 395 Albinoidyzm otzno-skórny 395 Albumma(y) 261, 298, 408, 773 stęŜenie we krwi 915 Albuminemia 774 Aldehyd(y), glicerynowy 161 izomery 162 D-gliterynowy 165 malonowy 184 tłuszczowe 178 Aldolaza 209. 210 B247 treoninowa 367 Aldosteron 632, 633 transport w osoczu 635 Aldosteronizm pierwotny 644 Ałdozy 161 Aifa-fetoproteina 825 Alkaptonuria 370 Alkohole 178 Alkoholizm przewlekły 308 Allopurynol 424, 436

Amantadyna 902 Amenorrhoea 605 Amid kwasu nikotynowego 696 Amidoimidazoloka rboksyamidorybozylo-5-fosforan 429 Aminoacydurie 35 Aminocukry 171 — metabolizm 249 - synteza 250 Aminoi midazolobursztynylokarboksyamidprybozylo-5-fosforan 427 Aminoitnfcazolokarboksyaraidorybozylo-5-fosforan 427 Amin oimidazolokarboksylo-rybozylo-5-fosfbran 427 Aminoimidazolorybozylo-5-fosforan 427 Aminokwasy) 13, 189, 190, 193, 234 — biosynteza 338 - częściowo niezbędne w poŜywieniu 343 degradacja 344, 345 dysocjacja 37 egzogenne 35, 191, 331, 337 endogenne 191, 204 glukogenne 358 glukoneogeniczny 352 - grupa, a-aminowa 37 ----- e-aminowa 37 ----- fenolowa 37 ----- funkcyjne 36 ----- guanidynowa 37 ----- imidazolowa 37 ----- a-karboksylowa 37 ----- nie ct-karboksylowa 37 ----- słabokwaśne 37 — sulfhydrylowa 37 katabolizm 347 ----- szkieletów węglowych 357 ketogenne 358 konfiguracja bezwzględna 36 ładunek całkowity 37 metabolizm 121, 190, 191 nie a waŜne dla metabolizmu ssaków 43 niepolame 39 niezbędne 35, 191, 345, 724, 725 oznaczanie ilościowe 44 podstawowe 35 polarne 39 punkt izoelektryczny 37 rozdzielanie 44 rozgałęzione, katabolizm 378, 380 oksydacyjna dekarboksylacja 378 ------zaburzenia metabolizmu 383 rozpuszczalność 38 równowagi protonowe 36

936 / SKOROWIDZ Aminokwasy), sekwencja a struktura Haka 66 synteza 191 temperatura topnienia 38 właściwości a struktura 43 wymiana między narządowa 351 po posiłku 353 ---- w stanie poresorpcyjnym 352 — z łańcuchem bocznym, alifatycznym 39 — z atomem siarki 40 - zgrupą.kwaśnąlubjcgoamid40 ------- hydroksylową 40 ------- zasadową 40 — zawierające, pierścień aromatyczny 41 ---- siarkę, wady metabolizmu 365 znaczenie biomedyczne 35 zjonizowany 36 a-Aminokwasy 347, 348 — nie występujące w biaikach ale istot ne w metabolizmie 41 L-a-Aminokwasy 36 Aminolipidy 173 y-Aminomaślan, metabolizm 396, 397 Aminopeptydaza(y) 345, 739, 742

Aminoproteinaza 812 Aminotransferaza(y) 158, 204, 347, 396 aktywność w surowicy 913, 927 glutamylo-PRPP, regulacja aktyw ności 432 tyrozyna: a-ketoglu taran 368 Aminy 35 aromatyczne 826 Amobarbital 147 Amoniak 344, 346, 349, 748 cząsteczka, dipolama 27 tetraedryczna 27 przemiana w wątrobie 351 stęŜenie we krwi 913, 927 tworzenie w nerkach 350 wydalanie 350 zatrucie 349 Amoniako-liaza histydynowa 117, 121 AMP patrz: Adenozynomoiiofosforan Amylaza 734, 739 aktywność w surowicy 914, 927 trzustkowa 742 Amylo-(l-4)-(l-6)-transglukozydaza 219 Amylo-(l-6)-glukozydaza 220 Amyloid 903 Amylopektyna 169 Amylopektynoza 225 Amyloza 169 Anabolizm 132 Anaerobioza 199 Androgeny 585, 588, 630 biosynteza, schemat 655 mechanizm działania 657 przemiana i wydalanie 636 rola fizjologiczna 657 synteza 634 Androstendion 630, 632, 656, 660 Androsteron, a stęŜenie potasu 638 — mechanizm działania 642 Angiotensydaza 637 Angiotensyna II 585, 589, 636

Anhy draŜa węglanowa 735 Ankiryna 874, 875 Anoksja 199, 200 Anomery 163 Anseryna 3Sfi, 387 Antybiotyki 167 polipeptydowe 51 Antychymoirypsyna at- 885 Antygen, D 878 rakowo-płodowy 825 Anty koagulanty kumarynowe 789 Antymycyna A 152 Antyoksydanty 713, 716 ttj-Antyplazmina 790 3,Antyproteaza 885 Antyproteaza(y) 885 ctj-Antyproteinaza, niedobór 777 Antytrombina III 789 3,Antytrypsyna, niedobór 777 — stęŜenie we krwi 927 Aparat stop-flow 110 Apoenzym 83 Apolipoproteinemia C-II 302 Apolipoproteiny 295 C303 E3O3 Apomioglobina 72 Apoproteiny 295 APP 903 Arabinoza 171, 424 DArabinoza 165 Arabinozylocytozyna 424 Arginaza 361 Argimna 40, 204, 343, 355, 361, 397, metabolizm 388 L-Arginina, kalabolizm 360 Argininobursztynaza 355 brak aktywności 356 Argininobursztynian 355 Arsenin 201 Askorbinian 244 Asparagina 40, 350 deaminacja 359 Asparaginaza 350 L-Asparaginaza 351 Asparaginian 204, 355 biosynteza 339 transaminacja 359 L-Asparaginian 125 AspAT 913, 927 Aspiryna 895 AST 013, 927 Astma 583 ctj-AT patrz: dj-Antyproteinaza Ataxia teleangiectasia 475 ATP patrz: Adenozynotrifosforan Atraktylozyd 152, 159 Atrotla mięśniowa rdzeń i owo-opuszkowa 898 Autoantygeny 769 Autooksydacja lipidów 184 Autoprzeciwciała 890 Autoradiografia 547 Awidyna 703 Azacytydyna 5423 Azaguanina 8-423 Azaseryna 430

Azatiopryna 424 5-Azaurydyna 423 6-Azaurydyna 441 Azot, aminokwasowy, katabolizm 347 bilans, dodatni 344 ujemny 344 katabolizm 353 metabolizm 349 mocznikowy 914 — stęŜenie we krwi 927 — produkty końcowe przemiany 346 Bakterie jelitowe 748 Bakteriofag(i) 464, 547 — lambda 513 Barbiturany 152 Barwniki Ŝółciowe, krąŜenie jelitowo-wątrobowe410 w moczu 412 Benzo-a-piren 826 Białaczka(i) 845, 885 szpikowa, przewlekła 847 Bialko(a) 189, 194 4.1 875 a mikrofotografia elektronowa 68 adhezyjne 880 amyliodowe p 902 błon komórkowych 749 — erytrocytów 873 ero 525

degradacja 344 - szlaki 346 ------szybkość 345 denaturacja 62, 66 funkcje 60 G883 globuiarne 59 grupy modyfikowane 67 — hemowe 70 - jakość 345, 725 katabolizm 344, 345 klasyfikacja 59 kompleksy wielkocząsteczkowe 66 monomery 66 niehemowe zawierające Ŝelazo 117 okres połowicznego rozpadu 345 oligomery 65 osocza 193, 749 całkowite 771 oznaczanie masy, cząsteczkowej 68 pasma I 874 podjednostki 66 pokarmów 190 polimorficzne 773 protomery 66 przemiana, a insulina 681 — przenoszące, acyl 252 ----- estry cholesterolu 303, 322 ----- skwalen i sterole 318 rozpuszczalność 59 sekwencja aminokwasów 65 a struktura drugo- i trzeciorzę dowa 66 stęŜenie we krwi 914, 927 struktura, p 64, 65 czwartorzędowa 65, 69

SKOROWIDZ / 937 Biaiko(a), struktura, czynniki stabilizujące 61,'62 -------- badanie 68 ----- drugorzędowa 65 —■-------- badanie 67 ---- globularna 65 — — helikalna 62 heliks a 65 - — łańcucha pofałdowanego 64 pierwszorzędowa 60, 65 — -------- oznaczanie 67 ----- trójwymiarowa 60? ----- trzeciorzędowa 65 — -------- badanie 67 ----- zakręty (3 65 — --- zwoju przypadkowego 65 synteza, elongacja 502, 503 inicjacja 500 - terminacja 502, 504 tkankowe 190 wartość energetyczna 723 wiązania elektrostatyczne 62 wiąŜące, kwasy tłuszczowe 261, 299 właściwości fizyczne 60 ■ - włókienkowe 60 wymiana 344 anionów 874, 875 - zapotrzebowanie 725, 732 znaczenie biomedyczne 59 Ŝelazosiarkowe 148, 149 Biblioteka genomowa 536, 547 Bielactwo oczne 395 Bilans azotowy, dodatni 344 ujemny 344 Bilirubina 407 bezpośrednia 409. 411 — ■ pośrednia 411 sprzęŜona 409, 411 stęŜenie we krwi 915, 927 transport 409 wolna 411 wychwytywanie przez wątrobę 408 — wydzielanie 409 Biliwerdyna IX-« 407 Bioenergetyka, znaczenie biomedyczne 131 Biofosfatydyloglicerol 179 Biomolekuly, analiza metabolizmu 22 izolowanie 20 metody, określania struktury 21 ----- rozdziału 21 Biopolimery, główne 16, 17 Biotyna 227, 251,702 1,3- Bisfosfogljcerynian 210, 211, 212 2,3- Bisfosfoglicerynian 78 Blotling 537 Blona(y), komórkowe, budowa 172 lipidowe 186, 187 mitochondrialne 179 przenośniki 157 — równowaga, elektryczna 158 osmotyczna 158 ----- transport, anionów 159 ------ kationów i 60 —- — układy transportujące 159 — przewodzenie bodźców nerwowych 568

Blona(y), struktura 43 systemy transportowe 565 sztuczne 556 Błonica 507 Błonnik 170 BMAA 901 Bradykimna 51, 881 Brak miesiączki 605 Bromocyjan 55 Buforowanie 32 Bufory 31 a- Bungarotoksyna 889 Bursztynian 107, 199, 201

cAMP patrz: Adenozynomonofosforan cykliczny CAP 511 CBG 629 CCK patrz: Cholecystokinina CDP patrz: CyIydynodifosforan CDPDiacyloglicero lo- iransferaza inozytolowa 286 CEA 825 Celiakia 747 Celobioza 168 Celuloza 170 Centromer 460 Ceramid 181, 293 biosynteza 290 Cerebrozydy 290 w błonach 551 Ceruloplazmina 776 stęŜenie we krwi 916, 927 cGMF patrz: Guanozyno-3',5'-monofosforan Chimera 547 Chityna 170, 171 Chlorki 729 — stęŜenie we krwi 916, 927 Chlorofil 398 Chioniak(i), Burkttta 834 Cholecystokinina 585, 691 Cholekalcyferol synteza 714 Cholera 590, 844, 855 Cholestaza 328 Cholesterol 182,183.189,190,191,294, 631, 632,634, 660 biosynteza 314, 317 regulacja 318, 319 równowaga, w komórce 320 — w tkankach 319 stęŜenie we krwi 916, 927 a dieta 325 — a leki hipolipemizujace 326 -------a styl Ŝycia 326 — transport 320 — odwrócony 322 w błonach 552 wydalanie 322 Cholesterologeneza 190 Cholestyramina 326 Cholina 179, 181, 307, 889 Chondroityno-4-siarczan 764 Choriocarcinoma 669 Choroba(y), a biochemia 843

Choroba(y), Addisona 609, 643 Alzheimera 902 przyczyny 904 Andersena 225 autoimmunologiczne 889 beri-beri 694 chromosomalne 846 Cori 225 Crohna 773 Farbera292 Forbesa 225 Gauchera 292,845, 851 genetyczne, 848 ----- diagnostyka 92 ----- leczenie 850 ----- testy 850 — von Gierkego 225, 440 - Gravesa-Basedowa 582, 618 — Hartnupów 377, 387, 698, 728, 734, 747 — - hemSStyczna noworodków 879 Hersa 225 Humingtona 892 jednogenowe 846 - Krabbego 292 miąŜszu wątrobowego 32S „moczu o zapachu syropu klonowe go" 383 niedokrwienna serca 325, 727, 847 Niemanna-Picka 292 Parkinsona 897, 899 Pompego 225 receptorowe 583 Refsuma 265 Sandhoffa 292, 766 - spichrzania cystyny 366 ----- glikolipidów 284 ----- lipidów 293 szerokiego pasma p 327 Tarui'ego 225 Tay-Sachsa 292, 766, 844 trzewna 747 - upośledzonego usuwania remnantów 327 wieńcowa 325, 727, 847 Wilsona 388, 776, 846 Wolmana 327 wtrętów komórkowych 761, 767, 844 wymiotna jamajska 265 wyspy Tangier 326 ziarnicza przewlekła 884 Chrom 730 zapotrzebowanie 732 Chromatografia 21, 44, 52 bibułowa 44 ----- dwuwymiarowa 46 cieczowa, wysokociśnieniowa w fa zie odwróconej 52 cienkowarstwowa 46, 185, 186 gazowa 751 — - gazowo-cieczowa 185 hydrofobowa 88 jonowymienna 46, 87 podziałowa 45 powinowactwa 88, 751 z barwnikiem jako ligandem 88

