Biochemia Harpera, Wydanie 23, 965 Stron

B IO C H E M IA HARPERA

a LANGE medical book

Harper's

Biochemistry

Twenty-second Edition

Robert K. Murray, MD, PhD Professor of Biochemistry Universtty of Toronto Daryl K. Granner, MD Professor and Chairman Department of Moiecuiar Physiology and Biophysics Professor of Medicine Vanderbitt University Nashville, Tennessee Peter A. Mayes, PhD, DSc Reader in Biochemistry Royał Veterinary College University of London Victor W. Rodwell, PhD Professor of Biochemistry Purdue University West Lafayette, Indiana

Prentice-Hall International Inc.

Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Victor W. Rodwell

B IO C H E M IA HARPERA Wydanie III Redaktor naukowy tłumaczenia Franciszek Kokot

IHhl. Medyczna CM ID

1816004318

Warszawa 1995 Wydawnictwo Lekarskie PZWL 50LA T

Copyright for the Polish Edition by ydawnictwo Lekarskie PZWL J994, 1995

Z oryginału angielskiego Harper's Biochemistry ed. 22 Copyright © 1990 by Appleton Lange Ali Rights Reserved i rozdz. 60, 64 z oryginału angielskiego Harper's Btochemistry ed. 23 Copyright © 1993 by Appleton Lange Alt Rights Reserved

pod red. prof. dra hab. FRANCISZKA KOKOTA Tłumaczyli Doc. med. ZENON ALEKSANDROWICZ (rozdz. 12—19) Prof. dr hab. MIECZYSŁAW CHORĄŻY (rozdz. 35—42) Prof. dr hab. MARIAN DRÓŻDŻ (rozdz. 57, 58) Prof. dr hab. ZOFIA KILAŃSKA (rozdz. 2—5) Prof. dr hab. LEOKADIA KŁYSZEJKO-STEFANOWICZ (rozdz. 1, 6, 32, 33) Prof. dr hab. FRANCISZEK KOKOT (rozdz. 44—56, 60, 62 i przedmowa) Prof. dr hab, WANDA MAŁGORZATA KRAJEWSKĄ (rozdz. 7, 10, l i , 34) Prof. dr hab. EUGENIUSZ KUCHARZ (rozdz. 63) Prof, dr hab. BOHDAN LEWARTOWSKI (rozdz. 59) Prof. dr hab. ANNA LIPIŃSKA (rozdz. 8, 9, 30, 31) Prof. dr hab. JERZY VETULANI (rozdz. 64) Prof. dr hab. TADEUSZ WILCZOK (rozdz. 43, 61) Prof. dr hab. MARIUSZ ZYDOWO (rozdz. 20—29) Projekt okładki i strony tytułowej Anna Dluiewaka Redaktorzy Krystyna Chąjęcka, Renata Piotrowska-Siemdzka Redaktor techniczny Joanna Głodowska Korektorzy Zespół

1SBN 83-200-1798-X Wydawnictwo Uliatskie PZWL Warszawa ]»5 Wydanie Iii Cieszyńska Drukarnia Wydawnicza ul. Pokoju I, 43-400 Cieszyn Zam. nr 2543/K-94

PRZEDMOWA / 5

Przedmowa do wydania polskiego Do rąk Czytelnika oddajemy tłumaczenie 22. wydania „Biochemii Harpera". W trakcie tłumaczenia ukazało się wydanie 23. tej książki, wzbogacone o kitka nowych rozdziałów w stosunku do wydania 22. Dlatego też, chcąc dostarczyć Czytelnikom możliwie aktualnej wiedzy, postanowiono włączyć do wydania 22. dwa nowe rozdziały z wydania 23. („Erytrocyty i leukocyty" oraz „Podłoże biochemiczne niektórych chorób neuropsychiatrycznych"), uwzględniając stan wiedzy z końca 1992 r. Jako redaktor naukowy, odpowiedzialny za obecne polskie wydanie książki, kieruję wyrazy głębokiego szacunku i podziękowania do wszystkich Współtłumaczy za trud włożony w tłumaczenie poszczególnych rozdziałów. Pragnę

podkreślić, że tłumaczenie książki natrafiało na duże trudności w zakresie mianownictwa biochemicznego, często nie ustabilizowanego nie tylko w skali naszego kraju, lecz także międzynarodowej. Toteż sądzę, że wartość merytoryczna, a nie nomenklaturowa, będzie głównym kryterium oceny książki przez Czytelników. Pragnę wyrazić nadzieję, że i obecne wydanie „Biochemii Harpera" nie tylko spełni wymagania „starych" Czytelników tej książki, lecz także przysporzy jej wielu nowych Czytelników i przyjaciół.

Prof. dr hub. med. Franciszek Kokot

PRZEDMOWA / 7

Przedmowa „Biochemia Harpera" dostarcza zwięzłej, choć dostatecznie szerokiej, wiedzy dotyczącej podstaw biochemii i biologii molekularnej. Zawiera ona liczne przykłady na to, że wiedza biochemiczna jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów podtrzymujących zdrowie oraz przyczyn i racjonalnego leczenia licznych chorób, jakimi są szczególnie zainteresowani lekarze i inni pracownicy opieki zdrowotnej. Zmiany dokonane w wydaniu 22. Dwa cele przyświecały autorom przygotowującym obecne wydanie: 1) przedstawienie możliwie najnowszej wiedzy biochemicznej, potrzebnej przy studiowaniu medycyny oraz 2) dostarczenie studentom medycyny i innych nauk dotyczących zdrowia książki interesującej i lubianej przez użytkownika. Odzwierciedleniem tego jest układ i treść nowego wydania. • Wszystkie rozdziały zostały przeredagowane z uwzględnieniem ważnych postępów wiedzy biochemicznej. • We wstępie większości rozdziałów zasygnali zowano główne problemy będące ich treścią. • Zredukowano szczegółowe omawianie drugorzędowych szlaków metabolicznych. • Liczne ryciny zmodyfikowano w celu po prawienia ich czytelności. • Włączono nowe rozdziały dotyczące „Wody i pH", „Witamin rozpuszczalnych w wo dzie", „Witamin rozpuszczalnych w tłusz czach", „Utleniania kwasów tłuszczowych i ketogenezy", „Żywienia" i „Przemiany ksenobiotyków". • W ostatnim rozdziale, który jest również nowy, znajduje się zwięzłe omówienie bio chemicznych aspektów przyczyn i mechaniz mów chorób. Na podstawie historii choroby 8 chorych zilustrowano użyteczność wiedzy biochemicznej dla medycyny. Przedstawione przypadki dotyczą głównych klas przyczyn chorobowych. Rozdział ten, wraz z suple mentem omawiającym testy laboratoryjne, stanowią pomost wypełniający dotychczaso wą lukę dzielącą biochemię od kliniki.

Układ książki Tekst składa się z 3 rozdziałów wprowadzających i 6 głównych działów. Dział 1 jest poświęcony białkom i enzymom, będącym końmi roboczymi organizmu. Ponieważ większość reakcji zachodzących w komórkach ludzkich ma charakter enzymatyczny, jest istotne zapoznanie się z właściwościami enzymów przed omawianiem innych problemów. W dziale II przedstawiono a) różne reakcje komórkowe, w których zachodzi utylizacja lub wytwarzanie nośników energetycznych oraz b) szlaki syntezy i rozkładu węglowodanów i lipidów. Ponadto przedstawiono funkcję poszczególnych związków należących do wymienionych klas cząsteczek. W dziale III omówiono poszczególne aminokwasy i ich losy oraz przemiany tych związków przebiegające ze zużytkowaniem lub wytwarzaniem energii. W dziale IV przedstawiono strukturę i funkcję kwasów nukleinowych oraz szlak DNA-tRNA->białka. W tej części opisano również zasady technologii rekombinacji DNA, tj. zagadnienie o niezwykłych implikacjach w dyscyplinach biomedycznych. Treścią działu V są hormony i ich kluczowa rola w komunikacji międzykomórkowej i regulacji poszczególnych szlaków metabolicznych. Po to, aby hormony mogły zadziałać na komórkę, muszą mieć kontakt z błonami komórkowymi. Nic więc dziwnego, że początek tego działu jest poświęcony strukturze i funkcjom błon. Dział VI składa się z 7 specjalnych rozdziałów, w tym nowego rozdziału omawiającego przemianę ksenobiotyków i biochemiczne aspekty niektórych chorób. W suplemencie podano zwięzłą interpretację wyników badań laboratoryjnych i główne ich implikacje diagnostyczne.

8 / PRZEDMOWA

Podziękowanie Autorzy pragną wyrazić podziękowanie Panu Aleksandrowi Kugushewowi; wiele zmian dokonanych w tym wydaniu nie mogłoby być zrealizowanych bez Jego stałego zainteresowania, rady, „popychania sprawy" i zachęcania. Nasza wdzięczność należy się również naszym zawodowym Kolegom i Przyjaciołom z całego świata za przekazane sugestie, mające na celu poprawienie książki. Zachęcamy ich, aby w dalszym ciągu wykazali zainteresowanie książką i nie szczędzili wysiłku w jej ulepszaniu. Za szczególnie cenne uważamy opinie wyrażone przez studentów.

Autorzy czują się szczególnie usatysfakcjonoszeroką akceptacją i poparciem książki w ca ^ m świecie. Przedruki licznych wydań opublikowanych w języku angielskim ukazały sie w Japonii, Libanie, na Tajwanie, Filipinach oraz w Korei. Ponadto książkę przetłumaczono na j ązy ^ włoski, hiszpański, francuski, portugalski, japoński, polski, niemiecki, serbsko-chorwacki i grecki, wam

, ■

___ RKM ___ DKG ___ PAM ___VWR

SPIS TREŚCI / 9

Spis treści 1. Biochemia i medycyna — Robert K. Murray ............................................................ 2. Biomolekuły i metody biochemiczne — Robert K. Murray .................................... 3. Woda i pH — Victor W. Rodwell ............................................................................... Część I. Budowa oraz funkcje białek i enzymów

4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

11 16 26

....................................

35

Aminokwasy — Victor W. Rodwell ............................................................................ Peptydy — Victor W. Rodwell .................................................................................. Białka: struktura i właściwości — Victor W. Rodwell ............................................. Białka; mioglobina i hemoglobina — Vtctor W. Rodwell ....................................... Enzymy: właściwości ogólne — Victor W. Rodwell ................................................ Enzymy: kinetyka — Victor W. Rodwell .................................................................... Enzymy: mechanizmy działania — Victor W. Rodwell ............................................. Enzymy: regulacja aktywacji — Victor W. Rodwell ...............................................

35 49 59 70 82 94 110 118

Część II. Bioenergetyka i metabolizm węglowodanów oraz

lipidów

12. Bioenergetyka — Peter A. Mayes ............................................................................ 13. Utlenianie biologiczne — Peter A. Mayes ................................................................. 14._ Fosforylacja oksydacyjna i mitochondrialne systemy transportujące — Peter A. Mayes ............................................................................. 15. Węglowodany o znaczeniu fizjologicznym — Peter A. Mayes ............................... 16. Lipidy o znaczeniu fizjologicznym — Peter A. Mayes ............................................. 17. Zarys przemian pośrednich — Peter A. Mayes ......................................................... 18. Cykl kwasu cytrynowego. Katabolizm acetylo-CoA— Peter A. Mayes ............... y 19. Glikoliza i utlenianie pirogronianu — Peter A. Mayes ............................................ 20. Metabolizm glikogenu — Peter A. Mayes ................................................................ v 21. Glukoneogeneza i kontrola stężenia glukozy we krwi — Peter A. Mayes ............ 22. Szlak pentozofosforanowy oraz inne szlaki przemiany heksoz — Peter A. Mayes 23. Biosynteza kwasów tłuszczowych — Peter A. Mayes ............................................. 24. Utlenianie kwasów tłuszczowych: ketogeneza — Peter A. Mayes ......................... 25. Metabolizm nienasyconych kwasów tłuszczowych i eikozanoidów — Peter A. Mayes .............................................................................................................................. 26. Metabolizm acylogliceroli i sfingolipidów — Peter A. Mayes .............................. 27. Transport i magazynowanie lipidów — Peter A. Mayes ......................................... 28. Synteza, transport i wydalanie cholesterolu — Peter A. Mayes ............................ 29. Integracja metabolizmu i dostarczanie substratów energetycznych do tkanek — Peter A. Mayes ................................................................................................... Część III.

Metabolizm białek i aminokwasów

131 131 139 147 161 173 188 198 207 217 226 239 251 260 274 284 294 314 329

..........................................

337

30. Biosynteza aminokwasów, które nie muszą być dostarczane w pożywieniu — Victor W. Rodwell ......................................................................... 31. Katabolizm białek i azotu aminokwasów — Victor W. Rodwell ............................ 32. Katabolizm szkieletów węglowych aminokwasów — Victor W. Rodwell .............

337 344 357

10 / SPIS TREŚCI

33. Przemiana aminokwasów w wyspecjalizowane produkty — Victor W. Rodwell . 34. Porfiryny i barwniki żółciowe — Robert K. Murray ................................................. Część IV. Budowa, czynność i replikacja makrocząsteczek informacyjnych

35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42.

385 398

.................................................................... 415

Nukleotydy — Victor W. Rodweil ............................................................................. Metabolizm nukleotydów purynowych i pi rym idy nowych — Victor W. RoJwell . Struktura i funkcja kwasów nukleinowych — Dary! K. Granner ........................... Organizacja i replika DNA — Dary/ K. Granner ......................................................... Synteza, przekształcenie i metabolizm RNA — Dary/ K. Granner ......................... Synteza białek i kod genetyczny — Dary/ K. Granner ............................................. Regulacja ekspresji genu — Dary/ K. Granner ......................................................... Technologia rekombinacji DNA — Dary/ K. Granner .............................................

415 425 443 456 476 491 508 529

Część V. Biochemia zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej komuni kacj i ............................................................ 549

43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52.

Błony: struktura, organizacja i funkcja — Dary/ K. Granner ..................................... 549 Charakterystyka układów hormonalnych — Dary I K. Granner .............................. 573 Działanie hormonów — Dary! K. Granner ................................................................. 584 Przysadka mózgowa i hormony podwzgórza — Dary/ K. Granner .......................... 599 Hormony tarczycy — Dary/ K. Granner .................................................................... 612 Hormony regulujące przemianę wapniową — Dary/ K. Granner ............................ 619 Hormony kory nadnerczy — Dary/ K. Granner ......................................................... 629 Hormony rdzenia nadnerczy — Dary! K. Granner ................................................... 645 Hormony gonadalne — Dary I K. Granner ................................................................. 652 Hormony trzustki i żołądkowo-jelitowe — Dary/ K. Granner .................................. 671

Część VI. Zagadnieni a wybrane

53. 54. 55. 56. 57.

............................................................................. 693

Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w wodzie — Peter A. Mayes . . . Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w tłuszczach — Peter A. Mayes . . Żywienie — Peter A. Mayes ........................................................................................ Trawienie i wchłanianie — Peter A. Mayes .............................................................. Glikoproteiny i proteoglikany — Robert K. Murray ................................................ 58. Białka osocza, immunoglobitliny i czynniki krzepnięcia — Elizabeth J. Harfenist Robert K. Murray .............................................................. 59. Białka kurczliwe i strukturalne — Victor W. Rodwell, Robert K. Murray, Frederick W. Keetey .................................................................... 60. Metabolizm ksenobiotyków — Robert K. Murray .................................................. 61. Rak, onkogeny i czynniki wzrostowe — Robert K. Murray ..................................... 62. Biochemia a choroby — Robert K. Murray .............................................................. 63. Erytrocyty i leukocyty — Robert K. Murray ............................................................... 64. Podłoże biochemiczne niektórych schorzeń neuropsychiatrycznych — Robert K. Murray .................................................................................................... Dodatek ................................................................................................................................. Skróty spotykane w biochemii .......................................................................................... Skorowidz ..........................................................................................................................'.

693 710 721 734 749 770 794 817 824 842 865 887 910 930 935

Biochemia i medycyna Robert K. Murray, MD, PhD

WPROWADZENIE Biochemia jest to nauka zajmująca się różnorodnymi molekułami i związanymi z nimi reakcjami chemicznymi, które zachodzą w żywych komórkach i organizmach. Każda informacja wykraczająca poza skrajnie powierzchowną wiedzę o życiu — we wszystkich jego zróżnicowanych przejawach — wymaga poznania biochemii. Co więcej, studenci medycyny, zdobywając solidną porcję wiedzy z zakresu biochemii, będą w stanie skonfrontować zarówno w praktyce, jak i w pracy badawczej 2 podstawowe problemy wszystkich nauk medycznych: 1) zrozumienie, jak zachować zdrowie oraz 2) zrozumienie istoty chorób i ich skuteczne leczenie. Biochemia to chemia życia Biochemię można, bardziej konwencjonalnie, zdefiniować jako naukę dotyczącą chemicznych podstaw życia (gr. bios — życie). Komórka jest strukturalną jednostką organizmu żywego. Rozważenie tej koncepcji prowadzi do funkcjonalnej definicji biochemii, jako nauki zajmującej się chemicznymi składnikami żywych komórek oraz reakcjami i procesami, którym one ulegają. Zgodnie z nią biochemia obejmuje przepastne obszary biologii komórki i całość biologii molekularnej. Zadaniem biochemii jest opisanie i wyjaśnienie na poziomie molekularnym wszystkich procesów chemicznych zachodzących w żywych komórkach Głównym celem biochemii jest dogłębne poznanie na poziomie molekularnym wszystkich procesów chemicznych związanych z życiem komórki. Aby wypełnić to zadanie, biochemicy

usiłują wyizolować liczne molekuły znajdujące się w komórkach, określić ich strukturę i zanalizować, jak funkcjonują. Przykładem takich działań są próby zrozumienia molekularnych podstaw skurczu — procesu związanego przede wszystkim, ale nie wyłącznie, z komórkami mięśniowymi, co wymaga oczyszczenia wielu cząsteczek zarówno prostych, jak i złożonych, a następnie poddania ich szczegółowym badaniom strukturalno-funkcjonalnym. Dzięki tym wysiłkom ustalono niektóre cechy molekularnych podstaw skurczu mięśni. Kolejnym zadaniem biochemii jest usiłowanie docieczenia, jak powstało życie. Wiedza na ten fascynujący temat pozostaje nadal w powijakach. Zasięg biochemii jest tak niezmierzony, jak samo życie. Gdziekolwiek to życie się pojawia, tam zachodzą procesy chemiczne. Biochemicy badają je w mikroorganizmach, roślinach, owadach, rybach, ptakach, u niższych i wyższych ssaków oraz u ludzi. Studenci nauk biomedycznych będą zainteresowani zwłaszcza biochemią 2 ostatnich grup. Należy jednak docenić również biochemię mniej skomplikowanych form życia, często bezpośrednio związaną z biochemią człowieka. Ma przykład współczesne teorie regulacji aktywności genów i enzymów u ludzi emanują z pionierskich badań dotyczących drożdży piekarskich i bakterii. Dziedzina rekombinacji DNA wyłoniła się z doświadczeń na bakteriach i ich wirusach. Szybkość namnażania się (multyplikacji) i łatwość wyekstrahowania ich materiału genetycznego czynią je odpowiednimi dla genetycznych analiz i manipulacji. Wiedza zdobyta z badania genów wirusów odpowiedzialnych za niektóre typy raka u zwierząt (wirusowych onkogenów) zapewniła gruntowny wgląd, w jaki sposób komórki ludzkie stają się nowotworów ymi.

12 / ROZDZIAŁ 1

Znajomość biochemii jest istotna dla wszystkich nauk przyrodniczych, z medycyną włącznie Biochemia kwasów nukleinowych leży w sercu genetyki; z kolei zastosowanie metod genetycznych staio się kluczowe do wyjaśnienia wielu dziedzin biochemii. Fizjologia, badająca funkcjonowanie organizmu, niemal kompletnie pokrywa się z biochemią. Immunologia posługuje się licznymi technikami biochemicznymi, a wiele podejść immunologicznych znalazło S2erokie zastosowanie w biochemii. Farmakologia i farmacja opierają się na rzetelnej znajomości biochemii i fizjologii, zwłaszcza że większość leków jest metabolizowana w reakcjach katalizowanych enzymatycznie, a skomplikowane interakcje pomiędzy lekami najlepiej zrozumieć za pomocą biochemii. Trucizny oddziałują na reakcje i procesy biochemiczne i to jest domeną toksykologii. Biochemiczne podejście znajduje coraz więcej zastosowania w badaniu podstawowych aspektów patologii (nauki o chorobach), np. stany zapalne, uszkodzenia komórek 1 nowotwory. Wiehi przedstawicieli mikrobiolo gii, zoologii i botaniki posługuje się niemal wyłącznie metodami biochemicznymi. Te po wiązania nie są zaskoczeniem, ponieważ życie, jak wiadomo, polega na reakcjach i procesach biochemicznych. Istotnie, dawne bariery mię dzy naukami przyrodniczymi padają, a bio chemia coraz bardziej staje się ich wspólnym językiem. Wzajemne oddziaływanie między biochemią a medycyną pobudza stały postęp w obu tych dziedzinach Jak wspomniano na początku tego rozdziału, 2 główne problemy pracowników nauk medycz nych, a zwłaszcza lekarzy, to: 1) zrozumienie, jak zachować zdrowie oraz 2) zrozumienie istoty chorób i ich skuteczne leczenie. Biochemia zapisała się na trwałe w obu tych fundamentalnych zagadnieniach medycyny. Faktycznie wzajemne oddziaływanie biochemii i medycyny to tak, jak szeroka dwukierunkowa ulica. Analizy biochemiczne wyjaśniły wiele aspektów z dziedziny zdrowia oraz choroby i odwrotnie, badanie różnych przejawów zdrowia i choroby otwiera coraz to nowe obszary przed biochemią. Wzajemna współpraca medycyny i biochemii ma ważne implikacje filozoficzne dla tej pierwszej. Jak długo postępowanie lekarskie będzie mocno zakorzenione w gruntownej znajomości

biochemii oraz innych pokrewnych nauk podstawowych (np. fizjologii, mikrobiologii, żywienia), tak długo medycyna praktyczna będzie miała racjonalną podstawę do zastosowania coraz to nowych osiągnięć wiedzy. Kontrastuje to jaskrawo z kultem niekonwencjonalnej medycyny, która często opiera się na niczym więcej niż na micie, pobożnych życzeniach i braku bazy intelektualnej. PRAWIDŁOWE PROCESY BIOCHEMICZNE SĄ PODSTAWĄ ZDROWIA Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) definiuje zdrowie jako stan w pełni dobrego samopoczucia fizycznego, umysłowego i socjalnego, a nie tylko jako brak choroby lub zniedołężnienia. Z czysto biochemicznego punktu widzenia zdrowie może być rozważane jako sytuacja, » której wszystkie z wielu tysięcy reakcji wewnątrz- i zewnątrz komórkowych, zachodzących w organizmie, przebiegają z szybkością adekwatną do jego maksymalnego przetrwania w stanie fizjologicznym. Badania biochemików znajdują oddźwięk w odżywianiu i medycynie prewencyjnej Głównym warunkiem zachowania zdrowia jest pobieranie w pożywieniu optymalnej ilości związków chemicznych; głównymi z nich są witaminy, niektóre aminokwasy, pewne kwasy tłuszczowe, różne substancje mineralne i woda. Wiele zagadnień z biochemii oraz żywienia dotyczy badania różnych aspektów tych właśnie związków chemicznych, wobec czego współdziałanie obu wymienionych dyscyplin jest bardzo ścisłe. Ponadto, ze względu na dążenie do obniżenia rosnących kosztów opieki lekarskiej, najprawdopodobniej większy nacisk zostanie położony na systematyczne działania w celu zachowania zdrowia i zapobiegania chorobom, tj. na medycynę prewencyjną. Zatem podejście żywieniowe do przeciwdziałania np. miażdżycy tętnic i nowotworom prawdopodobnie uzyska rosnące poparcie. Zrozumienie znaczenia odżywiania zależy jednak w rozległym zakresie od znajomości biochemii.

BIOCHEMIA i MEDYCYNA /

Każda choroba ma biochemiczne uzasadnienie Wszystkie choroby są manifestacją zaburzeń w cząsteczkach, reakcjach chemicznych i procesach. Główne czynniki odpowiedzialne za powstawanie chorób u ludzi i zwierząt są wymienione w tab. l-l. Wszystkie one mogą wpłynąć na jedną lub więcej zmian chorobotwórczych w reakcjach chemicznych lub molekułach organizmu.

Tabela 1 -1 . Główne przyczyny chorób, wpływają ce na różnorodne mechanizmy biochemiczne w ko mórce lub organizmie*

1.

Czynniki fizyczne: urazy mechaniczne, eks tremalne temperatury, nagle zmiany ciśnienia atmosferycznego, promieniowanie, szok elekt ryczny

2.

Czynniki chemiczna i leki: pewne związki toksyczne, środki terapeutyczne itp.

3.

Czynniki biologiczne: wirusy, riketsje, bak terie, grzyby, wyższe formy pasożytów

4.

Brak tlenu: niedokrwienie, zmniejszenie poje mności tlenowej krwi, zatrucie enzymów ok sydacyjnych

-

5. Genetyczna: wrodzone, molekularne 6. Reakcje immunologiczne: anafilaksja. cho roba autoimmunologiczna

7.

Zaburzania w odżywianiu: miary

niedobory i nad

8. Zachwiania równowagi wewnątrzwydzielniczej: niedobory i nadmiary hormonów * Zaadaptowano za zgodą z: Robbins SL, Cotram RS, KumarV: The Pathologic Bas/s of D/sease, wyd. 3, Saunders, 1984.

Badania biochemiczne pomagają w diagnozie, prognozie i leczeniu Istnieje bogata dokumentacja potwierdzająca zastosowanie biochemii w zapobieganiu chorobom, diagnozie i leczeniu chorób. Wiele dowodów na to można znaleźć w kolejnych rozdziałach tej książki. Jednakże na tym etapie, w celu zilustrowania ogromu przedmiotu i zainteresowania nim Czytelnika, wydaje się niezbędne podanie 7 krótkich przykładów. 1. Człowiek musi pobrać pewną liczbę złożonych cząsteczek organicznych, zwanych witaminami, aby utrzymać zdrowie. Witaminy są,

13

ogólnie rzecz biorąc, zamieniane w organizmie na bardziej kompleksowe cząsteczki (koenzymy), które odgrywają kluczową rolę w wielu reakcjach komórkowych. Brak którejś z witamin w pożywieniu znajduje oddźwięk w spowodowanej tym faktem chorobie, takiej jak gnilec lub krzywica (wynikłej odpowiednio z niedoboru witaminy C lub D). Wyjaśnienie kluczowej roli witamin, lub też ich aktywnych biologicznie pochodnych w komórkach zwierzęcych i ludzkich jest głównym wspólnym problemem biochemików i dietetyków od przełomu naszego stulecia. Gdy tylko ustalono, że dana choroba jest wywoływana brakiem jakiejś witaminy, wówczas stało się racjonalne jej leczenie podawaniem brakującej witaminy. 2. Fakt, iż wiele roślin- afrykańskich jest pozbawionych jednego lub kilku istotnych, czyli niezbędnych, aminokwasów, które muszą być dostarczone z zewnątrz w celu utrzymania zdro wia, pomógł wytłumaczyć wyniszczające nie dożywienie białkowo-energetyczne (kwashiorkor), będące chorobą tych, dta których owe rośliny stanowią główne źródło białka. Leczenie niedoboru istotnych aminokwasów jest tu roz sądną konsekwencją, ale, niestety, nie zawsze możliwą do przeprowadzenia. Polega ono na zapewnieniu wyważonej diety, zawierającej od powiednie ilości wszystkich niezbędnych ami nokwasów. 3. Grenlandzcy Eskimosi (ang. Inuit) spoży wają duże ilości oleju rybnego bogatego w nie które wiełoRienasycone kwasy tłuszczowe (ang. polyunsaturated fatty acids; skrót — PUFA). Badania wykazały, że odznaczają się oni małym stężeniem cholesterolu w osoczu i rzadką za chorowalnością na miażdżycę tętnic. Te obser wacje wywołały żywe zainteresowanie możliwo ścią stosowania PUFA w celu zmniejszenia stężenia cholesterolu. Zarówno choroby wywołane brakiem witamin, jak i te spowodowane niedoborem istotnych aminokwasów, to przykłady zaburzeń odżywiania (p. tab. 1-1). Miażdżyca tętnic może być uważana za przykład zaburzenia spowodowanego nieprawidłowym odżywianiem, ale wiążą się z nią także inne, np. genetyczne, czynniki. 4. Stan znany jako fenyloketonuria (ang. phenylketonuria; skrót — PKU) nie leczony prowadzi do ciężkich zaburzeń umysłowych już w dzieciństwie. Podstawa biochemiczna PKU jest znana od ponad 30. lat. Jest to zaburzenie uwarunkowane genetycznie (tab. 1-1), spowo-

14 / ROZDZIALI dowane brakiem lub małą aktywnością enzymu, który przekształca fenyloalaninę w tyrozynę. W konsekwencji niedoboru enzymu, fenyloalanina i niektóre jej metabolity, takie jak fenyloketony, gromadzą się w tkankach i niszczą rozwijający się ośrodkowy układ nerwowy. Odkąd udowodniono naturę biochemicznego zaburzenia w PKU, kolejnym logicznym krokiem stało się leczenie dzieci z fenyloketonurią dietą o małej zawartości fenyloalaniny. Gdy tylko masowe testy biochemiczne na rozpoznanie PKU zaraz po urodzeniu okazały się możliwe do przeprowadzenia, wówczas stało się realne skuteczne leczenie tej wady metabolicznej. 5. Mukowiscydoza (łac. fibrosis cystica) jest to znana choroba gruczołów wydzielania ze wnętrznego i gruczołów potowych, uwarunko wana genetycznie (p. tab. 1-1), Charakteryzuje ją nienaturalnie lepka wydzielina, która zatyka przewody wydzielnicze trzustki i oskrzeliki. Chorzy na mukowiscydozę mają także zwięk szone ilości chlorków w pocie. Ofiary tej choro by często umierają w młodym wieku na zakaże nie płuc. Bardzo niedawno (1989 r.) wyizolowa no i zsekwencjonowano gen związany z tą chorobą. Prawidłowy gen koduje łańcuch 1480 aminokwasów białka transbłonowego, które wydaje się być kanałem dla chlorków lub, prawdopodobnie, jakimś regulatorem takiego kanału. Nieprawidłowością u prawie 70% cho rych na mukowiscydozę wydaje się być delecja 3 nukleotydów w DNA, co powoduje brak w tym transmembranowym białku aminokwasu w pozycji 508, tj. reszty fenyloalaniny. W ja ki sposób ta delecja uszkadza czynność owego transbłonowego białka i powoduje gęs ty śluz, czeka Jeszcze na opracowanie. To ważne zadanie powinno Ułatwić odnalezie nie nośników genu fibrosis cystica i spowo dować racj onalniej sze leczenie niż obecne. Prawdopodobnie możliwe byłoby przygoto wanie leku, który korygowałby zaburzenie w białku transbłonowym, a także nie jest wy kluczone, że można by wprowadzać prawid łowy gen do komórek płuc w wyniku leczenia genetycznego. 6. Analiza mechanizmu działania toksyny bakteryjnej, powodującej cholerę, dostarczyła ważnego czynnika do zrozumienia przyczyny klinicznych objawów tej choroby (obfita bie gunka, utrata elektrolitów i wody z organizmu). 7. Odkrycie, iż komary przenoszące zarodźce (plazmodia) powodujące zimnicę są w stanie

wytworzyć w sobie barierę ochronną o podłożu biochemicznym na działanie środków owadobójczych, ma ważne implikacje w próbach wyeliminowania tej choroby. Ten przykład i poprzednie reprezentują choroby powodowane przez czynniki biologiczne (p, tab. 1-1), Wiele analiz biochemicznych naświetla mechanizmy chorób, które z kolei inspirują badania w określonych działach biochemii Wstępne obserwacje, poczynione w początkach naszego stulecia przez angielskiego lekarza Archibalda Garroda na małej grupie wrodzonych wad metabolicznych, wzbudziły poszukiwanie biochemicznych przyczyn tego stanu. Badania dotyczące genezy przyczyn choroby uwarunkowanej genetycznie, znanej jako hipercholesterolemia rodzinna, będącej przyczyną zaawansowanej miażdżycy tętnic w młodym wieku, umożliwiły radykalny postęp w dziedzinie receptorów komórkowych i mechanizmów przyswajania cholesterolu przez komórki. Prace z zakresu onkogenów w komórkach rakowych zwróciły uwagę na mechanizmy molekularne związane z kontrolowaniem prawidłowego wzrostu komórkowego. Te i wiele innych przykładów ilustruje, jak obserwacje poczynione w klinice mogą otworzyć szerokie obszary funkcjonowania komórek dla badań biochemicznych. TA KSIĄŻKA POMOŻE POWIĄZAĆ WIEDZĘ Z ZAKRESU BIOCHEMII Z PROBLEMAMI KLINICZNYMI Końcowy rozdział podsumowuje wiele koncepcji, pojawiających się w tekście, dotyczących powiązania biochemii z patologią. Przykładami są tutaj także mechanizmy biochemiczne działające w poszczególnych chorobach, które powoduje każda z 8 przyczyn wymienionych w tab. 1-1. W suplemencie omówiono również podstawowe rozważania stosowane podczas interpretacji wyników biochemicznych testów laboratoryjnych wykonywanych rutynowo w praktyce klinicznej. Głównym celem tych starań jest pomoc i zachęta dla Czytelnika, aby umiał przetransponować wiedzę z zakresu biochemii w swoją działalność kliniczną. Wykorzystanie badań biochemicznych w odniesieniu do chorób można podsumować w 5 punktach.

BIOCHEMIA I MEDYCYNA / 16

Takie badania mogą: 1) odkryć przyczyny choroby, 2) zaproponować racjonalne i skuteczne jej leczenie, 3) umożliwić masowe testy do wczesnej diag nozy, 4) ułatwić monitorowanie postępów choroby, 5) ułatwić ocenę skutku leczniczego.

Suplement do tej książki opisuje najważniejsze rutynowe biochemiczne testy diagnostyczne, używane do wykrywania chorób (tzn. do celów określonych w pkt. 3, 4 i 5). Posłuży on za pożyteczne źródło informacji przy omawianiu biochemicznej diagnostyki chorób (np. zawału serca, ostrego zapalenia trzustki).

2

Biomolekuły i metody biochemiczne Robert K. Murray, MD, PhD

WPROWADZENIE Celem niniejszego rozdziału jest przedstawienie 5 zagadnień istotnych dla zrozumienia biochemii oraz wskazania głównych kierunków pomagających w przyswojeniu wiedzy niniejszego podręcznika. Omówiono więc zwięźle kolejno: 1. Skład chemiczny organizmu i podstawowe klasy cząsteczek w nim występujących. 2. Budowę struktur komórkowych i sposobu ich wydzielania. 3. Wagę rozwiązań doświadczalnych i właś ciwego dobom metod stosowanych w biochemii. 4. Główne osiągnięcia w biochemii oraz 5. Słabo rozwinięte działy biochemii dotyczą ce m.in. rozwoju, różnicowania, funkcji mózgu, nowotworów i innych chorób człowieka. Wobec powyższego być może staną się one dla niektórych Czytelników motorem przyszłego ich udziału w badaniach nad tymi problemami.

ORGANIZM LUDZKI SKŁADA SIĘ Z KILKU PIERWIASTKÓW, KTÓRE TWORZĄ RÓŻNE CZĄSTECZKI Główne pierwiastki to: węgiel (C), wodór
Skład chemiczny organizmu ludzkiego został poznany, a podstawowe jego składniki przedstawiono w tab. 2-1. Węgiel, tlen, wodór i azot stanowią główne składniki większości biomolekuł. Fosfor jest składnikiem kwasów nukleinowych i innych związków, a w fprmie zjonizowanej jest również szeroko rozprzestrzeniony w organizmie człowieka. Wapń odgrywa kluczową

rolę w licznych procesach biologicznych i znajduje się w centrum wielu aktualnie prowadzonych badań. Pierwiastki wyszczególnione w kolumnie 3. tab. 2-1 pełnią różnorakie funkcje. Większość z nich spotyka się w codziennej praktyce lekarskiej u chorych z zaburzeniami równowagi elektrolitowej (K.+, Na + , Cl" i Mga+), niedokrwist ością spowodowaną niedoborem żelaza (Fe2+) lub chorobami tarczycy (I"). Tabela 2-1. Przybliżony skład chemiczny organizmu ludzkiego (w przeliczeniu na suchą masę)* Pierwiastek Procent Pierwiastek Procent Węgiel Tlen Wodór Azot Wapń Fosfor

50 20 10 8,5 4 2,5

Potas Siarka Sód Chlor Magnez Żelazo Mangan Jod

1

0,8 0,4 0,4 0,1

0,01 0.001 0,00006

* Cytowane za zgodą z: West ES, Todd WR: Textbook of Biochemistry, 3 wyd., Macmillan, 1961.

Główne biopołinrtery to DNA, RNA, białka, polisacharydy i złożone lipidy

Jak przedstawiono w tab. 2-2, główne zespoły biocząsteczek w komórkach i tkankach wyższych zwierząt (włączając człowieka) to: DNA, RNA, białka, polisacharydy i lipidy. Te złożone cząsteczki są zbudowane z prostych cząsteczek, które także wymieniono w tab. 2-2. Cegiełki

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 17

budulcowe DNA i RNA (ogólnie znane jako kwasy nukleinowe) to odpowiednio deoksyrybonukleotydy i rybonukleotydy, natomiast bu-

dujące białka to aminokwasy. Polisacharydy są zbudowane z prostych węglowodanów: w przypadku gfikogenu (głównego polisacharydu występującego w tkankach ludzkich) cegiełką budulcową jest glukoza. Kwasy tłuszczowe mogą

być uważane za jednostki budulcowe lipidów, chociaż lipidy nie są polimerami kwasów tłuszczowych. DNA, RNA, białka i polisacharydy zalicza się do hiopolimerów, ponieważ składają się z powtarzających się cegiełek budulcowych (monomerów). Te złożone cząsteczki stanowią istotne „tworzywo życia". Większość przedstawionego tekstu będzie wiec związana z opisem różnych biochemicznych właściwości tych biopolimerów i monomerów. Takie same złożone cząsteczki znaleziono również wśród niższych organizmów, chociaż cegiełki budulcowe w niektórych przypadkach mogą się różnić od tych przedstawionych w tab. 2-2, np. bakterie nie mają glikogenu i triacylogliceroli, ale mają one inne poiisacharydy i lipidy.

Białka, tłuszcze, węglowodany, woda i składniki mineralne stanowią główne komponenty organizmu ludzkiego Skład chemiczny organizmu ludzkiego przedstawiono w tab. 2-3. Główne jego komponenty to: białka, tłuszcze, węglowodany, woda i składniki mineralne. Woda stanowi główny składnik, choć jej ilość waha się w szerokim zakresie wśród różnych tkanek. Polarny charakter i zdolność tworzenia wiązań wodorowych czynią wodę idealnym rozpuszczalnikiem w organizmie. Szczegółowe znaczenie właściwości wody zostanie przedstawione w rozdz. 3. Tabela 2-3. Prawidłowy skład chemiczny człowieka o masie ciała 65 kg* Kilogramy Białka

11

17,0

Tłuszcze

9

13,8

Węglowodany

1

1,5

Woda**

40

61,6

4

6,1

Składniki mineralne Tabela 2-2. Główne złożone biomolekuły organiczne komórek i tkanek. Kwasy nukleinowe, białka i polisacharydy są biopolimerami zbudowanymi z poniżej przedstawionych jednostek budulcowych. Lipidów ogólnie nie zalicza się do biopolimerów i nie wszystkie lipidy zawierają kwasy tłuszczowe jako jednostki budulcowe Blomolekula Jednostka budulcowa

Podstawowe funkcje

DNA

Materiał genetyczny

RNA

Białko

Polisacharydy (glikogen) Lipidy

2

Biochemia

Deoksyry bonu kleotyd Rybonukleotyd Aminokwasy

Matryca w biosyntezie białek Różnorodność pełnionych funkcji w komórkach (np, enzymy, elementy kurczliwe) Krótkotrwałe magazynowanie energii w postaci glukozy Różnorodne, np. składniki błon komórkowych, długotrwałe magazynowanie energii w postaci triacylogliceroli

Glukoza

Kwasy tłuszczowe

■

Procent

* Cytowane za zgodą z: Davidson SD, Passmore R, Brock JF: Human Nutrition and Dietetics, wyd. 5, Churchill Livingstone, 1973. ** Zawartość wody może różnić się między różnymi tkankami, występując w małej ilości (22,5%) w kościach bezszpikowych, Zawartość procentowa wody wykazuje tendencje zmniejszania, gdy zwiększa się odsetek lipidów w organizmie.

KOMÓRKA PODSTAWOWĄ JEDNOSTKĄ ŻYCIA W XIX w. w badaniach Schleidena i Schwanna oraz innych pionierów, takich jak Virchow uznano komórkę za podstawową jednostkę aktywności biologicznej. Jednakże dopiero bezpośrednio po II wojnie światowej 3 wydarzenia zapoczątkowały okres nierównomiernego rozwoju w biochemii i biologii komórki. Były to: 1) zwiększająca się dostępność mikroskopu elektronowego, 2) wprowadzenie metod pozwalających rozbijać komórki, w warunkach względnie

łagodnych, zapewniających ich funkcje, oraz 3) zwiększająca się dostępność wysokoobrotowej

ultra wirówki z chłodzeniem, zapewniającej wy-

tworzenie siły odśrodkowej wystarczającej do

18 / ROZDZIAŁ 2

rozdzielenia rozbitych komórek, bez ich przegrzewania. Zastosowanie mikroskopu elektronowego ujawniło wiele nie znanych wcześniej lub słabo widocznych składników komórkowych, których rozbicie i ultrawirowanie pozwoliło na ich wydzielenie i analizę in vitro,

3 i steczka Srńdplazmatyczna

Cytozol Rybosom

Hepatocyt szczura — modelowa komórka eukariotyczna Schemat strukturalny komórki wątroby {hepatocytu) szczura przedstawiono na ryc. 2-1. Hepatocyt jest prawdopodobnie najczęściej badaną komórką ze wszystkich komÓTek pod względem biochemicznym, częściowo z powodu łatwej jej dostępności w stosunkowo dużych ilościach odpowiednich do frakcjonowania i badania różnorodności jej funkcji. Hepatocyt zawiera główne organelle występujące w komórkach eukariotycznych (tab. 2-4). Są to: jądro komórkowe, mitochondria, siateczka śródplazmatyczna, wolne rybosomy, aparat Golgiego, lizosomy, peroksysomy, błona komórkowa i niektóre elementy cyt o szkieletu. Do rozbicia komórek i wydzielania organelli i wewnątrzkomórkowych cząsteczek stosuje się techniki fizyczne W celu zbadania funkcji dowolnej organelli należy, w pierwszej kolejności, wydzielić ją we względnie czystej formie, wolnej od większych zanieczyszczeń innymi elementami strukturalnymi komórki. Utarty sposób, który pozwala to osiągnąć, nazywa się frakcjonowaniem subkomórkowym i ogólnie wymaga 3 operacji, tj. ekstrakcji, homogenizacji i wirowania. Większość pionierskich badań w tym zakresie wykonano wykorzystując wątrobę szczura. Ekstrakcja. Pierwszy etap w kierunku izolowania określonej organelli (czy cząsteczek) stanowi jej ekstrakcja z komórek, w których się znajduje. W większości organelle i biomolekuły są nietrwałe i tracą biologiczną aktywność; muszą więc być ekslrahowane w warunkach łagodnych (np. stosowanie roztworów wodnych i pozbawionych ekstremalnych wartości pH, ciśnienia osmotycznego i wysokich temperatur). Rzeczywiście, większość metod izolowania organelli wykorzystuje temp. 0 — 4°C (tj. w chłodni lub utrzymywanie badanego materiału w pojemnikach z lodem). Znaczna utrata aktywności może mieć miejsce w temperaturze pokojowej, częściowo wskutek działania różnych enzymów trawiennych (proteaz, mikleaz, itd.), uwolnionych podczas rozbijania komó-

Aparat Golgiego

B ło n a cytoplazmatyczna

Lizosom

Ryc. 2-1. Schemat komórki wątroby szczura z jej głównymi organellami.

rek. Ogólnie stosowany roztwór do ekstrakcji organelli komórkowych zawiera 0,25 mol/l sacharozy (izotonicznej), doprowadzonej do pH 7,4 za pomocą 0,05 mol/l buforu Tris (trishydroksymetyloaminometan) — kwas solny i jony K+ i Mg2+ o stężeniu zbliżonym do wartości fizjologicznych; ten roztwór jest nazywany umownie STKM. Nie wszystkie roztwory stosowane do ekstrakcji są tak łagodne jak STKM; np. rozpuszczalniki organiczne wykorzystywane do ekstrakcji lipidów i kwasów nukleinowych. Homogenizacja. Aby wyekstrahować organelle (lub biocząsteczkę) z komórek, najpierw należy rozbić komórki w łagodnych warunkach. Narządy (np. wątroba, nerka, mózg) i zawarte w nich komórki mogą być rozbite w sposób standardowy przez homogenizację, podczas której napędzany ręcznie lub mechani-

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE /

19

Tabeła 2-4. Główne organelle wewnątrzkomórkowe i ich czynnością W zestawieniu podano tylko podstawowe funkcje związane z każdą z tych struktur. W wielu przypadkach w organellach może przebiegać kilka szlaków metabolicznych, procesów czy reakcji Organella lub frakcja* Znacznik (Marker)

Główne czynności

Jądro komórkowe

DNA

Miejsce chromosomów Miejsce syntezy RNA zależnej od DNA (transkrypcja)

Mitochondrium

Dehydrogenaza bursztynianowa

Cykl kwasu cytrynowego, oksydacyjna fosforyiacja

Rybosom*

Duża zawartość RNA

Miejsce biosyntezy białek (translacja mRNA w biatka)

Siateczka śródpiazmatyczna

GI u kozo - 6 - fosfataza

Rybosomy związane z błonami są głównym miejscem biosyntezy białek Biosynteza różnych lipidów Utlenianie wielu ksenobiotyków (cytochrom P-450)

Uzosom

Fosfataza kwaśna

Miejsce licznych hydrolaz (enzymów katalizujących rea kcje degradacyjne)

Błona cytoplazmatyczna

Na +/K + -ATPaza, 5'-nukleotydaza

Transport cząsteczek do i z komórek Wewnątrzkomórkowa adhezja i wymiana

Aparat Golgiego

Galaktozylotransferaza

Wewnątrzkomórkowy rozdział białek Reakcje glikozylacji Reakcje powstawania siarczanów

Peroksysom

Katalaza Oksydaza moczanowa

Degradacja niektórych kwasów tłuszczowych Wytwarzanie i degradacja nadtlenku wodoru

Cytoszkielet*

Brak swoistych znaczników**

Mikrof i lamenty, mikrotubule; filamenty pośrednie

Cytozol*

Dehydrogenaza mlecza nowa

Enzymy glikoltzy, syntezy kwasów tłuszczowych

-

* Orga nel la sta nowi wewnątrzkomórkową substrukturę otoczoną btoną i wydzieloną pr zez wirowanie przy dużej sile odśrodkowej. W związku z powyższym rybosomy, cytoszkielet i cytozol nie są organellami. Zamieszczono je w tabeli ze względu na ich izolowanie przez wirowanie różnicowe. Mogą być rozpatrywane jako struktury wewnątrzkomórkowe lub frakcje. Organeile izolowane w toku pojedynczego cyklu wirowania różnicowego nie są czyste. W celu uzyskania czystych frakcji jest wymagane wielokrotne powtórzenie cyklu oczyszczania, ** Frakcje cytokszkieletowe mogą być ocenione za pomocą mikroskopii elektronowej lub przez analizę elektroforetyczną charakterystycznych dla nich białek.

cznie ttok obraca się w szklanej probówces odpowiednich rozmiarów, zawierającej pocięte kawałki narządu we właściwym środowisku, takim jak STKM. Kontrolowane obroty tłoka powodują cięcie i rozbijanie komórek, uwalniając ich składniki do roztworu sacharozy. Otrzymana zawiesina, zawierająca wiele nie naruszonych organelli, nazywa się homogenałem. Wirowanie. Frakcjonowanie składników homogenatu przez wirowanie różnicowe jest techniką o kluczowym znaczeniu w biochemii, W klasycznej metodzie stosuje się serię 3 odwirowań przy stopniowo zwiększających się szybkościach (ryc. 2-2), z których każde dostar-

cza osadu i supernatantu. Supernatant na każdym etapie poddaje się odwirowaniu. Takie postępowanie pozwala otrzymać 3-krotnie osad, nazywany odpowiednio frakcją jądrową, mitochondrialną i mikrosomalną. Żadna z tak uzyskanych frakcji nie reprezentuje w pełni czystych organelli. Jednakże, na podstawie badań w mikroskopie elektronowym oraz analizy aktywności odpowiednich enzymów — znaczników (ang, markerów) i składników chemicznych (np. DNA i RNA), stwierdzono, że głównymi elementami opisywanych 3 frakcji są odpowiednio: jądra komórkowe, mitochondria i mikrosomy. Znacznikowy enzym lub składnik chemiczny jest jednym z parametrów prawie

20 / ROZDZIAŁ 2

, Supernatant (1)

•

600 g

15,000 g

x 10 min.

x 5 min

Supernatant ( 2 )

Supernatant (31

105,000 g x 60 min

,Homogenat

\i

.

■:-::-i

p Frakcja Jądrowa

Frakcja mllochondfialna

, Frakcja ml kro BO ma tna

Ryc. 2-2. Schemat rozdziału frakcji wewnątrzkomórkowych za pomocą wirowania różnicowego. Zhomogenizowaną tkankę (np. wątrobę) początkowo poddaje się wirowaniu przy małej sile odśrodkowej, która dostarcza frakcji jądrowej {zawierającej jądra komórkowe i nienaruszone komórki) oraz supernatantu (1). Supernatant (1) dekantujesię i poddaje wirowaniu przy średniej sile odśrodkowej, które prowadzi do otrzymania frakcji mitochondrialnej {zawierającej mitochondria, lizosomy i peroksysomy) i supernatantu (2). Supernatant ten poddaje się dekantacji oraz wirowaniu przy dużej sile odśrodkowej. Osad z tego wirowania stanowi frakcję mikrosomainą (zawierającą mieszaninę wolnych rybosomów oraz gładką i szorstką siateczkę śród plaż maty czną) i końcowy, klarowny płyn — supernatant {3). Ten ostatni odpowiada cytozolowi, czyli sokowi komórkowemu. Różne modyfikacje tego podstawowego schematu wirowania różnicowego umożliwiają izolację każdej organelli komórkowej we względnie czystym stanie.

wyłącznego występowania w określonej organelli, np. fosfataza kwaśna — w lizosomach, DNA — w jądrze komórkowym (tab. 2-4). W ten sposób znacznik może stanowić wskaźnik obecności lub braku w poszczególnej frakcji organelli, w których on występuje. Frakcja mikrosomalna (mikrosomy) zawiera głównie mieszaninę gładkiej i szorstkiej (siateczka śródplazmatyczna z połączonymi z nią rybosomami) siateczki śródplazmatycznej oraz wolnych rybosomów. Zawartość ostatniego supernatantu odpowiada rozpuszczalnej frakcji cytopiazmy (cytozoł). Modyfikacja tej podstawowej metody wirowania różnicowego przez stosowanie odmiennych środowisk do homogenizacji tkanek, różnych technik wirowania (np. ciągły lub skokowy gradient stężenia sacharozy) pozwala wydzielić lepiej lub gorzej oczyszczone postacie wszystkich organelli komórkowych przedstawionych na ryc. 2-1 i wymienionych w tab. 2-4. Opisany powyżej schemat frakcjonowania może znaleźć zastosowanie, w ogólnym zarysie, do większości narządów i komórek. Jednak frakcjonowanie komórek tym sposrobem musi być ocenione przez analizę w mikroskopie elektronowym w celu standaryzacji metody. Nie należy

przeceniać znaczenia badań frakcjonowania struktur komórkowych w rozwoju biochemii i biologii komórki. Stanowi ono jedno z ważniejszych rozwiązań doświadczalnych (patrz niżej) i głównie dzięki jego wykorzystaniu wyjaśniono funkcje organelli, przedstawionych w tab. 2-4. Informacje o funkcjach poszczególnych organelli, przedstawione w tej tabeli, stanowią główne osiągnięcia badań biochemicznych (patrz niżej). Rozwiązanie doświadczalne obejmuje 3 etapy Rozwiązanie doświadczalne stosowane w biochemii obejmuje 3 główne etapy: 1) izolowanie biomolekul i organelli (p. powyżej: Wirowanie), 2) określenie struktury biomolekuł oraz 3) analizy, z wykorzystaniem różnych preparatów, funkcji i metabolizmu biomolekuł (tj. syntezy i degradacji). Izolowanie biomolekuł Wyjaśnienie funkcji biomolekuł, podobnie jak w przypadku organelli, wymaga przede wszystkim wydzielenia ich w czystej postaci. W tabeli 2-5 przedstawiono główne metody

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 21

wykorzystywane do rozdziału i oczyszczania biomolekuł. W tym podrozdziale nie podano szczegółów metodycznych, niektóre z nich zostaną krótko opisane w różnych miejscach tego podręcznika. Połączenie kilku metod jest prawie zawsze nieodzowne w oczyszczaniu biomolekuł do stanu jednorodności (wolnych od zanieczyszczeń innymi biomolekułami). Należy podkreślić, że postępy biochemii są uwarunkowane rozwojem nowych metod analizy, oczyszczania i badania struktury. Na przykład biochemię lipidów zrewolucjonizowało wprowadzenie chromatografii ciecz owo-gazowej i chromatografii cienkowarstwowej. Analiza błon biologicznych i wielu białek przysparzała ogromnych trudności, aż do chwili wprowadzenia elektroforezy w żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS (SDS-PAGE). Wprowadzenie detergentu — siarczanu dodecylu sodu (SDS) — pozwala „rozpuścić" wiele białek do analizy elektroforetycznej, które przedtem uchodziły

Tabela 2-5. Główne metody stosowane do rozdziału i oczyszczania biomolekuł. Większość z nich jest użyteczna do analizy składników obecnych w ekstraktach komórkowych i innym materiale biologicznym. Połączenie kilku technik pozwala oczyścić większość biomolekuł. Zaleca się Czytelnikowi podręczniki przedstawiające szczegółowe opracowania metod wykorzystywanych w badaniach biochemicznych Frakcjonowanie za pomocą soli (np. wytrącanie siarczanem amonu) Chromatografia Bibułowa Jonowymienna (wymieniacze anionowe i kationowe) Powinowactwa Cienkowarstwowa Cieczowogazowa Cieczowa wysokociśnieniowa Filtracja żelowa E le k t roto r e za Bibułowa Wysokonapięciowa Na agarozie Na octanie celulozy W żelu skrobiowym W żelu poliakryloamidowym W żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS U Itra w i rowan i e

raczej za nierozpuszczalne. Rozwój metod sekwencjonowama i klonowania DNA dokonał przewrotu w badaniach kwasów nukleinowych i biologii w ogóle. Określanie struktury biomolekuł Kiedy biocząsteczki zostaną oczyszczone, wtedy należy określić ich strukturę. Pozwoli to na szczegółowe znalezienie zależności między ich budową a Funkcją. Główne metody, wykorzystywane w analizie budowy biomolekuł, przedstawiono w tab. 2-6. Są one znane Czytelnikowi, który ma pewien zakres wiedzy z chemii organicznej. Znana swoistość niektórych enzymów czyni je bardzo użytecznymi narzędziami w wyjaśnieniu właściwości strukturalnych pewnych biomolekuł. Udoskonalenia w ich rozdzielaniu dokonano dzięki postępowi teoretycznemu i technologicznemu, w wyniku wprowadzenia spektrometrii masowej i spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR), które stały się metodami z wyboru do oznaczania budowy. Na przykład budowa bardzo złożonych łańcuchów węglowodanowych, wykryta w niektórych biomolekulach, takich jak glikoproteiny, obecnie często może być wyjaśniona dzięki spektroskopii wysokorozdzielczej NMR. Najbardziej wnikliwej informacji o budowie biomolekui dostarcza dyfrakcja promieniami X i krystalografia. Zastosowanie ich było przełomem w wyjaśnieniu szczegółów budowy różnych białek i enzymów oraz natury podwójnego heliksuDNA. Tabela 2-6. Główne metody stosowane w określeniu struktur biomolekuł Analiza elementarna Spektrofotometria w świetle nadfioletowym i widzialnym Spektroskopia w podczerwieni, spektroskopia jądrowego rezonansu magnetycznego Zastosowanie kwasowej lub zasadowej hydrolizy do degradacji btomolekufy w badaniu jej podstawowych składników Zastosowanie enzymów swoiście degradujących biomolekuły (np. proteazy, nukleazy, glikozydazy) Spektrometria masowa L Metody swoistego sekwencjonowania {np. białek, kwasów nukleinowych) Krystalografia rentgenowska

22 / ROZDZIAŁ 2

Analiza czynności i metabolizmu biomolekuł Początkowe badania biochemiczne człowieka i zwierząt wykonywano na poziomie „całego organizmu". Przykładem były badania oddychania i śledzenie losu trawionych związków. Wkrótce stało się jasne, że cały organizm jest zbyt złożonym obiektem, aby można było uzyskać ostateczne odpowiedzi na wiek postawionych pytań. Rozpoczęto zatem rozwijać prostsze postępowania in vitro, które usuwały wiele

komplikacji powstających w doświadczeniach na całym organizmie. W tabeli 2-7 podsumowano różne typy postępowania preparatywnego, dostępne obecnie w badaniach procesów biochemicznych; większość danych przedstawionych w tym podręczniku otrzymano przez ich zastosowanie. Wykaz metod przedstawiono w zmniejszającym się porządku stopnia ich złożoności. Zarówno wykorzystanie badań na poziomie całego organizmu, jak i inne metody postępowania mają swoje ograniczenia. Przy-

Tabela 2-7. Kolejność postępowania w badaniu procesów biochemicznych Poziom badań (metoda) Organizm zwierzęcy

Wyizolowany, perfundowany narząd Skrawki tkankowe

Uwagi Badania mogą obejmować: 1) usunięcie narządu (np. hepatektomia) 2) zmiany w diecie (np. głodzenie) 3) podawanie leków (np. fenobarbital) 4) podawanie toksyn (np. tetrachlorek węgla) 5) wykorzystanie zwierząt z określoną chorobą {np. cukrzyca) 6) stosowanie wyrafinowanych technik, jak spektroskopia NMR i to mografia emisji pozytronowej Badania na tym poziomie są często fizjologiczne, ale ich interpretacja może być utrudniona przez wpływ na narządy układu krążenia i układu nerwowego Szczególnie użyteczne narządy: wątroba, serce i nerka. Takie podejście pozwala badać narząd poza wpływem innych narządów lub układu nerwowego. Zastosowanie perfuzji zapewnia, że czynności narządu są podtrzymywane przez kilka godzin Często używa się skrawków wątroby. Skrawki narządu, odizolowane od innych wpływów; preparaty takie wykazują jednakże tendencję do degradacji w ciągu niewielu godzin, częściowo, z powodu niedostatecznego odżywienia

Komórki

1. Szczególnie przydatne dla komórek krwi, które można stosunkowo

Homogenat

1. Zapewnia preparatykę w układach bezkomórkowych 2. Możliwość dodawania lub usuwania określonych składników (np, przez dializę) i analiza ich wpływu 3. Możliwość frakcjonowania przez wirowanie indywidualnych orga nelli komórkowych

Wydzielone organelte komórkowe

Szeroko stosowane w badaniach czynności mitochondriów, siateczki śródplazmatycznej, rybosomów, itp.

Pod Struktury organelli komórkowych Izolowanie i charakterystyka metabolitów i enzymów

Szeroko wykorzystywane, np. w badaniach czynności podstruktur mitochondriów

Klonowanie genów kodujących enzymy i białka

Izolowanie sklonowanych genów jest istotne dla badań ich budowy i regulacji, może stanowić podstawę w określaniu sekwencji aminokwasowych kodowanych przez nie enzymów lub białek

łatwo oczyścić 2. Stosowanie komórek w kulturach tkankowych jest niezbędne w wielu dziedzinach biologii

Istotna część analizy reakcji chemicznych lub szlaków metabolicznych

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 23

czyną fałszywych wyników (artefaktów) doświadczeń in ntro może być np. homogenizacja komórek, uwalniająca enzymy, które mogą częściowo trawić składniki komórkowe.

STRATEGIE W BADANIU REAKCJI BIOCHEMICZNYCH SA ZŁOŻONE I WIELOPOZIOMOWE Niniejsza książka w większości będzie dotyczyła złożonych procesów biochemicznych (np. biosyntezy białka, skurczu mięśnia), łącznie ze szlakami metabolicznymi. Szlak metaboliczny stanowi serie reakcji odpowiedzialnych za biosyntezę bardziej złożonego związku, zbudowanego z jednego lub wielu prostych związków, czy za degradację związku do jego końcowych produktów. O istnieniu złożonego procesu biochemicznego można wnioskować na podstawie obserwacji poczynionych na poziomie całego organizmu, np. obserwując człowieka można stwierdzić, że mięśnie szkieletowe się kurczą. Wiemy, że glukoza służy jako źródło energii dla

ludzi i innych organizmów zwierzęcych, a zatem można wnioskować, że musi ona być degradowana (metaboiizowana) w organizmie w celu uzyskania energii. Jednakże, aby zrozumieć w pełni przebieg tego procesu w komórkach ludzkich, a wiedza nasza o tym jest wciąż niekompletna, należy przeprowadzić analizy na różnych poziomach. Na rycinie 2-3 przedstawiono schematycznie różne typy obserwacji i analiz, które są nieodzowne w celu zrozumienia procesów biochemicznych, takich jak rozkład glukozy w celu uzyskania energii (proces znany jako gjikoli/a). Schemat ten stosuje się do podstawowego poziomu wszystkich głównych procesów biochemicznych omawianych w niniejszej książce i przedstawienia ogólnej strategii w ich wyjaśnianiu. Powinien on się przypominać wtedy, kiedy każdy z opisywanych głównych procesów biochemicznych (np. glikoliza, utlenianie kwasów tłuszczowych) będzie rozpatrywany, chociaż nie zawsze punkt wyszczególniony na rycinie będzie z nim związany. Wiele ważnych punktów, przedstawionych w tabeli 2-7 i na ryc. 2-3, zasługuje na dyskusję.

Wnioskowania o obecności procesu biochemicznego lub szlaku metabolicznego na poziomie całego organizmu zwierzęcego Badanie mechanizmów jago kontroli in vtvo Badanie wpływu swoistych chorób (np. wrodzone bloki metaboliczne, nowotwór itp,) na Jego przebieg

ł

Umiejscowienie procesu w Jednym (lub więcej) narząd z ie(ach) Umiejscowienie procesu w Jednej (lub więcej) organem czy frakcji komórkowej Przedstawienie reakcji zaangażowanych w jego przebieg

t

Oczyszczanie uczestniczących w nim Indywidualnych substratOw, produktów, enzymów, koenzymów I innych składników

t t

Badanie mechanizmów Jego kontroli In vttro Ustalenie mechanizmów reakcji zaangażowanych w Jego przebieg Ftekonstytucja przebiegu procesu (szlaku)

ł Badanie procesu na poziomie genu za pomocą rekombinacji DNA Ryc. 2-3. Schemat ogólnego postępowania w analizie procesu biochemicznego lub szlaku metaboliczne go. Wyszczególnione etapy nie muszą być stosowane dokładnie w wymienionej kolejności. Wykorzystanie ich prowadzi zwykle do wyjaśnienia szczegółów procesu biochemicznego lub szlaku metabolicznego. Schemat ten znajduje zastosowanie we wszystkich głównych szlakach metabolicznych przedstawionych w następnych rozdziałach niniejszej książki.

-

24 / ROZDZIAŁ 2

1. Aby. zrozumieć proces biochemiczny na poziomie molekularnym, pomimo możliwości pojawienia się artefaktów, nieodzowne jest wyizolowanie i identyfikacja każdego z jego składników w czystej postaci. Liczne przykłady tego będą spotykane później. 2. Istotna jest także możliwość rekonstytucji procesu w warunkach in vitro przez systematyczną jego odbudowe z indywidualnych składników. Jeżeli po rekonstytucji z jego składników proces nie przebiega, oznacza to, że pewien krytyczny składnik został utracony i nie został wprowadzony do układu. 3. Ostatnie zdobycze technologiczne (np. spektroskopia NMR i tomografia emisji pozytronowej; ang. PET scanning) pozwalają wykrywać pewne biomolckuły na poziomie narządu i rejestrować zmiany ich ilości w czasie. Takie rozwiązania wskazują, że staje się możliwe wykonywanie wyrafinowanych analiz wielu procesów biochemicznych na poziomie in vivo. 4. Jeżeli wyniki badań uzyskiwanych na różnych poziomach pokrywają się, to ma się prawo wnioskować, że został poczyniony rzeczywisty postęp w zrozumieniu procesu biochemicznego. Jeśli pojawią się duże rozbieżności przy zastosowaniu różnych rozwiązań doświadczalnych, to ich przyczyny muszą być badane aż do uzyskania racjonalnego wyjaśnienia. 5. Przedstawione sposoby preparatywne i poziomy analiz mogą być wykorzystane w badaniu różnic biochemicznych u zwierząt ze zmienionym stanem metabolicznym {np. głodzenie, karmienie) lub swoistymi chorobami (np. cukrzyca, rak). 6. Większość przedstawionych metod i rozwiązań można wykorzystać w badaniach prawidłowych i zmienionych chorobowo komórek lub tkanek człowieka. Jednakże należy uwzględnić warunki (czas) pobierania takiego materiału i szczególnie brać pod uwagę względy etyczne prowadzenia doświadczeń z materiałem ludzkim. Zastosowanie radioaktywnych i ciężkich izotopów przyczyniło się do wyjaśnienia procesów biochemicznych Wprowadzenie izotopów do badań w biochemii w latach 30. naszego wieku stanowiło punkt zwrotny, zatem ich zastosowania zasługują na specjalną wzmiankę. Przed ich użyciem bardzo trudno było „naznaczyć" biomolekuły, aby można było łatwo śledzić ich los „metaboliczny". Pionierskie doświadczenia, zwłaszcza Schoenheimera i wsp., wprowadzające niektóre izotopy trwałe (np. 2D, l5N), połączone z ich detekcją na drodze spektrometrii

masowej, znalazły zastosowanie w rozwiązywaniu wielu problemów biochemicznych. Na przykład pewne zsyntetyzowane aminokwasy, cukry i kwasy tłuszczowe, zawierające odpowiednie trwałe izotopy, podaje się zwierzętom lub in vitro w toku preparatyki, aby śledzić ich los metaboliczny (np. okres połowicznego rozpadu, przemianę w inne biomolekuły). Związki znakowane trwałymi izotopami wykorzystano do poznania wielu aspektów metabolizmu białek, węglowodanów i lipidów. Z tych doświadczeń wynika jasno, że metabolizm jest bardzo aktywnym procesem, a większość związków w komórce jest stale syntetyzowana i degradowana, choć z odmienną szybkością. Te odkrycia, zdaniem Schoenheimera, zwróciły uwagę na „dynamiczny charakter metabolizmu". Tabela 2-8. Główne izotopy stosowane w badaniach biochemicznych Izotopy trwale

Izotopy promieni ot wó rcze

2

D

"N

"C M Ca 131 1

Późniejsze wprowadzenie izotopów radioaktywnych oraz przyrządów umożliwiających pomiar ich aktywności było także niezmiernie ważne. W tabeli 2-8 przedstawiono główne trwałe i radioaktywne izotopy wykorzystywane w układach biologicznych. Zastosowanie zarówno izotopów trwałych, jak i radioaktywnych jest fundamentalne dla rozwoju każdego działu biochemii. Badania za ich pomocą złożonych i prostych biomolekuł zarówno in vivo, jak i in vitro budzą zaufanie. Ogromny postęp, poczyniony ostatnio w sekwencjonowaniu kwasów nukleinowych, a także w oznaczaniu substancji występujących w-układach biologicznych w niezwykle małych ilościach stosując metody radioimmunologiczne, opiera się na wykorzystaniu izotopów.

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 25

BIOCHEMIA, PRZEZ LICZNE ODKRYCIA, WSPIERA BIOLOGIĘ KOMÓRKI I MEDYCYNĘ Poniżej dokonano podsumowania głównych osiągnięć w dziedzinie biochemii, zwłaszcza w odniesieniu do biochemii człowieka. Obejmują one: • Ustalenie pełnego składu chemicznego komó rek, tkanek i organizmu oraz wydzielenie i określenie budowy podstawowych związ ków w nich występujących. • Dostarczenie informacji, przynajmniej na ogólnym poziomie, o funkcjach wielu pro stych, a także głównych złożonych biomolekuł (opisanych w dalszych rozdziałach książ ki), W centrum zainteresowania pozostaje DNA, materiał genetyczny, z którego infor macja jest przenoszona na 1 z typów RNA (informacyjny RNA, czyli mRNA), który z kolei dyktuje kolejność (sekwencje) amino kwasów w białkach. Przepływ informacji z DNA może być zapisany następująco: DNA-> RNA-+ białko. • Wydzielenie głównych organelli komórek zwierzęcych i ustalenie ich podstawowych funkcji. • Stwierdzenie, że prawie wszystkie reakcje przebiegające w komórkach katalizują en zymy; oczyszczono i zbadano wiele enzymów oraz przedstawiono obszernie właściwości i mechanizmy ich działania. • Przedstawienie szlaków metabolicznych syn tezy i degradacji głównych prostych i złożo nych biomolekuł. Szlak syntezy danego związ ku w zasadzie różni się od szlaku jego de gradacji. • Wyjaśnienie licznych aspektów regulacji me tabolizmu. • Przedstawienie, w szerokim zakresie, w jaki sposób komórki zachowują i wykorzystują energię. • Wyjaśnienie wielu aspektów budowy i funkcji różnych błon występujących w komórkach, których głównymi składnikami są białka i li pidy. • Przedstawienie, w ogólnym zarysie, sposobu działania głównych hormonów • Wykrycie biochemicznych podstaw wielu chorób.

POZOSTAŁO WIELE DO ZBADANIA Zdając-sobie sprawę, jak wiele zgromadzono wiadomości biochemicznych, należy ocenić, jak niewiele jeszcze wiadomo w wielu działach tej nauki. Dwa istotne problemy, wymagające wyjaśnienia, dotyczą ustalenia biochemicznych podstaw rozwoju i różnicowania oraz funkcji mózgu. Chociaż obecnie dobrze poznano naturę chemiczną materiału genetycznego, prawie nic nie wiadomo o mechanizmach, które włączają i wyłączają geny w czasie rozwoju. Zrozumienie regulacji genów stanowi klucz do poznania, jak różnicują się komórki i jak zmieniają się w komórki nowotworowe. Wiedza o podziale komórkowym i wzroście komórek prawidłowych i nowotworowych oraz o ich regulacji jest bardzo skąpa. Rzeczywiście nic nie wiadomo na temat biochemicznych podstaw złożonych zjawisk ncuronalnych, takich jak świadomość i pamięć. Bardzo ograniczona jest również nasza wiedza 0 mechanizmach wydzielania komórkowego. Pomimo pewnego postępu, molekularne pod stawy większości głównych chorób genetycznych nie są wyjaśnione, ale wiele nadziei niesie tech nologia rekombinacji DNA, zwiastując zauwa żalny rozwój w tej dziedzinie w ciągu kilku najbliższych lat. Ludzki genom może być zsekwencjonowany w następnym stuleciu lub wcześniej. Wiadomości uzyskane przez tak ogromny wysiłek będą potężnym wyzwaniem dla biologii człowieka 1medycyny.

PIŚMIENNICTWO Freifelder D: Physicał Biochemistry: Appiicalions to Biochemistry and Molecułar Biology. Fceeman, 1982. Fruton JS: Mołecuks and Life; Historical Essays on the Interplay of Ckemistry and Biology. Wiley-Interscience, 1972, Weinberg RA: The molecules of life. Sci Am (Oct) 1985; 253: 48. [Entire issue is of interest.]

3

Woda i pH Vicłor W. Rodwelł, PhD

WPROWADZENIE Biochemia dotyczy w większości właściwości i reakcji chemicznych związków organicznych. Często jednak się zapomina, że w komórkach żywych większość reakcji chemicznych przebiega w środowisku wodnym. Woda jest czynnym składnikiem w wielu reakcjach biochemicznych i jest ważnym czynnikiem determinującym właściwości makrocząsteczek, takich jak białka. Woda dysocjuje do jonów OH~ i H+. Termin pH stosuje się do określenia stężenia jonów wodorowych w komórkach oraz płynach ustrojowych i stanowi kluczowe pojęcie w biochemii i medycynie. Grupy funkcyjne (aminowe, karboksylowe itd.) biomolekuł dysocjują przy określonej wartości pH, a wiele ich właściwości biologicznych i fizycznych zależy od tej dysocjacji.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Wiadomo, że dla zdrowia nieodzowna jest stałość środowiska wewnętrznego organizmu,

utrzymywana we względnie wąskich granicach. Dotyczy to ogólnego rozmieszczenia wody, a także utrzymywania pH i stężenia różnych elektrolitów, np. Na+, K+, Ca2+, Mg2+ i fosforanów w organizmie. Ogólna zawartość wody w organizmie mężczyzny waha się w granicach 55—65% masy ciała; mniejsza wartość odnosi się do osób otyłych. Dane dla kobiet są mniejsze, średnio o ok. 10%. Dwie trzecie wody organizmu stanowi płyn wewnątrzkomórkowy

(ang. intraceliular fluid; skrót — ICF), zaś pozostałą część reprezentuje płyn pozakomórkowy (ang. extracellular fluid; skrót — ECF). Około 25% ECF występuje' w osoczu.

Regulacja równowagi wodnej jest złożona i za-

ieży przede wszystkim od podwzgórza, kontrolującego pragnienie, hormonu antydiuretycznego (ADH) i czynności nerek. Stany niedoboru wody i nadmiaru wody ustrojowej są powszechne. W wielu przypadkach towarzyszy im niedobór lub nadmiar jonów sodowych. Przyczynami niedoboru wody mogą być: 1) zmniejszone jej pobieranie (np. podczas śpiączki) lub 2) nadmierne jej wydalanie (np. utrata z moczem w cukrzycy, przy silnych potach przez skórę, w ostrej biegunce u dzieci, w przebiegu chslery). Nadmiar wody ustrojowej powodują: 1) zwiększone pobieranie (np. przy nadmiernym podawaniu płynów dożylnie) bądź 2) zmniejszone jej wydalanie (np. w ostrej niewydolności nerek). U osób zdrowych pH płynu pozakomórkowego utrzymuje się w granicach 7,35—7,45. Bufor wodorowęglanowy (HCOf/H2CO3) odgrywa szczególnie ważną rolę w tym względzie. Kiedy pH osiąga wartość poniżej 7,35, wtedy dochodzi do stanu określanego jako kwasica, jeżeli zaś pH przekroczy wartość 7,45 występuje zasado wica. Zaburzenia równowagi kwasowo-zasadowej można zwykle

rozpoznać oznaczając pH krwi tętniczej, pCO2 oraz ogólną zawartość COj we krwi żylnej, znając poprzednio wymienione wartości, stężenie HCOf. Istnieją liczne przyczyny kwasicy (ketoacydoza cukrzycowa, kwasica mleczanowa itp.) i zasadowicy (wymioty kwaśną treścią żołądkową, działanie niektórych leków moczopędnych itp.). Znajomość patogenezy zaburzeń równowagi wodnej i równowagi kwasowo-zasadowej jest podstawą właściwej diagnozy i ich leczenia. Wymaga to zatem poznania tych właściwości wody, które umożliwiają jej odegranie kluczowej roli w biochemii.

WODA I pH / 27

Cząsteczka wody wykazuje budowę tetraedryczną Cząsteczka wody ma postać nieregularnego czworościanu (tetraedr) z atomem tlenu w jego środku (ryc. 3-1). Dwa wiązania z wodorem są skierowane w 2 rogi czworościanu, podczas gdy 2 pozostałe rogi są zajęte przez niesparowane elektrony na zhybrydyzowanych orbitalach 2sp3. Kąt pomiędzy 2 atomami wodoru a tlenem (105°) jest nieco mniejszy niż kąt tetraedryczny (109,5c), co przyczynia się do utworzenia nieznacznie skośnego czworościanu. Ryc. 3-2. Tetraedryczna struktura amoniaku.

STRUKTURA TETRAEDRYCZNA I DIPOLARNY CHARAKTER WODY UŁATWIAJĄ REAKCJE

Ryc. 3-1. Tetraedryczna struktura wody

Nierównomierne rozmieszczenie ładunku w cząsteczce wody przyczynia się do utworzenia dipolu (cząsteczki biegunowej) Lekko pochyla struktura czworościanu wody jest przyczyną nierównomiernego rozmieszczenia w niej ładunku. Przeciwległa do 2 atomów wodoru strona tlenu jest stosunkowo bogata w elektrony, natomiast druga strona, zawierająca względnie odsłonięte jądra wodoru, tworzy obszar o ładunku miejscowo dodatnim. Pojęcie „dipol" oznacza taką cząsteczkę, jak woda, w której ładunek elektryczny (elektrony) jest rozmieszczony nierównomiernie. Amoniak, podobnie jak woda, jest tetraedryczną cząsteczką dipolową W cząsteczce amoniaku kąty między wiązaniami atomów wodoru (107°) są zbliżone do kąta tetraedrycznego nawet bardziej niż w wodzie {ryc. 3-2). Wiele związków organicznych budujących komórki jest dipolami, np. alkohole, fosfolipidy, aminokwasy i kwasy nukleinowe.

W stanie ciekłym woda jest stabilizowana przez wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe, które tworzą strukturę wielkocząsteczkową przypominającą strukturę lodu Cząsteczki wody, z powodu dwubiegunowego charakteru, tworzą uporządkowane układy (przypominające płatki śniegu). Jednakże uporządkowanie takie, jak w cząsteczce wody, nie ogranicza się do lodu. Woda w stanie ciekłym wykazuje strukturę wielkocząsteczkową, która jest ściśle równoległa do rozkładu geometrycznego cząsteczek wody w lodzie. Zdolność cząsteczek wody do łączenia się ze sobą zarówno w stanie ciekłym, jak i stałym wynika z dipolarncgo charakteru wody. Pozostaje ona w stanie ciekłym z powodu przemijającego charakteru jej kompleksów wielkocząsteczkowych (okresu półtrwania asocjacji — dysocjacji cząsteczek wody — ok. 1 as). W stanie stałym każda cząsteczka wody asocjuje z 4 innymi cząsteczkami wody. W stanie ciekłym liczba asocjujących cząsteczek jest nieco mniejsza (ok. 3,5) i w tym stanie woda swoją budową wielkocząsteczkową, z wyjątkiem przemijającej natury wewnątrzcząsteczkowych interakcji, przypomina lód w znacznie większym stopniu niż można było początkowo przypuszczać. Dipolarny charakter cząsteczek wody sprzyja ich wzajemnemu łączeniu się w uporządkowanym, precyzyjnym szyku, wynikającym z wewnętrznej geometrii cząsteczki wody (ryc. 3-3).

28 / ROZDZIAŁ 3

V ł Ryc. 3-3. Strona Iswa: Asocjacja 2 dipoiarnych cząsteczek wody. Linia kropkowana przedstawia wiązanie wodorowe Strona prawa: Asocjacja cząsteczki wody (środkowej) z 4 innymi cząsteczkami wody za pomocą wiązań wodorowych. Struktura ta H ,, jest typowa dla lodu i w mniejszym stopniu dla wody w stanie ciekłym.

V

Oddziaływanie elektrostatyczne między jądrem wodoru jednej cząsteczki wody a wolną parą elektronów drugiej nazywa się wiązaniem wodorowym. W porównaniu do wiązań kowalencyjnych, wiązania wodorowe są raczej słabe. Rozerwanie wiązania wodorowego w wodzie (w stanie ciekłym) wymaga ok. 18,8 kJ/mol (4,5 kca!/mol), tj. ok. 4% energii wymaganej do rozerwania wiązania O—H w wodzie (461 kJ/mol=llO kcal/mol).

Słabe wiązania wodorowe odgrywają istotną rolę w biochemii, włączając stabilizacje struktury białek i kwasów nukleinowych

Wiązania wodorowe, które są słabe, lecz mogą powstawać w dużych ilościach, odgrywają istotną rolę w biochemii. Liczne wiązania

CH3 — CHj—

CHj — CH

Ryc. 3-4. Powstawanie wiązań wodorowych między cząsteczkami etanolu i wody, między 2 cząsteczkami etanolu oraz między tlenem grupy karbonylowej peptydu i wodorem grupy aminowej sąsiadującego peptydu.

wodorowe narzucają uporządkowanie struktury nie tylko wodzie, lecz także innym cząsteczkom dipolowym, tak odmiennym od wody, jak alkohole, DNA i białka. Tworzenie wiązań wodorowych między przedstawicielami cząsteczek ważnych fizjologicznie związków przedstawia ryc. 3-4. Powstawanie ich nie ogranicza się do cząsteczek wody. Atomy wodoru, połączone z atomami azotu, mogą uczestniczyć także w wiązaniach wodorowych. Problem ten będzie rozpatrywany w dalszej części książki w związku z omawianiem trójwymiarowej struktury białek oraz reguł łączenia się (parowania) zasad azotowych w DNA,

Cząsteczki wody wykazują niewielką, ale fizjologicznie ważną, tendencję do dysocjacji, tj. tworzenia małych ilości jonów OH- i H

Cząsteczki wody wykazują ograniczoną tendencję do dysocjacji (jonizowania) na jony H + i OH " : H2O ~ H+ + OH" Ponieważ jony są w ciągłym ruchu, twcTrząc cząsteczki wody i dysocjując, trudno określić, czy pojedynczy atom wodoru Jub tlenu występuje jako jon, czy jako część cząsteczki wody. W danym momencie może być jonem, a w następnym częścią cząsteczki. Jonów oraz cząsteczek wody nie rozpatruje się pojedynczo. Wiedząc, że 1 g wody zawiera 3,46 x 1022 cząsteczek, jonizację wody można opisać statystycznie. Należy znać prawdopodobieństwo występowania wodoru w formie jonu lub części cząsteczki wody. W przypadku gdy prawdopodobieństwo występowania wodoru w formie jonu wynosi 0,01 oznacza to, że atom wodoru ma 1 szansę na 100 bycia jonem, a 99 szans na sto — istnienia w cząsteczce wody. Faktyczne prawdopodobieństwo znalezienia atomu wodoru w postaci jonu w czystej wodzie wynosi ok. 0,0000000018, tj. 1,8 x 10~9. Zatem jest on prawie w całości częścią cząsteczki wody. Wynika z tego, ze w czystej wodzie na każdy jon wodorowy i hydroksylowy przypada 1,8 x 109, tj, 1,8 mld cząsteczek wody. Jony wodorowe i hydroksylowe mają jednak znaczny wpływ na właściwości wody. Tendencję wody do dysocjacji wyraża się następująco: [H2O]

WODA I pH / 29

W nawiasach przedstawiono stężenia molowe jonów wodorowych, hydroksylowych i niezdysocjowanych cząsteczek wody*, a K nazwano stalą dysocjacji. Aby obliczyć stalą dysocjacji dla wody, natęży przypomnieć, że 1 mol ma masę 18 g. Jeden litr (1) (1000 g) wody zawiera zatem 1000:18 = 55,56 mol. Stężenie molowe czystej wody wynosi więc 55,56 mol. Ponieważ prawdopodobieństwo występowania wodoru w formie jonowej wynosi 1,8 x 10~9, stężenie molowe jonu H + (lub jonów OH~) w wodzie oblicza się, mnożąc prawdopodobieństwo 1,8 x 10~* przez stężenie molowe wody, tj. 55,56, co daje wynik= 1,0 x 10"7 mol/l. Teraz można wyliczyć wartość K dla wody: K

[107] [107]

[H+] [ O H ]

[55,56] 14 = 1,8

[HZO]

= 0,018 x 10 x 1O"

1S

1,8 x 10- 16 mol/l [HZO]

K w = (K) [H t O] = [H+] [ O H ] =

- 1,8x10

16

mol/l) (55,56 mol/l) =

= 1,00 x 10"

14

(mol/l)

10~1'1

(mol/1)2

dla

wszystkich

roztworów

wodnych, nawet dla tych, które zawierają kwasy lub zasady. W dalszej części rozdziału stalą ta będzie wykorzystywana do obliczenia wartości pH roztworów kwaśnych i zasadowych.

pH JEST UJEMNYM LOGARYTMEM STĘŻENIA JONÓW WODOROWYCH, A ŚCIŚLEJ AKTYWNOŚCI JONÓW WODOROWYCH Termin pH wprowadził w 1909 r. Sórensen, definiując pH jako ujemny logarytm stężenia jonów wodorowych: pH = -log[H + ]

mol/l

Duże stężenie molowe wody (55,56) prawie nie ulega zmianom przez dysocjację. Stąd wygodnie jest rozpatrywać wodę jako zasadniczo niezdysocjowaną (stalą). Stała ta może być włączona w stałą dysocjacji K, jako nowa stała Kw, zwana iloczynem jonowym wody. Stosunek między Kw a K przedstawiono K poniżej: [OH

kiego (37°C) stężenie H+ w wodzie jest nieco większe niż 10~7 mol/l. W ramach ustalonych granic wpływu temperatury, wartość Kw =

1

Stałą K wyraża się w molach na litr, zaś Kw — w mol2 na litr2. Z nazwy wynika, że iloczyn jonowy Kw jest liczbowo równy iloczynowi stężeń molowych jonów H + i OH ~: Kw = [H+] [ O H ]

W temperaturze 25°C Kw = (10~7)2 m 10~14 (mol/f)2. Natomiast w temperaturach poniżej 25°C wartość Kw jest większa, zaś powyżej 25°C mniejsza niż 10~14. W temperaturze ciała ludz-

Definicja ta, aczkolwiek niezbyt ścisła*, jest na ogół wystarczająca do celów biochemicznych. Aby obliczyć pH roztworu należy: 1) oznaczyć stężenie jonów wodorowych (H+), 2) obliczyć logarytm dziesiętny (H+), 3) pH jest ujemną wartością znalezioną w punkcie (2). Na przykład w przypadku czystej wody w temp. 25°C:

pH = -log[H*] = -logiO

-[-7]= 7,0

Małe wartości pH odpowiadają dużym stężeniom jonów H+, a duże — małym stężeniom H+ Kwasy określa się dawcami protonów, a zasady biorcami protonów. Wyróżnia się mocne kwasy (np. HC1, H2SO4) całkowicie zdysocjowane, nawet w mocnych roztworach kwaśnych (niskie pH), oraz słabe kwasy, częściowo tylko dysocjujące w roztworach kwaśnych. Podobnie można wyróżnić mocne zasady (np. KOH, NaOH) i słabe zasady (np. Ca(OH)2>. Tylko mocne zasady dysocjują przy małych wartościach pH. Większość związków organicznych w komórkach to słabe kwasy. Wyjątek stanowią ufosforylowane związki pośrednie, które zawierają

Ściśle mówiąc, wyrażenia w nawiasach reprezen- * scisie mówiąc, wyrażenia w nawiasacn reprczen----------------------------------------------------------------------------------------------------------tują raczej aktywność molową niż stężenie molowe. * pH= — log (aktywności H + )

30 / ROZDZIAŁ 3

silnie kwasową grupę pierwszorzędowego kwasu fosforowego. Poniższe przykłady ilustrują sposób obliczania pH roztworów kwaśnych i zasadowych: Przykład. Jakie jest pH roztworu, w którym stężenie jonu wodorowego wynosi 3,2 xlO"4 mol/l?

= -log (3,2x10"*) = -log (3,2) -logCIO"

4

)

=-0,5+4 = 3,5 Przykład. Jakie jest pH roztworu, w którym stężenie jonu hydroksylowego wynosi 4,0 x 10"4 mol/l? Aby rozwiązać to zadanie, należy określić ilościowo wartość pOH, które jest równe —log [OH~]; wartość tę można wyprowadzić z definicji K: [OH-] = 10"14 zatem log [H + ] + log [ O H ] = log 10" lub

pH + pOH = 14

A następnie: [ O H ] = 4,0 x 1 0 * pOH = -log [ O H ] = -log (4,0 x 10 4

1og(10" ) =

4

) = -log (4,0) -

-0,60 + 4,0 = 3,4 i teraz

pH = 14 - pOH = 14 - 3,4 = 10,6

Przykład. Jakie jest pH roztworu (a) 2,0xl0" ! mol/l KOH, (b) 2,0 x 10"* mol/l KOH? W roztworach tych jony OH~ pochodzą z 2 źródeł: KOH i wody. Ponieważ pH określa całkowite stężenie jonów [H+] (pOH — całkowite [OH ]) należy obydwa źródła brać pod uwagę. W pierwszym przypadku udział wody w całkowitej puli [OH~] jest nieistotny, czego nie można powiedzieć w drugim przypadku.

Stężenie (mol/1) (a)

Molowość KOH [0H-] 2 KOH [OH-j z wody Całość [0H-]

(b)

2,0xicr 2 2,0 xl O" 2 1,0x10" 7 2,00001 x10~ 2

2,0x10" 6 2,0x10~ e 1,0x10" 7 2,1 x10" 6

W momencie podjęcia decyzji o znaczeniu udziału wody, pH można wyliczyć jak powyżej. , W przedstawionych przykładach przyjęto założenie, że mocna zasada KOH jest w pełni zdysocjowana, a stężenie molowe jonów OH~ równa się stężeniu molowemu KOH. Założenie to jest słuszne dla względnie rozcieńczonych roztworów mocnych zasad i kwasów lecz nie dotyczy słabych zasad i kwasów. Ze względu na fakt, że te słabe elektrolity tylko w niewielkim stopniu dysocjują w roztworach, należy przed obliczeniem całkowitego [H+] (lub całkowitego [OH~]) oraz obliczeniem pH, obliczyć stężenie H+ (lub stężenia OH~) z danego stężenia molowego kwasu (lub zasady), wykorzystując stałą dysocjacji. Biomolekuły zawierają grupy funkcyjne czynne o istotnym znaczeniu fizjologicznym, które zachowują się jak słabe kwasy Wiele związków organicznych żywych komórek ma grupy funkcyjne, typowe dla słabych kwasów lub zasad. Jedna lub więcej grup funkcyjnych — głównie grupy karboksylowe, aminowe lub utworzone w wyniku drugorzędowej dysocjacji fosforanowej estrów fosforanowych — występują we wszystkich białkach i kwasach nukleinowych, większości koenzymów oraz metabolitów pośrednich. Aby zrozumieć wpływ wewnątrzkomórkowego pH na budowę i aktywność biochemiczną tych związków, należy poznać sposób dysocjacji (równowagi protono-

Tabela 3-1. Przykłady słabych kwasów i sprzężonych z nimi zasad Kwas

Sprzężona zasada

CH3COOH

CH3COO-

CH3NH3

CH3NH2

OH

H+N

O"

NH

N

NH

WODA I pH / 31

wej) grup funkcyjnych słabo kwaśnych i słabo zasadowych. W laboratoriach badawczych i klinicznych rozdział i identyfikacja tych związków opiera się na znajomości przebiegu dysocjacji ich grup funkcyjnych. Protonowa forma kwasu (HA lub RNH+) odnosi się do kwasu, zaś nieprotonowa (A~ lub RNH2} — do sprzężonej z nim zasady (tab. 3-1). Podobnie można opisać zasadę (np. A~ lub RNH2) i sprzężony z nią kwas (np. HA lub RNH+) (lac. conitmgere — połączyć razem). Względną moc słabych kwasów i zasad wyraża sie ilościowo przez ich stale dysocjacji, które obrazują ich tendencje do jonizacji. Poniżej podano wyrażenia stałej dysocjacji (K.) dla 2 przedstawicieli słabych kwasów: i R—NH+ R—COOH ++ R—COO + IR-COO ] [H

+

]

[R—COOH] R-NH

IR—COO] = R—COOH

lub gdy [R—NH

] = [R—NHj]

Z

to wtedy K = [H+]

Można to wyrazić słowami: gdy rodzaj jonów zasocjowanych (protonowych) i zdysocjowanych (sprzężone zasady) występuje w równych stężeniach, wówczas przeważające stężenie jonów wodorowych [H+] jest równe liczbowo stałej dysocjacji K.

Jeśli obliczy się logarytmy powyższego równania i obie strony pomnoży się przez — I, to

H *+ R—NH

Z powyższych równań, odnoszących K do [H+] i do stężenia niezdysocjowanego kwasu i sprzężonej z nim zasady, wynika, że gdy

2

K = [R—MH 2] [H [RNHj]

Ponieważ wartości liczbowe K dla słabych kwasów są ujemnymi liczbami wykładniczymi, wygodniej jest wyrażać K jako pK, gdzie: pK = -log K

K [H+] log -log[H K Z definicji —log K opisuje się jako pK, zaś — log [H+] jako pH. W związku z tym można ostatnie równanie zapisać pK = pH

tj. pK grupy kwasowej jest takim pH, w którym stężenia postaci protonowej i niepro tonowej są

Tabela 3-2. Stałe dysocjacji i wartości pK dla przedstawicieli kwasów karboksylowych Kwas

K

Octowy Gluta rowy

1,76x10

4,75

4,58 x10"

5

4,34

3,89x10"

6

5,41

(1-rz.)

8,40x10"

4

3,08

(2-rz.) (3-rz.)

1,80x10" 4,00x10"

E

4,74 5,40

(1-rz.) (2-rz,)

Cytrynowy

pK 5

6

Należy odnotować, że pK odnosi się do K tak, jak pH do stężenia H + . W tabeli 3-2 przedstawiono wartości K i pK dla kwasu mono-, di- i trikarboksylowego. Należy podkreślić, że grupy mocniejszych kwasów mają mniejsze wartości pK.

równe. Wartość pK kwasu można oznaczyć doświadczalnie przez dodanie 0,5 równoważnika* zasady na równoważnik kwasu. Powstałe w ten sposób końcowe pH będzie odpowiadać pK kwasu. Charakter słabych kwasów i buforów, które są roztworami słabych kwasów i ich soli opisuje równanie Hendersona--Hasselbalcha Wartość pH roztworu zawierającego słaby kwas jest zależna od stałej dysocjacji tego kwasu, jak przedstawiono powyżej dla słabo kwaśnej wody. Zależność tę opisuje, w przystęp* Według układu SI pojęcie równoważnika chemicznego nie jest używane, jednak w tym tłumaczeniu określenie to świadomie utrzymujemy {przyp. red. nauk. tłum.).

32 / ROZDZIAŁ 3

nej formie, równanie Hendersona-Hasselbalcha, wyprowadzone poniżej. Słaby kwas HA dysocjuje w następujący sposób:

Zatem w przypadku zobojętnienia w połowie pH = pK. 2. Kiedystosunek(;A-]/[HA]wynosi 100:1

HA~ H + +A" Stała dysocjacji dla tej reakcji dysocjacji wynosi:

pH = pK + log 100/1 = pK + 2 3. Kiedy stosunek [A~]/[HA] wynosi 1:10

" [HA] Po pomnożeniu na krzyż:

pK + (-1)

pH = pK +■ log-

[H+] [ A ] = K[HA] 1,0 -

Po podzieleniu obu stron przez [A~]

i

Po zlogarytmowaniu obu stron:

0,8

10

o ■o

■og[H+]

I%

l i

[HA]

[A ] log K + log

1*08

Po pomnożeniu przez — 1 -fc»g[H+] = -logK - log

[HA ]

Po podstawieniu zamiast —log H+ i —log K odpowiednio pH i pK otrzymuje się [HA] pH = pK - log

i

ojpK -3

pK -2

pK -1

pK 0

pK +1

pK +2

pK +3

łtyc. 3-5. Typowa krzywa miareczkowania wykreślona na podstawie wyników obliczeń z równania Hendersona-Hasselbalcha.

[A]

Z kolei usuwa się znak minus, odwracając ostatni człon równania: pH = pK 4 log [HA]

Ta ostatnia forma równania, opisywana jako równanie Hendersona-Hasselbalcha, służy do wyliczania równowagi protonowej, np.: 1. Kiedy kwas jest zobojętniony dokładnie w połowie, tj. A~ =[HA]. W tych warunkach [A] pH = pK + tog [HA]

pK +- log— =pK + 0

Jeśli równanie zastosuje się dla różnych stos unków [A- ]/ [HA] w zakres i e 10M 0" 3 i przedstawi na wykresie wyliczone wartości pH. to otrzymany wynik opisuje krzywą miareczkowania słabego kwasu (ryc, 3-5).

Roztwory słabych kwasów i ich soli buforują pH w przypadku dodania lub usuwania protonów

Roztwory słabych kwasów i sprzężonyct z nimi zasad (lub słabych zasad i sprzężonycl z nimi kwasów) wykazują zjawisko buforowa nia, tj. zdolności utrzymywania pH. Wartość pt roztworu buforowego po dodaniu mocnego kwasi lub mocnej zasady nie zmienia się bardziej niż p< dodaniu takiej samej objętości wody. Zjawisk*

WODA I pH / 33

buforowania można najlepiej zilustrować poprzez miareczkowanie słabego kwasu lub zasady wykorzystując pH-metr. W innym rozwiązaniu można obliczyć przesunięcie pH, które ma miejsce w przypadku dodania kwasu lub zasady do zbuforowanego roztworu. W przedstawionym przykładzie, zbuforowany roztwór (mieszanina słabego kwasu i sprzężonej z nim zasady, pK = 5,0) wykazuje początkowo w jednej z 4 wartości pH. Można obliczyć przesuniecie pH, które wystąpi, jeśli zostanie dodany 0,1 mmol/1 K.OH na każdy milirównoważnik kwasu w roztworze (o stężeniu 1 mmol). Początkowe pH [" ] początkowe

5,00 0,50 0,50 1,00

5,37 0,70 0,30 2.33

5,60 0,80 0,20 4,00

5,86 0,88 0,12 7,33

f

1,0-

2

3

4

5

6

7

8

Ryc. 3-6. Krzywa miareczkowania kwasu typu HA.

Punkt {) wskazuje pK o wartości 5,0.

Dodanie 0,1 mmol KOH powoduje

Kortcowe pH

0,60 0,40 1,50 0,176 5,18

0,80 0,20 4,00 0,602 5,60

0,90 0,10 9,00 0,95 5,95

0,98 0,02 49,0 1,69 6,69

ipH

0,18

0,23

0,35

0,83

[A f/[HA]końcowe

Zmiana pH, wywołana przez dodanie 1 mmol jonów OH~ różni się znacznie w zależności od pH. Przy wartościach pH zbliżonych do wartości pK, roztwory buforowe utrzymują skuteczniej pH, co określa się ich efektem buforującym. Roztwory słabych kwasów i sprzężonych z nimi zasad są najskuteczniejszymi układami buforowymi w zakresie pH równym pK + 2,0 jednostki

pH. Oznacza to, że aby zbuforować roztwór w pH X, można wykorzystać słaby kwas lub zasadę, których pH nie różni się od pH X więcej niż o 2 jednostki pH. Na rycinie 3-6 przedstawiono ładunek eJektryczny 1 cząsteczki kwasu jako funkcję pH.

3 — Biochemia

Ładunek ułamkowy —0,5 nie oznacza, że pojedyncza cząsteczka jest obdarzona ładunkiem ułamkowym, lecz wyraża statystyczne prawdopodobieństwo, że ma ona ładunek —0,5. Przyjęcie ładunku elektrycznego makrocząsteczek jako funkcji pH stwarza podstawę dla wielu użytecznych technik rozdziału, włączając eiektroforetyczny rozdział aminokwasów, białek osocza i nieprawidłowych hemogJobin. W komórkach żywych bufory fosforanowy i wodorowęglanowy, oprócz białczanowych, stanowią podstawowe bufory.

PIŚMIENNICTWO Segel IM: 1968.

Biochemical

Calcuiations.

Wiley,

CZĘŚĆ I Budowa oraz funkcje białek i enzymów

4

Aminokwasy Victor W. Rodweli, PhD

genne) muszą być dostarczane w pożywieniu, ponieważ nasz organizm nie może ich synŻywe komórki wytwarzają makrocząsteczki tetyzować w ilościach niezbędnych do pod(białka, kwasy nukleinowe, polisacharydy), które trzymania wzrostu (dzieci) i utrzymania zdrosłużą jako składniki strukturalne, katalizatory, wia (dorośli). Metabolizm aminokwasów przyhormony, receptory lub magazyny informacji czynia się do powstania wielu biomedycznie genetycznej. Te makrocząsteczki są biopolime- ważnych związków. Na przykład dekarboksylarami, utworzonymi z jednostek monomerycz- cja pewnych aminokwasów prowadzi do ponych lub cegiełek budulcowych. Jednostkami wstania amin, wśród których cześć pełni ważne monomerycznymi w kwasach nukleinowych są funkcje biologiczne (np. histamina i kwas 7-anukleotydy, w złożonych polisacharydach — po- minomasłowy [GABA]). Liczne choroby są chodne cukrowe, a w białkach — L-a-amino- spowodowane nieprawidłowościami transportu kwasy. aminokwasów do komórek. W pewnych warunChociaż białka mogą także zawierać poza kach może dojść do pojawienia się w moczu aminokwasami, dodatkowe substancje (np. znacznej ilości jednego lub wielu aminokwasów hem, cukrowce, tłuszcze), ich trójwymiarową — takie stany określa się jako aminoacydurie. strukturę i właściwości biologiczne warunkuje w głównej mierze rodzaj aminokwasów, kolejność, w jakiej łączą się ze sobą w łańcuchu WSZYSTKIE AMINOKWASY polipeptydowym oraz ich przestrzenne ułożenie,, ZAWIERAJĄ PRZYNAJMNIEJ 2 GRUPY FUNKCYJNE względem siebie. Aminokwasy pełnią dodatkowe funkcje Aminokwasy zawierają 2 grupy funkcyjne, tj. w komórkach. W tabeli 4-4 i 4-5 przedstawiono niektóre biologicznie ważne substancje, które aminową i karboksylową. W a-aminokwasach obie te grupy połączone są z tym samym (a) wywodzą się z aminokwasów. WPROWADZENIE

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Niektóre aminokwasy wydają się być zaangażowane w przenoszeniu impulsów w układzie nerwowym, czego przykładem są glicyna i kwas Ryc. 4-1. glutaminowy. Aminokwasy podstawowe (egzo- kwasu.

H

\a R-C-NHj I

COOH

OH

Dwie formy przedstawienia j.amino-

36 / ROZDZIAŁ 4

atomem węgla (ryc. 4-1). Chociaż w przyrodzie występuje ok. 300 aminokwasów, tylko 20 z nich występuje w białkach (tab. 4-3). Całkowita hydroliza* biatek dostarcza 20 L-a-aminokwasów. Należy podkreślić, że białka wszystkich form życia — roślin, zwierząt, drobnoustrojów — zawierają te same 20 aminokwasów. Przyczyną tego jest uniwersalność kodu genetycznego, co stanie się oczywiste dla Czytelnika w toku omawiania tego zagadnienia później (p. rozdz. 30). W skład niektórych białek wchodzą pochodne aminokwasów, utworzone po ich włączeniu w cząsteczkę białka (p. lab. 6-4). Z wyjątkiem glicyny, dla której R (R — łańcuch boczny aminokwasu) stanowi atom wodoru (ryc. 4-1), wszystkie 4 podstawniki związane z atomem węgla et-aminokwasów są różne. Tetrąędryczne. ułożenie 4 różnych podstawników wokół atomu węgla a (tzw. węgiel asymetryczny) nadaje aminokwasom właściwość op-.tyczna. (zdolnośćTjio_ _skręcania . płaszczyzny światła spolaryzowanego). Chociaż pewne aminokwasy występujące w białkach są prawo-skrętne, a niektóre lewoskrętne, w pH 7,0 wszystkie mają bezwzględną konfigurację porównywalną z konfiguracją aldehydu Lglicery-nowego, stąd opisuje się je jako L-aamino-kwasy. Ogólne reakcje chemiczne aminokwasów można przewidzieć znając właściwości grup funkcyjnych Grupy funkcyjne aminokwasów — karboksylowa i aminowa — wykazują typowe dla nich reakcje, np. tworzenie soli, estryfikację, acyla-

RÓWNOWAGI PROTONOWE AMINOKWASÓW W zależności od pH otaczającego środowiska aminokwas może mieć ładunek dodatni, ujemny lub nie mieć żadnego ładunku Aminokwasy zawierają co najmniej 2 zjonizowanc, słabo kwaś ne grupy: —C OOH i —NHt- W roztworze obie formy tych grup.

* Hydroliza = rozerwanie wiązania kowalencyjnego przy udziale cząsteczki wody.

jedna naładowana, a druga obojętna, występują w równowadze protonowej: R—COOH « R—COO" + H+ H+

W równowadze tej R—COOH i R—NH^ reprezentują związki protonowe lub kwaśne, natomiast R—COO~ i R—NH2 — zasady sprzężone (protonobiorców) z odpowiednimi kwasami. Chociaż zarówno R—COOH jak i R NH; są słabymi kwasami, R—COOH jest znacznie silniejszym kwasem niż R—NH r W pH osocza krwi czy przestrzeni śródkomórkowej (pH odpowiednio 7,4 i 7,1) grupy karboksylowe istnieją prawie całkowicie jako jony karboksyjowe — R—COO~. Przy tych wartościach pH większość grup aminowych występuje w formie zasocjowanej (protonowej) — R—NH3. Ze względu na przeważającą postać zjonizowaną aminokwasów we krwi i większości tkanek, należy przedstawić ich budowę tak, jak na ryc. 4-2A. Należy pamiętać, że struktura B (ryc. 4-2) nie może istnieć w żadnym pH. Przy dostatecznie niskim pH, w którym cofa się jonizacja grupy karboksylowej, znacznie słabsza kwaśna grupa aminowa będzie występować także w formie protonowej. Przybliżone wartości pKa dla grup a-karboksylowej i oc-aminowej wynoszą odpowiednio 2 i 10 (tab. 4-1). Przy pH wynoszącym 2 jednostki poniżej wartości pKa, kwas w ok. 99% ma formę protonową. Jeżeli pH stopniowo wzrasta, to proton z grupy karboksylowej odłącza się znacznie wcześniej niż z grupy R—NH 3 • W każdym wystarczająco wysokim pH do utworzenia przewagi grupy aminowej R—NH2 musi być również obecny jon karboksylowy (R—COO~). Jednakże w wielu reakcjach, poza równaniami równowagi protonowej, stosuje się wzory aminokwasów w formie B. NHj

NH,+ 0-

II O 8

Ryc. 4-2. Poprawna struktura ^jonizowanego aminokwasu w pH fizjologicznym lub blisko pH fizjologicznego (A). Postać B (niezjonizowana) nie występuje w żadnym pH, ale jest często' używana, dla wygody, przy omawianiu chemii aminokwasów.

AMINOKWASY / 37 Tabela 4-1. Słabo kwaśne grupy aminokwasów występujących w białkach Sprzężony kwas

Sprzężona zasada

Przybliżona wartość pK

a-Karboksylowa

R—COOH

R—COO"

2.1 ±0,5

Nie a-kar boksy Iowa (asparaginian, glutaminian)

R—COOH

R—COO"

4,0 + 0,3

f

Imidazolowa (histydyna)

1---------R

6,0

r v

^-Aminowa

R-NH +

R—NH2

9,8 ±1,0

s-Aminowa (lizyna)

R-NH^

R—NHa

10,5

Fenolowa OH (tyrozyna)

Guanidynowa (arginina)

10,1

H NH2

1 11+ R—N—C —NH2

Sulf hydry Iowa (cystein3)

R—SH

Względną moc słabych kwasów wyrażają wartości pK, Względną moc słabych kwasów wyraża się przez ich stale dysocjacji Ka lub przez ich pK — ujemny logarytm ze stałej dysocjacji:

W tabeli 4-1 przedstawiono wartości pK dla grup funkcyjnych 20 aminokwasów spotykanych w białkach. Całkowity ładunek (algebraiczna suma wszystkich dodatnio i ujemnie naładowanych grup) aminokwasu zależy od pH lub stężenia protonów otaczającego środowiska. Możliwość zmiany ładunku aminokwasów i ich pochodnych, przez umiejętne sterowanie pH, ułatwia fizyczny rozdział aminokwasów, peptydów i białek.

12,5

H NH j II R—N—C —NH2

■

8,3

R-S-

Punkt izoelektryczny aminokwasu (pl) jest to takie pH, przy którym nie jest on obdarzony żadnym ładunkiem i nie porusza się w polu elektrycznym Strukturę aminokwasu alifatycznego, takiego jak alanina, w pH odpowiadającym punktowi izoelektrycznemu przedstawia ryc. 4-3.

NrV

Ryc. 4-3. Struktura postaci zjonizowanej lub jonu obojnaczego alaniny. Chociaż jon obojnaczy alaniny ma grupy obdarzone ładunkiem elektrycznym, nie wędruje w polu elektrycznym.

♦ Dla wygody zapis Ka lub pKtt będzie stosowany, w przypadku aminokwasu z tylko dwiema lecz opuszczony później w przypisach dotyczących grupami zjonizowanymi (np. alanina) nie ma symboli. niejasności w wyliczeniu pl. Ponieważ wartość

38 / ROZDZIAŁ 4

W mocnym kwasie (pH ponlżeji); całkowity ladunek= + l

O B pH ok. 3; całkowity ładunek = o

pH ok. 6 - ft całkowity ładunek = -1

D W mocno) zasadzie (pH powyżej 11); całkowity ładunek = -2

Ryc. 4-4. Równowagi protonowe kwasu asparaginowego.

pK, (R—COOH) = 2,35 natomiast pK 2 (R—NH*) = 9,69, to punkt izoelektryczny (pl) alaniny wynosi: = 6,02

2,35+9,69 Pl

Wyliczenie wartości pl dla aminokwasu z dodatkowymi grupami zjonizowanymi, poza tymi związanymi z węglem ot, jest bardziej skomplikowane. Na rycinie 4-4 przedstawiono różne formy jonowe kwasu asparaginowego. Jakie będzie zatem pH odpowiadające punktowi izoelektrycznemu dla tego aminokwasu? W poszukiwaniu pl dla kwasu asparaginowego trzeba napisać wszystkie możliwe formy jonowe tego związku w kolejności, w której pojawiają się w roztworach — od silnie kwaśnych, poprzez obojętne do zasadowych (porównaj przykład kwasu asparaginowego na ryc. 4-4). Następnie należy rozpoznać formę izojonową, jon obojnaezy lub obojętny (jak na ryc. 4-4B). Punkt izoelektryczny (pl) jest to pH w środku pomiędzy wartościami pK po obydwu stronach form izojonowych. W omawianym przykładzie: 2,98 2,09+ 3,86 Pl =

Takie rozwiązanie jest również stosowane do obliczania wartości pl aminokwasów z innymi, dodatkowymi grupami dysocjującymi, np. lizyny lub histydyny. Po napisaniu wszystkich możliwych form elektrycznie naładowanych aminokwasów zasadowych — lizyny i argininy — należy zapisać, że: pK 2+ pK 3 P'= ----------«-------

Wartość pl dla lizyny wynosi 9,7; dla argininy 10,8. Czytelnik powinien umieć określić pl dla histydyny. Określenie wartości pK po każdej stronie jonu obojnaczego przez sprawdzenie form naładowanych, nie ogranicza się do aminokwasów. Można ją stosować do obliczania ładunku cząsteczki z każdą liczbą grup dysocjujących. Możliwość wykonywania takich obliczeń okazuje się bardzo przydatna w laboratorium klinicznym, gdyż pozwala przewidzieć ruchliwość elektroforetyczną związków w polu elektrycznym i dobrać właściwe bufory do ich rozdziału. Na przykład, w buforze o pH 7,0 można rozdzielić 2 typy cząsteczek: z pl 6,0 i 8,0, ponieważ cząsteczka z pI = 6,0 będzie mieć większy całkowity ujemny ładunek przy pH 7,0 niż cząsteczka z pI = 8,0. Podobne rozważania stosują się do rozdziałów na złożach jonowych zarówno dodatnio, jak i ujemnie naładowanych polimerów (np. DEAE-celuloza, żywica Dowex 1), Rozpuszczalność i temperatura topnienia aminokwasów odzwierciedlają ich charakter jonowy Obecność elektrycznie naładowanych grup większości aminokwasów przyczynia się do ich rozpuszczalności. W formie jonowej rozpuszczają się one łatwo w rozpuszczalnikach polarnych, takich jak woda i etanol, ale nie rozpuszczają się w rozpuszczalnikach niepolarnych, jak: benzen, heksan i eter. Wysoka temperatura topnienia (punkty topnienia powyżej 200DC) odzwierciedla ilość energii potrzebnej do pokonania sił jonowych stabilizujących strukturę sieci kryształów.

AMINO KW ASY /33 Tabela 4-2. Podział L-at-aminokwasów występu PODZIAŁ AMINOKWASÓW jących w białkach na podstawie względnej polar- WYSTĘPUJĄCYCH W BIAŁKACH NA ności ich grup R. W grupie niepolarnej jest mała PODSTAWIE WZGLĘDNEJ bądź nie ma wcale różnicy w ładunku elektrycznym POLARNOŚCI ICH GRUP R między regionami, podczas gdy w grupie polarnej różnica ta jest względnie duża Aminokwasy niepolarne

Aminokwasy polarne

Alanina

Arginina

Izoleucyna Leucyna Metionina Fenyloa Janina Prolina Tryptolan Walina

Asparagina Kwas asparaginowy Cysteina Kwas glutaminowy Glutamina Glicyna Histydyna Lizy na Sery na Treonina Tyrozyna

Aminokwasy występujące w białkach można podzielić na 2 duże grupy na podstawie poiarności grup R. przyłączonych do atomu węgla a. W celu ułatwienia przedstawiania niezwykle długich sekwencji amin o kwasowych niektórych białek, praktykuje się stosowanie jednoliterowych symboli aminokwasów (tab. 4-3). Aminokwasy w stanie wolnym lub związanym (nie będące składnikami białek) odgrywają ważną rolę w procesach przemiany materii (tab. 4-4 i 4-5). Na przykład ornityna, cytrulina i kwas argininobursztynowy uczestniczą w biosyntezie mocznika, katanie naturalnym występuje ponad 20 D-aminokwasów. Należą do nich Dalanina i kwas D-glutami nowy ścian komórkowych niektórych bakterii oraz różne D-aminokwasy wchodzące w skład antybiotyków.

Tabela 4-3.L-s-aminokwasy występujące w białkach* Nazwa

Symbol

Wzór strukturalny

Aminokwasy z. alifatycznymi łańcuchami bocznymi Glicyna

Alanina

Walina

Leucyna

H—CH™COCT

Gly [G]

CH3

Ala [A]

,CH—CH—COO"

Vaf [V]

Leu [L]

Izoleucyna Ile [1]

t

H,C

X

7>

CH—CB —CGO"

40 / ROZDZSAŁ 4

cd. tab. 4-3 Nazwa

Symbol

Wzór strukturalny

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym grupy hydroksylowe (OH) Sery na

CH^CH^rC&O-

Ser [S]

Treonina

Thr[T]

Tyrozyna

Tyr [Y]

.---.Li

^łJLJf-

CH,-CH—OH—COCT OH *NHj

patrz niżej

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym atomy siarki Cysterna* Cys [C]

SH fl^

Metionina

CH;—

CH3-CH—COO"

Met [M]

CH SH ;

C H

3

H COO

O^~Cn3

Aminokwasy z łańcuchem Kwas asparaginowy

bocznym zawierającym Asp[D]

-^

grupy kwaśne lub ich amidy • "OOC—C Hs —CH—COO" t 1L1M

flfTJ

Asparagina

rwij

Asn [N]

.$.

H j N - C - C H , - C H — C O O 0" ^H,

Kwas glutaminowy

Glu ! El

"OOC—C H2—C H3 —CH—COO"

Glutamina

Gin [Q]

H,N—C—CH 2—C H2 ~CH—COO-

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym grupy zasadowe H—N—CH 2—CH,—CH?—CH—COO"

I Arginina Lizy na

Arg

Histydyna

[R]

+

NH5

r

N H, H s - C H ,— C H ,— C HS - C M — C O O "

Lys [K]

His |h|

H3 j______I

+ NH, C H,—GH—COO*

AMINOKWASY / 41 cd. tab. 4-3 Nazwa

Symbol

Wzór strukturalny

Aminokwasy zawierające pierścień aromatyczny -Histydyna

His [H]

Fenyioaianina

Phe {F]

Tyrozyna

Tyr[Yl

Tryptofan

Trp[W]

patrz wyżej \—/

>—CHj—CH^COO"

pCH;—CH—cocr H

Immokwasy Ptoiina

i------------1

Pro [P]

*. Z wyjątkiem hydroksyl i zyny (Hyl) thydroksyproliny (Hyp), które są włączane w wiązania peptydowe jako lizyna i proiina, a następnie hydroksylowane, swoiste tRNA istnieją dla wszystkich aminokwasów przedstawionych w tej t3be/i. Ich włączanie w białka pozostaje pod bezpośrednią kontrolą genetyczną. ** Cystyna składa się z 2 reszt cystetn połączonych wiązaniem disiarczkowym: I "OOC—CH—CH Z—S—S—CH 2 —CH—COO" NH +

Tabela 4-4. Przykłady oc-aminokwasów nie występujących w białkach, ale spełniających istotną rolę w metabolizmie ssaków Nazwa po tuczna i systematyczna Homocysteina (kwas 2amino--4-merkaptoma słowy) Kwas cysteinosulfinowy {kwas 2-amtno-3-sulfinopropionowy)

Wzór strukturalny w pH obojętnym

Znaczenie

CH2— CH?—CH—COCf ł

SH

NH3

H2—CH—COO" CH2—C

so t^

Homoseryna (kwas 2-amino-4-hydroksymasłowy)

CHS—CHS OH

Związek pośredni w biosyntezie metiortiny Związek pośredni w katabotizmie cysteiny Związek pośredni w metabolizmie treoniny, asparaginianu i metioniny

42 / ROZDZIAŁ 4

cd. tab. 4-4 Nazwa potoczna i systematyczna

Wzór strukturalny w pH obojętnym

Ornityna (kwas 2,5-diaminoamylowy)

Znaczenie

C H2—CH2—CH2—bi—COO"

Cytrulina (kwas2-amtno-5-ureidoamylowy)

Związek pośredni w biosyntezie mocznika

I NH,

Kwas argininobursztynowy

■NH CH2~™CHj

11

"CHj

JW.

H N—C —NH "COO—CH2—C—COO*

Dopa {3,4-dihydroksyfenyloalanina)

3—T

V—CH,

Prekursor meianiny

HO

3-Monojodotyrozyna

CH,—

HO

Prekursor hormonów tarczycy

I

3,5 - D i j od oty r ozy n a

HO

-CH,

3,5,3'-Trijodotyronina (T3) .

Tyroksyna (3,5,3',5'-tetrajodotyronina; T4}

jw.

HO

CH,

jw.

AMINOKWASY / 43 Tabela 4-5. Przykłady nie a-aminokwasów ważnych dla metabolizmu ssaków Nazwa potoczna i systematyczna B-alanina (kwas 3-aminoproprionowy) Tauryna {kwas 2-amtnoerytosu)fonowy) Kwas y-aminomasłowy (GA8A)

Wzór strukturalny

Znaczenie

CH2—CH2—COO"

Składnik koenzymu A i witaminy

[ + NH3 CH2—CH2—SO3"

pantoteiny

Występuje w żółci w połączeniu z kwasami żółciowymi

11

On 2 —v*r1 2 —^rl2—UUU

Neuroprzekażnik powstający z

(kwas 4-aminomasłowy) Kwas fi-aminuizumasłowy

glutaminianu w tkance mózgowej

Końcowy produkt katabolizmu pirymidyny, występujący w moczu niektórych osób

H 3 N+—CH 2 —CH—COO"

(kwas 2-metylo-3-aminopropionowy)

WŁAŚCIWOŚCI POSZCZEGÓLNYCH AMINOKWASÓW ZALEZĄ ÓD ICH GRUP R PRZY ATOMIE WĘGLA a Glicyna, najmniejszy aminokwas, może „dopasować się" łatwo w obszary trójwymiarowej struktury białek, niedostępne dla innych aminokwasów i występuje w obszarach, w których łańcuchy peptydowe ulegają silnemu zwinięciu. Alifatyczne grupy R jłaniny, waliny, leucyny jjzoleucyny oraz aromatyczne grupy R fenyloajaniny, tyrozyny i tryptofanu są hydrofobowe i ta właściwość ma ważne znaczenie w uporządkowaniu cząsteczek wody w białkach, w bezpośrednim sąsiedztwie tych grup. Te aminokwasy są charakterystyczne przede wszystkim dla wnętrza łańcuchów białek cytozolowych. Naładowane grupy R aminokwasów zasadowych odgrywają kluczową rolę w utrzymywaniu swoistej konformacji białka przez tworzenie wiązań typu soli. Przerwanie i odtworzenie wiązań typu soli towarzyszy utlenowaniu i odtlenowaniu hemoglobiny {p. rozdz. 7). Ponadto aminokwasy z dodatnio lub ujemnie naładowanymi grupami R uczestniczą w układach „przekazywania ładunku" (ang, „charge relay"). które przesyłają ładunki na znaczne odległości podczas katalizy enzymatycznej. Histydyna ponadto pełni wyjątkową i ważną funkcję w katalizie enzymatycznej, gdyż wartość pK jej formy protonowej układu imidazolowego dopuszcza w pH 7,0 działanie jej jako katalizatora zasadowego lub kwasowego.

ĆH3

Pierwszorzędowa grupa alkoholowa seryny i pierwszo rzędowa grupa tioalkoholowa (—SH) cysteiny są doskonałymi czynnikami nukleofilowymi, których funkcja jest ważna dla katalizy. Z kolei drugorzędowa grupa alkoholowa treoniny jest dobrym czynnikiem nukleofiiowym, aczkolwiek nie jest znany jej udział w katalizie. Dodatkowo, poza katalityczną rolą grupy —OH w przypadku seryny i tyrozyny, odgrywa ona rolę w regulacji aktywności niektórych enzymów, których aktywność katalityczna zależy od stanu ufosforylowania reszt serylowych lub tyrozylowych.

5

"L

6-1

I |3H

Tryptofan

1-


I <3

Fenyioalanlna

1 ^1 240

" r ------1---r

260 DłusjoSć fali [nm|

280

Ryc. 4-5. Widma absorpcyjne tryptofanu, tyrozyny

i fenyloalaniny.

____

44 / ROZDZIAŁ 4

Aminokwasy nie absorbują światła widzialnego (tj. są one bezbarwne) i, z wyjątkiem aminokwasów aromatycznych: tryptofanu, tyrozyny, fenyloalaniny i histydyny, nie absorbują światła nadfioletowego o długości powyżej 240 nm. Jak przedstawiono na ryc. 4-5 większość światła nadfioletowego o długości fali powyżej 240 nm, absorbowanego przez białko, pochłania zawarty w nim tryptofan.

Ryc. 4-7. Fluorescamma.

REAKCJA Z NINHYDRYNĄ LUB FLUORESCAMINĄ SŁUŻY DO WYKRYWANIA AMINOKWASÓW

RÓŻNORODNOŚĆ TECHNIK ROZDZIAŁU AMINOKWASÓW

Ninhydryna (ryc. 4-6). Powoduje oksydacyjną dekarboksylację aminokwasów, w wyniku czego powstają CO Z , NH 3 i atdehyd uboższy o jeden atom węgla w porównaniu z macierzystym aminokwasem. Zredukowana ninhydryna reaguje wtedy z uwolnionym amoniakiem, tworząc niebieski kompleks, który absorbuje światło o długości 570 nm. Natężenie barwy niebieskiej powstałego kompleksu stanowi podstawę

Chromatografia

We wszystkich rodzajach chromatografii czą-

steczki rozdzielają się między fazę stacjonarną a ruchomą (tab. 4-6). Rozdział zależy od względnej tendencji cząsteczek mieszaniny do ich silniejszego wiązania się z jedną z tych faz. Chociaż

przedstawione techniki rozdziału dotyczą głównie aminokwasów, ich zastosowanie nie ogranicza się tylko do tych cząsteczek.

ilościowej metody oznaczania aminokwasów, za

pomocą której można wykryć mikrogramowe ilości aminokwasów. Aminy, inne niż a-aminokwasy, także reagują z ninhydryna, tworząc barwny niebieski kompleks, ale bez tworzenia CO2. Powstawanie CO? wskazuje zatem na obecność a-aminokwasów. Peptydy i NH$ reagują także z ninhydryna, lecz znacznie wolniej niż a-aminokwasy. Pro lina i 4-hydroksyprolina tworzą z ninhydryna kompleks o barwie żółtej.

Ryc. 4-6. Ninhydryna.

Fluorescamina (ryc. 4-7). Jest czulszym związkiem, za pomocą którego można wykryć nanogramowe ilości aminokwasów. Podobnie jak ninhydryna, fluorescamina tworzy kompleks z aminami innymi niż a-aminokwasy.

Tabela 4-6. Relacje zachodzące między fazami w chromatografii T YP chromatografii Chromatografia podziałowa na stałych sorbentach; filtracja żelowa Chromatografia jonowymienna Chromatografia podziałowa między cienką warstwą ciekłego złoża i przepływającym gazem

Faza stacjonarna

Faza ruchoma

Ciekła

Ciekła

Stała

Ciekła

Ciekła

Gazowa

Chromatografia bibułowa

Chromatografia bibułowa, pomimo wypierania jej przez bardziej wyrafinowane metody, wciąż znajduje zastosowanie w rozdziałach aminokwasów. Próbki aminokwasów nanosi się na pasek bibuły, w określonym punkcie, w odległości 5 cm od jego końca. Następnie pasek zawiesza się w szczelnym naczyniu (komorze) zawierającym rozpuszczalnik (ryc, 4-8).

AMINOKWASY / 45

Kierunek wędrówki rozpuszczalnika

TnT Pasek iblbutyj

1

Naczynia 2 rozpuszczalnikiem

Ryc. 4-8. Chromatografia bibułowa zstępująca (przekrój komory).

Rozpuszczalniki stosowane do rozdzielania aminokwasów są mieszaninami wody, alkoholi, kwasów lub zasad. Bardziej polarne składniki rozpuszczalnika wiążą się z celulozą i stanowią fazę stacjonarną, zaś mniej polarne składniki — fazę ruchomą. Tak jest w klasycznej chromatografii podziałowej. W chromatografii podziałowej w odwróconej fazie polarności fazy ruchomej i stacjonarnej są odwrócone (np. przez

Kierunek

* ■

wędrówki rozpuszczalnika Lys Asp

Glv

•

1

Thr

Pro Val

_ Start Cys His Arg Ser Glu

1

Ala'

i i

Tvr Met

Trp Phe Leu

#

Ryc. 4-9. identyfikacja aminokwasów występują cych w białkach. Po rozdziale mieszaniny amino kwasów techniką chromatografii bibułowej zstępu jącej w układzie n- butanol -kwas octowy-woda plamy aminokwasów wywołano za pomocą ninhydryny. _______________________________________

pierwotne zanurzenie bibuły w roztworze silikonu). Chromatografię podziałową w odwróconej fazie stosuje się do rozdziału niepolarnych peptydów lub lipidów, niepolarnych związków, takich jak niektóre aminokwasy. Wyróżnia się 2 typy technik stosowanych do rozwijania chromato gram u; chromatografię wstępującą i zstępującą, tj. odpowiednio gdy rozpuszczalnik wędruje przez bibułę z naniesioną próbą w górę lub w dół. Kiedy rozpuszczalnik zbliży się prawie do końca bibuły, wtedy wyjmuje się ją, suszy i przeprowadza reakcję identyfikacji badanych związków (w przypadku aminokwasów przeprowadza się reakcję z 0,5% roztworem ninhydryny w acetonie, po czym ogrzewa przez kilka minut w temp. 90—110°C. Aminokwasy z dużymi niepolarnymi łańcuchami bocznymi (Leu, Ile, Phe, Trp, Val, Met, Tyr) wędrują dalej niż te z krótszymi niepolarnymi łańcuchami bocznymi (Pro, Ala, Gly) lub z polarnymi łańcuchami bocznymi (Thr, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lys, Cys) (p. ryc. 4-9). Odzwierciedla to większą względną rozpuszczalność cząsteczek polarnych w hydrofilowej fazie stacjonarnej, zaś cząsteczek niepolarnych w rozpuszczalnikach organicznych. W grupie cząsteczek niepolarnych (Gly. Ala, Val, Leu) zwiększeniu długości niepolarnego łańcucha bocznego towarzyszy zwiększenie ruchliwości tych cząsteczek. Stosunek odległości przebytej przez aminokwas do odległości przebytej przez czoło rozpuszczalnika, mierzonych od miejsca naniesienia mieszaniny aminokwasów, opisuje się jako wartość Rf tego aminokwasu (względną ruchliwość). Wartości Rf dla danego aminokwasu zmieniają się w zależności od warunków doświadczalnych, np. od stosowanego rozpuszczalnika. Chociaż możliwa jest próbna identyfikacja aminokwasu za pomocą samej wartości Rf, bardziej wskazane jest rozdzielenie chromatograficzne nieznanej mieszaniny aminokwasów równocześnie ze znanymi aminokwasami wzorcowymi. Wobec tego ruchliwość może być porównana do ruchliwości wzorców (np. jako RAia raczej niż jako Rf). Ruchliwości, przedstawione jako względne wobec standardowych, różnią się mniej niż wartości Rf z kolejnych doświadczeń. Zawartość aminokwasów można oznaczyć ilościowo, wycinając każdą plamę i eluując odpowiednim rozpuszczalnikiem, a następnie przeprowadzając analizę kolorymetryczną (z ninhydryną). W innym rozwiązaniu bibułę

46 / ROZDZIAŁ 4

spryskuje się ninhydryną, a natężenie barwy wyeluowanych plam mierzy się w fotometrze z zapisem natężenia światła przepuszczanego lub odbitego. W innej technice — chromatografii bibułowej dwuwymiarowej, próbkę nanosi się w jednym rogu kwadratowego arkusza bibuły i rozdziela w odpowiednio dobranej mieszaninie rozpuszczalników. Po wysuszeniu i usunięciu rozpuszczalnika arkusz obraca się o 90°C i rozdziela w innej mieszaninie rozpuszczalników (ryc. 410).

Butanol-kwas octowy-woda (4:1:5).

Ryc. 4-10. Dwuwymiarowa chromatografia aminokwasów (przerysowano, nieznacznie zmodyfikowano z: Levy A. J. i Chung D.: Two-dimensional chi-omatographyof aminoacidsonbuffered papers. Aria!. Chem. 1953; Copyright ©1953 by American Chemical Society; zamieszczono za zgodą).

Chromatografia cienkowarstwowa Wyróżnia się 2 odrębne klasy chromatografii cienkowarstwowej (ang. thin-layer chromatography; skrót — TLC). Pierwsza — chromatografia cienkowarstwowa podziałowa (ang. partition thin-layer chromatography: skrót — PTLC), w pełni przypomina chromatografię bibułową podziałową. W metodzie PTLC wykorzystuje się te same układy rozpuszczalników i sposoby identyfikacji badanych związków, co w chromatografii bibułowej. Natomiast bibułę zastępuje płytka pokryta cienką warstwą sproszkowanej celulozy lub innego względnie obojętnego złoża. Możliwy jest również wariant PTLC w odwróconej fazie. Z kolei druga klasa — adsorpcyjna TLC (adsorption thin-layer chromatography; skrót

— ATLC), nie przypomina chromatografii bibułowej i opiera się na innych zasadach. W tej technice rozpuszczalnik (który nie musi być dwuskładnikowy lub bardziej złożony) eluuje składniki próby z zaadsorbowanych miejsc na aktywowanym sorbencie, takim jak prażony żel krzemionkowy. Metoda ATLC znajduje zastosowanie do rozdziału związków niepolarnych, takich jak lipidy, i stąd nie jest przydatna dla części aminokwasów i większości peptydów. Chromatografia jonowymienna Całkowita analiza reszt aminokwasowych po hydrolizie łańcucha peptydowego wymaga na ogół automatycznej chromatografii jonowymien-

nej. Pełen rozdział, identyfikacja i oznaczenie ilościowe hydrolizatu białkowego nie trwa dłużej niż 3 h. W metodzie Moore'a i Steina stosuje się kolumny (krótką i długą) zawierające formę Na+ sulfonowanej żywicy polistyrenowej. Kiedy kwaśny hydrolizat w pH 2,0 zostanie naniesiony na kolumny, aminokwasy wiążą się z jonem Na+ wymieniacza kationowego. Następnie kolumny eluuje się cytrynianem sodu w zaprogramowanych warunkach pH i temperatury. Krótką kolumnę eluuje się jednym buforem, zaś długą — dwoma, W eluatach z kolumn wywołuje się reakcję z odczynnikiem ninhydrynowym, a odczyty natężenia barwy przeprowadza się w kolorymetrze przepływowym. Dane są rejestrowane na katodowej lampie obrazowej ze sprzężonym komputerowym odczytem integracji powierzchni pól rozdzielonych aminokwasów (ryc. 4-11).

570 nm Ryc. 4-11A

AMINOKWASY / 47 55 °C

570 nm -pH 3,25-

-pH 4,25-

C.

4-11. Automatyczna analiza kwaśnego hydrolizatu białkowego na kolumnach Dowex 50 Moore'a iSteina (w temp. 55°C). A; Do rozdziału aminokwasów zasadowych użyto krótkiej kolumny (5,0x0,9 cm), stosując elucję roztworem o pH 5,28; potrzebny czas = 60 min. B: Do rozdziału aminokwasów obojętnych i kwaśnych użyto dłuższej kolumny (55 x 0,9 cm), stosując elucje najpierw buforem o pH 3,25, a potem buforem o pH 4,25. Norleucynę użyto jako substancję wzorcową {tzw. wzorzec wewnętrzny). Aminokwasy zasadowe pozostają związane na kolumnie; potrzebny czas =180 min. Eluowane próbki reagują z odczynnikiem ninhydrynowym, a pomiar ich gęstości optycznej jest dokonywany przy długości fal światła 570 nm i 440 nm. Przy 440 nm wykrywa się jedynie prolinę i hydroksyprolinę. Oś rzędnych — gęstość optyczna w skali logarytmicznej: oś odciętych — czas w min (reprodukowano za zgodą: Prof. ET. Mert, Pardue University).

Elektroforeza wysokonapięciowa

Elektroforeza wysokonapięciowa (ang. high-voltage electrophoresis; skrót — HVE) rozdzielająca aminokwasy, polipeptydy i inne amfolity (cząsteczki, których ładunek całkowity zależy od pH otaczającego środowiska) w polu prądu stałego ma wiele zastosowań w biochemii. W analizie aminokwasów najczęściej używanymi nośnikami są arkusze bibuły albo cienkowarstwowe płytki powleczone sproszkowaną celulozą. W rozdziałach wielkocząsteczkowych polipeptydów i białek używa się usieciowanego żelu poliakryloamidowego. W analizie oligomerów nukleotydowych wykorzystuje się głównie 2 złoża — agarozę i żel poliakryloamidowy. Rozdział amfolitów, umieszczonych w polu elektrycznym o napięciu 2000—5000 V w ciągu 0,5—2 h, zależy od ich ładunku elektrycznego i masy cząsteczkowej, W przypadku cząsteczek obdarzonych jednakowym ładunkiem elektrycznym, szybciej będą wędrować cząsteczki o mniejszej masie. Ładunek elektryczny jest jednak ważniejszym czynnikiem w określeniu stopnia osiągniętego rozdziału. Elektroforeza HVE znajduje zastosowanie w analizie aminokwasów, małocząsteczkowych polipeptydów,

niektórych białek, nukleotydów i fosfocukrów. Próbki nanosi się na nośnik zwilżony buforem o odpowiednim pH i łączy się ten nośnik ze zbiornikami buforu za pomocą bibułowych łączników, a cały układ z bibułą można przykryć płytą szklaną lub zanurzyć w chłodziwie węglowodorowym. Po podłączeniu prądu cząsteczki obdarzone ładunkiem dodatnim wędrują w roztworze o wybranym pH w kierunku katody, a cząsteczki z ładunkiem ujemnym — w kierunku anody. W celu zidentyfikowania rozdzielonej próby elektroforegram wybarwia się odczynnikiem ninhydrynowym (aminokwasy, peptydy), bromkiem etydyny i ogląda w świetle lampy UV (oligomery nukleotydowe) itd. Wybór pH „narzucają" wartości pK grup zjonizowanych cząsteczek w mieszaninie.

NAJWAŻNIEJSZĄ REAKCJĄ AMINOKWASÓW JEST TWORZENIE WIĄZANIA PEPTYDOWEGO W zasadzie tworzeniu wiązania peptydowego towarzyszy odłączenie 1 mola wody, powstającego z grupy a-aminowej jednego aminokwasu

48 / ROZDZIAŁ 4 — NH

Alanina

OH + H O Walina

hydrolizy wiązania peptydowego. Aby przeprowadzić biosyntezę wiązania peptydowego między dwoma aminokwasami, najpierw musi ulec aktywacji grupa karboksylowa. Chemicznie grupę karboksylowa można przekształcić w chlorek kwasowy. W przyrodzie, aktywację zapoczątkowuje kondensacja z ATP (p. rozdz. 30).

HS O

PIŚMIENNICTWO

CHpeptyd; alanyiowaltna (Ala-Val) Ryc. 4-12. Aminokwasy połączone wiązaniem peptydowym (obszar zaciemniony).

i grupy oc-karboksylowej drugiego aminokwasu (ryc. 4-12). Reakcja ta nie przebiega jednak tak, jak przedstawiono na tej rycinie, gdyż stała równowagi reakcji jest przesunięta w kierunku

Barrett GC: Chemistry and Biochemistry ofthe Amino Acids. Chapman & Hal], 1985. Davies JS: Amino Acids and Peptides. Chapman & Hali. 1985. Gehrke CW, Kuo KCT, Zumwalt RW, Kenneth CT: Amino Acid Analysis by Gas Chromatography. 3 vols. CRC Press, 1987. Hancock WS: Handbook ofHPLCfor the Separation of Amino Acids, Peptides. and Proteins. 2vols. CRC Press, 1984. Hugli TE: Techniaues in Protein Chemistry. Academic Press, 1989. Rattenbury JM: Amino Acid Analysis. Halstead Press, 1981.

5

Peptydy Victor W. Rodweli, PhD

WPROWADZENIE Po połączeniu grup aminowych i karboksylowych aminokwasów z utworzeniem wiązań peptydowych, składowe ami no kwasowe określa się resztami aminokwasowymi. Peptyd składa się z dwóch lufo więcej reszt aminokwasowych połączonych wiązaniami peptydowymi. Peptydy zawierające więcej niż 10 reszt aminokwasowych nazywa się polipeptydarni, ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Peptydy są związkami budzącymi szerokie zainteresowanie, szczególnie w endokrynologii. Wiele hormonów jest peptydami i mogą być podawane chorym w celu korygowania ich niedoborów (np. wstrzyknięcia insuliny chorym na cukrzycę). Pewne antybiotyki są peptydami (np. walinomycyna i gramicydyna A), a nieliczne z nich substancjami przeciwnowotworowymi (np. bleomycyna). Szybka synteza chemiczna i technologia rekombinacji DNA ułatwiły produkcję znacznych ilości hormonów peptydowych. Wiele z nich występuje w organizmie w stosunkowo małych stężeniach, co utrudnia możliwość ich wydzielenia w ilościach wystarczających do leczenia. Ta sama technologia pozwala syntetyzować inne peptydy, dostępne z naturalnych źródeł w niezwykle małych ilościach (np. niektóre peptydy i białka wirusowe), wykorzystywane do produkcji szczepionek.

4 — Biochemia

PEPTYDY TWORZĄ SIĘ Z L- K AMINOKWASÓW POŁĄCZONYCH WIĄZANIAMI PEPTYDOWYMI Na rycinie 5-1 przedstawiono tripeptyd utworzony z reszt aminokwasowych alaniny, cysteiny i waliny. Należy odnotować, że tripeptyd składa się z 3 reszt aminokwasów ych. ale nie zawiera 3 wiązań peptydowych. Umownie strukturę peptydu zapisuje się rozpoczynając od lewej strony N-końcową resztą aminokwasów ą (z wolną grupą a-aminową), a kończąc po prawej stronie C-końcową resztą aminokwasową (z wolną grupą a-karboksylową). Przedstawiony peptyd ma jedną wolną grupę a-aminową oraz 1 wolną grupę a-karboksylową. Jednakże w niektórych pepiydach końcowe grupy aminowe lub karboksylowe mogą być podstawione (np. N-formyloamina lub amid grupy karboksylowej) i w ten sposób nie są wolne.

Alanyb-

cysteinylo-

walina

Ryc. 5-1. Wzór strukturalny tripeptydu {wiązania peptydowe zaciemniono).

Prosta metoda przedstawiania wzorów strukturalnych peptydów Aby w prosty sposóbzapisać wzór strukturalny peptydu, w pierwszej kolejności rysuje się jego „szkielet" z połączonych grup oc-NHU

50 / ROZDZIAŁ 5

i a-COOH oraz atomów węgla a. Następnie wpisuje się w odpowiednie miejsca łańcucha atomy węgla a (patrz niżej). Należy więc: 1. Narysować szkielet (zyg-zag) i dodać N-końcową grupę aminokwasową:

2. Dopisać atomy węgla a, grupy a-karboksylowe i a-aminowe:

CO O +

H3 N

3. Dopisać właściwe grupy R i atomy wodoru a do atomów węgla a: SH 0 H

CH,

II V-

H

H

\

00

H O

H CH, CH,

Kolejność aminokwasów określa strukturę pierwszorzędową peptydu Pierwszorzędową strukturę peptydu określa liczba, budowa chemiczna i kolejność (sekwen-

Symboli trój- i jednoliterowych używa się w zapisie aminokwasów w peptydach Ponieważ polipeptydy (białka) mogą zawierać 100 i więcej reszt aminokwasowych, w celu przedstawienia ich struktury pierwszorzędowej (ryc. 5-2) stosuje się symbole albo trój- albo jednoliterowe (tab. 4-3, kolumna 2).

G!u-A!a-Lys-Gly-Tyr-Ala E A

K

G Y

A

Ryc. 5-2. Przykład zapisu jednoliterowymi i trójI(terowymi symbolami reszt aminokwasowych przedstawiający pierwszorzędową strukturę heksapeptydu, zawierającego, jako N-końcowy aminokwas, kwas glutaminowy (Glu, E) oraz jako Ckońcowy — alaninę {Ala, A).

Glu-Lys-(A!a,Gly,Tyr)-His-Ala Ryc. 5-3. Przykład heptapeptydu, zawierającego fragment o niepewnej strukturze pierwszorzędowej (w nawiasie).

Zapis struktury pierwszorzędowej za pomocą trójliterowych symboli, połączonych kreskami reprezentującymi wiązania peptydowe, jest zrozumiały i jednoznaczny. Kreski zwykle pomija się w zapisie sekwencji peptydów przy użyciu symboli jednoliterowych. W przypadku niepewności w ustaleniu kolejności fragmentu polipeptydowego, wątpliwą sekwencję reszt aminokwasowych umieszcza się w nawiasie i oddziela przecinkami (ryc. 5-3). Zmiana w pierwszorzędowej strukturze peptydu może zmieniać jego aktywność biologiczną Podstawienie pojedynczego aminokwasu przez inny, w liniowej sekwencji polipeptydu o 100 lub więcej resztach aminokwasowych, może zmniejszyć lub znieść jego aktywność biologiczną oraz powodować potencjalnie poważne następstwa (np. niedokrwistość sierpowata). Wiele dziedzicznych wad metabolicznych wynika ze zmiany pojedynczego aminokwasu w określonym białku. Wprowadzenie nowych metod badania struktury białek i DNA przyczyniło się do poszerzenia wiedzy o biochemicznych podstawach wielu dziedzicznych chorób metabolicznych. Peptydy są potielektrolitami, których ładunek zależy od pH otaczającego środowiska Wiązanie peptydowe (amidowe) nie ma ładunku w żadnym ważnym fizjologicznie pH. Powstawaniu peptydów z aminokwasów w pH

PEPTYDY / 51

7,4 towarzyszy utrata jednego ładunku dodatniego i ujemnego przy utworzeniu jednego wiązania peptydowego. Jednakże peptydy są cząsteczkami obdarzonymi ładunkiem elektrycznym w pH fizjologicznym dzięki ładunkom ich grup C- i N-końcowych oraz grup funkcyjnych występujących w polarnych resztach aminokwasowych przyłączonych do atomów węgla a (p. tab. 4-1).

S

0

H C

CHj

H-

N I H

H2 CHj

I

coo-

C-NHS Liczba możliwych konformacji peptydu jest wymuszona siłami cooniekowalencyjnymi Ryc. 5-4. Giutation (y-glutamylocysteinyloglicyPolipeptydy mogą wykazywać różną konfor- na). mację (ułożenie przestrzenne), jednak w roztworze przeważa tendencja do niewielkich zmian konformacyjnych. Konformację pepty- zym — reduktaza glutationowa — uczestniczą dów utrwalają takie czynniki, jak zawada prze- w powstawaniu prawidłowych wiązań disiarczstrzenna, oddziaływania kulombowskie, wiąza- kowych w wielu białkach i hormonach polipepnia wodorowe i hydrofobowe (p. rozdz. 6). Tak tydowych (p. rozdz. 6). jak w przypadku białek, do fizjologicznej akAntybiotyki jolipeptydowe. Są wytwarzane tywności polipeptydów jest nieodzowna specy- przez grzyby i zawierają zarówno D- jak ficzna konformacja. ...LLcaminokwasy, a także aminokwasy nie występujące w białkach. Zalicza się do nich np. tyrocydynę i gramicydynę S, cykliczne polipepWIELE MAŁO CZĄSTECZKOWYCH tydy zawierające D-fenyłoalaninę oraz niebiałPEPTYDÓW WYKAZUJE kowy aminokwas — ornitynę. Należy podkreśAKTYWNOŚĆ FIZJOLOGICZNĄ lić, że wymienione polipeptydy nie są syntetyzowane na ry boso mach. Komórki zwierząt, roślin i bakterii zawierają Hormon tyreotropowy (TRH). W tym warianróżnorodne małocząs tęcz k owe polipeptydy cie peptydowym N-końcowy kwas glutamino(3—100 reszt aminokwasowych) o istotnej ak- wy- ulega, cyklizacji do kwasu piro glutamino tywności fizjologicznej. Niektóre z nich, łącznie we-.gOjjiatomiast N-końcowa grupa z większością polipeptydowych hormonów ssa- karboksylowa jjroliny występuje jako amid ków, zawierają tylko wiązania peptydowe, (ryc. 5-5). utworzone między grupami a-aminowymi i 7-karboksylowymi, 20 L-a-arninokwasów występujących w białkach. Jednakże w polipeptydach mogą również występować dodatkowe, ,,niebiałkowe" aminokwasy, lub też pochodne aminokwasów budujących białka. Krótki polipeptyd — bradykinina, czy.anik zj32ui£^szaJ3«y.jłapica.e.inięśni^ła
Arg-Pro-Pro-Giy-Phe-Ser Pro-Phe Arg Bradykinirta

Glutation (ryc, 5-4). Jest nietypowym tripeptydem, w którym N-końcowy kwas glutaminowy wiąże się z cysteiną wiązaniem nie-ot-peptydylowym. Jest związkiem niezbędnym do działania niektórych enzymów. Glutation i en-

W niektórych przypadkach polipeptydy ssaków w swojej cząsteczce mogą zawierać więcej niż 1 fizjologicznie czynny peptyd, np, (3-lipotropina. Ten hormon przysadki pobudza uwalnianie kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej. W strukturze pierwszorzędowej pMipotropiny występują fragmenty łańcucha wspólne dla innych hormonów peptydowych o odrębnych właściwościach fizjologicznych (ryc. 5-6). Długi polipeptyd jest prekursorem krótszych polipeptydów.

52 / ROZDZIAŁ 5 G LT

S

O

R

L

R

N

G

D A S N P O N G A E G G

P

N

SA L L ! _ ■E »

H

0-Endorflna « D L V » A E K

...K OrETSXPlTrftYMl €Y HTFYRYW

G / S YPYP YKYDl K

R

Endorfina a-Endorflna Enkefallna metloninowa Byc. 5-6. Pierwszorzędowa struktura fMipotropiny. Reszty 41-58 reprezentują hormon pobudzający melanocyty (p-MSH). Reszty 61—91 zawierają sekwencje odpowiadające wskazanym endorfinom.

ZŁOŻONĄ MIESZANINĘ PEPTYDÓW MOŻNA ROZDZIELIĆ PODCZAS ELEKTROFOREZY LUB CHROMATOGRAFII Chromatografia i elektroforeza wysokonapięciowa (HVE) Techniki, które jako podstawę rozdziału wykorzystują ładunek elektryczny, znajdują zastosowanie zarówno w badaniach polipeptydów, jak i aminokwasów (p. rozdz. 4). Wartość pK. C-końcowej grupy karboksylowej polipeptydu jest większa niż grupy a-karboksylowej odpowiedniego aminokwasu (oznacza to, że grupa karboksylowa peptydu jest słabszym kwasem). Odwrotnie, N-końcowa grupa aminowa polipeptydu jest silniejszym kwasem (ma mniejszą wartość pK) niż grupa aminowa aminokwasu, od którego on pochodzi (tab. 5-1).

Tabela 5-1. Wartości pK glicyny i peptydów glicynowych 9.6 0 8,1 7 Gly Gly-Gly GlyGty-Gly

Filtracja żelowa W metodzie automatycznego sekwencjonowania wykorzystuje się niewielką liczbę peptydów o długości 30—100 reszt aminokwasowych. Jednakże wiek wielkocząsteczkowych polipeptydów może być nierozpuszczalnych, z powodu odsłonięcia w procesie dcnaturacji uprzednio niedostępnych reszt hydrofobowych. Nierozpuszczalnośc polipeptydów można pokonać przez ich rozpuszczenie w moczniku, alkoholach, kwasach organicznych lub zasadach, ale czynniki te ograniczają stosowanie technik chromatografii jonowymiennej w ich oczyszczaniu. Okazuje się, że filtrację żelową dużych hydrofobowych peptydów można przeprowadzić, używając roztworów kwasu mrówkowego lub octowego w dużych stężeniach (1 —4 mol/1). Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa w fazie odwróconej Skuteczną techniką tv oczyszczaniu wielkocząsteczkowych, niepolarnych peptydów jest wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (ang. high performance liquid chromatography; skrót — HPLC) na niepolamych nośnikach, z wykorzystaniem polarnych rozpuszczalników. Na rycinie 5-7 przedstawiono 'rozdział bromocyjanowych fragmentów ludzkiej globiny płodowej za pomocą tej techniki. Połączenie

y-

PEPTYDY / 53

sie lub solami srebra, natomiast polinukleolydów — bromkiem etydyny. Popularną odmianą elektroforezy jest PAGE w warunkach denaturujących. Białka przed elektroforeza, poddaje się gotowaniu w odpowiednim buforze, a następnie rozdziela w obecności czynników denaturujących — mocznika lub siarczanu dodecylu sodu (SDS). Ujemny ładunek cząsteczek \ CH1 - (CH,), L - SO3") pokrywa białka w stosunku 1 cząsteczka SDS na 2 wiązania pcptydowe. ["o „obładowanie" białek ładunkami czyni je silnie ujemnymi (anionami). Późniejszy rozdział białek jest oparty na wielkości ich masy cząsteczkowej. Metoda SDS-PAGE jest szeroko stosowana do określania masy cząsteczkowej białek przez porównanie ich ruchliwości elektroforetycznej z ruchliwością białek wzorcowych o znanej masie cząsteczkowej.

o

Ryc. 5-7. Profil elucyjny rozdziału bromocyjanowych fragmentów ludzkiej globiny pfodowej, uzyskanej metodą HPLC w odwróconej fazie. Przedstawiono oznaczenia dowolnie numerowanych fragmentów OL i 7 łańcuchów (reprodukowano dzięki uprzejmości: J.D. Pearson i wsp.r Deparrment of Biochemistry, Pardue Ur>iversity).

filtracji żelowej i HPLC w odwróconej fazie stosuje się do oczyszczania złożonych mieszanin peptydów, otrzymanych w wyniku częściowego trawienia białek.

Wysokonapięciowa elektroforeza (HVE) na sitach molekularnych

Sączenie molekularne, w połączeniu z rozdziałem związków i wykorzystujące ładunek, ułatwia ich rozdział. Oprócz skrobi i agarozy, najczęściej używanym nośnikiem jest usiedowany polimer akryloamidu (CH2 = CHCONH,,). Podczas elektroforezy w żelu poliakryloamido-

wym (ang. polyacrylamide gel electrophoresis; skrót — PAGE) roztwór białka nanosi się na spolimeryzowany akryloamid, w odpowiednim buforze, uformowany w postaci płytki lub w ru■rkach. Czynnikiem sieciującym złoże poliakryloamidu może być 2—10% roztwór metyłeno-tó-akryloamidu (CH2 = CONH) ? - CH2 lub podobne związki sieciujące. Rozdział naniesionych prób, w odpowiednim buforze, dokonuje się pod wpływem prądu elektrycznego. Identyfikację poiipeptydów po rozdziale elektro foretycznym przeprowadza się za pomocą barwienia żeli błękitem brylantowym Coomas-

PIERWSZY ETAP W OKREŚLANIU STRUKTURY PIERWSZORZĘDOWEJ PEPTYDU TO POZNANIE JEGO SKŁADU AMIN0KWASOWEG0 W analizie struktury peptydów najpierw przeprowadza się hydrolizę wiązań peptydowych łączących aminokwasy. Ponieważ wiązania te są trwałe w roztworach o obojętnym pH, przeprowadza się hydrolizę kwaśną lub zasadową. Kataliza enzymatyczna jest stosunkowo mało przydatna do przeprowadzenia pełnej hydrolizy wiązań peptydowych. Każdy typ hydrolizy białek przebiega z utratą pewnych reszt aminokwasowych. Metodą z wyboru jest hydroliza w zatopionych, odpowietrzonych probówkach w 6 mol/l roztworze HC1 w temp. HO^C. Podczas takiej hydrolizy wszystkie reszty tryptofanu i cysteiny oraz większość reszt cystynowych ulegają zniszczeniu. W obecności jonów metali dochodzi do częściowej utraty metioniny i tyrozyny. Glutamina i asparagina ulegają deamidacji do kwasów: glutaminowego i asparaginowego. Odzysk seryny i treoniny jest niepełny, a ilość tych aminokwasów zmniejsza się w miarę przedłużania czasu hydrolizy. Niektóre wiązania między resztami aminokwasów obojętnych (Val-Val, Ile-Ile, Val-Ile, Iłe-Val) ulegają rozbiciu tylko w ok. 50% po 20 h hydrolizy. Zwykle przeprowadza się hydrolizę próbek (w powtórzeniach) przez 24, 48, 72 i 96 h, ekstrapolując potem zawartość seryny i treoniny do czasu zerowego. Zawartość waliny i izoieucyny oznacza się po 96 h hydrolizy. Amino-

5* / ROZDZIAŁ 5

kwasy dikarboksylowe i ich amidy oznacza się razem i przedstawia łącznie jako „Glx" i „Asx". Cysteina i cystyna przechodzą w trwałą w środowisku kwaśnym pochodną (np. kwas cysternowy) przed hydrolizą. Hydroliza zasadowa, w czasie której ulegają zniszczeniu seryna, treonina, arginina i cysteina, a wszystkie aminokwasy ulegają racemizacji, jest stosowana do oznaczania tryptofanu. Po hydrolizie prób ich skład aminokwasowy może być oznaczony podczas automatycznej chromatografii jonowymiennej (p. ryc. 4-11) lub HPLC. Sekwencjonowanie pierwszego białka przeprowadził Fred Sanger, za pomocą odczynnika mającego od tej pory jego nazwisko Minęło już ponad 30 lat od określenia przez Sangera pełnej sekwencji aminokwasowej hormonu polipeptydowego — insuliny. W metodzie Sangera najpierw rozdzielono insulinę na 2 łańcuchy polipeptydowe A i B, po czym poddano swoistemu trawieniu enzymatycznemu do krótkich peptydów, zawierających odcinki sekwencji zachodzących. Następnie zastosowano związek — i-fluoro-2,4-dinitrobenzen (ryc. 5-8), tworzący pochodne tylko Ryc. 5-8. Reakcja aminokwasu z 1 -fluoro-2,4--N-CH -COOH

CH-COOH dinitrobenzenem (odczynnikiem Sangera). Odczynniki nazwano od nazwiska laureata nagrody Nobla (1958), biochemika Fryderyka Sangera, który zastnsowal go w celu oznaczenia pierwszorzędowej struktury insuliny. Odczynnik ilościowo aryluje wszystkie wolne grupy aminowe, dając intensywnie żółto zabarwione 2,4-dinitrofenyloaminokwasy. Pochodne te łatwo się oznacza ilościowo za pomocą spektrototometru. Oprócz reszt N-końcowych, fluorod(nitrobenzen reaguje także 'z grupami; e-aminową lizyny, imidazolową histydyny, hydroksyl ową tyrozyny i grupą SH cysteiny. Ponieważ grupa dinitrofenylowa nie jesi usuwana podczas kwaśnej hydrolizy, stosuje sieją do analizy N-końcowego aminokwasu polipeptydów.

z N-końcowymi resztami aminokwasowymi peptydów, które po hydrolizie usuwano i identyfikowano. Porównanie sekwencji zachodzących pozwoliło Sartgerowi jednoznacznie wydedukować sekwencje obydwu łańcuchów insuliny. Pomimo że metoda Sangera jest wciąż stosowana, 2 inne techniki zrewolucjonizowały oznaczanie struktury pierwszorzędowej polipeptydów (białek). Pierwsza z nich, wprowadzona w 1967 r., to metoda automatycznego usuwania i identyfikowania N-końcowych reszt aminokwasowych peptydów, jako ich pochodnych fenylotiohydantoinowych (degradacja Edmana). Druga — wprowadzona niezależnie przez Sangera oraz Maxama i Gilberta — polega na szybkim sekwencjonowaniu DNA genów kodujących poszukiwane białko. Obecnie optymalną strategią jest stosowanie obydwu równocześnie. Technika automatycznej degradacji Edmana, choć szybsza w analizie sekwencji peptydów od metod Sangera, napotyka trudności i dostarcza wolniej wyników niż metoda sekwencjonowania DNA. Technika sekwencjo no wania DNA nie dostarcza jednak nieomylnych, jednoznacznych wyników dotyczących pierwszorzędowej struktury białek. Najpoważniejsze trudności w sekwencjonowaniu genów eukariotycznych są związane z obecnością w ich obrębie intronów — sekwencji nukleotydowych nie ulegających ekspresji w dojrzałym białku. Pomimo to, główna przewaga tej metody polega na stosunkowo łatwej detekcji i sekwencjonowaniu regionów prekursorowych cząsteczek, które mogą „umknąć" wykryciu w technice degradacji Edmana (wskutek dojrzewania przed jego wydzieleniem). Metody sekwencjonowania DNA i degradacji Edmana należy traktować jako uzupełniające się. Zrewolucjonizowały one i daleko posunęły naszą wiedzę o pierwszorzędowej strukturze białek. Oznaczanie pierwszorzędowej struktury polipeptydów za pomocą techniki automatycznej degradacji Edmana Ze względu na fakt, że wiele białek składa się z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego, połączonych wiązaniami niekowalencyjnymi lub przez mostki disiarczkowe, pierwszy etap stanowi dysocjacja i rozdzielenie indywidualnych łańcuchów poiipeptydowych. Czynniki denaturujące (mocznik, chlorowodorek guanidyny) rozbijają wiązania wodorowe i dysocjują niekowalencyjnie połączone polipeptydy,

PEPTYDY / 55

a czynniki utleniające i redukujące rozrywają mostki disiarczkowe (ryc. 5-9). Następnie peptydy rozdziela się metodami chromatograficznymi. Wielkocząsteczkowe polipeptydy muszą ulec rozszczepieniu do peptydów o długości nadającej się do automatycznego sekwencjonowania Aparaty służące do automatycznego sekwencjonowania (sekwentatory) analizują skutecznie polipeptydy o długości 20—60 reszt aminokwasowych. Ten fakt wpływa na wybór techniki rozcinania polipeptydów oraz oczyszczania otrzymanych fragmentów. Zmierza się więc do uzyskania niewielkiej liczby dłuższych fragmentów (o długości 30—100 reszt aminokwasowych). Korzystne jest zatem bardzo swoiste i pełne rozszczepienie łańcucha polipeptydowego w określonych miejscach. Takie wymagania spełnia rozszczepienie za pomocą bromocyjanu (CNBr), trypsyny lub o-jodozobenzenu. CNBr. Reszty cysteiny są najpierw modyfikowane przez kwas jodooctowy. CNBr rozcina Ryc, 5-9. Rozszczepienie łańcuchów poiipepty-

=O

wówczas łańcuch polipeptydowy (w większości ilościowo) tylko w miejscach występowania reszt metioninowych, po ich stronie karboksylowej. Ponieważ metionina występuje rzadko w polipeptydach, takie rozszczepienie powoduje powstawanie fragmentów peptyd owych o właściwej długości. Trypsyna. Trypsyna nacina łańcuchy pohpeptydowe po karboksylowej stronie reszt lizyny i argininy. Jeśli reszty lizyny najpierw przeprowadzi się w pochodne za pomocą bezwodnika kwasu cytrakonowego (reakcja odwracalna), w celu zmiany ładunku reszt hzynowych z dodatniego na ujemny, to trypsyna rozszczepia tylko reszty argininowe. Wykorzystanie pochodnych reszt argininowych jest mało użyteczne z powodu stosunkowo dużego „nadmiaru" reszt hzynowych w białkach. Jednakże jest przydatne do kolejnego rozszczepiania CNBr fragmentów. o- Jodozobenzen. Związek len rozszczepia swoiście i ilościowo miejsca względnie rzadko występujących reszt: Trp-X. Nie wymaga wcześniejszej osłony innych reszt aminokwasowych. Hydroksyloamina. Hydroksyloamina rozrywa względnie rzadko wiązania: Asn-Gly, chociaż nie w sposób ilościowy. Proteaza V8. Enzym ze Staphylococcus aureus rozcina peptyd przy resztach Glu-X, z wyraźną wybiórczością w stosunku do reszty X o charakterze hydrofobowym. Wiązanie Glu--Lys nie ulega rozszczepieniu przez tę proteazę. Ta reakcja jest wykorzystywana do kolejnej degradacji CNBr fragmentów.

Łagodna kwaśna hydroliza. W toku

O =

dowych połączonych wiązaniami disiarczkowymi (pole zaciemnione) za pomocą czynników utleniających (kwas nadmrówkowy, strona lewa) bądź redukujących (2-merkaptoetanol; strona prawa) prowadzące do utworzenia 2 peptydów — odpowiednio z resztą kwasu cysteinowego lub resztą cysteiny Iową.

takiej hydrolizy ulega rozerwaniu rzadko spotykane wiązanie Asp-Pro. 2 lub 3 procesy trawienia pierwotnego polipeptydu, przy resztach Met, Trp, Arg i Asn-Gly, połączone z odpowiednio nadtrawionymi powstałymi fragmentami, zazwyczaj pozwalają określić pełną sekwencję polipeptydu. Oprócz wyjątkowych trudności w oczyszczaniu fragmentów peptydowych, oznaczenie pierwszorzędowej struktury polipeptydu można wykonać, dysponując zaledwie kilkoma jego mikromolami. Mieszanina peptydów, otrzymana z rozszczepienia polipeptydu, musi być rozdzielona do homogennych peptydów przed ich sek we ncjo no wan i em Oczyszczanie fragmentów peptydowych przeprowadza się głównie przez ich filtrację

56 / ROZDZIAŁ 5

żelową w kwasie octowym lub mrówkowym, wykorzystując technikę HPLC w odwróconej fazie (ryc. 5-7), albo w toku chromatografii jonowymiennej na fosfocelulozie lub na złożu sulfofenyło-Sephadex w roztworach kwasu ortofosforowego. Sekwencjonowanie z zastosowaniem odczynnika i reakcji Edmana Automatyczna analiza sekwencji aminokwasów wykorzystuje fenyloizotiocyjanian (odczynnik Edmana) i reakcje, w wyniku których usuwana jest N-końcowa grupa aminowa peptydu, jako pochodna fenylotiohydantoinowa (reakcja Edmana, ryc. 5-10). Metoda tzw. degradacji Edmana polega na kolejnym odłączaniu reszt am i no kwasowych od aminowego końca peptydu. Główną część reaktora stanowi obracające się naczynie szklane, zapewniające przebieg reakcji na ścianie naczynia w postaci cienkiej warstwy. To ułatwia ekstrakcję i kolejne usuwanie rozpuszczalników. W pełni zautomatyzowanym aparacie można zsekwencjonować do 30—40 reszt aminokwasowych w 1 ciągu operacyjnym (w wyjątkowych przypadkach do 60 lub nawet 80 reszt). Aparat jest zaprogramowany do wykonywania kolejnych degradacji reszt aminokwasowych od N-końca polipeptydu. Po usunięciu pierwszego N-końcowego aminokwasu, wydzieleniu i identyfikacji powstaje następna w kolejności N-końcowa pochodna Edmana, itd. (ryc. 5-10). Pochodne fenylotiohydantoinowe rozdziela się techniką HPLC i identyfikuje na podstawie ich kolejności i miejsca elucji. Wnioskowanie o pełnej strukturze pier wszo rzędowej po I i peptydu wymaga sekwencjonowania nakładających się peptydów W przypadku oznaczenia sekwencji reszt aminokwasowych wszystkich uzyskanych CNBr peptydów wciąż nie znana jest informacja, dotycząca kolejności ułożenia tych peptydów w łańcuchu białkowym. W celu uzyskania jednoznacznych danych o pierwszorzędowej strukturze białka, należy otrzymać i zsekwencjonować dodatkowe CNBr peptydy, których N-i i C-końcowe reszty nakładają się. Te

dodatkowe peptydy otrzymuje się technikami, które rozrywają białko w miejscach innych niż reszta metioninowa (np. przez trawienie chymotrypsyną). Jednoznaczne określenie struktury pierwszo rzędowej, przez porównanie sekwencji

NH3

R' Fsnylolzotlocyjanlan (odczynnik Edrnana) I peptyd Fenylotiohydantnina I peptyd krótszą o jedną resztę aminokwasową

Ryc. 5-10. Fenyloizotiocyjanian przeprowadza

R' O Kwas fenylotlohydanloinowy

resztę aminokwasową (lub N-końcową resztę poliH+, nitrometan

peptydu) do fenylotiohydantoiny. Fenyloizotiocyjanian reaguje z grupami aminowymi aminokwasów i peptydów, co prowadzi do powstania kwasów fenylotiohydantoinowych, które po dodaniu kwasu, w rozpuszczalnikach niehydroksytowych, cyklizują do pochodnych fenylotiohydantoinowych. Reakcję tę wykorzystuje się głównie w celu identyfikacji N-końcowych reszt peptydu w metodzie automatycznego sekwencjonowania polipeptydów.

PEPTYDY / 57

peptydowych, przypomina sposób analogiczny do budowy układanki (ryc. 5-11). W celu umiejscowienia wiązań disiarczkowych peptydy. z kontrolnych oraz zredukowanych lub utlenionych białek, rozdziela się metodą dwuwymiarowej chromatografii lub elektroforezy i chromatografii (tzw. finger-printing). Identyfikacja za pomocą ninhydryny ujawnia w produkcie trawienia białka kontrolnego 2 mniejsze peptydy, zaś w białku, na które działano wymienionymi powyżej czynnikami, 1 nowy peptyd. Mając informację dotyczącą sekwencji tych peptydow, można wyznaczyć w nich położenie wiązań disiarczkowych. Peptyd Y

Paptyd X Paptyd Z

1 C —końcowy fragment

N —końcowy fragmenl

peptydu X

peptyd u Y

Ryc. 5-11. Nakładające się sekwencje peptydu Z stosuje się w celu stwierdzenia, że peptydy X i Y występują w pierwotnym białku w kolejności X-*Y, a nie Y-»Z.

N

SYNTEZA PEPTYDOW METODAMI AUTOMATYCZNYMI Rycina 5-12 ilustruje procedurę syntezy dipeptydu A -B za pomocą automatycznej, stałofazowej techniki Merrifielda, podsumowującej wszystkie reakcje wymagane do zsyntetyzowania peptydu o dowolnej długości. Te etapy syntezy obejmują: 1. Zablokowanie N-końcowego aminokwasu A (otwarty prostokąt) i aminokwasu B (zaciemniony prostokąt) za pomocą grupy /-butylooksykarbonylowej (t-BOC) (■): O II (CH3)—C—O—C—

co prowadzi do utworzenia pochodnych /-BOC-aminokwas A i /-BOC-aminokwas B.

C

Ryc. 5-12. Schematyczne przedstawienie syntezy powstającego dipeptydu za pomocą techniki wprowadznnej przez IWerrifielda. Wyjaśnienie symboli znajdzie Czytelnik w towarzyszącym tekście.

2. Aktywację grupy karboksylowej (-BOC-aminokwas B za pomocą dicykloheksylokarboimidu(DCC) (A): N

C = N-C6H(

3. Reakcje grupy karboksylowej aminokwa su A (który staje się C-końcową resztą peptydu) z zaktywowaną, nierozpuszczalny żywicą poli styrenową ($). 4. Usunięcie grup blokujących z połączeń f-BOC-aminokwas A, za pomocą kwasu trifluorooctowego w temperaturze pokojowej (TFA, FjC—COOH). Uwaga. W praktyce etapy 3 i 4 można pominąć, gdyż żywica z danym ż-BOC-aminokwasem, połączone wiązaniem estrowym z fe-

58 / ROZDZIAŁ 5

nyloacetamidometylowym (PAM) „łącznikiem" zakotwiczonym w żywicy polistyrenowej, są dostępne w sprzedaży. 5. Kondensacje zaktywowanej grupy karboksylowej połączenia t-BOC-aminokwas B z wolną grupą aminową unieruchomionego ami nokwasu A. 6. Usunięcie blokującej grupy f-BOC za po mocą TFA (p. etap 4). 7. Uwolnienie dipeptydu A—B od cząste czek żywicy przez działanie fluorowodoru (HF) w dichlorometanie w temp, — 2°C, Pierwsze osiągnięcia techniki Merrifielda dotyczyły syntezy łańcucha A (21 reszt) i łańcucha B (30 reszt) insuliny w ciągu 11 dni oraz enzymu — rybonukkazy trzustkowej z wydajnością 18%. Kolejne jej udoskonalenia skróciły czas syntezy wiązania peptydowego do ok. 1 h i znacznie zwiększyły wydajność. Technika Merrifielda otworzyła nowe nadzieje nie tylko w badaniach de novo syntezy białek o określonej strukturze pierwszorzędowej, lecz także w immunologii, do produkcji szczepionek i hormonów polipeptydowych i być może także w leczeniu wybranych wrodzonych wad metabolicznych.

PIŚMIENNICTWO Allen G: Sequencing of Proteins and Peptides. North Holland, 1981. Bhwon AS: Protein/Peptide Sequence Analysis: Current Methodologies. CRC Press, 1988.

Cantor CR, Schimmel PR: Biophyskal Chemistry, Part I: The Conformation of Macromolecules. Freeman, 1980. Dayhoff M {editor): Atlas of Protein Seąuence and Structure. Vol 5. National Biomedicai Research Foundation, Washington, DC. Doolittle RF: Ol" uris and orfs: a Primer on How to Analyze Derived Amino Acid Seąuences. University Science Books. 1987. Hewick RM, Hunkapiiler MW. Hood LE, Dryer WJ: A gasliquid solid phase peplide and protein sequenator. J Biol Chem 1981; 256: 7990. Hunkapiiler MW, Hood LE: Protein sequence analysis: automated microseąuencing. Science 1983; 219: 650. LipmanDJ, PearsonWR: Similar amino acid seąuences: chance or common ancestry?/Mo/Bw/19Sl; 16:9. Mahoney WC, Smith PK, Hermodson MA: Fragmentation of proteins with o-iodosobenzoic acid: Chemical mechanism and identification of o-iodosobenzoic acid as a reactive contaminant that modifies tyrosyl residues. Biochemistry 1981; 20: 443; Methods Enzymol. Vols. 47; 48, 49, 91 (published continuously). Meriifield RB: Solid phase synthesis. Science 1986; 232: 341. Pearson JD et al: Reversed-phase supports fó"r thc resolution of iarge denatured protein fragments. / Chromatogr 1981; 207: 325. Regnier FE. Gooding K.M: High performance liquid chromatography of proteins. Anal Biochem 1980; 103: 1. Strickler JE, Hunkapiller MW, Wilson KJ: Ulility of the gasphase sequencer for both liąuid- and solid*phase degradation of proteins and peptides at Iow picomole levels. Anal Biochem 1984; 140: 553.

Białka: struktura i właściwości

6

Victor W. Rodweli, PhD

WPROWADZENIE Białka to wielkocząsteczkowe polipeptydy. Granica oddzielająca duże polipeptydy od małych białek przebiega zazwyczaj między masami cząsteczkowymi 8000 — 10 000. Białka proste są zbudowane tylko z aminokwasów. Białka złożoee^awierąją dodatkowe związki nieaminokwasowe, takie jak hern, pochodne witamin, lipidy lub węglowodany. Ten rozdział dotyczy białek prostych. W innych rozdziałach zostaną omówione typowe białka złożone, jak hemowe, glikoproteiny i lipoproteiny, a także właściwości białek prostych o szczególnie odrębnej strukturze, takich jak kolagen i białka kurczliwe. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Białka odgrywają wiodącą rolę w czynności i budowie komórki. W celach diagnostycznych szeroko stosuje się analizę niektórych białek i enzymów krwi. Dobrym przykładem jest oznaczenie elektroforetyczne stosunku zawartości albumin do globulin osocza, które stanowi integralną część rozpracowania diagnostycznego w chorobach wątroby. Analiza lipoprotein oraz immunoglobulin osocza, za pomocą elektroforezy oraz innych metod, jest powszechnie stosowana w diagnostyce odpowiednio swoistych typów hiperlipoproteinemii i zaburzeń odporności. Prawidłowy ludzki mocz zwykle jest wolny od białek, a więc stwierdzenie znaczącej proteinurii stanowi zazwyczaj ważny sygnał chorób nerek, takich jak różne postacie ich stanów zapalnych.

BIAŁKA SĄ KLASYFIKOWANE W RÓŻNE SPOSOBY W CELU ZILUSTROWANIA RÓŻNORODNYCH WŁAŚCIWOŚCI ICH FUNKCJI STRUKTURALNYCH Ze względu na brak uniwersalnego, wszechstronnie zadowalającego systemu klasyfikacji białek, powszechnie stosuje się kilka wzajemnie przeciwstawnych sposobów ich podziału. Wszystkie one mają raczej ograniczoną wartość jako pomoc w zrozumieniu wielu kluczowych właściwości białek. Utrzymywanie się w użyciu tych klasyfikacji i terminów — zwłaszcza w laboratoriach klinicznych — zmusza do krótkiej refleksji. Poniżej zostaną przedstawione podstawowe cechy systemów klasyfikacji, opartych na rozpuszczalności białek, ich kształcie, funkcji, właściwościach fizycznych oraz trójwymiarowej strukturze. Klasyfikacja na podstawie rozpuszczalności System klasyfikacji białek oparty na ich rozpuszczalności i rozwinięty w latach 1907—1908 jest nadal stosowany w zawężonym stopniu, zwłaszcza w biochemii klinicznej (tab. 6-1). Rozgraniczenia między klasami nie są przekonywające. Wyraźne rozróżnienie, np. miedzy albuminami i globulinami, nie może być przeprowadzone jedynie na podstawie ich rozpuszczalności w wodzie lub roztworach soli. Klasyfikacja na podstawie kształtu Dwie obszerne klasy białek mogą być wyodrębnione za pomocą ich stosunku osiowego (długości do szerokości). Białka globularnc, dla których wartość tego stosunku jest mniejsza od 10 i na ogół nie przekracza 3—4, mają łańcuchy polipeptydowe ściśle pofałdowane i zwinięte.

60 / ROZDZIAŁ 6 Tabela 6-1. Klasyfikacja białek oparta na ich rozpuszczalności Albuminy

Rozpuszczalne w wodzie i roztworach soli. Żadnych szczególnych aminokwasów

Globuliny

Słabo rozpuszczalne w wodzie, ale dobrze w roztworach soli. Żadnych szczególnych aminokwasów

Prolaminy

Histony Skleroprotetny

Rozpuszczalne w 70 80% etanolu, ale nierozpuszczalne w wodzie i etanolu absolutnym. Wzbogacone w arginine Rozpuszczalne w roztworach soli (i kwasów nieorganicznych*) Nierozpuszczalne w wodzie ani w roztworach soli. Wzbogacone w Gly, Aia, Pro

* Przyp. tłum.

Należą do nich m.in. insulina, albuminy i globuliny osocza oraz wiele enzymów. Białka włókienkowe, dla których wartości stosunków osiowych są większe niż 10, zawierają odcinki łańcuchów polipeptydowych zwiniętych śrubowo lub w heliks i połączone krzyżowo wiązaniami kowalencyjnymi lub wodorowymi. Przykładami białek włókienkowych są: kerą.tyna, miozyna, kolagen i włóknik.

Tabela 6-2. Główne funkcje biafek Funkcja

Białka (przykłady)

Katalityczna

Enzymy

Strukturalna Ochronna

Kolagen, elastynar keratyny Włóknik, immunogiobuliny, interferon

Regulatorowa

Kalmoduiina

Regulacja genowa Histony, białka represorowe Regulacja Insulina hormonalna Skurcz Transport

Aktyna, miozyna Albumina (bilirubina, kwasy tłuszczowe itp.), hemoglobina (tlen)Jipoproieiny (różne lipidy), transferyna (żelazo)

Klasyfikacja na podstawie czynności

Zgodnie z ich funkcjami biologicznymi, białka mogą być sklasyfikowane np. jako strukturalne, katalityczne lub transportowe (tab. 6-2). Białka katalityczne (enzymy), stanowiące większość tych związków, są ujmowane w klasy według typu reakcji, którą katalizują.

Klasyfikacja na podstawie właściwości fizycznych

Dla białek budzących zainteresowanie medyczne, wyspecjalizowane systemy klasyfikacji pozwalają rozróżnić ściśle spokrewnione białka. W powszechnym użyciu są np. 2 układy nazewnictwa lipoprotein osocza, a 3. jest rozważany. Pierwszy z nich wyodrębnia ot]-, ot2-, P- i Y-lipoproteiny na podstawie ich ruchliwości elektroforetycznej w środowisku o pH 8,6. Lipoproteiny są także klasyfikowane pod względem ich zachowania się podczas sedymentacji jako: chylomikrony, VLDL, LDL, HDL i VHDL. Ponadto 6 obszernych klas lipoprotein osocza może być rozpoznanych w zależności od występowania w nich apoprotein A, B, C, D, E lub F, które z kolei różnicuje się za pomocą kryteriów immunologicznych.

Klasyfikacja na podstawie struktury trój wy m ia ro wej

Białka mogą być zróżnicowane na podstawie występującej w nich struktury czwartorzędowej lub jej braku (patrz niżej). Ponadto podobieństwa w strukturze, wykryte głównie przez krystalografię promieniami X, dostarczają cennej podstawy do klasyfikacji białek. Na przykład białka łączące się z nukleotydami mają w strukturze trzeciorzędowej wspólną „domenę wiążącą nukleotyd" i mogą być ewolucyjnie spokrewnione. W miarę rozszyfrowywania dalszych struktur krystalicznych możliwe będzie rozpoznanie i ustalenie dodatkowych wspólnych domen.

PIERWSZORZĘDOWA STRUKTURA BIAŁEK WYWODZI SIĘ Z KOWALENCYJNEGO POŁĄCZENIA L-a-AMINOKWASÓW WIĄZANIAMI PEPTYDOWYMI Wprawdzie wiodącą rolę wiązań peptydowych w białkach wydedukowano dawno temu, na podstawie wielorakich faktów, to jednak najbardziej przekonywającym dowodem nie-

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 61

zbędności jedynie tych wiązań stalą się pełna synteza chemiczna insuliny i rybonukleazy, wyłącznie w wyniku połączenia aminokwasów za pomocą wiązań amidowych. Wiązanie łączące atomy węgla grupy karbonyiowej i azotu w wiązaniu peptydowym ma częściowo charakter wiązania podwójnego Chociaż peptydy zapisuje się z pojedynczym wiązaniem łączącym atomy a-karboksylu i a-azotu, wiązanie węgiel—azot w rzeczywistości ma częściowo charakter wiązania podwójnego (ryc. 6-!). Nie ma tu żadnego swobodnego O O

obrotu wokół wiązania łączącego atomy C i N, a wszystkie 4 atomy' przedstawione na ryc. 6-1, leżą w tej samej płaszczyźnie (tj. są koplanarne). Przeciwnie, rozległa swobodna rotacja zachodzi wokół pozostałych wiązań szkieletu polipeptydowego. Te koncepcje są przedstawione na ryc. 6-2, gdzie wiązania obdarzone swobodnym obrotem są okółkowane strzałkami, a współpłaszczyznowe (koplanarne) atomy znajdują się w obszarach zacienionych. Ta półsztywność ma ważne konsekwencje w uporządkowaniu struktury białek powyżej poziomu pierwszego rzędu. W uzupełnieniu do wiązań peptydowych, które tworzą „szkielet" łańcucha polipeptydowego, dodatkowe wiązania kowalencyjne i niekowalencyjne przyczyniają się do stabilności polipeptydów.

H

C H

H

Ryc. 6-1. Stabilizacja rezonansowa wiązania peptydowego nadaje mu częściowo charakter wiązania podwójnego i stąd sztywność połączenia C-N.

Ryc. 6-2. Wymiary calkowiciewyciągniętegotańcucha polipeptydowego. 4 atomy w zacienionych obszarach są wspó! płaszczyzn owe (kop la na me) i tworzą wiązanie peptydowe. Niezacienionymi są: atom węgla a, atom wodoru a i grupa a-R danego aminokwasu. Swobodna rotacja zachodzi wokół wiązań łączących węgiel a z azotem a i węglem cc-karbonylowym (białe strzałki). Rozciągnięty łańcuch poiipeptydowy stanowi więc strukturę półsztywną, w której 2/3 atomów jego szkieletu jest utrzymywanych w stałych wzajemnych powiązaniach płaszczyznowych. Odległość pomiędzy sąsiednimi atomami węgla (/wynosi 0,36 nm. Podano również odległości międzyatomowe i kąty pomiędzy wiązaniami, które nie są równoważne. (Przerysowano i reprodukowano za zgodą z: L Pauiing, L. P. Corey, H. R. Branson: Proc. Nałl. Acad. Sci. USA 1951:37:205).

Mostki disiarczkowe uformowane przez reszty cysterny tworzą kowalencyjne wiązania w obrębie oraz pomiędzy polipeptydatni niektórych białek Wiązanie disiarczkowe, utworzone między 2 resztami cysteiny, łączy 2 części łańcucha polipeptydowego za pomocą reszty cystyny. Wiązanie cystynowe jest oporne na warunki powodujące denaturację białka. Kwas nadmrówkowy (utleniający wiązanie S-S) lub fS-merkaptoetanol (redukujący mostki S-S z utworzeniem 2 reszt cysteiny) rozdziela łańcuchy polipeptydowe połączone wiązaniami disiarczkowymi bez wpływu na ich strukturę pierwszorzędową (ryc. 5-9). NIEKOWALENCYJNE WIĄZANIA RÓWNIEŻ STABILIZUJĄ CZĄSTECZKĘ BIAŁKA Trzy główne typy wiązań niekowalencyjnych szczególnie się przyczyniają do utrwalenia struktur białkowych. Wielokrotne wiązania wodorowe stabilizują ogólną strukturę białek Wiązania wodorowe. utworzone pomiędzy: resztami w łańcuchach bocznych peptydowo związanych aminokwusówj-iłtomami wodoru i tlenu w samych wiązaniach peptydowych oraz między resztami polarnymi na powierzchni białek i cząsteczkami wody, odgrywają ważną rolę w utrzymaniu struktury białek powyżej pierwszego rzędu (p. niżej: heliks a i struktura P).

62 / ROZDZIAŁ 6

Interakcje hydrofobowe przyczyniają się do stabilizacji wnętrza cząsteczek białkowych Niepolarne łańcuchy boczne aminokwasów obojętnych w białkach dążą do zasocjowania. Powiązanie nie jest stechiometryczne, wobec tego nie istnieje prawdziwe wiązanie. Tyra niemniej ich duża liczba powoduje, że te oddziaływania odgrywają znaczącą rolę w utrzymaniu struktury białek. Elektrostatyczne oddziaływania wiążą reszty powierzchniowe w białkach Wiązania typu soli, czyli elektrostatyczne, tworzą się albo między przeciwstawnie naładowanymi grupami w łańcuchach bocznych aminokwas ów, al bo pomi ędzy res zt am i Ni C-końcowymi a innymi ugrupowaniami o przeciwnym ładunku. Na przykład w pH fizjologicznym s-aminowa grupa lizyny dźwiga ładunek netto + 1, zaś nie-a-karboksyl asparaginianu i glutamianu — czysty ładunek — 1. Mogą więc one nawzajem oddziaływać elektrostatycznie, stabilizując cząsteczki białka.

Dane rentgenograficzne wykazały obecność powtarzających się jednostek o długości 0,5—0,55 nm wzdłuż długiej osi a-keratyn włosa i wełny. Niestety, żaden wymiar rozciągniętego łańcucha poiipeptydowego nie wynosił 0,5— 0,55 nm (ryc. 6-2). Tę oczywistą anomalię rozstrzygnęli Pauling i Corey, którzy zaproponowali ukształtowanie łańcucha polipeptydowego a-keratyny w formie a-heliksu (ryc. 6-3). W strukturze tej grupy R wystają na zewnątrz od centrum heliksu (ryc. 6-4). Na jedenjJsok śruby (zwój a-heliksu) przyj>adajL&reszt aminokwasowych, a odległość "przebyta przez jeden skręt (inaczej: odległość między Ryc. 6-3. Przedstawienie helikalnej konfiguracji

Związki denaturujące białka rozrywają w nich wiązania niekowafencyjne, powodując utratę aktywności biologicznej Denaturacja białka za pomocą takich odczynników, jak: mocznik, siarczan dodecylu sodu (SDS), umiarkowane stężenie jonów H4 lub OH~ rozrywa wiązania wodorowe, hydrofobowe i elektrostatyczne, z wyjątkiem wiązań kowalencyjnych: peptydowych lub disiarczkowych. HELIKS a JEST JEDNYM Z MOTYWÓW STRUKTURALNYCH UTRZYMUJĄCYCH UPORZĄDKOWANE KONFORMACJE W BIAŁKACH Odkrycie, że łańcuchy polipeptydowe charakteryzują się bardzo uporządkowanymi konformacjami, utrzymywanymi przez wiązania wodorowe, stało się głównym postępem pojęciowym. Wprawdzie istnienie tych bardzo uporządkowanych struktur zostało potwierdzone przez krystalografię rentgenowską, jednak było ono najpierw zaproponowane w wyniku rozważań teoretycznych.

Skok 0,54 nm (3.6 reszt)

głównego łańcucha polipeptydowego wokół osi a-heiiksu.

BiAŁKA: STRUKTURA i WŁAŚCIWOŚCI / 63

0,5 r Ryc. 6-4. Przekrój poprzeczny heltksu a. Łańcuchy boczne (R) wystają na zewnątrz heiiksu. Promienie van der Waalsa są większe niż wykazano na rycinie, stąd wewnątrz heiiksu prawie nie ma wolnej przestrzeni. (Nieznacznie zmodyfikowano i reprodukowano za zgodą z: Stryer L; Biochemistry, wyd.2, Freeman, 1981, Copyright© 1981 by W. H. Freeman and Co).

zwojami*) wynosi 0,54 nm. Odstęp przypadający na Jedną resztę aminokwasem A wzdłuż osi ctheliksu wynosi 0,15 nm. Właściwości a-helik-su są następujące: 1. Strukturę cc-heliksu stabilizują miedzyaminokwasowe wiązania wodorowe. Każde z nich jest utworzone przez atom H połączony z azotem jednego ugrupowania peptydowego (NH) i znajdujący się między silnie elektroujemnymi atomami (układami*), tj. wymienionym azotem peptydowym oraz tlenem grupy karbonylowej (ĆO) 4. z kolei reszty aminokwasowej w strukturze pierwszorzędowej. 2. Każde wiązanie peptydowe uczestniczy w wytworzeniu wiązania wodorowego, co za pewnia maksymalną stabilność. 3. Wszystkie atomy azotu peptydowego i tle nu karbonylowego reszt aminokwas owych w łańcuchu głównym są zaangażowane w wiąza nia wodorowe, co znacznie zmniejsza hulrofilowy (zwiększając hydrofobowy) charakter regionu a-helikalnego. 4. Heliks ot formuje się spontanicznie, ponie waż — przy najmniejszym zużyciu energii — stanowi najbardziej stabilną konformację łańcucha polipeptydowego. * Przyp. tłum.

Ryc. 6-5. Wiązania wodorowe (kropki} uformowane między atomami H i O stabilizują polipeptyd w konformacji a-heltkalnej. (Przedrukowano za zgodą z; Haggis G. H. i wsp. tntroduetion to Motecular Biology. Witey, 1964). Tabela 6-3. Wpływ różnycfi reszt aminokwasowych na formowanie heiiksu a

Heliks a stabilizują (utrwalają)

destabilizują

kończą (przerywają)

Ala

Arg

Pro

Asn Cys Gin His Leu Met Phe Trp Tyr Val

Asp Glu Gly Lys Ile Ser Thr

Hyp

64 / ROZDZIAŁ 6

5. Prawozwojowy heliks występujący w biał kach jest znacznie bardziej trwały niż lewoskrętny, gdy resztami są L-aminokwasy. 6. Resztami destabilizującymi heliks są: pro.liną_(w której atom N jest częścią sztywnego pierścienia, co uniemożliwia rotację wokół wią zania N C) oraz aminokwasy z naładowanymi elektrycznie lub masywnymi grupami R, które elektrostatycznie lub fizycznie przeszkadzają w uformowaniu heliksu (tab. 6-3).

RÓWNOLEGŁE I PRZE CiW RÓWNO LEGŁE POFAŁDOWANE ŁAŃCUCHY STANOWIĄ DRUGI TYP ROZPOZNAWALNIE UPORZĄDKOWANEJ STRUKTURY Pauling i Corey zaproponowali również drugie uporządkowanie struktury białka, tj^jtruktury p, czyli pofałdowanej kartki (inaczej: pofałdowanego łańcucha, pofałdowanego lub „splisowanego" arkusza*) (ang. f3-pleated sheet; p — ponieważ to była druga struktura po opisanym najpierw a-heliksie). W heliksie J. łańcuch polipeptydowy jest zwarty, natomiast w_. strukturze p (inaczej: fałdowej, „harmonijkowej" lub „dywanowej"*) pozostaje on niemal całkowicie rozciągnięty (ryc. 6-6). Struktura P noslnazwę przeciwrównoległej, gdy sąsiadujące łańcuchy polipeptydowe biegną w przeciwnych kierunkach (N-koniec jednego łańcucha do C-końca drugiego) (ryc. 6-6); luedy łańcuchy podążają w tym samym kierunku jest ona nazywana równoległą (nie wykazano). W wielu białkach występują współbieżne i przeciwbieżne regiony struktury p. Może ją formować 2—5 przylegających łańcuchów polipeptydowych. Na rycinie 6-7 przedstawiono region rybonukleazy, w której 3 odcinki łańcucha polipeptydowego tworzą strukturę p. Heliks a jest stabilizowany mostkami wodorowymi między wiązaniami peptydowymi, oddzielonymi od siebie 4 resztami w sensie struktury pierwszorzędowej, podczas gdy strukturę fS utrwalają wiązania wodorowe między segmentami peptydowymi oddalonymi od siebie w sensie struktury pierwszorzędowej (ryc. 6-7).

Przyp. tłum.

Ryc. 6-6. W przeciwrównoległej fałdowej strukturze p sąsiednie łańcuchy polipeptydowe biegną w przeciwnych kierunkach. Wiązania wodorowe między grupami NH i CO sąsiednich łańcuchów stabilizują tę strukturę. Łańcuchy boczne (R) aminokwasów znajdują się powyżej i poniżej płaszczyzny kartki. O atomy węgla; © atomy azotu; O atomy wodoru. (Zmodyfikowano i reprodukowano za zgodą z: Siryer L: Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981, Copyright © 1981 by W. H. Freeman and Co.).

ZAKRĘTY p UMOŻLIWIAJĄ POLIPEPTYDOM PRZYJMOWANIE KSZTAŁTÓW GLOBULARNYCH Polipeptydy z reguły formują zbite masy globularne, muszą więc istnieć możliwości zmiany kierunku łańcucha polipeptydowego. Jednym z nich jest utworzenie ciasnej pętli zakrętu P (inaczej: skrętu p, zwrotu p1 lub zwrotu typu spinki do włosów*), w której tlen grupy karbonylowej jednej reszty łączy sie wiązaniem wodorowym z wodorem amidowym aminokwasu oddalonego o 3 reszty do przodu. Często w zakrętach p występują prolina i glicyna. Część struktury przestrzennej (geometrii) zakrętu p jest ukształtowana w prolinie, która bardziej niż inne aminokwasy podlega konfor* Przyp. tłum.

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 65

ASPEKTY STRUKTURY BIAŁEK ROZWAŻA SIĘ POD KĄTEM 4 POZIOMÓW UPORZĄDKOWANIA Struktura pierwszorzędowa Strukturę pierwszego rzędu stanowi, jak w przypadku peptydów, kolejność aminokwasów w łańcuchu lub łańcuchach polipeptydowych oraz umiejscowienie wiązań disiarczkowych, jeżeli one w tych łańcuchach występują.

Ryc. 6-7. Cząsteczka rybonukleazy trzustki wołu jest zbudowana z pojedynczego łańcucha 124 reszt połączonego poprzecznie w 4 miejscach za pomocą wiązań disiarczkowych. Region a-heliksu ujęto w kropkowany owal, a region struktury fałdowej zacienione Pozostałe części cząsteczki występują giównie w postaci przypadkowego zwoju. Centrum aktywne enzymu znajduje się w miejscu związania jonu fosforanowego (PO^~). (Zaadoptowano z: Kartha G., Bello J.r Harker D.: Tertiary structure of nbonuclease. Naturę 1967; 213:862) Białko zostato w całości z syntetyzowane chemicznie.

macyjnym ograniczeniom. Dla kontrastu mała grupa R. pozwala glicynie działać jako giętki „zawias" między regionami polipeptydu, którego ugrupowania R sprzyjałyby inaczej bardziej rozciągniętej konformacji. REGIONY BIAŁEK, KTÓRE NIE SĄ UFORMOWANE W HELIKSY, STRUKTURY p LUB ZAKRĘTY % WYSTĘPUJĄ WTZW. KONFORMACJI „PRZYPADKOWEGO" (NIEPLANOWANEGO) ZWOJU Znaczne części cząsteczki białkowej mogą występować w konformacji przypadkowego (nieplanowanego) zwoju (ang. random-coil; kłębek statystyczny) (ryc. 6-7), Termin „przypadkowy" jest niefortunny, ponieważ może bardziej implikować mniejsze biologiczne znaczenie niż regionów o dużej powtarzalności. Dla funkcji biologicznej regiony przypadkowego zwoju są równie ważne, jak heliks a lub konformacja p. 5 — Biochemia

Struktura drugorzędowa Struktury drugiego rzędu, czyli przestrzenne współzależności między aminokwasami zwartymi w pierwszorzędowym strukturalnym zakresie, mogą być regularne (np. heliks a, struktura f>) lub przejawiać niewiele tej regularności (np. przypadkowy zwój). Struktura trzeciorzędowa Ogólne rozmieszczenie i wzajemne powiązanie rożnych regionów lub domen oraz poszczególnych reszt amin o kwas owych w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym stanowi trzeciorzędową strukturę białka. Wprawdzie rozgraniczenie pomiędzy strukturą drugo- i trzeciorzędową nie jest wyraźne, struktura trzeciorzędowa wyraża wzajemne przestrzenne usytuowanie reszt aminokwasowych, które — generalnie — są daleko od siebie w- sensie budowy pierwszego rzędu. Struktura czwartorzędowa Białka wykazują strukturę czwartego rzędu, jeżeli składają się z 2 lub więcej łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniami innymi

niż kowalencyjne (tj. niepeptydowymi lub disiarczkowymi*). Siłami stabilizującymi te agregaty są wiązania wodorowe i elektrostatyczne (typu soli) utworzone miedzy resztami aminokwasowymi na powierzchniach łańcuchów polipeptydowych. Takie białka noszą nazwę oltgomerów, a pojedyncze łańcuchy polipeptydowe je

* Cząsteczka białka nie dająca się, przynajmniej potencjalnie, rozdzielić na podjednostki (związane wiązaniami mekowalencyjnymi) nie ma struktury czwartorzędowej. Przykładami białek bez struktury czwartorzędowej są: rybonukleaza (1 łańcuch) i chymotrypsyna (3 łańcuchy). Przyp. tłum. zaczerpnięty z: Morawiecki A. (red.): Nowe polskie słownictwo biochemiczne. PWN, 1983, s. 113.

66 / ROZDZIAŁ 6 tworzące określa się jako protomery, monomery lub podjednostki.

Wiele białek oligomerycznych zawiera 2 lub 4 protomery, nosząc odpowiednio nazwy dimerów lub tetramerów. Oligomery zbudowane z więcej niż 4 protomerów są również rozpowszechnione, zwłaszcza wśród enzymów regulatorowych (przykładem — karbamoilotransferaza asparaginianowa). Białka oligomeryczne odgrywają szczególną role w regulacji wewnątrzkomórkowej, ponieważ protomery mogą przyjmować względem siebie różne ułożenia przestrzenne, co powoduje zmiany we właściwościach oligomeru. Niektóre białka tworzą kompleksy wielkocząsteczkowe Asocjację różnorodnych białek czynnościowych, z których każde ma 4 poziomy struktury, w wielofunkcjonalne makromolekularne kompleksy spotyka się w transporcie elektronów, biosyntezie kwasów tłuszczowych i metabolizmie pirogronianu. DRUGORZĘDOWĄ I TRZECIORZĘDOWĄ STRUKTURĘ BIAŁEK WYZNACZA SEKWENCJA AMINOKWASÓW W ŁAŃCUCHU POLIPEPTYDOWYM Skoro tylko utworzy się łańcuch polipeptydowy, grupy R aminokwasów kierują swoistym zwijaniem się poszczególnych jego regionów (struktura drugo rzędowa), jak również zasocjowaniem tych regionów (struktura trzeciorzędowa). Dowodzi tego klasyczne doświadczenie. Zadziałanie na rybonukleazę łagodnym związkiem redukującym (P-merkaptoetanolem) i czynnikiem denaturującym (mocznikiem lub guanidyną; p. niżej) inaktywuje ją tak, że przyjmuje konformację przypadkowego zwoju. Powolne usunięcie czynnika denaturującego i łagodne ponowne utlenienie, w celu rekonstrukcji wiązań S—S, prowadzi do niemal kompletnego odtworzenia aktywności enzymatycznej. Nie jest więc niezbędne postulowanie niezależnej genetycznej kontroli uporządkowania struktury białka powyżej poziomu pierwszego, ponieważ budowa pierwszorzędowa wyznacza drugorzędową, trzeciorzędową oraz (kiedy jest obecna) czwartorzędową strukturę (tj. konformację) cząs-

teczki białkowej. Rodzimą konformacją białka, takiego jak rybonukleaza, wydaje się być ta,

która jest term o dynamicznie najbardziej stabilna w danym otoczeniu, np. w hydrofilowym w przeciwieństwie do hydrofobowego. Struktura białka może być modyfikowana podczas po trans! acyjnego dojrzewania, takiego jak konwersja prcproenzyirm w postać katalitycznie aktywną lub usunięcie peptydowego „lidera" (peptydu sygnałowego), który przeprowadza poprzez błonę białka przeznaczone „na eksport'7. Stosunkowo słabe oddziaływania odpowiedzialne za utrzymanie drugo-, trzecio- i czwartorzędowej struktury białek ulegają łatwo rozerwaniu, powodując utratę ich aktywności biologicznej Naruszenie rodzimej struktury nosi nazwę denaturacji. Fizycznie denaturacja może być rozpatrywana jako zaburzenia konformacji łańcucha polipeptydowego, nie wpływające aa jego strukturę pierwszorzędowa. Dla protomeru proces ten może być przedstawiony tak, jak na ryc. 6-8. Dla białka oligomerycznego denaturacja może obejmować rozdysocjowanie protomerów, czemu towarzyszą zmiany wich konformacji.

Enzym aktywny

Dsnaturacja Enzym nieaktywny (z denaturowany)

Ryc. 6-8. Zobrazowanie denaturacji protomeru.

Biologiczną aktywność niszczą mocne kwasy lub zasady, wysoka temperatura, detergenty jonowe (amfipatyczne), związki chaotropowe (mocznik, guanidyną), ciężkie metale (Ag, Pb, Hg) lub rozpuszczalniki organiczne. Zdenaturowane białka są na ogół gorzej rozpuszczalne i ulegają wytrąceniu. Znajduje to zastosowanie w laboratorium klinicznym. Do krwi lub surowicy, w której oznacza się zawartość małych cząsteczek (np. glukozy, kwasu moczowego, leków), generalnie najpierw dodaje się kwasu trichlorooctowego, fo sforo wolframowego lub fosforomolindenowcgo w celu strącenia białek.

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 67

Po usunięciu ich, przez wirowanie, analizuje się wolny od białek supernatant. Wrażliwość większości enzymów na ogrzewanie, kwasy oraz proteazy, stanowi podstawę wstępnego badania, stwierdzającego czy daną

reakcję katalizuje enzym. Ekstrakt komórek, obdarzony aktywnością enzymatyczną, który traci tę właściwość w wyniku zagotowania, zakwaszenia i ponownego zobojętnienia lub zadziałania proteazą, zapewne zawiera jakiś enzym w charakterze katalizatora. Często na denaturację jakiegoś enzymu wpływa obecność jego substratu. Pojawienie się zmiany konformacyjnej podczas związania substratu dowodzi, że nowa konformacja może być trwalsza lub mniej trwała niż poprzednia.

PIERWSZORZĘDOWE STRUKTURY BIAŁEK SĄ OZNACZANE METODAMI STOSOWANYMI DO SEKWENCJONOWANIA PEPTYDOW Z białek złożonych usuwa się najpierw grupy prostetyczne (np. hem), a wiązanie disiarczkowe utlenia się w celu uzyskania liniowych polipeptydów (p. ryc. 5-9). Techniki stosowane do Tabela 6-4. Modyfikacja grup a-COOH i a-NH 2 w białkach* Grupy modyfikowane a-COOH Amidowa

Asp Glu Gly His Met Phe Pro

N-formylowa

N-ace tyłowa

N -metylowa

Ala Asp

Ala Asp

Gly

Gly

Gly

Met

Met

Met

Ser Thr

Ser Thr

Tyr

Val

Val

* Według R. Uy, F. Wold: Posttranslational covalent modification of proteins, Science 1977; 198:890. Copyright © 1977 American Association for the Advancement of Science, w modyfikacji autora rozdziału za zezwoleniem autorów cyto wanej pracy.

Tabela6-5. Zmodyfikowane nie-a-funkcyjne gru py w białkach* G ru py m od yfikowa ne —OH PO3H2 Ser Thr Tyr

Mto-et-N N- metylowa N dimetylowa N-trimetylowa Arg His Lys

Arg

Lys

Lys

* Według R. Uy, F. Wold: Posttranslational covalent modification of proteins.Science 1977; 198:890. Copyright © 1977 by the American Association for the Advancement of Science, w modyfikacji autora rozdziału za zezwoleniem autorów tej pracy.

sekwencjonowania tych polipeptydów przedstawiono w rozdz. 5. Wprawdzie większość białek 2awiera tylko aminokwasy wymienione w tab, 4-3, pochodne tych reszt również występują w niektórych białkach (tab. 6-4 i 6-5). Jakkolwiek omówienie metod używanych do zidentyfikowania owych pochodnych aminokwasowych nie wchodzi w zakres tego rozdziału, jednak ich obecność może komplikować określenie struktury pierwszorzedowej.

Drugorzędowa i trzeciorzędowa struktura białek jest analizowana za pomocą krystalografii rentgenowskiej

Techniki poprzednio stosowane, pozwalające wnioskować o występowaniu w białkach struktur helikalnych (np. optyczna dyspersja rotacyjna, wymiana protonów trytu) zostały wyparte przez rentgenowską analizę krystalograficzną. Promienie X są kierowane na kryształ białka oraz na jedną z jego pochodnych, zawierającą dodatkowo jon ciężkiego metalu. Promienie ulegają rozproszeniu w sposób zależny od gęstości elektronów w różnych częściach cząsteczki białkowej. Obrazy zbioru plamek dyfrakcyjnych, uzyskane na błonie fotograficznej (po jej wywołaniu), są tłumaczone na tzw. mapy rozkładu gęstości elektronowej, które po ułożeniu jednej na drugiej pozwalają krystalografowi skonstruować wiarogodny model danego białka. Krystalografia rentgen o graficzna, chociaż czasochłonna, kosztowna i wymagająca specjalistycznego przeszkolenia, ujawniła szcze-

68 / ROZDZIAŁ 6

gólowe i precyzyjne obrazy z usytuowaniem wszystkich aminokwasów w wielu białkach. Nie można nie docenić jej ogromnego wkładu do naszego dzisiejszego pojmowania struktury białek. Wyłoniona technika zobrazowania magnetycznego rezonansu (ang. magnetic resonance imaging; skrót — MRI) została ostatnio wykorzystana do zanalizowania trójwymiarowej struktury małego białka. Technika MRI wydaje się mieć szansę zastosowania do większych białek. Metody fizyczne stosowane do zbadania czwartorzędowej struktury białek Badanie czwartorzędowej struktury białka oligomerycznego obejmuje określenie liczby i rodzaju obecnych w nich protomerów, ich położenia względem siebie oraz łączących je oddziaływań. Zakładając, że oJigomery nie ulegają denaturacji podczas procedury stosowanej do oznaczenia masy cząsteczkowej, wiele metod może dostarczyć o niej danych. Te same techniki mogą być wykorzystane do określenia masy cząsteczkowej protomeru po wcześniejszym zdenaturowaniu oligomeru. Ultrawirowanie, filtracja żelowa i elektroforeza w żelu pozwalają oznaczyć masę cząsteczkową białek oi izomerycznych Rozwinięta przez Svedberga technika ultrawirowania mierzy szybkość sedymentacji* w polu siły odśrodkowej ok. 105 x g. W ostatnich latach istnieje tendencja, aby zastąpić ją mniej złożonymi metodami. W pokrewnej technice, tj. ultrawirowaniu w gradiencie gęstości sacharozy, nawarstwia się

* Matematycznym wyrazem tej szybkości jest tzw. stała sedymentacji S20, tj. szybkość opadania warstwy roztworu białka pod działaniem jednostki siły odśrodkowej, wyrażona w jednostkach układu cgs, sprowadzona do gęstości i lepkości wody w temp. 20°C. Dla większości białek wartości liczbowe stałej sedymentacji wahają się w granicach l,510~ 13 — 2010~"; dla cząsteczki białka o kształcie kulistym jednostka stałej sedymentacji (1I0""13) odpowiada masie cząsteczkowej ok. 16 000. (Przyp. tłum. zaczerpnięty z: Skarżytiski B.: Chemia fizjologiczna, t. I, PWRiL, 3956, s. 85).

białka wzorcowe i badane na gradient stężeń roztworów sacharozy (5—20%), przygotowany w probówce plastikowej. Po ultrawirowaniu przy 10 5 x g przez kilkanaście godzin (np. w ciągu nocy) przekłuwa się mały otworek w dnie probówki, zbiera jej zawartość w postaci kropel w serii kolejnych małych probówek i oblicza ruchliwości na podstawie względnego położenia białek w gradiencie. Masę cząsteczkową białka globu larnego można określić z jego ruchliwości w sicie molekularnym Kolumny z żelu Sephadex lub podobne matryce, mające „pory" o wiadomym rozmiarze kalibruje się, stosując białka o znanej masie cząsteczkowej. Poszukiwaną masę cząsteczkową nieznanego białka oblicza się z porównania jego objętości elucyjnej z objętościami elucyjnymi białek wzorcowych. Można popełnić duże błędy, jeżeli cząsteczka białka jest bardzo asymetryczna albo oddziałuje silnie ze związkami, z których zostały wyprodukowane molekularne sita. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) to jeszcze jedna metoda oznaczania masy cząsteczkowej Białka wzorcowe rozdziela się elektroforetycznie w 5—15% żelach poliakrylamidowych o zmiennej porowatości, wybarwia się je na obecność białek, generalnie błękitem Coomassie lub tzw. srebrem, i masę cząsteczkową oznacza względem ruchliwości elektroibretycznej wzorców. Najbardziej powszechne zastosowanie tej techniki, PAGE-SDS, pozwala oznaczyć masę cząsteczkową protomeru w wyniku wcześniejszego zdenaturowania oligomeru (np. przez zagotowanie w roztworze detergentu w obecności p-merkaptoetanolu) i rozdzielenie w żelach zawierających detergent jonowy — siarczan dodecylu sodu (SDS). KOMPLEKSY BIAŁKOWE MOGĄ BYĆ UWIDOCZNIONE PRZEZ ELEKTRONOWĄ MIKROFOTOGRAFIĘ Uzyskane w mikroskopie elektronowym powiększenia rozmiarów średnicy nawef 100000 razy pozwalają uwidocznić białka o bardzo dużej masie cząsteczkowej, takie jak cząstki

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 69 Tabela 6-6. Czwartorzędowe struktury wybranych Enzym (oligomer)

enzymów* Liczba protomerów

Masa cząsteczkowa protomeru

Aminotransferaza asparaginianowa serca kury Syn ta za kwasów tłuszczowych wątroby goiębia Fruktozobisfosfataza wątroby królika

22 2" 2**

50 000 230 000 29 000 37 000

Aminotransferaza ornitynowa wątroby szczura Karboksylaza propionylo-CoA serca świni LDH serca, wątroby lub mięśni wołu

44 4**

33 000 175 000 35 000

ATPaza mitocriondrrów serca wołu

10

Syntetaza glutaminowa Escherichia coli Karboksylaza acetylo-CoA wątroby kury

12 2** 10**

26 0O0 48 500 4 100 000 409 000

* Zaadaptowano z: Klotz I. M., Langerman N. R., Darnall D. W.: Cłuaternary structure of enzymes, Annu Rev Biochem 1970; 39:25. ** Niezidentyfikowane podjednostek.

wirusów, kompleksy enzymatyczne i białka oligomeryczne. W tabeli 6-6 podano przykłady liczby oraz mas cząsteczkowych protomerów stanowiących czwartorzędowe struktury wybranych enzymów.

PIŚMIENNICTWO Advances in Protein Chemistry. Academic Press, 1944 to datę, [Annual publicalion.] Celis JE. Bravo R: Two-dimensional Gel Electrophoresis of Proteins. Methoiłs and Applications. Academic Press, 1984. Chothia C. Principles that determine the structure of proteins. Annu Rev Biochem 1984; 53:537. Dunn MJ: Gel Electrophoresis of Proteins. Wright, 1986.

Franks F: Characterization of Proteins. Wright, 1986 One AD, Braun W, Wuthrich K. Studies by l H NMR and distanoe geometry of the solution conformation of the a-amylase inhibitor tendamistat. / Mol Biol 1986; 189:377. Lennarz WJ (editor): The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycarrs. Plenum Press, 1980. L'Italien JJ: Proteins: Structure and Function. Plenum Press, 1987. Rosę CD, Geselowitz AR, Lesser GJ, Lee RM, Zehfus MH. Hydrophobiciiy of amino acid residues in globular proteins. Science 1985; 229:834, Schlessinger DH: Macromolecular Seąuencing and Analysis: Selected Methods and Applications. AR Liss, 1988. Schott H: Affinity Chrotnatography. Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. Marcel Dekker, 1984. Wittmann-Liebold B, Solnikow J, Erdmann VA: Advancetl Methods in Protein Microseąuence Analysis. Springer Verlag, 1986.

7

Białka: mioglobina i hemoglobina Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE W rozdziale tym omówiono zależność struktury i funkcji na przykładzie mioglobiny i hemoglobiny, białek nie tylko bardzo istotnych fizjologicznie, lecz także obrazujących, w jaki sposób struktura białek decyduje o ich funkcji biologicznej.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Białka hemowe biorą udział w transporcie i magazynowaniu tlenu, transporcie elektronów oraz fotosyntezie. Badania mioglobiny i hemoglobiny ujawniły istnienie cech struktury wspólnych dla wielu białek, jak również istnienie zależności między strukturą a funkcją. Ponadto umożliwiły one poznanie molekularnych podstaw chorób genetycznych, takich jak niedokrwistośc sierpowata (wynik zmienionych właściwości powierzchniowych podjednostki p hemoglobiny) i taJasemie (przewlekłe dziedziczne choroby hemolityczne, charakteryzujące się upośledzeniem syntezy hemoglobiny). Badania wykazały, że cyjanek i tlenek węgla stanowią śmiertelne zagrożenie, ponieważ uniemożliwiają fizjologiczną funkcję odpowiednio oksydazjŁ cytocJLrpmowei-J^hemoglobiny, a stabilizacja struktury czwartorzędowefnieutJenowanej hemoglobiny przez 2,3-bisfosfoglicerynian (BPG) stanowi podstawę mechanizmów choroby górskiej i adaptacji do dużych wysokości.

ZDOLNOŚĆ MIOGLOBINY I HEMOGLOBINY DO MAGAZYNOWANIA I TRANSPORTU TLENU WIĄŻE SIĘ Z OBECNOŚCIĄ PROSTETYCZNEJ GRUPY HEMOWEJ I JONU ŻELAZAWEGO Grupą proste ty czną mioglobiny i hemoglobiny jest hem, cykliczny tetrapirol nadający tym białkom zabarwienie czerwone. W tetrapirolu 4 pierścienie pirolowe są połączone mostkami tt-metinowytni, tworząc płaski układ cykliczny (ryc. 7-1). Podstawniki w pozycjach P pierścieni

n

Ryc. 7-1. Pirol. Węgle a fączą się za pomocą mostków metinowych tworrac cykliczny tetrapirol. Przy węglach p występują podstawniki charakterystyczne dta swoistych tetrapiroli, np. hemu.

pirolowych określają rodzaj pochodnej tetrapirolu. W hemie w pozycjach p znajdują się grupy metylowe (M), winylowe (V) i pfbpionianpwe (P) ułożone w następującej kolejności: M, V, M, V, M, P, P, M (ryc. 7-2). W centrum tego układu znajduje się atom żelaza w formie jonu żelazawego (Fe2+), Innymi białkami, w których grupą prostetyczną jest tetrapirol zasocjowany z jonem metalu są cytochromy (Fe2+ i Fei+), katalaza, 2,3-dioksygenaza tryptofanowa oraz chlorofil (Mg 2+). Funkcja biologiczna cyto-

BIAŁKA: MJOGLOBtNA f HEMOGLOBINA / 71

Ryc. 7-2. Hem. Pierścienie pirolowe, węgle mostków metinowych i atom żelaza Fe'4 + leżą praktycznie w jednej płaszczyźnie. Piąte i szóste wiązanie

nu, wewnątrz cząsteczki mioglobiny znajdują się wyłącznie aminokwasy niepolarne (np. Leu, Val, Phe i Met). Mioglobina, pierwsze białko, którego strukturę rozszyfrowano rentgenograficznie, jest bogata w ot-heliks Mioglobina jest silnie upakowaną, w przybliżeniu kulistą cząsteczką o wymiarach 4,5x3,5 x2,5 nm(ryc. 7-3). Niemniej jednak jej

koordynacyjne Fe2+ są usytuowane prostopadle, znajdując się nad i pod płaszczyzną hemu. Na uwagę zasługuje rodzaj podstawników przy węglach P pierścieni piroiowych, centralnie położony atom zela2a oraz polarne łańcuchy boczne, które są zwrócone na zewnątrz cząsteczki mioglobiny.

chromów wynika z utlenienia i redukcji atomu żelaza. W przeciwieństwie, w przypadku mioglobiny i hemoglobiny utlenienie Fe 2+ wiąże się z utrat -A przez te białka ich aktywności biologicznej.

Utlenowana mioglobina mięśni stanowi rezerwę tlenu Fnnk^pt iTiinplrthiTiy jftst ma^Tynnwfinie t1f»-

nu w mięśniach. W warunkach niedoboru tlenu (np. w przypadku intensywnych ćwiczeń fizycznych) tlen utlenowanej miogiobiny jest wykorzystywany w mitochondriach mięśni do syntezy ATP na drodze fosfcrylacji oksydacyjnej. Poza dwoma wyjątkami reszty polarne znajdują się na zewnątrz, a niepolarne wewnątrz cząsteczki mioglobiny Mioglobina jest to pojedynczy łańcuch polipęptydowy o masie cząsteczkowej 17 000 zbudowany zejj_5J)reszt aminokwasowych rozmieszczonych w "cKaraktery styczny dla białek globularnych sposób. Zewnętrzna cześć cząsteczki białka jest polarna, a wnętrze — niepolarne. Reszty aminokwasowe, zawierające zarówno grupę polarną, jak i niepolarną (np. Thr, Trp i Tyr), są skierowane swoją niepolarną częścią do wnętrza częsteczki. Poza 2 resztami histydynowymi, biorącymi udział w wiązaniu tle-

Ryc. 7-3. Model mioglobiny opracowany na podstawie analizy rentgenograficznej. W modelu zaznaczono wyłącznie węgle s, (Reprodukcja za zgodą z: Dickerson R. E.r w: The Proteins, wyd. 2, t. 2, Neurath H, [red], Academic Press, 1964).

struktura jest nieregularna i wykazuje brak symetrii. Okojo 75% ^"^nyfia wy^t^ry^\yfgarnie R prąwnslfi-^tiiyrh a-heiiksów o długości 7—20 aminokwasów. Licząc od N-końca odcinki helikalne oznacza się kolejnymi literami od A do H, natomiast fragmenty między helikalne literami 2 odcinków helikalnych, które one łączą. Poszczególne aminokwasy określa się za pomocą litery oznaczającej hełiks, w którym dana reszta występuje, oraz liczby wskazującej jej pozycję od końca N w tym heliksie. Na przykład „His F8" odpowiada 8, reszcie w heliksie F zidentyfikowanej jako histydyna. Odległe w rozumieniu struktury pierwszorzędowej reszty aminokwasowe (np. w różnych heliksach) ze względu na ułożenie przestrzenne łańcucha polipeptydowego mogą znajdować się blisko

72 / ROZDZIAŁ 7

siebie, jak na przykład histydyna F8 (proksymalna) i histydyna E7 (dystalna) {ryc. 7-3). Drugorzędowa i trzeciorzędowa struktura mioglobiny w roztworze ściśle odpowiada strukturze mioglobiny krystalicznej. Wykazują one identyczne widma absorpcji, obie wiążą tlen. a zawartość cc-heliksów w strukturze mioglobiny w roztworze (oznaczona za pomocą dyspersji skręcalności optycznej i dichroizmu kołowego) jest porównywalna z zawartością ujawniony przez analizę rentgenograficzną.

His praksymalna (F8)

Pierwszorzędowa struktura a po mioglobiny zapewnia prawidłowe upakowanie białka w obecności hetnu Przekształceniu mioglobiny w pozbawioną hemu apomioglobine, wskutek obniżenia pH do 3,5, towarzyszy zmniejszenie zawartości struktury a-helikalnej, a w obecności mocznika całkowity jej zanik. Usunięcie mocznika poprzez dializę i dodanie hemu przywraca całkowicie strukturę helikalną, a w obecności Fe2+ aktywność biologiczną (wiązanie tlenu). Wskazuje to, że informacja zawarta w strukturze pierwszorzędowej apomioglobiny jest odpowiedzialna za swoiste upakowanie białka w obecności hemu. Stwierdzenie, że struktura pierwszorzędowa białka determinuje jego strukturę drugo- i trzeciorzędową okazało się być uniwersalne. Histydyny F8 i E7 odgrywają unikatową rolę w wiązaniu tlenu przez mioglobinę W mioglobinie grupa hemowa znajduje się w zagłębieniu między heliksem E i F (ryc. 7-3). Polarne, propionianowe łańcuchy boczne hemu są skierowane na zewnątrz cząsteczki mioglobiny, a jego pozostała część znajduje się we wnętrzu białka, gdzie, z wyjątkiem His_F_8 j.His Ę7, otaczają go reszty niępolarne. Atom żelaza piąj^mwiąza niemkoordvnacvjnvm wiąż esie z pierścieniem imidazoTowym His F8 określanej mianem histydyny proksymalnej (ryc. 7-4). Po drugiej stronie płaszczyzny hemu w stosunku do His F8 znajduje się His E7, określaną mianem histydyny dystalnej, która jednak nie zajmuje szóstej pozycji koordynacyjnej żelaza (ryc. 7-4). Atom żelaza umiejscowiony nieco poza płaszczyzną hemu przesuwa się w jej kierunku po związaniu tlenu W mioglobinie pozbawionej tlenu atom żelaza jest wysunięty o ok. 0,03 nm (0,3 A) poza płaszczyznę hemu w kierunku His F8. W przy-

His dystalna (B7)

Ryc. 7-4. Wiązanie tlenu z żelazem hemowym podczas reakcji utlenowania. W reakcji tej istotną rolę odgrywają pierścienie imidazolowe 2 reszt histydynowych globiny, łączące się z żelazem he mowym. (Reprodukcja za zgodą z: Harper H. A. i wsp., Physiologische Chemie, Springer-Verlarg, 1975). _______________________________________

padku utlenowanej mioglobiny, w którejjjm, zajmuje szósta, pozycje koordynacyjną, żelazo jeśT~ wy sunięte poza płaszczyznę hemu tylko ook. 0,01 nm(0,l A). Utlenowaniu mioglobiny towarzyszy więc ruch atomu żelaza, a w konsekwencji His F8 i reszt kowalencyjnie połączonych z His F8, w stronę płaszczyzny grupy prostetycznej. Skutkiem tego zjawiska jest zmiana konformacji części białka. Apomioglobina zmniejsza powinowactwo żelaza hemowego do tlenku węgla W utlenowanej mioglobinie wiązanie między atomem tlenu i Fei+ jest prostopadłe~db płaszczyzny nemu. Drugi atom tlenUj w stosunku do płaszczyzny hemu, jest przyłączony natomiast pod kątem 121 stopni z dala od histydyny dystalnej (ryc. 7-5). Około 25 000 razy silniej niż tlen do wyizolowanego hemu wiąże się tlenek węgla (CO). Chociaż CO znajduje się w atmosferze w ii oś-

BIAŁKA: MLOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 73

O

I

O III c

I

Ryc. 7-5. Preferowane kąty wiązania tlenu i tlenku węgla do atomu żelaza w hemie.

ciach śladowych, a podczas prawidłowego katabótizmu hemu powstają jedynie niewielkie jego ilości, nasuwa się pytanie, jak to się dzieje, że O2, a nie CO zajmuje szóste miejsce koordynacyjne w żelazie hemu mioglobiny. Przyczyną jest przestrzenna zawada, jaką stanowi otoczenie "Fiemu w mioglobinie. Preferowane ułożenie CO przyłączonego do żelaza hemowego jest dla wszystkich 3 atomów (Fe, C. O) prostopadłe w stosunku do płaszczyzny hemu (ryc. 7-5). Podczas gdy taka orientacja jest możliwa w^przypadku wyizolowanego hemu, w mio-

KRZYWE DYSOCJACJI TLENOWEJ MIOGLOBINY I HEMOGLOBINY OBRAZUJĄ ICH ODMIENNE FUNKCJE FIZJOLOGICZNE Mioglobina jest białkiem magazynującym, a nie"transportującym"tlen.llość_przyłączonego do mioglobiny tlenu (wyrażona w „procentach nasycenia") zakżv od jego stężenia (wyrażonego jako pO2, czyli stężenie cząstkowe tlenu) w nąjbliższyjn_gtoczeniu żelaza hemowe^o. Zależność międzypbi i ilością związanego tlenu obrazują graficznie krzywe dysocjacji tlenowej. Dla mioglobiny krzywa dysocjacji tlenowej w. warunkach izotermicznych ma kształt hiperboli

(ryc. 7-7). W naczyniach włosowatych płuc,

Ryc. 7-7. Krzywa dysocjacji tlenowej mioglobi

globinie histydy na dystalna stanowi przestrzenną

zawadę dla wiązania CO pod tym kątem (ryc. 7-6). Powoduje to, że CO wiąże się w mniej korzystriejTcbnfiguracji, co zmniejsza siłę wiązania hem-CO o ponad 2 rzędy wielkości, do wartości ok. 200 razy przewyższającej wiązanie hem-O2. Pomimo tego w warunkach fizjologicznych niewieika część mioglobiny (ok. 1%) występuje w formie karboksymioglobiny.

Ryc. 7-6. Kąty wiązania tlenu i tlenku węgla do atomu żelaza hemu w mioglobinie, Histydyna dystalna E7 stanowi przestrzenną zawadę dla wiązania CO pod preferowanym w stosunku do płaszczyzny hemu kalem (180°),

ny. Na uwagę zasługuje zależność stopnia utlenowanra i ciśnienia cząstkowego tlenu w płucach (100 mm Hg), tkankach (20 mm Hg) i pracujących mięśniach (5 mm Hg). ______________

w których pOj wynosi 100 mm Hg, mioglobina mogłaby skutecznie wiązać tlen. Ponieważ jednak wartość pO2 w żyłach i mięśniach wynosi odpowiednio 40 i 20 mrn_Hgj a mioglobina nie oddaje znacznej części związanego tlenu nawet przy ciśnieniu 20 mm Hg nie może ona służyć jako przenośnik tlenu z płuc do tkanek. Dopiero w warunkach niedoboru tlenu, towarzyszącego dużej aktywności fizycznej, kiedy pO, w mięśniach spada do 5 mm Hg, mioglobina uwalnia związany tlen, który w mitochondriach mięśni jest wykorzystywany do biosyntezy ATP w wyniku fosforylacji oksydacyjnej.

74 / ROZDZIAŁ 7

HEMOGLOBINA TRANSPORTUJE TLEN, DWUTLENEK WĘGLA I PROTONY MIĘDZY PŁUCAMI I TKANKAMI Hemoglobina, zawarta w erytrocytach kręgowców, spełnia dwie główne funkcje biologiczne; 1) przenosi O2 z płuc do tkanek i 2) przenosi CO2 i protony z tkanek do phic w celu wydalenia. Mimo że biochemia porównawcza hemoglobin kręgowców jest bardzo interesująca, przedmiotem dalszych rozważań są hemoglobiny ludzkie. KONSEKWENCJĄ CZWARTORZĘDOWEJ STRUKTURY HEMOGLOBINY SĄ JEJ WŁAŚCIWOŚCI ALLOSTERYCZNE Właściwości poszczególnych hemoglobin są prawidłowością wynikającą z ich struktury czwartorzędowej (jak również drugo- i trzeciorzędowej). Czwartorzędowa struktura hemoglobiny jest odpowiedzialna za nowe, dodatkowe w stosunku do mioglobiny, właściwości, które warunkują jej unikatową funkcję biologiczną i pozwalają na jej precyzyjną regulację. Właściwości allosteryczne (gr. allos — inna, steros — przestrzeń) hemoglobiny stanowią ponadto model do zrozumienia innych białek allosterycznych. W przeciwieństwie do mioglobiny, hemogtobina jest tetramerem Hemoglobina w odróżnieniu od jednołańcuchowej mioglobiny nie mającej struktury czwartorzędowej, jest tetramerem składającym się z 2 par identycznych łańcuchów polipeptydowych, czyli podjednostek (określanych jako a, p, 7,8, S itd.). Podobne pod względem długości polipeptydy a (14l) reszt aminokwas owych) i P (146 jeszt aminokwasowych) hemoglobiny A (HftA) są kodowane przez różne geny i mają odmienną strukturę pierwszorzedową. W przeciwieństwie, łańcuchy p, y i 5 hemoglobin ludzkich charakteryzuje duża konserwatywność ich sekwencji. Najczęściej występujące hemoglobiny mają następujący skład tetrameru: HbA j (podstawowa hemoglobina prawidłowa u ludzi dorosłych) = ąj^, ^^(hemoglobina płodowa) = a2Y2, HBS ^hemoglobina sierpowatych krwinek czerwonych) = <x2S2, HbA2 (hemoglobina prawidłowa u ludzi doros-

łych stanowiąca ok. 2,5%* Hb całkowitej) = Mioglobina i podjednostki P hemoglobiny mają praktycznie identyczną strukturę drugorzędową 1 trzeciorzędową Pomimo różnic w rodzaju i liczbie aminokwasów, mioglobina i łańcuchy polipeptydowe P HbA wykazują praktycznie identyczną strukturę drugorzędową i trzeciorzędową. To ścisłe podobieństwo, dotyczące również umiejscowienia hem u i odcinków helikalnych, jest przynajmniej w części wynikiem substytucji aminokwasów o podobnych właściwościach i równoznacznych pozycjach w strukturze pierwszorzędowej mioglobiny i podjednostki P HbA. Nawet występowanie 7 a nie 8 odcinków helikalnych w łańcuchu P nie zmienia zasadniczego podobieństwa strukturalnego tych polipeptydów. Podobnie jak w przypadku mioglobiny, zarówno podjednostki ot, jak i p HbA charakteryzuje obecność hydrofobowych reszt aminokwasowych wewnątrz cząsteczki (z wyjątkiem 2 reszt His w każdej podjednostce), a hydrofilowych na zewnątrz cząsteczki. Uttenowaniu hemoglobiny towarzyszy wsunięcie żelaza w płaszczyznę hemu oraz zmiana konformacji sprzężonej apoproteiny wywołana przemieszczeniem histydyny proksymalnej Tetramcryczna hemoglobina wiąże 4 cząsteczkftlenu (hem każdej podjednostki wiąże jedną cząsteczkę tlenu), a jej krzywa dysocjacji tlenowej ma kształt sigmoidalny (ryc. 7-8). Przyłączenie O2 przez jeden z hemów ułatwia wiązanie kolejnych O2 przez pozostałe grupy hemowe. To kooperatywne wiązanie tlenu z hemoglobiną jest właściwością pozwalającą na wiązanie maksymalnej ilości O2 w płucach i uwalnianie maksymalnej ilości O3 w tkankach (ryc. 7-8). Miarą powinowactwa hemoglobiny do tlenu jest wielkość Pso, odpowiadająca ciśnieniu cząstkowemu tlenu, przy którym występuje 50% nasycenia Oa Wartość P;o jest różna dla różnych organizmów, przy czym jest ona zawsze większa od wartości pO2 w tkankach badanych organiz* Przyp. tłum.

BIAŁKA; MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 75 20

40

60

140 80 100 120 Ciśnienie cząstkowe tlenu (mm Hg) Utlenowana krew ___ opuszczająca płuca

Ryc. 7-8. Krzywedysociacjitlenowej Odtlenowana krew powracająca z tkanek

hemoglobiny

i

mioglobiny.

Hemoglobina

1,1

Ciśnienie cząstkowe tlenu w krwi tętniczej wynosi ok. 100 mm Hg; wkrwiżylnej—40 mm Hg; w naczyniach włosowatych — 20 mm Hg; minimum niezbędne dla funkcji cytochromów — 5 mm Hg. Połączenie łańcuchów polipeptydowych w strukturę tetrameryczną (hemoglobina) pozwala na zwiększenie, w porównaniu z pojedynczymi łańcuchami, wydajności dostarczania tlenu. (Zmodyfikowana i reprodukowane za zgodą z: StanburyJ, B,,Wyngaarden J. B., Fredrickson D.S. [red.], The Metabolic Bas/s of Inherited Disease, wyd.4, McGraw-Hill, 1978).

mów, czego dobrym przykładem jest ludzka hemoglobina płodowa (HbF). Wartość P50 dla HbA = 26 mm Hg, podczas gdy dla HbF = 2(1 mm Hg. Ta różnica w powinowactwie Hbl i HbA do tlenu umożliwia HbF pobieranie tlenu od HbA w obrębie łożyska. Po porodzie HbF przestaje właściwie spełniać swoją funkcję ponieważ jej duże powinowactwo do O2 utrudnia jego oddysocjowywanie w tkankach. Najwcześniej w rozwoju osobniczym człowieka są syntetyzowane łańcuchy £ i e. Pod koniec pierwszego trymestru ciąży łańcuch £ zastępuje podjednostka et, a łańcuch e — podjednostka7. Hemoglobina F, pojawiająca się więc w tym okresie życia płodowego, jest zbudowana według wzoru d2 y . Podjednostka % której synteza rozpoczyna się w trzecim trymestrze ciąży, całkowicie zastępuje łańcuch y dopiero kilka tygodni po porodzie. Utlenowamu hemoglobiny towarzyszą zmiany konformacji białka PrzyJaszernu O2 towarzyszy rozerwanie wiązań poprzecznych pomiędzy końcami karboksylowymi wszystkich 4 podjednostek hemoglobiny (ryc. 7-9), co powoduje zmiany w dru-

Ryc. 7-9. Wiązania poprzeczne międ2y podjednostkarni oraz w obrębie podjednostek nieutlenowanej hemoglobiny. Podczas utlenowania te niekowalencyjne, elektrostatyczne wiązania zostają rozerwane, {Zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Stryer L: Biochemistry. wyd. 2, Freeman, 1981). _______________________________________

go-, trzecio- i czwartorzędowej strukturze białka. Jedna para podjednostek a/P obraca się w stosunku do drugiej pary a/&\ w wyniku czego następuje zbliżenie podjednostek tetramem i zwiększenie powinowactwa hemów do tlenu (ryc, 7-10 i 7-11).

8

cc, S 1 i/

.i \

\\

V ' 1 /

/

1

/6

s

■ ~ ~ - _________ -■

Postać T

15° Postać R

Rvc. 7-10. W czasie przejścia postaci T w postać R hemoglobiny jedna para podjednostek (a2/f>2) obraca się o 15° w stosunku do drugiej pary (a1/fl]). Ponieważ oś obrotu jest niewspółśrodkowa, para at2/P2 przesuwa się również nieco w kierunku osi. Na diagramie para a,/^ utrzymująca się w stałej pozycji jest niezaciemniona, a para a2/P: dokonująca obrotu i przesunięcia jest zaciemniona.

Czwartorzędową strukturę częściowo utlenowanej hemoglobiny określa się jak o stanT(ang. taut — naprężony), a całkowicie utlenowanej hemoglobiny (HbOj) jako stan R (ang. relaxed

76 / ROZDZIAŁ 7

— rozluźniony) (ryc. 7-12). Symbole R i T są również używane w celu określenia czwartorzędowej struktury enzymów allosterycznych, gdzie forma T wykazuje mniejsze powinowactwo do stibstratu.

Pod jednostka /)t

Utlenowanie hemoglobiny prowadzi do zmian konformacyjnych w bezpośrednim otoczeniu grupy hemowej Podczas utlenowania hemoglobiny atomy żelaza (Mace ok. 0,06 nm poza płaszczyzną hemów w nieutlenowanej hemoglobinie) wsuwają się w płaszczyznę hemów, pociągając za sobą histydynę proksymalną (F8) i połączone z nią reszty aminokwasowe (ryc. 7-13).

Ryc. 7-11. Zmiany oddziaływań w obrębie ot,/p, podczas utlenowania. Przesunięcie zazębiających się obszarów powoduje zmianę miejsc oddziały wań i „przełączanie" jednych wiązań wodorowych na inne. Pozostałe wiązania mają charakter niepolarny. (Reprodukcja za zgodą z: Perutz M. F.: Molecular pathology of human hemoglobin: stereochemical interpretation of abnormal oxygen affinities, Naturę 1971; 232:408)._____________________

Odtlenowanie (posiać T)

Podjednostka a.

AspG1(94! TyrC7|«)

Utlenowani e (postać R)

Podjednostka f)2

Postać T

Postać R

Ryc. 7-12. Przejście postaci T w postać R zwiększa prawdopodobieństwo utlenowania każdego z 4 hemów. Przekształcenie to nie następuje z chwilą przyłączenia określonej liczby cząsteczek tlenu, lecz dokonuje się wraz z utlenowaniem kolejnych hemów. Stopniowe przyłączanie tlenu powoduje pękanie (linie cienkie) i osłabianie (linie wężykowate) wiązań poprzecznych łączących podjednostki w postaci T. Przejście między tymi dwoma postaciami pozostaje pod wpływem różnych czynników, takich jak: protony, dwutlenek węgla, chlorki, BPG. Im większe stężenie tych czynników, tym więcej tlenu musi zostać związane, aby zapoczątkować przekształcenie. Schemat nie zawiera całkowicie utłenowanej cząsteczki w postaci T oraz całkowicie nieutlenowanej cząsteczki w postaci R, ponieważ są one zbyt nietrw'ałe, aby istnieć w znaczącej liczbie. (Zmodyfikowana i przerysowana za zgodą z: Perutz M. F,: Hemoglobin structure and respiratory transport, Sci. Am. [Dec], 1978; 239:92),

BIAŁKA: MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 77 Hlslydyna FB HeliKs F

Odpychania ' przestrzenne I Płaszczyzn a nam u

przed szkodliwym wpływem zwiększenia kwasowości krwi, pełni m.in. hemoglobina._QJL-, łączeniu 4 cząsteczek tlenu z hemoglobiny towarzyszy wiązanie 2 protonów. W płucach natomiast zachodzi zjawisko odwrotne, tj. przyłączenie tlenu do hemoglobiny powoduje uwolnienie protonów. Uwolnione-prolony łączą się z wodorowęglanem, tworząc kwas węglowy, który pod wpływem dehydratazy węglanowej przekształca się w CO2, usuwany w procesie oddychania. Stad wiązanie tlenu zwiększa wydychanie CO2. To odwracalne zjawisko nosf nazwę efektu Bohra (ryc. 7-l5)7EfekTBohTa jest właściwością

Wydychania Tkanki

Cykl

2 H C O, "

Ryc. 7-13. Podczas utlenowania atom żelaza wsuwa się w płaszczyznę hemu. Razem z atomem źeiaza przemieszcza się histydyna F8 i związane z nią reszty aminokwasowe. (Zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 2. Freeman, 1981).

40

JD.2H

(Buforujące działania —-------------hemoglobiny) Płuca

kwasów

Po uwolnieniu tlenu w tkankach hemoglobina transportuje dwutlenek węgla i protony do płuc

Oprócz transportu tlenu z płuc do tkanek, hemoglobina bierze udział w przenoszeniu COj z tkanek do płuc, skąd jest on usuwany podczas oddychania. Bezpośrednio po odłączeniu tlenu, cząsteczka hemoglobinjL.^dąiŁ_CQs_ w ilości stanowiącej~oJć7l5% CO2 transportowanego . Ponadto z chwilą za"SBsorbtyw"ania

p j

COj przez Ićrew dehydrataza węglanowa erytrocytów katalizuje utworzenie kwasu węgiowego, który dysocjuje do wodorowęglanu i protonu na skutek przesunięcia równowagi reakcji w kierunku dysocjacji (ryc. 7-14). Funkcję układu buforowego, zabezpieczającego organizm HCO.-+ H+

co,+ Ryc. 7-14. Tworzenie kwasu węglowego pod wpływem dehydratazy węglanowej i jego dysocjacja do jonu wodorowęglanowego i protonu.

trlkarboksylowych (Krebsa) Ryc. 7-15. Efekt Bohra. Powstający w tkankach dwutlenek węgla laczy się z wodą, tworząc kwas węglowy, który dysocjuje do protonu i jonu wodorowęglanowego. Nieutlenowana hemoglobina wiąże protony i transportuje je do płuc. W płucach, w wyniku przyłączania tlenu, następuje uwalnianie protonów, które łącząc się z jonem wodorowęglanowym tworzą kwas węglowy, przekształcany przez dehydrataze węglanową do dwutlenku węgla usuwanego w procesie oddychania.

charakterystyczną dla tetramerycznej hemoglobiny, 7al1?iB[l ffl jnterakcji hem-hem, czyli kooperatywności wiązania tlenu. Efektu Bohra nie obserwuje się w przypadku mioglobiny.

78 / ROZDZIAŁ 7

Rozerwanie wiązań poprzecznych podczas przyłączania tlenu do hemoglobiny w postaci T dostarcza protonów odpowiedzialnych za efekt Bohra Protonv_odpowiedzialne za elekt Bohra powstają w wyniku rozerwania \\ i a&łjl „poprzecznych podczas przyłączania tlenu do postaci T, Sa one głównie uwalniane z atomów N pierścieni imidazolowych C-końcowych reszt histydyny łańcuchów P HC3 (146). Uwolnione pmtnny pye kształcą ją wodorowęglan w kwaś" węglowy, u suwany pkn m, w naczyniacF )

węglowy, u suway p włosowatych pęcherzyków nłucnych fryc. 7-15). Natomiast podczas odłączania tlenu tworzenie wiązań poprzeczaych, pjaslaci T hemoglobiny wymaga przyłączenia protonów do reszt HC3 łańcuchów p. oiwnrrer protonów w tkankach ułatwia więc tworzenie wiązań poprzecznych na skjJteYprotonacji końcowych/reszt Hisw podjednostkach p. Odtworzenie wiązań poprzecznych sprzyja wiec uwalnianiu łferm z, ufleno'wanej (postajLKLJiamo.globiny. Uogólniając, /większenic stężeniajworpntm; powoduje odjaczenSjttnu.JJOticS^gdy zwiększenie stężenia tlenu powoduje odłączenie protonów. Zależność tęorjrazuje przesunięcie krzywej dysocjacji tlenu na prawo w wyniku zwiększenia zawartości jonów wodorowych (protonów).

z 1,3-bisfosfoglicerynianu, będącego metabolitem pośrednim glikolizy. BPG wiąże się z hemoglobiną w stosunku 1 cząsteczka BPG na tetrameryczną cząsteczkę hemoglobiny, a miejscem wiązania jest przestrzeń między 4 podjednostkami, znajdująca się w centrum cząsteczki hemoglobiny. Rozmiar tej wnęki jest odpowiedni dla BPG tylko w przypadku postaci T, tj. wtedy, kiedy przestrzeń między heliksami H łańcuchów p jest wystarczająco duża. BPG przyłącza się za pomocą wiązań poprzecznych, twofzą-ćycn się pomiędzy atomami tlenu BPG i dodatnio naładowanymi resztami Val NA1 (grupy aminowe N-koricowe), Lys EF6 oraz His H21 łańcuchów p (ryc. 7-17). BPG stabilizuje

Ryc. 7-17. Sposób wiązania 2,3-bisfosfogltcerynianu z nieutlenowaną hemoglobiną człowieka. BPG oddziałuje z 3 dodatnio naładowanymi grupami każdego z łańcuchów fi. (Reprodukcja za zgodą z: Arnone A,: X-ray diffraction siudy of binding 2,3-diphosphoglycerate to human deoxyhemoglobin. Naturę 1972; 237:146).

W centralnej wnęce cząsteczki nieutlenowanej hemoglobiny 2,3bisfosfoglicery niań (BPG) tworzy wiązanie poprzeczne, stabilizujące strukturę T W warunkach niedoboru tlenu w tkankach zwiększa się zawartość 2,3-bisfosfogIicerynianu (BPG) (ryc. 7-16). Związek ten tworzy się

Ryc. 7-16. (BPG).

o-op

\\

o Struktura 2,3bisfosfoglic erynianu

więc postać T lub nieutlenowaną postać hemoglobiny przez tworzenie wiązań poprzecznych w obrębie łańcuchów p oraz dostarcza dodatkowe wiązania poprzeczne, które muszą ulec zerwaniu przy przechodzeniu postaci T w postać R. Wiązanie BPG z hemoglobiną płodową jest znacznie słabsze niż z hemoglobiną Judzi dorosłych, ponieważ zamiast His resztą H2T w łańcuchu y hemoglobiny płodowej jest seryna, która nie tworzy wiązań poprzecznych z BPG.

BIAŁKA: MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 79

BPG ma więc mniejszy wpływ na stabilizację formy T w przypadku hemoglobiny płodowej, co powoduje jej większe w porównaniu z hemoglobiną ludzi dorosłych, powinowactwo do tlenu. Przejście postaci T w postać R hemoglobiny i odwrotnie jest wyzwalane przez ruch żelaza do wewnątrz i na zewnątrz płaszczyzny układu porfirynowego. Przejście to jest uruchamiane przez czynniki oddziałujące przestrzennie i elektrostatycznie przy nakładzie energii ok. 12 560 J/mol (3000 cal/mol). Niewielka zmiana pozycji Fe2+ w stosunku do płaszczyzny układu porfirynowego indukuje więc znaczne zmiany w konformacji hemoglobiny, wpływając decydująco na jej funkcje biologiczną w odpowiedzi na sygnały środowiska. ZIDENTYFIKOWANO KILKASET MUTANTÓW HEMOGLOBINY WWIĘKSZOŚCI NIE OBJAWIAJĄCYCH ZABURZEŃ FUNKCJI Mutacje genów kodujących łańcuchy ot lub P mogą wpływać na biologiczną funkcje hemoglobin. Poniżej opisano kilka, spośród kilkuset znanych (w większości łagodnych), mutantów hemoglobin Judzkich o zmienionej funkcji biologicznej, Stan, w którym w wyniku mutacji następuje zaburzenie funkcji biologicznej hemoglobiny określa się mianem hemoglobino-

p a ta .

W hemoglobinach typu M proksymalna lub dystalna reszta histydyny w podjednostkach ot lub ji jest zastąpiona resztą tyrozyny Zastąpienie proksymalnej lub dystalnej histydyny resztą tyrozyny przyczynia się do stabilizacji żelaza hemowego w formie Fe 3+ , na skutek tworzenia przez niego trwałego połączenia z anionem fenolanowym Tyr. Obecność hemu w formie żelazowej nie wiążącej 02 powoduje met hemoglobinemię. W przypadku wariantów hemoglobin M dotyczących łańcuchów a obserwuje się przesunięcie równowagi przejścia R-T w kierunku formy T, zmniejszenie powniowaćTwa do tlemi i zniesienie efektu BohraTNatomiast w przypadku wariantów dotyczących łańcuchów P efekt Bohra jest zachowany, ponieważ nie ulega zakłóceniu przejście R-T. Mutacje, które sprzyjają tworzeniu się postaci R charakteryzują się zwiększeniem powino-

wactwa do tlenu (np. hemoglobina Chesapeake). W hemoglobinie Sj^ęsztŁ Dostarczanie wskutek tego zbyt małej ilości l tlenu do tkanek powoduje hipoksje, która prowadzi do policytemii (zwiększenie liczby erytrocytów). gl j^ęs glutaminowego w pozycji 6 łańcucha {> jest zastąpiona resztą waliny Hemoglobina S powstaje w wyniku zastąpieuiśLCjju A2 (ó)p\ tj, reszty 6 w łańcuchu (3 przez ^al. Reszta A2 (Glu lub Val) znajduje się na powierzchni cząsteczki, odpowiadając za jej kontakty z wodą. Zastąpienie polarnego kwasu glutaminowego niepolarną waliną powoduje powstanie na powierzchni łańcucha P „lepkich miejsc". „Lepkie miejsca" występują zarówno w utlenowanej, jak i nieutlenowanej postaci hemoglobiny S; nie ma ich n^ b T glojbinic: AJJ koTei na powierzchni hemoglobiny nieutlenowanej występują miejsca komplementarne do „lepkich miejsc". Są one niedostępne w hemoglobinie utlenowanej (ryc. 7-18). IMieutlenowana hemoglobina S może tworzyć włókna, które zniekształcają erytrocyty „Lepkie miejsca" nieutlenowanej hemoglobinySmogą łączyć się z miejscami komplementarnymi innej cząsteczki nieutlenowanej hemoglobiny. Oddziaływania te powodują polimeryzację nieutlenowanej hemoglobiny S, w wyniku czego powstają długie, wytrącające się agregaty zniekształcające erytrocyty (erytrocyty przybierają kształt sierpowaty), odpowiedzialne za ich liżę i inne objawy kliniczne. Utrzymanie hemoglobiny S w postaci utlenowanej lub zmniejszenie do minimum jej stężenia w postaci nieutlenowanej zapobiegałoby tworzeniu się polimerów, a tym samym sierpowatości krwinek. Jest bowiem wiadomo, że polimeryzacji ulega postać T hemoglobiny S. Interesujący, chociaż nie do zastosowania terapeutycznego, jest fakt, że forma żelazowa hemoglobiny S (methemoglobina S) nie tworzy polimerów. Podobnie bowiem jak w przypadku methemoglobiny A, jon żelazowy pozostaje w płaszczyźnie układu porfirynowego, stabilizując strukturę R hemoglobiny. Chociaż nieutlenowana hemoglobina A zawiera miejsca komplementarne do „lepkich miejsc" występujących w utlenowanej i nieutlenowanej hemoglobinie S, to jej przyłączenie do hemoglobiny S uniemożliwia dalsze wydhiżanie polimerów na skutek braku na jej

80 / ROZDZIAŁ 7 Utleń owa na A

Nieutlenowana A

U tlen owa na S

Nieutlenowana S

a. a

e

lllllllllll

Nieutlenowana A Nieutlenowana S

Ryc. 7-18. Schemat przedstawiający „lepkie miejsca" (A) w hemoglobinie S i ich „receptory" wnieutlenowanej hemoglobinie A i S. Komplementarność oddziałujących powierzchni powoduje faczenie się n te utleń owa n ej hemoglobiny S w polimery. Wydłużanie polimerów przerywa nieuttenowana hemoglobina A nie zawierająca „iepkich miejsc". (Zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981).

powierzchni „iepkich miejsc" sprzyjających dalszemu wiązaniu (ryc. 7-18). Przyłączenie nieutlenowanej hemoglobiny A do hemoglobiny S zarówno w formie R, jak i T stanowi barierę do dalszej polimeryzacji.

6,2 nm

RyC-7-19, Proponowana helikaIna struktura włókna utworzonego w wyniku agregacji nieutlenowanej hemoglobiny S, (Reprodukcja za zgodą z: Maugh T. II: A new understanding of sickle celi emerges. Science 1981; 211:265, Copyright © 1981 by the American Associatiort for the Advancement of Science).

W,_wyniku agregacji nieutlenowanej hemoglobiny S tworzą się włókna o helikalnej strukturze, w których każda cząsteczka hemoglobiny oddziałuje z 4 przylegającymi cząsteczkami (ryc. 7-19). Włókna te deformują erytrocyty tak, że przybierają ońlTEsżtałt sieTpowaty (ryc. 720). Krwinki te wykazują zwiększoną podatność do hemolizy w czasie przechodzenia przez zatoki śledzionowe. Talasernie są niedokrwistościamj charakteryzującymi się upośledzeniem syntezy łańcuchów cc lub p hemoglobiny W talasemiach zmniejsza się synteza łańcuchów a (a-talasemie) lub łańcuchów p (fi-talasemie) hemoglobiny. Wywołuje to często groźną w skutkach niedokrwistość. Wyniki badań ostatnich lat wniosły duży wkład do naszej wiedzy o molekularnych mechanizmach odpowiedzialnych za talasernie.

BIAŁKA: MI0GL0B1NA I HEMOGLOBINA / 81

Ryc. 7-20. Obraz erytrocytu prawidłowego (A) oraz sierpowatego (B)w skaningowym mikroskopie elektronowym. Obserwowane różnice strukturalne są wynikiem zmiany w obrębie łańcuchów (i będącej skutkiem mutacji punktowej w DNA. Zamiana T na A powoduje, że w łańcuchu {J zamiast kwasu glutaminowego znajduje się walina.

PIŚMIENNICTWO Bunn HF, Forget BG: Hemoglobin: Molecular, Genetic, and Ciinical Aspects, Saunders, 1986. Dickerson RE, Geis I: Hemoglobin. Benjamin/Cummjngs, 1983. Embury SH: The ciinical pathology of sickle-ceil disease. Anmt Rcv Med 1986;37:36[. Embury SH, Scharf SJ, Saiki RK, Gholson MA, Golbus M, Arnheim N, Erlich HA: Rapid prenatal diagnosis of sickle celi anemia by a new method of DNA analysis. New Engl J Med 1987;316:ó56. Fermi G, Perutz MF, Shaanan B, Fourme R: The crystal structure of hunian deoxyhemoglobin at 1.74 angstrom resolution. J Mol Biol I984;175: 159.

6 — Biochemia

Friedman JM: Structure, dynamics, and reactivity in hemoglobin. Science 1985;228:1273. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, MuBis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N: Enzymatic amplification of beta-globin genomic: seąuences and restriction site analysis for diagnosis of sickle-cell anemia. Science, 1985;230:1350. Schacter L, Wartti JA, Gordon EM, Prasad A, Klein BL: Altered araount and activity of superoxide dismutase in sickle celi anemia. FASEB J 198S;2:237. Weatherall DJ, Clegg JB, Higgs DR, Wood WG: The hemoglobinopathies. In The Metabolk Basis of InheritedDisease, 6th Ed. Serwer CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (editors). McGraw-Hill, p. 2281, 1989.

8

Enzymy: właściwości ogólne Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE Katalizatory przyspieszają reakcje chemiczne. Podczas reakcji ulegają one zmianom fizycznym, ale po ich zakończeniu powracają do stanu pierwotnego. Chociaż są znane przypadki katalizy przez cząsteczki RNA, prawie wszystkie enzymy są katalizatorami białkowymi. Większość reakcji biochemicznych zachodziłaby bardzo wolno, gdyby nie były one katalizowane przez enzymy. W przeciwieństwie do katalizatorów niebiałkowych (H+, OH , jony metali), każdy enzym katalizuje niewielką liczbę reakcji, często tylko jedną. Enzymy są więc swoistymi katalizatorami danych reakcji. W zasadzie wszystkie reakcje biochemiczne są katalizowane przez enzymy.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Enzymy czynią możliwym życie na Ziemi i stąd łączą wiele dziedzin nauk biomedycznych. Pewne choroby (wrodzone wady metabolizmu) są spowodowane genetycznie uwarunkowanymi nieprawidłowościami w syntezie enzymów. Gdy komórki są uszkodzone (np. przez ograniczenie dopływu krwi lub przez zapalenie), wówczas pewne enzymy przechodzą do osocza. Pomiar aktywności takich enzymów w osoczu staje sie integralną częścią diagnozowania ważnych zaburzeń (np. zawał serca). Enzymologia diagnostyczna jest dziedziną medycyny obejmującą wykorzystanie enzymów w diagnostyce. Enzymy mogą być również użyte w leczeniu.

SYSTEM MIĘDZYNARODOWEJ UNII BIOCHEMICZNEJ (IUB) KLASYFIKUJE ENZYMY WEDŁUG TYPU I MECHANIZMU REAKCJI Początkowo nazwy enzymów tworzono przez dodanie końcówki -aza do nazwy substratów, na które one działają. Enzymy, które hydrolizują skrobię (gr.: amyłori) nazywano amylazami, rozkładające tłuszcze (gr.: lipos) lipazami, a~nydrolizujące białka -—. proteinazarrjUóźniei enzymom, które katalizują podobne reakcje, dawano nazwy wskazujące na typ katalizowanej reakcji chemicznej. Określano je jako dehydrogenązyjOksydazY^dekąrbok^ylazy, acylazy itd". System nomenklaturowy podany przez Międzynarodową Unię Biochemiczną (IUB), mimo że jest złożony, jest niedwuznaczny. Jego podstawową zasadą jest to, że nazewnictwo i klasyfikacja enzymów na podstawie typu reakcji chemicznej i mechanizmu reakcji może integrować informację z różnych obszarów metabolizmu. Główne zasady systemu IUB są następujące: 1. Reakcje i katalizujące je enzymy tworzą 6 klas, a każda z nich ma 4—13 podklas. 2. Nazwa enzymu składa się z 2 części. Pierwsza, zakończona na -aza, wskazuje na typ katalizowanej reakcji, druga — określa substrat lub substraty. 3. Dodatkowa informacja, jeśli jest potrzebna do wyjaśnienia reakcji, może być podana w na wiasach; np. enzym katalizujący reakcję L-jabłczan + NAD+ = pirogronian -I- COj-l+ NADH + H+ oznacza się 1.1,1.37 L-jabłczan: NAD+ oksydoreduktaza (dekarboksylująca).

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 83

4. Każdy enzym ma numer kodu (EC), który charakteryzuje typ reakcji, czyli klasę (pierwszy człon), podklasę (drugi człon) i pod-podklasę (trzeci człon). Czwarty człon wskazuje na nazwę określonego enzymu. EC 2.7.1.1 oznacza więc klasę 2 (transferaza), podklasę 7 (przenoszenie fosforanu), pod-podklasę 1 (alkohol jako akceptor fosforanu). Ostatnia cyfra wskazuje heksokinazę, czyli 6-fosfotransferaza ATP: D-heksoza, enzym katalizujący przeniesienie fosforanu z ATP na grupę hydroksylową przy 6 węglu glukozy.

r H,C O Plrogronlan

o L-Mleczan

NAD*

NADH* + H+

Ryc. 8-1. Działanie NAD + jako kosubstratu w reakcji o ksy do red u kej i.

WIELE ENZYMÓW DO AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ WYMAGA KOENZYMU

Wiele enzymów wymaga swoistej, termostabilnej, małocząsteczkowej molekuły organicznej zwanej koenzymem, Holoenzym (pełen układ katalityczny) składa się z apoenzymu (część białkowa) i przyłączonego koenzymu. Koenzym może przyłączać się do apoenzymu kowalencyjnie lub niekowalencyjnie. Termin „grupa prostetyczna" oznacza kowalencyjnie przyłączony koenzym. Reakcje, które wymagają koenzymów, obejmują reakcje oksydacyjno-redukcyjne, reakcje przenoszenia grup i izomeryzacji oraz reakcje prowadzące do tworzenia wiązań kowalencyjnych (IUB, klasy I, 2, 5 i 6). Reakcje lityczne, łącznie z reakcjami hydrolitycznymi katalizowanymi przez enzymy trawienne, nie wymagają koenzymów.

KOENZYM MOŻE BYĆ ROZPATRYWANY JAKO DRUGI SUBSTRAT Koenzym może być rozpatrywany jako drugi substrat, tj. kosubstrat, z 2 powodów. Po pierwsze, chemiczne zmiany w koenzymie dokładnie równoważą zmiany zachodzące w substracie. Na przykład w reakcjach oksydacyjno-redukcyjnych, gdy 1 cząsteczka substratu utlenia się, wówczas 1 cząsteczka koenzymu ulega redukcji (ryc. 8-1). Podobnie w reakcjach transaminacji fosforan pirydoksalu działa jako drugi substrat w 2 kolejnych reakcjach oraz jako przenośnik w przekazywaniu grupy aminowej na różne aketokwasy. Drugim powodem podkreślenia roli koenzymu jest to, że reakcja zjego udziałem może mieć większe podstawowe znaczenie fizjologiczne. Na przykład zdolność mięśnia pra-

cującego beztlenowo do przemiany pirogronianu w mleczan tkwi nie w samym pirogronianie lub mleczanie. Reakcja służy głównie do utlenienia NADH do NAD+. Bez NAD+ glikoliza nie może dalej przebiegać i ustaje beztlenowa synteza ATP (a tym samym praca). W warunkach beztlenowych redukcja pirogronianu do mleczanu służy do ponownego utlenienia NADH i umożliwia biosyntezę ATP. Inne reakcje mogą spełniać równie dobrze taką samą funkcję. Na przykład w bakteriach lub drożdżach, rosnących w warunkach beztlenowych, metabolity pochodzące z pirogronianu służą jako utleniacze dla NADH, przy czym same się redukują (tab. 8-1). Tabela 8-1. Mechanizmy beztlenowej regeneracji NAD+

Utleniacz Piróg ronian

Produkt zredukowany

Forma życia

Mleczan

Mięśnie, bakterie fermentacji mlekowej

Aldehyd octowy Alkohol etylowy Drożdże Fosfodihydroksyaceton

a-Glicerofosforan

Escherichia coli

Fruktoza

Mannitol

Bakterie fermentacji pseudomlekowej

Koenzymy działają jako czynniki przenoszące określone grupy funkcyjne

Biochemiczne reakcje przenoszenia grup typu: D-G+A=A-G+

D

w których funkcyjna grupa G jest przenoszona z cząsteczki donora D —G na cząsteczkę akceptora A, zazwyczaj wykorzystują koenzym albo

84 / ROZDZIAŁ 8

jako ostateczny akceptor (np. w reakcjach odwodorowania), albo jako pośredni przenośnik grup (np. reakcje transaminacji). Schemat ilustruje drugą koncepcje: A—G D—G CoE Ct

Mimo że sugeruje to tworzenie 1 kompleksu CoE—G w ciągu całej reakcji, w grę może wchodzić w danej reakcji tworzenie kilku pośrednich CoE—G kompleksów (np. transaminacja). Gdy przenoszona grupą jest wodór, wówczas przyjęto przedstawiać tylko lewą stronę — „polowę reakcji":

nami d. fiamina. ryboflawina i kwas pantotenowy

są ważnymi składnikami koenzymów reakcji biologicznego utleniania i redukcji, a kwas foliowy i koenzymy kobamidowe biorą udział w przemianach reszt jednowęgl owych. Wiele koenzymów zawiera adeninę, rybozę, fosforan i są one pochodnymi monofosforanu adenozyny (AMP). Przykłady obejmują NAD + i NADP+ (ryc. 8-2).

NHj

D—H XCoE CoE—H D

To, że reakcja ta przedstawia tylko szczególny przypadek ogólnego transferu grupy H ilustrują reakcje zachodzące w nienaruszonych komórkach (tab. 8-1). Można je zapisać następująco: CoE D A— H —H Koenzymy mogą być klasyfikowane zależnie od grupy, przeniesienie której one ułatwiają Na podstawie powyższej koncepcji można sklasyfikować koenzymy następująco: Koenzymy przenoszące inne grupy niż H Fosforany cukrów CoASH Pirofosforan tiaminy Fosforan pirydoksalu Koenzymy folia nowe Biotyna Koenzymy kobamidowe (B1;) Kwas liponowy Koenzymy przenoszące H NAD+, NADP+ FMN, FAD Kwas liponowy Koenzym Q Wiele koenzymów jest pochodnymi witamin B i monofosforanu adenozyny Witaminy grupy B tworzą część struktury wielu koenzymów. Witaminy grupy B: nikoty-

Ryc. 8-2. NAD(P)+. W NAD+, R = H; w NADP+, R="OPO1".

Skoro substraty łączą się z enzymami w 3 punktach, enzymy działają jako stereoswoiste katalizatory Większość substratów tworzy z enzymami co najmniej 3 wiązania. Takie „3-punktowe dolą* czenie" może nadawać cząsteczce, skądinąd symetrycznej, asymetrię. Na rycinie 8-3 przedstawiono cząsteczkę substratu w postaci atomu węgla z 3 różnymi grupami, które mogą się przyłączyć w 3 punktach do miejsca enzymu. Jeżeli miejsce na enzymie jest dostępne tylko z jednej strony i mogą ze sobą reagować tylko atomy i miejsca komplementarne (uzasadnione przypuszczenia dla istotnych enzymów), cząsteczka substratu może się przyłączyć do enzymu tylko w jeden sposób. Reakcja może ograniczać się do atomów związanych w miejscach 1 i 2,

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 86

Większość enzymów wykazuje absolutną swoistość optyczną dla przynajmniej części swoistych substratów Z wyjątkiem epimeraz (racemaz), które katalizują wewnętrzne przekształcenie izomerów optycznych, ogólnie enzymy wykazują absolutną swoistość optyczną dla przynajmniej części cząsMiejsce enzym etyczne Ryc. 8-3. Schemat trzypunktowego przyłączenia się substratu do płaskiego miejsca aktywnego enzymu.

nawet jeśli atomy 1 i 3 są takie same. Jeśli wyobrazimy sobie obrót cząsteczki substratu w przestrzeni, to widać, że istnieje tylko jedno położenie substratu, w którym może on łączyć się z 3 punktami miejsca planarnego enzymu. W wyniku tego atomy 1 i 3, chociaż identyczne, po połączeniu substratu z enzymem stają się różne. Zmiana chemiczna może obejmować atom 1, ale nie atom 3 i odwrotnie. To może wyjaśnić, dlaczego katalizowana przez enzym redukcja optycznie nieaktywnej cząsteczki pirogronianu prowadzi do L-, a nie D, L-mleczaffu. WIĘKSZOŚĆ ENZYMÓW KATALIZUJE ALBO SWOISTĄ REAKCJĘ, ALBO, W PEWNYCH PRZYPADKACH, SWOISTY TYP REAKCJI Zdolność enzymu do katalizowania tylko 1 swoistej reakcji i zasadniczo żadnej innej, być może jest jego najważniejszą właściwością.

Szybkość procesów metabolicznych może być zatem regulowana przez zmiany w katalitycznej sprawności odpowiednich enzymów, Niemniej większość enzymów katalizuje ten sam typ reakcji (przenoszenie fosforanu, utlenianie i redukcja, itp.) dla kilku strukturalnie pokrewnych substratów. Reakcje z pokrewnymi substratami zachodzą wówczas, gdy substraty te występują w dużym stężeniu. To, czy w żywych organizmach będą zachodziły wszystkie z możliwych reakcji, zależy od względnych stężeń alternatywnych substratów w komórce i od względnego powinowactwa enzymu do tych substratów.

teczki substratu. Dlatego enzymy glikolizy i bezpośredniej przemiany tlenowej katalizują przekształcenie fosfocukrów szeregu D-, a nie L. Z kilkoma wyjątkami (np. oksydaza D-aminokwasu nerki), większość enzymów ssaków działa na L-izomery aminokwasów. Swoistość optyczna enzymów może rozciągać się na część lub całość cząsteczki substratu.

Glikozydazy są przykładem obu tych przypadków. Te enzymy, które katalizują hydrolizę wiązań glikozydowych między cukrami a alkoholami, są wysoce swoiste dla części cukrowej i dla typu wiązania (a lub P), ale są stosunkowo nieswoiste dla aglikonu (część alkoholowa). Enzymy wykazują swoistość wyższego rzędu dla typu reakcji, które one katalizują Enzymy lityczne działają na określone ugrupowania chemiczne, np. glikozydazy na glikozydy, pepsyna i trypsyna na wiązania peptydowe, a esterazy na estry. Ten fakt tłumaczy możliwości rozkładu znacznej ilości różnych substratów peptydowych przez nieliczne tylko enzymy trawienne. Wiele proteaz katalizuje również hydrolizę estrów. Chociaż ten rodzaj reakcji ma ograniczone znaczenie fizjologiczne, użycie estrów, jako substratów syntetycznych znacznie się przyczyniło do poznania mechanizmu działania proteaz. Pewne enzymy lityczne wykazują większą swoistość. Chymotrypsyna hydrolizuje wiązania peptydowe, w których grupa karboksylowa pochodzi od aminokwasów aromatycznych: fenyloalaniny, tyrozyny lub tryptofanu. Karboksypeptydazy usuwają po 1 aminokwasie od końca karboksylowego, a aminopeptydazy — od końca aminowego łańcucha polipeptydowego. Chociaż niektóre oksydoreduktazy wykorzystują albo NAD+ lub NADP+ jako akceptor elektronu, większość z nich używa przede wszystkim jednego lub drugiego. Mówiąc ogólnie, oksydoreduktazy biorące udział w procesach biosyntezy u ssaków (np. synteza kwasu tłuszczowego lub sterolu) wykorzystują jako substan-

86 / ROZDZIAŁ 8 cję redukującą NADPH, natomiast oksydoreduktazy działające w procesach degradacji (np. glikoliza, utlenianie kwasu tłuszczowego) wykorzystują NAD+ jako substancje utlenia-

KATALITYCZNA AKTYWNOŚĆ ENZYMU JEST WYBIÓRCZĄ I CZUŁĄ PRÓBĄ DO ICH DETEKCJI Mała zawartość enzymów w komórkach komplikuje pomiar ich ilości w wyciągach tkankowych lub w płynach ustrojowych. Szczęśliwie aktywność katalityczna enzymu stanowi czułą i swoistą próbę do ich pomiaru. Aby zmierzyć ilość enzymu w próbce ekstraktu tkankowego lub innego płynu biologicznego, oznacza się szybkość reakcji katalizowanej przez enzym obecny w próbce. W odpowiednich warunkach oznaczana szybkość reakcji jest proporcjonalna do ilości obecnego

A

1. 0 0. 8

0.

i

0. 4

1

I6 s0.

NADH

\ \

2

/

V

0

\_____ i

200

250

NAD1

,

400

300 350 Długość fali (nm)

Ryc. 8-4. Widma absorpcji NAD ' i NADH Gęstość dotyczy roztworu o stężeniu 44 mg/l w kuwecie 1 cm. NADP + i NAOPH mają widma analogiczne odpowiednio do widm NAD i NADH

enzymu. Ponieważ trudne jest określenie ilości cząsteczek lub masy obecnego enzymu, wy-

niki są wyrażone w jednostkach enzymatycz-

nych. Względne ilości enzymu w różnych ekstraktach mogą być wówczas porównywane. Jednostki enzymu wyraża się w mikromolach (umol; 10 6 mol), nanomolach (nmol; 10~9 mol) lub pikomolacb. (pmol; 10 1Z mol) reagującego substratu Jub wytwarzanego produktu na minutę. Dehydrogenazy zależne od NAD' mogą być analizowane przez pomiar zmiany absorbancji przy 340 nm, spowodowanej i nterkon wersją NAD+ i NADH W reakcjach z udziałem NAD+ lub NADP+ (dehydrogenazy) wykorzystuje się właściwość absorbowania światła o długości fali 340 nm przez NADH lub NADPH (ale nie NAD + lub NADP+) (ryc. 8-4). Gdy NADH jest utleniany do NAD+ (lub odwrotnie) zmienia się gęstość optyczna (OD) przy 340 nm. W określonych warunkach szybkość zmiany w OD zależy bezpośrednio od aktywności enzymu (ryc. 8-5). Krzywą kalibracyjną (ryc. 8-6) wykreśla się, oznaczając zmiany OD względem ilości dodanego enzymu (ryc. 8-5). Ilość enzymu obecnego w nieznanym roztworze można obliczyć znając szybkość zmian w OD przy 340 nm.

0,90

2,0

0,85 -

0,80 L t,0 Minuty Ryc. 8-5. Oznaczenie dehydrogenazy zależnej od NADH i NADPH. Obserwuje się wielkość zmiany OD (gęstości optycznej) przy 340 nm na skutek przejścia koenzymu zredukowanego w koenzym utleniony. Do kuwety są dodawane: utleniony substrai (S), zredukowany koenzym (NADH) i bufor. Następnie przepuszcza się światło o długości 340 nm. Początkowo OD jest duża, ponieważ NADH {lub NADPH) absorbuje światło, przy 340 nm. Po dodaniu 0,025 — 0,2 ml standardowego roztworu enzymu OD się zmniejsza.

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 87 0.20

0,10 r

determinują określoną metodę obliczeń. Często dogodnie jest połączyć produkt reakcji z dehydrogenaza, dla której ten produkt jest substratem (ryc. 8-7). CZYSTE ENZYMY SĄ KONIECZNE DO ZROZUMIENIA ICH STRUKTURY, FUNKCJI, MECHANIZMU REAKCJI I REGULACJI ICH AKTYWNOŚCI

0,05 0,10 0,15 Roztwór enzymu (ml)

Ryc. 8-6. Krzywa kalibracyjna do analizy enzymatycznej. Nachylenia prostych z ryc. 8-5 są wykreślone względem ilości enzymu.

Ilościowa analiza wielu enzymów może być uproszczona, sprzęgając reakcje przez nie katalizowane z reakcją katalizowaną przez dehydrogenazę zależną od NAD W powyższym przykładzie, aby określić aktywność enzymu, oznaczano szybkość tworzenia produktu (NADH). Enzymy inne niż dehydrogenazy mogą być także badane przez pomiar szybkości pojawiania się produktu (lub, rzadziej, szybkości zanikania substratu). Fizykochemiczne właściwości produktu lub substratu Glukoza

[HEKSOKINAZA I *ADP, Mi Glu kozo- 6fosforan , NADP* DEHYDROGENAZA GLUKO2O-6.FOSFORANOWA NADPH + H ł 6-Fosfool ukonolakton

Ryc. 8-7. Oznaczanie aktywności heksokinazy metodą „sprzężoną". Reakcja jest sprzężona z reakcją katalizowaną przez dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową. Dehydrogenaza g I u kozo - 6 - f osf ora -nowa, glukoza, ATP, Mg2 "* i NADP + są dodawane w nadmiarze. Ilość obecnej heksokinazy determinuje szybkość całej sprzężonej reakcji i przede wszystkim szybkość tworzenia NADPH, która może być mierzona przy 340 nm.

Wiedza o reakcjach i chemicznych związkach pośrednich w szlakach metabolicznych i mechanizmach regulacyjnych, które działają na poziomie katalizy, pochodzi w dużym stopniu z badań oczyszczonych enzymów. Wiarygodna informacja dotycząca kinetyki, k o fakt o rów, miejsc aktywnych, struktury i mechanizmu działania także wymaga bardzo oczyszczonych enzymów. Efektywny przepis oczyszczania enzymu, z dobrą wydajnością na każdym etapie, zwiększa swoistą aktywność enzymu W tabeli 8-2 przedstawiono przebieg typowego oczyszczania enzymu wątroby, z dobrą wydajnością i 490-krotnym oczyszczaniem całkowitym. Należy zwrócić uwagę, jak oblicza się swoistą aktywność i odzysk początkowej aktywności. Celem jest osiągnięcie maksymalnej swoistej aktywności (jednostki enzymu na miligram białka) z możliwie najlepszym odzyskiem początkowej aktywności. Oczyszczanie enzymu polega na wyizolowaniu swoistego enzymu z surowego ekstraktu komórkowego, zawierającego wiele innych komponentów. Małe cząsteczki można usunąć przez dializę lub filtrację żelową, kwasy nukleinowe przez strącanie antybiotykiem, np. streptomycyną, itd. Największym problemem jest wydzielanie pożądanego enzymu z tysięcy chemicznie i fizycznie podobnych białek. Klasyczne metody oczyszczania enzymów obejmują strącanie wybiórcze, chromatografię jonowymienną i filtrację żelową Użyteczne, klasyczne techniki oczyszczania obejmują strącanie solami o różnych stężeniach (głównie siarczanem amonu i siarczanem sodu) lub rozpuszczalnikami (aceton lub etanol), różnicową denaturację cieplną iub w wyniku zmian pH,1 różnicowe wirowanie, filtrację żelową i ele-

88 / ROZDZIAŁ 8 Tabela 8-2, Schemat typowego oczyszczania enzymu Frakcja enzymu Surowy homogenat wątroby Supernatant 100 000xff Osad — 40—50% {NH4)2SO4 Osad — 20—35% aceton Kolumna DEAE, frakcja 80—110 Osad — 43—48% (NH4)2SO4 Pierwsze kryształy Rekrystalizacja

Całkowita

Białko

aktywność

całkowite (nig)

(pU)

100 000 98 000 90 000 60 000 58 000 52 000 50 000 49 000

ktroforezę. Niezwykle skuteczną do wydajnego i szybkiego oczyszczenia enzymów okazała się selektywna adsorpcja i elucja białek z anionowego jonitu celulozowego— dietyloaminoetylo (DEAE) celulozy i kationowego jonitu — karboksymetylocelulozy (CMC). Szeroko stosowany jest rozdział białek na sitach molekularnych, takich jak Sephadex, które rozdzielają białka na podstawie ich wielkości. Metody te są względnie nieselektywne (z wyjątkiem przypadków stosowania kombinacji kilku takich metod), ponieważ nie rozdzielają one pojedynczego białka od wszystkich innych białek. Jest to lepiej osiągane za pomocą chromatografii powinowactwa. Techniki chromatografii powinowactwa wykorzystują unieruchomione Ugandy, które reagują ze swoistymi regionami enzymu Uderzającą cechą chromatografii powinowactwa jest jej zdolność do wybiórczego usuwania jednego określonego białka lub, najwyżej, małej liczby poszczególnych białek z ich mieszaniny. Technika wykorzystuje unieruchomiony ligand swoiście reagujący z enzymem, który zamierzamy oczyścić. Gdy mieszanina białek jest poddana działaniu tego unieruchomionego ligandu, wówczas białkami, które przyłączą się, są te, które silnie z nim reagują. Niepożądane białko wypływa z kolumny i jest odrzucane. Badane białko jest wówczas eluowane z unieruchomionego ligandu. na ogół za pomocą dużych stężeń soli lub przeprowadzając ligand w postać rozpuszczalną. Oczyszczania, dokonane za pomocą techniki chromatografii powinowactwa, są imponujące, często przewyższają to, co jest możliwe przez sukcesywne stosowanie wielu

10 000 8 000 1 500 250 29 20 12 10

Aktywność

Całkowity

właściwa (pU/mg)

odzysk (%)

10 12,2 60 240 2 000 2 600 4 160 4 900

(100) 98 90 60 58 52 50 49

technik klasycznych. Preferowanymi Ugandami są substraty lub pochodne koenzymów kowaJencyjnie przyłączone do nośnika, takiego jak Sephadex. Przyłączenie może być bezpośrednie lub przez molekularny łącznik, zawierający 3—8 atomów węgla. Jeżeli sposób przyłączenia ligandu uniemożliwia jego zdolność do interakcji z enzymem, to mogą pojawić się trudności, których można uniknąć, używając cząsteczek łącznikowych. Użycie hydrofobowego „Mnkera" może jednak komplikować rozdział przez wprowadzenie elementu chromatografii hydrofobowej (p. poniżej). Przykłady udanej chromatografii powinowactwa obejmują oczyszczanie wielu różnych dehydrogenaz na nośniku z NAD+. Chociaż wiele dehydrogenaz może się przyłączać i eluować wspólnie, gdy kolumnę poddaje się działaniu rozpuszczonego NAD+, to kolejne użycie kolumn, raczej z substratem (niż koenzymem) lub elucja kolumny za pomocą usuwającej mieszaniny trójskładnikowej (ang. abortive ternary mixture) w wielu przypadkach umożliwia uzyskanie czystego enzymu. Chromatografia z barwnikiem jako ligandem i chromatografia hydrofobowa wykorzystują zasady analogiczne do zasad chromatografii powinowactwa Chromatografia z barwnikiem jako ligandem na nośnikach, takich jak błękit, zieleń lub czerwień Sepharose i chromatografia z ligandem hydrofobowym na nośniku, takim jak oktyi- lub fenyl-Sepharose są technikami ściśle spokrewnionymi z chromatografią powinowactwa. Pierwsza wykorzystuje jako unieruchomiony ligand barwnik organiczny, który służy jako analog substratu, koenzymu lub allosterycznego efektora. Elucja jest przeprowadzona za

ENZYMY-. WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 89

pomocą gradientu stężenia soli. W chromatografii z ligandem hydrofobowym, alkilowy lub arylowy węglowodór jest przyłączony do nośnika, takiego jak Sephadex. Zatrzymywanie białek na nośniku obejmuje hydrofobowe interakcje między łańcuchem alkilowym a regionami hydrofobowymi białka. Białka są nanoszone w roztworach, które zawierają duże stężenia soH (np. (NH4)2SO4) i są eluowane przy zmniejszającym się gradiencie stężenia tej samej soli. Elektroforeza w żelu połiakryłoamidowym wykrywa zanieczyszczenia w preparatach enzymów

Homogenność białka jest najlepiej oceniana przez elektroforezę w żelu połiakryłoamidowym (PAGE) przeprowadzoną w różnych warunkach. Jeżeii nałożona jest dostateczna ilość próbki, jednowymiarowa PAGE natywnego białka ujawni większe i mniejsze zanieczyszczenia białkowe. W dwuwymiarowej (O'Farrell) PAGE w pierwszym wymiarze, który zawiera mocznik i gradient pH utrzymywany przez polimeryzowane amfolity, zdenaturowane białka rozdzielają sie na zasadzie ich wartości pl przez zrównoważenie ich w polu elektrycznym. W drugim wymiarze białka, po zadziałaniu na nie SDS, rozdzielają sie na zasadzie wielkości mas cząsteczkowych ich protomerów (jeżeli występują). 0 WEWNĄTRZKOMÓRKOWYM ROZMIESZCZENIU ENZYMÓW WNIOSKUJE SIĘ NA PODSTAWIE TECHNIK HISTOCHEMICZNYCH, A TAKŻE PRZEZ IZOLOWANIE 1 BADANIE ORGANELLI SUBKOMORKOWYCH

W obrębie komórki bardzo ważne jest przestrzenne rozmieszczenie i przedziałowość (kompartmentacja) enzymów, substratów i kofaktorów. Na przykład w komórkach wątroby enzymy glikolizy są umiejscowione w cytoplazmie, podczas gdy enzymy cyklu kwasu cytrynowego w mitochondriach. Umiejscowienie enzymów w subkomórkowych organellach może być badane po frakcjonowaniu homogenatu komórkowego za pomocą wirowania z dużą szybkością. Badana jest wówczas zawartość enzymu w każdej frakcji.

Umiejscowienie poszczególnego enzymu w tkance lub komórce, w stosunkowo nie zmienionym stanie, jest często dokonywane za pomocą metod histochemicznych (histoenzymologia). Na cienkie (2—10 um) zamrożone skrawki tkanki działa się substratem dla odpowiedniego enzymu. W miejscu, w którym znajduje się enzym, powstaje produkt reakcji przez niego katalizowanej. Jeżeli produkt jest barwny i nierozpuszczalny, to pozostaje on w miejscu powstania i umiejscawia enzym. Histoenzymologia daje obraz względnie fizjologicznego rozmieszczenia enzymów. IZOENZYMY SĄ FIZYCZNIE ODMIENNYMI FORMAMI TEJ SAMEJ AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ

Chociaż takie terminy, jak „dehydrogenaza jabłczanowa" lub „glukozo-6-fosfataza" wydają się opisywać pojedynczą jednostkę katalityczną, to obejmują one wszystkie białka, które katalizują odpowiednio utlenianie ja błczanu do szczawiooctanu lub hydrolizę glukozo-6-fosforanu do glukozy i Pr Jeżeli np. techniki oczyszczania enzymów były zastosowane dla dehydrogenazy jabłczanowej z różnych źródeł (np. wątroba szczura i Escherichia coli), stało się oczywiste, że chociaż dehydrogenaza jabłczanowa wątroby szczura i E. coli katalizuje tę samą reakcje, ich właściwości fizyczne i chemiczne wykazują znaczne różnice. Fizycznie odmienne formy o tej samej aktywności katalitycznej mogą także występować w różnych tkankach tego samego organizmu, w różnych typach komórek, w subkomórkowych kompartmentach lub w organizmie prokariotycznym, takim jak E. coli. To odkrycie wynika z zastosowania metod rozdziału elektroforetycznego do oddzielenia elektroforetycznie odmiennych postaci określonej aktywności enzymatycznej. Wprawdzie określenie „izozym" (izoenzym) obejmuje wszystkie powyższe przykłady fizycznie różnych postaci o danej aktywności katalitycznej, w praktyce jednak, a zwłaszcza w medycynie klinicznej, „izozym" ma bardziej ograniczony sens, określając mianowicie fizycznie odmienne i rozdzielające się postacie danego enzymu, występujące w różnych typach komórek lub kompartmentach subkomórkowych człowieka. Izoenzymy są powszechne w surowicy i tkankach wszystkich kręgowców, owadów,

90 / ROZDZiAŁ 8

roślin i organizmów jednokomórkowych. Zarówno rodzaj, jak i liczba enzymów jest w równym stopniu różna. Znane są izoenzymy szeregu dehydrogenaz, oksydaz, aminotransferaz, fosfataz, transfosforylaz i enzymów proteolitycznych. Różne tkanki mogą zawierać różne izoenzymy, a te izoenzymy mogą się różnić w ich powinowactwie do substratu.

Zredukowany NBT (niebieski formazan) DEHYDflOGENAZA MLECZANOWA

O L-Mleezan

'-----------------------* V

NAD+

Możliwość rozdzielenia i identyfikacji izoenzymów ma znaczenie diagnostyczne Medyczne zainteresowanie izoenzymami było stymulowane odkryciem, że surowica człowieka zawiera kilka izoenzymów rlehydrngenazy mleczaiiowej, 1 ze ich względne proporcje zmieniają się znacznie w pewnych stanach chorobowych. Następnie opisano, jako wynik choroby, wiele dodatkowych przykładów zmian w proporcjach izoenzymów. Izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej surowicy mogą być ujawnione przez poddanie próbki surowicy elektroforezie, zazwyczaj w pH 8,6, używając jako nośnika skrobi, agaru lub żelu poliakryloamidowego. W tym pH izoenzymy mają różne ładunki elektryczne i wędrują do 5 odmiennych obszarów elektroforegramu. Zdolność izoenzymów do katalizowania redukcji barwników bezbarwnych do nierozpuszczalnej postaci barwnej wykorzystuje się w celu ich umiejscowienia. W typowym zestawie odczynników do wykrycia izoenzymu dehydrogenazy znajduje się: 1. Zredukowany substrat (np. mleczan). 2. Koenzym (NAD+). 3. Barwnik utleniony (np. sól tetrazolowa błękitu nitrowego [NBT]). 4. Związek pośrednio przenoszący elektrony miedzy NADH a barwnikiem (np. metosiarczan fenazyny [PMS]). 5. Bufor; w razie potrzeby jony aktywujące. Dehydrogenaza mleczan owa katalizuję przeniesienie 2 elektronów f 1 H+ z mleczanu na NAD+ (ryc. 8-8). Reakcja przebiega z dającą się zmierzyć szybkością tylko w obecności dehydrogenazy mleczanowej. Po spryskaniu eiektroforegramu mieszaniną odczynników testowych i inkubacji w temp. 37°C, reakcje przenoszenia elektronów zajdą tylko w tych miejscach, w których znajduje się dehydrogenaza mleczanowa (ryc. 8-9). Względne nasilenie barwy prążków można ocenić ilościowo za pomocą fotometru skaningowego (ryc. 8-10). Izoenzym o największym ładunku ujemnym określono jako Ir

H,C

O Plrngronlan

NADH+ + H+

Ryc. 8-8. Reakcja dehydrogenazy L-mleczanowej.

Ryc. 8-9. Wykorzystanie reakcji sprzężonych do oznaczania aktywności dehydrogenazy mleczanoMleczan SH

S Pirogronian

NAD*

NADH + H*

Zredukowany PMS

Utleniony NBT (bezbarwny)

Utleniony PMS

wej na elektroferogramie.

Izoenzymy są produktami ekspresji ściśle spokrewnionych genów Enzymy oligomeryczne z różnymi protomerami mogą występować w kilku postaciach. Często jedna tkanka wytwarza głównie jeden protomer, a inna — drugi protomer. Jeżeli protomery mogą się łączyć w różny sposób, aby utworzyć aktywny enzym (np. tetramer), tworzą się izoenzymy o tej aktywności enzymatycznej. Izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej różnią się między sobą na poziomie struktury czwartorzędowej. Oligomeryczna cząsteczka dehydrogenazy mleczanowej (m.cz. 130000) składa się z 4 protomerów 2 typów — H i M (mcz. ok. 34000). Tylko cząsteczka tetrameryczna ma aktywność katalityczną. Jeżeli uporządkowanie jest bez znaczenia, to te protomery mogą się ze sobą łączyć w następujących 5 kombinacjach: HHHH HtłHM

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 91

Norma

Wątroba

I

f

Ryc. 8-10.Prawidłowy i patologiczny wykres izoenzymów dehydrogenazy mleczanowej w surowicy ludzkiej, izoenzymy LDH rozdzielono na octanie celulozy w pH 8,6 i barwiono na obecność enzymu. Wykres fotometru pokazuje względną zawartość izoenzymów. Wykres A — surowica chorego z zawałem mięśnia sercowego; B — prawidłowa surowica; C — surowica chorego z chorobą wątroby, (Za zgodą Dr Me!virta Blacka, Mr Hugha Millera, St Luke's Hospital, San Francisco),

HHMM HM MM MMMM

W. celu wyjaśnienia związku miedzy izoenzymami dehydrogenazy mleczanowej, Market wykorzystał znane warunki do rozbicia i ponownego utworzenia struktury czwartorzędowej. Rozszczepienie i rekonstrukcja dehydrogenazy mleczanowej I^ub dehydrogenazy mleczanowej I, nie spowodowały utworzenia się żadnych nowych izoenzymów. Wynika to z faktu, że składają się one z 1 typu protomeru. Gdy tym samym zabiegom poddano mieszaninę dehydrogenazy Ij i dehydrogenazy mleczanowej I5, wówczas otrzymywano dehydrogenazę mleczanową I2, 13 i I+. Stwierdzone proporcje izoenzymów wskazywałyby na następujący skład podjednostek: Dehydrogenaza mlecza nowa Izoenzym Podjednostki HHHH HHHM HHMM H (vi (VI lvi JVIIVI In lvi

Synteza podjednostek H i M jest kontrolowana przez odmienne loci genetyczne, które ulegają odmiennej ekspresji w różnych tkankach, np. w sercu i mięśniach szkieletowych.

ILOŚCIOWA ANALIZA PEWNYCH ENZYMÓW OSOCZA MA ZNACZENIE DIAGNOSTYCZNE Pewne enzymy, proenzymy i ich substraty znajdują się stale we krwi krążącej zupełnie zdrowych ludzi, pełniąc określone funkcje fizjo-

logiczne. Do takich enzymów osocza należy m.in. lipaza lipo proteinowa, pseudochołinesteraza, proenzymy krzepnięcia krwi i fibrynolizy. Na ogół są one syntetyzowane w wątrobie, ale występują we krwi w takich samych lub większych stężeniach niż w tkankach.

Niefunkcjonalne enzymy osocza, jak sama

nazwa wskazuje, nie pełnią żadnej znanej funkcji fizjologicznej we krwi. Ich substraty często nie występują w osoczu, a same enzymy występują we krwi osób zdrowych w ilościach do miliona razy mniejszych niż w tkankach. Występowanie ich w osoczu, w ilościach powyżej wartości prawidłowych, sugeruje zwiększenie szybkości destrukcji określonych tkanek. Pomiar stężenia tych niefunkcjonalnych enzymów osocza może dostarczać lekarzowi cennych informacji przy ustalaniu rozpoznania i rokowaniu. W grupie niefunkcjonalnych enzymów osocza znajdują się enzymy występujące w wydzielinach gruczołów wydzielania zewnętrznego i „prawdziwe" enzymy wewnątrzkomórkowe.

92 / ROZDZIAŁ 8

Enzymy wydzielania zewnętrznego — amylaza trzustkowa, lipaza, fosfataza alkaliczna żółci i fosfataza kwaśna gruczołu krokowego — dyfundują do osocza. Prawdziwe enzymy wewnątrzkomórkowe w warunkach fizjologicznych nie występują w układzie krążenia. Małe stężenie niefunkcjonalnych enzymów osocza wynika z fizjologicznego rozpadu komórek Małe ilości niefunkcjonalnych enzymów stwierdzane w osoczu pochodzą z rozpadu erytrocytów, leukocytów i innych komórek zachodzącego nawet w warunkach fizjologicznych. Przy szybkim obumieraniu komórek uwalniające się z nich enzymy dostają się do krwi. Chociaż ogólnie uważa się, że zwiększone stężenie tych enzymów w osoczu świadczy o martwicy komórek, intensywne ćwiczenia fizyczne również powodują uwalnianie znacznej ilości enzymów mięśni. Stężenia niefunkcjonalnych enzymów osocza od wielu lat są wykorzystywane w diagnostyce klinicznej Praktykujący lekarze długo wykorzystywali ilościowe określenie stężenia pewnych niefunkcjonalnych enzymów osocza. Tę wartościową diagnostycznie i prognostycznie informację w większości przypadków otrzymuje się za pomocą całkowicie zautomatyzowanego wyposażenia. W tabeli 8-3 podano listę głównych enzymów wykorzystywanych w dziedzinie diagnostyki enzymatycznej. Dalsze szczegóły wykorzystania tych enzymów są podane w suplemencie, obejmując omówienie ważnych pojęć — czułości i swoistości testów diagnostycznych. ENDONUKLEAZY RESTRYKCYJNE DOSTARCZAJĄ NOWEJ METODY W DIAGNOSTYCE CHORÓB GENETYCZNYCH Ogromny postęp w rozpoznawaniu chorób genetycznych dokonał się od wprowadzenia technologii rekombinacji DNA. Chociaż od dawna wiedziano, że wszystkie choroby molekularne są konsekwencją zmienionego DNA, to techniki bezpośredniego badania sekwencji DNA stały się dostępne od niedawna. Rozwój badań hybrydyzacjj fragmentów DNA wskazał drogę do technik o dostatecznej czułości do prenatalnego zbadania zaburzeń dziedzicznych

Tabela 8-3. Główne enzymy osocza wykorzystywane w diagnostyce klinicznej Wiele enzymów nie jest swoistych dla podanych chorób; szczegóły dotyczące warunków, w których enzymy te wykazują zmienną aktywność, podano w suplemencie Enzym osocza

Aminotransferazy Aminotransferaza asparaginianowa (AspAT lub S60T) Aminotransferaza alaninowa (AIAT lub SGPT) Amylaza Cerutoplazmina

Główna wykorzystanie diagnostyczne Zawał serca Wirusowe zapalenie wątroby

Ostre zapalenie trzustki Zwyrodnienie wątrobowo- soczewko watę {choroba Wilsona) Fosfokinaza kreatynowa Choroby mięśni i zawał serca Transpeptydaza y-gluta- Różne choroby wątroby mylowa Dehydrogenaza mlecza- Zawał serca nowa (izoenzymy) Lipaza Ostre zapalenie trzustki Fosfataza kwaśna Fosfataza alkaliczna {izoenzymy)

Rak gruczołu krokowego z przerzutami Różne choroby kości, choroby wątroby z utrudnionym odpływem żółci

przez mapowanie DNA, pochodzącego z komórek płodowych w płynie owodniowym, za pomocą enzymu restrykcyjnego. Zasadniczo badania DNA mogą być zastosowane w diagnostyce większości chorób genetycznych. Na przykład do prenatalnego wykrycia talasemii (charakteryzującej się wadą w syntezie podjednostek hemoglobiny; p. rozdz. 7), badaniem wykonanym z użyciem części genu dla normalnej podjednostki hemoglobiny można wykryć skrócenie lub brak fragmentu restrykcyjnego, wynikające z delecji w tym genie, jakie ma miejsce w pewnych a-talasemiach i pewnych rzadkich typach |3- i p,5-talasemiach. Alternatywnie, można wykonać badanie z użyciem syntetycznego cDNA, który hybrydyzuje z sekwencją fl-globiny, zawierającą nonsensowną mutację obecną w pewnych p-talasemiach, ale

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 93

nie z normalnym genem fi-globiny. Nieobecność osoezowego inhibitora proteazy o^-antytrypsyny jest związana z rozedmą płuc i marskościa. wątroby. Obecność nieaktywnej c^-antytrypsyny wykryto sondą wykrywającą nieaktywny allel, który zawiera punktową mutacje w genie o^-antytrypsyny. Metoda hybrydyzacji może także być użyta do wykrycia zmian genetycznych prowadzących do utraty miejsc działania dla endonukleazy restrykcyjnej (p. rozdz, 38). Na przykład mutacja punktowa kodonu dla Glu (GAG) na kodon Val (GTG), charakterystyczna dla niedokrwistości sierpowatej, może być wykryta w genie (ł-globiny, uzyskanym z komórek pochodzących tylko z 10 ml płynu owodniowego, za pomocą endonukleazy restrykcyjnej Mst II lub Sau I. BADANIE PRODUKTÓW TRAWIENIA ENZYMAMI RESTRYKCYJNYMI MOŻE UJAWNIĆ HOMOLOGICZNE GENY Z RÓŻNYMI SEKWENCJAMI ZASAD Badania DNA mogą być także wykorzystywane do wykrycia sekwencji ściśle sprzężonych "z genem, ale nie umiejscowionych w obrębie interesującego genu. Badania takie można rozszerzyć o określenie swoistych chromosomowo zmian (różnice w sekwencji między homologicznymi chromosomami). Przez trawienie DNA endonukleazami restrykcyjnymi uzyskuje się różne mapy restrykcyjne (wykresy fragmentów DNA) z homologicznych genów, które zawierają jednak różne sekwencje zasad. Zjawisko to określa się jako polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (ang. restrietion fragment length polymorphism; skrót — RFLP). W przypadku choroby genetycznej sprzężonej z polimorfizmem długości fragmentów restrykcyjnych, nosiciel jej będzie miał 1 chromosom z prawidłowym genem i 1 z genem wadliwym. Gdy fragmenty restrykcyjne poddaje się rozdziałowi, wówczas wykrywa się 2 pasma hyb-iydyzacji (odmienne od pojedynczego pasma,

jeżeli oba geny są identyczne). Potomek, który odziedziczył chromosom kodujący chorobę wykazuje wprawdzie tylko pojedyncze pasmo hybrydyzacji, ale różniące się od pasma produkowanego przez prawidłowe chromosomy. Zjawisko RFLP wykorzystuje się do wykrycia cechy niedokrwistości sierpowatej (związanej z Hpa I RFLP) i p-talasemii (związanej z Hind III i Bam HI RFLP). Metodę opartą na RFLP rozwinięto do wykrycia dziecięcej fenyloketonurii (p. rozdz. 32). Skoro RFLP nie powoduje choroby, lecz jest spowodowany zmianami chroinosomaJnymi, umiejscowionymi blisko wadliwego genu, badanie to nie jest niezawodne. RFLP jest punktem wyjścia do badań zmierzających do identyfikacji genu odpowiedzialnego za sprzężone z nim choroby. Ten sposób podejścia wykorzystano już w badaniach skriningowych zjawisk mutacyjnych uczestniczących w powstawaniu retinobiastoma i choroby Huntingtona. Następne przykłady wykorzystania enzymów restrykcyjnych w diagnostyce p. rozdz. 36. PIŚMIENNICTWO Methods in Enzymohgy. Over 130 volumes, 1955—present. Advances in Enzymohgy. Issued annually. Boyer PD, Lardy H, Myrbach K (editor): The Enzymes, 3rd ed. 7 vols. Academic Press, 1970-1973. Bergmeyer HH, Bergmeyer J, Grass M: Methods of EnivmkAnalysis. Vol. XI, Antigens and Antibodies. VCH Publishers, 1986. Fersht A: Enzyme Structure and Mechanizm. 2nd ed. Freeman, 1985. Freifelder D: Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry and Moleadar Biology. Freeman, 1982. Kaiser T, Lawrence DS, Rokita SZ: The chemical modification of enzyme specificity. Ann Rev Biochem 1985;54:597. Naąui A: Where are the asymptotes of Michaelis-Menten? Trends Biochem Sci 1986; 1J:64. Scopes R: Protein Purifwation: Principles and Practke. Springer-Verlag, 1982. Tijssen P: Practice and Theory of Enzyme fmmunoassays. Elsevier, 1985.

9

Enzymy: k inetyka Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE W tym rozdziale zostanie omówiony charakter chemiczny katalizy przeprowadzonej przez enzymy oraz charakter interakcji enzym-substrat odpowiedzialny za swoistość reakcji tych biologicznych katalizatorów.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Rozpatrując główne czynniki, tj. stężenie enzymu i substratu. temperaturę, pH i inhibitory, które wpływają na aktywność enzymu, 3 ostatnie są szczególnie interesujące w badaniach klinicznych. Ponieważ aktywność enzymów zwiększa się wraz ze wzrostem temperatury, szybkość procesów metabolicznych znacznie się zwiększa podczas gorączki. Jeżeli gorączka jest długotrwała, rezultaty mogą być fatalne, częściowo z powodu wyczerpania metabolicznego. Obniżenie temperatury ciała (hipotermia), a w konsekwencji zmniejszenie aktywności większości enzymów, okazuje się użyteczne wówczas, gdy zachodzi potrzeba redukcji całkowitego metabolizmu (np. podczas operacji na otwartym sercu lub transportu narządów przeznaczonych do transplantacji). Zasadniczą regułą biologiczną jest homeostaza, tj. utrzymywanie wewnętrznego środowiska ciała bardzo zbliżone do jego normalnych warunków. Stosunkowo małe zmiany pH mogą wpływać na aktywność wiciu enzymów lub białek. Większość leków działa przez wpływ na reakcje katalizowane przez enzymy. Wiele leków przypomina naturalne substraty i działa jako inhibitory kompetycyjne aktywności enzymatycznej. Lepsze zrozumienie farmakologii i toksykologii zależy od prawdziwej znajomości zasad hamowania działania enzymów.

TWORZENIE I ZANIK STANÓW PRZEJŚCIOWYCH W CAŁKOWITEJ REAKCJI WIĄŻE SIĘ Z DYSKRETNYMI ZMIANAMI W WOLNEJ ENERGII W reakcji zastąpienia grupa Y zastępuje pozostającą grupę X: V + R - X

Y - R + X

Ta reakcja przebiega w 2 reakcjach połówkowych: 1) tworzenie stanu przejściowego, w którym Y i X są przyłączone do R, i 2) zanik stanu przejściowego i utworzenie Y-R + X produktów: ........R.......... Y+R-X Stan przejściowy

Jak we wszystkich reakcjach chemicznych, zmiany w wolnej energii są związane z każdą połówką reakcji. AGp definiuje się jako zmianę w wolnej energii związaną z tworzeniem stanu przejściowego, a AGD jako zmianę w wolnej energii związaną z zanikiem stanu przejściowego do utworzenia produktów:

m

[V- R] [Y] [Y -R -X]

gdzie zmiana w wolnej energii dla całej reakcji — AG jest sumą zmian wolnej energii w obu reakcjach połówkowych: AG= AG + AG F

"

Tak jak dla każdego równania z dwoma członami, nie jest tu możliwe wywnioskowanie

ENZYMY: KINETYKA / 95

znaku lub wielkości ani AGF, ani AGD przez zbadanie algebraicznego znaku i wielkości AG. Nie ma wiec możliwości prostego wnioskowania na podstawie zmian wolnej energii AG dla całej reakcji o zmianach wolnej energii związanych z tworzeniem i zanikiem stanów przejściowych. Skoro kataliza jest ściśle związana z AG> i AGD, to pociąga za sobą to, że termodynamika całkowitej reakcji (AG) nie może nam powiedzieć nic o drodze przebiegającej reakcji {tj. jej mechanizmie). Jest to zadanie kinetyki. Profile reakcji ilustrują zmiany wolnej energii związane z tworzeniem i zanikiem stanów przejściowych Profile reakcji na ryc. 9-1 i 9-2 ilustrują zależności między AG, AGp i AG D Należy Wielkość wolnej energii

Reakcje katalizowane enzymatycznie obejmują stany przejściowe przy niższym poziomie energii niż reakcje niekatalizowane Na rycinie 9-3 przedstawiono profile reakcji 2 różnych stanów przejściowych w tej samej reakcji całkowitej. W obu przypadkach, wielWielkoSfi wolnej energii [V ■ - ■ R ■ ■ ■ Xl

■x]' AGF

Y

+ R-X

Ryc. 9-3. Profil reakcji dla tworzenia 2 różnych s t a n ó w p r z e j ś c i o w y c h [ Y- R - X ] a i [ Y - - R - X ]b i towarzysząca im wolna energia tworzenia, AGp

iAG£ r

Y + R-X

y---R

AGF

AG o<0 A6<0

Y-R + X Ryc. 9-1. Profil reakcji dla reakcji zastąpienia z ujemną całkowitą zmianą w wolnej energii, tj. AG

Wielkość we In ej enerflil AGD A GF> 0

Ryc. 9-2. Profil

AG>0

reakcji dla reakcji zastąpienia z dodatnią całkowitą zmianą w wolnej energii, tj. AG>0. Y + R-X

zwrócić uwagę, że podczas gdy na ryc. 9-1 AG jest ujemna (AG<0), a na ryc. 9-2 AG jest dodatnia (AG > 0), w obu przypadkach AGFjest dodatnia (AG t > 0) i AG D jest ujemna (AGD<0). Dlatego, jak stwierdzono powyżej, ze znaku i wielkości AG nie można wnioskować o znaku i wielkości ani AGF ani AGD. -

kość wolnej energii tworzenia stanu przejściowego reprezentuje barierę energetyczną dla cafej reakcji. Bariera energetyczna dla reakcji, która przebiega przez stan przejściowy [Y — R-"X]b, jest niższa niż bariera energetyczna dla reakcji, która przebiega przez stan przejściowy [Y — R — X]a- Katalizatory zmieniają wielkość wolnej energii stanu przejściowego. W powyższym przykładzie [Y —R — X]a przedstawia stan przejściowy dla niekatalizowanej reakcji, natomiast [Y •■• R ■*■ X]b przedstawia stan przejściowy dla reakcji katalizowanej. Wszystkie katalizatory, łącznie z enzymami, zmniejszają wolną energię tworzenia stanu przejściowego AGp. Następnie należy zauważyć, że skoro kataliza nie ma żadnego wpływu na AG, zmiana w wolnej energii dla reakcji całkowitej jest niezależna od katalizy. Skoro stała równowagi dla reakcji chemicznej jest funkcją standardowej zmiany wolnej energii dla reakcji: AG°= -RTIn K eq

to powoduje to, że enzymy i inne katalizatory nie mają żadnego wpływu na stałą równowagi reakcji.

96 / ROZDZIAŁ 9

ABY REAGOWAĆ, CZĄSTECZKI MUSZĄ SIĘ ZBLIŻYĆ DO SIEBIE NA ODLEGŁOŚĆ TWORZONEGO WIĄZANIA Z WYSTARCZAJĄCĄ ENERGIĄ, ABY PRZEKROCZYĆ BARIERY ENERGETYCZNE MIĘDZY STANAMI PRZEJŚCIOWYMI Teoria kinetyczna lub teoria zderzeń dla reakcji chemicznych zawiera 2 kluczowe pojęcia: 1. Aby ze sobą reagować, cząsteczki muszą się zderzać (tj. być jedna obok drugiej w obrębie odległości tworzonego wiązania). 2. W zderzeniu kończącym się reakcją, reagu jące cząsteczki muszą mieć wystarczającą ilość ener gii, aby przekroczyć barierę energetyczną reakcji. Czynniki, które zwiększają częstość zderzeń i energię kinetyczną zwiększają szybkość reakcji Jeżeli cząsteczki mają wystarczającą energię aby reagować, to wszystkie czynniki, które zwiększają częstość zderzeń między cząsteczkami, będą zwiększały szybkość reakcji. Natomiast czynniki, które zmniejszają albo częstość zderzeń, albo energię kinetyczną, będą zmniejszały szybkość reakcji. Jeżeli te same cząsteczki w populacji mają niewystarczającą energię aby reagować, to podwyższenie temperatury, która zwiększa energię kinetyczną, będzie zwiększało szybkość reakcji. Te koncepcje przedstawiono Bariera energetyczna

Energia kinetyczna Hyc. 9-4. Bariera energetyczna dla reakcji chemicznych.

na ryc. 9-4. W przypadku A żadna, w B część i w C wszystkie cząsteczki mają wystarczającą energię kinetyczną, aby przekroczyć barierę energetyczną reakcji. W nieobecności katalizy enzymatycznej wieJe reakcji chemicznych zachodzi bardzo wolno w temperaturze żywej komójki. Jednak, nawet w tej temperaturze, cząsteczki są w ruchu i podlegają zderzeniom. Nie reagują one szybko,

ponieważ większość ma niewystarczającą energię kinetyczną do przekroczenia bariery energetycznej reakcji. W znacznie wyższej temperaturze (i większej energii kinetycznej) reakcja będzie zachodziła dużo szybciej. To, że reakcja zachodzi świadczy o tym, że jest to reakcja samorzutna (AG<0). W niższej temperaturze reakcja przebiega samorzutnie, ale wolno; w wyższej temperaturze — samorzutnie i szybko. Zadaniem enzymów jest spowodowanie, aby w warunkach panujących w żywych komórkach reakcje samorzutne zachodziły szybko. Wiele reakcji chemicznych ważnych biologicznie obejmuje tworzenie lub rozpad wiązań kowalencyjnych W reakcji przeniesienia grupy: D-G + A^A-G+D grupa G jest przenoszona z donora D—G na akceptor A. Całkowita reakcja obejmuje zarówno rozbicie wiązania D—G, jak i tworzenie nowego wiązania A—G. Katalizowane enzymatycznie reakcje przeniesienia grupy mogą być przedstawione następująco: DAEnz G G EnzA G

To uwydatnia 3 główne cechy katalizowanych enzymatycznie reakcji przenoszenia grup: 1. Każda połowa reakcji zawiera zarówno rozbicie, jak i tworzenie wiązania kowalencyj nego. 2. Enzym reaguje zarówno z D—G, jak A. 3. Podczas gdy w całkowitej reakcji enzym działa katalitycznie (tzn. jest wymagany tylko w śladowych ilościach i może być odzyskiwany w postaci nie zmienionej, gdy reakcja jest za kończona), dla każdej polowy reakcji enzym jest stechiometrycznym substratem (tzn. jest on wymagany w stosunku molowym z innymi substratami równymi:!). Można rozważyć wiele dodatkowych reakcji biochemicznych, w których D, A lub oba mogą być nieobecne. Na przykład reakcje izomeryzacji (takie, jak przekształcenie glukozo-6-fosforanu i glukozo-1-fosforanu) mogą być przedstawione jako reakcje, w których zarówno D, jak i A są nieobecne: S ^T Enz

ENZYMY: KINETYKA / 97

KILKA REAKCJI CZĄSTKOWYCH 1 KOMPLEKSY ENZYM-SUBSTRAT UCZESTNICZĄ W REAKCJACH KATALIZOWANYCH ENZYMATYCZNIE Powyższe prezentacje nie podkreślają jeszcze innej kluczowej cechy reakcji katalizowanych enzymatycznie udziału w całkowitej reakcji 2 lub więcej pośrednich form kompleksu EnzS i późniejszego udziału zespołu kolejnych reakcji

połówkowych. Prezentacją reakcji przeniesienia grupy, która podkreśla te cechy, może być Enz-G

Enz DG

AG

A+ B -* A-B

Enz-G**

jest, jak zostanie przedstawione poniżej, proporcjonalna do stężeń obu A i B, przyłączenie

Enz-G

w której Enz-G, Enz-G* i Enz-G** reprezentują kolejne kompleksy EnzS w reakcji całkowitej. Przyłączanie substratów do enzymu zwiększa ich stężenie miejscowe i sprowadza je na odległość tworzenia wiązania Aby każda z powyższych reakcji zaszła, wszystkie substraty muszą zbliżyć się do siebie na odległość tworzenia wiązania (lub rozerwania wiązania). Dla homogennego roztworu chemicznego w nieobecności katalizatorów stężenia reagujących cząsteczek w roztworze są stałe. Ten warunek nie jest dłużej zachowany po wprowadzeniu katalizatora. Katalizator musi mieć powierzchniowe domeny, które przyłączają reagujące cząsteczki. Mimo że to przyłączenie jest procesem odwracalnym, całkowita stała równowagi dla reakcji przyłączania silniej uprzywilejowuje przyłączenie niż wolne formy reagujących cząsteczek. Jakościowo można przedstawić to następująco: Substrat + Katalizator -± Kompleks b st rat - kata ł izato r

su

Ilościowo można wyrazić ścisłość asocjacji miedzy substratem R a katalizatorem C w formie stałej dysocjacji Kd dla kompleksu R-C lub stałej równowagi dla reakcji: +c [CJ

[R-C] 7 — Biochemia

Mała wartość Kd przedstawia zatem ścisły kompleks R-C. ' Jedną ważną konsekwencją jest to, że gdy substrat przyłączy się do katalizatora, wówczas zwiększa się stężenie substratu w określonym obszarze roztworu wyraźnie powyżej jego stężenia w wolnym roztworze. Dlatego nie ma się dłużej do czynienia z homogennym, ale heterogennym roztworem chemicznym. Jeżeli katalizator dla dwucząsteczkowej (dwusubstratowej) reakcji przyłącza oba substraty, stężenie miejscowe każdego z nich jest zwiększone o czynnik, który zależy od indywidualnego powinowactwa (wartość Kj) do katalizatora. Jeżeli szybkość całkowitej reakcji dwucząsteczkowej

obu A i B przez katalizator może powodować ogromne (kilka tysięcy razy) zwiększenie całkowitej szybkości reakcji.

Obszar enzymu związany z przyłączeniem substratu i katalizą jest nazywany „miejscem aktywnym" Kluczową właściwością enzymów jest ich zdolność do przyłączenia jednego lub (coraz częściej) obu substratów w reakcji bimolekularnej z towarzyszącym miejscowym zwiększeniem stężenia substratu i wynikającej z tego miejscowej szybkości reakcji. Enzymy są zarówno niezwykle czynnymi, jak i bardzo wybiórczymi katalizatorami. Aby zrozumieć te charakterystyczne właściwości enzymów, należy wprowadzić pojecie „miejsca aktywnego" lub „katalitycznego"*. Ogromna wielkość białek, w stosunku do substratów, prowadzi do koncepcji, że ograniczony obszar enzymu, „miejsce aktywne", jest związany z katalizą. Początkowo było intrygujące, dlaczego enzymy są tak ogromne, gdy tylko część ich struktury okazuje się być konieczna do przyłączenia substratu i katalizy. Dzisiaj wiadomo, że z substratem reaguje dużo większa część cząsteczki białka niż to poprzednio przypuszczano. Gdy zwiększa się zapotrze♦ Podczas gdy wiele tekstów zrównuje aktywne i katalityczne miejsca enzymów, w enzymach znajdują się inne „aktywne" miejsca związane raczej z regulacją aktywności enzymu niż z pośrednią enzytnologią procesu katalitycznego per se. Użyto zatem terminu „miejsce katalityczne" aby uniknąć dwuznaczności.

98 / ROZDZIAŁ 9

bowanie na miejsca allosteryczne równej wielkości, wówczas wielkość enzymów nie powinna być dłużej niespodzianką. Wiele właściwości enzymów może być zrozumiałych na podstawie sztywnego modelu „zamka i klucza" miejsca aktywnego Model miejsca katalitycznego, zaproponowany przez Emila Fischera, przedstawiał interakcję między substrałem a enzymem na zasadzie analogii „zamka i klucza". Ten model „zamka i klucza" lub sztywny model matrycowy (ryc. 9-5) jest ciągle użyteczny w celu zrozumienia pewnych właściwości enzymów, np. uporządkowanego przyłączenia 2 lub więcej substratów (ryc. 9-6) lub krzywej kinetyki prostego nasycenia substratem.

Ryc. 9-5. Przedstawienie tworzenia kompleksu EnzS zgodnie z matrycową hipotezą Fischera.

Ryc. 9-6. Przedstawienie kolejnej adsorpcji koenzymu (CoE) i 2 substratów (S, i Ss) do enzymu według hipotezy matrycowej. Zakłada się, że koenzym ma grupę niezbędną do przyłączenia pierwszego substratu (S,), który z kolei ułatwia przyłączenie S:

W modelu „indukowanego dopasowania się" miejsca katalitycznego, substrat indukuje konformacyjną zmianę w enzymie, która „tworzy" miejsce katalityczne Niefortunna cechą modelu Fischera jest założenie sztywności miejsca katalitycznego. Bardziej uniwersalnym modelem jest model „indukowanego dopasowania się" Koshlanda. Ten model miał znaczne potwierdzenie doświadczalne. W modelu Fischera założono, że miejsce katalityczne jest z góry ukształtowane w taki sposób, że pasuje do substratu. W modelu indukowanego dopasowania się substrat indukuje konformacyjną zmianę w enzymie. Zmiana ta dotyczy ustawienia reszt

aminokwasowych lub innych grup enzymu we właściwym położeniu przestrzennym do związania substratu, katalizy lub obu zjawisk łącznie. W przykładzie z ryc. 9-7 zarówno grupy hydrofobowe (zakreskowane) jak i grupy naładowane elektrycznie (zakropkowane) są zaangażowane w przyłączeniu substratu. W katalizie

Ryc. 9-7. Dwuwymiarowe przedstawienie indukowanego dopasowania się przez zmianę konformacyjną w strukturze białka. Należy zwrócić uwagę na odpowiednie pozycje kluczowych reszt aminokwasowych przed przyłączeniem i po przyłączeniu substratu.

bierze udział reszta fosfoseryny (—P) i grupa —SH reszty cysterny. Inne reszty, nie biorąte udziału w żadnym procesie, są reprezentowane przez reszty Lys i Met. W nieobecności substratu i;rupy katalityczne i wiążące substrat są od siebie oddalone na odległość kilku wiązań. Zbliżenie się -ubstratu wywołuje zmianę konformacyjną w biał ku enzymatycznym, ustawiając w odpowiedni sposób grupy uczestniczące w wiązaniu substratu i katalizie. W tym samym czasie zmienia się również przestrzenne ustawienie innych obszarów — Lys i Met są teraz blisko siebie (ryc. 9-7). Analogi substratów mogą powodować pewne, ale nie wszystkie, zmiany właściwej konformacji (ryc. 9-8). Po przyłączeniu właściwego substratu A wszystkie grupy (przedstawione jako zaciemnione kółka) ustawiają się we właściwym położeniu. Przyłączenie analogu EnzS substratu, który jest

Eni + S B

Ryc. 9-8. Przedstawienie zmian konformacyjnych w białku enzymatycznym po przyłączeniu substratu (A) i nieaktywnych analogów substratu (B, C) {według Koshlanda).

ENZYMY; KINETYKA / 99

zbyt „gruby" (ryc. 9-8B) lub zbyt „chudy" (ryc, 9-8C) indukuje nieprawidłowe ustawienie grup. Ostatnią cechą enzymu jest miejsce pokazane jako małe nacięcie z prawej strony. Można sobie wyobrazić przyłączenie się w tym miejscu cząsteczki regulatorowej i „ściąganie w dół" jednego z ramion polipeptydowych wrazz grupą katalityczną. W takim przypadku może zachodzić przyłączenie substratu, ale nie kataliza. Jak to ilustruje model indukowanego dopasowania się, reszty aminokwasów, które znajdują się w miejscu katalitycznym, mogą być oddalone od siebie w strukturze pierwszorzędowej, ale przestrzennie zbliżone w strukturze trzeciorzędowej. Katalityczne miejsca Itzozymu, rybonukieazy i wielu innych enzymów znajdują się w bruzdach powierzchni enzymu Lizozym występujący we łzach, śluzie nosowym, plwocinie, tkankach, soku żołądkowym, mleku i białku jaja, katalizuje hydrolizę wiązań P-1,4 kwasu N-acetyloneuraminowego w proteoglikanach i glukozoaminoghk ariach. Jego działanie polega na niszczeniu ścian komórkowych wielu bakterii Gram-dodatnich, przedostających się z powietrza do łez i śluzu nosowego. Lizozym jest zbudowany z jednego łańcucha polipeptydowego, składającego się ze 129 reszt aminokwasowych. Ponieważ nie ma koenzymu ani jonu metalu, kataliza, swoistość i trójwymiarowa struktura są określone wyłącznie przez te reszty aminokwasowe. W cząsteczce lizozymu są małe obszary struktury harmonij-

kowej, a-heliksu i szerokie obszary struktury nie uporządkowanej! Cząsteczka ma przebiegającą przez środek bruzdę, w której znajduje się miejsce katalityczne, z 6. „podmiejscami" (ang. subsites) (ryc. 9-9), które przyłącza różne substraty lub inhibitory. Reszty aminokwasowe odpowiedzialne za rozbicie wiązania leżą między miejscami D i E, blisko grup karboksylowych Asp 52, Glu 35. Glu 35 przekazuje protony wiązaniu acetalowemu substratu, podczas gdy ujemnie naładowany Asp 52 stabilizuje powstający jon karboniowy. Katalityczne miejsce rybonukieazy leży w obrębie bruzdy podobnej do bruzdy lizozymu, w poprzek której leżą 2 reszty aminokwasowe — His 12 i His 119. Już wcześniejsze badania chemiczne wskazywały na obecność tych 2 aminokwasów w miejscu katalitycznym enzymu. Obie reszty aminokwasowe znajdują się blisko miejsca wiążącego kwas urydylowy (ryc. 9-10).

411

Grupa fosforanowa

Ryc. 9-10. Struktura rybonukieazy określona za pomocą dyfrakcji promieni X. Liczby odpowiadają swoistym resztom aminokwasowym (p. też ryc. 6-7).

A) Asp 101 1 Trp 62 (§) Ser 100 Trp63 I

\ Ala 107 f) Argt14

Ryc. 9-9. Schematyczne

Wspólny motyw struktury Asp 52 [ Glu 35 Ala 110 Ser 36

przedstawienie miejsca katalitycznego w okolicy bruzdy lizozymu. Punkty A—F przedstawiają reszty glikozydowe heksasacharydu. Pewne reszty aminokwasowe, lezące w okolicy bruzdy, są podane wraz z ich numerami w sekwencji lizozymu (według Koshlanda),______

pierwszorzędowej występuje w miejscach katalitycznych licznych enzymów hydrolitycznych Struktury pierwszorzędowe miejsc katalitycznych enzymów hydrolitycznych wykazują wiele podobieństw (tab. 9-1). Może to oznaczać, że liczba mechanizmów, według których zachodzi rozrywanie wiązań w układach biologicznych, jest stosunkowo mała. W świetle tych podobieństw nie jest zaskakujące to, że sekwencje aminokwasów blisko miejsc katalitycznych tego samego enzymu, z różnych gatunków, wykazują nawet jeszcze większe podobieństwo.

100 / ROZDZIAŁ 9 Tabela 9-1. Sekwencje aminokwasów i sąsiedztwie miejsc katalitycznych kilku proteaz wołu. w stawiono regiony miejsca 30 stronie reszty serylowej (S) i histydylowej (H)* Przedkatalitycznego Sekwencja aminokwasów Enzym Sekwencja aminokwasów wokółseryny wokół histydyny ® (§ Trypsyna

D S C Q D G

Chymotrypsyna A S S C M G

Q D (•

Chymotrypsyna B S S C M G D Trombina

D A C E G

D G >) G

=)

G Q D Q >)

G PV V C

s GK

V V S A A ® C Y K SG

G P LV

K KN

V V T A A ® G G V T T

G

c P LV c

Q KN

V V T A A ® C G V T T

G P FV M K SP V L T A A @ C LL Y P G * Reprodukowano za zgodą z: Dayhoff MO (red.) Atlas Sekwencji Białek i Struktury,t. 5, Narodowa Fundacja Badań Biomedycznych, 1972.

W OGRANICZONYM ZAKRESIE TEMPERATUR SZYBKOŚĆ REAKCJI KATALIZOWANYCH ENZYMATYCZNIE ZWIĘKSZA SIĘ WRAZ ZE WZROSTEM TEMPERATURY Ma rycinie 9-11 przedstawiono wpływ temperatury na typową reakcję katalizowaną enzymatycznie. Szybkość reakcji początkowo się Optimum temperatury

Temperatura (°C) Ryc. 9-11. Wpływ temperatury da szybkość hipo tetycznej reakcji katalizowanej enzymatycznie.

zwiększa, wraz ze wzrostem temperatury, z powodu zwiększenia energii kinetycznej reagujących cząsteczek. Ostatecznie energia kinetyczna enzymu przekracza jednak barierę energetyczną do rozerwania słabych wiązań wodorowych i hydrofobowych, które utrzymują ich strukturę drugo- i trzeciorzędową. W tej temperaturze denaturacji dominuje towarzysząca strąceniu strata aktywności katalitycznej enzymu. Dlatego enzymy wykazują optymalną temperaturę.

Niemniej nie jest to podstawowy parametr, ponieważ optymalna temperatura zależy od czasu trwania próby użytej do jej określenia, tj. im dłużej enzym jest utrzymywany w temperaturze, w której jego struktura jest mało stabilna^ tym bardziej prawdopodobne jest to, że będzie zdenaturowany. Współczynnik temperatury lub Q1B jest to

czynnik, o który się zwiększa szybkość procesu biologicznego przy wzroście temperatury 0 10°C. Szybkość wielu procesów biologicz nych, np. szybkość skurczów izolowanego ser ca, w przybliżeniu podwaja się wraz ze wzros tem temperatury o 10°C {QI0 =2). Dla większości enzymów optymalne temperatury są takie same lub wyższe od tych, jakie występują w miejscu ich działania, tj. w komórkach. Na przykład enzymy mikroorganizmów przystosowanych do wzrostu w naturalnych gorących źródłach mogą wykazywać optymalną temperaturę blisko temperatury wrzącej wody, pH WPŁYWA NA AKTYWNOŚĆ ENZYMU PRZEZ ZMIANĘ ŁADUNKU GRUPZJON1ZOWANYCH ENZYMU 1 CZĘSTO TAKŻE SUBSTRATU Gdy aktywność enzymu zmierzy się w kilku wartościach pH, obserwuje się wówczas, że optymalna aktywność mieści się na ogói między wartościami pH 5,0—9,0, niemniej kilka enzymów, np. pepsyna, jest aktywnych przy wartościach pH wyraźnie wykraczających poza ten zakres. Kształt krzywych wyrażających zależność aktywności od pH określają następujące czynniki: 1. Denaturacja enzymu przy małych i dużych wartościach pH.

ENZYMY: KINETYKA / 101 2. Zmiany w ładunku enzymu i (lub) sub-

stratów. W przypadku enzymu pH może wrjłyr wać na J*ego aktyvjnaś£j^!^x3rirlar\c fltrnktuj; fub^przez zmianę ładunku reszty aminokwasowej, biorącej udział w przyłączaniu substratu lubwkata]izie. Aby to zilustrować, należy wziąć pod uwagę ujemnie naładowany enzym (Enz~) reagujący z dodatnio naładowanym substratem (SH+): SH* >EnzSH

Enz

Przy niskim pH Enz~ dąży do przyłączenia protonów i traci swój ładunek EnzH ujemny: Enz +

Przy wysokim pH SH+ jonizuje i traci swój ładunek dodatni: SH+-S+ H+ Ponieważ, z definicji, jedynymi formami, które będą wchodzić w interakcje są SH+ i Enz , krańcowe wartości pH będą zmniejszały skuteczne stężenie Enz~ i SH+, zmniejszając w ten sposób szybkość reakcji fryc. 9-12). Tylko na 100 Enz"

Niskie pH wysokie

Ryc. 9-12. pH na aktywność

Wpływ enzymu.

obszarze zakreskowanym na krzyż zarówno Enz, jak i S są we właściwym stanie jonowym i największe stężenie Enz i S są odpowiednio naładowane w punkcie X. Enzymy- mogą takie podlegać zmianom w konfqrmacjj_na skutek zmian pH. Grupy mające ładunek, dystalne w stosunku do regionu, w którym przyłącza się substrat, mogą być niezbędne do utrzymania aktywnej struktury trzecio- i czwartorzędowej. Jeżeli zmieni się ładunek elektryczny tych grup, białko może się rozluźnić, stać się bardziej zbite lub dysocjować na podjednostki —wszystko to powoduje stratę

aktywności, W zależności od ostrości tych zmian aktywność może iub nie może być przywrócona, gdy enzym powróci do swojego optymalnego pH.

JEŻELI SUBSTRATY SĄ OBECNE W PRAWIE RÓWNO MOLOWYCH PROPORCJACH,SZYBKOŚĆ REAKCJI JEST PROPORCJONALNA DO STĘŻENIA WSZYSTKICH SUBSTRATÓW W dużych stężeniach substratów zarówno liczba cząsteczek mających dostateczną energię, aby reagować, jak i częstość ich zderzeń są duże. Ten stan utrzymuje się niezależnie od tego, czy wszystkie cząsteczki, czy tylko ich część ma wystarczającą energię, aby reagować. Biorąc pod uwagę reakcję, w której uczestniczą 2 różne cząsteczki A i B: A+B-* AB podwojenie stężenia albo A albo B podwoi szybkość reakcji. Podwojenie stężenia zarówno A, jak i B zwiększy prawdopodobieństwo zderzenia 4-krotnie. Szybkość reakcji zwiększy się zatem 4-krotnie. Szybkość reakcji jest proporcjonalna do stężeń cząstek reagujących. Nawiasy kwadratowe ([ ]) użyto do oznaczenia stężeń molowych*; a oznacza „proporcjonalny do". Określenie szybkości jest następujące: Szybkość a [cząsteczki reagujące] lub Szybkość a [A] [B] W przypadku gdy wyrażeniem szybkości jest: Szybkość x [A] [B][B] lub Szybkość? [A] [BY Dla przypadku ogólnego, gdy n cząsteczek A reaguje z m cząsteczkami B nA+mB-AnBm wyrażeniem szybkości jest: Szybkość oc [A]n[B]m * Ściślej mówiąc, powinny być użyte raczej aktywności molowe niż stężenia molowe.

102 / ROZDZIAŁ 9 STAŁA RÓWNOWAGI JEST STOSUNKIEM STAŁYCH SZYBKOŚCI REAKCJI PRZEBIEGAJĄCEJ DO PRZODU I REAKCJI ODWROTNEJ

4. Stałą równowagi można wyrazić liczbowo, jeśli są znane stężenia A, B i \„BW w stanie równowagi.

Ponieważ wszystkie reakcje chemiczne są odwracalne, dla reakcji odwrotnej, gdzie AnBra tworzy n cząsteczek A i m cząsteczek B An^n, - nA+mB odpowiednim wyrażeniem szybkości jest: Szybkość a [AnBm] Odwracalność wyraża się podwójnymi strzałkami;

Standardową zmianę wolnej energii (AG ) dla danej reakcji można obliczyć ze stałej równowagi Związek stałej równowagi z AG" jest następujący:

nA + mB ^± A„Bm

To wyrażenie czyta się: ,,n cząsteczek A i m cząsteczek B jest w równowadze z AnBm". Symbol a „proporcjonalny do" można zastąpić znakiem równości, wstawiając stalą proporcjonalności k, charakterystyczną dla danej reakcji. Dla przypadku ogólnego nA + mB j± AnBm

wyrażeniami szybkości dla reakcji przebiegającej w prawo (szybkośćj) i reakcji w lewo (szybkość_,) są: Szybkość,= k1[A]"[B]m i Szybkość, = k_,rAnBm] Gdy szybkości reakcji przebiegającej w prawo i odwrotnie są równe, mówi sie, że system jest w stanie równowagi, tj. wtedy

Szybkość^ Szybkość.,

ZiG^-RTInK^,

R jest stałą gazową i T — temperaturą bezwzględną. Ponieważ są one znane, znajomość wartości liczbowej K^ umożliwia wyliczenie war-

tości AG°. Jeżeli stała równowagi jest większa od 1, reakcja jest spontaniczna, tj. przeważa reakcja zachodząca zgodnie z zapisem (od strony lewej do prawej). Jeżeli jest ona mniejsza od 1, to kierunek przebiegu reakcji jest przeciwny, tzn. jest bardziej prawdopodobne, że reakcja będzie przebiegała od strony prawej do lewej. Jednakże należy zauważyć, że chociaż stała równowagi reakcji wskazuje kierunek, w którym reakcja zachodzi samorzutnie, to nie wskazuje,

czy będzie ona przebiegać szybko, tj. nie mówi ona nic o wielkości bariery energetycznej dla

reakcji (czyli o AGF; patrz powyżej). To wypływa z faktu, że K^ określa AG", która —• co wykazano uprzednio — dotyczy tylko stanu początkowego i końcowego. Szybkość reakcji zależy od wielkości bariery energetycznej, a nie od wartości AG".

Wiele czynników wpływających na szybkość reakcji katalizowanych przez enzymy działa przez zmianę miejscowego stężenia substratu.

k1[A]n[B]m=k_1[AnBm] o

[A]"[B] Stosunek kj do k , nazwano stalą równowagi, K^,. Należy zapamiętać następujące ważne właściwości układu w stanie równowagi: 1. Stała równowagi jest stosunkiem stałych szybkości reakcji ki/k_t. 2, W stanie równowagi szybkości reakcji (nie stałe szybkości reakcji) w obie strony są równe. 3. Równowaga jest stanem dynamicznym.

Chociaż w stanie równowagi nie zachodzi żadna zmiana netto w stężeniu cząsteczek substratu i produktu, A i B nieustannie przechodzą w A„Bm i odwrotnie.

Enzymy nie wpływają na stałe równowagi reakcji, które katalizują Enzym jest związkiem reagującym, który łączy się z substratem, tworząc kompleks enzym—substrat — EnzS, który rozkłada się, tworząc produkt P i wolny enzym. W najprostszej formie może to być przedstawione następująco k. Enz+ S ^ Podczas gdy wyrażenia określające szybkość dla reakcji zachodzącej w prawo, odwrotnej i reakcji ogólnej zawierają składnik [Enz], Enz+ S ^ Enz+ P ■ •M Szybkość = k-, [Enz] [S]

ENZYMY: KINETYKA / 103 Szybko4ć_i= k., [Enz] [PJ

V

-------'

to w wyrażeniu dla całkowitej stałej równowagi [Enz] znosi się. K

= k, _ [En»] [P] = [P] •*" IM [Enz] [S] [S]

Stężenie enzymu nie ma zatem żadnego wpływu

na stałą równowagi. Mówiąc inaczej, skoro enzymy wpływają na szybkość reakcji, a nie na stałą szybkości, nie mogą one wpływać na K.^, która jest stosunkiem starych szybkości. K^ reakcji jest taka sama bez względu na ta, czy równowaga jest osiągana w wyniku (lub bez) katalizy enzymatycznej (należy sobie przypom-

nieć AG"). Enzymy zmieniają drogę reakcji, ale nie wpływają na początkowe i końcowe równoważne stężenia substratów i produktów, czynników, które determinują K^i AG°. SZYBKOŚĆ POCZĄTKOWA REAKCJI KATALIZOWANEJ PRZEZ ENZYM JEST WPROST PROPORCJONALNA DO STĘŻENIA ENZYMU Szybkość początkowa reakcji jest to szybkość mierzona przed utworzeniem dostatecznej ilości produktu, pozwalającej na zachodzenie reakcji odwrotnej. Szybkość początkowa reakcji katalizowanej przez enzym jest zawsze proporcjonalna do stężenia enzymu. Należy jednak zanotować, że to stwierdzenie odnosi się tylko do szybkości początkowej. W WIELU SYTUACJACH OZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM STĘŻENIE SUBSTRATU WPŁYWA NA SZYBKOŚĆ REAKCJI KATALIZOWANEJ ENZYMATYCZNIE Reakcje enzymatyczne są tak rozpatrywane, jeżeli mają 1 substrat i 1 produkt. Mimo że istnieje taki przypadek dla pewnych reakcji katalizowanych enzymatycznie, większość reakcji enzymatycznych ma 2 lub więcej substratów i produktów. Uwaga ta jednak nie unieważnia omówienia. Jeżeli zwiększa się stężenie substratu [S], a wszystkie inne warunki pozostają nie zmienione, to mierzona szybkość początkowa V; (szyb-

kość mierzona wtedy, kiedy przereagowało bardzo mało substratu) zwiększa się do wartości

-/f r !

c~

TL

J 2 .

•V

/A!

Ti

.

.

■

I

.

1

I

.