938 / SKOROWIDZ Chromatydy 460 Chromatyna 456 Chromosom(y), PhiJadelphia 834 — politeniczne 459 Chrząstka 764 Chylomikrony 193, 295, 299 — katabolizm 301 resztkowe 302 Chyluria 746 Chymotrypsyna 738 działanie, etapy reakcji 111 mechanizm U0 system przekazywania ładunku 112 Ciałko(a) Heiza 871 Ciało(a) ketonowe 190, 191, 194, 260, 266—268, 331 utlenianie 334 CiąŜa 664 stęŜenie, hormonów prawidłowe 665 Ciśnienie cząsteczkowe dwutlenku wę gla we krwi 927 CK. patrz: Fosfokinaza kreatynowa CLIP 607 Clomid 668 CMP patrz: Cytydynomonofosforan CoA patrz: Koenzym A COMT 645 CoQ patrz: Koenzym Q CPK patrz: Fosfokinaza kieatynowa CRBP 712 CRH patrz: Hormon uwalniający kortykotropinę Crossing-over 463 CS patrz: Somatomammotropina fcosmówkowa CT patrz: Kalcytonina CTP patrz: Cytydynotrifosforan Cukrzyca 237, 260, 267, 268, 298, 335, 678, 726, 734

a zaćma 247 niewyrównana 307 typu I z kwasicą ketonową 862 typu II 583 Cyjanki 147, 152 ^ Cyjankobalamina, stęŜenie we krwi 927 Cykl(e), adenozynotrifosforan/adenozynodi fosforan 135, 136 alaninowo-glukozowy 235 Cori 234 glukoza-alanina 234, 352 glukoza-kwasy tłuszczowe 333 hydroksylacyjny 144 koenzymu Q 155 kwasu cytrynowego 135, 148, 189, 191, 194, 198, 199, 200, 20i, 205, 216, 226, 271 ---- a glikoliza 213 — rola w metabolizmie 203 ------ wytwarzanie ATP 203 kwasu mlekowego 235 miesiączkowy 663 mocznikowy 353, 355 nukleotydów purynowych 422 pentozofosforanowy 189. 191, 87i, 883 substratowe 233

Cyklaza, adenylanowa 220, 311, 421, 589, 595, 792 ------ w błonach 554 guanylanowa 595 guanylowa 422 Cykloheksymid 506 Cyklooksygenaza 279, 280 Cynk, rola, niedobór 731 stęŜenie we krwi 927 zapotrzebowanie 733 Cystationina 377 Cysteina 40, 204, 369, 388 biosynteza 340 transami nacja wstępna 365 zapotrzebowanie 725 L-Cysleina. katabolizm 364 Cystyna 40, 41, 363 Cystyno-lizynuria 365 Cystynoza 366 Cystynuria 365 Cytarabina 424 Cytochrom(y) 148, 199, 399 aa3 140 b-245 883 — b, 144 b-558 883 P-448 819, 826 P-450 139,144,631, 818 jako dehydrogenazy 142 Cytopiazma 194 Cytoszkielet 805 Cytozol 194 Cytozyna416, 419,449 — pochodne 423 Cytrulina 42, 355 Cytrulinemia 356 Cytrynian 159, 194, 198, 199,200,201, 204, 205, 258 klomifenn 668 translokacja 256 Cytydyna 418, 419 Cytydynodifosforan (CDP) 286 Cytydynomonofosforan (CMP) 286 Cytydynotrifosforan (CTP) 137, 286 Cząsteczka©, aktywność optyczna 163 amoniaku, dipolarna 27 tetraedryczna 27 biegunowa 27 asocjacja 28 dipolarna 27 dysocjacja 28 jonizowanie 28 ----- tetraedryczna 27 Czółenko fosfokreatynowe 136 Czynnik(i), aktywujący płytki krwi (PAF)284, 287, 881,894 -------biosynteza 288 antyhemofilowy, A 784 B 784 chemotaktyczne 880 Christmasa 784 Hagematia 784 - krzepnięcia krwi 784, 785 — lipotropowy 307 poprzedzający tromboplastynę osoczową 784 Rh878

Czynnik(i), rho 479 stabilizujący, fibrynę 784 —- Stuarta-Prowera 784 układu dopełniacza 881 von WiUebranda 791, 882 wewnętrzny 704 brak 704 wzrostowe hemopoetyczne 868 fibroblastyczny 585 — insulinopodobne 585, 837 —■ — polipeptydowe 837 ----- komórek nerwowych 585, 599, 837 ------ naskórkowy 585, 837, 838 — nerwowy 585, 837 ---- pochodzenia płytkowego 585, 838 ---- transformujący 837 nerwów 585, 599, 837 DAG patrz: Diacyloglicerol Daktynomycyna 826 DBH645 Deaminacja 190, 191, 193, 203 — oksydacyjna 348 Deaminaza. adenozyn owa, niedobór 440, 542, 885 Defenzyny 881,883 Degradacja, Edmana 54 — enzymu 119 Dehydrataza, serynowa 121 7-Dehydrochoiesterol 714 Dehydroepiandrosteron (DHEA) 629, 630, 632, 666 Dehydrogenaza(y), acylo-CoA 142, 262, 695 a koenzymy nikotyn oamidowe 141 aldehydowa 140, 695 alkoholowa 117, 308 bursztynianowa 107, 142,201,202, 216 dihydrolipoilowa 696 dihydroorotanowa 434, 435 6-fosfoglukonianowa 241 gliceraldehyd o- 3- fosforanów a 1 57. 209,210, 212, 216 glicerolo-a-fosforanowa 121, 157, 209, 210, 212, 216 glicerolo-3-fosforanowa 157, 229, 595 — glukozo-6-fosforanowa 121, 241 niedobór 866, 871 glutaminianowa 338 L-glutaminianowa 349 glutaranowa 216 L{ + )-3-hydroksyacylo-CoA 264 3-hydroksymaślanowa 157 15-hydroksyprostaglandynowa 281 3p-hydroksysteroidowa 653 17-fMiydroksysteroidowa 654 1MP 429, 430 ---- regulacja aktywności 432 — izocytrynianowa 200, 201, 216, 255 jabłczanowa 158, 201, 202, 216 dekarboksylująca 255 ot-ketoglutarowa 201, 202

SKOROWIDZ / 939 (>eh v d rogenaza(y), mi Eochondrialna glicerolo-3-fosforanowa 142 — mleczanowa 209, 212, 396, 696 - izoenzymy 90, 917 ----- stęŜenie we krwi 917 — NADH 142. 150, 696 — pirogromanowa 128, 205, 213, 214, 232, 310, 595,685 - regulacja aktywności 214. 215, 258 przenoszenie wodoru 141 semialdehydu burszryniauowego 396 sorbitolowa 247 sukcynylowa 695 transport elektronów 141 utlenianie metabolitu 141 - zaleŜne od, NAD 141 NAD+, oznaczanie 86 NADH 142, 150,696 NADP 142 ----- ryboflawiny 142 Dekarboksylacja oksydacyjna 200 Dekarbok sy I aza, S- adenozyl ometion i nowa 390 — L-aminokwasów aromatycznych 388 - DOPA 397 - rola 647 L-gLitaminianowa 396 histydynowa 388 a-ketokwasowa 383, 384 omitynowa 390 oro łydy la nowa, niedobór 441 pirpgronianowa 1 J7 — uroporfirygenowa 400, 402, 403, 404 Deksametazon 632 Dekstroza 164 Dekstrynoza, graniczna 225 Dekstryny 161, 170 Demekolcyna 810 Denaturacja, białka 66 DNA 447 enzymu 100 2-Deoksy-D-rybofuranoza 167 Deoksyadenozylokobalamirja 704 Deoksy adenozyna 419 2' -Deo ksyadenozyno- 5 - monofosforan 420 Deoksyadenylan 443 Deoksycukry 167 Deoksycytydylan 443 Deofcsycytydyna 419 Deoksyguanozyna 419 Deoksyguanylan 443 11Deoksykortykostcron 632 11Deoksykortyzol 632 Deoksynojirimycyna 761 Deoksynukleotydy 443 Deoksyrybonukłeazy 488, 739, 742 Deoksyrybonukleotydy 419 Deoksyryboza lf>6 Depreml 901, 902 Depurynacja DNA 473 A*-Desaluraza 275, 276 Desmina 811

Desmolaza, cholesterolowa, niedobór 644 Desmosterol 318 Detoksykacja 818 DHEA patrz: Dehydroepiandrosteron DHT patrz: Dihydrotestosteron Diacyloglicerol (DAG) 180, 597, 791, 883 Diagnostyka prenatalna 545 hemofilii 790 w chorobie Huntingtona 892 Diazonorleucyna 430 Dietylostylbestrol 667 Difosfohydroksyetylotiamina 214 Difosfotiamina 214 Diglukuronid, bilirubiny 409 Dihydrodiol 822 Dihydrofolian 435 Dihydroksyaceton 161, 164 Di hyd rok syacetono fosforan 157, 210, 286 1,25-Dihydroksycholekalcyferol 715 24,25-Dihydroksycholekalcyferol 715 3,4-Dihydroksyfenyloalanina 42 Dihydroorotaza 122, 434, 435 Dihydrotestosteron (DHT) 653, 656, 660 Diizopropylofluorofbsforan 891 Dijodotyronina (DIT) 3,5Dijorozyna 42 Dijodotyrozyna 612, 613 Dikumaroi 719, 789 Dimerkaptol 152 N6-NeDimetyloadenina 416 Di nitrofenol i 52 Dinukleotyd, adenin owy 696 flawinoadcninowy (FAD) 140, 203, 69i flawinowy 695 nikotynoamidoadeninowy (NAD+) 83, 141, 203 Dioksygenaza(y) 144 homogentyzynowa 144 3-hydroksyamranilanowa 144 4-hydroksyfenylopirogronianowa 368 — L-tryptofanowa 144 1,2-Dioksygeneza homogentyzynianowa 368, 370 2,3-Dtoksygenaza tryptofknowa 375, 399 Dipalmitoiiofosfatydylocholina287 Dipalmitoilo lecytyna 179 Dipeptydaza(y) 742 aminoacylohistydynowa, niedobór 387 Dipol 27 Disacharyduria 745 Disacharydy 161, 168, 169 Disulfiduria merkaplomleczano-cysteinowa 365 DIT patrz: Dijodotyromna DNA patrz: Kwas deoksyrybonukkotydowy Dolichol 184, 318, 756 — biosynteza 316 Dolicholo-Poligosacharyd 758

Dppa 42 Dopa a- 901 Dopamina 600 Dwutlenek węgla 189, 190, 194. 198, 205 Dyfrakcja, promieniami X 21 Dyfuzja, bierna 563 prosta 743 ułatwiona 565 Dyneina 810 Dysbetalipoproteinemia rodzinna 327 Dysgeneza gonad 669 Dyslipoprotcinemie 326 Dysmutaza, ponadtlenkowa 145, 146, 870, 883 Dysocjacja wody 28 Dystrofia, mięśniowa typu Duchenne'a 794, 847, 860 — miotoniczna 898 Dziedziczność 443 Edrofonium 891 Efekt, Bohra 77, 78 — buforujący 33 Pasteura 232 Efektor(y) allosteryczne 123, 125, 196 ujemny 124 EGF 585 Egzocytoza 571 Egzonukleaza 474, 547 Eikozanoidy 174,881, 894 biosynteza 279, 280 Ekscytytotoksyny 892 Eksony484, 491, 530, 547 Eksplozja tlenowa 883 Ekspresja genu 508 Elastaza 738, 885 Eiastyna8I4 a kolagen, róŜnice 815 Elektroforegram 47 Elektroforeza 21, 771 w Ŝelu poliakryloamidowym 53 wysokonapięciowa 47, 52 na sitach molekularnych 53 SDS-PAGE 872 Elektrolity 26 Elektrony przenoszenie 141 przez cytochromy 142 w łańcuchu oddechowym 142 Eliptocytoza dziedziczna 876 Emulsje 186, 187 Encefalopatia 147 motochondialna 896 Wernickego 694 Endocytoza 569 Endoglikozydaza 752 Endonadtlenek 184 Endonukleaza(y) 488, 531, 547 apirymidynowa 474 apurynowa 474 restrykcyjne 92, 489 Endopeplydazy 345 p-Endorfiny 575, 607 Endorfiny, struktura i funkcja 609 Energia swobodna 131 Enkefaliny 691

940 / SKOROWfDZ Enolaza 209, 211 Entalpia 132 Enteroglukagon 691 Entropia 131 Etizym(y), aktywność, a jony metali 115, 116, 117 ---- a modulatory 109 ---- a oznaczanie ilości 86 ---- a pH 100 ---- a temperatura 100 ---- hamowanie, kompetycyjne 108 --------kooperatywne 135 ---- kumulatywne 125 - — przez sprzęŜenie zwrotne 121 127 ---------- wielowartokiowe 125 —inhibitor, allosteryczny 126 zwrotny 124 ---- katalityczna, regulacja 122 ---- regulacja 118 aktywowane przez metale 115 allosteryczne 125 ---- kinetyka wiązania substratu 126 ■ wiązanie substratu, kooperaty wne 126, 127 analiza ilościowa 86, 87 biosyntezy hemu 404 degradacja 119, 345 regulowanie 121 denaturacja 100 działanie mechanizm 84 hydrolityczne, miejsca katalityczne 99 indukcja 118 inhibitory, kompetycyjne 107 ---- niekompetycyjne 107 ------- nieodwracalne 109 --- — odwracalne 109 — jako katalizatory kwasowo-zasadowe 114, 115 — kinetyka nasycenia substratem 106 klasyfikacja 82 kobal amidowe 117 kompartmentacja 122 kompleksy wielkocząsteifcijowe 123 konstytutywne 120 mechanizm działania 110 ----- a doświadczenia stop-flow 110 ----- a jony metali ! 16. 117 - — miejsca aktywne 97 ------ allosteryczne 124, 125 — ■ ---- a inhibitory 107 ----- foslbrylacji 137 - katalityczne 97, 99, 125 ------a inhibitory 107 — model, indukowanego dopasowa nia się 98 ----- zamka i klucza 98 modyfikacja kowaiencyjn a 196,197 nazewnictwo 82 obrót metaboliczny 120 oczyszczanie 87, 88 odgałęziający 220 oligomeryczne 90 osocza, analiza ilościowa 91 i ----- niefunkcjonalne 91, 92 ----- wykorzystaniediagnostyczne92