Ryc. 9-13. Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji katalizowanej enzymatycznie.

maksymalnej — Ym^ i nie przekracza jej (ryc. 9-13). Szybkość reakcji zwiększa się wraz ze zwiększeniem stężenia substratu, aż do momentu, gdy enzym jest „nasycony"' substratem. Mierzona szybkość początkowa osiąga wartość maksymalną i nie ma na nią wpływu dalsze zwiększanie stężenia substratu, ponieważ substrat występuje w dużym nadmiarze molowym w stosunku do enzymu. Na przykład, jeżeli enzym o masie cząsteczkowej 100 000 działa na substrat o masie cząsteczkowej 100 i oba związki występują w stężeniu 1 mg/ml, to 1000 mol. substratu przypada na każdy mol enzymu. Bardziej realistyczne są niżej podane proporcje wagowe enzymu do substratu: [Enz]=0 r1 ng/ml=1(T [S]= 0,1 mg/ml=10~

9

mol

3

mol

co daje 106 mol więcej substratu w stosunku do enzymu. Nawet jeżeli [S] zmniejszy się 100-krotnie, substrat jest w dalszym ciągu w 10000-krotnym molowym nadmiarze w stosunku do enzymu. Sytuacje w punktach A, B i C 7. ryc. 9-13 są przedstawione na ryc. 9-14. W punktach A i B tylko część enzymu łączy się z substratem, jakkolwiek jest dużo więcej cząsteczek substratu niż enzymu. Dzieje się tak dlatego, że stała równowagi dla reakcji Enz+S ^ EnzS (tworzenie kompleksu EnzS) nie jest nieograniczenie duża. W punkcie A lub B zwiększenie lub zmniejszenie [S] będzie zwiększać lut) zmniejszać ilość enzymu związanego z S, jako EnzS, i v f będzie zatem zależeć od |S|.

W punkcie C zasadniczo wszystkie cząsteczki enzymu łączą się z substratem tak, że dalsze zwiększenie [S], chociaż zwiększa częstość zde-

104 / ROZDZIAŁ 9

ćT*

.Q

w Być. 9-14. Przedstawienie enzymu przy maiym (A), dużym (C)i przy stężeniu substratu równym Km (B). Punkty A, B i C odpowiadają punktom z ryc. 9-13. ■___________________

rżeń między Enz i S, nie może spowodować zwiększenia szybkości reakcji, skoro nie ma wolnych cząsteczek enzymu, które mogłyby reagować. Przypadek B opisuje sytuację o dużym znaczeniu teoretycznym, w której dokładnie połowa cząsteczek enzymu jest „wysycona" substratem. Szybkość równa się połowie szybkości maksymalnej (Vmaks/2), która mogłaby być osiągnięta przy danym stężeniu enzymu. Równanie Michaelisa-Menten obrazuje wpływ stężenia substratu na szybkość wielu reakcji katalizowanych enzymatycznie Stężenie substratu, które powoduje osiągniecie potowy szybkości maksymalnej, określane wartością Km lub stalą Michaelisa, można oznaczyć doświadczalnie przez graficzne przedstawienie Vj jako funkcji [S] (ryc. 9-13). Km ma wymiary

stężenia molowego. Gdy [S] jest prawie równe Km, wówczas V; bardzo reaguje na zmiany [S] i enzym działa z dokładnie połową szybkości maksymalnej. W rzeczywistości wiele enzymów ma wartości K.m zbliżone do fizjologicznego stężenia ich substratów. Równanie Michaelisa-Menten Vl

V.nak..[S] Km + [S]

opisuje zachowanie się wielu enzymów przy zmieniającym się stężeniu substratu. Na podstawie równania Michaelisa-Menten zależność początkowej szybkości reakcji katalizowanej przez enzym od [S] i od Kra można przedstawić następująco:

1. Gdy [S] jest znacznie mniejsze od Km (punkt

A na ryc. 9-13 i 9-14). Dodanie [S] do K™ w mianowniku zmienia bardzo niewiele jego wartość, tak że wyrażenie [S] można w mianowniku pominąć. Ponieważ W^^. i Km są stałe, można zastąpić ich stosunek nową stałą, K: .

v

Vj

. [S]

[S]'

^

[S

]~K[S]

(~ oznacza „prawie równa się"). Innymi słowy, jeżeli stężenie substratu jest znacznie mniejsze od tego, które jest wymagane do uzyskania połowy szybkości maksymalnej (wartość Kra), to szybkość początkowa vt zależy od stężenia substratu [S|. 2. Gdy |S| jest znacznie większe od Km (punkt

C na ryc. 9-13 i ryc. 9-14). Dodanie K„ do [S] w mianowniku zmienia wartość mianownika bardzo niewiele, tak że wyrażenie Km można w mianowniku pominąć: "maha.

Km+[S]

[S]

Oznacza to, że jeżeli stężenie substratu [Sj znacznie przewyższa wartość K„, to szybkość początkowa Vj jest szybkością maksymalną, 'ntaks.'

3. Gdy ISJ = *Cm (punkt B na ryc. 9-13 i ryc. 914),

'

Km+ [S]

2[S]

ENZYMY: KINETYKA / 105

Oznacza to, że jeżeli stężenie substratu jest równe wartości Krai to szybkość początkowa \-, równa się połowie szybkości maksymalnej. To także wskazuje, jak oznaczyć Km, a mianowicie trzeba określić doświadczalnie stężenie substratu, przy którym początkowa szybkość stanowi połowę szybkości maksymalnej. Aby określić wartość Km i Vmaks. równanie Michaeiisa-Menten jest tak przekształcane, aby wykres stanowiła linia prosta Ponieważ dla wielu enzymów krzywa nasycenia nie pozwala na łatwe określenie Vm!lk5 (i stąd Kw), kiedy V; jest wykreślone względem [S], wygodniej jest przekształcić równanie Michaelisa-Menten tak, aby uprościć wyznaczenie Km i Ymats.- Równanie Michaeiisa-Menten można odwrócić i przekształcić następująco:

nych odwrotności, tj. odwrotność ¥|(1/Vj) jest wykreślona względem odwrotności [S] (1/[SJ). Z wykresu podwójnych odwrotności lub wykresu Lineweavera-Burka można określić Km (ryc. 9-15), wykorzystując albo nachylenie krzywej i odcinek na osi y, albo odcinek na ujemnej

C. 9-15. Podwójna odwrotność albo wykres Lineweavera-Burka zaie2ności 1/v względem 1/ [S] wykorzystywany do określenia Km i y^k,,,.

Vmakl. [S] V| =

po odwróceniu [SJ [S]

po przekształceniu: 1

Km

1 [S]

Vraak.. [S]

po uproszczeniu: Km

1

1 ■ + ■

vi

VmakB,

[S]

Vmaks. Jest

to równanie linii prostej y= a■x+ b

gdzie:

części osi x. Skoro [S] jest wyrażone w stężeniu molowym, wymiarem Km jest stężenie molowe lub liczba mol na litr. Szybkość V; można wyrazić w dowolnych jednostkach, ponieważ Kra nie zależy od [EnzJ. Technika podwójnych odwrotności wymaga stosunkowo niewielu punktów dla określenia Km i jest metodą najczęściej używaną do wyznaczenia K„,. Doświadczalnie wykorzystanie równania Linę weavera-Burka do wyznaczenia Km może spowodować nieuzasadnione położenie nacisku na dane otrzymane przy małych stężeniach substratu. Dzieje się tak wówczas, gdy stężenia substratu, wybrane do badania, różnią się stałą przyrostu. Ta niedogodność może być ominięta przez selekcjonowanie odwrotności stężeń substratów, które różnią sie stałą przyrostu. Innym podejściem do doświadczalnego wyznaczenia Km i Vmaks jest podejście Eadie i Hofstee. Równanie Michaeiisa-Menten może być przekształcone:

y= — z aś x = [S]

Jeżeli y lub l/v, jest wykreślony jako funkcja x lub l/[S], to b jest równe l/VmakSi na osi y, a kąt nachylenia a jest równy K.aJVaiaks.- Ujemny odcinek na osi x można określić przez przyjęcie y = 0. Wtedy x = - — = Km

Taki wykres jest nazwany wykresem podwój-

Aby wyznaczyć Km i Y,,^. wykreśla się Vj/[S] (oś y) wobec \, (oś x). Miejsce przecięcia osi y wyznacza wówczas Vmaks /Km, a miejsce przecięcia osi x Vmaks.. Nachylenie jest - 1/Km. Zarówno podejście Linweavera-Burka i Eadie-Hofstee są użyteczne w wybranych przypadkach, natomiast dokładne wyznaczenie K m i Vm!,ks. wymaga opracowania statystycznego.

106 / ROZDZIAŁ 9

Wartości K,,,, oprócz ich użyteczności w interpretacji mechanizmów reakcji katalizowanych enzymatycznie, mają duże znaczenie praktyczne. Przy stężeniu substratu 100-krotnie przewyższającym Km, enzym będzie działał w zasadzie z maksymalną szybkością i dlatego maksymalna szybkość (Vmiks) będzie odzwierciedlała ilość obecnego aktywnego enzymu. Taka sytuacja jest ogólnie pożądana w badaniach enzymów. Wartość Km wskazuje, ile substratu natęży użyć w celu pomiaru VMkŁ. Technika podwójnych odwrotności znajduje także szerokie zastosowanie w ocenie inhibitorów enzymów. W szczególnych przypadkach K być zbliżona do stałej przyłączania

m

może

Powinowactwo enzymu do substratu jest równe odwrotności stałej dysocjacji—Kd kompleksu enzym-substrat (EnzŚ). ■_

Enz + S ;===* EnzS k-.

wtedy k*

W tych warunkach 1/Kro = 1/K^ = powinowactwo. Jeżeli k2 + k_t ^ k_! to 1/K.m zbyt nisko oceni powinowactwo RÓWNANIE HILLA PRZEDSTAWIA WPŁYW STĘŻENIA SUBSTRATU NA ENZYMY ALLOSTERYCZNE

Pewne enzymy i inne białka przyłączające ligandy, takie jak hemoglobina, nie działają zgodnie z klasyczną kinetyką nasycenia Michaelisa-Menten. Jeżeli [S] wykreśli się względem Vj, to krzywa nasycenia jest sigmoidalna (ryc. 916). Ogólnie wskazuje to na kooperatywne

Mniejsza tendencja substratu i enzymu do dysocjacji wskazuje na większe powinowactwo enzymu do substratu. Wartość Km enzymu dla jego substratu może również służyć do pomiaru jego Kd. Jednak, aby to było prawdziwe, założenie dokonane w przekształceniu wyrażenia Michaelisa-Menten musi być słuszne. Przekształcenie zakłada, że pierwszy etap reakcji katalizowanej enzymatycznie Enz + S~±EnzS k-i

jest szybki i zawsze w równowadze. Innymi słowy, szybkość dysocjacji EnzS do Enz + S musi być dużo większa od szybkości dysocjacji enzym + produkt; Enz S

k2 k-2

' Enz + P

W wyrażeniu Michaelisa-Menten [S], które daje Vj = Vmik!./2 wynosi

Ale kiedy

-i> >

0

[S]

8

Ryc. 9-16. Sigmoidalna kinetyka nasycenia.

przyłączenie substratu do licznych miejsc. Przyłączenie w jednym miejscu wpływa na przyłączenie w innych miejscach, jak opisano w rozdz. 7 dla hemoglobiny. W przypadku sigmoidalnej kinetyki nasycenia enzymu substratem, omówione powyżej metody graficznej oceny stężenia substratu, które powoduje osiągnięcie połowy szybkości maksymalnej, są nie wartościowe (brak linii prostych). Aby ocenić sigmoidalna kinetykę nasycenia, można wykorzystać graficzne przedstawienie równania Hilla, równania, które pierwotnie wyprowadzono, aby opisać kooperatywne

ENZYMY: KINETYKA / 107

przyłączenie O2 do hemoglobiny. Opisane w formie linii prostej równanie Hilla jest następujące: log

V;

= nlog [S] - log k'

gdzie k' jest stalą złożoną. Z równania wynika, że kiedy [S] jest małe w porównaniu z k', to szybkość reakcji zwiększa się jako n-ta potęga [S]. Na rycinie 9-17 przedstawiono wykres Hilla Log [S]

I Nachylenie ■ n

-3

Ryc. S-17. Graficzna ocena równania Hilla w celu oznaczenia stężenia substratu, przy którym szybkość, osiąga potowe szybkości maksymalnej. Stosowana wówczas, gdy kinetyka nasycenia substratem jest sigmoidalna.

danych kinetycznych dla enzymu z kinetyką wiązania kooperatywnego. Wykres Vj/VmaiŁ—vj względem log [S] daje linię prostą o nachyleniu = n, gdzie n jest parametrem empirycznym, którego wartość zależy od liczby miejsc wiążących substrat oraz liczby i typu interakcji między tymi miejscami. Kiedy n = 1, miejsca wiązania działają niezależnie jedno od drugiego. Jeżeli n > 1, to miejsca są kooperatywne i przy większej wartości n kooperatywność jest silniejsza i wtedy bardziej „sigmoidalne" są kinetyki nasycenia. Jeżeli n
RÓŻNICA MIĘDZY KOM PETYCYJNYMI I NIEKOMPETYCYJNYMI INHIBITORAMI ENZYMÓW POLEGA NA TYM, CZY ZWIĘKSZAJĄCE SIĘ STĘŻENIE SUBSTRATU USUWA HAMOWANIE Chociaż rozróżnia się inhibitory aktywności enzymatycznej w zależności od tego, czy hamowanie ustępuje lub nie w wyniku zwiększenia stężenia substratu, to jednak wiele inhibitorów nie wykazuje idealnych właściwości czysto kompetycyjnego i niekompetycyjnego hamowania omawianego poniżej. Innym sposobem klasyfikacji inhibitorów jest podział według ich miejsca działania. Miektóre z nich wiążą się z enzymem w tym samym miejscu co substrat (miejsca katalityczne); inne wiążą się w innym miejscu (miejsce allosteryczne) z dala od miejsca katalitycznego.

Inhibitory kompetycyjne wykazują ścisłe podobieństwo strukturalne do substratu

Klasyczne hamowanie kompetycyjne zachodzi w miejscu wiązania substratu (katalitycznym). Chemiczna struktura inhibitora, analoga substratu (I), ogólnie przypomina strukturę substratu (S). Łączy się on zatem odwracalnie z enzymem, tworząc kompleks enzym-inhibitor (Enzl), a nie kompleks EnzS. Gdy jest obecny zarówno substrat, jak i ten typ inhibitora, wówczas współzawodniczą one ze sobą o te same miejsca wiązania na powierzchni enzymu. Najlepiej zbadanym przypadkiem hamowania kompetycyjnego jest para: malonian (I) i bursztynian (S) w stosunku do dehydrogenazy bursztynianowej. Dehydrogenaza bursztynianowa katalizuje tworzenie fumaranu przez usunięcie po jednym atomie wodoru z każdego atomu ot-węgla bursztynianu (ryc. 9-18).

H H-CCOO-

OOC-Ć-H

H-C-COO -2H

■-OOC-C-H

IH

DEHYDROGENAZA BURSZTYNIANOWA Bursztyn lan

Fu maran

Ryc. 9-18. Reakcja dehydrogenazy bursztynianowej.

108 / ROZDZIAŁ 9

Malonian ("OOC-CH 2 -COO") może łączyć się z dehydrogenazą, tworząc kompleks EnzI. Maionian nie może ulec odwodorowaniu, gdyż nie ma żadnego sposobu, aby usunąć nawet jeden atom H z pojedynczego atomu węgla a bez utworzenia pięcio wartościowe go atomu węgla. Jedyną reakcją, której może podlegać kompleks EnzI jest rozpad z powrotem na wolny enzym i inhibitor. Dla reakcji odwracalnej EnzI

stała równowagi K= =

tEnz + I

wynosi [I] [EnzIJ

Działanie inhibitorów kompetycyjnych można zrozumieć w formie następujących reakcji: ■ Enzl (nieaktywny) » Enz + P 'EnzS (aktywny) -> Enz+ p Enz

Szybkość tworzenia produktu, to co jest głównie mierzone, zależy wyłącznie od stężenia EnzS. Załóżmy, że I przyłącza się do enzymu bardzo silnie (Ks = mała liczba). W takiej sytuacji jest mało wolnego enzymu (Enz) dostępnego do połączenia się z S, aby utworzyć EnzS i ewentualnie Enz+P. Szybkość reakcji (tworzenie P) będzie bardzo mała. Z analogicznych powodów równe stężenie słabiej wiązanego inhibitora (Kj = większa liczba) nie zmniejszy tak znacznie szybkości katalizowanej reakcji. Przypuśćmy, że przy stałym stężeniu I doda się więcej S. Zwiększy to prawdopodobieństwo, że Enz będzie raczej łączył się z S niż z I. Wzrośnie stosunek EnzS do EnzI, a także szybkość reakcji. Przy dostatecznie dużym stężeniu S, stężenie Enzl powinno być znikomo małe. Jeżeli tak jest, to szybkość katalizowanej reakcji będzie taka sama, jak w nieobecności I (ryc. 9-19). Efektywność różnych inhibitorów kompetycyjnych jest oceniona przez wykres podwójnych odwrotności 1/v; względem 1/[S] Rycina 9-19 przedstawia typowy przykład hamowania kompetycyjnego pokazany graficznie w formie wykresu Lineweavera-Burka. Przy stałym stężeniu inhibitora mierzono szybkość reakcji (v,) przy różnych stężeniach S. Linie przeprowadzone przez punkty doświadczalne zbiegają się przy osi y. Ponieważ odcinek na osi

Ryc. 9-19. Wykres Linevueavera-Burka klasycznego kompetycyjnego hamowania. Należy zauważyć całkowite zwolnienie hamowania przy dużym [S] (małe.1/[S]). y odpowiada 1/Vmats , to świadczy o tym, że przy nieograniczenie dużym stężeniu S (1/|S] = O), Vj jest taka sama, jak w nieobecności inhibitora.

Jednak odcinek na osi x (który odpowiada Km) zmienia się wraz ze stężeniem inhibitora i staje się większą liczbą {— 1/Kra jest mniejszy niż — 1/K^,) w obecności inhibitora. W ten sposób inhibitor kotnpetycyjny zwiększa Km (Kń) sub-

stratu. Ponieważ Km jest stężeniem substratu, w którym stężenie wolnego enzymu jest równe stężeniu enzymu występującego jako EnzS, spora ilość wolnego enzymu może się łączyć z inhibitorem. W przypadku prostego hamowania kompetycyjnego miejsce przecięcia na osi x daje się przedstawić

Km może być oznaczone w nieobecności I, a K; określa się wykorzystując powyższe równanie. Jeżeli liczba moli dodanego I jest dużo większa niż liczba moli obecnego enzymu, to stężenie I można przyjąć jako stężenie (znane) dodanego inhibitora. Wartości Ks dla serii inhibitorów (kompetycyjnych) będących analogami substratów wykazują, które z nich są najbardziej efektywne. Przy małych stężeniach największy stopień zahamowania będą powodowały inhibitory o najmniejszych wartościach Kj.

Wiele skutecznych klinicznie leków działa jako inhibitory kompetycyjne ważnych enzymów w komórkach mikroorganizmów i zwierząt.

ENZYMY: KINETYKA / 109

Odwracalne niekompetycyjne inhibitory zmniejszają Vmaki.' ale nie wpływają na Km Jak sama nazwa wskazuje, w tym przypadku nie ma konkurencji między S i I. Inhibitor zazwyczaj nie wykazuje żadnego albo małe podobieństwo do S i można przyjąć, że wiąże się z inną domeną enzymu. Odwracalne niekompetycyjne inhibitory zmniejszają szybkość maksymalną, osiągalną przy danej ilości enzymu (zmniejszają Vraaka), ale zazwyczaj nie wpływają na

Km. Ponieważ I i S mogą łączyć się w różnych miejscach, jest możliwe tworzenie zarówno kompleksów Enzl, jak i EnzIS. Ponieważ EnzIS może się rozpaść, tworząc produkt z mniejszą szybkością niż EnzS, reakcja może być spowolniona, ale nie zatrzymana. Mogą zachodzić następujące reakcje EnzIS -> Enz +P konkurencyjne: Enz

±1

Jeżeli S ma takie samo powinowactwo zarówno do Enz, jak i do Enzl (I nie wpływa na powinowactwo Enz do S), to otrzymuje się wyniki przedstawione na ryc. 9-20 w formie wykresu zależności l/vj względem 1/ [S] w obecności i nieobecności inhibitora. (Zakłada się, że po przyłączeniu I nie ma żadnych ważnych zmian w konformacji miejsca aktywnego).

jony metali ciężkich (Ag+, Hg2+), czynniki utleniające itd. Ponieważ te inhibitory nie wykazują strukturalnego podobieństwa do substratu, zwiększenie stężenia substratu na ogół nie zmniejsza tego hamowania. Obecność jednego lub więcej substratów lub produktów może chronić enzym przed inaktywacją. Omawiana powyżej analiza kinetyczna może być niewystarczająca do odróżnienia przedstawionych trucizn od odwracalnych inhibitorów niekompetycyjnych. W każdym razie odwracalne niekompetycyjne hamowanie zdarza się rzadko. Niestety nie jest to zawsze uchwycone, ponieważ zarówno odwracalne, jak i nieodwracalne hamowanie niekompetycyjne wykazuje podobną kinetykę. AKTYWNOŚĆ KLUCZOWYCH ENZYMÓW MOŻE BYĆ ±1

REGULOWANA PRZEZ POZYTYWNE I NEGATYWNE CZĄSTECZKI MODULATOROWE Małe cząsteczkowe modulatory, które zmniejszają aktywność katalityczną, są określane jako modulatory negatywne, a te, które zwiększają aktywność, są nazywane modulatorami pozytywnymi. To zagadnienie jest omawiane w następnych rozdziałach.

PIŚMIENNICTWO

■*

0

_L (Sl

Ryc. 9-20. Wykres Lineweavera-Burka odwracalnego nie kom petycyjnego hamowania.

Wiele „trucizn" działa jako nieodwracalne, ni ekom petycyjne inhibitory aktywności enzymatycznej Aktywność enzymatyczną redukują działające na enzymy „trucizny", np. jodoacetamid,

Bender ML, Bergeron RJ, Komiyama M: The Bioorganić Chemistry of Enzymatic CataJysia. Wiley-[nierscience, 1984. Cabral F, Barlow SB; Mechanisms by which mammalian cells aequire resistance to drugs that affect microLubule assembly. FASEB J 1988;3:1593. CechTR: RNA as anenzyme. Sci Amer 1986;255:64. Dugas H, Penny C: Bioorganic Chemistry: A Chemicat ApproachtoEnzyme Action. Springer-Verlag, 1981. Fersbt AR, Leatherbarrow RJ, Wells TNC: Binding energy a.nd catalysis: a lesson from protein engineering of the tyrosyl-tRNA synthetase. Trendu Biochetn Sci 1986;11:321. Freeman RB, Hawkins HC (editors): Tne Enzymology of PosttransiatiOrial ModiftcatiOn ofProteins, Academic Press, 1985. Segel IH: Emyme Kinetks. Wiley, 1975. Walsh CT: Suicide substrates, mechanism-based enzyme inactivators; recent dcvelopments. Amiu Rev Biochem 1984;53:493. Patrz także piśmiennictwo w rozdz. 7.

1 0

Enzymy: mechanizmy działania

Yictor W, Rodwell, PhD

WPROWADZENIE W rozdziale tym, w celu zilustrowania zasad reakcji enzymatycznych, przedstawiono w szczegółach reakcję katalizowaną przez enzym proteolityczny chymotrypsynę.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Przedmiotem badań mechanizmów działania enzymów są zmiany molekularne towarzyszące przekształceniu substratu w produkt. Rokują one wielką nadzieję na właściwy sposób postępowania podczas leczenia, jak również opracowywania leków. Wyniki anaiizy rentgenograficznej struktury białek, w połączeniu z danymi odnośnie do mechanizmów katalizy enzymatycznej, już obecnie umożliwiają opracowywanie ieków hamujących swoiste enzymy, takie jak reduktaza HMG-CoA, która reguluje biosyntezę cholesterolu. Badania te sugerują również sposób wykorzystania technik rekombinacji DNA oraz ukierunkowanej mutagenezy w celu zmodyfikowania swoistości i (lub) aktywności katalitycznej enzymu. Techniki te zapewnię ułatwią wprowadzenie enzymów o żądanych właściwościach.

MECHANIZM DZIAŁANIA CHYMOTRYPSYNY ILUSTRUJE OGÓLNE CECHY KATALIZY ENZYMATYCZNEJ Chymotrypsyna katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, w których grupa karboksylowa pochodzi z aminokwasów aromatycznych (Phe,

Tyr, Trp) lub z aminokwasów z dużą grupą niepolarną R (Met). Podobnie jak wiele innych proteaz, chymotrypsyna katalizuje hydrolizę niektórych estrów. Chociaż zdolność chymotrypsyny do katalizowania hydrolizy estrów nie jest istotna z fizjologicznego punktu widzenia, umożliwia ona badania mechanizmu katalizy enzymatycznej. Zmiany molekularne zachodzące podczas katalizy określane są mianem „intermediary enzymology". Syntetycznym substratem, pozwalającym na kolorymetryczną analizę aktywności chymotrypsyny, jest octan />-nitrofenylu (ryc. 10-1).

Ryc. 10-1. Octan p-mtrofenylu

W wyniku hydrolizy octanu p-nitroienylu uwalnia się/f-nitrofenol, który w środowisku zasadowym przekształca się w żółty anion^-nitrofenolanowy.

KINETYKA REAKCJI „STOP-FLOW" UJAWNIŁA MECHANIZM DZIAŁANIA CHYMOTRYPSYNY Kinetykę reakcji hydrolizy octanu /J-nitrofenylu można badać za pomocą aparatu „stop-tiow". W doświadczeniach „stop-flow" ilość enzymu odpowiada ilości substratu (w przy-

ENZYMY: MECHANIZMY DZIAŁANIA / 111

bliżeniu równomolowe ilości enzymu i substratu), a oznaczenie dotyczy zdarzeń zachodzących w pierwszych kilku milisekundach po zmieszaniu enzymu i substratu. Aparat „stop-flow" jest wyposażony w 2 strzykawki: jedna przeznaczona na chymotrypsynę, a draga na octan />-nitrofenylu. Natychmiastowe zmieszanie enzymu i substratu następuje za pomocą urządzenia mechanicznego, które szybko i równocześnie usuwa zawartość obu strzykawek do jednej, wąskiej probówki. Probówka przesuwa się przez spektrofotometr i wartość absorbancji, jako funkcja czasu, ukazuje się na ekranie oscyloskopowym.

w kategoriach kolejnych etapów katalizy przedstawionych na ryc. 10-3, Wolny etap reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę odpowiada hydrolizie kompleksu chymotrypsyna-octan (CTAc) Z chwilą związania chymotrypsyny w kompleks CT-Ac dalsze uwalnianie anionu p-nitrofenolanowego zależy od regeneracji wolnej chymotrypsyny w wyniku hydrolizy tego kompleksu (ryc. 10-3). Faza szybka uwalniania anionu /7-nitrofenolanowego (ryc. 10-2) odpowiada przekształceniu całej dostępnej chymotrypsyny w kompleks CT-Ac, z równoczesnym uwolnieniem anionu/>-nitrofenolanowego. Następujące po niej dalsze odszczepianie anionu p-nilTO fenol ano wego (PNP) jest uzależnione od wolnego odzyskiwania chymotrypsyny z kompleksu CT-Ac. Uwolniona chymotrypsyna ponownie reaguje z PNP, tworząc kompleks CT-Ac i anion /j-nitrofeno łanowy. Szybkość reakcji w fazie szybkiej (tj. liczba moli uwolnionego anionu jc-nitrofen o łanowego) jest wprost proporcjonalna do liczby moli chymotrypsyny w momencie rozpoczęcia reakcji.

Uwalnianie anionu p-nitrof enolanowego ma charakter dwufazowy Uwalnianie anionu /j-nitrofenolanowego przebiega w 2 wyraźnych fazach (ryc. 10-2): 1)

Faza stacjonarna

Kluczową rolę w reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę odgrywa seryna 195 W kompleksie CT-Ac grupa acylowa jest połączona z bardzo reaktywną resztą seryny, znajdującą się w pozycji 195 chymotrypsyny. Dowodem szczególnej roli i dużej reaktywności Ser 195 (w porównaniu z pozostałymi 27 resztami serynowymi chymotrypsyny) jest jej reakcja z diizopropylofluorofosforanem (DIPF) (ryc. 10-4). Przyłączenie DIPF do Ser 195 powoduje inaktywację chymotrypsyny. Analogicznie inaktywacji przez DIPF ulega wiele innych proteaz określanych mianem proteaz sery nowych.

i

i Czas (ms)

Ryc. 10-2. Kinetyka uwalniania anionu p-nitrofenolanowego w wyniku hydrolizy octanu /)-nitrofenytu katalizowanej przez chymotrypsynę. Ilość „uwolnionego fenolu" wyliczono na podstawie absorbancji.

w fazie szybkiego uwalniania i 2) następującej po niej fazie wolniejszego uwalniania dalszych anionów />-nitrofen olano wy ch. Dwufazowy charakter uwalniania anionu /7-nitrofenolanowego jest w pełni zrozumiały

Fenol

CT +

PNP

CT-PNP Szybko

■J Szybko

Ac

* ■ CT-Ac

-^--------^ - t

CT

Wolne

Ryc. 10-3. Pośrednie etapy hydrolizy octanu p-nitrofenylu katalizowanej przez chymotrypsynę, CT — chymotrypsyna, PNP — octan p-nitrofenyfu; CT-PNP — kompleks: chymotrypsyna-octan p-nitrofenylu; CT-Ac—kompleks: chymotrypsyna-octan (acetylochymotrypsyna);feno!-anionp-nitrofenolanowy: Ac~ — anion octanowy. Tworzenie kompleksów CT-PNP i CT-Ac w stosunku do hydrolizy kompleksu CT-Ac przebiega s^ybko.

112 / ROZDZIAŁ 10

V ? Enz-CHjOH+F-P-O ?

y

P

P»=O » Enz—CH, — O—

°

Ryc. 10-4. Reakcja pierwszorzędowej grupy hydroksylowej Ser 195 chymotrypsyny z diizopropylofluorofosforanem (DIPF). ________________________________________________________________________________

W reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę 3 aminokwasy tworzą system przekazywania ładunku W reakcji hydrolizy katalizowanej przez chymotrypsynę szczególną role odgrywają 3 reszty aminokwasowe, które, mimo że zajmują odległe w stosunku do siebie miejsca w sensie struktury pierwszorzędowej, znajdują się w pozycjach pozwalających na tworzenie między nimi wiązań w sensie struktury trzeciorzędowej. Są to Asp 102, His 57 i Ser 195. Podczas gdy większość naładowanych reszt aminokwasowych jest umiejscowiona na zewnątrz cząsteczki, 3 oddziałujące ze sobą reszty są ukryte w niepolarnym wnętrzu cząsteczki, tworząc układ: Asp 102 — His 57 — Ser 195. Aminokwasem, który ulega acylacji podczas reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę, jest Ser 195. Zbliżenie anionu octanowego (pochodzącego z octanu /)-nitrofeny)u) do tlenu grupy OH* Ser 195 wyzwala reakcję przeniesienia protonu z Ser 195 poprzez His 57 na Asp 102 (ryc. 10-5), — C — O"--"H-N^N---H — O— Ser u:.

ic 1

Sub- (tj. AG")

9

— C—O—H-

•N

N—H

O-Ser

U _ 0A Ryc. 10-5. Przeniesienie protonu w chymotrypsynie podczasacylacji Ser 195 przezsubstrat (Sub').

Podczas deacylacji intermediatu acylo-Ser 195 (enzym) protony przekazywane są w przeciwnym kierunku. Przypuszcza się, że analogi* Przyp. tłum.

czna sekwencja zdarzeń ma miejsce podczas hydrolizy fizjologicznych substratów chymotrypsyny, takich jak peptydy. WIELE PROTEAZ WYDZIELA SIĘ W POSTACI NIEAKTYWNYCH PROENZYMÓW, CZYLI ZYMOGENÓW Wiele białek jest syntetyzowanych w postaci nieaktywnych prekursorów określanych jako probiałka. W przypadku gdy białka te są enzymami ich probiałka nazywane są proenzymatni lub zymogenami. Przekształcenie probiałek w aktywne białka następuje w wyniku jednolub kilkustopniowej swoistej proteolizy. Białkami syntetyzowanymi w formie probiałek są np. insulina (probiałko=proinsulina), enzymy trawienne: pepsyna, trypsyna i chymotrypsyna (odpowiednie probiałka = pepsynogen, trypsynogen, chymotrypsynogen), czynniki krzepnięcia krwi i fibrynoiizy (p. rozdz. 58) oraz biatko tkanki łącznej — kolagen (probiałko = prokolagen). Przekształcenie proch ymotry psy ny (pro-CT), 245-aminokwasowego polipeptydu, w aktywną a-chymotrypsynę przebiega przez formę pośrednią znaną jako chymotrypsyna U (7C-CT) {ryc. 10-6). W chymotrypsynie a łańcuchy A, B i C (ryc. 10-6) są połączone ze sobą 2 mostkami disiarczkowymi (ryc. 10-7). Proenzymy umożliwiają szybkie uruchomienie aktywnych form w momencie zapotrzebowania fizjologicznego Jaka jest przyczyna syntezy niektórych białek w formie nieaktywnej? Podczas gdy jedne białka są wykorzystywane w organizmie stale, inne (np. enzymy krzepnięcia krwi i fibrynoiizy) tyiko czasami, ale wówczas enzymy te są po-

ENZYMY: MECHANIZMY DZIAŁANIA / 113 1

146

13

149

13/^415

13

16_

146 / 149

16

146

245

f

245

149

245

e Ryo. 10-6. Przekształcenie prochymotrypsyny (pro-CT) w chymotrypsynę enzymatycznie chymotrypsynę ot (ct-CT). _______

ProCT

»CT

ttCT

n (it-CT) i w pełni aktywną

S- - - -S

Ryc. 10-7. Wewnątrzłańcuchowe i rniędzyłańcuchowe wiązania disiarczkowe w chymotrypsynie a («-CT). ________________________________________________________________________________________

trzebne natychmiast. Pewne procesy fizjologiczne, takie jak trawienie, są sporadyczne, przy czym często regularne i możliwe do przewidzenia (chociaż nie jest to regułą u ludzi prymitywnych). Inne natomiast, jak krzepnięcie krwi i fibrynoliza, zachodzą tylko w przypadku zadziałania określonych czynników fizjologicznych lub patologicznych, przy czym do zachowania hemostazy muszą one być skoordynowane w czasie. Ponadto synteza proteaz w formie nieaktywnych prekursorów zabezpiecza tkanki, w których są one wytwarzane (np. trzustkę) przed samotrawieniem. (Samotrawienie może zachodzić w przypadku zapalenia trzustki). Synteza de novo niezbędnych w danym momencie białek, przy założeniu, że byłaby dostępna odpowiednia pula aminokwasów, mogłaby przebiegać niewystarczająco szybko w stosunku do potrzeb organizmu indukowanych czynnikami chorobotwórczymi, np. utratą krwi. Również sam proces wydzielania mógłby być zbyt wolny w stosunku do potrzeb.

8 — Biochemia

Aktywacja prochymotrypsyny polega na swoistej proteolizie Przekształcenie probiałek w fizjologicznie czynne białka przebiega według następujących zasad: 1. Przekształcenie polega na swoistej proteo lizie, która może dotyczyć hydrolizy tylko poje dynczego wiązania. 2. Produkty proteolizy mogą zostać rozdzie lone lub pozostać razem w ostatecznym białku. 3. Proces może (lub nie) prowadzić do znacz nej zmiany masy cząsteczkowej. 4. Podstawową konsekwencją swoistej pro teolizy jest nowa konformacja. 5. Jeśli probiałko jest enzymem, to zmiana konformacji powoduje powstawanie miejsca katalitycznego. W przypadku proenzymów wy biórcza proteoliza może być rozpatrywana jako proces, który uruchamia zmiany konformacyjne „tworzące" miejsce katalityczne. Wybiórcza proteoliza prochymotrypsyny (chymotrypsynogenu) umożliwia zbliżenie 3 reszt aminokwasowych tworzących system przekazywania ładunku. W chymotrypsynie a His 57 i Asp 102 znajdują się w łańcuchu B, a Ser 195 — w łańcuchu C (ryc. 10-6).

114 / ROZDZIAŁ 10

WIĄZANIE SUBSTRATU PRZEZ SWOISTE ENZYMY ODBYWA SIĘ W SPOSÓB PRZYPADKOWY LUB UPORZĄDKOWANY Większość enzymów katalizuje reakcje między 2 lub więcej substratami, dostarczając 1 lub więcej produktów. Pewne enzymy wymagają obecności wszystkich substratów równocześnie, inne natomiast wiążą najpierw jeden substrat, a następnie katalizują jego reakcję z drugim substratem. Sposób w jaki enzymy wiążą substraty może być przypadkowy lub uporządkowany (ryc. 10-8).

C. 10-8. Przypadkowe i uporządkowane przyłączanie substratów A i B i oddysocjowywanie produktów P i Q od enzymu E.

Wiele reakcji, wymagających udziału koenzymów, przebiega za pomocą mechanizmu określanego jako „ping-pong" (enzym występuje na przemian w formie E i E x) (ryc. 10-9 i 10-10). Chociaż pewne koenzymy są często rozpatrywane jako drugi substrat, inne (np. fosforan pirydoksalu) są związane z enzymem kowalencyjnie lub niekowalencyjnie tak silnie, że ich dysocjacja praktycznie nie występuje (np. difosforan tiaminy). W tych przypadkach kompleks enzym-koenzym jest rozpatrywany jako enzym.

RESZTY AMINOKWASOWE W MIEJSCU KATALITYCZNYM MOGĄ FUNKCJONOWAĆ JAKO KATALIZATORY KWASOWO-ZASADOWE Z chwilą związania substratu w miejscu katalitycznym naładowane (lub zdolne do naładowania) grupy funkcyjne łańcuchów bocznych aminokwasów, znajdujących się w bliskim otoczeniu, mogą brać udział w katalizie, działając na zasadzie katalizatorów kwasowych lub zasadowych. Istnieją 2 odrębne rodzaje katalizy enzymatycznej kwasowo-zasadowej: ogólna i swoista. Reakcje, których szybkość zmienia się wraz ze zmianą stężenia jonów H+ lub H3O+, a jest niezależna od stężenia innych kwasów lub zasad znajdujących się w roztworze, uważa się za podporządkowane swoistej katalizie kwasowej

P EA-

-E'P

'P * > E'

Ryc. 10-9. Ogólny mechanizm „ping-pong" kata lizy enzymatycznej________________

E-CHO CHO

lub zasadowej. Natomiast reakcje, których szybkość jest uzależniona od wszystkich kwasów (donorów protonów) lub zasad (akceptorów protonów) obecnych w roztworze uważa się za podporządkowane ogólnej katalizie kwasowej lub zasadowej.

E-CH,NH,

Glu

E-CHO Glu

Ryc. 10-10. Mechanizm „ping-pong" w reakcji transaminacjt. ECHO i E-CH2NH2 reprezentują odpowiednio kompleksy enzym-fosforan pirydoksalu i enzym-fosforan pirydoksaminy. (Ala—alanina; Pyr — pirogronian; KG — a-ketoglutaran; Glu — glutaminian). _____

ENZYMY: MECHANIZMY DZIAŁANIA / 115

Ogólną i swoistą katalizę kwasowozasadową pozwala odróżnić pomiar szybkości reakcji w buforach o różnych wartościach pH i stężenia Jeżeli przy stałym stężeniu buforu szybkość reakcji zmienia się wraz ze zmianą pH roztworu, to reakcję określa się jako swoiście katalizowaną przez zasadę (jeżeli pH jest powyżej 7) lub swoiście katalizowaną przez kwas (jeżeli pH jest poniżej 7). Jeżeli natomiast przy stałym pH szybkość reakcji zmienia się wraz ze zmianą stężenia buforu, to reakcję określa się jako ogólną katalizę zasadową (w przypadku, gdy pH jest powyżej 7) lub ogólną katalizę kwasową (w przypadku, gdy pH jest poniżej 7). Przykładem swoistej katalizy kwasowej może być przekształcenie substratu (S) w produkt (P). Przybiega ono w 2 etapach — etapie szybkiego, odwracalnego transferu protonu: S+

oraz następującym po nim wolniejszym i dlatego determinującym szybkość reakcji, etapie zamiany zawierającego proton substratu w produkt: SH + + H,O-*P+ H 3 0 +

Zwiększenie stężenia jonu hydronowego
Rozpatrzmy sytuację, w której oprócz opisanej powyżej swoistej katalizy kwasowej, w buforze, np. imidazolowym, zachodzi również kataliza poprzez jon imidazolowy. Imidazol, będąc słabym kwasem (pKa ok. 7), jest słabym protonodawcą i powoduje, że etap

S + Imidazol

H+ -* SH+ + Imidazol

przebiega wolno, determinując szybkość reakcji. Na uwagę zasługuje fakt, że wraz ze zmianą mechanizmu katalizy kwasowej ze swoistego na ogólny następuje odwrócenie etapów szybkiego i wolnego. Matematyczne przedstawienie szybkości reakcji ogólnie katalizowanej przez kwas jest często bardzo skomplikowane. WIĄZANIE SUBSTRATU I KATALIZĘ MOGĄ UMOŻLIWIAĆ JONY METALU Ponad 25% wszystkich enzymów zawiera silnie związany jon metalu, który jest niezbędny do ich aktywności. Funkcje jonów metali w katalizie enzymatycznej bada się za pomocą analizy rentgenograficznej, spektroskopii MRI (magnetic resonance imaging) oraz ESR (electron spin resonance). Wyniki tych badań, w połączeniu ze znajomością tworzenia i rozpadu kompleksów metali i reakcji w obrębie sfer koordynacyjnych jonów metali, pozwalają na określenie funkcji jonów metali w reakcjach katalizowanych przez enzymy. Metsuoenzymy zawierają określoną liczbę funkcyjnych jonów metalu, które nie są usuwane podczas oczyszczania enzymu. Enzymy aktywowane przez metale wiążą natomiast metal słabiej, jednak jest on niezbędny do ich funkcji katalitycznej. Powinowactwo określonego enzymu do jonu metalu jest więc podstawą rozróżnienia między metaloenzymami i enzymami aktywowanymi przez metale. Mechanizmy działania jonów metali zarówno w przypadku metaloenzymów, jak i enzymów aktywowanych przez metale są podobne. W katalizie enzymatycznej funkcjonują trójskładnikowe kompleksy zawierające metal W wyniku połączenia miejsca aktywnego enzymu (Enz), jonu metalu (M) i substratu (S) w stosunku 1:1:1 tworzą się trójskładnikowe kompleksy. Możliwe są 4 sposoby połączeń między tymi składnikami: Enz—S—M Kompleks z mostkiem utworzonym przez substrat

M—Enz—S Kompleks z mostkiem utworzonym przez enzym

116 / ROZDZIAŁ 10 M

Enz—M—S Kompleks z mostkiem utworzonym przez metal

Cykliczny kompleks z mostkiem utworzonym przez metal

W przypadku enzymów aktywowanych przez metale mogą się tworzyć kompleksy wszystkich 4 typów. Metaloenzymy nie tworzą natomiast kompleksu typu EnzSM, ponieważ silnie związany z enzymem metal stanowi już kompleks EnzM. Wyniki badań pozwalają obecnie na następujące uogólnienia: 1. Większość, ale nie wszystkie, kinaz (fosfotransferaza: ATP) tworzy kompleksy z most kiem przez substrat typu Enz—nukleotyd—M. 2. Fosfotransferazy działające na pirogronian lub fosfoenolopirogronian, enzymy katali zujące inne reakcje fosfoenolopirogronian u oraz karboksylazy tworzą kompleksy z most kiem poprzez metal. 3. Dany enzym może tworzyć różne typy kompleksów w zależności od substratu. Kompleksy z mostkiem utworzonym przez enzym(MEnzS)

W kompleksach tego typu metale odgrywają przypuszczalnie ro]ę strukturalną utrzymując aktywną konformację (np. syntetaza glutaminowa) lub tworząc mostek z substratem (np. kinaza pirogronianowa). W kinazie pirogronianowej jon metalu, oprócz funkcji strukturalnej, aktywuje ponadto jeden substrat (ATP), który utrzymuje w określonej pozycji.

Kinaza pirogronianowa------ATP Kreatyna Kompleksy z mostkiem utworzonym przez substrat (EnzSM)

Utworzenie trójskładnikowych kompleksów enzymu, metalu i substratu w przypadku trifosforanów nukleozydów przypisuje się wyparciu przez ATP wody ze sfery koordynacyjnej metalu: ATPS + M(HaO)£+ ^ATP—M(HaO)|- + 3HaO a następnie związanie z enzymem; ATP— MfH^O)!"+ Enz^Enz—ATP—WHHjO);-

Uważa się, że w reakcjach fo sfo transferu funkcja jonów metali polega na aktywacji atomów fosforu i tworzeniu polifosforanowoadeninowych kompleksów o charakterystycznej konformacji w aktywnych układach czteroskładnikowych. Kompleksy z mostkiem utworzonym przez metal: Enz—M—S lub Enz

Wyniki badań krystalograficznych i analizy sekwencji aminokwasów wykazały, że resztą wiążącą metal w aktywnym miejscu wielu białek jest His (rip. karboksypeptydaza A, cytochrom c, rubredoksyna. metmioglobina i methemoglobina; p. rozdz. 7), W dwuskładnikowych kompleksach EnzM etapem ograniczającym szybkość wiązania jest często odłączenie wody ze sfery koordynacyjnej jonu metalu. Dla wielu peptydaz aktywacja jonami metalu jest powoJnym, trwającym wiele godzin procesem, prowadzącym do utworzenia aktywnej konfcrrmacji dwuskładnikowego kompleksu. Wiązanie metalu: Enz— Szybko

M
Przekształcenie w aktywną strukturalnie formę (Enz*):

Powstawanie trójskładnikowego kompleksu w przypadku mctalocnzymów polega na przyłączeniu substratu (S) do dwuskładnikowego kompleksu EnzM; Enz—M+S

Enz—M—S lub

Jony metałi odgrywają różnorodne funkcje w katalizie

z^

Jony metali mogą brać udział w każdym z 4 znanych mechanizmów zwiększenia szybkości reakcji chemicznej przez enzymy: 1) ogólnej katalizie kwasowo-zasad owej, 2) katalizie kowalencyjnej, 3) zbliżeniu reagujących związków oraz 4) indukcji zmian strukturalnych w enzymie lub substracie. Oprócz żelaza, funkcjonującego w hemoproteinach, najczęściej zwią-

ENZYMY: MECHANIZMY DZIAŁANIA / 117

zanymi z katalizą enzymatyczną są Mg-2"1", Mn2"1", Ga2*, chociaż w przypadku niektórych enzymów mogą to być również jony innych metali (np, K+). Jony metali, podobnie jak protony, spełniając funkcję kwasów Lewisa (związków elektrofilowych) mogą. uczestniczyć w tworzeniu pary elektronów wiązania sigma. Można je również Enzym

Funkcja jonu metalu

Tabela 10-1. Wybrane przykłady funkcji jonów metaii w mechani2mie działania enzymów* Amoniako-liaza histyMaskowanie grupy nukdynowa leofilowej Kinazy, liazy, dekarbok- Aktywacja grupy eleksylaza pirogronianowa trof iłowej Dehydrataza węglanowa Aktywacja grupy nukleofilowej Enzymy kobamidowe Metal pełni funkcję nukleoftlu Karboksylaza pirogronia- Usunięcie elektronu TT nowa, karboksypeptydaza, dehydrogenaza alkoholowa Niehemowe białka zawierające żelazo Kinaza pirogronianowa, karboksylaza pirogronianowa, kinaza adenylanowa

Oddawanie etektronu %

rozpatrywać jako^.superkwasy", ponieważ występują w środowisku obojętnym, mają ładunek dodatni powyżej 1 i mogą tworzyć wiązania pi. Ponadto (w przeciwieństwie do protonów) mogą służyć jako trójwymiarowa matryca do ustawienia grup zasadowych enzymu lub substratu w określonej pozycji. Jony metali, będąc akceptorami elektronów przez wiązania sigma lub pi, mogą aktywować grupy elektrofilowe oraz nukleofilowe (ogólna kataliza kwasowo-zasadowa). Oddając elektrony jony metali mogą z kolei aktywować grupy nukleofilowe lub same funkcjonować jako nukleofile. Poprzez sferę koordynacyjną metale mogą powodować zbliżenie enzymu i substratu lub w wyniku połączeń chelatowych zmiany konformacyjne w enzymie czy substracie. Ponadto jony metalu mogą „maskować" grupy nukleofilowe zapobiegając w ten sposób reakcji ubocznej, która przebiegałaby prawdopodobnie w ich nieobecności. Wreszcie jony metali poprzez sferę koordynacyjną mogą funkcjonować jako trójwymiarowa matryca utrzymująca reagujące grupy w określonej orientacji przestrzennej, co ma decydujące znaczenie w stereochemicznej kontroli przebiegu katalizowanej przez enzym reakcji (tab. 10-1).

Gromadzenie i ustawianie ligandów

Fosf otrą nsf eraza, izomeraza ksylozowa, hemo- Zmiany konformacji proteiny

* Zaadaptowane z: Mildvan AS, Metals in enzyme catalysis, t. 2, str. 456, w The Enzymes, Boyer PD, Lardy H, Myrback K (red.), Academic Press, 1970.

PIŚMIENNICTWO Fersht A: Enzyme Structure and Meckanism, 2nd ed. Freeman, 1985. Freeman RB, Hawkins HC (editors): The Enzymotogy oj'Past-translationalModification ojProteins, Academic Press, 1985. Purith DL (editor): Enzyme kinetics and mechanisms. Parts A and B in: Methods in Enzymołogy. Vol 63, 1979; Vol 64; 1980. Academic Press. Patrz także piśmiennictwo w rozdz, 7 i 8

1 1

Enzymy: regulacja aktywności Victor W. Rodweii, PhD

WPROWADZENIE

Indukcja enzymów stanowi biochemiczną pod-

W rozdziale tym, na podstawie wybranych przykładów, przedstawiono udział enzymów w regulacji procesów metabolicznych. Przykłady ilustrujące odmienne mechanizmy regulacji metabolizmu zaprezentowano w innych rozdziałach tego podręcznika.

REGULACJA METABOLIZMU ZAPEWNIA HOMEOSTAZĘ

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Mechanizmy, za pomocą których komórki i organizmy regulują i koordynują ogólny metabolizm, są przedmiotem zainteresowania badaczy w wielu dziedzinach nauk biomedycznych dotyczących tak różnych problemów, jak; nowotwory, choroby serca, starzenie, fizjologia drobnoustrojów, różnicowanie, przeobrażenie, działanie hormonów czy działanie leków. We wszystkich tych przypadkach wykazano istnienie zarówno prawidłowej, jak i nieprawidłowej regulacji enzymatycznej. Nieprawidłowości w regulacji aktywności enzymów (brak indukcji lub represji) stwierdza się np. w wielu komórkach nowotworowych. Potwierdza to ogólnie przyjęte założenie, że zaburzenia mechanizmów kontrolujących ekspresje genów leżą u podstaw procesu nowo tworzenia. Niektóre wirusy onkogenne zawierają gen kodujący tyrozyno-swoistą kinaze białek. Ekspresja tego genu w komórkach gospodarza prowadzi do nie mającej miejsca w warunkach prawidłowych fosforylacji wielu białek i enzymów, powodując znaczne zmiany fenotypowe. Uważa się, że zmiany tego typu są główną przyczyną transformacji nowotworowej wywoływanej przez pewne wirusy onkogenne. Innym znamiennym przykładem regulacji enzymatycznej jest działanie leków.

stawę interakcji leków, a więc sytuacji, w której podanie jednego leku powoduje znaczne zwiększenie metabolizmu innego leku.

Wysunięta przez Claude Bernarda pod koniec XIX w. koncepcja homeostatycznej regulacji środowiska wewnętrznego podkreślała zdolność zwierząt do utrzymania stałości środowiska wewnątrzkomórkowego, mimo zmian zachodzących w środowisku zewnętrznym. Chociaż koncepcja ta wyprzedzała współczesną enzymologię, sugerowała ona, że zmiany środowiska zarówno wewnętrznego, jak i zewnętrznego wpływają na szybkość reakcji katalizowanych przez enzymy. Komórka lub organizm, reagujące w sposób niewystarczający lub nieprawidłowy na bodźce wewnętrzne lub zewnętrzne, mogą być określone jako chore. Wiedza o czynnikach wpływających na szybkość reakcji katalizowanych przez enzymy ma szczególne znaczenie zarówno w zrozumieniu mechanizmów homeostazy w komórkach prawidłowych, jak i poznaniu molekularnych podstaw chorób.

Przepływ metabolitów jest z reguły jednokierunkowy Wszystkie reakcje chemiczne, łącznie z reakcjami katalizowanymi przez enzymy, są do pewnego stopnia odwracalne*. W komórkach ży* Reakcje łatwo odwracalne charakteryzuje mała wartość liczbowa AG. Reakcje o dużej wartości ujemnej AG, do jakich należy większość przemian biochemicznych, można określić jako nieodwracalne.

ENZYMY; REGULACJA AKTYWNOŚCI / 119

wych jednak reakcje odwracalne zasadniczo nie zachodzą, ponieważ produkty jednej reakcji są natychmiast usuwane na skutek włączania ich w następne reakcje katalizowane przez inne enzymy. Przepływ metabolitów w żywej komórce przypomina przepływ wody w instalacji wodociągowej. Chociaż woda może płynąć w dowolnym kierunku, w praktyce jej przepływ jest jednokierunkowy. Podobnie przepływ metabolitów w żywych komórkach jest także w znacznym stopniu jednokierunkowy. Stan równowagi, nietypowy dla życia, komórka osiąga dopiero w chwili śmierci. Jednokierunkowy przepływ metabolitów w żywej komórce pozwala na zachowanie stałości środowiska wewnętrznego (ryc. 11-1). W pełni wykształconej

sorów makrocząsteczek, transport, wydzielanie lub wchłanianie musi ulegać zmianom pod wpływem nawet niewielkich zmian w środowisku komórki, narządu lub całego organizmu. Procesy te muszą być skoordynowane i reagować zarówno na krótkotrwałe zmiany w środowisku zewnętrznym (np. dodanie lub usuniecie składnika pokarmowego), jak również wydarzenia okresowo zachodzące wewnątrz komórki (np. replikacja DNA). Brak złożonych systemów kontroli hormonalnej i nerwowej, a także stosunkowa łatwość prowadzenia badań na poziomie genomu powoduje, że obecnie najlepiej poznane są szczegóły molekularnych podstaw regulacji u bakterii. Chociaż jest oczywiste, że pozornie podobne zjawiska u bakterii i ssaków znacznie się różnią, regulacja procesów metabolicznych u bakterii stanowi podstawę do zrozumienia tej regulacji u człowieka. AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW REGULUJĄ 3 PODSTAWOWE MECHANIZMY

Ryc. 11-1. Schemat homeostazy komórkowej.

komórce średnie stężenie metabolitów pozostaje względnie stałe w dużych przedziałach czasowych*. Zdolność przystosowawczą żywej komórki najlepiej ilustrują jedynie niewielkie zmiany i przesunięcia, za pomocą których organizm zachowuje stałość środowiska wewnętrznego pomimo dużych różnic w pobieraniu pokarmu, wody i soli mineralnych, wykonywaniu pracy, czy temperaturze zewnętrznej. Szybkość reakcji odzwierciedla zmieniające się potrzeby fizjologiczne Aby procesy życiowe przebiegały w uporządkowany sposób, przepływ metabolitów przez szlaki anaboliczne i kataboliczne musi podlegać regulacji, a szybkość reakcji chemicznych niezbędnych w danym momencie musi odpowiadać potrzebom organizmu ze względu na jego otoczenie. Przebieg wszystkich procesów, takich jak wytwarzanie ATP, biosynteza prekur-

Ogólnie mówiąc, na przepływ węgla przez jakąkolwiek reakcję katalizowaną przez enzym mają wpływ: 1) zmiany bezwzględnej ilości obecnego enzymu, 2) zmiany wielkości puli reagujących związków, innych niż enzym oraz 3) zmiany sprawności katalitycznej enzymu. Wszystkie te możliwości są wykorzystywane przez większość form życia. Szybkość syntezy i degradacji determinuje ilość enzymu Bezwzględna ilość danego enzymu jest wypadkową szybkości jego syntezy (ks), oraz szybkości jego degradacji (k^) (ryc. 11-2). Ilość enzymu w komórce może się zwiększyć w wyniku zwiększenia szybkości jego biosyntezy (zwiększenie wartości ks), zmniejszenia szybkości jego degradacji (zmniejszenie wartości kdes) lub obu procesów równocześnie. Podobnie zmniejszenie ilości enzymu może być wynikiem zmniejszenia wartości ks, zwiększenia wartości k^g lub obu Enzym

k, f

) k„.fl

Aminokwasy * Zdarzają się jednak krótkotrwałe zmiany w stężeniach metabolitów i enzymów mające ogromne znaczenie fizjologiczne.

Ryc. 11-2. Ilość enzymu jest wypadkową jego syntezy i degradacji.

120 / ROZDZIAŁ 11

wartości równocześnie. We wszystkich formach życia biosynteza enzymu (białka) z aminokwasów i degradacja enzymu (białka) do aminokwasów są odmiennymi procesami, katalizowanymi przez zupełnie różne zestawy enzymów. Dzięki temu regulacja biosyntezy i degradacji enzymu może przebiegać niezależnie.

Synteza enzymów może być uruchamiana w odpowiedzi na pewne indu który

Reakcją komórek na obecność swoistych małocząsteczkowych induktorów jest synteza swoistych enzymów. Na przykład Escherichia coli hodowana na pożywce zawierającej glukozę nie fermentuje laktozy na skutek braku pgalaktozydazyhyrolizującej laktozę do galaktozy i glukozy. Dodanie do podłoża laktozy lub innych p-ga lak to żydów indukuje P-galaktozydazę, dzięki czemu w hodowli może zachodzić fermentacja laktozy. Chociaż na ogół induktorami są substraty indukowanych enzymów, mogą być nimi również związki strukturalnie przypominające substraty, nie będące jednak substratami. Określa się je mianem induktorów gratisowych. Odwrotnie, pewne związki, mimo że są substratami, nie muszą być induktorami. Często jeden związek indukuje kilka enzymów danego szlaku metabolicznego (np. laktoza indukuje zarówno permeazę p-g a laktozy do wą, jak i P-galaktozydaze). Enzymy, których stężenie w komórce jest niezależne od dodanego induktora określa się jako konstytutywne. Ten sam enzym, w zależności od szczepu bakteryjnego, może mieć charakter konstytutywny, ulegać indukcji lub być w ogóle nieobecny. Komórki, w których dany enzym \ub inne białko ulega indukcji, zwykle zawierają bardzo małą, ale dającą się zmierzyć, podstawową ilość tego białka nawet w nieobecności induktora. Wrażliwość komórek na induktory jest uwarunkowana genetycznie. Dlatego też określenia „konstytutywny" czy „ulegający indukcji'1 mają charakter względny, podobnie jak „ciepły" i „zimny", i oznaczają jedynie krańcowe możliwości reakcji komórki w obecności induktora. Indukcja enzymów jest zjawiskiem występującym również u eukariontów. U zwierząt enzymami ulegającymi indukcji są np. 2,3-dioksygenaza tryptofanowa, dehydrataza treoninowa, aminotransferaza tyrozyna :a-ketoglutaran, p-D-fruktofuranozydaza, enzymy cyklu mocz-

nikowego, reduktaza HMG-CoA i cytochrom P-450.

Synteza enzymów może ulegać represji pod wpływem ostatecznego produktu

Obecność w środowisku reakcyjnym syntetyzowanego metabolitu może powodować represję dalszej jego syntezy. Małe cząsteczki, takie jak puryny czy aminokwasy, działając na zasadzie korepresorów mogą więc blokować syntezę enzymów biorących udział w ich własnej biosyntezie. Na przykład u Salmonella typhimuriurn w obecności egzogennej histydyny (His) następuje represja syntezy wszystkich enzymów biosyntezy histydyny, a po dodaniu do pożywki leucyny represji ulega synteza 3 enzymów typowych jedynie dla biosyntezy Leu. Po usunięciu lub wyczerpaniu w podłożu konkretnego związku pośredniego dla danej biosyntezy zachodzi proces odwrotny, określony jako derepresja. Powyższe przykłady ilustrują charakterystyczną dla szlaków biosyntezy u bakterii represję na zasadzie sprzężenia zwrotnego za pomocą produktu. Zjawiskiem pokrewnym jest represja za pomocą katabolitu. Polega ona na represji syntezy enzymów biorących udział w katabolizmie pod wpływem związków pośrednich, powstających w reakcjach kata bo licznych kataiizowanych przez te enzymy. Zjawisko to po raz pierwszy zaobserwowano w hodowlach E. coli rosnących na pożywkach zawierających inne (X) niż glukoza źródło węgla. Nazwano je „efektem glukozy", dodanie bowiem do podłoża glukozy powodowało represję syntezy enzymów związanych z katabolizmem związku X. Z chwilą, kiedy stwierdzono, że utlenianie składników pożywienia innych niż glukoza wywołuje podobne efekty, wprowadzono termin represji za pomocą katabolitu. Związkiem pośredniczącym w represji katabolicznej jest cAMP. Molekularne mechanizmy indukcji, represji i derepresji przedstawiono w rozdz. 41.

WE WSZYSTKICH FORMACH ŻYCIA ZACHODZI OBRÓT METABOLICZNY BIAŁEK Procesy syntezy enzymu i jego degradacji określa się mianem obrotu metabolicznego. Obrót metaboliczny białek stwierdzono jako właściwość cechującą wszystkie komórki ssaków na długo zanim zaobserwowano występowanie tego zjawiska u bakterii. O istnieniu przemiany

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI / 121

białek (enzymów) u ludzi wywnioskowano z doświadczeń dotyczących odżywiania się człowieka przeszło 100 lat temu. Klasyczne już badania Schoenheimera, prowadzone tuż przed II wojną światową i w czasie jej trwania, niezbicie dowiodły, że w czasie życia człowieka zachodzi ciągła przemiana białek komórkowych. Mierząc szybkość wbudowywania znakowanych' ;N-aminokwasów do białek oraz szybkość ich ubytku z białek, Schoenheimer wykazał, że w organizmie białka są w stanie „dynamicznej równowagi". Koncepcja ta obejmuje również inne składniki organizmu, łącznie z lipidami i kwasami nukleinowymi. Degradacja swoistych enzymów jest regulowana Szczegóły degradacji białek ssaków w wyniku proteoiizy zależnej od ATP i ubikwityny oraz niezależnej od ATP przedstawiono w rozdz. 31. Wrażliwość enzymów na proteolityczną degradację jest uzależniona od ich konformacji. Obecność lub brak czynników zmieniających konformację białka, takich jak substraty, koenzymy lub jony metali, wpływa więc na podatność enzymów na proteolizę. Stężenie substratów, koenzymów i prawdopodobnie jonów w komórce może w ten sposób warunkować szybkość degradacji swoistych enzymów. Koncepcję tę ilustrują dwa enzymy: arginaza i 2,3-dioksygenaza tryptofanowa (pirolaza tryptofanowa).

Regulacja stężenia arginazy w wątrobie obejmuje zmianę wartości kj lub kdcg. Zwiększenie stężenia arginazy w wątrobie po spożyciu pokarmu bogatego w białko jest wynikiem zwiększonej syntezy tego enzymu. Zwiększenie natomiast stężenia arginazy w wątrobie zwierząt głodzonych jest skutkiem zmniejszonej degradacji tego enzymu, podczas gdy wartość ks pozostaje nie zmieniona. W przypadku drugiego enzymu zwiększenie stężenia 2.3-dioksygenazy tryptofanowej u ssaków obserwuje się po wstrzyknięciu glikokortykoidów lub spożyciu tryptofanu. Stwierdzono, że hormony powodują zwiększenie syntezy tego enzymu (zwiększenie ks), Trp natomiast nie wpływa na wartość IŁ,, ale zmniejsza wartość k^g w wyniku zmniejszenia podatności enzymu na proteolizę. Zwiększenie stężenia arginazy w wątrobie, w wyniku zwiększonego spożycia azotu w diecie bogatobia&owej (p. rozdz. 31) przypomina indukcję za pomocą substratu u bakterii. Jednak w przypadku 2,3-dioksygenazy tryptofanowej, nawet jeśli tryptofan może działać jako induktor u bakterii (zmienia kj, to u ssaków wpływa on wyłącznie na proces degradacji enzymu (zmniejsza kdpg). Na stężenie enzymu w tiankach ssaków mają znaczny wpływ zmiany fizjologiczne, hormonalne lub pokarmowe (tab. 11 -1), ale wiedza o molekularnych podstawach tych zmian jest nadal fragmentaryczna.

Tabela 11-1. Adaptacja wybranych enzymów wątroby szczura do zmian w środowisku*

Enzym

Bodziec



Zmiana

aktywności

Metabolizm aminokwasów Arginaza

100—120 Głodzenie lub glikokortykosteroidy

Zamiana diety z bogatobiarkowej na matobiałkową

+2 -2

Dehydrataza sery nowa

20

Glukagon lub aminokwasy egzogenne

+ 100

Amoniako-liaza histydynowa

60

Zmiana diety z maiobiałkowej na bogatobiałkowa

+ 20

15

Hormony tarczycy lub dieta bogatowęglowodanowa poprzedzona głodzeniem

+ 10

Hormony tarczycy

+ 10

Glukoza

+ 10

Metabolizm węglowodanów Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa

Dehydrogenaza glicerolo-a-fosforanowa Fruktozobisfosfataza (Fruktozo-1,6-bisfosfataza)

100

122 / ROZDZIAŁU cd. tab. 11-1 Enzym

ti/2

W

Metabolizm lipidów Enzym rozszczepiający cytrynian

Dieta bogatowęglowodanowa i małottuszczowa poprzedzona głodzeniem Głodzenie Dieta beztłuszczowa poprzedzona głodzeniem

Syntetaza kwasów tłuszczowych

Reduktaza HMG-CoA

Metabolizmpuryn i

Bodziec

2—3

Zmiana aktywności

+30

-10

+30

Głodzenie lub dieta zawierająca 5% - 10 ± 5 cholesterolu Zmiany dobowe + 2do10 Insulina lub hormony tarczycy

pjrymidyn

Oksydaza ksantynowa Karbamoilotransferaza asparaginianowa

60

Dihydroorotaza

12

Dieta bogatobiatkowa Dieta zawierająca 1% kwasu orotowego

-10

Dieta zawierająca 1% kwasu orotowego

+3

+2

* Dane poza dotyczącymi reduktazy HMG-CoA z: Schimke RT, Doyle D: Control of enzyme levels in animał tissues, Annu, Rev, Biochem. 1970; 39:929.

AKTYWNOŚĆ KATALITYCZNA ENZYMÓW MOŻE BYĆ REGULOWANA W ROŻNY SPOSÓB

Glikokortykosteroidy powodują zwiększenie stężenia aminotransferazy tyrozynowej przez pobudzenie jej syntezy. Stwierdzenie to było pierwszym dowodem istnienia hormonalnej regulacji biosyntezy enzymów u ssaków. Insulina i glukagon — pomijając ich wzajemne antagonistyczne działanie fizjologiczne — niezależnie od siebie zwiększają 4—5-krotnie wartość k s . W działaniu glukagonu pośredniczy prawdopodobnie cAMP, który w hodowlach tkankowych wątroby szczura wywołuje podobne do hormonu skutki.

Zmiana aktywności enzymu może być wynikiem zmiany bezwzględnej ilości enzymu lub obecny enzym może stać się bardziej lub mniej skutecznym katalizatorem. Zmiany aktywności

Regulacja poprzez syntezę niektórych enzymów w formie nieaktywnych prekursorów

KOMPARTMENTACJA ENZYMÓW UŁATWIA REGULACJĘ METABOLIZMU

Regulacja aktywności enzymatycznej może polegać na biosyntezie enzymu w formie nieaktywnego proenzymu. Przekształcenie proenzy-,mu w formę aktywną katalitycznie jest wynikiem ograniczonej proteolizy, procesu któremu towarzyszą zmiany konformacyjne odsłaniające lub „tworzące" miejsce katalityczne (p. rozdz. 9). Synteza enzymów w formie nieaktywnych prekursorów jest zjawiskiem charakterystycznym dla enzymów trawiennych oraz czynników krzepnięcia krwi i fibrynolizy (p. rozdz. 58).

katalitycznej enzymu, zachodzące bez zmiany jego ilości, określa się jako „wpływ na sprawność katalityczną enzymu".

Znaczenie kompartmentacji procesów metabolicznych w komórkach eukariotycznych, łącznie z komórkami ssaków, jakkolwiek bardzo ważne, nie może być przeceniane. Umiejscowienie swoistych procesów metabolicznych w cytozolu lub organellach komórkowych umożliwia ich niezależną regulację, Kompartmentacja procesów metabolicznych, charakterystyczna dla wyższych form życia, daje więc możliwość bardzo finezyjnej regulacji metabolizmu. Jed-

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI / 123

nocześnie stwarza jednak problem przemieszczania metabolitów przez błony oddzielające poszczególne struktury subkomorkowe. Przenikanie przez te bariery jest możliwe dzięki istnieniu mechanizmów zapewniających przemiesz-

czanie w wyniku przekształcania metabolitów w formy przepuszczalne dla błon. Po przejściu przez Honę metabolity są ponownie przekształcane w postać pierwotną. W konsekwencji wymaga to występowania tej samej aktywności katalitycznej w 2 formach, np. cytozolowej 1 mitochondrialnej. Fizyczne rozdzielenie tych 2 form enzymu ułatwia ich niezależną regulację. W rozdziale 18 przedstawiono udział mechaniz mów umożliwiających przenikanie przez błony w zachowaniu równowagi puli metabolicznej związków pośrednich cyklu kwasu cytrynowe go i innych związków amfibolicznych.

ENZYMY KATALIZUJĄCE CIĄGI REAKCJI METABOLICZNYCH MOGĄ TWORZYĆ WIELKOCZĄSTECZKOWE KOMPLEKSY Organizacja enzymów katalizujących kolejne reakcje szlaku metabolicznego w wielkocząsteczkowe kompleksy koordynuje działanie enzymów i przepływ metabolitów. Istnienie układów wieloenzymowych zwiększa dostępność związków pośrednich dla enzymów danego szlaku przemian, umożliwia bowiem przenoszenie produktów między enzymami bez uprzedniego ustalenia ich równowagi z pulami metabolicznymi. Pozwala to na bardziej precyzyjną kontrolę metabolizmu niż miałoby to miejsce w przypadku enzymów nie pozostających w kompleksie. Ponadto zmiany konformacyjne jednego ze składników kompleksu przez interakcje białko-białko mogą być przekazywane innym składnikom tego kompleksu, powodując w ten sposób wzmocnienie skutków regulacji.

STĘŻENIE SUBSTRATÓW, KOENZYMÓW, KATIONÓW MOŻE REGULOWAĆ AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW Średnie wewnątrzkomórkowe stężenie substratu, koenzymu lub jonu metalu może nie stanowić właściwej podstawy do oceny aktywności enzymu in vivo. Niezbędna jest w tym celu znajomość stężeń metabolitów bezpośrednio do-

stępnych dla danego enzymu. Jednak nawet

pomiar stężenia metabolitu w organellach komórkowych nie odzwierciedla faktycznego stanu rzeczy m.in. wskutek znacznej bliskości wytwarzania i usuwania danego związku. Ponadto istnieją często duże różnice pomiędzy całkowitym stężeniem metabolitu a stężeniem metabolitu wolnego, tj. dostępnego dla enzymu. Na przykład, mimo że całkowite stężenie 2,3-bisfosfoglicerynianu w erytrocytach jest bardzo duże, to stężenie wolnego bisfosfoglicery-nianu jest porównywalne z innymi tkankami. Podobnie dostępność wielu innych metabolitów ulega znacznemu zmniejszeniu w obecności wiążących je białek. Jednym z podstawowych założeń teorii kinetyki enzymatycznej Michaelisa-Menten jest to, że ogólne stężenie substratu odpowiada stężeniu dostępnego substratu. Założenie to może się jednak nie sprawdzać w warunkach in vivo, gdzie stężenie wolnych substratów często jest tego samego rzędu wielkości co stężenie enzymów. Regulatorową rolę mogą spełniać również jony metali zaangażowane w strukturę i funkcję ponad JĄ wszystkich znanych enzymów (p. rozdz. 10), a szczególnie w przypadku reakcji, w których substratem jest ATP. Największą aktywność obserwuje się zazwyczaj wówczas, gdy w kompleksie ATP-jon metalu stosunek ATP do metalu wynosi ok. 1. Nadmiar metalu lub ATP ma wpływ hamujący. Ponieważ difosforany i trifosforany nukleozydów tworzą trwale kompleksy z jonami metali dwuwartościowych, wydaje się, że wewnątrzkomórkowe stężenie nukleotydów może regulować wewnątrzkomórkowe stężenie wolnych jonów metali, a tym samym aktywność pewnych enzymów. X

AKTYWNOŚĆ OKREŚLONYCH ENZYMÓW REGULUJĄ EFEKTORY ALLOSTERYCZNE Aktywność katalityczna pewnych kluczowych w danym szlaku metabolicznym enzymów — enzymów regulatorowych — jest modulowana za pomocą ma łocząs teczko wych efektorów allosterycznych, które na ogół nie wykazują podobieństwa do substratów lub koenzymów danego enzymu. Hamowanie aktywności enzymu szlaku biosyntezy przez końcowy produkt tego szlaku nosi nazwę hamowania przez sprzężenie zwrotne. W biosyntezie

124 / ROZDZIAŁ 11

związku D ze związku A, katalizowanej przez enzymy Enz1; Enz2 i Enz3 Enz,

B

Enza

Enz,

duże stężenie związku D z reguły hamuje przemianę A w B. Nie zachodzi tu proste „cofanie się" związków pośrednich, ale związek D wiąże się z Enzl5 hamując jego aktywność. Związek D działa więc jako ujemny efektor allosteryczny lub inhibitor zwrotny Enz,. W ten sposób hamowanie Enz! przez D na zasadzie sprzężenia zwrotnego reguluje ostatecznie syntezę związku D. Związek D łączy się zwykle z miejscem allosterycznym, oddalonym od miejsca katalitycznego enzymu. Hamowanie przez sprzężenie zwrotne może mieć charakter kompetycyjny, niekompetycyjny, częściowo kompetycyjny lub inny. Hamowanie przez sprzężenie zwrotne najczęściej jest spotykane w przypadku szlaków biosyntezy. Często inhibitorem zwrotnym jest ostatnia mała cząsteczka przed utworzeniem związku wielkocząsteczkowego (np. aminokwasy w szlaku biosyntezy białek, nukleotydy w szlaku biosyntezy kwasów nukleinowych). Zazwyczaj regulacja przez sprzężenie zwrotne dotyczy najwcześniejszego, funkcjonalnie nieodwracalnego* etapu charakterystycznego wyłącznie dla danego szlaku biosyntezy; najlepiej poznanym przykładem jest hamowanie karbamoilotransferazy asparaginianowej przez CTP (p. rozdz. 36). Często szlak biosyntezy jest rozgałęziony, tzn. metabolity początkowe są wykorzystywane do biosyntezy 2 lub więcej metabolitów końcowych. Hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego w rozgałęzionym szlaku biosyntezy (np. biosyntezy aminokwasów, puryn lub pirymidyn) przedstawia ryc. 11-3. Związki S^ S2 iS3 są prekursorami wszystkich 4 produktów końcowych (A, B, C i D) natomiast związek S 4 jest prekursorem produktów B i C, a związek S; prekursorem wyłącznie produktu D. Przekształcenia: S, ------ A

S3

► C

, - D

* Reakcją przebiegającą praktycznie w jednym kierunku {wznaczeniu termodynamicznym) jest reakcja o dużej wartości ujemnej AG.

Ryc. 11-3. Hamowanie przez sprzężenie zwrotne w rozgałęzionym szlaku biosyntezy.S-\ — S5 są związkami pośrednimi w biosyntezie ostatecznych produktów A — D. Strzałki proste oznaczają -en zymy katalizujące określone przemiany. Strzałki wygięte wskazują hipotetyczne miejsca hamowa nia przez swoiste produkty końcowe w wyniku sprzężenia zwrotnego.

stanowią więc liniowe ciągi reakcji, które jak można się spodziewać, są hamowane na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez ich produkty końcowe. Konkretnym przykładem tego zjawiska jest biosynteza nukleotydów (p. rozdz. 36). Różnorodne mechanizmy hamowania przez sprzężenie zwrotne regulują rozgałęzione szlaki metaboliczne ~ Różnorodność mechanizmów hamowania przez sprzężenie zwrotne w rozgałęzionych szlakach metabolicznych stanowi dodatkowy poziom regulacji (ryc. 11-4). Na przykład, jeśli produkt B występuje w nadmiarze, to zmniejsza sie zapotrzebowanie na związek S2. Zdolność produktu B do zmniejszenia syntezy S2 jest więc korzystna z biologicznego punktu widzenia. Jeśli jednak nadmiar związku B hamuje tę część szlaku, która dotyczy nie tylko jego własnej

Ryc. 11-4. Regulacja rozgałęzionego szlaku bio syntezy w wyniku hamowania przez sprzężenie zwrotne. Dodatkowe, w porównaniu ze schematem przedstawionym na ryc. 11-3, strzałki wygięte, oznaczone liniami ciągłymi, wskazują-różnorodno&ć mechanizmów hamowania przez sprzężenie zwrotne.

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI / 125

biosyntezy, ale jest wspólna dla biosyntezy związków A, C czy D, to nadmiar związku B potencjalnie mógłby wstrzymać syntezę wszystkich 4 produktów. Istnieją jednak mechanizmy, które zapobiegają takiemu niepożądanemu efektowi. W kumulatywnym hamowaniu przez sprzężenie zwrotne hamujący wpływ 2 lub więcej produktów końcowych na I enzym regulatorowy jest sumą skutków wywoływanych przez każdy z tych produktów niezależnie. W zgodnym lub wielo wartościowym hamowaniu przez sprzężenie zwrotne całkowite zahamowanie ma miejsce tylko wtedy, kiedy jednocześnie 2 lub więcej produktów końcowych jest obecnych w nadmiarze. W kooperatywnym hamowaniu przez sprzężenie zwrotne I końcowy produkt występujący w nadmiarze hamuje enzym regulatorowy, ale w obecności 2 lub więcej produktów końcowych stopień hamowania znacznie przewyższa sumaryczny efekt kumulatywnego hamowania przez sprzężenie zwrotne. Najlepiej poznanym enzymem atlosterycznym jest karbamoiłotransferaza asparaginia nowa Karbamoiłotransferaza asparaginianowa (ATCaza) katalizuje pierwszą reakcję w szlaku biosyntezy pirymidyn {ryc. 11-5). Enzym ten jest hamowany na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez trifosforan cytydyny (CTP). W obecności związków rtęci ATCaza staje się niewrażliwa na CTP, ale zachowuje pełną aktywność syntezy karbamoiioasparaginianu. Sugeruje to, iż CTP wiąże się z enzymem w innym miejscu (allosterycznym) niż każdy z substratów. Cząsteczka ATCazy składa się z 2 podjednostek katalitycznych i 3 lub 4 podjednostek regulatorowych. Każda podjednostka katalityczna zawiera 4 miejsca wiązania asparaginianu (substratu), a każda jednostka regulatorowa co najmniej 2 miejsca wiązania CTP (regulatora). Otrzymanie mutantów pozbawionych prawidłowej kontroli zwrotnej przez CTP, a z nich rewertantów z prawidłowymi właściwościami pozwoliło wykazać, że oba rodzaje podjednostek podlegają niezależnej kontroli genetycznej. Miejsca allosteryczne i katalityczne są przestrzennie odmienne Około 1963 r. Monod zwrócił uwagę na brak strukturalnego podobieństwa pomiędzy inhibi-

0

■*ii

CH,

I

-o-c.

♦

•"Mv C 00

~

KARBAMOILOTRANSFERAZA ASPARAGIN1AN0WA I

o u o-c *CH,

Kar b ama i I o as p a r ag i n i an

Ryc. 11-5. Reakcja katalizowana przez karbamoilotra nsferazę asparag in ianową.

torem zwrotnym a substratem dla enzymu, którego aktywność podlega regulacji. Skoro efektory nie są izosteryczne, ale allosteryczne („zajmują inną przestrzeń") z substratem zaproponował on, że enzymy, których aktywność jest regulowana przez efektory allosteryczne (np. inhibitory zwrotne) wiążą efektor w miejscu fizycznie odmiennym od miejsca katalitycznego, tj. w miejscu allosterycznym. Enzymy, których aktywność miejsca katalitycznego może być regulowana przez efektory allosteryczne znajdujące się w miejscu atlosterycznym określa się jako enzymy allosteryczne. Istnienie fizycznie odrębnych miejsc allosterycznych w cząsteczce enzymu potwierdzają m.in. następujące fakty: 1. Modyfikacje enzymów za pomocą technik chemicznych lub fizycznych często prowadzą do utraty ich wrażliwości na efektory allosteryczne. nie zmieniając jednocześnie ich aktywności katalitycznej. Wybiórczą denaturacje miejsc allosterycznych można spowodować działając związkami rtęci, mocznikiem, promieniowaniem X, enzymami proteolitycznymi, roztworami o skrajnych wartościach siły jonowej lub pH, przechowywaniem w temp. 0—5°C, zamrażaniem lub ogrzewaniem.

i

126 / ROZDZIAŁ 11

2. Efektory ałlosteryczne, w odróżnieniu od substratów, często zabezpieczają miejsce katali tyczne przed denaturacją. Wydaje się mało prawdopodobne, aby związanie efektora z miej scem katalitycznym zapobiegało denaturacji, podczas gdy związanie substratu nie. Sugeruje to istnienie drugiego miejsca allosterycznego w innej części cząsteczki enzymu. 3. Enzymy pewnych mutantów komórek ba kteryjnych i ssaków wykazują zmienione właś ciwości regulatorowe, mimo identycznych 2 ty pem dzikim (z którego mutant powstał) właś ciwości katalitycznych. Miejsca ałlosteryczne i katalityczne są zatem odmienne genetycznie. 4. Badania dotyczące wiązania substratów i efektorów aU o sferycznych wykazały, że wiążą się one niezależnie od siebie. 5. W niektórych przypadkach miejsce ałlo steryczne i miejsce katalityczne są umiejscowio ne w odrębnych podjednostkach. Enzymy allosteryczne charakteryzuje sigmoidalny przebieg krzywej kinetyki wiązania substratu Na rycinie 11 -6 przedstawiono zależność szybkości reakcji katalizowanej przez typowy enzym allosteryczny od stężenia substratu w obecności i nieobecności inhibitora allosterycznego. W nieobecności inhibitora allosterycznego krzywa nasycenia substratem ma kształt hiperboli, podczas gdy w jego obecności ma kształt

Ryc. 11 -6. Sigmoidalna krzywa wiązania substratu w obecności inhibitora allosterycznego.

sigmoidamy; przy dużych stężeniach substratu krzywa sigmoidalna może się łączyć z krzywą hiperbo liczną. Analogiczną zależność obserwuje się w przypadku krzywych nasycenia O2 dla mioglobiny i hemoglobiny (p. rozdz, 7). Na podstawie analizy kinetyki reakcji wykazano, że hamowanie przez sprzężenie zwrotne może mieć charakter kompetycyjny, niekompetycyjny, częściowo kompetycyjny lub inny. Jeśli przy dużych stężeniach S aktywność enzymu w obecności i nieobecności inhibitora allosterycznego jest porównywalna, to kinetycznie reakcja odpowiada hamowaniu kompetycyjnemu. Sigmoidalny, a nie hiperboliczny, przebieg krzywej nasycenia substratem uniemożliwia jednak w przypadku hamowania allosterycznego określenie charakterystycznych wielkości za pomocą metody stosowanej w przypadku hamowania kompetycyjnego w miejscu katalitycznym, tj. graficznego przedstawienia danych jako liniowej funkcji odwrotności stężenia substratu i szybkości reakcji. Przyczyną jest fakt, że inhibitory ałlosteryczne wiążą się w innym miejscu {allosterycznym} niż analog substratu. Sigmoidalny charakter krzywej zależności v od S w obecności inhibitorów allosterycznych odzwierciedla zjawisko kooperatywności. Przy małych stężeniach S aktywność w obecności inhibitora, w porównaniu z aktywnością w jego nieobecności, jest mała. Jednak, w miarę zwiększania się stężenia S, hamowanie się zmniejsza. Wskazuje to na istnienie 2 lub więcej wzajemnie na siebie oddziałujących miejsc wiązania substratu. Obecność cząsteczki substratu w jednym miejscu katalitycznym ułatwia wiązanie drugiej cząsteczki substratu w drugim miejscu. Zjawisko kooperatywności wiązania substratu przedstawiono w rozdz. 7 dotyczącym hemoglobiny. Sigmoidalny przebieg krzywej nasycenia O% jest wynikiem kooperatywnego oddziaływania między miejscami wiążącymi O2 umiejscowionymi w różnych podjednostkach. W wyniku oddziaływań allosterycznych zmienia się wartość Km lub Vmaka. Odnoszenie określeń „kompetycyjny" lub „niekompetycyjny" z substratem do kinetyki hamowania allosterycznego może wprowadzać w błąd. Słuszniejszym wydaje się podział enzymów podlegających regulacji na 2 grupy, tj. enzymy serii K i enzymy serii V. W-przypadku enzymów allosterycznych serii K kinetyka nasycenia substratem jest kompetycyjna w sensie

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚĆ! / 127

zwiększenia wartości Km (zmniejszenie powinowactwa dp substratu) i braku wpływu na wartość Vmaks. Natomiast w przypadku enzymów allosterycznych serii V efektor allosteryczny zmniejsza wartość Vmai£s. (zmniejszenie sprawności katalitycznej) bez widocznego wpływu na wartość Km. Zmiany wartości Km i Vmai;S. wynikają prawdopodobnie ze zmian konformacyj-nych w miejscu katalitycznym wywołanych związaniem efektora all o sferycznego w miejscu allosterycznym. Dla enzymów allosterycznych serii K skutkiem zmian konformacyjnych może być osłabienie wiązań pomiędzy substratem a resztami amin okwa sowy mi w miejscu wiążącym substrat. Odpowiednio dla enzymów allosterycznych serii V pierwotnym skutkiem może być zmiana orientacji przestrzennej reszt katalitycznych, prowadząca do zmniejszenia wartości Vmaks.- Zmiany konformacyjne mogą mieć również pośredni wpływ na wartości K_m i Vma)(S, Kooperatywne wiązanie substratu ma istotne znaczenie fizjologiczne Fizjologiczne następstwa kooperatywnego wiązania substratu są analogiczne jak w przypadku efektów kooperatywnego wiązania O2 przez hemoglobinę. Przy małym stężeniu substratu efektor allosteryczny jest skutecznym inhibitorem. Jego oddziaływanie regulatorowe jest więc najbardziej efektywne w warunkach największego zapotrzebowania, tj. kiedy wewnątrzkomórkowe stężenie substratu jest małe. Wraz ze zwiększeniem dostępności substratu ścisła regulacja staje się mniej konieczna. W miarę zwiększania stężenia substratu stopień hamowania maleje i w rezultacie powstaje więcej produktu. Podobnie jak w przypadku hemoglobiny, sigmoidalna krzywa nasycenia substratem świadczy o tym, że względnie małe zmiany stężenia substratu powodują duże zmiany aktywności. W ten sposób poprzez małe zmiany stężenia substratu jest osiągana czuła kontrola aktywności katalitycznej enzymu. Ponadto, analogicznie do zróżnicowania krzywych nasycenia O2 hemoglobin odmiennych gatunków, sigmoidalne krzywe nasycenia enzymów regulatorowych, pochodzących z różnych źródeł, mogą być przesunięte w lewo lub w prawo w zależności od istniejącego in vivo stężenia substratu.

REGULACJA NA ZASADZIE SPRZĘŻENIA ZWROTNEGO NIE JEST SYNONIMEM HAMOWANIA PRZEZ SPRZĘŻENIE ZWROTNE Zarówno w komórkach ssaków, jak i bakterii produkty końcowe, działając na zasadzie „sprzężenia zwrotnego", kontrolują swoją syntezę. W wielu przypadkach mechanizm tego zjawiska polega na hamowaniu enzymu katalizującego początkowe etapy biosyntezy. Należy jednak odróżnić regulację na zasadzie sprzężenia zwrotnego, stanowiącą jedynie określenie fenomenologiczne, od hamowania przez sprzężenie zwrotne stanowiącego mechanizm regulacji wielu enzymów bakterii i ssaków. Na przykład cholesterol zawarty w diecie ogranicza syntezę cholesterolu z octanu w tkankach ssaków. Ta regulacja na zasadzie sprzężenia zwrotnego nie polega jednak na hamowaniu przez sprzężenie zwrotne enzymu katalizującego pierwsze etapy biosyntezy cholesterolu, ale cholesterol lub jego metabolit powoduje zmniejszenie ekspresji genu kodującego reduktazę HMG-CoA. Cholesterol bezpośrednio nie ma natomiast żadnego wpływu na aktywność reduktazy HMG-CoA. REGULACJA KLUCZOWYCH ENZYMÓW SSAKÓW MOŻE POLEGAĆ NA ICH ODWRACALNYCH MODYFIKACJACH KOWALENCYJNYCH Aktywność katalityczna enzymów może być regulowana za pomocą odwracalnych modyfikacji, polegających na przyłączaniu grup fosforanowych (głównie u ssaków) lub nukleotydów (głównie u bakterii). Enzymy ulegające modyfikacjom wpływającym na ich aktywność są określane jako enzymy o wewnątrzcząsteczkowej zmienności (ang. interconvertible enzymes) (ryc. 11-7). Enzymy te występują w 2 formach różniących się sprawnością katalityczną. W zależności od rodzaju enzymu formą o większej aktywności katalitycznej może być postać ufosforylowana lub defosforylowana (tab. 11-2). Enzymy mogą mieć wiele miejsc fosfory lacji Fosforylacji ulega swoista reszta Ser lub rzadziej Tyr, z utworzeniem odpowiednio Ofosfoserynowej lub O-fosfo tyrozyn owej po-

128 / ROZDZIAŁ 11 ATP

P-Enz

ADP

Enz-Ser>O-PO,: NMP-Enz Ryc. 11-7. Regulacja aktywności enzymu w wyniku modyfikacji kowalencyjnej. Strona lewa: fosforylacja. Strona prawa: nukleotydylacja. W przypadku obu procesów trifosforanem nukleozydu (NTP) jest zazwyczaj ATP, Tabela 11-2. Wybrane przykłady enzymów ssaków, których aktywność katalityczną warunkuje fosforylacja-defosforylacja. E — forma defosforylowana, EP — forma ufosforylowana Enzym

Aktywność mała duża

Ka r bo ks y I aza a cety I o - Co A

EP E

Syntaza glikogenowa

EP E

Dehydrogenaza pirogronianowa

EP E

Reduktaza HMG-CoA

EP E E EP

Fosforylaza glikogenowa Liaza cytrynianowa Kinaza fosforylazy b

E EP E EP

Kinaza reduktazy HMG-CoA

E EP

chodnej. Mimo że enzymy mogą zawierać wiele reszt Ser lub Tyr, fosforylacja ma charakter wybiórczy i dotyczy tylko niektórych z nich. Przypuszczalnie reszty te nie wchodzą w skład miejsca katalitycznego, przynajmniej w sensie struktury pierwszorzędowej, ale stanowią następny przykład miejsca allosterycznego. Białkami przekształcającymi są kinazy i fosfatazy białek Fosforylację i defosforylację katalizują odpowiednio kinazy i fosfatazy białek (białka przekształcające — ang. converter proteins), które w pewnych szczególnych przypadkach same mogą ulegać tym modyfikacjom kowalencyjnym (ryc. 11-8, tab. 11-2). Istnieją więc kinazy kinaz białek i fosfatazy kinaz białek katalizujące wewnątrzcząsteczkowe zmiany enzymów odpowiedzialnych za fosforylację innych enzymów. Mniej są" natomiast przekonujące dowody o fosforylacji i defosforyjacji

Ryc. 11-8. Regulacja aktywności enzymu w wyniku modyfikacji kowalencyjnej, polegającej na fosforylacji i defosiorylacjt reszty Ser.

fosfataz, chociaż ich aktywność jest również regulowana. Aktywność zarówno kinaz, jak i fosfataz białek jest kontrolowana przez układ hormonalny i nerwowy, przy czym szczegółowy mechanizm tej regulacji nie jest w wielu przypadkach poznany. Regulacja przez fosforylację i dafosforylację zużywa ATP Reakcje przedstawione na ryc. 11-8 przypominają wzajemne przekształcenia glukozy i glukozo-6-fosforanu oraz fruktozo-6-fosforanu i fruktozo-l,6-bisfosforanu (p. rozdz. 19). W wyniku fosforylacji, a następnie defosforylacji 1 mola substratu (enzymu lub cukru) hydrolizie ulcg;i 1 mol ATP. Sugeruje to, że aktywność kinaz (katalizujących reakcje 1 i 3) i fosfataz (katalizujących reakcje 2 i 4) jest wzajemnie regulowana, bowiem w przeciwnym razie powodowałyby one niekontrolowaną hydrolizę ATP. 1. Glukoza + ATP -+ ADP + Giukozo-6-P 2. H,O + Glukozo-6-P -* P\ + Glukoza Netto: 3.

HaO + ATP -» ADP + P;

Enz-Sar-OH + ATP — ADP + Enz-Ser-O-P

4. HaO + Enz-Ser-O-P -» P, + Enz Ser-OH Netto:

HaO + ATP -> ADP + Pf

Modyfikacje kowalencyjne, podobnie jak hamowanie przez sprzężenie zwrotne, regulują przepływ metabolitów Regulacja aktywności enzymów, w wyniku fosforylacji i defosforylacji wykazuje analogie z regulacją na zasadzie hamowania przez sprzę-

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI / 129

żenię zwrotne. Oba mechanizmy regulują przepływ metabolitów w odpowiedzi na sygnały fizjologiczne, nie wywołując zmian w ekspresji genów, obejmując enzymy początkowych etapów szlaków metabolicznych (często biosyntez) oraz działając poprzez zmiany w miejscu allosterycznym, a nie katalitycznym. Jednak hamowanie przez sprzężenie zwrotne dotyczy pojedynczego białka i nie podlega regulacji hormonalnej i nerwowej. Przeciwnie regulacja aktywności enzymów ssaków w wyniku fosforylacji i defosforylacji obejmuje wiele białek oraz ATP lub inne trifosforany nukleozydów, a także jest bezpośrednio kontrolowana przez układ hormonalny i nerwowy.

9 — Biochem in

PIŚMIENNICTWO Crabtree B, Newsholme EA: A systematic approach to describing and analyzing metabolic control systems. Trends Biochem Sci 1987;12:4. Kacser H, Porteus JW: Control of meta boli sm: What Nestler EJ, Greengard P: Protein phosphorylation in the brain. Naturę l983;305:583. Soderling TR; Role of hormones and protein phosphorylation in metabolit regulation. Fed Proc I982;41;2615. Scriver CR et al (editors): The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6th ed. MeGraw-Hill, 1989. Weber G (editor): Advances in Emyme Regulatiots. Pergamon Press, 1963—1990.

■

CZĘSC Bioenergetyka i metabolizm węglowodanów oraz lipidów Bioenergetyka

1 2

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Bioenergetyka, czyli termodynamika biochemiczna, zajmuje się badaniem zmian energetycznych towarzyszących reakcjom biochemicznym. Dostarcza ona podstawowych reguł wyjaśniających, dlaczego niektóre reakcje mogą zajść, a inne nie mogą. Układy niebiologiczne mogą wykorzystywać energię cieplną do wykonywania pracy. Natomiast układy biologiczne są zasadniczo izotermiczne i używają energię chemiczną do napędzania procesów życiowych. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Do prawidłowego przebiegu procesów życiowych jest wymagane odpowiednie „paliwo" dostarczające energii. Znajomość sposobu, w jaki organizm czerpie energie z pożywienia, jest podstawą zrozumienia prawidłowego odżywiania i metabolizmu. Jeżeli dostępne rezerwy energetyczne ulegną wyczerpaniu, to dochodzi do śmierci głodowej. Pewne formy wadliwego odżywiania są związane z brakiem równowagi energetycznej (marazm). Szybkość uwalniania energii, mierzona szybkością metabolizmu, jest regulowana przez hormony tarczycy, której niedoczynność wywołuje chorobę. Wynikiem magazynowania nadmiaru energii jest otyłość, jedna z najbardziej powszechnych chorób społeczeństw zachodnich.

ENERGIA SWOBODNA JEST ENERGIĄ UŻYTECZNĄ UKŁADU Zmiana energii swobodnej (AG) jest tą częścią zmiany energii całkowitej układu, która jest wykorzystywana do wykonania pracy, tzn. jest ona energią użyteczną, znaną w układach chemicznych jako potencjał chemiczny. Podstawowe prswa termodynamiki dotyczą również układów biologicznych Pierwsza zasada termodynamiki podaje, że energia całkowita układu i jego otoczenia jest stała. Jest to również prawo zachowania energii. Głosi ono, że w układzie zamkniętym żadna zmiana nie powoduje straty bądź zysku energii. Jednakże w obrębie tego układu zamkniętego, energia możne być przekazywana z jednej części układu do drugiej lub może być przekształcona w inną formę energii. Na przykład w układzie biologicznym energia chemiczna może być przekształcona w energię cieplną, elektryczną, mechaniczną lub energię promieniowania. Druga zasada termodynamiki podaje, że jeśli proces zachodzi samorzutnie, to musi się zwiększać entropia całkowita układu. Entropia jest miarą nieuporządkowania (bezładu molekularnego) układu. Przybiera ona wartości maksymalne z chwilą osiągnięcia przez układ równowagi. W warunkach stałej temperatury i ciśnienia zależność między zmianą energii swobodnej (AG) układu reagującego a zmianą entropii

132 / ROZDZIAŁ 12

(AS) ujmuje następujące równanie, które łączy 2 zasady termodynamiki: AG = AH - TAS

gdzie AH oznacza zmianę entalpii (ciepło), a T oznacza temperaturę bezwzględną. W warunkach reakcji biochemicznych, ponieważ AH równa się w przybliżeniu całkowitej zmianie energii wewnętrznej (AE) reakcji, powyższą zależność można wyrazić następująco: AG = AE - TAS Jeżeli AG ma znak ujemny, to reakcja zachodzi samorzutnie z utratą energii swobodnej, tzn. jest egzoergiczna. Jeśli wartość AG jest duża, to reakcja zachodzi właściwie aż do końca i jest zasadniczo nieodwracalna. Jeżeli AG ma wartość dodatnią, to reakcja zachodzi tylko wówczas, gdy energia swobodna może być pobrana z zewnątrz, tzn. reakcja jest endoergiczna. Jeśli wartość AG jest duża, to układ jest trwały i charakteryzuje się brakiem lub tylko niewielką skłonnością do reagowania. Jeżeli AG równa się zeru, układ jest w stanie równowagi i nie zachodzą żadne zmiany. Gdy reagenty znajdują się w stężeniach 1,0 mol/l, AGC oznacza standardową zmianę energii swobodnej. Dla reakcji biochemicznych jako warunki standardowe przyjęto umownie pH 7,0. Standardową zmianę energii swobodnej w tych standardowych warunkach (tzn. w pH 7,0) oznacza się jako AG0' Standardową zmianę energii swobodnej można obliczyć, znając stałą równowagi K'eq AG°' = -2,303 RT logK'eq

gdzie R jest stałą gazową, a T oznacza temperaturę bezwzględną (p. str. 95), Należy zwrócić uwagę, że w zależności od stężeń różnych reagentów wartość AG może być większa lub mniejsza od wartości AG"'. Należy podkreślić, że w układach reakcji biochemicznych enzym tylko przyspiesza dojście do stanu równowagi i nigdy nie zmienia końcowych stężeń reagentów w stanie równowagi. PROCESY ENDOERGICZNE PRZEBIEGAJĄ W SPRZĘŻENIU Z PROCESAMI EGZOERGICZNYMI Procesy życiowe, np. reakcje syntez, skurcz mięśniowy, przewodnictwo nerwowe i aktywny transport, czerpią energię przez chemiczne połą-

czenie lub sprzężenie z reakcjami oksydacyjnymi. W najprostszej formie ten typ sprzężenia można przedstawić tak, jak na ryc. 12-1. ,M 3

4 b Ciepło

fi Ryc. 12-1.

egzoergicznej z en doergiczna.

Sprzężenie reakcji

Przemiana metabolitu A w metabolit B zachodzi z uwolnieniem energii swobodnej. Przemiana ta jest sprzężona z inną reakcją, która wymaga energii swobodnej do przekształcania metabolitu C w metabolit D. Ponieważ część energii uwalnianej w reakcji degradacji jest przekazywana reakcji syntezy w innej postaci niż ciepło, nie należy w przypadku tych reakcji używać terminów chemicznych: reakcja egzotermiczna i reakcja endotermiczna. Zamiast nich używa się określeń egzoergiczna lub endoergiczna, aby wskazać, że procesom towarzyszy odpowiednio strata lub zysk energii swobodnej, niezależnie od formy energii biorącej udział w tych procesach. W praktyce, procesy endoergiczne nie mogą zachodzić samodzielnie, lecz musza być składnikiem sprzężonego układu egzoergiczno-endoergicznego, w którym wypadkowa zmiana netto jest egzoergiczna. Reakcje egzoergiczne określa się mianem katabolizm (degradacja lub utlenienie cząsteczek „paliwa"), natomiast reakcja syntez, w wyniku których powstają cząsteczki, określa się jako anabolizm. Wszystkie procesy kataboliczne i anaboliczne nazywa się ogólnie metabolizmem. Jeśli reakcja przedstawiona na ryc. 12-1 przebiega z lewa na prawo, to całemu procesowi musi towarzyszyć utrata energii swobodnej w postaci ciepła. Jeden z możliwych mecha-

BIOENERGETYKA / 133

nizmów sprzężenia mógłby polegać na uczestnictwie w obu reakcjach wspólnego koniecznego związku pośredniego (I), I

B+D

A+C

W ten sposób są sprzężone niektóre reakcje egzoergiczne i endoergiczne w układach biologicznych. Należy uświadomić sobie, że ten typ układu ma wbudowany mechanizm biologicznej kontroli szybkości procesów oksydacyjnych, ponieważ istnienie wspólnego koniecznego związku pośredniego powoduje, że szybkość zużycia produktu szlaku syntezy (D) warunkuje z kolei, przez jego działanie masowe, szybkość, z jaką ulega utlenieniu A. Istotnie, te wzajemne powiązania stanowią podstawę koncepcji kontroli oddechowej, procesu który zabezpiecza organizm przed spalaniem poza kontrolą. Rozwinięciem koncepcji sprzężeniowej są reakcje odwodornienia, sprzężone za pośrednictwem przenośnika międzyenzymowego z reakcjami uwodornienia (ryc. 12-2).

Alternatywną metodą sprzęgania procesów egEoergicznych z' procesami endoergicznymi jest synteza związku bogatoenergetycznego w reakcji egzoergicznej i włączenie tego nowego związku w reakcję endoergiczną. Tym sposobem następuje przeniesienie energii swobodnej z procesu egzoergicznego do endoergicznego (ryc 12-3). Na rycinie 12-3 — © jest związkiem bogatoenergetycznym, a © jest odpowiadającym mu związkiem małoenergetycznym. Zaletą biologiczną tego mechanizmu jest to, że ®, w przeciwieństwie do I w poprzednim układzie, nie musi być strukturalną pochodną A, B, C lub D. W ten sposób związek ® może shiżyć jako przekaźnik energii pochodzącej z wielu reakcji egzoergicznych na równie dużą liczbę reakcji lub procesów endoergicznych, jak to przedstawiono na ryc. J2-4. PracMy endoMglczne Syntezy

Rnkcja «gioergiezne

AH,

Przenośnik A Przenośni k-H

BH;

Skurcz mięśni

Ryc. 12-2. Sprzężenie reakcji odwodornienia i B uwodornienia za pośrednictwem przenośnika międzyenzymowego. Ryc. 12-3. Przeniesienie energii swobodnej z reak Transport aktywny

Ryc. 12-4. Przekazanie energii endoergicznym procesom biologicznym przy udziale „uniwersalnego" pośrednika bogatoenergetycznego.

W żywych komórkach najważniejszym boga toenergetycznym związkiem pośrednim hib związkiem przenośnikowym (oznaczonym ~ ©) jest trifosfoadenozyna (ATP).

B

cji egzoergicznej do endoergicznej za pośrednict wem bogatoen erg etycznego metabolitu pośred niego.

FOSFORANY BOGATOEN ERG ETYCZNE ODGRYWAJĄ KLUCZOWĄ ROLĘ W PRZEJMOWANIU I PRZENOSZENIU ENERGII Wszystkie organizmy, w celu podtrzymania procesów życiowych, mus74 pobierać energię swobodną ze swojego środowiska. Organizmy

134 / ROZDZIAŁ 12

a u to troficzne sprzęgają swój metabolizm z pewnymi procesami egzoergicznymi zachodzącymi w ich otoczeniu, np. rośliny zielone wykorzystują energię słoneczną, a niektóre bakterie autotroficzne wykorzystują reakcję Fe2+ --------------------------------------------------------------------------------------------------

> Fe3+. Natomiast organizmy heterntroficzne uzyskują energię swobodną przez sprzężenie ich metabolizmu z degradacją złożonych cząsteczek organicznych występujących w ich środowiskach. We wszystkich tych procesach ATP odgrywa kluczową rolę w przenoszeniu energii swobodnej z procesów egzoergicznych na procesy endoergiczne {ryc. 12-3 i 12-4). ATP jest wyspecjalizowanym nukleotydem zawierającym adeninę, ryboze i 3 grupy fosforanowe (ryc. 12-5). W komórce ATP uczestniczy w reakcjach w postaci kompleksu z Mg2+ (ryc. 12-6).

od dostarczenia energii pochodzącej z procesów utleniań przebiegających w mięśniach. Rola tych związków w bioenergetyce była wyraźnie niedoceniana, aż do czasu gdy Lipmann wprowadził pojęcie „fosforanów bogatoenergetycznych" i „fosforanowych wiązań bogatoenergetycznych". Pośrednia wartość energii swobodnej hydrolizy ATP, w porównaniu z innymi fosforanami organicznymi, ma istotne znaczenie bioenergetyczne Standardową energię swobodną hydrolizy niektórych biochemicznie ważnych fosforanów przedstawiono w tab. 12-1. Na podstawie daTabela 12-1. Standardowa energia swobodna hydrolizy niektórych biochemicznie ważnych fos foranów organicznychł+

AG" Fosforan organiczny

0i

o-

u

»

O-P-O-PO-P-O-CHS n

° ° °

l

O

kw HO OH

Ryc. 12-5. Adenozynotrifosforan (ATP).

Fosfoenolopirogronian Karbamoilofosforan 1,3-Bisfosfogliceryntan (do 3-fosfoglicerynian) Fosfokreatyna ATP----------► ADP + Pf

-61,9 -51,4 -49,3

-14,8 -12,3 -11,8

-43,1 -30,5

-10,3 - 7,3

ADP-----------» AMP + P,

-27,6

- 6,6

Pirofosforan Glukozo-1 -fosforan Fruktozo-6-f osf ora rt

-27,6 -20,9 -15,9 -14,2 -13,8 - 9,2

-

AMP

o~ o-

o~

-0-P-O-P-O-P-O- Adenozyna M II II 0 0 0

kj/mof kcal/mol

Glukozo-6-fosforan Glicerolo-3-fosforan

6,6 5,0 3,8 3,4 3,3 2 ,2

Ryc. 12-6. Magnezowy kompleks ATP. {Podobnie wygląda kompleks Mg-ADP).

* Pi —fosforan nieorganiczny. + Wartości dla ATP i większości pozostałych związków na podstawie Krebsa i Kornberga (1957).

Znaczenie fosforanów w metabolizmie pośrednim stało się jasne wraz z poznaniem chemicznych szczegółów glikolizy oraz roli ATP, difosfoadenozyny (ADP) i fosforanu nieorganicznego (Pj) w tym procesie (p. str. 213). Przyjęto, że ATP jest pośrednikiem w przenoszeniu rodników fosforanowych w procesie fosforylacji. Rolę ATP w energetyce biochemicznej sugerowały dane doświadczeń, wskazujących, że podczas skurczu mięśniowego' rozpada się ATP j fosfokreatyna, a ich ponowna synteza zależy

nych AG°' hydrolizy (oznaczanej w temp. 37°C) można ocenić porównawczo skłonność każdej z grup fosforanowych do przejścia na odpowiedni akceptor. Jak widać z tabeli, wartość — 30,5 kJ/mol dla hydrolizy końcowego fosforanu ATP dzieli wymienione związki na 2 grupy. Jedną grupę stanowią fosforany małoenergetyczne, reprezentowane przez estry fosforanowe uczestniczące w glikohzie, dla których wartość AG°' hydrolizy jest mniejsza niż dla ATP, natomiast w drugiej grupie, określanej mianem

BIOENERGETYKA / 135

fosforany bogatoenergetyczne, wartość jest większa niż dla ATP. Składniki tej ostatniej grupy, obejmującej ATP i ADP, są zwykle bezwodnikami (np. fosforan-1 w 1,3 -bis fosfo glicery nianie), enolofosforanami (np. fosfoenolopirogroniań) lub fosfoguanidynami (np. fosfokreatyna, fosfoarginina). Środkowa pozycja ATP pozwala mu odgrywać istotną rolę w przenoszeniu energii. Inne biologicznie ważne „związki bogatoenergetyczne" to estry tioiowe zawierające koenzym A (np. acetylo-CoA), białko przenoszące reszty acylowe kwasów tłuszczowych (ang. acyl carrier protein; ACP), estry aminokwasów uczestniczące w syntezie białek, S-adenozylometionina (aktywny metyl), UDP-Glc (urydynodifosfoghikoza) i PRPP (5-fosforybozylo-l-pirofosforan). Fosforany bogatoenergetyczne oznacza się symbolem ~ ©

W celu zaznaczenia obecności bogatoenergetycznej grupy fosforanowej, Lipmann wprowadził symbol ~®, oznaczający bogatoenergetyczne wiązanie fosforanowe. Symbol ten wskazuje, że dołączona do tego wiązania grupa, po przeniesieniu na odpowiedni akceptor, przekaże większą ilość energii swobodnej. Z tego lub Adenozyno

r

Ad e n o zy n o - 0 -P M O -Adenozynotrlfosto ran (ATP)

o-

o-

Adeno,2yno - 0 - P - ©/—P II """"T

0

o-

0

lub Adenozyno- (&)—(?) Adenozynodltosforan (ADP)

0 Adenozyno -O - P - 0 ~

h

lub Adenozyno — (ji) Adenozynomonofosforan (AMP)

Ryc. 12-7. Struktura ATP, ADP i AMP ukazująca położenie i liczbę fosforanów bogato en erg etycznych (~).

powodu, niektórzy preferują określenie potencja! przenoszenia grupy zamiast wiązanie bogatoenergetyczne. ATP więc zawiera 2 bogatoenergetyczne grupy fosforanowe, a ADP zawiera 1; natomiast fosforan w AMP (adenozynomonofosforanie) jest typu małoenergetycznego, ponieważ jest połączony zwykłym wiązaniem estrowym (ryc, 12-7). FOSFORANY BOGATOENERGETYCZNE DZIAŁAJĄ JAKO OBIEGOWA MONETA ENERGETYCZNA KOMÓRKI

Dzięki swemu położeniu, pośrodku listy standardowych energii swobodnych hydrolizy (tab. 12-1), ATP może być donorem fosforanu bogatoenergetycznego dla związków znajdujących się w tabeli poniżej ATP. Z tego samego powodu, w obecności odpowiednich enzymów, ADP może być akceptorem fosforanu bogatoenergetycznego od związków znajdujących się w tabeli powyżej ATP; w reakcji tej powstaje ATP. W istocie, cykl ATP/ADP łączy procesy generujące ~© z procesami zużywającymi ~® (ryc. 12-8). W ten sposób ATP jest stale zużywany 1odtwarzany. Zasadniczym źródłem MS są 3 procesy uczestniczące w wychwytywaniu energii, czyli zachowaniu energii: 1. Foforylacja oksydacyjna. Jest to ilościowo największe źródło ~ ® w organizmach tlenowych. Energia swobodna, napędzająca ten proces, pochodzi z utlenian w mitochondriainym łańcuchu oddechowym (p. str. 153). 2. Glikoli/a. W wyniku przemiany do mleczanu z 1 mola glukozy uzyskuje się netto 2 ~©, tworzone w 2 reakcjach katalizowanych odpowiednio przez kinazę fosfogliceryniartową i kinazę pirogronianową (p. ryc. 19-2). 3. Cykl kwasu cytrynowego. Bezpośrednio w cyklu po wstaje jeden ~ ®, na etapie katalizowanym przez syntetazę sukcynylo-CoA (p. ryc. 18-3). Inna grupa związków, fosfageny, stanowi zapasową formę fosforanów boga to energetycznych. Należy do niej fosfokreatyna, występująca w mięśniach kręgowców i w mózgu, oraz fosfoarginina występująca w mięśniach bezkręgowców. W warunkach fizjologicznych fosfageny pozwalają utrzymać stężenie ATP w mięśniach w sytuacji, gdy ATP jest szybko zużywany, służąc jako źródło energii do skurczu mięśniowego. Odwrotnie, w sytuacji gdy ATP jest pod dostatkiem, zwiększa się stężenie fosfage-

136 / ROZDZIAŁ 12 Fosfoanolopirogronian

ga toenergetyczny z mitochondriów do sarkolemy i działa jako bufor bogatoenergetyczny. Ten bufor może mieć ważne znaczenie w mięśniu sercowym, odgrywając rolę natychmiastowej osłony przed skutkami zawału. Gdy ATP działa jako donor fosforanu z utworzeniem związku charakteryzującego się niniejszą energią swobodną hydrolizy (tab. 12-1), grupa fosforanowa przekształca się zawsze w grupę małoenergetyczną, np.

1,3-B isfosfog 11 ceryn i a n Fosforylacja oksydacyjna

Sukcynyto -CoA

Gl I ce ra to-3f osf □ ran

KINAZA G LICE ROLO W A

Glicerol +Adenozyno-? Glicerolo-n + Adenozyno-® ~®

ATP pozwala sprząc reakcje tertnodynamicznie niekorzystne z reakcjami termodynamicznie korzystnymi Na rycinie 12-1 oraz 12-3 przedstawiono szczegółowo energetykę reakcji sprzężonych. Tego rodzaju reakcją jest pierwsza reakcja ciągu glikoli tycznego (p. ryc. 19-2), fosforylacji glukozy do giukozo-6-fosforanu. Jest ona bardzo endoergiczna i nie może przebiegać samodzielnie w warunkach fizjologicznych.

Inne fosfory I acje, -aktywacje i procesy endoerglczne

Gl ukozofosforan

6Glukoza-1,6blsfosforan

1. Glukoza+ P

Ryc. 12-8. Rola cyklu ATP/ADP w przenoszeniu ■fosforanu bogatoenergetycznego. Należy zwrócić uwagę, że — © nie występuje w stanie wolnym, ale w takiej postaci jest przenoszony we wskazanych reakcjach.

nów służących jako zapas fosforanów bogatoenergetycznych (ryc. 12-9). W mięśniach „czółenko fosfokreatynowe" transportuje fosforan bo-

C

H3CN

KINAZA 1 KREATYNOWA

C=MH-«*-

*T

ADP

CH, COOH Fosfokreatyna

t

ATP

= -12,6 kJ/mol)

CHi

^Glukozo-6-fosforan +

(AG°'=+13,8kJ/mol) Aby reakcja mogła zajść, musi zostać sprzężona z inną reakcją, która jest bardziej egzoergiczna niż fosforylacja glukozy endoergiczna. Taką reakcją jest hydroliza końcowego wiązania fosforanowego w ATP, 2. ATP

(AG°'= -30,5 kJ/mol) Gdy (1) i (2) są sprzężone w reakcji katalizowanej przez heksokinazę, fosforylacja glukozy przebiega bc/. trudu w bardzo tgzoergicznej reakcji, która w warunkach fizjologicznych jest daleka od równowagi i z tego powodu praktycznie nieodwracalna.

COOH

Kfeatyna

Ryc. 12-9. Przenoszenie fosforanu bogatoenergetycznego z fosfokreatyny ń'a ADP i z ATP na kreatynę, „Czółenko fosfokreatynowe".

MEKSOKINAZA

Glukoza + ATP

-----------► Gliikozo-6-fosforan+ADP
BIOENERGETYKA /137

Wiele reakcji „aktywacji" zachodzi w ten sposób. Kinaza adenylanowa umożliwia wzajemną przemianę nukleotydów adenino wych Kinaza adenylanowa (miokinaza) jest enzymem występującym w większości komórek. Katalizuje ona przemianę ATP i AMP w ADP:

Kombinacja pąwyższych reakcji umożliwia obieg fosforanu i przemianę wzajemną nukleotydów adeninowych (ryc. 12-10). PIROFOSFATAZA NIEORGANICZNA

KINAZA ADENYLANOWA

ATP +■ AMP «-

- rel="nofollow"> 2 ADP

Reakcja ta spełnia 3 zadania: 1. Umożliwia wykorzystanie fosforanu bogatoenergetycznego w ADP do syntezy ATP. 2. Umożliwia refosforylację AMP, powstałe go z ATP w różnych reakcjach aktywacji. 3. Umożliwia zwiększenie stężenia AMP wraz ze zmniejszeniem się stężenia ATP. AMP działa jako sygnał metaboliczny (allosteryczny) do zwiększenia szybkości reakcji katabolicznych, które z koiei prowadzą do tworzenia większych ilości ATP (p. str. 246). Gdy ATP uczestniczy w reakcjach z utworzeniem AMP, wówczas powstaje pirofosforan nieorganiczny (PPi) Następuje to np. w reakcji aktywacji długołańcuchowych kwasów tłuszczowych: SYNTETAZA ACYLO-CoA

Ryc. 12-10. Cykle fosforanowe i przem iana wza jem n a nuk ieotydów aden in ow ych.

Również inne trifosfonukleozydy uczestniczą w przenoszeniu fosforanu bogatoene rgety cz n eg o Przy udziale kinazy difosfonukleozydowej z odpowiednich difosforanów mogą być syntetyzowane trifosfonukleozydy podobne do ATP, ale zawierające inną zasadę niż adenina, np.

ATP + HS—CoA + R—COOH AIWP + PP,+ R—CO—SCoA

Reakcji towarzyszy utrata energii swobodnej w postaci ciepła, co gwarantuje przebieg reakcji aktywacji w prawo. Jest ona dodatkowo wspomagana przez hydrohtyczne rozszczepienie PPj (AG°r = — 27,6 kJ/mol), katalizowane przez pirofosfatazę nieorganiczną. Należy zwrócić uwagę, że w wyniku reakcji aktywacji, zachodzącej z utworzeniem pirofosforanu, dochodzi do utraty 2~©, a nie l~®, jak w przypadku reakcji z utworzeniem ADP i Pj. PIROFOSFATAZA NIEORGANICZNA

i + HzO

2P,

ATP+UDP

KINAZA DIFOSFONUKLEOZYDOWA

ADP+UTP (u r yd y n ot r if osfo ra n)

ATP+GDP

ADP-rGTP (guanuzynotrifosforan)

ATP+CDP

------—<■ ADP+CTP (cytydynotrifosforan)

Wszystkie te trifosforany uczestniczą w reakcjach fosforylaeji zachodzących w komórce. Podobnie kinazy monofosfonukleozydowe, swoista dla nukleozydów purynowych i swoiste dla nuk]eozydów pirymidynowych, katalizują reak-

138 / ROZDZIAŁ 12

cje tworzenia disfosfonukleozydów z odpowiednich monofosforanów: SWOISTA KINAZA MONOFOSFO NUKLEOZYDOWA

ATP + Nukleozydo-J < ADP+ Nukleozydo-© ~©

Wynika z tego, że kinaza adenylanowa jest wyspecjalizowaną kinazą monoiosforanową.

PIŚMIENNICTWO Ernsier L (editor): Bioenergetics. Elsevier, 1984. Harold FM; The Vitat Force: A Study of Bioenergetics. Freeman, 1986. Klotz IM: Introduclion to Biomolecular Energetics. Academic Press, 1986, Krebs HA, Kornberg HL: Energy Transformatwns in Living Matter. Springer, 1957. Lehninger AL: Bioenergetics: The Molecułar Basis of BiologicaJ Energy Transformatwns, 2nd ed, Benjamin, 1971.

■

1 3

Utleniania biologiczne

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Chemicznie utlenianie definiuje się jako proces usuwania elektronów, natomiast redukcję jako proces przyłączania elektronów; ilustruje to reakcja utlenienia jonu żelazawego w jon żelazowy:

Je~ (elektron)

-

+ Fe3+

Wynika z tego, że utlenieniu zawsze towarzyszy redukcja biorcy elektronów. Ta reguła utleniania — redukcji obowiązuje również w układach biologicznych i jest zasadniczym pojęciem pozwalającym zrozumieć istotę utleniań biologicznych. Należy podkreślić fakt, że wiele utleniań biologicznych może zachodzić bez udziału tlenu cząsteczkowego np. procesy odwodorowania.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Chociaż pewne bakterie (beztlenowce) żyją w nieobecności tlenu, życie wyższych gatunków zwierząt jest bezwzględnie zależne od obecności tlenu. Głównym procesem zużywającym tlen jest oddychanie tkankowe, które można określić jako proces kontrolowanej reakcji wodoru z (Jenem i tworzenia wody, w którym komórka uzyskuje energię w postaci ATP. Poza tym tlen cząsteczkowy jest wbudowywany do różnych substratów przez enzymy określane mianem oksygenaz; wiele leków, chemicznych zanieczyszczeń środowiska i chemicznych karcynogenów (ksenobiotyków) jest meta boi izowanych przy udziale tej klasy enzymów, określanych jako system cytochromu P-450. Podawanie tlenu chorym z niewydolnością oddechową lub krążeniową może uratować im życie, a sporadyczne podawanie tlenu pod wysokim ciśnieniem (hiperbaria) ma również zastosowanie kliniczne, aczkolwiek może to prowadzić do wystąpienia toksycznych działań tlenu.

ZMIANY ENERGII SWOBODNEJ W UKŁADACH OKSYDACYJNO-REDUKCYJNYCH MOGĄ BYĆ WYRAŻONE JAKO POTENCJAŁ RED.-OKS. W reakcjach obejmujących utlenianie i redukcję wymiana energii swobodnej jest proporcjonalna do skłonności związków reagujących do oddawania lub pobierania elektronów. Stąd też, oprócz wyrażania zmian energii swobodnej jako AG°' (p. rozdz. 12), możliwe jest analogiczne wyrażenie ich liczbowo jako potencjał oksydoredukcyjny lub red.-oks. układu (Eo')_ Zazwyczaj porównuje się potencjał oksydoredukcyjny układu (Eo) z potencjałem elektrody wodorowej, którego wartość w pH 0 określa się jako 0,0 woltów. Jednak w przypadku układów biologicznych przyjęło się wyrażanie potencjału oksydoredukcyjnego (Eo'} w pH 7,0, w którym to pH potencjał elektrody wodorowej równa się -0,42 V. W tabeli 13-1 podano potencjały Tabela 13-1. Niektóre potencjały oksydoredukcyjne o specjalnym znaczeniu w układach oksydoredukcyjnych ssaków Układ

EO'[V1

Bursztynian/cc-ketogluiaran H + /H2 NAD+/NADH Liponian/dihydroliponian Acetoocta n/J3- hydroksymaślan Piróg ronian/mleczan Szczawiooctan/jabłczan Flawoproteina -stary żółty enzym; ult./zred. fumaran/bursztynian Cytochrom b; Fe3+/Fe2+ Ubichinon/ubichinol Cytochrom c; Fe3+/Fe2+ Cytochrom a; Fe3+/Fe2+ Tlen/woda

-0,67 -0,42 -0,32 -0,29 -0,27 -0,19 -0,17 -0,12 + 0,03 + 0,08 + 0,10 + 0,22 + 0,29 + 0,82

140 / ROZDZIAŁ 13

oksy do redukcyjne niektórych biologicznych układów oksydoredukcyjnych, szczególnie interesujących w biochemii ssaków. Na podstawie przedstawionych w tabeli wartości potencjałów oksy do redukcyjnych można przewidzieć kierunek przepływu elektronów z jednej pary oksyd o redukcyjnej na drugą. ENZYMY UCZESTNICZĄCE W UTLENIANIU I REDUKCJI OKREŚLA SIĘ MIANEM OKSYDOREDUKTAZ Oksydoreduktazy podzielono na 4 grupy: oksydazy, dehydrogenazy, peroksydazy i oksygenazy. OKSYDAZY UŻYWAJĄ TLENU JAKO AKCEPTORA WODORU Oksydazy katalizują oderwanie wodoru z substratu w reakcji, w której tlen jest biorcą wodoru*. Produktem reakcji jest woda lub nadtlenek wodoru (ryc. 13-1).

Ryc. 13-1. Utlenianie metabolitów katalizowane przez oksydazę (A) tworzącą wodę, (B) tworzącą H2 O 3 .

Niektóre oksydazy zawierają miedź Oksydaza cytochromowa jest hemoproteiną szeroko rozpowszechnioną w wielu tkankach roślinnych i zwierzęcych. Jest ona końcowym przenośnikiem elektronów w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym, a zatem jest odpowiedzialna za reakcję, w której elektrony pochodzące z utleniania cząsteczek substratów przez dehydrogenazy są przenoszone na ich * Czasami nazwa „oksydaza" jest używana jako ogólne określenie wszystkich enzymów, które katalizują reakcje wymagające udziału tlenu cząsteczkowego-

końcowy akceptor — tlen. Oksydaza traci aktywność w obecności tlenku węgla, cyjanku lub siarkowodoru. Enzym ten również nazywano cytochromem a3. Początkowo przypuszczano, że cytochrom a i cytochrom a3 są związkami niezależnymi, gdyż każdy z nich ma inne widmo i różne właściwości w odniesieniu do działania tlenku węgla i cyjanku. W późniejszych badaniach wykazano, że te 2 cytochromy występują w tym samym białku, a kompleks jest znany jako cytochrom aa3. Zawiera on 2 cząsteczki hemu, z których każda ma atom Fe występujący podczas utleniania i redukcji w formie Fe3+ lub Fe2+. Kompleks zawiera również 2 atomy Cu, każdy z nich związany z jednostką hemową. Fcnolaza (tyrozynaza, oksydaza polifenolowa, oksydaza katecholowa) jest zawierającym miedź enzymem o szerokiej swoistości substratowej. Katalizuje ona przemianę monofenoli lub o-difenoli w 0-chinony. Również inne enzymy zawierają miedź. Niektóre oksydazy są flawoproteinami Enzymy flawo protein owe zawierają mononukleotyd flawinowy (FMN) lub dinukleotydflawinoadeninowy (FAD) jako grupy prostetyczne. FMN i FAD są wytwarzane w organizmie z witaminy — ryboflawiny (p. rozdz. 53). FMN i FAD są zwykle mocno — ale nie kowalencyjnie — związane z odpowiednim apoenzymem. Enzymy flawoproteinowe, określane mianem meltdoflawoprotein, zawierają jeden lub więcej metali, które są niezbędne do działania enzymu. Do tej grupy oksydaz zalicza się min. oksydazę L-aminokwasową, współdziałający z FMN enzym występujący w nerkach. Enzym ten katalizuje deaminację oksydacyjną naturalnie występujących L-aminokwasów. Szeroko rozpowszechniona jest oksydaza ksantynowa, której aktywność wykryto w mleku, jelicie cienkim, nerce i wątrobie. Zawiera ona molibden i odgrywa ważną rolę w przemianie zasad purynowych w kwas moczowy (p. str. 425). Ma ona szczególne znaczenie w wątrobie i nerkach ptaków, które wydalają kwas moczowy jako główny azotowy produkt końcowy metabolizmu nie tylko puryn, iecz także katabolizmu białek i aminokwasów. Dehydrogenaza aldehydowa jest enzymem związanym z FAD, występującym wwątrobie ssaków. Jest to tnetaloflawoproteina zawierająca molibden i żelazo niehemowe, a działa na aldehydy i substraty N-heterocykliczne.

UTLENIANIA BIOLOGICZNE /

(Utl)

8H,

Przenośnik (Uli)

(Zred)

Przenośnik(Zred)

B (Utl) DEHYDflOGENAZA SPECYFICZNA DLft

DEHYDROGENAZA SPECYFICZNA DLA A

Ryc. 13-2. Utlenianie metabolitów katalizowane przez dehydrogenazy, zachodzące bez udziału łań cucha oddechowego,

Interesująca, ze względu na zastosowanie w oznaczaniu stężenia glukozy, jest oksydaza glukozowa, FAD-zaJeżny enzym otrzymywany z grzybów. Mechanizm reakcji oksydoredukcyjnych, katalizowanych przez te enzymy, jest złożony. Jednakże są dowody na to, że redukcja pierścienia izoalloksazynowego zachodzi w 2 etapach przez pośredni związek semichinonowy (wolny rodnik) (ryc. 13-3). DEHYDROGENAZY NIE MOGĄ UŻYWAĆ TLENU JAKO AKCEPTORA WODORÓW Ta klasa obejmuje dużą liczbę enzymów. Spełniają one 2 zasadnicze funkcje: a. Przenoszą wodory z jednego substratu na

drugi w sprzężonej reakcji oksydoredukcyjnej (ryc. 13-2). Te deriydrogenazy są swoiste względem ich substratów, ale często używają tego samego koenzymu lub przenośnika wodorów co inne dehydrogenazy. Ponieważ reakcje są odwracaine, właściwości te pozwalają swobodnie przenosić równoważniki redukujące wewnątrz komórki. Ten typ reakcji, w której jeden subslrat utlenia się kosztem drugiego, jest użyteczny zwłaszcza w nieobecności tlenu umożliwia bowiem przebieg procesów oksydacyjnych, b. Jako składniki łańcucha oddechowego transportującego elektrony z substratu na tlen (ryc. 13-4). Niektóre dehydrogenazy są zależne od koenzymów nikotynoamidowych Ta kategoria enzymów obejmuje liczną grupę dehydrogenaz, których koenzymem jest dinukleotyd nikotynoamido-adeninowy (NAD+) lub fosforan dioukleotydu nikotynoamido-adeninowego (NADP+). Niektóre dehydrogenazy mogą używać zarówno NAD+, jak i NADP+NAD+ i NADP+ są wytwarzane w organizmie 2 witaminy —• niacyny (p. ryc. 53-4). Koenzymy te ulegają redukcji przez swoisty substrat dehydrogenazy i reoksydacji przez właściwy akceptor elektronów (ryc. 13-5). Mogą one swobodnie i odwracalnie dysocjować od odpowiednich apoenzymów. Na ogół NAD-zależne dehydrogenazy katalizują reakcje oksydoredukeji w oksydacyjnych

Ryc. 13-3. Redukcja pierścienia izoalloksazynowego w

[DEHYDROGENAŹA]

AH

A

lU tt)

| DEHYPROGENAZAl

nukleotydach Ilawinowych.

j PEHYDROSENAZAI

Przenośnik

1 (Zred)

141

[OKSYDAZA I

Przenośnik-H,Przenośnik 3 (Utl)

Przenośni k 2 (Utl)

y\przenośnlK-H, (Zred)

przez oksydazę w łańcuchu Ryc. 13-4. Utlenianie metabolitu przez dehydrogenazy oddechowym.

ostatecznie

142 / ROZDZIAŁ 13

DEHYDFIOGENAZ A SWOISTA DLA A

CONHj N

Postać A

R

DEHYDROGENAZA SWOISTA DLA B

NAD+ + Ryc. 13-5. Mechanizm utleniania i redukcji koenzymów nikotynoamidowych. Nikotynoamid jest redukowany stereospecyficznie w pozycji 4 przez substrat AH2. Jeden z atomów wodoru zostaje oderwany od substratu jako anion wodorkowy H" (jądro wodoru z 2 elektronami) i przeniesiony na atom węgla w pozycji 4 nikotynoamidu, gdzie może zostać przyłączony w położeniu A lub B w zależności od swoistości dehydrogenazy katalizującej tę reakcję. Drugi atom wodoru z pary wodorów oderwanych od substratu pozostaje w środowisku wolny jako kation wodorowy.

szlakach metabolizmu, np. w glikolizie, cyklu kwasu cytrynowego i mitochondrialnym łańcuchu oddechowym. Z kolei NADP-zależne dehydrogenazy są charakterystyczne dla syntez redukcyjnych, np. pozamitochondrialnej syntezy kwasów tłuszczowych i syntezy steroidów, NADP jest również koenzymem dehydrogenaz cyklu pentozofosforanowego. Niektóre dehydrogenazy zależne od koenzymu nikotynoamidowego zawierają cynk, np. dehydrogenaza alkoholowa z wątroby i dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa z mięśni szkieletowych; jony cynku nie uczestniczą w reakcji oksydoredukcji. Niektóre dehydrogenazy są zależne od ryboflawiny Grupy {lawinowe związane z tymi dehydrogenazami są podobne do FMN i FAD występujących w oksydazach. Zasadniczo są one ściślej związane ze swoimi apoenzymami niż koenzymy nikotynoamidowe. Większość dehydrogenaz ryboflawi nowych bierze udział w przenoszeniu elektronów w (lub dn) łańcuchu oddechowym. Dehydrogenaza NADH jest członem

łańcucha oddechowego działającym jako przenośnik elektronów między MADH a składnikami bardziej elektrododatnimi (p. ryc. 14-2). Inne dehydrogenazy, takie jak dehydrogenaza

bursztynianowa, dehydrogenaza acylo-CoA i mitochondrialna dehydrogenaza glicerolo-3-fosfo-

ranowa przenoszą równoważniki redukcyjne bezpośrednio z substratu na łańcuch oddechowy (p. ryc. 14-3). Inną rolą dehydrogenaz zależnych od flawin jest udział w odwodorowaniu (przez dehydrogenazę dihydroliponianową) zredukowanego liponianu, związku pośredniego w dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu i a-ketoglutaranu (p. ryc. 14-3). W tym szczególnym przypadku, z powodu niskiego potencjału o ksy do redukcyjnego, flawoproteina (FAD) działa jako przenośnik wodorów ze zredukowanego liponianu na NAD (p. ryc. 195). Flawoproteina przenosząca elektrony jest

pośredniczącym przenośnikiem elektronów między dehydrogenaza acylo-CoA a łańcuchem oddechowym (p. ryc. 14-3). Niektóre cytochromy mogą być traktowane jako dehydrogenazy Z wyjątkiem oksydazy cytochromowej (opisanej wcześniej), cytochromy są klasyfikowane jako dehydrogenazy. Ich identyfikację i badanie ułatwia właściwość występowania w stanie zredukowanym charakterystycznych pasm absorpcyjnych, które zanikają po utlenieniu cząsteczki. W łańcuchu oddechowym cytochromy funkcjonują jako przenośniki elektronów między

UTLENIANIA BtOLOGiCZNE / 143

flawoproteinami a oksydazą cytochromową (p. ryc. 14-3-). Cytochromy są hemoproteinami zawierającymi żelazo, w których atom żelaza podczas oksydoredukcji występuje naprzemiennie w postaci Fe3+ lub w postaci Fe2+. W łańcuchu oddechowym występuje kilka różnych cytochromów, mianowicie cytochromy b, Ci, c, a i a3 (oksydazą cytochromową). Spośród nich tylko cytochrom c jest rozpuszczalny w wodzie. Cytochromy występują również poza łańcuchem oddechowym, np. w siateczce endoplazmatycznej {cytochromy P-450 i b5).

PEROKSYDAZY UŻYWAJĄ NADTLENKU WODORU LUB NADTLENKÓW ORGANICZNYCH JAKO SUBSTRATÓW Do tej kategorii zalicza się 2 typy enzymów: klasyczne peroksydazy i katalazę. Oba typy występują zarówno u zwierząt, jak i u roślin, Peroksydazy chronią organizm przed szkodliwymi nadtlenkami. Nagromadzenie się nadtlenków może prowadzić do tworzenia wolnych rodników, co z kolei może być przyczyną uszkodzenia błon itp. i jednym z czynników prowadzących do miażdżycy i nowotworów (p. rozdz. 16).-

Peroksydazy redukują nadtlenki, używając wielu różnych związków jako akceptorów elektronów

Aczkolwiek pierwotnie sądzono, że są enzymami roślinnymi, peroksydazy znajdują się w mleku, w leukocytach, płytkach krwi i innych tkankach metabolizujących eikozanoidy (p. str. 290). Grupą prostetyczną peroksydaz jest protonem, który przeciwnie niż w większości hemoprotein jest luźno związany z apoproteiną. W reakcji katalizowanej przez peroksydaze. nadtlenek wodoru jest redukowany kosztem różnych związków, np. askorbinianu, chinonów i cytochromu c, które działają jako biorcy elektronów. Reakcja katalizowana przez peroksydaze jest złożona, ale jej ogólny zapis można przedstawić następująco:

go glutationu rozkład H2O2 i nadtlenków lipidów, zapobiegając w ten sposób utlenieniu lipidów błonowych i hemoglobiny przez nadtlenki (p. str. 233).

Katalaza używa nadtlenku wodoru zarówno jako donora, jak i akceptora elektronów

Katalaza jest hemoproteiną zawierającą 4 grupy hemowe. Wykazuje ona aktywność peroksydazową oraz dodatkowo może katalizować reakcję, w której jedna cząsteczka H3O2 jest substratem oddającym elektrony, a druga cząsteczka H2Oi jest utleniaczem, czyli akceptorem elektronów. W warunkach in vivo katalaza wykazuje zwykle aktywność peroksydazową. KATALAZA

2 H2O2

2 H2O + O2

Występowanie katalazy stwierdzono we krwi, szpiku kostnym, błonach śluzowych, nerkach i wątrobie. Przyjmuje się, że rozkłada ona nadtlenek wodoru tworzony w reakcjach oksydaz. W wątrobie oraz wielu innych tkankach wykazano w komórkach obecność peroksysomów, które charakteryzują się dużą aktywnością oksydaz i katalazy. Ten fakt sugeruje, że zgrupowanie enzymów wytwarzających H2O2 z enzymem rozkładającym nadtlenek wodoru jest biologicznie korzystne (ryc. 13-6). Poza

A H2

A

- H2O5 I KATALAZA 2H;O

Ryc. 13-6. Rola katalazy w procesie rozkładu nadtlenku wodoru.

JPEROKSYDAZA

H2 O 2

2 H 2O + A

W erytrocytach i innych tkankach, peroksydaza glutationu, zawierająca selen jako grupę prostetyczną, katalizuje w obecności zredukowane-

enzymami peroksysomalnymi, wytwarzającymi nadtlenek wodoru, źródłem H2O2 mogą być reakcje katalizowane przez mitochondrialny i mikrosomalny układ transportujący elektrony oraz oksydazę ksantynową.

144 / ROZDZIAŁ 13

OKSYGENAZY KATALIZUJĄ BEZPOŚREDNIE PRZENIESIENIE I PRZYŁĄCZENIE TLENU 00 CZĄSTECZKI SUBSTRATU

Mikrosomalne systemy monooksygenaza-cytochrom P-450 katalizują hydroksylację wielu leków Monooksygenazy te występują w mikrosomach wątroby razem z cytochromem P-450 i cytochromem b 5 . Zarówno NADH, jak i NADPH dostarczają równoważników redu kujących do redukcji tych cytochromów (ryc. 13-7), które z kolei są utleniane przez substraty w wieloetapowym procesie enzymatycznym określanym mianem cyklu hydroksylacyjnego (ryc. 13-8). "

Oksygenazy uczestniczą raczej w syntezie lub degradacji wielu różnych typów metabolitów, a nie w procesach dostarczających komórce energii. Enzymy tej grupy katalizują reakcje przyłączenia tlenu do cząsteczki substratu. Reakcja przebiega dwuetapowo: 1) wbudowanie tlenu do centrum katalitycznego enzymu i 2) reakcja redukcji lub przeniesienia związanego z enzymem tlenu do substratu. Oksygenazy można podzielić na 2 podgrupy. Dioksygenazy (transferazy tlenu, prawdziwe oksygenazy) przyłączają do substratu oba atomy tlenu Podstawowa reakcja przebiega następująco: AO2

A + 02

Do tej podgrupy należą enzymy zawierające żelazo, np. dioksygenaza homogentyzynowa (oksydaza, p. str. 369) i dioksygenaza 3-hydroksyantrani łanowa (oksydaza, p. str. 376) z wątroby oraz enzymy wykorzystujące hem, np. dioksygenaza L-trj ptofanowa (pirolaza tryptofanowa, p. str. 376) z wątroby. Monooksygenazy (oksydazy o mieszanej funkcji, hydroksylazy) wbudowują do substratu tylko 1 atom tlenu Drugi atom tlenu ulega redukcji do wody, co wymaga udziału dodatkowego donora elektronów lub kosubstratu A— H + O2 + ZH2

A—OH + H 2 O + Z

IHYDHOKSYLAZA [

Lek-H

O2+ 2Fez+ + ZH (P-4S0) (P-450)

Wśród leków metaboiizowanych przez ten układ enzymatyczny znajdują się: benzopiren, aminopiryna, anilina, morfina i benzofetamina. Wiele leków, np. fenobarbital, może wywoły- ■ wać indukcję syntezy enzymów mikrosomalnych i cytochromu P-450. Mitochondrialne układy monooksygenaza-cytochrom P-450 katalizują reakcje hydroksylacji steroidów Te układy enzymatyczne występują w tkankach steroidogenicznych, takich jak kora nadnerczy, jądra, jajniki, łożysko. Biorą one udział w biosyntezie hormonów sterośdowych z cholesterolu (hydroksylacja na C22 i C20 w procesie odszczepiania łańcucha bocznego oraz w pozycji l i p i 18). Nerkowe systemy monooksygenaza-cytochrom P-450 katalizują la- i 24-hydroksylacje 25-hydroksychotekalcyferolu, a układ wątrobowy katalizuje hydroksylację w pozycji 26 w procesie biosyntezy kwasów żółciowych.

Amlnooksydaza Itp.

CN" Cyt b»-ł*- Desaturaza Efearolio-CoA

NADH Flawoproleina

■A

9

Cvt P-450-^ Hydroksylacja

Flawroprotelna,

NADPHf-* . Feroksydacja lipidów Oksygenaza hem u

Ryc. 13-7. Mikrosomalnyjańcuch przenoszący elektrony. Zaznaczono miejsce hamowania przez cyjanek (CN>.

UTLENIANIA BIOLOGICZNE /

145

SubstratA-H A-OH ■ P-450-A-H

Ryc P-450-A-H I

| REDUKTAZA NADPH-CylP^t50 NADP

+

^

-

Strona zewnętrzna

Wewnętrzna błona mitochondriaina

Strona^ wewnętrzna

Jabłczan

Ryc. 13-9. Mitochondnalny lzocytryukład monooksygenlan naza-cytochrom P450. Fe2S 2- białko żelazosiar- kowe (adrenodoksyna). Ponieważ NADP{H) nie może przejść przez bfonę Hydroksysteroid mitochondrialna, źródła równoważników redukujących są ograniczone do takich substratów, jak jabłczan i izocytrynian, które mogą być utleniane przez wewnątrzmitochondriat- ne dehydrogenazy współdziałające z NADP.

W korze nadnerczy zawartość mitochondrjlalnego cytochromu P-450 jest 6-krotnie większa od ilości cytochromów łańcucha oddechowego. Układ monooksygenazy zawiera 3 składniki

II) — Bicthcmia

13-8.

Mikrosomalny

cykl

hydroksylacyjny. Przedstawiony układ jest typowy dla hydroksylaz steroidowych kory nadnerczy. Mikrosomalny system hydroksylacyjny w wątrobie nie wymaga udziału białka żelazosiarkowego (Fe^). Zaznaczono miejsce hamowania przez tlenek węgla (CO).

umiejscowione na wewnętrznej powierzchni mi-tochondrialnej błony wewnętrznej: swoistą względem NADP flawoproteine mającą FAD, białko Fe2S2 (adrenodoksynę) i cytochrom P-450 (ryc. 139).

WOLNY RODNIK PONADTLENKOWY MOŻE BYĆ ODPOWIEDZIALNY ZA TOKSYCZNOŚĆ TLENU Tlen jest substancją potencjalnie toksyczną. Jego toksyczność wiązano dotychczas z tworzeniem H2O:- Ostatnio jednak, uwzględniając łatwość, z jaką tlen w tkankach ulega redukcji do wolnego anionorodnika ponadtlenkowego {C>2~') i występowanie u organizmów tlenowych (ale nie u beztlenowców bezwzględnych) dysmutazy ponadtlenkowej, przypuszcza się, że toksyczność tlenu wynika z przemiany jego w ponadtlenek. Dotychczas brak jednak bezpośrednich dowodów toksyczności ponadtienku. Ponadtlenek powstaje wówczas, gdy zredukowane flawiny, znajdujące się np. w oksydazie ksantynowej, ulegają jednoetektronowej reoksydacji przez tlen cząsteczkowy. Ponadtlenek powstaje również z tlenu cząsteczkowego podczas jednoetektronowych utieniań zachodzących w łańcuchu oddechowym:

146 / ROZDZIAŁ 13

Enzym-H2 + O2-----------* Enzym-H + O2~ + H+ Ponadtlenek może redukować cytochrom c będący w formie utlenionej: Cytc(F« 2+ )

Cytc

lub może być usuwany przez swoisty enzym — dysmutazę ponadtlenkową. DYSMUTAZA PONADTLENKOWĄ 2

" +2H +

H 2 O 2 + O2

W tej reakcji ponadtlenek działa zarówno jako utleniacz, jak i reduktor. Chemiczne działanie ponadtlenku w tkankach wzmacnia się w wyniku reakcji łańcuchowej wolnych rodników. Przypuszcza się, żeO2~' związany z cytochromem P-450, jest związkiem pośrednim w reakcji aktywacji tlenu w procesie hydroksylacji (ryc. 13-8). Wydaje się, że funkcja dysmutazy ponadtienkowej polega na ochronie organizmów tlenowych przed cytotoksycznym działaniem ponadtlenku. Enzym występuje w wielu różnych kompartmentach komórkowych. Enzym cytoplazmatyczny składa się z 2 podjednostek zawierających po jednym jonie Cu2+ i Zn3+, podczas gdy enzym mitochondrialny zawiera Mn2+ podobnie jak enzym bakteryjny. Fakt ten potwierdza hipotezę, że mitochondria rozwinęły się z Procaryota, które weszły w symbiozę z Protoeucaryota. Dysmutaza występuje we wszystkich głównych tkankach tlenowych. Aczkolwiek przeniesienie zwierząt do atmosfery składającej się w 100% z tlenu powoduje adaptacyjne zwiększenie ilości enzymu, zwłaszcza w płucach, to jednak przedłużony pobyt w tej atmosferze prowadzi do uszkodzenia płuc i śmierci. Przeciwutleniacze, np. a-tokoferol (witamina E), działają również jako wychwytywacze wolnych

*

rodników, takich jak O2~" i ograniczają toksyczność tlenu (p. rozdz. 54). PODSUMOWANIE 1. W układach biologicznych, tak jak w che micznych, utlenieniu (utracie elektronów) za wsze towarzyszy redukcja biorcy elektronów. 2. Oksydoreduktazy dzieli się na 4 grupy: oksydazy, dehydrogenazy, peroksydazy i oksygenazy. 3. Oksydazy i dehydrogenazy spełniają różne funkcje w metabolizmie, ale obie klasy en zymów odgrywają zasadniczą rolę w oddycha niu. 4. Peroksydazy chronią organizm przed uszkodzeniem przez woine rodniki, a oksygenazy pośredniczą w hydroksylacji leków. PIŚMIENNICTWO Bonnett R: Oxygen activation and tetrapyrroles. Essays Biochem 1981;17:1. Ernster L (editor): Bioenergetics. Elsevier, 1984. Fleisher S, Packer L (editors); Biologica) oxidations, mierosomal, cytochrome P-450, and other hemoprotein systems. In: Methods in Enzymology. Vol 52. Biomembranes, part C. Academic Press, 1978. Friedovich I: Superoxide dismutases. Annu Rev Biochem 1975;44:147. Nicholls DG: Cytochromes and Celi Respiration. Carolina Biological Supply Company, N. Carolina, 1984. Salemme FR: Structure and function of cytochromes c. Annu Rev Biockem 1977;46:299. Tolbert NE: Metabolic pathways in perosisomes and g]yoxysomes. Annu Rev Biochem 1981;5©:133. Tyler DD, Sutton CM: Respiratory enzyme systems in mitochondrial membranes. Page 33 in: Membranę Structure and Function. Vol 5. Biltar EE (editor). Wiley, 1984. White RE, Coon MJ: Oxygen activation by cytochrorae P-450. Annu Rev Biochem 1980;49:315.

Fosforyla cja oksydacyjna mitochondrialne systemy transportujące

i

1 4

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Mitochondrion określa się mianem „sifowni" komórki, ponieważ wewnątrz tej organelli zachodzi wychwytywanie większości energii pochodzącej z utleniań tkankowych. Mitochondrialny proces wytwarzania bogatoenergetycznego związku (ATP), sprzężony z oddychaniem, określa się mianem fosforylacji oksydacyjnej.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Fosforylacja oksydacyjna umożliwia organizmom tlenowym związać znacznie większą część dostępnej energii swobodnej substratów oddechowych w porównaniu z organizmami beztlenowymi. Przebieg tego procesu wyjaśnia teoria chemiosmotyczna. Niektóre leki (np. amobarbital) i trucizny (np. cyjanek, tlenek węgla) hamują iaricuch oddechowy i wtórnie fosforylację oksydacyjną, zwykle z fatalnymi następstwami. Obecnie znamy wiele wad dziedzicznych, dotyczących składników mitochondrialnego łańcucha oddechowego i fosforylacji oksydacyjnej. Wady te ujawniają się w postaci iniupatii, encefalopalii, a często i kwasicy mleczanowej.

ŁAŃCUCH ODDECHOWY ZBIERA I UTLENIA RÓWNOWAŻNIKI REDUKUJĄCE Cała użyteczna energia, uwalniana podczas utleniania kwasów tłuszczowych i aminokwasów, oraz niemal cała energia z utleniania

węglowodanów jest dostępna w obrębie mitochondriów w postaci równoważników redukujących ( —H lub elektrony). Mitochondria zawierają zespół katalizatorów, nazwany łańcuchem oddechowym. Zbiera on i przenosi równoważniki redukujące, kierując je do ich końcowej reakcji z tlenem, w której powstaje woda. Mitochondria zawierają również układ enzymatyczny gromadzący uwalnianą energię swobodną w postaci bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego. Poza tym zawierają one układy enzymatyczne warunkujące wytwarzanie większości równoważników redukujących zbieranych przez łańcuch oddechowy. Są to enzymy P-oksydacji i cyklu kwasu cytrynowego. Ten ostatni układ jest końcowym szlakiem metabolicznym wspólnym dla utleniania wszystkich głównych składników pokarmowych. Powiązania te przedstawiono na ryc. 14-1.

SKŁADNIKI ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO SĄ UPORZĄDKOWANE W KOLEJNOŚCI WZRASTAJĄCYCH POTENCJAŁÓW RED. OKS. Zasadnicze składniki łańcucha oddechowego przedstawiono na ryc. 14-2. Wodory lub elektrony przepływają stopniowo przez łańcuch oddechowy — od składników bardziej elektroujemnych do bardziej elektrododarniego tlenu. Rozpiętość red.-oks. układu od NAD+/NADH do O2/2H2O wynosi 1,1 V (p. tab. 13-1). Główny łańcuch oddechowy w mitochondriach katalizuje ciąg reakcji, przebiegających od dehydrogenaz, współdziałających z NAD, przez

148 / ROZDZIAŁ 14 POKARM

I

Ttuszcze—.®

Węgło- -g woda my—* g

1

Kwasy tłuszczowe Glicerol

ATP p- Oksydacja

. Glukoza itp__

Łańcuch oddechowy I ADP

. Aminokwasy Białka — i-

Pozamitochondrialne źródła równoważników redukujących Ryc. 14-1. Rola mitochondrialnego łańcucha oddechowego w przekształcaniu energii chemicznej pożywienia w ATP. Utlenianiu większości składników pokarmu towarzyszy wytwarzanie równoważników redukujących (2H), które są zbierane przez łartcuch oddechowy w cełu ich utlenienia i sprzężonego z tym wytwarzania ATP. Cytochromy

-^l^Substral

H+

Y

H+

2H+

2H+

Ryc. 14-2. Przenoszenie równoważników redukujących w łańcuchu oddechowym. Pro I i na 3-Hyd ro k sy acyl o-Co A 3-Hyd roksymaślan Glutami niań Jabtczan Izocytrynian

Bursztynian Cholina Fp (FAD) FeS

Acyło-CoA Sarkozyna Dl metyl og li cyna

\.. -Cyt

■Cytc Cu

Glice ro lo-3-f osf o ran Ryc. 14-3. Składniki mitochondrialnego łańcucha oddechowego. FeS uczestniczy w transporcie elektronów, zbierając je z flawoproteiny lub cytochromu b: Cyt — cytochrom, ETF — flawoproteina przenosząca elektrony, FeS — białko że I a zos i arko we, Fp — flawoproteina, Q — ubichinon.

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 149

Forma całkowicie utleniona. ożyli chfnonowa

OH

Forma samlchlronowa (wolny radnik}

Forma zredukowana, czyli chinolowa (hydrochincn)

Ryc. 14-4. Struktura ubichinonu (Q), n — liczba jednostek izoprenoidowych; waha się ona w granicach 6—10, tj. Q6-io-

flawoproteiny i cytochromy do tlenu cząsteczkowego, Nie wszystkie substraty są związane z łańcuchem oddechowym przez dehydrogenazy współdziałające z NAD; niektóre ze względu na ich bardziej dodatnie potencjały red.-oks. (np. fumaran/bursztynian; P- tab. 13-1) wiążą się bezpośrednio z dehydrogenazami będącymi fiawoproteinami, które z kolei są związane z cytochromami łańcucha oddechowego (ryc. 14-3). Poza wspomnianymi przenośnikami w łańcuchu oddechowym znajduje się dodatkowy przenośnik łączący flawoproteiny z cytochromcm b, białkiem o najniższym potencjale oksydo/edukcyjnym w Łańcuchu cytochromowym. Ten dodatkowy przenośnik, który na-

flawoproteinami) i 7. cytochromem b. Zarówno siarka, jak i żelazo uczestniczą w jednoelektronowym mechanizmie oksyd o redukcyjnym (ryc. 14-5).

Pr—Cvl-S

zwano ubichinonem lub CoQ (koenzymem Q; p.

ryc. 14-4), występuje w mitochondriach w warunkach tlenowych w utlenionej formie chinonowej, a w warunkach beztlenowych w zredukowanej formie chinolowej, Ubichinon jest składnikiem lipidów mitochondrialnych, zawierających przede wszystkim fosfolipidy, tworzące część struktury błony mitochondrialnej. Struktura koenzymu Q jest bardzo podobna do budowy witamin K i E; podobna jest również do plastochinonu znajdującego się w chloroplastach. Wszystkie te związki charakteryzują się poliizoprenoidowym fańcuchem bocznym. W mitochondriach koenzym Q występuje w znacznym stechiometrycznym nadmiarze względem pozostałych członów łańcucha oddechowego. Ten fakt sugeruje, że jest on ruchomy m_ elementem łańcucha oddechowego i że zbiera on równoważniki redukujące z bardziej nieruchomych kompleksów flawoproteinowych i przenosi je na cytochromy. Innym składnikiem, występującym również w preparatach łańcucha oddechowego jest bial-c (Fe:S; żelazo niehemowe). J l i i (metało-

Ryc, 14-5. Kompleks białka żelazosiarkowego (^6484).®— siarka nietrwała w środowisku kwaśnym, Pr — apoprotein3, Cys — reszta cysteinowa. Niektóre białka żeiazosiarkowe zawierają 2 atomy żelaza i 2 atomy siarki

Na rycinie 14-3 przedstawiono, zgodnie z współczesnymi poglądami, sekwencję zasadniczych składników łańcucha oddechowego. N a elektroujemnym końcu łańcucha dehydrogeńazy katalizują przeniesienie elektronów z substratów na NAD łańcucha. Sposoby tego przenoszenia mogą być dosyć różne, a-Ketokwasy — pirogronian i a-ketoglutaran — mają własne kompleksy dehydrogenaz, zawierające liponian 1 FAD, które pośredniczą w przenoszeniu elektronów na NAD łańcucha oddechowego. Inne dehydrogenazy, np. dehydrogenaza h( + )-3-hydroksyacylo-CoA, D(—)-3-hydroksymaśIanowa,

150 / ROZDZIAŁU prolinowa, glutami ni a nowa, jabtczanowa lub izocytrynianowa, przenoszą elektrony bezpośrednio na NAD łańcucha oddechowego. Zredukowany NAD łańcucha oddechowego jest z kolei utleniany przez dehydrogenazę NADH, która jest metalofloawoproteiną. Enzym ten zawiera Fe:S i FMN i jest ściśle związany z łańcuchem oddechowym. Przenosi on równoważniki redukujące na koenzym Q. Koenzym Q stanowi w łańcuchu oddechowym również punkt zbiorczy dla równoważników redukujących, pochodzących z innych substratów, które przez flawoproteinowe dehydrogenazy kontaktują się bezpośrednio z łańcuchem oddechowym. Takimi substratami są bursztynian, cholina, giiceróló:5-Fósibran;~sarkozyna, dimetyloglicyna i acylo-CoA (ryc. 14-3). W dehydrogenazach tych substratów część flawinową stanowi FAD. Elekt£o^y_zCoQ przepływają następnie przez. y h H y ^ 7 y T y e n cząsteczkowy. Cytochromy są ułożone zgodnie ze wzrastającym potencjałem oksydoredukcyjnym. Znajdujący się na końcu łańcucha cytochrom aa3(oksydaza cytochromowa) odpowiada za ostateczne połączenie równoważników redukujących

z tlenem cząsteczkowym. Enzym _ten_zawięra miedź, składnik wielu oksydaz. Oksydaza cytochromowa ma bardzo duże powinowactwo do tlenu, co pozwala na funkcjonowanie łańcucha oddechowego z maksymalną szybkością, aż do momentu, w którym tkanka zostanie całkowicie pozbawiona tlenu. Ponieważ jest to reakcja nieodwracalna (jedyna w łańcuchu), nadaje ona kierunek przemieszczania się równoważników redukujących w łańcuchu oddechowym i do sprzężonego z nim wytwarzania ATP. Organizacja strukturalna łańcucha oddechowego była przedmiotem wielu hipotez. Istotnym odkryciem było stwierdzenie niemal starych stosunków molowych miedzy składnikami łańcucha oddechowego. Funkcjonalnie i strukturalnie składniki łańcucha oddechowego są zgrupowane w wewnętrznej błonie mitochondrialnej w 4 lipidowo-białkowc

kompleksy

łańcucha

od-

dechowego. Powyższe dane wskazują, że przenośniki mają w błonach określoną orientację przestrzenną. Cytochrom c jest jedynym rozpuszczalnym cytochromem i tak jak koenzym Q wydaje się być bardzo ruchomym składnikiem łańcucha oddechowego łączącym nieruchome kompleksy (ryc, 14-6).

Malonian Kompleks II &&

Bursztynian

Karboksyna TTFA BAL Antymycyna Kompleks II! I

NADH Związki rozprzęgające

H;S CO* CN * ,'x Kompleks IV I Cyt a Cyt

yt b, FeS. Cyt c,

Plerycydyna A Amobarbltal ^ _ 1 _ ^ R o t e n o n Oligomyoyna" i J ' O ADP+P,

■

ATP

Miejsce sprzęgająca 1

I

^\ ADP + P,

Związki rozprzęgające

Mtejsce sprzęgające 2 O ligo mycy na ATP P,

ADP +

ATP

Miejsce sprzęgające 3

Ryc. 14-6. Proponowane miejsca hamowania (0) tańcucha oddechowego prze* niektóre leki, substancje chemiczne i antybiotyki. Zaznaczono „miejsca sprzęgające", które tworząc gradient protonowy wspierają fosforylację. BAL (dimerkaprol); TTFA jest czynnikiem chelatującym Fe, Kompteks I — oksydo/eduktaza NADH : ubichinon; kompleks tl •— oksydoreduktaza bursztynian : ubichinon; kompleks III —oksydoreduktaza ubichinot: utleniony cytochrom c; kompleks IV — oksydoreduktaza zredukowany cytochrom c: tlen. Inne skróty jak na ryc. 14-3, ____________________________

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 151

ŁAŃCUCH ODDECHOWY UMOŻLIWIA ZMAGAZYNOWANIE ZNACZNEJ CZĘŚCI ENERGII CHEMICZNEJ UTLENIAM BIOLOGICZNYCH ADP jest cząsteczką, która wiąże w postaci bogatoenergetycznych fosforanów część energii

swobodnej uwalnianej w procesach katabolicznych. Powstający ATP może z kolei przekazać tę energię swobodną procesom wymagającym energii. Stąd też ATP bywa nazywany „monetą obiegową" komórki (p. ryc. 12-8). Wjęakcjach glikolizy powstają 2 bogatoenergęticznejrugy fosforanowe, co jest równoważne ok. 61 kJ/moI glukozy (p. tab. 19-1). Wynika z.tęgo^że ilość energii wychwytywanej w procesie glikolizy, w reakcjach fosforylacji substratowej, jest mata, jako że 1 mol glukozy,"ulegając całkowitemu spaieniu dostarcza ok. 2780 kJ. Reakcje cyklu kwasu cytrynowego, końcowego szlaku całkowitego uflemania"glukozy, obejmują 1 .^tap fosforylacii — przekształcenie y sukcynylo-CoA w bursztyniajŁ_co pozwala wytworzyć następne 2 boga to energetyczne wiąza-"hia__fosforaiiowe na moTglukozy, Wszystkie wspomniane powyżej fosfbrylacje zachodzą na po4pjnje_jybstratu. Wyniki badań prowadzonych na nie naruszonych oddychających mito-chondriach wykazują, że utlenieniu substratów J ^ A D k ^ h ^ i " ) ń h oddechowy towarzyszy wbudowanie 3 mol fosforanu nieorganicznego w 3 mol ADP i powstanie w ten sposób 3 mol ATP na każde ]j2 mol zużytego O2, tzn. stosuneTt P:O = 3 (ryc. 14-6). Jeżeli natomiast substrat ulega utlenieniu przy udziale dehydrogenazy flawinowej, powstaje tylko 2 mol ATP, a stosunek P:O = 2. Reakcje te są znane jako fosforyiacje oksydacyjne (fosforylacjc na poziomie łańcucha oddechowego). Uwzględniając reakcje odwodorowania w szlaku katabolicznym glukozy zarówno w glikolizie, jak i w cyklu kwasu cytrynowego oraz fosforyiacje substratowe można obliczyć, że niemal 42% energii swobodnej, pochodzącej ze spalenia glukozy, zostaje związane w postaci bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych. Jest oczywiste, ze to łańcuch oddechowy odpowiada za znaczną część puli tworzonego ATP.

KONTROLA ODDYCHANIA W MITOCHONDRIACH ZABEZPIECZA STAŁE DOSTARCZANIE ATP Szybkość oddychania mitochondriów może być kontrolowana przez stężenie ADP. Dzieje się tak, ponieważ utlenianie i fosforyłacja są ze sobą ściśle sprzężone, tzn. utlenianie w łańcuchu oddechowym nie może zachodzić bez towarzyszącej fosforylacji ADP. Chance i Williams podali 5 czynników, które mogą kontrolować szybkość oddychania w mitochondriach {tab. 14-1). Tabela 14-1. Stany kontroli oddechowej Czynniki ograniczające szybkość oddychania Sta 1 n Sta 2 n Sta 3 n Sta 4 n Sta 5

Brak ADP i substratu Brak tylko substratu Aktywność samego łańcucha oddechowego, gdy wszystkie substraty i ADP są obecne w stężeniach wysycających Brak tytko ADP Brak tylko tlenu

n

Zasadniczo większość komórek w okresie spoczynkowym znajduje się w stanie metabolicznym 4, w którym szybkość oddychania zależy od dostępności ADP. W czasie wykonywania pracy następuje przemiana" ATP w ADP, co powoduje zwiększenie szybkości oddychania, a to z kolei prowadzi do uzupełnienia zapasu ATP (ryc. 14-7). Należy dodać, że w pewnych warunkach szybkość funkcjonowania łańcucha oddechowego może zależeć również od stężenia fosforanu nieorganicznego. Gdy szybkość oddychania się zwiększa (np. podczas pracy), metabolizm komórki zbliża się do stanu 3 lnb stanu 5, wówczas łańcuch oddechowy albo osiąga stan wysycenia, albo pO2 zmniejsza się poniżej Km dla cytochromu ay Niewykluczone, że sprawność przenośnika ADP/ATP, który ułatwia wejście cytoplazmatycznego ADP do wnętrza mitochondrionu, może być czynnikiem ograniczającym szybkość fosforylacji oksydacyjnej. Proces utleniań biologicznych, w których energia swobodna, powstała w wyniku utleniania składników pokarmowych, staje się dostępna i może być związana, przebiega stopniowo,

152 / ROZDZIAŁ 14

Ciepto

Procesy zużywające energię

T

\

SUBSTHAT

Ryc. 14-7. Rota ADP w kontroli oddechowej.

wydajnie (40—45%) i podlega kontroli — a nie wybuchowo, nieskutecznie i w sposób niekontrolowany. Pozostała energia swobodna, która nie została związana w formie bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego, uwalnia się w postaci ciepła. Nie znaczy to, że jest „stracona", gdyż dzięki temu układ oddechowy, jako całość, jest dość egzoergiczny, aby być w stanie nierównowagi, co pozwala na ciągły jednokierunkowy przepływ elektronów i stałe zaopatrywanie komórki w ATP. U zwierząt stałocieplnych zapewnia to utrzymanie odpowiedniej temperatury ciała.

WIELE ZNANYCH TRUCIZN TO INHIBITORY ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO Wiele informacji dotyczących łańcucha oddechowego uzyskano po zastosowaniu związków, których przypuszczalne miejsce działania przedstawiono na ryc. 14-6. Do celów opisowych związki te można podzielić na inhibitory łańcucha oddechowego, inhibitory fosforylacji oksydacyjnej i związki rozprzęgające fosforylację oksydacyjną. Inhibitory, które hamują oddychanie przez blokowanie łańcucha oddechowego, działają w 3 miejscach. W miejscu pierwszym działają,. barbiturany (np. amobarbital), antybiotyk pierycydyna A oraz jad rybi — rotenon. Inhibitory te hamują utlenianie substratów.Hofe kontaktują się bezpośrednio z łańcuchem oddechowym przez NAD-zaJeżne dehydrogenazy, jak np. 3hydroksymaślan.

Dimerkaprol i antymycyna AJiamują łańcuch oddechowy między cytochromem.b a cytochromem c. Klasyczne trucizny, jak H2S, tlenek węgla i cyjanki hamują oksydazę cytócEfomową. Karboksyna i TTFA swoiście hamują przeniesienie równoważników redukujących z dehydrogenazy bursztynianowej na koenzym (^ natomiast malonian jest inhibitorem kompetycyjnym dehydrogenazy bursztynianowej. Antybiotyk oUgomycyna całkowicie hamuje utlenianie i fosforylację w nie uszkodzonych mitochondriach. Jednakże, w obecności .związku rozprzęgającego — di nitrofenolu — zachodzi utlenia,nie_hez. towarzyszącej fosforylacji, co wskazuje, że oligomycyna nie działa bezpośrednio" na łańcuch oddechowy, lecz na etapie fosforylacji (p. ryc. 14-8). Atraktylozyd hamuje fosforylację oksydacyjną, "która zależy od transportu nukleotydów adeninowych przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Przyjmuje się, że hamuje on przenośnik nukleotydów adeninowych, odpowiedzialny za transport ADP do wnętrza, a ATP na zewnątrz mitochondrionu (p. ryc. 14-16). Działanie związków rozprzedających polega na „odłączeniu" procesu utleniania w łańcuchu oddechowym od fosforylacji. Wskutek tego oddychanie przebiega w sposób niekontrolowany, ponieważ stężenie ADP lub P, nie ogranicza już szybkości oddychania. Najczęściej stosowanym związkiem rozprzęgającym jest 2,4-dinitrofenol, ale także inne związki działają w podobny sposób, np. dinitrokrezol, pentachlorofenol i CCCP (m-chlorokarbonyiocyjanidofenylohydrazon). Ten ostatni jest ok. 100-krotnie aktywniejszy od dinitrofenolu.

:

ADP Stan 4 A"

i \

—

ADP f

d B "c

i

i S

>

5

i Stan 3

\ \

(v Związek razprzegąjący

\Stan4

Ollgomycyna ^1 i | Związek 1 \i rozprzęgający \

i

3 Minuty Ryc. 14-8. Kontrola oddechowa w mitochondriach. Doświadczenie A: na wykresie przedstawio no szybkość zużycia tlenu w stanie 4, która ulega przyspieszeniu po dodaniu ADP. Gdy cały egzo genny ADP zostanie ufosforylowany do ATP, wó wczas szybkość oddychania maleje do wartości w stanie 4. Dodanie związku rozprzedającego, np. dinitrofenolu, uniezależnia oddychanie od fosfory lacji. W doświadczeniu B: dodanie oNgomycyny hamuje fosforylację dodanego uprzednio ADP i w związku z tym obserwujemy hamowanie od dychania. Dodanie z kolei związku rozprzedającego zwiększa szybkość zużycia tlenu, ponieważ unieza leżnia oddychanie od fosforylacji.

TEORIA CHEMIOSMOTYCZNA WYJAŚNIA MECHANIZM SPRZĘŻENIA UTLENIANIA Z FOSFORYLACJA W ciągu ubiegłych lat przedstawiono wiele hipotez dotyczących sprzężenia utleniania z fosforylacją. Można je podzielić na 2 zasadnicze grupy. Hipotezy sprzężenia chemicznego postulowały bezpośrednie sprzężenie chemiczne na wszystkich etapach procesu, tak, jak ma to miejsce w reakcjach tworzących ATP w glikolizie. Jednakże hipotezy te odrzucono, ponieważ nie udało się nigdy wyizolować bogatoenergetycznych pośredników, które miały łączyć utlenianie z fosfory lacją. Według innych hipotez energia pochodząca z utleniania jest przechowywana w stanach konformacyjnych cząsteczek. Zmiana konformacji miała prowadzić do tworzenia bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych.

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 153

Teoria chemiosmotyczna postuluje, że utlenianie przenośników w łańcuchu oddechowym prowadzi do tworzenia jonów wodorowych, które są wyrzucane na zewnątrz sprzęgającej błony mitochondriałnej. Różnica potencjałów elektrochemicznych, wynikająca z asymetrycznego rozmieszczenia jonów wodorowych (protonów, H+), jest zużywana następnie do napędzania mechanizmu odpowiedzialnego za tworzenie ATP (ryc 14-9). Łańcuch oddechowy jest pompą protonową Według Mitchella, pierwotnym etapem procesu fosforylacji oksydacyjnej jest przemieszczenie protonów (H +)1n£|^wjiait4£z>iblony sprzęgającej (tzn. wewnętrznej hłoriy mitochondriałnej) napędzane przez utleniania w łańcuchu oddechowym. Każdy z kompleksów łańcucha oddechowego I, III i IV (p. ryc. 14-6} działa jako pompa protonowa. Postulował on również, że błona jest zasadniczo nieprzepuszczalna dla jonów, a zwłaszcza dla protonów, które gromadzą się na zewnątrz błony, wytwarzając transmembranową różnice potencjału elektrochemicznego (AU,H+). Na tę różnicę składa się potencjał chemiczny (różnica pH) oraz potencjał elektryczny. Różnica potencjału elektrochemicznego jes^zużywana-przez błonową syntazę ATP (syntaza ATP, transportująca H+), która w obecności ADP i Pj wytwarza ATP (ryc. 14-9). Nie ma tu więc bogatoenergetycznego pośrednika wspólnego dla utleniania i fosforylacji, jak to sugerowano w hipotezie sprzężenia chemicznego. Według pierwotnej wersji teorii łańcuch oddechowy jest tak ułożony w błonie, że tworzy 3 pętle utłeniająco-redukcyjne (o/r). Na rycinie 14-10 przedstawiono schematycznie pojedynczą pętlę zawierającą przenośnik wodoru i przenośnik elektronów. Jednakże ten wymóg trudno było pogodzić w pełni ze znanymi składnikami błonowych kompleksów łańcucha oddechowego, np. kompleks IV nie zawiera przenośnika wodoru. Co więcej, nie jest znana dokładna liczba protonów pompowanych przez każdy kompleks, przypadająca na każdy transportowany elektron. Na rycinie 14-11 przedstawiono cykl Q, wyjaśniający możliwy mechanizm pompowania protonów przez kompleks III. Powierzchnię błony wewnętrznej pokrywają Jednostki fosforylujące" odpowiedzialne za biosyntezę ATP (ryc. 14-12). Każda z nich składa się z wielu różnych białek. Hydrofilowy

154 / ROZDZIAŁ 14

O lig o mycy na

Błona sprzęgająca Ubtahfnon

Cytochrom c

NA ZEWNĄTRZ

Byc. 14-9. Założenia teorii chemiosmotycznej dotyczącej fosforytacji oksydacyjnej. F1( Fo, czynniki białkowe warunkujące fosforylację Syntaza ATP, transportująca H + (FiFo), działa jako wtórna pompa protonowa. Pierwotna pompa protonowa funkcjonuje w wyniku sprzężenia utleniania z przemieszczeniem protonów z wewnętrznej na zewnętrzną powierzchnię błony. To przemieszczenie H + prowadzą kompleksy łańcucha oddechowego I, III i IV, z których każdy działa jako pompa protonowa. Związki rozprzęgające, takie jak di nitrofenol, + powodują „przeciek" H przez błonę, skutkiem czego jest zanik elektrochemicznego gradientu protonów. Oligomycyna swoiście blokuje transport H+ przez Fo. NA ZEWNĄTRZ

BŁONA SPRZĘGAJĄCA

WEWNĄTRZ

Ryc. 14-10. Pętla oksydoredukcyjna (o/r) przemieszczająca protony (teoria criemiosmotyczna).

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 155 CYTOZOL (NA ZEWNĄTRZ)

WEWNĘTRZNA BŁONA MITOCHONDRIALNA

Ryc. 14-11. Pompujący protony cykl koenzymu Q. QH* jest zakotwiczony po obu stronach btony przez przyłączenie się do białka wiążącego Q, natomiast CIH2 i Q są ruchome. Cytochromy zaznaczono odpowiednio jako b, c-|.

rinr

B U8Ł0N A -: j ZEWNĘTRZNA f BŁONA*--*] WEWNĘTRZNA

Jednostki fosforylujące

systemów błonowych.

Cząstki submitochondrialne powstałe z fragmentów błony wewnętrznej

Ryc. 14-12. Budowa błon mitochondrialnych. Cząstki submitochondrialne są „przenicowane", tzn, mają odwróconą orientację błony, a więc i odwrócony błonowy gradient protonów. Na ich powierzchni zewnętrznej znajdują się Fi. Taki preparat pozwala prowadzić badania zamkniętych * ■■ -

BŁONA ZEWNĘTRZNA

Działanie ultradźwiękami

* I Jt3>/

156 / ROZDZIAŁ 14 Pj

ATP ADP

Pj + ADP

Ryc. 14-13. Syntaza ATP, transportująca H+ (Mitchell).

kompleks tych białek określa się mianem Fj (czynnik sprzęgający I; ang. factor 1); wystaje on w kierunku małriks i wy|fa7il]jei aktywność _syntązyATP (ryc. t4-9).JEtje5tpołąc2.ony przez tzw. szyjkę (ang. stalk) z—błonowym f hydrofobowym) kompleksem-biaŁŁ-owym. Tkanym FD (czynnik sprzęgający wiążący oligomycyne), który prawdopodobnie zajmuje całą szerokość błony (ryc. 14-9). Protony przechodzą przez kompleks Fo— F, (syntazę. ATP, transportują£&Ji+), co umożliwia syntezę ATP z ADP i Pj. Ciekawe, że podobne jednostki fosforylujące znaleziono na wewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej bakterii i na zewnętrznej powierzchni błony tylakoidowej chloropiastów. Charakterystyczne, że błonowy gradient protonów skierowany jest w mitochondriach i bakteriach z zewnątrz do wewnątrz, ale w odwrotnym kierunku w chloroplastach. Mechanizm sprzężenia przemieszczania protonów z anizotropowym (wektorowym) układem syntezy ATP nie jest wyjaśniony. Jeden 7. modeli proponowanych przez Mitchella jest przedstawiony na ryc. 14-13. Para protonów atakuje jeden z tlenów P,, tworząc wodę i aktywny Pj, który natychmiast reaguje z ADP, tworząc ATP. Wyniki innych badań wskazują, że bezpośrednia reakcja syntezy ATP nie jest głównym etapem wymagającym dostarczenia energii — jest nim raczej etap uwalniania ATP z centrum aktywnego syntazy. Niewykluczone, że wymaga to konformacyjnych zmian cząsteczki Dane doświadczalne potwierdzają teorię chemiosmotyczną 1. Dodanie protonów (kwasu) do środowiska inkubacyjnego zawierającego mitochondria prowadzi do wytwarzania ATP.

2. Fosforylacja oksydacyjna nie zachodzi w układach rozpuszczalnych, w których nie ma możliwości występowania wektorowej syntazy ATP, Aby fosforylacja oksydacyjna mogła za chodzić, w układzie inkubacyjnym muszą być zamknięte pęcherzyki błonowe (ryc. 14-9). 3. Składniki łańcucha oddechowego są uło żone w błonie w sposób asymetryczny (poprze czna asymetria), co jest zgodne z wymaganiami teorii chemiosmotycznej. Teoria chemiosmotyczną wyjaśnia zjawisko kontroli oddechowej Powstała wskutek przemieszczania protonów różnica potencjałów elektrochemicznych po obu stronach błony hamuje dalsze przenoszenie ~ równoważników redukujących przez łańcuch oddechowy dopóty, dopóki nie zostanie ona rozładowana w wyniku wstecznego transportu protonów przez błonę przy udziale wektorowej syntazy ATP. To z kolei zależy od dostępności ADP i Pi. Tłumaczy działanie związków rozprzęgających Te związki (np. dinitrofenol) są amfipatyczne (p. str. 190) i zwiększają przepuszczalność błony mitochondrialnej d!a protonów (ryc. 14-9), zmniejszając w ten sposób potencjał elektrochemiczny i „zwierając" syntazę ATP. Dlatego też w ich obecności utlenianie może przebiegać bez fosforylacji. Tłumaczy istnienie mitochondrialnych układów transportujących na zasadzie wymiany przeciwprądowej Te układy transportujące są konsekwencją wymogu, że aby utrzymać gradient elektro-

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 157

chemiczny błona sprzęgająca musi być nieprzepuszczalna dla protonów i innych jonów (patrz poniżej). WZGLĘDNA NIEPRZEPUSZCZALNOŚC WEWNĘTRZNEJ BŁONY MITOCHONDRIAŁNEJ NARZUCA POTRZEBĘ OBECNOŚCI PRZENOŚNIKÓW Systemy transportu wymiennego znajdują się w błonie i katalizują wymianę przeciwprądową anionów z OH~ oraz kationów z H + . Każdy z tych systemów jest niezbędny do zachowania równowagi elektrycznej i osmotycznej podczas pobierania i uwalniania zjonizowanych metabolitów. Roz m i eszczen ie c ha rakterystycz nych enzymów, tzw. znacznikowych, w przedziałach rozdzielonych błonami mitochondrialnymi Mitochondria mają błonę zewnętrzną przepuszczalną dla większości metabolitów, błonę wewnętrzną, która jest wybiórczo przepuszczalna i pofałdowana w tzw. grzebienie, oraz macierz .wewnątrz mitochondrionu (ryc. 14-12). Działając na mitochondrion digitoniną można usunąć z niego błonę zewnętrzną, której enzymami znacznikowymi są monoaminooksydaza, syntetaza acyio-CoA, acylotransferaza glicerolo fosforanowa, acylotransferaza lizofosfatydowa i ibsfolipaza A2, W przestrzeni międzybłonowej znajduje się kinaza adenylanowa oraz

CYTOZOL

NAD

GI icerolo-3-fosfo ra n DEHYDROGENAZA GLICEROLO-3-FOSFORANOWA Dlhydroksyacetonofosforan "*■

kinaza kreatynowa. W Wonie wewnętrznej jest nagromadzony fosfolipid — kardiolipina. W macierzy mitochondriainej znajdują się rozpuszczalne enzymy cyklu kwasu cytrynowego i enzymy P-oksydacji kwasów tłuszczowych. Oba procesy wymagają udziału układów transportujących metabolity oraz nukleotydy przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Dehydrogenaza bursztynianowa znajduje się na wewnętrznej powierzchni mitochondriainej błony wewnętrznej, gdzie przenosi równoważniki redukujące bezpośrednio na ubichinon łańcucha oddechowego, z pominięciem kompleksu I łańcucha oddechowego. Na powierzchni matryksowej wewnętrznej błony mitochondriainej znajduje się również dehydrogenaza 3-hydroksymaślanowa. Na zewnętrznej powierzchni błony wewnętrznej zlokalizowana jest dehydrogenaza glicerolo-3-fosforanowa, co pozwala jej uczestniczyć w „mostku" glicerolofosforanowym (układ wahadłowy glicerolofosfuran-dihydroksyaceton, ryc. 14-14).

Utlenianie pozamitochondrialnego NADH odbywa się za pośrednictwem „mostków" substratowych Wewnętrzna błona mitochondrialna nie jest przepuszczalna dla NADH, który jest stale wytwarzany w cytozolu w reakcji szlaku glikolityczncgo, katalizowanej przez dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową (p. ryc. \9-2).Jedńakże w warunkach tlenowych pozamitochondrialny NADH nie gromadzi się i ulega przypuszczalnie utlenieniu w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym. Rozważano kilka mechanizmów, według których ten proces mógłby

WEWNĘTRZNA BŁONA MłTOCHONDRIALNA

GI icerolo-3-f osf oran

FAD

DEHYDROGENAZA GLICEROLO-3-FOSFORANOWA ■Dlhydroksyacetonofosforan

FADH2

t

Łańcuch oddechow y Ryc. 14-14. Mostek glicerolofosf ora nowy {układ wahadłowy glicerolo-3-fosforan : dihydroksyacetonofosforan) transportujący równoważniki redukujące z cytozolu do mitochondrionu. Ponieważ mitochond rialna dehydrogenaza giicerolo-3-fosforanowa znajduje się na zewnętrznej powierzchni btony wewnętrz nej, układ ten nie wymaga transportu substratów przez błonę. _______________________________________________________________________________

158 / ROZDZIAŁ 14 CYTOZOL

BŁONA

Jabłczan, Glutaminian

NADł

^Jabłczan Szczawiooctan

OEHYDROGENAZA JA8ŁCZAN0WA

NAD H+ H+

Szczawiooctan

MITOCHONDRION

a-KG

*

NAD

DEHYDROGENA2A JABŁCZANOWA a-KG

AMINOTHANSFERAZA

Glutaminian

AMIN0TRANSFERA2A

Asp

Asp

Ryc. 14-15. Mostek jabłczanowo-asparaginianowy (układ wahadłowy jabłczan : asparaginian) przenoszący równoważniki redukujące z cytozolu do mttochondrionu. 1 — przenośnik a-ketoglutaranowy, 2 — przenośnik glutaminianowo-asparaginianowy (przenoszący z glutaminianem proton, symport).

przebiegać. Jednym z nich jest przenoszenie równoważników redukujących przez błonę mitochondriałną za pośrednictwem par substratów sprzężonych odpowiednimi dehydrogenazami. Niezbędnym warunkiem przebiegu tego procesu jest obecność swoistej dehydrogenazy po obu stronach wewnętrznej błony mitochondrialnej. Na rycinie 14-14 przedstawiono mechanizm przenoszenia przy użyciu „mostka" glicerolofosforano wego. Należy zwrócić uwagę, że w związku z tym procesem zostaną wytworzone tylko 2, a nie 3 mol ATP na atom zużytego tlenu, ponieważ enzym mitochondrialny jest flawoproteiną związaną z łańcuchem oddechowym bez udziału NAD. U niektórych gatunków aktywność FAD-zależnego enzymu (mitochondrialnego) zmniejsza się po tyreoidektomii i zwiększa po podaniu tyroksyny. Chociaż obecność tego układu wahadłowego wykazano w mięśniach skrzydłowych owada i w mięśniu białym i może on mieć znaczenie w wątrobie, to w innych tkankach (np. w mięśniu sercowym) stwierdza się niedobór mitochondrialnej dehydrogenazy glicerolo-3-fosforanowej. Przeto uważa się, że bardziej uniwersalny jest układ transportujący wykorzystujący jabłczan i dehydrogenazy jabłczanowe, cytoplazmatyczną i mitochondrialną. Ten „mostek" (układ wahadłowy jabłczan : asparaginian) przedstawiono na ryc. 14-15, Złożoność tego układu wynika z nie-

przepuszczalności wewnętrznej błony mitochondrialnej dla szczawiooctanu. Szczawiooctan, kosztem glutaminianu, musi najpierw ulec transaminacji do asparaginianu, z którego po jego przejściu przez błonę mitochondrialną zostanie w cytozolu odtworzony szczawiooctan. Transport jonów w mitochondriach jest procesem wymagającym dostarczenia energii Aktywnie oddychające mitochondnaj wjctórych zachodzi fosforylacja oksydacyjna, utrzymują lub gromadzą kationy, takie jak K+,Na +, Ca2 + i Mg2 + oraz P*. Rozprzężenie fosforylacji oksydacyjnej za pomocą dinitrofenolu prowadzi do ucieczki jonów z mitochondrionu, ale pobieranie jonów ze środowiska nie jest hamowane przez oligomycynę, co sugeruje, że energia konieczna do procesu transportu nie pochodzi z bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego, powstającego podczas fosforylacji ADP. Przyjmuje się, że wymianę kationów napędza pierwotna pompa protonowa. Układy transportujące zabezpieczają równowagę elektryczną i osmotyczną po obydwu stronach błony mitochondrialnej (p. ryc. 14-16) Wewnętrzna błona mitochondrialną swobodnie przepuszcza elektrycznie obojętne małe

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 159

NA ZEWNĄTRZ

Wewnętrzna błona WEWNĄTRZ mltochondrlalna N-

Ety)orraieimłd OH" H3PO4" N-Etyloma!eJmld i Hyd r o teycyn am on lan Pirogronian"

Jabtazan1" _Jabłczan'Cytrynian*-+ Hł Jablczarr et-Ketoglutaran1" . ADP 3" ■

ków lub układów transportujących, ułatwiających ich transport przez błonę. Okazuje się, że aniony monokarboksylowe przenikają przez błonę łatwiej ze względu na mniejszy stopień dysocjacji tych kwasów. Uważa się, że niezdysocjowany i dobrze rozpuszczalny w lipidach kwas jest tym rodzajem cząsteczki, która przechodzi przez błonę lipidową. Transport anionów dikarboksylowych i trikarboksylowych jest ściśle związany z przenoszeniem fosforanu nieorganicznego. Ten ostatni łatwo przechodzi przez błonę jako jon HZPO~, wymieniając się z OH". Pobranie jabłczanu przez przenośnik anionów dikarboksylowych wymaga na wymianę fosforanu nieorganicznego po przeciwnej stronie błony. Pobranie cytrynianu, izocytrynianu, lub ds-akonitanu przez transporter anionów trikarboksylowych wymaga na wymianę jabłczanu. Transport acketoglutaranu również zachodzi na zasadzie wymiany z jabłczanem. Dzięki użyciu mechanizmów wymiany przeciwp radowej (antyport) zostaje więc zachowana równowaga osmotyczna. Transport cytrynianu przez wewnętrzną błonę mitochondrialną zależy nie tylko od przenoszenia jabłczanu, lecz także od transportu fos-

■ATP* Atraktylozyd i

Byc. 14-16. Układy przenośnikowe w błonie mitochondrialnej, 1 ~ przenośnik fosforanowy, 2 — sprzężony transport (symport) pirogronianu, 3 — przenośnik anionów dikarboksylowych, 4 — przenośnik anionów trikarboksylowych, 5 — przenośnik a-ketoglutaranowy, 6 — przenośnik nukleotydów adeninowych, Zaznaczono miejsca hamowania (0) przez N-etylomaleimid, hydroksycynarnonian i atraktylozyd, W błonie znajdują się również (nie pokazano) przenośniki: glutaminianowo-asparaginianowy (ryc. 14-15), glutaminowy, ornttynowy i karrtitynowy (ryc. 24-1).

NA ZEWNĄTRZ

Wewnętrzna ^„a mliocriondrialna F 1

WEWNĄTRZ

} t ATP""

_J

j

cząsteczki, takie jak tlen, woda, CO2 i NH3, oraz kwasy monokarboksylowe, takie jak 3-hydroksymasłowy, acetooctowy i octowy. Długołańcuchowe kwasy tłuszczowe są przenoszone do mitochondriów jako pochodne karnityny (p. ryc. 24-1), a specjalny przenośnik w wewnętrznej bionie rnitochondrialnej umożliwia sprzężony transport pirogronianu z H+ {kotransport, symport), co jest równoznaczne ze zużyciem transmembranowego gradientu protonów. Aniony dikarboksylowe i trikarboksylowe oraz aminokwasy wymagają swoistych przenośni-

"l

0

Ryc. 14-17. Współdziałanie przenośnika fosforanowego (1) z przenośnikiem nukleotydów adeninowych (2) podczas syntezy ATP. Przedstawiony sprzężony transport (symport) H+/Pj jest odpowiednikiem przeć i wtrans portu (antyport) Pj/OH~ (ryc. 14-16). Na każdą zsyntetyzowaną w mitochondriach i uwalnianą cząsteczkę ATP, mitochondrion pobiera 3 protony. Natomiast pobiera tylko 2 protony, jeżeli zsyntetyzowana cząsteczka ATP zostanie zużyta wewnątrz mttochondrionu.

160 / ROZDZIAŁ 14

forami nieorganicznego. Przenośnik nukleotydów adeninowych umożliwia wymianę ATP z ADP, ale nie z AMP. Pozwala on wyjść cząsteczce ATP z mitochondrionu do pozamitochondrialnych miejsc zużywających energię oraz zapewnia powrót ADP do wnętrza mitochondrionu, gdzie służy do syntezy ATP (ryc. 14-17), Na+ może wymieniać się z H + , zużywając gradient protonów. Uważa się, że aktywny transport Ca 2h do mitochondriów zachodzi z przemieszczeniem I ładunku (uniport). prawdopodobnie na zasadzie antyportu CaJ + /H+, Uwalnianie wapnia z mitochondriów jest ułatwione przez wymianę z Na+. Jonofory umożliwiają swoistym kationom transport przez błonę Jonofory uzyskały taką nazwę ze względu na ich zdolność do kompleksowania swoistych kationów i ułatwiania ich transportu przez błony biologiczne. Ta właściwość jonoforów wynika z ich lipofilowego charakteru, który umożliwia penetrację błon lipidowych, takich jak błona mitochondrialna. Za przykład może posłużyć walinomycyna umożliwiająca przechodzenie K+ przez błonę mitochondriainą. w następstwie czego dochodzi do rozładowania potencjału błonowego między środowiskiem zewnętrznym i wewnętrznym mitochondrionu. Nigerycyna również działa jako jonofor dla K+, ale na zasadzie wymiany z H + . Prowadzi to do zniesienia transmembranowego gradientu pH. W obecności walinomycyny i nigerycyny, zostaje wyeliminowany zarówno potencjał błonowy, jak i gradient pH i stąd całkowite hamowanie fosforylacji. Klasyczne związki rozprzęgające, takie jak dinitrofenol, są w rzeczywistości jonoforami protonowymi. Transhydrogenaza transportująca H* wytwarza wewnątrzmitochondrialny NADPH Znajdująca się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej energetycznie zależna transhydrogenaza katalizuje przeniesienie H+ z wewnątrzmitochondrialnego NADH na NADP, tworząc NADPH, który jest sprzężony z przemieszczeniem protonów ze środowiska zewnętrznego do wnętrza mitochondrionu. Wydaje się, że

enzym działa jako energetycznie zależny bufor red.-oks. i jako źródło NADPH dla enzymów wewnątrzmitochondrialnych, takich jak dehydrogenaza glutaminianowa i hydroksylazy uczestniczące w syntezie steroidów. Niedoczynność łańcucha oddechowego

jest przyczyną choroby

Niedobory lub brak większości oksydoreduktaz łańcucha oddechowego są przyczyną śmiertelnej miopatii tnitochondrialnej niemowląt i dysfunkcji nerek. MELAS (miopatia mitochondrialna, encefalopatia, kwasica mkczanowa i udar) jest dziedzicznym zespołem chorobowym, wynikającym z niedoboru oksydoreduktazy NADH; ubichinon {kompleks 1) lub oksydazy cytochromowej. Opisano wiek chorób spowodowanych niedoborem któregoś z enzymów mitochondrialnych (Scholte). PIŚMIENNICTWO Boyer PD: The unusual enzymology of ATP synthase. Biochemistry 1987;26:8503. Cross RL: The mechanism and regulation oT ATP synthesis by FrATPases. Annu Rev Biochem 1981;50:<581. Hatefi Y: The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation system. Annu Rev Biochem 1985;54:1015. Hinkle PC, McCarty RE: How cells make ATP. Sci Am (March) 197K;238:104. Mitchcll P: BCeilin's respiratory chain concept and its chemiosmotic consequences. Science 1979;206:1148. Nicholls DG: Bioenergetics: An introduetion to the Chemiosmotic Theory. Academic Press, 1982. Prince RC: Tbe proton pump of cytochrome oxidase. TIBS 1988;13:159. Schohe HR, et al: Defects in oxidative phosphorylation. Biochemical iiwestigations in skeletal muscle and expression of the lesion in other cells. / Inher Metab Dis 1987;I0, Suppl 1:81. Tyler DD: The mitochondrial ATP synthase. Page 117 in: Membranę Structure and Function, Vol. 5. Bittar EE (editor). Wiicy, 1984. Tyler DD, Sutton CM: Mitochondrial transporting systems. Page 181 in: Membranę Structure and Function. Vol 5. Bittar EE (editor). Wiley, 1984.

Węglowodany o znaczeniu fizjologicznym

1 5

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Węglowodany są szeroko rozpowszechnione w świecie roślinnym i zwierzęcym. Odgrywają one rolę zarówno strukturalną, jak i metaboliczną. W roślinach glukoza jest syntetyzowana z dwutlenku węgla i wody w procesie fotosyntezy i przechowywana jako skrobia lub ulega przekształceniu w błonnik szkieletu roślinnego. Zwierzęta mogą syntetyzować niektóre węglowodany, wykorzystując do tego celu tłuszcz i białka, ale większa część węglowodanów zwierzęcych jest pochodzenia roślinnego.

WĘGLOWODANY SĄ ALDEHYDOWYMI LUB KETONOWYMI POCHODNYMI ALKOHOLI WIELOHYDROKSYLOWYCH Węglowodany klasyfikuje się następująco:

Monosacharydy są to węglowodany, które nie ulegają hydrolizie do form

prostszych. Na podstawie liczby atomów węgla można je podzielić na triozy, tetrozy, pentozy, heksozy i hcptozy; oraz na aldozy i ketozy zależnie od obecności grupy aldehydowej lub ketonowej. Przykładami są:

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Znajomość struktury i właściwości węglowodanów fizjologicznie ważnych jest niezbędna do zrozumienia ich roli w ekonomii organizmu ssaków. Glukoza jest najważniejszym węglowodanem, ponieważ większość węglowodanów zawartych w pokarmach wchłania się do krwiobiegu jako glukoza lub jest przekształcana w nią w wątrobie, a w organizmie z glukozy mogą powstać wszystkie inne cukry. Glukoza jest istotnym źródłem energii w tkankach, ssaków (z wyjątkiem przeżuwaczy) i uniwersalnym „paiiwem" dla płodu. Jest ona przekształcana w inne cukry odgrywające swoiste role, np. glikogen jako spichlerz; ryboza w kwasach nukleinowych; galaktoza w laktozie mleka, w pewnych lipidach złożonych oraz w połączeniu z białkami w glikoproteinach i proteoglikanach. Do chorób związanych z zaburzeniami węglowodanów zalicza się cukrzycę, galaktozemic, zaburzenia spichrzania glikogenu i nietolerancję mleka. II — Biochemia

Triozy

(C3H6O3)

Tetrozy (C.H.OJ Pentozy (CBH10Os) Heksozy (C6H12O0)

Aldoza Aldehyd glicerynowy Erytroza Ryboza Glukoza

Ketoza Dihydroksyaceton Erytruloza Rybuloza Fruktoza

Disacharydy to węglowodany, które podczas hydrolizy rozpadają się na 2 cząsteczki takich samych lub różnych monosacharydów. Przykładami są sacharoza, laktoza i maltoza. Oligosacharydy to cząsteczki, które podczas hydrolizy rozpadają się na 3—6 jednostek monosacharydowych. Przykładem może być maltotrioza*.

Polisacharydy w wyniku hydrolizy rozkładają się na ponad 6 cząsteczek monosacharydów. Przykładami polisacharydów, które mogą być liniowe lub rozgałęzio* Należy podkreślić, że nie jest to trioza, ale trisacharyd zbudowany z 3 reszt a-glukozy.

162 / ROZDZIAŁ 15

ne, są skrobie i dekstryny. Niekiedy określa się je jako heksozany lub pentozany, w zależności od rodzaju monosacharydów otrzymywanych w wyniku hydrolizy.

Cukry występują w formie różnych ro dzajów izomerów

GLUKOZA JEST GŁÓWNYM MONOSACHARYDEM Struktura glukozy może być przedsta wiona 3 sposobami

-

Chociaż wzór strukturalny w formie prostego łańcucha (aldoheksoza, ryc. 15-1 A) pozwala zrozumieć niektóre właściwości glukozy, to strukturą uprzywilejowaną termo dynamicznie i warunkującą jej pozostałe właściwości chemiczne jest forma cykliczna. W większości przypadków wzór strukturalny glukozy może być przedstawiony jako płaski pierścień narysowany perspektywicznie, jak zaproponował Haworth (ryc. 15-1B). Na podstawie analizy dy0 11

II -H ■c H— -OH 2 C

frakcji promieni rentgenowskich ustalono, że ten sześcioczłonowy pierścień zawierający 1 atom tlenu, w rzeczywistości istnieje w formie krzesełkowej (ryc. 15-1C). -

Związki o takim samym wzorze strukturalnym, ale różnej konfiguracji przestrzennej są znane jako stereoizomery. Warunkiem powstania izomerów przestrzennych są asymetryczne atomy węgla (atomy węgla połączone z 4 różnymi atomami lub grupami). Liczba możliwych izomerów danego związku zależy od liczby asymetrycznych atomów węgla (n) i równa się 2n. Glukoza, z 4 asymetrycznymi atomami węgla, ma 16 izomerów. Ważniejsze rodzaje izomerów glukozy są następujące:

1. Izomery konf iguracyjne D i L. Okre-

ślenie izomerujako formy D lub jej lustrzanego odbicia jako formy L jest uwarunkowane przestrzennym podobieństwem do macierzystego związku rodziny węglowodanów, trójwęglowego cukru — aldehydu glicerynowego (gliceroza jest nazwą nie wskazaną). Formy L i D tego cukru, wraz z odpowiadającymi im izomerami glukozy, przedstawiono na ryc. 15-2. Ustawie-

H-« -OH C

i e


CH,OH

C—H I H-C —OH CHjOH

'CHjOH Aldehyd L-pllcerynowy

J

C-H OH

«C -H

'C-H t HOI H- SCI HO— I *C —H I 'CHsOH

Aldehyd D-gtfoeryrtowy (D-G!loeroza)

C —H I H-C —OH ( HO —C —H i H-C

Ć

—OH H-C

CH,O H

m I

a-D-Glutoza

Ryc. 15-1. a-D-Glukoza. A — forma łańcuchowa, B — wzór rzutowy Hawortha, C — konformacja krzesełkowa.

L-Glukoza

D- Glukoza

Ryc. 15-2. D- i L-lzomery aldehydu glicerynowe go i glukozy.

-

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 163 nie grup — H i -OH wokół atomu węgla (tj. 5 atomu, węgla w glukozie) przylegającego do końcowego węgla pierwszorzędowego alkoholu warunkuje przynależność cukru do szeregu D lub

L. Jeżeli grupa — OH przy tym atomie węgla (atomie odniesienia) znajduje się po stronie prawej (jak przedstawiono na ryc. 15-2), to cukier należy do szeregu D; jeśli grupa — OH znajduje się po stronie lewej, to cukier należy do szeregu L. Większość monosacharydów występujących u ssaków ma konfigurację D, a enzymy warunkujące ich metabolizm są swoiste dla tej konfiguracji. Obecność asymetrycznych atomów węgla nadaje również cząsteczce aktywność optyczną. Gdy strumień światła spolaryzowanego przechodzi przez roztwór izomeru optycznego, wówczas płaszczyzna polaryzacji przechodzącego światła spolaryzowanego może zostać skręcona w prawo, prawoskrętność (+), lub w lewo, lewoskrętność (—). Związek może być oznaczony D(—), D( + ), L( —) lub L(-t-), co wskazuje na jego pokrewieństwo strukturalne 2 aldehydem Dlub L-gliceryn owym, oraz wskazuje, że wykazuje on niekoniecznie ten sam kierunek skręca lności optycznej co aldehyd, np. naturalnie występującą formą fruktozy jest D(—) izomer. Mieszanina równych ilości izomerów D i L nie wykazuje żadnej aktywności optycznej, gdyż aktywności każdego z izomerów wzajemnie się znoszą. Mieszaninę taką nazywamy racemiczną lub DL-mieszaniną. Związki otrzymywane syntetycznie są z konieczności racemiczne, ponieważ każdy z izomerów powstaje z taką samą łatwością. 2. Piranozowe i furanozowe formy pierścieniowe. Podstawą terminologii jest fakt, że trwale struktury pierścieniowe mono sacharydów są podobne do struktury pierście nia piranu lub furanu (ryc. 15-3). Ketozy mogą również występować w formach pierścienio wych (np. D-fruktofuranoza lub D-fruktopiranoza) (ryc. 15-4). W przypadku znajdującej się w roztworze glukozy, ponad 99% jej cząsteczek znajduje się w postaci piranozowej; a więc mniej niż 1% znajduje się w postaci furanozowej. 3. a i p Ano mery. Struktura pierścieniowa aldozy jest półacetalem, ponieważ została utwo rzona w wyniku reakcji grupy aldehydowej z grupą alkoholową (ryc. 15-5). Podobnie pierś cieniowa struktura ketozy jest półketalem. Kry staliczna glukoza jest a-D-glukopiranozą. W roztworze zachowuje się struktura cykliczna, ale pierwszy atom węgla (karbonylowy) staje się

Fu ran

Plran H OH

■i- D- GI u kołu ranoza

HOCH j HCOH I

HOCH

n-OGIukopIranoza

Ryc. 15-3. Postacie pira nożowa i furanozowa glukozy.

OH

H

a-D-FruktopIranoza

OH

H a - D-

Fru ktof u r an oza

Ryc. 15-4. Postacie pira nożowa i furanozowa fruktozy.

asymetryczny (anomeryczny atom węgla). Wyni-

kiem tego jest powstanie mieszaniny zawierającej a-glukopiranozę (36%) i P-glukopiranozę (63%) oraz śladowe ilości oc i P anomerów glukofuranozy (1%). Ustalaniu się równowagi w tym układzie towarzyszy zmiana skręcalności optycznej (mutarotacja), w miarę otwierania się

164 / ROZDZIAŁ 15 HOCH,

HOCH

H/H

\

OH

/

HO\OH

H

\

H/H

W

OH

H

«r-D-Glukoplranoza (fl-anomer)

OH

/f-OGIukopIranoza (0-anomer) Acykliczna forma aldehydowa

Ryc. 15-S. cc- i DMechanizm

p-stereoizomery glukopiranozy. mutarotacji.

pierścienia pó lace tal owego i jego odtwarzania, wraz ze zmianami położenia grup — H i — OH przy pierwszym atomie węgfa. Pośrednikiem w tym procesie jest przypuszczalnie uwodniona

prostolańcuchowa cząsteczka acykliczna, aczanaliza HO\OH kolwiek polarograficzna wykazała, że najwyżej 0,0025% glukozy istnieje w formie acyklicznej. Rotacja optyczna obserwowana w roztworach glukozy jest prawoskretna; z tego powodu w praktyce klinicznej często używa się nazwy dekstroza zamiast glukoza. 4. Epimery. Izomery różniące się konfigu racją — OH i — H przy atomach węgla 2, 3 lub 4 glukozy nazywamy epimerami. Najważniej szymi biologicznie epimerami glukozy są mannoza i galaktoza, utworzone przez epimeryzację odpowiednio przy węglu 2 i 4 (ryc. 15-6). 5. Izomery konstytucyjne — aldoza, ketoza. Fruktoza ma ten sam wzór cząstecz kowy co glukoza, lecz różni się wzorem struk turalnym. Przy drugim atomie węgla cząsteczki fruktozy znajduje się potencjalna grupa ketono wa (ryc. 15-7), natomiast glukoza zawiera po tencjalną grupę aldehydową w pozycji 1 (ryc. 15-8). Wiele monosacharydów to związki fizjologicznie ważne Pochodne trioz powstają w wyniku metabolicznej degradacji glukozy w ciągu glikolitycz-

H

OH a-

HOCH,

HOCH

D-Galaktoza Ryc. 15-6. Epirneryzacja glukozy H

H a-

D-Mann ola

CH,OH I

CH,OH

C=O

CH,OH

CHiOH

CHjOH

c=o

ć=o

i

I HO—C—H

H-C-OH i CH,OH Dihydroksyaceton

D-(Jsyluloza

C = O I HO — C— H

I H-C — OH

H—C —OH

H- C - OH

CH,OH

H —C—OH

CH,OH D-Rybuloza

Ryc. 15-7. Przykłady ketoz o znaczeniu fizjologicznym.

D-Fruktoza

CH3OH i

c=o

HO—C—H H—C —OH I H—C —OH I H—C —OH CHiOH D-Sedoheptuloza

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU RZJ O LOGICZNYM /

165

CHO H-C-OH CH,OH Aldehyd D-gllcarynowy

" *

CHO

CHO H-C-OH

HO-Ć-H H-C-OH

H-C-OH

CHjOH D-Treoza

ł

CHO

CHO

HO-Ć-H HO-Ć-H j

CHiOH D-Erytroza

H-Ć -OH LJA

/*

n v^ w

H -C -OH ĆH3OH

LJ

n

H-C -OH CH.OH D-Ksyloza

D-LIksoza CHO

H-C-OH

HO-Ć-H

HO-Ć-H

ł

CHO

HO-Ć-H H-Ć-OH H-Ć -OH

CHO

H-Ć -OH H-Ć -OH H-C -OH

CHiOH

CHjOH

D-Arablnoza

D-Ryboia

r 1 HO-C-H

H-Ć-OH

HO-C-H

HO-Ć-H

H-Ć-OH

H-Ć-OH

H-C-OH

H-C-OH

H-Ć-OH

ĆH,OH

CH,OH

CH,OH

O-Galakloza

D-Mannoza

D -Glukoza

Ryc. 15-8. Współzależności strukturalne szeregu D. D-Treoza nie ma znaczenia fizjologicznego. aldoz Szereg utworzono przez teoretyczne dodawanie jednostki CH2O do grupy -CHO cukru.

nym. Pochodne trioz, tetroz, pentoz i 7-wcglowego cukru (sedoheptulozy) powstają w procesie degradacji glukozy w cyklu pentozofosforanowym. Pentozy są istotnym składnikiem nukleotydów, kwasów nukleinowych i wielu koenzymów (tab. 15-1). 2 heksoz najważniejsze fizjologicznie są; glukoza, galaktoza, fruktoza i mannoza (tab. 15-2). Na rycinie 15-8 przedstawiono strukturę znaczących biochemicznie aldoz, a ryc. 15-7 budowę 5 ważnych w metabolizmie ketoz. Ważną rolę odgrywają kwasy karboksylowe pochodne glukozy, takie jak D-glukuronian (uczestniczący w tworzeniu gtukuronidów i występujący jako składnik glikozaminoglikanów) i jego pochodne metaboliczne, L-iduronian (skiadnik glikozaminoglikanów) (ryc, 15-9) i L-gulonian (metabolit szlaku kwasu uronowego; p. ryc. 22-1).

coo-

OH

OH

Ryc. 15-9. a-D-Glukuroman (z lewej) 1 p-L-iduronian (z prawej).

Cukry tworzą glikozydy, reagując z innymi związkami lub między sobą Glikozydy są to związki powstające w wyniku kondensacji między grupą hydroksylową, znajdującą się na anomerycznym atomie węgla monosacharydu lub reszty monosacharydowej, a drugim związkiem, którym może — lecz nie

166 / ROZDZIAŁ 15 Tabela 15-1. Pentozy Cukier

mające znaczenie fizjologiczne

D-Ryboza

Kwasy nukleinowe

Składnik strukturalny kwasów nukleinowych i koenzymów, np. ATP, NAD, NADP, flawoprotein. Metabolit pośredni w cyklu pentozofosforarrowym

D-Rybuloza

Powstaje w procesach metabolicznych

Związek pośredni w cyklu pentozofosforan owym

D-Arabinoza

Guma arabska Gumy śliwkowa i czereśniowa Gumy drzewne proteoglikany, glikozaminoglikany

Składnik glikoprotein

D-Liksoza

Mięsień sercowy

Składnik liksoflawiny izolowanej z mięśnia sercowego człowieka

L-Ksyluloza

Związek pośredni szlaku

<wasu uronowego

Tabela 15-2. Heksozy Cukier

mające znaczenie fizjologiczne

D-Glukoza

Soki owocowe. Hydrolizat skrobi, sacharozy, maltozy i laktozy

„Cukier" organizmu. Przenoszony przez krew. pobierany i wykorzystywany przez tkanki

D- Fruktoza

Soki owocowe. Miód. Hydrolizat sacharozy i inuliny (z bulw karczochów) Hydrolizat laktozy

W wątrobie i jelitach przekształca się w glukozę i tak zużywa ją organizm W wątrobie ulega przekształceniu w glukozę i jest metabolizowana. Syntetyzowana w gruczole sutkowym tworzy laktozę mleka. Składnik glikolipidów i glikoprotein Składnik wielu glikoprotein

D-Ksyloza

D-Galaktoza

D-Mannoza

Występowanie

Źródło

Hydrolizat gum i martnozanów roślinnych

musi (w przypadku aglikonu — być inny monosacharyd. Jeżeli drugą grupa jest hydroksyl, to wiązanie O-gliknzydowe jest połączeniem aceta-

lowym, ponieważ jest ono wynikiem reakcji

Znaczenie biochemiczne

Znaczenie kliniczne

Składnik głikoprotein

Znaczenie biochemiczne

Pojawia się w moczu w pentozurii wrodzonej

Znaczenie kliniczne

Pojawia się w moczu (giukozuria) w wyniku zwiększenia stężenia glukozy we krwi (hiperglikemia) w cukrzycy Dziedziczna nietolerancja fruktozy jest przyczyną akumulacji fruktozy i hipoglikemit Zaburzenia jej metabolizmu prowadzą do galak-

tozemii i zaćmy

między półacetalową grupą hydroksylową a inną grupą — OH. Jeżeli częścią hemiacetalową jest glukoza, to utworzony związek jest glukozydem; jeśli galak-

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 167

HO/CH.OH

OH Ryc, 15-10.

H

OH

OH

Streptomycyna (z lewej) i ouabaina (z prawej).

toza — galaktozydent, itd. Jeżeli drugą grupą jest amina, powstaje wiązanie N-glikozydowe, np. między adeniną a rybozą w takich nukleotydach, jak ATP (p. ryc. 12-5). Glikozydy są składnikami wielu leków i przypraw korzennych oraz tkanek zwierzęcych. Aglikonem może być metanol, glicerol, steroł, fenol lub zasada, np. adenina. Wszystkie glikozydy, ważne w medycynie ze względu na ich działanie na mięsień sercowy (glikozydy nasercowe), zawierają, jako składnik aglikonowy, steroidy. Należą tu pochodne naparstnicy i strofantusa, takie jak ouabaina będąca inhibitorem Na+/K+-ATPazy błon komórkowych. GUkozydami są niektóre antybiotyki, np. streptomycyna (ryc. 15-10). Deoksycukrom brak atomu tlenu W deoksycukrach grupę hydroksylową przyłączoną do pierścienia zastąpił atom wodoru. Deoksycukry otrzymuje się w wyniku hydrolizy pewnych biologicznie ważnych związków. Przykładem jest deoksyryboza (ryc. 15-11) występująca w kwasach nukleinowych (DNA).

OH

H

Ryc. 15-11. 2- Deoksy- D-rybofuranoza (anomer ji),

Deoksycukrem jest również L-fukoza (p. ryc. 15-17), składnik glikoprotein, oraz 2-deoksyglukoza, znany inhibitor metabolizmu glukozy. Aminocukry (heksozoaminy) są składnikami glikoprotein, gangliozydów i glikozaminoglikanów Przykładami aminocukrów występujących w przyrodzie są D-glukozamina (ryc. 15-12), D-galaktozamina i D-mannozamina. Glukozamina jest składnikiem kwasu hialuronowego. Galaktozamina (chondrozamina) jest składnikiem chondroityny (p. rozdz. 54), HOCH

Ryc. 15-12. Giukozamina (2-amino-D-glukopiranoza) (anomer a). Galaktozamina jest 2-amino-D-galaktopiranozą. Zarówno giukozamina, jak i ga laktozamina występują jako N-acetylowe pochod ne w większośc i węglow odanów z łożonych, np. w glikoproteinach. _____________

Niektóre antybiotyki (erytromycyna, karbomycyna) zawierają w swojej cząsteczce aminocukry. Uważa się, że aktywność lecznicza związana jest z obecnością aminocukrów w cząsteczkach tych antybiotyków.

168 / ROZDZIAŁ 15

NAJWAŻNIEJSZYMI DISACHARYDAMI SĄ MALTOZA. SACHAROZA I LAKTOZA Disacharydy są cukrami złożonymi z 2 reszt monosacharydowych połączonych wiązaniem glikozydowym (ryc. 15-13). Nazwę chemiczną

disacharydów tworzy się na podstawie ich monocukrowych składników. Ważnymi fizjologicznie disacharydami są maltoza, sacharoza, laktoza i trehaloza {tab. 15-3). W wyniku hydrolizy sacharozy powstaje mieszanina zwana „cukrem inwertowanym", gdyż powstająca w czasie hydrolizy silnie lewoskręt-

Maltoza

Trehaloza

A----\ iOH 1

—o—'

H

OH OH

H

0-a-0-Glukoplranozylo-(1D-giukopiranoza

ł4)-aH

OH

H

0-a-OGIukoplranozyto-(1-ł1)-«-[>-g!ukoplranozyd

Celobioza HOCH2

HO H

OH

OH

H

H

OH

OH

O-/t-D-Fru ktof u ra n ozylo-(2 -• 1 )-a - D-g I u to p I ran ozyd

Laktoza

H

OH

H

OH

O-0-D-GaJal
Ryc. 15-13. Struktura typowych disacharydów. Przedrostek a i p odnosi się do konfiguracji przy anomerycznym atomie węgla(*). Jeżeli węgiel anomeryczny drugiej reszty uczestniczy w tworzeniu wiązania glikozydowego, to ta|ją resztę glikozydową nazywa stę furanozydem lub piranozydem. W odróżnieniu od większości innych cukrów, cukier nie mający wolnej potencjalnej grupy aldehydowej lub ketonowej na węglu anomerycznym nie wykazuje właściwości redukujących.

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 169 Tabela 15-3. Disacharydy Cukier

Źródło

Znaczenie kliniczne

Maltoza

Produkt trawienia amylazą lub hydrolizy skrobi. Kiełkujące ziarna zbóż i słód

Laktoza

Mleko

Może pojawiać się w moczu podczas ciąży. Przy niedoborze laktazy, zaburzenie wchłaniania prowadzi do biegunki i wzdęcia

Sacharoza

Cukier trzcinowy i z buraków cukrowych. Sorgo, ananasy, marchew

Przy niedoborze sacharazy, zaburzenie wchłaniania prowadzi do biegunki i wzdęcia

Trehaloza

Grzyby i drożdże. Główny cukier hemolimfy owadów.

na fruktoza powoduje zmianę (inwersję) skręcał no ści optycznej pierwotnie prawoskrętnej sacharozy.

POLISACHARYDY PEŁNIĄ FUNKCJE ZAPASOWE I STRUKTURALNE Do polisacharydów zalicza się następujące ważne fizjologicznie węglowodany: Skrobia. Ma budowę łańcucha a-glikozydoweg"b. Takie związki, rozpadające się w trakcie hydrolizy tylko na cząsteczki glukozy, są homopolimerami zwanymi glukoza na mi tub glukanatni. Skrobia jest najważniejszym źródłem węglowodanów w pożywieniu i znajduje się w kaszach, ziemniakach, roślinach strączkowych i innych warzywach. Dwoma głównymi skład-

nikami skrobi s ą: amylo z a (15 20%),two rżąca nierozgałęzioną strukturę helikoidalną (ryc. 15--14), oraz amylopektyna (80—85%), tworząca łańcuchy rozgałęzione. W tej ostatniej do łańcucha głównego są przyłączone wiązaniem 1 -+ó łańcuchy boczne; jedno odgałęzienie przypada na 24—-30 reszt glukozowych połączonych wiązaniami l-*4. Glikogen (ryc. 15-15). Jest zapasowym polisacharydem organizmów zwierzęcych. Często nazywa się go skrobią zwierzęcą. Ma strukturę bardziej rozgałęzioną niż amylopektyna, bowiem jedno odgałęzienie przyłączone do łańcucha głównego wiązaniem a(l -»-6)-glikozydowym przypada na 10—18 reszt a-D-glukopiranozowych połączonych wiązaniami a(l-»4)-glikozydowymi, Inulina. Jest polisacharydem występującym

Ryc. 15-14. Struktura skrobi. A — amyloza o strukturze spiralnego zwoju, B — amylopektyna z rozgałęzieniami przyłączonymi wiązaniami 1 -»6. _____

170 / ROZDZIAŁ 15

REGION ZEWNĘTRZNY

Ryc. 15-15. Cząsteczka glikogenu. A — struktura ogólna, B — powiększona struktura w punkcie rozgałęzienia. Liczby w A oznaczają kolejne etapy wzrostu cząsteczki. R — pierwotna reszta glukozy zawierająca, jako jedyna w cząsteczce glikogenu, redukującą grupę przy Cv Rozgałęzienia są bardziej różnorodne niż to przedstawiono na tej rycinie: wartość stosunku wiązań 1 -* 4 do wiązań 1 -* 6 waha się w granicach 10—18.

w bulwach i korzeniach dalii, karczochów i mniszka lekarskiego. Ulega ona hydrolizie do fruktozy, jest więc fruktozanem. Ten cukier zapasowy, w odróżnieniu od skrobi ziemniaków, jest łatwo rozpuszczalny w ciepłej wodzie i bywa używany w badaniach fizjologicznych do określenia szybkości filtracji w kłębuszkach nerkowych. Dekstryny. Są substancjami powstającymi podczas częściowej hydrolizy skrobi. Pierwszymi produktami trawienia skrobi, tworzonymi w wyniku skracania łańcuchów bocznych amylopektyny, są dekstryny graniczne. Błonnik (celuloza). Jest głównym składnikiem podporowym u roślin. Nie rozpuszcza się w po-

pularnych rozpuszczalnikach. Tworzy, zbudowane z jednostek p-D-glukopiranozowych, połączonych wiązaniami P(l-ł4), długie, proste łańcuchy wzmocnione krzyżowymi wiązaniami wodorowymi. Błonnik nie jest trawiony w przewodzie pokarmowym wielu ssaków, w tym człowieka, z powodu braku hydrolazy działającej na wiązania p. Jest ważnym składnikiem „objętościowym" pożywienia. W żołądku przeżuwaczy i innych trawożernych występują mikroorganizmy zdolne rozbić wiązanie p, co pozwala wykorzystać bionnik jako znaczące źródło energetyczne. Chiryna. Jest ważnym polisacharydem strukturalnym u bezkręgowców. Znajduje się ona np.

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM I 171 C hity na

HOCH2

H

HOCH,

HN*CO«CH3

N-Acetyloglukozamina

H

HN»CO*CH3

N-Acełylogiu Kozami na

Kwas hiahironowy

w pancerzach skorupiaków i owadów. Strukturalnie chityna składa się z jednostek N-acetylo-D-glukozaminy, połączonych wiązaniami P(l-*4)-glikozydowymi (ryc. 15-16). Glikozamiaogliksny (mukopohsacharydy). Składają się z łańcuchów węglowodanów złożonych, charakteryzujących się zawartością aminocukrów i kwasów uronowych. Po przyłączeniu tych łańcuchów cukrowych do cząsteczki białka powstaje składnik zwany proteoglikanem. Razem z elastyną i kolagenem, elementami strukturalnymi takich tkanek, jak kość, tworzą substancję podstawową, czyli kitową. Znaczna liczba grup — OH i ładunków ujemnych, które przez odpychanie utrzymują w cząsteczce łańcuchy węglowodanowe osobno, powoduje, że glikozaminoglikany mają właściwość zatrzymywania znacznej ilości wody oraz pęcznienia i dzięki temu zdolność do nadawania właściwości amortyzujących lub poślizgowych innym strukturom. Przykładem są kwas hiałuronowy, siarczan chondroityny i heparyna (ryc. 15-16),

HOCH, COO" H

OH Kwas /(-g luku ran owy

N-

Acatylogukozamlna 4-Siarczan chondroltyny

(Uwaga: występuje również 6-siarczan)

HOCH, H HN-COCH3 H

omówienie szczegółowo w rozdz. 57, Glikoproteiny (mukoproteiny). Występują w różnych płynach i tkankach, w tym w błonach komórkowych (p. rozdz. 43 i 57). Są to białka złożone zawierające w różnych ilościach węglowodany, przyłączone jako krótkie lub długie (do 15 jednostek) rozgałęzione lub nierozgałęzione łańcuchy. Łańcuchy takie nazywa się zwykle łańcuchami oligosacharydowymi. Składniki cukrowe obejmują: Heksozy Mannoza (Man)

Galaktoza (Gal)

Acetyloheksozaminy N-Acetyloglukozarnina (GIcNAc)

N-Acetylogalaktozarriina (GaiNAc)

Pentozy Arabinoza (Ara)

Ksyloza (Xyi)

Metylopentozy L-Fukoza (Fuc; p. ryc, 15-17)

OH

Kwasy sjałowe Pochodne N-acylowe kwasu neuraminowego, np. Kwas 0-glukuronowy Siarczan N-acatylogalaktozaminy kwas N-acetyloneuraminowy (NeuAc; p. ryc. 15-18), główny kwas sjalowy. Heparyna

H/H

\H

Hy

"O.

H NH«SO3~ Suttonowana giukozamina

H

OSĄ1

Sulfonowany kwas Iduronowy

R yc. 15-16. S truktura niektórych polisacharydów złożonych.

Dojrzale glikoproteiny, oprócz kolagenu, nie zawierają glukozy i w przeciwieństwie do gliko-/aminoglikanów i proteogiikanow nie zawierają kwasów uronowych. Kwasy sjalowe. Są N- lub O-acylowymi pochodnymi kwasu neuraminowego (ryc. 15-18). Kwas neuraminowy jest 9-węglowym cukrem,

172 / ROZDZIAŁ 15

JtrsO\H

HO/0

W OH

H

R y c . 1 5 - 1 7 .( i - L F u k o z a ( 6 - d e o k s y - p - L - g a l a k t o za).

COCT

Ac —NH

OH

stanowią węglowodany, które znajdują się w glikoproteinach i gliko lipid ach. Ich obecność na zewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej (glikokaliks) wykazano przy użyciu lektyn roślinnych, aglutynin białkowych, które wiążą się swoiście z pewnymi resztami glikozylowymi, np. kimkanawalina A jest swoista w stosunku do reszt a-glukozy 1 owych i a-mannozylowych. Glikoforyna. Jest główną integralną glikoproteiną błony ludzkich erytrocytów. Zbudowana ze 130 reszt aminoacylowych tkwi w błonie lipidowej tak, że zarówno z zewnętrznej, jak i z wewnętrznej (cytoplazmatycznej) powierzchni błony wystają wolne części polipeptydowe. Łańcuchy sacharydowe są przyłączone tylko do części N-końcowej, znajdującej się na zewnątrz powierzchni zewnętrznej błony (p. rozdz, 43).

H

Ryc. 15-18. Struktura kwasu N-acetyloneuraminowego (kwasu sjalowego). Ac = CH3-CO-.

którego strukturę można wyprowadzić, tączac mannozaminę (epimer glukozaminy) z pirogronianem. Kwasy sjalowe są składnikami zarówno glikoprotein jak i gangliozydów. WĘGLOWODANY ZNAJDUJĄ SIĘ W BŁONACH KOMÓRKOWYCH Lipidową strukturę błon komórkowych opisano w rozdz. 16 i 43. Analiza składników błon komórkowych ssaków wykazuje, że ok. 5%

PIŚMIENNICTWO Advances in Carbohydrate Chemistry. Academic Press, 1945—current. Collins PM (editor); Carbokydrates. Chapman & Hali, 1987. Ferrier RJ, Collins PM; Monosaccharide Chemistry. Penguin Books, 1972. Hughes RC: The comple* carbohydrates of mammalian celi surfaces and their biological roles. Essays Biochem 1975;11:1. Lindahl U, Hook M: Glycosaminoglycans and their binding to biological macromolecules. Annu Rev Biochem 1978;47:385. Pigman WW, Horton D (editors): The Carbohydrates. Vols — 1A and 1B. Academic Press, 1972. Rees DA: Poiysaccharide Shapes. Wiley, 1977. Sharon N: Carbohydrates. Sci Am 1980;245:90

Lipidy o znaczeniu fizjologicznym

1 6

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Lipidy są heterogenną grupą związków rzeczywiście lub potencjalnie pokrewnych kwasom tłuszczowym. Mają one wspólną cechę, którą jest t) względna nierozpu szcza Iność w wodzie oraz 2) rozpuszczalność w rozpuszczalnikach niepolarnych, takich jak eter, chloroform i benzen. Do lipidów zalicza się wiec thiszcze, oleje, woski i związki pokrewne. Lipidy są ważnymi składnikami pokarmów nie tylko ze względu na ich dużą wartość energetyczną, lecz także dlatego, że w tłuszczach zawartych w naturalnych pokarmach znajdują się -witaminy rozpuszczalne w tłuszczach oraz niezbędne (tzw. egzogenne) kwasy tłuszczowe.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE W organizmie tłuszcze służą jako wydajne źródło energii zarówno bezpośrednio, jak i potencjalnie, gdy odłożone są w tkance tłuszczowej. Tłuszcze tkanki podskórnej i gromadzące się wokół pewnych narządów służą jako izolator termiczny, a lipidy niepolarne jako izolatory elektryczne pozwalające na szybkie rozprzestrzenianie się fal depolaryzacyjnych wzdłuż mielinowych włókien nerwowych. Zawartość tłuszczów jest wyjątkowo duża w tkance nerwowej. Połączenia tłuszczu z białkiem (lipoproteiny) stanowią ważne składniki komórkowe występujące zarówno w błonie komórkowej, jak i w mitochondriach, a także służą jako środki transportu lipidów w osoczu krwi. Znajomość biochemii lipidów jest konieczna do zrozumienia wielu bieżących zagadnień biomedycznych, np. otyłości, miażdżycy oraz roli różnych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych zarówno w żywieniu, jak i w zdrowiu.

LIPIDY DZIELI SIĘ NA PROSTE I ZŁOŻONE Zmodyfikowana klasyfikacja lipidów wg Bloora jest następująca: A. Lipidy proste: estry kwasów tłuszczowych z różnymi alkoholami. 1. Thiszcze właściwe — estry kwasów tłu szczowych z glicerolem. Tłuszcze występujące w stanie płynnym nazywa się olejami. 2. Woski — estry kwasów tłuszczowych z długołańcuchowymi alkoholami monohydroksylowymi. B. Lipidy złożone: estry kwasów tłuszczowych zawierające, oprócz alkoholu i kwasów tłu szczowych, jeszcze grupy dodatkowe. 1. Fosfolipidy — lipidy zawierające oprócz kwasów tłuszczowych i glicerolu, resztę kwasu fosforowego. Często zawierają one zasadę azo tową i inne podstawniki. a. Glieerofosfolipidy — alkoholem jest glicerol. b. Sfingofosfolipidy — alkoholem jest sfingozyna. 2. Glikolipidy (glikosfingolipidy) — lipidy za wierające kwas tłuszczowy, sfingozynę i wę glowodany, 3. Inne lipidy złożone — takie lipidy, jak sulfolipidy i aminolipidy. W tej grupie można umieścić również lipoproteiny. C. Prckursory i pochodne lipidów: nakżą tu kwasy tłuszczowe, glicerol, steroidy, alkohole inne niż gHcerol i sterole, aldehydy tłuszczowe, związki ketonowe (p, rozdz. 24), węglowodory, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach i hor mony. Ze względu na brak ładunku w cząsteczkach, acylogiicerole (glicerydy), cholesterol i estry cholesterolu określa się mianem lipidów obojętnych.

174 / ROZDZIAŁ 16

KWASY TŁUSZCZOWE SĄ ALIFATYCZNYMI KWASAMI KARBOKSYLOWYMI

CH3(CH2),CH = CH(CHj)7COOH lub

Kwasy tłuszczowe występują głównie w formie zestryfikowanej w naturalnych tłuszczach i olejach, ale w surowicy krwi występują i są transportowane w formie niezestryfikowanej jako wolne kwasy tłuszczowe. Kwasy tłuszczowe występujące w tłuszczach naturalnych są zwykle pochodnymi nierozgałęzionych łańcuchów węglowodorowych i zawierają parzystą liczbę atomów węgla, ponieważ są syntetyzowane z jednostek dwuwęglowych. Ich łańcuch może być nasycony (brak wiązań podwójnych) lub nienasycony (z jednym, lub więcej, wiązaniem podwójnym). Nazwy kwasów tłuszczowych wyprowadza się od odpowiednich węglowodorów Według najczęściej używanej nomenklatury nazwę systematyczną kwasu tłuszczowego tworzy się od nazwy węglowodoru o tej samej liczbie atomów węgla przez dodanie końcówki -owy do nazwy węglowodoru (nomenklatura genewska). Tym sposobem nazwa kwasu nasyconego kończy się na -anowy np. oktanowy, a kwasu nienasyconego z wiązaniami podwójnymi na -enowy, np. oktadekenowy (kwas oleinowy). Numerację atomów węgla rozpoczyna się od węgla grupy karboksylowej (węgiel nr 1). Atom węgla przylegający do węgla karboksylowego (nr 2) jest również znany jako węgiel a. Atom węgla nr 3 jest węglem p, a atom węgla w grupie metylowej znajdującej się na dystalnym końcu łańcucha nazywa się węglem w lub n-atomem węgla. W użyciu jest kilka sposobów wskazywania liczby i położenia wiązań podwójnych; np. A9 oznacza wiązanie podwójne między atomami węgla 9 i 10 kwasu tłuszczowego; to9 wskazuje wiązanie podwójne przy węglu 9, licząc od atomu węgla co. Na ryc. 16-1 przedstawiono powszechnie używane sposoby wskazywania liczby atomów węgla, liczby i położenia wiązań podwójnych w cząsteczce kwasu tłuszczowego. U zwierząt dodatkowe wiązania podwójne są wprowadzane tylko miedzy istniejącym wiązaniem podwójnym (np. (o9, ro6 lub ca3) a węglem karboksylowym, wynikiem czego są 3 serie kwasów tłuszczowych, znane odpowiednio jako rodzina o>9, 006 i co3.

a>9,C18:1 lub n-9, 18:1 CH3CH2CH,CH2CH£H2CHJCH2CH = CH(CH2)7COOH n

17

10

9

1

Ryc. 16-1. Kwas oleinowy, n-9 (n minus 9).

Nasycone kwasy tłuszczowe nie zawierają wiązań podwójnych Nasycone kwasy tłuszczowe można traktować jako pochodne kwasu octowego, pierwszego przedstawiciela szeregu. W tabeli 16-1 przedstawiono przykłady kwasów tego szeregu. Inne długołańcuchowe kwasy tłuszczowe z tego szeregu występują przeważnie w woskach. Wyodrębniono również kilka kwasów tłuszczowych o łańcuchu rozgałęzionym zarówno z materiału roślinnego, jak i zwierzęcego. Nienasycone kwasy tłuszczowe zawierają jedno lub więcej wiązań podwójnych (p. tab. 16-2) Kwasy te można podzielić na podgrupy ze względu na ich stopień nienasycenia. A. Kwasy jednonienasycone (monoetenoidy, kwasy monoetenowe) zawierające jedno wiąza nie podwójne. B. Kwasy wielonienasycone (polienoidy, kwa sy polienowe) zawierające więcej wiązań po dwójnych. C. Eikozanoidy. Grupa związków, pochod nych ikoza-(20-C) polienowych kwasów tłusz czowych, obejmująca prostanoidy i leukotrieny (LT). Do prostanoidów zalicza się prostaglandyny (PG), prostacykliny (PGI) i tromboksany (TX). Terminu „prostaglandyny" używa się często nieściśle jako określenia ogólnego obej mującego wszystkie prostanoidy. Prostagiandyny. Odkryto pierwotnie w nasieniu, ale obecnie wiadomo, że występują praktycznie we wszystkich tkankach ssaków, działając jako miejscowe hormony lokalne; wykazują one istotne aktywności fizjologiczne i farmakologiczne. In vivo są one syntetyzowane z 20-C wielonienasyconych (ikozanowych) kwasów tłuszczowych (np. kwasu arachidonowego). Pierwszy etap biosyntezy polega na cyklizacji środkowej części łańcucha i utworzeniu pierś-

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 175 Tabela 16-1. Nasycone Nazwa

zwyczajowa kwasu

kwasy tłuszczowe Liczba atomów węgla

Mrówkowy*

1

Uczestniczy w metabolizmie reszt Ci (mrówczanu)

Octowy

2

Główny produkt końcowy fermentacji węglowodanów u przeżuwaczy-

Propionowy

3

Końcowy produkt fermentacji węglowodanów u przeżuwaczy+

4 56

Wpewnych tłuszczach w mafych ilościach (zwłaszcza w maśle). > Końcowy produkt fermentacji węglowodanów u przeżuwaczy1"

Masłowy Walerianowy Kapronowy Kaprylowy (oktanowy) Kaprynowy (dekanowy) Laury no wy

a 10

^W wielu tłuszczach (łącznie z masłem) w małych ilościach, > zwłaszcza w tłuszczach roślinnych

12

Spermacet, cynamon, nasiona palmy, olej kokosowy, owoc wawrzynu

Mirystynowy

14

Palmitynowy

16

Gałka muszkatołowa, nasiona palmy, olej kokosowy, mirt 1 Powszechnie występujące we wszystkich tłuszczach zwie-f rzęcych i roślinnych

Stearynowy Arachidowy (ikozanowy)

18 20

Olej arachidowy

Behenowy

22

Nasiona

Lig npc ery nowy

24

Cerebrozydy, olej arachidowy

* Tylko kwas mrówkowy, bez pochodnych alkilowych. + Również w okrężnicy człowieka.

cooRyc. 16-2. Prostaglandyna E2 (PGE2). Byc. 16-3. Tromboksan A2 (TXA2).

COCr

cienia cyklopentanowego (ryc. 16-2). Pokrewny szereg związków, tj. tromboksaiiy wykryte w płytkach krwi, ma pierścień cyklopentanowy przerwany atomem tlenu (pierścień oksanowy) (ryc. 16-3), Trzy różne ikozanowe kwasy tłuszczowe dają początek 3 grupom eikozanoidów z charakterystyczną liczbą wiązań podwójnych w łańcuchach bocznych, np. PGj, PG2, PG> Zmiany dotyczące podstawników przyłączonych do pierścieni są przyczyną istnienia różnych typów podstawienia oznakowanych A, B itd. w każdym szeregu prostaglandyn i tromboksanów. Typ „E" prostaglandyn (jak w PGE2) ma grupę ketonową w pozycji 9, natomiast typ „F" ma grupę hydroksylową w tej pozycji. Lcukotrkny są trzecią grupą pochodnych eikozanoidów powstających raczej przez szlak lipooksygenazy niż przez cyklizację łańcucha kwasu tłuszczowego (ryc. 16-4). Leu-

176 / ROZDZIAŁ 16 Tabela 16-2. Nienasycone kwasy tłuszczowe występujące w pokarmach i mające znaczenie fizjologiczne Liczba atomów C oraz liczba i pozycja wiązań podwójnych

Szereg

Nazwa zwyczajowa

N a z wa systematyczna

Występowanie

Kwasy monoenowe (z 1 podwójnym wiązaniem) 16:1; 9

w7

Palmitooleinowy

cis - 9 - H eksa de ke n o w y

Niemal we wszystkich tłuszczach

18:1; 9

w9

Oleinowy

cis - 9 - 0 kta d eke n owy

Prawdopodobnie najbardziej rozpowszechniony kwas tłuszczowy w tłuszczach naturalnych

18:1; 9

w9

Ela i dyn owy

frans- 9 • 0 ktadeken o wy

Tłuszcze przeżuwaczy i utwardzane

22:1;13

u9

Erukowy

c/s-13-Dokozenowy

Oleje rzepakowy i gorczyczny

24:1;15

w9

Nerwonowy

c«-15-Tetrakozenowy

W cerebrozydach

Kwasy drenowe (z 2 podwójnymi wiązaniami) cis,cis-B,12-Oktadekadienowy

18:2; 9, 12

Oleje: kukurydziany, arachidowy, bawełniany, sojowy i wiele innych roślinrfych

Kwasy trienowe (z 3 podwójnymi wiązaniami) 18:3; 6, 9, 12

Y-Linolenowy

6,9,12-Oktadekatrienowy

Niektóre rośliny, np. olej z wiesiołka. Niewielkie ilaści w tłuszczach zwierzęcych

18:3; 9, 12, 15

et-Linolenowy

9,12,15-Oktadekatrienowy Często występuje z kwasem linolowym, zwłaszcza w oleju lnianym

Kwasy tetraenowe {z 4 podwójnymi wiązaniami)

20:4; 5, 8, 11, 14

Arachidonowy 5,8,11,14- Ikozatetraenonowy

Występuje z kwasem linolowym, zwłaszcza w oleju arachidowym; istotny składnik fosfolipidów zwierzęcych

Kwasy pentaenowe (z 5 podwójnymi wiązaniami)

20:5; 5, 8, 11, 14, 17

Timnodonowy

5,8,11,14,17-lkozapentaenowy

Istotny składnik olejów rybich, np. tranu dorszowego

22:5; 7, 10, 13, 16, 19

Klupanodono-

7,10,13,16,19-Dokozapentaenowy

Oleje rybie, fosfolipidy w mózgu

Kwasy heksaenowe {z 6 podwójnymi wiązaniami) 22:6; 4, 7, 10, 13, 16, 19

Cerwonowy

4,7,10,13,19-Dokozaheksaenowy

Oleje rybie, fosfolipidy w mózgu

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 177

cooCOO"

Ryc. 16-5. Izomery Postać trans (kwas eialdynowy)

Ryc. 16-4. Leukotnen A4 (LTA4).

kotrieny izolowane z leukocytów charakteryzują się obecnością 3 sprzężonych wiązań podwójnych. Większość naturalnie występujących nienasyconych kwasów tłuszczowych ma podwójne wiązanie cis Łańcuchy węglowe nasyconych kwasów tłuszczowych po rozciągnięciu w niskich temperaturach przyjmują konformację typu zygzak. W wyższych temperaturach niektóre wiązania ulegają rotacji, powodując skrócenie łańcucha, co wyjaśnia, dlaczego błony biologiczne stają się cieńsze wraz ze wzrostem temperatury. Typ izomerii geometrycznego, w jakim występują nienasycone kwasy tłuszczowe, zależy od ustawienia atomów lub grup wokół osi wiązania podwójnego. Jeśli łańcuchy węglowe znajdują się po tej samej stronie wiązania, to wiązanie ma konfigurację cis, jak w kwasie oleinowym; jeśli po przeciwnych stronach — trans, jak w kwasie elaidynowym, sztucznym izomerze kwasu oleinowego (ryc. 16-5). Prawie wszystkie występujące w przyrodzie nienasycone długołańcuchowe kwasy tłuszczowe mają konfiguracje cis; łańcuchy węglowodorowe cząsteczek są „zgięte" w miejscu podwójnego wiązania o 120°. Kwas oleinowy ma więc kształt litery L, natomiast kwas elaidynowy mając podwójne wiązanie trans, pozostaje „prosty". Zwiększenie liczby wiązań podwójnych cis w kwasach tłuszczowych pozwala na różnorodność konfiguracji przestrzennych cząsteczki, np. kwas arachidonowy, z 4 wiązaniami podwójnymi cis, może mieć kształt „supła" lub litery „U", To może mieć istotne znaczenie dla molekularnego upakowania w błonie i dla ułożenia przestrzennego kwasów tłuszczowych w bardziej złożonych cząsteczkach, takich jak fosfolipidy. Obecność wiązań podwójnych trans będzie zmieniać te przestrzenne współzależności. Kwasy tłuszczowe o konfiguracji trans występują w pewnych pokarmach. Większość z nich powstaje jako produkt uboczny podczas wysycania kwasów 12 — Biochemia

geometryczne kwasu tłuszczowego A9,18:1 (kwasy oleinowy i elaidynowy).

tłuszczowych w procesie uwodornienia, czyli „utwardzania" naturalnych olejów w zakładach produkujących margarynę. Dodatkowa niewielka część kwasów tłuszczowych trans pochodzi ze spożywanych tłuszczów przeżuwaczy, u których powstają one w źwaczu w wyniku działania mikroorganizmów. Zarówno fizyczne, jak i fizjologiczne właściwości kwasów tłuszczowych są warunkowane długością i stopniem nienasycenia ich łańcucha Temperatura topnienia kwasów tłuszczowych o parzystej liczbie węgli wzrasta wraz z długością łańcucha i obniża się zgodnie z jego nienasyceniem. Triacyłoglicerol, zawierający tylko nasycone kwasy tłuszczowe o 12 atomach węgla lub dłuższe, występuje w stanie stałym w temperaturze ciała, natomiast jeżeli wszystkie 3 reszty kwasów tłuszczowych są 18:2 jest w stanie płynnym do temperatury poniżej 0°C. O

'CH 3 -O-C-R, [I

O 11

R»-C-O-CH

O u

*CH, -OC - R , Ryc. 16-6. Trtacyloglicerol.

coo-

178 / ROZDZIAŁ 16

W rzeczywistości naturalne acyloglicerole zawierają mieszaninę kwasów tłuszczowych dobraną zgodnie z funkcją lipidu. Lipidy błon, które muszą być płynne w zakresie temperatur środowiska, są bardziej nienasycone niż lipidy zapasowe. Lipidy tkanek narażonych na schłodzenie, np. u zwierząt podczas snu zimowego lub w kończynach zwierząt, są w wyższym stopniu nienasycone. Pewne alkohole i aldehydy występują w naturalnych lipidach Alkohole. Do alkoholi występujących w cząsteczkach lipidów należy glicerol, cholesterol i występujące zwykle w woskach wyższe alkohole (np. alkohol cetylowy, Cj6H33OH) oraz dolichol, alkohol poliizoprenoidowy (p. ryc. 16-27).

Aldehydy tłuszczowe. Kwasy tłuszczowe

mogą zostać zredukowane do aldehydów tłuszczowych. Związki te znaleziono w tłuszczach naturalnych w formie wolnej lub związanej. TRIACYLOGLICEROLE (TRIGLICERYDY)* TO GŁÓWNA FORMA ZAPASOWA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Triacyloglicerole są estrami alkoholu — glicerolu z kwasami tłuszczowymi. W naturalnie występujących tłuszczach procent cząsteczek triacyloglicerolu, w których glicerol jest zestryfikowany 3 takimi samymi kwasami, jest bardzo mały. Niemal wszystkie one są acyloglicerolami mieszanymi. Gdyby wszystkie 3 kwasy tłuszczowe oznaczone na ryc. 16-6 jako R, były kwasami stearynowymi, tłuszcz nazywałby się tristearyną, ponieważ składałby się z glicerolu zestryfikowanego 3 resztami kwasu stearynowego. Na rycinach 16-7 i 16-8 przedstawiono przykłady acylogliceroli mieszanych.

* Monoglicerydy, diglicerydy i triglicerydy zgodnie z obecną standardową terminologią Międzynarodowej Unii Chemii Czystej i Stosowanej (IUPAC) oraz Międzynarodowej Unii Biochemicznej (IUB) określa się odpowiednio jako "monoacyioglicerole, diacyloglicerole i triacyloglicerole.

O 'CH2 -O-C-C,7H» C„H l t -C-O-'ĆH 0 >CHa -0-C — C„H3S Ryc. 16-7. 1,3-Distearynopalmityna.

C„H„-C-O-iCH O a CH,-O-C-C„H 1 , Ryc. 16-8. 1,2-Distearynopalmityna.

Atomy węgla 1 i 3 w cząsteczce glicerolu nie są identyczne Aby jednoznacznie ponumerować atomy węgla glicerolu, stosuje się system -sn- (stereochemiczne numerowanie), np. 1,2-distearoilo--3palmitoilo-OT-glicerol (przedstawiony,wzorem projekcyjnym również na ryc. 16-9). Nale-

i II HjC-O-C-R,

O Rs-COI

i

i

i

i

H'Ć-0-C-R-,

Ryc. 16-9. Triacylo-s/ł-glicerol.

ży podkreślić, że węgle 1 i 3 cząsteczki glicerolu nie są identyczne, jeżeli ogląda się trójwymiarowy model cząsteczki. Enzymy bez trudu rozpoznają je i są prawie zawsze swoiste względem jednego lub drugiego węgla, np. glicerol jest zawsze fosforylowany przez glicerokinazę na sn-i dając glicerolo-3-fosforan, a nigdy glicerolo-l-fosforan. W tkankach znaleziono również częściowe acyloglicerole, tzn. mono- lub diacyloglicerole, w których glicerol jest zestryfikowany 1 lub 2 kwasami tłuszczowymi. Mają one szczególne znaczenie w syntezie i hydrolizie triacylogliceroli.

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 179

FOSFOLIPIDY SĄ GŁÓWNYM SKŁADNIKIEM LłPIDOWYM BŁON Do grupy fósfolipidów zalicza się: 1) kwas fosfatydowy i fosfatydyloglicerol, 2) fosfatydylocholinę, 3) fosfatydyloetanoloaminę, 4) fosfatydyloinozytol, 5) fosfatydyloserynę, 6) lizofosf o lipidy, 7) plazmalogeny i 8) sfingomieliny. Wszystkie te związki są fosf o glicerydami, oprócz sfingomidin, których cząsteczki nie zawierają glicerolu. Mogą one być traktowane jako pochodne kwasu fosfatydowego (ryc. 16-10), w którym fosforan jest zestryfikowany z grupą -OH odpowiedniego alkoholu.

Fosfatydylocholiny (lecytyny) występują w błonach komórkowych Fosfatydylocholiny są to fosf o glicerydy zawierające cholinę (ryc. 16-12). Są one przeważającymi ilościowo lipidami błon komórkowych O 1

O

"

CH;.-O-C-R, 3

CH2-O-P-OTCH£-CH2~N~CH3 x

*^ ^ ^ H

c \-\ ■

Cholina Ryc. 16-12. 3-Fosfatydylocholina.

o II O CHi-O-C-R, II 1 R 2 -C-O-CH I li CH2-O-P~O I Ryc. 16-10. Kwas fosfatydowy

Kwas fosfatydowy jest kluczowym związkiem pośrednim w syntezie triacylogliceroli oraz fosf o glicerydów, ale w tkankach występuje w niewielkich ilościach. Kardiolipina jest istotnym lipidem błon mitochondrialnych Kwas fosfatydowy jest prekursorem fosfatydyloglicerolu, który z kolei w mitochondriach ulega przekształceniu w kardiolipinę (ryc. 16-11).

i stanowią dużą część zasobów choliny w organizmie, Cholina odgrywa ważną rolę w przewodnictwie nerwowym oraz jako zapas labilnych grup metylowych. Dipalmitoilolecytyna jest bardzo aktywnym związkiem powierzchniowo czynnym (surfaktant), zmniejszającym napięcie powierzchniowe pomiędzy fazą tkanki płucnej i fazą gazów oddechowych i zapobiegającym sklejaniu się wewnętrznych powierzchni płuc. Brak surfaktantu w płucach wcześniaków jest przyczyną zespołu błon szklistych, którego zasadniczym objawem jest zespól niewydolności oddechowej. Większość fosfolipidów ma nasycony rodnik acylowy w położeniu Cls a rodnik nienasycony w położeniu C2 glicerolu. Fosfatydyloetanoloamina (kefaiina) Kefaliny różnią sic od fosfatydylocholiny tylko tym, że zamiast choliny zawierają etanoloaminę (ryc. 16-13).

■■ ■ii CH2— O-P—O—CH2

i ■ f

I<

4Ś

H-C-OH

u

i

O O H-C-O-C-Ra

Fosfatydyloglicerol

Bisfosfatydyloglicerol (kardiolipina) Ryc. 16-11. Kardiolipina (bisfosfatydyloglicerol}.

O

u

180 / ROZDZIAŁ 16

Etanoloamina Ryc. 16-13. 3-Fosfatydytoetanoloamina

Lizofosfolipidy są związkami pośrednimi w metabolizmie fosfoglicerydów Są to fosfoacyloglicerole zawierające w swojej cząsteczce tylko jedną resztę acylową, np. lizolecytyna, uczestnicząca w metabolizmie i przekształcaniu fosfolipidów (ryc. 16-16).

Fosfatydyloinozytol jest prekursorem wtórnych przekaźników Występuje tu stereoizomer ino2ytolu, mioi-

0 II CH 2-O-C-R

nozytol (ryc. 16-14). Fosfatydyloinozytoto-4,5-bis-

CH 2-O-P-S-CH3-CHi-N-ĆH | ^

fosforan jest ważnym składnikiem fosfolipidów błon komórkowych. Po pobudzeniu komórki przez właściwy hormon jest hydrolizowany do diacyloglicerolu i inozytolo-tris-fosforanu. z których każdy działa jako wewnątrzkomórkowy sygnał, czyli drugi posłaniec (p. str. 594).

1 O CH,—O—C—Rt ii I 2 R2- C - O - C H

Ryc. 16-14.3-Fosfatydyloinozytol.

Fosfatydyloseryna W większości tkanek występuje fosfatydyloseryna, która zamiast etanoloaminy ma serynę (ryc. 16-15). Wyizolowano również fosfolipidy zawierające treoninę. OO

( Seryna Ryc. 16-15.3-Fosfatydyloseryna^______

o !t

{

CH2-O-P-i

V._____________

O'

Kwas plazmenowy

Etanoloamina

Ryc. 16-17. Plazmalogen (plazmenyloelanoloamina).

'CHi-O-C-R,

R J - C - O - CH 1

Plazmalogeny występują w mózgu i mięśniach Związki te stanowią co najmniej 10% fosfolipidów mózgu i mięśni. Strukturalnie plazmalogeny przypominają fosfatydyloetanolpaminc. ale przy C, zamiast wiązania estrowego, występującego w większości acylogliceroli, mają wiązanie eterowe. Zazwyczaj rodnikiem alkilowym jest nienasycony alkohol (ryc. 16-17). W niektórych przypadkach etanoloamina może być zastąpiona choliną, seryną lub inozytolem.

3

,1 !t . - i.Ł : - I ■III C H 2-O-P- O-C H2-C H-C OO" : O

Cholina Ryc. 16-16.Lizolecytyna.

Rj-C-O-CH

CH 2-O-C-R,

a

Sfingomieliny również występują w układzie nerwowym Sfingomieliny wykryto w dużych ilościach w mózgu i tkance nerwowej. W wyniku hydrolizy sfingomielin otrzymuje się kwas tłuszczowy, kwas fosforowy, cholinę i złożony amirioalkohol — sfingozynę (ryc. 16-18), W lipidach tych nie występuje glicerol. Amidowe połączenie sfingo-

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 181 Ceramid Sfingozyna

?H

H

CH 3 - (CH s ),s-CH=CH-CH-CH-NĆH; Kwas tłuszczowy

Ó Kwas fosforowy

Ryc. 16-18. Sfingomielina. Cholina

zyny z kwasem tłuszczowym nazywa się ceramidem; struktura tego typu występuje również w glikolipidach (p, poniżej). GLIKOLIPIDY (GLIKOSFINGOLIPIDY) SĄ ISTOTNYM SKŁADNIKIEM TKANKI NERWOWEJ I BŁON KOMÓRKOWYCH Glikolipidy są szeroko rozpowszechnione w każdej tkance organizmu, zwłaszcza w tkance nerwjowej takiej jak mózg. Znajdują się głównie w zewnętrznej warstwie błony plazmatycznej, z której wystają ich. łańcuchy oligosacharydowe, tworząc sacharydy powierzchni komórki. Głównymi glikolipidami zwierzęcymi są glikosfingolipidy. Zawierają one ceramid i jedną lub więcej cząsteczek cukru. Dwoma najprostszymi glikolipidami są gaiaktozyloceramid i glukozyloceramid. Galaktozyloceramid jest głów-

nym gJikosfingolipidem mózgu i innych tkanek nerwowych, ale we względnie małych ilościach występuje on wszędzie. Zawiera sporo charakterystycznych Ci4 kwasów tłuszczowych. Galaktozyłoceramid (ryc. 16-19) może zostać przekształcony w sulfogalaktozyloceramid (klasyczny sulfoglikozylosfingolipid; dawniej sulfatyd), który występuje obficie w mielinie. Glukozyloceramid jest przeważającym prostym glikosflngolipidem tkanek pozanerwowych, aJe w małych ilościach znajduje się również w mózgu. Bardziej złożonymi glikosfmgolipidami są gangliozydy, pochodne glukozyloceramidu. Gangliozyd jest glikosfingolipidem zawierającym dodatkowo jedną lub więcej reszt kwasu sjalowego. Kwas N-acetyloneuraminowy (NeuAc; p. rozdz. 15) jest zasadniczym kwasem sjalowym występującym w tkankach ludzkich. Gangliozydy występują w dużych stężeniach również w tkance nerwowej. Wydaje się, że pełnią one funkcje receptorowe i inne. Najprostszym gang-

Sfingazyna

____A

O O H II H CH-CH—N—C3—(CH2)12-CH= CHI CH(OH) -

H

OH

Kwas tłuszczowy, np. kwas cerebronowy

O-CH,

GalaWoza

Ryc. 16-19. Struktura gaiaktozyloceramidu (galaktocerebrozyd, R = H) i sulfogalaktozyloceramidu (dawniej sulfatyd, R = SO|~).

182 / ROZDZiAŁ 16

liozydem występującym w tkankach jest GM3-Zawiera on ceramid, 1 cząsteczkę glukozy, 1 cząsteczkę galaktozy i 1 cząsteczkę NeuAc. W użytym tu skrótowym zapisie gangliozydu: G oznacza gangliozyd, M = monosjalo, a cyfra arabska wskazuje kolejność lokowania się na chromatogramach cienkowarstwowych. Na rycinie 16-20 przedstawiono strukturę GM], bar- Rvc. 16-21. Szkielet (rdzeń) steroidowy. dziej złożonego gangliozydu będącego pochodną GM3. G M| jest związkiem dosyć interesująCaramid-Glukoza-Galaklcwa -N-Acetylo- GalaMoza (Acy
Cer-GIc-Gal-GalNAc-Gal

I

NeuAc Ryc. 16-20. Gangliozyd GM1, monosjaloganglio/yd.

cym biologicznie, jako że jest on znanym receptorem dla toksyny cholery w jelicie cienkim. Inne gangliozydy mogą zawierać w swojej cząsteczce od jednej do 5 reszt sjalowych, tworzących odpowiednio di-, trisjalogangliozydy itd. STEROIDY PEŁNIĄ WIELE WAŻNYCH FUNKCJI FIZJOLOGICZNYCH Cholesterol jest prawdopodobnie najbardziej znanym steroidem ze względu na jego udział w rozwoju miaidiycy. Odgrywa on bardzo ważną rolę biochemiczną, ponieważ jest prekursorem wielu równie ważnych steroidów, takich jak kwasy żółciowe, hormony kory nadnerczy, hormony płciowe, witaminy D, glikozydy nasercowe, sitosterole w świecie roślin i niektóre alkaloidy. Wszystkie steroidy mają podobny rdzeń cykliczny, przypominający fenantren (pierścienie A, B i C), do którego jest dołączony pierścień cyklopentanu (D). Atomy węgla w rdzeniu steroidowym są numerowane tak, jak pokazano na ryc. 16-21. Przy rozpatrywaniu wzorów strukturalnych steroidów należy zwrócić uwagę, że prosty pierścień heksagonalny oznacza całkowicie nasycony pierścień 6-węglowy ze wszystkimi wartościowościami wy sycony mi wodorem, chyba

że zaznaczono inaczej; tzn. nie jest to pierścień benzenowy. We wzorze zaznacza się wszystkie wiązania podwójne. Boczne grupy metylowe przedstawia się w postaci wiązań pojedynczych nie połączonych na dalszym końcu (metyl). Występują one typowo w pozycji 10 i 13 (tworząc 18 i 19 atom węgla), W pozycji 17 występuje zwykle łańcuch boczny (jak w cząsteczce cholesterolu). Jeżeli związek zawiera 1 lub więcej grup hydroksylowych, a żadnej grupy karbonylowej lub karboksylowej, jest sterolem i jego nazwa ma końcówkę — ol. Ze względu na asymetrię cząsteczki steroidu możliwe jest istnienie wielu stereoizomerów Każdy z pierścieni sześciowęglowych rdzenia steroidowego może istnieć w trójwymiarowej konformacji krzesełkowej lub lódeczkowej (ryc. 16-22).

Konformacja, Krzesełkowa"

Konformaoja . (Maczkowa" Ryc. 16-22. Konformacje stereo izomerów.

W steroidach naturalnych wszystkie pierścienie występują właściwie w formie krzesełkowej, która jest bardziej stabilną konformacją. Poszczególne pierścienie mogą znajdować się względem siebie w konformacji cis lub trans (ryc. 16-23).

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 183

Byc. 16-23. Siereochemta steroidów: (A) konfiguracja trans między wszystkimi sąsiadującymi pierścieniami; (B) konfiguracja cis między pierścieniami A i B.

W naturalnych steroidach sposób połączenia pierścieni A i B może być cis lub trans, natomiast między B i C jest trans, a połączenie CjD jest trans, z wyjątkiem glikozydów nasercowych i jadów wydzielanych przez ropuchy. Wiązania utrzymujące podstawniki nad płaszczyzną pierścieni przedstawia się linią ciągłą (p1), natomiast wiązania łączące grupy znajdujące się pod płaszczyzną pierścieni linią przerywaną (a). W steroidzie "5a, pierścień A przyjmuje zawsze konformację trans względem pierścienia B, natomiast w steroidzie 5P — zawsze cis. Grupy metylowe, przyłączone do atomów węgla Ci0 i Cu, są niezmiennie w konfiguracji p. Cholesterol jest istotnym składnikiem wielu tkanek Cholesterol jest szeroko rozpowszechniony we wszystkich komórkach organizmu, a zwłaszcza w tkance nerwowej. Jest jednym z ważniejszych składników błon plazmatycznych i lipoprotein surowicy krwi. Występuje zwykle w połączeniu z kwasami tłuszczowymi jako ester cholesterolu. Jest w tłuszczach zwierzęcych, lecz nie ma go w tłuszczach roślinnych. 3-Hydroksy-5,6-cholesten (ryc. 16-24) to nazwa systematyczna cholesterolu. Ergosterol jest prekursorem witaminy D Ergosterol występuje w roślinach i drożdżach i jest ważnym prekursorem witaminy D (ryc. 16-25). Naświetlanie promieniami nadfioletowymi powoduje otwarcie pierścienia B (p. ryc. 54-6) w wyniku czego związek nabywa właściwości przeciwkrzywiczych.

Ryc. 16-24. Cholesterol.

HO Ryc. 16-25. Ergosterol

Koprosterol znajduje się w kale Koprosterol (koprostanol) powstaje w jelicie w wyniku bakteryjnej redukcji podwójnego wiązania Cs—C6 cholesterolu i jest wydalany w kale. Prekursorem poliprenoidów i cholesterolu jest ten sam związek Poliprenoidy, chociaż nie są steroidami, są im pokrewne (p. ryc. 28-3), ponieważ są syntetyzowane, podobnie jak cholesterol (ryc. 16-26),

184 / ROZDZIAŁ 16

PEROKSYDACJA LIPIDÓW JEST ŹRÓDŁEM WOLNYCH RODNIKÓW IN VIVO

CH3 I -CH=CCH=CHRyc. 16-26. Jednostka izoprenowa.

z 5-wcglowej jednostki izoprenowej. Należy do nich ubichinon (p.str. 149), składnik mitochondrialnego łańcucha oddechowego, oraz długołańcuchowy alkohol dolichol (ryc. 16-27), który

,OH

Ryc. 16-27. Dolichol — alkohol C95,

uczestniczy w syntezie glikoprotein, przenosząc reszty oligosacharydowe na reszty asparaginy łańcucha poiipeptyd owego (p. rozdz. 57). Grupa roślinnych izoprenoidów obejmuje kauczuk, kamforę, rozpuszczalne w tłuszczach witaminy A, D, E i K oraz P-karoten (prowitaminę A).

H

Peroksydacja (autooksydacja) lipidów narażonych na działanie tlenu jest przyczyną nie tylko psucia się żywności (jełczenie), lecz także uszkodzenia tkanek in vivo, które z kolei może być przyczyną odczynów zapalnych, nowotworów, miażdżycy, starzenia się itp. Szkodliwe działania są inicjowane przez wolne rodniki (ROO*, RO*, OH*) powstające podczas tworzenia nadtlenków kwasów tłuszczowych, zawierających wiązania podwójne oddzielone grupą metylenową, a więc takie jak te, które znajdują się w naturalnych wielo nienasyconych kwasach tłuszczowych (ryc. 16-28). Peroksydacja lipidów jest procesem lawinowym, zapewniającym ciągłą dostawę wolnych rodników, które inicjują następne reakcje peroksydacji. Pełny proces może być zapisany następująco: 1. Inicjacja peroksydacji lipidów. Wytwarzanie R' z prekursora. ROOH + metal<«>+

X'+ RH-R* +XH Rozprzestrzenianie peroksydacji lipidów:

ROO'+ RH-ROOH+ R\ ttd.

H

+RH

H

Aldehyd malonowy

Endonad tlenek

WodoronadUenek ROOH

Ryc. 16-28. Peroksydacja tipidów. Reakcje inicjuje światło lub jony metali. Aldehyd matonowy powstaje tylko z kwasów tłuszczowych mających 3 lub więcej wiązań podwójnych. Miarą peroksydacji lipidów jest ilość powstającego aldehydu malonowego oraz etanu lub pentanu powstających odpowiednio z 2 końcowych węgli kwasów u3-tłuszcz owych lub z końcowych 5-węgli kwasów a>6-tłuszczowych.

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 185 3. Zakończenie: ROCT+ ROO°->ROOR+ O, ROCT+ R' .ROOR R*+ R'^RR

Ponieważ molekularnym prekursorem dla inicjacji procesu jest zazwyczaj wodoronadtlenek ROOH, peroksydacja lipidów jest rozgałęzionym procesem łańcuchowym z potencjalnymi skutkami niszczycielskimi. W celu kontroli i ograniczenia peroksydacji lipidów zarówno ludzie, jak i natura używają związków przeciwutleniających. Propyiogalusan, butylowany hydroksyanizol (BHA) i butylowany hydroksytoluen (BHT) są przeciwutleniaczami używanymi jako dodatki (środki konserwujące) do żywności. Naturalnie występującymi przeciwutleniaczami są witamina E (tokoferol), która jest rozpuszczalna w lipidach, oraz moczan i witamina C, które są rozpuszczalne w wodzie. pKaroten wykazuje właściwości przeciwutleniacza przy małym pOz. Przeciwutleniacze dzielą się na 2 klasy: 1) przeciwutleniacze zapobiegające, które zmniejszają szybkość inicjacji peroksydacji i 2) przeciwutleniacze przerywające proces lawinowy, które utrudniają rozprzestrzenianie peroksydacji. Przeciwutleniacze zapobiegające obejmują katalazę i inne peroksydazy, które reagują z ROOH, oraz związki chelatujące jony metali, takie jak DTPA (dietylenotriaminopentaoctan) i EDTA (etylenodiaminotetraoctan). Przeciwutleniacze przerywające rozprzestrzenianie peroksydacji są często fenolami lub aminami aromatycznymi. In vivo głównymi przeciwutleniaczami przerywającymi rozprzestrzenianie są: dysmutaza ponadtlenkowa (p, str. 146), która działa w fazie wodnej, wychwytując wolne rodniki ponadtknkowe (Oi*), być może moczan oraz witamina E, która działa w fazie tipidowej, wychwytując rodniki ROO*. Peroksydacja jest katalizowana in vivo również przez związki hemowe i przez lipooksygenazy znajdujące się w płytkach krwi i leukocytach, itp.

DO ROZDZIAŁU I IDENTYFIKACJI LIPIDÓW W MATERIALE BIOLOGICZNYM UŻYWA SIĘ METOD CHROMATOGRAFICZNYCH ■ — —

Obecnie metody chromatograficzne coraz częściej wypierają z użycia starsze metody roz-

dzieiania i identyfikacji lipidów oparte na klasycznych procedurach chemicznych, takich jak krystalizacja, destylacja i ekstrakcja rozpuszczalnikiem. Szczególnie użyteczna do rozdziału różnych klas lipidów jest chromatografia cienkowarstwowa (TLC), a do rozdziału poszczególnych kwasów tłuszczowych — chromatografia gazowo-cieczowa (GLC; ryc. 16-29). Przed użyciem tych technik lipidy ekstrahuje się z tkanek nieodwodnionych układem rozpuszczalników, opartym zwykle na mieszaninie chloroformu z metanolem (2:1). Detektor

Gaz

PróbKa

Rajestrator kreślący Ryc. 16-29. Schemat chromatografu gazowo-cieczowego. Po prawej stronie ryciny przedstawiono chromatogram rozdziału cHugołańcuchowych kwasów tłuszczowych (jako estrów metylowych).

Chromatografia gazowo-cieczowa polega na fizycznym rozdziale ruchomej fazy gazowej przez adsorpcję na fazie stacjonarnej, zawierającej obojętne ciało stałe, takie jak żel krzemionkowy lub obojętne ziarna glinki ogniotrwałej pokrytej nielotną cieczą (np. smarem lub olejem silikonowym). W praktyce szklaną lub metalową kolumnę napełnia się nieczynnym ciałem stałym, a mieszaninę metylowych estrów kwasów tłuszczowych odparowuje się na jednym końcu kolumny, która na całej swej długości nia temp. 170—225°C(ryc. 16-29). Stale przepływający strumień gazu obojętnego, np, argon lub hel, powoduje przesuwanie się lotnych estrów wewnątrz kolumny. Podobnie jak w przypadku innych rodzajów chromatografu, rozdział parujących estrów kwasów tłuszczowych zależy od różnic powinowactwa składników mieszaniny

186 / ROZDZIAŁ 16

gazowej do fazy stacjonarnej. Ga2y silniej przyciągane przez fazę stacjonarną wolniej przesuwają się w kolumnie i dlatego znajdą się na końcu kolumny później od gazów przyciąganych stosunkowo słabiej. Poszczególne estry kwasów tłuszczowych, wydostające się z kolumny, wykrywa się metodami fizycznymi lub chemicznymi i zapisuje automatycznie w postaci pików ukazujących się w różnym czasie w zależności od siły, z jaką poszczególne estry kwasów tłuszczowych są zatrzymywane przez fazę stacjonarną (ryc. 16-29). Powierzchnia pod każdym pikiem jest proporcjonalna do stężenia poszczególnego składnika mieszaniny. Identyfikację każdego składnika przeprowadza się przez porównanie z wzorcowym chiomatogramem standardowej mieszaniny o znanym składzie. Na drodze strumienia gazu można umieścić, oprócz detektora masy, również detektor mierzący radioaktywność. W ten sposób można zmierzyć swoistą radioaktywność każdego wydzielonego składnika. Zaletą chromatografii gazówo-cieczowej jest jej niezwykła czułość, która pozwala używać bardzo małych ilości mieszaniny do rozdziału, a także to, że kolumny chromatograficzne mogą być używane wielokrotnie. Za pomocą tej techniki wykazano w tłuszczach naturalnych obecność wielu dotychczas niewykrytych różnych kwasów tłuszczowych. Chromatografię cienko warstwową (TLC)

przeprowadza się na płytkach szklanych pokrytych cienką warstwą adsorbentu, zwykle żelu krzemionkowego. Po osuszeniu adsorbentu, płytki ogrzewa się w cieplarce w standardowej temperaturze przez standardowy czas. Po oziębieniu na „aktywowaną" płytkę nakrapia się mieszaninę lipidów rozpuszczonych we właściwym rozpuszczalniku. Po odparowaniu rozpuszczalnika brzeg płytki, najbliższy miejsca naniesienia próbki, zanurza się w odpowiedniej mieszaninie rozpuszczalników i pozostawia w zamkniętym naczyniu do czasu, aż czoło rozpuszczalnika znajdzie się blisko górnego brzegu płytki. Płytkę osusza się i miejsce rozdzielonych substancji ustala się przez „zwęglenie" (spryskując powierzchnię płytki kwasem siarkowym, a następnie ogrzewając) lub przez fiuorescencję (z dichlorofluoresceiną), albo po reakcji z parami jodu (ryc. 16-30).

Estry cholesterolu

Trlacylogllcerole

Czoło rozpuszczalnika

m

Kwasy HUSZCZOWB (wolne) Cholesterol 1,3DlacyloQllcwole 1,2DlacyloBH08role

i i

Monoacytogjlcerole Fosfo lipidy Miejsce naniesienia

Ryc. 16-30. Rozdział głównych klas lipidów przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej. Właściwym układem rozpuszczalników dla powyższego rozdziału była mieszanina heksan : eter etylowy : kwas mrówkowy w stosunku objętościowym 80:20:2.

AMFIPATYCZNE LIPIDY SAMOORIENTUJĄ SIĘ NA GRANICY OLEJ : WODA Tworzą one błony, micele, liposomy i emulsje Lipidy są na ogół nierozpuszczalne w wodzie, gdyż przeważają w ich cząsteczkach grupy niepolarne (węglowodory). Jednakże kwasy tłuszczowe, fosfolipidy, sfingolipidy, kwasy żółciowe i, w mniejszym stopniu, cholesterol zawierają grupy polarne. Dlatego część cząsteczki jest hydrofobowa, czyli nierozpuszczalna w wodzie, a inna część jest hydrnfilowa, czyli rozpuszczalna w wodzie. Tego rodzaju cząsteczki określa się jako amtlpatyczne (ryc. 16-31). Ustawiają się one na granicy faz woda: olej w ten sposób, że ich grupy polarne znajdują się w fazie wodnej, a niepolarne w fazie olejowej. Uważa się, że

podstawową strukturą błon biologicznych jest podwójna warstwa takich polarnych lipidów (p. rozdz. 42). Lipidy polarne znajdujące się w środowisku wodnym w stężeniu krytycznym tworzą micele. Przyłączanie się soli kwasów żółciowych do miceli i liposomń w i tworzenie miceli mieszanych z produktami trawienia tłuszczu

LIPIDY O ZNACZENiU FIZJOLOGICZNYM / 187 LIPID AMFIPATYCZNY A

Grupy polarne, czyli hydrofitowa

Grupy nie polarna, czyli hydrofobowe

Faza wodna

Faza wodna

OOOOOO

Faza wodna

.Olej*, czyli laza nlepoarna

uouuoo Faza wodna PODWÓJNA WAHSTWA LIPIDOWA

EMULSJA OLEJU W WOOZIE D

LiPOSOM

Faza nie po I ar na

Fala wodna

L1POSOM (JEDNOWARSTWOWY) E

Przedzi ał wodny

Podwójna warstwa llpldowa (WIELOWARSTWOWY)

R yc . 16-31. Powstaw anie błon lip idow ych, mice li, em u ls ji i liposom ów z lipidów am ftpatycznych, n p. fosfolipidów. _____________________________________

ułatwia wchłanianie lipidów z jelita. Liposomy można otrzymać działając ultradźwiękami na amfipatyczne lipidy w środowisku wodnym. Liposomy są utworzone z podwójnej warstwy lipidowej, otaczającej część środowiska wodnego. Potencjalnie, zwłaszcza gdy połączy się je ze swoistymi tkankowo przeciwciałami, mogą być one użyteczne klinicznie jako przenośniki leków w krwiobiegu, trafiając do odpowiednich narządów. Emulsje są cząstkami dużo większymi, powstającymi zwykle z lipidów niepolarnych znajdujących się w środowisku wodnym. Są one stabilizowane przez środki emulgujące, takie jak lipidy polarne (np. lecytyna), które tworzą warstwę powierzchniową oddzielającą główną masę fazy niepolarnej od fazy wodnej (ryc. 16-31).

PIŚMIENNICTWO Christie WW: LipidAnalysis. 2nd ed. Pergamon Press, 1982. Cotgreave 1A et al: Host biochemical defence mechanisms against prooxidants. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1988;28:189. Frankel EN: Chemistry of free radical and singlet oxidation of lipids. Próg Lipid Res 1985;23:197. Gunscone FD, Harwood JL, Padley FB: The Lipid Handbook. Chapraan & Hali, 1986. Gurr AI, James AT: Lipid Biochemistry: An Introduclion. 3rd ed. Wiiey, 1980. Hawthorne JN, Ansell GB (editors): Phospholipids, Elsevier, 1982. Johnson AR, Davenport JB: Biochemistry and Methodołogy of Lipids. Wiley, 1971. Vance DE, Vance JE {editors}: Biochemistry of Lipids and Membranes. Benjamin/Cummings, 1985.

1 7

Zarys przemian pośrednich Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Losy składników diety po strawieniu i absorpcji składają się na przemiany pośrednie. Stanowią więc one szeroką dziedzinę, która usiłuje nie tylko opisać szlaki metaboliczne indywidualnych cząsteczek, lecz także próbuje zrozumieć współzależności między nimi oraz mechanizmy, które regulują przepływ metabolitów przez te szlaki. Szlaki metaboliczne dzieli się na 3 kategorie (ryc. 17-1): 1. Szlaki anaboliczne prowadzące syntezy związków tworzących strukturę ciała i warsztat metaboliczny. Takim szlakiem

jest synteza białek. Energia swobodna, napędzająca te procesy, pochodzi z drugiej kategorii szlaków. 2. Szlaki kataboliczne dotyczą procesów oksydacyjnych, które uwalniają energię swobodną zwykle w postaci fosforanu bogatoenergetycznego lub równoważników redukujących, np. łańcuch oddechowy i fosforylacja oksydacyjna. 3. Szlaki amfiboliczne mają więcej niż jedną funkcję i biegną na „skrzyżowaniu dróg" metabolicznych, działając jako łączniki między ciągami anabolicznymi i katabo licznym, np. cykl kwasu cytrynowego.

Białka,

Cząsteczki pokarmu

węglowodany, lipidy, kwasy nukleinowe Itp.

Trawienie

Cząsteczki prostsze

Wchłanianie

Szlaki amfl bo Heine

Ryc. 17-1.3 główne kategorie szlaków meta bo licznych. Szlaki kataboliczne uwalniają energię swobodną w formie równoważników redukujących (2H) lub fosforanu bogBioenergetycznego (~ P). ta warunkuje przebieg szlaków a na bo licznych. Szlaki amfiboliczne jako łączniki między szlakami 2 pozostałych kategorii.

Inne procesy endoerglczne

Energia działają

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 189

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Znajomość metabolizmu zdrowego zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do pełnego zrozumienia wielu stanów chorobowych. Prawidłowa przemiana obejmuje zmiany metabolizmu i jego adaptację w okresach głodzenia, wysiłku, ciąży i laktacji. Zaburzenia metabolizmu mogą być wynikiem np. niedoborów żywieniowych, braku enzymu lub nieprawidłowego wydzielania hormonu. Ważnym przykładem choroby,

wynikającej z nieprawidłowego metabolizmu (choroby metaboliczne), jest cukrzyca.

PODSTAWOWE SZLAKI METABOLICZNE PRZETWARZAJĄ GŁÓWNE PRODUKTY TRAWIENIA Podstawowy typ metabolizmu w tkankach jest warunkowany rodzajem diety. Ssaki, takie jak człowiek, muszą przetwarzać wchłaniane w przewodzie pokarmowym produkty trawie-

Pokarmy

Glikogen 3CO,

Glukoza

Gl u kozotosforany

Trlozofosforany

s

Cykl pentnzof osf oran owy

(3

--------- ^ -------»Rybozofosforan

Plrogronian.

' Acyt oglte erol Mlec zan Kwasy tłuszczowe Cholesterol

Ryc. 17-2. Ogólny schemat metabolizmu węglowodanów i jego główne produkty końcowe.

190 / ROZDZIAŁ 17 Steroidy

Trlacyloglicerol (tłuszcz)

Cholesterol Cti oieslerologeneza Ketogeneza Pokarmy

Związki ketonowe Ryc. 17-3. Ogólny schemat metabolizmu kwasów tłuszczowych i jego główne produkty końcowe. Związki ketonowe to acetooctan, 3-hydroksymaślan aceton

Białka pokarmów

Białka tkankowe

I

Aminokwasy

Nisbialkowe pochodne azotowe 2CO,

TFWNSAMINACJA

Ryc. 17-4. Ogólny schemat przemiany aminokwasów i jej

główne produkty końcowe.

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 191

nia pokarmów — węglowodanów, lipidów i białek. Głównie są to (odpowiednio): glukoza, kwasy tłuszczowe z glicerolem oraz aminokwasy. U przeżuwaczy (i w mniejszym stopniu u innych trawożernych) błonnik diety ulega trawieniu przez symbiotyczne mikroorganizmy do niższych kwasów tłuszczowych (octowego, propionowego, masłowego), a tkanki tych zwierząt są przygotowane metabolicznie do zużycia niższych kwasów tłuszczowych jako zasadniczych substratów. Wszystkie produkty trawienia są przetwarzane we właściwych szlakach metabolicznych do wspólnego produktu — acetylo-CoA, który ulega następnie całkowitemu utlenieniu w cyklu kwasu cytrynowego (p. ryc. 14-1 oraz 17-2, 17-3 i 17-4). Metabolizm węglowodanów dotyczy głównie glukozy (p. ryc. 17-2) Glukoza jest metabolizowana we wszystkich komórkach ssaków w procesie glikolizy do pirogronianu i mleczanu. Aby wejść do tego szlaku glukoza musi ulec fosforylacji. Glikoliza może przebiegać w nieobecności tlenu (anaerobowo), ale końcowym produktem jest wtedy tylko mleczan. Tkanki, które mogą zużywać tlen (aerobowe), są zdolne do metabolizowania pirogronianu do acetylo-CoA, który z kolei może 'wejść do cyklu kwasu cytrynowego, ulegając całkowitemu utlenieniu do CO3 i H2 O z uwolnieniem znacznej ilości energii swobodnej, wykorzystanej do syntezy ATP w procesie zwanym fosforylacją oksydacyjną (p. ryc. 18-2). Glukoza jest więc główną cząsteczką energetyczną wielu tkanek. Uczestniczy ona (i pewne jej metabolity) również w innych procesach, a mianowicie: i. W przemianie do jej zapasowego polimeru — glikogenu, zwłaszcza w mięśniach szkieletowych i w wątrobie. 2. W cyklu pentozofosforano wy III, który bierze początek od metabolitu pośredniego glikolizy. Cykl jest dostawcą równoważników redukujących (2H) do biosyntezy np. kwasów tłuszczowych — oraz jest źródłem rybozy koniecznej w procesach syntez nukleotydów i kwasów nukleinowych. 3. Fosfotriozy uczestniczą w tworzeniu glicerolowej części acylogliceroli (tłuszczu). 4. Pirogronian i metabolity pośrednie cyklu kwasu cytrynowego dostarczają szkieletów węglowych do syntezy aminokwasów, a acetylo-CoA jest jednostką budującą długołaricuchowe kwasy tłuszczowe i cholesterol będący z kolei prekursorem wszystkich steroidów syntetyzowanych w organizmie.

Metabolizm lipidów dotyczy głównie kwasów tłuszczowych i cholesterolu (p,ryc.17-3) Źródłem dlugołańcuchowych kwasów tłuszczowych jest albo synteza de novo z acetylo-CoA pochodzącego z przemiany węglowodanów, albo lipidy z pokarmów. W tkankach kwasy tłuszczowe mogą zostać utlenione do acetylo-CoA (fi-oksydacja) lub ulec estryfikacji do acylogliceroli, które w postaci triacylogliceroli (tłuszcz) stanowią główną rezerwę energetyczną organizmu, Acetylo-CoA, wytwarzany w procesie jł-oksydacji, ma kilka ważnych przeznaczeń: 1. Tak jak w przypadku acetylo-CoA po chodzącego z przemiany węglowodanów, ulega całkowitemu utlenieniu do CO 2 i H2 O w cyklu

kwasu cytrynowego. Kwasy tłuszczowe są bar dzo wydajnym tkankowym źródłem energetycz nym, dostarczając znacznych ilości energii zaró wno w procesie p-oksydacji, jak i w cyklu kwasu cytrynowego. 2. Są one źródłem atomów węgla dla chole sterolu i innych steroidów. 3. W wątrobie jest z nich wytwarzany acetooctan, macierzysty związek ketonowy*. Zwią zki ketonowe rozpuszczalne w wodzie są alter natywnym paliwem tkankowym, które w pew nych warunkach (np. w głodzeniu) staje się ważnym źródłem energii. Metabolizm większości aminokwasów wymaga transaminacji (p. ryc. 17-4) Aminokwasy są konieczne do biosyntezy białka. Niektóre z nich muszą być obowiązkowo doprowadzone z pożywieniem (aminokwasy niezbędne lub egzogenne), ponieważ tkanki są niezdolne do ich syntezy. Pozostałe, czyli aminokwasy endogenne, są również dostarczane z pokarmem, ale mogą być także wytwarzane w organizmie z węglowych związków pośrednich w procesie transaminacji, wykorzystującym azot aminowy z występujących w nadmiarze innych aminokwasów. Po deaminacji aminokwasów nadmiar azotu aminowego jest usuwany jako

* Jako związki ketonowe należy rozumieć nie tylko związki zawierające grupę ketonową (acetooctan, aceton), lecz także P-hydroksymaślan. W tyrn sensie określenie „związki ketonowe" pokrywa się z treścią określenia angielskiego „ketonc bodies" — ciała ketonowe (przyp, wyd.).

192 / ROZDZIAŁ 17

mocznik. Szkielety węglowe powstające w wyniku transaminacji są: 1) utleniane do COi w cyklu kwasu cytrynowego, 2) wykorzystane do syntezy glukozy (glukoneogeneza) lub 3) ulegają przemianie w związki ketonowe. Poza niezbędnym udziałem w syntezie białka, aminokwasy są również prekursorami wielu innych ważnych związków, np. puryn, pirymidyn i hormonów, takich jak adrenalina lub tyroksyna. Szlaki metaboliczne mogą być badane na różnych poziomach organizacji Dotąd patrzyliśmy na metabolizm zachodzący w całym organizmie. Umiejscowienie szlaków metabolicznych i ich integrację ustala się za pomocą badań na niższych poziomach organizacji, a mianowicie: 1. Na poziomie tkanki i narządu — określa się rodzaj substratów wchodzących i metabolitów opuszczających tkanki lub narządy i podaje ogólny opis ich przemian. 2. Na poziomie subkomórkowym — każda struktura subkomórkowa (np. mitochondrium) lub kompartment komórki (np. cytozol) pełni swoiste funkcje biochemiczne.

które tworzą część subkomórkowego zestawu szlaków metabolicznych. Krążenie krwi integruje metabolizm na poziomie tkanki i narządu Aminokwasy powstające w procesie trawienia białek pokarmowych oraz glukoza powstająca w wyniku trawienia węglowodanów są wchłaniane z jelita do krwi żyły wrotnej wątroby. To gwarantuje, że zarówno te metabolity jak i inne rozpuszczalne w wodzie produkty trawienia są początkowo kierowane do wątroby (ryc. 17-5). Podstawową funkcją metaboliczną wątroby jest regulowanie stężenia większości metabolitów we krwi, zwłaszcza glukozy i aminokwasów. W przypadku glukozy odbywa się to przez wychwytywanie nadmiaru glukozy i przekształcanie jej w glikogen (gUkogenogeneza) lub w tłuszcz (lipogencza). Pomiędzy posiłkami, w celu uzupełnienia stężenia glukozy we krwi, wątroba uwalniają ze zmagazynowanego glikogenu (glikogenoliza) lub, wraz z nerką, przekształca metabolity niecukrowe, takie jak mleczan, glicerol i aminokwasy, w glukozę (glukoneogeneza). Utrzymanie właściwego stężenia

anina itn. '#. ■ \'.''. ^

fosforan o^yk.-j ^SllkoW/// Sllkogen

5

S^

JELITO CIENKIE

Ryc. 17-S. Transport i los głównych substratów i metabolitów węglowodanowych i amtnofcwasowych. Uwaga: w mięśniu wolna glukoza występuje w niewielkich stężeniach, ponieważ po wniknięciu do komórki ulega natychmiast fosforylacji. _____ _____

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 193

glukozy we krwi jest konieczne ze względu na pewne tkanki (np. mózg lub erytrocyty), dla których jest ona obligatoryjnym źródłem energii. Do zadań wątroby należy również syntetyzowanie głównych białek osocza krwi (np. albuminy) oraz deaminatja aminokwasów będących w nadmiarze, i związane z tym tworzenie mocznika. Ten ostatni jest transportowany z krwią do nerek i wydalany. Mięśnie szkieletowe używają glukozy jako paliwa, wytwarzając z niej mleczan i CO2. Magazynują glikogen z przeznaczeniem na źródło energii do skurczu mięśnia oraz syntetyzują białka mięśniowe z aminokwasów osocza. Mięśnie stanowią ok. 50% masy ciała, przeto reprezentują znaczny zapas białek, który może być wykorzystany do zaopatrzenia osocza w aminokwasy, zwłaszcza przy niedoborach pokarmowych. Z lipidów (ryc. 17-6) po strawieniu powstają monoacyloglicerole i kwasy tłuszczowe. W komórkach jelitowych zachodzi resynteza lipidów, które po połączeniu z białkiem są wydzielane w formie lipoprotein, znanych jako ehylomikrony, początkowo do układu chłonnego, a na-

stępnie do krwiobiegu. Wszystkie rozpuszczalne w lipidach hydrofobowe produkty trawienia (np. cholesterol), wchodzą w skład lipoprotein, co ułatwia ich transportowanie miedzy tkankami w środowisku wodnym — osoczu. Triacyloglicerol chylomikronów, w odróżnieniu od glukozy i aminokwasów, nie jest wychwytywany przez wątrobę. Jest on metabolizowany przez tkanki pozawątrobowe przy udziale Kpazy lipoproteinowej, która hydrolizuje triacyloglicerol, uwalniając kwasy tłuszczowe, które są następnie wbudowywane do lipidów tkankowych lub utleniane jako źródło energii. Innym ważnym źródłem długołańcuchowych kwasów tłuszczowych jest synteza (lipogeneza) z węglowodanów, głównie w tkance tłuszczowej i w wątrobie. Triacyloglicerol tkanki tłuszczowej stanowi zasadniczą rezerwę energetyczną w organizmie. W następstwie jego hydrolizy (lipolizy) kwasy tłuszczowe są uwalniane do krwiobiegu jako woine kwasy tłuszczowe. Są one wychwytywane przez większość tkanek (ale nie przez mózg i erytrocyty) i estryfikowane do acylogliceroli lub utleniane, jako główne źródło energetyczne do CO2 i H^O. W wątrobie zachodzą 2 szlaki JELITO CIENKIE

Glukoza

Kwasy ^tłuszczowe

Ryc. 17-8. Transport i losy głównych substratów i metabolitów liptdowych: WKT — wolne kwasy tłuszczowe, LPL — lipaza lipoproteinowa, MG — monoacyloglicerol, TG — triacyloglicerol, VLDL — lipoproteiny o bardzo malej gęstości. ______________ 13 — Biochemia

194 / ROZDZIAŁ 17

o dodatkowym znaczeniu: 1. Nadwyżka triacyloglicerolu, będąca zarówno wynikiem lipogenezy, jak i podaży wolnych kwasów tłuszczowych, jest wydzielana do krwiobiegu w postaci

Na poziomie subkomórkowym: gltkoliza przebiega w cytozolu, a cykl kwasu cytrynowego w mitochondriach Główne funkcje biochemiczne składników subkomórkowych i organelli komórki przedstawiono w tab. 2-4. Jednakże, większość komórek jest podporządkowana wyspecjalizowanym funkcjom różnych tkanek i zmierza do uwydatnienia pewnych szlaków metabolicznych i ograniczenia innych. Rycina 17-7 ilustruje zasadnicze szlaki metaboliczne, ze specjalnym uwzględnieniem umiejscowienia we-

Kpoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL: ang.

very Iow density lipoprotein). Ten triacyloglicerol ulega przemianom podobnym do tych z chylomikronów. 2. Częściowe utlenianie wolnych kwasów thiszczowych pozwala wytwarzać związki ketonowe (ketogeneza). Związki ketonowe są transportowane do tkanek pozawąlrobowych, gdzie są wykorzystywane jako inne ważne źródło energii.

CYTOZOL

Gtikogen

, Białko /

AA

Cykl per lożof ostoranowy

/ .:-.Siateczka.-\śród p I azm a tyczn a /

Glicerofosforan \ G ii cero I

Ryc.

J^ybosom

Triacytogliceral

17-7. Wewnątrzkomórkowe umiejscowienie i integracja gjównych Fosfoenolopirogronian

Kwasy tłuszczowa

szlaków

Meczan

\ T Pirogronian

Szczawiooctan

Fumaran

Sukcynylo-CoA

AA

Acetyio-CoA

Cytrynian

a-Ketoglutaran

AA

M1TOCHONDRIUM

metabolicznych w wątrobowej komórce miąższowej. AA -> — przemiana jednego lub więcej aminokwasów egzogennych, AA *+ — przemiana jednego lub więcej aminokwasów endogennych.

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 19S

wnątrzkomórkowego oraz ich integrację w wątrobowej komórce miąższowej. Wyraźnie widoczna jest centralna rola mitochondrium. Jest on siedliskiem krzyżujących się torów metabolicznych węglowodanów, lipidów i aminokwasów. Mieszczą się w nim m.in. enzymy cyklu kwasu cytrynowego, łańcucha oddechowego z syntazą ATP, P-oksydacji kwasów tłuszczowych i ketogenezy. Dodatkowo jest on punktem zbiorczym dla powstających podczas transaminacji szkieletów węglowych aminokwasów przekazywanych następnie do procesu syntezy aminokwasów endogennych. W cytozolu zachodzą: glikohza, cykl pentozo fosforan owy i synteza kwasów tłuszczowych. Należy podkreślić, że w glukoneogenezie nawet substancje, które są wytwarzane w cytozolu, takie jak mleczan i pirogroniatt, muszą wejść do mitochondrium, aby ulec przemianie w szcza wio octan, nim zostaną przekształcone w glukozę. Błony siateczki śródplazmatycznej zawierają układ enzymatyczny katalizujący biosyntezę acylogliceroli. Rybosomy z kolei są miejscem syntezy białka. Należy zdać sobie sprawę, że transport metabolitów o różnej wielkości, ładunku i rozpuszczalności przez błony oddzielające struktury subkemórkowe wymaga złożonych mechanizmów. Niektóre z nich przedstawiono przy opisie błony mitochondrialnej (p. rozdz. 14), a pozostałe w następnych rozdziałach. PRZEPŁYW METABOLITÓW W SZLAKACH METABOLICZNYCH MUSI BYĆ REGULOWANY W SPOSÓB ZHARMONIZOWANY Regulacja całkowitego przepływu metabolitów przez szlak metaboliczny sprowadza się często do kontroli tylko jednej lub prawdopodobnie dwóch kluczowych reakcji ciągu, katalizowanych przez „enzymy regulatorowe". Najważniejsze w kontroli całkowitej szybkości szlaku metabolicznego są czynniki fizykochemiczne kontrolujące szybkość reakcji enzymatycznej, np. stężenie substratu (p. rozdz. 10). Natomiast temperatura i pH, czynniki, które mogą wpływać na aktywność enzymatyczną, mają niewielkie znaczenie regulacyjne u kręgowców stałocieplnych ze względu na stałą wartość tych parametrów. (Jednak należy zwrócić uwagę na zmiany pH w przewodzie pokarmowym i ich wpływ na trawienie [p. rozdz. 56]).

Reakcje, które zachodzą w stanie nierównowagi nadają kierunek szlakom metabolicznym i są potencjalnymi punktami ich kontroli W reakcji zachodzącej w stanie równowagi szybkości reakcji w obydwu kierunkach są jednakowe i dlatego nie obserwuje się żadnego przepływu w jakimkolwiek kierunku. Wiele reakcji w szlakach metabolicznych jest „reakcjami równowagi": A «—► B «—* C <—. D

In vivo, w warunkach stanu stacjonarnego (ang. steady state), prawdopodobnie przepływ netto będzie zachodził ze strony lewej na prawą w przypadku ciągłego dostarczania A i ciągłego usuwania D. Taki szlak mógłby funkcjonować, ale kontrola przepływu przez regulację aktywności enzymu nie byłaby tu celowa, gdyż zwiększenie aktywności służyłoby tylko do przyspieszenia osiągnięcia stanu równowagi. Zazwyczaj w szlaku metabolicznym jedna albo więcej reakcji zawsze jest w stanie nierównowagi. W reakcjach tych stężenia reagentów są dalekie od stanu równowagi, W wyniku dążenia do osiągnięcia stanu równowagi powstają duże straty energii swobodnej, wydzielanej w postaci ciepła, która nie może być ponownie wykorzystana. Powoduje to, że tego typu reakcja jest zasadniczo nieodwracalna, np.: Ciepło Reakcja nierównowagi

Taki szlak ma kierunek i zachodzi w nim przepływ metabolitów, ale przy braku kontroli szlak wyczerpuje się sam. Enzymy katalizujące reakcje w warunkach nierównowagi występują zwykle w mniejszych stężeniach i podlegają innym mechanizmom kontroli. Przypomina to otwieranie i zamykanie jednokierunkowego" wentyla, stwarzając możliwość kontroli przepływu netto. Reakcją powodującą przepływ jest ta pierwsza reakcja w ciągu, która jest wysycona substratem Można ją zidentyfikować jako reakcję nierównowagi, w której K^ enzymu jest znacznie mniejsza od fizjologicznego stężenia substratu. Przykładem takiej reakcji powodującej przepływ jest pierwsza reakcja w glikolizie katalizowana przez heksokinaze (p. ryc. 19-2).

196 / ROZDZIAŁ 17

MECHANIZMY ALLOSTERYCZNY I HORMONALNY MAJĄ DUŻE ZNACZENIE W METABOLICZNEJ KONTROLI REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Na rycinie 17-8 przedstawiono hipotetyczny szlak metaboliczny A, B, C, D, w którym reakcje A <-> B i C «-» D zachodzą w stanie równowagi, a B -* C jest reakcją „nierównowagi". Przepływ w tym szlaku może być regulowany przez dostępność substratu A, a zależy od dostarczania go z krwi, co z kolei zależy od spożycia odpowiedniego pokarmu lub od pewnych kluczowych reakcji, które wytwarzają i uwalniają substraty do krwi. Przykładem tego są 2 reakcje powodujące przepływ — jedna katalizowana przez fosforylazę w wątrobie (p. ryc. 20-1), która dostarcza giukozę do krwi, oraz druga, katalizowana przez lipazę wrażliwą na hormony (p. ryc. 27-8), która dostarcza

wolne kwasy tłuszczowe. To zależy również od zdolności substratu A do przenikania przez błonę komórkową. Przepływ może być również warunkowany przez sprawność usuwania końcowego produktu D i dostępność kosubstratu lub kofaktorów oznaczonych na rycinie jako Xi Y. Enzymy katalizujące reakcje nierównowagi są często białkami allosterycznymi podiegającymi kontroli przez efektory ailosteryczne szybko działające przez sprzężenie zwrotne (ang. feed-back) albo przez sprzężenie ku przodowi (ang. feed-forward) (p. rozdz. 10). Często końcowy produkt szlaku biosyntezy hamuje aktywność enzymu katalizującego pierwszą reakcję tego szlaku, np. dlugołańcuchowe kwasy tłuszczowe hamują karboksylazę acetylo-CoA. Inne mechanizmy kontroli zależą od działania hormonów reagujących na potrzeby całego organizmu. Są znane różne mechanizmy działania hormonów (p. rozdz. 44). Jednym z nich jest kowalenNieaktywny enzym,

Ca* + /kalmodulinaBtona komórkowa

©

0

(Y) •cAMP

Aktywny Inhibicja ailosteryezna przez ujemne Aktywacja ailosteryezna sprzężenie zwrotne przez dodatnie

[Enzym,]

sprzężenie ku przodowi

lub ©

Ryb osom a I na biosynteza nowego białka enzymatycznego

Jądrowa biosynteza Indukcja mHNA Represj a

Ryc. 17-8. Mechanizmy kontroli reakcji enzymatycznych. Liczby w kółkach wskazują możliwe miejsca działania hormonów. CD—zmiany przepuszczalności błony, © — przemiana postaci nieaktywnej w postać aktywną enzymu, ® — zmiana szybkości translacji mRNA na poziomie rybosomu, © — indukcja biosyntezy mRNA. © — represja biosyntezy mRNA. ________________________________________________________________________________

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 197 cyjna modyfikacja enzymu przez fosforylację lub defosforylację jego cząsteczki. Jest ona szybka

i często zachodzi za pośrednictwem drugiego posłańca — cAMP, który z kolei powoduje przekształcenie enzymu nieaktywnego w enzym aktywny. To przekształcenie jest przeprowadzane albo przez kinazę białek cAMP-zależną, która fosforyzuje enzym, lub przez swoistą fosfatazę, która defosforyluje enzym. Aktywną formą enzymu może być albo jego cząsteczka ufosforylowana, jak w enzymach szlaku degradacji (np. fosforylaza a), albo cząsteczka defosforylowana, jak w enzymach procesów syntez (np. glikogenowa syntaza a). Niektóre enzymy regulatorowe mogą być fosforylowane bez pośrednictwa cAMP i zależnej od cAMP kinazy białek. Te enzymy reagują na inne sygnały metaboliczne, takie jak stosunek [ATP]/[ADP] (np. dehydrogenaza pirogronianowa; ryc. 19-6) lub kinaza białek kontrolowana przez Ca2+/kalmodulinę (np. kinaza fosforylazy; p. ryc. 20-6). Synteza enzymów kontrolujących szybkość szlaku może być regulowana hormonalnie. Ponieważ dotyczy to syntezy nowego białka, nie

jest to zmiana szybka, Jęcz jest częstą reakcją na zmianę odżywiania. Hormony mogą działać jako induktory lub represory syntezy mRNA w jądrze komórkowym lub jako stymulatory translacji w procesie syntezy białka na poziomie rybosomów (p. rozdz. 41 i 44). Znamienną cechą, która ułatwia kontrolę metabolizmu, jest to, że szlak degradacji substratu nie jest prostym odwróceniem syntezy. Zwykie w grę wchodzą 2 całkowicie oddzielne ciągi, z których każdy podlega oddzielnej regulacji, np. synteza i rozpad glikogenu (ryc. 20-1).

PIŚMIENNICTWO Cohen P: Control ofEnzyme Actinty, 2nd ed. Chapman & Hal), 1983. Hue L, Van de Werve G (editors): Short-Term Regulation of Liver Metabolism. Elsevier/North Holland, 1981. Newsholme EA, Crabtree B: Flus-generating and regulatory steps in metabolic control. Trends Bio-

h m

Newsholme EA, Start C: Regulation in Metabolism, WiJey, 1973.

1 8

Cykl kwasu cytrynowego. Katabolizm acetylo-CoA Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Cykl kwasu cytrynowego (cykl Krebsa, cykl kwasów trikarboksylowych) jest ciągiem reakcji zachodzących w mitochondriach, w wyniku których reszty acetylowe ulegają katabolizmowi z uwolnieniem równoważników wodoro wych. Utlenieniu tych ostatnich towarzyszy uwolnienie przeważającej części energii swobo dnej zawartej w spalanych substratach. Reszty acetylowe występują w formie acetylo-CoA (CH3-CO-S-CoA, aktywny octan), estru koen zymu A. Jednym ze składników CoA jest wita mina ....kwas pantotenowy.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Zasadnicza rola cyklu kwasu cytrynowego polega na działaniu jako wspólny szlak końcowy utleniania węglowodanów, lipidów i białek. Wynika to z faktu, że glukoza, kwasy tłuszczowe oraz niektóre aminokwasy są tnetabolizowane .do acetylo-CoA lub związków po-.Średnich cyklu. Cykl odgrywa również istotną rolę w jlukoneogenezie, tran sam i nacji, deami-nacji T lipogenezie. Chociaż niektóre z tych procesów zachodzą w wielu tkankach, to jedynym narządem, w którym wszystkie te procesy zachodzą w znaczącym stopniu, jest wątroba. Stącfteż uwidaczniają się głębokie następstwa wówczas, gdy np. znaczna liczba komórek wątrobowych jest uszkodzonych lub zastąpionych tkanką łączną, jak ma to miejsce w ostrym zapaleniu lub marskości wątroby. Pośrednim dowodem, świadczącym o życiowym znaczeniu cyklu kwasu cytrynowego, jest fakt, że u ludzi odkryto bardzo niewiele genetycznie uwarun-

kowanych nieprawidłowości enzymów cyklu; tego typu nieprawidłowości są przypuszczalnie nie do pogodzenia z prawidłowym rozwojem organizmu. CYKL KWASU CYTRYNOWEGO DOSTARCZA SUBSTRATU DLA ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO Istotą cyklu jest połączenie czas teczki *acetylo-CoĄ z 4-węglowym dikarboksylowym kwasem szczawiooctowym; czego wynikiem jest powstanie 6-węglowego kwasu trikarboksy(owe-

go — cytrynianu. Następuje po tym ciąg reakcji, w czasie których odłączają się 2 cząsteczki CO2 i odtwarza się szczawiooctan (ryc. 18-1). Szczawiooctan spełnia tu właściwie funkcję katalitycz-

ną, ponieważ tylko niewielkie jego ilości są konieczne do ułatwienia przemiany znacznej liczby jednostek acetylowych w CO2. AoatykJ-CoA Co-A

Szczawiooctan

Cytrynian (CJ

Ryc. 18-1. Cykl kwasu cytrynowego. Katalityczna rola szczawiooctanu.

CYKL KWASU CYTRYNOWEGO / 199

Cykl kwasu cytrynowego jest integralni} częścią procesu, w wyniku którego przeważająca cześć energii swobodnej, uwalnianej podczas utleniania węglowodanów, lipidów i aminokwasów, staje się dostępna. W wyniku działania w cyklu swoistych dehydrogenaz podczas utleniania acetylo-CoA powstają równoważniki reWęglowodany

Bursztynlan

NAD

dukujące w postaci wodpru lub elektron ów^Ta . równoważniki redukujące wchodzą patem do łańcucha oddechowego, gdzie w procesie fpsforylacji oksydacyjnej są wytwarzane duże ilości ATP
Białka

Lipidy

2H

Sukcynylo-CoA lCA

Fosforylacja ' oksydacyjna

Łańcuch i-----? txl
J

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

200 / ROZDZIAŁ 18

e

Stąd też brak (anoksja) lub częściowy niedobór (hipoksja) O2 jest przyczyną całkowitej lub częściowej inhibicji cyklu. Enzymy cyklu kwasu cytrynowego znajdują sic~w macierzy mitochondrialnej albo w formie wolnej, albo przyłączone do wewnętrznej powierzchni wewnętrznej błony mitochondrialnej, co ułatwia przenoszenie równoważników redukujących na.odpowiednie enzymy łańcucha oddechowego, umiejscowionego również w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. REAKCJE CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO UWALNIAJĄ RÓWNOWAŻNIKI REDUKUJĄCE I CO a (p. ryc. 18-3)

Enzym kondensujący — syntaza cy trynianowa — katalizuje inicjującą cykl kondensację acelylo-CoA ze szczaswfloctąnem* i powstanie cytrynianu przez utworzenie" wiązania wę-gielwęgiel między atomem węgla grupy metylowej acety]o-CoA a atomem węgla grupy karbonylowej szczawiooctanu. Po reakcji kondensacji, w której powstaje cytrylo-CoA, następuje jiyjlroliza wiązania tioestrowego CoA połączona ze znaczną utratą energii swobodnej w postaci ciepła, co zapewnia przebieg reakcji do końca. Acetylo-CoA+Szczawiooctan+H.,0 -> -> Cytrynian+ Co-A

Cytrynian ulega przekształceniu w izocyirynian pr2ez enzym akonitazę (hydrataza akonitanowa), która zawiera żelazo, jakujop Fe2 + , w formie białka żclazo-siarkowegofFeiSJT^rże^ miana ta zachodzi w 2 etapach :_dehydratacji do ds-akonitanu pozostającego w^pbłączeniu ż en~ zymem i ponownej rehydratacji do izocytrynianu.

7i

Cw-akonitan - — jf fzocytryniarc

Cytrynian związany z enzymemj

* Z okólnika nr 200 Komitetu Wydawców Biochcmical Joumals Recommendations (]975): „Zgodnie ze standardową konwencją biochemiczną końcówka -an (np. palmitynian) oznacza dowolną mieszaninę wolnego kwasu i jego form(y) zjonizowanych(ej) (w zależności od pH), w której nie wyszczególnia się kationów". Tę samą konwencję przyjęto w tej książce dla wszystkich kwasów karboksy1 owych.

Reakcja jest wrażliwa na fluorooctan, który w formie fluoroacetylo-CoA kondensuje ze szczawiooctanem, tworząc fluorocytryman. Ten ostatni hamuje akonitazę, powodując akumulację cytrynianu. Wyniki doświadczeń z użyciem związków pośrednich znakowanych węglem lłC wskazują, że akonitaza reaguje z cytrynianem w sposób asymetryczny. Enzym zawsze działa na tę część cząsteczki cytrynianu, która pochodzi ze szczawiooctanu. Fakt ten był zaskakujący, ponieważ kwas cytrynowy wydawał się być związkiem symetrycznym. Okazało się (gdy cząsteczkę rozpatruje się w 3 wymiarach), że 2 grupy — CH2COOH nie są przestrzennie identyczne w odniesieniu do grup —OH i —COOH. Następstwa asymetrycznego działania akonitazy można ocenić, śledząc losy znakowanego acetylo-CoA w cyklu kwasu cytrynowego przedstawionego na ryc. 18-3. MożJiwe, że CŁs-akonitan nie jest koniecznym związkiem pośrednim miedzy cytrynianem a izocytrynianem, lecz w rzeczywistości stanowi boczne odgałęzienie głównego szlaku. Izocytrynian przy udziale dehydrogenazy izocytrynianowej ulega odwodornieniu i powstaje szczawiobursztyńian. Znane są 3 różne dehydrogenazy izocy tryniano we. Jedna, swoista względem NAD", znajduje się tylko w chondriach. Pozostałe 2 enzymy są swoiste względem NADP+, jeden z nich znajduje się ? (Irilgi W rytmniii. TTtWia-

nie izocytrynianu związane z łańcuchem oddechowym odbywa się niemaJ wyłącznie przy udziale enzymu zależnego od NAD+. Izocytrynian + NAD+.—> *—* Szczawiobursztyńian <—► (związany z enzymem) i—>txKetoglutaran + COa+ NADH + H+

ksylacji do a-ketoglutaranu w reakcji kąjaj^owąnej także przez dehydrogenazę izocytrynianową. Ważnym składnikiem tej reakcji jest Mnz+ (lub Mg?.jt)j Wydaje się, że.s_zczawk>bursztynian pozostaje związany z enzymem jako związek pośredni w ogólnej reakcji. Towstały a-ketogtutaran ulega dekarbo ksylacji oksydacyjnej w sposób analogiczny do dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu (p. ryc. 19-5) — oba substraty są a-ketokwasami. :-Ketoglutaran + NAD* + Co-A -» -* Sukcynylo-CoA + COa + NADH + H+

CYKL KWASU CYTRYNOWEGO / 201

JABŁ.CZANOWA C H 3 ~ COC T NADH + H HłSzczawlooctan J° HO—C-COO"

CH5-COCT Cytrynian JAKONITAZA]

Fluorocytrynian C—COO

JJH-COCT

Cis-a. koni tan t

DEHYDROG BURSZTYNIANOWA

HO-CH-COO izocytrynian DEHYDROGENAZA IZOCYTRYNIANOWA1

r

O-C-S-CoA Sukcynylo-CoA DEHYDROGENAZY

K-KETOGLUTARANOWEJ

OC a-

Ketoglutaran

p

Szczawicbursztynian DEHYDROGENAZA IZOCYTRYNIANOWA

DEHYDROGENAZA OWA | Ryc. 18-3. Cykl kwasu cytrynowego (cykl Krebsa). Utlenianie NADH i FADH2 w łańcuchu oddechowym umożliwia syntezę ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej, W celu łatwiejszego śledzenia losów acetylo-CoA w cyklu, atomy węgla rodnika acetylowego oznakowano na węglu karboksyiowym {używając znaku [*]) i na węglu metylowym {używając znaku [ • ] ) W jednym obrocie zostają uwolnione 2 atomy węgla w postaci CO2, W pierwszym obrocie cyklu le uwolnione atomy nie pochodzą zacetyio-CoA, który bezpośrednio wszedt do cyklu, ale z lej części cząsteczki cytrynianu, która pochodzi ze szczawtooctanu. Jednakże, po pierwszym pełnym obrocie cyklu, odtworzony szczawiooctan jest już znakowany, stąd też w następnym obrocie cyklu uwolnieniu ulega znakowany CO^. Ponieważ bursztynian jest związkiem symetrycznym, a dehydrogenaza bursztyn ianowa nie rozróżnia 2 grup karboksylowych, na tym etapie dochodzi do „przypadkowości" znakowania, w wyniku czego wszystkie 4 atomy węgla szczawiooctan u okazują się być znakowane po jednym obrocie cyklu. W wyniku glukoneogenezy część węgl i znakowanego szcza wtooctanu może się zna leźć w glukozie i glikogenie (p. ryc 21 -1). Stereochemiczne aspekty cyklu kwasu cytrynowego omówił Grevrl(e (1968). Na rycinie zaznaczono miejsca hamowania (O) przez fluorocytrynian, malonian i arsenin.

202 / ROZDZIAŁ 18

Reakcja katalizowana przez kompleks dehydrogenazy a-ketoglu tara nowej £akże__»;^ma-ga obecności identycznych kofaktorów, tj. difosfotiaminy, Ijponianu, NAD+, FAD i "CoA. "Wj ej_wy ni kupo wstaj e sukcynylo-CoA, tioester zawierający wiązanie bogatoenergetyczne. Ró wnowaga tej reakcji jest tak znacznie przesunię ta na korzyść tworzenia sukcynylo-CoA, że należy ją uważać za fizjologicznie jednokierun kową. Tak jak w przypadku utleniania pirogronianu (p, str. 214), reakcję tę hamuje arsenin, powodując nagromadzenie się su.bstratu, ot-ke^ toglutarann. W następnym etapie cyklu sukcynylo-CoA jpstaje przekształcony w bursztyniań pr7«z en zym tiokinazę bursztyn Janową (syntetazę sukcynylo-CoA). Sukcynylo-CoA + Pj + GDP <—• «—» Bursztynian + GTP + CoA

Reakcja ta wymaga GDP lub IDP, które w obecności fosforanów nieorganicznych zo stają przekształcone odpowiednio w GTP lub TYP. W cyklu kwasu cytrynowego jest to jedyny przypadek powstawania bogatoenergetyczncgo mazania fosforanowego na poziomie substratu. Występuje on dlatego, że uwolnienie energii swbbodnejw reakcji dekarboksylacji oksyda cyjnej a-ketoglutaranu jest wystarczające do dodatkowego utworzenia wiązania bogatoenergetycznego, oprócz wytwarzania NADH (rów noważnik 3~®). Przy udziale kioaz^^lifos^ fonukleozydowej (p. str. [37) z GTP lub ITP może powstawać ATP,. m>.: GTP + ADP

GD P+A TP

W tkankach po za wątrobowych reakcją alter natywną, katalizowaną przez transferazę CoA sukcynylo-CoA: acetooctan (tioforaze), jest prze miana sukcynylo-CoA w bursztynian sprzężona z przekształceniem acetooctanu w acetoacetylo--CoA (p, str. 268). W wątrobie stwierdza się również aktywność deacylazy, która powoduje nieznaczną hydrolizę sukcynylo-CoA do bursz- tynianu i CoA. 35Ldalszych_przemianach bursztynian ulega odwodornicniu, po którym następuje przyłącze nie cząsteczki wody oraz jeszcze jedno odwodornienie prowadzące do odtworzenia szczawiooctanu. Bursztynian + FAD <-^> Fumaran + FADH2

Pierwszą reakcję odwodoraiejH^J^^izuje dehydrogeriaza burszry niannwa. która jest związana_ z wewnętrzną.jowierzchni a:,wawl^4ee&eT Błony mitn^nnHpalinpj

w nńrń?r\ipr\h\ nńj^

zostałych enzymów cyklu, które znajdują się Śt to jedyna reakcja odwodor- y kwasu cytrynowego, w której następuje bezpośrednie przeniesienie wodoru z substratu na flawoproteinę bez udziału NAD + Enzym zawiera FAD i białko żelazo siarkowe (Fe:S). Wynikiem odwodornienia jest powsta nie fumaranu. Dane uzyskane z doświadczeń z izotopami wykazały, że enzym jest stereospecyficzny względem atomów wodoru w poło żeniu trans na węglach metylenowych bursztynianu. Dodanie malonianu. lub szczawiooctanu hamuje kompetycyjnie dehydrogenazę bursztymanową, powodując nagromadzenie się bursztynianu. Fumaraza (hydrataza fumaranowa) katalizuje reakcję przyłączenia cząsteczki wody do fuma ranu, dając jabłezan. Fumaran + HaO <—> L-Jabłezan

Oprócz swoistości dla L-izomeru jabłezanu, fumaraza katalizuje przyłączenie j:jem£ató.w_ wody do podwójnego wiązania fumaranu w konfiguracji trans. Jabłezan ulega przekształ ceniu przez dehydrogenazę jablczanową w szczawlooctan w reakcji wymagającej obecności NAD+. L-Jabłczan + NAD+

Szczawiooctan + + NADH + H +

Aczkolwiek równowaga tej reakcji jest znacznie przesuniętajv_stron^ jabłezanu, zachodzi ona jednak w kierunku szczawi o octanu, ponieważ związek ten, wraz z drugim produktem reakcji (NADH), jest ciągle usuwany w następnych reakcjach. Enzymy cyklu kwasu cytrynowego, z wyjąt kiem dehydrogena^a-TteTo^tutara^no^eji bTJrsZtyaianowcj*,występują również poza mitochondriarniT Łhociaż katalizują one podobne reak cje, niektóre z enzymów, np. dehydrogenaza jabłezanowa, nie muszą być w rzeczywistości tymi samymi białkami, co enzymy mitochondrialne o tej samej nazwie.

* Powinna być również wymieniona syntaza cytrynianowa (przyp.

CYKL KWASU CYTRYNOWEGO / 203

KAŻDY OBRÓT CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO UMOŻLIWIA SYNTEZĘ 12 CZĄSTECZEK ATP W_jvyniku utleniań katalizowanych przez dehydrogenazy cyklu kwasu cytrynowego, zostają wytworzone 3 cząsteczki NADH i 1 F.4DH2 na każdą cząsteczkę acetylo-CoA TĆataboIiźówaną w jednym obrocie cyklu. Te równoważniki redukujące są przenoszone do łańcucha oddechowego w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (ryc. 18-2). Podczas wędrówki w łańcuchu, równoważniki redukujące z NADH generują 3 boga t o e ne rgety czn e wiązania fos-" foranowe powstające w procesie fostorylaćji oksydacyjnej wskutek fosforylacjf AD? do ATP (p. rozdz. 14). Natomiast FADH, daje tylko 2 bo^tgenerąerycznej ffi^zataTT&sfera nowe, gdyż przenosi swą siłę redukcyjną na CoQ, omijając w ten sposób pierwsze miejsce fosforylacji oksydacyjnej w łańcuchu oddechowym (p. ryc. 14-6). JDalsze bogatoenc rgety czne wiązanie fosforanowe.-powstaje na poziomie samego cyklu (tj. na poziomie subs trat u) podczas przemiany sukcynylo-CoA w bursztynian. Prz^-każdym obrocie cyklu powstaje więc 12 cząsteczek ATP {tab. 18-1)!

Tabela 18-1. Wytwarzanie ATP przez cykl kwasu cytrynowego____________— ------------------Enzym katalizujący reakcję Dehydrogenaza izocytrynianowa Kompleks dehydrogenazy 3-ketoglutaranowej Tiokinaza bursztyn janowa Dehydrogenaza bursztynianowa

Dehydrogenaza ablczanowa

Sposób wytwarzania ~P Utlenianie NADH włańcuchu oddechowym Utlenianie MADH wtańcuchu oddechowym Fosforylacja substratowa Utlenianie FADH2 w łańcuchu oddechowym Utlenianie NADH w łańcuchu oddechowym Zysk

Liczba utworzonych cząsteczek ATP

3

3

1

2

3 12

NIEKTÓRE WITAMINY ODGRYWAJĄ KLUCZOWĄ ROLĘ W CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO Cztery rozpuszczalne witaminy kompleksu B maJ4 określone rok w funkcjonowaniu cyklu kwasu cytrynowego. Są to: I) ryboflawina w formie dinukleotydu flawinoadeninowego_(jFĄD), kofaktor w kompleksie dehydrotzcnazy «-ketoglutarano..weji w dehydrogenazic burszty-nta nowej, 2) niacjTia w formie dinukleotydu nikotyaoa ni i do u dt ni nowego (NAD), koenzym dla 3 dehydrogenaz cyklu: dehydrogenazy i/oe>tryniunowej, kompleksu dehydrugenazy .r-ktitoglutaranowej i dehydrogenazy jaWczanowej, 3) tiamina (witamina B,), jak£ difosfo tiamina, koenzym procesu dekar boksy lacjiw" reakcji dehydrogenazy ot-ketoglutaranowej, 4) kwas pantotenowy, jako C2ęść koenzymu A, kofaktor związany z „aktywnymi" resztami kwasów karboksylowych, takich jak acetylo-CoA i sukcynylo-CoA. CYKL KWASU CYTRYNOWEGO ODGRYWA WĘZŁOWĄ ROLĘ METABOLICZNĄ Niektóre szlaki metaboliczne kończą się na związku pośrednim cyklu kwasu cytrynowego, a inne szlaki wywodzą się z tego cyklu. Dotyczy to takich procesów, jak: glukoneogcneza^ transaminacja, deaminacja i synteza kwasów,.tłuszczowych. Jak widać cykl kwasu cytrynowego odgrywa role zarówno w procesach oksydacyjnych, jak i w procesach syntez, a zatem jest amilbolicztiy. Poniżej przedstawiono podsumowanie tej dwoistej roli cyklu. Cykl kwasu cytrynowego ma udz iał w giukoneogenezie, tran sam i nacji i deaminacji Wszystkie ważniejsze metabolity ryWlu, od „Cytrynianu do szczawiooctanu, są potencjalnie g! ukogennc. gdyż mogą zwiększyć wytwarzanie glukozy w wątrobie lub nerce, narządach zawie rających pełny zestaw enzymów niezbędnych do przeprowadzenia glukoneogenezy (p. str. 226). Kluczowym enzymem, umożliwiającym przejś cie z cyklu do głównego szlaku glukoneogenezy, jest kar boksy kiiiiizii fosfoenolopirogr omanowa, katalizująca reakcję dekarboksylacji szczawic:octanu do fosfoenolopirogronianu z GTP jajko źródłem fosforanu bogatoenergetycznego (ryc. T8-4). ' -

204 / ROZDZIAŁ 18 Hlstydyna Prollna Hydroksyprollna Seryna Cysta! na Trsonlna Gtloyna

Mleczan

)\

&

,JV f

Glutamina f Pirogronian

Tryptofan.

Arglnln.

J KARBOKSYLAZA FOSFOENO LOPIHOGRONIANOWA

KARBOKSYLAZA PIHOGHONIANOWA

Fosfeanolo-

plrogrnnlanln "^

Ryc. 18-4. Uczestnictwo cyklu kwasu

T y ro zy n a Fenyloalanina

cytrynowego w transaminacji i glukoneogenezie. Grubsze strzałki wskazują główny szfak glukoneogenezy. Szczawiooctan ł GTP-» -» Fosfoenoloptrogronian + CO3+ GDP

Wprowadzenie do cyklu następuje jako wynik kilku różnych reakcji. Jedną z najważniejszych jest tworzenie szczawi o octanu w reakcji karboksylacji pirogronianu katalizowanej przez karboksylazę pirogronianową.

W reakcjach katalizowanych przez truns a mi-

na/y (aminotransferazy) wytwarza się; pirogronian z alaniny, szczawiooctan z asparaginianu oraz a-ketoglutaran z glutaminianu. Ponieważ reakcje te są odwracalne, cykl służy również jako źródło szkieletów węglowych do syntezy aminokwasów endogennych, np.:

ATP + COa + HaO + Pirogronian ■ -» Szcza wiooctan + ADP + P|

Asparaginian + Pirogronian *—> Szczawiooctan + Alanina

Reakcję tę uważa się za ważną w utrzymaniu odpowiedniego stężenia szczawiooctanu dla reakcji kondensacji z acetylo-CoA. Jeżeli nagromadza się acetylo-CoA, to działa on jako allosteryczny aktywator kaiboksylazy pirogronianowej, zapewniając w ten sposób dopływ szczawiooctanu. Mleczan, ważny substrat glukoneogenezy, wchodzi dó^ cykl u w^wyniku przemiany w pirogronian i szczawiooctan.

Glutaminian + Pirogronian<—»a-Ket oglu taran + Alanina

Inne aminokwasy wspierają glukoneogeneze, ponieważ cały ich szkielet węglowy lub jego cześć po deaminacji lub transaminacji zasila cykl kwasu cytrynowego. Przykładami s$ ąląnina, cysteina^glicyjia, hydroksyprolina, seryoa, treońma i^yptofaiir któie ulegaią" prze-

CYKL KWASU CYTRYNOWEGO / 205 ^rmnina htetyrlyna "

"glutamina i prolina. które"poprzez glutaminian przechodzą w a-ketoglu\ąran; izołeucyna, metionina i walina, które tworzą sukcynylo-CoA; tyt6fcyjia"T"ienyIoai an i n"a. z którjcE powstaje fumaran (p. ryc. 18-4). Substancje tworzące pirogronian mogą ulec całkowitemu utlenieniu dp^CO^jeśli ulegną przekształceniu w acetylo-CoA przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej, lub też mogą trafić do glukoneogenezy przez karboksylację do szczawi o octanu. " Szczególne znaczenie dla przeżuwaczy ma przemiana propionianu, będącego głównym produktem glikogennym fermentacji węglowodanów w żwaczu przeżuwaczy, w sukcynylo-CoA poprzez metyloma)onylo-CoA (p. ryc, 21-2). Cykl kwasu cytrynowego uczestniczy w biosyntezie kwasów tłuszczowych (p. ryc. 18-5) Acetylo-CoA, utworzony z pirogronianu w wyniku działania kompleksu dehydrogenazy piróg ronią nowej, stanowi podstawowy element do syntezy długo łańcuch owych kwasów tłuszczowych u nieprzeżuwaczy. (U przeżuwaczy acetylo-CoA powstaje bezpośrednio z octanu).

Ponieważ dehydrogenaza pirogronian owa jest enzymem mitochóndrialnym, a enzymy katalizujące syntezę kwasów tłuszczowych znajdują się poza mitochondriami. acetylo-CoA musi zostać przetransportowany przez nieprzepuszczalną dla niego błonę mitochondrialną. Dokonuje się to przez utworzenie z acetylo-CoA cytrynianu w cyklu kwasu cytrynowego, następnie przetransportowanie cytrynianu z mitochondrium i w końcu utworzenie acetylo-CoA w cytozolu przez rozszczepienie cytrynianu w reakcji katalizowanej przez enzym Uazę ATP: cytrynianową. Cytrynian + ATP + CoA-» Acetylo-CoA + Szczawiooctan + ADP+ P.

Regulacja cyklu kwasu cytrynowego zależy głównie od podaży utlenionych kofaktorów Bez wątpienia w większości tkanek, w których zasadnicza funkcja cyklu kwasu cytrynowego polega na dostarczeniu energii, „kontrola oddechowa" przez łańcuch oddechowy T fosforylację oksydacyjną jest nadrzędnym elementem regulacji aktywności cyklu kwasu cytrynowego. Aktywność cyklu jest więc bezpośrednio Siczawlodan

i -Glukoza Pirogronian

LIA2A ATP: CYTHYNIANOWA Cytryn łan

DEHYDROGENAZA PIROGRO NIANOWA

Ryc. 18-5. Udział cyklu kwasu cytrynowego w procesie syntezy kwasów tłuszczowych z glukozy {p. też ryc. 23-5). _________________________

Saczawioocian Cykl kwasu cytrynowego

CO, BŁONA MITOCHONDRIALNĄ

Kwasy tłuszczowe

Acetylo-CoA

206 / ROZDZIAŁ 18

zależna od podaży utlenionych kofatetorów dehydrogenaz (np. NAD), ta z kolei, ze względu na sprzężenie utleniania z fosforylacją, zależy od dostępności ADP, a w końcu także od szybkości zużywania ATP. Szybkość wykonywanej pracy, w wyniku której zużywa się ATP, warunkuje zatem zarówno szybkość oddychania, jak i aktywność cyklu kwasu cytrynowego pod warunkiem, że tlen jest dostępny. Poza tą ogólną lub zgrubną kontrolą, właściwości niektórych enzymów cyklu sugerują, źe regulacja może mieć miejsce na poziomie samego cyklu. W tkance, takiej jak mózg, która jest zależna w znacznym stopniu od węglowodanów dostarczających acetylo-CoA, kontrola cyklu kwasu cytrynowego może zachodzić na etapie dehydrogenazy pirogronianowej. W samym cyklu niektóre enzymy wykazują wrażliwość na stan energetyczny wyrażony stosunkiem [ATP]/[ADP] i [NADH]/[N AD+]. I tak syntaza eytrynianowa jest hamowana allosterycznie przez ATP i długołaricuchowe acylo-CoA. Allosteryczna aktywacja przez ADP mitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynianowej zależnej od NAD jest znoszona przez ATP i NADH. Kompleks dehydrogenazy tx-ketoglutaranowej wydaje się być pod analogiczną kontrolą, jak dehydrogenaza pirogronianowa. Dehydrogenaza bursztynianowa jest hamowana przez szczawiooctan, a dostępność szcza wi o octanu,

kontrolowana przez dehydrogenazę jabłezanową,.zalęży.od stosunku [NADH]/[NAD], Ponieważ wartość Km syntazy cytrynianowej dla szczawiooctanu jest tego samego rzędu, co jego stężenie wewnatrzmitochondrialne, to wydaje się, że stężenie szczawiooctanu może odgrywać pewną rolę w regulacji szybkości powstawania cytrynianu. Jak na razie nie rozstrzygnięto, który z powyżej wymienionych mechanizmów funkcjonuje w warunkach in vivo.

PIŚMIENNICTWO Baldwin JE, Krebs HA: The cvolution of metabolic cydes. Naturę 1981;291:381. Boyer PD (editor): The Enzymes, 3rd ed. Academic Press, 1971. Goodwin TW (editor): The Metabolic Rołes of Citrate. Academic Press, 1968. Greville G"D: Vol 1, p 297, in: Carbohydrate MetaboHsm and hs Disorders. Dickens F, Randle PJ, Whelan WJ (editors). Academic Press, 1968. Kay J, Weitzman PDJ (editors): Kreb's Citric Acid Cyde - Half a Century and Still Turning. Biochemical Society of London, 1987. Lowenstein JM (editor): Citric Acid Cyde: Control and Compartmentalion. Dekker, J969. Lowenstein JM (editor): Citric Acid Cyde. Vol 13 in: Methods in Enzymology. Academic Press, 1969. Srere PA: The enzymology of the formation and breakdown of citrate. Adv Enzymol I975;43:57.

Glikoliza i utlenianie piróg ronianu

1 9

Peter A, Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Wszystkie tkanki wymagają pewnej minimalnej podaży glukozy, ale dla niektórych tkanek (np. dla mózgu i erytrocytów) jest to wymóg zasadniczy. GlikolizaJesL^ównym szlakiem r ^ ? T h i k i h ■Komórkach. Jest to wyjątkowy szlak, ponieważ może on przebiegać zarówno w warunkach tlenojłjchjaerobowych), jak i beztlenowych (anaerobowych).

ZNACZENIE BIOMED/CZNE Glikoliza jest nie tylko podstawową drogą metabolizmu glukozy prowadzącą do wytwa rzania acetylo-CoA i utleniania w-cyklu-kwasu cjffynowcgo. lecz także stanowi główny szlak, metabolizmu fruktozy i galaktozy i y g pokarmowego. Jej zasadnicze znaczenie biomedyczne wynika z faktu, że glikoliza może dostarczać _&!£■ w BWobecnoścDtoua^cqrpo,T. zwala mięśniom szkieletowym funkcjonować sprawnie przy niedostatecznych procesach aerobowych i co pozwala tkankom z dużą aktywnością glikolityczną przetrwać epizod Beztlenowy. Odwrotnie, mięsień sercowy, przystosowany do warunków tlenowych, charakteryzuje się względnie mała aktywnością glikolityczną i słabą zdolnością przetrwania w warunJtach niedotlenienia. Znamy niewielką liczbę chorób, w których stwierdzono brak aktywności enzymów glikolizy (np. kinazy pirogronianowej); zasadniczym ich objawem jest niedokrwistość hemolityczna. W szybko rosnących komórkach nowotworowych, glikoliza przebiega ze znacznie większą szybkością niż wymaga tego

cykl kwasu cytrynowego. Znaczy to, że wytwarzanie pirogronianu przewyższa zdolność jego metabolizowania. W rezultacie prowadzi to do nadmiernego wytwarzania mleczanu i miejscowego zakwaszenia środowiska w guzie, a to z kolei może mieć następstwa w terapii pewnych typów nowotworów. Kwasica mleczanów u może wynikać z wielu przyczyn, włącznie z niedoborem dehydrogenazy pirogronianowej.

GLIKOLIZA MOŻE PRZEBIEGAĆ W WARUNKACH BEZTLENOWYCH Już we wczesnym okresie badań nad glikolizą zauważono, że proces fermentacji w drożdżach jest podobny do rozpadu glikogenu w mięśniu. Stwierdzono, że gdy mięsień kurczy się w środowisku beztlenowym, tzn. takim, z którego usunięto tlen, znika glikogen, a pojawia się mleczan jako główny produkt końcowy. Gdy tlen jest dostępny, czyli istnieją ponownie warunki tlenowe, pojawia.-sje.glikjo.gen, natomiast mleczan .znika. Jeżeli jednak skurcz następuje w warunkach tlenowych, to mleczan się nie gromadzi, a głównym produktem glikolizy jest pirogronian; ten ostatni nie akumuluje się, ponieważ jest utleniany dalej do CO2 i wody (ryc. 19-1). Na podstawie tych obserwacji przyjęto rozdział metabolizmu węglowodanów na fazę tlenową i beztlenową. Jednak tego typu zróżnicowanie jest arbitralne, gdyż reakcje w procesie glikolizy, przebiegające zarówno w obecności, jak i przy braku tlenu, są takie same z wyjątkiem ich intensywności oraz produktów końcowych. Je: żeli.tlęnjest dostęnny-tyJko^r-zez-króiki-okres, to jest. ograniczona peoksydacja NADH powstałego w czasie glikolizy. W tych warunkach

208 / ROZDZIAŁ 19

Glukoza + 2 AOP + 2 Pf -* -» 2 L(+)-Ml«aan + 2 ATP + 2 H3O

Gllkogen

Ryc. 19-1. Uproszczony schemat glikolizy. Q — zablokowane w warunkach beztlenowych lub przy braku mitochondriów, np. w erytrocytach.

NADH jest utleniany w reakcji redukcji pirogronianu do rn]eczanu,7a_tak utworzony_NAD_.. umożliwia dalszy przebieg glikolizy (ryc, 19-1), W ten sposób glikoliza może zachodzić w warunkach beztlenowych, lecz ma to swoją cenę — dochodzi do ograniczenia ilości energii uwalnianej na mol utlenianej glukozy. W konsekwencji, aby wytworzyć tę samą ilość energii, więcej glukozy musi ulec glikolizie w warunkach beztlenowych niż w warunkach tlenowych.

CIĄG REAKCJI W GLIKOLIZIE TO GŁÓWMY SZLAK ZUŻYCIA GLUKOZY Ogólne równanie glikolizy do mleczanu jest następujące:

Wszystkie_ enzymy- ■ szlaku -glikojitycznego (ryc. 19-2) znajdują się w pozamitochondrialnej rozpuszczalnej frakcji komórkowej.jK.c^tozplu. Katalizują one reakcje zachodzące podczas przemiany glukozy do pirogronianu i mleczanu następująco: Glukoza wchodzi do szlaku glikołitycznego przez fosforylację do glukozo-6-fosforanu: Za-chodzi to przy udziale enzymu heksokinazy, a w hepatocytach przy udziale glukokinazy, k*torej aktywność jest indukowana i modyfikowana w wyniku zmian odżywiania. Jak»-dawca fnsfhranp pnrr^frny jggf ATPJ* jak W Wielu reakcjach związanych z fosforylacją, regguje-on w formie kompleksu Mg^ATP. \f reakcji zużywa sie 1 bogatoenergetyczne wiązanie fosforanowe ATP i powstaje ADP._Reakgji tej towarzyszy znaczna strata energii swobodnej w postaci ciepła i dlatego w warunkach fizjologicznych może być ona traktowana jako reakcja nieodwracalna. Heksokirta7M jp&t .hamawana w SpOsób izosteryczny przez produkt reakcji glultpzo--6-fosforan. Glukoza + ATP-—* -» Glukozo-6-fosforan + ADP r wy stepująca we wszystkich komórkach, z wyjątkiem komórek parenchymalnych wątroby, ma duże powinowactwo (mata wartość Km) do jej substratu, tj, glukozy. Jej rola polega na zapewnieniu dostarczenia gluko■ZXjjo_ tkanek. Nawet przy małych stężeniach glukozy we krwi, przez fosforylację wszystkich jej cząsteczek wnikających do komórki, jest możliwe utrzymywanie dużego gradientu stężenia glukozy między krwią a środowiskiem wewnątrzkomórkowym. Heksokinaza działa zarówno na a, jak i p anomer glukozy i może również katalizować fosforylację innych heksoz, jednak ze znacznie mniejszą szybkością niż fosforylację glukozy. Funkcia ęlukokinazy iest usuwanie glukozy Z krwi po spożyciu posiłków. W przeciwieństwie

Ryć. 19-2. Szlak glikolizy. ®-------P O3 , P , — H0P 0 | , 9 — ham owa nie. * A tom y wę gla 1 — 3 fruktozobisfosforanu tworzą hydroksyacetonofosforan, natomiast węgle 4 — 6 tworzą giicera)dehydo-3fosforan. Przedrostekbis- (jak w fruktozobisiosforanie) wskazuje, że grupy fosforanowe są- od separowane, natomiast określerile difosforan, np. w difosforanie adenozyny, wskazuje że są bezpośrednio ze sobą połączone.

GLIKOUZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU /

209

Gtifcogen Glukozo-

1-fosforan

[ HEKSOKINAZA ]

CHj

| GLUKOKINAZA j

J—- 0

L

Q

_ c

CHa-O-©

12OMEHA2A FOSFOHEKSOZOWA

^OH

Hy

Mg' +

HO\?H H

OH it-

H

y0H

OH H 0H ADP ■-D-G lu kozo-6-f osf oran ATP

ATP

D-Glukoza

OH - V FOSFOFRUKTOKINAZA

;ł

cooH-C-OH i

CH,-O-

MUTA2A

FOSFOGUCERYNIANOWA

D-F r u kicz o -1.6-b i sf o sf o ran

Jod oo otan

2-Fnsfogllcerynian

CHjOH Dlhyd ALDEHYDO-3-FOSFORANOWAroksy aoeto nofoslo r

FOSFOGLICERYNIANOWA

c oo H - Ć -O -® ĆH,OH

ER AZ A

_____ ADP 1,3-Blsfostogl icery n

Fluorek

-H;O —-5 3-Fos1oglioeryniari

lan

I ENOLAZA

coo Ć-0-® II

H D-FrukJczo-6-łosforan

CH,

■

-ADP Mg

KINA2A PtROGRONIANOWĄ

Mltochondrlalny łańcuch

1

ATP Samorzutnie

coo Ć-OH -CH, (Enol) Plrogfonian

Ryc. 19-2 14

Biochemia

Fosfoenolo piróg ron lan Utlenianie w cyklu kwasu cytrynowego

cooi

CH3

3ATP

3ADP + P-.

NADH+H^

y: o£

NAD +

U

0EHYDH0G6NAZA MLECZANOWA

(Keton) Plrogronlan

cooHO-C-H

Ć

, | \ g , ____

■

210 / ROZDZIAŁ 19

do heksokinazy ma ona dużą wartość Km dła glukozy i działa optymalnie przy stężeniu glukozy we krwi wynoszącym powyżej 5 mmol/1 (p. ryc. 21-5). Jest swoista względem fliulfozy Glukoz o-6-fosforan jest ważnym związkiem łączącym wiele szlaków metabolicznych (glikoliza, glukoneogeneza, cykl pentozofosforanowy, glikogcneza i glikogenoliza). W glikolizie jest ona przekształcana w fruktozo-6-fosforan przez izomeryzację aldozowo-ketozową przy udziale izomerazy fosfoheksozowej. Przemianie tej ulegaJyIkjDjąjm£nier_glukozó-6-fos...D-Głukozo-6-fosforan <—» *—> a>D-Fruktozo-6-fosforan

Po tej reakcji następuje druga fosforylacja z udziałem ATP, katalizowana przez enzym fosfofruktokinazę (fosfofruktokinazc-1), tworząca fruktozo-l,6-bisibsforan. Fosfofruklokinazajest zarówno enzymem allosterycznym, jak i indukowanym, którego aktywność odgrywa główną rolę w regulacji szybkości glikolizy. Reakcja katalizowana przez fosfofruktokinazę e być uważana za nieodwracalną w warunkach fizjoJogicznych. D-Fruktozo-6-fosforan + ATP > ■ D - F ruktozo-1,6-bisf osforan

Fruktozo-l,6-bisfosforan jest rozszczepiany przcz aldolazę (aldolazę fruktozo-1,6-bisf o sforanową) na 2 fosfotriozy, glicfiraldehydo-3-fosforan i dihydroksyacetonofosforan. D-Fruktozo-1,6-bisfosforan «—► <-^>Gliceraldehydo-3 -fosforan + + Dihydroksyacetonof osforan

Stwierdzono występowanie kilku różnych aldolaz; wszystkie zawierają 4 podjednostki. W większości tkanek występuje aldolazą A, natomiast w wątrobie i nerce występuje dodatkowo aldolaza B. Chociaż fruktozofosforany występują w komórce głównie w formie furanozowej, to z izomerazą fosfoheksozową, fosfofruktokinazą i aldolaza wiążą się w formie łańcuchowej. Gliceraldehydo-3-fosforan oraz dihydroksyacetonofosforan przekształcają się jeden w drugi pod wpływem enzymu izomerazy fosfotriozowej. D -Gliceraldehydo-3-f osforan *—► «—► Dihydroksyacetonofosforan

Następny etap glikolizy to utlenienie gliceraldehydo-^Tosforanu do J^^BisfbsfogUcer^ nianu. Dzięki aktywności izomerazy TosTotriozowej również dihydroksyacetonofosforan^ przechodząc uprzednio w gliceraldehydo-3-fosforan, jest utleniany do 1,3-bisfosfoglicerynianu, D-Gliceraldehydo-3-fosforan + NAD * + + Pj. —.1,3-bisfosfoglicerynian +NADH + H +

Kn^ym warunkujący utlenianie—dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa —jest zależny od NAD. Strukturalnie składa się on z 4 identycznych polipeptydów (monomerów) tworzących tetramer. Każdy polipeptyd zawiera 4 grupy -SH, znajdujące się w resztach cysteiny łańcucha polipeptydowego. Jedna z grup -SH znajduje się w centrum katalitycznym enzymu. Początkowo substrat łączy się z tą resztą -SH, tworząc tiohemiacetal, który w wyniku utlenienia ulega przekształceniu w bogatoenergetyczny tioester; wodór oderwany w czasie tego utleniania jest przenoszony na NAD związany z enzymem. Wytworzony NADH nie jest tak mocno związany z enzymem jak NAD. Dlatego też NADH może być łatwo zastępowany przez następną cząsteczkę NAD, W końcu w reakcji fosforolizy, przy udziale nieorganicznego fosforanu (P;), tworzy się" 1,3bisfosfoglicerynian i wolny enzym z odtworzoną grupą -SH (ryc. 19-3). Energia uwalniana w czasie utleniania zostaje zatrzymana najpierw w formie bogatoenergetycznego wiązania siarczkowego, a po jego fosforolizie w formie bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego w pozycji 1 1,3-bisfosfogIicerynianu. Ten_„ bogatoenergetyc2ny fosforan znajdzie się następnie w ATP w wyniku katalizowanej przez kinaze fosfoglicerynianową reakcji zachodzącej w obecności ADP i tworzącej J-fosfoglicery-nian. 1,3-bisfosfoglicerynian-)- ADP «—» <—• 3-fosfoglicerynian+ ATP

Ponieważ z cząsteczki glukozy podlegającej glikolizie powstają 2 cząsteczki fosfotrioz, na tym etapie wytwarzają się również 2 cząsteczki ATP na cząsteczkę glukozy; jest to przykład fosforylacji „na poziomie substratu" (fosforylacja substratowa). W przypadku obecności arseniami, współzawodniczy on w powyższych reakcjach z fosforanem nieorganicznym (Pj), tworząc 1-arse-

GLIKOUZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU / 211

H-C-0 H-C-OH

S-Enz H- C - OH

i

NAD+)

H- C - OH

CH-O-(P) G! fceraldehyd o-3-fosf □ ra n

CHrO-(P-

Kompleks enzym -substrat HS-Enz

nzym

o-®

Utlenianie sabstratu przez związany NAtT

H-C-OH CH,-O-(P) 1,3-Blsfostoglloerynlan

Hyc-. 19-3. utleniania fosforanu. Em gliceraldehydojest hamowany wiążący się z sposób jodooctan może hamować glikolizę.

no-3-fosfoglicerynian, który spontanicznie hydrolizuje, dając 3-fosfoglicerynian i ciepło, bez tworzenia ATP. Jest to ważny przykład zdolności arsenianu do rozprzęgania utleniania i fosforylacji. Powstający w powyższych reakcjach 3-jpsfogliceryhian jest przekształcany w 2-fosfoglicerynian przez enzym mutaze fosfoglicerynianową. Prawdopodobnie 2,3-bisfosfoglicerynian (dawniej określany jako difosfoglicerynian, DPG) jest związkiem pośrednim w tej reakcji. 3-Fosfoglicerynian *—f2-Fosfoglr cery niań

Następny etap glikolizy jest katalizowany przez enolazę, którą powoduje odłączenie wod^,_pr_zernieszczenie energii wewnątrz cząsteczki, przejście fosforanu w pozycji 2 w stan bogatoenergetyczny i w rezultacie tego utworzenie fosfoenolopirogronianu. Enoląza, jest

Intefmedlat bogatoeneroełyczny

Mechanizm gliceraldefiydo-3~~ dehydrogenaza 3--fosforanu. Enzym przez jodooctan grupą -SH, W ten

hamowana przez fluorki; ta właściwość może być wykorzystana w sytuacji, gdy zachodzi potrzeba zahamowania glikolizy, np. w próbce krwi w celu oznaczenia w niej stężenia glukozy. Aktywność enzymu zależy od obecności Mg2 + lub Mn2+. 2-Fosfoglicerynian «-» *-* Fosfoenolopirogronian + H2O

Następnie fosforan bogatoenergetyczny jest przenoszony z fosfoenolopirogronianu na ADP przez enzym kinazę pirogronianową, tworzący na tym etapie 2 cząsteczki ATP na cząsteczkę utlenianej glukozy. Utworzony w tej reakcji enolopirogronian przekształca się spontanicznie w formę ketonową pirogronianu. Jest to kolejna reakcja, której towarzyszy znaczna utrata energii swobodnej w postaci ciepła i musi być ona traktowana jako fizjologicznie nieodwracalna.

212 / ROZDZIAŁ 19 Fosfoenolopirogronian + ADP -* -» Pirogronian + ATP

Teraz stan red.-oks. tkanki jest czynnikiem decydującym, który z 2 możliwych szlaków metabolicznych zajdzie. Jeżeli przeważają waranki beztlenowe, to uniemożliwiona jest reoksydacja NADH w łańcuchu oddcdumym-pczez przeniesienie równoważników redukujących na tlen. Pirogrojiiaji ulega redukcji przez NADH rjrprpiwyfiTpi w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanów ą. Opisano izozymy tego "enzymu i ich znaczenie kliniczne (p. str. 82). Pirogronian + NADH + H+ ~ <-.L(+)-Mleczan + NAD* Reoksydacja NADH w reakcji powstawania mleczanu, przez odtworzenie NAD+ potrzebnego w następnym cyklu reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową, umożliwia przebieg glikolizy w nieobecności tlenu. Tkanki funkcjonujące w warunkach niedotlenienia wytwarzają więc mleczan (ryc. 19-2). Dotyczy to zwłaszcza mięśni szkieletowych, gdyż szybkość wykonywanej przez mięśnie pracy nie jest ograniczona przez ich stan oksygenacji. Nadmierne ilości utworzonego mleczanu można stwierdzić w tkankach oraz we krwi i w moczu. W _ervtrocvtach ^ikgjizajjiawet w warunkach tlenowych, kończy się zawsze utworzeniem mleczanu, z powodu braku w tych komórkach mitochondriów, które zawieraj4 system enzymatyczny utleniający pirogronian. Jedynie w erytrocytach ssaków ok^90% całkowitego zapotrzebowania energetycznego pokrywa glikolizaJ_Coza mięśniem szkieletowym i erytrocytami, tkankami, które również czerpią energię głównie z glikolizy i wytwarzają mleczan, są: mózg, jelito, rdzeń nerki, siatkówka 1 skóra. Wątroba, nerki i serce zwykle pobierają mleczan i utleniają go, ale w warunkach niedotlenienia narządy te mogą wytwarzać mleczan. Glikoliza jest regulowana na 3 etapach obejmujących reakcje „nieodwracalne" Chociaż większość reakcji glikoli ty cznych jest odwracalna, to jednak 3 z nich są wyraźnie egzoergiczne i z tego powodu muszą być uważane za rgakcj£jftzjologicznie nieodwracalne. Są to reakcje katalizowane przez heksokinazę (i glukokinazę),"ibsfofruktokinazę 'i kinazę pirogronianowa,. Reakcje te stanowią zasadnicze miejs-

ca_regulacji glikolizy. Komórki, mające różne systemy~enzyriiatyczne, pozwalające na alternatywny przebieg nieodwracalnych reakcji katalizowanych przez wyżej wymienione enzymy, mają możliwość dokonywania w szlaku glikolitycznym przesunięcia metabolitów w kierunku syntezy (glukoneogenezy). Te reakcje oraz regulacja glikolizy i regulacja glukoneogenezy są przedstawione w rozdz. 21. W glikolizie zachodzącej w erytrocytach reakcja kinazy fosfog li cery nia nowej może być ominięta W erytrocytach wie\u gatunków ssaków dochodzi do ominięcia reakcji katalizowanej przez kinazę fosfoglicerynianowa. W tym przypadku energia swobodna wiązania bogatoenergetyczi. nego 1,3-bisfosfoglicerynianu zostaje rozproszona w postaci ciepła (ryc. 19-4). Dodatkowy --------Glukoza H-C-GH Gl fceraldehyd o-3-fosforan

NAD* DEHYDROGENAZA GLICERALDEHYOO-3-FOSFORANIOWA

'NADH + H*

MUTAZA BISFOSFO GLICERYNIANOWA

H-C-OH

1.3-BtefoBfoglicerynlan

ADP,

J

KINAZA FOSFOGLICEHYNIANOWA

COO" H-COH CH 2-O(F

Gl I cer o I o-2,3-b I sf osf o ra n

FOSFATAZA 2^-BISFOSFOGUCERYN1AN0WA

3-Fosfogllcerynlan Pfrogronlan

Ryc. 19-4. Szlak 2,3- bisfosfoglicerynianowy w erytrocytach.

GLIKOLIZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU / 213

enzym, imitasa ■faisfosfpglieerynianowa, katalizuje przekształcenie 1.3-bisfosfoglJccryniami w 2.3 - b i stos fbgl u: e ry ni an. Ten ostatni u lega przemianii: do .i-loslosilicciynianu prze/ fosfatazę ~TfośiSgBcerynianową, której aktywność wykazuje cząsteczka mutazy bisfosfoglicerynianowej. W związku z utratą bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego proces glikoiizy, przebiegający z udziałem tych reakcji, nie daje zysku energetycznego w postaci ATP. Jednakże może to być korzystne dla erytrocytów, ponieważ pozwala na przebieg glikolizy nawet w warunkach minimalnego zapotrzebowania na ATP. Poza tym 2,3-bisfosfoglicerynian, występujący w komórce w dużym stężeniu, łączy się 7. hemoglobiną, powodując zmniejszenie jej powinowactwa do tlenu i przesuniecie krzywej dysocjacji oksyhemoglobiny w prawo. W_,Jten sposób w erytrocytach ułatwia on uwalnianie tlenu z oksj hemoglobiny (p. rozdz. 7). UTLENIANIE PIROGRONIANU DO ACETYLO-CoA JEST NIEODWRACALNYM PROCESEM ŁĄCZĄCYM GLIKOLIZĘ Z CYKLEM KWASU CYTRYNOWEGO AUy.piiogroniaajnógł wejść do cyklu kwasu cytrynowego, musi najpierw zostać przetransportowany do wnętrza mitochondrium przez przenośnik pirogronianowy, który umożliwia przejście pirogronianu przez wewnętrzną Honę mitochondrialną. W tym procesie transportowi cząsteczki pirogronianu towarzyszy transport 1 protonu (kotransport). Tego typu mechanizm transportu określa się mianem symportu (p. ryc. 14-15). Wewnątrz mitochondrium pirogrogjfrn do acetylo-

;CpA. Reakcja ta jest katalizowana przez kilka różnych enzymów, działających kolejno w kompleksie wieloenzymatycznym. Enzymy te określa_sic-zbk>rowo mianem kompleksu dehydrogenazy pirogr omanowej, który jest analogiczny do kompleksu dehydrogenazy a-ketoglutaranowej w cyklu kwasu cytrynowego (p. str. 199). Pirjagnjniarijyilega.4ekarboksylacji do hydroksyetyłowej pochodnej pierścienia tiazolowego difosfoLićtmmy związanej z enzymem, która reaguje z kolei z utlenionym lipoamidem, tworząc acetylolipoamid (ryc. 19-5). W obecności acetylotransfcrazy dihydroliponianowcj acetylolipoamid reaguje z koenzymem A., tworząc acetylo-CoA i zredukowany lipoamid. Gdy

ten ostatni zostanie ponownie utleniony przez flawoprofeinę, w obecności dehydrogęnazy dihydroliponianowej, cykl reakcji jest" zakończony! Ostatecznie zredukowana flawoproteina jest utleniana-pfzezr.:NAD, który z kolei przenosi równoważniki redukujące do łańcucha oddechowego. Pirogronian + NAD + + CoA -• -» Acetylo-CoA + NADH + H+ + COa

Kompleks_dshydrogenazy pirogronianowej składa się z szeregu łańcuchów polipeptydowych. każdego z 3 składowych enzymów, ułożonych w regularny układ przestrzenny. Ruchy każdego z enzymów są ograniczone, a metabolity pośrednie nie dysocjują swobodnie, lecz pozostają przyłączone do enzymów. Taka organizacja kompleksu enzymatycznego, w którym substraty są przekazywane z jednego enzymu na następny, powoduje zwiększenie szybkości reakcji i uniemożliwia przebieg reakcji ubocznych, a w konsekwencji zwiększa wydajność ogólną procesu. Należy zaznaczyć, że system dehydrogenazy pirogronianowej jest wystarczająco elektroujemny względem łańcucha oddechowego, aby generować zarówno zredukowany koenzym (NADH), jak i dodatkowo bogatoenergetyczne wiązanie tioestrowe w acetylo-CoA. Dehydrogenaza pirogronianowa jest regulowana przez hamowanie produktami końcowymi oraz przez modyfikacje kowalencyjne pehydrogenaza pirogronianowa jest hamowana przez produkty jej reakcji, acetylo-CoA oraz NADH (ryc. 19-6). Jest ona również regulowana przez ATP-zależną fosforylację, katalizowaną przez kinazę, co prowadzi do zmniejszenia aktywności oraz przez defosforylację przy udziale fosfatazy, co z kolei prowadzi do zwiększenia aktywności dehydrogenazy. Kinaza ulega aktywacji przy zwiększeniu wartości stosunków facetyIo-CoAj/XCoA], [NADHJ/tNAD1-] lub [ATP]/[ADP] Dęhydrogenaza pirogronianowa — a zatem i glikoli/a — jest więc hamowana nie tylko przez potencjał bogatoenergetyczny, lecz także w warunkach, gdy zachodzi utlenianie kwasów tłuszczowych, w czasie którego zwiększają się wartości wyżej wymienionych stosunków,...W- -głodzeniu dochodzi do zmniejszenia ilości aktywnej formy enzymu, a po podaniu insuliny obserwuje się

214 / ROZDZIAŁ 19 Dltosfotlamlna w formie karbanionu S

C=Ć-CH,-CH,- O-®-®

CH -{C H S ) 4 -C OO-

DEHYDROGENAZA PlROGFIONIANOWA

Oifosforiydroksyetylotiamina DEHYDflOGENAZA P1R0GR0NIAN0WA DEHYDFIDGENAZA PIROGRONIANOWA

Związek pośredni

ACETYLOTRANSFERAZ A CKHYDHOLIPONWNOWA

O II CnA-S-C-CHj Aeetylo-CoA.

[4

Zredukowany lipoamid

Utleniony lipoamid

O II S -C — CH 3

Aoetytolipoamld

DEHYDROGENAZA DIHYDflOLIPONIANOWA NAD*

NADH Ryc. 19-5. A. Dekarboksylacja oksydacyjna pirogronianu przez kompleks dehydrogertazy pirogronianowej, B, Kwas liponowy. Kwas li porto wy jest połączony wiązaniem amidowym z resztą lizyny acetylotransferazy będącej składnikiem kompleksu enzymatycznego. ________________________________________________________________________________________

zwiększoną aktywność w tkance (ale me w wątrobie).

iwej

Zahamowanie utleniania pirogronianu prowadzi do kwasicy mleczanowej Arsenin i jony rtęciowe, kompleksując grupę — §H kwasu liponowego, hamują dehydrogenazę pirogronianową i, tak jak niedobór tiaminy w diecie, powodują nagromadzenie się pirogronianu. Niedożywieni alkoholicy mają 7wykte niedobór darniny i jeżeli poda się im glukozę, to dochodzi do szybkiego nagromadzania się

pirogronianu i kwasicy mleczanowej, często śmiertelnej. Kwasica mleczanowa, zwłaszcza po obciążeniu glukozą, jest jednym z objawów u osób z dziedzicznym niedoborem dehydrogenazy pirogronianowej. Opisano wady genetyczne dotyczące niemal każdego z enzymów metabolizujacych węglowodany; każda z nich jest związana z odpowiednią chorobą u ludzi. Dziedziczny niedobór aldolazy A oraz niedobór kinazy pirogroniano wej w erytrocytach wywołuje niedokrwistość hemolityczną.

GUK0L1ZA I UTLENIANIE PiROGRONIANU / 215 Piróg ronian

B

Piróg ronlan ATP

PDH-a-(Aktywny DEFOSFOEN2YM)

NAD ł

PDHb (nieaktywny FOSFO ENZYM)

GcA H,0

Insulina (w tkance tłuszczowej)

Ryc. 19-6. Regulacja dehydrogenazy piróg roni a nowej (PDH). Strzałki faliste dotyczą efektów allosterycznych. A — regulacja przez hamowanie produktami końcowymi, B — regulacja przez wzajemną przemianę postaci aktywnej i nieaktywnej enzymu.

Utlenienie cząsteczki glukozy dostarcza 38 mol ATP w warunkach tlenowych i tylko 2 mol ATP w nieobecności tlenu Gdy 1 cząsteczkę glukozy spali się w kalorymetrze do CO2 i wody, uwolni się ok. 2780 kJ ciepła. Gdy utlenianie zachodzi w tkankach, wówczas część tej energii nie jest rozpraszana bezpośrednio w postaci ciepła, lecz zostaje „zachowana" w postaci bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych. Każdej___cząsteczce glukozy utlenionej do CO2 i wody to~warzyszy ^wytworzenie—3fr-vBSg.l-.ATP.—:Zakładając, że każde wiązanie bogatoenergetyczne odpowiada

30,5 kJ, to energia magazynowana w postaci ATP, przypadająca na cząsteczkę utleniojieL glukozy, wynosi 1159 kJ, czyli stanowi ok. 41,7% całkowitej energii spalania. Większość ATP tworzy się podczas fosforylacji oksydacyjnej wwyniku reoksydacji zredukowanych koenzymów w łańcuchu oddechowym. Pozostały ATP jesMvytwarzany przez fosforvfaj|j^ substratową (p^oż3ż~T^rr-W-ta^e^T^ :TpTzed^ stawiono reakcje warunkujące wytwarzanie bogatoenergetycznego fosforanu podczas utleniania glukozy i zysk energetyczny w warunkach tlenowych oraz beztlenowych.

216 / ROZDZIAŁ 19 Tabela 19-1. Wytwarzanie bogatoenergetycznych wiązań fosfo ran owych podczas kata boi iz mu glukozy Reakcja, którą Sposób Liczba ~ (J) Szlak katalizuje: wytwarzania tworzonych na przemian mol glukozy Giikoliza

Dehydrogenaza gliceraldehydo--3-fosforanowa Kinaza fosfoglicerynianowa

Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym

6

Fosforylacja substratowa

2

Kinaza pirogronianowa

Fosforylacja substratowa

2 10

Zużycie ATP w reakcjach katalizowanych przez heksokinazę i fosfofruktokinazę Zysk Dekarboksylacja Kompleks dehydrogenazy oksydacyjna pirogronianowej

Cykl kwasu cytrynowego

-2 8

Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym

6

Dehydrogenaza izocytrynianowa Dehydrogenaza a-ketogiutaranowa

Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym Utlenienie 2 NADH w tańcuchu oddechowym

6

Tiokinaza bursztyntanowa Detiydrogenaza bursztynianowa

Fosforylacja substratowa Utlenienie 2 FADH2 w łańcuchu oddechowym

2

Dehydrogenaza jabłczanowa

Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym

6

4

Zysk Ogólny bilans w warunkach tlenowych Ogólny bitans w warunkach beztlenowych

6

30 38

2

' Przyjęto, że NADH powstający w glikolizie przekazuje wodory do wnętrza mitochondriów przy udziale mostka jabłczanowego (p. ryc. 14-15). Przy użyciu mostka fosfoglicerynianowego powstałyby tylko 2 ~ © na mol NADH, stąd całkowity zysk wyniósłby 36 zamiast 38. W kalkulacji pominięto niewielką stratę ATP (ok, 1 mol ATP) wynikającą z transportu do wnętrza mitochondriów H+ z pirogronianem oraz podobnego transportu Hł w działającym mostku jabłczanowym

PIŚMIENNICTWO Boitcux A, Hess B: Design of glycolysśs. Phil Trans

R Soc LonOm 3 imO93i5.

Blass JP: Disorders of pyriwate metabolism. Neurology 1979;29:280. Boyer PD (editor): The Enzymes, 3rd ed. Vols 5—9. Academic Prcss, 1972. Dickens F, Randle PJ, Whelan WJ (editors): Carbohydrate Mewholism and Its Disorders. 2 vols. Acadcmic Press, 1968.

Greenberg DM {editor): MetaboHc Patkways, 3rd ed, Vol. 1. Academic Press, 1967. Randle PJ, Steiner DF, Whelan WJ (editors): Carbohydrate Metabolism and Its Disorders. Vol 3. Academic Press, 1981. Scriver CR (editor); MetaboHc Basis of Inherited Disease. McGraw HjU, óth ed. 1989. Sols A: Multimodulation of enzymeactivity. Curr Top Celt Reg 1981;19:77. Veneziale CM (editor): The Regulatwn ofCarbohydrate Formation and Utiiizaiion in Mammals. University Park Press, 1981.

Metabolizm glikogenu

2 0

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Glikogen jest główną formą magazynowania węglowodanów u zwierząt i jest odpowiednikiem skrobi u roślin. Występuje głównie w wątrobie (do 6%) i w mięśniach, gdzie rzadko przekracza 1%. Jednak mięśnie, z powodu dużej masy, zawierają 3—4-krotnie większy zapas glikogenu niż wątroba (tab. 20-1). Glikogen, podobnie jak skrobia, jest rozgałęzionym polimerem ot-glukozy (p. ryc. 15-15). Tabela 20-1. Magazynowanie węglowodanów u przeciętnego dorosłego człowieka (70 kg) w stanie postabsorpcyjnym Glikogen wątroby Glikogen 4,0% = 72 g' 0,7% = 245 g* mięśni Glukoza 0,1% = 10 g" pozakomórkowa

327 g Masa wątroby 1800 g Masa mięśni 35 kg Całkowita objętość 10 I

kogenu i odkładaniem nieprawidłowych postaci glikogenu, co prowadzi do osłabienia mięśni, a nawet zgonu. GLIKOGEN WYSTĘPUJE GŁÓWNIE W MIĘŚNIACH I W WĄTROBIE W szlaku biosyntezy glikogenu bierze udział specjalny aktywny nukleotyd glukozy (p. ryc. 20-1) ' Glukoza jest fosibrylowana do glukozo-6-fosforanu w reakcji, która jest również pierwszą reakcją szlaku glikolizy z glukozy. Ta reakcja jest katalizowana przez beksokinazę w mięśniu i przez glukakinaze w wątrobie. Glukozo-6-fosforan jest zmieniany w glukozo-1-fosforan w reakcji katalizowanej prze2 fosfoglukomutazę. Sam enzym jest fosforylowany w przebiegu reakcji, a grupa fosforanowa bierze udział w reakcji odwracalnej, w której związkiem pośrednim jest glukozo-l,6-bisfosforan. Enz-P + Glukozo-6 fosforan <-t ♦* Enz + Glukozo-1,6-bisfosforan «■»

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Glikogen mięśni jest łatwo dostępnym źródłem jednostek heksozowych do glikolizy w samym mięśniu. Glikogen wątroby głównie magazynuje i eksportuje jednostki heksozowe w celu utrzymania fizjologicznego stężenia glukozy we krwi, zwłaszcza między posiłkami. Po 12—18 h głodzenia wątroba staje się niemal zupełnie pozbawiona glikogenu, podczas gdy glikogenu w mięśniach znacznie ubywa tylko po długotrwałym intensywnym wysiłku. Choroby spichrzania glikogenu są to dziedziczne zaburzenia, charakteryzujące się wadliwą mobilizacją gli-

*+ Enz-P + Glukozo-1-fosforan Następnie glukozo-1-fosforan reaguje z ury.dynotriibsforanem (UTP), aby utworzyć urydyaodifosfoglukozę (UDPGic)* {ryc. 20-2).

* Są również znane i inne związki będące nukleozydodifosfopochodnymi cukrów, up. UDPGal. Ponadto ten sam cukier może być połączony z różnymi nukleotydami, np. glukoza może być przyłączona do urydyny Gak to pokazano powyżej), aie także do nukleotyd u guanozy nowego, tymidy nowego, adenozyno w ego lub cytydynowego.

218 / ROZDZIAŁ 20 Gllkogen (jednostki glukozylowe 1 -*i i 1 -*6) SYNTAZA Enzym rozgałęziający GUKOGENOWA Insulina

I

i©

(jednostki glukozylowe 1-

Q

UDP

ł

©

_ c A M P-------~—*Ą

FOSFORYLAZA

. Prlmer ^ gllkogenu TRANSFER AZA GLLJKANO

Glukagon Adrenalina

ATP U rydyno d ifosf ag I u ko za (UDPGIc) KINAZA K

ENZYM ODGAŁĘZIAJĄCY WA

GI u k oz o-1 -f osf o ran

ADP

FOSFOGLUKOMUTAZA GI u kozo-6-łostoran NUKLEOZYDODH

*

-FOSFORANOWA

ADP

MgI+ USLUKOKINAZA ATP

H,0

GLUKOZO6--

Wolna glukoza z enzymu odgałęziającego Do gltkollzy I szlaku pentozofosforan oweg o

14 Glukoza

Ryc. 20-1. Szlak glikogenogenezy i glikogenolizy w wątrobie. 2 bogatoenergetyczne fosiorany są zużywane przy wbudowaniu 1 mola glukozy w glikogen. © — pobudzenie, © — hamowanie. Insulina zmniejsza stężenie cAMP jedynie wówczas, gdy było ono uprzednio zwiększone działaniem glukagonu lub adrenaliny, tzn. jest antagonistą ich działania. Glukagon działa na mięsień sercowy, ale nie na mięśnie szkieletowe. "Transferaza glukanowa i enzym odgałęziający wydają się być 2, oddzielnymi aktywnościami tego samego enzymu.

Uracyl

.CHjOH

H/ł—OH

UTP + Glukozo-1-fosforan « UDPGIc + PP.

IY3H HZ II II HO^rfO-P-O— P-O-CH T^^ I H OH O"

Reakcja pomiędzy glukozo-1-fosforanem i urydynotrifosforanem jest katalizowana przez enzym pirofosforylazę UDFGlc.

i O"

Następująca potem hydroliza nieorganicznego pirofosforanu pod wpływem nieorganicznej Ryboza pirofosfatazy przesuwa reakcję na prawą stronę równania. Glukoza

T

Dlfosforan

Urydyna

Ryc. 20-2. Urydynodifosfoglukoza {UDPGIc).

METABOLIZM GLIKOGENU / 219

Działaniem enzymu syntazy glikogenowej, C, aktywnej, glukozy UDPGlc tworzy wiązanie glikozydowe z C4 końcowej reszty glukozowej glikogenu, uwalniając urydyn od i fosforan (UDP). Aby zainicjować tę reakcję, musi być obecna istniejąca już wcześniej cząsteczka glikogenu, czyli primer. Sam primer (wymawiaj prajmer) glikogenu może być utworzony na szkielecie białkowym, co może być procesem podobnym do syntezy innych glikoprotein (p. rozdz. 57). UDPGlc + (C6)„ -* UDP + (C6)n+1 Glikogen Glikogen

Częścią mechanizmu rozgałęziania jest odłączenie istniejących już łańcuchów glikogenu Dodawanie reszty glukozy do istniejącego już łańcucha glikogenowego, czyli primera, nastęP.ujej!3._ nieredukującym zewnętrznym końcu cząsteczki tak, że „gałęzie" „drzewa" glikogenu wydłużają sie wraz z sukcesywnym po wsta waniem wiązań I ->4 fryc. 20-3), Gdy łańcuch zostanie przedłużony do co najmniej 11 reszt glukozowych, wówczas inny enzym, enzym rozgałęziający (amylo [l-+4i->[l->6]-łransglukozydaza) przenosi część łańcucha I ->4 (długości co najmniej 6 reszt glukozowych) na sąsiedni łańcuch, tworząc wiązanie l-*-6 i ustanawiając w ten sposób punkt rozgałęzienia w cząsteczce. Rozgałęzienia wzrastają poprzez dalsze dodawanie jednostek l-»4 glukozylowych i dalsze rozgałęzienia. Wraz ze zwiększeniem liczby nieredukujących reszt końcowych zwiększa się

w cząsteczce całkowita liczba miejsc zdolnych do reagowania, przyspieszając zarówno glikogenogenezę, jak i glikogenolizę. Działanie enzymu rozgałęziającego badano na żywym organizmie zwierzęcym, podając glukozę znakowaną i4C, a następnie badając glikogen wątroby w odpowiednich odstępach czasu (ryc, 20-3).

GLIKOGENOLIZA NIE JEST ODWRÓCENIEM GLIKOGENOGENEZY, LECZ JEST ODRĘBNYM SZLAKIEM REAKCJI W szlaku degradacji jest zawarty mechanizm odgałęziania (p. ryc. 20-1) Etapem ograniczającym szybkość glikogenolizy jest reakcja katalizowana przez fosforytazę. (C e ) n + Pj -* (C e ) n -, + Glukozo-1-fosforan Glikogen

Glikogen

Ten enzym jest swoisty dla fosfor o litycznego rozkładu (fosforolizy) wiązań od-+4 w glikogenie z wytworzeniem glukozo-1-fosforanu. Z najbardziej zewnętrznych łańcuchów cząsteczki glikogenu są usuwane reszty glukozylowe, aż do pozostania ok. 4 reszt glukozy po każdej stroaie rozgałęzienia l-*6 (ryc. 20-4). Inny enzym (a-[l->4]->a-[l -*4]-transferaza glukanowa) przenosi jednostkę trisacharydową z jednego rozgałęzienia na inne, odsłaniając punkty rozgałęzienia 1-+6. Hydroli ty czne rozbicie wiązań l->6 wymaga działania swoistego enzymu

o_o Wiązanie giukazydowe 1 -»4 o Reszty glukozy nie znakowane Oło Wiązania glukozydowe 1-*6 • Fteszty glukozy znakowane WC

Ryc. 20-3. Biosynteza glikogenu. Mechanizm rozgałęziania został wyjaśniony przez dodawanie gfukozy znakowanej 14C.

220 / ROZDZIAŁ 20 FOSFORYLAZA

TRANSFEHAZ A GLUKANOWA

ENZYM ODGAŁĘZIAJĄCY

Q_Q

ł Reszty glukozy połączone r wiązaniami (jtukozydowyml Reszty glukozy połączone wiązaniami glukozydawyml 1 -»6

Wiele kowalencyjnych modyfikacji jest spowodowanych działaniem cAMP (3', 5'-cykliczny kwas adenylowy; cykliczny AMP) (p. ryc. 20-5 i str. 594). cAMP jest wewnątrzkomórkowym pośrednikiem" albo drugim posłańcem, przez który działa wiele hormonów. Tworzy się on z ATP pod wpływem enzymu cyklazy adenylanowej, występującej na wewnętrznej powierzchni błony komórkowej. Cyklaza adenylanowa jest aktywowana takimi hormonami, jak adrenalina i noradrenalina, działającymi przez receptory P-ad ren ergi czne w błonie komórkowej, a ponadto w wątrobie glukagonem działającym przez niezależny receptor glukagonu. Fosfodiesteraza rozkłada cAMP i to właśnie aktywność tego enzymu utrzymuje normalnie małe stężenie cAMP. Wykazywano, że insulina zwiększa aktywność tego enzymu w wątrobie, zmniejszając w ten sposób stężenie cAMP.

Ryc. 20-4. Etapy glikogenolizy.

odgałęziającego (amy)o-[1 -►ńj-glukozydazy). Po usunięciu rozgałęzienia może postępować dalsze działanie fosforylazy. Wspólne działanie fosforylazy i wspomnianych innych enzymów prowadzi do całkowitego rozkładu glikogenu. Reakcja katalizowana przez fosfoglukomutazę jest odwracalna, wobec czego z glukozo-1-fosforanu może być wytwarzany glukozo-6-fosforau, W wątrobie i w Derce (ale nie w mięśniach) "cTIzym' glukozo-6-fosfataza, który usuwa fosforan z glukozo-6-fosforanu, umożliwiając powstającej gJukozie dyfundowanic z komórki do krwi. Jest to końcowy etap glikogenolizy wątrobowej, która odzwierciedla się zwiększeniem stężenia glukozy we krwi. CYKLICZNY AMP INTEGRUJE REGULACJĘ GLIKOGENOLIZY I GLIKOGENOGENEZY Główne enzymy kontrolujące metabolizm glikogenu, tj. fosforylaza glikogenowa i syntaza glikogenowa, są regulowane przez złożoną serię reakcji, wśród których są zarówno mechanizmy allosteryczne (p. str. 123) jak i modyfikacje kowalencyjne, polegające na odwracalnej fosforylacji i defosforylacji enzymatycznego białka (p. str. 127).

NH,

I

;H

II

" W ■CHj

-O-P»O

■i ■—n

/ S \H H/ ■■■■

J^ >.

\

rtu

OH

Ryc. 20-5. Kwas3',5'-adenylowy (cykliczny AMP, cAMP). _____________ __________________

Fosforylaza wątroby różni się od fosforylazy mięsni

W wątrobig fosforylaza istnieje zarówno w postaci aktywnej, jak i nieaktywnej. Aktywna fosforylaza (fosforytaza a) ma jedną z grup hydroksylowych seryny ufosforylowaną przez wytworzone wiązanie estrowe. Działaniem swoistej fosfatazy (fbsfataza-1 białek), enzym ten zostaje unieczynniony, przez przekształcenie go w fosforylazę b, w reakcji polegającej na hydrolitycznym usunięciu fosforanu z reszty seryny. Reaktywacja wymaga refosforylacji z udziałem ATP i swoistego enzymu kinazy fosforylazy.

METABOLIZM GLIKOGENU / 221

Mięśniowa fosforylaza jest immunologicznie i genetycznie odmienna od wątrobowej. Jest dimerem, a każdy monomer zawiera 1 mol fosforanu pirydoksalu. Występuje w..2 postaciach, jako fostoryla/a a, która jest ufosforylowana i aktywna zarówno w obecności, jak 1nieobecności AMP (jej allosterycznego mody fikatora), oraz fosforylaza b, która jest zdefosforylowana i aktywna jedynie w obecności AMP, co ma miejsce w czasie wysiłku, kiedy stężenie AMP się zwiększa. Fosforylaza a jest normalną fizjologicznie aktywną formą enzy mu. Aktywacja mięśniowej fosforylazy odbywa się z udziałem cAMP Fosforylaza w mięśniu jest aktywowana przez adrenalinę (ryc. 20-6)! Jednakże nie jest to .działanie bezpośrednie, lecz przez eAMP. Zwiększenie stężenia cAMP aktywuje cAMP--zależną kinazę białek, enzym o raczej szerokiej swoistości. Ta kinaza katalizuje fosforylację, z udziałem ATP, nieaktywnej kinazy b fosforylazy do aktywnej kinazy a fosforylazy, która z koJei przez kolejną fosforylacje aktywuje fosforyiazę b do fosfory Jazy a. Nieaktywna cAMP-zależna kinaza białek ma 2 pary podjednostek. każda para składa się z podjednostki regulacyjnej (R), która wiąże 2 mol cAMP, oraz podjednostki katalitycz nej (C), która ma miejsce aktywne. Połącze nie z cAMP powoduje dysocjację komplek su R 2C 2 , uwalniając aktywne monomery C (p. str. 596). B,Ca + 4cAMP »2C + 2{R~cAMPt) Nieaktywny Aktywny enzym enzym Ca2 synchronizuje aktywację fosforylazy ze skurczem mięśnia Glikogenoiiza wjnigśniu^ zwiększa się kilkasetkrotnie bezpośrednio po rozpoczęciu skurczu mięśnia. Przyczynia się do tego szybka aktywacja kinazy fosforylazy przez CaJ~., ten sam sygnał, który inicjuje skurcz. Mięśniowa kinaza fosforylazy ma 4 typy podjednostek: ot, (J, y i 5, w strukturze, którą można, przedstawić jako (apy§)4. Podjednostki a i p mają reszty seryny, które są fosforylowane wskutek działania cAMP-zależnej kinazy białek. Podjednostka p wiąże 4 Ca2+ i jest identyczna z białkiem wiążącym Ca2+ — kalmoduliną (p. str. 595). Związanie Ca2ł aktywuje katalityczne miejsce

podjednostki y jedynie wówczas, gdy cząsteczka znajduje się w zdefo'sforylowanej konfiguracji b. Jednakże ufosforylowana postać a jest w pełni aktywna w obecności Ca2 + . Jest ważne, źe kalmoduiina jest podobna w swojej strukturze do TpC, białka wiążącego Ca2+ w mięśniach. Dodatkowa cząsteczka kalmoduliny lub TpC może oddziaływać z kinaza fosforylazy, powodując dalszą aktywację. Aktywacja skurczu mięśnia i glikogenolizy jest więc dokonywana przez to samo białko wiążące Ca2+, zapewniając w ten sposób synchronizację tych procesów. Glikogenoiiza w wątrobie może być niezależna od cAMP Pomimo, że głównym działaniem glukagonu w wątrobie jest powodowanie powstawania cAMP i aktywacja fosforylazy, badania wykazały, że receptory a, są głównymi pośrednikami pobudzenia glikogenolizy przez aminy katecholowe. Bierze w tym udział niezależna od cAMP mobilizacja Ca3+ z mitochondriów do cytozolu, w następstwie czego następuje pobudzenie wrażliwej na CV + kalniotfullnę kinazy fostorylary. Niezależną od cAMP glikogenolizę wywołują również wazopresyna, oksytocyna i angiotensyna II, działające przez wapń albo przez fosfatydyloinozytolobisfosforan, Inaktywacja fosforylazy następuje pod wpływem fosfatazy-1 białek Zarówno fosforylaza a, jak i kinaza a fosforylazy są defosforylowane i inaktywowane przez fosfatazę-1 białek. Fosfataza-ł białek jest hamowana przez białko zwane inhibitorem-1 które jest aktywne jedynie wówczas, gdy zostanie ufosforylowane działaniem cAMP-zależnej kinazy białek, W ten sposób cAMP kontroluje zarówno aktywację, jak i inaktywację fosforylazy (ryc. 20-6). Aktywność syntazy glikogenowej i fosforyłazy są regulowane wspólnie (p. ryc. 20-7) Podobnie jak fosforylaza, syntaza glikogenowa występuje w stanie ufosforylowanym i nie ufosforylowanym. Jednakże, odmiennie niż w przypadku fosforylazy, aktywną formą jest zdefosforylowany enzym (syntaza a glikogenowa), który może być zinaktywowany do syntazy b glikogenowej przez fosforylacje 7 reszt seryny wskutek działania co najmniej 6 różnych kinaz białek. Wszystkie 7 miejsc fosforylacji znajduje się na każdej z 4 identycznych podjednostek

Ryc. ZO-6. Kontrola fosforylazy w mięśniu (n = liczba reszt glukozy). Ciąg reakcji ułożonych jako kaskada pozwala na zwielokrotnienie (wzmocnienie) sygnału hormonal nego na każdym etapie, ___________

Adrenalina /t-recepior

B 7 3

©

O N

□

Nieaktywna cyklazaadenylanowa

Aktywna cyklaza adenytanowa G!lkogen|rg

+

G!lkogen(B+11

Glukozo-1 -fosforan

ATP Nieaktywna KINAZA BIAŁEK ZALEŻNA ODcAMP Aktywna KINAZA BIAŁEK ZALEŻNA OOeAMP

| FOSFOHYLAZA a (aktywna)

KALMODULINOWY SKŁADNIK KINAZY FOSFORYLAZY

lnhlbttor-1 (nieaktywny)

ATP-

KINAZA b FOSFORYLAZY (nieaktywna)

FOSFATAZA-1 BIAŁEK

KINAZA a FOSFORYLAZY (aktywna)

FOSFORYLAZA b (nieaktywna)

ADP

FOSFATAZA-1 BIAŁEK lnhlbltor-1 ufoeforylowany (aktywny) F05FOOIESTERAZA I cAMP ----------------------------------------------*■ 5'-AMP

METABOLIZM GLIKOGENU / 223 Adrenalina /(-receptor Aktywna eyklaza adenylanowa

Nieaktywna eyklaza ----------adenylanowa

O F05F0DIESTERAZA ATP

cAMP SYNTAZA b GLIKOGENOWA (nieaktywna)

0

ADP

Nieaktywna KINAZA BIAŁEK ZALEŻNA OD CAMP Glu kozo-6-fosforan lnhlbltor-1 nieaktywny)

ATP KINAZA FOSFATAZ FOSFORYLAZY A BIAŁEK

• - 5 'A MP SYNTAZAa GLIKOGENOWA (aktywna)

Aktywna KINAZA BIAŁEK ZALEŻNA OD cAMP

FOSFATAZA-1 BIAŁEK

CaJ

Gllkogenln] + UDPG

KINAZA BIAŁEK ZALEŻNA OD KALMODULINY

lnhlbltor-1 u fosfory Iow any (aktywny)

R yc. 20 -7 . K ontrola syn tazy g likogenowe j w m ię śn iu (n = liczb a reszt g lukozy). C iąg rea kcji u łożo ny w kaskadę powoduje wzmocnienie na każdym etapie, pozwalając na to, że zaledwie nanomolowe ilości hormonu powodują znaczne zmiany stężenia glikogenu, GSK — kinaza -3, -4 i -5 syntazy glikogenowej, wężykowate strzałki — aktywacja allosteryczna.

enzymu. Dwie spośród wspomnianych kinaz białek są zależne od Ca2 + ,/kalmoduliny (jedna z nich to kinaza fosforyiazy). Inna z kinaz to cAMP-zależna kinaza białek, która pozwala na to, aby działanie hormonalne wywierane za pośrednictwem cAMP powodowało hamowanie syntezy glikogenu, zsynchronizowane z aktywa-

cją glikogenolizy. Pozostałe kinazy są znane jako kinaza-3, kinaza-4 i kinaza-5 syntazy glikogenowej. Glu kozo - 6-fo sfora n jest allosterycznym aktywatorem syntazy b glikogenowej, powodującym zmniejszenie Km dla UDP-glukozy i pozwalającym na syntezę glikogenu pod wpływem u fos fory Iow a nego enzymu. Glikogen wywiera

także hamujące działanie na tworzenie siebie samego, a insulina także pobudza wytwarzanie glikogenu w mięśniu przez sprzyjanie defosforylacji i wobec tego aktywacji syntazy b glikogenowej. Defosforylacja syntazy b glikogenowej zwykle odbywa się podczas działania fosfatazy-1 białek, która pozostaje pod kontrolą cAMP-zależnej kinazy białek (ryc. 20-7).

224 / ROZDZIAŁ 20

REGULACJA METABOLIZMU GLfKOGENU JEST EFEKTYWNA DZIĘKI RÓWNOWADZE MIĘDZY AKTYWNOŚCIAMI SYNTAZY GLfKOGENOWEJ I FOSFORYLAZY (p. ryc. 20-8) Syntaza glikogenowa i fosforyiaza są zarówno pod kontrolą substratów (przez allosterię), jak i pod kontrolą hormonalną. Nie tylko fosforylaza jest aktywowana przez zwiększenie stężenia cAMP (przez kinazę fosforyiazy), ale w tym samym czasie syntaza glikogenowa jest zamieniana w postać nieaktywną; obydwa skutki osiąga się za pośrednictwem cAMP-zaAdrenalina (wątroba.

leżnej kinazy białek. Wobec tego zahamowanie glikogenolizy wzmaga efektywną glikogenogeneze, natomiast zahamowanie glikogenogenezy zwiększa netto glikogenolizę. Istotne dla regulacji metabolizmu glikogenu jest stwierdzenie, że defosforylacja fosfory]azy a, kinazy fosforyiazy i syntazy b glikogenowej dokonuje się wskutek działania 1 enzymu o szerokiej swoistości — fosfatazy-1 białek. Z kolei fosfataza-1 biatek jest hamowana przez cAMP-zależną kinazę białek poprzez inhibitor-1 (ryc, 20-8). Wobec tego synchronicznie może zostać przerwana glikogenoliza, a wzmożona glikogenogeneza i odwrotnie, ponieważ kluczem do regulacji obydwóch tych procesów jest aktywność cAMP-zależnej

FOSFODIESfTERAZA

■*» cAMP

*-

Inhibitor 1 ufosiorylowany

KINAZABWLEK ZALEŻNA OD OAMP

Glukoza (wątroba) Glukoza Mleczan (mięsień 5-AMP

lnhlbllor-1

Byc. 20-8. Skoordynowana kontrola glikogenotizy i glikogenogenezy przez kinazy biatek zależne od cAMP. Reakcje, które prowadzą do gtikogenolizy, w rezultacie zwiększenia stężenia cAMP/zaznaczono grubymi strzałkami, a te, które są hamowane, zaznaczono przerywanymi strzałkami. Dzieje się odwrotnie, gdy stężenie cAMP zmniejsza się w wyniku aktywności f osf od testera zy, co prowadzi do glikogenogenezy.

METABOLIZM GLIKOGENU / 225

kinazy białek. Zarówno kinaza fosforylazy, jak i syntaza glikogenu mogą być odwracalnie fosforyiowane w więcej niż 1 miejscu przez odrębne kinazy i fosfatazy. Te wtórne fosforylacje modyfikuj;} wrażliwość pierwotnych miejsc fosforylacji na fosforylację i defosforylaeję. Jest to znane jako wielomiejscowa fosfory lacja, Głównym czynnikiem, który kontroluje metabolizm glikogenu w wątrobie, jest stężenie fosforyłazy a Ten enzym jest nie tylko etapem ograniczającym szybkość glikogenolizy, lecz także jest inhibitorem aktywności fosfatazy-1 białek, przez co kontroluje syntezę glikogenu (ryc. 20-8). Inaktywacja fosforylazy zachodzi jako wynik all o sferycznego hamowania przez glukozę wówczas, gdy jej stężenie zwiększa się po posiłku. Aktywacja jest powodowana pr2ez 5'AMP jako reakcja na wyczerpanie się ATP. Podanie insuliny powoduje niezwłoczną inaktywację fosforylazy z następującą aktywacją syntazyglikogenowej. Do osiągnięcia tych działań insuliny niezbędna jest obecność glukozy. Enzymy rozgałęziający i odgałęziający nie są regulowane. CHOROBY SPICHRZANIA GLIKOGENU SĄ DZIEDZICZNE Termin „choroba spichrzania glikogenu" jest ogólną nazwą używaną do opisania grupy zaburzeń dziedzicznych, charakteryzujących się odkładaniem nieprawidłowego rodzaju lub nieprawidłowych ilości glikogenu w tkankach. W typie 1 glikogenozy (choroba von Cierkego) zarówno kpjnórkj wątroby, jak i komórki kanalików krętych nerki są^ w charakterystyczny sposób przeładowane glikogenem. Jednakże te magazyny glikogenu me są dostępne, co uwidacznia się występowaniem hjgoglikemii i brakiem uwalniania glukozy pod wpływem takich bodźców, jak adrenalina lub glukagon. U chorych tych obserwuje się także ketozę i hiperlip.emiL.co jest charakterystyczne~aTa"Ófgai)izmu pozbawionego węglowodanów. W wątrobie, nerce i w ścianie jelit aktywność glukozo-6-fosfatazy jest skrajnie mała lub w ogóle jej nie ma. Typ II (choroba Pompego) jest zgubny i charakteryzuje się niedoborem lizosomalncj a-l-»4i l-*6-glukozydazy {kwaśnej maltazy), której 15 — Biochemia

funkcją jest degradowanie glikogenu nagromadzającego się w Uziomach. Typ 11.1 (graniczna dekstrynoza; choroba Forbesa albo Coriega) charakteryzuje się brakiem enzymu odgałęziającego, co powoduje nagromadzanie charakterystycznego rozgałęzionego polisacharydu. Tj_pJV (amylopektynoza: choroba Andersena) wynika z nieobecności enzymu rozgałęzi ającego^czego rezultatem jest to, że gromadzi się polisacharyd mający niewiele punktów rozgałęzienia. Zgon następuje zwykle w pierwszym roku życia z powodu niedomogi serca lub wątroby. Brak mięśniowej fosforylazy (miofosforylazy) jest przyczyną glikogenozy typu V (glikogenoza z niedoboru miofosforylazy; zespół McArdle'a). Chorzy wykazują zwykle znacznie zmniejszoną tolerancję na wysiłek. Chociaż ich mięśnie szkieletowe wykazują nienormalnie dużą zawartość glikogenu (2,5—4,1%), w krwi tych chorych po wysiłku wykrywa się tylko w niewielkim stężeniu mleczan lub też całkowicie go brak. Wśród chorób spichrzenia glikogenu opisano także niedobór fosforyiazy w wątrobie (typ VI; choroba Hersa), niedobór fosfofruktokinazy w mięśniach i w erytrocytach (typ VII; choroba TaruPego) oraz glikogenozę, w której występuje niedobór wątrobowej kinazy fosforylazy (typ VIII). Donoszono również o niedoborach kinazy adenylanowej i cAMP-zależnej kinazy białek.

PIŚMIENNICTWO Cohen P: Conirol ofEnzyme Acthity, 2nd ed. Chapman & Hali, 1983. Cohen P: Thc role of protein phoaphorylation in the hormonal control of enzyme activity. Eur J Biochem 1985; 151:439. Exton JH: Molecular mechanisms involved in a-adrenergic responses. Mol Cel! Endocrinoi 1981; 23:233. Geddes R: Glycogcn: A metabolic viewpoint. Bioscience Rep 1986;6:415. Hers HO: The control of glycogen metabolism in the liver. Annu Rev Biochem 1976;45:167. Randle PJ, Steiner DF, Whelan WJ (editors): Carbohydrate Metabolism and Its Disorders. Vol 3. Academic Press, !98i. Siriver CR et al (editor): The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6th ed. McGraw-Hill, 1989. Sperlmg t), de Vries A (editors): Inborn Errors of Metabolism in Man. Karger, 1978.

2 1

Glukoneogeneza i kontrola stężenia glukozy we krwi Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE W procesie glukoneogenezy_ uczestniczą wszystkie "mechanizmy ~i s~zlaki odpowiedzialne za przekształcenie związków nie węglowo danowych.w glukozę lub glikogen,_Gtówny_mi_s_ubstratami dla glukoneogeMeży są glikogenne aninokwasy, mleczan, glicerolj (istotny u przeżuwaczy) propionian. Głównymi tkanka mi. w których odbywJTśię ten proces, są wątroba ingJŁjgdyż one właśnie zawierają pełen zestaw niezbędnych do tego enzymów. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Glukoneogeneza zaspokaja zapotrzebowanie organizmu na glukozę wówczas, gdy. węglowodany nie są dostępne w wystarczającej ilości z dostarczanych pokarmów. Ciągłe dostarczanie glukozy jest niezbędne jako źródło energii, zwłaszcza dla układu nerwowego i dla erytrocytów. Poniżej pewnego krytycznego stężenia glukozy we krwi występuje zaburzenie czynności mózgu, które w warunkach ciężkiej hipoglikemii może prowadzić do śpiączki i zgonu. Glukoza jest także potrzebna w tkance tłuszczowej jako źródło glicerolu glicerydów i prawdopodobnie odgrywa rolę w utrzymaniu odpowiedniego stężenia związków pośrednich cyklu cytrynianowego w wielu tkankach. Wiadomo, że nawet w warunkach, w których tłuszcze mogą pokrywać większość zapotrzebowania energetycznego organizmu, zawsze istnieje pewne podstawowe zapotrzebowanie na glukozę. W dodatku glukoza jest jedynym źródlem.snergii dla mięśnia szkieletowego w warunkach beztlenowych. Jest_ prekursorem cukru mleka_

( ą X i y X ^ J l ^ J ^ ę i pobierana przez płód. EodfiS!^ glukoneogenezy są także usuwane z krwi produkty metabolizmu innych tkanek, np. mleczan wytwarzany przez mięśnie i erytrocyty oraz glkerol, który jest stale wytwarzany przez tkankę tłuszczową. Propionian. główny glikogenny kwas tłuszczowy, wytwarzany podczas trawienia węglowodanów przez przeżuwacze, jest najważniejszym, substratem glukoneogenezy u tych gatunków. GLUKONEOGENEZA OBEJMUJE REAKCJE GLIKOLIZY, CYKLU CYTRYNIANOWEGO ORAZ NIEKTÓRE REAKCJE SPECJALNE (p. ryc. 21-1) Bariery termodynamiczne zapobiegają prostemu odwróceniu glikolizy Krebs zwracał uwagę na to, że bariery energetyczne nie pozwalają na proste odwrócenie glikolizy: 1) pomiędzy pirogronianiem a fosfoenolopirogronianem, 2) pomiędzy fruktozo--1,6-bisfosforanem a fruktozo-6fosforanem. 3} pomiędzy glukozo-6-fosforanem a glukozą: oraz 4) pomiędzy glukozo-1fosforanem a glikoge-nem. Wszystkie te reakcje nie są w stanie równowagi, uwalnla}ą~cl:użą ilość energii w postaci ciepła i wobec tego są fizjologicznie nieodwracalne. Są one omijane poprzez specjalne reakcje.

Pirogronian i fosfoenolopirogronian.

W mitochondriach znajduje się enzym karboksylaza pirogronianowa, który w obecności ATP, jednej z witamin B — biotyny. — oiaz^COi,. przekształca pirogronian w szczawiooctan. Funkcją biotyny jest związanie CO3 na enzymie

GLUKONEOGENEZA I KONTROLA STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI / 227

przed przyłączeniem go_do pirogronianu. Drugi :iuj m karLoi^^4ft»z»fo^enolopirogroriiano wa, katalizuje przekształcenkjzczawiogctan.u. do rosibepolopirogroiuanu. W tej reakcji jest niezbedjLy.bogato-energetyczny fosforan w postaci GTP lub-ITP. a uwalnia.si? GO.. Wobec tego, za pomocą tvch 2 enzymów i dehy drogenazy mleczanowej, mliyTan możt- hyć ^ ^ p goięrjia^kury i W-wa królika karboksykinaza fosfoeri ol ii)ii rtwwMua.no.wa jest enzymem mi loch ond Halnym i fosfoenolopirogronian jest transportowany do cytozolu w celu przekształcenia go w fruktozo- 1,6-bisfosforan przez odwrócenie glikolizy. U szczura i u myszy len cnzvm jest w cvlo7ohi. a 1 e.. szcza wi noc ran nie dyCuadiĄ]e]a^twQ.iLJJiaQdig.ndriów, Dostępne są natomiast alternatywne środki do osiągnięcia tego samego skutku końcowego; polegają one na przekształceniu szcza wio octan u w związki, które mogą łatwo dyfundować z mitochondriów, i późniejszej rekonwersji do szczawiooctanu w pozamitochondrialnej części komórki. Takim związkiem jest jabłezan, którego tworzenie ze szczawiooctanu w mi loch on dri ach i rekonwersja do szczawiooctanu w pozamitochondrialnym kompartmencie przebiega z udziałem dehydrogenazy jabłezanowej. W_w^trobje_człoi i i i k ^ morskiejj_wołu_teiL enzym jest chojidrjaroi -i Qtazolem. Fruktozo-6-fosforan i fruktozo-1,6- bisfosforan. P£zekszUiceni£_iruklozo-l,ć-bisfosibraiiu ..do. fruktozo-ń-fosforanu konieczrie_ dq_osiagnięcia odwrócenia ^likolizy^ jest katalizowane przez swoisty enzym fruktozJir.lU6-bisfosfąt^S. Jest to kluczowy enzym także z innego punktu widzenia, ponieważ jego obecność warunkuje _.to, czy dana tkanka jest /dolna do biosyntezy glikogenu nie tylko z pirogromanu, lecz także z fosfotrioz. Enzym len \vy stępuje, w. wątrobie i w iiertctch, wykazano jego występowanie także w mięśniu szkieletowy ni. U w;iża się, ze nie występuje on w mięśniu .serc.uw^KLLW mięśniu"gładkim. Glukozo-6-fosforan i glukoza. jYz_e r k_sztaicenie—gJukjOZOj^fosforanu _w__jgl_ukozę jest _ katalizowane przez inna .aiwrintTi fncfalsizę glukozo-6-fosfatazc. Występuje ona hi i \« nerkąf h ale nie ma jej w mięśniu i w tkance tłuszczowej. Obecność jej podwala tkance na_oddawaiiie„glukQzy do krwi. Glukozo-1 -fosforan i glikogen. Roz-

talizowany przez fosforylaze. Biosynteza glikogenu odbywa się całkiem odmiennym szlaJdem, przez utworzenie urydynodifosfoglukozy i z udziałem syntazy glikogenowej (p. ryc: 20-1). Te kluczowe enzymy pozwalają na to, że odwrócenie glikolizy odgrywa zasadniczy rolę w glukoneogenezie. Zależności między gluko-..neagenezą a flakiem glik o litycznym przedstawiono na ryc. 21-1. Aminokwasy glikogenne po transaminacji lub dcaminacji tworzą albo piro-gronian. albo stają się członami cyklu kwasu cytrynowego. Wobec tego powyżej opisane reakcje są odpowiedzialne za przekształcenie w glukozę lub glikogen zarówno aminokwasów gli-kogennych, jak i mleczanu. Wiadomo, że mle-_ cjąn przekształca się w pirogronian i wnika do mitochondriów przed przekształceniem do szczawiooctanu i ewentualnym przekształceniem w glukozę. Propitmian jest głównym źródłem glukozy u przeżuwaczy i wchodzi do głównego szlaku glukoneogenezy przez cykl kwasu cytrynowego po przekształceniu w sukcynylo-CoA. _Pxapioniań jest najpierw aktywowany z udziałem ATP i CoA przez odpowiednią syntetazę acylo-CoA. Propionylo-CoA, produkt tej reakcji, uczestniczy w reakcji wiązania -CQ^ katalizowanej przez karboksylazę propionylo-CoA, czego wynikiem jest wytworzenie D^jnelyljQnia=..... lonyb-CoA (ryc. 21-2). Ta reakcja jest analogiczna do reakcji wiązania CO2 do acetylo-CoA przez karboksylazę acetylo-CoA (p. rozdz. 23), w której powstaje pochodna malonylowa, co wymaga udziału jednej z witamin — biotyn^ — jako koenzymu. D-Metylomalonylo-CoA musi być zamieniony w jego stereoizomer L-metylomalonylo-CoA przez racemaze mety-lomalonylo-CoA, zanim nastąpi ostateczna izomeryzacja do sukcynylo-CoA. katalizowana przez izomerazę metylomalonylo-Co A, wymagającą witaminy B12 jako koenzymu. Wynikiem niedoboru witaminy B12 u ludzi i zwierząt jest wydalanie dużych ilości metylomalonianu (acy-duria metylomalonowa). Chociaż przemiana do bursztynianu jest głównym szlakiem metabolicznym propionianu, to jednak może on zapoczątkowywać, w tkance tłuszczowej i gruczole sutkowym, wytwarzanie kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgla. Kwasy tłuszczowe C, 5 i C 17 znajdują się w tłuszczach, zwłaszcza u przeżuwaczy. Glicerol jest produktem metabolizmu tkanki tłuszczowej i tylko te tkanki, które mają enzym

228 / ROZDZIAŁ 21 Glukoza

J!gLUKOZt>6-f

ATP

oiui««o-

JGLUKOKINAZAl

o- ^s ^_

| HEKSOKIKAZA]

Aop

j

-fosforan OSFAT AZA |j

J?

t

H2O Glikogen AMP FHUKTOZO-1,6B(SFOSFATAZA

FruktozoH|,6-blsfosforan"

A

T Gliceroloaldshyd o-3- fo sf o ran

! cAMP (glukagon)

e

\e \

fFOSFOFRUKTOKINAZA ADP

FruWozo-^6-blsfosforan e

AMP

rp

Fruktozo„_^ 1,3-BtetosfogH(»rynlan

DEKYDHOGENA2A GLICEROLO-.FOSFORANOWA __________________CAMP - 2.6-btefosforan (glukagon)

ATP 3Foefogllcerynlan

KINAZA GLICEROLOWAl P-dihydroksyacetor; KAD H

2-Fo8fogllo«ynlen cAMP (glukagon;

GI!cerolo-3-fosforan ■ Fosfoenoloplrogronian . GDP + CO,

-ADP

f

|0

Q

/ Alanina

A

Kwasy ATP tłuszczowa Cytrynian

Plrogronlan—

L Mleczan

NADH

KARBOKSYU\ZA PtROGRONIANOWA

Cykl kwaau cylrynowago akstoglutaran

/

GLUKONEOGENEZA i KONTROLA STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI /

229

Hyc. 21 -1. Główne szlaki i regulacja glukoneogenezy i glikolizy w wątrobie. Punkty wejścia giikogennych aminokwasów po ich transaminacji są zaznaczone znaczkami s—* (p. też ryc. 18-7). Kluczowe enzymy glukoneogenezy są obwiedzione podwójną ramką. ATP niezbędny do glukoneogenezy powstaje w procesie utleniania kwasów tłuszczowych o długim łańcuchu węglowym. Propionian ma ilościowe znaczenie jedynie u przeżuwaczy. Wężykowatymi strzałkami zaznaczono efekty allosteryczne, a strzałkami z przerywaną linią — kowalencyjną modyfikację przez odwracalną fosforylację. Duże stężenia alaniny działają jak „sygnał do glukoneogenezy" przez zahamowanie glikolizy na etapie kinazy pirogronianowej. KARBOKSYLAZA I CH3 CoA»SH PROPIONYLO-CoA ' H-C-COO" CO-S-CoA D-Mstytomaionylo-CoA RACEMAZA METYLOMALONYLO-CoA IZOMEHAZA METYLOMALONYLO-CoA

coointermedlaty cyklu kwasu cytrynowego

ĆHj "** B„

CH,

Koenzym

^OOC-Ć-H

CO-S-CoA Sukcynylo-CoA

CO-S-CoA L-Metyfomalonylo-CoA

Ryc. 21-2. Metabolizm propionianu.

aktywujący go, kinazę glicerolową, mogą go zjiżjttfeewać. Enzym ...tflii, wyTtiagaja6Ł-..AIT, znajduje się poza innymi tkankami także w wątrobie i w nerce. Kinaza Hiceroinwa, ^trilizi^ie, zamianę glicerolu w glicerolo-3-ibsfonia. Łączy się to z etapem triozofosforanów szlaku glikolitycznego, gdyż gjicerolo^fosioran może.hyi utleniony __djŁ__dih^droksyacetonofosforan\] przez NAD+ w obecności dehydrogenazy glicerolo-Ś^^^nUffief Wątroba i nerka są zdolne do zamiapy ąlicera lii w -glukozc krwi dzięki y ^ y y ^ _ z y ^ i y _ zymów^jkolizy i swoistych enzymów, szlaku glukoneogenezy, fruktozo-ł,6-bisfosfatazy i glukozo-6-fosfatazy (ryc. 21-1).

GLIKOLiZA I GLUKONEOGENEZA DZIELĄ TEN SAM SZLAK. MUSZĄ BYĆ WOBEC TEGO WZAJEMNIE KONTROLOWANE Zmiany w dostępności substratów są albo bezpośrednio, albo pośrednio odpowiedzialne za większość zmian w metabolizmie. Wahania

stężeń substratów we krwi, spowodowane zmianami ich dostępności z pokarmów, mogą zmieniać szybkość wydzielania hormonów, które z kolei wpływają na przebieg szlaków metabolicznych, zmieniając często aktywność kluczowych enzymów w taki sposób, że dążą one do skompensowania pierwotnych zmian w dostępności substratu. Można zidentyfikować 3 typy mechanizmów odpowiedzialnych za regulację aktywności enzymów uczestniczących w metabolizmie węglowodanów, a wymienionych w tab. 21-1: 1) zmiany szybkości syntezy enzymu, 2) kowalencyjna modyfikacja przez odwracalną fosforylację oraz 3) efekty allosteryczne.

Indukcja i represja kluczowych enzymów nie jest szybka, ale zachodzi w ciągu kilku godzin

W tabeli 21-1 wymieniono niektóre z tych lepiej udokumentowanych zmian aktywności enzymów, co do których wiadomo, że zachodzą w różnych warunkach metabolicznych. Informacja w tej tabeli odnosi się głównie do wątroby. Enzymy tutaj zaangażowane katalizują reak-

230 / ROZDZIAŁ 21 Tabela 21-1. Enzymy regulacyjne adaptacyjne u szczura (głównie w w ą tro b ie )

Aktywność przy karmie-

głodze-

niu węglowodanami

niu i w cukrzycy

Induktor

Rep resor

Aktywator

Inhibitor

Enzymy glikogenogenezy,glikolizy utleniania pirogron i anu Układ syntazy glikogenowej

t

1

Insulina

Insulina

Glukokinaza

t

1

Insulina

Fosfofruktokinaza-1

T

I

Insulina

Kinaza pirogronianowa

t

1

Dehydrogenaza pirogron Janowa

I

I

'Cytrynian (kwasy tłuszczowe, ciała ketonowe), *ATP, glukagon (cAMP) ATP, alanina, glukagon (cAMP), adrenalina CoA, NAD, insu- Acetylo-CoA, lina', ADP, piro- NADH, ATP (kwagron ian sy tłuszczowe. ciała ketonowe)

Giukokortykoidy, Insulina glukag on, adrenalina {cAMP) Giukokortykoidy, Insulina glukagon, adrenalina (cAMP) Giukokortykoidy, Insulina glukagon, adrenalina (cAMP)

*Acetylo-CoA

Heksokinaza Glukagon (cAMP)

Glukagon (cAMP), fosforylaza, glikogen *Glukozo-6-fosforan

*AMP, "fruktozo-6-fosforan, *Pj *fruktozo-2,6-bisfosforan Insulina, fruktoza Glukagon (cAMP) *Fruktozo-1,6-bisfosforan

Enzymy glukoneogenezy Karboksylaza pirogron i a nowa

I

T

Karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa Fruktozo-1,6-bisfosfataza

1

I

I

I

Glukozo-6-fosfa-

1

T

taza

Giukokortykoidy, Insulina glukagon, adrenalina (cAMP)

Enzymy szlaku pentozofosforanowego i lipogenezy Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa Dehydrogenaza 6-fosfoglukonianowa „Enzym jabłczanowy"

T

1

I

I

I

i

Insulina

Insulina

Insulina

*ADP

Glukagon?

Glukagon (cAMP) *Fruktozo-1,6-bisfosforan, *AMP, fruktozo-2,6-bisfosforan

___________________GLUKONEOGENEZA

I KONTROLA STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI / 231

cd. tab. 21 -1 Aktywność przy karmieniu węglowa -

głodzeniu i w cu-

Induktor

danami

krzycy

ATP-liaza cytry-

T

1

Insulina

nianowa Karboksylaza acetylo-CoA

t

I

Insulina?

Syntaza kwasu tłuszczowego

T

I

Insulina?

Rep resor

Aktywator

* Cytrynian, insulina

Inhibitor

ADP Długotań cuch owy acylo-CoA, cAMP, glukagon

Ali o sferyczny " W tkance tłuszczowej, ale nie w wątrobie

cje^nie będące w sianie równowagi i można je uważać raczej za fizjologicznie przebiegające :,w jedną stronę" niż osiągające stan równowagi. Często wymienione w niej procesy są wzmocnione, ponieważ aktywność enzymów katalizujących zmiany w odwrotnym kierunku ulega równoczesnym zmianom (ryc. 21-1). Jest ważne, aby kluczowe enzymy zaangażowane w odpowiedni szlak metaboliczny ulegały w sposób skoordynowany aktywacji lub hamowaniu. W tabeli 21-1 pokazano, że tak jest rzeczywiście. Wszystkie enzymy uczestniczące w zużywaniu glukozy (tj. enzymy glikolizy i lipogenezy) stają się bardziej aktywne wówczas, gdy występuje obfitość glukozy, natomiast w tych warunkach enzymy odpowiedzialne za wytwarzanie glukozy podczas glukoneogenezy wykazują małą aktywność. Wydzielanie insuliny, które jest wrażliwe na stężenie glukozy we krwi, wzmaga biosyntezę enzymów odpowiedzialnych za glikolizę. Podobnie wydzielanie insuliny przeciwdziała pobudzaniu enzym ów; odpowiedzialnych za glukoneogeneze, a zachodzącej jako efekt działania glikokortykosteroidów i cAMP powstającego pod wpływem glukagoiiu. Wszystkim tym działaniom, które mogą być wyjaśnione indukcją lub represją enzymów, można zapobiec działaniem czynników blokujących biosyntezę białka, takich jak puromycyna i etionina. Wykazano, że jest regulowany mRNA tych enzymów i że zachodzi modulacja ekspresji ich genów.

Obydwie dchydrogenazy cyklu pentozofosforanowego mogą być zaliczone do enzymów adaptacyjnych, gdyż ich aktywność zwiększa się u dobrze odżywionych zwierząt oraz po podaniu insuliny zwierzęciu z cukrzycą. Aktywność tych enzymów jest mała w cukrzycy i w okresie głodzenia. Podobnie zachowują się „enzym jabłczanowy" i ATP-zależna liaza cytrynianowa, co wskazuje na to, że te 2 enzymy są raczej zaangażowane w lip o genezę niż w glukoneogenezę. Kowalencyjna modyfikacja przez odwracalną fosfory iację zachodzi szybko Glukagon, a_3'.imii£jszj:tn,stopniu adrenalina, hamują glikoli/ę, natomiast pobudzają glukoneogenezę w wątrobie przez zwiększenie stężenia cAMP, który z kolei aktywuje cAMP-zależną Klnazę białek, doprowadzając do foslbrylacji i inaktywacji kinazy pirogronianowej. Obydwa te hormony wpływają również na stężenie fruktozo-2,6-bisf o sfor an u i w^obec tego na glikolizę i gluk one o genezę w sposób wyjaśniony poniżej. Aliosteryczna modyfikacja jest również szybka Znane są przykłady z metabolizmu węglowodanów, ilustrujące allosteryczną regulację enzymu. W procesie glukoneogenezy synteza szczawiooetanu z wodorowęglanu i pirogroniahu, Aktora jest katalizowana przez karboksylazę

232 / ROZDZIAŁ 21

pirogi omanowy, wymaga obecności acetyl o-Co A jako aktywatora allosterycznego. Dodanie acetyl o-Co A powoduje zmianę czwartorzędowej struktury białka, zmniejszając wartość Km dla wodorowęglanu. To działanie ma ważne następstwa dla samoregulacji przemian pośrednich: gdy powstaje acetylo-CoA z pirogronianu, przez aktywację karboksylazy pirogronianowej, zapewnia on niejako automatycznie dostarczanie szczawiooctanu i wobec tego możliwość swojego dalszego utleniania w cyklu kwasu cytrynowego. Aktywacja karboksylazy pirogronianowej i równoczesne hamowanie dehydrogenazy pirogronianowej przez acety-loCoA, powstający z utjeniania kwasów tłuszczowych, pomaga wyjaśnić oszczędzające działanie utleniania kwasów tłuszczowych na utlenianie pirogronianu w wątrobie i pobudzenie glukoneogenezy wątrobowej. Odwrotny stosunek między aktywnością dehydrogenazy pirogronianowej a karboksylazy pirogronianowej zarówno w wątrobie, jak i w nerce zmienia metaboliczne losy pirogronianu wówczas, gdy tkanka przechodzi z utleniania węglowodanów podczas glikolizy na gl ukoneogenezę. Taka zmiana ma miejsce przy przechodzeniu stanu poresorpcyjnego w stan głodu (ryc. 21-1). Zasadniczą rolą utleniania kwasów tłuszczowych w pobudzaniu glukoneogenezy jest dostarczanie ATP, potrzebnego w reakcjach karboksylazy pirogronianowej i kar boksy kinazy fosfoenolopirogronianowej. Innym enzymem, który podlega kontroli na zasadzie hamowania zwrotnego, jestJfosjMruk-. tokinaza (fosfofrukrokinaza-1). Zajmuje ona kluczową pozycję w regulacji glikolizy. Fosfofruktokinaza-1 jest hamowana przez cytrynian i przez ATP, natomiast jest aktywowana przez AMP. AMP działa jak wskaźnik stanu energetycznego komórki. Obecność kinazy adenylanowej w wątrobie i w wielu innych tkankach pozwala na szybkie osiągnięcie równowagi reakcji: 2ADP ATP + AMP Kiedy ATP jest zużywany w procesach wymagających energii, czego rezultatem jest powstawanie ADP, wtedy zwiększa się [AMP]. Ponieważ w stanic równowagi [ATP] może być 50-krotnie większe od [AMP], małe cząstkowe zmniejszenie [ATP] spowoduje wielokrotne zwiększenie [AMP]. Duża zmiana w [AMP] jest zatem wyrazem tego, że działa ona jako wzmacniacz malej zmiany w [ATP]. Ten mechanizm

pozwala na to, że aktywność fosfofruktokinazy--1 jest bardzo czuła nawet na małe zmiany w stanie energetycznym komórki i że kontroluje ona ilość węglowodanów ulegających giikolizie przed wejściem do cyklu kwasu cytrynowego. Zwiększenie stężenia AMP może być również wyjaśnieniem, dlaczego glikoliza zostaje pobudzona w czasie niedotlenienia, gdy [ATP] maleje. Równocześnie AMP aktywuje fosforylazę, wzmagając glikogenolizę. Inhibicja fosfofruktokinazy-1 przez cytrynian i ATP mogłaby być jeszcze jednym wyjaśnieniem oszczędzającego działania utleniania kwasów tłuszczowych na utlenianie glukozy, a także wyjaśnieniem efektu Pasteura; ten ostatni jest zjawiskiem hamowania beztlenowego (anaerobowego) metabolizowania glukozy przez jej aerobowe utlenianie (w cyklu kwasu cytrynowego). Konsekwencją zahamowania aktywności fosfofruktokinazy-1 jest nagromadzenie glukozo-6-fosforanu, który z kolei hamuje dalsze pobieranie glukozy w tkankach po za wątrobowych przez allosteryczne hamowanie heksoldnazy.

Fruktozo-2,6-bisfosforan odgrywa wyjątkową rolę w regulacji glikolizy i glukoneogenezy

Najbardziej skutecznym pozytywnym efektom cemall o sferycznym fosfofruktokinazy-1, a inhibitorem fruktozo-1,6-bis fosfatazy w wątrobie, jest fmktozo-2,6-bisfosforan. Żnosj^onjha; mowanie fosfolruktokinazy-l przez ATP i powoduje zwiększenie powinowactwa do fruktozo-6-fosforanu. Powoduje trjzo-jjć-Jbisfosfatazy przez zwiększenie wartości K„, dla fruktozo-l,6-bisfosforanu. Jego stężenie jest zarówno pod kontrolą substratową (allosteryczną), jak i hormonalną (modyfikacja kowalencyjna) (ryc. 21-3). Fruktozo-2,6-bisfosforan powstaje przez fosforylację fruktozo-6-fo sforami działaniem ?5sfofruktokinazj-2, Zo^samo białko enzymatyczne jest odpowiedzialne również za jego rozpad, ponieważ ma także aktywność fruktozo-lłó-bisfosfatazy. Ten bifunkcyjny enzym jest pod allosteryczną kontrolą fruktozo-6-fósTo7anu7Tćtóregó" zwiększone stężenie występująre~przx;pbfitości glukozy, a więc w stanie poposiłkowym pobudza kinazę oraz hamuje fosfatazę. Jeżeli natomiast występuje niedobór glukozy, glukagon pobudza wytwarzanie cAMP, aktywując cAMP-zależną kinazę białek, która z kolei inaktywuje fosfofruktokinazę-2 oraz aktywuje fruktozo-2,6-bisibsfatazę przez fosforylację.

G LU K O N E O G E N E Z A I K O N TR O L A S T Ę ŻE N IA G LU K O Z Y W E K R W I / 23 3

że to, że gobudzeoie glikogenoUzj; glukagonem w_wątrobie prowadzi raczei do uwalniania glukozy niż do wzmożonej gtikolizy.

Glukoza I Glikogan Fr u Ktoz o-6-f □ sio ran

KINAZA BIAŁEK ZALEŻNA 00 cAMP

Glukagon Fru ktozo-1,6-bisf osforan

Cykle substratowe (daremne) pozwalają na subtelne dostrajanie

W wielu punktach kontrolnych glikolizy i metabolizmu glikogenu są zawarte cykle fosforylacji i defosforylacji, np. glukokinaza/glukozo6--fosfataza; fosfofruktokinaza- l/fruktozo1,6--bisfosfataza; kinaza pirogronianowa/karbo-ksylaza pirogronianowa/karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa. Gdyby były one pozostawione bez kontroli, wówczas stanowiłyby ilościowo pokaźne cykle daremne, których rezultatem końcowym byłaby jedynie hydroliza ATP. To, że tak się nie dzieje na wielką skalę, zabezpieczają różne mechanizmy kontrolne, dzięki którym jedno ramię cyklu jest hamowane wówczas, gdy przeciwne ulegają pobudzeniu zgodnie z potrzebami tkanki i całego organizmu. Jednakże w pewnych przypadkach może istnieć korzyść z tego, że cykl przebiega swobodnie. Na przykład w cyklu foslbfruktokina-zal/fruktozo-1.6-bisfosfataza, zachodzi wzmocnienie efektu allosterycznego modyfikatora fruktozo-2,6-bisfosforan u, powodując większy przepływ metabolitów w którymkolwiek kierunku, niż miałoby to miejsce bez udziału cyklu substratowego. To „subtelne dostrajanie" kontroli metabolicznej zachodzi jedynie kosztem utraty pewnej ilości ATP.

Piróg ronlan

STĘŻENIE GLUKOZY KRWI

R y c . 21 -3 . K o n tro la gt ik o l iz y i g lu k o ne o g e n ez y JEST PRECYZYJNIE REGULOWANE w wątrobie przez fnjktozo-2,6-bisfosforan ibifunkW WĄSKICH GRANICACH Gy^hy enzym PFK-2/F-2,6-Pazę <6-fosfofrukto-2kinazę/fruktozo-2,6-bisfosfatazę). PFK — fosfoW stanie poabsorpcyjnym stężenie glukozy fruktokinaza (S-fosfofrukto-1-kinaza), F-1,6-Paza u ludzi i u wielu ssaków waha się w granicach — fru ktozo-1,6- bisfosfataza. Strzałki wężykowate 4,5- 5,5 mmoi/L Pa.spożyc|uposiłku3!ęglmja> oznaczają efekty allosteryczne.

Przy nadmiar/i- glukozy zwiększa sig więc stężenie fniktozu-2.(t-hisfostoriinu, pobudzając gUkolize przez aktywację fosfofruktokinazy-1 oraz hamowanie fniktoziMj6-bisfosfatazy. W warunkach niedoboru-^glukozy gkjkoneogeneza jest pobudzana przez zmniejszenie stężenia fruktozo-2,6-bisfosforan u, który inaktywujc fosfolr.uktoJunazę-1 oraz znosi hamowanie fruktozo--1.6-bisfostatazy. Ten mechanizm zapewnia tak-

Hanowego może się ono zwiększać do 6,5—7,2 jńmoj/L-W czasie głodzenia stężenie glukozy zmniejsza się do"ok, JT-PT,? mmol/l. Stężenie glukozy we krwi ptaków jest znacznie większe (14,0 mmol/l), a u przeżuwaczy znacznie mniejsze (2,2 u owiec a 3,3 mmol/l u bydła). Te normalnie mniejsze stężenia wydają się być związane z faktem, że u przeżuwaczy właściwie wszystkie węglowodany pokarmu fermentują do niższych (lotnych) kwasów tłuszczowych, które w dużej mierze zastępują glukozę jako główne metaboliczne źródło energii tkanek w okresie między posiłkami. Gwałtowne zmniej-

234 / ROZDZIAŁ 21

szenie stężenia giukozyjwęjawgowoduje drgawki, podobnie~jak™przy przedawkowaniu insuliny, ze względu na bezpośrednie uzależnienie mózgu od dostawy glukozy. Jednakże znacznie mniejsze stężenia glukozy mogą być dobrze tolerowane pod warunkiem, że pozwoli się na stopniową adaptację; np. szczury zaadaptowane do diety boga to tłuszcz owej zachowują się zupełnie normalnie przy tak małym stężeniu glukozy we krwi, jak 1,1 mmol/1. GLUKOZA KRWI POCHODZI Z POKARMÓW, GLUKONEOGENEZY I GLIKOGENOLIZY

Glukoza węglowodanów w spoży-

tych pokarmach. Większość węglowodanów po Łtrawie-niu pokarmów~tó glukoza, galąktoza 1fruktoza. Są one transportowane do wątroby przez żyłę wrotną. G a laktoza i fruktoza są łatwo przekształcane w wątrobie w glukozę (p. rozdz. 22). Glukoza pochodząca z różnych związków glukogennych, które ulegają glukoneogenezie (ryc. 18-7 i 21-1). Są to związki 2 kategorii: 1) ulegające bezpośredniemu prze kształceniu w glukozę bez znaczącej recyklizacji, np. niektóre aminokwasy i propionian i 2) związki będące produktami częściowego meta bolizmu glukozy w niektórych tkankach, które po dostaniu się do wątroby i nerek są prze kształcane w glukozę. 1 tak mleczan, powstały z glukozy w mięśniach i erytrocytach, jest transportowany do wątroby i nerek, gdzie jest przekształcany w glukozę. W ten sposób ta ostatnia dostając się do krwi staje się ponownie dostępna dla tkanek do utleniania. Ten proces jest znany jako cykl Cori lub cykl kwasu mle kowego (ryc. 21-4). GUcerol do syntezy triacylogliceroli tkanki tłuszczowej pochodzi z glu kozy krwi. Acyloglicerole tkanki tłuszczowej ciągle ulegają hydrolizie, wytwarzając gjicerol, który nie może być zużytkowany przez tkankę tłuszczową i wobec tego dyfunduje do krwi. Jest on ponownie przekształcany w glukozę przez mechanizmy glukoneogenezy w wątrobie i w nerce (ryc. 21-1). Istnieje zatem ciągły cykl, w którym glukoza jest transportowana z wątroby i nerek do tkanki tłuszczowej, a glicerol powraca z tkanki tłuszczowej do wymie nionych narządów, aby ulec resyntezie do glu kozy. Wśród aminokwasów transportowanych

z mięśni do wątroby w czasie głodzenia _p_rgeważa alanina! DopfowacTzifoTo do postulowania istnienia cyklu glukozowo-alaninowego. przedstawionego na ryc. 21-4, w wyniku którego glukoza z wątroby przepływa do mięśni L utworzeniem tam pirogronianu ulegającego transaminacji do alaniny. Alanina jest następnie transportowana do wątroby, aby w procesie glukoneogenezy przekształcić się ponownie w glukozę. W ten sposób dokonuje się transport azotu aminowego z mięśni do wątroby oraz wolnej energii z wątroby do mięśni. Energia potrzebna do wątrobowej syntezy glukozy z pirogronianu pochodzi z utleniania kwasów tłuszczowych. Glukoza powstająca z glikogenu, wątroby podczas glikogenolizy, (p. rozdz. 20). Metaboliczne i hormonalne mechanizmy kontroli stężenia glukozy we krwi Utrzymywanie stałego stężenia glukozy we krwi jest jednym z najbardziej precyzyjnie regulowanych mechanizmów homeostatycznych i to takim, w którym odgrywa rolę zarówno wątroba, jak i tkanki pozawątrobowe, a także wiele hormonów. Przez komórki wątrobowe wydaje się swobodnie przenikać glukoza, podczas gdy komórki tkanek poza wątrobowych są dla niej stosunkowo nieprzenikalne. Wynikiem tego jest, że przechodzenie przez błony komórkowe jest etapem ograniczającym szybkość pobierania glukozy przez tkanki pozawątrobowe. Po wniknięciu do komórki glukoza jest szybko fosforylowana działaniem heksokinazy. Jest prawdopodobne, że na pobieranie glukozy przez wątrobę i jej oddawanie z wątroby do krwi bardziej bezpośredni wpływ wywierają aktywności niektórych enzymów i stężenia kluczowych związków pośrednich. Stężenie glukozy we krwi jest jednak ważnym czynnikiem kontrolującym szybkość pobierania glukozy zarówno przez wątrobę, jak i przez tkanki pozawątrobowe,

Glukokinaza jest ważnym regulatorem stężenia glukozy we krwi po posiłku. Należy zauważyć, że heksokinaza jest hamowana działaniem glukozo-6-fosforanu. Ten ostatni metabolit może więc wywierać pewne hamowanie zwrotne na pobieranie glukozy przez tkanki pozawątrobowe zależne od fosfory! o warna glukozy działaniem heksokinazy. Wątroba nie podlega takiemu ograniczeniu, ponieważ glukoki nic jest wrażliwa na działanie gmkozo-6-

Pirogronian .* .i^—i--!-—..«•■>•—--»•»■——ii-»»'.«" i*'

Ryc. 21-4. Cykl kwasu mlekowego (Cori) i cykl ala ni nowo- glukozowy.

236 / ROZDZIAŁ 21 Heksokinaza

.100

■o

50 o GlukoKinaza

0

5

10 15 Glukoza krwi, mmoi/1

20

25

Ryc. 21-5. Zmiany aktywności fosforylującej glukozę heksokinazy i glukokinazy w zależności od zwiększającego się stężenia glukozy we krwi. Km heksokinazy dla glukozy wynosi 0,05 mmol/i, a Km glukokinazy 10 mmol/l.

-fosforanu. Glukokinaza, która ma większą wartość Km (mniejsze powinowactwo) dla glukozy niż heksokinaza, zwiększa swoją aktywność wraz ze zwiększeniem stężenia glukozy w przedziale fizjologicznych stężeń tego związku (ryc. 21-5) i wydaje się w swoisty sposób sprzyjać pobieraniu glukozy do wątroby, w przypadku jej dużego stężenia występującego w żyle wrotnej po posiłku węglowodanowym. Brak glukokinazy u przeżuwaczy, u których niewiele glukozy przechodzi z jelita do krążenia wrotnego, wydaje się potwierdzać tę funkcję tego enzymu. Przy prawidłowym stężeniu glukozy w krążącej krwi (4,5—5,5 mmol/l), wątroba wydaje się być producentem glukozy. Jeżeli jednak stężenie gJukozy się zwiększa, to wydalanie glukozy przez wątrobę ustaje, a przy dużym stężeniu pobiera ona glukozę z krwi. Ustalono, że u szczura szybkość oddawania glukozy przez wątrobę staje się równa szybkości pobierania przy stężeniu w żyle wrotnej wątroby równym 8,3 mmol/l.

Insulina odgrywa centralną rolę w regulacji stężenia glukozy we krwi. Poza bezpośrednim wpływem hiperglikemii na pobieranie glukozy zarówno przez wątrobę, jak i tkanki obwodowe, zasadniczą rolę w regulacji stężenia gJukozy we krwi odgrywa hormon insulina. Wytwarzają ją komórki B wysp trzustkowych, a wydziela się do krwi wskutek bezpośredniej reakcji na hiperglikemię. Jej stężenie we krwi zmienia się równolegle ze stężeniem

glukozy, a szybkim skutkiem jej podania jest hipoglikemia. Do substancji pobudzających wydzielanie insuliny należą także aminokwasy, wolne kwasy tłuszczowe, ciała ketonowe, glukagon, sekretyna oraz lek tolbutamid. Adrenalina i noradrenalina blokują uwalnianie insuliny. Insulina pobudza natychmiast pobieranie glukozy przez takie tkanki, jak tkanka tłuszczowa i mięśniowa. To działanie jest spowodowane wzmożonym transportem przezbłonowym glukozy uwarunkowanym przeniesieniem transportera insulinowego z wnętrza komórki do błony plazmatycznej. Insulina nie ma natomiast bezpośredniego wpływu na penetrację glukozy do komórek wątrobowych. To stwierdzenie jest zgodne z faktem, że szybkość metabolizmu glukozy w komórkach wątrobowych nie jest ograniczana ich przenikalnością. Jednakże insulina wpływa pośrednio na pobieranie glukozy przez wątrobę, działając na enzymy kontrolujące glikolizę i glikogenogenezę. Glukagon jest hormonem wytwarzanym przez komórki A wysp trzustkowych. Jego wydzielanie jest pobudzane przez hipoglikemie. Gdy dostanie się do wątroby (przez żyłę wrotną), pobudza glikogenolizę przez aktywację fosforylazy. Większość endogennego giukagonu jest usuwana z krążenia przez wątrobę. Odmiennie niż adrenalina, glukagon nie ma wpływu na fosforylazę mięśni. Glukagon wzmaga również glukoneogenezę z aminokwasów i mleczanu. Zarówno glikogenoliza wątrobowa, jak i glukoneogeneza uczestniczą w hiperglikemizującym działaniu glukagonu, którego działania są przeciwne do insuliny. Przedni płat przysadki mózgowej wydziela hormony, które zwiększają stężenie glukozy krwi, a więc działają antagonistycznie w stosunku do insuliny. Są to: hormon wzrostu, kortykortofina (ACTH) i zapewne inne czynniki „diabetogenne". Wydzielanie hormonu wzrostu pobudza hipoglikemia. Hormon wzrostu zmniejsza pobieranie glukozy przez niektóre tkanki, np. przez mięśnie. Niektóre z tych działań mogą być nie bezpośrednie, wiadomo bowiem, że hormon wzrostu mobilizuje z tkanki tłuszczowej wolne kwasy tłuszczowe, które same zmniejszają zużycie glukozy. Długotrwałe podawanie hormonu wzrostu prowadzi do cukrzycy. Hormon wzrostu wywołując hiperghkemię, pobudza wydzielanie insuliny, powodując czasami wyczerpanie komórek B (i w konsekwencji cukrzycę).

GLUKONEOGENEZA I KONTROLA STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI / 237

Glikokortykosteroidy (11-oksosteroidy) są wydzielane przez korę nadnerczy i są istotne dla metabolizmu węglowodanów. Podanie tych steroidów pobudza glukoneogenezę. Zwiększenie glukoneogenezy jest wynikiem zwiększonego katabolizmu białek w tkankach, zwiększonego pobierania aminokwasów przez wątrobę i zwiększonej aktywności amino tran sfe raz i innych enzymów wątrobowych związanych z glukoneogenezą. Ponadto glikokortykosteroidy hamują zużycie glukozy w tkankach pozawątrobowych, działają więc anłagonistycznie w stosunku do insuliny. Adrenalinę wydziela rdzeń nadnerczy* pod wpływem bodźców stresogennych (strach, podniecenie, krwotok, hipoglikemia, hipoksja itd.). Pobudza ona glikogenoiizę w wątrobie i mięśniu wskutek pobudzenia fosforylazy. Brak glukozo-6-fosfatazy w mięśniach sprawia, że glikogenoliza wiąże się z powstawaniem mleczanu, podczas gdy w wątrobie głównym jej produktem jest glukoza, co jest przyczyną zwiększenia stężenia glukozy we krwi. Hormony tarczycy powinny być również rozpatrywane jako wpływające na stężenie glukozy we krwi. Istnieją dane doświadczalne przemawiające za tym, że tyroksyna ma działanie diabetogenne, a usunięcie tarczycy przeciwdziała rozwojowi cukrzycy. Zauważono również całkowity brak glikogenu w wątrobach zwierząt z tyreotoksykozą. U chorych z nadczynnością tarczycy stężenie glukozy we krwi na czczo jest zwiększone, natomiast jest zmniejszone u chorych z niedoczynnością tego narządu. Należy jednak dodać, że u chorych z nadczynnością tarczycy utylizacja glukozy przez tkanki jest normalna lub zwiększona, natomiast u chorych z hipotyreozą jest zmniejszona. Chorzy z niedoczynnością tarczycy są znacznie bardziej wrażliwi na hipoglikemiczne działanie insuliny niż osoby zdrowe lub chorzy z hipertyreozą. Glukozuria występuje wówczas, gdy jest przekroczony próg nerkowy dla glukozy Kiedy stężenie giukozy we krwi zwiększa się do stosunkowo dużego, wtedy również nerka działa regulująco na glikemię. Glukoza jest wciąż przesączana w kłębuszkach nerkowych, ale normalnie powraca w całości do krwi, ulegając wchłanianiu zwrotnemu w kanalikach nerkowych. Wchłanianie zwrotne glukozy wbrew gradientowi stężeń jest energochłonne i wymaga obecności ATP w komórkach kanali-

kowych. Zdolnoić kanalików nerkowych do wchłaniania zwrotnego glukozy jest ograniczona do ok. 350 mg/min. Gdy stężenie glukozy we krwi jest zwiększone, ilość przesączanej w kłębuszkach nerkowych glukozy przekracza pojemność resorpcyjną kanalików nerkowych w stosunku do glukozy i wówczas stwierdza się obecność glukozy w moczu, czyli glukozurię. U osób zdrowych glukozuria pojawia się wtedy, kiedy stężenie glukozy we krwi żylnej jest większe niż 9,5—10mmol/l. To stężenie jest nazywane progiem nerkowym dla glukozy. Glukozurię można wywołać u zwierząt doświadczalnych floryzyną, która hamuje układ reabsorbujący w kanaliku. To zjawisko jest znane jako glukozuria nerkowa. Glukozuria pochodzenia nerkowego może być wynikiem wrodzonych wad kanalikowych, może też być nabyta jako wynik procesów chorobowych. Stwierdzenie glukozurii jest często objawem cukrzycy (diabetes mellitus). Niedobór fruktozo-1,6-bisfosfatazy powoduje laktacydozę i hipogtikemię Blokowanie glukoneogenezy przez niedobór tego enzymu nie pozwala na przekształcanie w wątrobie mleczanu i innych substratów glukogennych w glukozę. Ten stan może być kontrolowany przez karmienie pokarmami o dużej zawartości węglowodanów. MOŻNA SIĘ PRZEKONAĆ O ZDOLNOŚCI ORGANIZMU DO ZUŻYWANIA GLUKOZY, OZNACZAJĄC JEGO TOLERANCJĘ NA GLUKOZĘ Wskaźnikiem tolerancji glukozy jest przebieg krzywej stężenia glukozy we krwi po podaniu określonej ilości glukozy (ryc. 21-6). Diabetes mellitus (cukrzyca, moczówka słodka) charakteryzuje się zmniejszoną tolerancją na glukozę spowodowaną niedostatecznym wydzielaniem insuliny (cukrzyca typu 1 albo cukrzyca insulinozależna; ang.: insulin-dependent diabetes mellitus. IDDM). Charakteryzuje się ona zwiększonym stężeniem giukozy we krwi (hipergiikemia) oraz glukozuria (cukromoczem), a mogą jej towarzyszyć zmiany metabolizmu tłuszczu. Tolerancja glukozy jest zmniejszona nie tylko w cukrzycy typu I, lecz także w stanach uszkodzenia wątroby oraz w niektórych zakażeniach, w cukrzycy typu II (cukrzycy niezależnej

238 / ROZDZIAŁ 21

może również wystąpić w nadczynności przysadki lub kory nadnerczy ze względu na antagonizm hormonów tych gruczołów wydzielania wewnętrznego w stosunku do działania insuliny. Insulina zwiększa tolerancję glukozy. Wstrzy-

knięcie insuliny zmniejsza zawartość glukozy we krwi i powoduje zwiększenie jej zużywania oraz magazynowania w formie glikogenu w wątrobie i w mięśniach. Nadmiar insuliny może spowodować ciężką hipnglikemię, prowadzącą do drgawek, a nawet do śmierci, jeżeli nie poda się szybko glukozy. Zwiększoną tolerancję glukozy obserwuje się w niedoczynności przysadki i kory nadnerczy, co można przypisać zmniejszeniu normalnego antagonistycznego działania kortyzolu w stosunku do insuliny, wskutek czego dochodzi do względnego jej nadmiaru. 1 Czas (h)

2

Ryc. 21-6. Test tolerancji glukozy. Krzywe stężenia glukozy we krwi osoby zdrowej i u chorego na cukrzycę po doustnym podaniu 50 g glukozy. Zauważ początkowe duże zwiększenie stężenia glukozy u chorego na cukrzycę. Kryterium normalności jest powrót stężenia glukozy do początkowej wartości w ciągu 2 h.

od insuliny; ang.: non-insulin-dependent diabetes mellitus, NIDDM), której towarzyszy zwykle otyłość i zwiększone stężenie wolnych kwasów tłuszczowych po podaniu niektórych leków oraz niekiedy również w miażdżycy. Cukrzyca

PIŚMIENNICTWO Krebs HA: Gluconeogenesis. Proc R Soc London (Biol) 1964;159:545. Ncwsholme EA, Chaliss RAJ, Crabtrcc B: Substratc cycles: Thcir role in improving sensitivity in mctabolic control. Trmds Biochem Sci 1984;9:277, Newsholme EA, Start C: Regulation in Metabolism. Wiley, 1973. Pagliara AS et al: Hepatic fruL-tose1,6-Diphosphatase deficiency, a cause of laciic acidosis and hypoglycemia in infaticy. ■/ Ciin Invest 1972;51:2l 15. Pilkis SJ, El-Maghrabi MR, Claus TH: Hormonal rcgulation of licpaiic gluconeogenesis and glycolysis. Anrtu Rev Biochem 1988;57:755. Watford M: What is the metabolic fate of dietary glucosc? Trends Biochem Sci 1988;13:329.

Szlak pentozofosforanowy oraz inne szlaki przemiany heksoz

2 2

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Szlak pentojofosforanowy aie generuje ATP, ale spełnia '2 główne tuli keje: l)j&#miuza NADJffl dk takich redukujących syntez, jak Biosynteza kwasów tłuszczowych i steroidów oraz 2) dostarcza rybozy do biosyntezy nuklcotydówTkwifsow riukieinowych. Glukoza, fruktoza i galaktoza są ilościowo najważniejszymi heksozami wchłanianymi z pfzewodu pokarmowego. Pochodzą one odpowiednio ze skrobi, sacharozy i laktozy zawartych w pożywieniu. Specjalne szlaki metaboliczne rozwinęły się, zwłaszcza w wątrobie, do przemiany fruktozy i galaktozy w glukozę. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Niedobory pewnych enzymów szlaku pentozofosforanowego są główną przyczyną hemoiizy erytrocytów, występującej w jednym z typów niedokrwistości hemolitycznej Głównym zaangażowanym w tym enzymem jest dehydrogenaza glukozo6-fosfora nowa. Aż u 100 min ludzi na świecie można wykazać genetycznie uwarunkowane małe stężenie tego enzymu. Głównymi szlakami metabolicznymi zużywanja glukozy są glikoliza i szlak pentozofosforano"włl~- ilościowo mniej znaczące, ale bardzo ważne dla wydalania obcych organizmowi związków (ksenobiotyków) w postaci glukuronidów jest wytwarzanie kwasu glukuronowego z glukozy w szlaku kwasów uronowych. Zaburzenia tego szlaku są przyczyną samoistnej pentozurii. Całkowity brak jednego z enzymów tego szlaku

u wszystkich naczelnych sprawia, że kwas askorbinowy (witamina C) jest niezbędnym składnikiem pokarmu dla ludzi, ale nie dla większości ssaków. Niedobory enzymów metabolizmu fruktozy .i galaktozy prowadzą do takich chorób metabolicznych, jak samoistna fruktozuria i galaktozemia Fruktoza bywa używana w żywieniu pozajelitowym, ale w dużym stężeniu może ona powodować uszczuplenie puli nukleotydów adeninowych w wątrobie i martwicę wątroby. SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY WYTWARZA NADPH ORAZ RYBOZĘ Szlak pentozofosforanowy (spięcie heksozomo no fos fora nowe) jest alternatywną drogą utleniania glukozy. Jest to proces wielocykliczny, w którym z 3 cząsteczek glukozo-6-fosforanu powstają 3 cząsteczki CO2 i 3 reszty 5węglowe. Te ostatnie zostają tak przetworzone, że regenerują się z nich 2 cząsteczki glukozo--6fosforanu i wytwarza się 1 cząsteczka związku pośredniego glikolizy — gliceraldehydo-3-foslbranu. Ponieważ z 2 cząsteczek giiceraldehydo-3-fosforanu może regenerować glukozo-6- fosforan, w szlaku pentozofosfora nowym może zachodzić całkowite utlenienie glukozy. 3(Glukozo-6-fosforan) + 6 NADP+ -» -> 3 COa + 2 (Glukozo-6-fosforan) + - Gliceraidehydo 3-fosforan + 6 NADPH + + 6H +

240 / ROZDZIAŁ 22

KOLEJNE REAKCJE SZLAKU PENTOZOFOSFORANOWEGO ZACHODZĄ W CYTOZOLU

pentozofo sfora nowego akceptorem wodoru jest NAPD, a nie NAD. Sekwencję reakcji szlaku można podzielić na 2 etapy: oksydacyjny i nieoksydacyjny. W pierw-

Enzymy^szlaku pentozofosforanowego, podobnie jak TglikoTizy, znajdują się w cytozolu. Utlenianie, tak jak w glikolizie, odbywa się przez oSwodorowanie, jednakżęjw przypadku szlaku

szym glukozo-6-fosforan ulega odwodorowanhi i dekafboksylacji, przechodząc w pentoze — rybulozo.-5-fosforan. W drugim etapie rybulozo-5-fosforan ulega przekształceniu z powro-

NADPf NADPH+H^ HO-C-H

H-Ć-

OH I HO-Ć-H

Q H-

C-OH I

H-i-----1

DEHYDROGENAZA GLUKOZO-6- FOSFORANOWA

HjO V lub

H OCOO" -C-H H-C-O H HO-C-H H-C-O H H - C- O H

6-Fosfogtukonlan — N A D P1

CHj-O-l

DEHYDROGENAZA 6FOSFOGLUKDNIANOWA

^D-G lu kozo-6-fosfo ran

Mg 1 ; Mn ! ; lub Ca**

Ca" HYDROLAZA GLUKONOLAKTONOWA 6- f osi o g lukonolakton

4

CH,-0 -(F Forma enotlowa

H-C-OH

CH,O CHOH 11 H

KETOIZOMERAZA RYBOZO-S- FOSFOflANOWA

H-C-OH H-C-OH i

NADPH + H+

i

c=o H-CH-C-OH i

I

C=O H-C-OH H-Ć-OH

C-OH

C H ,- O- ( P) Rybulozo-5-fosforan

i

3-Kato-B-f

O -T-H H^C-OH H-C

oafogl u ko n la n

3-EPIMERAZA HYBUL020-5-F0SF0RAN0WA

*CH2OH i

HO-C-H H^ t^1^ (JM >

Ć

H-C-OH HC-OH

K syl u I o zO-5-f osf o r an

CHj-ORybozo^Si-ftwfora n

Sadoheptu lożo -7-f osto ra n

H-KC-OH

"CH2-O~®

Gl

lcaraldehydo-3-tosfo ra n

PRPP Ryc. 22-1.

Szlak pentozofosforanowy. P POf, PRPP — 5-fosforybozylo-

i-pirofosforan.

SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 241

-f

H-"Ć-OH Sliceraldehyda-

•CHjOH

•3-1o«toran

"CH.OH

|THANSALDOLAZA|

TH-Ć-

HOJC-H

H-Ć-OH ~*_____ H-Ć-OH H-Ć-OH CH,-O-®

H-C = O

O C H

H-^t-OH H-iC-OH

OH H-Ć-OH CH, -O-(P)

ł

CH,0H

ćo

Etyt roz o-4-1o sto r an

Sadoheplulozo-7-fosforan

HO-C-H H-C-OH H-Ć-OH

4

*CHaOH

HO-C-H

H-Ć-OH CH,-O-
ć

FruktoiD-6-iosforan

| TRAN8KET0LAZA Tlamlrw- ®j Mg ' ł

H-C=O

FruKtozo-S-losforan

H-C-OH

Ksyiuiozo-5-fostoran

CH,-O-® SilcerakJBhydo-3-fosłofan

■

Ryc. 22-1 cd. Szlak pentozofosforanowy,

tem_dp5!ukozQ-i-ibsforanu w całej serii reakcji, głównie z udziałem 2 enzymów; transkętotazy UransaMolazy (ryc. 22-1). Etap oksydacyjny wytwarza NADPH Odwodorowanie glukozo-6-fo sforanu do 6fosfoglukonianu zachodzi przez utworzenie 6fosfoglukonolaktonu katalizowane przez dehydrogentizę glukQzo-6-fo$foranową, enzym zależny od NADP. Hydrolizę 6-fosibglukonolaktonu katalizuje hydrolaza glukonol a klonowa Drugi etap oksydacyjny jest katalizowany przez dehydrogenazę 6-fosfoglokonianową, która potrzebuje NADP+ jako akceptora wodoru. Dalej następuje dekarboksyjacja_z_ wy tworzeniem kelopentozy — rybuiozo-5-ibsforanu. Reakcja zachodzi prawdopodobnie w 2 etapach przez związek pośredni 3-keto-6-fosfoglukonian. Etap nieoksydacyjny wytwarza

prekursory rybozy

Rybulozo-5-fosforan jest substratem dla 2 różnych enzymów, 3-Epimeraza ryhulozo-5-fosforanowa zmienia konfiguracje wokół C3, twol<>

Biochemia

rząc epimer ksylulozo-5-fosforan będący ketopentozą, Ketoizomeraza rybozo-5-fosforanowa zamienia rybulozo-5-fosforan.w odpowiednią aldopentoze, rybozo-5-fosforan. Transketolaza przenosi jednostkę 2-węglową zawierającą węgle 1. i .2 ketozy na aldehydowy węgiel cukru — aldozy. Powoduje ona .zatem zamianę cukcu ketozj w aldozę uboższą-o-2-atomy węgla, a równocześnie zamienia cukier aldozę w ketozę bogatszą o 2 atomy węgla. Reakcja wymaga udziału jednej z witamin B — darniny — jako koenzymu w postaci difosforanu tiaminy, a także jonów Mg2:. Przenoszona jednostka 2-weglowa jest prawdopodobnie glikolaldehydem związanym do difosforanu tiaminy, tzn. jest „aktywnym glikolaldehydem". Transketolaza katalizuje więc przeniesienie opisanej jednostici"2*węglowej z ksylulozo-5-fosforanu na ryb ozo-5-fosforan, tworząc 7-węgiową ketozę sedoheptulozo-7-fosforan oraz aldozę gliceraldehydo-3-fosforan. Te 2 produkty wchodzą następnie w inną reakcję, znanąjakotransaldolacja. Transaldolaza umożliwia przeniesienie jednostki 3-węglowej „ak-

242 / ROZDZIAŁ 22 GI ukozo-6-fosf o ran

Gl ufco zo-6-fosforan

-NADP*

NADP*

- NADPH

*■ NADPH

DEHYDROGENAZA GLUKOZO-6-FOSFORANOWA

6-Fosfogukonlan

1i ^ CO2

Ryb u lozo-5-tostoran

>■ NADPH + H* 6-Fosfoglukonian

NADP*

NADPH + H+

»

NADP ł

e-Fosfoflukonian

- NADP*

DEHYDROGENAZA 6-FOSFOGLLJKON1ANOWA

Glukozo-6-fosforan -

NADP*

NADPH+ H* k

^"

N

* CO, Rybulozb-5-taatoran

COj

Rybulozo-S-fosfcran

C, |3-EPIMERA2A~|

KETOIZOMERAZA

Ksytu lozo-S-tosf o ran

| 3-EPIMERA2AJ

Rybozo-5-f osf o ra n

Ksylulozo-5-fosforan

C TRANSKETOLAZA

f

Gllcef aldehyd o-3-fosforan Ci 1 TRANSALDOLAZA

f Fruktozo-6-fosloran C«

Sedoheptulazo-7-fosforan C,

Erytrozo-4-tosforan TFIANSKETOLAZA Gl I ce r aldehyd o-3-f o sfa ra n Fru ktoz o-6-f osfo ran

ALDOLAZA

IZOMERAZA FOSFOHEKSOZOWA

IZOMEHAZA FOSFOHEKSOZOWA

IZOMERAZA FOSFOTRIOZOWA

, Fruklozo-1,6-btefosforanu FHLTKTOZO-1,6-BISFOSFATAZA /j Fruktozo-6-fosforanu IZOMEHAZA FOSFOHEKSOZOWA

GI ukozo-6-fostoran

Gl ukozo-6-fosforan

Vj Glut
Ryc. 22-2. Schemat przebiegu szlaku pentozof osforan owego i jego połączeń ze szlakiem glikolizy.

SZLAK PEIMTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 243

tywnegodihydroksyacetonu" (węgli l-3)_zketo- dehydrogenazy ghitaminianowej, albo zredu zy, którą1 jest sedoheptulozo-7-fosforan, na al- kowanego glutationu w erytrocytach. Jest pra dozę gliceraldehvdo-3-fosfora n. aby_utworzyć wdopodobne, że obecność aktywnej lipogenezy ketozę — fruktozo-6-fosforan i 4-węglową al- albo układu zużywającego NADPH pobudza dozę — ery trozo-4-fosforan. rozkład. glukozy w szlaku pentozofosforanoN astępnie zachodzi dalsza reakcja, znów wym. Zużywanie NADPH dostarcza bowiem z udziałem transketolazy, w której ksylulozo-5- NADP, którego stężenie jest normalnie bardzo Ti JFuży jako da_w_c_a „aktywnego gli - mafe ze względu na nierównowagowy charakter kolaldehydu". W tym przypadku utworzony pierwszych reakcji szlaku. Również synteza uprzednio eryfrozo-4-fosforan jest akcpptnjeay ■ dehydrogenaz glukozo-6-fosforanowej i 6-fosProduktami wymienionej reakcji są fruktozo-6- foglukonianowej może być indukowana przez fosforan i gIiccraldehydo-_3-fosforan. insulinę wydzielaną w warunkach związanych Aby glukoza u legia_ całkowitemu utlenieniu ze „stanem sytości" (tab. 21-1). h do CO, w szlakupentozofosforanowym, niei Ryboza może być syntetyzowana j bJ ™ tkance enzym ów przek sz t nic aj ą c y e h gl i ce ra I dc h y d o - 3 - fo s f oran w g lu we wszystkich tkankach -j^zo-6-fosforan..Są to enzymy szlaku giikolizy, SzJak pentozo fosforan o wy dostarcza ryhozy dz^aja^e.\£o£LwŁQinyjn kierunku, i dodatkowo do syntezy nukleotydów i kwasów nukleino enzym glukoneogenezy frtiktozo-l,6-bisfosfata- wych (ryc. 22-1). Źródłem jes.t rybozo-5-fas^ foran. który reaguje z ATP, tworząc PRPP Ł-A. Schemat tego szlaku przedstawiono na rye. używany w biosyntezie nukleotydów (p. str. 427). Tkanka mięśniowa ma bardzo niewielkie ilości dehydrogenaz glukozo-6-fo sfora nowej 2 najważniejsze szlaki katabolizmu i 6-fosfoglukonianowej. Mięsień szkieletowy, glukozy mają niewiele ze sobą podobnie jak większość innych tkanek, jest wspólnego Chociaż niektóre metabolity są wspólne, np. jednak zdoiny do syntetyzowania rybozo-5-fosglukozo-6-fosforan, to jednak szlakpectozo- foranu na potrzeby syntezy nukleotydów. Od bywa się to przez odwrócenie nie oksydacyjnego i etapu szlaku pentozofo sfora nowego z użyciem ^xJ£liJq "DTI^jerue następuje w pierwszych reakcjach fruktozo-6-fosforanu. Oznacza to, że nie jest Z udziałcin~RKDP. a nieNAD. a CO 3, który konieczny kompletny funkcjonujący szlak penw ogóle nicjeśt produktem giikolizy, jest chara- tozofosforano wy, aby tkanka mogła syntetyzo kterystycznym pr^ukteatszłafea=--pentozofos- wać fosforany rybozy. Ryboza nie jest znaczącym składnikiem krą fofahowego. ATP nie powstaje w szlaku pentozofos fora nowym, podczas gdy jego generacja żącej krwi. Wobec tego tkanka musi sama jest zasadniczą funkcją giikolizy. Fosforany zaspokajać zapotrzebowanie na ten ważny pre rybozy powstają w szlaku pentozo fosforano- kursor nukleotydów. wym, ale me w glikolizie. Równoważniki redukujące są wytwarzane w tych tkankach, które są wyspecjalizowane w syntezach redukujących Oznaczenia aktywności szlaku pentozofosforanowego w różnych tkankach wskazują na jego znaczenie metaboliczne. Jest on aktywny w wątrobie, tkance tłuszczowej, korze nadner czy, w tarczycy, erytrocytach, jądrze i w gruczo le sutkowym w okresie laktacji. Brak jest jego _le sutkowym po_ga okresem wn"^ występuje w mięśniu szkielet o wy rn. Wszystkie tkanki, w których ten szlak"jest aktywny, zużywają NADPH do syntez redukujących, np. do syntezy kwasów tłuszczowych, steroidów, aminokwasów szlakiem

SZLAK PENTOZOF0SF0RAN0WY WSPOMAGA PEROKSYDAZĘ GLUTATIONOWĄ W OCHRONIE ERYTROCYTÓW PRZED HEMOLIZĄ Szlak pentozofosforanowy w erytrocytach dostarcza NADPH do redukcji utlenionego glutationu (G-S-S-G) do glutationu zreduko wanego (2G-SH). Redukcja ta jest katalizowa na przez reduktazę gluta tionową. enzym będący flawoproteiną zawierającą FAD. Z kolei zredu kowany glutation usuwaH 2 O 2 z erytrocytu w reakcji katalizowanej przez peroksydazę gtutationową, enzym zawierający pierwiastek śla dowy selen.

244 / ROZDZIAŁ 22

GLUKURONIAN, PREKURSOR PROTEOGLIKANÓW I SPRZĘGNIĘTYCH GLUKURONIDÓW, JEST PRODUKTEM SZLAKU KWASU URONOWEGO

W szlaku-kwasu.JirQn.owJego„.glu;kuronian pQWStaje-z,_glukQzy w wyniku reakcji pokazanych na ryc. 22-3. Glukozo-6-fosforan jest przekształcany w glukozo-1-fosforan, który następnie reaguje z urydynotrifosforanem (UTP), tworząc aktywny nukleotyd — urydynodifosloglukozę (UDPGlcK Ta ostatnia reakcja jest katalizowana przez enzym urydylilotransferazę glukozo-1-fosforanowa (polifosfory!azę UT3F' glukozową). Wszystkie etapy, aż do tego miejsca, są identyczne z tymi, które uprzednio opisano jako szlak glikogenogenezy w wątrobie. UDPGlc jest utleniana w dwuetapowym procesie do glukuronianu. Produktem utleniania, które jest katalizowane przez dehydrogenazę UPPglukozową, jest UDP-glukuronian. UDP-gliikuroman jest „aktywną" formą glukuntnianu w reakcji whudowywania glukuronianu w proteoglikany lub dla reakcji, w których glukuronian jest sprzęgany z takimi substratami, jak hormony steroidowe, niektóre leki lub bilirubina (p. ryc. 34-13). W NADPH-zależnej reakcji glukuronian jest redukowany do L-gulonianu {ryc. 22-3). Ten ostatni związek jest bezpośrednim prekursorem askorninianu u zwierząt zdolnych do syntetyzowania tej witaminy. U człowieka i innych naczelnych, jak również u świnki morskiej, kwas askorbinowy nie może być syntetyzowany ze względu na brak enzymu oksydazy [-oulonolaktonowej. Gulonian jest utleniany do 3-keto-L-gulonianu, który jest dekarboksylowany do pentozy — L-ksylulozy. Związkiem pośrednim szlaku pentozofosforanowego jest D-ksyluloza. W reakcjach przedstawionych na ryc. 22-3 z ketogulonianu powstaje natomiast L-izomer ksylulozy. W celu połączenia tych 2 szlaków niezbędne jest przekształcenie L-ksylulozy do jej izomeru D. Zachodzi ono w wyniku NADPH-zależnej redukcji do ksylitolu, który jest następnie utleniany w reakcji NAD-zależnej do D-ksylulozy, Ten ostatni związek, po przekształceniu do D-ksylulozo-5-fosforanu jest dalej metabolizowany w szlaku pentozofosforanowym.

Poza opisanymi wyżej głównymi szlakami metabolizmu glukozo-6-fosforanu istnieje szlak,- w którym -glukoza, jest przemieniana w kwas glukuronowy, kwas askorbinowy i pentozy, nazywany szlakiem kwasu uranowego. Jest on także alternatywnym szlakiem utleniania glukozy, ale, podobnie jak szlak pentozofosforanowy, nie prowadzi do wytwarzania ATP.

Przerwanie ciągłości szlaku kwasu uranowego jest powodowane wadami enzymatycznymi i przez niektóre leki W samoistnej pentozurii, rzadkiej chorobie dziedzicznej, pojawiają się w moczu, znaczne ilości L-ksylulozy. Obecnie się uważa, że przyczyną tego jest brak u chorych z pentozurią enzymu niezbędnego do przeprowadzenia redu-

G-S-S-G + NADPH + H+—. 2G-SH + NADP+ REDUKTAZA OLUTATIONOWA FAD

G-S-S-G + 2H,0

2G-SH +

PEROKSYDAZA GLUTATIONOWA SELEN

Ta reakcja jest ważna, ponieważ nagromadzenie H2O2 może skrócić czas życia erytrocytów, zwiększając szybkość utlenienia hemoglobiny do methemoglobiny. W niektórych populacjach występuje mutacja charakteryzująca się niedoborem dehydrogenazy di!ki>/i>-6-fosforanowej, czego konsekwencją są zaburzenia w wytwarzaniu NADPH. To zaburzenie charakteryzuje się hemolizą erytrocytów wówczas, gdy osobnik z tą wadą jest narażona na działanie takich utleniaczy, jak lek przeciwzimniczy — prymachina, kwas acetylosalicylowy lub sulfonamidy, albo spożywa pewien gatunek fasoli (Viciafaba — fawizm). Peroksydaza glutationowa jest naturalnym przeciwutleniaczem znajdującym się w wielu tkankach. Oprócz H3O2, działa ona również na nadtlenki organiczne. Razem z witaminą E jest częścią układu ochronnego przeciw peroksydacji lipidów (p, str. 185). Donoszono o związku między występowaniem niektórych nowotworów a małym stężeniem selenu we krwi i (lub) małą aktywnością peroksydazy glutationowej. Oznaczanie aktywności transketolazy we krwi odzwierciedla stopień niedoboru tiaminy. Jedynym stanem, w którym aktywność tego enzymu jest zwiększona jest niedokrwistość złośliwa.

SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 245 3-Keto-L-gulonian

PKOFOSFO HYDRO LAZA UDPGIc

Urydyn od ifosf og iu koza (UOPGlc)

9

O

c-o-

c-o-

HO-C-H Ć=0 H-C-OH HO-Ć-H -

c=o H-C-OH HO-Ć-H L-Kiylulon

HO-Ć-H HO-C-H H-C-OH HO-Ć-H

*CH ;OH Szczawian

+

Glikolan 4

t

Urydynodlfosfoglukuronian

BLOK W PENTOZURI!

•CHjOH C-Gulonlan L-GulonolaMon BLOK U NACZELNYCH ^~

C02

BLOK U CZŁOWIEKA i Aldehyd gllkolowy I SWWW MORSKIEJ D- Ksyl u lożo -1 2-Keto-L-gulonoiakton -f osf o ran

t

I

*CH 2OH NADP +

[2H]

J _

HO-C-H

H - C- O H ĆH,OH KsyMol NADPH + H+

J>

•CHjOH C=O

HO-Ć-H D-Ksyjuloza

H- Ć-OH HEDUKTAZA 0ĆHsOH ATp KSYLULOZOWA

O

C

0=Ć 0=Ć HĆ HOĆ-H L-Dehyd roaekor bl nlan HO-Ć HO-C H-Ć HO- CH •ĆH,OH L-Askorbinlan

AOP ' D-Ksylu lozo-5-fosfo ran

Szła

ntozofw fo

Rye. 22-3. Szlak kwasu uranowego. * — losy węgla 1 glukozy,-------P0 © 3

kcji L-ksylulozy do ksylitolu. Pozajelitowe podanie ksylitoJu może prowadzić do oksalozy, łącznie z odkładaniem się złogów szczawianu wapnia w mózgu i w nerkach. Wynika to z przekształcenia D-ksylulozy do szczawianu, przez kolejne tworzenie ksylulozo-1-fosforanu, aldehydu glikolowego i glikolanu. Różne leki wzmagają szybkość wchodzenia glukozy do szlaku kwasu uronowego, np. podanie barbitalu lub chlorobutanolu szczurom powoduje znaczne zwiększenie przekształcania glukozy do glukuronianu, L-gulonianu i askor-

binianu. Donoszono, że aminofenazon i fenazon zwiększają wydalanie L-ksylulozy u osób z pentozurią.

SPOŻYCIE DUŻYCH ILOŚCI FRUKTOZY MA GŁĘBOKIE KONSEKWENCJE METABOLICZNE Spożycie pokarmów o dużej zawartości sacharozy jest przyczyną dużego napływu fruktozy (i glukozy) do żyły wrotnej i wątroby.

246 / ROZDZIAŁ 22 Fru ktozo-1 ,&- blstosf c ran ATP

Gllkogen

Gtu kozo-6-fosf □ ran

i GLUKOZO-6-FOSFATAZA

tZOMERAZA FOSFOHEKSOZOWA

DEHYDROGENAZA

Ffuktozo-6-fosforan

FflUKTOZO-1,6BISFOSFATAZA

-*------------------------------------:-----------------------------, - - D-Fru ktoza

FOSFOFRUKTOKINAZA BLOK PRZY SAMOISTNEJ FRUKTOZURII

t

Fruttozo-I-fosforan

[ALDOLAZA B|

BLOK PRZY DZIEDZICZNEJ NIETOLERANCJI FRUKTOZY Fosto dłhyd roKsyacełon

[ALDOLAZA A | 1ALDOLAZA"B1

IZOMERAZA FOSFOTRIOZOWA

ATP

Gllcer a H ehyd o-3-fosforan

D-Oileeraldenyd

| TRIOZOKINAŻA] 2-Fosfagllcerynlan

Plrogronlan Ryc. 22-4. Metabolizm fruktozy, Aldolaza A znajduje się we wszystkich tkankach, z wyjątkiem wątroby, w której występuje jedynie aldotaza B.

Fruktoza znacznie szybciej niż glukoza ulega

glikolizie w wątrobie. Jest to spowodowane tym, że omija ona etap metabolizmu glukozy katalizowany przez fosfofniktokinazę. Na tym etapie zachodzi bowiem kontrola metaboliczna szybkości katabolizmu glukozy. Pozwala to na pobudzenie przez fruktozę szlaków metabolicznych w wątrobie, prowadzących do wzmożonej syntezy kwasów tłuszczowych, estryfikacji kwasów tłuszczowych i wydzielania VLDL oraz do

zwiększenia stężenia triacylogliceroli w surowicy krwi. Nadmiar glukozy^dostający się do krwiobiegu, pobudza wydzielanie insuliny, co wzmaga wszystkie w. procesy. Fruktoza może być fosforylowana do fruktozo -6-fo sfora mi. Proces ten jest katalizowany przez ten sam enzym - heksokjnazę, który katalizuje fosforylaqe glukozy (lub mannozy) {p. ryc. 22-4), Jednakże powinowactwo tego enzymu do fruktozy jest bardzo małe w porów-

SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 247

naniu z powinowactwem do glukozy. Dlatego wydaje się mało prawdopodobne, aby to była główna droga zużytkowania fruktozy. Inny enzym,^fi]!^ctokinaza^wystcpujący_w wąJrobae_katalizuje przeniesienieTósfbranu z ATP na fruktozę, ale z wytworzeniem fruktozo-1-fhsŁiraiiu. Jego występowanie wykazano również w nerkachi \y jelitach. Enzym ten nie fosforyluje glukozy. W odróżnieniu od glukokinazy, na jego aktywność nie wpływa głodzenie ani insulina, co może tłumaczyć, dlaczego fruktoza znika z normalną szybkością z krwi chorych na cukrzycę. K.™ tego enzymu pochodzącego z wątroby dla fruktozy jest bardzo mała, co wskazuje na duże powinowactwo enzymu do substratu. Wydaje się, że to jest wjainie_głó.wria dr-Oga-Jhsfbrjdficji fruktozy. Samoistna fruktozuria_jęst wynikiem braku fruktokinazy watro bovffij.. Fruktozo-1-fosforan jest rozkładany do aldeTryduD-glicerynowego i dihyBrbksyącstonofmforanujyjgalccu^lfFital^riwaripj p^e? aldolazc B, enzym znajdujący się w wątrobie. Ten enzjQL_.. atakuje również fruktozo-1,6-bisfoslbran. Jego brak jest przyczyną wrodzonej nietolerancji fruktozy. Aldehyd D-gliceryno-: ■ / Y?.kuj.e możliwość wejścia do sekwencji reakcji szlaku gl'^gljzj{ dzięki innemu enzymo-wi obecnemu w wątrobie, triokinazie, która katalizuje jego fosforylację do gliccraldehydo3--foslbranu. Dwie fosfotriozy: dihydroksyaceto-nolosforan i gliceraldehydo3-fosforan mogą być katabolizowane w szlaku glikolitycznym albo mogą łączyć się ze sobą pod wpływem aldolazy i być przetworzone w glukozę. To ostatnie jest losem większości fruktozy metabo-lizowanej w wątrobie. Jedną L konsekwencji wrodzonej nietolerancji fruktozy i innej choroby spowodowanej niedoborem fruktozo-l,6-bisfosfatazy jest indukowana fniVtr>7iiJjiipnpljl<,piiiia, pnmmuy.występowania dużych zapasów glikogenu.-5^apewne nagromadzanie się fruktozo-1-fosforanu i fruktózo-l,6-bisfosforanu hamuje aktywność fosforylazy wątrobowej przez mechanizmy allosteryczne. Jeżeli zwierzęciu doświadczalnemu usunąć jelito i wątrobę, to przemiana wstrzykniętej fruktozy w glukozę nie zachodzi i zwierzę popada w hipoglikemię, jeśli nie podać mu glukozy. Jednakże stwierdzono, że ludzka nerka może przekształcać fruktozę do glukozy i mleczanu. U ludzi, ale nie u szczurów, znaczna ilość fruktozy pochodząca z rozpadu spożytej sacha-

rozy jest przemieniana w jelicie do glukozy, zanim dostanie się do krążenia wrotnego. Wolna fruktoza znajduje się w płynie nasiennym i jest wydzielana w nader dużych ilościach do płodowego krążenia zwierząt kopytnych 1wielorybów, u których gromadzi się w płynach owodniowym i omoczniowym. Fruktoza i sorbitol uczestniczą patogenezie zaćmy cukrzycowej

w

Zarówno fruktoza jak i sorbitol znajdują się w ludzkiej soczewce, w której ich stężenie zwiększa się w cukrzycy, i mogą one mieć udział w patogenezie zaćmy cukrzycowej. Szlak sorbitolowy (poliolowy), którego nie ma w wątrobie, jest odpowiedzialny za powstawanie &«ktozy z glukozy (ryc. 22-4). U chorych na cukrzycę jego aktywność się zwiększa, w miarę zwiększania stężenia glukozy we krwi, w tkankach, które nie są wrażliwe na insulinę, tj. w soczewce, nerwach obwodowych i kłębuszkach nerkowych. Glukoza jest redukowana do sorbitolu, przez reduktazę aldozową z udziałem NADPH. Następnie sorbitol jest utleniany do fruktozy przez dehydrogenazę sorbitolową (dehydrogenazę L-iditolową, zwaną także poliolową), w obecności NAD. Sorbitol nie przenika łatwo przez błony komórkowe i dlatego gromadzi się w tkankach, powodując ich uszkodzenie w mechanizmie osmotycznym. Równocześnie zmniejsza się stężenie mioinozytolu. U szczurów 2cukrzycą można zapobiec nagromadzaniu się sorbitolu w tkankach, niedoborowi mioinozy tolu i powstawaniu zaćmy cukrzycowej, stosu jąc inhibitor reduktazy aldozowej. Reduktaza aldozową znajduje się w łożysku owiec i jest odpowiedzialna za wydzielanie sorbitolu do krwi płodowej. Dehydrogenaza sorbitolowa w wątrobie oraz w wątrobie płodu jest odpowiedzialna za przemianę sorbitolu do fruktozy. Ten szlak jest również odpowiedzialny 2a występowanie fruktozy w płynie nasiennym. Po dożylnym podaniu sorbitolu jest on raczej przekształcany do fruktozy niż do glukozy. Po doustnym podaniu sorbitolu znaczna jego część nie wchłania się i ulega w jelicie grubym fermentacji pod wpływem bakterii do takich produktów, jak octan i H2. Bóle brzucha spowodowane nietolerancją sorbitolu mogą być wywołane „wolnymi od cukru" środkami słodzącymi zawierającymi sorbitol.

248 / ROZDZIAŁ 22

GALAKTOZA JEST POTRZEBNA DO SYNTEZY LAKTOZY, GLIKOLIPIDÓW, PROTEOGLIKANOW I GLIKOPROTEIN Galaktoza powstaje w jelitach w następstwie hydrolizy disaćnarydu — lalctozy, tj. cukru zawartego w mleku. W wątrobie jest ona łatwo przemieniana w glukozę. Zdolność wątroby do dokonania takiej przemiany może być miernikiem sprawności czynności wątroby i jest podstawą testu tolerancji galaktozy. Szlak przemiany galaktozy w glukozę przedstawiono na ryc. 22-5. W reakcji 1 galaktoza jest fosforylowana przez galaktoklnazę z użyciem ATP jako dawcy fosforanu. Produkt tej reakcji galaktozo-1-fosforan reaguje z urydynodifosfoglukozą (UDPGlc), tworząc urydynodtfosfogalaktozę

(UDPGal) i glukozo-1-fosforan. W reakcji tej (reakcja 2), katalizowanej przez urydylilotransferazc galaktozo-1 -fosforanową, galaktoza jest przenoszona na miejsce glukozy zawartej, w UDPGlc. Przemiana galaktozy w glukozę (reakcja 3) jest katalizowana przez epimerazę. Jej produktem jest UDPGlc. Epimeryzacja prawdopodobnie odbywa się przez utlenienie i redukcję na C4, z udziałem NAD jako koenzymu. W końcu (reakcja 4) glukoza jest uwalniana jako glukozo-1-fosforan prawdopodobnie po inkorporacji do glikogenu i następującej potem fo sforo lizie. Reakcja 3 jest swobodnie odwracalna. W ten sposób glukoza może być przemieniana w galaktozę, tak że obecność gotowej galaktozy nie jest niezbędna w pokarmach. Galaktoza jest potrzebna w organizmie nie tylko przy tworzeniu laktozy, lecz także jako

Galaktoza

ATP

Ni

GALAKTOKINAZA|(2J

Mg'* ADP-*

Gal aktozo-1 -fosforan Glukozo-1 -fosforan

UDPGlc URYDYLOTRANSFERAZA UDPGal UDP 1-FOSFOGAtAKTOZOWA

5)

4EPIMEHA2A IMYDYNODIFOSFOGALAKTOZOWA

Ł

Laktoza

NAD'

LAKTOZ Y Glukoza

]

Gllkogen FOSFORYLAZA ]

UDPGlc PBOFOSFOHYLAZA UDPGlc

UTP ATP

HEKSOKINAZAI I FOSFOGLUKOMUTAZA ADP lub

Glukoza

GluKOZO-6-fostoran 6LUK0KINAZA

Ryc. 22-5. Szlak przemiany galaktozy w glukozę oraz syntezy laktozy.

SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 249 ■y.

c #*

ATP

Gllkogen

_

i

Gl u kozo-1 -fosforan w ADP i

Glukoza ^* "^ - Glukozo-6-tostoran

Gllkollza Fruktozo-d-fosforan Plrogrontan

— Glutamina

ATP

IAMINOTHANSFERAZA]

ADP

Glukozoamlna

ATP r+Acetyloglukozoamlna

e

Glukozoamino-6■* -fosforan FOSFOGLUKOMUTAZA Acetylo-CoA

COŹ+HŹO

UTP

■ Glutamin lan

^M^Ę

Acetylo-CoA

Cykl kwasu cytrynowego

Glukozoamino-1-fosforan

j PJ

ADP

Glukozoamlna

* I

k. N-Acetyioglukazoamlno-■1 -fosforan UTP

UDP— N-acaty log a! a Kl ozoami n a -glukozoamłno--6fosfaran

Gllkozam! nogi łkany (np, heparyna)

Gllkozam Inogtlkany (kwas hiaiuronowy, gllkoprotelny)

EPIMERAZA ] N-Acstylomannozcamino-5-fosioran Fosfoenotoplrogronian ■

NAO+ I EPIMERAZA I 9-Fosforan kwasu UDPN-aoetylcrieuraminowego -N-aoatylogalaWozoamina

e

UJsm ny

(inhl bujacy) afekt allosteryez ny Kwas slalowy, gangliozydy, gllkoprotalny

GtlkozoamlnogJlkany fchonaroltyny), gllkoprotalny

Ryc. 22-6. Zestawienie wzajemnych powiązań w metabolizmie aminocukrów. * Analogiczna do UDPGIc. Inne nukleotydy purynowe lub pirymidynowe mogą być podobnie związane z aminocukrami. Przykładami są tymidynodifosfo{TDP)-glukozoamina oraz TDP-N-acetyloglukozoamina. ________________________________________________________________________________

składnik glikolipidów (cerebrozydów), proteoglikanów i glikoprotein. Przy syntezie latriozy w gruczole sutkowym, glukoza ^jest przemieniana w UDPGal pod wpływem opisanych powyżej enzymów.

UDPGal łączy się z glukozą tworząc laktozę. Proces ten jest katalizowany przez syntazę laktozową.

Niedobory enzymatyczne szlaku galaktozowego są przyczyną galaktozemii Niezdolność do metabolizowania galaktozy występuje w galaktozemiach, które mogą być powodowane wrodzoną wadą każdego z enzymów zaznaczonych na ryc. 25-5 cyframi 1, 2, 3, chociaż niedobór urydylilotransferazy (2) jest

250 / ROZDZIAŁ 22

najlepiej poznany. Gal a ktoza której stężenie we krwi się zwiększa, jest w oku redukowana przez reduktaze aldozową do odpowiedniego poliolu (galaktytolu). Gromadzenie się galaktytolu w rogówce jest przyczyną występowania zaćmy. W przypadku wady ury dylil o tran sfe razy ogóiny stan chorego jesi ciężki, ponieważ nagromadza się galaktozo-1 -fosforan, co pozbawia wątrobę zapasów nieorganicznego fosforanu. Końcowym skutkiem tej wady jest niedoczynność wątroby i zaburzenia umysłowe. Przy wrodzonym niedoborze urydylilotransferazy galaktozo-1-fosforanowej, dotyczącym zarówno wątroby, jak i erytrocytów (reakcja 2), epimeraza (reakcja 3) jest obecna w dostatecznej ilości, tak że chorzy z tą postacią galaktozemii mogą tworzyć UDPGal z glukozy. Wyjaśnia to, dlaczego u dotkniętych tą wadą dzieci jest możliwy normalny wzrost i rozwój, pomimo stosowania diety wolnej od galaktozy w celu zwalczania objawów choroby. Opisano kilka wad genetycznych, które polegają raczej na zmniejszonej ilości transferazy niż na jej całkowitym braku. Ponieważ enzym normalnie występuje w nadmiarze, zmniejszenie jego aktywności do 50% lub nawet mniejszej nie powoduje klinicznych objawów choroby, która pojawia się jedynie u homozygot. U niektórych chorych niedobór epimerazy dotyczy jedynie erytrocytów, a nie wątroby lub innych tkanek. W tych stanach choroba przebiega bezobjawowo. Glukoza jest prekursorem wszystkich aminocukrów (heksozoamin) (p. ryc. 22-6) Aminocukry są ważnymi składnikami glikoprntein (p. rozdz. 57), niektórych glikosfingolipidów (np. gangliozydów) (p. rozdz. 16) oraz glukozoaminoglikanów (p. rozdz. 57). Głównymi aminocukrami są glukrwoamina, gnlaklozuamina i mannozoamina (wszystkie są heksozoammami) oraz związek 9-węglowy - kwas sjalowy. Głównym kwasem sjalowym znajdywanym w tkankach człowieka jest kwas N-acetyloneu-

raminowy (NeuAc). Zestawienie relacji po między aminocukrami przedstawiono na ryc. 22-6. Najważniejsze są następujące fakty: 1. Glukozoamina jest głównym ammocukrem. Po wstaje ona jako glukozoam ino- 6 -fosforan z fruktozo-6-fosforanu przy użyciu glutaminy jako dawcy grupy aminowej. 2. Aminocukry występują głównie w formie N-acetylowanej. Dawcą grupy acetylowej jest acetylo-CoA. 3. N-Acetylomannozoammo-6-fosforan powstaje przez epimeryzację ghikozoam ino -6 -fosforan u. 4. NeuAc powstaje przez kondensację mannozoamino-6-fosforanu z fosfoenolopirogronianem. S. Galaktozoamina powstaje przez epi meryzację UDP-N-acetyloglukozoaminy (UDPGlcNAc) do UDP-N-acetylogalaktozoaminy (UDPGałNAc). 6, Nukleotydosacharydy są wykorzystywane do biosyntezy glikoprotein i innych złożonych związków. Ważnymi nukleotydami zawierającymi aminocukry są: UDPGlcNAc, UDPGalNAc oraz CMP-NeuAc. PIŚMIENNICTWO Huijing F: Textbook ermrs>: Galaetose metabolism and galactosemia. Trends Biochem Sei James HMeLal: Models forthemetabolicproduction of oxalate from xylitol in humans. Aust. J Exp Biol MedSci 1982;60:!17. Ka.dor PF: The role of aldose reductase in the development of diabetic complications. Med Res Rev 1988;8:325. Macdonald I, Vrana A {editors}: Metabolk Effects of Dietary Carbohydrates. Karger, 1986. Randle PJ, Steiner DF, Whclan WJ (editors): Carbohydrate Metabolizm and Its Disorders. Vol 3. Academic Press, 1981. Sperling O, de Vries A (editors): Inborn Errors of Metabolism in Man. K_arger, 1978. Various authora: In: The Metabolic Basis oflnheńted Dhease, 6th ed. Serwer CR et al (editors). McGraw-Hill. 19S9. Wood T: The Pentose Phosphate Palhwaw Aeademit; Press; 1985.

Biosynteza kwasów tłuszczowych

2 3

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Podobnie jak przy innych procesach degradacji i syntezy (np. przy glikogenolizie i glikogenogenezie), do niedawna uważano, że synteza kwasów tłuszczowych (iipogeneza) jest po prostu odwróceniem ich utleniania. Jednak obecnie wydaje się, że mitochondrialny układ syntezy kwasów tłuszczowych, zawierający pewne modyfikacje szlaku P-oksydacji, jest odpowiedzialny jedynie za przedłużanie (elongację) istniejących już kwasów tłuszczowych o średniej długości łańcucha. Natomiast zupełnie odmienny i bardzo aktywny układ pozamitochondrialny jest odpowiedzialny za kompletną syntezę palmitynianu z acetylo-CoA. Aktywny uktad elongacji łańcucha występuje również w siateczce śródplazmatycznej wątroby. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Istnieje ogromna różnorodność między gatunkami zarówno co do rozmieszczenia szlaku lipogenetycznego w różnych tkankach, jak i głównych substratów do syntezy kwasów tłuszczowych. V szczura, gatunku, który dostarczył najwięcej wiadomości o lipogenezie. szlak ten jest obficie reprezentowany w tkance tłuszczowej i w wątrobie, podczas gdy u człowieka tkanka tłuszczowa nie jest istotnym miejscem lipogenezy, a wątroba ma stosunkowo małą aktywność. U ptaków Iipogeneza jest ograniczona do wątroby, gdzie jest ona szczególnie istotna w tworzeniu jaj. U większości ssaków pierwotnym substratem do lipogenezy jest glukoza, ale u przeżuwaczy rolę tę przejmuje octan, który jest głównym związkiem o znaczeniu

energetycznym wytwarzanym zpożywienia. Ponieważ u człowieka szlak lipogenezy może mieć ograniczone znaczenie, nie jest zaskakujące, że nie donoszono dotychczas o istotnych chorobach z nim związanych. Jednakże różnorodna jego aktywność u poszczególnych osobników może być w istotny sposób znacząca dla istoty i rozmiarów otyłości. GŁÓWNY SZLAK SYNTEZY KWASÓW TŁUSZCZOWYCH DE NOVO (LIPOGENEZY) WYSTĘPUJE W CYTOZOLU Ten układ występuje w wielu tkankach, łącznie z wątrobą, nerkami, mózgiem, gruczołem sutkowym i tkanką tłuszczową. Do jego funkcjonowania są potrzebne takie kofaktory, jak NADPH, ATP, Mn2 + , biotyna, i HCO7 (jako źródło CO2). Bezpośrednim substratem jest acetylo-CoA, a końcowym produktem jest wolny palmitynian. Te cechy odróżniają znacząco lipogeneze od p-oksydacji. Wytworzenie malonylo-CoA jest początkowym i kontrolującym etapem w syntezie kwasów tłuszczowych Wodorowęglan, jako źródło CO2, jest potrzebny w początkowej reakcji do karboksylacji acetylo-CoA do malonylo-CoA w obecności ATP i karboksylazy acetylo-CoA. Biotyna, będąca jedną z witamin, jest niezbędna do działania karboksylazy acetylo-CoA (ryc. 23-1). Enzym ten ma zmienną liczbę identycznych podjednostek, w każdej są zawarte: biotyna, karboksylaza biotyny, białko nośnikowe karboksybiotyny, transkarboksylaza, jak również al-

252 / ROZDZIAŁ 23 ■ » - - O OC - C H 2 - C O- S- C o A

CH 3 - C O- S - C oA

Malotiyla-CoA

Aoetyio-CoA Enz-biotyna-COO-

Enz-btotyna

/£♦■ ADP+Pi ATP+HCO," + Era-Wotyna Ryc. 23-1. Biosynteza malonylo-CoA. Enz — karboksytaza acetylo-CoA.

losteryczne miejsce regulatorowe. Jest to wiec białko wieloenzymowe. Reakcja zachodzi w 2 etapach: 1) karboksylacja biotyny (z udziałem ATP, p. ryc. 53-13) oraz 2) przeniesienie karboksylu na acetylo-CoA z wytworzeniem malonylo-CoA. Kompleks syntazy kwasu tłuszczowego jest polipeptydem zawierającym 6 enzymów Wydają się istnieć 2 typy układu syntazy kwasu tłuszczowego znajdującego się w rozpuszczalnej części komórki, U bakterii, roślin i niższych form poszczególne enzymy układu są oddzielne, a reszty acylowe występują w połączeniu z białkiem nazywanym białkiem przenoszącym acyl (ACP, ang.: Acyl Carrier Protein). Jednakże u drożdży, ssaków i ptaków układ syntazy jest kompleksem wieloenzymowym, którego nie można rozdzielić bez utraty aktywności, a ACP jest częścią tego kompleksu. ACP zarówno bakterii, jak i kompleksu wieloenzymowego zawiera witaminę — kwas pantotenowy w postaci 4'-fosfopanteteiny (p. ryc. 53-6). W układzie tym ACP przejmuje rolę CoA. Połączenie wszystkich enzymów określonego szlaku metabolicznego w jedną funkcjonalną jednostkę wieloenzymową sprawia, że taki szlak jest bardzo wydajny i wolny od interferencji ze strony innych współzawodniczących o substraty procesów, przez co osiąga się, bez konieczności wytwarzania barier przepuszczalności, kompartmentację procesu w komórce. Inną zakta istnienia pojedynczego polipeptydu wieloenzymowego jest to. że wszystkie enzymy kompleksu są syntetyzowane w sposób skoordynowany. Kompleks syntazy kwasu tłuszczowego jest dimerem (ryc. 23-2). U ssaków obydwa monomery są identyczne, każdy z nich stanowi godny

uwagi pojedynczy polipeptyd, zawierający wszystkie 6 enzymów syntazy kwasu tłuszczowego oraz ACP z grupą — SH 4-fosfopanteteiny. W bezpośrednim sąsiedztwie tej grupy znajduje się inna grupa tiolowa reszty cysteiny, połączonej z syntazą 3-ketoacylową (enzymem kondensującym) drugiego monomeru (ryc. 23-2). Ponieważ obydwie grupy sulfhydrylowe uczestniczą w aktywności syntazy, jedynie cały dimer jest aktywny. Na początku inicjująca cząsteczka acetylo-CoA łączy się z grupą — SH cysteiny, co jest katalizowane przez transacylazę acetylową (ryc. 23-3). Malonylo-CoA łączy się z sąsiadującą grupą — SH 4'-fosfopanteteiny należącej do ACP drugiego monomeru, co jest katalizowane przez transacylazę malonylową i wytwarza się aeetylo-(acylo)-malonyloenzym. Niedawne prace wykazały, że najprawdopodobniej transacylaza acetylową i transacyłaza malonyiowa jest tym samym enzymem (jak to pokazano na ryc. 23-2 i 23-3). Grupa acetylową atakuje grupę metylenową reszty malonylowej w reakcji katalizowanej przez syntazę 3-ketoacylu i uwalnia COa, tworząc 3-ketoacyloenzym (acetoacetyloenzym). To uwalnia grupę — SH cysteiny, związaną dotychczas przez grupę acetylową. Dekarboksylacja pozwala na zajście reakcji do końca dzięki temu, że działa jako siła pociągająca całą sekwencję reakcji. Powstała grupa 3-ketoacylowa zostaje zredukowana, odwodniona i ponownie zredukowana, aby utworzyć odpowiedni nasycony acyto-S-enzym. Te reakcje są analogiczne do tych, które zachodzą w p-oksydacji, z wyjątkiem tego, że 3-hydroksykwas jest izomerem D(—) a nie L( +), oraz że NADPH służy jako dawca wodoru, a nie NADH w obu redukcjach. Nowa cząsteczka malonylo-CoA łączy się z grupą — SH 4'-fosfopanteteiny, wypierając nasyconą resztę acylową na wolną grupę —SH cysteiny. Ta sekwencja reakcji

Podział funkcjonalny 4'-F osfop a ntetaln a SH

Podział SH

podjednostek

4'-F(»topani8telna

w o

1 5

>

I Ryc. 23-2. Wieloenzymowy kompleks syntazy kwasu tłuszczowego. Kompleks jest dimerem o 2 identycznych monomerach polipeptydowych, 1 i 2, każdy składający się z 6 oddzielnych aktywności enzymatycznych i białka przenoszącego acy I (ang.: AcylCarrier Protein—ACP). Cys-SH —grupa sulf hydry Iowa cysteiny. Grupa -SH 4'-fosfopanteteiny jednego monomeru jest w bliskim sąsiedztwie grupy -SH cysteinylowej reszty syntazy ketoacylowej drugiego monomeru, co sugeruje ułożenie „głowa do ogona" obu monomerów w stosunku do siebie. Szczegółowe ułożenie sekwencji enzymów w każdym z monomerów jest hipotetyczne (na podstawie danych Tsukamoto). Chociaż każdy z monomerów zawiera wszystkie cząstkowe aktywności ciągu reakcji, rzeczywista funkcjonalna jednostka składa się z połowy monomeru współdziałającej z komplementarną polową drugiego monomeru. Wobec tego 2 łańcuchy acylowe są wytwarzane równocześnie.

I c < n I M W W

Acetylo-CoA HS-c HS-Pan

Matonyio-CoA

Pan — SH

Wisloenzymowy kompleks syntazy kwasu tłuszczowego

Przeniesienie C„ z

CoA (Cj albo - C l ) - Cys — S~C — O1 3

cn )

Aoyto (aoetylo Jmalonylo-enzym

*co.

SYNTAZA 3KETOACYLOWA

Cys - SH O -( a }-Pan— S ~ C — CH 2 — C — CH 3 3- Kato acylc-enzy m (aceto acetyio-enzy m) NADPH + H +

REDUKTAZA 3KETOACYLOWA

NADP+

s-SH O W

OH

I

-T2_)-Pan-S~C-CH

2

-CH-

CH,

D(-)-3-HydroksyacyloB nzym HYDRATAZA

Dehydrogenaza izooytrynlanowa

i-SH ( 2 ) NADPH t H +

Pan -S ~ C - CH = CH CH, 2,3-Nlenasycony acytoenzym REDUKTAZA ENOILOWA

NADP + ^~

V

H,0 Tloesleraza Po 7-Krotnym cyklicznym praejtclu przez eta^

"(T>Cy

S

-

SH

J-— ^

-( 2 }-Pan-S ~C—CH2 —CHa —CH 3 Acyloenzym

PalmKynlan

Ryc. 23-3. Biosynteza kwasów tłuszczowych o dtugim łańcuchu. Szczegóły wskazują, jak dodawanie reszty malonylowej powoduje, że łańcuch acylowy wydłuża się skokowo po 2 atomy węgla Ćys — reszta cysteiny, pan — 4'-fosfopanteteina. Szczegóły budowy dimeru syntazy kwasu tłuszczowego przedstawiono na ryc. 23-2. (J) i (2) przedstawiają poszczególne monomery syntazy kwasu tłuszczowego. 2 łańcuchy acyiowe są syntetyzowane równocześnie na 1 dłmerze przy użyciu każdej pary grup SH Cys/pan.

BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH / 255 AcyloglicerolB Estry cholesterolu

ATP + CoA

AMP + PP: Estryfikacja

Palmltynlan.

Paimltollo-CoA SYNTETAZA ACYLO-CoA

Elongacja łańcucha, desaturacja Acylo-CoA

Ryc. 23-4. Los palmitynianu po jego biosyntezie

powtarza się jeszcze 6 razy, za każdym razem włącza się nowa reszta malonylowa, aż do powstania ló-węglowego (palmityłowego) rodnika. Jest on uwalniany z kompleksu enzymatycznego działaniem 6. enzymu znajdującego się w kompleksie, tioesterazy (deacylazy). Wolny palmitynian musi zostać zaktywowany do acylo-CoAzanim będzie mógł wejść do jakiegokolwiek innego szlaku metabolicznego. Zazwyczaj jego losem jest estryfikacja do acylogliceroli (ryc. 23-4). W gruczole sutkowym istnieje oddzielna tioesteraza swoista dla reszt acylowych C8, C10 lub C12, które następnie znajdują się w tłuszczu mleka. W gruczole sutkowym przeżuwaczy ten enzym jest częścią kompleksu syntazy kwasu tłuszczowego. Wydają się istnieć 2 centra aktywności w jednym dimerycznym kompleksie, które działają niezależnie, tworząc równocześnie 2 cząsteczki palmitynianu. Poniżej przedstawiono sumarycznie równanie całkowitej syntezy palmitynianu z acetylo-CoA i malonylo-CoA: CH,CO-S-CoA + 7HOOC-CH 3 C0-S-CoA t + 14NADPH + 14H+ -> ^CHatCHJ^COOH + 7CO 3 + 6H 2 O + + SCoA-SH + 14NADP1

Z acetylo-CoA, użytego jako cząsteczka inicjująca, tworzą się atomy węgla 15 i 16 palmitynianu. Dodawanie wszystkich następnych jednostek dwuwęglowych odbywa się przez uprzednie tworzenie malonylo-CoA. Jako cząsteczka inicjująca w wątrobie i gruczole sutkowym ssaków może działać butyrylo-CoA. Jeżeli propionylo-CoA działa jako cząsteczka inicjująca, powstają dlugołańcuchowe kwasy

tłuszczowe o nieparzystej liczbie atomów węgla. Występują one zwłaszcza u przeżuwaczy, u których propionian powstaje pod wpływem działania mikroorganizmów w żwaczu. Głównym źródłem równoważników redukujących (NADPH) jest szlak pentozofosforanowy NADPH jest zaangażowany, jako koenzym, w redukcję zarówno 3-ketoacylopochodnych, jak i acylowych pochodnych 2,3-nienasyconych. Oksydacyjne reakcje szlaku pentozofosforanowego (p. str. 240) są głównym źródłem wodorów niezbędnych do redukcyjnej syntezy kwasów tłuszczowych. Jest znamienne, że tkanki, które wykazują aktywny szlak pentozofosforanowy, są także tkankami wyspecjalizowanymi w aktywnej lipogenezie; są to wątroba, tkanka tłuszczowa i gruczoł sutkowy w okresie laktacji. Co więcej, obydwa szlaki metaboliczne znajdują się w pozamitochondrialnej przestrzeni komórki, lak że nie istnieją błony, ani inne bariery do przenoszenia NADPH/NADP od jednego szlaku do drugiego. Innymi źródłami NADPH jest reakcja, która przekształca jabłczan w pirogronian, katalizowana przez „enzym jabłczanowy" (dehydrogenaza jabłczanowa dekarboksylująca) (ryc. 23-5) oraz pozamitochondrialna reakcja dehydrogenazy izocytrynianowej (prawdopodobnie nie jest to istotne źródło). Acetylo-CoA jest głównym budulcem kwasów tłuszczowych Jest on wytwarzany z węglowodanów przez utlenianie pirogronianu wewnątrz mitochondriów. Jednakże acetylo-CoA nie przenika swobodnie do kompartmentu pozamitochondrialnego, zasadniczego miejsca syntezy kwasów tłuszczowych. Aktywność pozamitochondrial-

256 / ROZDZIAŁ 23 Paimltynlan

Glukozo-6-fosforan

Frukto zo-6-fosforan ■»

Glloeraldehyd o-3-fosforan DEHY DRO GEN AZA 3 -F O S F O G U C E H A LDE HYDO W A

Cytrynian W EW NĘTRZN A BŁO NA M ITOC H ON D R IALN A

S trona zew nętrzna OEHYDROGENAZA IZOCYTRYNtANOWA

A DEHYDR0G6MAZA S P tR O G H O N I A N O W A ^

Piróg rc n ian.-:' ; ' - ' ' ;; " " " : " • ' '

Jiii

;y-Vj rsrtmntan

:

Cykl kwasu cytrynowego ;,

mmmmKmmm

G lu ko za

Ryc. 23-5. Dostarczanie acetyl o-Co A i NADPH dla lipogenezy. PP — sztak pentozofosforanowy: T— przenośnik trikarboksylanów, K —- przenośnik a-ketoglutaranu.

nej liazy ATP-cytrynianowej, podobnie jak i „enzymu jabłczanowego", zwiększa się w stanie dobrego odżywienia, zachowując się równolegle do aktywności układu syntetyzującego kwasy tłuszczowe (tab. 21-1). Obecnie uważa się, że zużywanie pirogronianu do lipogenezy odbywa się przez cytrynian. Ten szlak obejmuje

glikolizę, po której następuje oksydacyjna dekarboksylacja do acetylo-CoA wewnątrz mitochondrium i następnie kondensacja ze szczawiooctanem do cytrynianu, jako część szlaku kwasu cytrynowego. Potem następuje tramslokacja cytrynianu do kompartmcntu pozamitochondrialnego, gdzie, w obecności CoA i ATP,

BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH / 257

ulega on rozszczepieniu do acetylo-CoA i szczawiooctanu, co jest katalizowane przez liazę ATP-cytrynianową. Ten aeetylo-CoA jest wówczas dostępny do tworzenia malonylo-CoA i syntezy palmitynianu (ryc. 23-5). Szczawiooctan może tworzyć jablczan pod wpływem działania NADH-zależnej dehydrogenazy jabłczanowej, po czym następuje wytwarzanie NADPH pod wpływem enzymu jabłczanowego. Ten NADPH z kolei staje się dostępny do lipogenezy. Ten szlak jest sposobem przeniesienia równoważników redukujących z pozamitochondrialnego NADH na NADP. Inną alternatywą dla jablczanu jest jego przetransportowanie do mitochondrium, gdzie może on przejść ponownie w szczawiooctan. Należy zwrócić uwagę, że przenośnik cytrynianu (trikarboksylanów) ■•' błonie mitochondrialnej wymaga jabłczanu do wymiany z cytrynianem (p. ryc. 14-16). U przeżuwaczy niemal nie ma liazy ATP-cytrynianowej ani enzymu jabłczanowego, prawdopodobnie dlatego, że u tych gatunków octan (pochodzący z żwacza) jest głównym źródłem acetylo-CoA. Ponieważ octan jest pozamitochondrialnie aktywowany do acetylo-CoA, nie ma potrzeby, aby wnikał on do mitochondriów i tworzył cytrynian przed inkorporacją w długołańcuchowe kwasy tłuszczowe. U tych gatunków, ze względu na brak enzymu jabłczanowego, znacznie większe znaczenie ma wytwarzanie NADPH działaniem pozamitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynia nowej. Elongacja łańcucha kwasów tłuszczowych zachodzi w siateczce śródplazmatycznej Ten szlak (elongacyjny układ mikrosomainy) przekształca acylo-Co A-pochodne kwasów tłuszczowych w pochodne acylowe, mające o 2 atomy węgla więcej, przy użyciu malonylo-CoA jako dawcy acetylu oraz NADPH jako czynnika redukującego. Związkami pośrednimi w tym procesie są tioestry CoA. Grupy acylowe, które mogą działać jako cząsteczki inicjujące, obejmują serię nasyconych kwasów tłuszczowych od Clo wzwyż, jak również nienasycone kwasy thiszczowe. Głodzenie w znacznej mierze znosi elongację łańcucha. Eiongacja stearylo-CoA w mózgu przyspiesza się w okresie mielinizacji, aby dostarczyć kwasów tłuszczowych C22 i C24, które występują w sfingolipidach (ryc. 23-6).

0 + •CH1-»Cl-S-CoA I 'COOH Malonylo-CoA

Acylo-CoA

SYNTAZA 3-KETOACYLO-CoA

C o A * S H +ł C O ,

R -CH, -O CI -'I CHI -*C - S - CoA3Koioaoylo-CoA

■NAOPH + REDUKTAZA3KETOACYLO-CoA

H

O

R-tHj-^H-fCHjJC - S-CoA 3-HydroksyacyloXoA

HYDRATAZA

^CH-Jfi - S-CoA 2,3-N<enasycony ac/lo^CoA

N A D P H + H+ REDUKTAZA 2,3-NSENASYCONYCH ACYLO-CoA NA DP*

:-JCH,-?
R y c . 2 3 - 6 . M ik r o s o m a ln y u k ł a d e l o n g a c j i ła ń c- u cha {e long aza).

258 / ROZDZIAŁ 23

STAN ODŻYWIENIA REGULUJE LIPOGENEZĘ Wiele zwierząt, łącznie z człowiekiem, przyjmuje pokarm jako oddzielone czasem posiłki i dlatego magazynuje wiele energii pochodzącej z pożywienia, aby móc ją użytkować między posiłkami. Proces lipogenezy dotyczy przekształcenia glukozy i takich związków pośrednich, jak pirogronian, mleczan i acetylo-CoA w tłuszcz, co stanowi anaboliczną fazę tego cyklu. Stan odżywienia organizmu i tkanki jest głównym czynnikiem kontrolującym szybkość lipogenezy. I tak szybkość ta jest duża u dobrze odżywionego zwierzęcia, którego dieta zawiera dużo węglowodanów. Zmniejsza się w warunkach ograniczonego dostarczania energetycznego pokarmu, pokarmu boga to tłuszczowego, lub gdy istnieje niedobór insuliny, jak to jest w cukrzycy. Warunki te są związane ze zwiększonym stężeniem wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu. Regulacja mobilizacji wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej jest opisana w rozdz. 27. Istnieje odwrotna zależność miedzy wątrobową lipogenezą a stężeniem wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy (ryc. 23-7). Największe zahamowanie lipogenezy występuje w zakresie zmian stężeń wolnych kwasów tłuszczowych o 0,3—0,8 jamot/ml osocza. Stężenia te w osoczu krwi zmieniają się o podany zakres podczas przejścia ze stanu sytości w stan 2,0 3,0 głodzenia. 0.5 1J0 WKTw surowicy (fimol/ml)

Ryc. 23-7. Bezpośrednia inhibicja wątrobowej lipogenezy przez wolne kwasy tłuszczowe. Lipo-genezę oceniano oznaczając wbudowywanie trytu 3H2O do wolnych kwasów tłuszczowych w perfun-dowanej wątrobie. WKT —, wolne kwasy tłuszczowe. (Doświadczenia z laboratorium autora wspólnie z D.L. Toppingiem).

Tłuszcze zawarte w pożywieniu powodują także zmniejszenie lipogenezy w wątrobie. Jeżeli ich zawartość w pożywieniu przekracza 10%, to nie ma przekształcania węglowodanów pożywienia w tłuszcze. Lipogenezą jest większa wówczas, gdy sacharoza zastąpi glukozę w pokarmie, ponieważ fruktoza omija etap kontrolny glikoiizy, jakim jest fosforruktokinaza i zalewa szlak lipogenezy (p. ryc. 22-4). LIPOGENEZĄ JEST REGULOWANA POPRZEZ MECHANIZMY KRÓTKOTERMINOWE I DŁUGOTERMINOWE Synteza długołańcuchowa kwasów tłuszczowych w trybie krótkotrwałym jest kontrolowana przez allosteryczne i kowalencyjne modyfikacje enzymów, a w dłuższym czasie przez zmiany szybkości syntezy i degradacji odpowiednich enzymów. Stężenie cytrynianu i acylo-CoA reguluje karboksylazę acetylo-CaA Reakcja ograniczająca szybkość szlaku lipogenezy znajduje się na etapie karboksylazy acetyio-CoA. Ta karboksylaza jest aktywowana przez cytrynian, którego stężenie się zwiększa w stanie dobrego odżywienia i który jest wskaźnikiem obfitego dostarczania acetylo-CoA. Jednakże jest ona hamowana działaniem cząsteczek acylo-CoA o długim łańcuchu węglowym, co jest przykładem hamowania zwrotnego przez końcowy produkt ca^go ciągu reakcji. Wobec tego, jeżeli nagromadza się acylo-CoA, ponieważ nie jest on dostatecznie szybko estryfikowany, automatycznie zmniejsza się synteza nowych kwasów tłuszczowych. Podobnie, gdy acylo-CoA nagromadza się w wyniku wzmożonej lipolizy lub dopływu wolnych kwasów tłuszczowych do tkanki, wówczas również następuje zahamowanie syntezy nowych cząsteczek kwasu tłuszczowego. Acylo-CoA może również hamować transporter trikarboksy łanów i wobec lego zapobiegać wychodzeniu cytrynianu z mitochondriów do cytozolu. Dehydrogenaza piróg ronią nowa jest także regulowana przez acylo--CoA Istnieje odwrotna zależność między stężeniem wolnych kwasów tłuszczowych, a proporcją aktywnej postaci dehydrogenazy pirogro-

BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH / 259

nianowej do nieaktywnej, co reguluje dostępność ace.tylo-CoA dla lipogenezy. Acylo-CoA powoduje zahamowanie aktywności dehydrogenazy pirogronianowej przez hamowanie wymiennego transportera ATP-ADP wewnętrznej błony mitochondrialnej, co prowadzi do zwiększenia wewnątrzmitochondrialnego stosunku [ATP] / jADP] i w konsekwencji do przekształcenia aktywnej postaci dehydrogenazy pirogronianowej w nieaktywną (p. ryc. 24-4). Ponadto utlenianie acylo-CoA, spowodowane zwiększonym stężeniem wolnych kwasów tłuszczowych, może powodować zwiększenie stosunku [acetylo-CoA] / [CoA] oraz [NADH] / [NAD+] w mitochondriach hamując w ten sposób dehydrogenazę pirogronianową. Hormony regulują również lipogenezę Insulina pobudza lipogenezę za pomocą kilku mechanizmów. Wzmaga transport glukozy do komórki (np. w tkance tłuszczowej) i przez to zwiększa dostępność zarówno pirogronianu do syntezy kwasów tłuszczowych, jak i glicerolo-3-fosforanu do estryfikacji kwasów tłuszczowych. Insulina zmienia nieaktywną postać dehydrogenazy pirogronianowej w aktywną, ale czyni to w tkance tłuszczowej, a nie w wątrobie. Ponadto karboksylaza acetyl o-Co A jest enzymem, który może być regulowany przez odwracalną fosforylację. Insulina aktywuje karboksylazę acetylo-CoA, zapewne przez aktywację fosfatazy białek. Także insulina, przez jej zdolność zmniejszania stężenia cAMP w komórce, hamuje lipolizę i przez to zmniejsza stężenie acylo-CoA o długim łańcuchu węglowym, będącego inhibitorem lipogenezy. Za pomocą tego samego mechanizmu insulina staje się antagonistą działania glukagonu i adrenaliny, które hamują karboksylazę acetylo-CoA, a więc i lipogenezę, dzięki zwiększeniu stężenia cAMP i umożliwieniu cAMP-zależnej kinazie białek unieczynnienie enzymu przez fosforylację. Ostatnio opisano AMP-zależną kinazę Watek, która wykrywa stan małej energii w komórce, wykazując wrażliwość na zwiększone stężenie AMP. Ta nowa kinaza także inaktywuje

przez fosforyiacj^ karboksyiaze acetylo-CoA. Ponadto aminy katecholowe hamują ten enzym przez receptory a-adrenergiczne i kinazę białek zależną od Ca2+/kalmoduliny. U przeżuwaczy octan, a nie glukoza, jest materiałem wyjściowym do lipogenezy. Następstwem tego jest to, że u tych zwierząt wiele mechanizmów regulacyjnych z udziałem mitochondriów nie ma zastosowania. Zarówno kompleks syntazy kwasu tłuszczowego jak i karboksylaza acetylo-CoA są ezymami adaptacyjnymi Adaptują się one do fizjologicznych potrzeb organizmu przez zwiększenie ich całkowitej ilości w stanie sytości, a zmniejszenie w głodzie, karmieniu tłuszczem i w cukrzycy. Insulina jest ważnym hormonem powodującym indukcję biosyntezy enzymu, a przeciwdziała temu glukagon. Musi upłynąć kilka dni, aby te działania uwidoczniły się i wzmagały bezpośredni i natychmiastowy efekt wolnych kwasów tłuszczowych oraz takich hormonów, jak insulina i glukagon.

PIŚMIENNICTWO Goodridge AG: Fatty acid synthesis in eukaryotes. Page 143 in: Biochemistry ojLipids andMembranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 1985. Goodridge AG: Dietary regulalion of gene expression: Enzymes involved in carbohydrate and lipid metabolism. Annu Rev Nuir 1987; 7:157. Hardie DG, Carling D, Sim ATR: The AMP-activated protein kinase: a multisubsiratę regulator of lipid metabolism. Trends Biochem Sci 1989; 14; 20. Singh N, Wakil SJ, Stoops JK: On the question of half-or full-site reactivity of animal fatty acid synthetase. J Biol Chem 1984; 259:3605. Tsukamoto Y et al: The architecture of the fatty acid synłhetasecotccia. JBkAChem 1983; 258:15312. Wakil SJ, Stoops JK, Joshi VC: Fatty acid synthesis and its regulation, Annu Rev Biochem 1983; 52:537.

2 4

Utlenianie kwasów tłuszczowych: Ketogeneza Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Kwasy tłuszczowe są utleniane zarówno do acetylo-CoA, jak i są syntetyzowane z acetylo-CoA. Jakkolwiek materiał wyjściowy jednego procesu jest identyczny z produktem drugiego procesu, a chemiczne etapy pośrednie zaangażowane w obydwa procesy są porównywalne, to jednak utlenianie kwasów tłuszczowych nie jest zwyczajnym odwróceniem ich biosyntezy, lecz zupełnie odmiennym procesem, zachodzącym w innym kompartmencie komórki. Oddzielenie utleniania kwasów tłuszczowych od ich biosyntezy umożliwia indywidualną kontrolę każdego z tych procesów i ich integrację z potrzebami tkanki. Utlenianie kwasów tłuszczowych zachodzi w mitochondriach. W każdym jego etapie uczestniczy pochodna acylo-CoA i każdy etap jest katalizowany przez oddzielny enzym. Koenzymami tego procesu są NAD i FAD. W wyniku utleniania kwasów tłuszczowych powstaje ATP. W odróżnieniu od utleniania, biosynteza kwasów tłuszczowych (lipogeneza) odbywa się w cytozolu. Uczestniczą w niej acylowe pochodne związane z wieloenzymowym kompleksem, NADP jako koenzym, i jest potrzebny ATP oraz jon wodorowęglanowy. Utlenianie kwasów tłuszczowych jest procesem aerobowym, wymagającym obecności tlenu.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Wzmożone utlenianie kwasów tłuszczowych jest charakterystyczne dla stanu głodzenia i cukrzycy (diabetes mellitits/. Jest ono przyczyną

powstawania ciał ketonowych* w wątrobie (ketoza). Ciała ketonowe są kwasami. Jeżeli są wytwarzane w nadmiarze przez długi czas, jak to ma miejsce w cukrzycy, to mogą być przyczyną kwasicy ketonowej (ketoacidosis), która nie leczona może być zgubna w skutkach. Ponieważ glukoneogeneza jest zależna od utleniania kwasów tłuszczowych, każde zmniejszenie ich utleniania prowadzi do hipoglikemii. Taka sytuacja ma miejsce w różnych stanach niedoboru karnityny lub enzymów istotnych w utlenianiu kwasów tłuszczowych (np. palmitoilotransferazy karnitynowej), albo pfzy zahamowaniu utleniania kwasów tłuszczowych spowodowanym truciznami (np. hipoglicyną).

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH ZACHODZI W MITOCHONDRIACH Kwasy tłuszczowe są transportowane we krwi jako wolne kwasy tłuszczowe (WKT, FFA) Określenie „wolne kwasy tłuszczowe" (ang. free fatty acids) odnosi się do kwasów tłuszczowych, które występują w stanie niezestryfikowanym. Alternatywnymi skrótami są UFA (ang.

*W języku polskim określenie „ciała ketonowe" (ketone bodies) było wielokrotnie przedmiotem krytyki. Zastąpiono je określeniem „związki ketonowe", mając na myśli 3 substancje, tj. aceton, acetooctan i p-bydroksymaślan. Określenie „ciała ketonowe" pozostawiono na wyraźne życzenie Tłumacza (przyp. red. i wyd.).

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 261

unesterified fatty acids) lub NEFA (ang. non-estenfię.d fatty acids). W osoczu WKT o dłuższym łańcuchu węglowym są związane z albuminą, zaś w komórkach z białkiem wiążącym kwasy tłuszczowe albo z białkiem Z. W rzeczywistości kwasy te nigdy nie występują w stanie „wolnym1'. Kwasy tłuszczowe o krótszym łańcuchu są lepiej rozpuszczalne w wodzie i występują w postaci niezjonizowanych kwasów lub anionów kwasu tłuszczowego. Kwasy tłuszczowe muszą być aktywowane, aby mogły być metabolizowane Podobnie jak to ma miejsce z przemianą glukozy, kwasy tłuszczowe muszą najpierw w reakcji z udziałem ATP zostać zamienione w aktywny metabolit, aby mogły reagować z enzymami odpowiedzialnymi za ich dalszy metabolizm. W całym szlaku całkowitej degradacji kwasów tłuszczowych jest to jedyny etap, który wymaga energii zawartej w ATP. W obecności ATP i koenzymu A, enzym — syntetaza acylo-CoA (tiokinaza) — katalizuje przemianę kwasu tłuszczowego, tj. wolnego kwasu tłuszczowego w „aktywny kwas tłuszczowy'*, czyli w acylo-CoA. Reakcja ta jest związana z wydatkiem 1 bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego. SYNTETAZA ACYLO-CoA

Kwas tłuszczowy + ATP + Co A---------------» - Acylo-CoA + PP, + AMP

Obecność pir o fosfatazy nieorganicznej sprawia, że aktywacja przebiega do końca dzięki ułatwieniu utraty dodatkowego bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego pirofosforanu. W rzeczywistości w czasie aktywacji każdej cząsteczki kwasu tłuszczowego są wiec wydatkowane 2 bogatoenergetyczne wiązania fosforanowe. PPi + HaO PIR0FOSFATA2A NIEORGANICZNA

Syntetazy acylo-CoA występują w siateczce śródplazmatycznej, w obrębie mitochondriów i na zewnętrznej błonie mitochondrialnej. Opisano kilka syntetaz acylo-CoA. Każda z nich jest swoista wobec kwasów tłuszczowych o określonej długości łańcucha.

Kwasy tłuszczowe o długim łańcuchu przenikają przez wewnętrzną błonę mitochondrialną jedynie w połączeniu z karnityną Karnityna (p- hy droksy-y-trimety loaminomaślan), (CH 3 ) 3 N+-CH 2 -CH(OH)-CH 2 -— COO~, jest szeroko rozpowszechniona, a szczególnie obficie występuje w mięśniach. Jest syntetyzowana z iizyny i metioniny w wątrobie i nerkach. Aktywacja niższych kwasów tłuszczowych i ich utlenianie może zachodzić w mitochondriach niezależnie od karnityny. W odróżnieniu od krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych WKT o długim łańcuchu nie wnikają do mitocbondriów i nie są utleniane bez uprzedniego przekształcenia w acylo karnityny. Acylo-CoA + Karnityna--------------------------► PALMITOILOTRANSFERAZA KARNITYMOWA

> Acylo karnityna + CoA

Enzym, palmitoilotransferaza karnitynowa 1, znajdujący się po wewnętrznej stronie zewnętrznej błony mitochondrialnej, katalizuje przekształcenie długołańcuchowych acylo-CoA w acylokarnitynę, która przenika do mitochondriów, przez co kwasy tłuszczowe stają się dostępne dla enzymów szlaku p-oksydacji. Translokaza karnitynoacylokarnitynowa działa jako błonowy wymienny przenośnik karnityny. Transport acy lokami ty ny do wnętrza mitochondriów jest sprzężony z przeniesieniem 1 cząsteczki karnityny na zewnątrz. W mitochondrium acylokarnityna reaguje z CoA, w wyniku czego powstają acylo-CoA i wolna karnityna uwalniane do macierzy mitochondriainej. Reakcja ta jest katalizowana przez palm i to i to transfer a «■ ka mity nową II, związaną z wewnętrzną powierzchnią wewnętrznej błony mitochondrialnej (ryc. 24-1). W mitochondriaeh występuje jeszcze inny enzym, acetylotransferaza karnitynowa, katalizujący przenoszenie grup acy 1 owych o krótkim łańcuchu węglowym między CoA a kamityną. Funkcja tego enzymu jest niejasna. Jest możliwe, że ułatwia on transport grup acetyl owych przez błonę mitochondrialną. Acetylo-CoA + Karnityna ACETYLOTRANSFERAZA KARNITYMOWA

Acetylokarnttyna +■ CoA

262 / ROZDZIAŁ 24 CoA

Strona FFA zewnętrzna SYNTETAZA ACYLO-Co/ł

ZEWNĘTRZNA ■-tM BŁONA l.>'£i;.'>j

MITOCHONDFNALNA ■

.

-

.

■

■

-

.

.

:

.

.

:

Acytokarnltyna PALMITOILORANSFERAZA KARNffYNOWAf RANSLOKAZA, WEWNĘTRZNA KARNITYNA->ił BŁONA,^. ACYLOMITOCHONDRIALNA RNITYN Strona wewnętrzna

PALMITO1LOTRANSFERAZA RNITY-A l l

Karnityna

A cv I o kar nity na Acylo-CoA

0-OksydtcJa Ryc. 24-1. Rola karnityny w transporcie długołańcuchowych kwasów tłuszczowych przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Oługołańcuchowy acylo-CoA nie może przenikać przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, ale produkt jego metabolizmu, acylokarnityna, ma tę zdolność.

p-Oksydacja kwasów tłuszczowych polega na kolejnym odczepianiu r uwalnianiu acetyło-CoA W p-oksydacji (ryc. 24-2) odczepiane są od cząsteczek acylo-CoA, począwszy od końca karbonylowego, reszty dwuwęglowe. Łańcuch jest rozrywany pomiędzy atomami węgla a (2) 1 p (3) i stąd nazwa ^-oksydacja. Powstające jednostki dwuwęglowe to cząsteczki acetylo-CoA; tak wiec z palmitoilo-CoA tworzy się S cząsteczek acetylo-CoA. W cyklicznej sekwencji reakcji są wytwarzane NADH i FADH 2 Kilka enzymów, znanych pod zbiorczą nazwą „oksydaza kwasów thiszczowych", znajduje się w macierzy mitochondrialnej w pobliżu łańcucha oddechowego (który jest umiejscowiony w wewnętrznej Honie mitochondrialnej). Katalizują one utlenianie acyio-CoA do acetylo-CoA, co wiąże się z fosforylacją ADP do ATP (ryc. 24-3). Po wniknięciu reszty acylowej przez wewnętrzną błonę mitochondrialną za pośrednictwem uktadu transportującego karnitynę i po odtworzeniu acyio-CoA, następuje oderwanie 2 atomów wodoru od atomów węgla 2 (a) i 3 (p), katalizowane przez dehydrogenazę acylo-CoA. W wyniku tej reakcji powstaje A2-tranj-enoilo-CoA. Koenzymem tej dehydrogenazy jest flawoproteina zawierająca FAD jako grupę pro-

CO-S-CoA AcetyloCoA Kolejne usuwanie jednostek dwuwęglowych

co-s-coA+a

8 CH3-CO-S-CoA Acetylo-CoA Ryc. 24-2. Ogólny schemat [i-oksydscji kwasów tłuszczowych.

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 263 Kwas tłuszczowy CoA-SH

ATP

SYNTETAZA ACYLO-CoA

^ł* AMP-ł- PP, i.

Aoyto-Co* (Aktywny Kwas tłuszczowy)

0

R^CHr *CHrC - S -CoA i

WEWNĘTRZNA BLDNAMITOCHONDHIALNA

(zewnętrzna)strona cytoplazmatyczna

TRANSPOHTER KARNITYNOWY (wewnętrzna) strona mltochoncfrlatna

'CH

j -C -

S C o A DEHYDBOGENAZA] ACYLO-OoA

(Flawoprotaina) 2~(P; -»-H,0 Łańcuch Q oddechowy

S RCH =

A'-S»n*Enolło-CoA

CoA H-C-SHYDRATAZA A"ENOILO-CnA

-CoA

H,0

?H ł

RJCH-JCH

3

-C-

SCoA

DEHYDROGENAZA L( + )-^KYDROKSYACYLO-CoA

»Xatoacylo-CoA

3

R-

3-KETOACYLOTIOLAZA TIOLAZA

«:«

Łańcuch oddechow y

3-© (4) H,0

CoA-SH 2CO,

Ryc. 24-3. [J-Oksydacja kwasów tłuszczowych. Długołańcuchowy acylo-CoA przechodzi cyklicznie przez reakcje 2-5, a w każdym cyklu jest odczepiany acetylo-CoA działaniem tiolazy (reakcja 5). Gdy pozostanie reszia acyiowa o długości jedynie 4 atomów węgla, wówczas w reakcji 5 wytwarzają się 2 cząsteczki acetylo-CoA

264 / ROZDZIAŁ 24

stetyczną. Reoksydacja tej grupy prostetycznej przez łańcuch oddechowy wymaga pośrednictwa innej fiawoproteiny nazwanej flawoproteiną przenoszącą elektrony. Wysyccnic podwójnego wiązania i wytworzenie 3-hydroksyacylo-CoA odbywa się przez przyłączenie cząsteczki wody, co katalizowane jest przez enzym hydratazę A2-enoilo-CoA. Pochodna 3-hydroksylowa ulega dalszemu odwodorowaniu na węglu 3 pod wpływem dehydrogenazy L(+)-3-hydroksyacylo-CoA, W wyniku tej reakcji powstaje odpowiedni 3-ketoacylo-CoA. W reakcji tej MAD, a nie FAD jest koenzymem uczestniczącym w odwodorowaniu. W końcu 3-ketoacylo-CoA jest rozrywany w pozycji 2,3 przez tiolazę (3-ketoacylotiolazę aibo poprą wnie: acetyl o trans ferazę acetylo-CoA), katalizującą tiolityczne rozerwanie wiązania z udziałem drugiej cząsteczki CoA. Produktami tej reakcji są acetylo-CoA i acylo-CoA zawierający o 2 atomy węgla mniej niż pierwotna cząsteczka acy-loCoA, która uległa utlenieniu. Utworzony w reakcji rozszczepienia acylo-CoA ponownie wchodzi w szlak oksydacyjny rozpoczynający się reakcją 2 (ryc. 24-3), W ten sposób długi łańcuch kwasu tłuszczowego może zostać całkowicie rozłożony na acetylo-CoA (jednostki C2), Ponieważ acetylo-CoA może być utleniony do CO2 i wody w cyklu kwasu cytrynowego (który także jest umiejscowiony w mitochondriach), kwasy tłuszczowe mogą ulegać całkowitemu utlenieniu.

W wyniku utleniania kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgła powstaje cząsteczka propionylo-CoA

Kwasy tłuszczowe o nieparzystej liczbie atomów węgla są utleniane w szlaku p-oksydacji z wytwarzaniem acetylo-CoA, aż do pozostania trójwęglowej reszty propionylo-CoA. Ten związek jest przekształcany do sukcynylo-CoA, metabolitu będącego związkiem pośrednim cyklu cytrynianowego (p. też ryc. 21-2). Wobec tego reszta propionylowa z kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgla jest jedynym fragmentem kwasów tłuszczowych, który jest glukogenny.

Utlenianie kwasów tłuszczowych powoduje powstanie wielu cząsteczek ATP

Transport elektronów w łańcuchu oddechowym ze zredukowanych fiawoproteiny i NAD

prowadzi do syntezy 5 bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych (p. rozdz. 14) na każdą z pierwszych 7 cząsteczek acetylo-CoA utworzonych przez P-oksydację palmitynianu ( 7 x 5 = 35), W sumie wytwarza się 8 mol acetylo-CoA, z których każdy może dostarczyć 12 wiązań o dużej energii przez utlenienie w cyklu cytrynianowym. Ogółem powstaje więc 8 x 1 2 = 96 wiązań bogatoenergetycznych pochodzących z utlenienia cząsteczek acetylo-CoA utworzonych w wyniku rozpadu palmitynianu. Po odjęciu 2 wiązań bogatoenergetycznych na początkową aktywację kwasu tłuszczowego zysk netto wynosi 129 wiązań bogatoenergetycznych na mol utlenionego palmitynianu albo 129 x 30,5 = 3935 kJ. Swobodna energia spalania kwasu palmitynowego wynosi 9791 kJ/mol, wobec czego w omawianym procesie przetworzeniu na energię zawartą w bogatoenergetycznych wiązaniach fosforanowych ulega ok. 40% całkowitej energii spalania kwasu tłuszczowego.

Kwasy tłuszczowe o bardzo długim łańcuchu są utleniane w peroksysomach

W peroksysomach zachodzi zmodyfikowana forma p-oksydacji. Produktami jej są acetylo-CoA i K2O2 (H2O2 powstaje na etapie działania dehydrogenazy związanej z flawoproteiną). Ten szlak nie jest bezpośrednio powiązany z fosforylacją i wytwarzaniem ATP, ale pomaga utlenić kwasy tłuszczowe o bardzo długim łańcuchu (np. C20) C22). Jest on indukowany przez spożycie pokarmów o dużej zawartości tłuszczu, a także przez leki o działaniu hipolipemicznym, np. klofibrat. Enzymy zawarte w peroksysomach nie atakują kwasów tłuszczowych o krótszym łańcuchu. Sekwencja P-oksydacji kończy się na oktanoilo--CoA. Grupy oktanoilowe i acetylowe są usuwane z peroksysomów w postaci oktanoilo-i acctylokamityny, a następnie sa utleniane w mitochondriach.

ot- i (o-OKSYDACJA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH SĄ WYSPECJALIZOWANYMI SZLAKAMI Ilościowo p-oksydacja w mitochondriach jest najważniejszym szlakiem utleniania kwasów tłuszczowych. Jednakże w mózgu wykryto oc-oksydację, tj. proces usuwania po 1 atomie węgla od karbonylowego końca cząsteczki. Ten

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 265

proces nie wymaga przekształcenia kwasów tłuszczowych w pochodną Co A i nie wiąże się z wytwarzaniem bogatoenergetycznych fosforanów. tó-Oksydacja jest normalnie szlakiem o bardzo niewielkim znaczeniu. Uczestniczą w niej układy hydroksylujące zawierające cytochrom P-450 siateczki śródpiazmatycznej. Grupa — CH3 jest przekształcana w grupę — CHjOH, a następnie utleniana do — COOH i w ten sposób powstaje kwas dikarboksylowy. Jest on utleniany przez B-oksydacje zwykle do kwasów adypinowego (C6) i suberynowego (C8), które są wydalane z moczem.

WADLIWE UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH JEST PRZYCZYNĄ CHORÓB METABOLICZNYCH Niedobór karnityny może występować zwłaszcza u noworodków, a szczególnie u wcześniaków. Może on być spowodowany niedostateczną biosyntezą karnityny albo jej utratą przez nerki. Utratę może także spowodować hemodializa lub acyduria spowodowana kwasami organicznymi. Karnityna jest wówczas wydalana po sprzęgnięciu z kwasami organicznymi. W wymienionych stanach zachodzi potrzeba uzupełnienia karnityny, podobna do potrzeby uzupełnienia niedoborów witaminowych w pokarmach. Objawami niedoboru karnityny są: okresowa hipoghkemia, spowodowana zmniejszoną glukoneogenezą (uwarunkowaną zmniejszonym utlenianiem kwasów tłuszczowych), upośledzona ketogeneza w obecności zwiększonego stężenia WK.T w osoczu, osłabienie mięśni oraz spichrzanie Jipidów w tkankach miąższowych. Leczenie polega na doustnym podawaniu karnityny. Objawy niedoboru karnityny są podobne do zespołu Reye'a, w którym stężenie karnityny jest prawidłowe. Przyczyna zespołu Reye'a jest nieznana. Niedobór wątrobowej palmitoilotransferazy karnitynowej jest przyczyną hipoglikemii i małego stężenia związków ketonowych w osoczu, podczas gdy niedobór mięśniowej palmitoilotransferazy karnitynowej charakteryzuje się nieprawidłowym utlenianiem kwasów tłuszczowych, co powoduje napadów o występujące osłabienie mięśni i mioglobinurię. Mechanizm działania hipoglikemizującego pochodnych sulfonyl o mocznika (gliburyd i tolbutamid) poJega min. na zmniejszeniu utleniania kwasów tłusz-

czowych uwarunkowanym hamowaniem palmitoilotransferazy karnitynowej. Jamajska choroba wymiotna jest spowodowana spożywaniem niedojrzałych owoców drzewa akee, zawierających toksynę hipoglicyn, która inaktywując dehydrogenazę acylo-CoA hamuje P-oksydację i powoduje hipoglikemię. Acyduria dik ar boksytów a charakteryzuje się wydalaniem &>-dikarboksylowych kwasów 0 długości łańcucha Ce do C,o i hipoglikemią. Jest ona spowodowana brakiem mitochondrialnej dehydrogenazy acylo-CoA swoistej dla substratów o średniej długości łańcucha. Brak tego enzymu upośledza p-oksydację, ale wzmaga (o-oksydację kwasów tłuszczowych o długim 1 średnim łańcuchu, które są następnie skracane podczas P-oksydacji do kwasów dikarboksyiowych o średniej długości łańcucha i są wydalane z moczem. Choroba Rei suma jest rzadkim zaburzeniem neurologicznym spowodowanym nagromadzaniem się kwasu fitanowego, powstałego z fitolu, składnika chlorofilu występującego w pokarmach roślinnych. Kwas fitanowy zawiera grupę metylową przy węglu 3, która blokuje p-oksydację. U osób zdrowych początkowa a-oksydacja usuwa grupę metylową. Osoby z chorobą Refsuma mają dziedziczną wadę cc-oksydacji, która jest przyczyną nagromadzania się kwasu fitanowego w tkankach. Zespół Zellwegera {mózgo wo-wątrobo wo-nerkowy) występuje u osób z rzadko stwierdzanym wrodzonym brakiem peroksysomów we wszystkich tkankach. Gromadzą się u nich kwasy polienowe C26—C33w tkance mózgowej, gdyż nie ma w tej wadzie zdolności do utleniania kwasów tłuszczowych o długim łańcuchu w peroksysomach.

UTLENIANIE NIENASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH ODBYWA SIĘ W ZMODYFIKOWANYM SZLAKU 8- OKSYDACJI Nienasycone kwasy tłuszczowe związane estrowo z CoA są degradowane przez enzymy uczestniczące normalnie w p-oksydacji, aż do etapu powstania A3-cn-acylo-CoA albo A4-cis-acylo-CoA, zależnie od pozycji podwójnego wiązania (ryc. 24-4). Pierwszy z tych związków jest izomeryzowany (izomeraza A3-m -+ A2-trałts-euoilo-CoA) do odpowiedniego etapu A2-trans-enoUo-CoA p-oksydacji, aby następnie

266 / ROZDZIAŁ 24 cis

cis

:-sLinolalto-CoA 3 cykle /J-oksydacji 3-Acetylo-CoA cis

Ryc. 24-4. Kolejność reakcji zachodzących podczas utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych, np. kwasu finolowego. Kwasy tłuszczowe Ai-cis lub kwasy tłuszczowe tworzące A*-as-enoilo-CoA, wchodzą do szlaku w pokazanym miejscu.

cis

tf-cts-Cć-cis-O l«n o Ilo-Co A IZOMERAZA A'-cfc (albo

as

A1- trans~ó?-cts-D leno Ilo-Co A [etap /J-oksydaejl odpowiadający AMrans-enoilc-CoAi

ulec hydratacji i dalszemu utlenieniu. Każdy A*-c«-acylo-CoA pozostający w tym szlaku, czego przykładem jest przemiana kwasu linolenowego (ryc. 24-4), albo wchodzący w szlak na tym etapie (3-oksydacji jest przekształcany do A2-(fanj-A+-c/.c-dienoilo-CoA przez dehydrogenazę acylo-CoA, Ten związek pośredni jest przekształcany do A3-/rans-enoilo-CoA pod wpływem redukta/y A2-trans-A4-cis-dienoilo-CoA — enzymu zależnego od NADP. Izomeraza A3-c/5-*A;:-ffa«5-enoilo-CoA atakuje również podwójne wiązanie óP-trcms, powodując powstanie A2-mzns-enoilo-CoA, związku pośredniego P-oksydacji.

1 cykl ^-oksydacji Acetylo-CoA cs

'

C-S-CoA O A*-//a/7*A4-rfs-Dl8nollo-CoA ^ DEHYDflOGENAZA ACYLO-CoA H + +NA0PH-O . Ał-c/s-Enollo-CoA REDUKTAZA

*

C-S-CoA

A^frans-Enollo-CoA IZOMERAZA Ał-c/9{albo A*-irans-ENOILOCoA

O // C-S-CoA

•J

4 cykle ^-oksydacji

4-Aoe(ylo-CoA

Mikrosomalna peroksydacja wielonienasyconych kwasów tłuszczowych jest zależna od NADPH NADPH-zależna peroksydacja nienasyconych kwasów thaszczowych jest katalizowana przez enzymy mikrosomalne. Przeciwutleniacze BHT (butylowany hydroksytoluen) i a-tokoferol (witamina E) hamują mikrosomalna peroksydację lipidów. KETOGENEZA ZACHODZI WÓWCZAS, GDY NATĘŻENIE UTLENIANIA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH W WĄTROBIE JEST DUŻE W pewnych warunkach metabolicznych, związanych z dużym natężeniem utleniania kwasów tłuszczowych, wątroba wytwarza znaczne ilości acetooctanu i D(-)-3-hydroksymaślanii (P-hydroksymaślanu). Acetooctan ulega ciągłej samoistnej dekarboksylacji, dając aceton. Te 3 substancje są znane pod wspólną nazwą ciała ketonowe (nazywane także związkami acetonowymi, lub niewłaściwie „ketonami"*) (ryc. 24-5). Acetooctan i 3-hydroksymaś-

* Termin „ketony" nie powinien byc używany, ponieważ 3-hydroksymaśIan nie jest ketonem, a we krwi jest wiele ketonów, które nie są związkami (ciałami) ketonowymi, np. pirogronian, fruktoza.

UTLENIANiE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 267

O I ICH,-C-CH,-

COO"

DEHYDHOGENAZA D(-}3-HYDROKSYMAS ŁANOWA

Acetooctan

NADH + H NA D ł

CH,-CH-CH,-COCT DMa-Hydroksyinaślan Ryc. 24-S. Wzajemne zależności ciał ketonowych. Dehydrogenaza D(-)-3-hydroksymaślanowa jest enzymem mitochondrialnym.

lan są wzajemnie w siebie przekształcane działaniem mitochondrialnego enzymu dehydrogenazy D(-)-3-hydroksymaślanowej. Równowaga tej reakcji jest kontrolowana mitochondrialnym

2COi

stosunkiem [NAD+] do [NADH], tj. stanem red.-oks. Stosunek [3-hydroksymaślan]; [acetooctan] w krwi waha się w granicach 1:1—10:1. Stężenie całkowite ciał ketonowych we krwi dobrze odżywionych ssaków normalnie nie przekracza 0,2 mmol/L Jest ono nieco większe u przeżuwaczy dzięki tworzeniu 3-hydroksymaślanu z kwasu masłowego (produktu fermentacji w żwaczu) w ścianie żwacza. U człowieka utrata ciał ketonowych z moczem wynosi zwykle mniej niż 1 mg/24 h. Stany zwiększonego stężenia ciał ketonowych we krwi określa się jako ketonemię (hiperketonemię), zaś zwiększone ich wydalanie z moczem jako ketouuric. Oba te stany określa się jako ketozę. Kwasy acetooctowy i 3-hydroksymasłowy są umiarkowanie mocnymi kwasami i są zbuforowane, gdy występują we krwi lub w tkankach. Jednakże w stanach zwiększonego wydalania nadmiaru obu tych związków dochodzi do utraty kationu buforującego (pomimo zwiększonego wytwarzania amoniaku w nerce). W konsekwencji dochodzi do stopniowego wyczerpania rezerwy alkalicznej i do rozwoju kwasicy ketonowej. Wystąpienie kwasicy ketonowej może być fatalne w skutkach u chorych z niewyrównaną cukrzycą.

2CO,

Ryc. 24-6. Powstanie, zużywanie i wydalanie ciał ketonowych. Główny szlak jest zaznaczony ciągłymi strzałkami

268 / ROZDZIAŁ 24

Najprostsza postać ketozy występuje przy truciu ciążowym u owiec i ketozie u mlecznych głodzeniu, kiedy dochodzi do wyczerpania się krów. Postacie ketozy pozbawione znaczenia zapasów węglowodanowych i do zwiększenia chorobowego stwierdza się u osób żywionych stężenia wolnych kwasów tłuszczowych. Każdy dietą o dużej zawartości tłuszczu oraz po wykoinny stan, w którym występuje ketoza, nie różni naniu ciężkiego wysiłku u niektórych osób się jakościowo od tego modelu metabolicznego, będących na czczo. ale ilościowo może być tak nasilony, że jest In vivo wątroba wydaje się być jedynym przyczyną stanów chorobowych obserwowa- narządem u nieprzeżuwaczy wydzielającym nych np. w cukrzycy {diabetes mellitus), w za- znaczne ilości ciał ketonowych do krwi. Poza-

wątrobowe tkanki zużywają ciała ketonowe jako substraty energetyczne. Pozawątrobowe źródła ciał ketonowych, występujące u przeżuwaczy w okresie sytości nie mają znaczącego udziału w powstawaniu ketozy u tych gatunków. Wypływ ciał ketonowych z wątroby do tkanek pozawątrobowyeh jest wynikiem aktywnego mechanizmu enzymatycznego pobudzającego wytwarzanie ciał ketonowych w wątrobie oraz małej aktywności w tym narządzie enzymów odpowiedzialnych za ich zużytkowanie. Odwrotna sytuacja ma miejsce w tkankach pozawątrobowych (ryc. 24-6). 3-Hvdroksy-3-metyloglutarylo-CoA (HMG-CoA) jest związkiem pośrednim na szlaku ketogenezy w wątrobie Enzymy odpowiedzialne za powstawanie ciał ketonowych są związane głównie z mitochondriami. Pierwotnie sądzono, że tylko 1 cząsteczka acetooctanu może powstać z końcowych 4 węgli kwasu tłuszczowego podczas jego utleniania. Później, aby wyjaśnić powstawanie większych niż równoważne ilości acetooctanu z I cząsteczki kwasu tłuszczowego o długim iańcuchu, jak i możliwość tworzenia ciał ketonowych 2 kwasu octowego, zaproponowano, że jednostki C2 powstające w p-oksydacji mogą ze sobą kondensować, tworząc acetooctan. Taki proces może być wynikiem odwrócenia reakcji katalizowanej przez tiolazę, w której 2 cząsteczki acetylo-CoA kondensują tworząc acetoacetylo-CoA. Acetoacetylo-CoA, który jest związkiem wyjściowym do ketogenezy, mógłby więc powstać albo bezpośrednio pod-

czas p-oksydacji, albo jako wynik kondensacji acetylo-CoA (ryc. 24-7). Zaproponowano JLszlalagowstawania acetooctapH ? fgetff"^^lo-CoA.?terwszv"z'nicn"ma bvć prosta deacyla■cjąTDrugrszlak (ryc. 24-8) obejmuje kondensację acetoacetylo-CoA z jeszcze 1 cząsteczką acetylo-CoA i wytworzenie HMG-CoA. Reakcję tę katalizuje syntaza 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-CoA. Obecność w mitochondriach innego enzymu, liazy 3-hydroksy-3-metyloghtfarylo-CoA, umożliwia odczepienie acetylo-CoA od HMG-CoA z pozostawieniem wolnego acetooctanu. Atomy węgla odczepione jako cząsteczka acetylo-CoA pochodzą z pierwotnej cząsteczki acetoacetylo-CoA (ryc. 24-8). Obydwa te enzymy muszą być w ntitochondriach, aby zachodziła ketogeneza. Ma to miejsce jedynie w wątrobie i w nabłonku żwacza. Obecnie przeważa opinia, że szlak HMG-CoA jest główną drogą tworzenia ciał ketonowych. Chociaż podczas głodu występuje znaczne zwiększenie aktywności liazy HMG-CoA, dane doświadczalne nie sugerują, aby byl to enzym ograniczający szybkość ketogenezy. Acetooctan jest przetwarzany do D(-)-3-hydroksymaślanu przez dehydrogenazę D(-)-3-hydroksymaślanową, która występuje w mitochondriach wielu tkanek, łącznie z wątrobą. D(-)-3-Hydroksymaślan jest ilościowo dominującym ciałem ketonowym występującym we krwi 1 w moczu w ketozie. Ciała ketonowe są wykorzystywane jako materiał energetyczny przez tkanki pozawątrobowe Chociaż wątroba jest wyposażona w aktywny mechanizm enzymatyczny potrzebny do wytwarzania acetooctanu z acetoacetylo-CoA, to raz powstały acetooctan nie może być w zasadzie w wątrobie ponownie reaktywowany. W cytozolu komórek wątrobowych zachodzi znacznie mniej aktywny proces biosyntezy cholesterolu, dla którego acetoacetylo-Co A jest prekursorem. Wszystko to sprawia, że w wątrobie przeważa powstawanie acetooctanu nad jego utylizacją. W tkankach pozawątrob owych zachodzą 2 reakcje, w których acetooctan jest aktywowa ny do acetoacetylo-Co A. W jednej z nich uczest niczy sukcynylo-CoA i enzym transfera/a bursz tyny ło-CoA-acetoacetylo-Co A. Enzym ten kata lizuje przeniesienie CoA z sukcynylo-CoA na acetooctan z wytworzeniem acetoacetylo-Co A i wolnego bursztynianu.

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 269

D(-)-3-HydroksymaśIan może być bezpośrednio aktywowany w tkankach pozawątrobowych przez odpowiednią syntetazę; jednakże przemiana do acetooctanu z udziałem dehydrogenazy D(-)- 3 -hydro ksym a sianowej i NAD+, z następującą potem aktywacją do acetoacetylo-CoA, jest ważniejszą drogą dalszej przemiany hydroksymaślanu. Acetoacetylo-CoA powstały w tych reakcjach jest rozszczepiany do acetylo-CoA działaniem tiolazy i utleniany w cyklu kwasu cytrynowego, jak to przedstawiono na ryc. 24-7. Ciała ketonowe są utleniane w tkankach pozawątrobowych proporcjonalnie do ich stężenia we krwi. Są one utleniane preferencyjnie przed glukozą i WKT. Kiedy stężenie ciał ketonowych we krwi zwiększa się, zwiększa się ich utlenianie, aż do stężenia ok. 12 mmol/l, w którym wysycają one układy utleniające. Gdy to nastąpi, znaczna ilość pobieranego przez zwierzę tlenu może być zużywana do utleniania ciał ketonowych.

CHaC0O" I CH a CO-S-CoA Sukcvnylo-CoA

CH3COCHaCOO Acetooctan CH 3COCH3 CO-S-CoA ITRANSFCRAZACOAI

CHaCOO" i CHaCOO" Bursztynian Acetoa cetylo -CoA

Druga reakcja polega na aktywacji acetooctanu przez ATP w obecności CoA, katalizowana jest przez syntctazę acetoacetjlo-CoA, SYNTETAZA ACETOACETYLO-CoA

CH 3 COCH ICOO"+ ATP+ CoA- SH Acetooctan - CH3COCHJCOSCoA+AMP+ A ceto a c et y I o - C o A

FFA AT P- v CoA

SYNTETAZA ACYLOCoA

AMP+ PPt ^-Oksydacja •[AMrtylo-CoA).

AcytoCoA

Ettryflkacja

Tfiacylogilcaro l fosioiipld

|DEACYLAZA|

"7T" H,0

CoA

SYNTAZA HMG-CoA

ITPLAZAI

\ Pula aeetylo-CoA

H,O\ *

3-HydrDk£y-3-me! yloglutar^o-CoA (HMG-CoA) LIAZA HMG-CoA

Acetylo-CoA

I kwasu! cytrynowego

2CO,

DEHYDROGENAZA D(-)3-HYDROKEYWASLANOWA

D(-)3My0roksyfna4ian

Rve. 24-7. Szlak ketogenezy w wątrobie. WKT — wolne kwasy tłuszczowe, HMG — 3-hydroksy-3-metylogiuiaryl.

270 / ROZDZIAŁ 24 O

O

CH J - C- CH J -C- S - CoA Acetoacetylo-CoA

HjO

3

-*C- S —Co A Awtylo-CoA

V _________ SYNTAZA HMG-CoA OH I

O li

CH,- C - CHi —C-S-CoA "Ć H , -* C O O 3-Hyd ro ksy-3-m styl og! u ta rył o-CoA LSAZA HMG-CoA

i CH 3 - C Acełooctan

H.-C-S — <

CH 3 -C~S —CoA Acetylo-CoA

Byc. 24-8. Powstawanie acetooctanu przez pośrednie wytwarzanie HMG-CoA.

Większość danych doświadczalnych przemawia za tym, że kctonemia jest powodowana raczej nadmiernym wytwarzaniem ciał ketono-

wych w wątrobie niż upośledzonym ich zużywaniem przez tkanki pozawątrobowe. Wyniki doświadczeń na szczurach z usuniętą trzustką przemawiają jednak za tym, że w ciężkiej cukrzycy ketoza może być pogłębiana zmniejszeniem katabolizowama ciał ketonowych. Przy umiarkowanej ketonemii utrata ciał ketonowych z moczem stanowi zaledwie niewielki procent całkowitego ich wytwarzania i utylizacji. Ponieważ ciała ketonowe zachowują się w nerkach podobnie jak związki „progowe" (w rzeczywistości nie istnieje prawdziwy próg nerkowy dla tych metabolitów), przy czym poszczególne gatunki i poszczególni osobnicy wykazują znaczne różnice indywidualne; ciężkość ketozy należy oceniać na podstawie nasilenia ketonemii, a nie ketonurii. Podczas gdy utlenianie acetooctanu i D(-)3--hydroksymaślanu w tkankach pozawątrobo-wych przebiega nader sprawnie, utlenianie acetonu in vivo jest raczej trudne.

KETOGENEZA JEST REGULOWANA NA 3 KLUCZOWYCH ETAPACH 1. Pierwsze miejsce kontroli ketogenezy znaj duje się w tkance tłuszczowej. Retoza nie wy stąpi in vivo, jeżeli nie ma równoczesnego zwięk szenia stężenia krążących wolnych kwasów tłu szczowych, które pochodzą z lipolizy triacylogliceroli w tkance tłuszczowej. Kwasy tłusz czowe są prekursorami ciał ketonowych w wąt robie. Wątroba zarówno w fazie sytości, jak i w czasie głodzenia ma zdolność wychwytywa nia ok. 30% lub więcej kwasów tłuszczowych z krwi docierającej do tego narządu. Przy dużych stężeniach wolnych kwasów tłuszczo wych we krwi ich napływ do wątroby jest znaczny. Wobec tego dla kontroli ketogenezy znacząca jest rola czynników regulujących mobi lizację wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej (ryc. 24-9). 2. Losy wychwytywanych przez wątrobę wo lnych kwasów tłuszczowych mogą być dwojakie po wstępnej ich aktywacji do acylo-CoA. Mogą one zostać zestryfikowane, głównie do triacylo-

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 271

gliceroli i fosfolipidów, lub też ulegają fi-oksydacji do CO, względnie do związków ketonowych. Wydolność estryfikacji, jako czynnika przeciwketogennego, zależy od dostępności w wątrobie prekursorów glicerolo-3-fosforanu. Jednak w głodzonych perfundowanych wątrobach dostępność glicerolo-3-fosforanu nie jest czynnikiem ograniczającym estryfikację WKT. Nie rozstrzygnięto ostatecznie, czy ta dostępność w wątrobie jest w ogóle czynnikiem ograniczającym szybkość estryfikacji. Nie ma również pewnych informacji, czy aktywność in vivo enzymów uczestniczących w estryfikacji jest czynnikiem ograniczającym szybkość tego procesu. Wydaje się, że nim nie jest, gdyż nie zdarza się spichrzanie w wątrobie ani wolnych kwasów tłuszczowych, ani związków pośrednich na drodze ich estryfikacji (p. ryc. 26-1). Używając perfundowanej wątroby wykazano, że narząd ten. pochodzący od dobrze kar-

Trlacyloglioerol

TKANKA TŁUSZCZOWA

©

Llpoliza

WKT KREW

WKT

Cykl kwasu cytrynowego Ketogeneza CO, Ciała ketonowe

Ryc. Z4-9. Regulacja ketogenezy. 1-3— 3-węzłowe etapv szlaku metabolizmu wolnych kwasów tłuszczowych (WKT), które dete/minują wielkość ketogenezy. ________ _____________

mionyeh szczurów, estryfikuje znacznie więcej kwasów tłuszczowych znakowanych 14C niż wątroba szczurów głodzonych, w której nie zestryfikowany nadmiar wolnych kwasów tłuszczowych jest utleniany do 14CO;, lub 14C-ciał ketonowych. Te wyniki tych badań można wyjaśnić tym, że aktywność palmitoilotransferazy I kamity nowej, umiejscowionej w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, reguluje wnikanie grup acylowych o długim łańcuchu do wnętrza mitochondriów przed ich fi-oksyda-cją (p. ryc. 24-1). Aktywność tego enzymu jest mała w stanie sytości, gdy utlenianie kwasów tłuszczowych jest małe, natomiast duża przy głodzeniu, kiedy zwiększa się utlenianie kwasów tłuszczowych. Malonylo-CoA, początkowy metabolit w biosyntezie kwasów tłuszczowych (p. ryc, 23-1), którego stężenie zwiększa się w stanie sytości, jest inhibitorem wymienionej pataitoilotransferazy, przez co ustaje p-oksydacja. W warunkach sytości zachodzi więc aktywna lipogeneza i jest duże stężenie malonylo-CoA, hamującego palmitoilotransferazę I (ryc. 24-10). Wolne kwasy tłuszczowe, wnikające do wątroby przy ich małym stężeniu w osoczu, są niemal w całości estryfikowane do acyl o gliceroli i wydalane z wątroby do krwi w postaci lipoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL), Na początku głodzenia, kiedy stężenie wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu się zwiększa, zahamowana zostaje karboksylaza acetylo-CoA i stężenie malonylo-CoA się zmniejsza. W następstwie tego procesu odblokowaniu ulega palmiloilotransferaza kani i ty nowa, co pozwala na zwiększenie utleniania acyl o-Co A. Te zdarzenia nasilają się w stanach głodzenia, kiedy zmniejsza się stosunek [insulina] / [glukagon], przez co zwiększa się lipoliza w tkance tłuszczowej, natomiast zahamowaniu ulega karboksylaza acetylo-CoA w wątrobie (p. ryc. 24-10). 3. Acetylo-CoA, powstały w procesie P-oksydacji, jest utleniany w cyklu kwasu cytrynowego albo wchodzi w szlak ketogenezy wytwarzający ciała ketonowe. Gdy stężenie wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy się zwiększa, wówczas proporcjonalnie więcej kwasów tłuszczowych jest przekształcanych w ciała ketonowe, a mniej jest utlenianych w cyklu cytrynianowym do CO7. Proporcja acetylo-CoA, napływającego do szlaku ketogenezy i szlaku utleniania do CO2, jest tak regulowana, że całkowita energia swobodna zgromadzona w postaci ATP w wyniku utleniania kwasów

272 / R O ZD ZIA Ł 24

WKT KREW

VLDL

W ęglowodany — »• Acetyto-CoA KARBOKSYLAZA ACETYLD-CoA

Glukagon

WKF ł Estryłlkacja ^ , , A c y lo -C o A ---------------------------------------------

WĄTROBA Acytagllcerole

Cylosol

Insulina

Matonylo-CoA __________________

O.

PALMITOILOTRANSFERAZA KARNITYNOWA I .Acylo-CoA [ 0-Oksydacja

Milochondrlum A ootylo-C oA

—

Ketoganeza

Ciała ketonowe Ryc. 24-10. Regulacja utleniania dtugołańcuchowych kwasów tłuszczowych w wątrobie. WKT —wolne kwasy tłuszczowe, VLDL — lipoproteiny o bardzo malej gęstości. Dodatnie (©) i ujemne (©) efekty regulacyjne są przedstawione przerywanymi liniami, a przepływ substratów iiniami ciągłymi. ________________________________________________________________________________________

tłuszczowych pozostaje stalą. Całkowitemu utlenieniu 1 mol palmil ynianu towarzyszy wytwarzanie netto 129 mol ATP, gdy proces ten zachodzi poprzez ft-oksydację i wytworzenie CO^ w cyklu kwasu cytrynowego (p. wyżej). Jeżeli końcowym produktem przemiany palmitynianu jest acetooctan ilość powstałego ATP wynosi tylko 33 moi. Ilość powstającego ATP zmniejsza się nawet do 21 mol, gdy produktem końcowym jest 3-hydroksymaśtan. Ketogeneza może więc być uważana za mechanizm, który umożliwia wątrobie utlenienie zwiększających się ilości kwasów thiszczowych w układzie skojarzonych oksydacyj-

nych fosforylacji, bez zwiększenia całkowitego wydatku energetycznego. Wysuwano kilka innych hipotez w celu wyjaśnienia przełączania utleniania kwasów tłuszczowych ze szlaku prowadzącego do CO2 na szlak ketogenezy. Teoretycznie zmniejszenie stężenia szczawi o octanu, zwłaszcza w mitochondriach, mogłoby zmniejszać zdolność cyklu kwasu cytrynowego do metaboltzowania acetylo-CoA. Takie zmniejszenie może się zdarzać wtedy, kiedy dochodzi do zwiększenia stosunku [NADH] / [NAD+], spowodowanego intensywniejszą p-oksydacją. Krebs sugerował,

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 273

że wzmożona glukoneogeneza, na szlaku której występuje także szczawiooctan, jest przyczyną zmniejszenia stężenia tego związku, co może być powodem ciężkich postaci ketozy występującej w cukrzycy, a także ketozy u bydła. Jednakże Utter i Keech wykazali, że karboksylaza pirogronianowa, katalizująca przemianę pirogronianu w szczawiooctan, jest aktywowana przez acetylo-CoA. Wynika stad, że w razie występowania znacznych ilości acetyl o-Co A są niezbędne dostatecznie duże ilości szczawiooctanu w celu zainicjowania reakcji kondensacji, rozpoczynającej cykl kwasu cytrynowego.

PIŚMIENNICTWO Boyer Pd (editor): The Enzymes, 3rd ed. Vol 16 of Lipid Enzymology. Academic Press, 1983,

1S — Biochemia

Debeer LJ, Mannaerts GP: The mitochondrial and peroxisomal pathways of fatty acid oxidation in rat liver. Diabete Metab (Paris) 1983;9;134. Mayes PA, Laker ME: Regulation of ketogenesis in the liver. Biochem Soc Trans 1981;9:339, McGarry JD, Foster DW: Regulation ofhepatic fatty acid oxidation and ketone body production. Annu Rev Biochem 1980;49:395. Pandę SV, Parvin R: Page 143 in: Carnitine Biosynthesis, Metabolium. and Functions, Frenkel RA, McGarry JD (editors). Academic Prcss, 1980. Schulz H: Oxidation of fatty acids. Page 116 in: Biochemistry ofLipids and Membranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 19S5. Various authors: In: Tke Metabolit- Basia of Inherited Disease, 6th ed. Scriver CR et ul (editors). McGraw-Hill, 1989. Vianey-LiaudCetal: Theinborn errorsofmitochondriai fatty acid osidation. / Inher Metab Dis 1987;1O: Suppl 1:159.

2 5

Metabolizm nienasyconych kwasów tłuszczowych i eikozanoidów Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE W porównaniu z roślinami tkanki zwierzęce mają ograniczoną zdolność desaturacji kwasów tłuszczowych. Stwarza to konieczność przyjmowania w pokarmie pewnych wielo nienasyconych kwasów tłuszczowych głównie pochodzenia roślinnego. Te egzogenne kwasy tłuszczowe umożliwiają powstawanie ikozanowych (C20) kwasów tłuszczowych, z których pochodzą związki znane jako eikozanoidy. Należą do nich prostaglandyny, tromboksany i leukotrieny.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych w tłuszczu wyznacza jego temperaturę topnienia, a więc i jego płynność. Fosfolipidy błony komórkowej również zawierają nienasycone kwasy tłuszczowe istotne do utrzymania odpowiedniej płynności błony. Duży stosunek stężenia wielo nie nasyconych kwasów tłuszczowych do nasyconych (stosunek P:S) w pokarmach jest ważnym czynnikiem do zmniejszenia stężenia cholesterolu w surowicy krwi za pomocą diety i uważa się, że działa korzystnie w zapobieganiu chorobie niedokrwiennej serca. Prostaglandyny i tromboksany są miejscowymi hormonami, które w miarę potrzeby są szybko syntetyzowane i działają blisko miejsca swojej syntezy, Niesteroidowe Leki przeciwzapalne, takie jak kwas acetylosalicylowy, działają na zasadzie hamowania syntezy prostaglandyn. Prostaglandyny odgrywają fizjologiczną rolę głównie jako modulatory aktywności cyklazy

adenylanowej, np. 1) w regulacji agregacji płytek krwi oraz 2) w hamowaniu działania hormonu antydiuretycznego w nerkach. Leukotrieny mają właściwości kurczenia mięśni gładkich, a także właściwości chemotaktyczne, co sugeruje, że mogą one odgrywać ważną rolę w reakcjach alergicznych i zapalnych. Mieszaninę leukotrienów zidentyfikowano jako wolno reagującą substancję anafilaksji (SRS-A). Przez zmianę proporcji różnych wielo nienasyconych kwasów tłuszczowych w diecie jest możliwe wpływanie na typ syntetyzowanych eikozanoidów. Wskazuje to na możliwość wpływania na przebieg choroby przez zmiany składu diety.

NIEKTÓRE WfELONIENASYCONE KWASY TŁUSZCZOWE NIE MOGĄ BYĆ SYNTETYZOWANE PRZEZ SSAKI I SĄ NIEZBĘDNYMI SKŁADNIKAMI POKARMU Niektóre długołańcuchowe nienasycone kwasy tłuszczowe, mające znaczenie metaboliczne u ssaków, przedstawiono na ryc. 25-1. (Przegląd nazewnictwa kwasów tłuszczowych omówiono w rozdz. 16). Inne C20 kwasy polienowe, kwasy C22 i C2A można również znaleźć w tkankach. Mogą one powstawać z kwasów olejowego, linolowego i a-linolenowego przez elongację łańcucha. Należy zauważyć, że wszystkie podwójne wiązania w naturalnie występujących kwasach tłuszczowych mają konfigurację cis. Kwasy palmitoolejowy i olejowy nie należą do kwasów egzogennych, ponieważ tkanki są

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDÓW / 275

/W W VW \ 16

9 Kwas palmltoolejowy (a> 7, 16:1 A") Kwas olejowy (w 9,18:1, A")

AAAAAAA/ *Kwas llnolawy {as 6, 18:2,

/WWWWNA 18

15

12

rych wiadom o,że są niezbędnym i składnikam i COOH pożywienia dla wielu gatunków zwierząt, łącznie z człowiekiem i muszą być dostarczane z pokar mem; nazywa się je przeto egzogennymi kwasa mi tłuszczowymi. Kwas linolowy nie jest syn tetyzowany u człowieka i dlatego musi być COOH dostarczany w gotowej postaci w pożywieniu. Kwas arachidonowy może być jednakże wy twarzany z kwasu linolowego u większości ssaków (p. ryc. 25-4). U zwierząt podwójne wiązanie może być wprowadzane do pozycji A4, COOH A5, A6 i A9 (licząc od końca karboksylowego; p. rozdz. 16), ale nigdy poza pozycję A9. Odmien nie jest u roślin, które są zdolne do wprowadza nia nowych podwójnych wiązań w pozycje As, A9, A12 i A15 i wobec tego mogą syntetyzować egzogenne (niezbędne w pokarmie zwierzęcym) COOH kwasy tłuszczowe.

9

'Kwas «-llno(enowy (a» 3, 18:3, £*■*«)

COOH

Stearoito-CoA + Enzym

20

'Kwas arachidonowy (co 6, 20:4,

THANSFERAZ A ACYLOWA

CoA-SH

' C O OH Kwas elkozapenlaenowy (m 3, 20:5, A**"'

1t1T

)

Byc. 25-1. Budowa niektórych nienasyconych kwasów tłuszczowych. Chociaż atomy węgla są numerowane konwencjonalnie, tzn. od węgla karboksylowego, liczby poprzedzone grecką literą at (np. to7 w kwasie palmitoolejowym) oznaczają pozycje liczoną od odwrotnego końca {końcowej grupy metylowej) cząsteczki. Informacja zawarta w nawiasach wskazuje, że np. kwas a-linolenowy ma podwójne wiązania począwszy od C3, licząc od końca metylowego, ma 18 atomów węgla i 3 podwójne wiązania oraz że te podwójne wiązania są umiejscowione przy 9,12 i 15 atomie węgla, licząc od końca karboksylowego. Znak * oznacza, że dany związek jest „egzogennym kwasem tłuszczowym".

Stearollo-Enzym

HYDROKSYUKZA

Cytbs * . NAD+

Hyd roksyslearoilo-Enzym

HYDRATAZA

Olallo-Enzym

zdolne do wprowadzania podwójnego wiązania w pozycji A9 do odpowiedniego nasyconego TRANSFEHAZA kwasu tłuszczowego. Doświadczenia ze znakoACYLOWA wanym kwasem palmitynowym wykazały, że znacznik łatwo pojawia się w kwasie palmitootejowym i olejowym, ale nie ma go w kwasach Oleilo-CoA + Enzym Ryc 25-2. Uktad linolowym, ot-linolenowym ani arachidonowym. Są one jedynymi kwasami tłuszczowymi, o któ- mikrosomalnej A9-desaturazy.

• 276 / ROZDZIAŁ 25

MONONIENASYCONE KWASY TŁUSZCZOWE SĄ SYNTETYZOWANE PRZEZ UKŁAD A9-DESATURAZY Uważa się że wiek tkanek, łącznie z wątrobą, ma zdolność tworzenia mono nienasyconych kwasów tłuszczowych z odpowiednich kwasów nasyconych. Pierwsze podwójne wiązanie jest wprowadzane do nasyconego kwasu tłuszczowego niemal zawsze w pozycji A9. Układ enzymatyczny — A9-desaturaza — (ryc. 25-2) w siateczce śródplazmatycznej katalizuje przekształcenie palmitoilo-CoA w palmitooleilo-CoA albo stearoilo-CoA w oleilo-CoA. Do reakcji jest niezbędny tlen oraz NADH albo NADPH. Enzymy uczestniczące w tej reakcji wydają się być typowymi enzymami układu monooksygenazy zawierającego cytochrom b; (hydroksylaza).

Kwas olejowy 18:1 -

18:2 .

Rodzlna

■ 20:2

Dodatkowe wiązania podwójne, wprowadzane do istniejących już niononienasyconych kwasów tłuszczowych, zawsze (z wyjątkiem bakterii) są od siebie przedzielone grupą metylenową. U zwierząt dodatkowe wiązania podwójne są zawsze wprowadzane między istniejące podwójne wiązanie a grupę karhoksyIową, ale u roślin mogą być wprowadzane między istniejące wiązanie podwójne i węgiel to (koniec metylowy). Ponieważ zwierzęta mają A9-desaturazę, są one zdolne do kompletnej syntezy rodziny a>9 (kwasu olejowego) nienasyconych kwasów tłuszczowych przez kombinację elongacji i desatu-

| ELONGAZA A'-DESATURAZA

20i3-----------^ 22:3

'

ELONGAZA \

20:1 ELONGAZ A

22:1

B_0NGAZA

ELONGAZA

A'-DE5ATURAZA

W SYNTEZIE WIELONIENASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH UCZESTNICZĄ UKŁADY ENZYMATYCZNE DESATURAZY 1 ELONGAZY

A'-DESATURAZA

22:4

Spichrza nie przy niedoborze kwasów tłuszczowych egzogennych

A i

24:1

Rodzina

Kwas lin o Iowy 18:2-------.—

18:3

-20:3

-20:4

18:4

20:4

20:5

22:5

ELONGAZA

20:2

Rodzina (D 3

/e

Kwas a-llnolenowy 18:3

-*- 22:5 •

22:6

--------------------------1

Ryc. 25-3. Biosynteza wielonienasyconych kwasów tłuszczowych rodzin u9, w6 oraz co3. Każdy z etapów jest katalizowany przez mikrosomalne układy elongacji albo desaturacji. Ilość wielonienasyconych kwasów tłuszczowych »9 staje się znacząca jedynie wówczas, gdy kwasy linolowy i ot-linolenowy zostają wyłączone z diety. Dzieje się tak dlatego, że każda z przedstawionych serii współzawodniczy o te same układy enzymatyczne, a powinowactwa zmniejszają się począwszy od mZ aż do <»>9. © —■ hamowanie.

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASOW TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDÓW / 277

Llnolelto-CoA (A^-oktadefcadfenolto-CoA) Oj + NADH + H + ,

y-Lfnoteno(to-CoA(4**"-aktadekatrlenollo-CoA)

(Malonyto-CoA, NADPH)

C-S — CoA Arachldonollo-CoA (A""'1*-«lkozatetraenollo-CoA)

Ryc. 25-4. Przemiana kwasu linolowego do arachidonowego. U kotów nie zachodzi ta przemiana, gdyż nie mają one A6-desaturazy i muszą wobec tego otrzymywać arachidonian z pokarmem._____________

racji łańcucha (ryc. 25-3). Ponieważ jednak nie są one zdolne do syntetyzowania ani kwasu linolowego ((06), ani a-linolenowego (co3), gdyż nie mają potrzebnych do tego odpowiednich desaturaz, te kwasy muszą być dostarczone w pokarmach, aby mogła zachodzić synteza innych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych rodziny w6 i o>3. Linolenian może być przemieniony w arachidonian (ryc. 25-4). W szlaku tym dochodzi najpierw do odwodorowania estru kwasu linolowego z CoA i utworzenia Y-linolenianu, po czym następuje dodanie jednostki dwuwęglowej przez przyłączenie malonylo-CoA

w mikrosomalnym układzie elongacyjnym (p. str. 257). W wyniku tych reakcji powstaje ikozatrienian (dihomo-y-linolenian), który przez dalsze odwodorowanie tworzy arachidonian. Układ odwodorowujący jest podobny do tego, który opisano powyżej dla nasyconych kwasów tłuszczowych. Z powyższego wynika, że przy dostatecznej podaży kwasu liściowego kwas arachidonowy przestaje być kwasem egzogennym.

Aktywność układu desaturacji i eiongacji jest znacznie zmniejszona w stanie głodzenia i przy braku insuliny.

278 / ROZDZIAŁ 25

OBJAWY NIEDOBORU WYSTĘPUJĄ WÓWCZAS, GDY BRAK JEST W POKARMACH EGZOGENNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH (EFA) W 1928 r. Evans i Burr zauważyli, że szczury karmione oczyszczoną dietą bezlipidową, do której dodano witaminę A i D, wykazują zmniejszone tempo wzrostu i upośledzoną reprodukcję. Późniejsze prace wykazały, że ten zespół niedoboru można wyleczyć przez dodanie do diety kwasów linolowego, a-linolenowego i arachid ono wego. Dalsze objawy zespołu niedoboru egzogennych kwasów tłuszczowych to łuszcząca się skóra, martwica ogona i uszkodzenie układu moczowego, ale choroba nie jest śmiertelna. Leczące ten zespół kwasy tłuszczowe występują w dużym stężeniu w różnych olejach roślinnych (p. str. 175), a w niewielkich tylko ilościach w produktach zwierzęcych. Funkcje egzogennych kwasów tłuszczowych wydają się być różnorodne, chociaż niezbyt dobrze określone, z wyjątkiem znaczenia, jakie mają w tworzeniu prostaglandyn i leukotrienów. Egzogenne kwasy tłuszczowe występują w strukturalnych lipidach komórki i mają znaczenie w utrzymaniu strukturalnej integralności błon mitochondrialnych. Kwas arachidonowy występuje w błonach komórkowych i stanowi 5—15% wszystkich kwasów tłuszczowych w fosfolipidach. Kwas dokozaheksaenowy (DHA: a>3,20:6), który jest syntetyzowany z kwasu a-linolenowego lub otrzymywany bezpośrednio z tłuszczu ryb, występuje w dużych stężeniach w siatkówce, korze mózgu, w jądrach i w spermie. DHA jest przede wszystkim potrzebny do rozwoju mózgu i jest dostarczany poprzez łożysko i z mlekiem. Aby spełnić wiele funkcji strukturalnych egzogenne kwasy tłuszczowe występują w fosfolipidach głównie w pozycji 2. W niedoborze egzogennych kwasów tłuszczowych endogenne polienowe kwasy tłuszczowe z rodziny 0)9 zastępują egzogenne kwasy w fosfolipidach w innych złożonych lipidach i w błonach. Takim polienowym kwasem tłuszczowym jest kwas Ai'811ikozatrienowy (ryc. 25-3). Oceny stopnia niedoboru egzogennych kwasów tłuszczowych można dokonać, oznaczając stosunek stężenia trienów do tetraenów (arachidonianu) w osoczu. U ludzi spożywających pokarmy pozbawione egzogennych kwasów tłuszczowych zauważono zmiany skórne oraz upośledzenie transportu

lipidów. Objawów takich nie stwierdzono u dorosłych pozostających na zwykłej diecie. Jednak u dzieci otrzymujących pożywienie ubogie w tłuszcze obserwowano zmiany skórne, które ustępowały po podaniu linolenianu. Niedobory dające się przypisać brakowi egzogennych kwasów tłuszczowych, łącznie z kwasem a-linolenowym mogą wystąpić także u chorych żywionych przez dłuższy czas dożylnie płynami z małą zawartością egzogennych kwasów tłuszczowych. Temu niedoborowi można zapobiec przez podawanie egzogennych kwasów tłuszczowych w ilości 1—2% całkowitego zapotrzebowania energetycznego. Kwasy tłuszczowe o konfiguracji trans mogą konkurować z kwasami tłuszczowymi cis Śladowe ilości nienasyconych kwasów tłuszczowych o konfiguracji trans powstają w tłuszczach przeżuwaczy, gdzie występują dzięki działaniu mikroorganizmów znajdujących się w żwaczu. Obecność dużych ilości trans nienasyconych kwasów tłuszczowych w częściowo uwodorowanych olejach roślinnych (np. wmargarynie) nasuwa wątpliwości odnośnie do bezpieczeństwa ich stosowania jako dodatków pokarmowych. Skutki długotrwałego ich spożywania przez ludzi są trudne do ocenienia, chociaż już od wielu lat są one składnikami pożywienia człowieka. W czasie autopsji w tkankach człowieka stwierdza się do 15% nienasyconych kwasów tłuszczowych o konfiguracji trans. Dotychczas nie opisano poważnych ujemnych skutków ich występowania. Są one metabolizowane raczej w sposób bardziej podobny do nasyconych kwasów tłuszczowych niż do cis nienasyconych. Może to być spowodowane ich podobną prostolań cuch ową konformacją (p. rozdz. 16). Wielonienasycone kwasy tłuszczowe o konfiguracji trans nie mają działania egzogennych kwasów tłuszczowych. Mogą one antagonizować metabolizm tych ostatnich, pogłębiając niedobór egzogennych kwasów tłuszczowych. Nieprawidłowy metabolizm egzogennych kwasów tłuszczowych występujący w niektórych chorobach Poza niedoborem egzogennych kwasów tłuszczowych i zmianami w proporcji zawartości poszczególnych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, spowodowanym długotrwałym wadliwym odżywianiem, nieprawidłowy metabolizm egzogennych kwasów tłuszczowych

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDÓW / 279

stwierdzono u chorych z torbielowatym włóknieniem trzustki, w acrodermatitis enteropathtca, zespole wątrób owo-nerkowym, zespole Sjógrena-Larssona, wieloukładowym zwyrodnieniu nerwów, chorobie Crohna, marskości wątroby, alkoholizmie oraz zespole Reye'a. Duże stężenie polienowych kwasów tłuszczowych o bardzo długim łańcuchu węglowym stwierdzono w mózgu chorych z zespołem Zellwegera (p. str. 265). Spożywanie pokarmów o dużym stosunku P;S (wielonienasycone : nasycone kwasy tłuszczowe) zmniejsza stężenie cholesterolu surowicy, zwłaszcza cholesterolu LDL. Jest to korzystne z punktu widzenia relacji zachodzącej między stężeniem cholesterolu w surowicy a chorobą niedokrwienną serca.

EIKOZANOIDY POWSTAJĄ Z C3O-WIEL0NIENASYC0NYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Arachidonian i niektóre inne C10 kwasy tłuszczowe, z wiązaniami podwójnymi poprzedzielanymi grupami metylenowymi, są źródłem powstawania eikozanoidów, fizjologicznie i farma kologicznie czynnych związków znanych jako prostaglandyny (PG), tromboksany (TX) i leukotrieny (LT) (p. rozdz. 16).

Arachidonian, zwykle pochodzący z pozycji 2 fosfatydylodiacylogliceroli błon plazmatycznych w wyniku działania fosfolipazy A2 (p. ryc. 26-5), jest substratem do syntezy PG2, TXj oraz LT4. Szlaki ich metabolizmu są różne. Biosynteza PG i TX2 (prostanoidów) współzawodniczy 0substrat, tj. arachidonian, z syntezą serii LT4. Te 2 szlaki są znane jako szlaki cyklooksygenazy 1lipooksygenazy (ryc. 25-5). Istnieją 3 grupy eikozanoidów (każda zawierająca PG, TX i LT) syntetyzowane odpowiednio z 3 egzogennych kwasów tłuszczowych: linolanu, arachidonianu i a-Hnolenianu (ryc. 25-6).

SZLAK CYKLOOKSYGENAZY JEST ODPOWIEDZIALNY ZA BIOSYNTEZĘ PROSTANOIDÓW Biosynteza prostanoidów (ryc. 25-7), podczas której dochodzi do zużycia 2 cząsteczek O2, jest katalizowana przez syntazę endoperoksydu prostaglandyny, wykazującą 2 oddzielne aktywności enzymatyczne, cyklooksygenazy i peroksydazy. Produkt szlaku cyklooksygenazy, endoperoksyd (PGH), jest przemieniany do prostagJandyn D, E i F, a także do tromboksanu (TXA 2) i prostacykliny (PGI2). Każdy rodzaj komórki

FoEtolipId błonowy

Różne bodźce, np. anglotensyna II, twadyktntna. adrenalina,

FOSFOLIPAZA A,

irombina

KortykoBteroltJy przeciwzapalne

Arachidonian UPOKSYGENA2A

Kwas acetylosalicylowy

Indomstacyna Leukotrieny Prostaglandyny i tromboksany

Ryc. 25-5, Przemiana kwasu arachidonowego do prostaglandyn i tromboksanów szlakiem cyklooksygenazy oraz do leukotrienów szlakiem I i po k sygenazy. Na rycinie pokazano, dlaczego steroidy, które hamują całkowite wytwarzanie eikozanoidów, są lepszymi czynnikami przeciwzapalnymi niż kwas acetylosalicylowy i podobne do niego leki, które hamują tylko szlak cyklooksygenazy. Uważa się, że steroidy przeciwzapalne hamują fosfolipazę Az przez to, że indukują inhibitorowe białko lipokortynę.

280 / ROZDZIAŁ 26 Pokarm

Llinolan Pros!anofdy;:

POD, PGE,

LTD,

I-2H y-Unolenian

J+2C COOH 8,11,14Eikozatrienoart (d th omo-y-l in ols n ian)

Ei kc zatet raanoan

GRUPA3

|+2C Oktadekatettaenaan

Prostanoidy;

.

PGD , PGE,

.__-----

PG133

T-2H ot-Linolenian

-COOH

-2H

TXAj, Leukatrieny

5 8, 11, 14, 17-Elkozape nlaen o a n

©

LTCS

Dieta c

Ry - 25-6. 3 grupy eikozanoidów i ich biosyntetyczne pochodzenie. PG — prostaglandyna, PGI — prostacykltna, TX — tromboksan, LT — leukotrien, 1 —szlak cyklooksygenazy, 2—szlak Itpotcsygenazy Indeks we frakcji dolnej oznacza całkowitą liczbę podwójnych wiązań w cząsteczce i serię, do której ten związek należy.

wytwarza tylko 1 typ prostanoidu. Kwas acetylosalicylowy hamuje cyklooksygenazę i podobnie działa indometacyna. Aktywność egzogennych kwasów tłuszczowych jest skorelowana z wytwarzaniem prostagłandyn Jakkolwiek istnieje znaczna korelacja między aktywnością poszczególnych egzogennych kwasów tłuszczowych a ich zdolnością do przekształcania się w prostaglandyny nie wydaje się, aby egzogenne kwasy tłuszczowe wywierały wszystkie swoje fizjologiczne efekty przez

biosyntezę prostagłandyn. Rola egzogennych

kwasów tłuszczowych w powstawaniu błon nie ma związku z tworzeniem prostagłandyn. Pod wpływem prostagłandyn nie dochodzi do cofania się objawów niedoboru egzogennych kwasów tłuszczowych zaś zespół niedoboru egzogennych kwasów tłuszczowych nie jest spowodowany dhigo trwałym hamowaniem syntezy prostagłandyn. Cyklooksygenaza jest „enzymem samobójczym" „Wyłączenie" syntezy prostagłandyn zachodzi częściowo dzięki godnej uwadze właściwości cyklooksygenazy, mianowicie enzym ten wyka-

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASOW TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDÓW / 281 COOH

9

Ryc. 26-7. Przemiana kwasu arachidonowego do prostaglandyrt i tromboksanów serii 2. PG — prosta-glandyna, TX — tromboksan, PGI — prostacyklina, HHT —

Kwas acetylosalicylowy Indomalacyna

STNTETAZA PROSTACYKLINOWA COOH

SYNTETAZA TROMBOKSANOWA

COOH

hydroksyheptadekatrienoan. * Obydwie te aktywności są związane z jednym enzymem — syntazą endoperoksydów prostaglandyn owych. Podobne przemiany zachodzą z prostaglandynami i tromboksanami serii 1 i 3.

zuje 2dolność katalizowania samozagłady, czyli jest ona „enzymem samobójczym". Inaktywacja raz powstałych prostaglandyn jest szybka. Przyczyną tego jest prawdopodobnie obecność w większości tkanek ssaków dehydrogenazy 15hydroksyprostag landy nowej. Wykazano, że

zablokowanie tego enzymu sulfasalazyną lub indometacyną może przedłużyć biologiczny okres póltrwania prostaglandyn w organizmie. Prostanoidy są substancjami o dużej aktywności biologicznej Tromboksany są syntetyzowane w płytkach krwi. Przy uwolnieniu powodują skurcz naczyń i agregację płytek. Prostacykliny (PGI2) są wytwarzane przez ściany naczyń krwionośnych i są silnymi inhibitorami agregacji płytek.

Tromboksany i prostacykliny są więc antagonistami. Niewielką zapadalność na choroby serca, występowanie zmniejszonej agregacji płytek i przedłużonego czasu krzepnięcia u grenlandzkich Eskimosów przypisuje się dużemu spożyciu olejów rybnych zawierających kwas tłuszczowy 20:5 w3 (EPA albo kwas ikozapentaenowy), który jest wyjściowym związkiem do syntezy serii 3 prostaglandyn (PG3) oraz tromboksanu TX3 (ryc. 25-6). PG3 i TX3 hamują uwalnianie arachidonianu z fostblipidów i tworzenie PG2 oraz TX2. PGI3 ma takie samo silne działanie przedwagregacyjne płytek krwi jak PGI2, natomiast TXA3 jest słabszym czynnikiem agregującym płytki krwi niż TXA2. W rezultacie przeważa więc działanie hamujące agregację płytek krwi. Ponadto w osoczu Eskimo-

282 / ROZDZIAŁ 25 COOH Gtlcyna

Kw as gluta m ino w'---------* y — +-J ^^ COOH

EJ

fl

OH Leukotrlen C,

COOH

NH,1

A

Cystelna

o s COO

OH Leukotrion

H

D, Leukotrlen E, Glleyna

Ryc. 25-8. Przemiana kwasu arachidonowego do feukotrienów serii 4 szlakiem lipoksygenazy HPETE — hydroperoksyeikozatetraenoan, HETE — hydroksyeikozatetraenoan. Niektóre podobne prze miany zachodzą z leukotrienami serii 3 i 5. 1 — Peroksydaza, 2 — epoksydohydrolaza leukotrienu A,, 3 — S-transferaza glutationowa; 4 — y-glutamylotransferaza, 5 — dipeptydaza cysteinyłoglicynowa. ______

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWAS0W TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDOW / 283

sów stwierdza się małe stężenia cholesterolu, triacylogliceroli, LDL i VLDL, natomiast zwiększone stężenie lipoprotein o dużej gęstości (HDL). Taki profil stężeń wymienionych lipidów zdaje się przeciwdziałać powstawaniu miażdżycy naczyń i występowaniu zawałów serca. Zaledwie 1 ng/m] niektórych prostaglandyn powoduje skurcz mięśni gładkich u zwierząt. Potencjalnymi wskazaniami do stosowania prostaglandyn m.in. są: zapobieganie zapłodnieniu, sprowokowanie porodu przy ciąży donoszonej, przerwanie ciąży, złagodzenie bólu u chorych z chorobą wrzodową żołądka, łagodzenie procesów zapalnych, ciśnienia tętniczego krwi, dychawicy oskrzelowej oraz obrzęków błony śluzowej nosa. Prostaglandyny zwiększają stężenie cAMP w: płytkach krwi, tarczycy, ciałku żóhym, kościach płodowych, w przysadce gruczołowej i w płucach, natomiast zmniejszają go w komórkach kanalików nerkowych i w tkance tłuszczowej.

pujące potem odczepienie glutaminianu i glicyny powoduje kolejno powstanie leukotrienu D4 i leukotrienu E4.

Leukotrieny są silnymi regulatorami wielu procesów chorobowych

Wolno reagująca substancja anafilaksji (SRS-A) jest mieszaniną leukotrienów C4, D4 i E4. Ta mieszanina Jeukotrienów jest 100-1000-krotnie silniejszym czynnikiem kurczącym mięśnie oskrzeli niż histamina lub niektóre prostaglandyny. Te leukotrieny, razem z leukotrienem B4, zwiększają przepuszczalność naczyń krwionośnych oraz wywołują chemotaksję i aktywację leukocytów. Wydaje się, że związki te są więc ważnymi regulatorami wielu procesów chorobowych przebiegających ze stanami zapalnymi oraz uczestniczą w reakcjach nadwrażliwości bezpośredniej, takich jak dychawica oskrzelowa. Leukotrieny są aktywne w stosunku do naczyń, zaś 5-lipoksygenazę wykazano w ścianie naczyń tętniczych.

PIŚMIENNICTWO LEUKOTRIENYSĄ SYNTETYZOWANE W SZLAKU LIPOKSYGENAZY Lenkotrieny są rodziną skoniugowanych trienów powstających z kwasów ikozanowych w szlaku lipoksygenazy w leukocytach, komórkach mastocytoma, płytkach krwi i w makrofagach, jako reakcja zarówno na bodźce immunologiczne, jak i nieimmunologiczne. Trzy różne lipoksygenazy (dioksygenazy) katalizują przyłączanie tlenu do atomu węgla w pozycjach 5, 12 i 15 kwasu arachidonowego, powodując powstanie hydroperoksydów (HPETE). Jedynie 5-lipoksygenaza bierze udział w powstawaniu leukotrienów. Najpierw powstaje leukotrien A4, który jest metabolizowany albo do leukotrienu B4, albo do leukotrienu C4 (ryc. 25-8). Leukotrien C4 powstaje przez połączenie z glutationem wiązaniem tioeterowym. Nastę-

Hammarstróm S: Leukotrienes. Annu Rev Biochem 1983;52:355. Holman RT: Controi of polyunsaturated acids in tissue lipids. J Am Coli Nutr 1986;5:183. Kinsella JE: Food components with potential therapeutic benefits: The n-3 polyunsaturated fatty acids of fish oils. Food Technology 1986;40:89. Lagarde M, Gualde N, Rigaud M: Metabolicinteractions between eicosanoids in blood and vascular cells. Biochem J 1989;257:313. Moncada S (editor): Prostacyclin, thromboxane and leukotrienes. Br Med Buli I989;39:2O9. Neuringer M, Anderson GJ, Connor WE; The essentiality of a-3 fatty acids for the devdopment and function of the retina and brain. Annu Rev Nutr 1988;8:517. Piper P: Formation and actions of leukotrienes. PhyswlRev 1984;64:744. Smith WL, Borgeat P: The eicosanoids. In: Biochemistry of Lipids and Membranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 1985.

OC £*"

Metabolizmacylogliceroli i sfingolipidów Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Acyloglicerole stanowią większość lipidów organizmu. Triacyloglicerole są głównymi lipidami tłuszczu zapasowego organizmu i zawartego w pokarmach. W dodatku acyloglicerole, zwłaszcza fosfolipidy, są głównym składnikiem błon plazmatycznych i innych błon żywych organizmów. Fosfolipidy biorą także udział w metabolizmie wielu lipidów. Glikosfingolipidy, które zawierają reszty sfingozyny i cukru, jak również kwasów tłuszczowych, stanowią 5 —10% lipidów błon plazmatycznych.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Rola triacyloglicerolu w transporcie i spichrzaniu lipidów oraz w patogenezie różnych chorób, takich jak otyłość, cukrzyca i hiperlipoproteinemie, jest szczegółowo opisana w dalszych rozdziałach. Fosfoglicerole, fosfosfingolipidy i glikosfingolipidy są amfipatycznymi lipidami i dlatego są idealnie dopasowane do tego, aby spełniać funkcję głównych składników lipidowych błon plazmatycznych. Niektóre fosfolipidy spełniają specjalne funkcje, np. dipa1 m i t o i 1 o 1 ecy t y n a (dipa 1 mi toi lof o sf at y d y loch oli -na) jest głównym składnikiem surfaktantu płucnego, którego brak u wcześniaków jest przyczyną zespołu niewydolności oddechowej

(RDS) u noworodków. Fosfolipidy inozytolowe są prekursorami wtórnych przekaźników działania hormonu, a czynnik aktywujący płytki

krwi jest alkilofosfolipidem, Glikosfmgolipi-dy, występujące w zewnętrznej warstwie błony plazmatycznej z ich oligosacharydowymi łańcuchami wystającymi na zewnątrz, tworzą cześć glikokaliksu powierzchni komórki. Uważa się, że są one ważne: 1) w komunikowaniu się komórek i kontakcie międzykomórkowym, 2) jako receptory dla toksyn bakteryjnych (np. toksyny, która powoduje cholerę) oraz 3) jako substancje grupowe krwi ABO. Opisano ok. 12 glikolipidowych chorób spichrzeniowych (np.

choroba Gauchera, choroba Tay-Sachsa); są one spowodowane niedoborem glikolipidowych hydrolaz normalnie występujących w lizosomach.

KATABOLIZM ACYLOGLICEROLI NIE JEST ODWRÓCENIEM ICH BIOSYNTEZY Katabolizm triacy logliceroli zaczyna się od hydrolizy

Triacyloglicerole muszą zostać zhydrolizowane przez odpowiednią lipaze do ich skład* ników, tj. kwasów tłuszczowych i glicerolu zanim nastąpi dalszy ich katabolizm. Taka hydroliza (lipoliza) zachodzi głównie w tkance

Byc. 26-1. Biosynteza triac^loglicerolu i fosfolipidów. 1 — szlak monoacyloglicerolowy, 2 — szlak glicerolofosf ora nowy, 3 — szlak dihydroksyacetonofosforanowy. Diacy logi icerołotransferazy fosfoetanoloaminowej nie ma w wątrobie.

AOP

NAD*

HjC-OH I HOC-H I

H,C-OH Gllcero!

HjC-OH - Ghfcc iiz.a

HO-C-H -■ KINAZA GUCEROLOWA -3-tosforan

HZC-OH,C--O-© DEHYDROGENAZA Di hydro ksyaoet onoGLICEROLO-3-fosforan FOSFORANOWA Acylo-CoA (zwykle nienasycony)

Acylo-CoA (głownie nasycony)

©

ACYLOTRANSFERAZAI GLICEROLO--afOSFORANOWA

®

ACYLOTRANSFERAZA DIHYDROKSYACETONOFOSFORANOWA

~* CoA

NADPH ». H"* ** CoA

O HjC-

O II

O-C-R,-*REDUKTA2A 1-ACYLODIHYDROKSYACETONO -FOSFORANOWA

n ,— c — o — c — H O

HjC-OH

H jC -O -C -H ,

HO-CH

2- U D n oa cy I og I łce ro!

C = O

®

©

H, C- O- ® 1-AcvlogllGero]ot-Acylod I hyd rpksy- -acetonofosfofan ff (lizofosfatydan) ^Acylo-CoA (flłdwnle nlenasyoony)

Acylo-CaA ACYLOTRAMSFI

ACYLOTRANSFEflAZA 1-ACYLOGLICEROLO-3-FOSFORANOWA

MpNOACYLOGLICE- i SOLOWA (w jelicie) ■ C hol Ina (otanoloamina)

Lipidy eterowe ~^CoA O-C-R, fii-C~O-c-H

II

Fosfocholmai to sto e t an o lo a m i n a ■

I

O It HjC-

_

O 1,2-DI acyl ogl ioe r o I o1 o sf o ra n FOSFOHYOROLAZA (fosfatydan, kwas F Ofosfatydowy) SF ATY0AN 0W A

H,C-O-®— CTP

CYTYDYLOTRANSF6RAZA l_CTP-FOSFATYOANOWA_ _

-PP, Kardioliplna

ACYLOTRANSFERAZA H c-o-c-n, DIACYLOGLICEROLOWA ?

CYTYD YLO TRANSFERAZA FOSFOCHOLINOWA

R j-C -O -C -H

O

PP,

M;C-O-®-© Cytydyna CD P-d lacv!og llcoro I— >— Inozytol (NOZYTOLOTRANSFERAZA CDPDIACYLOGLICEHOLOWA

CDP-crrallna (CDP-etanoloamlna) DlACYLOGLICEROLCh TRANSFERAZAF0SFOCHOLIN0WA

ATP

ADP

■ OMP

HjC-O-C-

HjC-O-C-R,

Hj-C-O-C-H O

O

................

O

Hj-C-O-C-H H SC-O-®

H;C — O-C— R

O

H;C-O-

- S-

-< H;C-O-C-R, l n,-c-o-c-H o HjC-o-@-lnoz/tol-®

Fosfalydyloelanoloamln a

Fo

sfalyclylol nozytolo-4-fosforan

Trlacylogltoerot inozytot Fostatydylolnozylol

Chollna (elan o loa mina) Fosfatvdv1ocriolina (foafatytMoetan oloaml na)

Foafatydyloseryna

R,

R j-C -O -C -H

[KINAZA | Seryna Etan oi oa ml na

ADP ■*'

•

H;C-O-Ć-R, R,-C-O-C-H o

H,c-o-@-inozytol®

Fosfatydyło In ożyto lo-4,5- blsfosfor an

286 / ROZDZIAŁ 26

tłuszczowej. Uwolnione w wyniku lipolizy wolne kwasy tłuszczowe dostają się do osocza, gdzie występują w postaci związanej z albuminą. Następnie wolne kwasy tłuszczowe są wychwytywane przez tkanki i utleniane lub ponownie estryfikowane. Wiele tkanek (łącznie z wątrobą, sercem, nerkami, mięśniami szkieletowymi, płucami, gonadami męskimi, mózgiem i tkanką tłuszczową) ma zdolność utleniania kwasów tłuszczowych o długim łańcuchu węglowym, chociaż mózg niezbyt łatwo pobiera je z krwi. Zużytkowanie glicerolu zależy od tego, czy dana tkanka ma konieczny do tego aktywujący enzym kinazę glkerolową (ryc. 26-1). Enzym ten wykazano w znacznych ilościach w wątrobie, nerkach, jelitach, brunatnej tkance tłuszczowej i w gruczole sutkowym w okresie laktacji.

KWAS FOSFATYDOWY JEST WSPÓLNYM PREKURSOREM BIOSYNTEZY TRIACYLOGLICEROLI I FOSFOGLICEROLI Chociaż reakcję hydrolizy triacyloglicerolj z udziałem lipazy można odwrócić w warunkach laboratoryjnych, nie jest to jednak mechanizm, przez który acyloglicerole są syntetyzowane w tkankach. Zarówno kwasy tłuszczowe, jak i glicerol muszą zostać zaktywowane przez ATP zanim będą mogły być wbudowane do acylogliceroli. Kinaza glicerolowa katalizuje aktywację glicerolu do sn-glicerolo-3-fosforanu. Jeżeli tego enzymu nie ma lub jego aktywność jest mała, jak to ma miejsce w mięśniach lub w tkance tłuszczowej, większość glicerolo-3-fosforanu musi pochodzić ze związku pośredniego glikolizy — dihydroksyacetonofosforantt, który przekształca się w glicerolo-3-fosforan przez redukcję z NADH, katalizowaną przez dehydrogenazę gliceroIo-3-fosforanową (ryc, 26-1).

Biosynteza triacylogliceroli. Kwasy

tłuszczowe są aktywowane do acylo-CoA pod wpływem enzymu syntetazy acylo-CoA z udziałem ATP i CoA (p. str. 261). 2 cząsteczki acylo-CoA wiążą się z glicerolo-3-fosforanem, tworząc fosfatydan (l,2-diacyloglicerolo-3-fosforan). Reakcja ta przebiega w 2 etapach przez lizofosfatydan i jest katalizowana najpierw przez acylołransferazę gIicerolo-3-fosforanową, a następnie przez acylotransferazę l-acyloglicerolo-3-fosforanową (acylotransferazę lizofosfatydanową). Pod wpływem fosfohydrolazy fos-

fatydanowej fosfatydan jest przekształcany do 1,2-diacyloglicerolu. W błonie śluzowej jelita istnieje szlak monoacyloglicerolowy, w którym monoacyloglicerol jest przekształcany do 1,2diacyloglicerolu pod wpływem acylotransferazy mo no ac>log lice rolo w ej. Następna cząsteczka acylo-CoA wchodzi w reakcję z diacyloglicerolem, tworząc triacyloglicerol. Reakcja ta jest katalizowana przez acylotransferazę diacyloglicerolową. Większość aktywności tych enzymów jest umiejscowiona w siateczce śródplazmatycznej komórek, chociaż niektóre z nich znajdują się w mitochondriach, np. acylotransferaza glicerolo-3-fosforanowa. Aktywność fosfohydrolazy fosfatydanowej występuje głównie we frakcji supernatantu pozbawionej struktur subkomórkowych, ale pewne jej ilości są związane z błonami. Dihydroksyacetonofosforan może być acylowany i przemieniany do lizofosfatydanu po redukcji przez NADPH. Ilościowe znaczenie tego szlaku przemiany jest kontrowersyjne. Ten szlak wydaje się być bardziej istotny w peroksysomach, gdzie uczestniczy w syntezie lipidów eterowych.

Biosynteza fosfogliceroli. Te fosfoiipi-

dy są syntetyzowane albo z fosfatydanu, np. fosfatydyJoinozytol, albo z 1,2-diacyloglicerolu, np. fosfatydylocholina i fosfatydyloetanoloamina. W syntezie fosfatydyloinozytolu, cytydynotrifosforan (CTP), bogatoenergetyczny fosforan wytwarzany z udziałem ATP (p, str. 137) reaguje z fosfatydanem, tworząc cyłydynodifosfodiacyloglicerol (CDP-diacyloglicerol). Ostatecznie ten związek reaguje z inozytolem w reakcji katalizowanej przez CDP-diacylogliceroiotransferazę inozytolową, tworząc fosfatydyioinozytol (ryc. 26-1). Przez kolejne fosforylacje fosfatydyloinozytol jest przekształcany najpierw do fosfatydyloinozytolo-4-fosforanu, a następnie do fosfatydyloinozyto!o-4,5-bisfosforanu. Ten ostatni jest rozkładany do diacyloglicerolu i inozytolotrisfosforanu po zadziałaniu na komórkę hormonu, który zwiększa stężenie Ca2+, np. wazopresyny. Te 2 produkty odgrywają rolę drugiego przekaźnika w działaniu hormonu. W biosyntezie fosfatydylocholiny i fosfatydyloetanoloaminy (lecytyn i kefalin) cholina lub etanoloamina muszą najpierw zostać przekształcone w „aktywną choiinę" lub „aktywną etanoioaminę". Jest to proces 2-etapowy, w którym zachodzi najpierw reakcja z ATP, z wytworzeniem odpowiednich monofosforanowych pochodnych, a następnie reakcja z CTP

METABOLIZM ACYLOGLICEROLI I SFINGOLIPIDÓW / 287

z wytworzeniem cytydynodifosfocholiny (CDP--choliny), lub cytydynodifosfoetanoloaminy (CDPetanoloaminy). W takiej postaci cholina lub etanoloamina reagują z 1,2-diacylogiicero-lera w ten sposób, że ufosforylowana zasada (fosfbchoiina albo fosfoetanoloamina) jest przenoszona na 1,2-diacy logi ice roi z wytworzeniem albo fosfatydylocholiny, albo fosfatydyloetanoloaminy. Cytydylotransferaza wydaje się być regulacyjnym enzymem szlaku biosyntezy fosfatydylocholiny. Fosfatydyloseryna powstaje z fosfatydylo-etanolaminy w bezpośredniej reakcji z seryną. Fosfatydyloseryna może odtwarzać fosfatydyloetanoloaminę przez dekarboksylację, W wątrobie występuje alternatywna droga umożliwiająca bezpośrednią przemianę fosfatydyloetanoloaminy w fosfatydylocholinę przez kolejne metylacje reszty etanoioaminowej przy użyciu S-adenozylometioniny jako dawcy grup metylowych. Z kolei grupa metylowa w metioninie może pochodzić z metylo-H+-fołianu (p. ryc. 53-15). Pomimo tych możliwych szlaków wytwarzania choliny. jest ona uważana za egzogenny składnik pożywienia dla wielu gatunków ssaków, chociaż nie ustalono tego dla człowieka. Fosfolipidem występującym w mitochondriachjest kardiolipina (difosfatydyloglicerol, p. str. 179). Powstaje ona z fosfatydyloglicerolu, który jest syntetyzowany z CDP-diacyloglicerolu (ryc. 26-1} oraz glicerolo-3-fosforanu według schematu przedstawionego na ryc. 26-2.

CDP-dlacylogltoeral

Ryc. 26-2. Biosynteza kardioiipiny.

Surfaktant płucny. Jest wydzieliną powierzchniowo aktywną, złożoną głównie z lipidu z niewielką ilością białka i węglowodanów. Zapobiega ona zapadaniu się pęcherzyków płucnych. Aktywność surfaktantu jest przypisywana głównie obecności fosfolipidu — dipalmitoilofosfatydylocholinie, który jest syntetyzowany krótko przed porodem u donoszonego dziecka. Niedobór surfaktantu w płucach wielu niedonoszonych noworodków jest przyczyną zespołu niewydolności oddechowej (RDS). Podawanie naturalnego lub sztucznego surfaktantu ma korzystne działanie terapeutyczne.

Biosynteza eterowych fosfolipidów glicerolowych oraz plazmalogenów.

Plazmalogenowy diacyloglicerol jest to taki związek, w którym w pozycji 1 (lub 2) glicerolu znajduje się reszta alkenylowa, zawierająca wiązanie aldehydogenne eteru winylowego (CHj - O - CH = CH - R). Prekursorem części glicerolowej jest dihydroksyacetonofosforan (ryc. 26-3), który reaguje z acylo-CoA, tworząc 1-acylodihydroksyacetonofosforan. Następnie zachodzi reakcja wymiany między grupą acylową i alkoholem o długim łańcuchu węglowym z wytworzeniem 1 -alkilodihydroksyacetonofosforanu (mającego wiązanie eterowe). Związek ten w obecności NADPH jest przemieniany w l-alkiloglicerolo-3-fosforan. Po następnej acylacji, w pozycji 2, utworzony l-alkilo-2-acyloglicerolo-3-fosforan (analogiczny do fosfatydanu z ryc. 26-1), jest hydrolizowany z wytworzeniem pochodnej glicerolu pozbawionej reszty fosforanowej. Plazmaiogeny powstają przez desaturację odpowiednich pochodnych z fosfoetanoloamina (ryc. 26-3). Znaczną część fosfolipidów w mitochondriach stanowią plazmaiogeny. Czynnik aktywujący płytki krwi (PAF) jest syntetyzowany z odpowiedniej pochodnej fosfocholinowej, a zidentyfikowano go jako l-alkilo-2-acetylo-i7j-glicerolo-3-fosfocholinę. Jest on wytwarzany przez wiele komórek krwi oraz inne tkanki. Powoduje on agregację płytek krwi w tak małych stężeniach, jak 10"11 mol/l. Ma on także właściwości hipotensyjne i wrzodotwórcze. Fosfolipazy pozwalają na degradację oraz przemodelowanie glicerolofosfolipidów Degradacja wielu złożonych cząsteczek w tkankach przebiega do całkowitego ich rozłożenia, np. białka są rozkładane do aminokwasów. Wobec tego można określić czas ob-

CMP CMP Kardiolrpma sn-GllceroloFoefatydyloglicerol i- ost atyd yl og I i ce r o la f ■3-fosforan osf o ra n (dttosfatydyloglloeral)

HiCOH

H 3 C-O-C-R,

Acylo-CoA

ml

i . HjC- O-O

_I

A^

NADPH-fH4 NAOP +

R,-(CH; I,-OH H

ACYLO ;YLÓ -

H ^ C - O -IC H ^R,

I

I

|RH>UKTAZA|

~

HOOC-R,

SFEHA2AI H,C~O-(p) DihydrokByaeetonofosforan

i -Al ki I o g I icero lo-3-f osf o ra n r Acyto-CoA

aceton ofoaforati

1-Acytodl hydro ksyaoetonofosforan

ACYLOTRANSFERA2,

H

CMP k.

lf Rj-C-O-C-

1-Alki!o-2-acy!ogl(cerolo-a-insfoetafwłDamlna

NADPH, O*

CDP-etanoloamlna l O H ;C-

\ J

[DESATURAZA I

- i -

O II

i

H^C-O I

Ł1ACVLC>GLICEROLO TRANSFERAZA HjC-OH FOSFOETANOLO1-Alkilo-2-acy1oglicerol C - O - C - H AM1NOWA -CDP-chollna IP0SF0HYDR0LA2AI

R ,-

I

DiACYLOGLICEHOLOTFIANSFERAZA FOSFOCHOLINOWA

HjC-0-® CMP

1-

Alkilo-2-acy log lloeroło-3-tosfof an Alktlodiacylogllcerole

O

HiC-O-CH-CH-ft,

O H^-O-ICH^-R,

R) COOH

;

CO

V

HUC-O-

H jC - G -IC H A -R ! HO -C-H

I FOSF0L1PA2A | 1 -Alkarylo-Eaeylogllcorolo- - 3-f osf oatanoloamlna, plaż mato gen

Cholina

Cholina

1-Alkilo-2-acylog!icerolo3-fosfocholina

Acetylo-CoA

w

i-Aikilo-2-iizoglioerolo3-fosfcchalina ACYLOTRANSFERAZA |

O II

HjC — O-

i H^-C-O-C-H Ryc. ?6-3. Biosynteza lipidów eterowych, plazmalogenów i ciynrrika aktywującego płytki {PAF). W szlaku syntezy PAF rfe novo acetylo-CoA jest wbudowywany w etapie*, unikając ostatnich 2 etapów pokazanych tutaj.

Cholina 1 -A Ikllo -2-acety lo g I icef o I a-3-iosf oc hol i na PAF

METABOLIZM ACYLOGLICEROLI I SFINGOLIPiDÓW / 289

o O II

FOSFOLIPAZA A,J

HjC-O-C-fi, I

ij -C-O-C-H HjC-O-(P)-Cf)ollna Fosfatydyloohollna H,0 jFOSFOLIFAZAA; |

FÓSFOLIPAŻAD I

— 0 - - C — R, R 3 —C--O-C -H O

Acylo-CoA

H,C-O-C-R 1 HOOH H 3 C-O-®CHolina Lizofosfatydylocholina ( > iz o lecytyna)

ZASADA AZOTOW

FD3FOLIPAZA A,

| FOSFOLIPAZA C |

Ryc. 26-5. Miejsca hydfolitycznego działaniafos-

folipaz na substrat fosfolipidowy.

H, 0 ILIZOFOSFOLIPAZA

R, -COOH H2C-OH HO -C -H l

Gl ioery lofosfocho lina HYDROLAZA GUCERYLOFOSFOCHOLtNOWA

HO-C-H HjC-O-®

+ Chollna src-G

I icero I o-3-f o sio ran Ryc. 26-4. Metabolizm lustćityuylijUioiiiiy (lu^yty

ny).

rot u (turnover time) dla takich cząsteczek. Chociaż fosfolipidy są aktywnie degradowane, każda cześć składowa ich cząsteczki ulega obrotowi (rozpadowi i re syn tezie) z odmienną szybkością, np. czas obrotu grupy fosforanowej jest inny niż czas obrotu grupy 1-acylowej, Jest to spowodowane obecnością enzymów, które umożliwiają częściową degradację z następującą zaraz po niej resyntezą (ryc. 26-4). Fosfolipaza Aj katalizuje hydrolizę wiązania estrowego w pozycji 2 gl icero lofosfolipid ów z wytworzeniem wolnego kwasu tłuszczowego i lizofosfolipidu, który może zostać ponownie acylowany przez acylo-CoA w obecności acylotransferazy. 19 — Biochemia

HjC-0 + P -+ O —I O

Alternatywnie lizofosfolipid (np. lizolecytyna) może być atakowana przez lizofosfoiipazę (fosfolipazę A^, która usuwa pozostałą grupę 1 -acylową, pozostawiając glicerol połączony losfodiestrowo z odpowiednią zasadą. Ten ostatni związek może być rozkładany przez odpowiednią hydrolazę z uwolnieniem glicero-Io-3-fosforanu i zasady. Fosfolipaza Aj działa na wiązanie estrowe w pozycji 1 fosfolipidów (ryc. 26-5). Fosfolipaza C atakuje wiązanie estrowe w pozycji 3, uwalniając 1,2diacylo-glicerol i ufosforylowaną zasadę. Jest to jedna z głównych toksyn wytwarzanych przez bakterie. Fosfolipaza D jest enzymem opisywanym głównie u roślin, a katalizującym odhydrolizo-wanie zasady azotowej od fosfolipidów. Lizo lecytyna może powstawać alternatywną drogą, z udziałem acylotransferazy lecytyna: : cholesterol (LCAT), Ten enzym, występujący w osoczu, a syntetyzowany w wątrobie, katalizuje przeniesienie 1 reszty kwasu tłuszczowego z pozycji 2 lecytyny na cholesterol z wytworzeniem estru cholesterolowego. Enzym ten ma być odpowiedzialny za dużą ilość estru cholesterolowego zawartego w li po proteinach osocza. Następstwa niedoboru LCAT są dyskutowane na str. 321 A C E T Y LO T B A N S F E R A Z A LE CY T Y NA— CHO L E S T E RO L

Lecytyna + cholesterol Lizolecytyna + Ester cholesterolowy

Nasycone kwasy tłuszczowe o długim łańcuchu występują przeważnie w pozycji 1 fosfolipidów, podczas gdy wielo nienasycone kwasy (np, prekursory prostaglandyn) są wbudowa-

290 / ROZDZIAŁ 26

ne raczej w pozycji 2. Wbudowywanie kwasów tłuszczowych do lecytyny odbywa się przez kompletną syntezę fosfolipidu, przez transacylacje między estrami cholesterolu i lizolecytyną i przez bezpośrednią acylacje lizolecytyny z udziałem acylo-CoA. Wobec tego możliwa jest ciągła wymiana kwasów tłuszczowych, zwłaszcza gdy chodzi o wprowadzanie egzogennych kwasów tłuszczowych do cząsteczek fosfolipidów.

sforanem pirydoksalu, aminokwas seryna łączy sie z palmitoilo-CoA, tworząc po odłączeniu CQ2 3-ketosfinganine. Sama sfingozyna powstaje po etapie redukcji, o którym wiadomo że uczestniczy w nim NADPH jako dawca wodorów. Potem następuje etap oksydacyjny, analogiczny do etapu P-oksydacji z udziałem dehydrogenazy acylo-CoA, w którym uczestniczy enzym będący flawoproteiną. Ceramid (N-acylosfingozyna) powstaje pr2ez połączenie acylo-CoA i sfingozyny (ryc. 26-7).

WSZYSTKIE SFINGOLIPIDY POWSTAJĄ Z CERAMIDU Aminoalkohol sfingozyna (ryc, 26-6) jest syntetyzowany w siateczce śródplazrnatycznej. Po zaktywowaniu, polegającym na połączeniu z foNH3+

Fosfatydylochnilna

Sflngozyna

-- ^

Ceramid

Acyfo-CoA CoA

CH 3 -
, -»■ SfingomWIna CDP- CMP -oholfna

Ryc. 26-7. Biosynteza ceramidu i sfingomieliny.

Palmltollo-CoA

Grupą acylową często jest reszta długołańcuchowego kwasu nasyconego lub monoenowego. Sfingomieliny są fosfolipidami (p. str. 181) powstającymi w wyniku reakcji ceramidu z CDP-choliną albo z fosfatydylocholiną; pierwsza reakcja jest analogiczna z tą, jaka zachodzi podczas biosyntezy fosiatydy locho liny (ryc. 26-1).

CoA • SH

3-Ketosiinganina ■NADPH+H REDUKTAZA 3KETOSRNGANINOWA NADP

+

I I OH NHa + Dlhydrosflngozyrta REDUKTAZA SFINGANINOWA \

I I OH NH 3 + Sflngozyna Ryc. 26-6. ina.

Sflngomlellna Acylogllcerol

Biosynteza sfingoz/ny. Fp-flawoprote-

Glikosfingolipidy są połączeniem ceramidu z jedną lub wieloma resztami cukrowymi W wielu glikosfingolipidach, zwłaszcza w mózgu, jest charakterystyczne występowanie kwasów tłuszczowych C24 (kwasów lignocery-n owego, cerę brono we go i nerwonowego). Kwas lignocerynowy(C23H47COOH) jest w całości syntetyzowany z acetylo-CoA. Kwas cerębronowy jest 2-hydroksypochodną kwasu lignocerynowego i jest z niego syntetyzowany. Kwas nerwonowy (C;3H4;COOH) jest mononienasyconym kwasem i powstaje przez elongację kwasu olejowego. Najprostszymi glikosfingolipidami (cerebrozydami) są galaktozyloceramid (GalCer) i glukozyloceramid (GlcCer). GalCer jest głównym lipidem mieliny, podczas gdy GlcCer jest głównym glikosfingolipidem tkanek pozanerwowych oraz prekursorem większości bardziej

METABOLIZM ACYLOGLICEROLI I SFINGOUPiDÓW / 291 UDPGIc [EPIMERAZA| Acyl-CoA CoA Sfngozyna ^> * »,

UDPGal UDP PAPS f Galaktozyloceramld ( Sulfogalaklozyloceramid Cerami d —^-*- (cerebrazyd) -----^-*(aurtaNdl (sulfatyd)

Ryc. 26-8.Biosynteza galaktozyloceramidu i jego siarczanowej pochodnej, PAPS — „aktywny siarczan' fosfoadenozyno-B-tosfosiarczan. Acylo-CaA

UOPGIc

CoA

UDPGal

UDP

L

Stingozyna Ceramtd

UDP

Glukozylaceramid (Cer-Glc)

Prosty gangilozyd (mon QS ialogan g I! ozyd)

CerGIcGal

CMP-NeuAc

Cer-GIcGal-GalNAc-Gal --------- Ne!,Ac

(GMI)

CM P

UDP

Wyższe ganfllbzydy [disialo-1 trisialogangllozydy)

'— UDPGal

UDP

UDP-N-acBtylogalaktazoamina

Cer-GIc-Gal-GalNAc

NeuA c

I

Cer-GIc-Gal I NeuA c

Ryc. 26-9.Biosynteza gangliozydów. NeuAc — kwas N-acetyloneuraminowy

złożonych glikosfingolipidów. Epimeraza urydynodifosfogalaktozowa (ryc. 26-8) katalizuje epimeryzację glukozy do galaktozy, przekształcając urydynodifosfoglukozę (UDPGIc) w urydynodifosfogalaktozę (UDPGal). W mózgu reakcja przebiega podobnie do przedstawionej na ryc. 22-5 dla wątroby i gruczołu sutkowego. Galaktozyloceramid powstaje w wyniku reakcji między ceramidem i UDPGal. Sulfagalaktozyloteramid jest rezultatem dalszej reakcji z 3'-fosfoadenozyno-5'-fosfosiarczanem (PAPS; „aktywny siarczan"). PAPS uczestniczy także

w biosyntezie innych suliblipidów, tj. sulfo(galakto)głicerololipidów i estrów siarczanowych steroidów, Gangliozydy są syntetyzowane z ceramidu przez stopniowe przyłączanie zaktywowanych cukrów (np. UDPGIc i UDPGal) oraz kwasu sjalowego, którym zwykle jest kwas N-atetylone u mm i na wy (ryc. 26-9). Może powstawać wiele gangliozydów o coraz większej masie cząsteczkowej. Większość enzymów przenoszących cukry z nukleotydocukrów (glikozylotransferazy) jest umiejscowiona w aparacie Golgiego.

292 / ROZDZIAŁ 26

Glikosfingolipidy są składnikami zewnętrznej warstwy błony plazmatycznej i są ważnymi strukturami uczestniczącymi w kontakcie międzykomórkowym i komunikowaniu się komórek. Niektóre z nich są antygenami, np. antygen Forssmana i antygeny układu grupowego krwi ABO, Podobne łańcuchy oligosacharydowe występują w glikoproteinadi błon komórkowych. Niektóre gangliozydy funkcjonują jako receptory toksyn bakteryjnych (np. toksyny cholery, która następnie aktywuje cyklazę adenylanową).

FOSFOLIP1DY I SFINGOLIPIDY UCZESTNICZĄ W PATOGENEZIE STWARDNIENIA ROZSIANEGO I LIPIDOZ Pewne choroby charakteryzują się występowaniem nieprawidłowych ilości wspomnianych powyżej lipidów w tkankach, często w tkance nerwowej. Choroby te można podzielić na 3 grupy: 1) prawdziwe choroby demielinizacyjne, 2) sfmgoiipidozy oraz 3) leu kody strofie. W stwardnieniu rozsianym, które jest chorobą

Tabela 26-1. Zestawienie sfingolipidoz Choroba Fukozydoza

Niedobór enzymu

Nagromadzający się lipid

Objawy kliniczne

Cer-GIc-Gal-GalNAc-GaljFuc Izoantygen H

Zwyrodnienie mózgu, przykurczę mięśniowe, gruba skóra

Uogólniona gang- Gurf)-galaktozydaliozydoza

Cer-Glc-Gal(NeuAc)-GalNAc|Gal GM1-Gangliozyd

Niedorozwój umysłowy, powiększenie wątroby, zniekształcenia kośćca

Choroba Tay-Sach- Hekso2oaminidaza A sa

Cer-Glc-Gal(NeuAc)jGalr\!Ac GM2Gangliozyd

Niedorozwój umysłowy, ślepota, osłabienie mięśni

Odmiana choroby Heksozoaminidaza Tay-Sachsa albo A i B choroba Sandhoffa

Cer-GIc-Gal-GalJGalNAc Globozyd plus G^2 gangliozyd

Takie same, jak w chorobie Tay-Sachsa, ale postępujące znacznie szybciej

Choroba Fabry'ego u-Galaktozydaza

Cer-GIc-GalJGal Globotriaozylocefamid

Wykwity skórne, niedoczynność nerek (pefne objawy tylko u osobników męskich, gen recesywny związany z chromosomem X)

Lipid oia laktozydoceramidowa

Laktozydaza ceramidowa (f}-galaktozydaza)

Cer-Glc|Gal Laktozydoceramid

Postępujące uszkodzenie mózgu, powiększenie wątroby i Śledziony

Leukodystrofia metach romatyczn a

Ary losu Ifataza A

Cer-GaljOSOj 3Sulfogalaktozyloceramid

Niedorozwój umysłowy, a u dorosłych zaburzenia psychiczne, demielinizacja

Choroba Krabbego p-Galaktozydaza

Ce^Gal Galaktozyioceramid

Niedorozwój umysłowy, prawie zupełny brak mieliny

Choroba Gauchera

p-Glukozydaza

CeriGlic Glukozy loceramid

Powiększona wątroba i śledziona, ubytki osteolityczne kości długich. U dzieci niedorozwój umysłowy

Choroba Miemanna-Picka

Sfingomielinaza

CerjP-cholina Sfingomielina

Powiększona wątroba i śledziona, niedorozwój umysłowy; zgon we wczesnym okresie życia

Choroba F3fbera

Ceramidaza

AcyljSfingozyna Cera m id

Chrypka, zapalenie skóry, zniekształcenie kośćca, niedorozwój umysfowy, zgon we wczesnym okresie życia

oc-Fukozydaza

NeuAc — kwas N-acetyloneu/aminowy, Cer — ceramid; Glc — glukoza, Gal — galaktoza, Fuc — fukoza. Wiązania oznaczone j są miejscami reakcji katalizowanej przez enzym, którego niedobór występuje

METABOLIZM ACYLOGL1CEROLI I SFINGOLIPIDOW / 293

demielinizacyjną, stwierdza się utratę z substancji białej zarówno fosfolipidów (zwłaszcza plazmalogenu etanoloaminowego), jak i sfmgolipidów. Wynikiem tego jest zbliżenie składu chemicznego substancji białej mózgu do składu substancji szarej. W substancji białej u takich chorych można stwierdzić obecność estrów cholesterolu, chociaż normalnie ich tam nie ma, a w płynie mózgów o- rdzeniowym występuje zwiększone stężenie fosfolipidów. Sfingoiipidozy są grupą chorób dziedzicznych, często ujawniających się już w dzieciństwie. Choroby te zalicza się do dużej grupy zaburzeń lizosomalnych. Choroby charakteryzujące się spichrzaniem lipidów mają kilka stałych cech: 1. W różnych tkankach stwierdza się spichrzanie złożonych lipidów, w których skład wchodzi wspólny składnik —■ ceramid. 2. Szybkość syntezy spichrzanego lipidu jest porównywalna do szybkości u zdrowych osób. 3. Enzymatycznym defektem jest niedobór swoistego hydrolityczneg© enzymu lizosomalnego, niezbędnego do rozkładania na-

gromadzanego lipidu. 4. Stopień niedoboru aktywności enzymu, warunkującego spichrzanie lipidu, jest podobny we wszystkich tkankach chorego z ttj. wadą. Na podstawie tej jednakowej aktywności opracowano metody rozpoznawania, -dzięki którym stało się możliwe również wykrycie heterozygotycznych osób z tymi nieprawidłowościami genetycznymi, odpowiedzialnymi za przenoszenie choroby, a także wykazanie występowania dystrofii sfmgolipidowej

u nienarodzonego płodu. Zestawienie najważniejszych lipidoz przedstawiono w tab. 26-1. Skutkiem licznych postaci niedoboru sulfataz

jest spichrzanie w tkankach sulfogalaktoceramidu, estrów siarczanowych steroidów i proteoglikanów. Jest to spowodowane złożonym niedoborem arylosulfataz A, B i C oraz sulfatazy steroidowej.

PIŚMIENNICTWO Boyer PD (editor): The Enzymes, 3rded. Vol 16: Lipid Enzymoiogy. Academic Press, 1983. Brady RO: Sphingolipidoses. Annu Rev Biochem 1978;47:Ó87. Hawthorne JN, Ansell GB (editors): Phosphoiipids. Bfeevier, 1982. Snyder F: Biochemistry of plateletactivating factor. PSEBM 1989; 190:125. Various authors: In: The Metaboik Basis oflnherited Disease, óth ed. Scriver CR et al (editors). McOraw-Hill, 1989. Various authors: Metabolism of triacylglycerols; phospholipid metabolism; ether-linked glyrerolipids; sphingolipids. In: Biochemisiry of Lipids and Hormones. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummiugs, 1985. VanGolde LMG. Batenburg JJ, Robertson B; The pulmonary surfaelant system: biochemical aspects and functional significance. Physiol Rev 1988;68:374. Watts RWE, Gibbs DA: Lysosomal Storage Diseases: Biochemical and Clinical Aspects. Taylor & Francis, London, 1986.

Transport i magazynowanie

lipidów Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Tłuszcze wchłonięte z pokarmów i lipidy syntetyzowane przez wątrobę i tkankę tłuszczową muszą być transportowane między różnymi tkankami i narządami, aby mogły być zużytkowane i magazynowane. Ponieważ lipidy są nierozpuszczalne w wodzie, powstaje problem, jak je transportować w środowisku wodnym, jakim jest osocze krwi. Zosta! on rozwiązany dzięki asocjacji niepoiarnych lipidów (triacylogliceroli i estrów cholesterolu) z amfipatycznymi lipidami (fosfolipidami i cholesterolem) oraz z białkami, przez co powstają mieszające się z wodą lipoproteiny. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE U zwierząt wszystkożernych, takich jak człowiek, spożywających posiłki przedzielone okresami postu, nadmiar energii zostaje zmagazynowany w fazie anabolicznej procesu karmienia, po której następuje okres negatywnej równowagi energetycznej, w czasie którego organizm czerpie potrzebną mu energię ze swoich zapasów węglowodanowych i tłuszczowych. Lipoproteiny pośredniczą między tymi cyklami, transportując lipidy z jelita (w postaci chylomikronów) i z wątroby (w postaci lipoprotein o bardzo małej gęstości — VLDL) do większości tkanek, gdzie są utleniane, lub do tkanki tłuszczowej, gdzie są magazynowane. Z tkanki tłuszczowej tłuszcz jest mobilizowany jako wolne kwasy tłuszczowe (WKT), które, dostając się do krwi, łączą się z albuminami surowicy. Nieprawidłowości przemiany lipidów mogą być spowodowane zaburzeniami syntezy lub utyli-

zacji lipoprotein i mogą powodować różne hipolipoproteinemie lub hiperlipoproteinemie. Najbardziej powszechna z nich występuje u chorych na cukrzycę (diabetes melłitus), u których niedobór insuliny jest przyczyną nadmiernej mobilizacji WKT oraz zmniejszonego zużytkowywania chylomikronów i VLDL, prowadzących do powstawania hipertriacyloglicerolemii. Większość innych stanów patologicznych dotyczących zaburzeń transportu lipidów jest uwarunkowana dziedzicznymi wadami syntezy części apoproteinowej lipoprotein, kluczowych enzymów ich przemiany lub receptorów lipoprotein. Niektóre z tych wad powodują hipercholesterolemic i przedwczesną miażdżycę (atherosclerosis). Nadmierne spichrzanie tłuszczów jest cechą otyłości, której jedna z postaci jest spowodowana wadliwą termogenezą indukowaną dietą w brunatnej tkance tłuszczowej. LIPIDY SĄ TRANSPORTOWANE W OSOCZU JAKO LIPOPROTEINY Zidentyfikowano 4 główne grupy lipoprotein Przez wyekstrahowanie lipidów osocza odpowiednim rozpuszczalnikiem tłuszczowym i po rozdziale wyciągu na poszczególne klasy lipidów można wykazać w nim obecność triacylogikeroli, fosfolipidów, cholesterolu i estrów cholesterolu oraz niewielkie ilości niezestryfikowanych, długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (wolnych kwasów tłuszczowych), które stanowią mniej niż 5% całkowitej ilości kwasów tłuszczowych występujących w osoczu. Ta frakcja wolnych kwasów tłuszczowych (WKT; ang. Free Fatty Acids — FFA) jest najbardziej aktyw-

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 295 Tabela 27-1. Lipidy osocza krwi u człowieka Lipid

Gęstość

mmol/l Średnio

zakres

Triacyloglicerol Całkowite fosfolipidy+

1,6

0,9-2,0 1,8-5,8

Całkowity cholesterol Wolny cholesterol (nie-zegtryf i kowany}

5,2

2,8-8,3

1,4

0,7-2,7

Wolne kwasy tłuszczowe (niezestryfikowane)

3,1

0,4

0,2-0,6

_ Miejsce , starlu

<0,96

ł

Z catej ilości kwasów tłuszczowych 45% znajduje się w triacyloglicerolach, 35% w fosioiipidach, 15% występuje jako estry cholesterolu, a mniej niż 5% to wolne kwasy tłuszczowe * Waha się w zależności od stanu odżywienia Oznaczone jako fosfor lipidowy

+

ną metabolicznie frakcją lipidów osocza. Stężenie głównych klas lipidów osocza krwi przedstawiono w tab. 27-1. Czysty tłuszcz ma gęstość właściwą mniejszą od wody. Wobec tego obserwuje się malejącą gęstCść w miarę zwiększania proporcji lipidu do białka w lipoproteinach (tab. 27-2). Tę cechę fizyczną wykorzystano do rozdziału lipoprotein osocza metodą ultra wirowani a. Szybkość, z jaką każda lipoproleina wznosi się przez roztwór NaCl (gęstość właściwa 1,063) może być wyrażona w jednostkach flotacji Svedberga (Sf). Jedna jednostka Sf jest równa 10-11 cm/s/ /dyna/g w temp. 26°C, Skład różnych frakcji lipoproteinowych otrzymanych metodą wirowania przedstawiono w tab. 27-2. Z tabeli tej wynika, że różne klasy chemiczne lipidów występują w większości frakcji lipoproteinowych w różnych ilościach. Ponieważ frakcje lipoproteinowe o określonych gęstościach spełniają określone funkcje fizjologiczne, sama analiza chemiczna lipidów osocza (z wyjątkiem WKT), dostarcza tylko niewielu informacji o ich znaczeniu w patofizjologii. Poza zastosowaniem technik polegających na wykorzystaniu różnic gęstości, lipoproteiny można rozdzielić na podstawie ich właściwości elektroforę ty cznych na a-, 0- oraz preP--li po proteiny (ryc. 27-1) i można je zidentyfikować dokładniej za pomocą immunoelektrofore-

1,006-1,063 iLDL) < 1.006 (VLDL) 1,063-1,21 (HDL)

Chylomlkrony

^Lipoproteiny Pre-/Hipoprotalny a-LIpoprotelny

Ryc. 27-1. Elektroforetyczny rozdział lipoprotein

Poza WKT zidentyfikowano 4 główce grupy lipoprotein o ważnym znaczeniu fizjologicznym oraz diagnostycznym. Są to: 1) chylomikrony, powstające z wchłanianych w jelicie triacylogliceroli, 2) lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL lub pre-P-lipoproteiny), pochodzące z wątroby i spełniające funkcję eksportera triacylogliceroli z tego narządu, 3) lipoproteiny 0 małej gęstości (LDL lub Plipoproteiny), będą ce przedstawicielem końcowych produktów katabolizmu VLDL oraz 4) lipoproteiny o dużej gęstości (HDL lub a-lipoproteiny), biorące udział w metabolizmie VLDL i chylomi kranów, a także w przemianie cholesterolu. Triacylo glicerol jest głównym lipidem chyJomikronów 1 VLDL, podczas gdy cholesterol i fosfolipidy są dominującymi składnikami lipidowymi odpo wiednio LDL i HDL (tab. 27-2). Amfipatyczne lipidy są istotnymi składnikami lipoprotein Typowa iipoproteina — taka jak chyloinikron lub VLDL — składa się z rdzenia lipidowego, zawierającego głównie triacyloglicerole i estry cholesterolu, otoczonego pojedynczą warstwą powierzchniową złożoną z cząsteczek amfipatycznyeh fosfolipidów i cholesterolu. Te cząsteczki są tak ułożone, że ich grupy polarne są skierowane na zewnątrz, do środowiska wodnego, tak jak w błonie komórkowej (p. str. 187), Białkowe części lipoprotein są znane jako a po lipoproteiny lub apoproteiny Stanowią one ok. 60% masy niektórych HDL, a zaledwie 1% masy chyl orni kro nów. Niektóre apolipoproteiny są ściśle zintegrowane z częścią lipidową, tak

Tabela 27-2.Skład lipoprotein osocza u człowieka Źródło Średnica Gęstość [nm] Frakcja

Chylomikrony Jelito Lipopfoteiny o bar- Wątroba dzo małej gęstości i jelitu (VLDL) VLDL i chyLipoprotetny o po- lomikrony średniej gęstości VLDL (IDL) Wątroba i Lipoproteiny o małej jelito. gęstości (LDL) VLDL? Lipoproteiny o dużej Chylomigęstości HDLj krony? Tkanka HDL3 WKT— tłuszczowa

90-1000

< 0 r95 0.95-

S

Skład

.

Białko CałkowiProcent całkowitych lipidów te lipidy [%] [%] Triacy- Fosfoli Estry Cholest Wolne loglice- pidy cholest erol kwasy rol erolu (wolny) tłuszczowe > 400

1-2

30-90 25-30

1,006 1,006-1,019

20-400

7-10 11

20-25

1,019-1,063

12-20 2-

21 33

10-20 7,5-10

1,063-1,125 1,125-1,210

12

57 99

98-99 90-93 89 79 67 43 1

88 56 29 13 16

8 20 26 28 43

13 0 46 0

3 15 34 48 31 29 0

> 1,2810

albumina

WKT — wolne kwasy tłuszczowe. VHDL (ang.; very high density lipoproteins) jest niewielką frakcją o gęstości 1,21 -1,25,

18 9

1

10 10 60

11 6 100

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 297 Obwodowa apolipo protein a (np, Apo-C} Jednowarstwowa błona

Wolny

Fosfotlpld

cholesterol

Trlacylogllcerol

'Rdzeft złożony ' głćwnie z nie polarnych lipidów Integralna s apoll po proteina "V,, {np. apo-B)

z

zbudowana głównie lipidów amflpatycznych

c- 27-2. Uogólniona budowa lipoproteiny osocza. Należy zauważyć podobieństwa z bfoną plazmatyczną. Niedawne badania wskazują, że niewielkie ilości estrów cholesterolu i triacyloglicerolu znajdują się w powierzchniowej warstwie, a małe ilości wolnego cholesterolu występują w warstwie rdzeniowej.

że nie można ich usunąć z cząstek lipoproteinowych, podczas gdy inne mogą być swobodnie przenoszone do innych lipoprotem (ryc. 27-2), Skład apolipoprotein jest charakterystyczny dla danej lipoproteiny W każdej lipoproteinie występuje 1 lub więcej apolipoprotein (białek lub polipeptydów). Według nomenklatury ABC główną apolipoproteinę HDL (ot-lipoproteiny) określa się jako apolipoproteinę A. Główną apolipoproteina. LDL (P~hpoproteiny) jest apolipopro_tęinajgv. która znajduje się również w VLDL i w chylomikronach. Jednakże apo B chylomikronów (B-48) jest mniejsza niż apo B pochodząca z LDL lub VLDL (B-100). B-48 jest syntetyzowana w jelicie, natomiast B-100 w wątrobie (u szczura wątroba wydaje się syntetyzować 2arówno B-48, jak i B-100). Apo B-100 jest zapewne najdłuższym łańcuchem ze znanych pojedynczych łańcuchów polipeptydowych, złożonym z 4536 reszt aminokwasowych. Apo B-48 (mająca wielkość 48% apo B-100) jest syntetyzowana na tym samym mRNA, co apo B-100. Zapewne w jelicie kodon stop, którego nie ma w odpowiednim DNA genomu, jest wprowadzany do RN A w procesie

posttranskrypcyjnej jego obróbki w taki sposób, że translacja zatrzymuje się na reszcie aminokwasu 2153. Apolipoproteiny C-I, C-II i C-HI są małymi polipeptydami swobodnie dającymi się przenosić między różnymi lipoproteinami (tab. 27-3). Węglowodany stanowią ok. 5% masy apo-B i zawierają mannozę, galaktozę, fukozę, glukozę, glukozoaminę oraz kwas sjalowy. Niektóre lipoproteiny są więc także glikoproteinami. W lipoproteinach osocza znaleziono również inne apolipoproteiny. Jedną z nich jest bogata w argininę apolipoproteina E wyizolowana z VLDL i HDL. Zawiera ona argininę w ilości aż 10% wszystkich aminokwasów i stanowi 5—10% wszystkich apolipoprotein VLDL u zdrowych osób. Nadmierne jej ilości stwierdza się u chorych z hiperlipoproteinemia. typu III o szerokim paśmie PVLDL. Apolipoproteiny spełniają różne funkcje: 1) są kofaktorami enzymów, np. C-Il jest kofaktorem Jipazy lipoproteinowej, AA acylotransferazy lecytynaxholesterol, 2) mogą działać jako białka przenoszące lipidy, np. apo D w HDL, 3) działają jako Ugandy w interakcjach z receptorami lipoprotein w tkankach, np. apo B-100 i apo E w interakcji z receptorami LDL, apo E z receptorami remnantów, a apo A-I z receptorami HDL,

298 / ROZDZIAŁ 27 Tabela 27-3. Apolipoproteiny lipoprotein osocza człowieka Apo 1 i pop rotei na

Li po proteina

Masa cząstecz kowa {Da)

Dodatkowe uwagi

A-l

HDL, chylomikrony

28000

Aktywator acylotransferazy lecytyna: cholesterol (LCAT)

A-ll

HDL, chylomikrony

17000

Zbudowana z 2 identycznych mono merów połączonych mostkiem disiarczkowym. inhibitor LCAT?

B-100

LDL, VLDL. IDL

550000

Syntetyzowana w wątrobie. Ligand dla receptora LDL

B-48

Chylomikrony, chyiomikrony resztkowe

260000

Syntetyzowana w jelicie

Cl

VLDL, HDL

7 600

Możliwe, że aktywator LCAT

C-ll

VLDL, HDL, chylomikrony

8 800

Aktywator poza wątrobowej lipazy li po proteinowej

-

c-m

VLDL, HDL, chylomikrony

8750

Wiele postaci pohmorficznych zależ nie od zawartości kwasów sjalowych

-

D

Subfrakcja HDL

20000

Możliwe, ze identyczna z białkiem przenoszącym estry cholesterolu

E (bogata w argmine)

VLDL, HDL, chylomikrony, chylomikrony resztkowe

34 000

Obecna w nadmiarze w (5-VLDL u chorych z hiperlipoproteinemią typu III. Jest to jedyna apolipoproteina znajdująca się w HDL c u zwierząt z hipercholesterolemią wywołaną dietą Ligand dla receptora remnantów chylomikronów w wątrobie i dla receptora LDL

WOLNE KWASY TŁUSZCZOWE SĄ BARDZO SZYBKO METABOLIZOWANE Wolne kwasy tłuszczowe (WK.T, FFA, niezestryfikowane kwasy tłuszczowe) osocza pochodzą z lipolizy triacylogliceroii w tkance tłuszczowej albo powstają w wyniku działania lipazy lipoproteinowej w czasie wychwytywania triacylogliceroli osocza prze2 tkanki. W surowicy występują one w połączeniu z albuminą w stęże-

niach wahających się miedzy 0,1—2 u.mol/ml osocza. Są to głównie długołańcuchowe kwasy tłuszczowe znajdowane w tkance tłuszczowej (np. palmitynowy, stearynowy, olejowy, palmitoolejowy, hnolowy i inne wielonienasycone kwasy tłuszczowe) oraz w niewielkich ilościach różne inne długołań cuch owe kwasy tłuszczowe. Opisano miejsca wiążące dla kwasów tłuszczowych na albuminie mające różne powinowactwo. W warunkach sytoścL notuje się małe stężenie wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy. Zwiększa się ono do ok. 0,5 jimol/ml

-

w fazie poposiłkowej i do 0,7 ^mol/ml i 0,8 u.mol/ml w stanie całkowitego głodu. W niewyrównanej cukrzycy stężenie ich może się zwiększyć do 2 ^mol/ml. Stężenie WKT zmniejsza się tuż po jedzeniu i zwiększa się przed następnym posiłkiem. U takich zwierząt jak przeżuwacze, odżywiających się w sposób ciągły i u których zachodzi nieprzerwany napływ składników pokarmowych 7 jelita do krwi, stężenie wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu jest małe. Szybkość usuwania wolnych kwasów tłuszczowych z krwi jest wyjątkowo duża. Część WKT pobranych przez tkanki jest utleniana i pokrywa w głodzie 25—50% zapotrzebowania energetycznego organizmu. Pozostała część pobranych WKT jest estryfikowana. Iloraz oddechowy (RQ), oznaczony w okresie głodu, wskazuje na to, że spalaniu ulega znacznie więcej tłuszczów niż to wynika z ilości utlenionych wolnych kwasów tłuszczowych. Na t£ różnicę składa się utlenianie estrów lipidowych pochodzących z krążącej krwi lub obecnych w tkankach. Ostatnie ma szczególnie znaczenie w mieś-

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 299

niach szkieletowych i w sercu, gdzie mogą występować w dość znacznych ilościach zapasy lipidu w komórkach mięśniowych. Obrót (ang. turnover) wolnych kwasów tłuszczowych jest wprost proporcjonalny do stężenia wolnych kwasów tłuszczowych. Oznacza to, że

szybkość wytwarzania wolnych kwasów tłuszczowych w tkance tłuszczowej jest czynnikiem kontrolującym stężenie wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu, co z kolei determinuje pobieranie wolnych kwasów tłuszczowych przez inne tkanki. Stan odżywienia nie wydaje się mieć wielkiego wpływu na frakcje wolnych kwasów tłuszczowych pobieranych przez tkanki, wpływa natomiast na proporcje ilości kwasów tłuszczowych utlenianych w stosunku do estryfikowanych. W stanie głodzenia więcej kwasów tłuszczowych się utlenia niż w stanie sytości, W cytozolu komórek większości tkanek stwierdzono obecność białka wiążącego kwasy tłuszczowe, czyli białka Z. Uważa się, że rola tego białka w wewnątrzkomórkowym transporcie wolnych kwasów tłuszczowych jest podobna

do roli albumin surowicy w pozakomórkowym transporcie długolańcuchowych kwasów tłuszczowych. TRIACYLOGLICEROLE SĄ TRANSPORTOWANE Z JELITA W CHYLOMI KROWACH, A Z WĄTROBY W LIPOPROTEINACH O BARDZO MAŁEJ GĘSTOŚCI Jak sama nazwa wskazuje, chylomikrony znajdują się w chłonce, czyli limfie (łac: chyluś). Powstają one jedynie w układzie odprowadzającym chlonke z jelita. Są odpowiedzialne za transport wszystkich lipidów zawartych w pokarmach do układu krążenia. W chłonce stwierdza się również mniejsze cząstki lipoproleinowe o nieco większej gęstości, wykazujące fizykochemiczną charakterystykę cząstek VLDL. Skład chemiczny tych mniejszych cząstek przypomina raczej chylomikrony niż VLDL, wskazując na to, że powinno się je uważać raczej za

Światło jelita

Kanalik żółciowy Komórka śrńdblonka

Włosowate naczynie Krwionośne

Naczynie llmfatyczne prowadzące do przewodu piersiowego

E Światło zatoki żylnej

Ryc. 27-3. Tworzenie i wydzielanie (A) chyiomtkronów przez komórki jelita oraz (B) lipoprotein o bardzo małej gęstości przez komórkę wątrobową. RER — szorstka siateczka śródpiazmatyczna, SER — gładka siateczka śródplazmatyczna, G — aparat Golgiego, N —jądro, C — chylomikrony, VLDL— lipoproteiny o bardzo małej gęstości, E —śródbłonek, SD — przestrzeń okotozatokowa {Dissego) zawierająca osocze krwi. Rycina jest schematycznym przedstawieniem zdarzeń, które można zobaczyć w mikroskopie elektronowym.____________________________________________________________________

300 / ROZDZIAŁ 27

małe chylomikrony niż za VLDL. Ich wytwarzanie odbywa się nawet w okresie głodzenia, a ich lipidy pochodzą głównie z żółci i z wydzieliny ścian jelita. Ilość wytwarzanych chylomikronów o normalnej wielkości zwiększa się z ilością triacylogliceroli wchłoniętych ze światła jelita. Większość VLDL osocza jest pochodzenia wątrobowego. Są one przenośnikami triacylogliceroli z wątroby do tkanek poza wątrobowych. Istnieje wiele podobieństw w mechanizmie wytwarzania chylomikronów przez komórki jelita i VLDL przez hepatocyty wątroby (ryc. 27-3). Apoiipoproteina B jest syntetyzowana przez rybosomy w szorstkiej siateczce śródplazmatycznej i wbudowywana do lipoprotein w gładkiej siateczce śródplazmatycznej, która jest głównym miejscem syntezy triacylogliceroli. Następnie lipoproteiny przechodzą przez aparat Golgiego. gdzie — jak się sądzi — do lipoproteiny przyłączane są reszty cukrowcowe. Chylomikrony albo VLDL są uwalniane z komórki jelita lub wątroby przez fuzję pęcherzyka wydzielniczego z błoną komórkową (zjawisko to określa się jako odwrotną pinocytozę). Chy-

lomikrony przechodzą do przestrzeni między komórkami jelitowymi, skąd dostają się do układu limfatycznegojelita. VLDL są wydzielane przez komórki miąższu wątrobowego do przestrzeni okolozatokowej (Dissego), skąd dostają się do zatok wątrobowych, przenikając przez okienka śródbłonka naczyń. Podobieństwa pomiędzy tymi dwoma procesami i mechanizmami anatomicznymi są uderzające, gdyż — pomijając gruczoł sutkowy — jelito i wątroba są jedynymi tkankami, z których są wydzielane lipidy w postaci lipoprotein. Niezdolność cząstek lipidowych o rozmiarach chylomikronów i VLDL do przechodzenia przez komórki śródbłonka naczyń włosowatych, bez uprzedniej hydrolizy, jest prawdopodobnie przyczyną, dla której tłuszcze pokarmowe dostają się do krążenia poprzez układ limfatyczny (ductus thoracicus), a nie przez układ żyły wrotnej. Chociaż zarówno chylomikrony, jak i VLDL izolowane z krwi zawierają apoli po proteiny C i E, lipoproteiny te i.n statu nascendi zawierają ich bardzo niewiele albo wcale. Wydaje się więc, że do chylomikronów i VLDL syntetyzowanych de novo przyłączanie polipeptydów apo C r apo

TGidłety. Receptor remnantów ohylomikronu (Apo-E)

Romnant Glloerol chytomlkronu

Chyjo mikron świeżo utworzony

27-4. Metaboliczne losy chylomikronów. A — apolipoproteina A, B-48 — apoiipoproteina B-48, © — apolipoproteina C, E — apolipoproteina E, HDL — lipoproteina o dużej gęstości, TG — triacylo-giicerol, C — cholesterol i

JELFTO CIENKI E

TKANKI POZAWĄTFIOBOWE ILIFAZA LIPOPHOTEINOWAl -Kwasy tłuszczowe

Przedstawiono tytko ilościowo dominujące lipidy.

estry

cholesterolu,

P

—

fosfolipid.

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 301 świeżo wytworzona VLDL IDL Jremnant VLDL) Gllcerol TKANKI

Receptor LDL Apo-B-1QO Apo-E

"KANKI POZAWĄTHOBOWE

Kwasy tłuszczowe Cholesterol WĄTHOBA Receptor LDL . Kwasy ~ tłuszczowe POZAWĄTROBOWE I w tkankach pozawąlrobowych (np. w limfocytach, fibro toastach) drogą endocytozy

Rvc. Z7-5. Metaboliczne losy lipoprotein o

bardzo małej gęstości (VLDL) i biosynteza lipoprotein o małej gęstości (LDL). A — apolipoproteina A, B-100 — apolipoproteina B-100, © — apolipoproteina C, E — apolipoproteina E, HDL— lipoproteina o dużej gęstości, TG —triacyloglicerol, IDL — lipoproteina o pośredniej gęstości, C — cholesterol i estry cholesterolu, P — fosfolipid. Pokazano jedynie lipidy przeważające ilościowo.

E z HDL zachodzi dopiero wówczas, gdy chylomikrony i VLDL znajdują się w układzie krążenia (ryc. 27-4 i 27-5). Bardziej szczegółowy opis czynników kontrolujących wątrobowe wydzielanie VLDL podano niżej. Apo B jest istotna w tworzeniu chylomikronów i VLDL. W a beta li pop rotę ine mii (rzadkiej chorobie) apo B nie jest syntetyzowana; hpoproteiny zawierające tę apolipo proteinę nie są wytwarzane, przez co dochodzi do spichrzania lipidów w jelitach i w wątrobie. KATABOLIZM CHYLOMIKRONOW I LIPOPROTEIN O BARDZO MAŁEJ GĘSTOŚCI JEST SZYBKIM PROCESEM Oczyszczanie krwi z chylomikronów, oznaczane znikaniem znakowanych chylomikronów z krążenia, jest szybkie. Biologiczny okres półtrwania tych cząstek jest rzędu minut u ma-

łych zwierząt (np. u szczura) i nieco dłuższy u większych zwierząt (np. u człowieka), u których i tak wynosi mniej niż 1 h. Większe cząstki są szybciej katabolizowane niż małe. Jeżeli podać dożylnie chylomikrony ze znakowanymi kwasami tłuszczowymi triacyloglicerolu, to ok. 80% znakowanych kwasów stwierdza się w tkance tłuszczowej, sercu i mięśniach, a ok. 20% w wątrobie. Ponieważ doświadczenia z perfundowaną wątrobą wykazały, że wątroba nie metabolizuje w istotnym stopniu chylomikronów ani

VLDL, obecność znakowanych kwasów w wątrobie jest zapewne zjawiskiem wtórnym i pochodzi z przemiany tych lipoprotein w tkankach pozawątrobowych. Triacyloglicerol chylomikronów i VLDL jest hydrolizowany przez lipazę lipoproteinową Istnieje znamienna korelacja między zdolnością tkanek do wbudowywania kwasów tłuszczowych z triacylogliceroli lipoprotein a aktyw-

302 / ROZDZIAŁ 27

nością enzymu lipa/y lipoproteinowej. Ten enzym ic:iL umiejscowiony na ścianach włosowatych naczyń krwionośnych zakotwiczony proteoglikanowym łańcuchem siarczanu heparanu. Jego obecność wykazano w wyciągach z serca, tkanki tłuszczowej, śledziony, płuc, rdzenia nerki, aorty, przepony oraz gruczołu sutkowego w okresie Laktacji. Prawidłowa krew nie zawiera znaczących ilości tego enzymu, jednak po wstrzyknięciu heparyny lipaza li po protein owa zostaje uwolniona do krwiobiegu z jej zakotwiczenia siarczanem heparanu. Procesowi temu towarzyszy klarowanie iipemicznego osocza. Lipaza jest również uwalniana z wątroby po podaniu dużych ilości heparyny (lipaza wątrobowa uwalniana heparyną), ale ten enzym ma właściwości odmienne od lipazy lipoprotcinowej i nie reaguje łatwo z chyl om ikro na mi. Do aktywności lipazy lipoproteinowej są potrzebne, jako kofaktory, fosjfolipidy oraz apolipoproteina C-II. Apo C-II ma swoiste miejsce wiązania fosfolipidu, przez które jest ona związana z lipoproteiną. A zatem chylomikrony i VLDL dostarczają enzymowi potrzebnemu do przemiany tych lipoprotein zarówno kofaktorów, jak i substratu. Hydroliza zachodzi wówczas gdy lipoproteiny są przyłączone do enzymu na powierzchni śródblonków. Triacyloglicerol jest hydrolizowany stopniowo poprzez diacy loglicerol do monoacylogiicerolu, który w końcu jest hydrolizowany do glicerolu i wolnego kwasu tłuszczowego. Niewielka ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych wraca do krwiobiegu, gdzie jest wiązana z albuminą, ale znaczna większość z nich jest transportowana do tkanki (ryc. 27-4 i 27-5). Lipaza lipoproteinowa serca ma małą wartość Km dla triacyloglicerolu, podczas gdy Km tego enzymu w tkance tłuszczowej jest 10-krotnie większa. Gdy stężenie triacylogliceroli osocza zmniejsza się przy przejściu ze stanu sytości w stan głodu, wówczas sercowy enzym pozostaje nadal wysycony substratem, natomiast wysycenie enzymu w tkance tłuszczowej zmniejsza się, co sprawia, że następuje intensywniejsze pobieranie kwasów tłuszczowych przez serce niż przez tkankę tłuszczową. Podobne odwrócenie kierunku pobierania kwasów tłuszczowych następuje podczas laktacji, w czasie której zmniejsza się aktywność lipazy lipoproteinowej w tkance tłuszczowej, a zwiększa się w gruczole sutkowym, pozwalając na pobieranie długołańcuch owych kwasów tłuszczowych, z triacylogliceroli lipoprotein potrzebnych do syntezy tłuszczu mleka.

W tkance tłuszczowej insulina zwiększa syntezę lipazy lipoproteinowej w adypocytach i jej przemieszczanie do powierzchni luminarnej śródbłonka naczyń włosowatych. Działanie lipazy lipoproteinowej powoduje powstawanie resztkowych lipoprotein (remnantów) Wynikiem działania lipazy lipoproteinowej jest utrata z chylomikronów ok. 90% triacylogliceroli i utrata apo C (która powraca do HDL), ale nie apo E, która pozostaje połączona z powstałymi cząstkami, określonymi jako retnnanty chylomikronów lub chylomikrony resztkowe (od angielskiego „remnant" - pozostałość, resztka). Te cząstki mają średnicę o połowę mniejszą niż pierwotne chylomikrony. Na skutek utraty triacylogliceroli są one bogatsze w cholesterol i estry cholesterolu (ryc. 27-4). Podobne zmiany zachodzą w VLDL, które zamieniają się w remnanty VLDL, określane jako IDL (od angielskiej nazwy intermediate-density lipoproteins, czyli lipoproteiny o pośredniej gęstości) (ryc. 27-5). Wątroba jest odpowiedzialna za wychwytywanie remnantów lipoprotein Remnanty chylomikronów są wychwytywane przez wątrobę, a zawarte w nich estry cholesterolu i triacyloglicerole są hydrolizowane i meiabolizowane. Wychwytywanie to wydaje się odbywać za pośrednictwem receptora swoistego dla apo E {ryc. 27-4), Badania z użyciem VLDL zawierających znakowaną apo B-100 wykazały, że VLDL są prekursorami IDL oraz LDL. Tylko 1 cząsteczka apo B-100 występuje w każdej z wymienionych lipoprotein i ta cząsteczka pozostaje nie zmieniona w czasie przekształcania lipoprotein. Każda cząstka LDL pochodzi więc od pojedynczej cząstki VLDL (ryc. 27-5). IDL są przekształcane jedną z 2 możliwych dróg. Mogą one być wychwytywane bezpośrednio przez wątrobę za pośrednictwem receptorów LDL (wiążących apo B-100 i apo E), lub też mogą być przekształcane w LDL. U szczura większość apo B z VLDL pojawia się w wątrobie, a tylko niewielki procent w LDL. Może to być spowodowane faktem, że u szczura część cząstek VLDL zawiera apo B-48 zamiast apo B-100. Jeżeli wątrobowy receptor dla apo E wyklucza wychwytywanie cząstek zawierających apo B100, ale me cząstek zawierających apo B-48,

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 303

to jest to wytłumaczeniem większego usuwania przez wątrobę szczura I DL i mniejszego wytwarzania LDL u szczurów.

LDL SĄ METABOLIZOWANE ZA POŚREDNICTWEM RECEPTORA LDL Jak to opisano wyżej, większość LDL powstaje 2 VLDL; istnieją jednak dowody na to, że pewna ich iJość jest wytwarzana bezpośrednio przez wątrobę. Okres połowicznego znikania z krwi apoproteiny B-100, występującej w LDL, wynosi ok. 2,5 dnia. Badania w hodowli fibroblastów, limfocytów i komórek mięśni gładkich tętnic, a także wątroby wykazały istnięnje_swQisiy_ch miejsc wiążących, czyli receptorów LDL, tzw. receptorów B-100 E. Receptor ten tale nazwano, ponieważ jest on swoisty dla apo B-100, ale nie dla apo B-48, a w pewnych warunkach wiąże lipoproteiny bogate w apo E. W apo B-48 brakuje domeny znajdującej się przy karboksylowym końcu apo B-100, która zawiera ligand dla receptora LDL. W rodzinnej hipercholesterolemii występuje wa-

da tych receptorów. Około 50% LDL ulega degradacji w tkankach pozawątrobowych, a pozostałe 50% w wątrobie. Istnieje dodatnia korelacji między występowaniem miażdżycy naczyń wieńcowych a stężeniem LDL w osoczu. Dalsza dyskusja na temat regulacji receptora LDL p. str. 319.

HDL UCZESTNICZĄ ZARÓWNO W METABOLIZMIE TRIACYLOGLICEROLU, JAK I CHOLESTEROLU HDL są syntetyzowane i wydzielane zarówno w wątrobie, jak i w jelicie (ryc. 27-6). Jednakże HDL nowo wytworzone (świeżo wydzielone) w jelitach nie zawierają apolipoproteiny C ani E, a jedynie apolipoproteinę A. Apo C i apo E są więc syntetyzowane w wątrobie i przenoszone do jelitowych HDL wówczas, gdy te ostatnie znajdą się w osoczu. Główną funkcją HDL jest działanie jako składowisko dla a po li po protein C i E, które są potrzebne w metabolizmie chylomikronów i VLDL (p, ryc. 27-4 i 27-5).

Nowo wytworzone HDL składają się z dyskoidalnych podwójnych błon fosfolipidowych zawierających apolipoproteinę i wolny cholesterol. Te lipoproteiny są podobne do cz4Stek

znajdujących się w osoczu chorych z niedoborem enzymu acyibtransferazy lecytyna : chole-

sterol (LCAT) oraz w osoczu chorych na żółtaczkę zastoinowij. LCAT oraz jej aktywator — apolipoproteina A-1 wiążą się z tym tworem dyskoidalnym. Katalizowana przez LCAT reakcja zamienia fosfolipid i wolny cholesterol znajdujące się na powierzchni HDL w estry cholesterolu i łizolecytynę. Niepołarne estry cholesterolu przemieszczają się do hydrofobowego wnętrza struktury bilamelarnej, a lizolecytyna zostaje przeniesiona na albuminę osocza. Reakcja postępuje dalej i wytwarza niepolarny rdzeń, który rozpycha podwójną błonę cząstek aż do ukształtowania się sferycznego pseudomicelarnego HDL, pokrytego błoną złożoną z polarnych lipidów i apolipoprotein. Zestryfikowany cholesterol może być przenoszony z HDL do lipoprotein o mniejszej gęstości, np. do chylomikronów, VLDL i LDL, za pośrednictwem białka przenoszącego estry cholesterolu

(apo D), które jest jeszcze jednym składnikiem HDL. Białko przenoszące estry cholesterolu umożliwia więc transport estrów cholesterolu HDL do wątroby poprzez resztkowe chylomikrony i VLDL albo przez wychwytywanie LDL w wątrobie. Układ LCAT uczestniczy więc w usunięciu nadmiaru niezestryfikowanego cholesterolu z lipoprotein i z tkanek. Wątroba, a możliwe że i jelita, wydają się być miejscem końcowej degradacji apolipoprotein HDL. Nie jest jasne, czy w tym procesie uczestniczy swoisty receptor dla HDL, czy dla apo A. Zaproponowano istnienie cyklu HDL, odpowiedzialnego za transport cholesterolu z tkanek do wątroby (szczegóły są przedstawione na ryc. 27-6). To wyjaśnia, dlaczego stężenie HDLj w osoczu zmienia się odwrotnie proporcjonalnie do stężenia chylomikronów i VLDL, a wprost proporcjonalnie do aktywności lipazy lipoproteinowej. Stężenia HDL (HDL2) są odwrotnie proporcjonalne do częstości występowania miażdżycy naczyń wieńcowych być może dlatego, że

odzwierciedlają one wydajność usuwania cholesterolu z tkanek. HDL,; znajdują się we krwi zwierząt, u których występuje indukowana dietą hipercholesterolemia. Ta lipoproteina jest szczególnie bogata w cholesterol, a jej jedyną apolipoproteina jest apo E. Jest ona wychwytywana przez wątrobę poprzez receptor remnantów wiążący apo E oraz poprzez receptory LDL. To właśnie dlatego te ostatnie bywają czasem oznaczane jako receptory wiążące apo B-100 E. Płytki miażdżycowe mają komórki,

304 / ROZDZIAŁ 27 Clttci I Kwasy żółciowe

Dyskoldatna nowe postacie HDL

Dwu warstwa fosiollpidowa

Ryc. 27-6. Metabolizm lipoprotein o dużej gęstości (HDL). HRHL — lipaza uwalnialna przez heparynę, LCAT— acylotransferaza lecytyna : cholesterol, LPL — lipaza tipoproteinowa, C — cholesterol, CE — estry cholesterolu, PL — fosfolipid, WKT — wolne Chylomlkron kwasy tłuszczowe, A-l — y VLDL apolipoproteina A-l. Na rycinie przedstawiono rolę 3 enzymów HRHL, LCAT i LPL w postuiowanym cyklu HDL, służącym do transportowania cholesterolu z tkanek do wątroby HDL2, HDL3 — p. tab. 27-2. Poza triacyloglicerolem, HRHL hydrofizuje fosfolipidy na powierzchni HDL2, uwalniając cholesterol, który jest wykorzystywany przez wątrobę. Równocześnie powstają mniejsze cząstki o większej gęstości. Aktywność HRHL zwiększa się pod wpływem aridrogenów, a maleje pod wpływem estrogenów, co może być przyczyną większego stężenia HDL2w osoczu kobiet.

które wychwyciły tyle cholesterolu, że zmieniły się w przeładowane estrami cholesterolu komórki piankowate. Większość tych komórek pochodzi z makrofagów, które pochłonęły nieprawidłowe, bogate w cholesterol lipoprote-

iny, takie jak chemicznie zmodyfikowane LDL lub p-VLDL(p. str. 319). Makrofagi wydzielają zarówno cholesterol (przekazując go odpowiedniemu biorcy, takiemu jak HDL), jak i apo E. Ta apolipoproteina E, po odpowiednim przetwo-

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 305

rżeniu w obecności LCAT, może być źródłem bogatej w cholesterol HDLC. HDLC mogłaby więc być ważnym ogniwem w przemieszczaniu cholesterolu z tkanek do wątroby („odwrócony transport cholesterolu"). Wszystkie lipoproteiny osocza są. wzajemnie ze sobą powiązanymi ogniwami jednego lub kilku cykli metabolicznych, a wszystkie razem są odpowiedzialne za złożony proces transportu lipidów w osoczu.

WĄTROBA ODGRYWA GŁÓWNĄ ROLĘ W TRANSPORCIE I METABOLIZMIE LIPIDÓW Uprzednio sądzono że większość przemian lipidów odbywa się w wątrobie. Odkrycie, że większość tkanek ma zdolność całkowitego utleniania kwasów tłuszczowych oraz nagromadzona z czasem ilość informacji o tym, że tkanka tłuszczowa jest nadzwyczaj aktywnym metabolicznie narządem, zmusiły do zmodyfikowania tego poglądu o dominującej roli wątroby. Jednakże koncepcja, przypisująca wątrobie bardzo ważną i jedyną w swoim rodzaju rolę w przemianie lipidów, pozostaje nadal obowiązująca. Wątroba sprawuje następujące bardzo ważne funkcje w przemianie lipidów: 1) ułatwia trawienie i wchłanianie lipidów z przewodu pokarmowego, dlatego że wytwarza żółć zawierającą cholesterol i sole kwasów żółciowych syntetyzowane w wątrobie (p. str. 345), 2) wątroba ma aktywne układy enzymatyczne niezbędne do syntetyzowania i utleniania kwasów tłuszczowych (p. rozdz. 23 i 24), syntetyzowania triacylogliceroli, foslblipidów (p. rozdz. 26) i cholesterolu (rozdz. 27), 3) syntetyzuje lipoproteiny osocza (opisane w tym rozdziale), 4) przekształca kwasy tłuszczowe w ciała ketonowe (ketogeneza) (p. rozdz. 24), 5) odgrywa integrującą rolę w przemianie lipoprotein osocza (patrz ten rozdział).

Istnieje zależność między wydzielaniem VLDL przez wątrobę a składem spożytych pokarmów

Powyżej opisano procesy komórkowe uczestniczące w tworzeniu i wydzielaniu VLDL (str. 322). Wątrobowe triacyloglicerole są bezpośrednimi prekursorami triacylogliceroli zawartych w VLDL osocza krwi (ryc. 27-7). Biosynteza triacylogliceroli stanowi bezpośredni bodziec do tworzenia i wydzielania VLDL: Kwasy tłusz20 — Biochemia

czowe użyte do syntezy wątrobowych triacylogliceroli pochodzą z 2 możliwych źródeł: 1) z syntezy w wątrobie z acetylo-CoA pochodzącego z węglowodanów oraz 2) z kwasów tłuszczowych wychwytywanych z krążenia. Pierwsze źródło dominuje w stanie sytości, gdy synteza kwasów tłuszczowych zachodzi intensywnie, a stężenie kwasów tłuszczowych wkrażącej krwi jest małe. Ponieważ normalnie w tych warunkach triacyloglicerole nie gromadzą się w wątrobie, należy sądzić, że są przez nią wydalane w postaci VLDL z taką samą szybkością, z jaką są syntetyzowane. Natomiast w czasie głodzenia, podczas spożywania pokarmów bogatych w tłuszcze lub w cukrzycy stężenie krążących wolnych kwasów tłuszczowych jest zwiększone i więcej kwasów jest wychwytywanych przez wątrobę. W tych warunkach lipogeneza jest zahamowana i wolne kwasy tłuszczowe są głównym źródłem kwasów tłuszczowych zawartych w triacyloglicerolach wątroby oraz VLDL. Mechanizmy enzymatyczne uczestniczące w syntezie triacylogliceroli i fosfolipidów opisano na slr. 286. Czynnikami, które powodują zarówno zwiększenie syntezy triacyloglicerolu, jak i wydzielania VLDL w wątrobie, są: 1) stan sytości, a nie głodzenia, 2) karmienie pokarmami o dużej zawartości węglowodanów (zwłaszcza, gdy zawierają one sacharozę lub fruktozę), prowadzące do znacznej lipogenezy i estryfikacji kwasów tłuszczowych, 3) duże stężenie krążących we krwi wolnych kwasów tłuszczowych, 4) spożywanie etanolu oraz 5) duże stężenie insuliny, a małe stężenie glukagonu, co wzmaga syntezę i estryfikację wolnych kwasów tłuszczowych, a hamuje ich utlenianie.

Brak równowagi między wytwarzaniem triacylogliceroli a ich wydzielaniem jest przyczyną stłuszczenia wątroby (ryc. 27-7)

Z rozmaitych powodów lipidy, głównie jako triacyloglicerole, mogą sie nagromadzić w wątrobie. Znaczne ich spichrzenie jest uważane za stan chorobowy. Gdy nagromadzanie się lipidów ma charakter przewlekły, dochodzi do rozwoju zmian włóknistych, przechodzących w marskość (cirrhosis) i upośledzających czynność wątroby. Wyróżnia się 2 główne typy stłuszczenia wątroby: 1. Pierwszy typ jest związany ze zwiększonym stężeniem wolnych kwasów tłuszczowych osocza,

spowodowanym mobilizacją tłuszczów z tkanki

306 / ROZDZIAŁ 27

KREW

VLDL

HDL

Apo-C

' Apo-E*

Świażo wytworzona VLDL

J

A poA Apo-C Apo-E

Kwas orotowy Reszty glikozylowe

Tatra chlorek węgla Puromycyna Etlonlna

Gładka siateczka śródplazmatyczna

^ln< Syntez a blatka

Apo-B-100 ■ Apo-C Apo-E

\

i f§ f

Poiirybosomy

ou Szorstka siateczka śródplazmatyczna

Karmienie cholesterolem niedobór EFA Fosfochollna

1,2-Dlaoylogllcerol

OD świeży taft cuch policeptydowy

Niedobór ofiollny . Chollna

CDP-chollna

Etanol Acyto-CoA

_». Utlenianie

Llpogeneza z węglowodanów

WKT

Ryc. 27-7. Synteza lipoprotein o bardzo malej gęstości (VLDL) oraz prawdopodobne miejsca działania czynników powodujących spichrzanie triacylogliceroii i stłuszczenie wątroby EFA — egzogenne kwasy tłuszczowe, WKT — wolne kwasy tłuszczowe, HDL — iipoproteiny o dużej gęstości, ApoA — apolipoproteina A, ApoB — apolipoproteina B, ApoC — apolipoproteina C, ApoE — apolipoproteina E. Zaznaczone szlaki są podstawą dla zdarzeń przedstawionych na ryc. 27-3 B.

tłuszczowej albo z hydrolizą triacylogliceroli lipoprotein lub chylomikronów przez Iipa2ę lipoproteinową tkanek poza wątrobowych. Zwiększone ilości wolnych kwasów tłuszczowych osocza są wychwytywane przez wątrobę i estryfikowane. Wytwarzanie lipoprotein nie

nadąża za napływem wolnych kwasów tłuszczowych, co jest przyczyną nagromadzania się triacylogliceroli i stłuszczenia wątroby. Ilość triacyloglicerohi w wątrobie znacznie się zwiększa podczas głodzenia oraz spożywania pokarmów o dużej zawartości tłuszczów.

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 307

W wielu stanach (np. w głodzeniu) jest zaburzona zdolność wydzielania VLDL przez hepatocyty. Może to być spowodowane małym stężeniem insuliny i upośledzoną syntezą białka. W niewyrównanej cukrzycy {diabetes mellitus), w zatruciu ciążowym u owiec i w ketozie bydła nacieczenie tłuszczami może być tak znaczne, że powoduje widoczną bladość lub tłuszczowaty wygląd i powiększenie wątroby. 2. Drugi typ stluszczenia wątroby jest zwykle spowodowany metabolicznym blokiem wytwarzania lipoprotein osocza, co pozwala na nagromadzenie się tnacylogliceroli w wątrobie. Teoretycznie to upośledzenie może być spowodowane a) zablokowaniem syntezy apohpoprotein, b} zablokowaniem tworzenia iipoprotein z lipidu i apolipoproteiny, c) niedoborem w dostarczaniu fosfolipidów, które są w lipoproteinach lub d) niewydolnością samego mechanizmu wydzielania. Typem stłuszczenia wątroby, który byt przedmiotem licznych badań u szczura, jest stłuszczenie wywoływane niedoborem choliny i dlatego związek ten bywa nazywany czynnikiem lipotropowym. Ponieważ do syntezy choliny są potrzebne labilne grupy metylowe, których dawcą jest metionina w procesie transmetylacji (p. rozdz. 32 i 33), niedobór choliny w rzeczywistości jest spowodowany niedostatkiem grup metylowych tego typu, jaki zawiera metionina. Sugerowano kilka różnych mechanizmów, które mogłyby wyjaśnić rolę choliny jako czynnika lipotropowego, m.jn. taki, że brak choliny powoduje niedobór fosfolipidów niezbędnych do syntezy lipoprotein. Antybiotyk puromycyna hamuje biosyntezę białka i powoduje stłuszczenie wątroby oraz znaczne zmniejszenie stężenia VLDL u szczurów. Innymi związkami o podobnym działaniu są: elionina {kwas cc-amino-y-merkaptoetylomasłowy). tetrachlorek węgla, chloroform, fosfor, ołów i arsen. Cholina nie chroni organizmu przed toksycznym działaniem tych czynników, ale wydaje się przyspieszać proces zdrowienia. Jest bardzo prawdopodobne, że tetrachlorek węgla wpływa również na sam mechanizm wydzielania lub na łączenie się lipidu z apolipoproteiną. Działanie tetrachlorku węgla nie jest bezpośrednie, ale zależy od przekształcenia jego cząsteczki. Prawdopodobnie polega ono m.in. na tworzeniu wolnych rodników, które uszkadzają lipidy błon siateczki śródplazmatycznej, tworząc nadtlenki lipidowe. Uzupełnienie diety witaminą Ejest czynnikiem ochronnym przeciw

peroksydacji lipidów indukowanej tetrachlorkiem węgla. Uważa się że działanie etioniny polega na zmniejszeniu dostępności ATP. Wynika to z tego, że etionina, zastępując metioninę w S-adenozylometiomnie, wiąże pewną część dostępnej puli adenylanów i zapobiega tworzeniu się ATP. Kwas orotowy także powoduje stłuszczenie wątroby. W tym przypadku VLDL gromadzi sie w aparacie Golgiego. Dlatego uważa się, że kwas orotowy zaburza glikozylację lipoprotein i hamuje ich uwalnianie, co jest przyczyną znacznego zmniejszenia się w osoczu stężenia lipoprotein zawierających apo B. Niedobór witaminy E nasila martwicę wątroby występującą w przebiegu jej stłuszczenia wywołanego brakiem chohny. Podanie witaminy E lub selenu ma ochronne działanie przeciw peroksydacji lipidów. Tłuszczowe nacieczenie wątroby może być spowodowane — poza niedoborem białka — także niedoborem egzogennych kwasów tłuszczowych i witamin (np. kwasu hnolowego, pirydoksyny i kwasu pantotenowego). Uważa się że niedobór egzogennych kwasów tłuszczowych upośledza syntezę fosfolipidów. To sprawia, że takie substancje, jak cholesterol, które współzawodniczą o niezbędne dla estryfikacji egzogenne kwasy tłuszczowe, mogą także powodować stłuszczenie wątroby. Etanol także powoduje stłuszczenie wątroby Alkoholizm powoduje spichrzenie thiszczów w wątrobie, hiperlipemię i ewentualnie marskość wątroby {cirrhosis hepatis). Dokładny mechanizm długotrwałego działania etanolu jest wciąż niepewny. Nie jest jasne, czy w procesie spichrzania thiszczów jakąś rolę odgrywa dodatkowa mobilizacja wolnych kwasów tłuszczowych, chociaż wielokrotnie wykazano, że pojedyncza toksyczna dawka etanolu, podana szczurowi, powoduje zwiększenie stężenia wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu. Jednakże spożywanie etanolu przez dłuższy okres powoduje spichrzenie kwasów tłuszczowych, w wątrobie, które raczej pochodzą z endogennej syntezy niż z mobilizacji z tkanki tłuszczowej. Po spożyciu alkoholu nie stwierdza się upośledzenia syntezy białka w wątrobie. Istnieją przekonujące dowody na to, że utlenianie etanolu w wątrobie wzmaga syntezę triacylogliceroli i hamuje utlenianie kwasów tłuszczowych oraz zmniejsza aktywność cyklu cytrynianowego. Zmniejszenie aktywności tego cyklu jest spowodowane utlenianiem etanolu przez

308 / ROZDZIAŁ 27

dehydrogenazę alkoholową, co prowadzi do nadmiernego wytwarzania NADH. DEHYDROGENAZA ALKOHOLOWA

CH,-CH*-OH Etanol -.----------, CHj- CHO + NADH + H Aldehyd octowy

+

Powstający w tej reakcji NADH współzawodniczy z równoważnikami redukcyjnymi pochodzącymi z utleniania innych substratów o łańcuch oddechowy, hamując w ten sposób utlenianie tych substratów. Zwiększenie stosunku [NADH]/[NAD+] powoduje przesunięcie w lewo równowagi jablczan ^ szcza wio octan, co może zmniejszyć aktywność cyklu cytrynianowego. Sumarycznym skutkiem zahamowania utleniania kwasów tłuszczowych jest wzmożenie estryfikacji kwasów tłuszczowych do triacylogliceroli, co wydaje się być przyczyną stłuszczenia wątroby. W wyniku utleniania etanolu powstaje najpierw aldehyd octowy, który jest utleniany w mitochondriach do kwasu octowego przy udziale dehydrogenazy aldehydowej. Innymi skutkami spożywania etanolu może być m.in. zwiększona lipogeneza i zwiększona synteza cholesterolu z acetylo-CoA. Zwiększony stosunek [NADH]/[NAD+] powoduje także zwiększenie stosunku [mleczan]/[pirogronian], czego wynikiem jest hiperlaktacydemia, która z kolei jest przyczyną 2mniejszenia zdolności nerek do wydalania kwasu moczowego. Upośledzenie wydalania kwasu moczowego jest prawdopodobnie przyczyną pogorszenia się dny moczanowej po wypiciu alkoholu. Chociaż główna droga przemiany etanolu przebiega szlakiem dehydrogenazy alkoholowej, pewna jego ilość jest metabolizowana przez układ mikrosomalny zależny od cytochromu P-450, w którym uczestniczą także NADPH i O2. Aktywność tego układu zwiększa się w przewlekłym alkoholizmie i może być przyczyną zwiększenia metabolicznego usuwania etanolu z krwi w tych warunkach, na co wskazują zwiększone stężenia aldehydu octowego i octanu. CH 3 -CH a 0H + NADPH + H Etanol -* CH,-CHO Aldehyd octowy

2HaO

TKANKA TŁUSZCZOWA JEST GŁÓWNYM MAGAZYNEM TRIACYLOGLICEROLI W ORGANIZMIE Zapasy triacylogliceroli w tkance tłuszczowej ulegają ciągle lipolizie (hydrolizie) i reestryfikacji (ryc. 27-8). Te 2 procesy nie są prostym odwróceniem tej samej reakcji. Przebiegają one całkowicie odmiennymi szlakami zawierającymi inne pośrednie związki i inne enzymy. Wiele czynników żywieniowych, metabolicznych i hormonalnych, które regulują przemianę tkanki tłuszczowej działa albo na proces estryfikacji, albo na lipolizę. Wypadkową tych 2 procesów jest wielkość puli wolnych kwasów, tłuszczowych w tkance tłuszczowej. Pula ta determinuje stężenie wolnych kwasów tłuszczowych krążących w osoczu. Ponieważ stężenie wolnych kwasów tłuszczowych ma bardzo duży wpływ na metabolizm innych tkanek, zwłaszcza wątroby i mięśni, czynniki działające w tkance tłuszczowej i regulujące wypływ z niej wolnych kwasów tłuszczowych, wywierają wpływ sięgający daleko poza samą tkankę tłuszczową. Dostępność glicerolo-3-fosforanu reguluje estryfikację. Lipoliza jest kontrolowana przez lipazę wrażliwą na hormony W tkance tłuszczowej triacylogltcerol jest syntetyzowany z acylo-CoA i glicerolo-3-fosforanu według mechanizmu przedstawionego na ryc. 26-1. Ponieważ w tkance tłuszczowej aktywność enzymu kinazy glicerolowej jest mała, glicero! nie może być wykorzystany w znaczniejszym stopniu do estryfikacji z acylo-CoA. Dlatego pod względem dostarczania glicerolo-3-fosforanu tkanka tłuszczowa jest zależna od glikoiizy i od dostępności glukozy. Triacyloglicerol jest hydrolizowany pod wpływem lipazy wrażliwej na hormony. Produktami tej reakcji są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. Lipaza ta jest odmienna od lipazy lipoproteinowej, która katalizuje hydrolizę triacylogliceroli zawartych w iipoproteinach przed ich wychwytem przez tkanki pozawątrobowe (p. str. 302). GJicerol, nie mogąc być wykorzystany przez tkankę tłuszczową, przenika do osocza krwi, skąd jest wychwytywany i zużytkowywany prze2 takie narządy, jak wątroba i nerka, które mają aktywną kinazę giicerolową. Wolne kwasy tłuszczowe powstające w procesie lipolizy mogą być ponownie przekształcone w tkań-

TRANSPORT I MAGAZYNOWANfE LIPIDÓW / 309

Glukoza

G lice roi

Ryc. 27-8. Metabolizm tkanki tłuszczowej. Upaza wrażliwa na hormony jest aktywowana przez ACTH, TSH, glukagon, adrenalinę, noradrenalinę i wazopresyne, zaś hamowana przez insulinę, prostag landy nę E, i kwas nikotynowy. Szczegóły powstawania glicerolo-3-fosforanu z produktów pośrednich glikolizy przedstawiono na ryc. 26-1. PPP — szlak pentozofosforanowy, TG — triacyloglicerol, WKT — wolne kwasy tłuszczowe, VLDL — lipoproteina o bardzo małej gęstości.

ce tłuszczowej w acylo-CoA działaniem sycitetazy acylo-CoA i mogą być reestryfikowane z glicerolo-3-fosforanem, tworząc triacyloglicerol. W tkance tłuszczowej istnieje zatem ciągły cykl lipolizy i reestryfikacji. Gdy szybkość reeslryfikacji nie jest dostatecznie duża, aby zrównoważyć szybkość lipolizy, wówczas dochodzi do nagromadzenia wolnych kwasów tłuszczowych, które przenikają do osocza, gdzie wiążą się z albuminą i sa. przyczyną zwiększenia

stężenia wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu. Są one najważniejszym źródłem energetycznym dla wielu tkanek. Zwiększony metabolizm glukozy zmniejsza uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych Przy zwiększeniu zużycia glukozy przez tkankę tłuszczową zmniejsza się wypływ z niej wolnych kwasów tłuszczowych. Pomimo tego

310 / ROZDZIAŁ 27

utrzymuje się uwalnianie glicerolu. Sugeruje to, że hamujący wpływ glukozy na uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych nie jest spowodowany zmniejszeniem lipolizy. Uważa się, że jest to spowodowane dostawą glicero-lo-3fosforanu, który nasila procesy estryfikacji wolnych kwasów tłuszczowych po ich uprzednim przekształceniu w acylo-CoA. Glukoza w tkance tłuszczowej może wchodzić w wiele szlaków metabolicznych, łącznie z utlenianiem do CO2 poprzez cykl cytrynianowy, z utlenianiem poprzez szlak pentozofosforanowy, przekształceniem w długołańcuchowe kwasy thiszezowe oraz wytworzeniem acyloglicerolu poprzez glicerolo-3-fbsforan. Gdy zużycie glukozy jest duże. wówczas większa część pobranej glukozy jest utleniana do CO2 i przetwarzana w kwasy thiszczowe. Jeżeli jednak całkowite zużycie glukozy się zmniejsza, większość jej jest przekształcana w glicerolo-3-fosforan, wykorzystywany do estryfikacji z acylo-CoA. Proces ten pomaga-zminimaiizować wypływ wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej. Wolne kwasy tłuszczowe są wychwytywane przez tkanki w wyniku aktywności lipazy lipoprotei nowej W tkance tłuszczowej istnieje więcej niż 1 pula wolnych kwasów tłuszczowych. Wykazano, że pula wolnych kwasów tłuszczowych (ryc. 27-8, pula 1) powstająca w wyniku lipolizy triacylogliceroli, jest tą samą pulą, która dostarcza kwasów tłuszczowych do estryfikacji. Jest to także ta sama pula, z której wolne kwasy tłuszczowe są uwalniane do osocza. Jednakże kwasy tłuszczowe pobierane z osocza w wyniku działania lipazy lipoproteinowej na triacyloglicerole chylomikronów lub VLDL nie mieszają się z pulą 1, zanim nie zostaną wbudowane w triacyloglicerole, lecz przechodzą przez bardzo małą pulę 2, o bardzo dużej liczbie obrotów (krótkim okresie półtrwania). HORMONY REGULUJĄ MOBILIZACJĘ TŁUSZCZÓW Insulina zmniejsza uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych Na szybkość uwalniania wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej działa wiele hormonów, które wpływają^albo na szybkość estryfikacji, albo na szybkość lipolizy. Insulina hamuje uwalnianie wolnych kwasów tłuszczo-

wych z tkanki tłuszczowej, czego następstwem jest zmniejszenie stężenia wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu. Wzmaga ona lipogenezę i syntezę acyloglicerolu oraz nasila utlenianie glukozy do CO2 w szlaku pentozofosforanowym. Te działania insuliny są zależne od obecności glukozy. W dużej mierze mogą one być wyjaśnione pobudzającym wpływem insuliny na pobieranie glukozy przez komórki tkanki tłuszczowej. To działanie insuliny polega na spowodowaniu przemieszczania przenośników glukozy z aparatu Golgiego do błony plazmatycznej. Wykazano również, że insulina wzmaga aktywność dehydrogenazy pirogronianowej, karhoksylazy acetylo-CoA oraz acylotransferazy glicerolo--3-fosforanowej, wzmacniając przez to skutki wynikające ze wzmożonego pobierania glukozy, zwiększające wytwarzanie kwasów tłuszczowych i acylogliceroli. Wiadomo, że wymienione powyżej 3 enzymy są regulowane w sposób skoordynowany przez modyfikacje kowalencyjne, tj. przez mechanizm fosforylacji i defosforylacji. Zasadniczym działaniem insuliny w tkance tłuszczowej jest hamowanie aktywności lipazy wrażliwej na hormony. W wyniku tego działania zmniejsza się uwalnianie nie tylko wolnych kwasów tłuszczowych, lecz także glicerolu. Tkanka tłuszczowa jest znacznie bardziej wrażliwa na działanie insuliny niż wiele innych tkanek, co wskazuje na tkankę tłuszczową jako główne miejsce działania insuliny In vivoDuża liczba hormonów ma zdolność pobudzania lipolizy W odróżnieniu od insuliny, inne hormony przyspieszają uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej i zwiększają stężenie wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu dzięki temu, że zwiększają szybkość hydrolizy spichrzanych triacylogliceroli (ryc. 27-9). Wśród tych hormonów znajdują sie m.in. adrenalina, noradrenalina, glukagon, kortykotrofina (ACTH), <x- oraz p-melanotrofina (MSH), tyreotrofina (TSH), hormon wzrostu (GH) i wazopresyna. Wiele z nich aktywuje lipazę wrażliwa, na hormony. W celu osiągnięcia optymalnego skutku w wielu 2 tych procesów lipolizy jest potrzebna obecność glikokortykoidów i hormonów tarczycy. Same te hormony nie wzmagają w znaczny sposób lipolizy, ale działają ułatwiająco lub permisywnie w stosunku do innych lipolitycznych czynników wewnątrzwydziel niczych.