Enzymd1}, powinowactwo do substratu 106 procesów syntez 197 przekształcający angiotensynę 637 reakcja, zastąpienia 94 ----- a stęŜenie substratu 101, 103 ----- szybkość początkowa 103, 104 — regulacja, aktywności 118 przez modyfikację kowalencyj ną 127, 128 ----- mechanizmy 119 ----- nieprawidłowa w komórkach nowotworowych 118 — — przez efektory allosteryczne 123 ----- przez kationy 123 — — przez koenzymy 123 przez metabolity 123 ----- przez sprzęŜenie zwrotne 123, 124, 127 — — przez substraty 123 ----- przez syntezę proenzymu 122 regulatorowe 123, 195 restrykcyjne 93 rozgałęziający 219 rozmieszczenie w komórce 89 rozszczepiający cytrynian 122 równowaga, dynamiczna 121 sprawność katalityczna 122 stan przejściowy 94, 95 zmiany wolnej energii 95 struktura czwartorzędowa 69 swoistość 85 ■---- optyczna 85 — synteza 119 derepresja 120 -----induktory, gratisowe 120 ----- korepresory 112 -----represja za pomocą, katabolitu 120 -----------produktu 120 szlaku degradacji 197 wątroby szczura, adaptacja do zmian w środowisku 121 wiązanie substratu 114 zmiana ładunku 101 znaczenie biomedyczne 82, 94 Epimeraza 248 urydynodifosfogalaktozowa 290 3-Epimeraza rybulozo- 5-fbsforan owa 241 Epimcry 164 Epinefryna, stęŜenie we krwi 927 Epoksydaza, skwalenowa 317 Epoksydy 822 Ergokalcyferol 714 Ergosterol 183 Ergotioneina 386, 388 Erytrocyt(y), białka błony 873 budowa i funkcja 866 metabolizm 869 sierpowaty 81 uwalnianie tlenu 213 Erytrokruoryny 399 Erytropoetyna 837, 867, 885 Erytroza 161 D-Erytroza 165

Erytruloza 161 Esteraza cholesterolowa 319 Estradiol 632, 653, 656 — rozwój gruczołu sutkowego 666 17-P-Estradiol 631, 661, 663 Estriol 632, 666 Estrogeny 585, 588, 660 biosynteza 660 funkcja 664 mechanizm działania 668 metabolizm 661 syntetyczne 667 Estron 632, 656 Estry cholesterolu 294, 295 osocza 322 Estryfikacja 190, 308 Etanol 307 zatrucie 858 Etanolamirta 180 Elanoloamina 180 Etiocholanon 632 N-Etylomaleimid 159 17ct-Etynyloestradiol 667 Euchromatyna 459 Eumelaniny 394 FAD patrz: Dinukleotyd flawinoadeninowy Fagi 534 Faza, folikularna. 663, 664 lutealna 663, 664 Fenolaza 140 Fenotiazyny 802 Fenyloalanina 41, 204 hydroksylacja 371 katabolizm szlaki alternatywne 373 zaburzenia 371 metabolity 372 — - zapotrzebowanie 725 Fenyloizotiocyjanian 56 Fenyloketonuria 13, 542, 847, 848, 851 — klasyczna 371, 372 Feomelaniny 394 Ferrechelataza 400, 401, 403, 404 Ferryna stęŜenie we krwi 927 Ferrytyna 775 FGF 585 Fibronektyna 814, 882 hibryna 787, 790 Fibrynogen 784, 785, 787 -- stęŜenie we krwi 927 Fibrynoligaza 784 Fibrynopeplydy A 787 Filamenty pośrednie 811 Fi lani i na 806 Filtracja Ŝelowa 21, 52, 87 Flawina 695 Flawoproteina{y) 140, 148, 199, 202, 348 — przenosząca elektrony 142, 264 Horyzyna 237 Fluor 731 — zapotrzebowanie 732 ' Fluorescamina 44 l-Fluoro-2,4-di nitrobenzen 54 Fluorocytrynian 200, 201

9ct-Fluorokortyzol 632 5-Fluorouracyl 423, 436 FMN patrz: Mononukleotyd flawinowy Folacyna 705 Folkropina (FSH) 585, 599, 657, 784 -- działanie 606 — spermatogeneza 657 ł'ormamidaza 375 Fo rmyloglicynoatnid orybozy I o- 5-fosforan 427 Fosfagen(y) 135, S03 Fosfataza(y) 740 - białek 128 — białek-1 220, 221, 223, 224

— 2,3-bisfo5foglicerynianowa212,213 fosfoprotein 594 2p-fosfoproteinowa 595 kwaśna, aktywność 918, 928 gruczołu krokowego 825 zasadowa aktywność 918, 928 Fosfatydan 286 5-Fosfatydylo-l-pirofosforan(PRPP) Fosfatydylocholiny 179 — metabolizm 289 Fosfalydyloetanoloamina 179 3-Fosfatydyloetanoloamina 180 Fosfatydyloglicerol 179 Fosfatydyloinozytol 180 Fosfatydyl o inozy tol o-4.5-bisfosforan 180, 791 Fosfatydyloseryna 180 Fosfodiesterazafy) 220. 422, 593, 685 CAMP421 — cyklicznego, 3', 5'-nukleotydu 311 ----- nukleotydu 595 Fosfoenoiopirogronian 194, 204, 211, 212, 226 Fosfofruktokinaza 209, 210, 212, 246 Fosfofruktokinaza-1 232 Fosfofruklokinaza-2 232 Fosfoglicerole biosynteza 286 Fosfoglicerydy 179, 180 2Fosfoglicerynian 211 3Fosfoglicerynian 210, 211, 212 Fosfoglukomutaza 217 Fosfohydrolaza fosfatydanowa 286 hosfoinozytydy 594, 596 Fosfokinaza kreatynowa 803, 919, 928 Fosfokreatyna 136 Fosfolipaza(y) 2S7, 289, 740, 742 A, 289 Aj 289, 595, 739 C289 C597 C791

C883 D 289

Fosfolipidy 173, 179,187, 289, 294, 302 glicerolowe biosynteza 287 płytkowe 7S4 w błonach 551 4'-Fosfopanteteina 698 Fosfoproteiny 592 Fosfor 729 nieorganiczny stęŜenie we krwi 919, 928 -łl- -.1 Jn I.

Fosfor, zapotrzebowanie 733 Fosfbran(y). dinukleotydu nikotynoamid o-adeni nowego (NADP+) 141, 239,240, 241, 255,696 kreatyny 803 organiczne bogatoenergetyczne 133, 134, 199 ---- energia swobodna hydrolizy 134 ---- małoenergetyczne 134 — pirydoksalu 347, 700, 702 5-Fosforybozulo-l-pirofosforan 427 Fosforybozylacja wolnej puryny 430 Fosforybozylotransferaza, adeninowa 430 — hipoksantynowo-guaninowa 430, 431,440 — orotanowa 434, 435, 436 ---- niedobór 441 Fosforylacja, oksydacyjna 135, 147, 151, 191, 199, 803 subsLratowa 216 wielomiejscowa 225 Fosforylaza 685 a 197, 225 b220 glikogenowa 128 nukleozydowa puryn niedobór 440 w mięśniu 222 Fosfotransferaza 117 Fragmenty Okazaki 468 Frakcja{e), cytoplazmy 20 jądrowa 20 mikrosomalna 20 mitochondrialna 20 wewnątrzkomórkowe 20 Frakcjonowanie, subkomórkowe 18 za pomocą soli 21 Fruktokinaza 247 Fruktoza 161, 247 — metabolizm 245, 246 — nietolerancja wrodzona 247 D-Fruktoza 164, 166 Fruktozo-1,6-bisfosfataza 121, 227, 243, 247 niedobór 237 Fruktozo- 1,6-bisfosforan 210, 227 fruktozo- 2,6- bisfosfataza 232, 685 Fruktozo-2,6-bisfosforan 232, 233 Fruktozo-6-fosforan 210, 227 6Fruktozo-2-kinaza 685 Fruktozobisfosfataza 121 Fruktozuria samoistna 239, 247 Fruktozydoza 292 FSH patrz: Folitropina Fukoza 751 L-Fukoza 167, 171, 172 Fukozydaza 767 Fumaran 107, 194, 199, 201, 202, 204, 355, 36S Fumaraza 202, 220

CAG patrz: Glikozaminoglikany Galactorrhoea 605 Galaktocerebtozyd 181 Galaktokinaza 248

J3 a laktoza 161. Ti szlak przemiaay 9BH — test tolerancji 14* D-Galaktoza 165, 166 a-D-Galakioza 164 Galaktozamina 167. 250 Galaktozemia(e) 239, 249, Ul Galaktozydaza 752 p-Ga laktozydaza 766 Galaktozydy 167 Galaktozyloceramid 181, 290 Galaktozylotransferaza 554 Gangliozydoza uogólniona 292 Gangliozydy 172, 181, 182, biosynteza 291 w błonach 551 GAP 599, 600 Gastroenteropatia z utraty białka 773 Gastryna 585, 691 Gemfibrozyl 326 Gen(yj^annplirikacja 835 chimeryczne 523 ekspresja 508 fuzyjne 523, 588 hamujące wzrost nowotworu 839 homologiczne polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych 93 indukowatny 510 insuliny 677 mapowanie 541 MT-PK 898 regulacja ekspresji 516, 518 metody 518 Z 512 Genom mitochondriaJny mutacje 847 Gęstość względna 928 GH patrz: Hormon wzrostu GHRH patrz: hormon uwalniający hormon wzrostu GHRIH patrz: Hormon hamujący uwalnianie hormonu wzrostu GIP patrz: Peptyd Ŝołądkowy hamujmy Giraza bakteryjna 447 GIcNAcdifosfo-dolichol 757 Gliceraldehydo3-fosforan 210, 211, 239

Glicerofosfolipidy 173 Glicerofosforan 194 Glicerol 194, 227, 234, 334 Glicerolo-2,3,-bisfosforan 212 Glicerolo-3-fosforan 157, 308 Glicerolofosfolipidy degradacja 287 Ghcyna 39, 204, 363, 397, 400 — biosynteza 339 katabolizm 362 Glicynoami dorybozylo- 5-fosforan427 Glicynuria 362 Glikoforyna(y) 172, 874, 875, 879 Glikogen 161. 169, 170, 189, 191, 194, 207, 219, 227 biosynteza 217, 218 choroby spichrzania 217, 225 metabolizm, regulacja 220, 224 — w wątrobie 225 Glikogenogeneza 192, 218, 219 regulacja 220. 224

942 / SKOROWIDZ Glikogenoliza 192, 218, 219, 234 enzymy 230 pobudzanie 233 regulacja 220, 224 w mięśniu 221 w wątrobie 221 Glikogenoza typ I 225 typ II 225 typ III 225 typ IV 225 typ V 225 typ VI 225 — typ VII 225 - typ VIII 228 z niedoboru miofosforylazy 225 Glikokaliks 172 Glikokortykoidy a lipoliza 310 Glikokortykosteroidy 237 Glikolipidy 173, 181, 248 — choroby spichrzeniowe 284 Glikoliza 135, 189, 191. 207, 208,216, 226, 308 a cykl kwasu cytrynowego 213 enzymy 230 etapy 212 hamowanie 213, 231 pobudzanie 233 regulacja w wątrobie 228, 229, 233 Glikoneoseneza znaczenie biomedycz ne 226 Glikoproteiny 167, 171, 172, 248, 250, 749 degradacja 346 Funkcje 749 glikozydacja 760 klasy 753 Glikosfmgolipidy 173, 181, 250, 290, 291 — w błonach 551 Glikozaminoglikany (GAG) 171, 749, 761 — właściwości 763 Glikozuria 237 Glikozydacja giikoprotein 760 Glikozydazy 752 "**> Glikozydy 165 — nasercowe 167 Globina 407 Giobulina(y), antyhemofilowa 784 — stęŜenie we krwi 928 — wiąŜąca, hormony płciowe 655 ---- kortykosteroidy 629, 635 ---- testosteron i estrogeny 655 ---- tyroksynę 616 -------- stęŜenie we krwi 920 Glukagon 220. 231, 236, 259, 585. 589, 671, 672 — rola 688 — sekwencja aminokwasowa 689 — synteza 68 Glukany 169 Glukokinaza 208, 209, 212, 217, 234, 236 Glukokortykoidy 585 efekty biologiczne 638 mechanizm działania 640 przemiana i wydalanie 635

Glukokortykoidy. regulacja syntezy 636 synteza 634 transport w osoczu 635 Glukoneogencza 192, 303, 204, 234, 331, 704 a insulina 680 enzymy 230 pobudzanie 231 regulacja w wątrobie 228, 229, 233 — z białek 334 D-Glukopiranoza stereoizomery 164 Giukoza 161, 189, 193, 194, 204, 205, 227, 308, 403, 751 a stęŜenie insuliny 677 epimeryzacja 164 izomery 162 metabolizm 191 zwiększony 309 postać, furanozowa 163 pirazonowa 163 próg nerkowy 237 stęŜenie, fizjologiczne we krwi 217 ------- we krwi 920, 928 ------- a hormony przedniego piąta przysadki 236 ------- a hormony tarczycy 237 ------- a insulina 236, 677 -------- regulacja 233, 234 tolerancja organizmu 237, 238 transport 568 przez błony 744 utlenianie minimalne 331 zapotrzebowanie 226 źródła 234 D-Glukoza 165, 166 2-D-Glukoza 164 Glukozami na 167 Glukozami nogi i kany 250 Glukozany 169 Glukozo fosforany 5 89 Glukozo-6-fosfataza 227, 554 Glukozo-1-fosforan 227 Glukozo-6-fosforan 208, 210, 220, 227, 239 Glukozoamina 250 Glukozuria 237 nerkowa 237 Glukozydy 166 Glukozyloceramid 181, 2.90 G luk uro niań 244 a-D-Glukuronian 165 Glukuronidacja 819 P-Glukuronidaza(y) 410 niedobór 767 Glukuronidy 239 sprzęgnięte 244 Glutamina 40, 204, 350, 427 biosynteza 339 deaminacja 359 Glutaminaza 350 Glutaminian !58, 204, 347 biosynteza 338 transaminacja 359 Ł-Glutaminian 348 Ghitation 51,870 Głodzenie 306

Głodzenie, parametry metaboliczne 333 Gnilec 709 GnRH patrz: Hormon uwalniający gonadotropinę Gonad oliberyna 585, 599, 600 Gonadotropina(y) 606, 663 — kosmówkowa (HCG) 575, 585, 589, 575, 585, 589, 599 ----- działanie 606 ----- funkcja 664 ----- stęŜenie w ciąŜy 665 Granulocyty 865 — obojetnochłonne, cechy biochemi czne 880 ----- enzymy i białka 881 GRH 599 Gruczolak przytarczyc 624 Gruczoi(y), Brunnera 739, 742 — Ebnera 734 języka 741 -- sutkowy 666 Grupa{y) 143 aminowa 36 — a-aminowa 347 - karboksylowa 36 krwi 876 Gryzeofulwina 819 Grzebień nerwowy 574 Guanaza 433 Guanina416, 419, 449 Guanozyna418, 419 pochodne 422 Guanozyno-3', 5r-monofosforan (cGMP) 422 Guanozynotrifosforan 137 Guz chromochlonny 651 Hamowanie kompetycyjne 108 Haptoglobina(y) 774 — stęŜenie we krwi 928 HDL patrz: Lipoproteiny o duŜej gęstości Heksokinaza 136, 195, 208, 209, 212, 217,236 oznaczanie 87 Heksozoaminy 249, 250 Heksozy 161, 171 szlaki przemian 239 znaczenie fizjologiczne 166 Heliks a 62 Hem 70, 398 — biosynteza 385, 400, 401 enzymy 404 -----regulacja 404 katabolizm 407 metabolity 404 -----zaburzenia 405 Hematokryt 867 Hematyna 403 Hemina 407 Hemochromatoza 846 pierwotna 776 » Hemofilia 847,851 A 789 B789