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 311

Adrenalina, nnradrenalina

/ ACTH, \ I TSH, ) Nglukagon'

Blokery ■'© \ 0adrenergiczns j^ Hormony--^) \© tarczycy \

CYKUAZA G.TPADENYLANOWA

WKT + diacylaglicerol

insulina, proatag landy na E„ Kwas nikotynowy ATP

WKT + monoacylogllcerol

l"acylog licerolawa b wrażliwa na hormony

--—WKT-*-' ATP

Hormon W Z f 0 8 t u ,-

')& e J

inhibitory"' ,-"'"*! syntezy ,'' białka / Adenozyna

cAMP

cAMPzależna kJnaza białek

Metyloksantyrty (np. kofeina} ..©_ FOSFODIESTEFIAZA

Fosfataza lipazy ■Llpaza triacyloglicero Iowa a wrażliwa na hormony (aktywna)

ADP x

Hormon tarczycy

5'AMP ^ Glukokortykoldy

WKT + glicerol

Insulina

'Inhibitory biosyntezy białka

THIACYLO GLICEROL

Llpaza Llpaza dlacylogllcerolowa monoacylogHeerolowa

Ryc. 27-9. Kontrola lipolizy w tkance tłuszczowej, TSH — tyreotropina, WKT — wolne kwasy tłuszczowe. Zauważ kaskadową sekwencję reakcji zmierzającą do zwielokrotnienia na każdym etapie. Bodziec lipolityczny jest „wyłączony" przez: 1) usunięcie hormonu pobudzającego, 2) działanie fosfatazy lipazy, 3) hamowanie lipazy i cyklazy adenylanowej działaniem dużych stężeń WKT, 4} hamowanie cyklazy adenylanowej dziafaniem adenozyny oraz 5) usunięcie cAMP w reakcji katalizowanej przez fosfod ieste rażę, ACTH, TSH i glukagon raczej nie mogą aktywować cyklazy adenytanowej in i/ivo, gdyż niezbędne do tego stężenia hormonu//? vitro są znacznie większe niż znajdywane w krążeniu Pozytywne (©) i negatywne (G) skutki regulacyjne są zaznaczone przerywanymi liniami, a przepływ substratów ciągłymi liniami.

Te hormony, które szybko pobudzają lipolizę, np. aminy katecholowe, czynią to pobudzając aktywność cyklazy adenylanowej, enzymu, który przemienia ATP w cAMP. Ten mechanizm jest analogiczny do tego, który jest odpowiedzialny za hormonalne pobudzenie glikogenolizy (p. rozdz. 20). cAMP, pobudzając cAMP-zależną kina/ę białek, przekształca nieaktywną, wrażliwą na hormon, lipazę triacyloglicerolową w aktywną lipazę. Lipoliza jest w dużej mierze kontrolowana przez ilość cAMP znajdującego się w tkance. Wobec tego procesy, które rozkładają lub chronią przed rozkładem cAMP, mają wpływ na lipolizę. cAMP jest rozkładany do 5'-AMP przez enzym fosfodiesterazę cykli-

cznego 3',5'-nukleotydu. Ten enzym jest hamowany przez metyloksantyny, takie jak kofeina i reoillina. Wiadomo, że picie kawy zawierającej kofeinę powoduje zwiększenie WKT w osoczu człowieka. Insulina działa antago ni stycznie w stosunku do hormonów Iipolityc2nych. Obecnie się uważa, że lipolka może być bardziej wrażliwa na stężenie insuliny niż proces zużywania glukozy i estryfikacja kwasów tłuszczowych. Przeciwlipolityczne działania insuliny, kwasu nikotynowego i prostaglandyny E, mogą być spowodowane hamowaniem syntezy cAMP w miejscu działania cykJazy adenyJanowej. Insulina pobudza także fosfodiesterazę. Możliwe mecha-

312 / ROZDZIAŁ 27

niżmy działania hormonów tarczycy na lipazę polegają na zwiększeniu stężenia cAMP, uwarunkowanym ułatwionym przenikaniem bodźca z miejsca na receptorze, umiejscowionego po zewnętrznej stronie błony komórkowej, do miejsca cykJazy adenylanowej umiejscowionej po wewnętrznej stronie błony, a także na hamowaniu aktywności fosfodiesterazy. Pobudzający wpływ hormonu wzrostu na lipolizę jest powolny. Zależy on od syntezy białek uczestniczących w wytwarzaniu cAMP. Glikokortykosteroidy pobudzają lipoiizę poprzez syntezę de now białka lipazy w sposób niezależny od cAMP, co może być hamowane przez insulinę. Te fakty pomagają wyjaśnić rolę przysadki mózgowej i kory nadnerczy w pobudzaniu mobilizacji tłuszczów. Współczulny układ nerwowy, wskutek uwalniania noradrenaliny w tkance tłuszczowej, odgrywa główną rolę w mobilizacji wolnych kwasów tłuszczowych, działając tonizująco na ten proces nawet przy braku wzmożonej aktywności nerwowej. Wobec tego wzmożoną lipolizę, spowodowaną wieloma czynnikami opisanymi powyżej, można zredukować lub nawet całkowicie zahamować przez odnerwienie tkanki tłuszczowej, przez blokadę zwojów współczulnych heksametonium lub przez zubożenie zapasów noradrenaliny rezerpiną. U RÓŻNYCH BADANYCH GATUNKÓW WYKSZTAŁCIŁY SIĘ ROZMAITE MECHANIZMY SŁUŻĄCE SUBTELNEJ KONTROLI METABOLIZMU TKANKI TŁUSZCZOWEJ Tkanka tłuszczowa człowieka nie wydaje się być ważnym miejscem lipogenezy. Wskazuje na to obserwacja, że nie ma znaczącego wbudowywania znaczników do długołańcuchowych kwasów tłuszczowych ze znakowanej glukozy lub pirogronianu. Ponadto ATP-zależna liaza cytrynianowa, kluczowy enzym lipogenezy, wydaje się być nieobecna w tkance tłuszczowej, a w wątrobie wykazuje bardzo małą aktywność. Inne enzymy, np. dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa i enzym jabłezanowy, których aktywność u szczura ulega adaptacyjnym zmianom zależnym od zwiększającej się intensywności lipogenezy, nie ulegają podobnym zmianom w tkance tłuszczowej człowieka. W związku z tym sugerowano, że u człowieka istnieje

„zespół nadmiaru węglowodanów", spowodowany wyjątkowym ograniczeniem zdolności organizmu do usuwania nadmiaru węglowodanów przez lipogenezę. U ptaków lipogeneza jest ograniczona do wątroby, gdzie jest ona bardzo istotna, ponieważ dostarcza lipidów potrzebnych do tworzenia jaj pobudzonego przez estrogeny. Ludzka tkanka tłuszczowa nie jest wrażliwa na działanie większości hormonów lipolitycznych, poza aminami katecholowymi. Dalszymi ciekawostkami są: brak reakcji lipolitycznej na działanie adrenaliny u królika, świnki morskiej, świni i kurczęcia, bardzo znaczne działanie lipolityczne glukagonu u ptaków, przy braku przeciwlipolitycznego działania insuliny oraz brak syntezy acylogliceroiu i glicerolu z glukozy u gołębia. Biorąc pod uwagę głębokie zaburzenie metabolizmu występujące w cukrzycy (które jest spowodowane głównie zwiększonym uwalnianiem wolnych kwasów tłuszczowych z ich magazynów) oraz fakt, że podanie insuliny w dużej mierze poprawia le zaburzenia, należy wysnuć wniosek, że insulina odgrywa pierwszoplanową rolę w regulacji metabolizmu tkanki tłuszczowej.

BRUNATNA TKANKA TŁUSZCZOWA POBUDZA TERMOGENEZĘ Brunatna tkanka tłuszczowa uczestniczy w metabolizmie szczególnie wówczas, gdy jest konieczne wytwarzanie ciepła. Ten fakt tłumaczy, że ta tkanka jest bardzo aktywna metabolicznie u niektórych gatunków zwierząt w okresie budzenia się ze snu zimowego, u zwierząt narażonych na zimno (termogeneza bezdrżeniowa) oraz przy wytwarzaniu ciepła, u noworodków. Chociaż nie jest to pierwszoplanowa tkanka u ludzi, ostatnio wykazano, że jest aktywna u osób zdrowych, u których wydaje się ona odpowiadać za „termogenezę indukowaną przez

dietę". Ten fakt tłumaczy, dlaczego niektóre osoby mogą Jeść i nie być otyłymi". Godne uwagi jest to, że ilość brunatnej tkanki tłuszczowej jest mniejsza lub w ogóle brak jej u ludzi otyłych. Brunatną tkankę tłuszczową charakteryzuje dobrze rozwinięte ukrwienie, duża zawartość mitochondriów i cytochromów, ale mała aktywność syntazy ATP. Metabolicznie przeważa utlenianie zarówno glukozy, jak i kwasów tłuszczowych.

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 313 WEWNĘTRZNA BŁONA MITOCHONDRIALNA

STRONA ZEWNĘTRZNA

Noradrenallna

9

\

cAMP

I

F

STRONA WEWNĘTRZNA

°

ffN K

f I ------------------------------1 i.

ATP

,

Hl

Ciepło

Laficuch oddechowy Trfaoyfo.

WKT Tarmogsnlna Równoważniki

Acyio-CoA -*-j

redukcyjne

Ciepło JMuKeotydy purynowe

Transporter karnltynowy

^Oksydacja

Ryc. 27-10. Termogeneza w brunatnej tkance tłuszczowej. Aktywność łańcucha oddechowego wytwarza ciepło, prowadząc równocześnie translokację protonów (p. str. 151). Gdy te protony wracają do kompartmentu wewnątrzmitochondrialnego za pośrednictwem termogeniny, następuje rozproszenie ciepła, zamiast wytwarzania ATP, które zachodzi wówczas, gdy protony powracają za pośrednictwem F^syntazy ATP. Jeżeli brunatna tkanka tłuszczowa nie jest pobudzana, to przejście Hł przez termogeninę jest zahamowane przez nukleotydy purynowe. Pod wpływem noradrenaliny ta inhibicja zostaje zniesiona, gdyż są wytwarzane wolne kwasy tłuszczowe (WKT) i acylo-CoA. Zauważ podwójną rolę acylo-CoA, z jednej strony ułatwiają działanie termogeniny, z drugiej zaś dostarczają równoważników redukujących dla łańcucha oddechowego. Zaznaczone są pozytywne (©) i negatywne (0) skutki regulacyjne.

Noradrenalina, uwalniana z zakończeń nerwów współczułnycli, jest ważna do wzmożenia lipolizy w brunatnej tkance tłuszczowej. Utlenianie i fosforylacja nie są skojarzone w brunatnej tkance tłuszczowej, czego wyrazem jest brak wpływu dinitrofenolu na zużycie tlenu i brak kontroli oddechowej wywieranej przez ADP. Fosforylacje, które zachodzą, mają miejsce na poziomie substratu, np. w reakcji katalizowanej przez tiokinazę bursztynianową oraz w glikolizie. W procesie utleniania wytwarza się więc dużo ciepła, a tytko niewiele energii swobodnej jest wiązane w postaci ATP. W katego-

riach teorii chemiosmotycznej dzieje się tak, że gradient stężeń protonów, istniejący normalnie po obydwóch stronach wewnętrznej błony mJtochondrialnej skojarzonych mitochondriów, w brunatnej tkance tłuszczowej ulega ciągłej dyssypacji działaniem ciepłotwórczego białka termogeniny, którego mechanizm działania polega na tworzeniu drogi swobodnego przenikania protonów przez błonę. Wyjaśniałoby to pozorny brak efektu związków rozkojarzajacych (ryc. 27-10). PIŚMIENNICTWO Borensztajn J (edilor): Lipoprotein Lipase. Eveuer Publishers, Chicago, 1987. Brewer HB, et al: Apolipoproteins and lipoproteins in human plasma: An overview. Clin Chem 1988;34:B4. Brown Ms, Goldsten JL: Lipoprotein metabolisra in the macrophage: Implication for cholesterol deposition in atherosclerosis. Amtu Rev Biochem 1983;52:223. Eisenberg S: High densiiy lipoprotein metabolism. J Lipid Res 1984;25:1017. Fielding CJ, Fielding PE: Metabolism of cholesterol and lipoproteins. Page 404 in: Biochemiitry of&ptds and Membmnes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 1985. Himms-Hagen J: Brown adipose tissue metabolism and thermogenesis. Ann Rev Nutr I985;5:69. Liber CS: Biochemical and molecular basis of alcohol-induced injor>- to liver and other tissues. New Eng JMed 1988:319:1639. Sparks JD, Sparks CE: Apolipoprotein B and lipoprotein metabolisra, Ath Lipid Res 19S5;21:t.

2 8

Synteza, transport i wydalanie cholesterolu Pater A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Cholesterol występuje w tkankach oraz w lipoproteinach osocza jako wolny cholesterol albo w połączeniu z kwasami tłuszczowymi o długim łańcuchu węglowym jako estry cholesterolu. Jest on syntetyzowany w wielu tkankach z acetyl o-Co A i ostatecznie wydalany z organizmu z żółcią jako cholesterol lub sole kwasów żółciowych. Cholesterol jest prekursorem wszystkich innych steroidów w organizmie, takich jak: korty kos teroidy, hormony płciowe, kwasy żółciowe i witamina D. Jest typowym produktem metabolizmu zwierzęcego, a więc znajduje się w pokarmach pochodzenia zwierzęcego, takich jak: żółtko jaja, mięso, wątroba i mózg. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Cholesterol jest amfipatycznym lipidem i jako taki jest istotnym strukturalnym składnikiem błon oraz zewnętrznej warstwy Hpoprotein osocza. Ponadto lipoproteiny transportują wolny cholesterol w krążącej krwi, gdzie wymienia się on, na zasadzie równowagi, z cholesterolem innych lipoprotein i błon. Cholesterol zestryfikowany jest postacią zapasową cholesterolu znajdującego się w większości tkanek. Jest on transportowany jako „cargo" w rdzeniu Iipoprotein osocza .fCDD jest pośrednikiem w pr^Ł noszeniu cholesterolu i estrów cholesterol u do wielu Tkanek. Wolnycholesterol jest usuwany z tkanek przez fHDJ^ i transportowany do wątroby, gdzie jest przekształcany w kwasy żółciowe. Cholesterol jest głównym składnikiem kamieni żółciowych. Jednakże najważniej-

sza jego rola w procesach patologicznych polega na uczestniczeniu w powstawaniu miażdżycy {(itherosderosis) życiowo ważnych tętnic, stając się przyczyną chorób naczyń mózgowych, tętnic wieńcowych i naczyń obwodowych. Nasilenie miażdżycy naczyń wieńcowych wykazuje dodatnią korelację ze stosunkiem stężenia cholesterolu LDL do cholesterolu HDL. CHOLESTEROL POCHODZI MNIEJ WIĘCEJ W TEJ SAMEJ ILOŚCI Z POKARMÓW CO I Z BIOSYNTEZY Około połowa cholesterolu organizmu człowieka pochodzi z syntezy (ok. 500 mg/24 h), pozostała zaś ilość jest dostarczana z pokarmem. Około 50% syntetyzowanego cholesterolu pochodzi z wątroby, 15% z jelit, zaś znaczna część pozostałej ilości syntetyzowanego w organizmie cholesterolu pochodzi ze skóry. Praktycznie wszystkie tkanki zawierające komórki jądrzaste są zdolne do syntetyzowania cholesterolu. Za syntezę jest odpowiedzialna zarówno frakcja mikrosomalna (siateczka śródplazmatyczna), jak i frakcja cytozolowa komórki. Źródłem wszystkich atomów węgla cholesterolu jest acetylo-CoA Biosynteza cholesterolu może być podzielona na 5 etapów. 1. Najpierw następuje synteza mewalonianu, 6węglowego związku powstającego z acetylo-CoA (ryc. 28-1). 2. Następnie dochodzi do wytworzenia jednostki izoprenoidowej z mewalonianu przez utratę COZ (ryc. 28-2). 3. 6 jedno-

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 315

CH3 -C-S -CoA 2-Acatylo-CoA | TIOLAZA | CoA-SH CH3 ot

O *

CM

Ć - C H ; - C~ S - C o A 0 Acetoacełylo-CoA

o

ĆH3-°£!-S-CoA Acetylo-CaA SYNTAZA KMG-CoA

CH , O

•

Ol

CoA.S H O

, o *

:- !|

- OOC - CH ; - C- CH j - C - S -C o A I OH 3-Hydrofoy-3-metylaglutaryto-CaA (HMG-CoAJ IREDLKTAZA HMG-CoA

2NADPH+2H1 0

Cholesterol Mewastaryna Lowastafyrra c

•

-OOC-CH 2

^ 2 N AD P+ + C 0 A .S H OCH^

- C-CH.-CH^OH I OH Mewalonlan

Ryc. 28-1. Biosynteza mewalonianu. HMG — reszta 3-hydroksy-3-metyloglutarylowa. Reduktaza HMG-CoAjest hamowana przez cholesterol i metabolity grzybów, mewastatynę (Compactin) i lowastatyne (Mevinolin), które działają kompetycyjnie w stosunku do HMG-CoA.

stek izoprenoidowych kondensuje tworząc produkt pośredni — skwalen. 4, Skwalen cyklizuje i powstaje macierzysty steroid — lanosterol. 5. Z lanosterolu powstaje cholesterol w wyniku kilku dalszych reakcji związanych z utratą 3 grup metylowych (ryc. 28-3).

Etap 1. Z acetylo-CoA powstaje HMG-CoA i mewalonian Szlak prowadzący przez HMG-CoA (3-hydroksy-3-metyloglutarylo-CoA) przebiega według tej samej sekwencji reakcji, jaka została opisana w rozdz. 24 przy syntezie ciał ketonowych w mitochondriach. Ponieważ synteza cholesterolu jest procesem pozamitochondrialnym, te 2 szlaki przebiegają oddzielnie. Na początku 2 cząsteczki acetylo-CoA kondensują tworząc acetoacetylo-CoA. Reakcję te katalizuje enzym cyto-

zolowy — tiola/a. W wątrobie acetoacetylo-CoA może powstawać alternatywnie w taki sposób, że acetooctan wytworzony w szlaku ketogenezy wewnątrz mitochondrium (p. rozdz. 24) dyfunduje do cytozolu. gdzie może być aktywowany do acetoacetylo-CoA działaniem syntazy acetoacetylo-CoA. Reakcja ta wymaga obecności ATP i CoA. W wyniku kondensacji acetoacetylo-CoA z kolejną cząsteczką aceiylo-CoA (reakcje te katalizuje syntaza HMG-CoA) powstaje HMG-CoA. HMG-CoA jest przekształcany w mewalonian w 2-etapowej redukcji z udziałem NADPH i mikrosomalnego enzymu reduktazy HMG-CoA. Reakcja ta jest uważana za etap ograniczający szybkość szlaku biosyntezy cholesterolu (ryc. 28-1).

Etap 2. Z mewalonianu powstają aktywne jednostki izoprertoidowe. Mewa-

lonian jest fosforylowany przez ATP z wytworzeniem kilku aktywnych ufosforylowanych związków pośrednich (ryc. 28-2). Przez dekarboksylację powstaje aktywna jednostka izoprenoidowa — izopentenylopiro fosforan. Etap 3. 6 jednostek izoprenoidowych tworzy skwalen. W tym etapie dochodzi do kondensacji 3 cząsteczek izopentenylopirofosforanu z powstaniem pirofosforanu famezylu. Odbywa się to wskutek izomeryzacji izopentenylopirofosforanu, w czasie której dochodzi do przesunięcia wiązania podwójnego i wytworzenia pirofosforanu dimetyloalilu. Z kolei następuje kondensacja z inną cząsteczką izopentenylopiro fosforanu i wytworzenie 10-węglowego związku pośredniego, pirofosforanu geranylu (ryc, 28-2). W wyniku dalszej kondensacji z izopentenylopirofosforanem powstaje pirofosforan farnezylu. 2 cząsteczki pirofosforanu farnezylu kondensują przy końcu piro fosforanowym. W tej reakcji najpierw odszczepia się 1 pirofosforan i powstaje pirofosforan preskwalenu, po czym następuje redukcja z udziałem NADPH i oderwanie pozostałej reszty piro fosforanowej. Produktem tych reakcji jest skwalen. Może istnieć alternatywny szlak zwany „spięciem trans-metyloglutakonylanowym". W tym szlaku jest eliminowana znaczna część (5% w wątrobie w stanie sytości, a do 33% w wątrobie w stanie głodzenia) pirofosforanu dimetyloalilu, który wraca do HMG-CoA przez (rans-3-metyloglutakonylo-CoA. Ten szlak może mieć znaczący wpływ regulacyjny na sumaryczną szybkość syntezy cholesterolu.

316 / ROZDZIAŁ 28 ADP

ATP

CH 3

-ooc CH ,

\r

OH

CH, ^L_-OOC

KINAZA MEWALONIANOWA

OH

\ifCH C \ CH, / \ 2

5-Fosforan mewalonianu CH 5

CH :

OH

KINAZA FOSFOMEWALONIANOW A

CH3

ADP

ATP

COj+Pj

Spięcie trans-matyloglutakonłanowa ^

' ^_____C /

CH, 'Izopentenylo-IRNA

ADP OH

CH3

A A

CH, CH; O-®-® 3-Fosto-5-plrofosłoran rnawalonlanu ~

CH3 I

- CP J

ATP

Mewalonian

HMG-CoA

O

H5 CH2 5Plrofosforan mewalonlanu

DEKARBOKSYLAZ A PIROFOSFOMEWA-

^/ \ °

°

IZOMEflAZA IZOPENTENYLODtFOSFORANOWA

Pirofostoran

____J L___

OS-PRENYLOTRANSFERAZA

CH3

CH3

CH

Piralosforan Izopentenylu

CH3

CH, CH Pirofosforan geranylu

CIS-PRENYLOTRANSFERAZA Łańcuch boczny___ ubichlnonu ^—

»-

Dollchol

Hem a Skwalen

Ryc. 28-2. Biosynteza skwa len u, ubichinonu idoMcholu, HMG — reszta 3-hydroksy-3-meiylo'gluiarylowa: x— cytokinina. Reszta farnezylowa jest obecna w hemie a oksydazy cyto chrom owej. Węgiel zaznaczony * staje się C,, lub C 12 w skwatenie. Syntetaza skwalenowa jest enzymem mikrosomainym; wszystkie inne enzymy zaznaczone na schemacie są rozpuszczalnymi białkami cytozolowymi. ________________________________________________________________________________________

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 317

CH 3 -°C~S-CoAAcetylc-CoA

CH, O

•

ul

•

T»

O

" OOC -CH!-C -CH3 -CH20H

CHa~C

l OH

ca

Mewalontan

=

ol

*

a ^"1

CH — CH;— Jednoalka

H,0

izoprenoldowa

CH,

* aH

" ^

c

" ' ^ =

H2 C

LANOSTEROLOCYKLAZA O KSY DOSKWALENOW A

HO Cholesterol

Daamosterol (24-ae hyd r oe ho I astero i)

Ryc. 28-3. Biosynteza cholesterolu. Ponumerowane pozycje oznaczają numery atomów węgla pierścienia steroidowego. 'Odnosi się do znakowania skwalenu na ryc. 28-2.

Etap 4. Skwaien jest przekształcany

w tanosterol. Skwaien ma budowę przypominającą pierścień steroidowy (ryc. 28-3). Przed zamknięciem pierścienia skwaien jest przekształcany w 2,3-tlenek. Reakcję tę, zachodzącą w siateczce śród plazma ty cznej, katalizuje oksydaza o mieszanej funkcji zwana epoksydazij

skwalenową, W trakcie cykiizacji, katalizowanej przez lanosterolocyklazę 2,3-oksydoskwatenową, grupa metylowa przy C14 zostaje przeniesiona do C]3, a grupa metylowa z C8 na CM.

Etap 5. Lanosterol jest przekształca-

ny do cholesterolu. W tym ostatnim etapie (ryc, 28-3) przejście lanosterolu w cholesterol

318 / ROZDZIAŁ 28

zachodzi w błonach siateczki śródplazmatycznej i obejmuje zmiany w pierścieniu steroidowym oraz w łańcuchu bocznym. Grupa metylowa przy C,4 zostaje utleniona do CO2 i powstaje 14-demetyloianosteroI. Podobnie 2 grupy metylowe przy C4 zostają usunięte, czego wynikiem jest zymosterol. Z zymosterolu tworzy się przez przesunięcie podwójnego wiązania z pozycji pomiędzy Cg i C9 do pozycji pomiędzy C3 a C7, A7>24-cholestadienol. Na tym etapie powstaje, przez dalsze przesunięcie podwójnego wiązania w pierścieniu B do pozycji między C; a Cfi —jak w cholesterolu — des most er o I W końcu, po redukcji podwójnego wiązania w łańcuchu bocznym, powstaje cholesterol. Reakcja ta może zachodzić na każdym etapie biosyntezy cholesterolu. Dokładna kolejność, w jakiej rzeczywiście zachodzą opisane powyżej etapy, nie jest znana z pewnością. Jest prawdopodobne, że związki pośrednie od skwalenu do cholesterolu są związane ze swoistym białkiem nośnikowym, znanym jako białko przenoszące skwalen i steroJe. To białko wiąże sterole i inne nierozpuszczalne lipidy, umożliwiając im wchodzenie w reakcje w wodnej fazie komórki. Ponadto jest prawdopodobne, że cholesterol, właśnie w formie związanej ze specjalnym białkiem nośnikowym, jest przekształcany w hormony steroidowe i w kwasy żółciowe, a także uczestniczy w tworzeniu błon i lipoprotein. Pirofosforan farnezylu jest związkiem wyjściowym do wytwarzania innych ważnych związków izoprenoidowych Pirofosforan farnezylu jest kluczowym związkiem, od którego rozgałęziają się szlaki syntezy innych poliizoprenoidów, dolicholu i ubichinonu. Alkohol poliizoprenylowy — dolichol (p. str. 184 i str. 756) powstaje przez dalsze dołączanie, maksymalnie 16 reszt, izopentenylopiro fosforanu, natomiast łańcuch boczny ubichinonu (p. str. 149) przez dołączenie dalszych 3—7 takich jednostek. SYNTEZA CHOLESTEROLU JEST REGULOWANA IMA ETAPIE REDUKTAZY HMG-CoA Synteza cholesterolu jest regulowana blisko początku szlaku na etapie reduktazy HMG-CoA. U_. .głodzonych zwierząt stwierdza się znaczne zmniejszenie aktywności reduktazy

JJMG-CoA, co wyjaśnia fakt zmniejszania syntezy cholesterolu w czasie głodzenia. Istnieje mechanizm sprzężenia zwrotnego, dzięki któremu rcduklazŁt IIMG-CoA w wątrobie jest hamowana przez cholesterol — główny produkt szlaku. Ponieważ nie udało się wykazać bezpośredniego hamowania enzymu przez cholesterol, wydaje się możliwe, że cholesterol (albo jego metabolit, np. sterol z wprowadzonym dodatkowo tlenem) działa albo przez represję syntezy nowego białka reduktazy, albo przez indukcję syntezy enzymów rozkładających istniejącą reduktazę. Syntezą cholesterolu jest również hamowana przez cholesterol zawarty w LDL, wychwytywany przez receptory LDL (receptory apo-B-100, E). Istnieją okołodobowe wahania dotyczące zarówno szybkości syntezy cholesterolu, jak i aktywności reduktazy HMG-CoA. Wpływ cholesterolu na aktywność reduktazy może jednak wystąpić szybciej, niż to można by wyjaśnić zmianami szybkości syntezy białka. Podanie insuliny lub hormonu tarczycy z wieksza~a~k~tywność reduktazy HMCŁCoA, podczas gdy glukagon i gluko korty kos teroidy ją zmniejszają. HMG-CoA występuje zarówno w postaci aktywnej, jak i nieaktywnej. Te postacie mogą odwracalnie w siebie przechodzić działaniem mechanizmów fosforylacji — defosforylacji. Niektóre z tych mechanizmów mogą być zależne od cAMP i przez to wrażliwe na glukagon, a możliwe, że i na insulinę (ryc. 28-4). Wpływ zmiennych ilości cholesterolu spożytych w pokarmach na endogenne wytwarzanie cholesterolu badano u szczurów. Przy podaży jedynie 0,05% cholesterolu w diecie, 70-80% cholesterolu zawartego w wątrobie, jelicie cienkim i nadnerczach pochodziło z biosyntezy w organizmie, natomiast gdy stężenie cholesterolu w pożywieniu zwiększono do 2% jego endogenne wytwarzanie było mniejsze Wydaje się, że jest hamowana jedynie wątrobowa synteza cholesterolu. Doświadczenia z perfundowaną wątrobą wykazały, że bogate w cholesterol resztkowe chylomikrony wychwytywane przez wątrobę (p. str. 303) hamują syntezę sterol i. Próby zmniejszenia stężenia cholesterolu w osoczu u ludzi przez zmniejszenie podaży cholesterolu w pokarmach dają zmienne wyniki. Na ogół zmniejszenie ilości cholesterolu w diecie o 100 mg powoduje zmniejszenie jego stężenia w surowicy o ok. 0,13 mmcrt/1.

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 319

KINAZA

AT P KINAZA KINAZY FOSFATAZY BIAŁEK

— Insulina ?

e

ADP H,0 REDUKTAZY (nieaktywna)

REDUKTAZY

KINAZA HEDUKTAZY (aktywna) ADP

ATP,

Glukagon

I

HMG-CoA

♦

REDUKTAZ A HMGCoA (aktywna)

J

Cholesterol

Oksy ster ole

FOSFATAZY BIAŁEK

BEDUKTAZA HMG-CoA (nieaktywna)

Utosforylowany f inhlbltor-1 "* cAMP

e Synteza

Ryc. 28-4. Możliwe mechanizmy regulacji syntezy cholesterolu przez reduktazę HMG-CoA. Insulina odgrywa dominującą rotę w porównaniu z glukagonem.

WIELE CZYNNIKÓW WPŁYWA NA RÓWNOWAGĘ CHOLESTEROLU W TKANKACH Na poziomie tkanki rozważa się następujące procesy jako stanowiące o równowadze cholesterolu komórkowego {ryc. 28-5). Zwiększenie stężenia cholesterolu w komórkach może być spowodowane: 1) pobieraniem przez receptory, np. za pośrednictwem receptora LDL, lipoprotein zawierających cholesterol, 2) pobieraniem przez komórkę lipoprotein zawierających cholesterol bez pośrednictwa receptorów, 3) wychwytywaniem przez błonę komórkową wolnego cholesterolu z lipoprotein bogatych w cholesterol, 4) syntezą cholesterolu oraz 5) hydrolizą estrów cholesterolu przez enzym esteraze cholesterolową.

Zmniejszenie zawartości cholesterolu w komórkach może być spowodowane: 1) wypły-

wem cholesterolu z błon komórkowych do lipoprotein o małym potencjale cholesterolowym, zwłaszcza do HDLj albo do cząstek HDL świeżo syntetyzowanych de novo (proces ten jest pobudzany przez LCAT-acylotransferazę lecytyna: cholesterol), 2) estryfikacją cholesterolu przez ACAT (acylotransferazę acylo-CoA:cholesterol) oraz 3) zużywaniem cholesterolu do syntezy innych steroidów, takich jak hormony lub kwasy żółciowe w wątrobie. Receptor LDL jest intensywnie regulowany Receptory LDL (apo B-100, E) znajdują się na powierzchni komórek we wgłębieniach, które są pokryte od strony cytozolowej błony komórkowej białkiem zwanym klatryną. Receptor jest glikoproteiną przezbłonową, a jej miejsce wiążące apo B-100 jest umiejscowione na N-koricu wystającym na zewnątrz komórki.

320 / ROZDZIAŁ 28 BŁONA KOMÓRKOWA

Ftewptcty U3L (Apo-B-100, E) w opfaszczortym zagłębieniu

LDL

HDL Ryc. 28-5. Czynniki wpływające na równowagę cholesterolu na poziomie komórki. C — cholesterol, CE — estry cholesterolu, ACAT — acylotransferaza acylo-CoA : cholesterol, LCAT — acytotransferaza lecytyna : cholesterol, A-l — apolipoproteina A-l, LDL — lipoproteina o małej gęstości, VLDL — lipoproteina o bardzo małej gęstości.

Receptor reaguje z ligandem LDL, tj. apo-B-100. Cząstka LDL w całości jest wchłaniana przez endocytozę. Jest ona następnie rozkładana w Jizosomach, który to rozkład obejmuje zarówno hydrolizę apoproteiny, jak i estrów cholesterolu. Cholesterol jest następnie przemieszczany do cytozolu komórki. Receptory nie są rozkładane, lecz wracają na powierzchnię komórki. Ten napływ cholesterolu do komórki hamuje aktywność reduktazy HMG-CoA i syntezę cholesterolu oraz pobudza aktywność ACAT. Wydaje się, że liczba receptorów LDL na powierzchni komórki jest regulowana zgodnie z zapotrzebowaniem komórki na cholesterol niezbędny do budowy błon i syntezy hormonów steroidowych. Napływ cholesterolu do komórki zmniejsza więc liczbę receptorów LDL — zjawisko nazywane po angielsku „down reguiation" (ryc. 28-5).

Receptor apo B-100, E jest receptorem LDL o „dużym powinowactwie" i może być wysycony w większości zaistniałych warunków. Poza tym wydają się istnieć receptory LDL o „małym powinowactwie", jak również szlak wnikania cholesterolu do komórki za pomocą mechanizmu niereceptorowego, określany jako „szlak oczyszczający" („scavenger pathway"), który nie jest regulowany.

TRANSPORT CHOLESTEROLU MIĘDZY TKANKAMI ODBYWA SIĘ ZA POŚREDNICTWEM LIPOPROTEIN OSOCZA (p. ryc. 28-6) U ludzi stężenie całkowitego 'Cholesterolu w osoczu wynosi ok. 5,2 mmo[/l; zwiększa się ono z wiekiem, wykazując dużą zmienność

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 321

osobniczą. Większość cholesterolu znajduje się w osoczu w posUici ^estryfikowanej. Cholesterol jest transportowany w i]n i< !i lipoproteina ch osocza, a ^ W warunkach, w których dominująca, lipoproteiną osocza jest VLDL, większa ilość cholesterolu przypada na K Trakcję. Cholesterol spożyty wraz z pokarmami dopiero po kilku dniach miesza sie (osiąga równowagę) z cholesterolem osocza, a po-

trzeba kilku tygodni, aby osiągnął stan równowagi z cholesterolem tkanek. Obrót cholesterolu w wątrobie jest stosunkowo szybki w porównaniu z biologicznym okresem półtrwania cholesterolu w całym organizmie człowieka, który wynosi kilka tygodni. Wolny cholesterol w osoczu i w wątrobie osiąga stan równowagi w ciągu godzin. Estry cholesterolu zawarte w pożywieniu są hydrolizowane do wolnego cholesterolu, który

KRĄŻENIE JELIT OWO-WĄTROBOWE ZYLA WROTNA WĄTROBY

?

Pożywlente (0,5 g/24 h) C

JELITO

t

i

C Kwasy (0,5 g/24 h) żółciowo (0^ g/Z4 h) Kat

Hyc. 28-6. Transport cholesterolu między tkankami u ludzi, C — wolny cholesterol, CE — estry cholesterolu, VLDL — lipoproteiną o bardzo malej gęstości, I DL— lipoproteiną o pośredniej gęstości, LDL — lipoproteiną o malej gęstości, HDL — lipoproteiną o dueej gęstości, ACAT — acylotransferaza acylo-CoA : cholesterol, LCAT ...acy I otrą n sfera za lecytyna : cholesterol, A-l — apotipoproteina A-l, D — apolipoproteina D, LPL — lipaza lipoproteinowa. ______________ Biochemia

322 / ROZDZIAŁ 28

miesza się z wolnym cholesterolem z pożywienia i cholesterolem żółci, zanim wchłonie się z jelita razem z innymi lipidami. Następnie miesza sie z cholesterolem syntetyzowanym w jelitach i zostaje wbudowany do chylornikronów. Z wchłoniętego w jelitach cholesterolu 80—90% zostaje zestryfikowane z dhigołańc uch owymi kwasami tłuszczowymi w błonie śluzowej jelit. Sterole roślinne (sitosterole) słabo wchłaniają się w przewodzie pokarmowym. Gdy chylomikrony reagują z lipazą lipoprofeinową i powstają resztkowe chylomikrohy, wówczas następuje utrata jedynie ok. 5% estrów cholesterolu. Reszta jest wychwytywana przez wątrobę, gdy resztkowe chyloralkrony reagują- iieceptorem -flEŚLJL—i_ hydrolizowana do wolnego cholesterolu, VLDL powstałe w watro biejr^nśpg rtiuą cholesterol rtn osonzn If-rlna'lc7e u 1iiH?i jpst to głównie wolny cholesterol, gdyż aktywność ACAT w wątrobie jest mała. Lstry cholesterolu zawarte w VLDL pochodzą głównie z działania LCAT w osoczu. Większość cholesterolu zawartego w VLDL pozostaje w resztkowych VLD L. które są wychwytywane przez wątrobę albo przetwarzane do LDL. Te ostatnie z kolei wiążą się z receptorami LDL wątroby i tkanek po/awątrobowych. LCAT jest odpowiedzialna za powstawanie większości estrów cholesterolu osocza U ludzi aktywność LCAT osocza jest odpowiedzialna praktycznie za obecność wszystkich estrów cholesterolu w osoczu. (Tak nie jest u innych gatunków, takich jak szczur, w którego wątrobie jest znaczna aktywność ACAT, pozwalająca na znaczny eksport estrów cholesterolu w VLDL syntetyzowanych de novo). Aktywność LCAT jest związana z typem HDL zawierającym apo A-L Gdy cholesterol zawarty w HDL zostaje zestryfikowany, wytwarza się gradient stężenia wciągający wolny cholesterol z tkanek i z innych lipoprotein do cząstek HDL (ryc. 28-6). W wyniku tych procesów gęstość właściwa HDL się zmniejsza, tworząc tzw. HDL,, o której się sadzi „..że dostarcza cFolesterolu do wątroby__(ryc- 28-6). HDL spełnia więc ważną funkcję w odwróconym transporcie cholesterolu, tj. procesie, przez który cholesterol tkanek jest przemieszczany do wątroby.

Białko przenoszące estry cholesterolu ułatwia przenoszenie estrów cholesterolu między lipoproteinami To białko, znajdywane w osoczu ludzi, lecz nie u szczurów, jest także związane HDL i wydaje się być identyczne z apo D. Ułatwia ono przenoszenie estrów cholesterolu z HDL do VLDL, LDL, a w mniejszym stopniu do chylomikronów w wymianie za triacyloghcerol. Znosi ono w ten sposób hamowanie w obrębie HDL aktywności LCAT produktem reakcji katalizowanej przez ten enzym. U ludzi duża ilość estrów cholesterolu, utworzonych działaniem LCAT w HDL, trafia do wątroby poprzez resztkowe VLDL (IDL) albo LDL (p. ryc. 28-6). CHOLESTEROL, PRZEZNACZONY DO WYDALENIA Z ORGANIZMU, MUSI WEJŚĆ DO WĄTROBY I BYĆ WYDALONY Z ŻÓŁCIĄ ALBO JAKO CHOLESTEROL, ALBO JAKO KWASY ŻÓŁCIOWE (ICH SOLE) W ciągu jednego dnia z organizmu wydala się ok. 1 g cholesterolu. Prawie połowa, po przekształceniu w kwasy żółciowe, wydala się z kałem. Pozostała ilość jest wydalana w postaci obojętnych steroidów. Znaczna część cholesterolu wydalana z żółcią ponownie wchłania się w jelitach. Uważa się, że przynajmniej pewna ilość cholesterolu, który jest prekursorem steroli występujących w kale, pochodzi z błony śluzowej jelita. Koprostanol jest głównym sterolem w kale. Jest on wytwarzany z cholesterolu w dolnych odcinkach jelita pod wpływem działania miejscowej flory bakteryjnej. Duża część wydalanych z żółcią soli kwasów żółciowych jest reabsorbowana do krążenia wrotnego, a następnie wychwytywana przez wątrobę i ponownie wydalana z żółcią. Zjawisko to jest znane jako krążenie jelito wo-wątro bo we. Sole_kw_asów żółciowych lub ich pochodne, które nie zostały wchłonięte w jelitach, są wydalane z kałem. Sole kwasów żółciowych ulegają przemianom pod wpływem bakterii jelitowych, tworząc wtórne kwasy żółciowe. Kwasy żółciowe są wytwarzane z cholesterolu Pierwotne kwasy żółciowe są „syntetyzowane w wątrobie z cholesterolu w kilku etapach pośrednich. Kwas cholowy jest kwasem żółcio-

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 323

NADPH + Hł NADP* }7g-HYDROKSYLAŻAJ Cholesterol

e

-

HQ

OH

Witamina C

Kwas gllkocholowy

7cc- Hyd ro Ksyc h o I estero I

, I +

|12iHYDROKSY-| Oj

NADPH + H+ 2 CoA-SH HO

Kwas taurocholowy (pbrwotny kwas iótelowy)

Żółciowe

I

LA7A

j^N^N, COOH

rrj

Oekonrugscja 7odehycfrokaylacja

j-^Y]

Kwas deoksycholowy (wlórny kwas żófolowy) (pierwotny kwas żółciowy) Dekonlugacja -------------------» 7«-de hyd ro ksylacja

Kwas lauroi glikochenodeoksycholowy (pierwotne kwasy ióteiowe}

COO

Kwas lltocholowy (wtOrny kwas Żółciowy)

Rye. 28-7. Biosynteza i degradacja kwasów żółciowych. 'Katalizowane przez enzymy bakteryjne.

wym występującym w żółci w największej ilości. Zarówno kwas cholowy, jak i chenodeoksycholowy powstają ze wspólnego prekursora, który sam pochodzi z cholesterolu (ryc. 28-7). 7a-Hydroksylacja cholesterolu jest pierwszą reakcją w szlaku biosyntezy kwasów żółciowych i to właśnie ta reakcja jest etapem ograniczającym nasilenie całego szlaku. Reakcja ta jest

katalizowana przez 7<x-hydroksylazc, która jest enzymem mikrosomalnym. Wymaga ona udziału tlenu, NADPH i cytochromu P-450. Enzym ten wydaje się być typową monooksygenazą, podobnie jak i enzymy dalszych etapów hydroksylacyjnych. Niedobór witaminy C zaburza tworzenie kwasów żółciowych na etapie 7ot-hydroksyłacji, prowadzi do spichrzania choie-

Cholollo-CoA

324 / ROZDZIAŁ 28

sterolu i miażdżycy naczyń u świnek morskich chorych na gnilec. Szlak biosyntezy kwasów żółciowych rozgałęzia się we wczesnych stadiach i jedna droga prowadzi do kwasu cholowego, charakteryzującego się obecnością dodatkowej grupy a-OH w pozycji 12, druga zaś do kwasu chenodeoksycholowego. Poza tą różnicą, w obydwóch szlakach zachodzą podobne reakcje hydroksylacji i skracania łańcucha bocznego (ryc. 28-7), tak że powstają typowe struktury kwasów żółci owych z grupam i a- OH w pozycj ach 3 i 7 i z całkowicie wysyconym pierścieniem steroid owym. Kwasy żółciowe przechodzą do żółci jako połączenia z glicyną lub z tauryną. Uważa się, że nowo syntetyzowane kwasy żółciowe w komórce wątrobowej występują jako tioestry CoA, tj, jako choloilo-CoA albo chenodeoksycholoilo-CoA (ryc. 28-7). Pochodne CoA powstają przy udziale enzymu aktywującego występującego w mikrosomach wątroby. Inny enzym katalizuje połączenie odpowiednich pochodnych CoA z glicyną lub z tauryną, tworząc kwasy glikocholowy lub glikochenodeoksycholowy oraz taurocholowy lub taurochenodeoksycholowy. Są to tzw. pierwotne kwasy żółciowe. U ludzi stosunek glicyny do tauryny w tych połączeniach wynosi normalnie 3:1. Ponieważ żółć zawiera znaczne ilości jonów sodowych i potasowych, a jej pH jest zasadowe, należy przyjąć, że kwasy żółciowe i ich połączenia występują w postaci soli, diatego niekiedy jest używany termin „sole kwasów żółciowych". Pewna część pierwotnych kwasów żółciowych może podlegać dalszym przemianom w jelicie, dzięki aktywności bakterii jelitowych. Te przemiany mogą obejmować od szczepienie przyłączonej uprzednio glicyny i tauryny oraz grupy 7a-OH. W ten sposób powstają wtórne kwasy żółciowe, kwas deoksycholowy z kwasu cholowego i litocholowy z kwasu chenodeoksycholowego (ryc. 28-7). Prawie wszystkie kwasy żółciowe powracają do wątroby w krążeniu jelito wo- wątrobowym Chociaż produkty trawienia tłuszczu, łącznie z cholesterolem, zostają wchłonięte w początkowych 100 cm jelita cienkiego, pierwotne i wtórne kwasy żółciowe są wchłaniane wyłącznie w jelicie krętym. W krążeniu wrotnym wraca do wątroby ok. 98—99% kwasów żółciowych wydzielonych do światła jelita. Zjawisko to jest

znane jako krążenie jelitowo-wątrobowe. Jedriafcże kwas-łitochołowy, ze względu na jego nierozpuszczałność, nie wchłania się zwrotnie w znaczniejszych ilościach. Niewielka część soli kwasów żółciowych, może tak niewiele jak 500 mg/24 h, unika wchłaniania zwrotnego i jest eliminowana z kałem. Jakkolwiek jest to niewielka ilość, to jednak jest to główna droga eliminacji cholesterolu. Krążenie jelitowo-wątrobowe kwasów żółciowych jest tak wydajne, że każdego dnia stosunkowo mała pula kwasów żółciowych (ok. 3—5 g) może cyklicznie przejść przez jelito 6—10 razy z niewielką tylko ich utratą w kale, wynoszącą nie więcej niż 1—2% ilości, która przeszła przez krążenie jelitowo-wątrobowe. Jednak każdego dnia taka sama ilość kwasów żółciowych, Jaka została utracona z kałem, jest syntetyzowana w wątrobie

z cholesterolu, tak że wielkość puli kwasów żółciowych jest stała, nad czym czuwa układ kontrojny oparty na sprzężeniu zwrotnym. Synteza kwasów żółciowych jest regulowana na etapie 7tx-hydroksylazy Głównym etapem ograniczającym szybkość biosyntezy kwasów żółciowych jest reakcja katalizowana przez 7a-hydroksylaze, a w biosyn-

tezie cholesterolu jest to etap katalizowany przez reduktaze HMG-CoA (ryc. 28-1). Aktywności tych 2 enzymów często ulegają równoległym zmianom, co sprawia, że trudno stwierdzić, czy hamowanie syntezy kwasów żółciowych ma miejsce pierwotnie na etapie działania reduktazy HMG-CoA, czy na etapie reakcji 7ot-hydroksylazy. Obydwa enzymy ulegają takim samym okołodobowym zmianom aktywności, jednak pobudzający wpływ karmienia cholesterolem na aktywność 7a-hydroksylazy wydaje się być raczej reakcją na samą aktywność enzymu niż wynikiem zwiększonej dostępności substratu. Kwasy żółciowe z pewnością wywierają zwrotny wpływ hamujący na aktywność 7a-hydroksylazy, ale mechanizm tego hamowania nie wydaje się być bezpośrednim działaniem alłosterycznym. Pod tym względem powrót kwasów żółciowych do wątroby, przez krążenie jelitowo-wątrobowe, stanowi ważny czynnik kontroli, który, jeśli zostaje przerwany, prowadzi do aktywacji 7a-hydroksylazy. Niedawne badania wykazały, że 7a-hydroksylaza (jak również reduktaza HMG--CoA) może być regulowana przez kowalencyjną fosforylację i defosforylację. W odróżnieniu od reduktazy HMG-CoA, postać ufosforylowana 7cc-hydroksylazy jest bardziej aktywna.

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 32S

Hipercholesterolemię można leczyć przez przerwanie krążenia jelitowo- wątrobowego kwasów żółciowych Znaczne zmniejszenie stężenia cholesterolu osocza można osiągnąć za pomocą żywicy cholestyraminy (Questran) lub chirurgicznie przez wyłączenie jelita krętego. Obydwa sposoby powodują zablokowanie wchłaniania zwrotnego kwasów żółciowych. Wówczas, w wyniku zniesienia hamowania zwrotnego, wywieranego przez kwasy żółciowe, przemiana cholesterolu w kwasy żółciowe znacznie się zwiększa w dążeniu do utrzymania stałej puli kwasów żółciowych. W następstwie tego zwiększa się liczba receptorów LDL w wątrobie, powodując wzmożone wychwytywanie LDL przez hepatocyty i w konsekwencji zmniejszenie stężenia cholesterolu w osoczu. Stężenie cholesterolu w surowicy jest skorelowane z częstością występowania miażdżycy tętnic i z chorobą niedokrwienną serca Spośród lipidów surowicy najczęściej wskazywano na cholesterol jako najbardziej zaangażowany w tę zależność. Jednakże i inne parametry, takie jak stężenie triacylogliceroli w surowicy, wykazują podobne koreiacjevChorzy 2 chorobą tętnic mogą mieć jedną z następujących nieprawidłowości: 1) zwiększone stężenia VLDL przy prawidłowych stężeniach LDL, 2) zwiększone stężenie LDL przy prawidłowych stężeniach VLDL, 3) zwiększenie stężeń obydwu frakcji lipoprotein. Występuje wównież odwrotna zależność między stężeniami HDL (HDL2) a chorobą niedokrwienną serca. Niektórzy badacze uważają, że progn o stycznie najbardziej znaczący jest stosunek cholesterol LDL : HDL. Tę zależność można wyjaśnić, biorąc pod uwagę proponowane role frakcji LDL w transporcie cholesterolu do tkanek, a frakcji HDL, działającej jako czyściciel cholesterolu, w odwrotnym kierunku (w transporcie cholesterolu z tkanek do wątroby). Miażdżyca naczyń charakteryzuje się odkładaniem cholesterolu i estrów cholesterolu z lipoprotein zawierających apo B-100, w tkance łącznej ścian naczyń tętniczych. Chorobom, w których występują długotrwałe zwiększenia stężenia VLDL, 1DL lub LDL we krwi (np. cukrzycy, nerczycy lipidowej, hipotyreozie i innych stanach przebiegających z hiperlipidemią), towarzyszy zwykle przedwczesna lub cięższa miażdżyca.

Jak wykazują badania doświadczalne, podatność na rozwój miażdżycy zależy od gatunku zwierząt. Króliki, świnia, małpa i człowiek są gatunkami, u których miażdżycę można wywołać karmieniem cholesterolem. Szczur, pies i kot są pod tym względem odporne. Tyroidektomia lub podawanie leków pochodnych tiouracylu umożliwia wywołanie miażdżycy u psa i szczura. Małe stężenie cholesterolu we krwi jest charakterystyczne dla nadczynności tarczycy. Zmiany w składzie diety odgrywają ważną rolę w zmniejszaniu stężenia cholesterolu w surowicy Czynniki dziedziczne mają największy wpływ na stężenie cholesterolu we krwi. Z czynników środowiskowych i pokarmowych, które powodują zmniejszenie stężenia cholesterolu we krwi, najkorzystniejszym czynnikiem jest zastąpienie w diecie pewnej ilości nasyconych kwasów tłuszczowych wielontenasyconynii i mononienasyconymi kwasami tłuszczowymi. Naturalnie występujące oleje, które zawierają wielonienasycone kwasy tłuszczowe w dużych ilościach, to olej słonecznikowy, z nasion bawełny, kukurydzy i soi, zaś olej z oliwek zawiera znaczne ilości mononienasyconych kwasów tłuszczowych. W odróżnieniu od wymienionych olejów, masło, tłuszcz wołowy i olej kokosowy zawierają duże ilości nasyconych kwasów tłuszczowych. Sacharoza i fruktoza mają większy wpływ na zwiększenie stężenia lipidów we krwi, zwłaszcza triacylogliceroli, niż inne węglowodany. Przyczyna, dla której wielonienasycone kwasy tłuszczowe powodują zmniejszenie stężenia cholesterolu wciąż nie jest jasna. Wysunięto wiele hipotez w celu wyjaśnienia tego zjawiska, min, przypuszcza się, że pobudzają one wydalanie cholesterolu do jelita i pobudzają utlenianie choiesteroJu do kwasów żółciowych. Jest całkiem możliwe, że estry cholesterolu z wielontenasyconymi kwasami tłuszczowymi są szybciej metabolizowane przez wątrobę i inne tkanki, co mogłoby zwiększać szybkość ich obrotu i wydalania. Inne dane świadczą o tym, że działanie to jest głównie spowodowane przemieszczaniem cholesterolu z osocza do tkanek, ponieważ wielonienasycone i mononienasycone kwasy tłuszczowe zwiększają liczbę receptorów LDL, przez co zwiększają szybkość katabolizmu LDL, natomiast nasycone kwasy tłuszczowe mają odwrotne działanie na liczbę receptorów LDL. Nasycone kwasy tłuszczowe powodują także powstawanie mniejszych cząstek

326 / ROZDZIAŁ 28

VLDL, które zawierają stosunkowo więcej cholesterolu i są zużywane przez tkanki pozawątrobowe z mniejszą szybkością niż większe cząstki. Takie zmiany mogą sprzyjać aterogenezie. Styl życia wpływa na stężenie cholesterolu w surowicy Wśród innych czynników, o których się sądzi, że uczestniczą w powstawaniu choroby niedokrwiennej serca należy wymienić nadciśnienie tętnicze, palenie tytoniu, otyłość, brak ruchu i picie miękkiej wody, a nie twardej. Zwiększenie stężenia wolnych kwasów tłuszczowych osocza, pobudzające wydzielanie VLDL przez wątrobę do krwi, jest kolejnym czynnikiem zwiększającym stężenie triacylogliceroli i cholesterolu w osoczu. Czynnikami prowadzącymi do większych albo zmieniających się stężeń wolnych kwasów tłuszczowych są m.in. stres emocjonalny, nikotyna pochodząca z palenia papierosów, picie kawy i spożywanie kilku dużych posiłków zamiast częstego przyjmowania małych ilości pokarmów. Kobiety w okresie premenopauzalnym wydają się być chronione przed wieloma tymi szkodliwymi czynnikami być może dlatego, że mają one większe stężenie HDL niż mężczyźni i kobiety w okresie pomenopauzalnym. Kiedy dieta zawodzi można stosować leki hipolipemizujące, które zmniejszą stężenie cholesterolu w surowicy O wielu lekach wiadomo, że blokują tworzenie cholesterolu na różnych etapach szlaku jego biosyntezy. Wiele z tych leków ma działanie szkodliwe, ale pochodzące z grzybów inhibitory reduktazy HMG-CoA mewastattn i lowastatin zmniejszają stężenie cholesterolu LDL, powodując niewiele działań niepożądanych. Sitosterol jest czynnikiem zmniejszającym stężenie cholesterolu, działającym przez blokowanie wchłaniania cholesterolu z przewodu pokarmowego. Żywice, takie jak kolestypol i cholestyramina (Questran), zapobiegają wchłanianiu soli kwasów żółciowych, łącząc się z nimi, przez co zwiększają ich utratę z kałem. Hipolipemizujące działanie klofi bratu i gemfibrozylu polega m.in. na pobudzeniu utleniania napływających do wątroby wolnych kwasów tłuszczowych, a nie na ich estryfikacji, przez co zmniejsza się wydzielanie przez wątrobę VLDL zawierających triacyloglicerol i cholesterol. Ppnadto wymienione leki ułatwiają hydrolizę triacylogliceroli VLDL przez lipazę lipoproteinową. Probucol wydaje się

zwiększać katabolizm LDL w sposób niezależny od receptorów. Kwas nikotynowy zmniejsza napływ do krwi i wątroby WKT, dzięki temu, że hamuje lipolizę w tkance tłuszczowej, a tym samym wytwarzanie VLDL w wątrobie. Pierwotne zaburzenia lipoprotein osocza (dyslipoproteinemie) są dziedziczne Pewna liczba osób ma wrodzone wady przemiany lipoprotein, prowadzące do stanu hipolipoproteinemii albo hiperlipoproteinemii. Wiele innych osób z takimi chorobami, jak cukrzyca, niedoczynność tarczycy i miażdżyca, ma nieprawidłowe profile lipoprotein o we osocza, które są bardzo podobne do występujących w pierwotnych wrodzonych wadach przemiany lipoprotein. Praktycznie każde z tych pierwotnych zaburzeń jest spowodowane wadą na którymś z etapów tworzenia, transportu albo rozkładania lipoprotein (p. ryc. 27-4, 28-5 i 28-6). Nie wszystkie te zaburzenia są szkodliwe. A. Hipolipoprotsinemie 1. Abetalipoproteinemia. Jest to readka choroba wrodzona charakteryzująca się bra kiem (J-lipoprotein (LDL) w osoczu. Lipidy we krwi występują w bardzo małych stężeniach — zwłaszcza acyloglicerole, których praktycz nie nie ma, ponieważ nie są syntetyzowane chylomikrony ani VLDL. W tej wadzie dochodzi do spichrzania acyloglicerolu zarówno w ścia nach jelit, jak i w wątrobie. Abetalipoproteine mia jest spowodowana wadą syntezy apolipoproteiny B. 2. Rodzinna hipobetalipoproteinemia. W hipobetalipoproteinemii stężenie LDL wy nosi 10—50% stężenia prawidłowego, ale two rzenie chylomikronów zachodzi. Należy więc sądzić, że apo-B jest istotna dla transportu triacylogliceroli. Większość osób z tą wadą jest klinicznie zdrowa i cieszy się długim życiem. 3. Rodzinny niedobór -/-lipoprotein (choroba wyspy Tangier). U osób homozygotycznych prawie nie ma w osoczu HDL, zaś w tkankach stwierdza się nagromadzenie estrów cholesterolu. Nie ma zaburzenia w tworzeniu chylomikronów, ani wydzielaniu VLDL przez wątrobę. Jednak w obrazie elektro foretycznym nie ma pre-pMipoprotein, ale zamiast tego stwie rdza się szerokie pasmo fi, zawierające endogen ny triacyloglicerol. Dzieje się tak dlatego, że prawidłowe pasmo pre-p zawiera inne apoJipoproteiny normalnie dostarczane przez HDL.

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 327

U chorych występuje skłonność do rozwinięcia się hipertriacylogiicerolemii, spowodowanej brakiem apo-C-II, która normalnie aktywuje lipaze li po pro lei nową. B. Hiperlipoproteinemie

1. Rodzinny niedobór Hpazy lipopro-

tetnowej (typ < ) ■ Ten stan charakteryzuje się bardzo powolnym klirensem chylomikronów z krążenia, prowadzącym do nienormalnie du żych stężeń chylomikronów w osoczu. Może być także zwiększone stężenie VLDL, nato miast zmniejszone LDL i HDL. Ten stan jest indukowany spożywaniem tłuszczów. Można go skorygować przez zmniejszenie w diecie ilości tłuszczów, a zwiększenie ilości złożo nych węglowodanów. Pewna odmiana tej cho roby jest spowodowana niedoborem apo-C-II, potrzebnej jako kofaktor lipazy lipoproteinowej. 2. Rodzinna hipercholesterolemia (typ I I). Chorzy charakteryzują się hiperbetalipoproteinemią (LDL), która jest przyczyną zwiększonego stężenia całkowitego cholestero lu. Może także wystąpić tendencja do zwięk szenia stężenia VLDL (w typie Ilb). U chorych może wystąpić nieco zwiększone stężenie triacyloglkerolu, chociaż osocze — w odróżnieniu od innych typów hiperlipoproteinemii — pozostaje przejrzyste (klarowne). Powszechnym zjawis kiem jest odkładanie się lipidów w tkankach, np. w postaci żółtaków (xanthoma) lub ognisk miażdżycowych (atheroma). Typ II hiperlipo proteinemii może także powstać jako zjawisko wtórne u chorych z niedoczynnością tarczycy. Choroba jest spowodowana zmniejszonym kli rensem LDL z krążenia uwarunkowanym wad liwymi receptorami LDL. Wada ta jest związana ze zwiększeniem częstości występowania miaż dżycy. W leczeniu może być przydatne zmniej szenie podaży cholesterolu i nasyconych kwa sów tłuszczowych. Inną chorobą wywołującą hipercholesterolemię, ale spowodowaną inną przyczyną, jest choroba Wolmana (choroba spichrzania estrów cholesterolu). Jest ona spowo dowana niedoborem hydrolazy estrów chole sterolu w lizosomach takich komórek, jak fibroblasty, które normalnie metabolizują LDL. 3. Rodzinna hiperlipoproteinemia ty pu III (choroba szerokiego pasma p, choroba upośledzonego usuwania re mnantów, rodzinna dysbetaltpoproteinemia) Ten stan charakteryzuje się za równo zwiększeniem stężenia resztkowych chylomikronów, jak i remnantów VLDL; są to

lipoproteiny o gęstości mniejszej niż 1,019, a charakteryzujące się w elektroforogramie jako szerokie pasmo p (p-VLDL). Powodują one hipercholesterolemię i hipertriacyloglicerolemię. Występują żóltaki (xanthoma) i miażdżyca zarówno tętnic obwodowych, jak i tętnic wieńcowych. Zalecane jest leczenie, polegające na redukcji masy dała i stosowaniu diety zawierającej złożone węglowodany, nienasycone kwasy tłuszczowe oraz mało cholesterolu. Choroba jest spowodowana wadliwym metabolizmem remnantów w wątrobie, uwarunkowanym obecnością nieprawidłowych apo £, które zwykle występują w 3 izoformach: E2, E3 i E4. U chorych z typem III hiperlipoproteinemii występuje tylko forma E2t która nie reaguje z receptorem E. 4. Rodzinna hipertriacyloglioerolemia (typ IV). Ten stan charakteryzuje się dużymi stężeniami endogennie wytwarzanych triacylogliceroli (VLDL). U chorych z tą wadą stężenie cholesterolu zwiększa się proporcjonalnie do hipertriacyloglicerolemii. Często występuje nie tolerancja glukozy. Zarówno LDL, jak HDL występują w stężeniach poniżej normy. Ten pro fil lipoproteinowy często jest powiązany z wy stępowaniem choroby niedokrwiennej serca, insulinoniezależnej cukrzycy typu II, otyłości oraz wielu innych stanów, łącznie z alkoholizmem oraz przyjmowaniem gestagenów. Leczenie pier wotnej hiperiipoproteinemii typu IV polega na redukcji masy ciała, zastąpieniu prostych węg lowodanów w diecie węglowodanami złożonymi, spożywaniu pokarmów zawierających nienasy cone tłuszcze i mało cholesterolu, a także na stosowaniu leków hipolipemizujących. 5. Rodzinna hiperlipoproteinemm ty pu V. Profil lipoproteinowy osocza jest złożo ny, gdyż występuje zarówno zwiększone stęże nie chylomikronów, jak i VLDL, co powoduje zarówno hipertriacyloglicerolemię, jak i hiper cholesterolemię. Stężenia LDL i HDL są małe. Żółtaki są częste, ale występowanie miażdżycy nie jest uderzająco częste. Tolerancja glukozy jest zmniejszona i często związana z występowa niem otyłości i cukrzycy. Przyczyna występowa nia tego stanu, który ma charakter rodzinny, nie jest jasna. Leczenie polega na redukcji masy ciała i stosowaniu w diecie niezbyt dużej ilości węglowodanów i tłuszczów. Sugerowano, że dalszą przyczyną hiperlipoproteinemii jest nadmierne wytwarzanie apo B, co może być przyczyną zwiększonego stężenia VLDL i LDL w osoczu.

328 / ROZDZIAŁ 28

6. Rodzinna hiperalfalipoproteinemia. Jest to rzadki stan związany ze zwiększonym stężeniem HDL, okazujący się być dobroczynny dla zdrowia.

C. Rodzinny niedobór acylotransf erazy lecytyna: cholesterol (LCAT). U osób

z tą wadą stężenie estrów cholesterolu i Hzolecytyny jest małe, natomiast cholesterolu i lecytyny zwiększone. Osocze często jest mętne. Nieprawidłowości występują takie w lipoproteinach. Jedna z frakcji HDL zawiera dyskowate struktury ułożone w stosy lub rulony, które są najwidoczniej świeżo powstałymi HDL niezdolnymi do pobrania cholesterolu ze względu na nieobecność LCAT. Występuje także nieprawidłowa subfrakcja LDL, lipoproteina X, skądinąd znajdywana jedynie u chorych z cholestazą. VLDL są także nieprawidłowe, wędrujące w elektroforezie z p-lipoproteinami (|3-VLDL). Chorzy z chorobami miąższu wątrobowego także wykazują zmniejszenie aktywności LCAT i nieprawidłowości w lipidach surowicy i lipoproteinach.

PIŚMIENNICTWO Bjórkhem I, Akerlund JE: Studies on the link between HMG-CoA reductase and cholesterol 7a-hydroxylase in rat liver, /. Lipid Res 1988;29:136. Brown MS, Goldstein JL: Lipoprotein metabolism in the macrophage: lmplications for cholesterol deposition in atherosclerosis. Annu Rev Biochem 1983;52:223. Fears R, Sabinę JR (editors): Cholesterol 7tt.-Hydroxylase (7v.-Manooxygenase). CRC Press, 1986. Fielding CJ, Fielding PE: Mefabolism of cholesterol and lipoproteins. Page 404 in: Biochemistry of Lipids and Membranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummmgs, 1985. Kane JB, Havel RJ: Treatment of hypercholesterolemia. Annu Rev Med 1986;37:427. Mahley RW, Innerarity TL: Lipoprotein receptors and cholesterol homeostasis. Biockim Biophys Acta 1983;737:197. NIH Publication No 88-2925: Report of the Expert Panel on Detection, Evaltmtian and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults. January, 1988. Rudney H, Sexton RC: Regulation of Cholesterol Biosynthesis, Annu Rev Nutr 1986;6:245.

Integ racja metabolizmu i dostarczanie substratów energetycznych do tkanek

2 9

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Węglowodany i Hpidy spełniają wiele funkcji strukturalnych i metabolicznych. Największy wpływ tych związków na metabolizm i zdrowie polega jednak na tym, że są głównymi substratami energetycznymi zawartymi w pokarmach. Regulacja dopływu tego źródła energii i sposób, w jaki jest on zintegrowany z innymi tkankowymi substratami energetycznymi, są w centrum zainteresowania badaczy, ponieważ wkraczają one w wiele innych procesów metabolicznych i mają związek z chorobami metabolicznymi.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE W stanie dodatniej równowagi energetycznej znaczna część energii pobranej z pokarmami jest magazynowana jako glikogen albo jako tłuszcze. Jednak w wielu tkankach, nawet w stanie sytości, kwasy tłuszczowe są utleniane preferencyjnie w stosunku do glukozy, co zaznacza się szczególnie w warunkach niedoboru energetycznego lub przy głodzeniu. Ma to na celu zaoszczędzenie glukozy dla tych tkanek (np. dla mózgu i erytrocytów), które potrzebują glukozy w każdych warunkach. Mechanizmy regulacyjne, często za pośrednictwem hormonów, zapewniają więc dostawę źródła energii dla wszystkich tkanek i w każdym czasie, począwszy od stanu sytości aż do stanu całkowitego głodu. Załamanie się tych mechanizmów zdarza się jako skutek nierównowagi hormonalnej (np. indukowanej niedoborem insuliny w cukrzycy),

jako wynik zaburzeń równowagi metabolicznej spowodowanej intensywną laktacją {np. charakteryzującą się ketozą u bydła), albo jako wynik zwiększonego zapotrzebowania metabolicznego występującego podczas ciąży, a będącego np. przyczyną zatrucia ciążowego u owiec. Wszystkie te stany są patologicznymi postaciami zespołu głodzenia, występującego jako powikłanie wielu zespołów klinicznych przebiegających ze zmniejszonym łaknieniem.

NIE WSZYSTKIE Z GŁÓWNYCH SKŁADNIKÓW POKARMOWYCH ULEGAJĄ WZAJEMNYM PRZEKSZTAŁCENIOM (p. ryc. 29-1) Fakt, że zwierzęta mogą się stać otłuszczone, gdy karmi sieje dietą o przewadze węglowodanów, wskazuje na łatwość przekształcania węglowodanów w tłuszcze. Jednakże, jak to już wspomniano, u ludzi istnieją zapewne ograniczone możliwości przekształcania glukozy w kwasy tłuszczowe. Najbardziej znaczącą reakcją w tym względzie jest przemiana pirogronianu do acetylo-CoA, ponieważ właśnie acetylo-CoA jest materiałem wyjściowym do syntezy długołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Odwrotny proces, tj. przemiana kwasów tłuszczowych w glukozę nie zachodzi, ponieważ reakcja katalizowana przez dehydrogeaazę pirogroniaaową jest zasadniczo nieodwracalna, co

zapobiega bezpośredniemu przekształcaniu acetylo-CoA w pirogronian. Ponadto nie może zachodzić przekształcenie (sumarycznie) acetylo-CoA w szczawiooctan, nawet przez cykl

330 / ROZDZIAŁ 29 Tłuszcze

Węglowodany

(

GHkogen v Glukoza /

Trlacylogiieeroi

Seryna

Tryptolan Treonina \ Glioyna Fenyloalanlna Tyrozyna Leucyna^

Hydroksyprollna

Szczaw! ooclan

\

Asparaglnlan Fanyloalanina

Cylrynlan Cykl kwasu cytrynowego

-»- Fu maran

1

Arginin a

Tyrozyna a-Katoglutaran

( Ornltyna

Izoleucyna \ Proplony(o-CoA

t \ Proplonlan

I—

Sukcyny(o-CoA

Glutami Glutamlnlan

t Wallna

Węgle m1 -to3 kwasów tłuszczowych o nieparzystej kolbie atomów wf flta

Prollna Htstydyna

Metlonlna

1

\

Hydroksyprollna

Ryc. 29-1. I nterkon wersja głównych składników pokarmowych.

cytrynianowy, gdyż 1 cząsteczka szczawiooctanu jest niezbędna do każdej reakcji kondensacji z acetylo-CoA, podczas gdy w cyklu regeneruje się tylko 1 cząsteczka szczawiooctanu. Z podobnych powodów nie może zachodzić netto przekształcenie kwasów tłuszczowych o pa-

rzystej liczbie atomów węgla (które wytwarzają acetylo-CoA) w glukozę lub glikogen. jedynie końcowy trójwęglowy fragment kwasu tłuszczowego o nieparzystej liczbie atomów węgla jest glukogenny. Jest nim propionylo-CoA, powstający jako końcowy produkt p-oksydacji

INTEGRACJA METABOLIZMU I DOSTARCZANIE SUBSTRATÓW ENERGETYCZNYCH / 331

tych kwasów. Jest jednak możliwe występowanie znakowanych atomów węgla kwasu tłuszczowego w glikogenie po przejściu przez cykl cytrynianowy. Dzieje się tak dlatego, że szczawiooctan jest związkiem pośrednim zarówno cyklu kwasu cytrynowego, jak i szlaku ghikoneogenezy. Glicerol, będący częścią triacyloglicerolu, może brać udział w tworzeniu glukozy po aktywacji do glicerolo-3-fosforanu. Wiele spośród szkieletów węglowych aminokwasów endogennych może powstać z węglowodanów przez cykl kwasu cytrynowego i transaminację. Przez odwrócenie tych procesów z aminokwasów glikogennych powstają szkielety węglowe, które są albo metabolitami cyklu cytrynianowego, albo ich prekursorami. Są one zatem łatwo przekształcane drogą glukoneogenezy w glukozę i w glikogen. Aminokwasy ketogenne są przemieniane do acetooctanu, który jak i inne ciała ketonowe jest metabolizowany w tkankach pozawątrob owych, tworząc acetylo-CoA. Z tych samych powodów, dla których kwasy tłuszczowe nie mogą być przetwarzane w węglowodany, nie może również zachodzić przemiana kwasów tłuszczowych do aminokwasów glikogennych. Nie jest również możliwe odwrócenie szlaku rozkładu aminokwasów ketogenhych i innych należących do niezbędnych składników pożywienia, tzw. aminokwasów egzogennych. Przemiana szkieletów węglowych aminokwasów glikogennych do kwasów tłuszczowych jest możliwa albo przez utworzenie pirogronianu i acetylo-CoA, albo przez odwrócenie pozamitochondrialnych reakcji cyklu cytrynianowego od a-ketoglutaranu do cytrynianu, a następnie zadziałanie ATP-zależnej liazy cytrynianowej i wytworzenie acetylo-CoA (p. rozdz. 23), Jednak w większości warunków naturalnych, np. w okresie głodzenia, rozpadowi białek i aminokwasów towarzyszy rozpad tłuszczów. Sumarycznie więc przekształcanie aminokwasów w tłuszcze nie jest procesem ilościowo znaczącym, może z wyjątkiem przypadków, w których zwierzęta są karmione dietą bogatą w białko.

EKONOMIA PRZEMIANY WĘGLOWODANÓW ł LIPIDÓW OBEJMUJE CAŁY ORGANIZM Glukoza jest metaboliczną koniecznością w każdym stanie odżywienia

Opisano uprzednio wiele szczegółów współzależności między przemianą węglowodanów i tłuszczów w różnych tkankach, zwłaszcza łatwe przetwarzanie wielu substancji glukogennych w glukozę i w glikogen przez glukoneogcneze. Glukoneogeneza jest bardzo ważna, ponieważ niektóre tkanki i typy komórek, łącznie z ośrodkowym układem nerwowym i erytrocytami, są znacznie bardziej zależne od ciągłego dostarczania glukozy niż inne. Pewien minimalny dopływ glukozy do tkanek pozawątrobowych jest prawdopodobnie niezbędny do utrzymania odpowiednich stężeń szczawiooctanu, aby zachować integralność cyklu cytrynianowego. Ponadto glukoza wydaje się być głównym źródłem glicerolo-3-fosforanu w tych tlcankach, które są pozbawione aktywności kinazy glicerolowej. Istnieje zatem pewne minimalne i obligatoryjne utlenianie glukozy w każdych warun-

kach. Duże ilości glukozy są także niezbędne do odżywiania płodu i do syntezy laktozy mleka. Pewne dodatkowe mechanizmy, poza glukoneogeneza, zapewniają dostarczanie glukozy w okresach jej niedoboru. Dzieje się to przez oszczędzanie utleniania glukozy kosztem innych substratów. Preferencyjne zużywanie ciał ketonowych i wolnych kwasów tłuszczowych oszczędza glukozę celu spełnienia przez nią jej istotnych funkcji

w

Ciała ketonowe i wolne kwasy tłuszczowe powodują oszczędniejsze utlenianie gJukozy w mięśniach, upośledzając: jej wnikanie do komórek, fosforylację do glukozo-6-fosforanu, reakcję katalizowaną przez fosfofruktokinazę i reakcję oksydacyjnej dekarboksylacji pirogronianu. Utlenianie wolnych kwasów tłuszczowych i ciał ketonowych powoduje zwiększenie wewnątrzkomórkowego stężenia cytrynianu, który z kolei jest allosterycznym inhibitorem fosfofruktokinazy. Te i inne obserwacje, które wykazały, że w perfundowanym sercu acetooctan jest utleniany preferencyjnie w stosunku do wolnych kwasów tłuszczowych, uzasadniają wniosek, że w warunkach niedobo-

332 / ROZDZIAŁ 29

Acyio-CoA

GHcerolo-3-fosforan

//TKANKĄ/ TŁUSZCZOWA

/POZAWATRCIBOWE'//' np. MIĘSIEŃ SESCOWY''

VLDL Glukoza

związki ketonowe

2CO3

WKT

Acylo-CoA

łłttłłi

r

■—«^i

__

Gllcerolon3-foeforan

>

Giukozo-6-fciHtoran Glikogen Aminokwasy, mleczan

Ryc. 29-2. Metaboliczne zalftżności między tkanką tłuszczową, wątrobą i tkankami poza wątrobowym i. Zakropkowane przestrzenie przedstawiają obszary działania lipazy lipoproteinowej ściany naczyń włosowatych, WKT — wolne kwasy tłuszczowe, VLDL — Iipoproteiny o bardzo malej gęstości.

INTEGRACJA METABOLIZMU I DOSTARCZANIE SUBSTRATÓW ENERGETYCZNYCH / 333

ru węglowodanów dostępne substraty energetyczne są utleniane w następującej kolejności preferencyjnej: 1) ciała ketonowe (i prawdopodobnie inne krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, np. octan), 2) wolne kwasy tłuszczowe oraz 3) glukoza. Nie oznacza to, że utlenianie określonego substratu energetycznego całkowicie wyklucza utlenianie jakiegokolwiek innego (ryc. 29-2). Te mechanizmy funkcjonują w sposób bardziej zaznaczony w tych tkankach, które mają znaczną wydolność tlenowej przemiany kwasów tłuszczowych, np. w sercu i we włóknach mięśniowych typu powolnego (czerwonego) niż w tkankach z małą wydolnością, np. we włóknach mięśniowych typu szybkiego (białego). Połączenie efektu woinych kwasów tłuszczowych (polegającego na oszczędzaniu zużywania glukozy przez serce i mięsień) oraz efektu zaoszczędzonej glukozy (hamowania mobilizacji wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej) nazwano cyklem glukoza-kwasy tłuszczowe.

1

W CZASIE GŁODZENIA NASTĘPUJE CIĄGŁE DOSTARCZANIE SUBSTRATÓW ENERGETYCZNYCH DLA TKANEK U zwierząt karmionych dietą bogatą w węglowodany jest oszczędzane utlenianie kwasów tłuszczowych. Dzieje się tak dlatego, ponieważ jest hamowana lipoliza w tkance tłuszczowej pod wpływem dużych stężeń glukozy i insuliny. Skutkiem tych procesów jest małe stężenie wolnych kwasów tłuszczowych (ryc. 29-3). Gdy zwierzę przechodzi ze stanu sytości do stanu głodzenia, wówczas dostępność glukozy z pokarmu się zmniejsza, przez co zostaje uruchomiony glikogen wątroby w celu utrzymania odpowiedniego stężenia glukozy we krwi. Stężenie insuliny we krwi się zmniejsza, natomiast stężenie giukagonu się zwiększa. Ponieważ zużycie glukozy w tkance tłuszczowej zmniejsza się, a działanie insuliny hamujące lipolizę staje się mniejsze, następuje mobilizacja tłuszczów w postaci womych kwasów tłuszczowych i glicerolu. Wolne kwasy tłuszczowe są transportowane do tkanek, gdzie są utleniane ajbo estryfiko-

G utógon osacza

"xV/ /\

____

c—--

\\

yf

ć-i --------

i

N

\

•£

•/ /J

V ? ^-/

Glukoza Krwi

12-24 Godzfny gtodzertta

Ryc. 29-3. Względne zmiany parametrów metabolicznych po rozpoczęciu głodzenia.

334 / ROZDZIAŁ 29

wane. Glicerol, po aktywacji do glicerolo-3-fosforanu, włącza się głównie w wątrobie i w nerkach w pulę węglowodanową. Podczas tej fazy przejściowej od stanu sytości do stanu całkowitego głodzenia, endogenne wytwarzanie glukozy nie nadąża za jej zużywaniem i utlenianiem, ponieważ zapasy glikogenu wątroby zostają wyczerpane. Odzwierciedleniem tych procesów jest zmniejszenie stężenia glukozy we krwi oraz mobilizacja tłuszczów, zachodząca z coraz to większą szybkością. Jednak już po kilku godzinach stężenia wolnych kwasów tłuszczowych i glukozy stabilizują się na poziomie charakterystycznym dla stanu na czczo (odpowiednio 0,7— 0,8 inmol/1 oraz 3,3—3,9 mmol/1). Należy założyć, że w tym stadium w całym organizmie zwierzęcia nastąpiło zrównoważenie między dostawą glukozy, a zapotrzebowaniem tkanek na jej zużytkowanie i utlenianie. Stan taki osiąga się przez zwiększone utlenianie wolnych kwasów tłuszczowych i ciał ketonowych oraz ograniczenie utleniania glukozy do możliwego minimum. Ta subtelna równowaga zostaje zaburzona w stanach, w których zapotrzebowanie na glukozę jest zwiększone, lub gdy użytkowanie glukozy przez tkanki jest upośledzone. W takich przypadkach dochodzi do dalszej mobilizacji tłuszczów. Dostarczanie węglowodanów przez tkankę tłuszczową w postaci glicerolu jest ważną funkcją, ponieważ jest to jedyne źródło węglowodanów, oprócz glukoneogenezy z białek, w głodującym organizmie dla tych procesów, które muszą zużytkowywać glukozę. U człowieka w długotrwałym głodzie zmniejsza się glukoneogeneza z białek wskutek zmniejszonego uwalniania aminokwasów, zwłaszcza alaniny z mięśni. Towarzyszy temu adaptacja mózgu do zastąpienia około polowy utlenianej glukozy utlenianiem ciał ketonowych. Ketoza jest metaboliczną adaptacją do głodzenia Pierwotną funkcją ketogenezy jest usuwanie z wątroby nadmiaru węgli kwasów tłuszczowych w postaci związków, które są łatwo utleniane przez tkanki pozawątrobowe zamiast glukozy. Ketoza jest rezultatem zmniejszonej dostępności węglowodanów. Zwiększenie ketogenezy powoduje (p. ryc. 24-9 i 24-10); 1. Nierównowaga między estryfikacją a lipolizą w tkance tłuszczowej, czego następstwem jest uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych do krążenia. Wolne kwasy tłuszczowe są głównym substratem do wytwarzania ciał ketonowych

w wątrobie. Oznacza to, że wszystkie czynniki metaboliczne i wewnątrzwydzielnicze, wpływające na uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej, wpływają również na ketogenezę. 2. Podczas wnikania wolnych kwasów tłuszczowych do wątroby równowaga między ich estryfikacją a utlenianiem zależy od palmitoilotransferazy karnitynowej I, której aktywność jest pośrednio zwiększana przez zwiększenie stężenia wolnych kwasów tłuszczowych i zwiększenie stosunku [glukagon]: [insulina]. 3. Przy zwiększonym utlenianiu kwasów tłuszczowych większa ich ilość przetwarza się w ciała ketonowe, a mniej tworzy się CO2. Proces ten jest regulowany w taki sposób, że całkowite wytwarzanie ATP w wątrobie pozostaje stałe. Uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej w stanie głodu może być kontrolowane przez sprzężenie zwrotne, polegające na tym, że ciała ketonowe i woine kwasy tłuszczowe bezpośrednio pobudzają trzustkę do wytwarzania insuliny. W większości przypadków uwalnia się nadmiar wolnych kwasów tłuszczowych w stesunku do zapotrzebowania na ich utlenianie, przez co znaczna ich część jest estryfikowana nawet w czasie głodzenia. Ponieważ wątroba wychwytuje i estryfikuje znaczną część kwasów tłuszczowych uwalniających się z tkanki tłuszczowej, można powiedzieć, że ten narząd odgrywa istotną rolę regulacyjną w usuwaniu nadmiaru wolnych kwasów tłuszczowych z krążenia. Gdy podaż węglowodanów jest wystarczająca, wówczas większość napływających kwasów tłuszczowych jest estryfikowana w wątrobie i następnie eksportowana z wątroby jako VLDL, które są zużytkowywane przez inne tkanki. W przypadku nadmiernego napływu wolnych kwasów tłuszczowych wątroba dysponuje alternatywną drogą ich przemiany, tj. ketogenezą, która pozwala wątrobie kontynuować eksport większości napływających kwasów tłuszczowych w postaci łatwej do zużytkowania przez tkanki pozawątrobowe i to w każdym stanie odżywienia. Większość powyższych procesów przedstawiono na ryc. 29-2. Należy zwrócić uwagę, że istnieje cykl węglowodanowy, obejmujący uwalnianie glicerolu z tkanki tłuszczowej i jego przetworzenie w wątrobie do glukozy. Powstała w ten sposób glukoza wraca ponownie do tkanki tłuszczowej, zamykając cykl. Inny cykl, cykl Hpidowy, obejmuje uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych przez tkankę tłuszczową,

INTEGRACJA METABOLIZMU 1 DOSTARCZANIE SUBSTRATOW ENERGETYCZNYCH / 335

ich przetransportowanie do wątroby i estryfikację w tym narządzie oraz powrotny transport powstałych estrów do tkanki tłuszczowej w postaci VLDL. Patologiczna ketoza jest spowodowana zwielokrotnionym działaniem czynników powodujących ketozę głodową Ketoza występująca w głodzie i przy karmieniu tłuszczami jest stosunkowo łagodna, w porównaniu ze stanem spotykanym w niewyrównanej cukrzycy, zatruciu etażowym u owiec albo w ketuzie u bydła w okresie laktacji. Główną przyczyną tych stanów jest jeszcze znaczniejsza niedostępność węglowodanów dla tkanek niż w łagodnych stanach ketozy. W łagodniejszych postaciach cukrzycy, przy karmieniu tłuszczami i w przewlekłym głodzeniu, glikogen występuje w wątrobie w zmiennych ilościach, natomiast stężenie wolnych kwasów tłuszczowych jest mniejsze, co prawdopodobnie jest przyczyny mniej ciężkiej ketozy występującej w tych stanach. W cukrzycy typu I brak (albo względny brak) insuliny prawdopodobnie wpływa na tkankę tłuszczową bardziej niż na jakąkolwiek inną tkankę, z powodu niezwykłej wrażliwości tej tkanki na ten hormon. Skutkiem tego jest uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych w ilościach powodujących zwiększenie ich stężenia w osoczu krwi do wartości przekraczających 2-krotnie prawidłowe stężenie na czczo u osób zdrowych. Występuje również wiele zmian aktywności enzymów w wątrobie, nasilających glukoneogenezę i eksport glukozy do krwi pomimo występowania znacznej hiperglikemh. W ketozie przeżuwaczy zachodzi intensywne pobieranie glukozy z krwi przez płody bliźniacze lub proces intensywnej laktacji (ryc. 29-2).W rezultacie rozwija się krańcowa hipoglikemia, połączona z niezwykle małą ilością glikogenu

w wątrobie. Ketoza powstająca w tych warunkach bywa bardzo ciężka. W miarę rozwoju hipoglikemii zmniejsza się wydzielanie insuliny, przez co zmniejsza się nie tylko zużywanie glukozy, lecz równocześnie wzmaga się lipoliza w tkance tłuszczowej. Kobiety w ciąży często mają łagodną ketozę. W nie leczonej cukrzycy typu I zgon jest spowodowany powikłaniami kwasicy uwarunkowanej długotrwałą utratą zasad, niezbędnych do zobojętnienia kwaśnych związków ketonowych wydalanych z moczem (p. rozdz. 62. Przypadek 8: Cukrzyca przebiegająca z kwasicą ketonową). W zatruciu dążowym owiec zgon następuje szybko z powodu ciężkiej hipoglikemii.

PIŚMIENNICTWO Caprio S et al: Oxidative fuel metabolism during mild nypoglycemia: critical role free fatty acids. Am J Physiol 1989:256:E413. Cohen P: Comroi of Enzyme Activitv, 2nd ed. Chapman & Hali, 1983. Hue L, Van de Werve G (editors): Short-Term Regulation of Liver Metabolism. Elsevier/North Holland, 1981. Knopp RH et al: Lipoprotein metabolism in pregnancy, fat transport to the ferus and the effects of diabetes. Biol Neonate 1986;5O:297. Maycs PA, Laker ME: Regulation of ketogenesis in the liver. Biochem Soc Trans 1981;9:339. McGarry JD, Foster DW. Regulation of hepatic fatty acid oxidation and ketone body produetion. Annu Rev Biochem 1980;49:395. Siess EA, KientschEngel Rl, Wieland OH: Concentration of free oxaloacetate in the mitochondrial compartment of isolated liver cells. Biochem J 1984;218:171. Zorzano A et al: Effects of starvation and exercise on concentrations of citrate, hexose phosphates and glycogen in skeletal muscle and heart; Evidence for selectivc operation of the ghicose-fatty acid cycle. Biochem J 1985;232:585.

CZĘSC Metabolizm białek aminokwasów

Biosynteza aminokwasów, które nie muszą być

3 0 dostarczane w pożywieniu Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE

mie, jako o „nie podstawowych" i „nie niezbędnych" (tab. 30-1). Chociaż w sensie żywienia Często mówi się o aminokwasach, które terminy te są poprawne, zaciemniają one podmuszą być dostarczone w pożywieniu, jako stwową, biologiczną naturę wszystkich 20 amio „podstawowych" i „niezbędnych", i o amino- nokwasów. Można udowodnić, że aminokwakwasach niekoniecznie występujących w pokarsy, których nie trzeba dostarczać w pożywieniu są ważniejsze dla komórki od tych, które muszą być dostarczone w pożywieniu, skoro organizTabela 30-1. Zapotrzebowanie na aminokwasy my (np. człowiek) zatraciły zdolność syntezy u człowieka ostatniej, ale nie pierwszej grupy. Aminokwasy, które Aminokwasy, które Ponieważ książka ta kładzie nacisk na procemuszą być dostarczo- nie muszą być dostarsy metaboliczne tkanek ludzkich, będzie tu ne w pożywieniu czona w pożywieniu omówiona tylko biosynteza aminokwasów, które nie muszą być dostarczone w pożywieniu, Arginina* Alanina a nie będziemy omawiać tych, które są biosynHistydyna* Asparagina tetyzowane przez rośliny i mikroorganizmy, Izoieucyna Asparaginian i muszą być dostarczone w pożywieniu. Leucyna Cysteina Lizy na Metionina Fenyloalanina Treonina Tryptofan Walina

Glutaminian Glutamina Glicyna Hydroksyprolina" Hydroksylizyna** Prolina Seryna Tyrozyna

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Znaczenie medyczne materiału zawartego w tym rozdziale wiąże się ze stanami niedoboru aminokwasów, które mogą wynikać z faktu, że konieczne w pożywieniu aminokwasy nie wy'Częściowo niezbędny w pożywieniu. Syntety - stępują w pożywieniu lub występują w niedozowany z niedostateczną szybkością, aby podtrzy statecznych ilościach. Ponieważ pewne zboża są mać rozwój dzieci. "Niekonieczny do syntezy białka, ale tworzący stosunkowo ubogimi źródłami tryptofanu i lizyny, może wystąpić stan dramatycznego niedosię podczas zmian potranslacyjnych kolagenu. 22 - Biochemia

338 / ROZDZIAŁ 30

boru tych aminokwasów w regionach, w których pożywienie opiera się na tych zbożach i nie jest uzupełniane przez takie źródła białka, jak mleko, ryby i mięso. Kwashiorkor i wyniszczenie (ang. marasmus) są endemiczne w pewnych regionach Afryki Zachodniej. Kwashiorkor pojawia się wówczas, gdy dziecko po odjęciu od piersi matki przechodzi na dietę skrobiową ubogą w białko. W wyniszczeniu istnieje niedobór zarówno energetycznego pożywienia, jak i swoistych aminokwasów. PODCZAS EWOLUCJI ZWIERZĘTA WYŻSZE TRACĄ ZDOLNOŚĆ DO BIOSYNTEZY AMINOKWASÓW, KTÓRYCH TWORZENIE WYMAGA DŁUGIEGO CIĄGU REAKCJI Istnienie zapotrzebowania na pożywienie sugeruje, że zależność od dostarczania z zewnątrz potrzebnego związku pośredniego może mieć większą wartość do utrzymania się przy życiu niż zdolność do jego biosyntezy. Jeżeli swoisty intermediat występuje w pożywieniu, to organizm, który może go syntetyzować, rozmnażając się przekazuje przyszłym pokoleniom informację genetyczną o ujemnej wartości tej zdolności dla przeżycia. Zdolność ta dla preeży-

Tabela 30-2. Enzymy biorące uctzial w syntezie aminokwasów z amfibolicznych związków pośrednich Liczba enzymów potrzebna do syntezy Aminokwasy, które nie Aminokwasy, które muszą być dostarczone muszą być dostarczone w pożywieniu

Arg1 His Thr Met

w pożywieniu

7 6 6

5 (4 wspólne)

Lys 8 Ile 8 (6 wspólnych) Val 1 (7 wspólnych) Leu 3 (7 wspólnych) Phe 10 Trp 5 (8 wspólnych) 59

Ala Asp Asn=

1

Glu

1

Gin' Hyl3 Hyp4 Pro1 Ser Gly= Cys6 Tyr'_

1

a

2

3

4

!

WIĘKSZOŚĆ AMINOKWASÓW, KTÓRE NIE MUSZĄ BYĆ DOSTARCZANE W POŻYWIENIU, TWORZY SIĘ Z AMFIBOLICZNYCH ZWIĄZKÓW POŚREDNICH W KRÓTKICH SZLAKACH ANABOL1CZNYCH Z 12 aminokwasów, które nie muszą być dostarczone w pokarmie (tab. 30-1), 9 tworzy się z amfibolicznych związków pośrednich. Pozostałe 3 (Cys, Tyr, Hyl) tworzą się z aminokwasów, które muszą być w pożywieniu. Dehydrogenaza glutaminianowa., syntetaza glutaminowa i transaminazy zajmują centralną pozycję w biosyntezie aminokwasów. Wynikiem ich wspólnego działania jest katalizowanie przekształcenia nieorganicznego jonu amonowego w organiczny azot a-aminowy różnych aminokwasów. Glutaminian. Redukcyjna aminacja a-ketoglutaranu jest katalizowana przez dehydrogenazę glutaminianową (ryc. NAD(P]30-1). W dodatku do NAD(P)H + H

1 1

1

1 3 3 1

2 1

17 1

cia jest ujemna, a nie zerowa, ponieważ organizm zużywa ATP i środki pokarmowe na syntezę niepotrzebnego DNA. Liczba enzymów wymagana przez komórki prokariotyczne do biosyntezy aminokwasów niezbędnych w pożywieniu jest ogromna w porównaniu z liczbą enzymów potrzebną do syntezy aminokwasów, które nie muszą być dostarczone w pożywieniu (tab. 30-2). To sugeruje, że pożyteczne dla przeżycia organizmu jest utrzymanie zdolności wytwarzania „łatwych" aminokwasów, natomiast strata zdolności do syntezy „aminokwasów trudnych".

6

z Glu. z Asp, z Lys. z Pro. z Ser. z Ser. plus S. 7 z Phe.

NH, '■

Ryc. 30-1. Reakcja dehydrogenazy glutaminiano-wej. Redukcyjna aminacja aketoglutaranu przez NHl zachodzi kosztem NAD(P)H.

BIOSYNTEZA AMINOKWASÓW / 339

NH+ O NH. Mg-ATP

Mg-ADP+P;

Ryc. 30-2. Reakcja syntetazy glutaminowej.

tworzenia L-glutaminianu z amfi bo licznego związku pośredniego a-ketoglutaranu, reakcja ta stanowi kluczowy, pierwszy etap w biosyntezie wielu dodatkowych aminokwasów. Glutamina. Biosynteza glutaminy z glutaminianu jest katalizowana przez syntetazę glutaminową (ryc. 30-2). Reakcja wykazuje zarówno podobieństwa, jak i różnice w porównaniu z reakcją katalizowaną przez dehydrogenazę glutaminianową. Obie reakcje wbudowują azot nieorganiczny -—jedna w grupę aminową, druga w wiązanie amidowe. Obie reakcje są połączone z reakcjami wysoce egzoergicznymi: w przypadku dehydrogenazy glutaminianowej z utlenieniem NAD(P)H, a w przypadku syntetazy glutaminowej — hydrolizą ATP.

Alanina i asparaginian. L-alanina po-

wstaje w wyniku transaminacji pirogronianu, natomiat w wyniku transaminacji szczawiooctanu tworzy się L-asparaginian (ryc. 30-3). Przeniesienie grupy a-aminowej glutami niań u na te amfiboliczne związki pośrednie ilustruje zdolność transaminaz do kierowania jonu amonowego, przez glutaminian, w oc-aminowy azot aminokwasów.

Plrogronlan Q GlulubAsp

ot-Ketoglutaran lubazczawiooctan

Ryc. 30-3. Tworzenie alaniny przez transami nację pirogronianu. Donorem grupy aminowej może być glutaminian lub asparaginian. Innym produktem jest a-ketoglutaran lub szczaw i oo etan.

Asparagina. Synteza asparaginy z asparaginianu, katalizowana przez syntetazę asparaginowa (ryc. 30-4), przypomina syntezę glutaminy (ryc. 30-2). Tym niemniej enzym ssaków wykorzystuje jako źródło azotu raczej glutaminę niż jon amonowy; syntetaza asparaginowa u ssaków nie przyłącza nieorganicznego azotu, natomiast bakteryjna syntetaza asparaginowa wykorzystuje jon amonowy i wskutek tego przyłącza azot. Tak jak w przypadku innych, reakcji, w których tworzy się PPj: hydroliza PP; do P| przez pirofosfatazę zapewnia, że reakcja jest silnie uprzywilejowana energetycznie. Mg-ATP

NH,+

NH,+ Mg-AMP + PP, H,N O

L-Asparaglnlan

L-Asparagina

R —NH3+-

Ryc. 30-4. Reakcja syntetazy asparaginowej. Należy zwrócić uwagę na podobieństwa i różnice w porównaniu z reakcją syntetazy glutaminowej (ryc. 30-2).

Seryna. Seryna tworzy się ze związku pośredniego glikolizy — D-fosfoglicerynianu (ryc. 30-5). Grupa ot-hydroksylowa jest utleniana przez NAD+ do grupy ketonowej, a następnie podlega transaminacji, tworząc fosfoserynę. Ta jest wówczas defosforylowana, dając serynę. Głicyna. Synteza glicyny w tkankach ssaków jest prowadzona kilkoma drogami. Cytozol wątroby zawiera Lransaminazy glicynowe, które katalizują syntezę glicyny z glioksalanu i glutaminianu lub alaniny. W przeciwieństwie do większości reakcji transaminacji, ta silnie uprzywilejowuje syntezę glicyny. Dwoma dodatkowymi ważnymi szlakami tworzenia glicyny u ssaków jest jej synteza z choliny (ryc. 30-6) i z seryny przez reakcję katalizowaną przez hydroksymetylotransferazę serynową (ryc. 30-7). Prolina. U ssaków i niektórych innych form życia prolina tworzy się z glutaminianu wskutek odwrócenia reakcji kataboiizmu proliny (ryc. 30-8).

340 / ROZDZIAŁ 30

OKSYDAZA SARKO2YNOWA i

o 3- Fosf o- D-g! loory nlan L--NAD +

9 (P)- O o Fosfo hyd ro teyplrog ron lan DEHYDROGENAZA ALDEHYDU BETAINY

NH,+

Fosfo-L-swyna

OKSYDAZA DIMETYl.OGLlCYNOWA

Ryc. 30-5. Biosynteza seryny. a-AA — a-aminokwasy, a-KA — a-ketokwasy.

Cysteina. Cysteina, której obecność w pożywieniu nie jest konieczna, tworzy się z metioniny (koniecznej w pożywieniu) i seryny (niekoniecznej w pożywieniu). Metionina ulega najpierw przemianie w homocysteinę przez S-adenozylometionine i S-adenozylohomocysteinę (p. rozdz. 32). Przekształcenie homocysteiny i seryny w cysteinę i homoserynę przedstawiono na ryc. 30-9. Tyrozyna. Tyrozyna powstaje z fenyloalaniny w reakcji katalizowanej przez hydroksylazę fenyloalaninową (ryc. 30-10). Podczas gdy fenyloalanina jest aminokwasem niezbędnym w pożywieniu, tyrozyna nim nie jest — dostarczone pożywienie powinno zawierać odpowiednie ilości fenyloalaniny. Reakcja jest nieodwracalna, dlatego tyrozyna nie może zastępo-

ICHjO) Formaldahyd i

NHJ Silcyna

Ryc. 30-6. Powstawanie glicyny z cboliny.

wać w pożywieniu fenyloalaniny. Kompleks hydroksylazy fenyloalaninowej jest oksygenazą o mieszanej funkcji, występuje w wątrobie ssaków, ale nie występuje w innych tkankach.

BIOSYNTEZA AMINOKWASÓW / 341 Metyteno-

NH,*

H^-follan i

NH +

!

HO ] +/

O L-

Glteyna Seryna

Ryc. 30-7. Reakcja hydroksym etyl otrą nsf era zy serynowej. Reakcja jest łatwo odwracalna. H4-fo)ian — tetrahydrofolian. O

L-GkJtamlnten

L-Glutam/lo-y-eemialoohyd L-Cysteina

Seryna L-Homowryna

A'-Pirolldyno-5-karboksyian

Ryc. 30-9. Przekształcenie homocysteiny i seryny w homoserynę i cysteine. Należy zauważyć, że podczas gdy siarka cysteirty pochodzi z transsuifu racji z metioniny, szkieletu węglowego dostarcza seryna.

O

L-Prollna Ryc. 30-8. Biosynteza proliny zglutaminianu przez odwrócenie reakcji katabolizmu proliny.

Reakcja polega na wbudowaniu jednego atomu tlenu w pozycjepara fenylo alaniny, podczas gdy drugi atom jest redukowany z utworzeniem wody (ryc. 30-10). Moc redukcyjną, zawartą

ostatecznie w NADPH, natychmiast dostarcza tctrahydrobiopteryna. przypominająca pterydyne kwasu foliowego. Hydroksyprolina. Ponieważ prolina służy jako prekursor hydroksyproliny, prolina i hydroksyprolina należą do rodziny glutaminianu. Chociaż w tkankach ssaków występuje zarówno 3-, jak i 4-hydroksyprolina, wszystkie podane niżej fakty dotyczą tylko żran.s-4-hyclroksyproliny, Hydroksyprolina, podobnie jak hydroksyli2yna, jest prawie wyłącznie związana z kolagenem, białkiem występującym w największej iloś-

342 / ROZDZIAŁ 30 NADP+

NADPH+H+

TetrahydroDmydrablopteryna biopteryna

L-Fanyloalanlna

H

0H

L-Tyroiyna

OH ÓH

Tatra hyd ro bi o ptery n a

Ryc. 30-10. Reakcja hydroksylazy fenyloalaninowej. Biorą udział 2 różne enzymy. Enzym II katalizuje redukcję dihydrobiopteryny przez NADPH i enzym I — redukcję O2 do H2O oraz fenyloalaniny do tyrozyny Reakcja ta wiąże się z zaburzeniami metabolizmu fenyloalaniny omawianymi w rozdz. 32.

i-Ketoglularan

[ "OJ-Bursztyn la n

Ryc. 30-11. Reakcja hydroksylazy prolilowej. Substratem jest peptyd bogaty w prolinę. Podczas przebiegu reakcji tlen cząsteczkowy wbudowuje się zarówno do bursztynianu, jak i do proliny (wykazano wykorzystując izotop tlenu 13O2).

ci w tkankach ssaków. Kolagen zawiera ok. 1/3 glicyny, 1/3 proliny i hydroksyproliny. Hydroksyprolina, która stanowi wiele reszt aminokwasowych kolagenu, chroni potrójny heliks kolagenu przed trawieniem przez proteazy.

W przeciwieństwie do grup hydroksylowych hydroksylizyny, które służą jako miejsca przyłączenia reszt galaktozyd owych i glukozowych, grupy hydroksylowe hydroksyproliny kolagenu nie są podstawione. Wyjątkową cechą metabolizmu hydroksyproliny i hydroksylizyny jest to, że jeśli aminokwasy te pochodzą z białka przyjmowanego pożywienia, to nie są włączane do kolagenu. Nie ma żadnego tRNA zdolnego przyłączyć hydroksyprolinę i hydroksylizynę i wbudować je w wydłużający się łańcuch polipeptydowy. Prolina zawarta w pokarmie jest prekursorem hydroksyproliny kolagenu, natomiast lizyna — prekursorem hydroksylizyny kolagenu. Hydroksylacje proliny lub lizyny katalizuje hydroksylaza prolilowa lub hydroksylaza lizylowa, enzymy związane z frakcją mikrosomalną wielu tkanek (skóry, wątroby, płuc, serca, mięśni szkieletowych i zi a minujących ran). Enzymy te są hydroksylazami peptydowymi, ponieważ hydroksylacja zachodzi tylko po wbudowaniu proliny i lizyny do polipeptydu. Obie hydroksylazy są oksygenazami o mieszanej funkcji, które wymagają w dodatku do substratu obecności tlenu cząsteczkowego, askorbinianu, Fe2"1" i a-ketoglutaranu. Intensywniej badano hydroksylazę prolilowa, ak okazuje się, że hydroksylaza lizylowa jest bardzo podobna. Na każdy mol hydroksylowanej proliny, 1 mol oc-ketoglutaranu ulega dekarboksylacji do bursztynianu. Podczas tego procesu 1 atom tlenu cząsteczkowego wbudowuje się w prolinę i 1 w bursztynian (rys. 30-11). Hydroksylizyna. 5-Hydroksylizyna (a,e-diamino-S-hydroksykapronian) występuje w kolagenie, ale nie występuje w większości innych białek ssaków, Hydroksylizyna kolagenu pochodzi bezpośrednio z lizyny, ale nie z hydroksylizyny pożywienia. Zanim lizyna ulegnie hydroksylacji musi być wbudowana w peptyd. HydroksyJacje peptydu lizylowego katalizuje wówczas hydroksylaza lizylowa, oksydaza o mieszanej funkcji, analogiczna do hydroksylazy prolilowej (ryc. 30-11). 7-Ketokwasy 3 aminokwasów o rozgałęzionych łańcuchach bocznych mogą zastąpić w pożywieniu człowieka odpowiadające im aminokwasy Chociaż leucyna, walina i izoleucyna są dla ludzi i innych wyższych zwierząt aminokwasami, które muszą być dostarczone w pokarmie, tkanki ssaków mają transaminazy, które od-

BIOSYNTEZA AMINOKWASÓW / 343

wracalnie katalizują wzajemne przemiany wszystkich 3 aminokwasów i odpowiadających im a-ketokwasów. Dlatego odpowiednie a-ketokwasy mogą zastępować w pożywieniu odpowiadające im aminokwasy.

byłyby prowadzone w dłuższych okresach, jest prawdopodobne, że ujawniłoby się zapotrzebowanie na histydynę również u dorosłego człowieka.

Histydyna i arginina są uważane jako aminokwasy częściowo niezbędne w pożywieniu Arginina, aminokwas który musi być dostarczony w pożywieniu dla rozwoju człowieka, może być syntetyzowana przez szczury, ale w ilościach niewystarczających do prawidłowego wzrostu. Histydyna, podobnie jak arginina, nie jest całkowicie niezbędna w pożywieniu. W nieobecności histydyny u dorosłych ludzi i-dorosłych szczurów była utrzymywana przez krótki okres równowaga azotowa. Rosnące zwierzę wymaga jednak w pożywieniu histydyny. Jeżeli badania

PIŚMIENNICTWO Cardinale GJ, Udenfriend S: Prolyl hydroxylase. Adv Eniymol 1974;41:245. Mercer LP, Dodds SJ, Smith DI: Dispensable, indispensable, and conditionally indispensable amin o acid ratios in the diet. Chapter 1 in Vol. 1 of; Adsorption and Utilization of Amino Acids. Friedman M (editor). CRC Press. 1989. Rosenberg LE. Serwer CR: Disorders of amino acid metabolism. Chapter 11 in: Metaboiic Control and Disease. Bondy PK, Roscnberg LE (editors). Saunders, 1980. Tyler B: Regulation of the assimilation of nitrogen tompounds. Annu Rev Biochem 1978;47:1127.

3 1

Katabolizm białek i azotu aminokwasów Victor W. Rodwełt, PhD

WPROWADZENIE W tym rozdziale będzie omówiony sposób, w jaki azot jest usuwany z aminokwasów i przekształcany w mocznik oraz problemy medyczne pojawiające się wskutek zaburzeń tych reakcji. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Amoniak, pochodzący głównie z a-aminowego azotu aminokwasów, jest dla ludzi potencjalnie toksyczny. Mechanizmy, które powodują, że amoniak jest toksyczny, nie są całkowicie poznane. Człowiek usuwa amoniak przez przekształcenie go w nietoksyczny związek chemiczny — mocznik. Prawidłowy przebieg szlaku metabolicznego, który przekształca amoniak w mocznik — cykl mocznikowy —jest istotny do utrzymania zdrowia. W warunkach, w których funkcja wątroby jest poważnie zagrożona, np. u chorych z zaawansowaną marskośdą wątroby (gdzie prawidłowe hepatocyty są zastąpione przez fibrobiasty i kolagen) lub ostrym zapaleniem wątroby — stężenie amoniaku we krwi się zwiększa, co w rezultacie powoduje objawy kliniczne. W przypadku nielicznych dzieci urodzonych z brakiem aktywności jednego z enzymów cyklu mocznikowego właściwe leczenie wymaga zrozumienia biochemii syntezy mocznika. WYMIANA BIAŁKA ZACHODZI WE WSZYSTKICH FORMACH ŻYCIA Białka żywych komórek są stale odnawiane przez wymianę białka, nieprzerwany proces degradacji i następnie resyntezy z wolnych amino-

kwasów. Fizjologiczne znaczenie wymiany białka jest wykazane przez jej obecność we wszystkich formach życia, nawet u bakterii rosnących logarytmicznie w bogatym podłożu. Chociaż wymiana obejmuje zarówno syntezę, jak i degradację białek, rozdział ten omawia degradację białek i aminokwasów. Syntezę białek opisano w rozdz. 40. Klinicyści i dietetycy używają swoistych terminów w celu scharakteryzowania różnych stanów bilansu azotowego Swoiste terminy opisują stan metabolizmu azotu u ludzi. Bilans azotowy dotyczy różnicy między całkowitym azotem spożytym a całkowitym azotem wydalonym. Przyjęcie więcej azotu niż wydalenie stanowi dodatni bilans azotowy, stan typowy dla rosnącego dziecka lub kobiety w ciąży. W równowadze azotowej, typowej dla dorosłego człowieka, ilość azotu spożytego odpowiada ilości azotu wydalonego w kale i moczu. Ujemny bilans azotowy, w którym ilość azotu wydalonego przewyższa ilość azotu spożytego, charakteryzuje pewnych chorych po operacjach, chorych z zaawansowanym rakiem i osoby, które przyjmują nied o stateczną ilość azotu (np. w kwashiorkor) lub dietę ubogobiałkową. Każdego dnia dorośli degradują 1—2% białka ich organizmu Wymiana 1—2% całkowitego białka ciała dziennie u zdrowego człowieka wynika głównie z degradacji białka mięśni. 75—80% uwolnionych aminokwasów jest wówczas ponownie wykorzystywanych do syntezy białka. Azot pozostałych jest katabolizowany do mocznika.

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 345

Degradacja białka ( 20 - 35 g azotu dziennie)

Białko organizmu Ponowne wykorzystanie do syntezy nowego białka (15 - 2B g azotu dziennie) Aminokwasy

Kalabollzm (5 — 7 g azotu dziennie)

Ryc. 31 -1. Zależności ilościowe zachodzące między obrotem białek i aminokwasów.

a szkielety węglowe do amfibolicznych związków pośrednich (ryc. 31-1). W społeczeństwie zachodnim ta dzienna strata wynosi do 30—40 g białka lub 5—7 g azotu.

Szybkość degradacji białka znacznie się różni między białkami oraz w różnych stanach fizjologicznych

Poszczególne białka są degradowane z różną szybkością. Średnia szybkość degradacji białka w danej komórce, tkance lub w całym organizmie odzwierciedla średnią wartość dJa różnych białek. Szybkość degradacji lub połowicznego rozpadu białek w odpowiednich tkankach odpowiada ich fizjologicznemu wymaganiu. Średnia szybkość degradacji może być niezmiernie duża, gdy tkanka ulega poważnemu strukturalnemu przekształceniu (np. tkanka macicy podczas ciąży lub tkanka ogona kijanki podczas metamorfozy). Degradacja białek mięśni szkieletowych także się zwiększa podczas ostrego głodzenia.

Okres połowicznego rozpadu białek waha się od 30 min do powyżej 150 h

Ponieważ in vivo szybkość degradacji białka odpowiada kinetyce reakcji I-rzędu, wrażliwość enzymu aa degradację jest wyrażona przez jego okres połowicznego rozpadu — tt„. Jest to czas wymagany do zmniejszenia jego stężenia do 50% wartości początkowej. Okres połowicznego rozpadu enzymów wątroby waha się od mniej niż 40 min do powyżej 150 h. Wiele kluczowych enzymów regulatorowych wykazuje krótki okres połowicznego rozpadu. Na przykład t,,2 oksygenazy tryptofanowej i transaminazy tyro-

zynowej wynosi ok. 2 h, a tm reduktazy HMG-CoA może wynosić tylko 30 min. Te wartości wyraźnie kontrastują z okresem połowicznego rozpadu powyżej 100 h dJa aldolazy, dehydrogenazy mleczanowej i cytochromów. Domeny bogate w Pro, Ser, Asp i Glu, określane jako sekwencje PEST, występują w białkach z krótkim okresem połowicznego rozpadu. W reakcji na potrzeby fizjologiczne szybkość degradacji kluczowych enzymów regulatorowych może być przyspieszona lub opóźniona, zmieniając stężenie enzymu i stąd podzielenie metabolitów między różne szlaki metaboliczne.

Aminokwasy przyjęte w nadmiarze w stosunku do potrzeb są degradowane, a nie przechowywane

Utrzymanie zdrowia typowego zachodniego dorosłego człowieka wymaga 30 — 60 g białka dziennie lub jego równoważników w postaci wolnych aminokwasów. Niemniej jakość białka (proporcja niezbędnych aminokwasów w pożywieniu względem ich proporcji w syntetyzowanych białkach) ma szczególne znaczenie. Nadmiar aminokwasów nie jest magazynowany. Bez względu na ich pochodzenie, te które bezpośrednio nie zostały włączone do nowego białka są szybko degradowane. Spożycie nadmiaru aminokwasów nie służy zatem żadnemu pożytecznemu celowi, który nie może równie dobrze być spełniony i przy niższym nakładzie przez węglowodany i lipidy.

PROTEAZY I PEPTYDAZY DEGRADUJĄ BIAŁKA DO AMINOKWASÓW Analogicznie do procesów zachodzących w przewodzie żołądkowo-j elito wy m, proteolityczne trawienie endogennych białek w obrębie komórek wymaga proteaz i peptydaz. Wewnątrzkomórkowe proteazy hydrolizują wewnętrzne wiązania peptydowe białek, tworząc peptydy. Te peptydy są wtedy degradowane do wolnych aminokwasów przez peptydazy. Endopeptydazy przecinają wewnętrzne wiązania w peptydach, tworząc krótsze peptydy, Aminopeptydazy i karboksypeptydazy usuwają wówczas odpowiednio aminokwasy z N- i C-końców peptydów. Ostatecznymi produktami są wolne aminokwasy.

346 / ROZDZIAŁ 31

Białka są degradowane na szlaku ATP-zależnym i ATP-niezależnym Wewnątrzkomórkowe białka komórek eukariotycznych są degradowane w 2 głównych szlakach. Pozakomórkowe, związane z błoną, i długo żyjące białka wewnątrzkomórkowe są degradowane w organeliach komórkowch, nazwanych lizosomami, w procesach ATP-niezależnych. Przeciwnie, degradacja nieprawidłowych i innych krótko żyjących białek wymaga ATP i ubikwityny, i przebiega w cytozolu. Receptory asjaloglikoprotein hepatocytów przyłączają i internalizują glikoproteiny przeznaczone do degradacji Jakie czynniki „wyznaczają" białko do szybkiej degradacji? Dla białek w krążeniu (np. pewnych hormonów peptydowych) strata cząsteczki kwasu sjalowego, od końców nieredukujacych ich łańcuchów oligosacharydowych, sygnalizuje ich degradację. Te pozbawione kwasu sjalowego glikoproteiny są rozpoznawane przez asjaloglikoproteinowy receptor hepatocytów i internalizowane. Wówczas są one degradowane w lizosomach przez proteazy zwane katepsynami. Ubikwityna „wyznacza" wiele wewnątrzkomórkowych białek do degradacji Wiele wewnątrzkomórkowych białek jest „wyznaczanych" do degradacji przez ubikwitynę, małocząs teczko we (8,5 kD) białko występujące we wszystkich komórkach eukariotycznych. Pierwszorzędowa struktura ubikwityny jest bardzo konserwatywna. Tylko 3 z 76 reszt aminokwasowych różni ubikwitynę drożdżową od ludzkiej. Cząsteczki ubikwityny przyłączają

się do białka przeznaczonego do degradacji na drodze reakcji zależnych od ubikwityny. Są one przyłączane w 3-etapowym procesie, kończącym się utworzeniem wiązania izopeptydowego między końcem karboksylowym ubikwityny i g-aminową grupą reszty iizyny w białku (ryc. 31-2). To czy białko zostanie zmodyfikowane przez ubikwitynę zależy od rodzaju aminokwasu obecnego na jego N-końcu. Reakcja z ubikwityną jest opóźniana przez N-końcową resztę metioniny i seryny, a przyspieszana przez resztę kwasu asparaginowego i argininy. ZALEŻNIE OD ICH NISZY EKOLOGICZNEJ, ZWIERZĘTA PRZEKSZTAŁCAJĄ AZOT W RÓŻNE PRODUKTY KOŃCOWE Zwierzęta przekształcają azot z aminokwasów i innych źródeł w jeden z 3 produktów końcowych: amoniak, kwas moczowy lub mocznik. Który z produktów przeważa u różnych zwierząt, zależy od dostępności wody w ich specyficznej niszy ekologicznej. Organizmy amonoteliczne, ryby kostnoszkieletowe, wydalają azot jako amoniak. Ich nisza wodna, zmuszająca do ciągłego usuwania wody, ułatwia stałe wydalanie bardzo toksycznego komponentu — amoniaku. Natomiast zwierzęta lądowe przekształcają azot albo w kwas moczowy (urykoteliczny tryb życia), albo w mocznik (organizmy ureoteliczne). Ptaki, które muszą zarówno zachowywać wodę, jak i utrzymywać małą masę ciała są urykoteliczne. Kwas moczowy, stosunkowo nierozpuszczalny produkt końcowy, jest wówczas wydalany jako półstałe guano. Zwierzęta lądowe, a także człowiek, są ureoteliczne, przekształcające azot w dobrze rozpuszczalny nietoksyczny związek — mocznik. Nie-

o 1.

o

UB—C—O" + E, -SH + ATP -»AMP + PP, + UB—C—S—E1 O

2.

O

UB—C—S—E, + E, -SH -* E, -SH + UB-C—S—E,

O E O H 3. UB—C-^S—E2+ H2N—E— Białko 4 Ej -SH + UB—C—N-e— Białko c. 31-2. Reakcje cząstkowe w przyłączaniu ubikwityny (UB) do białka. 1. Terminalna grupa karboksylowa COOH ubikwityny tworzy wiązanie tioestrowe z grupą -SH enzymu E, w reakcji kierowanej przez przekształcenie ATP wAMPi PP,. 2. Reakcja wymiany tioestru przenosi zaktywowang ubikwitynę na enzym E;. 3. Enzym E3 katalizuje transfer ubikwityny na e-aminowe grupy lizyny docelowego białka.

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 347

zwykle mała toksyczność mocznika jest niejednokrotnie zaciemniona przez zwiększone stężenie mocznika we krwi osób z chorobami nerek. To zwiększone stężenie mocznika we krwi jest konsekwencją, ale nie przyczyną, chorób nerek. BIOSYNTEZA MOCZNIKA PRZEBIEGA W KILKU ETAPACH Ze względów dydaktycznych omówienie biosyntezy mocznika podzielono na 4 etapy: 1) transaminacja, 2) deaminacja oksydacyjna, 3) transport amoniaku i 4) reakcje cyklu mocznikowego. Rycina 31-3 wiąże te zagadnienia w całkowity katabolizm azotu aminokwasowego. Chociaż każdy etap odgrywa także rolę w biosyntezie aminokwasów, najpierw zostanie rozpatrzony z perspektywy ich katabolizmu. a-Aminokwas

i-Ketokwas

Transami nacja

a-Ketoglutaran Deamlnacja oksydacyjn

L-G lutami nian NH3

CO,

Cykl nweanlkowy Mocznik Ryc. 31 -3. Ogólny przepływ azotu w kataboiizmie aminokwasów.

USUNIĘCIE GRUPY < AMINOWEJ JEST WSTĘPNĄ REAKCJĄ KATABOLIZMU AMINOKWASÓW Wolne aminokwasy? pochodzące z egzogennych białek pożywienia lub z degradacji białek endogennych w procesach opisanych powyżej, są metabolizowane w identyczny sposób. Ich aaminowy azot jest najpierw usuwany albo przez transaminację albo przez deaminację ok-

sydacyjną. Powstały węglowy „szkielet" jest wówczas degradowany w szlakach, które będą opisane w następnym rozdziale. W tym rozdziale omówiono los samego azotu. Fosforan pirydoksalu jest obecny w miejscu katalitycznym wszystkich transaminaz Fosforan pirydoksalu tworzy istotny część miejsca katalitycznego transaminaz i wielu innych enzymów, których substratami są aminokwasy. We wszystkich reakcjach aminokwasów, zależnych od fosforanu pirydoksalu, wstępnym etapem jest tworzenie związku pośredniego — zasady Schiifa — połączonego z enzymem. Ten związek pośredni, stabilizowany pr2ez interakcję z kationowym regionem miejsca aktywnego, może być przekształcany w sposób, który obejmuje uwolnienie ketokwasu z utworzeniem związanego z enzymem fosforanu pirydoksaminy. Połączona aminowa forma koenzymu może wówczas tworzyć z ketokwasem analogiczny związek pośredni typu zasady Schiffa. Podczas transaminacji przyłączony koenzym służy jako przenośnik grup aminowych. Wobec tego, że stała równowagi dla większości reakcji transaminacji jest bliska 1, transaminacja jest procesem łatwo odwracalnym. To pozwala Łransaminazom funkcjonować zarówno w kataboiizmie, jak i biosyntezie aminokwasów. Transaminacja kieruje azot ::-aminokwasów do glutaminianu Transaminacja, katalizowana przez transaminazy lub aminotransferazy, obejmuje wzajemne przemiany pary aminokwasów i pary ketokwasów. Są to głównie a-aminokwasy i a-ketokwasy (ryc. 31-4). Dwie transaminazy, transaminaza alanina-pirogronian (transaminaza alaninowa) i transaminaza glu tam i nian-a-ke to glut ara n (transaminaza glutaminianowa), występujące w większości tkanek ssaków, katalizują przeniesienie grup aminowych z większości aminokwasów, tworząc alaninę (z pirogronianu) i glutaminian (z ce-ketoglutaranu) (ryc. 31-5). Transaminazy są swoiste tylko dla, jednej pary -aminokwasów i a-ketokwasów. Każda transaminaza jest swoista dla danej pary aminokwasów i ketokwasów jako jednej pary substratów, ale nieswoista

348 / ROZDZIAŁ 31

i hydroksyprolinę. Transaminacja nie jest ograniczona do grup a-aminowych. 8-Aminowa grupa ornityny (ale nie e-aminowa grapa lizyny) łatwo ulega transaminacji, tworząc 7-semialdehyd glutaminianu (p. ryc. 32-3). W pewnych stanach chorobowych stężenie transaminaz w surowicy jest zwiększone (p. Suplement).

o

o

Ryc. 31-4. Transaminacja. Reakcję przedstawiono dla dwóch a-aminokwasów i dwóch ot-ketokwasów. Grupy nie ot-aminowe lub karbonylowe również uczestniczą w transaminacji, chociaż stosunkowo rzadko. Reakcja jest łatwo odwracalna ze stalą równowagi równą ok. 1.

Plrogronlan

a-Amlnokwas a-Ketokwas a-Am

L-Glutamlnłan L-Alanlna

ino kwas a-Ketokwas

a-Ketoglutaran

Ryc. 31-5. Transaminazaalaninowa (gfira) itransamtnaza glutaminianowa (dói).

dla innej pary, którą może tworzyć jakikolwiek aminokwas z odpowiadającym mu ketokwasem. Ponieważ alanina jest także substratem w reakcji transaminazy glutaminianowej, cały azot aminowy z aminokwasów, które mogą ulegać transaminacji, może być gromadzony w glutaminianie. Jest to ważne, ponieważ Lglutaminian jest jedynym aminokwasem w komórkach ssaków ulegającym deaminacji oksydacyjnej ze znaczną szybkością. Tworzenie amoniaku z grup tx-aminowych przebiega więc głównie poprzez przemianę w azot a-aminowy Lglutaminianu.

Transaminacja nie jest ograniczona do grup a-aminowych. Substratamj w transaminacji jest większość aminokwasów (ale nie wszystkie). Wyjątki obejmują lizynę, treoninę oraz cykliczne iminokwasy — proline

OKSYDAZA L-AMINOKWASOWA RÓWNIEŻ PRZEKSZTAŁCA 5-AMINOKWASY W ct-KETO KWASY Tlenowa przemiana wielu aminokwasów w odpowiadające im ketokwasy zachodzi w wątrobie i nerkach ssaków. Chociaż prawie cala aktywność w stosunku do a-aminokwasów jest wynikiem wspólnego działania transaminaz i dehydrogenazy L-glutaminianowej, w wątrobie i nerkach ssaków jest również aktywna oksydaza L- i D-aminokwasowa, enzym bardzo rozpowszechniony u innych zwierząt i drobnoustrojów. Oksydazy aminokwasowe są autoutleniającymi się flawoproteinami Zredukowany FMN lub FAD oksydaz aminokwasowych jest ponownie utleniany bezpośrednio przez tlen cząsteczkowy, tworząc nadtlenek wodoru (H2Oj) bez udziału cytochro-

OKSYDAZA AMINOKWASOWA

Riw|n(ł

O a-lmtnokwas ■HjO

NH„* -*' ■

O KATALAZA

C

140,

11 O a-Katokwas

Ryc. 31-6. Deaminacja oksydacyjna katalizowana przez oksydazę L-aminokwasową (oksydoreduktaza L-a-aminokwas: O2). a-lminokwas w nawia sie nie jest trwałym produktem pośrednim._______

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 349

mów Jub innych przenośników elektronów (ryc. 31-6). Kata luz a, która powszechnie występuje w tkankach, szczególnie w wątrobie, rozkłada toksyczny H2O2 do O2 i H^O. Chociaż reakcje oksydazy a min o kwasowej są odwracalne, w nieobecności katalazy a-ketokwasowy produkt jest nieenzymatycznie dekarboksylowany przez H2O2 z utworzeniem kwasu karboksylowego uboższego o jeden atom węgla. Niemniej jest wątpliwe, czy ta dekarboksylacja zachodzi w jakimś dużym stopniu w nie uszkodzonych tkankach ludzkich. W reakcji oksydazy aminokwasowej (ryc. 31-6) aminokwas jest najpierw odwodorowany przez flawoproteine oksyda2y, tworząc a-iminokwas. Ten spontanicznie przyłącza cząsteczkę wody i rozkłada się na odpowiedni a-ketokwas z utratą oc-iminowego azotu w postaci jonu amonowego.

DEHYDROGENAZA LGLUTAMINIANOWA ZAJMUJE CENTRALNĄ POZYCJĘ W METABOLIZMIE AZOTU Grupy aminowe większości aminokwasów w wyniku transaminacji są ostatecznie przenoszone*na a-ketoglu taran z utworzeniem L-glutaminianu (ryc. 31 -3). Uwolnienie azotu aminowego jako amoniaku jest katalizowane przez dchydrogenazę L-glutaminianową, enzym o dużej aktywności, rozpowszechniony w wielu tkankach ssaków (ryc. 31-7). Dehydrogenaza glutaminianowa wątroby jest enzymem regulatorowym, na którego aktywność wpływają allosteryczne modyfikatory, takie jak ATP, GTP i NADH, które hamują enzym i ADP, który go aktywuje. Pewne hormony mają wpływ na aktywność dehydrogenazy glutaminia nowej in vuro. NAD(P}+

L-Glutamlnlan

a-KefogJutarari

Ryc. 31-7. Reakcja katalizowana przez dehydrogenazę L-gtutaminianową. NAD(P) f oznacza, że kosubstratem może być albo NAD + , albo NADP+. Reakcja jest odwracalna, ale stalą równowagi uprzywilejowuje tworzenie giutaminianu.

Dehydrogenaza ^lutaminianowa wykorzystuje jako kosubstratNAD+ lubNADP + . Reakcja jest odwracalna i przebiega zarówno w kataboJizmie, jak i biosyntezie aminokwasów. Jej zadaniem jest nie tylko oddzielenie azotu od giutaminianu i wbudowanie go do mocznika (kataboiizm), lecz także katalizowanie aminacji a-ketoglutaranu przez wolny amoniak (p. rozdz. 30).

AMONIAK WE KRWI POCHODZI TAKŻE Z AMONIAKU UTWORZONEGO PRZEZ BAKTERIE JELITOWE Amoniak* wchłania się z jelita do krwi żyły wrotnej, w której stężenie amoniaku jest większe niż we krwi krążenia ogólnego. W warunkach prawidłowych wątroba szybko usuwa amoniak z krwi żyły wrotnej, tak że krew opuszczająca wątrobę (i w rzeczywistości cała krew obwodowa) jest faktycznie pozbawiona amoniaku. Jest to ważne, skoro nawet znikome ilości amoniaku są toksyczne dla ośrodkowego układu nerwowego. Przy poważnym upośledzeniu funkcji wątroby lub rozwinięciu obocznyeh połączeń między żyłami wrotną i krążenia dużego (jak to może zachodzić w marskości wątroby), krew wrotna może ominąć wątrobę, przez co stężenie amoniaku we krwi krążenia ogólnego może się wówczas zwiększyć do poziomu toksycznego.

Zatrucie amoniakiem jest groźne dla życia

Do objawów zatrucia amoniakiem należą drgawki, bełkotliwa mowa, upośledzenie ostrości widzenia, a w ciężkich przypadkach śpiączka i zgon. Objawy te przypominają symptomy zespołu śpiączki wątrobowej, które występują wówczas, gdy stężenie amoniaku we krwi i prawdopodobnie w mózgu jest zwiększone. Uważa się, że zatrucie amoniakiem jest czynnikiem etiologicznym śpiączki wątrobowej. Zatem leczenie jej polega na stosowaniu metod zmniejszających stężenie amoniaku we krwi.

* Obecny w fizjologicznym pH prawie wyłącznie jako jon amonowy ^

350 / ROZDZIAŁ 31

TWORZENIE I WYDALANIE AMONIAKU PRZEZ NERKI UTRZYMUJE RÓWNOWAGĘ KWASOWO-ZASAD OWĄ Zawartość amoniaku we krwi żyl nerkowych przewyższa jego stężenie w tętnicach nerkowych wskazując, że nerki wytwarzają amoniak, który przechodzi do krwi. Jednakże wydalanie do moczu amoniaku wytwarzanego przez komórki kanalików nerkowych stanowi najważniejszy aspekt metabolizmu amoniaku nerkowego. Wytwarzanie amoniaku, ważny mechanizm kanalików nerkowych w regulacji równowagi kwasów o-zasad owej i zatrzymywania kationów, znacznie się zwiększa w kwasicy metabolicznej i maleje w zasadowicy. Ten amoniak nie pochodzi z mocznika, lecz z wewnątrzkomórkowych aminokwasów, zwłaszcza glutaminy. Uwalnianie amoniaku jest katalizowane przez nerkową glutaminazę (ryc. 31-8). Chociaż amoniak może być wydalany jako sole amonowe — szczególnie w kwasicy metabolicznej — większość jego jest wydalana w postaci mocznika, głównego składnika azotowego moczu. Amoniak, stale produkowany w tkankach, ale obecny tylko w śladowych ilościach we krwi obwodowej (100 — 200 u.g/1), jest szybko usuwany z krążenia przez wątrobę i przekształcany w glutaminian, glutaminę lub w mocznik.

Syntetaza glutaminowa przekształca amoniak w nietoksyczną glutaminę do transportu między tkankami O usuwaniu amoniaku przez dehydrogenaze glutaminianową wspomniano powyżej. Tworzenie glutaminy jest katalizowane przez syntetazę glutaminową (ryc. 31-9), enzym mitochondrialny, występujący w największych ilościach w tkance nerkowej. Synteza wiązania amidowego glutaminy dokonuje się kosztem hydrolizy ATP do ADP i P ;. Reakcja jest dlatego silnie uprzywilejowana w kierunku syntezy glutaminy.

C II O

II O

„u, L-Glutamlnlan Mg-ATP SYNTETAZA GLUTAMINOWA Mg-AOP NH* H^

L-Glutamirta

RYC. 31-9. Reakcja katalizowana przez syntetazę glutaminową. Reakcja silnie uprzywilejowuje syntezę glutaminy.

L-Glutamlnlari

Ryc. 31 -8. Reakcja katalizowana przez glutaminaze zachodzi w zasadzie nieodwracalnie w kierunku tworzenia glutaminianu i HH^. Należy zwrócić uwagę, że usuwany jest azot amidowy, a nie azot s-aminowy.

Glutaminaza i asparaginaza uwalniają amoniak z glutaminy i asparaginy Uwalnianie azotu amidowego glutaminy w formie amoniaku zachodzi w wyniku hydrolitycznego usunięcia amoniaku, katalizowanego przez glutaminazę (ryc. 31-8). W reakcji katalizowanej przez glutaminazę, w odróżnieniu od reakcji katalizowanej przez syntetazę glutaminową, nie biorą udziału nukleotydy adeninowe. Glutaminaza sprzyja tworzeniu glutaminianu, nie ma natomiast wpływu na syntezę glutaminy. Syntetaza glutaminowa i glutaminaza kataiizują wzajemną przemianę wolnego jonu amonowego i glutaminy (ryc. 31-10) w sposób przypominający wzajemną przemianę glukozy i glukozo-6-fosforanu katalizowaną przez glukokinazę i glukozo-6-fosfataze (p. rozdz. 18). Reakcja, analogiczna do reakcji katalizowanej przez glu-

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 351 Glu

Glu + Mg-ATP

Mg-ADP + P:

N\i.'

Jon amonow y

Glutamina

H,0 Ryc. 31 -10. Wzajemna przemiana amoniaku i glutaminy katalizowana przez syntetaze glutaminową i glutaminazę, Obie reakcje przebiegają w kierunkach wskazanych strzałkami. Glutaminaza katalizuje wyłącznie deamidację glutaminy, natomiast syntetaza glutaminowa — wyłącznie syntezę glutaminy z glutarninianu. Glu — glutaminian.

taminazę, jest katalizowana przez L-asparaginazę zwierząt, roślin i bakterii. Zarówno asparaginaza, jak i glutaminaza były badane jako czynniki przedwnowotworowe, gdyż pewne nowotwory wykazują nieprawidłowo duże zapotrzebowanie na glutaminę i asparaginę. Wątroba przekształca amoniak w mocznik Podczas gdy w mózgu głównym mechanizmem usuwania amoniaku jest tworzenie glutaminy, w wątrobie najważniejszym szlakiem jest tworzenie mocznika. Tkanka mózgowa może tworzyć mocznik, chociaż to nie odgrywa większej roli w usuwaniu amoniaku. Tworzenie glutaminy w mózgu musi być w nim poprzedzone przez syntezę glutarninianu, ponieważ jego ilość dostarczana przez krew jest niewystarczająca w obecności dużego stężenia amoniaku we krwi. Bezpośrednim prekursorem glutarninianu jest a-ketoglutaran, W ten sposób tworzenie glutaminy z amoniaku mogłoby szybko pozbawić cykl kwasu cytrynowego związków pośrednich, chyba że mogą one być zastąpione przez związki pośrednie powstałe przez przyłączenie CO2, tj. szczawiooctan powstały z przekształcenia pirogronianu (p. rozdz. 18). W mózgu rzeczywiście zachodzi w dużym stopniu wbudowywanie CO2 w aminokwasy, prawdopodobnie w cyklu kwasu cytrynowego, i po wniknięciu amoniaku więcej szczawi o octanu włącza się w syntezę glutaminy (a nie asparaginianu) przez a-ketoglutaran.

MIĘDZYNARZĄDOWA WYMIANA UTRZYMUJE STAŁE STĘŻENIE KRĄŻĄCYCH AMINOKWASÓW Utrzymanie stanu stacjonarnego stężeń aminokwasów w osoczu między posiłkami zależy od równowagi netto między aminokwasami uwolnionymi z endogennych zapasów białkowych i wykorzystanymi przez różne tkanki. Mięśnie wytwarzają więcej niż 50% całkowitej puli wolnych aminokwasów, podczas gdy wątroba jest miejscem enzymów cyklu mocznikowego niezbędnych do usuwania odpadków azotowych. Dlatego mięśnie i wątroba odgrywają główną rolę w określeniu stężenia krążących aminokwasów i ich wymianie. Mięśnie. Alanina i glutamina odpowiadają za ok. 50% całkowitego azotu ot-a mi no kwasowego uwolnionego z tkanki mięśniowej. Natomiast mięśnie stale wychwytują z krążema małe ilości seryny, cysteiny i glutaminianu. Wątroba i jelito. Wątroba i jelito (tkanki trzewne) nieprzerwanie pobierają z osocza znaczne ilości alaniny i glutaminy, główne aminokwasy uwalniane przez mięśnie. Wątroba jest najważniejszym miejscem wychwytywania alaniny, zaś jelito — glutaminy. W jelicie większość grup aminowych glutaminy uwalnia się z tej tkanki jako alanina lub wolny amoniak. Seryna jest także wychwytywana przez te same tkanki trzewne, jak również przez mięśnie. Nerki. Nerki są głównym źródłem uwalniania seryny; ponadto uwalniają one małe, ale znaczące, ilości alaniny. Nerki pobierają z krążenia glutaminę, prolinę i glicynę. W ten sposób istnieje dość ścisła zgodność między uwalnianiem większości aminokwasów z mięśni szkieletowych i ich wychwytywaniem przez tkanki trzewne. Mózg. Wychwytywanie waliny przez mózg przewyższa pobieranie wszystkich innych aminokwasów przez ten narząd. Zdolność mózgu szczura do utleniania aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (leucyna, izoleucyna i walina) jest co najmniej 4-krotnie większa niż mięśni i wątroby. Chociaż w stanie poresorpcyjnym znaczne ilości tych aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu są uwalniane z mięśni, nie są one pobierane przez wątrobę i dlatego istnieje możliwość, że mózg jest głównym miejscem ich wykorzystania.

352 / ROZDZIAŁ 31

Złożony układ wymiany międzyn a rządowej charakteryzuje stan po resor pcyjny Rycina 3 1 - 1 1 podsumowuje stan poresorpcyjny. Wolne aminokwasy, szczególnie alanina i glutamina, są uwalniane do krążenia z mięśni.

Wątroba

Ryc. 31-11, Międzyn a rząd owa wymiana amino kwasów w stanie poresorpcyjnym. Wykazano klu czową role alaniny wśród aminokwasów uwol nionych z mięśni i jelita t wychwytywanych przez wątrobę. (Reprodukowano za zgodą z: Felig P.: Metabolizm aminokwasów u człowieka. Annu. Rev. Biochem, 1975; 44:937, Copyright 1975 przez Annual Reviews. Inc).

MIĘSIEŃ

iPlrogronian

Alanina, która okazuje się być środkiem transportu azotu w osoczu, jest wychwytywana głównie przez wątrobę. Glutamina jest pobierana przez jelito i nerki, które przekształcają znaczną jej cześć w alaninę. Glutamina służy także jako źródło amoniaku do wydalania przez nerki. Nerki stanowią główne źródło seryny wychwytywanej przez takie tkanki jak wątroba i mięśnie. Aminokwasy o rozgałęzionym łańcuchu, zwłaszcza walina, są uwalniane przez mięśnie i pobierane głównie przez mózg. Alanina służy jako kluczowy prekursor glukozy pochodzenia biaikowego, tj. kluczowy aminokwas glukoneogeniczny (ryc. 31-12). W wątrobie szybkość syntezy glukozy z alaniny i seryny jest dużo większa niż obserwowana w przypadku wszystkich innych aminokwasów. Zdolność wątroby do glukoneogenezy z alaniny jest ogromna, aie nie osiągnie ona nasycenia, aż stężenie alaniny nie będzie równe 9 mmol/1, tj. 20—30-krotności jej poziomu fizjologicznego. Przewaga alaniny nad innymi a-aminokwasami wychwytywanymi z mięśni odzwierciedla jej syntezę w mięśniu przez łransaminację pirogronianu.

Aminokwasy

_Mocznik

Alanina WĄTROBA

Gfukoza

Alanina

Ryc. 31-12. Cykl glukoza-alanina. Alanina jest syntetyzowana w mięśniach, przez transami nację pochodzącego z glukozy pirogronianu, uwalniana do krwtobiegu i wychwytywana przez wątrobę. W wątrobie szkielet węglowy alaniny jest przekształcany w glukozę, która uwalniana do krwiobiegu jest wychwytywana przez mięSnie i wykorzystywana do resyntezy alaniny. (Reprodukowano za zgodą z: Felig P,: Metabolizm aminokwasów u człowieka. Ann u. Rev. Biochem. 1975; 44:938, Copyright 1975 przez Annual Reviews. Inc).

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 353 -Ala

Ryc. 31-13. Miedzy narządowa wymiana aminokwasów zaraz po posiłku.

60% aminokwasów o łańcuchu rozgałęzionym Wątroba

Mięsień

Między narządowa wymiana rozgałęzionych aminokwasów następuje po posiłku Po przyjęciu boga to białkowego posiłku, tkanki trzewne uwalniają aminokwasy, głównie z łańcuchem rozgałęzionym (ryc. 31-13), natomiast mięśnie szkieletowe również głównie je wychwytują. Aminokwasy te po przyjęciu pokarmu są także utleniane w mięśniach i prawdopodobnie służą jako główne donory grup aminowych w transaminacji pirogronianu do alaniny. Aminokwasy o rozgałęzionym łańcuchu odgrywają specjalną rolę w metabolizmie azotu zarówno na czczo, kiedy dostarczają mózgowi źródła energii, jak i po posiłku, kiedy są wychwytywane głównie przez mięśnie i zachowane przez wątrobę. W mięśniach wydają się one stanowić ważne źródło energii oraz azotu. MOCZNIK JEST GŁÓWNYM KOŃCOWYM PRODUKTEM KATABOLIZMU AZOTU U LUDZI Umiarkowanie aktywny mężczyzna, spożywający dziennie ok. 300 g węglowodanów, 100 g tłuszczowi lOOgbiałka, musi wydalać ok. 16,5 g azotu w ciągu doby, przy czym 95% tej ilości jest wydalane przez nerki i pozostaie 5% z kalem. Głównym szlakiem wydalania azotu u ludzi jest mocznik syntetyzowany w wątrobie, uwalniany do krwi i wydalany przez nerki. U ludzi pozostających na diecie spożywanej w państwach zachodnich, mocznik stanowi 80—90% wydalanego azotu. 23 — Biochemia

Mocznik tworzy się z amoniaku, dwutlenku węgla i asparaginianu w reakcjach cyklu mocznikowego Na rycinie 31-14 przedstawiono reakcje i związki pośrednie w biosyntezie 1 mola mocznika z 1 mola jonu amonowego, dwutlenku węgla (aktywowanego przez Mg2+ i ATP) oraz a-aminowego azotu asparaginianu. Cały proces wymaga 3 moli ATP (2 z nich są przekształcane do ADP + Pi, a 1 w AMP + PP() i sukcesywnego udziału 5 enzymów katalizujących reakcje ponumerowane na ryc. 31-14. Z 6 aminokwasów, uczestniczących w syntezie mocznika, 1 (N-acetyloglutaminian) działa jako aktywator enzymu, a nie jako związek pośredni. Pozostałe 5 — asparaginian, arginina, ornityna, cytrulina i argininobursztynian—wszystkie działają jako nośniki atomów, z których ostatecznie powstaje mocznik. Dwa z nich (asparaginian i arginina) występują w białkach, podczas gdy pozostałe 3 (ornityna, cytrulina i argininobursztynian) nie wchodzą w skład białek. Główną funkcją metaboliczną tych 3 ostatnich aminokwasów u ssaków jest udział w syntezie mocznika. Należy zwrócić uwagę, że wytwarzanie mocznika jest częściowo procesem cyklicznym. Ornityna wykorzystana w reakcji 2 jest regenerowana w reakcji 5. W ten sposób podczas syntezy mocznika nie ma żadnych strat lub zysków ornityny, cytruliny, argininobursztynianu lub argininy; natomiast zużywa się jon amonowy, CO2, ATP i asparaginian.

354 / ROZDZIAŁ 31

2Mg-ATP

2M9-ADP + P,

H C- C O O OOC-CH

TRANSKAflBAMOILAZA ORNfTYNOWA

Fu maran

coo CH Z -NH C QY\ SYNTETAZA AHGININOBURSZTYNIANOWA

Mg-ATP

COO" Arglnlnobursztynmn

coo-

AMP + Mg-PP,

COO" -CH C O O " LAsparagl rtian

Ryc. 31-14. Reakcje i produkty pośrednie biosyntezy mocznika. Grupy aminowe biorące udział w tworzeniu mocznika zaciemniono. * Enzymy mitochondrialne.

Synteza karbamoiłofosforanu z jonu amonowego i dwutlenku węgla wymaga 2 cząsteczek ATP Tworzenie karbamoiłofosforanu jest katalizowane przez syntetazę karbamoilofosforanową, enzym występujący w mitochondriach wątroby wszystkich organizmów ureotelicznych, łącznie z człowiekiem. 2 mole ATP, ulegające w czasie tej reakcji hydrolizie, dostarczają siły napędowej do syntezy 2 wiązań kowalencyjnych w karbamoilofosforanie — wiązania amidowego i mieszanego wiązania między kwasem karbo-

ksylowym a bezwodnikiem kwasu fosforowego. Oprócz Mg2 + wymagany jest kwas dwukarboksylowy. preferencyjnie N-acetyloglutaminian. Jego obecność powoduje głęboką zmianę konformacyjnij w strukturze syntetazy karbamoilofosforanowej, w wyniku której pewne grupy suifhydrylowe zostają wyeksponowane, inne schowane, a ponadto wpływa on na powinowactwo enzymu do ATP. Syntetaza karbamoilofosforanowa działa w połączeniu z mitochondrialną dehydrogenazą glutaminianową, przenosząc azot z glutaminia-

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 355

nu (i tym samym ze wszystkich aminokwasów; p. ryc. 31-3) na karbamoilofosforan i w końcu na mocznik. Podczas gdy stalą równowagi reakcji katalizowanej przez dehydrogenaze glutaminianową sprzyja raczej tworzeniu glutaminianu — niż amoniaku, to usuwanie amoniaku przez syntetazę karbamoilofosforanową i utlenianie a-ketoglutaranu przez enzymy cyklu kwasu cytrynowego w mitochondriach powodują uprzywilejowanie katabolizmu glutaminianu. Działanie to zwiększa obecność ATP. który, oprócz tego że jest substratem w syntezie karbamoilofosforami, pobudza jednokierunkowo aktywność dehydrogenazy glutaminianowej w stronę tworzenia amoniaku. Kondensacja karbamoilofosforanu z ornityną tworzy cytrulinę Utworzenie cytruliny +P( wskutek przeniesienia reszty karb amo ii owej z karbamoilofosforanu na ornitynę katalizuje transkarbamoilaza L-ornitynowa z mitochondriów wątroby. Reakcja jest bardzo swoista dla ornityny i równowaga reakcji przechyla się znacznie w stronę syntezy cytruliny (ryc. 31-14). Kondensacja cytruliny z asparaginianem tworzy arguiinobursztynian W reakcji katalizowanej przez syntetazę argininobursztynianową asparaginian i cytrulina łączą się razem przez grupę aminową asparaginianu. Reakcja wymaga ATP i jej równowaga przechyla się znacznie w stronę syntezy argininobursztynianu (ryc. 31-14). Rozszczepienie argininobursztynianu tworzy argininę i fumaran Odwracalne rozszczepienie argininobursztynianu do argininy i fumaranu katalizuje argininobursztynaza, enzym wątroby i nerek ssaków. Reakcja przebiega na zasadzie eliminacji trans. Utworzony fumaran może w reakcjach katalizowanych przez fumarazę i dehydrogenaze jablczanową przekształcić się w szczawiooctan, który ulega trans animacji, regenerując asparaginian. Rozszczepienie argininy uwalnia mocznik i odtwarza ornitynę Reakcja ta zamyka cykl mocznikowy i regeneruje ornitynę, substrat dla reakcji 2. Hydrolityczne rozszczepienie grupy guanidynowej argininy katalizuje arginaza występująca w wąt-

robie wszystkich organizmów ureotelicznych. Mniejsze ilości arginazy występują także w tkance nerkowej, mózgu, gruczołach sutkowych, tkance jąder i skórze. Co2+ lub Mn2+ aktywują arginazę wątroby ssaków. Ornityną i lizyna są potencjalnymi inhibitorami kompetycyjnymi argininy.

ZNANE ZABURZENIA METABOLICZNE SĄ ZWIĄZANE Z KAŻDĄ REAKCJĄ CYKLU MOCZNIKOWEGO Szybkość syntezy mocznika ograniczają reakcje katalizowane przez syntetazę karbamoilofosforanową (reakcja 1), transkarbamoilazę ornitynową (reakcja 2) i arginazę (reakcja 5) (ryc. 31-14). Ponieważ cykl mocznikowy przekształca toksyczny amoniak w nietoksyczny mocznik, wszystkie zaburzenia syntezy mocznika powodują zatrucie amoniakiem. Najcięższe zatrucia występują w przypadkach, gdy blok metaboliczny dotyczy reakcji 1 lub 2 ponieważ w wyniku syntezy cytruliny występuje pewnego stopnia kowalencyjne wiązanie amoniaku z węglem. Klinicznymi objawami wspólnymi dla wszystkich zaburzeń cyklu mocznikowego są: wymioty w wieku niemowlęcym, unikanie pokarmów bogatobiałkowych, ataksja przerywana, nerwowość, letarg i opóźniony rozwój umysłowy. Objawy kliniczne i leczenie wszystkich 5 omówionych poniżej zaburzeń są podobne. Znaczną poprawę obserwuje się przy spożywaniu pokarmów o małej zawartości białka, co może w dużym stopniu zapobiec uszkodzeniu mózgu. Aby uniknąć gwałtownego zwiększenia stężenia amoniaku we krwi, pożywienie należy rozłożyć na częste, niewielkie posiłki. Hiperamonemia typu I. Opisano ok. 24 przypadków niedoboru syntetazy karbamoilofosforanowej (reakcja 1, ryc. 31-14). Jest to prawdopodobnie zaburzenie rodzinne. Hiperamonemia typu I I . Zaburzenie to

jest związane z chromosomem X i powoduje je niedobór transkarbamoilazy ornitynowej (reakcja 2, ryc. 31-14). U matek także występuje hiperamonemia i niechęć do pokarmów bogatobiałkowych. Stałym objawem jest zwiększone stężenie glutaminy we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym i moczu. Przypuszczalnie odzwierciedlą to zwiększoną syntezę glutaminy przez syntćjaSe glutaminową spowodowaną zwiększony natężeniem amoniaku w tkankach.

356 / ROZDZIAŁ 31

Cytrułinemia. To rzadkie zaburzenie jest prawdopodobnie dziedziczone jako cecha recesywna. Znaczne ilości (1—2 g na dobę) cytruliny wydalają się z moczeni i zarówno w osoczu, jak i w płynie mózgowo-rdzeniowym stężenie cytruliny jest znacznie zwiększone. U 1 chorego zaobserwowano całkowity brak aktywności syntctazy argminobursztynianowej (reakcja 3, ryc. 31-14). U innego Kmdla cytmliny była 25 razy większa od wartości prawidłowej. Sugeruje to mutację powodującą znaczną, ale nie ,,letalną", modyfikację miejsca katalitycznego syntetazy. Cytrulina (i argininobursztynian; p. niżej) może służyć jako nośnik azotu, skoro zawiera ona azot przeznaczony do syntezy mocznika. Podawanie argininy zwiększa u tych chorych wydalanie cytruliny. Podobnie podawanie benzoesanu nasila wbudowywanie azotu amoniaku w hipuran przez glicyne fp. ryc. 33-1).

Acyduria argininobursztynianowa. Ta

rzadka, recesywnie dziedziczna choroba, charakteryzująca się zwiększonym stężeniem argininobursztynianu we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym i moczu, często wiąże się z występowaniem łamliwych, rosnących kępkami włosów (trichorrhexis nodosa). Chociaż są znane zarówno wczesne, jak i późniejsze początki choroby, pojawia się ona zawsze w 2 roku życia i zazwyczaj kończy się zgonem w dzieciństwie. Acyduria argininobursztynianowa jest skutkiem braku aktywności argininobursztynazy (reakcja 4, ryc, 31-14). Hodowane fibroblasty skóry zdrowych ludzi zawierają ten enzym, natomiast nie stwierdza się jego obecności w fibroblastach chorych z acydemią argininobursztynianowa.. Argininobursztynaza nie występuje również w mózgu, wątrobie, nerkach i erytrocytach chorych z tym zaburzeniem. Chociaż można je łatwo zdiagnozować. na podstawie dwuwymiarowej chromatografii bibułowej moczu, po wybarwieniu pojawiają się nieprawidłowe plamki z powodu tendencji argininobursztynianu do tworzenia cyklicznych bezwodników, to potwierdzeniem rozpoznania jest pomiar erytrocytarnego stężenia argininobursztynazy. W celu wczesnego wykrycia zaburzenia,

ten test można przeprowadzić na krwi z pępowiny. Ponieważ argininobursztynaza jest obecna w komórkach z płynu owodniowego, możliwa jest również diagnoza przez nakłucia owodni. Z powodów opisanych przy omawianiu cytrulinemii, podawanie argininy i benzoesanu sprzyja znacznemu wydalaniu azotu również u tych chorych. Hiperargininetnia. To zaburzenie w syntezie mocznika charakteryzuje sie zwiększonym stężeniem argininy we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym, małym stężeniem arginazy w erytrocycie (reakcja 5, ryc. 31-14) i składem aminokwasów w moczu przypominającym lizyno-cystynurię. Prawdopodobnie skład ten odzwierciedla współzawodnictwo argininy z Hzyną i cysty ną w reabsorpcji w kanaliku nerkowym. U chorych z hiperargininemią ubogobiałkowa dieta zmniejsza stężenie amoniaku w osoczu i powoduje zanik profilu aminoacydurii, obserwowanej w lizyno-cystynurii.

PIŚMIENNICTWO Adams E, Frank L: Metabolism of proline and the hydroxyprolines. Annu Rev Biochem 19K0;49:1005. Batshaw ML et al: Treatment of inbom errors of urea synthesis: Actwation of alternative pathways of waste nitrogen synthesis and escretion, JV Engl J Med 1982;3«i:1387. Felig P: Amino acid metabolism in man. Annu Rev Biochem 1975;44:933. Msall M et al: Neurologie outeome in chiidren with inborn errors of urea synthesis: Outeome of urea-cydeenzymopathies. NEnglJMed 1984;3Jft]500. Rosenberg LE, Scriver CR: Disorders of amino acid metabolism. Chapter 11 in: Metabotic Contro! and Disease. Bondy PK, Rosenberg LE (cditors). Saunders, 1980. Stanbury JB et al: The Mctabolk Basis oj htherited Disease, 5th ed. McGraw-Hill, 1983. Torchinsky YM: Tran sami na tion: Its discovery, biologicai and clinical aspects (1937-1987). Trends Biochem Sci 1987:12:115. Wellner D, Meister A: A s«rvey of inborn errors of amino acid metabolism and transport in man. Annu Rev Biochem 19S1;5O:911.

Katabolizm szkieletów węglowych aminokwasów

3 2

Victor W. Rodweil, PhD

WPROWADZENIE Ten rozdział dotyczy przekształcenia szkieletów węglowych, pospolitych L-aminokwasów w amfiboliczne związki pośrednie oraz chorób metabolicznych lub „wrodzonych wad metabolizmu" skojarzonych z tymi szlakami metabolicznymi.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Historycznie niektóre zaburzenia w metabolizmie aminokwasów odegrały kluczową rolę w wyjaśnieniu szlaków, w których u zdrowego człowieka aminokwasy ulegają przemianie. Choroby te należą do rzadkości i wydaje się mało prawdopodobne, aby miała z nimi do czynienia, większość lekarzy praktyków. Zaburzenia te jednak stary się groźnym wyzwaniem dla psychiatry, pediatry, konsultanta z genetyki albo biochemika. Wykrywa się je najczęściej u dzieci. Niejednokrotnie są przyczyną śmierci we wczesnym wieku i nie leczone powodują często nieodwracalne uszkodzenia mózgu. Istotne jest wczesne ich rozpoznanie i natychmiastowe, jeżeli to możliwe, podjęcie właściwego leczenia. Niektóre enzymy związane z wadami metabolizmu aminokwasów dają się wykryć w hodowli komórek płynu owodniowego, wobec tego możliwa jest diagnostyka prenatalna przez nakłucie o wodni. Obecne leczenie polega przede wszystkim na stosowaniu diety ubogiej w aminokwasy, których katabolizm jest uszkodzony. Technologia rekombinacji DNA może ewentualnie dostarczyć środka korygującego wady genetyczne w wyniku „terapii genowej". Te zaburzenia metaboliczne są wyrazem mu-

tacji genetycznych powodujących wytwarzanie białek o zmodyfikowanych strukturach pierwszorzędowych. Podczas gdy niektóre zmiany w sekwencji aminokwasowej enzymów mają tylko niewielki wpływ albo nawet nie okazują żadnego wpływu, inne mogą głęboko naruszać strukturę trzeciorzędową centrów katalitycznych lub regulatorowych. Zmodyfikowany lub zmutowany enzym może mieć zmienioną skuteczność katalityczną (mała wartość Vmai(S, bądź duża Km), albo zaburzoną zdolność wiązania allosterycznego regulatora jego aktywności. Różnorodne mutacje mogą wywoływać te samą chorobę, np, jakaś mutacja, która znacznie zmniejsza funkcję katalityczną liazy argininobursztynianowej (p. ryc. 31-14), wywoła wadę metaboliczną znaną jako kwasica (acydemia) argininobursztynianowa. Jest jednak wielce nieprawdopodobne, aby wszystkie przypadki tej kwasicy reprezentowały tę samą zmianę struktury pierwszorzędowej liazy argininobursztynianowej. Na poziomie cząsteczek są to odrębne choroby molekularne. Niektóre znane zaburzenia metabolizmu aminokwasów omówiono w tym rozdziale. Po inne przykłady Czytelnik powinien sięgnąć do ważniejszych publikacji przeglądowych, które specjalizują się w tym zagadnieniu, np. Scriver i wsp. The Mełabolic Basie of Inherited Disease, wyd. 6, 1989.

AMINOKWASY SĄ PRZEMIENIANE W SUBSTRATY DO BIOSYNTEZY WĘGLOWODANÓW I LIPIDÓW Prace badawcze z okresu 1920—1940 dotyczące odżywiania, potwierdzone przez doświadczenia przeprowadzone w latach 1940—1950,

358 / ROZDZIAŁ 32

Ac8ioacetyto-CoA

Asparagmtan Lys Phe Trp Tyr

Asn

Tabela 32-1. Losy szkieletów węglowych powszechnie występujących L- a -aminokwasów Aminokwasy przekształcone w amfiboliczne związki pośrednie tworzące glikogen i tłuszcza glikogen tłuszcze (aminokwasy (aminokwasy (aminokwasy glukogenne) ketogenne) i ketogenne} Ala

Hyp

Arg Asp

Met Pro Ser Thr Val

Cys

Glu Glv His

Leu

Ile Lys

Phe Trp Tyr

z użyciem aminokwasów znakowanych izotopowo, podtrzymały pogląd, o wzajemnej przekształca Iności atomów węgla tłuszczu, węglowodanu i białka oraz ustaliły, że każdy amino-

Ryc. 32-1. Amfiboliczne produkty pośrednie powstające ze szkieletu węglowego aminokwasów.

kwas może być przemieniany bąóż w węglowodan (13 aminokwasów), tłuszcz (1 aminokwas), bądź w oba typy tych związków (5 aminokwasów) (tab. 32-1). Rycina 32-1 przedstawia przebieg owych wzajemnych przekształceń.

REAKCJĄ WSTĘPNĄ DLA WIELU AMINOKWASÓW JEST USUNIĘCIE AZOTU (-AMINOWEGO Usunięcie azotu ac zazwyczaj (ale nie zawsze, przykładem: prolina, hydroksyprolina, lizyna) obejmuje transaminację. A20t ten, jak tylko zostanie usunięty, może być wykorzystany w procesach anabolicznych (np. w biosyntezie białka) Jub przekształcony w mocznik i wydalony. Pozostający szkielet węglowy, wolny od azotu, w większości przypadków jest utlenionym węglowodorem, ulegającym degradacji do ainfibolicznych związków pośrednich w reak-

KATAB0L1ZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 359

H.O H-C-l COO" LAsparaglna

PYR

CT

|ASPARAGINAZA I

ALA

AMINOTRANSFERAZ/ COO LAsparaginian

V GLUTAMINAZA COO" LGlutamlna

Szczawiooctan

PYR

NH.

H,o

C-0

cocr

ALA

c=o I COO" a-

CHj, CH;

AMINOTRANSFBWA Ketag tu taran L-Giulamlnlan

coo -

Ryc, 32-2. Katabolizm L-asparaginy (góra) i L-glutaminy (dól) w amfiboliczne związki pośrednie. PYR — pirogronian, ALA — L-alanina. Zaciemnienie grup funkcyjnych na tej rycinie i następnych uwydatnia części cząsteczek ulegające przemianie chemicznej.

cjach podobnych do tych, przy udziale których inne utlenione węglowodory są katabolizowane. Deamidacja asparaginy dostarcza asparaginianu, który ulega transami nacji, tworząc szczawiooctan Wszystkie 4 węgle asparaginy i asparaginianu przekształcają się w szczawiooctan przy udziale asparaginazy i aminotransferazy (ryc. 32-2, góra). Nie jest znana wada metaboliczna związana z tym krótkim szlakiem kata bo licznym. Wada w transaminacji może mieć konsekwencje, które nie są do pogodzenia z życiem, ponieważ aminotransferazy spełniają centralne funkcje zarówno w anabolizmie, jak i w katabolizmie. Deamidacja glutaminy dostarcza glutaminianu, który ulega transami nacji, tworząc a-ketoglutaran Katabolizm glutaminy i glutaminianu przebiega podobnie jak asparaginy i asparaginianu, ale z powstaniem ct-ketogmtaranu (2-oksoglutaranu*) (ryc. 32-2. dól). Wprawdzie zarówno glut a mi niań, jak i asparaginian są substratami dla tej samej aminotransferazy, deamidację asparaginy i glutaminy katalizują odrębne enzymy: glutaminaza i asparaginaza. Przyp. tłum.

Prawdopodobnie z powodów podanych powyżej dla asparaginy i asparaginianu nie są znane wady metaboliczne szlaku katabolicznego glutamina—glutaminian. Wszystkie 5 atomów węgla proliny tworzą -j-ketoglutaran Prolina utlenia się do dehydroproliny, która po przyłączeniu cząsteczki wody tworzy y-semialdehyd glutaminianu. Ulega on utlenieniu do glutaminianu i transaminacji do ot-ketoglutaranu (ryc. 32-3, na lewo). Opisano 2 genetycznie odrębne hiperprolinemie, obie jako wyraźnie autosomalne cechy recesywne. Pomimo opóźnienia w rozwoju umysłowym w połowie znanych przypadków, żaden typ nie zagraża życiu. Hiperprolinemia typu I. Miejscem bloku metabolicznego w tej hipcrprolinemii jest dehydrogenaza prolinowa (ryc. 32-3). W przeciwieństwie do hiperprolinemii typu II, brak tu uszkodzenia katabolizmu hydroksyproliny. Heterozygoty typu I wykazują tylko łagodną hiperprolinemię. Model zwierzęcy, mysz Pro/Re, ma tylko 10% aktywności dehydrogenazy prolinowej prawidłowej wątroby, Hiperprolinemia typu I I . Blok metaboli-

czny jest umiejscowiony w dehydrogenazie, która katalizuje utlenianie 7-semialdehydu glutaminianu do glutaminianu (ryc. 32-3). Enzym ten funkcjonuje w katabolizmie hydroksy proliny (p. niżej). Okazuje on zatem wpływ zarówno na

DEHYDROGENAZA PROLINOWA

360 / ROZDZIAŁ 32

REAKCJA NIEENZYMATYCZNA

L-Ornltyna N H/ a-Keloglutaran AMINOTHANSFERAZA

y-Se ml aldehyd L-

glutamlnlanu

NAD"1 0EHYDH0GENA2A SEMIALDEHYDOL--GLUT AMINOWA

NADH+H+

CH

L-Glutammlan i

^-Pyr

AMIŃOTRANSFEHAZA| (

^-Ala O

n-Ketoglutaran

Ryc. 32-3. Katabolizm proliriy (na lewo) 1 L-argininy (na prawo) w a-ketoglularan. Cyfry w kółkach zaznaczają miejsca wad metabolicznych. 1 — hiperprolinemia typu I, 2 — hiperprolinemia typu II, 3 — hiperargininemia (p. rozdz. 31),

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 361

katabolizm proliny, jak i hydroksyproliny, a mocz zawiera A^pirolinoO-hydroksy^-karboksytan, kataboiit hydroksyproliny (p. ryc. 32-12). Heterozygoty typu II, niepodobnie do heterozygot typu I, nie wykazują żadnej hiperprolinemii. Arginaza przekształca argininę w ornitynę, która, ulegając transaminacji na węglu s, tworzy oc-ketoglutaran Wprawdzie arginina i histydyna również tworzą a-ketoglutaran, najpierw z tych 6-węglowych aminokwasów muszą zostać usunięte: 1 atom węgla oraz 2 (histydyna) lub 3 (arginina) atomy azotu. W przypadku argininy proces ten wymaga tylko 1 etapu; hydroli ty czne go usunięcia grupy guanidynowej. katalizowanego przez arginazę. Produkt reakcji, ornityna, ulega wtedy transaminacji na grupie 5-amitiowej, tworząc y-semialdehyd glutaminianu, który przekształca się w a-ketoglutaran w sposób opisany powyżej dla proliny (ryc. 32-3).

AMONIAKOLIAZA HISTYDYNOWĄ

HYDRATAZA UR0KAN1AN0WA (UROKANAZA)

Hiperargininemię, zaburzenie metaboliczne spowodowane niedoborem arginazy, omówiono w rozdz. 31 wraz z wadami metabolicznymi cyklu mocznikowego, Katabolizm histydyny ostatecznie dostarcza oc-ketoglutaranu W przypadku histydyny usuniecie zbędnego atomu węgla oraz azotu wymaga 4 reakcji (ryc. 32-4). Deaminacja histydyny wytwarza urokanian. Przekształcenie urokanianu w 4-imidazoIono-5-propioaian, katalizowane przez urokanazę, obejmuje zarówno przyłączenie cząsteczki wody, jak i wewnątrzcząsteczkowa reakcję oksydoredukcyjną. Wprawdzie 4-imidazolono-5-propionian może sie włączyć w dodatkowe szlaki metaboliczne, jego przekształcenie w a-ketoglutaran obejmuje hydrolizę do Nformiminoglutaminianu, a następnie przeniesienie grupy formiminowej na węgiel ot tetrahydrofolianu, z utworzeniem N5-fonniminotetrahydrofolianu. U chorych z niedoborem kwasu foliowego zachodzi częściowe lub całkowite zablokowanie tej oslatniej reakcji i N-formiminoglutaminian (Figlu) jest wydalaRvc. 32-4. Katabolizm L-histydyny w a-ketogfutaran. Reakcja katalizowana przez amonia-koliazę histydynową (Inaczej: histydaza — nazwa nie zatecana) reprezentuje miejsce prawdopodobnej wady metabolicznej w histydynemii.

O

o

N- Fo rm Im inog! utam i n ia n (Figlu) H,folian FORM1MINOTRANS FEH AZA GLUTAM1NIAN0WA N°-Formi(nino -H,folian

4

a

L-G lutami niań

[AMINOTRANFERAZAJ

V

■O

6

4 a-Kato gluta ran

362 / ROZDZIAŁ 32

ny w moczu. To stało się podstawą testu na niedobór kwasu foliowego. Polega on na wykrywaniu w moczu N-formiminoglutaminianu po wprowadzeniu dużej dawki histydyny. Histydynemia jest dziedziczona jako autosomalna cecha recesywna. Ponad polowa dotkniętych nią osób jest opóźniona w rozwoju umysłowym i wykazuje charakterystyczną wadę wymowy. W uzupełnieniu do zwiększonych zawartości histydyny we krwi i w moczu zwiększa się wydalanie imidazolopirogronianu (który w barwnej próbie z chlorkiem żelazowym może być pomylony z fenylopirogronianem i stać się przyczyną błędnego rozpoznania fenyloketonurii). Metaboliczną wadą w histydynemii jest niedostateczna aktywność w wątrobie amoniako-liazy histydynowej (inaczej: histydazy — nazwa nie zalecana), co uszkadza przekształcanie histydyny w urokanian (ryc. 32-4). Sprzyja to transami nacji do imidazolopirogronianu. W moczu wydala się nadmiar imidazolopirogronianu, a także produktów jego redukcji, tj. imidazolooctanu oraz imidazolomleczanu. Wydatne zwiększenie wydalania histydyny cechuje prawidłową ciążę. Jest to odzwierciedleniem zmian w czynności nerek. 6 AMINOKWASÓW TWORZY PIROGRON1AN Wszystkie atomy węgla glicyny, alaniny, cysteiny i seryny — ale tylko 2 atomy węgla treoniny — formują pirogronian, który może być następnie przekształcony w acetylo-CoA. L-Treonina

I

m

O L-Seryna

Mety ten oH41o!lan

Gil cyna

Ryc. 32-5. Łatwo odwracalna reakcja hydroksymetylotransferazy serynowej. H4 foilan — tetrahydrololian.

wane przez kompleks syntazy glicynowej. Ta odwracalna reakcja (ryc. 32-6) pod niektórymi względami przypomina przemianę pirogronianu w acetylo-CoA przy udziale enzymów kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej. Oba kompleksy stanowią makromolekularne agregaty w mitochondriach wątroby. Reakcje systemu rozszczepiającego glicynę są prawdopodobnie główną drogą nie tylko w katabolizmie glicyny, lecz także seryny u ludzi i wielu innych kręgowców. Glicynuria. To rzadko występujące zaburzenie charakteryzuje się nadmiernym wydalaniem glicyny w moczu i tendencją do tworzenia szczawianowych kamieni nerkowych. Wydaje się ona być cechą dominującą, prawdopodobnie sprzężoną z chromosomem X. Przy prawidłowych stężeniach glicyny w osoczu, wydalanie tego aminokwasu w moczu sięga 8,1—13,5 mmol/24 h (600—1000 mg/24 h), wobec czego glicynurię przypisuje się niewydolności wchłaniania zwrotnego (Inaczej: reabsorpcji) glicyny w kanalikach nerkowych.

Pierwotna hiperoksaluria. Charaktery-

Glicyna I L-Sery na Cysty na

I

H^Folian

L-

i

L- Alanina -• Pirogronian*-L-Cystei na

I

Acetylo-CoA

Katabolizm glicyny przebiega z udziałem rozszczepiającego ją systemu Wprawdzie glicyna może utworzyć pirogronian w wyniku przekształcenia w serynę (ryc. 32-5), główny szlak katabo]izmu glicyny u kręgowców obejmuje przekształcenie w CO2, NH + i Ns, N'°-metylenotetrahydrofolian, katalizo-

zuje się ciągłym, wzmożonym wydalaniem w moczu szczawianów, niewspółmiernym do ich pobierania w pożywieniu. W następstwie postępującej obustronnie szczawiano-wapniowej kamicy moczowej, wapnicy nerek {nephrocakinosis) i nawracającego zakażenia dróg moczowych dochodzi w dzieciństwie lub we wczesnej młodości do zgonu z powodu niewydolności nerek lub nadciśnienia. Nadmiar szczawianów najwidoczniej pochodzi z glicyny, która może ulec deaminacji do glioksylanu, prekursora szczawianu. Wada metaboliczna jest zaburzeniem przemiany glioksyjanu związanym z zaburzeniem w katabolizmie glioksylanu, którego nadmiar utlenia się do szczawianu.

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 363 H.Follan

,O~ + NAD

■*-

PLP

NH4 + + NAOH + H+

SYNTAZA GLICYNOWA

o Gllcyna Ryc. 32-6. Odwracalne przesunięcie glicyny przez mitochondrialny kompleks syntazy glicynowej. PLP — fosforan pirydoksalu.

NH ■

HX

HO

T o

O

L-Seryna

c

NH

' -c-°"

L-Alanina

DEHYDRATAŻA 1 SERYNOWA

Ryc. 32-7. Przemiana alaniny i seryny w pirogronian. Reakcje katalizowane zarówno przez aminotransferazę alaninową, jak i dehydratazę serynową wymagającą fosforanu pirydoksalu. Reakcja katalizowana przez dehydratazę serynowg przebiega z usunięciem cząsteczki H 2O z seryny, tworząc nienasycony aminokwas. Ten jest przeorganizowany w cc-iminokwas, który samorzutnie hydrolizuje do pirogronianu i amoniaku. Glu — glutami niań, oc-KG — a-ketoglutaran.

Tran sam i nacja alaniny dostarcza pirogronianu Pirogronian utworzony w wyniku transaminacji alaniny (ryc. 32-7) może być dekarboksylowany do acetylo-CoA, w reakcji katalizowanej przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej. Prawdopodobnie, z przyczyn wymienionych przy katabolizmie glutaminianu i asparaginianu, nie wykryto żadnego metabolicznego zaburzenia w katabolizmie a-alaniny. Katabolizm seryny przebiega poprzez jej przekształcenie w glicynę Przemiana seryny w pirogronian, katalizowana przez dehydratazę serynową, enzym z fosforanem pirydoksalu, obejmuje usunięcie cząsteczki wody i hydrolityczną stratę amoniaku z intermediatu aminokwasu (ryc. 32-7). Wprawdzie w wątrobie szczura i świnki morskiej przekształcenie seryny w pirogronian katalizuje dehydrataza serynową, u człowieka i wielu innych kręgowców seryna rozpada się głównie do glicyny oraz N5,N1(1-metylenotetrahydro foliami. Reakcję początkową katalizuje hydroksymetylotransferaza serynowa (ryc. 32-5). Dalszy katabolizm seryny pokrywa się z katabolizmem glicyny {ryc. 32-6).

Reduktaza cystynowa redukuje cystynę do cysteiny Siarka, podobnie jak węgiel i azot, ulega ciągłej recyklizacji w biosferze w wyniku zespolonych aktywności metabolicznych organizmów prokariotycznych i eukariotycznych. Ssaki uczestniczą w tym cyklu przez katabolizm organicznych związków siarki w nieorganiczne. Na przykład człowiek wydala 20—30 mmol siarki na dobę, przeważnie w postaci nieorganicznych siarczanów. Głównym katabolicznym przeznaczeniem cystyny u ssaków jest jej przekształcanie w cysteinę, katalizowane przez reduktazę cystynowa (ryc. 32-8). Katabolizm cystyny łączy się następnie z katabolizmem cysteiny. Przekształcenie cysteiny w pirogronian może obejmować wstępną reakcję utleniania Katabolizm cysteiny odbywa się w 2 szlakach: bezpośredniego utleniania (suliinian cysteiny) i szlaku transaminacji (3-merkaptopirogronian). Przekształcanie cystyny w sulfinian cysteiny (ryc. 32-9) jest katalizowane przez dioksygenazę cysteinową, enzym wymagający Fe2+ i NAD(P)H. Dalszy katabolizm cysteinosulfinianu obejmuje prawdopodobnie transami-

364 / ROZDZIAŁ 32

1

&

N

REDUKTAZA CYSTYNOWA!

ł

! CH,

O "

ł

NADH + H

NAD

i

II

L-

II O

Cyslyna Ryc. 32-8.Reakcja katalizowana przez reduktaze

L-Cystelna

cystynowa

NH3+

T O

Cystelna [O]

a-K eto kwas

DIOKSYGENAZA \ CYSTEINOWA

{(-Aminokwas

J

AMiNOTRANSFERA ZA

L-Cysteinosulfinlfln

9 H,C'^C' a-Aminokwas

0

C II O

"

Plrogronian 3-Markaptoptrcgranian (tło piróg ronlan)

0-Sufflnylopirooronlan [SWHKOTHANSFE DESULFINAZA

h 2" C

A

Plrogronlan

DEKYDROGENAZA MLEC2AN0WA

2H

3

1

C

HS

3-Merkaptomleczan

NADH H

HXS NAD+ Ryc. 32-9. Katabolizm L-cysteiny na szlaku bezpośredniego utlenienia (cysteinosulfinian) (na lewo) oraz na szlaku transaminacji (3-merkaptopirogronian) (naprawo),p-sulfinylopirogronian jest przypuszczalnym związkiem pośrednim. Utlenienie siarczynu, utworzonego w ostatniej reakcji na szlaku bezpośredniego utleniania, jest katalizowane przez oksydazę siarczynową, st-KA — a-ketokwas, a-AA — a-aminokwas.

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 365

nację do [ł-sulfinylopirogronianu, chociaż ten katabolit powinien być jeszcze wyizolowany. Przekształcenie p-sulfinylopir ogromami wpirogronian i suMInian może nie być katalizowane enzymatycznie. Desulfinacja zachodzi niezwykle szybko, nawet w nieobecności katalizy enzymatycznej. Wstępna transaminacja cysterny dostarcza 3-merkaptopirogronianu Swoiste aminotransferazy: cysteinowa oraz glutaminianowa bądź asparaginianowa z wątroby i nerek ssaków katalizują odwracalną transaminację cysteiny w 3-merkaptopirogronian (tiolopirogronian) (ryc. 32-9). Cząsteczka 3-merkaptopirogronianu może następnie zostać zredukowana przez dehydrogenazę L-mleczanową. Produkt, 3-merkaptomleczan, prawidłowy składnik moczu ludzkiego w postaci jego mieszanego disiarczku z cysteiną, wydala się w zwiększonych ilościach z moczem chorych Ł

nia atomu siarki*^ tworząc pirogronian i H2S (ryc. 32-9). W tabeli 32-2 podsumowano znane zaburzenia katabolizmu aminokwasów siarkowych.

Cystynuria (cystyno-lizynuria) W tej

dziedzicznej chorobie metabolicznej wydalanie cystyny z moczem przewyższa 20—30-krotnie wartości prawidłowe. Towarzyszy temu również znaczne zwiększenie wydalania lizyny, argininy i ornityny, co sugeruje upośledzenie mechanizmów wchłaniania zwrotnego w nerkach tych 4 aminokwasów. „Cystynuria" jest więc nazwą niewłaściwą. Cystyno-lizynuria może być teraz preferowanym terminem opisowym tej choroby. Z powodu względnej nierozpuszczalności cystyny, u chorych z cystynuria wytrąca się ona w kanalikach nerkowych i tworzy kamienie cystynowe. Gdyby nie możliwość takiego powikłania, cystynuria byłaby zupełnie nieszkodliwą wadą.

disulfidurią merkaptomleczano-cysteinową. Al-

ternatywnie, 3-merkaptopirogronian ulega desulfuracji (odsiarczaniu, ij. reakcji odszczepie-

Przyp. tlura.

Tabela 32-2. Wrodzone wady w metabolizmie aminokwasów zawierających siai Nazwa Wada Hornocystynuria 1 Homocystyrturia II Homocystynuria III

f)-syntaza cystati on inowa Reduktaza N 5,NT0-mety len otetra hydrofolianowa Mała aktywność transmetylazy Ns-metylotetrahydrofoliano-homocystei nowej wskutek niezdolności do syntezy merylokobalaminy

kę

Odsyłacze

Ryc 30-9, reakcja 1

Homocystyrturia IV

Mała aktywność transmetylazy Ns-metylotetrahycirofoliano-homocysteinowej wskutek zaburzenia wchłaniania kobalamirsy w jelicie

Hipermeiioninemia

Adenozylotransferaza metioninowa wątroby*

Ryc. 32-22

Cysta tionimiria

y-Liaza cystationinowa (cystationaza)

Ryc. 30-9, reakcja 2

Sulftturia (sulfocysieinuria) Cysrynoza Disulfidurią 3-merkaptopirogroniano-cysteinowa

Oksydaza siarczynowa 2Laburzenie funkcjonowania lizosomów Siarkotransferaza 3-merkaptopirogronianowa

Ryc. 32-9, legenda Ryc. 32-9

Syndrom niedostatecznej absorp- Niewydolność wchłaniania metioniny cji metioniny z jelita Może również występować w cystationirturii, tyrozynemii i nietolerancji na fruktozę.

366 / ROZDZIAŁ 32

wstawać kosztem cysteiny, zmniejsza skłonność do tworzenia kryształów cystyny i kamieni.

CH 2 -$-S-CH 2 HCNH 3+

CH2

COO-

Cystynoza (choroba spichrzania cys-

HCNH,'

ćoo(Cystelna)

(Homocysteina}

Ryc. 32-10. Mieszany disiarczek cysieiny i homocysteiny.

Mieszany disiarczek L-cysteiny i L-homocysteiny (ryc. 32-10), występujący w moczu chorych z cystynurią, jest nieco lepiej rozpuszczalny niż cystyna. Rozległość, w jakiej on może poHO

tyny). W cystynozie, która jest również chorobą dziedziczną, kryształy cystyny odkładają się w wielu tkankach i narządach (szczególnie w układzie siateczko w o-śródbłonko wy m). Towarzyszy jej zazwyczaj uogólniona aminoaeyduria. Inne czynności nerek są również przeważnie uszkodzone, a chorzy zwykle umierają we wczesnym wieku z wszystkimi objawami ostrej niewydolności nerek. Homocystynurie. Częstotliwość występowania tych wrodzonych wad katabolizmu metioniny ocenia się na ok. 1/160000 urodzeń. Homocystyna (do 2,22 mmol/24 h = 300 mg/24 h),

^H +

Treonina

LALDOLAZA TREONINOWA

O

^H3+

ROZSZCZEPIENIE GLICYNY CO 2 + NH 4 +

CH3

+Metylen oH4fo1lan

Aldefryd octowy

(P- W- 32-

FAD EHYDROGENAZA ALDEHYDOWA

O

O

Aoetyto-CoA

Gllcyna HYDROKSYME7YLOTHANSFERAZA SEHYNOWA H 4 F o il a n */

Mg-ATP

H2C (p. ryc. 32-7)

Mg-ADP

HO L-Seryna

NADH+H i-C o A

DEHYDHATAZA SEHYNOWA

NH4CO,

NAD"

O

CoA«SH Pircgronian DEHYDBOGENAZA PIROGHONIANOWA

Ryc. 32-11. Przemiana treoniny i glicyny w serynę, pirogronian i acetylo-CoA, f — formylo[5-10]tetrahydrofolian

B 10

-Hłfolian

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 367

w niektórych przypadkach wraz z S-adenozylometioniną jest wydalana z moczem, a stężenie metioniny w osoczu się zwiększa. Homocystynuria powoduje przynajmniej 4 wady metaboliczne (tab. 32-2). Kliniczne objawy towarzyszące homocystynurii typu I to: zakrzepica, osteoporoza (zrzeszotnienie kości), zwichnięcie soczewek w oczach oraz często opóźniony rozwój umysłowy. Znane są 2 postacie tej choroby, tj. wrażliwa i niewrażliwa na witaminę Bfi. Zmianom chorobowym zapobiega stosowanie diety z matą zawartością metioniny, a dużą — cysteiny, jeżeli zostało rozpoczęte odpowiednio wcześnie. Inne typy homocystynurii odzwierciedlają wady w cyklu remetylacji (tab. 32-2).

DEHYDROGENAZA HYDROKSYPROLINOWA

L-A'-P iro II no -3-hyd roksy-5-karbo ksyl an

Aldolaza treoninowa inicjuje katabolizm treoniny Przy udziale aldolazy treoninowej treonina rozszczepia się do glicyny oraz aldehydu octowego, który tworzy następnie acetylo-CoA (ryc. 32-11). Katabolizm glicyny omówiono powyżej. Katabolizm hydroksyproliny przypomina katabolizm proliny Cząsteczka 4-hydroksy-L-proliny przekształca się w pirogronian i glioksylan (ryc, 32-12), Mitochondrialna dehydrogenaza katalizuje przekształcenie hydroksyproliny w L-A1-piro-! ino-3-hydroksy-5-karboksylan. Pozostaje on w nieenzymatycznej równowadze z Y-semialdehydem 7-hydroksy-L-glutaminianu, utworzonym po dodaniu cząsteczki wody. Semialdehyd utlenia się do odpowiedniego kwasu karboksylowego, e ry tro-y- hy dr oksy- L-glutaminianu i ulega transaminacji do a-ket0-7-hydro ksyglutaranu. Rozszczepienie typu aldolowego dostarcza glioksylanu oraz pirogronianu.

REAKCJA NIEENZYMATYCZNA

OH 4

y-Semlaldehyd y-hydroksy-L-gtutaminianu

NAD1 [2) [DEHYDROGENAZA

c^ cr

cHf

11

n

o

o

Erylro-y-hyd ro kay- L-glutamlnian a-

KA [AM1NOTRANSFERAZA|

Hiperhydroksyprolinemia. Charaktery-

o

zuje się dużym stężeniem 4-hydroksy pro liny w osoczu. Miejscem zaburzenia metabolicznego tej autosomalnej cechy recesywnej jest dehydrogenaza 4-hydroksy pro linowa (ryc. 32-12). W przeciwieństwie do hiperprolinemii typu II, nie towarzyszy temu uszkodzenie katabolizmu

c

k'°i

«-Keło-y-hydrokByglutaran

ALDOLAZA

Ryc. 32-12. Związki pośrednie w katabolizmie Lhydroksyproliny, st-KA — a-ketokwas, a-AA — aaminokwas. Cyfry w kółku reprezentują miejsca wad metabolicznych: 1 — hiperhydroksyprolinemia, 2 — hiperhydroksyprolinemia typu II.

II

o

Glioksylan

M,

O Pirogr onian

368 / ROZDZIAŁ 32

proliny, ponieważ zaatakowany enzym funkcjonuje jedynie w katabolizmie hydroksyproliny. Stan ten nie ma żadnego wpływu na metabolizm kolagenu i, podobnie do hiperproHnemii, wydaje się być nieszkodliwy. 12 AMINOKWASÓW TWORZY ACETYLO CoA Wszystkie aminokwasy tworzące pirogronian (alanina, cysteina, cystyna, glicyna, hydroksyprolina, seryna i treonina) dostarczają acetylo-CoA (przypomnij dehydrogenazę pirogronianową). Ponadto 5 aminokwasów formuje acetylo-CoA bez wstępnego wytwarzania pirogronianu. Te obejmują fenytoalaninę, tyrozynę, tryptofan, lizyne i leucynę. 5 kolejnych reakcji przekształca tyrozynę w fumaran i acetooctan Kilka związków pośrednich metabolizmu tyrozyny (ryc. 32-13) odkryto podczas badania choroby genetycznej u ludzi — alkaptonurii. Chorzy z alkaptonurią wydzielają homogentyzynian w moczu i wiele pożytecznych informacji uzyskano przez ich odżywianie prekursorami homogentyzynianu.

Transaminacja tyrozyny dostarcza p-hydroksyfenylopirogronianu. Transaminację tyrozyny do p-hydroksyfenylopirogronianu katalizuje aminotransferaza tyrozynowa (aminotransferaza tyrozyna: a-ke togi u taran), tj. ulegający indukcji enzym wątroby ssaków.

Dioksygenaza4-hydroksyfenylopirogronianowa (inaczej: hydroksylaza p-hydroksyfenylopirogronianowa). metaloproteina zawierająca miedź, utlenia p-hydroksyfenylopirogronian do homogentyzynianu. Chociaż ta reakcja (ryc. 32-13) wydaje się obejmować hydroksylację /7-hydroksyfenylopirogronianu w położeniu orto, z towarzyszącą oksydacyjną utratą węgla karboksy 1 owego, w rzeczywistości polega ona na wędrówce łańcucha bocznego. Hydroksylacja pierścienia i wędrówka łańcucha bocznego zachodzi w sposób zgrany. Ze względu na to, że fizjologicznym czynnikiem redukującym jest askorbinian, chorzy z gnilcem (szkorbutem) wydalają niecałkowicie utlenione produkty metabolizmu tyrozyny. Enzym 1,2-dioksygenaza homogentyzynianowa (inaczej: oksydaza homogentyzy-

nianowa — nazwa nie zalecana), metaloproteina zawierająca żelazo, otwiera pierścień aromatyczny. Pierścień benzenowy homogentyzynianu zostaje rozerwany, formując maleiloacetooctan w reakcji oksydacyjnej katalizowanej przez 1,2-dioksygenazę homogentyzymanową wątroby ssaków.

Izomeryzacja z następczą hydrolizą tworzy fumaran oraz acetooctan. Przekształcenie maleiloacetooctanu w fumaryloacetooctan, czyli izomeryzację cis w trans, katalizuje izomeraza cis, trans maleiloacetooctanowa. W wyniku hydrolizy fumaryloacetooctanu, przy udziale hydrol azy fumaryloacetooctanowej (inaczej: fumaryloacetoacetazy), powstaje fumaran i acetooctan. Acetooctan może następnie przekształcić się w acetylo-CoA i octan w reakcji, którą katalizuje acylotransferaza acetylo-CoA (inaczej: p-ketotiolaza — nazwa nie zalecana) (p. rozdz. 23). Kilka zaburzeń metabolicznych charakteryzuje się tyrozynemią, tyrozynurią i fenyloacydurią Tyrozynemią typu I (tyrozynoza). W tyrozynozie nagromadzenie metabolitów niekorzystnie wpływa na aktywność kilku enzymów i systemy transportu. Patofizjologia jest zatem złożona. Wada metaboliczna tkwi przypuszczalnie w hydrolazie fumaryloacetooctanowej (ryc. 32-15) i prawdopodobnie również w hydrolazie maleiloacetooctanowej. Znane są zarówno ostre, jak i przewlekłe postacie tyrozynozy. W ostrej tyrozynozie u niemowiąt występuje biegunka, wymioty, „zapach przypominający kapustę" oraz brak prawidłowego rozwoju i wzrostu. Zgon z powodu niewydolności wątroby, w przypadku nie leczonej ostrej tyrozynozy, następuje w ciągu 6—8 miesięcy, W tyrozynemii przewlekłej podobne, ale łagodniejsze, objawy prowadzą do zgonu w wieku 10 lat. W osoczu zwiększa się stężenie tyrozyny (0,33 —0,67 mmol/l = 6—12 mg/dl) jak również dodatkowych aminokwasów, szczególnie metioniny. Leczenie obejmuje dietę z małą zawartością tyrozyny i fenyloalaniny, a niekiedy także metioniny.

Tyrozynemia typu II (zespół Richne-

ra-Hanharta). Prawdopodobnym umiejscowieniem wady metabolicznej w tyrozynemii typu II jest aminotransferaza tyrozynowa wątroby (ryc. 32-13). Klinicznie stwierdzone zmiany obejmują: zwiększone stężenie tyrozyny w osoczu (0,22—0,27 nunol/l=4—5 mg/dl)

DIOKSYGENAZA < FEMYLOPIHOGRON1ANOWA Giutaiinn

[O)

V

1,2DIOKSYGENAZA

(O!

Askorbinian, 'CO,

XH, g CH,

c^

**c

MU

II

T AMINOTRANSFERAZA TYROZYNOWA

p -Hydroksyfenylopirogrontan

Maldloacetoodan (przepisano) tnOMOGENTYZYNIANOWA

o

2 O"

MX

II

I ł-HYOROKSY-l RONLANOWA 1

O

O

Fumaryloacetooctan

IZOMERAZA Cis. trans MALEILO-

CD

O

~ CoA O Aoełylo-CoA

X

o c

+ Aoetoootan FUMARYLOACETOACETAZA

CoA^SH ACYLOTRAMSFEHAZA ACETYLO-CoA

r ;

O

Fumaran

-

O

N

Maleiloacetaoctan

\ H; O

o o

Homogantyzynlan

O .T !J

O Octan

Hyc. 32-13. Związki pośrednie w katabolizmie tyrozyny. Wszystkie reakcje, oprócz katalizowanej przez acylotrartsferaze acetylo-CoA, omówiono w tekście. Ponumerowano atomy węgla związków pośrednich, aby Czytelnik mógł śledzić ostateczny los każdego z nich (p. też ryc. 32-15). ot-KG— a-ketoglutaran, G)u — glutaminian, PJ.P — fosioran pirydoksatu. Cyfry w kółkach reprezentują prawdopodobne miejsca wad metabolicznych: 1 — tyrozynemta typu II, 2 — tyrozynemia noworodków, 3 — alkaptonuria, 4 — tyrozynemia typu I lub tyrozynoza.___________________________

I z. o

s

370 / ROZDZIAŁ 32

uszkodzenia narządu wzroku i skóry oraz umiarkowane opóźnienie rozwoju umysłowego. Tyrozyna jest jedynym aminokwasem, którego stężenie w osoczu ulega zwiększeniu. Jednak tzw. klirens nerkowy i wchłanianie zwrotne tyrozyny pozostają w granicach prawidłowych. Metabolitami występującymi w osoczu są: ^hydroksyfenylopirogronian, />-hydro ksyfenylomleczan, /?-hydroksyfenylooctan, N-acetylotyrozyna i tyramina (ryc. 32-14).

Tyrozynemia noworodków (neonata-

łna). Jak sądzi się, zaburzenie to jest wynikiem względnego niedoboru hydroksylazy p-hydroksyfenytopirogronianowej (ryc. 32-13). Zwiększają się stężenia tyrozyny i (enyloalaniny we krwi, a w moczu — tyrozyny, />-hydroksyfeny-

looctanu, N-acetylotyrozyny i tyraminy. Leczenie polega na stosowaniu diety ubogiej w białko. Alkaptonuria. To wrodzone zaburzenie metaboliczne, odnotowane już w XVI stuleciu, scharakteryzowano w 1859 r. Choroba ma duże znaczenie historyczne, stała się bowiem podstawą idei Garroda dotyczących zaburzeń metabolicznych. Najbardziej charakterystycznym objawem klinicznym alkaptonuni jest ciemnienie moczu przechowywanego na powietrzu. W późniejszym stadium choroby następuje uogólniona pigmentacja tkanki łącznej (ochronoza) i pewna postać zapalenia stawów. Wadą metaboliczną jest brak 1,2-dioksygenazy homogentyzynianowej (ryc. 32-13). Substrat, homoOH

AMINOTHANSFERAZA TYHOZYNDWA

DEKARBOKSYLAZA TYROZYNOWA

OH p-Hyd ro ksyfenyl oplfogranian

-NADH + H-

OKSYOAZA TYHAMINOWA

DEHYDROGENAZAI

DEHYDROGENAZA

NADH+H p-Hyd ro ksyfenylooctan

p-Hyctfoksyfenyfom leozan

OH N-Acety] o-L-ty rozyn a p

Ryc. 32-14. Alte rnatywne katabo lity tyrozyny; p-hydroksyfenyloa cetalde hyd tw orzy sie jako zwią zek pośredni podczas utleniania tyram iny do p-hydroksyfenylooctanu.

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 371

gentyzynian, przechodzi do moczu, w którym w obecności powietrza utlenia się do ciemnobrązowego barwnika. Opisano ponad 600 przypadków alkaptonurii. Częstość jej występowania szacuje się na 2—5/1000 000 urodzonych dzieci. Alkaptonuria dziedziczy się jako autosomalna cecha recesywna. Dotychczas nie jest dostępne żadne diagnostyczne postępowanie w celu wykrycia heterozygot. Mechanizm ochronozy obejmuje utlenianie homogentyzynianu prze2 lakkazę (inaczej: oksydazę polifenolową — nazwa nie zalecana), tworzącą octan benzochinonu, który polimeryzuje i wiąże się z wielkocząs teczkami tkanki łącznej.

Liczne zaburzenia metaboliczne cechują szlaki katabolizmu fenyloalaniny Główne zaburzenia metaboliczne z uszkodzoną zdolnością przekształcania fenyloalaniny w tyrozynę (p. ryc. 30-12) mogą być sklasyfikowane w 3 obszerne grupy: wady w 4-monooksygenazie fenyloalaninowej (hiperfenyloalaninemia typu I lub klasyczna fenyloketonuria), wady w reduktazie dihydrobiopterynowej (hiperfenyloalaninemia typu II i III) oraz wady w biosyntezie dihydrobiopteryny (hiperfenyloalaninemia typu IV i V). Zidentyfikowano jeszcze dodatkowe typy (tab. 32-3). Główną konsekwencją nie leczonej hiperfeityloalaninemii typu I (klasycznej fenyloketonurii;

Octan banzochinonu

Hydroksylacja fenyloalaniny tworzy tyrozynę Fenyloalanina jest najpierw przekształcana w tyrozynę przez 4-monooksygenazę fenyloalaninową (inaczej: hydroksylaza fenyloalaninowa) (p. ryc. 30-10). Wzór znakowania w amfibolicznych produktach, fumaranie i acetooctanie(ryc. 32-15), jest więc taki sam jak w przypadku tyrozyny (ryc. 32-13).

r CH,

,ĆH,-COO+

'CO,

CH, H"

"ĆOO-

Fumaran

Aeetooctan Dwutlenek węgla

Ryc. 32-15. Ostateczne losy każdego węgla fenytoalaniny. Obraz znakowania izotopowego w ostatecznych katabolitach lenyloalaniny (i tyrozyny).

l_-Fenyto alanina

skrót — PKU) jest niedorozwój umysłowy. Dodatkowe kliniczne objawy obejmują ataki padaczkowe, psychozy, wyprysk oraz zapach „mysi". Mogą one jednakże nie pojawić się w przypadku wczesnego rozpoznania i podjęcia właściwego leczenia. Ze względu na to, że dostępność modeli zwierzęcych i bezzwłoczna interwencja dietetyczna mogą zapobiec inaczej nieuniknionemu opóźnieniu w rozwoju umysłowym, fenyloketonuria służyła jako model w badaniach takiego niedorozwoju związanego z chorobami metabolicznymi. W klasycznej fenyloketonurii, dziedzicznym zaburzeniu o częstotliwości występowania 1/10000 urodzonych dzieci, stężenie komponentu I, tj. 4-monooksydazy fenyloalaninowej wątroby (p. ryc. 30-10) stanowi w przybliżeniu średnio 25% normy i enzym ten jest niewrażliwy na regulację poprzez fenyloalaninę. Ze względu na uniemożliwione przekształcenie fenyloalaniny w tyrozynę, u chorych wytwarzane są alternatywne katabolity(ryc. 32-16). Zaliczają się do nich: fenylopirogronian (z deaminacji fenyloalaniny), fenylomleczan (z redukcji fenylopirogronianu) i fenylooctan (z dekarboksylacji i utlenienia fenylopirogronianu). Duża część fenylooctanu wydala się z moczem w postaci fenyloacetyl o glutaminy. Tabela 32-4 ilustruje chemiczny obraz krwi i moczu chorego z fenyloketonuria. Wprawdzie fenylopirogronian można oznaczyć za pomocą prostego biochemicznego testu plamkowego, ostateczne rozpoznanie wymaga wykrycia zwiększonego stężenia fenyloalaniny w osoczu. Pogorszeniu sprawności umysłowej dzieci dotkniętych fenyloketonuria daje się zapobiec, jeżeli spożywa się pokarmy z bardzo małą zawartością fenyloaianiny. Przestrzegania diety można zaprzestać w wieku 6 lat, kiedy to duże

372 / ROZDZIAŁ 32 Tabela 32-3.Hiperfenyloalaninemie" Typ

Wada

Przypadek

Leczenie

Brak 4-monooksygenazy lenyloalaninowej Uporczywa hiperfenyloalamnemia Niedobór 4-monooksygenazy fenyloalaninowej Przejściowa łagodna hiperfenyło Opóźnienie w dojrzewaniu 4-monooksygenazy lenylo alaninemia alaninowej Fenyloketonuria

IV V VI VI I

VIII

Dieta z matą zawartością feny loalaniny Żadne, albo czasem leczenie dietetyczne Jak w typie II

Niedobór reduktazy dihydroptery- Niedobór lub brak reduktazy Dopa, 5hydroksytryptofan, dy nowej d i hy d ro pteryd y n o w e j Wada w syntezie dihydrobio- karbidopa Anormalna funkcja dihydrobiopteryny pteryny Dopa, 5hydroksytryptofan, Uporczywa hiperfenyłoalaninemia ? Katabolizm tyrozyny karbidopa i tyrozynemia

Zahamowanie dioksygenazy Zmniejszone pobieranie fe-nyloa taniny 4 - hyd roksy f en y I o p i rog ro -nianowej Witamina C Niedobór: dioksygenazy 4-hydroksyfenyiopirog ronią nowej Dieta z małą zawartością cytoplazmatycznej amityrozyny noiransferazy tyrozynowej fumaryloacetoacetazy

Przejściowa neonatalna tyrozynemia Dziedziczna tyrozynemia

Dieta z małą zawartością tyrozyny oraz wstrzykiwanieglutationu * Zmodyfikowano i reprodukowano za zgodą z: Tourian A, Sidbury JB: Phenytketonuria and hyperphenylalaninemia; s. 273 w: Stanbury JB i wsp. (redaktorzy); The Metabolic Basis of tnherited Disease, wyd. 5,McGraw-Hill, 1983.

Tabela 32-4,Metabolity fenyloalaniny, które gromadzą się w osoczu i moczu chorych na fenytoketonurię Metabolit

Fenyloalanina Fenylopirogronian Fenyiomleczan Fenylooctan Fenyloacetyloglutamina

Osocze mmol/l (mg/ctl)

Mocz mmol/l (mg/dl)

prawidłowe

chory na feny loketonu ric

prawidłowy

chory na fenyloketonurie

0,06-0,12 (1-2)

0,91-3,82 (15-63) 0,18-1,08 (0,3-1,8)

1,82 (30) 5,22-7,83 (200-300)

18,2-66,6 (300-1000) 18,2-133,3 (300-2000) 17,6-33,3 (290-550) zwiększenie 52,7 (2400)

■p

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 373 Fen y to a cety I og I utam i n a +

NH3 LFenyloalanina ot-Ketoglutaran

CONH, Ryc. 32-16. Alternatywne szlaki katabolizmu fenyloalaniny w fenyloketonurii Reakcje zachodzą również w wątrobie osób zdrowych, lecz mają znikome znaczenie w obecności funkcjonującej hydroksylazyfenyloalaninowej. Glu — glutaminian, Gin—glutamina.

stężenia fenyloalaniny i jej pochodnych przestają być groźne dla mózgu. Wprawdzie zawartość fenyloalaniny w osoczu oznacza się za pomocą zautomatyzowanej mikrometody, w której na jedno oznaczenie potrzeba zaledwie 20 ul krwi, nieprawidłowe duże stężenia fenyloalaniny we krwi noworodków mogą wystąpić dopiero w 3. lub 4. dniu życia, a nie bezpośrednio po urodzeniu. Co więcej, u dzieci urodzonych przedwcześnie próba daje niekiedy wynik fałszywie dodatni mi skutek opóźnionego dojrzewania enzymów uczestniczących w katabolizmie fenyioalaniny. Użyteczny, ale mniej wiarygodny, masowy test polega na wykryciu w moczu zwiększonego

stężenia fenylopirojjronianu na podstawie reakcji z chlorkiem żelazowym. Podawanie fenyloalaniny chorym na fenyloketonurię mogłoby spowodować przedłużające się zwiększenie zawartości tego aminokwasu we krwi, dowodzące zmniejszonej tolerancji na fenyl o alaninę. Jednakże u rodziców dzieci chorych na fenyloketonurię także stwierdzono nieprawidłowo małą tolerancję na wstrzykniętą fenyloałaninę i duże stężenie fenyloalaniny na czczo. Defektywny gen odpowiedzialny za fenyloketonurię może być w ten sposób wykryty biochemicznie u fenotypowo prawidłowych rodziców heterozygotycznych. Żaden azot lizyny nie uczestniczy w transami nacji Ssaki przekształcają nietknięty szkielet L-lizyny w a-aminoadypinian i cc-ketoadypinian (ryc. 32-17) poprzez sacharopinę (ryc. 32-18), produkt pośredni w biosyntezie lizyny u grzybów. Cząsteczka L-lizyny kondensuje najpierw z a-ketoglutaranem, tworząc zasadę Schiffa. Ta ulega redukcji do sacharopiny przez dehydrogenazę, a następnie utlenieniu przez drugą oksydoreduktazę. W wyniku przyłączenia cząsteczki wody tworzy się L-glutaminian i 5-semialdehyd L-a-aminoadypinianu. Czysty wynik tego ciągu reakcji jest równoważny usunięciu atomu azotu w pozycji e z lizyny wskutek transaminacji. Niezbędnymi koenzymami jednak w tej reakcji są NAD + i NADH. Dalszy katabolizm a-aminoadypinianu obejmuje transaminację do a-ketoadypinianu, prawdopodobnie z następującą oksydacyjną dekarboksylacją do glutarylo-CoA. Podczas gdy lizyna jest zarówno glikogenna, jak i ketogenna, natura kolejnych katabolitów glutarylo-CoA u ssaków pozostaje nieznana. Dwie rzadko występujące nieprawidłowości metaboliczne wynikają z zaburzonego przekształcenia L-lizyny i a-ketoglutaranu w sacharopinę (ryc. 32-18). HjC-NH3+

C

coo-

COO"

COO

coo-

c=o ćoo-

L-Lizyna a-Aminoadypinian

C lCH)

a-Ketoadypinian

Ryc. 32-17. Przemiana L-lizyny w a-aminoadypinian i a-ketoadypinian. Wielokrotne strzatki reprezentują wielokrotne reakcje.

a-Ketoglutaran

O;

NAOH+H+ NAD+"O"

„. ■

NH+

L-LIzyna

■ T

C^-CH' NAD+ NADH+H+

„CK

CH:

CH

C

P" DEHYDROGENAZA S^CHAROPINOWA TWORZĄCA L-LIZYNĘ

Sacharopi na

-CH'^NH*

-Q

DEHYOROGENAZA SACHAROPINOWA TWORZĄCA LGLUTAMINIAN

?

NH

CH^

Glu

|AMINOIRANSFERAZAl

n-

° A CoA*SH \^r P2

i

L-ot-Am inoadypinian

L-B-arninoadyplniianu

-CO, +H»O

CH

a-Ketoadyplnian

CH,

co,

Glu(afylo-CoA

Ryc. 32-18. Katabolizm L-lizyny. (a-KG —a-ketoglutaran, Glu^glutaminian, PLP — fosforan pirydoksalu). Cyfry w kotkach wskazują prawdopodobne miejsca wad metabolicznych: 1 — okresowa hiperlizynemia z hiperamonemią i 2 uporczywa hiperlizynemia bez hiperamonemii. ___________

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 375

Okresowa hiperlizynemia z towarzyszącą hiperamonemią. W okresowej hiperlizynemii spożycie prawidłowych ilości białka wywołuje hiperlizynemię. Hiperamonemią powstaje wtedy w wyniku kompetycyjnego zahamowania aktywności arginazy wątroby przez zwiększenie stężenia lizyny w tkankach. Terapia płynami oraz ograniczenie pobierania łizyny łagodzi zarówno hiperamonemię, jak i jej objawy kliniczne. Przeciwnie, stosowanie obciążenia lizyną przyspiesza wystąpienie przełomu i śpiączki.

Nawracająca hiperlizynemia bez hi-

peramonemii. Niektórzy chorzy są opóźnieni w rozwoju umysłowym. Nie towarzyszy temu żadna hiperamonemią, nawet jako reakcja na obciążenie lizyną. Katabolity lizyny mogą lub nie mogą nagromadzać się w płynach biologicznych. Uważa się, że nawracająca hiperlizynemia dziedziczy się jako autosomalna cecha recesywna. Oprócz uszkodzenia przekształcenia lizyny i a-ketoglutaranu w sacharopine, niektórzy chorzy wydają się mieć dodatkową wadę przekształcania sacharopiny w L-glutaminian 16-semialdehyd a-amiaoadypinianu (ryc. 32-18). Katabolizm tryptofanu inicjuje 2,3dioksygenaza tryptofanowa, metaloproteina zawierająca żelazoporf i rynę Połączenia atomów węgla zarówno łańcucha bocznego, jak i pierścienia aromatycznego mogą ulegać kompletnej degradacji do amfibolicznych związków pośrednich na szlaku kinureninowo-antranilanowyin (ryc. 32-19) o ważnym znaczeniu nie tylko w rozkładzie tryptofanu, lecz także w przekształcaniu tego aminokwasu w nikorynainid (amid nikotynianu). Enzym 2,3-dioksygi'naza tryptofanowa (inaczej: oksygenaza tryptofanowa lub pirolaza tryptofanowa — nazwy nie zalecane) katalizuje rozszczepienie pierścienia indolowego z wbudowaniem 2 atomów tlenu cząsteczkowego, co wytwarza N-formylokinureninę. Ta 2,3-dioksygenaza, żelazoporfirynowa metaloproteina, jest indukowana w wątrobie przez kortykosteroidy nadnerczy oraz tryptofan. Znaczna porcja nowo syntetyzowanego enzymu występujewpostaci utajonej, wymagającej aktywacji. Tryptofan również stabilizuje go na degradację proteolityczną. Pochodne kwasu nikotynowego, włączając NADPH, hamują 2,3-dioksygenazę tryptofanowa na zasadzie sprzężenia zwrotnego.

Hydrolityczne usunięcie grupy formylowej z N-formy)okinureniny, katalizowane przez forFnamidazę (inaczej: formylazę kinureninową — nazwa nie zalecana) wątroby ssaków dostarcza kinureniny (ryc. 32-19). Enzym ten katalizuje podobne reakcje z różnymi formyloaminami aromatycznymi. Kinurenina może ulec dezaminacji w wyniku transaminacji grupy aminowej bocznego łańcucha do ketoglutaranu. Powstała pochodna ketonowa, 2-amino-3-hydroksybenzoilopirogronian, traci cząsteczkę wody i spontaniczne zamknięcie pierścienia tworzy kwas kinurenowy, produkt uboczny, który nie powstaje w głównym szlaku katabolizmu tryptofanu (ryc. 32-19). Dalszy metabolizm kinureniny obejmuje przekształcenie jej w 3-hydroksykimireninę, a następnie w 3-hydroksyantraniian. Hydroksylacja wymaga tlenu cząsteczkowego w reakcji zależnej od NADPH, przypominającej hydroksylację fenyloalaniny (p. rozdz. 30). Alternatywny metabolit tryptofanu, ksanturenian, nagromadza słę przy niedoborze witaminy B6 Kinurenina i hydroksykinurenina są przekształcane w hydroksyantranilan prze2 kinureninazę, enzym z fosforanem pirydoksalu. Niedobór witaminy B6 powoduje częściową niewydolność w katabolizmie tych pochodnych kinureninowych, które przedostają się do różnych tkanek pozawątrobowych, gdzie są przekształcane w ksanturenian (ryc. 32-20). Ten nienormalny metabolit występuje w moczu w przypadku niewystarczającego przyswajania z pożywienia witaminy Bf). Odżywianie nadmiarem tryptofanu wywołuje wydalanie ksanturenianu przy niedoborze witaminy Bć. U wielu zwierząt przekształcanie tryptofanu w kwas nikotynowy powoduje, że dostarczanie tej witaminy w pożywieniu staje się zbyteczne. Tryptofan może całkowicie zastąpić tę witaminę u szczurów, królików, psów i świń; u człowieka i innych zwierząt tryptofan zwiększa wydalanie z moczem pochodnych kwasu nikotynowego (np. N-metylonikotynamidu). W przypadku niedoboru witaminy Be synteza NAD + i NADP+ może być upośledzona w wyniku niedostatecznej przemiany tryptofanu w kwas nikotynowy do wytwarzania nukleotydów pirydynowych. Synteza tych nukleotydów przebiega prawidłowo przy dostarczeniu odpowiedniej ilości kwasu nikotynowego, nawet w nieobecności witaminy B6.

NH3 +

NH3+

Mrćwcian

Oz

L-Klnurenlna

V 2.3-DIOKSYGENAZA TRYPTOFANOWA (Indukowana)

FORMAMIDAZA

L-Tryptofan

N-Formylo- L-klnurenina

-i

*

■

A

H3C

IjjjH B B jjjjfl

HjO

O,

O ,

*

VNADPH + H +

V

KINUREN1NAZA

3-MONOOKSYGENAZA KINURENINOWA

NH3+

2-Akro lei lo-3-am in of u m aran

OH 3-L-Hydroksyk In u roni na

V CO;

o-^CH, Ha C

T

°1\O

NADH+H+

A _____

""NHJ

NAD +

1

NH,*

I

1

i

-CH; no

a-Ketoadypin!an (przepisano)

! + HjO (p. ryc, 34-18)

NAD(P) <

3.4-DIOKSTGENAZA 3HYDROKSYANTHANILOWA

Szozawlokrotonian

Serr (aldehyd 2-amlnocfaicte-mukonlanu

a-Ketoadypinlan

CH2

NADIP)H + H +

A_____ Ryc. 32-19. Katabolizm tryptofanu. PLP — fosforan pirydoksalu.

KATABOLIZM AMINOKWASÓW / 377

Metionlna

S CM,

SZKIELETÓW WĘGLOWYCH

-CO,

i-' n-Ketoglutaran

CO, - AcCoA Izoleuoyna---------------». Proplonylo-CoA

Walina

-CO, Metylo ma lo nyl □- CoA

I

Sukcynylo-CoA O" HO

Ryc. 32-21. Ogólny metabolizm metioniny, izoleucyny i waliny Ksanturenian

Ryc. 32-20. Powstawanie kwasu ksanturenowego w sianie niedoboru witaminy B6. Przekształcenie metabolitu tryptofanu 3-hydroksykinureniny w 3-hydroksyantranilan jest upośledzone (p. ryc. 32-19). Duża jej część przekształca się zatem w ksanturenian.

To, co następuje w dalszym tekście, dotyczy tylko przekształcenia metioniny oraz izoleucyny w propionylo-CoA, a waliny — w metylomalonylo-CoA. Reakcje prowadzące do propionylo-CoA przez metyl omal onylo-Co A do sukcynylo-CoA omówiono w rozdz. 23, w związku z katabolizmem propionianu i kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgia.

CHbroba Hartniipa, dziedziczne zaburzenie metabolizmu tryptofanu, charakteryzuje się wysypką skórną przypominającą pelagrę, nawracającą ataksją móżdżkową i upośledzeniem urny sto wy m. Mocz zawiera zwiększone iiości indolooctami (a-N [ind o lo-3-acetyl o] glutaminy) oraz tryptofanu.

Atomy węgla metioniny tworzą propionylo-CoA poprzez homocysteinę, cystationinę i ,-ketoglutaran Cząsteczka L-metioniny kondensuje najpierw z ATP, tworząc S-adenozylometioninę*, „aktywną metioninę" (ryc. 32-22). Aktywowana grupa S-metylowa może być przenoszona na różne akceptory. Usunięcie grupy metylowej wytwarza S-adenozylohomocysteinę. Hydroliza wiązania S-C dostarcza L-homocysteiny oraz adenozyny. Homocysteina łączy się następnie z seryną, tworząc cystationinę (ryc. 32-23). W wyniku hydrol i tycznego rozszczepienia cystationiny powstaje L-homoseryna i cysteina, tak że ostatecznym wynikiem jest przekształcenie homocysteiny w homoserynę, a seryny w cysteinc. Te 2 reakcje uczestniczą zatem

METIONINA, 1ZOLEUCYNA I WALINA SĄ KATABOLIZOWANE DO SUKCYNYLO-CoA Wprawdzie sukcynylo-Co A (bursztynylo-CoA) jest amfibolicznym produktem końcowym katabolizmu metioniny, izoleucyny i waliny, w rzeczywistości przemianie ulega tylko część ich szkieletu węglowego (ryc. 32-21). W tworzeniu sukcynylo-CoA uczestniczą tylko 4 /s atomów węgla waliny, 3/s tych atomów metioniny i jedynie ich polowa w przypadku izoleucyny. Atomy węgla karboksylowego wszystkich 3 aminokwasów tworzą. CO2. Końcowe 2 atomy węgla izoleucyny formują acetylo-CoA, a grupa metylowa metioniny jest usuwana w całości jako taka.

* Związkami, których grupy metylowe pochodzą z S-adenozylometioniny są: betainy, cholina, kreatyna, epinefryna, melatonina, sarkozyna, aminokwasy N-melylowane oraz wiele alkaloidów pochodzenia roślinnego.

378 / ROZDZIAŁ 32

coo-

COO

■13N-Ć-H HSO

<-H3N-C-H CHS

+ rr,

CHS

Adenina ADENOZYLOTRANSFEHAZA L-METIONINOWA

•■S------CH t CH

HO

L-Metionina

OH

S-Ade n ozylo-L- rnatlo n I n a (, aktywna metlonina")

Ryc. 32-22. Utworzenie S-adenozy!ometioninY. ~ CH3 reprezentuje duży potencja) transferu „aktywnej metioniny".

również w biosyntezie cysteiny z seryny (p. rozdz. 30). Homoserynę przekształca w a-ketomaślan y-liaza cyst a ti o ni nowa (inaczej: deaminaza homoserynowa — nazwa nie zalecana) (ryc. 32-24), Przekształcenie a-ketomaślanu w prflpionylo-CoA przebiega na sposób oksydacyjnej karboksylacji a-ketokwasów (np. pirogronianu. a-ket o glut ara mi) w celu utworzenia pochodnych acylo-CoA. Metaboliczne zaburzenia katabolizmu metioniny przedstawia tab. 32-2. 2 POCZĄTKOWE REAKCJE KATABOLICZNE SĄ WSPÓLNE DLA WSZYSTKICH 3 ROZGAŁĘZIONYCH AMINOKWASÓW Katabolizm leucyny, waliny oraz izoleucyny obejmuje początkowo te same reakcje. Następnie szkielet każdego aminokwasu wchodzi na swój własny unikatowy szlak prowadzący do amfibolicznych związków pośrednich (ryc. 32-25 i 32-26). Charakter tych amfibolicznych produktów końcowych określa, czy dany aminokwas jest glukogenny (walina), ketogenny (leucyna) lub dwojaki (izoleucyna). Wiele z tych reakcji dokładnie przypomina reakcje katabolizIDU kwasów tłuszczowych o łańcuchach prostych i

rozgałęzionych. Numery reakcji w dalszym tekście odpowiadają numeracji reakcji na ryc. 32-26 — 32-29.

Ten sam enzym wydaje się katalizować transaminację wszystkich 3 aminokwasów rozgałęzionych Za odwracalną transaminację (reakcja 1, ryc. 32-26) wszystkich 3 rozgałęzionych aminokwasów przypuszczalnie odpowiada jedna aminotransferaza. Ze względu na odwracalność owej reakcji dobowe zapotrzebowanie na te aminokwasy w pożywieniu mogą pokryć odpowiednie a-ke tok wąsy. Oksydacyjna dekarboksylacja rozgałęzionych 3-ketokwasów jest analogiczna do przekształcenia pirogronianu w acetylo-CoA Dehydrogenaza a-ketokwasu o łańcuchu rozgałęzionym (reakcja 2, ryc. 32-26), wewnątrzmitochondrialny kompleks wieloenzymowy, katalizuje oksydacyjną dekarboksylację a-ketoizokaproniami (z leucyny), ct-keto-|3-metylowalerianianu (z izoleucyny) i a-ketoizowalerianianu (z waliny). Podjednostki kompleksu dehydrogenazy a-ketokwasu są analogiczne do kompleksów dehydrogenazy pirogronianu: dekarhoksylaza a-ketokwasu, transacylaza i dehydrogenaza dihydrolipoilowa. Tak, jak w przypadku dehydrogenazy pirogronianowej, kompleks jest inaktywowany, kiedy ulega fosforylacji przez ATP i kinazę białek. Niezależna od Ca2+ fosfataza fosfoproteinowa katalizuje jego defosforylację i towarzyszącą temu reaktywację. Stan fosforylacji może w ten sposób regulować katabolizm aminokwasów rozgałęzionych. Kinazę białek hamują: ADP, produkty a-ketokwasów o łańcuchu rozgałęzionym,' czynniki hipolipemiczne, jak klofibrat i dichlorooctan, a także tloestry koenzymu A (np. acetoacetylo-

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 379

L-Metionina

NH3+

HO

-ATP

,cr

c

II O

I

H O

L-Hornoseryna

NHn

9

S-Aden ozy I o-L-metionl n a ^ Akceptor

]

Nfc CH,-Akoeptor S-

Aden ozy lo-L-h om ocystei n a

lenozyna

CT

o 1^

L-Homocysteina CYSTATIONtNOWA

•H,0

+

NH3 LSeryna

S

Cystationina

II

H H3 C

(

H3CV 0

-

' C H --

L-Cysteina

2

i

\ ►NH4 >

II

11

/ -H 2 O

II

KtH3+

CH

0 a-Ketorna4fan +

NH„ a-Kelomaślan (p.ryc. 31-24)

Ryć. 32-24. Przekształcenie L-homoseryny wa-ketomaślan katalizowane przez y-liazę cystationinową (inaczej: deaminazę homoserynową — nazwa nie zalecana).

-CoA). Spośród cx-ketokwasów o łańcuchu rozgałęzionym najpotężniejszym inhibitorem jest a-ketoizokapronian(a-ketoteucyna). "CH 2 ^

^S-CoA

Proplonylo-CoA

Ryc. 32-23. Przekształcenie mationiny w propionylo-CoA.

Odwodorowanie rozgałęzionych tioestrów acylo-CoA jest analogiczne do reakcji w katabolizmie kwasu tłuszczowego Reakcja 3 jest analogiczna do odwodorowania tioestrów acylo-CoA o prostym łańcuchu w katabolizmie kwasów tłuszczowych. Wpraw-

380 / ROZDZIAŁ 32 Ryc. 32-25. Kataboiizm aminokwasów o łańcu chach rozgałęzionych Reakcje 1 -3 są wspólne dla wszystkich 3 aminokwasów. Pogrubione linie prze cinające strzałki zaznaczają miejsca bloków meta bolicznych w 2 chorobach rzadko występujących u ludzi. Przy 2 — choroba z moczem o zapachu syropu klonowego, wada w metabolizmie 3 amino kwasów; przy 3 — kwasica izowaferianowa, wada w kataboiizmte leucyny.

Lsucyna, wal i na, izoleueyna

© Odpowiednie a-ketokwasy

COj + odpowiednie tioealry acylo-CoA

T<

Odpowiednie a-, 0-nienasycone tloestry acylo-CoA Val / Leu PropionyloCoA + acetyloCoA

Sukcynylo-CoA

p-Hyd ro ksy-P-metylo g lu ta ry lo-CoA

Ryc. 32-26. Analogiczne pierwsze 3 reakcje w katabolizmie leucyny, waliny oraz izoleucyny. Zauważ analogię w reakcjach 2 i 3 do katabolizmu kwasów tłuszczowych. Ta analogia jest kontynuowana, jak wykazanow następnych rycinach. a-KA — ot-ketokwas, a-AA — a-aminokwas.

CH,

,CH

I

H3 C

O

H3C.

CH 3 CH 3 L-Wallna

L-Leuoyna a-Ketokwas

0

-*- «-Ketokwas ^*- a-Arnlnokwas

O.

O

II

-CH

H3 C

V "N-

ŁI

O

L-l Zole u cyn a

-''■

x-Ke! okwas - aAminokw as

x- Keto Izowalerianian a- K et o iz □ ka p r o n i a n

■CoA.SH

-CoA*SH
o

an

CH3

--CoA.S

H3 C Izowaterylo^CoA

C H:i

H

S-CoA

■12H] O

H3 C

I

\* Ln 5 — t.oA ^-Metylo kroto nylo- CoA

■S~CoA CH 3

CH3 aMetylo butyrylo-Co A

MetaakrylNo-CoA [2H]

TyaWo-CoA

-

KATABOLIZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 381

dzie pojedynczy enzym może katalizować odwodorowanie wszystkich 3 rozgałęzionych tioestrów acylo-CoA, pośredni dowód implikuje konieczność przynajmniej 2 enzymów, W acytlemii i/o walerianowej, po spożyciu pokarmów bogatych w białko, nagromadza się we krwi izowalerianian (produkt deacylacji izowalerylo-CoA). Nie dochodzi w niej do zwiększenia ilości innych rozgałęzionych a-ketokwasów. 3 reakcje są swoiste dla katabolizmu leucyny

Reakcja 4L, karboksylacja |i-metylo-

krotonylo-CoA. Kluczowym spostrzeżeniem, które doprowadziło do wyjaśnienia ketogcnnego działania leucyny, było odkrycie, że 1 mol CO2 był „umocowany" (tj. związany kowalencyjnie) z każdym molem grupy izopropylowej (z terminalnej grupy izopropylowej

leucyny) przekształconej w acetooctan. To wbudowanie CO2 (reakcja 4L, ryc. 32-27) wymaga obecności biotynylo-CO2 i tworzy (ł-metyloglutakonylo-CoA.

Reakcja 5L, uwodnienie p-metytogluta-

konylo-CoA. Produkt, p-hydroksy-p-metyloglutarylo-CoA, jest prekursorem zarówno związków ketonowych (reakcja 6L, ryc. 32-27), jak i mewalonianu, a stąd cholesterolu oraz innych poliizoprenoidów (p. rozdz. 29).

Reakcja 6L, rozszczepienie p-hydro-

ksy-p-metyloglutaryia-CoA. Rozszczepienie f3-hydroksy-P-metylogrutarylo-CoA na acetylo-CoA i acetooctan zachodzi w mitochondriach wątroby, nerek i serca. To tłumaczy silne ketogenne działanie leucyny, ponieważ oprócz 1 mola acetooctanu powstającego z 1 mola leucyny może się utworzyć lji mola

0-Metylokro1onylo-CoA

Mg-ADP+Pi

■ Biotynylo-*CD

o . Blotyna

Mg-ATP

^-

r

Hi

MetytoglutakonylchCoA

OH

C

0-Hyd ro ksy-^rnety lo g I utaryio-C oA

'O'

CH.

9

O O r* r1 CH Acetoootan

AcetyloCoA

Ryc. 32-27. Katabolizm fi-rnetylokrotonylo-CoA pochodzącego z L-leucyny. * Atomy węgia pochodzące z CO,.

382 / ROZDZIAŁ 32

związków ketonowych z pozostałego produktu, acetylo-CoA (p. rozdz. 29).

o li

4 reakcje są swoiste dla katabolizmu wafiny

CH3 Metakrylilo-CoA

Reakcja 4V. uwodnienie metyloakry-

lilo-CoA. Reakcję tę, która z dość dużą szybkością zachodzi nieenzymatycznie, katalizuje hydrataza enoilo-CoA, hydrolaza o szerokiej swoistości dla tioestrów L-p-hydro ksyacy-loCoA mających 4—9 atomów węgla.

HO

Reakcja 5V, deacylacja [l-hydroksy-

I

izobutyrylo-CoA. Tioester Co A nie jest substratem dla następnej reakcji (reakcja 6V, ryc. 32-28), wobec tego musi on najpierw ulec deacylacji do p-hydroksyizomaślanu (reakcja 5V. ryc. 32-28) przy udziale deacylazy, dla której drugim substratera jest jedynie P-hydroksypropionylo-CoA.

CH3 ^Hydroksylzobutyryto-CoA

Reakcja 6V, utlenienie (>-hydroksy-

I CH, /I-Hyd ro ksyizo m as I an

izomaślanu. Odwracalne, zależne od NAD"*", utlenienie pierwszo rzędowej grupy alkoholowej p-hydroksyizomaślanu do aldehydowej (reakcja 6V, ryc. 32-28) tworzy semialdehyd metylomalonianu.

Reakcja 7V, los semialdehydu mety-

lomalonianu. Przypuszczalnym przeznaczeniem semialdehydu metylomalonianu jest transaminacja i przekształcenie do sukcynylo-CoA. Transaminacja tworzy a-aminoizomaślan, prawidłowy aminokwas moczu (reakcja 7V, ryc, 32-28). Drugie główne przeznaczenie obejmuje oksydacyjną acylację do metylomalonylo-CoA oraz izomeryzację do sukcynylo-CoA (reakcje 8V i 9V, ryc. 32-28). Izomeryzacja (reakcja 9V, ryc. 32-28) wymaga obecności koenzymu adenozynokobalaminy i jest katalizowana przez mutazę metylomaionylo-CoA. Ta reakcja ma duże znaczenie nie tylko w katabolizmie waliny lecz także dla propionylo-CoA, katabolitu izoleucyny (ryc. 32-29). Przy niedoborze kobalaminy (witaminy B|2) aktywność ulega uszkodzeniu. To powoduje „żywieniową wadę metaboliczną" u przeżuwaczy, wykorzystujących propionian (z fermentacji w żwaczu) jako źródło energii. Przegrupowanie do sukcynylo-CoA odbywa się wskutek wewnątrzcząsteczkowego przesunięcia grupy karboksylo-CoA. 3 reakcje są swoiste dla katabolizmu izoleucyny Badania nad odżywianiem zwierząt zidentyfikowały początkowo izoleucynę jako glukogenną i w niewielkim stopniu ketogenną. Syn-

O I! HC,

O II

NADH + H +

■CH

I

CH3 -AA aKA Semialdehyd metylom alanian u COASH NADI

CoAS"

O II

NH3 I ■CH

H,C. 'S-CoA

I

CH3 Metylomalonylo-CoA

I CH3 0-Aminolzomaślan

KOENZYM B1( O

I I

HSC

S-CoA

Sukcynylo-CoA

Ryc. 32-28. Dalszy katabolizm metakry!ilo-CoA utworzonego z L-waliny (p. ryc. 32-26). a-KA — »-ketokwas, s-AA — a-aminokwas.

KATABOLiZM SZKIELETÓW WĘGLOWYCH AMINOKWASÓW / 383 Propionylo-CoA

Acetylo-CoA »

CH3 Tyglilo-CoA

Ryc. 32-29. Dalszy katabolizm tyglilo-CoA powstałego z L-izoleucyny.

H,C

S~CoA

s-Metyl o-0 -hyd ro teybutyrylo-CoA

[2H]

O li

tezę glikogenu z izoleucyny potwierdzono późCH3 a ■ M ety I o actrtoa cety I o-Co A

niej posługując się D2O. Zastosowanie znakowanych l4C-intermediatów oraz skrawków wątroby dowiodło, że szkielet izoleucyny ulega rozszczepieniu na acetylo-CoA i propionylo-CoA (ryc. 32-29).

Reakcja 41, uwodnienie tyglilo-CoA.

Reakcję tę, podobnie jak analogiczna w katabolizmie waliny (reakcja 4V, ryc. 32-28) katalizuje hydrataza enoilo-CoA (inaczej: krotonaza — nazwa nie zalecana). Reakcja 51, od wodorowa nie ::-mety lo-p-hydroksybutyrylo-CoA. Jest ona analogiczna do reakcji 5V w katabolizmie waliny (ryc. 32-28).

Reakcja 61, tioliza s-metyloacetoace-

tylo-CoA. Rozszczepienie tiolityczne wiązania łączącego węgle 2. i 3. w cząsteczce a-metyloacetylo-CoA przypomina tiolizę acetoacetylo-CoA przez acetyl o tran sferazę acetylo-CoA (inaczej: (3-ketotioIazę). Produkty: acetylo-CoA (ketogenny) i propionylo-CoA (glukogenny) nadają izoleucynie właściwości ketogenne i glukogenne.

Kilka zaburzeń metabolicznych wiąże się ze szlakiem katabolicznym aminokwasów o łańcuchu rozgałęzionym Hiperwalinemia. Ta rzadko występująca choroba metaboliczna, charakteryzująca sie zwiększonym stężeniem w osoczu waliny (ale nie leucyny lub izoleucyny) jest wyrazem niezdolności do przeprowadzenia transami nacji waliny do a-ketoizowalerianianu (reakcja 1, ryc. 32-26). Transaminacja leucyny oraz izoleucyny pozostaje nieuszkodzona.

Choroba „moczu o zapachu syropu klonowego" (ketonuria łańcuchów roz-

gałęzionych). Najbardziej charakterystyczną właściwością tej dziedzicznej choroby (występującej z częstotliwością 5—10/1 000 000 urodzeń) jest zapach moczu przypominający zapach syropu klonowego lub przypalonego cukru. Zawartość leucyny, izoleucyny, waliny oraz ich oc-ketok wąsów w osoczu i w moczu jest znacznie zwiększona. W moczu są również obecne mniejsze ilości ct-hydrok syk wąsów o łańcuchu rozgałęzionym, utworzonych w wyniku redukcji a-ketokwasów. Choroba uwidacznia sie pod koniec pierwszego tygodnia życia pozamacicznego. Oprócz opisanych wyżej zaburzeń biochemicznych niemowie z trudem daje się karmić, może wymiotować i być w letargu. Rozpoznanie przed pierwszym tygodniem życia jest możliwe tylko za pomocą analizy enzymatycznej. Rozległe uszkodzenia mózgu występują u dzieci przeżywających. Dzieci nie leczone umierają zwykle pod koniec pierwszego roku życia. Wada biochemiczna polega na braku lub znacznym zmniejszeniu aktywności dekarboksylazy a-ketokwasowej, która katalizuje przemiany wszystkich 3 a-ketokwasów o łańcuchu rozgałęzionym do CO2 oraz tioestrów acylo-CoA (reakcja 2, ryc. 32-26). Mechanizm zatrucia pozostaje nieznany. Rozpoczęcie leczenia w pierwszym tygodniu życia może w znacznym stopniu zapobiec stra-

384 / ROZDZIAŁ 32

szliwym skutkom tej choroby. Pokarmy białkowe zastępuje się mieszaniną oczyszczonych aminokwasów, spośród których eliminuje się leucynę, izoleucynę I walinę. Jeżeli tylko stężenie tych aminokwasów w osoczu zmniejszy się poniżej poziomu prawidłowego, chorzy powracają do diety w postaci mleka oraz innych pokarmów w ilościach pokrywających, lecz nie przekraczających, zapotrzebowanie na aminokwasy o łańcuchach rozgałęzionych. Nie ma żadnych kryteriów, kiedy — jeżeli w ogóle jest to możliwe — można złagodzić ograniczenia żywieniowe.

Nawracająca ketonuria łańcuchów

rozgałęzionych. Ta odmiana choroby „moczu o zapachu syropu klonowego", jest zapewne konsekwencją mniej groźnej strukturalnej modyfikacji dekarboksylazy oc-ketokwasowej. Ponieważ chorzy mają upośledzoną, niemniej jednak wyraźną zdolność do katabolizmu leucyny, waliny oraz izoieucyny, objawy choroby „moczu o zapachu syropu klonowego" występują w późniejszym okresie życia i tylko przejściowo. W przypadku terapii żywieniowej rokowania dla tych chorych są pomyślni ej s ze. Choroba, .moczu o zapachu syropu klonowego" oraz nawracająca ketonuria rozgałęzionych łańcuchów odzwierciedlają mutacje powodujące różne zmiany w strukturze pierwszorzedowej tego samego enzymu. Prawdopodobnie szeroki zakres aktywności, od otwartej choroby przez objawy nawracające do wartości prawidłowych, zdarza się u poszczególnych chorych. Acydemia izowalerianowa. Istotnymi zmianami są: woń „serowa" oddechu i płynów ustrojowych, wymioty, kwasica i śpiączka wywołana nadmiernym spożyciem białka. Uszkodzonym enzymem jest dehydrogenaza izowalerylo-CoA (reakcja 3, ryc. 32-26). W ten sposób nagromadza się izowalerylo-CoA, który hydrolizuje do izowalerianianu i wydala z moczem oraz potem. Zaburzenia w katabolizmie metylomalonylo-CoA odzwierciedlają niewydolność w przemianie witaminy B12 do jej koenzymu Przekształcenie w amfiboliczne intermediaty propionylo-CoA (pochodzącego z izoieucyny, metioniny, łańcucha bocznego cholesterolu

oraz kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgla) obejmuje zależną od biotyny karboksylację do metylomalonylo-CoA. Metylomalonylo-CoA powstaje również z waliny bezpośrednio (tj. bez uprzedniego utworzenia propionylo-CoA). W reakcji zależnej od koenzymu witaminy Bi3 metylomalonylo-CoA izomeryzuje następnie do sukcynylo-CoA. Chorzy z niedoborem witaminy B^ wydalają z moczem metylomalonian. Ta acyduria metylomalonianowa ustępuje po podaniu wystarczających ilości witaminy B]2.

Acydamia propionianowa. Niedobór

karboksylazy propionylo-CoA charakteryzuje się dużym stężeniem propionianu w surowicy. Leczenie polega na przestrzeganiu diety małobiałkowej i stosowaniu środków przeciwdziałających kwasicy metabolicznej. Acyduria metylomaionowa. Znane są 2 postacie. Jedna reaguje na farmakologiczne stężenie witaminy B]2. Typ drugi wymaga leczenia za pomocą masywnych dawek witaminy B^ (1 g na dobę).

PIŚMIENNICTWO Cooper AJL; Biochermstry of the sulfur-containing amino acids. Annu Rev Biochem 1983;52:187. Paxton R, Harris RA: Isolation of rabbit liver branched chain a-ketoacid dehydrogenase and regulation by phosphorylation. J Blol Chem 1982;257:14433. Paxton R, Harris RA: Regulation of branched-chain a-ketoacid dehydrogenase kinase. Arch Biochem Biophys 1984;231:48. Rosenberg LE, Serwer CR: Disorders of amino acid naetabolisin. Chapter 11 in: Metaboiic Control and Bueme. Bondy PK, Rosenberg LE (editors). Saunders, 1980. Scriver CR et al (editors): The Metabołic Basis oj Inherited Disease, 6th ed. McGraw-HM, 1989. Wellner D, Meister A: A survey of inborn errors of amino acid metabolismand transport in man. Annu Rev Biochem (981:50:911.

3 3

Przemiana aminokwasów w wyspecjalizowane produkty Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE Aminokwasy stanowią główne źródło azotu dla zwierząt i służą jako prekursory dla innych składników azotowych. Większość z nich to związki nieami no kwasowe, wobec czego omówienie ich zbiega się ze szlakami metabolicznymi przedstawionymi w innych rozdziałach tego podręcznika. Fizjologicznie ważne produkty pochodzące z aminokwasów to: hem, puryny, pirymidyny, hormony i neuroprzekaźniki (neur o transmitery), włączając biologicznie aktywne" peptydy. Ponadto wiele białek zawiera aminokwasy, które zostały zmodyfikowane w celu wypełnienia swoistych funkcji, np. związania wapnia lub poprzecznego połączenia, i w ten sposób reszty aminokwasowe w tych białkach służą jako prekursory dla owych zmodyfikowanych reszt. Występują także małe peptydy lub cząsteczki peptydopodobne nie syntetyzowane na rybosomach, które wykonują swoiste czynności w komórce.

GLICYNA UCZESTNICZY W BIOSYNTEZIE HEMU, PURYN, POŁĄCZEŃ GL1CYNOWYCH IKREATYNY Synteza hemu. Atomy węgla ot i azotu glicyny są wykorzystywane w syntezie porfirynowej części hemoglobiny (p. rozdz. 34), Atom azotu w pierścieniu pirolowym pochodzi z azotu glicyny, a przylegający atom węgla — z węgla

O"

Mg-ATP Mg-ADP + P,

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Histamina, biologicznie aktywna amina, utworzona w wyniku dekarboksylacji histydyny, odgrywa główną rolę w reakcjach alergicznych. Swoiste neuroprzekaźniki pochodzące z aminokwasów obejmują: y-aminomaśian z giutaminianu, 5-hydroksytryptaminę (serotoninę) z tryptofanu oraz dopaminę, noradrenaiinę i adrenalinę z tyrozyny. Wiele leków stosowanych w leczeniu stanów neurologicznych i psychiatrycznych wpływa na metabolizm wymienionych wyżej neuroprzekaźników.

CoA-SH

Hipuran

Ryc. 33-1. Biosynteza hipuranu 25 — Biochemia

386 / ROZDZIAŁ 33

ot glicyny. Węgiel a jest również źródłem atomów mostków metylenowych łączących pierścienie pirolowe. Zaburzenia metabolizmu hemu są omówione w rozdz. 34.

Synteza nukleotydów purvnowych.

Cała cząsteczka glicyny tworzy pozycje 4, 5 i 7 w szkielecie purynowym (p. rozdz. 36).

-cHrNH'+

Ergotloneina

Tworzenie połączeń glicynowych. Gli-

cyna wiąże się z kwasem cholowym w kwas żółciowy glikocholowy. Z benzoesanem glicyna tworzy hipuran (ryc. 33-1). Zdolność wątroby do ilościowej przemiany benzoesanu w hipuran wykorzystywano dawniej jako próbę czynnościową wątroby. Synteza kreatyny. Sarkozyna (N-metyloglicyna), składnik kreatyny, pochodzi z glicyny i S-adenozylometioniny.

NH CH;

o Karnozyna

-ALANINA JEST GŁÓWNYM AMINOKWASEM OSOCZA Alanina wraz z glicyna stanowi znaczną część azotu aminowego w osoczu ludzkim. Alanina jest również głównym składnikiem ścian komórek bakteryjnych, częściowo jako D-izomer: 39—50% u Streptococcus faecalis i 67% u Staphylococcus aureus.

Anse ry na

SSAKI TWORZĄ |i-ALAI\HNĘ Z URACYLU I KATABOLIZUJĄ JĄ PRZEZ SEMIALDEHYD MALONIANU W tkankach znajduje się niewiele wolnej Palaniny, znacznie więcej występuje w postaci palanylowych dipeptydów oraz koenzymu A (p. ryc. 18-6). Wprawdzie mikroorganizmy wytwarzają palaninę przez dekarboksylację p-asparaginianu, fi-alanina tkanek ssaków pochodzi głównie z katabolizmu uracylu, karnozyny i anseryny (ryc. 33-2). Katabolizm p-alaniny u ssaków obejmuje transaminację do semialdehydu malonianu, który utlenia się do octanu i dalej do CO2. W rzadko występującym zaburzeniu metabolicznym, jakim jest hiper-p aiartinemia dochodzi do zwiększenia stężenia P-alaniny w płynach ustrojowych oraz w tkankach. Stężenia tauryny i P-aminoizomaślanu są również zwiększone.

O. NH

I CH O Homo kar n ozyn a Ryc. 33-2. Związki spokrewnione z histydyną. Prostokąty ujmują komponenty nie pochodzące z histydyny.

KARNOZYNA JEST DIPEPTYDEM (3-ALANYLOWYM P-Alanina występuje głównie jako karnozyna, dipeptyd ludzkich mięśni szkieletowych (ryc. 33-2). Ściśle spokrewniony dipeptyd (3-alanyJowy, anse ry na (N-metylokarnozyna, ryc. 33-2), występuje obficie u gatunków, u których mięśnie szkieletowe odznaczają się szybką czynnością skurczową (kończyny królika, mięśnie

PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY / 387

piersiowe ptaków). Brak jej w mięśniach człowieka. W ten sposób może on spełniać funkcje fizjologiczne odrębne od karnozyny. P-Alanylo-imidazol buforuje pH mięśnia szkieletowego kurczącego się beztlenowo. Karnozyna i a n sery na wzmagają aktywność ATPazy miozynowej in vitro. Oba dipeptydy chelatują również miedź i pobudzają pobieranie związków miedzi. Dipeptydy p-alanylowe są syntetyzowane i degradowane na krótkich szlakach Karnozyna powstaje z p-alaniny i L-histydyny w reakcji wymagającej ATP, katalizowanej przez syntetazę karnozyny: ATP + L-Histydyna + [3-Alanina > -» AMP + PP + Karnozyna

Anseryna powstaje z karnozyny (donorem grupy metylowej jest S-adenozylometionina) w reakcji katalizowanej przez N-metylotransferazę karnozynową: S-Adenozylometionina + Karnozyna -» -» S-Adenozyiohomocysteina + Anseryna

Ogólna reakcja obejmuje związany z enzymem p-alanyloadenyian. Karnozyna jest hydrolizowana do p-alaniny i L-histydyny przez występujący w surowicy metaloenzym związany z cynkiem—dipeptydazę aminoacylohistydynową (inaczej: karnozynaza

lub hydrolaza karnozynową — nazwy nie zaleca-

z chorobą Hartnupa reakcja histydynemii jest prawidłowa, jeżeli Icarnozyna znajduje się w pokarmie, ale jest osłabiona po podaniu L-histydyny. Homokarnozyna jest dipeptydem ośrodkowego układu nerwowego Fizjologiczna funkcja homokarnozyny (y-aminobutyrylo-L-histydyny; ryc. 33-2), dipeptydu ośrodkowego układu nerwowego, spokrewnionego strukturalnie i metabolicznie z karnozyną, nie jest znana. Ten dipeptyd y-aminomaślanu i L-histydyny występuje w tkance mózgu ludzkiego, gdzie jego stężenie zmienia się wraz z badanym obszarem. Biosynteza homokarnozyny w ludzkim mózgu wydaje się być katalizowana przez syntetazę homo karnozynową. Dipeptydaza aminoacylohistydynową surowicy nie hydrolizuje jednak homokarnozyny. FOSFORYLOWANE RESZTY SERYLOWE I TREONYLOWE WYSTĘPUJĄ W WIELU BIAŁKACH Dużo cząsteczek seryny w fosfoproteinach występuje w postaci O-fosfoseryny. Sery na uczestniczy w syntezie sfingozyny (p. rozdz. 26) oraz puryn I pirymidyn. Węgiel jest źródłem grup metylowych tyminy (i choliny) oraz atomów węgla w pozycjach 2 i 8 rdzenia purynowego (p. rozdz. 36). Treonina nie ulega tran sam i nacji, wobec czego D-izomer i ot-ketokwas nie są wykorzystywane przez ssaki. W niektórych białkach treonina występuje jako O- fosfo treonina.

ne) . Niedobór tego enzymu w surowicy to zaburze-

nie dziedziczne, prawdopodobnie autosomalne, recesywne, charakteryzujące się uporczywą karnozynurią i sporadycznie również hiperkarnozynemią. Karnozynuria utrzymuje się nawet po wyłączeniu karnozyny z pożywienia.

Reakcja na dietę karnozynową ułatwia rozpoznanie choroby Hartnupa Tkanka nerki i enterocyty jelitowe pobierają karnozynę i i p-alaninę za pomocą nośników błonowych, które rozróżniają jeden substrat od drugiego i oba od innych dipeptydów. Zdolność do zróżnicowanego pobierania P-alaniny od karnozyny znalazła zastosowanie do zidentyfikowania choroby Hartnupa, dziedzicznego zaburzenia w transporcie niektórych obojętnych a-aminokwasów (p. rozdz. 32). U osób

S-ADENOZYLOMETIONINA STANOWI GŁÓWNE ŹRÓDŁO GRUP METYLOWYCH W BIOSYNTEZIE Metioninę, jako donora grup metylowych, omówiono w rozdz. 32. W postaci S-adenozylometioniny jest ona głównym źródłem grup metylowych w organizmie, które mogą być wykorzystywane zarówno w postaci nie naruszonej, jak i po utlenieniu. Węgiel grupy metylowej może także posłużyć do utworzenia reszty jednowęglowej, łączącej się z glicyną w procesie syntezy seryny, Metionina funkcjonuje jako Sadenozylometionina w charakterze prekursora dla 1,3^diaminopropanu, części poliamin sperminy i spermidyny (p. niżej).

388 / ROZDZIAŁ 33

SIARCZAN ZAWARTY W MOCZU POCHODZI GŁÓWNIE Z CYSTEINY Siarczan zawarty w moczu powstaje niemal całkowicie z utlenienia cysteiny. Siarka metioniny (jako homocysteiny) jest przenoszona na serynę (p. ryc. 30-9) i w ten sposób przyczynia się pośrednio do puli siarczanów zawartych w moczu (tj. za pośrednictwem cysteiny). LCysteina służy jako prekursor tioetanoloaminowcj części koenzymu A oraz tauryny, która sprzęga się z kwasami żółciowymi, formując np. kwas taurocholowy.

DEKARBOKSYLACJA HISTYDYNY TWORZY HISTAMINĘ Histamina pochodzi z histydyry w wyniku jej dekarboksylacji katalizowanej w tkankach ssaków przez dekarboksylazę [.-aminokwasów aromatycznych. Enzym ten powoduje również dekarboksylacje cząsteczek: dopa, 5-hydroksytryptofanu, fenyloalaniny, tyrozyny i tryptofanu (p. niżej). Dekarboksylację hamują oc-m etyl oaminok wąsy, które w ten sposób znalazły zastosowanie w klinice jako czynniki obniżające ciśnienie krwi. Odmienny enzym, dekar-

boksylaza histydynowa, występujący w większości tkanek, katalizuje dekarboksylację histydyny. Do związków histydynowych występujących w organizmie należą: ergotioneina, w erytrocytach i w wątrobie, karnozyna i anseryna (ryc. 33-2). Prawdopodobnie z anseryny pochodzi 1-metylohistydyna występująca w moczu ludzkim. W nim zidentyfikowano także 3-metylohistydynę w ilości 3,2 mmol/1 (= ok. 50 mg/dl). Pojawia się ona w niezwykle małych iiościach w moczu chorych na chorobę Wilsona (p. rozdz. 58).

ARGININA PRZEZ ORNITYNĘ JEST PREKURSOREM PO LI AM IN Arginina służy jako dawca grupy formamidynowej w syntezie: kreatyny u Naczelnych (p. ryc. 33-10) oraz streptomycyny u Streptomyc.es. Inne jej przeznaczenia obejmują przekształcanie, przez ornitynę, w putrescynę, sperminę i spermidynę (ryc. 33-3) oraz biosyntezę fosforanu argininy (funkcjonalnego analogu fosforanu kreatyny) w mięśniach bezkręgowców. W uzupełnieniu do jej roli w biosyntezie mocznika (p. rozdz. 31), ornityna_(z metioniną) stanowi prekursor występujących powszechnie

J B i a ł k| a

y-Śemialdehyd glutamimanu

Putrescyna, sperm idyna spermlna

I Prollnal Glutamin ian

Ryc. 33-3. Metabolizm argininy, ornityny i proliny. W tkankach ssaków zachodzą wszystkie reakcje zaznaczone strzałkami ciągłymi. Synteza putrescyny i sperminy przebiega zarówno u 'ssaków, jak i u bakterii. Fosforan ornityny występuje w mięśniach bezkręgowców, gdzie funkcjonuje jako fosfagen analogiczny do fosforanu kreatyny w tkankach ssaków._______________________________

PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY / 389 A'

B

\ t'

H, CH^

r"*LJ"^^"1"

CH^

1,3-Oiaminopropan (A)

r*Ul

i*W

Kl

H3*

Spermidyna A

B

A ,1,________

1,4-Diaminobutan (B) (pulrescyna)

Spermina

^c<

J

-NH;

1,5-Diaminopenian (kadaweryna} Ryc. 33-4. Struktury naturalnych poliamin Zauważ, że spermidyna i spermina są polimerami diaminopropanu (A) i diaminobutanu (B). Diaminopentan {kadaweryna) również występuje w tkankach ssaków.

u ssaków (i bakterii) pojiamin: sperm idy ny i sp^n^ny (ryc. 33-4). Zdrowi ludzie biosyntetyzujt) w przybliżeniu 0,5 mmol sperminy dziennie. Farmakologiczne dawki poliamin obniżają temperaturę i ciśnienie. Spermidyna i spermina biorą udział w różnorodnych procesach fizjologicznych, które laczy wspólna nić — ścisłe powiązanie z proliferacją i wzrostem komórkowym. One są czynnikami wzrostu w hodowlach komórek ssaków i bakterii uczestniczących w stabilizacji nie naruszonych komórek, organelii subkomórkowych oraz błon. W konsekwencji ich mnogich ładunków dodatnich poliaminy asocjuja. chętnie z polianionami, np. DNA i RNA, i są zaangażowane w takie fundamentalne procesy, jak stymulacja biosyntezy DNA i RNA, stabilizacja DNA oraz upakowanie DNA w bakteriofagu. Poliaminy mają także różnorodny wpływ na syntezę białka i działają jako inhibitory enzymów, włączając kinazy białek. Wprawdzie obecnie nie jest możliwe wytłumaczenie (w precyzyjnych określeniach mechanistycznych) sposobu oddziaływania poliamin na jakieś swoiste procesy metaboliczne, istotna ich natura w metabolizmie ssaków została przekonywająco udokumentowana przez doświadczenie następującego typu. Początkowa reakcja w biosyntezie poliamin jest katalizowana przez dekarboksylazę ornitynową (ryc. 33-5). Doda-

nie do hodowli komórek ssaków inhibitorów aktywności dekarboksylazy ornitynowej (np. L-metyloornityny lub difluorometyloornityny) wyzwala nadprodukcję dekarboksylazy ornitynowej. To sugeruje istotną rolę fizjologiczną tego enzymu, którego jedyną znaną funkcją jest biosynteza poliamin. Biosynteza poliamin jest ważna dla wzrostu komórek i tkanek Na rycinie 33-5 podsumowano biosyntezę poliamin w tkankach ssaków. Zauważ, że część putrescynowa spermidyny i sperminy pochodzi z L-ornityny, a fragment diaminopropanowy z L-metioniny przez uformowania związku pośredniego S-adenozylometioniny. Dekarboksylaza orni ty no w a i de kar boksy laza S-adenozylometioninowa są to indukowane enzymy z krótkimi okresami półtrwania. Przeciwnie, syntazy sperminowe i spermidynowe nie są enzymami ani indukowanymi, ani niezwykle łabilnymi. Spośród enzymów biosyntezy poliamin u ssaków 2 (dekarboksylaza ornitynową i dekarboksylaza S-adenozylometioninowa) budzą zainteresowanie ze względu na regulację ich obu, jak również możliwość ich wykorzystania w chemioterapii kierowanej enzymatycznie. Biologiczny okres półtrwania dekarboksylazy ornitynowej (w przybliżeniu 10 min) jest krótszy od

390 / ROZDZIAŁ 33

Metionina + Mg-ATP

. Mg-PP;

CH,

OHOH

S-Aden ozy lometion in a

coo~

OEKAfIBOKSYLAZA OHNITYNOWA

OEKARBOKSYLAZA S-ADENOZYLOMETIONINOWA

Dekarboksylowana Sadenozylamettonlna SYNTAZA SPERMIDYNOWA

OHOH MetylotloadencTyna

Spennldyna Da karbo ksylowan a Sadenozylometlonina-

Melylotloadenozyna

SYNTAZA SPEHMINOWA

Spermina

Ryc. 33-5. Związki pośrecTnie i enzymy uczestniczące w biosyntezie spermidyny i sperminy. Grupy metylenowe podano w postaci skrótowej, aby ułatwić uwidocznienie całości procesu.

PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY / 391

biologicznego okresu półtrwania jakiegokolwiek innego znanego enzymu ssaków, a jej aktywność szybko i gwałtownie reaguje na wiele bodźców. Zwiększenie aktywności dekarboksylazy ornitynowej 10—200-krotne następuje szybko po podaniu hodowanym komórkom ssaków hormonu wzrostu, kortykojteroidów, testosteronu lub naskórkowego czynnika wzrostu, Poliaminy wprowadzone do hodowli komórkowej pobudzają syntezę białka o nazwie antyzym (ang. antizyme), które wiąże się z dekarboksylazą ornitynową i hamuje jej funkcje. Aktywność dekarboksylazy ornitynowej wydaje się być kontrolowana w wyniku oddziaływania białko-białko, przypominającego regulację aktywności trypsyny przez białkowe inhibitory trypsyny. Difluorometyloornityna, „samobójczy inhibitor" dekarboksytazy ornitynowej, była wykorzystywana do wyizolowania linii komórkowych mutantów, które wytwarzają w nadmiernych ilościach dekarboksylazę ornitynową i hamują replikację komórki przez chemioterapię kierowaną enzymatycznie.. Dekarboksylaza S-adenozylometioninowa, jedyny znany enzym eukariotyczny ze związanym pirogronianem jako niezbędnym kofaktorem (dekarboksylazy zwykle zawierają fosforan pirydoksalu, którego brak w dekarboksylazie S-adenozylometioninowej), ma krótki biologiczny okres póttrwania (1—2 h) i reaguje na promotory wzrostu komórkowego w sposób jakościowo podobny do karboksylazy ornitynowej. Zarówno jednak szybkość, jak i rozległość są mniej dramatyczne. Dekarboksylaza Sadenozylometioninowa (ryc. 33-5) ulega zahamowaniu przez dekarboksylowaną S-adenozylometionine i jest aktywowana przez putrescyne. Produkty katabolizmu poliamin są wydalane z moczem Na rycinie 33-6 przedstawiono katabolizm poliamin w tkankach ssaków. Enzym, oksy^daza poliaminowa, występujący w peroksysomach wątroby i utlenia sperminę do spermidyny, a następnie sperm idy nę do putrescyny, Obie części diaminopropanowe są przekształcane w aldehyd P-aminopropionowy. Następnie putrescyna jest częściowo utleniana do MHj iCC^przez mechanizmy, które pozostają do wyjaśnienia. Jednak główne części putrescyny i spermidyny są wydalane z moczem w postaci koniugatów (związków sprzężonych), przede wszystkim jako pochodne acetyl owe.

HA

NH3+ Aldehyd fi-amInoproplonlanu

Aldehyd 0-aminopropionianu Puirsscyna

NH+ +CO 3 Ryc. 33-6. Katabolizm poliamin. Aby ułatwić przedstawienie procesu struktury podano w -formie skrótowej. ____ _____________

Z TRYPTOFANU WYTWARZA SIĘ SEROTONINA Drugi szlak metabolizmu tryptofanu obejmuje jego hydroksylację do 5-hydroksytryptofanu. Utlenienie tryptofanu do pochodnej hydroksylowej przebiega analogicznie do przemiany fenyloalaniny w tyrozynę (ryc. 30-10), a 4-monooksygenaza fenyloalaninowa katalizuje również hydroksylację tryptofanu. W wyniku dekarboksylacji 5-hydroksy tryptofanu powstaje 5-hydroksytryptamina (serotonina) (ryc. 33-7), ważny czynnik zwężający naczynia krwionośne i stymulator skurczu mięśni gładkich.

392 / ROZDZIAŁ 33

O, > Wydalane jako koniugaty

5-Hydroksytryptofan 5-Hydroksytryptamina

5-Hydroksyindolo-3-octan

Wydalany Melatonina w postaci sprzężonej (N-acetylo-5-meioKsyserotonlna)

Wydalany w postaci sprzężonej

Ryc. 33-7. Biosynteza i metabolizm melatoniny. [NH*] — przez transami nację, MAO — oksydaza aminowa (oksydaza monoaminowa — nazwa nie zalecana).

Dekarboksylaza 5-hydroksytryptofanowa, która wytwarza serotonine z hydroksytryptofanu, występuje w nerkach (psa i świnki morskiej), w wątrobie i żołądku. Szeroko rozpowszechniona dekarboksylaza aromatycznych amino-

kwasów może również katalizować dekarboksylacje 5-hydroksytryptofanu. Większość serotoniny jest w wyriiku oksydacyjnej deaminacji przemieniana do 5-hydroksyindolooctanu. Katalizuje tę reakcję oksydaza

PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY / 393

aminowa (inaczej: oksydaza monoaminowa — nazwa' nie zalecana) (ryc. 33-7). Do inhibitorów tego enzymu należy iproniazyd. Pobudzenie psychiczne, wywołane przez podanie tego leku, jest przypisywane jego zdolności przedłużania pobudzającego działania serotoniny przez hamowanie aktywności oksydazy aminowej. W prawidłowym moczu ludzkim wydala się dziennie 10,52—42,06 umol (2—8 mg) 5-hydroksyindolooctanu.

Zwiększone wytwarzanie serotoniny zachodzi w złośliwym rakowiaku

Znacznie zwiększone wytwarzanie serotoniny występuje w złośliwym rakowiaku (argentaffinoma), chorobie charakteryzującej się szerokim rozprzestrzenieniem się komórek nowotworowych wytwarzających serotoninę w tkance srebrochłonnej jamy brzusznej. Rakowiak jest rozpatrywanyjako zaburzenie metabolizmu tryptofanu, w którym, znacznie większa niż zwykle, część puli tego aminokwasu ulega przemianie na szlaku hydroksyjndolowym. W warunkach prawidłowych tylko 1% tryptofanu przekształca się w serotoninę, ale u chorego na rakowiaka przemianie tej ulega nawet 60% tryptotanu. Takie przesunięcie metabolizmu znacznie zmniejsza wytwarzanie kwasu nikotynowego z tryptofanu, co w konsekwencji może spowodować wystąpienie objawów pelagry, a także uiemnego bilansu azotowego. Innymi metabolitami serotoniny, zidentyfikowanymi w moczu chorych na rakowiaka, są; 5-hydroksyindoloaceturan (połączenie glicyny z 5-hydroksyindołooctanem) oraz N-acetyl o sero toni -na sprzężona z kwasem glukuronowym.

Melatonina wytwarza się podczas N-acetyiacji serotoniny

Melatonina powstaje z serotoniny w wyniku N-acetylacji z następczą metylacją grupy 5-hydroksylowej (ryc. 33-7). Proces ten zachodzi w tkance szyszynki. W uzupełnieniu do metylacji N-acetyloseryny, zachodzi również bezpośrednia metylacją serotoniny oraz jej metabolitu — 5-hydroksyindolooctanu (ryc. 33-7). Serotonina i 5-metyloksytryptarnina są przekształcane w odpowiednie kwasy pod wpływem oksydazy aminowej. Z krwiobiegu melatonina jest wychwytywana przez wszystkie tkanki, włączając mózg, ale ulega szybkiej przemianie w wyniku hydroksylacji w pozycji 6, z następczym sprzężeniem z siarczanem (70%)

i kwasem glukumnowym (6%). Część puli melatoniny przekształca się w związki nieindolowe.

Metabolity tryptofanu są wydalane z moczem i kałem

Tryptofan może ulegać przemianie w kilka pochodnych indolowycfi (33-7). Produktami końcowymi tych przekształceń, pojawiającymi się w moczu, są przede wszystkim: 5-hydroksyindolooctan, główny końcowy produkt szlaku prowadzącego od hydroksytryptofanu do serotoniny, oraz indolo-3-octan, powstający w wyniku dekarboksyiacji i utlenienia indolopirogronianu, ketokwasu pochodzącego z tryptofanu. Nerki i wątroba ssaków oraz bakterie z kału ludzkiego dekarboksylują tryptofan do tryptaminy, która może być dalej utleniania do indolooctanu. Chorzy z fenyloketonurią wydalają zwiększone ilości indolooctanu (oraz indolomleczanu, powstającego w wyniku redukcji indolopirogronianu).

MELANINY SĄ POLIMERAMI KATABOLITÓW TRYPTOFANU Biosynteza melaniny jest skomplikowana wskutek wydłużonych i rozgałęzionych szlaków biosyntezy złożonych chemicznych struktur heteropolimerów mekniny, a także ich nierozpuszczalności, co utrudnia określenie ich struktury. Melaniny są syntetyzowane w melanosomach — cząstkach związanych z błonami w obrębie melanocytów. Sądzi się, że powstający polimer eumelaniny wychwytuje wolne rodniki i ulega częściowej degradacji przez H2O2, wytwarzany podczas procesu autooksydacji. Feomelaniny i eumelaniny wchodzą w kompleks z białkami macierzy melanosomalnej, wytwarzając melanoproteinę. Na rycinie 33-8 przedstawiono znane związki pośrednie oraz reakcje w biosyntezie eumelaniny i feomdaniny. Reakcję początkową katalizuje monooksygenaza monofenolowa (inaczej: tyrozynaza — nazwa nie zalecana), enzym zależny od miedzi. Reakcja katalizowana przez ten enzym ulega zaburzeniu w oezno-skórnym albinizmie tyrozynazo-ujemnym (p. niżej).

Związek pośredni benzoliazyny TH1CHOCHROMY MONOOKSYGENAZA MONOFENOLOWA p

(3,4- d i hyd ro ksyfen yloalan fn a) OKSYDAZA KATECHOLOWA

zredukowany "\

Dopachinon

Ryc. 33-8. Poznane związki pośrednie i reakcje w biosyntezie

MELANINY TYPU MIESZANEGO

eumeianin i feomelanin. Polimery melaniny zawierają zarówno eumelaninę, jak r feomelaninę w zmiennych proporcjach. Strzałki kreskowane wskazują, które związki pośrednie przyczyniają się do syntezy eumelanin w różnych proporcjach. Cyfry w kółkach wskazują na prawdopodobne regulatorowe reakcje szlaku biosyntetycznego. Reakcja 1, katalizowana przez monooksygenazę monoienolową i oksyda2ę katecholową (ogółem: tyrozynazę), jest wadliwa (niepełna) w ty rozynazo- ujemnym albinizmie ocznoskórnym.

PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY / 395

Kilka wad w biosyntezie melaniny może spowodować albinizm Termin „albinizm" obejmuje wiele objawów klinicznych, charakteryzujących hipomelanozę powstającą z dziedzicznych wad komórek barwnikowych (melanocytów oczu j skóry). Jest znane kilka pożytecznych modeli albinizmu u gryzoni. Objawy kliniczne, wspólne dla wszystkich 10

S-Adefiozylohomocystaina

jr- H, • bioptaryna

3-MONOOKSYGENAZA TYROZYNOWA

H. ■ bloptaryna

postaci albinizmu oczno-skórnego, obejmują

osłabione zabarwienie skóry i oczu. Wszystkie 10 postaci można zróżnicować na podstawie ich właściwości klinicznych, biochemicznych, ultraslrukturalnych i genetycznych. U albinosów tyrozynazo-ujemnych (inaczej:

tyrozynazo-negatywnych) jest całkowity brak widocznego barwnika. Cebulki włosów u tych chorych nie są zdolne do przekształcenia in vitro dodanej tyrozyny w barwnik, a ich melanocyty zawierają bezbarwne melanosomy. Albinosi tyrozyn a/ o -doda tui (inaczej: tyrozynazo-pozytywni) mają nieco barwnika, chociaż może być on niewidoczny u „białych" niemowląt. Barwa włosów waha się od białożółtej do jiisnobrązowej i bywają zabarwione znamiona. Melanocyty cebulek włosów mogą zawierać lekko zabarwione melanosomy, które przekształcają ta vitro tyrozynę w czarną eumelanine. Bielaetwo oczne zdarza się albo jako cecha autosomalna recesywna, albo sprzężona z chromosomem X. Melanocyty u albinosówz bielactwem ocznym u heterozygot sprzężonych z chromosomem X (ale nie u autosomalnych recesywnych) zawierają makromelanosomy. Siatkówki oczu u heterozygot żeńskich z bielactwem ocznym sprzężonym z chromosomem X (odmiana Nettleship) wykazują mozaikowy wzór rozmieszczenia barwnika związany z przypadkową inaktywacją chromosomu X. Precyzyjne zaburzenia metaboliczne, prowadzące do hipomelanozy w bielactwie ocznym, pozostają nieznane. Aibinoidyzm oczno-skórny jest dziedziczony

jako autosomalna cecha recesywna, U chorych, poza rzadkimi wyjątkami, nie występuje oczopląs, światłowstręt i zmniejszona ostrość widzenia. Z TYROZYNY WYTWARZA SIĘ ADRENALINA I NORADRENALINA Tyrozyna jest prekursorem adrenaliny i noradrenąliny,-iŁtóre"ś^Tcyiw"afżane w komórkach pochodzenia nerwowego. Chociaż DOPA jest

TRANSFERAZA NDopamlna

METYLOFENYLO ETANOLOAMINOWA

OH Adrenalina

Ryc. 33-9. Przemiana tyrozyny w adrenalinę i noradrenalinę w komórkach nerwowych i nadnerczy. PLP — fosforan pirydoksalu.

396 / ROZDZIAŁ 33 NH, H,N+ =

(Nerki) TflANSAMIDYNAZA AGRININO-GLI CYNOWA

+

I

ćoo-

r

HNCH,.COO "

H,N-CH2-COO'

Ornltyna

Glikocyjamina (guanidynooctan) (i. aktywnej met i o ni ny') ATP METYLOTRANSFERAZA

Glicyna (Wątroba) S-Adanozylometionlna

L-Arginlna

homocystelna

ADP

REAKCJA NIEENZYMATYCZNA W MIĘŚNIU

r

HN=C CH;

Pi+HsO CH-, Kreatynina Ryc.

HN;

tC

N CH3

Fosforan kreatyny

33-10. Biosynteza

kreatyny i kreatyniny. Bursztyn lan [A MIN OT R ANSF ERAZ A ]

DEKARBOKSYLAZA L-GLUTAMINIANOWA

a-AA

cooy-HydroKsymaS!an CHS

coo-

cooDEHYDROGENAZA MLECZANOWA

a-Ketoglutaran Semlaldehyd bursztyn łanu

Ryc. 33-11. Metabolizm y-aninomaślanu. a-KA — aDEHYDflOGENAZA SEMIALDEHYDU BURSZTYNIANOWEGO

ketokwasy, a-AA — ^aminokwasy, PLP — fosforan pirydoksalu.

PRZEMIANA AMINOKWASÓW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY / 397

związkiem pośrednim w powstawaniu zarówno melańiny ■ w melanocytach, jak i adrenaliny w komórkach neuronowych, odmienne enzymy przeprowadzają reakcje hydroksylacji w różnych typach komórkowych. Enzym 3-raonooksygenaza tyrozynowa (inaczej: hydroksylaza tyrozyny nazwa nic zalecana) tworzy cząsteczkę DOPA w komórkach neuronalnych i nadnerczy na szlakach wiodących do wyprodukowania noradrenaliny (ryc. 33-9). Dekarboksylaza DOPA, enzym zależny od fosforan u pirydoksal u, wytwarza dopaminę. Ta ostatnia ulega dalszej hydroksylacji przez p-monooksydazę dopaminową (inaczej: p-oksydazę dopaminową — nazwa nie zalecana), enzym zależny od miedzi, który wydaje się wykorzystywać witaminę C, aby wytworzyć noradrenaline. W rdzeniu nadnerczy N-metylotransferaza fenyloetanoloaminowa posługuje się S-adenozylometioniną do metylacji pierwszorzędowej aminy noradrenaliny, w celu utworzenia adrenaliny (ryc. 33-9). Tyrozyna jest równieżjirekursorem hormosyny (p. rozdz. 47).

WYDALANA KREATYNINA JEST ODZWIERCIEDLENIEM MASY MIĘŚNIOWEJ Kreatyna występuje w mięśniach, mózgu i krwi zarówno jako fosfokreatyna, jak i w stanie wolnym. Śladowe ilości kreatyny są również w prawidłowym moczu. Kreatynina, bezwodnik kreatyny, jest wytwarzana w znacznej mierze w mięśniu w wyniku nieodwracalnego nieenzymatycznego odwodnienia fosfokreatyny (ryc. 33-10). Wydalanie dobowe kreatyniny w moczu przez daną osobę jest w znacznym stopniu stałe, nie zmienia się z clnia na dzień oraz pozostaje proporcjonalne do masy mięśni. W biosyntezie kreatyny uczestniczą bezpośrednio 3 aminokwasy, tj. glicyna, arginina i metionina. Pierwszą reakcją jest tran sam idy nacja, tj. przeniesienie grupy amidynowej z argininy na glicynę z utworzeniem guanidynooctanu (glikocyjaminy). Zachodzi ona w nerce, a nie w wątrobie ani w mięśniu sercowym. Synteza kreatyny kończy się w wątrobie reakcją metylacji glikocyjaminy przy udziale „aktywnej metioniny" {ryc. 33-10).

UTWORZONY Z GLUTAMINIANU yAMINOMAŚLAN ULEGA PRZEMIANIE DO SEMIALDEHYDU BURSZTYNIANU Cząsteczka y- amin o mas łanu (GABA) powstaje w wyniku dekarboksylacji L-glutaminianu, w reakcji katalizowanej przez enzym zależny ód fosforanu pirydoksalu, dek ar boksy lazę L-glu ta minia nową (ryc. 33-11). Ta dekarboksylaza znajduje się w tkankach ośrodkowego układu nerwowego, głównie w substancji szarej. Dwie kolejne, mniej ważne, reakcje również przekształcają putresycynę w y-aminomaślan. Jedna obejmuje deaminację przez fyksydarzę aminową (oksydazę diaminową — nazwa nie zalecana), druga wykorzystuje N-acetylowane produkty pośrednie. Względne znaczenie tych 3 szlaków biosyntezy y-aminomaślanu zmienia się wśród tkanek i wraz ze stadium rozwojowym. Na przykład arnityna (ryc. 33-5) jest skutecznie przekształcana w y-aminomaślan w tkance embrionalnej siatkówki kury oraz w zakończeniach nerwowych dojrzałego mózgu. Katabolizm y-aminomaślanu (ryc. 33-11) obejniuje transaminację katalizowaną przez aminotransferazę y-aminoma sianową do semialdebydu bursztynianu. Semialdehyd bursztynianu może być redukowany do y-hydroksymaślanu w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę L-mleczanową lub utleniany do produktu pośredniego cyklu cytrynian owego, bursztynianu, a następnie do CO2 i H2O. Wraz z anionami innych aminokwasów y-aminomaśian jest sfabo transportowany przez komórkowe błony plazmatyczne. Stężenia y-aminomaślan u w moczu zmieniają się bezpośrednio z jego stężeniami w surowicy. Wprawdzie wada biochemiczna nie została sprecyzowana, może być jednak wynikiem upośledzonej transaminacji y-aminomaślanu do semialdehydu bursztynianu.

PIŚMIENNICTWO Scriver CR et al (editors): The Metabolic Basis of Inherited Diseasa, 6th ed. McGraw-Hill, I9S9. Tabor CW, Tabor H: Polyamines. Annu Rev Biochem 19S4;53:749.

3 4

Porfiryny i barwniki żółciowe

Robert K. Murray, MD, PhD

WPROWADZENIE W rozdziale tym omówiono biochemię porfiryn i barwników żółciowych. Te 2 zagadnienia są ze sobą ściśle powiązane, ponieważ hem jest syntetyzowany z porfiryn i żelaza, a produktami jego degradacji są barwniki żółciowe i żelazo.

styczną właściwością porfiryn jest tworzenie kompleksów z jonami metali, które łączą się z atomami azotu pierścieni pirolowych. Przykładami są takie żelazo porfiryny, jak hem hemoglobiny oraz porfiryna zawierająca magnez, tj. chlorofil, barwnik roślin zielonych biorący udział w fotosyntezie. W przyrodzie metaloporfiryny występują w postaci sprzężonej z białkami, tworząc liczne

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Znajomość biochemii porfiryn i hemu stanowi podstawę do zrozumienia różnorodnych funkcji hemoprotein w organizmie (udział w transporcie tlenu, transporcie elektronów, metabolizmie leków itd.). Grupą chorób spowodowanych zaburzeniami w biosyntezie porfiryn są porfirie. Chociaż nie należą one do powszechnych, spotyka się je u pacjentów dermatologów, hepatologów i psychiatrów. Znacznie bardziej powszechnymi, z klinicznego punktu widzenia, są żółtaczki spowodowane zwiększonym stężeniem bilirubiny w osoczu. Większa zawartość bilirubiny w osoczu, będąca wynikiem zwiększonego wytwarzania lub niewydolności wydalania bilirubiny, jest obserwowana w przypadku licznych chorób — od wirusowego zapalenia wątroby do nowotworów trzustki.

METALOPORFIRYNY SĄ ZWIĄZKAMI WAŻNYMI W PRZYRODZIE Porfiryny są związkami cyklicznymi, zbudowanymi z 4 pierścieni pirolowych połączonych mostkami metinowymi (ryć 34-1). Charaktery-

HC

XH N H Plrol

H

c .ĆH IV

H

HN

N

?HC—C

C=CH & H

H

•

t

Porfifyna

(C„HltN.) Ryc. 34-1. Cząsteczka porfiryny Pierścienie oznaczono cyframi rzymskimi I, II, III, IV, a pozycje podstawników w pierścieniach pirolowych cyframi arabskimi 1. 2, 3, 4, 5, 6, 7, S. Mostki metinowe (-HC=) określono jako a, 3, y, 6,

PORHRYNY I BARWNIK! ŻÓŁCIOWE / 399

związki odgrywające istotną rolę w procesach biologicznych. Należą do nich: Hemoglobiny- Są to żelazo po rfiryny związane z białkiem globiną. Mają zdolność odwracalnego wiązania tlenu. Służą jako środek transportu tlenu we krwi (p. rozdz. 7). Strukturę hemu przedstawiono na ryc, 7-2. Erytrokruoryny. Są to białka żelazoporfirynowe występujące we krwi i w płynach tkankowych niektórych bezkręgowców. Funkcja ich odpowiada funkcji hemoglobin. Mioglobiny. Są to białka oddechowe występujące w komórkach mięśni kręgowców i bezkręgowców. Cząsteczka mioglobiny przypomina podjednostkę hemoglobiny. Cytochromy. Są to białka biorące udział w transporcie elektronów w reakcjach utleniaj ąco-red u kujących. Ważnym przykładem jest cytochrom c o masie cząsteczkowej ok. 13 000 i jednym atomie żelaza na cząsteczkę, Katalazy. Są to enzymy żelazo porfiry no we rozkładające nadtlenek wodoru; niektóre z nich 1

2

6

5 Ryc. 34-2.

Uroporfiryna III.

A

P

A

A

P

t A

A

A

k___

P A

P M

P

i M

Koproporfiryna I

Ryc. 34-3. Uroporfiryny i koproporf iryny.

Uroporfiryny wykryto po raz pierwszy w moczu, ale nie jest to Jedyne miejsce Ich występowania

Uroporfiryna III M

P M

[

P

Naturalne porf iryny zawierają łańcuchy boczne podstawione do szkieletu porf i nowego Porfiryny występujące w przyrodzie są związkami, w których 8 atomów wodoru porfiny, oznaczonych na ryc. 34-1, jest podstawionych różnymi łańcuchami bocznymi. W celu prostego przedstawienia tych podstawień Fischer zaproponował uproszczony wzór, w którym mostki metinowe są pominięte, a każdy pierścień pirolu ma postać klamry z zaznaczonymi pozycjami łańcuchów bocznych numerowanymi jak na ryc. 34-2. Na rycinach 34-2—34-4 przedstawiono różne porfiryny (A [octan] = — CH2COOH; P [propionian]= -CH2 -CH2 COOH; M [metyl] = -CH3; V [winyl] = -CH = CH2). Przedstawione na ryc. 34-2 ułożenie podstawników A i P w uroporfirynie jest asymetryczne (w pierścieniu IV kolejność ułożenia łańcuchów kwasu octowego i propionowego jest odwrócona), Porfiryny z tym typem asymetrii podstawników są określone jako porfiryny typu III. Porfiryny z całkowicie symetrycznym ułożeniem podstawników są natomiast określane jako porfiryny typu L W przyrodzie występują

P

A

Uroporfiryna I

M

2,3 Dioksyyenaza tryptofanowa. En-

zym żelazo porfiry nowy katalizujący utlenianie tryptofanu do formy loki nureniny.

*

P

P

P

otrzymano w postaci krystalicznej. W roślinach aktywność katalazy jest bardzo mała, ale podobne funkcje pełni enzym żelazo porfiry no wy - peroksydaza.

P

M

Koproporfiryna III

Koproporfiryny po raz pierwszy wyizolowano z kału, ale znajdują sie one także w moczu

400 / ROZDZIAŁ 34 M

V

M P

P

M

I

V

M

Protoporfiryna lii (IX) {macierzysta porfiry na dla

Ryc. 34-4. Przyuczenie żelaza

M

1V

(FERRECHELATAZAJ

V M

1

i

P M Hem hemu) (grupa prosietyczna hemoglabiny) do protoporfiryny z utworzeniem hemu.

porfiryny typu I i Ul, przy czym porfiryny typu III są znacznie bardziej rozpowszechnione i istotne, ponieważ należy do nich hem (ryc. 34-3). Hem i jego bezpośredni prekursor — protoporfiryna IX (ryc. 34-4) są porfirynami typu III (tj. grupy metylowe rozmieszczone są asymetrycznie, jak w koproporfirynie typu III). Jednakże zalicza sieje czasami do szeregu IX, gdyż były oznaczone jako dziewiąte w serii izomerów postulowanych przez Hansa Fishera, pioniera w dziedzinie badań chemii porfiryn.

UKŁAD PORFIRYNOWY HEMU JEST SYNTETYZOWANY Z SUKCYNYLO-CoA I GLICYNY Syntezę porfiryn w żywych komórkach przeanalizowano na przykładzie hemu, żelazoprotoporfiryny hemoglobiny. Dwoma związkami wyjściowymi są: sukeynylo-CoA, pochodzący z cykiu kwasu cytrynowego zachodzącego w mitochondriach i glicyna. Niezbędny jest również fosforan pirydokśalu, który „aktywuje" glicyne. Produktem reakcji kondensacji sukcynylo-CoA i glicyny jest kwas a-amino-fS-ketoadypinowy, który natychmiast jest dekarboksylowanydo kwasu 8-ami no lewul ino wego (ALA) (ryc. 34-5). Etap ten katalizuje syntaza ALA, która jest enzymem kontrolującym nasilenie biosyntezy

porfiryn w wątrobie ssaków. Syjiteza^ALA, zachodzi w rmtochcndriach, W cy_tozolu, przy udziale syntazy porfobilinogen owej, kondensują 2 cząsteczki ALA, tworząc porfobilinogen (PBG) i 2 cząsteczki wody (ryc. 34-5). Syntaza porfobilinogen owa jest enzymem zawierającym cynk, a hamuje ją ołów. Kondensacja 4 cząsteczek PBG prowadzi do utworzenia tetrapirolu, tj. porfiryny (ryc. 34-6).

X?_4,„CZftsteczki. kondensują liniowo, tworząc łańcuchowy tetrapirol - hydroksymetylenobilan. Reakcję katalizuje syntaza u roporfiry no genowa I, znana również jako deaminaza porfobilinogcnowa. Hydroksymetylenobilan ulega samorzutnej cyklizacji do uroporfirynogemi I (lewa strona ryc. 34-6) lub jest przekształcany w uroporfirynogen III pod wpływem syntazy uroporfirynogenowej I i kosyntazy uroporfirynogenowej III (prawa strona ryc. 34-6). W warunkach fizjologicznych powstaje prawie wyłącznie izomer uroporfirynogen u typu III, ale w niektórych porfiriach (omawianych poniżej) tworzą się również izomery porfiry no genów typu I. W uroporfirynogenach pierścienie pirolowe są połączone mostkami metylenowymi (— CH2 —), które nie tworzą układu sprzężonych wiązań podwójnych. Dlatego też związki te (jak wszystkie porfirynogeny) są bezbarwne. Porfirynogeny łatwo utleniają się do odpowiednich porfiryn. Reakcje utleniania katalizuje światło i utworzone porfiryny. Uroporfirynogen III przekształca się w koproporfirynogen III w wyniku dekarbokśylacji łańcuchów kwasu octowego do grup metylowych^ Reakcję katalizuje dekarboksylaza jiroporfirynogenowa, która przekształca również~uroporfirynogen I w kopro porfiry no gen I (ryc, 34-7). Koproporfirynogen III wnika do mitochondriów, gdzie powstaje protoporfirynogen nT,"a następnie protoporfirynaJII^Wydaje się,

że ta przemiana zacfiocIzT w kilku etapach. Znajdująca się w mitochondriach oksydaza koproporfirynogenowa katalizuje dekarboksylację i utlenianie 2 łańcuchów kwasu propionowego z utworzeniem protoporfirynogęnu. Substratem dla tego enzymu jest wyłącznie koproporfirynogen typu III, co mogłoby tłumaczyć brak naturalnego występowania p roto porfiryny

PORFIRYNY I BARWNIKI ŻÓŁCIOWE / 401

Sukcynylo-CoA („aktywny" bursztyn tan)

Glicyna

SYNTAZA ^AMINOLEWULINiANOWA

U

CoA-SH

1

f i

COOH

COO H

SYNTAZA 5-AMINOLEWULIMANOWA

C=O CH, H-C-l

Fosforan plrydoksalu

CH, c=o

CO,

-♦-H-C-NH, H

a-Ami n o-0-ketoadyp In lan

a-Aminolewulinlan (ALA)

JH-

COOH

I

CHj CH J

C=O ; S-CoA

+

i. -C~NH,

COOH

COOH CH, t

COOH CH,

C

i

OOH

J_ SYNTAZA P0RF08ILIN0GENOWA

CH,

ŃH, NH

COOH CH, ĆH* CH,

ć --C

I CH NH, 2 cząsteczKI jarnlnolewullnlanu

Porto bili nogen (prekursor plrolu)

Ryc. 34-5. Biosynteza porfobilinogenu. Syntaza 8-aminolewulinianowa znajduje się w mitochondriach, podczas gdy syntaza porfobilinogenowa w cytozolu.

typu I. Utlenianie protoporfirynogenu do protoporfiryny katalizuje inny enzym mitochondrialny — oksydaza protoporfirynogenowa. W wątrobie ssaków warunkiem przekształcenia koproporfirynogenu w protoporfirynę jest obecność tlenu cząsteczkowego. Tworzenie hemu polega na wbudowaniu Fe do protoporfiryny Końcowy.eLąp syntezy_hemu,p.olega-na wbudowaniu jonu żelazawego do protoporfiryny w reakcji katalizowanej przez syntazę hemową, czyli fcrrechelatazę, umiejscowioną w mitocbondriach (ryc. 34-4). Zestawienie etapów biosyntezy pochodnych porfiryny z PBG przedstawiono na ryc. 34-8. Biosynteza hemu zachodzi w większości tkanek

ssaków, z wyjątkiem dojrzałych erytrocytów, które nie zawierają mitochondriów. Opisane powyżej porfirynogeny są bezbarwne i, w porównaniu z odpowiadającymi im barwnymi porfirynami, zawierają 6 dodatkowych atomów wodoru. Wiadomo obecnie, że te zredukowane porfiryny (porfirynogeny),

a nie odpowiadające im porfiryny, są związkami pośrednimi w biosyntezie protoporfiryn i hemu.

Kluczowym enzymem regulującym biosyntezę hemu jest syntaza ALA Reakcją ograniczającą syntezę hemu jest kondensacja sukcynylo-CoA i glicyny 2 utworzeniem ALA, katalizowana przez syntazę kwasu 5-aminolewulinowego (syntaza ALA) (ryc, 34-5). Syntaza ALA jest enzymem podlegającym regulacji. Uważa się, że hem, przypuszczal26 -

Biochemia

nie przez cząsteczkę aporepresora, dzialajako_ ujemny regulator; . . gromadzenia sfę syntazy ALA. Mechanizm represji i derepresji przedstawiono schematycznie na ryc. 34-9. Możliwe, że na tym etapie ma miejsce również hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego, lecz główny wpływ regulujący hemu polega na tym, że sz^bkość^agromadząnia się syntazy ALA znacznie się zwiększa w nieobecności hemu, a maleje w jego obecności. Syntazę ALA Z wątroby ssaków charakteryzuje szybki obrót metaboliczny (okres póltrwania wynosi ok. 1 h) właściwy

A cząsteczki porfociiinogenu 4NH,

SYNTAZA UROPORFIRYNOGENOW A

Hyd roksy metylen o b ila SYNTA2A UR0PORFIRYNOGENOWA I KOSYNTAZA UROPORFIRYNOGENOWA lll

SAMORZUTN A

n (łańcuchowy tetrapirol) Uroporflrynagan typu i

Uroporflrynogen typu II!

Ryc. 34-6. Przekształcenie porfobilinogenu w uroporfirynogeny.

„

A

l—

1

r mIV ni P

p A

i—,

W k------,P 4CO3

IV

u

Uroporfirynogen I

■L

M

II

lll |DEKARBOKSYLAZA | UROPORFIRYUOGENOWA

Ko pro porfiry nogen I

I

M iv

TT

M P

IM A Uroporflrynogen lll

4COj

Koproporfirynogen lll

Ryc. 34-7. Dekarboksylacja uroporfirynogenów do koproporfirynogenów w cytozolu. A — octan, M — metyl, P — propionian.

PORFIRYNy I BARWNIKI ŻÓŁCIOWE / 403 Porto bil ino gen SYNTAZA UROPORFłRYNDGENOWA I Hyd ro ksymety len obi! an

KOSYNTAZA UROPORFIRYNOGENOWA II! SYNTAZA UHOPORFIRYNOGENOWA I

Światło

■-»„ SAMORZUTNIE

s \

6H

Uroporfirynogen I

Uroporfiryna -o-

Uroporftryn a 1

Umpoffirynogen Światło DEKARBOKSYLAZAURO PO RFIR YNO GEN OWA

6H

4CO5 K op ro p o r f iiy na - ^- ^ — K o pr o p o r f i ry n o ge n IM Światło

Koproporfirynogen -----^ » Koproparflryna I Światłe |

OKSYDAZA KOPROPORFiRYNOGENOWA Protoporfirynogen III

OKSYDAZA PROTOPORFIRYNOGENOWA

Lub światło In vltro

Protoporfiryna I FERRECHELATAZA

Fe!

Hem

Ryc. 34-8. Eiapy biosyntezy pochodnych porfiryny z porfobilinogenu.

dla enzymów katalizujących reakcje ograniczające tempo przemian. Wiele ksenobiotyków (p. rozdz. 60) powoduje znaczne zwiększenie stężenia syntazy ALA w wątrobie człowieka. Większość tych związków jest metabolizowana w wątrobie przy udziale swoistej hemoproteiny, tj. cytochromu P-450. Metabolizm ksenobiotyków pociąga za sobą zwiększone wykorzystanie hemu przez cytochrom P-450, powodując zmniejszenie wewnątrzkomórkowego stężenia hemu, co z kolei wpływa na derepresję syntazy ALA i przyspieszenie syntezy hemu zgodnie z zapotrzebowaniem komórki. Indukcja syntazy ALA w wątrobie zależy od wielu innych czynników. Glukoza zapobiega indukcji syntazy ALA, żelazo w postaci kom-

pleksów chelatowych działa synergicznie na indukcję syntazy ALA w wątrobie, a steroidy ułatwiają derepresję syntazy ALA wywołaną in vivo lekami. Podanie hematyny zapobiega natomiast derepresji syntazy ALA, jak również innych hemoprotein w wątrobie, wywołanej in vivo lekami. Znaczenie niektórych z tych mechanizmów regulacyjnych omówiono w części poświęconej chorobom sklasyfikowanym jako porfirie.

404 / ROZD2IAŁ 34

PORFIRYNY SĄ BARWNE ł FLUORYZUJĄ

Hemoproteiny 11

Białka Hem------------.

a.

presor

FEHRECHELATAZA

Protoportlryna It! OKSYDAZA PROTOPOfr 7. FIRYNOGENOWA Protoporf rynogen |]| OKSYDAZA r.OPROPOR-6 FIRYNOGENOWA Kaproporfitynoflen III DEKARBOKSYLAZA UROIs PORFIRYNOGENOWA Uroporfirynogen Uli KOSYNTAZA imDPORFl-, RYNOGENOWA III Hyctraksymetylanobi la n SYNTAZA UROPORFI-a RYNOGENOWA I Porfobilmogen SYNTAZA PORFO2 BILINOGENOWA ALA SYNTAZA ALA

Porfirynogeny są bezbarwne, podczas gdy porfiryny są barwne, W badaniach porfiryn i ich pochodnych duże znaczenie mają charakterystyczne widma pochłaniania zarówno w świetle widzialnym, jak i nadfioletowym. Przykładem może być krzywa absorpcji roztworu porfiryny w 5% kwasie solnym (ryc. 34-10). Na szczególną uwagę zasługuje wyraźne pochłanianie w paśmie o długości ok. 400 nm, charaktery styczne dla pierścienia porfirynowego niezależnie od rodzaju łańcuchów bocznych porfiryn. To pasmo pochłaniania jest określone mianem pasma Soreta od nazwiska jego odkrywcy. Porfiryny rozpuszczone w mocnych kwasach nieorganicznych lub rozpuszczalnikach organicznych i naświetlone światłem UV wykazują silną czerwoną fluorescencję. Jest ona tak charakterystyczna, że jest często wykorzystywana do wykrywania małych ilości wolnych porfiryn. Absorpcja i fiuorescencja porfiryn są spowodowane obecnością wiązań podwójnych. Jak już wspomniano, redukcja (w wyniku przyłączenia wodoru) mostków metinowych (—HC=) do metylenowych (— CH2 —) prowadzi do powstania bezbarwnych związków zwanych porfirynogenami.

Porfiryny i ich prekursory wykrywa stę za pomocą spektrofotometrii

Wykrywanie obecności koproporfiryn i uroporfiryn jest istotne z klinicznego punktu widzenia, gdyż związki te są wydalane w zwiększonych ilościach w przypadku porfirii. Obecne w moczu i kale związki można rozdzielić za pomocą ekstrakcji odpowiednią mieszaniną rozpuszczalników, a następnie zidentyfikować

Sukcynylo-CoA + Glteyna

Ryc.34-9. Metabolity pośrednie, enzymy i regulacja syntezy hemu. Numeracja enzymów zgodna z numeracją w tab, 34-1. Brak enzymów 2-8 powoduje porfirie. Regulacja syntezy hemu odbywa się na poziomie symazy ALA za pomocą mechanizmu represja-de represja przez łiem i jego hipotetyczny aporepresor. Linie przerywane wskazują negatywną (—) regulację przez represję.

Ryc. 34-10. Widmo absorpcji hematoporfiryny (0,01% roztwór w 5% HCt)

Ą

3

" J

/

\

/

f

\

1

\ 300

400

A / ^ s

500

V

600

Długość fali (nm)

700

PORFIRYNY I BARWNIKI ŻÓŁCIOWE / 405

i oznaczyć ilościowo metodami spektrofotometrycznymf. Stosując odpowiednie testy kolorymetryczne można również oznaczyć w moczu ALA i PBG. PORFIRIE SĄ CHOROBAMI GENETYCZNYMI ZWIĄZANYMI METABOLIZMEM HEMU

Z

Porfiife.należa. do grupy chorób wrodzonych związanych zjabujrzejjiamilnetarjolizmu hemu, wynikających z mutacji genów odpowiedzialnych za syntezę enzymów uczestniczących w biosyntezie hemu. Chociaż nie występują one powszechnie, należy je brać pod uwagę, a szczególnie w pewnych okolicznościach (np. w diagnostyce różnicowej ostrego brzucha lub różnorodnych zaburzeń o charakterze neuropsychicznym), aby uniknąć niewłaściwego postępowania z chorymi. Przypuszcza się, że król Jer2y III chorował na porfirię mieszaną, która mogła być przyczyną jego okresowych odosobnień na zamku Windsor i pewnych jego poglądów odnośnie do amerykańskich kolonistów. Także nadwrażliwość skóry na światło (powodująca aktywność nocną) i ciężkie zniekształcenia występujące u niektórych ofiar wrodzonej porfirii erytropoetycznej sugerowały, że osoby te mogły być prototypami wilkołaków. Biochemia tkwi u podstaw przyczyn, rozpoznawania i leczenia porfirii Biorąc pod uwagę zmniejszenie aktywności każdego z enzymów 3--8 na ryc. 34-9 (p. tab. 34-1) wyróżnia się 6 typów porfirii. Oznaczenie aktywności 1 lub kilku z tych enzymów w odpowiednim materiale (np. erytrocytach) jest podstawą diagnostyki porfirii. Dotychczas nie stwierdzono przypadków z małą aktywnością enzymu 1 (syntaza ALA), a zmniejszenie aktywności enzymu 2 (syntaza porfobilinogenowa) jest zjawiskiem obserwowanym bardzo rzadko. Porfirię dziedziczy się autosomalnie dominująco, z wyjątkiem wrodzonej porfirii erytropoetyc2nej, którą dziedziczy się w sposób recesywny. Nieprawidłowości w genach odpowiedzialnych za syntezę enzymów biorących udział w biosyntezie hemu określa się technikami rekombinacji DNA. Podobnie, jak w przypadku większości chorób wrodzonych, kliniczne objawy porfirii są wynikiem nagromadzenia metabolitów poprzedzających blok enzymatyczny lub braku metabo-

litów występujących za blokiem enzymatycznym. Jeśli wada metaboliczna dotyczy początkowych etapów biosyntezy hemu, tj. poprzedzających tworzenie porfiry no genów (np. enzymu 3 na ryc. 34-9, porfiria ostra przerywana) następuje nagromadzenie ALA i PBG w tkankach i płynach ustrojowych (ryc. 34-11). Zarówno każdy z tych związków, jak i oba razem oddziałują toksycznie na nerwy brzuszne i ośrodkowy układ nerwowy, powodując bóle brzucha i objawy neuropsychiczne charakterystyczne dla tego typu porfirii. Biochemicznym podłożem tych objawów jest prawdopodobnie hamujący wpływ ALA na aktywność ATPazy w tkance nerwowej i (lub) wychwytywanie ALA przez mózg, powodujące w bliżej nie wyjaśniony sposób porażenie przewodnictwa. Blok enzymatyczny występujący w późniejszych etapach szlaku powoduje nagromadzenie porfirynogenów określonych na ryc. 34-9 i 34-1!. Produkty ich utlenienia, czyli odpowiednie porfiryny, powodują nadwrażliwość skóry na światło widzialne o długości fali ok. 400 nm. Porfiryny eksponowane na światło o tej długości fali przechodzą w stan wzbudzenia i reagują z tlenem cząsteczkowym, wytwarzając rodnikowe formy tlenu, które uszkadzają lizosomy i inne organelle komórkowe. Uwolnione enzymy powodują zmiany w skórze, aż do powstawania blizn. Innym kryterium klasyfikacji porfirii może być rodzaj tkanki lub komórki, w których występują nieprawidłowości metaboliczne. Są to przede wszystkim tkanki i komórki szczególnie aktywne w syntezie hemu, takie jak szpik kostny syntetyzujący znaczne ilości hemoglobiny w ciągu doby oraz wątroba bardzo aktywnie syntetyzująca cytochrom P-450. Zgodnie z tą klasyfikacją wyróżnia się porfirię eryrropoetyczne, wątrobowe oraz erytropoeryczno-wąrrobowe (postacie mieszane). Typy porfirii należące do każdej z tych klas przedstawiono w tab. 34-1. Przyczyny ujawniania się w przypadku określonej porfirii zaburzeń metabolicznych, głównie w jednym typie tkanek, nie są do końca wyjaśnione. Przypuszcza się, że wynika to z różnej aktywności enzymów syntezy hemu w różnych tkankach i komórkach. Jak już wspomniano, syntaza ALA jest kluczowym enzymem regulującym szlak biosyntezy hemu. Chociaż enzym ten nie jest bezpośrednią przyczyną 6 omawianych typów porfirii, jego regulacja stanowi podstawę zrozumie-

406 / ROZDZIAŁ 34 Tabela 34-1. Główne objawy porfirii ■Wada enzymatyczna

Porfiria

typ i (klasa)

Wyniki testów

objawy kliniczne

laboratoryjnych

3. Syntaza uroporfirynogenowa 1

Porfiria ostra przerywana (wątrobowa)

Bóle brzucha PBG w moczu + Zaburzenia neuropsy- Uroporfiryna w moczu chiczne Brak + nadwrażliwości skóry na światfo

4. Kosyntaza uroporfirynogenow3 IM

Wrodzona porfiria erytropoetyczna (erytropoetyczna)

Nadwrażliwość skóry na światło

Uroporfiryna w moczu + PBG w moczu

5. Dekarboksylaza uroporfirynogenowa

Porfiria skórna późna (wątrobowa)

Nadwrażliwość skóry na światło

Uroporfiryna w moczu + PBG w moczu

6, Oksydaza koproporfirynogenowa

Koproporfiria wrodzona (wątrobowa)

Nadwrażliwość skóry na światło Bóle brzucha Zaburzenia neuropsy-chiczne

PBG w moczu + Uroporfiryna w moczu + Koproporfiryna w kale +

7. Oksydaza protoporfirynogenowa

Porfiria mieszana (wątrobowa)

Nadwrażliwość skóry na światło Bóle brzucha Zaburzenia neuropsy-chiczne

PBG w moczu + Uroporfiryna w moczu + P rato porfiry na w kale +

8. Ferrechelataza

Protoporfiria erytropoetyczna (erytropoetyczno-wątrobowa)

Nadwrażliwość skóry na światło

P rato porfiry na w kale + P rato porfiry na w erytrocytach +

Tabela zawiera wyniki badań biochemicznych typowych dla ostrych stanów porfirii. W okresie utajenia wyniki niektórych oznaczeń mogą być prawidłowe. * Numeracja enzymów odpowiada numeracji na ryc. 34-9. Mutacja W DMA

Nieprawidłowoścl w obrębie enzymńw syntezy hemu

Nagromadzanie ALA oraz RBG I (lub) zmniejszenie stężenia hemu w komórkach i płynach ustrojowych

Nagromadzenie porfirynogenow w skórze i tkankach

Zaburzenia neuropaycniozne

Samorzutne utienianie porfirynogenow do porfiryrr

Nadwrażliwaścskorynaiwiatło

Ryc. 34-11. Biochemiczne podstawy głównych objawów klinicznych porfiru

PORFIRYNY I BARWNIKI ŻÓŁCIOWE / 407

nia tych chorób. Syntaza ALA ulega zarówno indukcji,'jak i represji, a jej aktywność w pewnych warunkach może się znacznie zwiększyć (aż do 50 razy). Wiele leków (np. barbiturany, gryzeofulwina) indukuje syntaze ALA. Mechanizm tej indukcji w większości przypadków polega na indukcji cytochromu P-450 (p. rozdz. 60), a zwiększone zapotrzebowanie na hem powoduje derepresję (indukcję) syntazy ALA. U chorych z porfirią zwiększenie aktywności syntazy ALA prowadzi do zwiększenia stężenia potencjalnie szkodliwych prekursorów hemu poprzedzających blok metaboliczny. Przyjmowanie leków, które indukują cytoehrom P-450 (induktory mik roso mai ne), może więc wywołać napad porfirii. Podstawą rozpoznania swoistej postaci porfirii są; wywiad dotyczący samego chorego i wywiad rodzinny, badania przedmiotowe chorego i odpowiednie testy laboratoryjne. Główne dane, dotyczące 6 postaci porfirii, przedstawiono w tab. 34-1. Zatrucie ołowiem może również wpływać na metabolizm hemu w wyniku wiązania ołowiu z grupami SH takich enzymów, jak ferrechelataza czy syntaza porfobilinogenowa. Powoduje to zwiększenie zawartości protoporfiryny w erytrocytach oraz ALA i koproporfiryny w moczu. Należy mieć nadzieję, że w przyszłości możliwe będzie leczenie porfirii na poziomie genu. Tymczasem leczenie ma charakter objawowy. Chorzy powinni unikać środków znieczulających oraz leków, w tym również alkoholu, które indukują cytochrom P-450. Przyjmowanie dużych ilości pokarmu bogatego w węglowodany (obciążenie glukozą) lub podawanie hematyny (wodorotlenek hemu) może powodować represję syntazy ALA, a tym samym zmniejszać tworzenie szkodliwych prekursorów hemu. W przypadku chorych z wrażliwością skóry na światło korzystne jest stosowanie {3-karotenu; związek ten zmniejsza wytwarzanie wolnych rodników, zmniejszając tym samym nadwrażliwość skóry na światło. Pomocne mogą być również ekrany słoneczne eliminujące zakres światła widzialnego.

PRODUKTEM KATABOLIZMU HEMU JEST BILIRUBINA U dorosłego człowieka fizjologicznie w ciągu godziny rozpada się 1—2xlO9 erytrocytów. W ciągu dnia osoba o masie ciała 70 kg metabo-

iizuje ok. 6 g hemoglobiny. C_zejć_ białkowa —jilobina — może być ponownie wykorzystana jako taka lub w formie jej składowych aminokwasów, a żeUzo_hęm.Qwe jest włączane w ogólna pule żelaza w organizmie, również w celu ponownego wykorzystania. Natomiast pozbawiona żelaza cześć porfirynowa hemu jest degradowana, głównie w komórkach siateczkowo-śródbłonkowych wątroby, śledziony i szpiku kostnego. Katabolizm hemu, pochodzącego ze wszystkich hemoprotein, jzachodzi we frakcji raikrosomalnej komórek siateczkowo-śródbłonkowych przez złożony układ enzymatyczny, określany mianem oksygenazy hemowej. Działanie oksygenazy hemowej poprzedza zwykle utlenienie żelaza w hemie do formy żelazowej l z utworzeniem heminy oraz luźne połączenie z"albuminą do methemalbuminy. Oksygenaza Uemawa jest indukowana pod wpływem subsuatu i jest sprzężona z mi krosom alnym łańcuchem przenoszenia elektronów. Jak przedstawiono na ryc. 34-12, w obecności NADPH hemina ulega redukcji, po czym — również przy udziale NADPH — do wiązania a-metinowego między I i II pierścieniem pirolowym porfiryny przyłącza się grupa hydroksylowa, a jon żelazawy jest ponownie utleniany do jonu żelazowego. W konsekwencji w obecności tlenu uwalnia się jon żelazowy i odłącza się tlenek węgla, a w wyniku rozerwania pierścienia tetrapirolowego powstaje równomolarna ilość biliwerdyny lX-a. Hem pełni w tej reakcji funkcję katalizatora. U ptaków i płazów zielona biliwerdyna IX-tx wydala się; u_ ssaków reduktaza bili werdy nowa ^Hjjki^ip mostek m et ino w. y .miedzy pierścieniami pirolowymi III i IVdo grupy metylenowej, tworząc bilirubinę IX ^- barwnik żółty (ryc. 34-12). Ocenia się, że 1 g hemoglobiny dostarcza 59,9 jrniol ( = 35 mg) bilirubiny. Dobowe wytwarzanie bilirubiny u człowieka wynosi ok. 427,5 —598,5 urnol < = 250—350 mg). Chemiczne przekształcenie hemu do bilirubiny przez komórki siateczkowo-śródbłonkowe można obserwować in vivo na przykładzie krwiaka, w którym purpurowa barwa hemu przechodzi powoli w żółte zabarwienie bilirubiny. Dalszy metabolizm bilirubiny zachodzi głównie w wątrobie. Można w nim wyróżnić 3 procesy: 1) wychwytywanie bilirubiny przez komórki miąższowe wątroby, 2) sprzęganie bilirubiny w siateczce śródplazmatycznej gładkiej i 3)

%/■

408 / ROZDZIAŁ 34 Hen-

HN

i

l

Hemina

HN

t

|

p^

-N

H

11 p

/=

p

rf

n r?

HN

Vi

i

■NADP H

I

p

HN NADP-

-NADP

-t Bilirubina IXa

^J NADPH -^

n

HŃ H V

■NADPH

\

NADP

Fea+ (ponownie wykorzystywany) i CO (wydychany)

I

— i

r

■Ny

r

m

J_i___

HNm \ = /

Biliwerdyna IX —a

Bvc. 34-12, Schemat mikrosomalnego układu oksygertazy hemowej (zmodyfikowany wg Schmida R., McDonougha A. F. w: The Porphyrins. Dolphin D. [red.]. Academic Press, 1978).

wydalanie sprzężonej bilirubiny w żółci. Każdy z tych procesów będzie rozpatrywany oddzielnie. Bilirubina jest wychwytywana przez wątrobę SJaifeo~tozpti szczał na w osoczu i wodzie bilirubina wiąże się z białkami osocza, a głównie z albuminą. Każda cząsteczka albuminy ma 1 miejsce o dużym i 1 miejsce o małym powinowactwie do bilirubiny. W przeliczeniu na 1000

ml osocza ok. 427,5 umol( = 250 mg) bilirubiny wiąże się silnie z albuminą w miejscu jej dużego powinowactwa do bilirubiny. Nadmiar bilrrubiny wiąże się tylko luźno i tym samym łatwo ulega odłączeniu i dyfuzji do tkanek. Niektóre związki, takie jak antybiotyki i leki, współzawodniczą z bilirubiną o miejsce o dużym powinowactwie w albuminie. Związki te mogą zatem wypierać bilirubinę z połączenia z albuminą, odgrywając dużą rolę kliniczną.

PORFIRYNY I BARWNIKI ŻÓŁCIOWE / 409

W^ wątrobie bilirubina odłącza się od al- Tworzenie diglukuronidu bilirubiny przebiebuminy ,i przy udziale nieswoistego układu^' ga w pobliżu bieguna żółciowego hepatocytu przenośnikowego przenika przez biegun naczy- (otaczającego kanalik żółciowy) przy udziale niowy hepalocytu do wnętrza komórki. Ten UDPglukuronozylotransferazy lub enzymu kaukład ułatwiający transport charakteryzuje się talizującego przekształcenie 2 cząsteczek monodużą wydajnością i nawet w warunkach patolo- glukuronidu bilirubiny w 1 cząsteczkę diglukugicznych nie ogranicza szybkości i przemian ronidu bilirubiny i 1 cząsteczkę niesprzężonej bilirubiny. bilirubiny (ryc. 34-14). Dalszą charakterystykę Ponieważ układ ułatwiający transport umoż- układu sprzęgania bilirubiny przedstawiono liwia utrzymanie równowagi bilirubiny po obu w czcści poświęconej wrodzonym zaburzeniom stronach bieguna naczyniowego hepatocytu, sprzęgania bilirubiny. bilans wychwytywania bilirubiny zależy od jej Aktywność UDPglukuronozylotransferazy usuwania w wyniku dalszych etapów szlaku jest indukowana przez wiele stosowanych w klimetabolicznego. nice leków jak fenobarbital. Sprzęganie bilirubiny zachodzi w wątrobie w \y^{rnhif w wyniku przyłączenia grup polarnych, bilirubina .przekształcą się w postać rri7pns7r;7tiir^] w \yp/ł-rig i '"jfdziela się do żółci. rozpuszczalności w wodzie,

czyli zwiększenia polarności bilirubiny, dgkonuje się w wyniku sprzęgania i przebiega, przynajmniej początkowo, w siateczce śródplazmaf. F r 7 V udziale swoistycn enzy_ y j g E J . F y y mów. U ssaków większość bilirubiny wydala się dp żółci w postaci diglukur""idn h^nNny (ryc. 34-13)! Tworzenie' pośredniego monoglukuronidir bilirubiny jest katalizowane przez urydynodifosfoglukuronozylotransferazę (U DPglukuronozylotransferazę), enzym występujący w siateczce śródplazmatycznej gładkiej w prawdopodobnie więcej niż jednej postaci. Reakcję przedstawiono na ryc. 34-14. Zachodzi ona przede wszystkim w wątrobie, ale także w nerkach i błonie śluzowej jelita. Nieprawidłowe stężenie sprzężonej bilirubiny w surowicy człowieka jest głównie związane z obecnością monoglukuronidów.

M

Bilirubina wydziela się do żółci Wydzielanie sprzężonej bilirubiny do żółci przebiega wbrew gradientowi stężeń na zasadzie transportu aktywnego, który prawdopodobnie spełnia funkcję regulującą dla całego metabolizmu bilirubiny w wątrobie. Transport sprzężonej bilirubiny do żółci jest indukowany przez te same leki, które indukują proces sprzęgania bilirubiny. Układy sprzęgania i wydzielania bilirubiny stanowią więc skoordynowaną jednostkę funkcjonalną. W warunkach fizjologicznych praktycznie cala (> 97%) bilirubina wydzielana do żółci jest w postaci sprzężonej. Znaczne ilości bilirubiny niesprzężonej w żółci można znaleźć jedynie po fototerapii. Wątroba dysponuje wieloma układami wydzielającymi do żółci produkty metabolizmu związków występujących naturalnie oraz preparatów farmaceutycznych. Niektóre z nich są wspólne z układem wydzialającym diglukuronid bilirubiny, podczas gdy inne działają niezależnie.

o -OOC
C-0 -C| CH;O)4CO O-

M H H H

Ryc. 34-13. Struktura digiukuronidu bilirubiny (bilirubina sprzężona, bezpośrednia). Kwas glukuronowy wiąże się estrowo z 2 resztami kwasu propionowego, tworząc acyloglukuronid.

41 0 / R O ZD ZIA Ł 3 4

UDP-glukoza.

DEHYDflOGENAZA LIDPl to ■♦■ Kwas UDP-glukuronowy 2NAD ł

Kwas UDP-glukuronowy

2NADH +2H

UOP-GLUKURONOZYLOTflANSFERAZA

Bilirubina

Kwas UD P-glu kuro nawy Monoglukuronid bilirubiny 2 cząsteczki monogiukurortWu bilirubiny

Monog I uku ro ni d bilirubiny UDP

UDP-GLUKURONOZYLO TRANSFERAZA

+

ł

GLUKURONOZYLO TRANSFERAZA GLUKURON1DU BILIRUBINY

Dlglukuronid bilirubiny UDP

Oiglukuronid bilirubiny

+

Bilirubina

Ryc. 34-14. Sprzężenie bilirubiny z kwasem glukuronowym. Donor gtukuronianu, kwas UDP-gfukuronowy, tworzy się z UOP-glukozy

Sprzężona bilirubina jest redukowana do urobilinogenu przez bakterie jelitowe W miarę, jak sprzężona bilirubina dociera do jelita krętego i jelita grubego, swoiste enzymy bakteryjne (p-glukuronidazy) usuwają kwas glukuronowy, a flora bakteryjna kału redukuje barwnik do bezbarwnych związków tetrapirolowych, zwanych urobilinogenami (ryc. 34-15). W jelicie kretyni oraz w jelicie grubym pewna część urobilinogenów wchłania się i ponownie wydala z wątroby, stanowiąc krążenie jelitowo--

kach nieprawidłowych, zwłaszcza przy wytwarzaniu nadmiernej ilości barwników żółcio.wych Jub w przypadku choroby wątroby upośledzającej krążenie jęli to wo-watro bo we, następuje wydalanie urobilinogenu również z moczem. W warunkach fizjologicznych większość bezbarwnych urobilinogenów. powstałych w ókrężnicy pod wpływem flory bakteryjnej występującej w kale, utlenia się do urobilin (związków barwnych) i wydala z kalem (ryc. 34-15). Utlenianie pozostałych urobilinogenów powoduje ciemnienie kału na powietrzu.

wątrobowe barwników żółciowych. W warunM

H,C

N NH

H

OH M M HN \=\ CHj

P Sterkobllinogen (L-u robi lin ogan)

Ryc. 34-15. Struktura niektórych barwników żółciowych.

PORFIRYNY I BARWNIKI ŻÓŁCIOWE / 411

HIPERBILIRUBINEMIA WYWOŁUJE ŻÓŁTACZKĘ Zwiększenie stężenia bilirubiny we krwi powyżej 17 umol/1 (=1 mg/dl) nazywamy hiperbilirubinemią. Hiperbilirubinemia może być wynikiem wytwarzania większej ilości bilirubiny niż wydala zdrowa wątroba lub też skutkiem niewydolności uszkodzonej wątroby do wydalania bilirubiny powstającej w ilościach prawidłowych. Przyczyną liiperbilirubinemii, jeśli nie stwierdza się uszkodzenia wątroby, może być również zaczopowanie przewodów żółciowych wątroby, uniemożliwiające wydalanie żółci. We wszystkich tych przypadkach bilirubina gromadzi się we krwi i po przekroczeniu pewnego stężenia dyfunduje do tkanek, powodując ich zażółcenie. Zjawisko to określa się mianem żółtaczki. Oznaczenie stężenia bilirubiny w surowicy ma ogromne znaczenie w badaniach klinicznych żółtaczek. Van den Bergh jako pierwszy wprowadził metodę ilościowego pomiaru zawartości bilirubiny w surowicy, wykorzystując test Ehrlicha na bilirubinę w moczu. Test Fhrlicha polega na reakcji diazowanego kwasu sulfanilowego (odczynnik diazowy Ehrlicha) i bilirubiny z utworzeniem czerwono-purpurowego związku arowego. W oryginalnej metodzie Ehrlicha do rozpuszczenia zarówno bilirubiny, jak i odczynnika diazowego wykorzystywano metanol. Przypadkowe pominięcie przez Van den Bergha metanolu podczas oznaczania barwników żółciowych w żółci doprowadziło do wykrycia, że reakcja barwna zachodzi „bezpośrednio". Postać bilirubiny reagującą w nieobecności metanolu określono jako „bezpośrednią". Następnie stwierdzono, że taka sama reakcja zachodzi także w surowicy chorych z żółtaczką mechaniczną. Niemniej dodawanie metanolu było nadal konieczne przy oznaczaniu bilirubiny w surowicy prawidłowej oraz bilirubiny występującej w zwiększonej ilości w surowicy chorych z żółtaczką hemolityczną, u których nie stwierdzono niedrożności przewodów żółciowych. Postać bilirubiny, którą można było oznaczyć jedynie po dodaniu metanolu, określono jako „pośrednią". Obecnie wiadomo, że bilirubina pośrednia jest bilirubiną „wolną" (niesprzężona.), która przechodzi do tiepatócytów z komórek siateczkowo-śró~dbłoukowych, gdzie powstaje w wyniku rozpadu układu porfirynowego hemu. Ponieważ ta bilirubina nie rozpuszcza się w wodzie,

reakcja z odczynnikiem diazowym wymaga obecności metanolu. W wątrobie bilirubina wolna łączy się z kwasem glukuronowym i w postaci sprzężonej, jako glukuronid bilirubiny, wydziela się do żółci. Bilirubina sprzężona, jako rozpuszczalna w wodzie, reaguje bezpośrednio z odczynnikiem diazowym, a więc „bilirubina bezpośrednia" Van den Bergha odpowiada bilirubinie sprzężonej (glukuronid bilirubiny). W zależności od typu bilirubiny występującej w osoczu, tj. bilirubiny niesprzężonej lub bilirubiny sprzężonej, hiperbilirubinemie można sklasyfikować odpowiednio jako hiperbilirubinemie retencyjną (miąższową) oraz hiperbilirubinemie zwrotną (zastoinową), w której następuje wtórne wchłanianie się barwnika do krwi. Tylko bilirubina niesprzężona może przenikać pr/c/ barierę krew-mózg do ośrodkowego układu nerwowego; a zatem encefalopatia spowodowana hiperbilirubinemia (kemicterus) może wystąpić wyłącznie w przypadku retencji bilirubiny, czyli niesprzężonej hiperbilirubinemii. Tylko sprzężona bilirubina może pojawić się w moczu. Zgodnie z tym żółtaczka z obecnością barwników żółciowych w moczu występuje tylko w przypadku hiperbilirubinemii sprzężonej (zwrotnej), a. żółtaczka bez barwników żółciowych w moczu w przypadku nadmiaru bilirubiny niesprzężonej. Hiperbilirubinemia niesprzężona Ze względu na dużą wydajność metabolizowania bilirubiny w wątrobie, nawet w przypadku znacznej hemolizy, hiperbilirubinemia niesprzężona jest zazwyczaj niewielka < 68,4 umol/1 (= <4 mg/dl). Jednakże upośledzenie metabolizowania bilirubiny, na skutek wady nabytej bądź wrodzonej nieprawidłowości, może spowodować wystąpienie hiperbilirubinemii. Najczęściej spotykanymi przyczynami hiperbilirubinemii niesprzężonej są:

„Żółtaczka fizjologiczna" noworod-

ków. Ten przejściowy stan jest najczęstszą przyczyną hiperbilirubinemii niesprzężonej. Jest ona wynikiem nadmiernej hemolizy i niedojrzałości układu wątrobowego do wychwytywania, sprzęgania i wydzielania bilirubiny. Zmniejszona jest nie tylko aktywność UDPglukuronozylotransferazy, ale przypuszczalnie również synteza substratu dla tego enzymu, czyli kwasu UDPgiukuronowego. Ze względu na fakt, że zwiększone stężenie bilirubiny jest spowodowane przez bilirubinemię niesprzężona, może ona przenikać przez barierę krew-mózg,

412 / ROZDZIAŁ 34

gdy jej zawartość w osoczu przekroczy ilość silnie wiązaną przez albuminę 340 — 428 jimol/1 (= 20 — 25 mg/dl). Następstwem toksycznego działania bilirubiny jest kernicterus, żółtaczka jąder podstawnych mózgu, powodująca upośledzenie umysłowe. Skuteczne jest podawanie fen o bar bi tal u, ze względu na jego zdolność indukowania układu metabolizującego bilirubinę niesprzężoną. Ponadto fototerapia światłem widzialnym (przez niewyjaśniony dotychczas mechanizm) pobudza wydzielanie przez wątrobę bilirubiny niesprzężonej w wyniku przekształcenia pewnej ilości bilirubiny w inne pochodne wydalane w żółci, takie jak fragmenty maleimidowe i izomery geometryczne.

Zespół Criglera-Najjara, typ I; wrodzona żółtaczka niehemolityczna. Zespół Criglera-Najjara typu I jest rzadkim zaburzeniem dziedziczonym jako cecha recesywna autosomalna, ujawniającym się u człowieka na skutek wady metabolicznej w sprzęganiu bilirubiny. Charakteryzuje się on ciężką żółtaczką wrodzoną z powodu braku aktywności UDPglukuronozylotransferazy w wątrobie. Choroba /. vykle kończy się zgonem w ciągu pierwszych 15 miesięcy życia, chociaż istnieją doniesienia o nastolatkach, u których choroba nie ujawniła się aż do okresu dojrzewania płciowego. Dzieci te poddawano fototerapii powodującej pewne zmniejszenie stężenia bilirubiny w osoczu. Fenobarbital nie wpływa na tworzenie glukuronidów bilirubiny u chorych z zespołem Criglera-Najjara typu I. U chorych nie leczonych stężenie bilirubiny w surowicy przewyższa zwykle 340 umol/1 ( = 20 mg/dl). Zespół Criglera-Najjara, typ I I . Wydaje

się, że to zaburzenie wrodzone wynika z lżejszej wady genetycznej w systemie sprzęgania bilirubiny i ma znacznie łagodniejszy przebieg. Stężenie bilirubiny w surowicy nie przekracza zazwyczaj 340 |omol/l ( = 20 mg/dl), niemniej cała bilirubina jest gromadzona w postaci niesprzężonej. W żółci chorych stwierdza się monoglukuronid bilirubiny, co pozwala przypuszczać, że wada genetyczna dotyczy UDPglukuronozylotransferazy wątrobowej, która dołącza drugą resztę glukuronianu do monoglukuronidu bilirubiny. Chorzy z tym zespołem reagują na podawanie dużych dawek fenobarbitalu. Zespół Gilberta. Zespół Gilberta stanowi niejednorodną grupę zaburzeń, z których większość uważa się obecnie za wynik hemolizy wyrównawczej związanej z'hiperbilirubinemią niesprzężoną. Stwierdza się także nieprawid-

łowości klirensu wątrobowego bilirubiny, będące wynikiem upośledzenia wychwytywania bilirubiny przez komórki miąższowe wątroby, jak również zmniejszoną aktywność UDPglukuronozylotransferazy bilirubiny.

Hiperbilirubinemia toksyczna. Hiper-

biiirubinemia niesprzężoną może być wynikiem zaburzenia czynności wątroby, wywołanego przez takie toksyny, jak: chloroform, arsfenamina. tetrachlorek węgla, acetaminofen, wirus zapalenia wątroby, marskość lub zatrucie grzybami z rodzaju Amanita, Chociaż większość z tych nabytych zaburzeń jest skutkiem uszkodzenia komórek miąższowych wątroby, towarzyszy im często niedrożność przewodów żółciowych w obrębie wątroby powodująca występowanie hiperbilirubinemii sprzężonej, Htperbilirubinemię sprzężoną można wykryć badając mocz Ponieważ bilirubina sprzężona jest rozpuszczalna w wodzie, można ją wykryć w moczu chorych z hiperbilirubinemia sprzężoną; dlatego też mówi się o nich często, że mają żółtaczkę z wydalaniem barwników żółciowych z moczeni (z cholurią). Najczęściej spotykanymi przyczynami hiperbilirubinemii sprzężonej są:

Przewlekła żółtaczka samoistna (zespół Dubina-Johnsona). To zaburzenie, dziedziczone jako cecha autosomalna recesywna, charakteryzuje się hiperbilirubinemia sprzężoną w dzieciństwie lub u dorosłego człowieka. Hiperbilirubinemia jest wynikiem upośledzenia wydzielania wątrobowego bilirubiny sprzężonej do żółci. Wada ta nie ogranicza się do bilirubiny, ale dotyczy także wydzielania estrogenów i związków stosowanych w testach klinicznych, takich jak barwnik bromosulfoftaleina. Cechą znamienną u chorych z zespołem Dubina-Johnsona jest obecność w hepatocytach środkowego obszaru zrazika nietypowego, dotychczas nie zidentyfikowanego pigmentu.

Niedrożność przewodów żółciowych.

Hiperbilirubinemię sprzężoną wywołuje także zablokowanie przewodów żółciowych wątrobowych lub przewodu żółciowego wspólnego. Uważa się, że przechodzenie barwników żółciowych z krwi do komórek wątroby przebiega prawidłowo, lecz nie są one wydzielane. Konsekwencją tego zaburzenia jest wchłanianie bilirubiny sprzężonej do żył wątrobowych i naczyń chłonnych. Wszystkie postacie poza wątrób owych żółtaczek mechanicznych (zaporowych, zastoino-

PORHRYNY 1 BARWNIKI ŻÓŁCIOWE / 413 Tabela 34-2. Wyniki analizy biochemicznej pacjentów zdrowych oraz z trzema różnymi rodzajami ł żółtaczek Stan zdrowia Prawidłowy

Niedokrwistość hemolityczna Zapalenie wątroby

Żółtaczka mechaniczna

Surowica bilirubina Bezpośrednia: 1,7-6,8 umol/l

Mocz urobilinogen 0-6,75 nmol/24h

Mocz bilirubina Brak

Kał urobilinogen 67,48-472,4 umol/24 h (40280 mg/24 h)

(0,1 -0,4 mg/dl) Pośrednia: 3,4-12 umol/l (0,2-0,7 mg/dl) Zwiększenie stężenia pośredniej

(0-4 mg/24 h)

Zwiększenie

Brak

Zwiększenie

Zwiększenie stężenia bezpośredniej i pośredniej

Zwiększenie

Występowanie

Zmniejszenie

Brak

Występowanie

Ilości śladowe lub brak

Zwiększenie stężenia bezpośredniej

* Najczęściej występującą przyczyną żółtaczki mechanicznej (pozawątrobowej) jest rak głowy trzustki oraz kamienie w przewodach żółciowych

wych) oraz niektóre postacie żółtaczki miąższowej (postacie cholestatyczne) charakteryzujące się hiperbittrubinemią sprzężoną, określa się mianem żółtaczki cholestatycznej. Występowanie urobilinogenu w moczu jest wskaźnikiem klinicznym Zazwyczaj w moczu znajduje się jedynie śladowe ilości urobilinogenu. W przypadku całkowitego /a czopów ani a przewodu żółciowe-

go nie stwierdza się w ogóle urobilinogenu w moczu, ponieważ bilirubina, z której powstaje, nie przedostaje się do jelita, gdzie mogłaby być przekształcona w urobilinogen, W takim przypadku obecność w moczu bilirubiny, przy braku urobilitiogenu, wskazuje na żółtaczkę mechaniczną śródwątrobową lub pozawąlrobową. W żółtaczce hemolitycznej zwiększone wytwarzanie bilirubiny prowadzi do zwiększonego wytwarzania urobilinogenu, który pojawia się w moczu w dużych ilościach. W moczu chorego na żółtaczkę hemolityczna. bilirubina zazwyczaj nie występuje (niesprzężona bilirubina nie przenika bowiem do moczu), tak że zwiększenie wydalania urobilinogenu i brak bilirubiny w moczu sugerują występowanie żółtaczki hemolitycz-

nej. Wzmożony, z jakichkolwiek przyczyn, proces niszczenia krwinek (np. niedokrwistość złoś-

liwa) powoduje również zwiększenie urobilinogenu w moczu. W tabeli 34-2 podsumowano wyniki analizy biochemicznej chorych z różnymi rodzajami żółtaczek: niedokrwistością hem o lityczną (przyczyna przedwątrobowa), zapaleniem wątroby (przyczyna wątrobowa) i zaczopowaniem przewodu żółciowego wspólnego (przyczyna za wątrobowa).

PIŚMIENNICTWO Billett,HH, Porphyrias; Inbornerrorsinhemeproduetion. Hosp Pract 1988; 41:60. Goldberg A et al: Porphyrin metabolism and Ibe porphyrias. In: Oxford Textbook of Medianę. 2nd ed- Weatherall DJ et al (editors). Oxford University Press, 1987. Kappas A, Sassa S, Anderson KE: The porphyrias. In:'-The Metabolu■ Basis of Inherited Disease, 5th et. Sta^ury JB et al (editors). McGraw-Hill, 1983. Meyer UA, Porphyrias. In: Harrison's Principles of Internat Medii-me, l l t h ed. Braunwald E et al (editors). McGraw-Hill, 1987. Wolkoff AW, Chowdliury JR, Arias IM. Hereditary jiiundice a.nd disorders of bilirubin metabolism. In: The MetaboJic Basis of btheriied Disease, 5th ed, Stanbury JB et al (editors). McGraw-Hill, 1983.