SKOROWIDZ / 943 Hemoglobina(y), 70, 407 a transport dwutlenku węgla 77 A 74, 79 A, 74 F74 funkcje 74 krzywa dysocjacji tlenowej 73 M 79 mutacje 19 płodowa 74, 78, 79 podobieństwo do mioglobiny 74 postać R 75. 76 ----- T 75, 76 ' -------- stabilizacja 78 powinowactwo do tlenu 74 S79 ----- agregacja 80 ----- lepkie miejsca 79 — utlenowanie 74 ----- a zmiany konformacji 75, 76 właściwości aliostcryczne 74 zwiększenie powinowactwa do tle nu 79 Hemoglobitiopatia(e) 79 — HbS 847 Hemoliza 241 Hemopeksyna 775 Hemoproteiny 117, 398 Hemostaza etapy 783 Hemosyderyna 776 Heparyna 171, 302, a 763, 765, 768 jako anty koagulant 789 Hepatocyt szczura 18 Hepat omega lia 845 Heterocbromatyna 459 fakultatywna 459 konstytutywna 459 Hialuronidaza 766 Hiperalaninemia 728 Hiperalfalipoproteinemia rodzinna 328 Hiperamonemia(e) 355 z hiperlizynemią 375 Hipcrargininemia 356, 361 Hiper-p-alanincmia 386 Hiperbilirubinemia niesprzęŜona 411 retencyjna 411 sprzęŜona 411, 412 toksyczna 412 zwrotna 411 Hipercholesterolemia 325 rodzinna 303, 847 — typ II 327 Hiperfenyloalaninemie 371, 372 Hiperglikemia 678 Hiperhydroksyprolinemia 367 Hiperkalcemia 926 Hiperkalemia 923 Hiperlipoproteinemia(e) 327 rodzinna, typ III 327

-----

typ V 327

Hiperlizynemią okresowa, bez hiperamonem ii 375 — z hiperamonemią 375 Hipermagnezemia 922 Hipernatremia 923 Hiperoksaluria pierwotna 362 Hiperprolinemie 359

Hipersyderemia 927 Hipertriacyloglicerolemia rodzinna 327 Hiperurykemia 439, 921 Hiperurykozuria 922 tfiperwalinemia 383 Hipobetahpoproteinemia rodzinna 326 Hipoglicyn 265 Hipoglikemia 236, 237, 238, 247 Hipogonadyzm 659 u kobiet, pierwotny 669 wtórny 669 u męŜczyzn, pierwotny 659 ---- wtórny 659 Hipokalcemia 926 Hipoka letnia 923 Hipoksantyna 416 — pochodne 422 Hipoksja 199, 200 Hipolipoproteincraia 326 Hipomagnezemia 922 Hiponatremia 923 Hiposyderemia 927 Hipourykemia(e) 439, 440, 922 Hipuran biosynteza 385, 386 Histamina 385, 881 Histony 456 Histydyna40. 41, 204,343 dekarboksylacja 388 katabolizm 361 zapotrzebowanie 725 Histydynemia 362 HMM 798 Holoenzym 83 Homeostaza 94, 118 fosforanowa rola paratbormonu 623 komórkowa 119 — wapniowa rola paralhormonu 623 Homocysteina 377, 41 Homocystynuna(e) 366, 728 Homogentyzynian 368 Homokarnozyna 386, 387 Homoseryna 41, 379 Hormon(y), adrenokortykotropowy patrz: Kortykotropina — antydiuretyczny (ADH) patrz: Wazopresyna charakterystyka układów 573 i— działanie 584 gJikoproteinowe 605 gonadalne 652 — hamujący uwalnianie, hormonu wzrostu (GHR1H) 599 ---- proiak-tyny (PRIH) 600 jajnikowe 659 rola 662 katecholaminowe 645 kontrola metabolizmu 196 konwersja 575 - kortykotropowy (ACTH) patrz: Kortykotropina — kory nadnerczy 629 laktotropowy patrz: Prolaktyna luteinizujący patrz: Lutropina luteotropowy patrz: Prolaktyna łoŜyskowe 664 narządy docelowe 576

Hprmonfy), pobudzający melanocyty patrz: Melanotropina 609 podstawy klasyfikacji 584 przedniego ptata przysadki a stęŜe nie glukozy we krwi 236 przekaźniki działania wtórne 2S4 rdzenia nadnerczy 645 receptory 578 — tarczycy 612 a lipoliza 310 ----- a stęŜenie glukozy we krwi ----- mechanizm działania 617 — trzustki 671 tyreotropowy (TRH) p. Hormon uwalniający tyreotropinę tyreotropowy patrz: Tyreotropina uwalniający, gonadotropinę (GnRH) 599 ----- hormon wzrostu (GHRH) 599 ----- kortykotropine(CRH)589,599, 600 ------ tyftotropinę (TRH) 585, 599, 600 — wzrostu (GH) 585, 599, 585, 599 budowa 603 ----- działanie 603 ----- efekty prolaktynopodobne 604 — — niedobór 542 patofizjologia 604 ----- przemiana, elektrolitów 604 — ■ ---- lipidów 604 -------- węglowodanów 604 — struktura genu 602 — synteza 603 -------- białka 603 ------w karłowatości 604 — Ŝołądkowo-jelitowe 671, 690 cechy 690 HVA 901 Hybrydyzacja 541, 547 Hydrataza, akonitowa 200. 201 — fumaranowa 202 Hydrataza-A7-enoilo-CoA 264 Hydrokorlyzon 600 3-Hydroksyantranilan 375 p-Hydroksy-p-metyloglutarylo-CoA 3S0 3-Hydroksy-3metyloglutaryto-CoA 268 25-Hydroksycholekalcyferol 715 Hydroksycynamonian 159 pHydroksyfenylopirogroman 368 fS-Hydroksyizobutyrylo-CoA 382 p-Hydroksyizomaślan 382 3Hydroksykinurenina 375 Hydroksykobabmina 704 Hydroksylacja, leków 144 steroidów 144 w mitochondriach 144 Hydroksylaza(y) 144 fenylo alanin owa 340, 342 tyrozynowa 646, 902 — węglowodorów aromatycznych 819, 826 21-Hydroksylaza 633,634 — niedobór 644 la-Hydroksylaza 626

944 / SKOROWIDZ 7a-Hydroksylaza 323, 324 17a-Hydroksylaza 654 11 p-Hydroksylaza 633, 634 niedobór 644 fi-Hydroksylaza dopaminowa 645 roia 643 Hydroksylizyna 342 Hydroksyloamina 55 D(-)-3-Hydroksymaślan 266, 267 5-Hydroksymetylocylozyna 416 Hydroksymetylotransferaza 341 serynowa 362 17-Hydroksyprogcsteron 663 Hydroksyprolina 204 biosynteza 341 katabolizm 367 5-Hydroksytryp tarnina 391 Hydrolaza, fumaryloaretooctanowa 368 giukonolaktonowa 241 Hydroliza, łagodna kwaśna 55 zasadowa peplydu 54 I celi disease patrz: Choroba wtrętów komórkowych pL-Iduronian 165 aL-Iduronidaza 766 niedobór 767 IGF 837 I 585, 599, 687, 837 II 585, 599. 687, 837 I i II 837 — porównanie z insuliną 687 Iloraz irtsulino-glukagonowy 689 Iminokwasy 41 Immunoglobiilma(y) 778 budowa cząsteczki 779 G, model cząsteczki 779

stęŜenie w osoczu 915 właściwości 780 IMP patrz: In ozynorn on o fosforan Informacja genetyczna 443 Inhibitory). 1, 221 allosteryczny 126 t% cholinesterazy 891 kompelycyjne 107 niekompetycyjne, nieodwracalne 109 i --------odwracalne 109 — zwrotny 124, 125 Inozynomonofosforan (IMP) 427 Inozylolo-l,4,5-tnslbsforan 791, 883 Insulina 223. 236, 237, 238, 259, 310—312, 671 czynniki farmakologiczne 677 czynniki hormonalne 677 ekspresja genów 685 gen 677 glukoneogeneza 680 metabolizm 677 niedobór 678 - patofizjologia 687 podziały komórkowe 682 przemiana, białek 681 * ■ glukozy 680 - tłuszczowa 680

Insulina, regulacja wydzielania 677 róŜnice miedzygatunkowe 673 struktura 672 translacja mRNA 685 utylizacja glukozy 679 wytwarzanie 675 znaczenie biomedyczne 672 Integryny 880, 882 Interleukina I i II 837 Introny 462, 484, 530, 547 In uli na 169 Iproniazyd 393 Izocytrynian 199, 200, 201 Izoenzymy 89 rozdzielanie 90 Izoleucyna 39, 204 katabolizm 377, 378, 380 reakcje swoiste 382 zapotrzebowanie 725 Izomaltaza 743 lzoineraza, 3-cis- 2-trans-enoilo-CoA 265 cis, transmaleiloacetooctanowa 368 fosfoheksozowa 209 (bsfotriozowa 209, 210 ksylozowa 117 Izomer(y), konstytucyjne 164 optyczny 163 Izoniazyd 698 Izopentenylopirofosforan 315 I2olopy, cięŜkie 24 radioaktywne 24 trwale 24 w biochemii Izozym 89 Jabłczan 158, 15S, 199, 201, 202 Jajniki 659 Jądra 652 nadwzrokowe 609 przykomorowe 609 regulacja hormonalna 657 zespół feminizacji 659 Jądrzaki 669 Jednostki, enzymatyczne 86 SI 912 Jelito, cienkie 741 czcze 747 grube, rak 726 O-Jodobenzen 55 5-Jodo-2-deoksyurydyna 423 5-Jododeoksyurydyna 424 Jodotyrozyny, sprzęganie 616 Jodowanie tyrozyny 615 Jod, przemiana w pęcherzyku tarczycowym 614 rola, Ŝródla 730 utlenianie 615 zagęszczanie w tarczycy 615 zapotrzebowanie 733 Jonofory 160 Jon(y). amonowy 349 — karboksylowe 36 metali regulacja aktywności enzy mów 123 sodowe 26

Kalcytonina 585, 589, 825 — homeostaza wapniowa 628 Kalcytriol 5S5. 624 - biosynteza 626 patofizjologia 627 regulacja syntezy i przemiany 626 wpływ na błonę śluzową jelita 627 Kalmodutina 221, 595, 798 Kamica, ksantynowa 440 nerkowa 846 Kamienie, moczowe 418 nerkowe 845 Ŝółciowe 314, 734 Kancerogeneza 828 inicjator i promotor 828 onkogeny 829 Kancerogeny 822, 825 chemiczne 826 ----- metabolizm 826 Karbamoiłoasparaginian 125, 434, 435 Karbatnoilofosforan 125, 355, 433 — biosynteza 354 Karbamoiłotransferaza, asparaginianowa 122, 125.434,435, 436 — ornitynowa, niedobór 441 Karbid opa 902 Karboksyklnaza fosFoenolopirogronianowa 203, 227 Karboksyłaza acetylo-CoA 128, 251, 252, 310,685, 703 regulacja aktywności 258, 2?9 fosfoenolopirogronianowa 204 0-metylokrotonylo-CoA 703 pirogronianowa 117, 204, 226, 231, 232, 595 — propionylo-CoA 227 Karboksyna 152 Karboksypeptydazall7, 345, 739, 742 Karboksyproteinaza prokola genowa 812 Kardiolipina 157, 179 biosynteza 287 Karłowatość, typu 1.armia 604 z niedoboru GH 604 Karnilyna 261, 262 Karnozyna 386, 387 p-Karoten 184, 711, 713 stęŜenie we krwi 928 Karotenoidy, działanie przeciwnowotworowe 713 Kaskada glutamin i anowa 895 Katabolizm 132 Katałaza 143, 349, 399, 870 Kataliza enzymatyczna 95 — kwasowo-zasadowa 114, 115 ogólna 114, 115 ----- swoista 114, 115 mechanizm, działania 110 ------jony metali 116, 117 — wiązanie substratu 114 Katecholaminy, a-adrenergiczne 585 P-adrenergiczne 585 klasyfikacja 650 magazynowanie i uwalnianie 648 metabolizacja 648 — synteza 649 Katepsyna B i D 622

SKOROWIDZ I 945 Kationy, stęŜenie a aktywność enzymów 123 Kefalina 179 Keratyna 811 Ketogeneza 190, 260, 266, 334 regulacja 270 w wątrobie 268, 269 a-Ketoglutaran 159, 194, 199—202, 204,359, 361, 377 Ketoizomeraza rybozo- 5 -fosforanowa 241 i-Ketokwasy 347. 348 . — aminokwasów o rozgałęzionych łańcuchach bocznych 342 Ketonemia 267, 270 Ketonuria 267 — łańcuchów rozgałęzionych 383 — nawracająca 384 Ketony 161 Ketoza 267 bydła 307 — w okresie laktacji 335 — głodzenie 334 Kinaza 128 adenozynowa 430 — adenylanowa 117, 137, 157, 232 niedobór 225 — białek 591. 685 C 791 rodzaje 591 - zaleŜna od, cAMP 197,221,234 — niedobór 225, 311 kalmoduliny 223 bialkowo-tyrozynowa 830 deoksycytydynowa 430, 435 difosfonukleozydowa 137, 202 dolicholowa 757 fosfoglicerynianowa 209, 210, 212, 216 -----fosforylazy 220, 595, 685

-----a 221 -----b 128

gUcerolowa 136. 229, 285, 286, 308 kreatynowa 136, 157 miozyny 595 monofosforanowa swoista 138 nukleozydoinonofosforanowa 430 pirogronianowa 117, 209, 212, 216, 231, 595, 685, 703 — niedobór 866, 879

pirydoksalowa 700 reduktazy HMG-CoA 128 -- tymidynowa 435 urydynowo-cytydynowa 435 Kinureninaza 375 Klatryna 319 Klofibrat 326 Klomifen 668 Klon 547 Klonowanie DNA 534 — wektory 534 Klozapina 907 Koagulaza gronkowcowa 787 Kobalamina 703, 704 Kobalt 730 Kod genetyczny 491 Kodony nonsensowne 492