CZĘŚĆ IV Budowa, czynność i replikacja makrocząsteczek informacyjnych Nukleotydy

3 5

Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE Nukleotydy biorą udział w różnych procesach biochemicznych. Najlepiej jest poznana rola nukleotydów purynowych i pirymidynowych* jako monomerycznych prekursorów RNA i DNA, Jednak rybonukleotydy purynowe to także wszechobecne źródła dużej energii (ATP), sygnały regulatorowe (cykliczny AMP [cAMP] i cykliczny GMP [cGMP]), a także komponenty koenzymów FAD, NAD+ oraz NADP+, a S-adenozy lornet ionina jest donorem grup metylowych. Nukleotydy pirymidy no we, oprócz tego, że stanowią monomeryczne prekursory syntezy kwasów nukleinowych, są także półproduktami o dużej energii, takimi jak UDP-glukoza i UDP-galaktoza, biorącymi udział w metabolizmie węglowodanów, oraz CDP-acyloglicerol w syntezie tłuszczów.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Heterocykliczne zasady purynowe i pirymidynowe są macierzystymi cząsteczkami nukleozydów i nukleotydów. Nukleotydy są wszechobecne w żywych komórkach, gdzie spełniają liczne, kluczowe funkcje, np.: wbudowywanie w kwasy nukleinowe ich rybozowych (RNA) lub deoksyrybozowych (DNA) postaci, przenoszenie energii (ATP); są one częściami

koenzymów (AMP), akceptorami oksydacyjnej fosforylacji (ADP). allosterycznymi regulatorami aktywności enzymatycznej i „wtórnymi przekaźnikami" (cAMP, cGMP). Syntetyczne analogi naturalnie występujących nukłeotydów są stosowane w chemioterapii nowotworów jako inhibitory enzymów i mogą zastąpić w kwasach nukleinowych naturalnie występujące nukleotydy. W terapii zmierzającej do zahamowania wzrostu komórek rakowych lub niektórych wirusów często stosowano analogi zasad nukleozydów lub nukleotydów, które hamują syntezę DNA lub RNA. Do związków tych należą: 5-fluorouracyl, 5'-jodo-2'-deoksyurydyna, 6-tioguanina, 6-merkaptopuryna, 6-azaurydyna i arabinozyd cytozyny (p. niżej). Allopurynol, analog puryny, jest szeroko stosowany w leczeniu dny.

HETEROCYKLICZNE ZASADY NUKLEOTYDÓW SĄ POCHODNYMI PURYNY I PIRYMIDYNY Zasady purynowe i pirymidy nowe (puryny i pirymidyny) nukleotydów powstają przez podstawienie atomów w aromatycznym pierścieniu macierzystych heterocykli puryny i pirymidyny (ryc. 35-1). Należy zwrócić uwagę, że kierunek, w którym atomy ó-członowego pierścienia są oznaczone, jest odwrotny w purynie (przeciwny

416 / ROZDZIAŁ 35

II .CH

Puryna

Pirymldyna

Ryc. 35-1. Struktura puryny i pirymidyny, pozy cje atomów ponumerowano zgodnie z systemem międzynarodowym. NH,

Cytozyna (2-oksy-4am In op iry m Idyn a)

Tym In a (2,4-dioKsy-5-metyloplrymldyna)

Uracyl (2,4-d loksypl ry m i dyna)

Ryc. 35-2. 3 główne zasady pirymidynowe wy stępujące w nukleotydach.

-

NH,

HjN Adenina (6amlnopuryna)

~NT

NH

Guanina (2- am In o6-o ksypu ryn a)

ruchom wskazówek zegara) i inny w pirymidynie (zgodny ze wskazówkami zegara). Jednakże

atom 5 (węgiel) jest tak samo oznaczony w obu związkach, Puryny i pirymidyny są płaskimi cząsteczkami — jest to właściwość o dużym znaczeniu dla struktury kwasu nukleinowego (p. rozdz. 38).

Terminy „główne" i „pomniejsze" zasady odnoszą się do ich względnej obfitości, a nie do znaczenia fizjologicznego Ponieważ w komórkach niektóre puryny i pirymidyny występują w znacznie większej ilości niż inne, zwyczajowo rozróżnia się puryny i pirymidyny główne i drugorzędne. Jednak ze względu na to, że te dodatkowe puryny i pirymidyny odgrywają także kluczowe role w metabolizmie, to rozróżnienie polega jedynie na ich względnej ilości, a nie na ich względnym znaczeniu fizjologicznym. Głównymi purynami i pirymidynami kwasów nukleinowych zarówno u prokariontów, jak i eukariontów są: puryny — adenina i guanina oraz pirymidyny cytozyna, tymi na i uracyl (ryc. 35-2 i 35-3). Puryny, hipoksantyna i ksantyna (ryc. 35-3), są metabolitami adeniny i guaniny, a człowiek wydala utlenioną purynę — kwas moczowy — jako końcowy produkt katabolizmu purynowego. Dodatkowe zasady są obecne w DNA i transferowym RNA (tRNA) zarówno u prokariontów jak i eukariontów. Inne, których funkcje są słabo poznane, znajdują się jedynie w kwasach nukleinowych bakterii i wirusów. Na przykład bakteryjny i ludzki DNA zawiera 5-metyIocyfozynę, a fagowy DNA 5-hydroksymetylocy-

tozynę (ryc. 35-4). Drugorzędne zasady mRNA komórek ssaków to N^-metyloadenina, Nfi, N6-dimetyloadenina i N7-metyioguanina (ryc. 35-5).

CHZOH

Hipoksantyna (6-oksypuryna)

Ksantyna (2,6-dloksypuryna)

5-Metyloeytozyna

5-Hyd roksy mety tocyi ozy na

Ryc. 35-3. Główne zasady purynowe nukleotydów.

Ryc. 35-4. Struktura 2 rzadkich, naturalnie wy stępujących, zasad pirymidynowych.

NUKLEOTYDY / 417

N',N*-DI metyloaden in a

N'-Metylog u an in a

Ryc. 35-5. Struktura 2 rzadkich, naturalnie występujących, zasad purynowych.

Metylowane puryny i pirymidyny mają właściwości farmakologiczne Metylowane puryny roślinne o właściwościach farmakologicznych zawierają: kawa (kofeina czyli 1,3,7-trimetyloksantyna), herbata (teofilina, czyli 1,3-dimetyloksantyna) i kakao (teobromina, czyli 3,7-dimetyloksantyna) (ryc. 35-6).

Tym In a (laktam) NH

Kofeina (1,3,7-lrimetyloksantyna) Taoftllna (1,3dlmelyloksantyna)

Adenina (laktam)

Adenina (laktym)

OH

H3C

H,N

O Guanina (laktam)

Guanina (laktym)

Ryc. 35-7. Postacie tautomeryczne cytozyny, tyminy, adeniny i guaniny; wskazano postacie dominujące.

Teobromina (3,7-dlmetyloksantyna)

Ryc. 35-6. Metylowane ksaniyny zawarte w pożywieniu.

Puryny i pirymidyny wykazują tautomeryzm typu keto-enol Puryny i pirymidyny istnieją w formie laktymowej (—OH) lub laktamowej ( = 0) (ryc. 35-7). W warunkach fizjologicznych główną 27 — Biochemia

formą tautomeryczną guaniny i tyminy jest forma laktamowa. W rozdziale 39 i 41 omówiono znaczenie tautomeryzmu laktam/laktym w parowaniu zasad i mutagenezie. MAŁA ROZPUSZCZALNOŚĆ ZASAD PURYNOWYCH W KWAŚNYM pH STANOWI PROBLEM MEDYCZNY W obojętnym pH najmniej rozpuszczalnymi zasadami są guanina i hipoksantyna, jednak guanina w warunkach fizjologicznych nie występuje w ludzkim moczu. Chociaż sole kwasu

418 / ROZDZIAŁ 35

moczowego (moczący) są względnie rozpuszczalne w wodzie w obojętnym pH, kwas moczowy jest nierozpuszczalny w roztworach o niskim pH (np. w moczu). Ks anty na i kwas moczowy mogą występować jako składniki kamieni moczowych. WOLNE PURYNY I PIRYMIDYNY WYSTĘPUJĄ W ZNACZNIE MNIEJSZEJ ILOŚCI NIŻ ODPOWIADAJĄCE IM NUKLEOZYDY I NUKLEOTYDY Nukleozydy (ryc. 35-8) składają się z cukru (zwykle D-rybozy lub 2-deoksy-D-rybozy) dołączonego do puryny lub pirymidyny przez względnie labilne w środowisku kwaśnym wiązanie P-N-glikozydowe przy Ne (puryna) lub N1 (pirymidyna). Głównymi ryb o nukleo żydami są: adenozyna (D-ryboza związana z N9 adeniny), guanozyna (D-ryboza związana zN' guaniny), cytydyna (D-ryboza związana z N1 cytozyny) i urydyna (D-ryboza związana z N1 uracylu). 2'-Deoksyrybonukleozydy składają się z 2-deoksy-D-rybozy związanej z pozycjami opisanymi wyżej również przez wiązanie [i-N-glikozydowe. OH

OH ,

Elementy przestrzenne przeszkadzają rotacji wokół wiązania N-glikozydowego i w naturalnie występujących nukleozydach dominuje konformacja anty (ryc. 35-9). Jak wskazano w rozdz. 38, postać anty jest istotna do uplasowania komplementarnych zasad purynowych i pirymidynowych w dwupasmowym DNA. Jednak powszechnie stosowane przedstawianie D-rybozy nakazuje prezentowanie nukleozydów i nukleo ty d ów, w tym i innych rozdziałach, w mniej popularnej konformacji syn. Nukleotydy są fosforylowanymi nukleozydami Mononukleotydy są to nukleozydy mające pojedynczy fosforan zamiast grup hydroksylowych cukru (na ogół rybozy lub 2r-deoksyrybozy(ryc. 35-10). Na przykład adenozynomonofosforiin (AMP lub adenylan) jest złożony z adeniny, rybozy i fosforanu. Jedynymi cukrami, związanymi zwykle z uracylem i tyminą, są odpowiednio D-ryboza i 2'-deoksy-D-ryboza. W tabeli 35-1 przedstawiono zależności między głównymi purynami i pirymidynami a odpowiadającymi im monofosforanami 5-oksy-^ i 5'-deoksyrybonukleozydów. DNA jest polimerem złożonym z dTMP, dCMP, dAMP

Cytydyna Ryc. 35-8.

Struktura rybonukleozyctów

OH OH

NUK LE OT YDY / 419

HO

Anty OH

OH

OH

Ryc. 35-9. Konformacje syn i anty adenozyny

OH

OH Ryc. 35-10. Struktura kwasu adenylowego (AMP)(po lewej strome) i kwasu 2-deoksyadenylowego; dAMP (po prawej stronie).

Tabela 35-1. Główne zasady, nukleozydy i nukleotydy Zasada Rybonukleozyd Adenina (A) Guanina (G) Cytozyna (C) U racy I (U) Zasada Adenina (A) Guanina (G) Cytozyna (C) Tymina (T)

Adenozyna Gua nożyna Cy ty dyn a Urydyna Deo k sy ry bon u k I eozy d Deoksyadenozyna Deoksyguanozyna Deoksycytydyna Tymidyna

Rybonukleotyd (5'-monofosforan) Adenozyno-5'-monofosforan (AMP) Gua nożyno-5'-monof osf ora n (GMP) Cy tydyno- 5'-m onofosforan (CMP) Urydyno- 5'-m onofosforan (UMP) Deoksyrybonukleotyd (5'-monofosforan) Oeoksyadenozyno-5'-monofosforan (dAMP) Deoksyguanozyno-5'-monofosforan (dGMP) Deoksycytydyno- 5'-monofosforan (dCMP) Tym idyn o- 5-m oriofos foran (dTM P)

420 / ROZDZIAŁ 35

i dGMP, a RNA polimerem złożonym z UMP, CMP, AMP i GMP. Od powyższych struktur nukleozydów są wyjątki. Na przykład w tRNA ryboza jest czasami związana z 5 atomem uracylu przez wiązanie węgiel-węgiel, a nie jak zwykle przez wiązanie N-do-C. Ta nietypowa cząsteczka jest pseudourydyną (f). tRNA zawiera dodatkowe nietypowe nukleotydy, np. TMP, czyli rymine związaną z rybozomonofosforanem (ryc. 35-11). TMP tworzy się po syntezie tRNA na drodze metylacji UMP przez S-adenozylometioninę. Podobnie kwas pseudourydynowy (^MP) tworzy się przez przegrupowanie w kwasie urydyłowym po syntezie cząsteczki tRNA. Pozycję reszty fosforanowej w nukleotydzie oznacza się numerem atomu ze znakiem „prim". Na przykład adenozyna z resztą fosforanową związana z 3 atomem węgla cukru rybozy to adenozyno-3'-monofosforan. Znak „prim" odróżnia atomy cukru od atomów puryn lub pirymidyn, które nie są nim oznaczane (ryc. 35-12). A, G, C, T i U oznaczają odpowiednio nukleozydy adeniny, guaniny, cytozyny, tyminy i uracylu. Przedrostek d wskazuje, że cukrem jest 2'-deoksy-D-ryboza. Skrót ,,MP" (monofosforan) dodaje się do skrótu oznaczającego nukleotyd. Oznaczenie 5' jest pomijane, gdy fosforan jest zestryfikowany z węglem 5' rybozy lub 2'-deoksyrybozy, np. guanozyno-5'-monofosforan ma skrót GMP. Dodatkowe reszty fosforowe są związane z cukrem mononukleotydu przez wiązanie typu bezwodnika kwasowego, tworząc di- i trifosforany nukleozydów, takie jak ADP (adenozynodifosforan) i GTP (guanozynotrifosforan) (ryc. 35-13). Warto przypomnieć, że kwasowe

NH

Ryc. 35-12. Adenozyno-3'-monofosforan (po lewej stron/e) i 2'-deoksyadenozyno-5'-monofosforan (po prawej stronie).

bezwodniki mają wysoki potencjał przenoszenia grupy i że AG0 dla hydrolizy ATP do ADP wynosi 30 kJ/mol ( = 7 kcal/mol). Trifosforany nukleozydów uczestniczą w tworzeniu wiązań kowalencyjnych Ponieważ wszystkie trifosforany puryn i pirymidyn mają wysoki potencjał przenoszenia grupy, uczestniczą one w licznych reakcjach, w których tworzą się wiązania kowalencyjne. Czołowym przykładem jest polimeryzacja głównych trifosforanów w trakcie syntezy DNA lub RNA. W dodatku swoiste di- i trifosforany nukleozydów spełniają swoiste funkcje fizjologiczne w różnych tkankach i różnych żywych organizmach.

Pochodne adenozyny. ADP i ATP są

odpowiednio substratami i produktami dla fosforylacji oksydacyjnej, a ATP jest głównym

!

OH

OM

03P

OH

f

Ryc. 35-11. Kwas urydylowy (UMP) (po lewej stronie) i kwas tymidylowy (TMP) (po prawej stronie).

NUKLEOTYDY / 421

O" O O-/ HO-P-O-P-O-P II

O

I

O

Adenina Ftyboza HO

OH

M

"

O AaenozynoS'-

monofo5foran

(AMP)

Adenazyno-5r-difosforan (ADP) Adenozyn o-5'-tr[fosforan (ATP)

Ryc 35-13. Adenozyna, jej monofosforan, difosforan i ATP,

wewnątrzkomórkowym przenośnikiem wolnej energii. Średnie wewnątrzkomórkowe stężenie ATP, występującego w największych ilościach wolnego mikleotydu komórek ssaków, wynosi ok. 1 mmol. - Cykliczny AMP (cAMP, czyli adenozyno3', 5'-mo no fosforan), wytworzony z ATFw reakcji katalizowanej przez cyklazę adenylanową

(ryc. 35-14), pośredniczy w wielu procesach wewnątrzkomórkowych. Aktywność cyklazy adenylanowej jest regulowana przez złożone interakcje, a w wielu z nich biorą udział receptory hormonów (p. rozdz. 44). Wewnątrzkomórkowe stężenia cAMP (ok. 1 u.mol) są o ok. 3 rzędy wielkości mniejsze od stężeń ATP. Hydroliza cAMP, katalizowana przez fosfodiesterazę cAMP (ryc. 35-14) prowadzi "do" wytworzenia 5'.-ĄM|\_ " Włączanie reszty siarczanowej w wiązanie estrowe w takich związkach, jak siarczany proteoglikanów (p. rozdz. 43), wymaga najpierw „aktywacji" reszty siarczanowej w reakcji z ATP prowadzącej do powstania adenozyno-3'-fosfo-5'-fosfosiarczatm (PAPS, czyli fosfoadenozynofosfosiarczanu) (ryc. 35-15). PAPS jest też substratem w reakcji wiązania siarczanów. S-Adenozylunietionina (ryc 35-16). Postać aktywnej metioniny służy jako donor grup metylowych w reakcjach metylacji i jako źródło propylaminy do syntezy poliamin (p. rozdz. 33). AMP-P-P

ATP ATP

CYKLAZA ADENYLANOWA -pp,

ADP

N

(ATP) Adenina-Hyboza- © -O -S03J"

N

Ryo. 35-15. Powstawanie adenozyno-3'-fosfo-5'-fosfosiarczanu. NH2

N

O-------- CH,

Ćr>

-o-p=o OH Cykliczny 3',5'~AMP

FOSFODIESTERA2A

H,0

cooC H -C H,-C H3 i

+

NH3+

HO

AMP Ryc. 35-14. Powstawanie cAMP z ATP z udziałem cyklazy adenyfanowej i hydroliza cAMP przez fosfodiesterazę cAMP.

l\ /

Metionina

OH

Adenozyna

Ryc. 35-16. S-Adenozylometionina.

422 / ROZDZIAŁ 35

Pochodne gua nożyny, Utlenianie a-ketoglutaranu do sukcynylo-CoA wymaga fosforylacji GDP do GTP. GTP jest konieczny do aktywacji cyklazy adenylanowej przez niektóre hormony i służy zarówno jako allosteryczny regulator, jak i źródło energii do syntezy białek na polisomach. GTP odgrywa zatem ważntj rolę w utrzymaniu środowiska wewnętrznego. Cykliczny GMP (cGMP, czyli guanozyno-3\5'-monofosforan) (ryc. 35-17) jest także sygnałem wewnątrzkomórkowym, czyli wtórnym przenośnikiem (messenger) zewnątrzkomórkowych zmian, cGMP jest tworzony z GTP przez cyklazę guanylanową. Podobnie jak cyklaza adenylanowa, cyklaza guanylanowa jest regulowana przez różne efektory, z hormonami włącznie. Podobnie jak cAMP, cGMP jest także katabolizowany przez fosfodiesterazę do jego 5'-monofosforanu, GMP.

także przez deaminację AMP, a reakcja przebiegająca w tkance mięśniowej stanowi część cyklu nukleotydów purynowych (ryc. 35-18). Aminacja IMP, odtwarzająca AMP, wymaga amoniaku pochodzącego z asparaginianu. Defosforylacja IMP daje nukleozyd inozynowy (rybonukleozyd hipoksantyny), związek pośredni reakcji rezerwowej cyklu purynowego (p. rozdz. 36). Pochodne uracylu. Pochodne UDP-cukier biorą udział w epimeryzacji cukru (np. wewnętrzne przekształcenie glukozo- i gaiaktozo-1-fosforanu), a UDP-glukoza jest donorem glikozylu w biosyntezie glikogenu i disacharydów glikozydowych. Związki UDP-cukry biorą także udział w biosyntezie oligosacharydów glikoprotein i proteoglikanów (p. rozdz. 55). Wreszcie UDP-kwas glukuronowy jest donorem kwasu giukuronowego w reakcjach koTabela 35-2. Wiele koenzymów i związków po krewnych jest pochodnymi adenozyno-monofosforanu RNH, Adsnozyna

Ryc. 35-17. Cykliczny 3',5'-guanozynomonofosforan (cykliczny GMP, cGMP)

Pochodne hipoksantyny. Rybonukleo-

tyd ksantyny (IMP, czyli i noży niań) jest prekursorem wszystkich rybonukleotydów purynowych syntetyzowanych de noro. IMP powstaje

*• AMP

I IAZA ADFNV|_OBURSZTYNtANOWA

D-Ryboza

R

R'

R"

n

Aktywna metionina Metionina* Adenylany amino- Aminokwas kwasów Aktywny siarczan

H

H

0

H

H

1

3', 5'-Cykliczny AMP

H

H

PO^-

NAD" NADP +

.. ••

H

H

2

PO*-

H

2

..

H

H

2

Koenzym

FAD

CoA SH

..

GTP

Ryc. 35-18. Cykl nukieotydów purynowych.

1

H

Zastępuje resztę fosforanową. R jest pochodną witaminy B.

H

PO=" 2

NUKLEOTYDY / 423

niugacji, takich jak tworzenie glukuromdu bilirubiny (p. rozdz. 34).

Pochodne cytozyny. CTP jest potrzebny

do biosyntezy w tkankach zwierzęcych niektórych fosfoglicerydów. Reakcje obejmujące ceramid i CDP-cholinę są odpowiedzialne za syntezę sfingomieliny i innych podstawionych sfmgozydów. Opisano cykliczne nukleotydy pochodne cytydyny, analogiczne do takich pochodnych adenozyny i guanozyny.

Wiele koenzymów jest pochodnymi nukleotydów

Liczne koenzymy zawierają nukleotydy oraz związki podobne do nukleotydów purynowych i pirymidy nowych (tab. 35-2).

HO 5-J od o-2-d eoksyu ry dyn a SH

SYNTETYCZNE ANALOGI NUKLEOTYDÓW MAJĄ ZASTOSOWANIE W MEDYCYNIE KLINICZNEJ Syntetyczne analogi puryn i pirymidyn, nukleozydów i nukleotydów są szeroko stosowane w medycynie doświadczalnej i klinicznej. Zwykle stosuje się je w celu wyjaśnienia roli nukleotydów jako komponentów kwasów nukleinowych niezbędnych dia wzrostu i podziału komórek. Aby komórka mogła się podzielić, musi być zreplikowany DNA. Wszystkie prekursory DNA — prawidłowe deoksyry bo nukleotydy puryn i pirymidyn — muszą być zatem dostępne. Jednym z najbardziej ważnych składników farmakopei onkologicznej jest grupa syntetycznych analogów puryn i pirymidyn i ich nukleozydów. W podejściu farmakologicznym używa się analogu, w którym została zamieniona albo heterocykliczna struktura pierścienia albo cząsteczka cukru tak, aby uzyskać działanie toksyczne, gdy analog jest wbudowany w swoiste składniki komórki. Wiele z tych działań odzwierciedlają 2 procesy: 1) zahamowanie przez lek swoistych enzymów niezbędnych do syntezy kwasów nukleinowych lub 2) wbudowanie metabolitów leku w kwasy nukleinowe, gdzie zaburzają one parowanie zasad niezbędne do prawidłowego przenoszenia informacji. Jako przykład można podać 5-fluoro- lub 5-jodo pochodne uracylu lub deoksyurydyny, które spełniają funkcję odpowiednio analogu tyminy i tymidyny (ryc. 35-19). Zarówno 6-tioguanina, jak i ó-merkaptopuryna, w których grupy hydroksylowe w pozycji 6 za-

6-Merkaptopuryna

Ryc. 35-19. Syntetyczne analogi pirymidyn {u góry) i syntetyczne analogi puryn (u dołu).______

stępują grupy tiolowe, mają szerokie zastosowanie kliniczne. Analogi takie jak 5- lub ó-azaurydyna, 5- lub 6-azacytydyna i 8-nzaguanina (ryc. 35-20), w których heterocykliczny atom węgla w pierścieniu zastąpiono atomem azotu mają również zastosowanie kliniczne. Purynowy analog 4-hydroksypirazolopirymidyna (allopurynol), stosowany w leczeniu hiperurykemii i w skazie moczanowej, hamuje > HO

H

OH

6-Azaurydyna

8-Azaguanina

Ryc. 35-20. 6-azaurydyna i 8-azaguanina.

H 5Fluorouracyl

6-Tioguanina

424 / ROZDZIAŁ 35 0 0 II II II B-R-0 —P—0-P-0-P-0Allopurynol (laktym)

I o-

0

I I o-

o-

Maelerzysty trlfosforan nukleozydu 0 0 II II B-R-0-P-O-P-CH^-p-O1 I

o-

0 II I

o-

o-

Pochodna ^^met/lenowa

HO

H

Arabinozylocytozyna

B

0

0 II II H

|| B—R—0—P—O—P—N-P—0

I o-

I o-

I o-

Pochodna

Ryc. 35-Z2. Syntetyczne pochodne trifosforanów nukleozydów niezdolne do hydrol i tycz n eg o oddzielenia końcowej reszty fosforanowej. B — zasada purynowa lub pirymidynowa, R — ryboza lub deoksyryboza. Pokazano macierzysty trifosforan nukteozydu ulegający hydrolizie {u góry) oraz nie ulegające hydrolizie p,7-metyleno (środek) i p,7-imino (dóf) pochodne.

Azatiopryna Rye. 35-21. 4-Hydroksypirazoiopirymidyna (allopurynol). arabinozylocytozyna (cytarabina) iazatiopryna.

de novo biosyntezę puryny i oksydaze ksantynową. Nukleozydy zawierające jako cząsteczkę cukrową arabinozę zamiast rybozy, np. cytarabina (arabinozylocytozyna, Ara-C) są stosowane w chemioterapii nowotworów i zakażeniach wirusowych (ryc. 35-21). Azatiopryna, która jest katabolizowana do 6-merkaptopuryny, ma zastosowanie w transplantacji narządów dla supresji reakcji immunologicznego odrzucenia przeszczepu. Między licznymi analogami nukleozydów, mających aktywność przeciwwirusową, 5-jododeoksyurydyna (patrz wyżej) jest skutecznym lekiem sto-

sowanym miejscowo w opryszczkowym zapaleniu rogówki — zakażenie rogówki przez wirus opryszczki. Liczne analogi rybonukleotydów puryn i pirymidynr z nieu legającym i hydrolizie grupami di- i trifosforanowymi, zostały zsyntetyzowane do użytku in vitro. Analogi te pozwalają badaczowi oznaczyć, czy dane biochemiczne skutki działania di- i trifosfonukteozydów wymagają hydrolizy albo czy skutki przez nie wywołane polegają na zajęciu swoistych miejsc wiążących nukleotydy w cząsteczkach enzymów lub białek regulatorowych. Na rycinie 35-22 przedstawiono nieulegające hydrolizie analogi GTP.

PIŚMIENNICTWO Mainwanng WIP, Parrish JH, Pickering JD. Mann NH; Nucleic Acid Biochemistry and Molecular Biology. Blackwell Scientific Publications. !982.

Metabolizm nukleotydów

purynowych 3 6

*%/*

i pirymidynowych Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE W rozdziale tym omówiono trawienie, biosyntezę i kataboiizm nukleotydów purynowych i pirymidynowych oraz wybrane choroby związane z wadami genetycznymi w tych procesach.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE A«i nukleotydy dostarczane z pożywieniem, ani ich macierzyste zasady purynowe i pirymidynowe nie są wbudowywane zarówno w kwasy nukleinowe tkanek ludzkich, jak i w pochodne puryn i pirymidyn, np. w ATP, NAD + albo koenzyn A. Nawet jeśli dostarczone pożywienie jest bogate w nukleoproteiny, organizm ludzki buduje składniki kwasów nukleinowych tkanek z amfi bo licznych związków pośrednich. Ta synteza de novo pozwala na wbudowanie do DNA analogów puryn i pirymidyn, mających potencjał leków przcciwnowotworowych. Stopień syntezy oksy- i deoksyrybonukleotydów purynowych i pirymidynowych jest precyzyjnie regulowany przez mechanizmy, które zapewniają wytworzenie tych związków w odpowiednich ilościach i w czasie odpowiednim do zmiennego zapotrzebowania fizjologicznego. Te mechanizmy obejmują szlaki awaryjne typu „salvage" (reakcje rezerwowe) dla reutytizacji zasad purynowych i pirymidynowych uzyskanych in vivo przez degradację kwasów nukleinowych. Choroby ludzi, związane z nieprawidłowościami metabolizmu puryn i pirymidyn, obejmują skazę moczanową, zespół Lescha-Nyhana, niedobór deaminazy adenozynowej i niedobór fosforylazy nukleozydowej puryn.

PURYNY I PIRYMIDYNY NIE SĄ NIEZBĘDNE W LUDZKIM POŻYWIENIU Podczas gdy zwierzęta przyjmują kwasy nukleinowe i nukleotydy z pożywieniem, przeżycie nie zależy od wchłaniania i zużytkowania tych związków, ponieważ człowiek i większość kręgowców łatwo syntetyzują de novo nukleotydy purynowe i pirymidynowe z ich amfi bo licznych związków pośrednich. Organizm ludzki przemienia większość puryn uzyskanych z pobranych nukleoprotein w kwas moczowy (ryc. 36-1). Niewiele (lub wcale) puryn i pirymidyn pobranych z pożywieniem jest wbudowanych do kwasów nukleinowych tkanek, natomiast związki podane pozajelitowe są wbudowywane, dlatego wbudowywanie wstrzykniętej [3H] tymidyny bezpośrednio do nowo syntetyzowanego DNA stanowi szeroko używaną technikę oznaczania stopnia syntezy DNA zarówno in vivo, jak i in ritro.

ENZYMY PRZEWODU POKARMOWEGO DEGRADUJĄ POBRANE KWASY NUKLEINOWE DO PURYN I PIRYMIDYN Kwasy nukleinowe, wyzwolone ze strawionych nukleoprotein przez proteolizę w przewodzie pokarmowym, są degradowane do mononukleotydów przez rybonukleazy, deoksyrybonukleazy i polinukleotydazy, Nukleotydazy i fosfatazy hydrolizują mononukleotydy do nukleozydów, które są albo absorbowane albo dalej degradowane do zasad purynowych i pirymidynowych przez fosforylazy jelitowe. Zasady

426 / ROZDZIAŁ 36

OH OH Adenozyna DEAMINAZA ADENOZYNOWA

HOH2C C

H

H

T L> HOH.C

nf"

OH OH Guanozyna -P

-

FOSFORYLAZA NUKLEOZYDOWA PURYN

Hybozo-1-fosforan OKSYDAZA KSANTYNOWA

FOSFORYLA2A Rybozo-1NUKLEOZYOOWĄ PUHYN fosforan

Hipoksantyna

Ksantyna

Guanina

H„0 + 0, H,0

V

OKS YDA EA KSA NTY NOW A

Kwas moczowy

RYC. 36-1. Wytwarzanie kwasu moczowego z nulOeozydów purynowych przez zasady purynowe — hipoksantynę, ksantynę i guaninę. Deoksyrybonukleozydy purynowe są degradowane przez ten sam szlak metaboliczny i enzymy, które znajdują się w błonie śluzowej przewodu pokarmowego ssaków.

METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I P1RYMIDYNOWYCH / 427

purynowe, utlenione do kwasu moczowego (ryc. 36-1), mogą być absorbowane, a następnie wydalane z moczem. ZWIERZĘTA TWORZĄ NUKLEOTYDY Z AM FI BO LICZNYCH ZWIĄZKÓW POŚREDNICH Człowiek i inne ssaki syntetyzują nukleotydy purynowe z amfibolicznych związków pośrednich w ilościach wystarczających zarówno do syntezy kwasów nukleinowych, jak i do dodatkowych czynności wymienionych w rozdz. 35. U niektórych kręgowców biosynteza nukleotydów służy dodatkowym celom. Chociaż ssaki i inne zwierzęta ureoteliczne wydalają odpady azotowe w postaci mocznika, zwierzęta urykoteliczne (ptaki, gady, plaży) wydalają odpady azotowe jako kwas moczowy. Ponieważ reakcje syntezy de novo nukleotydu purynowego są analogiczne u organizmów ureotelicznych i urykotelicznych, żywe organizmy urykoteliczne muszą przeto syntetyzować nukleotydy purynowe w względnie większym stopniu. Inozynomonofosforan (IMP), macierzysty mononukleotyd purynowy, tworzy się z amfibolicznych związków pośrednich Na długo zanim poznano detale wydłużonej drogi biosyntezy IMP, badania przy użyciu znaczników izotopowych pozwoliły na zidentyfikowanie źródła każdego z atomów w zasadzie purynowej (ryc. 36-2). Te wczesne badania izotopowe utorowały drogę do odkrycia reakcji i związków pośrednich omawianych niżej. W teGlutamina Gllcyna

Ns-Formylo. tetrahytirofolian

N'.N"Metenylotetrahydrofolian

Ryc. 36-2. Pochodzenie atomów azotu i węgla w pierścieniu purynowym. Atomy 4, 5 i 7 (przyciemnione) pochodzą z glicyny.

kście podanym niżej cyfry arabskie poszczególnych akapitów odpowiadają ponumerowanym reakcjom na ryc. 36-3, a cyfry rzymskie związków odpowiadają strukturom związków pośrednich z tej ryciny. Przeniesienie pirofosforanu z ATP do C-l D-rybozo-5-fosforanu (I) tworzy 5-fosforybozylo-I-pirofosforan, PRPP (II), także związek pośredni dla NAD + , NADP + i biosyntezy nukleotydu pirymidynowego. Przekształcenie PRPP (II) i glutaminy do 5-fosfo-P-D-rybozyloaminy (III) obejmuje wy rugowanie pirofosforanu przez azot amidowy glutaminy z inwersją konfiguracji przy C-l. Kształtuje to wiązanie P-N-glikozydowe koń cowego nukleotydu. Kondensacja glicyny ze związkiem (III) daje glicynoamidorybozylo-S-fosforan (IV) I wnosi 3 atomy, które ostatecznie staną się atomami C-4, C-5 i N-7 puryny. Przeniesienie na związek (4) grupy formylowej z N5,NIO-metenylotetrahydrofolianu (N5N10-metenylo-THF) tworzy formyloglicynoamidorybozylo-5-fosforan (V) i dodaje C-8 do przyszłej zasady purynowej. Dodanie do związku (V) grupy amido wej pochodzącej z glutaminy daje formyloglicynoamidorybozyJo-5-fosforan (VI) i wnosi atom N, który stanie się N-3 w pierścieniu purynowym. Eliminacja cząsteczki wody, której towa rzyszy zamknięcie pierścienia imidazolowego. w y t wa rza ami no i mi da zo lory boży lo-5fosforan (VII). Początkową reakcją, która wymaga ATP, jest przeniesienie grupy fosforanowej z ATP do oksogrupy związku (VI). Atak nukleofilowy przez przyległy azot grupy aminowej przemiesz cza P., czemu towarzyszy zamknięcie pierścienia imidazolowego. Dodanie do związku (VII) CO2, reakcja, która nie potrzebuje ani ATP, ani biotyny, daje a m i noimidazo lok a rbo k sy lo-ry boży lo-5-fosfora n (VIII). Dodany węgiel stanie się atomem C-6 puryny. Reakcja 8 i 9 przypomina przekształ cenie orni ty ny w argininę w cyklu moczniko wym (ryc. 31-13). Kondensacja asparaginianu ze związkiem (VIII) tworzy aminuimidazolobursztynylokarboksyamidorybozylo-S-fosforan (IX) i wprowadza N-l do pierścienia purynowe go. Grupa bursztynowa w związku (IX) od dziela się jako fumaran, dając aminoimidazolokarboksyamidorybozylo-5-fosforan(X).

) —O-CHj ATP AMP SYNTETATAZA PRPP

OH OH ) —O —CH,

NH,

Glutamina a-O-Rybozo-5-f DS1CP ran 4

© -O -C H j Glutamin tan

NH N",NM-MetenyloH lolian H tallan

L ^^^ C

AMIDOTRANSFERAZA GLLTTAMYLO-PRPP

(I)

H

FOHMYLOTRANSFERAZA

R-5-

OH OH

OH OH PRPP

Gllcynoamldorybozylo-5-feaforan

5-F osf o-0-D-rybozyioa mina (III)

(II)

Fomiylogłlcynaiiildo - rybozylo-5-fosłoran (V)

()V)

-ooc

Glutamina ATP

Asparaglnlan

I CH2

Glutamin i an -

-ooc coo-

-ooc

I CH

CO,

H3O

Fumaran HC

f

I -OOC

~ooc

® O

R-5-®

ATP, Mg=+ Zamknięcie pierścienia

H,O

i m idazo I □ bu rszty ny to karb □ -ksyamldorybozyio-5-fosto ra n (IX) LtAZA ADENYLDBURSZTYNWNOWA N'°-Formylt>-H,folian H4foltan

II

Amlno im id azo lo kar bo ksy lanorybozy to-5-fosf o ran (VIII)

N

Formyloolteynaml dyno-rybozylo-5fostoran (VI)

O

II

H,0

C l-

II

| FORMYLOTRANSFERAŻA] H Amlnoimidazoto kafbo -ksyam i a ory bozylo-5-f o s f a ran

Aminoimidazo lory boży io-5-fosioran (VII)

HN

CH

R-5-®

Amidolmldazolokarbo -ksyam i d o ryb ozylo -5-f osf □ r a r. (XI)

1 HN'

Zamkniecie pierścienia

II

CH

Inozynomonotostoran (IUP) (XII)

Ryc. 36-3. Szlak de novo biosyntezy puryn z 5-łosłoryboży i ATP. (Objaśnienie patrz w tekście). ®— PO^" lub

METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH / 429

Formylowanie związku (X) przez N10-formylo-THF daje amidoimidazolokarnoksyamidorybozylo-5-fosforan (XI). Nowy węgiel bę dzie stanowi! C-2 w szkielecie puryny. Zamknięcie pierścienia związku (XI) daje pierwszy nukleotyd purynowy, kwas inozynowy (XII) (monofosforan inozyny, czyli IMP).

nych. Na rycinie 36-3 przedstawiono, jak 3 wielofunkcjonalne polipeptydy u eukariontów katalizują więcej niż ] reakcję. Są to syntaza 5' -fosfory boży loami noimidazolo wa (kata lizuje reakcję 3,4 i 6), syntaza 5'-fosfory boży loaminoimid azolo bursztyny lok ar boksy a mi do wa (k a t a J i -żuje reakcję 7 i 8) i syntaza IMP (katalizuje reakcję 10 i 11).

Wielofunkcjonalne polipeptydy powstałe przez fuzje genów katalizują liczne reakcje w biosyntezie nukleotydów purynowych U prokariontów każda reakcja pokazana na ryc. 36-3 jest katalizowana przez różny polipeptyd. Jednakże u eukariontów fuzja genów data w wyniku ewolucji pojedyncze polipeptydy z licznymi funkcjami katalitycznymi. Taka ewolucja niesie 2 główne korzyści. Pierwsza dotyczy skatalizowania metabolitów. Bliskość miejsc katalitycznych sąsiadujących aktywności zapewnia fizyczną bliskość danego produktu do miejsca aktywności katalitycznej, dla którego jest on substratem. Druga korzyść wynika z tego, że fuzja genów zapewnia wytwarzanie jednakowych iiości różnych aktywności katalitycz-

Leki, które interferują z metabolizmem tetrahydrofolianu (THF) mogą blokować biosyntezę nukleotydu pury nowego Dwa atomy węgla, włączone podczas reakcji 4 i 10, które stają się atomami 8 i 2 pierścienia purynowego, pochodzą z N5,N10-metenylo-THF i NJ0-formylo-THF. N5,N'°-metenylo-THF jest tworzony przez utlenienie NS,N10-metyleno-THF. Jednakże raz zsyntetyzowany N 5 ,N 10 -metenylo-THF jest zaangażowany w syntezę puryn albo bezpośrednio, albo po przekształceniu do N10-formylo-THF. Zahamowanie syntezy tych związków tetrahydrofolianowych może zatem hamować syntezę puryn de novo.

-ooc-c-c-coo-

ooc-c-ccoo-

H2O

J_

H, I 2

GTP, Mg

LIAZA ADENYLOBUHSZTYNIANOWA

SYNTETAZA ADENYLOBURSZTYNWNOWA

R-5-®

Adenyloburs2t>nian (AMPs}

In o zyn o m o n otfo sfo ran (IM P] NAD*

-N

i

Ksantozy no mo nofoaforan (XMP)

H H "OOCC = C —COO"

R-S-(£> Guanozynomonotosforan (GMP)

Ryc. 36-4. Przekształcenie IMP w AMP i GMP.

Aden ozyno mo notorforan (AMP)

430 / ROZDZIAŁ 36

Utlenianie i aminacja IMP daj e AMP iGMP Na rycinie 36-4 są naszkicowane reakcje i związki pośrednie, przez które IMP jest zamieniane do AMP i GMP; cyfry arabskie odnoszą się do tych reakcji. Dodanie asparaginianu do IMP daje adenylobursztynian. Reakcja ta, katalizowana przez syntetazę adenylobursztynianową, z grub sza przypomina reakcje 8, ale wymaga ona swoiście GTP; wymóg ten stwarza potencjalne miejsce do regulacji syntezy nukleotydu adeniny (p. niżej). Odłączenie fumaranu daje adenozyno-5'monofosforan (AMP). Reakcja ta jest katali zowana przez liazę adenylobursztynianową, ten sam enzym, który katalizuje reakcję 9. Utlenienie IMP przez NAD+, katalizo wane przez dehydrogenaze IMP, daje ksantozynomonofosforan (XMP). Wprowadzenie grupy aminowej, po chodzącej z grupy amidowej glutaminy, biegnie analogicznie do reakcji 5. Niektóre analogi glutaminy hamują biogenezę nukleotydu purynowego Liczne anty metabolity, będące analogami glutaminy, są efektywnymi inhibitorami biosyntezy nukleotydu purynowego. Azaseryna (Odiazoacetylo-L-seryna) jest antagonistą glutaminy, szczególnie w reakcji 5. Diazonorleucyna [(6-diazo-5-okso)-L-norleucyna] blokuje reakcje 2, a 6-merkaptopuryna, oprócz innych działań, hamuje reakcje I 3 i l4.Kwasmikofenolowy swoiście hamuje reakcje 14. Przekształcenie AMP i GMP do ich dii trifosforanów zachodzi stopniowo Przekształcenie AMP i GMP do odpowiednich im di- i trifosforanów nukleozydów zachodzi w 2 etapach {ryc. 36-5). Sukcesywne przeniesienie grup fosforowych z ATP jest katalizowane odpowiednio przez kinazę nukleozydomonofosforanową i kina/ę nukleozydod ifosforano wą. Enzym, który fosforyluje adenylan, jest także nazywany miokinazą.

Monofoeioran

ATP ADP ATP ADP V ^^ Dlfosforari V ^» Trifosforan

Ryc. 36-5. Przekształcenie monofosforanu nukleozydu do di- i trifosforanu

PURYNY I ICH NUKLEOZYDY MOGĄ BYĆ PRZEMIENIANE BEZPOŚREDNIO DO MONONUKLEOTYDOW PRZEZ REAKCJE TYPU „SALVAGE" Przekształcenie wolnych puryn i nukleozydów purynowych wprost w mononukleotydy przez reakcję typu ,.salvage" (reakcja rezerwowa) wymaga znacznie mniej energii niż synteza nukleotydów de novo. Ilościowo ważniejszym mechanizmem jest fosfory boży lacj a wolnej puryny (Pu) przez PRPP, dająca 5'-mononukleotyd (Pu-RP). Pu + PP-RP -. PP, + Pu-RP

Fosforybozylację zasady purynowej katalizują 2 enzymy zależne od PRPP: fosforybozylotransferaza adeninowa, która zamienia adeninę w AMP (ryc. 36-6), i fosforybozylotransferaza hipoksantynowo-guaninowa, która katalizuje dodanie PRPP do hipoksantyny lub guaniny, w wyniku czego powstaje IMP lub GMP (ryc. 36-7).

C rysv r*

PRPP

P

J

H FOSFORYBOZYLOTRANSFERAZA ADENINOWA

AMP

Ryc. 36-6. Fosfory boży I a ej a adeniny jest katalizowana przez fosforybozylotransferazę adeninową.

Drugi mechanizm typu „salvage" obejmuje bezpośrednią fosforylację rybonukleozydu purynowego (PuR) przez ATP PuR + ATP -* ADP + PuR-P

Kinaza adenozynowa katalizuje fosforylację adenozyny i deoksyadenozyny do AMP lub dAMP, podczas gdy kinaza deoksycytydynowa

METABOLIZM NUKLEOTYDOW PURYNOWYCH 1 PIRYMIDYNOWYCH / 431

PflPP

■CV

Dostępność PRPP jest głównym determinantom nasilenia biosyntezy nukleotydów purynowych Synteza de novo IMP zużywa 6 mol równoważników ATP + glicynę, glutaminę, metenylo-THF i asparaginian. Aby uzyskać wydajne zużytkowanie zasobów, jest zatem konieczne, aby komórki regulowały de novo biosyntezę

PP

N

Hipoksantyna

'O-jP-OCH

FOSFORYBOZYLOTHANSFERAZA HIPOKSANTTNOWO-GUANINOWA

HO HO IMP

puryn. Głównym detcrminantcm nasilenia syntezy de novo nukleozydów purynowych jest stęże-

nie PRPP. To stężenie z kolei jest determinowane przez względną szybkość syntezy PRPP, jego zużytkowanie i degradację. Stopień syntezy PRPP zależy zarówno od dostępności rybozo5--fosforanu, jak i od aktywności syntetazy PRPP. Aktywność syntetazy PRPP jest wrażliwa na stężenie fosforanu i rybonukleotydów purynowych, które działają jako regulatory allosteryczne (ryc. 36-8). Zużytkowanie PRPP Rybozo-5-f osfo ran

0

GMP

Hyc. 36-7. Fos fory boży la c;a hipoksantyny t guaniny prowadzi do utworzenia odpowiednio IMP i GMP. Obie reakcje są katalizowane przez fosfory boży I otrą nsfe rażę tiipoksantynowo-guaninową.'

PRPP

5-Fosforybazyloaml na

fosforyluje deoksycytydynę, de o ksy adenozynę i 2'-deoksyguanożynę odpowiednio do dCMP, dAMP i dGMP. BIOSYNTEZA WĄTROBOWYCH NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH JEST DOKŁADNIE REGULOWANA Wątroba ssaków, główne miejsce syntezy de noro nukleotydów purynowych, dostarcza zasad purynowych i ich nukleozydów, które tworzą rezerwę do zużytkowania w tkankach niezdolnych do ich syntezy de novo. Na przykład w tkance mózgowej jest małe stężenie amidotransfera2y PRPP, a tkanka mózgowa człowieka przynajmniej częściowo zależy od egzogennych puryn. Erytrocyty i granulocyty obojetnochłonne nie mogą syntetyzować 5-fosforybozyloaminy i dlatego muszą korzystać z egzogennych puryn do syntezy nukleotydów purynowych. Jednak krążące limfocyty mają pewną zdolność do syntezy puryn cle novo.

IMP

ADP

GDP

AMP ATP

GTP

Ryc. 36-8. Kontrola nasilenia syntezy de novo nukleotydów purynowych. Linie ciągłe przedstawiają ciąg reakcji chemicznych, a linie przerywane ilustrują zahamowanie (Q) przez sprzężenie zwrotne przez końcowe produkty szlaku. Reakcje ® i © są katalizowane odpowiednio przez syntetazę PRPP i amid otrą nsierazę glutamino-PRPP.

432 / ROZDZIAŁ 36

odzwierciedla głównie aktywność reakcji rezerwowych (typu „salvage") dia hipoksantyny i guaniny, a tylko wtórnie stopień syntezy puryn de noro. Ten wniosek wynika z obserwacji, że stężenie PRPP w erytrocytach i fibroblastach w hodowlach pochodzących od mężczyzn z wrodzonym niedoborem fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej było wielokrotnie zwiększone. AMP i GMP regulują przez sprzężenie zwrotne amidotransferazę glutamylo-PRPP Amidotransferaza glutamylo-PRPF (reakcja 2, ryc. 36-3), pierwszy enzym wyłącznie zaangażowany w syntezie puryn de navo, jest wrażliwa na zwrotne zahamowanie przez nukleotydy purynowe, szczególnie AMP i GMP, które hamują, współzawodnicząc z PRPP (ryc. 36-8). Jednak regulacja syntezy puryn de novo przez amidotransferazę ma prawdopodobnie mniejsze znaczenie fizjologiczne niż regulacja syntetazy PRPP. Sprzężenie zwrotne AMP i GMP reguluje ich syntezę z IMP Dwa mechanizmy regulują przekształcanie IMP do GMP i AMP (ryc, 36-9). AMP przez sprzężenie zwrotne reguluje syntetaze adenylobursztynianową, a GMP przez sprzężenie zwrotne hamuje dehydrogenazę IMP. Co więcej, prze-

kształcenie IMP w adenylobursztynian na drodze do syntezy AMP wymaga GMP, a przekształcenie ksantynianu (XMP) w GMP wymaga ATP. Wzajemna regulacja między przemianami w metabolizmie IMP służy więc osłabieniu syntezy jednego nukleotydu purynowego wówczas, gdy zachodzi niedobór drugiego nukleotydu. Fosfory boży łotra n sferaza h ipo k sa ntyn owo -guaninowa, która przemienia hipoksantynę i guaninę odpowiednio do IMP i GMP (ryc. 36-7), jest także hamowana przez te same nukleotydy. REDUKCJA NDP DAJE dNDP Redukcja deoksyrybonukleotynów puryn i pirymidyn przy węglu 2'rybozy odpowiedniego difosforanu rybonukleotydu (NDP) jest katalizowana przez kompleks reduktazy rybonukleotydowej (ryc. 36-10). System ten działa jedynie w komórkach, które aktywnie syntetyzują DNA przed podziałem komórek. Redukcja wymaga tioredoksyny (białkowy kofaktor), reduktazy tioredok synowej (flawoprotema) i NADPH. U niektórych bakterii, ale nie u ssaków, reakcja ta wymaga także kobalaminy (witaminy B12). Zredukowana tioredoksyna, uzyskana z utlenionej tioredoksyny w reakcji katalizowanej przez NADPH: reduktaza tioredoksynowa, jest bezpośrednim czynnikiem redukującym NDP (ryc. 36-10).

IMPREDUKTAZA HYBO NUKLEOTYOOWA □ifoaforan rybonukieozydu 0 (fosforan 2 -deoksyrybonukleozydu

Tioredoksyna zredukowana

Ryc. 36-9. Regulacja przemiany IMP do nukleotydów adenozyny i guanozyny. Linie ciągłe przedstawiają ciąg reakcji che/nicznych. a linie przerywane regulację zarówno przez dodatnie (©), jak i ujemne (0) sprzężenie zwrotne.

NADP

Tloredoksyna u Kanion a

NADPH + H+

Ryc. 36-10. Redukcja difosforanów rybonukleozydudodifosforanów2'-deoksyrybonukleozydów.

METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH / 433 CDP

-*■ 2'dCTP

-** 2'dCDP-

3(=)R

ATP

Kw

!*,

as

-»-—».-»- 2PCdTTP

UDP-

moczowy tO] + H 2O ^ LJHY KA2A

CO.

GDP-

fi

b *>2'dGDP

H

H

Alantoina Ryc, 36-12. Przekształcenie kwasu moczowego w aiamómę.

ADP

Ryc. 36-11. Regulacja redukcji purynowych i pirymidynowych rybonukleotydów do odpowiednich 2'-cieoksyrybonukleotydów. Linie ciągle przedsta wiają ciąg reakcji chemicznych, a linie przerywane ujemne (Q) lub dodatnie (©) sprzężenie zwrotne.

cienkiego i nerek (ryc. 35-1). Oksydaza ksantynowa jest potencjalnym miejscem farmakologicznej interwencji u chorych z hiperurykemią i skazą moczanową (por, niżej).

Redukcja difosforaaów rybonukleozydów (NDP) do difosforanów deoksyrybonukieozydów podlega złożonej regulacji (ryc. 36-11), w wyniku której uzyskuje sie zrównoważone wytwarzanie deoksyrybonukleotydów dla syntezy DNA.

TWORZENIE WIĄZANIA P-NGLIKOZYDOWEGO WYSTĘPUJE W PÓ2NYCH ETAPACH BIOSYNTEZY NUKLEOTYDÓW PIRYMIDYNOWYCH

ORGANIZM LUDZKI KATALIZUJE PURYNY DO KWASU MOCZOWEGO Podczas gdy niższe naczelne i inne ssaki katabolizują kwas moczowy, przez hydrolizę katalizowaną urykazą, dalej do końcowego rozpuszczalnego w wodzie produktu alantoiny (ryc. 36-12), końcowym produktem katabolizmu puryn w organizmie ludzkim jest kwas moc2owy. Gady, ptaki i plaży, które podobnie jak człowiek nie mają urykazy, wydalają kwas moczowy i guanine jako produkty końcowe katabolizmu zarówno puryn, jak i białka. Guanina i hipoksantyna tworzą kwas moczowy z ksantyny w reakcji katalizowanej przez guanazę i oksyda/ę ksantynową wątroby, jelita — Biochemia

Synteza de novo nukleozydów pirymidynowych i purynowych obejmuje różne wspólne prekursory: PRPP, glutaminę, CO2, asparaginian. a dla nukleotydu tymidyny pochodne tctrahydrotolianu. Uderzająca różnica między tymi procesami biosyntezy polega na tym, że podczas, gdy fosforan rybozy jest integralną częścią najwcześniejszego prekursora w syntezie nukleotydu purynowego (p. ryc. 36-3), przyłączeni? cząsteczki fosforanu rybozy do N-3 zasady pi rym idy nowej zachodzi w późnej fazie biosyntezy (ryc. 36-13). Cyfry arabskie w akapitach poniżej odpowiadają numerom reakcji na ryc. 36-13. (1) Synteza pierścienia pirymidynowego zaczyna się od utworzenia karbamoilofosforanu z glutaminy, ATP, CO2 w reakcji katalizowanej przez cytoplazmatyczną syntaze karbamoilofosfuranową. Przeciwnie, syntaza karbamoilowa, biorąca udział w syntezie mocznika, jest en-

434 / ROZDZIAŁ 36

CO; + Glutamina + ATP SYNTETAZA KARBAMOILOFOSFORANOWA

°

-n-c4

"a" Karbamoilofosforan (CAP)

KARBAMOILOTHANSFERAZA ASPARAGINIANOWA

T

COO"

Kwas asparaginowv

DIHYDROOROTAZA

o-c.

H Kwas karbamoiloasparaginowy (CAA)

T

H H COO" Kwaa dlhydroorotowy (DHOH)

NAD+DEHYDROGENAZA DIHYDROOROTANOWA NADH + H ł-

Kwas orotowy (OA)

OMP DEKARBOKSYU\ZA OROTYDYNO-5-FOSFOHANOWA

COO'

CO,

PRPP

FOSFOHYBOZYLOTRANSFERAZA OROTANOWA UDP-

(Dlfosfora n REDUKTAZA HYBONUKLEOTYDOWA

UTP ATP

dUMP ^- N i ,N 1 °-Metyleno H,follan

Glutamina SYNTETAZA TYMIDYLłNOWA

H,tollan

Ry c. 36 -13. Szlak biosyntez y nukleotydów pirym idynowych.

METABOLIZM NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH / 435

zymem mitochondrialnym. Ta kompartmentacja zabezpiecza niezależną dostawę fosforanu karbamoilu dla tych procesów. Kondensacja karbamoilofosforanu z asparaginianem tworzy karbamoiloasparaginian w reakcji katalizowanej przez karbamoilotransferazę asparaginianową. Zamkniecie pierścienia przez utratę wo dy, katalizowane przez dihydroorotazę, prowa dzi do utworzenia kwasu dihydroorotowego. Odjęcie wodorów od atomów węgla 5 i 6 przez NAD + wprowadza wiązanie podwój ne, tworząc kwas octowy. Ta reakcja jest katali zowana przez mitochondrialny enzym dehydrogenazę dihydruorotanową Wszystkie inne en zymy biorące udział w syntezie de novo pirymidyn są enzymami cytoplazmatycznymi. Dodanie cząsteczki rybozofosfo ran owej z PRPP tworzy wiązanie p-N-glikozydowe z po wstaniem orotydynomonufosforanu (OMP). Re akcję tę, analogiczną do reakcji lrans-rybozylacji na ryc. 36-7, katalizuje fosforybozylotransferaza orotanowa. Podczas dekarboksylacji orotanu po wstaje lirydynomonofosforan (UMP) — pierw szy rzeczywisty rybonukleotyd pirymidynowy. (7 i 8) Po przeniesieniu reszty fosforanowej z ATP tworzy się UDP i UTP w reakcjach analogicznych do reakcji fosforylacji monofosfbranów nukleozydów purynowych (ryc. 36-5). (9) UTP jest aminowany do CTP przy udziale glutaminy i ATP. Redukcja difosforanów rybonukleotydów (NDP) do odpowiednich dNTP zachodzi w reakcjach analogicznych do reakcji dla nukleotydów purynowych (p. ryc. 36-10 i 36-11). dUMP może przyjąć resztę fosforano wą z ATP, tworząc dUTP (nie pokazano). Alternatywnie, ponieważ dUMP jest substratem dla dTMP, dUDP jest defosforylowany do dUMP. Metylacja dUMP przy C-5 przez N10-metyleno-TNF, katalizowana przez syntetazę tymidylanową, powoduje utworzenie tjmidylanu (tymidynomonofosforan, dTMP). Przeciwnowotworowy lek metotreksat blokuje redukcję dihydrofolianu

. Reakcja 12 na ryc. 36-13 jest jedyną reakcją w biosyntezie nukleotydu pirymidyny, która wymaga pochodnej tetrahydrofolianu. Podczas procesu przeniesienia reszta metylenowa N5, NIO-metyJeno-THF jest redukowana do reszty

metylowej, a nośnik tetrahydrofolianowy jest utleniany do dihydrofoUanu. Aby zaszła dalsza synteza, dihydrofolian musi być zredukowany do tetrahydrofolianu w reakcji katalizowanej przez reduktazę dihydrofolianową. W związku z tym komórki dzielące się, które muszą wytwarzać TMP i dihydrofolian, są szczególnie wrażliwe na inhibitory reduktazy dihydrofolianowej. Jednym z takich inhibitorów jest metotreksat (ametopteryna) szeroko stosowany lek przeciwnowotworowy.

RYBO-IDEOKSYRYBONUKLEOTYDY URACYLU I CYTOZYNY SĄ SUBSTRATAMI W REAKCJI REZERWOWEJ PIRYMIDYNY Podczas gdy komórki ssaków nie maja efektywnej drogi do zachowania rezerw wolnych zasad pirymidynowych, reakcje rezerwowe przemieniają rybonukleozydy pirymidynowe, urydynę i cytydynę, oraz deok syry bonu kle ozydy, tymidynę i deok sycy ty dynę, w odpowiednie nukleotydy(ryc. 36-14). 2'-Deoksycytydynajest fosforylowana przez kinazę deoksycytydynową, enzym, który także fosforyluje deoksyguanozy-

ATP

ADP

Urydyna-

- •• U MP KINAZA UHYDYNOWO-CYTYDYMOWA

Cytydyna Tym idy na

-diMp

ATP

AD?

KINAZATYMIDYNOWA I ATP

ADP

DeoksycylyOyna.

-dCMP

|KINAZA DEOKSYCYTYDYNOWĄ] Ryc. 36-14. Reakcje kinaz nukleozydów pirymidynowych odpowiedzialne za tworzenie monofosforanów nukleozydów pirymidynowych.

436 / ROZDZIAŁ 36

nę i deoksy adenozynę. Fosfory boży łotra nsferaza orotanowa (reakcja 5, ryc. 36-13), enzym biorący udział w syntezie de novo nukleotydów pirymidyny, może syntetyzować OMP z kwasu orotowego.

ANALOGI PIRYMIDYNY SĄSUBSTRATAMI DLA NIEKTÓRYCH ENZYMÓW SYNTEZY NUKLEOTYDU Pl RYM I DYMOWEGO Podczas gdy fosforybozylotransferaza orotonianowa nie może używać normalnych zasad pirymidynowych jako substratów, katalizuje ona jednak przekształcenie allopurynolu (4-hydroksypirazolopiramidyna) do nukleotydu, w którym rybo zofosfo ran jest dołączony do N-l pierścienia pirymidy nowego allopurynolu. Także lek przeciwnowotworowy 5-fIuorouracyl jest fosfory boży Iow any przez fosfory boży łotr ansferazę orotanowa.

KATABOLIZM PłRYMIDYN WYTWARZA PRODUKTY ROZPUSZCZALNE W WODZIE K atabolizm pirymidyn. który zachodzi głównie w wątrobie, prowadzi do wytworzenia łatwo rozpuszczalnych produktów końcowych (ryc. 36-15). Kontrastuje to z katabolizmem puryn, w wyniku którego powstaje bardzo słabo rozpuszczalny kwas moczowy i moczan sodu. Uwolnienie CO2 (wydalonego przez oddychanie) z węgla (C2) rdzenia pirymidyny Teprezentuje główny szlak dla katabolizmu uracylu, cytozyny i tyminy. P-Alanina j p-aminoizomaślan są końcowymi produktami katabolizmu cytozyny, uracylu i tyminy. Wydalanie (3-aminoizomaślanu zwiększa się w białaczce i po ekspozycji promieniami X z powodu zwiększonego niszczenia komórek i ich DNA. Nieprawidłowe duże wydalanie p-aminoizomaślanu, spowodowane recesywną ekspresją genu, zachodzi u hetcrozygotycznego potomstwa (heterozygot), skądinąd zdrowych osobników. Około 25% badanych osób, z pochodzenia Chińczyków i Japończyków, stale wydala duże ilości P-aminoizomasianu. Chociaż wiemy mało, jak organizm ludzki degraduje p-aminoizomaślan, nerka śwjni metabolizuje go przez transaminację do semialdehydu metylomalonianu. Po utlenieniu do propionianu ten

semialdehyd tworzy sukcynylo-CoA (p. ryc. 21-2).

Pseudourydyna jest wydalana w stanie nie zmienionym

Ponieważ żaden z enzymów u ludzi nie katalizuje hydrolizy lub fosforolizy pseudourydyny, ten niezwykły nukleotyd, który po raz pierwszy wykryto w moczu ludzi, u osób zdrowych jest wydalany z moczem w stanie nie zmienionym.

BIOSYNTEZA NUKLEOTYDÓW PIRYMIDYNOWYCH JEST REGULOWANA ZARÓWNO NA POZIOMIE EKSPRESJI GENU, JAK I AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ Dwa pierwsze enzymy biorące udział w biosyntezie nukleotydów pirymidy nowych są wrażliwe na regulację allosteryczną. Co do regulacji przez ekspresję genu, 3 pierwsze i 2 ostatnie enzymy są regulowane przez skoordynowaną represję i derepresję. Syntetaza karhamoilofosforano w a jest hamowana przez UTP C nukleotydy purynowe, a aktywowana przez PRPP (ryc. 36-16). Karbamoilotransferaza asparagiiiianowa jest bardzo wrażliwa na hamujące działanie CTP. Właściwości allosteryczne karbamoilotransferazy asparaginianowej u prokariontów stanowią klasyczny obiekt badań allosterii.

ZRÓWNOWAŻONE WYTWARZANIE PREKURSORÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH WYMAGA SKOORDYNOWANEJ KONTROLI BIOSYNTEZY NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH Biosynteza pirymidyny i biosynteza puryn biegnie równolegle, jeśli weźmie się pod uwagę stosunki molowe; sugeruje to skoordynowaną kontrole obu tych procesów, Syntetaza PRPP (reakcja 1, ryc. 36-3), enzym, który katalizuje reakcję wytwarzania podstawowego prekursora obu procesów, podlega zahamowaniu przez sprzężenie zwrotne zarówno przez nukleotydy purynowe, jak i pirymidy no we oraz aktywacji przez PRPP. Są więc liczne miejsca, w których zachodzi krzyżowa regulacja między syntezą nukleotydów purynowych i pirymidyn owych.

METABOLIZM NUKLEOTYDOW PURYNOWYCH I PtRYMIDYNOWYCH I 437

Tymlna

-~. NADPH + H+

Di hyd roty mina 0-llretdopropionian N-k a r ba m o ilo-^-al a n I n a

Dihydrouracyl

COO' H5 N i

^Alanina

O'

J

H,Nł - CH, - CH2 - COO" ^

HZO

/

H ^-Ureidolzomaślan

(N- Garbarń o Ho-0-am ino -Izomaślan)

H 3 N+ -CH;,-CH—COO CH3 ^-Aminoizomaślan

Ryc. 36-15. Rozkład pirymidyn.

SKAZA MOCZANOWA JEST ZABURZENIEM KATABOLiZMU PURYNOWEGO Tak jak dla. każdego słabego kwasu względne proporcje niezdysocjowanego kwasu (kwas moczowy) i jego sprzężonej zasady (moczan sodu) zależą od pH. W fizjologicznych wartościach pH musimy rozważyć jedynie dysocjację pierw-

szego protonu z kwasu moczowego (pK = 5,75) ponieważ drugi proton (pK=]0,3) dysocjuje przy wartościach pH znacznie wyższych od pH jakiegokolwiek płynu ustrojowego. W płynach ustrojowych występuje więc kwas moczowy i jego sól monosodowa. W hiperurykemii stężenie moczanu sodu w surowicy przewyższa granice rozpuszczalności. Kryształy moczanu sodu mogą się zatem tworzyć w tkankach miękkich

438 / ROZDZIAŁ 36 NuKleotycfy purynowe-------„

natomiast kwas moczowy występuje w płynie kanalikowym kanalików nerkowych znajdujących się za odcinkiem kanalików zakwaszających mocz. Powstawanie kamieni złożonych z kwasu moczowego można więc zahamować przez alkalizację moczu.

PRPP-------

,

ATP + Rybozo-5-toaforan Asparaginian

©

ATP + COj + Glutamina

O UDP

TDP

dUDP

"TMP-

Ryc. 36-16. Kontrola syntezy nukleotydu pirymidynowego. Linie ciągłe ilustrują ciąg reakcji chemicznej. Linie przerywane pokazują pozytywną (©) i negatywną (©) regulację przez sprzężenie zwrotne.

• —CTP

i stawach w postaci depozytów, określanych jak~o "guzki dnawe. Proces ten wywołuje ostrą reakcję zapalną, ostre (moczanowe) zapalenie stawów, które może przejść w przewlekłe (moczanowe) zapalenie stawów.

Podczas gdy mocz o pH 5 może być wysycony moczanami do stężenia 892 umol/1 (=15 mg/dl), w moczu o pH 7 rozpuszcza się 8922-11896 umol/I (=150—200 mg/dl) moczanów. W moczu prawidłowym, o pH najczęściej niższym od 5,75, przeważa kwas moczowy. W odcinkach kanalików nerkowych proksymalnie położonych w stosunku do kanalika dystalnego i zbiorczego (gdzie głównie zachodzi zakwaszenie moczu) w moczu występuje moczan sodu,

Metody izotopowe pozwalają zmierzyć ogólnoustrojowa, pulę moczanów Po dożylnym podaniu (1!N)-kwasu moczowego osobom zdrowym i chorym na skazę moczanową, stopień rozcieńczenia izotopu używa się do wyliczenia ogól noust rojowej wymienialnej puli moczanów. Pula ta u zdrowych mężczyzn wynosi 7,08 mmol (=1200 mg), a u zdrowych dorosłych kobiet 3,54 mmol ( = 600 mg), natomiast u chorych ze skazą moczanową bez guzków dnawych 11,8—23,6 mmol ( = 2000-^000 mg), a nawet 182,9 mmol ( = 31 000 mg) u chorych z ciężką skazą moczanową z guzkami dnawymi. Moczan sodu jest aktywnie reabsorbowany i częściowo wydzielany w kanaliku proksymalnym. W pętli nefronu zachodzi dalsze wydzielane moczanów do światła nefronu, natomiast w kanaliku krętym dystalnym zachodzi ponowne, chociaż tylko częściowe, jego wchłanianie zwrotne. Wydalanie netto kwasu moczowego z moczem u zdrowego człowieka wynosi 2,36 — —3,54 mmoł/24 h (= 400—600 mg/24 h). Wiele związków farmakologicznych i naturalnie występujących wpływa na wchłanianie nerkowe i wydalanie moczanu sodu. Na przykład kwas acetylosalicylowy w dużych dawkach hamuje kompetycyjnie zarówno wydzielanie moczanów przez kanaliki nerkowe, jak i jego wchłanianie zwrotne.

Kryształy moczanowe mają znaczenie diagnostyczne w skazie moczanowej W skazie moczanowej znaczenie diagnostyczne ma uwidocznienie w granulocytach obojętnochłonnych w płynie stawowym, w świetle spolaryzowanym i w mikroskopie świetlnym, iglastych, intensywnie świecących podwójnie załamujących światło kryształów moczanu sodu. Kryształy mają barwę żółtą, gdy ich długa oś jest równoległa, lub niebieską, gdy oś jest prostopadła do płaszczyzny światła spolaryzowanego.

________________METABOLIZM NUKLEOTYD&W PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH / 439 Tabela 36-1. Dziedziczne zaburzenia metabolizmu purynowego i towarzyszące im nieprawidłowości enzymatyczne Zaburzenie kliniczne

Uszkodzony enzym

Dna Syntetaza PRPP Dna Syntetaza PRPP Dna Syntetaza PRPP Dna HGPRTaza* Zespół Lescha-Ny-

han a

HGPRTaza

Charakter uszkodzenia

Charaktery styka zaburzenia klinicznego

Typ dziedziczności

Mad aktywność (zwię- Nadmierne wytwarzanie i nadmier- Sprzężony z chromone wydalanie pufyn kszenie Vmaks.) somem X recesywny Oporność na zaha- Nadmierne wytwarzanie i nadmier- Sprzężony z chromomowanie w reakcji ne wydalanie puryn somem X recesywny sprzężenia zwrotnego Mała Km dla rybozo- Nadmierne wytwarzanie i nadmier- Prawdopodobnie sprzęne wydalanie puryn żony z ■5-fosforanu chromosomem X recesywny Częściowy niedobór Nadmierne wytwarzanie i nadmierne wydalanie puryn Sprzężony z chromosomem X tecesywny Nadmierne wytwarzanie i nadmierZupełny niedobór ne wydalanie puryn; porażenie mó- Sprzężony z chromosomem X recesywny żdżkowe i samookaleczenia

Niedobór immuCiężki niedobór nologiczny Deaminaza adenozynowa

Niedobór immunologiczny zfozony (komórki T i B), deoksyadenozy- Autosomalny recesynuria wny

Niedobór immuCiężki niedobór nologiczny Fosforylaza nukieozydowa puryn

Niedobór komórek T, inozynuria, deoksyinozynuria, guanoiynuria, Autosomalny recesydeoksygua nożyn uria, hipouryke- wny mia

Kamica~nerkowa

Zupełny niedobór

Kamica nerkowa 2,8-dihydroksyadeninowa

Zupełny niedobór

Kamica nerkowa ksantynowa, hipourykemia Autosomalny recesywny

Ksantynuria

Fosforybozylotransferaza adeninowa Oksydaza ksantynowa

Autosomalny recesywny

* HGPRTaza = ło sf o ry boży I otrą n sferaza hipoksantynowo-guaninowa.

ZABURZENIA W METABOLIZMIE PURYN OBEJMUJĄ CHOROBY PRZEBIEGAJĄCE Z HIPERURYKEMIĄ LUB HIPOURYKEMIĄ

Tabela 36-2. Klasyfikacja chorych z hipemrykemią

Zaburzenia w metabolizmie puryn (tab. 36-1) obejmują choroby przebiegające z hiperurykemią lub hipourj kemią oraz choroby charakteryzujące się niedoborem immunologicznym. Hiperurykemie mogą być dalej klasyfikowane na podstawie wydalania z moczem prawidłowych lub nadmiernych (ponad 3,54 mmol/ 24 h = 600 mg/24 h) ilości moczanów (tab. 36-2). Niektóre zaburzenia są spowodowane swoistymi niedoborami enzymatycznymi. W innych hiperurykemia jest zjawiskiem wtórnym, np.

II. Nadmierne wydalanie moczanów z powodu nadmiernego wytwarzania A Wtórna zmiana towarzysząca innym chorobom, np nowotwory, łuszczyca B Znane niedobory enzymatyczne odpowiedzialne za nadmierne wytwarzanie 1 Nieprawidłowości syntezy PRPP 2. Niedobory fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej 3. Niedobory g!ukozo-6-fosfatazy C. Uszkodzenia nieznane

I. Prawidłowe wydalanie moczanów; upośledzone wydalanie nerkowe odpowiedzialne za zwiększone stężenie moczanów w surowicy

440 / ROZDZIAŁ 36

spowodowanym nowotworem lub łuszczycą, charakteryzującymi się wzmożonym obrotem tkankowym. Zespół Lescha-Nyhana jest przejawem całkowitego braku fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-gua ni nowej Zespół Lescha-Nyhana jest następstwem braku aktywnej fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-gua ninowej (HGPRTazy), enzymu „rezerwowego1' szlaku syntezy puryn (ryc. 36-7). To zaburzenie recesywne, dziedzicznie sprzężone z chromosomem X, charakteryzuje uszkodzenie ośrodkowego układu nerwowego, przebiegające z choreoatetozą i zwiększonym napięciem mięśniowym, znaczną hiperurykemią z nadmiernego wytwarzania, połączoną często z kamicą moczanową i zespoiem samookaleczenia. Mniej szkodliwym mutacjom, w wyniku których powstaje częściowy niedobór HGPRTazy, towarzyszy u mężczyzn znaczna hiperurykemia, przebiegająca bez wyraźnych objawów klinicznych. Nadmierne wytwarzanie puryn w niedoborze HGPRTazy jest wyrazem oszczędzania PRPP w szlaku rezerwowym syntezy puryn z następującym zwiększeniem wewnątrzkomórkowego stężenia PRPP. Chorobę von Gierkego charakteryzuje nadmierne wytwarzanie puryn i hiperurykemia Nadmierne wytwarzanie puryn i hiperurykeO ^ ^ t gluko^ ^ ^ ^ g zo- ó-fosfatazy) są zjawiskami wtórnymi w odnięsjeniudo wzmożonego wytwarzania rybozo--5-fcsforanu, prekursora PRPP. Współtowarzysząca kwasica mleczanowa podwyższa jedynak nerkowy próg wydalania moczanów, przyczyniając się do gromadzenia moczanów w całym organizmie. Hipourykemie powstają w wyniku nadmiernego wydalania lub zmniejszonego wytwarzania kwasu moczowego Psy daimatyriskie, które niekompletnie reabsorbują kwas moczowy, wydalają moczany i kwas moczowy w nadmiarze w stosunku do ich stężenia w surowicy. Podobne wady obserwuje się u ludzi z hipourykemią.

Hipourykemia towarzyszy niedoborowi oksydazy ksanty nowej Hipourykemią i wzmożone wydalanie hipoksanfyny i ksantyny jest związane z niedoborem oksydazy ksantynowej, spowodowanym albo wadą genetyczną, albo ciężkim uszkodzeniem wątroby. W poważnym niedoborze oksydazy ksantynowej u chorych "może wystąpić zwiększona ksantynuria i kamica ksantynowa.

Wady genetyczne powodują niedobór deaminazy adenozynowej i fosforylazy nukleozydowej puryn Niedobór deaminazy adenozynowej jest zwią-

zany z ciężkim złożonym niedoborem immunologicznym, chorobą, w której zarówno limfocyty pochodzenia grasiczego (komórki T), jak i pochodzenia szpikowego (komórki B) są nieliczne i wykazują zaburzenia czynności. Niedobór fosforyiazy nukleozydowej puryn jest zwią-

zany z poważnym niedoborem limfocytów pochodzenia grasiczego przy prawidłowej czynności komórek B. Oba zaburzenia są autosomalne i recesywne. Zaburzenia immunologiczne wynikają ?e spichrzenia dGTP i dATP, które hamują allosterycznie reduktazę rybonukleotydową i przez to pozbawiają komórki prekursorów DNA, szczególnie dCTP. Niedobór puryn u ludzi występuje rzadko Stany niedoboru purynowego u łudzi są-ograniczone do sytuacji przypisywanych przede wszystkim niedoborom kwasu foliowegoj być może witaminy B12, gdy ta ostatnia powoduje wtórny niedobór pochodnych folianów. NADMIERNE WYTWARZANIE KATABOLITÓW PIRYMIDYNOWYCH JEST RZADKO ZWIĄZANE ZE ZNACZĄCYMI KLINICZNIE NIEPRAWIDŁOWOŚCIAMI Produkty-katabołizmu pirymidyny, odwrotnie niż puryny, są rozpuszczalne "wwodzie. Dlatego nawet w przypadku, gdy zachodzi nadmierne wytwarzanie pirymidyny rzadko pojawiają się wykrywalne klinicznie nieprawidłowości (tab. 36-3). W hiperurykemii, której towarzyszy nadmierne wytwarzanie PRPP, zachodzi nadmierne wytwarzanie nukleotydów pirymidynowych i zwiększone wydalanie fi-alaniny. Ponieważ do syntezy tymidylanu jest

METABOLIZM NUKLEOTYDOW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH 441 / Tabela 36-3.Wrodzone zaburzenia metabolizmu pirymidyn i towarzyszące im nieprawidłowości enzymatyczne Zaburzenie kliniczne

Uszkodzony enzym

Cechy zaburzeń klinicznych

Typ dziedziczności

Acyduria p-amino- Transami naza izomaślanowa Orotoacyduria typu I

Brak objawów, częste zaburzenieAutosomalny recesywny u ludów Wschodu Kryształy kwasu orotowego w moczu Fosfory bozylotransfera Autosomalny ręce -;a orotowa i dekarbok- i niedokrwistość megaioblastyczna.sywny sylaza o roty dyl a nowa Niedobór immunologiczny Remisja po podaniu doustnym urydyny

Orotoacyduria typu II

- Autosomalny ręceDekarboksylaza oroty- Orotydynuria i acyduria orotowa, nie dokrwistość megaioblastyczna Re - sywny dylanowd misja po podaniu doustnym urydyny

Niedobór karbamoi- Karbamoilotransferaza Nietolerancja białek, encefalopatiaSprzężony z chrowątrobowa i acyduria orotowa o lek - mosomem X recesyiotransferazy ornity- ornitynowa kim nasileniu wny nowej

potrzebny N5,N10-metyleno-THF, zaburzenia w metabolizmie folianów i witaminy B12 powodują niedobory dTMP (w przypadku niedoboru witaminy B, 2 przez mechanizm pośredni). Acyduria P-aminomaślanowa była omówiona poprzednio w związku z katabolizmem pirymidyn. Acyduria orotowa, która towarzyszy zespołowi Reye'», jest prawdopodobnie procesem wtórnym, wynikającym z niezdolności silnie uszkodzonych mitochondriów do zużytkowania karbamoilofosforanu, który może wówczas być dostępny do nadmiernego wytwarzania cytozolowego kwasu orotowego.

Niedoborowi enzymu cyklu mocznikowego towarzyszy wzmożone wydalanie prekursorów pirymidyny Wzmożone wydalanie kwasu orotowego, uracylu i urydyny opisano u chorych z niedoborem wątrobowego mitochondriałnego enzymu

Chorzy na orotoacydurię są pi rym idy nowy mi auksotrofami, reagującymi na nukleozydy pirymidynowe w pożywieniu W częściej występującym typie I tej choroby stwierdza się niedobór zarówno fosfory boży lo-

Leki mogą eliminować acydurię orotowa Analogpuryny allopurynol(p. ryc. 35-21) jest inhibitorem oksydazy ksantynowej stosowanej w leczeniu skazy moczanowej, Allopurynol, substrat fosfory boży 1 o transferazy orotanowej (reakcja 5, ryc, 36-13) hamuje kompetytywnie fosfory boży lację naturalnego substratu kwasu orotowego. Ponadto powstający produkt nukleotydowy hamuje dekarboksylazę orotydylanową (reakcja 6, ryc. 36-13) wy twarzając orotoacydurię lub orotydynurię. Ponieważ szlak biosyntezy de novo nukleotydu pi rym idy nowego przystosowuje się do takiego hamowania, organizm ludzki jest tylko przejściowo pozbawiony nukieotydów pirymidynowych we wczesnym okresie leczenia. 6-A/aury dyna, po przekształceniu do 6-azaurydylanu, kompelytywnie hamuje dekarboksy-

transferazy orotanowej, jak i dekarboksylazy

orotydy łanowej (reakcja 6, ryc. 36-13). Głównym wydalanym nieprawidłowym produktem jest kwas orotowy. Oba typy chorych są auksotrofami, którzy reeagują na podaną urydynę. Znacznie zwiększona aktywność karbamoilotransferazy asparagi niań owej i dihydroorotazy u chorych z orotoacyduria typu I powraca do normy po doustnym podaniu urydyny.

karbamoilotransferazy ornitynowej. Nagroma-

dzony fosforan karbamoilu, substrat tego enzymu, przechodzi do cytozolu, gdzie jest użyty do syntezy nukleotydów pirymidynowych. Powstająca w wyniku tego słaba acyduria orotowa wzmaga się wówczas, gdy chorzy spożywają pożywienie z dużą zawartością azotu.

442 / ROZDZIAŁ 36

lazę orotydylanową (reakcja 6, ryc. 36-13) silnie wzmagając wydalanie kwasu orotowego i orotydyny. PIŚMIENNICTWO Ames BN, Cathcarl R, Sthwiers E, Hochstein P: Uric acid provides an anlioxidant defense in huraans against oxidant- and radical-caused aging and cancer: A hypoLhesis. Proc Nati Acad Sci USA 19S1; 78:6858. Benkovic SJ: The transfomiylase enzymes in de novo purine biosynthesis. Trends Biochem Sci 1984;9:320.

Holmgren A: Thioredoxin. Annu Rev Biochem 1985; 54:237. Joties M: Pyrimidine nucleotide biosynthesis in animal cells. Annu Rev Biochem 1980; 49:253. Martin DW Jr, Gelfand EW: Biochemistry of diseases of immunodevelopment. Annu Rev Biochem 1981; 50:845. Schinke RT: Methotrexate resistance and gene amplification. Mechanisras and implications. Cancer 1986; 57:1912. Seegmiller JE: Overview of the possible relation of defects in purine metabolism to imraune deficiency. Ann NY Acad Sci 1985; 45:9. Stanbury JB et al (editors): The Metaboiic Basis of Inherited Disease, 5th ed. McGraw-Hill, 1983.

Struktura i funkcja kwasów nukleinowych

3 7

Dary! K. Granner. MD

WPROWADZENIE Odkrycie, że informacja genetyczna jest zakodowana wzdłuż cząsteczki polimeru, złożonej z 4 rodzajów jednostek monomerycznych, jest wielkim osiągnięciem naukowym tego stulecia. Ta cząsteczka polimeru, DNA, jest chemiczną podstawą dziedziczności. Składa się ona z genów, podstawowych jednostek informacji genetycznej. Geny kontrolują syntezę różnych typów RJSA, większość z nich bierze udział w syntezie białek. Geny nie działają autonomicznie; ich replikatja i funkcja są kontrolowane przez słabo jeszcze poznane sprzężenia zwrotne, w których same produkty genów odgrywają krytyczną rolę. Wiedza o strukturze i funkcji kwasów nukleinowych jest podstawowa do zrozumienia genetyki i stanowi podstawę do dalszych badań.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Chemiczna podstawa dziedziczności i chorób genetycznych jest zawarta w strukturze DNA. Główny szlak informacyjny (tj. kierowanie przez DNA syntezą RNA, który z kolei kieruje syntezą białek) został już wyjaśniony. Wiedza ta została użyta dla sprecyzowania fizjologii komórkowej i patofizjologii chorób na poziomie molekularnym.

DNA ZAWIERA INFORMACJĘ GENETYCZNĄ Fakt, że DNA zawiera informację genetyczną wykazali po raz pierwszy w 1944 r. w serii doświadczeń Avery, MacLeod i McCarty. Za-

obserwowali oni, że genetyczna determinacja otoczki swoistych pneumokoków może być przeniesiona do innych pneumokoków o wyraźnie odmiennym typie otoczki przez wprowadzenie oczyszczonego DNA od pierwszych do drugich. Autorzy ci określili czynnik, który dokonuje tej zmiany, jako „czynnik transformujący" (później wykazano, że był to DNA). W późniejszym okresie ten typ manipulacji genetycznej stal się pospolity. Podobne doświadczenia wykonano ostatnio posługując się drożdżami, hodowanymi w kulturach komórkami ssaków i zarodkami owadów oraz gryzoni jako biorców, a klonowanym DNA jako dawcą informacji genetycznej.

DNA składa się z 4 deoksynukleotydów

Chemiczną naturę jednostek deoksynukJeotydowych DNA — deoksyadenylan, deoksyguanylan, deoksycytydylan i tymidylan — opisano w rozdz. 35. Te monomeryczne jednostki DNA są utrzymane w postaci polimeru przez mostki 3', 5'-fosfodiestrowe, tworząc w ten sposób pojedyncze pasmo przedstawione na ryc. 37-1. Treść informacyjna DNA (kod genetyczny) iest zawarta w'"seTiwencji, w której te monomery - deoksyrybonukleotydy purynowe i pirymidynowe — są zorganizowane. Cząsteczka polimeru DNA, jak to pokazano, jest polarna; na jednym końcu ma grupę 5'-hydroksylową lub fosforanową, a na drugim grupę 3'-fosforanową lub hydroksylową. Znaczenie tej popularności zostanie wyjaśnione w dalszej części rozdziahi. Ponieważ informacja genetyczna jest zawarta w kolejno ułożonych jednostkach monomerycznych w cząsteczkach polimeru, musi istnieć mechanizm reprodukowania, czyli replikowania tej swoistej informacji mającej bardzo duży

/ ROZDZIAŁ 37

H

\ H. y l

3' H Ryc. 37-1. Segment jednego pasma cząsteczki DNA, w której zasady purynowe i pi rym idy no we: adenina (A), tymina (T), cytozyna (C) i guartina (G) są połączone przez fosfod iestro we wiązania (szkielet) między resztami 2'-deoksyrybozylowymi związanymi z zasadami przez wiązanie N-glikozydowe. Zwróć uwagę, że szkielet wiązań fosfod i estrowych wykazuje polarność (tj, ukierunkowanie).

stopień wierności. Ten wymóg, razem z danymi uzyskanymi za pomocą dyfrakcji promieni X przez cząsteczkę DNA, i spostrzeżenia Chargaffa, że w cząsteczkach DNA stężenie nukleotydów deoksy a de noży nowych (A) równa się stężeniu nukleotydów tymidynowych (T) iA^JJ^ji stj^eniejiukleotydów deoksyguanozynowych (G) równa się stężeniu nukleotydów deoksycytydynowych (C) (G = C) pozwoliły zaproponować we wczesnych latach 50. model dwupasmowej cząsteczki DNA. Propozycję taką przedstawili Watson,~Crick i Wilkins. Model, który ci uczeni zaproponowali, przedstawiono na ryc. 37-2. 2 pasma prawoskrętnej dwupasmowej cząsteczki są utrzymane przez wiązania wodorowe między zasadami purynowymi a pi rym idy no wy mi odpowiadających sobie cząsteczek linijnych. Wytworzenie par między nukleotydami purynowymi a pirymidyno-

wymi naprzeciwległych pasmach jest bardzo swoiste i zależy od wiązań wodorowych A i T oraz G i C (ryc. 37-3). W dwupasmowej cząsteczce ograniczenia narzucone przez możliwość rotacji wokół wiązania fosfodiestrowego, uprzywilejowana konfiguracja antywiązania glikozydowego (p. ryc. 35-9) oraz dominujące tautomery (p. ryc. 35-4) 4 zasad (A, G, T i C) pozwalają tylko na sparowanie A wyłącznie z T i G wyłącznie z C, jak to przedstawiono na ryc. 37-3, Takie ograniczenie w parowaniu zasad wyjaśnia wcześniejszą obserwację, że w_dwupasmowej cząsteczce DNA ilość A równa się ilości T, a ilość G równa się ilości C. 2 pasma, z których każde jest polarne, w dwupasmowej cząsteczce są przeciwległe; tj. jedno pasmo biegnie w kierunku 5' do 3', a drugie w kierunku 3' do 5'. Jest to analogiczne do 2 równoległych ulic, z których

STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH / 44S

2,0 nm

Rowek mniejszy I większy

nm 3,4 nm Ryc. 37-2. Model Watsona-Cricka dwupasmowej helikalnej struktury postaci B DNA. Na lewo: Schemat struktury. Strzałka pozioma pokazuje szerokość (średnicę) podwójnego heliksu (2,0 nm), a strzałka pionowa długość jednego petnego zwoju heliksu (3,4 nm). Centralna oś podwójnego heiiksu jest pokazana jako pionowa linia. Krótkie strzałki wskazują polarność przeciwległych pasm. (A — adenina, C — cytozyna; G — guanina; T — tymina; P — fosforan, S — cukier [deoksyryboza]). Na prawo: Model przestrzenny struktury DNA. (Zdjęcie wg James D, Watson, Molecutar Biology of the Gene, 3rd ed. Copyright © 1976, 1970, 1965, by W. A. Benjamin, Inc, Menlo Park, CalifJ. ________________________________________________________________________________________

każda jest jednokierunkowa, ale ruch na nich biegnie w odwrotnych kierunkach. W dwupasmowych cząsteczkach DNA informacja genetyczną mieści się w sekwencji nukleotydów na jednym paśmie, nazywanym pasmem matrycowym; przeciwległe do niego pasmo jest pasmem kodującym, ponieważ odpowiada ono transkryptowi RNA, który z kolei koduje białko. Na rycinie 37-3 przedstawiono, jak 3 wiązania wodorowe utrzymują nukleotyd deoksyguanozynowy z nukleotydem deoksycytydynowym, podczas gdy druga para, para A-T. jest połączona 2 wiązaniami wodorowymi. Wiązanie G^T jest więc mocniejsze o ok. 50%. Z powoduiej dodatkowej siły wiązali, a także z powodu interakcji typu „stacking" regiony DNA o dużej liczbie wiązań G-C są bardziej oporne na denaturację, czyli „topnienie", niż regiony o dużej liczbie wiązań A-T.

DNA istnieje w postaci kilku dwupasmowych helikalnych struktur Dotychczas opisano 6 postaci cząsteczek DNA (A do E i Z), ale większość z nich znaleziono tylko w rygorystycznych warunkach doświadczalnych. Postacie te odróżnia; 1) liczba par zasad, które zajmują każdy zwój heliksu, 2) nachylenie, czyli kąt między każdą parą zasad, 3) średnica heliksu cząsteczki i 4) kierunek skrętu (prawy lub lewy) podwójnego heliksu (tab. 37-1). Niektóre z tych postaci ulegają przekształceniu wewnętrznemu przez zmianę takich warunków, jak stężenie soli i hydratacja. Możliwe, źe takie przekształcenie wewnętrzne może się zdarzać in vivo. Posfoć B, powszechnie dominująca postać DNA w warunkach fizjologicznych (małe stężenie soli, duży stopień hydratacji), ma wielkość skoku 3.4 nm na każdy zwój (ryc. 37-2). W ob-

446 / ROZDZIAŁ 37 CH3 O-. N Cukier

N„ O

Tymidyna

Adenozyna

Ryc. 37-3. Wzajemne parowanie między deoksyadenozyna. i tymidyna. obejmuje wytworzenie 2 wiązań wodorowych 3 takie wiązania tworzą się między deoksycytydyną i deoksyguanożyną. Linie przerywane przedstawiają wiązania wodorowe. W DNA cząsteczką cukrową jest 2-deoksyryboza, podczas gdy w RNA — D-ryboza.

rębie każdego zwoju mieści się lOpar zasad (pz) (liczba ta może się zmieniać między 10,0-—10,6 pz na każdy zwój), każda z płaskich zasad uktada się jedna nad drugą,, przypominając 2 skręcające się stosy monet przyłożonych bok <Jb boku. Na każdym poziomie 2 stosy są złączone wiązaniami wodorowymi między dwoma monetami z 2 przeciwległych stosów, a także utrzymywane przez 2 prawoskrętne wstęgi owiTabela 37-1. Cechy niektórych struktur DNA Typ Kierunek skrętu

Liczba Odległość par między Średnica zasad sąsiednią heliksu na 1 zwój parą zasad

A

Prawy

11

0,256 nm

2,3 nm

B Z

Prawy Lewy

10 12

Cr,338 nm 0,371 nm

1,9 nm 1,8 nm

jające 2 stosy i reprezentujące szkielet fosfodiesTrówy. Odmianą tej podstawowej struktury jest postać A, której powstaniu sprzyja środowisko nieco niniej uwodnione i o większej liczbie jonów Na+ i K + . Ta prawoskrętna struktura zajmuje więcej miejsca niż postać B, ma więcej par zasad na 1 skręt i przypomina strukturę dwupasmowego RNA i podwójnego hybrydu DNA-RNA. Postacie C—E są także prawoskrętne, obserwuje się je w bardzo swoistych warunkach doświadczalnych i sądzi się, że nie istnieją one in vivo. Formy Z-DNA są podwójnymi lewoskrętnymi heliksami, w których szkielet fosfodiestrowy biegnie zygzakiem („zigzag1") wzdłuż cząsteczki -- stąd nazwa Z-DNA. Z-DNA jest najmniej skręcony (12 pzna 1 zwój), jego heliks ma najmniejszą znaną średnicę i jedynie 1 rowek (p. niżej). Z-DNA egzystują jako sekwencje powtarzających się naprzemiennych deoksynukleotydów purynowych i pirymidy nowych (GC lub AC). lecz wymagają one także warunków stabilizujących. Do warunków stabilizujących zalicza się m.in.: 1) obecność dużego stężenia soli lub swoistych kationów, takich jak spermina lub spermidyna, 2) duży stopień ujemnego skręcenia DNA (p. rozdz. 38), 3) wiązanie białek swoistych dla Z-DNA i 4) zmetylowanie pozycji przy C5 niektórych nukleotydów deoksycytydynowych w sekwencji naprzemiennej. Z-DNA może powodować skutki regulatorowe zarówno~w obszarze proksymalnym, jak i dystalnym w stosunku do swego położenia. Niektóre białka, które wiążą się w mniejszym rowku B-DNAj prawdopodobnie nie mogą się wiązać z postacią Z. W dodatku odwrócenie (rewersja) gostaci Z do postaci B-DNA, zdarzem.6,. które może zajść w następstwie utraty grup metylowych z 5-metylodeoksycytydyny, zachodzi prawdopodobnie wskutek różnic w skręca 1ności DNA w obszarze dystalnym do aktualnego miejsca zajmowanego przez Z-DNA, Jak to będzie omawiane niżej, torsyjne skręcanie i rozkręcanie, jak. też metylacja deoksycytydyny mogą wpływać na aktywność genów. Istnienie Z-DNA wykazano w chromosomach muszki owocowej {Drosophila), posługując się przeciwciałami, które rozpoznają i wiążą się do Z-DNA. Ludzki DNA -ma- regiony, rozproszone w obrębie genomu, stanowiące potencjalne odcinki do utworzenia postaci ZDNA; mogą również istnieć warunki stabilizujące tę postać.

STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH / 447

Denaturacja (topnienie) DNA jest używana do analizy jego struktury Dwupasmowa struktura DNA w roztworze może być "stopiona przez podwyższenie temperatury lub zmniejszenie stężenia solj_ W tym procesie nie tylko 1 pasmu zasad odrywają się od siebie, lecz także same zasady zmieniają płaszczyznę wzajemnego położenia, podczas gdy są one stale jeszcze związane, jako polimer, szkieletem wiązań fosfodiestrowych. Takiej denaturacji cząsteczki DNA towarzyszy zwiększenie optycznej wartości absorpcji zasad purynowych i pirymidynowych; zjawisko to określa się jako efekt hiperchromiczny denaturacji.

Dwupasmowa cząsteczka DNA, dzięki efektowi typu ,,stacking" (oddziaływania między sąsiadującymi parami zasad) i dzięki wiązaniom wodorowym między zasadami, tworzy sztywne twory paJeczkowe; w roztworze ma dużą lepkość, która zmniejsza się po deoaturacji. Podczas denaturacji pasma danej cząsteczki DNA oddzielaja^_się od siebie w pewnym przedztał^Lejn2e_ralury. Punkt środkowy przejścia temperatury nazywa się temperaturą topnieniu.

czyli Tm. ffiactoieJjŁjiależy od składu zasad .. stężenia soli w roztworze. ONA 0 dużej liczbie par G-C, które mają 3 wiązania wodorowe, topią się w wyższej temperaturze niż DNA .o dużej liczbie par A-T, które mają 2 wiązania wodorowe. Dziesięciokrotne zwięk szenie stężenia jednowartościowych kationów powoduje zwiększenie wartości Tm o 16,6°C. Formamid , który jest często używany w do świadczeniach z rekombinowanym DNA, des tabilizuje wiązania wodorowe między zasadami 1przez to zmniejsza wartość Tm. Pozwala to na oddzielenie pasm DNA albo hybrydów DNA-RNA w znacznie niższej temperaturze i mini malizuje pęknięcia pasm, które zachodzą w wy sokich temperaturach.

Cząsteczka DNA ma rowki Szczegółowe badanie modelu DNA, przedstawione na ryc. 37-2, ujawnia rowek większy i rowek mniejszy wijące się wzdłuż cząsteczki równolegle do szkieletu fosfodiestrowego. Białka mogą oddziaływać swoiście z eksponowanymi atomami nuklcotydów (zwykle przez wiązania wodorowe) w obrębie tych rowków i przez to rozpoznawać i wiązać ze swoistymi sekwencjami nukleotydowymi, bez rozrywania sparowanych zasad w dwupasmowej cząsteczce DNA. Jak to omawiano w rozdz. 39 i 41, białka

regulatorowe przez takie oddziaływanie mogą kontrolować ekspresję swoistych genów. DNA istnieje w postaciach zrelaksowanej i silnie skręconej (postać kłębka) W niektórych organizmach, takich jak _bak_Ieikl._w bakteriofagach i licznych wirusach zwierzęcych typu DNA końce cząsteczek DNA wiążą się, tworząc zamkniętą cząsteczkę kolistą

nie mającą końca. To oczywiście nie zaburza polarności cząsteczek, ale eliminuje wolne 3' i 5' grupy hydroksylowe i fosforowe, „Zamknięte cząsteczki koliste istnieją w postaci zrelaksowanej (rozluźnione) i w postaci bardzo skręconej. Nadmierne skręcenia są wprowadzone wow-"fiźas, gdy zamknięta kolista cząsteczka jest skręcona wokół swej własnej osi, lub też gdy jest skręcona cząsteczka linijna dwupasmowego DNA, której końce są zakotwiczone. Ten proces, wymagający energii, wprowadza napięcia do cząsteczki; czym większa iiczba „superskrę-tów" tym większe napięcie, czyli torsja (przetestuj to na gumowej taśmie). Ujemne siinejzwoie tworzą się wówczas, gdy cząsteczka prawo-skrętnego dwupasmowego heliksu, znajdowana w BDNA, jest skręcona w kierunku odmiennym od kierunku wskazówek zegara. Taki DNA nazywa się rozwiniętym. Energia potrzebna do uzyskania tego stanu jest w pewnym sensie zmagazynowana w superskretach. Przejście zatem do innej postaci, które wymaga energii, jest ułatwione przez rozkręcenie. Jednym z takich przejść jest oddzielenie pasm, co jest niezbędne do replikacji DNA i transkrypcji. DNA w postaci superskrętów jest zatem preferowaną postacią istniejącą w układach biologicznych. Enzymy, które katalizują topologiczne zmiany DNA są nazywane topoizomerazami. Topoizomerazy mogą wprowadzać rozluźnienie albo superskręty w cząsteczce DNA. Najlepiej scharakteryzowaną topoizomerazą jest giraza bakteryjna, która wprowadza negatywne superskręty w DNA przy użyciu ATP jako źródła energii. DNA SŁUŻY JAKO MATRYCA DO REPLIKACJI I TRANSKRYPCJI Informacja genetyczna zmagazynowana w sekwencji nukleotydowej DNA służy 2 celom. Jest ona źródiem informacji do syntezy wszystkich cząsteczek białkowych komórki i organiz-

448 / ROZDZIAŁ 37

mu oraz dostarcza informacji dziedziczonej przez komórki potomne i potomstwo. Obie te funkcje stawiają wymóg, że DNA musi służyć jako_matryca w pierwszym przypadku do transkrypcji informacji na RNA, a w drugim do replikacji informacji dla 2 potomnych .cząs teczek DNA. -——— IComplementarność w dwupasmowym modelu DNA Watsona i Cricka silnie sugeruje, że replikacjii DNA zachodzi w sposób semikonserdwupasmowej

STARE

NOWE

STARE

ddż]I~i~aT

p macierzystej cząsteczki DNA oddż]eIa~5ię~aaT ~s"węgo_ komplementarnego pasma w czasie replik acjj, wówczas każde z nich służy jako matryca, na której syntetyzuje się nowe pasmo komplementarne (ryc. 37-4). Dwie wytworzone na nowo dwupasmowe siostrzane cząsteczki DNA* każda zawierająca 1 paSDSP Osompłemen -tarnc..a.nie identyczne) z macierzystej dwupasmn.wej.cząstęczki DN A, są następnie sortowane rmpjlm/ 7 *ifrtoouif komórki frvc 37~51 K.riLżtiTi z komórek potomnych zawiera cząsteczki DNA z informacją identyczną z tą, jaką miała cząsteczka macierzysta. Półzachowawczy (sem i konserwatywny) charakter replikacji DNA^ wykazali jednoznacznie u bakterii Escherichid~~ćdtł~ Meselson i Stahl w klasycznym doświadczeniu, stosując ciężki izotop azotu i techniki wirowania równoważnego. Pod względem chemicznym DNA E. coli jest identyczny z DNA człowieka, choć oczywiście sekwencje nukleotydów różnią się, a ludzka komórka zawiera 1000 razy więcej DNA niż bakteria. Chemia replikacji DNA u prokariontów, takich jak E. coli, jest identyczna z chemią replikacji u eukariontów z ludzkimi włącznie, mimo, że enzymy prowadzące reakcje syntezy DNA są różne. Wszelkie spostrzeżenia odnośnie do natury chemicznych reakcji kwasów nukleinowych u prokariontów bardzo prawdopodobnie stosują się też do eukariontów. Istotnie, doświadczenia Meselsona i Stahla. wykonane na komórkach ssaków, dały wyniki porównywalne do tych, jakie otrzymano przy użyciu E. coli. RNA RÓŻNI SIĘ OD DNA POD WZGLĘDEM WŁAŚCIWOŚCI CHEMICZNYCH Kwas rybo nukleino wy (RNA) jest polimerem złożonym z rybo nukleotydów pury nowych i pirym idy nowych, połączonych między sobą

STARE

NOWE

NOWE

Ryc. 37-4. Dwupasmowa struktura DNA i funkcja matrycowa każdego starego pasma, na której jest syntetyzowane nowe komplementarne pasmo (zaciemnione). (Wg James D. Watson Molecular Biology of the Gene. 3rd ed. Copyright © 1976, 1970, 1965, by W. A. Beniamin, Inc, Menlo Park, Calif)

STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH

Oryginalna cząsteczka macierzysta

Drugie pokolenie cząsteczek stost rżanych Sarn (konserwatywny .. (

Konserwatywny

Pierwsze pokoleń id cząsteczek siostrzanych

Ryc. 37-5. Oczekiwane rozmieszczenie pasm macierzystych DNA w przypadku sem i konserwatywnego i konserwatywnego mechanizmu replikacji. Pasma macierzyste są oznaczone jako linie pełne, pasma syntetyzowane od nowa jako Finie otwarte Mechanizm repiikacji DNA jest semikonserwatywny. (Przerysowane i zreprodukowane za zgodą z: Lehninger A. L: Biochemistry, 2nd ed. Worth, 1975).

prz&z 3', 5; wiązania fosfodiestrowe^.aaalo.giczne da.lych, które występują w DNA (ryc. 37-6). RNA, chociaż ma wiele wspólnych cech z DNA, ma też swoiste różnice: 1. W RNA cząsteczką cukru,,/ którą są związane losforany oraz zasady purynuwe i piryP"^ygfl»fi*i^t.rybyza, a nie 2-deoksyryboza jak _w_DNA. Komponenty pirymidynowe w RNA różnią się od tych, które występują w DNA. Chociaż RNĄ^zawiera rybonukleotydy adeniny, guaniny i cytozyny, to nie zawiera ty miny ,_z wyjąt kiem rzadkiego przypadku wymienionego poni żej. Zamiast tynuny RNA zawiera rybonukleotjd uracylu. RNA występuje jako pasmo pojedyncze, ppdczas_.gdy DNA występuje jako clwupasmowjLcząsteczka helikalna. Jednakże w okreś lonych sekwencjach, zawierających komplemen tarne zasady o odwrotnej polarności, pojedyn cze pasmo RNA, jak to przedstawiono na ryc. 37-7, jest zdolne do zawinięcia się na nim saaiym, tak jak spinka do włosów, przyjmując w ten sposób cechy struktury dwupasmowej. 29 — Biochemia

4.._Ponieważ cząsteczka RNA jest pojedynczym pasmem komplementarnym tylko do 1 z 2 pasm genu, iJość guaniny nie musi się równać ilości cytozyny, ani ilość adeniny nie musi się równać ilości uracylu. 5. RNA może być hydrolizowany przez odczyn zasadowy do 2\ f cyklicznych dicstrów mononukieotydów, związków, które nie powstają po działaniu aa DNA alkaliami, ponieważ DNA nie ma grup 2'-hydroksylowych. Labilność RNA w stosunku do środowiska zasadowego jest użyteczna zarówno dla diagnostyki, jak i dla analizy. Informacja w pojedynczym paśmie RNA jest zawarta w sekwencji nukleotydów puiynowych i pirymidynowych („struktura pierwszorzędowa") w obrębie tego polimeru. Sekwencja £a jest komplementarna do matrycowego pasma genu, z którego była przepisana. Ze względu na tę komplementamość, cząsteczka RNA może się swoiście wiązać według reguły parowania zasad do jej matrycowego pasma DNA; nie będzie się ona wiązała („hybrydyzowała") z drugim (kodującym) pasmem tego genu. Sekwencja cząste-

450 / ROZDZIAŁ 37

NH2

Ryc. 37-6. Segment cząsteczki kwasu rybonukleinowego (RNA), w której zasady purynowe i pirymidynowe — adenina (A), uracyl (U), cytozyna (C) i guanina (G) są utrzymywane razem przez wiązania fosfod i estrowe między resztami rybozylowymi związanymi z zasadami wiązaniami N-glikozydowymi. Zwróć uwagę, że polimer wykazuje polarność oznaczoną przez reszty fosforanowe związane w pozycji 3' i 5'.

czijiJŁNA (z wyjątkiem U, które zastępuje T) jest taka sama, jak kodującego pasma genu (ryc. 37-8). Prawie wszystkie rodzaje z licznych rodzajów RNA są związane z niektórymi aspektami syntezy białek Cząsteczki cytoplazmatycznego RNA, które służą jako matryce do syntezy białek (tj. te, które przenoszą informacje z DNA do ośrodków syntetyzujących białko) są nazwane informacyjnym RNA lub mRNA (ang. messenger

RNA). Liczne inne cząsteczki cytoplazmatycznego RNA (rybosomalny RNA, czyli rRNA)

odgrywają rolę strukturalną przez co biorą udział w tworzeniu rybosomów (system organelli do syntezy białek) alboFsłużą jako cząsteczki łącznika (tRNA) do translacji informacyj-

nego RNA (mRNAj na swoistą sekwencję spo! i mery zo wanych aminokwasów. Znaczna część RNA syntetyzowanego na matrycy DNA w komórkach eukariotycznych, w tym również w komórkach ssaków, jest degradowana w obrębie jądra i nigdy nie służy

jako jednostka strukturalna lub informacyjna w cytoplazmie komórkowej. W komórkach ludzkich istnieją drobnocząs-

teczkowe jądrowe RNA (smali nuclear RNA,

sriRNA), które nie są bezpośrednio włączone w proces syntezy białek, ale odgrywają rolę w przekształcaniu (processing) RNA i budowie komórkowej. Te stosunkowo małe cząsteczki zawierają 90—300 nukleotydów (tab. 37-3). Materiałem genetycznym niektórych wirusów zwierzęcych i roślinnych jest RNA, a nie DNA. Choć niektóre wirusy RNA nigdy nie

STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH /,

Pętla

C —G C —G G —C A—U A—U A —U U G U G C C G-C U —A U —A U C U —A C —

Szypuła

G GC Ryc. 37-7. Schematyczny obraz dru go rzędowej struktury cząsteczki jednopasmowego R MA, w której wytworzyła się szypuła i pętla {struktura spinki do wtosów) wskutek wewnątrzcząsteczkowego parowania zasad.

mają przepisanej swojej informacji na cząsteczki DNA, liczne zwierzęce wirusy RNA — zwłaszcza retrowirusy (np. wirus HIV, czyli AIDS) - są przepisane przez RNA-zależną polimęrazę DNA, tj. tzw. odwrotną transkryptązc na DNA, w wyniku tego powstaje dwupasmowa, kopia DNA genomu RNA. W licznych przypadkach powstający dwupasmowy przepisany DNA jest włączony (integrowany) w genom gospodarza i następnie służy jako matryca do ekspresji genów, z której także mogą być przepisane wirusowe genomy RNA.

RNA jest zorganizowany w kilka unikatowych struktur We wszystkich organizmach prokariotycznych i eukariotycznych istnieją 3 główne klasy RNA: informacyjny RNA (mRNA), transferowy RNA (tRN A) i rybosomalny RNA (rRNA). Każda z tych klas różni się od innych wielkością, funkcją i ogólną stabilnością. Informacyjny RNA (mRNA). Ta klasa RNA jest najbardziej heterogenna odnośnie do wielkości i stabilności. Wszystkie cząsteczki tej klasy funkcjonują jako przenośniki informacji z genu do ośrodków syntetyzujących białko, gdzie każda z nich służy jako matryca, na której poiimeryzują"arńmokwasy w swoistej sekwencji, aby utworzyć swoistą cząsteczkę białkową jako końcowy produkt genu (ryc. 37-9). Informacyjny RNA, zwłaszcza u eukarion-tów, ma niektóre charakterystyczne cechy chemiczne. Koniec 5' cząsteczki mRNA jest opatrzony „czapeczką" („kapturkiem", ang. cap) z.kjżonąz tritosforanu 7-metyloguanozyny, który jest przyłączony do przyległego 2'-O-metylorybomikleozydu do jego grupy 5'-hydroksylowej przez 3 reszty fosforanowe (ryc. 37-10). Cząsteczki mRNA zawierają często wewnętrzne ó-metyloadenylany i inne nietylowane nukleotydy 2'-O-rybozy.,,Czapeczka" prawdopodob ywarolę w rorpo/nanin mRNA prze z nie ądpry a tAkż&pomagaw-stabilizacji mRNA poprzez 5^egzonukleaz. „Maszyneria" syntetyzująca białko rozpoczyna translacje mRNA na białko od końca 5 r , czyli końca z „czapeczką", metylo-wanych nukleotydów. Drugi koniec większości mRNA, koniec 3 -hydroksylowy, ma dołączony polimer zbudowany z 200—250 nukleotydów adenylowych. Swoista funkcja tego „ogona" poli(A) na 3'-hydroksylowym końcu cząsteczek mRNA nie jest w pełni poznana, ale wydaje się, że y niw swoistyrfi mRNA-Chroniąc ppjpd g^kiem

Pasm a DNA: K o d u j ą c e — 5 ' - TAG AG T T G T G A G C G G A T A A C A A T T T C A C A C A G G A A A C A G C T A T G A C C A T G - 3 ' M a t r y c o w e3 - -- A C C T T A A C A C T CC TG AC T T G T T A A A G T G T G T C C T T T G T C G A T A C T G G T A C - 5 ' T ra n s k ryp t RNA

51

p A UU G U G A 6 C G G AA AU C A A U UU C A C A C GA G A A A C A a C U A U G A C C3 ' A U B

Ryc. 37-8. Współzależności między sekwencjami transkryptu RNA i jego genu, w którym pokazano kodujące i niekodujące (matrycowe) pasma oraz ich polarność. Transkrypt RNA o polarności 5' do 3' jest komplementarny do pasma matrycowego o poiarności 3' do 5'. Zwróć uwagę, że sekwencja w transkrypcje RNA i jego poiarność jest taka sama, jak pasma kodującego, z wyjątkiem U w transkrypcie zastępującym T w genie. _______ _______

452 / ROZDZIAŁ 37 DNA

mRNA . 3'

5'. Synteza białek na matrycy mRNA Rybosom

Ryc. 37-9. Ekspresja informacji genetycznej DNA w formie transkryptu mRNA Ten ostatni jest następnie przepisany (translacja) przez rybosomy na cząsteczkę swoistego białka

H,N NH,

Ryc. 37-10. Struktura „czapeczki" dołączonej do końca 5' większości cząsteczek eukariotycznego informacyjnego RNA. Trifosforan 7-metyloguanozyny jest związany z końcem 5' mRNA, który zwykle zawiera nukleotyd purynowyzmetyiowany w pozycji 2 rybozy (nukleotyd 2-0-metylopuryny).

O' STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW NUKLEiNOWYCH / 453

Niektóre cząsteczki mRNA, włączając^? to niektóre mRNA histonów, nie mają poli(A). Ogon poli(A) może tworzyć wią zania na zasadzie parowania zasad z polimera mi oligodeoksytymidyny, związanej ze stałym podłożem, np. celulozą, i dzięki temu może być użyty do oddzielenia cząsteczek mRNA od innych rodzajów RNA. Cząsteczki mRNA cytoplazmy komórek ssakówrwłączając komórki ludzkie, nie są produk -

Ramię - T "* receptorowe •

5'P

Region wiązań wodorowych pomiędzy param! zasad

ię dodatkowe

tami bezpośrednio syntetyzowanymi na mat rycy DNA, ale.sa_ tworzone przez przeksztai■cenkuz.prekursorowej cząsteczki przed wejś ciem do cytoplazmy. W jądrach ssaków bezpo średnie produkty transkrypcji genów stanowią wigc 4. klasę cząsteczek RNA. Te jądrowe cząsteczki RNA są bardzo heterogenne co do wielkości i są całkiem duże. Cząsteczki jądrowegojięteragennegp fiNAihnRNA) mają ma sę cząsteczkową powyżej 10 7, podczas gdy masa cząsteczkowa (MW) cząsteczek mRNA jest na ogól mniejsza niż 2 x 10 6. Jak to przedstawiono w rozdz. 39, cząsteczki h nRNA podiegaja_gbróbce do cząstecze k mRNA. kflóre nast ępnie wnikają do cytoplazmy i służą jako matryce do syntezy białek. RNA transferowy (tRNA). Cząsteczki tRNAskladająsięzok. 75nukleotydów.S.a_aaę j (p. rozdz. 39). Cząsteczki kd li i l b tRNA slużą_JąJ^ft.iaeaM-kt-do translacji in.lbr- iriacjL, zawartej w sekw-encji^ nukleotydow inRNA na swoiste aminokwasy. W każdej komórce istnieje przynajmniej 20 rodzajów czą steczek tRNA i przynajmniej 1 (a często kilka) odpowiada każdemu z 20 aminokwasów po trzebnych do syntezy białka. Chociaż każda swoista cząsteczka tRNA różni się od innych sekwencją nukleotydową, to cząsteczki tRNA jako klasa mają wiele wspólnych cech. Struk tura pjerwszorzędowa, tj. sekwencja nukleoty dową, wszystkich cząsteczek tRNA pozwala na sfałdowanie ich, a wewnątrzcząs teczko wa kom pletne ntarność zasad pozwala wytworzyć drugorzędową strukturę, która jest podobna do .liścia koniczyny (ryc. 37-11). Wszystkie cząsteczki tRNA zawierają 4 głów ne ramiona. Kumie akceptorowe składa sie z szyputy utworzonej ze sparowanych zasad, która kończy się sekwencją CCA (5'-3'). Aminokwasy wiążą się swoimi grupami karboksylowymi przez wiązanie estrowe do grupy 3'-hydroksylowej reszty adenozylowej. Inne ramiona mają „szypuły ze sparowanych zasad i pętle zasad nie p

U \T__?/i— Alkilowa na puryna J M ■ ■ , Ramię antykodonowe Ryc. 37-11. Typowy acylo-tRNA, w którym aminokwas (aa) jest związany 3'-końcową sekwencją CCA, Oznaczono antykodon oraz ramiona T f C i dihydrouracylowe (DHU), jak również pozycję wewnątrecziisteczkowych wiązań wodorowych między parami zasad. (Wg James D. Watson, Molecular Biology of tha Gene, 3rd ed. Copyright © 1976, 1970, 1965, by W. A. Benjamtn, Inc, Menlo Park, Calif.)

sparowanych (ryc. 37-7). Ramię antykodonowe przy końcu szypuly o sparowanych zasadach rozpoznaje tryplet nukleotydow, czyli kodon (omówiono w rozdz. 40) matrycy mRNA. Ma ono sekwencję nukleotydow komplementar nych do kodonu i jest odpowiedzialne za swois tość tRNA. Ramię D zostało tak nazwane dzięki obecności zasady dihydrourydyny, a ramię T f C ze względu na obecność sekwencji T, pseudonrydyny i C. podatkowe ramie jest naj bardziej zmienną cecną tRNA i stanowi pod stawę do klasyfikacji cząsteczek tRNA. Klasa ljtŁKA (_ok. 75% wszystkich tRŃA) ma dodat kowe ramię długości 3 —5 pz. Klasa 2 tRNA ma dodatkowe ramię długości 13—21 pz i często strukturę typu szypuła-pętla. Drugorzędową strukturę cząsteczek tRNA utrzymują sparowane zasady w tych ramio-

454 / ROZDZIAŁ 37 Tabela 37-2. Części składowe rybosomów ssaków Komponent Białko Masa cząsteczkowa Liczba Masa

40 S pod jednostka 60 S podjednostka

1,4* 106 2,8 x 10s

35 50

7 x 1 05 1x-|0 6

RNA Wielkość

Masa cząsteczkowa

Liczba zasad

18 S 5 S 5,8 S 28 S

7x1 0! 35000 45000 1,6*10 fl

1900 120 160

4700

Podjednostki rybosomalne są określone stosownie do ich szybkości sedymentacji w jednostkach Svedberga (40 S lub 60 S). W tabeli przedstawiono całkowitą masę cząsteczkową każdej z nich. Pokazano również: liczbę unikatowych białek i ich całkowitą masę cząsteczkową, składowe RNA każdej podjednostki, ich wielkość (w jednostkach Svedberga), masę cząsteczkową i liczbę zasad.

nach, stanowiąc stałą cechę tRNA. Ramię akceptorowe ma 7 pz, ramiona T f C i antykodonowe — 5 pz, a ramię D3 (lub 4) pz. Chociaż tRNA są trwale u prokariontów, u eukariontów są one nieco mniej trwałe. Odwrotnie jest z mRNA, który jest nietrwały u prokariontów, ale na ogół trwały w organizmach eukariotycznych.

Rybosomalny RNA (rRNA). Rybosom

jest iiukleoproteinowa sH^^lurfl flylppla7matyczną, iiójra funkcjonuje jako „maszyneria" do syntezy białek na matrycach mRNA. Na rybosomacb cząsteczki mRNA i tRNA współdziałają w procesie translacji na swoiste cząsteczki białek informacji przepisanej uprzednio z genu. Składowe komponenty rybosomu ssaków, który ma masę cząsteczkową ok. 4,2 x \06 i szybkość sedymentacyjną 80 S (jednostek Svedberga) przedstawiono w tab. 37-2. Rybosom ssaków zawiera 2 główne podjednostki nukleoproteinowe, większą o masie cząsteczkowej 2,8 x 10s (60S) i podjednostkę mniejszą o masie cząsteczkowej 1.4 x 106 (40S). Podjednostka 60S zawiera 5S rybosomalny RNA {rRNA), 5,8S rRNA i 28S rRNA; znajduje się tam także ponad 50 swoistych polipeptydów. Mniejsza podjednostka, czyli podjednostka 40S, zawiera pojedynczą cząsteczkę 18S rRNA oraz ok. 30 łańcuchów poiipeptydowych. Wszystkie cząsteczki rybosomalnego RNA, z wyjątkiem 5S rRNA, pochodzą z przekształcenia na terenie jądra pojedynczej prekursorowej cząsteczki 45S RNA (p. rozdz. 40). Cząsteczka 5S rRNA ma także swoją własną cząsteczkę prekursorową, która jest niezależnie przepisywana. Cząsteczki

rybosomalnego RNA, w dużym stopniu zmetylowane, są na terenie jąderka upakowane wraz ze swoistymi białkami rybosomalnymi. W cytoplazmie rybosomy są dość trwale i zdolne do wejścia w wiele cykli transiacyjnych. Funkcje RNA w rybosomie ^j^^jg

y

nie są w pełni poznane, lecz są one niezbędne do uformowania struktury rybosomu i zdają się mieć kluczową rolę w wiązaniu mRNA do rybosomów i w jego translacji. Mało cząsteczkowe trwałe RNA. W komórkach eukariotycznych znajdują się w dużej ilości dyskretne, ewolucyjnie zachowywane, małocząstęczkowe, trwałe rodzaje RNA. Większość tych cząsteczek egzystuje w postaci rybonukleoprotein i są one rozmieszczone w jądrze, w cytoplazmie albo w obu tych częściach komórki. Mają one od 90—300 nukleotydów Tabela 37-3. Niektóre rodzaje mat o cząsteczkowych, trwałych RNA występujących w komórkach ssaków Nazwa

Długość (nukleotydów)

U1 U2 U3 U4 U5 U6

165 188 216 139 118 106

Liczba cząstecze k w komórce U10 6 5*10= 3* 105 1 * 10s 2* 10B 3*10 !

4,5 S 7S 7-2 7-3

91-95 280 290 300

3*10* 5*10= 1*10E 2*10s

Umiejscowienie N u kleopi azma/ hn R N A Nukleoplazma Jądro Nukleoplazma Nukleoplazma Ziarnistości perictiromatynowe Jądro i cytoplazma Jądro i cytoplazma Jądro i cytoplazma Jądro

STRUKTURA I FUNKCJA KWASÓW N U KLE IM OWYCH / 455

i występują w komórce w liczbie 100000- -1000000 kopii. Małe jądrowe cząsteczki rybonukleoprotein,

często nazywane ,,sniirps" mogą mieć znaczenie w regulacji genów. Cząsteczka U7 wydaje się odgrywać rolę w wytworzeniu prawidłowego końca 3' w histonowym mRNA. Cząsteczki U4 i U6 mogą być potrzebne przy obróbce poli(A), a cząsteczka Ul jest włączona w wycinanie intronu i obróbkę mRNA (p. rozdz. 39). W tabeli 37-3 przedstawiono niektóre cechy małocząsteczkowych trwałych RNA.

38

PIŚMIENNICTWO lluni T: DNA Makes RNA Miiko Protein. Ełsewier, 1983. Rich A et al: The chemistry and biology of left-handed Z-DNA. Anrtu Rev Biochem 1984;53:847. Turner Pr Con trolli ng roi es for snurps. Naturę !985;31ó:105. Wa(son JD: The Doubk Helix. Atheneum, 1986. Watson JD, Crick FHC: Molecular structure of nucleic acids. Naturę 1953;171:737. Zieve GW: Two groups of smali stable RNAs. Celi 1981;25:296.

Organizacja i replikacja DNA Dary/ K. Granner, MD

WPROWADZENIE W organizmach prokariotycznyćh DNA jest na ogół nie związany z białkami innymi niż te, które są związane z replikacja i transkrypcją DNA, W organizmach eukariotycznych duża część DNA jest pokryta różnymi białkami. Białka te i DNA tworzą chromatynę, złożoną strukturę, która umożliwia liczne konfiguracje cząsteczki DNA i takie rodzaje kontroli, które są unikatowe dla organizmu eukariotycznego. Informacja genetyczna DNA chromosomu może być przekazywana przez wierną replikację (DNA), lub też może podlegać wymianie w licznych procesach, takich jak „crossing over", rekombinacja i konwersja. Procesy te zabezpieczają zdolność do adaptacji i warunkują różnorodność organizmu, aie mogą także prowadzić do powstania procesu chorobowego. Rephkacja DNA, proces bardzo złożony i uporządkowany, postępuje zgodnie z pokrnością 5' do 3' typową dla syntezy RNA opisanej w innych rozdziałach. W komórkach eukariotycznych replikacja DNA w chromosomach zaczyna się w licznych miejscach i postępuje jednocześnie w obu kierunkach. Do syntezy i naprawy DNA, procesów postępujących według reguły parowania zasad Watsona i Cricka, potrzebne są liczne enzymy.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Mgtacje są wynikiem zmian w sekwencji zasad DNA. Mutacje mogą nastąpić w wyniku nieprawidłowej replikacji, przefitie|SZ£d Łab iiaprawy DNA i zachodzą z częstością ok. 1 na każdych 106 podziałów komórkowych. W wyniku mutacji, które zachodzą w kodujących lub regulatorowych regionach DNA, powstaje nie-

prawidłowy produkt genu^ Mutacja w obrębie komórki rozrodczej będzie przeniesiona na potomstwo (jest to tzw. pionowe przeniesienie choroby dziedzicznej). Liczne czynniki, obejmujące wirusy, związki chemiczne, promieniowanie nadfioletowe i promieniowanie jonizujące zwiększają tempo mutacji. Mutacje dotyczą komórek somatycznych i są. przenoszone na następne generacje komórek w obrębie organizmu. Jest oczywiste, że wiele chorób i prawdopodobnie większość nowotworów złośliwych powstaje wskutek horyzontalnej transmisji mutacji.

CHROMATYNA JEST MATERIAŁEM CHROMOSOMALNYM Z JĄDER KOMÓREK ORGANIZMÓW EUKARIOTYCZNYCH * _ak)a.da. się z bardzo długich dwupasmow-ych cząsteczek DNA i prawie równej masy małych białek zasadowych, zwanych htstonunik jak również z mniejszej ilości niehistonowych (większość z nich są to białka kwaśne i większe niż histony) uiiaiejiklŚsiRNA. Badania chromatyny przy zastosowaniu mikro-

* Tak daleko, jak to jest możliwe, dyskusja w tym rozdziale oraz w rozdz. 39, 40 i 41 będzie się odnosiła do ssaków, które należą oczywiście do wyższych organizmów eukariotycznych. W pewnych przypadkach będzie konieczne odnosić się do spostrzeżeń poczynionych na organizmach prokariotycznych, takich jak bakterie i wirusy. W tych przypadkach będą to także informacje, które mogą być ekstrapolowane na ssaki. Podział materiału przedstawionege w rozdz, 37—41 jest cokolwiek arbitralny, a opisane procesy nie powinny być odbierane jako procesy niezintegrowane i wzajemnie niezależne.

ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 457

skopu elektronowego wykazafy zbite, kuliste cząsteczki, zwane nukleosomami, które mają ok. 10 nm średnicy i są powiązane pasmami DNA (ryc. 38-1). ----.""

Ryc. 38-1. Zdjęcie z mikroskopu elektronowego nukleosomów przywiązanych do nici kwasu nuk(einowego (DNA), (Biały odcinek odpowiada 2,5 nm.) (Reprodukowane za zgodą z: Oudet P, Gross-Beliard M., Chambon P.: Electron microscopic and biochemical evidence that chromaiin structure is a repeating unit Celt 1975; 4:281)

Histony są najbardziej obfitymi białkami chromatyny Jlistony-^są nieco heterogenne, składają się z wielu blisko spokrewnionych białek. Wśród histonów najsłabiej związane z chromałyrtą są histony HI i dlatego są łatwo usuwane roztworem soli, w wyniku czego chromatyna staje się rozpuszczalna. Wyizolowany rdzeń nukleo-.somów zawiera 4 klasy histonów: H2A, H2B, H3 i H4. Struktura słabo lizy nobogatych histonów — H2A i H2B — jest w znacznym stopniu zachowywana (konserwowana) między gatunkami, podczas gdy struktura arginino--bogatych histonów — H3 i H4 — jest ściśle zachowywana między gatunkami. Takie silne zachowywanie nasuwa wniosek, że czynność histonów jest identyczna we wszystkich komórkach eukanotycznych i że cała cząsteczka (histonu) jest włączona swoiście w pełnienie takiej funkcji. 2/3 końca C cząsteczek histonów ma zwykły skład aminokwasów, natomiast1 /3 koń-

ca N ma większość aminokwasów zasadowych. Wymienione 4 histony rdzenia nuklcosoniu podlegają 5 rodzajom modyfikacji w reakcjach kowalencyjnych: acety lacji, metylacji, fos fory lacji, ADP-rybożylaćji i związaniu .kowalencyjnemu (wyłącznie histonu H2A) z jądrowym białkiem ubikwityną. Te modyfikacje histonów zapewne odgrywają pewną mało jeszcze poznaną rolę w strukturze ehromatyny i w jej czynności. Histony usunięte z ehromatyny oddziaływają wzajemnie w bardzo swoisty sposób.Jrj3JJ34, agregują, tworząc tetramer zawierający po 2 czą5iecAi każdego z nich (H3/H4)2, podczas gdy H2A i H2B tworzą, dimery (H2A-H2B) i wyższe kompleksy oligomerów (H2A-H2B)n. W małym stężeniu soli tetramer H3-H4 nie asocjuje z dimerem lub oligomerem H2A-H2B, a Hl nie łączy się wprost z innymi histonami w roztworze. NukJeosom jest strukturą zawierającą h i stan i DNA Gdy tetramer H3-H4 i dimer H2A-H2B są zmieszane z czystym dwupasmowym DNA, wówczas obserwuje się ten sam wzór dyfrakcji promieni X, jak w świeżo izolowanej chromatynie. Badania w mikroskopie elektronowym potwierdzają obecność zrekonstruowanych nukleosomów. Rekonstrukcja nukleosomów z DNA i histonów H2A, H2B, H3 i H4 nie zależy od tego, czy różne te komponenty pochodzą z tych samych komórek. Do rekonstrukcji rdzenia nukleosomu nie są potrzebne ani histonHl, ani białka niehistonowe. W nukleosomie DNA jest dodatkowo nawinięty, jako lewoskrętny heliks, na powierzchni podobnego do dysku oktameru histonów, składającego się z tetrameru H3-H4 (H3/H4)2 zajmującego część centralną nukleosomu i 2 dimerów H2A-H2B (ryc. 38-2). Histony rdzenia nukleosomu oddziaływają z DNA na wewnętrznej powierzchni superzwoju. Sam tetramer (H3/H4)2 narzuca DNA właściwości podobne do tych, jakie ma cały nukleosom; tetramer odgrywa przeto główną rolę w tworzeniu nukleosomu. Dodanie 2 dimerów H2A-H2B stabilizuje pierwotną cząsteczkę i wiąże silnie 2 dodatkowe półskoki spirali DNA, uprzednio jedynie luźno związane do tetrameru (H3/H4)3.1,75 saperhelikalnego zwoju DNA owija się więc wokół powierzchni oktameru histonu, chroniąc 146 par zasad DNA i tworząc rdzeń aukleosotnti (ryc. 38-2). Gdy DNA owija się wokół powierzchni oktameru

458 / ROZDZIAŁ 38

-H1 O klamer 148 par zasad chrohistorio wynionych (1,75 zwoju superbelikalnego} + H1 166 par zasad (2 skręty superhetikalne) chronione □raz eksponowany (niechroniony) DNA łącznikowy

Ryc. 38-2. Model struktury nukleosomu {nalewo) i części rdzennej nukleosomu (na prawo), w których DNA jest owinięte wokół powierzchni płaskiego cylindra białkowego składającego się z 2 cząsteczek każdego z histonów H2A, H2B, H3 i H4. Histon H1 (obszar zaciemniony) powoduje zwiększenie liczby chronionych par zasad. (Reprodukowano za zgodą z: Laskey R. A., Earnshaw W. C: Nucleosome assembly. Nawre 1980, 286:763).

histonu, tworząc nukleohiston, kolejność kontaktu cząsteczki DNA z histonami zachodzi w następującym porządku: H2A—H2B—H4—H3—H3—H4—H2B—H2A

Histon Hl wiąże się. z DNA wówczas, gdy cząsteczka DNA wchodzi i wychodzi z rdzenia nukleosomu w taki sposób, że łączy 2 zwoje superspirali DNA długości 166 par zasad, tworząc nukleosom (ryc. 38-2). Formowanie nukleosomów jest prawdopodobnie wspomagane przez kwaśne białko jądrowe nukleoplazminc. Mocne zasadowe histony mogą wiązać silnie kwaśny DNA przez tworzenie mostków typu soli. Oczywiście takie nieswoiste oddziaływania histonów z DNA byłyby destrukcyjne dla tworzenia nukleosomów i funkcji chromatyny. Niikleoplazmina jest pentamerem kwaśnego białka, które nie wiąże się ani z DNA, ani z chromatyną, ale może oddziaływać odwracalnie z oktamerem histonowym w taki sposób, że histony nie mogą przylegać nieswoiście do ujemnie naładowanych powierzchni, takich jak DNA. Wydaje się zatem, że nukjeopiazmina utrzymuje w iadrze środowisko jonowe, prowadza^e_(io-siw)isiego_oddziaływariv& histonów i DNA oraz tworzenia nukleosomów. Gdy zostaje .utworzona. struktura~~ńukleosomu, nukleoplazmina zostaje uwolniona z histołłów. Nukieosomy wykazują preferencję do pewnych regionów na szczególnych cząsteczkach DNA, ale podstawa takiego nieprzypad-

kowego rozmieszczenia nukleosomów, zwanego fazowaniem, nie jest znana. Prawdopodobnie jest to związane ze względną fizyczną giętkością pewnych sekwencji nukleotydowych, które są zdolne do przyjęcia formy załamanej (kinking) w obrębie superspirali. Dalsze upakowanie nukleosomów w jądrach jest zależne od interakcji histonów Hl z dwupasmową cząsteczką DNA wiążącą nukieosomy. Topologia oddziaływania dwupasmowego DNA z histonami Hl, z wytwarzaniem regionów przerywników między nukleosomami, nie jest bliżej poznana.

STRUKTURY WYŻSZEGO RZĘDU DECYDUJĄ O UPAKOWANIU CHROMATYNY Chromatyną badana za pomocą mikroskopu elektronowego wykazuje, oprócz struktury samych nukleosomów, 2 struktury wyższego rzędu: nić chromatynową 10 nm i 25- 30 nm. Struktura podobna do dysku nukleosomu ma średnicę 10 nm i wysokość 5 nm. Nić 10 nm składa się z nukleosomów ułożonych w taki sposób, że ich brzegi się spotykają, a ich płaskie powierzchnie leżą równolegle do osi nici (ryc. 38-3). Nić 10 nm jest prawdopodobnie dodatkowo skręcona, tworząc 30 nm nić chromatynową o 6—7 nukleosomach na 1 skok (ryc. 38-3). Każdy zwój superspirali jest względnie płaski, a powierzchnie nukleosomów następujących po Oś włókna Włókno 30 nm

Ryc. 38-3. Włć kro 10 nm

Proponowana struktura 30 nm włókna chromatyny, składającego się z 10 nm' włókna nukleosomatnego dodatkowo skręconego. Oś 30 nm włókna jest prostopadła do płaszczyzny papieru.

ORGANIZACJA I REFLIKACJA DNA / 459

sobie skrętów są prawie równolegle jedna względem drugiej. Histony Hl wydają się stabilizować nić 30 nm, ale ich pozycja i pozycja przerywnika DNA o różnej długości nie zostały jeszcze zdefiniowane. Jest możliwe, że nukleosomy mogą tworzyć różne upakowane struktury. Aby wytworzyć chromosom mitotyczny 30 nm nić musi ulec dalszemu, ok. 100-krotnemu, upakowaniu swojej długości (p. niżej). W chromosomach interfazowycti nici chromatyny są zorganizowane w pętle lub jlomeny ,p długości 30000 100 000 par zasad zakotwiczone w jądrze w strukturze szkieletowej (lub macierzy podporowej). W obrębie tych domen niektóre sekwencje DNA mogą być umiejscowione w sposób nieprzypadkowy. Sugeruje się, że każda wypętlona domena chromatyny odpowiada oddzielnej funkcji genetycznej zawierając zarówno kodujące, jak i niekodujące regiony genu. NIEKTÓRE REGIONY CHROMATYNY SĄ „AKTYWNE"; INNE REGIONY SĄ „NIEAKTYWNE" Ogólnie każda komórka indywidualnego organizmu wielokomórkowego zawiera tę samą informację genetyczną w postaci takich samych sekwencji DNA. Zatem różnice między różnymi rodzajami komórek w obrębie jednego organizmu mogą być wytłumaczone zróżnicowaną ekspresją wspólnej informacji genetycznej. Chromatyna zawierająca geny aktywne (tj. chromatyna aktywna transkrypcyjnie) różni się pod wieloma względami od regionów nieaktywnych. Struktura nukleosomalna aktywnej chromatyny jest zmieniona lub w bardzo aktywnych regionach jest jej brak. DNA w aktywnej chromaty_nie zawiera obszerne regiony (długości ok. TOOOOO par zasad), które są wrażliwe na trawienie iiuklca/ą. taką jak DNaza I. Wrażliwość regionów chromatyny na DNazę I, które są aktywnie transkrybowane, odzwierciedla raczej tylko potencjał dla transkrypcji niż samą transkrypcję, a w wielu systemach jest skorelowana ze względnym brakiem 5'-metylodeoksycytydyny w DNA. W obrębie dużych regionów aktywnej chromatyny" istnieją krótkie odcinki o 100—300 nukleotydach, które wykazują nawet większą {20-krotną) wrażliwość na DNazę I. Te miejsca nadwrażliwe prawdopodobnie wynikają z konformacji strukturalnej, która sprzyja dostępno-

Jdnukkazy-DN A, Regiony te są zwykle umiejscowione bezpośrednio przed aktywnym genem i w regionach tych struktura nukleosomalna jest przerwana w wyniku związania białek niehistonowych (p. rozdz. 39 i 41). Wydaje się, że w wielu przypadkach, gdy gen jest zdolny do transkrypcji, musi on mieć nadwrażliwe miejsce w chromatynie w regionie bezpośrednio poprzedzającym gen. Białka biorące udział w transkrypcji oraz białka zaangażowane w utrzymaniu dostępu do matrycowego pasma DNA biorą udział w powstawaniu miejsc nadwraż-liwych. Miejsca nadwrażliwe często dostarczają pierwszej wskazówki odnośnie do obecności i umiejscowienia elementu kontrolującego transkrypcję. Chromatyna nieaktywna transkrypcyjnie jest w interiazle gęsto upakowana, co można stwierdzić przy użyciu mikroskopu elektronowego. Nazywa sieją heterochromatyną. Chromatyna aktywna" transkrypcyjnie wybarwia się jako substancja mniej gęsta i określa się ją jako euchromatyne. Euchromatyna replikuje się zwykle wcześniej w cyklu komórkowym ssaków niż heterochromatyną (p. niżej). Są 2 typy heterochromatyny: konstytutywna i fakultatywna, Heterochromatyną konstytutywna jest zawsze upakowana, a "więc jest nieaktywna. Heterochromatyne konstytutywną znajduje się w regionach w pobliżu centromeru i w końcach chromosomów (w telomerach). He ter ochrom atyoa fakultatywna jest niekiedy skondensowana, ale kiedy indziej jest aktywnie przepisywana, a. więc nieskondensowana i mająca wygląd euchromatyny. Spośród 2 żeńskich chromosomów X u ssaków 1 chromosom jest prawie całkowicie nieaktywny transkrypcyjnie i jest chromosomem heterochromatycznym. Jednakże heterochromatyczny chromosom X ulega dekondensacji w okresie gametogenezy j staje się aktywnym transkrypcyjnie we wczesnej embriogenezie; tak więc jest to chromosom o fakultatywnej heterochromatynie. Niektóre komórki insektów, np. Chironomus, zawierają chromosomy olbrzymie, które uległy replikacji w 10 cyklach, ale siostrzane chromatydy nie oddzieliły się. Kopie DNA leżą jedna obok drugiej w precyzyjnym układzie i w rezultacie tworzą chromosom prążkowany, zawierający regiony chromatyny skondensowanej i jasne prążki chromatyny bardziej rozproszonej. Transkrypcyjnie aktywne regiony tych chromosomów politenicznych o silnie rozluźnionej budowie tworzą „pufy" zawierające enzymy

460 / ROZDZIAŁ 38

Bp-

Ryc. 38-4. Korelacja między aktywnością polimerazy RNA klasy II a syntezą RNA. U larwy Chironomus tentans wiele genów aktywuje się pod wpływem szoku cieplnego (39X, 30 min). A: Rozmieszczenie RNA polimerazy B (zwanej także klasą II) w izolowanym IV chromosomie ślinianki. Enzym uwidoczniono przez immunofluorescencję, stosując przeciwciało przeciw pohmerazie. Swoiste prążki w chromosomie IV oznaczono symbolami 5C i BR3; pufy pokazuje strzałka, B: Auto radiogram chromosomu IV po inkubacji z 3H-urydyną w celu wyznakowania RNA. Zwróć uwagę na zgodność fiuorescencji z obecnością radioaktywnego RNA (punkty). Odcinek skali =7 \im (Reprodukowano za zgodą z: Sass H.: RNA polymerase B in potytene chromosomes. Celi 1982; 28:274. Copyright © 1982 by the Massachusetts Instituteof Technology).

odpowiedzialne za transkrypcję; są to miejsca, gdzie przebiega synteza RNA (ryc. 38-4).

DNA JEST ZORGANIZOWANY W POSTACI CHROMOSOMÓW W met a fazie chromosomy ssaków wykazują 2-osiową symetrie z identycznymi siostrzanymi chromatydami połączonymi w centromerze, którego względne położenie jest charakterystyczną cechą danego chromosomu {ryc. 38-5). Każda siostrzana diromatyda zawiera cząsteczkę dwupasmowego DNA, W czasie Lnterfazy upako-

Ryc. 38-5. Dwie siostrzane chromatydy ludzkiego chromosomu Nr12. * 27,850. (Reprodukowanoza zgodą z: DuPraw E. J.: DNA and Chromosomes. Holt, Rinehart, and Winston, 1970).

wanie cząsteczki DNA jest mniej zbite niż w skondensowanym chromosomie metafazowym. Chromosomy metafazowe są nieaktywne transkrypcyjnie. Ludzki genom haploidalny skiada się z 3,5 x 10° par zasad, czyli par nukleotydów i ok. 1,7 x 107 nukleosomów. Zatem każda z 23 chromatyd w ludzkim genomie haploidalnym zawiera średnio 1,5 x 10B nukleotydów w jednej dwupasmowej cząsteczce DNA. Długość każdej cząsteczki DNA musi być zredukowana ok. 8000 razy, aby się wytworzyła struktura skondensowanego chromosomu interfazowego! W chromosomach, metafazowych 25— 30 nm nici chromatynowe są także sfałdowane w upetlone domeny, których proksymalne końce są zakotwiczone do niehistonowego białkowego rusztowania. Stopień upakowania każdego rzędu struktury DNA jest podsumowany w tab. 38-1. Upakowanie nukleoprotein w obrębie chromatyd nie jest przypadkowe, o czym świadczy charakterystyczny wzór po wybarwieniu chro-

ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 461 Tabela 38-1. Współczynniki upakowania każdego rodzaju struktur DNA Współczynnik Postać w chrnmatynie upakowania 1,0

„Nagi" dwupasmowy heliks DNA

1-10

10 nm nić nukleosomalna 25—30 nm nić chromatynowa zawierająca superhelikalne nukleosomy

40-60

Skondensowane pętle chromosomów rnetafazowych

8000

mosomów swoistymi barwnikami, takimi jak kwinakryna lub barwnik Giemsy (ryc. 38-6). Wzór wybarwiania (prążkowania) całego zestawu chromosomów od osobnika do osobnika w obrębie jednego gatunku jest wysoce powtarzalny; niemniej różni się on znacznie od innych, nawet blisko spokrewnionych, gatunków. Upakowanie nukleoprotein w chromosomach wyższych organizmów eukariotycznych musi być w jakiś sposób zależne od gatunkowo swoistych cech cząsteczek DNA.

WIĘKSZA CZĘŚĆ GENOMU SSAKÓW NIE JEST TRAlMSKRYBOWANA Genom haploidaJny każdej komórki ludzkiej składa się z 3,5 x 10a par zasad DNA podzielonych na 23 chromosomy. Cały genom haploidalny składa się z DNA wystarczającego na zakodowanie ok. 1,5 min par genów. Jednakże badania nad tempem mutacji i złożonością genomów organizmów wyższych wybitnie sugerują, że u ludzi występuje tylko ok. 100000 rodzajów podstawowych białek. To nasuwa wniosek, że większość DNA nie jest DNA kodującym, czyli zawarta w nim informacja nie jest nigdy tłumaczona na sekwencje aminokwasów cząsteczki białkowej. Z pewnością pewien nadmiar sekwencji DNA służy do regulacji ekspresji genów w czasie rozwoju, różnicowania i adaptacji do środowiska. Pewien nadmiar tworzą sekwencje wtrącone, które rozdzielają kodujące regiony genu, ale większość nadmiaru sekwencji składa się z wielu rodzin sekwencji powtarzających, którym nie przypisuje się jeszcze jasno określonych funkcji. DNA eukariotycznego genomu może być

i 10

\7

11

19 t * 14 • > «

* 20

■

*

16

21

1 7

4 % 22

Ryc. 38-6. Ludzki kariotyp (człowieka z normalnym zestawem 46 XY), w którym chromosomy wybawiono barwnikiem wg metody Giemsy i ułożono stosownie do Konwencji Paryskiej (Dzięki uprzejmości H. Ławce i F. Conte),

462 / ROZDZIAŁ 38

podzielony na różne „klasy sekwencji". S4 to: sekwencje unikatowe, czyli niepowtarzające DNA i sekwencje DNA powtarzające, W genomie haploidalnym unikatowe sekwencje DNA zawierają zwykle pojedyncze kopie genów kodujących białka. Sekwencje powtarzające DNA w genomic haploidalnym zawierają sekwencje, które zmieniają się odnośnie do liczby kopii od 2 aż do 107 kopii na 1 komórkę. Ponad połowę DNA w organizmach eukariotycznych stanowią sekwencje unikatowe, czyli niepowtarząjące Dane szacunkowe (jak również rozmieszczenie powtarzających DNA) są oparte na licznych technikach hybrydyzacji DNA-RNA. Podobne techniki są stosowane do określenia liczby aktywnych genów w populacji unikatowych sekwencji DNA. W drożdżach, niższym organizmie eukariotycznym. występuje ekspresja ok. 4 000 genów. W typowych tkankach wyższych organizmów eukariotycznych (np. wątroba i nerka ssaków), ekspresji ulega 10 000-15 000 genów. Regiony kodujące są często przerywane sekwencjami wtrąconymi Kodujące regiony DNA, z których transkrypty ostatecznie pojawiają się w cytoplazmie jako pojedyncze cząsteczki mRNA, są zwykle poprzerywane w gen omie dużymi sekwencjami wtrąconymi niekodującego DNA. Wskutek tego pierwotne transkrypty DNA-hnRNA zawierają niekodujące sekwencje RNA, które muszą być usunięte w takim procesie, w którym także zachodzi wzajemne połączenie odpowiednich segmentów kodujących z wytworzeniem dojrzałego mRNA. Większość sekwencji kodujących pojedynczy mRNA jest poprzerywanych w genomie (a zatem i w pierwotnym transkrypcie) przynajmniej przez 1, a w niektórych przypadkach aż przez 50 niekodujących sekwencji wtrąconych (introny). W większości przypadków introny są znacznie dłuższe niż przyległe regiony kodujące (eksony). Obróbkę pierwotnego transkryptu, która obejmuje zabranie in tron ów i połączenie przyległych eksonów, opisano szczegółowo w rozdz. 39. Funkcja sekwencji wtrąconych, czyli iDtronów nie jest jasna. Mogą one służyć do rozdzielenia domen funkcjonalnych (eksonów) zakodowanej informacji w takiej postaci, która pozwala, aby rearanżacje genetyczne przez rekombinację

przebiegały szybciej niż w przypadku, gdyby wszystkie regiony kodujące dla danej funkcji genetycznej były w postaci ciągłej. Takie zwiększone tempo rearanżacji genetycznej funkcjonalnych domen może prowadzić do szybkiej ewolucji funkcji biologicznych. W ludzkim DNA przynajmniej 20—30% genomu składa się z sekwencji powtarzających Powtarzające sekwencje DNA mogą być ogólnie sklasyfikowane jako umiarkowanie powtarzające i często powtarzające. Często powtarzające sekwencje składają się z odcinków o długości 5—500 par zasad, powtórzonych wiele razy w postaci tandemu. Sekwencje te są zwykle zgrupowane w centromerach i telomerach chromosomu i występują w ok. 1—10 min kopii w genomie haploidalnym. Sekwencje te są transkrypcyjnie nieaktywne i mogą odgrywać w chromosomie rolę strukturalną. Umiarkowanie powtarzające sekwencje, które występują w genomie w liczbie mniejszej niż 106 kopii na genom haploidalny, nie są zgrupowane, lecz rozproszone wśród sekwencji unikatowych i są klasyfikowane jako krótkie lub długie. Długie sekwencje rozproszone mają długość 5000—7000 par zasad i występują w genomie haploidatnym w liczbie 1000—100000 kopii. Te długie rozproszone sekwencje są otoczone z każdego końca przez sekwencje powtórzone wprost (ang, direct repeats) o 30O—600 parach zasad (ryc. 38-7), które bardzo przypominają długie końcowe sekwencje powtarzające (ang. long terminal repeats, LTR) występujące na końcach zintegrowanych DNA retrowirusów, W wielu przypadkach te długie sekwencje rozproszone

abc

Dtugie rozproszone sekwencja powtarzające (5 - 7tyslęcypar zasad) abc a'b'c*

a'b'c'

Sekwencje -powtarzająceproste (300 -60G par zasad)

Ryc. 38-7. Obraz długich rozproszonych sekwencji powtarzających z końcowymi krótkimi prostymi sekwencjami powtarzającymi (abc) i ich sekwencjami komplementarnymi (a'b'c').

ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 463

są transkrybowane przez potimerazę U i zawierają „czapeczki metylacyjne" nieodróżnialne od tych zawartych w mRNA. Krótkie sekwencje powtarzające tworzą rodzi-

ny spokrewnionych, ale indywidualnie różnych, sekwencji o długości od kilku do kilkuset par nukleotydów. Krótkie sekwencje powtarzające są aktywnie przepisywane albo jako integralne składowe intronów, albo jako dyskretne elementy przepisywane przez DNA-zależną polimerazę RNA III (p. rozdz. 39). Wśród krótkich rozproszonych sekwencji powtarzających w genomie ludzkim rodzina Alu występuje w 500 000 kopii na genom haploidalny i stanowi przynajmniej 3—6% ludzkiego genomu. Składowe ludzkiej rodziny Alu i ich spokrewnione analogi u innych zwierząt są przepisywane jako integralne komponenty hnRNA lub jako dyskretne cząsteczki RNA, zawierające dobrze poznane 4,5S RNA i 7S RNA. Jednostki należące do tych szczególnych rodzin są bardzo konserwatywne w obrębie gatunków, jak również w obrębie gatunków ssaków. Struktury krótkich sekwencji powtarzających, włączając w to rodzinę Alu, przypominają końcowe sekwencje powtarzające retrowirusów i mogą być elementami przemieszczającymi się, zdolnymi do „przeskakiwania" z różnych miejsc do innych w obrębie genomu (p. niżej).

MATERIAŁ GENETYCZNY MOŻE PODLEGAĆ ZMIANOM I MOŻE ULEGAĆ REARANŻACJI Zmiany sekwencji zasad purynowych i pirymidynowych w genie spowodowane zamianą, ubytkiem lub insercją jednej lub więcej zasad mogą prowadzić do zmienionego produktu genu, którym to produktem w większości przypadków jest białko. Taka zmiana materiału genetycznego daje mutację, której następstwa będą omawiane dokładnie w rozdz. 40. Rekombinacja chrom os o ma I na jest jedną z dróg rearanżacji materiału genetycznego Organizmy prokariotyczne i eukariotyczne wykazują zdolność wymiany informacji genetycznej między podobnymi, czyli homologicznymi, chromosomami. Zdarzenie wymiany, czyli rekombinacja, zachodzi przede wszystkim w okresie mejozy w komórkach ssaków i wymaga równoległego ustawienia homologicznych

Ryc. 38-8. Proces rekombinacji (crossing over) między homologicznymi chromosomami prowadzący do powstania rekombinantów chromosomowych.

chromosomów, co prawie zawsze zachodzi z wielką precyzją. Na rycinie 38-8 pokazano, jak przebiega proces ,,crossing-over". Wynikiem tego procesu jest równa i wzajemna wymiana informacji genetycznej między homologicznymi chromosomami. Jeśli homologiczne chromosomy mają różne allele łych samych genów, crossing-over może spowodować zauważalne i dziedziczne różnice w sprzężeniu genów. W rzadkich przypadkach, gdy ułożenie homologicznych chromosomów nie jest dokładne, crossing-over lub zdarzenie rękombinacyjne powodują nierówną wymianę informacji. Jeden z chromosomów może otrzymać mniej materiału genetycznego, a zatem może mieć delecje, podczas gdy drugi

464 / ROZDZIAŁ 38

LEPORE

Ryc. 38-9. Proces nierównoważnej rekombinacji w regionie genomu ssaków generujących geny strukturalne dia hemoglobiny i powstawanie nierównoważnych produktów rekombinacji 8-6 Lepore i 0-5 Lepore. Przykłady pokazują miejsca regionów, w których zaszła rekombinacja, (Reprodukowane za zgodą z: Clegg J, B., Weetherall D, J.: |3S Thalassemia: Time for a reappraisal? Lancet 1974; 2:133).

partner pary chromosomów otrzymuje więcej materiału genetycznego w postaci dołączenia lub podwojenia (ryc. 38-8), Nierówny crossing-over występuje u ludzi, na co wskazuje obecność hemoglobin typu Lepore lub anty-Lepore. Nierówny crossing-over oddziałuje na tandemową organizację powtarzających DNA czy to będą np. spokrewnione geny globiny, jak na ryc, 38-9, czy bardziej liczne powtarzające sekwencje DNA. Nierówny crossing-over, powtarzający w wyniku „poślizgu", powoduje zwiększenie lub zmniejszenie liczby kopii rodziny sekwencji powtarzających i może mieć udział w ekspansji i utrwalaniu wariantów w obrębie tego uporządkowanego obszaru. Niektóre wirusy mogą być włączone w chromosomy Niektóre wirusy bakteryjne (bakteriofagi) są zdolne do rekombinacji z DNA bakteryjnego gospodarza w taki sposób, że informacja genetyczna bakteriofaga zostaje wbudowana linijnie do genetycznej informacji gospodarza. Ta integracja, która jest formą rekombinacji, zachodzi w mechanizmie pokazanym schematycznie na ryc. 38-10, Struktura kolistego genomu bakteriofaga zostaje przerwana, podobnie jak cząsteczka DNA gospodarza; odpowiednie końce są ponownie spojone z zachowaniem polarności. W celu uproszczenia, DNA bakteriofaga jest pokazany jako cząsteczka wyciągnięta („linijna") w postaci zintegrowanej w cząsteczce bakteryjnego DNA; często pozostaje ona również jako zamknięte koło. Miejsce, w którym genom bakteriofaga integruje, czyli rekombinu-

je, 7. genomem bakteryjnym jest wybrane przez 2 mechanizmy. Jeśli bakteriofag zawiera sekwencje DNA homologiczne do sekwencji cząsteczki DNA gospodarza, to może zajść zdarzenie rękombinacyjne analogiczne do zdarzenia, jakie zachodzi między homologicznymi chromosomami. Jednakże niektóre bakteriofagi syntetyzują białka, które wiążą swoiste miejsca

I

I

I

=t

ć. 38-10. Integracja kołowego genomu (zawierającego geny A, B i C) z cząsteczką DNA gospodarza (zawierającą geny 1 i 2) i następujące ubożenie genów.

ORGANIZACJA I BEPLIKACJA DNA / 465

w chromosomach bakteryjnych z niehomologicznymi miejscami określonej cząsteczki DNA bakteriofaga. Integracja taka zachodzi w określonym miejscu i nazywa się „miejscowo swoista". Liczne wirusy zwierzęce, zwłaszcza wirusy onkogenne, albo bezpośrednio, albo w przypadku wirusów RNA przez transkrypty DNA, mogą być integrowane w chromosomy komórek ssaków. Integracja DNA wirusów zwierzęcych do genomu zwierzęcego na ogół nie jest „miejscowo swoista". Transpozycja może wytwarzać „przekształcone geny" W komórkach eukariotycznych małe elementy DNA, które na pewno nie są wirusami, mają zdolność do transpozycji, czyli opuszczania i włączania się w obręb genomu gospodarza, w taki sposób, że funkcja sąsiadujących sekwencji DNA zostaje naruszona. Te ruchome (mobilne) elementy, są czasami nazywane „skaczącym DNA", mogą nieść ze sobą flankujące odcinki DNA i przeto mogą głęboko wpływać na procesy ewolucji. Jak wspomniano wyżej, rodzina Alu średnio powtarzających sekwencji DNA ma charakterystyczne cechy strukturalne, podobne do odcinków końcowych retrowirusów, które u tych ostatnich s4 odpowiedzialne za włączanie i opuszczanie genomu ssaków. Bezpośrednim dowodem na transpozycję innych małych elementów DNA w genomie człowieka było odkrycie „przekształconych genów" dla cząstek i mm un o globuliny, cząsteczek a-globiny i wielu innych. Te przekształcone geny składają się z sekwencji DNA identycznych lub prawie identycznych do tych, jakie znajdują się w informacyjnym RNA kodującym produkt odpowiedniego genu, W takich sekwencjach DNA, nietranskrybowany region 5', region kodujący bez intronu i 3' sekwencja (poli)A są ułożone w sposób ciągły. Takie szczególne ułożenie sekwencji DNA musiało powstać przez wsteczną traskrypcję przekształconej cząsteczki informacyjnego RNA, z której zostały zabrane regiony intronowe i dodany szlak (poIi)A. Jedynym poznanym mechanizmem, który mógł być użyty do integracji odwrotnego transkryptu do genomu jest zdarzenie typu transpozycji. Istotnie, takie „przekształcone geny" mają krótkie końcowe sekwencje powtarzające przy każdym ze swych końców, podobnie jak sekwencje, które uległy transpozycji u niższych organizmów. Niektóre z tych przekształconych genów 30 — Biochemia

w trakcie ewolucji zostały przypadkowo zmienione tak, że obecnie mają nonsensowne kodony, które uniemożliwiają ekspresję tych genów (p. rozdz. 40). Geny takie określa się nazwą „pseudogeny". Konwersja genu powoduje rearanżację Oprócz nierównego ,,crossing-over" i transpozycji, trzeci mechanizm może wpływać na gwałtowne zmiany w materiale genetycznym. Podobne do siebie sekwencje na homologicznych lub niehomologicznych chromosomach mogą przypadkowo wytwarzać miedzy sobą sparowane struktury dwupasmowe i eliminować wszystkie sekwencje niesparowane. Proces ten może prowadzić do przypadkowego utrwalenia w rodzinie sekwencji powtarzających jednego lub drugiego wariantu i przez to powodować, że sekwencje składowe rodzin powtarzającego DNA stają się jednolite. Ten ostatni proces nazywany jest konwersją genu.

W diploidalnych organizmach eukariotycznych, takich jak ludzie, komórki, które przeszły przez fazę S, zawierają tetraploidalną ilość DNA. Występuje ona w postaci siostrzanych chromatyd w każdej parze chromosomów. Każda z tych siostrzanych chromatyd zawiera identyczną informację genetyczną, ponieważ każda z nich jest produktem semikonserwatywnej replikacji oryginalnej macierzystej cząsteczki DNA tego chromosomu. Między tymi genetycznie identycznymi siostrzanymi chromały dam i zachodzi crossing-over. Oczywiście takie wymiany siostrzanych chromatyd (ryc. 38-11) nie

mają konsekwencji genetycznych tak długo, jak długo wymiana jest wynikiem równego crossing-over. W komórkach ssaków w czasie prawidłowego rozwoju lub różnicowania zachodzą niektóre interesujące rearanżację genów. Na przykład u myszy geny VL i CL dla pojedynczej cząsteczki immunoglobuliny (p. rozdz. 41) są w germinalnej linii DNA oddalone od siebie. W DNA komórek zróżnicowanych wytwarzających immunogiobulinę (komórki plazmatyczne) te same geny VL i CL fizycznie zbliżyły się do siebie w obrębie genomu i utworzyły 1 jednostkę transkrypcyjną. Jednak nawet wówczas taka rearanżacja DNA w czasie różnicowania nie spowodowała ciągłego ułożenia genów VL i CL w cząsteczce DNA. Zamiast tego w cząsteczce DNA są zawarte rozproszone, czyli wtrącone, sekwencje o długości ok. 1200 par zasad w miej-

466 / ROZDZIAŁ 38

Ryc, 38-11. Wymiany siostrzanych chromatyd między ludzkimi chromosomami Wymiany wykryło przez barwienie wg Giemsy chromosomów komórek, które miały 2 cykie replikacji w obecności bromodeoksyurydyny. Strzałki pokazują niektóre regiony wymian (Dzięki uprzejmości S Wolff i J. Sodycote).

scu lub sąsiedztwie połączenia regionów V i C. Te wtrącone sekwencje są przepisane na RNA wraz z genami VL i CL, a sekwencje wtrącone zostają usunięte z RNA w czasie jego przekształceń w obrębie jądra (p. rozdz. 39 i 49). SYNTEZA I REPLIKACJA DNA SĄ ŚCIŚLE KONTROLOWANE adaniem., replikacji DNA jest dostarczenie potomstwu mformagi genetycznej zawartej w"cząsteczćemaderzyslej. Repiikacja DNA musi więc być kompletna i przeprowadzona z dużym stopniem wierności, aby utrzymać stabilność genetyczną w obrębie organizmów i

gatunków. Proces replikacji DNA jest złożony i obejmuje wiele funkcji komórkowych i wiele procesów weryfikacyjnych, gwarantujących wierność replikacji. Arthur Kornberg dokonał pierwszych obserwacji enzymologicznej repli-

kacji DNA u Escherichia coli, a następnie opisał występowanie w tym organizmie enzymu, nazwanego obecnie polimerazą DNA I. Ten enzym ma liczne aktywności katalityczne, złożoną strukturę i powinowactwo do trifosforanów 4deoksyrybonukleozydów adeniny, guaniny, cytozyny i tyminy. Reakcja polimeryzacji katalizowana przez polimerazę DNA I u £ colt służyła jako prototypowa reakcja dla wszystkich polimeraz DNA zarówno u organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych, choć obecnie wiadomo, że główna rola tej polimerazy polega raczej na zachowaniu wierności i udziale w procesach naprawczych niż na replikacji DNA. Inicjacja syntezy DNA wymaga zapoczątkowania przez RNA Inicjacja syniezy pNA (ryc. 38-12) wymaga zapoczątkowania przez krótkie fragmenty RNA. o długości ok. 10—200 nukleotydów.

■

Dołączanie pierwszego dNTP Ryc. 38-12. Inicjacja syntezy DNA na primerze RNA i następujące dołączenie drugiego trifosforanu deoksyrybonukleotydu

Dołączanl edrugteg

_ ft/> - ^/W

0

ri" H N* *H OH H

0

'

■

468 / ROZDZIAŁ 38

Proces zapoczątkowania obejmuje atak nukleofilowy grupy 3'-hydroksylowej primera j
czki DNA, stosownie do reguły zaproponowanej pierwotnie przez Watsona i Cricka (ryc. 38-13). Gdy w odpowiednim miejscu .na matrycy jest; umiejscowiona cząsteczka monofos-fJ ks vrv bonuk leozy du adeniny, włącza

się trifosforan tymidyny w rosnącym nowym p^mSy- a jego reszta cc-tostóranowa będzie atakowana pr?e7 grupę .1'-hydroksyl ową monofbsforami deoksyrybonukleraydujwiężo dodanego do polimeru. Przez ten stopniowy proces ęasmo matrycowe dyktuje, który trifosforan deoksyrybonukleozydu jest komplementarny i prze? wiązania wodorowe utrzymuje go w miejscu, podczas gdy grupa 3'-hydroksyiowa rosnącego pasma atakuje i powoduje inkorporację nowego nukleotydu do polimeru. Te fragmenty DNA, które zostają dołączone do cząsteczki inicjującego RNA, zostały wykryte przez Okazaki i nazywane są obecnie fragmentami Okazaki (ryc. 38-14). U ssaków, gdy powstanie wiele fragmentów Okazaki, kompleks replikacyjny zaczyna usuwać primery RNA i uzupełniać ubytki powstałe przez ich usunięcie odpowiednimi deoksynukleotydami, dobieranymi przez

Prlmar RNA

Rosnący polimer DNA

Dołączanie TTP

Ryc. 38-13. Synteza DNA inicjowana przez primer RNA ilustrująca funkcję matrycową komplementarnego pasma macierzystego DNA.

O R G A N IZ A C J A i R E P L 1 K A C JA D N A /46 9 OMA matrycowy 3' ; 5' Primer RNA

Nowo syntetyzowane pasmo ONA

lOpz

10 pz 100 pz-----------H h—H

Fragmenty Okazak!R yc. 38-14. N ieciągła polimeryzacja deoksyrybonukleozydów i tw orzenie fragm entów OkazakL

parowanie zasad, a następnie łączenia fragmentów nowo zsyntetyzowanych. DNA przez enzymy zwane iiga/ami DNA. Proces replikacji jest polarny Jak już wspomniano, cząsteczki DNA są dwupasmowe i 2 pasma są przeciwrównoległe, tj. biegną w przeciwnych kierunkach. Replikacja..X>NA u prokariontów i eukariontów zachodzi równocześnie na obu pasmach. Jednak w żadnym organizmie nie ma enzymu zdolnego polimeryzować DNA w kierunku 3' do 5' tak, że oba nowo replikujące pasma DNA nie mogą wydłużać się równocześnie w tym samym kierunku. Niemniej len sam enzym prowadzi replikacle obu pasm w tym samym czasie.JEajfc dyngsy-enzym-replikuje Jedno pjtsnio („pasmo wLadące-")_w_spasób ciągły w kierunku 5' do 3'. tj. w tym samym kierunku replikacji. Taki sam enzym prowadzi implikację siostrzanego pasma Gipftsmfi.opóźnione") w sposób nieciągly polimeryzując nukleotydy w krótkich odcinkach 150—250 nukleotydów znowu w kierunku 5' do 3', ale w tym samym czasie synteza biegnie w kierunku tylnego końca poprzedzającego primera RNA, a nie w kierunku mozreplikowanej części cząsteczki. Taki proces połowicznej

nietiąglej syntezy DNA jest pokazany schematycznie na ryc. 3&-15. W jądrowym genomie ssaków większość primerów RNA jest usuwanych w trakcie procesu replikacji, podczas gdy w replikacji mitochondrialnego genomu mak odcinki RNA pozostają jako integralna część zamkniętych kołowych struktur DNA. Polimeryzacja i naprawianie DNA wymaga licznych enzymów W komórkach ssaków istnieje klasa polimeraz DNA, zwana polimerazą et, która znajduje się w jądrze i jest odpowiedzialna za replłkację chromosomów. 1 cząsteczka polimerazy a jest zdolna polimeryzować 100 nukleotydów na sekundę; jest to tempo 10-krotnie mniejsze niż tempo polimeryzacji deoksynukleotydów przez bakteryjną polimerazę DNA. To zmniejszenie tempa polimeryzacji może być wynikiem oddziaływań nukleosomów. Nie wiadomo, jak polimeraza DNA pokonuje nukleosomy w procesie replikacji DNA. Jednak po zreplikowaniu DNA budujące się nukleosomy są rozmieszczone przypadkowo na każdej z nici siostrzanych. Nowo zsyntetyzowane rdzenie histonów, w postaci oktameru, dołączają się do drugiego

Początek repllkacjl

3' 51

-5' -31

Ogólny kierunek replikacjiR yc. 38-15. Proces pótciągtej i jednoczesnej repltkacji obu pasm dw upasm ow ego DNA.

470 / ROZDZIAŁ 38 Początek replikacji

.Bańka replikaoyjna"

Białka rozwijające u nasady widełek repllkacyjnych

reputacji

Ryc. 38-16. Powstawanie „baniek replikacyjnych" w procesie syntezy DNA. Przedstawiono replikację w obu kierunkach i proponowane pozycje białek rozwijających w widełkach replikacyjnych.

pasma w miarę posuwania się widełek replikacyjnych. Poiimeraza o mniejszej masie cząsteczkowej, tzw. poiimeraza p\ występuje także w jądrach komórek ssaków, ale nie jest odpowiedzialna za zwykłą replikację DMA. Może ona służyć w procesach naprawczych DNA (p. niżej). Mitochondrialna poiimeraza DNA, poiimeraza 7, jest odpowiedzialna za replikację miJochondrialnego genomu, innej cząsteczki DNA, która istnieje w postaci kolistej. Cały genom ssaków replikuje się w ciągu 9 h — okres potrzebny do utworzenia tetraploidalnego genomu z genomu diploidalnego w replikującej komórce. Proces ten wymaga obecności licznych miejsc zapoczątkowania re-

plikacji DNA, które tworzą zgrupowania zawierające ok. 100 takich jednostek replikacyjnych. Replikacja przebiega w obu kierunkach wzdłuż chromosomu i oba pasma są replikowane jednocześnie. Taki proces replikacji wytwarza „ba-

wodorowe swoich zasad nukleotydów wiąże wprowadzane trifosforany deoksynukleozydów. Oddzielenie dwupasmowego heliksu DNA osiąga się przez cząsteczki białka, które stabilizują strukturę je d no pasmową w miarę posuwania się widełek replikacyjnych. Te białka stabilizujące wiążą się stechiometrycżnie"~do_ pojedynczych pasm, nie zaburzając jednocześnie zdolności nukleotydów do pełnienia ich funkcji matrycowych (ryc. 38-17). Aby uzyskać oddzielenie pasm, opróc2 rozdzielenia 2 pasm podwójnego heliksu, musi zachodzić proces rozkręcenia cząsteczki (raz na każde 10 par nukleotydów). Biorąc pod uwagę czas, w którym musi zajść replikacja DNA, proces rozkręcenia musi zachodzić segmentami. We wszy-

ńki replikacyjne" (ryc. 38-16).

Liczne miejsca, które służą jako początki replikacji DNA w komórkach eukariotycznych, są słabo określone, wyjątek stanowią niektóre wirusy zwierzęce i drożdże. Jest jasne, że inicjacja jest regulowana zarówno w przestrzeni, jak i czasie, ponieważ zgrupowania przyległych miejsc rozpoczynają replikację w sposób zsynchronizowany. Sugeruje się, że funkcjonalne domeny chroma tyny replikują jako pełne jednostki, co nasuwa wniosek, że początki replikacji są umiejscowione swoiście w odniesieniu do jednostek transkrypcji. W czasie replikacji DNA*2,pasma muszą być od siebie oddzielone, aby każde z nich mogło służyć jako matryca, która poprzez wiązania

Ryc. 38-17. Hipotetyczny schemat działania białka wiążącego jednopasmowe sekwencje DNA w re gionie widełek replikacyjnych. Po związaniu jednopasmowych regionów matrycy i ułatwieniu replika cji białko podlega recyklizacji. (Dzięki uprzejmości B. Albertsa).

ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 471

stkich organizmach istnieją liczne obrotowe widełki ,,swivels" rozproszone w cząsteczkach DNA. Mechanizm funkcji „swivels" polega na działaniu swoistych enzymów, które wprowadzają przerwy w 1 paśmie rozkręcającego się podwójnego heliksu, co umożliwia postępowaniau>rocesu rozkręcania heliksu. Przerwy są szybko-ponownie spajane bez nakładu energii, ponjewiti. tworzy się jednocześnie wysokoenergetyczne, .wiązanie kowalencyjne między przerwanym wiązaniem fosfodiestrowym a enzymem wykazującym aktywność przerywania I spajania pasma (ang. nicking-sealing enzyme). finzymy takie są nazwane topoizomerazami DNA. Proces ten jest przedstawiony schematyStopień 1

cznie na ryc. 38-15: i porównany do ATP-zależnego procesu spajania prowadzonego przez ligazy DNA. Topoizomerazy są także zdolne do rozkręcania superzwinietęgo DNA. Superzwinięty DNA jest strukturą wyższego rzędu kolistych cząsteczek DNA skręconych wokół środka, jak to pokazano na ryc. 38-19. W jednym gatunku wirusów zwierzęcych £re.trowirusy) istnieje klasa enzymów zdolnych do syntezy jednopasmowej, a następnie dwupasmowej cząsteczki DNA z jednopasmowej matrycy RNA. Ta polimeraza, RNA-zależna polimeraza DNA, czyli „odwrotna transkryptaza" syntetyzuje najpierw hybrydową cząsteczkę DNA-RNA, wykorzystując genom RNA jako

Topolzomeraza I DNA

Ligaza DNA E + ATP = E (AMP-Enzym)

Nacięcie O 3' pojedynczego pasma przez M enzym

Sioplen 2

Tworzenie wiązania wysokoenergetycznego

Istniej E}ce nacięcie Jednego pasma

Stopień 3

Naprawione nacięcie

Naprawione nacięcie

Ryc. 38-18. Porównanie 2 typów reakcji naprawiania nacięć w DMA Ciąg reakcji po stronie prawej jest katalizowany DNA ligazą; reakcje po stronie lewej topoizomerazą I DNA. (Nieco zmodyfikowane i zreprodukowane za zgodą Lehninger A. L: Biochemistry. 2nd ed, Worth, 1975). _______________________________________________________________________________

472 / ROZDZIAŁ 38 Ryc. 38-20. Cyk) komórkowy w komórkach ssaków. Faza syntezy DNA (faza S) jest oddzielona od mitozy przez przerwę Gf (gap 1) i przerwę G2 (gap 2). Strzałka wskazuje kierunek progresji cyklu.

Mitcza

Ryc. 38-19. Superzwoje DNA. Lewoskrętny solenoidalny superzwój (na lewo) i forma odwrócona, prawoskrętny wewnętrznie zwinięty superzwój powstający po usunięciu cylindrycznego rdzenia. Takie przekształcenie jest analogiczne do tego, które zachodzi po rozerwaniu nukleosomów w wyniku ekstrakcji histonów z chromatyny dużymi stężeniami soli.

matrycę. Swoisty enzym, RNaza H degraduje pasmo RNA, a pozostałe pasmo DNA służy z kolei jako matryca do utworzenia dwupasmowej cząsteczki DNA zawierającej informacje istniejącą pierwotnie w genomie RNA zwierzęcego wirusa. Synteza DNA zachodzi w czasie fazy S cyklu komórkowego W komórkach zwierzęcych, włączając także komórki ludzkie, replikacja DNA genomu zachodzi tylko w określonym czasie życia komórki. C2as ten jest nazwany okresem syntezy albo fazą g. Okres ten jest zwykle czasowo oddzielony od fazy mitotycznej przez okresy, w których nie zachodzi synteza DNA określanych jako przerwa 1 (ang. gapi - - Gi) i przerwa 2 (ang. gap2 — G:), które mają miejsce odpowiednio przed i po fazie S (ryc. 38-20). Komórka reguluje syntezę swego DNA, głównie przez dopuszczenie procesu syntezy tylko

w określonych czasach, a synteza DNA zachodzi głównie w komórkach przygotowujących się do podziału w procesie mitozy. Regulacja wejścia komórki w fazę S obejmuje cykliczne nukleotydy purynowe i prawdopodobnie substraty do syntezy DNA, ale mechanizm ten nie jest znany. Liczne wirusy wywołujące nowotwory (onkowirusy) są zdolne zmienić lub przerwać ograniczenia, które zwykie kontrolują wejście komórki ssaków z fazy Gi do fazy S. Ten mechanizm także nie jest poznany, ale prawdopodobnie obejmuje fosforylację swoistych cząsteczek białek gospodarza, W czasie fazy S komórki ssaków zawierają większe ilości polimerazy a DNA niż w niesyntetyzujących fazach cyklu komórkowego. Dalej, enzymy, które są odpowiedzialne za wytworzenie substratów do syntezy DNA, tj. trifos fora nów deoksyrybonukleozydów, zwiększają także swoją aktywność, która zmniejsza się po fazie syntezy, aż do ponownego pojawienia sie sygnału do ponowienia syntezy DNA. W czasie fazy S jądrowy DNA jest replikowany kompletnie raz i tylko raz. Wydaje się, że raz zreplikowanachromatyna jest tak „naznaczona", że jej dalsza replikacja jest niemożliwa do momentu, aż przejdzie ona ponownie przez okres mitozy. Sugeruje się, że metylacja DNA może służyć jako taki kowalencyjnie związany znacznik. Zwykle dana para chromosomów replikuje równocześnie i w określonej części fazy S w każ-

ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 473

dym cyklu replikacyjnym. W obrębie chromosomu zgrupowania jednostek replikacyjnych są replikowane w sposób skoordynowany. Natura sygnałów, klóre regulują syntezę DNA na tych poziomach, nie jest znana, ale regulacja wydaje się być wewnętrzną właściwością każdego indywidualnego chromosomu. Uszkodzony DNA jest naprawiany przez enzymy Utrzymanie integralności informacji w cząsteczkach DNA jest problemem o największym znaczeniu dla przeżycia poszczególnego organizmu, jak i przeżycia gatunków. Stąd można wyciągnąć wniosek że gatunki, które przeżyły, wytworzyły w procesie ewolucji mechanizm do naprawiania uszkodzeń DNA, zachodzących w wyniku błędów replikacyjnych lub ujemnych wpływów środowiskowych. Określono, że uszkodzenia w czasie replikacji DNA lub indukowane środowiskowo powodują średnio 6 zmian nukleotydów na rok w komórkach linii rozrodczej jednego osobnika. Przypuszczalnie przynajmniej taka sama liczba zmian nukleotydowych, czyli mutacji, musi zachodzić w ciągu roku również w komórkach somatycznych. Jak to opisano w rozdz. 37, główna odpowiedzialność za wierność replikacji leży w swoistym parowaniu zasad nukleotydów. Odpowiednie parowanie zależy od obecności preferowanych postaci tautomerycznych nukleotydów purynowych i p i rym idy nowych (p. ryc. 35-7), ale równowaga, w której jeden tautomer jest bardziej stabilny niż inny, wynosi tylko 104 lub 10s na korzyść tautomeru o większej stabilności. Chociaż wielkość ta nie jest wystarczająco korzystna, aby zapewnić wymaganą wierność, faworyzowanie wybranych tautomerów, a zatem odpowiednie parowanie zasad, może być zapewnione przez 2-krotne monitorowanie procesu parowania 2asad. Takie podwójne monitorowanie zachodzi zarówno w systemach bakteryjnych, jak i systemach komórek ssaków: po raz pierwszy w trakcie włączania trifosforanów deoksyrybonukleozydów, a później przez ponowną kontrolę i mechanizm wymagający energii, który usuwa wszystkie nieprawidłowe zasady, które mogą się pojawić w nowo wytworzonym paśmie. Ten podwójny proces monitorowania nie pozwala na powstanie błędów z nieodpowiedniego parowania zasad z powodu obecności niefaworyzowanych tautomerów z częstością większą niż raz na każde 108 —101 ° par zasad. U E, coli cząsteczką

odpowiedzialną za taki mechanizm monitorowania jest aktywność egzonukleazowa 3'-»5' „wbudowana"' w polimerazę DNA, ale polimerazy DNA ssaków nie mają takich korekcyjnych właściwości nukleazowych. Taką funkcję naprawczą sprawują inne enzymy. Uszkodzenia DNA, wywołane przez czynniki środowiskowe, fizyczne i chemiczne, mogą być sklasyfikowane jako 4 typy (lab. 38-2). Uszkodzone regiony DNA mogą być naprawione, wymienione przez rekombinację lub zachowane. Zachowanie regionów uszkodzonych prowadzi do mutacji i jest potencjalną przyczyną śmierci komórki. Proces naprawy i wymiany korzysta z faktu powielenia informacji w dwupasmowej heliksalnej strukturze DNA. Uszkodzony region w jednym paśmie może być przywrócony do swej postaci oryginalnej na podstawie komplementarnej informacji zachowanej w paśmie nie uszkodzonym. Kluczem do wszystkich procesów naprawczych i rekombinacyjnych jest początkowe rozpoznanie uszkodzenia i albo naprawienie go w czasie tego rozpoznania, albo oznakowanie go do naprawienia w przyszłości. Depurynacja DNA, która zachodzi spontanicznie dzięki termolabilności wią-zania N-glikozydowego puryn, zachodzi z prędkością 5000—10000 na komórkę na dobę w temp. 37°C. Swoiste enzymy rozpoznają miejsca depurynowane i zaTabefa 38-2. Rodzaje uszkodzeń DNA I. Zmiana 1 zasady A. Depurynacja B. Deaminacja cytozyny do uracylu C. Deaminacja adeniny do hipoksantyny D. Alkilacja zasady E. Insercjo lub delecja nukleotydu F. Inkorporacja analogu zasady II. Zmiana 2 zasad A, Powstanie dimeru tymina-tymina induko wane promieniowaniem nadfioletowym B. Wiązanie poprzeczne dwufunkcyjnym czynnikiem alkilującym III. Pęknięcie łańcucha A. Promienie jonizujące B. Rozpad wiązań losfodiestrowych pod wpływem radioaktywności [V. Wiązania poprzeczne A. Między zasadami tego samego pasma lub pasm przeciwległych B. Między DNA i cząsteczkami białka (np. histony)

474 / ROZDZIAŁ 38

stępują je odpowiednimi purynami bezpośrednio bez przerwania wiązań fosfodiestrowych. WDNA zasady, cytozyny i adeniny ulegają spontanicznej deaminacji z wytworzeniem odpowiednio uracylu i hipbicsantyny, Ponieważ ani uracyl ani hipoksantyna w warunkach prawidłowych nic występują w DNA, nie jest zaskoczeniem, że swoiste N-glikozydazy mogą rozpoznawać te nieprawidłowe zasady i usuwać je z DNA. Takie usunięcie zasad stanowi oznakowanie miejsca wady i pozwala endonukleazie apurynowej lub apirymidynowej naciąć odpo-

wiednio szkielet pasma w pobliżu uszkodzenia. Następnie kolejne działania egzonukleazy, naprawczej polimerazy DNA i ligazy przywracają DNA jego stan oryginalny (ryc. 38-21). Ta seria zdarzeń ma nazwę naprawa przez wydęcie.

W podobnych seriach procesów, obejmujących pierwotnie rozpoznane uszkodzenia, mogą być usuwane z DNA alkilowane zasady i analogi zasad, a cząsteczka DNA jest przywracana do jej pierwotnej treści informacyjnej. Naprawa insercji lub delecji nukleotydowych zachodzi zwykle przez mechanizmy rekombinacyjne z równoczesną replikacją lub bez replikacji. Promieniowanie nadfioletowe indukuje wy-

tworzenie dimerów pjrymidyna-pirymidyna. głównie dimerów 2 przyległych tymin w tym samym paśmie (ryc. 38-22). Istnieją 2 mechanizRyc. 38-22. Dimer tym i na-tymi na utworzony po-

D-Ryboza

A T C G G C T t ł A T C C G A T 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MI M A T A G C C G A G T G G C T A i

Energia cieplna

H3C D-ftyboza

A T C G G C T U A T C C G A T

1 1 1 1 1 1 ! 1 1 1 1 1 1 1 1 T A G C C G A G T A G G C T A

przez wiązania typu cyklobutanu między po-tożonymi w sąsiedztwie resztami tyminy DNA.

DNA-GLIKOZYDAZA URACYLOWA A T C G G C T U A T C C G A T

MMI I !

1 1M1 M

T A G C C G A G T A G G C T A NUKLEAZY

A T C G G C

T C C G A T

II II M

MI MI

T A G C C G A G T A G G C T A i

POLIMERAZA DNA + LIGAZA DNA

A T C G G C T U A T C C G A T

II M II II M I M II T A G C C G A G T A G G C T A

Ryc. 38-21. Naprawa ONA przez wycinanie. En zym DNA-glikozydaza uracylowa usuwa uracyl powstały podczas spontanicznej deaminacji cyto zyny w DNA. Endonukleaza przecina wiązanie fosfodiestrowe w pobliżu miejsca uszkodzenia; następ nie, po usunięciu przez endonukleazę kilku zasad, ubytek jest uzupełniony dzięki.działaniu polimerazy naprawczej i pasmo jest ponownie spojone przez ligazę (Dzięki uprzejmości B. Albertsa) _______________________________________

my usunięcia lub naprawienia takich Jirnerów tymina-tymina. Jeden z nich to mechanizm typu naprawa przez wycięcie, analogiczny do opisanego wyżej, a drugi mechanizm p_ol_ega na fotoreaktywacji światłem widzialnym swoistego

enzymu, który bezpośrednio in situ przekształca wytworzony dimer do 2 monomerów. Pęknięcia w pojedynczym paśmie, indukowane przez promienie jonizujące, mogą być naprawiane przez bezpośrednie spojenie lub przez rekombinację. Mechanizmy odpowiedzialne za naprawę wiązań „poprzecznych" między zasadami przeciwległych pasm dwupasmowego heliksu DNA lub między DNA i cząsteczkami białek są słabo poznane. Uszkodzenia wywołane promieniami jonizującymi i przez alkilacje są zwykle naprawiane przez wycięcie i resynteze krótkich odcinków. Uszkodzenia promieniowaniem nadfioletowym i poprzeczne wiązania miedzy pasmami sa naprawiane przez wycięcie i resynteze większych

ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 475

odetrtk&w DNA^W komórkach ssaków replikacja naprawcza może być obserwowana jako nieprogramu warta synteza DNA, tj. inkorpora

cja prekursorów DNA (radioaktywnej tymidyny) do DNA w okresie, w którym komórka nie jest w fazie S. — Zwiększonej aktywności typu wycięcie—naprawa, jako reakcji na czynniki uszkadzające ONA, towarzyszy w komórkach ssaków zwiększona aktywność enzymu polimerazy poli (ADP-rybozy). Enzym ten do ADP-rybozylacji chroma ty ny wymaga koenzymu NAD+. Dodajejjn głównie cząsteczkę mono(ADP-rybozy), nie, w pewnym stopniu także homopolimerowy łańcuch ADP-rybozy. Nie jest jasne, jaką funkcję w procesie wycięcia—naprawy pełni polimeraza poli{ADP-rybozy} lub jej produkt (ADP-ryboza). Istnieje czasowa zależność między zwiększoną aktywnością naprawczą i zwiększeniem aktywności swoistego enzymu. W dodatku zahamowanie enzymu swoistymi inhibitorami zapobiega spojeniu złamanych nici DNA. Zwiększenie aktywności polimerazy poli (ADP-rybozy) wydaje się być reakcją na fragmentację DNA w jądrze. Taka fragmentacja może być indukowana pierwotnie przez czynniki fizyczne, takie jak promieniowanie X, lub wtórnie przez mechanizmy nacinające DNA jako reakcja na inne czynniki chemiczne lub fizyczne, takie jak promieniowanie nadfioletowe lub związki alkilujące. Aktywność polimerazy jest dostatecznie duża, aby zmniejszyć ilość wewnątrzkomórkowego NAD+ w następstwie uszkodzeń DNA czynnikami środowiskowymi. Skóra pergaminowa ta barwnikowa {xeroder-

ma pigmentosum) jest aulosomalną, recesywną chorobą genetyczną. Kliniczne objawy obejmują znaczną wrażliwość na promieniowanie słoneczne (nadfioletowe) z następującym powstawaniem mnogich nowotworów skóry i przedwczesną śmiercią. Wrodzona wada dotyczy naprawy uszkodzonego DNA. Komórki osób chorych na xewderma pigmentosum, hodowane w kulturach, wykazują mafą aktywność w procesie rozbijania dimeru tyminy na drodze fotoreaktywacji. Jednak w tej chorobie procesy naprawcze DNA są bardzo złożone; istnieje przynajmniej 7 grup komplementacji genetycznej.

3 9

JWkomórkach pochodzących z większości, jeśli nie wszystkich, grup komplementacyjnych xeroderma pigmentosum, w reakcji na ekspozycję na światło nadfioletowe spostrzega się nieprawidłową przejściową lub ilościową reakcję ze strony polimerazy połi(ADP-rybozy). Wydaje się, że nieprawidłowa reakcja przynajmniej w jednej grupie komplementacji jest spowodowana niezdolnością do nacięcia pasma DNA w miejscu uszkodzenia, ponieważ dodanie deoksyrybonukleazy do wadliwych permeabilizowanych komórek prowadzi do prawidłowego lub prawie prawidłowego zwiększenia aktywności polimerazy poli{ADP-rybozy). U chorych z ataxia teleangiectasia, autosomalnej, recesywnej choroby u ludzi powodującej ataksję móżdżkową i nowotwory układu limforetykularnego (chłoniakosiateczkowego), istnieje wzmożona wrażliwość na uszkodzenia promieniami X. Chorzy z niedokr wist ością Fanconiego, autosomalną niedokrwistością recesywną, charakteryzują się także wzmożoną zapadalnością na nowotwory i niestabilnością chromosomalną, wykazują prawdopodobnie wadliwą naprawę uszkodzeń wywołanych wiązaniami tzw. poprzecznymi. Wszystkim tym 3 zespołom klinicznym towarzyszy zwiększona zapadalność na nowotwory. Jest możliwe, że w przyszłości zostaną odkryte u ludzi inne choroby wynikające z zaburzeń zdolności naprawy DNA.

PIŚMIENNICTWO Kornberg, A: / Bied Chem 1988; 263:1. lgo-Kemenes T, Horz W, Zachau HG: Chromatin. Annu Re\ Biochem 1982; 51:89. Jelinek WR, Schmid CW: Repetitive seąuences in eukaryotic DNA and their cxpression. Annu Rev Biochem 1982; 51:813. McGhcc JD, Felsenfeld G: Nucleosome structure. Annu Rev Biochem 1980; 49:1115. Sancar A, Sancar G: DNA repair enzymes. Annu Rev Biochem 1988: 57:29. Campbell JL: Eucaryotjc DNA replication. Annu Rev Biochem 1986; 55:733. Gross DS, Garrard WT; Annu Rev Biochem 1988; 57:159.

Synteza, przekształcanie i metabolizm RNA

Dary/ K, Granner, MD

WPROWADZENIE I ZNACZENIE DLA BIOMEDYCYNY Transkrypcja cząsteczki RNA z DNA jest bardzo złożonym procesem, w który jest włączony jeden z enzymów z grupy polimeraz RNA oraz liczne towarzyszące białka. Podstawowe etapy, konieczne do syntezy pierwotnego transkryptu, to inicjacja, elongacja i terminacja. Najlepiej znany jest etap inicjacji. Zidentyfikowano liczne regiony DNA (na ogół umiejscowione „pod prąd", czyli na lewo od miejsca inicjacji) oraz czynniki białkowe, które wiążą się do tych sekwencji i regulują inicjację transkrypcji. Ten proces jest najlepiej poznany u prokariontów i wirusów, ale w ostatnich latach dokonano znacznego postępu w poznaniu procesu transkrypcji w komórkach ssaków. Niektóre RNA, a zwłaszcza mRNA mają bardzo różny okres przeżycia w komórce. Ważne jest poznanie podstawowych zasad metabolizmu RNA, ponieważ modulacja tego procesu powoduje zmiany w stopniu syntezy białek i w następstwie zmiany metaboliczne. Jest to sposób, w jaki wszystkie organizmy adaptują się do zmian w środowisku, a także sposób, w jaki powstają i utrzymują się zróżnicowane struktury i funkcje komórki u wyższych organizmów wielokomórkowych. Cząsteczki RNA syntetyzowane w komórkach ssaków są często bardzo różne od tych, które są wytwarzane w organizmach prokariotycznych. Odnosi się to zwłaszcza do transkryptów kodujących mRN A. mRJ^Aji,oxgaiiizmów ptók^aoi^czrj^ch może ulegać translacji w takiej "postaci,~w jakiej został ^syntetyzowany, podczas" gdy w komórkach, „śs&JŁp w większość RNA jest syntetyzowana jako cząsteczki prekur-

sajowe, które ulegają przekształceniom .(„obróbce") w dojrzały, aktywny RNA. Błędne przekształcenie i składanie transkryptów mRNA jest przyczyną takich chorób, jak niektóre typy talasemii (p. rozdz. 42).

RNA JEST SYNTETYZOWANY NA MATRYCY DNA PRZEZ POLIMERAZĘ RNA Proces syntezy RNA (transkrypcji RNA) na matrycy DNA najlepiej scharakteryzowano w organizmach prokariotycznych. Mimo że w komórkach ssaków synteza RNA i przekształcanie transkryptów RNA są różne niż w organizmach prokariotycznych, proces syntszy—RNĄj jako taki, jest całkiem podobny w tych 2 klasach organizmów. Dlatego też opissyntezy RNA w organizmach prokariotycznych odnosi się do organizmów eukariotycznych, mimo że enzymy biorące udział w tym procesie i sygnały regulatorowe są różne. Sekwencja rybonukleotydów w cząsteczce RNA jest komplementarna do sekwencji deoksyrybonukleotydów 1 pasma w dwupasmowej cząsteczce DNA (p. ryc. 37-8). Pasrnov które ulega transkrypcji na cząsteczkę RN.A nazywa się matrycowym pasmem DNA. Drugie pasmo DNA często określa się jako pasmo kodujące danego genu. Jest ono tak nazwane ponieważ, 7 wyjątkiem tego, że ma T zamiast U, odpowiada ono dokładnie sekwencji pierwotnego transkryptu, w którym zawarty jest kod dla Białka - produktu danego genu. W przypadku dwupasmowej cząsteczki DNA, zawierającej liczne geny, pasmo matrycowe dla każdego z genów niekoniecznie jest tym samym pasmem

S Y N T E Z A , P R Z E K S Z T A Ł C A N I E I M E T A B O L I Z M R N4A7 7/ Gen A

Gen B

Gen C

Tran skrypt RNA

Gen □ P

5 P-P-P

Pasma matrycowe R y c . 3 9 - 1 . N a ry c in ie te j p o k a z a n o , z e g e n y m o g ą b y ć tr a n s k r y b o w a n e z o b u p a s m D N A . S tr z a łk i w s k a z u ją k ie r u n e k tr a n s k r y p c ji {p o ia r n o ść }. Z w ró ć u w a g ę , ż e p a sm o m a try c o w e je s t z a w s z e o d c z- yt y Kompleks RNAP w a n e w k i e r u n k u 3 ' - 5 ' . P a s m o p r z e c iw le g ł e je s t z w a n e k o d u j ą c y m , p o n i e w a ż j e s t o n o id e n t y c z n e ( z w y j ą t k i e m z a m i a n y T n a U ) d o t r a n s k r y p t uRyc. 39-2. Polimeraza FINA (RNAP) katalizuje rybonukleotydów na sekwencje m R N A ( p ie r w o t n y t r a n s k r y p t w k o m ó r k a c h e u k apolimeryzację r io t y c z n y c h ), k tó r y k o d u je b ia łk o w y p r o d u k t g e n u . RNA, które są komplementarne do pasma matrycowego genu Transkrypt RNA ma tę samą poiarność (5' do 3'), co kodujące pasmo DNA, ale w dwupasmowym heliksie DNA (ryc. 39-1). zawiera U zamiast T. RNAP z Escherichia coli składa Dan£;paspłe-wtiwupasmowej cząsteczce DNA się z kompleksu 2 a podjednostek i 2 [} podjednos(P i p") tworzących kompleks rdzeniowy. Holomoże więc służyć jako pasmo matrycowe dla tek enzym zawiera podjednostkę 6 w momencie, gdy niektórych genów i jako pasmo kodujące dla kompleks znajduje się w sąsiedztwie miejsca startu innych genów. Należy zwrócić uwagę, że sek- (ok. 10 pz), a następnie transkrypcja postępuje wencja nukleotydów transkryptu DNA będzie jedynie przy użyciu kompleksu rdzeniowego. „Bańtaka sama (z wyjątkiem U, która zastępuje T) ka" transkrypcyjna obejmuje obszar 17 nukleotyjak w paśmie kodującym. Informacja na paśmie dów stopionego DNA (zdenaturowanego DNA), a cały kompleks pokrywa 30-75 pz w zależności od matrycowym jest odczytywana w kierunku 3' do 5'. ------«*. konłormacji RNAP.

DNA-zależna polimeraza RNA jest enzymem odpowiedzialnym za polimeryzację rybonukjeotydjów-6 sekwencji kornplcmentarnej do pasma m^ixyco.w£gtLgenu (p. ryc. 39-2 i 39-3). Enzym przyjaczajsic do swoistego miejscajEgjnotpta, na_p_a^nie_jn,atrycowym. Następuje po tym itucjiiiaą^syntfiZŁRHA w_.mmkcie startui.pioees p_ostęj3iyc.dalej, aż osiągnie sekwencje teimjnacyjne (ryc. 39-3). Jednostka transkrypcji jest to regifin_I2NA rozciągający się między promotorern_£i lermmatorL-m. Produkt RNA, który jest -syBtetyztąyany wjąenmku 5"" do 3r, nazywamy piamaiłuym trangkr^p^i iAT^roani^maJ-h prn-

kariotycznych może on reprezentować produkt kodowany przez kilka przyległych do siebie genów; w komórkach ssaków jest to zwykle produkt pojedynczego genu. Knike.5' pierwotnego transkryptu RNA i dojrzałego cytoplazmatycznego RNA są identyczne. Miejsce startu transkrypcji odpowiada więc imWeotydowi końca 5' roRNA Pierwotne transkryply generowane KNA 11 są szybko opatrzone 7-melyloguanozylotrifosforanem (p. ryc. 37-10) --^czaggczka" któiajutrzymujesię ryc. 37-10)

^g

i pojawia się na końcu 5' dojrzałego cytoplazmatycznego mRNA. Te ,.czapeczki metylacyjne" są przypuszczalnie potrzebne do przekształceń (obróbki): pierwotnego transkryptu do

mRNA, do translacji mRNA i do ochrony mRNA przed atakiem egżonukieoiitycznym w kierunku 5: -* 3'. RN.Ą.(RHAJEXba-

kterii Escherichia coli występuje ja k& cząsteczka rfożoiiLi z 4 podjedtiostek. 2 z nich są identyczne Ipodjednostki a), a 2 są podobne co do wielkości, ale nie identyczne (podjednostka p i P') (ryc. 39-2). RNAP zawiera także 2 atomy cynku. Rdzeń polimerazy RNA posługuje się swoistym czynnikiem białkowym (czynnik sigma [o]), który pomaga rdzeniowi enzymu dołączyć się mocniej do swoistej sekwencji deoksyrybonukleotydowej regionu promotora. Bakterie zawierają wiele czynników o, ?. których każdy działa jako białko regulatorowe, które modyfikuje swoistość rozpoznania promotora polimerazy RNA. Pojawianie się różnych czynników a jest w systemach prokariotycznych skorelowane w czasie z różnymi programami ekspresji genów, takimi jak rozwój bakteriofagów, sporulacja i reakcje na szok cieplny.

478 / ROZDZIAŁ 39 Negatywne czynniki kontrolne: represory Pozytywne czynniki kontrolne: aktywatory Holoenzym pollmerazy RNA

Rdzeń pollmerazy □ Czynniki sigma

2. Inicjaoja nici HNA pppApX 4. Termlnacja transkrypcji nici RNA I uwolnienie enzymu a Elongacja nici

+ATP+XTP Uwolnienie sigma wiązanie nusA

Czynniki term i nacji CzynnlW antyierrnlnaojt

XTP

RNA PPPA

Ryc. 39-3. Cykl transkrypcyjny u bakterii. Transkrypcję RNA bakteryjnego przedstawiono w 4 etapach: 1. Wiązanie z matrycą. Polimeraza RNA (RNAP) wiąże się z DNA i lokalizuje promotor. Z. Inicjacja nici. Holoenzym RNAP (rdzeń+czynniki 6) katalizuje przyłączenie pierwszego nukleotydu (zwykle ATP lub GTP) do drugiego trifosforanu rybonukleozydu z wytworzeniem dinukleotydu, 3. Elongacja nici. Kolejne reszty nukleotydowe są dołączane do 3'-OH końca powstającej cząsteczki RNA; czynnik 5 dysocjuje od holoenzymu, gdy nić RNA osiągnie długość ok. 10 zasad. 4. Terminacja nici i uwolnienie enzymu. Ukończona nić RNA i RNAP są uwolnione z matrycy. Regeneruje się hoioenzym RNAP, który odnajduje promotor i cykl rozpoczyna się od nowa. {Zreprod u kowano z niewielkimi modyfikacjami z: M, Chamberiin, The Enzymes, vol. XV, 1982). ■ _______

SYNTEZA RNA OBEJMUJE INICJACJĘ, ELONGACJĘ ITERMINACJĘ Proces syntezy RNA pokazany na ryc. 39-3 obejmuje najpierw związanie cząsteczki hoi.opoHtnerazy RNA do matrycy w miejscu promotorowym. Po.związaniu następuje zmiana konformacji RNAP, a następnie pierwszy nukleotyd (zwykle purynowy) wiąże się z miejscem inicjacji p podjednostki enzymu. W obecności 4 nukleÓtydow"RNAP przemieszcza się do drugiej zasady na matrycy, tworzy się wiązanie fosfodiestrowe, a tworzący sie łańcuch RNA jest

teraz związany w miejscu polimeryzacji na ~(J podjednostce RNAP. (Nasuwa się analogia "do" miejsc A i P na rybosomie; p. ryc. 40-7 i 40-8). Inicjacja tworzenia cząsteczki RNA przy jej końcu 5' następuje z oddzieleniem czynnika-cr, a elongacja cząsteczki RNA biegnie przeciwrównolegje do jej matrycy w kierunku od 5'do jJTEnzym polimeryzuje rybonukleotydy według swoistej sekwencji dyktowanej przez pasmo matrycowe i reguły parowania zasad według Watsona-Cricka. W trakcie reakcji polimeryzacji uwalnia się pirofosforan. Zarówno u prokariontów, jak i u eukariontów rybonukleotyd

SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA / 479

puiynaw.y-4es.t .zw.ykk pierwszym, który ulega polimeryzacji w cząsteczce RNA. Wmiarę^k4iompl£kjLelongacyjny. zawierający rdzeń poliinerazy RNA. przemieszcza się wzdluz cząsteczkiJD2Ś&. jnusi nastąpić rozwinięcie heliksu DNA, aby udostępnić miejsca do odpowiedniego parowania zasad do mikleotydów ua paśmie matrycowym. Odcinek rozwijającego się DNA ma stalą wielkość w okresie transkrypcji, która wynosi ok. 17 par zasad na cząsteczkę polimerazy. Wydaje się więc, że wielkość regionu rozwiniętego DNA jest dyktowana przez polimerazę i jest niezależna od sekwencji DNA w obrębie kompleksu. Sugeruje to, że polimęraza^RNA.jesi.zwi^zana z aktywnością typu rozwijającego (ang, ,,unwindase"). która otwiera heliks DNA. Fakt, że podwójny heliks musi ulec rozwinięciu, i że pasma oddzielają się przynajmniej przejściowo w okresie transkrypcji nasuwa wniosek, że

w komórkach eukariotycznych struktura nukleosomów ulega rozerwaniu. Termmacja syntezy cząsteczki RNA jesl-wyznaczona przez sekwencję na paśmie matrycowym cząsteczki DNA, ta sekwencja sygnalna jest rozpoznana przez białko terminacji nazwane czynnikiem rho [p]. Po ukończeniu syntezy cząsteczki RNA rdzeń enzymu (polimerazy) oddziela się od matrycy DNA. W obecności innego czynnika enzym rozpoznaje promotor i synteza nowej cząsteczki RNA zaczyna się ponownie. To samo pasmo matrycowe genu może przepisywać jednocześnie więcej niż 1 cząsteczka polimerazy RNA, ale proces ten jest sfazowany i rozmieszczony w taki sposób, że w danym momencie ulega transkrypcji inna część sekwencji RNA. Na rycinie 39-4 przedstawiono zdjęcie przebiegu syntezy RNA z mikroskopu elektronowego-

/%^:;-** ^m<:;V ,-

Ryc. 39-4. Fotografia z mikroskopu elektronowego ficznych kopii genów rybosomalnego RNA u płazów w trakcie transkrypcji. Powiększenie ok 6000 x. Zauważ, że długość transkryptów zwiększa sie, w miarę jak cząsteczki polimerazy RNA posuwają się wzdłuż poszczególnych genów rybosomalnego RNA. Proksymainy, początkowy region transkrybowanego genu ma zatem krótkie przymocowane do genu transkrypty, podczas gdy znacznie dłuższe transkrypty są związane z dystalnym końcem genu. Strzałki pokazują kierunek (5' do 3) transkrypcji, począwszy od miejsca inicjacji do miejsca terminacji. (Reprodukowano za zgodą z: Miller O. L. Jr, Beatty B. R,: Portrait of a gene. J. Celi Physiol. 1969, 74 [Suppl. 1]: 225),

480 / ROZDZIAŁ 39

KOMÓRKI SSAKÓW ZAWIERAJĄ LICZNE DNA-ZALEŻNE POLIMERAZY RNA Właściwości polimeraz ssaków przedstawiono w tab. 39-1. Każda z tych DNA-zależnych polimeraz RNA jest odpowiedzialna za transkrypcję różnych klas genów. Masa cząsteczTabela39-1. Mianownictwo zwierzęcych DNA-zależnych polimeraz RNA Klasa enzymu

Wrażliwość na 3-amanitynę

Główny produkt rRNA

I (A)

Niewrażliwa

II (B)

Wrażliwa na matę stężenia hnRNA(mRNA) (10" 8 do 10- a mo!/l)

III
Wrażliwa na duże stężenia tRNAi5SRNA

kowa (MW) polimeraz RNA dla 3 głównych klas eukariotycznego RNA waha się w granicach 500000 — 600 000. Wszystkie z tych polimeraz mają podstawową organizację podjednostek strukturalnych, podobną do bakteryjnej polimerazy RNA. Wszystkie mają 2 duże podjednostki i kilka mniejszych podjednostek. Współczesne badania z zastosowaniem klonowania i sekwencjonowania DNA wskazują, że eukariotyczne polimerazy RNA wykazują duże podobieństwo aminokwasów z prokariotycznymi polimerazami RNA. Funkcje każdej z podjednostek nie są jeszcze poznane. Niektóre mogą mieć funkcje regulatorowe, służące polimerazie w rozpoznawaniu swoistych sekwencji, takich jak sygnały promotorowe i sygnały terminacyjne. a-Amanityna, toksyna grzyba Amanita phalloides jest swoistym inhibitorem eukariotycznej nukleoplazmatycznej DNA-zależnej polimerazy RNA (polimeraza RNA II); toksyna ta okazała się potężnym narzędziem badawczym (tab. 39-1).

NIEKTÓRE SEKWENCJE DNA SĄ WAŻNYMI SYGNAŁAMI TRANSKRYPCJI Analiza sekwencyjna DNA swoistych genów, uzyskana za pomocą technologii rekombinacji DNA, umożliwia rozpoznanie licznych sekwencji ważnych w procesie transkrypcji genów. Na podstawie badań licznych genów bakteryjnych możliwe było zbudowanie zgodnych modeli

sekwencji sygnalnych dla inicjacji i terminacji. Kwestia .jak RNAP znajduje właściwe miejsce dla inicjacji transkrypcji?" nie jest kwestią błahą, jeśli weźmie się pod uwagę złożoność genomu. Esckerichia coli ma ok. 2 x 103 miejsc inicjacji transkrypcji w DNA o ok. 4x 10" par zasad. Sytuacja jest jeszcze bardziej złożona u ludzi, gdzie ok. 105 miejsc inicjacji transkrypcji jest rozproszonych wśród 3 x 109 par zasad DNA. RNAP może wiązać się z wieloma regionami DNA, ale przeszukuje ona sekweecje nt^Az prędkością ok. 103pz/s, a2.domo.jnen.lu, gdy rozpozna pewne swoiste regiony w.D.N.A. z którymi wiąże się z dużym powinowactwem. Region taki jest nazywany promotorem, a związanie RNAP z promotorem zapewnia dokładną inicjację transkrypcji. Promotory bakteryjne mają długość ok. 40 nukleotydów (40 par zasad, czyli 4 zwoje podwójnego heliksu DNA); jest to region dostatecznie mały, aby być pokrytym przez cząsteczkę holopolimerazy RNA E. coli. Na tym obszarze promotora są 2 krótkie konserwowane sekwencje. Około 35 par zasad w górę od miejsca startu transkrypcji znajduje się sekwencja o 8 parach nukleotydów 5-TGTTGACA-3' przedstawiona na ryc. 39-5. Bardziej proksymalnie do miejsca startu transkrypcji, ok. 10 nukleotydów w górę, jest sekwencja o 6 parach nukleotydów bogata w AT "(5r-TATAAT-3r). Ta ostatnia sekwencja ma niską temperaturę topnienia, ponieważ brak jest w niej par nukleotydów GC. Wskutek tego sekwencja TATA, czyli ramka Pribnowa, ułatwia dysocjację między pasmem kodującyrrn rnckodującyfHTw;' nuklgpiydjowej promojhura bezpośrednio „w 3óJ\'_na kodującym paśmie. Inne bakterie mają odmienne kombinacje (ramki), ale na ogół mają 2 komponenty promotora; mają one tendencje zajmować tę samą pozycję względem miejsca startu transkrypcji i we wszystkich przypadkach sekwencje między ramkami nie są do siebie podobne. U E. coli transkrypcyjne rho-zależne sygnały terminacji mają również wyraźne sekwencje zgodne, jak to przedstawiono na ryc. 39-6. Zachowawczo zgodna (konsensus) sekwencja, która ma długość 40 par nukleotydów zawiera przerwaną, odjwrjjceB<j~sdLaKQCJ£^Q^Łóxzojia, ia p.tjlępjię^ gar zasad ĄT. rę jak postępuje transkrypcja przez ten od-

SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA / 481 Miejsce Gtartu transkrypcji

Tran skrybo wany

Pasmo kodujące 5' Pasmo matrycowe 3'

region genu

TGTTGACA

___z

TATAAT

DNA

■*■ +1

Region —35

Region — K

51 PPP-

Produkt

•— — tra n sk ry p cji (RNA)

Ryc. 39-5. Promotory bakteryjne, takie jak pokazany na tej rycinie promotor E. coli. mają 2 wspólne regiony wysoko konserwowanych sekwencji nukleotydowych. Regiony te są umiejscowione 35 i 10 pz w górę (w kierunku 5' pasma kodującego) od miejsca startu transkrypcji, które oznaczono symbolem +1. Wszystkie nukleotydy w górę od miejsca inicjacji transkrypcji określa się umownie za pomocą liczb ujemnych. Elementy sekwencji regulatorowych DNA {ramka TATA, itp.) są także umownie podawane w kierunku 5'do 3', tak jak w paśmie kodującym. Jednak te elementy funkcjonują tytko na dwupasmowym DNA,

Kierunek transkrypcji Pasmo kodujące -Pasmo matrycowe-

AGCCCGC TCGGGCG

GCGGGCT TTTTTTTTCGCCCGA AAAAAAAA-

Pasmo kodujące -Pasmo

AAAAAAAA-

DNA

DNA

matrycowe-

UUUUUU

Tran skrypt RNA

Ryc. 39-6. Bakteryjny sygnał terminacji transkrypcji w genie zawiera odwróconą sekwencję powtarzającą się (2 pola objęte ramką) podzieloną łącznikiem, po której następuje ciąg bogaty w pary AT {rycina ugory). Sekwencja powtarzająca odwrócona po transkrypcji na RNA może generować strukturę drugorzędową (dwuniciową) w transkrypcje RNA, jak to pokazano w dolnej części ryciny.

powtórzony układ sekwencji pt może wyJwo,Ezyć wswnątrzcząsteczJcową strukturę petlową, jak to przedstawiono na ryc. 39-6. Transkrypcja biegnie dalej do regionu AT w końcu genu i tam za pomocą czynnika białkowego kończącego transkrypcję, zwanego czynnikiem rho (p), polimeraza RNA zatrzymuje się i dysoćjuje. a pierwotny iranskrypt oddziela się od DNA. 31 — Biochemia

W komórkach ssaków sygnały transkrypcyjne są, co nie jest zaskoczeniem, bardziej złożone Jest jasne, że sygnaiy (sekwencje sygnalne) w DNA, które kontrolują transkrypcję w komórkach eukariotycznych, są różnego rodzaju. Dwa fypy sekwencji sygnalnych są umiejscowione w proksymalnym regionie do promotora. Jedna z nich określa na cząsteczce DNA miejs-

482 / ROZDZIAŁ 39

+1 Region kodujący tk

Ryc. 39-7. Sygnalne elementy transkrypcji i regulatorowe czynniki białkowe wiążące DNAwgeniekinazy tymidynowej (tk) DNA-zależna poiimeraza II RNA wiąże się z regionem w dół od regionu ramki TATA (który wiąże czynnik trans^rypcyjny TFIID) i inicjuje transkrypcję od pojedynczego określonego nukleotydu. Częstość tego zdarzenia zwiększa się wówczas, gdy są obecne elementy c/5 położone w górę (na lewo) oć początku genu (ramki GC i CAAT). Te elementy sygnalne wiążą odpowiednio czynniki transkrypcyjne Sp1 i CTF i mogą funkcjonować, w położeniu o odwróconej polarności (strzałki). ty, grŁ>ML.ma_gif .iaiY};f: tramaltrypija, irmg determinują tak-i^ esto ten pr ^tlt^ ">■* Taj"^ Na

przykład w genie kinazy tymidynowej wirusa Herpes simplex, który do ekspresji genów po sługuje się czynnikami transkrypcyjnymi po chodzącymi od gospodarza, którym jest komór ka ssaków, znajduje się unikatowe miejsce star tu transkrypcji; dokładność transkrypcji z tego miejsca startu zależy od sekwencji nukleotydowej — umiejscowionej fó nnkięatydńw w £Órę od miejsca startu (ryc. 39-7). Region ten ma sekwencje IATAAAAG i wykazuje znaczną homologię do czynnościowo spokrewnionej ra mki Pribnowa (TATAAT), która u prokariontów jest umiejscowiona ok. 10 par zasad w górę od punktu startu mRNA. Polimeraza RNA \S prawdopodobnie wiąże się do DNA w regionie ramki TATA i następnie zaczyna transkrypcję pasma matrycowego w miejscu odległym o 32 nukleotydy w dół (na prawo'). Ramka TATA wydaję E

g

mi&jsca startu, określają, jak często ma zacho dzić, zdarzenie transkrypcyjne. Mutacje w tych regionach zmniejszają częstość startu transkry pcji 10—20 razj. l.c.dcmenty DNA nazywają się ramkamipC i CAAT, ponieważ występują tam tego typu sekwencje (tab. 39-2), Jak przed stawiono na ryc. 39-7, j^ażday tych ramek wi^że unikatowe białki^-Sp^w-pfzypadkoii&fflii GC i Clf lalbó^CTEPB, NF1, NFY) j^_przypadku" ramki CAAT. Częstość inicjacji transkrypcji jestnastcpslw"ern ruiń7inhni!^-" Ttje.nVi' białkami _g ONA, podczas gdy oddziaływanie białko-DNA z famicą '1A'1 A"zapewma_wisni0Ść jnic-" ^ N A określa sie jako elementy ^ ^ ^ j y o aktywności cis, ponieważ są one umiejscowione na tej samej cząsteczce DNA, na której mieści się

Ta ba la 39-2. Niektóre elementy transkrypcji i czynniki, które się z nimi wiążą, i które znaleziono w genach ssaków, przepisywane przez polimerazę RNA II. Sekwencje DNA tych elementów podano w nawiasach. Mała litera n oznacza każdy z nukieotydów Element TATA box (TATAAT) CAAT box (CCAAT) TGG(n)6.7GCCAA GC box (GGGCGG) Ig oktamer (ATTTCGAT) Element wstrząsu cieplnego (Cnn GAAnn TTCnnG)

Czynnik TFIID Białka wiążące CAAT NF1 (czynnik jądiowy) Sp1

NFXB (czynnik b genu łańcucha^, tmmunoglobuliny) Czynnik transkrypcyjny wstrząsu cieplnego

gen podlegający regulacji. Czynniki białkowe określa się jako czynniki typu trans, ponieważ pochodzą one od genów umiejscowionych prawdopodobnie na innych chromosomach. Elementy umiejscowione w górę od genu (na lewo od genu) odpowiadają za wierność i częstość inicjacji i podlegają rygorystycznym wymaganiom zarówno co do ich pozycji, jak i orientacji. Zmiany w pojedynczych zasadach mają dramatyczny wpływ na ich funkcję. Krytyczna jest odległość tych elementów od miejsca startu i w zasadzie nie są one aktywne, jeśli zostanie odwrócona ich orientacja normalnie biegnąca w kierunku 5' do 3' (ryc. 39-8). Trzecia kłasa sekwp.ncii noisLiiD^zmacniania lub inicjacji transkrypcji eukariolycznych genów. Elementy te są nazywane w zależności od skut: ku. jaki wywołują elementarni (enhancers) lub tłumiącymi (silencers) t pcję. Elementy te znaleziono w różnych miejs-

SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA / 483

Ekspresja regulowana

Inne elementy regulatorowe

Sekwencje wzmacniające (+)I

wyciszające (-)

Ekspresja podstawowa j

HHh

Elementy w górę od genu (ramka CAAT) ttp.

Elementy bliższe genu (ramka TATA)

+1 Gen strukturalny V/ -------------

1 ukturalny j

Ryc. 39-8. Schematyczny diagram pokazujący transkrypcyjne regiony kontrolne hipotetycznego euka riotycznego genu klasy II (dającego jako produkt mRNA}. Taki gen może być podzielony na region strukturalny i regulatorowy, a miejsce graniczne tych regionów jest zdefiniowane jako miejsce startu transkrypcji (+1 -w-*). Gen strukturalny zawiera sekwencję DNA, która jest transkrybowana na mRNA, który ostatecznie ulega translacji na białko. Region regulatorowy składa się z 2 elementów zapewniających podstawową ekspresje genu Komponent proksymalny, zwykle ramka TATA, kieruje polimerazę II RNA na odpowiednie miejsce (co zapewnia wierność transkrypcji). Inny komponent, element położony w górę, określa częstość inicjacji. Spośród tych elementów najlepiej jest poznane białko CAAT, ale występują inne sekwencje (Sp1, NF1, AP1, itp.), które mogą być użyte w różnych genach. W regulowanej ekspresji biorą udział elementy, które wzmacniają (enhancers) lub wyciszają (silencers) ekspresję oraz elementy, które pośredniczą w reakcji na różne sygnały, jak hormony, szok cieplny, metale i związki chemiczne. Swoista tkankowo ekspresja jest zapewniona także przez swoiste sekwencje tego typu. Jest możliwe, że te 2 regiony regulatorowe nakładają się funkcjonalnie (pokazuje to linia łącząca). Zależności funkcjonalne od orientacji wszystkich tych elementów pokazują strzałki wewnątrz prostokątów. Na przykład element proksymalny musi mieć orientację 5' do 3'. Elementy położone w górę od elementów proksymalnych najlepiej funkcjonują w orientacji 5' do 3', ale niektóre z nich mogą mieć odwróconą orientację (odwróconą polarność). Linie przerywane pokazują, że niektóre elementy nie są uplasowane na stałe w stosunku do miejsca startu transkrypcji. Istotnie, niektóre elementy odpowiedzialne za regulowaną ekspresję mogą być umiejscowione jako elementy rozproszone wśród elementów uplasowanych w górę od genu lub mogą być one umiejscowione w dół od miejsca startu transkrypcji (np. w obrębie intronów).

cach zarówno w górę, jak i w dół od miejsca startu transkrypcji. W odróżnieniu od elementów leżących proksymalnie i w górę od promotora, sekwencje wzmacniające i tłumiące mogą wywierać swój wpływ także wówczas, gdy są umiejscowione w odległości setek lub tysięcy zasad od jednostek transkrypcyjnych umiejscowionych na tym samym chromosomie (cis sprzężonych). Jest zaskakujące, że sekwencje wzmacniające i tłumiące są aktywne niezależnie od ich orientacji (polarności). Elementy reakcji hormonalnej (dla steroidów,

T3, TRH, cAMP, prolaktyny itp.) działają jako sekwencje wzmacniające lub tłumiące, albo w sprzężeniu z nimi (p. rozdz. 44). Inne procesy wzmacniają lub tłumią ekspresję genu, np. reakcje na wstrząs cieplny, metale (Cd 2+ i Zn2+) i niektóre toksyczne związki chemiczne (np. dioksyna), działając przez swoiste elementy regulatorowe. Tkankowo swoista ekspresja genów, np. gen albuminy w wątrobie, zachodzi także przez swoiste sekwencje DNA. Wspólną cechą tych podstawowych i regulatorowych elementów jest to, że zawsze zachodzi

interakcja swoistych białek z sekwencjami DNA. Wiele takich czynników zidentyfikowano (tab. 39-2), a wielki wysiłek badawczy poświęca się analizie wpływu oddziaływań białko--DNA na transkrypcję genu. Sygnały terminacji transkrypcji dla eukarioty-

cznej polimerazy RNA klasy II są słabo poznane. Jednak wydaje się, że sygnały terminacji znajdują się daleko w dół (na prawo) od sekwencji kodujących genów eukariotycznych. Na przykład sygnał dla terminacji transkrypcji mysiej P-globiny występuje w licznych miejscach 1000 do 2000 zasad od miejsca, w którym jest dodawana sekwencja (ogon) poli (A). Niewiele wiadomo o procesie terminacji ani o tym, czy w proces ten są włączone swoiste czynniki terminacji podobne do bakteryjnego czynnika p. Wiadomo jednak, że koniec 3' mRNA jest syntetyzowany_w_jakxesie potranskrypcyjnym TwyHajejię pr^biegać w 7 fflzftch. Pn przejściu pomńerazy RNA klasy II regionu jednostki transkrypcyjnej kodującego 3' końcowy fragment trańskryptu, endonukłeaza RNA przecina pierwotny transkrypt w miejscu ok. 15 zasad

4-84 / ROZDZIAŁ 39

.w kierunku 3' od sekwencji AAUAAA, która wydaje się być sygnałem do przecięcia transkryptów eukariotycznych. Wreszcie nowo utworzony koniec 3' jest poliadenylawany w nirkieóplazmie, jak to opisano niżej.

ELEMENTY DNA TYPU CIS W GENACH KLASY III SĄ UMIEJSCOWIONE WEWNĄTRZ GENU polimcraza RNA klasy III, która odpowiada za transkrypcję genów tRNA geńÓW inałocząsteczkowych RNA (p;- rozdz. 37) rozpoznaje promotor, który jest umiesz czony wewnątrz genu, który ma ulec ekspresji, a nie w górę od punktu startu transkrypcji. W przypadku eukariotycznych genów tRNA są wewnętrzne oddzielne bloki (A i B) sekwencji, które działają jako promotor wewnątrzgenowy. Sekwencje w obrębie bloków A i B w dojrzalej cząsteczce tRNA znajdują się w regionach dob rze konserwowanych i biorą udział w wytworze niu odpowiednio pętli DHU i pętli TłC (ryc. 37-11). Dzięki manipulacji strukturą genów tRNA wykazano, że optymalna odległość dla funkcji promotora między blokami A i B wynosi 30 — 40 par zasad, i że punkt startu transkrypcji znajduje się między 10— 16 parą zasad.w górę od bloku A. Dla genu 5S RNA, który także jest przepisywany przez polimerazę RNA klasy III, istnieje swoisty transkrypcyjny czynnik biał kowy, który prawdopodobnie, przez interakcję z cząsteczką RNA polimerazy klasy III, umoż liwia dopasowanie jej miejsca katalitycznego do punktu startu transkrypcji na DNA. Podobny mechanizm, wykorzystujący swoiste czynniki transkrypcyjne o aktywności trans, może być włączony w transkrypcję genu tRNA.

ZANIM CZĄSTECZKI RNA STANĄ SIĘ CZĄSTECZKAMI AKTYWNYMI CZYNNOŚCIOWO. CZĘSTO SĄ PRZEKSZTAŁCANE W organizmach prokariotycznych pierwotne transkrypty genów kodujących mRN A są użyte jako matryce do translacji nawet przed ukończeniem transkrypcji. Dzieje się tak prawdopodobnie dlatego, że miejsce transkrypcji nie jest ograniczone do obszaru jądra, jak to ma miejsce w organizmach eukariotycznych. Zatem w ko-

mórkach prokariotycznych transkrypcja i translacja są ze sobą sprzężone. W konsekwencji prókariotyczne mRNA podlegają niewielkim modyfikacjom i przekształceniom przed rozpoczęciem swojej czynności w procesie syntezy białek. Prókariotyczne cząsteczki rRNA i tRNA są przepisywane w postaci jednostek znacznie dłuższych niż ich cząsteczka końcowa. W istocie liczne jednostki transkrypcji tRNA zawierają więcej niż 1 cząsteczkę. Zatem w organizmach prokariotycznych do wytworzenia dojrzałych czynnościowo cząsteczek jest niezbędne przekształcenie prekursorowych cząsteczek rRNA i tRNA. Prawie wszystkie pierwotne transkrypty eukariotyczne RNA podlegają dużym przekształceniom w okresie między czasem, w którym zostają zsyntetyzowane a czasem, w którym służą swojej funkcji końcowej; przekształceniom podlegają zarówno mRNA, jak i cząsteczki strukturalne, takie jak rRNA, 5S RNA albo tRNAjfoces.. przekształcenia /ach ody i głównie w obre-bk jądra. Proces ten obejmuje dodanie czapeczki metylacj jnej, reakcje nuklcolitycznc i reakcje łączenia (ligacji), dodanie niikleotydów końcowych i modyfikacje nukleozydów. Jednak wiadomo, że w komórkach ssaków 50-—70% jądrowego RNA, włączając w to RNA, które otrzymały czapeczki w końcach 5', nie znajduje się w cytoplazmatycznym mRNA. Ten jądrowy ubytek RNA jest znacząco większy niż należałoby tego oczekiwać jedynie jako wyniku utraty samych sekwencji wtrąconych (patrz niżej). Dokładna rola widocznego nadmiaru transkryptów w jądrze komórek ssaków nie jest znana.

KODUJĄCE CZĘŚCI (EKSOIUY) WIĘKSZOŚCI GENÓW EUKARIOTYCZNYCH SĄ POPRZEDZIELANE INTRONAMI W wyniku postępu w technice klonowania i sekwencjonowania DNA stało się oczywiste, że między porcjami wielu^enów kodującyi arnioakwast (eEsony) są rozproszone długie sekwencje DNA, które nie niosą informacji genetycznej ostatecznie przetłumaczonej na sekwencję aminokwasów w cząsteczce białkowej (p. rozdz, 38). W rzeczywistości te sekwencje przerywają kodujące regiony genów struktura!nych. JTerTrtn|cone sekwencje (introny).znajdują się w-wtększości, ale nie we wszystkich genach

SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA f 4«S

wyższych organizmów eukariotycznych. Pierwotne transkryp ty genów strukturalnych zawienija.RNA komplementarny do sekwencji wtrąconych. Icdnakickwcncjc mtronowe w RNA są -^.wycięte z tTgij^Tr^, g ftrsru™ transkryptu. sa. jijdra tidpowicdntET5fet!«l»«*j4iilCZ£me (ligacja) zanim pows, tająca cząsteczka mRJ\A pojawi się w cytoplazmic, gdzie będzie służyła do translacji (ryc. 39-9 i 39-101. Wyjaśniono mechanizmy, przez które introny są usuwane z pierwotnego transkryptu na terenie jądra, mechanizmy spajania eksonów z wytworzeniem „dojrzalej" cząsteczki mRNA i mechanizmy transportu cząsteczki mRNA do cytoplazmy. Mimo że sekwencje nukleotydów w intronach różnych eukariotycznych transkryptów, a nawet te w obrębie pojedynczego

transkryptu, są bardzo heterogenne, w każdym z 2 połączeń ekson-intron (miejsce spojenia) sekwencje są dobrze konserwowane (sekwencje konsensus pokazane są na ryc. 39-10). Swoista struktura, zwana spiiceosomem, bierze udz w przekształceniu pierwotnego transkryptu na mRNA. Spliceosomy składają się zpierwotnego transkryptu, 4 małocząs teczko wy ch RNA (Ul, U2, U5 i U4/U6) i nieokreślonej liczby biatek. Cząsteczka Ul snRNAjest komplementarna do sekwencji konsensus w miejscu składania 5', U2 do miejsca rozgałęzienia, a U5 do miejsca składania 3'. Te cząsteczki snRNA wnoszą prawdopodobnie aktywność katalityczną. Obecnie odkryto, że w procesie usuwania sekwencji intronowych z pre-mRNA tworzy sie niezwykła cząsteczka RNA i przypominająca

Two rzen ie stru ktu ry

Nacięcie przy koficu 3' Intronu

Cap—[

G-G

Ugacja ekaonu 1 do Kań ca S'eksonu Z Enzymatyczne strawtenre [ntronii

Ryc. 39-9. Przekształcanie pierwotnego transkryptu (hnRNA) w mRNA. W tym hipotetycznym transkrypcie lewy koniec intronu jest przecięty (|) i intron tworzy pętlę (lasso) między swoim końcem 5' i A przy końcu 3' w obrębie sekwencji konsensus UACUAAC. Następuje wówczas nacięcie prawego końca intronu (O). Powoduje to uwolnienie pętli, która jest strawiona enzymatycznie, a ekson 1 ulega połączeniu z eksonem 2 przez reszty G.

-»l Ekson 3'

Sekwencja kon UAAGU - IntronRyc. 39-10.Sekwencje konsensus w miejscu połączenia.

486 / ROZDZIAŁ 39

lasso. Okazuje się, że koniec 5' sekwencji wtrąconej, łączy się przez wiązanie fosfodiestrowe 2r—-5' z resztą nukleotydu adenylowego 28-37 nukleotydów w górę (na lewo) od końca 3' sekwencji wtrąconej (intronu). Proces ten i omawiana struktura jest schematycznie przedstawiona na ryc. 39-9. Wydaje się, że rozwiązano tajemnicę wzajemnych relacji hnRNA i odpowiadającego mu dojrzałego mRNA w komórkach eukariotycznych. Cza^leczkiJinRNA są pierwotnymi transkryptami oraz produktami swoich wczesnych przeTĆśztaloent^ó "dodaniu czapeczek i sekwencji poli(A) oraz zabraniu części odpowiadającej mtronom, cząsteczki te są transportowane do cytoplazmy jako dojrzałe cząsteczki mRNA. Przekształcanie cząsteczek hnRNA może potencjalnie shiżyiTSo regulacji ekspresji genów. Wykazano, że alternatywne wzory składania RNA mogą być przedmiotem kontroli rozwoju embrionalnego. Można podać liczne przykłady, ale 3 z nich określają istotę zagadnienia. Na przykład cytoplazmatyczne mRNA dla a-amylazy w śliniance szczura i wątrobie szczura różnią się sekwencjami 5', podczas gdy pozostała część mRNA genów zawierających region kodujący i miejsce dodania sekwencji poli(A) są identyczne. Dalsza analiza wykazała, że chociaż pierwotne transkrypty są duże i nakładające się, różne miejsca składania są użyte do połączenia 2 różnych czapeczek i sekwencji liderowych do takiego samego trzonu mRNA. W dodatku alternatywne wzory składania DNA są użyte do wytworzenia 2 różnych mRNA kodujących ciężki łańcuch immunog] obu liny —jeden, który koduje ciężki łańcuch białkowy związany z błoną i drugi, który koduje ciężki łańcuch białka ulegający wydzielaniu (p. rozdz. 41). Składanie (spajanie) RNA jest zwykle niezbędne w celu wytworzenia cząsteczek informacyjnego RNA, a wymóg składania jest dodatkowym mechanizmem zróżnicowanej regulacji ekspresji genu. Przynajmniej 1 postać p-talasemii, choroby, w której gen p-globiny jest silnie wytłumiony, pojawia się w wyniku zmiany nukleotydów w miej scu połączenia ekson-intron, co wyklucza usunięcie intronu i przez to prowadzi do zmniejszonej syntezy łańcucha p lub ją wyklucza. Jest to konsekwencja przerwania normalnej ramki odczytu w mRNA. Jest oczywiste, że wada w podstawowym procesie, jakim jest składanie RNA, zmniejsza dokładność, jaką musi mieć proces składania RNA-RNA.

RNA MOŻE DZIAŁAĆ JAKO CZYNNIK KATALITYCZNY Jako dodatek do katalitycznej aktywności wnoszonej przez snRNA w kształtowaniu cząsteczki mRNA, przynajmniej 3 inne reakcje przekształcenia RNA są katalizowane przez RNA. Obserwacje, przeprowadzone na organellach roślin, drożdży, wirusów i komórek wyższych eukariontów, wykazują, że RNA może działać jako enzym. Odkrycie to zrewolucjonizowało nasze pojęcia o działaniu enzymów i początkach życia.

INFORMACYJNY RNA (mRNA) JEST MODYFIKOWANY NA KOŃCACH 5' i 3' Jak wspomniano wyżej, cząsteczki mRNA ssaków mają strukturę zwaną czapeczką na końcu 5' i większość z nich ma sekwencję (ogon) poli(A) w końcu 3'. Struktura czapeczki jest dodana do końca 5' nowo przepisywanego prekursora mRNA w jądrze przed transportem cząsteczki mRNA do cytoplazmy. Sekwencja poli(A)(gdy występuje) jest dodana albo w jądrze, albo w cytoplazmie. Wtórne metylacje cząsteczek mRNA w obrębie grup 2'-hydroksylowych i atomu N6 reszt adenylanowych występują po pojawieniu się cząsteczki mRNA w cytoplazmie. Czapeczka 5' transkryptu RNA jest niezbędna do wytworzenia kompleksu rybo nukleoprotei nowego, do reakcji składania, i może być włączona w transport mRNA oraz rozpoczęcie translacji, a także osłania koniec 5' mRNA przed atakiem egzonukleaz działających w kierunku 5'—*3r. Rola sekwencji poli(A) jest nieznana, ale wydaje się, że polega ona na osłonie końca 3' RNA przed atakiem cgzonukleazy działającej w kierunku 3'-+ 5'. W żadnym przypadku występowanie lub brak sekwencji poli(A) nie determinuje, czy prekursorowa cząsteczka obecna w jądrze pojawi się w cytoplazmie, ponieważ nie wszystkie cząsteczki hnRNA zawierające sekwencję poli{A) wchodzą w skład cytoplazmatycznego mRNA, ani nie wszystkie cytoplazmatyczne cząsteczki mRNA zawierają sekwencję poli(A) (histony są najlepiej zauważalnym przykładem). W komórkach ssaków reakcje cytoplazmatyczne mogą dodawać i usuwać reszty adenylanowe z sekwencji poli(A); procesy te są związane ze zmianą stabilności mRNA.

SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA / 487

Wielkość cząsteczek cytoplazmatycznego mRNA, nawet po usunięciu sekwencji poli(A), jest znacznie większa, często 2—3 razy, od wielkości wymaganej do kodowania swoistych białek, dla których stanowią one matrycę. Dodatkowe nukleotydy występują w regionach nie ulegających translacji (niekodujących) zarówno po stronie 5', jak i 3' regionu kodującego; najdłuższe sekwencje nie ulegające translacji znajdują się zwykle przy końcu 3'. Właściwa rola tych sekwencji nie jest znana, ale są one włączone w przekształcanie RNA, transport, degradację i translację. Transportujący RNA (tRNA) jest znacznie modyfikowany Czas teczki _tRNA, jak to opisano w rozdz. 37 i 40,~sIużą jako cząsteczki adaptacyjne do translacji mRNA na sekwencje aminokwasów jw^KSEacnTCźąsteczki tRNA zawierają liczne modyfikacje zasad podstawowych A, U, G i C. Niektóre" z nich są to proste metylowane pochodne, a niektóre mają przekształcone wiązania glikozydowe. Cząsteczki tRNA u prokariontów i u eukariontów są przepisywane w pośtacldużych cząsteczek prekursorowych, zawierających często więcej niż 1 tRNA i wtedy podlegają przekształceniom nukleolitycznym i zmniejszeniu wielkości; proces jest katalizowany przez swoistą klasę rybonukleaz. W dodatku geny niektórych cząsteczek tRNA mają, bardzo blisko części odpowiadającej pętli antyk odonowej, pojedynczy intron o długości 10-—40 nukieotydów. Te introny w genach tRNA są przepisywane; dlatego też przekształcanie prekursorowych transkryptów wielu cząsteczek tRNA musi obejmować usunięcie intr.ouów i odpowiednie rlp^-nie rpginn^ antyjcodoiiowego tak, aby powstała aktywna cząsteczka adaptacyjna do syntezy białek. Enzymy nukleolityczne, przekształcające prekursory tRNA, rozpoznają najpewniej 3-wy miarową strukturę, a nie tylko sekwencję liniową RNA. Dzięki temu ten układ enzymatyczny przekształca tylko te cząsteczki, które są zdolne do sfaldowania w produkty mające właściwości czynnościowe. Dalsze modyfikacje cząsteczek tRNA obejmują alkilację nukieotydów i dołączenie charakterystycznej końcówki C-C-A przy końcu 3' cząsteczki. Ta końcówka C-C-A jest miejscem przyłączenia swoistego aminokwasu, który ma wejść w reakcję polimeryzacji podczas syntezy białka. Metylacja prekursorów tRNA u ssa-

ków zachodzi prawdopodobnie w jądrze, podczas gdy o"9cTęcie i dołączenie C-C-A są czynnościami cytoplazmatycznymi, ponieważ końcówki te mają szybszy metabolizm niż same cząsteczki tRNA. W cytoplazmie komórek ssaków są enzymy niezbędne do dołączenia aminokwasów do reszt C-C-A. Rybosomalny RNA (rRNA) jest syntetyzowany jako duża cząsteczka prekursorowa W komórkach ssaków 2 większe cząsteczki rRNA i 1 mniejsza cząsteczka rRNA są przepisane jako część pojedynczej dużej cząsteczki prekursorowej (ryc. 39-11). Cząsteczka prekursorowa jest następnie na terenie jąderka przekształcana, w wyniku czego powstają składowe RNA dla podjednostek rybosomów znajdujących się w cytoplazmie. Geny rRNA są umiejscowione w jąderkach komórek ssaków. W każdej komórce znajdują się setki kopii tych genów. Geny rRNA są przepisywane jako jednostki, z których każda koduje (w kierunku 5'-*3') 18S, 5,_8S i 28S rybosomalny RNA. Pierwotny transkrypt j?st cząsteczką o masie 45S silnie z me ty 1 owa ną nartę renie jąderka. Prekursorów a cząsteczka 45S, dająca ewentualnie segment 28S, zawiera 65 grup metylowych w rybozach i 5 grup metylowych w zasadach. Metylowane są tylko te części prekursora, które ewentualnie staną się stabilnymi cząsteczkami rRNA. Cząsteczka prekursorowa 45S jest przekształcana nukleolitycznie, ale sygnały do tego przekształcania są zupełnie inne niż te, które znajdują się w hnRNA. Stąd przekształcanie nukleolityczne zachodzi na drodze mechanizmu swoistego i odmiennego od tego, który jest odpowiedzialny za przekształcenie hnRNA do mRNA. Jak przedstawiono na ryc. 39-11 prawie połowa oryginalnego pierwotnego transkryptu jest degradowana. W czasie przekształcania rRNA zachodzi dalsza metylacja i ewentualnie na terenie jad erek łańcuchy 28S łączą się z białkami rybosomalnymi i tworzą większą podjednostkę rybosomalną o masie 60S. Cząsteczka 5,8S rRNA powstaje także z prekursorowego .Rhl A 45S na terenie jąderka i staje się integralną częścią podjednostki rybosomalnej. Mniejsze rybosomalne podjednostki (40S) tworzą się przez połączenie odpowiednich białek rybosomalnych z cząsteczką 18S rRNA.

488 / ROZDZIAŁ 39

|5.es Ryc. 39-11. Schematyczny obraz przekształcania rybosomalnego RNA, Końcowe produkty są pokazane jako zaczernione pałeczki. Seria złożonych procesów potranskrypcyjnych, obejmujących przekształcanie przy użyciu auto- i egzonukleolitycznych, swoistych dla RNA, rybonukleaz generuje rR NA klas 18S, 5,8S i 28. Cząsteczki 5,8S i 28S są związane ze sobą wiązaniami wodorowymi. Na ryc. 39-4 pokazano fotografię z mikroskopu elektronowego rybosomalnych genów w trakcie transkrypcji.

z tych klas znajdują się enzymy zdolne do rozszczepienia wewnętrznych wiązań fosfodiestrowych, w wyniku czego powstają końcówki 3'-hydroksylowe i 5'-fosforanowe albo 5'-hydroksylowe i 3'-fosforanowe. Enzymy te nazywa się endonukleazami. Niektóre z nich zdolne są do hydrolizy obu pasm dwupasmowej cząsteczki, podczas gdy inne mogą przecinać pojedyncze pasma kwasów nukleinowych. Niektóre nukleazy mogą hydrolizować tylko niesparowa-

28S

KWASY TRAWIONE NUKLEAZY

NUKLEINOWE SĄ PRZEZ SWOISTE

Od wielu lat są znane enzymy zdolne do rozkładu kwasów nukleinowych. Enzymy te są klasyfikowane w różny sposób. Te, które są swoiste w.stosunku do kwasu_de.Qksyjpy.bonukkinowego nazywa sie deoksyryhonukLeazami, a te, które swoiście Tiydrolizują kwasy rybonukleinowe są rybonukleazami, W obrębie każdej

SYNTEZA, PRZEKSZTAŁCANIE I METABOLIZM RNA /

ne pojedyncze pasma, podczas gdy inne mają zdolność' hydrolizowania pojedynczych pasm pozostających w strukturze dwupasmowej cząsteczki. Istnieją klasy endonukleaz. _które rozpoznają swoiste sekwencje w DNA; większość z nich to endonukleazj restrykcyjne, które obecnie stały się ważnym narzędziem w genetyce molekularnej i naukach medycznych. W tabeli 42.1 przedstawiono listę niektórych obecnie znanych endonukleaz restrykcyjnych. Niektóre nukleazy są zdolne hydrolizować nukleotyd tylko wówczas, gdy znajduje się on na końcu cząsteczki; są to egzonukieazy. Egzonukleazy działają tlkoWjectayjiJeruK y ją y j y j J . 3' aipo a -» 5 j. u bakterii eg^ortuiOeaza 3'-» 5' jest mtegraTną"ćzęścią replikacyjnej maszynerii DNA, gdzie służy do odcięcia świeżo dodanego deoksynukleotydu w przypadku błędnego parowania zasad.

REGULACJA ROZPADU STANOWI JESZCZE INNY MECHANIZM REGULUJĄCY ILOŚĆ INFORMACYJNEGO RNA Chociaż w komórkach ssaków większość mRNA jest bardzo stabilna (okresy półtrwania wynoszą godziny) obrót innych jest bardzo szybki (okresy póhrwania 10 — 30 min). W aiektórych przepadkach stabilność mRNA podlega regulacji. Ma to ważne implikacje, ponieważ zwykle mamy do czynienia z prostą zależnością między iJością mRNA a przetłumaczeniem tego mRNA na kodowane przez niego białko. Zmiany w stabilności swoistych mRNA mogą mieć przeto duże wpływy na procesy biologiczne. Informacyjne RNA egzystują w cytopiazmie jako cząsteczki rybonukleoproteinowe (RNP).

Czapeczka -----

5'NCS

O

489

Niektóre z białek ehronią mRNA przed trawieniem przez- Hukleazy, podczas gdy inne mogą w pewnych warunkach pobudzać atak nukleazowy. Sądzi się, że mRNA są stabilizowane łub destabilizowane przez interakcje białek z ich różnymi strukturami i sekwencjami. Niektóre efektory, np. honnony, mogą regulować stabilność mRNA przez zwiększanie lub zmniejszanie ilości tych biaiek. Obecnie wiadomo, że końce cząsteczek mRNA odpowiadają za stabilność mRNA (p. ryc. 39-12). Struktura, zwana czapeczką, w końcu 5r cukariotycznego mRNA zapobiega atakowi 5' egzonukleaz, a sekwencja poli (A) zapobiega "aktywności 3' egzonukieaz. Zakłada się, że w cząsteczkach mRNA mających te struktury pojedynczy atak endonukleolityczny pozwala na atak egzonukieaz i strawienie całej cząsteczki. Sądzi się, że inne struktury (sekwencje) w obrębie 5' niekodujących sekwencji (5' NCS), w obrębie regionu kodującego i w obrębie 3'NCS mogą pobudzać albo zapobiegać temu początkowemu działaniu endonukleaz (ryc. 39—12). W celu ilustracji podano kilka przykładów. Usunięcie 5'NCS powoduje 3 — 5-krotne przedłużenie okresu półtrwania c-myc mRNA. Skrócenie kodującego regionu histonowego mRNA powoduje przedłużenie okresu półtrwaoia. Rodzaj autoregulacji stabilności mRNA pośrednio obejmuje region kodujący. Wolna tubulina wiąże się z pierwszymi 4 aminokwasami powstającego łańcucha tubuliny, w miarę jak ten wyłania się z rybosomu. Powoduje to aktywację RNazy związanej z rybosomem, która następnie trawi mRNA tubuiiny. Struktury przy końcu 3', łącznie z sekwencją poli(X7 wymagają tub osłabiają stabilność swoistych mRNA. Brak sekwencji poli(A) jest związany z szybkim rozkładem mRNA, a zabranie

Sekwencja Kodujące

3'NCS

----A-A-A-A-A"

AUUUA

Ryc. 39-12. Struktura typowego eukariotycznego mRNA pokazująca elementy biorące udział w regulacji stabilności mRNA. Typowy eukariotyczny mRNA ma 5' niefcoduja.ee sekwencje (5' noncoding sequences, 5' NCS), region kodujący i 3' NCS. Prawie wszystkie eukariotyczne mRNA mają czapeczkę zmodyfikowa nych nukleotydów (cap) w końcu 5' i większość ma w końcu 3' trakt („ogon") sekwencji poliadenylowych. Czapeczka u końca 5' i ogon poli (A) u końca 3' chronią mRNA przed atakiem egzonukieaz.

-

490 / ROZDZIAŁ 39

poli(A) z niektórych RNA powoduje ich destabilizację. Histonowe mRNA nie mają sekwencji poli(A), ale przy końcu 3' mają sekwencję, która może tworzyć strukturę pętli z szypułą i ta struktura wydaje się być odpowiedzialna za oporność na atak egzonukleolityczny. mRNA histonu H4jest np, degradowany od końca 3' do 5', ale tylko wówczas, gdy zajdzie pojedyncze przecięcie endonukleolityczne w odległości ok. 9 nukleotydów do końca 3', w rejonie zdolnym wytworzyć strukturę pętli z szypułą. Struktury typu pętla z szypulą w obrębie 3* niekodujących sekwencji końca 3' są także krytyczne dla regulacji jonami żelaza mRNA kodującego receptor transferyny. Struktury pętla-szypuła są również związane ze stabilnością mRNA u bakterii, co sugeruje, że mechanizm ten jest szeroko wykorzystywany. Inne sekwencje końca 3' pewnych eukariotycznychmRNA biorą udział w destabilizacji tych cząsteczek. Szczególnie interesujące są regiony bogate w sekwencje AU, z których wiele zawiera sekwencje (motyw) AUUUA. Sekwencje takie znajdują się w mRNA, które mają krótki okres półtrwania i obejmują mRNA dla wielu onkogenów i cytokin. Ważność tego regionu uwypukla doświadczenie, w którym sekwencja odpowiadająca regionowi niekodującemu 3' krótko żyjącego mRNA,czynnika stymulującego kolonie (CSF), który zawiera motyw AU U U A, byta dodana do końca 3' mRNA P-globiny. Zamiast uzyskania dużej stabilności taki hybrydowy mRNA |3-globiny stal się krótko żyjącym mRNA, CO jest cechą charakterystyczną mRNA CSF. Z tych kilku cytowanych przykładów jasno wynika, że liczne mechanizmy

uczestniczą w regulacji stabilności mRNA, podobnie jak liczne mechanizmy biorą udział w regulacji syntezy mRNA CSF. Skoordynowana regulacja tych 2 procesów daje komórce znaczną zdolność adaptacyjną.

PIŚMIENNICTWO Breathnach R, Chambon P: Organization and eipression of eucaryotic split genes coding for proteina. Annu Rev Biochem 1981;5O:349. Dynan WS, Tjian R: Control of eucaryotic mRNA synthesis by seąuence specific DNA binding proteins. Naturę (Łondon) 1985i3I6:774. Maniatis T, Read R; The role of smali nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splieing. Naturę (London) 1987:315:671. McClure WR: Protein-nucleic acid interactions in transcription: A molecular analysis. Annu Rev Biochem 1985;54:171. McKnight S, Tjian R: Transcriptional selectivity of viral genes ia mammalian cells. Celi 1986; 46:795. Nevins JR: The pathway of eukaryotic mRNA formation. Annu Rev Biochem 1983,52:44J. Pacigett RAet al: Splicingof messenger RNA precursors. Annu Rev Biochem 1986;55:1119. Ross J: The turnover of messenger RNA. Sci Ani 1989;260:48. Ruskin B et al: Excision of an intact intron as a novel lariat structure during pre-mRNA splicing in vitro. Cel! 1984;38:317. Sentenec A: Eucaryotic RNA polymerases. Crit Rev Biol 1985;18:31. Shapiro DJ et al: Regulation of mRNA stability in eukaryotic cells. Bioessays 1987;6:221, Sliarp PA; On the origin of RN A splicing and introns. Celi 1985;42:397.

■

Synteza białek i kod genetyczny

40

Dary! K. Granner, MD

WPROWADZENIE Litery A, G, T i C odpowiadają nukleotydom występującym w DNA. Są one zorganizowane w 3 literowy kod zwany kodonem, a zbiór tych kodonów obejmuje kod genetyczny. Linijny szereg kodonów (gen) określa syntezę różnych cząsteczek RNA, z których większość jest włączona w syntezę białek. Synteza białek zachodzi w 3 głównych etapach: inicjacji, elongacji i termin acji. Proces ten przypomina replikację DNA i generalną zasadę transkrypcji i faktycznie przebiega z zachowaniem polarności 5'—3'.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Zrozumienie syntezy białek i wyjaśnienie mutacji było niemożliwe zanim nie został wyjaśniony kod genetyczny. Kod genetyczny stanowi podstawę do wyjaśnienia, w jaki sposób wady w białkach mogą wywoływać choroby genetyczne oraz w diagnostyce i w pewnych przypadkach leczenia tych chorób. Ponadto patofizjologia wielu zakażeń wirusowych jest związana ze zdolnością wirusów do przerywania syntezy białek gospodarza.

INFORMACJA GENETYCZNA PRZEPŁYWA Z DNA DO RNA ł DO BIAŁEK Informacja genetyczna zawarta w sekwencji nuktetsdytów DNA jest przepisywana w jądrze komórkowym na swoistą sekwencję nukleotydów w cząsteczce RNA. Sekwencja nukJeotydc-w w transkrypcie RNA jest komplementarna

do sekwencji nukleotydów w kodującym paśmie odpowiedniego genu, stosownie do reguły parowania zasad. Wiele różnych klas RNA bierze udział w kierowaniu syntezą białek. U prokariontów zachodzi linijna współzależność między genem a informacyjnym RNA (mRNA) przepisywanym z genu i produktem nohpeptydowym. Sytuacja ta jest bardziej sTcompIikowana w komórkach wyższych organizmów eukariotycznych, w których pierwotny transkrypt, heterogenny jądrowy RNA (hnRNA), jest znacznie dłuższy niż dojrzały mRNA. Duża cząsteczka hnRNA zawiera kodujące regiony (eksony), które będą tworzyły dojrzały mRNA, oraz długie sekwencje wtrącone (introny), które oddzielają eksony. hnRNA podlega przekształceniom na terenie jądra i introny, które często stanowią większą część hnRNA niż eksony, zostają usunięte. Eksony są w tym procesie łączone i tworzą dojrzały mRNA, który jest transportowany do cy toplazmy, gdzie ulega translacji na białko. Komórka musi mieć niezbędny mechanizm do dokładnego i wydajnego przetłumaczenia informacji z nukleotydowej sekwencji mRNA na sekwencję aminokwasów odpowiedniego swoistego białka. Wyjaśnienie i zrozumienie tego procesu, zwanego translacją, było możliwe po złamaniu kodu genetycznego. Już we wczesnym okresie badań było wiadomo, że cząsteczki mRNA jako takie nie mają powinowactwa do aminokwasów, a zatem translacja informacji zawartej w sekwencji nukleotydów mRNA na sekwencję aminokwasów w białku wymaga pośredniczącej cząsteczki adaptacyjnej. Taka cząsteczka adaptacyjna musi z jednej strony rozpoznać sekwencję nukleotydową, a z drugiej swoisty aminokwas. Za pomocą takiej cząsteczki

492 / ROZDZIAŁ 40

adaptacyjnej komórka może wprowadzić aminokwas w odpowiednią pozycję sekwencji białkowej dyktowanej sekwencją nukleotydów swoistego mRNA, Istotnie funkcjonalne grupy aminokwasów nie kontaktują się bezpośrednio z matrycą mRNA.

SEKWENCJA NUKLEOTYDÓW CZĄSTECZKI mRNA SKŁADA SIĘ Z SERII KODONÓW, KTÓRE ODPOWIADAJĄ KAŻDEMU AMINOKWASOWI Cząsteczki adaptacyjne, biorące udział w translacji kodbnow na sekwencje aminokwasów w białku, sa cząsteczkami ti (tRNA). Ryfeosom jest składnikiem komórki, na którym oddziaTują~ze~roba-różGe wspomniane elementy funkcjonalne, aby złożyć cząsteczkę białka. Liczne rybosomy mogą zbierać się w zespoły biorące udział równocześnie w procesie tłumaczenia pojedynczej cząsteczki mRNA; zespoły takie nazywamy poiisoniami. Polisomy przyłączone do błon cytoplazmy tworzą szorstką siateczkę środplazmałyczną, która służy dla syntezy integralnych białek błon wewnętrznych i białek, które będą wydzielone z komórki. Struktury polisomalne znajdują się także w cytoplazmie w postaci wolnej; zachodzi na nich synteza tych białek, które pozostaną w obrębie komórki. Do syntezy zestawu białek, komórkowych potrzeba 20 różnych aminokwasów, dlatego musi być przynajmniej 20 oddzielnych kodonówj które obejmują kod genetyczny. Ponieważ w mRNA występują tylko 4 różne mikleotydy. na każdy kodon musi przypadać więcej niż 1 nukleotyd purynowy lub pi rym idy no wy. Kodony, z których każdy składałby się z 2 flufcleotydów, dałyby tylko 16 (4') swoistych kodonów, podczas gdy kodony o 3 nukleotydach dałyby 64 (43) swoistych kodonów. W wyniku pierwszych spostrzeżeń Matthaei i Nirenberga wiemy obecnie, że każdy z kodonów ma sekwencję 3 aukJcotydów, czyli kod składa się z tripletów niikjegfrflów. Złamanie kodu genetycznego w dużej mierze zależało od chemicznej syntezy polimerów nukleotydowych, a zwłaszcza tripletów nukleotydowych.

KOD GENETYCZNY JEST ZDEGENEROWANY, JEDNOZNACZNY, NIENAKŁADAJĄCY SIĘ, BEZPRZESTANKOWY I UNIWERSALNY Trzy spośród kodonów nie kodują swoistego aminokwasu; nazwano le Kodonami nonsensownymi. Przynajmniej 2 z tych nonsensownych kodonów są używane w komórce jako sygnały terminach'. Określają one, gdzie należy zatrzymać polimeryzację aminokwasów w cząsteczce białkowej. PózostałyćTi 61 kodonów koduje 20 aminokwasów. W kodzie genetycznym występuje zatem ląjfeff&ilgffJtfiłjjC;tztl-i że |igzne j^ n! sam aminokwas, iiadanie kodu genetycznego wskazuje, że 64 możliwe kodony mogą być zgrupowane w 16 rodzin. Rodzinę tworzą takie kodony, które mają. te same pierwsze 2 zasady (tab. 40-1). Każda rodzina zajmuje pojedynczą kolumnę między Imiami poziomymi, np. kodony CCN, gdzie Ń może być U, C, A i G, definiują rodzinę umiejscowioną w 2 kolumnie 2 przedziału od góry. W niektórych rodzinach wszystkie 4 kodony kodują ten sam aminokwas, podobnie jak członkowie rodziny CC opisani wyżej. Odnosi się to do rodzin niemieszanych. Kodonów niemieszanych jest 8 wśród 16 rodzin kodonów (tab. 40-1). Te rodziny kodonów, które kodują więcej niż 1 aminokwas, określa się jako rodziny mieszane. W 6 rodzinach, spośród rodzin mieszanych, kodony zawierające pirymidynę (U lub C) w 3 pozycji kodują 1 aminokwas, podczas gdy kodony zawierające w 3 pozycji purynę (A lub G) kodują inny aminokwas albo stanowią sygnał lerminacji łańcucha (tab. 40-1). Pozostałe 2 rodziny — rodzina UG i rodzina AU — nie wykazują żadnego z tych wzorów i są unikatowymi. Na ogół więc 3 nukleotyd w kodonie jest mniej ważny niż pozostałe 2 w określeniu swoistego aminokwasu, jaki musi być wbudowany do białka i zjawisko to odpowiada głównie za degenerację kodu. Jednak dla każdego swoistego kodonu wskazuje się tylko pojedynczy aminokwas; z rzadkimi wyjątkami kod genetyczny jest jednoznaczny, ti. dany swoisty kodiiiujesIriEZjpisany dopryedjaiGzegojimino diiijIriEZjpisany dopryedjaiGzegojimino kwasu. Rozróżnienie między _dwuznąc_znoscią a degeneracją jest ważnyni,. godnym podkreślenia, pojęciem. Jednoznaczny, ale zdegeneFswafty-kodjaoże być objaśniony w kategoriach molekularnych.

SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY / 493 Tabela 40-1. Kod genetyczny kodony w informacyjnym RNA)" Pierwszy

Drugi

nukleotyd

nukleotyd

U

C

A

G

U

C

Phe Pne Leu Leu Leu

Trzeci nukieotyd

A

G

Ser

Tyr

Cys

U

Ser Ser

Ser

TV r Term Term

Cys Term' Trp

C A G

Pro

His

Arg

U

Leu Leu Leu

Pro Pro Pro

His Gin Gin

Arg Arg Arg

C A

G

Ile

Thr

Asn

Ser

U

de Ile" Met

Thr Thr Thr

Asn Lys Lys

Ser Arg* Arg"

C

Val

Ala

Asp

Gly

U

Val Val Val

Ala Ala Ala

Asp Glu Glu

Gly Gly Gly

C A G

A G

* Określenia pierwszy, drugi i trzeci nukleotyd odnoszą się do indyw idualny ch nukleo ty dów w kodonie tripletowym. U — nukleotyd urydyny; C — nukleotyd cytydyny, A — nukleotyd adeniny; G — nukleotyd guaniny; Met — kodon inicjujący łańcuch peptydowy; Term — kodon kończący łańcuch. AUG — triplet kodujący Met, służy jako kodon inicjujący w komórkach ssaków. (Skróty aminokwasów są objaśnione w rozdz. 3). ** W mitochondriacb ssaków AUA koduje Met a UGA — Trp; kodony AGA I AGG służą J3ko sygnały kończące łańcuch.

Rozpoznanie swoistych kodonów w mRNA przez adaptacyjne cząsteczki tRNA jest zależne od ich regionu antykodonowego i reguł swoistego parowania zasad. Każda cząsteczka tRNA zawiera swoistą sekwencję komplementarną do kodonu, którą nazywa się antyk odo nem. Dla danego kodonn_jw~ -riRNA lylko pojedynczy roĆTźaj cząsteczki tRNA ma odpowiedni anty kod on. Ponieważ każda cząsteczka tRNA może być obarczona tylko 1 swoistym aminokwasem, dlaiego każdy kodon określa tylko 1 aminokwas. Jednak niektóre cząsteczki tRNA mogą używać antykodonu do rozpoznawania więcej niż 1 kodonu. Jak można zaobserwować na przykładzie niemieszanych rodzin kodonów,

nukleotyd w antykodonie, który rozpoznaje 3. zasadę (w kierunku 3') kodonu, może być mniej dyskryminującym (rodziny mieszane) albo niedyskryminującym (rodziny niemieszane), a mimo to jest w stanie wprowadzić odpowiedni, aktualnie potrzebny, aminokwas. Zjawisko to zmniejsza rygor parowania między 3 zasadą kodonu a komplementarnym nukleotydem w antykodonie i objaśnia je hipoteza tolerancji („wobble" hypothesis). Zjueltcznymi wyjątkami dany swoisty kodon będzie wprowadza! tylko 1 swoisty aminokwas, chociaż .dany swoisty aminokwas może być rozpoznany przez więcej niż 1 kodon. "Jak "to wyjaśnimy niżej odczytywanie kodu genetycznego w trakcie procesu synt^^y jj d łdjh i g ^^y nie obejmuje żadnych nakładających się kodonów. Kod genetyczny jest wiec kodem nienakłaeJającym się. Od momentu, od którego zacznie się odczytywanie od swoistego kodonu nie ma znaków przestankowych między kodonami 1 przekaz informacji jest odczytywany z ciągłej sekwencji triplctów nukleotydowych, aż do cza su gdy osiągnie się kodon nonsensowny. Dotychczas sądzono, że kod genetyczny jest uniwersalny. Obecnie wykazano, że grupa cząsteczek tRNA w mitochondriach (które zawierają oddzielny i różniący się od cytoplazmatycznego mechanizm translacyjny) u niższych i wyższych eukariontów, z człowiekiem włącznie, odczytuje 4 kodony w sposób inny niż cząsteczki tRNA w cytoplazmie nawet tych samych komórek. Jak to wynika z tab. 40-1, kodon AUA jest odczytywany jako Met, a UGA koduje Trp w mitochondriach u ssaków. Te 2 kodony mieszczą się w 2 rodzinach kodonów określonych jako unikatowe: w rodzinie UG i rodzinie AU. Oczywiście w celu zmniejszenia liczby cząsteczek tRNA, niezbędnych do trans lacji kodu genetycznego, mitochondria były zdolne przekształcić rodzinę UG i rodzinę AU do prostych typów mieszanych. Ponadto kodo ny AGA i AGG są odczytywane jako sygnały stop, czyli kodony terminacji łańcucha, a nie jako kodony Arg. W wyniku tego mitochondria potrzebują jedynie 22 rodzaje cząsteczek tRNA, aby odczytać swój kod genetyczny, podczas gdy system translacji w cytoplazmie ma pełny ze staw 31 rodzajów cząsteczek tRNA. Oprócz tego wyjątku kod genetyczny jest uniwersalny. Częstość, z jaką jest używany kodon każdego aminokwasu, różni się znacznie między gatun kami i w obrębie różnych tkanek tego samego gatunku. Zestawienia częstości używania kodo-

494 / ROZDZIAŁ 40

nów stają się coraz dokładniejsze w miarę jak coraz więcej genów jest sekwencjonowanych. Ma to duże znaczenie, ponieważ badacze potrzebują odtworzyć strukturę mRNA na podstawie dedukcji sekwencji aminokwasów w części białka w celu uzyskania, na drodze syntezy, sondy oligonukleotydowej niezbędnej do rozpoczęcia procesu klonowania rekombinacyjnego DNA.

DLA KAŻDEGO Z 20 AMINOKWASÓW ISTNIEJE PRZYNAJMNIEJ 1 RODZAJ TRANSFEROWEGO RNA (tRNA) Cząsteczki tRNA mają zadziwiająco podobne funkcje i trójwymiarowe struktury. Funkcja cząsteczek rRNA jako adaptatorów wymaga obarczenia każdego swoistego tRNA swoistym aminokwasem. Ponieważ nie ma powinowactwa kwasów nukleinowych do swoistych grup funkcyjnych aminokwasów, rozpoznania musi dokonać cząsteczka białka zdolna do rozpoznania swoistej cząsteczki tRNA i swoistego aminokwasu. Dla tych swoistych funkcji rozpoznawczych i dla właściwego dołączenia 20 aminokwasów do swoistych cząsteczek tRNA jest konieczne przynajmniej 20 swoistych enzymów. Proces^ rozpoznania i dołączenia aminokwasu (proces oTiarczenla tRNA} przebiega w 2 etapach dla każdego enzymu swoistego dla każdego z 20 aminokwasów. Enzymy te są nazwane syntetazami aminoacyla-tRNA...Tworzą one aktywny kompleks pośredni aminoacylo-AMP-enzym, który przedstawiono na ryc. 40-1. Swoisty kompleks aminoacylo-ĄMP-enzym rozpoznaje następnie swoisty tRNA, do którego dołącza resztę aminoacylową przy po-

zycji 3'-hydroksylowej końcowej adenozyny. Aminokwas pozostaje przyłączony do swoistegtrtRNĄ wiązaniem estrowym do czasu, aż będzie użyty do polimeryzacji w swoistej pozycji w trakcie tworzenia prekursora polipeptydowe^~ go cząsteczki białkowej. Na tym etapie naszych rozważań musimy powrócić do ważnych regionów cząsteczki tRNA opisanych w rozdz. 37 (i zilustrowanych na ryc. 37-11). Ramię tymidyna-pseudourydyna-cytydyna (T?Ć) jest włączone w proces wiązania aminoacylo-tRNA do powierzchni rybosomu w miejscu syntezy białka. Ramię D jest jednym z miejsc istotnych do właściwego rozpoznania danego rodzaju tRNA przez właściwą mu syntetazę aminoacylo-tRNA. Ramię akceptorowe, umiejscowione przy końcu 3'^hydroksyloadenozylowym jest miejscem.dołączenia swoistego aminokwasu. Region antykodonowy składa się z JLoukleotydów i jest rozpoznawany przez 3-liteiawy kodon w mRNA (ryc. 40-2). Sekwencja ta, odczytywana w pętli antykodonowej w kierunku 3' do 5', składa się z: dowolnej zasady zmodyfikowanej puryny-X-Y-Z—pirymidyny-pLrymidyny—5'. Zwróć uwagę, że kierunek odczytu antykodonu jest 3' do 5', podczas gdy kod genetyczny w tab. 40-1 jest odczytywany w kierunku 5' do 3', ponieważ kodon mRNA i pętla antykodonu w tRNA są przeciwrownoJegłe pod względem komplementamości. Degeneracja kodu genetycznego odnosi się głównie do ostatniego nukleotydu w triplecie kodonowym, co sugeruje, że parowanie zasad między tym ostatnim nukkoiydem a odpowiadającym mu nukleotydem w antykodonie nie jest precyzyjne. Jak to przedstawiono wyżej, zjawisko to objaśnia hipoteza tolerancji; w tym

ATP

HOOC-HC-R

OH

Aminokwas (AA)

AMP + Enz

Enz— Adenina — Ryhoza-O—P— 0-C— CH-R

Enzym (Enz} SYNTETAZA AMINOACYLO-tRNA

NH.

EnZnAMP-AA (aktywowany aminokwas) tRNA Kompleks amlnoacyla-AMP-enzym

tRNA -AA

Aminoacylo-tRNA

Ryc. 40-1. Tworzenie aminoacylo-tRNA. Dwustopniowa reakcja przy udziale enzymu syntetazy aminoacylo-tRNA prowadzi do utworrenia aminoacylo-tRNA. Pierwsza reakcja obejmuje utworzenie kompleksu AMP-aminokwas-enzym. Taki zaktywowany aminokwas jest przenoszony następnie na odpowiednią cząsteczkę tRNA. AMP i enzym uwalniają się i enzym może być ponownie użyty w reakcji.

SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY / 495

mRNA

5'

kodon

nie odgrywa roli w rozpoznaniu kodonu. Jak to zanotowano wyżej reszta aminoacylowa nigdy nie kontaktuje się bezpośrednio z matrycą mRNA zawierającą kodony.

MUTACJA POWSTAJE W WYNIKU PEWNYCH TYPÓW ZMIAN, KTÓRE ZACHODZĄ W SEKWENCJI NUKLEOTYDÓW i)Ramieantytw<Jonowe 2)RamięT^C

3 ) F ta m O lą

Ryc. 40-2. Rozpoznanie kodonu przez antykodon Jednym z kodonów dla fenyloalaniny jest U-U-U. tRNA obarczony fenyloalaniną (Phe) ma komple mentarną sekwencję A-AA, która na zasadzie paro wania zasad tworzy kompleks z kodonem. Region antykodonowy zwykle składa się z sekwencji 7 nukleotydów w kolejności od 3' do 5': nukleotydu zmiennego (N), zmodyfikowanej puryny (Pu*), X, Y, Z i 2 pirymidyn (Py).

swoistym miejscu parowania nukleotydu do nukleotydu kodon i antykodon są w stanie „rozchwiania". Na przykład 2 kodony dla argininy A-G-A i A-G-G mogą się wiązać z tym samym antykodonem mającym uracyl przy swoim końcu 5'. Podobnie 3 kodony dla glicyny, G-G-U, G-G-C i G-G-A, mogą tworzyć pary zasad z 1 kodonem C-C-I. „I" jest nukleotydem inozyny, inną jeszcze szczególną zasadą pojawiającą się w cząsteczkach tRNA. Rozpoznanie kodonu przez cząsteczkę tRNA nie zaieży od aminokwasu, który jest związany przy końcu 3'-hydroksylowym. Wykazano to w pomysłowym doświadczeniu przez obarczenie tRNA swoistego dla cysteiny (tRNAcys) cysteiną radioaktywną. Na drodze chemicznej reszta cysteinylowa została następnie zmieniona tak, aby uzyskać cząsteczkę tRNA swoistą dla cysteiny, ale obarczoną alaniną. Chemiczna transformacja reszty cysteinylowej do alanilowej nie zmieniła części antykodonowej cysteinoswoistej cząsteczki tRNA. Gdy taki alanilo-tRNA^s został użyty do translacji hemoglobinowego mRNA, wówczas radioaktywna alanina została wbudowana w normalne miejsce cysteinowe w cząsteczce białka hemoglobinowego. Doświadczenie to wykazało, że pochodna

Chociaż początkowa zmiana może nie zachodzić w kodującym paśmie dwupasmowej cząsteczki DNA w danym genie, to po replikacji siostrzane cząsteczki DNA, zawierające mutacje w paśmie kodującym, będą się segregować i pojawią się w populacji organizmów.

Niektóre mutacje zachodzą na drodze podstawienia zasad

Zmiany w pojedynczej zasadzie (mutacje punktowe) mogą być typu tranzycji lub iranswersji. W pierwszym przypadku dana pirymidyna jest zamieniona na inną pirimidynę lub dana puryna jest zamieniona na inną purynę. Transwersje są to zmiany puryny na 1 z 2 pirymidyn albo zamiany pirymidyny na 1 z 2 puryn, jak to przedstawiono na ryc. 40-3.

Tranzyoje

Transwersje

Ryc. 40-3. Schematyczne przedstawienie mutacji typu tranzycji i transwersji. ____________

Jeśli sekwencja nukleotydowa genu zawierająca mutację ulega transkrypcji na cząsteczkę RNA, to cząsteczka RNA będzie miała zmianę w postaci komplementarnej zasady w miejscu odpowiadającym tej mutacji. Zmiany pojedynczej zasady w cząsteczkach mRNA mogą powodować różne skutki, jeżeli ulegną translacji na białko: 1. Może nie wystąpić żaden wykrywalny sku-

tek, ponieważ kod jest zdegenerowany. Będzie to tym bardziej prawdopodobne, gdy zmieniona zasada w cząsteczce mRNA jest 3. nukleotydem kodonu. Zgodnie z hipoteza, toleran-

496 / ROZDZIAŁ 40

cji, translacja kodonu jest mało wrażliwa na zmianę w pozycji 3. Skutek typu mutacji sensu (missense) zajdzie wówczas, gdy odmienny aminokwas zostanie wbudowany w odpowiednie miejsce w cząsteczce białka. Taki blednie dobrany aminokwas, czyli mutacja sensu, w zależnoś ci od umiejscowienia w swoistym białku może być akceptowalny, częściowo akceptowalny lub nie akceptowalny w odniesieniu do funkcji tej cząsteczki białkowej. Ze szczegółowej ana lizy kodu genetycznego można wyciągnąć wnio sek, że większość zmian w pojedynczej zasa dzie prowadzi do zastąpienia 1 aminokwasu przez inny aminokwas mający raczej podobne grupy funkcjonalne. Jest to bardzo skuteczny mechanizm, który zapobiega drastycznym zmianom w fizycznych właściwościach cząste czki białkowej. Jeśli zachodzi błędny akcep towalny skutek, to powstająca cząsteczka biał kowa może nie być odróżniana od normalnej cząsteczki. Jeśli zachodzi błąd nie akceptowal ny, cząsteczka białkowa nie będzie zdolna spra wować przypisanej jej funkcji. Kodon typu nonsens może się pojawiać i powodować przedwczesną terminację w proce sie wbudowywania aminokwasów do łańcucha peptydowego, w wyniku czego zostaje wytwo rzony tylko fragment zamierzonej cząsteczki Hb Milwaukee

(Glutamlnlan)

Hb Bristol Asparaglnlan

białkowej. Jest duże prawdopodobieństwo, że przedwcześnie ukończona cząsteczka białka lub fragment peptydu nte będą spełniały przypisanej im funkcji. Cząsteczka hemoglobiny może być użyta do wykazania skutków zmian w pojedynczej zasadzie w strukturalnym genie hemoglobiny Niektóre mutacje nie powodują widocznego skutku. Brak skutku wynikającego ze zmiany w pojedynczej zasadzie może być wykazany tylko przez sekwencjonowanie nukleotydów w cząsteczkach mRNA lub w genach hemoglobiny u dużej liczby osób mających normalne cząsteczki hemoglobiny. Jednakże można dedukować, że kodon waliny w pozycji 67 łańcucha P hemoglobiny nie jest identyczny u wszystkich osób mających normalny łańcuch b1 hemoglobiny. Hemoglobina typu Milwaukee ma w pozycji 67 kwas glutaminowy; hemoglobina typu Bristol ma w tej pozycji kwas asparaginowy. Aby wyjaśnić zmiany aminokwasu zmianami w pojedynczej reszcie kodonu dla aminokwasu 67, należy wnioskować, że mRNA kodujący hemoglobinę typu Bristol zawiera! kodon G-U-U lub G-U-C zanim wystąpiła zmiana do G-A-U lub G-A-C, kodonów kodujących kwas asparaginowy (ryc. 40-4). Jednak mRNA kodujący

Hb A (normalna) Walfna

GAU

•+

HbSydney /HS7 Alanina

GUU

------* -

GUC

------+- GCC

GUA

------+~ GCA

GUG

------»- GCG

GCU

------------------------GAC

-*

-----------------------GA A - * -------------------------GAG

**

--------------------------

Ryc, 40-4. W warunkach prawidłowych walina w pozycji 67 iańcucha p hemoglobiny A może być kodowana jednym z 4 kodonów pokazanych w prostokącie. W hemoglobinie patologicznej typu Milwaukee aminokwas w pozycji 67 łańcucha P zawiera gfutaminian kodowany przez G A A lub G A G — każdy z tych kodonów może powstać z jednostopniowejtranswersji kodonów waliny G- U A lub G-U-G. Podobnie alanina, obecna w pozycji 67 łańcucha hemoglobiny typu Sydney, mogła powstać-w wyniku jed nos to pni owej tranzycji jeefnego z 4 kodonów waliny. Jednak reszta asparaginianu w pozycji 67 hemoglobiny typu 8ristol mogła powstać w wyniku jednostopniowej transwersji jedynie z kodonów waliny G-U-U lub G U C .

SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY / 497

hemoglobinę typu Milwaukee powinien mieć mniej w 2 rodzinach Japończyków. Ta hemow pozycji 67 kodon G-U-A lub G-U-G, aby globina ma asparagtne, która zastąpiła łizynę zmiana w pojedynczym nukieotydzie mogła w pozycji 61 łańcucha p. Odpowiadająca temu spowodować pojawienie się kodonów kwasu transwersja mogła być albo A-A-A lub A-A-G glutaminowego G-A-A lub G-A-G. Hemoglo- zamieniona albo na A-A-U lub na A-A-C. bina typu Sydney, która zawiera alaninę w po- Zastąpienie swoistej lizyny asparaginą pozornie zycji 67, mogła powstać przez zmianę pojedyn- nie zmienia normalnej funkcji łańcucha P u tych czego nukleotydu w którymkolwiek z 4 kodo- osobników. nów waliny (G-U-U, G-U-C, G-U-A lub GCzęściowo akceptowalne mutacje U--G), co dało kodony alaniny odpowiednio: sensu. Najlepszym przykładem częściowo akG-C-U, G-C-C, G-C-A lub G-C-G. ceptowalnej mutacji sensu (ryc. 40-5, środek) jest hemoglobina S (hemoglobina występująca Podstawienie aminokwasów w niedokrwistości sierpowatej), w której norpowoduje mutacje sensu malnie występujący aminokwas w 6 pozycji Akceptowalne mutacje sensu. Przy- łańcucha p-globiny — kwas glutaminowy został kładem akceptowalnej mutacji sensu (ryc. 40-5, zastąpiony wahną. Odpowiadająca temu zmia-' u góry) w strukturalnym genie łańcucha P he- na pojedynczego nukleotydu w kodonie kwasu moglobiny może być wykryta obecność zmie- glutaminowego G-A-A lub G-A-G byłaby Gnionej hemoglobiny, o odmiennych właściwoś- U-A lub G-U-G w kodonach waliny. Jest ciach elektrofbretycznych, która występuje oczywiste, że te mutacje sensu zaburzają norw erytrocytach z pozoru zdrowego osobnika. malne funkcje i prowadzą do niedokrwistości Hemoglobinę typu Hikari znaleziono przynaj- sierpowatej, jeżeli zmutowany gen jest obecny Cząsteczka białka Akceptowalna mutacja sensu

Aminokwas

Hb A łańcuch j

1

61 hzyna

Hb Hikari łańcuch fi

Częściowa akceptowalna mutacja sensu

HbA, łańcuch £

1

Hb S łańcuch fi

Nleakoeplo walna mutacja sensu

T

T

Kodony AAA

lub

AAG

AAU

lub

AAC

IX!

Afiparaglna

GAA

lub

GAG

Wallna

GUA

lub

GUG

i I

, I

Ct W \ 58Histydyna

Hb M (Boston), łańcuch a

W

lub

CAC

\0 lub UAC Tyrozyna

Ryc. 40-5. Przykłady 3 typów mutacji sensu, w wyniku których powstają patologiczne łańcuchy hemoglobiny. Wskazano zmiany w aminokwasach i możliwe zmiany w odpowiadających im kodonach. Mutacja w łańcuchu p hemoglobiny Hikari ma prawidłowe właściwości fizjologiczne, ale różni się pod względem ruchliwości elektroforetycznej. Hemoglobina S ma mutację w łańcuchu p i zachowuje częściową funkcję; hemoglobina S wiąże tlen, ale w postaci odtlenowanej wytrąca się. Hemoglobina M Boston zawiera mutację w łańcuchu a, umożliwia utlenienie jonu żelazawego hemu do jonu żelazowego, przez to w ogóle nie może wiązać tlenu.__________________________________ 32

Biochemia

498 / ROZDZIAŁ 40

w stanie homozygotyc2nym. Zmiana kwasu glutaminowego na wahnę może być rozpatrywana jako częściowo akceptowana, ponieważ hemoglobina S może wiązać i oddawać tlen, chociaż proces ten nie jest zupełnie normalny.

Nie akceptowane mutacje sensu. Nie

akceptowana mutacja sensu (ryc. 40-5, dól) w genie hemoglobiny daje niefunkcjonalną cząsteczkę hemoglobiny. Na przykład mutacje występujące w hemoglobinie M generują cząsteczki, które umożliwiają utlenienie żelaza Fei + reszty hemowej do Fe3+, w wyniku czego powstaje methemoglobina, Methemogłobina nie może transportować tlenu (p. rozdz. 7). Mutacje typu przesunięcia ramki odczytu powstają w wyniku delecji lub insercji nukfeotydów w genie i w ten sposób wytwarzają zmienione sekwencje nukleotydowe w cząsteczkach mRNA W wyniku delecji pojedynczego nukleotydu w kodującym paśmie genu powstaje zmieniona ramka odczytu w mRNA. „Maszyneria" uczestnicząca w translacji mRNA nie rozpoznaje brakującej zasady, ponieważ w trakcie odczytywania kodonów nie ma znaków przestankowych. W wyniku tego powstaje głęboka zmiana w sekwencji spolimeryzowanycb aminokwasów, jak to przedstawiono w przykładzie 1, na ryc. 40-6. Zmieniona ramka odczytu daje w rezultacie zniekształconą translację mRNA na całym obszarze dystalnym od miejsca delecji pojedynczego nukleotydu. Nie tylko jest zniekształcona sekwencja aminokwasów na obszarze dystalnym od tej deJecji, ale odczytywanie informacji może także ujawnić nonsensowny kodon i w ten sposób może zajść synteza zniekształconego i przedwcześnie ukończonego polipeptydu w jego końcu karboksylowym (przykład 3, ryc. 40-6). Jeśli delecji w genie ulegną 3 nukleotydy albo wielokrotność 3, to odpowiadający informacyjny RNA, gdy ulegnie translacji, da białko, w którym brak będzie odpowiedniej liczby aminokwasów (przykład 2, ryc. 40-6). Ponieważ ramkę odczytu stanowi triplet, faza odczytu nie zostanie zmieniona dla tych kodonów, które leżą dystalnie od miejsca delecji. Jeśli jednak zachodzi delecja 1 lub 2 nukleotydów tuż przed albo w obrębie normalnego kodonu terminacji {kodonu nonsensownego),, to może dojść do zaburzeń w odczytaniu sygnału normalnej terminacji. Taka delecja może prowadzić do od-

czytywania ponad sygnałem terminacji do momentu, aż znajdzie się następny inny kodon nonsensowny (przykład 1, ryc. 40-6). Doskonałym przykładem takiego zjawiska są dyskusje poświęcone hemoglobino patiom. Insercje 1, 2 lub niewiel o krotności 3 nukleotydów do genu dają w wyniku mRNA, w którym ramka odczytu jest zmieniona w czasie translacji i zachodzi taki sam skutek, jak w przypadku delecji. Może to być a) zniekształcona sekwencja aminokwasowa dystalna od miejsca insercji, b) generacja kodonu noosensowego w miejscu insercji 1ub w części dystalnej albo też niemożność rozpoznawania sygnału terminacyjnego (reading through). Jeśli po delecji w genie nastąpi insercją (lub odwrotnie), to taka insercja ponownie ustawi prawidłowo ramkę odczytu (przykład 4, ryc. 40-6). Przy translacji odpowiedniego mRNA uzyska się zniekształconą sekwencję aminokwasową między insercją a delecja, W obszarze po przywróceniu ramki odczytu sekwencja aminokwasową będzie prawidłowa. Można sobie wyobrazić, że różne kombinacje delecji i insercji albo delecje i insercje dadzą informację dla białka, którego-część będzie nieprawidłowa, ale ta część otoczona będzie przez normalną sekwencję aminokwasów. Takie zjawisko wykazano w sposób przekonujący u bakteriofaga T4; odkrycie to dostarczyło ważnego dowodu, że ramkę odczytu stanowi triplet. Mutacje supresorowe redukują skutki mutacji sensu, mutacji nonsensowych i przesuniecie ramki odczytu Powyższa dyskusja na temat zmienionych produktów białkowych w wyniku mutacji genów jest oparta na normalnie funkcjonujących cząsteczkach tRNA. W organizmach prokariotycznych i niższych organizmach eukariotycznych odkryto jednak cząsteczki tRNA, które funkcjonują nieprawidłowo i które same są wynikiem mutacji. Niektóre z tych nieprawidłowych cząsteczek tRNA są zdolne do supresji skutków mutacji w odległych genach strukturalnych. Te supresorowe cząsteczki tRNA, zwykle powstałe w wyniku zmian w ich regionach antykodonowych, są zdolne do supresji mutacji sensu, mutacji nonsensownych i mutacji z przesunięcia ramki odczytu. Ponieważ jednak cząsteczki supresorowego tRNA nie są zdolne rozróżnić kodon prawidłowy od kodonu powstałego w wyniku mutacji genu, ich obecność w komórce prowadzi zwykle do zmniejszonej

SYNTEZA BIAŁEK i KOD GENETYCZNY / 499

Stan normalny | Typ

dziki

mRNA

;

UAG UUUG

Poiłpeptyd

AUG

GCC

UCU

UGC

A AA

GGC

UAU

AG U

AGU

UAG...

Met-----Ala------Ser-----Cys------Lys------Gly------Tyr------Ser-------Ser

STOP

Przykład 1

mRNA

UAG

UUUG

Pollpeptyd

AG.

AUG Met-

Ala

Sekwencja zniekształcona Przykład 2

| D8lec]a(-3) | mRNA

UAG

UUUG

Pollpeptyd

AUG Met

GCC UCU ■Ala — Ser — -

AAA —Lys —

GGC

Gly

UAU

AGU

---- ----Ser

AGU UAG... - S e r STOP

Tyr —

Przyfcteda

I Inaercja (+1} | mRNA

UAG

UUUG

Pollpeptyd

AUG

GCC

AGG

Met—Ala-

CUA

UAG

-Leu

STOP

UAG

UUAG...

Sekwencja zniekształcona

Przykt*d4 Insercja ) Deleoja (—1]

mRNA Pollpeptyd

UAG

UUUG

AUG

GCC

Met- - A l a -

UUG UCU

CAA

AGG

UAU

AGU

AGU

UAG...

-Ser-

-Leu-----Gin------Arg-------Tyr-----Ser------Ser STOP SakwencjE zniekształcona

Ryc. 40-6. Wpływ delecji i insercji w genie na sekwencję nukleotydów w transkrypcje mRNA i na sekwencję aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym uzyskanym z mRNA. Strzałki pokazują miejsca delecji i insercji, a liczby w owalach odpowiadają liczbie usuniętych lub włączonych reszt nukleotydowych.

żywotaości komórki. Na przykład cząsteczki tRNA tłumiące mutacje nonsensowne mogą tłumić prawidłowe sygnały terminacji i umożliwiać translację mimo obecności kodonu „stop" („read-through") wówczas, gdy nie jest to pożądane. Cząsteczki supresorowego tRNA typu przesunięcia ramki odczytu mogą odczyty-

wać kodon prawidłowy i składową część przyległego kodonu, dając w len sposób przesunięcie ramki także wówczas, gdy nie jest to potrzebne. Cząsteczki supresorowego tRNA mogą istnieć w komórkach ssaków ponieważ u tych ostatnich zachodzi zjawisko transkrypcji „read-through".

500 / ROZDZIAŁ 40

Proces syntezy białek, podobnie jak replikacja DNA i transkrypcja genu, może być podzielony na 3 fazy: inicjację, elongację i terminację W rozdziale 39 opisano ogólne cechy strukturalne rybosomów i proces ich montowania. Te twory ziarniste służą jako „maszyneria", na której sekwencja nukleotydów mRNA jest tłumaczona na sekwencję aminokwasów w określonym białku. Translacja mRNA zaczyna się blisko końca 5' od tworzenia odpowiedniego końca aminowego cząsteczki białkowej. Informacja jest czytana w kierunku od 5' do 3' i kończy się utworzeniem końca karboksylowego białka. Ponownie występuje tutaj pojęcie polarności. Jak to opisano w rozdz. 39, transkrypcja genu na odpowiedni mRNA albo jego prekursor prowadzi najpierw do utworzenia końca 5' cząsteczki RNA. U prokariontów pozwala to na rozpoczęcie translacji mRNA zanim zostanie ukończona transkrypcja genu. W organizmach eukariotycznych proces transkrypcji zachodzi w jądrze komórkowym, a translacja mRNA zachodzi w cytoplazmie. Wyklucza to jednoczesną transkrypcję i translację w organizmach eukariotycznych i umożliwia proces przekształcenia niezbędny do wytworzenia dojrzałego mRNA z pierwotnego transkryptu — hnRNA. Inicjacja obejmuje złożone struktury i białka (p. ryc. 40-7) Jak to opisano w rozdz. 39 końce 5' w większości cząsteczek mRNA w organizmach eukariotycznych są opatrzone czapeczką metylacyjną. Ta metyloguanozylotrifosforanowa czapeczka ułatwia wiązanie cząsteczek mRNA do podjednostki 40S rybosomu. Zanim zostanie ona związana z 40S rybosomera, ulega modyfikacji dzięki działaniu kilku białek zdolnych do wiązania się z mRNA: eIF-4A, eIF-4B, eIF-4E i eIF-4F. Obecność kompleksu eIF-4F wiążącego czapeczkę, a składającego się z 4 polipeptydów (24 kd, 46 kd, 73 kd i 220 kd) jest niezbędna do inicjacji syntezy białka na mRNA opatrzonym czapeczką charakterystyczną dla organizmów eukariotycznych. Pierwszy kodon,

który ulega translacji, to zazwyczaj A-U-G. 18S rybosomainy RNA (rRNA) podjednostki rybosomalnej 40S wiąże się z regionem mRNA, który poprzedza pierwszy kodon ulegający translacji. To wiązanie mRNA do podjednostki rybosomalnej 40S wymaga obecności czynnika białkowego, czynnika inicjacji 3 (IF-3). ^7 W następnym etapie aminoacylo-tRNA, odpowiadający pierwszemu kodonowi, wchodzi w reakcję z GTP i czynnikiem inicjacyjnym 2 (IF-2), tworząc kompleks. Kompleks ten w obecności czynnika inicjacji 1 (IF-1) dołącza anty_koilQn_tRNA do 1 kodonujoRNA, tworzac-kampieks iniciacyjny z podjednostką 40S rybosomu. Po uwolnieniu czynników inicjacyjnych (IF-l, IF-2 i IF-3) dołącza się podjednostką rybosomalna 60S i GTP ulega hydrolizie, W ten sposób zostaje ukończone formowanie rybosomu SOS. Kompletny rybosom zawiera 2 miejsca dla cząsteczek tRNA. Miejsce peptydylowe (miejsce P) zawiera cząsteczkę peptydylo-tRNA związaną z właściwym kodonem mRNA. Miejsce aminoacylowe (miejsce A) obejmuje aminoacylo-tRNA związany z odpowiadającym nTu kodonem na mRNA. W momencie tworzenia kompleksu inicjacyjnego na \\ kodonie, cząsteczka aminoacylo-tRNA wchodzi w miejsce P, pozostawiając wolne miejsce A. Ramka odczytu zostaje więc zdefiniowana popr2ez związanie tRNA do 1. kodonu mRNA. kodonu, który ulegnie translacji. Rozpoznanie tego 1. kodonu inicjującego jest oczywiście zależne od drugorzędowej struktury cząsteczki mRNA, a ponadto u prokariontów i być może eukariontów obejmuje swoistą sekwencję nukleotydów komplementarnych do segmentu 16S (18S) rybosomalnego RNA. U prokariontów w inicjację syntezy większości, jeśli nie wszystkich, cząsteczek białkowych jest włączony swoisty aminoacylo-tRNA. U prokariontów większość białek jest inicjowana N-formylometionylo-tRNA. Mimo że metionina występuje jako N-końcowy aminokwas w wielu białkach eukariotycznych, u tych ostatnich metionylo-tRNA nie jest formylowany. U prokariontów N-formylowanie cząsteczki

Ryc. 40-7. Schematyczna ilustracja inicjacji syntezy białka na matrycy mRNA zawierającej czapeczkę metylacyjną na końcu 5' i sekwencję poii(A) na końcu 3'. IF-1, IF-2 i IF-3 przedstawiają odpowiednio czynnik inicjujący 1, 2 i 3, a struktura podobna do szpilki do włosów z symbolem Met na jednym końcu ilustruje metionylo-tRNA, Miejsce P i miejsce A są odpowiednio miejscem wiążącym peptydyloiRNA i aminoacylo-tRNA na rybosomie.

SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY / 501 Kodon Inicjujący 5' Czapeczka

3' Ogon polt(A) ■nHh"

G m T P- 8' C= AUG

+ V

J tyDoMmu

1F-3

J

mHN A l3'IAl n

5'

GTF

— Ił IM

•GTP

'

Ryc . 40- 7.

Podjsdnoslka rybosomu

A ■ • + IF-2 + IM

G^P-fi*

Miejsce P

Met

J

502 / ROZDZIAŁ 40

metionylowej tRNA jawi się jako wiązanie peptydowe błędnie rozpoznawane przez miejsce P rybosomu. U prokariontów istnieje także enzym zdolny do usuwania N-końcowej reszty formylowej lub N-końcowej reszty metionylowej (albo obu) 2 cząsteczek białkowych, w wielu przypadkach nawet przed ukończeniem syntezy cząsteczki białkowej. Elongacja następuje przez przemieszczenie (p. ryc. 40-8) W kompletnym rybosomie SOS, utworzonym w procesie inicjacji, miejsce A pozostaje wolne. Związanie odpowiedniego aminoacyio-tRNA w miejscu A wymaga rozpoznania odpowiedniego kodonu. Czynnik elongacyjny 1 (EF-1) tworzy kompleks z GTP i wchodzącym aminoacylo-tRNA (ryc. 40-8). Kompleks ten pozwala na wejście aminoacylo-tRNA na miejsce A z jednoczesnym uwolnieniem EF-l-GDP i fosforanu. Jak przedstawiono na ryc. 40-8, EF-l-GDP ulega recyklizacji do EF-l-GTP przy udziale innych rozpuszczalnych czynników białkowych i GTP. Grupa a-aminowa nowego aminoacylo-tRNA w miejscu A dokonuje nukleofilowego ataku na zestryfikowaną grupę karboksylową peptydylo-tRNA, zajmującego miejsce P. Reakcja ta jest katalizowana komponentem białkowym podjednostki rybosomalnej 60S — peptydylotransferazą. Ponieważ aminokwas aminoacylo-tRNA jest już „zaktywowany", dla tej reakcji nie jest wymagane dalsze źródło energii. W wyniku tej reakcji zachodzi przyłączenie rosnącego łańcucha peptydowego do tRNA w miejscu A. Po usunięciu reszty peptydowej z tRNA w miejscu P, oswobodzony tRNA szybko dysocjuje i opuszcza miejsce P. Nowo utworzony peptydylo-tRNA ulega przemieszczeniu z miejsca A do pustego miejsca P przy udziale czynnika elongacji 2 (EF-2) i GTP. W procesie przemieszczania GTP jest hydrolizowany do GDP i fosforanu. Przemieszczenie nowo utworzonego peptydylo-tRNA i odpowiedniego kodonu na miejsce P uwalnia miejsce A dla następnego cyklu rozpoznania kodonu przez aminoacylo-tRNA i dla elongacji. Związanie reszty aminoacylowej przez cząsteczkę tRNA wymaga hydrolizy ATP do AMP, równoważnej hydrolizie 2 ATP do 2 ADP oraz fosforanów. Wejściu aminoacylo-tRNA na miejsce A towarzyszy hydroliza jednego GTP do GDP. Podobnie przemieszczenie nowo

utworzonego peptydylo-tRNA z miejsca A do miejsca P przez EF-2 powoduje hydrolizę GTP do GDP i fosforanu. W sumie zapotrzebowanie energetyczne na wytworzenie 1 wiązania peptydowego obejmuje równoważnik energii powstałej z hydrolizy 2 cząsteczek ATP do ADP i 2 cząsteczek GTP do GDP, czyli hydrolizy 4 bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych. Terminacja następuje w momencie, gdy zostaje rozpoznany kodon nonsensowny (p. ryc. 40-9) Po licznych cyklach elongacji, powodujących spolimeryzowanie aminokwasów w cząsteczkę białkową, w miejscu A pojawia się nonsensowny terminujący kodon mRNA. W warunkach prawidłowych nie istnieje tRNA zawierający antykodon zdolny do rozpoznania takiego sygnału terminacji. W komórce istnieją czynniki uwalniające zdolne do rozpoznania sygnału terminacji w miejscu A (ryc. 40-9). Czynnik uwalniający, w połączeniu z GTP i transferazą peptydyiową, powoduje hydrolizę wiązania między peptydem a tRNA zajmującym miejsce P. W wyniku tej hydrolizy z miejsca P uwalnia się białko i tRNA. W następstwie hydrolizy i uwolnienia białka oraz tRNA rybosom SOS dysocjuje do podjednostek 40S i 60S, które następnie wchodzą ponownie do cyklu. Czynniki uwalniające są zatem białkami, które hydrolizują wiązanie peptydylo-tRNA w momencie, gdy nonsensowny kodon zajmuje miejsce A. W procesie translacji tej samej cząsteczki mRNA może brać udział jednocześnie wiele rybosomów. Ponieważ rybosomy mają stosunkowo duży wymiar cząsteczki, wiążą się z mRNA w odległości nie mniejszej niż 80 nukleotydów. Liczne rybosomy związane z tą samą cząsteczką mRNA tworzą polirybosom albo „polisom". W systemie nierestrykcyjnym liczba rybosomów związanych z mRNA (a zatem wielkość polirybosomów) jest skorelowana dodatnio z długością cząsteczki mRNA. Oczywiście masa cząsteczki mRNA jest całkiem mała w porównaniu do masy pojedynczego rybosomu. Pojedynczy rybosom ssaków jest zdolny do wytworzenia ok. 100 wiązań peptydowych w każdej minucie. Polirybosomy aktywnie syntetyzujące białka mogą egzystować jako wolne ziarenka w cytoplazmie komórkowej albo mogą być przyczepione do błoniastych struktur cytoplazmatycznych określanych jako siateczka

3' (AL

1

GDP

Ryc. 40-8. Schemat procesu elongacji pepiydu w trakcie syntezy białka. (Wale kóika, oznaczone n-1, n, n+1 itd., oznaczają reszty aminokwasowe w nowo powstającej cząsteczce białkowej. EF-1 i EF-2 przedstawiają odpowiednio czynnik elongacyjny 1 i 2. Miejsca peptydyio-tRNA i aminoacylo-tRNA na rybosomie są odpowiednio oznaczane jako miejsce P i A.

3'(A)„

504 / ROZDZIAŁ 40 Kodon termlnacyjrty (nonsensowny)

GmTP-5

tRNA

60P +

Ryc. 40-9. Schemat ilustrujący proces terminacji syntezy bi3tka. Miejsca peptydylo-tRNA i amtnoacylo-tRNA są oznaczone odpowiednio jako miejsce P i A. Hydroliza kompleksu peptydylo-tRNA jest oznaczona jako wejście H2O. Symbole N i C oznaczają odpowiednio aminokwasy na końcu NH 3 i karboksylowym i ilustrują polarność syntezy białka

SYNTEZA BIAŁEK i KOD GENETYCZNY / 505

śródplazmatyczna. Doczepienie ziarnistości polirybosomalnych do siateczki śród plazma ty cznej jest odpowiedzialne za jej „szorstki" wygląd, co łatwo zaobserwować w mikroskopie elektronowym. Białka syntetyzowane na polirybosomach przyczepionych do siateczki są wydzielane do wnętrza cystern pomiędzy listkami szorstkiej siateczki śródplazmatycznej, a następnie eksportowane dalej. Niektóre z produktów białkowych szorstkiej stateczki śródplazmatycznej są upakowywane jako cząsteczki zymogenu w obrębie aparatu Golgiego w ceiu ewentualnego dalszego ich eksportu (p. rozdz. 42). Cząsteczki polirybosomalne, które znajdują się w cytosolu w stanie wolnym, są odpowiedzialne za syntezę białek potrzebnych dla funkcji wewnątrzkomórkowych. Złożona maszyneria syntezy białka może być wykorzystana w reakcjach obronnych organizmu, inicjowanych zagrożeniem Środowiskowym, lub może stać się częścią mechanizmu chorobowego Ferrytyna, białko wiążące żelazo, zapobiega osiągnięciu toksycznego stężenia zjonizowanego żelaza (Fe2+) w obrębie komórek. Żelazo pobudza syntezę ferrytyny przez aktywację 1 lub.więcej białek cytoplazmatycznych, które następnie mogą się wiązać ze swoistym regionem sekwencji nie ulegających translacji przy końcu 5' mRNA ferrytyny. Interakcja białko-mRNA aktywuje ferrytynowy mRNA i powoduje jego translację. Taki mechanizm zapewnia szybką kontrolę syntezy białka, usuwając Fe 2+ — cząsteczkę potencjalnie toksyczną. Maszyneria syntezy białka może być także modyfikowana w procesie, który jest szkodliwy dla komórki. Wirusy replikują, wykorzystując procesy komórki gospodarza łącznie z procesami syntezy białka. Niektóre cząsteczki wirusowego mRNA ulegają translacji znacznie wydajniej niż cząsteczki komórki gospodarza (np. mengońrm, wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego). Inne, np. reowirus i wirus opryszczkowego zapalenia jamy ustnej, replikują w sposób nadmierny i ich mRNA współzawodniczą z cząsteczkami mRNA komórki gospodarza o ograniczoną ilość czynników translacji. Inne wirusy hamują syntezę białek komórki gospodarza, uniemożliwiając wytworzenie połączeń mRNA z rybosomem 40S. Wirus polio osiąga to przez aktywację proteaz komórkowych, które degradują 220 kd składnik kom-

pleksu wiążącego czapeczkę z eIF-4F opisanego wyżej. POTRANSLACYJNA MODYFIKACJA MA WPŁYW NA AKTYWNOŚĆ WIELU BIAŁEK Niektóre wirusy zwierzęce, m.in. wirus polio (wirus typu RNA), syntetyzują długie, policysŁronowe białka na 1 długiej cząsteczce mRNA. Cząsteczki takich białek są następnie przecinane w określonych miejscach, w wyniku czego powstaje wiele swoistych białek, koniecznych do funkcji wirusowych. W komórkach zwierzęcych wiele białek jest syntetyzowanych na 1 matrycy mRNA jako cząsteczka prekursorowa, która następnie musi być zmodyfikowana tak, aby powstało aktywne białko. Przykładem i prototypem jest insulina, która jest białkiem małocząsteczkowym mającym dwa łańcuchy polipeptydowe zawierające międzycząsteczkowe i wewnątrzcząsteczkowe mostki disiarczkowe. Cząsteczka insuliny jest syntetyzowana jako jednołaricuchowy prekursor, czyli prohormon, który fałduje się, umożliwiając powstanie mostków disiarczkowych. Następnie swoista proteaza wycina segment, który łączy 2 łańcuchy tworząc funkcjonalną cząsteczkę insuliny (p. ryc. 52-3). Wiele innych peptydów jest syntetyzowanych jako proproteiny, które, zanim osiągną biologiczną aktywność, wymagają modyfikacji. Liczne potranslacyjne modyfikacje obejmują usunięcie reszt aminokwasowych z końca aminowego, co zachodzi przez działanie swoistych aminopeptydaz. Kolagen, białko występujące w wielkiej ilości w przestrzeniach pozakomórkowych u wyższych eukariontów, jest syntetyzowany jako prokolagen. 3 cząsteczki polipeptydu prokolagenu, często nie mające identycznej sekwencji, układają się podłużnie, a proces ten zależy od obecności swoistych peptydów na końcu aminowym. Następnie swoiste enzymy przeprowadzają hydroksylację i oksydację swoistych reszt aminokwasowych w obrębie cząsteczek prokolagenu w celu wytworzenia wiązań poprzecznych powodujących większą stabilność. Peptydy w końcu aminowym są odcięte od cząsteczki i w ten sposób tworzy się produkt końcowy — mocna, nierozpuszczalna cząsteczka kolagenu (p. rozdz. 58). Znane są również inne potranslacyjne modyfikacje białek. Na przykład częste są modyfikacje przez acetylację, fosforylację i glikozylację.

506 / ROZDZIAŁ 40

WIELE ANTYBIOTYKÓW DZIAŁA SKUTECZNIE, PONIEWAŻ HAMUJĄ ONE WYBIÓRCZO SYNTEZĘ BIAŁKA BAKTERII Rybosomy bakterii i rybosomy w mitochondriach komórek wyższych organizmów eukariotycznych różnią się od rybosomów opisanych w rozdz. 37. Rybosom bakteryjny jest mniejszy (TOS, a nie SOS) i ma różny, nieco uproszczony, zestaw cząsteczek RNA i białek. Te różnice wykorzystano do celów klinicznych, ponieważ wiele skutecznie działających antybiotyków oddziaływuje swoiście z białkami prokariotycznych rybosomów, hamując syntezę białek. W wyniku takiego oddziaływania zachodzi za-

hamowanie wzrostu lub śmierć bakterii. Większość najbardziej skutecznych antybiotyków tej klasy (np. tetracykliny, linkomycyna, erytromycyna i chloramfenikol) nie oddziaływuje ze swoistymi białkami eukariotycznych cząsteczek rybosomalnych i przez to nie są one toksyczne dla eukariontów. Inne antybiotyki hamują syntezę białka na wszystkich rybosomach (puromycyna) albo na rybosomach komórek eukariotycznych (cykloheksymid). Puromycyna, której strukturę przedstawiono na ryc. 40-10 jest strukturalnym analogiem tyrozynylo-tRNA. Puromycyna jest wbudowywana przez miejsca A na rybosomie do karbok syk o licowego peptydu, ale proces ten powoduje przedwczesne uwolnienie polipepty-

OCH,

O" tRNA- 0-P- O-CH^O.

NO

Rvc. 40-10. Porównanie struktury antybiotyku puromycyny (cfół).

(góra) i 3' końcowej części tyrozylo-tRNA

SYNTEZA BIAŁEK I KOD GENETYCZNY / 507

du. Puromycyna, jako analog tyrozynylo-tRNA, skutecznie hamuje syntezę białka zarówno u prókariontów, jak i eukariontów. Toksyna błonicy, egzotoksyna Carynebacterium diphteriae, wprowadzona ze swoistym fagiem lizogenicznym katalizuje ADP rybozyiację czynnika EF-2 w komórkach ssaków.Ta modyfikacja inaktywuje EF-2 i przez to hamuje swoiście syntezę białka w komórkach ssaków. Liczne zwierzęta {np. myszy) są oporne na toksynę błoniczą. Oporność ta wynika z niezdolności toksyny błoniczej do przejścia przez btonę komórkową, a nie z niewrażliwości mysiego EF-2 na ADP rybozylację przez NAD w reakcji katalizowanej toksyną błoniczą. Liczne z tych związków, a zwłaszcza puromycyna i cykloheksymid, są klinicznie bezużyteczne, ale były użyteczne w celu wyjaśniania roli syntezy białka w regulacji procesów metabolicznych, zwłaszcza indukcji enzymów przez hormony.

PIŚMIENNICTWO BanerjeeAK: 5-Terminalcapstnictureineucaryotic messenger ribonucleic acids. Microbiot Rev 1980;44:175.

Barrell BG et al: Different pattern of codon recognition by mammalian mitochonrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci USA 77:3164. Caskey CT: Peptide chain tennination. Trends Biochem Sci 1980;5;234. Drakę JW, BaltzRHiThebiochemistry ofmutagenesis. Annu Rev Biochem 1976;45:1I. Forget BG: Molecular genetics of human hemoglobin synthesis. Ann Int Med 1979;91:605. Kozak M: Comparison of initiation of protein synthesis in procaryotes, eucaryotes and organelles. Microbiol Rev 1983;47:1. Maitra U, Stringer EA, Chaudhuri, A: Initiation factors in protein biosynthesis. Annu Rev Biochem 1982;51:869, Pelletier J, Sonenberg N: Internal initiation of translationofeukaryoticmRNAdirectedby asequence derived from picornavirus mRNA. Naturę (Londonj 1988;334:320. Schlessinger D; Genetic and antibiotic modification of protein synthesis. Annu Rev Genet 1974;8:135. Schneider RJ, Sfienk T: Impact of virus infectioo on host celi protein synthesis. Annu Rev Biochem 1987^56:317. Shatkin AJ: mRNA cap binding proteins: Essential factors for initiating translation. Cel! 1985;4©:223. Wool I: The structure and function of eukaryotic ribosomes. Annu Rev Biochem 1979;48:719.

4 1

Regulacja ekspresji genu Daryl K. Granner, MD

WPROWADZENIE Organizmy przystosowują się do zmian środowiskowych przez zmianę ekspresji genów. Proces zmian ekspresji genów zbadano szczegółowo u bakterii i wirusów; na ogól polega on na interakcji swoistych białek mających zdolność wiązania z różnymi regionami DNA w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca startu transkrypcji. Taka interakcja białek może mieć pozytywny lub negatywny wpływ na transkrypcję. Komórki eukariotyczne stosują tę podstawową regułę regulacji transkrypcji, ale wykorzystują również inne mechanizmy. Takie procesy jak: wzmacnianie/wyciszanie, ekspresja tkankowoswoista, regulacja za pomocą hormonów, metali i związków chemicznych, amplifikacja genów, rearanżacja genów oraz modyfikacje potranskrypcyjne są także używane do kontroli ekspresji genów.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Liczne z mechanizmów kontroli ekspresji genu są wykorzystywane jako reakcje na hormony i C2ynniki terapeutyczne. Zrozumienie tych procesów może prowadzić do opracowania związków, które hamują czynność lub zatrzymują wzrost organizmów chorobotwórczych.

REGULOWANA EKSPRESJA GENÓW JEST NIEZBĘDNA DO PROCESU ROZWOJU, RÓŻNICOWANIA I ADAPTACJI Informacja genetyczna, występująca w każdej komórce somatycznej ^organizmów wielokomórkowych, jest praktycznie identyczna. Wyjątek stanowią nieliczne rodzaje komórek,

które mają amplifikowane lub przegrupowane geny do wykonywania swoistych funkcji komórkowych. Ekspresja informacji genetycznej musi być regulowana w czasie ontogenezy i różnicowania organizmu i jego komórkowych komponentów. Aby organizm mógł adaptować się do środowiska i magazynować energię i substraty odżywcze, ekspresja informacji genetycznej musi być również wrażliwa na sygnały zewnętrzne. W miarę ewolucji organizmów pojawiały się coraz to bardziej skomplikowane mechanizmy regulacyjne, które dawały organizmowi i jego komórkom możliwość takiej reakcji, która umożliwiała przeżycie w złożonym środowisku. Komórki ssaków mają ok. 1000 razy więcej informacji niż bakteria Escherichia coli. Znaczna część tej dodatkowej informacji genetycznej prawdopodobnie służy regulacji ekspresji genów w czasie różnicowania tkanek i takim procesom biologicznym w organizmie wielokomórkowym, które zapewniają organizmowi jego przetrwanie w złożonych czynnikach środowiskowych. W uproszczeniu są 2 typy regulacji genu: regulacja pozytywna ii regulacja negatywna (tab.

41-1). Gdy ekspresja informacji genetycznej ilościowo sie zwiększa, dzięki obecności swoistego elementu regulatorowego, wówczas regulacja jest pozytywna; gdy ekspresja informacji genetycznej jest zmniejszona pod wpływem swoTabela 41-1. Wpływ regulacji pozytywnej i negatywnej na ekspresję genów Wskaźnik ekspresji genu Regulacja negatywna Jest regulator

Zmniejszenie

Brak regulatora Zwiększenie

Regulacja pozytywna Zwiększenie Zmniejszenie

REGULACJA EKSPRESJI GENU / SOS

c/t genu

istego elementu regulatorowego, wówczas regulacja jest negatywna. Czynnik lub cząsteczka, które pośfedniczą w regulacji negatywnej są negatywnym regulatorem, a czynniki pośredniczące w regulacji pozytywnej są regulatorami pozytywnymi. Jednakże podwójna regulacja negatywna może działać jako regulacja pozytywna. Elektor, który hamuje funkcję regulatora negatywnego, ujawnia się wiec jako regulator pozytywny. Wiele regulowanych systemów, które działają jak systemy indukowane, jest w rzeczywistości systemami ulegającymi derepresji na poziomie molekularnym. (Opis tych. zjawisk podano w rozdz. 11).

W SYSTEMACH BIOLOGICZNYCH ISTNIEJĄ 3 TYPY CZASOWEJ REAKCJI NA SYGNAŁ REGULATOROWY Takie 3 typy reakcji przedstawiono schematycznie na ryc. 41-1 jako stopień ekspresji genu w reakcji na sygnał indukujący w skali czasu. Reakcja typu A charakteryzuje się wzmożoną ekspresją genu, która zależy od stałej obecności sygnału indukującego. Gdy sygnał indukujący jest usunięty, wówczas stopień ekspresji genu zmniejsza się do wartości podstawowej, ale ekspresja ta ponownie się zwiększa wskutek

1 Typ A

1 i Czas

-fleganaracjaSygnał

Czas

» TypC

Czas Sygnał

Ryc, 41-1. Schemat aktywacji genu jako reakcja na swoiste sygnały reguiatorowe, takie jak hormon.

510 / ROZDZIAŁ 41

reakcji na ponowne pojawienie się swoistego sygnału. Ten typ reakcji często obserwuje się u wielu wyższych organizmów po ekspozycji na takie czynniki indukujące, jak hormony steroidowe (p. rozdz. 45). Reakcja typu B wykazuje wzmożony przejściowy stopień ekspresji genu, nawet jako reakcja na stale trwający sygnał regulatorowy. Gdy ustaje sygnał regulatorowy i komórka powraca do stanu prawidłowego, wówczas może mieć miejsce druga przejściowa reakcja na następny sygnał regulatorowy. Zjawisko reakcja-odczula nie-regeneracja cechuje mechanizm działania środków farmakologicznych, ale jest także cechą wielu procesów zachodzących w warunkach naturalnych. Ten typ reakcji zachodzi zwykle w procesie rozwoju organizmu, gdy jest potrzebny tylko w okresie przejściowym produkt określonego genu, mimo trwałej obecności sygnału. Reakcja typu C na sygnał regulatorowy obejmuje zwiększony stopień ekspresji genu, który trwa nieskończenie nawet po usunięciu, sygnału. W takim systemie sygnał działa jak mechanizm spustowy. Gdy raz ekspresja genu w komórce zostaje zainicjowana, wówczas ekspresja ta nie może być zakończona nawet w komórkach potomnych; jest to zatem zmiana nieodwracalna i dziedziczna (w sensie komórkowym).

Organizmy prokariotyczne stanowią modele do badań regulacji ekspresji genów w komórkach ssaków

W ciągu ostatnich 20 lat wraz ze zrozumieniem, jak przepływa informacja z genu za pośrednictwem informacyjnego RNA do swoistej cząsteczki białkowej, rozwinęła się szczegółowa wiedza o regulacji ekspresji genów w komórkach prokariotycznych. Większość szczegółowej wiedzy o molekularnych mechanizmach regulacji ograniczała się aż do współczesnych lat do prokariontów i niższych eukariontów. Było to możliwe dzięki zaawansowanej analizie genetycznej, dostępnej przede wszystkim u tych prymitywnych organizmów. Współczesne postępy w technologii rekombinacji DNA pozwoliły na rozpoczęcie bardziej wyszukanej analizy ekspresji genu u ssaków. W tym rozdziale początkowa dyskusja będzie się koncentrowała na systemach prokariotycznych. Nie będą dyskutowane bardziej zaawansowane badania genetyczne, ale raczej będzie dyskutowany problem, który może być nazwany fizjologią ekspresji genu. Jednak prawie

wszystkie wnioski dotyczące tej Fizjologii uzyskano z badań genetycznych. Zanim wyjaśnimy fizjologię ekspresji genu, muszą być zdefiniowane niektóre specjalistyczne terminy genetyczne używane w systemach prokariotycznych. Cystrun jest najmniejszą jednostką ekspresji genetycznej. Jak to opisano w rozdz. 11 niektóre enzymy i inne cząsteczki białkowe są złożone z 2 lub więcej nieidentycznych podjednostek. Koncepcja „1 gen — 1 enzym" nie jest więc już obecnie zasadna. Cystron jest jednostką genetyczną kodującą strukturę podjednostki cząsteczki białkowej działającej jako najmniejsza jednostka ekspresji genetycznej. Idea 1 gen — 1 enzym może być obecnie uważana jako koncepcja 1 cystron — 1 podjednostka. Gen indukowalny jest to gen, którego ekspresja zwiększa się w wyniku reakcji na swoisty sygnał regulatorowy — indtiktor. Ekspresja niektórych genów jest konstytutywna, co oznacza, że ekspresja ich utrzymuje się na stałym poziomie i nie podlega regulacji. W wyniku mutacji niektóre produkty genów indukowalnych są syntetyzowane w sposób konstytutywny. Mutację, w której wyniku następuje ekspresja konstytutywna genu, który ijprzednio był genem regulowanym, nazywamy mutacją konstytutywną.

ANALIZA METABOLIZMU LAKTOZY U E. COLI DOPROWADZIŁA DO SFORMUŁOWANIA HIPOTEZY OPERONU W 1961 r. Francois Jacob i Jacąues Monod opisali w swojej klasycznej pracy model operonu. Ich hipoteza w dużej mierze opierała się na obserwacjach regulacji metabolizmu laktozy przez bakterie jelitowe Escherichia coli. Mechanizm molekularny odpowiedzialny za regulację genów biorących udział w metabolizmie laktozy należy obecnie do najlepiej poznanych mechanizmów regulacyjnych w każdym organizmie. JiGalaktozydaza hydrolizuje p-galaktozyd laktozy do galaktozy i glukozy (ryc. 41-2). Gen strukturalny p-galaktozydazy (gen lac Z) występuje łącznie z genem odpowiedzialnym za przenikanie galaktozy do komórki (Y) i z genem acetylazy galaktozydowej (A), której funkcja nie jest dobrze poznana. Geny strukturalne dla tych 3 enzymów są fizycznie połączone i stanowią operon lac. przedstawiony na ryc. 41-3.

REGULACJA EKSPRESJI GENU / S11 Wiązanie /f-gllkozydowe /f-GALAKTOZYDAZA

H I

I H

CH,OH OH

CH3OH

O

H;

H

H HO Laktoza

HO '

H Galafctoza

HO

H HO

Glukoza

Ryc. 41-2. Hydroliza laktozy do galaktozy i glukozy przez p-galaktozydazę.___________________ Miejsce s

Operator pen Y gen A

promotora' Operon lac

Ryc. 41 -3. Zależności przestrzenne położenia genów strukturalnych i regulatorowych operonu lac. Gen Z koduje Pgataktozydaze, gen Y — permeaze, a gen A — acetylazę. Gen „i" koduje białko represora operonu lac.

Takie genetyczne uszeregowanie genów strukturalnych i ich genów regulatorowych zapewnia skoordynowaną ekspresję 3 enzymów włączonych w metabolizm laktozy. Każdy z tych sprzężonych genów jest przepisywany na wielką cząsteczkę mRNA, która zawiera iiczne i niezależne kodony startu translacji (AUG) i zatrzymania translacji (UAA) dla każdego cystronu. Taki typ cząsteczki mRNA nazywa się policystronowym mRNA. Po licy strono we mRNA występują głównie w organizmach prokariotycznych. Gdy bakterie E. coli zostają eksponowane na laktozę lub swoisty analog laktozy, wówczas ekspresja aktywności p-galaktozydazy, permeazy galaktozydowej i acetylazy gal aitozyd owej zwiększa się 10—100-krotnie. Jest to reakcja typu A przedstawiona na ryc. 41-1. Po usunięciu sygnału, tj. induktora, nasilenie syntezy tych 3 enzymów-sie zmniejsza. Ponieważ u bakterii nie zachodzi znaczący rozpad tych enzymów, stężenie fS-galaktozydazy oraz pozostałych 2 enzymów pozostaje takie samo, aż nie zostanie zmniejszone przez podział komórkowy. Gdy bakterie E. coli są eksponowane zarówno na laktozę, jak i na glukozę, jako źródła

węgla, to najpierw metabolizują glukozę, następnie chwilowo ograniczają wzrost do czasu, aż geny operonu lac zostają indukowane i umożliwią metabolizm laktozy. Chociaż laktoza jest obecna od początku fazy wzrostowej bakterii, komórka nie indukuje enzymów niezbędnych do katabolizmu laktozy, zanim nie wyczerpie się glukoza. Fenomen ten początkowo przypisywano represji operonu laktozowego przez pewne katabolity glukozy; stąd zjawisko to nazwano represją kataboliczną. Obecnie wiadomo, że „represja kataboliczną" w istocie powstaje za pośrednictwem białka — catabolite gene activator protein (CAP) w połączeniu z cyklicznym AMP {cAMP; p. str. 221). Ekspresja wielu układów indukowalnych enzymów lub operonów u E. coli i innych prokariontów jest wrażliwa na represję kataboliczną, co będzie opisane poniżej. Fizjologia indukcji operonu lac jest dobrze poznana na poziomie molekularnym (ryc. 41-4). Ekspresja normalnego genu i operonu lac jest konstytutywna; jest to ekspresja na stałym poziomie, w wyniku której tworzą się podjednostki represora lac. Cząsteczka represora lac składa się z 4 identycznych podjednostek

512 / ROZDZIAŁ 41

Operator Promotor Gen Y

Gen Z

Gen A

A. Poiimeraza RNA nie Represor może przepisać (tetratrar} operatora lub dystainych genów (Z,Y/i) RNA Po d j e d n o stkl • • CAP-AMP represora • • Białko /t-galaktozydazy

Obecny Induktor brak glukozy

Białko permeazy

Poiimeraza RNA przepisująca geny Nieaktywny ^^ represor • łt.

Siatko acetyl azy Induktory

Ryc.41 -4. Mechanizm represji i derepresji operonu laktozy. Gdy brak jest induktora (A) produkty genu „i", które są syntetyzowane konstytutywnie tworzą cząsteczkę represora, która wiąże się z locus operatora i zapobiega związaniu polimerazy RNA z locus promotora, uniemożliwiając następującą transkrypcję strukturalnych genów Z, Y i A. Gdy induktor jest obecny (B), wówczas konstytutywnie działający gen „i" wytwarza cząsteczki represora, które są inaktywowane przez induktor i przez to nie mogą wiązać się z locus operatora, W obecności cAMP i wiążącego go białka (CAP) poiimeraza RNA może przepisać strukturalne geny Z, Y i A, a pot i cy stron owa cząsteczka mRNA może ulec translacji na odpowiadające im cząsteczki białkowe f)-galaktozydazy, permeazy i acetylazy, umożliwiając katabolizm laktozy.

o m.cz. 38 000. Cząsteczka białka represorowego - - produkt genu „i" — ma duże powinowactwo (Kd ok. \0~lz mol/l) do locus operatora. Locus operatora jest to region dwupasmowego DNA o długości 27 par zasad, mający 2-osiową symetrię rotacyjną (pokazaną jako ciągłe linie wokół kropkowanej osi) w regionie obejmującym 21 par zasad, jak to przedstawiono poniżej:

grubionymi literami na pokazanej wyżej sekwencji). W każdym czasie tylko 2 podjednostki represora wiążą sie z operatorem, a w obrębie regionu długości 17 par zasad przynajmniej 1 zasada każdej pary zasad jest włączona w proces rozpoznania i wiązania represora lac. Wiązanie zachodzi głównie w większym rowku bez rozerwania dwupasmowej, opartej na sparowanych zasadach, struktury DNA operatora. Locus operatora jest położony między miejscem 5'AAT TGTGAGC G GATAACAATT promotora, w którym wiąże się DNA-zależna 3' TTA ACACTCG C CTATTGTTAA poiimeraza RNA w momencie rozpoczynania * Najmniejsza długość operatora dla represora transkrypcji, a miejscem inicjacji transkrypcji lac, która warunkuje jeszcze skuteczne działa- genu Z, czyli strukturalnego genu pnie, wynosi 17 par zasad (zaznaczonych po- galaktozy-'dazy (ryc. 41-3). Po związaniu się w locus

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 513

operatora cząsteczka represora uniemożliwia transkrypcję locus operatora, jak również dystalnych strukturalnych genów Z, Y i A. Cząsteczka represora działa wiec tu jako negatywny regulator; w jej obecności (i w nieobecności induktora, p. niżej) jest uniemożliwiona ekspresja genów Z, Y i A. W każdej komórce na 1 operator przypada normalnie 20—40 cząsteczek tetramerowego represora. Analog laktozy, który jest zdolny indukować operon lac, ale jednocześnie sam nie służy jako substrat do |t-galaktozydazy, stanowi przykład induktora poronnego. Dodanie laktozy lub induktora poronnego do bakterii, rosnących na źle użytkowanym źródle węgla (np. takim jak btirsztynian), powoduje szybką indukcję enzymów operonu lac. Małe ilości induktora poronnego lub laktozy są zdolne do wniknięcia do komórki nawet w nieobecności permeazy. Zarówno te cząsteczki represora, które są związane z loci operatora, jak również te, które występują w stanie wolnym w eytozolu mają duże powinowactwo do induktora. Związanie induktora z cząsteczką represora skompleksowaną z operatorem powoduje zmiany konformacyjne w strukturze represora i prowadzi do dysocjacji jego od DNA. Jeśli DNA-zależna polimeraza RNA była już wcześniej dołączona do kodującego pasma w miejscu promotorowym, to transkrypcja zajdzie. Polimeraza generuje policystronowy RNA, którego koniec 5' jest komplementarny do pasma matrycowego operatora. W ten sposób induktor wywołuje derepresję operonu iac i pozwala na transkrypcję strukturalnych genów [S-galaktozydazy, permeazy galaktozydowej i acetylazy galaktozydowej. Translacja policystronowego mRNA może zachodzić nawet wtedy, zanim zakończy się transkrypcja. Derepresja operonu lac pozwala komórce na syntezę enzymów niezbędnych do katabolizy laktozy jako źródła energii. Aby polimeraza RNA mogła związać się z miejscem promotorowym, musi być obecne białko CAP (catabolite gene activator protein), z którym jest związany cAMP. Odpowiedni mechanizm pozwala na gromadzenie przez bakterię cAMP tylko wówczas, gdy jest ona pozbawiona źródła węgla. W obecności glukozy lub glicerolu, w stężeniach zapewniających wzrost bakterii, będzie niedostatek cAMP do związania się z białkiem CAP. W obecności glukozy i glicerolu brak jest więc białka CAP wysyconego cAMP i DNA-zależna polimeraza RNA nie może zainicjować transkrypcji operonu lac. W obecności kom33

Biochemia

pleksu CAP-cAMP, który wiąże się do DNA w górę od miejsca promo torowego, transkrypcja może zachodzić (ryc. 41-4). Regulator CAP--cAMP działa więc jako pozytywny regulator, ponieważ jego obecność jest wymagana do ekspresji genu. Operon lac podlega zarówno pozytywnej, jak i negatywnej regulacji. Gdy gen „i" jest zmutowany w ten sposób, że jego produkt - represor lac - nie jest zdolny do związania się z DNA operatora, wówczas w organizmie zajdzie konstytutywna ekspresja operatora lac. Odwrotnie, gdy w organizmie zajdzie mutacja genu „i", uniemożliwiająca związanie induktora z represorem, organizm taki pozostanie w stanie represji nawet w obecności cząsteczki induktora, ponieważ induktor nie może związać represora w locus operatora w celu derepresji operonu. Bakterie wytwarzające w locus operatora takie mutacje, które nie pozwalają na związanie przez sekwencje operatora normalnej cząsteczki represorowej, będą wykazywały konstytutywną ekspresję genów operonu lac. Przełącznik genetyczny u bakteriofaga lambda (X) stanowi wzorzec dla interakcji białko-DNA w komórkach eukariotycznych Niektóre bakterie stanowią źródło wirusów, które istnieją w stanie uśpienia w chromosomie bakteryjnym lub mogą replikować w bakterii i doprowadzać do lizy i zabicia bakteryjnego gospodarza. Niektóre bakterie E. coli wytwaP-giobiny; w wyniku tych mutacji powstaje — bakteriofaga X. Podczas zakażenia wrażliwych E. coli wirusem X, ten ostatni wstrzykuje do komórki bakteryjnej linijny, dwupasmowy genom DNA o długości 45 000 par zasad (ryc. 41-5). W zależności od stanu odżywczego komórki bakteryjnej DNA X albo integruje się z genomem gospodarza (szlak lizogeniczny) i pozostaje tam w stanie uśpienia do czasu aktywacji (p. niżej), albo też zaczyna replikować się do czasu wytworzenia ok. 100 kopii kompletnego, opakowanego w białko wirusa, który w tym momencie powoduje liżę swego gospodarza (szlak lityczny). Nowo utworzone cząsteczki wirusa mogą następnie zakażać inne wrażliwe bakterie. Wirus X,, po integracji z genomem gospodarza pozostaje w stanie uśpienia do momentu, aż lizogeniczny bakteryjny gospodarz będzie eksponowany na czynniki uszkadzające DNA, W reakcji na taki bodziec uszka-

514 / ROZDZIAŁ 41

Promieniowanie nadfioletowe

Byc. 41-5. Zakażenie bakterii E. coli fagiem lambda zaczyna się wówczas, gdy cząsteczka wirusa przyczepia się do komórki bakteryjnej (1) i wstrzykuje swój DNA (linia pogrubiona) do komórki (2). Zakażenie może biec dalej 2 drogami w zależności od tego, które z 2 zestawów genów wirusa zostają włączone (uaktywnione). Droga hzogeniczna prowadzi do integracji wirusowego DNA z chromosomem bakteryjnym (4, 5), gdzie wirusowy DNA ulega biernej replikacji wraz z podziałem komórki bakteryjnej. Drzemiący wirus nazywamy profagiem, a komórkę, która go wytwarza, nazywamy lizogenem. W alternatywnej drodze zakażenia litycznego wirusowy DNA replikuje samodzielnie (6) i steruje syntezą białek wirusowych (7) Wytwarza się ok. 100 nowych caąsteczek wirusowych. Namnażające się wirusy doprowadzają do lizy lub rozsadzenia komórki (8). Profag może być „wyind u kowany" takim czynnikiem, jak promieniowanie nadfioletowe (9). Czynnik indukujący przerzuca przełącznik tak, że inny zespół genów ulega włączeniu Wirusowy DNA wypetla się z chromosomu (10) i replikuje; wirus wchodzi na drogę lityczną. (Reprodukowane za zgodą z: Ptashne M., Johnson A. D., Pabo C. O.: A genetic switch in a bacterial virus. Sci. Am. /Nov/ 1982; 247:128).

dzający uśpiony bakteriofag zostaje „indukowany" i geny jego własnego genomu, niezbędne do wycięcia go z chromosomu gospodarza, niezbędne do replikacji jego DNA do syntezy białek otoczki i enzymów litycznych, zaczynają być przepisywane i następnie ulegają translacji.

To zdarzenie działa jak spust (trigger) lub reakcja typu C (ryc. 41-1); tzn. gdy bakteriofag A. raz zaangażuje się w proces indukcji, wówczas nie ma powrotu do stanu wyjściowego zanim komórka nie ulegnie lizie, a zreplikowany bakteriofag nie zostanie uwolniony. Ten przełącz-

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 515 Gm rsprssora B

RNAraprasora --*"-" 0R3

Gen ero

0R2

ORI

J 1111 u j t ] iN i u 11 Ji h i u i N u u Ji i ji 1111 y 111 ■ L i n 111111 iii f 11111 n

Promotor repraaora

Promotor ero

i l i l i l l i i l i l ii l ł

X ero RNA

1

Ryc. 41-6. Prawy operator (OR) jest pokazany w tej serii rycin z uwidocznieniem coraz większych szczegółów. Operator jest regionem wirusowego DNA o długości ok. 80 par zasad ( = pz) (A). Po jego lewej stronie leży gen kodujący represor X., po jego prawej stronie gen ero. Gdy region operatora powiększymy (B), uwidaczniają się jego 3 podregiony OR1, OR2 i OR3r z których każdy ma długość 17 pz. Są to miejsca sygnalne, do których może wiązać się zarówno represor, jak i białko ero. W miejscach tych nakładają się 2 promotory: sekwencje zasad, do których wiąże się polimeraza RNA w celu przepisania genu na mRNA (linie faliste), który następnie ulega przetłumaczeniu na białko. Fragment ryciny (C) przedstawia w powiększeniu miejsce 0R1 wraz z sekwencją zasad. Zauważ, ze w tym regionie chromosomu X oba pasma DNA służą jako matryca dla transkrypcji {p. rozdz. 39). (Reprodukowano za zgodą z : Ptashne M., Johnson A. D., Pabo C. O,: A genetic switch in a bacterial virus. Sci. Am. /Nov/ 1982; 247:128).

nik ze stanu uśpienia albo ze stanu profaga do zakażenia litycznego jest dobrze poznany na poziomie genetycznym i molekularnym i będzie opisany szczegółowo. Zjawisko przełączenia w bakteriofagi! X zachodzi w obrębie jego dwupasmowej cząsteczki DNA, określanej jako „prawy operator" (OR) 0 długości 80 par zasad (ryc. 41-6A), Prawy operator jest ograniczony ze strony lewej przez gen strukturalny represorał ,, az prawej strony przez gen strukturalny kodujący białko regula torowe zwane ero. Jeżeli bakteriofag X jest w stanie profaga, to jest w stanie zintegrowa nym z genomem gospodarza, jedynym genem wirusa X, który ulega ekspresji, jest gen represorowy. Gdy bakteriofag znajduje się w sta nie wzrostu litycznego, wówczas gen represorowy nie ulega ekspresji, ale w stanie ekspresji jest gen ero oraz wieie innych genów wirusa X. Gdy gen represorowy jest włączony, wówczas ero jest wyłączony, a gdy gen ero jest włączony, wówczas gen represorowy jest wyłączony. Jak widać te 2 geny regulują wzajemnie swoją ekspresję 1 ostatecznie decydują o wyborze litycznego lub lizogenicznego wzrostu baktenofaga X. Decyzja o transkrypcji genu represorowego lub transkryp cji genu ero jest przykładem przełącznika mole kularnego. Region operatorowy może być podzielony na 3 podregiony, każdy składający się z 17 par

zasad o podobnej, ale nie identycznej sekwencji DNA, złączonych jedna z drugą (ryc. 41-6B). Każdy z tych 3 podregionów, OR1, OR2 i OR3 może wiązać białko represorowe lub białko ero głównie przez kontakt między represorem a dwupasmowym heliksem DNA w obrębie rowka większego. Region DNA między genami ero a represorem zawiera także 2 sekwencje promotorowe, które kierują wiązaniem polimerazy RNA o swoistej orientacji wówczas, gdy polimeraza rozpoczyna transkrypcję przyległych genów. Jeden promotor zawiaduje polimeraza RNA tak, aby przepisywała ona w kierunku na prawo, a więc przepisywała gen ero i inne geny dystalne, podczas gdy inny promotor zawiaduje transkrypcją genu represorowego w kierunku na lewo (ryc. 41-6B). Produkt genu represorowego, białko represorowe o 236 aminokwasach, istnieje jako cząsteczka o 2 domenach, w których domena końca aminowego wiąże się do DNA operatora, a domena końca karboksylowego pobudza związanie jednego białka represorowego z drugim białkiem, w wyniku czego powstaje dimer. Cząsteczki represorowe w postaci dimerii wiążą się z DNA operatora znacznie silniej niż postać monomeryczna (ryc. 41-7A-C). Produkt genu ero, 66 aminokwasowe białko ero ma pojedynczą domenę, ale także wiąże się z DNA operatora znacznie silniej jako dimer

516 / ROZDZIAŁ 41

(ryc. 41-7D). Oczywiście pojedyncza domena białka ero pośredniczy zarówno w wiązaniu operatora, jak i dimeryzacji. W bakterii lizogenicznej, tj. zawierającej profaga X., dimer represora K wiąże sie preferencyjnic do OR) i w czasie tego procesu, przez działanie kooperatywne, wzmacnia (rzędu 10-krotnie) wiązanie się innego dimeru represora do OR2 (ryc. 41-8). Powinowactwo represora do regionu O R 3 jest najmniejsze z wszystkich

3 podregionów operatora. Związanie represora z ORI powoduje 2 główne skutki. Zajęcie podregionu OR1 przez represor blokuje wiązanie polimerazy RNA do prawego promotora, co

zapobiega ekspresji genu ero. Po wlóre, jak to wspomniano wyżej, dimer represora związany z OR1 wzmacnia wiązanie dimeru represora do OR2 . Związanie represora do OR2 wywiera dodatkowy ważny skutek w postaci wzmocnienia wiązania polimerazy RNA do lewostron-

ero

Byc. 41 -7. Schematyczne struktury molekularne cl (represor I pokazany w Ar B i C) oraz białka ero. Białko represora X jest łańcuchem polipeptydowym o 236 aminokwasach. Łańcuch ulega sfałdowaniu na 2 podstruktury o kształcie hantli (ciężarków gimnastycznych): domenę w końcu aminowym (NH2) i domenę w końcu karboksylowym (COOH). Te 2 domeny są połączone fragmentem łańcucha polipeptydowego wrażliwego na przecięcie proteazami (2 strzałki na ryc. A). Cząsteczki pojedynczego represora (monomery) mają tendencję do asocjowania i utworzenia formy dimeru (B); dimer może dysocjować, dając ponownie monomery. Forma dimeru jest utrzymywana głównie dzięki kontaktowi domen w końcu karboksylowym (zakreskowane). Dimery represora wiążą się (t mogą opuszczać) z miejscami sygnalnymi w regionie operatora; ich największe powinowactwo jest do miejsca OR1 (C). Kontakt z DNA zachodzi przez domenę aminoterminalną cząsteczki represora (zacieniowane). Białko ero ma pojedynczą domenę odpowiadającą za dimeryzację i inne miejsca promujące wiązanie dimerów do operatora, zwłaszcza do OR3. (Reprodukowano za zgodą z : Ptashne M., Johnson A. D., Pabo C. O.: A genetic switch in a bacterial virus. Sci. Am. /Nov/ 1982; 247:128).

Ryc. 41 -8. Konfiguracja przełącznika w 4 etapach cyklu życiowego bakteriofaga X. Droga lizogeniczna (w której wirus pozostaje w stanie drzemania jako profag) zostaje wybrana wówczas, gdy dimer represora wiąże się z OR1, przez co umożliwia związanie OR2 przez inny dimer. W stanie profaga (góra) dimery represora związane z OR1 i OR2 zapobiegają związaniu się polimerazy RNA z prawym promotorem i blokują syntezę białka ero (kontrola negatywna). Cząsteczki represora wzmagają także wiązanie polimerazy do lewego promotora (kontrola pozytywna), w wyniku czego gen represorowy ulega transkrypcji na RNA (linia falista) i syntetyzuje się więcej cząsteczek represora, utrzymując stan lizogeniczny. Indukcja profaga następuje po aktywacji proteazy recA przez promieniowanie nadfioletowe, która hydrolizuje monomery represora. Zostaje przez to przesunięta równowaga między wolnymi monomerami, wolnymi dimerami i związanymi dimerami, a dimery opuszczają miejsce operatora, Polimeraza nie ma warunków do wiązania się z lewym promotorem, w wyniku czego nie jest dłużej syntetyzowany represor. W miarę postępu indukcji wszystkie /oc/operatora są opróżnione z cząsteczek represora, dzięki czemu potimeraza może się wiązać do prawego promotora i zaczyna syntetyzować się białko ero. W czasie wczesnego wzrostu litycznego pojedynczy dimer ero wiąże się do OR3 — miejscem, do którego białko ero ma największe powinowactwo. Poiimeraza RNA nie może teraz wiązać się do lewego promotora, ale udostępniony pozostaje prawy promotor. Polimeraza wiąże się do prawego promotora i gen ero oraz inne wczesne geny lityczne ulegają transkrypcji. Następuje wzrost lityczny. (Reprodukowano za zgodą z : Ptashne M., Johnson A, D,, Pabo C O.: A genetic switch in a bacterial virus, Sci. Am. /Nov/ 1982; 247:128).

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 517

nego promotora, który nakłada się z podregionem C>R2,i przez to wzmaga transkrypcję i następnie ekspresję genu represorowego. To wzmocnienie transkrypcji zachodzi przypuszczalnie przez bezpośrednie działanie białko-biatko pomiędzy polimerazą RNA związaną z promotorem a represorem związanym z OR2. Represor X, jest wiec zarówno negatywnym regulatorem zapobiegającym transkrypcji genu ero,

transkrypcję swego własnego genu represoro~ wego. To podwójne działanie represora jest odpowiedzialne za stabilny stan uśpionego bakteriofaga X; represor nie tylko zapobiega ekspresji genów niezbędnych do lizy, lecz także pobudza ekspresję samego siebie, aby stabilizować ten stan zróżnicowania. W przypadku, gdy stężenie białka represora jest bardzo duże, wówczas represor może się wiązać do OR3 i przez to zmniejszyć transkrypcję genu represorowego

jak i pozytywnym regulatorem wzmacniającym Profag

OR3

0=2

O„1

Fciimeraza RNA Indukcja (1] Pollmeraza RNA

indukcja (2)

Polimerazą RNA

\ W W W VT \V WWWWU 0*3

0,2

0R1 Promotor represora ero

Wczesny wzrost lityczny

Promotor

Polimeraza HNA

\ V > . \\ Vv. W W W W W 0=3 Promotor ropresora

Ryc. 41 -8.

0H2

0„1 Promotor ero

518 / ROZDZIAŁ 41

z lewostronnego promotora do czasu, aż stężenie represora się zmniejszy i represor oddysocjuje od OR3. Gdy sygnał uszkadzający DNA, taki jak promieniowanie nadfioletowe, zaatakuje lizogeniczną bakterię-gospodarza, wówczas są wytwarzane jednopasmowe fragmenty DNA. które aktywują swoiste proteazy kodowane przez gen bakteryjny nazwany genem recA(ryc. 41-8). Aktywowana proteaza recA hydrolizuje tę część białka represorowego, która wiąże domenę cząsteczki przy końcu aminowym z domeną przy końcu karboksylowym. Takie ścięcie domen represora powoduje dysocjację di mero w represora, co z kolei powoduje dysocjację cząsteczek represora z OR2 i ewentualnie z OR1. Można przewidzieć skutki usunięcia represora z OR1 i z OR2. Polimeraza RNA natychmiast uzyskuje dostęp do prawego promotora i rozpoczyna transkrypcję genu ero, a wzmacniające działanie represora w podregionie OR2 na transkrypcję w kierunku lewym się zatraca (ryc. 41-8). Białko ero. uzyskane z nowo przepisywanego genu ero, wiąże się z regionem operatora jako dimery, ale kolejność jego preferencji jest odwrotna niż białka represorowego (ryc. 41-8). Białko ero, wiąże się najsilniej do OR3, ale nie ma skutku współdziałania białka ero w podregionie OR3 na wiązanie białka ero do OR2. Przy zwiększających się stężeniach ero białko będzie się wiązało do OR2 i ewentualnie do ORI. Zajęcie podregionu OR3 przez białko ero natychmiast wyłącza transkrypcję z lewego promotora a zatem zapobiega dalszej ekspresji genu represorowego. W ten sposób przełącznik działa w pełni skutecznie: gen ero jest teraz w stanie ekspresji, a gen represorowy jest w pełni wyłączony. Zdarzenie to jest nieodwracalne i ekspresja innych genów A, może mieć miejsce jako część cyklu litycznego. Gdy stężenie represora ero osiąga dużą wartość, wówczas białko ero zajmie ewentualnie podregionORl, przez co spowoduje wyłączenie własnego genu; proces ten jest niezbędny do oddziaływania na końcowe etapy cyklu litycznego. Trójwymiarową strukturę białka ero i białka represora X poznano dzięki krystalografii przy użyciu promieni X, a modele wiązania tych białek i skutki opisanych wyżej zdarzeń genetycznych i molekularnych zostały zaproponowane i przetestowane. Dotychczas system ten przedstawia najlepiej poznane zdarzenia molekularne związane z regulacją genu.

REGULACJA GENU U PROKARIONTÓW I EUKARIONTÓW RÓŻNI SIĘ W WIELU WAŻNYCH ASPEKTACH Oprócz regulacji transkrypcji, komórki eukariotyczne stosują różne mechanizmy w celu regulacji ekspresji genu (p. tab. 41-2). W komórkach eukariotycznych błona jądrowa fizycznie Tabela 41 -2. W komórkach eukariotycznych ekspresja genu jest regulowana przez transkrypcję i innymi etrogami Inna metody regulacji Amplifikacja genu Rearanżacja genu Przekształcanie RNA Alternatywne składanie mRNA Transport mRNA z jądra do cytoplazmy Regulacja stabilności mRNA

rozdziela proces transkrypcji genu od procesu translacji, ponieważ rybosomy znajdują się jedynie w cytoplazmie. W_proces ekspresji genów eukariotycznych włącza się znacznie więcej etapów, zwłaszcza dotyczących przekształceń RNA, niż w proces ekspresji genów prokariotycznych; te etapy mogą stanowić dodatkowe miejsca na wpływy czynników regulujących w porównaniu z prokariontami. Etapy przekształcania RNA w komórkach eukariotycznych obejmują modyfikację końca 5' pierwotnego transkryptu. dodanie łańcucha poliadenylowego do końca 3' transkryptów oraz wycięcie regionów intronowych do generowania połączonych eksonów w dojrzałej cząsteczce mRNA. Dotychczasowa analiza ekspresji genu eukariotycznego dostarczyła dowodu, że regulacja zachodzi na poziomie transkrypcji, przekształceń jądrowego RNA i stabilności mRNA, Wykazano także, że zachodzi amplifikacja i rearanżacja genów, co ma wpływ na ekspresję genów. Dzięki pojawieniu się technologii rekombinacji (czyli inżynierii genetycznej) DNA, w obecnych latach poczyniono znaczny postęp w zrozumieniu ekspresji genów eukariotycznych. Jednak wobec faktu, że większość organizmów eukariotycznych zawiera znacznie więcej informacji genetycznej niż organizmy prokariotyczne, i że manipulacja genami u tych pierwszych jest ograniczona, molekularne aspekty regulacji

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 519

genów eukariotycznych są znacznie mniej poznane niż przykłady dyskutowane uprzednio w tym rozdziale, W następnych podrozdziałach opisano krótko kilka różnych typów regulacji genów eukariotycznych. Geny eukariotyczne mogą być amplif ikowane podczas rozwoju osobniczego i podczas odczynu na związki chemiczne W, okresie wczesnego rozwoju organizmów wielokomórkowych pojawia się gwałtowne zapotrzebowanie na swoiste cząsteczki, takie jak rybosomalny RNA i informacyjny. RNA, do syntezy biatek, z których tworzą się takie tkanki, jak osłonka jajowa. Jednym ze sposobów, które mogą wzmóc syntezę takich cząsteczek, jesl: zwiększenie liczby genów dostępnych do "transkrypcji tych cząsteczek. Wśród powtarzających sekwencji DNA znajdują się setki kopii genów rybosomalnego RNA i tRNA. Geny te preegzystują w postaci licznych kopii w materiale genetycznym gamet i w ten sposób są przenoszone z pokolenia na pokolenie w wielkiej liczbie kopii. W niektórych szczególnych organizmach, takich jak muszka owocowa (Drosaphila) w czasie oogenezy zachodzi amplifikacja już uprzednio niewielu istniejących genów, np. tych, które kodują białka chorionu (osłonki jajowej). Następnie takie amplifikowane geny, które powstają prawdopodobnie w procesie powtarzającej inicjacji w czasie syntezy DNA (złożone banieczki replikacyjne), dostarczają licznych miejsc do transkrypcji genów (ryc. 38-15 i 41-9). Geny nleampllf I kowane

s36

$38

Ryc. 41-9. Schematycina ilustracja ampltfikacji genów s36 i s38 białka chorionu. (Reprodukowano za zgodą z: Chisholm R: Gene amplificatton during development. Trends B/ochem. Sci. 1982; 7:161).

W ostatnich latach było możliwe pobudzenie do amplifikacji określonych genów w komórkach ssaków hodowanych w kulturach. W niektórych przypadkach było możliwe uzyskanie kilkuset kopii swoistych genów podczas ekspozycji komórek na zwiększane dawki wybranych związków chemicznych, U chorych otrzymujących metotreksat, w ceiu leczenia nowotworu, obserwowano rozwój oporności na lek w komórkach nowotworowych wskutek zwiększenia liczby genów kodujących reduktazę dihydrofolianową, która jest włączona w metabolizm metotreksatu. Podobna amplifikacja genów zachodzi spontanicznie in vivo, tj. bez dodanego z zewnątrz czynnika wybiórczego, a nie zamierzone dodatkowe cykle replikacji mogą zostać „zamrożone" w genomie pod wprywem presji odpowiednich czynników wybiórczych. Utworzenie aktywnych genów immunoglobuliny obejmuje wybiórczą rearanżację DNA Jedną z najbardziej interesujących i złożonych kwestii, podnoszonych w obecnej dekadzie przez biologów, jest problem genetycznych i molekularnych podstaw różnorodności przeciwciał (p. rozdz. 55). Postępy immunologii wykazały niezbicie, że komórki układu obronności humoralnej podlegają różnicowaniu, wytwarzają przeciwciała o takiej samej swoistości, ale o różnych funkcjach efektorowych. W ciągu ostatnich lat wiele laboratoriów znacznie się przyczyniło do zrozumienia podstaw różnorodności przeciwciał i regulacji ekspresji genów immunoglobulinowych w czasie rozwoju i różnicowania. Jak to opisano w rozdz. 39, sekwencje kodujące, odpowiedzialne za powstawanie swoistych cząsteczek białkowych, nie występują w jednym bloku u ssaków. Jako pierwsze rozpoznano kodujące segmenty zmiennej i stałej domeny lekkiego łańcucha immunoglobuliny znajdujące się w oddzielnych miejscach w obrębie genomu. Jak to opisano szczegółowo w rozdz. 55 cząsteczki immunoglobuliny są złożone z 2 typów łańcuchów polipeptydowych: łańcucha lekkiego (L, light) i ciężkiego (H, heavy) (p. ryc. 55-6). Każdy z łańcuchów L i H jest podzielony na region zmienny (V) N-końcowy i region stały (C) przy końcu karboksylowym. Regiony V są odpowiedzialne za rozpoznanie antygenu (obcych cząsteczek), a regiony stałe za funkcje etektorowe, które determinują, jak cząsteczka przeciwciała potraktuje antygen.

520 / ROZDZIAŁ 41

Są znane 3 niesprzężone rodziny genów odpowiedzialnych za strukturę cząsteczki immunoglobuliny. 2 rodziny są odpowiedzialne za łańcuchy lekkie (łańcuchy \ i X ) oraz jedna rodzina za syntezę ciężkich łańcuchów. Każdy łańcuch lekki jest kodowany przez 3 oddzielne segmenty: segment zmienny {Vi), łączący (JL) i stały (CL)- Haploidalny genom ssaków zawiera ponad 500 segmentów V,,, 5 lub 6 segmentów JL i przypuszczalnie 10 lub 20 segmentów CL. W czasie różnicowania łim-

foidalnej komórki B segment VL jest przeniesiony z odległego miejsca tego samego chromosomu na pozycję bliższą tego regionu genomu, który zawiera segmenty JL i CL. Taka rearanżacja DNA umożliwia następnie transkrypcję segmentów VL, JL i CL w postaci pojedynczego prekursora mRNA, który następnie ulega przekształceniu, dając mRNA dla swoistego łańcucha lekkiego przeciwciała. Przez rearanżację różnych segmentów VL, JL i CL w obrębie genomu układ odpornościowy może dawać

C H1 Zawias CH 2 C H3

C„3 Cl

C..2b

*C2a C

jimRNA

2b mRNA LVDJ Byc. 41-10. Zdarzenie rekombinacyjne prowadzące do powstania genu kodującego ciężki łańcuch immunoglobuliny (y 2b). A: DNA Unii zarodkowej przed rearanżacją. Istnieje zespół przynajmniej 50 genów (z których każdy ma krótką sekwencję liderową) kodujących część zmiennego (V) regionu, zespół segmentów D kodujących głównie 3, region hiperzmienny i w pewnej odległości od niego 4 segmenty J, które uzupełniają sekwencję kodującą regionu V. Segmenty J leżą w odległości ok. 8000 zasad od genu Cn, który jest umiejscowiony na początku zespołu genów kodujących region C łańcucha H immunoglobuliny. Sekwencje C są poprzerywane sekwencjami niekodującymir dając serię eksonów odpowiadających domenom oraz zawiasie w sekwencji aminokwasowej regionu C, B: W trakcie pierwszego zdarzenia translokacyjnego każdy z segmentów V, D i J ulega rekombinacji, dając kompletny łańcuch n jednostki transkrypcyjnej. Tran skrypt jest kopią pokazanego na rycinie genu, ale sekwencje niekodujące (introny) są usuwane w procesie składania, który prowadzi do wytworzenia ciągłej kodującej sekwencji umRNA. C: Drugie zdarzenie translokacyjne, zwane przełączeniem ciężkiego łańcucha, usuwa segmenty genów C\i, Cy3i Cyl i umieszcza segment V-D-J i części intronu J-C41 w pobliżu genu Cy2b. Po transkrypcji introny są usuwane w trakcie składania mRNA, co prowadzi do uzyskania ciągłej, kodującej sekwencji w y2b mRNA. (Reprodukowano za zgodą z: Molgaard H. V,: Assembly ot immunoglobulin heavy chain genes. Naturę 1980; 286:659)

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 521

niezmiernie różnorodną bibliotekę (miliony) cząsteczek immunoglobulin swoistych antygenowo. Taka rearanżacja DNA jest określana jako łączenie V-J łańcucha lekkiego. Łańcuch ciężki jest kodowany przez 4 segmenty genowe: VH, D (diversity), JH i segment DNA kodujący CH. Region zmienny łańcucha ciężkiego powstaje przez połączenie segmentów VH z segmentem D oraz JH- Powstały region DNA V -D-JH jest następnie dołączony do jednego z 8 genów CH- Te geny CH (C,,, Q, CT3, G,l, CY2b, C72a i CE) determinują klasę lub podklasę cząsteczki immunoglobulin — IgM, IgG, IgA itd. (p. rozdz. 55). Przykład takiej rearanżaeji i procesów przekształcających, w wyniku których powstaje gen kodujący ciężki łańcuch Cy2b, przedstawiono na ryc. 41-10. H

W PROCES ROZWOJU I RÓŻNICOWANIA SA WŁĄCZONE RÓŻNE WPŁYWY NA STRUKTURĘ CHROMATYNY Większość DNA w komórkach prokariotycznych jest zorganizowana w postaci genów i matryce te mogą być stale przepisywane. W komórkach ssaków sytuacja ta jest bardzo odmienna. Tutaj stosunkowo mała część całkowitego DNA jest zorganizowana w postaci genów i przyległych do nich regionów regulatorowych. Nieznana jest funkcja nadmiaru DNA (jest to jeden z powodów, dla którego jest tak duże zainteresowanie sekwencjonowaniem całego genomu ludzkiego). Dodatkowy poziom kontroli znajduje się na poziomie struktury chromatyny. Jak to podano w rozdz. 38 istnieją duże regiony chromatyny, które są nieaktywne tran skry pcyj nie, podczas gdy inne regiony są aktywne lub potencjalnie aktywne. Z nielicznymi wyjątkami każda komórka zawiera ten sam zestaw genów (z wyjątkiem komórek wytwarzających przeciwciała). Rozwój wyspecjalizowanych narządów, tkanek i komórek oraz ich funkcji w organizmie zaieży od zróżnicowanej ekspresji genów. Taką zróżnicowaną ekspresję osiąga się m.in. przez udostępnienie do transkrypcji różnych regionów chromatyny w komórkach różnych tkanek. Na przykład DNA zawierający zespół genów P-globiny występuje w „aktywnej" chroma ty nie w retykulocycie, natomiast w komórce mięśniowej jest w chromatynie „nieaktywnej". Mechanizmy, które determinują chromatynę

„aktywną" lub „nieaktywną" nie są znane, ale prawdopodobnie proces ten polega na interakcji białko-DNA. Ponadto, jak to opisano w rozdz, 38, istnieją dowody, że metylacja reszty deoksycytydynowej (w obrębie sekwencji 5' -"CpG-3') w DNA może wpływać na ogólne zmiany w chromatynie, takie, które wykluczają jej aktywną transkrypcję. Na przykład w wątrobie myszy mogą ulegać ekspresji tyiko niemetylowane geny rybosomalne; są także dowody, że wiele wirusów zwierzęcych nie ulega transkrypcji, gdy ich DNA jest metylowany. Jednakże nie jest możliwe uogólnienie poglądu, że metylowany DNA nie jest aktywny trans kry pcyj nie i że cała nieaktywna chromatyna jest metylowana, albo że aktywny DNA nie jest metylowany. DNA eukariotyczny, który znajduje się w „aktywnym" regionie chromatyny, może być przepisywany. Podobnie jak w komórkach prokariotycznych promotor narzuca miejsce, w kórym polimeraza RNA rozpocznie transkrypcję, aJe ten promotor nie może być często zdefiniowany jako obszar -35 i -10, zwłaszcza w komórkach ssaków (p. rozdz. 39). W komórkach eukariotycznych także czynniki typu trans na ogół pochodzą z innych chromosomów (a więc działają w systemie trans), podczas gdy sprawa ta jest dyskusyjna w przypadku komórek prokariotycznych zawierających pojedynczy chromosom. Dodatkową złożoność wnoszą elementy/czynniki, które wzmagają lub wyciszają transkrypcje, które określają ekspresję swoistą tkankowo i które modulują działanie wielu cząsteczek efektorowych.

NIEKTÓRE ELEMENTY DNA WZMACNIAJĄ LUB WYCISZAJĄ TRANSKRYPCJĘ GENÓW EUKARIOTYCZNYCH Oprócz prostych zmian w chromatynie, które wpływają na aktywność transkrypcyjną, gromadzą się dowody, że w obrębie DNA znajdują się elementy, które ułatwiają lub wzmacniają inicjację transkrypcji w obszarze promotora. Na przykład u wirusa naczelnych (SV40) jest region położony ok. 200 pz w górę od promotora genów wczesnych; region ten, złożony z 2 identycznych tandemowych sekwencji o długości 72 pz, może silnie wzmagać transkrypcję genów in vivo. Każdy z tych elementów o 72 pz może być podzielony na grupy mniejszych elementów; tak

S22 / ROZDZIAŁ 41

więc niektóre elementy wzmacniające transkrypcję mają bardzo złożoną budowę. Elementy wzmacniające transkrypcję (enhancer) różnią się od promotora pod względem 2 znaczących cech. .Mogą one wywierać pozytywny wpływ na transkrypcję nawci wówczas, gdy są oddzielone od promotora przez tysiące par zasad, działają one bez względu na polarność, a także są aktywne, jeżeli znajdują się w górę (5P) lub w dól (3') od promotora. Sekwencje, wzmacniające mają charakter ogólny; mogą one pobudzać każdy promotor, który znajdzie się w ich sąsiedztwie. Element wzmacniający virusa SV40 może np. wywierać wpływ na transkrypcje genu P-globiny przez 200-krotne zwiększenie transkrypcji genu w komórkach zawierającego w obrębie tego samego plazmidu zarówno sekwencję wzmacniającą, jak i gen P-globiny (p. niżej oraz ryc. 41-11), Element wzmacniający transkrypcje nie wydaje się wytwarzać produktów, które działają na promotor, ponieważ jest on aktywny tylko wówczas, gdy istnieje w obrębie tej samej cząsteczki DNA, gdzie istnieje promotor (czyli znajduje się w położeniu cis do promotora). Obecnie wyizolowano białka wiążące sekwencje wzmacniające, co powinno pomóc w wyjaśnieniu mechanizmu działania tych elementów. Sekwencje wzmacniające wydają się wnosić nadwrażliwość na nukleazę w obrębie tych regionów, w których one się znajdują (p. rozdz. 38). Podsumowanie właściwości sekwencji wzmacniających przedstawiono w tab. 41-3.

Element odpowiadający A

Promotor

Uer strukturalr

SV40

$ globlna

P globlna

SV40

fi globlna

fi globlna

B -d

D-

GRE

CAT

Ryc. 41-11. Schematyczne objaśnienie działania sekwencji wzmacniających transkrypcję {enhan cer) i innych regulujących elementów działających w układzie cis. W tym modelu gen chimeryczny składa się z genu reportera (genu strukturalnego), który koduje białko, łatwe do oznaczenia, promoto ra, który zapewnia inicjację transkrypcji oraz do mniemanego elementu regulatorowego. Przykłady A i B ilustrują fakt, że sekwencje wzmacniające transkrypcję (np. SV40) mogą działać w obu orien tacjach i na promotor heterologiczny. Przykład C pokazuje, że regulatorowy element meta I ot i o ne iny — mt (który pod wpływem kadmu lub cynku indukuje transkrypcję endogennego genu mt i syn tezę białka wiążącego metal) może działać przez promotor kinazy tymidynowej (łk) w procesie wzmocnienia transkrypcji genu ludzkiego hormonu wzrostu (hGH). Konstrukty uzyskane metodą -in żynierii genetycznej wprowadzono do przedjądrza Tabela 41-3. Podsumowanie właściwości sek męskiego jednokomórkowych embrionów myszy, wencji wzmacniających transkrypcję (enhancer) które umieszczano w macicy matki zastępczej i uzy skiwano zwierzęta transgeniczne. Wśród potom Właściwości sekwencji wzmacniających stwa uzyskanego w tych warunkach było takie, Działają wówczas, gdy są umiejscowione w dużej które na podanie jonów cynku w wodzie do picia odległości od promotora reagowało zwiększeniem stężenia hormonu wzros Działają wówczas, gdysą umiejscowione w górę tu w wątrobie. W takim przypadku te zwierzęta (na lewo) lub w dół (na prawo) od promotora transgeniczne reagowały na duże stężenie hormo Działają wówczas, gdy są zorientowane w obu nu wzrostu podwojeniem wzrostu w porównaniu kierunkach do swego normalnego rodzeństwa w miocie. Przy kład D pokazuje, że element reakcji na glikokorDziałają przez promotory herero logiczne tykosteroidy (GRE) będzie działai przez promotor Działają przez związanie 1 lub więcej białek homologiczny (gen PEPCK) lub heterologiczny i że promotor genu PEPCK zawiera także element, który działa zarówno jako enhancer na poziomie pod stawowym, jak i jako element odpowiadający na Zidentyfikowano także elementy działające cykliczny AMP (CRE).

w układzie cis, które zmniejszają lub wyciszają ekspresję swoistych genów. Tylko nieliczne takie elementy zostały zbadane tak, że niemożliwe są uogólnienia co do ich mechanizmu działama.

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 523

Swoista tkanko w o ekspresja może być wynikiem działania sekwencji wzmacniających lub wyciszających Poznano obecnie wiele genów, które wytworzyły elementy wzmacniające umiejscowione w różnych miejscach w stosunku do regionów kodujących. Oprócz tego, że elementy wzmacniające wzmagają transkrypcję genów, niektóre z nich mają zdolność wzmacniania transkrypcji swoistej tkankowe Na przykład element wzmacniający, związany -Ł genami immunoglobuliny i umiejscowiony miedzy regionem J i C, wzmaga ekspresje tych genów w sposób wybiórczy w komórkach limfbidalnych. Elementy wzmacniające związane z genami enzymów trzustkowych sti zdolne do wzmocnienia transkrypcji nawet w stosunku do niespokrewnionych, ale fizycznie sprzężonych, genów w sposób swoisty w komórkach trzustkowych myszy, do których specjalnie spreparowane konstrukty genu były wprowadzone metodą mikrochirurgii na poziomie pojedynczej komórki embrionalnej. Użycie ta-

szenie ekspresji genu reporterowego, jeśli DNA będzie zawierał element reagujący na hormon lub jony metalu (ryc. 41-12). Umiejscowienie elementu może być ustalone przez używanie do konstrukcji coraz to krótszych fragmentów DNA, delecje lub mutacje punktowe (ryc. 41-13).

kiego zwierzęcia transgenicznego okazało sie

I TRANSFEKCJA PRZY UŻYCIU DNA STRĄCONEGO CaHPO,

bardzo użyteczne w badaniach nad swoistą tkankowo ekspresją genów. Na przykład, gdy DNA zawierający element wzmacniający swoisty dla komórek P trzustkowych (należący do genu insulinowego) sprzężono w wektorze z dużym antygenem T wirusa polioma, konstrukcja taka powodowała u myszy transgenicznych powstanie nowotworów wywodzących się z komórek p\ Nowotwory nie rozwijały się w żadnej innej tkance. Swoista tkankowo ekspresja genu może być żalem indukowana za pośrednictwem elementów wzmacniających lub elementów do nich podobnych. Geny chimeryczne są używane do badania elementów wzmacniających i innych elementów regulatorowych Przez złączenie regionów DNA podejrzanych o sekwencje regularowe z różnymi genami reporterowymi (geny fuzyjne lub geny chimeryczne)

(p. ryc. 41-11,41-12) można oznaczyć te regiony w sąsiedztwie genów strukturalnych, które mają wpływ na ich ekspresję. Fragmenty DNA, które są podejrzane o funkcje elementów regulatorowych, są wiązane do odpowiedniego genu reporterowego i wprowadzone do komórki gospodarza (ryc. 41-11). Podstawowa ekspresja genu reporterowego będzie się zwiększała, jeśli fragment DNA zawiera sekwencję wzmacniającą. Dodanie do pożywki kultur hormonu lub metalu ciężkiego będzie powodowało zwięk-

Taka strategia z użyciem transfekowanych komórek w hodowli lub zwierząt transgenicznych

umożliwiła identyfikację dziesiątków sekwencji Promotor testowany

Gen reportera wy

5'L

J3' CAT GEN FUZYJNY: PHOMOTOR PEPCK REGULUJĄCY GEN CAT

PEPCK

Podzielenie i ponowne wysiania Kontrola Hormony ZBlOR PO 24 h OZNACZENIE .AKTYWNOŚCI CAT Identyfikacja elementów kontrolnych

Ryc. 41-12. Użycie genów fuzyjnych do określenia regulatorowych elementów DNA. Fragment DNA, uważany za nośnik jednego lub więcej elementów regulatorowych, jest włączony w wektor plazmido wy, który zawiera odpowiedni gen reporterowy kodujący bakteryjny enzym — aminotransferazę chloramienikotu {CAT). Komórki ssaków nie za wierają CAT, zatem wykrycie tej aktywności w eks traktach komórkowych oznacza, że komórki zostały skutecznie zakażone plazmidem. Zwiększenie ak tywności CAT ponad poziom podstawowy, np. po dodaniu hormonu glikokortykosteroidowegoozna cza, że region DNA, użyty jako insert zawiera aktywny element reakcji na hormon glikokortykosteroidowy {GRE). Mogą być przygotowane inserty zawierające coraz to krótsze fragmenty DNA, regiony z wewnętrznymi delecjami lub regiony z mutacjami punktowymi. Takie inserty mogą pre cyzyjnie określać elementy regulatorowe odpowia dające na sygnały._________________________

524 / ROZDZIAŁ 41 INDUKCJ Tabela 41-4. Przykłady białek regulatorowych A CAT transkrypcji, które zawierają różne motywy struk-C Hormon: A B turaine wiążące DNA

KONSTRUKTY GENÓW FUZYJNYCH

o * +■

o

o

o

CAT}

S1-

i

-1000

O—-i HRE A

i i

i

i

i

r

♦ Motyw wiążący Hel rks- skręt- heliks + o

Ssaki

-I—l----1—£±-<----1- -rHR E 41-13. B

o cechach wzmacniających, wyciszających, elementów swoistych tkankowo, elementów reagujących na hormony, jony metali, związki chemiczne itd. Aktywność genów w każdym momencie przejawia się jako oddziaływanie tych licznych elementów DNA funkcjonujących w układzie cis z odpowiadającymi im czynnikami typu trans. Wyzwaniem dla nauki jest problem poznania, jak one działają. KILKA MOTYWÓW STRUKTURY POŚREDNICZY W WIĄZANIU BIAŁEK REGULATOROWYCH DO DNA Swoistość kontroli transkrypcji wymaga, aby białka regulatorowe wiązały się z dużym powinowactwem do odpowiednich regionów DNA. Wiadomo, że 2a wiele z tych swoistych o& działywań białko-DNA są odpowiedzialne 3 unikatowe motywy w strukurze białka: heliks--skręt-heJiks, palec cynkowy i zamek kucynowy. Przykłady białek zawierających te motywy są przedstawione w tab. 41-4. Porównanie aktywności wiążącej białek, które zawierają te motywy, prowadzi do licznych ważnych uogólnień. Oto one:

E. coli Drożdże Drosophita Xenopus Ssaki

HR E

Ryc. Podejście gen fuzyjny-iransfekcja W celu zlokalizowania (A, B i C) elementów reakcji na hormon. Gen fuzyjny, zbudowany tak, jak to pokazano na ryc. 41-12, wprowadzono na drodze transfekcji do komórek biorców. Analizując moment utraty reakcji na odpowiedni hormon (przez oznaczenie aktywności CAT) w miarę delecji końca 5' można zlokalizować elementy reakcji na swoisty hormon.

E. cali

Fag

Palec cynkowy (Zinc finger)

-500 Pozycja nuklaotydu

Organizm

Zamek leucynowy (Leucine zipper)

Drożdże Ssaki

Białko regulatorowe Represor lac CAP Represory ero, X, tryptofanowyi434 Białka homeo box ? białka po u Białko genu 32 Gal 4 Serertdrpity, Hunchback TFIIIA Rodzina receptorów steroidowych, Sp1 GCN4 C/EBP, Fos, Jun/Ap1, c-myc, n-myc, l-myc

Wiązanie musi wykazywać duże powino wactwo do swoistego miejsca w DNA i małe powinowactwo do innych regionów DNA. Małe regiony białka wchodzą w bezpośre dni kontakt z DNA; pozostała cześć białka może zapewniać odpowiednią informację od nośnie do rozpoznania regionu DNA, albo też może być wciągnięta w dimeryzację monome rów białka wiążącego. Oddziaływania białko-DNA są utrzymy wane przez wiązania wodorowe i siły Van der Waalsa. Motywy, które znajdują się w tych białkach są unikatowe; obecność ich w białku o nieznanej funkcji może nasuwać przypuszczenie, że białko to wiąże sie z DNA. Białka z motywami heliks-skręt-heliks lub zamek leucynowy tworzą symetryczne dimery, a odpowiadające im miejsca wiążące w DNA są symetrycznymi palindromami. W przypadku białek mających motyw palec cynkowy miejsce wiążące powtarza się 2—9 razy. Cechy te po zwalają na kooperatywne współdziałanie mię dzy miejscami wiązania i zwiększają stopień i powinowactwo wiązania. Motyw heliks-skręt-heliks (hefix-turn-helix) Motyw heliks-skręt-heliks jest pierwszym motywem, który opisano i który był najlepiej

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 525

•* Oś symetrii podwójnej

Ryć. 41-14. Schematyczna ilustracja trójwymiarowej struktury białka ero i jego wiązania do DNA przez motyw heliks-skręt-heliks. Monomer ero składa się z 3 przeciwrównolegtych płaszczyzn [JJ^ — ft3) J3he1iksówa (a, a3). Motyw heiika skręt- heliks powstaje wskutek tego, że heliksy 013 i a 2 są utrzymane pod kąterii 90 urie/-skręt 4 aminokwasów, Heliks a3 białka ero stanowi powierzchnię rozpoznającą DNA (przyciemnione). 2 monomery asocjują poprzez przeć i wrów no ległe płaszczyzny fo z wytworzeniem dimeru, który ma 2-krotną symetrię (na prawo). Dimer ero wiąże się do DNA przez swoje 1x3 heliksy, z których każdy kontaktuje się z ok. 5 pz na tej samej powierzchni rowka większego DNA. Odległość między 2 porównywalnymi punktami na 2 heliksach na DNA wynosi 34 A, co odpowiada odległości 1 kompletnego zwoju podwójnej spirali DNA. (Dzięki uprzejmości Dr Brian Mathews).

zbadany. Analiza trójwymiarowej struktury -wyjawiła, że każdy z monomerów srzeciwrównoległych płaszczyzn 41-14). pjmer powstaje przez związanie przeciw równo ległych płaszczy? 11 fSj. Skręty atjTwbrzą powierzchnię rozpozmijącą DNA, a reszta cząsteczki wydaje się być włączona w stabilizację tych struktur. Średnia średnica skrętu 7 wynosi 120 nm, co odpowiada w przybliżeniu szerokości większego rowka DNA w formie B. Domena każdego monomeru ero, rozpoznająca DNA, oddziaływuje z 5 pz, a miejsca wiążące dimer obejmują 340 nm, co pozwala na dopasowanie kolejnych półskrętów w rowku większym na tej samej powierzchni (ryc. 41-14). Analiza za pomocą promieni X represora X, czyli CRP (białko receptora cyklicznego AMP u Escherichia coli), represora tryptofanu i represora faga 434 potwierdza dimeryczną strukturę heliks-skręt-heliks.

Motyw „palec cynkowy" (zinc finger) Drugim poznanym motywem wiążącym DNA był motyw „palec cynkowy". Było wiadomym, że białko TFIIIA, które jest pozytywnym regulatorem transkrypcji genu 5S RNA, wymaga do swej aktywności jonów cynkowych. Analiza strukturalna i biofizyczna wykazały, że każda cząsteczka TFIIIA ma 9 jonów cynkowych w powtarzającym się skoordynowanym kompleksie, utworzonym przez blisko rozmieszczone reszty cysteina-cysteina, po których następuje sekwencja 12-13 aminokwasów, a następnie para histydyna-histydyaa (ryc. 41-15). W niektórych przypadkach, mianowicie w przypadku rodziny receptorów steroidowych i tarczycowych, dublet his-his jest zastąpiony przez drugą parę cys-cys. Białko zawierające palec cynkowy wydaje się leżeć na jednej płaszczyźnie heliksu DNA, a jego następujące po sobie palce

526 / ROZDZIAŁ 41

się, że struktura^, ta .umożliwia połączenie, na wzór zamka błyskawicznego, i utworzenie mocnego kompleksu dimerowego przez 2 identyczne monomery, lub też wytworzenie heterodimeHTfnp. białka Fos i Jun tworzące beterodimer API {ryc. 41-16). Taka interakcja białko-białko może służyć do wzmocnienia wiązania oddzielnych domen białka, wiążących DNA z sekwencjami docelowymi w DNA (ryc. 41-16). , Palce cynkowe" Cys- Cys

. Palce cynkowa" Cys-Hls

Ryc. 41 -15. „Palce cynkowe" (zinc finger) stano wią serie powtarzalnych domen (2-9), z których każda osadza się w postaci tetraedralnej konfor macji na atomie cynku. W przypadku TFII1A koor dynację zapewnia para reszt cysteiny (C) oddzielo nej przez 12-13 aminokwasów od pary reszt histydyny (H). W,,palcach cynkowych" innych białek drugą parę także stanowią reszty C. „Palce cyn kowe" wiążą się w rowku większym, przy.czym przyległe palce wchodzą w kontakt z 5 pz wzdłuż tej samej płaszczyzny hetiksu DNA________, ^ „ ^ _

są ułożone naprzemiennie w obrębie 1 skrętu w dużym rowku. Podobnie jak w przypadku domeny rozpoznającej, w białku typu heliks-skręt-heliks każdy palec cynkowy białka TFIIIA kontaktuje ok. 5 pz DNA. Znaczenie tego motywu dla funkcji hormonów steroidowych podkreśla „doświadczenie przyrody". Mutacja pojedynczego aminokwasu w 1 z 2 palców cynkowych białka receptora kalcytriolu powoduje oporność na działanie tego hormonu i pojawienie się klinicznego zespołu krzywicy (rozdz. 48). Motyw zamek leucynowy (leucine zipper) Szczegółowa analiza sekwencji o 30 aminokwasach w końcowym karboksyJowym regionie białka C/EBP. wiążącego nukleotydową sekwencję wzmacniającą w DNA (enhancer), pozwoliła na ujawnienie nowej struktury. Jak to przedstawiono na ryc. 41-16 region tego białka tworzy a hdiks, w którym reszty leucynyjajmują cyklicznie powtarzające się miejsca co aminokwasów. Organizacja taka obejmuje helikalnych skrętów i 4 powtarzające się leucyny. Podobne struktury znaleziono w wielu innych białkach związanych z regulacją trans krypcji w komórkach ssaków i drożdży. Sądzi

Domeny tych białek regulatorowych, wiążące DNA i mające funkcje transaktywacji, są oddzielne i nie oddziałują wzajemnie ze sobą Związanie białka do DNA wywołuje zmianę ogólnej konformacji DNA, co pozwala związanemu białku aktywować transkrypcję, lub też te 2 funkcje mogą być obsłużone przez oddzielne i niezależne domeny. Doświadczenia z wymianą domen sugerują tę ostatnią możliwość. Genowy produkt GALI bierze udział w metabolizmie galaktozy u drożdży. Gen ten jest pozytywnie regulowany przez białka GAL4, które wiążą się do sekwencji aktywatorowej (UAS), położonej w górę od genu, przez domenę przy końcu aminowym GAL4. Koniec białka GAM, o długości 73 aminokwasów, który ma zdolność wiązania DNA, usunięto i zastąpiono wiążącą DNA domeną białka lex A z E. coli. W wyniku tego powstała częsteczka, która nie wiązała się do GALI sekwencji aktywatorowej UAS i oczywiście, która nie aktywowała genu GALI (ryc. 41-17). Jeśli jednak do regionu promotora genu GAL wprowadzono operator lex A, to powstałe w wyniku tego zabiegu białko hybrydowe wiązało się do tego promotora (w obrębie operatora lex A) i aktywowało transkrypcję GALI. Doświadczenie to, które powtarzano wielokrotnie (włączając także białka fuzyjne z glukokortykoidowym receptorem lex A, które to białka aktywowały w układzie trans geny reagujące na glukokortykoidy), dostarcza solidnego dowodu, że region końca karboksylowego białka GAL4 powoduje aktywację transkrypcji. Domeny wiążące DNA i mające funkcje transaktywacji są więc niezależne i nie oddziałujące wzajemnie. Regiony przy końcu karboksylowym mają dużą koncentrację ujemnie naładowanych aminokwasów. Domeny te, często określane jako „kwaśne plamy" albo „ujemne węzły", prawdopodobnie oddziałują z dodatnio naładowanymi regionami niektórych komponentów kompleksu transkrypcyjnego.

REGULACJA EKSPRESJI GENU / 527

NH,

NH„

Ryc. 41-16. Motyw „zamka ieucynowego" (leucinezipper). Rycina po stronie lewej {A) pokazuje analizę helikainego kota karboksylowej części białka C/EBR wiążącego DNA. Sekwencja aminokwasów jest pokazana jako wiązanie koniec do końca biegnąca w dół (pod płaszczyznę papieru) wzdłuż osi a-heliksu. Koło heiikalne składa się z 7 szprych, które odpowiadają 7 aminokwasom obejmującym każdy z 2 skrętów a-heliksu. Zauważ, że reszty leucyny (L) pojawiają się w co 7. pozycji. Inne białka mające „zamki leucynowe" mają podobny układ helikainego koła. Schematyczny model domeny wiążącej DNA białka C/EBP jest pokazany po stronie prawej (B). 2 identyczne łańcuchy polipeptydowe C/EBP są trzymane w formie dimeru przez domenę „zamka Ieucynowego" każdego z polipeptydów (oznaczonych na rycinie jako "prostokąty z doczepionymi owalami). Taka struktura jest najwidoczniej wymagana aby utrzymać domeny wiążące DNA każdego polipeptydu (zaczernione prostokąty) w odpowiedniej konformacji niezbędnej do związania z DNA. (Rycina dzięki uprzejmości Stevena McKinght).

Alternatywne przekształcanie RNA stanowi inny mechanizm kontrolny

Komórki eukariotyczne, oprócz wpływania na wydajność promotora, wykorzystują do kontroli ekspresji genów alternatywne przekształcanie RNA. Ma to miejsce w odniesieniu do alternatywnych promotorów, miejsc granicznych intron-ekson lub miejsc poliadenylacji. Czasami powoduje to heterogennośc transkryptów w komórce, ale znacznie częściej ten sam pierwotny transkrypt jest przekształcany odmiennie w różnych tkankach. Kilka przykładów każdego z tych typów regulacji przedstawiono poniżej. Użycie naprzemiennych miejsc startu transkrypcji daje w rezultacie różne eksony przy końcu 5' w mRNA, odpowiadającym amylazie i lekkiemu łańcuchowi miozyn u myszy, glukokinazy u szczurów oraz alkoholowej dehydrogenazy i aktyny u Drosophila. Wybór alternatywnego miejsca poliadenylacji w pierwotnym

transkrypcje ciężkiego łańcucha immunoglobuliny u daje w wyniku cząsteczki mRNA albo o długości 2700 zasad (u^), albo o długości 2400 zasad (u.^. W wyniku tego powstają białka o różnych regionach przy końcu karboksylowym, przy czym białko jara pozostaje umocowane do błony komórkowej limfocytu B, a immunoglobulina ujest wydzielana. Alternatywne składanie i przekształcanie powoduje wytworze-

nie 7 unikatowych mRNA a-tropomiozyny w 7 różnych tkankach. Nie jest jasne, w jaki sposób zapadają decyzje odnośnie do przekształceń i składania RNA, ani też czy te etapy mogą być regulowane. Regulacja stabilności informacyjnego RNA stanowi inny mechanizm kontrolny

Stabilność cząsteczek informacyjnego RNA w cytoplazmie może w sposób oczywisty wpływać na poziom ekspresji genu w kierunku

528 / ROZDZIAŁ 41 GAL4 Aktywny

Ryc. 41 -17. Doświadczenie z wymianą domen wykazujące, że funkcje wiązania białka do DNA i aktywacji transkrypcji egzystują jako funkcje oddzielne. Promotor genu GAL1 zawiera położoną na lewo sekwencję aktywującą {UAS), która wiąże regulatorowe białko GAL4 {przykład A). Oddziaływanie GAL4 z tą sekwencją powoduje pobudzenie transkrypcji genu GALI. Białko fuzyjne, w którym zabrana została domena GAL4 u końca aminowego i podstawiona regionem wiążącym DNA białka lexA E. coli, nie stymuluje transkrypcji genu GAL1, ponieważ domena lexA nie może związać się z UAS {przykład B), Białko fuzyjne lexA-GAL4 wzmaga transkrypcję genu GAL1 wówczas, gdy do regionu promotora GAL1 wstawi się sekwencję operatora lexA (przykład C)._________________________________________* _________________________________________________________________________

pozytywnym lub negatywnym. Zakładając stały stopień transkrypcji, stabilizacja mRNA będzie prowadziła do zwiększenia akumulacji mRNA i odwrotnie. W poprzednim rozdziale omawiano mechanizmy biorące udział w regulacji stabilności mRNA. Każdy z tych mechanizmów jest potencjalnym miejscem kontroli, na które mogą oddziaływać hormony i inne efektory. Niektóre hormony wpływają na syntezę i degradację swoistych cząsteczek mRNA. Na przykład estradiol przedłuża okres półtrwania mRNA witelogeniny od kilku godzin do ponad 200 godzin. Zjawisko to, w powiązaniu z faktem, że estrogeny zwiększają stopień transkrypcji tego genu rzędu 4—6 razy, powoduje dramatyczne zwiększenie ilości mRNA witeiogeniny.

PIŚMIENNICTWO Breitbart RE, Andreadis A, Wadal-Ginard B: Alternative splicing: A ubiquitous mechanism for the

generation of multiple protein isoforms from single genes. Annu Rev Biochent 1987;56:467. Jacob F, Monod J: Genetic regulatory mechanisms in protein synthesis. J Mol Biol 1961;3»3TS. Klug A, Rhodes D: „Zinc fingers": A novel protein motif for nucleic acid recognition. Trends Biochem Sci 1987;12. Landschulz WH, Johnson PF, McKnight SL: The leucine zipper: A hypothetical structure common to a new elass of DNA binding proteins. Science 1989;240:1759. McKnight S, Tjian R: Transcriptional selectivity of viral genes in mammalian oells. Celi 1986;46:795. Ptasne M: Gene regulation by proteins acting nearby and ai a distance. Naturę (London) 1986;322:697. Ptasne M: A genetic switch. Celi Press and Blackwell Scientific Publications, 1986. Shimizu A, Honjo T: Immunoglobulin c)ass switching. Cdi 1984;3fe801. Schlief R; DNA binding by proteins. Science 1988;241:1182. Struh) K: ftomoters, activator proteins and the mechanism of transcriptional initiation in yeast. Cel! 1987;49:295. Wu R, Bah! CP, Narang SA: Lactose operator-repressor interaction. Curr Top Celi Reg 1978;13:137.

Technologia rekombinacji DNA Dary/ K. Granner, MD

WPROWADZENIE Technologia rekombinacji DNA, nazywana często inżynierią genetyczną, dokonała rewolucji w biologii. Wykazuje ona coraz to większy wpływ na medycynę kliniczną. Na podstawie analizy rodowodów i badania białek włączonych w proces chorobowy zgromadzono dużą wiedzę o ludzkich chorobach genetycznych, ale w wielu przypadkach, w których swoista wada genetyczna jest nieznana, podejście takie nie może być zastosowane. Nowa technologia pokonuje te ograniczenia, czerpiąc bezpośrednio informację z cząsteczki DNA. Rozdział ten ma za zadanie naświetlenie tego dość złożonego zagadnienia. Przedstawia on podstawowe koncepcje technologii rekombinacji DNA, zastosowanie jej w medycynie klinicznej oraz słownik. Aby ten rozdział był możliwie wyczerpujący znajdą się w nim pewne powtórzenia dyskutowane już w innych rozdziałach.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Poznanie technologii rekombinacji DNA jest ważne z wielu względów. 3. Eksplozja informacji, dotycząca tej dziedziny jest zdumiewająca. Aby zrozumieć i móc śledzić tę dziedzinę należy docenić jej podstawowe koncepcje. 2. Obecnie mamy racjonalne podejście do zrozumienia molekularnej podstawy licznych chorób (np. rodzinna hipercholesteroiemia, niedokrwistość sierpowata, t&i&semk, fibrosis cystica, dystrofia mięśniowa). 3. Stosując technikę rekombinacji DNA można wyprodukować białka człowieka w dużych ilościach, niezbędnych dla lecznictwa (np. insulina, hormon wzrostu, aktywator plazminogenu). 4. W ten sposób można uzyskać białka do szczepionek (np. zapalenia J4 - Biochemia

wątroby typu B) i do testów diagnostycznych (np. test do wykrywania AIDS). 5. Technologia rekombinacji DNA jest stosowana w diagnostyce aktualnie występujących chorób i do przewidywania ryzyka rozwoju określonej choroby. 6. Specjalne techniki doprowadziły do znaczącego postępu w medycynie sądowej. 7. Może być opracowane leczenie genowe'niedokrwistości sierpowa tej, talasemii, niedoboru deaminazy adenozynowej i innych chorób.

WYJAŚNIENIE PODSTAWOWYCH CECH DNA DOPROWADZIŁO DO TECHNOLOGII REKOMBINACJI DNA DNA jest złożonym biopolimerem zorganizowanym w podwójny hsliks

Podstawowym elementem organizacji jest sekwencja zasad purynowych (adeniny [A] lub guaniny [G]) oraz pirymidynowych (cytozyny [C] lub tyminy (Tj). Zasady te są dołączone w pozycji C-1' do cukru deoksyrybozy, a zasady połączone są razem poprzez wiązanie fosfodiestrowe, łączące cząsteczki cukru w pozycjach 3' i 5' (p. ryc. 37-1), Naprzemienne grupy deoksyrybozy i fosforanowe tworzą szkielet podwójnego heliksu (p. ryc. 37-2). Te wiązania 3'-5' określają także orientację danego pasma w cząsteczce DNA, a ponieważ 2 pasma biegną w przeciwnych kierunkach określa się je jako przeciwrównoległe.

Parowanie zasad jest jednym z najbardziej podstawowych pojęć w odniesieniu do struktury i funkcji DNA

Adenina i tymina, podobnie jak guanina i cytozyna, dzięki wiązaniom wodorowym zawsze występują jako pary (p. ryc. 37-3). Mówimy,

530 / ROZDZIAŁ 42

że pary te są komplementarne i że zawartość guaniny we fragmencie dwupasmowego DNA będzie zawsze równa zawartości cytozyny w tym fragmencie; podobnie zawartość tyminy 1adeniny jest również jednakowa. Sparowanie zasad i oddziaływania hydrofobowe miedzy zasadami utrzymują razem 2 pasma DNA. Te wzajemne oddziaływania mogą być zmniejszo ne przez ogrzanie DNA prowadzące do denaturacji. Reguły parowania zasad przewidują, że 2 komplementarne pasma DNA mogą po renaturacji ponownie łączyć się dokładnie nukleotyd w nukleotyd; zjawisko to zachodzi wów czas, gdy temperatura roztworu jest powoli obniżana do normalnej temperatury. Faktycz nie stopień sparowania zasad (albo sparowania błędnego) może być oznaczany na podstawie temperatury potrzebnej do procesu denaturacji-renaturacji. Segmenty DNA o dużym stop niu prawidłowego sparowania wymagają wło żenia większej energii (ciepła), aby uzyskać denaturację, albo też mówiąc inaczej ściśle Sparowany segment wytrzyma wyższą tempera turę zanim pasma ulegną rozdzielaniu. Reakcja ta jest użyta do określenia znacznych różnic między 2 sekwencjami DNA i stanowi podstawę hybrydyzacji, która jest zasadniczym elementem procesów opisanych niżej. Każdy ludzki genom haploidalny zawiera ok. 3 x KF par zasad (pz). Jeśli długość przeciętnego genu wynosi 3 x 103 pz (3 kilozasady [kz]), cały genom składałby się z 106 genów, zakładając, że nie ma nakładania się genów i że transkrypcja przebiega tylko w jednym kierunku. Sądzi się, że u człowieka jest tylko ok. 10s genów, a tylko 10% DNA koduje białka. Funkcja pozostałych 90% ludzkiego genomu nie jest jeszcze dokład nie określona. Dwupasmowy helikalny DNA jest upakowany w bardziej zbite struktury za pomocą białek, głównie białek zasadowych zwanych histonami. Ta kondensacja może odgrywać rolę regulatora i z pewnością służy praktycznym celom. Gdyby DNA występujący w jądrze komórki byl linijnie rozciągnięty, zajmowałby ok. 1 m długości. Białka chromosomalne powodują skondensowanie tak długich cząsteczek DNA w taki sposób, że DNA zostaje upakowany w jądrze w objętości kilku jim3. Geny są zorganizowanymi elementami DNA Geny prokariotyczne zwykle składają się z małego regionu regulatorowego (100—500 pz)

i dużego segmentu kodującego białko (500—10 000 pz). Często kilka genów jest kontrolowanych przez pojedynczą jednostkę regulatorową. Większość genów ssaków ma bardziej złożoną strukturę, w której regiony kodujące są poprzerywane regionami niekodującymi; te ostatnie są usuwane w trakcie przekształcania pierwotnego transkryptu RNA w dojrzały informacyjny RNA (mRNA, messenger RNA). Regiony kodujące (czyli regiony, które pojawiają się w dojrzałym RNA) są nazywane eksonami, a regiony niekoduja.ee, które są wtrącane między eksony nazywają sie intronami (ryc. 42-1). lntrony są zawsze usuwane z prekursorowych cząsteczek RNA przed ich przemieszczeniem do cytoplazmy. Proces, w trakcie którego introny są usuwane z prekursorowego RNA, a eksony są łączone razem,) nazywamy składaniem jtN_A (RNA splicing). Nieprawidłowe przekształcanie pierwotnego transkryptu w dojrzały mRNA może prowadzić u ludzi do stanów chorobowych (p. niżej); podkreśla to znaczenie potranskrypcyjnego przekształcania RNA. Regiony regulatorowe swoistych genów eukariotycznych są zwykle umiejscowione w DNA,-który ogranicza miejsce inicjacji transkrypcji od końca^ (5' flankujące sekwencje DNA). Czasami takie sekwencje są znajdywane w obrębie samego _ge"fiu albo w regionie, który flankuje komec 3' genu. W komórkach ssaków każdy gen ma swój własny region regulatorowy. Liczne geny eukariotyczne (i niektóre wirusy, które replikują wTcomórkach ssaków) mają specjaJne^egiony, zwane sekwencjami wzmacniającymi (enhancer), które powodują nasilenie stopnia transkrypcji. Niektóre geny mają także sekwencje DNA zwane sekwencjami wyciszającymi (silencers), które zmniejszają transkrypcję. Geny ssaków są złożonymi strukturami o wielu komponentach. Geny są przepisywane na RNA Przepływ informacji zachodzi na ogół od DNA do mRNA i dalej do białka, tak jak to przedstawiono na ryc. 42-1 i co opisano dokładniej w rozdz. 41. Jest to proces ściśle kontrolowany, obejmujący wiele złożonych etapów, z których każdy bez wątpienia jest regulowany przez 1 lub więcej enzymów albo innych czynników; nieprawidłowa funkcja jakiegokolwiek z tych etapów może wywołać stan chorobowy.

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI

. Ftegion regulatorowy

Miejsce dodania poll(A)

Miejsce startu transkrypcji

Podstawowy region promotora

ł

Ekaon

5r Ftegion nleko dujący

JĄDRO

Ekson

Intron

3' Region niekodujący

Transkrypcj a

Pierwotny iransKrypt RNA PPP-J Modyfikacja

końców 5'l 3' \A—A

Tran skrypt zmodyfikowany Czapeczka

Ogon poli(A) Usunięcie intronów i składania aksonów

-AAA—A

Przekształcony Jądrowy mFtNA

CYTOPLAZM A mRNA

i_ Transport przez błono ___________________________ jądrową

-AAA—A Translacja

Białko

COOH

Ryc._42r1. Organizacja jednostki transkrypcyjnej w organizmach eukariotycznych i szlak ekspresji eukariotycznego genu. Geny eukariotyczne mają regiony strukturalne i regulatorowe. Region strukturalny składa sie z DNA kodującego i niekodujacych sekwencji DNA u końców 5' i 3'. Region kodujący dzieli się na 2 części: 1) eksony, które ewentualnie staną się dojrzałym mRNA i 2) introny, które są usuwane z pierwotnego transkryptu w trakcie iego przekształcenia. Region strukturalny jest ograniczony przy końcu 5' przez miejsce inicjacji transkrypcji, a przy końcu 3' przez miejsce dodania poli (A) lub miejsce terminacji. Region promotora, który zawiera swoiste sekwencje DNA oddziałujące z różnymi czynnikami białkowymi regulującymi transkrypcję, jest opisany szczegółowo w rozdz. 39 i 41. Transkrypt pierwotny ma specjalną strukturę, „czapeczkę" przy swym końcu 5' i sekwencje (A)n przy końcu 3'. Transkrypt ten jest przekształcany w celu usunięcia intronów, a dojrzały mRNA jest następnie transportowany do cytoplazmy, gdzie ulega przettumaczeniu na białko._________________________________________. ^ _ _ _ ______

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA OBEJMUJE IZOLOWANIE ł MANIPULACJĘ DNA W CELU UZYSKANIA CZĄSTECZEK CHIMERYCZNYCH Izolowanie i manipulacja PNA, włączając w to spajanie typu koniec do końca sekwencji Z; różnych odległych źródeł, w celu uzyskania cząsteczek chimerycznych -{np. cząsteczek zawierających sekwencje zarówno Judzkich, jak

i bakteryjnych DNA w sposób niezależny od organizacji sekwencji), jest podstawa techniki inżynierii genetycznej. Obejmuje ona liczne, unikatowe metody i odczynniki. Enzymy restrykcyjne przecinają łańcuchy DNA w swoistych miejscach Niektóre endonukleazy, czyli enzymy, które przecinają DNA w swoistych sekwencjach w obrębie cząsteczki (w odróżnieniu od egzonukleaz,

532 / ROZDZIAŁ 42

które trawią cząsteczki DNA od- końców), są pod stawowym i narzędziami w inżynierii genetycznej. Enzymy te pierwotnie nazwano-enzymami restrykcyjnymi, ponieważicŁułbecaość-w-Łianej bakterii ograniczała wzrost pewnych wirusów bakteryjnychj zwanych bakteriofagami. Ęnzy-_ myrestrykcyjne przecinają DNA na krótkie Tcawałki wmiejscsich_sw,Qistych sekwencji, w odróżnieniu do większości metod enzymatycznych, chemicznych lub fizycznych. Jt.tóre przecinają DNA w miejscach dowolnych. Te.enzymy-obronng.(dotychczas wykryto ich ponad 200) chroni^JDNA^bakteni gospodarza przed-DNA obcych organizmów (głównie zakaźnych fagów). Enzymy te występują jednak w tych komórkach, które mają towarzyszący enzym zdolny do mctylowania DNA gospodarza, który_tp proces /mienia DNA gospodarza w substrat nieodpowiedni do trawienia enzymem restrykcyjnym. Swoiste dla określonych miejsc DNA metylazy i enzymy restrykcyjne występują zawsze w bakteriach jako pary. Nazwy enzymów restrykcyjnych pochodzą od nazwy bakterii, z której /ustały wyizolowane. Na przykład Eco Rl jest enzymem restrykcyjnym z Escherichia coli, a Bam HI pochodzi z Bacilius amyłoliąuefaciens (tab. 42-1). Pierwsze 3 litery w nazwie enzymu restrykcyjnego składają się z pierwszej litery nazwy rodzaju (E) i pierwszych 2 liter nazwy gatunku (co). Symbol ten może być uzupełniony określeniem szczepu (R) i cyfrą rzymską (I) w celu wskazania kolejności, w jakiej enzymy zostały odkryte (np. Eco RI, Eco RII). ^Każdy enzym restrykcyjny rozpoznaje i przecina sekwencję o długości 4 7 pz w.dwu£asmow_y.ni DNA. Takie przecięcia DNA dają vv wyniku tępe końce (Kpa 1) lub końce nakładające się, czyli końce lepkie (Bam HI), zależnie od mechanizmu cięcia; jakim posługuje się enzym (ryc. 42-2). Końce lepkie sa szczeflólnif* UTrytPrftnii **' 1-T-irnrtriilr "ji h)'hrvriff'"vch. czyli chimerycznych, cząsteczek DNA (p. niżej). Jeśli w obrębie danej cząsteczkiDNA nukleotydy są rozmieszczone przypadkowo, można wyliczyć jak często dany enzym będzie przecinał całą cząsteczkę DNA, DJa_Jcajd£gajiii£Jsca_w_czas-teczce-DNAsą 4 możliwości (A, C, G lub T); ztitpm enTiym restrykcyjny. Vt"<-" T>7poznaje sekwencje o d h i Z ł ^ i ^ i )N A sreilr^fl r.n

p

inny enzym, który rozpoznaje sekwencję o_6_pz będzie przecinał raz co 4096 pz (46), f)any fragmeaL.DNA będzie miał charakterystyczne linijnc ułożenie mirjtjr. Hprjjj (jp t]iS7nvcli en-

Tabala 42-1. Wybrane endonukleazy restrykcyjne i ich swoiste sekwencje* Endonu -kleaza

Przecinane sekwencje

1

Bam Hl

G G A T C C T A

Bgl II

A 1

A T

T C

T A

1

A T

C T

T A

Eco Rl

G

G

A

i Eco Rll

Pochodzenie bakteryjne

C Bacillus amyloliqueG G faciens H

c 1

C T Bacillus globigii

G A

T

T C Escherichia coli A G RY13 T

C C T G G G A C

G C

T

i

Escherichia coli R245

Kind III

A A G C T T Haemophilus T T C G A A enzae Rd

Hha I

G C G i

T

C

C G C G

T

Hpa i

G T

Mst II

C C T \l

influ-

Haemophilus' haemolyticus

T i

A C Haemophilus parainA C A A T T G fiuenzae

T

G G Szczep Microcoieus

f A G G A N C C Pst I

r

G Providencia stuanii A G A C G T C 164 C T

G C

i

ri Tag I

T c G A A G C T

Thermus aquaticus YTI

T * A adenina; C cytozyna; G guanina; T tymina. Strzałki pokazują miejsce przecięcia; w zależności od miejsca przecięcia tworzą się lepkie końce (np. Bam HI) lub tępe końce (np. Hpa I). Długość rozpoznawalnych sekwencji wynosi 4 pz {Taq I), 5 pz (Eco Rll), 6 pz (Eco Rl) lub 7 pz (Mst II). Umowny zapis sekwencji: pasmo górne w kierunku 5' do 3', pasmo dolne 3' do 5:, czyli o odwrotnej polarności Zwróć uwagę, że większość rozpoznawalnych sekwencji jest sekwencjarni palindromowymi (tj. odczytywane są tak samo w odwrotnych kierunkach na 2 pasmach). Reszty N oznaczają, że może występować tu jakikolwiek nukleotyd.

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI ONA / 533 A. Lepkie, czyli nierówna końce ------GGATCC —

—G BamHI

■CCTAGG —

—CCTAG

B. Tępń końce -------GTTAAC

—

GATCC -

GHpal

-----CAATTG —

— GTT AAC— CAA

TTG-

-----"\

Ryc. 42-2. Wynik trawienia endonukleazą restrykcyjną. Trawienie endonukleazą restrykcyjną daje fragmenty DNA z końcami lepkimi, łączącymi się ze sobą (A), lub z końcami tępymi (B). Jest to ważna okoliczność do opracowania strategii klonowania. ________________________________________________________________________________

zjmówy-copozwala na konstrukcję map restrykcyjnych. Gdy DNA jest trawiony danym enzymem, wówczas końce wszystkich fragmentów DNA będą miały tę samą sekwencję. Uzyskane fragmenty mogą być wyizolowane przez elektroforezę" na żelu z agarozy lub poliakrylamidu (przenoszenie fragmentów DNA jest dyskuto-

wane niżej); jest to podstawowy etap w procesie klonowania i główne zastosowanie enzymów restrykcyjnych. Inne enzymy działające na DNA i RNA są ważną częścią technologii rekombinacji DNA. Liczne z tych enzymów są podane w tym i następnych rozdziałach (tab. 42-2).

Tabela 42-2. Enzymy stosowane w badaniach techniką rekombinacji DNA* Enzym

Reakcja

Podstawowe zastosowanie Usuwanie grup 5'-PO4 przed znakowaniem kinazą dla uniknięcia samospojenia

Fosfataza alkaliczna

Defosforyluje końce 5' DNA i RNA

Nukleaza BAL 31

Degraduje zarówno 3', jak i 5' końce Progresywne skracanie cząsteczek DNA DNA

Ligaza DNA

Katalizuje wiązania między cząsteczkaSkładanie cząsteczek DNA mi DNA

Polimeraza DNA I

Syntetyzuje dwupasmowy DNA z jedSynteza dwupasmowego cDNA; nick nopasmowego DNA translation

DNaza I

W odpowiednich warunkach przecina Nick translation; mapowanie miejsc 1 pasmo w DNA nad wrażliwych

Egzonukleaza III

Usuwa nukleotydy od końców 3' DNA

Egzonukleaza X

Usuwa nukleotydy z końców 5' DNA

Sekwencjonowanie DNA; mapowanie interakcji DNA-biatko

Sekwencjonowanie DNA Kinaza polinukleotydo- Przenosi końcowy fosforan (pozycja y) H wa z ATP do grup 5'-OH DNA lub RNA Znakowanie DNA lub RNA P Odwrotna transkryptaSyntetyzuje DNA ną_matn/C¥JlNA___ Synieza cDNA z mRNA; mapowanie za końca 5' RNA Degraduje jednopasmowy DNA Usuwanie struktur „spinka do włosów" Nukleaza Sl w syntezie cDNA; mapowanie RNA (zarówno końca 5' jak 3') Dodaje nukleotydy do końców 3' DNA Dodawanie ogonów monopolimeroTransferaza terminalna wych 'Adaptowano za zgodą z: Emery AEH: Str. 41 w; Introduction to Recombinant DNA. Wiley, 1984.

534 / ROZDZIAŁ 42

W celu uzyskania chimerycznych cząsteczek DNA stosuje się trawienie i ponowne spajanie DNA TedmoJogia spajania DNA przez lepkie końce jest łatwa, ale często są wymagane specjalne techniki, aby pokonać problemy nieodłączne dla tego podejścia. Lepkie końce wektora mogą się łączyć ponownie same ze sobą bez włączenia do wektora fragmentów DNA, które zamierzaliśmy wprowadzić. Fragmenty DNA mogą także łączyć sie przez lepkie końce, dając w ten sposób tandemowe, Ueterogenne inserty. Lepkie końce mogą być również niedostępne albo mogą występować w nieodpowiednim położeniu. Aby ominąć te problemy stosuje się enzym, który. daje., te.pe~ko.nce,, do których dodaje się końcówki, stosując enzym fjgjaze. Jeżeli dodaje się do końców 3' wektora poli d(G), a poli d(C) do końców 3' obcego DNA, to 2 cząsteczki mogą się łączyć każda ze sobą, omijając wyżej wymienione problemy. Ta procedura, nazwana dodawaniem ogonów homopoiimerów, tworzy miejsce restrykcyjne dla enzymu Sma 1, umożliwiając w ten sposób łatwe odzyskanie fragmentu. W niektórych przypadkach do tępych końców DNA wiąże się łączniki syntetycznych oligonukleotydów, zawierających sekwencję dla enzymu restrykcyjnego, który nam odpowiada. Bezpośrednie związanie tępych końców uzyskuje się enzymem bakteriofagowym — ligazą T4 DNA. Ta technika, chociaż trudniejsza niż wiązanie końców lepkich, ma te wyższość, że można łączyć jakiekolwiek pary na końcach fragmentu. Wadą tej techniki jest brak kontroli nad orientacją insertu lub nad liczbą spojonych cząsteczek, a także trudności w odzyskaniu insertu. Chimeryczny DNA namnaża się przez klonowanie Klon jest to duża populacja identycznych cząsteczek, bakterii lub komórek, które pochodzą od

wspólnego przodka. Klonowanie pozwala na wyprodukowanie dużej liczby identycznych cząsteczek DNA, które następnie mogą być scharakteryzowane albo użyte do innych celów. Technika ta oparta jest na fakcie, że chimeryczne, czyli hybrydowe, cząsteczki DNA mogą posłużyć do konstrukcji wektorów klonujących, którymi są zwykle plazmidy bakteryjne, fagi albo kosmidy; konstrukcje takie podlegają replikacji w komórce gospodarza pod "kontrolą swoich własnych systemów. W ten sposób chimeryczny DNA jest namnażany (amphfikowa-

ny). Ogólną procedurę przygotowania wektorów klonujących przedstawiono na ryc. 42-3. Bakteryjne plazmidy są to małe, kołowe cząsteczki dwupasmowego DNA, których naturalną funkcją jest nadawanie komórce gospodarza Oporności na antybiotyki. Plazmidy mają wiele właściwości, które są niezwykle użyteczne do konstrukcji wektorów klonujących. Istnieją one jako pojedyncze lub liczne kopie w obrębie bakterii i replikują niezależnie od bakteryjnego DNA. Znane są kompletne sekwencje DNA licznych plazmidów; dzięki temu dostępne są precyzyjne miejsca przecięć enzymami restrykcyjnymi dla insercji obcego DNA. Plazmidy są mniejsze niż chromosom gospodarza (bakterii) i przeto można je łatwo oddzielić od bakteryjnego DNA, a żądany fragment DNA można łatwo uzyskać przez przecięcie plazmidu enzymem swoistym dla miejsca restrykcyjnego, w które włączono oryginalny odcinek DNA. Fagi zawierają zwykle cząsteczki linijnego DNA, do których może być włączony obcy DNA w licznych miejscach restrykcyjnych. Chimeryczny DNA otrzymuje się po przejściu faga przez jego cykl lityczny i po uzyskaniu dojrzałych zakaźnych cząsteczek fagowych. Wyższość wektorów fagowych polega na tym, że podczas gdy plazmidy mogą przyjąć fragmenty DNA o długości 6—10 kz, fragmenty przyjmowane przez fagi mogą mieć długość 10—20 kz; ograniczenie to narzuca ilość DNA, która może być upakowana w główkę faga. Jeszcze dłuższe fragmenty DNA mogą być klonowane w kosmidach, które mają kombinację najlepszych cech plazmidów i fagów. Kosmidy są to plazmidy, które mają sekwencję DNA, tzw. miejsca cos, niezbędne do upakowania X DNA do cząsteczki faga. Wektory te rosną w postaci plazmidów w bakteriach, ale ponieważ zabiera się z nich większą część niepotrzebnego DNA, więcej chimerycznego DNA może być upakowane do główki cząsteczki. Wcale nierzadkie są kosmidy, które niosą inserty chimerycznego DNA o długości 35—50 kz. Porównanie tych wektorów p. tab. 42-3. Insercja DNA do funkcjonalnego regionu Tabela 42-3. Pospolite wektory do klonowania Wektor Plazmid pBR322 Charon X 4A Kosmidy

Wielkość insertu DNA 0,01-10 kz 10-20 kz 35-50 kz

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 535

Restrykcyjn a endonukteaza Eco Hl

Kałowy plazmidowy DNA

I Restrykcyjna endonukleaza Eco Rl

AATT TTAA Fragmenty ludzkiego DNA przecięte endonukleazą restrykcyjny zawierające lepkie końca

Unijny plazmidowy DNA z lapktml końoaml Cząsteczka plazmidowego DNA z inserlem ludzkiego DNA (rakom blnantowa cząsteczka DNIA)

Ryc'42-3. Użycie nukleaz restrykcyjnych w celu uzyskania nowych rekombinacyjnych, czyli chimerycz nych, cząsteczek DNA Plazmidowy DNA, po wprowadzeniu z powrotem do komórki bakteryjnej (w procesie zwanym transformacją), replikuje się nie tylko sam, ale replikuje również fizycznie połączony insert nowego DNA. Ponieważ ponowne połączenie lepkich końców —jak to pokazano — regeneruje tę samą sekwencję DNA, rozpoznawaną przez pierwotnie użyty enzym restrykcyjny, sklonowany insert DNA może być ponownie precyzyjnie wycięty z kołowego plazmidowego rekombinata tą samą endonukleazą. Jeśli, jako źródło DNA ludzkiego, użyje się mieszaniny wszystkich fragmentów DNA uzyskanych przez trawienie caiego ludzkiego DNA pojedynczą nukleazą restrykcyjną można uzyskać miliony różnych typów cząsteczek rękombinacyjnego DNA, a każdy z typów będzie czysty (jednorodny) w swoim bakteryjnym klonie. (Zmodyfikowano i reprodukowano za zgodą z: Cohen S. N.: The maniputation of genes. Sci. AM (Juty) 1975; 233:34). _________

może interferować z czynnością tego regionu, należy więc uważać, aby nie nastąpiło przerwanie podstawowych funkcji wektora. Tę koncepcję wykorzystuje się jednak w technice selekcji. Popularny wektor plazmidowy pBR322 ma geny oporności zarówno dla tetracykliny (tet), jak również ampicyliny (amp). Pojedyncze miejsce dla enzymu restrykcyjnego Pst I w obrębie genu oporności na ampicylinę jest używane zwykle jako miejsce insercji dla fragmentu obcego DNA. Oprócz uzyskania lepkich końców (tab. 42-1 i ryc. 42-2), włączony w to miejsce obcy DNA przerywa gen oporności na am-

picylinę i sprawia, że bakteria nosząca taki plazmid staje się wrażliwa na ampicylinę (ryc. 42-4). Rodzicielski plazmid, który dostarcza oporności na 2 antybiotyki może więc być tatwo oddzielony od chimerycznego plazmidu, który jest oporny jedynie na tetracyklinę. Dodatkowym potwierdzeniem faktu, że insercja miała miejsce, może być oszacowanie wielkości plazmidowego DNA uzyskane z domniemanego rekombinantu podczas elektroforezy na żelu agarozowym, ponieważ cząsteczka chimerycznego DNA jest dłuższa niż DNA wektora gospodarza.

536 / ROZDZIAŁ 42 Gen oporności

Gen oporności na ampicylinę

Następnie włączyć Insert DNA po Pst I

PBR322 - gospodarz

na tetracyklinę pBR32E — cząsteczka chimeryczna

Ryc. 42-4. Metoda przesiewu rekombinantów w celu uzyskania włączonych fragmentów DNA. Do plazmidu pBR322 w unikatowe miejsce Pst I włączono fragment obcego DNA. To wstawienie przerwało gen kodujący białko wnoszące oporność bakterii gospodarza na ampicylinę. Skutkiem tego .ptazmid chimeryczny nie jest w stanie przeżyć po wysianiu na pożywkę zawierającą ten antybiotyk. Do odróżnienia klonów plazmidowych, które zawierają insert, może być zatem zastosowana zróżnicowana wrażliwość na tetracyklinę i ampicylinę.

Klony rekombinantów genomu danego organizmu tworzą jego bibliotekę Zastosowanie kombinacji enzymów restrykcyjnych, i różnych wektorów do klonowania pozwala na upakowanie w wektorach całego genomu danego organizmu. Zbiór takich różnych klonów rekombinantów nazywa się biblioteką. Biblioteka genomowajestprzygptpwana z całkowiiego DNA-linti konioiTioweJJub tkanki. Biblioteka cDNA reprezentuje zbiór mRNA wdanej tkance. Biłjlioiejyjięnomowe uzyskuje się dzięki częściowemu trawieniu całkowitego DNA enzymami restrykcyjnymi, które tną DNA często, tzn. na krótkie odcinki (np. Sau IIIA). Pożądane jest uzyskanie raczej dużych fragmentów, tak aby większość genów była pozostawiona w stanie nie naruszonym. Do konstrukcji takich bibliotek preferowane są wektory fago we, ponieważ fagi akceptują duże fragmenty DNA (do 20 kz). Ostatecznym celem jest uzyskanie pełnej biblioteki. Liczba fragmentów, niezbędnych dla osiągnięcia tego celu, jest odwrotnie skorelowana z rozmiarem fragmentów i zależna wprost od rozmiaru genomu (tab. 42-4). Biblioteka genomu ludzkiego, która

zawiera 10 6 rekombinacyjnych fragmentów o dużej długości, ma 99% szansę być biblioteką kompletną. Wobec tego szansę na znalezienie pojedynczej kopii genu są bardzo duże. Biblioteki cDNA przygotowuje się izolując najpierw populację cząsteczek mRNA z tkanki, ąjiastejpnie kopiując te cząsteczki na dwupasmowy DNA, stosując (koiejno) odwrotną 'Efanskryptazę i DNA polimerazę. Z przyczyn technicznych rzadko, uzyskuje .się kopie cDNA o pełnej długości, tak że są zwykle klonowane mniejsze fragmenty DNA. jUaajydj są często preferowane jako wektory do sporządzania bibliotek cDNA, ponieważ są one wygodniejsze w..pracy niż fagi lub kosmidy, chociaż wektory z różnych fagów X mają szczególne zalety do klonowania DNA (p. niżej). Wektorów którym jest aktualnie syntetyzowane białko Ipjz"ezr"gerr3^iEowaaz6ny ieehn ologią rekombinacji DNA, nazywa się wektftrem ekspresyjnym. Takie wektory są obecnie powszechnie stosowane w celu wykrycia swoistych cząsteczek cDNA w bibliotekach i do produkcji białek technikami inżynierii genetycznej. Wektory te są tak konstruowane, aby zawierały

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 537 Tabela 42-4. Skład pełnych bibliotek genomowych* Źródło

Pełna biblioteka genomowa

E coli Drożdże Drosophila

1 500 Iragmentów 4 500 Iragmentów 50 000 fragmentów 800 000 fragmentów

Ssaki

* Liczba przypadkowych fragmentów (unikatowych klonów), które powinna zawierać biblioteka zapewniająca, że jest reprezentowany każdy pojedynczy gen, jest odwrotnie proporcjonalna do średniej wielkości Iragmentów użytych do sporządzenia biblioteki i wprost proporcjonalna do liczby genów w organizmie. Liczby podane w tabeli przedstawiają liczbę fragmentów (niezależnych klonów) niezbędnych do uzyskania 99% pewności znalezienia danej sekwencji DNA w bibliotece rekombinacyjnego DNA o średniej wielkości insertu 2x1(r nukleotydów. Różnice wynikają ze zmienności stopnia złożoności genomu między organizmami. Liczba niezbędnych klonów jest wyliczona z wzoru: N= In (1 - P) ln(1 — f) gdzie P jest żądanym prawdopodobieństwem, a f frakcją całkowitego genomu zawartą w pojedynczym-klonie, W przypadku genomowej biblioteki ssaków, przedstawionej wyżej, przyjmując 3x10 9 nukfeotydów jako wielkość genomu haploidalnego, równanie to ma postać jak niżej:

In (1—0,99)

N= ln

<1 — [ 3 x1 0s J

Wyższość, jaką przedstawia biblioteka ziożona z dużych fragmentów DNA. jest oczywista, gdy rozwiąże się to równanie biorąc wielkość fragmentów 5 x 103 nukleotydów zamiast 2 x 104 nukleotydów.

bardzo aktywne promotory indukcyjne, odpowiednie i będące w fazie kodony inicjacyjne dla translacji, sygnały zarówno do transkrypcji, jak i terminacji translacji oraz, jeśli potrzeba, odpowiednie sygnały do przekształcania białka. Niektóre wektory ekspresyjne zawierają nawet geny inhibitorów proteazy, aby w ten sposób uzyskać zwiększone ilości końcowego produktu. Wektor X gt 11 jest powszechnie używany do konstrukcji bibliotek, ponieważ akceptuje większe cząsteczki cDNA, które są replikowane i tłumaczone na białka; w tym stanie rzeczy

biblioteki rekombjnacyjne w wektorze X gtll mogą być przesiewane zarówno sondami cDNA, jak i sondami przeciwciał. Biblioteki stosowane do przesiewu sondami w celu wykrycia swoistych genów i cząsteczek cDNA Różnorodne cząsteczki mogą być użyte jako „sondy" do poszukiwania swoistych genów lub cząsteczek cDNA w bibliotekach lub do ilościowego określenia DNA i RNA rozdzielonych podczas elektroforezy na różnych żelach^^SaŁ^fiUfll sf nii "fViłi fra-gmentv DNA liiIT RNA znakowane przy użyciu nukleotydu zawierąjąfTfjfliM?p Ałiv sonda była użyteczna i skuteczna musi ona rozpoznawać komplementarną sekwencję. W celu przeszukiwania biblioteki cDNA w odniesieniu do długich fragmentów cDNA lub przeszukiwania biblioteki genomowej w odniesieniu do sekwencji komplementarnej kodującego regionu genu mogą być użyte cDNA syntetyzowane na swoistych mRNA jako matrycach. Popularną techniką wyszukiw&nia._.swaislycii genów jest wzięcie krótkiej sekwencji aminokwasowej i, stosując zestawienie kodonów dla tej sekwencji (p, rozdz. 40), sporządzenie sondy oligonukłeotydowej, która wykryje odpowiadający fragment DNA w bibliotece genomowej. Jeśli sekwencje sondy komplementarnej dokładnie pasują do sekwencji poszukiwanych, to sondy "o długości 15—20 nukleotydów będą z nimi hybrydyzowały. Sondy cDNA są stosowane do wykrywania fragmentów DNA metodą Southerna i do wykrywania ilościowego RNA.jnetodą Northern. Techniki „blotting" i hybrydyzacji pozwalają na uwidocznienie swoistych fragmentów TJwadocznienie swoistych fragmentów DNA i RNA spośród wielu tysięcy „kontaminujących" cząsteczek wymaga użycia kilku technik, które określa się zbiorczym terminem przeniesienie plam (błot transfer), Na rycinie 42-5 przedstawiono procedury przeniesienia plam metodą-Soitfherita (DNA), metodą Northern (RNA) i Western (białko). (Pierwsza technika uzyskała nazwę od badacza, który ją opracował, a inne nazwy wzięły się z laboratoryjnego żargonu i zostały zaakceptowane). Te metody są użyteczne do oznaczenia liczby kopii genu w danej tkance albo określenia, czy gen ma duże zmiany strukturalne (delecje, insercje lub rearanżacje). W pewnych przypadkach, jeśli jest

538 / ROZDZIAŁ 42 Southarn

Northe r

Western Białko y^

nn j

\

IcDNA* OOD

żelowa

i IcOfJA* CJC3 E=l

1

W

Przeniesienie na bibułę

Przeciwciało* sondę

-------

Dodać

|

Autoradlogram

Ryc. 42-5. Technika przenoszenia plam. W technice Southerna, czyli przenoszenia DNA, wyizolowany z linii komórkowej lub tkanki DNA trawi się jednym lub wieloma enzymami restrykcyjnymi. Mieszaninę inkubacyjną nanosi się do studzienek w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym i eksponuje_na pole elektryczne prądu stałego. DNA dzięki ładunkowi ujemnemu wędruje w kierunku katody; małe fragmenty wędrują najszybciej. Po odpowiednim czasie DNA denaturuje się łagodną alkatizacją i przenosi na bkmę nitrocelulozową (filtr) w postaci dokładnej repliki układu prążków na żelu techniką przenoszenia plam (blotting) opracowaną przez Southerna. DNA wiąże się z bibułą przez wygrzewanie i następnie bibułę eksponuje na znakowaną sondę cDNA, która hybrydyzuje z komplementarnymi fragmentami DNA związanego z filtrem. Po dokładnym przemyciu bibułę eksponuje się na film rentgenowski, który po wywołaniu ujawnia swoiste prążki odpowiadające fragmentom DNA, które rozpoznały sekwencje cDNA sondy. Koncepcja techniki przenoszenia plam RNA, czyli metoda Northern jest podobna. Przed przeniesieniem RNA jest poddany elektroforezie. Technika przeniesienia wymaga nieco odmiennego postępowania niż przeniesienie DNA, aby przede wszystkim zapewnić pozostawienie nietkniętych cząsteczek RNA; ogólnie metoda ta jest nieco trudniejsza. Przenoszenie plam białek, czyli technika Western, polega na elektroforezie i przeniesieniu białek na filtr nitrocelulozowy, a następnie użycie jako sondy swoistego przeciwciała lub innych sond molekularnych.

zmieniona swoista zasada, w wyniku czego zmienia się miejsce restrykcyjne, metody te mogą wykryć mutację punktową. Techniki przeniesienia plamy typu Northern i Western są stosowane do określenia wielkości i ilości swoistych cząsteczek RNA i białek. Hybrydyzacja kolonii lub hyhrydyzacja płyt-

kowa jest metodą za pomocą której identyfikuje się i oczyszcza swoiste klony. Bakterie są hodowane w postaci kolonii na płytce agarowej, którą następnie pokrywa się nitrocelulozową bibułą filtracyjną. Komórki z każdej kolonii przylepiają się do filtru i są do niego trwale ufiksowane przez podgrzanie, co jednocześnie z działaniem NaOH, doprowadza także do iizy komórek i denaturacji DNA, a następnie po-

zwoli na jego hybrydyzację z sondą. Sondę radioaktywną dodaje się do filtru i po przemyciu kompleks hybrydowy jest lokalizowany przez ekspozycję filtru na kliszę fotograficzną. Po zidentyfikowaniu plamy na auto radio gramie z kolonią, ta ostatnia może być wyodrębniona z płytki. Podobna strategia jest stosowana do identyfikacji fragmentów DNA w bibliotekach fagowych. Kolejne etapy tej procedury dają w wyniku wyizolowany klon (kolonie bakteryjne) lub kolonię pochodzącą z indywidualnego faga. Wszystkie metody hybrydyzacji, omawiane w tej części, zależą od swoistych właściwości parowania zasad komplementarnych pasm kwasów nukleinowych opisanych wyżej. Do-

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 539

kładne sparowanie daje łatwo hybrydę oporną na wysokie temperatury w trakcie reakcji hybrydyzowania i przemywania. Kompleksy takie tworzą się również w małych stężeniach soli. Parowanie zasad, przebiegające z mniejszą dokładnością, nie toleruje takich ostrych warunków, tj. podwyższonych temperatur i małych stężeń soli; w takim przypadku hybrydyzacja albo nie zachodzi albo hybrydy zostają rozerwane w czasie przemywania. Rodziny genów, mających pewien stopień homologii, mogą być wykryte przez zmianę ostrości warunków hybrydyzacji i przemywania. To podejście pozwala także na między gatunkowe porównania danego genu. Do analizy cząsteczek rekombinacyjnego DNA stosuje się sekwencjonowanie DNA Segmenty cząsteczek swoistego DNA, uzyskane techniką rekombinacyjnego DNA, mogą być analizowane odnośnie do ich. sekwencji ddATP

ddTTP

ddGTP -

ddCTP

Sekwencja oryginalnego pasma 1

11

3 t _

1

i _

1

S

<

1 1 1 1

1

i

I

I

I

i

t

•

* -A-G-T-C-T-T-G-G-A-G-C-T-3 ..

Reakcja:

nukleotydowej. Metoda ta zależy od istnienia dużej liczby identycznych cząsteczek DNA, Wymóg len może być spełniony przez klonowanie danego fragmentu, stosując wyżej opisane techniki. Enzymatyczna metoda (metoda Sangera) sekwencjonowania DNA wykorzystuje swoiste dideoksynukleotydy, które kończą syntezę pasma DNA w miejscu swoistego nukleotydu w trakcie syntezy pasma na oczyszczonej matrycy kwasu nukleinowego. Reakcje są tak dobrane, że uzyskuje się populację fragmentów DNA reprezentujących zatrzymanie syntezy na każdym nukleotydzie. Wprowadzając radioaktywny znacznik w miejsce naprzeciw miejsca terminacji można uzyskać oddzielne fragmenty, które są segregowane pod względem wielkości za pomocą elektroforezy na żelu poliakryiamidowym. Po sporządzeniu autoradiogramu każdy z fragmentów da pasmo na kliszy rentgenowskiej. Pasma te, czytane po kolei, dają sekwencję DNA (p. ryc. 42-6). Obecnie jest opracowana metoda półautomatycznego sek-

*

1 A T Zasada kończąca

1

A G T C T T G G A G C T

Ryc. 42-6. Sekwencjonowanie DNA metodą opracowaną przez Sangera. Drabinkowy układ prążków na żelu od dotu do góry przedstawia stopniowo wydłużające fragmenty pasma oryginalnego DNA. Wiedząc, która ze swoistych reakcji dideoksynukleotydowych została wykonana w celu uzyskania mieszaniny fragmentów, można oznaczyć sekwencję nukieotydów od znakowanego końca w kierunku końca nieznakowanego na podstawie „odczytywania" żelu. Reguły parowania zasad wg Watsona-Cricka (A-T, G-C) dyktują sekwencję drugiego (komplementarnego) pasma. ________________________________________________________________________________

540 / ROZDZIAŁ 42

Sekwencja docelowa

VW

START CYKL1

wencjonowania DNA. Inna metoda (Maxama i Gilberta) wykorzystuje metody chemicznego przecinania DNA w miejscu swoistych nukleotydów.

vAW Synteza oligonukleotydów jest CYKL 2 VSA/

V\A> CYKL 3

W\A

wv

vw*

^AA/

W V

nTrff l

obecnie metodą rutynową Rutynową metodą laboratoryjną jest zautomatyzowana synteza chemiczna umiarkowanie długich (~100 nukleotydów) oligonukleotydów o precyzyjnej żądanej sekwencji. Każdy cykl syntezy zajmuje kilka minut, tak że synteza całej cząsteczki może być wykonana w ciągu godzin w zależności od jej długości. Takie oligonukleotydy są obecnie konieczne do sekwencjonowania DNA, przeszukiwania bibliotek., określania przesunięć w mobilności DNA, polimerazowej reakcji łańcuchowej (p. niżej) i licznych innych zastosowań.

Poiimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR) pozwała na amplifikację sekwencji DNA Poiimerazowa reakcja łańcuchowa jest metodą służącą do amplifikacji okreslonycrrsekwencji DNA. Swoistość tej reakcji jest oparta na użyciu 2 primerów oligonukieotydowych, które hybrydyzują do komplementarnych sekwencji położonych na przeciwległych pasmach DNA i flankujących interesującą nas sekwencję docelowy (ryc. 42-7), Próbką DNA jest najpierw podgrzewana, aby..rozdziełić 1 pasińa, następnie sekwencje primerów wiajj&jjicj DNA i każde z pasm jest kopiowane przez polimerazę DNA p_ocząwszy od miejsca pnmera. Każde z 2 pasm D.NA służy jako matryca do syntezy nowego DNA, począwszy od 2 primerów. Powtarzane cykle denaturacji cieplnej, łączenia primerów do ich sekwencji komplementarnych i wydłużenie sekwencji primerów przez polimerazę DNA dają ostatecznie eksponencjalną amplifikację Ryc. 42-7. Użycie polimerazowej reakcji łańcuchowej do amplifikacji swoistych sekwencji genowych. Dwupasmowy DNA jest podgrzewany w celu rozdzielenia na pojedyncze pasma. Pasma te wiążą 2 określone primery, które są komplementarne do swoistych sekwencji na przeciwległych pasmach, i które określają fragment przeznaczony do amplifikacji. Polimeraza DNA wydłuża primery w obu kierunkach i syntetyzuje 2 pasma komplementarne do 2 pasm oryginalnych. Cykl ten powtarza się wielokrotnie, dając zamplifikowany produkt o określonej długości sekwencji.

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 541

segmentów DNA o określonej długości. Na. _ rób ^u ludzi. Dwiejechniki pozwalają uzyskać początku , .stosowania reakcji PCR używano ten cel: hybrydyzacja komórek somatycznych połimerazy DNA z E. coli; polimeraza była oraz hybrydyzacja in situ. Hybrydyzacja in situ niszczona przez każdy cykl denaturacji cieplnej. jest najprostszą i najbardziej bezpośrednią proPodstawienie stabilnej termicznie polimerazy cedurą, w której radioaktywna sonda jest dodaD..NĄ z Thermus aguaticus, organizmu, który wana do rozproszonych na powierzchni szkiełżyje i replikuje się w temp. 70-80°C, ominęło ka mikroskopowego chromosomów metafazoproblem wrażliwości enzymu na temperaturę wycja,. Dokładne miejsce hybrydyzacji określa i pozwoliło na automatyzację reakcji PCR, się przez nałożenie na szkiełko emulsji fotoponieważ reakcja prowadzona tą polimerazą graficznej i po ekspozycji porównanie rozmieszmoże przebiegać w temp. 70°C. Pozwoliło to czenia ziaren w obszarach strukturalnych chrotakże zwiększyć swoistość i wydajność DNA. mosomów. Pozwala to często na umiejscowieMożna uzyskać zamplifikowane sekwencje nie genu w określonym prążku lub regionie DNA krótkie, np. 50—100 pz oraz długie o 2,5 chromosomu. Niektóre z genów Judzkich, kpz. 20 cykli w reakcji PCR daje amplifikację umiejscowione za pomocą tej metody, przedrzędu ~1G6, a 30 cykli rzędu ~109. Reakcja stawiono w tab. 42-5. PCR pozwala na amplifikację i analizę DNA W tabeli tej przedstawiono jedynie wybrane z pojedynczej komórki, cebulki włosowej lub próbki, ponieważ dotychczas zmapowano już .nasienia. Oczywiste jest zastosowanie reakcji setki genów. Mapa genomu ludzkiego będzie PCR w medycynie sądowej. Metoda PCR jest kompletowana w nadchodzących latach; isttakże stosowana do: 1) wykrywania czynników nieją także zamierzenia zsekwencjonowania cazakaźnych, zwłaszcza latentnych wirusów, 2) łego genomu ludzkiego. Z dotychczasowych prenatalnej diagnostyki genetycznej, 3) wykry- badań wyłaniają się następujące wnioski: 1. wania polimorfizmu alleli, 4) precyzyjnego usta- Geny, które kodują białka o podobnych funkclania typu tkanek do transplantacji i 5) do jach, mogą być umiejscowione na oddzielnych badań nad ewolucją, stosując archeologiczne chromosomach (a- i P-globiny). 2. Geny, które próbki DNA. Równie liczne są zastosowania stanowią część rodziny, mogą także mieścić się techniki PCR do problematyki badań podsta- w oddzielnych chromosomach (hormon wzroswowych i z pewnością pojawią się nowe moż- tu i prolaktyna). 3. Geny odpowiedzialne za liwości zastosowania tej metody. wiele chorób dziedzicznych, wywołanych niedoborem swoistych białek, włączając w to również choroby związane z chromosomem X, są umiejPRAKTYCZNE ZASTOSOWANIE scowione w miejscach swoistych. Może najTECHNOLOGII REKOMBINACJI DNA ciekawszy jest fakt, że dzięki dostępności okreśSTALE SIĘ ZWIĘKSZA lonych sklonowanych fragmentów restrykcyjnych było możliwe umiejscowienie chromosoWyizolowanie swoistego genu z całego geno- malne wielu zaburzeń o nieznanym niedoborze mu wymaga takich technik, które umożliwiają białkowym, np. pląsa wica Huntingtona — wyróżnienie jednej milionowej części. Identyfi- chromosom 4; mukowiscydoza — chromosom kacja obszaru regulatorowego, który może mieć 7; torbielowatość nerek u dorosłych — chromodługość tylko 10 pz, wymaga czułości wyróż- som 16; dystrofia mięśniowa typu Duchenne niającej 1 część z 3xlO8; taka choroba, jak — chromosom X. Z chwilą umiejscowienia niedokrwistość sierpowata jest spowodowana wady do regionu DNA, który ma cechy budowy przez mutację pojedynczej zasady, co wymaga genu (ryc. 42-1) można skonstruować gen synprecyzji rzędu 1—3 x 105. Technologia rekom- tetyczny i uzy^.ać jego ekspresję w odpowiedbinacji DNA jest dostatecznie skuteczna, aby nim wektorze oraz określić jego funkcję albo sprostać tym wymogom. można zsyntetyzować domniemany peptyd na podstawie dedukcji z układu otwartej ramki Mapowanie genów pozwala odczytu w obrębie regionu kodującego. Przena umiejscowienie swoistych genów ciwciała przeciwko takiemu peptydowi można w określonych chromosomach użyć w celu zbadania, czy taki peptyd ulega Umiejscowienie genów uniożliwia.sp.orządze- ekspresji u zdrowych osobników i czy jest nie mapy ludzkiego genomu, Pozwala to na nieobecny u osobników z określonym zespołem uzyskanie użytecznych informacji w opisie cho- genetycznym.

542 / ROZD ZIAŁ 42 Tabela 42-5.Umiejscowienie genów uczłowieka* Gen

Insulina Prolaktyna

Chromosom

Choroba

11p15 6p23-q12

Hormon wzrostowy a-Globina

17q21 -qter 16p12-pter

Niedobór hormonu wzrostu a-Ta I asem i a

P-Globina

11q12 20g13-qter

p-Talasemia, niedok-rwtstość sierpowata Niedobór deaminazy adenozynowej

Deaminaza adenozynowa

Hydroksylaza fenyloalaniny 12q24 Fosfory boży 1 otrą nsferaza hipoksantynowo-guaninowa Xq26-q27 Segment G8 DNA

Fenyloketonuria Zespół Lescha-Nyhana Pląsawica Huntingtona

* Tabela ta przedstawia chrom osom alne umiejscowienie niektórych genów i chorób związanych z niedoborem lub nieprawidłowym wytwarzaniem produktów genowych. Omawiany chromosom jest wskazany przez pierwszą podkreśloną cyfrę lub literę. Inne cyfry i litery odnoszą się do szczegółowego umiejscowienia podanego w: McKusick VA: Mendeiian Inheritance in Man, 6 th ed. Johns Hopkins Univ. Press, 1983.

Określone białka mogą być produkowane do celów badawczych 1diagnostycznych Praktycznym celem badań nad rekombinacyjnym DNA jest uzyskanie materiałów do zastosowań w biomedycynie. Ta technologia ma 2 określone zalety: 1, Może ona dostarczyć dużych ilości materiału, które nie byłyby moż liwe do otrzymania zwykłymi metodami oczysz czania (np. interferon, aktywator plazminogenu). 2. Może ona dostarczać ludzkiego materia łu (np, insulina, hormon wzrostu). Korzyści w obu tych przypadkach są oczywiste. Chociaż pierwotnym celem jest dostarczenie produktów, na ogół białek, do leczenia (insulina) lub diag nostyki (test do wykrywania AIDS) chorób ludzi i zwierząt lub do celów zapobiegania (szczepionka przeciwko wirusowi zapalenia wą troby B), są także inne realne i potencjalne zastosowania o wartości rynkowej, zwłaszcza w rolnictwie. Przykładem tego ostatniego za stosowania są usiłowania uzyskania, na drodze inżynierii genetycznej, roślin, które są bardziej oporne na ekstremalne warunki suszy lub tem peratury albo bardziej wydolne w asymilacji azotu.

Technologia rekombinacji DNA ma zastosowanie w molekularnej analizie chorób

Naturalna zmienność genowa. W wa-

runkach naturalnych, podobnie jak w większości ludzkich struktur, występuje normalna zmienność sekwencji DNA, .Zmienność w sekwencji ,UNA,£zyn polimorfizm. zachodzi z częstością 1 na każdych 500 nukleotydów, czyli ok. 107 razy na genom. Nie ulega wątpliwości, że zmienność polega na delecjach i insercjadi DNA oraz podstawieniach pojedynczych zasad. U zdrowych ludzi zmiany te zachodzą zwykle w niekodujących regionach DNA lub w miejscach, które nie wywołują zmian w funkcji kodowanego białka. Polimorfizm struktury DNA może mieć związek z niektórymi chorobami i może być użyty do poszukiwania swoistego genu odpowiedzialnego za chorobę, jak to opisano niżej. Polimorfizm ma także różne zastosowania w medycynie sądowej.

Zmienność genowa powodująca cho-

robę. Genetyka klasyczna uczy, że większość chorób genetycznych jest spowodowana mutacjami punktowymi, w wyniku których dochodzi do syntezy uszkodzonych białek. Podejście to jest nadal prawdziwe, choć należy tu zaznaczyć, że choroba genetyczna może być także wynikiem dezorganizacji jakiegokolwiek etapu

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 543

przemian opisanych w początkowych ustępach tego rózdziałuT "ilustrowanych na ryc. 42-1. Zagadnienie to dobrze ilustrują badania nad genem fi-globiny. Gen ten jest umiejscowiony w zespole genów na chromosomie 11 (ryc. 42-8),

5'-

\

G,

A7

t(3

DDD

a jego bardziej szczegółową wersję przedstawiono na ryc. 42-9. Nieprawidłowe wytwarzanie pglobiny prowadzi do wielu chorób i jest spowodowane różnorodnymi uszkodzeniami w obrębie genu i w jego otoczeniu (tab. 42-6).

-B

■3'

Hemoglobino patia 10 kz

0°-Talasemla

Hemoglobina Lepore

Ryc. 42-8. Schematyczny obraz zespołu genów p-globiny i niektórych zaburzeń genetycznych. Gen figlobiny jest umiejscowiony w chromosomie 11 w ścisłym powiązaniu z 2 genami y-globiny i genem 8globiny. Rodzina genów pjest ułożona w kolejności 5'- £-Gy-Ay- f p-S-p-3'. Locus 5 ulega ekspresji we wczesnym okresie płodowym (c^ £2). Geny y ulegają ekspresji w życiu płodowym, dając hemoglobinę płodową (HbF, a2y2)- Hemoglobina osobników dorosłych składa się z HbA(OjP2) li>b HbA2 (o^Sj). Gen f p jest pseudogenem, który wykazuje homologię sekwencji z p, ale zawiera mutacje, które zapobiegają jego ekspresji. Delecje (czarne paski) w obrębie (ocus p powodują powstanie §-talasemii (niedobór lub brak [P°] P-globiny), Delecja genów 5 i P jest przyczyną powstania hemoglobiny Lepore (w której obecna jest tylko hemoglobina a). Inwersja (AyŚP)° w tym regionie (pasek niezaciemniony z napisem „Inwersja") niszczy funkcje genu i także powoduje talasemie (typ III). Każdy z typów talasemii ma tendencję do występowania w pewnych populacjach, np. delecja (Ay5(ł)° i inwersja pojawiają się u osób z Indii, Znacznie więcej delecji zmapowano w tym regionie chromosomu i każdej z nich towarzyszy pewien typ talasemii.

00 0

T T

AA

AA

T

00 O

Ryc. 42-9. Mutacje w genie p-giobiny powodujące taiasemie, Gen P-globiny pokazany jest w orientacji 5' do 3', Pola zakreskowane ilustrują regiony 5r i 3' nie ulegające translacji. Czytając w kierunku od 5' do 3' — pola zaciemnione są eksonami 1 -3, a przestrzenie niezacienione intronami 1 i 2, Mutacje dotyczące kontroli transkrypcji ( #) są umiejscowione w regionie DNA flankującym gen od końca 5'. Wskazano przykładowo zidentyfikowane mutacje nonsensowne (A), mutacje dotyczące przekształceń RNA (O) i przecinania RNA (O)- W niektórych regionach znaleziono liczne mutacje. Oznaczono je klamrami (,!,).

S44 / ROZDZIAŁ 42 Tabela biny Zmiana

6. Zmiany Uszkodzona funkcja

Mutacje Fałdowanie białka punktowe Kontrola transkrypcji Mutacje typu przesunięcia ramki odczytu i nonsensowne Przekształcanie RNA Delecje Wytwarzanie mRNA

Rearanżacje

1

w genie p-

Choroba Niedokrwistość sierpowata P-Talasemia p-Talasemia

p-Talasemia p°-Ta lasem i a Hemoglobina Lepore Wytwarzanie mRNA P-Talasemia typ III

Mutacje punktowe. Klasycznym przy-

kładem jest choroba zwana niedokrwistością sierpowata, która jest spowodowana mutacją pojedynczej zasady w całym genomie złożonym z 3 x l O 9 pz; jest to substytucja T przez A w DNA, która następnie powoduje zmianę A na U w mRNA odpowiadającą ć.kodonowi w genie p-globiny (ryc. 7-20). Zmieniony kodem określa inny aminokwas (walinę zamiast kwasu glutaminowego), co powoduje nieprawidłowości strukturalne C7ąstcczki fi-glohiny. Inne mutacje punktowe w obrębie genu P-globiny i jego otoczeniu powodują zmniejszenie, a w niektórych przypadkach zatrzymanie wytwarzania rzają takiego łagodnego („temperate") wirusa p-talasemia. Talasemie charakteryzują się wadami w syntezie podjednostek hemoglobiny, a (ł-talasemia powstaje wówczas, gdy jest niedostateczne wytwarzanie p-globiny. Na rycinie 42-9 przedstawiano mutacje punktowe, które mogą wpływać na wytwarzanie normalnego mRNA (a zatem normalnego białka), a które są uwikłane w powstawanie p-talasemii.

Delecje, insercje i rearanżacje DNA.

Badania bakterii, wirusów, drożdży i muszki owocowej wskazują, że fragmenty DNA mogą w obrębie genomu przemieszczać się z jednego miejsca na drugie. Delecja krytycznego frag■mentu DNA, rearanżacja DNA w obrębie genu albo insercja fragmentu DNA do kodującego lub regulatorowego regionu mogą wywoływaćtakie zmiany w ekspresji genu, które prowadzą do choroby. Molekularna anafiza p-talasemii dostarcza znowu licznych przykładów takich

procesów, a zwłaszcza delecji, które są przyczyną choroby (ryc. 42-8). Zespół genów globiny wydaje się być szczególnie podatny na tego typu uszkodzenie. Delecje w zespole genów ccglobiny, umiejscowionym na chromosomie 16, powodują powstanie ct-talasemii. Istnieją silne związki etniczne z licznymi typami tych delecji, tak że północni Europejczycy, Filipiń-czycy, rasa czarna i ludzie zamieszkali w rejonie Morza Śródziemnego mają różne typy uszkodzeń, a wszystkie z nich powodują brak hemoglobiny A i a-talasemię. Podobna analiza może być wykonana dla licznych innych chorób. Mutacje punktowe są zwykle określane na drodze sekwencjonowania danego genu, choć przypadkowo, gdy mutacja niszczy albo stwarza nowe miejsce restrykcyjne, technika analizy fragmentów restrykcyjnych może być użyta do wykazania uszkodzenia. Delecje lub insercje DNA, większe niż 50 pz, często są wykrywane techniką „blotting" według Southerna. Analiza rodowodu. Niedokrwistość sierpowata ponownie dostarcza doskonałego przykładu jak technologia rekombinacji DNA może być zastosowana do badań nad chorobą u człowieka. Podstawienie T przez A w paśmie matrycowym DNA genu P-globiny zmienia sekwencję w regionie, który odpowiada 6 kodonowi z sekwencją

1

C C T G A G G GA C G

CDC C

pasmo kodujące pasmo matrycowe

na sekwencję C C T G T G GG G A C@C C

pasmo kodujące pasmo matrycowe

i .niszczy miejsce rozpoznania enzymu restrykcyjnego Mst II (CCTNAGG; wskazane przez małą strzałkę pionową; tab.42-1). Inne miejsca dla Mst II, umiejscowione w kierunku 5' i 3' od miejsca omawianego (ryc. 42-10), nie są objęte mutacją, a zatem będą przecięte. W wyniku tego inkubacja z enzymem restrykcyjnym DNA od osobników normalnych (AA), heterozygot (AS) i homozygot (SS) da 3 różne wzory prążków uzyskanych metodą Southerna (ryc. 42-10). Przykład ten ilustruje jak można ustalić rodowód DNA, stosując zasady omówione w tym rozdziale. Analiza rodowodu jest stosowana w odniesieniu do licznych chorób genetycznych i jest najbardziej użyteczna w przypadku chorób

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 54S A Miejsca restrykcyjne Mst tl w obrębie I wokot genu /f-globlny Prawidłowy (A)

5:

3' 0,2 1,15 kz kb

Niedokrwlsto&ć slerpowata (S)

5

-

1.35 kz

B. Analiza rodowodu

nWielkość fragmentu

- 1,35 pz

- 1,15 pz

AS

AS

SS

AA

AS

Fenotyp

Ryc. 42-10. Analiza rodowodu niedokrwistości sierpowatej. Górny fragment ryciny (A) pokazuje pierwszą część genu (3-globiny i miejsce restrykcyjne Mst II (f) w genie p-globiny prawidłowym (A) i genie w niedokrwistości sierpowatej (S), U osób zdrowych trawienie ONA enzymem restrykcyjnym Mst II daje fragmenty o długości 1,15 kz i 0r2 kz. Zamiany T na A, jakie zachodzą u chorych na niedokrwistość sierpowatą, usuwają jedno z 3 miejsc restrykcyjnych w obrębie genu fś-globiny, w wyniku czego po trawieniu Mst 11 powstaje tylko pojedynczy fragment o diugości 1,35 kz, Te różnice w długości fragmentów są łatwo wykrywalne techniką Southerna (B). (Na tej rycinie fragment 0,2 kz wyszedł pozazel). Analiza rodowodu pokazuje 3 możliwości: AA — osoba zdrowa (O); AS — heterozygota {o, |J); SS — homozygota (■) Podejście to pozwala na prenatalną diagnozę niedokrwistości sierpowatej lub nosicieli tej choroby («£)___________________^ _ _ _ ^ ______________________________________

spowodowanych delecjami i insercjami lub rzadziej w przypadku zmian w miejscu restrykcyjnym, jak to podano na przykładach cytowanych w tym ustępie. Analiza taka jest ułatwiona przez zastosowanie reakcji PCR, która może dostarczyć dostatecznej ilości DNA dla takiej analizy. .15

Bioche imj

Diagnostyka prenatalna, Diagnostyka

prenatalna jest możliwa w przypadku, gdy jest znana wada genetyczna i gdy jest dostępna swoista sonda molekularna. DNA uzyskany z "niewielkiej ilości (np. 10 ml) płynu owodniowego (albo z biopsji kosmówek) może być

546 / ROZDZIAŁ 42

użyty do aaalizy metodą Southerna. Piód, mający wzór restrykcyjny AA (ryc. 42-10), nie jest chory na niedokrwistość sierpowatą, ani nie jest jej nosicielem. U płodu mającego wzór SS rozwinie się niedokrwistość sierpowatą. Obecnie są dostępne sondy do tego typu analizy dla wielu chorób genetycznych.

Polimorfizm długości, fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Przytaczane wyżej różnice w sekwencjach DNA mogą wynikać ze zmienności miejsc restrykcyjnych, w wyniku czego fragmenty restrykcyjne mają różne długości. Wrodzone różnice wzoru restrykcyjnego (np. zmienność w DNA zachodząca w ogólnej populacji w stopniu większym niż 1 %) są znane jako polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych, czyli RFLP (restrietion fragment length polymorphism). RFLP powstałe w wyniku zmian w pojedynczej zasadzie (np. niedokrwfstość sierpowatą) albo w wyniku delecji lub insercji DNA w obrębie fragmentu restrykcyjnego (np. talasemie) są użytecznym narzędziem diagnostycznym, Polimorfizm taki znaleziono w znanych genetycznych loci, a także w obrębie sekwencji, których funkcja nie jest znana; tak więc polimorfizm RFLP może prowadzić do zniszczenia funkcji genu, lub też nie mieć żadnych konsekwencji biologicznych. Polimorfizmy RFLP są dziedziczne i segregują się według wzoru Mendla. Polimorfizm RFLP (dotychczas poznano prawie 350) jest głównie używany w celu określenia chorób dziedzicznych, w których nie znamy ubytku funkcji. RFLP może być użyty do ustalenia Nienaruszony 5' -DNA

grap sprzężeń, które następnie, w procesie zwanym kroczenie po chromosomie, może ewentualnie określić locus związany z chorobą. W metodzie kroczenia po chromosomie (ryc. 42-11) fragment przedstawiający 1 z końców długiego odcinka DNA jest użytydo izolowania innego fragmentu, który pokrywa się z pierwszym, ale wychodzi poza jego obręb. Kierunek tego wyjścia jest określany przez mapowanie restrykcyjne i proces ten jest powtarzany stopniowo, aż uzyska się sekwencję stanowiącą przedmiot zainteresowania. Choroby sprzężone z chromosomem X są szczególnie odpowiednie do tego typu podejścia, ponieważ ekspresji ulega tylko 1 allel. Dzięki temu ok. 20% wszystkich zdefiniowanych RFLP jest umiejscowionych w obrębie chromosomu X i prawie kompletna mapa sprzężeń na tym chromosomie została opracowana. Stosując technikę RFLP znaleziono gen dystroiii mięśniowej typu Duchenne sprzężony z chromosomem X. Podobnie wadę w pląsawicy Huntingtona umiejscowiono w końcowym regionie krótkiego ramienia chromosomu 4, a wada wywołująca torbielowatość nerek jest sprzężona z locus a-globiny w chromosomie 16. Terapia genowa. Choroby wywołane niedoborem produktu genowego (tab. 42-5) mogą być odpowiednie do leczenia zastępczego. Strategia takiego leczenia polega na sklonowaniu genu (np. genu, który koduje deaminazę adenozyny) w wektorze, który może być pobrany przez komórkę gospodarza i włączony do genomu. Komórki prekursorowe szpiku kostnego są —3'

Fragmenty

Sonda początkowa

c. 42-11. Technika kroczenia po chromosomie. Zamiar polega na izolowaniu genu X z dużego odcinka DNA. Dokładne położenie tego genu nie jest znane, ale jest dostępna sonda (• —) komplementarna do fragmentu DNA (na rycinie pokazano sondę do końca 5'), jak również dostępna jest biblioteka zawierająca serię nakładających się fragmentów DNA. W celu uproszczenia pokazano tylko 5 takich fragmentów. Początkowo sonda będzie hybrydyzowała tylko z klonami zawierającymi fragment 1, który można następnie wyizolować i użyć'jako sondę do wykrycia fragmentów 2. Tę procedurę powtarza się aż do hybrydyzacji fragmentu 4 z fragmentem 5, który zawiera całą sekwencję genu X.

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 547

przydatne do tego celu, ponieważ komórki takie mogą zasiedlić szpik i tam się namnażać. Wprowadzony gen może zacząć kierować ekspresją swego białkowego produktu i w ten sposób naprawiać ubytek w komórce gospodarza. Takie zastąpienie genu w komórce somatycznej oczywiście nie może być przekazane potomstwu. Opracowano inne strategie do zmiany linii komórek rozrodczych, ale strategie te zbadano jedynie na zwierzętach doświadczalnych. Pewien odsetek genów wstrzykniętych do zapłodnionego jaja myszy może być włączony do genomu i można go znaleźć zarówno w komórkach somatycznych, jak i komórkach rozrodczych. Takie zwierzęta transgeniczne okazały się bardzo użyteczne w analizie swoistych tkankowo wpływów na ekspresję genów oraz wpływu nadmiernego wytwarzania produktów genowych (np. hormonu wzrostu lub onkogenów) oraz w poszukiwaniu genów związanych z rozwojem osobniczym, procesem, który dotychczas było trudno badać. Podejście z użyciem metody transgenicznej zastosowano współcześnie w celu skorygowania wad genetycznych u myszy. Do zapłodnionych jaj, uzyskanych od myszy z genetycznym hipogonadyzmem, wstrzykiwano DNA zawierający kodującą sekwencję prekursora białkowego hormonu uwalniającego gonadotropine (GnRH). Gen ten ulegał ekspresji i podlegał prawidłowej regulacji w podwzgórzu pewnej liczby myszy, a zwierzęta te były pod wszystkimi względami prawidłowe. Ich potomstwo nie wykazywało niedoboru GnRH. Jest to zatem dowód na somatyczną ekspresję transgenu i na jego egzystencję w komórkach rozrodczych.

SŁOWNICZEK Auta radiografia. Wykrywanie cząsteczek radioaktywnych (np. DNA, RNA, białko) przez uwidocznienie ich elektów na filmie fotograficznym. Baktertofag. Wirus, który zakaża bakterię. Biblioteka. Zbiór sklonowanych fragmentów, które reprezentują cały genom. Biblioteki mogą być albo genomowe (w których są reprezentowane zarówno introny, ;ak i eksony oraz inne sekwencje DNA) lub biblioteka cDNA {w której są reprezentowane jedynie eksony}. cDNA. Cząsteczka jedno pasmowego DNA, która jest komplementarna do cząsteczki mRNA i jest na niej syntetyzowana przy użyciu odwrotnej transkryptazy Chimeryczna cząsteczka. Cząsteczka (np. DNA, RNA, białko) zawierająca sekwencje uzys-

kane z 2 różnych rodzajów sekwencji (np. 2 różnych genów. . Endonukleaza. Enzym, który przecina wewnętrzne wiązania DNA lub RNA Ekson. Sekwencja w genie, która jest reprezentowana (ulega ekspresji) w cząsteczce mRNA. Egzonukłeaza. Enzym, który odcina nukleotydy w DNA lub RNA od końca 3' lub 5'. Hybrydyzacja. Swoista reasocjacja komplementarnych pasm kwasów nukleinowych (DNA z DNA, DNA z RNA lub RNA z RNA) łnsert. Dodatkowa sekwencja w DNA na ogół wprowadzona technikami rekombinacji DNA. Intron. Sekwencja w genie, która jest przepisana na RNA, ale wycięta i usunięta przed translacja, w trakcie przekształcania pierwotnego transkry-ptu. Klon. Duża liczba komórek lub cząsteczek, które są identyczne z pojedynczą macierzystą komórką lub cząsteczką. Kosmid. Plazmid, do którego włączono sekwencje DNA bakteriofaga X, które są niezbędne d/a upakowania DNA (miejsca cos); pozwala to na upakowanie in vitm plazmidowego DNA. Lepkie końce DNA. Komplementarne pojedyncze pasma DNA wystające na przeciwległych końcach dwupasmowej cząsteczki DNA lub wystające z końców różnych dwupasmowych cząsteczek (p. także tępe końce). Ligacja. Katalizowane enzymatycznie łączenie przez wiązania fosfod i estrowe 2 odcinków DNA lub RNA; odpowiednimi enzymami są ligazy DNA i RNA. Nick translation. Technika znakowania DNA oparta na zdolności polimerazy DNA z £. coli do degradowania pasma DNA, które zostało nacięte, i do następującej resyntezy tego pasma; jeśli zastosuje się radioaktywne trifosforany nukleo-zydów, to nowo syntetyzowane pasmo będzie wyznakowane i będzie mogło być użyte |ako radioaktywna sonda. Northern błot. Metoda przenoszenia RNA z żełu agarozowego na błonę (filtr) nitrocelulozową, na której cząsteczki RNA mogą być wykryte odpowiednią sondą. Oligonukleotyd. Krótka zdefiniowana sekwencja nukleotydów, połączonych typowym wiązaniem fosfod i estrowym. Odwrotna transkrypcja. Synteza DNA na matrycy RNA katalizowana odwrotną transkryptazą Palindrom. Sekwencja dwupasmowego DNA. która jest taka sama, gdy 2 pasma są czytane w przeciwnych kierunkach. Plazmid. Mała, pozachromosomalna, kołowa cząsteczka DNA, która replikuje niezależnie od DNA gospodarza. Polimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR). Enzymatyczna metoda wielokrotnego kopiowania dwupasmowego DNA, które może stanowić np. sekwencję określonego genu.

548 / ROZDZIAŁ 42 Pseudogen. Nieaktywny segment DNA powstały wskutek mutacji aktywnego genu macierzystego. Rekombinacyjny DNA. Zmieniony DNA, powstały w wyniku msercji sekwencji deoksynukłeotydowych (które uprzednio nie były obecne), do określonej cząsteczki DNA na drodze reakcji enzymatycznych lub chemicznych. Restrykcyjny enzym. Endonukfeaza, która przecina oba pasma DNA w bardzo swoistych miejscach określonych sekwencją zasad. Sonda. Cząsteczka użyta do wykrywania obecności swoistego fragmentu DNA lub RNA, np. w kolonii bakteryjnej, sformowana z biblioteki genetycznej lub w czasie analizy technikami przenoszenia plam; zwykłe używanymi sondami są cząsteczki cDNA, syntetyczne oligodeoksynukleotydy o określonej sekwencji i przeciwciała przeciwko swoistym białkom. Southern błot. Metoda przenoszenia DNA z żelu agarozowego na błonę (filtr) nitrocelulozową, na której DNA może być wykryty przy użyciu odpowiedniej sondy (np. komplementarnego DNA lub RNA). Spinka do włosów (hairpin). Dwupasmowy odcinek utworzony dzięki sparowaniu zasad między sąsiednimi komplementarnymi sekwencjami pojedynczego łańcucha DNA lub RNA. Splicing (składanie RNA). Usuwanie intronów z RNA z jednoczesnym łączeniem eksonów. Sygnał. Znak pozwalający na obserwację końcowego produktu, gdy np. swoiste sekwencje DNA lub RNA są wykrywane metodą autoradiografii lub inną metodą. W cełu uzyskania sygnału stosowana jest zwykle hybrydyzacja z komplementarnym radioaktywnym polinukleotydem (np. technika Southerna lub technika Northern). Tandem. Liczne kopie tej samej sekwencji {np. DNA), które leżą przyległe jedna do drugiej. Terminalna transferaza. Enzym, który dodaje nukleotydy jednego typu (np. reszty deoksyadenonukteotydylowe) do końca 3' pasm DNA. Tępe końce. 2 pasma DNA, mające końce zrównane z sobą (p. lepkie końce). Transkrypcja. Synteza RNA na matrycy DNA.

Transgeniczny. Termin opisujący wprowadzenie nowego DNA do komórek rozrodczych przez wstrzyknięcie do jądra komórki jajowej. Translacja. Synteza białka na matrycy mRNA. Wektor. Plazmid lub bakteriofag, do którego może być wprowadzony obcy DNA w celu sklonowania. Western błot. Metoda przenoszenia białka na błonę (filtr) nitrocelulozową, na której białko to może być wykryte odpowiednią sondą, np. przeciwciałem. PIŚMIENNICTWO Beaudet AL: Bibliography of cloned human and other selected DNAs. Am J Hunt Genet 1985; 37:386. Berger SL, Kimmel AR: Guide to Moleculor Cłoning Techniques, Vol 152, Methods in Enzymology, Academic Press, New York, 1987. DNA inmedtcine. Lance* 1984; 2:853,908,966,1022, 1086, 1138, 1194, 1257, 1329, 1380, 1440. Gusetla JF: Recombinant DNA techniąues in the diagnosis and treatment of inherited disorders. J Clin Invest 1986; 77:1723. Kan YW et al: Pages 275—283 in: Thalossemia: Recent Advance$ in Detectian and Treatmettt. Cao A, Carcassi U, Rowley P (edttors). AR Liss, 1982. Lewin B: Genes III. Wiley, 1987. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J: Molecuhr Cloning, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. Martin JB, Gusella JF: Huntington's disease: Pathogenesis and management. N Engl 3 Med 1986: 315:1267. Orkin SH et al: Improved detection of the sickle mutation by DNA analysis: Application to prenatal diagnosis. N Engł J Med 1982; 307:32. Watson JD, Tooze J, Kurtz DT: Recombinant DNA: A Short Course. Freeman, 1983. Weatherall DJ: The New Genetics and Clinicai Practice, 2nd ed. Oxford Univ Press, 1986. Yuan R: Structure and mechanism of multifunctional restriction endonucleases. Annu Rev Biockem 1981; 50:285.

CZĘŚĆ V Biochemia zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej komunikacji Btony: struktura, organizacja i funkcja

4 3

Daryl K. Granner, MD

WPROWADZENIE Błony są strukturami o bardzo dużej lepkości, chociaż wciąż jeszcze plastycznymi. Błony plazmatyczne tworzą zamknięte obszary wokół komórkowej cytoplazmy, oddzielając jedną komórkę od drugiej, umożliwiając tym samym ich indywidualizacje. Błony plazmatyczne charakteryzują się wybiórczą przepuszczalnością i działają jako bariery, dzięki którym możliwe jest istnienie różnic w składzie wnętrza i zewnętrznego otoczenia komórki. Wybiórcza przepuszczalność uwarunkowana jest istnieniem kanałów i pomp dla jonów i substratów, a także obecnością specyficznych Veccptorów dla odbioru sygnałów, np. hormonów. Błony plazmatyczne wymieniają także składniki ze Środowiskiem pozakomórkowym w procesach egzocytozy i endocytozy, zaś specjalne przestrzenie w strukturze błon — złącza szczelinowe — umożliwiają wymianę materiału między przylegającymi komórkami. Dzięki istnieniu błon możliwe jest także powstawanie wyspecjalizowanych odrębnych obszarów (kompartmentów) wewnątrz komórek. Takie wewnątrzkomórkowe błony otaczają wiele morfologicznie odrębnych struktur (organelli), np. mitochondria, siateczkę śródplazmatyczną, siateczkę sarkoplazmatyczną, aparat

Golgiego, ziarnistości wy dziel nicze, lizosomy i błonę jądrową. Błony, lokalizując enzymy działają jako integralne elementy w stymulacji sprzężenia pobudzenie — odpowiedź oraz są miejscami transdukcji energii np. w procesach fotosyntezy i oksydacyjnej fosforyiacji.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Większe zmiany w strukturze błon mogą zakłócić równowagę wodną i przepływ jonów, a tym samym każdy z procesów zachodzących wewnątrz komórki. Specyficzne niedostatki lub zmiany określonych składników błon prowadzą do wielu chorób. Przykładami tego są m.in.: nieobecność w lizosomach kwaśnej maltazy, wywołująca chorobę związaną z gromadzeniem glikogenu typu II; brak przenośnika jodkowego wywołujący wrodzone powiększenie tarczycy (p, ryc. 47-2); zaburzenie w endocytozie lipoprotein o małej gęstości, będące przyczyną hipercholesterolemii i wczesnego rozwoju choroby naczyń wieńcowych. Prawidłowy stan błon gwarantuje normalne funkcjonowanie komórek.

550 / ROZDZIAŁ 43

UTRZYMYWANIE NORMALNEGO ŚRODOWISKA WOKÓŁ I WEWNĄTRZ KOMÓRKI JEST WYMOGIEM PODSTAWOWYM Życie powstało w środowisku wodnym; reakcje enzymatyczne, procesy komórkowe, subkomórkowe i inne rozpoczęły się w tym ośrodku. Skoro większość ssaków żyje w środowisku gazowym, to w jaki sposób utrzymywane jest środowisko wodne? To zadanie, dzięki zatrzymaniu i kompartmentyzacji wody w organizmie, spełniają właśnie błony komórkowe.

Tabela 43-1. Porównanie średniego stężenia różnych substancji wewnątrz i na zewnątrz komórek zwierzęcych S u b s ta n c ja Płyn pozaPłyn śród komórkowy komórkowy Na + K+

140 mmol/l

10 mmol/l

4 mmol/l

140 mmol/l

C a 2 + (z jo n izowany)

2,5 mmol/l

0,1 mmol/l

Mg2

1.5 mmol/l 100 mmol/l

30 mmol/l 4 mmoi/l

27 mmol/l

10 mmol/l

2 mmol/i

60 mmol/l

ci-

Woda w organizmie jest kompartmentyzowana Woda stanowi ok. 56% beztłuszczowej masy ciała ludzkiego i rozmieszczona jest w dwóch dużych obszarach.

HCO3

komórkowy (ICF — intracellular fluid). Ten obszar obejmuje -f całkowitej ilości wody i stanowi środowisko dla; 1) wytwarzania, magazynowania i wykorzystania energii; 2) procesów samonaprawczych; 3) replikacji i 4) wykonywania określonych funkcji.

* Dotyczy stężenia białka w osoczu. W płynie śródmiąższowym stężenie białka jest < 20 g/l (przyp tłum.}.

Płyn wewnątrzkomórkowy lub śród-

Płyn zewnątrzkomórkowy lub poza-

komórkowy (ECF — extracellular fluid). Ten obszar zawiera ok. y ogól no ustrój owej ilości wody rozdzielonej między osoczem krwi a kompartmentem śródmiąższowym. Płyn pozakomórkowy jest układem dostawczym. Tą drogą dostarczane są do komórek składniki odżywcze (np. glukoza, kwasy tłuszczowe, aminokwasy), tlen, różne jony, w tym pierwiastki śladowe i wiele związków regulujących (hormonów), które koordynują funkcje znacznie oddalonych od siebie komórek. Płyn pozakomórkowy usuwa dwutlenek węgla, substancje odpadowe, składniki toksyczne i produkty detoksykacji z bezpośredniego środowiska komórkowego. Skład jonowy środowiska śród kom orkowego różni się znacznie od składu jonowego środowiska pozakomórkowego Jak pokazano w tab. 43-1 środowisko wewnętrzne komórki jest bogate w K + i Mg 2+ , a podstawowym anionem jest jon fosforanowy. Płyn pozakomórkowy charakteryzuje się dużą zawartością Na+ i Ca2+, a podstawowym anionem jest tu jon chlorkowy Cl~. Należy zwrócić uwagę na stężenie glukozy,' które jest większe w płynie pozakomórkowym niż wewnątrz ko-

Białka Glukoza

70 g/l* 5,5 mmol/l

160 g/l 0-1 mmol/l

mórki. Stężenie białek, odwrotnie niż glukozy, jest większe wewnątrz komórek niż w płynie pozakomórkowym. Skąd taka różnica? Przypuszcza się, że pierwotne morze, w którym powstało życie, było bogate w K+ i Mg2 + . Z tego też wynika, że reakcje enzymatyczne i inne procesy biologiczne zachodzą najlepiej w tym właśnie środowisku i od tego czasu istnieje to wysokie stężenie tych jonów wewnątrz komórek. Komórki były narażone na znaczną selekcję w okresie, kiedy morze stopniowo zmieniało swój skład i stało się bogate w Na+ i Ca2+. Do wytworzenia całkowicie nowego zestawu procesów biochemicznych i nowej maszynerii fizjologicznej konieczne byłyby ogromne zmiany; zamiast tego komórki wytworzyły bariery — błony z wbudowanymi w nie pompami, aby zachować wewnętrzne mi kro środowisko. BŁONY SĄ ZŁOŻONYMI STRUKTURAMI ZBUDOWANYMI Z LIPIDÓW, BIAŁEK I WĘGLOWODANÓW Różne błony wewnątrz komórki i między komórkami zbudowane są z różnych składników, jak to wykazuje stosunek białek do lipidów (ryc. 43-1). Różnice te nie są zaskakujące, jeżeli bierze się pod uwagę bardzo zróżnicowane

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 551

lo ,2 3 0,

Kwasy tłuszczowe

85 . Mlellna

R,-C-O-'CH,

Komórki

w ą tro b y

I

myszy

P-0-Rj

■0 Pręciki siatkówki wołu

Erytrocyty 1.1 ludzkie

o-

I >>CH,-0-

Alkohol Gllcerol

Ryc. 43-2. Fosfogliceryd z umiejscowieniem kwasów tłuszczowych (R1 i R2), glicerolu i fosforylowanego alkoholu. W kwasie fosfatydowym R3 jest wodorem.

1.3 Ameba Komórki 1.5 HeLa Zewnętrzna 1.1błona mltochondrlalna Siateczka2,0 śródplazmatyczna Wewnętrzna błona mltochondrialna

3,2

i

i

0

i

1 2 3 Stosunek białek do lipidów

4

Ryc:43-1. Stosunek białek do lipidów w różnych błonach. Białka występują w jednakowych iloś ciach lub przewyższają ilości lipidów niemal we wszystkich błonach. Wyjątkowym odstępstwem jest mielina, elektryczny izolator występujący w wielu włóknach nerwowych.

funkcje tych Won. Są one asymetrycznymi zamkniętymi strukturami warstwowymi mającymi powierzchnie zewnętrzne i wewnętrzne. Te warstwowe struktury są niekowalencyjnymi zbiorami stabilnymi i aktywnymi biochemicznie. W błonach zakotwiczone są określone cząsteczki białek, i tu właśnie pełnią specyficzne funkcje charakterystyczne dla organelli, komórek, czy też organizmu. Podstawowymi lipidami błon komórek zwierzęcych są fosfolipidy, glikosfingolipidy i cholesterol Fosfolipidy. Spośród dwóch głównych grup fosfolipidów występujących w błonach fosfoglicerydy występują częściej. Składają się

one ze szkieletu glicerolowego, do którego przyłączone są dwa kwasy tłuszczowe wiązaniem

estrowym i jeden fosforylowany alkohol (ryc. 43-2). Wymienione kwasy tłuszczowe są zwykle cząsteczkami o jednakowej liczbie atomów węgla. Najczęściej występują w nich 14- lub 16-węglowe łańcuchy. Kwasy te nie są rozgałęzione i mogą występować zarówno w postaci nasyconej, jak i nienasyconej. Najprostszym fosfoglicerydem jest kwas fosfatydowy, który jest l,2-diacyloglicero-3-fosforanem. Jest to podstawowy związek pośredni w tworzeniu się wszystkich innych fosfolipidów (p. rozdz. 25). W innych fosfolipidach fosforan w pozycji 3 jest estryfikowany alkoholem, takim jak etanoloamina, cholina. seryna, glicerol lub inozytol (p. str. 173). Druga klasa fosfolipidów to sfingomieliny, które mają szkielet sfingozynowy, a nie glicerolowy. Kwas tłuszczowy przyłączony jest wiązaniem amidowym do grupy aminowej sfingozyny. Pierwszorzędowa grupa hydroksylowa sfingozyny jest estryfikowana przez fosfocholinę. Sfingomieliny, co odzwierciedla ich nazwa, są głównymi składnikami osłonek mielinowych. Glikosfingolipidy. Są lipidami zawierającymi składnik węglowodanowy. Są nimi cerebrozydy i gangliozydy, będące również pochodnymi sfingozyny. Cerebrozydy i gangliozydy różnią się od sfingomielin podstawnikiem przyłączonym do pierwszorzędowej grupy hydroksylowej sfingozyny. W sfingomielin ach fosfocholina jest przyłączona do grupy alkoholowej. Cerebrozyd zawiera w tym miejscu pojedynczą resztę heksozy będącą glukozą lub galaktozą. Gangliozyd zawiera łańcuch 3 lub więcej węglowodanów, z których przynajmniej jeden jest kwasem sjalowym przyłączonym do pierwszorzędowego alkoholu, jakim jest sfingozyna.

552 / ROZDZIAŁ 43

Sterole. Najczęściej występującym w błonach sterolem jest cholesterol, który występuje niemal wyłącznie w błonach plazmatycznych komórek zwierzęcych, lecz może występować także, choć w mniejszych ilościach, w mitochondriach, aparacie Golgiego i w błonach jądrowych. Cholesterol występuje zwykle w większej ilości w zewnętrznej stronie błon plazmatycznych. Wchodzi on między fosfolipidy błon kierując swoją grupę hydroksylową w stronę fazy wodnej, a pozostałą część cząsteczki w stronę dwuwarstwy. W temperaturach powyżej przejścia fazowego (patrz dyskusja o modelu płynnej mozaiki, poniżej), jego sztywny pierścień sterolowy oddziałuje z łańcuchami acylowymi fosfolipidów, limitując ich ruchliwość i tym samym zmniejszając płynność błon. Z drugiej strony, gdy temperatury zbliżają się do temperatury przejścia fazowego, interakcja cholesterolu z łańcuchami acylowymi interferuje z ich wyrównywaniem (jeden wobec drugiego); to zjawisko zmniejsza temperaturę, w której ciecz przechodzi w żel, co obserwuje się przy utrzymywaniu błon w niższych temperaturach.

byłyby nierozpuszczalne w oleju, a rozpuszczalne w wodzie. Amfipatyczne lipidy błonowe mają polarne główki i niepolarne ogony, jak to przedstawiono na ryc. 43-3. Nasycone kwasy tłuszczowe tworzą proste ogony, podczas gdy nienasycone kwasy tłuszczowe, które zwykle występują w błonach w postaci cis. tworzą skręcone ogony. Im więcej skrętów jest w ogonie, tym mniej gęsto upakowane stają się błony i tym bardziej są one ciekłe. Detergenty są amfipatycznymi cząsteczkami ważnymi zarówno w biochemii, jak i w gospodarstwie domowym. Ich struktura cząsteczkowa jest podobna do struktury fosfolipidów. Lipidy błon ułożone są dwuwarstwowo Amfipatyczny charakter fosfolipidów sugeruje, że obydwa regiony tych cząsteczek mają niezgodne rozpuszczalności; jednak w takich rozpuszczalnikach jak woda fosfolipidy organizują się w postać „zadowalającą" termodynamicznie oba regiony, Micella (ryc. 43-4) to właśnie

Błony są amf ipatyczne Wszystkie podstawowe lipidy występujące w błonach zawierają zarówno regiony hydrofobowe, jak i hydrofilowe, i dlatego nazywane sa amfipatycznymi. Gdyby hydrofobowe regiony były oddzielone od reszty cząsteczki, byłyby one nierozpuszczalne w wodzie, ale rozpuszczalne w oleju. Odwrotnie, gdyby hydrofilowe regiony były oddzielone od reszty cząsteczki, Polarna główka

Niepolarne węglowodorowe ogony

S S

Ryc. 43-3. Schematyczne przedstawienie fosfolipidu bądź innego lipidu błon Polarna grupa główki jest hydrofitowa, a węglowodorowy łańcuch jest hydrofobowy lub lipofilowy. Kwasy tłuszczowe w ogonach są nasycone (S) lub nienasycone (U). Kwasy S są przyłączone do glicerolu przy węglu 1, a kwasy U przy węglu 2.

Ryc. 43-4. Schematyczny przekrój micelli. Polarne grupy główki znajdują się w wodzie, podczas gdy hydrofobowe węglowodorowe ogony otoczone są innymi węglowodorami i dlatego chronione są przed wodą. Micelie są strukturami sferycznymi.

taka struktura: hydrofobowe regiony są osłonięte od wody, podczas gdy hydrofilowe grupy polarne ulokowane są w środowisku wodnym.

Lipidowa dwu warstwa. Jak wykazali to

biisko 60 lat temu Gorter i Grendel; warstwa bimolekularna, czy też podwójna, może spełniać termodynamiczne wymagania amfipatycz-

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 553

nych cząsteczek w środowisku wodnym. Dwuwarstwar istnieje jako arkusz, w którym hydrofobowe regiony fosfo lipid ów są chronione przed środowiskiem wodnym, podczas gdy hydrofilowe regiony są zanurzone w wodzie (ryc. 43-5). Tylko regiony hydrofitowe albo naroża Roztwór wodny

mu Ul

cze*

hydrofobo-

hydratu owa Roztwór wodny Ryc. 43-5. Schemat poprzecznego cięcia przez dwuwarstwę błony utworzonej z cząsteczek fosfolipidowych. Ogony nienasyconych kwasów tłuszczowych są załamane i wymagając więcej miejsca oddalają od siebie polarne główki ułatwiając tym samym możliwość przemieszczeń. To jest przyczyną większej „płynności" błony, (Rycina nieznacznie zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Stryer L, Biochemistry, wyd, 2, Freeman, 1981),

dwuwarstwowego arkusza są eksponowane na niesprzyjające środowisko, lecz nawet te eksponowane naroża mogą być eliminowane dzięki załamaniu „arkusza" w celu stworzenia zamkniętego pęcherzyka bez naroży. Zamknięta dwuwarstwa stanowi jedną z najbardziej istotnych właściwości błon. Jest ona nierozpuszczalna dla większości rozpuszczalnych w wodzie cząsteczek, gdyż byłyby one nierozpuszczalne w hydrofobowym wnętrzu dwuwarstwy.

Natychmiast pojawiają się dwie kwestie. Pierwsza, ile materiału biologicznego rozpuszcza się w tłuszczach i tym samym może łatwo przedostać się do komórki? Gazy, takie jak tlen, dwutlenek węgla i azot, jako matę cząsteczki reagujące w niewielkim stopniu z rozpuszczalnikami łatwo dyfundują przez hydrofobowe regiony błony. Łatwo przechodzą przez dwuwarstwy pochodne lipidów, np. hormony steroidowe. Organiczne cząsteczki nie będące elektrolitami cechują się szybkością dyfuzji zależną od współczynników podziału w układzie olej—woda (ryc. 43-6); im większa jest zdolność cząsteczki do rozpuszczania się w oleju, tym większa jest szybkość dyfuzji przez błony. Druga kwestia dotyczy cząsteczek, które nie są rozpuszczalne w tłuszczach. W jaki sposób ukształtowują się przezbłonowe gradienty stężeń dla cząsteczek nierozpuszczalnych w tłuszczach? Odpowiedź na to pytanie związana jest z występowaniem w błonach białek, są one bowiem także cząsteczkami amfipatycznymi, które mogą być wbudowane w odpowiednie regiony amfipatyczne lipidowej dwuwarstwy. Białka tworzą kanały dla ruchu jonów i małych cząsteczek, a także służą jako przenośniki dla większych cząsteczek, które w inny sposób nie mogłyby przejść przez dwuwarstwe. Proces ten opisano poniżej. Białka błon są związane z lipidową dwuwarstwa Fosfolipidy błon działają jako rozpuszczalniki dla białek membranowych, tworząc środowisko, w którym białka te mogą pełnić swoje funkcje. Spośród 20 aminokwasów tworzących pierwszorzędową strukturę białek grupy funkcyjne związane z a atomem węgla są silnie

Tryptolan I-

Kr"

10""

Glukoza oza \

Indol

Mocznik Gllcerol

Wi

10" 10-* 10" 10Wspdłczynnlk przanlkalnoiol (cm/s)

10=

Mała-----------------------------> Duża PrzenikalnoBc Y 43-6. Współczynniki przenikałności dla wody, niektórych jonów i innych małych cząsteczek w liptdowych dwuwarstwach błon. Cząsteczki, które szybko przechodzą przez określoną błonę, określa się jako mające wysoki współczynnik przenikania. (Według: Stryer L, Biochemistry wyd., 2. Freeman, 1981, nieznacznie zmodyfikowana, za zezwoleniem).

554 / ROZDZIAŁ 43

hydrofobowe w 6 przypadkach, słabo hydrofobowe w kilku przypadkach, a w pozostałych aminokwasach nawet hydrofilowe. Jak to opisano w rozdz. 6, oc-helikalna struktura białek minimalizuje hydrofllowy charakter wiązań peptydowych. Tym samym białka mogą mieć charakter amfipatyczny i tworzą integralną część błony, gdzie hydrofilowe regiony wystają zarówno do wnętrza, jak i na zewnątrz, przy czym hydrofobowe regiony przenikają przez hydrofobowe wnętrze dwuwarstwy. W istocie, te części białek membranowych, które przenikają btony, mają znaczącą ilość hydrofobowych aminokwasów i dużą zawartość struktur a-helikalnych lub składających się w arkusze p. Liczba różnych białek w błonie wynosi 6—8 w siateczce sarkoplazmatycznej, a ponad 100 w błonach plazm a tycz nych. W ich skład wchodzą: enzymy, białka transportujące, białka strukturalne, antygeny zgodności tkankowej i receptory dla różnych cząsteczek. Ponieważ każda błona ma różny skład białek, nie może istnieć takie pojęcie jak typowa struktura błon. Enzymatyczne właściwości kilku różnych błon przedstawiono w tab. 43-2. Tabela 43-2. Enzymatyczne markery w różnych błonach* Enzymy Błony Błona piazmatyczna

Siateczka śródplazmatyczna

5'nukleotydaza Cyklaza adenylanowa Na7K + ATPaza G1 u kozo - 6 - f osf ataza

Aparat Golgiego

Galaktozylotransferaza

Wewnętrzne btony mitochondrialne

Syntaza ATP

' Błony zawierają wiele białek. Niektóre z nich mają aktywność enzymatyczną, niektóre zlokalizowane są wyłącznie w określonych błonach i dlatego mogą być użyte jako markery śledzenia stopnia oczyszczania błon.

Błony i ich składniki są dynamicznymi struk-

turami. Lipidy i białka w błonach cechują się szybkościami obrotu metabolicznego podobnymi do tych, jakie występują w innych obszarach komórki. Różne lipidy mają różne szybkości obrotu metabolicznego. Również różne białka membranowe cechują się znacznym zróżnicowaniem szybkości obrotu metabolicznego. Błona sama w sobie może przekształcić się

szybciej niż każdy z jej składników. Ten problem jest dyskutowany z większymi szczegółami w rozdziale poświęconym endocytozie. Ważną cechą błon jest asymetria Asymetria jest częściowo spowodowana nieregularnym rozmieszczeniem białek w błonach. Asymetria typu wewnątrz—zewnątrz jest także spowodowana zewnętrzną lokalizacją węglowodanów przyłączonych do białek membranowych. Dodatkowo, specyficzne enzymy są zlokalizowane wyłącznie po stronie zewnętrznej lub wewnętrznej błon, jak np. w błonach mitochondrialnych i plazmatycznych. Istnieją również regionalne asymetrie w błonach. Niektóre, np. występujące na kosmkowym biegunie komórek śluzówkowych, są widoczne niemal makroskopowo. Inne, takie jak w złączach szczelinowych, w złączach zwartych i w synapsach, pojawiają się w mniejszych regionach błon i generują odpowiednio mniejsze lokalne asymetrie. Istnieje również asymetria poprzeczna (wewnątrz—zewnątrz) fosfolipidów. Zawierające cholinę fosfolipidy (fosfatydylocho)ina i sfingomielina) zlokalizowane są przede wszystkim w zewnętrznej molekularnej warstwie: aminofosfolipidy (fosfatydyloseryna i etanol o a mi na) zaś w warstwie wewnętrznej. Cholesterol zasadniczo występuje w większych ilościach w warstwie zewnętrznej niż w wewnętrznej. Oczywiście, jeżeli taka asymetria w ogóle istnieje, to ruchliwość poprzeczna fosfolipidów membranowych (flip-flop) powinna być ograniczona. W rzeczywistości, fosfolipidy w syntetycznych dwuwarstwach cechują się niezwykle powolną szybkością procesu flip-flop; okres półtrwania tej asymetrii może wynosić dni lub tygodnie. Jednak, gdy określone białka membranowe, takie jak białko błony plazmatycznej erytrocytów, glikoforyna, są sztucznie wbudowane do syntetycznej dwuwarstwy, częstość procesu flip-flop fosfolipidów może wzrosnąć nawet 100-krotnie. Mechanizmy rządzące asymetrią lipidów nie są znane. Enzymy związane z syntezą fosfolipidów zlokalizowane są po cytoplazmatycznej stronie błon pęcherzyków mik roso mai nych. Przypuszcza się więc, że istnieją translokazy, które przenoszą określone fosfolipidy z wewnętrznej warstwy do zewnętrznej. Również specyficzne białka, które w sposób preferencyjny wiążą określone fosfolipidy, mogą występować w dwóch arkuszach, co prowadzi do asy met-

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 555

rycznego rozmieszczenia cząsteczek lipidowych. Istnieją integralne i powierzchniowe białka membranowe Większość białek membranowych to integralne składniki błon (współdziałają one z fosfolipidami) i w rzeczywistości wszystkie z tych, które były dokładnie badane, zajmują 5—10 nm w poprzek dwuwarstwy. Te integralne białka są zwykle globularne i amfipatyczne. Składają się one z 2 hydrofilowych końców rozdzielonych hydrofobowym regionem, który przecina hydrofobowe wnętrze dwuwarstwy. Im lepiej poznaje się strukturę integralnych białek: membranowych, tym bardziej oczywisty staje się fakt, że niektóre z nich (szczególnie cząsteczki transportujące) mogą przenikać przez dwuwarstwę wiele razy, co przedstawiono na ryc. 43-9, Integralne białka są asymetrycznie wbudowane w dwuwarstwę błony (ryc. 43-7). Niektóre białka uzyskały swą asymetryczną orientację w błonie w czasie ich wbudowywania

do dwuwarstwy lipidowej. Hydrofilowe zewnętrzne regiony amfipatycznego białka, które zostały zsyntetyzowane wewnątrz komórki, muszą przeniknąć przez hydrofobowe wnętrze błony, aby znaleźć się na zewnątrz niej. Na przykład ankiry na, białko peryferyjne, jest związana z integralnym białkiem ,,band III" błony erytrocytów. Spektryna, cyt o szkielet owa struktura wewnątrz erytrocytu, jest związana z ankiryną, przez co odgrywa ważną rolę w utrzymaniu jego dwuwklęsłego kształtu. Cząsteczki immunoglobulin w błonach plazmatycznych limfocytów są integralnymi białkami membranowymi i mogą być uwolnione dzięki zrzuceniu z siebie małych fragmentów błon. Wiele cząsteczek receptorów hormonalnych to białka integralne, zaś specyficzne hormony polipeptydowe, które wiązane są przez te cząsteczki receptorowe, mogą przez to być uznane za białka peryferyjne. Białka peryferyjne, takie jak hormony peptydowe, mogą nawet organizować rozmieszczenie białek integralnych, jak np. ich receptory w płaszczyźnie dwuwarstwy (patrz poniżej).

Łańcuchy węglowodanowe

Biatka integralne

Białka peryferyjne Lipid

Ryc. 43-7. Model płynnej mozaiki opisujący strukturę błon. Błona składa się zdwucząsteczkowej warstwy lipidów z białkami, które albo są wbudowane do niej, albo związane są z jej cytoplszmatyczną powierzchnią. Integralne białka błon są silnie zakotwiczone w warstwie lipidowej. Niektóre z tych białek przenikają błony całkowicie wystając jak gdyby z obu stron~dw u warstwy i nazywane są białkami transmembranowymi, podczas gdy inne białka zakotwiczone są w zewnętrznej lub wewnętrznej warstwie lipidowej dwuwarstwy. Luźno związane z wewnętrzną powierzchnią błony są biatka peryferyjne. Wiele z tych białek i tłuszczów ma wystające na zewnątrz łańcuchy oligosacharydowe. (Według: Junqueira L C, Carbeiro J., Long J. A.: Basie Histology, wyd, 5, Appletan i Lange, 1986, za zezwoleniem),__________

S56 / ROZDZIAŁ 43

SZTUCZNE BŁONY MOGĄ BYĆ UŻYTE DO BADANIA FUNKCJI BŁON Sztuczne systemy błonowe mogą być przygotowane różnymi metodami. Systemy te zasadniczo składają się z jednego lub więcej fosfohpidów pochodzenia naturalnego lub syntetycznych, które mogą być spreparowane (np. przez łagodną sonifikację) w postaci sferycznych pęcherzyków, w których lipidy tworzą dwuwarstwę. Takie pęcherzyki otoczone dwuwarstwą lipidów nazywamy liposomami. Niektóre z zalet stosowania sztucznych systemów membranowych w badaniach funkcji błon opisano poniżej. Skład lipidów błon można zmienić, co pozwala na systematyczne badania wpływu zmiennego składu lipidów na określone funkcje błon. Dla przykładu, pęcherzyki mogą być utworzone wyłącznie z fosfatydylocholiny lub, alternatywnie, z określonej mieszaniny różnych fosfolipidów. glikolipidów i cholesterolu. Ro dzaje kwasów tłuszczowych użytych lipidów mogą również być zmieniane dzięki zastosowa niu syntetycznych lipidów o znanym składzie, co umożliwia systematyczne badanie wpływu składu kwasów tłuszczowych na określone fun kcje błon (np. transport). Oczyszczone białka membranowe lub en zymy mogą być wbudowywanc do pęcherzyków w celu wyjaśnienia, jakie czynniki (np. specyfi czne lipidy lub pomocnicze białka) są wymaga ne przez białka, aby przywrócić ich funkcję. Badania oczyszczonych białek, np. Ca2+/ATP-azy siateczki sarkoplazmatycznej, w określo nych przypadkach sugerowały, że do regenera cji pompy jonowej są wymagane tylko pojedyn cze białko i pojedynczy lipid. Środowisko tych systemów może być do kładnie kontrolowane i systematycznie zmienia ne (np. stężenie jonowe). Systemy te mogą być również eksponowane na różne znane ligandy, jeżeli, dla przykładu, liposomy zawierają specy ficzne receptory białkowe. Gdy sporządza się liposomy, można „na ładować"' je określonymi substancjami, np. le kami lub izolowanymi genami. Istnieje duże zainteresowanie badaniami nad użyciem liposomów do dystrybucji leków do określonych tkanek. Gdyby niektóre składniki (np. przeciw ciała wobec określonych cząsteczek zlokalizo wanych na powierzchni komórki) mogły być wbudowane do liposomów w taki sposób, aby liposomy te trafiały do określonych tkanek lub

nowotworów, efekt terapeutyczny mógłby być istotny. DNA zamknięty wewnątrz liposomów staje się mniej wrażliwy na ataki nukleaz; to podejście może być użyteczne w terapii genowej.

FUNKCJONALNIE BŁONY SĄ DWUWYMIAROWYMI ROZTWORAMI INTEGRALNYCH GLOBULARNYCH BIAŁEK ROZPUSZCZONYCH W CIEKŁEJ FOSFOLIPIDOWEJ MACIERZY Ten model płynnej mozaiki dotyczący struktury bion został zaproponowany w 1972 r. przez Singera i Nicolsona (ryc. 43-7). Wcześniejszym potwierdzeniem tego modelu była szybka i przypadkowa redystrybucja gatunkowo specyficznych integralnych białek w błonie plazmatycznej komórki będącej między gatunkową hybrydą utworzoną przez sztuczną fuzję dwóch różnych komórek rodzicielskich. Później wykazano, że fosfolipidy również ulegają szybkiej redystrybucji w płaszczyźnie błony. Dyfuzja ta, nazywana dyfuzją translacyjną (boczną),*może być bardzo szybka; w rzeczywistości, jedna cząsteczka fosfolipidu może w płaszczyźnie błony przemieszczać się o kilka mikrometrów na sekundę. Zmiany fazowe, a tym samym konsystencja błon, są ściśle zależne od składu lipidów tworzą-

cych je. W lipidowej dwuwarslwie łańcuchy hydrofobowe kwasów tłuszczowych mogą być bardzo wyrównane lub uporządkowane dla zabezpieczenia stosunkowo sztywnej struktury. Gdy temperatura wzrośnie, hydrofobowe łańcuchy boczne przechodzą ze stanu uporządkowanego do stanu nieuporządkowanego uzyskując cieczopodobną lub ciekłą konsystencję. Temperatura, w której struktura przechodzi z uporządkowanej w nieuporządkowaną, nosi nazwę temperatury przejścia fazowego. Dłuższe i bardziej nasycone łańcuchy kwasów tłuszczowych cechują się wyższymi temperaturami przejścia fazowego, tzn. wymagają wyższych temperatur do zmiany struktury na ciekłą. Nienasycone wiązania, które istnieją w konfiguracji cis, powodują upłynnianie dwuwarstwy przez zmniejszenie zwartości upakowania łańcuchów bocznych bez zmniejszania ich hydrofobowości (ryc. 43-3). Fosfolipidy błon komórkowych zwykle zawierają przynajmniej 1 nienasycony kwas tłuszczowy z przynajmniej 1 wiązaniem podwójnym typu cis.

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 557 Cholesterol działa także jako cząsteczka regulacyjna w błonach, wytwarzając stany pośredniej

płynności. Jeżeli acylowy łańcuch boczny występuje w fazie nieuporządkowanej, cholesterol będzie wywierał wpływ kondensujący; jeżeli zaś acylowy łańcuch boczny będzie uporządkowany lub w krystalicznej fazie, cholesterol wprowadzi nieu po rząd kowanie. Przy dużych wartościach stosunku cholesterol/fosfolipid, temperatury przejścia fazowego są niewyznaczalne. Płynność Won w istotnym stopniu determinuje ich funkcje. Jeżeli płynność ta wzrasta, zwiększa się również ich przepuszczalność dla wody i małych hydrofilowych cząsteczek. Ze wzrostem płynności błon zwiększa się także mobilność boczna integralnych białek. Jeżeli aktywna część białka integralnego odpowiedzialna za określone funkcje znajduje się wyłącznie w jego regionach hydrofilowych, to zmiana płynności lipidów będzie prawdopodobnie miała jedynie niewielki wpływ na aktywność tego białka; jeżeli jednak białko to uczestniczy w funkcji transportowej, a biorące udział w transporcie składniki przenikają przez błonę, to zjawiska zachodzące w fazie tipidowej mogą w istotny sposób wpływać na szybkość transportu. Wyjątkowo dobrym przykładem zmian funkcji wywołanych zmianami w płynności jest receptor insulinowy (p. rozdz. 52). Gdy stężenie nienasyconych kwasów tłuszczowych w błonie wzrasta (przy hodowli komórkowej w pożywce bogatej w takie cząsteczki) zwiększa się również płynność błony. To zmienia receptor do tego stopnia, że wiąże on więcej insuliny. Stan ciekłości i stan mobilności bocznej może w pewnych warunkach być ograniczony do określonych regionów w błonie. Przykładem są interakcje białko-białko, zachodzące w płaszczyźnie błony, które powodują, że integralne białka tworzą sztywną macierz w przeciwieństwie do częściej spotykanych sytuacji, gdzie lipidy działają jako macierz. Złącza szczelinowe, złącza zwarte i regiony zawierające bakteriorodopsynę szkarłatnych błon halobakterii są dobrymi przykładami koegzystencji przylegających do siebie różnych macierzy. Niektóre z oddziaływań białko-białko w płaszczyźnie błony mogą następować za pośrednictwem peryferyjnych białek wiążących, takich jak przeciwciała lub lektyny, które znane są ze zdolności do umiejscawiania się na powierzchni błon. W taki sposób peryferyjne białka, dzięki zdolności do specyficznych przyłączeń, mogą ograniczać ruchliwość białek integralnych w błonie.

TWORZENIE SIĘ BŁON Oceniając tworzenie błon trzeba wziąć pod uwagę zarówno lipidy, jak i białka. Omówienie tych pierwszych będzie krótkie, gdyż niewiele wiadomo o tym, w jaki sposób lipidy są wbudowywane w błony. Więcej uwagi poświęcimy natomiast wbudowywaniu białek w błony siateczki śródplazmatycznej (ER), aparatu Golgiego (GA) i powierzchni komórek (błony plazmatyczne) zwierzęcych. Zostaną omówione także inne problemy, które pojawiły się przy ocenie biosyntezy innych błon (np. mitochondriów). Duże znaczenie ma fakt, że sekwencja specyficznych aminokwasów (lub mannozo-6-fosforanu w przypadku lizosomów) ukierunkowuje wiele białek do jedynej w swoim rodzaju lokalizacji w komórce. Zlokalizowanie takich białek w odpowiednich organellach następuje za pośrednictwem sygnału. Wyjaśnienie sekwencji docelowych ułatwiła w znaczącym stopniu technologia rekombinacji DNA. Umożliwia ona także wprowadzenie do białek lub wycięcie z nich określonych sekwencji. Cząsteczki cDNA dla tak zmienionych białek mogą być wbudowane do odpowiednich komórek drogą transfekcji; zmiany w komórkowym rozmieszczeniu są potem wykrywane za pomocą fluoryzujących przeciwciał lub innymi technikami. Wydzielane białka zwykle przed opuszczeniem komórki przechodzą od siateczki śródplazmatycznej (ER) do aparatu Golgiego (GA), a stąd do błony plazmatycznej (PM) (ER -» GA -*PM). Ten fakt uzasadnia omawianie niektórych aspektów ich biosyntezy. Jest oczywiste, że tego rodzaju białka powinny zawierać specyficzne sekwencje oznaczające, że są one zdolne do sekrecji, lub alternatywnie białka te muszą wykazywać brak sygnałów sprawiających, że inne białka stają się rezydentami membran. Wydaje się, że dane pozwalające odróżnić te dwie możliwości będą niedługo dostępne.

Asymetria błon powstaje w czasie ich tworzenia

Aparat Golgiego i pęcherzyki siateczki śródplazmatycznej (ER) wykazują poprzeczną asymetrię zarówno lipidów, jak i białek, a asymetrie te powstają w czasie fuzji z błonami plazmatycznymi. Wnętrze pęcherzyka po fuzji staje się zewnętrzną stroną błony plazmatycznej, a cytoplazmatyczna strona pęcherzyka pozostaje cytoplazmatyczną stroną błony (ryc. 43-8). Poprzeczna asymetria w błonach istnieje w pę-

558 / ROZDZIAŁ 43 Białka błonowe

Zewnętrzna powierzchnia

Błona plazmatyczna pech

Cytoplazma

Białka Integralna Błona pęcherzyka

Ryc. 43-8. Zlewanie się pęcherzyków z błoną plazmatyczną zachowuje orientację każdego białka integralnego zakotwiczonego w dwuwarstwie pęcherzyków. Początkowo N-koniec białka skierowany jest do wnętrza pęcherzyka. Po fuzji N-koniec znajduje się na zewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej. Fakt, że orientacja białka nie została odwrócona, wynika ze spostrzeżenia, że drugi koniec cząsteczki, Ckoniec, jest zawsze zanurzony w cytoplazmie. Światło pęcherzyka i przestrzeń pozakomórkowa są topologicznie równoważne względem opisanego przekształcenia. (Wedtug: Lodish H. F., Rothman J. E.: The assembfy of celi membranes; Sci. Am. 1979, 240, 43, za zezwoleniem).

cherzykach ER zanim zleją się one z błoną plazmatyczną, dlatego też głównym problemem montażu błon jest sposób, w jaki integralne białka mogą być wbudowywane asymetrycznie w lipidową dwuwarstwe siateczki śródplazmatycznej. " Główną klasą lipidów w błonach są fosfolipidy. Enzymy odpowiedzialne za syntezę

fosfolipidów zlokalizowane są na powierzchni cytoplazmatycznej cystern siateczki śródplazmatycznej. Skoro fosfolipidy zlokalizowane są po tej stronie siateczki, wbudowywują się one prawdopodobnie samorzutnie w term ody namicznie stabilne dwucząsteczkowe warstwy, powodując rozrastanie się błony i promując tym samym odłączenie się od niej pęcherzyków lipi-

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 559 N

N N

N Cytocfirom b, POWIERZCHNIA POZACYTOPLftZMATYCZNA

Rożna przenośniki (np. glukozy Neuramidaza wirusa grypy Receptor as]aloglikcp'otemowy Receptor transteryny część niezmienna łańcucha HLA—DR

C Receptory i i IGF-1

Pod jednostka receptora acetylocholiny Rodopsyna wolowa

Raca oto r LDL Ciężki taflCUCtl HLA-A Hemaglutynina indukowana wirusem grypy

Ryc. 43-9. Różnorodność mechanizmów insercji białek do błon. Ta schematyczna reprezentacja przedstawiająca wiele możliwych orientacji pokazuje część peptydu wewnątrz błony jako a-heliksy), a inne jego części jako linie. N to NH2-koniec, a Cto COOH-koniec. (Według: Wickner W. T., Lodish H. F.: Multiple mechanisms of protein insertion into and across membranes. Science 1985, 230, 400. Copyright (C) 1985 by the American Association for ihe Advancement of Sciences, za zezwoleniem).

dowych. Ten proces określa się jako formowanie błon. Takie pęcherzyki lipidowe rozpoczynają swoją wędrówkę i zlewają się z innymi błonami, takimi jak błony aparatu Goigiego. które z kolei mogą zlewać się z błonami plazmatycznymi. Białka cytoplazmy, które wychwytują fosfolipidy z jednej błony i przenoszą je do innej nazywane są białkami wymiany fosfolipidowej.

Prawdopodobnie wpływają one na specyficzny skład lipidów w różnych błonach. Różnorodność dróg, jakimi białka są wbudowywane w błony, pokazano na ryc, 43-9. Modele każdego z tych typów wbudowywania nie będą przedstawione w tym opracowaniu, zostaną natomiast omówione w zarysie problemy dotyczące wbudowywania białek w błony siateczki śródplazma ty cznej i aparatu Golgiego, a także w błony plazmatyezne.

Hipoteza „sygnałowa" opisuje montaż błon

Hipotezę sygnałową zaproponowali Sabatini i Blobel. Wykazali oni, że białka syntetyzowane na związanych z błoną polirybosomach (np.

białka sekrecyjne, niektóre integralne białka błon plazmatycznych, błon aparatu Golgiego, błon siateczki śródplazmatycznej) miały na

N-końcu wydłużenie peptydowe, tzw. peptyd sygnałowy, który był odpowiedzialny za ich wiązanie z błonami siateczki. Białka, których synteza przebiegała w całości na wolnych polirybosomach (np, białka cytozolowe, zewnętrzne białka wewnętrznej strony błon plazma tycznych, mitochondrialne białka kodowane przez jądrowy DNA, białka peroksysomalne) nie mają tego sygnałowego peptydu. Ważnym aspektem tej hipotezy jest zasygnalizowanie, iż wszystkie cytoplazmatyczne rybosomy mają tę samą strukturę i że różnice między rybosomami związanymi z błoną a wolnymi zależą wyłącznie od wyżej omówionych białek, które mają sygnałowe peptydy. Wiele doświadczeń potwierdziło tę oryginalną hipotezę. Przebieg syntezy wielu białek membranowych na polirybosomach związanych z błonami potwierdza, że hipoteza sygnałowa odgrywa istotną rolę w koncepcji tworzenia błon. Niektóre właściwości peptydów sygnałowych zostały podsumowane w tab. 43-3. Rycina 43-10 przedstawia podstawowe cechy hipotezy sygnałowej w odniesieniu do przenikania białek sekrecyjnych przez błonę ER. Cząsteczki mRNAdla takich białek mają zakodowane informacje dla sygnałowego peptydu lokalizując go przy N-końcu. Białko wbudowuje sie

560 / ROZDZIAŁ 43 Tabela 43-3. Niektóre właściwości peptydów sygnałowych Zwykte, ale nie zawsze, zlokalizowane są przy N-końcu Zawierają ok. 12—25 aminokwasów Metionina jest zwykle N-końcowym aminokwasem Zawierają centralny pęk hydrofobowych aminokwasów Zawierają co najmniej 1 dodatnio naładowany aminokwas położony blisko N-końca Zwykle odszczepiają przy C-końcu resztę Ala przy udziale sygnałowej peptydazy

w błonę równolegle z translacją jego mRNA na polisomach. Proces ten nazywamy insercją kotranslacyjną Gdy sygnałowa sekwencja białka wynurza się z rybosomu, jest ona rozpoznawana przez cząsteczkę rozpoznającą sygnał (SRP — signal recognition particle), która blokuje dalszą translacje wtedy, gdy zostało spolimery-

Peptyd sygnałowy SRP

Receptor ryb os o mowy

zowanych ok. 70 aminokwasów (40 schowane w dużym rybosomalnym kompleksie, a 30 wystaje na zewnątrz). Cząsteczka SRP zawiera 6 białek i jest związana z 7S RNA, który jest ściśle spokrewniony Z sekwencją rodziny Alu często powtarzającą się w DNA (p. rozdz. 38). Blok SRP nie jest uwalniany dopóki kompleks SRP-sekwencja glówna-rybosom jest związany z tzw. ,.białkiem dokowym" będącym receptorem dla SRP na siateczce śródplazmatycznej. K.otranskcyjna insercja tego białka do siateczki rozpoczyna się wtedy w tym właśnie miejscu. Proces wydłużania się pozostałej części cząsteczki białka kieruje powstające białko w całą szerokość lipidowej dwuwarstwy, gdyż rybosomy pozostają przyłączone do retikulum. W ten sposób powstaje szorstka strona siateczki śródplazmatycznej (ribosome studded ER). Rybosomy pozostają przyłączone do niej w czasie syntezy białek membranowych, ale są uwalniane i rozpadają się na podjednostki, gdy

Receptor sygnałowy

Ryc. 43-10. Schemat hipotezy sygnałowej dla transportu białek wydzielniczych przez błony siateczki śródplazmatycznej. Rybosomy syntetyzujące białko przemieszczają się wzdłuż informacyjnego RNA ustalając sekwencję aminokwasów w białku (informacyjny RMA oznaczony jest linią między 5' a 3'). Kodon AUG oznacza stan informacji dla białka. Linia poprzecznie kreskowana, występująca po AUG, reprezentuje kodony dla sygnałowej sekwencji. W miarę rozrastania się białka i jego wystawania poza dużą rybosomalną podjednostkę sygnalna sekwencja jest eksponowana i wiąże się z cząsteczką rozpoznającą sygnał (SRP — signai recognition particle}. Translacja jest blokowana dopóki kompleks nie zwiąże się z „białkiem dokowym" oznaczonym czarnym słupkiem na błonie siateczki śródplazmatycznej. Jest tam także receptor (nie zaczerniony słupek) dla samego rybosomu. Interakcja rybosomu i powiększającego się łańcucha peptydowego z błoną siateczki śródplazmatycznej powoduje otwarcie porów, przez które białko jest transportowane do wewnętrznej przestrzeni śródpiazmatycznej siateczki. W czasie transportu sygnałowa sekwencja większości białek zostaje usunięta przez enzym zwany sygnałową peptydazą. Kompletne białko jest albo uwolnione przez rybosom, który potem rozpada się na swoje dwie składowe, tj, małą i dużą podjednostkę rybosomu. Koniec biafka znajduje się wewnątrz siateczki śródplazmatycznej. (Według: Newly madę proteins zip through the celi; Science 1980, 207, 154. Copyright © 1980 by the American Association for the Advancement of Science, nieznacznie zmodyfikowana, za zezwoleniem).

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 561

synteza białka jest zakończona, ©łowna sekwencja jest nacinana przez peptydazę sygnałową, a węglowodan zostaje przyłączony w momencie, gdy wcześniej zsyntetyzowana część białka wchodzi do wnętrza siateczki. Integralne białka membranowe siateczki śródplazmatycznej, takie jak cytochrom P-450, nie przenikają całkowicie przez błonę. Zamiast tego rezydują one w błonie siateczki mając nienaruszony peptyd sygnałowy. Najwidoczniej ich przejściu przez tę błonę zapobiega sekwencja aminokwasów zwana sygnałem stop. Wydzielane białka przenikają całkowicie przez membranową dwuwarstwę i są wyrzucane do światła siateczki. Składniki węglowodanowe są przyłączone (zwykle przez dolichoio-pirofosfo-oligosacharydy, p. rozdz. 57) dopiero wtedy, gdy białka przechodzą przez wewnętrzną cześć błony siateczki śródplazmatycznej. Proces ten nosi nazwę kotranslacyjnej glikozylacji. To jest przyczyną, że białka wydzielnicze znajdujemy w świetle aparatu Golgiego, gdzie ich węglowodanowe łańcuchy są modyfikowane przed wydzieleniem. Istnieją poważne dowody, że główna sekwencja wiodąca uczestniczy w procesie insercji białek do błon siateczki. Zmutowane białka zawierające zmienioną sekwencję wiodącą, w której hydrofobowy aminokwas zastąpiony jest aminokwasem hydrofilowym, nie są wbudowywane w błony siateczki. Białka niemembranowe, jak hemoglobina, do których sygnałowe sekwencje zostały włączone metodami inżynierii genetycznej, mogą być wbudowywane do błon, a nawet wydzielane. Białka mogą być wbudowywane do błon siateczki endoplazmatycznej w różny sposób Mechanizmy związane z insercją białek do błon obejmują: Kotranslacyjną insercję za pośrednictwem sygnału stop — np. cytochrom P-450 (p. wyżej). Syntezę na wolnych polirybosomach i póź niejsze przyłączenie do błony siateczki śródplaz matycznej — np. cytochrom b5. Zatrzymywanie w obrębie siateczki endo plazmatycznej przez specyficzne sekwencje aminokwasowe. Ostatnie badania wykazały, że wiele białek ma sekwencję KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) na C-końcu. Ta sekwencja powodu je, że będą one przyłączone do wewnętrznej ściany cysterny siateczki śródplazmatycznej względnie luźno. 36 - Biochemia

■ 4. Niektóre biajka przeznaczone dla błon siateczki śródplazmatycznej mogą przejść do aparatu Golgiego drogą transportu pęcherzykowego, a potem powrócić do siateczki, aby być do niej wbudowane. Powyższa lista wskazuje, że w biosyntezę białek błony siateczki jest włączonych wiele zróżnicowanych mechanizmów; podobna sytuacja prawdopodobnie występuje i w innych błonach (np. mitochondrialnych i plazmatycznych). Sekwencje docelowe zostały zidentyfikowane jedynie dla kilku z wymienionych wyżej mechanizmów (np. sekwencje KDEL). Wykazano, że obrót lipidów w błonach siateczki śródplazmatycznej wątroby szczura jest generalnie znacznie szybszy niż obrót białek, co oznacza, że obrót lipidów i obrót białek są od siebie niezależne. Również szybkość obrotu białek tych błon jest zmienna w szerokim zakresie, niektóre wykazują szybkie (godziny), inne powolne (dni) obroty. Dlatego też poszczególne lipidy i białka błon siateczki są wbudowane w nie w sposób względnie niezależny od siebie; jest to zjawisko charakterystyczne dla większości błon. Białka przemieszczają się przez komórkowe obszary do właściwych błon Schemat ilustrujący możliwy przepływ białek membranowych drogą ER -» GA -» PM pokazany jest na ryc. 43-11. Poziome strzałki określają etapy transportu, które mogą być niezależne od sygnałów docelowych. Przepływ określonych białek membranowych z siateczki do błony plażmatycznej (opisywany jako przepływ masowy, gdyż nie jest on wybiórczy), może zachodzić bez żadnych sekwencji docelowych uczestniczących w tym procesie. Z drugiej strony insercją stałych białek membranowych do siateczki śródplazmatycznej i aparatu Golgiego może zależeć od specyficznych sygnałów (np. KDEL lub sekwencji stop dla siateczki). Podobnie transport do Hzosomów i do pęcherzyków wydzielniczych może także następować za pośrednictwem sygnałów (mannozo-6-fosforan w przypadku określonych enzymów lizosomalnych). Podstawowy mechanizm umożliwiający dotarcie białka syntetyzowanego na związanych z błonami polirybosomach do struktur aparatu Golgiego lub błony plazmatycznej drogą przepływu masowego oparty jest na transporcie pęcherzykowym. Nie wiadomo dziś, w jaki sposób białka syntetyzowane na szorstkiej stronie

562 / ROZDZIAŁ 43 Lizosomy Siateczka Śród plazma. tycz na

Ap. Go Ig lego -cis {powierz ohnla tworząca)

O

Ap. Goiglego -strefa przejściowa

O

Ap.GoIglagc -trans (powierzchnia

dojrzewająca) -ty

Powier zchnia komórk i

O

Pęcfterzykl wydztałnlcze Ryc. 43-11. Przepływ białek błonowych z siateczki śródplazmatycznej na powierzchnię komórki. Poziome strzałki oznaczają etapy, które zostały uznane za niezależne od sygnałów i dlatego reprezentują one przepływ masowy. Otwarte pionowe strzałki w kolejnych kwadratach wskazują na retencję białek, które znajdują się w błonach zaznaczonych organelli. Otwarte pionowe strzałki poza narysowanymi prostokątami wskazują na uwarunkowany sygnałem transport do lizosomów i do zapasowych ziarnistości sekrecyjnych (Według Pfeffer i Rothman, 1987).

siateczki są wbudowywane do odpowiednich pęcherzyków. Pęcherzyki uczestniczące w przepływie masowym wydają się być wolne od klatryny, podczas gdy te pęcherzyki, które związane są z docelowym transportem białek do lizosomów i do pęcherzyków wydziel ni czy ch, wydają się być pokryte tym białkiem. Nie zostało jeszcze potwierdzone istnienie specyficznych sekwencji, które kodują sygnały wskazujące ich przeznaczenie dla aparatu Golgiego lub błony plazmatycznej. Wydaje się prawdopodobne, że niektóre białka przeznaczone do wbudowania do błony plazm a tycz nej drogą transportu pęcherzykowego mogą nie zawierać specyficznych sygnałów i że ich ostateczne przeznaczenie wynika z braku innej możliwości. Nie wyjaśniono również dotychczas, czy pojedyncze pęcherzyki (łatwo widoczne w mikroskopie elektronowym) zawierają tylko jedno białko czy wiele białek. Aparat Golgiego pełni dwie ważne roie w syntezie błon; 1) uczestniczy w modyfikowaniu łańcuchów oligosacharyd owych błon i innych N-wiązanych glikoprotein (rozdz. 57); 2) bierze udział w sortowaniu różnych białek zgodnie z ich wewnątrzkomórkowym przeznaczeniem. Wszystkie składowe aparatu Golgiego uczestniczą w pierwszym punkcie, podczas gdy powierzchnia dojrzewania trans aparatu Golgiego uczestniczy szczególnie w drugim punkcie i jest bardzo bogata w pęcherzyki. Określone białka wewnętrznej strony błony plazmatycznej mogą być syntetyzowane na wolnych rybosomach, a dopiero potem zostają wbudowane w błony siateczki. Ostatnie osiągnięcia wykorzystujące system in vitro do badania transpor-

tu pęcherzykowego i losów transportowanych przez nie białek powinny wyjaśnić wiele problemów z tym związanych. Mitochondrialne białka syntetyzowane są w mitochondriach i poza nimi * Mitochondria zawierają wiele białek. Określone białka (np. niektóre białka integralne błon) są syntetyzowane w mitochondriach przy użyciu mitochondrialnego układu syntezy białek. Jednak większość białek syntetyzowana jest na zewnątrz mitochondriów i muszą one być przeniesione do środka. Szczególnie dobrym układem dla badań mechanizmów importu takich białek mitochondrialnych okazały się komórki drożdży. Największe osiągnięcia zarejestrowano w badaniach nad białkami występującymi w mitochondrialnej macierzy (np. podjednostki FjATP-azy). Te białka są syntetyzowane na wolnych polirybosomach. Kolejno przechodzą one przez zewnętrzne i wewnętrzne błony mitochondriów, aby dotrzeć do celu. Przypuszcza się, że muszą one być w formie niep o fałdowanej, aby przejść przez te błony. ATP musi być obecny, aby mógł nastąpić import białek. Nie jest jeszcze jasne, czy ATP wpływa na potencjał elektryczny, czy na siły protonomotoryczne działające w poprzek błony wewnętrznej, czy też odgrywa on jakąś rolę w rozwijaniu się importowanego biatka. Wykazano, że te białka zawierają sekwencję sygnałową, o długości do 70 aminokwasów, która musi zawierać także określone dodatnio naładowane aminokwasy. Ta sekwencja jest równoznaczna sygnałowi peptydowemu, kierującemu te białka do macierzy;

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 563

gdy to wydłużenie peptydowe zostanie odcięte, białka te nie będą miały możliwości wnikania. Na powierzchni zewnętrznej błony mitochondrialnej istnieją prawdopodobnie receptory dla importowanych białek. Presekwencja może być odszczepiona przez metaloproteazy występujące w macierzy. Niektóre inne białka mitochondrialne nie zawierają presekwencji, co sugeruje istnienie wielu mechanizmów i dróg wykorzystywanych przez białka w celu wniknięcia do mitochondriów. Szczególnymi przypadkami są lizosomy i inne organelle Jak napisano w rozdz. 57, określone hydrolazy przeznaczone dla lizosomów zawierają reszty mannozo-6-fosforanu, który znakuje je w szczególnym celu. Coraz więcej dowodów potwierdza istnienie swoistych sekwencji dla znakowania białek przeznaczonych dla innych organelli, takich jak jądra i peroksysomy; problem ten jest przedmiotem intensywnych badań. Niektóre z poznanych sekwencji lub sygnałów, które doprowadzają różne białka do ich właściwych wewnątrzkomórkowych lokalizacji, przedstawiono w tab. 43-4. Tabela 43-4. Sekwencje lub związki, które kierują białka do określonych organelli Sekwencja lub związek

Docelowe organelle

Sekwencja peptydu sygnałowego Sekwencja KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) Sekwencja N-końcowa (70-resztowy fragment)

Błony siateczki Luminaina strona błon siateczki Mitochondrium

Krótkie sekwencje za- Jądro sadowych aminokwasów Mannozo-6-fosforan

Lizosomy

WYBIÓRCZOŚC BŁON OKREŚLA ICH WYSPECJALIZOWANE FUNKCJE Jeżeli błona plazmatyczna jest względnie nieprzepuszczalna, to w jaki sposób większość cząsteczek dostaje się do komórki? W jaki sposób zapewniona jest wybiórczość tego przenikania? Odpowiedzi na te pytania są ważne dla zrozumienia, jak komórki dostosowują się do stale zmieniającego się środowiska zewnątrz-

komórkowego. Aby złożone biologiczne procesy mogły być koordynowane, wielokomórkowe organizmy muszą także mieć środki dla komunikowania się między przylegającymi i odległymi komórkami. Te sygnały muszą dotrzeć do błony i przejść przez nią, lub też muszą powstać jako konsekwencja pewnych interakcji z błoną. Niektóre z głównych mechanizmów wykorzystywanych do tych celów przedstawiono w tab. 43-5. Tabela 43-5. Przenoszenie materiału i informacji przez błony Ruch małych cząsteczek przez błony Dyfuzja (bierna i ułatwiona) Aktywny transport Ruch dużych cząsteczek przez błony Endocytoza Egzocytoza Transmisja sygnałów przez błony Receptory powierzchni komórek Transdukcja sygnałów (np. glukagon -»cAMP) InPrnalizacjasygnału (sprzężonazendocytozą, np. receptor LDL) Ruch do wewnątrzkomórkowych receptorów {hormony steroidowe; rodzaj dyfuzji) Międzykomórkowy kontakt i komunikacja

Niektóre małe cząsteczki przechodzą przez błony Cząsteczki mogą biernie przenikać przez dwuwarstwę zgodnie z elektrochemicznym gradientem w wyniku prostej lub ułatwionej dyfuzji. To spontaniczne przemieszczanie w kierunku równowagi kontrastuje z aktywnym transportem, który wymaga energii, gdyż ruchy są przeciwne do elektrochemicznego gradientu. Na rycinie 43-12 przedstawiono schemat tych zjawisk. Bierna dyfuzja. Jak opisano powyżej, niektóre substancje rozpuszczone, takie jak gazy, mogą wnikać do komórki dyfundując zgodnie z elektrochemicznym gradientem przez błonę, co nie wymaga energii metabolicznej. Prosta dyfuzja przez błonę jest ograniczona termiczną „agitacją" danej molekuły, a także przez gradient stężeń w poprzek membrany i przez rozpuszczalność substancji rozpuszczanej (współczynnik przenikania, ryc. 43-6) w hydrofobowym wnętrzu dwuwarstwy błony. Rozpu-

564 / ROZDZIAŁ 43 Transportowana \

Białko Kanałow e

\

Btatko nośnikowe

/^

/ V

n

Gradient elektrochemiczny

Dwuwarstwa llpidow a Prosta dyfuzja

Dyfuzja ułatwiona

Transport bierny

Transport aktywny

Ryc. 43-12. Wiele małych nie naładowanych cząsteczek przechodzi swobodnie przez lipidową dwuwarstwę. Naładowane cząsteczki, większe nie naładowane cząsteczki i niektóre małe nie naładowane cząsteczki przenoszone są przez kanały i pory lub przez specyficzne białka transportowe. Bierny transport następuje zawsze zgodnie z gradientem elektrochemicznym w kierunku równowagi. Aktywny transport zachodzi w kierunku przeciwnym do elektrochemicznego gradientu i wymaga wydatkowania energii, podczas gdy transport bierny nie wymaga energii. {Według: Alberts B. i wsp.; Moleculw Biology of the Celi. Garland, 1983, za zezwoleniem).

szczalność jest odwrotnie proporcjonalna do ilości wiązań wodorowych, które muszą zostać rozenvane, aby umożliwić substancji rozpuszczonej, znajdującej się w zewnętrznej fazie wodnej, wbudowanie się w,hydrofobową dwuwarstwę. Elektrolity, jako słabo rozpuszczalne w lipidach, nie tworzą wiązań wodorowych z wodą, ale tworzą otoczki z wody dla hydratacji na drodze elektrostatycznej interakcji. Wielkość tej otoczki jest wprost proporcjonalna do gęstości ładunku jonu. Jony z dużą gęstością ładunku mają większą otoczkę hydratacyjną i przez to mniejszą szybkość dyfuzji. Na+ np. ma większą gęstość ładunku niż K+. Uwodniony jon sodu jest więc większy niż uwodniony jon potasu i dlatego potas przenika łatwiej przez błony. W naturalnych błonach, w przeciwieństwie do syntetycznych dwuwarstw membranowych, istnieją przezbłonowe kanały, będące strukturami przypominającymi pory, które zbudowane są z białek tworzących szlaki wybiórczego przewodzenia jonowego. Kanary przewodzenia ka-

tionowego mają średnicę otworów 5—8 nm i są ujemnie naładowane wewnątrz kanału. Przepuszczalność kanału zależy od wielkości jonu, wielkości jego hydratacji i od wartości gęstości ładunku jonu. Wykazano istnienie specyficznych kanałów dla jonów Na+, K+ i Ca2+. Błony komórek nerwowych zawierają dobrze zbadane kanały jonowe, które odpowiedzialne są za potencjały czynnościowe powstające w poprzek błony. Aktywność niektórych z tych kanałów jest kontrolowana przez neurotransmitery; dlatego też aktywność kanałów może być regulowana. Jeden jon może regulować aktywność kanału innego jonu. Dla przykładu, spadek stężenia jonu Ca2+ w płynie pozakomórkowym powoduje wzrost przepuszczalności błon i wzrost dyfuzji jonów Na+. To depolaryzuje błony i wyzwala bodziec nerwowy. Zjawisko to może tłumaczyć pojawienie się zdrętwienia, mrowienia i skurczów mięśni, tak charakterystycznych dla stanów chorobowych przebiegających z niskimi stężeniami jonów wapnia w surowicy.

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 565

Kanały są otwarte tylko przez krótki okres, co znaczy, że są bramkowane. Bramki mogą otwierać się lub zamykać. W kanałach bramkowanych ligandami określona cząsteczka wiąże się z receptorem i otwiera kanał. Kanały bramkowane napięciem otwierają sie (lub zamykają) w odpowiedzi na zmianę potencjału błonowego. Niektóre drobnoustroje są zdolne do syntezy małych organicznych cząsteczek, zwanych jonoforami, które funkcjonują na zasadzie ruchu posuwisto-zwrotnego, „wahadłowego" (zasada „czółenka") w celu przemieszczania jonów przez błonę. Jonofory te zawierają hydrofilowe centra, które wiążą okreśJone jony i jednocześnie są otoczone przez peryferyjne regiony hydrofobowe; taka struktura pozwala cząsteczkom rozpuszczać się dobrze w błonach i dyfundować przez nie. Inne cząsteczki, jak np. dobrze zbadany polipeptyd gramicydyna, zdolne są do tworzenia kanałów. Toksyny bakteryjne, takie jak toksyna błonicy, i aktywne składniki dopełniacza, mogą wytworzyć duże pory w błonie komórkowej, dzięki czemu możliwe staje się przejście makromolekuł bezpośrednio do płynu śródkomórkowego. Podsumowując, czysta dyfuzja substancji zależy od: 1) jej gradientu stężeń w poprzek błony (substancje rozpuszczane przemieszczają się w kierunku od dużych do małych stężeń); 2) pola elektrycznego w poprzek błony (substancje rozpuszczane przemieszczają się w kierunku roztworu mającego przeciwny ładunek); 3) współczynnika przepuszczalności danej substancji przez błonę; 4) gradientu ciśnienia hyd-

rostatycznego w poprzek błony (wzrost ciśnienia spowoduje wzrost szybkości i częstości zetknięć cząsteczki z błoną); 5) temperatury (podwyższenie temperatury spowoduje wzrost ruchliwości cząsteczek, co zwiększa częstotliwość kolizji między nimi a błoną).

UŁATWIONA DYFUZJA I AKTYWNY TRANSPORT Systemy transportowe można opisać w sensie funkcjonalnym na podstawie liczby przenoszonych cząsteczek oraz na podstawie kierunku ruchu (ryc. 43-13), lub też uwzględniając, czy odbywa się on w kierunku uzyskania równowagi, czy odwrotnie. System uniportowy powoduje dwukierunkowy ruch określonej cząsteczki. W systemach kotransportowych przeniesienie jednej substancji rozpuszczonej zależy od stechiometrycznych równoległych lub kolejno po sobie następujących przeniesień innych substancji rozpuszczonych. Symport opisuje ruchy takich substancji rozpuszczonych w tym samym kierunku. Przykładem są transporty proton-węglowodan w bakteriach oraz Na "'"-węglowodan (glukoza, mannoza, galaktoza, ksyloza i arabinoza), a także Na+-aminokwasowe transporty w komórkach ssaków. Antyportowe systemy odpowiedzialne są za ruch dwóch cząsteczek w przeciwnych kierunkach (np. Na+ do środka i Ca2+ na zewnątrz). Cząsteczki, które nie mogą w sposób samorzutny swobodnie być przenoszone przez Iipidową dwuwarstwę błon,

JDwuwarstwa Hpldowa

Unlport

Symport

Antyport Kotransport

c. 43-13. Schematyczne przedstawienie rodzajów systemów transportowych, Transportery mogą być klasyfikowane uwzględniając kierunek ich ruchu, lub też fakt, czy przemieszczana jest jedna czy więcej specyficznych cząsteczek. (Według: Alberts B. i wsp.; Molecular Biology of łhe Celi. Garland, 1983, za zezwoleniem).

566 / ROZDZIAŁ 43

czynią to przez asocjację z białkami transportującymi. W to zjawisko włączone są dwa procesy: ułatwiona dyfuzja i aktywny transport, a także bardzo specyficzne systemy transportowe. Ułatwiona dyfuzja i aktywny transport mają wiele cech wspólnych. Oba przebiegają z udziałem białek, transportujących i oba wykazują specyficzność dla jonów, węglowodanów i aminokwasów. Badania mutacji w komórkach bakteryjnych i zwierzęcych (włączywszy takie, które dotyczą chorób u ludzi) potwierdziły te przypuszczenia. Ułatwiona dyfuzja i aktywny transport przypominają reakcje substrat-enzym z wyjątkiem występowania kowalencyjnej interakcji. Podobieństwa są następujące: 1) istnieje specyficzne miejsce wiązania dla substancji rozpuszczonej; 2) białko transportujące jest wysycane, dlatego też istnieją maksymalne szybkości transportu (Vmas; p. ryc. 43-14); 3) istnieje stała wiązania (Km) dla substancji rozDyfuzja .

bierna

2 L

Dyfuzja za pośrednictwem nośnika

Stężenie substancji rozpuszczonej

czas gdy aktywny transport przebiega zwykle w jednym kierunku; 2) aktywny transport zwykle zachodzi w kierunku przeciwnym do pola elektrycznego lub chemicznego gradientu, dlatego też wymaga energii. Ułatwiona dyfuzja. Niektóre substancje rozpuszczone dyfundują zgodnie z gradientem elektrochemicznym przez błonę znacznie szybciej niż można oczekiwać na podstawie ich wielkości, ładunku lub wartości współczynnika podziału. Ta ułatwiona dyfuzja cechuje się odmiennymi właściwościami od tych, które znane są dla prostej dyfuzji. Szybkość ułatwionej dyfuzji będącej systemem miiportowym może osiągnąć stan nasycenia; oznacza to, że liczba miejsc biorących udział w dyfuzji określonej substancji rozpuszczonej jest wielkością skończoną. Wiele systemów ułatwionej dyfuzji cechuje się stereo specyficznością, jednak podobnie jak prosta dyfuzja nie wymagają one energii metabolicznej. Jak opisano wcześniej, zewnętrzno-wewnętrzna asymetria białek membranowych jest wielkością stałą, a ruchliwość białek w poprzek (raczej niż do) błony jest nieczęsta; dlatego poprzeczna ruchliwość specyficznych białek transportujących nie jest prawdopodobnie uwarunkowana procesami ułatwionej dyfuzji, z wyjątkiem tych, które uczestniczą w jonoforach mikroorganizmów, co opisano wcześniej. Mechanizm „ping-pong" (ryc. 43-15) tłumaczy ułatwioną dyfuzję. W tym modelu białko

transportujące istnieje w dwu podstawowych konformacjach. W stanie ,,pong" jest ono eksRyc. 43-14. Porównanie kinetyki dyfuzji z udziaponowane na duże stężenia substancji rozpuszłem transportera (ułatwionej) z bierną dyfuzją. Szybkość ruchu wiej ostatniej jest wprost proporc- czonej i cząsteczki tej substancji przyłączają się jonalna do stężenia substancji rozpuszczonej, pod- do specyficznych miejsc w białku transportujączas gdy proces wykazuje cechy nasycenia, gdy cym. Transport zachodzi wtedy, gdy zmiana uczestniczy w nim transporter. Vm3X oznacza mak- /konformacyjna wystawi białko transportujące symalną szybkość. Stężenie w połowie maksymal- w stronę niższych stężeń substancji rozpusznej szybkości jest zgodne ze stałą wiązania (Km) czonej (stan „ping"). Proces ten jest całkowicie Transportera dla substancji rozpuszczonej. odwracalny i rzeczywisty przepływ w poprzek błony zależy od gradientu stężenia. Szybkość, z którą substancja rozpuszczona wchodzi do puszczonej i dlatego cały system może być komórki na zasadzie ułatwionej dyfuzji, wyopisany przez Km (p. ryc. 43-14); 4) struktural znaczona jest następującymi czynnikami: 1) nie podobne inhibitory kompetycyjne blokują gradientem stężenia w poprzek błony; 2) ilością transport. P białka transportującego (jest to główny czynnik Zasadnicze różnice są następujące: 1) ułat- kontrolny); 3) szybkością oddziaływania mięwiona dyfuzja może być dwukierunkowa, pod- dzy substancją rozpuszczoną a białkiem transportującym; 4) szybkością zmiany konformacyjnej obu stanów białka, naładowanego substancją rozpuszczoną i uwolnionego od substancji rozpuszczonej.

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 567

oo Ryc, 43-15. Model „ping-pong" ułatwionej dyfuzji. Białko transportujące (zakreskowane struktury) w dwuwarstwie lipidowej ascocjuje z substancją rozpuszczoną w wysokich stężeniach na jednej stronie btony. Następnie dochodzi do konformacyjnej zmiany („pong" do „ping") i substancja rozpuszczona jest rozładowana od strony nowej równowagi Pusty przenośnik powraca wtedy do swojej oryginalnej konformacji („ping" do „pong"), aby zamknąć cykl przemiany.

Hormony regulują ułatwioną dyfuzję przez zmiany w liczbie dostępnych białek transportujących. Insulina zwiększa transport glukozy w tkance tłuszczowej i w mięśniach czerpiąc białka transportujące z zapasów wewnątrzkomórkowych (p. ryc. 52-9). Insulina zwiększa także transport aminokwasów w wątrobie i innych tkankach. Jedną z koordynowanych akcji hormonów glikokortykoidowych jest wzmożenie transportu aminokwasów do wątroby, gdzie służą one jako substraty dla procesu glukoneogenezy. Hormony wzrostu zwiększają transport aminokwasów do wszystkich komórek, a estrogeny do tych, które znajdują sie w macicy. Istnieje co najmniej 5 różnych układów transportujących dla aminokwasów w komórkach zwierzęcych. Każdy z nich jest swoisty dla grupy blisko spokrewnionych aminokwasów, a większość z nich działa w systemie symportu Na+ (ryc. 43-13).

Transport aktywny. Proces aktywnego

transportu różni się od dyfuzji tym, że cząsteczki przenoszone są niezgodnie z równowagą termodynamiczną; dlatego też wymagana jest tu energia. Jej źródłem może być hydroliza. ATP, ruch elektronów lub światło. Utrzymywanie gradientów elektrochemicznych w układach biologicznych jest tak ważne, że pochłania to ok. 30—40% energii wydatkowanej w komórce. W zasadzie komórki utrzymują wewnątrz niskie stężenie Na+ i wysokie stężenie K4 (tab. 43-1), wraz z ujemnym potencjałem elektrycznym wewnątrz. Pompą, która utrzymuje te gradienty, jest A PT-aza, która jest aktywowana przez Na+ i K+ (ryc. 43-16). ATP-aza ta jest

STRONA WEWNĘTRZNA

STRONA ZEWNĘTRZNA

ATP

Ryc 43-16. Stechiometria pompy Na+/K+-ATP-aza. Ta pompa przenosi 3 jony !Ma + z wnętrza komórki na jej zewnętrzną stronę i wprowadza 2 jony K+ z zewnętrznej strony do jej wnętrza na każdą cząsteczkę ATPhydrolizowartądo AD P przez związaną z błoną ATP-azę. Strofantyna i inne glikozydy nasercowe hamują działanie tej pompy przez oddziaływanie na zewnątrzkomórkową powierzchnię błony (dzięki uprzejmości R. Post).

integralnym białkiem membranowym i do uaktywnienia wymaga fosfolipidów. Ma ona katalityczne centra zarówno dla ATP, jak i dla Na+ po cytoplazmatycznej stronie błony, ale miejsce wiązania K f zlokalizowane jest po zewnętrznej stronie błony komórkowej. Strofantyna lub inne giikozydy naparstnicy hamują tę ATP-azę przez wiązanie do zewnątrzkomorkowych domen. Zjawisko to może być antagonizowane przez zewnątrzkomórkowy K+.

568 / ROZDZIAŁ 43 Przewodzenie bodźców nerwowych zachodzi w górę i w dół błony Błona utworzona na powierzchni komórek neuronalnych utrzymuje różnicę potencjałów elektrycznych miedzy wnętrzem a „zewnętrzem" (napięcie elektryczne) i jest elektrycznie wzbudzalna. Gdy zostanie pobudzona bodźcem chemicznym, za pośrednictwem specyficznego synaptycznego receptora błonowego (patrz dyskusja o przenoszeniu biochemicznych sygnałów, poniżej), otwory w błonie otwierają się, aby umożHwić szybkie wnikanie Na+ lub CaJ+ (połączone lub nie połączone z wypływem K+), Prowadzi to do szybkiego zaniku istniejącego gradientu napięcia, dzięki czemu ten odcinek błony ulega depolaryzacji. Pompy jonowe w Wonie jednak szybko odtwarzają to napięcie. Gdy duże powierzchnie błony ulegają w ten sposób depolaryzacji, to zaburzenia elektrochemiczne przemieszczają się w sposób podobny do fali wzdłuż błony generując impuls nerwowy. Osłonki mielinowe wytworzone przez komórki Schwanna pokrywają włókna nerwowe tworząc elektryczny izolator, który otacza większość nerwu i znacznie przyspiesza propagację fali (sygnału) umożliwiając wypływ lub napływ jonów tylko w miejscach błony nie pokrytych izolatorem. Osłona mtelinowa zbudowana jest z fosfolipidów, głównie z sfingomieliny i cholesterolu, a także z białka i glikosfin go lipidów. Związanych jest z nią zaledwie kilka białek integralnych lub peryferyjnych; to one powodują utrzymywanie się razem wielu membranowych dwuwarstw tworzących hydrofobową izolacyjną strukturę, nieprzepuszczalną dla jonów i wody. Ntektóre choroby, jak stwardnienie rozsiane czy zespół Guillain-Barre, charakteryzują się demielinizacją i zaburzeniami przewodzenia nerwowego. Istnieje kilka mechanizmów transportu glukozy W tym rozdziale zostanie omówionych kilka mechanizmów transportu glukozy. Aby mogła być ona wykorzystana jako źródło energii, musi wniknąć do komórki. W adypocytach i w mięśniach glukoza wnika do komórek za pośrednictwem specyficznego systemu transportowego, który wspomagany jest przez insulinę. Zmiany w transporcie są przede wszystkim spowodowane zmianami Vma:i (prawdopodobnie spowodowane przez większą liczbę1 lub przez bardziej aktywne przenośniki), ale można także zaobserwować zmiany w K„. Transport glukozy moż-

na rozpatrywać w różnym ujęciu. Jego zasady opisano wyżej. Glukoza i Na+ wiążą się w różnych miejscach na przenośniku glukozowym. Na+ przenika do komórki zgodnie z elektrochemicznym gradientem i pociąga glukozę za sobą (ryc. 43-17), Dlatego im wyższy jest graSWIATŁO JELITA

Glukoza PŁYN POZAKOM0HK0WY Ryc. 43-17. Przezkomórkowy ruch glukozy w komórkach jelita Glukoza przechodzi za jonem Na* przez luminalną błonę komórek nabłonkowych. Gradient Na*, który napędza ten aymport, wy twarza się przez wymianę Na+/K+, zachodzącą na błonie podstawowej w stronę przestrzeni pO2akomórkowej. Glukoza występująca w wysokich stę żeniach wewnątrz komórki przemieszcza się zgod nie z gradientem stężeń do płynu poza komórkowe go na drodze ułatwionej dyfuzji (mechanizm uniportu). ______

dient Na+, tym więcej glukozy wnika do komórki, natomiast gdy stężenie Na+ w płynie pozakomórkowym jest małe, dokomórkowy transport glukozy zatrzymuje się. Dła utrzymania dużego gradientu Na+, symport Na+-glukoza zależny jest od gradientów generowanych przez pompę Na+/K+, która utrzymuje małe wewnątrzkomórkowe stężenie Na + . Podobne mechanizmy obserwuje się przy transporcie innych węglowodanów, a także aminokwasów. Przezkomórkowy transport węglowodanów wymaga jeszcze jednego dodatkowego składnika: uniportu, który pozwala glukozie zgromadzonej wewnątrz komórki przemieszczać się przez inne błony w kierunku nowej

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 569

równowagi; zachodzi to np. w jelicie i w komórkach nerki. Komórki transportują przez błony plazmatyczne także makromolekuły Endocytoza jest procesem, dzięki któremu komórki pobierają duże cząsteczki. Niektóre z nich (np. polisacharydy, białka i polinukleotydy) mogą być źródłami składników odżywczych. Endocytoza stanowi mechanizm regulujący zawartość niektórych składników membranowych, czego najlepszym dowodem są receptory hormonów. Jest ona procesem pozwalającym na poznanie większej liczby szczegółów dotyczących funkcjonowania komórki. DNA jednego typu komórki może być użyty w procesie transfekcji innej komórki i zmienić tym samym jej funkcje lub jej fenotyp. W tych doświadczeniach często używany jest specyficzny gen, co pozwala na unikatową drogę badania i analizowania procesów regulowanych przez niego. Transfekcja DNA zależy od endocytozy; endocytoza jest odpowiedzialna za wniknięcie

DNA do komórki. W takich doświadczeniach zwykle wykorzystuje się fosforan wapnia, gdyż CaJ+ pobudza endocytozę i wytrąca DNA, co ułatwia jego endocytozę. Zarówno endocytoza, jak i egzocytoza wymagają utworzenia się pęcherzyków z błony plazmatycznej lub z błoną plazmatyczną. Endocytoza. Wszystkie komórki eukariotyczne w sposób ciągły trawią części swoich bfon. Endocytarne pęcherzyki powstają w momentach uwypuklania się do wewnątrz segmentów błony plazmatycznej, co powoduje zamknięcie w nich niewielkiej objętości płynu zewnątrzkomórkowego i występujących w nim składników. Pęcherzyki takie odrywają się od błony, następuje fuzja membran plazmatycznych i otwór po pęcherzyku w miejscu pierwotnego dośrodkowego wpukienia zasklepia się (ryc. 43-18). Pęcherzyk taki zlewa się z innymi strukturami membranowymi, co wyjaśnia transport zawartości pęcherzyka do innych obszarów komórki, lub nawet poza nią. Większość pęcherzyków endocytarnych zlewa się z pierwo-

Ryc, 43-18. Dwa typy endocytozy. Endocytarny pęcherzyk (V) tworzy się w wyniku wpuklenia określonej partii błony plazmatycznej w kierunku cytoplazmy. Endocytoza dotycząca płynów (A) jest przypadkowa i nieukierunkowana. Endocytoza, w której pośredniczy receptor (B) jest wybiórcza i zachodzi w ciołkach (CP) pokrytych klatryną (postrzępiona otoczka). Wybiórczość tę zapewnia receptor (czarne kwadraty), który jest specyficzny dla wielu cząsteczek. W tym ostatnim procesie powstają otulone pęcherzyki (CV).

570 / ROZDZIAŁ 43

tnymi lizosomami, tworząc lizosomy wtórne, które zawierają enzymy hydrolityczne i tym samym są wyspecjalizowanymi strukturami wykorzystywanymi śród komórkowe Składniki makromolekularne są trawione i powstają aminokwasy, proste cukry i nukleotydy, które z kolei dyfundują poza pęcherzyki do cytoplazmy, gdzie mogą być ponownie użyte. Endocytoza wymaga: 1) energii, zwykle pochodzącej z hydrolizy ATP; 2) Ca2+ w płynie zewnątrzkomórkowym i 3) kurczliwych elementów w komórce (prawdopodobnie układów mikrofilamentowych). Istnieją dwa zasadnicze typy endocytozy. Fagocytoza zachodzi tylko w wyspecjalizowanych komórkach, takich jak makrofagi i granulocyty. Fagocytoza związana jest z wchłonięciem dużych cząsteczek, jak wirusy, bakterie, komórki i resztki komórek. Makrofagi są niezwykle aktywne w tym procesie i mogą wchłonąć substancje, stanowiące nawet 25% swojej objętości na godzinę. Działając w ten sposób makrofag może zużyć 3% swoich błon płazmatycznych w każdej minucie lub całą swoją błonę w ciągu 30 min. Pinocyroza jest właściwością wszystkich komórek i pozwala na pobieranie przez komórkę płynów i ich zawartości. Tutaj także wyróżniamy dwa typy. Pinocytoza płynnej fazy jest niewybiórczym procesem, w którym pobranie substancji rozpuszczonej przez tworzenie małych pęcherzyków jest wprost proporcjonalne do stężenia tej substancji w płynie pozakomórkowym otaczającym komórkę uczestniczącą w tym procesie. Tworzenie się tych pęcherzyków jest niezwykle aktywnym procesem. Fibroblasty np. zużywają swoją błonę plazmatyczną 3 razy szybciej niż makrofagi. Proces ten zachodzi szybciej niż wytwarzanie nowych błon. Ponieważ w procesie pinocytozy całkowita powierzchnia i objętość komórek tylko niewiele sie zmieniają, błony muszą się odtwarzać na drodze egzocytozy lub przez recyklizację tak szybko, jak szybko są usuwane przez endocytozę. Drugi etap pinocytozy, pinocytoza absorpcyjna, jest wybiórczym procesem, w którym uczestniczy receptor odpowiedzialny przede wszystkim za pobieranie ma kro molekuł, dla których istnieje skończona liczba miejsc wiążących na błonie plazmatycznej. Receptory te cechujące się wysokim powinowactwem, pozwalają na wybiórczą koncentrację tigandów z medium, minimalizując pobieranie płynów lub rozpuszczonych nie związanych makromolekuł, a także

w znacznym stopniu zwiększają szybkość wnikania specyficznych molekuł do komórki. Pęcherzyki powstające w czasie pinocytozy absorpcyjnej powstają z wpukleń (dołków) błony, które pokryte są od strony cytoplazmatycznej materiałem filamentarnym. W wielu układach tym materiałem filamentarnym jest klatryna; jest ona prawdopodobnie peryferyjnym białkiem membranowym. Pokryte dołki mogą stanowić nawet 2% powierzchni niektórych komórek. Na przykład lipoproteiny o małej gęstości (LDL) i ich receptor (p. rozdz. 26} wnikają poprzez pokryte dołki zawierające receptor LDL. Te endocytarne pęcherzyki, zawierające LDL i jego receptor, zlewają się z lizosomami w komórce. Receptor jest uwalniany i ponownie przemieszczany do zewnętrznej błony komórkowej, natomiast apolipoproteina LDL jest degradowana, a estry cholesterolowe są metabolizowane. Synteza receptorów LDL jest regulowana dru go rzędowymi lub trzeciorzędowymi następstwami pinocytozy, tj. przez produkty metabolizmu, takie jak cholesterol, uwolnione w czasie degradacji LDL. Defekty w budowie receptora LDL lub w jego wnikaniu do komórki są ważne z medycznego punktn widzenia i zostały omówione w rozdz. 26. Inne makromolekuły, w tym wiele hormonów, związane są z procesem absorpcyjnej pinocytozy i tworzą receptosomy jako pęcherzyki, które omijają lizosomy i dostarczają swoją zawartość do innych wewnątrzkomórkowych obszarów, takich jak aparat Golgiego. Absorpcyjna pinocytoza zewnątrzkomórkowych glikoprotein wymaga, aby miały one specyficzny węglowodanowy sygnał rozpoznawczy. Te sygnały rozpoznawcze związane są z membranowymi cząsteczkami receptorów, które odgrywają rolę analogiczną do tej, jaką odgrywa receptor LDL. Receptor galaktozylowy na powierzchni hepatocytów jest pomocny w absorpcyjnej pinocytozie asjaloglikoprotein z krążącej krwi. Kwaśne hydrolazy pobierane na drodze absorpcyjnej pinocytozy przez fibroblasty są rozpoznawane dzięki występowaniu w nich mannozo-6-fosforanu. Prawdopodobnie reszta ma nnoz o-6-fosforan owa odgrywa także ważną rolę w wewnątrzkomórkowym transporcie kwaśnych hydrolaz do lizosomów, w których są one syntetyzowane (p. rozdz. 57). Nie jest całkowicie wyjaśniony proces endocytozy za pośrednictwem receptorów w przypadkach wirusów: zapalenia wątroby (uszka-

BŁONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 571 Endocytoza

Egzocytaza

Ryc. 43-19. Porównanie mechanizmów endocytozy i egzocytozy. Egzocytoza wymaga kontaktu dwu wewnętrznych powierzchni (cytoplazmatyczna strona) monowarstwy, podczas gdy endocytoza jest wynikiem kontaktu dwóch zewnętrznych powierzchni monowarstwy.

dzających hepatocyty) czy poliomyelitis (uszkadzających neurony motoryczne) i AIDS. Toksyczność żelaza także rozpoczyna się znacznym jego pobieraniem przez komórki na drodze endocytozy. Egzocytoza. Większość komórek uwalnia makromolekuły do środowiska na drodze egzocytozy. Proces ten występuje także w zjawisku remodelowania błon, gdy składniki syntetyzowane w aparacie Golgiego są przenoszone w pęcherzykach do błonplazmatycznych. Sygnałem dla egzocytozy jest często hormon, który, gdy zwiąże się Z receptorem powierzchniowym komórki, wywołuje lokalne i przemijające zmiany w stężeniu Ca3+. Jony wapnia z kolei uruchamiają- egzocytozę. Rycina 43-19 przedstawia porównanie mechanizmów egzocytozy i endocytozy. Cząsteczki uwalniane przez egzocytoze można zaliczyć do 3 grup: 1) mogą one przyłączać się do powierzchni komórki i stać się peryferyjnymi białkami, np. antygeny; 2) stają się one częścią zewnątrzkomórkowej macierzy, np. kolagen i glikozaminoglikany; 3) mogą one przejść do płynu zewnątrzkomórkowego i być sygnałem dla innych komórek. Insulina, parathormon i katecholaminy znajdują się w ziarnistościach i są poddane obróbce w komórkach, a po zadziałaniu określonego bodźca zostają uwolnione (p, rozdz. 48, 50 i 52). Niektóre sygnały są przenoszone w poprzek błon Sygnały biochemiczne specyficzne, takie jak neurotransmitery, hormony i immunoglobuliny, wiążą się ze swoistymi receptorami (białka integralne) znajdującymi się po zewnętrznej stronie błony plazmatycznej, przekazując następnie informacje poprzez tę błonę do cytoplazmy. Mechanizm ten wymaga wytworzenia szeregu sygnałów, m.in. cyklicznych nukleoty-

dów, wapnia, fosfozytydów i diacyloglicerolu. Szczegółowo mechanizm ten omówiono w rozdz. 45. Informacja może być przekazana przez kontakty międzykomórkowe Istnieje wiele miejsc międzykomórkowych kontaktów w organizmie metazoicznym. Wymaga to kontaktu między błonami plazmatycznymi indywidualnych komórek. Komórki blisko ze sobą sąsiadujące wytworzyły w tym celu wyspecjalizowane regiony na swoich błonach. Złącza szczelinowe pośredniczą i regulują przechodzenie jonów i małych cząsteczek przez wąskie i hydrofilowe wnętrze kanalików, łączących cytoplazmę przylegających komórek. To właśnie jest przyczyna, że jony i małe cząsteczki mogą przenikać z jednej komórki do drugiej w sposób kontrolowany.

PIŚMIENNICTWO Blobel G et al: Tramlocation of proteins across membranes: The signal hypothesis and beyond, Symp Soc Exp Biol 1979;33:9. Dautry-Varsat A, Lodish HF: How receptors bring proteins and particles into cells. Sci Am (May) 1984;250:52. Dawidowicz EA: Dynamics of membranę lipid metabolism and turnover. Annu Rev Biochem 1987;56:43. Ellers M, Schatz G: Protein Unfolding and the Energetics of Protein Translocation across Biological Membranes. Celi 1988;52:481. Goldstein J et al: Receptor-mediated endocytosis. Annu Rev Cel! Biol 1985;1:1. Lodish HF: Transport of secretory and membranę glycoproteins from the rough endoplasmic reticulum to the Golgi: A rale-limiting step in protein maturation and secretion. J Biol Chem 1988;263:2107.

572 / ROZDZIAŁ 43 Matlin, KS: The sorting of proteins to the plasma membranę in epithelia! cells. J Celi Biol 1986; 103:2565. Pfeffer SR, Rothman JE: Biosyntnetic protein transport and sorting by the endoplasmic reticulum and Golgi. Annu Rev Biochcm 1987;56:829. Roise D, Schatz G: Mitochondriai preseąuences. J Biol Chem 19 88; 263:4 509. Singer SJ, Nicolson GL: The fluid tnosaic model of the structure of oell membranes. Science 1972;175:720.

•

Stahl P, Schwartz AL: Receptor-mediated endocytosis. J. Clin lnvest 1986;77:657. Stein WD: Transport and Diffusion Across Celi Membranes. Academic Press, 1986. UnwinN, HendersonR: Thestructuresof proteinsin biological membranes, Sci Am (Feb) 1984;25(h78. Walter P, Gilmore R, Blobel G: Protein translocation across the endoplasmic reticulum. Celi 1984;38:5. Wickner WT, Lodish HF: Multiple mechanisms of protein insertion into and across membranes. Science 1985;230:400.

Charakterystyka układów hormonalnych

44

Dary/ K. Granner, MD

WPROWADZENIE Celem tego rozdziału jest dostarczenie informacji o zmieniającej się istocie układu wewnątrzwydzielniczego i definicjach kilku podstawowych koncepcji, które przewijać się będą w kolejnych podrozdziałach.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Postęp, jaki dokonał się w zakresie badań nad funkcjonowaniem układu wewnątrzwy dziel niczego — umożliwiający odpowiedzi na pytania, dlaczego niektóre gruczoły endokrynne znajdują się w sąsiedztwie drugich, w jaki sposób wytwarzane są hormony, jak również koncepcje o występowaniu komórek docelowych, receptorów oraz kontroli wydzielania hormonów opartej na mechanizmach sprzężenia zwrotnego — ma bezpośrednie implikacje kliniczne. Obecnie można dokładnie określić przyczyny niektórych chorób układu wewnątrz wydziel niczego. Wiele z nich spowodowanych jest defektami receptorowymi, chociaż zapewne i inne przyczyny tych chorób zostaną wkrótce zidentyfikowane.

WYSPECJALIZOWANE TKANKI ORGANIZMÓW WIELOKOMÓRKOWYCH POTRZEBUJĄ ZŁOŻONEJ KOORDYNACJI Cechą charakterystyczną ustrojów wielokomórkowych jest występowanie różnorodnych tkanek pełniących swoiste funkcje, niezbędne

dla przeżycia tych organizmów. Konieczne są również mechanizmy dla "komunikacji śródkomórkowej, zapewniające koordynację procesów adaptacyjnych na zmiany środowiska zewnętrznego i wewnętrznego. Rozwinęły się dwa ogólne układy spełniające le czynności. Są nimi: układ nerwowy, przekazujący sygnały lub informacje za pośrednictwem niezmieniającego się systemu strukturalnego oraz układ wewnątrz wy dzielniczy, wydzielający różne hormony w swoistych gruczołach, przenoszone jako sygnały do komórek przylegających lub do tkanek oddalonych od tych gruczołów. Obecnie wiadomo, że występuje zadziwiająca zbieżność w działaniu tych systemów regulatorowych. Regulacja nerwowa jest bardzo ważna. I tak np. epinefryna (adrenalina) jest wytwarzana i wydzielana przez komórki pozazwojowe rdzenia nadnerczy, zaś wazopresyna jest syntetyzowana w podwzgórzu i transportowana aksonami do przysadki nerwowej (tylnej części przysadki mózgowej), gdzie jest wydzielana do krwiobiegu. Wiele neuroprzekaźntków (katecholaminy, dopamina, acetylocholina itd.) jest podobnych do hormonów, jeśli uwzględni się ich syntezę, uwalnianie, transport i mechanizm działania. I tak np. aminy katecholowe są neuroprzekaźnikami dla jednej tkanki zaś hormonami dla innych tkanek. Innym takim przykładem jest fakt wykrycia niedawno pewnych metabolitów steroidów nadnerczowych będących modulatorami receptorów y-amino-maślanowych (GABA) w mózgu, o działaniu podobnym do barbituranów. W końcu należy wspomnieć, że niedawno znaleziono w mózgu wiele hormonów tj. insulinę, ACTH, wazoaktywny polipeptyd jelitowy (VIP), somatostatynę, hormon uwalniający tyreotropinę (TRH) oraz cho-

574 / ROZDZIAŁ 44

lecystokininę. Do wyjaśnienia pozostaje, czy wszystkie wymienione hormony syntetyzowane są w mózgu i czy działają tam jako neuromodulatory lub neuroprzekaźniki. Skoro w mózgu wykryto swoiste receptory dla wielu z wymienionych hormonów, możliwe jest, że działają one w mózgu. Pojecie „hormon" pochodzi od greckiego słowa, oznaczającego „pobudzić do działania". Według klasycznej definicji pod pojęciem hormonu należy rozumieć substancję, syntetyzowaną w jednej tkance i przenoszoną krwią do innego narządu, w którym rozwija swoje działanie. Ta definicja hormonu wykazuje zbyt mały zakres, wiadomo bowiem, że hormony mogą działać również na przylegające komórki w określonej tkance (działanie to określa się jako parakrynne), a nawet na komórki, w których są syntetyzowane (działanie to określa się jako autokrynne).

CECHĄ ZNAMIENNĄ UKŁADU WEWNĄTRZWYDZIELNICZEGO JEST JEGO RÓŻNORODNOŚĆ Jedną z najbardziej znamiennych cech układu wewnątrzwydzielniczego jest to, że zabezpiecza ustrój w liczne sposoby rozwiązywania problemów. Celem tego podrozdziału jest krótkie przedyskutowanie wybranych przykładów najlepiej ilustrujących różnorodność układu wewnątrzwydzielniczego . Gruczoły wewnątrzwydzielnicze są przeważnie pochodzenia nabłonkowego i rozmieszczone strategicznie Gruczoły wydzielania wewnętrznego są najczęściej pochodzenia nabłonkowego. Szczególnymi wyjątkami od tej reguły są: komórki Leydiga wywodzące się z tkanki łącznej gonady męskiej a wytwarzające testosteron, komórki ziarniste jajnika, produkujące estrogeny oraz komórki sekrecyjne przysadki nerwowej, wywodzące się z komórek nerwowych. Grzebień nerwowy (neural crest) ma być embriologicznym zalążkiem licznych rodzajów komórek endokrynnych. Jeśli to jest prawdą, łatwo sobie wytłumaczyć związek między ośrodkowym układem nerwowym a układem wewnątrzwydzielniczym. Skoro tkanka wywodząca się z grzebienia nerwowego może się pojawić w każdym narządzie, łatwo sobie wytłumaczyć wy-

twarzanie niektórych hormonów w mózgu i tkankach wywodzących się przeważnie z jelita środkowego pierwotnego lub z przedniej części prajelita. Tłumaczy to również zespoły ektopowej syntezy hormonów, w których zachodzi wytwarzanie hormonów przez „niewłaściwą" tkankę (np. wytwarzanie parathormonu lub ACTH przez komórki raka płuc). Ogólnie biorąc, zespoły te dotyczą raczej ograniczonej liczby hormonów peptydowych, natomiast licznych i różnorodnych tkanek. O ile powszechnie uważano, że zespoły te są wyrazem aktywacji „milczących" genów w obrębie określonej komórki, obecnie wydaje się, że zespoły te są wyrazem aktywacji „uśpionych" komórek wykazujących wspólnych przodków w obrębie tkanki. Inny dziwny przykład to zespoły wielogruczolakowatości wewnątrz w ydzielniczej (mul-

tiple endocrine neoplasia syndromes — MEN), w których stwierdza się rodzinne występowanie nowotworów w kilku gruczołach wewnątrzwydzielniczych równocześnie. Cechą tych zespołów jest nadmiernie wytwarzanie hormonów peptydowych lub amin katecholowych często przez jedną i tę samą tkankę. Komórki wytwarzające hormony nie są rozmieszczone przypadkowo. Występują one w różnych tkankach dla określonych celów. Lokalne występowanie wysokich stężeń hormonów (tj. wyższych od występujących w osoczu krwi) jest potrzebne dla swoistych procesów biologicznych. Dla przykładu należy podać, że miejscowe stężenie testosteronu, niezbędne w procesie sperma to genezy, jest wyższe od występującego w osoczu krwi. Tym faktem należy tłumaczyć występowanie komórek Leydiga wytwarzających testosteron tuż obok n a sień io wodo w. Do powstania ciałka żółtego potrzebne jest bardzo duże miejscowe stężenie estrogenów. Tłumaczy to bliskie położenie komórek ziarnistych pęcherzyka jajnikowego (Graafa) w stosunku do ciałka żółtego. Gros działania insuliny i glukagonu polega na regulacji wytwarzania glukozy w wątrobie (w procesie glukoneogenezy — przyp- tłumacza); dlatego istnieje bliskie powiązanie wysp trzustkowych z krążeniem wrotnym wątroby. Kortyzoi, który jest niezbędny w dużych stężeniach w rdzeniu nadnerczy do indukcji N-metylo-transferazy fenyloetanoloaminowej (jest to enzym określający wydajność biosyntezy katecholamin), dociera tam drogą wrotnego układu naczyniowego, biorącego swój początek w korze nadnerczy. Istnieje ścisły związek między

CHARAKTERYSTYKA UKŁADÓW HORMONALNYCH / 575

podwzgórzem a przednią częścią przysadki mózgowej (przysadka gruczołowa), co sprawia, że wysokie stężenia bardzo iabilnych hormonów uwalniających podwzgorza docierają łatwo do narządu docelowego, tj. do przysadki gruczołowej za pośrednictwem swoistego wrotnego układu naczyniowego. W końcu należy wspomnieć o wyjątkowym rozmieszczeniu swoistych komórek wysp trzustkowych wobec siebie. Wytwarzając miejscowo wysokie stężenia somatostatyny, polipeptydu trzustkowego, glukagonu i insuliny, sekrecja każdego z tych hormonów wpływa na wydzielanie pozostałych hormonów. Biosynteza hormonów i modyfikacja tej biosyntezy są harmonijnie zgrane ze swoistymi zadaniami czynnościowymi tych hormonów Istnieje wielka różnorodność w zakresie struktury chemicznej oraz w mechanizmach biosyntezy i przemian po syntetycznych w odniesieniu do poszczególnych aktywnych hormonów. I tak hormony mogą powstawać z prekursorów lipidowych, przez modyfikację struktury aminokwasu tyrozyny, lub też drogą syntezy białek prostych lub złożonych (np. glikoprotein). Hormony mogą być syntetyzowane i wydzielane w swej ostatecznej postaci. Do takich hormonów należą aldosteron, hydrokortyzon, trijodotyronina (T3), estradiol i aminy katecholowe. Inne hormony muszą ulec obróbce w obrębie komórki, zanim zostaną wydzielone lub zanim nabędą pełnej aktywności biologicznej. Takimi przykładami są: insulina, która jest syntetyzowana jako proinsulina (jest ona prototypem białek prekursorowych) oraz hormon przytarczyc — parathormon (PTH). Ten ostatni wywodzi się z co najmniej dwóch prekursorów peptydowych (prepro- i pro-PTH), z których powstaje w pełni aktywna postać hormonu — przez odcięcie dwóch polipeptydów. Opis białek prekursorowych, ich syntezy i śródkomórkowej obróbki do końcowego produktu przedstawiono w rozdz. 43. Jeszcze bardziej złożonym przykładem jest proopiomelanokortyna (POMC), składająca się z 285 aminokwasów, a będąca produktem pojedynczego genu. POMC ulega rozpadowi z wytworzeniem takich hormonów, jak ACTH, P-lipotropiny, fS-endorfiny, ot-melanotropiny (cc-MSH) i P-melanotropiny (P-MSH) oraz innych hormonów poiipeptydowych dotychczas jeszcze nie zidentyfikowanych. Obróbka (prze-

kształcanie) tej cząsteczki prekursorowej jest tkankowo swoista '(p. rozdz. 46). Przykładem może najbardziej drastycznym występowania dużego prekursora hormonalnego jest tyreoglobulina. Jest to duża cząsteczka białkowa (masa cząsteczkowa wynosi 660000 D) występująca w pęcherzykach gruczołu tarczowego. Wśród 5000 aminokwasów cząsteczki tyreoglobuliny znajduje się 120 reszt tyrozylowych, z których tylko nieliczne ulegają jodowaniu w procesie biosyntezy hormonów tarczycowych (p. rozdz. 47). Cała cząsteczka tyreoglobuliny musi ulec degradacji, aby uwolnić zaledwie kilka cząsteczek tetrajodo- (T4) lub trijodotyroniny (T3). Niektóre hormony ulegają konwersji do cząsteczek bardziej aktywnych w tkankach obwodo-

wych. Konwersja może zachodzić w narządzie docelowym, np. konwersja T4 do T3 zachodzi w wątrobie i przysadce mózgowej, zaś testosteronu do dihydrotestosteronu w drugorzędowych tkankach płciowych. Konwersja obwodowa może zachodzić również w tkankach niedocelowych. I tak dehydroepiandrosteron jest wytwarzany w nadnerczach, natomiast ulega konwersji do androstendionu w wątrobie. Ten ostatni metabolit może ulec dalszej konwersji do testosteronu, estronu lub estradiolu w adypocytaeh, wątrobie lub skórze. Konwersja nieaktywnego hormonu w hormon czynny może zachodzić zarówno w tkankach docelowych jak i niedocelowych. Przykładem tego jest konwersja witaminy D3 skóry do 25-hydroksycholekalcyferolu w wątrobie oraz przekształcanie tego ostatniego metabolitu do 1,25-dihydroksycholekalcyferolu w nerkach (p. rozdz. 48). Hormony wydzielane przez bardzo różne tkanki i wykazujące różne komórki docelowe mogą wykazywać podobieństwo strukturalne. I tak np. hormony glikoproteinowe przysadki gruczołowej (tyrcotropina — TSH, folitropina — FSH, lutropina — LH) lub łożyska (gonadotropina kosmówkowa — HCG) są heterodimerami składającymi się z podjednostek a i p, przy czym podjednostka a jest identyczna we wszystkich wymienionych hormonach.

576 / ROZDZIAŁ 44

DOCELOWYM NARZĄDEM HORMONÓW MOŻE BYĆ WIĘCEJ NIŻ JEDNA TKANKA: KONCEPCJA NARZĄDU DOCELOWEGO (TARCZOWEGO) U człowieka występuje ok. 200 rodzajów zróżnicowanych komórek. Tylko niektóre z nich wytwarzają hormony. Występujące u człowieka 75 bilionów (75 x 10t2) komórek to komórki docelowe dla jednego lub więcej z ok. 50 znanych hormonów. Hormon może mieć tylko jedną tkankę docelową, tub też może oddziaływać na kilka tkanek równocześnie. Klasyczna definicja jako tkankę docelową określa taką, która charakteryzuje się unikalną reakcją biochemiczną lub fizjologiczną na bodziec hormonalny, np. tarczyca jest swoistym narządem docelowym dla TSH; TSH zwiększa liczbę i wielkość komórek gronek tarczycowych i pobudza wszystkie etapy enzymatyczne związane z biosyntezą hormonów tarczycowych, W odróżnieniu od TSH insulina działa na wiele tkanek. Pobudza wychwyt glukozy i jej utlenianie w mięśniach, Hpogenezę w tkance tłuszczowej, transport aminokwasów do hepatocytów i limfocytów oraz syntezę białek w wątrobie i mięśniach, żeby wymienić jedynie kilka efektów tego hormonu. Ostatnio, po zidentyfikowaniu swoistych receptorów hormonalnych na powierzchni komórek lub w obrębie komórek, definicja narządu lub tkanki docelowej została poszerzona. Obejmuje ona jakąkolwiek tkankę, wykazującą zdolność wiązania hormonu przez swoisty receptor, niezależnie od występowania lub niewystępowania klasycznego efektu biochemicznego lub fizjologicznego dla danego hormonu (np. wiązanie insuliny przez komórki śródbłonkowe). Ta definicja także nie jest idealna, ma ona jednak wartość heurystyczną, uzmysławia bowiem, że nie wszystkie efekty działania hormonów zostały wyjaśnione. Ogólna odpowiedź na określony hormon zależy zarówno od jego stężenia we krwi, jak i od narządu docelowego. Z kolei stężenie miejscowe hormonu w narządzie docelowym zależy od: 1) nasilenia syntezy i wydzielania hormonu, 2) odległości dzielącej narząd wydzielania wewnętrznego od narządu docelowego, 3) stałej wiązania lub dysocjacji hormonu ze swoistymi białkami nośnikowymi osocza (jeśli takie występują), 4) szybkości konwersji nieaktywnego lub słabo aktywnego prekursora w aktywny hormon, oraz 5) szybkości oczyszczania

krwi z danego hormonu poprzez jego wydalanie z ustroju lub biodegradację (procesy te zachodzą głównie w wątrobie i nerkach). Odpowiedź tkanki docelowej na bodziec hormonalny zależy z kolei od 1) względnej aktywności i (lub) stopnia wysycenia hormonem swoistych receptorów hormonalnych błon komórkowych, cytoplazmatycznych lub jądrowych oraz 2) poreceptorowej amplifikacji lub supresji sygnału hormonalnego. Zmiany wymienionych czynników mogą wpływać na nasilenie reakcji indukowanej hormonem w narządzie docelowym i należy je uwzględnić rozpatrując działanie klasycznych pętli sprzężenia zwrotnego.

WYSTĘPOWANIE ZARÓWNO UJEMNEGO, JAK I DODATNIEGO SPRZĘŻENIA ZWROTNEGO JEST MECHANIZMEM KONTROLUJĄCYM Utrzymywanie się fizjologicznych stężeń hormonów we krwi jest wynikiem działania różnorodnych mechanizmów homeostatycznych na linii gruczoł wydzielania wewnętrznego — narząd docelowy, W mechanizmach tych często pośredniczy jeden lub więcej gruczołów. Powszechnie występuje kontrola sekrecji hormonów na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego, szczególnie w takich układach jak; podwzgórze-przysadka mózgowa-gruczoł docelowy. Przykład takiego sprzężenia zwrotnego przedstawia ryc. 44-1. Jak widać na rycinie, podwzgórzowy hormon uwalniający pobudza syntezę i uwalnianie hormonu przedniego płata przysadki mózgowej, który z kolei stymuluje wytwarzanie hormonu w narządzie docelowym. Wysokie stężenia hormonu tego ostatniego hamują syntezę i działanie hormonu podwzgórzowego, i odwrotnie, małe stężenia pobudzają układ na poziomie podwzgórza. Wyjątkową cechą tego szczególnego układu jest to, że synteza hormonu przysadki gruczołowej może się zmniejszyć w następstwie działania tzw. krótkiej pętli sprzężenia zwrotnego. Działanie takiego systemu zapewnia precyzyjną kontrolę stężenia hormonu w osoczu. Pokazuje on, że w obrębie jednego układu wewnątrz wy dzielniczego istnieje wiele hormonów i wiele tkanek docelowych. Istnienie takich „pętli" kontroli wydzielania hormonów wykazano dla nadnerczy, tarczycy oraz gonady męskiej i żeńskiej. W innych przypadkach regulacja mechaniz-

CHARAKTERYSTYKA UKŁADÓW HORMONALNYCH / 577 e

Hormon ' uwalniający Krotka pętla

t

Przykład zasadzie regulującego

jajników męskiej.

e

PODWZGÓRZE (PRZEDNI PŁAT PRZYSADKI MÓZGOWEJ)

Ryc. 44-1. układu kontrolnego opartego na ujemnego sprzężenia zwrotnego, NARZĄD DOCELOWY

czynność tarczycy, nadnerczy, i gonady

mem ujemnego sprzężenia zwrotnego jest realizowana za pośrednictwem zmiany stężenia określonych metabolitów lub substratów powstałych w następstwie działania hormonu na komórkę docelową. I tak np. wzrost stężenia glukozy w osoczu krwi, czyli hiperglikemia, pobudza uwalnianie insuliny, która z kolei nasila pobór i utylizację glukozy przez liczne tkanki; w następstwie tych procesów stężenie glukozy normalizuje się, dzięki czemu uwalnianie insuliny maleje, W określonych warunkach chorobowych uwalnianie insuliny do krwi może być nadmierne, co może być przyczyną wystąpienia hipoglikemii. Odpowiedzią fizjologiczną na taki groźny dla życia stan jest uwalnianie amin katecholowych, hormonu wzrostu, glukagonu, ACTH, wazopresyny i angiotensyny II, tj. hormonów zwiększających stężenie glukozy we krwi. Jak widać, rozwinęła się złożona sieć mechanizmów regulujących stężenie krytycznego metabolitu (w omawianym przypadku glukozy) niezbędnego dla czynności mózgu. W innych przypadkach hormony działają na zasadzie dodatniego sprzężenia zwrotnego. I tak na przykład estrogeny i progesteron są potrzebne do wystąpienia wzrostu sekrecji LH, indukującego owulację oraz powstanie ciałka żółtego, jak również dalszą syntezę wymienionych hormonów steroidowych. W wielu przy37

padkach pętie sprzężenia zwrotnego nie zostały jeszcze określone,' najczęściej dlatego, że nieznane są końcowe produkty działania hormonu. Liczne zjawiska patofizj o logiczne, takie jak wstrząs, uraz, hipoglikemia, ból i stres wpływają na czynność osi podwzgórze-przysadka-narząd docelowy poprzez oddziaływanie na wyższe ośrodki mózgowe. Wymienione czynniki pobudzające wykazują znaczny wpływ na przemianę amin katecholowych i hormonu wzrostu, jak również na czynność kory nadnerczy, tarczycy i gonad, chociaż jeszcze słabo poznano poszczególne ogniwa działania tych czynników. W chorobach wydzielania wewnętrznego oraz przemiany materii wspomniane mechanizmy sprzężenia zwrotnego ulegają zaburzeniu. W celu wykrycia zaburzeń tych układów używa się testów diagnostycznych odróżniających stany fizjologiczne od chorobowych. RECEPTORY HORMONALNE ODGRYWAJĄ GŁÓWNĄ ROLĘ Receptory wykazują zdolność precyzyjnego odróżniania cząsteczek Rycina 44-2 pokazuje główne zasady działania hormonalnego układu komunikacji. Stężenie hormonów w płynie pozakomórkowym jest zwykle bardzo małe i waha się w granicach od 1O"1S do 10~e mol/l. Są to stężenia znacznie niższe w porównaniu do stężeń licznych, strukturalnie podobnych do hormonów cząsteczek (substancje steroidowe, aminokwasy, peptydy, białka) i innych substancji krążących we krwi. Stężenia tych ostatnich wahają się od tO~5 do 10"3 mol/l. Dlatego też komórki docelowe muszą odróżnić nie tylko różne hormony obecne we krwi w małych stężeniach, ale również rozpoznać je wśród cząsteczek występujących w 106 do I09-krotnie większym stężeniu. Ten wysoki stopień dyskryminacji poszczególnych cząsteczek zapewniają struktury komórkowe zwane receptorami. Hormony rozpoczynają swoje działanie biologiczne wiążąc się ze swoistym receptorem komórkowym. Każdy skuteczny układ kontroli musi jednak również obejmować-mechanizmy hamujące efekty hormonalne. Zachodzą one zwykle w ten sposób, że efektor odłącza się od receptora. Pod pojęciem komórki docelowej należy rozumieć komórkę wykazującą zdolność wiązania

578 / ROZDZIAŁ 44

□ o

A

/ Różnorodność cząsteczek w płynie pozakomórkowym

—v—

■

---- Hormon

3

w 1

2

l_J

2

— Rodzaje komórek

4

Ryc. 44-2. Swoistość i wybiórczość receptorów hormonalnych. W płynie pozakomórkowym znajduje się wiele różnorodnych cząsteczek, lecz tylko kilka z nich jest rozpoznawanych przez receptory hormonalne. Receptory te muszą je rozpoznać wśród innych cząsteczek występujących w wysokich stężeniach. Komórka może mieć tylko jeden rodzaj receptora, lub też receptory dla kilku hormonów.

określonego hormonu przez swoisty receptor. Zjawisko interakcji między hormonem a jego receptorami można określić ilościowo, używając ligandów radioaktywnych, wykazujących właściwości wiązania hormonów. W badaniach zjawiska wymienionej interakcji ważne są następujące elementy; 1) radioaktywność nie może zmienić aktywności biologicznej ligandu, 2) wiązanie musi mieć charakter swoisty, tj. znakowany ligand musi zostać wyparty przez nieznakowanego agoniśtę lub antagonistę, 3} wiązanie musi być „wysycalne" oraz 4) wiązanie powinno zachodzić w zakresie stężeń wywołujących spodziewaną odpowiedź biologiczną. W obrębie receptora występuje zarówno domena rozpoznająca, jak i sygnalizacyjna Wszystkie receptory, zarówno dla hormonów polipeptydowych, jak i steroidowych, mają przynajmniej dwie domeny czynnościowe. Domena rozpoznająca wiąże hormon, zaś drugi obszar receptora wytwarza sygnał łączący proces rozpoznawania hormonu z jakąś czynnością śródkomórkową. Proces wiązania hormonu dowodzi, że pewien obszar jego cząsteczki wykazuje strukturę komplementarną do określonego obszaru cząsteczki receptora. Stopień tej kom-

plementarnośd określa siłę wiązania hormonu z receptorem wyrażoną współczynnikiem powinowactwa (K) (affinity of binding). Jeżeli natywny hormon wykazuje wartość K umownie określoną jako 1, inne cząsteczki naturalne wykazywać będą wartości K od 0 do 1. W rzeczywistości absolutne wartości powinowactwa poszczególnych cząsteczek do receptora mogą się różnić 1012-krotnie. Syntetyzowano nawet Ugandy o względnej wartości K>1. Te ostatnie używane są w badaniach różnych aspektów biologii receptora. Proces trans du kej i sygnału odbywa się najczęściej dwiema drogami. Cząsteczki hormonu białkowego lub polipeptydowego, lub też amin katecholowych łącząc się z receptorami zlokalizowanymi w błonie plazmatycznej wyzwalają sygnał regulujący różne czynności środkom orkowe, najczęściej poprzez zmianę aktywności jakiegoś enzymu. Hormony steroidowe oraz tarczycy wiążą się z receptorami śródkomórkowymi, zaś powstały w ten sposób kompleks hormon-receptor sam jest sygnałem {patrz niżej)Dotychczas poznano sekwencję ami no kwasową wymienionych dwóch domen dla wielu receptorów wiążących hormony polipeptydowe, W celu uzyskania zmiany siły wiązania

CHARAKTERYSTYKA UKŁADÓW HORMONALNYCH / 579

hormonu do receptora oraz aktywności biologicznej hormonu dokonano syntezy jego analogów różniących się od natywnego hormonu określonymi podstawnikami aminokwasowymi. Receptory hormonów steroidowych mają wiele domen czynnościowych; jedna z nich wiąże się z hormonem, druga z określonym obszarem łańcucha DNA, trzecia pobudza (lub też hamuje) proces transkrypcji genu, zaś czwarta może określać powinowactwa (high affmity binding) do DNA. Podwójna funkcja receptora, tj, zdolność wiązania hormonu i inicjacja określonej czynności środkom orkowej leży u podstawy tzw. sprzężenia receptorowo-efektorowego (receptor--effector coupling) stanowiącego pierwszy etap amplifikacji odpowiedzi hormonalnej. Ta cecha odróżnia receptor komórki docelowej od białek nośnikowych osocza, które wprawdzie wiążą hormony, lecz nie indukują określonego sygnału hormonalnego. Receptory i białka transportowe (nośnikowe) wykazują działania wzajemnie się uzupełniające Ważne jest odróżnienie wiązania hormonów przez receptory od łączenia się hormonów z różnymi białkami transportowymi (nośnikowymi). Tabela 44-1. Porównanie receptorów hormonalnych z białkami nośnikowymi hormonów w osoczu krwi Białka nośniCecha Stężenie

Receptory

kowa hormo-

nów w osoczu Bardzo małe Bardzo duże (tysiące na (miliardy/fil) jedną komórkę)

Powinowactwo Bardzo duże

Swoistość wiązania Wysycenie przy stężeniach fizjologicznych Odwracał ność wiązania Zdolność wywoanta sygnału dla komórki

Małe

mol/l)

mol/l)

Duża

Mała

Tak

Nie

Tak

Tak

Tak

Nie

Tabela 44-1 przedstawia kilka cech tych dwóch rodzajów białek. Na jedną komórkę przypada tysiące cząsteczek receptorowych wiążących określony iigand (hormon), wykazujących wysokie powinowactwo i wysoką swoistość. Receptory mogą rozpoznać i wyselekcjonować swoiste cząsteczki przy gradiencie stężenia rzędu 10* lub 107. Ponadto wiązanie hormonu przez receptory jest wysycalne przy fizjologicznych stężeniach tego hormonu. Interakcje zachodzące między hormonem a receptorem są zależne od siły jonowej, temperatury i pH roztworu. Te ostatnie cechy są różne, choć charakterystyczne dla poszczególnych hormonów i ich receptorów. U podstawy wiązania hormonu przez swoisty receptor leżą mechanizmy hydrofobowe i elektrostatyczne, przez co wiązanie to jest szybko odwracalne, z wyjątkiem określonych przypadków. Krążące we krwi hydrofobowe steroidy i hormony tarczycy związane są ze swoistymi białkami transportowymi (nośnikowymi). Ilość białek nośnikowych jest znacznie większa niż liczba śródkomórkowych białek receptorowych dla tych hormonów; odznaczają się one jednak słabszym powinowactwem i mniejszą swoistością w porównaniu do receptorów. Białka nośnikowe, wiążąc określony hormon, stanowią rodzaj puli rezerwowej dla tego hormonu; kompleks białko nośnikowe-hormon nie ulega bowiem ani metabolizacji, ani też wydaleniu z ustroju. Tylko frakcja hormonu wolnego, nie związanego z białkami nośnikowymi, wykazuje aktywność biologiczną. Hormony peptydowe i białkowe nie mają białek nośnikowych w osoczu krwi, przez co wykazują znacznie krótszy okres półtrwania (wynoszący sekundy lub minuty) niż hormony steroidowe (których okres półtrwania wynosi kilka godzin). Zatezność między liczbą receptorów związanych z hormonem a jego działaniem biologicznym jest złożona Jak widać na ryc. 44-3A, stężenia hormonu wykazują często proporcjonalność do nasilenia swoistego działania biologicznego. Dotyczy to głównie hormonów steroidowych, ale również niektórych hormonów peptydowych. Jest to zjawisko zaskakujące, uwzględniając liczne etapy dzielące proces wiązania hormonu przez receptor od wystąpienia złożonej reakcji na ten hormon, na którą się składają m.in. indukcja enzymatyczna, rozpad komórki i transport ami-

580 / ROZDZfAŁ 44 A. Nie ma receptor ów zapasowych

B. Są receptory zapasowe

50-

IM-, 50-

i ir

-log stężenia hormonu

6 _ = 100-, Wiązani e -------■ Efekn ..........Efekt2

. ----1 --------r 10

9 8 7 — log stężenia hormonu

Ryc. 44-3. Porównanie wiązania hormonu z jego działaniem bioiogiczym w nieobecności (A) lub obecności (B, efekt 2) receptorów zapasowych. W niektórych przypadkach efekt biologiczny jest ściśle sprzężony z wiązaniem hormonu przez określoną tkankę, podczas gdy w innych przypadkach efekt biologiczny wykazuje zjawisko „zapasowych receptorów" (porównaj efekt 1 z efektem 2 na rycinie B).

nokwasów. W innych przypadkach stwierdza się znamienna dysocjacje między liczbą receptorów zajętych przez hormon a biologicznymi skutkami jego działania, rj. obserwuje się maksymalny efekt biologiczny hormonu wtedy, kiedy tylko maty odsetek receptorów jest związanych przez hormon (p. ryc. 44-3B, efekt 2). Receptory bezpośrednio nie uczestniczące w reakcji biologicznej na hormon określane są jako receptory zapasowe (spare receptors). Obecność receptorów zapasowych obserwuje się w reakcjach wywołanych przez wiele hormonów peptydowych. Sądzi się, że te receptory zwiększają wrażliwość komórki docelowej na małe stężenia hormonu oraz, że stanowią rezerwuar receptorów. Koncepcja występowania receptorów zapasowych ma charakter operacyjny i zależy od tego, który aspekt odpowiedzi hormonalnej jest badany oraz jaka tkanka w niej bierze udział. Przykładem tego jest występowanie wspaniałej zgodności zachodzącej między wiązaniem LH i wytwarzaniem cAMP przez komórki ziarniste pęcherzyków jajnika (przy aktywacji cyklazy adenylanowej przez jakikolwiek hormon zwykle nie stwierdza się receptorów zapasowych); natomiast steroidogeneza, która jest cAMP-zależna, zachodzi w tych komórkach wtedy, kiedy mniej niż 1 % wszystkich receptorów jest związanych przez hormon (porównaj efekt !*z efektem 2 przedstawionym na ryc. 44-3B). Transkrypcja genu

dla karboksykinazy fosfoenolopirogronianowej ulega supresji, jeśli liczba receptorów insulinowych na hepatocytach związanych z tym hormonem jest znacznie mniejsza niż 1%, podczas gdy w tymocytach stwierdza się wysoce znamienną korelację między liczbą receptorów związanych przez insulinę a nasileniem transportu aminokwasów. Innym przykładem dysocjacji zachodzącej między liczbą związanych przez hormon receptorów a efektami biologicznymi danego hormonu jest wpływ amin katecholowych na skurcz mięśni, lipolizę i transport jonów. Przyjmuje się, że wymienione reakcje końcowe odzwierciedlają działanie kaskadowe lubuwielokrorniające tych hormonów. Opisano występowanie zmiennej czułości poszczególnych reakcji na hormon w obrębie jednej i tej samej komórki. Przy wzrastającej liczbie związanych przez hormon receptorów insulinowych adypocytów w pierwszej kolejności wzrasta lipogeneza, a w następnej utlenianie glukozy, transport aminokwasów i synteza białek. Liczba receptorów hormonalnych komórki może się zwiększać (upregułation) lub zmniejszać (down regułation) Liczbę receptorów na powierzchni komórki lub występujących w jej obrębie cechuje stan dynamiczny; podlega on regulacjom fizjologicznym i może się zmieniać w stanach chorobo-

CHARAKTERYSTYKA UKŁADÓW HORMONALNYCH / 581

wych lub pod wpływem zabiegów ieczniczych. Najwięcej wiadomo o receptorach błony plazma tycznej. W błonie komórkowej regulacji podlega zarówno liczba receptorów hormonalnych, jak i powinowactwo hormonów do tych receptorów. Zmiany te mogą być szybkie i w znamiennym stopniu wpłynjjć na nasilenie reakcji komórki na działanie hormonu. Na przykład ekspozycja komórek na agonistów (3adrenergicznych przez minuty lub godziny sprawia, że stosowanie większego stężenia agonisty nie tylko nie nasila aktywacji cyklazy adenylanowej, lecz nawet może być przyczyną całkowitej utraty jej aktywności biologicznej. Ten proces odczulania (desensytyzacji) komórki na hormon odbywa się dwoma mechanizmami. Pierwszy polega na utracie receptorów z błony plazma ty cznej. To zmniejszanie się liczby receptorów (down regulation) polega na śródkomórkowej sekwestracji receptorów, tj. na oddzieleniu ich od innych składowych układu odpowiedzi hormonalnej, w tym również na oddzieleniu podjednostki regulacyjnej cyklazy adenylanowej od jej podjednostki katalitycznej (p. rozdz. 45). Usunięcie agonisty ze środowiska powoduje ponowne pojawienie się receptorów na powierzchni komórki oraz przywraca wrażliwość komórki na dany hormon. Drugi mechanizmt>dczulania na hormon polega na kowalencyjnej modyfikacji receptora poprzez fosforyla-

A. Nie ma receptorów zapasowych

cję. Ten zależny qd cAMP proces nie zmienia liczby receptorów, ani też nie powoduje ich translokacji. Doświadczenia nad rekonstytucja, receptora wykazały, że fosforylowany receptor nie jest zdolny aktywować cyklazę, tak że dochodzi do rozkojarzenia funkcji wiązania hormonu oraz procesu aktywacji komórki. Zjawisko fizjologicznej adaptacji komórek drogą zmniejszania liczby receptorów (down regulation) obserwuje się między innymi po zadziałaniu insuliny, glukagonu, tyreoliberyny (TRH), hormonu wzrostu, LH, FSH i amin katecholowych. Kilka hormonów, takich jak angiotensyna II i prolaktyna, wykazuje odwrotny wpływ na liczbę swoich receptorów, tj. hormony te zwiększają liczbę receptorów (zjawisko to określa się jako up regulation). Taka zmiana liczby receptorów może zachodzić w krótkim czasie (w ciągu minut lub godzin) i najpewniej stanowi ważny mechanizm regulacji odpowiedzi biologicznej. Sposób w jaki utrata receptorów wpływa na odpowiedź biologiczną indukowaną hormonem, zależy od obecności lub nieobecności receptorów zapasowych. Rycina 44-4 przedstawia wpływ utraty Liczby receptorów do f wartości normalnej na przebieg krzywej odzwierciedlającej zależność efektu biologicznego od stężenia hormonu w obecności i nieobecności receptorów zapasowych. W nieobecności

B. Są receptory zapasowe

r

S

r 10

— log (stężeńte hormonu)

8 7

— log (slęzenle hormon u) — Prawidłowa liczba receptorów - - tkrotne zmniejszenie liczby receptorów

Ryc. 44-4. Wpływ 5-krotnego zmniejszenia liczby receptorów na efekt biologiczny układu nie mającego {A) i mającego (B) receptory zapasowe. ______________________________________

582 / ROZDZIAŁ 44

receptorów zapasowych maksymalna odpowiedź na działanie hormonu wynosi 20% wartości obserwowanej przy normalnej liczbie receptorów (część A ryc. 44-4) (efekt odpowiada wartości Vmax). W obecności receptorów zapasowych {część B ryc. 44-4) uzyskuje się maksymalna reakcję, lecz przy stężeniu hormonu pięciokrotnie większym od pierwotnego stężenia skutecznego (efekt analogiczny do efektu Receptory są białkami Najwięcej informacji uzyskano na temat receptora acetylocholi nowego, który łatwo oczyścić i który występuje we względnie dużych ilościach w narządzie elektrycznym węgorza Torpedo całifomica. Receptor składa się z czterech podjednostek o konfiguracji a.%, p, y, 8. Dwie jednostki et wiążą acetylochohnę. Używając techniki mutagenezy określonych regionów receptora udało się wykazać, który obszar podjednostki a uczestniczy w formowaniu przezblonowego kanału jonowego, pełniącego główną czynność receptora acetylocholinowego. Inne receptory występują w bardzo małej liczbie, stąd też proces ich oczyszczania i charakteryzowania jest trudny. Jednak dzięki technice rekombinacji DNA, istnieje dzisiaj możliwość uzyskania ilości receptorów wystarczającej do badań. Ten fakt sprawił, że stały się one przedmiotem intensywnych studiów. I tak receptor insulinowy jest heterotetramerem (a2, p2), w którym podjednostki połączone są ze sobą licznymi wiązaniami dwusiarczkowymi. Podjednostka zewnątrz błon owa a łączy się z insuliną, podczas gdy pedjednostka p1, sprzęgająca zewnętrzną i wewnętrzną warstwę błony, przekazuje sygnał do komórki, najpewniej za pośrednictwem komponentu cytoplazmatycznego tego polipeptydu, będącego kinazą tyrozynową. Podobną strukturę wykazują receptory dla insulinopodobnego czynnika wzrostowego I (lgF-1), nabłonkowego czynnika wzrostowego (ECF) oraz lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) (p. ryc. 52-12). Receptory dla innych hormonów polipeptydowych zostały słabiej scharakteryzowane. Przyjmuje się jednak, że i one składają sie z podstawowego komponentu białkowego, wrażliwego na działanie różnych peptydaz i enzymów proteolitycznych. W wielu przypadkach proces wiązania hormonu przez receptor wymaga obecności wiązań dwusiarczkowych, fosfolipidu i komponentu węglowodanowego.

Receptory hormonów steroidowych są również białkami. W ostatnich latach poznano funkcję tych cząsteczek, zaś obecnie zaczynamy poznawać ich strukturę. Dobrym przykładem jest receptor glukokortykoidowy (ryc. 49-6). Ma on kilka domen funkcyjnych: 1) domenę wiążącą hormon, zlokalizowaną w C-koricowym odcinku, 2) przylegającą do niej domenę wiążącą DNA, 3) obszar rozpoznający, położony w N-końcowej części cząsteczki, niezbędny do wiązania odcinka łańcucha DNA i zawierającego większość domen antygenowych cząsteczki oraz 4) jedną lub więcej domen aktywujących lub hamujących transkrypcję genu. Istnienie wymienionych domen funkcyjnych potwierdzono w badaniach receptorów syntetyzowanych metodami inżynierii genetycznej za pomocą swoistego dla danego receptora cDNA. Wydaje się, że różne typy receptorów steroidowych mają taką samą ogólną strukturę (opisaną wyżej) i odznaczają się znaczną homologią w zakresie sekwencji aminokwasowej w wyżej opisanych domenach. Występuje również godna uwagi homologią między wymienioną klasą receptorów a onkogenem \-erb A. Nieprawidłowości w strukturze receptorów hormonalnych uczestniczą w patogenezie różnych chorób Wyjaśnienie roli receptorów w działaniu hormonów było punktem wyjścia do badań nad rolą nieprawidłowości w zakresie jego funkcji w patogenezie pewnych chorób. Tabela 44-2

przedstawia 3 ogóme grupy defektów receptorowych. W pierwszej przyczyną choroby są przeciwciała skierowane przeciwko swoistemu receptorowi hormonalnemu. Przeciwciała należące do klasy IgG mogą blokować wiązanie się hormonu ze swoim receptorem (taką sytuację spotyka się w acanthosis nigricans przebiegającej z insulin o opornością oraz w astmie oskrzelowej), mogą naśladować działanie właściwego hormonu (przykładem tego jest choroba Gravesa-Basedowa) lub przyspieszać obrót metaboliczny receptora (na przykład w myasthenia gravis).

W drugiej grupie nie stwierdza się wiązania hormonu z receptorem. Nie jest jasne, czy przyczyną tego zjawiska jest brak odpowiednich receptorów, lub też receptor jest obecny, lecz wykazuje określony defekt. Trudności w tym zakresie wynikają stąd, że wykrywanie większości receptorów oparte jest na określaniu ich powinowactwa do hormonów.

CHARAKTERYSTYKA UKŁADÓW HORMONALNYCH / 583 Tabela 44-2. Choroby receptorowe ' Choroba

Receptor

Przyczyna choroby

Choroba Gravesa-Basedowa (nadczynność tarczycy) Acanthosis nigricans z odpornością na insulinę

Dla TSH

Przeciwciało pobudza receptor TSH

Dla insuliny

Przeciwciało blokuje wiązanie insuliny do receptora

Myasthenia gravis

Dla acetytocholiny

Przeciwciało nasila obrót metaboliczny receptora acety I oc hol i nowego

Astma

Adrenergiczny

Przeciwciało blokuje wiązanie neurotransmitera do receptora

Moczówka prosta nerkowopoc ho dna, wrodzona

Dla ADH

Niedobór receptora

Zespół femtnizujących jąder

Dla androgenów

Rzekoma niedoczynność przytarczyc Krzywica typu II oporna na witaminę D

Dta PTH

Niedobór receptora Niedobór receptora i

Dla kalcytriolu (1,25/OH/2D3)

Niedobór receptora

Otyłość

Dla insuliny

Cukrzyca typu II (insulinoniezależna-NIDDM)

Dla insuliny

Obniżone wiązanie przez receptor Obniżone wiązanie przez receptor

Trzecia grupa obejmuje choroby spowodowano-nieprawidłową regulacją liczby i powinowactwa receptorów. Chorzy z otyłością lub chorzy na cukrzyce typu II i z otyłością często wykazują objawy nietolerancji glukozy i oporność na insulinę pomimo występowania podwyższonych stężeń tego hormonu w osoczu. Chorzy ci wykazują mniejszą liczbę receptorów insulinowych (indukowanych zjawiskiem down-regulation) w komórkach docelowych dla tego hormonu, tj. w adypocytach, hepatocytach i komórkach mięśni szkieletowych. W miarę zmniejszania masy ciała u chorych tych obserwuje się obniżanie się stężenia insuliny w osoczu krwi, wzrost liczby receptorów insulinowych w komórkach docelowych dla tego hormonu, poprawę wrażliwości na insulinę oraz zmniejszanie się nietolerancji węglowodanów. Nowsze badania w dziedzinie biologii molekularnej sugerują, że nieprawidłowości w zakresie sprzężenia zachodzącego między receptorem dla czynnika wzrostowego a reakcją komórki efektorowej mogą być przyczyną niekontrolowanego wzrostu komórek nowotworowych (złośliwych). Przykłady te są ilustracją wielu

>

hormonu hormonu

chorób indukowanych nieprawidłową funkcją receptora.

PIŚMIENNICTWO Ginsberg BH: Synthesis and regulation of receptors for polypeptide honnones, Pages 59—97 in: Biologicai Regulation and Dewlopment. Vol 3B, Yamamoto K (editor). Plenum Press, 1985. Granner DK, Lee F: The multiple endocrine neoplasia syndromes. Chapter 76 in: Comprekensive Textbook of'Oncology. Moosa AR, Robson MC, Schimpff SC (editors). Williams & Wilkins, 1984. Mishina M et al: Expression of functional acetylcholine receptor frotn cloned cDNAs. Naturę 1984;307:604. Roth J, Taylor Sl: Receptors for peptide hormones: Alterations in disease of humans. Annu Rev Physiol 1982;44:639. Roth i et al: The evolutionary origins of hormones, neurotransmitters, and othcr ejttracellular messengers. N Eng! J Med 1982;306:523. Sibley DR, Lefkowitz RJ: Motet ul ar mech ani sms of receptor desensitization using the p-adrenergic recepto r-coupled adenylate cyclase system as a model. Nautre 1985;317:124.

4 5

Działanie hormonów

Dsryl K. Granner, MD

WPROWADZENIE Działanie hormonu na poziomie komórkowym zaczyna się od połączenia go ze swoistym receptorem. Klasyfikacja hormonów może być oparta na lokalizacji receptorów dla tych hormonów lub też na tym, jaki rodzaj sygnału lub wtórnego przekaźnika pośredniczy w działaniu hormonu na poziomie komórki. Dotychczas poznano dokładnie liczne rodzaje wtórnego przekaźnika, lecz dla wielu hormonów nie zdefiniowano jeszcze środkom orkowego sygnału. Znaczne są postępy w zakresie wyjaśnienia mechanizmu działania hormonów w obrębie komórki, szczególnie w odniesieniu do wpływu tych substancji na ekspresję swoistych genów.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Racjonalna diagnostyka i terapia określonej choroby opierają się na znajomości jej patofizjologii oraz możliwości ilościowej analizy tej ostatniej. Choroby układu wewnątrzwydzielniczego, najczęściej spowodowane nadmiernym lub niedostatecznym wytwarzaniem określonego hormonu, są bardzo dobrymi przykładami zastosowania wyników badań nauk podstawowych w medycynie klinicznej. Znając ogólne mechanizmy działania hormonów oraz rozumiejąc fizjologiczne i biochemiczne skutki działania każdego z nich, można rozpoznać chorobę endokrynną, będącą następstwem zaburzonej równowagi hormonalnej oraz skutecznie ją leczyć.

KLASYFIKACJA HORMONÓW MOŻE BYĆ OPARTA NA RÓŻNYCH PODSTAWACH Hormony można sklasyfikować na podstawie ich struktury chemicznej lub rozpuszczalności w różnych środowiskach, lokalizacji receptora hormonalnego lub rodzaju sygnału pośredniczącego działanie hormonu w obrębie komórki. Tabela 45-1 przedstawia klasyfikację hormonów opartą na ostatnich dwóch cechach, zaś tab. 45-2 ogólne cechy każdej z dwóch grup wymienionych w pierwszej tabeli. Hormony grupy I mają właściwości lipofilne i są, z wyjątkiem Ty i T4, pochodnymi cholesterolu. Po wydzieleniu do krwi, zostają one związane przez białka nośnikowe (transportowe), przez co odpada problem ich rozpuszczalności i wydłuża się ich okres półtrwania w osoczu krwi. Cząsteczki tych hormonów, nie związanych z białkami nośnikowymi, łatwo przechodzą przez błony plazmatyczne wszystkich komórek, łącząc się po drodze z receptorami cytoplazmatycznymi lub jądrowymi w komórkach docelowych. Przyjmuje się, że kompleks z!ożony z hormonu i jego receptora spełnia rolę śródkomórkowego przekaźnika dla tej grupy hormonów. Druga duża grupa składa się z hormonów rozpuszczalnych w wodzie wiążących się z receptorami błony plazma tycz nej komórki docelowej. Hormony, wiążące się z błoną plazmatyczną komórek, komunikują się z śródkomórkowymi procesami metabolicznymi za pośrednictwem cząsteczek, określanych jako drogie przekaźniki (second messenger — sam hormon określany jest jako pierwszy przekaźnik). Te ostatnie powstają w wyniku interakcji hormonu z receptorem. Koncepcja drugiego przekaźnika

DZIAŁANIE HORMONÓW / 585 Tabela 45-1. Klasyfikacja hormonów oparta na mechanizmie ich działarjia Grupa I. Hormony wiążące się z receptorami śródfcomórkowymi Estrogeny Kaicytriol [1-25(OH),D3] Glukokortykoidy Androgeny Minera lokortykoidy Hormony tarczycy {Ta i Tt) Progestyny Grupa II. Hormony wiążące się z receptorami powierzchni komórkowej A. Drugim przekaźnikiem jest cAMP Hormon adrenokortykotropowy {ACTH) Parathormon Angiotensyna II Opioidy Hormon antydiuretyczny (ADH) Acetyl ochot i na Folitropina (FSH) Glukagon Gonadotropina kosmówkowa (hCG) Kortykoliberyna (CRH) Lipotropina (LPH) Kalcytonina Lutropina (LH) Katecholaminy a-adrenergiczne Melanotropina (MSH) Somatostatyna Tyreotropina (TSH) Katecholaminy p-adrenergiczne B. Drugim przekaźnikiem jest cGMP Przedsionkowy czynnik natriuretyczny (ANF) C. Drugim przekaźnikiem są jon wapniowy Acetylochoiina (receptor rnuskarynowy) lub (i) fosfatydyloinozytydy: Oksytocyna Katecholaminy c^-adrenergiczne Gonadoliberyna Cholecystokinina Angiotensyna II G astry na Substancja P Tyreoliberyna (TRH) Wazopresyna D. Przekaźnik śród komórko wy jest nieznany Nerwowy czynnik wzrostowy (NGP) Somatomammotropina kosmówkowa (CS) Naskórkowy czynnik wzrostowy (EGF) Hormon wzrostu (GH) Insulina Fibrobiastyczny czynnik wzrostowy (FGF) Czynniki wzrostowe insulinopodobne (IGF-I, IGF-II) Czynnik wzrostowy pochodzenia płytkowego Prolaktyna (PDGF)

pochodzi z obserwacji Sutherlanda, który wykazał, że epinefryna, wiążąc się z błoną plazmatyczną erytrocytów gołębia, zwiększa stężenie śródkomórkowcgo eAMP. W serii kolejnych doświadczeń wykazano, że cAMP bierze udział w działaniu biologicznym licznych hormonów. Hormony, dla których udowodniono w sposób jednoznaczny taki mechanizm działania, zestawione są w grupie HA tab. 45-1. Jak dotychczas tylko dla przedsionkowego hormonu natriuretycznego (ANF) drugim przekaźnikiem jest cGMP. Zapewne do tej grupy (grupa IIB tab. 45-1) dołączą i inne hormony. Okazało się, że dta wiehi hormonów, dla których za drugi przekaźnik uważano cAMP, w rzeczywistości są nimi jony wapniowe lub (i) metabolity złożonych fosfoinozytydów. Hormony te zestawiono w pkt. IIC tab. 45-1. Dotychczas nie zidentyfikowano drugiego przekaźnika dla grupy

IID, tj. dla bardzo ciekawej klasy hormonów. Nie będzie zaskoczeniem, jeśli się okaże, że działanie tej grupy hormonów zależy od wielu mediatorów lub różnych mechanizmów. Kilka hormonów można zaliczyć do więcej niż jednej grupy. Podana klasyfikacja hormonów zapewne ulegnie zmianie w miarę uzyskania nowych informacji. HORMONY GRUPY I MAJĄ RECEPTORY ZLOKALIZOWANE SRÓDKOMÓRKOWO ORAZ WPŁYWAJĄ NA EKSPRESJĘ GENÓW Ogólne zasady działania hormonów tej grupy przedstawia ryc. 45-1. Te lipofilne cząsteczki przenikają przez błony plazmatyczne wszystkich komórek, wiążą się natomiast tylko ze

586 / ROZDZIAŁ 45 8LONA KOMÓRKOWA

JĄDRO KOMÓRKOWE

A + Receptor U „Aktywacja'

Kompleks hormon —receptor Sekwencja odpowiedzi hormonalnej (HRE)

DNA (chromatyna)

mHNA Translacj a Swoiste białko t Odpowleći metaboliczna

Ryc. 45-1. Hormon steroidowy lub tarczycy wiąże się ze śródkomórkowym receptorem wywotując zmianę konformacyjną. Następnie kompleks ten wiąże się do swoistego fragmentu nici DNA, tj. do sekwencji odpowiedzi hormonalnej (hormone response element); w wyniku tej interakcji dochodzi do aktywacji lub supresji ograniczonej liczby genów.

swoistym receptorem wysokiego powinowactwa w komórkach docelowych. Kompleks złożony z hormonu i receptora ulega następnie „aktywacji" (zależnej od temperatury i siły jonowej środowiska), w wyniku której zmienia się jego wielkość, konformacja oraz ładunek powierzchniowy. W wyniku takich zmian kompleks staje się zdolny do wiązania się z chromatyną. Dla zrozumienia istoty sprawy nie ma większego znaczenia, czy proces wiązania hormonu z receptorem i aktywacja kompleksu zachodzą w cytoplazmie czy w jądrze komórkowym (problem ten jest przedmiotem dyskusji). Kompleks hormon-receptor wiąże się ze swoistym fragmentem DNA określanym jako ,,element (lub sekwencja) odpowiedzi hormonalnej" {„hormone response element"), aktywując lub inaktywując określone r geny. Wpływając w sposób selektywny na transkrypcję określonego genu i produkcje odpowiadającego mu

mRNA, zmienia stężenia swoistych białek oraz procesy metaboliczne. Skutek biologiczny każdego hormonu jest wysoce swoisty. Ogólnie biorąc hormony zmieniają mniej niż 1% białek i mRNA w komórce docelowej. Przedmiotem dalszej dyskusji będzie głównie działanie steroidów i hormonów tarczycy na poziomie jądra komórkowego, ponieważ zostało ono zupełnie dobrze poznane. Opisano również bezpośredni wpływ wymienionych hormonów na różne organella subkomórkowe i błony. Przeważają dowody, że hormony steroidowe wpływają głównie na transkrypcję genów, chociaż mogą one, podobnie jak liczne hormony innych grup (omawiane niżej), oddziaływać na „dowolny etap" szlaku informacyjnego przedstawionego na ryc. 45-2. Chociaż biochemia procesu transkrypcji genu w komórkach u ssaków nie została jeszcze dobrze poznana, można przyjąć ogólny model wymagań strukturalnych, niezbędnych

DZIAŁANIE HORMONÓW / 587 Tabela 45-2. Cechy ogólne poszczególnych kłas hormonów

Grupa 1

Grupa II

Rodzaj hormo- Hormony steroinu dowe, jodotyro-

Lipofiłne

TRANSKRYPT r JĄDRO KOMÓRKOWE

Degradacja

Procesy modyfikujące Degradacja mRNA

Nie

Tak

Transport

Długi (godziny do Krótki (minuty) dni) Śród kom orkowa

tor-hormon

■▲•O 1

aktywny z± nieaktywny

W błonie plazmatycznej cAMP, Ca!+, metabolity złożonych fosfoinozytydów i inne

Kompleks recep-

Sekwencja odpowiedz hormonalnej (HRE)

5'-----5 —1

Transkrypcja

Homnony polipeptydowe, białkowe lub glikoproteinowe, aminy katechdowe Hydrofilne

niny, kalcytriol

Rozpuszczalność Związanezbiaikami przenośnikowymi Osoczowy okres półtrwanta Lokalizacja receptora Charakter drugiego przekaźnika

GEN

Fragment pro motorowy (PE) ■

Translacja mRNA CYTO PLAZMA BIAŁKO

Ryc. 45-2. „Szlak informacyjny". Hormony mogą oddziaływać na każdy z wymienionych etapów szlaku informacyjnego.

Gen i

— \

------

f-----------------|

■ - . ''. . * " ■ ■

j

/ / / / / / /

Regulatorowy fragment nici DNA

1 Miejsce (erminacii Miejsce transkrypcji Inicjacji transkrypcji Strukturalny ___I L___i . nici DNA fragment

Ryc. 45-3. Wymagania strukturalne niezbędne dla procesu hormonalnej regulacji transkrypcji genu.

dia regulacji transkrypcji genu przez hormon steroidowy lub hormony tarczycy {ryc. 45-3). Geny te muszą się znajdować w obszarach „otwartej", trans kry pcyj nie aktywnej chromatyny oznaczonej na ryc. 45-1 jako wystająca bańka podatnej na trawiące działanie DNA-zy. Dotychczas przebadane geny wykazują przynajmniej dwa oddzielne odcinki regulatorowe („obszary kontrolujące"), zlokalizowane w sekwencji DNA przylegającej bezpośrednio do końca 5' regionu inicjacji transkrypcji (ryc. 45-3). Pierwszy z nich, tzw. element promotorowy (PE — promotor element) ma charakter nieswoisty (generyczny), gdyż występuje w ta-

kiej samej lub innej postaci we wszystkich genach. Ten element określa miejsce wiązania się poliraerazy RNA II do DNA i tym samym dokładność inicjacji transkrypcji (p. rozdz. 41). Drugim fragmentem, poznanym w wielu genach regulowanych przez hormony steroidowe jest tzw. sekwencja odpowiedzi hormonalnej

(HRE — hormone response element). Jest ona umiejscowiona nieco dalej od końca 5' niż odcinek promotorowy (PE) i może się składać z kilku oddzielnych fragmentów. HRE najpewniej moduluje częstość inicjacji transkrypcji i jest mniej zależny od położenia i orientacji przestrzennej. Pod tym względem jest podobny

588 / ROZDZIAŁ 45 do fragmentów wzmacniających transkrypcje

(enhancer elements) występujących w innych genach (p. rozdz. 41). Ogólnie mówiąc HRE zlokalizowany jest w paśmie DNA przed fragmentem inicjacji transkrypcji i oddzielony od tego ostatniego przez kilkaset nukleotydów. Dokładne położenie HRE jest różne dla poszczególnych genów. W niektórych przypadkach zlokalizowany jest w obrębie samego genu. Geny kontrolowane przez kilka hormonów mają odpowiadającą im liczbowo HRE. Również transkrypcja indukowana hormonami pepty do wy mi odbywa się poprzez odpowiedni HRE, chociaż początek inicjacji tego procesu różni sie od wyżej opisanego dla hormonów steroidowych, np. wiele hormonów, dla których drugim przekaźnikiem jest cAMP, oddziałuje na transkrypcję. W tych przypadkach czynnikiem przenoszącym sygnał (podobnym do kompleksu receptor—hormon steroidowy lub hormon tarczycy) jest specjalne białko, określane jako „białko wiążące sekwencję HRE powstałe pod wpływem cAMP" (cAMP response element binding protein) (CREB). W tabeli 45-3 podano sekwencje konsensus DNA dla kilku HRE. Fragment HRE odznacza się tym, że wiąże się lepiej z kompleksem hormon—receptor niż otaczające go fragmenty nici DNA lub DNA pochodzące z innego źródła. W wyżej opisanych przypadkach potwierdzono występowanie tego rodzaju swoistego wiązania. HRE musi również inicjować odpowiedź na działanie hormonu. Domniemana sekwencja regulatorowego DNA może być sprzężona z genami reporterowymi dla realizacji takiego działania. Normalnie te geny fuzyjne (fusion genes) zawierają geny reporterowe, na które hormony zwykle nie mają wpływu. Często geny te nie ulegają normalnej ekspresji w badanych tkankach. Wśród powszechnie stosowanych genów reporterowych należy wymienić geny dla: globiny, kinazy tymidynowej, bakteryjnej acetylotransferazy chloramfenikolowej i lucyferazy. Jeżeli po transfekcji genu fuzyjnego do komórki docelowej hormon wykazuje działanie regulujące transkrypcję genu reporterowego, wówczas można twierdzić, że HRE został zdefiniowany. Posługując się taką techniką można określić wpływ zmian położenia, orientacji i podstawienia zasad w łańcuchu DNA na działanie HRE. Przedmiotem intensywnych badań jest mechanizm wpływu interakcji kompleksu hormon-receptor z HRE na proces transkrypcji. Inicjacja transkryptu jest prawdopodobnym mechanizmem kontroli

Tabela 45-3. Sekwencje DNA dla kilku HRE

Hormon/ Elektor

HRE

Sekwencja DNA*

Glukokortykoidy

GRE

GGTACAnnnTGTTCf

Progestyny

PRE

_ " _

M i nerałokorty ko - MRE

— " .___

idy

Androgeny

ARE

— " —

Estrogeny

ERE

AGGTCAnnnTGTCCT

Hormony tarczy-

TRE

GATCAnnnnnTGACC'

cy

Kwas retinolowy RRE cAMP

CRE TGAC GTCA1

* Litery oznaczają trifosłorany nukleotydów, „n" oznacza, że w tym położeniu może być użyty którykolwiek z czterech nukteotydów. Strzałki skierowane w przeciwnych kierunkach wskazują na występowanie nieco niedoskonałej, odwróconej sekwencji palindromowej w wielu HRE; w niektórych przypadkach te ostatnie określa sie jako „sekwencję połowicznie wiążącą" (haIf-binding sites"), ponieważ każdy z nich wiąże jeden monomer receptora. HRE oznaczone jako GRE, PRE, MRE i ARE wykazują taką samą sekwencję zasad w nici DNA, Swoistość może być uwarunkowana Śród kom orkowym stężeniem receptora hormonalnego lub sekwencją DNA flankującą nie występującą w sekwencji konsensus. Druga grupa HRE dotyczy hormonów tarczycy, estrogenów i kwasu retinotowego. Te HRE są bardzo do siebie podobne różniąc się fragmentem dzielącym połówki palindromowe. Wszystkie te H R t mają sekwencję konsensus, z wyjątkiem HRE dla hormonów tarczycy. Jego sekwencja odpowiada TRE dla genu hormonu wzrostu. Receptor kwasu retinolowego może wiązać się z taką samą sekwencją jak receptor hormonów tarczycy. Hormony peptydowe, działające 2a pośrednictwem zmiany stężenia śródkomórkowegocAMP, oddziaływują na proces transkrypcji za pośrednictwem CRE.

tego procesu, chociaż możliwy jest również jego wpływ na proces elongacji i terminacji. Przypuszcza sie, że istnieją sekwencje DNA kontrolujące proces transkrypcji, położone w pewnym oddaleniu od końca 5* sekwencji sygnałowej lub w dół za końcem 3*, albo w obrębie genu, albo też poza nim. Mogą również występować mechanizmy regulacji typu trans (tj. przez inne chromosomy).

DZIAŁANIE HORMONÓW / 589

HORMONY GRUPY (I (HORMONY PEPTYDOWE) MAJĄ RECEPTORY UMIEJSCOWIONE W BŁONIE PLAZMATYCZNEJ I DZIAŁAJĄ ZA POŚREDNICTWEM PRZEKAŹNIKÓW ŚRÓDKOMÓRKOWYCH Największa liczba hormonów: a) jest rozpuszczalna w wodzie, b) nie wiąże się z białkami nośnikowymi (przez co wykazują krótki półokres trwania w osoczu) oraz c) zapoczątkowuje odpowiedź hormonalną wiążąc się z receptorem zlokalizowanym w błonie plazmatycznej (tab. 45-1 i 45-2). W mechanizmie działania tych hormonów biorą udział śródkomórkowe przekaźniki. Wiełe hormonów działa za pośrednictwem cAMP jako drugiego przekaźnika cAMP (cykliczny AMP, kwas 3', 5'-adenylowy — p. str. 215) jest wszędobylskim nukleotydem powstałym z ATP pod wpływem działania cyklazy adenylanowej. Odgrywa on decydującą rolę w działaniu licznych hormonów. Pod wpływem tych ostatnich (tab. 45-4) śródkomórkowe stężenie cAMP zwiększa się tub zmniejsza, przy czym efekt ten może być różny w różnych tkankach. I tak epinefryna powoduje duży wzrost stężenia cAMP w mięśniach szkieletowych, natomiast względnie małe zmiany stężenia tego nukleotydu w wątrobie. Tabela 45-4. Subklasyfikacja hormonów grupy 1I.A (p. tab. 45-1) Hormony pobudzające oykiazę adenylanową (Hs)

Hormony hamujące cyklazę adenylanową (Hj)

ACTH

Acetylochoiina Substancje ctj-adrenergiczne Angiotensyna II Opioidy Somatostatyna

ADH

Substancje j3-adrenergiczne Kalcytonina CRH (kortykoliberyna) FSH (folitropina) Gtukagon bCG (gonadorropina kos mówko wa, ludzka) LH (lutropina) LPH (lipotropirta) MSH (melanotropina) PTH (parathormon) TSH (tyreotropina)

Odwrotny wpływ na stężenie cAMP wykazuje glukagon (wywołując znaczny wzrost jego stężenia w wątrobie zaś mały wzrost w mięśniach szkieletowych). Tkanki reagujące na kilka hormonów tej samej grupy posiadają niepowtarzalne receptory sprzężone zjedna i tą samą cząsteczką cyklazy adenylanowej. Najlepszym tego przykładem jest adypocyt, w którym dochodzi do aktywacji cyklazy adenylanowej i wzrostu stężenia cAMP pod wpływem takich hormonów jak epinefryna. ACTH, TSH, glukagon, MSH iwazopresyna (ADH). Maksymalne efekty działania kilku hormonów działających równocześnie na komórkę docelową nie mają charakteru addycyjnego. Ponadto działania niszczące jeden rodzaj receptora nie mają wpływu na odpowiedź komórki indukowaną innymi hormonami.

Układ cyklazy adenylanowej. Składowe

tego układu, występującego w komórkach ssaków, przedstawia ryc. 45-4. Interakcja hormonu ze swoim receptorem jest przyczyną aktywacji lub inaktywacji cyklazy adenylanowej. W procesie tym pośredniczą przynajmniej dwa białka regulatorowe GTP-zależne oznaczone jako Gs (białko pobudzające) i Gi (białko hamujące). Każde z tych białek składa się z trzech podjednostek a, p i y. Cyklaza adenylanowa, umiejscowiona na wewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej, katalizuje powstawanie cAMP z ATP w obecności jonów magnezowych (p. ryc. 34-14). To co pierwotnie uważano za jedno białko z dwiema domenami funkcyjnymi w rzeczywistości jest nadzwyczaj złożonym układem. W ciągu ostatnich 15 lat dzięki licznym badaniom ustalono biochemiczną niepowtarzalność receptora hormonalnego oraz GTP-zaJeżne domeny regulatorowe i katalityczne kompleksu cyklazy adenylanowej przedstawionej na ryc. 45-4. Przedstawiony na rycinie model wyjaśnia, w jaki sposób różne hormony peptydowe mogą pobudzać (s) lub hamować (i) wytwarzanie cAMP (tab. 45-4). Dwa równoległe układy, jeden pobudzający (s) i jeden hamujący (i) umiejscowione są na pojedynczej cząsteczce katalitycznej (c). Każdy z nich składa się z receptora R s lub Rj oraz z kompleksu regulatorowego Gs i Gi. Białka regulatorowe Gs i Gj są trimerami z podjednostek a, p i y. Podjednostki p i y białka Gs wydają się być identyczne z występującymi w białku G;. Podjednostka a białka Gs (określana jako as) wykazuje masę cząsteczkową równą 45 000 i ró-

590 / ROZDZIAŁ 45 cAMP

CYTOPU\ZMA ATP

Ryc. 45-4. Sygnał indukowany przez kompleks hormon-receptor przekazywany jest za pośrednictwem kompleksu białka regulatorowego Gs (pobudzającego) lub Gj (hamującego) na układ cyklazy adenylanowej (C), przez co dochodzi do stymulacji (s) lub hamowania (i) produkcji cAMPzATP. (Według: Gilman A, G.-. G proteins aoddual control of adenylatecyclase. Celi 1984r36,577. Copyright © the Massachusetts Institute of Technology, za zezwoleniem).

żni się od podjednostki a białka G, (określanego jako oij) o masie cząsteczkowej 41 000. Połączenie się hormonu z Rs lub Ri indukuje aktywację białka G, wyrażającą się wiązaniem GTP do podjednostki x(proceg Jen jest zależny od jonów Mg 2+ ) oraz od szczepieniem podjednostek P i y od podjednostki a zgodnie z równaniem GTP «PY H a-GTP + Py GTP-aza

Podjednostka Og posiada wewnętrzną aktywność GTP-azową, zaś jej aktywna postać cts-GTP ulega inaktywacji przez hydrolizę GTP do GDP. Z kolei odnowieniu ulega trimeryczna postać kompleksu Gs. Toksyna cholery, znana jako nieodwracalny aktywator cyklazy, powoduje ADP rybozylacje podjednostki os przez co inaktywacji ulega CTP-aza, zaś podjednostka ots zachowuje swoją postać aktywną. Podjednostka

ott także wykazuje aktywność GTP-azową, jednakże GDP nie odszczepia się swobodnie od

kompleksu Oj-GDP. Reaktywacja podjednostki Oj odbywa się na drodze wymiany GDP na GTP. Toksyna krztuśca aktywuje cyklazę adenylanową w sposób nieodwracalny poprzez ADP rybozyiację podjednostki aif przez co uniemożliwia aktywacje tej ostatniej. Fluorek sodu,

będący innym nieodwracalnym aktywatorem cyklazy, przypuszczalnie działa na podjednostkę ots lub a*, ponieważ wpływa w sposób podobny na kompleksy regulatorowe Gs i Q. Nie określono dotychczas właściwej roli wymienionych podjednostek ot, p1 i y. Zbadano dwie możliwości. Podjednostki as i a-, w sposób niekompetycyjny reagują z cyklazą adenylanową (C), wywołując przeciwne efekty. Skutek netto byłby zależny od stosunku aktywnej postaci as do aktywnej postaci OL,. Niestety aktywna postać a, wykazuje słabe działanie hamujące na C w układach izolowanych. Stąd bardziej prawdopodobne wydaje się, że podjednostka P kompleksu Gj hamuje podjednostkę a s . W tym modelu podjednostka <*„ wiążąc podjednostkę (J, spełniłaby rolę antyinhibitora cyklazy

DZIAŁANIE HORMONÓW / 591

adenylanowej t jako taka nie wykazałaby żadnego bezpośredniego działania. Wiele składowych układu cyklazy zostało już oczyszczonych, w tym również jej podjednostka katalityczna. Obecnie nie ulega już wątpliwości, że istnieje cala rodzina białek G. Transducyna, będąca białkiem sprzęgającym impuls świetlny z fotoaktywacją w obrębie siatkówki, jest podobna do białka G cyklazy adenylanowej. Takie samo podobieństwo wykazują produkty onkogenów ras. Niepowtarzalne białko, określane jako Go, wyizolowane zostało z tkanki mózgowej. Inne, słabiej scharakteryzowane białka tej rodziny, wydają się odgrywać rolę w przezbłonowym transporcie wapnia i potasu oraz w przemianie fosfoinozytydów. Znaczenie tych składników podkreśla niżej opisane „doświadczenie przyrody". Rzekoma iiiedoczynność przytarczyc jest zespołem chorobowym charakteryzującym się hipokalcemią i hiperfosfatemią, tj. głównymi objawami niedoczynności przytarczyc oraz innymi wrodzonymi defektami. Osoby dotknięte tym zespołem nie wykazują jednak upośledzonej czynności przytarczyc. Wydzielają one duże ilości biologicznie aktywnego PTH. Niektórzy z tych chorych wykazują jednak oporność narządu docelowego na PTH o charakterze defektu poreceptorowego. Chorzy ci wykazują częściowy niedobór białka G (prawdopodobnie tylko niedobór podjednostki as), przez co dochodzi do niewystępowania sprzężenia pomiędzy wiązaniem PTH z receptorem a pobudzeniem cyklazy adenylanowej. U innych chorych PTH indukuje powstawanie cAMP, natomiast brak jest odpowiedzi na ten drugi sygnał w obrębie komórki. Stąd nie jest zaskoczeniem, że chorzy z rzekomą niedoczynnością przytarczyc często wykazują również upośledzoną reakcję na inne hormony, takie jak TSH, glukagon i związki padrenergiczne (dla których cAMP jest drugim przekaźnikiem). Kinaza białek. W komórkach prokariotyc2nych cAMP wiąże się ze swoistym białkiem określanym jako kata bo liczne białko regulatorowe (catabolite regulatory protein — CRP). Białko to wiąże się bezpośrednio z DNA i wpływa na ekspresję genów. Analogia z opisanym wyżej mechanizmem działania steroidów jest oczywista. W komórkach eukariotycznych cAMP wiąże się z kinazą białek, będącą cząsteczką heterotetrameryczną, złożoną z dwóch podjednostek regulatorowych (R) i dwóch podjednostek katalitycznych (C).

Reakcję wiązania cAMP przedstawia następujące równanie: 4cAMP+ R 2C a i± R2 - (4cAMP) + 2C

Kompleks R2C2 nie wykazuje aktywności enzymatycznej, lecz po związaniu się R z cAMP dochodzi do odłączenia się R od C, przez co aktywacji ulega C (ryc. 45-5). Aktywna podjednostka C katalizuje przenoszenie reszty fosforanowej z ATP{Mg2+) na serynę lub treoninę całego szeregu białek. Miejscem fosforylacji jest zwykle sekwencja -Arg-Arg-X-Ser- i -LysArg--S-S-Ser- gdzie w miejscu X może występować dowolny aminokwas. Pierwotnie wyróżniano kinazy białek cAMP--załeżne i cAMP-niezależne. Jak widać w tab. 45-5, problem ten star^się znacznie bardziej złożony po wykazaniu, że fosforylacja białek stanowi ważny mechanizm regulatorowy. Wymienione w tabeli kinazy są niepowtarzalnymi cząsteczkami różniącymi się liczbą podjednostek wchodzących w ich skład, masą cząsteczkową, autofosforylacją, wartością Km dla ATP i swoistością substratową. W największych szczegółach przebadano cAMP-zależną kinazę białek I i II. Kinazy te wykazują taką samą podjednostkę C, lecz skłaTabela 45-5. Oczyszczone kinazy białek Reagujące (wrażliwe) na hormony Kinaza zależna od Ca/kalmoduliny Kinaza zależna od Ca/fosfolipidu Kinaza II kazeiny Kinaza typu I i II zależna od cAMP Kinaza zależna od cGMP Kinaza tyrozynowa zależna od naskórkowego czynnika wzrostowego Kinaza zależna od cyklicznego nukleotydu owadów Kinaza tyrozynowa zależna od insuliny Kinaza lekkich łańcuchów miozyny Kinaza fosforylazy Kinaza dehydrogenazy pirogronianowej Nie wiadomo, czy reagują na hormony elF-2-a-kinaza zależna od dsRNA e)F-2-akinaza zależna od hemtny Kinaza I aktywowana przez proteazę Kinaza rod o psy ny Wirusowa kinaza tyrozynowa typu I, l( i 1(1 Kinazy mogące reagować na hormony Kinaza I kazeiny Kinaza II aktywowana przez proteazę

592 / ROZDZIAŁ 45 Nieaktywna kinaza białek

Hormon ■

Białko Hecepior regulatorowe

ATP

Cyklaza

adenylanowa

GTP-za lezne

(•) | FOSFODIESTERAZA

BŁONA KOMÓRKOWA Aktywna kinaza

b U to fc ' Mg1+-ATPN Blarko

Fosfoprotalna

Fosfataza

" Elekty flzjoloBlczne

Ryc. 45-5. Hormonalna regulacja procesów komórkowych pośredniczonych kinazami biafek zależnymi od cAMP. cAMP (•) powstały w wyniku działania cyklazy adenylanowej wiąże się z podjednostką regulatorową (R) cAMP-zależnej kinazy białek. Wynikiem tej reakcji jest uwalnianie i aktywacja podjednostki katalitycznej (C). (Za pozwoleniem J. Corbin).

dają się z różnych podjednostek R. Pierwotnie odróżniano je na podstawie odmiennego ładunku powierzchniowego i wynikających stąd szybkości elucji z kolumny używając chromatografii jonowymiennej (typ I jest bardziej kwaśny i ulega elucji przy niższych stężeniach soli niż typ II). Większość tkanek wykazuje obecność obu postaci kinaz, natomiast istnieją znaczne różnice międzygatunkowe i między narządowe w odniesieniu do rozmieszczenia tych izozymów. Ostatnie badania sugerują, że typ I różni się od typu II reakcją na różne kombinacje analogów cAMP. Takie badania mogą być pożyteczne przy określaniu izozymu pośredniczącego w swoistej reakcji biologicznej. Istnieją również fakty, dowodzące, że stymulacja hormonalna swoiście podwyższa aktywność albo kinazy typu I albo typu II. Wiele innych kinaz białek uczestniczy w mechanizmie działania hormonów. Rolę tych kinaz przedstawiono na ryc. 45-6 i w dalszych częściach niniejszego rozdziału, (śinazy zależne od naskórkowego hormonu wzrostowego lub in-

suliny są niepowtarzalne dlatego, że aktywność enzymatyczna zlokalizowana jest w obrębie receptora i że aktywacja kinazy zależna jest od połączenia się hormonu z receptorem (p. rozdz. 52). Inną wyróżniającą cechą jest to, że kinazy te preferencyjnie katalizują fosibrylację reszt tyrozynowych, podczas gdy fosforylacja tyrozyny nie jest często spotykana w komórkach ssaków. Rola jaką odgrywają te kinazy białek, fosforylujące tyrozynę, a występujące w obrębie receptora, w mechanizmie działania hormonów nie jest jasna. Możliwe, że hormon zapoczątkowuje kaskadę fosforylacji oraz że jeden lub więcej produktów tej kaskady są środkomórkowymi przekaźnikami. Fosfoproteiny. Zakłada się, że działanie cAMP w komórkach eukariotycznych odbywa się za pośrednictwem fosforylacji lub defosforylacji białek. Kontrola efektów działania cAMP, obejmujących tak różnorodne procesy, jak steroidogeneza, wydzielanie, transport jonów, przemiana węglowodanów i tłuszczów, indukcja enzymatyczna, regulacja genów,

DZIAŁANIE HORMONÓW / 593

Wieloczynnościowa Kinaza kalmoduliny

Ryc. 45-6. Interakcja pewnych hormonów z receptorem powoduje aktywację fosfolipazy C. W procesie tym uczestniczy swoiste białko G, które również może aktywować kanał wapniowy. W wyniku działania fosfolipazy C powstaje IP=, który uwalnia jony Ca1'1" ze środkom orkowych magazynów oraz diacyloglrcerol (DAG), aktywujący kinazę białek C. W tym schemacie aktywowana kinaza białek C katalizuje fosforylację swoistych substratów, które z kolei zmieniają procesy fizjologiczne. Podobnie, również kompleks Ca 2+ -kalmodulina (Cam) może aktywować swoiste kinazy. W wyniku tych działań substraty ulegają modyfikacjom, co z kolei zmienia reakcje fizjologiczne.

wzrost komórek i ich replikacja, mogłaby być zależna od swoistej kinazy białek, swoistej fosfatazy lub od swoistych substratów fosforylacji. W niektórych przypadkach zidentyfikowano fosfoproteinę, uczestniczącą w określonym szlaku metabolicznym. Fosfoproteiny uczestniczące w większości procesów wymienionych wyżej niestety nie są dotychczas znane. Wymienione substraty mogą być pomocne w określaniu tkanki docelowej i zapewne determinują nasilenia reakcji w obrębie określonej komórki. Wiele białek może ulec fosforylacji, w tym kazeina, histony i protamina. Takie fosforylacje mogą jednak być tylko zjawiskiem wtórnym, chociaż mogą być użyteczne przy oznaczaniu aktywno— Biochemia

ści kinazy białek. Do niedawna, jedynymi działaniami cAMP, które bliżej zdefiniowano, były jego działania poza jądrem komórkowym. Opisany zostai wpływ cAMP na transkrypcję kilku genów. Wydaje się, że w tych przypadkach cAMP działa za pośrednictwem białka CREB opisanego wyżej. Fosfodiesterazy. Działanie hormonów wywołujące podwyższenie środkomórkowego stężenia cAMP może zostać zakończone kilkoma sposobami, w tym poprzez hydrolizę cAMP katalizowaną przez fosfodiesterazy. Obecność tych enzymów hydrolitycznych zapewnia szybki obrót sygnału (tj. cAMP) i tym samym szybkie zakończenie procesu biologicznego in-

594 / ROZDZIAŁ 45

dukowanego bodźcem hormonalnym, skoro tylko ten ostatni przestaje działać. Fosfodiesterazy cAMP występują w postaciach, charakteryzujących się niską lub wysoką wartością Km i podlegają zarówno regulacjom hormonalnym, jak i przez takie śródkomórkowe przekaźniki jak jony wapnia (prawdopodobnie działające poprzez kalmodulinę). Inhibitory fosfodiesterazy, w tym szczególnie metylowane pochodne ksantyny (takie jak kofeina), podwyższają śródkomórkowe stężenie cAMP i wywołują efekty podobne do hormonów lub wydłużają działanie tych ostatnich.

Fosfatazy fosfoprotein. Inny sposób ko-

ntroli działania hormonu polega na regulacji reakcji defosforylacji białka. Same fosfatazy fosfoprotein podlegają regulacji przez procesy fosforylacji i defosforylacji oraz przez inne różnorodne czynniki. Najwięcej wiadomo o roli fosfatazy w regulacji przemiany glikogenu mięśni szkieletowych. W tkance tej opisane zostały dwa rodzaje fosfataz fosfoprotein owych. Typ I preferencyjnie defosforyluje podjednostkę P kinazy fosforylazowej, zaś typ II — defosforyluje podjednostkę a. Aktywność fosfatazy typu I regulują dwa ciepłooporne inhibitory białkowe. Inhibitor-1 jest fosforylowany i aktywowany przez kinazę białek cAMP-zależną, podczas gdy inhibitor-2 (który wydaje się być podjednostką inaktywowanej fosfatazy) ulega także fosforylacji być może przez kinazę-3 syntazy glikogenowej. W wyniku fosforylacji inhibitora-2 dochodzi też do aktywacji fosfatazy. Pewne fosfatazy mogą atakować swoiste ugrupowania chemiczne, np. mogą występować fosfatazy odszczepiajacc^grupę fosforanową od reszty tyrozynowej.

Pozakomdrkowy cAMP. Pewne ilości

cAMP opuszczają komórki i mogą być łatwo wykrywane w płynach pozakomórkowych. Tak np. w wyniku działania glukagonu na wątrobę lub wazopresyny i PTH na nerki można stwierdzić podwyższone stężenia cAMP w osoczu krwi lub w moczu. Fakt ten leży u podstawy testów diagnostycznych mających na celu określenie reaktywności narządów docelowych na ww. hormony. U ssaków pozakomórkowy cAMP ma znikomą aktywność, lub też nie ma żadnej aktywności biologicznej. Jest on natomiast nadzwyczaj ważnym przekaźnikiem śródkomórkowym u niższych eukariontów i prokariontów.

Jeden hormon używa cGMP jako drugiego pośrednika Cykliczny GMP powstaje z GTP pod wpływem cyklazy guanyianowej występującej w postaci rozpuszczalnej i związanej z błoną komórkową. Każdy z tych izozymów wykazuje niepowtarzalne właściwości kinetyczne, fizykochemiczne i antygenowe. Przez pewien czas cGMP uważano za czynnościowego antagonistę cAMP. Obecnie wydaje się, że cGMP zajmuje wyjątkową pozycję w mechanizmie działania hormonów. Atriopeptyny, rodzina peptydów wytwarzanych przez kardiomiocyty przedsionków, wywołują natriurezę, diureze i rozszerzenie naczyń oraz hamują sekrecje aldosteronu. Te peptydy (np. przedsionkowy czynnik na- * triuretyczny) wiążą się i aktywują cyidazę gnanylanową, związaną z błoną plazma tyczną.. W wyniku tej reakcji wzrasta stężenie cGMP, w niektórych przypadkach aż 50-krotnie. Przypuszcza się, że wyżej wymienione efekty atriopeptyn są spowodowane wzrostem generacji cGMP. Inne fakty wskazują na udział cGMP w procesie wazodylatacji. Wiele związków, wśród których znajdują się nitroprusydek, nitrogliceryna, azotyn sodu i azydek sodu, powodują rozkurcz miocytów naczyniowych i są bardzo silnymi lekami rozszerzającymi naczynia krwionośne. Związki te zwiększają stężenie cGMP aktywując rozpuszczalną postać cyklazy guanyianowej. Efekt ten nasilają i wydłużają w czasie inhibitory fosfodiesterazy cGMP. Uwalniające się zwiększone ilości cGMP aktywują cGMP-zależną kinazę białek, która z kolei katalizuje fosforykcję szeregu białek miocytów naczyniowych, w tym również łańcuchów lekkich miozyny. Przypuszczalnie proces ten uczestniczy w relaksacji miocytów i wazodylataWiele hormonów działa za pośrednictwem jonów wapnia lub fosfoinozytydów Jon wapniowy jest ważnym regulatorem: a) różnych procesów komórkowych w tym procesu skurczu mięśnia, b) sprzężenia zachodzącego między bodźcem sekrecyjnym a sekrecją, c) układu krzepnięcia krwi, d) aktywności enzymów i pobudliwości komórkowej. Jest on również śródkomórkowym przekaźnikiem w mechanizmie działania hormonów. Przemiana wapnia. Stężenie wapnia ogólnego w płynie pozakomórk owym wynosi ok, 2,5 mmol/1. Podlega on bardzo ścisłej kontroli

DZIAŁANIE HORMONÓW / 595


teczkowej 17000, iiomologiczne w swej strukturze i czynności do tropiny C będącej białkiem mięśni. Kalmodulina wykazuje 4 miejsca wiążące CaJ+, po wysyceniu których dochodzi do znaczącej zmiany konformacyjnej, tak że większość cząsteczki przybiera strukturę a-heliksu. Ta zmiana konformacyjna związana jest przypuszczalnie ze zdolnością kalmoduliny do aktywowania lub inaktywowania enzymów. Interakcja jonów wapnia z kalmodulina (w wyniku czego dochodzi do zmiany aktywności tej ostatniej) jest koncepcyjnie podobna do wiązania cAMP z kinazą białek, przez co ulega ona aktywacji. Kalmodulina jest często tylko jedną z licznych podjednostek wielu kompleksów białkowych. Uczestniczy ona szczególnie w regulacji aktywności różnych kinaz i enzymów syntezy i rozkładu cyklicznych nukleotydów. Częściową listę enzymów regulowanych bezpośrednio lub pośrednio zmianami stężenia Ca2+ (najpewniej za pośrednictwem kalmoduliny) przedstawia tab. 45-6. Tabela 45-6. Enzymy regulowane przez Ca' ; /kalmodulinę Cyklaza adenyianowa Cai+za!eżna kinaza białek Kinaza białek. Ca2+/fosfotipidowo-zależna Fosfodiesteraza cyklicznego nukfeotydu Dehydrogenaza gliceroto-3-fosf ora nowa Syntaza glikogenowa Cyklaza guanylanowa Kinaza miozyny NAD-kinaza Fosfoiipaza A2 Kinaza fosforytazy Fosfataza 2B fosfoproteinowa Karboksylaza pirogronianowa Dehydrogenaza pirogronianowa Kinaza pirogronianowa

Oprócz działania na enzymy i transport jonów Ca2+ kalmodulina reguluje aktywność licznych elementów strukturalnych komórki. Wśród nich należy wymienić kompleks aktyna-miozyna mięśni gładkich (znajdujący się pod kontrolą P-adrenergiczną) oraz różne procesy, w których biorą udział mikrofilamenty w nie kurczących się komórkach (ruchliwość komórek, zmiany konformacyjne, mitozę, uwalnianie ziarnistości i endocytozę).

596 / ROZDZiAŁ 45

Jony wapnia są mediatorami działania hormonów Za udziałem jonów wapnia w mechanizmie działania hormonów przemawiają następujące obserwacje: 1) działanie wielu hormonów ulega osłabieniu w środowisku pozbawionym Ca2 + lub w stanach zubożenia komórek w wapń, 2) działanie hormonów można naśladować używając substancji zwiększających stężenie wapnia śródkomórkowego np. jonoforu wapnia A 23187 oraz 3) działanie hormonów ma wpływ na napływ wapnia do komórki lub przemieszczenie Ca2+ w obrębie komórki. Procesy te badano w pewnych szczegółach w przysadce mózgowej, mięśniówce gładkiej, płytkach i śliniankach. Najwięcej jednak wiadomo o udziale Ca2+ w mechanizmie działania wazopresyny i katecholamin a-adrenergicznych dotyczącego regulacji przemiany glikogenu w wątrobie. Pokazano to na ryc, 19-5 i 19-7. Dodanie do izolowanych hepatocytów agonistów at-adrenergkznych lub wazopresyny wywołuje 3-krotny wzrost stężenia CaJ+ w cytoplazmie (od 0,2 do 0,6 umol/J w ciągu kitka sekund). Zmiana ta wyprzedza i jest równa wzrostowi aktywności fosforylazy a, zaś stężenia hormonów potrzebnych do wywołania wymienionych efektów są porównywalne. Efekt działania Ca2+ ulega zahamowaniu przez ctt-antagonistów, zaś usunięciu hormonu ze środowiska towarzyszy szybki spadek stężenia Ca2 + w cytoplazmie i aktywności fosforylazy a. Źródłem jonów Ca2 + są depozyty tego jonu w organellach śród komórkowych. Są one wystarczające do wywołania pierwszych efektów działania hormonów.^Przy dłuższym działaniu hormonów potrzebny jest zwiększony napływ Ca2 + do komórki lub hamowanie wypływu tego jonu z komórki za pośrednictwem pompy wapniowej. Aktywność tej ostatniej może zależeć od wzrostów cAMP towarzyszących ww. zmianom stężenia Ca2+. Aktywacja fosforylazy jest wynikiem konwersji fosforylazy b do fosforylazy a przez enzym — kinazę fosforylazy b. Enzym ten zawiera kalmodulinę w swej podjednostce 8, zaś jego aktywność wzrasta przy wzroście stężenia Ca2 + z 0,1—1 (imol/1, tj. w zakresie stężeń, przy których hormony zwiększają stężenia Ca ł+ w wątrobie. Sprzężenie występujące między śródkomórkowym stężeniem Ca2 + i aktywacją fosforylazy nie podlega już wątpliwości. Aktywność wielu enzymów o znaczeniu krytycznym dla pewnych szlaków metabolicznych

regulowana jest przez zmiany stężenia Ca3 + lub (i) fosforylację tych enzymów. Wśród takich enzymów wymienić należy m.in. syntazę glikogenową, kinazę piróg ronią nową, karboksylazę pirogronianową, dehydrogenazę glicerolo-6-fosforanową oraz dehydrogenazę pirogronianową. Nie jest pewne, czy kalmodulina bezpośrednio uczestniczy w regulacji wymienionych enzymów, czy tez uczestniczą w niej niedawno odkryte kinazy białek, zależne od Ca3+/kalmoduliny lub Ca^/fosfolipidu. Przemiana fosfotnozytydu odgrywa rolę w działaniu hormonów zależnych od Caa+ Musi istnieć sygnał zapewniający komunikację między receptorem hormonalnym błony komórkowej a śródkomórkowymi rezerwuarami wapnia. Najlepszymi kandydatami na taki sygnał wydają się być produkty przemiany fosfoinozytydu. Receptory dla acety locho liny, hormonu antydiuretycznego i katecholamin oc,-adrenergtcznych, występujące na powierzchni błony plazmatycznej, po połączeniu się ze swoimi swoistymi ligandami, są potężnymi aktywatorami fosfolipazy. Proces wiązania się hormonu z receptorem oraz aktywacja fosfolipazy C są ze sobą sprzężone przez unikatowe białko G (ryc. 45-6). Fosfolipaza C katalizuje hydrolizę fosfatydyloinozytoio-4,5-bisfosforanu do trifosforanu inozytolu i 1,2-diacyloglicerolu (ryc. 45-7). Choć sam diacyloglicerol może aktywować kinazę białek C, aktywność tego enzymu zależy jednak również od obecności wolnych jonów wapnia. Trifosforan inozytoiu jest efektywnym uwalniaczem wapnia ze śródkomórkowych magazynów, takich jak siateczka sarkoplazmatyczna i mitochondria. Tak więc hydroliza fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanu jest przyczyną aktywacji kinazy białek C i wzrostu stężenia Ca2 + w cytoplazmie. W obecności ACTH i cAMP w korze nadnerczy, angiotensyny, jonów K"1", serotoniny, ACTH i dibutyrylo-cAMP w warstwie kłębkowatej nadnerczy, LH w jajnikach oraz LH i cAMP w komórkach Leydiga gonady męskiej, w wymienionych tkankach stwierdza się zwiększone ilości kwasu fosfatydowego, fosfoinozytolu i polifosfoinozytydów. Można by przytoczyć kilka innych przykładów. Na ryc. 45-6 przedstawiono rolę jaką odgrywają jony Ca2+ i produkty rozpadu fosfoinozytydu w mechanizmie działania hormonów. W tym schemacie aktywna kinaza białek

DZIAŁANIE HORMONÓW / 597

R R, OH I I I 1,2-Diacy log lice roi (DAG)

Fosfaiydy tol nozyto to-4,5-blstosf oran (PIP,)

I nozytob-1,4.5-trisf osf o ran

Ryc. 45-7. Fosfolipaza C rozkłada fosfatydyloinozytylo-bisfosforan (PIPa) do diacytoglicerolu i inozytolo-bts-fosforanu. Ri jest zazwyczaj stearynianem, zaś Rj-arachidonianem. IP 3 może ulec defosforylacji {do nieaktywnego inozytolo-1,4-bisfosforanu (1-1,4P2) lub "fosforyIacji (do potencjalnie aktywnego 1,3,4,5-tetra fosforan u inozytolu 1-1, 3, 4, 5-P4). _____

C katalizuje fosforylację swoistych substratów, które następnie zmieniają procesy fizjologiczne. Podobnie kompleks Ca2+-kalmodulina (Cam) może aktywować swoiste kinazy. Te ostatnie z kolei modyfikują substraty, przez co zmieniają reakcje fizjologiczne. Dla niektórych hormonów śród kom orkowy przekaźnik jest nieznany Duża grupa ważnych hormonów nie ma zidentyfikowanego przekaźnika śródkomórkowego. Jest dziwne, że hormony te tworzą duże grupy. Do jednej należą insulina, czynniki insulinopodobne (IGF-I i IGF-II) i wiele różnych hormonów, mających wspólnego przodka. Druga grupa składa się z białek kodowanych przez rodzinę genu hormonu wzrostowego (hormon wzrostu, prolaktyna, somatomammotropina kosmówkowa); są one wyraźnie ze sobą spokrewnione (p. rozdz. 46). Podział na wymienione dwie grupy nie jest ostry, skoro w wieiu działaniach hormonu wzrostu bierze udział IGF-I. Oksytocyna jest hormonem nie zaliczanym do żadnej z wymienionych dwóch grup. Włożono wiele wysiłku, by znaleźć śródkomórkowy mediator działania insuliny. Wśród kandydatów na taki mediator proponowano m.in. cAMP, cGMP, H2O2, Ca2+ i samą insulinę. W wyciągach tkankowych znaleziono różne substancje pośredniczące, będące pochodnymi peptydów lub fosfolipidów, lecz dotych-

czas nie zostały one oczyszczone i scharakteryzowane. Niedawna obserwacja, że receptor insulinowy wykazuje wewnętrzną aktywność kinazy tyrozynowej zapoczątkowała badania, mające na celu znalezienie układu fosforylacji, mogącego wyjaśnić działanie insuliny. Nie jest to obserwacja odosobniona, skoro receptor dla naskórkowego czynnika wzrostowego jest również kinazą tyrozynową. W rzeczywistości ten ostatni fakt był punktem wyjścia dla badań nad receptorem insulinowym. W końcu należy wspomnieć, że czynnik wzrostowy pochodzenia płytkowego jest również kinazą tyrozynową, bardzo przypominającą v-sb i c-sis, tj. produkty onkogenów swoistych wirusów i komórek. Pobudzenie komórek docelowych dla hormonu wzrostowego pochodzenia płytkowego, tj. fibroblastów, komórek glejowych lub komórek mięśni gładkich, jest przyczyną powstawania kilku produktów genowych, uczestniczących w replikacji wymienionych komórek. Prawdopodobne wydaje się, że ta duża grupa hormonów posługuje się różnymi mechanizmami sygnalizacji śródkomórkowej. Wydaje się, że tradycyjne przekaźniki nie odgrywają tu określonej roli. PIŚMIENNICTWO Andersen JE: Theeffectof steroid hontiones on gene transcription. In: Biahgical Reguiation and Deveh-

598 / ROZDZIAŁ 45 pment. Ooldbergcr RF, Yamamoto KR (editors). Vol 3B: Hormone Aclion. Plenum Press, 1985. Blackmore PF, Eston JH: Mechanisms involved in the actions of calcium dependent hormones. In: Biockemical Action of the Hormones. Vol 12. Lit* wack G (editor). Academic Press, 1985. Beato, M: Gene regulation by steroid hormones. Celi 1989;56:335.

Enhancers and eukaryotic gene espression. In: Current Communications in Mokcular Biology. Oluzman Y, Shenk T (editors). Cold Spring Harbor Press, 1983. Gilman A: G proteins and dual control of adenylate cyclase. Celi 1984;36:577. Rasmussen H: The calcium messenger system. (2 parts.) N Engl J Med 1986;314:J094, 1164.

P

■■

1

Przysadka mózgowa hormony podwzgórza

i

4 6

Daryl K. Granner, MD

WPROWADZENIE

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Przedni płat przysadki mózgowej (przysadka gruczołowa) wydziela, pod kontrolą hormonów podwzgórzowych, grupę hormonów (hormony tropowe), regulujących wzrost i czynność innych gruczołów wydzielania wewnętrznego lub wpływających na reakcje metaboliczne innych tkanek docelowych. Tylny płat przysadki mózgowej wytwarza hormony regulujące równowagę wodną oraz wytrysk mieka z gruczołu sutkowego w czasie laktacji.

Utrata czynności przedniego płata przysadki mózgowej (panhypopituitarismus) jest przyczyną zaniku tarczycy, kory nadnerczy i gonad. Wtórne skutki niedoboru hormonów gruczołów będących narządami docelowymi dla hormonów tropowych przysadki dotykają większości narządów i tkanek oraz wiele ogólnych procesów, takich jak przemiana białek, tłuszczów, węglowodanów oraz wodno-elektrolitowa. Utrata czynności tylnego płata przysadki jest przyczyną moczówki prostej wyrażającej się niezdolnością nerek do zagęszczania moczu.

Skróty używane w tym rozdziale ACTH korADH CG

CLIP płata CRH CS

FSH GAP GH

— hormon kortykotropowy,

GnRH

tykotropina — hormon antydiuretyczny, wazo presy na — gonadotropina kosmówkowa

IGF 1,-11

przysadki podobny do kortykotropiny — hormon uwalniający kortykotropinę, kortykoliberyna — somatomammotropina kosmówkowa, laktogen łożysko wy — folitropina — peptyd związany z GnRH — hormon wzrostu (somatotrapina)

NGF

— peptyd

pośredniego

GH RH lub GRH GHRIH

LM

LPH MSH

PO MC PRIH lub PIH PRL

SRIN T3 T

TRH — hormon uwalniający hormon wzrostu, somatoliberyna — hormon hamujący uwalnianie hormonu W2rostu, somatostatyna

TSH VIP

— hormon uwalniający gonadotropine, gonadohberyna — czynnik wzrostowy insulinopodobny 1 i II — lutropina — lipotropina — melanotropina, hormon pobudzający melanocyty — czynnik wzrostu nerwów — rodzina peptydów proopiomeianokortyny — hormon hamujący uwalnianie protakiyny, prolaktostatyna — prolaktyna — hormon hamujący uwalnianie somatotropiny, somatostatyna — trijodotyronina — tyroksyna, tetrajodotyronina — hormon uwalniający tyreotroptnę, tyreoliberyna — tyreotropina — wazoaktywny peptyd jelitowy

600 / ROZDZIAŁ 46

HORMONY PODWZGÓRZOWE REGULUJĄ CZYNNOŚĆ PRZEDNIEGO PŁATA PRZYSADKI MÓZGOWEJ Uwalnianie (a w niektórych przypadkach również wytwarzanie) każdego z hormonów wymienionych w tab. 46-1 znajduje się pod

ciągłą kontrolą przynajmniej jednego hormonu podwzgórzowego. Hormony podwzgórzowe uwalniają się z zakończeń podwzgórzowych włókien nerwowych do przestrzeni okołowłośniczkowej układu podwzgórzowego, po czym dostają się przez łodygę do przysadki gruczołowej za pośrednictwem specjalnego krążenia

Tabela 46-1. Hormony osi podwzgórze-przysadka-narząd docelowy tworzą integralne pętle sprzężenia zwrotnego* Hormon przysadki Hormon Hormon podwzgówydzielany Skrót gruczołowej, na który przez docelowy gruczoł rzowy działa hormon pod- endOkrynny wzgórzowy** Korty koi ibery na

CRH

Tyreoliberyna

TRH

ACTH (LPH, MSH, en- Hydrokortyzon dorfiny) TSH (PRL)

Gonadotiberyna

GnRH (LHRH, FSRH)

LH, FSH

Androgeny, progestyny

Somatoliberyna

GHRH.GRH

GH

IGF-1; inne?

Somatostatyna

GHRIH.SHIH

GH (TSH, FSH,ACTH)

IGF-I, T3 i T4; inne?-

PRL

Neurohormony (?)

Prolaktostatyna, dopa- PRIH lub PIH mina i GAP

estrogeny,

* Ogólny schemat sprzężenia zwrotnego dla każdego układu można sporządzić wstawiając odpowiedni hormon podwzgórzowy, przysadkowy i gruczołu efektorowego na odpowiednie miejsce ryc. 44-1. ** Hormon podwzgórzowy wykazuje wtórne lub słabsze działanie na hormon ujęty w nawiasach.

Tabela 46-2. Struktura hormonów uwalniających (liberyn) podwzgórza Hormon Struktura TRH

(pyro)Glu-His-Pro-NH2

Somatostatyna

Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NHZ {pyro)Głu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 HO \ HO—L /-\-CH2CHjNHi Peptyd związany z GnRH (GAP) Ser-GIn-Glu-Pro-Pro-ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-A)a-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-lle-Ala-NH2 Tyr-Ala-Asp-A)a-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Vai-Leu-Gly-Gih-Leu-Ser-Ala-Afg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-lle-Met-Ser-Arg-GIn-GIn-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2

GnRH PRIH Owcza korty kotibery na Ludzka somatoliberyna

PRZYSADKA MÓZGOWA I HORMONY POD WZGÓRZA / 601

wrotnego, łączącego podwzgórze z przednim płatem przysadki. Strukturę kilku hormonów podwzgórzowych przedstawiono w tab 46-2. Hormony podwzgórzowe uwalniane są pulsacyjnie (epizodycznie), zaś izolowane komórki docelowe przysadki gruczołowej reagują lepiej na pulsacyjną niż ciągłą ekspozycję tych hormonów (podwzgórzowych). Uwalnianie hitropiny (LH) i folitropiny (FSH) jest regulowane przez wspólny hormon uwalniający — gonadoliberynę (GnRH). Z kolei wydzielanie tej ostatniej jest zależne od stężenia krążących we krwi hormonów gonadalnych docierających do podwzgórza (patrz pętla sprzężenia zwrotnego przedstawiona na ryc. 44-1). Podobne pętle sprzężenia zwrotnego istnieją dla wszystkich układów podwzgórze-przysadka-gruczoły docelowe. Uwalnianie ACTH jest głównie kontrolowane kortykolifaeryną (CRH), chociaż i inne hormony, takie jak ADH, aminy katecholowe. VIP i angiotensyna II wpływają na jej wydzielanie. Z kolei uwalnianie CRH jest zależne od stężenia koityzolu we krwi, glukokortykoidu, wydzielanego przez nadnercza. Uwalnianie tyreotropiny (TSH) zależne jest głównie od tyreoliberyny (TRH), zaś wydzielanie tej ostatniej regulowane jest przez hormony tarczycy — T3 (trijodotyroninęjr i T4 (tyroksynę). Hamujący wpływ na uwalnianie TSH wykazuje jednak również somatostatyna. Uwalnianie i produkcja hormonu wzrostu (GH) znajdują się pod stałą kontrolą podwzgórzowego hormonu pobudzającego oraz hormonu hamującego wydzielanie GH. Ponadto regulacja wydzielania GH znajduje się pod wpływem obwodowej pętli sprzężenia zwrotnego. IGF-I (somatomedyna C), który jest pośrednikiem niektórych efektów GH, pobudza uwalnianie somatostatyny, hamującej uwalnianie somatoliberyny (GHRH). Regulacja syntezy i uwalniania prolaktyny znajdują się pod stałą kontrolą hamujących czynników podwzgórzowych. Jest to wyjątkowy hormon, wydzielanie którego zależy od współdziałania czynników nerwowych (np. drażnienie brodawki piersiowej) realizowanych przez neuroprzekaźniki oraz od neurohormonów. Dopamina hamuje syntezę (hamując transkrypcję genu dla prolaktyny) i uwalnianie prolaktyny, lecz nie jest jedynym czynnikiem odpowiedzialnym za hamowanie wydzielania tego hormonu. Ostatnio odkryto neuropeptyd złożony z 56 aminokwasów wykazujący działanie podobne zarówno do GnRH, jak i prolaktostatyny (PRIH)

— stąd określany jest jako peptyd związany z GnRH (GAP). GAP jest potężnym inhibitorem uwalniania prolaktyny i być może jest tym hormonem, którego dotychczas nie udało się zidentyfikować. Występowanie GAP tłumaczy dziwny związek zachodzący pomiędzy sekrecją GnRH i prolaktyny, szczególnie u niekórych gatunków zwierząt. Wiele hormonów podwzgórzowych, w tym szczególnie tyreoliberyna (TRH), kortykoliberyna (CRH) i somatostatyna występuje również w innych obszarach mózgu i w wielu tkankach obwodowych. Pierwotnie uważano, że działanie pobudzające hormonów uwalniających podwzgórza na przysadkę mózgową odbywa się za pośrednictwem cAMP, Nowsze badania sugerują udział w tym procesie mechanizmu wapniowo-fosiolipidowego, podobnego do opisanego wyżej. Na temat, czy hormony uwalniające wpływają również na syntezę odpowiedniego hormonu w przysadce mózgowej, istnieją rozbieżne opinie, chociaż ostatnio wykazano, że GHRH pobudka transkrypcję genu kodującego GH i TRH transkrypcję genu prolaktyny. PRZEDNI PŁAT PRZYSADKI MÓZGOWEJ WYTWARZA DUŻĄ LICZBĘ HORMONÓW POBUDZAJĄCYCH RÓŻNORODNE PROCESY FIZJOLOGICZNE I BIOCHEMICZNE W TKANKACH DOCELOWYCH (TARCZOWYCH) Tradycyjnie hormony przedniego płata przysadki mózgowej omawiano oddzielnie. Uwzględniając wyniki nowszych badań dotyczących syntezy tych hormonów oraz śródkomórkowych mediatorów ich działania (tab, 45-1) hormony przysadki gruczołowej można podzielić na trzy grupy: pierwsza z nich obejmuje hormon wzrostu, prolaktynę i somatomammotropinę kosmówkową, druga — hormony glikoproteinowe oraz trzecia — rodzinę hormonów pochodnych proopiomei ano korty ny. Hormon wzrostu, prolaktyna i somatomammotropina kosmówkową tworzą jedną grupę hormonów Hormon wzrostu (GH), prolaktyna (PRL) i somatomammotropina kosmówkową (CS, laktogen łożyskowy) tworzą rodzinę hormonów białkowych wykazujących bardzo podobną se-

602 / ROZDZIAŁ 46 Mron Ekson

1

3'

Rvc. 46-1. Schemat struktury genu tudzkiego hormonu wzrostu (z uwzględnieniem takiej samej skali dla wszystkich jego składowych). Gen wykazuje długość ok. 45 kb i składa się z 5 eksonow i 4 intronów. Obszary zakreskowane oznaczają niekodujące sekwencje eksonu 1 i 5. Strzałki oznaczają kierunek transkrypcji.

kwencję aminokwasową. Liczba aminokwasów GH, CS i PRL waha się u różnych gatunków zwierząt od 190 do 199. Każdy z tych hormonów zawiera jedną tylko resztę tryptofanową (w położeniu 85 w GH i CS, zaś w położeniu 91 w PRL) oraz dwa homologiczne wiązania dwusiarczkowe. Homologia między składem aminokwasowym ludzkiego GH i CS wynosi aż 85%, zaś pomiędzy ludzkim GH a ludzką prolaktyną 35%. Ta homologia aminokwasową sprawia, że wymienione trzy hormony wykazują wspólne determinanty antygenowe, co nie jest zaskoczeniem oraz, że wszystkie one pobudzają wzrost i wykazują działanie laktogenne. Są one wytwarzane w swoistych tkankach, tj. GH i PRL wytwarzane są w przysadce gruczołowej, zaś CS w komórkach syncytium trofoblastycznego łożyska. Każdy z tych hormonów podlega odmiennej regulacji (p. tab. 46-1). Na podstawie uderzających podobieństw, wiele lat temu przypuszczano, że wymienione hormony powstały przez duplikację wspólnego genu-przodka. Używając techniki rekombinacji genetycznej wykazano jednak, że istnieją, liczne geny dla GH i CS \i naczelnych i u ludzi, natomiast tylko pojedynczy gen kodujący PRL, będący pięciokrotnie większy od genu GH i CS. Ponadto stwierdzono, że ludzki laktogen łożyskowy jest odmianą ludzkiego hormonu wzrostu oraz, że geny dla GH i CS umiejscowione są u człowieka na chromosomie 17, podczas gdy dla PRL — na chromosomie 6. Istnieje znaczna rozbieżność ewolucyjna wymienionych genów. I tak tkanki szczura i bydta mają pojedynczą kopię GH i PRL w genornie haploidalnym, zaś człowiek — pojedynczy gen dla PRL. Człowiek ma jeden czynny gen dla GH (GH-N) i jego wariantu (GH-V), zaś dwa geny dla CS, które ulegają ekspresji (CS-A i CS-B) i jeden nie ulegający ekspresji (CS-L). Wiele gatunków małp ma przynajmniej 4 geny rodziny GH-CS. Sekwencja kodująca dla wszystkich tych genów

zawarta jest w 5 eksonach poprzedzielanych 4 intronami (ryc. 46-1). Geny te wykazują wysoką homologię w regionach flankujących 5' końce oraz w zakresie sekwencji kodujących (homologia ta wynosi ok. 95% w obszarze kodującym), różnią się natomiast sekwencją na końcach 3'. Miejsca przekształcenia i składania (splicingu) są w wysokim stopniu zachowane, pomimo że introny genu PRL są znacznie dłuższe. Rodzina ludzkiego genu GH-CS jest umiejscowiona w okolicy q 22-24 drugiego ramienia chromosomu 17. Na rycinie 46-2 przedstawiono wzajemne usytuowanie każdego z tych genów wobec siebie począwszy od końca 5' do końca 3'. Geny ulegają transkrypcji począwszy od końca 5' w kierunku do 3. Gen dla GH-N oddzielony jest od genu CS-B sekwencją o wielkości ok. 45 kb. hGH-N hCS-L

hCS-A

hGH-V hCS-B

Ryc. 46-2. Umiejscowienie i polarność rodziny genów na chromosomie 17 dla ludzkiego GH i CS. Przedstawiona jest lokalizacja genów tudzkiego GH i CS w stosunku do końców 5' i 3' pasma DNA. Strzałki oznaczają kierunek transkrypcji. _______________________________________

Sekwencja genu GH-N koduje sekwencję aminokwasową GH krążącego we krwi. Gen ten jest wrażliwy na DNA-zc I, co dowodzi, że jest zlokalizowany w obszarze „aktywnej chromatyny". Gen GH-V, jeśli ulega ekspresji, koduje białko różniące się 13 aminokwasami od GH zakodowanego w sekwencji GH-N. Gen GH-V jest oporny na działanie DNA-zy I, co wskazuje na to, że zapewne nie jest aktywny. Obecność genu GH-V stwierdza się u chorych wykazujących brak genu GH-N (tj. u chorych

PRZYSADKA MÓZGOWA I HORMONY PODWZGÓRZA / 603

z dziedzicznym niedoborem GH). Ponieważ u chorych tych występuje zupełny brak GH, należy przypuszczać, że gen GH-V jest nieaktywny, lub też produkuje cząsteczki hormonu wzrostu pozbawione aktywności biologicznej. Fakt, że chorzy d wytwarzają przeciwciała anty-GH po podaniu egzogennego GH sugeruje, że ich układ immunologiczny nigdy nie zetknął się przedtem z tym antygenem {białkiem hormonalnym). Ekspresję genów CS-A i CS-B stwierdza się w łożysku; nie stwierdza się natomiast ekspresji genu CS-L (jest to gen „niemy"). Hormon wzrostu (GH) Synteza i budowa. Hormon wzrostu jest syntetyzowany w komórkach somatotropowych przysadki gruczołowej, tj. w podgrupie komórek kwasochłonnych. Komórki te stanowią najliczniejszą grupę komórek przysadki mózgowej. Stężenie GH w przysadce wynosi 5—15 mg/g tkanki, tj. stężenie to jest znacznie wyższe niż innych hormonów przysadkowych (wyrażające się w ug na gram tkanki przysadkowej). U wszystkich ssaków GH składa się z pojedynczego łańcucha polipeptydowego o masie cząsteczkowej ok. 22 000. Ogólną strukturę ludzkiego GH, złożonego z 191 aminokwasów, przedstawia ryc. 46-3. Pomimo że istnieje duże podobieństwo w sekwencji aminokwasowej między GH różnych gatunków, tylko ludzki GH oraz GH uzyskany od naczelnych są aktywne u człowieka. Obecnie dostępny jest dla celów leczniczych GH uzyskany metodą rekombinacji DNA.

Ludzki hormon wzrostu

Działanie fizjologiczne i biochemicz-

ne. Hormon wzrostu jest niezbędny dla wzrostu w okresie pourodzeniowym i dla prawidłowej przemiany węglowodanowej, lipidowej, azotowej i mineralnej. Wpływ GH na wzrost następuje za pośrednictwem IGF-I kodowanego przez gen należący do rodziny czynników wzrostowych insulinopodobnych. Czynnik ten określano pierwotnie jako czynnik sulfatacji (sulfation factor), ponieważ pobudza wbudowywanie siarczanów do tkanki chrzestnej. Z kolei określano go jako somatomedynę C. Pod względem struktury jest podobny do proinsuiiny (p. rozdz. 52 i ryc. 52-5). Innym polipeptydem bardzo podobnym lub nawet identycznym pod względem aktywności biologicznej do IGF-I jest polipeptyd IGF-II, określany u szczura jako czynnik pobudzający rozrost (MSA — multiplication stimulating activity). Zarówno IGF-I, jak i IGF-II wiążą się z receptorami błonowymi. Można je odróżnić od siebie używając swoistych metod radioimmunologicznych. IGF-I składa się z 70, zaś IGF-II z 67 aminokwasów. Stężenie IGF-II w osoczu jest dwukrotnie wyższe od stężenia IGF-I, pomimo że efekt biologiczny GH wykazuje bardziej bezpośrednią korelację ze stężeniem IGF-I. Chorzy z niedoborem IGF-I, lecz prawidłowym stężeniem IGH-II (tj. osoby z karłowatością z niedoboru GH i Pigmeje, p. tab. 46-3) wykazują upośledzony wzrost. GH wykazuje kilka działań 1. Synteza białka. GH wzmaga transport aminokwasów do komórek mięśni oraz nasila

Prolaktyna owcza

Ryc. 46-3. Porównanie ogólnej struktury ludzkiego hormonu wzrostu (po stronie lewej) ze strukturą prolaktyny owczej (po stronie prawej). Hormon wzrostu wykazuje wiązanie dwusiarczkowe między aminokwasami w pozycjach 53 i 165 oraz 182 i 189, w prolaktynie wiązania dwusiarczkowe występują między aminokwasami w pozycji 4 i 11, 58 i 173 oraz 190 i 198.

604 / ROZDZIAŁ 46 Tabela 46-3. Zachowanie się hormonu wzrostu (GH), insulinopodobnego czynnika wzrostowego I (IGF-I) i II (IGF-I!) w karłowatości Stężenie w osoczu GH

Karłowatość z niedoboru GH Pigmeje Karłowatość typu Larona

Małe Prawidłowe Duże

Reakcja na egzo-

IGF-I

IGF-II

genne podanie GH

Małe Małe Małe

Małe lub prawidłowe Prawidłowe

Dodatnia Ujemna Ujemna

syntezę białka (mechanizmem nie związanym z transportem aminokwasowym). Zwierzęta, którym podawano GH, wykazują dodatni bilans azotowy, wyrażający się ogólnym wzrostem syntezy białka, obniżeniem stężenia w osoczu aminokwasów i mocznika oraz spadkiem wydalania aminokwasów i mocznika z moczem. Zmianom tym towarzyszą wzmożona synteza RNA i DNA w niektórych tkankach. Pod tym względem efekty GH są podobne do występujących po podaniu insuliny. Przemiana węglowodanów. Ogólnie mó wiąc, GH wykazuje antagonistyczne działania w stosunku do insuliny. Występująca po poda niu GH hiperglikemia jest wynikiem zarówno zmniejszonej utylizacji glukozy przez tkanki obwodowe, jak i wzmożonego wytwarzania glukozy w wątrobie w procesie zwanym glukoneogenezą. W wątrobie GH zwiększa zawartość glikogenu najpewniej drogą stymulacji glukoneogenezy z aminokwasów. Może również wy stąpić upośledzenie glikolizy na kilku etapach. W mechanizmie spad_ku glikolizy w miocytach może również uczestniczyć wzmożona mobili zacja kwasów tłuszczowych z zapasów triacyloglicerolu. Długotrwałe podawanie GH może być przyczyną cukrzycy. Przemiana lipidów. GH pobudza uwal nianie wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu z tkanki tłuszczowej, podnosi stężenie wolnych kwasów tłuszczowych we krwi oraz zwiększa utlenianie wolnych kwasów tłuszczowych w wą trobie. W warunkach niedoboru insuliny (wy stępującego np. u chorych na cukrzycę) może również pojawić się nasilona ketogeneza. W patomechanizmie wymienionych skutków działa nia GH na przemianę lipidów i węglowodanów prawdopodobnie nie bierze udziału IGF-1. Przemiana elektrolitowa GH, a bardziej prawdopodobnie IGF-I sprzyjają powstawaniu dodatniego bilansu wapniowego, magnezowe-

Małe

go i fosforanowego oraz retencji w ustroju Na+, K+ i Cl". Wpływ GH lub IGF-I na gospodarkę wapniowo-fosforanową jest następstwem oddziaływania tych hormonów na kości (pobudzają one wzrost kości długich na poziomie jej nasady u dzieci oraz wzrost akralny i apozycyjny kości u dorosłych). U dzieci GH pobudza ponadto tworzenie się tkanki chrzestnej. 5. Efekty prolaktynopodobne. GH, wiążąc się z receptorami laktogenowymi, wykazuje wiele efektów podobnych do występujących po podaniu prolaktyny (pobudza gruczoł sutkowy, laktogenezę oraz wytwarzanie mleczka w wolu gołębi).

Patofizjologia hormonu wzrostu. Nie-

dobór GH spowodowany ogólną niedoczynnością przysadki gruczołowej (panhypopituitarismus) !ub wybiórczym niedoborem tego hormonu jest przyczyną poważnych następstw u dzieci, ponieważ dzieci te nie osiągają odpowiedniego wzrostu. Skutki metaboliczne niedoboru GH są mniej kłopotliwe. Różne rodzaje karłowatości pomagają zrozumieć znaczenie różnych faz działania GH (tab. 46-3). Karty z niedoborem GH reagują w sposób normalny na podawanie egzogennego GH. Opisano dwa rodzaje oporności narządów docelowych na działanie GH. Karły typu Larona wykazują nadmierne ilości GH-N, lecz ich hepatoeyty pozbawione są receptorów dla GH. U Pigmejów występuje defekt poreceptorowy, przez co wypada działanie GH, w którym pośredniczy IGF-I. Nadmiar GH, najczęściej spowodowany gruczolakiem kwasochłonnym przysadki, jest powodem gigantyzmu, jeśli nie doszło jeszcze do zamknięcia szpar nasadowych. U takich chorych obserwuje się przyspieszony wzrost kości długich. Akromcgalia jest następstwern nadmiernego uwalniania się GH w fazie życia, kiedy doszło już do zamknięcia szpar nasadowych

PRZYSADKA MÓZGOWA I HORMONY PODWZGORZA / 605

kości, czyli po ukończeniu wzrostu kości długich. Akralny wzrost kości jest przyczyną typowych zmian twarzy (wystająca szczęka dolna, powiększenie nosa), występowania powiększonych dłoni, sLóp i czaszki. Wśród innych anomalii należy wymienić powiększenie narządów trzewiowych, zgrubienie skóry oraz wiele zaburzeń metabolicznych, w tym cukrzycę. Znajomość regulacji wydzielania GH jest podstawą racjonalnego stosowania testów używanych w diagnostyce wymienionych stanów chorobowych. U chorych z niedoborem GH nie stwierdza się wzrostu stężenia tego hormonu w osoczu krwi po stosowaniu bodźca hipoglikemicznego, po podaniu argininy lub 1-dopa. U chorych z gigantyzmem lub akromegalią, spowodowanych nadmierną sekrecją GH przez gruczolak, nie obserwuje się supresji stężenia GH w osoczu po podaniu glukozy. Prolaktyna (PRL, hormon laktotropowy, mammotropina, hormon luteotropowy)

Synteza i struktura. PRL jest hormonem

białkowym o masie cząsteczkowej ok. 23 000. Ogólna jej struktura jest podobna do pokazanej dla GH na ryc. 46-3. Wydzielana jest przez kwasochłonne komórki laktotropowe przysadki gruczołowej. Liczba i wielkość tych komórek powiększają się gwałtownie w czasie ciąży. Podobieństwa strukturalne i czynnościowe między GH, PRL i CS zostały przedstawione wyżej.