Koenzym(y) 83 — A
— Q (CoQ) 149 - pochodne nukleotydów 422, 423 Kofeina 311, 417 Kolagen 811, 785 choroby 814

a elastyna, róŜnice 815 modyfikacje 812 typy 813 Kolagcnaza 885 Kolchicyna 810 Kolestypol 326 Kolipaza 739 Komórka(i), ciałka Ŝółtego 606 eukariotyczna 18 komunikowanie się 291 Kupfera 622 Uydiga 606, 652, 658 nowotworowe, regulacja enzymaty czna nieprawidłowa 118 Sertolego 606, 653 Kompleks, dehydrogenazy pirogromanowej 213 enzym-inhibitor 107 enzym-substrat 97 enzymów wielkocząsteczkowy 123 hydroksylazy fenyloalaninowej 340 reduktazy rybonukleotydowej 4.12 syntazy kwasu tłuszczowego 252, 253, 259 Konformacja peptydu 51 Konkanawalina 753 — A 172 Kontakt międzykomórkowy 291 Konwersja, genu 465 — hormonów 575 Koproporfirynogeny 402 Koproporfiryny 399 Koprostanoi 183, 322 Koprosterol 183 Kora nadnerczy, hormony 629 niewydolność wtórna 643 patofizjologia 643 Kortykoliberyna (CRH, CRF) 585, 589, 599, 600 ludzka, struktura 600 owcza, struktura 600 Kortykosteron 630, 632 Kortykotropina (A.CTH) 599, 629 struktura i funkcja 608 Kortyzoi630, 631, 632,656 stęŜenie we krwi 928 Kortyzon 632 Kosmidy 534, 547 Kosyntaza uroporfirynogenowa 403, 404 Kotransport 213 Kotromboplastyna 784 Krasnoludkowatość 687

KrąŜenie wrotne 743 Kreatyna 136 biosynteza 3S6, 396, 397 wydalanie z moczem dobowe 920 Kreatynina, biosynteza 396 stęŜenie we krwi 920 wydalanie 397 — z moczem 921 Kretynizm 618 Krew, funkcje 700 — przetaczanie 876 ukiad(y) grupowy(e) 876 ----- AB0 877 ----- MNSs 879 Krystalografia 21 rentgenowska 67 Kryształy moczanowe 438 Krzepnięcie krwi, czynniki 784, 785 szlak, zewnątrzpochodny 786 — wewnątrzpochodny 784 - tes^laboratoryjne 793 Krztusiec 590 Krzywica 624, 627, 715 — typu 11 oporna na witaminę D 583 Ksantozynomono fosforan 430 Ksanturenian 375, 377 Ksantyna 416, 418 Ksantynuria 440 Ksantyny metylowane 417 Ksenobiotyki 817 elektrofilowe 820 toksyczność 821 Ksyloza 171 D-Ksyloza 165, 166 D-Ksyluloza 164 L-Ksyluloza 166, 244 Kwas(y), N-acetyloneuraminowy 171, 172,291, 751 acetylosalicylowy 280 p-anfun o benzoesowy 705

2-aminoetylosulfonowy 43 2-amino-4-hydroksymasłowy 41 p-am i noizo masłowy 43 y-aminotnasłowy 43 4-aminomaslowy 43 2-amino-4-merkaptomaslowy 41 3-ammopropionowy 43 2-aminoO-sulfinopropionowy 41 2-amino-5-ureidoamylowy 42 — arachidonowy 176, 282, 792, 836 przemiana 281 — arachidowy 175 argminobursztynowy 42 — askorbinowy 239, 708 -----niedobór 709 -----stęŜenie we krwi 928 - asparaginowy 40 behenowy 175 cerebronowy 181 cerwonowy 176 chenodeoksycholówy 323, 737 cholewy 322 cysteinosulfinowy 41 dekanowy 175 deoksyrybonukleinowy (DNA) 456 budowa 443, 444, 448 ---- cząsteczka kolista 447

946 / SKOROWIDZ Kwasfy), deoksyrybonukleinowy (DNA), delecje 544 ---- denaturacja 447 -------- efekt hiperchromiczny 447 ---- depurynacja 473 —■ — insercje 544 ---- kancerogeneza 828 - — końce, lepkie 532

-------- tępe 532, 547 ---- mitochondrialny 895 — — naprawa 473 ---- pasmo, kodujące 445 ---- ■ — matrycowe 445

---- postać, K 446 ---- — B 445 ------- silnie skręcona 447 ---- — Z 446 ---- rearanŜacje 544 ---- rekombinacja 529 ---- replikacja 447—449, 469 ---- rowki 447 ---- rozwinięty 447 ---- sekwencje, powtarzające 462 — — ------- często 462 —---------- — długie, końcowe 462

----- ■-------------rozproszone 462 ----------- krótkie 463 -------- unikatowe 462 -------- wyciszające 530 ------- wzmacniające 522, 530 -----■ sekwencjonowanie 539

— — superzwoje ujemne 447 synteza 467 ----- temperatura topnienia 447 ----- transkrypcja 447, 448 2,5-diatnivioamylowy 42 dihydroorotowy 434, 435 elaidynowy 176, 177 ertlkowy 176 foliowy 84, 705 niedobór 706, 866 --- stęŜenie we krwi 928 — zapotrzebowanie 733^. formitninoglulaminowy 706 fo&fatydowy 179,286 glutaminowy 40, 705 hialuronowy 171, 763, 764 homowanilinowy 901 ikozanowy 175 inozynowy 429 kainowy 893 kapronowy 175 kaprylowy 175 kaprynowy 175 kinurenowy 375 klupanodonowy 176 ksamurenowy 377 laurynowy 175 lignocerynowy 175 linoletiowy 275, 27S a-linolenowy 176, 275, 278 y-linolenowy 176 — lino Iowy 176 - niedobór 727 ----- przemiana 277 — liponowy 214

Kwasfy), masłowy 175 merkapturowy 820 3-metoksy-4-hydroksyniigdak>wy 649 2-metylo-3-aminopropionowy 43 mikofenolowy 430 mirystycowy 175 mocne 29 moczowy 346, 416, 418, 427, 433 stęŜenie we krwi 921, 928 — wydalanie z moczem 922 ----- wytwarzanie 426, 427 ----- zaburzenia metabolizmu 440 monoetenowe 174 mrówkowy 175 nadjodowy 750 nerwonowy 176 neuraminowy 171 - nikotynowy 326, 696

nukleinowe, trawienie 425 octowy 175,434,435 — oktanowy 175 oleinowy 174, 176, 177 palmitynowy 175 — pal mi to oleinowy 176 pantotenowy 84, 203, 698 plazmenowy [80 podchlorawy 884 polienowe 174 propionowy 175

retinojowy 712 — retinolowy 588, 710 — rybonukleinowy (RNA) 476 -----budowa 448, 449 -----hydroliza 449 ---- ■ informacyjny (mRNA) 450, 451,486,489,491, 530 ------ jądrowy, drobnocząsteczkowy 450 -------- hetcrogenny 453 ---- rybosomalny (rRNA) 450, 454, 487 - splicing 530, 548 ---- synteza 478 ---- transkrypcja 480 ---- transportujący (tRNA) 450, 487 ---------- budowa 453 sjalowy(e) 171, 181, 250, 291, 751 słabe 29 solny 735 sprzęŜony z zasadą 31 stearynowy 175 timnodonowy 176 - tłuszczowe 189, 190, 194, 722 ---- aktywacja 261 ---- biosynteza 205. 251, 254, 255 ---- Ca 227 ---- Cn 227 ---- cis 278 ---- dienowe 176 ■ ----długolańcuchowe, transport do mitochondrium 262 ---------- utlenianie w wątrobie 272 — egzogenne 275, 289 — metabolizm nieprawidłowy 278

K.was(y), tłuszczowe, egzogenne, niedobór 278 -------- a prostagtandyny 280 ---- elongacja łańcucha 257 ---- estryfikacja 270 ---- heksaenowe 176 ---- jednonienasycone 174 -------- w diecie 325 ---- ■ metabolizm 190 ---- monoenowe 176 — — nasycone 174, 175 ---- nienasycone 176, 275 -------- metabolizm 274 — — utlenianie 265, 266 ---- p-oksydacja 262—264 ---- pentaenowe 176 ---- synteza 191, 203 ---- tettaenowe 176 — trans 278 — transport 746 we krwi 260 — trienowe 176 ------tworzenie nazw 174 uruchomienie z tkanki tłuszczo wej 270 ---- utlenianie 264 ■ ----wadliwe 265 ---- wielonienasycone 13, 173, 174, 274, 275, 727 -------- biosynteza 276 • ------- w diecie 325 — ------- peroksydacja mikfosomalna 266

---- właściwości, fizjologiczne 177 -------- fizyczne 177 - wolne 174, 260, 331, 294, 298 obrót 299 -------- stęŜenie zwiększone 305 wychwytywanie przez tkan ki 310 tymidylowy 420 UDP-gl u kuro nowy 819 uronowe 171, 762 urydylowy 420 walerianowy 175 wanilino migdałowy 645, 649 Ŝółciowe 322 — — biosynteza 323, 324 degradacja 323 ■---- ■ krąŜenie watro bowo-jelitowe 324 ■— wtórne 324 Kwashiorkor 338, 726, 853 Kwasica 26 i ketonowa 260, 267, S63

mleczanowa 147, 207, 214, 728 prioponowa 728

Laktacydoza 237 Laktaza 743 — niedobór 744 ----- dziedziczny 745 ■---- wtórny 745 Lakloferyna 881 Laklogen łoŜyskowy (CS) patrz: Somatotnammotropina kosmówkowa

SKOROWIDZ / 947 Laktoza 161, 163, 169 — synteza 248 Laminina 882 Lanosterol 3J7 Lanosterolocyklaza 2,3-oksydoskwalenowa 317 LCAT patrz: Acylotransferaza lecytyna: cholesterol LDH patrz: Dehydrogenaza rnlec/anowa | LDL patrz: Lipoproteiny o małej gęstości Lecytyna 179 metabolizm 288 Leczenie trombolityczne 895 Lek(i), hipolipemizujące 326 przeciwnowotworowe 425 przeciwtarczycowe 615 Lektyna(y) 172, 753 sojowa 753 Leprechaunizm 687 „Leucine zipper" 526 Leucyna 39 katabolizm reakcje swoiste 381 zapotrzebowanie 725 Leukodystrofia metachromatyczna 292 Leukotrien(y) 174, 175, 278, 280, S80 A4 177 — biosynteza 282, 28.1 znaczenie 283 LH patrz: Lutropina Liaza 117 adenylobursztynianowa 422, 429, 430 ATP-cytrynianowa 205, 256 cytrynianowa 128 3-hydroksy-3-melyloglutarylo-CoA 26S Ligacja 547 DLiksoza 166 Limfocyty 865 Lipaza 284, 736 aktywność we krwi 922, 92 S działanie 739, 742 Językowa" 734

lipoproteinowa 193, 301, 308, 310, 768 niedobór rodzinny 327 „ślinowa" 736 triacyloglicerolowa 685 wątrobowa uwalniana heparyną 302 wraŜliwa na hormony 308, 310 „Ŝołądkowa" 736 Lipidoza iaktozydoceramidowa 292 Lipidy 193. 727 amfipatyczne 186, 187, 295 błon 552 choroby spichrzające 293 chromatografia 185 eterowe biosynteza 288 — synteza 286 metabolity, transport 193 metabolizm 122, 191, 173 obojętne 173 osocza 295 peroksydacja 184

Lipidy, pochodne 173 prekursory 173 proste 173 stęŜenie we krwi 928 transport 304 — w osoczu 294 złoŜone 173 znaczenie biomedyczne 173 Lipoamid 214 Lipogeneza 190—194, 251, 255, 256 enzymy 230 odŜywianie organizmu 258 pobudzanie 259 regulacja 258 regulacja hormonalna 259 Lipoksygeneza 185 Lipołiza 190, 193, 308, 309 hamowanie 259 regulacja 311 Lipoprotemy 173, 193, 294 — o bardzo małej gęstości (VLDL) 194, 295, 299, 300 ---- biosynteza 306 ---- katabolizm 301 ---- a skład pokarmów 305 — o duŜej geslości (HDL) 295, 303 metabolizm 304 o malej gęstości (LDL) 295, 303, 769 ix, niedobór rodzinny 326 osocza 296 — 298. 320, 321 blok wytwarzania 307 zaburzenia pierwotne 326 resztkowe 302 rozdział 295 Liposomy 186, 187, 739 Lipotropina (LPH) 585, 589, 599 — p 51 ---- struktura i funkcja 609 Lizofosfolipidy 180 Lizolecytyna 180, 289 Lizosomy 346, 563 Lizozym 881 miejsce katalityczne 99 Lizyna 40 katabolizm 373, 374 zapotrzebowanie 725 Locus operatora 512 Lowastatin 326 LPH patrz: Lipotropina Lutropina (LH) 575, 585, 589, 599 działanie 606 steroidogeneza 657

Łańcuch (y), oddechowy 141, 142, 147, 199—201, 216 ---- hamowanie 152 ----- inhibitory 152 — •— kompleksy lipid owo-bialkowe 150 magazynowanie energii chemi cznej 151 — miejsca hamowane przez sub stancje chemiczne 150

Łaricuch(y), oddechowy, mitochondrialny, składniki 148 ---- medoczynnosc 160 ----- związki rozprzęgajace 152, 156 — oligosacharydowe 171

MAB826 Macierz mitochondrialna 157 Magnez 729 — stęŜenie we krwi 922 - zapotrzebowanie 733 0,-Makroglobulina 789, 885 Malonian 108 Malonylo-CoA 251, 252, 271 Maltaza 740, 743 Maltotrioza 161 Maltoa^ćl, 168, 168 Mammotropina p. Prolaktyna Mangan 730 — zapotrzebowanie 732 Mannoza 171, 751 D-Mannoza 165, 166 a-D-Mannoza 164 Mannozamina 167, 250 Mannozydaza 767 MAO-A patrz: Monoaminooksygenaza A MAO-B patrz: Monoaminooksygena-

zaB Mapowanie genów 541 Marazm 131, 726 Markery nowotworowe 824 Marskosc wątroby 307, 778, 845 Matołectwo 618 Mazindol 902 Mechanizm „ping-pong" 566 Melanina, biosynteza 393 typu mieszanego 394 Melanoproteina 393 Melanosomy 393 Melanotropina (MSH) 585, 589. 599 a 575 £575 struktura i funkcja 609 Melatomna, biosynteza 392, 393 metabolizm 392 Melonian 201 Menachinon 717 Menandion 717 Menopauza 667 3-Merkaptopirogronian 365 6-Merkaptopuryna 423, 430 Meromiozyna cięŜka 798 Mestranol 668 Metabolity, przepływ, regulacja 128 — w komórce 118, 119 stęŜenie, a aktywność enzymów 123 — w komórce 119 Metabolizm 132 aminokwasów 190 hamowanie przez sprzęŜenie zwrot ne 124 integracja 329 kontrola hormonalna 196

948 / SKOROWIDZ Metabolizm, kwasów tłuszczowych 190 nieprawidłowości !18 prawidłowy 131 regulacja znaczenie biomedyczne 118 umiejscowienie w komórkach 122 węglowodanów 189 zaleŜności między tkanką tłuszczo wą, wątrobą i tkankami pozawatrobowymi 332 Metaloenzymy 115 Metaloporfiryny 398 Metaloproteiny 368, 375 NJ, N'°-Metenylotctrahydrofo[ian427 Methemoglobina 872 Methemoglobinemia 79, 866. 872 Metimazol 615 Metionma 40. 204, 379, 397 — katabolizm 377, 378, 380 — zapotrzebowanie 725 Metotreksat 435 P- N - M etylami no- L-a I a u ina 901 otMetyloacetoacetylo-CoA 383 N°Metyloadenina 416 MetyloakryliloCoA 382 N-Metylo-4aminoazobenzen 826 5Mety!ocytozyna 416 pMetyloglutaronylo-CoA 381 f>PMetytoguanina 416 ot-Metylo-phydroksybutyrylo-CoA 383 Metyloko balami na 704 pMetylokrolonylo-CoA 381 Metylomalonylo-CoA. zaburzenia katabolizmu 384 Melylopentylozy 171 Metylotransferaza guanidynooctanowa396 N- Metylolransferaza, fenyloetano loaminowa 645 — rola 647 O-Metylotransferaza katecholowa 0 645 ^ — rola 648 Mewalonian. biosynteza 315 Mewastatin 326 Miastenia 887 MiaŜdŜyca 173, 182, 327, 792 naczyń wieńcowych 303 tętnic 13, 173, 325 Micela(e) 186. 187, 522 Miedź 730 niedobór 777 — stęŜenie we krwi 916, 928 zapotrzebowanie 732 — zatrucie 776 Mieloperoksydaza 870, 881, 884 Miesiączka, brak 605 Mieszanina racemiczna 163 Mięśnie, gładkie 801 — skurcz 802 prąŜkowane 803 — szkieletowe 804 Mikrosomy 20 Mineralokortykoidy 585, 630 — nadmiar 644

Mineralokortykoidy, przemiana 636 a równowaga elektrolitowa 639 synteza 634 — regulacja 636 transport jonów 639 w osoczu 635 wydalanie 636 Miofosforylaza niedobór 225 Mioglobina 70, 399 budowa 71 funkcja 71 krzywa dysocjacji tlenowej 73 podobieństwo do hemoglobiny 74 ullenowanie 7] ---- zmiana konformacji 72 wiązanie tlenu 72 wiązanie węgla 72 Miokinaza 137,430,804 Miopatia(e) 147 mitochondriaine 897 niemowląt 160 - oczna 896 Miozyna 795, 798 Mitochondnum 147, 194, 261, 354 budowa błon 155

gromadzenie kationów 158 rola w metabolizmie 195 układy, hydroksylacyjne 144 ---- transportujące 156 MIT patrz: Monoj odo tyrozyna Mleczan 189. 194, 204, 207, 208, 212, 234 Mlekotok 605 Moczan(y) 418 kryształy 438 pula ogólnoustrojowa 438 Mocznik 190. 192, 344, 346, 351, 353, 355, 427 — biosynteza 347, 353, 354 - stęŜenie we krwi 914 — wytwarzanie 353, 354 Moczówka prosta nerkowopochodna 583 Modulatory, negatywne 109 pozytywne 109 Mola hydatidosa 669 Molibden 731 zapotrzebowanie 732 Monoaminooksygenaza 645 A (MAO-A) 901 B(MAO-B)901 Monocyty 865 Monoetenoidy 174 Monofosforan inozyny (IMP) 429 3-Monojodotyrozyna 42 Monojodotyrozyna (MIT) 612, 613 Mononukleotyd, [lawinowy (FMN) 140, 695 nikotyniami 697 Monooksygenaza(y) 144, 827 monofenolowa 393, 394 3-Monooksygenaza tytorynowa 397 Monosacharydy 161 wchłanianie wadliwe 745 Monosjalogangliozyd 182 Mostek, glicerolofosforanowy 157 glicerolofosforanowy 158

Mostek, jabiczanowo-asparaginianowy 158 MolyJma 6>J1 Mózg, udar 894 MPTP901 MSH patrz: Melanotropina 3MSH patrz: Melanotropina a pMSH patrz: Melanotropina p Mukolipidozy 765 testy diagnostyczne 767 Mukopolisacharydozy 749, 765 testy diagnostyczne 767 Mukopolisacharydy 171, 749 Mukoproteiny 171 Mukowiscydoza 14, 844, 847 Mutacje 495 punktowe 835, 897 sensu 496 -— — akceptowalne 497 ----- częściowo akceptowalne 497 —■ — nie akceptowane 498 supresorowe 498 typu przesunięcia ramki 498 Mutageny 827 Mu ta rotacja 163 Mutaza, bisfodlbglicerynianowa 212, 213 — fosfogiicerynianowa 209, 211 Myasthenia gravis 583, 887 Nabłoniak kosmówkowy 669 Nadciśnienie tętnicze 847 reninozaleŜne 637 Nadczynność, przytarczyc 623 — wtórna tarczycy 618 NAD-kinaza 595 Nadnercza, kora, hormony 629 niewydolność wtórna 643 rdzeń 397 — hormony 645 rozrost wrodzony 644 NAD+ patrz: Dinukleotyd nikotynoamido-adeninowy NADP+ patrz: Fosforan dinukleotydu nikotynoamido-adenin owego Nadtlenek, redukcja 143 wodoru rozkład 143 Naftochinon 717 Neksyna 810 Neomycyna 748 Neostygmina'891 Nerka(i), dysfunkcja 160 zanik 845 Neuraminidaza 752 Neurofizyny 609 Neuropatia nerwu wzrokowego wrodzona Lebera 844, 847, 896 Neuroprzekaźniki 385 Neurotensyna 691 Neutropenia 868 NGP 585 Niacyna 141, 203.696 brak 698

zapotrzebowanie 733 Niedobór, desmolazy cholesterolowej 644

SKOROWIDZ / 949 Niedobór. 1 Ip-hydroksylazy 644 Niedoczyrinosc przyiarczyc 624 izekoma 583. 59!, 624 Niedokrwiwosc S45. S65 Faoconiego 475 Nkdokrwiitość hemolityczna 207. 214, 239. 867. 871 — badania laboratoryjne 880 ------pizyczyny 879 megatoblaslyczna 706, 866 z niedoboru miedzi 777 z niedoboru Ŝelaza 745, 860 u noworodków 717 sierpowata 70, 544, 866 syderopeniczna 845 złośliwa 704 Niedorozwój umysłowy 898 Niedotlenienie 207 tkanek 212 NiedoŜywienie 726 Nietolerancja, fruktozy wrodzona 247 mleka 734. 747 Nigerycyna 160 Nikotynamid 84, 375 Ninhydryna 44 Nilrozoaminy 826 NMN 697 Noradrenalina 31.1 — biosynteza 395 — stęŜenie we krwi 928 Norepinefryna patrz: Noradrenalina Noretyndron 668 Normy Ŝywieniowe 731 Northern błot 537, 547 Nukfcazy 488 Nukleoplazmina 458 Nukieosom 457 Nukleotyd(y), adeninowc 133—135, 137 fławinowe 141 pirymidynowe 415 biosynteza 433, 434 —- — regulacja 436, 438 pochodne syntetyczne 423 — purynowe, biosynteza, w wątrobie 431 -------- blokada 429 ------- regulacja 431 N uk leotydosacharydy 250 Nukleozydazy 740,743 Nukleozydy41S, 425

Oksydacja kwasów tłuszczowych 262, 263 [ł-Oksydaeja 148, 190. 191, 194 ^Oksydacja kwasów tłuszczowych 264 Oksydaza(y) 140. 143 aminokwasowa 348 a-aminokwasowa 695 2-aminokwasowa 140, 348 aminowa 392, 393 -■ cytochromowa 140 flawoproleiny 140 glukozowa 141 L-glukonolaktonowa 244 katecholowa 394 koproporfirynogenowa 400, 403, 404 ksantynowa 122, 140, 433, 695 niedobór 440 — lizylowa 815 monoaminowa 645 rola 648 NADPH 870 protoporfirynogenowa401,403,404 — zawierające miedź 140 Oksydoreduktaza 140 Oksygenaza(y) 139, 144 hemowa 407, 408 prawdziwe 144 Oksyhemoglobina, uwalnianie tlenu 213 Oksytocyna 585 mechanizm działania 610 regulacja sekrecji 610 Oligomery białkowe 65 Oligomycyna 152 Oligonukleotydy 547 Oligosacharydy 161 biosynteza 759 Onkogeny 14, 829, 83! aktywacja 835 z komórek nowotworowych 832 mechanizm działania 836 wirusa miesaka Rousa 830 Operon 510 lac 511 Opioidy 585, 589 Organełłe wewnątrzkomórkowe 18, 19 Organizm(y), amonoteliczne 346 autotrofkzne 133 skład chemiczny 16, 17 środowisko wewnętrzne 26

ureolityczne 427 ureoteliczne 346 Octan 259 — medroksyprogesteronu 668 p-nitrofenylu 110 ----- hydroliza, etapy 111 Odczyn Coombsa 880 Odczynnik, Edmana 56 Sangera 54 Schiffa 750 Oddychanie, mitochondrialne, kontro la 151, 153, 205 ----- teoria chemiosmotyczna 156 — tkankowe 139 OdŜywianie prawidłowe 131

urykoteliczne 346, 427 Omityna 42, 355

metabolizm 388 transami nacja 361 Orolacyduria 441 Orotydynomo no fosforan 434, 435 Orotydynuna 441 Osroolalność 928 Osocze 386

Osteogenesis imperfecta 794, 814 Osteomalacja 625, 628, 715, 734 Ostcoporoza 747

Otyłość 173, 583 Ouabaina 167

PABA patrz: Kwas p-aminobenzoesowy Padaczka mioklonalna 896 PAF patrz: Czynnik aktywujący płytki krwi „Palec cynkowy" 525 Palindrom 547 PaJmitoilolransferaza kamitynowa 261, 271, 272

— niedobór 265 Palmitynian 255 PAP 825 Papovawirusy 829 Parathormon (PTH) 585, 589, 629 patofizjologia 624 regulacja, przemiany 621 sekrecji 623 ---- syntezy 620 — rola w homeostazie, fosforanowej 623 - Vspniowej 623 rozpad 622 struktura 620 wytwarzanie ektopowe 624 Parkinsonizm 899 leczenie 900, 906 przyczyny 901 Pasmo Soreta 404 PCR 547 PDGF 585, 838 Pelagra 698 D-Fenicylamina 777 Pentozuria 239 samoistna 244 Peniozy 161, 171 znaczenie fizjologiczne 166 Pepsyna 735 Peptyd(y), aktywne fizjologicznie 51 — budowa 49 C 676 homogenne otrzymywanie 55 hydroliza zasadowa 54 insulinopodobne 676 jelitowy wazoaktywny 599. 691 konformacja 51 ładunek elektryczny 50 przedłuŜające 812 rozdzielnie 52 sekwencje nakładające sie 57 — sekwencjonowanie 54

----- fenyloizotiocyjanian 56 ----- peptydów nakładających się 56

— Struktura pierws^orzędowa 50 a aktywność biologiczna 50 poznanie składu aminokwasowego 53 sygnałowe 560 synteza metodami automatycznymi 57 — znaczenie biomedyczne 49 — Ŝołądkowy hamujący 691 Peptydaza 345 Peptydylo-3-metylom stydyna 805 Permeaza glukozowa 868 Peroksydacja lipidów 184 Peroksydaza 143 glutationowa 143, 243, 717. 870

950 / SKOROWIDZ Peroksydaza, tarczycowa 615 Peroksysomy 143, 264 Pęcherzyk Ŝółciowy 742 Pętla oksydoredukcyjna przemieszczająca protony 154 pH, a aktywność enzymu 100 definicja 29 — znaczenie biomedyczne 26 Pierścień Kaysera-Fłeischera 777 Pierycydyna A 152 Pigmeje 604 PIH 599 Pinocytoza 570 absorpcyjna 570 piynnej fazy 570 Pirofosfataza. nieorganiczna 137, 218, 261 -dimetyloalilu 315 Pirofosforan, farnezylu 315, 318 — geranylu 315 Pirofosforylaza ury dyn odi fosfog luk ozy 218 Pirogronian 159, 189, 194. 204, 205, 213, 226, 362, 363 enzymy ulteniania 230 utlenianie 207 stęŜenie we krwi 928 Pirol 70, 398 Pirydoksal 700 Pirydoksamina 700 Pirydoksyna 700 Pirydostygmina 891 Pirymidyny 415 katabolizm 436 ~ nadmiar produktów 440 metabolizm 122 — zaburzenia wrodzone 441 pochodne 415 ■ ----syntetyczne 423 postacie tautomeryczne 417 zapotrzebowanie organizmu 425 pI37 Plasmodium falciparum 875 Plazmalogeny 287 — biosynteza 288 "^*" Plazmidy 534, 547 Plazmina 790 Plazminogen 790 Plazmogeny 180 Pląsawica Humingtona 542, 546, 847, 892 Pl patrz: Somatomamrnotropma kosmówkowa Płyn, pozakomórkowy 26 — wewnątrzkomórkowy 26 Płytki aktywacja 791 PNMT 645 Poliaminy biosynteza 380, 390 budowa 389 katabolizm 391 prckursory 388 Policytemia 79 Polidystrofia pseudohurlerowska 767 Polienoidy 174 Polimeraza, DNA, a 469 - p 470