Rola fizjologiczna i biochemiczna

prolaktyny. Prolaktyna uczestniczy w inicjacji i podtrzymywaniu laktacji u ssaków. Przy stężeniach fizjologicznych prolaktyna działa tylko na gruczoły sutkowe odpowiednio przygotowane hormonami gonadalnymi. Przy nadmiernych stężeniach prolaktyna stymuluje wzrost gruczołów sutkowych również u kobiet pozbawionych jajników oraz u mężczyzn. U gryzoni PRL jest zdolna do podtrzymywania ciałka żółtego — stąd określenie hormon łuteotropowy. Cząsteczki podobne do PRL wydają się uczestniczyć w procesie adaptacji ryb słonowodnych do warunków słodko wodnych, w procesie linienia gadów oraz w wytwarzaniu mleczka w wolu ptaków. Nieznany jest śródkomórkowy mediator działania PRL. Miał nim być polipeptyd, lecz nie zostało to potwierdzone.

Patofizjologia prolaktyny. Guzy wy-

dzielające prolaktynę są przyczyną braku miesiączki (amenorrhoea) i mlekotoku (galactorrhoea) u kobiet. U mężczyzn nadmierna sekre-

cja PRL może być przyczyną ginekomastii (powiększenie sutków) i impotencji. Somatomammotropina kosmówkowa (CS, laktogen łożyskowy) U człowieka trzeci człon rodziny GH-PRL-CS nie wykazuje określonej czynności. W testach biologicznych CS wykazuje działanie laktotropowe i luteotropowe oraz efekty metaboliczne jakościowo podobne do opisanych dla hormonu wzrostu — hamuje utylizację glukozy przez komórki, pobudza uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu, wzmaga zatrzymywanie azotu i wapnia w ustroju (pomimo wzrostu wydalania wapnia z moczem) oraz zmniejsza wydalanie fosforu i potasu z moczem. Hormony glikoprotemowe tworzą drugą grupę hormonów przysadki gruczołowej Najbardziej złożonymi hormonami białkowymi dotychczas odkrytymi są hormony glikoproteinowe przysadki gruczołowej i łożyska tj. hormon tyreotropowy (tyreotropina — TSH), hormon luteotropowy (lutropina—LH), hormon pobudzający pęcherzyki jajnikowe Graafa (folitropina — FSH) oraz gonadotropina kosmówkowa (CG). Hormony te wpływają na różne procesy biologiczne, pomimo że wykazują znaczące podobieństwa strukturalne. Ta klasa hormonów występuje u wszystkich ssaków. Cząsteczki tych hormonów reagują podobnie jak inne hormony peptydowe lub białkowe z receptorami błony komórkowej i aktywują cyklazę adenylanową, tj. ich przekaźnikiem śródkomórkowym jest cAMP. Każdy z tych hormonów składa się z dwóch podjednostek a i p, połączonych ze sobą niekowalencyjnie. Podjednostki a są identyczne dla wszystkich tych hormonów w obrębie jednego gatunku i istnieją znaczne podobieństwa strukturalne między poszczególnymi gatunkami. Aktywność biologiczna tych hormonów zdeterminowana jest przez podjednostkę p. Sama podjednostka p nie jest aktywna biologicznie, zaś rozpoznanie swoistego receptora przez hormon zależne jest od interakcji określonych obszarów obu jego podjednostek. Cząsteczki hybrydowe między wymienionymi hormonami są w pełni aktywne. 1 tak cząsteczka hybrydowa składająca się z TSHa LHp wykazuje aktywność lutropiny, zaś cząsteczka złożona z podjednostki a ludzkiej tyreotropiny (hTSHa) i podjednostki P mysiej tyreotropiny (mTSHp) wykazu-

606 / ROZDZIAŁ 46

je aktywność tyreotropową (u myszy). Wynika z tego, że międzygatunkowe różnice między podjednostkami a i P nie mają wpływu na wiązanie niekowalencyjne pomiędzy nimi, ani też na aktywność biologiczną domeny podjednostki p. Każda podjednostka jest syntetyzowana na matrycy swoistych sekwencji mRNA oddzielnych genów. Przypuszcza się, że wszystkie hormony tej grupy pochodzą od wspólnego przodka genowego, który rozpada się na dwie cząsteczki a i p oraz, że ta ostatnia uległa dalszej ewolucji, stając się źródłem oddzielnych hormonów. Wiele wiadomo o strukturze tych cząsteczek, np. karboksykońcowy pentapeptyd podjednostki a jest istotny dla wiązania z receptorem, lecz nie dla połączenia się tej podjednostki z podjednostka p. Cechą odróżniającą hormony grupy glikoproteinowej od hormonów pozostałych grup, jest glikozylacja. W każdym hormonie glikoproteinowym podjednostka a zawiera dwie cząsteczki oligosacharydów związanych z asparaginą, zaś podjednostka p albo 1, albo 2 takie cząsteczki. Glikozylacja może być potrzebna w procesie interakcji podjednostki a i podjednostki p. Podjednostka a zawiera 5, zaś podjednostka p 6 mostków S-S. Wolne podjednostki a można znaleźć w przysadce i w łożysku. Ten fakt oraz obserwacja, że translacja podjednostek a i p odbywa się na matrycy oddzielnych mRNA, potwierdzają koncepcję, że synteza jednej podjednostki jest niezależna od drugiej oraz, że podjednostka P jest składową decydującą o syntezie całej cząsteczki hormonu. Wszystkie hormony tej grupy syntetyzowane są jako preprohormony i poddawane potranslacyjnej obróbce w obrębie komórki, dzięki czemu powstaje hormon glikozylowany,

Gonadotropiny (FSH, LHr hCG). Hor-

mony te odpowiedzialne są za gametogenezę i steroidogenezę w gonadach. Każdy z tych hormonów jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej ok. 25 000. 1. Hormon dojrzewania pęcherzyków (foli-

tropina — FSH). Hormon ten wiąże się z receptorami błon plazmatycznych komórek docelowych tj. komórek pęcherzyków jajnikowych (Graafa) oraz komórek Sertolego gonady męskiej. W następstwie wiązania się z receptorem dochodzi do aktywacji cyklazy adenytanowej i wzrostu syntezy cAMP. Efekty działania FSH opisane są w większych szczegółach w rozdziale 51.

2. Hormon luteinizujący (lutropina — LH). LH wiąże się ze swoistymi receptorami błon plazmatycznych pobudzając produkcję progesteronu w komórkach ciałka żółtego oraz testosteronu w komórkach Leydiga, Sródkomórkowym mediatorem działania LH jest cAMP, Nukleotyd ten wykazuje działanie podobne do LH, pobudzając konwersję octanów do skwalenu (jest to prekursor syntezy cholesterolu), oraz konwersję cholesterolu do 2ac-hydroksycholesterolu — niezbędnego metabolitu w szlaku syntezy progesteronu i testosteronu. Działanie LH jest bardziej szczegółowo opisane w rozdziale 51. Istnieje ścisłe sprzężenie między wiązaniem LH z receptorem a powstawaniem cAMP; steroidogeneza występuje jednak tylko wtedy, kiedy doszło do małych wzrostów cAMP. Dowodzi to obecności receptorów „zapasowych" w tym procesie (p, ryc. 43-3). Długotrwała ekspozycja komórek docelowych na LH jest przyczyną spadającej ich wrażliwości na ten hormon uwarunkowanej prawdopodobnie zmniejszeniem się liczby receptorów („down regulation"). Zjawisko to może być wykorzystywane jako sposób kontroli urodzeń.. 3. Ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG). Hormon ten jest glikoproteiną syntety zowaną w komórkach syncytium trofoblastu łożyska. Jest on dimerem złożonym z podjed nostek a i p (J est to struktura typowa dla tej gnipy hormonów) najbardziej podobnym do LH. Jego stężenie we krwi oraz wydalanie z moczeni wzrastają już krótko po implantacji zapłodnionego jaja (patrz wyżej). Stąd oznacza nie hCG wykorzystywane jest w wielu testach wykrywania ciąży.

Hormon tyreotropowy (TSH). TSH jest

glikoproteiną o strukturze dimerycznej a|3 i masie cząsteczkowej ok. 30 000. Podobnie jak inne hormony tej klasy, TSH, wiążąc się z receptorami błon plazmatycznych, aktywuje cykiazę adenylanową i wzmaga syntezę cAMP, Wzrost tego ostatniego odpowiedzialny jest za udział TSH w biosyntezie hormonów tarczycy. Mniej pewne jest działanie troficzne TSH na tarczycę. Można wymienić wiele przykładów „ostrego" wpływu TSH na czynność tarczycy. Efekt następuje w ciągu minut i wyraża się aktywacją wszystkich faz biosyntezy T3 i T4, tj. procesu koncentracji jodków w tarczycy, wbudowywania jodu do pierścienia tyrozyny, sprzęgania jodotyrozyn i hydrolizy tyreoglobuliny, TSH wykazuje również działanie przewlekłe na tarczycę. Skutki tego działania występują po kilku

PRZYSADKA MÓZGOWA I HORMONY POD WZGÓRZA / 607

dniach stosowania TSH i wyrażają się wzrostem syntezy białek, fosfolipidów, kwasów nukleinowych oraz wielkości i liczby komórek tarczycy. Skutki metaboliczne długotrwałego stosowania TSH są następstwem syntezy i działania hormonów tarczycy. Peptydy rodziny proopiomelanokortyny (POMC) są wynikłem złożonego procesu przekształcania Rodzina POMC składa się z peptydów działających jako hormony (ACTH, LPH, MSH), neuroprzekaźniki lub neuromodulatory (endorfiny). Prekursorem POMC jest cząsteczka złożona z ok. 285 aminokwasów, ulegająca różnym procesom w różnych obszarach przysadki.

Rozmieszczenie, przekształcenie i skutki działania produktów genu

POMC. Ekspresja genu POMC odbywa sie w przednim i pośrodkowym płacie przysadki mózgowej. Najbardziej stała sekwencja u różnych gatunków umiejscowiona jest we fragmencie N-końcowym oraz w obszarze sekwencji ACTH i p-endorfin. Zarówno POMC, jak i jego produkty stwierdza się również w kilku innych tkankach kręgowców, np. w mózgu, łożysku, przewodzie żołądkowo-j elito wy m, w przewodach-układu płciowego, w płucach i limfocytach. Są one raczej wynikiem ekspresji genów w wymienionych narządach, a nie ich absorpcji z osocza. Podobne peptydy stwierdzono również u wielu gatunków niekręgowców. Proces przekształcania POMC w przednim płacie przysadki różni się od występującego w płacie pośrodkowym. Płat pośrodkowy ma charakter szczątkowy u dorosłych ludzi, lecz . i

... 1

jest aktywny u ludzkich płodów, kobiet ciężarnych w późnej fazie ciąży oraz u wielu gatunków zwierząt. Proces przekształcania POMC w tkankach obwodowych (w przewodzie pokarmowym, łożysku, w drogach płciowych mężczyzn) jest podobny do występującego w płacie pośrodkowym. Istnieją trzy główne grupy hormonów pochodnych POMC. Pierwsza obejmuje ACTH, z której może powstać oc-MSH oraz peptyd kortykotropinopodobny pośredniego płata przysadki (CLIP). Druga grupa składa się z p-lipotropiny (fi-LPH), z której mogą powstać y-LPH, p-MSH i P-endorfiny i z tych ostatnich endorfiny a t y. Trzecia grupa składa się z dużego N-końcowego peptydu, z którego powstaje y-MSH. Różnorodność wymienionych produktów POMC spowodowana jest występowaniem licznych ugrupowań złożonych z dwóch aminokwasów zasadowych, będących potencjainymi miejscami działania enzymów trypsynopodobnych. Każdy z wymienionych peptydów wyprzedzają reszty Lys-Arg, Arg-Lys, Arg-Arg lub Lys-Lys. Po translacji segment prohormonu ulega rozszczepieniu, po czym następuje modyfikacja cząsteczki drogą glikozylacji, acetylacji i fosforylacji. Kolejny rozpad zachodzi między sekwencją ACTH i P-LPH, w wyniku którego powstaje ACTH na końcu N, zaś P-LPH na końcu C (ryc. 46-4). Proces ten zachodzi zarówno w przednim jak i pośrednim płacie przysadki. Po odszczepieniu sekwencji ACTH^JJ, w przednim płacie nie zachodzi już więcej żadna istotna dalsza obróbka tego hormonu. W płacie pośrednim ACTH!.39 ulega rozpadowi do a-MSH1.13 i CLIP]8.39, zaś 0-LPH41_,M do 7-LPH42.101 i [J-endor-4-i34. zaś p-MSHg^oiPOwstajez Y-LPH.

ACTH (1-39)

0-LPH (42134]

,.: a-MSH (1-13)

CLIP (1839)

7-LPH (42-101) I

0-Endorflna

(104-134) II 0-MSH (84-101) 7-Endorfina 1104-118) 1

■

■

■»

■

I

1

(104-117)

Ryc. 46-4. Produkty rozpadu proopiomelanokortyny (POMC), MSH — hormon pobudzający melartocyty, CLIP — peptyd kortykotropinopodobny pośredniego płata przysadki mózgowej, LPH — lipoiropina.

608 / ROZDZIAŁ 46

Wymienione peptydy ulegają znacznym dodatkowym modyfikacjom. Znaczna część N-końcowego peptydu i ACTH 1.39 ulega glikozylacji wprzednim płacie przysadki mózgowej. MSH występuje przeważnie w postaci N-acetylowanej i C-amidowanej. a-MSH deacetylowana wykazuje mniejszą aktywność. p-Endorfina ulega szybkiej acetylacji w płacie pośrednim. W odróżnieniu od a-MSH acetylowana p-endorfina jest około 1000-krotnie mniej aktywna od postaci nieacetylowanej, możliwe wiec, że Pendorfina jest nieaktywna w przysadce mózgowej. W podwzgórzu cząsteczki te ulegają acetylacji i dlatego są widocznie aktywne. p-Endorfina utega również modyfikacji na końcu C, stając się źródłem endorfiny a i y (ryc. 46-4). Wymienione 3 endorfiny (a, p, y) są głównymi endorfinami pośredniego płata przysadki mózgowej u gryzoni. Duży fragment N-końcowy najprawdopodobniej także zostaje pocięty, stając się źródłem y-MSH w przysadce szczurzej i bydlęcej. Mało jest jednak wiadomo o tym Nkońcowym fragmencie. Informacje o strukturze wymienionych hormonów uzyskano głównie w badaniach przysadek pochodzących od gryzoni. Wydaje się jednak, że ogólny schemat powstawania wymienionych hormonów dotyczy również innych gatunków. Dodać jednak należy, że dotychczas nie uzyskano dokładnych informacji o funkcji większości peptydów pochodnych POMC. Działanie i regulacja swoistych peptydów 1. Struktura i mechanizm działania hormonu adrenokortykotropowęgo (kortykotropiny — ACTH). ACTH, feędący łańcuchem polipeptydowym złożonym z 39 aminokwasów (ryc. 46-5), jest regulatorem wzrostu i czynności kory nadnerczy. N-końcowa sekwencja 24 aminokwasów jest niezbędna dla wystąpienia pełnej aktywności biologicznej i jest ona taka sama u różnych gatunków. W odróżnieniu od niej Ckońcowa sekwencja aminokwasowa wykazuje dużą zmienność międzygatunkową. Do testów diagnostycznych używany jest syntetyczny analog ACTH,.^. ACTH wzmaga syntezę i uwalnianie steroidów nadnerczowych, stymulując konwersję cholesterolu do pregnenolonu. Ten etap steroidogenezy polega na konwersji C37-steroidów do C^-steroidów przez odszczepienia 6-węglowego łańcucha bocznego. Skorb pregnenolon jest prekursorem dla wszystkich steroidów nadner-

I

£

3

4

5

6

7

9

9

10

II

Sekwencja stała, niezbędna do wywołania palnej aktywnofcl biologiczne) 25

24

23

22

21

20

19

18

1?

16 **"^?

Sakwa reja zmienna, niepotrzebna do wywołania Gly) _ aktywności blologlczrej

30

31

Ryc. 46-5. Budowa (ACTH).

32

33

3*

ludzkiej

35

38

37

kortykotropiny

czowych (p. ryc. 49-3), po długotrwałym podawaniu ACTH obserwuje się nadmierną syntezę gluko- i mineralokortykoidów, jak również dehydroepiandrosteronu (prekursora androgenów), W warunkach fizjologicznych udział ACTH w regulacji minerałokortykoidów i androgenów jest minimalny. ACTH pobudza wzrost nadnerczy (jest to efekt troficzny) pobudzając syntezę białek i RNA. ACTH, podobnie jak inne hormony peptydowe, wiąże się z receptorem błon plazmatycznych. Już po kilku sekundach interakcji ACTH z receptorem obserwuje się znaczny wzrost stężenia śródkomórkowego cAMP. Analogi cAMP potrafią naśladować działanie ACTH, lecz w procesie tym udział biorą również jony wapnia. 2. Patofizjologia ACTH. Nadmierne wytwarzanie ACTH przez guz przysadki lub pozaprzysadkowy jest przyczyną zespołu Cushinga. Słabe działanie melanotropowe ACTH oraz towarzyszące sekrecji ACTH uwalnianie P- lub ot-MSH są przyczyną hiperpigmentacji skóry. Skutki metaboliczne nadmiernego wydzielania steroidów nadnerczowych wyrażają się 1) ujemnym bilansem azotowym, potasowym i fosforowym, 2) retencją sodu objawiającą się nadciśnieniem tętniczym lub/i obrzękami, 3) nietolerancją węglowodanową lub jawną cukrzycą, 4) podwyższonym stężeniem kwasów tłuszczowych w osoczu oraz 5) spadkiem liczby eozynofilów i limfocytów, natomiast wzrostem leukocytów wielojądrzastych. Chorzy z zespołem Cushinga charakteryzują się zanikiem mięśni szkieletowych oraz swoistym rozmieszczeniem się tkanki tłuszczowej określanym jako otyłość tułowiową. Przy wypadaniu produkcji ACTH spowodowanej guzem, zakażeniem lub zawa-

PRZYSADKA MÓZGOWA [ HORMONY PODWZGORZA / 609

lem przysadki mózgowej objawy kliniczne są przeciwstawne do występujących w nadprodukcji ACTH.

P-lipotropina (P-LPH). Hormon ten skła-

da się z C-końcowego 91 aminokwasowego polipeptydu POMC (ryc. 46-4). p-LPH zawiera sekwencję aminokwasową p-MSH, y-LPH, Met-enkefaliny i p-endorfiny. Z wymienionych hormonów w ludzkiej przysadce mózgowej stwierdzono y-LPH, p-LPH i p-endorfinę, nie wykryto natomiast p-MSH. p-LPH znajduje się tylko w przysadce mózgowej, ponieważ w innych tkankach ulega ona szybkiej konwersji do y-LPH i p-endorfiny, fkLPH składa się z polipeptydu złożonego z 7 aminokwasów (p-LPH 47.53), identycznego do sekwencji ACTH4.10. P-LPH pobudza lipolizę i mobilizację tkanki tłuszczowej, chociaż jej rola fizjologiczna jest niewielka. Najpewniej służy ona tylko za prekursora P-endorfiny. End orfi ny. p-endorfiny składają się z C-końcowej sekwencji 31 aminokwasów pLPH (ryc. 46-4). Endorfina ot i y są pochodnymi endorfiny p, od której zostało odszczepio-nych 15 lub 14 aminokwasów od fragmentu Ckońcowego. Peptydy te występują w przysadce mózgowej, gdzie ulegają acetylacji (patrz wyżej) i przez to inaktywacji biologicznej. W innych miejscach (np. w neuronach ośrodkowego układu nerwowego) nie ulegają biochemicznej modyfikacji i dlatego spełniają role neuroprzekainików lub neuromodulatorów. W ośrodkowym układzie nerwowym endorfiny wiążą się tymi samymi receptorami co opiaty morfinowe, dzięki czemu mogą uczestniczyć w kontroli percepcji bólu. Wykazują one 18—30-krotnie silniejsze działanie przeciwbólowe niż morfina (uwzględniając masę cząsteczkową tych substancji). Sekwencja aminokwasowa enkefaliny występuje w cząsteczce POMC, lecz nie jest ona wyprzedzana aminokwasami dwu zasadowymi, przez co widocznie nie ulega odszczepieniu i ekspresji.

Hormon pobudzający melanocyty (melanotropina, MSH). U niektórych gatunków zwierząt MSH pobudza melanogenezę, powodując rozproszenie śródkomórkowych ziarnistości melaniny, prze2 co dochodzi do ściemnienia skóry. W obrębie cząsteczki POMC zawarte są 3 różniące się od siebie cząsteczki MSH określane jako oc, P i y. Dwie z nich (a i p) wydzielane są przez niektóre inne gatunki zwierząt (poza człowiekiem). U ludzi, krążąca we krwi melanotropina zawarta jest w obrębie

większych cząsteczek a lub P-LPH. a-MSH wykazuje sekwencję aminokwasowa identyczną z sekwencją ACTHI_B, lecz jest acetylowana na końcu N cząsteczki. ot-MSH i CLIP występują najczęściej u zwierząt z dobrze rozwiniętym płatem pośrednim przysadki. Nie stwierdza się ich u ludzi w życiu pozapłodowym. Chorzy z niedoborem glukokortykoidów (choroba Addisona) wykazują nadmierną pigmentację skóry, spowodowaną nadmierną aktywnością MSH. Może być ona spowodowana nadmiernym wydzielaniem ACTH (prekursora a-MSH), lub, co jest bardziej prawdopodobne, współwystępującą zwiększoną sekrecją pi y-LPH, wykazujących aktywność MSH.

TYLNY PŁAT PRZYSADKI MÓZGOWEJ ZAWIERA DWA AKTYWNE HORMONY — WAZOPRESYNĘ I OKSYTOCYNĘ Wazopresyna, której nazwa wywodzi się stąd, że hormon ten podany w dawkach farmakologicznych podnosi ciśnienie tętnicze, określana jest również jako hormon antydiuretyczny (ADH). Ta ostatnia nazwa jest bardziej właściwa, ponieważ główne działanie fizjologiczne tego hormonu polega na pobudzaniu resorpcji wody w dystalnych kanalikach nerkowych. Drugim hormonem przysadki nerwowej jest oksytocyna. Hormon ten ma przyspieszać poród wywołując skurcze mięśni gładkich macicy. Ta fizjologiczna rola oksy tocyny jest jednak kwestionowana. Ma ona raczej uczestniczyć w wydzielaniu mleka przez gruczoł sutkowy. Wymienione dwa hormony wytwarzane są przez podwzgórze, skąd transportowane są aksoplazmą do zakończeń nerwowych tyinej części przysadki mózgowej. Pod wpływem odpowiednich bodźców hormony te są uwalniane do krwi, Celem takiego systemu regulacji wydzielania tych hormonów jest najpewniej uniknięcie bariery, dzielącej krew od tkanki mózgowej. ADH jest syntetyzowana głównie w jądrach nadwzrokowych (nuclei supraoptici), zaś oksytocyna w jądrach przykomorowych (nucłei paraventriculares). Każdy z tych hormonów transportowany jest aksonami wraz ze swoistymi białkami nośnikowymi, zwanymi neurotlzynami. Zarówno neurofizyna I, jak i II syntetyzowane są z oksytocyna i adiuretyną jako części jednego białka (czasem określonego jako propresofizyna), kodowanego przez pojedyn-

610 / ROZDZIAŁ 46

czy gen, Neurofizyna I i II są unikatowymi białkami o masie cząsteczkowej 19 000 (neurofizyna I) i 21 000 (neurofizyna II). ADH i oksytocyna wydzielane są oddzielnie do krążenia wraz ze swoimi neurofizynami. We krwi krążą jako polipeptydy wolne, nie związane z białkami osocza. Wykazują one bardzo krótki okres półtrwania, wynoszący 2—4 minuty. Struktura ADH i oksytocyny pokazana jest poniżej. Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cvs-Pro-Arg-Gly-NH

2

A rg i n i no wazo p res y na Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH

a

Liz y no wazop resy na Cys-Tyr-lle-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-G1y-NH

a

Oksytocyna

Każdy z tych hormonów jest nonapeptydem zawierającym cząsteczki cysterny w pozycjach 1 i 6 połączone ze sobą mostkiem dwusiarczkowym. Większość zwierząt wytwarza argininowazopresynę. U świń i spokrewnionych z nimi gatunków zwierząt w miejscu argininy w pozycji 8 występuje lizyna. Podobieństwo strukturalne miedzy ADH i oksytocyna tłumaczy, dlaczego hormony te wywołują pewne wspólne efekty biologiczne. Głównym miejscem inaktywacji tych peptydów jest wątroba, chociaż znaczne ilości ADH wydzielane są przez nerki. Oksytocyna Regulacja sekrećji. Drażnienie brodawek piersiowych jest głównym bodźcem uwalniającym oksytocynę. Drugorzędnymi bodźcami są rozdęcie pochwy i macicy. Wiele czynników pobudzających uwalnianie proiaktyny uwalnia również oksytocynę. Sugerowano nawet, że fragment oksytocyny jest czynnikiem uwalniającym prolaktynę. Estrogeny pobudzają, zaś progesteron hamuje syntezę oksytocyny i neurofizyny I.

Mechanizm działania. Mechanizm dzia-

łania oksytocyny jest nieznany. Powoduje ona skurcz mięśniówki macicy, przez co używana jest, w dawkach farmakologicznych, do zapoczątkowania porodu u kobiet. Jest ciekawe, że po zniszczeniu powrózka podwzgórzowo-przysadkowego u zwierząt ciężarnych nie zawsze obserwuje się zaburzenia przy urodzeniu poto-

mstwa. Główne działanie oksytocyny wydaje się jednak polegać na obkurczeniu komórek mięśniowo-nabłonkowych otaczających pęcherzyki sutkowe. W wyniku takiego działania mleko zawarte w przewodach pęcherzykowych ulega transportowi do brodawki sutkowej i wytryskowi. Receptory dla oksytocyny występują w błonach komórkowych zarówno macicy, jak i sutków. Liczba ich ulega wzrostowi pod wpływem estrogenów, zaś zmniejszeniu pod wpływem progesteronu. Wzrost stężenia estrogenów, natomiast spadek progesteronu bezpośrednio przed rozwiązaniem ciąży, dobrze tłumaczą występowanie zjawiska laktacji tuż przed porodem. Pochodne progesteronu są powszechnie stosowanymi substancjami hamującymi laktacje u kobiet po porodzie. Wydaje się, że oksytocyna i neurofizyna I wytwarzane są również w jajnikach, gdzie oksytocyna może hamować steroidogenezę. Strukturami niezbędnymi dla działania oksytocyny są: N-końcowa grupa — NH2 cysteiny, grupa fenolowa tyrozyny, grupy karboksyamidowe asparaginy, glutaminy i glicynamidu oraz mostek dwusiarczkowy. Przez delecje i substytucję wymienionych grup wytworzono liczne analogi oksytocyny, np. po usunięciu Nkoricowej grupy aminowej cystyny (w pozycji 1} powstała w ten sposób dea mi no oksytocyna wykazuje 4—5 krotnie większe działanie antydiuretyczne od oksytocyny. Hormon antydiuretyczny (ADH, wazopresyna) Regulacja sekrećji. Bodźce nerwowe, stymulujące uwalnianie ADH, ulegają aktywacji przez wiele różnorodnych czynników. Najważniejszym bodźcem fizjologicznym dla uwalniania ADH jest wzrost molalności osocza. W uwalnianiu ADH biorą udział osmoreceptory umiejscowione w podwzgórzu oraz baroreceptory, zlokalizowane w sercu i w innych obszarach układu naczyniowego. Rozcieńczenie krwi, obniżając molalność osocza, wywiera odwrotny (hamujący) wpływ na wydzielanie ADH. Wśród innych bodźców wydzielania ADH wymienić należy: stresy fizyczne i psychiczne oraz leki, takie jak acetylocholma, nikotyna i morfina. Wymienione bodźce pobudzają głównie syntezę ADH i neurofizyny II, nie wpływają natomiast na uwalnianie zapasów tego hormonu. Epinefryna oraz leki zwiększające objętość osocza hamują sekrecję ADH. Podobne działanie ma etanol.

PRZYSADKA MÓZGOWA I HORMONY PODWZGORZA / 611

Mechanizm działania. Najważniejszymi

komórkami docelowymi dla ADH w stanach fizjologicznych są komórki dystalnych kanalików krętych i zbiorczych nerki. Kanaliki te przechodzą przez rdzeń nerki, którego płyn śródmiąższowy wykazuje do 4-krotnie wyższą molalność niż osocze. Komórki tych kanalików są względnie nieprzepuszczalne dla wody, tak że w nieobecności ADH nie dochodzi do zagęszczenia moczu, co w konsekwencji zwiększa dobową objętość moczu powyżej 2 1. ADH zwiększa przepuszczalność komórek kanalikowych dla wody i umożliwia wyrównanie molalności moczu zawartego w kanalikach z hiperosmolalnym płynem śródmiąższowym. W wyniku tego procesu dobowa objętość moczu zmniejsza się do 0,5—1,01. Receptory ADH występują w luminalnych błonach ptezmatycznych komórek kanalikowych. Receptor dla ADH, po połączeniu się z hormonem, aktywuje uyklazę adenylanową, zaś pozostały cAMP pełni funkcję mediatora śródkomórkowego ADH w komórkach nerkowych. To działanie fizjologiczne uzasadnia określenie „hormon antydiuretyczny". cAMP oraz inhibitory ibsfodiesterazy np. kofeina, wykazują działanie podobne do ADH. W badaniach in vivo, wzrost stężenia wapnia w płynie opłukującym luminalną powierzchnię komórek kanalikowych, hamuje efekt ADH na przezcewkowy ruch wody, najpewniej poprzez hamowanie cyklazy adenylanowej. Wzrost stężenia Ca2+ nie hamuje jednak samego działania cAMP. Obserwacja ta choć częściowo tłumaczy patomechanizm wydalania zwiększonych ilości moczu u chorych z hiperkalcemią. Patofizjologia. Nieprawidłowości w sekrecji lub działaniu ADH mogą być przyczyną moczówki prostej, charakteryzującej się wydalaniem wzmożonych ilości rozcieńczonego moczu. Moczówka prosta typu ośrodkowego spowodowana jest niedoborem ADH, uwarunkowanym zniszczeniem drogi podwzgórzowo-przysadkowej (występującym przy złamaniach kości podstawy czaszki), guzem mb infekcją przysadki mózgowej, lub dziedzicznym defektem syntezy tego hormonu. W moczówce prostej nerkowopochodnej (w postaci dziedzicznej), wydzielanie ADH jest prawidłowe, natomiast receptor dla tego hormonu jest uszkodzony (p. tab. 43-2). Dziedziczny defekt receptora ADH należy odróżnić od defektu nabytego, występującego w nabytej moczówce prostej norko w o pochodnej, spowodowanej najczęściej po-

dawaniem farmakologicznych dawek soli litu chorym z psychozą maniakalno-depresyjną. Nieadekwatne w stosunku do aktualnej osmolalności osocza, wzmożone wydzielanie ADH występuje u chorych z różnymi guzami (ektopowe nadmierne wydzielanie ADH przez nowotwór), zwykle z nowotworami płuc lub u chorych z zakażeniami płuc, chorobami mózgu lub niedoczynnością tarczycy. Przymiotnik „nieadekwatne" oznacza, że występuje normalna lub nawet wzmożona sekrecja ADH u osób wykazujących hipoosmolalność osocza. W następstwie, u takich chorych stwierdza się stałą lub postępującą hiponatremię spowodowaną rozcieńczeniem osocza oraz wydzielaniem moczu hipertonicznego.

PIŚMIENNICTWO Hormony przedniego płata przysadki

Douglass J, Civeili O, Herbert E: Polyprotein gene expression: Generation ofdiversityof neuroendocrine peptides. Annu Rev Biochem 1984;53:665. Frantz AG: Prolactin. N Engl J Med 1978;298:201. Krieger DT: The multiple faces of pro-opiomelanocortin, a prototype precursor molecule. Clin Res 1983;3:342. Nikolics K et al: A prolactin-inhibiting factor with the precursor for human gonad otropin-releasing hormone. Naturę 1986;316:511, Pierce JG, Parsons TF: Glycoprotein hormones: Structure and function. Annu Rev Biochem 198!; 50:465. Seeburg P: The human growth hormone gene family: Structure and evolution of the chromosomal locus. Nucletc Acids Res 1983;11:3939.

Hormony tylnego płata przysadki

Chord IT: The posterior pituitary gland. Clin Endocrinol 1975;4:89. Robertson GL: Regulation of vasopressin function in health and disease. Recent Próg Norm Res 1977; 33:333.

Hormony podwzgórza Imura H et al; Effect of CNS peptides on hypothalamic regulation of pituitary secretion. Adv Biochem Psychopharmacoi 1981;28:557. Labrie F et al: Mechanism of action of hypothalamic hormones in the adenohypophysis. Annu Rev Physiol 1979;41:555. Reichlin S; Systems for the study of regulation of neuropeptide secretion. In: Neurosecretion and Brain Peptides: ImpUcationsfor Brain Function and Neurological Disease, Martin JB, Reichlin S, Bick KL (editors). Raven Press, 1981.

4 7

Hormony tarczycy

Daryl K. Granner, MD

WPROWADZENIE Hormony tarczycy regulują ekspresję genów, różnicowanie tkanek i ogólny rozwój. Gruczoł tarczowy wytwarza dwa jodowane aminokwasy: a^^-trijodotyroninę (T3) i 3,5,3' ,5'-tetrajodotyroninę (T4, tyroksyna). Ich znaczenie w regulacji przemiany materii, rozwoju i różnicowaniu tkanek poznano już dawno. Hormony te, których strukturę przedstawiono na ryc. 47-1, regulują ekspresję genów przy pomocy mechanizmów podobnych do występujących przy hormonach steroidowych.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Choroby tarczycy należą do najczęściej występujących endokrynopatii. Zarówno diagnostyka jak i leczenie tyreopatii są ściśle oparte na znajomości fizjologii i biochemii hormonów tarczycy. Dostępność radioizotopów jodu w istotnym stopniu pomogła wyjaśnić jego fizjologię i biochemię. Radioaktywny jod, gromadząc się w tarczycy, jest szeroko wykorzystywany w diagnostyce i terapii zaburzeń jej

Skróty używane w tym rozdziale DIT - dijodotyrozyna MIT — monojodotyrozyna T3 — trijodotyronina T4 — tyroksyna, tetrajodotyronina TBG — globulina wiążąca tyroksynę TBPA — frakcja prealbumin wiążących tyroksynę TRH — hormon pobudzający tyreotropinę, tyreoliberyna TSH — tyreotropina TSI — immunoglobuliny klasy IgG pobudzające tarczycę

funkcji. Radioaktywny jod kryje w sobie również potencjalne ryzyko wywołania raka tarczycy, jeśli gruczoł ten przez dłuższy czas jest eksponowany na działanie radioizotopu (np. po wybuchach nuklearnych). Niebezpieczeństwo to dotyczy szczególnie niemowląt i młodzieży, u których komórki tarczycy dzielą się jeszcze aktywnie.

BIOSYNTEZA HORMONÓW TARCZYCY ZWIĄZANA JEST Z TYREOGLOBULINĄ I PRZEMIANĄ JODKÓW Hormony tarczycy odróżniają się od innych hormonów tym, że dla ich aktywności biologicznej potrzebny jest pierwiastek śladowy jod. W większej części świata jod występuje w niewielkich ilościach w ziemi, co sprawia, że jego zawartość w środkach spożywczych jest mała. Ten fakt tłumaczy, dlaczego rozwinął się złożony mechanizm zatrzymywania tego istotnego pierwiastka śladowego w ustroju i przekształcenia go w postać nadającą się do wbudowywania do związków organicznych. W tym samym czasie tarczyca musi syntetyzować tyroninę i synteza ta zachodzi w tyreoglobulinie. Procesy te zostaną omówione oddzielnie, chociaż przebiegają równolegle.

Tyreoglobulina jest białkiem złożonym

Biosynteza. Tyreoglobulina jest prekursorem T* i T3. Jest to duże białko jodowane i glikozylowane o masie cząsteczkowej 660 000 przy czym węglowodany stanowią 8—10%, zaś jod 0,2—1% całej masy tyreoglobuliny. Zawartość jodu w cząsteczce tyreoglobuliny zależna jest od zawartości tego pierwiastka w pożywieniu. Tyreoglobulina składa się z dwóch podjednostek.

HORMONY TARCZYCY I 613 NH,

ści luminalnej i magazynowana w pozakomórkowym koloidzie "pęcherzykowym. Ze światła

pęcherzyków tyreoglobulina ponownie dostaje się do komórek pęcherzykowych. Przemieszczając się od powierzchni luminalnej do bazal3-M o no) od o tyrozyna (MIT) nej komórek pęcherzykowych tyreoglobuliny ulega hydrolizie do aktywnych hormonów T 3 I i T4. Wszystkie wymienione etapy biosyntezy CH,CH-COOH nasilają się pod wpływem TSH. Hormon ten ( l u b cAMP) stymuluje również transkrypcje genu kodującego tyreoglobutinę. NH, Hydroliza. Tyreoglobulina jest zapasową 3,5-Dljodotyrozyna (DIT) postacią T3 i T4 w koloidzie. W normalnej tarczycy zapasy dla tych hormonów wystarczają na kilka tygodni. W ciągu zaledwie kilku CH,CH-COOH minut po zadziałaniu TSH (lub cAMP) stwierdza się znaczny wzrost mikrokosmków na szczytowej (apikalnej) dłonie komórek pęcherzykowych. W procesie tym, zależnym od mik3,5,3',5'-Tetrajodotyronlna (tyroksyna, TJ rotubul, tyreoglobulina jest wychwytywana przez mikrokosmki i przemieszczana do komóI I rek pęcherzykowych mechanizmem pinocy tozy. Te fagosomy zlewają się z lizosomami two-CH 2 CH-COOH 2 rząc fagolizosomy, w których zachodzi hydro____/ | liza tyreoglobuliny do aminokwasów, w tym NH2 również do jodotyronin, pod wpływem różnych 3,5j3'-Trljodotyronina (T3) proteaz kwaśnych i peptydaz. Powstałe T4 i T3 I I wydalane są z bazalnego bieguna komórek pęcherzykowych do krwi, najpewniej za pośrednictwem transportu ułatwionego. Stosunek T4:T3 we krwi tarczycy jest mniejszy niż w tyreoglobulinie, co sugeruje, że zachodzi określona, wybiórcza dejodynacja T4 w tym narządzie endokrynnyrn. Dziennie wydzielanych jest ok, 3,3',5'-Trl]odolyronlna {odwrotna T,, rTJ 50 (j.g jodu pod postacią hormonów tarczycy. Przy średnim wychwycie jodu przez tarczycę Ryc. 47-1. Struktura chemiczna hormonów tar(wynoszącym 25—30% jodu spożytego z pokarczycy i związków pokrewnych. mami) zapotrzebowanie na ten pierwiastek wynosi 150—200 (ig/d. Jak o tym wspomniano już wyżej, większość Zawiera ona 115 reszt tyrozynowych, z których każda jest potencjalnym miejscem jodowania. jodu zawartego w tyre o globulinie nie występuje Około 70% jodu cząsteczki tyreoglobulinowej w postaci jodotyronin, lecz (ok. 70%) pod występuje w postaci nieaktywnych prekurso- postacią nieaktywnej MIT i DIT. Te ostatnie rów, tj. monojodotyrozyny (MIT) i dijodotyrozy- dwa aminokwasy są uwalniane w wyniku hydny {DIT), zaś 30% w postaci reszt jodo ty ronino- rolizy tyreoglobuliny. Jod zawarty w MIT i DIT wych T4 i T3. Przy dostatecznej podaży jodu zostaje „odzyskany" dzięki enzymowi — dejostosunek T4 i T3 wynosi 7:1. W stanach niedobo- dynazie. Enzym ten, który jest zależny od ru jodu ten stosunek ulega zmniejszeniu, podob- NADPH, występuje również w nerkach i wątnie jak stosunek DIT:MIT. Przyczyna syntezy robie. Jod uwolniony z MIT i DIT stanowi dużej cząsteczki tyreoglobuliny, złożonej z ok. ważną pulę tego pierwiastka w obrębie tarczycy 5 000 aminokwasów, po to by wytworzyć i różni się od anionu I~ wchodzącego do zaledwie kilka tylko cząsteczek zmodyfikowa- tarczycy z krwi. W stanie równowagi ilość jodu nego dipeptydu, wydaje się tkwić w tym, że wchodzącego do tarczycy jest równa ilości tego sprzęgania reszt tyrozylowych i organifikacja pierwiastka opuszczającego ten gruczoł. Jeżeli jodu wymagają znacznej konformacji cząsteczki tyreoglobuliny. Tyreoglobulina jest syntetyzowana w części bazalnej komórek pęcherzyków tarczycowych skąd transportowana jest do czę-

CH,CH-COOH

HO

I NH,

"A

*=* 'L,

,-

614 / ROZDZIAŁ 47

jedna trzecia część jodu tyre o globulin owego i DIT, są dostępne ponownej biosyntezie w obopuszcza tarczycę (pod postacią T4 i T3),pozos- rębie tego gruczołu. Przemiana jodków składa tale dwie trzecie, pochodzące z dejodynacji MIT się z kilku odrębnych etapów (p. ryc. 47-2). I-

ŚWIATŁO PĘCHERZYKA TARCZYCOWEGO

PRZESTRZEC P0ZAK0M0RKOWA (SRODMtĄŻSZOWA) MIT MIT. DIT, DIT Sprzęganie'

Ryc. 47-2. Schemat przemiany anionu jodkowego I w pęcherzyku tarczycowym Przedstawiono komórkę pęcherzyka tarczycowego zwróconą u góry do światła pęcherzyka (przestrzeń zakropkowana), zaś na dole do przestrzeni pozakomórkowej (śródmiązszowej). Aniony ! wchodzą do komórki za pomocą pompy lub dyfuzji biernej. Synteza hormonów tarczycy zachodzi w świetle pęcherzyka; jest ona reakcją wieloetapową. W wielu jej etapach udział bierze peroksydaza. Uwolnienie hormonów tarczycy z tyreoglobuliny zachodzi przez hydrolizę. Tgb — tyreoglobulina, MIT — monojodotyrozyna, DIT — dijodotyrozyna, Ta — trijodotyronina, T, — tetrajodotyronina. Gwiazdka oznacza miejsca występowania dztśdzicznych defektów enzymatycznych, będących przyczyną wrodzonego wola przebiegającego często z niedoczynnością tarczycy.

T3, T,

HORMONY TARCZYCY / 615

1. Zagęszczanie jodków (I )w tarczy-

cy. Gruczoł tarczowy, podobnie jak wiele innych narządów lub tkanek typu nabłonkowego (np. gruczoł sutkowy, kosmówka, ślinianki, żołądek) wykazują zdolność zagęszczania I", wbrew obecności znacznego gradientu elektrochemicznego. Jest to energochłonny proces sprzężony z pompą zależną od Na+/K+ ATP-azy. Aktywność tarczycowej pompy I~ można oddzielić od kolejnych etapów biosyntezy hormonów tarczycy stosując inhibitory procesu organifikacji I~, będące pochodnymi tiomocznika (ryc. 47-3). Iloraz ze stężenia jodu w tarczycy (T) do stężenia tego pierwiastka we krwi (S) (iloraz T:S) jest odzwierciedleniem aktywności wymienionej pompy lub mechanizmu zagęszczającego I~. Aktywność tej pompy wyrażona ilorazem T/S jest kontrolowana głównie przez TSH i wahać się może od 500 u zwierząt przewlekle stymulowanych TSH, do 5 lub mniej u zwierząt pozbawionych przysadki mózgowej. U ludzi spożywających dietę o normalnej zawartości jodu iloraz T:S wynosi ok. 25. Tylko bardzo mała ilość jodków wnika do tarczycy na zasadzie dyfuzji. Anion I", który nie ulega organifikacji do MIT lub DIT (ok. 10%) opuszcza tarczycę w ten sam sposób. Mechanizm transportu I~ do tarczycy hamują dwie grupy związków. Pierwszą grupę tworzą nadchlorany (ClOl), nadreniany (ReOi), nadtechnecjany (TeO'i), tj. aniony o podobnej częściowo swoistej objętości do anionu I~. Aniony te działają konkurencyjnie do I~ w odniesieniu do przenośnika jodkowego i ulegają zagęszczaniu przez tarczycę. Radioaktywny TeO^. jest powszechnie stosowany w badaniach transportu anionu I" u ludzi. Linearny anion rodankowy (SCN~) jest przedstawicielem drugiej grupy związków będących kompetycyjnymi inhibitorami transportu I~, lecz nie ulegającymi zagęszczeniu w tarczycy. Te inhibitory trans-

NH2

I NH, Tio/noeznik

H

NC

y H Tlouracyl

portu I~ pozwalają ujawnić występowanie szybkiej dyfuzji wymienialnego I z tarczycy i wykorzystywane są w diagnostyce defektów procesu organifikacji jodu w tarczycy. Po podaniu inhibitora transportu I~ w stężeniu hamującym koncentracje I~, ilość zgromadzonego w tarczycy I ' (mierzonego z reguły przy użyciu izotopu 131I) opuszczającego ten gruczoł jest miarą frakcji jodu niezwiązanego, tj. jodu, który nie uległ organifikacji. U chorych z częściowym defektem w zakresie organifikacji jodu ilość 131I uwalniającego się z tarczycy po podaniu nadchloranów jest większa niż u osób zdrowych. 2. Utlenianie l ~ . Tarczyca jest jedyną tkanką wykazującą zdolność utleniania anionu I~ do wyższej wartościowości. Jest to niezbędny etap w procesie organifikacji I" i biosyntezy hormonów tarczycy. Tśn etap wymaga obecno ści peroksydazy, zawierającej hem i występuje na luminalnej powierzchni komórek pęcherzy ków tarczycowych. Peroksydaza tarczycowa jest białkiem tetramerycznym o masie cząsteczkowej 60 000. Do procesu utlenienia enzym ten wymaga nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru (HjCb) wytwarzany jest przez enzym zależny od NADPH, przypominający reduktaze cytochromu C. Utlenianie I~, i co za tym idzie, jego wbudowywanie do MIT i DIT, hamuje wiele związków. Do najważniejszych z nich, z punktu widzenia klinicznego, należą leki będące pochodnymi tiomocznika. Niektóre z nich przedstawiono na ryc. 47-3. Są one znane jako „leki przeciwtarczycowe7', ponieważ działają one hamująco na ten etap biosyntezy hormonów tarczycy. 3. Jodowanie tyrozyny. Utleniony anion I~ reaguje z resztami tyrozylowymi tyreoglobuliny; w reakcji tej uczestniczy prawdopodob nie tyreoperoksydaza. Najpierw ulega jodowa niu węgiel w pozycji 3, a następnie węgiel w pozycji 5 pierścienia aromatycznego tyrozy-

I >»

VN—C f S=C

,CH N-C—C3H7 H

PropylotlouracyJ

Ryc. 47-3. Leki przeciwtarczycowe, pochodne tiomocznika.

H N— CH

s=<( N—CH CH3

616 / ROZDZIAŁ 47

ny. W wyniku tych reakcji powstaje MIT iub DIT. Reakcja ta, czasami określana jako organifikacja jodu, zachodzi w ciągu sekund w świetle pęcherzyka tarczycowego. Po organifikacji jod niełatwo opuszcza tarczyce. Wolna tyrozyna może ulec jodowaniu, lecz nie zostaje wbudowywana do białek, ponieważ żaden tRNA nie rozpoznaje jodowanej tyrozyny.

4. Sprzęganie jodotyrozyn. Sprzęganie

dwóch cząsteczek DIT w celu wytworzenia T4) lub jednej cząsteczki DIT z jedną cząsteczką MIT, w celu wytworzenia Tj, zachodzi w obrębie cząsteczki tyreo globu liny. Nie wyklucza się, że również wolna cząsteczka MIT względnie DIT ulega sprzęganiu ze związaną w tyreoglobulinę cząsteczkę DIT. Ponieważ nie znaleziono dotychczas oddzielnego enzymu sprzęgającego, a proces ma charakter reakcji,utleniania, przyjmuje się, że reakcję tę katalizuje tyreoperoksydaza (patrz pkt 2), pobudzając tworzenie się wolnych rodników jodotyrozynowych. Taką hipotezę potwierdza m.in. to, że te same leki, które hamują utlenianie I~, hamują również proces sprzęgania. Powstałe hormony tarczycy stanowią integralną część tyreoglobuliny tak długo, jak długo ta ostatnia nie ulega degradacji. Hydrolizę tyreoglobuliny pobudza TSH, natomiast hamuje I". Ten ostatni fakt jest czasami wykorzystywany w leczeniu nadczynności tarczycy za pomocą jodku potasowego.

HORMONY TARCZYCY ULEGAJĄ ZWIĄZANIU PRZEZ BIAŁKA NOŚNIKOWE W OSOCZU A NASTĘPNIE PRZEMIANIE Połowa do \ ogóinoustrojowego T4 i T3 znajduje się poza tarczycą i większość tych hormonów jest związanych przez dwa swoiste białka wiążące, tj.przez globulinę wiążącą tyroksynę

(thyroxine binding globulin —TBG) oraz prcalhumine wiążącą tyroksynę (thyroxine binding prealbumin — TBPA). Pod względem ilościowym ważniejsza z nich jest TBG, będąca glikoproteiną o masie cząsteczkowej 50000. Wykazuje ona 100-krotnie większe powinowactwo do T4 i T3 niż TBPA. Jej pojemność wiązania tych hormonów wynosi 20 ug na 100 ml osocza. W warunkach prawidłowych TBG wiąże niekowalencyjnie prawie całą ilość T4 i T3 występującą w osoczu (p. tab. 47-1). Niewielka pod względem ilościowym frakcja T4i T3 nie związana z białkami nośnikowymi odpowiedzialna jest za aktywność biologiczną tych hormonów. Pomimo że ogólne slężenia T4 i T3 znacznie się od siebie różnią, stężenie wolnej (nie związanej z białkami nośnikowymi) T3 jest zbliżone do stężenia wolnej T4, chociaż okres póltrwania T4 jest 4-krotnie dłuższy od T3. Stężenie TBG zależne jest od wielu czynników regulacyjnych co ma istotne znaczenie dla badań czynności tarczycy, w których oznacza się najczęściej całkowite stężenie T4i T3 a nie stężenie frakcji wolnej tych hormonów. Biosynteza TBG zachodzi w wątrobie i wzrasta pod wpływem estrogenów (np. u kobiet ciężarnych lub zażywających doustne leki antykoncepcyjne). Spadek syntezy TBG obserwuje się po leczeniu androgenami lub glikokortykoidami oraz w przebiegu pewnych chorób wątroby. Zdarzają się również genetycznie uwarunkowana nadprodukcja lub niedobory TBG. We wszystkich tych stanach obserwuje się zmienione ogólne stężenia T4i T^, natomiast nie zmienione stężenia wolnej frakcji (nie związanej z białkami nośnikowymi) tych hormonów. Fenytoina i kwas salicylowy są lekami kompetycyjnie wiążącymi się z TBG (przez co wypierają T4 i T3 z TBG). W następstwie działania tych leków dochodzi do spadku ogólnego stężenia tych hormonów we krwi, przy czym stężenie frakcji

Tabela 47-1. Charakterystyka T. i T, występujących w osoczu krwi Całkowite stężenie hormonu nmol/l (Kg/dl)

T3

103 (8) 2,29 ' (0,15)

Stężenie wolnego hormonu (nie związanego z białkiem)

Okres półtrwania (w dniach)

jako % stężania całkowitego

w ng/dl

0,03

-2,24

3,0x10~11

6,5

0,3

-0,4

-0,6x10"11

1,5

w molach

HORMONY TARCZYCY / 617

nie związanej z TBG (stężenie wolnej T4 i T3) nie ulega zmianie. Ten fakt należy uwzględnić przy interpretacji wyników testów diagnostycznych. W procesie pozatarczycowego odjodowania T4 ulega konwersji do T3. Skoro w komórkach docelowych T3 wykazuje dziesięciokrotnie silniejsze powinowactwo do receptora niż T4, uważa się, że T3 jest głównym, metabolicznie aktywnym hormonem tarczycy. Około 80% krążącej we krwi T4 ulega w tkankach obwodowych konwersji do T3 lub odwrotnej T3 (rTj), Ta konwersja jest źródłem większości Tj powstającej w ustroju. Odwrotna T3 jest bardzo słabym agonistą T3 powstającym we względnie większych ilościach w przewlekłych chorobach, w stanach głodzenia węglowodanowego i u płodów. Propylotiouracyl i propranolol zmniejszają konwersje T4 do T3. Inne mechanizmy przemiany hormonów tarczycy polegają na ich całkowitym odjodowaniu oraz inaktywacji poprzez deaminację i dekarboksylację. W wyniku glukuronidacji lub sulfatacji zachodzącej w wątrobie, powstają cząsteczki bardziej hydrofilne, wydalane z żółcią, po czym ponownie resorbowane z przewodu pokarmowego, odjodowane w nerkach i wydalone z moczem pod postacią glukuronidów.

HORMONY TARCZYCY DZIAŁAJĄ NA POZIOMIE JĄDRA KOMÓRKOWEGO Hormony tarczycy wiążą się ze swoistymi receptorami wysokiego powinowactwa zlokalizowanymi w jądrze komórkowym komórek docelowych. T3 wykazuje 10-krotnie silniejsze powinowactwo do tych receptorów niż T4. Pytanie, czy cała aktywność biologiczna hormonów tarczycy pośredniczona jest przez T3, jest przedmiotem spornym, ponieważ zarówno T4, jak i T3 są hormonami aktywnymi. Hormony tarczycy wiążą się z białkiem cytoplazmy wykazującym słabe powinowactwo do Tj i T4. Białko to jest zapewne różne od białka receptorowego jąder komórkowych. Wiązanie hormonów tarczycy przez białka cytoplazmatyczne ma najpewniej na celu „trzymanie" tych hormonów w sąsiedztwie swoistych receptorów jądrowych. Ogólna funkcja hormonów tarczycy polega na stymulacji konsumpcji tlenu. Według hipotezy Edelmana i współpracowników znaczna ilość energii zużytkowana przez komórkę wykorzystywana jest do napędzania pompy Na ł/K+-

-ATP-azowej. Hormony tarczycy nasilają czynność tej pompy poprzez zwiększanie liczby jednostek pompujących. Skoro wszystkie komórki mają taką pompę i faktycznie reagują na hormony tarczycy, uważa się, że podstawowy mechanizm ich działania polega na zwiększaniu utylizacji ATP i związanej z nią wzmożonej konsumpcji tlenu w procesie fosforylacji oksydacyjnej. Innym ważnym skutkiem działania T4 i T3 jest wzrost syntezy białka oraz dodatni bilans azotowy. Hormony tarczycy, podobnie jak hormony steroidowe, pobudzają lub hamują syntezę białka nasilając lub obniżając transkrypcję odpowiednich genów (p. ryc. 45-1). W przypadku T3 i T4 czynnikiem działającym w układzie trans jest kompleks jecepiora z hormonem tarczycowym zawsze umiejscowionym w jądrze komórkowym. Element odpowiedzi hormonalnej, działający w układzie cis oraz wiążący się z tym kompleksem, składa się z następującej centralnej sekwencji DNA GATCAnnnnnn TGACC (p. tab. 45-3). Między tymi dwiema kłasami hormonów uczestniczących w procesie wzrostu, tj. między hormonami tarczycy a samym hormonem wzrostu (somatotropiną), istnieje ciekawa współpraca. T3 i glukokortykoidy nasilają transkrypcję genu kodującego hormon wzrostu, przez co wzrasta biosynteza GH. Ten fakt wyjaśnia klasyczną obserwacje braku GH w przysadkach mózgowych zwierząt z niedoborem Tj. Wyjaśnia on również, chociaż tylko częściowo, anabohczne działanie tego ostatniego hormonu. Bardzo duże stężenia T., są przyczyną spadku syntezy białka oraz wystąpienia ujemnego bilansu azotowego. Hormony tarczycy są znanymi, ważnymi modulatorami procesów rozwojowych. Jest to najlepiej widoczne w metamorfozie płazów. I tak hormony tarczycy są potrzebne w procesie przekształcenia się kijanki w żabę. W procesie tym dochodzi do resorpcji ogonka, proliferacji zawiązków kończyn, konwersji syntezy hemoglobiny płodowej na hemoglobinę typu dorosłego, pobudzenia enzymów cyklu mocznikowego (syntetazy karbamoilofosforanowej), przez co dochodzi do wydalania mocznika zamiast NHt oraz do zmian naskórka. Wymienione zmiany są zapewne wynikiem regulacji ekspresji swoistych genów przez te hormony. Hormony tarczycy są potrzebne do normalnego rozwoju człowieka. Niedoczynność tarczycy występująca w życiu płodowym lub u noworodków jest

618 / ROZDZIAŁ 47

przyczyną matołectwa (kretynizmu); jest to stan chorobowy charakteryzujący się licznymi defektami wrodzonymi oraz ciężkim nieodwracalnym niedorozwojem umysłowym. PATOFIZJOLOGIA WIELU CHORÓB TARCZYCY WYKAZUJE ZWIĄZEK Z SEKRECJĄ TSH, T 3 iT, Wole oznacza powiększoną tarczycę Wolem określa się jakiekolwiek powiększenie tarczycy. Wole proste jest wyrazem mechanizmu kompensacyjnego spowodowanego niedostatecznym wytwarzaniem hormonów tarczycy. Wspólnym mianownikiem dla wszystkich tych stanów jest podwyższony poziom TSH w surowicy krwi. Wśród przyczyn wola prostego należy wymienić niedobór jodków w pożywieniu, nadmierną podaż jodków u osób z uszkodzonym mechanizmem autoregulacji syntezy hormonów tarczycy oraz różnorodne dziedziczne zaburzenia biosyntezy hormonów tarczycy. Wśród tych ostatnich można wymienić:)) zaburzenia w zakresie transportu anionów I~, 2) zaburzenia procesu jodowania lub 3) sprzęgania, 4) niedobór dejodynazy oraz 5) biosyntezę nieprawidłowych białek jodowanych. Występowanie częściowych zaburzeń na poziomie poszczególnych etapów biosyntezy hormonów tarczycy może być przyczyna występowania wola prostego u osób dorosłych. Ciężkie zaburzenia natomiast są przyczyną nied oczy nnośti tarczycy. Leczenie wola prostego polega na podawaniu egzogennych hormonów tarczycy. Suplementacja lub restrykcja podaży I są właściwym postępowaniem tylko w określonych rodzajach wola. Niedostateczna ilość wolnej T, lub T4 jest powodem niedoczynności tarczycy Taką sytuację spotyka się w pierwotnej niedoczynności tarczycy, lecz może ona być również spowodowana chorobą przysadki mózgowej lub podwzgórza. W niedoczynności tarczycy stwierdza się obniżenie podstawowej przemiany materii oraz aktywności innych procesów zależnych od hormonów tarczycy. Głównymi objawami niedoczynności tarczycy są: zwolnienie czynności serca, nadciśnienie rozkurczowe, ogólne spowolnienie, senność, zaparcia, nadwrażliwość na zimno, sucha skóra, łamliwość włosów oraz bladożółta cera. Obec-

ność innych objawów zależna jest od wieku, w którym choroba się rozwinęła. Niedoczynność tarczycy, pojawiająca się w późnym dzieciństwie, przejawia się niskim wzrostem, nte ma tu jednak upośledzenia umysłowego. Różne rodzaje etiologiczne niedoczynności tarczycy leczy się podawaniem egzogennych hormonów tego gruczołu. Nadczynność tarczycy (tyreotoksykoza) spowodowana jest nadmiernym wytwarzaniem hormonów tarczycy Wiele jest przyczyn nadczynności tarczycy. W USA w większości przypadków przyczyną nadczynności tarczycy jest choroba Gravesa. Jest ona spowodowana wytwarzaniem immutioglobulin klasy IgG pobudzających receptory tyre-

otropinowe (thyroid stimulating immunoglobulins — TSI) (p. tab. 43-2). Są one przyczyną powiększania się tarczycy i nadmiernej, niekontrolowanej biosyntezy T3 i T4, spowodowane nie wy stąpieniem sprzężenia zwrotnego między TSI a wytwarzaniem hormonów tarczycy. Objawy chorobowe dotyczą wielu układów. Wśród nich należy wymienić tachykardię, wysoką amplitudę ciśnienia skurczowo-rozkurczowego, nerwowość, bezsenność, chudnięcie pomimo wzmożonego apetytu, osłabienie, nadmierne pocenie się, nietolerancję ciepła oraz zaróżowioną, wilgotną skórę. Leczenie nadczynności tarczycy spowodowanej chorobą Gravesa polega na stosowaniu leków blokujących biosyntezę hormonów tarczycy, niszczeniu miąższu tarczycowego za pomocą radioaktywnego jodu (ŁilI) lub równoczesnym stosowaniu obu sposobów terapii. Czasami usuwa się tarczycę chirurgicznie. PIŚMIENNICTWO Chopra U et al: Pathways of metabolism of thyroid hormones. Recent Próg Horm Res 1978;34:531. Larsen PR: Thyroid-pituitary iateraction: Feedback regulation of thyrotropin secretion by thyroid hormones. N Engl J Med 1982;396:23. Oppenheimer JH: Thyroid hormone action at the nuciear level. Ann Intern Med 1985;102:374. Robins J et al: Thyrosine transport proteins of plamsa: Molecular properties and biosynthesis. Recent Próg Horm Res 1978;34:477. Samuels H: Regulation of gene expression by thyroid hormone. J Clin Invest 1988;81:957.

Hormony regulujące przemianę wapniową

4 8

Dary/ K. Granner, MD

WPROWADZENIE Jony wapniowe są regulatorami licznych ważnych procesów fizjologicznych i biochemicznych. Wśród nich należy wymienić pobudliwość nerwowo-mięśniową, krzepnięcie krwi, procesy sekrecyjne, integralność morfologiczną błon, transport przez błony plazmatyczne, reakcje enzymatyczne, uwalnianie hormonów i neuroprzekaźników oraz śródkomorkowe działanie licz-

nych hormonów. Ponadto właściwe stężenia Ca2+ iPOJ~wpłyniepozakomórkowymiokostnej^potrzebne są w procesie mineralizacji kości. Do prawidłowego przebiegu wymienionych procesów stężenie CaI+ w osoczu musi być utrzymywane w wąskich granicach. Treścią tego rozdziału jest wyjaśnienie mechanizmów zabezpieczających izokalcemię.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Odchylenia stężenia wapnia zjonizowanego od wartości prawidłowej mogą być przyczyną licznych zaburzeń i są groźne dla życia. Aż 3% chorych hospitalizowanych wykazuje zaburzenia homeostazy wapniowej.

WAPŃ WYSTĘPUJE W KOŚCIACH I PŁYNIE P0ZAK0MÓRKOWYM Zawartość wapnia w ustroju wynosi ok. 1 kg. Z tej ilości 99% znajduje się w kościach, gdzie wraz z fosforanami tworzy kryształki hydroksyapatytu, stanowiące nieorganiczny składnik struktury kości. Kość jest tkanką dynamiczną, ulegającą ciągłej przebudowie pod wpływem zmieniających się obciążeń. W stanie równo-

wagi nasilenie osteogenezy (nowotworżenia kości) jest równa nasileniu osteolizy (resorpcji kości). Większość wapnia występującego w kościach nie jest swobodnie wymienialna z wapniem płynu pozakomórkowego (ECF). Tak więc oprócz funkcji mechanicznej kości są wielkim rezerwuarem wapnia. Około 1% wapnia występującego w kościach stanowi pulę wapnia wymienialnego. Ta pula tworzy wraz z drobną częścią wapnia przestrzeni podokostnowej (wynoszącą 1 % wapnia całkowitego tej przestrzeni) tak zwaną wymienialną pulę Ca*+. Hormony omawiane w tym rozdziale regulują stężenie wapnia w płynie pozakomorkowym oddziaływując na transport wapnia poprzez błonę oddzielającą przestrzeń wodną pozakomórkową systemową od przestrzeni wodnej kostnej (jest to przestrzeń otaczająca osteocyty i umiejscowiona pod warstwą osteoblastów i osteoklastów — przyp. tłumacza). Transport ten pobudza głównie parathormon, chociaż uczestniczy w nim również kalcytriol (1,25-dihydroksycholekalcyferol). Obecny w osoczu wapń występuje w trzech postaciach: l)jako wapń w kompleksach z kwasami organicznymi, 2) związany z białkami i 3) /jonizowany. Około 6% wapnia całkowitego osocza jest związanych (skompleksowanych) z anionami cytrynianowymi, fosforanowymi lub innymi. Pozostały wapń występuje w postaci związanej z białkami (głównie albuminami) lub zjonizowanej, nie związanej z białkami (po 47% wapnia całkowitego). Stężenie wapnia zjonizowanego (Ca2+) u większości ssaków, ptaków i ryb słodkowodnych utrzymywane jest w stężeniach od 1,1 do 1,3 mmol/1 i stanowi biologicznie aktywną frakcję tego pierwiastka. Ustrój człowieka wykazuje niewielką tolerancję na znaczniejsze odchylenia stężenia Ca2+ od

620 / ROZDZIAŁ 48

wymienionych wartości. W razie spadku stężenia wapnia zjonizowanego zwierzę wykazuje wzmożoną pobudliwość nerwowo-mięśniową i mogą wystąpić drgawki tężyczkowe. Znaczne wzrosty stężenia wapnia w osoczu mogą być przyczyną śmierci spowodowanej porażeniem mięśni i śpiączką. Stężenie wapnia zjonizowanego w osoczu wraz ze stężeniem towarzyszącego mu anionu fosforanowego znajduje się blisko ich iloczynu rozpuszczainości. Dlatego wydaje się, że wiązanie wapnia z białkami może zapobiec wytrącaniu się wapnia z roztworu i powstawaniu ektopowych zwapnień (kalcyfikacji). Zmiany stężenia białek w osoczu krwi (głównie uwarunkowane zmianą stężenia albumin, a w mniejszym stopniu zmianą stężenia globulin, które również wiążą wapń) są powodem równolegle przebiegających zmian stężenia wapnia całkowitego. Np. spadek stężenia albumin o 10 g/J jest powodem obniżenia się poziomu wapnia całkowitego o ok. 0,2 mmol/1 (0,8 mg/dl). Zmianę przeciwną obserwuje się w razie wzrostu stężenia albumin. Wiązanie wapnia przez białka osocza jest zależne od pH. I tak kwasica zwiększa stężenia wapnia zjonizowanego, natomiast zasadowica, zwiększając wiązanie wapnia przez białka osocza, jest przyczyną spadku stężenia Ca2+. Spadek stężenia Ca2 + jest prawdopodobnie przyczyną wystąpienia zdrętwieli i mrowień u chorych z zespołem hiperwentyJacyjnym, charakteryzującym się zasadowica oddechową. W HOMEOSTAZIE WAPNIOWEJ UCZESTNICZĄ Gł,0WNIE DWA HORMONY Pa rat hormon (PTH) jest polipeptydem jednołańcuchowym złożonym z 84 aminokwasów Hormon ten (o masie cząsteczkowej 9500) nie zawiera w swojej strukturze węglowodanów lub innych cząsteczek związanych z nim kowalencyjnie (ryc. 48-1). Pełna aktywność biologiczna związana jest z N-końcowym fragmentem hormonu. N-końcowy fragment, składający się z 34 aminokwasów (PTHj -„), wykazuje pełną aktywność biologiczną. Fragment PTH3;_34 jest głównie odpowiedzialny za wiązanie się z receptorem. PTH powstaje z cząsteczki prekursorowej złożonej z U 5 aminokwasów (ryc 48-1). Bezpośrednim prekursorem PTH jest proPTH, róż-

niący się od natywnego hormonu obecnością bardzo zasadowego heksapeptydu na N-końcu. Znaczenie czynnościowe tego heksapeptydu jest niejasne. Pierwotnym produktem transkrypcji genu kodującego ten hormon jest preproPTH, będący bezpośrednim prekursorem proPTH. PreproPTH różni się od proPTH obecnością dodatkowego łańcucha polipeptyd owego na N-końcu, złożonego z 25-aminokwasów. Ten dodatkowy polipeptyd ma charakter hydrofobowy, podobnie jak sekwencje liderowe lub sygnalne innych białek sekrecyjnych. Szczegółową sekwencję aminokwasową preproPTH, prePTH i PTH przedstawiono na ryc. 48-1. Sekwencję zjawisk związanych z przekształceniem preprohormonu PTH do PTH,^ przedstawiono na ryc. 48-2. PreproPTH ulega transferowi do cystern siateczki endoplazmatycznej podczas trwającej jeszcze translacji mRNA (kodującego PTH) na rybosomach. Podczas tego transferu, fragment sygnalny prepropeptydu, złożony z 25 aminokwasów, uiega odszczepieniu, dzięki czemu powstaje proPTH, Następnie ten ostatni ulega przemieszczeniu do aparatu Golgiego, gdzie zachodzi enzymatyczne odszczepienie heksapeptydu na N-końcu. W wyniku tej reakcji powstaje ostateczna „dojrzała" cząsteczka PTH. Cząsteczki PTH zlokalizowane w pęcherzykach sekrecyjnych uwalniających się z aparatu Golgiego mogą ulec I) magazynowaniu w puli „zapasowej", 2) degradacji lub 3) wydzielaniu do krwi. Synteza, sekrecja i przemiana PTH są regulowane Regulacja syntezy. Na szybkość syntezy i degradacji proPTH nie ma wpływu stężenie Ca2+ w środowisku, pomimo że synteza i wydzielanie PTH znamiennie wzrastają przy obniżonych stężeniach zjonizowanego wapnia. Rzeczywiście aż 80—90% powstaiego w obrębie komórek lub w układach doświadczalnych proPTH nie ulega przekształceniu do PTH. Z powyższego faktu należy wnioskować, że większość powstałego proPTH jest szybko rozkładana. Później wykryto, że nasilenie degradacji proPTH zmniejsza się przy niskich stężeniach Ca2+, natomiast wzrasta, jeśli stężenia Ca2 + są wysokie. Sugeruje to, że zmiany stężenia Ca2+ wpływają na syntezę PTH oddziałując na szybkość degradacji proPTH a nie jego syntezę. Nieustająca i stała synteza proPTH (synteza konstytutywna) znajduje swoje odzwierciedlenie w stężeniach mRNA kodującego

HORMONY REGULUJĄCE PRZEMIANĘ WAPNIOWĄ / 621 -Sekwencja sygnalna (prei

Ryc. 48-

1, Lysf AlaISer(MB«Met) - NH,

Sekwencja

Sakwencja warunkująca patną aktywność biologiczna Struktura bydlęcego pre-proPTH. Strzałki wskazują na miejsca działania enzymów rozszczepiających hormon w obrębie przytarczyc (strzałki oznaczone jako [1-5]) lub w obrębie (strzałki oznaczone jako [4-5]) po jego wydzielaniu do krwi.

wątroby Do

Fragment C—końcowy

ValfLeur Ile TLysfAiatLyslPralGIfl - C

OH

fragmentu biologicznie aktywnego (PTH,_M) przyłączona jest sekwencja aminokwasów, nie mająca wpływu na aktywność hormonu i jego wiązanie z receptorem. {Według J. F. Habener: Recent advances in parathyroid hormone research. Clin. Biochem. 1981, 14, 223, w niewielkiej modyfikacji i za zezwofeniem).

PTH, które nie zmieniają się pomimo zaocznych wahań stężenia Ca2 + w płynie pozakomórkowym. Wydaje się, że zwiększenie syntezy PTH jest możliwe jedynie poprzez przerost lub rozrost komórek głównych przytarczyc, wytwarzających ten hormon.

Regulacja przemiany PTH. Degradacja

PTH rozpoczyna się ok. 20 min po syntezie proPTH i nie ma na nią wpływu stężenie Ca2+. Występuje ona po wbudowaniu hormonu do pęcherzyków sekrecyjnych. Nowo powstały PTH może zostać natychmiast wydzielony do krwi lub też zmagazynowany w pęcherzykach sekrecyjnych, a dopiero później wydzielony. Proces rozkładu rozpoczyna się w chwili wejścia

pęcherzyków sekrecyjnych do przedziału (kompartmentu) zapasowego. W wyniku proteolitycznej degradacji powstają swoiste produkty rozpadu (ryc. 48-1, 48-2), we krwi zaś stwierdza się duże stężenia Ckońcowych fragmentów cząsteczki PTH. Te fragmenty, o masie cząsteczkowej ok. 7000, składają się z odcinka PTH37.S4 i w mniejszym stopniu odcinka PTH34.N4 łańcucha polipeptydowego tego hormonu. Większość nowo powstałego PTH ulega rozkładowi. Na 2 mole wydzielonych C-końcowych fragmentów przypada 1 mol natywnego PTH. Tak więc większość krążącego we krwi PTH składa sie z fragmentów C-końcowych. Dotychczas nie stwier-

622 / ROZDZIAŁ 48 Pre (31)

PTH 84

16) 1

Siateczka sródplazmatyczna szorstka komórek głównych przytarczyc

Syntez a stalą

LSS 84

(6)

Aparat Gol g lego komórek głównych przytarozyc

1

1 84

1

1

11

36 37

1 84

Paeksztatcante

Mafeeteż.Ca"* + r Dużeatęz.Ca^ ł Ziarnistości sekrecyjne Upakoutywa nie" -I-Ł komórek głównych przytarczye Degradacj [komórki Kupftera w wątrobie) a CAMP Małe etę; Ca2

•Fragmenty krążące we krwi

Wydzielani e

Ryc. 48-2. Prekursory i produkty rozpadu PTH oraz umiejscowienie tych procesów w przytarczycach i w wątrobie. Liczby podane w nawiasie wskazują ilość aminokwasów tworzących fragment pre(31) i pro(6).

dzono żadnych efektów biologicznych induko wanych tymi fragmentami. Wydaje się, że wy dłużają one okres półtrwania PTH w krążeniu. W przytarczycach stwierdzono występowanie licznych enzymów proteolitycznych, w tym ró wnież katepsyny B i D. Katepsyna B rozkłada cząsteczkę PTH na dwa fragmenty, tj. PTH1_36 i PTH37_S4. Fragment PTH37_84 nie ulega dal dji f f 37S4

3784

szej degradacji, natoiflfast fragment j^ ulega szybkiemu rozpadowi do di- i tripeptydów. We krwi krążącej nigdy nie stwierdzono obecności proPTH, natomiast stwierdzono małe (jeśli w ogóle) ilości PTH,.^ uwolnione z przytarczyc do krwi. Identyfikację preproPTH przeprowadzono drogą rozszyfrowania sekwencji genu kodującego syntezę PTH. Większość rozkładu proteolitycznego PTH odbywa się w samych komórkach przytarczycowych. W licznych badaniach wykazano jednak, że raz wydzielony do krwi PTH ulega rozkładowi proteolitycznemu w licznych tkankach. Dotychczas nie określono ilościowego udziału poszczególnych tkanek pozaprzytarczycowych w procesie proteolitycznego rozkładu PTH. Nie jest również jasne, czy enzymy proteolityczne, rozkładające PTH w samych przytarczycach są

identyczne z proteazami tkanek pozaprzytarczycowych, rozkładającymi ten hormon, oraz czy sposób degradacji oraz fragmenty rozpadu PTH w tych tkankach są identyczne z występującymi w przytarczycach. W przemianie wydzielonego przez przytarczyce PTH uczestniczą takie narządy, jak wątroba i nerki. Po hepatektomii we krwi krążącej nie stwierdzono fragmentów PTH34.Mi PTH37.144 co sugeruje, że wątroba jest głównym miejscem ich powstawania. Rola nerek może polegać na usuwaniu tych fragmentów z ustroju. Głównym miejscem proteoJizy PTH na obwodzie (poza przytarczycami) są komórki Kupffera, przylegające do śródzatokowych dróg wątroby. Endopeptydaza, zapoczątkowująca rozpad PTH na fragmenty N- i C-końcowe umiejscowiona jest na powierzchni tych komórek (podobnych do makrofagów), będącej w stałym kontakcie z osoczem krwi. Enzym ten, będący również katepsyna B, rozszczepia łańcuch polipeptydowy PTH między resztą aminokwasową w pozycji 36 i 37. Podobnie jak w przytarczycach, fragment C-końcowy dostaje się do krwi krążącej, natomiast fragment N-końcowy ulega szybkiej dalszej degradacji.

HORMONY REGULUJĄCE PRZEMIANĘ WAPNIOWĄ / 623

Regulacja sekrecji. Istnieje odwrotna zależność miedzy wydzielaniem czy stężeniem PTH a stężeniem wapnia zjonizowanego i magnezu w surowicy krwi. Stężenie PTH w surowicy obniża się liniowo w miarę wzrostu kalcemii od 1 mmol/1 (4 mg/dl) do 2,62 mmol/1 (10,5 mg/dl). Obecność biologicznie aktywnego PTH w surowicy krwi u chorych z kalcemią 3=2,62 mmol/1 (10,5 mg/dl) wskazuje na obecność nadczynności przytarczyc.

Istnieje liniowa zależność między ilością uwalnianego PTH a stężeniem cAMP w komórkach przytarczyc. W procesie tym najpewniej uczestniczą, jony Ca2ł~, za czym przemawia występowanie odwrotnej zależności między śródkomórkowym stężeniem wapnia i cAMP. Udział Ca2+, w tym procesie może polegać na znanym oddziaływaniu tego jonu na tbsfodiesterazę (w którym pośredniczy kinaza białek zależna od Ca:+ kalmoduliny) lub na hamowaniu kinazy adenylanowej. Fosforany nie wykazują żadnego bezpośredniego wpływu na wydzielanie PTH. Przytarczyce mają względnie niewielkie ilości ziarnistości zapasowych zawierających PTH. Wystarczają one do podtrzymania maksymalnego wydzielania tego hormonu zaledwie przez 1,5 godziny. Cecha ta odróżnia przytarczyce od wysp Langerhansa trzustki, zawierających zapasy insuliny wystarczające na kilka dni, oraz od tarczycy, której zapasy hormonów wystarczają na kilka tygodni. Dlatego też PTH musi być nieustannie syntetyzowany i wydzielany. W mechanizmie działania PTH uczestniczy receptor błonowy PTH wiąże się z białkowym receptorem błonowym o masie cząsteczkowej 70 000. Receptor ten, występujący w komórkach kości, wydaje się być identyczny z receptorem obecnym w nerkach. Nie stwierdzono obecności tego receptora w komórkach nieefektorowych (nietarczowych) dla tego hormonu. Interakcja hormonu z receptorem uruchamia następującą typową reakcję kaskadową; aktywacja cyklazy adenylanowej — wzrost stężenia śródkomórkowego cAMP-*wzrost stężenia śródkomórkowego wapnia -» fosforylacja swoistych białek śródkomórkowych przez kinazy -> aktywacja śródkomórkowych enzymów lub białek, będących końcowymi pośrednikami efektów biologicznych hormonu. Zespół reakcji indukowanych PTH, podobnie jak licznymi innymi hormonami peptydowymi lub białkowymi, jest przyczyną wy-

stąpienia zjawiska zmniejszenia liczby recepto-

rów (down regulation of receptor number) będącego przyczyną spadku wrażliwości komórek

tarczowych na ten hormon. W mechanizmie tym mogą uczestniczyć procesy toczące się z udziałem cAMP w podanej wyżej kaskadzie. Główne znaczenie biologiczne PTH polega na udziale tego hormonu w homeostazie wapniowej Główną rolę PTH w homeostazie wapniowej podkreśla obserwacja, że hormon ten pojawił się dopiero u zwierząt morskich próbujących dostosować się do życia w warunkach lądowych. Utrzymywanie się bilansu wapniowego w granicach fizjologicznych zależy od długotrwałych skutków działania PTH na wchłanianie jelitowe wapnia za'pośrednictwem kalcytriolu. Jeżeli w wyniku dłuższego niedoboru wapnia w pożywieniu wchłanianie Ca2+ w jelitach jest niedostateczne, wówczas zostaje uruchomiony złożony mechanizm regulacyjny, w którym uczestniczy również PTH. PTH przywraca normalne stężenie wapnia w płynie pozakomórkowym działając bezpośrednio na kości i nerki oraz pośrednio również na błonę śluzową jelit (PTH pobudzając syntezę kalcytriok w nerkach pobudza wchłanianie Ca w jelitach). PTH 1) nasila rozpuszczanie kości (osteolizę), oddziaływując zarówno na jej część organiczną, jak i nieorganiczną, przy czym uwolnione Ca2+ dostają się do przestrzeni wodnej pozakomórkowej, 2) zmniejsza wydalanie wapnia przez nerki, czyli klirens nerkowy tego jonu, przez co wzrasta stężenie wapnia w płynie pozakomórkowym oraz 3) nasila skuteczność wchłaniania wapnia przez jelita, pobudzając syntezę kalcytriolu w nerkach. Działanie PTH na nerki występuje najszybciej, lecz skutek biologiczny tego hormonu jest największy w kościach. PTH zapobiega więc wystąpieniu hipokalcemii w razie niedoboru tego jonu w pokarmach, jednak kosztem zubożenia masy kostnej. PTH wpływa również na homeostazę fosforanową Anionem wiążącym się z kationem wapnia jest zwykle anion fosforanowy, za czym przemawia fakt, że kryształki hydroksyapatytu, występujące w kościach składają się z fosforanu wapnia. W razie występowania osteolizy indukowanej przez PTH, wraz z wapniem uwalniają się również fosforany. PTH zwiększa również nerkowy klirens fosforanów. Działanie

624 / ROZDZIAŁ 48

netto PTH na kości wyraża się więc wzrostem stężenia wapnia, natomiast spadkiem stężenia fosforanów w płynie poza komórkowym. Dzięki takiemu działaniu PTH nie dochodzi, co jest ważne, do przesycenia osocza w wapń i fosforany.

Patofizjologia

Niedobór PTH jest przyczyną niedoczy nności przytarczyc. Głównymi markerami tego stanu chorobowego są spadek stężenia wapnia zjonizowanego oraz wzrost stężenia fosforanów nieorganicznych w surowicy krwi. Wśród objawów chorobowych należy wymienić nadwrażliwość nerwowo-mięśniową wyrażającą się skurczami spastycznymi mięśni lub tężyczką. Ciężka i nagle występująca hipokalcemia (hipokalcemia ostra) może być przyczyną: porażenia mięśni oddechowych z powodu kurczu tężcowego, kurczu głośni (laryngospasmus), ciężkich drgawek a nawet śmierci. Przewlekła hipokalcemia jest przyczyną zmian skórnych, zaćmy oraz zwapnień jąder podstawy mózgu. Niedoczynność przytarczyc jest zwykle spowodowana niezamierzonym chirurgicznym usunięciem przytarczyc (w czasie strumektomii) lub uszkodzeniem tych gruczołów w czasie zabiegu chirurgicznego na szyi (wówczas mówimy o wtórnej niedoczynności przytarczyc). Czasami jest ona wynikiem uszkodzenia tych gruczołów przez proces autoimmunologiczny (wówczas mówimy o

pierwotnej niedoczynności przytarczyc).

Rzekoma niedoczynność przytarczyc (pseudo-

hypoparathyreoidismuś) została omówiona w rozdz. 45. To dziedziczne zaburzenie charakteryzuje się syntezą prawidłowego PTH, natomiast opornością narządów docelowych na działanie tego hormonu. Skutki biochemiczne tego zaburzenia są identyczne z występującymi w klasycznej niedoczynności tarczycy. Chorobie towarzyszą zwykle różne nieprawidłowości rozwojowe takie jak niski wzrost, skrócenie kości śródręcza i śródstopia oraz niedorozwój umysłowy. Istnieje kilka postaci rzekomej niedoczynności przytarczyc spowodowanych: 1) niedoborem białka regulatorowego Gs cyklazy adenylanowej i 2) defektem biochemicznym na etapie działania PTH, położonym za cAMP. Nadczynność przytarczyc (hyperparathyreoidismus) charakteryzuje się nadmierną produkcją PTH najczęściej przez gruczolak przytarczyc. Przyczyną tego stanu chorobowego może być również rozrost (hyperplasia) przytarczyc, lub też ektopowe wytwarzanie PTH przez nowo-

twór złośliwy. Głównymi objawami biochemicznymi nadczynności przytarczyc są podwyższone stężenie wapnia zjonizowanego i PTH oraz obniżone stężenie fosforanów nieorganicznych w surowicy krwi. Długotrwająca (przewlekła) nadczynność przytarczyc charakteryzuje się rozległą resorpcją kości oraz różnymi zaburzeniami ze strony nerek, takimi jak kamica nerkowa i zwapnienie nerek, częste, nawrotowe stany zapalne dróg moczowych oraz (w ciężkich przypadkach) niewydolność nerek. Wtórna nadczynność* przytarczyc {hyperpara-

thyreoidismus secundarius) charakteryzuje się rozrostem (hiperplazją) przytarczyc i zwiększoną sekrecją PTH. Może ona występować u chorych z postępującą niewydolnością nerek, U takich chorych wtórna nadczynność przytarczyc spowodowana jest przypuszczalnie upośledzoną konwersją 25-OH-D3 do l,25(OH)rD3przez uszkodzony miąższ nerkowy. W wyniku niedoboru 1,25(OH)2-D3 dochodzi do niedostatecznego wchłaniania wapnia z przewodu pokarmowego, co w konsekwencji jest przyczyną wtórnej nadczynności przytarczyc. Ta ostatnia jest mechanizmem kompensacyjnym, mającym na celu utrzymywanie stężenia wapnia w płynie pozakomórkowym w granicach prawidłowych.

KALCYTRIOL (1,26(OH)2-D,) DZIAŁA NA KILKU POZIOMACH HOMEOSTAZY WAPNIOWEJ Rys historyczny. Krzywica, będąca chorobą dziecięcą, charakteryzującą się niedostateczną mineralizacją oraz okaleczającymi deformacjami kości, występowała epidemicznie w Ameryce Północnej i Europie Zachodniej jeszcze na początku bieżącego stulecia. Wyniki wielu badań wskazywały na to, że choroba ta spowodowana jest niedoborem jakiegoś składnika w pożywieniu. Po odkryciu, że powstawaniu krzywicy można zapobiec przez zażywanie tranu, otrzymywanego z wątroby dorsza, oraz po wykazaniu, że aktywnym składnikiem w tym tranie nie jest witamina A, aktywny czynnik (występujący w tym tranie), zapobiegający powstawaniu krzywicy, określono jako witamina D. Prawie w tym samym czasie wykazano, że powstawaniu choroby można zapobiec przez naświetlanie skóry promieniami ultrafioletowymi — sztucznymi lub słonecznymi. Następnie wykazano, że u dorosłych występuje odpowied-

HORMONY REGULUJĄCE PRZEMIANĘ WAPNIOWĄ / 625

nik krzywicy, określany jako ostcomalacja. charakteryzujący się upośledzoną mineralizacją kości oraz reagujący również na podawanie witaminy D. Punktami wyjścia dla kolejnych postępów w tej dziedzinie była obserwacja, że chorzy z chorobami wątroby i nerek nie reagują w sposób normalny na podawanie witaminy D. Badania nad struktura, i funkcją witaminy D w ciągu ostatnich 50 lat nabrały dużego rozmachu, szczególnie w ostatnich kilku latach.

Główna rola biologiczna kalcytriolu polega na pobudzaniu wchłaniania wapnia i fosforanów w przewodzie pokarmowym

Kalcytriol jest jedynym hormonem pobudzającym transport wapnia ze światła przewodu

pokarmowego przez warstwę nabłonka jelitowego wbrew występującemu gradientowi stężenia Ca2+. Ponieważ synteza kalcy triołu podlega określonym regulacjom (ryc. 48-3), konieczny jest subtelny mechanizm kontroli stężenia Ca2+ w piynie pozakomorkowym, działający w warunkach znacznych wahań zawartości wapnia w pożywieniu. Mechanizm ten zapewnia utrzymywanie stężenia wapnia i fosforanów na poziomie potrzebnym do tworzenia się kryształków hydroksyapatytu na włóknach kolagenowych kości. W stanach niedoboru witaminy D (ściśle mówiąc niedoboru kalcytriolu) nowotworzenie kości ulega zwolnieniu, zaś proces remodelacji kości jest zaburzony. Procesy te są regulowane głównie przez PTH, działający na komórki kostne, chociaż dla prawidłowego ich

Światło słoneczne

7-Dehydrocholealerol -

-»■ Prowltamlna D,-

•*• Witamina D! 25- Hydroksylazs

Inne

WĄTROBA

1,24,25(OH)3-D3

metaóol.ty --------- 25-Hydroksyoriolekalcyterol (2SOH-D3)

HO"' 7- Dehyd rochoiesiercl

Witamina D,

1,25(OH},-D3(kalcytrio!)

Ryc. 48-3. Powstawanie i hydroksylacja witaminy D. Proces 25-hydroksylacji odbywa się w wątrobie, zaś dalsze hydroksylacje w nerkach. W nerkach powstaje zarówno 24,25(OH)a-D3, jak i 1,25 (0H)±-D3. Na rycinie pokazano również strukturę 7-dehydrocholesteroiu, witaminy D^i 1,25 (OH)2~D3 (kalcytriolu). (Według Ganong W. F,: fteview of Medical Physiology. Wyd. 4 Appleton and Lange, 1989, za zezwoleniem). 40 -- Biochemia

626 / ROZDZIAŁ 48

przebiegu potrzebne są małe stężenia kalcytriolu. Kalcytriol nasila również działanie PTH w nerkach, tj. wchłanianie zwrotne wapnia w kanalikach nerkowych. W syntezie i przemianie kalcytriolu uczestniczy kilka tkanek. Procesy te są ściśle regulowane Biosynteza. Kalcytriol wykazuje wszelkie cechy hormonu. Jest on produktem serii reakcji enzymatycznych, wymagających transportu cząsteczek prekursorowych do kilku różnych tkanek (ryc. 48-3). Aktywna cząsteczka kalcytriolu jest transportowana do innych narządów, gdzie uczynnią procesy biologiczne w sposób podobny jak inne hormony steroidowe. Skóra. W pokarmach (tran rybi, żółtko jaj) zawarte są niewielkie ilości witaminy D, Większość witaminy D, która jest wykorzys tana do syntezy kalcytriolu, wytwarzana jest z 7-dehydrocholesterolu w komórkach Malpighiego.skóry. Jest ona wprost proporcjonalna do intensywności promieniowania ultrafioletowe go i odwrotnie proporcjonalna do stopnia pigmentacji skóry. W miarę starzenia się zawar tości 7-dehydrocholesterolu w naskórku zmnie jsza się, co wydaje się być przyczyną ujemnego bilansu wapniowego w starszym wieku. Wątroba. Swoiste białko przenośniko we, określone jako białko wiążące witaminę D (D-binding protein), wiąże witaminę D3 i jej metabolity, przenosząc je ze skóry i jelit do wątroby, gdzie ulegają 25-hydroksylacji, tj. pie rwszej niezbędnej reakcji syntezy kalcytriolu. 25-hydroksylacja odbywa sie w siateczce endoplazmatycznej. W reakcji tej potrzebny jest magnez, NADPH, tlen cząsteczkowy oraz bliżej nie scharakteryzowany czynnik cytoplazmatyczny. W reakcji tej uczestniczą reduktaza cytochromu P-450 zależna od NADPH oraz cytochrom P-450. Reakcja ta nie podlega regulacji 1 odbywa się w mniejszym nasileniu również w nerkach i jelicie cienkim. Następnie 25-OH-D3 dostaje się do krążenia, gdzie jest glówym metabolitem witaminy występującym w osoczu. Po związaniu się z białkiem wiążącym witaminę D, 25-OH-Dj transportowany jest do nerek. Nerki. 25-OH-D3 jest słabym agonistą kalcytriolu. Dla pełnej aktywności 25-OH-D3 niezbędna jest jego hydroksylacja przy węglu C[. Zachodzi ona w mitochondriach komórek proksymalnego kanalika krępego przy udziale trzyskładnikowej reakcji monooksygenazowej wymagającej obecności NADPH, Mg2+, tlenu

cząsteczkowego i przynajmniej trzech enzymów tj.: 1) nerkowej reduktazy ferredoksynowej będącej flawoproteiną, 2) nerkowej ferredoksyny (będącej białkiem żelazo siarkowym) oraz 3) cytochromu P-450, Ten układ wytwarza l,25(OH)rD3, który jest najbardziej aktywnym naturalnym metabolitem witaminy D. 4. Inne tkanki. Łożysko zawiera la-hydroksylazę i dlatego może być ważnym Źródłem kalcytriolu pochodzenia pozanerkowego. Podobną aktywność enzymatyczną stwierdzono w wielu różnych tkankach, w tym również w kościach. Znaczenie fizjologiczne poza nerkowej biosyntezy kalcytriolu wydaje się być niewielkie, skoro u nieciężarnych i pozbawionych nerek zwierząt w surowicy stwierdza się niewielkie ilości tego hormonu.

Regulacja syntezy i przemiany. Podob-

nie jak w przypadku innych hormonów synteza kalcytriolu regulowana jest mechanizmami opartymi na sprzężeniu zwrotnym (ryc. 48-3, tab. 48-1). U zwierząt normalnych podawanie diety Tabela 48-1. Regulacja aktywności 1a-hydi>oksylazy Główne czynniki regulujące Hipokalcemia (|) PTH

(1)

Hipofosfatemia (f) Kalcytriol (J

Drugorzedowe czynniki regulujące Estrogeny Androgeny Progesteron Insulina Hormon wzrostu Pro 1 akty na Hormony tarczycy

ubogo wapni owej oraz hipokalcemia wybitnie wzmagają aktywność lct-hydroksylazy. Zjawisko to wymaga obecności PTH, wydzielanie którego wzrasta pod wpływem hipokalcemii. Mechanizm działania PTH w tym zakresie nie został dotychczas wyjaśniony. Wiadomo tylko, że hormon ten zwiększa aktywność lot-hydroksylazy zarówno u zwierząt z niedoborem witaminy D, jak i u zwierząt leczonych tą witaminą. Podawanie diety ubogofosforowej oraz hipofosfatemia również pobudzają aktywność la-hydroksylazy, chociaż wymienione czynniki są słabszymi bodźcami od hipokalcemii. Sam kalcytriol jest ważnym regulatorem własnej syntezy. Duże stężenia kalcytriolu hamują nerkową la-hydroksylazę, natomiast pobudzają 24-hydroksylazę katalizującą powstawanie

HORMONY REGULUJĄCE PRZEMIANĘ WAPNIOWĄ / 627

24,25(OH)rD3, tj. pozornie nieaktywnego produktu ubocznego. Estrogeny, progestyny i androgeny znacznie zwiększają aktywność la-hydroksylazy u ptaków w okresie nośności. Niejasna jest rola wymienionych hormonów, podobnie jak i insuliny, hormonu wzrostu i prolaktyny, w regulacji biosyntezy kalcytriolu u ssaków. Podstawowa struktura cząsteczki sterolowej może zostać zmodyfikowana alternatywnymi szlakami metabolicznymi, tj. przez hydroksylację w pozycji 1,23,24,25 i 26 oraz powstawanie licznych laktonów. Zidentyfikowano dotychczas przeszło 20 metabolitów, lecz nie udowodniono, aby którykolwiek wykazywał aktywność biologiczną. Kalcytriol działa na poziomie komórkowym w podobny sposób jak inne hormony steroidowe Używając radioaktywnego kalcytriolu wykazano jego występowanie w jądrach komórkowych komórek kosmków i krypt jelitowych,. osteoblastów i komórek dystalnego kanalika nerkowego. Ponadto stwierdzono nagromadzanie się tego hormonu w jądrach komórkowych komórek, pierwotnie nie uważanych za komórki docelowe dla tego hormonu. Wśród nich należy wymienić komórki warstwy Malpighiego skóry, komórki wysp trzustkowych, niektóre komórki mózgu, przysadki mózgowej, jajników, gonady męskiej, łożyska, macicy, gruczołu sutkowego i grasicy oraz komórki prekursorowe układu białokrwinkowego. Kalcytriol wiąże się również z komórkami przytarczyc, co sugeruje, że może on uczestniczyć w przemianie PTH.

Receptor kalcytriolowy. Receptor kal-

cytriolowy należy do rodziny receptorów steroidowych (patrz ryc, 49-7), Domena tego receptora wiążąca kalcytriol wykazuje wysokie powinowactwo i małą wydajność. Wiązanie kalcytriolu przez receptor osiąga stan wysycenia, wysycanie jest swoiste i odwracalne. Receptor wykazuje motyw „palca cynkowego" podobny do innych receptorów steroidowych. wiążących się z odpowiednią domeną DNA jądrowego.

Produkty genowe zależne od kalcyt-

riolu. Od kilku lat wiadomo, że odpowiedź jelit na kalcytriol związana jest z syntezą RNA i białka. Obserwacja, że receptor kalcytriolowy wiąże się z chromatyną jądrową, sugeruje, że kalcytriol pobudza transkrypcję genową oraz powstawanie swoistego mRNA. Potwierdza to

praca, w której doniesiono o indukcji przez kalcytriol mRNA kodującego białko wiążące wapń (CBP — calcium binding protein). W cytoplazmie występuje kilka białek wykazujących duże powinowactwo do Ca2+. Jedna grupa tych białek jest zależna od kalcytriolu i obejmuje białka o różnej masie cząsteczkowej, antygenowości i umiejscowieniu tkankowym (jelito, skóra, kości). Najlepiej przebadano CBP pochodzenia jelitowego. Nie wykazano obecności CBP w jelitach szczurów z niedoborem witaminy D. Ponadto stwierdzono, że stężenie CBP jest zależne od ilości kalcytriolu związanego z jądrem.

Wpływ kalcytriolu na błonę śluzową

jelita. Transfer jonów Ca2+ lub PO43~ przez błonę śluzową jelita obejmuje następujące etapy: 1) wychwyt tych jonów przez rąbek szczoteczkowy i błonę mikrokosmków, 2) transport przez błonę plazmatyczną komórek błony śluzowej oraz 3) wypływ przez błonę podstawnoboczną do płynu pozakomorkowego. Jest pewne, że kalcytriol wpływa pobudzająco na jeden lub nawet kilka z wymienionych etapów, chociaż dokładny mechanizm jego działania nie został jeszcze poznany. Uważano, że w wymienionych procesach aktywnie uczestniczy CBP, dopóty nie wykazano, że translokacja jonów Ca2+ zachodzi w ciągu 1 - 2 godzin po podaniu kalcytriolu, tj. znacznie wcześniej niż wzrasta stężenie CBP. Wydaje się, że CBP, wiążąc Ca2+, chroni komórki błony śluzowej przed nadmiernym napływem tych jonów. Wielu badaczy zajmuje się poszukiwaniem innych białek uczestniczących w transporcie jonów Ca2+, podczas gdy inni sądzą, że w procesie transferu tego jonu, przynajmniej w pierwszej fazie wzrostu napływu Ca2+, uczestniczą zmiany błonowe. W procesie tym mają uczestniczyć metabolity polifosfoinozytydów. Patofizjologia. Krzywica występująca w dzieciństwie charakteryzuje się występowaniem niskich stężeń wapnia i fosforu w osoczu krwi, ubogą mineralizacją kości oraz zniekształceniami szkieletu kostnego. Jest ona najczęściej spowodowana niedoborem witaminy D. Wyróżnia się dwie postacie krzywicy zależnej od witaminy D. Typ I jest defektem genetycznym dziedziczącym się recesywnie chromosomem autosomalnym i charakteryzuje się upośledzoną konwersją 25-OH-D3 do kalcytriolu. Typ II jest defektem dziedziczącym się recesywnie genem autosomalnym i charakteryzuje się pojedynczą zamianą aminokwasową w obrębie sekwencji

628 / ROZDZIAŁ 48

jednej domeny „palca cynkowego" receptora, wiążącej się z odpowiednią sekwencją DNA, W wyniku takiej zamiany receptor jest nieczynny. Niedobór witaminy D u dorosłych jest przyczyną osteomalacji. Charakteryzuje się ona obniżonym wchłanianiem wapnia i fosforu w jelitach oraz matym stężeniem tych jonów w płynie pozakomórkowym. W konsekwencji tych zmian mineralizacja osteoidu jest upośledzona, sprawiając, że kości wykazują zmniejszoną twardość. Przy znacznym zaniku lub uszkodzeniu miąższu nerkowego produkcja kalcytriolu jest obniżona, co w konsekwencji jest przyczyną zmniejszonego wchłaniania wapnia z przewodu pokarmowego i wystąpienia hipokalcemii. Ta ostatnia jest pTzyczyną wzrostu sekrecji PTH, będącego wyrazem mechanizmu kompensacyjnego zwiększającego stężenie Ca2+ w płynie pozakomórkowym (jako następstwo działania osteolitycznego PTH). Wzrost obrotu kostnego oraz zmiany strukturalne kości występujące u takich chorych znane są pod pojęciem osteodystrofii nerkowej. Wczesne leczenie witaminą D może zahamować ten proces.

ROLA KALCYTONINY (CT) W HOMEOSTAZIE WAPNIOWEJ U CZŁOWIEKA NIE JEST JASNA CT jest polipeptydem zawierającym 32 aminokwasy, wytwarzanym przez komórki C, głównie tarczycy (rzadziej przytarczyc i grasicy)

oraz przez podobne komórki umiejscowione w gruczole skrzelopochodnym (głandula uhimobranchialiś) innych gatunków. Komórki te wywodzą się z grzebienia nerwowego (crista neuralis) i wykazują biochemiczne podobieństwo do komórek występujących w wielu różnych gruczołach wydzielania wewnętrznego. Cała cząsteczka, włącznie z pcllą 7-aminokwasową na N-końcu utworzoną przez mostek Cys-Cys, jest niezbędna dla wystąpienia pełnej aktywności biologicznej. Między CT poszczególnych gatunków istnieją znaczne różnice w sekwencji aminokwasowej (np, ludzka i świńska CT mają tylko 14 wspólnych aminokwasów na łączną liczbę 32), Pomimo tego CT jednego gatunku jest czynna u innych gatunków i odwrotnie. Najsilniej działająca CT została wyizolowana z łososia. Historia CT jest wyjątkowa. W ciągu 7 lat (1962—1968) CT została wykryta, wyizolowana, poznano jej sekwencję aminokwasową oraz dokonano jej syntezy. Pomimo tego jej rola fizjologiczna u człowieka nie jest pewna.

PIŚMIENNICTWO De Luca HF, Schnoes HK: Vitamin D: Recent advances. Anmt Rev Biochem 1983;52:411. Norman AW, Roth J, Orci L: The vitamin D endocrine system: Steroid metaboUsm, hormone receptors, and biological rcsponsc (calcium binding). Endocr Rev 1982;3:331. Potts JT Jr, Kronenberg HM, Rosenblatt M: Parathyroid hormone: Chemistry, biosynthcsis and modę of action. Ad\ Protein Chem 1982;35:323.

Hormony kory nadnerczy

4 9

Dary! K. Ganner, MD

WPROWADZENIE Kora nadnerczy wytwarza kilkadziesiąt różnych związków steroid owych, z których zaledwie kilka wykazuje aktywność biologiczną. Można je zaszeregować do trzech grup: glukokortykoidów, mineralokortykoidów i androgenów. Działanie tych hormonów rozpoczyna się od wiązania swoistego receptora śródkomórkowego, po czym powstały kompleks hormon-receptor wiąże się ze swoistymi fragmentami DNA indukując ekspresję genową. Ta ostatnia wyraża się syntezą małej liczby białek, które z kolei wpływają na różne procesy metaboliczne, np. glukoneogenezę i równowagę sodową i potasową. m

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Hormony kory nadnerczy, w tym szczególnie glukokortykoidy, stanowią istotne ogniwo Skróty używane w tym rozdziale ACTH — hormon kortykotropowy, kortykou opina ADH — hormon antydiuretyczny, wazopresyna CBG — globulina wiążąca kortykosteroidy

— hormon uwalniający kortykotropinę, kortykoliberyna DHEA — dehydroepiandrosteron OOC — deoksykortykosteron GH —■ hormon wzrostu, somatotropina 3|-OHSD — dehydrogenaza 3P-hydroksysteroid owa PEPCK — karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa POMC — pro-opiomelanokortyna PTH — parat hormon TBG — globulina wiążąca hormony tarczycy CRH

w procesie przystosowywania do silnego stresu, Mineralokortykoidy są potrzebne do utrzymania normalnej równowagi sodowej i potasowej. W medycynie znalazły zastosowanie syntetyczne analogi obu klas ke^rtykoidów. Szczególnie liczne analogi glukokortykoidów wykazują silne działanie przeciwzapalne. Nadmiernie duże lub małe stężenia któregokolwiek hormonu wymienionych klas są przyczyną poważnych powikłań, czasami groźnych dla życia. Dzięki badaniu wrodzonych zaburzeń enzymatycznych, można było poznać poszczególne etapy steroidogenezy i dało to możliwość poznania sprawności sekrecyjnej kory nadnerczy w odniesieniu do poszczególnych hormonów.

KORA NADNERCZY WYTWARZA 3 KLASY HORMONÓW W obrębie kory nadnerczy osoby dorosłej wyróżnia się 3 oddzielne warstwy. Warstwę podtorebkową określa się jako warstwę kłębkowatą (żona głomerulosa). Wytwarza ona minera lokortyk o steroidy. Pod nią znajduje się warstwa pasmowata fzona fascicularis), która wraz z warstwą siatkowatą (żona reticularis), wytwarza glukokortykoidy i androgeny. 2 kory nadnerczy wyizolowano i wykrystalizowano około 50 steroidów. Większość z nich jest związkami pośrednimi w steroidogenezie. Tylko niewiele steroidów nadnerczy wydzielanych jest w dużych ilościach i wykazuje znamienną aktywność biologiczną. Kora nadnerczy wytwarza trzy klasy hormonów steroidowych, przy czym u podstawy takiej klasyfikacji leży głównie ich działanie biologiczne. Granice między tymi klasami hormonów nie są ostre, skoro hormony jednej klasy mogą wykazywać również działanie hormonów pozostałych klas. I tak wszystkie naturalne glukokortykoidy wykazują również działanie mineralo-

630 / ROZDZIAŁ 49

kortykoidowe i odwrotnie. Ten fakt stał się zrozumiały w chwili wykrycia, faktu powszechnego występowania ..elementów odpowiedzi hormonalnej'1 pośredniczących w działaniu tych hormonów (i progestynów) na poziomie genów (tab. 45-3). Glukokortykoidy są 2l-węglowymi steroidami wykazującymi liczne efekty biologiczne, wśród których najważniejszy jest stymulujący wpływ na glukoneogenezę. Kortyzol jest najważniejszym glukokortykoidem u człowieka i wytwarzany jest w warstwie pasmowatej kory nadnerczy. Kurtykostcron syntetyzowany zarówno w warstwie pasmowatej jak i kłębkowatej, jest głównym glukokortykoidem u gryzoni, natomiast u ludzi występuje w mniejszych ilościach. Mineralokortykoidy są również 2l-węglowymi steroidami. Główne ich działanie polega na stymulacji retencji sodu i wydzielaniu K^ i H+, szczególnie w nerkach. Aldosteron jest silniej działającym hormonem tej klasy hormonów. Wytwarzany jest wyłącznie w warstwie kłębkowatej kory nadnerczy. W warstwie pasmowatej i siatkowatej kory nadnerczy wytwarzany jest w dużych ilościach prekursor androgenów — dehydroepiandrosteron oraz słaby androgen — androstendion. Te steroidy ulegają przekształceniu do silniej działających androgenów w tkankach pozanadnerczowych i mogą być przyczyną stanów chorobowych u osób z niedoborem niektórych enzymów uczestniczących w steroidogenezie. W normalnych nadnerczach powstają tylko niewielkie ilości estrogenów. W niektórych ro dzajach raków nadnerczy synteza ich może wzrastać. ^, Audrogeny pochodzenia nadnerczowego są ważnymi prekursorami estrogenów (powstają-

cych prze2 aromatyzację androgenów w tkankach obwodowych) u kobiet w okresie pomenopauzalnym.

SWOISTE NAZEWNICTWO OKREŚLA STRUKTURĘ CHEMICZNĄ STEROIDÓW Wspólną cechą wszystkich steroidów jest struktura 17-węglowego cykl open tan operhydrofenantrenu, złożona z 4 pierścieni oznaczonych literami A, B, C i D (ryc. 49-1). Dodatkowe atomy węgla mogą być dołączone w pozycjach 10 i 13 lub w pozycji CJ7 w postaci łańcucha bocznego. Hormony steroidowe oraz ich prekursory i metabolity różnią się liczbą i rodzajem podstawionych grup, liczbą i umiejscowieniem podwójnych wiązań oraz konfiguracją stereochemiczną. Zaproponowano bardzo precyzyjne nazewnictwo dla tych chemicznych struktur. Asymetryczne atomy węgla (na ryc. 49-1 są one zacienione) warunkują występowanie stereoizomerti. Kątowe grupy metylowe (C19 i Clg) przyłączone do węgli C10 i CtJ zwrócone są do przodu układu pierścieniowego i stanowią punkt odniesienia. Podstawniki leżące w tej samej płaszczyźnie co C19 i C18 oznacza się przedrostkami cis lub p i zaznacza się na rycinach ciągłą linią. Podstawniki leżące za płaszczyzną układu pierścieniowego określa się przedrostkami trans lub a i rysuje się linią przerywaną. Wiązania podwójne zaznacza się trójkątami z podaniem numeru pierwszego węgla, od którego ono się zaczyna (np. A3—A4 oznacza podwójne wiązanie między atomami węgla Cj i C4). Hormony steroidowe posiadające jedną kątową grupę metylową i 18 atomów

(OH) Pierścień cyMopentano-pe r hyd r ofenan tre n o wy

Ryc. 49-1. Cechy strukturalne związków steroidowych

Numeracja atomów węgla. Asymetryczna atomy węgla

są zaclan lowana

HORMONY KORY NADNERCZY / 631

węgla określa się jako estrany, posiadające dwie kątowe grupy metylowe i 19 atomów węgla — jako androstany, zaś hormony posiadające dwie kątowe grupy metylowe oraz boczny łańcuch dwuwęglowy przy C,7 —jako pregnany (łączna liczba atomów węgla w pregnanach wynosi 21). Ta informacja (ryc. 49-2) wraz z glosariuszem podanym w tab. 49-1 pozwala zrozumieć nazwy chemiczne hormonów naturalnych i syntetycznych przedstawionych w tab. 49-2.

W BIOSYNTEZIE HORMONÓW STEROIDOWYCH NADNERCZY UCZESTNICZY WIELE ENZYMÓW Wszystkie hormony steroidowe nadnercza są syntetyzowane w większości z cholesterolu pochodzącego z osocza. Tylko małe ilości cholesterolu pochodzą z syntezy in situ wychodzącej z acetyloCoA i prowadzącej poprzez mewalonian do skwalenu. Większość cholesterolu występującego w nadnerczach jest estryfikowana i magazynowana w kropelkach tłuszczowych Odazczep

cytoplazmy. W razie stymulacji nadnerczy przez ACTH (lub cAMP) dochodzi do aktywacji esterazy, powstały zaś wolny cholesterol (nieestryfikowany) ulega przemieszczeniu do mitochondriów, gdzie enzym rozszczepiający łańcuch boczny zawierający cytochrom P-450 (P-450SOC)

przekształca cholesterol w pregnenolon. Proces odszczepienia łańcucha bocznego związany jest z podwójną hydroksylacją, najpierw przy węglu C22, a następnie przy C20. Dopiero potem dochodzi do odszczepienia 6-węglowego łańcucha, tj. izokaproaldehydu i powstania 21-węglowego steroidu (ryc. 49-2). Białko zależne od ACTH być może wiąże i aktywuje cholesterol lub P-450SOC. Bardzo skutecznym inhibitorem P-450sa; i biosyntezy steroidowej jest aminoglutetimid. Wszystkie steroidy powstające u ssaków wytwarzane są z cholesterolu via pregnenolon za pośrednictwem szeregu reakcji zachodzących w mitochondriach lub siateczce śródplazmatycznej komórek nadnerczy. Istotną rolę w tych reakcjach odgrywają hydroksylazy wymagające obecności cząsteczkowego tlenu i NADPH. Ponadto na pewnych etapach biosyntezy polenie bocznego łańcucha cholesterolu

+

C-C-C-C

Pregnenolon + aldehyd tzokapronowy HO

Cholesterol

Podstawowe struktury hormonów steroidowych

HO Testosteron Związki andrastanowe (C 19) 170-Estradiol Związki eatranawe (C

19

Kortyzol

Progesteron

Związki pregnanowe (C :i)

)

Ryc. 49-2. Odszc2epienie łańcucha bocznego cholesterolu oraz podstawowe struktury hormonów steroidowych.___________________________________________^ _ _ _________^ ^ — _____________________________________________________

632 / ROZDZIAŁ 49 Tabela 49-1. Nazewnictwo steroidów Przedrostek Końcówka HydrofcsyDihydroksy-

- ol dio!

Okso-Cis

- on

Cecha chemiczna

Alkohole Ketony (np. dion = 2 grupy ketonowe) Ułożenie dwóch grup w

Trans-o t -

tej samej płaszczyźnie co Cig Ułożenie dwóch grup w

P -Deoksy izo- lub epi-

płaszczyźnie przeciwległej do C19 Podstawnik w położeniu trans

DehydroDihydroAllo-

w stosunku do grupy metylowej Podstawnik w położeniu cis w stosunku do grupy metylowej Cig Związek pozbawiony grupy hydroksylowej Występowanie izomerii przy wiązaniach C—C, C—OH lub C—H np. androsteron (5a) versus isoandrosteron (5p) Odjecie dwóch atomów wodoru z wytworzeniem podwójnego wiązania Dołączenie dwóch atomów wodoru do jednego wiązania podwójnego Konfiguracja trans pierścieni A i B

Tabela 49-2. Nazwy potoczne i chemiczne niektórych steroidów Nazwa potoczna Nazwa chemiczna Aldosteron Androstendion Cholesterol Dehydroepiandrosteron (DHEA) Deksametazon 11-Deoksykortykosteron (DOC) 11-Deoksykortyzol {związek S) Estradiol Estriol Estron Etiochofanolon Sa-Fluorokortyzoi Kortykosteron (związek B) Kortyzol (związek F) Kortyzon (związek E) Prednizoion Prednizon Pregnandiol Pregnantriol Pregnenolon Progesteron Testosteron Triamcynolon

1ip,21-Dihydroksy-3,20-diokso-4-pregnen-l8-al 4-Androsten-3,17-dion 5-Cholesten-3p-ol 3|)-Hydroksy-5-androsten-17-on 9a- Fluoro-16ot-metylo-11 p,17ac,21 -trifiydroksypregna-1,4-dien-3,20-dion 21 -Hydroksy-4-pregnen-3r20-dion 17,21 -Dihydroksy-4-pregnen-3,20-dion 1,3,5(10)-Estratrien-3,17p-diol 1.3.5(10)-Estratrien-3.16a,17p-triol 3-Hydroksy-t,3,5(10)-estratrien-3-ol-17-on 33Hydroksy-5p-androstan-17-on 9ot- Fluoro-11 p,17a,21 -trihydroksypregn-4-en-3,20-dion 11p,21-Dihydroksy-4-pregnen-3,20-dion 11 (3,17a,21 -Trihydroksy-4-pregnen-3,20-dion 1 7a,21 - D ihydroksy-4-pręg nen-3,11,20-trion 11 p,17a,21 -Trihydroksypreg na-1,4-dien-3,20-dion 17x,21 -Dihydroksypregna-1,4-dien-3,11,20-trion y 5p-Pregnan-3=t,20a-diol 5p-Pregnan-3%17a,20a-triof 3p-Hydroksy-5-pregnen-20-on 4-Pregnen-3,20-dion 17p-Hydroksy-4-androsten-3-on 9a-Fluoro-11p,16a,17a,21 -tetrahydroksypregna-1,4-dien-3,20-dion

HORMONY KORY NADNERCZY / 633 trzebne są dehydrogenazy, jedna izomeraza i lia-

za. Stwiendza się pewną swoistość komórkową w steroidogenezie, np. 18-hydroksylaza oraz dehydrogenaza I8-hydroksysteroidowa, potrzebne w biosyntezie aldosteronu, występują tylko w komórkach kłebkowych nadnerczy, przez co synteza tego mineralokortykoidu

ograniczona jest tylko do tej warstwy nadnerczy. Schemat szlaków syntezy 3 głównych klas steroidowych nadnerczy przedstawia ryc. 49-3. W prostokątach podano nazwę enzymów, zaś zacieniowaniem zaznaczono zmianę chemiczną, jaką dany enzym powoduje.

A'-Androsten-3-17-dion

11 -DBOksykortykosteron

11-Daoksykartyzoi 11fl-HYDROKSYLAZA Kortyzol

Kortykosts ron 18-HYDHOKSYLAZA 18HYDROKSYDEHYDROGENAZA

Aldosleron

Ryc. 49-3. Szlaki uczestniczące w syntezie 3 gtównych klas steroidów nadnerczowych. Enzymy katalizujące zmianę struktury zaznaczoną zacieniowaniem umieszczono w prostokątach. (Według Harding B. W., w: DeGroot L. J. (red.): Endocfinology, tom 2, Grune and Stratton, 1979, w niewielkiej modyfikacji, za zezwoleniem).

634 / ROZDZIAŁ 49 Synteza mineralokortykoidów odbywa się w warstwie kłębkowatej nadnerczy Synteza aldosteronu odbywa się szlakiem mineralokortykoidowym w warstwie kłębkowatej nadnerczy. Pregnenolon ulega przekształceniu do progesteronu przy udziale dwóch enzymów zlokalizowanych w siateczce śródplazmatycznej gładkiej, tj. dehydrogenazy 3 p-hydroksysteroidowej (3 P-OHSD) i A'-4-izomerazy. Po hydroksylacji progesteronu w pozycji C21 powstaje 11-deoksykortykosteron (DOC), który jest aktywnym mineralokortykoidem (zatrzymującym sód). Przez kolejną hydroksylacje w pozycji Cn powstaje kortykosteron, który wykazuje aktywność glukokortykoidową i słabą aktywność mineralokortykoidową (wynoszącą ok. 5% aktywności aldosteronu). U niektórych gatunków zwierząt, np. u gryzoni, kortykosteron jest najsilniejszym glukokortykoidem. Hydroksylacja w pozycji C21 jest potrzebna dla wystąpienia zarówno aktywności mineralo-, jak i glukokortykoidowej. Większość steroidów z grupą hydroksylową w pozycji C17 wykazuje większą aktywność glukokortykoidową i mniejsze działanie mineralokortykoidowe. W siateczce śródplazmatycznej gładkiej komórek warstwy kłębkowatej nadnerczy brak jest 17 at-hydroksylazy, natomiast występuje enzym mitochondrialny — 18--hydroksylaza. W wyniku działania 18hydro-ksylazy na kortykosteron powstaje 18hydro-ksykortykosteron, który, po przekształceniu grupy alkoholowej w pozycji C18 na aldehydową, tworzy aldosteron. Jednorazowe rozmieszczenie enzymów w warstwie kłębkowatej oraz odrębny mechanizrn regulacji jej czynności (patrz niżej) były punktem wyjścia sugestii niektórych badaczy, dopatrujących się nie tylko w całych nadnerczach występowania dwóch odrębnych gruczołów wydzielania wewnętrznego (tj. kory i rdzenia nadnerczy), ale również dwóch odrębnych gruczołów wydzielania wewnętrznego w samej korze nadnerczy.

Synteza glukokortykoidów. Synteza

kortyzolu wymaga obecności trzech rodzajów hydroksylaz działających w kolejności w pozycjach CJ7, C2] i Cir Pierwsze dwie reakcje zachodzą szybko, podczas gdy hydroksylacja przy C21, przebiega względnie wolno. W razie wystąpienia najpierw hydroksylacji w pozycji C21, dochodzi do zahamowania 17 a-hydroksylazy, przez co aktywacji ulega szlak mineralokortykoidowy (wytwarzany jest kortykosteron lub aldosteron, zależnie od rodzaju komó-

rek nadnerczowych). 17 a-hydroksylaza jest enzymem występującym w siateczce śródpiazmatycznej gładkiej oraz działającym albo na progesteron, albo—częściej — na pregnenolon. 17 a-hydroksyprogesteron, ulegając hydroksylacji w pozycji C21, tworzy 11-deoksykortyzol, który po kolejnej hydroksylacji w pozycji Cn tworzy kortyzol. Ten ostatni jest najsilniejszym naturalnym hormonem glukokortykoidowym u człowieka. 21-Hydroksytaza jest enzymem występującym w siateczce śródplazinatycznej gładkiej, natomiast 11 p-hydroksylaza jest enzymem mitochondrialnym. Tak więc steroidogeneza charakteryzuje się powtarzającym się transportem substratów steroidowych do i z mitochondriów komórek warstwy pasmowatej i siatkowatej (ryc. 49-4). Oclan

MITOCHONDRIUM

Pęcherzyki magazynujące

Kortyzol i Cholestero

VI 11-Daoksy-

Pregnenolon

SIATECZKA ŚHODPLAZMATYCZNA

Cholesterol

ł9 17«l-Hy(lraksyprogBstBron

Ryć. 49-4. Subkomórkowa kompartmentaiizacja biosyntezy glukokortykoidów. Steroidogeneza w nadnerczach związana jest z kursowaniem prekursorów między mitochondriami a siateczką śródptazmatyczną. Enzymami uczestniczącymi w biosyntezie są: 1) CM.M liaza, 2} dehydrogenaza 3p-hydroksysteroidowa i A°* izomeraza, 3) 17a-hydroksylaza, 4) 21 -hydroksylaza i 5) 1ip-hydroksylaza. (Według: Harding B. W.; w: DeGroot L. J. (red.): Endocrinoiogy, tom 2, Grune and Stratton, 1979, w niewielkiej modyfikacji, za zezwoleniem).

Synteza androgenów. Najważniejszym

androgenem lub prekursorem androgenów powstających w korze nadnerczy jestdehydroepiandrosteron (DHEA). Większość 17-hydroksypregnenolonu ulega dalszym przekształceniom

HORMONY KORY NADNERCZY / 635

w szlaku glukokortykoidowym, zaś tylko mata jego ilość ulega działaniu 17, 20-liazy odszczepiającej dwuwęglowy łańcuch boczny C20— C2V Enzym ten występuje w nadnerczach i gonadach i działa wyłącznie na cząsteczki steroidowe zawierające grupę cc-hydroksylową w pozycji C 17 . W razie braku jednej z hydrolaz i zahamowania biosyntezy glukokortykoidów (patr2 niżej — zespół nadnerczowo-płciowy), wytwarzanie androgenów w nadnerczach znacznie się nasila. Większość DHEA ulega szybkiej sulfatacji odbywającej się w połowie w nadnerczach, a w pozostałej części w wątrobie. Siarczan DHEA jest biologicznie nieaktywny, lecz ulega reaktywacji po usunięciu grupy siarczanowej. DHEA jest rzeczywistym prohormonem, ponieważ przekształca się w silniejszy androgen — audrnstendion {DHEA jest słabym androgenem) pod wpływem 3 p-OHSD i A5-4-izomerazy. Małe ilości androstendionu powstają również w nadnerczach pod wpływem działania liazy na 17-hydroksyprogesteron. Przez redukcję androstendionu w pozycji CI7 powstaje testosteron — najsilniejszy androgen nadnerczowy. Małe ilości testosteronu powstają właśnie w ten sposób w nadnerczach, większość natomiast powstaje drogą konwersji w innych tkankach. Z krwi żylnej nadnerczy można również wyizolować niewielkie ilości innych steroidów, w tym 11-deoksy korty kos tero n, progesteron, pregnenolon, 17 a-hydroksyprogesteron oraz bard2o niewielkie ilości estradiolu (powstającego drogą aromatyzacji testosteronu). Ilości tych steroidów powstałe w nadnerczach nie dorównują jednak ilościom tych hormonów wytwarzanych w innych gruczołach. WYDZIELANIE, TRANSPORT I PRZEMIANA STEROIDOWYCH HORMONÓW NADNERCZOWYCH WPŁYWAJĄ NA ICH DOSTĘPNOŚĆ BIOLOGICZNĄ Sekrecja hormonów steroidowych Tylko niewielkie ilości, jeśli w ogóle, hormonów steroidowych ulegają magazynowaniu w komórkach nadnerczy (lub gonad). Z reguły hormony te są uwalniane do osocza natychmiast po ich syntezie. Uwalnianie kortyzolu charakteryzuje się określoną periodycznością, zależną od rytmu dobowego wydzielania ACTH.

Transport w osoczu Glukokortykoidy. W osoczu krwi kortyzol krąży pod postacią wolną i związaną z białkiem. Głównym białkiem osocza wiążącym ten hormon jest a-globulina, zwana transkortyną lub globuliną wiążącą kortykosteroidy (CBG — cortic o steroid binding globulin). CBG syntetyzowana jest w wątrobie, podobnie jak globulina wiążąca hormony tarczycy (TBG). Nasilenie tej syntezy wzmagają estrogeny. CBG wiąże większość kortyzolu osocza, jeśli stężenie tego hormonu znajduje się w granicach normy. Znacznie mniejsze ilości kortyzolu związane są z albuminami. Różnice w zakresie powinowactwa pozwalają określić okres biologicznego półtrwania różnych glukokortykoidów. Kortyzoi wiąże się mocno z CBG, jego okres półtrwania wynosi 1,5-2 h, KortykEfsteron wiąże się słabiej z CBG, przez co jego okres półtrwania wynosi mniej niż 1 h. CBG wiąże nie tylko glukokortykoidy. I tak deoksy korty kosteron i progesteron wykazują dostateczne powinowactwo do CBG, by konkurować z kortyzolem o miejsca wiązania. Ilość kortyzolu nie związanego, a więc wolnego, stanowi ok. 8% stężenia kortyzolu całkowitego w osoczu krwi i stanowi biologicznie aktywną frakcję tego hormonu.

Mtneralokortykoidy. Aldosteron, będący

najsilniejszym naturalnym mineralokortykoidem, nie ma swoistego białka transportowego w osoczu, lecz tworzy słabe wiązanie z albuminami. Korty kosteron i 11-deok sy korty kosteron (są to steroidy wykazujące działanie mineralokortykoidowe) wiążą się z CBG. Te fakty pozwalają zrozumieć mechanizm działania aldosteronu (patrz niżej).

Przemiana i szybkość wydalania zależą od obecności lub nieobecności białek nośnikowych Glukokortykoidy. Kortyzoi i jego metabolity stanowią ok. 80% występujących w osoczu 17-hydroksykortykoidów. Pozostałe 20% to kortyzon i 11 -deoksy korty zol. Około połowa krążącego we krwi kortyzolu (podobnie jak kortyzonu i 11-deoksy korty zolu) krąży we krwi pod postacią metabolitów dihydro- lub tetrahydro, powstałych drogą redukcji podwójnego wiązania w pierścieniu A (pod wpływem hydrogenaz zależnych od NADPH) oraz grupy ketonowej w pozycji C3 (pod wpływem odwracalnej reakcji dehydrogenazowej). Znaczne ilości wszystkich wymienionych związków ulegają dalszej modyfikacji tworząc w pozycji C3

636 / ROZDZIAŁ 49

koniugaty z kwasem glukuronowym (glukuronidy) lub w mniejszym stopniu z kwasem siarkowym. Wymienione modyfikacje strukturalne zachodzą głównie w wątrobie, sprawiając, że lipofiina cząsteczka steroidowa staje się rozpuszczalna w wodzie i może być wydalana z ustroju. U człowieka większość koniugatów steroidowych. wydzielanych, z żółcią do światła jelita, jest wchłaniana do krwi i ponownie wychwytywana przez wątrobę, tworząc tzw. krążenie jelit owo-wątrobowe. Około 70% koniugatów steroidowych zostaje wydalona z moczem, 20% z kałem, a pozostałe 10% przez skórę.

Mineralokortykoidy. Aldosteron krążą-

cy we krwi ulega bardzo szybko klirensowaniu przez wątrobę, co nie jest dziwne, ponieważ hormon ten nie wiąże się z białkami nośnikowymi osocza. W wątrobie wytwarzane są 3-glukuronidy tetrahydroaldosteronu, które następnie wydalane są z moczem. Androgeny. Androgeny wydalane są jako 17-keto-związki. Wśród nich znajduje się siarczan DHEA, androstendion i jego metabolity. Testosteron, wydzielany w małych ilościach przez nadnercza, nie jest 17-keto-związkiem, lecz wątroba przekształca ok. 50% testosteronu w androsteron i etiocholanolon, które są 17-ketostero idami.

ISTNIEJĄ RÓŻNORODNE MECHANIZMY REGULACJI SYNTEZY HORMONÓW STEROIDOWYCH, NADNERCZY Hormony glukokortykoidowe Sekrecja kortyzolu jest zależna od ACTH. Z kolei wydzielanie ACTH jest kontrolowane przez hormon uwalniający kortykotropinę (CRH) (zwany również kortykoliberyną). Wydzielanie tych hormonów odbywa się na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego (p. ryc. 44-1 i tab. 46-1). Hormony minera I oko rtykoidowe Regulacja wydzielania aldosteronu w komórkach kłębkowatych kory nadnerczy jest zupełnie odmienna od regulacji sekrecji kortyzolu. Głównymi regulatorami sekrecji aldosteronu są układ reninowo-angiotensynowy oraz potas. W tej regulacji uczestniczą sód, ACTH i mechanizmy nerwowe.

Układ reninowo-angiotensynowy. Układ ten uczestniczy w regulacji ciśnienia tętniczego i przemiany elektrolitowej. Głównym hormonem w tych procesach jest angiotensyna II, oktapeptyd powstający z angiotensynogenu (ryc. 49-5). Synteza angiotensynogemi, będącego oyglobuliną, następuje w wątrobie. Jest on substratem dla reniny — enzymu wytwarzanego w komórkach tętniczki doprowadzającej kłęb uszka nerkowego. Lokalizacja tych komórek sprawia, że są one szczególnie wrażliwe na zmiany ciśnienia tętniczego. Wiele regulatorów fizjologicznych wpływa na uwalnianie reniny za pośrednictwem haroreceptorów nerkowych (tab. 49-3). Komórki przyklębuszkowe Tabela 49-3. Czynniki wpływające na uwalnianie reniny Czynniki pobudzające

Czynniki hamujące

Obniżane ciśnienie tętnicze

Podwyższone ciśnienie tętnicze

Zmiany pozycji ciała z poziomej na pionową

Zmiana pozycji ciała z pionowej na poziomą

Zubożenie ustroju w sód

Obciążenie solą

Związki p-adrenergiczne

Antagoniści p-adrenergiczni

Prostaglandyrty

Inhibitory prostaglandyn Potas Wazopresyna Angiotensyna II

są również wrażliwe na zmiany stężenia Na + i CI~ w płynie kanalikowym. Tak więc czynniki powodujące obniżenie efektywnej objętości krwi krążącej (odwodnienie, spadek ciśnienia tętniczego, utrata płynów ustrojowych lub krwi) lub obniżające stężenie NaCl w płynie kanalikowym pobudzają uwalnianie reniny. Nerwy współczulne nerek, ze swoimi zakończeniami w komórkach przykłębuszkowych pośredniczą w oddziaływaniu ośrodkowego układu nerwowego lub pozycji ciała na uwalnianie reniny. W tym mechanizmie regulacji biorą udział receptory p-adrenergiczne. Renina, działając na substrat — angiotensynogen, uwalnia dekapeptyd, zwany angiotensyną I. Syntezę angiotensynogenu w wątrobie wzmagają glukokortykoidy i estrogeny. Nadciśnienie tętnicze patogenetycznie powiązane z tymi hormonami, może być przynajmniej częściowo spowodowane wzrostem stężenia an-

HORMONY KORY NADNERCZY / 637 Anglolensynogen

Angiotensyna I

Asp-ArgValTyr-lle-His-Pro-Phe-HisLeu-Leu (-400dalszych A i aminokwasów)

Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-PheHi5-Leu

ENZYM PRZEKSZTAŁCAJĄCY ANGIOTENSYNĘ 1 (KONWERTAZA} Angiotensyna II

AspArg-ValTvr-lle-HiiPro-Phe

[AMINOPEPTYPAZA| Angiotensyna III

Arg-Va]-Tyr-lle His-ProPhe

ANGIOTENSYNAZY

P rod ukty deg radacj i

Ryc. 49-5. Powstawanie i przemiana angiotensyn. Strzałki wskazują na miejsca działania enzymów rozszczepiających.

giotensynogenu. Ponieważ stężenie krążącego angiotensynogenu jest bliskie wartości Kmw reakcji z reniną, małe jego zmiany mogą mieć znamienny wpływ na powstawanie angiotensyny II. Enzym przekształcający angiotensyitę (konwcrtaza) jest glikoproteiną występującą w płucach, komórkach śródbłonkowych i osoczu krwi. Katalizuje on odszczepienie dipeptydu od C-końca dekapeptydu angiotensyny I w wyniku czego powstaje oktapeptyd — angiotensyna II. Reakcja ta nie wydaje się mieć charakteru reakcji regulowanej. Różne analogi nonapeptydowe angiotensyny I i inne związki są kompetycyjnymi inhibitorami enzymu przekształcającego i stosowane są w leczeniu nadciśnienia tętniczego reninozależnego. Enzym przekształcający rozkłada również bradykininę, będącą silnym czynnikiem rozszerzającym naczynia. Tak więc enzym ten podwyższa ciśnienie tętnicze krwi dwiema odmiennymi drogami. Angiotensyna II podnosi ciśnienie tętnicze krwi działając kurcząco na letniczki. Jest ona silną substancją wazoaktywną. Hamuje ona uwalnianie reniny z komórek przykłębuszkowych i jest silnym stymulatorem syntezy aldo-

steronu. Pomimo że angiotensyna II działa bezpośrednio stymulująco na nadnercza, nie ma ona wpływu na syntezę kortyzolu. U niektórych gatunków angiotensyna II ulega przekształceniu do angiotensyny III, będącej des-Asp^heptapeptydem, pobudzającym syntezę aldosteronu równie silnie jak angiotensyna II (ryc. 49-5). U człowieka stężenie angiotensyny II w osoczu jest 4-krotnie wyższe od angiotensyny III, co sugeruje, że większość efektów biologicznych spowodowanych jest oktapeptydem — angiotensyna II. Zarówno angiotensyna II jak i III są szybko rozkładane przez angioteasynazy. Angiotensyna II wiąże się ze swoistym receptorem komórek warstwy kłębkowatej nadnerczy. Kompleks hormon-receptor nie aktywuje cyklazy adenylanowej co sugeruje, że cAMP nie pośredniczy w działaniu hormonu na poziomie komórkowym. Efekty angiotensyny II, polegające na stymulacji konwersji cholesterolu do pregnenolonu i kortykosteronu do 18-hydroksykortykosteronu i aldosteronu, wydają się zachodzić przy udziale zmian śródkomórkowego stężenia wapnia i metabolitów fosfolipidowych podobnie jak to'opisano w rozdz. 45.

638 / ROZDZIAŁ 49

Potas. Wydzielanie aldosteronu jest wraźliwe na zmiany stężenia potasu w osoczu, Wzrost stężenia K+ o zaledwie 0,1 mmol/1 pobudza sekrecję aldosteronu i odwrotnie, spadek kalemii obniża zarówno syntezę, jak i wydzielanie tego hormonu. Potas oddziałuje na te same etapy biosyntezy aldosteronu co angiotensyna II, chociaż mechanizm jego działania jest niejasny. Jon potasu, podobnie jak angiotensyna II, nie wpływa na biosyntezę kortyzolu. Inne stymulatory. W określonych warankach ACTH i sód mogą uczestniczyć w produkcji aldosteronu u człowieka. HORMONY STEROIDOWE WYWOŁUJĄ LICZNE I RÓŻNORODNE EFEKTY METABOLICZNE

Wypadnięcie czynności kory nadnerczy kończy się śmiercią, jeśli nie rozpoczęto dostatecznie wcześnie leczenia substytucyjnego. U człowieka leczenie substytucyjne niewydolności ko-

ry nadnerczy tylko mineralokortykoidami jest niewystarczające; glukokortykoidy mają znaczenie decydujące o przeżyciu. W odróżnieniu od człowieka, u szczurów podawanie mineralokortykoidów jako leczenie substytucyjne w niewydolności kory nadnerczy jest zupełnie wystarczające. Zarówno nadmiernie podwyższone, jak i obniżone stężenia obu klas hormonów, spowodowane procesem chorobowym lub postepowaniem leczniczym, są przyczyną poważnych powikłań związanych z efektami metabolicznymi tych hormonów. Glukokortykoidy wpływają na podstawową przemianę materii, mechanizmy odpornościowe i ciśnienie tętnicze krwi oraz uczestniczą w reakcjach ustroju na stres

Szczegółowy opis metabolicznych efektów hormonów glukokortykoidowych można zna leźć w standardowych podręcznikach fizjologii, Krótkie zestawienie tych efektów znajduje się w tab, 49-4,

Tabala 49-4. Efekty biologiczne glukokortykoidów I. Wpływ na pośrednią przemianę materii 1. Wzrost wytwarzania glukozy w wątrobie spowodowany: a. Zwiększonym napływem aminokwasów (substratów glukoneogenetycznych) z tkanek obwodowych b. Wzrostem glukoneogenezy uwarunkowanym aktywacją kluczowych enzymów tego procesu c. Maksymalizacją innych kluczowych reakcji (uwarunkowanych permisyjnym działaniem glukokortykoidów) 2. Wzrost odkładania się glikogertu w wątrobie poprzez aktywacje syntazy glikogenowej Wzrost I i po I i zy (w kończynach); mogą stymulować lipogenezę w innych miejscach (twarz, tułów) szczególnie wtedy, gdy ich stężenie w osoczu jest wyższe od fizjologicznego Stymulacja przemiany białek i RNA. Przy fizjologicznych stężeniach glukokortykoidów jest to dziaianie anaboliczne, natomiast przy stężeniach wyższych od fizjologicznych — działanie kataboliczne II. Działanie na mechanizmy odpornościowe:

Redukcja reakcji immunologicznych. Hormony te powodują rozpad limfocytów, który jest gatunkowo i komórkowo swoisty Supresja reakcji zapalnych przez: a. Zmniejszanie liczby krążących leukocytów i migracji leukocytów tkankowych b. Hamowanie proliferacji fibroblastów c. Stymulację powstawania lipokortyn, które hamując fosfolipazę A2, zmniejszają syntezę bardzo silnych substancji zapalnych, tj. prostaglandyn i leukotrien III. Inne efekty glukokortykoidów Są niezbędne do utrzymania prawidłowego ciśnienia tętniczego oraz prawidłowej objętości minutowej serca (rzutu serca) Są niezbędne do utrzymania prawidłowej równowagi wodnoelektrolitowej najpewniej poprzez hamowanie uwalniania ADH (przez co wpływają na wydalanie H2O przez nerki) i stymulację syntezy angiotensynogenu (przez co wpływają na retencję Na w nerkach). Te efekty glukokor tykoidów pośrednio oddziałują na ciśnienie tętnicze krwi Są niezbędne, wraz z hormonami rdzenia nadnerczy, w reakcji ustroju na stres

HORMONY KORY NADNERCZY / 639 Hormony mineralokortykoidowe wpływają na równowagę elekrolitową i transport jonów Hormony mineralokortykoidowe działają w nerkach pobudzając aktywny transport Na + w kanalikach krętych dystalnych i zbiorczych. Efektem „netto" ich działania jest retencja sodu. Hormony te pobudzają również w nerkach sekrecje jonów K+, H+ i NH^i wpływają na transport jonów w innych tkankach nabłonkowych, w tym w gruczołach potowych, błonie śluzowej jelit i śliniankach. Działanie mineralokortykoidowe aldosteromi jest 30—50 razy silniejsze niż deoksykortykosteronu (DOC) i 1000-krotnie silniejsze niż kortyzolu lub kortykosteronu. Jako najsilniejszy naturalny rnineralokortykoid, aldosteron jest głównym hormonem regulacji gospodarki sodowej i potasowej u człowieka. Kortyzol, choć wykazuje znacznie słabsze działanie minerał ot rop owe, wywiera również znamienny wpływ na retencję Na+ i wydalanie K+ przez to, że wytwarzany jest w znacznie większych ilościach niż aldosteron. Mniejsze znaczenie w regulacji gospodarki Na+ i K+ ma DOC, ponieważ jego wytwarzanie jest bardzo małe. Do wystąpienia skutków działania aldosteronu potrzebna jest synteza białek i RNA, co sugeruje, że w mechanizmie działania tego hormonu uczestniczą swoiste produkty genowe. MECHANIZMY DZIAŁANIA HORMONÓW STEROIDOWYCH NADNERCZY SĄ DO SIEBIE PODOBNE Hormony glukokortykoidowe rozpoczynają swoje działanie w komórkach docelowych reagując ze swoistym receptorem. Ten etap jest niezbędny, by mogły one wniknąć do jądra komórkowego i związać się z DNA. Na ogół stwierdza sie wysoką dodatnią korelację między wielkością powinowactwa hormonu z receptorem a nasileniem określonego efektu biologicznego. Dotyczy to szerokiej skali aktywności tych hormonów. 1 tak steroid wykazujący 10-krotnie słabsze powinowactwo do receptora niż np. kortyzol wywołuje odpowiednio mniejsze działanie biologiczne przy określonym stężeniu tych steroidów. W mechanizmie działania hormonów steroidowych na ogół nie uczestniczą „receptory zapasowe". Biologiczne działanie hormonu steroidowego

zależy zarówno od jego zdolności wiązania się z receptorem, jak również od stężenia wolnego hormonu (nie związanego z białkiem transportowym) w osoczu. Kortyzol, kortykosteron i aldosteron — wszystkie te hormony wykazują silne powinowactwo do receptora glukokortykoidowego, niemniej jednak w warunkach fizjologicznych głównym hormonem wiążącym się z receptorem glukokortykoidowym jest kortyzol, ponieważ jego stężenie w osoczu krwi jest najwyższe. W pewnych stanach chorobowych (np. w niedoborze 17 a-hydroksylazy) kortykosteron jest głównym glukokortykoidem, W odróżnieniu od niego, aldosteron nigdy nie osiąga stężenia w surowicy potrzebnego do wystąpienia efektów glukokortykoidowych. Domeny czynnościowe receptora glukokortykoidowego zostały rozszyfrowane Liczne badania biochemiczne, immunologiczne i genetyczne doprowadziły do poznania struktury receptora glukokortykoidowego przedstawionego schematycznie na ryc. 49-6. N-końcowa połówka receptora zawiera większość domen antygenowych oraz obszar modulujący czynność promotorową (frans-aktywację). C-końcowa połowa receptora zawiera domenę wiążącą DNA i hormon. Domena wiążąca DNA znajduje się bliżej środka cząsteczki, podczas gdy domena wiążąca hormon zlokalizowana jest blisko C-końca. Obie te domeny są niezbędne w żrans-aktywacji procesu transkrypcji genu. Dla dimeryzacji dwóch cząsteczek receptora potrzebna jest pewna sekwencja aminokwasowa na C-końcu, Sądzi się, że reakcja dimeryzacji jest potrzebna przy wiązaniu się receptora do każdej z dwóch „połówek" elementu odpowiedzi na glukokortykoidy (GRE) (p. strzałki w tab. 45-3). Wydaje się, że do procesu wniknięcia receptora do jądra komórkowego (czyli dla jego lokalizacji w Jądrze") potrzebne są dwa oddzielne obszary. Sekwencja aminokwasowa receptora, ustalona na podstawie analizy odpowiadającego mu cDNA, wykazała występowanie dwóch obszarów obfitujących w reszty Cys-Lys-Arg w obrębie domeny wiążącej DNA. Porównując te obszary z innymi białkami wiążącymi DNA (szczególnie TFIIIA), można zakładać występowanie struktury białka, posiadającego dwa „palce" (przy czym każdy z nich ma w środku atom cynku), które wiążą się z jednym skrętem pasma DNA. Jest to jedna z postaci interakcji

640 / ROZDZIAŁ 49

Domena zmienna

□omana wiążąca ONA

m.

Domena wiążąca hormon

■cooh trans— aktywacja Translokacja Jądrowa Dimeryzacja Antygenowość Homologia z on kog snem

v—»rt~ A

Ryc. 49-6. Schemat struktury fudzkiego receptora gfikokortykoidowego złożonego z 777 aminokwasów. W obrębie receptora można wyróżnić domeny antygenowe wiążące DNA oraz wiążące hormon. Pokazano również inne domeny oraz homologię z onkogenem v-erb-A.

białek z DNA omawianych w rozdz. 41. Ta obserwacja jak również wynik innych badań, w których wykazano, że C-końcowa połówka receptora ghikokortykoidowego jest bardzo podobna do onkogenu v-erb-A oraz że domeny tego onkogenu wiążące DNA są homologiczne z analogicznymi domenami receptora glukokortykoidowego, estrogenowego i progesteronowego, doprowadziły do wykrycia nadrodziny steroid o wo-tarczy co wego receptora hormonalnego.

Nadrodzina steroid owo-tarczyco wego receptora hormonalnego. Hormony

steroidowe i tarczycy regulują wiele procesów uczestniczących w rozwoju, różnicowaniu, wzroście, reprodukcji i adaptacji ustroju do zmian środowiskowych. W ostatnich latach stało się jasne, że wspólny mechanizm mógłby wyjaśnić działanie tych hormonów na poziomie molekularnym (p. rozdz. 45). W tym mechanizmie istotnym ogniwem są receptory hormonalne. Ponieważ występowanie tych ostatnich w ustroju nie jest obfite, analiza strukturalna receptorów stała się możliwa dopiero po wyizolowaniu klonów cDNA dla każdego z nich. Najpierw poznano strukturę receptora glukokortykoidowego, estrogenowego i progesteronowego. Stwierdzenie homologii w zakresie domen wiążących DNA dla tych hormonów, jak również wykazanie znacznego podobieństwa tych domen do \-erb-A — białka onkogennego, wiążącego DNA, były punktem wyjścia dla hipotezy, że wymienione receptory mogą należeć do nadrodziny genowej (supergene family). Jeżeli tak, oczywista stała się kolejna hipoteza, że z bibliotek cDNA powinno się

wyizolować inne receptory, używając sond na wspólny obszar (domenę DNA) w warunkach zredukowanej hybrydyzacji (p. rozdz. 42). Okazało się, że hipoteza ta była słuszna. Jak to pokazano na ryc. 49-7, określone zostały struktury dla wszystkich receptorów steroidowych, również dla kilku receptorów, których dotychczas nie zidentyfikowano. Uderzająca jest dla tych receptorów homologia domen wiążących DNA oraz fakt występowania ogólnej wspólnej organizacji. Omawiane receptory różnią się znacznie długością, głównie połówki N-końcowego fragmentu cząsteczki. Ta obserwacja znacznie przyspieszyła zrozumienie mechanizmu transkrypcji genów regulowanych przez te hormony. Działanie hormonów glukokortykoidowych polega przeważnie na regulacji ekspresji genów Ogólne mechanizmy działania hormonów glukokortykoidowych zostały opisane w rozdz. 45 i przedstawione na ryc. 45-1. Liczne dowody potwierdzają słuszność koncepcji, że ta klasa hormonów wywiera wpływ na swoiste białka komórkowe, oddziaływując na ilość „krytycznych" białek, najczęściej enzymów, w obrębie komórki. Zwykle gfukokortykoidy realizują swoje działanie poprzez regulację szybkości transkrypcji swoistych genów w komórkach docelowych, choć mogą wpływać również na inne etapy „szlaku informacyjnego" (p. ryc. 45-2). Regulacja transkrypcji polega na tym, że kompleks steroid-receptor wiąże się ze swoistymi sekwencjami DNA, położonymi w sąsiedztwie miejsca inicjacji transkrypcji i, że te obszary

HORMONY KORY NADNERCZY / 641 Domeny

Zmienne

Ugand

DNA

421

496 528

Receptor 777 GlukoKortykoidowy 984

Mlnsralokortykoldowy 567

633 680

934

V90< 185

Progestynowy

250 311

551 595 Estrogenów/

1 24

89

427

192

Dla wiła miny D

162

169 232

4S6 TĄ dla hormonów tarczycy

8S

153 198

Ola kwasu retlnol owego

462

291

358

421

639 V-erf>-A

Ryc. 49-7. Schematyczne porównania nadrodziny steroidowo-tarczycowego receptora hormonalnego. Sekwencje w obrębie ludzkich receptorów (v-erb-A jest pochodzenia ptasiego) zostały tak przedstawione, by ich domeny wiążące DNA i wykazujące największe podobieństwo w sekwencji aminokwasowej znajdowały się jedna nad drugą Liczby w obrębie za kres kowanego pola oznaczają procentowe podobieństwo danej domeny do odpowiedniej domeny receptora glukokortykoidowego. Liczby nad pionowymi liniami, odgraniczającymi poszczególne domeny, oznaczają pozycje aminokwasów. N-kotfcowy aminokwas oznaczono jako 1. Wyizolowano wiele innych podobnych cząsteczek, lecz nie określono ich czynności ani ich ligandów._____________ _____________________________________________

DNA nadają reakcji na hormon cech swoistości. W jaki sposób interakcja kompleksu steroid-receptor z DNA pobudza lub hamuje transkrypcję, na czym polega swoistość tkankowa tej interakcji oraz dlaczego w jednych tkankach hormon pobudza, zaś w innych hamuje transkrypcję określonego genu — oto kilka tylko pytań, na które dotychczas brak odpowiedzi. Krótki opis mechanizmu wpływu hormonów glukokortykoidowych na transkrypcję DNA wirusa wywołującego guz sutka u mys2y jest najlepszą ilustracją stanu wiedzy na temat działania hormonów steroidowych. Model wirusa wywołującego guz sutka jest bardzo użyteczny, ponieważ wpływ steroidów jest szybki i wyrazisty i dogłębnie zbadano biologię molekularną tego wirusa. Kompleks glukokortykoid-recep4i

Biochemia

tor wiąże się wybiórczo i swoiście z sekwencją DNA określoną jako glukokortykoidowy obszar (element) regulatorowy (GRE ■— glucocorticoid regulatory element). Obszar ten zlokalizowany jest o kilkaset zasad w górę w stosunku do miejsca inicjacji transkrypcji. W bliskim sąsiedztwie GRE znajdują się sekwencje bardzo podobne do sekwencji konsensus GGTACAnnnTGTCT zlokalizowanej we fragmencie regulatorowym genów regulowanych przez glukokortykoidy. Glukokortykoidowy obszar regulatorowy połączony z receptorem nasila inicjację transkrypcji genomu wirusa wywołującego guz sutka u myszy oraz wykazuje również działanie aktywujące na heterologiczne promotory. Ten element działający w układzie cis jest czynny również wówczas, kiedy zostanie przesunięty do innych obszarów DNA położonych

442 / ROZDZIAŁ 49 -

GRE \

Promotor MTV

( GRE

Promotor MTV

r Genom MTV

p

Promotor MTV

—

Genom MTV

Genom MTV

GRE

GRE

\

Promotor hetero logiczny

GRE

\

Promotor hetero logiczny

r

\

Genom MTV

r Gen hetero logiczny

Ryc. 49-8. GRE jest wzmacniaczem procesu transkrypcji. Wirus (typ dziki) wywołujący guz sutka u myszy (MTV) zawiera: obszar w paśmie DNA, które ulega skopiowaniu do jednostki transkrypcyjnej (genom MTV), promotor i GRE. GRE oddzielony jest normalnie od 5'-końcowego miejsca startowego transkrypcji przez ok. 200 zasad, choć może działać w obu kierunkach GRE może również ulec ttenslokacji w dół od miejsca startowego transkrypcji. Działa on również w heterologicznych układach promotorowych i kodujących. Te fakty dowodzą, że GRE i inne obszary regulatorowe wyizolowane z różnych genów działają jako wzmacniacze transkrypcji. ___________________ ______"

w dół lub w górę łańcucha i pracuje w obu kierunkach. Pod tym względem glukokortykoidowy obszar regulatorowy spełnia rolę wzmacniacza procesu transkrypcji. Występowanie tych cech wykazano również w kilku innych genach regulowanych przez glukokortykoidy. Są one zestawione na ryc. 49-8. Wydaje się, że niektóre geny regulowane przez glukokortykoidy wymagają obecności dodatkowego białka wiążącego DNA oraz odpowiadającego mu obszaru DNA. Główne działanie glukokortykoidów polega na kontroli nasilenia procesu transkrypcji genu, lecz nie jest to ich działanie jedyne. Dzięki możliwości mierzenia nasilenia różnych procesów wykazano, że glukokortykoidy regulują również szybkość degradacji swoistych mRNA (np. mRNA kodującego hormon wzrostu i karboksykinazę fosfoenolopirogronianową) oraz obróbkę potranslacyjną (np. różnych białek wirusa wywołującego guz sutka u myszy). Glukokortykoidy i inne klasy hormonów steroidowych mogą działać na każdym etapie „szlaku informacyjnego" począwszy od DNA, a kończywszy na końcowym białku (p. ryc. 45-2), przy czym nasilenie tego działania może być różne i zależne od danego układu.

Ogólne zasady działania hormonu m ineralokorty koidowego (aldosteronu) są podobne do opisanych dla innych hormonów steroidowych (ryc. 45-1, Z, 3. i tab. 45-3) Chociaż wyizolowano swoiste produkty genowe, do wystąpienia efektów działania aldosteronu potrzebna jest synteza białek i RNA. Przyjmuje się, że swoiste białka uczestniczą w transporcie jonów indukowanym aldosteronem. Receptory o wysokim powinowactwie do ałdosteronu (K d~1 nmol/l) stwierdzono w cytoplazmie i jądrach komórek docelowych Obecność takich receptorów stwierdzono w nerkach, śliniankach przyusznych i jelicie grubym oraz w innych komórkach, których nie uważano za komórki docelowe dla aldosteronu (komórki hipokampa i serca). Te receptory wykazują podobne powinowactwo do aldosteronu, kortyzolu i kortykosteronu i określone zostały jako receptory typu I w celu odróżnienia ich od klasycznych receptorów glukokortykoidowych (typu II). Uwzględniając fakt, że stężenie aldosteronu

HORMONY KORY NADNERCZY / 643

w osoczu krwi jest znacznie mniejsze od stężenia kortyzolu i kortykosteronu, można by przypuszczać, że receptory typu I zostaną zajęte głównie przez te dwa ostatnie steroidy, przez co działanie aldostoonu byłoby niewielkie. Należy jednak przypomnieć, że DOC i kortykosteron są chciwie wiązane przez globulinę wiążącą kortykosteroidy, tj. przez białko transportowe dla glukokortykoidów, podczas gdy aldosteron nie ma swoistego białka nośnikowego. Ten fakt sprawia, że efektywne stężenie wolnego (nie związanego z białkiem) aldosteronu w osoczu krwi jest wyższe od odpowiedniego stężenia zarówno kortykosteronu, jak i DOC Dlatego też aldosteron łatwo wnika do komórek co daje mu przewagę w konkurencji o wiązanie z receptorami typu I in vivo. Ważne dla ustroju działanie aldosteronu zabezpiecza dodatkowy mechanizm stanowiący rodzaj wentyla bezpieczeństwa. Receptor występujący w tkankach docelowych dla mineralokortykoidów wykazuje bezwzględną selektywność dla aldosteronu dzięki obecności enzymu dehydrogenazy 11 p-hydroksysteroidowej. Enzym ten przekształca kortyzol i kortykosteron do odpowiednich 11 pmetabolitów, lecz nie działa na aldosteron. Metabolity te nie wiążą się z receptorami typu I, sprawiając, że aldosteron ma do niego swobodny dostęp. Aldosteron działa głównie na transport jonów Działanie aldosteronu na transport sodowy na poziomie molekularnym nie zostało wyjaśnione. Niemniej wyniki kilku badań -uzasadniają następującą hipotezę. Jony Na+ występujące w płynie zawartym w świetle kanalików nerkowych wnikają biernie do komórek kanalikowych od strony luminalnej za pośrednictwem kanałów sodowych. Z kolei jony Na+ przechodzą do płynu śródmiąższowego za pośrednictwem Na+/K+ zależnej pompy ATP-azowej umiejscowionej na biegunie podstawnobocznym komórek kanalikowych. Energię dla tego procesu dostarcza ATP. Aldosteron zwiększa liczbę kanałów sodowych w błonie komórkowej luminalnego bieguna komórek kanalikowych, co zapewne jest przyczyną wzrostu środkom orkowego stężenia Na+. Aldosteron zwiększa również aktywność kilku enzymów mitochondrialnych, przez co nasila powstawanie ATP niezbędnego do napędzania pompy Na+/K+ umiejscowionej w błonie komórkowej po dstawnob ocznego bieguna

komórek kanalikowych. Skutkiem działania aldosteronu jest wzrost ilorazu NADH:NAD oraz aktywności kilku enzymów mitochondrialnych, w tym syntazy cytrynianowej. Wzrost aktywności syntazy cytrynianowej jest wynikiem rzeczywistej indukcji (pośredniczonej opisaną wyżej transkrypcją genu) i okresowy wzrost tego białka wykazuje wysoką korelację z działaniem aldosteronu na transport Na+. Nie wykazano bezpośredniego wpływu aldosteronu na pompę sodową. Tak więc wydaje się, że hormon ten zwiększa śródkomórkowe stężenia Na+ oraz stymuluje powstawanie związków wysokoenergetycznych niezbędnych przy wypompowywaniu tego jonu do płynu śródmiąższowego. Inne mechanizmy wydają się uczestniczyć w transporcie jonów K+ i H+, a wśród nich różne białka regulowane przez aldosteron*. PATOFIZJOLOGIA KORY NADNERCZY Zaburzenia spowodowane nadmiarem lub niedoborem glukokortykoidów Pierwotna niewydolność nadnerczy (choroba Addisona) charakteryzuje się hipoglikemią, niezwykłą nadwrażliwością na insulinę, nietolerancją stresu, jadłowstrętem, chudnięciem, nudnościami i znacznym osłabieniem. Chorzy na chorobę Addisona wykazują niskie ciśnienie tętnicze, obniżone przesączanie kłębuszkowe oraz zmniejszoną zdolność do wydalania ładunku wodnego. W wywiadach często podają „nałogowe" zjadanie soli. W surowicy krwi stwierdza się małe stężenie Na+, natomiast duże stężenie K+; ponadto obserwuje się wzrost liczby limfocytów i komórek eozynofdnych. U chorych takich stwierdza się nadmierną pigmentację skóry i błon śluzowych, uwarunkowaną wyrównawczym wzrostem sekrecji ACTH i produktów transkrypcji genu proopiomelanokortyny (POMC). Wtórna niewydolność kory nadnerczy uwa-

runkowana jest niedoborem ACTH spowodowanym zawałem przysadki gruczołowej lub jej zniszczeniem przez nowotwór lub zakażenie. Charakteryzuje się podobnymi aberracjami metabolicznymi co pierwotna niewydolność kory * Mechanizm działania aldosteronu na komórki

nabłonkowe gruczołów potowych, ślinianek i przewodu pokarmowego jest podobny do podanego dla komórek kanalików nerkowych {przyp. tłum.).

644 / ROZDZIAŁ 49

nadnerczy, różni się od niej jednak nieobecnością hiperpigmentacji skóry i błon śluzowych. Nadmiar glukokortykoidów, powszechnie określany jako zespół Cushinga, zwykle spowodowany jest podawaniem farmakologicznych dawek tych steroidów. Może on być również uwarunkowany nadmiernym wydzielaniem ACTH przez gruczolaka przysadki mózgowej, nadmierne wydzielanie glukokortykoidów przez gruczolaka lub raka nadnerczy lub ektopową sekrecję ACTH przez nowotwór. Dla chorych z zespołem Cushinga charakterystyczne jest zniknięcie dobowego rytmu wydzielania ACTH i kortyzolu. Wykazują oni obecność hiperglikemii lub cechy nietolerancji glukozy (lub obydwie anomalie metaboliczne) spowodowanej wzmożoną gluk one o genezą. Ze wzmożoną glukoneogenezą powiązany jest ciężki katabofizm białek przejawiający się ścieńczeniem skóry, zanikiem mięśni szkieletowych, osteoporozą, zanikiem tkanki limfoidalnej. Ogólnie mówiąc u chorych tych stwierdza się ujemny bilans azotowy. Stwierdza się też charakterystyczne rozmieszczenie tkanki tłuszczowej, tj. otyłość typu tułowiowego z obecnością typowego „garbu bawolego". Oporność na infekcje, reakcje zapalne oraz gojenie się ran są upośledzone. Wiele objawów, takich jak hipernatremia, hipokalemia, zasadowica, obrzęki i nadciśnienie, spowodowanych jest efektami minerał okortykoidowymi kortyzolu. Zaburzenia związane z nadmiarem mineralokortykoidów

Małe gruczolaki komórek warstwy kiębkowatej nadnerczy są przyczyną pierwotnego aldosteronizmu (zespołu Conna). Do klasycznych objawów tego zespołu należą: nadciśnienie tętnicze, hipokalemia, hipernatremia i zasadowica nieoddechowa. U chorych z aldosteronizmem pierwotnym nie stwierdza się objawów nadmiaru hormonów glukokortykoid owych, stwierdza się natomiast małą aktywność reninową osocza oraz małe stężenia angiotensyny II. Zwężenie tętnicy nerkowej z następczym spadkiem ciśnienia perfuzyjnego w nerkach może być przyczyną przerostu i zwiększonej funkcji komórek przykłębuszkowych, przejawiających się dużą aktywnością reninową osocza oraz podwyższonymi stężeniami angiotensyny II. Ta ostatnia jest przyczyną wtórnego aidosteronizmu, który jest podobny do postaci pierwotnej, różniąc się od tej ostatniej wysokimi stężeniami reniny i angiotensyny II w osoczu.

Wrodzony rozrost (hyperplasia) nadnerczy spowodowany jest niedoborem enzymatycznym

Zmniejszenie ilości enzymów uczestniczących w steroidogenezie jest przyczyną niedoboru jej produktów końcowych, akumulacji metabolitów pośrednich oraz nadmiernej syntezy steroidów szlakami alternatywnymi. Wspólną cechą większości tych zespołów, które powstają już w życiu zarodkowym in utero, jest niedobór kortyzolu, nadmierne wydzielanie ACTH oraz rozrost nadnerczy. Stąd określenie wrodzony rozrost nadnerczy. Inną wspólną cechą tych zespołów jest nadprodukcja androgenów nadnerczowych. Ta ostatnia jest przyczyną przyspieszonego wzrostu, wirylizacji oraz występowania obojnaczych narządów płciowych. Ten fakt tłumaczy alternatywne określenie tego schorzenia jako zespół nadnerczowo-płciowy. W 90% przypadków wrodzony rozrost nadnerczy spowodowany jest dwiema postaciami niedoboru 21-hydroksy!azy, tj. niedoborem częściowym będącym przyczyną tylko wirylizacji oraz niedobór całkowity przebiegający z utratą soli przez nerki. Pozostałe przypadki uwarunkowane są niedoborem 11 (S-hydrnksyla/y. Opisano tylko pojedyncze przypadki niedoborów innych enzymów (dehydrogenazy 3 p-hydroksysteroidowej, 17a-hydroksylazy, desmolazy cholesterolowej, 18-hydroksylazy, 18-dehydrogenazy). Niedobór I8-hydroksylazy i 18-dehyd-

rogenazy są przyczyną tylko niedostatecznej biosyntezy aldosteronu i nie przebiegają z rozrostem nadnerczy. Niedobór desmolazy cholesterolowej uniemożliwia biosyntezę któregokolwiek steroidu. Dlatego też defekt ten jest zwykle nie do pogodzenia z życiem pozamacicznym. PIŚMIENNICTWO Beanto M: Gene regulation by steroid hormones. Celt I989;56:335. Evans R: The steroid and thyroid hormone receptor superfamily: Science 1988;240:889. Granner DK: The role of glucocorticoid hormones as biotogical amplifiers. In: Glucocorticoid Hormone Action. Baxter JD, Rousseau GG (editors). Springer-Verlag, 1979. Gustafsson et al: Biochemistry, molecutar biology and physiology of the glucocorticoid receptor. Endocrine Rev 1987;8:185. MorrisDJ: The metabolism and mcchanismof action of action of aldosterone. Endocr Rev 1981;2:234. Yamamoto KR: Steroid receptor-regulated transcrip(ion of specific genes and gene networks. Ann Rev Genet 1985;19:209.

Hormony rdzenia nadnerczy

50

Dary! K. Granner, MD

WPROWADZENIE Układ współczulnonadnerczowy składa się z przywspókzulnego układu nerwowego z nerwami cholinergicznymi przed- i zazwojowymi, ze współczulnego układu nerwowego z cholinergicznymi nerwami przedzwojowymi i adrenergtcznynii nerwami zazwojowymi oraz z rdzenia nadnerczy. Ten ostatni stanowi w rzeczywistości wydłużenie współczulnego ukiadu nerwowego, ponieważ zakończenia włókien przędz woj owych nerwu trzewnego unerwiają komórki chromochłonne wytwarzające hormony katecholaminowe, tj. dopaminę, noradrenalinę (norepinefrynę) i adrenalinę (epinefrynę). Rdzeń nadnerczy jest więc wyspecjalizowanym zwojem bez wypustek aksonalnych. Jego komórki syntetyzują, magazynują i uwalniają substancje działające w miejscach oddalonych od rdzenia. Oznacza to, że rdzeń nadnerczy działa jako narząd wewnątrzwydzielniczy. Jest on doskonałym przykładem ścisłego powiązania układu nerwowego z układem endokrynnym, jak to zasygnalizowano w rozdz. 45.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Hormony układu współczulnonadnerczowego, choć nie są niezbędne do życia, są jednak potrzebne w procesie adaptacji do ostrego i przewlekłego stresu. Adrenalina, noradrenalina i dopamina są głównymi składowymi reakcji na silny stres. Reakcja ta składa się z licznych, zintegrowanych procesów przystosowawczych w narządach ważnych dla życia (w mózgu, mięśniach, układzie sercowoplucnym i w wątrobie), kosztem narządów mniej uczestniczących (skóry, układu żołądkowo-jelitowego, tkanki limfoidalnej) w tej reakcji. Aminy katecho-

Skróty używane w tym rozdziale COMT - - O-Metylotransferaza katecholowa DBH - — p -Hydroksv4aza dopaminowa (f3-oksydaza dopaminowa} MAO - - Oksydaza monoaminowa P NM T - - N - Metyl otrą nsferaza fenyloetanoloamtnowa VMA - - Kwas waniltnomigdatowy

lowe nie są jedynymi hormonami ułatwiającymi przezwyciężenie stresu. Wspomagają je glukokortykoidy, hormon wzrostu, wazopresyna, angiotensyna II i glukagon.

HORMONY KATECHOLAMINOWE SĄ 3,4-DIHYDROKSY-POCHODNYMI FENY LOETYLOAM INY * Dopamina, noradrenalina i adrenalina syntetyzowane są w komórkach chromochłonnych rdzenia nadnerczy. Nazwa tych komórek pochodzi stąd, że zawierają one ziarnistości barwiące się na kolor czerwono brunatny przy ekspozycji na dwuchromian potasu. Skupiska takich komórek znajdują się również w sercu, wątrobie, nerkach, gonadach, neuronach adrenergicznych zazwojowego układu współczulnego oraz w ośrodkowym układzie nerwowym. Głównym produktem rdzenia nadnerczy jest adrenalina. Związek ten stanowi 80% wszystkich katecholamin zawartych w rdzeniu. Nie jest ona syntetyzowana w innych tkankach położonych poza rdzeniem nadnerczy. W odróżnieniu od adrenaliny, większość noradrenaliny zawarta w narządach mających unerwienie współczuł ne syntetyzowana jest insitu (ok. 80% całej zawartości), pozostała zaś ilość wytwarza-

646 / ROZDZIAŁ 50

ł

HYDROKSYLAZA

TVROZYNOWA (4-MONOOKSYGENAZA

H

I

HO

HI

C— C—IMH, W

H

MONOFENOLO A)

H.

Dopamtna

I

/I-HYDROKSYLAZA DOPAMINOWA (JS - OKSYDAZA DOPAMINOWA)

HO H HO-

I

—C

\

No rad ren ati na

I

CI

U

CH,

C —C—NH I HI H

Adrenalina

Ryc. 50-1. Biosynteza katecholamin. PNMT — Nmety łotra nsferaza fenyloetanoloaminowa. (Według Goldfien A.: The adrertal medulla, w: Greenspan F. S., Forsharn P. H, (red): Basie and Clinical Endocrinoiogy. Wyd. 2, Appleton and Lange, 1986, w modyfikacji, za zezwoleniem).

na jest w innych zakończeniach nerwowych, skąd dociera do komórek docelowych drogą krwi. Adrenalina i noradrenalina mogą być syntetyzowane i magazynowane przez komórki rdzenia nadnerczy i innych tkanek chromochkmnych. Konwersja tyrozyny do adrenaliny obejmuje następujące kolejne reakcje: 1) hydroksylację pierścienia benzenowego, 2) dekarboksylację i 3) hydroksylację łańcucha bocznego oraz 4) N-metylację. Szlak biosyntezy katecholamin i udział w niej poszczególnych enzymów przedstawiono na ryc. 50-1, na ryc. 50-2 zaś przedstawiono schemat ich biosyntezy w komórce c hromochło nnej, Hydroksylaza tyrozynowa jest enzymem decydującym o wydajności biosyntezy katecholamin Tyrozyna jest bezpośrednim prekursorem katecholamin, zaś hydroksylaza tyrozynowa (4-monooksygenaza monofenolowa) jest enzymem krytycznym w biosyntezie tych związków, decydującym o jej nasileniu. Hydroksylaza tyrozynowa występuje tylko w tkankach wytwarzających katecholaminy i to w postaci bądź rozpuszczonej, bądź związanej z ziarnistościami. Działa ona jako oksydoreduktaza z tetrahydropterydynąjako koenzymem, przekształcając L-tyrozynę do L-dihydroksyfenyloalaniny (L-dopa). Jako enzym decydujący o nasileniu biosyntezy katecholamin, hydroksylaza tyrozynowa podlega różnym regulacjom. Najważniejszym mechanizmem jest hamowanie jej aktywności przez same katecholaminy (hamowanie mechanizmem sprzężenia zwrotnego), które współzawodniczą z hydroksylaza o koenzym pterydynowy tworząc z tym ostatnim zasadę Schiffa. Hydroksylazę tyrozynowa hamuje kompetycyjnie również cały szereg pochodnych tyrozyny, w tym a-metyl o tyrozyna. Związek ten stosowany jest sporadycznie w leczeniu stanu chorobowego przebiegającego z nadmiarem katecholamin u chorych z guzem chromochłonnym, chociaż znane są inne, bardziej skuteczne związki obciążone mniej licznymi objawami ubocznego działania. Trzecia grupa związków hamuje hydroksylazę tyrozynowa, chelatując żelazo, będące kofaktorem tego enzymu. Przykładem takiego związku jest a, a'-dipirydyl. Katecholaminy nie przenikają przez barierę krew-mózg; oznacza to, że muszą one być syntetyzowane na miejscu, tj. w samym mózgu. W określonych chorobach ośrodkowego ukła-

HORMONY RDZENIA NADNERCZY / 647 PŁYN POZAKOMORKOWY

Komórka chromochłonna

PŁYN POZAKOMORKOWY

EINE

+

DBH ATP

Tyrozyna

Chromogranina A Wapfi

związki 0-adre-© nerglczne I chaiinergiczne 0 związki K-adfenarglczne

Ryc. 50-2. Schemat biosyntezy katechoiamin w komórce chromochtonnej. TH — hydroksylaza tyrozynowa, DD — dekarboksylaza dopa, PNMT—N-metylotransferazafenyloetanoloa/ninowa, DBH — (J-hydroksylazadopaminowa, ATP-— adenozynotrifosforan. Biosynteza katecholamin odbywa się w cytoplazmie i w różnych ziarnistościach komórki rdzenia nadnerczy. Niektóre ziarnistości zawierają adrenalinę (epineirynę) (E), inne noradrenaiinę, zaś jeszcze inne — obydwa hormony. Po stymulacji cała zawartość ziarnistości jest uwalniana do płynj pozakomórkowego.

du nerwowego, np. w chorobie Parkinsona stwierdza sie lokalne upośledzenie syntezy dopaminy. W odróżnieniu od dopaminy, L-dopa, będąca prekursorem dopaminy, bardzo łatwo przenika przez barierę krew-niózg, dzięki czemu jest "ważnym lekiem stosowanym w terapii choroby Parkinsona. Dekarboksylaza dopa jest obecna we wszystkich tkankach Ten rozpuszczony w cytoplazmie enzym wymaga obecności fosforanu pirydoksalu w procesie konwersji L-dopa do 3,4-dihydroksyfenylo etyloaminy (dopaminy). Związki strukturalnie podobne do L-dopa, np. L-metylodopa, są kom petycyjnym i inhibitorami tej reakcji. Chlorowcowe związki tworzą z L-dopa zasadę Schiffa oraz hamują reakcję dekarboksylacji, a-Metylodopa oraz spokrewnione z nią związki, takie jak 3-hydroksytyramina (pochodna tyraminy), a-metyl o tyrozyna i metaraminol są skutecznymi lekami stosowanymi w niektórych postaciach etiologicznych nadciśnienia tętniczego(i-Hydroksylaza dopaminowa (Poksydaza dopaminowa) (DBH) katalizuje konwersję dopaminy do noradrenaliny DBH jest oksydaza o mieszanej funkcji. Nośnikiem elektronów dla tego enzymu jest askor-

binian, zaś jego modulatorem fumaran. W centrum aktywnym tego enzymu znajduje się miedź. DBH występuje prawdopodobnie w specjalnej frakcji subkomórkowej komórek rdzenia nadnerczy, tj. w ziarnistościach wydzielniczych. Tak więc konwersja dopaminy do noradrenaliny zachodzi w tej strukturze śródkomórkowej. DBH jest uwalniana z rdzenia nadnerczy i zakończeń nerwowych wraz z noradrenaliną. W odróżnieniu od noradrenaliny nie może ona ponownie wrócić do zakończeń nerwowych na zasadzie powrotnego wychwytu. N-Metylotransferaza fenyloetanoloaminy (PNMT) katalizuje powstawanie adrenaliny Enzym ten, rozpuszczony w cytoplazmie, katalizuje N-metylację noradrenaliny, dzięki czemu powstaje adrenalina. Reakcja ta zachodzi w komórkach rdzenia nadnerczy syntetyzujących ten hormon. Skoro PNMT jest enzymem rozpuszczalnym, przyjmuje się, że reakcja konwersji noradrenaliny do adrenaliny zachodzi w cytoplazmie. Syntezę PNMT indukują hormony glukokortykoidowe, docierające z kory do rdzenia nadnerczy śródnadnerczowym układem wrotnym. Układ ten sprawia, że stężenia steroidów we krwi rdzenia są 100-krotnie wyższe niż we krwi obwodowej. Wydaje się, że tak duże stężenie glukokortykoidów w rdzeniu nadnerczy jest niezbędne do indukcji PNMT.

648 / ROZDZIAŁ 50

KATECHOLAMINY SĄ MAGAZYNOWE I UWALNIANE

KATECHOLAMINY ULEGAJĄ SZYBKIEJ METABOLIZACJI

Magazynowanie w ziarnistościach chromochłonnych

Bardzo niewielkie ilości adrenaliny (mniej niż 5%) są wydalane z moczem. Katecholaminy ulegają szybkiej metabolizacji pod wpływem Ometylotransferazy katecholowej i oksydazy monoaminowej. W wyniku działania tych enzymów powstają nieaktywne metabolity O-metyiowane oraz produkty deaminacji katecholamin (ryc. 50-3). Większość katecholamin jest substratem dla obu wymienionych enzymów, zaś reakcje metylacji i oksydacji mogą zachodzić w dowolnej kolejności. O-Metylotrartsferaza katecholowa (COMT) jest enzymem cytozolowym występującym w wielu tkankach. Katalizuje ona przyłączenie grupy metylowej do pierścienia benzenowego zwykle w pozycji 3 (meta) różnych katecholamin. Do reakcji tej potrzebne są kation dwuwartościowy oraz adenozylometionina jako donor grupy metylowej. Produktami tej reakcji są, zależnie od wyjściowego substratu, kwas homowanilinowy, normętanefryna i metanefryna. Oksydazamonoaminowa (MAO) jest oksydoreduktazą katalizującą deaminację monoamin. Występuje ona w licznych tkankach, lecz największe jej stężenie jest w wątrobie, żołądku, nerkach i jelitach. Opisano co najmniej 2 izozymy MAO. Izozym MAO-A, występujący w tkance nerwowej, katalizuje deaminację serotoniny, adrenaliny i noradrenaliny. Izozym MAO-B spotykany jest w tkankach nienerwowych i wykazuje największą aktywność w stosunku do 2-fenyloetyloaminy i benzyloaminy. Dopamina i tyramina ulegają metabolizacji pod wpływem obu izozymów. Wiele badań poświęcono zależności między zaburzeniami psychicznymi o podłożu afektywnym a wzrostem lub spadkiem aktywności tych izozymów. Inhibitory MAO znalazły zastosowanie w leczeniu nadciśnienia tętniczego i depresji, ich zastosowanie ograniczają jednak poważne interakcje zachodzące ze środkami spożywczymi i lekami zawierającymi aminy sympatykomimetyczne. Pochodne O-raetyłowe katecholamin ulegają dalszym przemianom, tj. koniugacji z kwasem glukuronowym lub siarkowym. Liczba wytwarzanych metabolitów katecholamin jest ogromna. Wśród nich dwie grupy metabolitów mają znaczenie diagnostyczne, ponieważ wydalane są z moczem w ilościach dających się zmierzyć. Do pierwszej grupy nale-

Komórki rdzenia nadnerczy zawierają chromochłonne ziarnistości. Są to struktury śródkomórkowe zdolne do biosyntezy, wychwytu, magazynowania i wydzielania katecholamin. Ziarnistości te zawierają oprócz katecholamin wiele innych substancji, takich jak ATP-Mg2+, Ca2+, DBH i białko — chromagraninę A. Katecholaminy wchodzą do tych ziarnistości ATP-zależnym mechanizmem transportowym i wiążą ten nukleotyd w stosunku 4; I (stosunek hormonu do ATP). Noradrenalina, magazynowana w tych ziarnistościach, może je opuścić, by następnie ulec N-metylacji. Tak powstała adrenalina wchodzi do nowej populacji ziarnistości.

Uwalnianie katacholamin jest zależne od jonów Caa+

Pobudzenie nerwów rdzenia nadnerczy powoduje zlanie się błon ziarnistości zapasowych z błoną plazmatyczną, co jest przyczyną egzocytozy i tym samym uwalniania noradrenaliny i adrenaliny. Proces ten jest zależny od Ca2+, i jak większość zjawisk związanych z egzocytozą, jest pobudzany przez związki cholinergiczne i |3-adrenergiczne, natomiast hamowany przez związki a-adrenergiczne (ryc. 50-2). Katecholaminy i ATP są uwalniane w tych samych proporcjach, w jakich występują w ziarnistościach. Wraz z nimi uwalniane są również inne składniki wymienionych ziarnistości, takie jak DBH, jony wapnia i chromagranina. Powrotny wychwyt katecholamin przez zakończenia nerwowe jest ważnym mechanizmem oszczędzania tych hormonów i szybkiego przerwania hormonalnej i neuroprzekaźnikowej ich czynności. W odróżnieniu od nerwów współczulnych, rdzeń nadnerczy nie dysponuje mechanizmem powrotnego wychwytu i magazynowania raz wydzielonych katecholamin. Uwolniona z nadnerczy adrenalina dostaje się do wątroby i mięśni szkieletowych, gdzie ulega szybkiej metabolizacji. Tylko bardzo małe ilości noradrenaliny nadnerczowej docierają do tkanek obwodowych. We krwi katecholaminy krążą jako luźno związane z albuminami. Ich okres biologicznego półtrwania jest niezwykle krótki (wynosi 10—30 s).

HORMONY RDZENIA NADNERCZY / 649 Kwas difiydroksyfenyloocłowy

3- Metoksytyramlna

, CHaO

OH

Kwas hamowań III nowy

Kwas 3-metoksy-4-hy(Jrok l d t

Ryc. 50-3. Przemiana katecholamin przy udziale O-metylotransferazy kaiecholowej (COMT) i oksydazy monoaminowe) (MAO). (Według: Goldfien A.: The adrenal medulla, w: Greenspan F. S. i Forsham P. H. (red.): Basie andCiinical Endocrinotogy. wyd, 2,Appleton and Lange, 1986, reprodukcja za zezwoleniem).

żą mełanefryny, do których należą metoksypochodne adrenaliny i noradrenaliny. Do drugiej grupy metabolitów zalicza sie produkt deaminacji O-metylowanej pochodnej adrenaliny i noradrenaliny, ij, kwas 3-metoksy*4-hydroksymigdalowy (określany również jako kwas wanilino-migdalowy — VMA) (ryc. 50-3).

U 95% chorych z guzem chromochłonnym ilość wydalanych z moczem metanefryn i VMA jesl wzmożona. Oznaczanie wymienionych metabolitów cechuje sie znakomitą precyzją diagnostyczną, szczególnie wtedy, kiedy równolegle oznacza się katecholaminy w osoczu lub w moczu.

SYNTEZA KATECHOLAMIN JEST REGULOWANA BODŹCAMI NERWOWYMI Pobudzenie nerwu trzewnego, którego włókna przedzwojowe docierają do rdzenia nadnerczy, wywołuje uwalnianie się (mechanizmem egzocytozy) katecholamin, nośnikowych białek

zawartych w ziarnistościach sekrecyjnych oraz DBH. Stymulacja ta regulowana jest przez podwzgórze i pień mózgowy, chociaż nieznana jest dokładna pętla sprzężenia zwrotnego. Pobudzenie nerwu trzewnego wzmaga również syntezę katecholamin. Ostry stres zwiększa syntezę noradrenaliny, nie wpływając na ilość hydroksylazy tyrozynowej, chociaż aktywność jej wzrasta. Hydroksyłaza tyrozynowa jest substratem dla cAMP-zależnej kinazy białek, co sugeruje, że wzrost aktywności hydroksylazy występujący po stymulacji nerwowej spowodowany jest jej fosforylacją. Przewlekły stres, któremu towarzyszy aktywacja układu wspólczulnego, indukuje syntezę hydroksylazy tyrozyaowej, przez co ilość tego enzymu wzrasta. Doniesiono również o podobnej indukcji syntezy DBH. Indukcja wymienionych dwóch enzymów szlaku biosyntezy katecholamin jest wyrazem mechanizmów adaptacyjnych na stres fizjologiczny i zależy od czynników nerwowych (indukujących syntezę hydroksylazy tyrozynowej i DBH) i endokrynnych (indukujących PNMT).

650 / ROZDZIAŁ 50 KLASYFIKACJA KATECHOLAMIN MOŻE BYĆ OPARTA NA MECHANIZMIE ICH DZIAŁANIA Mechanizm działania katecholamin przyciąga! uwagę badaczy przez blisko jedno stulecie. Rzeczywiście, wiele ogólnych koncepcji dotyczących biologii receptorów i działania hormonów bierze swój początek w badaniach nad mechanizmem działania katecholamin. Katecholaminy działają za pośrednictwem dwóch większych klas receptorów. Są one określane jako receptory a-adrenergiczne i P-adrenergiczne, przy czym każda z nich obejmuje dwie podklasy, tj. a, i a2, i pt i P2. Klasyfikacja ta oparta jest na sile wiązania się różnych agonistów lub antagonistów do wymienionych receptorów. Adrenalina wiąże się i aktywuje zarówno receptory a, jak i p. Jej efekt biologiczny w tkankach zawierających obydwie klasy receptorów zależeć będzie od powinowactwa tego hormonu do poszczególnych rodzajów receptorów. Noradrenalina w stężeniach fizjologicznych wiąże się głównie z a-receptorami. Struktura receptora padrenergicznego jest znana Klonowanie genu i cDNA dla receptora Padrenergicznego ssaków ujawniło kilka niespodziewanych cech. Po pierwsze wskazano, że gen nie zawiera intronów, należy więc do grupy genów ssaków (do takich genów należą geny

histonów i interferonów) nie posiadających tych struktur. Po drugie receptor fi-adrenergiczny wykazuje bliską homologię 2 rodopsyną (przynajmniej w zakresie trzech fragmentów peptydowych), tj. z białkiem, zapoczątkowującym konwersję bodźca świetlnego w reakcję wzrokową. Inne podobieństwa dyskutowane są w dalszej części rozdziału. Trzy receptory adrenergiczne należące do wymienionych wyżej podgrup sprzężone są z układem cyklazy adenylanowej Hormony wiążące się z receptorami Px i P2 aktywują cyklazę adenylanową, natomiast hormony wiążące receptor a2 ją hamują (ryc. 45-4 i tab. 45-4). Po związaniu hormonu przez receptor dochodzi do przyłączenia białka G, które wiąże sic z kolei z GTP. W wyniku tych reakcji dochodzi albo do stymulacji (jeśli związaniu uległo białko Gs) albo do hamowania (w razie wiązania białka Gj przez kompleks hormon-receptor) cyklazy adenylanowej, tj. do stymulacji lub hamowania syntezy cAMP. Reakcja zatrzymuje się w chwili hydrolizy GTP 'przez GTP-azę połączoną z podjednostką a receptora (p. ryc. 45-4). Receptory ax są sprzężone z procesami zmieniającymi śródkomórkowe stężenia wapnia lub (i) modyfikującymi przemianę fosfatydyloinozytydów (p. rozdz. 45). W tej reakcji uczestniczy odrębny kompleks zawierający białko G.

Tabela 50-1. Skutki biochemiczne i fizjologiczne stymulacji poszczególnych typów receptorów adrenergicznych *l* Receptory ^1

Receptory -i2

Receptory [■'.,

Wzrost glikogenolizy Rozkurcz mięśni gładkich Stymulacja lipolizy Skurcz mięśni gładkich żołądka i jelit Skurcz Wzrost liczby i siły skurnaczyń krwionośnych czu mięśnia sercowego mięśni gładkich niei dróg moczowo-płcio- których łożysk n a czyn i o wych wych Hamowanie: lipolizy uwalniania reniny agregacji płytek sekrecji insuliny

Receptory p2 Wzrost glukoneogenezy wątrobie Wzrost glikogenol w izy w wątrobie Wzrost gfikogenolizy w mięśniach Wzrost uwalniania: insuliny glukagonu reniny Rozkurcz mięśni gładkich oskrzeli naczyń krwionośnych dróg moczowo-płciowych żołądka i jelit

HORMONY RDZENIA NADNERCZY / 651 ISTNIEJE CZYNNOŚCIOWE PODOBIEŃSTWO MIĘDZY RECEPTOREM KATECHOLAMINOWYM A UKŁADEM REAKCJI WZROKOWEJ

Stymulacja rodopsyny przez światło indukuje wiązanie jej z transducyną, tj. kompleksem zawierającym białko G, którego podjednostka a także wiąże się z GTP. Z kolei aktywowane białko G pobudza fosfodiesteraze. hydrolizującą cGMP. W wyniku tej reakcji zostają zamknięte kanały jonowe zlokalizowane w błonie komórek pręcikowych siatkówki, co wyzwala reakcję wzrokową. Reakcja kończy się w chwili hydrolizy przez GTP-azę (połączoną z podjednostka a receptora) związanego z nią GTP. Zestawienie niektórych efektów biochemicznych i fizjologicznych zapoczątkowanych pobudzeniem poszczególnego typu receptora adrenergicznego zawiera tab. 50-1. Aktywacja fosfoprotein przez cAMP-zależną kinazę białek (p, ryc. 45-5) jest przyczyną wielu efektów biochemicznych wywołanych przez adrenalinę. GUZY CHROMOCHŁONNE WYWODZĄ SIĘ Z RDZENIA NADNERCZY Guzów tych zwykle nie wykrywa się do chwili, kiedy nie wytwarzają i wydzielają ad-

renaliny lub norad/enaliny w ilościach wywołujących ciężki zespół nadciśnienia tętniczego. W guzach chromochłonnych stosunek noradrenaliny do adrenaliny jest często podwyższony. Ten fakt może tłumaczyć różnice w obrazie klinicznym występujące między poszczególnymi chorymi, noradrenalina jest bowiem głównie przyczyną nadciśnienia tętniczego, zaś adrenalina — wzmożonej przemiany materii.

PIŚMIENNICTWO Cryer PE: Diseases of the adrenal medulla and sympathetic nervous system. Pages 511-550 in: Endocrinology and Metabolism. Felig P et al (ediLors). McGraw-Hill, 1981, Dixon RAF et al: Cloning of the gene and cDNA for mammalian f5-adrenergic receptor and homology with rhodopsin. Naturę (London) 1986;321:75. Exton JH; Mechanisms involved in a-adrenergic phenomena: Role of caicium ion in actions of ca tech olani mes in Kver and other tissues. Am J Physiol 1980;238:E3. Kaupp UB: Mechanism of photoreception in vertebrate vision. Trends Biochem Sci 1986^11:43. Sibley DR, Lefkowitz RJ: Molecular mechanisms of receptor desensitization using the P-adrenergic receptor-coupled adenylate cyclase system as a model. Naturę (London) 1985;317:124. Stiles GL, Caron MG, Lefkowitz RKL: The p-adrenergic receptor: Biochemical mechanisms ofphysiological reguiation. Physiol Rev 1984;64:66).

5 1

Hormony gonadalne

Dary/ K. Granner, MD

WPROWADZENIE Gonady są narządem o podwójnej czynności, tj. wytwarzającym komórki rozrodcze oraz hormony płciowe. Te dwie funkcje realizowane są w bliskim sąsiedztwie anatomicznym, wysokie stężenia hormonów płciowych sa bowiem nie-

Skróty używane w tym rozdziale ACTH ABP CBG DHEA DHT E2 FSH

-

GnRH hCG hCS

—

LH MIF

—

3H-OHSD — 17P-OHSD— PL SHBG TBG TEBG

—

hormon adrenokortykotropowy, kortykotropina białko wiążące androgeny globulina wiążąca kortykosteroidy dehydroepiandrosteron dihydrotestosteron estradiol folitropina (hormon pobudzający pertherzyki Graafa) hormon uwalniający gonadotropiny, gonadoliberyna ludzka gonadotropina kosmówkowa Iud2ka somatomammotropina kosmówkowa lutropina czynnik hamujący przewody Mullera d eh yd rog en aza 3 p - hyd roksy steroidowa dehydrogenaza 17{i-hydroksysteroidowa laktogen łożyskowy globulina wiążąca hormony płciowe globulina wiążąca hormony tarczycy globulina wiążąca testosteron i estrogeny

zbędne w miejscu powstawania komórek rozrodczych. Jajniki wytwarzają komórki jajowe i hormony steroidowe — estrogeny i progesteron, gonady męskie (jądra) wytwarzają plemniki i testosteron. Gonady wytwarzają, podobnie jak nadnercza, bardzo liczne steroidy, z których tylko kilka wykazuje aktywność hormonalną. Produkcja tych hormonów podlega ścisłej regulacji na zasadzie sprzężenia zwrotnego, w których uczestniczą przysadka mózgowa i podwzgórze. Hormony gonadalne działają za pośrednictwem mechanizmu jądrowego, podobnego do opisanego dla steroidowych hormonów nadnerczowych.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Prawidłowe funkcjonowanie gonad ma ogromne znaczenie dla procesu reprodukcji i, co za tym idzie, dla przetrwania gatunku. I odwrotnie — zrozumienie fizjologii i biochemii endokrynologicznej związanej z procesem reprodukcji stanowi podstawę wielu metod antykoncepcyjnych. Ponadto hormony gonadalne wykazują również inne ważne działanie, np. działają anabolicznie i są niezbędne dla utrzymania prawidłowego stanu skóry, kości i mięśni.

JĄDRA WYTWARZAJĄ TESTOSTERON (MĘSKI HORMON PŁCIOWY) I PLEMNIKI (MĘSKIE KOMÓRKI ROZRODCZE) Te funkcje realizowane są przez trzy typy wyspecjalizowanych komórek; 1) sperm a t ogonie i bardziej zróżnicowane komórki rozrodcze, umiejscowione w kanalikach krętych, 2) komórki Leydiga (określone również jako komórki

HORMONY GONADALNE / 653

śródmiąższowe) rozrzucone w tkance łącznej (zlokalizowanej pomiędzy kanalikami krętymi zawierającymi nabłonki plemnik o twórcze) i wytwarzające testosteron pod wpływem stymulacji LH oraz 3) komórki Sertolego wytwarzające błonę podstawną dla nabłonka plemnikotwórczego w kanalikach krętych oraz środowisko dia prawidłowego różnicowania i dojrzewania komórek rozrodczych. Spermatogenezę pobudzają przysadkowa fblitropina (FSH) i lutropina (LH). Wymaga ona środowiska sprzyjającego zróżnicowaniu komórek rozrodczych oraz stężenia testosteronu znacznie wyższego od występującego w krążeniu systemowym. Ten warunek jest spełniony, ponieważ komórki Leydiga (wytwarzające testosteron) znajdują się w bliskości nabłonka plemnikotwórczego kanalików krętych. Pomimo udziału licznych enzymów w syntezie steroidów gonadalnych, enzym odszczepiający łańcuch boczny cholesterolu oraz dehydrogenaza 3|hydroksysteroidowa są enzymami katalizującymi krytyczne etapy tej syntezy Androgeny gonady męskiej wytwarzane są przez komórki Leydiga zlokalizowane w tkance śródmiąższowej. Bezpośrednim prekursorem steroidów gonadalnych jest, podobnie jak i steroidów nadnerczowych, cholesterol. Etapem krytycznym, decydującym o nasileniu syntezy androgenów gonadalnych, jest odszczepienie łańcucha bocznego cholesterolu. Proces konwersji cholesterolu do pregnenolonu jest taki sam zarówno w nadnerczach, jądrach, jak i jajnikach. W ostatnich dwóch narządach proces ten pobudzany jest przez LH a nie przez ACTH. Konwersja pregnenolonu do testosteronu wymaga działania 5 enzymów. Są nimi: 1) dehydrogenaza 30-hydroksysteroidowa (3j3-OHSD), 2) A5'4 izomeraza, 3) 17a-hydroksylaza, 4) C^^-liaza i 5) dehydrogenaza 170-hydroksysteroidowa (17p-OHSD). Ten szlak biosyntezy testosteronu określony jako szlak progesteronowy (Jub szlak A4) przedstawiony jest po prawej stronie ryc. 51-1. Konwersja pregnenolonu do testosteronu może się również odbyć szlakiem dehydroepiandrosteronowym (zwanym również szlakiem A5) przedstawionym po lewej stronie ryc. 51-1. W jądrach ludzkich szlak A4 jest szlakiem preferowanym. Ponieważ jądra ludzkie są rzadko dostępne do badań,

większość informacji dotyczących szlaków biosyntezy męskich hormonów gonadalnych uzyskano na materiale zwierzęcym. Możliwe jest występowanie znacznych różnic międzygatunkowych w tym zakresie. Wymienionych 5 enzymów jest zlokalizowanych we frakcji mikrosomamej jąder szczurzych. Stwierdza się bliskie czynnościowe sprzężenie między aktywnością 3p-OHSD i ASA-izomerazy oraz między aktywnością 17a-hydroksylazy i C]7.2O-liazy. Te pary enzymów pokazane są na ryc. 51-J przedstawiającej ogólną sekwencję poszczególnych reakcji oraz na ryc. 51-2, ilustrującej przykładowo schemat biosyntezy androgenów w błonach mikrosomalnych jądra szczura. Ta druga rycina pokazuje, w jaki sposób poszczególne substraty biosyntezy testosteronu wchodzą do przestrzeni mikrosomalnej oraz, w jaki sposób przechodzą z jednego etapu sziaku A* do następnego. Skoro występują 4 potencjalne substraty wobec tylko jednej 3JJ-OHSD, możliwe są liczne szlaki alternatywne. Tak więc o rodzaju szlaku biosyntezy androgenów decyduje prawdopodobne stężenie substratu znajdującego się w sąsiedztwie poszczególnych enzymów uczestniczących w tym procesie. Wiązanie w błonach mikrosomalnych może wywołać taki gradient.

Dihydrotestosteron (DHT) powstaje z testosteronu przez redukcję pierścienia A szkieletu steroidowego przez Ba-reduktazę. Jądra ludzkie wytwarzają ok. 50 i00 jig DHT na dobi, lecz większość DHT pochodzi z konwersji w tkankach obwodowych (p. niżej). Jądra wytwarzają również małe, choć znaczące ilości 170-estradiolu (E2), będącego żeńskim hormonem płciowym, choć większość E 2 wytwarzana przez mężczyznę pochodzi z aromatyzacji testosteronu i androstendionu przez tkanki obwodowe. Przyjmuje się, że w produkcji E2 uczestniczą komórki Leydiga i Sertolego oraz nabłonek plemnikotwórczy w kanalikach krętych. Znaczenie E2 u mężczyzny nie zostało dotychczas określone, choć wydaje się, że może uczestniczyć w regulacji wydzielania FSH. Występowanie zbyt wysokich stężeń E2 oraz zmian ilorazu stężenia wolnego E2 do wolnego testosteronu wiąże się z pojawieniem gmekomastii (powiększeniem gruczołu sutkowego u mężczyzn) w okresie pokwitania oraz w okresie po pokwitaniu, szczególnie u osób starszych oraz chorych z przewlekłą chorobą miąższu wątrobowego lub z nadczynnością tarczycy.

654 / ROZDZIAŁ 51 C=0

„oJCDr

~

Progesteron iii

Prag nano ton ii 17a-HYDR0KSYU\ZA

171-HYDHOKSYLAZA

i

i i

CH3

UJ

i

LBo„

i

1i7a-Hydrokaypregneno]on i

TEROIDC

i

C^-LIAZA

ł

( J T ^ — Dehyd roe p i a n d r oste ro n A DEHYDHOGENAZA 170HYDROKSYSTER0ID0WA

ii

C^-LIAZA

o IX

O » LU

DEHYDROt

i1

17ct - Hy d ro ksy p rog estero n

I I

t

—XiJ~^ Androstendlon

DEHYDROGENAZA 170HYDROKSYSTEROIDOWA

T j

^

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

A*-AndroEtendlol

Testosteron

Rvo. 51 -1. Szlaki biosyntezy testosteronu Szlak po stronie lewej określany jest jako szlak A5 lub szlak dehydroepiandrosteronowy, zaś szlak przedstawiony po stronie prawej — jako szlak A* lub szlak progesteron owy.

HORMONY GONADALNE 655 /

Pregnenolon

Trzy warstwy stateczki śródplazmatycznej

17a- Hydroksyprogesleron

Warstwy hydrofobowe

A

i*

v Warstwy hydrofllne

Ryc. 51-2. Przykładowy schemat biosyntezy androgenu w błonie mikrosomalnej jąder. Przebieg błony jest horyzontalny, prawdopodobnie tak jak w komórce. W preparatach mikrosomalnych błony te tworzą pęcherzyki. A — androstendion, T — testosteron. (Według; DeGroot L.Endocrinology, J.: tom 3, Grune and Stratton, 1979, za zezwoleniem), ___________________________________________________

Produkcja hormonalna jąder jest w znaczącym stopniu zależna od wieku. Testosteron jest głównym hormonem u płodu i nąworodka szczurzego, lecz już krótko po urodzeniu jądra wytwarzają tylko androsteron. Zdolność syntetyzowania testosteronu przez jądro zostaje przywrócona w okresie pokwitania, po czym utrzymuje się przez całe życie. Podobne obserwacje poczyniono u innych gatunków zwierząt i wydaje się, że również u człowieka występują zmiany syntezy androgenów przez jądra zależne od wieku.

testosteron, odznaczającą się swoistością, lub też wysokim powinowactwem i ograniczoną pojemnością (tab. 51-1). Białko to, zwykle określane jako globulina wiążąca hormony płciowe (SHBG — sex-hormone binding globulin) lub globulina wiążąca testosteron i estrogeny (TEBG — testosterone-estrogen-binding globulin) wytwarzane jest w wątrobie. Jego synteza wzrasta pod wpływem estrogenów (u kobiet stężenie SHBG w surowicy krwi jest 2-krotnie wyższe niż u mężczyzn) oraz u chorych z pewnymi chorobami wątroby lub z nadczynnością tarczycy, natomiast ulega obniżeniu pod wpływem andTestosteron wiąże się ze swoistym rogenów, w miarę starzenia się oraz w niedobiałkiem osocza czynności tarczycy. Wiele z wymienionych U większości ssaków, w tym i u człowieka, czynników wpływa również na wytwarzanie w osoczu krwi stwierdza się p-głobulinę wiążącą CBG (p. rozdz. 44) i TBG (p. rozdz. 47). Ponieważ SHBG i albuminy wiążą 97—99% krążącego we krwi testosteronu, tyiko drobna frakcja tego hormonu występuje w surowicy Tabela 51-1.W iązanie hormonów do globuliny w postaci wolnej (biologicznie aktywnej). Główwiążącej hormony płciowe (SHBG) na funkcja SHBG wydaje się polegać na ograniczaniu stężenia wolnego testosteronu w surowiSteroidy ulegające Steroidy cy krwi. Testosteron wykazuje większe powinowiązaniu nie wiążące się Testosteron Androgeny koniugowane wactwo do SHBG niż estradiol (tab. 51-2). Dlatego też zmiana stężenia SHBG powoduje 17 p-Estradiol 17 a-Testosteron większe zmiany stężenia wolnego testosteronu D i hy d rotestoste ro n Dehydroepiandrosteron niż wolnego estradiolu. Wzrost stężenia SHBG Inne 17 fS-hydroksyste- Kortyzol w surowicy, występujący u osób starych ora2 roidy Progesteron chorych z marskością wątroby lub (i) nadczynEstron

656 / ROZDZIAŁ 51

nością tarczycy, jest przyczyną wzrostu ilorazu stężenia wolnego E3 i stężenia wolnego testosteronu oraz stwierdzanych u nich objawów estrogenizacji. We krwi żylnej jąder stwierdza się obecność licznych steroidów. Testosteron jest jednak głównym steroidem wytwarzanym przez jądra osób dorosłych. Dobowe wytwarzanie testosteronu wynosi u zdrowych osób dorosłych ok. 5 mg. Podobnie jak inne steroidy testosteron uwalniany jest do przestrzeni pozakomorkowej natychmiast po jego syntezie. Wiele metabolitów testosteronu jest nieaktywnych, podczas gdy inne np. dihydrotestosteron i estradiol wykazują zwiększoną lub zróżnicowaną aktywność

Tabela 51-2. Przybliżone powinowactwa steroidów do białek wiążących surowicy* SHBG" CBG" 5

Estradiol Estron Androstendion Testosteron Dihydrotestosteron Progesteron Kortyzol

>1O

>10

>100

2 1

>100 >100

>100 >100

2 3

Według Stiteri P.K., Febres F.: Ovarian hormone synthesis, circulation and mechanism of action, str. 1401; w: Endocrinology, tom 3, pod redakcją DeGroot L.J., Grune and Stratton, 1979, w adaptacji autora rozdziału. Powinowactwo wyrażone jest jako Kd ilości molowej x 10".

Szlaki metaboliczne. Przemiana testos-

teronu odbywa się dwoma szlakami. W jednym z nich zachodzi oksydacja w pozycji 17, w drugim natomiast redukcja podwójnego wiązania pierścienia A oraz grupy ketonowej w pozycji 3. Przemiana pierwszym szlakiem zachodzi w licznych tkankach w tym i w wątrobie; produktami tego szlaku są 17-ketosteroidy, które są zwykle nieaktywne lub mniej aktywne od hormonu macierzystego. Przemiana drugim szlakiem jest mniej skuteczna i zachodzi głównie w tkankach docelowych; jest on źródłem silnego metabolitu — DHT.

Metabolity testosteronu. Najważniej-

szym metabolitem testosteronu jest DHT. W wielu tkankach, w tym w pęcherzykach nasiennych, gruczole fokowym, zewnętrznych narządach płciowych i w niektórych obszarach skóry DHT jest aktywną postacią hormonu. Stężenie DHT u dorosłego mężczyzny stanowi 1/10 stężenia testosteronu. W ciągu doby po-

OH Testosteron

wstaje ok. 400 ug DHT, natomiast ok. 5 mg testosteronu. Reakcję konwersji testosteronu do DHT katalizuje NADPH-zależna 5-oc-reduktaza (p. niżej). Testosteron może więc być uznany za prbhormon, ponieważ ulega przekształceniu do znacznie silniej działającego związku (dihydrotestosteronu) i większość tej konwersji odbywa się poza jądrami. Maty odsetek testosteronu ulega także konwersji do estradioiu poprzez aromatyzację, tj. reakcję, która jest szczególnie ważna w mózgu, gdzie hormony te są pomocne w kształtowaniu zachowania płciowego zwierzęcia. Inny silny androgen, androstandiol, wytwarzany jest również z testosteronu.

15a-Reclulctazal CWhytJrotestosteron (DHT)

HORMONY GONADALNE / 657

Główne metabolity I7-ketosteroidowe — androsteroff i ctiucholannlon — ulegają koniugacji z kwasem glukuronowym lub siarkowym tworząc rozpuszczalne w wodzie glukuronidy iub siarczany, łatwo wydalane z ustroju. WIELE HORMONÓW UCZESTNICZY W REGULACJI HORMONALNEJ JĄDER LH pobudza steroidogenezę w jądrach LH pobudza steroidogenezę i wytwarzanie testosteronu, wiążąc się z receptorami błony plazmatycznej komórek Leydiga (podobny receptor dla LH stwierdza się w komórkach ciałka żółtego jajnika) oraz pobudzając cyklazę adenylanową i, co za tym idzie, zwiększając śródkomórkowe stężenie cAMP. W wyniku takiego działania nasila się reakcja odszczepienia łańcucha bocznego od cząsteczki cholesterolu. Tak wiec istnieje podobieństwo między działaniem LH na jądro i ACTH na nadnercza. Testosteron jest ogniwem mechanizmu sprzężenia zwrotnego działającym hamująco na uwalnianie lub (i) syntezę GnRH w podwzgórzu (ryc. 51-3). Spermatogeneza regulowana jest przez FSH i testosteron FSH wiążąc się z komórkami Sertolego pobudza syntezę biafka wiążącego androgeny (ABP — androgen binding protein). ABP jest glikoproteiną wiążącą testosteron. ABP różni się od śródkomórkowego receptora androgenoLH

wego, natomiast jest homologiczny do SHBG. ABP wydzielane jest do światła kanalików krętych. W procesie tym testosteron, wytwarzany przez komórki Leydiga, zostaje przeniesiony do miejsca spermatogenezy, gdzie obecny jest w bardzo dużym stężeniu. Jest to krytyczny etap spermatogenezy, ponieważ normalne stężenia testosteronu we krwi obwodowej lub osiągalne przy leczeniu substytucyjnym są niewystarczające dla tego procesu. Androgeny wpływają, na kilka złożonych procesów fizjologicznych Androgeny, głównie testosteron i DHT, uczestniczą w: 1) różnicowaniu pici, 2) spermatogenezie, 3) rozwoju drugorzędowych cech płciowych i struktur godowych, 4) przemianach, anabolicznych i regulacji genowej oraz 5) kształtowaniu się męskiego profilu behawioralnego (ryc. 51-3). Liczne tkanki docelowe, uczestniczące w tych procesach^ dzieli się na takie, które reagują na testosteron, i pozostałe, reagujące na DHT, Klasycznymi narządami docelowymi dla DHT (wykazującymi też największą aktywność 5-cc-reduktazy) są: gruczoł krokowy, pęcherzyki nasienne, zewnętrzne narządy płciowe oraz skóra okolicy narządów płciowych. Wśród narządów docelowych testosteronu należy wymienić: embrionalne struktury wywodzące się z przewodu Wolffa, spermatogonie, mięśnie szkieletowe, kości, nerki i mózg. Dotychczas nie znaleziono swoistego androgenu uczestniczącego w regulacji pozostałych licznych procesów wymienionych wyżej.

KOMÓRKA DOCELOWA

Regulacja wydzielania gonadolroplny

J

Spemnatofleneza

)

Regulacja aktywności genu ) Różnicowanie płciowe przewodu Wotffa I Zewnętrzna wlryllzacja Dojrzewanie pici owe w o kresie po kwi lania Regulacja aktywności ganu

Ryc. 51-3. Mechanizm działania androgenów LH — lutropina, T — testosteron, DHT — dihydrotestosteron, R — receptor androgenowy. (Według: WilsonJ. D. i wsp.:Theendocrinecontro! of małe phenotypic development; Aust J. Biol. Sci. 1983, 36, 101, w modyfikacji autora rozdziału, za zezwoleniem). 42 — Biochemia

658 / ROZDZIAŁ 51

Androgeny działają za pośrednictwem mechanizmu jądrowego, podobnego do opisanego dla steroidów nadnerczowych Aktualną koncepcję działania androgenów przedstawia ryc. 51-3. Wolny testosteron wnika przez błonę plazmatyczna. do wnętrza komórek na zasadzie dyfuzji biernej lub ułatwionej. Komórki docelowe zatrzymują testosteron najpewniej dlatego, że hormon wiąże się ze swoistym receptorem śródkomórkowym. Większość zatrzymanego hormonu stwierdza się w jądrach komórkowych, pomimo znacznych różnic występujących w tym zakresie między tkankami. Cytoplazma licznych (chociaż nie wszystkich) komórek docelowych zawiera enzym — 5a-reduktazę — przekształcający testosteron w DHT. Jest sprawą sporną, czy istnieją dwa odrębne receptory dla testosteronu i DHT. Przy założeniu, że istnieje tylko jeden rodzaj receptora, powinowactwo jego do DHT jest wyższe od powinowactwa do testosteronu. Pojedyncza mutacja genu u myszy jest przyczyną utraty powinowactwa receptora zarówno do DHT, jak i do testosteronu, co sugeruje, że mamy do czynienia tylko z jednym rodzajem białka receptorowego. Różnice powinowactwa, związane ze zdolnością tkanek docelowych do konwersji testosteronu do DHT, najpewniej decydują o tym, czy aktywny jest kompleks testosteron-receptor, czy też kompleks DHT-receptor. Lokalizacja kompleksu testosteron/DHT-receptor

w jądrze komórkowym jest procesem niezbędnym do wystąpienia działania androgenowego. Wiązanie kompleksu receptor-steroid przez chromatynę jądrową wydaje się wyprzedzać pewien etap aktywacji, zaś swoistość reakcji zapewnia „element odpowiedzi androgenowej". Podobnie jak inne steroidy (i niektóre hormony peptydowe), kompleks testosteron/DHT-receptor aktywuje swoiste geny. Produkty biał-

kowe tych genów są pośrednikami licznych, jeśli nie wszystkich, efektów działania wymienionych hormonów. Testosteron pobudza syntezę białek w drugorzędowych męskich narządach płciowych. Działaniu temu towarzyszy zwykle wzrost ogólnokomórkowego RNA, w tym mRNA, tRNA i rRNA. Innym bardziej swoistym przykładem działania testosteronu jest wpływ tego hormonu na syntezę ABP. Hormon ten zwiększa tempo transkrypcji genu kodującego ABP, co wyraża się wzrostem ilości mRNA kodującego to białko. Innym, dobrze przebadanym przykładem, jest aa„— globulina, będąca głównym białkiem wydalanym z moczem u szczurów płci męskiej. Tempo syntezy a2ji globuliny jest proporcjonalne do iloścrkodującego ją mRNA. Z kolei ilość tego ostatniego zależna jest od tempa transkrypcji genu « globuliny. Wszystkie wymienione etapy syn tezy cc2ji ■— globuliny pobudzają androgeny. Nerka jest ważnym narządem docelowym dla androgenów. Androgeny powodują ogólne powiększenie się tego narządu oraz indukują synKOMÓRKA DOCELOWA

KOMÓRKA LEYDIÓA

5a-REDUKTAZA|

Niedobory enzymatyczna w zakresie: odszczeplanla łańcucha bocznego cholesterolu 17a—hydro ksylazy konwersji C„ do C la redukcji grupy ketonowej w pozycji 17 oksydacji pierścienia A do A'-3-ketosteroldow

Niedobór 5a—reduktazy

Zaburzenia receptorowe

Oporność u chorych wykazujących obecność receptora (R + )

Ryc. 51-4. Przyczyny oporności na androgeny Na rycinie pokazano 4 defekty, dla których zidentyfikowano występowanie mutacji. T — testosteron, DHT — dihydrotestosteron, R — receptor androgenowy (Według: Wilson J. D. i wsp.: The endocrine controt of małe phenotypic development; Aust. J. Biol. Sci. 1983, 36, 101, w modyfikacji autora rozdziału, za zezwoleniem).

HORMONY GONADALNE / 659

tezę licznych enzymów u różnych gatunków zwierząt,' W kilku narządach docelowych androgeny pobudzają podział komórek. Działanie to jest mało zrozumiałe. Testosteron lub DHT wraz z estradiolem wydają się uczestniczyć w ekstensywnym i niekontrolowanym dzieleniu się komórek gruczołu krokowego stając się przyczyną łagodnego przerostu tego narządu, występującego aż u 75% mężczyzn po 60 rż. PATOFIZJOLOGIA MĘSKIEGO UKŁADU ROZRODCZEGO ZWIĄZANA JEST Z DEFEKTAMI HORMONALNYMI Stan chorobowy spowodowany brakiem testosteronu określa się jako hipogonadyzm. Jeśli pojawi się on przed pokwitaniem, wówczas aie dochodzi do rozwoju dru go rzędowych cech płciowych, natomiast jego występowanie u dorosłych powoduje zanik tych ostatnich. Pierwotny hipogoimdyzm charakteryzuje się pierwotnym uszkodzeniem jąder przez proces chorobowy, natomiast hipogonadyzm wtórny jest następstwem upośledzonego wydzielania gonadotropin. Występowanie przypadków izolowanych niedoborów enzymatycznych w szlaku biosyntezy androgenów by to pomocne w określaniu znaczenia poszczególnych jej etapów dla produkcji i działania tych hormonów. Na rycinie 51-4 pokazane są szczeble działania androgenów począwszy od biosyntezy testosteronu do działania poreceptorowego zarówno tego hormonu, jak i DHT. Opisano co najmniej 5 dokładnie zdefiniowanych defektów biosyntezy testosteronu. Ponadto znany jest niedobór 5<x-reduktazy. W wielu przypadkach wykrywa się albo brak receptora DHT, albo testosteron owego, albo też receptor ten jest w jakimś stopniu nienormalny. W końcu w wielu przypadkach wszystkie oznaczalne parametry, w tym również receptory, są prawidłowe, mimo występowania cech feminizacji o zmiennym nasileniu. W tych ostatnich przypadkach zawsze stwierdza się męski genotyp. Nasilenie klinicznych objawów jest zależne od nasilenia występującego defektu biochemicznego. U chorych z całkowitym brakiem jakiegoś enzymu biosyntezy androgenów stwierdza się fenotyp żeński pomimo występowania genotypu męskiego XY. W odróżnieniu od niedoboru całkowitego, w niedoborach najła-

godniejszych stwierdza się tylko aberrację w zakresie lokalizacji cewki moczowej. U osobników z genotypem męskim, wykazujących całkowity brak czynnościowo sprawnych receptorów androgenowych, stwierdza się obecność jąder oraz produkcję testosteronu, pomimo występowania całkowitej feminizacji zewnętrznych narządów płciowych (jest to tzw. zespół femiuiżujących jąder). Jest interesujące, że nie zidentyfikowano niedoboru w zakresie syntezy lub działania estrogenów, porównywalnego do ww. niedoboru androgenów. JAJNIKI WYTWARZAJĄ ŻEŃSKIE HORMONY PŁCIOWE (ESTROGENY I PROGESTYNY) ORAZ ŻEŃSKIE KOMÓRKI ROZRODCZE (KOMÓRKI JAJOWE) Biosynteza i przemiana hormonów jajnikowych są podobne do opisanych dla hormonów męskich Estrogeny tworzą rodzinę hormonów syntetyzowanych w różnorodnych tkankach. Głównym estrogenem pochodzenia jajnikowego jest 17 p-estradiol. U innych gatunków zwierząt estrogenem wytwarzanym w większych ilościach w licznych tkankach jest estron. W ciąży w łożysku wy twa rżany jest we względnie dużych ilościach estriol. Ogólny szlak biosyntezy estrogenów oraz lokalizacja subkomórkowa enzymów uczestniczących we wczesnych jej etapach są identyczne z biosyntezą androgenów. Cechy różniące biosyntezę estrogenów od androgenów przedstawione są na ryc. 51-5. Estrogeny wytwarzane są drogą aromatyzacji androgenów. W tym złożonym procesie występują trzy hydroksylacje z udziałem O 2 i NADPH. Przyjmuje się, że kompleks enzymatyczny, określany jako aromataza, zawiera oksydazę P-450 o mieszanej funkcji. Jeśli substratem dla tego kompleksu enzymatycznego jest testosteron, produkowany jest estradiol, natomiast jeśli substratem tym jest androstendion — wytwarzany jest estron. Trudne było zdefiniowanie komórek wytwarzających poszczególne steroidy jajnikowe. Obecnie wydaje się, że w ich syntezie uczestniczą dwa rodzaje komórek. Te komórki są głównym źródłem androstendionu (jest to główny androgen wytwarzany w jajnikach) oraz 17a-hydroksyprogesteronu. Z tego ostatniego steroidu komórki ziarniste wytwarzają estradiol. Proges-

660 / ROZDZIAŁ 51

Pregnenolo

Cholesterol -

17«-Hydroteypraononoton-

ł

Dehydroepiandrosternn Androstendlon

n

17« - Hyd ro ksy p rogester o n

Progesteron

-

Inne .» metabolity

Estron (E,

170-Eslradiol (E,)

Inne metabolity Kta-Hydrotcsylaza OH

-0H

Estriol Ryc. 51 -5. Biosynteza estrogenów. (Według: Ganong W. F.: Review of Medicsl Physfology, wyd. 13, Appleton and Lange, 1987, w nieznacznej modyfikacji autora rozdziału, za zezwoleniem).

teron jest wytwarzany i wydzielany przez komórki ciałka żółtego, które produkują również nieco estradiolu. Znamienne ilości estrogenów powstają w tkankach obwodowych drogą aromatyzacji androgenów. U mężczyzn aromatyzacja testosteronu przez tkanki obwodowe jest źródłem 80% wytwarzanego u nich estradiolu. U kobiet ważnym substratem dla estrogenów są androgeny nadnerczowe. W dąży 50% wytworzonego E2 jest wynikiem aromatyzacji ańdrogenów nadnerczowych. W końcu konwersja androstendiomi w estron jest głównym źródłem estrogenów u kobiet po menopauzie. Aktywność aromatazową stwierdza się w komórkach tłuszczowych oraz w wątrobie,'skórze i w innych tkankach. Nadmierna aktywność tego enzymu wydaje się uczestniczyć w patogenezie zespołu

estrogenizacji występującego u osób starych oraz w takich chorobach, jak marskość wątroby, nadczynność tarczycy i otyłość. Estrogeny i progestyny są w różnym stopniu związane z białkami transportowymi osocza Estrogeny związane są z SHBG, zaś progestyny z CBG. Estradiol wiąże się z SHBG 5-krotnie słabiej niż testosteron lub DHT. W odróżnieniu od wymienionych steroidów progesteron i kortyzol wykazują małe powinowactwo do tego białka nośnikowego (p. tab. 51-2). Progesteron i kortyzol wykazują prawie takie samo powinowactwo do CBG. Z kolei globulina wiążąca kortykoidy (CBG) wykazuje małe powinowactwo do estradiolu i jeszcze mniejsze do testosteronu, DHT lub estronu.

HORMONY GONADALNE /

661

OH

170-Estradlol

Wymienione białka nośnikowe nie odgrywają widocznej roli w mechanizmie działania tych hormonów na poziomie komórkowym (podobnie jak w działaniu innych hormonów steroidowych), ponieważ prawdopodobnie tylko wolny, nie związany z białkami hormon wykazuje aktywność biologiczną. Białka nośnikowe spełniają rolę krążącego rezerwuaru dla wymienionych hormonów. Ponieważ wykazują one względnie wielką pojemność wiązania, stanowią one zapewne rodzaj buforu chroniącego ustrój przed nagłymi zmianami stężenia hormonów w osoczu krwi. Wielkość klirensu metabolicznego wymienionych steroidów jest odwrotnie proporcjonalna do ich powinowactwa do SHBG. Ten fakt tłumaczy szybsze klirensowanie estronu niż estradiolu, oraz szybsze klirensowanie tego ostatniego niż testosteronu i DHT. Koniugaty wymienionych hormonów (p. niżej) nie ulegają wiązaniu ani przez SHBG, ani też przez CBG. W dalszej części rozdziału omawiane są czynniki regulujące produkcję SHBG. Wielkość sekrecji steroidów jajnikowych ulega znacznym wahaniom zależnym od fazy cyklu miesiączkowego i jest proporcjonalna do ich produkcji w jajnikach. Wymienione hormony nie są magazynowane, ulegają one wydzielaniu natychmiast po ich biosyntezie. Estrogeny i progestyny są aktywnie metabolizowane przez wątrobę Estrogeny. Wątroba przekształca estradiol i estron w estrioi poprzez szlaki metaboliczne przedstawione na ryc. 51-5. Estradiol, estron i estrioi są substratami dla enzymów wątrobowych katalizujących powstawanie pochodnych glukuronidowych lub siarczanowych. Poszczególne gatunki zwierząt różnią się aktywnością wymienionych enzymów sprzęgających. I tak np. gryzonie wykazują tak aktywne układy

Proaesteron

Octan Cholesterol

^^u^V HO' Sól sodowa glukuronidu-20-pregnandlolu Progesteron

Ryc. 51-6. Biosynte2a progesteronu i główne szlaki jego przemiany. Stwierdza się również inne metabolity, (Według: Ganong W. F.: Review of Medical Physiology, wyd. 13, Appleton and Lange, 1987, w niewielkiej modyfikacji autora rozdziału, za zezwoleniem).

662 / ROZDZIAŁ 51

enzymów metabolizujących, że estrogeny ulegają prawie całkowitej metabolizacji w wątrobie i po doustnym ich podaniu nie wykazują praktycznie żadnej aktywności. U naczelnych te układy enzymatyczne są mniej aktywne, więc doustnie podane estrogeny są bardziej skuteczne. Steroidy sprzężone (z kwasem glukuronowym lub siarkowym) są rozpuszczalne w wodzie i nie wiążą się z białkami transportowymi (nośnikowymi); ten fakt tłumaczy, dlaczego są szybko wydalane z żółcią, kałem i moczem. Progestyny. Ponieważ wątroba aktywnie metabolizuje progesteron do kilku związków, doustnie podany hormon nie wykazuje działania

biologicznego. Głównym metabolitem progestynowym znajdowanym w moczu ludzkim jest sól sodowa glukuronidu-20-pregnandioiu (ryc. 51-6). Określone steroidy syntetyczne, np. pochodne 17 ct-hydroksyprogesteronu i 17 a-alkilopochodne 19-nortestosteronu, wykazują aktywność progestynową i nie są metabolizowane w wątrobie. Ten fakt tłumaczy, dlaczego związki te są szeroko stosowane jako doustne leki antykoncepcyjne.

GŁÓWNĄ FUNKCJĄ HORMONÓW JAJNIKOWYCH JEST ICH UDZIAŁ W DOJRZEWANIU I PODTRZYMYWANIU CZYNNOŚCI UKŁADU ROZRODCZEGO KOBIETY Hormony te przygotowują strukturalne determinanty żeńskiego układu rozrodczego (patrz niżej) do reprodukcji: 1) wpływając na dojrzewanie pierwotnych komórek rozrodczych i 2) powstawanie tkanek pozwalających na implantację blastocytu oraz 3) zabezpieczając hormonalny zegar dla procesu jajeczkowania, 4) zapewniając środowisko niezbędne dla podtrzymywania ciąży i 5) wpływając na poród i laktację. Estrogeny pobudzają rozwój tkanek uczestniczących w procesie reprodukcji. Ogólnie mówiąc, hormony te wpływają na wielkość i liczbę komórek, pobudzając syntezę białek, rRNA, tRNA, mRNA i DNA. Pod wpływem estrogenów dochodzi do: 1) proliferacji i różnicowania nabłonka pochwowego, 2) proliferacji endometrium, przerostu i wydłużenia jego gruczołów, 3) rozwoju rytmicznej aktywności skurczowej myometrium oraz 4) proliferacji przewodów gruczołu sutkowego. Ponadto estradiol wykazuje działanie anaboliczne na kości i chrząstki, dzięki czemu pobudza wzrost. W końcu, est-

rogeny, działając na obwodowe naczynia krwionośne, wywołują ich rozszerzenie i rozproszenie ciepła. Progestyny hamują działanie proliferacyjne estrogenów na nabłonek pochwowy i przekształcają nabłonek macicy z postaci proliferacyjnej w sekrecyjną (co wyraża się wzrostem wielkości i funkcji gruczołów wydziel niczych oraz wzrostem zawartości glikogenu). W ten sposób nabłonek macicy przygotowuje się do zagnieżdżenia zapłodnionej komórki jajowej. Ponadto progestyny wzmagają rozwój zrazikowych obszarów gruczołów sutkowych, po uprzedniej stymulacji rozwoju przewodów tych gruczołów przez estrogeny. Progestyny zmniejszają przepływ krwi przez naczynia obwodowe, dzięki czemu zmniejszają utratę ciepła. Ten fakt tłumaczy wzrost temperatury ciała w fazie lutealnej cyklu miesiączkowego, tj. w fazie, w której hormony te są wytwarzane. Ten wzrost temperatury ciała, zwykle wynoszący 0,5°C, wykorzystywany jest jako oznaka jajeczkowania. Ogólnie rzecz biorąc, progestyny wymagają, dla wywołania swego efektu biologicznego, wyprzedzającego lub równoczesnego działania estrogenów. Jest to, być może, uwarunkowane tym, że estrogeny pobudzają powstawanie receptorów progesteronowych. Wymienione dwie klasy hormonów często działają synergistycznie, chociaż mogą być również antagonistami. Liczba pierwotnych komórek jajowych (oogonie) w ludzkim jajniku jest największa w 5 miesiącu ciąży i wynosi ok, 6—7 min, spadając do ok. 2 min w okresie porodu. Na początku pokwitania wynosi ona tylko 100 000—200 000. Z wymienionych liczb oogonii zaledwie 400—500 ulega ostatecznie przekształceniu do dojrzałych oocytów. Pozostała ilość ulega zanikowi w procesie, którego mechanizm nie jest jasny, chociaż sugeruje się udział w nim androgenów pochodzenia jajnikowego. Dojrzewanie pęcherzyków jajnikowych rozpoczyna się już w niemowlęctwie. W okresie przedpokwitaniowym jajniki stopniowo powiększają się przez to, że wzrasta objętość pęcherzyków (dzięki rozrostowi komórek ziarnistych) oraz narasta ilość tkanki po zanikłych atretycznych pęcherzykach jajnikowych oraz ilość tkanki zrębowej rdzenia, zawierającej komórki śródmiąższowe i osłonko we wytwarzające steroidy. Stężenia hormonów płciowych w osoczu krwi są małe w dzieciństwie, chociaż wzrastają one po podaniu egzogennych gonadotropin.

HORMONY GONAPALNE / 663

Cykl miesiączkowy zależy od złożonej interakcji trzech gruczołów endokrynnych Hormony determinują częstość występowania owulacji i parzenia się. Gatunki monoestryczne jajeczkują i parzą się raz w roku, natomiast gatunki poliestryczne powtarzają taki cykl kilka razy w roku. Naczelne maja. cykle miesiączkowe ze złuszczaniem się endometrium błony śluzowej macicy na końcu każdego cyklu zaś parzenie się nie jest ściśle skojarzone z owulacją. Cykl miesiączkowy u kobiety jest wynikiem złożonej interakcji podwzgórza, przysadki mózgowej i jajnika. Normalna długość jednego

Należy więc sądzić, że niedojrzały jajnik ma zdolność 'syntetyzowania estrogenów. Uważa się, że te małe stężenia hormonów płciowych hamują syntezę gonadotropin w okresie przedpokwitaniowym u dziewcząt oraz że w okresie pokwitania układ podwzgórzowo-przysadkowy staje się mniej wrażliwy na supresyjne działanie tych hormonów. W okresie pokwitania pulsacyjne wydzielanie GnRH stymuluje wydzielanie lutropiny. Z kolei ta ostatnia powoduje gwałtowny wzrost produkcji hormonów jajnikowych. Folitropina (FSH), będąca głównym stymulatorem sekrecji estrogenów, pobudza dojrzewanie jednego pęcherzyka jajnikowego, po którym następuje jajeczkowanie.

cyklu waha się od 25 do 35 dni (średnio wynosi 28

Faza luleafna

Faza folikularna Podstawowa temperatura ciała

36.8-1 °C 36,6-r 36.4

20

2.0

Pro gest ero n (ng/ rnl)

170-HydroKsyprogesteron 1.017-HydroKsyprogesteron

200 P9/mL

170-Estradloi

100 0

Gonadotroplny (mlU) IRP-hMG/ml

25 27 1

3

5

7

9 11 13 (5 17 19 21 23 25 27 1

3

5

Dni cyklu

Ryc. 51-7. Zmiany hormonalne i czynnościowe zachodzące podczas typowego cyklu miesiączkowego u kobiety. M — miesiączka, IRP — hMG — międzynarodowy preparat referencyjny dla gonadotropin. (Według: Midgley H. R.: w: Hafezy E. S. E., Evans T.N. (red,): Human Reproduction, Harper and Row, 1973, za zezwoleniem).

664 / ROZDZIAŁ 51 dni). Cały cykl miesiączkowy daje się podzielić na fazę folikularną (pęcherzykową), lutealną i miesiączkowanie (ryc. 51-7). Faza folikularną

(pęcherzykowa). Z przyczyn niewyjaśnionych jeden pęcherzyk jajnika zaczyna się powiększać, głównie pod wpływem FSH. W pierwszym tygodniu fazy pęcherzykowej stężenia E, są małe. lecz wzrastają w miarę wzrostu pęcherzyka. Szczytowe stężenie E2 stwierdza się w 24 godziny przed szczytowym stężeniem LH (i FSH). E2 uczula przysadkę mózgową na działanie GnRH. Uwalnianie LH może być wynikiem reakcji na wysokie stężenie E2 (jest to rodzaj „dodatniego sprzężenia"), lub też następstwem nagłego spadku stężenia tego hormonu (ze stężenia szczytowego). Ciągłe podawanie wysokich dawek estrogenów (jako doustne leki antykoncepcyjne) hamuje uwalnianie LH i FSH oraz działanie GnRH na przysadkę mózgową. Stężenia progesteronu w osoczu krwi są bardzo małe w fazie folikularnej. Szczytowe stężenie LH zwiastuje koniec tej fazy i wyprzedza jajeczkowanie 0 16—18 h. Faza lutealną. Po owulacji komórki ziarniste pękniętego pęcherzyka ulegają luteinizacji 1 tworzą ciałko żółte. tj. strukturę rozpoczynają cą w krótkim czasie produkcję progesteronu i w mniejszym stopniu również estradiolu. Stę żenie estradiolu osiąga najwyższy poziom w po łowie fazy lutealnej (mowa tylko o stężeniu E2 w fazie lutealnej), po czym stopniowo spada do bardzo małych wartości. Głównym hormonem fazy lutealnej cyklu miesiączkowego jest proges teron, który, jak to zaznaczono wyżej, jest potrzebny do przygotowania i podtrzymywania czynności sekrecyjnej endometrium, stanowią cego źródło substratów energetycznych dla za gnieżdżonego blastocytu we wczesnej fazie jego rozwoju. Lutropina jest niezbędna do podtrzy mywania funkcji ciałka żółtego we wczesnej fazie jego występowania. Źródłem LH przez 10 pierwszych dni trwania fazy lutealnej jest przy sadka mózgowa. Jeśli nastąpi implantacja za płodnionej komórki jajowej (między 22 a 24 dniem normalnego cyklu), funkcję przysadko wej lutropiny przejmuje gonadotropina kosmówkowa (hCG), tj. hormon o bardzo podob nej strukturze do LH, wytwarzany przez komó rki cytotrofoblastu zagnieżdżonego zarodka. HCG pobudza syntezę progesteronu przez ciał ko żółte, do chwili wytwarzania tego ostatniego w dużych ilościach przez łożysko. Jeśli implan tacja nie nastąpi i komórki cytotrofoblastu nie

wytworzą hCG, ciałko żółte zanika i pojawia stę miesiączka. Po złuszczeniu endometrium rozpoczyna się nowy cykl miesiączkowy. Czas trwania fazy lutealnej wynosi zawsze 14 + 2 dni. Zmiany w czasie trwania jednego cyklu miesiączkowego uwarunkowane są prawie zawsze zmienionym czasem trwania fazy folikularnej (pęcherzykowej). Ciąża pobudza syntezę hormonów łożyskowych Zagnieżdżony blastocyt wytwarza trofoblast, który z kolei przekształca się w łożysko. Łożysko jest pośrednikiem w przekazywaniu substratów energetycznych z krążenia matki do płodu oraz jest miejscem produkcji wielu hormonów.

Ludzka gonadotropina kosmówkowa

(hCG). Główną funkcją hCG, będącej hormonem glikoproteinowym (strukturalne podobieństwa pomiędzy hCG i LH są omówione w rozdz. 46), jest podtrzymywanie czynności ciałka żółtego do chwili wytworzenia przez łożysko progesteronu w ilościach potrzebnych do podtrzymywania ciąży. Obecność hCG we krwi można wykazać już kilka dni po implantacji zapłodnionej komórki jajowej, co zostało wykorzystane w testach diagnostycznych dla wykazania wczesnej dąży. Szczytowe stężenia hCG stwierdza się w połowie pierwszego trymestru, po czym obserwuje się stopniowe obniżenie się stężenia tego hormonu do końca ciąży. Zmiany stężenia hCG i innych hormonów zachodzące w ciąży przedstawiono na ryc. 51-8. Progestyny. Ciałko żółte jest głównym źródłem progesteronu w pierwszych 6—8 tygodniach trwania ciąży, po czym rolę jego przejmuje łożysko. Pomimo że ciałko żółte nie przerywa swej funkcji, ilość progesteronu wytwarzanego przez łożysko w późnej fazie ciąży jest 30—40-krotnie większa niż produkowana przez ciałko żółte. Łożysko nie wytwarza cholesterolu, co oznacza, że- jest ono zależne od dostawy tego lipidu przez matkę. Estrogeny. W miarę trwania ciąży stwierdza się stopniowy wzrost stężenia w osoczu krwi estradiolu, estronu i estriolu. W największych ilościach wy twarzany jest estriol; jest to odzwierciedlenie wielu funkcji jednostki płodowo-łożys-

kowej. Nadnercza płodu wytwarzają DHEA i siarczan DHEA, które w wątrobie płodu ulegają przekształceniu do 16cc-hydroksy-pochodnych. W łożysku te ostatnie ulegają przekształceniu do estriolu. Z kolei estriol dostaje się

HORMONY GONADALNE / 665 Dobowe wydalanie

I

-36 -33 -30 -27 -2 4 "'* >

50-

-1 8

-15 -12 -9 4-

100-

-6

2-

-3 70

140 Oni ciąży

210

2B0

Ryc. 51-8. Stężenia hormonów podczas prawidłowej ciąży: hCG — ludzka gonadotropina kosmówkowa, hCS — ludzka somatomammotropina kosmówkowa (dane wzięte od kilku autorów, wg Ganong W, F.; Revhw of Medical Physiology, wyd. 13, Appleton and Lange, 1987). ________________________________________________________________________________________

poprzez łożysko i krążenie matki do wątroby, gdzie ulega koniugacji do glukuronidów i wydakniu z moczem (patrz ryc. 51-9). Oznaczenie dobowego wydalania estriolu wykorzystane jest do oceny wielu procesów zachodzących w układzie matka — płód. Inna interesująca wymiana substratów między płodem a matką jest potrzebna dla syntezy kortyzolu przez nadnercza płodu. Nadnercza płodowe nie posiadają kompleksu enzymatycznego złożonego z dehydrogenazy 3 P-hydroksysteroidowej i As'4-izomerazy i dlatego zależne są od dostawy łożyskowego progesteronu niezbędnego do syntezy kortyzolu (ryc. 51-9).

Laktogen łożyskowy. Łożysko wytwarza

hormon określany jako laktogen łożyskowy (PL). PL bywa również określany jako somato-

mammotropina lub łożyskowy hormon wzrostu, ponieważ wykazuje właściwości biologiczne prolaktyny i hormonu wzrostu. Genetyczne relacje zachodzące między tymi hormonami omówione zostały w rozdz. 46. Rola fizjologiczna PL jest niepewna, skoro kobiety nie posiadające tego hormonu wykazują normalny przebieg ciąży i rodzą normalne dzieci. Nieznany jest mechanizm wyzwalający poród Czas trwania ciąży jest ściśle określony dla poszczególnych gatunków zwierząt. Nieznane są jednak czynniki odpowiedzialne za zakończenie ciąży. Podejrzewa się tu udział hormonów, chociaż nie zostało to udowodnione. Prawdopodobnie chodzi o estrogeny i progestyny,

6 6 6 / R O Z D Z IA Ł 5 1 PLOD

c

ŁOŻYSKO

MATKA

Kortyz ol

Kortyzol

Progesteron

Nadnercza

—.

Pregnenolon DHEA ■ Siarczan DHEA

+

"ł

Wątroba

Glukuronld

Estriol (E3)

t

DHEA siarczan DHEA

Glukuronld eslrłolu

16a-Hydreksy-DHEA Nerki

»- 1&r-Hydraksy-DHEA-----1 Wątroba

DHEA

Glukuronld estrlolu

w moczu

Ryo. 51-9. Przemiana steroidów w jednostce matczy no-płodowej. DHEA — dehydroepiandrosteron.

ponieważ wpływają one na kurczliwość macicy. Są również dowody na to, że katecholaminy uczestniczą w procesie indukcji porodu. Ponieważ oksytocyna zwiększa kurczliwość macicy, wykorzystywana jest jako lek wspomagający poród. Dodać jeditsk należy, że podanie egzogennej oksytocyny nie inicjuje porodu, jeśli ciąża nie dobiega końca. Przy końcu ciąży liczba receptorów oksytocynowych w macicy jest stokrotnie większa niż na początku ciąży. Wzmożona ilość estrogenów przy końcu ciąży być może zwiększa liczbę receptorów oksytocynowych (p. rozdz. 46). Po raz rozpoczętym porodzie dochodzi do rozszerzenia szyjki macicy, wyzwalającego odruch nerwowy, pobudzający uwalnianie się oksytocyny. Ta ostatnia z kolei nasila skurcze macicy. W tym procesie ważną role mogą odgrywać również czynniki mechaniczne, tj. nasilenie rozciągania szyjki macicy lub siła działająca na mięsień macicy. Po porodzie dochodzi do gwałtownych zmian w środowisku hormonalnym zarówno matki, jak i płodu, zas po wydaleniu łożyska we krwi matki stwierdza się szybki spadek stężenia pro-

gesteronu (określanego jako pregnandiol) i estriolu (ryc. 51-8). Estradiol i progesteron pobudzają rozwój gruczołu sutkowego, zaś prolaktyna laktację Różnicowanie i czynność gruczołu sutkowego regulowane sa harmonijnym współdziałaniem wielu hormonów. Proces ten zapoczątkowują żeńskie hormony płciowe, estrogeny bowiem pobudzają wzrost przewodów, zaś progestyny proliferację zrazików sutkowych. Pewien wzrost tkanki gruczołowej i tłuszczowej gruczohi sutkowego ma miejsce w okresie pokwitania. Znaczny rozwój gruczołu sutkowego występuje w ciąży, kiedy tkanka gruczołowa eksponowana jest na duże stężenia estradiolu i progesteronu. Dla całkowitego różnicowania się gruczołu sutkowego (przebadanego przeważnie na eksplantach szczurzych tego gruczołu) potrzebne są ponadto prolaktyna, glukokortykoidy, insulina lub peptyd wzrostowy oraz nie zidentyfikowany jeszcze czynnik surowicy krwi. Z wymienionych hormonów tylko stężenie pro-

HORMONY GONADALNE / 667

laktyny ulega dramatycznym zmianom. Wzrasta ono ż wartości wyjściowej mniejszej niż 2 ng/ml do powyżej 200 ng/ml w późnej fazie ciąży. Wpływ wymienionych hormonów na syntezę białek mleka, w tym na laktoalbuminę, laktoglobulinę i kazeinę, zosta! szczegółowo przebadany. Hormony te pobudzają syntezę białek zwiększając ilość swoistych mRNA. Przynajmniej w odniesieniu do kazeiny wzrost ten jest skutkiem wzrostu transkrypcji genowej i stabilizacji mRNA. Progesteron, niezbędny dla różnicowania się zrazików gruczołu sutkowego, hamuje produkcję i wydzielanie mleka w zaawansowanej ciąży. Laktacja rozpoczyna się w chwili nagłego obniżenia się stężenia tego hormonu po porodzie. Również stężenie prolaktyny w osoczu obniża się szybko po porodzie, sekrecja tego hormonu ulega jednak stymulacji podczas każdego aktu ssania brodawki sutkowej (p. rozdz. 46) podtrzymując przez to proces laktacji. W razie zakazu karmienia piersią, laktacja stopniowo zanika. Można ją również szybko zakończyć podając pozajelitowo duże dawki androgenu, zanim rozpoczęto karmienie piersią. Ssanie brodawki piersiowej stymuluje również uwalnianie się oksytocyny z tylnego płata przysadki nerwowej. Oksytocyna obkurcza komórki mięśniowo-nabłonkowe otaczające przewody zrazikowe, wyciskając w ten sposób mleko z gruczołu sutkowego. Regulację syntezy i wydzielania oksytocyny przedyskutowano w rozdz. 46. Koniec menopauzy charakteryzuje się zanikiem produkcji estrogenów jajnikowych

Kobiety żyjące na zachodniej półkuli przestają miesiączkować średnio w 53 rż. Ten okres pokrywa się z zanikiem wszystkich pęcherzyków jajnikowych i syntezy estrogenów jajnikowych. Nie ma alternatywnego źródła progesteronu, natomiast pokaźne ilości słabego estrogenu, tj. estronu, powstają przez aromatyzację androstendionu (ryc. 51 -5). Stężenia estronu w osoczu są jednak zbyt mak, by zahamować sekrecję gonadotropin przysadkowych. Ten fakt tłumaczy występowanie bardzo dużych stężeń FSH i LH w osoczu, tak charakterystycznych dla pierwszych lat pomenopauzalnych. Kobiety po menopauzie są narażone na dwa zjawiska związane z katabolizmem tkankowym indukowanym estrogenopenią. Estron nie zawsze jest w stanie zapobiec zanikowi

drugorzędowych cech płciowych, w tym szczególnie nabłonka dolnych dróg moczowych i pochwy. Ponadto ważnym problemem zdrowotnym u osób starszych jest osteoporoza; kobiety z ciężkim zanikiem masy kostnej wykazują niższe od normalnych stężenia estronu w osoczu krwi. Syntetycznych agonistów i antagonistów używa się zarówno promocji, jak i zahamowania zapłodnienia oraz dla zahamowania wzrostu guzów

dla

Estrogeny. Wiele związków syntetycznych wykazuje aktywność estrogenową oraz jedną lub kilka korzystnych cech farmakologicznych. Większość modyfikacji, vw strukturze estrogenów wprowadzono po to, by zmniejszyć przemianę tych hormonów w wątrobie oraz, by skuteczne było doustne ich podawanie. Jednym z pierwszych takich związków był dietylostylbestrol. Innymi przykładami takich steroidów o zmodyfikowanej strukturze są 17a-etynyloestradiol i mestranol, używane jako doustne teki antykoncepcyjne.

Dletylostylbestrol

Dokonano syntezy licznych związków wykazujących aktywność antyestrogenową. Kilka z nich znalazło zastosowanie kliniczne. Działanie większości tych antagonistów polega na tym, że wiążą się one kompetycyjnie ze śródkomórkowym receptorem estradiolowym (p. niżej).

I7a-Etynyloestrad(ol

668 / ROZDZIAŁ 51 CH3O r-C=CH

--OAc

Mesiranol

Cytrynian kiomifenu (Clomid) wykazuje szczególne powinowactwo do receptorów estrogenowych podwzgórza. Początkowo związek ten stosowano jako lek hamujący płodność, podczas gdy obecnie używany jest do celów przeciwnych, tj. jako lek zwiększający płodność. Klomifen działa kompetycyjnie w stosunku do estradiolu, jeśli chodzi o wiązanie z receptorami estrogenowymi podwzgórza. W wyniku takiego działania dochodzi do odblokowania sekrecji GnRH oraz wtórnie do nadmiernego wydzielania się LH i FSH przez przysadkę mózgową. W następstwie działania kiomifenu dochodzi do równoczesnego dojrzewania licznych pęcherzyków jajnikowych oraz, co za tym idzie, do częstego rozwoju ciąży mnogiej. Nafoksydyna — związek niesteroidowy — oraz tamoksyfen, łącząc się z receptorami estrogenowymi, tworzą z chromatyną bardzo trwałe kompleksy. Uniemożliwia to recyrkulację receptorów, przez co dochodzi do blokowania działania estradiolu na długi czas. Wymienionych antagonistów używa się w leczeniu estrogenozależnego raka piersi.

^

Cytrynian klomtfenu

Progestyny. Trudne byio wytworzenie związków wykazujących aktywność progestynową, lecz pozbawionych działania estrogenowego lub androgenowego. 17 a-alkilopochodne 19-nortestosteronu (np. noretyndron) u większości kobiet wykazują minimalną aktywność androgenową. Są one używane jako doustne leki antykoncepcyjne. Inną silną progestyną jest octan medroksyprogesteronu (Provera). Med-

CH3 Octan medroksyproossleronu

OH

■—CsCH

Noretyndron

roksyprogesteron hamuje występowanie jajeczkowania przez kilka miesięcy, jeśli zostanie podany domięśniowo pod postacią depót. Ponieważ progestyny hamują wzrost komórek ww. związek jest częściej używany w leczeniu dobrze zróżnicowanego raka endometrium (błona śluzowa macicy). Estrogeny i progestyny działają poprzez regulację ekspresji genów Działanie wymienionych hormonów polega na ich wiązaniu się ze swoistymi receptorami śródkomórkowymi. Te ostatnie, wiążąc się z określonymi obszarami chromatyny lub(i) DNA jądrowego, oddziałują na tempo transkrypcji swoistych genów. Wiele informacji dostarczyły wyniki badań nad wpływem estradiolu i progesteronu na transkrypcję genów kodujących białko jaj ptasich, w tym szczególnie owalbuminy i konalbuminy. Dokładny mechanizm działania tych hormonów w procesie transkrypcji genów jest wciąż przedmiotem intensywnych badań. Receptory estrogenów© i progesteronowe należą do jednej rodziny genowej Sekwencję aminokwasową receptorów estrogenowych (ER) i progesteron owych (PR) rekonstruowano na podstawie sekwencji odpowiadających im cDNA. Receptory te należą do

HORMONY GONADALNE / 669

rodziny genowej receptorów steroidowych i hormonów tgrczycy, omawianych w rozdz. 49. Jak to przedstawiono na ryc. 49-3. każdy receptor ma kilka domen czynnościowych. Steroidy wiążą się z miejscami ligandowymi C-koricowego obszaru cząsteczki receptorowej. To indukuje zmianę konformacyjną umożliwiającą wiązanie się receptora z DNA. Domena ER, wiążąca się z DNA, rozpoznaje sekwencję AGGTCAnnnTGCCCT (jest to sekwencja odpowiedzi estrogenowej — ERE — estrogen response element), natomiast domena PR — sekwencję GGTACAnnnTGTTCT (jest to sekwencja odpowiedzi progesteron owej — PRE — progesterone response element). Interakcja receptora z DNA umożliwia różnym działającym w konfiguracji trans domenom każdego receptora oddziaływanie na geny przylegające do obszarów odpowiedzi hormonalnej. Wzmożona (lub zmniejszona) aktywność swoistych genów wyraża się zmienionym tempem syntezy swoistych białek, co przejawia się zmianą reakcji metabolicznych. Cechy szczególne. Na uwagę zasługuje kilka faktów, dotyczących mechanizmu działania omawianych hormonów: 1) receptory wiążące hormony płciowe odznaczają się pewną nieswoistością, i tak progesteron wiąże się z receptorem androgenowym, przez co wykazuje słabe działanie androgenowe, natomiast kilka androgenow wiąże się z receptorami estrogenowymi, przez co mogą naśladować działanie tych ostatnich na macicę; jak to pokazano na ryc. 49-3, centralne sekwencje obszarów odpowiedzi hormonalnej dla omawianych hormonów wykazują znaczne podobieństwo. Ten fakt tłumaczy, dlaczego niektóre hormony wykazują działanie mieszane, tj. androgenowe, jak i progestynowe lub estrogenowe; 2) estrogeny zwiększają liczbę zarówno receptorów estrogenowych, jak i progesteronowych; 3) wydaje się, że progesteron przyspiesza tempo obrotu własnego receptora; 4) tak zwane słabe estrogeny, np. estriol, podawane często działają jak estrogeny silne.

NIEKTÓRE ZABURZENIA ŻEŃSKIEGO UKŁADU ROZRODCZEGO WYKAZUJĄ ZWIĄZEK Z ANOMALIAMI HORMONALNYMI Omawianie wszystkich zaburzeń żeńskiego układu rozrodczego przekracza ramy tego roz-

działu. Toteż tylkp wybrane przykłady tych zaburzeń są przedmiotem bliższego omówienia. Pierwotny hipogonadyzm jest następstwem procesu chorobowego bezpośrednio uszkadzającego jajniki. W następstwie tego uszkodzenia upośledzeniu ulega proces jajeczkowania lub(i) czynność endokrynna gonady żeńskiej. Hipogonadyzm wtórny spowodowany jest wypadnięciem gonadotropinowej czynności przysadki mózgowej. Dysgeneza gonad (zespół Turnera) jest często spotykanym zaburzeniem genetycznym, charakteryzującym się kariotypem XO, występowaniem żeńskich narządów płciowych zarówno zewnętrznych, jak i wewnętrznych oraz nieprawidłowościami rozwojowymi i opóźnionym pokwitaniem. Wiele zespołów spowodowanych jest nieprawidłowościami w zakresie ilości hormonów. Najczęściej występuje zespól policystycznych jajników (zespół Steina-LeventhaEa), w którym na

skutek nadprodukcji androgenow pojawiają się takie objawy jak hirsutyzm, otyłość, nieregularne miesiączkowanie OTaz zmniejszona płodność. Rzadko występujące guzy złożone z komórek Leydiga oraz jądrzaki (arrhenoblastoma) wytwarzają testosteron. Guzy określone jako ziarniszczaki (granulosa celi tumor) lub otoczkowiaki (thecoma) produkują estrony, zaś śródjajnikowe guzy złożone z komórek nadnerczy

(intraovarian adrenal rest tumor) — kortyzol. Przetrwała tkanka trofoblastyczna jest przyczyną łagodnego zaśniadu graniastego (mola hydatidosa) mogącego ulec transformacji do złośliwego nabłoniaka kosmówkowego (choriocarcinoma). Ostatnie dwa nowotwory wytwarzają ogromne ilości hCG. Oznaczanie radioimmunologiczne hCG wykorzystywane jest w diagnostyce wymienionych dwóch rodzajów niebezpiecznych guzów oraz monitorowaniu skuteczności ich leczenia.

PIŚMIENNICTWO Ogólne

Huggins C: Two principles in endocrine therapy of cancer. Hormonedcpnval and hormone interference. Ccmcer Res 1965,25:1163. O'MalLey BW: Steroid hormone action in eucaryotic cells. / Clin Inrest 1984;74:307. Wilson JD et al: The endocrioe control of małe phenotypic development, Aust J Bioł Sci 1983;36:101.

670 / ROZDZIAŁ 51 Hormony jąder Chang C et al: Structural analysis of complementary DNA and amino acid seąuences of human and rat androgen receptors. Proc Nail Acad Sci USA 198835:7211. Hali PF; Testicular hormones: Synthesis and control. Pages 1511 — 1520 in: Endocrinołogy, Vol 3. DeGroot LJ (editor). Grune & Stratton, 1979. Wilson J; Metabolism of testicular androgens. Chap 25, pp 491—508, in: Handbook of Endocrinołogy. Section 7: Endocrinołogy, Vol 5: Małe Reproductive System, Hamilton DW, Greep RP (editors). American Physiological Society, Washington DC, 1975.

Hormony jajników

Green S et al: Human estrogen receptor DNA: Sequence, expression and homology to N-erb-A, Naturę (London) 1986;320:134. Siitcri PK, Fcbrcs F: Ovarian hormone synlhesis, circulation and mechanisms of action. Pages 1401—1417 iu: Endocrinołogy, Vol 3. DeGroot LJ (editor). Grune & Stratton, 1979. Toft D, Górski J: A receptor molecule for estrogens. Proc Natł Acad Sci USA 1966;55:1574.

Hormony trzustki i żołądkowo-jelitowe

5 2

Dary/ K. Granner, MD

WPROWADZENIE Trzustka stanowi strukturę, zawierającą dwa różne narządy. Część zrazikowa trzustki wykazuje czynność zewnątrzwydzielnkzą (egzokrynną); wydziela ona do światła dwunastnicy enzymy i jony potrzebne w procesach trawienia pokarmów. Na część wewnątrz wy dzieiniczą (endokryimą) trzustki składają się wyspy Langerhansa. Masa 1—2 min wysp występujących w trzustce stanowi 1—2% całej masy tego narztfdu. Wyspy 2awierają kilka rodzajów komórek wymienionych w tab. 52-1. Tabela 52- . Rodzaje komórek występujących w wyspach Langerhansa Procentowy Nazwa udział komóHormon komórek rek w struktu- wytwarzany rze wysp A (luba) Ok. 25% Glukagon B (lub |3) Ok. 70% Insulina D (lub 8) F

Mniej niż 5% Śladowy

Somatostatyna Polipeptyd trzustkowy

Wyspy trzustkowe wydzielają przynajmniej 4 hormony, tj. insulinę, glukagon, somatostatynę i polipeptyd trzustkowy. Wymienione hormony uwalniane są do żyły trzustkowej wpadającej do żyły wrotnej. Taki układ anatomiczny jest korzystny z punktu widzenia fizjologicznego, albowiem wątroba jest głównym miejscem działania insuliny i glukagonu. Ostatnie dwa hormony, choć uczestniczą głównie w przemianie węglowodanów, wykazują również wpływ na

Skróty używane w tym rozdziale ACTH — hormon ad reno korty kotropo wy, adrenokortykotropina EGF — naskórkowy czynnik wzrostowy FGf — czynnik wzrostowy fibroblastów GIP — żołądkowy polipeptyd hamujący IGF — czynnik wzrostowy insulinopodobny LDŁ — lipoproteiny o małej gęstości — cukrzyca tnsulinozależna IDDM NIDDM — cukrzyca insulinoniezależna PDGF czynnik wzrostowy pochodzenia płytkowego PEPCK — karboksykinaza fosfoenoi opirogronią nowa PGF2 — prostaglandyna F2 PP — polipeptyd trzustkowy VLDL — lipoproteiny 0 bardzo małej gęstości

wiele innych procesów. Somatostatyna, po raz pierwszy wykryta w podwzgórzu, gdzie hamuje wydzielanie hormonu wzrostu, występuje w wyższych stężeniach w wyspach niż podwzgórzu. W trzustce hormon ten uczestniczy w lokalnej regulacji sekrecji insuliny i glukagonu. Polipeptyd trzustkowy wywiera wpływ na wydzielanie soków przez przewód pokarmowy. Przewód pokarmowy wydziela wiele hormonów, zapewne więcej niż jakikolwiek inny pojedynczy narząd. Do funkcji przewodu pokarmowego należą: a) dostarczanie pokarmów do miejsca ich trawienia, b) stworzenie właściwego środowiska (odpowiednie pH i stężenie jonów, obecność właściwych enzymów) niezbędnego dla procesów trawienia, c) wchłanianie produktów trawienia przez błonę śluzową jelit, przeniesienie ich do przestrzeni pozakomórkowej a stamtąd do krążenia, skąd dostają się do komórek obwodowych oraz d) wydalanie z ustroju pro-

672 / ROZDZIAŁ 52

duktów odpadowych. We wszytkich tych funkcjach uczestniczą hormony przewodu pokarmowego.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Insulina jest pod wieloma względami modelowym hormonem, który jako pierwszy uzyskano w stanie oczyszczonym i krystalicznym oraz syntetyzowano metodami chemicznymi i biologii molekularnej. Badania nad jego biosyntezą dostarczyły podstaw dla koncepcji o występowaniu prohormonów (propeptydów). Insulina posiada ważne implikacje medyczne. Około 5% populacji w krajach rozwiniętych cierpi na cukrzyce, zaś dalsze 5% ludzi jest potencjalnie narażonych na rozwijanie się tej choroby. Cukrzyca jest skutkiem niedostatecznego działania insuliny spowodowanego niedoborem tego hormonu, lub też opornością tkanek na ten hormon. Działanie glukagonu nasila cukrzyce, jeśli jego działanie nie jest hamowane mechanizmami wyrównawczymi. Opisano wiele zespołów chorobowych spowodowanych nadmiarem hormonów wydzielanych przez przewód pokarmowy. Diagnostyka tych zespołów chorobowych może być trudna z dwóch powodów: po pierwsze lekarz często nie jest obeznany z symptomatologią tych zespołów oraz, po drugie, objawy chorobowe podawane przez chorego lub stwierdzane przez lekarza mogą dotyczyć równocześnie wielu narządów. Hormony przewodu pokarmowego są przedmiotem zainteresowania również z innego powodu, mianowicie^ wykazują one bliski związek z neuropeptydamf.

HORMONAMI TRZUSTKI SĄ: INSULINA, G LUK AGO IM, SOWIATOSTATYNA I POLIPEPTYD TRZUSTKOWY Stężenie glukozy we krwi jest regulatorem produkcji insuliny

Rys historyczny. W latach sześćdziesiątych ubiegłego stulecia Langerhans zidentyfikował wyspy trzustkowe, chociaż nie rozumiał jeszcze ich funkcji, podobnie jak von Mering i Minkowski. Ci ostatni badacze wykazali w 1889 r„ że pankreatektomia jest przyczyną cukrzycy. Występowanie związku przyczynowego między czynnością wysp trzustkowych

a cukrzycą sugerowali w 1909 r. Mayer oraz wl917r. Sharpey-Schaffer. Taki związek został jednak udowodniony dopiero w 1921 r. przez Bantinga i Besta. Ci ostatni badacze użyli kwaśnego etanolu do ekstrakcji czynnika wyspowego, który wykazywał silne działanie hipoglikemiczne. Czynnik ten nazwali insuliną. Szybko przekonano się, że wyspy trzustkowe bydła i świń zawierają insulinę, aktywną również u człowieka. W ciągu roku insulina znalazła szerokie zastosowanie w leczeniu cukrzycy. Okazała się ona lekiem ratującym życie tych chorych. Fakt dysponowania dużymi ilościami insuliny bydlęcej i świńskiej miał ogromny wpływ na dalsze badania biomedyczne dotyczące tego hormonu. Insulina była: 1) pierwszym białkiem dla którego udowodniono działanie hormonalne, 2) pierwszym białkiem uzyskanym w postaci krystalicznej (Abel, 1926), 3) pierwszym białkiem, dla którego określono sekwencję aminokwasową (Sanger i wsp., 1955), 4) pierwszym białkiem syntetyzowanym metodami chemicznymi (Du i wsp., Zahn, Katsoyanis — 1964), 5) pierwszym białkiem dla którego wykazano, że produkowane jest pod postacią cząsteczki prekursorowej (Steiner i wsp. — 1967) oraz 6) pierwszym białkiem uzyskanym technologią rekombinacji genetycznej do celów handlowych. Pomimo tych licznych „pierwszych" pozycji o mechanizmie działania tego hormonu na poziomie molekularnym wiadomo znacznie mniej niż w przypadku innych hormonów.

insulina jest polipeptydem heterodimerycznym

Insulina jest polipeptydem składającym się z 2 łańcuchów, tj. z łańcucha A i B połączonych ze sobą mostkami dwusiarczkowymi w pozycjach A7 i B7 oraz A20 i B19. Trzeci, śródłańcuchowy mostek dwusiarczkowy łączy aminokwasy A6 z Ali. U większości gatunków zwierząt wymienione 3 mostki dwusiarczkowe są niezmienne, zaś łańcuchy A i B składają się z 21 (łańcuch A) lub 30 (łańcuch B) aminokwasów. Kowalencyjna struktura insuliny ludzkiej (o masie cząsteczkowej 5 734) przedstawiona jest na ryc. 52-1. Dla porównania w tab. 52-2 przedstawiono podstawniki aminokwasowe dla insulin różnych gatunków zwierząt (w porównaniu do insuliny ludzkiej). Występowanie odmiennych aminokwasów dotyczy zarówno łańcucha A, jak i B, a szczególnie pozycji 8, 9 i 10 łańcucha A. Dowodzi to, że ten obszar sekwen-

HORMONY TRZUSTKI I ŻOŁADKOWO-JELITOWE / 673

n

Łańcuch A

Gly- Il e- Val-G lu- Gl nCv s-Cvs -Th r- Se r-I le j - 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Cv s-Ser -Le u- Tv r-G ln Le u-Glu -As n- Tv r-C vs S S As n 1 2 3 4 5 6 t 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 I 1 72 1 1 3 1 9

18

19

/

ŁańcuchS Li-Val-Cys-C

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cvs-Glv-Ser-His-Leu-V3l-Glu-Ala-Leu-Tvr-Leu-Val-Ćys-Gly-Glu1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 - Arg -G ly-Ph e-Pt) e-Ty r -Th r- Pro- Lys-Th r22 23 24 25 26 27 28 29 30 Ryc. 52-1. Kowalencyjna struktura insuliny (Według: Ganong W, F.:Review of MedicaiPhysiotogy,wyd. 13, Appleion and Lancje, 1987.ŁA zezwoleniem).

Tabela 52-2. Różnice w strukturze insuliny pomiędzy poszczególnymi gatunkami ssaków Gatunek

Różnice w sekwencji aminokwasowej w stosunku do insuliny ludzkiej Łańcuch A Aminokwas w pozycji 8 9 10

Łańcuch B Aminokwas w pozycji 30

Thr

Thr — Ser — Ile Thr —Ser —Ile

Ala

Thr —Ser —Ile

Ser

Ala — Ser — Val

Ala

koza Owca

Ala — Gly — Val

Ala

Koń

Thr

Wieloryb

Ala — Ser —Thr

Ala Ala

cji aminokwasowej nie jest krytyczny dla występowania działania biologicznego. Istnieje kilka niezmiennych pozycji i sekwencji w strukturze

insuliny. S$ nimi: 1) położenie wymienionych 3 mostków dwusiarczkowych, 2) występowanie reszt hydrofobowych w obszarze C-koricowym łańcucha B oraz 3) niezmienność sekwencji aminokwasowej w obszarze N- i C-końcowym łańcucha A. Przez modyfikację chemiczną i wprowadzenie swoistych aminokwasów do wymienionych obszarów struktury insuliny 4 ■;

Bioche mia

Łańcuch A

ńcuoriB

Człowiek Świnia, pies, olbrotowiec (kas2alot) Królik Krowa,

G l y — Ile

określono determinanty aktywności biologicznej tego hormonu (ryc. 52-2). Hydrofobowy C-końcowy obszar łańcucha B uczestniczy również w procesie dimeryzacji insuliny.

Ryc. 52-2. Obszar cząsteczki insuliny niezbędny dla jej aktywności biologicznej. Struktura schema tyczna insuliny uzyskana badaniem krystalograficz nym. Pole zakreskowane oznacza obszary ciaste czki insuliny, od których najbardziej zależy aktyw ność biologiczna tego hormonu. Reszty w pozycji B24 i B25 są najbardziej podatne na mutacje wpływające na aktywność biologiczną insuliny. N-końce łańcuchów A i B zaznaczono znakiem ( + ), zaś C-końce — znakiem {-), Według: Tager H, S.: Abnormal products of the human insulin gene; Diabetes, 1984, 33,693, przerysowane za zezwole niem autora pracy). ____________ __________

674 / ROZDZIAŁ 52

Istnieje duże podobieństwo pomiędzy insuliną ludzką, świńską i bydlęcą (tab. 52-2) Insulina świńska różni się od insuliny ludzkiej tylko jednym aminokwasem (w miejsce treoniny w pozycji B30 występuje alanina). Insulina bydlęca różni się od ludzkiej obecnością alaniny na miejscu treoniny w pozycji B30, alaniny na miejscu treoniny w pozycji A8 oraz waliny na miejscu izoleucyny w pozycji A10. Wymienione modyfikacje nie mają wpływu na aktywność biologiczną insuliny i w bardzo niewielkim stopniu zmieniają jej antygenowość. Pomimo że wszyscy chorzy leczeni insuliną heterologiczną wykazują obecność krążących przeciwciał anty insulin owych (o bardzo małych mianach), tylko u niewielu z nich miano ich jest tak duże, że ma znaczenie kliniczne. Insulina świńska i bydlęca były standardowymi lekami stosowanymi w leczeniu cukrzycy do chwili wyproduko-

wania insuliny ludzkiej technologią rekombinacji DNA. Pomimo występowania znacznej zmienności w strukturze pierwotnej aktywność biologiczna dla wszystkich rodzajów insulin (niezależnie od gatunku) wynosi 25—30 IU/mg suchego hormonu. Insulina tworzy bardzo ciekawe struktury kompleksowe. Cynk, występujący w dużych stężeniach w komórkach B, tworzy kompleksy z insuliną i proinsuliną. Cząsteczki insulin wszystkich kręgowców tworzą izologiczne dimery dzięki wiązaniom wodorowym między grupami peptydowymi dwóch monomerów w pozycjach B24 i B26, zaś przy dużych stężeniach insuliny dimery ulegają przekszałceniu do heksamerów, zawierających po dwa atomy cynku każdy. Ta struktura wyższego rzędu umożliwiła badania struktury krystalicznej insuliny. W stężeniach fizjologicznych insulina występuje prawdopodobnie pod postacią monomeryczną.

Byc. 52-3. Struktura ludzkiej proinsuliny. insulina i peptyd C połączone są ze sobą w dwóch miejscach za pośrednictwem łączników di peptyd owych. Po zadziałaniu enzymu trypsyn o podobne go {jasne strzałki) i kilku kolejnych reakcjach katalizowanych przez enzymy karboksypeptydazopodobne (ciemne strzałki) powstają heterodimeryczna cząsteczka insuliny oraz peptyd C.

HORMONY TRZUSTKI I ŻOŁĄDKOWO-JELITOWE / 675

Insulina jest produkowana pod postacią cząsteczki prekursorowej Insulina jest syntetyzowana jako preprohormon (o masie cząsteczkowej 11 500) i jest prototypem dla peptydów powstających drogą przekształcenia większych cząsteczek prekursorowych. 23-aminokwasowa hydrofobowa sekwencja pre- lub prowadząca (liderowa) naprowadza cząsteczkę do cystern siateczki śródplazmatycznej, po czym ulega od szczepieniu. W wyniku tej reakcji powstaje proinsulina o masie cząsteczkowej 9000, wykazująca zmiany konformacyjne niezbędne dla wytworzenia właściwych mostków dwusiarczkowych. Jak widać na ryc. 52-3, cząsteczka proinsuliny 2aczyna się od łańcucha B na N-końcu, połączonego za pośrednictwem polipeptydu C z łańcuchem A. Proinsulina ulega kilku procesom rozszczepieniowym, swoistym dla określonych pozycji łańcucha polipeptyd owego, w wyniku których powstają równoważne ilości insuliny i peptydu C. Te procesy enzymatycznego rozszczepienia proinsuliny są przedstawione na ryc. 52-3. (nne hormony komórek wyspowych są również wytwarzane pod postacią cząsteczek prekursorowych Synteza innych hormonów wyspowych także wymaga potranslacyjnego przekształcenia enzymatycznego cząsteczek prekursorowych o wyższej masie cząsteczkowej. Na rycinie 52-4 znajduje się porównanie schematycznej struktury polipeptydu trzustkowego, glukagonu i somatostatyny ze strukturą insuliny. Przy rozszczepieniu wymienionych prohormonów uczestniczy kilka kombinacji enzymów endoproteolitycznych(trypsynopodobnych)iegzoproteolitycznych (podobnych do karboksypeptydazy B), ponieważ sekwencja aminokwasowa aktywnego hormonu może się znajdować na C-końcu cząsteczki prekursorowej (so mato s taty na), na N-końcu (polipeptyd trzustkowy), na obu końcach (insulina) lub w środkowym fragmencie (glukagon) prekursora. Synteza insuliny i powstawanie ziarnistości wydzielniczych odbywają się w organellach subkomórkowych ProinsuJina jest syntetyzowana na siateczce śródplazmatycznej szorstkiej. Enzymatyczne odcięcie polipeptydu prowadzącego, czyli lidera (presegmentu), utworzenie wiązań dwusiarczkowych oraz proces załamania odbywają się w cysternach siateczki śródplazmatycznej (ryc.

Polipeptyd trzustkowy

Insulina

Somatostatyna

Glukagon Ryc. 52-4. Schemat struktury prekursorów wy twarzanych przez 4 główne rodziny komórek wysp trzustkowych. Odcinki prekursorów odpowiadają ce właściwym hormonom wymienionym na rycinie oznaczono jako czarne prostokąty. Segmenty polipeptydowe nie stanowiące części hormonu przed stawiono jako Finie. Reszty aminokwasów dwuzasadowych (argininy lub lizyny) odpowiadające miejscom działania enzymów przekształcających prohormon w hormon zaznaczono czarnymi punk tami. Należy zwrócić uwagę na to, że strukturę proinsuliny przedstawiono w postaci wyprostowa nej nie wykazującej wiązań dwusiarczkowych. Struktura proinsuliny ma następującą sekwencję; Łańcuch B — peptyd C — łańcuch A. (Wedtug: Taylor H. S.: Abnormal products of the human insulin gene; Diabetns 1984, 33, 693, za zezwole niem). _______ ______________

52-3). Z kolei proinsulina zostaje przeniesiona do aparatu Golgiego, gdzie rozpoczyna się proces proteolizy i upakowania hormonu do ziarnistości wydzielniczych. Dalszy proces dojrzewania ziarnistości odbywa się w czasie ich wędrówki przez cytoplazmę do błony cytoplazmatycznej. Zarówno proinsulina, jak i insulina, łącząc się z cynkiem, tworzą heksamery. Ponieważ 95% proinsuliny ulega przekształceniu do insuliny, kryształki tego ostatniego hormonu są determinantami cech morfologicznych ziarnistości wydzielniczych. W obrębie ziarnistości znajdują się równoważnikowe stężenia peptydu C (w stosunku do stężenia insuliny); te ostatnie nie tworzą jednak struktur krystalicznych. Po zadziałaniu swoistego bodźca ziarnistość wydzielnicza zlewa się z błoną pkzmatyczną i wyrzuca swoją zawartość do przestrzeni pozakomórkowej. Proces ten określany jest jako emiocytoza.

676 / ROZDZIAŁ 52

Właściwości proinsuliny i peptydu C różnią się od właściwości insuliny Proinsuliny wykazują zmienną dhigość łańcucha polipeptydowego składającego się z 78 do 86 aminokwasów. Zmienność ta uwarunkowana jest zmienną dhigością polipeptydu C. Proinsulina wykazuje taką samą rozpuszczalność oraz taki sam punkt izoelektryczny co insulina. Tworzy ona również heksamery z kryształkami cynku i silnie wiąże przeciwciała antyinsulinowe. Proinsulina wykazuje aktywność biologiczną mniejszą niż 5% aktywności insuliny, co sugeruje, że większość miejsc aktywnych insuliny jest zablokowana w cząsteczce proinsuliny. W pewnych okolicznościach (u chorych z guzami wysp trzustkowych) równolegle z insuliną wydzielaniu ulegają większe niż zwykle ilości proinsuliny. Ponieważ okres półtrwania proinsuiiny jest znamiennie dłuższy od insuliny, zaś proinsulina daje silna reakcję krzyżową z surowicą anty insulin ową, metody radioimmu no logicznego oznaczania „insuliny" mogą okazyjnie dostarczyć wyników zawyżonych w stosunku do rzeczywistej aktywności biologicznej „insuliny" zawartej w osoczu. Dla peptydu C nie udowodniono żadnej aktywności biologicznej. Wykazuje on odrębne W stosunku do insuliny i proinsuliny własności antygenowe. Przez oznaczanie peptydu C metodą immunologiczną możliwe jest odróżnienie insuliny endogennej od egzogennej (po podaniu

insuliny egzogennej nie stwierdza się obecności peptydu C w osoczu — przyp- tłumacza) oraz ilościowe określenie insuliny endogennej u osób wykazujących obecność w surowicy krwi przeciwciał anty insulinowych (obecność przeciwciał antyinsuli nowych w surowicy uniemożliwia oznaczanie insuliny metodą immunologiczną). Istnieją znaczne różnice w sekwencji aminokwasowej peptydu C pomiędzy poszczególnymi gatunkami. Ten fakt potwierdza słuszność twierdzenia, że peptyd C prawdopodobnie nie posiada żadnej aktywności biologicznej. Peptydy insu I i nopodobne też mają swoje prekursory Struktura cząsteczki prekursorowej nie jest wyjątkowa dla insuliny. Podobną strukturę wykazują blisko spokrewnione z nią peptydy, tj. relaksyna i czynniki wzrostowe insulinopodobne (ryc. 52-5). Wszystkie te hormony wykazują znaczną homologię w obszarach łańcucha B i A położonych na końcach N- i C- cząsteczki prekursorowej. Obszary te są ze sobą połączone przez segment łączący. W prekursorze relaksyny i insuliny (p. ryc. 52-3) segment łączący związany jest na obu końcach przez dwa aminokwasy zasadowe. Po połączeniu się łańcucha B z łańcuchem A przez wiązania dwusiarczkowe, ten segment zostaje wycięty przez enzymy proteolityczne, przy czym powstaje hormon dwułaricuchowy. Czynniki wzrostowe insulino-

Ryc. 52-5. Schemat struktury prekursorów peptydów spokrewnionych z insuliną. Obszary homologiczne relaksyny, insuliny oraz czynnika wzrostowego insulinopodobnego (IGF) przedstawiono jako czarne prostokąty. Sekwencję aminokwasów^ łączącą łańcuch B z łańcuchem A relaksyny lub insuliny oznaczono prostokątami białymi. Te sekwencje ulegają „wyctęciu"(w miejscach zaznaczonych strzałkami) przy przekształceniu prohormonu do właściwego dwuiańcuchowego hormonu. Sekwencję aminokwasową czynnika wzrostowego insulinopodobnego, która odpowiada wymienionym peptydom łączącym insuliny i relaksyny, lecz nie ulega „wycięciu" enzymatycznemu, zaznaczono prostokątem kropkowanym. Dlatego czynnik wzrostowy insulinopoflobny jest hormonem jednołańcuchowym. (Według: Tager H. S.: Abnormal products of The human insuiin gene; Diabetes 1984, 33, 693, za zezwoleniem).

HORMONY TRZUSTKI I ŻOŁĄDKOWO-JELITOWE / 677

podobne, chociaż wykazują znaczną homologię z insuliną i relaksyną w zakresie struktury pierwszorzędowej, nie mają zasadowego dipeptydu na końcach segmentu łączącego, co sprawia, że są niepodatne na rozszczepienie przez odpowiednie enzymy proteolityczne i są hormonami jednołańcuchowymi. Wyizolowano ludzki gen insuliny Ludzki gen insulinowy zlokalizowany jest na krótkim ramieniu chromosomu 11 (ryc. 52-6). U większości ssaków stwierdza się ekspresję tylko pojedynczego genu insulinowego, wykazującego podobną organizację jak gen ludzki.

1i

■

Ryc. 52-6. Schemat struktury ludzkiego genu insulinowego. Skośnie zakreskowane obszary odpowiadają sekwencjom nie ulegającym transkrypcji do odpowiednich sekwencji mRNA. Białe poia odpowiadają sekwencjom intronów, zaś pola kropkowane — sekwencjom kodującym. Litery L, B, C i A oznaczają sekwencje kodujące peptyd liderow y {sygnalny) L, łańcuch B, peptyd C i łańcuch A. Należy zwrócić uwagę na to, że sekwencję kodującą peptyd C rozdziela sekwencja intronu. Schemat struktury odpowiada rzeczywistej skali. (Według: Tager H. S.: Abnormal proctucts of the human insulin gene; Diabetes 1984, 33, 693, za zezwoleniem).

W odróżnieniu od nich szczury i myszy mają dwa nieallelowe geny insulinowe. Każdy z nich koduje swoistą proinsulinę, ulegającą przekształceniu do aktywnej cząsteczki insulinowej. Synteza ludzkiej insuliny w bakteryjnych układach ekspresyjnych, używając technologii rekombinacji DNA, jest znakomitym źródłem insuliny dla chorych na cukrzycę. Wydzielanie insuliny jest precyzyjnie regulowane Ludzka trzustka wydziela 40—50 jednostek insuliny dziennie. Stanowi to ok. 15% hormonu magazynowanego w tym gruczole. Sekrecja insuliny jest procesem energochłonnym, w którym uczestniczy układ mikrokanalików i mikrofilamentów komórek B wysp trzustkowych. W uwalnianiu insuliny biorą udział liczne mediatory. Glukoza. Wzrost stężenia glukozy w osoczu jest najważniejszym regulatorem wydzielania

insuliny. Progowe stężenie glukozy, przy którym dochodzi do pobudzenia sekrecji insuliny, wynosi 4,4—5,5 mmol/1 (80—100 mg/dl), zaś maksymalne wydzielanie tego hormonu występuje przy glikemii wynoszącej 16,7—27,8 mmol/1 (300—500 mg/dl). Zaproponowano dwie różne hipotezy tłumaczące regulację sekrecji insuliny przez glukozę. Według jednej hipotezy glukoza wiąże się z receptorem umiejscowionym prawdopodobnie w błonie plazmatycznej komórek B, aktywując w ten sposób mechanizm uwalniania insuliny. Druga hipoteza zakłada, że czynnikiem regulującym sekrecję insuliny są środkomórkowe metabolity lub tempo ich przepływu przez określony szlak metaboliczny, np. przez cykl penlozofosforanowy, cykl kwasów trikarboksylowych lub przez szlak glflrólityczny. Istnieją dane doświadczalne dowodzące słuszności obu hipotez.

Czynniki hormonalne. Liczne hormony

wpływają na uwalnianie insuliny. Agoniści oc-adrenergiczni, głównie adrenalina, hamują uwalnianie insuliny nawet wtedy, kiedy proces ten był pobudzany glukozą. Agoniści P-adrenergiczni pobudzają uwalnianie insuliny prawdopodobnie poprzez zwiększanie stężenia śródkomórkowego cAMP (patrz niżej). Przewlekła ekspozycja na duże stężenia hormonu wzrostu, kortyzolu, laktogenu łożyskowego, estrogenów i progestyn również zwiększa sekrecję insuliny. Nie jest więc zaskoczeniem, że wydzielanie insuliny znacznie wzrasta w późnych stadiach ciąży.

Czynniki farmakologiczne. Wiele leków

pobudza wydzielanie insuliny, lecz najczęściej używane w lecznictwie są pochodne sulfonylomocznika. Leki, takie jak tolbutamid, pobudzają uwalnianie insuliny w inny sposób niż opisany wyżej dla glukozy. Znalazły one szerokie zastosowanie w leczeniu cukrzycy typu II (insulinoniezależnej). — CH 3 SO 2 — NH— C—NH-

H3 C

O Tolbutarnid

Insulina jest szybko metabolizowana W odróżnieniu od czynników wzrostowych insulinopodobnych insulina nie ma białek transportowych w osoczu krwi. Ten fakt tłumaczy

678 / ROZDZIAŁ 52

krótki okres półtrwania insuliny wynoszący w normalnych warunkach mniej niż j—5 min. Głównymi narządami uczestniczącymi w przemianie insuliny są wątroba, nerki i łożysko. 50% insuliny zawartej we krwi ulega klirensowaniu przez wątrobę po jednorazowym jej przejściu przez ten narząd. Za przemianę insuliny odpowiedzialne są mechanizmy, w których uczestniczą dwa układy enzymatyczne. Pierwszy

z nich zawiera proteazę występującą w wielu tkankach, natomiast w najwyższym stężeniu w ww. narządach. Proteazę tę oczyszczono z mięśni szkieletowych. Wykazano, że jest ona zależna od grup sulfhydrylowych i aktywna przy fizjologicznym pH. Drugi układ enzymaty-

jest omawiany bardziej szczegółowo w dalszych częściach tego rozdziału. Wielomocz (poliuria). wzmożone pragnienie (polidypsja) oraz utrata masy ciała pomimo adekwatnego odżywiania kalorycznego są głównymi objawami niedoboru insuliny. Jak wytłuma-

czyć taki stan rzeczy? U osób zdrowych stężenie glukozy w osoczu krwi rzadko przekracza 6,7 mmol/1 (120 mg/dl). Z reguły znacznie wyższe stężenia spotykane są u chorych, u których działanie insuliny jest niedostateczne (ryc. 52-8).

40 0

-

■

czny zawiera transhydrogenaze glutationowo-in-

sulinową. Enzym ten redukuje wiązania dwusiarczkowe, po czym powstałe w ten sposób łańcuchy A i B ulegają szybkiej degradacji. Nie wyjaśniono, który z wymienionych mechanizmów jest bardziej aktywny w warunkach fizjologicznycb, ani też, czy wymienione procesy są regulowane. Główną rolę insuliny w przemianie węglowodanowej, tłuszczowej i białkowej można najlepiej ocenić badając skutki niedoboru insuliny u ludzi Głównym objawem cukrzycy jest hipergliktmia. Jest ona spowodowana: 1) upośledzonym napływem glukozy do komórek, 2) upośledzonym zużytkowaniem (utylizacją) glukozy przez różne tkanki i 3) wzmożonym wytwarzaniem glukozy w wątrobie (w procesie zwanym glukoneogenezą) (ryc. 52-7). Każdy z tych procesó W

Niedobór Insuliny nadmiar glukagonu) Wzmożon y katabollzm białek

ł

Wzrósł lipolizy

Wzrost stężenia wolnych kwasów tłuszczowych, ketogenezy, ketonu rl i ketonernil

ł

Upośledzony wychwyt glukozy przez komórki

Hlpergllkemla, gllkozurla, d! uraza osmotyczna. utrata elektrolitów

-Wzrost stężenia aminokwasów we krwi, utrata związków azotowych z moczem

+

Odwód nie-" nie, kwasica

Ryc. 52-7. Patofizjologia niedoboru insuliny. (Dzięki uprzejmości R. J. Havela).

20 0 n

s"^

— 1

,

1

,

Insulina i

i

i

200 400 600 800 Stężenie glukozy w przestrzeni pozakomórkowej (mg/dl)

Ryc. 52-8. Wnikanie glukozy do komórek mięśniowych.

Po przekroczeniu określonego stężenia glukozy we krwi zwykle stężenia 10 mmol/1 (180 mg/dl), zostaje przekroczony górny próg reabsorpcji tego cukru w kanalikach nerkowych, co sprawia, że glukoza wydalana jest z moczem (obecność glukozy w moczu określa się jako glukozuric). W wyniku diurezy osmotycznej zwiększa się objętość wydalonego moczu, zaś współwystępująca translokacja układu transportowego glukozy jest zależna od temperatury i energochłonna, a niezależna od syntezy białka (ryc. 52-9). Komórka wątrobowa stanowi godny uwagi wyjątek w podanym schemacie działania insuliny.

Insulina nie zwiększa napływu glukozy do hepatocytów na zasadzie dyfuzji ułatwionej, natomiast pośrednio nasila taki napływ indukując syntezę glukokinazy — enzymu przekształcającego śródkomórkową glukozę do glukozo-6-fosforanu. Ta szybka fosforylacja sprawia, że stężenie wolnej glukozy w hepatocytach jest bardzo małe, co sprzyja napływowi tego cukru do komórek wątrobowych na zasadzie prostej dyfuzji zgodnie z gradientem stężenia przez błonę komórkową.

HORMONY TRZUSTKI i ŻOŁĄDKOWO-JELITOWE / 679 Dysocjacja

© Transport U Kłady — t ran sportowe glukozy

© Połączenie

Błona plazmatyczn a

Rya. 52-9. Translokacja transporterów glukozowych przez insulinę (Według: Karnieti E, i wsp.: Insulin-stimulated translocation of glucose transport systems in the isolated adipose celi; J. Biol. Chem. 1981, 256, 4772, za zezwoleniem, dzięki uprze/mości S. Curshman).

Insulina wzmaga również napływ do komórek, szczególnie mięśniowych, aminokwasów, potasu, jonów wapniowych, nukleozydów i fosforanów nieorganicznych. To działanie insuliny jest niezależne od jej wpływu na dokomórkowy transport glukozy.

Wpływ na utylizację glukozy. Insulina

wpływa na śród komórkowe zużytkowanie glukozy za pośrednictwem wielu mechanizmów omawianych niżej.

Glukoza wspożytych

pokarmach

Przekształco rta >w energię (w procesie glikolizy) 'Przekształcana w tłuszcze ► Przekształcana w glikogen

U zdrowego człowieka około połowa spożytej glukozy jest pf żekształcana w energię w szlaku glikolkycznym, zaś dalsza połowa zostaje zmagazynowana pod postacią tłuszczów i glikogenu. Glikoliza zmniejsza się, jeśli nie ma insuliny, równocześnie zahamowane zostają anaboliczne procesy glikogenogenezy i lipogenezy. Rzeczywiście u chorego na cukrzycę z niedoborem insuliny zaledwie 5% spożytej glukozy ulega konwersji do tłuszczów. Insulina nasila procesy glikolityczne zwiększając aktywność i stężenie kilku głównych enzymów tego szlaku metabolicznego w tym glukokinazy, fosfofruktokinazy i kinazy pirogronianowej. Wzrost glikolizy nasila utylizację glukozy, przez co pośrednio zmniejsza napływ glukozy do osocza. Insulina obniża również aktywność glukozo-6-fosfatazy, enzymu występującego w wątrobie, lecz nieobecnego w mięśniach. Ponieważ glukozo-6-fosfo ran nie jest w stanie przejść przez barierę błony plazmatyczaej, dochodzi, w wyniku hamującego działania insuliny na glukozo-6-fo sfatazę, do zatrzymania glukozy w obrębie komórek wątrobowych. Insulina pobudza lipogeneze w tkance tłuszczowej 1) dostarczając acetylo-CoA i NADPH niezbędnych do syntezy kwasów tłuszczowych, 2) podtrzymując normalną aktywność karboksylazy acetylo-CoA katalizującej konwersję acetylo-CoA do malonylo-CoA oraz 3) dostarczając glicerolu niezbędnego do syntezy triglicerydów. W niedoborze insuliny aktywność wszystkich wymienionych enzymów jest obniżona, przez co spada nasilenie lipogenezy. Inną przyczyną obniżonej lipogenezy w stanach niedoboru insuliny są wolne kwasy tłuszczowe uwalniane w dużych ilościach przez kilka hormonów, normalnie blokowanych przez insulinę. Wzrost stężenia wolnych kwasów tłuszczowych jest przyczyną hamowania ich własnej syntezy mechanizmem sprzężenia zwrotnego (poprzez hamowanie karboksylazy acetylo-CoA). Efekt netto insuliny na tkankę tłuszczową ma więc charakter anaboliczny. Wpływ insuliny na utylizację glukozy obejmuje jeszcze inny proces anaboliczny. W wątrobie i mięśniach szkieletowych insulina pobudza konwersję glukozy do glukozo-6-fosforanu, ulegającego z kolei izomeryzacji do glukozo-t-fosforanu i wbudowaniu do glikogenu przez syntazę glikogenową. Ta ostatnia jest aktywowana przez insulinę. Ten wpływ insuliny jest pośredni i ma dwoisty charakter. Insulina obniża śródkomórkowe stężenie cAMP aktywując

680 / ROZDZIAŁ 52

fosfodiesterazę. Ponieważ cAMP-zależna fosforylacja powoduje inaktywację syntazy glikogenowej, małe stężenia wymienionego nukleotydu sprawiają, że enzym ten występuje w postaci aktywnej. Insulina aktywuje również fosfatazę katalizującą defosforylację syntazy glikogenowej, przez co dochodzi do aktywacji tego enzymu. W końcu insulina hamuje fosforylazę za pośrednictwem mechanizmu opisanego wyżej, a realizowanego przy udziale cAMP i fosfatazy. W wyniku tego procesu dochodzi do spadku uwalniania glukozy z glikogenu. Efekt netto działania insuliny na przemianę glikogenową ma więc charakter anaboliczny.

Wpływ insuliny na produkcję glukozy (glukoneogenezę). Wpływ insuliny na

transport glukozy, glikolizę i glikogenogenezę realizowany jest w ciągu sekund lub minut, ponieważ polega na aktywacji lub inaktywacji enzymów drogą ich fosforylacji lub defosforyłacji. Dłużej trwający wpływ na glikemię wywiera insulina poprzez hamowanie glukoneogenezy. W procesie tworzenia glukozy z prekursorów nieweglowodanowych uczestniczą: enzymy pobudzane przez glukagon (działający za pośrednictwem cAMP), hormony glukokortykosteroidowe oraz, w mniejszym stopniu, związki ai p-adrenergiczne, angiotensyna II i wazopresyna. Insulina działa hamująco na enzymy stymulowane przez glukagon. Głównym enzymem glukoneogenetycznym jest karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa (PEPCK) przekształcająca szczawiooctan w fosfoenolopirogronian. Nowsze badania wykazały, że insulina zmniejsza stężenie tego enzymu, wybiórczo hamując transkrypcję mRNA kodującego PEPCK (patrz niżej).- s

Wpływ na przemianę glukozy. Skut-

kiem wszystkich wyżej wymienionych działań insuliny jest spadek stężenia glukozy we krwi. W tym działaniu insulina samotnie przeciwdziała wielu hormonom, wykazującym działanie hiperglikemiczne. Działanie tych hormonów jest niewątpliwie wyrazem bardzo ważnego mechanizmu wyrównawczego, umożliwiającego uniknięcie potencjalnie śmiertelnych skutków działania długotrwałej hipoglikemii na mózg.

Wpływ na przemianę tłuszczową.

Działanie lip o genetyczne insuliny przedyskutowano przy omawianiu wpływu tego hormonu na utyiizację glukozy. Insulina jest również potężnym inhibitorem lipolizy w wątrobie i tkance tłuszczowej, przez co wykazuje również pośrednio działanie anaboliczne. Działanie to

jest częściowo wynikiem hamującego działania insuliny na powstawanie cAMP w tkankach (stężenie tego nukleotydu w tych tkankach podwyższają glukagon i adrenalina) oraz na aktywność lipazy wrażliwej na działanie hormonów nasilających lipolizę. Ten hamujący wpływ spowodowany jest prawdopodobnie aktywacją fosfatazy powodującej defosforylacje, i tym samym inaktywacje lipazy lub kinazy białek cAMP-zależnej. Dlatego też insulina zmniejsza stężenie wolnych kwasów tłuszczowych we krwi krążącej. To działanie insuliny pośrednio wpływa również na przemianę węglowodanów, bowiem wolne kwasy tłuszczowe hamują glikolizę na różnych etapach szlaku glikolitycznego oraz pobudzają glukoneogenezę. To wszystko tłumaczy, dlaczego niemożliwe jest omawianie regulacji metabolicznej w kontekście tylko jednego hormonu lub jednego metabolitu. Regulacja jest złożonym procesem, w którym aktywność określonego szlaku metabolicznego jest wynikiem interakcji licznych hormonów i metabolitów. U chorych z niedoborem insuliny wzrasta aktywność lipazy, będąca przyczyną wz/ostu lipolizy i stężenia wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu krwi i w wątrobie. U chorych tych wzrasta również stężenie glukagonu, tj. hormonu pobudzającego uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych. Glukagon działa antagonistycznie w stosunku do insuliny, tak że stan metaboliczny chorego na cukrzyce jest odzwierciedleniem względnych stężeń glukagonu i insuliny. Część wolnych kwasów tłuszczowych ulega metabolizacji do acetylo-CoA (jest to odwrócenie lipogenezy), a następnie do CO2 i wody w cyklu kwasów trikarboksyłowych (w cyklu kwasu cytrynowego). U chorych z niedoborem insuliny proces ten szybko przekracza „pojemność" tego cyklu, przez co acetylo-CoA ulega konwersji do acetoaoetylo-CoA, i kolejno do kwasu acetooctowego i p-hydroksymasłowego. Insulina odwraca ten ostatni proces. Insulina w sposób wyrazisty wpływa na powstawanie i klirens VLDL i LDL. Stężenia tych frakcji fipidowych, a w ich następstwie również stężenie cholesterolu, często ulegają podwyższeniu u chorych z niedostatecznie kontrolowaną cukrzycą, W tym defekcie ma tkwić przyczyna przyspieszonego rozwoju miażdżycy, stanowiącego poważny problem u wielu chorych na cukrzycę. O mechanizmach działania insuliny można sobie wyrobić pogląd, śledząc ryc. 52-10, od-

HORMONY TRZUSTKI I ŹOŁĄDKOWO-JELITOWE / 681

Glukoza

Tłuszcze (tfcanka

tłuszczowa) Glukozo-6-fosforan ^ T. Shunt \ I heKsozo- \ ; -monofosfo- , ! ranowy

""" rrrn

Obecność glukozy w moczu (glikozuria)

Wolne Kwasy tłuszczowe (osocze)

/

ł

<■

"' *S Wzmożona llpollza Wzmożona gllkogenollza

------» Upośledzania glikollzy, syntezy

gllkogenu i utylizacji aoetylo-CoA

T

i

y Fosforan trlozy ■*- Aminokwasy

Fosfoenolopirogronian I i ł PI rogron ian

■■^ Wzmożona glukoneogsneza

I

:awloc

T

r

// Trlacylogllceroi

i

*•*.

Acylo-CoA

AcetyioCoA

Szcza wio octan Cykl kwasu cytrynowego

Ketokwasy (hlperKetonacnia)

Cylrynian Ketokwasy w moczu (keton uria)

a-Ketoglutaran

Amlnolwasy

Bye. 52-10. W ciężkim niedoborze insuliny dochodzi do nasilenia lipolizy. Znajduje to swoje odzwierciedlenie we wzroście stężenia triacytoglicerolu (triglicerydów) we krwi (hiperlipidemia). Małe ilości acetylo-CoA są metabolizowane w cyklu kwasu cytrynowego (cyklu kwasów trikarboksylowych), pozostała zaś część ulega konwersji do ketokwasów wyrażającej się ketonemią i ketonurią. Ponieważ glikoliza jest zahamowana, powstały w wyniku glikogenolizy glukozo-6-fosforan (G-6-P) ulega przekształceniu do gfukozy. Proces ten, wraz ze wzmożoną glukoneogenezą, jest przyczyną hiperglikemii. Wzmożona glukoneogeneza spowodowana jest zwiększonym napływem aminokwasów (pochodzących z katabolizmu białkowego) oraz wzrostem aktywności karboksykinazy fosioenolopirogronianowej (PEPCK), Wszystkie wymienione procesy ulegają odwróceniu pod wpływem insuliny.

zwierciedlającą kierunki zmian kilku krytycznych szlaków metabolicznych uwarunkowanych nieobecnością tego hormonu.

Wpływ na przemianę białek. Insulina

generalnie wykazuje wpływ anaboliczny na przemianę białek pobudzając ich syntezę i hamując degradację. Insulina pobudza pobieranie aminokwasów obojętnych przez mięśnie, przy czym działanie to nie jest sprzężone z pobiera-

niem glukozy, ani też z wbudowywaniem tych aminokwasów do białek. Przyjmuje się, że wpływ insuliny na syntezę białek w mięśniach szkieletowych i w mięśniu sercowym realizowany jest na poziomie translacji mRNA. W ostatnich latach wykazano, że insulina wpływa na syntezę swoistych białek powodując zmiany odpowiednich mRNA. Działanie insuliny, które może ostatecznie tłumaczyć wpływ

682 / ROZDZIAŁ 52

tego hormonu na aktywność lub ilość swoistych białek, jest przedmiotem dyskusji dalszej części tego rozdziału.

Wpływ na podziały komórkowe. In-

sulina pobudza mnożenie się licznych komórek w hodowlach oraz może uczestniczyć w regulacji wzrostu in vivo. W badaniach dotyczących regulacji procesów wzrostowych najczęściej używa się hodowli fibroblastów. W takich komórkach insulina nasila działanie czynnika wzrostowego fibroblastów (FGF), czynnika wzrostowego pochodzenia płytkowego (PDGF), naskórkowego czynnika wzrostowego (EGF), estrów forbolowych pobudzających nowotwory, prostaglandyny F^PGF^), wazoprcsyny i analogów cAM P. pobudzając progresję cyklu komórkowego zatrzymanego w fazie G,. Nowa frapująca dziedzina badań dotyczy aktywności kinazy tyrozynowej. Receptor insulinowy, podobnie jak receptor dla peptydów pobudzających wzrost, w tym również dla

Transpo rt gluKozy

PDGF i EGF, wykazuje aktywność kinazy tyrozynowej. Interesujący jest fakt, że co najmniej 10 produktów onkogenów, spośród których wiele jest podejrzanych o działanie pobudzające podział złośliwych komórek nowotworowych, jest również kinazami tyrozynowymi. Komórki ssaków zawierają analogi tych onkogenów (protoonkogeny), które mogą uczestniczyć w podziale normalnych komórek. Za słusznością takiego poglądu przemawiają niedawne obserwacje, że dodanie PDGF lub komórek z zatrzymaniem wzrostu (uwarunkowanym niedoborem insuliny) do hodowli normalnych komórek nasila ekspresję co najmniej 2 produktów p roto onkogenów, tj. c-fos i c-myc. Działanie insuliny zostało wyjaśnione Działanie insuliny rozpoczyna się z chwilą wiązania się tego hormonu ze swoistym receptorem glikoproteinowym umiejscowionym na powierzchni komórek docelowych. Skutki działania tego hormonu (ryc. 52-11) mogą wystąpić

Insulina

Wzrost i replikac|a komórek

Sygnał (sygnały) przBZ błon owy (przez błonowe) Foaforylaeja — dełostorylacja białek Aktywacja I hamowanie enzymów

Ryc. 52-11. Relacja między receptorem insulinowym a działaniem insuliny. Insulina wiąże się ze swoim receptorem błonowym wyzwalając jeden lub więcej sygnałów przezblonowych. Ten sygnał (lub te sygnały) moduluje (modulują) bardzo różnorodne zjawiska śród kom orkowe.

HORMONY TRZUSTKI I ŻOŁĄDKOWO-JELITOWE / 683

w ciągu sekund lub minut (wpływ insuliny na transport', fosforylację białek, aktywację lub hamowanie enzymów, syntezę RNA) lub po kilku godzinach (synteza białek i DNA, wzrost komórek). B^cejstojLinsulinc-wy przebadano szczegółowo, używając technik biochemicznych i rekombinacji DNA, Jest on heterodimerem złożonym z .dwóchi rjodjednostek. określanych jako a i p, o konfiguracji oti-p^ połączonych ze sobą wiązaniami -dwusiarczkowymi (ryc. 52-12). Obydwie pod jednostki są obficie glikozylowane, zaś odszczepienie od nich kwasu sjalowego i galaktozy zmniejsza wiązanie insuliny i aktywność tego hormonu. K.aida z wymienionych podjednostek glikoproteinowych wykazuje wyjątkową strukturę i czynność. Ppdjednostka cc (o masie cząsteczkowej 135 000) położona jest całkowicie pozakomÓĘkgwjp, ^iaże ona insulinę prawdopodobnie przez domenę bogatą w cysteinę. Podjednos^aJ} (o masie cząsteczkowej 95 000) jest białkiem przezbłonowym, pełniącym drugą ważną funkcję receptora (p. rozdz. 45), tj. przekaźnika sygnału. Część cyloplazmatyczna lej podjcdnostki wykazuje aktywność kinazy tyrozynowej oraz posiada obszar o właściwościach autofosforylujących. Obydwa te obszary uczestniczą w transdukcji sygnału i działaniu insuliny (p. niżej). Na rycinie 52-12 przedLOL

EGF

stawiono uderzające podobieństwa miedzy 3 receptorami wykazującymi różne funkcje. Rzeczywiście kilka obszarów podjednostki p wykazuje homologię w zakresie sekwencji aminokwasowej z receptorem EGF. Receptor insulinowy ulega nieustannej syntezie i degradacji i wykazuje okres półtrwania wynoszący 7—12 h. Receptor jest syntetyzowany w siateczce śródplazmatycznej szorstkiej jako jednołańcuchowy peptyd, po czym ulega szybkiej glikozylacji w aparacie Golgiego. Prekursor ludzkiego receptora insulinowego składa się z 1 382 aminokwasów. Jego masa cząsteczkowa wynosi 190 000. Ulega on rozszczepieniu z wytworzeniem „dojrzałych" podjednostek a i p. Gen kodujący ludzki receptor insulinowy zlokalizowany jest na chromosomie 19. Receptory insulinowe występują na powierzchni większości komórek ssaków, w ilości do 20 000 na jedną komórkę, często również na komórkach, których nie uważa się za typowe komórki docelowe dla tego hormonu. Insulina wywiera wpływ na wiele dobrze poznanych procesów metabolicznych i uczestniczy w procesach wzrostu i rephkacji komórek (patrz wyżej), w organogenezie i różnicowaniu tkanek u płodów oraz w procesach naprawczych i regeneracyjnych. Struktura receptora insulinowego oraz zdolność różnych insulin do wiązania się z recełnsuima NH, NH,

FRAGMENT RECEPTORA POŁOŻONY POZAKOMORKOWO COOH

CYTOPLAZMATYCZNY FRAGMENT RECEPTORA

) O OO H

Ryc. 52-12. Schemat struktury receptorów LDL, EGF i insulinowego. N-koniec każdego z tych receptorów znajduje się w po z a kom orko wo położonej części cząsteczki. Prostokąty oznaczają sekwencje aminokwasowe bogate w cysteinę, wiążące hormon. Każdy receptor posiada krótką domenę (złożoną z ok. 25 aminokwasów) przenikającą błonę plazmatyczną (zaznaczoną jako pole zakreskowane) oraz domenę śródkomórkową o zmiennej długości. Receptor EGF i insulinowy wykazują aktywność kinazy tyrozynowej związanej z domeną cytoplazmatyczną (zaznaczoną kółeczkami) oraz miejsca autofosforyfacji położone w tym obszarze receptora. Receptor insulinowy jest heterodimerem. Jego podjednostki związane są ze sobą przez wiązania dwusiarczkowe (zaznaczone jako kreski poziome), ________________________________________________________________________________

684 / ROZDZIAŁ 52

ptorem i wywołania reakcji biologicznych są praktycznie identyczne we wszystkich komórkach i u wszystkich gatunków zwierząt. Dodać jednak należy, że insulina świńska jest 10—20-krotnie bardziej skuteczna niż proinsulina świńska, zaś ta ostatnia jest 10—20-krotnie bardziej efektywna niż insulina świnki morskiej nawet u tego gatunku zwierząt. Sugeruje to oczywiście bardziej konserwatywny charakter struktury receptora insulinowego niż samej insuliny. W chwili wiązania się insuliny z receptorem zachodzą następujące zjawiska: 1) dochodzi do zmian konformacyjnych receptora, 2) receptory łączą się ze sobą tworząc mikroagregaty, 3) receptor ulega internalizacji oraz 4) wyzwolony zostaje jeden lub kilka sygnałów. Znaczenie zmian konformacyjnych jest nieznane, zaś internalizacja receptora jest zapewne wyrazem działania mechanizmu regulującego stężenie i obrót receptorów. W stanach przebiegających z dużym stężeniem insuliny w osoczu krwi, np. w otyłości lub akromegalii, liczba receptorów insulinowych jest obniżona, zaś tkanki docelowe (tarczowe) są mniej czułe na działanie insuliny. Ten proces zmniejszenia się liczby receptorów (down reguł a ti on) jest spowodowany ich internalizacją, tj. procesem, w którym kompleksy złożone z insuliny i receptora wnikają do komórki na zasadzie endocytozy, pod postacią pęcherzyków pokrytych białkami klatrynowyrai (p. rozdz, 41). Proces „down regulation" częściowo tłumaczy oporność na insulinę występującą w otyłości i cukrzycy typu II. Dotychczas nie oRreślono śródkomórkowego (śródkomórk owych) przekaźnika (przekaźników) działania insuliny Pomimo że mechanizm działania insuliny jest przedmiotem badań od 60 lat, w dalszym ciągu nie wyjaśniono pewnych krytycznych jego elementów, takich jak istoty śródkomórkowego sygnału tego hormonu. Pod tym względem insulina nie jest wyjątkiem, nie zidentyfikowano bowiem również śródkomórk owych pośredników dla wieiu innych hormonów (p. tab. 45-1). Zaproponowano cały szereg różnych cząsteczek jako drugiego przekaźnika działania insuliny. Wśród nich należy wymienić samą insulinę, wapń, cykliczne nukleotydy (cAMP, cGMP), H2O2, peptydy pochodzenia'błonowego, błonowe glikany ibsfoinozytoiowe, jedno wartościowe kationy oraz kinazę tyrozynową (tj. sam

receptor insuliny). Żadna z tych cząsteczek nie wytrzymała rygorów sprawdzających. Aktualnie zainteresowanie koncentruje się na obserwacji, że sam receptor insuliny jest enzymem insulino wrażliwym, ponieważ ulega auto fosfory lacj i w chwili związania się z insuliną. Funkcję fosforylacji przypisuje się podjednostce p, która działa jak kinaza białek przenosząc resztę y-fosforanową ATP na resztę tyrozylową podjednostek p (ryc. 52-12). Insulina zwiększa Vmax tej reakcji enzymatycznej, Fosforylacja tyrozyny jest zjawiskiem niezwykłym w komórkach ssaków (fosfo tyrozyna stanowi zaledwie 0,03% fosforylowanych aminokwasów normalnej komórki) i możliwe, że nie jest to przypadkiem, że receptory EGF, PDGF i IGF-I wykazują również aktywność kinazy tyrozynowej. Uważa się, że aktywność kinazy tyrozynowej stanowi istotny czynnik w działaniu licznych produktów onkogenów wirusowych. Relację tej kinazy tyrozynowej do komórkowych analogów wykazujących podobne właściwości pobudzające wzrost zarówno złośliwych komórek nowotworowych, jak i komórek normalnych omówiono wyżej. W miarę poznawania struktury ujawniono występowanie homologii wysokiego stopnia między receptorami i onkogenami, np. między receptorem EGF a onkogenem erb-B, między receptorem PDGF a onkogenem v-sis oraz między receptorem insulinowym a onkogenem v-ros. Nie udowodniono, by kinaza tyrozynową uczestniczyła w transdukcji sygnału. Jej udział w tym procesie mógłby polegać na fosforylacji swoistego białka rozpoczynającego działanie insuliny, na inicjacji kaskady fosforylacji-defosforylacji, na indukowaniu zmiany niektórych właściwości błony komórkowej lub na tworzeniu produktu związanego z błoną komórkową, np. glikanu fosfoinozytolowego. Reakcje fosforylacji i defosforylacji białek uczestniczą w niektórych działaniach insuliny Wieie skutków metabolicznych insuliny, szczególnie te, które następują szybko, są wynikiem reakcji fosforylacji i defosforylacji białek, zmieniających z kolei aktywność enzymatyczną tych ostatnich. Listę enzymów podlegających takim reakcjom przedstawia tab. 52-3. W niektórych przypadkach insulina zmniejsza stężenie środkom orkowe cAMP (aktywując fosfodiesterazę cAMP), w wyniku czego zmniejsza się aktywność cAMP-zależnej kinazy białek.

HORMONY TRZUSTKI ! ZOŁĄDKOWO-JELITOWE / 686 Tabela 52-3. Enzymy, których stopień fosforylacji i aktywności utega zmianie pod wpływem insuliny* Enzym Zmiana aktywności Możliwy mechanizm Przemiana cAMP F osłod testera za {niska wartość K ) Kinaza białek (cAMP-zalezna)

Wzrost Spadek

Fosforylacja Sprzężenie receptora z podjednostkami C

Syntaza glikogenowa

Wzrost

Defosforylacja

Kinaza fosforylazowa

Spadek

Defosforylacja

Fosfory laza

Spadek

Defosforylacja

Dehydrogenaza pirogronianowa Kinaza pirogronianowa

Wzrost Wzrost

Defosforylacja Defosforylacja

6-Fosfofrukto-2-kinaza Fru ktozo - 2,6 - b isf osf ata za

Wzrost Spadek

Defosforytacja Defosforylacja

Ka r b oksy) aza acety 1 o - C o A

Wzrost

Fosforylacja

Reduktaza hydroksy mety logi uta ryf o- CoA

Wzrost

Defosforylacja

Lipaza triacylogticerolowa

Spadek

Defosforylacja

Przemiana glikogenu

Glikoliza i glukoneogeneza

Przemiana lipidowa

Inne Kineza tyrozyn owa (receptor insulinowy)

Fosforylacja

* Według Denton R.M. i współ.: Apartial viewof themechanism of insulin action; Diabetologia 1981, 21, 347, w modyfikacji autora rozdziału, za pozwoleniem.

Przykładami takiego działania są syntaza glikogenowa i fosforylaza. W innych przypadkach działanie insuliny jest niezależne od cAMP i polega na aktywacji (jak w przypadku receptora insulinowego, w którym insulina aktywuje kinaze tyrozynową stanowiącą część łańcucha P tego receptora) lub hamowaniu innych kinaz białek (p. tab. 45-5), lub też, co zdarza się częściej, na stymulacji fosfataz fosfoprotein. Defosforylacja zwiększa aktywność licznych enzymów kluczowych (tab. 52-3). Te modyfikacje kowaiencyjne umożliwiają prawie natychmiastowe zmiany aktywności enzymów. Insulina wpływa na proces translacji mRIMA Wiadomo, że insulina wpływa na aktywność lub ilość co najmniej 50 białek występujących w różnych tkankach, przy czym wiele jej efektów jest wynikiem modyfikacji kowalencyjnej

struktury tych białek. Insulinie przypisuje się również rolę w procesie translacji mRNA, głównie na podstawie wyników badań nad rybo somalnym białkiem S6 stanowiącym składową rybosomalnej podjednostki 40S. Taki mechanizm działania dotyczy wpływu insuliny na syntezę białek w wątrobie, mięśniach szkieletowych i w mięśniu sercowym. Ważnym działaniem insuliny jest jej wpływ na ekspresję genów Dotychczas omawiane przykłady działania insuliny zachodzą w błonie plazmatycznej lub w cytopiaztnie. Insulina wpływa także na swoiste procesy w jądrach komórkowych, przypuszczalnie za pośrednictwem śród komórkowego mediatora. Enzym — karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa (PEPCK) katalizuje główny etap glukoneogenezy decydujący o tempie tego procesu. Insulina hamuje syntezę PEPCK i, co

686 / ROZDZIAŁ 52

za tym idzie, również glukoneogeneze. Nowsze badania wykazały, że tempo transkrypcji genu PEPCK zmniejsza się w ciągu kilku minut po dodaniu insuliny do hodowli komórek wątrobiaka(ryc. 52-13). Hamowanie 0.5 procesu trans3,0

100

Tabela 52-4. Informacyjne RNA regufowane przez insulinę Enzymy śród komórkowe A m i n ot ra n sf e ra za tyrozynowa* Karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa* Syntaza kwasów tłuszczowych Kinaza pirogronianowa* Dehydrogenaza glicerolo-3-fosf ora nowa* Detiydrogenaza 1 -gliceraldehydowa* Glukokinaza Białka sekrecyjrte i enzymy Albuminy* Adypsyna* Amylaza* a^-Globułina Hormon wzrostu* Białka uczestniczące w reprodukcji Albumina jaja kurzego Kazeina*

1.0 1.5 2.0 2.5 Czas po dodaniu Insuliny (h)

Ryc. 52-13. Wptyw insuliny na transkrypcję swoistych genów. Dodanie insuliny do hodowli komórek wątrobiaka H411E powoduje szybki spadek tempa transkrypcji genu PEPCK, W wyniku takiego działania stwierdza sie spadek ilości pierwotnego transkryptu w jądrze komórkowym oraz dojrzałego mRNA kodującego PEPCK, Tempo syntezy PEPCK spada po obniżeniu się ilości cyloplazmatycznego mRNA kodującego PEPCK. (Według Sasaki K. i wsp.: Multihormonal regulation of phosphoenolpyruwate carboxykinase gene transcription; J. Biol. Chern. 1984, 259, 15242, za pozwoleniem).

krypcji jest przyczyn£Vpadku ilości pierwotnego transkryptu oraz dojrzałego mRNA kodującego PEPCK (mRNAPEPCK), co w następstwie prowadzi do zmniejszonego tempa syntezy PEPCK. To działanie insuliny zachodzi przy fizjologicznych stężeniach tego hormonu w surowicy (10~12 do 10~9 mol/l). Pośredniczy w nim receptor insulinowy. Działanie to wydaje się być spowodowane zmniejszonym nasileniem inicjacji transkrypcji mRNAPEPCK. Pomimo że badania nad regulacją syntezy PEPCK byty pierwszymi, w których udowodniono wpływ insuliny na proces transkrypcji genu, nie są one już jedynymi tego rodzaju. Rzeczywiście wydaje się, że jeden z ważniejszych mechanizmów działania insuliny polega na regulacji syntezy mRNA, Insulina wpływa na wiele swoistych mRNA, choć wiele mRNA będących pod wpływem tego hormonu a wy-

Białka strukturalne 8-Krystalina Inne białka Wątroby (g33, itd.) Tkanki tłuszczowej Mięśnia sercowego Mięśni szkieletowych * Insulina reguluje tempo transkrypcji swoistych mRNA,

stepujących w wątrobie, tkance tłuszczowej, mięśniach szkieletowych i w mięśniu sercowym, nie zostało jeszcze zidentyfikowanych (tab. 52-4). W kilku przypadkach wiadomo, że hormon ten wpływa na transkrypcję genu. Insulina wpływa na syntezę: 1) enzymów nie opuszczających komórek, 2) enzymów i białek wydzielanych przez komórkę oraz 3) białek strukturalnych (tab, 52-4). Wymienione skutki działania insuliny występują w licznych narządach i tkankach oraz u wielu gatunków zwierząt. W chwili obecnej wpływ insuliny na regulację transkrypcji swoistych mRNA jest dobrze udokumentowany. Znaczenie tego mechanizmu działania insuliny modulującego aktywność enzymów jest równoważne działaniu tego hormonu mechanizmem fosforylacji/defosforylacji. Wpływ insuliny na proces transkrypcji genu można tłumaczyć jej działaniem na embriogenezę oraz różnicowanie, wzrost i replikację komórek.

HORMONY TRZUSTKI I ŻOŁĄDKOWO-JELITOWE / 687

Rola patofizjofogiczna insuliny jest najbardziej wyrażona w cukrzycy Niedobór insuliny lub oporność na działanie tego hormonu są przyczyną cukrzycy. Około 90% chorych na cukrzycę cierpi na cukrzycę insulinoniezależną (typ H) (non-insulin dependent diabetes metlitus — NIDDM). U pozostałych 10% stwierdza się cukrzycę insulinozależną (typ I) (insulin dependent diabetes mellitus — IDDM). Omówione wyżej zaburzenia metaboliczne dotyczą głównie cukrzycy typu I. Określone, rzadkie sytuacje ilustrują istotne cechy działania insuliny. Nieliczni chorzy wytwarzają przeciwciała skierowane przeciwko własnym receptorom insulinowym. Przeciwciała te uniemożliwiają wiązanie się insuliny ze swoim receptorem, co sprawia że u takich chorych rozwija się zespół ciężkiej oporności na insulinę (p. tab. 44-2), Guzy wywodzące się z komórek B wysp Langerhansa są przyczyną hiperinsulinizrnu oraz zespołu charakteryzującego się ciężką hipoglikemią. Rola insuliny (a może również IGF-I lub IGF-II) w organogenezie i rozwoju jest widoczna na przykładzie rzadkich przypadków leprechaunizmu (krasnoludkowatuści). Zespół ten charakteryzuje się małą masą urodzeniową, zmniejszoną masą mięśniową i zmniejszoną podskórną tkanką tłuszczową, twarzą elfową oraz opornością na insulinę przy występowaniu znacznie podwyższonych stężeń biologicznie aktywnego hormonu w osoczu. Dzieci takie umierają we wczesnym dzieciństwie. Wiele osób dotkniętych leprechaunizmem wykazuje brak receptorów in-

sulinowych lub obecność receptorów uszkodzonych.

CZYNNIKI WZROSTOWE INSULINOPODOBNE (IGF-I I IGF-II) NIE SĄ HORMONAMI TRZUSTKOWYMI, LECZ WYKAZUJĄ PODOBIEŃSTWO STRUKTURALNE I CZYNNOŚCIOWE DO INSULINY Trudno oddzielić wpływ insuliny na wzrost i podziały komórkowe od podobnych efektów IGF-I i IGF-II. Rzeczywiście może występować interakcja insuliny z wymienionymi czynnikami wzrostowymi w tych procesach. O strukturalnym podobieństwie wymienionych białek wspomniano już wyżej (p. ryc. 52-5). Bardziej szczegółowe porównanie tych hormonów przedstawia tab. 52-5. IGF-I i IGF-II są peptydami jedtiołańcuchowymi złożonymi z 70 (IGF-I) lub 67 (IGF-II) aminokwasów. Istnieje 62 procentowa homologia pomiędzy IGF-I i IGF-II, zaś 50% reszt aminokwasowych zawartych w tych hormonach jest identycznych z insuliną. Cząsteczki te mają wyjątkowe domeny antygenowe. Regulacja sekrecji tych hormonów jest różna (tab. 52-5). Insulina jest hormonem silniej oddziałującym na metabolizm, zaś czynniki wzrostowe insulinopodobne bardziej pobudzają wzrost. Każdy hormon posiada swoisty dla niego receptor. Receptor dla IGF-I, podobnie jak receptor insulinowy, jest heterodimerem o strukturze a 2 -P 2 i jest kinazą tyrozynową.

Tabela 52-5. Porównanie insuliny z czynnikami wzrostowymi insuiinopodobnymi (dzięki uprzejmości C.R. Kahn) Insulina Inne nazwy

Liczba aminokwasów Miejsce produkcji

IGF-I

—

Somatomedyna C

51

70 Wątroba i inne tkanki

Komórki B wysp trzustkowych

IGF-łl Czynnik stymulujący aktywność mnożenia się komórek (MSA) 67

Różne tkanki

Regulacja stężenia we krwi przez

Glukozę

Hormon wzrostu, stan odżywiania

Nieznany czynnik

Stężenie w osoczu

0,3-2 ng/ml

Rząd wielkości ng/ml

Rząd wielkości ng/ml

Białka wiążące w osoczu Główna rola fizjologiczna

Nieobecne Kontrola przemiany materii

Obecne Wzrost kości i chrząstek

Obecne Nieznana (może uczestniczy w rozwoju zarodka)

688 / ROZDZIAŁ 52

W odróżnieniu od receptora dla IGF-I, receptor dla IGF-II jest polipeptydem jednołańcuchowym o masie cząsteczkowej 260 000 i nie jest kinazą tyrozynową. Jest on bardzo podobny, jeżeli nie identyczny, z receptorem dia mannozo-6-fbsforanu. Występuje pewne krzyżowe wiązanie między wymienionymi hormonami i ich receptorami, co sprawia, że jeden hormon wykazuje pewną aktywność biologiczną również drugiego hormonu (tab. 52-6). Ogólnie mówiąc, aktywność pobudzająca wzrost wymienionych hormonów koreluje najlepiej z wielkością ich powinowactwa do receptorów IGF-I lub IGF-II. Tabela 52-6. Powinowactwo insuliny, IGF-I i IGF-II do różnych receptorów Hormon

Receptor insulinowy

IGF-I

IGF-II

Insulina

Duże

Małe

Prawie żadne

IGF-I

Umiarkowane

Duże

Umiarkowane

IGF-II

Prawie żadne

Małe

Duże

GLUKAGON JEST ANTAGONISTĄ INSULINY Po podaniu pierwszych handlowo dostępnych preparatów insulinowych obserwowano najpierw wzrost giikeaui a dopiero potem jej spadek. Zwiększenie glikemii było spowodowane zanieczyszczeniem tych preparatów glukagonem. Był on drugim hormonem odkrytym w komórkach wysp trzustkowych. Glukagon jest również syntetyzowany pod postacią cząsteczki prekursorowej Glukagon jest syntetyzowany głównie przez komórki A wysp trzustkowych. Jest on polipeptydem jednołań cuch owym (o masie cząsteczkowej 3485) złożonym z 29 aminokwasów (ryc. 52-E4). Glukagon jest produkowany pod postacią znacznie większej cząsteczki prekursorowej o masie cząsteczkowej 9000. Wyizolowano również cząsteczki większe, lecz nie ustalono, czy są one rzeczywistymi prekursorami glukagonu, czy też peptydami blisko z nim spokrewnionymi. Zaledwie 30-40% występującego

w osoczu „glukagonu" immunoreaktywnego jest glukagonem trzustkowym. Pozostałą ilość stanowią cząsteczki większe, biologicznie nieaktywne. Glukagon trzustkowy ma pewne wspólne właściwości immunologiczne i fizjologiczne z enteroglukagonem — peptydem wyekstrahowanym z błony śluzowej dwunastnicy. 14 z 27 reszt aminokwasowych sekretyny jest identycznych z glukagonem. Glukagon krąży w osoczu w postaci wolnej. Ponieważ nie wiąże się z białkami transportowymi, jego okres półtrwania jest krótki (wynosi ok. 5 min). Glukagon ulega inaktywacji w wątrobie zawierającej enzym odszczepiający pierwsze dwa N-końcowe aminokwasy między Ser2 i Gin3. Ponieważ wątroba jest pierwszym narządem, do którego dociera glukagon po jego wydzielaniu i w którym hormon ten ulega inaktywacji, stężenie jego we krwi wrotnej jest znacznie wyższe niż w krążeniu obwodowym. Glukoza hamuje wydzielanie glukagonu. Ten fakt podkreśla przeciwstawne role metaboliczne' insuliny i glukagonu Nie jest jasne, czy glukoza hamuje bezpośrednio sekrecje glukagonu, czy też pośrednikami takiego działania są insulina lub IGF-I. Te ostatnie dwa hormony hamują bezpośrednio wydzielanie glukagonu. Na sekrecję glukagonu wpływa wiele innych substancji, takich jak aminokwasy, kwasy tłuszczowe i związki ketonowe, hormony przewodu pokarmowego oraz neuroprzekaźniki. Działanie ogólne glukagonu jest przeciwstawne do działania insuliny O ile insulina sprzyja magazynowaniu energii, pobudzając glikogenogenezę, lipogenezę i syntezę białek, o tyle glukagon powoduje szybką mobilizację potencjalnych źródeł energetycznych, tj. glikogenolizę i lipolizę. Glukagon jest również hormonem najsilniej pobudzającym glukoneogenezę i ma działanie ketogenne. Wątroba jest najważniejszym narządem docelowym glukagonu. Glukagon wiąże się ze swoistymi receptorami błony plazm a ty cznej hepatocytów, aktywując cyklazę adenylanową. Powstały cAMP, aktywując fosforylazę, nasila tempo rozpadu glikogenu, równocześnie zaś hamuje syntazę glikogenową, i co za tym idzie, powstawanie glikogenu (p. rozdz. 45). To dzia-

HORMONY TRZUSTKI I ŻOŁĄDKOWO-JELITOWE / 689

lanie wykazuje pewną swoistość hormonalną i tkankową. I tak glukagon nie wywiera żadnego wpływu na glikogenolizę w mięśniach, podczas gdy adrenalina jest pod tym względem aktywna zarówno w mięśniach, jak i w wątrobie. Zwiększone stężenie cAMP w komórkach wątrobowych pobudza konwersję aminokwasów w glukozę indukując syntezę licznych enzymów szlaku glukoneogenetycznego. Głównym enzymem tego 'szlaku jest PEPCK. Glukagon, za pośrednictwem cAMP, zwiększa tempo transkrypcji mRNA genu kodującego PEPCK, i tym samym syntezę PEPCK. Jest to działanie Tabela 52-7. Indukcja lufa represja enzymów przez insulinę lub glukagon* Indukcja enzymów przez wysoki iloraz insulino -glukagonowy (l/G) oraz ich represja przez niski iloraz I/G Glukokinaza Enzym rozszczepiający cytrynian Karboksylaza acetylo-CoA Reduktaza HMG-CoA Kinaza pirogronianowa 6-Fosfofrukto-1 -kinaza 6-Fqsfo1rukto-2-kinaza (fruktozo-2,6-bisfos1ataza) Indukcja enzymów przez niski iloraz l/G i ich represja przez wysoki iloraz l/G Glukozo-6-fosfataza Karboksykinaza fosioenolopirogronianowa (PEPCK) Fruktozo-1,6-bisfosfataza * Według: Karam J, H., Salber P. R., Forsham P. H.: Pancreatic hormones and diabetic mellitus; w: Basie and Ctinical Endocrino/ogy. Wyd. II, pod redakcją Greenspan F. S., Forsham P. H., Appleton and Lange, 1986, w niewielkiej modyfikacji, za pozwoleniem.

diametralnie różne od insuliny, która hamuje transkrypcję genu kodującego PEPCK. Inne przykłady przedstawione są w tab. 52-7. Skutkiem działania glukagonu w wątrobie jest zwiększone wytwarzanie glukozy. Ponieważ większość powstałej glukozy opuszcza wątrobę, w osoczu krwi stwierdza się wzrost stężenia tego cukru po podaniu glukagonu. Glukagon jest silnym czynnikiem lipolitycznym. Podwyższa on stężenie cAMP w adypocytach, przez co aktywuje lipazę wrażliwą na działanie hormonów. Uwolnione pod wpływem lipazy kwasy tłuszczowe mogą zostać przekształcone do związków ketonowych, tj. acetooctanu i p-hydroksymaślanu. Jest to ważny aspekt przemiany materii u chorych na cukrzycę, ponieważ stężenia glukacgnu w osoczu krwi są zawsze podwyższone w stanach niedoboru insuliny. SOMATOSTATYNA HAMUJE WYDZIELANIE HORMONU WZROSTU (GH) Somatostatyna została po raz pierwszy wyizolowana z pod wzgórza jako czynnik hamujący sekrecję hormonu wzrostu. Jest to cykliczny peptyd syntetyzowany w komórkach D wysp trzustkowych pod postacią dużego prohormonu o masie cząsteczkowej 11 500. Tempo transkrypcji genu prosomatostatynowego znacznie się zwiększa pod wpływem cAMP. Prohormon ulega najpierw przekształceniu do peptydu złożonego z 28 aminokwasów, a następnie do cząsteczki o masie cząsteczkowej 1640 składającej się z 14 aminokwasów (ryc. 52-14). Wszystkie postacie prekursorowe somatostatyny wykazują aktywność biologiczną.

]

aiukaoon

10

NHj-His-Ser-Gbi-Gly-Trir — Phe— Thr-Ser-Asp-Tyr — 1 1

»

Ser — Lys — Tyr — Leu — Asp — Ser — Arg — Ang — Ala — Gin — 81

23

Asp — Phe — Val — Gtn — Trp — Leu — Met — Asn — Thr — COOH

1

Somatostatyna

ID

NH2— Ala — Gly — Cys— Lys— Asn — Phe— Phe— Trp — tys — Thr11

14

Phe - Thr - Ser - Cys - COOH Ryc. S2-14. Sekwencje aminokwasowe glukagonu i somatostatyny. 44 — Bi ochemia

690 / ROZDZIAŁ 52

Oprócz podwzgórza i wysp trzustkowych somatostatyna występuje w licznych tkankach przewodu pokarmowego (gdzie przypuszczalnie spełnia różnorodne funkcje) oraz w licznych obszarach ośrodkowego układu nerwowego, gdzie może być neuroprzekaźnikiem. Somatostatyna hamuje wydzielanie innych hormonów wysp trzustkowych dzięki działaniu parakrynnemu. Hormon ten, podany w dawkach farmakologicznych wyraźnie zmniejsza nasilenie ketozy indukowanej niedoborem insuliny. Zjawisko spowodowane jest zapewne blokowaniem przez somatostatynę sekrecji glukagonu, towarzyszącej insulinopenii. Hormon ten zmniejsza również napływ substancji odżywczych do tkanek: a) opóźniając opróżnianie się żołądka, 2) zmniejszając sekrecję gastryny i tym samym również kwasu solnego, 3) zmniejszając wydzielanie przez trzustkę enzymów trawiennych, 4) obniżając perfuzję naczyń trzewnych oraz 5) zwalniając absorpcję glukozy w przewodzie pokarmowym. Mało jest informacji na temat biochemicznego i molekularnego działania tego hormonu. NIEZNANA JEST CZYNNOŚĆ POLIPEPTYDU TRZUSTKOWEGO Polipeptyd trzustkowy o masie cząsteczkowej ok, 4200 składa się z 36 aminokwasów. Niedawno stwierdzono, że jest wytwarzany przez komórki F wysp trzustkowych. U człowieka sekrecję tego hormonu pobudzają posiłek białkowy, głodzenie, aktywność fizyczna oraz ostra hipoglikemia, natomiast hamują ją somatostatyna i glukoza podana dożylnie. Czynność polipeptydu trzustkowego jest nieznana, choć sugeruje się, że hormon ten wpływa na zawartość glikogenu w wątrobie i sekrecję soków żołądkowo-jelitowych. HORMONY ZOŁĄDKOWO-JELITOWE Rozwój endokrynologii, jako samodzielnej dyscypliny naukowej, rozpoczął się od wykrycia hormonu zołądkowo-jelitowego W roku 1902 Bayliss i Starling, perfundując odnerwioną pętlę jelita czczego psa kwasem solnym, zaobserwowali wzrost wydzielania soku trzustkowego. Podobnego zjawiska nie stwierdzili po dożylnym podaniu kwasu sol-

nego, natomiast obserwowali go po dożylnym podaniu wyciągu uzyskanego z błony śluzowej jelitowej. Badacze ci przypuszczali, że „sekretyna" uwalniana pod wpływem jakiegoś bodźca z błony śluzowej górnego odcinka jelit dostaje się drogą krwi do trzustki, gdzie pobudza czynność egzokrynną tego gruczołu. Bayliss i Starling byli pierwszymi badaczami, którzy użyli określenia „hormon", zaś sekretyna była pierwszym hormonem, którego czynność została zidentyfikowana. Pomimo że czynność sekretyny poznano już w 1902 r., potrzeba było dalszych 60 lat dla określenia struktury chemicznej tego hormonu. Przyczyna takiego stanu rzeczy jest obecnie znana: mianowicie rodziny blisko ze sobą spokrewnionych peptydów żołądkowo-jelitowych wykazują znaczne podobieństwa strukturalne i czynnościowe i większość tych peptydów występuje pod licznymi postaciami. Wśród ważniejszych hormonów żołądkowo-jelitowych tylko sekretyna występuje w jednej postaci. Występowanie wielu postaci molekularnych peptydów żołądkowo-jelitowych zarówno w tkankach przewodu pokarmowego*, jak i we krwi krążącej stało na przeszkodzie w ustaleniu liczby i struktury tych cząsteczek. Przy rozwiązywaniu tych trudności pomocna była koncepcja o występowaniu prekursorów hormonalnych. Wykazano, że heterogenność poszczególnych postaci określonego hormonu zależy od tkanki, w której zachodzi synteza hormonu. Wprowadzone niedawno techniki izolacyjne okazały się pomocne przy określaniu różnic między poszczególnymi prekursorami jednego i tego samego hormonu. Hormony zołądkowo-jelito we wykazują kilka szczególnych cech Z tkanek przewodu pokarmowego wyizolowano więcej niż tuzin peptydów wykazujących wyjątkowe działanie (tab. 52-8). Szczególną cechą tej grupy hormonów jest to, że wiele z nich spełnia kryteria klasycznych hormonów, podczas gdy inne wykazują działania parakrynne lub działają jako neuroprzekaźniki lub neuromodulatory. Inną szczególną cechą hormonów żołądkowo-jelitowych jest to, że nie są one wytwarzane w jednym konkretnym gruczole, jak klasyczne hormony, lecz przez liczne komórki rozrzucone w całym przewodzie pokarmowym. Jest to widoczne w tab. 52-8. Ponieważ liczne hormony żołądkowo-jelito-

HORMONY TRZUSTKI I 2OŁĄDKOWO-JELITOWE / 691 Tabela 52-8- Hormony żołądkowo-jelitowe Hormon Miejsce syntezy

Główne działania

Gastryna

Antrum żołądka, dwunast- Stymulacja sekrecji kwasu solnego i pepsyny nica

Cholecystokinina (CCK)

Dwunastnica, jelito czcze

Sekrety na

Dwunastnica, jełito czcze

Stymulacja sekrecji amylazy trzustkowej Stymulacja sekrecji wodorowęglanów z sokiem trzustkowym Wzmaga sekrecję insuliny, indukowaną bodźcem glukozowym, hamuje wydzielanie soku żołądkowego

Żołądkowy peptyd harnu- Jelito cienkie iący (GIP) Wazoaktywny peptyd jeli- Trzustka towy (VIP)

Rozkurcz mięśni gładkich, pobudza wydzielanie wodorowęglanów z sokiem trzustkowym

Motyli na

Zapoczątkowuje aktywność motoryczną jelit pomiędzy okresami trawiennymi

Jelito cienkie

Żołądek, dwunastnica, trzu- Liczne efekty hamujące stka Hamuje wydzielanie wodorowęglanów i białka Polipeptyd trzustkowy (PP) Trzustka z sokiem trzustkowym Somatostatyna

Enkefaliny

Żołądek, dwunastnica, pę- Efekty opioidowopodobne cherzyk żółciowy

Substancja P Cały przewód pokarmowy Immunoreaktywność bom- Żołądek, dwunastnica bezynopodobna (BLI)

Działanie fizjologiczne jest niepewne

Neurcjtensyna Enteroglukagon

Działanie fizjologiczne jest nieznane Działanie fizjologiczne jest nieznane

Jelito kręte Trzustka, jelito cienkie

Pobudza wydzielanie gastryny i CCK

we występują w nerwach unerwiających tkanki przewodu pokarmowego, nie jest zaskoczeniem, że większość z nich występuje również w ośrodkowym układzie nerwowym.

wspólną cechą tych ostatnich hormonów jest bardzo krótki okres ich trwania, co sugeruje, że nie odgrywają one roli fizjologicznej w osoczu krwi.

Istnieją „rodziny" hormonów żołądkowo-jelitowych Uwzględniając sekwencję aminokwas owa. oraz podobieństwa czynnościowe, liczne hormony żołądkowo-jelitowe można zakwalifikować do jednej z niżej podanych dwóch „rodzin". Pierwsza z nich — rodzina gastrynowa — obejmuje gastrynę i CCK, zaś druga — rodzina sekretynowa — sekretynę, glukagon, GIP, VIP i glicentynę (ta ostatnia wykazuje działanie podobne do glukagonu, choć jest odmiennym peptydem). Neurokrynne peptydy — neurotensyna, peptydy podobne do bombezyny, substancja P i somatostatyna — nie wykazują podobieństwa strukturalnego do żadnego z hormonów żołądkowo-jelitowych, W końcu inną

Względnie mało wiadomo o mechanizmie działania hormonów żołądkowo-jelitowych Dane o mechanizmie działania peptydowych hormonów żołądkowo-jelitowych ukazały się znacznie później niż innych hormonów. Było to niewątpliwie spowodowane potrzebą skatalogowania i określenia fizjologicznego działania tych hormonów. Godnym uwagi wyjątkiem od powyższego stwierdzenia jest hormonalna regulacja sekrecji enzymów przez komórki główne pęcherzyków trzustkowych. Zidentyfikowano 6 różnych klas receptorów w komórkach pęcherzyków trzustkowych. Są nimi receptory dla: 1) muskarynowych związków cholinergicznych, 2) hormonów rodziny

692 / ROZDZIAŁ 52

gastrynowo-cholecystokininowej, 3) bombezyny i pokrewnych peptydów, 4) hormonów rodziny fizaleminowej i substancji P, 5) sekretyny i VIP oraz 6) toksyny przecinkowca cholery. Hormony receptorów klasy 1—4 działają za pośrednictwem mechanizmu wapniowo-fosfoinozytydowego, zaś hormony klasy 5 i 6 — za pośrednictwem cAMP.