Polimeraza, DNA, RNA-zaleŜna 451 - RNA DNA-zaleŜna 477 klasy III 484 — — mianownictwo 480 Polimorfizm, białek 773 — długości fragmentów restrykcyj nych 93 DNA 542 Polinukleotydazy 740 Polipeptyd(y), z licznymi funkcjami ka talitycznymi 429 rola 690 struktura pierwszorzedowa, ozna cza nie 54 trzustkowy 671, 673, 691 wielkocząsteczkowe, rozszczepianie 55 Polipreonidy 183 Polisacharydy 161, 169 -— złoŜone 170, 171 PO MC patrz: Proopiomelanokortyna Pompa, protonowa w łańcuchu oddechowym 153 sodowa 744 Ponad tlenki 870 Porfiria(e) 398, 405 -- dziedziczenie 405 leczenie 407 — objawy, podstawy biochemiczne 406 Porfiryny, asymetria podstawnika 399 budowa 398 fluorescencja 404 z łańcuchami bocznymi 299 - pochodne biosynteza 403 spektrofotometria 404 widma absorpcji 404 znaczenie biomedyczne 398 zredukowane 401 Porfobilinogen 402 biosynteza 401 Poród 665 Potas 729 sekrecja aldosteronu 638 stęŜenie we krwi 923, 928 zapotrzebowanie 732 Potencjał, oksydoredukcyjny 139 przenoszenia grupy 135 PP patrz; Polipeptyd trzustkowy Prealbumina wiąŜąca tyroksynę 616 Prednizolon 632 Prednizon 632 Pregnandiol 632 Pregnantriol 632 Pregnenolon 631, 632, 654, 660, 661 Pre-[J-lipoproteiny 295 PRIH patrz: Hormon hamujący uwalnianie prolaktyny PRL patrz: Prolaktyna Proakceleryna 784 Probiałka 112 Probucol 326 Proces biochemiczny, analiza 23 Proenzym(y) 112 — przekształcenie w enzymy 113 Profilina 806

Progesteron 631, 632, 654, 656, 660 a gruczoł sutkowy 666 Progestyny 585, 588, 660 funkcja 664 mechanizm działania 668 metabolizm 662 syntetyczne 668 Proinsulina ludzka 674 Prokonwertyna 784 Prolaktostatyna 600 Prolaktyna 585, 599 laktacja 666 owcza 603 patofizjologia 605 rola fizjologiczna 605 synteza 605 Prolina41, 204, 359 biosynteza 339, 341 katabolizm 359, 360 metabolizm 388 Proopiomelanokortyna. 575, 599, 629 Propionian 204, 227. 234 Propylotiouracyl 615 Prostacykliny 174, 281, 792 Prostaglandyna{y) 174, 279-281, 636 E2 175 a kwasy tłuszczowe egzogenne 280 Prostanoidy 174, 281 biosynteza 279 Pro tarnina 789 Proteaza(y) 112,884 lizosomalna 903 wewnątrzkomórkowe 345 V8 55 Proteoglikany 171, 244, 248 biosynteza 749, 761, 762 funkcje 766 Protoonkogeny 831 aktywacja 832 Protoporfiryna 400 Protoporfirynogen 400 Protrombina 784, 786 Prourokinaza 790 Provera 668 Pro witamina A 184 Próg nerkowy dla glukozy 237 PRPP patrz: 5Fosforybozylo-l-pirofosforan Prymachina 87! Przemiana materii podstawowa 723 Przenośnik(i), energii 133 — pirogronianowy 213 Przerzuty 760i 840 Przewody Ŝółciowe, niedroŜność 412 Przysadka mózgowa, ptat, przedni 601 --------hormony 236 ---- tylny 609 Przy tarczyce, gruczolak 624 - nadczynność 623 -------wtórna 624 — niedoczynność 624 ---- rzekoma 583, 591, 624 — rozrost 624 Pseudogen 548 Pseudourydyna 420, 436 PTA 784 PTH patrz: Para (hormon

SKOROWIDZ / 951 PUFA patrz: Kwasy tłuszczowe wielonienasycoue Puromycyna 506 Puryny 416 kiitiihohziii. zaburzenia 437 metabolizm 122 ----- zaburzenia dziedziczne 439 niedobór 440 pochodne 415 syntetyczne 423 postacie tauromeryczne 417 redukcja 433 * zapotrzebowanie organizmu 425 Q„100 Racemaza metylomalonylo-CoA 227 Rak jelita grubego 726 Rakowiak złośliwy 393 Ramka Pribnowa 480 Reakcja(e), anaboiiczne 132 chemiczne, bariera energetyczna 96 — czynniki przyspieszające 96 ----- teona kinetyczna (zderzeń) 96 ----- szybkość początkowa 103, 104 egzoergiczne 132 — endoergiczne 132 ----- sprzęŜenie z reakcjami egzoergicznymi 136 — enzymatyczne 97 ----- hamowanie kompetycyjne 108 inhibitory niekompetycyjne od wracalne 109 ----- kinetyka nasycenia enzymu substratem 106 ----- kontrola, allosteryczna 196 -------- hormonalna 196 ----- mechanizm 110 -------- doświadczenia stop-flow 110 -------- a jony metali 116, 117 ----- a pH 100 ----- poziom energetyczny 95 ----- stała równowagi 102 ----- stany przejściowe 94, 95 ----- szybkość, maksymalna 106 -------- początkowa 103 — — — regulacja 119 -------- a stęŜenie substratów 101, 103 — a temperatura 100 —■ — wiązanie substratu 114 Fentona 870 Habera-Weissa B70 kataboliczne 132 - nierównowagi 195 powodująca przepływ 195 zastąpienia 94 Receptor{y), ot, 221 acetylooholinowy 582 p-adrenergiczny 650 androgenowy 898 - cholinergiczny 888, 890 - dopaminowy 907 ---- agoniści 902 — EGF 683

Receptor(y), estrogenowe 668 glikokortykoidowy 640 glulamimanowy 892 hepatocytów asjaloglikoproteinowy 346 hormonalne 578 insulinowy 582, 682 kalcytriolowy 627 —LDŁ 319, 683 — — wadliwe 327 progesteronów^ 668 swoisty dla apo E 302 dla transferyny 775 Receptosomy 570 Redukiaza, biliwerdynowa 407 cystynowa 363, 364 cytochromu bs 872 dihydrofolianowa 435 glutationowa 243 HMG-CoA 122, 128 methemoglobinowa 772 rybonukleotydowa kompleks 432 tioredoksynowa 432 Reestryfikacja 309 Rekombinacja, chromosomalna 463 DNA 529 Remnanty 327 chylomikronów 302 Renina 637 uwalnianie 636 Renmas 736 Replikacja DNA 469 Retinal 710 Retinitis pigmentosa 908 Retinoidy działanie przeciwnowotworowe 713 Retinol 710 Retrowirusy 829, 831 Retykulocyty 868 RNA patrz: Kwas rybonukleinowy Rodnik(i) wolny(e) 184 — ponadilenkowy 145 Rodopsyna 712. 908 Rotenon 152 Rozedma pluć 7?7 Roztwór buforowy 32 Równanie, Hendersona-Hasselbalcha 31 Hilla 106 Michaeiisa-Menten 104 Równowaga, azotowa 344 kwasowo-zasadowa 26, 350 wodna 26 RównowaŜniki redukujące 147, 199, 200, 255 Rybollawina 84, 140, 203, 695 zapotrzebowanie 733 Ryboiiukleaza 488, 739, 742 miejsce katalityczne 99 Rybonukleoproteiny jądrowe małocząsteczkowe 455 Rybonukleotyd(y) 419 purynowe 415 uracylu 449 Rybonukleozydy 418, 419 Rybosomy 194, 195, 454, 492 D-Ryboza 165. 166

Ryboza 161, 239,241, 449 — synteza w tkankach 243 Rybozofosforan 189 Rybuloza 161 D-Rybuloza 164, 166

Sacharaza 742 — niedobór 745 Sacharoza 161, 168, 169 Sacharydy powierzchni komórki 181 Sarkolemma 795 Sarkomer 795 Sarkoplazma 795 Schizofrenia, przyczyny 905 DSedoheptuloza 164 Sekretaza 903 Sekwencjonowanie, biatka 54 DNA 54 Selen «3, 717 jako grupa prostetyczna 143 niedobór 731 rola 731 zapotrzebowanie 733 Semiaidehyd, bursztynianu 396, 397 malonianu 386 metylomalonianu 382 Serotonina 881 biosynteza 391 a rakoiwak złośliwy 393 Seryna40, 180, 204, 387 biosynteza 339, 340 kata boi izm 363 Sferocytoza dziedziczna 866, 876 Slingolipidozy 173,292, 293 Sfingolipidy 284 Sfmgomielma(y) 180, 181 biosynteza 290 w błonach 551 Sfingozyna 180 biosynteza 290 SGOT 927 SGPT 927 SHBG patrz: Globulina wiąŜąca hormony płciowe Siarczai], choudroityny 171, 763, 764 dermatanu 763, 765, 768 heparanu 763, 765, 792, 844 keracanu 763, 765, 768, 844 w moczu 388 Siarkowodór 152 Siateczka śród plazma tyczn a 194, 195 Siatkówka, zapalenie barwnikowe 908 Sinica 872 Sjalidoza 767 Skaza, krwotoczna 791 ----- noworodków 719 moczanowa 425, 437, 438 Skład chemiczny organizmu 16, 17 Składniki, mineralne 730 pokarmowe interkonwersja 330 - — przekształcenia wzajemne 329, 330 Skóra, pergaminowa barwnikowa 475, 852 — synteza witaminy D hit

9S2 / SKOROWIDZ SkręcaUiość optyczna 163 Skrobia 161, 169 Skrzep 883 fibrynowy 788 Sk waleń 315 biosynteza 315. 316 Sok, trzustkowy 736, 738 Ŝołądkowy 735 Sole kwasów Ŝółciowych, krąŜenie jelitowo-wątrobowe 322 Somatoliberyna (GHRH) 600 Somatornarnmotropina kosmówkowa 585, 599 — stęŜenie w ciąŜy 665 Somatomedyna patrz: 1GF I Somatostatyna (GHRIH) 585. 589, 599.600, 671, 672,689, 691 a hormon wzrostu 689 sekwencja aminokwasów 689 Somatotropina 599 Sonda genetyczna 548 Sorbitol 247

Sód, stęŜenie we krwi 923, 928 — zapotrzebowanie 732 Spektrofotometria 404 Spektrometria masowa 21 Spektroskopia jądrowego rezonansu magnetycznego 21 Spektryna 874, 875 Sperma to geneza 657 Spermidyna 389, 390 Spermina 389, 390 Spliceosom 485 Splicing RNA 530 Spruć rodzima 746 SPRIN 500 Stała, dysocjacji 29. 31 — równowagi reakcji enzymatycznej 102 — sedymentacji 68 Stawy, zapalenie 769 Steroidogeneza 190. 634 Steroidy 182. 190, 191 - - cechy strukturalne 630 konfiguracja 183 konformacje 182 sekrecja 635 - stereoizomery 182 — transport w osoczu 635 Sterole w błonach 552 Stiuszczenie wątroby 305, 845 Stolce tłuszczowe 710, 747 Strącenie wybiórcze 87 Streptokina^a 790 Streptomycyna 167 Stres tlenowy 871 Stwardnienie rozsiane 292 Substancja, H 877 ■ - P 585, 691 Substrat(y), energetyczne kolejność utleniania 333 — powinowactwo do enzymu 106 stęŜenie, a aktywność enzymu 123 ----- inhibitory kompetycyjne 107 — kinetyka nasycenia enzymu 106 ' ---- oznaczanie 107 ---- a szybkość reakcji 101, 103

Substrat(y), wiązanie, kooperatywne 127 ----- przez enzym 114 Suchość spojówek 710, 713 Sukcynylo-CoA 194, 199—201, 204, 400 Suliagalaktozyloceramid 290 Sulfataza, iduronianowa 766 — niedobór 293, 767 Sulfatyd 181 SulfogaJaktozyloceratnid 181 Sulfoglikozyloslingolipiu 181 Sulfolipidy 173 Sulfonylomocznik, pochodne 677 Surfaktant płucny 284, 287 Swainsonma 761 Symport 213 Syntaza, ALA 401, 400 — ATP 554

- ATP błonowa 153, 154 ------transportująca protony 156 — cytrynianowa 200, 201 —■ endoperoksydu prostaglandynyTT? — glikogenowa 128,197,219,595,685 a 221 ---- b 221 ---- w mięśniu 223 — hemowa 401 3-hydroksy- 3-metyloglu ta rylo-Co A 268 3-ketoacylowa 252 kwasu tłuszczowego 252 laktozowa 249 porfobilinogenowa 404

spermidynowa 390 sperminowa 390 — - tiroporfirynogenowa 402—404 Syntetaza, acylo-CoA 137, 227, 261, 286, 309 adenylobursztynianowa 422, 429, 430 -------regulacja aktywności 432 aminoacylo-tRNA 494 argininobursztynianowa, brak ak tywności 356 asparaginowa 339 glutaminianowa 339 glutaminowa 350 karbamoilolbsforanowa 354, 433, 434, 436 kwasów tłuszczowych 122 PRPP431.436 sukcynylo-CoA 202 tymidylanowa 434, 435 Synteza, białka 491 — elongacja 502, 503 inicjacja 500

---- terminacja 502, 504

— DNA 467 peptydów metodą automatyczną 57 RNA 478 System cytochromu P-450 139 Szczawiobursztynian 200, 201 Szwawiooctan 158,194,198—202, 204, 205, 359 Szkorbut 709, 794

Szlak(i). amfiboliczne 188 anaboliczny 188 biosyniezy, nukleotydów pirymidynowych 434 — de novo puryn z 5-fosforybozy i ATP 428 2,3-bisfosfoglicerynianowy 212 cyklooksygenazy 279, 280 dihydroksyacetonofosforanowy 285 glicerolofosforanowy 285 kni.aholii.vnc 188 kelogenezy w wątrobie 269 kinureninowo-antranilanowy 375 - kwasu uronowego 244 — lipooksygenazy 279, 280, 283 — metaboliczne 188 analiza 23 ---- poziomy organizacji 192 ----- przeptyw metabolitów 195 ----- rozgałęziona regulacja przez sprzęŜenie zwrotne 124 ------ umiejscowienie w komórce 194 monoacyloglicerolowy 285, 286 pentozofbsforanowy 239, 240, 255 enzymy 230 ----- etap, oksydacyjny 241 -------- nieoksydacyjny 241 ----- a szlak glikolizy 242 — poliotowy 247

- przemiany galaktoiy 248 sorbitolowy 247 syntezy kwasów tłuszczowych 251 wydalanie azotu u ludzi 353 Szpiczak 783 Śledziona 876 Ślepota kurza 710 Ślina 734 Śliniąnki 741 Talasemie 70, 80, 542. 866, 885 Tarczyca, hormony 237, 612 — nadczynność 618 Tautyna 43 TBG patrz: Globulina wiąŜąca hormony tarczycy TBG patrz: Globulina wiąŜąca tyroksynę TBPA patrz: Prealbumina wiąŜąca tyToksynę TEBG patrz: Globulina wiąŜąca testosteron i estrogeny Teobromina 417

Teofilina 311, 417 Teoria chemiosmotyczna 153, 154 Terapia genowa 851 Termogeneza indukowana przez dietę 312, 313 Termogenina 313 Test, Amesa 827 oporności osmotycznej 876 tolerancji galaklozy 248 tolerancji glukozy 238 Testosteron 631,632, 652,654, 656,660 metabolity 656

SKOROWIDZ / 953 Testosteron, regulacja spermatogcnczy 657 . - szlaki metaboliczne 656 Tetrahydrobiopteryna 341 Tetrahydrofolian 706 3,5,3',5'Tetrajodotyronina 42 Tetrajodotyronina 599 Tetro2y 161 TGF 837 Tiamina 84, 203. 694 brak 694 zapotrzebowanie 732 TIBC 924 Tioesteraza 255 6-Tioguanina 423 Tiokinaza 261 bursztynianowa 201, 202, 216 Tiolaza 264, 268 Tiomocznik pochodne 615 Tioredoksyna 432 Tiouracyi 615 Tkanka tłuszczowa 173 brunatna 312 lipoliza 311 metabolizm 309 Tlenek węgla 147, 152 Tlen, toksyczność 145 Tłuszcze, mobilizacja 310 przemiana 680 — wartość energetyczna 723 — właściwe 173 a-Tokofero! 716 Tokoferol 716 Tolerancja glukozy 237, 238 Top,pizomerazy 447 TPA 790 T3 patrz: Trijodotyronina T4 patrz: Tyroksyna Transacylaza, acelylowa 252 -- malonylowa 252 Transaldolaza 241 Transamidynaza arginino-glicynowa 396 Transaminacja 190, 191, 203, 204, 347, 348 Transami n aza(y) 204, 347 alaninowa 347, 348 glutaminjanowa 347, 348 Transferaza, bursztynylo-CoA-acetoacetylo-CoA 268 fukozylowa 877 Gal 878 GalNAc 878 gtukanowa a-(l—*4)-a(l—»4) 219 glukuronylowa 819 — y-glutamylowa aktywność we krwi 924 terminalna 548 tlenu 144 Transferyna 775 stęŜenie we krwi 928 Transglutaminaza tiolowo-zaleŜna 785 Transhydrogenaza 160 Transkarbamoilaza ornitynowa nie dobór 355 Transketolaza 241. 244

Transkobalamina II 704 Transkrypcja 451, 452 — RNA 480, 548 ---- sygnały terminacji 483 Transkryptaza odwrotna 451, 471, 547 Translacja 452 Translokacja cytrynianu 256 Translokaza karnitynoacylokamitynowa261 Transmetylacja 307 Transpeptydaza aktywność we krwi 924 Transport aktywny 567 Transpozycja 465 Transwersja 495 Tranzycja 495 Trawienie 734 Trehalaza 743 Trehaloza 168, 169 Treonina 40, 204, 387 katabolizm 367 zapotrzebowanie 725 D-Treoza 165 TRH patrz: Hormon uwalniający tyreotropinę TriacylogliceroKe) 177, 178, 190, 194, 294,295 biosynteza 285, 286 chylomi tronów 301 katabolizm 284 lipoprotein o bardzo małej gęstości 301 magazynowanie 308 transport 299, 300 Triamcynolon 632 Trichochromy 394 Trifosfoadenozyna 133 Trifosfonukleozydy 137 Triglicerydy 178 stęŜenie we krwi 917, 924, 928 3,5,3'-Trijodotyronina 42 Trijodotyronina 575, 585. 599, 612 stęŜenie we krwi 616 wychwyt przez białka surowicy 925 Trikarboksylany 258 Trio-kinaza 245 Triozofosforan 189, 194 Triozy 161 Trombina 768, 788,791 Tromboksan 174, 175,279—281 Aj, 177. 792 Tropomiozyna 784, 797, 806 Troponina 797 C798 I 798 T797 Trypsyna 55, 738 Tryptofan4L 204, 391 absorpcja promieni nadfioletowych 43 katabolizm 375, 376 metabolity 393 — zapotrzebowanie 725 Trzustka 741 TSH patrz: Tyreotrapina TS1 612 Tuuikamycyna 760

.Tyglilo-CoA 383 Tymidylan 434, 435, 443 Tymidyna 419 Tymina416, 419 — związana z rybozomonofosforanem (TMP) 420 Tyreoglobulina, biosynteza 612 — hydroliza 613 Tyrcoliberyna. (TRH) patrz: Hormon uwalniający tyreotropinę Tyreotoksykoza 618 TyTeotropina (TSH) 51, 575, 585, 589, 599, 612 budowa i funkcja 606 Tyroksyna 42, 599 całkowita stęŜenie we krwi 925 stęŜenie we krwi 616 wolna stęŜenie we krwi 926 Tyrozyna 40, 41, 204, 371, 395 biosynteza 340 jofeyanie *•" katabolizm 369 transaminacja 368 Tyrozynemia 368 noworodków 370 Ubichinon 148, 149, 184,318 — biosynteza 316 Ubikwityna 346 Uchyikowatość jelit 726 Udar mózgu 894 UDP-glukoza 422 ŁJDP-glukuronozyloiransferaza 409, 411,412 UDP-kwas glukuronowy 422 Ukkd(y), dopełniacza 891 oksydoredukcyjne 139 reninowo-angiotensynowy 636 Ultrawirowanie 21 Uracyl386, 416, 419 pochodne 422 Urobilinogen 410 w moczu 413 Urokinaza 790 Uroporfirynogen 400 dekarboksylacja 402 Uroporftryny 399 Urydylilotransferaza. galaktozo-1-fosforanowa 248, 250 glukozo-1-fosforanowa 244 niedobór 249 Urydyna418, 419 Urydynodifosfogalakioza 248 Urydynodifosfoglukoza 24S U rydynod ifosfogiukuronozylotransferaza 409, 411, 412 Urydynodifbsforan 217 Urydynomonofosforan 434, 435 Urydynotri fosforan 137 Utlenianie, aminokwasów 147 biologiczne 139 kwasów tłuszczowych 147 pozamitochondrialnego NADH 157 przez dehydrogenazy 141 tkankowe 147 węglowodanów 147

954 / SKOROWIDZ U tlenowa nie, hemoglobiny 74 hemoglobiny zmiana konformacji 75, 76 mioglobiny 71 miglobiny zmiana konformacji 72

VIPpairz: Peptyd jelitowy wazuaktywny VLDL patrz: Lipoproleiny o bardzo malej gęstości VMA patrz: Kwas wanilino migdałowy

Wady metaboliczne wrodzone 14 Walina 39, 204 - katabolizm 377, 378, 380 — reakcje swoiste 383 zapotrzebowanie 725 Walinomycyna 160 Wapń 728 przemiana 594 rola w mięśniu 221, 800 stęŜenie we krwi 926, 928 Warfaryna719 Wazopresyna (ADH). 585,629 funkcja 609 mechanizm działania 611 patofizjologia 611 regulacja sekrecji 610 Wątroba 742 marskość 198, 778, 845 powiększenie 845 stłuszczenie 305, 845 synteza witaminy D 626 zapalenie ostre 198 Wchłanianie 734 Western błot 537, 548 Węglowodany 190 magazynowanie w organizmie 217 metabolity, transport 192 metabolizm 121. 189, 191 wartość energetyczna 72?** Wiązanie(a), amidowe 50 cystynowe 61 disiarczkowe 61 elektrostatyczne 62 fosforanowe bogatoenerEetyczne 135, 147, 202,216 - N-glikozydowe 754 (3-N-glikozydowe 433 O-glikozydowe 166, 754

kowalencyjne 61, 96 peptydowe 47, 48, 61 — wodorowe 28, 61 ----- w DNA 444 Wielomocz w cukrzycy 678 Wimentyna 811 Winblastyna 810 Winkulina 830 Wirus(y), białaczki, mysiej Abelsona 831 ------ mielocylowej 831 — Epsteina-Barr 829 — erytroblastozy ptasiej 83!

Wirus(y), grypy 875 herpcs 829 mięsaka, kociego 831 ----- małpy 831 ----- myszy 831 ----- Rousa 830, 831 — polyoma 829 - rakotwórcze 829 SV- 40 829 zapalenie wątroby B 829 Witamina, A 710 ----- metabolizm 712 --- niedobór 710 ----- stęŜenie we krwi 928 ----- zapotrzebowanie 732 B 84, 692 B, 203 B« 700 ----- niedobór 375, 377, 702 ----- zapotrzebowanie 733 — BIŁ 227, 703 niedobór 704, 866 ----- niewydolność przemiany do ko enzymu 384 ------ zapotrzebowanie 733 — C 239, 708

----- niedobór 709 ----- stęŜenie we krwi 928 ----- zapotrzebowanie 732

— D 183, 624,710, 714 ----- niedobór 627, 715 ----- powstawanie 625 ----- stęŜenie we krwi 928 ----- synteza 714 — £716,902 niedobór 717 ------ zapotrzebowanie 732 — K717 ----- niedobór 720 ----- rola 718 ----- zapotrzebowanie 732 — rozpuszczalne, w wodzie 693, 722, 727 -------- normy 733 ----- w tłuszczach 710, 722, 728 -------- normy 732 WKT patr2: Kwasy tłuszczowe wolne Włókna pokarmowe 726, 741 Woda, asocjacja cząsteczek 28 cząsteczka, dipolarna 27 tetraedryczna 27 dysocjacja 28 jonizowanie 28 regulacja równowagi 26 struktura wielkocząsteczkowa 27 znaczenie biomedyczne 26 Wodorowęglany, stęŜenie we krwi 926, 928 Wole rodzinne 851 Woski 173 Współczynnik, przenikarności 553 temperatury 100 Wykres, Lineweavera-Burka 105 ---- a hamowanie, kompetycyjne 109 niekompetycyjne odwra calne 109

Wykres, podwójnych odwrotności 105 ----- a hamowanie, kompetycyjne 108 niekompetycyjne odwracalne 109 Wyniszczenie 338 Wyspy Langerhansa 671 Xeroderma pigmentosum 475, 852 Xerophtalmia 713 Zaburzenia krzepnięcia 8S5 Zaćma 250 cukrzycowa 247 Zakrzepicą 770 „Zamek leucynowy" 526 Zanik nerki 845 Zapalenie 865 płuc 845 siatkówki barwnikowe 908 stawów 769 ---- moczanowe ostre 438 ---- przewlekłe 438 Zapotrzebowanie energetyczne 723 Zarodźce sierpowate 875 Zasada(y), mocne 29 - piryroidynowe 42, 416 purynowe 416, 425 rozpuszczalność 417 słabe 29 sprzęŜona z kwasem 31 Zasadowica 26 Zaśniad groniasty 669 Zatrucie, amoniakiem 349 ciaŜowe u owiec 307, 335 etanolem 858 Zawał serca 845, 856 Zespół, Conna 644 Criglera-Najjara 851 ---- typ,I 412 -------- II 412 Cushinga 644 Downa 846, 847 Dubina-Johnsona 412 Ehlersa-Danlosa 794, 814 ektopowej syntezy hormonów 574 feminizujących jąder 583, 659 Gilberta 412 Huntera 767 Hurler 766, 767, 844 Kearnsa^ayre'a 896 łamliwego X 898 Lescha-Nyhana 425, 440, 542 Marfana 814 McArdle'a 225 MELAS 160 Menkesa777, 814 Morquio-podobny 767 Morteaux-Lamy 767 mózgowo-wątrobowo-nerkowy 844 — nadnerczowo-płciowy 644 - niedoboru a-glukuronidazy 767 policystycznych jajników 669 rakowiaka złośliwego 698

SKOROWIDZ / 95S Zespół, Reye'a 441 Richnera-Hanharta 368 Sanfilippo 767 Scheiego 767 Steina-Leventha.la 669 Turnera 669 Zellwegera 265, 844 Ziarniszczaki 669 „Zinc fmger" 525 Złącze nerwowo-mięśmowe S88 Związki, glukogenne 234 — ketonowe (ciała ketonowe) 190, 191, 194,260,266,287,268,331 ----- utlenianie 334 — przeciwutleniające 185

Związki, rozprzegającc łańcuch oddechowy 152, 156 Zymogen 112 śelatynaza 885 śelazo, funkcja 775 hemowe 407 metabolizm 730, 775 zaburzenia 776 nadmiar 870 niedobór 775 stęŜenie we krwi 927

zapotrzebowanie 733 źródła 730

śelazoporfiryna 375 śółć 409, 736 — pęcherzykowa 737 - skład 736 wątrobowa 737 śółtaczka{i) 398, 411 analiza biochemiczna 413 cholestatyczna 413 fizjologiczna noworodków 411

hemolityczna 413 mechaniczna 413 niehemolityczna wrodzona 412 samoistna przewlekła 412 śywienie 721 normy 731

„Biochemia Harpera" to Jeden z najlepszych i najnowocześniejszych podręczników obejmujący całokształt przemian zachodzących w organizmie człowieka, Obecne, trzecie polskie wydanie tej ksiąŜki jest całkowicie zmienione w stosunku do poprzednich wydań. Przedstawiony materiał ujęto w 7 podstawowych częściach, uwzględniając zarówno chemizm; Jak [ przemiany metaboliczne podstawowych substancji niezbędnych do Ŝycia i funkcjonowania kaŜdego organizmu. Główny nacisk połoŜono na prawidłowe przemiany biochemiczne organizmu, zwracając jednak uwagę na wszelkie skutki patologiczne wynikające z zaburzeń lub nieprawidłowości zaistniałych w poszczególnych szlakach metabolicznych, czyli na biochemiczne podstawy chorób człowieka. KsiąŜka ta ma podwójną wartość. Jest niezbędna dla lekarzy oraz studentów w zrozumieniu podstaw zjawisk patologicznych, ale jest takŜe pasjonującą lekturą dla wszystkich zainteresowanych zagadnieniami biochemii w medycynie.

Cena zł 500000,zł 50,-

tSBN 83-200-1798-X