PIŚMIENNICTWO Cohen P: The role of protein phosphorylation in neural and hormonal control of oellular activity. Naturę 1982;296:613.

Docherty K, Steiner D: Post-translational proteolysis in polypeptide hormone biosynthesis. Anrtu Rev Physiol 1982;44:625. Granner DK, Andreone T: Insulin modulation of gene expression. In: Diabetes and Metabolism Reviews. Vol I, DeFronzo R (editor). Wiley, 1985. Kahn CR: The molecular mechanism of insulin action. Annu Rev Med 1985;36:429. Kono T: Action of insulin on glucose transport and cAMP phosphodiesterase in fat cells: Involvement of two distinct molecular mechanisms. Recent Próg Horm Res 1983;30:519. Ullrich A et al: Human insulin receptor and its relationship to the tyrosine kinase family of oncogenes. Naturę ]985;313:756. Unger RH, Orct L: Glucagon and the A celi. (2 parts.) N EnglJMed 1981;3O4:1518,1975.

.

CZĘŚĆ VI Zagadnienia wybrane Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w wodzie

Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Witaminy są organicznymi środkami odżywczymi niezbędnymi w małych ilościach do różnorodnych funkcji biochemicznych. W zasadzie związki te nie są syntetyzowane przez ustrój i dlatego muszą być dostarczanez pożywieniem. Pierwszymi odkrytymi witaminami byty rozpuszczalna w tłuszczach witamina A oraz rozpuszczalna w wodzie witamina B. W miarę poznawania następnych witamin okazało się, że są one rozpuszczalne albo w wodzie, albo w tłuszczach. Ta właściwość (rozpuszczalność w wodzie 1ub w tłuszczach) stała się podstawą klasyfikacji witamin. Wszystkie witaminy rozpuszczalne w wodzie należą (z wyjątkiem witaminy C) do grupy witaminy B. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach, wykryte później niż witamina A, oznaczono dalszymi literami alfabetu (np. witamina D, E, K). Oprócz wspólnej cechy fizycznej, tj. rozpuszczalności w wodzie, witaminy tej grupy mają bardzo mało wspólnego z chemicznego punktu widzenia.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Brak lub względny niedobór witamin w pożywieniu są przyczyną charakterystycznych stanów niedoborowych i chorób. Rzadko spotyka się niedobór jednej tylko witaminy grupy B, ponieważ dieta niedoborowa jest przyczyną wicloe/yiinikowych stanów niedoborowych. Nie-

5 3 vi.

mniej niedobór określonej witaminy charakteryzuje się swoistym zespołem objawów. Wśród objawów chorobowych spowodowanych niedoborem witamin rozpuszczalnych w wodzie należy wymienić: a) chorobę beri-beri (niedobór tiaminy), b) zajady, zapalenie języka, łojotok i światłowstręt (niedobór ryboflawiny), c) pelagrę (niedobór niacyny), d) zapalenie nerwów obwodowych (niedobór pirydoksyny), e) niedokrwistość megaloblastyczną, acydurię merylomalonową i niedokrwistość złośliwą (niedobór kobalamin), f) niedokrwistość megaloblas-

tyczna, (niedobór kwasu foliowego), oraz g) szkorbut (gnilec — niedobór kwasu askorbinowego). Niedoboru witamin można uniknąć spożywając różnorodne środki spożywcze w dostatecznych ilościach.

WITAMINY KOMPLEKSU B SĄ KOFAKTORAMI REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Do witamin kompleksu B istotnych w żywieniu człowieka należą: 1) tiamina (witamina Bj), 2) rybofiawina (witamina B2), 3) niacyna (kwas nikotynowy, amid kwasu nikotynowego) (witamina B3), 4) kwas pantotenowy (witamina Bs), 5) witamina B6 (pirydoksyna, pirydoksal, pirydoksamina), 6) biotyna, 7) witamina B!2 (kobalamina) oraz 8) kwas foliowy (kwas pteroiloglutaminowy). Ponieważ witaminy tej grupy są rozpuszczał-

694 / ROZDZIAŁ 53

ne w wodzie, nadmiar ich jest wydalany z moczem. Tylko rzadko kumulują się w ustroju osiągając stężenia toksyczne. Z tych też przyczyn ich magazynowanie w ustroju jest ograniczone (z wyjątkiem kobalamin), co sprawia, że muszą one być dostarczane regularnie.

TIAMINA Tiamina składa się z pochodnej pirymidynowej i tiazolowej. Są one ze sobą połączone przez grupę metylenową (ryc. 53-1). H

NH,

i

c*C-CH,-Ń*

O"

0"

-o-p-o-p-oII II o o

C=C-CHi-CH3-OH CH3 2,5-Dlmelylo6-tilryml(!yna

4-Metylo-S-rrydrokayetylotlazol

Ryc. 53-1. Tiamina. W cząsteczce difosforanu tiaminy w miejscu grupy -OH znajduje się pirofosforan (u góry).

Difosforan tiaminy jest aktywną postacią tiaminy Konwersję tiaminy do aktywnego difosforanu tiaminy (pirofosforanu tiaminy) katalizuje ATP-zależna difosfotransferaza tiaminowa występująca w tkance Mózgowej i wątrobowej (ryc. 53-1). Difosforan tiaminy jest koenzymem w reakcjach enzymatycznych przenoszących aktywną grupę aldehydową Występują dwa rodzaje takich reakcji: pierwsza z nich jest reakcją dekarboksylacji oksydacyjnej a-ketokwasów (np. a-ketoglutaranu i pirogronianu lub cc-ketoanalogów leucyny, izoleucyny i waHny), zaś druga reakcją katalizowaną przez transketolazę (np. w szlaku pentozowo-fosforanowym). Wszystkie te reakcje ulegają zahamowaniu przy niedoborze tiaminy. W każdej z tych reakcji difosforan tiaminy dostarcza reaktywnego atomu węgla w* pierścieniu tiazolowym, przyjmujący postać karboanionu, który następnie może się połączyć z grupą karbonylo-

wą np. pirogronianu (ryc. 19-5). Tak powstały związek addycyjny ulega dekarboksylacji, usuwającej CCV Reakcja ta jest katalizowana przez kompleks wieloenzymatyczny określany jako kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (szczegóły — p. rozdz. 19). Dekarboksylacja oksydacyjna a-ketoglutaranu do sukcynylo-CoA i C02 (p. rozdz. 18) jest katalizowana przez kompleks enzymatyczny, który jest strukturalnie podobny do kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej. Również w tej reakcji difosforan tiaminy dostarcza stabilnego karboanionu. reagującego z atomem węgla znajdującego się w pozycji a a~keto-glutaranu. Difosforan tiaminy uczestniczy również w dekarboksylacji oksydacyjnej kwasów ot-ketokarboksylowych pochodnych aminokwasów rozgałęzionych (rozdz. 32). Rola difosforanu tiaminy jako koenzymu w reakcjach katalizowanych przez transketolazę jest podobna do opisanej wyżej w reakcjach dekarboksylacji. Brak tiaminy jest przyczyną choroby beri-beri i pokrewnych zespołów niedoborowych U chorych z niedoborem tiaminy dochodzi do zablokowania lub znacznego ograniczenia reakcji zależnych od difosforanu tiaminy i.do akumulacji substratów tych reakcji, tj. pirogronianu, pentoz i pochodnych cc-ketokarboksylowych aminokwasów rozgałęzionych (leucyny, izoleucyny i waliny). Tiamina występuje prawie we wszystkich roślinach, a także prawie we wszystkich pokarmach pochodzenia zwierzęcego, choć w niewielkich ilościach. Nierafinowane ziarna zbóż są dobrym źródłem tej witaminy. Choroba beri--beri jest spowodowana spożywaniem diety bogato węglowodan owej i ubogotiaminowej, np. złożonej z polerowanego ryżu lub innych wysoce rafinowanych pokarmów (takich jak cukier i jasna mąka) jako głównych środków spożywczych. Wczesnymi objawami tej choroby są obwodowa neuropatia, wyczerpanie i brak apetytu. Z kolei ten ostatni jest przyczyną obrzęków oraz zmian zwyrodnieniowych w układzie sercowo-naczyniowym i nerwowym oraz mięśniach. Niedobór tiaminy jest również przyczyną encefalopatii Wernickego. Występuje ona często u alkoholików, spożywających mało innych pokarmów. Pewna surowa ryba zawiera termolabilny enzym (tiaminazę) rozkładający tiaminę. Nie odgrywa ona jednak większej roli w normalnym żywieniu człowieka.

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 695

łYBOFLAWINA Ryboflawina składa się z pierścienia izoalokzyny połączonego z cukrem alkoholowym rybitolem (p. ryc. 53-2). Jest to substancja barwna i fluoryzująca oraz względnie oporna na ciepło, lecz rozkładająca się pod wpływem światła.

Aktywnymi postaciami ryboflawiny są: mononukleotyd f lawinowy (FMN) oraz dinukleotyd flawinowy (FAD) FMN powstaje drogą ATP-zależnej fósforylacji ryboflawiny (ryc. 53-2). FAD jest wynikiem dalszej reakcji FMN z ATP, w której AMP (pochodzący z cząsteczki ATP) ulega przeniesieniu na FMN (ryc. 53-3). FMN i FAD są grupami prostetycznymt enzymów a ksydo redukcyjnych Enzymy te są znane jako flawoproteiny. Grupy prostetyczne wiązane są zwykle silnie, chociaż nie kowakncyjnie ze swoimi apoproteinami. Wiele enzymów flawoproteinowych zawiera jeden lub więcej metali,""rap. molibden i żelazo, będących istotnymi kofaktorami. Enzymy te są znane jako metaloflawoprotonry. Enzymy flawoproteinowe są szeroko rozpowszechnione. Ich przedstawicielami jest kilka ważnych oksydoreduktaz uczestniczących w metabolizmie ssaków. Wśród nich wymienić należy oksydazę a- aminokwasu w ą uczestniczącą w deaminacji aminokwasów, oksydazę ksantynową biorąca udział w degradacji puryn,

'

D-Rybllol

H,C

H,C

dehydrogenazę aldehydową, uczestniczącą w degradacji aldehydów, mitochondrialną dehydrogenazę gh'ceroIo-3-fosforanową, przenoszącą ró-

Fiawina

Ryc. 53-2. Ryboflawina. W cząsteczce fosforanu ryboflawiny (mononukleotyd flawtnowy — FMN) miejsce grupy -OH zajmuje fosforan.

wnoważniki redukujące z cytoplazmy do mito-

chondriów, dehydrogenazę sukcynyJową cykiu kwasu cytrynowego, dehydrogenazę acylo-ĆoA, flawoproteinę przenoszącą elektrony uczestni1

Pl rafo sfo ran

Fiawina

D-Rybilol

Ryc. 63-3. Dinukleotyd flawinoadeninowy

(FAD).

NH J

696 / ROZDZIAŁ 53

czącą w utlenianiu kwasów tłuszczowych, dehydrogenazę dihydrolipoilową, uczestniczącą w dekarboksyłacji oksydacyjnej pirogronianu i a-ketoglutaranu oraz dehydrogenazę NADH będącą ważną składową łańcucha oddechowego w mitochondriach. Aktywność wszystkich tych enzymów jest upośledzona w niedoborze ryboflawiny. W roli koenzymów pierścień izoaloksazynowy flawoprotein ulega odwracalnej redukcji tworząc zredukowaną postać FMNH 2 iFADH2 (p. ryc. 13-3). Brak ryboflawiny jest przyczyną niegroźnego zespołu niedoborowego Uwzględniając wielokierunkowe funkcje metaboliczne ryboflawiny jest zaskoczeniem, że niedobór tej witaminy nie prowadzi do poważnych stanów groźnych dla życia. Niemniej w stanach jej niedoboru stwierdza się różnorodne objawy chorobowe, w tym zapalenie kącików ust, pękanie i złuszczanie się warg, zapalenie języka, tojotok i światłowstręt. Ryboflawina wytwarzana jest przez rośliny i drobnoustroje, lecz nie przez ssaki. Drożdże, wątroba i nerki są dobrymi źródłami tej witaminy. Ulega ona wchłanianiu w jelitach za pośrednictwem reakcji fosforylacji-defosforylacji zachodzącej w błonie śluzowej. Hormony (hormony tarczycy i ACTH), leki (chloropromazyna jest inhibitorem kompetycyjnym) i czynniki pokarmowe wpływają na konwersję ryboflawiny do jej postaci kofaktorowych. Ponieważ ryboflawina jest światłoczuła, niedobór jej może wystąpić u noworodków z hiperbilirubinemią poddanych fototerajfifc NfACYNA Niacyna jest nazwą generyczną (zwyczajową) dla kwasu nikotynowego i amidu kwasu nikotynowego. Obydwa te związki mogą być źródłem witaminy w pożywieniu. Kwas nikotynowy jest kwasem monokarboksylowym pochodnym pirydyny (ryc. 53-4).

Aktywnymi postaciami niacyny są amid kwasu nikotynowego, dinukleotyd adeninowy (NAD) oraz fosforan dinukleotydu nikotynamido-adeninowego (NADP +) Nikotynian jest postacią niacyny potrzebną do syntezy NAD+ i NADP+ przez enzymy występujące w cytoplazmie większości komórek. Dlatego też amid kwasu nikotynowego zawarty w pokarmach wpierw musi ulec deamidacji do nikotynianu (ryc. 53-4). W cytoplazmie nikotynian ulega najpierw konwersji do dezamido-NAD+ w reakcji z 5-fosforybozylo-l-pirofosforanem (PRPP), a następnie adenylacji z ATP. Następnie grupa amidowa glutaminy ulega przeniesieniu na resztę nikotynianu dezamido-NAD. W wyniku tej reakcji powstaje NAD+. Ten ostatni może ulec fosforylacji do NADP+. NAD + i NADP + są koenzymami licznych enzymów oksydoredukcyjnych Nukleotydy nikotynamidowe odgrywają ważną rolę jako koenzymy wielu dehydrogenaz występujących zarówno w cytoplazmie (np. dehydrogenaza mleczanów a), jak i w mitochondriach (np. dehydrogenaza jabłczanowa). Są one ważnymi ogniwami licznych szlaków metabolicznych, wpływających na przemianę węglowodanów, tłuszczów i aminokwasów. Ogólnie można powiedzieć, że dehydrogenazy współdziałające z koenzymem NAD katalizują reakcje oksydoredukcyjne w szlakach oksydacyjnych (np, w cyklu kwasu cytrynowego), natomiast debydrogenazy lub reduktazy współdziałające z koenzymem NADP+ występują często w szlakach metabolicznych związanych z syntezą redukcyjną (np. szlak pentozofosforanowy). Mechanizm oksydoredukcji polega na odwracalnej addycji hybrydowego jonu H~ do pierścienia pirydynowego oraz generacji wolnego jonu wodorowego (H +) (p. ryc. 13-5). Na przykład: NAD+ + AH2 <— NADH + H+ + A

Ryc. 53-4. Synteza i rozkład dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD+). W fosforanie dinukieotydu nikotynamtdoadeninowego (NADP+) grupa 2'-hydroksylowa reszty adenozynowej jest fosforylowana. U człowieka, lecz nie u kota, całe zapotrzebowanie na niacynę może być pokrywane przez tryptofan, jeśli dostarczany jest w dostatecznych ilościach z pokarmami. Normalnie z tego źródła pochodzi f-niacyny. PRPP — 5-fosforybozylo-l -pirofosforan, QPRT — fosforybozylotransferaza chinolinianowa, PLP — fosforan pirydoksalu.

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 697

-

NMcotynamid

\

-Poktrmy

N—motylami Ikotyn amid (główny metabolit w

moczu)

0 ^ Mononukleotyd nikotynianu (NMN)

PPi

PRPP

^

O Chlnolinia n

NH, Aldehyd 2-amino-3karboksymukanawy

OH 3 - Hyd roksyantran II an PLP Kilka etapów (p. fyc. 32-19)

CHi-CHCOO" NH, Pokarrr Adenina

D—Ryboza

HAD*

698 / ROZDZIAŁ 53

Brak niacynyjest przyczyną zespołu niedoborowego określanego jako pelagra Objawami tego zespołu chorobowego są: utrata wagi, zaburzenia trawienia, zapalenie skóry, depresja i demencja. Niacyna występuje w wielu pokarmach pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Przy ocenie „wartości niacynowej" pokarmów należy uwzględnić fakt, że aminokwas egzogenny (niezbędny) tryptofan może ulec przekształceniu do NAD+ (p. ryc. 53-4). Z każdych 60 mg tryptofanu może powstać 1 mg równoważnika niaeynowego. Dlatego też dla wywołania stanu niedoboru niacyny spożyte pokarmy muszą być ubogie zarówno w niacynę, jak i w tryptofan.

Takie warunki występują u ludzi, dla których głównym pożywieniem jest kukurydza. Oni właśnie są narażeni na wystąpienie pelagry. W kukurydzy niacyna jest obecna, lecz w postaci związanej jako niacytyna, niedostępna dla przemiany u człowieka. Tylko przez wstępną obróbkę tych pokarmów zasadami można uwolnić biologicznie aktywną niacynę. Ludzie, dla których głównym pożywieniem jest sorgo (proso afrykańskie), są również narażeni na rozwój pelagry z powodu dużej w nim zawartości leucyny. Mechanizm niedoboru niacyny u osób spożywających głównie sorgo polega na tym, że zawarte w nich duże ilości leucyny hamują fosforybozylotransferazę ehinolinianową. tj. głó-

wny enzym konwersji tryptofanu do NAD (patrz ryc. 53-4). Należy zauważyć, że fosforan pirydoksalu, będący aktywną postacią witaminy Bs, jest kofaktorem w szlaku syntezy NAD4" z tryptofanu (p. r,yc. 53-4), co sprawia, że niedobór witaminy B6 może nasilić niedobór niacyny. Innymi przyczynami pelagry mogą być: podawanie leków takich jak izoniazyd, zespół rakowiaka złośliwego, w którym tryptofan ulega przekształceniu w serotoninę, oraz choroba Hartnupów, w której wchłanianie tryptofanu jest upośledzone. Kwas nikotynowy (lecz nie amid kwasu nikotynowego) stosowano w celach leczniczych dla obniżenia stężenia cholesterolu w osoczu krwi. Mechanizm takiego działania kwasu nikotynowego polega na hamowaniu napływu wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej, co jest powodem spadku syntezy lipoprotein zawierających cholesterol, tj. VLDL, 1DL i LDL.

KWAS PANTOTENOWY Kwas pantotenowy jest wynikiem połączenia się kwasu pantoinowego z P-alaniną (ryc. 53-5). Kwas pantoinowy

HaC OH

II H

0-Alanina 0'

II

HO-CH,

O II

-C-CH-C-N-CH,-CH,-C-OH Ryc. 53-5, Kwas pantotenowy.

Aktywnymi postaciami kwasu pantotenowego są koenzym A (CoA) oraz białko przenoszące grupy acylowe (ACP) Kwas pantotenowy wchłania się szybko w jelitach, po czym ulega fosforylacji przez ATP. W wyniku tej reakcji powstaje 4'-fosfopantotenian (ryc. 53-6). Przez przyłączenie cysteiny po jej dekarboksylacji czyli przez przyłączenie tioetanolaminy powstaje 4'-fosfopanteteina, będąca grupą czynną zarówno CoA, jak i ACP. Podobnie jak aktywne koenzymy będące pochodnymi wielu innych witamin rozpuszczalnych w wodzie, tak i CoA zawiera nukleotyd adeninowy. Tak więc 4'-fosfopanteteina ulega adenylacji przez ATP, przy czym powstaje defosfo-CoA. Ostatnia fosforylacja przez ATP polega na przyłączeniu reszty fosforanowej do grupy 3'-hydroksylowej rybozy. W wyniku tej reakcji powstaje CoA (ryc. 53-6). Grupa tiolowa działa jako przenośnik grup acylowych zarówno w CoA, jak i ACP CoA jest przenośnikiem grup acylowych w reakcjach cyklu kwasu cytrynowego, utleniania i syntezy kwasów tłuszczowych (patrz str. 251 i 261) oraz w reakcjach acetylacji (np. leków) i syntezy cholesterolu. ACP uczestniczy w reakcjach syntezy kwasów tłuszczowych. Powszechnym zwyczajem jest skrótowe przedstawianie struktury wolnej (zredukowanej) postaci CoA jako CoA-SH, dla podkreślenia, że grupa SH jest grupą reaktywną. Niedobór kwasu pantotenowego występuje rzadko Przyczyną tego jest fakt obfitego występowania kwasu pantotenowego w pokarmach, szczególnie w tkankach pochodzenia zwierzęcego,

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 699 ATP

ADP

Pantotenlan

H3C OH O i I II H CH,-C-CH —CN-CH5-CH5 —COO" O H,C 0 = P —O" I 4-Fosfoparrtotenian ■ Cystę I na

ATP

ADP + P, H-.C I

OH I

O II

O II

H

CH !-C-CH-C-N-CH

i

COO~ I

H

,-CH !-C-N-CH-CH

!

-SH

0 H3C = P- 0~ 1

4—Rwtopantołenylocystslna

H,C OH O I I I l u CH 2 -C-CH-C-N-CH

2

-CH

2

0 II H -C-N-CHs-CHj-SH

O H,C

= P —O"

I

4 - Foaf opantste I na

O

ACP

ATP -

r PP

V

OH OH Kwas pantolnowy

CH

/■

H

ATP AOP

0-Alanina PlrofoDotosfo- koanzym A sforan

Ry b ozo -3-

CH

H aC

OH

II H

O

Merkaploetanoamlna

II

Adenina

fosforan Koenzym A Ryc. 53-6. Synteza koenzymu A z kwasu

pantotenowego.

ACP — białko transportujące grupy acylowe.

700 / ROZDZIAŁ 53

w niepolerowanych ziarnach zbóż oraz w roślinach strączkowych. Niemniej opisano zespół palących nóg u jeńców wojennych, który ma być spowodowany niedoborem kwasu pantotenowego. Zespół ten charakteryzuje się zmniejszoną sprawnością procesów acetylacji występującą u tych chorych,

HOi H3 C -I

c—

H CHjOH

H Plrydoksal -ATP

WITAMINA Bs Witamina B6 składa się z trzech blisko ze sobą spokrewnionych pochodnych pirydyny, tj. piry-

Kłnaza plrydoksalowa

(toksyny, pirydoksalu i pirydoksaminy (ryc. 53-7)

ADP

oraz fosforanów wymienionych związków.

,p

C- H

CH^OH

HO - t f ^ s p H3 C-^+^

CH

2 0H

H

°

-rr^>|-CHjOH

H 3C

N

N

H

H

Pirydoksyna

Plrydoksal

Y II

o1

HO-r H C -1 ^.+<J

o-

Ryc. S3-8. Fosforylacja pirydoksalu przez kinazę pirydoksalową. w wyniku której powstaje pirydoksalu. Am 1 n ot ra n sTeraza

H

H C—L+^J

N H Pirydoksamina

Un

H Fosforan plrydoksaly

OH

Ryc. 53-7. Naturalne postacie

n

^^>— ^MjłJ . r

y

R—C— COOH

s

witaminy Bg

Z wymienionych związków pirydoksyna, fosforan pirydoksalu oraz fosforan pirydoksaminy są głównymi przedstawicielami witaminy B6 zawartymi w pożywieniu. Wszystkie trzy wymienione związki wykazują taką samą aktywność biologiczną.

Aldolaza ^*s (reonlnowa --------------------

1 ^^

ig -------Dekarboksylaza II C - H

Ryc. 53-9. Wiązania kowalencyjne sc-aminokwasu, które mogą stać się reaktywne po związaniu z enzymami swoiście współdziałającymi z fosfora nem pirydoksalu. ______

Ryc. 53-10. Rola koenzymu fosforanu pirydoksalu w procesie transaminacji a-aminokwasu. W pierwszej fazie dochodzi do wytworzenia ot-ketokwasu (pochodnego a-aminokwasu) oraz kompleksu fosforan pirydoksaminy — apoenzym, po czym zachodzi odwrotna reakcja, tj. aminacja nowego at-ketokwasu (jako substratu) Należy zauważyć, że fosforan pirydoksalu wiąże się ze swoim apoenzymem za pośrednictwem zasady Schiffa (utworzonej przez grupę e-aminową reszty lizyny apoenzymu i grupę aldehydową pirydoksalu) oraz wiązania jonowego (utworzonego przez grupę fosforanową koenzymu z apo"enzymem). Grupa ac-aminowa aminokwasu substratowego wypiera grupę e-aminową lizyny tworząc nową zasadę Schiffa.

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 701

a—Aminokwas (jako subslral)

Fosforan plrydoksalu apoenzym

N-Apoenzym

n

• ^.r. — rncr

a—Aminokwas (jako produkt)

a—Ketokwas (Jako produkt)

CH

Fosforan plrydo — ksamlny — enzym

702 / ROZDZIAŁ 53

Aktywną postacią witaminy Be jest fosforan pirydoksalu Wszystkie postacie witaminy B6 ulegają wchłanianiu w jelitach chociaż pewna ilość estrów fosforanowych wymienionych związków ulega rozkładowi hydro litycznemu w procesie trawienia pokarmów. Główną postacią witaminy Bfi w osoczu krwi jest fosforan pirydoksalu. Większość tkanek zawiera enzym — kinazę pirydoksalową — katalizującą fosforylację (za pomocą ATP) niefosforylowanej postaci tej witaminy do odpowiednich estrów fosforanowych (ryc. 53-8). Chociaż fosforan pirydoksalu jest głównym koenzymem reprezentującym aktywność witaminy Bń, taką samą funkcję może również spełniać fosforan pirydoksaminy.

i jajka. Możliwą przyczyną niedoboru witaminy B6 u dzieci może być karmienie ich piersią przez matki, których zapasy witaminy BB ulegty wyczerpaniu w następstwie długotrwałego zażywania doustnych leków antykoncepcyjnych. Również alkoholicy mogą wykazywać niedobór witaminy B6 spowodowany przemianą etanolu do aldehydu octowego, stymulującego hydrolizę fosforanu pirydoksalu lub pirydoksaminy. Niedobór witaminy B6 może być również spowodowany izoniazydem — szeroko stosowanym lekiem przeciwgruźliczym — tworzącym hydrazon z pirydoksalem (ryc. 53-11).

Fosforan pirydoksalu jest koenzymem dła kilku enzymów przemiany aminokwasowej Tworząc zasadę Schiffa (powstałą przez połączenie się grupy aldehydowej z grupą aminową a-aminokwasu) (ryc. 53-9) fosforan pirydoksalu może ułatwić wystąpienie zmian w zakresie pozostałych trzech wiązań węgla a-aminowego, tj. może umożliwić a) transami nację, b) dekarboksylację (p. ryc. 33-9) lub też c) aktywność aldolazową (ryc. 32-11). Rolę fosforanu pirydoksalu w procesie transaminacji przedstawia ryc. 53-10. Fosforan pirydoksalu uczestniczy również w glikogenolizie Koenzym ten jest integralną częścią mechanizmu działania fosforylazy, enzymu biorącego udział w rozkładzie gjikogenu (str. 220). W działaniu tym koenzym-ten na początku również tworzy zasadę Schiffa z grupą e-arainową jednej reszty lizynowej fosforylazy, która jednak nie ulega zmianie przez czas trwania fosforolizy wiązania glikozydowego 1 ->4, w wyniku której powstaje glukozo-1-fosforan. Fosforylaza mięśni szkieletowych zawiera 70—80% ogólnoustrojowej ilości witaminy Ba. Niedobór witaminy B6 może wystąpić u kobiet w czasie laktacji, u alkoholików oraz podczas leczenia izoniazydem Izolowany niedobór witaminy B6 spotyka się rzadko. Niedobór taki jest zwykle częścią niedoboru wielowitaminowego witamin grupy B. Dobrymi źródłami tej witaminy są: wątroba, makrela, owoc awokado, banan, mięso, jarzyny

HO CH,

Izonlkotynlan hydrazyny Reakcja spontaniczna HO CH3

«*>c-,-=.-O« \=/

II H

I

\_J/

Hydrazon pirydoksalu Ryc. 53-11. Powstawanie hydrazonu pirydoksalu (szybko wydalanego z moczem) z pirydoksalu i izonikotynianu hydrazyny (izoniazydu).

BIOTYNA Biotyna jest pochodną imidazolową zawartą w licznych naturalnych środkach żywnościowych (ryc. 53-12). Ponieważ znaczną część O

I I

H-N I H-CI

N-H - C-H

HSC,

Ryc. 53-12. Biotyna.

I „CH(CHjhCOOH

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE /

zapotrzebowania człowieku na biotynę pokrywa synteza tej witaminy przez drobnoustroje

jelitowe, niedobór jej nie jest spowodowany niedostateczną podażą tej witaminy w pokarmach, lecz defektami w zakresie jej wykorzystania. Biotyna jest koenzymem karboksylaz Biotyna jest składową swoistych enzymów, złożonych z wielu podjednostek (tab. 53-1), katalizujących reakcje karboksyjacji. Jon karboksylowy ulega przyłączeniu do atomu N 1 w pierścieniu biotyny, przez co powstaje aktywny związek pośredni karboksybiotyna-enzym

(ryc. 53-13). Ten etap wymaga obecności Enzym

Rola

Tabela 53-1. Enzymy biotynozaiezne występujące u zwierząt Karboksylaza pirogronianowa

Katalizuje pierwszą reakcje w szlaku metabolicznym prze kształcającym prekursory trójwęglowe w glukozę (glukoneogeneza)

Karboksylaza ace tyle-CoA

Dostarcza reszty octanowe do syntezy kwasów tłuszczowych katalizując powstawanie malonylo-CoA

Karboksylaza propionylo-CoA

Przekształca propionian do bursztyn ian u, który następnie wchodzi do cyklu kwasu cyt rynowego

Karboksylaza fi-metylokrotonylo-CoA

KataboMzm leucyny i pewnych związków izoprenoidowych

o II O-P-Cf o

ATP+HCOa"

I

HCH Bezwodnik kwasu wę g I owo-f osf □ ro weg o

Spożywanie surowych jaj może być przyczyną niedoboru biotyny Białko jaj zawiera termolabilne białko — awidynę — mocno wiążące biotynę, uniemożliwiając wchłanianie tej witaminy przez jelita, co z kolei może być przyczyną jej niedoboru. Wśród objawów niedoboru biotyny należy wymienić depresję, halucynacje, bóle mięśniowe i zapalenie skóry. Brak enzymu — syntazy bolokarboksylazowej — katalizującego przyłączenia biotyny do reszty lizyny apoenzymu karboksylazowego, może być również przyczyną objawów niedoboru? witaminy B6 oraz gromadzenia się w ustroju substratów enzymów biotynozależnych. Substraty te można wykryć w moczu. Wśród tych ostatnich należy wymienić mleczan, (J-metylokrotonian, p-hydroksyizowalerian oraz p-hydroksypropionian. U niektórych dzieci z niedoborem ww. enzymu występują choroby związane z niedoborami immunologicznymi. WITAMINA B 12 Witamina B12 wykazuje złożoną strukturę pierścieniową (pierścień korynowy), podobną do pierścienia porfiry nowego, w środku której znajduje się jon kobaltu {ryc, 53-14). Wytwarzana jest wyłącznie przez drobnoustroje. Tak więc nie występuje ona w roślinach, jeśli nie są

II

HC — ADP

HCO;, ATP, Mg2 + i acetylo-CoA (jako efektora allosterycznego). Z kolei aktywowana grupa karboksylowa ulega przeniesieniu na substrat reakcji np. na pirogronian.

o HW

703

NH

P,

— CH -----I HCy (CHj), «^ » i c Blotyna -enzym

=o

0=C li'

"NH

l HC -------CH HCH

HC-ICH JU

Kompleks karboksyblotyna — enzym |ENZYM - NH|

c=o

IENZYM - NH|

Ryc. 53-13. Powstawanie kompleksu karboksybiotyna-enzym. Udział tego kompleksu w procesie karboksylacji pirogronianu — p. ryc. 21 -1.

704 / R 0ZD21AŁ 53 (WUi-CONH, CH a

trobie, co jest zjawiskiem wyjątkowym dla witaminy rozpuszczalnej w wodzie, w postaci związanej z transkobalaminą.

1"*

—CH2

H3

CONH3

\ l / \

C

A

V

' ^

Aktywnymi koenzymami witaminy B,a są metylokobalamina i deoksyadenozylokobalamina Z krwi kobalamina zostaje uwolniona i przeniesiona do cytoplazmy jako hydroksykobalamina. W cytoplazmie następuje jej konwersja do metylokobalaminy, albo też witamina wnika do mitochondriów, gdzie ulega konwersji do 5'-deoksy adenozy lokobal aminy.

Deoksykobalamina jest koenzymem w procesie konwersji metylomalonyloCoA do sukcynylo-CoA (ryc. 53-15) Jest to główna reakcja w szlaku konwersji propionianu do metabolitu cyklu, kwasu cytrynowego. Dlatego też reakcja ta ma znaczenie dla procesu glukoneogenezy. Jest ona szczególnie ważna u przeżuwaczy, ponieważ propionian jest głównym produktem fermentacji, zapoczątkowanej przez drobnoustroje w żwaczu, H3C

Ryo. 53-14. Witamina B12 (kobalamina). R — może być różne warunkując powstawanie poszczegól-: nych postaci witaminy, np. przy R = CN powstaje cyjanokobalamina, przy R = OH — hydroksykobalamina. przy R = 5r-deoksyadenozylo — 5'-deoksyadenozylokabałamina, zaś przy R = CH3— metylokobalamina.

zanieczyszczone drobnoustrojami. U zwierząt witamina B]2 jest magazynowana w wątrobie, gdzie występuje pod postacią metylokobalaminy, adenozylokobalaminy i hydroksykobalaminy. Wątroba jest więc dobrym źródłem witaminy B12, podobnie jak drożdże. Preparaty handlowe zawierają cyjanokobalaminc. Do wchłaniania witaminy B,a w jelitach niezbędny jest czynnik wewnętrzny W procesie wchłaniania witaminy B12 pośredniczą receptory umiejscowione w nabłonku jelita biodrowego. Etapem wstępnym i niezbędnym w tym procesie jest wiązanie witaminy B12 przez czynnik wewnętrzny wydzielany przez komórki okładzinowe żołądka. Po absorpcji, witamina B12 ulega związaniu przez białko osocza, zwane transkobataminą if, i przeniesieniu do tkanek. Witamina ta jest magazynowana w wą-

Metylokobalamina jest koenzymem w sprzężonej konwersji homocysteiny do metioniny oraz metylotetrahydrofolianu do tetrahy* drofolianu (ryc. 53-15) W tej reakcji grupa metylowa, związana z kobalamina, zostaje przeniesiona na homocysteine, przez co powstaje metionina, po czym kobalamina zabiera grupę metylową z N5-metylotetrafolianu. W wyniku tej ostatniej reakcji powstaje tetrahy drofolian. Korzyściami tej reakcji są: tworzenie zapasów metioniny oraz udostępnienie tetrahydrofolianu do syntez puryn i pirymidyn oraz kwasów nukleinowych. Niedobór witaminy B1a jest przyczyną niedokrwistości megaloblastycznej Blok wchłaniania witaminy B12 spowodowany brakiem czynnika wewnętrznego (np. gastrektomią), jest przyczyną niedokrwistości złośliwej.

Na niedobór witaminy B12 narażeni są również jarosze, ponieważ witamina ta zawarta jest tylko w pokarmach pochodzenia zwierzęcego lub w pokarmach roślinnych zanieczyszczonych drobnoustrojami. Niedobór taki jest przyczyną upośledzenia reakcji katalizowanej przez syntazę metioninową. Niedokrwistośc jest następstwem upośledzonej syntezy DNA, co znajduje

STRUKTURA 1 FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 705

SH 1

■

- ■ '

1 H —C —NH3+

•

r

H — C — NH COCr

cocr Homocystelna

Metlonlna SYNTAZA METIONINOWA

f

Matyl oko balami na

Metyla-tetralolian

CH, H-C-COO" I c _ S - CoA

"-s

B,,

Tetfafolian

Hyd ra ksyKo ba lam i na 12

CH2-COO"

B

i2-----------------H — C —H" Deoksyad»nozyloko bałam Ina- -I -------------------------------------------C - S — CoA

MUTAZA METYLO- j MALONYLO-CoA L— M etylom alonylc — CoA

Su kcy nylo—CoA

Ryc. 53-15. Dwie ważne reakcje katalizowane przez enzymy zależne od koenzymu B12-

swoje odbicie w strukturze jąder erytroblastów. Z kolei upośledzona synteza DNA jest spowodowana zmniejszoną produkcją zasad purynowych i pirymidynowych uwarunkowaną niedoborem tetrahydrofolianu. Ten ostatni jest następstwem zablokowania roli folianu jako donora grup metylowych (folian jest wyłapywany do syntezy metylotetrahydrofolianu; proces ten określany jest jako „pułapka folianowa") (p. ryc. 53-15). W niedoborze witaminy B)3 może wystąpić homocystynuria i acyduria metylomalonowa. Zaburzenia neurologiczne, występujące w niedoborze witaminy B12, mogą być następstwem względnego niedoboru metioniny. Opisano cztery rodzaje wrodzonych zaburzeń przemiany kobalaminy. Dwa z nich dotyczą, tylko syntezy deoksyadenozylokobalaminy, w pozostałych dwóch chorzy nie są zdolni do syntezy albo deoksyadenozylokobalaminy, albo metylokobalaminy.

KWAS FOLIOWY Folacyna jest nazwą klasy związków, do których należą kwas foliowy i pokrewne substancje wykazujące aktywność biochemiczną kwasu foliowego. 45 —

Kwas foliowy albo folian składa się z zasady pterydynowej, połączonej z jedną cząsteczką kwasu p- ani ino benzoesów ego (PABA) i kwasu glutaminowego (ryc. 53-16). Zwierzęta pozbaPABA

O

COCT Kwas

OH PtwytJyna

glutaminowy Reszta ptera iłowa (kwas

pierolnowy)

Kwas foliowy Ryc. 53-16. Struktura i numeracja atomów kwasu foliowego.

wionę są zdolności syntezy PABA oraz połączenia glutaminianu z kwasem pteroinowym, co sprawia, że są one zależne od dostawy folianu z pokarmami. Głównymi źródłami folianu są drożdże, wątroba i jarzyny liściaste. W roś-

706 / ROZDZIAŁ 53

linach kwas foliowy występuje jako koniugat wieloglutaminianowy. Jego łańcuch polipeptydowy składa się z 7 reszt glutami ni ano wy ch połączonych ze sobą w pozycji y. Głównym folianem wątroby jest koniugat pentaglutamylowy. Aktywną postacią foliami jest tetrahydrofolian (H4 -folian) Pochodne folianu zawarte w pokarmach są rozszczepiane do mo no glutamyl o folianu pod wpływem swoistych enzymów jelitowych, a dopiero następnie absorbowane. Większość tego związku ulega redukcji do tetrahydrofolianu w komórkach jelitowych (ryc. 53-17) przy udziale reduktazy folianowej oraz NADPH jako donora równoważników redukujących. Aktywnymi koenzymami w tkankach są prawdopodobnie poliglutaminiany tetrahydrofolianowe.

H

OH Kwas

HN

to I Iowy

NADPH + H+

REDUKTAZA FOLIANOWA NADP+

I H*NY Tfyrnetoprym Metotreksal OH

g

Tetrahydrofolian (H«-folian) , jest nośnikiem aktywnych grup' jednowęglowych Grupami jedno węglowy mi przenoszonymi przez H4-folian, a odznaczającymi się różnym stopniem utlenienia są: grupa metylowa, metylenowa, metenylowa, fonnylowa i formiminowa. Wszystkie one mogą ulec przekształceniu z jednej postaci w drugą (ryc. 53-18). Seryna jest głównym źródłem grup jednowęglowych, mianowicie grupy metylenowej. Po przeniesieniu jej na H4-folian powstają glicyna i N5-, Nl6-metyleDO-H4-fołian, odgrywający główną rolę w przemianie grup jednowęglowych. Może on ulec redukcji do Ns-metylo-H4-folianu, odgrywającego ważną rolę w metylacji homocysteiny do metioniny. W reakcji tej uczestniczy metylokobalamina jako kofaktor (patrz ryc. 53-15). Grupa metylenowa N!, N10-metyleno-H4-folia-nu może również ulec utlenieniu. W wyniku takiej reakcji powstaje N!, N10-metenylo-H4--folian, który może ulec hydratacji do N10--formylo-H4folianu lub N5-formylo-H4-foliaiui. Ten ostatni jest również znany jako kwas fnlino-wy. Jest on postacią trwałą, nadającą się do doustnego podawania, zredukowanego folianu. H4-folian aktywnie uczestniczy w przemianie htstydyny. Produktem jej rozpadu jest kwas formiminoglutaminowy (Figlu), którego grupa formiminowa może ulec przeniesieniu na H4-folian tworząc N5-formimino-H4-folian. W niedoborze folianu stwierdza się nadmierne powstawanie Figlu po doustnym obciążeniu histydyną.

Kwas dihydrafotlowy

Kwas tetrahydrolollowy Ryc. 53-17. Redukcja przez reduktazę folianową kwasu foliowego do dthydrofołiowego i kwasu dihydrofoliowego do tetrahydrofoli owego. Trymetoprym jest swoistym inhibitorem reduktazy folianowej bakterii Gram-ujemnych, natomiast ma tylko mały wpływ na ten enzym u ssaków. Dlatego używany jest jako lekprzeciwbakteryjny. Metotreksat {ametopteryna) wiąże się silniej z wymienionym enzymem i stosowany jest jako lek przeciwnowotworowy._____________j___________________

Niedobór folianu jest przyczyną niedokrwistosci megaloblastycznej Przyczyna* niedokrwistości u chorych z niedoborem folianu jest podobna do występującej w niedoborze witaminy B1Z. Ns, Ni0-metyleno-H4-folian jest źródłem grup metylowych niezbędnych do syntezy tymidylanu. ten ostatni z kolei jest prekursorem niezbędnym w syntezie DNA i erytropoezie (ryc. 53-19). Równolegle

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 707 Metlonlna

Homocystelna Niedobór witaminy B„

| N1? H ■■

Seryna Gllcyna J

Fosforan plrydoksalu

t

NADH + H+

NAD* N1, Ń*-m»tyteno-H4-tollan

H,-tollan

NADP+ -O ■AT P NADPH

-ADP + P,

J

Mrówczan

-H S O

NH4

H

N

Synteza DNA

Niedobń; witaminy B,, iub tolianu

CH2

N'

^ CH ;.

N10-mat9nylo-H,-follan N1D-Tormylo-H,-follan

N'-form Imlno- ^-lol lan ^L-glutamlnlan Niedobór fólianu H4-foHan N-)o rm im Inog I uta ml n lan (Figlu) p. ryc 33-3 L-Hlstydyna NMormyto-H^follan (kwas toIInowy)

Ryc. 53-18. tnterkonwersje grup jednowęgiowych przyiączonych do tetrahydrofolianu.

7 08 / RO ZD ZIAŁ 5 3 Seryna

H,-folian V Metotreksat HEDUKTAZA I ^^F F0LWNOWA | ^7\

H

N

iT Y fK H,C-

H" Dlhydrofollan

1B

, N -rrtetyleno-H,-fołian O •

ii/ H

OH

SYNTAZA TYMIDYLANOWA y-daoksyurydylan (dUMP)

2- dao ksytymi dyl an (dTMP}

Ryc. 53-19. Transfer grupy metylenowej z N5 , N10-metyleno-H4 -folianu do deoksyurydylanu, W wyniku tej reakcji powstaje deoksytymidylan i dihydrofolian (H 2 -fo(ian).

z redukcją grupy metylenowej do metylowej zachodzi oksydacja H4-folianu do dihydrofolianu. Ten ostatni musi ulec redukcji do H 4-foliami, by mógł ponownie uczestniczyć w ww. reakcji. Ten fakt tłumaczy szczególną wrażliwość komórek syntetyzujących tymidyłan (niezbędny do syntezy DNA) na inhibitory reduktazy folianowej, takie jak metotreksat (ryc. 53-17 i 53-19). KWAS ASKORBINOWY (WITAMINA C) Struktura kwasu askorbinowego (ryc. 53-20) przypomina strukturę glukozy, z której powstaje witamina C u większości ssaków (ryc. 22-3). U niektórych naczelnych natomiast, w tym i u człowieka oraz u licznych gatunków zwierząt (np. u świnki morskiej, niektórych gatunków nietoperzy, ptaków, ryb i bezkręgowców), brak oksyda^y L-gulonolaktonowej uniemożliwia taką syntezę.

Aktywną witaminą C jest sam kwas askorbinowy, który jest donorem równoważników redukujących w pewnych kluczowych reakcjach Kiedy kwas askorbinowy działa jako donor równoważników redukujących, sam ulega utlenieniu do kwasu dehydro a skór binowego. Ten ostatni może być źródłem witaminy C. Kwas askorbinowy jest substancją redukującą o potencjale wodorowym wynoszącym +0,08 V, przez co jest zdolny do redukcji takich związków, jak tlen cząsteczkowy, azotany i cytochrom a i c. Mechanizm-działania kwasu askorbinowego w wieJu reakcjach nie został jeszcze wyjaśniony. Z lepiej udokumentowanych procesów wymagających obecności kwasu askorbinowego wymienić należy następujące: Hydroksylację proliny w syntezie kolagenu (p. rozdz. 59 i ryc. 30-i i),_____.___ Degradację tyrozyny — utlenienie p-hydroksyfenylopirogFoniaaw do homogentyzynianu wymaga obecności witaminy C, dla utrzymy wania miedzi w postaci zredukowanej, tj. w for-

ST RUKT URA I FUNKCJA WITAMIN RO ZP US ZCZA LNYCH W WODZIE 709 / Enzym — oksydaza L —gulonolaktonowa — nie występujeu naczelnych, świnkt morskiej Ud.

C=O

[2H]

HO-C-H I CH2OH Kwas askorbinowy Kwas dehydroaskorbinow y

CH2OH Gulonolakton

Ryc. 53-20. Kwas askorbinowy, jego pochodzenie u nienaczelnych i jego utlenienie do kwasu dehydroaskorb i nowego. Po jonizacji jest źródłem anionu askorbinianowego.

mie maksymalnie aktywnej (ryc. 32-13). Kolejny etap przemiany fenyloalaniny jest katalizowany przez 1,2-dioksygenazę homogentyzynianową, tj. przez enzym zawierający jon żelazawy i wymagający również obecności kwasu askorbinowego. 3. Syntezę adrenaliny z tyrozyny na etapie działania p-hydroksylazy dopaminowej. 4. łania 7 ahydroksyiazy. Syntezę steroidów w korze nadnerczy. Ko ra nadnerczy zawiera duże ilości witaminy C, które szybko znikają w razie pobudzenia gru czołu hormonem ad renokortyko tropowym. Przyczyna tego zjawiska nie jest jasna, chociaż wiadomo, że w steroid o genezie występuje kilka etapów o charakterze redukcyjnym. Wchłanianie żelaza w przewodzie pokar mowym. Ulega ono znacznemu nasileniu w obe cności witaminy C. Działanie antyoksydacyjoe. Rozpuszczal na w wodzie witamina C może działać jako antyoksydant i hamować powstawanie nitrozoamin w czasie procesu trawienia. Niedobór witaminy C jest przyczyną gnilca (szkorbutu) Szkorbut jest klasycznym zespołem chorobowym wywołanym niedoborem witaminy C. Jest on spowodowany upośledzoną syntezą kolagenu, przejawiającą się krwawieniami podskór-

nymi i do innych narząHów, osłabieniem mięśni, obrzękiem dziąseł oraz chwiejącymi się zębami. Zespól ten ulega wyleczeniu po dłuższym spożywaniu świeżych owoców i świeżych jarzyn. Normalne zapasy ustrojowe pokrywają zapotrzebowanie na witaminę C na okres 3-4 miesięcy, co sprawia, że objawy gnilca pojawiają się dopiero po kilku miesiącach spożywania pokarmów pozbawionych kwasu askorbinowego.

PIŚMIENNICTWO Bekovic SJ: On the mechanism of action of folate and biopterin-requiring enzymes. Annu Rev Biochem , 1980:49:227. Olson RE et a! (editors); Present Knowledge in Nutrition, 5th ed. The Nutrition Foundation, Inc, 1984. Passmore R, Eastwood, MA: Human Nutrition and Dietetks, Churchill Liyingstone, 1986. Rivlin RS: Hormones, drugs aad riboflavin. Nutr Rev 1979;37:241. Rosenberg L: Disorders of propionate, methylmalonate, and cobalamin metabolism.^agcs 474-497 in: The Metabołic Basis of Inherited Disease, 5th ed. Stanbury JB et al (editors). McGraw-Hill, 1983. Rubin RH, Swartz MN: Trimethroprim-sulfamethoxazolc. Af Engl J Med 1980;303:426. Sebrell WH Jr: History of pellagra. FedProc 1981;40t 1520. Seetharam B, Alpers DH: Absorption and transport of cobalamin (vitamin B^). Annu Rev Nutr 1982; 2:343.

5 4

Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w tłuszczach Peter A. Mayes, PhD, Dsc

WPROWADZENIE Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach (lipidach) są cząsteczkami apolarnymi, hydrofobowymi, pochodnymi izoprenu (ryc. 54-1). Nie są one syntetyzowane w dostatecznej ilości w ustroju człowieka, dlatego też muszą być dostarczane z pokarmami. Warunkiem sprawnego wchłaniania tych witamin z przewodu pokarmowego jest prawidłowe wchłanianie tłuszczów. Po absorpcji witaminy te transportowane są we krwi, podobnie jak inne apolarne lipidy, za pośrednictwem lipo protein lub swoistych białek nośnikowych. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach spełniają różnorodne funkcje np. witamina A uczestniczy w procesie widzenia, witamina D — w przemianie wapniowej i fosforanowej, witamina E jest antyoksydantem, zaś witamrrła K uczestniczy w procesie krzepnięcia krwi. Pomimo że witaminę D (cholekalcyferol) kiedyś zaklasyfikowano do tej grupy związków, w rzeczywistości nie jest witaminą, tęcz hormonem.

I

H,C

C

Ryc. 54-1. Dwa sposoby przedstawienia jednostki izop ren owej.

czyna kurzej ślepoty (hemeralopia) i suchości spojówek (xerophtalmia), niedobór witaminy D — krzywicy u dzieci i osteomalacji u dorosłych, niedobór witaminy E — objawów neurologicznych i niedokrwistości (u dzieci), niedobór witaminy K (spotykany jest bardzo rzadko u dorosłych) — krwawień i krwotoków u noworodków. Ze względu na możliwość magazynowania w ustroju nadmiaru witamin rozpuszczalnych w tłuszczach mogą wystąpić objawy zatrucia, np. po przedawkowaniu witaminy A lub D. Niektórym witaminom, np. witaminie A i p-karotenowi (jest to prowitamina A) przypisuje się właściwości zapobiegające rozwojowi raka.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Ze względu na swój charakter lipidowy, zaburzenia w zakresie trawienia i wchłaniania tłuszczów, manifestujące się wydalaniem stolców tłuszczowych (steatorrkea) mogą być przyczyną niedoboru witamin rozpuszczalnych w tłuszczach. Wśród przyczyn tych zaburzeń wymienić należy m.in. stany upośledzonego wytwarzania lub wydalania żółci. Niedebór tych witamin w pokarmach jest przyczyną wypadnięcia ich funkcji. I tak niedobór witaminy A jest przy-

CH;

H

WITAMINA A

i

Witamina A lub retinol jest związkiem poliizoprenoidowym posiadającym pierścień cykloheksenowy (ryc. 54-2). Witamina A jest nazwą zwyczajową odnoszącą się do związków pochodzenia zwierzęcego, wykazujących aktywność biologiczną witaminy A. Należą do nich retinol, kwas rcttnolnwy oraz retinal. TyJko retinol wykazuje pełną aktywność witaminy A, pozostałe dwa związki wykazują niektóre, choć

STRUKTURA t FUNKCJA WiTAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH / 711 CH3

A nie jest całkowita, (ł-karoten wykazuje tylko £ aktywności retinolu (tj. 1 ug retinolu jest równoważny 6 wg P-karotenu).

CH3

CH3

CH2OH CH3 Ryc.

54-2. Retinol

{witamina A).

nie wszystkie, jej właściwości biologiczne. Pod pojęciem retinoidów należy rozumieć naturalne postacie oraz analogi syntetyczne retinolu. Prowitaminą witaminy A jest (karoten W jarzynach witamina A występuje pod postacią prowitaminy tj. p-karot«nu. Jest to żóhy barwnik złożony z dwóch cząsteczek retinalu połączonych ze sobą za pośrednictwem grup aldehydowych umiejscowionych na końcu łańcucha węglowego tych związków (ryc. 54-3). Ponieważ konwersja p-karotenu do witaminy

Trawienie witaminy A towarzyszy trawieniu lipidów, po czym witamina A ulega transformacjom w błonie śluzowej jelit Estry retinolu rozpuszczone w tłuszczach pokarmowych ulegają zawieszeniu w kroplach żółci i hydrolizie w świetle jelita, a następnie dopiero wchłaniane są przez nabłonek jelitowy. Spożyty P-karoten może ulec rozszczepieniu oksydacyjnemu przez dioksygenazę p-karotenov/ą (ryc. 54-3). W procesie rozszczepienia potrzebny jest tlen cząsteczkowy. Proces ten nasila obecność soli kwasów ąółciowych. W następstwie rozszczepienia p-karotenu powstają dwie cząsteczki aldehydu retinowego (retinalu). W błonie śluzowej jelita retinal zostaje zredukowany do retinolu przez swoistą reduktazę retina-

ftetlnol (witamina A)

Ryc. 54-3. |.i-Karoten i jego rozpad do retinalu (aldehydu retinowego). Na rycinie pokazano również redukcję retinalu da retinolu oraz utlenienie retinalu do kwasu retinojowego.

DIOKSYGENAZA 0-KAROTENOWA

Aldehyd retinowy (retinal, witamina A,)

CH3

712 / ROZDZIAŁ 54

Iową. W reakcji tej donorem atomów wodorowych jest NADPH. Mała część retinalu jest utleniana do kwasu retinojowego. Większość retinolu jest estryfikowana i wbudowywana do chylomikronów limfy (p. str. 299), skąd dostają się do krwi krążącej. Chylomikrony ulegają degradacji do chylomikronów resztkowych. Te ostatnie, zawierające retinol, są wychwytywane przez hepatocyty. Karotenoidy mogą ominąć ww. procesy przemiany i dostać sie bezpośrednio do chylomikronów. Witamina A jest magazynowana w wątrobie i po uwolnieniu do krwi ulega związaniu przez białka transportujące W wątrobie witamina A jest magazynowana w lipocytach pod postacią estru prawdopodobnie w kompleksach lipoglikoproteinowych. Przed uwolnieniem do krwi i dostaniem sie do innych tkanek, estry witaminy A ulegają hydrolizie, zaś uwolniony retinol związaniu przez apo-bialko wiążące retinol (apo-retinol binding protein — RBP). Powstałe holo-RBP zostaje przekształcone w aparacie Golgiego, a następnie uwoinione do osocza. Kwas retinojowy przenoszony jest we krwi przez albuminy. Po dostaniu się do wnętrza komórek innych niż hepatocyty retinol zostaje związany przez tzw. komórkowe białko wiążące retinol (cellular reti-

nol binding protein — CRBP).

Objawy toksyczności spowodowane witaminą

A występują w chwili przekroczenia całkowite* go wysycenia RBP i eksponowania komórek na retinol wolny, nie związany białkiem nośniko wym. iv hY

Retinol, retinal i kwas retinojowy — każdy z tych związków wykazuje swoiste funkcje biologiczne Retinol może ulec przekształceniu do retinalu i odwrotnie pod wpływem dehydrogenaz lub reduktaz, występujących w wielu tkankach i wymagających obecności NAD lub NADP. Należy dodać, że raz powstały kwas retinojowy nie może powtórnie przekształcić się w retinal lub

retinol. Ten fakt sprawia, że kwas retinojoWy wpływa na wzrost i różnicowanie komórek, lecz

nie może zastąpić retinalu w procesie widzenia ani retinolu w zakresie działania na układ rozrodczy.

Retinol działa jak hormon steroidowy Po związaniu przez CRBP retinol przemieszcza się do jądra komórkowego i zostaje związany przez białka jądrowe. W jądrze komórkowym retinol prawdopodobnie uczestniczy w kontroli ekspresji pewnych genów. Pod tym wzglę-

dem witamina A zachowuje się podobnie jak hormony steroidowe. Udział witaminy w kontroli ekspresji genów wydaje się tłumaczyć jej niezbędność w procesie fizjologicznej reprodukcji. Retinal jest składową barwnika wzrokowego — rodopsyny Rodopsyna występuje w pręcikach (komórkach pręcikowych) siatkówki odpowiedzialnych za widzenie w słabym świetle. 11-cw-Retinal będący izomerem całkowicie-fr-ans-retf^alu

ulega swoistemu związaniu przez białko zwane opsyną tworząc rodopsynę (ryc. 54-4). Przy ekspozycji rodopsyny na światło, barwnik traci barwę ulegając rozpadowi do całko wicie- transHoOopsyna

(foton światła) 3 11

Ryc. 54-4. W pręcikach siatkówki oka 11 -c/sretinal, powstały z całkowicie- trans- retinal u, łączy się z opsyną tworząc rodopsynę Absorpcja fotonu przez rodopsynę jest powodem utraty jej zabarwienia i rozpadu doopsyny i całkowicietrans-retinalu. Dla podtrzymania cyklu tych reakcji niezbędny jest retinal.

STRUKTURA 1 FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH / 713

-retinalu i opsyny. Reakcji tej towarzyszy zmiana konftirmacyjna indukująca otwarcie kanału wapniowego w pręcikach. Wzmożony napływ jonów wapnia do pręcika wyzwala impuls nerwowy umożliwiający percepcję światła przez mózg. Kwas retinojowy uczestniczy w syntezie glikoprotein To działanie moż« częściowo tłumaczyć pobudzający wpływ ' kwasu retinojowego na wzrost i różnicowanie tkanek. Sugerowano, że fosforan retinoilowy spełnia funkcję przenośnika oligosacharydów przez lipidową dwuwarstwę błon komórkowych. Proces ten ma być enzymatyczną trans-cis izomeracją podobną do opisanej wyżej trans-cis izomeracji rodopsyny. Nie do odparcia dowodem na to, że kwas retinojowy uczestniczy w syntezie glikoprotein jest fakt akumulacji w stanach niedoboru witaminy A nienormalnie nisko cząsteczkowych intermediatów oligosacharydowo-lipidowych (p. rozdz. 57). Brak witaminy A wywołuje charakterystyczne objawy niedoborowe Sa one spowodowane upośledzeniem funkcjonowania różnych mechanizmów komórkowych, w których uczestniczą retinoidy. Jednym z pierwszych objawów niedoboru witaminy A jest upośledzone widzenie nocne, które pojawia się przy prawie całkowitym wyczerpaniu się zapasów witaminy A w wątrobie. Dalsze zubo-

Ch,

żenie w witaminę^A jest przyczyną Iceratyzacji nabłonka oka, dróg oddechowych, układu żołądkowo-jelitowego i dróg moczowo-płciowych oraz zmniejszenia wydzielania śluzu. Suchość spojówek (xerophtalmia) i rogówki prowadzi nieuchronnie do ślepoty. Przyczyną niedoboru witaminy A jest głównie spożywanie pokarmów pozbawionych tej witaminy, a szczególnie niespożywanie jarzyn zawierających prowitaminę A, tj. (3-karoten Zarówno retinoidy, jak i karotenoidy wykazują działanie przeciwnowotwo ro we Wiele nowotworów u człowieka wywodzi się z komórek nabłonkowych. Różnicowanie tych ostatnich zależne jest (jd_ retinoidów. Niektóre badania epidemiologiczne wykazały występowanie odwrotnej zależności między zawartością witaminy A w pokarmach a ryzykiem wystąpienia raka. Ponadto w niektórych doświadczeniach wykazano, że podawanie retinoidów zmniejsza aktywność niektórych karcynogenów. p-karoten jest antyoksydantem, Może on odgrywać rolę w wychwytywaniu wolnych rodników nadtlenkowych w tkankach, w których występuje małe ciśnienie cząstkowe tlenu. Mechanizm działania 0-karotenu jako antyoksydantu polega na stabilizacji wolnych, organicznych rodników nadtlenkowych w jego sprzężonej alkilowej strukturze (ryc. 54-5). Ponieważ (3-karoten jest skuteczny przy małych stężeniach tlenu, uzupełnia on anty oksydacyjne właściwo-

CH

ROO*

CH,

CH,

Ryc. 54-5. Powstawanie rezonansowo stabilnego rodnika z atomem węgla w centrum z rodnika nadtlenkowego (ROO*) i p-karotenu. (Według: Burton G, W., Ingold K. U.: An unusual type of lipid antioxidant; Science 1984, 224, 569 Copyright (0 1984 by Tne American Association for the Actvancement of Science. Niewielka modyfikacja, za zezwoleniem).

714 / ROZDZIAŁ 54

ści witaminy E, działającej przy dużych stężeniach tlenu (p. str. 185). Anty oksydacyjne właściwości obu wymienionych witamin rozpuszczalnych w tłuszczach mogą być odpowiedzialne za ich działanie przeciwnowotworowe. WITAMINA D Witamina jest prohormonem steroidowym. Jej przedstawicielem jest grupa steroidów występujących głównie u zwierząt, choć również w roślinach i drożdżach. W wyniku przemian biochemicznych z tych steroidów powstaje hormon — kalcytrioL, odgrywający główną rolę w przemianie wapniowej i fosforanowej (p. str . 623). Witaminy D powstają z prowitamin srgosterolu i 7-dehydrochoiesterolu w wyniku działania światła słonecznego Ergwstcrol występuje w rośtinach, natomiast 7-dehydrocholesterol u zwierząt. Ergosterol ró-

żni się od 7-dehydrocholesterolu tylko łańcuchem bocznym (który jest nienasycony) oraz dodatkową grupą metylową (ryc. 54-6). Pierścień B obu związków ulega rozszczepieniu pod wpływem promieni ultrafioletowych światła słonecznego. Synteza ergokalcyferolti (witaminy D2) odbywa się w roślinach, natomiast cholekalcyferolu (witaminy D3) w skórze zwierząt eksponowanej na działanie promieni słonecznych. Obydwie witaminy wykazują taką samą aktywność biologiczną i są produktami wyjściowymi do syntezy D2-kalcytriolu, lub też D3-kalcytriolu. W dalszej części rozdziału zostanie opisany tylko D3-kalcytriol, W syntezie kałcytriolu uczestniczą zarówno wątroba, jak i nerki Witamina D3 (lub Dj) zawarta w pokarmach, jest wchłaniana w jelitach, po czym dostaje się do krwi, gdzie ulega związaniu przez swoiste białko nośnikowe. Z krwi witamina D jest wychwytywana przez wątrobę, gdzie ulega hydrcksylacji w pozycji 25. Enzymem katalizującym tę reakcję jest 25-hydroksylaza witaminy

CH3

CH3 CH3

H—C—CH = CH —C —CH CH,| \ CH3

trgosterol (rośliny)

Ergokalcyterol (witamina D,)

— CHj — CH? — CH N CH3 7 - Dehyd rocholestaro I

Cholekalcyfero l (witamina D,)

H-C-CHj-CH, CH

Fotoliza (zwierzęta)

Ryc. 54-6. Ergosterol i 7-dehydrochoiesterol oraz konwersja tych związków przez fotolize do ergokalcyferolu lub cholekalcyferolu.

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH / 71fi CH3

/

CH3

H-C- CH;- CHj- CH2 - »C^-0H CH3 25 - Hydf oksyoho tekatcyferol [25hydroksywitamina O) 25-HYDRO KSYLAZA WĄTROBOWA Cholekalcyfer ol (witamina D3i 24- HYDROKSYLAZA NERKOWA. KOSTNA ŁOŻYSKOWA, JELITOWA, CHRZESTNA

1a-HYDROKSYLAZA NERKOWA, KOSTNA LUB ŁOŻYSKOWA

HO

OH i HO

\ CH3

CH3 H —C-(

O - CH2 -

H

CH,

,

C

H

3

24,23 - Dl hyd roksyoho lekaloyfero I (24,25-dlhydroksy-witamlna O,)

1,25 - D Ihydroksyc h o lekaloyferol (1.25-dltiydroksywHamlraa DJ

Ryc. 54-7. Cholekalcyferol może utec hydroksylacji w pozycji C26 przez enzym występujący w wątrobie. 25-hydroksychoiekalcyferol ulega dalszej metabolizacji do 1a,25-dihydroksycholekalcyferolu lub do 24,25-dihydroksycholekalcyferolu, Czynniki pobudzające syntezę ta,25-dihydroksycholekalcyfero)u hamują syntezę 24,25-dihydroksycholekalcyferolu i odwrotnie.

D3, występująca w siateczce śródplazmatycznej hepatocytów. Jest ona enzymem decydującym o szybkości produkcji aktywnych metabolitów witaminy D w szlaku syntezy tych związków (ryc. 54-7). 25-hydroksy-Dj jest główną postacią zapasową tej witaminy w wątrobie. Znaczna część 25-hydroksy-D;, podlega krążeniu jelitowo-wątrobowemu, co sprawia, że zaburzenia tego procesu mogą być przyczyną niedoboru witaminy D. W kanalikach nerkowych, kościach i w łożysku 25-hydroksy-D3 ulega dalszej hydroksylacji w pozycji 1 przez enzym mitochondrialny - l-hydroksylazę 25-hydroksy-D,. W wyniku tej reakcji powstaje 1 a, 25-dihydroksy-D3 (kalcytriol) — będący najsilniej działającym metabolitem witaminy O. Regulatorami syntezy tego hormonu są: samo stężenie tego metabolitu, jak również stężenie PTH i fosforanów w surowicy krwi.

25-hydroksy-D3 może ulec hydroksylacji również w pozycji 24 przez enzym mitochondrial-

ny obecny w kanalikach nerkowych, chrząstkach, jelitach i łożysku. Stężenie w surowicy krwi powstającego w tej reakcji 24, 25-dihydroksy-D3 wykazuje ujemną korelacje ze stężeniem 1,25-dihydroksy-Dj. Dalsze szczegóły dotyczące regulacji i roli kalcytriolu w przemianie wapniowej i fosforanowej zostały podane w rozdz. 48. Niedobór witaminy D jest przyczyną krzywicy i osteomalacji Krzywica występuje u dzieci, zaś osteomalacja u dorosłych, nie eksponowanych na działanie promieni słonecznych lub żywionych pokarmami nie zawierającymi dostatecznej ilości witaminy D. Niedobór witaminy D jest przyczyną rozmickania kości spowodowanego brakiem wapnia i fosforanów. Rybi oJej, żółtko jaj oraz wątroba są dobrymi źródłami tej witaminy.

716 / ROZDZIAŁ 54

WITAMINA E (TOKOFEROL)

Witamina E jest bardzo ważnym naturalnym antyoksydantem

Istnieje kilka tokoferoli występujących w przyrodzie. Wszystkie one są izoprenoidowymi pochodnymi 6-hydroksychromanów lub tokoli (ryc. 54-8). Najczęściej spotykanym w przyrodzie tokoferolemjest D-a-tokoferol. Wykazuje on największą aktywność biologiczną wśród tokoferoli. Inne tokoferole odgrywające znaczenie w żywieniu człowieka zestawione są w tab. 54-t.

Wydaje się, że witamina E stanowi pierwszą linię obrony przed peroksydacją wielonienasyconych kwasów tłuszczowych zawartych w fos-

Proces aktywnego wchłaniania tłuszczów sprzyja absorpcji witaminy E w jelitach Upośledzenie wchłaniania tłuszczów jest przyczyną niedoboru witaminy E, ponieważ jest ona

rozpuszczona w tłuszczach, a uwalniana i absorbowana z przewodu pokarmowego w trakcie trawienia lipidów. We krwi witamina E jest transportowana za pośrednictwem lipoprotein.

Początkowo znajduje się w chylomikronach, z którymi dociera do tkanek posiadających lipazę lipo proteinową. Do wątroby dociera w chylomikronach resztkowych (w remnantach chylomikronów). Z wątroby witamina E wydostaje się wraz z cząsteczkami lipoprotein o bardzo małej gęstości. Jest ona magazynowana w tkance tłuszczowej. Tabela 54-1. Naturalnie występujące tokoferole, wykazujące znaczenie w żywieniu Tokoferol człowieka Podstawniki 5,7,8 -Tr i mety I oto koi 5,8-Dimetylotokol 7,8- Dimetylot okol 8Metylotokol

folipidach błon komórkowych i organelli subkomórkowych. Fosfolipidy błon mitochondrialnych, siateczki śródplazmatycznej i błon plazmatycznych wykazują powinowactwo do cc-tokoferolu i wydaje się, ze witamina ta ulega koncentracji w tych strukturach. Tokoferole działają jako antyoksydanty (przeciwutleniacze) przerywając reakcje łańcuchowe generujące wolne rodniki. Działanie to polega na transferze wodoru fenolowego na wolny rodnik nadtlenkowy peroksydowanego, wielonienasyconego kwasu tłuszczowego (ryc. 54-9 oraz str. 184). Z kolei powstały wolny rodnik fenoksy- reaguje z dalszym wolnym rodnikiem nadtlenkowym. Tak więc a-tokoferol nie jest łatwo wciągany do reakcji odwracalnej oksydacji; pierścień chromanu i łańcuch boczny ulegają utlenieniu do związku nie będącego wolnym rodnikiem. Jest on pokazany na ryc. 54-10. Ten produkt oksydacji łączy się z kwasem glukuronowym za pośrednictwem grupy hydroksylowej w pozycji 2 i wydalaniu z żółcią. W odróżnieniu od innych witamin np. niacyny, witaminy B12 i folianu, tokoferol po wypełnieniu swojej funkcji nie u\ega recyrkulacji. Dlatego też musi być zastąpiony przez nowy tokoferol, by spełnić swoje zadanie biologiczne w komórce. Antyoksydacyjne działanie tokoferolu jest najbardziej skuteczne przy wysokich stężeniach tlenu, dlatego nie jest zaskoczeniem, że witamina ta wykazuje tendencję do gromadzenia się w strukturach lipidowych, eksponowanych na największe ciśnienia cząstkowe tlenu, tj. w błonach krwinek czerwonych oraz w błonach komórkowych dróg oddechowych.

i CH, CH,

-CHlCH^-CHCHj


Ryo. 54-8. a-Tokoferol.

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH / 717

ROOH + TocO*

ROO* + TocOH ■

Nieaktywny pi wolnego rodr nika

ROO' * TocO' ■

Ryc. 54-9. Aktywność antyoksydacyjna tokoferolu przerywająca łańcuch generacji rodników nadtlenkowych (ROO*). _______________________________________ : CH3 OH

)— I?

CH3 O-

4 ^ CH3 C H ,~^

Ryc. 54-10. Produkt oksydacji a-tokoferolu. Podana numeracja informuje o położeniu oznaczonych atomów w związku macierzystym.

Witamina E i selen działają synergistycznie. Każdy z tych czynników zmniejsza zapotrzebowanie ustroju na czynnik drugi Peroksydaza glutationowa, której integralnym składnikiem jest selen (p. str. 243), stanowi drugą linię obrony przed nadtlenkami zanim dojdzie do ich propagacji w reakcjach łańcuchowych, niszczących błony i inne struktury komórkowe. Tak więc tokoferol i selen uzupełniają się wzajemnie w reakcjach niszczących nadtlenki lipidowe, przy czym jeden z nich zmniejsza zapotrzebowanie na drugi. Ponadto selen jest niezbędny do prawidłowej czynności trzustki. Ta ostatnia z kolei jest potrzebna w procesie trawienia i wchłaniania lipidów, w tym również tokoferolu. Odwrotnie, witamina E zmniejsza zapotrzebowanie na selen, zapobiegając utracie tego pierwiastka przez ustrój oraz utrzymując go w postaci aktywnej. Niedobór witaminy E może być przyczyną niedokrwistości u noworodków U ciężarnych lub karmiących matek oraz u noworodków może zachodzić potrzeba suplementacji pokarmów witaminą E w celu zapobiegania niedokrwistości spowodowanej niedoborem tej witaminy. Niedokrwistość może być

spowodowana obniżoną syntezą hemoglobiny lub skróceniem okresu życia krwinek czerwonych. Zapotrzebowanie na witaminę E wzrasta przy wzroście spożycia wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Zażywanie olejów mineralnych, ekspozycja na czysty tlen (np. w namiotach tlenowych) oraz choroby przebiegające z upośledzonym wchłanianiem tłuszczów w jelitach mogą być przyczyną niedoboru witaminy E i wystąpienia zaburzeń neurologicznych. Witamina E ulega rozkładowi pod wpływem gotowania lub innych procesów obróbki środków spożywczych, miedzy innymi zamrażania w bardzo niskiej temperaturze. Dobrymi źródłami witaminy E są: kiełkujące ziarna pszenicy, olej z nasion słonecznika, krokosza, kukurydzy lub soi. Choć oleje uzyskane z wątróbek rybich są bogate w witaminę A i D, to jednak zawierają niewielkie ilości witaminy E.

WITAMINA K Witaminy należące do grupy K są poliizoprenoidowymi pochodnymi naftochinonu (ryc. 54-11). Menachinon (=menadion) będący związkiem macierzystym witamin grupy K (ryc. 54-12)

Jednostka Izopranoldowa 2-Metylo-1.4-n aftoeh ino n

Ryc. 54-11. Pochodna naftochinonu oraz jednostka izoprenoidowa. W witaminach grupy K podstawniki R są poliizoprenoidami.

nie występuje w przyrodzie. Po jego podaniu in vivo ulega alkilacji do jednego ze związków pochodnych menachinonu (witamina K2). Filochinon (witamina K,) jest główną postacią witaminy K. występującą w roślinach, Menachinon-7 jest jedną z poliizoprenoi ci owych, nienasyconych pochodnych witaminy K występujących w tkankach zwierzęcych i syntetyzowanych przez bakterie w jelitach.

718 / ROZDZIAŁ 54

Menadion (witamina K,)

CHS

CH,

= C-CH I -(CH 3 -CH 1 -CH-CH J ) 3 -H

O

Fllochlnon (witamina K,, filonatfłon, msflton)

O CH3 CH3 (CH]CH=C-CH1Jn -H Menaehlnon-n (witamina K^ n = 6,7 lub 9) Ryc. 54-12. Postacie witaminy K występujące w przyrodzie.

Niezaburzone wchłanianie tłuszczów jest warunkiem prawidłowego wchłaniania witaminy K Upośledzone wchłanianie tłuszczów jest najczęstszą przyczyną niedoboru witaminy K. Występujące w przyrodzie pochodne witaminy K ulegają wchłanianiu tylko w obecności kwasów żółciowych i podobnie jak inne lipidy dostają sie do krwi krążącej w chylomikronach za pośrednictwem rt&szyń limfatycznych. Menachinon (menadion), jako związek rozpuszczalny w wodzie ulega wchłanianiu nawet przy braku kwasów żółciowych, dostając się bezpo-

średnio do żyły wrotnej. Chociaż witamina K jest początkowo magazynowana w wątrobie, stężenie jej w tym narządzie szybko obniża się, bowiem gromadzenie się witaminy K w wątrobie jest ograniczone.

Witamina K jest kofaktorem karboksylazy katalizującej powstawanie reszt y-kar boksy gluta mi niań owych w białkach prekursorowych Powstawanie biologicznie aktywnych czynników krzepnięcia krwi związane jest z potranslacyjnym przekształceniem reszt glutaminianowych (Glu) białek prekursorowych do reszt ykarboksyglutaminianowych (Gla) przez swoistą karboksylazę zależną od witaminy K (ryc. 5413). Protrombma (drugi czynnik krzepnięcia krwi) zawiera 10 takich reszt, pozwalających na chelatowanie jonów wapniowych. Proces ten cha-

rakteryzuje się swoistą interakcją białek, jonów wapniowych i fosfolipidów, niezbędną dla wystąpienia ich efektu biologicznego (ryc. 54-14).

cocr

Witamina K jest niezbędna w biosyntezie osoczowych czynników krzepnięcia Udowodniono, że witamina K uczestniczy w utrzymywaniu prawidłowych stężeń II, VII, IX i X czynnika krzepnięcia krwi. Wszystkie te

czynniki są syntetyzowane w wątrobie w postaci

nieaktywnych białek prekursorowych (p. rozdz. 58).

COn

"OOC COO"

CH2

\/ CH I CH;,

WITAMINA K — C —CH —N — II H

o

— C —CH —N — (I H O '

Ryc. 54-13. Karboksylacja reszty glutominiano-

wej, katalizowanej przez witaminę K.

STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH / 719

V

Glu

Gla

CH -C-CH-N-

I

I

"

Ryc. 54-14. Chelatowanie jonów wapnia przez resztę 7-karboksylog lulamy Iową występującą w białkowych czynnikach krzepnięcia.

W kilku tkankach zidentyfikowano występowanie również innych białek zawierających reszty Gla zależne od witaminy K. „Cykl witaminy K" pozwala regenerować zredukowaną postać witaminy K W reakcji katalizowanej w siateczce śródplazmatycznej przez karboksylazę zależną od witaminy K niezbędna jest obecność tlenu cząsteczkowego, dwutlenku węgla (a nie HCOy), oraz postaci hydrochinomiwej (zredukowanej) witaminy K. W siateczce endoplazmatycznej hepatocytów występuje tzw. cykl witaminy K (ryc. 54-15), w którym produkt reakcji karboksylacji — 2,3-epoksyd — ulega najpierw konwersji do postaci chinonowej witaminy K. Reakcja ta jest katalizowana przez reduktazę 2,3-epoksydową działającą w obecności niezidentyfikowanego jeszcze reduktora ditiolowego. Reakcja ta jest

SH

SH

Warfaryna Dl ku maro I

Ryc. 54-15. Aktywności me taboliczne wątroby powiązane z witaminą K. Na rycinie pokazane jest miejsce działania anty koagulantów typu dtkumarolu. Szczegóły niektórych reakcji nie są jeszcze znane. 1 — monooksygenaza, 2 — karboksylaza, 3 — reduktaza 2,3-epoksydowa, 4 — reduktaza. (Według: SuttieJ. W. The metabolic roleof vitamin K; Fed. Proc. 1980, 39, 2730, modyfikacja, za zezwoleniem).

wrażliwa na hamujące działanie anty koagulantów grupy 4-hydroksydikumarynowej (dikuma-

rolowej) takich jak warfaryna (ryc. 54-16). Kolejna redukcja postaci chżnonowej do hydrochinonowej przez NADH zamyka cykl witaminy K. W ten sposób regeneruje się biologicznie aktywna postać witaminy K. Ważnym wskazaniem do stosowania witaminy K (jako antidotum) jest zatrucie lekami pochodnymi dikumarolu. Postać chinonowa witaminy K, omijając etap działania reduktazy epoksydowej, jest potencjalnym źródłem aktywnej, hydrochinonowej postaci tej witaminy. Skaza krwotoczna noworodków jest spowodowana niedoborem witaminy K Witamina K występuje w roślinach i tkankach zwierzęcych używanych jako pokarm oraz syntetyzowana jest przez mikroflorę jelitową.

R yc . 5 4- 16 . D iku m a ro l (b is -h yd ro ks yk um aryn o3,3' - mety leno - bis - hydroksyk umaryna)

Te fakty sprawiają, że u dorosłych nie spotyka się stanów niedoboru witaminy K. Na wystąpienie niedoboru tej witaminy są jednak narażone noworodki, ponieważ łożysko nie transportuje dostatecznie skutecznie witaminy K z krążenia matki do płodu i przewód pokarmowy u płodów jest sterylny bezpośrednio po urodzeniu. U zdrowych noworodków stężenie witaminy K w osoczu krwi spada bezpośrednio po porodzie, lecz wraca do normy z chwilą rozpoczęcia wchłaniania pokarmów. W razie zbyt dużego spadku stężenia protrombiny może wystąpić skaza krwotoczna.

720 / ROZDZIAŁ 54

Niedobór witaminy K. może wystąpić w stanach wadliwego wchłaniania tłuszczów spowodowanych upośledzoną czynnością egzokrynną trzustki, zaburzeniami wytwarzania i wydalania żółci, atrofią błony śluzowej jelit lub innymi chorobami charakteryzującymi się wydalaniem stolców tłuszczowych. Ponadto przyczyną niedoboru witaminy K może być wyjałowienie przewodu pokarmowego przez antybiotyki, jeśli

podaż tej witaminy w pokarmach jest niedostateczna.

PIŚMIENNICTWO Adams JS, et al: Vitamin-D synthesis and metaboiism after ultraviolet irradiation of norma! and vitamin--D-deficient subjects. JV Engl Med l982;30ó:722.

Goodman DS: Vitamin A and retinoids in heatth and disease. N Engl J Med 1984;310:1023. Norman AW, Roth J, Orci L: The vitamin D endocrine system. Endocr Rev 1982;3:331. Olson RE et al (editors): Present Knowiedge in Nutrition, 5th ed, The Nutrition Foundation, Inc, Washington, DC, 1984. Passmore R, Eastwood MA: Human Nutrition and Dietetics, Churchi!! Ljvingstone, 1986, Scott, ML: Advances in our understanding of vitamin E. Fed Proc 198O;39:273Ó. Sokol RJ: Vitamin E deficiency and neurologie disease. Annu Rev Nutr 1988;8:351. SpornMB, Roberts AB: Role of retinoids indifferentiation and carcinogenesis. Cancer Res 1983; 43:3034. SuttieJW: The metabolic role ofvitamin K. Fed Proc 1980;39:2730. Whitlon DS, et al: Mechanism of coumarin action: Significane of vitamin K epoxide reductase inhibition. Biochemistry 1978;17:1371.

-- ■ ■

i

Żywienie

5 5

Peter A. Mayes, PhD, DSc

■

WPROWADZENIE

są bardziej powszechne, np. niedobory biał-

Nauka o żywieniu bada jakościowe i ilościowe zapotrzebowanie na pokarmy niezbędne dla podtrzymania dobrego stanu zdrowia. Praktycznie biorąc znane są wszystkie składniki pokarmowe potrzebne do życia, możliwe jest bowiem utrzymywanie przy życiu zarówno zwierząt, jak i człowieka podając im pokarmy chemicznie dokładnie określone. Występują natomiast znaczne kontrowersje dotyczące zapotrzebowania ilościowego na poszczególne składniki pokarmowe szczególnie w odniesieniu do wiek~u, pici i stylu życia. Biochemia przemiany materii, przedstawiona w początkowych rozdziałach tego podręcznika, dostarczyła wiele danych pomocnych dla zrozumienia nowoczesnych koncepcji żywieniowych. W szczególności w poprzednich dwóch rozdziałach opisano role biochemiczne witamin rozpuszczalnych w wodzie i tłuszczach.

rophtahnia jako następstwo niedoboru witaminy A), składników mineralnych (niedokrwistość spowodowana niedoborem żelaza) lub kaloryczne (spowodowane głodzeniem energetycznym). Przyczyną niedoborów żywieniowych może być również wadliwe wchłanianie pokarmów (malabsorption) np. wadliwe wchłanianie witaminy B12 i folianu jest przyczyną niedokrwistości megaloblastycznej. Chociaż otyłość kojarzono zawsze z przejadaniem się w społeczeństwach bardziej rozwiniętych, coraz większą uwagę zwraca się ostatnio na wpływ nadmiernego pobierania określonego składnika pokarmowego na rozwój takich chorób jak miażdżyca i choroba wieńcowa serca, rak piersi i jelita grubego, choroby naczyń mózgowych oraz wylew krwi do mózgu oraz marskość wątroby.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Klinicznie jawne niedobory żywieniowe są rzadko spotykane w populacjach bardziej zasobnych, chociaż pewien stopień niedoborów żywieniowych może wystąpić wśród ludzi biednych lub starych, u osób o szczególnych zapotrzebowaniach żywieniowych, np. u dzieci w okresie wzrostu, kobiet ciężarnych lub karmiących, u osób chorych lub będących w okresie rekonwalescencji oraz u alkoholików. Czasami takie niedobory są wynikiem własnego wyboru np. u jaroszów lub też są Spowodowane koniecznością stosowania u niektórych chorych ograniczonej diety lub żywienia pozajelitowego. W populacjach biednych niedobory żywieniowe 4 6

l i i - . ■ ■ ■ . i: : :

kowe (choroba kwashioijkor), witaminowe (xe-

ZAPOTRZEBOWANIA ŻYWIENIOWE MOŻNA DZISIAJ USTALIĆ W tabeli 55-1 zestawiono istotne dla życia składniki pokarmowe.

ENERGIA JEST POTRZEBNA PRZY REALIZACJI WSZYSTKICH CZYNNOŚCI USTROJOWYCH Ustrój ssaków potrzebuje dostawy środków odżywczych w ilościach niezbędnych do pokrycia wydatków energetycznych związanych z wytworzeniem związków wysokoenergetycznych (głównie ATP) oraz równoważników redukujących (ZH), uczestniczących we wszystkich funkcjach ustrojowych (p. ryc. 17-1).

722 / ROZDZIAŁ 55 Tabela 55-1. Istotne (egzogenne) składniki pokarmowe Człowiek

Wybrane cechy różniące człowieka od innych gatunków

Aminokwasy

Histydyna*, izoleucyna, leucyna, metionina (cysteina"*), fenyloalanina (tyrozyna**"), treonina, tryptofan, walina

Arginina** jest niezbędna dla szczurów w okresie wzrostu. Glicyna jest niezbędna dla kurcząt, zaś tauryna dla kotów. U przeżuwaczy większość aminokwasów należy do aminokwasów endogennych. U innych zwierząt trawożemych z obfitą mikroflorą w przewodzie pokarmowym zapotrzebowanie na aminokwasy egzogenne jest mniejsze

Kwasy tłuszczowe

Kwas linolowy (kwas ara- U kotów kwas arachidonowy jest kwasem egzogenchidonowy""), kwas ot-li- nym nolenowy**"

Witaminy Rozpuszczalne w wodzie

Rozpuszczalne w tłuszczach Składniki mineralne Makromineralne

Kwas askorbinowy (C), biotyna, kobalamina (B^), kwas foliowy, kwas pantotenowy, pirydoksyna (B6), ryboflawina (Bs), tiamina (B.) Witamina A, D* K......

Większość ssaków potrafi syntetyzować witaminę C z wyjątkiem naczelnych, świnek morskich i owocowego nietoperza indyjskiego; u przeżuwaczy witaminy rozpuszczalne w wodzie nie należą do istotnych (egzogennych) składników pokarmowych. Zapotrzebowanie na te witaminy jest mniejsze u innych zwierząt trawożemych wykazujących obfitą kolonizację jelit mikroorganizmami

E, Większość gatunków potrafi wykorzystać (3-karoten

jako źródło witaminy A (retinol), natomiast koty muszą otrzymać retinol

Wapń, chlorki, magnez, fosfor, potas, sód

Śladowe (mikroele- Chrom, miedź, jod, żelazo, Wykazano, że krzem, wanad, nikiel, arsen, mangan, molibden, selen, fluorki i cyna są składnikami niezbędnymi dla menty) niektórych gatunków i być może są również cynk niezbędne dla człowieka; kobalt jest niezbędny do syntezy kobala-miny przez mikroorganizmy przeżuwacza Włókna

Niezbędne dla pełnego zdrowia

Woda

Najbardziej krytyczny składnik pokarmów

Energia

Zmienny udział węglowodanów, tłuszczów i białek w bilansie energetycznym

i

' Niezbędny u niemowląt i prawdopodobnie również u dzieci i dorosłych, ** Może być częściowo niezbędna u niemowląt. *** Cystę i na, tyrozyna i kwas arachidonowy zmniejszają zapotrzebowanie odpowiednio na metioni-nę, fenyloalaninę i kwas linolowy. **" Niektórzy badacze uważają, że kwas linoienowy nie należy do niezbędnych składników pokarmowych. ***** Jest wytwarzana przez mikroorganizmy jelitowe, dlatego trudno ustalić wielkość zapotrzebowa nia w pokarmach, ".......... Ekspozycja skóry na światło zmniejsza zapotrzebowanie na witaminę D.

ŻYWIENIE / 723

Węglowodany i tłuszcze są głównymi źródłami energetycznymi zawartymi w pokarmach Składnikami pokarmowymi dostarczającymi energię są głównie tłuszcze i węglowodany, zaś w mniejszym stopniu białka. Udział poszczególnych składników pokarmowych w bilansie energetycznym wykazuje znaczne wahania zależne

Tabela 55-2. Ciepło spalania w bombie kalorymetrycznej oraz wartość energetyczna podstawowych składników pokarmowych uzyskana przez utlenianie w ustroju człowieka Wartość energetyczna w kcal/g (kJ/g) Ciepło Energia Standarspalania uzyskana dowe w bombie przez współkaloryme- utlenianie czyntrycznej w ustroju niki mno(H> człowieka żenia * Białka 5,4 (22,6) 4,1 (17,2)" 4 (17) Tłuszcze 9,3 (38,9) 9,3 (38,9) 9(38) Węglowodany 4,1 (17,2) 4,1 (17,2) 4(17) Etanol 7,1 (29,7) 7,1 (29,7) 7 (29) Zaadaptowane wg Davidson S. i wsp.: Human Nutrition and Dietetics, Wyd. 7, Churchill Livingstone, 1979. * Standardowe współczynniki mnożenia uzyskano przez zaokrąglenie wartości ciepła spalania w bombie kalorymetrycznej z uwzględnieniem wydajności absorpcji. '" Wartości dotyczą utleniania białek z uwzględnieniem poprawki związanej z utratą grup aminowych z moczem.

od rodzaju populacji badanej. Spożycie alkoholu może stanowić znaczną część całodziennego poboru kalorycznego. Utrzymywanie się stałej masy ciała w warunkach nie zmieniającego się zapotrzebowarna energetycznego dowodzi, że wartość kaloryczna dostarczonych pokarmów jest wystarczająca dla bieżących potrzeb. Wartości kaloryczne głównych składników pokarmowych podane są w tab. 55-2. Dwa fakty wynikające z tabeli są godne zanotowania: wysoka wartość kaioryczna tłuszczu (w przeliczeniu na 1 g) w porównaniu do wartości kalorycznej węglowodanów i białek oraz wysoka wartość kaloryczna alkoholu. Zalecane zapotrzebowanie energetyczne dla wybranych populacji ludzkich zestawiono w tabeli 55-3. Wiele czynników ma wpływ na wydatek energetyczny W warunkach wyrównanego bilansu energety-

cznego pobór energetyczny jest równy jego wydatkowi. Wydatek energetyczny może się znacznie różnić zależnie od wielu czynników. Można go określić umieszczając np. zwierzęta w izolowanej komorze i mierząc wydatek energetyczny związany z utratą ciepła i określając wartość energetyczną produktów wydalanych przez ustrój. Znacznie wygodniejsze jest dokonanie pomiaru ilości zużytkowanego tlenu, bowiem w większości warunków konsumpcja I ] tlenu odpowiada ok. 4;83 kcal (20 kJ). Indywidualny wydatek energetyczny poszczególnego człowieka determinują głównie cztery czynniki: 1. Podstawowa przemiana materii. Jest to

ilość energii wydatkowanej na podtrzymywanie

Tabela 55-3. Zalecane normy dla mężczyzn i kobiet dotyczące poboru energii*

Wiek (lata) Mężczyźni Kobiety ciężarne karmiące

Masa ciała (kg)

Zapotrzebowanie energetyczne

(funty)

23-50

70

154

23-50

55

120


(MJ)

średnie

wahania

2900 2200 +300 +500

2300-3100 1600-2400

12,1 9,2

* Dane wzięte z pracy Recommended DietaryAllowances, wyd. 10, Foodand Nutrition Board, National Research Councii-National Academy of Sciences, 1989.

724 / ROZDZIAŁ 55

podstawowych czynności fizjologicznych w warunkach standardowych (osoba nie powinna spać, powinna przebywać w ciepłym pomieszczeniu, zaś pomiary wydatku energetycznego należy przeprowadzić 12 godzin po ostatnim posiłku). Podstawowa przemiana materii jest proporcjonalna do beztłuszczowej masy ciała oraz do powierzchni ciała. Jest ona większa u mężczyzn niż u kobiet, u małych dzieci, u osób gorączkujących oraz u chorych z nadczynnością tarczycy. Jest natomiast obniżona w niedoczynności tarczycy oraz w stanach głodzenia kalorycznego. Działanie termogeniczne pokarmów. Okre ślane jest również jako specyficzne dynamiczne działanie pokarmów. Stanowi ono 5-10% cał kowitego wydatku energetycznego. Jest to ilość energii wydatkowanej na trawienie oraz stymu lacje metabolizmu pod wpływem nowych substratów. Aktywność fizyczna. Jest to największa zmienna w wydatku energetycznym. Może ona wzrosnąć dziesięciokrotnie przy maksymalnym wysiłku u atletów w porównaniu z wydatkiem energetycznym w spoczynku. Temperatura otoczenia.Przy niskiej tem peraturze otoczenia wydatek energetyczny wzrasta z powodu wzmożonej termogenezy spowodowanej drżeniem z zimna, zaś u zwierząt w następstwie aktywacji termogenezy w brunat nej tkance tłuszczowej (p. str. 313). Przy tem peraturach otoczenia wyższych od temperatury krwi dodatkowa energia jest wydatkowana na chłodzenie. BIAŁKA SA ŹRÓDŁEM SWOISTYCH AMINOKWASÓW I AZOTU POTRZEBNEGO DO SYNTEZY PODSTAWOWYCH ZWIĄZKÓW AZOTOWYCH W warunkach prawidłowych białka pokrywają zapotrzebowanie na azot aminokwasowy oraz na same aminokwasy. Białka zawarte w pokarmach są trawione do aminokwasów, które dostają się do krwi. Ustrój człowieka potrzebuje 20 różnych aminokwasów do syntezy swoistych białek i innych, związków azotowych, takich jak zasady purynowe i pirymidynowe oraz hem.

Aminokwasy niezbędne (egzogenne) są aminokwasami jakich ustrój nie potrafi syntetyzować. Dlatego też muszą być dostarczane z pokarmami Do aminokwasów niezbędnych dla człowieka należą: histydyna, izoleucyna, leucyna, lizyna, metionina, fenyloalanina, treonina, tryptofan i walina (tab. 55-1). Dwa dalsze aminokwasy, cysteina i tyrozyna, mogą powstać z aminokwasów egzogennych, tj. metioniny (z niej powstaje cysteina) i fenyloalaniny (z której powstaje tyrozyna). Przy niedostatecznej ich podaży, obecność cysteiny i tyrozyny w pokarmach zmniejsza zapotrzebowanie na metioninę i fenyl o alaninę. Przy dostatecznej podaży aminokwasów egzogennych, pozostałe aminokwasy (endogenne), potrzebne do syntezy białek lub innych procesów metabolicznych, mogą powstać drogą transaminacji i innych procesów (p. str. 348). Utrzymanie wyrównanego bilansu białkowego wymaga ciągłego spożywania białka (p. również rozdz. 31) Zwierzę znajdujące się w stanie równowagi metabolicznej wymaga ciągłego pobierania białka celem pokrycia bieżących strat w zakresie aminokwasów egzogennych i azotu aminowego spowodowanych obrotem metabolicznym. Człowiek traci związki azotowe z moczem, kałem, śliną, ze złuszczającym się naskórkiem, włosami i paznokciami. Zapotrzebowanie na białko i aminokwasy egzogenne u człowieka zestawiono w tab. 55-4. Jeśli zapotrzebowanie obliczyć na podstawie masy ciała, wówczas u niemowląt i dzieci należy uwzględnić dodatkowe ilości białka na wzrost. Zapotrzebowanie na białko wzrasta u kobiet ciężarnych lub karmiących piersią, u chorych w okresie Tegeneracji tkanek po doznanym urazie, u chorych w okresie rekonwalescencji oraz przy wykonywaniu zwiększonego wysiiku fizycznego. W większości przypadków spożycie pokarmów, których wartość kaloryczna w 12% pokrywana jest przez białka, należy uważać za adekwatne. Stopień wykorzystania białek determinuje wielkość zapotrzebowania na ten składnik pokarmowy Wielkość zapotrzebowania na białko determinowana jest 3 czynnikami, tj. jakością białka, wartością kaloryczną spożytych pokarmów oraz aktywnością fizyczną.

ŻYWIENIE / 725 Tabala 55-4.Szacunkowe zapotrzebowanie na białka i aminokwasy oraz spożycie u ludzi* Spożycie Zapotrzebowanie(mg/kg (g/etobę) masy ciała/dzien)

Białka pochodzenia zwierzęcego

Niemowlęta(46 miesięcy)

Dzieci (1216 lat)

1100

1000

Dorośli 800

Dorośli (70 kg) zalecana 56

Spożycie w USA przez dorosłych 101 71

pochodzenia roślinnego

30

Aminokwasy egzogenne

(3-4 miesiące)

Histydyna

28

?

10

0,7*3

?

Izoleucyna Leucyna

70

28

10

5,3

161

42

14

0,70 0,98

Uzyna Metionina (i cysteina)

103

44

12

0,84

6,7

58

22

13

0,91

2,1

Fenyloalanina(i tyrozyna)

125

22

14

0,98

4,7

Treonina

87

28

Tryptofan

17

3,3

Walina

93

25

8,2

7

0,49

4,1

3,5

0,25

1,2

10

0,70

5,7

* Dane wzięte z pracy Recommended Dietary ASIowances, wyd, 10, Food and Nutrion Board.National Research Council-National Academy of Sciences, 1989. ** Dane wzięte; pracy Munro H. N., Crim M.; Theproteinsandamino acid.W: Goodhart R. S.r Shils M. E.: Modern Nutrition in Health and Disease. Wyd. 6, Lea and Febiger, 1980.

Jakość białka. Jakość białka ocenia się porównując zawartość aminokwasów egzogennych w spożytych pokarmach z zawartością tych składników w pokarmach gwarantujących dobry stan odżywiania. Im bardziej podobne są porównane wartości, tym wyższa jest jakość białka. Jajka i mleko zawierają białka o wysokiej jakości, które są w pełni wykorzystywane przez ustrój. Są białkami referencyjnymi w stosunku do białek innego pochodzenia przy ocenie wartości biologicznej tych ostatnich. Białka zawarte w mięsie są białkiem o wysokiej jakości. W odróżnieniu od nich wiele białek zawartych w roślinach używanych jako główne artykuły żywnościowe wykazuje względny niedobór określonych aminokwasów egzogennych, np.

kukurydza jest uboga w tryptofan i lizynę, pszenica w lizynę, zaś niektóre rodzaje fasoli w metioninę. Przy spożywaniu pokarmów mieszanych niedobór określonego aminokwasu egzogennego w jednym rodzaju białka może być wyrównywany obfitym występowaniem tego aminokwasu w drugim rodzaju białka. Takie białka określa się jako białka komplementarne (uzupełniające się), np. równoczesne spożywanie białka pszenicy i fasoli zapewnia zadowalającą jakość pobieranych aminokwasów. W takich sytuacjach łączna ilość spożywanych białek musi być większa by pokryć zapotrzebowanie na ten składnik pokarmowy. Aminokwasy, nie wykorzystane do syntezy nowych białek i niepotrzebne do innych bieżących syntez, nie są

726 / ROZDZIAŁ 55

magazynowane, lecz są rozkładane, zaś azot wydalany jest z ustroju pod postacią mocznika lub innych związków.

Wartość kaloryczna pokarmów. Ener-

gia pochodząca z oksydacji tłuszczów i węglowodanów wpływa na zapotrzebowanie białkowe, ponieważ oszczędza białka jako źródła energii. Aby właściwie i w pełni wykorzystać drogocenne białka wysokiej jakości i maksymalnie zmniejszyć zapotrzebowanie na nie, trzeba podawać niebialkowe źródła energii. Wśród nich powinny się znajdować węglowodany, aby oszczędzić białka wykorzystywane w procesie glukoneogenezy.

Aktywność fizyczna. Aktywność fizycz-

na wzmaga retencję azotu pochodzącego z rozpadu białek zawartych w pokarmach. Niedożywienie białkowe i kaloryczne są przyczyną uwiądu (marazmu) i kwashiorkoru Niedożywienie białkowo-kaloryczne obejmuje wiele zaburzeń związanych z głodzeniem i nieprawidłowym odżywianiem się. Charakteryzuje się ono nie tylko niedoborem białek, lecz i innych składników pokarmowych, takich jak witaminy i składniki mineralne. W ciężkiej postaci występuje ono u dzieci w okresie wzrostu, najczęściej w gospodarczo zacofanych krajach Azji, Afryki i Ameryki Południowej, Wyróżnia się dwie ekstremalne postacie niedożywienia białkowo-kaloryczne go: marazm (uwiąd) i kwashiorknr (p. rozdz. 62). W marazmie stwierdza się ogólne wycieńczenie spowodowane niedoborem zarówno kalorycznym, jak i białkowym. Kwashiofkor charakteryzuje się obrzękiem i niedoborem zarówno ilościowym, jak i jakościowym białek, natomiast pobór ener-

gii może być wystarczający. Często spotyka się postacie pośrednie. ZAPOTRZEBOWANIE NA GLUKOZĘ MOGĄ POKRYWAĆ RÓŻN E POSTACI E WĘG LOWODANÓW Liczne tkanki potrzebują glukozy dla swoich przemian. Nie musi ona być dostarczana jako taka z pokarmami, ponieważ może powstać z rozpadu innych węglowodanów pokarmowych, np. przez trawienie skrobi w przewodzie pokarmowym lub przez konwersję fruktozy lub galaktozy w wątrobie (p. str. 246). Glukoza powstaje również z gliccrolu (będącego produk-

tem rozpadu triglicerydów) oraz z aminokwasów glukogennych (w procesie glukoneogenezy). Choć zaleca się pobieranie 50—100 g węglowodanów na dobę, aby uniknąć ketozy i zaniku musy mięśniowej, zrównoważona dieta powinna zawierać więcej węglowodanów, by zmniejszyć ilość tłuszczów jako źródła energii. Główne artykuły żywnościowe zawierające węglowodany opisano w rozdz, 15. WŁÓKNA SĄ NIEZBĘDNE DLA UTRZYMANIA DOBREGO ZDROWIA Przez włókna zawarte w pokarmach należy rozumieć składniki błon komórkowych komórek roślinnych, które nie są rozkładane przez własne enzymy zwierząt. Do takich składników zalicza się celulozę, hemicelulozę, ligninę, gumy, pektyny i pentozany. U zwierząt trawożernych, takich jak przeżuwacze, włókna (głównie celuloza) są głównym źródłem energii po ich rozłożeniu przez mikroorganizmy do octanu, propionianu i maślanu. Te ostatnie są wchłaniane i dostają się do krążenia wrotnego. Fermentacja zachodząca w jelicie grubym może pokryć pewną część zapotrzebowania energetycznego również u człowieka (ok. 2—7% przy spożywaniu pokarmów o małej zawartości włókien). W tym procesie powstają również gazy, takie jak metan (CH4.), dwutlenek węgla (CO2) oraz wodór (H2), U człowieka duża zawartość włókien w pokarmach wywiera korzystny wpływ na konsystencję stolca. Włókna, zatrzymując wodę przy przechodzeniu treści pokarmowej przez jelita, zwiększają masę kałową i sprawiają, że ma ona luźniejszą konsystencję. Przy spożywaniu pokarmów o dużej zawartości włókien stwierdza się mniej szą częstość występowania uchyłkowatości jelit, raka jelita grubego,, chorób serca, naczyń i cukrzycy. Włókna trudniej rozpuszczalne, takie jak celuloza i lignina, występujące w otrębach pszenicy, wykazują korzystny wpływ na czynność jelita grubego, natomiast bardziej rozpuszczalne włókna roślin strączkowych i owoców, tj. gumy i pektyny, zmniejszają stężenie cholesterolu we krwi, najpewniej dzięki wiązaniu kwasów żółciowych i cholesterolu zawartego w pokarmach. Ponadto włókna rozpuszczalne zwalniają opróżnianie się żołądka, opóźniają występowania i zmniejszają nasilenie wzrostu glikemii poposiłkowej i, co za tym idzie,

ŻYWIENIE / 727

zmniejszają wydzielanie insuliny. To zjawisko jest korzystne dla chorych na cukrzycę oraz chorych przestrzegających określonej diety, pozwala ono bowiem uniknąć gwałtownego spadku glikemii, pobudzającego apetyt.

LIPIDY SĄ NIEZBĘDNE JAKO NOŚNIKI WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH ORAZ ŹRÓDŁO EGZOGENNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Choć lipidy często zapewniają znaczną część dobowego zapotrzebowania energetycznego, nie jest to ich istotna funkcja. Oprócz tego, że poprawiają one smak potraw oraz wywołują uczucie sytości, spełniają one dwie istotne funkcje w żywieniu ssaków. Są nośnikiem dla witamin rozpuszczalnych w tłuszczach oraz dostarczają egzogennych, wielonienasyconyeh kwasów tłuszczowych, których ustrój nie potrafi syntetyzować. Trzy wielonienasycowe kwasy tłuszczowe uważa się za niezbędne w diecie przynajmniej niektórych zwierząt. Są to kwas linolowy (OD 6, 18:2), kwas a-linolenowy {© 3, 18:3) i kwas arachidonowy (w 6, 20j4), Kwasy te występują w lipidach pokarmów pochodzenia roślinnego i zwierzęcego (p. tab. 16-2). Omówienie przemiany tych kwasów — p. również rozdz. 25. U człowieka kwas arachidonowy może powstać z kwasu linolowego, dlatego też przy dużej podaży tego ostatniego z pokarmami, kwas arachidonowy nic jest niezbędnym składnikiem pokarmowym. Przedmiotem dyskusji jest, czy kwas a-linolenowy jest rzeczywiście kwasem niezbędnym (egzogennym) u człowieka (p. str. 276). Niedobór kwasu linolowego spotyka się rzadko. Może on wystąpić u dzieci karmionych mlekiem odtłuszczonym oraz u chorych, u których stosuje się żywienie dożylne pozbawione tłuszczów. Podstawową funkcją niezbędnych (egzogennych) kwasów tłuszczowych jest to, że są prekursorami leukotrienów, prostaglandyn i tromboksanów (p. ryc. 25-6) działających jako „hormony miejscowe". Dieta, w której 1—2% całodobowego zapotrzebowania energetycznego jest pokrywane egzogennym kwasami tłuszczowymi, zapobiega wystąpieniu klinicznych objawów ich niedoboru.

Istnieje pewna zależność miedzy konsumpcją tłuszczów a występowaniem niektórych chorób

W licznych badaniach wykazano występowanie dodatniej korelacji między częstością występowania choroby wieńcowej serca a stężeniem cholesterolu w surowicy krwi oraz ilością spożywanych tłuszczów, w tym szczególnie nasyconych kwasów tłuszczowych (p. rozdz. 28). Ponadto stwierdzono związek między dużym spożyciem tłuszczów a występowaniem raka piersi i jeiita grubego. Głównymi źródłami nasyconych kwasów tłuszczowych dla człowieka są mięso przeżuwaczy, przetwory mleczne i utwardzona margaryna. Cholesterol występuje tylko w pokarmach pochodzenia zwierzęcego, w tym szczególnie w żółtku jaa*.

WITAMINY SPEŁNIAJĄ RÓŻNORODNE FUNKCJE BIOLOGICZNE Witaminy są organicznymi środkami odżywczymi, niezbędnymi w niewielkich ilościach w różnorodnych procesach biochemicznych, Z reguły związki te nie są syntetyzowane przez człowieka, dlatego muszą być dostarczane z pokarmami. Zapotrzebowanie dzienne na poszczególne witaminy u człowieka wyraża się w miligramach, a nawet mikrogramach. Witaminy dzieli się na dwie duże grupy, tj. na witaminy rozpuszczanie w wodzie (szczegółowo scharakteryzowane w rozdz. 53) oraz witaminy rozpuszczalne w tłuszczach (opisane bardziej szczegółowo w rozdz. 54). Do witamin rozpuszczalnych w wodzie zalicza się kompleks witamin grupy B (tiamina, ryboflawina, niacyna, kwas pantotenowy, witamina B6, biotyna, witamina B12 i kwas foliowy) oraz kwas askorbinowy (witamina C). Witaminy rozpuszczalne w wodzie po wchłonięciu przez jelita dostają się do krążenia wrotnego. Nadmiar ich jest wydalany z moczem. Większość witamin tej grupy nie jest magazynowana w ustroju w większych ilościach, co sprawia, że muszą one być ciągle dostarczane z pokarmami. Wyjątkami od reguły są kwas askorbinowy (zapasy ustrojowe wystarczają na ok, 3 miesiące), kwas foliowy (pewne ilości tej witaminy są magazynowane w wątrobie) oraz witamina B12 (zapasy tej witaminy w wątrobie wystarczają na pokrycie zapotrzebowania na kilka lat). Nadmierna podaż witamin rozpuszczalnych w

728 / ROZDZIAŁ 55

wodzie jest na ogól dobrze tolerowana. Wyjątkami od reguły są niacyna (podana pod postacią kwasu nikotynowego), kwas askorbinowy i pirydoksyna (witamina B6), których nadmiar może być przyczyną objawów ubocznych.

trawione, następnie wchłaniane w jelitach oraz wbudowywane do chylomikronów. Te ostatnie, po dostaniu się do krwi drogami limfatycznymi, są częściowo rozkładane przez tkanki obwodowe. Powstałe remnanty cnylomikro nowe są wychwytywane przez wątrobę. Wątroba jest głównym magazynem witamin A, D i K zaś tkanka tłuszczowa głównym magazynem wita-

Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach (wita-

mina A, D, E i K) zawarte są w tłuszczach pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Są one

Tabela 56-5. Zespoły chorobowe podatne na podawanie witamin. Przykłady swoistych defektów zaburzonego metabolizmu kofaktorów witaminowych ulegających korekcji przy podawaniu zwykle bardzo dużych dawek witamin" Witamina

Choroba

Biotyna Witamina B|:

Defekt biochemiczny

Kwasica propionowa Acyduria metylomalonowa

Kwas foliowy

Karboksylaza propionylo-CoA Tworzenie koenzymu kobamidowego Upośledzenie wchłaniania folianu Transport kwasu foliowego

Niacyna

Choroba Hartnupów

Pirydoksyna (witamina B 6)

Drgawki noworodków Cystationinuria Homocystynuria

Tiamina

HiperalaninemiaKwasica mlecza Dehydrogenaza pirogronianowa nowa reaktywna napodanie tiaminy

Transport tryptofanu Dekarboksylaza kwasu glutamino wego (?) Cystationinaza Syntaza cystationi nowa

"Według: Herman R. H., Stifel F. B., Greene H. L: Vitamin-deficient state and other related disease. W: Disorders of the Gastrointestinal Tract: Disorders of the Liver. Nutritionai Disorders.Grune and Stratton, 1976. Tabela 55-6.Charakterystyka „istotnych" (niezbędnych) ma kro minerałów Nazwa Funkcje Metabolizm* Choroba z nie- Choroba lub doboru lub obo b jaw y w yjaw y spowowołane naddowane niemiarem** doborem 1

Wapń

2

3

4

Składnik kościi zębów; regulacja czynności nerw ów i mięśni

Wchłanianie wymaga obecności białka wiążącego wapń. Regulacja przemiany Ca przez paratłionrton, kalcytoninę, witaminę D itd.

U dzieci krzywica. U dorosłych — osteomalacja. Może uczestniczyć w patogenezie osteoporozy

5

Źródła***

6

Objawy toksycz- Produkty mleności spowodo- czne, fasola, jawane nadmier- rzyny liściaste nym wchłanianiem Ca z przewodu pokarmowego spowodowane przedawkowaniem witaminy D, nadczynnością przytarczyc lub hiperkalcemią idiopatyczną

ŻYWIENIE / 729 ad. tab. 55-6 1

Fosfor

■

2

Składnik kości. zębów, ATP, fosforylowanych metabolitów pośrednich, kwasów nukleinowych

3

Nieznana jest kontrola wchłaniania z przewodu pokarmowego (wit. D?). Stężenia w surowicy są regulowane resorpcją zwrotną w kanalikach nerkowych Główny kation Regulowany płynu pozakomór- przez aldosteron kowego. Uczestniczy w regulacji wolemii, równowagi kwas owo zasadowej, czynności nerwów i mięśni. Składnik Na+/K+—ATP-azy Główny kation Także regulowapłynu śród ko- ny przez aldosteron mórkowego. Udział w czynności nerwów. mięśni, Na+/K+ — ATP-azy

4

U dzieci: krzywica. U dorosłych: osteomalacja

t

Sód

Potas

Chlorki

Udział w przemianie wodnej i elektrolitowej. w powstawaniu kwasu solnego w soku żołądkowym

Magnez

Składnik kości, kof aktor enzymów {kinaz, itd.)

5

6

Niski iloraz Ca:P Pokarmy bojest przyczyną gate w fosfor. wtórnej nad- przyprawy czynnoścś przytarczyc i może być przyczyną utraty masy kostnej

Przy normalnej diecie brak objawów. Różne objawy zależne od przyczyny chorobowej lub czynnika wywołującego niedobór

Nadciśnienie tę- Sól kuchenna. tnicze (u osób sól dodana do wrażliwych na pokarmów sód) *•*

Niedobór spowodowany chorobą podstawową lub stosowaniem leków moczopędnych. Objawy: osłabienie lub porażenie mięśni, splątanie Podawanie pokarmów bezsolnych niemowlętom, wymioty, podawanie leków moczopędnych, tubulopatie nerkowe Niedobór wtórny spowodowany wadliwym wchłanianiem, biegunkami, alkoholiz-

Zatrzymanie Jarzyny, owoczynności serca, ce, orzechy małe owrzodzenia jelit

Sól kuchenna

Zanik odruchów Liściaste, zielogłębokich, de- ne jarzyny (zapresja oddycha- wierające chlonia rofil)

mem

* Na ogól wchłanianie składników mineralnych wymaga białek transportowych. Wchłanianie rzadko jest całkowite. Wpływ mają tu inne składniki pokarmowe (np. szczawiany i fitany chelatują kationy dwuwartościowe). Transport i magazynowanie składników mineralnych także wymagają swoistych białek. Wydalane są z kałem (nie wchłonięte składniki pokarmowe), moczem, potem lub żółcią. ** Nadmierny pobór składników pokarmowych wywołuje objawy toksyczne. Jeśli nie są one specjalnie wymienione w tej rubryce, wówczas charakteryzują się nudnosctami, biegunkami i drazliwością. *** Zapotrzebowanie na składniki mineralne pokrywane jest przez spożywanie odpowiednich ilości produktów zbożowych (ziarna zbóż, niepolerowane), warzyw strączkowych, zielonych i liściastych jarzyn, mięsa oraz produktów mlecznych.

730 / ROZDZIAŁ 55

miny E. Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach nie są wydalane z moczem. Przy nadmiernej ich podaży mogą wystąpić objawy zatrucia (szczególnie po nadmiernej podaży witaminy A i D). W tabeli 55-5 zestawiono choroby spowodowane upośledzonym metabolizmem kofaktorów witaminowych, podatne na leczenie swoistymi witaminami. Zmniejszona dostępność witamin, spowodowana niedoborami pokarmowymi lub innymi czynnikami, np. zaburzeniami wchłaniania jelitowego, jest przyczyną swoistych zespołów niedoborowych (p. też rozdz. 53 i 54).

Składniki mineralne są niezbędne zarówno w czynnościach fizjologicznych, jak i w procesach bioch em iczn ych Składniki mineralne można arbitralnie podzielić na: I) makrom morały (niezbędne w ilościach większych niż 100 mg/d i 2) mikromineraty (pierwiastki śladowe), na które zapotrzebowanie dobowe jest mniejsze niż 100 mg. W tabeli 55-6 zestawiono właściwości makrominerałów, zaś w tab. 56-7 — właściwości elementów śladowych.

Tabala 55-7. Charakterystyka „istotnych" (niezbędnych) mikrominerałów (elementów śladowych) Nazwa

Funkcje

Metabolizm*

1

2

3

Chrom

Kobalt

Miedź Jod Żelazo Mangan

Chrom trójwartościowy, składnik „czynnika tolerancji glukozy" Potrzebny tylko jako składnik witaminy B12 Składnik oksydaz, oksydazy cytochromu c, itd. Składnik "tyroksyny i trijodotyroniny Składnik enzymów hemowych, hemoglobiny, cytochromów itd. Kofaktor hydrolaz, dekarboksylaz i transferaz. Potrzebny w syntezie glikoprotein i proteoglikanów

Jak witaminy B1S Transportowana przez albuminy, związana przez cerulopiazminę Magazynowany w tarczycy jako tyreoglobulina Transportowane przez transfaryny, magazynowanie — jako ferrytyna lub hemosyderyna. Utrata żelaza jest spowodowana krwawieniami i złuszczaniem się nabłonków

Choroba z niedo- Choroba lub obboru lub objawy jawy wywołane spowodowane nadmiarem" niedoborem 4 Objawy nietolerancji glukozy. Niedobór spowodowany żywieniem pozajelitowym Objawy niedoboru witaminy B12 Niedokrwistość niedobarwliwa, mikrocytam a. Niedobór wywołany wadliwym żywieniem. Zespół Menkesa U dzieci: matołectwo. U dorosłych: wole i niedoczynność tarczycy, obrzęk śluzowaty Niedokrwistość syderopeniczna, mikrocytarna Nieznaneuczłowieka

5 Rzadko spotykane Choroba Wilsona Nadczynność tarczycy, wole Syderoza, wrodzona hemochfomatoza Inhalacja par manganu wywołuje objawy psychozy i parki nson i zm

Źródła"

6 Pokarmy pochodzenia zwierzęcego Sól jodowana, ryby i skorupiaki morskie Żelazne naczynie do gotowania mięsa

ŻYWIENIE / 731

cd. tab. 55-7 Molibden

Składnik oksydaz (np. oksydazy ksantynowej)

Selen

Składnik peroksyda- Działa synergistycz- Niewielki niedobór zy glutationowej niez witaminą Eja- powstaje przy żywieniu potrawami ko antyoksydant wyrosłymi na gle• bach ubogich w selen. Niedobór jest najczęściej spowodowany żywieniem pozajelitowym i wadliwym żywieniem białkowo-kalorycznym

Podawany w megadawkach wywołuje wypada nie włosów, stany zapalne skóry, drazliwość

Cynk

Kofaktor licznych enzymów (dehydrogenazy mleczanowej, fosfatazy zasadowej, anhydrazy węglanowej)

Hipogonadyzm, zaburzenia wzrostu, upośledzone gojenie się ran, zaburzenia czucia smaku i węchu Niedobór wywołany żywieniem pozajelitowym lub przez acrodermałitis enteropathica

Podrażnienie przewodu żołądkowojelitowego, wymioty

Fluor*

Zwiększa twardość kości i zębów

Próchnica zębów, Fluoroza zębów osteopcroza?

Objawy niedoboru mogą być spowodowane żywieniem pozajelitowym

Woda pitna

" Nadmierny pobór mikroelementów wywołuje objawy toksyczne. Jeśli nie są one specjalnie wymieniane w tej rubryce, wówczas charakteryzują się nudnościami, biegunkami i drażliwością " Zapotrzebowanie na mikroelementy pokrywane jest przez spożywanie odpowiedniej ilości produk tów zbożowych (ziarna zbóż niepolerowane), warzyw strączkowych, zielonych i liściastych jarzyn, mięsa i produktów mlecznych. "* Fluor jest niezbędny dla wzrostu u szczurów. Pomimo, ze nie udowodniono jednoznacznie, ze jest niezbędny również dla człowieka, pierwiastek ten odgrywa określoną rolę w zapobieganiu próchnicy zębów.

ZALECANE NORMY ŻYWIENIOWE Komisja Żywienia i Żywności Narodowej Rady do Spraw Badań Naukowych (Food and Nutritional Board of the Natiooal Research Council) opublikowała listę dobowego zapotrzebowania na niezbędne składniki pokarmowe jako Zalecane Normy Żywieniowe (Recom-

mended Dietary Allowances) {tab. 55-8). Normy te dotyczą większości osób określonej populacji żyjących w zwykłych warunkach środowiskowych. Nie dotyczą one zapotrzebowania dla osób wymagających uzupełniającego lub specjalnego żywienia z powodu choroby. Dieta

powinna zawierać różnorodne potrawy, zapew-

niające pokrycie zapotrzebowania na dobrze znane i mniej dokładnie zdefiniowane składniki pokarmowe. W tabeli 55-8 podane jest dobowe zapotrzebowanie na białka, 10 witamin i 6 składników mineralnych. Mało jest jeszcze danych, by dokładnie sprecyzować zapotrzebowanie na pozostałe witaminy i składniki mineralne. Pomimo tego w tab. 55-9 podano zapotrzebowanie na te składniki, które wydaje się być zarówno bezpieczne, jak i wystarczające. Aby uniknąć stanów niedoborowych, trzeba pokryć zapotrzebowanie na wszystkie niezbędne składniki pokarmowe. Przyczynami niespeł-

732 / ROZDZIAŁ 55 Tabela 55-8. Zalecane normy żywnościowe (poprawki z r). Zabezpieczają one utrzymame dobrego 198S Witaminy rozpuszczalne w Waga Wzrost Białka (0) Wiek tłuszczach

(lata) kg

0,0-0,5 0,5-1.0 1-3 46 7-10

Dzieci

11-14 15-18 19-24 25-50 51 + 11-14 15-18 19-24 25-50 51 +

Mężczyźni

Kobiety

69 13 20 28 45 66 72 79 77 46 56 58 63 65

ft

cm

cale

13 20

BO 71

24

29 44 62 99 14S 160 174 170 101 120 128 138 143

90 112 132

28

157 176

177 176 173 157 163 164 163 160

35 44 52 52 69 70 70 68 B2 64 65 64 63

Wlt. Wit. D Wit. E a A lwV (mg -T E )— WRE) ' 375 7,5 3 375 10 4 6 400 10 77 500 10 700 10 1000 10 10 10 1000 10 10 1000 10 10 1000 10 55

13 ;A 16 24 28 45 59 56 63 63 46 44 46 50 50

10 10 10 55

B8 88 8

Tiamina (mg)

5 10 15 20 30 45 65 70 80 80 45 56 60 65 65

30 3&

0,3 0.4

40 45 45 50 60 60 60 60

0,7 0,9 1,0 1.3 1,5 1,5 1.5 1,2 1,1 1,1 1,1 1,1 1.0

da!

IOOO

800 800 800 800 800

Wrt.C (mg)

Wit. K

60 60 60 60 60

Kobiety ciężarne

60

800

10

10

65

70

1.5

Kobiety karmiące piersią

65

1300

10

12

65

35

1,6

* Równoważnik retinolu 1 równoważnik retrnolu- 1 v& retinolu lub 6 fig p-karotenu•' Jako chnlekalcyferol. 10 lig cholekalcyferolu = 400 IU witaminy D ** Równoważnik ot-tokoferolu. 1 mg atokoferolu = 1 TE■• 1 NE (równoważnik niacyny) jest równy 1 mg niacyny lub 60 mg tryptofanu zawartego w pokarmach

niania tego warunku są najczęściej ignorancja lub złe warunki ekonomiczne. Z drugiej strony występują pewne choroby społeczne spowodowane nadmiernym spożywaniem niektórych składników pokarmowych. I tak otyłość jest najczęściej spowodowana nadmiernym poborem pokarmów energetycznych. Sprzyja ona powstawaniu cukrzycy insulinoniezależnej. Nadmierne spożywanie tłuszczów, a szczególnie tłuszczów zawierających nasycone kwasy tłuszczowe, sprzy-

ja powstawaniu miażdżycy i choroby wieńcowej

serca. Również częstość występowania raka piersi, jelita grubego i gruczołu krokowego wykazuje dodatnią korelację z ilością spożywanych tłuszczów. Nadmierne spożywanie soli zwiększa częstość występowania wylewów krwi do mózgu i nadciśnienia tętniczego.

Wiele organizacji na całym świecie zajmowało się badaniem składu różnorodnych diet i wydawało zalecenia mające na celu poprawę od-

Tabela 55-9. Dobowe zapotrzebowanie na wybrane witaminy i składniki mineralne. Podane ilości są zarówno wystarczające, jak i bezpieczne. wnam Wiek (lata)

Bio-

ny

Pierwiastki śladowe

pannowy

Mied*

Mangan

Fluorki

(n»9)

(me)

(mg)

Chrom (mg)

Elektrolity Molibden

ę.

d-9)

Sód (mg)

Potas

Chlorki

(mg)

(mg)

(mg) Nitimowlęta

0-0,5 0.5 1

10 15

2 3

0,4-0,6 0.6-0.7

0,3-0,6 0,6-1,0

0.1-0,5 0,2-1,0

0,01-0,04 0,02-0,06

15-30 20-40

115-350 250 750

350-925 276-700 425-1275 400 1200

Dzieci

1-3 4-6

20 25 30

3 3-4 4-6 47

0,7-1.0 1,0-1,5 1,0-2.0 1,5-2,5

1,0-1,5 1,5-2,0 2,0-3.0 2,0-5,0

0,5-1.5 1,0-2,5 1,5 2.5 1,5-2,5

0,02-0,08 0,03-0,12 0,05 0.2 0,05-0,2

25-EO 30-75 60-150 75-250

326 »7S 450-1350 500 1800 900-2700

550-1650 775-2325 1000-3000 1525-4575

S00 1500 700-2100 młodzież 7-10 925-2775 > 11 30-100 14004-7 Dorośli 30-100 1,5-3,0 2,0-5,0 1,5-4,0 0,05-0,2 75-250 1100-3300 1875-6625 4200 17005100 Tir,-3 i 55-9 wzięto z: Recommended DietaryAllowances Wyd.iO.Foodand Nutrition Board, National Research Council-Natianal Academy of Science, 1989

ŻYWIENIE / 733 stanu odżywienia dla większości zdrowych mieszkańców Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej Witaminy rozpuszczalna wodzie RybOf lawina (mg)

Niaeyna (mg NE)*"*

Wił. B, (mg)

w

F o lian
Składniki mineralne Wit.B l>9)

1t

Wapń (mg)

Fosfor (mg)

Magnez (mg)

Żelazo (m 6)

Cynk (mg)

Jod (|.g>

Selen Cug)

0.4 0,5

5 6

0,3 0,6

25 35

0,3 0,5

400 600

300 500

40 60

6 10

5 B

40 50

10 15

0.8 1,1 1,2

S 12 13

1,0 1,1 1,4

50 75

0.7 1,0 1.4

800

• oo

80 120 170

10 10 10

10 10 10

70 90 120

800

800 800 800

20 20 30

1.5 1,8 1.7 1,7 1,4

17 20 19 19 1B

1,7/' 2,02,0 2,02,0

150 200 200 200 200

2,0 2.0 2,0 2.0 2,0

1200 1200 1200 800 800

1200 1200 1200 800 800

270 400 350 350 350

12 12 10 10 10

15 15 15 15 15

150 150 150 150 150

40 50 70 70 70

1,3 1,3 1,3 1,3 1.2

1B 16 15 15 13

1,4 1,5 1,6 1,6 1,5

150 iao 180 180 180

2,0 2.0 2,0 2,0 2,0

1200 1200 1200 800 800

1200 1200 1200 800 800

280 300 280 280 280

15 15 15 15 10 '

12 12 12 12

(i 12

150 150 150 150 150

45 50 56 55 55

1.6

17

2,2

400

2,2

1200

1200

320

30

16

175

65

i.B

20

2,1

280

2,6

1200

1200

3B6

15

19

200

75

aoo

żywiania się człowieka. Zalecenia te można podsumować w sposób następujący: 1. Przy występowaniu nadwagi należy zmniejszać wartość kaloryczną diety, aby osiąg nąć prawidłową masę ciała. Należy stopniowo zmniejszać ilość spożywa nych tłuszczów zastępując je węglowodanami. Większość węglowodanów należy spoży wać pod postacią wielocukrów, a nie cukrów prostych. Większość spożywanych tłuszczów po winny stanowić kwasy tłuszczowe wielo- i jednonienasycone, natomiast mniejszą część nasy cone kwasy tłuszczowe. Należy zmniejszyć spożycie cholesterolu i soli. 6, Należy zwiększać zawartość włókien w diecie.

PIŚMIENNICTWO Cummings JH: Dietary Fibrę. Brit Med Bul! 1981;37:65. Forbes JM: Metabolic aspects of the regulation of voluntary food intake and appetite. Nutr Res Rev 1988;1:145. Kritchevsky D: Dietary Fiber. Annu Rev Nutr 1988;8:3O1. Nestle M: Nutrition in Clinical Practice. Jones Medical Publications, 1985. Nielsen FH: Nutritional significance of uitratrace elements. Nutr Rev !988;46:337. Olson RE et al (editors): Present Knowłedge in Nutrition. 5th ed. The Nutrition Foundation Inc, Washington, DC, 1984. Passmore R, Eastwood MA: Human Nutrition and Dietetics, 8th ed. Churchill Livingstone, 1986, Woo R, Daniets-liush R, Horton, ES: Regulation of energy balance. Annu Rev Nutr 1985;5:411.

5 6

Trawienie i wchłanianie Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Większość spożywanych potraw nie może być wchłaniana z przewodu pokarmowego bez uprzedniego trawienia do mniejszych cząsteczek. Proces dezintegracji naturalnych środków spożywczych do postaci wchłanialnych w przewodzie pokarmowym nazywa się trawieniem. Zmiany chemiczne związane z trawieniem zachodzą w wyniku działania enzymów hydroHtycznych zawartych w sokach trawiennych przewodu pokarmowego, katalizujących hydrolizę białek do aminokwasów, skrobi do monosacharydów i triacylogliceroli do monoacylogliceroli, glicerolu i kwasów tłuszczowych. W przebiegu tych procesów trawiennych składniki mineralne i witaminy zawarte w środkach spożywczych stają się bardziej przyswajalne. Dokładne omówienie struktury i funkcji hormonów żołądkowo-jelitowych przedstawiono w rozdz. 52. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Zaburzenia wprocesach trawiennych są przyczyną niektórych stanów chorobowych takich jak owrzodzenie żołądka spowodowane kwasem solnym soku żołądkowego albo brak HC] będący przyczyną achlorhydrii. Nieprawidłowe wydzielanie żółci jest przyczyną powstawania kamieni żółciowych i może spowodować zaburzenia w trawieniu tłuszczów. Wadliwe wchłanianie składników pokarmowych, spowodowane bardzo licznymi defektami, często jest przyczyną niedoborów pokarmowych. I tak np. upośledzone wchłanianie witaminy B12 i folianów jest przyczyną niedokrwistości, wapnia i magnezu — tężyczki, witaminy D — krzywicy

u dzieci i osteomaiacji u dorosłych. W zespole wadliwego wchłaniania występują ww. i inne jeszcze zaburzenia. Niedobór laktazy jest przyczyną nietolerancji mleka, zaś zaburzenia wchłaniania aminokwasów obojętnych — choroby Hartnupów. PROCES TRAWIENIA ROZPOCZYNA SIĘ W JAMIE USTNEJ Ślina wydzielana przez ślinianki składa się w 99,5% z wody. Sprawia ona, że pokarmy stają się lepkie i śliskie, co jest ważne w procesie żucia i połykania. Dodanie wody do suchych pokarmów umożliwia rozpuszczanie niektórych składników pokarmowych i rozpoczęcie trawienia przez hydrolazy. Przez żucie pokarmy ulegają rozdrobnieniu, dzięki czemu wzrasta ich rozpuszczalność i powierzchnia oraz podatność na działanie enzymów. Ślina jest również płynem, z którym są wydalane niektóre Jęki (np. etanol i morfina), nieorganiczne jony, takie jak K+, Ca2+, HCOj i rodanki (SCN") oraz jod i immunoglobułiny (IgA). pH śliny wynosi najczęściej 6,8, chociaż może być wyższe i niższe od pH obojętnego. Ślina zawiera amylazę i lipazę Amylaza zawarta w ślinie wykazuje zdolność rozkładania skrobi i gŚkogenu do maltozy. Proces ten nie ma jednak większego znaczenia dla ustroju, ponieważ pokarmy przebywają w jamie ustnej krótko, a amylaza śliny ulega inaktywacjj przy pH 4,0 lub niższym, co oznacza, że jest nieczynna w kwaśnej treści żołądkowej. U licznych zwierząt amylaza w ogóle nie występuje w ślinie. Gruczoły Ebnera, położone na grzbiecie języka, wytwarzają lipazę ,Językową".

TRAWIENIE I WCHŁANIANIE / 735

TRAWIENIE BIAŁEK ROZPOCZYNA SIĘ W ŻOŁĄDKU Błona śluzowa żołądka wydziela sok żołądkowy. Jest on płynem przejrzystym o zabarwieniu lekko żółtawym i pH ok. 1,0, zawierającym 0,2—0,5% HC1. Zawartość wody w soku żołądkowym wynosi 97—99%. Pozostałe składniki to: mucyna, sole nieorganiczne, enzymy trawienne (pepsyna yrennina) i lipaza. Kwas solny denaturuje białka i zabija bakterie Źródłem kwasu solnego są komórki okładzinowe błony śluzowej żołądka. Jest on wynikiem reakcji przedstawionych na ryc. 56-1. Proces ten jest podobny do transportu chlorkowego opisanego dla krwinek czerwonych. Istnieje również pewne podobieństwo do mechanizmu wydzielania HT przez komórki kanalików nerkowych, w którym źródłem jonów H+ jest kwas węglowy (H2CO?) powstały z CO2 i H2O w wyniku działania anhydrazy węglanowej. Wydalanie zasadowego moczu po spożyciu pokarmów jest wynikiem powstawania wodorowęglanu w procesie wydzielania kwasu solnego. Wydzielanie H+ do światła żołądka jest aktywnym procesem, w którym uczestniczy błonowa H+/K+-ATP-aza. Enzym ten, w odróżnieniu od Na+/K.+-ATP-azy jest niewrażliwy na ouabainę. Komórki okładzinowe żołądka zawierają liczne mitochondria potrzebne do produkcji ATP napędza-

jącego H+/K+-ATC-azę. Jon HCO^ przenika do osocza, zaś miejsce jego zajmuje Cl . Wydzielanie tego ostatniego do światła żołądka jest sprzężone z wydzielaniem H+. W następstwie kontaktu z kwasem solnym, białka ulegają denaturacji, tj. dochodzi do utraty struktury trzeciorzędowej w wyniku rozerwania wiązań wodorowych. W wyniku tego procesu łańcuchy polipeptydowe ulegają „wyprostowaniu" stając się bardziej dostępne na działanie enzymów proteolitycznych (proteaz). Niskie pH treści żołądkowej wywiera ponadto działanie bakteriobójcze na mikroorganizmy zawarte w treści żołądkowej. Pepsyna rozpoczyna trawienie białek Trawienie białek jesti^łówną funkcją żołądka. Pepsyna wytwarzana jest przez komórki główne pod postacią nieczynnego zymogenu-pepsynogemi. Ten ostatni ulega aktywacji pod wpływem jonów wodorowych. W procesie tym zostaje odszczepiony protekcyjnie działający polipeptyd odsłaniając aktywną pepsynę. Z kolei aktywna pepsyna szybko aktywuje dalsze cząsteczki pepsynogenu (proces ten określa się jako autokatalizę). Pepsyna rozkłada zdenaturowane białko do proteoz, a następnie do peptonów. które są dużymi polipeptydami. Pepsyna jest endopeptydazą rozkładającą wiązanie peptydowe znajdujące się w obrębie głównej struktury polipeptyd owej, a nie wiązania peptydu przylegającego do C- lub N-końców. Te

Osocze Komórki okładzinowe

J

światło żołądka

cr Ryc. 56-1. Wytwarzanie kwasu solnego w żołądku. ©, H y. K+-ATP-a;a.

736 / ROZDZIAŁ 56

ostatnie wiązania są atakowane przez egzopeptydazy. Pepsyna hydrolizuje wiązania peptydowe utworzone przez aminokwasy aromatyczne (np. przez tyrozynę) lub dikarboksylowe (np. przez glutaminian). Ren ni na (chymozyna) wywołuje koagulację mleka Enzym ten jest ważny dia procesów trwawiennych u niemowląt, zapobiega on bowiem szybkiemu przedostawaniu się mleka z żołądka do jelit. W obecności wapnia rennina przekształca w sposób nieodwracalny kazeinę do parakazeiny, na którą działa z kolei pepsyna. Rennina nie występuje w żołądku osób dorosłych. Stosuje się ją w produkcji sera. Lipazy kontynuują trawienie triacylogliceroli Temperatura panująca w żołądku jest istotna dla procesu przekształcania tłuszczów stałych, zawartych w pokarmach do postaci płynnej. Temu procesowi towarzyszy powstawanie emulsji tłuszczowych. Proces ten wspomagają ruchy perystaltyczne żołądka. Sok żołądkowy zawiera lipazę „żołądkowa"' katalizującą hydrolizę triacylogliceroli złożonych z kwasów tłuszczowych o krótkich lub dłuższych łańcuchach. Ponadto lipaza ślinowa może kontynuować swoje działanie w żołądku pomimo niskiegio pH treści żołądkowej dzięki obecności emulsji tłuszczowych. Ponieważ czas przebywania pokarmów w żołądku wynosi 2—4 h, może tu zostać strawione aż 30% spożytych triacylogliceroli. Lipaza ślinowa działa silniej na triacyloglicerole zawierające kwasy tłuszczowe o krótszych łańcuchach i jest bardziej swoista dla wiązania estrów w pozycji m-3 niż I. Tłuszcze występujące w mleku zawierają kwasy tłuszczowe o krótkich lub średnio długich łańcuchach, estryfikowane przeważnie w pozycji sn-3. Dlatego też wydaje się, że tłuszcze zawarte w mleku są szczególnie dobrym substratem dla lipazy ślinowej. Uwolnione pod jej wpływem krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe przedostają się poprzez ścianę żołądka do żyły wrotnej, podczas gdy długołańcuchowe kwasy tłuszczowe rozpuszczają się w kroplach tłuszczowych zawieszonych w treści żołądkowej i transportowane są do dwunastnicy.

PROCES TRAWIENIA JEST KONTYNUOWANY W JELITACH Zawartość żołądka, czyli miazga pokarmowa, przedostaje się małymi porcjami w sposób nieciągły poprzez „zastawkę" odźwiernikową do światła dwunastnicy. Sekrecja zasadowego soku trzustkowego i zasadowej żółci jest przyczyną neutralizacji miazgi żołądkowej i przesunięcia jej pH w kierunku zasadowym. To przesunięcie pH w kierunku zasadowym jest niezbędne dla aktywności enzymów soku trzustkowego i jelitowego. Równocześnie przy takim pH dochodzi do zahamowania aktywności pepsyny. Żółć tworzy zawiesinę, zobojętnia miazgę żołądkową i jest wydzieliną, za pośrednictwem której zostają wydalone cholesterol i barwniki żółciowe Oprócz wielu innych funkcji w pośredniej przemianie materii wątroba jest miejscem produkcji żółci odgrywającej ważną rolę w procesie trawienia pokarmów. Pęcherzyk żółciowy magazynuje żółć wytwarzaną w okresach między posiłkami. W czasie trawienia pokarmów pęcherzyk żółciowy obkurcza się szybko dostarczając żółć przez przewód żółciowy wspólny, do światła dwunastnicy. Sok trzustkowy zostaje wymieszany z żółcią tuż przed jego dostaniem się do dwunastnicy. A. Skład żółci. Skład żółci zawartej w prze wodach żółciowych śródwątrobowych różni się od składu żółci w pęcherzyku żółciowym. Jak widać w tab. 56-1 ta ostatnia jest bardziej zagęszczona. B. Właściwości żółci

1. Tworzenie zawiesin. Sole kwasów żó-

łciowych wykazują zdolność zmniejszania napięcia powierzchniowego. Dzięki tej właściwości kwasów żółciowych tłuszcze ulegają zawieszeniu (tworzą emulsję)^' zaś kwasy tłuszczowe i nierozpuszczalne w wodzie mydła — rozpuszczeniu. Obecność żółci w świetle jelit w istotnym stopniu wspomaga zarówno trawienie, jak i wchłanianie tłuszczów oraz witamin rozpuszczalnych w tłuszczach (witaminy A, D, E i K). W razie upośledzenia trawienia tłuszczów również trawienie innych składników pokarmowych zostaje upośledzone; tłuszcze bowiem, tworząc warstwę na spożytych pokarmach, uniemożliwiają trawienie ich przez enzymy. W tych warunkach drobnoustroje jelito we, ata-

TRAWIENIE I WCHŁANIANIE / 737 Tabela 56-1 Skład żółci wątrobowej i pęcherzykowej Żółć wątrobowa natywna procentowa procentowa zawarzawartość tość w stow całej sunku do żółci wszystkich składników

Żółć pęcherzykowa procentowa zawartość w ca-lej żółci

stałych Woda

2,52

— —

Kwasy żółciowe

1,93

36,9

9,14

Mu cyna i barwiki żółciowe

0,53

21,3

2,98

Cholesterol

0,06

2,4

0,26

Kwasy tłuszczowe estryfikowane i nieestryfikowane

0,14

5,6

0,32

Sole nieorganiczne

0,84

33,3

0,65

1,01

_

1,04

—

6,9-7,7

Składniki stałe

Gęstość

PH

97,00

7,1-7,3

85,92 14,08

kując nie strawione pokarmy, są przyczyną wystąpienia procesów gnilnych i tworzenia się gazów. Zobojętnienie treści żołądkowej. Oprócz zdolności tworzenia zawiesin, żółć wy kazując pH nieco wyższe niż 7,0, neutralizuje kwaśną miazgę żołądkową, przygotowując ją do trawienia w jelicie. Wydalanie cholesterolu. Żółć jest ważną wydzieliną, z którą wydaiane są nie tylko cholesterol i kwasy żółciowe, lecz także liczne leki, toksyny, barwniki żółciowe oraz różnorod ne substancje nieorganiczne, takie jak miedz, cynk i rtęć. Ograniczona rozpuszczalność cho lesterolu w żółci jest przyczyną tworze nia się kamieni żółciowych. Wolny chole sterol jest praktycznie nierozpuszczalny w wo dzie; dlatego też w żółci występuje w micelach złożonych z fosfatydylocholiny i soli kwasów żółciowych (p. str. 187). W rzeczywistości rów nież fosfatydylocholina (główny fosfolipid żó łci) jest nierozpuszczalna w żółci, ulega ona jednak rozpuszczeniu dzięki soi om kwasów 47

żółciowych tworząc z nimi micele. Tak więc duże ilości cholesterolu zawarte w żółci człowieka ulegają solubilizacji dzięki rozpuszczalnym w wodzie micelom i transportowi przez drogi żółciowe do światła jelit. Aktualna rozpuszczalność cholesterolu w żółci zależy jednak od stosunku stężenia soli kwasów żółciowych do stężenia fosfatydylocholiny i do stężenia cholesterolu. Rozpuszczalność ta zależy również od zawartości wody w żółci. Ten fakt jest szczególnie ważny dla rozcieńczonej żółci wątrobowej. Używając układu trójkątnych współrzędnych (ryc. 56-2) Redinger i Smali byli w stanie określić maksymalną rozpuszczalność cholesterolu w żółci pęcherzykowej. W podanym układzie każdy punkt (determinowany trzema zmiennymi) znajdujący^ię ponad krzywą ABC dotyczy żółci przesyconej cholesterolem lub w której dochodzi do wytrącenia tego lipidu. Przyjmuje się, że uchorych z kamicą żółciową w pewnym okresie ich życia wytwarzana jest żółć przesycona cholesterolem. W pewnym momencie, pod wpływem sprzyjających czynników, stanowiących jakby jądro krystalizacyjne (np. infekcja bakteryjna) dochodzi do wytrącenia kryształków cholesterolu. Jeśli tak powstałe kryształki nie zostają szybko wydzielone z żółcią do światła jelita, mogą. one rosnąć, tworząc kamienie żółciowe. Kiedy oznaczono aktywność głównych enzymów syntetyzujących kwasy żółciowe w wątrobie u chorych z kamicą żółciową, stwierdzono małą ich aktywność, natomiast zwiększone wytwarzanie cholesterolu przez hepatocyty z następczym wzrostem stężenia tego lipidu w wątrobie. Wydaje się, że spadek aktywności 7a-hydroksylazy jest przyczyną zmniejszenia się pufi kwasów żółciowych w krążeniu jejitowo-wątrobowym, będącego dla wątroby sygnałem zapoczątkowującym wzrost syntezy cholesterolu. Skutkiem wzmożonej syntezy cholesterolu przez hepatocyty jest przesycenie żółci tym steroidem, który nie jest w stanie rozpuścić się całkowicie w micelach złożonych z fosfatydylocholiny i soli kwasów żółciowych. Podane informacje dotyczące rozpuszczalności cholesterolu wykorzystano w próbach klinicznych mających na celu zapobieganie powstawaniu nowych kamieni żółciowych lub rozpuszczanie już wytworzonych. Kwas chenodeoksycholowy wydaje się być lekiem przydatnym w leczeniu zachowawczym bezobjawowych i bezcieniowych kamieni żółciowych zlokalizowanych w pęcherzyku żółciowym. Ten kwas

738 / ROZDZiAŁ 56 60

40

Dwie lub więcej faz (kryształki cholesterolu płyn mioelamy)

-Procent soli kwasów ------------------\ Żółciowych Ryc. 56-2. Metoda prezentacji trzech głównych składników żółci {sole kwasów żółciowych, fosfatydylocholina i cholesterol) w układzie współrzędnych trójkątnych Każdy składnik wyrażony jest w procentach łącznej Ilości soli kwasów żółciowych, fosfatydylocholiny i cholesterolu wyrażonej w molach. Linia ABC przedstawia maksymalną rozpuszczalność cholesterolu w roztworach o zmiennej zawartości soli kwasów żółciowych i fosfatydylocholiny. Punkt P oznacza normalny skład żółci, przy którym zawartość cholesterolu wynosi 5%, fosfatydylocholiny 15% i soli kwasów żółciowych 80%. Znajduje się on w obrębie strefy pojedynczej fazy płynu micelarnego. Żółć o składzie wyznaczonym punktami znajdującymi się powyżej linii ABC zawiera nadmiar cholesterolu w postaci roztworu przesyconego lub wytrąconej (jako kryształki lub płynne kryształki). (Według: Redinger R. N., Smali D. M.: Bile composition, bile salt metabolism, and gallstones; Arch. intern. Med. 1972, 130, 620. Copyright © 1972, American Medical Association, za zgodą).

żółciowy wywiera bowiem swoiste działanie hamujące na reduktaze hydroksymetyloglutarylo-CoA, przez co zmniejsza syntezę cholesterolu w wątrobie.-vi. 5. Przemiana barwników żółciowych. Powstawanie barwników żółciowych z hemoglobiny zostało przedstawione w rozdz. 34. Sok trzustkowy zawiera enzymy atakujące wszystkie główne składniki pokarmowe Sok trzustkowy jest wodnistym, nielepkim płynem podobnym do śliny pod względem zawartości wody, zawierającym trochę białka i inne składniki organiczne i nieorganiczne, w tym głównie Na + , K+, HCO^" i chlorki oraz małe ilości Ca2 + , Zn2 + , HPOJ" i SO*". pH soku trzustkowego jest zdecydowanie zasadowe, waha się od 7,5 do 8,0 lub jest nawet wyższe. Sok trzustkowy zawiera liczne enzymy. Niektóre z nich wydzielane są jako zymogeny.

Trypsyna, chym otrypsyna i elast aza są endopeptydazami. Aktywność proteolityczna soku trzustkowego uwarunkowana jest obecnością 3 endopeptydaz, tj. trypsyny, chymotrypsyny i elastazy. Działają one na białka i polipeptydy treści żołądkowej. W wyniku ich działania powstają polipeptydy i (lub) peptydy. Trypsyna działa swoiście na wiązania peptydowe utworzone przez aminokwasy zasadowe, zaś chymotrypsyna na wiązania peptydowe utworzone przez aminokwasj pozbawione ładunku elektrycznego (np. aminokwasy aromatyczne). Wbrew swojej nazwie elastaza działa na wiele wiązań peptydowych utworzonych przez małe aminokwasy, np, glicynę, alaninę i serynę. Wszystkie 3 wymienione enzymy sa, wydzielane pod postacią zymogenów. Konwersja trypsynogenu do trypsyny katalizowana jest przez enzym proteolityczny błony śluzowej jelita — enterokinaze. Ta ostatnia, działając na wiązanie peptydowe utworzone przez lizynę odszczepia mały polipeptyd od zymogenu. W wyniku tego dzia-

TRAWIENIE I WCHŁANIANIE / 739

lania cząsteczka trypsyny rozprostowuje się, co jest równoznaczne z odsłonięciem jej aktywności proteolitycznej. Powstała aktywna postać trypsyny działa nie tylko na dalsze cząsteczki trypsynogenu, lecz również na inne zymogeny soku trzustkowego, przekształcając je w aktywne enzymy. I tak pod jej wpływem chymotrypsynogen ulega przekształceniu do chjmotrypsyny, proelastaza do elastazy i prokarboksypeptydaza do karboksyjpeptydazy.

Karboksypeptydaza jest egzopepty-

dazą. Powstałe pod wpływem endopeptydaz polipeptydy ulegają dalszemu rozkładowi hydrolitycznemu przez egzopeptydazę karboksypeptydazę. Enzym ten działa na C-końcowe wiązania peptydowe uwalniając pojedyncze aminokwasy.

Amylaza rozkłada skrobię i glikogen.

Aktywność amylolityczna soku trzustkowego uwarunkowana jest obecnością oc-amylazy trzustkowej. Działanie jej jest podobne do amylazy ślinowej. Rozkłada ona skrobię i glikogen do maltozy, maltotriozy (składającej się z 3 reszt ot-glukozowych połączonych ze sobą wiązaniami w położeniu 1 -»4), rozgałęzionych a-dekstryn (rozgałęzienia uwarunkowane są wiązaniami między dwoma cząsteczkami glukozy w położeniu 1-^6), nierozgałęzionych oligosacharydów4 glukozy.

Lipaza rozkłada pierwszorzędowe wiązanie esterowe triacylogliceroli. Li-

paza trzustkowa działa na granicy fazy wodnej i tłuszczowej kropelek tłuszczowych, utworzonych w przewodzie pokarmowym przez mechaniczne wytrząsanie treści pokarmowej w obecności produktów działania lipazy ślinowej i żołądkowej, soli kwasów żółciowych, kolipazy (jest to białko obecne w soku trzustkowym), fosfolipidów i fosfolipazy A2 {występującej również w soku trzustkowym). Zarówno fosfolipaza Aj, jak i kolipaza wydzielane są w postaci proenzymów (zymogenów). Do ich aktywacji konieczna jest hydroliza swoistego wiązania peptydowego przez trypsynę. Aktywność fosfolipazy A2 zależna jest od obecności jonów wapnia. Ograniczona hydroliza wiązania estrowego w pozycji 2 fosfolipidu przez fosfolipazę A2 (p. ryc. 25-5) sprawia, że lipaza zostaje związana przez substrat na granicy faz oraz że zachodzi szybka hydroliza triacyloglicerolu. Kolipaza, wiążąc się z fazą graniczną złożoną z soli kwasów żółciowych, triacyloglicerolu i wody, stanowi jakby kotwicę wysokiego powinowactwa dla lipazy. W wyniku całkowitej

hydrolizy triacyloglicerolu powstają glicerol i kwasy tłuszczowe. Należy jednak dodać, że odszczepienie drugiego i trzeciego kwasu tłuszczowego od cząsteczki triacyloglicerolu jest coraz trudniejsze. Działanie hydrolityczne lipazy trzustkowej jest prawie swoiste dla pierwszorzędowych wiązań estrowych, tj. dla wiązania estrowego w pozycji 1 i 3 triacylogliceroli. W czasie trawienia tłuszczów faza wodna lub „micelarna" zawiera micele o kształcie dysków i liposomy złożone z soli kwasów żółciowych nasycone produktami hpolizy (p. ryc. 15-34). Ze względu na trudności hydrolizy drugorzcdowego wiązania estrowego w cząsteczce triacyloglicerolu, wydaje się, że dochodzi najpierw do odszczepienia kwasów tłuszczowych w pozycji 1 i 3 i powstania 2-monoacyl o glicerolu. Ponieważ kwas tłuszczowy tego ostatniego związku związany jest z glicerolem drugorzędowym wiązaniem estrowym, musi on ulec, przed ostatecznym odszczepieniem się od glicerolu, izomeracji z wytworzeniem pier wszo rzędowego wiązania estrowego. Proces izomeracji jest jednak procesem powolnym. Ten fakt sprawia, że 2-monnglicerole są głównymi produktami końcowymi trawienia triacylogliceroli oraz że mniej niż \U spożytych tłuszczów jest całkowicie rozkładana do glicerolu i kwasów tłuszczowych (ryc. 56-3).

Estry cholesterolowe są rozkładane przez swoistą hydrolazę. W warunkach

panujących w świetle jelita estry cholesterolowe ulegają rozkładowi przez hydrolazę estrów cholesterolowych (esteraze cholesterolową). Tak więc w jelitach wchłaniany jest wolny (nieestryfikowany) cholesterol.

Rybonukleaza (RNA-za) i deoksyrybo-

nukleaza (DNA-za) warunkują trawienie kwasów nukleinowych zawartych w pokarmach (p. rozdz. 38 i 39).

Fosfolipaza A3 katalizuje hydrolizę drugorzędowego wiązania estrowego glicerolofosfolipidów zarówno pochodzenia żółciowego, jak i pokarmowego. W wyniku działania fosfolipazy A2 powstają lizofosfolipidy.

Enzymy soku jelitowego kończą proces trawienia Sok jelitowy, wydzielany przez gruczoły dwunastnicze (Brunnera) i jelitowe (Lieberkuhna), zawiera enzymy trawienne. Wśród nich należy wymienić następujące: 1. Aminopeptydazę (Jest to egzopeptydaza atakująca N-końcowe wiązania peptydowe po-

740 / ROZDZIAŁ 56 ŚWIATŁ O JELITA

Absorpcja z micel; złożonych z so!i

kwasów

żółciowych

|----I-----Aeyl I-- - -Aeyl Chyiomlkrony

*-Gliceroi

Ryc. 56-3. Trawienie i wchłanianie triacylogliceroli. FA — długołań cuch owe kwasy tłuszczowe, (Według: Mattson F. H., Volpenheim R. A.: The digestion and absorption of triglycerides; J. Biol. Chem., 1964, 239, 2772 w modyfikacji autora rozdziału). ____

Hpeptydów i oligopeptydów) i dipeptydazy (wykazują różną swoistogg, niektóre z nich znajdują się w obrębie nabłonka jelitowego rozkładając dipeptydy do wolnych aminokwasów). Swoiste disacharydazy i oligosacharydazy, np. a-glukozydazę zwaną również maltazą (en zymy te katalizują odszczepienie pojedynczych reszt cukrowych oligosacharydów i disacharydów wykazujących wiązanie ot (1 -» 4) glikozydowe, rozpoczynając to działanie od nieredukującego końca), izotnaltazę czyb' a -dekstrynazę (hydrolizującą wiązania 1 -» 6 glikozydowe a dekstryn), p-galaktozydazę czyli laktazę (odszczepia galaktozę od laktozy), sacharazę (hydrolizującą sacharozę) i trehalazę (hydroliżującą trehaioze). Fosfatazę (usuwającą resztę fosforanową z organicznych związków fosforanowych np. heksozofosforanów, glicerofosforanów i nukleotydów powstałych w wyniku trawienia kwa-

sów nukleinowych zawartych w pokarmach przez nukleazy), Polinukleotydazy (rozkładające kwasy nu kleinowe do nukleotydów). Nukleozydazy (określane również jako fosforylazy nukleozydowe —■ katalizują fosforolizę nukleozydow do wolnych zasad purynowych lub pirymidynowych i pentozofosforanów). Fosfolipazę (enzym'ten, zawarty w soku jelitowym, rozkłada foslblipidy do glicerolu, kwasów tłuszczowych, kwasu fosforowego oraz zasady, takiej jak cholina).

Większość produktów trawienia ulega asymilacji

Końcowym skutkiem działania opisanych wyżej enzymów trawiennych jest rozłożenie składników pokarmowych zawartych w pożywieniu do postaci, w której mogą być wchłaniane i przyswajane. Końcowymi produktami tra-

TRAWIENIE 1 WCHŁANIANIE / 7*1

wiema węglowodanów są monosacharydy (głównie glukoza), białek ~ aminokwasy, triacylogliceroli — kwasy tłuszczowe, glicerol i monoglicerole, zaś kwasów nukleinowych — zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy i pentozy. Polisacharydy błon komórkowych komórek roślinnych oraz ligniny zawarte w pożywieniu

nie są trawione przez enzymy ssaków. Tworzą one tzw. włókna pokarmowe i stanowią większość nie strawionych resztek pokarmowych. Włókna, oprócz tego że tworzą masę kałową, spełniają inne ważne funkcje (p. rozdz. 55). W tabeli 56-2 zestawiono ważniejsze procesy trawienne.

Tabela 56-2. Zestawienie procesów trawiennych Enzym

Miejsce i bodziec wydzielania

Sposób aktywac ji i optymalne warunki działania

Siinianki: wydzielają ślinę

Arnylaza śli-

Konieczna

w następstwie odruchu wyzwolonego obecnością pokarmu w jamie ustnej

nowa

ność chlorków, pH

Gruczoły jeżyka

obec-

Substrat

Produkty działania Bfizymu

Skrobią, ^gli-

Maltoza, 1:6-glu-

kogen

kozydy (oligosacharydy) i maltotrioza

6,6-6,8 Lipaza „języ-

pH 2,0-7,5 optymalne

Wiązanie est-

Kwasy tłuszczo-

kowa"

pH 4,0-4,5

rowe pierwszorzedowe w pozycji sn-3, utworzone przez kwasy tłuszczowe krótkofańcuchowe

we i 2,3-diacyloglicerole

Gruczoły żołądka: komórki

Pepsyna A

Konwersja pepsyno-

Białka

Peptydy

gtówne i okładzinowe wydzielają sok żołądkowy pod wpływem bodźca odruchowego lub gastryny

(dno żołądka) Pepsyna B (część odźwiernikowa) Rennina

genu do aktywnej pepsyny przez kwas solny, pH 1,0-2,0 Do aktywacji potrzebne są Ca1+, pH 4,0

Kazeina mleka

Wytrącanie kazeiny

Trypsyna

Konwersja irypsyno-

Białka

Potipeptydy

genu do aktywnej trypsyny przez enterokinazę jefitową przy pH 5,2-6,0. Auto kata lityczna aktywacja przy pH 7,9

Peptydy

Di peptydy

Chymotrypsy-

Wydzielana jako chy-

Białka

Te same jak przy

na

motrypsy nogen, Ulega konwersji do aktywnej chymotrypsyny przer trypsynę, pH8,0

Peptydy

irypsynie, silniej wytrąca kazeinę mleka

Trzustka: obecność kwaśnej treści żołądkowej w świetle dwunastnicy pobudza: 1) wydzielanie sekretyny przez błonę śluzową dwunastnicy, sekretyna z kolei stymuluje wydzielanie soku trzustkowego oraz 2) wydzielanie cholecystokininy stymulującej sekrecję enzymów trzustkowych

742 / ROZDZIAŁ 56 H tab. 56-2 Miejsce i bodziec wydzielania

Enzym

Sposób aktywacji i optymalne warunki działania

enzymu

Wydzielana pod po-

Białka

Poli peptydy

Peptydy

Dipeptydy

Karboksypep-

stacią proelastazy. ulega aktywacji przez trypsynę Wydzielana jako pro-

C-końcowe

Niskocząsteczko-

tydaza

karboksypeptydaza. aktywowana przez trypsynę

po li peptydy

we peptydy, wolne aminokwasy

Amylaza

pH 7,1

Skrobia,

Maltoza,

glikogen

-glukozydy (oligosacharydy) i maltotrioza

Lipaza

pęcherzyk

Produkty działania

Elastaza

trzustkowa

Wątroba i

Substrat

1:6-

Aktywo wa n e przez

Pierwszorzę-

Kwasy tłuszczo-

sole kwasów żółciowych, fosfolipidy i kolipazę, pH 8,0 Rybonuklea-

dowe wiązania estrowe triacylogliceroli Kwasy rybo-

we, monoacyloglicerole, diacyloglicerole, glicerol Nukleotydj'

za Deoksyrybo-

nukleinowe Kwasy deok-

Nukleotydy

nukleaza

syrybonukleinowe Estry chole-

Wotny choleste-

Hydrolaza es-

Aktywowana przez

trów cholesterolowych

sole kwasów żółciowych

sterolowe

Fosfolipaza

Wydzielana

Fosfolipidy

Aj

proenzym aktywowany przez trypsynę iCa 2+

(Sole

jako

rol i kwasy tłuszczowe Kwasy tłuszczowe, lizofosfolipi-

dy

kwa-

Tłuszcze oraz

Koniugaty kwa-

żółciowy. Cholecystokinina, hormon btony śluzowej jelita a prawdopodobnie również gastryna i sekrety na, pobudzają pęcherzyk żółciowy i wydzielanie żółci przez wątrobę

sów żółciowych i zasady)

kwaśna miazga pokarmowa po neutralizacji

sów żółciowych z kwasami tłuszczowymi, delikatna zawiesina obojętnych mice li złożonych z soli kwasów żółciowych i tłuszczów oraz lip osom ów

Jelito cienkie. Sok wy-

Aminopepty-

N-końcowe

Peptydy niskoczą-

twarzany przez gruczoły Brunnera dwunastnicy i gruczoły Lieberkiihna

daza

po li peptydy

steczkowe. Wolne aminokwasy

Dipeptydazy

Dipeptydy

Aminokwasy

Sacharoza

Fruktoza, gluko za

i

Sacharaza

pH 5,0-7,0

TRAWIENIE I WCHŁANIANIE / 743 cd. tab. 56-2 Miejsce i bodziec wydzielania

t

Enzym

Sposób aktywacji i optymalne warunki działania

Substrat

Produkty działania enzymu

Maltaza

pH 5,8-6,2

Maltoza

Glukoza

Laktaza

pH 5,4-6,0

Laktoza

Glukoza, galaktoza Glukoza

pH8,6

Trehaloza Fosforany organiczne

Izomaltaza lub 1 ^-glukozy daza

1:6 glukozydy

Glukoza

Polirtukleotydaza

Kwas nukleinowy 4|A-

Nukleotydy

Nukleozydazy (fosforylazy nukleozydowe)

Nukteozydy Zasady purynopurynowe i we i pirymidynopirymidyno-we we, fosforan pentozy

Trehalaza Fosfataza

WCHŁANIANIE Z PRZEWODU

POKARMOWEGO POLEGA NA TRANSPORCIE SKŁADNIKÓW POKARMOWYCH DO KRĄŻENIA WROTNEGO LUB NACZYŃ LIMFATYCZNYCH Wchłanianie pokarmów w żołądku jest niewielkie, choć możliwa jest absorpcja znacznych ii ości etanolu. Jelito cienkie jest głównym narządem trawiennym i wchłaniającym. W trakcie przechodzenia przez nie ok. 90% pokarmów jest wchłanianych z wodą. W jelicie grubym wchłanianie wody jest znaczniejsze, co sprawia, że pierwotnie płynna zawartość jelita cienkiego w okrężnicy nabiera konsystencji stałej. Wyróżnia się dwa szlaki wchłaniania składników pokarmowych z jelita cienkiego, leden z nich prowadzi do krążenia wrotnego wątroby, do którego dostają się składniki pokarmowe rozpuszczalne w wodzie, zaś drugi szlak przez naczynia limfatyczne i przewód piersiowy do krążenia ogólnego. Drugim szlakiem transportowane są składniki pokarmowe rozpuszczalne w tłuszczach.

Wolny fosforan

Węglowodany wchłaniane są w postaci monosacharyd ów Produkty trawienia węglowodanów wchłaniane są z jelita czczego do krążenia wrotnego w postaci monosacharydów, w tym głównie heksoz (glukozy, fruktozy, mannozy i galaktozy) i pentoz (rybozy). Oligosacharydy (produkty hydrolizy skrobi, zawierające 3—10 jednostek monosacharydowych) i disacharydy ulegają dalszej hydrolizie przez odpowiednie enzymy rąbka szczoteczkowego błony śluzowej jelita cienkiego, w tym również przez amylazę trzustkową adsorbowaną przez śluzówke jelitową. W świetle jelita stwierdza się tylko niewielką aktywność disacharydazową. Większą wykazują małe „węzły71 z rąbkiem szczoteczkowym komórek nabłonkowych jelita. Wchłanianie monosacharydów odbywa się dwoma sposobami — drogą aktywnego transportu (w obecności gradientu stężeń) oraz dyfuzji prostej. Wchłanianie niektórych cukrów odbywa się w jeszcze bardziej złożony sposób. Do aktywnego transportu niezbędna jest następująca konfiguracja cząsteczki cukru: konfiguracja grupy hydroksylowej przy węglu drugim powinna być identyczna z występującą w glukozie, musi być obecny pierścień piranozowy oraz przy węglu w pozycji piątej musi występować

744 / ROZDZIAŁ 56 grupa metylowa lub pochodna grupy metylowej (grupa metylowa podstawiona). Wchłanianie fruktozy jest wolniejsze od glukozy i galaktozy. i odbywa się na zasadzie dyfuzji prostej zgodnie z gradientem stężeń. W warunkach fizjologicznych we krwi stwierdza się niewielkie ilości fruktozy oprócz tej, która jest pochodzenia pokarmowego. Pompa sodowa nasila aktywne wchłaniania glukozy Rąbek szczoteczkowy enterocytów zawiera kilka układów transportowych. Niektóre z nich są podobne do układów występujących w rąbku szczoteczkowym komórek kanalikowych neironów wyspecjalizowanych w resorpcji zwrotnej różnych aminokwasów i cukrów. Przypuszcza się, że istnieje przenośnik wiążący w różnych miejscach glukozę i przenoszący obydwie te substancje przez błonę plazmatyczną enterocytów. Zarówno glukoza, jak i Na+ mogą być uwalniane do cytoplazmy, umożliwiając w ten sposób przenośnikowi ciągłe powtarzanie swej czynności transportowej. Jony Na+ transportowane są zgodnie z gradientem ich stężeń umożliwiając równocześnie przenośnikowi transport glukozy w kierunku przeciwnym do gradientu jej stężeń. Wolna energia potrzebna do transportu aktywnego pochodzi z rozpadu hydrolitycznego ATP współdziałającego z pompą sodową wyrzucającą jony Na u na zewnątrz komórki. W miejsce jonów Na+ do komórki wchodzą jony K+ (p. ryc. 56-4). Aktywny transport glukozy hamują oiiabaina, będąca glikozydem nasercowym a równocześnie inhibitorem pompy sodowej^oraz floryzyna, będąca znanym inhibitorem rćsbrpcji zwrotnej glukozy w kanalikach nerkowych. Stosunek wchłanianego sodu do glukozy może się zmienić lecz zawsze odpowiada aktywności dwóch przenośników pracujących równolegle. Dla jednego z nich stosunek wchłanianego Na do glukozy wynosi 1:1, zaś dla drugiego 3:1. Występuje również przenośnik glukozy niezależny od Na+. Proces hydrolizy polisacharydów, oligosacharydów i disacharydów jest procesem szybkim. Dlatego też mechanizmy wchłaniania glukozy i fruktozy ulegają szybkiemu nasyceniu. Rzucającym się w oczy wyjątkiem jest hydroliza laktozy, przebiegająca o połowę wolniej niż hydroliza sacharozy. Ten fakt tłumaczy, dlaczego hydroliza laktozy nie prowadzi do wysycenia mechanizmów transportowych glukozy i galaktozy.

Białko przenoSnlka

Glukoza

Rąbek szczoteczkowy

Nabłonek jelitowy

Da naczyń włosowatych

Ryc. 56-4. Tiansportglukozyprzez nabłonek jel> towy. Aktywny transport glukozy jest sprzężony z pompą Na+/K+ (1) lub z układem niezależnym od jonów Na+ (2). Proces dyfuzji przedstawia szlak (3).

Defekty enzymów uczestniczących w trawieniu węglowodanów są przyczyną swoistych zaburzeń Niedobór laktazy. Nietolerancja laktozy, disacharydu występującego w mleku, może być spowodowana niedoborem laktazy. Zespół niedoboru laktazy należy odróżnić od zespołu nietolerancji mleka spowodowanego nadwrażliwością na białka zawarte w mleku, w tym zwykle na pMaktoglobulinę. Objawy przedmiotowe i podmiotowe występujące w wymienionych zespołach są takie same. Wśród tych objawów należy wymienić bóle kolkowe brzucha, biegunki i wzdęcia. Objawy te spowodowane są z jednej strony obecnością laktozy w świetle jelita oraz z drugiej zaś strony fermentacją tego dwucukru przez mikroorganizmy jelitowe. Osmotycznie czynna laktoza, gromadząca się w świetle jelita, jest przyczyną biegunek osmoty-

TRAWIENIE I WCHŁANIANIE / 74S

cznych. Ponadto iaktoza nie wchłonięta przez jelito staje się substratem dla bakterii jelitowych, W wyniku fermentacji bakteryjnej powstają gazy oraz metabolity laktozy drażniące jelito. Wyróżnia się trzy typy niedoboru laktazy: Dziedziczny niedobór laktazy. Ten typ występuje względnie rzadko i charakteryzu je się występowaniem objawów nietolerancji laktozy krótko po,, urodzeniu. Po karmieniu dziecka dietą bezlalctozową wszystkie objawy nietolerancji znikają. Cechą charakterystyczną tego typu niedoboru jest obecność laktozy w moczu. Laktozuria spowodowana jest uszko dzeniem nabłonka jelitowego przez laktozę i wtórnym przedostaniem się tego disacharydu przez uszkodzoną błonę śluzową jelita do krwi. Wtórny niedobór laktazy. Spowodo wany jest pierwotną chorobą jelit i wtórnym niedoborem laktazy, przez co dochodzi do upośledzonego trawienia laktozy. Choroba ob jawia się nietolerancją mleka. Jest to typ niedo boru laktazy nierzadko występujący w sprue rodzimej i tropikalnej, kwashiorkor, zapaleniu jelita grubego oraz w zapaleniu żołądka i jelit. Może on wystąpić również po operacji wykona nej z powodu wrzodu trawiennego. Pierwotny niedobór laktazy. Jest to względnie często występujący zespół, szczegól nie wśród populacji kolorowych. Ponieważ ob jawy chorobowe tego zespołu występują nie w dzieciństwie, lecz dopiero u osób dorosłych, przyjmuje się, że jest on spowodowany po stępującym zanikiem aktywności laktazowej u osób do tego predysponowanych.

Niedobór sacharazy. Stwierdzono wystę-

powanie dziedzicznego niedoboru zarówno sacharazy, jak i izomaltazy. Te dwa rodzaje niedoboru występują równocześnie, ponieważ sacharaza i izomaltaza tworzą wspólny kompleks enzymatyczny. Objawy niedoboru wymienionych disacharydaz występują już we wczesnym dzieciństwie i są takie same jak w niedoborze laktazy. Disacharyduria. U niektórych chorych z niedoborem disacharydaz można stwierdzić wzmożone wydalanie disacharydów z moczu. U takich osób oraz u chorych z chorobą jelit (np. sprue) dobowe wydalanie disacharydów z moczem może wynosić 300 mg lub więcej.

Wadliwe wchłanianie monosachary-

dów. Znany jest wrodzony zespół w którym stwierdza się powolne wchłanianie glukozy i galaktozy, spowodowane defektem mechanizmu

transportowego dla tych cukrów. Ponieważ fruktoza nie jest transportowana tym mechanizmem przenośnikowym, wchłanianie jej jest normalne w tym zespole.

Produkty trawienia lipidów wchłaniane są z miceli utworzonych przez sole kwasów żółciowych

2-Monoacyloglicerole, kwasy tłuszczowe i niewielkie ilości 1-monoacylogiiceroli opuszczają fazę olejową zawiesiny tłuszczowej i dyfunduja do miceli mieszanych i liposomów złożonych z soli kwasów żółciowych, fosfatydylocholiny i cholesterolu pochodzenia żółciowego (ryc. 56-2). Ponieważ micele są rozpuszczalne w wodzie, umożliwiają one dostanie się produktów trawienia tłuszczów do rąbka szczoteczkowego komórek błony śluzowej jelita, a następnie do wnętrza enterocytów. Sole kwasów żółciowych docierają do jelita biodrowego, gdzie są wchłaniane i przechodzą do krążenia jelitowo-wątrobowego (p. rozdz. 27). Fosfolipidy pochodzenia pokarmowego i żółciowego (np. fosfatydylocholina) są rozkładane do kwasów tłuszczowych i lizofosfolipidów pod wpływem trzustkowej fosfolipazy A2 i resorbowane przez nabłonek jelitowy. Estry cholesterolowe ulegają hydrolizie pod wpływem hydrolazy estrów cholesterolowych pochodzenia trzustkowego. Uwolniony pod jej wpływem wolny cholesterol wraz z większością cholesterolu zawartego w żółci przedostaje się do rąbka szczoteczkowego po uprzednim wniknięciu do miceli. W warunkach fizjologicznych ponad 98% lipidów zawartych w pokarmach jest wchłanianych w jelitach. W obrębie ściany jelit 1-monoacyloglicerole ulegają dalszej hydrolizie do wolnego gticerolu i kwasu tłuszczowego pod wpływem lipazy różniącej się od Iipa2y trzustkowej. 2-Monoacyloglicerole ulegają rekonwersji do triacylogliceroli szlakiem monoacyloglicerolowym (ryc. 56-3). Proces resyntezy triacylogliceroli z kwasów tłuszczowych wymaga „aktywacji" tych ostatnich. Synteza triacylogliceroli w błonie śluzowej jelita przebiega podobnie jak w innych tkankach (p. str. 284). Wchłonięte lizofosfolipidy oraz większość wchłoniętego cholesterolu jest także reacylowana przez acylo-CoA, w wyniku czego powstają fosfolipidy i estry cholesterolowe. Uwolniony w świetle jelita w procesie lipolizy glicerol nie ulega reutylizacji, lecz jest bezpośrednio wchłaniany do krążenia wrotnego. Na-

746 / ROZDZIAŁ 56

tomiast glicerol uwolniony w obrębie komórek jelitowych może bye wykorzystany do resyntezy triacylogliceroli po uprzedniej aktywacji przez ATP do glicerolo-3-fosforanu. Tak więc długołańcuchowe kwasy tłuszczowe wchłonięte przez komórki błony jelita mogą być użyte do resyntezy triacylogliceroli.

Trtacyloglicerole, powstałe w enterocytach, przeważnie nie dostają się do krążenia wrotnego. Większość wchłoniętych lipidów, w tym również tbsfolipidy, estry cholesterolowe, wolny cholesterol i witaminy rozpuszczalne w tłuszczach tworzą chylomikrony. Te ostatnie tworzą limfę (tj. płyn o wyglądzie mleka), transportowaną naczyniami chłonnymi jamy brzusznej do przewodu piersiowego, a następnie dopiero do krążenia systemowego (p. również ryc. 26-3). Większość wchłoniętych kwasów tłuszczowych, złożonych z 10 lub więcej atomów węgla, niezależnie od tego, w jakiej postaci zostały reabsorbowane, występuje jako estry w limfie przewodu piersiowego. Kwasy tłuszczowe krótkołańcuchowe, zawierające mniej niż 10—12 atomów węgla, transportowane są krwią żyły wrotnej w postaci nieestryfikowanej (jako „wolne" kwasy tłuszczowe). Żaden ze steroli pochodzenia roślinnego (czyli fitosteroli) z wyjątkiem aktywowanego crgosterolu (czyli prowitaminy D) nie ulega reabsorpcji w jelitach. Chyluria jest stanem chorobowym charakteryzującym się wydalaniem przez chorego „mlecznego" moczu. Jest ona spowodowana przetoką limfatyczną, tj. połączeniem układu naczyń limfatycznych jelit z układem moczowym. Podobną anomShą jest chylothora* charakteryzujący się gromadzeniem się limfy w jamie opłucnowej. Jest on spowodowany nieprawidłowym połączeniem naczyń limfatycznych jamy brzusznej z jamą Opłucnową. Dzięki .podaniu w pokarmach triacylogliceroli zawierających krótkołaricuchowe kwasy tłuszczowe (złożone z mniej niż 12 atomów węgla) w miejsce

kwasów tłuszczowych długołańcuchowych, można spowodować zniknięcie chylurii. Podobne postępowanie u chorych z chyiothorax jest przyczyną przejaśnienia się płynu opłucnowego. Wymienione zmiany chylurii lub płynu w jamie opłucnowej spowodowane są wniknięciem krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych bezpośrednio do krążenia wrotnego, a nie do chylomikronów limfy.

Produktami trawienia białek ulegającymi wchłanianiu w jelitach są aminokwasy W stanach fizjologicznych białka pokarmowe zostają prawie całkowicie rozłożone do aminokwasów. Te ostatnie z kolei są szybko wchłaniane przez jelito do krążenia wrotnego. Możliwa jest jednak hydroliza niektórych produktów trawienia białek, tj. dipeptydów w obrębie ściany jelitowej. Należy dodać, że karmienie zwierząt pełnowartościową mieszaniną aminokwasów pozwala na normalne podtrzymanie ich życia. Izomery (L), lecz nie (D) aminokwasów transportowane są aktywnie przez ścianę jelita od bieguna luminalnego do surowicówkowego. W transporcie tym ma uczestniczyć witamina B<j (fosforan pirydoksalu). Aktywny transport L-aminokwasów zależny jest od dostawy energii, czego dowodem jest fakt, że 2,4-dinitrofenol, substancja rozprzęgająca fosforylację oksydacyjną, hamuje ten transport (p. str. 152). Aminokwasy są transportowane przez rąbek szczoteczkowy przez liczne przenośniki, z których wiele jest podobnych do przenośnika glukozowego zależnego od Na+ (ryc. 56-4). Wśród przenośników zależnych od Na+ należy wymienić przenośnik dla aminokwasów obojętnych, przenośnik dla fenyloalaniny lub metioniny oraz swoisty przenośnik dla iminokwasów takich jak prolina i hydroksyproiina. Scharakteryzowano również przenośniki niezależne od Na + , transportujące aminokwasy lipofilne i obojętne (np. leucynę i fenyloalaninę) oraz aminokwasy zasadowe (np. lizynę).

Aspekty kliniczne. Chorzy wykazujący

reakcję immunologiczną na niektóre spożyte białka wchłaniają je bez uprzedniego ich trawienia, strawione białka bowiem nie są immunogenne. Za możliwością przenikania niestrawionych białek przez błonę śluzową jelit przemawia fakt przedostania się przeciwciał zawartych w siarze z przewodu pokamiowego noworodka do krążenia. Istnieje coraz więcej dowodów popierających hipotezę, że sprue rodzima (nietropikalna) spowodowana jest defektem umiejscowionym w samych komórkach błony śluzowej jelit, W wyniku tego defektu polipeptydy powstałe po trawieniu glutenu (głównego białka zawartego w pszenicy) przez pepsynę i trypsynę wywierają nie tylko miejscowo szkodliwy wpływ na błonę śluzową jelit, lecz po wchłonięciu do krwi są przyczyną powstawania przeciwciał przeciwglu-

TRAWIENIE I WCHŁANIANIE / 747 Tabela 56-3. Miejsce wchłaniania poszczególnych składników pokarmowych Miejsce wchłaniania Składnik pokarmowy Glukoza i inne monosaJelito czc2e

*

Jelito kretę

charydy, niektóre disacharydy M o n oacy 1 og 1 i c ero le. kwasy tłuszczowe, glicerol, cholesterol Aminokwasy, peptydy Witaminy, foiian Elektrolity, żelazo. wapń, woda Kwasy żółciowe Witamina B-|2 Elektrolity Woda

ten owych. Udowodniono, że u chorych na rodzimą sprue we krwi krążącej bardzo często stwierdza się przeciwciała przeciwglutenowe lub skierowane przeciw frakcjom rozpadu tego białka. Czynnikiem szkodliwym glutenu jest polipeptyd złożony z zaledwie 6 lub 7 aminokwasów. Sprue rodzima u dorosłych jest niewątpliwie analogiem celiakii (choroby trzewnej) występującej u dzieci. Dowodzi ona możliwości przenikania przez błonę śluzową jelita do krwi fragmentów białkowych większych niż aminokwasy. Przenikanie takie zachodzi jednak tylko w określonych warunkach chorobowych. W tabeli 56-3 zestawiono miejsce wchłaniania niektórych ważniejszych składników pokarmowych w jelitach, zaś w tab. 56-4 objawy lub zespoły chorobowe spowodowane wadliwym ich wchłanianiem.

Tabela 56-4. Objawy lub zespoły chorobowe spowodowane wadliwym wchłanianiem poszczególnych składników pokarmowych Objawy lub zespół Wadliwe wchłaniachorobowy nie składnika pokarmowego Żelazo, witamina B,^ folian Produkty trawienia białka Wapń, magnez, witamina D Wapń, produkty trawienia białek, witamina D

Niedokrwistość Obrzęki Tężyczka Osteo poroża

Nietolerancja mleka ** Krwawienia, siniaki, łamliwość naczyń Stolce tłuszczowe (steatorrhea)

v

Chorba Hartnupów (dełekt przenośnika jelitowego dla aminokwasów obojętnych)

Aminokwasy obojętne

Laktoza

Witamina K Lipidy i witaminy rozpuszczalne w tłuszczach

propionowy i masłowy. W wyniku rozkładu bakteryjnego fosfatydylocholiny mogą powstać cholina oraz spokrewnione z nią aminy toksyczne (np. neuryna).

0 H3C-N-CH,-CH3OH

NCH

CHj

BAKTERIE JELITA GRUBEGO SĄ PRZYCZYNĄ PROCESÓW GNILNYCH I FERMENTACYJNYCH Większość spożytych pokarmów jest wchłaniana w jelicie cienkim. Tutaj też wchłania się większość wody, co sprawia, że początkowo półpłynna treść jelitowa przybiera konsystencję bardziej stałą. W czasie wchłaniania poszczególnych składników pokarmowych obserwuje sie żywą aktywność flory bakteryjnej jelit. Uczestniczy ona w procesach gnilnych i fermentacyjnych, podczas których powstają m.in. gazy (takie jak dwutlenek węgla, metan, wodór, azot i siarkowodór) oraz kwas octowy, mlekowy,

Neuryn a

Cholina

Wiele aminokwasów ulega dekarboksylacji pod wpływem bakterii jelitowych z wytworzeniem toksycznych amin (tj, ptomain). DEKAHBOKSYLAZA BAKTERYJNA R-C-NHj H

COj

Jedna z ptomain

W wyniku takich reakcji dekarboksylacji powstają: kadaweryna z lizyny, agmatyna z argininy, tyramina z tyrozyny, putrescyna z ornityny i histamina z histydyny. Niektóre z wy-

748 I ROZDZIAŁ 56

mienionych amin wykazują silne działanie wazopresyjne. Tryptofan w wyniku szeregu reakcji jest źródłem indolu i metyloindolu (skatolu), tj. substancji odpowiedzialnych za zapach kału. Indol

Skatol CH3

Aminokwasy zawierające siarkę zostają przekształcone w merkaptany, takie jak metyloi etylomerkaptan oraz siarkowodór. CH3SH CH^SH Etylomerkaptan Metyiomerkaptan !2H] CH3SH Mety!omerkaptan

-~CH, Metan 1 siarkowodór

Jelito grube jest źródłem znacznej ilości amoniaku powstającego w wyniku działania bakterii na substraty azotowe. Powstały amoniak dostaje się do krążenia wrotnego i następnie do wątroby, gdzie jest szybko usuwany z krwi. W chorobach wątrobydetoksykacyjna rola tego narządu w stosunku do amoniaku ulega upo-

śledzeniu, co jest przyczyną dostania się NH3 do krążenia ogólnego, w którym może osiągnąć stężenia toksyczne. Sądzi się, że amoniak uczestniczy w patogenezie śpiączki wątrobowej u niektórych chorych. Wykazano, że podanie neomycyny, antybiotyku hamującego rozwój jelitowej flory bakteryjnej, znamiennie obniża stężenie we krwi amoniaku pochodzenia jelitowego. Stosowanie diety wysokobiałkowej u chorych

z zaawansowaną chorobą miąższu wątrobowego lub wystąpienie u tych chorych krwawienia do światła przewodu pokarmowego mogą być przyczyną zatrucia amoniakiem. Również u takich chorych podawanie neomycyny ma działanie lecznicze.

Bakterie jelitowe spełniają również funkcje pożyteczne dla człowieka

Fiora jelitowa może stanowić aż 25% suchej masy kałowej. U zwierząt trawożernych, u których pokarmy składają się głównie z celulozy, bakterie jelitowe lub występujące w żwaczu odgrywają istotną rolę w procesie trawienia, rozkładają one bowiem polisacharydy do wchłanialnych monosacharydów. Ponadto bakterie te, żyjące w symbiozie z gospodarzem, uczestniczą w syntezie aminokwasów egzogennych i witamin. Chociaż rola jelitowej flory bakteryjnej u człowieka jest znacznie mniejsza niż u zwierząt trawożernych, niemniej jest ona pożyteczna, ponieważ wytwarza pewne witaminy, szczególnie witaminę K i Bł2 oraz niektóre inne witaminy grupy B.

PIŚMIENNICTWO Bórgstrom B: The miceliar hypothesis of fat absorption: Must it be revisited? Scand J Gastroenterol 1985;20;389. Gardncr M; Gastromtestinal absorption of intact proteins. Annu Rev Nurt 1988;8:329. Gargouri Y et al: Kinetic assay of human gastric lipase on short- and long-chain triacyiglycerol emulsions. Gastroenterology 198ó;91:919. Foltmann B; Gastric proteinases. Essays Biockem 1981;17: Nelson GJ, Ackman RG: Absorption and transport of fat in mammals with emphasis on N-3 poiyunsaturated fatty arids. Lipids 1988:23:1005. Steven BR, Kaunitz JD, Wright EM: Intestinai transport of amino acids and sugars. Annu Rev Pftysiol 1984;4fi:4l7. Tso P: Gastrointestinal digesśon and absorption of lipid. Adv Lipid Res 1985;21:143. Wolfe MM, Soli AH; The physiology of gastric acid secretion. New Engi J Med 1988;319:1707,

Glikoproteiny i proteoglikany

5 7

Robert K. Murray, MD, PhD ■

WPROWADZENIE Glikoproteiny są białkami, w których łańcuchy oligosacharydowe (glikanowe) przyłączone są kowalencyjnie do rdzenia polipeptydowego, Glikozoaminoglikany są polisacharydami złożonymi z powtarzających się jednostek disacharydowych. Jednostka disacharydowa składa się z aminocukru (glukozoaminy lub galaktozoaminy, która dodatkowo może być siarczanowa) oraz kwasu uranowego (gJukuronowego lub idunonowego). W przeszłości glikozoaminoglikany określano terminem „mukopolisacharydy". Obecnie wiadomo, że występują one zwykle jako kowalencyjnie związane z białkiem i określane są terminem proteoglikanów. Glikokoniugaty lub kompleksy węglowodanowe to dwa zamienne określenia, używane do opisywania makrocząsteczek zawierających jeden lub więcej łańcuchów węglowodanowych kowalencyjnie związanych z białkiem lub lipidami. Do tej grupy makrocząsteczek zalicza się: glikoproteiny, proteoglikany i giikolipidy.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Białka osocza, z wyjątkiem albumin, są glikoproteinami. Wiele białek błon komórkowych (p. rozdz. 45) zawiera znaczne ilości węglowodanów. Także niektóre substancje grupowe krwi (p. rozdz. 60) są glikoproteinami, podczas gdy inne są glikolipidamt. Niektóre hormony (np. gonadotropina kosmówkowa) to także glikoproteiny. Nowotwory coraz częściej rozpoznawane są jako zaburzenia wynikające z nieprawidłowej regulacji genetycznej (p. rozdz. 61). Główny

problem w nowotworach to przerzuty. Powstają one wskutek odrywwjia się komórek nowotworowych od tkanek, z których pochodzą (np. płuc) i dostają się z krwią do różnych narządów i tkanek ustroju (np. mózgu), gdzie w warunkach niekontrolowanych rozrastają się, wywołując katastrofalne następstwa. Onkolodzy sądzą, że do powstawania przerzutów przyczyniają się w znacznej części zmiany w strukturze ghkokoniugatów powierzchni komórek nowotworowych. Ponadto niektóre choroby (mukopolisacharydozy) są wynikiem zmniejszonej aktywności specyficznych enzymów lizosomalnych, degradujących poszczególne typy glikozoaminoglikanów; w wyniku spadku ich aktywności dochodzi do gromadzenia się jednego lub więcej typów glikozoaminoglikanów, co wywołuje różne objawy; przykładem może być zespół Hurler.

POWSZECHNIE WYSTĘPUJĄCYM GLIKOPROTEINOM PRZYPISUJE SIĘ LICZNE FUNKCJE Glikoproteiny występują w większości organizmów, od bakterii do człowieka. Wchodzą także w skład większości wirusów zwierzęcych. Nad niektórymi z nich prowadzono intensywne badania, ponieważ były w części przydatne do śledzenia procesów biosyntezy. Do glikoprotein zaliczanych jest wiele białek o odmiennych funkcjach (tab. 57-1); zawartość składnika węglowodanowego waha się od 1% do ponad 85% całkowitej ich masy. Mimo intensywnych badań nad funkcjami glikoprotein wciąż niejasna jest dokładna rola łańcuchów oligosacharydowych. Niektóre z nich przedstawione są w tab. 57-2.

750 / ROZDZIAŁ 57 Tabeła 57-1, Niektóre funkcje białek pełnione przez glikoproteiny Białka strukturalne: Ściany komórkowej Kolagen, elastyna Fibryny Białka macierzy kości Substancje o właściwościach smaru i ochronnych: Mucyny Wydzieliny śluzowe Białka transportujące: Witaminy Lipidy Minerały i pierwiastki śladowe Białka o właściwościach immunologicznych: Immunoglobuliny Antygeny zgodności tkankowej Składniki dopełniacza Interferony Hormony: Gonadotropina kosmówkowa Tyreotropina (TSH) Enzymy: Proteazy Nukieazy Glikozydazy Hydrolazy Czynniki krzepnięcia Substancje uczestniczące w interakcji ko mórek lub procesach rozpoznania biologicz nego: IJJ, Komórka — komórka Komórka — wirus Komórka — bakteria Receptory hormonów Substancje entyzamrożeniowe u ryb antarktycznych Lektyny

ŁAŃCUCHY OLIGOSACHARYDOWE ZAWIERAJĄ INFORMACJĘ BIOLOGICZNĄ Między sach ary darni może być tworzona ogromna liczba wiązań glikozyd owych. Na przykład 3 różne heksozy mogą łączyć się ze sobą, tworząc ponad 1000 różnych trisachary-

Tabela 57-2. Niektóre funkcje łańcuchów oltgosacharydowych glikoprotein* Modulują własności fizykochemiczne, np. rozpuszczalność, lepkość, ładunek i denaturację Ochraniają przed proteolizą zarówno zewnątrz-, jak i śródkomórkową Wpływają na proteolityczną obróbkę białek prekursorowych do mniejszych cząsteczek Wykazują aktywność biologiczną, np. hCG Wpływają na proces wbudowywania do błon, wewnątrzkomórkową migrację, przepuszczalność i wydzielanie Wpływają na rozwój embrionalny i różnicowanie Odpowiedzialne są w dużej części za umiejscowienie się przerzutów nowotworowych * Zaadaptowano z; Schachter H.: Biosynthetic controls that determine the branching and heterogenity of protein-bound oligosaccharides; Bfochem. Celt Bioi 1986, 64, 163.

dów. Konfiguracja przestrzenna cukrów w łańcuchach oligosacbarydowych zmienia się w zależności od rodzaju wiązań i możliwości oddziaływania z innymi makrocząsteczkami, znajdującymi się w sąsiedztwie oligosacharydów. Przyjmuje się ogólnie, że łańcuchy oligosacharydowe kodują znaczną ilość informacji biologicznej, która zależy od składu cukrowego, ich sekwencji i konfiguracji przestrzennej. Dowodem na to są niektóre leki i toksyny, które działają ze specyficznymi łańcuchami oligosacharydów glikokoniugatów powierzchni komórek {jak np. toksyna cholery oddziałuje z gangliozydami Gml; p. rozdz. 16). Ponadto, reszty mannozo-6-fosforanu skierowują nowo syntetyzowane enzymy lizosomalne do wnętrza lizosomów (p. poniżej).

DOSTĘPNE SĄ TECHNIKI DO WYKRYWANIA, OCZYSZCZANIA I STRUKTURALNEJ ANALIZY GLIKOPROTEIN Wykrywanie

Glikoproteiny mogą być wykrywane w różnych złożonych układach (np. błon komórkowych) metodą elektroforezy żelowej w obecności SDS (SDS-PAGE; p. rozdz. 3) i wybarwiane kwasem nad jodowym i odczynnikiem

Schiffa (PAS), bowiem PAS wywołuje reakcję barwną z grupą aldehydową cukrów. Mogą być one również wykrywane techniką SPS-PAGE-

GLIKOPROTEINY I PROTEOGLIKANY / 751

-radioautografii, opartej na pomiarze stopnia wbudowywania się odpowiedniego radioaktywnego cukru do komórek. Oczyszczanie i analiza strukturalna Przed przystąpieniem do analizy strukturalnej glikoprotein konieczne jest oddzielenie ich od innych makrocząsteczek. Można to osiągnąć stosując konwencjonalne metody oczyszczania białek. Najcenniejszą techniką stosowaną do oczyszczania glikoprotein okazała się chromatografia powinowactwa, wykorzystująca lektyny do specyficznego wiązania się z pewnymi glikoproteinami (p. poniżej). Ich skład węglowodanowy oznacza się następnie po hydrolizie kwaśnej, stosując chromatografię gazową z detekcją w postaci spektrometrii masowej (GLC-MS). W przeszłości stosowano różne metody pozwalające określić szczegółową strukturę ich łańcuchów oligosacharydowych. Obecnie sto-

suje się GLC-MS^ połączoną z wysokorozdzielczą spektrometrią NMR, co umożliwia często całkowite oznaczanie struktury (tzn. składu cukrowego, rodzaj wiązań i ich anomerycznej konfiguracji) łańcuchów glikanowych większości glikokoniugatów. Szczegółowe dane dotyczące wiązań między cukrami w glikoproteinach (co wykracza poza zakres tego rozdziału) są bardzo ważne w oznaczaniu struktury i funkcji tych makrocząsteczek. SIEDEM DOMINUJĄCYCH CUKRÓW W LUDZKICH GLIKOPROTEINACH Chociaż znanych jest ok. 200 naturalnie występujących monosacharydów, to tylko 7 powszechnie występuje w'łańcuchach oligosacharydowych glikoprotein (tab. 57-3). Większość tych cukrów omówiono w rozdz. 14. Kwas

Tabela 57-3. Najważniejsze cukry występujące w ludzkich glikoproteinach. Struktury większości wymienionych cukrów są przedstawione w rozdz. 15. Cukier

Typ

Ga laktoza

Heksoza

Gat

UDP-Gal

Glukoza

Heksoza

Glc

UDP-Glc

Mannoza

Heksoza

Man

GDP-Man

NeuAc

CMP-NeuAc

Kwas N-acety- Kwas sjalowy foneuraminowy

Fukoza

Używany skrót

Deoksyheksoza Fuc

Alukleotydowy cukier

GDP-Fuc

Uwagi

Występuje w N-wiązanych glikoproteirtach często jako przedostatni cukier wiązany do NeuAc oraz w rdzeniu trisacharydowym proteoglikanów Występuje podczas syntezy N-wiązanych glikoprotein, ale nieobecna w dojrzałych glikoproteinach Główny cukier N-wiązanych glikoprotein Występuje często jako terminalny cukier w 0- i N-wiązanych glikoproteinach. Znane są także inne typy kwasów sjalowych, ale w organizmie ludzkim głównie występuje NeuAc Występuje na zewnątrz łańcuchów 0- i N-wiązanych glikoprotein, lub też może być wiązana do reszty GIcNAc poiączonej N-glikozydowo z Asn

N-acetylogala- Aminoheksoza ktozoamina

GalNAc

UDP-GatNAc

Obecna w 0- i N-wiązanych glikoproteinach

N-acetyloglu- Aminoheksoza kozoamina

GIcNAc

UDP-GIcNAc

Cukier połączony jest z azotem Asn łańcucha polipeptydowego N-wiązanych glikoprotein ale może również występować w innych pozycjach łańcucha oligosacharydowego tych białek

752 / ROZDZIAŁ 57

N-acetyloneuraminowy (NeuAc) jest terminalnym cukrem łańcucha oligosacharydowego i zwykle przyłączony jest do reszty galaktozy (Gal) lub N-acety!ogaJaktozoaminy. inne przedstawione w tabeli cukry można znaleźć w bardziej wewnętrznych pozycjach.

CUKRY NUKLEOTYDOWE DZIAŁAJĄ JAKO CUKRY DONOROWE W WIELU REAKCJACH BIOSYNTEZY Pierwszym odkrytym cukrem nukleotydowym była urydynodifosfoglukoza (UDP-Glc). Typowe cukry nukieotydowe biorące udział w biosyntezie glikoprotein są wymienione w tab. 57-3. Nie wiadomo, dlaczego niektóre pochodzą z UDP, a inne z guanozynotrifosforanu (GTP) lub cytydynomonofosforanu (CMP). Te nukleotydy są wykorzystywane w wielu, ale nie we wszystkich reakcjach glikozylacji zachodzących w procesie biosyntezy glikoprotein. (p. poniżej). Hydrofobowe wiązanie między grupami fosforanowymi a cukrami jest typowym wiązaniem wysokoenergetycznym i ma wysoki potencjał przenoszenia, grup. Zaktywciwane cukry mogą być przenoszone do odpowiednich akceptorów pod warunkiem, że dostępne są swoiste transferazy. Cukry nukieotydowe są tworzone w cytoplazmie z odpowiednich nukleotydów trifosforanowych. Tworzenie u rydynod i fosforanu galaktozy przebiega w dwóch następujących reakcjach.

PIROFOSFORYLAZA

a ALAKTOZYLOTRANSFERAZA

UDP-Gal

białko -. białko-Gal + UDP NUKUEOZYDOD1FOSFOFOSFATAZA

UDP-+UMP+P,

EGZOG LI KOZYDAZY I EN DOG LI KOZYDAZY SĄ UŻYTECZNE W BADANIACH GLIKOPROTEIN Pewne glikozydazy o określonej specyfice okazały się użyteczne w badaniach aspektów funkcjonalnych i strukturalnych glikoprotein (tab. 57-4). Enzymy te działają albo w zewnętrzTabela 57-4. Niektóre glikozydazy używane do badań struktury i funkcji glikoprotein. Enzymy różnego pochodzenia są często specyficzne dla pewnych typów wiązań gtikozydowych, jak też dla ich anomerycznej konfiguracji. Miejsca działania endoglikozydazy F i H pokazane są na ryc. 57-4. F działa na wiązanie glikozydowe łańcuchów oligosacharydowych typu zarówno wysokomannozowego, jak i kompleksowego, podczas gdy H działa tylko na typ pierwszy. Enzymy

u nr-GLUKOZOWA

UTP-f Glukozo-1 -fosforan * + pirofosforan

nej cząsteczki odpowiedniego nukleotydu (np. UMP, GMP lub CMP), powstałego z cukru nukleotydowego. Ten mechanizm zapewnia odpowiednie stężenie każdego cukru nukleotydowego wewnątrz aparatu Golgiego. UMP jest tworzony z UDP-Gal w poniższej reakcji:

UDP-GIC +

EPIMiRAZA UDP-Glc

Neuraminidaza Galaktozy da za Endogfikozydaza F Endoglikozydaza H

Typ Egzoglikozydaza Egzoglikozydaza Endoglikozydaza Endoglikozydaza

UDP-Glc<->UDP-Gal

Ponieważ większość reakcji glikozylacji zachodzi wewnątrz aparatu Golgiego, systemy przekaźników (permutaz i systemy transportu) transportują cukry nukieotydowe przez błonę aparatu Golgiego. Znane są układy transportujące UDP-Gal, GDP-Man i CMP-MeuAc do cystern aparatu Golgiego. pziałają one na zasadzie anty portu; tzn. dopływowi jednego cukru nukleotydowego towarzyszy odpływ jed-

nej (egzoglikozydazy), albo w wewnętrznej (endoglikozydazy) pozycji iańcucha oligosacharydowego. Przykładami egzoglikozydaz są neuraminidaza i galaktozydaza; użyte po kolei powodują usunięcie końcowej reszty NeuAc oraz przedostatniej reszty Gal z większości glikoprotein. Endoglikozydazy F i H są przykładami drugiej grupy enzymów; enzymy te rozrywają łańcuch oligosacharydowy w określonych miej-

GLIKOPROTEINY i PROTEOGUKANY / 7S3

scach występowania reszt GlcNac, w pobliżu tańcucha^ polipeptydowego (tzn. w wewnętrznych pozycjach) i dlatego też są użyteczne w badaniach strukturalnych dużych łańcuchów oligosacharydowych. Trawienie glikoprotein jedną lub kilkoma z wymienionych glikozydaz wykorzystuje się do badań pewnych procesów biologicznych związanych z usunięciem specyficznych cukrów. Doświadczenia prowadzone przez Ashwella i wsp. na początku lat siedemdziesiątych wykazały, że odsłonięcie reszt Gal, na skutek działa-' nia neuraminidazy, prowadzi do szybkiego zanikania ceruloplazminy w surowicy. Kolejne prace wykazały, że na powierzchni komórek wątrobowych znajduje się receptor rozpoznający resztę galaktozylową wieJu desjalizowanych białek osocza (tzn. nie zawierających NeuAc), który zarazem prowadzi do ich endocytozy. Te prace jasno pokazały, że poszczególne cukry mogą odgrywać główną rolę w spełnianiu przynajmniej jednej biologicznej właściwości (determinują czas przebywania w krwiobiegu) głównych glikoprotein.

LEKTYNY MOGĄ BYĆ UŻYWANE DO OCZYSZCZANIA I BADANIA FUNKCJI GLIKOPROTEIN Lektyny są białkami pochodzenia roślinnego, które wiążą jeden lub więcej specyficznych cukrów. Ich rola w roślinach jest wciąż badana. Wiele lektyn zostało oczyszczonych i więcej niż 40 z nich jest dostępna w handlu (tab. 57-5). Lektyny znalazły liczne zastosowanie w badaniach biochemicznych, miedzy innymi:

Tabela 67-5.Trzy iektyny i cukry, z którymi one oddziałują. W większości przypadków lektyny wykazują specyficzność w stosunku do anornerycznej konfiguracji wiązania glikozydowego (a i {'•): to nie jest pokazane w tabeli. Lektyna

Stosowany skrót

Konkanawali-

Con A

Cukier Man i Glc

na

Lektyna sojowa

Agtutynina kiełków pszenicy 4S — Biochemia

— WGA

Gal i GalNA GIcNAc i NeuAc

1. W oczyszczaniu i analizie glikoprotein. Lektyny, takie jak* konkanawalina A (Con A), mogą wiązać się kowalencyjnie z podłożem obojętnym, takim jak sefaroza. Takie związane cząsteczki sefaroza-Con A mogą być użyteczne do oczyszczania glikoprotein, zawierających łańcuchy oligosacharydowe, reagujące z Con A, Jako narzędzie do badań powierzchni ko mórek. Ponieważ lektyny rozpoznają specyficz ne cukry, wiec mogą być używane do badań ogólnych reszt cukrowych znajdujących się na powierzchni komórek. Lektyn używano w licz nych badaniach porównawczych glikoprotein powierzchni komórek nowotworowych i prawi dłowych (p. rozdz. 61). Badania te wykazały, że do spowodowania aglutynacji komórek nowo tworowych w porównaniu z normalnymi po trzebne są mniejsze ilości pewnych lektyn, co sugeruje, że organizacja i struktura licznych glikoprotein powierzchni komórek nowotworo wych jest inna niż ta, którą można spotkać na powierzchni komórek normalnych. Do wytwarzania mutantów komórkowych pozbawionych pewnych enzymów, uczestniczą cych w syntezie oligosacharydów. Okazuje się bowiem, że jeśh prowadzi się hodowie tkan kowe komórek ssaków w odpowiednim stężeniu niektórych lektyn (np. Con A), to większość z nich obumiera, a tylko kilka opornych przeży wa. Wykryto, że takie komórki często pozba wione są pewnych enzymów, które uczestniczą w syntezie oligosacharydów. Przypuszcza się więc, że komórki są oporne dlatego, że nie wytwarzają jednej lub więcej powierzchniowych glikoprotein zdolnych do wiązania się z użytymi do tego celu lektynami. Użycie takich mutan tów komórkowych ma istotne znaczenie w wy jaśnianiu licznych aspektów biosyntezy gliko protein.

ISTNIEJĄ 4 GŁÓWNE KLASY GLIKOPROTEIN Na podstawie rodzaju wiązania między łańcuchem polipeptydowym a łańcuchem oligosacharydowym glikoproteiny mogą być podzielone na 4 klasy: 1) zawierające wiązanie między Ser lub Thr a GalNAc (ryc. 57-1), 2) proteoglikany zawierające wiązanie między Ser a Xyi, 3) kolagen zawierający wiązanie między hydroksylizyną (Hyl) a Gal i 4) glikoproteiny zawierające wiązanie między Asn a GIcNAc. W klasach 1, 2 i 3 odpowiednie aminokwasy

754 / ROZDZIAŁ 57 CH2OH

sekwencja jest glikozylowana i to, czy do niej dojdzie, zależy od konformacji przestrzennej białka występującego w siateczce śródplazmatycznej.

Występowanie i struktura łańcuchów oligosscharydowych 0-wiązanych glikoprotein. Wiele glikoprotein tej klasy wykryto w mucynach. O-glikozydowe wiązania występują również w glikoproteinach krążących lub związanych z błonami. Ponadto wykazano, że GalNAc jest cukrem najczęściej bezpośrednio wiązanym do reszt Ser iub Thr (ryc, 57-1) i zwykle reszta Gal lub NeuAc jest do niej przyłączona. Struktury dwóch typowych łańcuchów oHgosacharydowych tej klasy pokazano na ryc. 57-2. Poznano również wiele innych odmian.

Ryc. 57-1. Wiązanie N-acetylogalaktozoaminy do seryny i N-aceiyloglukozoaminy do asparaginy,

przyłączone są do reszt cukrowych przez wiązanie O-glikozydowe (tzn. w wiązaniu bierze udział grupa OH ze strony łańcucha aminokwas owego i reszta cukrowa). Natomiast w czwartej klasie występuje wiązanie N-glikozydowe (tzn. w wiązaniu bierze udział N grupy amidowej asparaginy i reszta cukrowa). Klasy 2 i 3 występują stosunkowo rzadko, dlatego też określenia O-wiązane glikoproteiny często używa się, podobnie jak tutaj, do opisywania glikoprotein klasy l^JCtasa 4 określana jest terminem N-wiązane "glikoproteiny. Znane są również inne mniejsze klasy. Liczba łańcuchów oligosacharydowych przyłączonych do jednego łańcucha polipeptydowego może zmieniać się od 1 do 30 lub więcej, a liczba reszt cukrowych tworzących jeden łańcuch oligosacharydowy waha się od 2 lub 3 do bardzo wielu. Ponadto, niektóre glikoproteiny zawierają łańcuchy oligosacharydowe zarówno O-, jak i N-wiązane. O-wiązane glikoproteiny zawierają tripeptydową sekwencję Asn-Y-Ser (Thr) Większość połączeń O-glikozydowych występuje przy wolnych grupach OH reszt Ser i Thr polipeptydu z tripeptydową sekwencją Asn-Y-Ser (Thr), gdzie Y jest dowolnym aminokwasem, innym niż asparaginian. Ta specyficzna

NeuAc

°2'6

GalNAc

GalNAc

■ Ser(Th r)

•Ser(Thr)

NeuAc

Ryc. 57-2. Struktury dwóch O-wiązanych oligosacharydów występujących w (A) mucynach śli-nianek podszczękowych i (B) fetuinie oraz sjalo-glikoproteinie bfon ludzkich erytrocytów. (Według; Lennarż W. J.: The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans; Plenum Press, 1980, za zezwoleniem)

Biosynteza O-wiązanych glikoprote-

in. Polipeptydowe łańcuchy tych i innych glikoprotein są kodowane przei mRNA; ponieważ większość glikoprotein to integralne białka błonowe lub białka sekrecyjne, toteż ogólnie można powiedzieć, że ulegają one translacji na polirybosomach związanych z błonami (p. rozdz. 40). Łańcuchy oligosacharydowe typu O-glikozydowo wiązanych glikoprotein są wytwarzane przez stopniowe dodawanie cukrów pochodzących z cukrów nukleotydowych, takich jak UDP-GalNAc, UDP-Gal i CMP-NeuAc. Enzymy katalizujące ten typ reakcji są glikozyiotransferazami glikoproteinowymi związanymi

GLIKOPROTEINY I PROTEOGLIKANY / 755

z błonami. Synteza każdego takiego enzymu jest kontrolowana przez jeden specyficzny gen. Ogólnie można powiedzieć, że synteza jednego specyficznego typu wiązania wymaga aktywności odpowiednio specyficznej transferazy (tzn. obowiązuje założenie „jedno wiązanie — jedna glikozylotransferaza"). Enzymy katalizujące dodawanie wewnętrznych reszt cukrowych znajdują się w siateczce śródplazmatycznej i dodawanie pierwszych cukrów następuje podczas translacji (tzn. występuje kotranslacyjna modyfikacja białka). Natomiast enzymy dodające końcowy cukier (taki jak NeuAc) znajdują się w aparacie Golgiego. N-wiązane glikoproteiny zawierają wiązanie Asn-GIcNAc Ta klasa wyróżnia się obecnością wiązania Asn-GIcNAc (ryc. 57-1). Jest ona główną klasą glikoprotein, dobrze zbadaną, dzięki łatwej dostępności do tkanek, w których występuje (np. białka osocza). Należą do niej zarówno glikoproteiny, będące integralnymi białkami błonowymi jak też białkami krążącymi (osoczowymi). Główne różnice między nimi, jak również poprzednimi klasami, poza rodzajem aminokwasu, do którego są przyłączone łańcuchy oligo-

Kwas sjalowy

Klasy IV-wiązanych glikoprotein i ich

struktury. Znane są 3 główne klasy N-wiązanych glikoprotein: kompleksowe, hybrydowe i wysokomannozowe (ryc. 57-3). Częścią wspólną w tej klasie jest pentasacharyd (Man)3 (GlcNAc)2, wyróżniony linią przerywaną na ryc. 57-3, jak również na ryc. 57-4. Różnią się one między sobą jedynie zewnętrznymi rozgałęzieniami. Obecność wspólnego pentasacharydu dowodzi, że wszystkie 3 klasy mają wspólny ogólny mechanizm biosyntezy. Glikoproteiny typu kompleksowego zwykle zawierają końcową resztę NeuAc oraz charakterystyczne reszty Gal i GlcNAc, które często są składnikami laktozoaminy (obecność powtarzającego się fragmentu laktozoaminy (Galp>4GlcNAc P l-3)n jest charakterystyczna dla czwartej klasy glikoprotein, tzw. klasy polUaktozoaminowej; klasa ta jest ważna, ponieważ do niej należą substancje grupowe krwi I/i. Większość oligosacharydów typu kompleksowego zawiera 2, 3 lub 4 zewnętrzne rozgałęzienia (ryc. 57-3), chociaż opisano także struktury zawierające 5 rozgałęzień. Rozgałęzienia oligosacharydów są często nazywane

Kwas sjatowy

2,3lub6

a2,3 Iub6

O

±GlcNAc-

l Man

6 (31, 4

aUl

GtcŃAc

±Fuc

sacharydowe (głównie Asn zamiast Ser), dotyczą ich biosyntezy.

GlcNAc

Man

Man

.1.3^

^.6

J--------------»-Man i 01,4 GIcNAe I 01,4 ■ GlcNAc

^ GlcNAc

Asn Kompleksowe

GtcNAc

Man

Man

Man

Man

a1>X

Man

Man


aUl

Man

Man

*
Man

«1,2|

Man Man

X^V6

Man-« p •-■■■ GicNAc i01,4

Man 101,4

GlcNAc |01,4

GlcNAc |01,4

GlcNAc

GlcNAc

L-------!------------1 |__Asn Hybrydowe

Asn Wysoko man nożowe

Ryc. 57-3. Struktury głównych typów asparagino-wiązanych oligosacharydów. Wyróżniony obszar jest rdzeniem pentasacharydowym, powszechnie występującym we wszystkich N-wiązanych glikoproteinach. (Według: Kornfeld R., Kornfeld S: Assembly óf asparagine-linked oligosaccharides^mw. Rev. Biochetn. 1985, 54, 631, za zezwoleniem).___________________________________________

\

756 / ROZDZIAŁ 57 Endogllkozydaza F ' 04 04 * Man ------ GIcNAc —j- GIcNAc —*—

Asn

Man-a3 Enduglikozydaza H Ryc. 57-4. Schematyczny diagram podstawowe go rdzenia peniasacharydowego wszystkich Nwiązanych oligosacłiarydów, do którego mogą być przyłączone różne łańcuchy oligosacharydowe. Wskazane są również miejsca działania endoglikozydaz F i H.

antenami i struktury takie określa się jako bi-, tri-, tetra- i pentaantenowe. W typie kompleksowym glikoprotein występuje ogromna liczba łańcuchów oligosacharydowych, a struktura przedstawiona na ryc. 57-3 jest jedną z wielu. Inne łańcuchy kompleksowe mogą być zakończone Gal lub Fuc. Łańcuchy oligosacharydowe typu wysokoman nożowego zawierają dodatkowo 2—6 reszt Man przyłączonych do rdzenia pentasacharydowego. Makrocząsteczki typu hybrydowego mają cechy charakterystyczne dla obu tych typów.

Przegląd procesów związany 2 biosyntezą N-wiązanych giikoprotein. Leloir i wsp. opisali występowanie oligosacharydu związanego z difosibdolicholem (aligosacharydo-P-P-DoI), który pełni główną rolę w biosyntezie N-wiązanych glikoprotein. Ogólną strukturę łańcucha oligosacharydowe go tego związku można przedstawić następującym wzorem (Glc)3(ManyGJcNAs)rR. gdzie R = P-P-Dol. W pierwszym etapie biosyntezy cukry najpierw przyłączone są do difosfodolicholu, a później łańcuchy oligosacharydowe są przenoszone w całości do odpowiednich reszt Asn, będących akceptorami apoglikoprotein podczas syntezy

na polirybosomach związanych z błonami. Łańcuchy oligosacharydowe typu kompleksowego powstają na skutek usunięcia reszt Glc i 6 Man, tworząc rdzeń pentasacharydu (Man)3(GlcNAc)2 (ryc. 57-4). Następnie określone glikozylotransferazy, zlokalizowane najczęściej w aparacie Golgiego, przenoszą charakterystyczne dla łańcucha kompleksowego cukry (GIcNAc, Gal, NeuAc) na odpowiedni akceptor. Natomiast łańcuchy wysokomannozowe powstają przez przyłączanie reszt Gal lub usuwanie pewnych peryferyjnych reszt Man. Proces, w wyniku którego łańcuchy głikanowe N-wiązanych glikoprotein są najpierw częściowo usuwane, a potem przebudowywane, określa się jako proces przekształcania (obróbki) oUgosacharydów. Początkowe etapy biosyntezy N- i O-wiązanych glikoprotein znacznie różnią się między sobą. I tak w biosyntezie N-wiązanych glikoprotein uczestniczy oligosacharyd-P-P-Dol, natomiast nie uczestniczy on w biosyntezie O-wiązanych glikoprotein. W procesie tym można wyróżnić dwa etapy: 1) tworzenie i przeniesienie oligosacharydu-P-P-dolicholu, 2) obróbka łańcuchów oligosacharydowych.

1. Tworzenie i przeniesienie związków typu oligosacharyd-P-dolichol- poliizoprenol występuje zarówno w tkankach eukariotycznych, jak i u bakterii. Ten nośnik prekursorowych jednostek oligosacharydowych bierze udział w syntezie błon komórkowych bakterii, jak również w biosyntezie Nwiązanych glikoprotein. W tkankach eukariotycznych do syntezy wykorzystywany jest dolichol, związek należący do rodziny poliizoprenoii. Dolichol, obok gumy, jest najdłuższym naturalnie występującym węglowodorem: składa się on z 17—20 powtarzających się pojedynczych podjednostek izoprenoidowych (ryc. 57-5).

i H I HO-CH,-CH,-CCH,-

I

CH, I ■CHiCH=;C-CHj

CH,

I CH,~CH=C-CHj

CH,

Ryc. 57-6. Struktura dolicholu. Fosforan w fosforanie dolicholu połączony jest z grupą alkoholową, po lewej stronie cząsteczki. Fragment objęty klamrą jest częścią izoprenu (n = 17—20 jednostek izo prenoidowych).

-

GLIKOPROTEINY I PROTEOGLIKANY 757 /

W biosyntezie oligosacharydu-P-P-dolicholu bierze udział fosfodolichol (Dol-P), który powstaje w reakcji dolicliotu z ATP (nośnik fosforanu), katalizowanej przez kinazę dolicholową. GkNAc-difosfo-doUchol (GlcNAc-P-P-Dol) jest głównym lipidem, spełniającym rolę akceptora dla innych cukrów tworzących oligosacharyd-P-P-Dol. Jest on syntetyzowany na błonach szorstkiej siateczki śródpiazmatycznej z Dol-P i UDP-GlcNAc w następujących reakcjach: Dol-P : UDP-GIcNAc GIcNAc-P-P-Dol+UMP

Reakcja ta jest pierwszym etapem tworzenia oligosacharydu-P-P-Dol. Kolejne reakcje przedstawione są na ryc. 57-6. Dalsze etapy tworzenia się oligosacharyduP--P-dolicholu przebiegają następująco: a. Druga reszta GlcNAc zostaje przeniesiona na pierwszą, przy czym UDP-GlcNAc jest jej nośnikiem.

b. Następnie przyłączonych zostaje 5 reszt Man, pochodzących z GDP-Man. c. W końcu przyłączone zostają 4 kolejne reszty Man, pochodzące z Dol-P-Man. DoJ-P-Man powstaje w następującej reakcji: Dol-P + GDP-Man <-> Dol-P-Man + GDP

d. Biosyntezę oligosacharydu prekursorowego kończą 3 reszty glukozy przeniesione z Dol-P-Glc. Dol-P-Glc powstaje w reakcji podobnej do wyżej przedstawionej z lą różnicą, że Dol-P i UDP-Glc są substratami. Należy zwrócić uwagę na to, że pierwsze 7 cukrów (2 reszty GlcNAc i 5 reszt Man) pochodzi z cukrów nukleotyd owych, podczas gdy 7 ostatnich cukrów W resziy Man i 3 reszty Glc) jest przenoszonycn^z cukrów dolicholowych. Rezultatem powyższych reakcji jest związek przedstawiony na ryc. 57-7. Jego wzór sumaryczny można podać jako (Glc)3(Man)9 (GlcNAc)2-P-P-Dol.

UDPGIcNAc Dol-P ■>*---------T u n l k a m y c y n a -UMP M-M

GlcNAc-P-P-Dol UDPGtaNAc

M M-M

UDP

M-tG!cNAc)s~P-P-Doi

G-G-G-M-M-M ,P-Dol

GlcNAcGl GDP-M

M- P -D ol iG -P - D ol

GDP" M-GIcNAc-GIcNAc-P-P-

{Ml.-(GlcNAc),-P-P-Dol Dol

P-Dol M

M-PDol M-(GlcNAc)i-P-PDol

(GOP-M),

M-M-M

Ryc. 57-8. Szlak biosyntezy dolicholo-P-P-oligosachsrydu. Rodzaje powstałych specyficznych wiązań sa pokazane na ryc. 57-7. Można zauważyć, że zewnętrzne resay mannozy pochodzą z GDP-mannozy, podczas gdy większość reszt mannozy i glukozy pochodzi z dolicholo-P-rnannozy i doticholo-P-glukozy. UDP-urydynod(fosforan;Ool—dolichol; P—fosforan; UMP — urydynomonofosforan,GDP — guanozynomonofosforan; M — mannoza; G — glukoza. _______________________________________________________________________________

758 / ROZDZIAŁ 57 Bi.2

Man ■ Man ^■Man

Man Do l l ch ol 1.3

Ma n j Si SiU Gl c N Ac — *Gl c N Ac - P- P•a1,3

_L2*Ma»^Man£H*Man Ryc. 57-7. Struktura dolicholo-P-oligosacharydu. {Według: Lennarz W, J.; Glycoproteins and Proteoglycans; Plenum Press, 1980, za zezwoleniem).

Oligosacharydy związane z difosfodolicholem są przenoszone w całości na nowo zsyntetyzowane białko związane z błoną szorstkiej siateczki śródplazmatycznej. by wytworzyć Nglikozydowe wiązanie z jedną lub kilkoma specyficznymi resztami Asn łańcucha polipeptydowego. Reakcja jest katalizowana przez „transferazę oligosacharydową", która jest enzymem związanym z błoną wewnętrzną siateczki. Transferaza ta może rozpoznać i przenieść każdy lipid o strukturze R-(GlcNAc)2-P-P-Dol. Glikozylacja zachodzi na resztach Asn tripeptydowej sekwencji Asn-X-Ser/Tłir, gdzie X jest dowolnym aminokwasem, innym niż reszty proiiny i kwasu asp ara gin owego. Uprzywilejowanymi miejscami do glikozylacjijest tripeptyd wykazujący konformację przestrzenną p. Tylko ok. \'i reszt Asn ulega glikozylacji i białka podatne na ten proces można podzielić na dwie grupy: sekrecyjne i integralne błonowe. Białka cytoplazmy stosunkowo rzadko ulegają glikozylacji. Na ryc. 57-8 przedstawiono reakcję przeniesienia oraz późniejszy proces gliksj^lacji N-wiązanych glikoprotein, jak również lokalizację tych ostatnich w strukturach subkomórkowycłi. Drugim produktem reakcji katalizowanej przez transferazę oligosacharydową jest dolicholo-P-P, który pod wpływem fosfatazy ulega konwersji do dolicholo-P, Dolicholo-P może ponownie służyć jako akceptor w syntezie innej czą steczki o I ig osa c h a ry do- P- P-dolich o lu. 2. Przekształcanie (obróbka) łańcuchów otigosacharydowych.

a. Wcześniejsza faza. Na rycinie 57-8

pokazane są różne typy reakcji biorących udział w tym procesie. Reakcję 1 katalizuje transferaza oligosacharydową (p. poniżej), W reakcji 2 i 3 kolejno usuwane są: przez glukozydazę I końcowa reszta Glc oraz przez glukozydazę II dwie reszty Glc. W przypadku glikoprotein typu wysoko ma nnozowego proces ten może być za-

The Biochemisłry of _________

trzymany na tym etapie, lub też mogą dodatkowo zostać usunięte 4 reszty Man. Natomiast łańcuchy typu kompleksowego tworzone są w dalszych etapach. Mianowicie 4 zewnętrzne reszty Man są usuwane w reakcjach 4 i 5 przez różne mannozydazy. W reakcji 5, katalizowanej przez GlcNAc-transferazę I, reszta GlcNAc jest dodawana do jednej Man. Działanie kolejnego enzymu, mannozydazy (ot-mannozydazy II aparatu Golgiego) umożliwia przebieg reakcji 7, w wyniku której dochodzi do redukcji reszt Man w rdzeniu do 3 reszt (ryc. 57-4). Na rycinie 57-8 reakcje I i II przedstawiają dodatkowy ważny szlak metaboliczny przekształcania oligosacharydów. Przedstawiona jest tutaj synteza jednostek oligosacharydowych enzymów Hzosomalnych, które po uzyskaniu specyficznego markera kierowane są do lizosomów. W reakcji I reszta GlcNAc-1-P jest przenoszona na grupę OH przy węglu 6 jednej lub więcej reszt Man tych enzymów. Reakcja ta, przedstawiona niżej, jest katalizowana przez GlcNAc-fosfotransferazę. Nośnikiem GlcNAc jest UDP-GlcNAc, zaś produktem reakcji UMP. | Glc-NAC-FOSFOTRAMSFERAZA |

UDP-GtellAc+Man-B ialkoiGIcN Ac-i-P-e-Man-Białko+U MP

W reakcji II reszta GlcNAc jest usuwana pod wpływem fosfodiesterazy, pozostawiając fosforylowane reszty Man w pozycji 6 Man. j FOSFODIESTEHAZA | GlcNAc-1-P-6-Man-Białko i P-6-Man-Białko+GlcNAc

Receptor dla Man-6-P zlokalizowany w aparacie Golgiego wiąże resztę Man-6-P i kieruje ją potem do lizosomów. Fibroblasty pochodzące od pacjentów, u których stwierdza się chorobę

GUKOPROTEINY I PROTEOGLIKANY / 759 SZORSTKIE RETIKULUM S ROD PLAZM ATYCZ NE'

Ryc. 57-8. Schematyczny szlak biosyntezy oligosacharydów. Reakcje są katalizowane przez następujące enzymy: 1 — oligosacłiarylotransferaza, 2 — a-glukozydaza I, 3 — a-glukozydaza II, 4 — ct1,2-mannozydaza, I. N-acetyloglukozoaminylofosfotransferaza, II. N-acetyio-glukozoamino-1-fosfodiestero-s-N-acetyloglukozoaminidaza siateczki śródplazmatycznej, 5 — a-mannozydaza I aparatu Golgiego, 6 — N-acetyloglukozoaminylotransferaza I, 7 — %- ma n noży baza II aparatu Golgiego, 8 — N-acetylologlukozoaminylotransferaza II, 9 — fu kozy I otrą n sfer aza, 10 — galaktozylotransferaza, 11 —sjalilotransferaza, ■— N-acetyloglukozoamina, O — mannoza, A — glukoza, A — fukoza, • — gaiaktoza, ♦ — kwas sjalowy. (Według: Kornfeld R.. Kornfeld S.: Assembly of asoaragine-Nnked oligosaccharides; Annu. Rev. Biochem. 1985, 54, 631, za zezwoleniem). ______ _________________________

wtrętów komórkowych (I-cell disease) (p. poniżej) mają receptory dla fosfomannożowych oligosacharydów, lecz wykazują duży niedobór GlcNAc-fbsfotransferazy. b. Późniejsza faza. Łańcuchy oligosacharydowe typu kompleksowego tworzą się dzięki przyłączaniu dodatkowych cukrów do jednostek oligosacharydowych powstałych w reakcji

7. W reakcji 8 druga reszta GlcNAc jest dodawana do zewnętrznej reszty Man innych rozgałęzień biantenowej struktury pokazanej na ryc. 57-8: enzymem katalizującym ten etap jest GlcNAc-transferaza II. Natomiast w reakcjach 9, 10, i 11 katalizowanych przez fukozylo-, gaiaktozylo- i sjalilotransferazy kolejno dodawane są reszty Fuc, Gal i NeuAc.

760 / ROZDZIAŁ 57

S u bk om orko we miejsca. Głównymi miejscami, w których zachodzi proces glikozylacji, są siateczka śródplazmatyczna i aparat Golgiego, co pokazano na ryc. 57-8. Łańcuchy oligosacharydowe są przyłączone w szorstkiej siateczce śródplazmatycznej i jest to zjawisko zarówno ko-, jak i potranslacyjne. W siateczce śródplazmatycznej zachodzi również odcinanie reszt GIc oraz niektórych peryferyjnych reszt Man. Aparat Goigiego składa się ze specyficznych cystern, mianowicie: cis, środkowych i trans, które mogą być rozdzielone za pomocą odpowiedniego wirowania. Glikoproteiny powstałe w siateczce śródplazmatycznej przenoszone są potem do cystern cis Golgiego. Wiele różnych badań potwierdziło, że enzymy uczestniczące w procesie syntezy glikoprotein wykazują swoistą lokalizację w cysternach Golgiego. Jak wynika z ryc. 57-8 oc-mannozydaza I aparatu Golgiego (katalizująca reakcje 5) znajduje się głównie w rejonie cis aparatu Golgiego, podczas gdy GlcNAc-transferaza (katalizująca reakcję 6) okazała się być obecna w rejonie środkowym aparatu Golgiego. Natomiast fukozylo-, galaktozyio- i sjalilotransferazy (katalizujące reakcje 9, 10 i 11) obecne są w rejonie trans aparatu Golgiego. W regulację procesu glikozylacji glikoprotein wciągniętych jest wiele enzymów i kolejność działania tych enzymów Jest oczywiste, że glikozylacja glikoprotein jest procesem złożonym, w którym bierze udział wiele enzymów. Udowodniono, że w tym złożonym procesie uczestniczy 7 glikozylotransferaz, ale teoretycznie może występować wiele innych. Znane są liczne rodzaje innych glikozylotransferaz (np. sjalilotransferazy). Pierwsze etapy biosyntezy N-wiązanych glikoprotein (tzn. tworzenie i przenoszenie oligosacharydów) są kontrolowane przez następujące czynniki: 1) obecność odpowiednich miejsc akceptorowych na białku, 2) odpowiednie stężenie Dol-P w tkankach i 3) aktywność transferazy oligosacharydowej. Proces przekształcania łańcuchów oligosacharydowych również podlega kontroli. Tymi czynnikami kontrolującymi są: 1) aktywność w komórkach różnych hydrolaz i transferaz biorących udział w syntezie różnych typów łańcuchów oligosacharydowych (np. typu kompleksowego czy wysokomannozowego); oczywiście, jeśli swoista transferaza nie występuje

w tkance, to odpowiednie wiązanie cukrów nie powstaje; 2) niektóre z enzymów mogą działać dopiero po uprzednim działaniu innych enzymów, np. działanie GlcNAc-transferazy I (ryc, 57-8) umożliwia następną reakcję katalizowaną przez oc-mannozydazę II aparatu Golgiego; 3) aktywności różnych transferaz zmieniają się w czasie cyklu życiowego organizmów, co częściowo wyjaśnia fakt tworzenia różnych łańcuchów oligosacharydowych podczas kolejnych etapów tego cyklu; 4) fakt, że poszczególne glikozyl o transferazy mają różną wewnątrzkomórkową lokalizację sprawia, że pełnią one ważną rolę w regulacji procesów biosyntezy glikoprotein, np. jeśli syntetyzujące sie białko ma być integralnym białkiem błonowym siateczki śródplazmatycznej (np. HMG-CoA), to nigdy nie jest transportowane w rejonie aparatu Golgiego, gdzie mogłoby napotkać enzymy przekształcające białka znajdujące się w tym rejonie; zgodnie z tym nie jest zaskoczeniem, że reduktaza HMG-CoA jest glikoproteiną wysokomannozową; 5) inny ważny czynnik to konformacja przestrzenna białka. Badania biosyntezy glikoprotein przez spokrewnione wirusy wykazały, że zawierają one różne typy łańcuchów oligosacharydowych, kiedy były hodowane w tej samej komórce; ten fakt można by najlepiej wytłumaczyć tym, że białka mają różną konformację przestrzenną, która decyduje o miejscach glikozylacji; 6) profile enzymów uczestniczących w procesie przekształcania jednostek oligosacharydowych wykazują znaczne różnice między gatunkowe; jednostki oligosacharydowe wirusa Sindbis, w zależności od komórki gospodarza, w której były hodowane, mogą być typem wysokomannozowym lub kompleksowym; 7) interesujące są również badania aktywności enzymów różnych typów komórek nowotworowych; są dowody, że komórki nowotworowe syntetyzują różne łańcuchy oligosacharydowe (np. często mają więcej rozgałęzień) w porównaniu do komórek kontrolnych. Interesująca wydaje się korelacja między aktywnością specyficznych enzymów uczestniczących w przekształceniach potranslacyjnych a zdolnością nowotworów do tworzenia przerzutów (p. rozdz. 61). Wiele substancji hamuje proces glikozyiacji Znane są liczne związki, które hamują różne etapy przekształcania glikoprotein. Przykładami takich związków mogą być: tunikamycyna,

GUKOPROTEINy I PROTEOGUKANY / 761 Tabela 57-6. Trzy inhibitory enzymów uczestniczących . w procesie glikozylacji glikoprotein i miejsca ich działania Inhibitor Miejsce działania Tunikamycyna Inhibitor enzymu katalizującego dodawanie reszty GIcNAc do Dolichol-P w pierwszym etapie biosyntezy oligosacharydu-PP--dolicholu Deoksynojirimycyoa Inhibitor glikozydazy i i II Swainsomria Inhibitor mannozydazy II

deoksynojirimycytia i swainsonina. W tabeli 57-6 przedstawiono działanie tych inhibitorów. Związki te mogą być używane jako czynniki hamujące różne etapy biosyntezy glikoprotein, jak również do badania skutków tego hamowania. Na przykład, jeśli komórki są hodowane w obecności tunikamycyny, to proces syntezy N-wiązanych glikoprotein nie nastąpi. Działanie tych inhibitorów w pewnych przypadkach wzmaga wrażliwość białek na proteolizę. Okazało się, że hamowanie glikozylacji przez różne inhibitory nie wpływa w sposób stały na sekwencję normalnie wydzielanych białek.

CHOROBA WTRĘTÓW KOMÓRKOWYCH (I -CELL DISEASE) JEST WYNIKIEM NIEMOŻNOŚCI UMIESZCZENIA ENZYMÓW L1Z0S0MALNYCH W LIZOSOMACH Jak to wyjaśniono powyżej, Man-6-P jest chemicznym markerem kierującym enzymy li2osomalne do lizosomów. Badania hodowli fibroblastów pochodzących od pacjentów, u których rozpoznano chorobę wtrętów komórkowych (l-cell disease), wykazały istotną rolę tego markera w tym procesie chorobowym. Okazało się bowiem, że fibroblasty zmienione chorobowo mają małe stężenie prawie wszystkich enzymów lizosomalnych, a lizosomy gromadzą duże ilości nie zdegradowanych różnych makrocząsteczek. Jednakże w surowicy pacjentów z tym schorzeniem stwierdza się znacznie zwiększone stężenie tych enzymów, co sugeruje, że enzymy lizosomalne są syntetyzowane, ale nie mogą dostać się do wewnątrzkomórkowych miejsc przeznaczenia. Dodanie do hodowli fib-

roblastów pochodzących od pacjentów, u których rozpoznano wymieniona chorobę, enzymów lizosomalnych otrzymanych od zdrowych osobników wykazało, że komórki mają zdolność wychwytywania egzogennych enzymów lizosomalnych, co dowodzi, że posiadają normalne receptory dla enzymów lizosomalnych. Badania te sugerują, że enzymy lizosomalne chorych z chorobą wtrętów komórkowych najprawdopodobnej nie mają markera rozpoznającego, a enzymy lizosomalne zdrowych osobników mają go. Fibroblasty pacjentów z chorobą wtrętów komórkowych, mimo że mają receptory dla fosfomannozowych oligosacharydów, nie są w stanie umieścić tego markera na jednostkach wielomannożowych hydrola2 lizosomalnych, gdyż nie mają GlcNAc-fosfotransferazy uczestniczącej w "f^tn procesie. Te badania biochemiczne nie tylko wyjaśniły patogenezę opisywanej choroby, ale również przyczyniły się do poszerzenia wiedzy na temat transportu nowo syntetyzowanych białek do specyficznych organelli, w tym przypadku do lizosomów.

PROTEOGLIKANY I GLIKOZOAMINOGLIKANY Glikozoaminogłikany występujące w proteoglikanach zbudowane są powtarzających się jednostek disacharydowych

z

Proteoglikany są białkami złożonymi, zawierającymi kowalencyjnie przyłączone glikozoaminoglikany (GAG). Białka kowalencyjnie wiążące GAG nazywane są rdzeniami białkowymi; wyizolowanie tych makrocząsteczek w formie nie zdegradowanej sprawia wiele trudności, ale wprowadzenie nowoczesnej techniki inżynierii genetycznej do badań nad proteoglikanami dostarcza coraz to ważniejszych informacji na temat ich struktury. Ilość składnika cukrowego przypadająca na łańcuch polipeptydowy w proteoglikanach jest znacznie większa niż w glikoproteinach, sięga aż 95% ich całkowitej masy. Znanych jest 7 rodzajów GAG: kwas hialuronowy, siarczan chondroityny, siarczan keratanu I i II, heparyna, siarczan heparanu i siarczan dermatanu. GAG są nierozgalęzionymi polisacharydami złożonymi z powtarzających się jednostek disacharydowych, gdzie jednym ze składników jest zawsze aminocukier (stąd nazwa GAG), tj. D-glukozoamina lub D-galaktozoa-

762 / ROZDZIAŁ 57

mina, drugim zaś (wyjątkiem jest siarczan keratanu) kwas uronowy, tj. kwas D-glukuronowy (GlcUA) lub jego epimer, kwas L-iduronowy (IdUA). Z wyjątkiem kwasu hialuronowego, wszystkie GAG zawierają grupę siarczanową, w postaci albo O-estrowej, albo N-siarczanowej (jak w heparynie i siarczanie heparanu). Kwas hialuronowy jest jedynym wyjątkiem, bowiem brak jednoznacznych dowodów na temat kowalencyjnego połączenia tego kwasu z białkiem, co wynika z powyższej definicji proteoglikanów. W przeszłości napotykano wiele trudności związanych z wyodrębnieniem tych złożonych makrocząsteczek. Jednakże są one ważnymi składnikami substancji podstawowej tkanki łącznej, pełniącymi wiele istotnych biologicznych funkcji, co więcej, w różnych stanach chorobowych, w których dochodzi do przebudowy tkanki, zachodzą równolegle zmiany w proteoglikanach. Nic dziwnego, że związki te są przedmiotem wzrastającego zainteresowania. Biosynteza proteoglikanów obejmuje przyłączenie glikozoaminoglikanów do rdzenia białkowego, wydłużenie i zakończenie łańcuchów

Przyłączenie do rdzenia białkowego.

Znane są 3 typy wiązania między GAG a rdzeniem białkowym. O-gHkozydowe wiązanie między ksylozą (Xyl) a seryną (Ser), które występuje tylko i wyłącznie w proteogtikanach. Powstaje ono przez przeniesienie reszty Xyl z LJDP-ksylozy na Ser. Następnie dwie reszty Gal są dodawane do reszty Xyl, tworząc charakterystyczny trisacharyd Gal-Gal-Xyl-Ser: Dalszy wzrost łańcuchów GAG zachodzi na końcowej reszcie Gal. O-glikozydowe wiązanie tworzone między GalNAc a Ser (Thr), występujące w siarczanie keratanu II. Powstaje ono dzięki przeniesieniu GalNAc z UDP-GlcNAc na Ser (lub Thr) łańcucha poiipeptydowego. N-glikozydowe wiązanie między GLcNAc a azotem amidowym Asn, które jest charak terystyczne dla N-wiązanych glik o protein. W syntezie tego wiązania uczestniczy oligosacharyd-P-P-Dol, co zostało opisane powyżej. Synteza rdzenia białkowego, jak też powstawanie niektórych wiązań, zachodzi w siateczce śródplazmatycznej. Natomiast większość późniejszych etapów biosyntezy łańcucha GAG i ich modyfikacje następują w aparacie Golgiego.

Wydłużanie łańcucha. Do syntezy łań-

cuchów GAG wykorzystywane są odpowiednie cukry nukleotydowe i wysoce specyficzne glikozylotransferazy, znajdujące się w aparacie Golgiego. Obowiązuje nadal zasada , jedno wiązanie—jeden enzym", podobnie jak dla pewnych typów wiązań występujących w glikoproteinach. Enzymy biorące udział w procesie wydłużania łańcucha są zdolne do wiernej reprodukcji złożonych GAG.

Zakończenie (terminacja) łańcucho-

wa. Jest ono wynikiem: 1) siarczanowania określonych pozycji pewnych cukrów, 2) wydłużenia łańcuchów GAG daleko poza błonami, gdzie zachodzi kataliza.

Dalsze modyfikacje. Po utworzeniu łań-

cuchów GAG, zachodzą liczne chemiczne modyfikacje, polegające na wprowadzeniu grupy siarczanowej do określonej pozycji GalNAc oraz na epimeryzacji reszt GlcUA do IdUA. Proces siarczanowania, katalizowany przez odpowiednie sulfotransferazy, przebiega przy udziale 3'-fosfoadenozyno-5'-fosfosiarczanu (PAPS, aktywny siarczan), będącego nośnikiem grupy siarczanowej. Sulfotransferazy znajdujące się w aparacie Golgjego są enzymami wysoce specyficznymi, katalizującymi siarczanowanie cukrów w różnych pozycjach (np. przy węg\u w pozycji 2, 3, 4 i 6). Epimeryzację reszt kwasu glukuronowego do iduronowego katalizują epimerazy.

Poszczególne rodzaje glikozoaminoglikanów wykazują subtelne różnice w strukturze oraz charakterystyczne rozmieszczenie Siedem wymienionych wyżej GAG różni się między sobą następującymi właściwościami: składem aminocukrowym, występowaniem kwasu glukuronowego lub iduronowego, typem wiązania między składnikami jednostek disacharydowych, długością jaricucha, występowaniem lub nie grup siarczanowych, składem aminokwasowym rdzeni białkowych, typem wiązania między rdzeniem białkowym a GAG, rozmieszczeniem w poszczególnych tkankach i strukturach subkomorkowych oraz funkcjami biologicznymi. Poniżej omówiono krótko strukturę GAG (ryc. 57-9), ich połączenia z rdzeniem białkowym lub innymi białkami oraz ich' rozmieszczenie w tkankach. Charakterystyczne właś-' ciwości tych 7 GAG wymienione są w tab. 57-7.

GL1K0PR0TE1NY I PROTEOGLIKANY / 763 Kwas hialu ronowy Siarczany chondroityny

,

£ * G a lN A ci

.G a, £ 1 1G a t Ą X y ( JL. S e r

G cUA

4- lub 6-Siarczan Siarczany keratanu 1 i ii

"5-* GlcNAc—-* Asn (Siarczan keratanu I) GlcN

Heparyna I siarczan heparan u

Siarczan ćermatanu

Ac^Gal ^GlcNAc

6-Siarczan

+

f

6-Siarczan ""GalNAc-^-* Thr ISer)[Siarczan | keratanu I!) Gal-NeuAc

6-Siarczan I —* WUA — GlcN —• GlcUA -^ GlcNAc -^ GlcUA ^* Gaf -^ Gal -^ X Y I — Ser

1

I

2-Slarczan

SO3- or Ac

—> IdUA —> GalNAc —- GlcUA —- GalNAc — GlcUA —* Gal —' Gal ^ Xy1 — Ser

I

I

3-Siarczan 4-Siarczan Ryc. 57-9. Struktury proteoglikanów i glikozoaminoglikanów. GlcUA — kwas D-glukuronowy; IdUA — kwas L-iduronowy: GlcN — D-glukozoamina; GaIN — D-galaktozoamina; Ac — acetyl; Gal — galaktoza; Xyl — ksyloza; Ser — L-seryna; Thr — L-treonina; Asn — asparagina; Man — mannoza; NeuAc — kwas N-acetyloneuraminowy. Przedstawione wzory tych makrocząsteczek obrazują jedynie skład jakościowy, nie odzwierciedlając w petni ich struktury. Żadna z wymienionych struktur nie oddaje wiernie wszystkich możliwości podstawienia dodatkowej grupy, np. w heparynie większość reszt kwasu iduronowego zawiera w pozycji 2 grupę siarczanową, natomiast w siarczanie dermatanu tylko niektóre reszty^ tego kwasu są podstawione siarczanem. W siarczanie chondroityny, dermatanu, heparanu i heparynie pokazano również charakterystyczny obszar wiążący GAG-i z rdzeniem białkowym {-Gal-Gal-Xy)-). {Według; Lennarz W. J.: The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans, Plenum Press, 1980, zmodyfikowane, za zezwoleniem).

Tabela B7-7. Główne właściwości glikozoaminoglikanów GAG

Cukry

HA

GIcNac, GlcUA

CS

GalNAc, GlcUA

KSI

Siarczan —

Wiązanie do białka

Występowanie

brak dowodów

Płyn stawowy, ciałko szkliste, luźna tkanka łączna

f lub 6' GalNAc

Xyl-Ser; łączy się z HA przez białka

Chrząstka, kość, rogówka

GlcNAc, Gal

6' GlcNAc, 6'Gal

GIcNAc-Asn

Rogówka

KS II

GlcNAc, Gal

jak w KS 1

GalNAc-Thr

Luźna tkanka łączna

Heparyna

GlcN, IdUA

N GlcN, 6rGlcN, 2'ldUA

Ser

Mastocyty

Siarczan heparanu

GlcN, GlcUA

N GlcN, 6'GlcN

Xyl-Ser

Fibroblasty skóry, ściana aorty

Siarczan dermatanu

GalNAc, idUA (GlcUa)

4'GalNAc 2'ldUA

Xyl-Ser

Powszechnie występujący

764 / ROZDZIAŁ 57

Kwas hialuronowy. Kwas hialuronowy

jest nierozgałęzionym łańcuchem polisacharydowym, złożonym z powtarzających się jednostek disacharydowych, zawierających GlcUA i GlcNAc. W przeciwieństwie do innych GAG nie tworzy on kowalencyjnego wiązania z białkami. Występuje on w komórkach bakteryjnych, jak również powszechnie w różnych tkankach zwierzęcych i ludzkich (np. w płynie stawowym, ciałku szklistym oka i w luźnej tkance łącznej). Siarczany chondroityny (chondroityno-4-siarczan i chondroityno-6-siarczan). Proteoglikany powstałe w wyniku Oglikozydowego wiązania Xyl-Ser-O- z siarczanem chondroityny są głównymi składnikami

chrząstki. Jednostki disacharydowe siarczanu chondroityny i kwasu hialuronowego są bardzo podobne, zawierają GlcUA, z tą jednak różnicą, że siarczan chondroityny zawiera GałNAc zamiast GlcNAc. Ponadto, reszta GalNAc jest podstawiona w pozycji 4 tub 6 siarczanem. W przybliżeniu 1 grupa siarczanowa przypada na 1 jednostkę disacharydową. Każdy łańcuch tego GAG złożony jest z ok. 40 jednostek disacharydowych, a jego masa wynosi 20 000. Wiele takich łańcuchów jest przyłączonych do pojedynczego łańcucha polipeptydowego, tworząc proteoglikany o dużej masie cząsteczkowej (np. w chrząstce nosa masa cząsteczkowa proteoglikanu w przybliżeniu wynosi 2,5 x 106). Siarczany chondroityny łączą się bardzo silnie z kwasem hialuronowym za pośrednictwem 2 „białek wiążących", które wiążą się hydrofobowo zarówno z kwasem hialuronowym, jak i rdzeniami białkowymi, tworząc w tkance łącznej bardzo duże makrocząsteczki, nazywane agregatami (p. ryc. 57-10 i 57-11). Ryc. 57-11. Schematyczne przedstawienie agregatu proteoglikanu. (Według: Lennarz W J.: The Kwas hialuronowy Siatka wiążące Siarczan keratanu rczan chondroityny Rdzeń białkowy

Podjednostk!

Ryo. 57-10. Obraz elektronomikroskopowy agregatu proteoglikanu średniej wielkości, w którym podjednostka (monomer) proteoglikanu i -filamemy rdzenia są znacznie powiększone. {Według: Rosenberg L, Hellman W., Klein-Schmidt A, K.: Electron microscopic studies of proteogiycan aggregates from bovinearticularcartilage; J. Biol. Chem. 1975; 250; 1877, za zezwoleniem).

Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans; Plenum Press, 1980, za zezwoleniem).

GLIK0PR0TE1NY I PROTEOGLIKANY / 785

Siarczany keratanu I i II. Jak przed-

stawiono na ryc, 57-9 składają się z powtarzających jednostek disacharydowych Gal-Gk NAc. Mogą one zawierać grupę siarczanową w pozycji 6 GlcNAc lub czasem Gal. Typ 1 tego GAG występuje przede wszystkim w rogówce, typ II, obok siarczanu chondroityny i kwasu hialuronowego, w luźnej tkance łącznej. Typ I i II różnią się sposobem wiązania z białkiem (ryc, 57-9). Heparyna. Powtarzająca się jednostka disacharydowa złożona jest z glukozoaminy (GlcN) i kwasu gtukuronowego lub iduronowego (ryc. 57-12). Większość grup aminowych GlcN jest N-siarczanowana, a nieliczne acetylowane. Ponadto, GlcN w pozycji 6 zawiera cstrowo związaną grupę siarczanową. W heparynie ok. 90% kwasu uranowego to IdUA. W pierwszym etapie biosyntezy GAG powstający łańcuch zawiera kwas glukuronowy, aie w wyniku procesu epimeryzacji z udziałem 5-epimerazy 90% reszt GlcUA zostaje przekształconych do reszt IdUA. Cząsteczka białka proteoglikanu heparyny jest wyjątkowa, składa się bowiem wyłącznie z reszt seryny i glicyny. Przeciętnie */a reszt seryny jest połączonych z łańcuchem GAG, tworząc proteoglikan o masie cząsteczkowej 5000—15 000 lub czasem większy. Heparyna występuje w 2iarnistościach komórek tucznych, a także w wątrobie, w płucach i skórze. Siarczan heparanu. Występuje jako proteoglikan zarówno na powierzchniach komór* kowych. jak i pozakomórkowo. Zawiera on GlcNAc z mniej licznymi resztami siarczanowymi niż heparyna i w odróżnieniu od heparyny głównym kwasem uranowym jest GlcUA. Reszta GlcNAc może być podstawiona kilkoma grupami siarczanowymi.

GlcN

Siarczan dermatanu. Powszechnie wystę-

puje w tkankach zwierzęcych. Strukturalnie jest podobny do siarczanów chondroityny i siarczanu heparanu. Jego struktura jest podobna do siarczanu chondroityny z tą jednak różnicą, że w miejscu GlcUA związanego z GatNAc wiązaniem 0-1,3 znajduje się IdUA związany z GlcNAc wiązaniem a-1,3. Synteza IdUa odbywa się podobnie jak w heparynie czy siarczanie heparanu, tj. przez 5-epimeryzację. GlcUA. Ponieważ proces ten jest regulowany przez stopień siarczanowania, w przypadku niecałkowitego siarczanowania siarczan dermatanu składa się zarówno z disacharydu: IdUA-GalNAc, jak i GlcUA-GalNAc. Niedobory enzymów degradujących

glikozoaminoglikany glikopyoteiny są przyczyną mukopolisacharydoz i mukołipidoz

Zarówno egzo-, jak i endoglikozydazy

degradują GAG. Podobnie jak i inne biomakroezijsteczki, GAG podlegają procesom metabolicznym, zarówno syntezy, jak i degradacji. Ich pótokres przemiany, w tkankach dojrzałych, jest stosunkowo krótki, rzędu kilku dni do paru tygodni. Poznanie szlaku degradacji glikoprotein, proteoglikanów i GAG w znacznym stopniu przyczyniło się do wykrycia wrodzonych wad metabolicznych, wynikających z niedoboru specyficznych enzymów. Do tych odkryć znacznie przyczyniły się badania dotyczące 2 grup chorób: mukopolisacłiarydoz i mukołipidoz. Początkowo sądzono, że mukolipidozy są wynikiem tylko zaburzeń w metabolizmie mukopolisacharydów (GAG) lub glikosfingoiipidów, dopóki nie wykazano, że również degradacja łańcuchów oligosacharydowych glikoprotein może

IdUA

GlcN

IdUA

GlcN

GlcUA

GlcNAc

Ryc. 57-12. Struktura heparyny. Fragment polimeru przedstawia charakterystyczne strukturalne cechy typowej heparyny. Jednakże na tej rycinie została przedstawiona wybrana sekwencja różnie pod stawionych powtarzających się jednostek disacharydowych. Dodatkowo mogą również występować w pozycji 3 niesiarczanowane bądź siarczanowane reszty glukozoaminy. (Według: Undahl U. i wsp.: Structure and biosynthests of heparin like polisaccharides; Ferf. Proc. 1977, 36, 19, za zezwoleniem; zmodyfikowana).______________________________

766 / ROZDZIAŁ 57

być upośledzona. Wszystkie schorzenia tej grupy, z jednym wyjątkiem, wykazują wspólne cechy: tj. niedobór aktywności enzymu degradującego (zwykle zlokalizowanego w lizosomach), rezultatem czego jest nagromadzenie się substratu w różnych tkankach. Nagromadzenie się substratu może być przyczyną powiększenia narządu, zaburzeń w strukturze kości, skóry, upośledzenia umysłowego i innych anomalii zależnych od nasilenia niedoboru enzymu i rozmieszczenia substratów w tkankach. Wyjątkiem jest choroba wtrętów komórkowych, która polega na niemożności umiejscowienia enzymów lizosmnalnych w lizosomach, co opisano wcześniej w tym rozdziale. Tabela 57-8 przedstawia biochemiczne defekty występujące w tych schorzeniach i związane z nimi zaburzenia. W większości przedstawionych w tabeli mukolipidoz w moczu stwierdza się wzrost zawartości frakcji glikoprotein, spowodowany blokiem metabolicznym. Endoglikozydazy, egzoglikozydazy i sulfatazy uczestniczą w procesie degradacji łańcuchów polisacharydowych GAG. Hialuronidaza jest szeroko rozpowszechnioną endoglikozydazą, rozszczepiającą wiązanie heksozoamidynowe. Działając na kwas łualuronowy generuje ona tetrasacharyd o strukturze (GlcUA-pi,3-GlcNAc-pi,4)2. Ponadto degraduje ona również siarczan chondroityny. Do tej pory nie została opisana jednostka chorobowa spowodowana niedoborem tego enzymu. Tetrasacharyd powstały w wyniku działania hialuronidazy może być dalej degradowany przez pglukuronidazę i p-N-acetyloheksozoaminidaP-glukouronidaza jeSt egzoglikozydazą, która usuwa GlcUA i ldUA z nie redukującego końca tetrasacharydu lub długich polisacharydów. Substratami dla niej są: siarczan dermatanu, siarczan heparanu, siarczan chondroityny i kwas hialuronowy. Wrodzony niedobór tego enzymu u ludzi jest przyczyną wydzielania z moczem pierwszych trzech wymienionych GAG, z wyjątkiem kwasu hialuronowego. Przypuszcza się, że tetrasacharyd powstały w wyniku trawienia kwasu hialuronowego hialuronidazą jest dalej metabolizowany w innym szlaku. p-D-acetyloheksozoaminida2a jest egzoglikozydazą, obecną w większości tkanek ssaków. Katalizuje ona reakcję hydrol i tycznego odszczepienia GlcNAc i GalNAc połączonych wiązaniem p-gh'kozydowym z nie redukującym końcem polisacharydów. Substratami dla tego

enzymu są: gangliozydy, siarczany chondroityny, kwas hialuronowy, siarczan dermatanu i siarczany keratanu I i II. Znane są dwa izoenzymy p-D -acety lohek sozoaminidazy: A i B. lzoenzym A składa się z 2 różnych podjednostek cc i P, natomiast izoenzym B tylko z podjednostki p. Zaburzenia w strukurze tych izoenzymów są przyczyną niektórych schorzeń, np. w chorobie Taya-Sachsa wadliwa jest podjednostka a, więc izoenzym A jest nieaktywny. W chorobie Sandhoffa z kolei wadliwa jest podjednostka p, co wywołuje niedobór obu izoenzymów A i B. Oba te schorzenia powodują zwykle zgon niemowlęcia, gdyż dochodzi do znacznego gromadzenia gangliozydów GM2 w mózgu. Wymienione choroby są raczej klasyfikowane jako sfingolipidozy (p. tab. 25-1), a nie mukopolisacharydozy, gdyż powstają głównie w wyniku zaburzeń procesów degradacji gangliozydów, P-galaktozydaza (egzoglikozydazą) występuje w kilku postaciach w tkankach zwierzęcych. Siarczan chondroityny i siarczan keratanu zawierają resztę P-galaktozydową, która może być substratem dla kwaśnej galaktozydazy. Niedobór kwaśnej galaktozydazy jest przyczyną gromadzenia się siarczanu keratanu i fragmentów glikoprotein, włącznie z gangliozydami GM, (p. rozdz. 26). oc-L-iduronidaza jest lizosomalną egzoglikozydazą, usuwającą IdUa z nie redukującego końca łańcucha polisacharydowego. Niedobór tego enzymu obserwuje się w zespole Hurler. Sulfataza iduronianowa jest specyficznym enzymem katalizującym odszczepianśe grupy siarczanowej w pozycji C2 reszty IdUA na nie redukującym końcu heparyny, siarczanu heparanu i siarczanu dermatanu. Dziedziczny niedobór tego enzymu stwierdza się w zespole Huntera. Aktywności wymienionych enzymów oraz innych przedstawionych w tab. 57-8 mogą być oznaczone w fibrobiastaoh skóry, leukocytach, komórkach owodni, a czasem również w surowicy. Badania stwierdzające wzrost ilości GAG w moczu mają również zastosowanie diagnostyczne.

Proteoglikany spełniają liczne funkcja Ogólne uwagi. Jak wykazano powyżej, proteoglikany w znacznym stopniu są złożonymi makrocząsteczkami, występującymi we wszystkich tkankach organizmu, głównie w pozakomórkowej macierzy lub w substancji pod-

Tabela 57-8. Biochemiczne defekty i diagnostyczne i mukolipidozach oraz związane z nimi zaburzenia *

Nazwa

Stosowane skróty

GLIKOPROTEINY 1 PROTEOGLIKANY / 767 testy stosowane w mukopolisacharydozach

Enzymatyczny defekt

Wykrywane meta bolity w moczu

M u kopo 1 i sachary dozy Zespól Hurler, Scheiego Hurler/Scheiego

MPSI

Niedobór a-L-iduronidazy

DS, HS

Zespół Huntera

MPS II

Niedobór sulfatazy iduronianowej

DS, HS

Zespół Sanfilippo A

MPS IM A

Niedobór N-sulfatazy HS (sulfamidazy)

HS

Zespół Sanfilippo B

MPS Ml B

Niedobór a-N-acetyloglukozoaminidazy

HS

Zespół Sanfilippo C

MPS III C

Niedobór acetyl otrą nsfe razy

HS

Zespół Morguio

MPS IV

Niedobór N-acetylogalaktozb* -6-sulfatazy

KS

Zespół Morquio podobny

—

Niedobór p-galaktozydazy

KS

Zespół Morteaux-Lamy

MPS VI

Niedobór N-acetylogalaktozoamino-4-sulfatazy {ary losu Ifatazy B)

DS

Zespól niedoboru p-glukurontdazy

MPS VII

Niedobór fl-glukuronidazy

DS, HS(ż)

Zespoły dotychczasowo bez imienne

MPS VIII

Niedobór N-acetylog!ukozoamino-6-sulfatazy

HS, KS

Niedobór sjalidazy (neuraminidazy) Niedobór N-acetyloglukozoaminofosfotra nsfe razy (kwaśne hydrolazy wykazują brak reszt fosfomannozowych)

GF

(i)

Mukolipidozy i podobne do nich zaburzenia Sjalidoza

ML !

Choroba wtrętów komórkowych (l-cell disease)

MLII

Poltdystrofia pseudohurlerowska

ML Hl

Jak w ML 1) ale niedobór jest całkowity

GF

Złożony niedobór sulfataz

—

Niedobór sulfatazy A i innych enzymów

DS, HS

Mannozydaza

—

Niedobór a-mannozydazy

GF

Fukozydaza

—

Niedobór a-L-fukozydazy

GF

GF

MPS — mukopolisacha/ydoza; ML — mukolipidoza; DS — siarczan dermatanu; KS —siarczan keratanu; HS — siarczan heparanu; GF — fragment glikoprotein. * Zmodyfikowano za zgodą DiNatale P., Neyfeld E. F.: The biochemicai diagnosis of mucopolisaccharidoses, mucolipidosisand relateddisorders. W. PerspectivesininheritedMetaboiic diseases. Vol2.Barra B i wsp. (red,): Editiones Ermes Milan 1979), Większość ww, enzymów może być oznaczana w fibroblastach, leukocytach, tkankach, w komórkach płynu owodniowego oraz surowicy.

768 / ROZDZIAŁ 57

stawowej tkanki łącznej. Ponadto, niektóre z nich mogą łączyć się z innymi składnikami macierzy, np. z kolagenem czy elastyną, co jest istotne dla utrzymania właściwej struktury organizacji tkanki łącznej. Ponadto niektóre proteoglikany oddziałują z pewnymi białkami adhezyjnymi, takimi jak fibronek tyna czy laminina (p. rozdz. 59). GAG obecne w proteoglikanach są polianionaim. dlatego też wiążą polikationy i kationy, takie jak Na* i K+. Dzięki tym ostatnim dochodzi do hydratacji tkanki łącznej i nadania jej odpowiedniego napięcia. Przy stosunkowo niskich stężeniach GAG wykazują skłonności do żelowania. Ich długie łańcuchy polisacharydowe oraz właściwości żelujące sprawiają, że działają one w poza komórkowej macierzy jak sito, uniemożliwiając przedostanie się dużych makrocząsteczek, natomiast ułatwiają przenikanie małym cząsteczkom. Ponadto, dzięki swej rozciągniętej strukturze i występowaniu często w postaci wielkocząsteczkowych agregatów proteoglikany zajmują względnie dużą objętość macierzy w stosunku do innych białek.

Niektóre funkcje specyficznych GAG

i (lub) proteoglikanów. Kwas hialuronowy w szczególnie dużym stężeniu występuje w tkankach embrionalnych. Sądzi się, że pełni on ważną rolę w migracji komórek podczas morfogenezy i w procesach naprawczych. Jego zdolność do zatrzymywania wody w pozakomórkowej macierzy sprawia, że ta ostatnia ulega zwiotczeniu, co może mieć znaczenie dla wymienionych procesów. Duże stężenie kwasu hialuronowego i siarczanów chondroityny w chrząstce zapewnia tej tkance utrzymanie właściwej sprężystości i wytrzymałości. Siarczan chondrcityny występuje w miejscach wapnienia w kościach śródchrzęstnych. Obecność jego stwierdza się również w obrębie neuronów, gdzie może tworzyć śródkomórkowy szkielet umożliwiający utrzymanie stałego kształtu tych komórek. Zarówno siarczan keratanu I, jak i siarczan riermatanu występują w rogówce. Umiejscowione są między włóknami kolagenowymi. Podstawową ich funkcją jest zapewnienie rogówce wysokiej przezroczystości. W przypadku uszkodzenia powierzchni rogówki stwierdza się zmiany w składzie proteoglikanów, które zanikają w przypadku wygojenia się wymienionych uszkodzeń. Siarczan dermatanu obecny w twardówce odpowiedzialny jest za utrzymanie właściwego kształtu gałek ocznych. Heparyna jest ważnym anty koagulantem. Łą-

czy się ona z IX i X czynnikiem krzepnięcia. Najistotniejsze jest jednak jej oddziaływanie z osoczową antytrombiną III. Wiązanie się heparyny z tym białkiem osoczowym w stosunku 1:1 znacznie przyspiesza zdolność antytrombiny III do inaktywacji proteaz serynowych, w szczególności trombiny. Ponadto, wiązanie się heparyny do reszt lizyny antytrombiny III powoduje zmiany konfonnacyjne, które sprzyjają łączeniu się z proteazami serynowymi. Heparyna może również wiązać się specyficznie z lipazą lipoproteinową, obecną w naczyniach włosowatych, przyczyniając się do uwalniania tego enzymu do krwiobiegu. Pewne proteoglikany (np. siarczan heparanu) wbudowane są w błonę plazmatyczną komórek, a ich rdzenie białkowe zapewniają tym błonom odpowiednie naprężenie. Ponadto, na powierzchni komórki mogą one działać jak receptory i uczestniczyć we wzroście komórek i oddziaływaniach komórka-komórka. W hodowlach komórkowych siarczan heparanu uczestniczy w procesie łączenia się komórek do substratów. Te proteoglikany znaleziono również w błonach podstawnych kłębuszków nerkowych,, razem z kolagenem typu IV i laminina (p. rozdz. 59), gdzie determinują selektywnośc filtracji kłębuszkowej cząsteczek zależną od ładunku. Obecność proteoglikanów stwierdzono również w wewnątrzkomórkowych organellach, jak np. w jądrze komórkowym. Ich funkcja w tej strukturze subkomórkowej nie została jednak wyjaśniona. Ich obecność wykazano również w ziarmstościach. spichrzeniowych łab wydzielniczych, np. w ziarnis teściach chromochlonnych komórek rdzenia nadnerczy. Przypuszczano, że proteoglikany odgrywają pewną rolę w uwalnianiu zawartości tych ziarnistości. Różne Funkcje GAG zestawiono w tab. 57-9.

Udział w patogenezie ważnych chorób i w procesie starzenia. Kwas hialuro-

nowy umożliwia migrację komórek nowotworowych przez macierz pozakomórkową. Komórki nowotworowe mogą poWdzać fibroblasty do wzmożonej syntezy GAG, co być może jest powodem ich łatwego rozprzestrzeniania się. Ponadto, niektóre komórki nowotworowe zawierają stosunkowo niewielkie ilości siarczanu heparanu, który najczęściej występuje w postaci związanej z błoną komórkową, co z kolei powoduje zanik zdolności adhezyjnych tych komórek. W skład śródbłottka (intimy) ściany naczyń wchodzą: proteogiikany zawierające kwas bia(uronowy, siarczan chondroityny, siarczan der-

GLIKOPROTEINY I PROTEOGLIKANY / 769 Tabela 57-9. Niektóre funkcje GAG i (lub) proteoglikanów*. Strukturalne składniki poza komórkowej (EC) macierzy Specyficzne oddziaływania z kolagenem, elastyną, fibronektyną, lamininą i innymi białkami macierzy Jako polianionowe substancje wiążą polikationy i kationy Uczestniczą w kształtowaniu charakterystycznego napięcia różnych tkanek Działają jak sita w EC macierzy Ułatwiają migrację komórek (HA) Odgrywają istotną rolę w sprężystości i wytrzymałości chrząstki (HA i CS) Zapewniają przezroczystość rogówce (KS I i DS) Strukturalna rola w twardówce (DS) Antykoagulacyjne właściwości (heparyna) Składniki plazmatycznych błon komórkowych, gdzie mogą działać jak receptory i uczestniczyć w adhezji komórek i oddziaływaniach komórka-komórka (np. HS) Składniki pęcherzyków synaptycznych i innych (HS) Determinują selektywność filtracji kłębuszkowej zależną od ładunku (HS) * Stosowane skróty: HA— kwas hialuronowy; CS — siarczan chondroityny; KS I — siarczan keratanu I; DS — siarczan dermatanu; HS — siarczan heparanu.

mataou i siarczan heparanu. Z wymienionych proteoglikanów siarczan dermatanu wiąże osobowe lipoproteiny niskiej gęstości. Co więcej, jest on głównym GAG syntetyzowanym przez miocyty naczyniowe. Ponieważ są to komórki, które w procesie miażdżycowym bardzo łatwo proliferują, uważa się, że siarczan dermatanu może pełnić istotną rolę w rozwoju blaszki miażdżycowej.

49 — Biochemia

W różnych postaciach zapalenia stawów proteoglikany mogą ' działać jak autoantygeny, uczestnicząc w patogenezie tych schorzeń. Wiadomo również, że wraz z wiekiem zmniejsza sie zawartość w chrząstce siarczanu chondroityny. natomiast wzrasta ilość siarczanu keratanu i kwasu hialuronowego. Zmiany te mogą przyczyniać się do rozwoju zmian zwyrodnieniowych u ludzi starych. Wraz z wiekiem obserwuje się także zmiany w zawartości niektórych GAG w skórze, co może wyjaśnić jej charakterystyczne zmiany starcze. <

PIŚMIENNICTWO Buckwalter JA, Rosenber&^C: Electron microscopic studies of cartilage proteoglycans. J Biol Chem 1982;257;9830. DiNatale P, Neufeld EF: The biochemical diagnosis of mucopolysaccharidoses, mucolipidosis and related disorders. In; Perspectives in Inkerited Metabo* lic Diseases. Vol 2. Barra B et al (editors). Editiones Ennes (Milaa), 1979. Hóok M et al: Cell-surface glycosaminoglycans, Annu Rev Biochem 1984;53:847. Jagues LB: Heparin: an old drug with a new paradigm. Saence 1979;206:528. Kornfeld R, Kornfeld Sr Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. Annu Rey Biochem 1985;54:631. Kornfeld S, Sly WS: Lysosomal storage defects. Hosp Prąd (Aug) 1985;20:71. Lennarz WJ: The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans. Plenum Press, 1980. Poole AR; Proteoglycans in health and disease: structures and functions. Biockem J 1986;236:1. Poole AR et al: Proteogiycans from bovine nasal cartilage: Immunochemical studies of link protein. J. Biol Chem 198O;255:9295. Schachter H: Biosynthetic controls that determine the branching and heterogeneity of protein-bound oligosacchartdes. Biochem Celi Biol 1986;64:163,

5 8

Białka osocza, immunoglobuliny i czynniki krzepnięcia Elizabeth J. Harfenist, PhD, Robert K. Murray. MD PhD

WPROWADZENIE Krew krąży w zamkniętym układzie naczyń krwionośnych. Zawiera ona elementy morfotyczne — czerwone i białe krwinki oraz płytki krwi — zawieszone w płynnym środowisku osocza. Jak zostanie to omówione poniżej, krew — a w szczególności osocze — spełnia wiele funkcji niezwykle istotnych dla zachowania zdrowia. Faza płynna krwi pozostała po jej skrzepnięciu nosi nazwę surowicy. Nie ma ona w swym składzie czynników krzepnięcia, w tym fibrynogenu, które prawidłowo występują w osoczu, lecz zużywają się podczas procesu krzepnięcia. Surowica zawiera pewne produkty degradacji czynników krzepnięcia, które powstają w tym procesie, a zwykle nie występują w osoczu.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Niezwykle istotna rola jaką spełnia krew w utrzymaniu homeostazy oraz łatwość, z jaką może być ona uzyskiwana do analiz sprawiły, że badania jej składników nabrały szczególnego znaczenia w rozwoju biochemii i biochemii klinicznej. Hemoglobina, albuminy, immunoglobuliny oraz różne czynniki krzepnięcia są

jednymi z najczęściej badanych białek. Zaburzenia w stężeniu poszczególnych białek osocza występują w wielu chorobach i mogą być monitorowane metodami elektroforetycznymi. Zmiany aktywności pewnych enzymów w osoczu mają przydatność diagnostyczną w wielu stanach patologicznych {p. Dodatek). Zaburzenia krzepnięcia stanowią poważny problem medyczny, a zakrzepica w naczyniach wieńcowych

lub mózgowych jest główną przyczyną zgonów w wielu rejonach świata. Racjonalne postępowanie w tych stanach patologicznych wymaga zrozumienia podstaw krzepnięcia krwi i fibry nolizy.

KREW SPEŁNIA WIELE FUNKCJI Funkcje krwi — z wyjątkiem swoistych dla elementów komórkowych, jak transport tlenu i odporność komórkowo-zależna — spełniane są przez osocze i jego składniki. Zostały one wymienione w tab. 58-1. Tabela 58-1. Główne funkcje krwi 1

Oddychanie — transport tlenu z płuc do tkanek, oraz dwutlenku węgla z tkanek do płuc

Odżywianie — transport wchłoniętych sub stancji odżywczych Wydalanie — transport zbędnych metaboli tów do nerek, płuc, skóry i jelit w celu ich usunięcia Utrzymywanie prawidłowej równowagi kwasowo-zasadowej w organizmie Regulacja gospodarki wodnej przez wpływ krwi na wymianę wodną między płynem tkan kowym i jego pulą krążącą Regulacja temperatury ustrojowej poprzez dystrybucję energii cieplnej w organizmie Obrona przed zakażeniem za pośrednictwem białych krwinek i krążących przeciwciał Transport hormonów i regulacja metabolizmu 9. Transport metabolitów 10. Krzepnięcie

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 771

Osocze składa się z wody, elektrolitów, metabolitów, składników pokarmowych, białek i hormonów. Zawartość wody i elektrolitów jest praktycznie taka sama jak we wszystkich płynach pozak om orkowych. Oznaczanie stężenia Na, K, Ca i Cl w surowicy oraz ciśnienia cząstkowego dwutlenku węgla i pH krwi (p. Dodatek) oddają nieocenione usługi w procesie leczenia wielu chorych. Osocze zawiera bardzo złożoną mieszaninę białek Stężenie białka całkowitego w osoczu ludzkim wynosi ok. 70—75 g/l {7,0—7,5 g/dl). Stanowią one główną część stałych składników osocza, BiaJka osocza są bardzo złożoną mieszaniną, zawierającą nie tylko białka proste, lecz również złożone, takie jak glikoproteiny i wiele rodzajów lipoprotein. W osoczu krwi człowieka znajduje się tysiące przeciwciał, chociaż zawartość poszczególnych ich rodzajów w warunkach prawidłowych jest zwykle stosunkowo mała. Względne rozmiary i masy cząsteczkowe kilku spośród białek osocza przedstawiono na ryc. 58-1. Albumina 69,000

10 nm

Skaia

Hemoglobina 64,450

Na+ Cl" Glukoza

0,-Globullna 90,000

■jr-GlobuNna 156,000

o,-Li po protein a 200,000 /(,-Li po proteina 1,300,000

Fibrynoge n 340,000

Ryc. 58-1. Względne wymiary i masy cząsteczkowe białek krwi (Oncley).

Rozdziału poszczególnych białek z mieszaniny dokonuje się często za pomocą różnych rozpuszczalników i (lub) elektrolitów w celu usunięcia różnych frakcji białkowych zgodnie z ich charakterystyczną rozpuszczalnością. Na zasadzie tej bazują tzw. metody wysalania, które znalazły pewne zastosowanie w oznaczaniu frakcji białkowych w laboratorium klinicznym. Stosując różne stężenia siarczanu sodowego lub siarczanu amonowego można rozdzielić białka osocza na 3 główne grupy — fibrynogen, albuminy i globuliny.

Powszechnie używaną metodą analizy białek osocza jest elektroforeza. W różnych jej rodzajach stosuje sie odmienne nośniki. W laboratoriach klinicznych szeroko stosowany jest octan celulozy, który pozwala na rozdzielenie białek osocza na 5 frakcji—albuminy, alfa2, p i y-globuliny (ryc. 58-2). Wybarwione paski octanu celulozy (lub innego nośnika) określa się jako elektroforegram. Stężenie każdej spośród 5 frakcji można wygodnie określić posługując się densytometrem. Tabela 7 Dodatku przedstawia główne białka osocza stwierdzone we frakcjach a,, oc 2 i y. W Dodatku wymieniono także wiele schorzeń, w których stężenia albumin, globulin i fibrynogenu ulegają zmianie. Stężenie białka w osoczu jest istotne dla rozmieszczenia płynu między krwią a tkankami Osocze krwi zgodnie z definicją jest płynem wewnątrznaczyniowym. W części tętniczej układu krążenia, wewnątrznaczyniowe ciśnienie hydrostatyczne wytwarzane przez serce i duże naczynia jest o 20—25 mmHg wyższe niż w tkankach. Ciśnieniu hydrostatycznemu przeciwstawia się wewnątrznaczyniowe ciśnienie koloidoosmotyczne generowane przez białka osocza. Przeciwdziała ono nadmiernemu przemieszczaniu płynu z wewnątrz do pozanaczyniowej przestrzeni. Gdy stężenie białka w osoczu znacznie się zmniejsza (np, w ciężkim niedożywieniu białkowym), płyn nie jest wciągany z powrotem do łożyska naczyniowego, lecz gromadzi się w przestrzeni pozanaczyniowej, co prowadzi do powstania obrzęków. Spośród wielu przyczyn tego stanu jedną jest niedobór białka. Białka osocza badano bardzo dokładnie Ze względu na dość dużą łatwość uzyskiwania, białka osocza były szeroko badane zarówno u ludzi, jak u zwierząt. Istotne informacje

772 / ROZDZIAŁ 58

Ryc. S8-2. Technika elektroforezy strefowej na octanie celulozy: A— matą ilość surowicy lub innego płynu nanosi się na pasek z octanu celulozy, B — przeprowadzany jest rozdział elektroforetyczny białek zawartych w próbce w elektrolitowym środowisku buforu, C — po zabarwieniu rozdzielone pasma białkowe uwidaczniają się w charakterystycznych dla nich miejscach, D — za pomocą pomiarów densytometrycznych rozdział elektroforetyczny na octanie celulozy przekształcany jest do diagramu, na którym odpowiednie charakterystyczne „piki" symbolizują; albuminy, a.,-globuliny, 0(2-globuliny, (J-globuliny i y-gfobuliny. {Według: Stites D. P., Stobo J. D.,Wells J.V.: BasieandC/imca//mmuno/ogy,\/vyd.6rApp\etonand Lange, 1987, za zezwoleniem).

uzyskano na temat biosyntezy, metabolizmu, struktury i funkcji głównych biatek osocza. Przedmiotem wielu badań były również zmiany w ich stężeniu i metabolizmie w wielu stanach chorobowych. W ostatnich latach sklonowano oraz zbadano struktury genów dla wielu białek osocza. Uzyskanie przeciwciał swoistych dla poszczególnych białek^osocza znacznie ułatwiło ich analizę dzięki możliwościom precypitacji oraz wyizolowania czystych białek ze złożonej mieszaniny występującej w tkankach lub w osoczu. Zastosowanie izotopów promieniotwórczych z kotei pozwoliło poznać ich szlaki biosyntezy oraz szybkość metabolizmu w osoczu. Na podstawie badań białek osocza wyłania się 6 następujących uogólnień:

1. Większość białek osocza syntety-

zowana jest w wątrobie. Stwierdzono to badając zwierzęta po wykonanej doświadczalnie hepatektomii oraz stosując perfundowane preparaty wyizolowanej wątroby, jej skrawki, homogenaty iub systemy translacji używając mRNA ekstrahowanego z wątroby. y-Globuliny syntetyzowane sa przez komórki piazmatyczne, a pewne białka osocza jeszcze w innych miejscach, np. w komórkach śródbłonka.

2. Białka osocza są syntetyzowane głównie przez polirybosomy związane z błonami. Przed wejściem do osocza przechodzą głównym szlakiem wydzieiniczym komórki, obejmującym szorstką i gładką siateczkę śródplazmatyczną, aparat Golgiego oraz błony cytoplazmatyczne. Większość spośród białek osocza jest syntetyzowana jako prebiałka mające peptydy sygnałowe na N-końcu (p. rozdz. 43). Podlegają one następnie wielu modyfikacjom potranslacyjnym (proteoliza. glikozylacja, fosforylacja itd.) podczas transportu przez komórkę. Czas przemieszczenia z miejsca syntezy do osocza waha się od 30 min do wielu godzin w zależności od rodzaju białka. 3. Prawie wszystkie białka osocza są glikoproteinami. Zawierają one łańcuchy oligosacharydowe połączone przez atomy N i (lub) O (p. rozdz. 57). Wyjątkiem jest albumina, która nie zawiera reszt cukrowych. Łańcuchy oligosacharydowe pełnią wiele funk cji (p. tab. 57-2). Usunięcie końcowej reszty kwasu sjalowego z pewnych białek osocza (np. ceruloplazminy) poprzez działanie neuraminidazy może znacznie skrócić ich okres potrwa nia w osoczu (p. rozdz. 57).

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 773

4. Wiele białek osocza wykazuje poli-

morfizm. Polimorfizm jest cechą mendlowską lub monogenowę występującą w populacji w co najmniej dwóch fenotypach, z częstością więk szą niż 1—2% (Vogel i Motulsky, 1986). Sub stancje grupowe krwi układu ABO (rozdz. 63) są najlepiej znanym przykładem polimorfizmu u ludzi. Polimorfizm ludzkich białek osocza stwierdza się w przypadku np. o^-antytrypsyny, haptoglobiny, trans|eryny, ceruloplazminy i immunoglobulin. Forniy polimorficzne tych bia łek najczęściej wykrywano po raz pierwszy metodą elektroforezy na żelu skrobiowym, gdzie każda postać wykazuje charakterystyczną ruchliwość. Analiza polimorfizmu białek osocza jest przedmiotem badań genetycznych i antropologicznych, a w pewnych przypadkach (np. arantytrypsyna, p. niżej) wzbudza także zainteresowanie klinicystów. 5. Każde białko osocza ma charakte rystyczny okres półtrwania w układzie krążenia. Okres półtrwania białek osocza mo że być oznaczony przez oznakowanie wyizolo wanego, oczyszczonego białka za pomocą l31I w warunkach zapobiegających jego denaturacji. Izotop ten łączy się kowalencyjnie z resztami tyrozyny w cząsteczce białka. Nie związany (31I oddziela się następnie od znakowanego białka i określa jego aktywność właściwą (dpm/mg białka). Znaną ilość aktywnego białka podaje się dorosłej osobie, a następnie pobiera się próbki krwi w określonych odstępach czasu i określa ich radioaktywność. Uzyskane warto ści wykreśla się jako funkcję czasu i oznacza okres półtrwania (czas obniżenia radioaktyw ności od wartości szczytowej do połowy tej wartości), po odliczeniu czasu koniecznego do zrównoważenia (wymieszanie się) stężenia po dawanego białka między krwią a przestrzenią pozanaczyniową. Okresy półtrwania uzyskane dla albumin i haptoglobin u zdrowych osób dorosłych wynoszą odpowiednio 20 i 5 dni. W pewnych schorzeniach okres półtrwania bia łek może się znacznie zmienić. Dla przykładu, w chorobie Crohna {ilettis regionalis) dotyczącej układu pokarmowego, 2naczna ilość białek oso cza, głównie albumin, może być bezpowrotnie tracona poprzez wydzielanie do światła jelita przez zmienioną zapalnie błonę śluzową. Pac jenci dotknięci tym schorzeniem cechują się gastroenteropałią z utraty białka, a okres pół trwania podanej dożylnie jodowanej albuminy może obniżyć się do ok. 1 dnia.

6. Stężenie niektórych białek w osoczu wzrasta podczas ostrych stanów zapalnych łub wtórnie w następstwie pewnych rodzajów uszkodzeń tkanek. Do białek tych, zwanych białkami ostrej fazy (lub reaktantami) zalicza się; białko C-reaktywne (CRP, zwane tak ze względu na reaktywność z polisacharydem pneumokoków), o^arttytrypsynę, haptoglobinę, ocrkwaśną glikoproteinę oraz fibrynogen. Wzrost stężenia tych białek waha się od 50% do ponad 1000-krotnego w przypadku CRP, Ich poziom jest również zazwyczaj podwyższony podczas przewlekłych procesów zapalnych oraz u pacjentów z nowotworami złośliwymi. Uważa się, że białka te pełnią rolę w odpowiedzi organizmu na proces zapalny. Dla przykładu białko C-reaktywne może aktywować drogę\lasyczną dopełniacza, a o^-antytrypsyna zdolna jest do neutralizacji pewnych proteaz uwalnianych podczas ostrego stanu zapalnego. Ostatnio wykonane badania wskazują, że interleukina 1 (IL-1), polipeptyd uwalniany z jednojądrzastych komórek fagocytujących, jest głównym, lecz nie jedynym stymulatorem syntezy większości białek ostrej fazy przez hepatocyty. Inne cząsteczki, m.in. IL-6, są również włączone w ten proces i podobnie jak IL-1 wydają się działać na poziomie transkrypcji genu. Następne podrozdziały przedstawiają podstawowe informacje dotyczące 6 spośród głównych białek ludzkiego osocza włącznie z immunoglobulinami. Lipoproteiny przedstawiono w rozdz. 27. Albumina jest głównym białkiem ludzkiego osocza Jest to główne białko ludzkiego osocza (ok. 45 g/1) o masie cząsteczkowej ok. 69000. Stanowi ok. 60% wszystkich białek osocza. Około 40% albumin znajduje się w osoczu, pozostałe 60% w przestrzeni poza komórkowej. Wątroba wytwarza ok. 12 g albumin na dobę, co stanowi ok. 25% całkowitej syntezy białek w tym narządzie, a połowę tych, które są wydzielane. Początkowo albumina syntetyzowana jest jako preprobiałko. Peptyd sygnałowy ulega usunięciu podczas przemieszczenia do cystern szorstkiej siateczki śródplazmatycznej, a następnie zostaje odcięty heksapeptyd na N-końcu podczas dalszej wędrówki szlakiem wydzielniczym. Synteza albumin zmniejsza się w różnych chorobach, szczególnie tych, które dotyczą wątroby (p. Dodatek-Białka). Osocze pacjentów z chorobami wątroby często cechuje się obniżonym

774 / ROZDZIAŁ 58

ilorazem stężenia albumin do globulin (obniżony stosunek A:G). Synteza albumin zmniejsza się stosunkowo wcześnie w warunkach wadliwego żywienia białkowego, m.in. w kwashiorkor. Dojrzała albumina iudzka składa się z 1 łańcucha polipeptydowego zbudowanego z 585 reszt ami no kwasowych i zawiera 17 mostków dwusiarczkowych. Stosując proteazy można podzielić albuminę na 3 domeny, spełniające odmienne funkcje. Albumina ma kształt elipsoidalny, co oznacza, że nie zwiększa lepkości osocza w tak znacznym stopniu jak cząsteczki o wydłużonym kształcie, np. fibrynogen. Ze względu na stosunkowo małą masę cząsteczkową (ok. 69 000) i duże stężenie, albumina wydaje się odpowiadać za ok. 75—80% ciśnienia onkotycznego ludzkiego osocza. Badania elektro foretyczne wykazały, że osocze pewnych osób pozbawione jest albuminy, co określa się terminem analbuminemii. Jedną z przyczyn tego stanu jest mutacja zaburzająca proces przycinania i składania („splicing"). Osoby z analbuminemią cechują się jedynie umiarkowanego stopnia obrzękami, mimo iż albumina jest głównym czynnikiem decydującym o ciśnieniu onkotycznym osocza. Uważa się, że wzrost stężenia innych białek osocza kompensuje skutki braku albumin. Inną istotną funkcją albumin jest ich zdolność do wiązania różnych ligandów. Należą do

nich wolne kwasy tłuszczowe (WKT), wapń, pewne hormony steroidowe, bilirubina oraz część tryptofanu obecnego w osoczu. Ponadto albumina wiąże ok. 10% miedzi występującej w osoczu, reszta pouczona jest 7 ceruloplazminą(p. niżej). Wiele leków, m.in. sulfonamidy. penicylina G, dikumarol, aspiryna, związanych jest z albuminą; ma to istotne implikacje farmakologiczne. Preparaty ludzkiej albuminy stosowane są w leczeniu wstrząsu krwotocznego oraz oparzeń.

A. Hb -> Nerka (m. cz. 65 000) Hp

nia Hp stwierdza się u pacjentów z niednkr wist ości ami hemolirycznymi. Wyjaśnia to obserwację,

■ Wydalanie w moczu lub precypitacja w kanalikach nerkowych; żelazo jesi tracone z organizmu Kompleks Hp:Hbx -+>

aO O ) B.

Haptoglobina wiąże pozakrwinkową hemoglobinę, zapobiegając przedostawaniu się wolnej hemoglobiny do nerek Haptoglobina (Hp) jest osoczową glikoproteiną, która wiąże pozakrwinkową hemoglobinę (Hb) w zwarty niekowalencyjny kompleks (Hb-Hp). Hp zawarta w 1 1 może związać 400—1 800 mg Hb. Około 10% Hb degradowanej każdego dnia uwalniane jest do krążenia, stąd określana jest jako pozakrwinkową. Pozostałe 90% obecne w starych uszkodzonych krwinkach czerwonych katabolizowane jest w komórkach układu histic>cytaniego. Masa cząsteczkowa Hb wynosi ok. 65 000, a najprostszej formy polimorficznej Hp (Hp-1-1) u ludzi — ok. 90000. Powstały kompleks Hb-Hp osiąga masę cząsteczkową 155000. Wolna Hb przechodzi przez kłębuszki nerkowe i wnika do cewek, gdzie ma skłonność do precypitacji (może to nastąpić w następstwie masywnego przetoczenia krwi niezgodnej grupowo z przekroczenia pojemności wiążącej Hp względem Hb) (p. ryc. 58-3). Kompleks Hb-Hp jest zbyt duży, by przenikać przez kłębuszki nerkowe. Funkcja Hp wydaje się polegać na zapobieganiu utracie wolnej Hb przez nerki. Chroni ona cenne atomy żelaza, obecne w Hb, przed utratą z organizmu. Ludzka Hp występuje w trzech formach polimorficznych, znanych jako Hp 1-1, HP 2-1 i Hp 2-2, Hp 1-1 wędruje w elektroforezie na żelu skrobiowym jako pojedyncze pasmo, podczas gdy Hp 2-1 i Hp 2-2 wykazują bardziej złożony profil pasm. Dwa geny, oznaczane jako Hp-1 i Hp-2, kodują te trzy fenotypy, gdzie Hp 2-1 jest fenotypem heterozygotycznym. Nie wykazano istotnych z punktu widzenia funkcji różnic między wspomnianymi formami Hp. Stężenie Hp w osoczu ludzkim jest zmienne i ma pewną wartość diagnostyczną. Małe stęże-

Hb

j

Nerka [)Ti. ez. 155 000]

+ Katabotizowany przez komórki wątroby; żelazo jest zatrzymane w ustroju i wtórnie wykorzystywane

Byc. 53-3. Różne losy wolnej hemoglobiny i kompleksu hemoglobma-haptoglobina.

BIAŁKA OSOCZA, IMIWJNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 775

że okres półtrwania Hp wynosi ok. 5 dni, podczas gdy w przypadku kompleksu Hb-Hp, szybko usuwanego z osocza przez hepatocyty, nie przekracza 90 min. Gdy Hp związana jest z Hb, eliminacja z osocza przebiega 80 razy szybciej niż zwykle. Zgodnie z tym stężenie Hp zmniejsza się szybko w sytuacjach, gdy Hb jest stale uwalniana z erytrocytów, co występuje w niedokrwistościach hemolitycznych. Hp należy do białek ostrej Ęazy i jej stężenie zwiększa się w wielu stanach zapalnych. Pewne białka osocza wiążą hem, lecz nie Hb. Hemopeksyna jest P,-globuliną, która wiąże wolny hem. Albumina łączy się z methemem (hem żelazowy), tworząc methemalbumine, a następnie przekazuje methem hemopeksynie.

Tabela 58-2. Roz/nieszczenie żelaza w organizmie dorosłego mężczyzny o masie 70 kg 3-4 mg Transferyna 2500 mg Hb w erytrocytach 300 mg Mioglobina i różne enzymy Żelazo zapasowe (ferrytyna i 1000 mg hemosyderyna) 7 mg/d Wchłanianie 1 mg/d Straty

Transferyna, przemieszczając żelazo z prądem krwi do miejsc, gdzie jest ono potrzebne, odgrywa główną rolę w metabolizmie żelaza Transferyna (Tf) jest p,-globuliną o masie cząsteczkowej ok. 80 000. Jest to glikoproteina syntetyzowana przez wątrobę. Wykazano obecność ponad 20 polimorficznych form tego białka. Tf odgrywa główną rolę w ustrojowej gospodarce żelazem, ponieważ transportuje je (2 mole Fe trójwartościowego na 1 mol Tf) w układzig krążenia do miejsc, gdzie jest ono potrzebne, m.in. z jelita do szpiku i innych narządów. Żelazo jest niezwykle ważne dla organizmu ludzkiego, ponieważ wchodzi w skład wielu hemoprotein, takich jak hemoglobina, mioglobina i cytochromy. Żelazo dostarczane jest w diecie, a jego wchłanianie jako żelaza dwuwartościowego jest ściśle kontrolowane na poziomie błony śluzowej jelita, W warunkach prawidłowych organizm strzeże zawartości żelaza niezwykle gorliwie. Stąd też jego dobowa utrata u zdrowego dorosłego mężczyzny wynosi ok. 1 mg i zostaje uzupełniona żelazem pokarmowym. Dorosłe kobiety są bardziej podatne na niedobór żelaza w związku z możliwością nadmiernej utraty krwi podczas miesiączki. Zawartość żelaza Tf w innych przedziałach organizmu przedstawiono w tab. 58-2. Okofo 20 ml krwinek czerwonych jest poddana procesom katabolicznym, dziennie uwalniając ok. 25 mg żelaza. Wolne żelazo jest toksyczne, lecz w powiązaniu z Tf jego potencjalna toksyczność zostaje zmniejszona, a ponadto zostaje ono skierowane do miejsc w organizmie, gdzie jest niezbędne- Na powierzchni wielu komórek występują receptory dla Tf. Białko wiąże

się z tymi receptorami i ulega internalizacji na zasadzie endocytozy sterowanej receptorem (por. losy LDL, rozdz. 27). W kwaśnym pH wewnątrz iizosomów następuje dysocjacja żelaza od białka. W przeciwieństwie jednak do białkowej części LDL, apoTf nie ulega degradacji w obrębie Iizosomów. Pozostaje ono związane z receptorem, powraca do błony cytoplazmatycznej, oddziela się od receptora, przenika następnie do osocza, pobiera kolejną porcję żelaza i znów dostarcza je do potrzebujących komórek.

W przypadku organizmu dorosłej kobiety o zbliżonej masie ciała ilości zmagazynowanego żelaza są ogólnie mniejsze (np.: 100-400 mg), natomiast straty większe (np.; 1,6-2,0 mg/d).

Problemy metabolizmu żelaza. Meta-

bolizm żelaza jest szczególnie ważny u kobiet, ze względów wyżej przedstawionych. Również w ciąży należy uwzględnić zapotrzebowanie żelaza wzrastającego płodu. U starszych ludzi odżywiających się skromnie (herbata, grzanki) może także dojść do niedoboru żelaza. Niedokrwistość z niedoboru żelaza zależna od niedostatecznego wchłaniania, nieprawidłowego wykorzystania lub nadmiernej jego utraty jest jednym z najczęściej spotykanych stanów chorobowych obserwowanych w praktyce lekarskiej. Stężenie Tf wynosi ok. 3,0 g/l (300 mg/dl). Ta ilość Tf może wiązać ok. 3 mg żelaza/l osocza, co określa się mianem całkowitej zdolności wiązania żelaza przez osocze. Prawidłowo, jedynie l /a transferyny jest wysycana żelazem. W niedokrwistości z niedoboru żelaza białko jest w mniejszym stopniu wy sycone żelazem, podczas gdy w warunkach spichrzania nadmiaru żelaza w organizmie (np. hemochromatoza) znacznie przekracza 1/i. Ferrytyna. Ferrytyna jest kolejnym białkiem istotnym z punktu widzenia metabolizmu

776 / ROZDZIAŁ 58

żelaza. W warunkach prawidłowych gromadzi ono żelazo, skąd może ono być pobierane w razie potrzeby. W przypadku nadmiaru żelaza (np. hemochromatoza) ustrojowe zapasy żelaza znacznie wzrastają i zdecydowanie więcej ferrytyny stwierdza się w tkankach, głównie w wątrobie i śledzionie. Ferrytyna zawiera ok. 23% żelaza oraz apoferrytynę (część białkowa nie zawierająca żelaza) i ma masę cząsteczkową ok. 440 000. Ferrytyna zbudowana jest z 24 podjednostek o masie cząsteczkowej i 8 500, które otaczają 3000—4000 atomów żelazowych występujących w postaci micelarnej. Prawidłowo stężenie ferrytyny w osoczu krwi jest niskie; u chorych z nadmiarem żelaza znacznie wzrasta; stężenie ferrytyny w osoczu można w sposób wygodny oznaczyć metodami radioimmunologicznymi. Parametr ten może być dobrym wskaźnikiem stanu ustrojowych zapasów żelaza. Hemosyderyna. Hemosyderyna jest cząsteczką słabo poznaną; wydaje się, że może to być częściowo zdegradowana postać ferrytyny. lecz wciąż zawierająca żelazo. Można ją wykryć barwieniami histologicznymi (np, błękitem pruskim) na obecność żelaza, a jej obecność dowodzi nadmiernego gromadzenia żelaza.

Pierwotna hemochromatoza. Pierwo-

tna hemochromatoza jest chorobą genetyczną charakteryzujący się nadmiernym gromadzeniem żelaza w tkankach, co prowadzi do ich uszkodzenia. Wydaje się, że przyczyna leży w nadmiernym wchłanianiu żelaza z błony śluzowej jeiila, chociaż niewiele wiadomo na temat molekularnego podłoża tej nieprawidłowości. Narządami legającymi uszkodzeniu są najczęściej: wątroba, skóra i jelita; u chorych rozwija się zwykie marskość wątroby, może ponadto wystąpić nadmierna pigmentacja skóry oraz cukrzyca (cukrzyca brązowa). Okresowe upusty krwi (flebotomia) pozwalają na utrzymanie kontroli nad schorzeniem. Tabela 58-3 przedstawia badania laboratoryjne przydatne w diagnostyce nieprawidłowości w zakresie gospodarki żelazem. Patrz również Dodatek — żelazo, surowica, zdolność wiązania żelaza. Ceruloplazmina łączy się z miedzią i uczestniczy w patogenezie chbroby Wiisona, będącej stanem zatrucia miedzią Ceruloplazmina jest a^-globuliną o masie cząsteczkowej ok. 160 000. występujący w osoczu

Tabela 58-3. Wartościowe testy laboratoryjne służące do oceny pacjentów z zaburzeniami metabolizmu żelaza Liczba erytrocytów i poziom hemogiobiny Określenie stężenia żelaza w osoczu, całkowitej zdolności wiązania żelaz3 (TiBC) i odsetka wysycenia transferyny Określenie stężenia ferryiyny w osoczu metodą radioimmunologicżną Barwienie wycinków tkankowych za pomocą błękitu pruskiego Ocena ilości żelaza (|ig/g) w bioptacie tkankowym

w stężeniu ok. 300 mg/3 (30 mg/dl). Zs względu na zawartość miedzi jej zabarwienie jest niebieskie. Zawiera 90% miedzi zawartej w osoczu. Każda cząsteczka ceruloplazminy wiąże 6 atomów miedzi w sposób bardzo mocny, co sprawia, że pierwiastek ten nie jest łatwo wymienialny. Albumina przenosi pozostałe 10% miedzi osocza. Siła, z jaką albumina wiąże miedź, jest jednak mniejsza w porównaniu z ceruloplazminą. W konsekwencji albumina łatwiej oddaje miedź tkankom niż ceruloplazmina i wydaje się być bardziej istotna w procesie transportu miedzi w organizmie człowieka. Ceruloplazmina wykazuje ponadto aktywność oksydazową, jednak znaczenie tego faktu nie jest jasne. Stężenie ceruloplazminy w osoczu zmniejsza się w chorobach wątroby. Ceruloplazmina wykazuje szczególny związek z chorobą Wiisona (zwyrodnienie wątrobowo-soczewkowe), chociaż wydaje się mało prawdopodobne, aby pierwotny defekt w tym schorzeniu dotyczył nieprawidłowości tego białka. Choroba Wiisona jest wrodzonym stanem, w którym miedź nie może być wydalana z żółcią, prawdopodobnie z powodu defektu lizosomów niezdolnych do wydalenia miedzi pochodzącej z rozpadu cerulopiazminy (ryc. 58-^j. W konsekwencji miedź sukcesywnie gromadzi się w organizmie, szczególnie w wątrobie, mózgu, nerkach oraz krwinkach czerwonych. Przyczyny choroby należy upatrywać w niezdolności organizmu do zachowania zerowego bilansu gospodarki miedzi, prowadzącej do zatrucia tym pierwiastkiem. Wzrost zawartości miedzi w komórkach wątroby hamuje wiązanie się miedzi z apoceruloptezminą, co prowadzi do zmniejszenia' stężenia tego białka w osoczu (poniżej 200 mg/I). W. miarę gromadzenia miedzi rozwija się niedoicrwis-

_____________BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 777 A. Stan prawidłowy: Cu -* Żółć Cu + Apoceruloplażrnlna -» Osoczowa ceruloplazmlna 6. Choroba Wllsona: i Spadek wydalania miedzi z zótclą i Gromadzenie miedzi w wątrobie

i Zahamowani jej wiązania się z ap oceniło plaż miną -> Mata stężenie ceruloplazminy w osoczu

Ryc. 58-4. Schematyczne przedstawienie losów miedzi w (a) prawidłowej wątrobie i (b) wątrobie pacjenta z chorobą ^ilsona. Wydalanie miedzi do żółci jest upośledzone w chorobie Wtlsona na skutek defektu w wydalaniu przez lizosomy miedzi pochodzącej z katabolizmu ceruloplazminy.

tość hemolityczna, przewlekle schorzenie wątroby oraz zespól objawów neurologicznych zależny od gromadzenia się miedzi w zwojach podstawy i innych ośrodkach mózgu. Częstym objawem klinicznym jest pierścień Kaysera-Fleischera, przybierający barwę zieloną lub złotą i występujący u podstawy rogówki, jako wyraz odkładania się miedzi w błonie Descemeta. W przypadku podejrzenia choroby Wilsona konieczna jest biopsja wątroby; wartość diagnostyczną ma zawartość miedzi w wątrobie przekraczająca 250 ug/g suchej masy z równoczesnym zmniejszeniem stężenia ceruloplazminy w osoczu poniżej 200 mg/l. Leczenie polega na stosowaniu diety niskomiedziowej i rozważnym podawaniu D-penicylaminy, która chelatuje miedź i prowadzi do jej wydalenia z moczem, a tym samym ustrój pozbawiony jest nadmiaru tego pierwiastka. Miedź jest metalem-kofaktorem wielu ważnych enzymów, takich jak oksydaza cytochromowa, tyrozynaza i miedzi o zależna dysmutaza ponadtlenkowa. W ustroju dorosłego człowieka znajduje się 100—150 mg miedzi, głównie w kościach, wątrobie i mięśniach. Wchłanianie miedzi zachodzi w górnym odcinku jelita cienkiego i wynosi 2—4 mg dziennie. Miedź przenoszona jest do wątroby w połączeniu z albuminą, wychwytywana przez komórki wątrobowe i częściowo wydalana do żółci. Może również pozostać w wątrobie połączona z ceruloplazminą, syntetyzowaną w tym narządzie. Niedobór miedzi. Niedobór miedzi jest stosunkowo rzadki i powoduje niedokrwistość". Zespól Menkensa (choroba „kręconych" lub „stalowych" włosów) jest innym zaburzeniem w metabolizmie miedzi o charakterze dziedzicznym, związanym z chromosomem X. Dotyczy dzieci pici męskiej, prowadząc do fatalnych następstw. Chłopcy dotknięci tym schorzeniem

mają łamliwe kręcone włosy, cechują się nieprawidłowym rozwojem fizycznym, opóźnieniem rozwoju umysłowego i rozległymi tętniakami. Wykazano, że u podłoża tej patologii leży nieprawidłowe wchłanianie miedzi w jelicie, chociaż biochemiczna natura tego defektu nie została jeszcze poznana. U chorych stwierdza się małe stężenie miedzi i ceruloplazminy we krwi. Niedobór y. -antyproteinazy (o^antytrypsyny) związany jest z rozedmą płuc i pewną postacią choroby wątroby G^-Antyproteinaza, zwana dawniej otj-antytrypsyną (ctj-AT) jest białkiem o masie cząsteczkowej ok. 45 000 stanowiącym główny składnik frakcji a! globulin osocza. Syntetyzowana jest w wątrobie i pełni funkcje najważniejszego inhibitora proteaz (Pi) w osoczu człowieka. Hamuje aktywność trypsyny, elastazy i pewnych

proteaz poprzez tworzenie kompleksów z nimi. Białko to jest wysoce polimorficzne; rozdział elektroforetyczny pozwala na wyodrębnienie poszczególnych jej postaci. Głównym genotypem jest MM, odpowiadający fenotypowi PiM. Zainteresowanie kliniczne o^-AT dotyczy dwóch aspektów. Niedobór tego białka odgrywa rolę w pewnych przypadkach rozedmy płac (ok. 5%). Dotyczy to głównie osobników z genotypem ZZ, wytwarzających PiZ w znacznie mniejszej ilości w porównaniu z PiM, W przypadku niedoboru otj-AT, wzrost ilości granulocytów w obrębie pluć (występujący np. w zapaleniu płuc) i wydzielanych przez nie enzymów proteolitycznych nie napotyka bariery antyproteazowej (otA-AT) prowadząc tym samym do uszkodzenia tkanki płucnej, głównie przez takie proteazy, jak elastaza (ryc. 58-5). Szczególne zainteresowanie wzbudza metionina

778 / ROZDZIAŁ 58 A-Aktywnaelasta2a + a -AT -> Kompleks nieaktywne] elastazy ->Brak proteolizy w płucach-* Brak uszkodzenia z a,-AT tkanek B. Aktywna elastazał J.iub brak a,-AT->Aktywna elastaza-* Proteollza w płucach-* Uszkodzenie tkanek Ryc. 58-5. Schemat ilustrujący (a) prawidłową inaktywację elastyny przez 2,-AT i (b) sytuację, gdy ilość 3,-AT jest zmniejszona, co prowadzi do proteolizy wskutek działania elastazy z następczym uszkodzeniem tkanek.

(reszta aminokwasowa w pozycji 358), uczestnicząca w wiązaniu ctj- AT z proteazami. Palenie tytoniu sprawia, że aminokwas ten zostaje utleniony do sulfotlenku metioniny, co inaktywuje go i tym samym prowadzi do utraty właściwości antyproteazowych c^-AT. Szczególne spustoszenie stwierdza się u pacjentów z fenotypem Pi ZZ, który odznacza się niskim poziomem e^-AT już w normalnych warunkach. Dalsze zmniejszanie aktywności ot,-AT będące następstwem palenia tytoniu powoduje wzmożoną destrukcję proteolityczną tkanki płucnej, przyspieszając tym samym rozwój rozedmy płuc. Dożylne podanie a,-AT może być pomocne w leczeniu pacjentów z rozedmą płuc zależną od niedoboru c^-AT. Dzięki technikom inżynierii genetycznej czynione są próby zastąpienia metioniny 358 przez aminokwas niepodatny na utlenianie (p. rozdz. 42). Powstałe „mutanty" o^-AT mogłyby wykazywać ochronne działanie przed proteazami przez znacznie dłuższy okres niż natywna a,-AT. Niedobór a,-AT może być również przyczyną jednego z typów marskości wątroby (choroba wątroby z niedoboru o^-AT). W tej sytuacji cząsteczki a r AT typu ZZ gromadzą się w cząsteczkach siateczki śródplazmatycznej, prawdopodobnie wsku^ftk niemożności ich wydzielania przez te komórki. Nie wiadomo dotąd, w jaki sposób prowadzi to do powstania marskości wątroby (w następstwie gromadzenia się dużych ilości kolagenu będącego przyczyną włóknienia). IMMUNOGLOBULINY OSOCZA ODGRYWAJĄ WAŻNA ROLĘ W MECHANIZMACH OBRONNYCH ORGANIZMU Układ immunologiczny organizmu składa się z 2 głównych składników, limfocytów B i limfocytów T. Limfocyty B wywodzą się głównie z komórek szpiku kostnego u wyższych zwierząt lub z torebki Fabrycjusza u ptaków. Limfocyty te pochodzą z grasicy. Limfocyty B odpowie-

dzialne są za syntezę krążących przeciwciał zwanych immunoglobulinami. Limfocyty T zaangażowane są w liczne reakcje immunologiczne typu komórkowego, takie jak odrzucanie przeszczepu, reakcje nadwrażliwości czy obronne przed komórkami nowotworowymi i wirusami. W podrozdziale tym omówiono wyłącznie immunoglobuliny osocza, które powstają głównie w komórkach plazma tycznych, wyspecjalizowa-

nej linii komórkowej wywodzącej się z limfocytów B, które syntetyzują i wydzielają immunoglobuliny do osocza. Wszystkie immunogłobułinv zawierają co najmniej 2 łańcuchy lekkie i 2 łańcuchy ciężkie Wszystkie cząsteczki immunoglobulin składają się z 2 identycznych łańcuchów lekkich (L) o masie cząsteczkowej 23 000 i 2 identycznych łańcuchów ciężkich (H) o masie cząsteczkowej 53 000—75 000 połączonych w tetramer (C2H2) przez mostki dwusiarczkowe (ryc. 58-6). W każdym z łańcuchów można wyróżnić swoiste domeny, regiony o strukturalnym i funkcjonalnym znaczeniu. Potowa łańcucha lekkiego w kierunku końca karboksylowego zwana jest regionem stałym (CL), podczas gdy połowa N-końcowa określana jest jako region zmienny (VL) łańcucha lekkiego. Około J ,U łańcucha ciężkiego fragmentu C-końcowego odpowiada regionowi zmiennemu (VH), a pozostałe 75% tego łańcucha określa się mianem regionów stałych (CH-1, CH-2, CH-3) łańcucha H. Część cząsteczki immunoglobuliny, która wiąże swoisty antygen, utworzona jest* przez fragmenty Ckońcowe (regiony zmienne) obydwu łańcuchów (H i L), tj. domeny VH i VL. Domeny łańcuchów peptydowych nie występują w formie liniowej, lecz tworzą regiony-globularne z odpowiednią strukturą drugo- i trzeciorzędową w celu wiązania swoistych antygenów. Jak przedstawiono na ryc. 58-6, trawienie cząsteczki immunoglobuliny pr2ez papainę prowadzi do powstania dwóch fragmentów wiążących antygen (Fab) i jednego fragmentu zdolnego do krystalizacji (Fc). Miejsce, w którym

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 779 Fab

Fc

TL J

CH3 CH2

Ryc. 58-6. Uproszczony model cząsteczki ludzkiego przeciwciała z klasy IgG, prezentujący czteroiańcuchowa, strukturę podstawową i domeny. V — oznacza region zmienny, C — region stały. Strzałka pionowa — region zawiasowy. Grube linie oznaczają mostki dwusiarczkowe. (Według: Stites D. P., Stobo J. D„ Wells J. V., (red): Basie and Clinkai immunology, wyd. 6, Appleton and Lange, 1987). ________________________________________________________________________________

paRaina rozszczepia cząsteczkę immunoglobuliny, tzn. przestrzeń między domenami CH-1 i CH-2, nosi nazwę regionu zawiasowego. Wszystkie łańcuchy (ełckie są typu kappa lub lambda Na podstawie różnic w strukturze regionów CL (tab. 58-4) łańcuchy lekkie dzieli się na typ kappa (x) oraz lambda {X). Cząsteczka immiinoglobuliny zawiera 2 łańcuchy lekkie tego samego typu, nigdy ich kombinację. U człowieka łańcuch typu x występuje częściej w cząsteczkach immunoglobulin niż X. Pięć typów łańcuchów ciężkich określa przynależność immunoglobuliny do określonej klasy U człowieka stwierdza się 5 klas łańcuchów ciężkich, wyróżniających się odmienną budową regionów CH (tab. 58-4). Łańcuchy te, oznaczane jako y, a, |i, 5 i e różnią się masą cząsteczkową, która waha się od 50000 do 70000 (tab. 58-4). Chociaż zwykle występują 3 domeny CH, łańcuchy \v i e mają ich po 4. Rodzaj łańcucha ciężkiego określa przynależność immunoglobuliny do określonej klasy, a przez to rodzaj pełnionej funkcji. Rozróżnia się 5 klas immuno-

globulin: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE. Jak przedstawiono w tab. 58-4, w obrębie każdej z klas łańcuchów ciężkich, na podstawie subtelnych różnic w strukturze regionów CH, można wyróżnić podklasy. Nie ma dwóch identycznych regionów zmiennych Regiony zmienne w cząsteczkach immunoglobulin składają się z domen VL i VH i cechują się znaczną heterogennością, W rzeczywistości nie stwierdzono 2 identycznych pod względem sekwencji aminokwasowej regionów zmiennych w cząsteczkach immunoglobulin uzyskanych od różnych osób. Zauważa się jednak pewne podobieństwa w strukturze tych regionów u różnych osób, wśród których na podstawie stopnia homologii sekwencji aminokwasowej można wyróżnić 3 główne grupy: grupę VK dla łańcuchów lekkich typux, grupę VL dla łańcuchów lekkich typu k i grupę VH dla łańcuchów ciężkich. Można ponadto wyróżnić podgrupy w obrębie wymienionych 3 grup. Reasumując, w obrębie regionów zmiennych występują miejsca względnie niezmienne w poszczególnych grupach i podgrupach. Porównując regiony zmienne w różnych łańcuchach

780 / ROZDZIAŁ 58 Tabela 58- Właściwości łańcuchów ludzkich immunogiobulin* 4. Cecha

Łańcuchy L

Łańcuchy H

7 IgG Klasy, w których dane łańcuchy występują Podklasy lub 1 2, 3 4 podtvov Odmiany al- Gm (1)-{25) lotypowe

Masa cząste- 5 0 0 0 0 "" czkowa (przybliżona) Podgrupy regionów V

a IgA

IgM

1 2

1 2

5 IgD

S

IgE

Y. Wszystkie klasy

X Wszystkie

klasy

Składnik sekrecyjny SC IgA

Łańcuch J J IgA, łgM

12 3 4

NIW 55 000

70 000 62 000 70 000

23 000

23 000

70 000

15 000

VKI-VKIV

VHI-VHIV

Węglowodany (przeciętny udział procentowy)

4

10

15

18

18

0

0

16

8

Ilość otigosacharydów

1

2 lub 3

5

7

5

0

0

1

i

" Według: Stattes D. P., Stobo J. D., Wells J. V. (red.); Basie and Clinical Immunology, wyd 6 Appleton and Lange, 1987. *• Poprzednio lnv(1)-(3). ••* 60 000 dla T3. Wewnątrzłańcuchawe

Obszary nadzmienne łańcucha lekkiego,

wiązania

Obszary nadzmienne łańcucha ciężkiego dwuslarczkowe

Ryc. 58-7. Schematyczny model cząsteczki IgG, prezentujący prawdopodobne położenie obszarów nadzmiennych w obrębie łańcuchów ciężkich i lekkich. (Według: Stites D. P„ Stobo J. D„ Wells J. W (red): Basie and Clinical immunoiogy, wyd. 6. Appleton and Lange, 1987, za zezwoleniem, zmodyfikowana).

lekkich tej samej grupy i podgrupy stwierdza się występowanie regionów nadzmiennych porozrzucanych między względnie niezmiennymi sekwencjami (determinującymi przynależność do podgrupy (ryc. 58-7). Łańcuchy lekkie mają 3 regiony nadzmienne (w VL), a łańcuchy ciężkie -4(wVH). Regiony stałe określają funkcje efektorowe immunoglobulin swoiste dla klasy Regiony stale cząsteczek immunoglobulin, szczególnie CH_2 i CH_, (oraz CHA w IgM i IgE), które tworzą fragmenty Fc, odpowiadają za funkcje efektorowe różnych cząsteczek immunoglobulin, swoiste dla poszczególnych klas (tab. 58-5). Niektóre immuno globu liny, jak IgG, występują jedynie w podstawowej strukturze tetramerycznej, podczas gdy inne, jak IgA czy IgM, mogą występować jako wyższe polimery złożone z 2, 3 (IgA) lub 5 (IgM) jednostek tetramerycznych (ryc. 58-8).

BIAŁKA OSOCZA, 1MMUNOGLOBINY 1 CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 781 Tabela 58-5. Właściwości ludzkich immunoglobulin IgG

IgA

IgM

IgD

IgE

7

a

\i

8

s

y1,72,73,74

al, a2

H1,H2

Typ łańcucha L Skład cząsteczkowy

xi X

V. i A

Y^

xi X a2L/* lub

Stała sedymentacji fS)

6-7

7

19

7-8

150 000

160 000" 400 000*""

900 000

180 000

Ruchliwość elektroforetyczna (przeciętna)

Y

Szybka y do|3

Szybka 7 do (3

Szybka 7

Szybka y

Wiązanie dopełniacza (klasyczne)

+

0

++++

0

0

10 000

2000

1200

30

0,5

+

0

0

0

0

Klasa łańcucha H Podklasa łańcucha H

Masa cząsteczkowa (przybliżona)

Stężenie w surowicy (przybliżone) mg/i Penetracja przez łożysko

Y.

iX

5aL, 8

■

190 000

Aktywność reaginowa

?

0

0

0

++++

Liza anty bakteryjna

+

+

+++

?

?

++ +

+

?

?

Aktywność przeciwwirusowa

+

* Według Stites D.P., Stobo J.D., Welts J.V. (red.): Basie and Ctinicat tmmunology, wyd. 6. Appleton i Lange, 1987. " Dla monornerycznych surowiczych IgA **" Łańcuch J **" Składnik sekrecyjny SC ***** Dla sekrecyjnej IgA

W limfocycie B lub w komórce plarmatycznej łańcuchy L i H syntetyzowane są jako oddzielne cząsteczki i następnie łączone w cząsteczkę immunoglobuliny, która wykazuje budowę glikoproteiny (tab. 58-4). Łańcuchy lekkie i ciężkie są produktami wielu genów Każdy łańcuch lekki jest produktem co najmniej 3 oddzielnych genów strukturalnych: genu regionu zmiennego (VL), genu regionu łączącego (J) (nie mającego związku z łańcuchem J w IgA lub IgM) oraz genu regionu stałego (CV), Każdy łańcuch ciężki jest produktem co najmniej 4 różnych genów: genu regionu zmiennego (VH), genu regionu nadzmiennego („różnorodności" D), genu regionu łączącego (J) oraz genu regionu stałego (CH). Nie ma tu zastosowania klasyczna koncepcja „jeden gen — jedno białko". Mechanizmy molekularne odpowiedzialne za tworzenie pojedynczego łań-

cucha immunoglobuliny z wielu genów strukturalnych przedstawiono w rozdz. 38 i 41. Różnorodność przeciwciał zależy od rearanżacji genów Każdy człowiek zdolny jest do wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko 1 milionowi różnych antygenów. Wydaje się, że powstawanie tak ogromnej liczby różnorodnych przeciwciał zależy od tworzenia kombinacji różnych genów strukturalnych uczestniczących w syntezie każdego łańcucha immunoglobuliny oraz od dużej częstości mutacji somatycznych w rearanżowanych genach VH i VL. Podczas odpowiedzi immunologicznej dochodzi do zmiany klasy tworzonych przeciwciał („elass switching" — „przełączenie") W większości przypadków odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego dochodzi do

782 / ROZDZIAŁ 58

Składnik sekreoyjny

A. IgA w surowicy

C. l(jM (pan ta mer)

B. Sekrecyjna IgA (dimer)

Ryc. 58-8. Wysoce schematyczne przedstawienie polimerycznych ludzkich immunoglobulin, Łańcuchy polipeptydowe są reprezentowane przez grube linie; wiązania dwusiarczkowe łączące różne łańcuchy polipeptydowe są przedstawione za pomocą cienkich linii (Według: Stites D P., Stobo J D., Weils J. W. (red): Basie and Clinica! Immunology wyd. 6, Appleton and Lange, 1987, za zezwoleniem).

tworzenia przeciwciał o identycznej swoistości, lecz różniących się przynależnością klasową i zjawisko to następuje w ścisłym porządku chronologicznym w odpowiedzi na podanie immunogenu (immunizującego antygenu). Jeden z typów łańcucha lekkiego immunoglobuliny może się połączyć z antygenowo swoistym łańcuchem u., tworząc swoistą cząsteczkę IgM. Następnie, ten sam antygenowo swoisty łańcuch lekki łączy się z łańcuchem y o identycznym regionie V„, tworząc cząsteczkę IgG

o identycznej specyficzności wobec antygenu jak początkowo wytwarzana IgM. Ten sam łańcuch lekki może również łączyć się z łańcuchem ciężkim a, zawierającym identyczny region VH, aby utworzyć cząsteczkę IgA cechującą się taką samą swoistością wobec antygenu. Te 3 klasy (IgM, IgG i IgA) cząsteczek immunoglobulin przeciwko temu samemu antygenowi mają identyczną domenę zmienną zarówno w łańcuchu lekkim, jak i ciężkim. Mówimy więc, że mają one wspólny idiotyp. Różne klasy

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLQBIWV I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 783

izotypów determinowane są przez regiony CH połączone z tym samym swoistym antygenowo regionem VH. Jeden z genetycznych aspektów mechanizmów regulatorowych, odpowiedzialnych za zmianę genu kodującego CH („switching") przedstawiono w rozdz. 41. Przyczyną schorzeń może być zarówno nadmierna, jak i niedostateczna synteza tmmunoglobulin Zaburzenia w zakresie immu no globulin obejmują wzmożoną syntezę swoistych klas imm u no globu lin lub nawet swoistych cząsteczek immunoglobulin, przy czym to ostatnie zjawisko zachodzi w przypadku klonalnego rozrostu nowotworowego komórek plazma tycznych określanego mianem szpiczaka. Hipogammaglobulinemie mogą być ograniczone wyłącznie do jednej klasy immimoglobulin (np. EgA lub IgG) lub mogą dotyczyć niedostatecznego wytwarzania wszystkich ich klas (IgA, IgD, IgE, IgG oraz IgM). Nieprawidłowe stężenia immunoglobulin są prawie bez wyjątku spowodowane nieprawidłową szybkością ich syntezy lub wydzielania, indukowaną licznymi czynnikami. W HEMOSTAZIE UCZESTNICZĄ ŚCfANY NACZYŃ. PŁYTKI KRWI ORAZ CZYNNIKI OSOCZOWE BIORĄCE UDZIAŁ ZARÓWNO W KRZEPNIĘCIU KRWI, JAK I W ROZPUSZCZANIU SKRZEPU Cztery etapy hemostazy He most a za jest procesem zatrzymywania krwawienia, które następuje po naruszeniu integralności ściany naczyniowej. Obejmuje ona powstawanie skrzepu i polega na współdziałaniu elementów ściany naczyniowej, płytek krwi i białek osocza, które powoduje zarówno krzepnięcie krwi, jak i liżę powstałego skrzepu. Istnieją cztery etapy hemostazy: Pierwszym z nich jest obfcurczanie się uszkodzonego naczynia, z jednoczesnym zmniej szeniem się przepływu krwi w odcinku dystalnym w stosunku do miejsca uszkodzenia. Na drugą fazę składa się formowanie luźnego, przejściowego czopu płytkowego w miejscu uszkodzenia. Płytki przylegają do włókien kolagenu w miejscu uszkodzenia ściany naczyniowej i podlegają aktywacji przez trombinę (mechanizm aktywacji płytek opisano po niżej), powstałą w kaskadowej reakcji krzep-

nięcia w tym samym miejscu lub przez ADP uwolniony z innych zaktywowanych już płytek. Podczas aktywacji płytki zmieniają swój kształt i w obecności flbrynogenu ulegają agregacji z utworzeniem czopu płytkowego. Trzeci etap hemostazy polega na utworze niu sieci fibryny lub skrzepu, który zatrzymuje w swoim obrębie czop płytkowy (biały skrzep) i (lub) erytrocyty (czerwony skrzep) formując ostatecznie bardziej trwałą skrzepline. W czwartej fazie dochodzi do częściowego lub całkowitego rozpuszczenia skrzepu przez plazminę. W warunkach prawidłowej hemosta zy istnieje stabilny, dynamiczny stan równo wagi, w którym skrzepliny są stale tworzone i rozpuszczane. Istnieją trzy rodzaje skrzepów Rozróżnia się następujące rodzaje skrzepów: Biały skrzep złożony z płytek i fibryny jest stosunkowo ubogi w erytrocyty. Powstaje on w miejscu uszkodzenia lub patologicznej zmia ny ściany naczyniowej, szczególnie w miejscach, gdzie przepływ krwi jest szybki (k-inice). Drugim rodzajem skrzepu jest czerwony skrzep, który początkowo składa się z krwinek czerwonych i fibryny. Czerwony skrzep mor fologicznie przypomina skrzepline powstałą w probówce i może formować się in vivo w ob szarach o zwolnionym przepływie krwi lub z jej zastojem, ze współistniejącym lub nie uszkodze niem naczyniowym, albo też może on być formowany w miejscu zranienia lub zmiany naczyniowej w połączeniu z tworzącym się pierwotnie czopem płytkowym. Trzecim rodzajem skrzepu są rozsiane złogi fibryny zlokalizowane w bardzo małych naczy niach i kapilarach. Poszczególne 3 rodzaje skrzepu zawierają fibrynę w zmiennych proporcjach. W pierwszej kolejności zostanie przedstawiony proces krzepnięcia prowadzący do powstania fibryny. Następnie opisane zostaną krótko pewne aspekty udziału płytek i ściany naczyń krwionośnych w całościowo ujętym procesie krzepnięcia. To oddzielenie czynników krzepnięcia i płytek jest sztuczne, jako że jedne i drugie pełnią wzajemnie współzależne i bardzo zbliżone funkcje w procesie krzepnięcia; takie postępowanie jednakże ułatwia opis całości toczących się procesów.

784 / ROZDZIAŁ 58

Wynikiem działania zarówno szlaku wewnątrzpochodnego, jak i zewnątrzpochodnego jest powstanie włóknika Dwa szlaki prowadzą do uformowania czopu fibrynowego; zewnątrzpochodny i wewnątrzpochodny. Tworzenie sie czerwonego skrzepu w miejscu o zwolnionym przepływie krwi lub w odpowiedzi na istnienie patologicznej zmiany w obrębie ściany nitczyniowej bez uszkodzenia okolicznych tkanek jest wynikiem aktywacji szlaku wewnątrzpochodnego. W powstaniu czopu fibrynowego w odpowiedzi na uszkodzenie tkanki uczestniczy szlak zewnątrz pochodny. Obydwa szlaki zbiegają się we wspólnym, końcowym etapie obejmującym aktywacje pro trombiny do trombiny i katalizowane przez powstały enzym rozszczepienia fibrynogenu z utworzeniem czopu fibrynowego. Szlaki zewnątrzpochodny i wewnątrzpochodny, jak również wspólny etap końcowy są skomplikowane i bierze w nich udział wiele różnych białek {ryc. 58-9, tab. 58-6). Ogólnie, jak przedstawiono w tab. 58-7, białka te mogą być zaklasyfikowane do 4 grup: l)zymogenów, obejmujących sery nowo --zależne proteazy, które ulegają aktywacji podczas procesu krzepnięcia; 2) kofaktorów; 3) fibrynogcnu i 4) transglutamina/y, która stabilizuje skrzep fibry no wy.

Tabela 58-6. Numeryczny system nazewnictwa czynników krzepnięcia krwi. Liczebniki wskazują kolejność, w jakiej czynniki osoczowe były odkrywane i nie mają związku z kolejnością, w jakiej one działają Czynnik 1

Fibrynogen \ Czynniki te są zwykle

II

f określane za pomocą / ich nazw zwyczajoProtrombina j wVch

III

Fosfolipidy płytkowej

.

Niesazwyk

1 le określane | jako czynniki Jony wapnia / krzepnięcia Proakceleryna, czynnik chwiejny, akcelerator (Ac-)-globuliny Prokonwertyna, akcelerator konwersji protrombiny (SPCA), kotromboplastyna Czynnik antyhemofiiowy A, globulina antyhemofiłowa (AHG) Czynnik antyhemolitowy B, czynnik Christmasa, os oczowy składni ktromboplastyny Czynnik Stuarta-Pro we ra

IV V VII

vm IX

X

Czynnik poprzedzający tromboplastynę osoczową (PTA) Czynnik Hagemana Czynnik stabilizujący fibrynę (FSF), fibrynoligaza

XI

Szlak wewnątrzpochodny prowadzi do aktywacji czynnika X Szlak wewnątrzpochodny (ryc. 58-9) obejmuje czynniki XII, Xl, IX, VIII i X, jak również UJEM&fE NAŁADOWANA POWIERZCHNIA

Nazwa(y) zwyczajowa(e)

XII

XIII

Uszka^ "\^_dzenle f^ tkanki g2|ak Czynnik tKankowy \ zewnątrzpochodny x

■—vii

Szlak

wewnątrz-.* pochodny

J Sponlanloznła

2el flbrynowy Rozpuszczalne monomery flbryny

Końcowy, wspólny etap krzepnięcia

u sieciowa rta fibry na

Fibfynogen

Ryc. 58-9. Szlaki krzepnięcia krwi; wewnątrzpochodny i zewnątrzpochodny, prowadzące do powstania nierozpuszczalnego skrzepu fibryny. HMK — wielkocząsteczkowy kininogen, PL — fosfolipidy. "

* Bfadykinlna

Faza kontaktu

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 7SS Tabela 58-7. Funkcje osoczowych czynników krzepnięcia 1. Zymogeny proteaz serynowych Czynnik XII Łączy się z odsłoniętymi cząsteczkami kolagenu w miejscu uszkodzenia ściany naczyniowej; aktywowany przez wielkocząsteczkowy kininogen i kalikretnę f Czynnik XI Aktywowany jest przez czynnik Wie Czynnik IX

Aktywowany jest przez czynnik Xla w obecności jonów wapnia

Czynnik VII

Aktywowany przez trombinę w obecności jonów wapnia

Czynnik X

Uczynniany na powierzchni zaktywowanych ptytek przez kompleks czynników (jony wapnia, czynniki VIMa i tXa), jak również przez czynnik VIla w obecności czynnika tkankowego i jonów wapnia

Czynnik

Uczynniany na powierzchni zaktywowanych płytek przez kompleks protrombtnowy (jony wapnia, czynnik Va i Xa) (czynniki II, VII, IX i X są zymogenami zawierającymi reszty karboksyglutaminianowe)

2. Kota który Czynnik V!ll Aktywowany przez trombinę, czynnik Vltla jest kofaktorem w reakcji aktywacji czynnika X przez czynnik iXa Czynnik V

Aktywowany przez trombinę; czynnik Va jest kofaktorem w reakcji aktywacji protrombiny przez czynnik Xa

3, Fibrynogen Czynnik I

Rozszczepiany przez trombinę z utworzeniem skrzepu fibrynowego

4. Tiolowo-zależna transglutaminaza Czynnik XIII Aktywowany przez trombinę w obecności jonów wapnia stabilizuje skrzep fibrynowy na zasadzie tworzenia krzyżowych wiązań kowalencyjnych 50 — Biochemia

prekalikreinę, wysokocząsteczkowy kininogen, jony wapnia i fosfolipidy płytek krwi. Ostatecznie doprowadza on do powstania czynnika Xa (według przyjętej konwencji zaktywowane czynniki krzepnięcia oznacza się za pomocą przyrostka „a"). Szlak ten rozpoczyna się „fazą kontaktu", w trakcie której prekalikreina, wysokocząsteczkowy kininogen, czynniki XII i XI są eksponowane na działanie ujemnie naładowanej powierzchni aktywującej. Prawdopodobnie to właśnie kolagen, znajdujący się na odsłoniętej powierzchni ściany naczynia spełnia in vivo rolę wspomnianej powierzchni aktywującej, podczas gdy szkło lub kaolin w warunkach laboratoryjnych in vitro stymulują szlak wewnątrzpochodny. W chwili, gdy czynniki uczestniczące w fazie kontaktu zostanl* zgromadzone na powierzchni aktywującej, czynnik XII ulega aktywacji do czynnika XIIa w reakcji proteolizy katalizowanej przez kalikreinę. Powstały pod wpływem kalikreiny czynnik XIIa działa na prekalikreinę uwalniając kolejne cząsteczki kalikreiny, tworząc tym samym układ wzajemnej, zwrotnej aktywacji. Utworzony czynnik XIIa aktywuje czynnik XI do XIa oraz uwalnia bradykininę (nonapeptyd o działaniu rozszerzającym naczynia krwionośne) z wysokocząsteczkowego kininogenu. Czynnik XIa w obecności jonów wapnia aktywuje czynnik IX (masa cząsteczkowa 55 000, będący zymogenem zawierającym zależne od obecności witaminy K reszty ykarboksyglutaminianowe) do proteazy serynowej — czynnika IXa. Czynnik ten rozkłada wiązanie między arginmą i izoleucyną (Arg-Ile) w cząsteczce czynnika X (masa cząsteczkowa 56 000), tworząc dwułańcuchową proteazę serynową — czynnik Xa. Ostatnia reakcja wymaga do swego przebiegu udziału zespołu składników określanych łącznie jako kompleks aktywny, zlokalizowany na powierzchni zaktywowanych płytek i składający się z jonów wapnia, czynników VHIa, IXa i X, Należy nadmienić, iż we wszystkich reakcjach, w których biorą udział zymogeny zawierające reszty Gla na N-końcach cząsteczek (c2ynniki II, VII, IX i X) reszty te są miejscami o wysokim powinowactwie dla jonów wapnia. Przed zgromadzeniem czynników kompleksu aktywnego na trombocytach, płytki muszą ulec aktywacji, aby mogły wyeksponować kwaśne (anionowe) fosfolipidy, tj. fosfatydyloserynę i fosfatydyloinozytol, które zwykle znajdują się na wewnętrznej powierzchni błony komórkowej nie ^aktywowanego trombocytu.

786 / ROZDZIAŁ 58

Czynnik VIII (masa cząsteczkowa 330000) jest glikoproteiną nie będącą prekursorem proteazy, lecz kofaktorem służącym jako receptor dla czynników IXa i X na powierzchni płytek krwi. Czynnik. VIII jest aktywowany przez niewielkie ilości trombiny, tworząc czynnik VIIIa, podlegający następnie unieczynnieniu na drodze dalszego rozszczepienia przez trombinę. Szlak zewnątrzpochodny również prowadzi do uczynnienia czynnika X, choć w odmienny sposób Czynnik Xa zajmuje w układzie krzepnięcia miejsce, gdzie zbiegają się oba szlaki; zewnątrzpochodny i wewnątrzpochodny (ryc. 58-9), rozpoczynając wspólny, końcowy etap krzepnięcia krwi. Szlak zewnątrzpochodny obejmuje czynnik tkankowy, czynnik VII, X i jony wapniowe, prowadząc do powstania czynnika Xa. Szlak ten jest aktywowany w miejscu uszkodzenia tkanki w chwili uwolnienia czynnika tkankowego (obficie występującego w łożysku, tkance płucnej i mózgu) (ryc. 58-9), który działa jako kofaktor w katalizowanej przez czynnik VIIa reakcji aktywacji czynnika X. Czynnik VIIa

rozszczepia to samo wiązanie między argininą i izoleucyną (Arg-Ile) w cząsteczce czynnika X, które jest rozszczepiane przez kompleks aktywnych czynników szlaku wewnątrzpochodnego. Czynnik VII (masa cząsteczkowa 53 000), będący glikoproteiną syntetyzowaną w wątrobie, zawiera reszty glutaminianowe i jest zymogenem o stosunkowo wysokiej endogennej aktywności; aktywność ta wzrasta w wyniku konwersji do aktywnej proteazy serynowej, tj. czynnika VIIa, przez trombinę lub czynnik Xa. Aktywacja czynnika X stanowi ważne sprzężenie

szlaku wewnątrzpochodnego z zewnątrzpochodnym.

Końcowy wspólny etap krzepnięcia obejmuje aktywacje protrombiny do trombiny Podczas końcowego, wspólnego etapu krzepnięcia, czynnik Xa, powstający zarówno na szlaku wewnątrzpochodnym, jak i zewnątrzpochodnym, aktywuje protrombinę do trombiny (czynnik Ha), która następnie przekształca fibrynogen w fibrynę (ryc. 58-9). Aktywacja protrombiny, podobnie jak uczynnienie czynnika X, zachodzi na powierzchni zaktywowanych płytek i wymaga obecności kompleksu protrombinazy składającego się z płytkowych, anionowych fosfolipidów, jonów wapnia, czynnika Va, czynnika Xa i protrombiny.

Czynnik V (masa cząsteczkowa 330000), glikoproteiną pod wieloma względami zbliżona do czynnika VIII i ceruloplazminy, jest syntetyzowany w wątrobie, śledzionie i nerkach, i obecny zarówno w płytkach krwi, jak i osoczu. Działa on jako kofaktor w sposób podobny do czynnika VIII w kompleksie aktywnym. PD aktywacji do czynnika Va, zachodzącej pod wpływem niewielkich ilości trombiny, wiąże się on ze specyficznymi receptorami błony komórkowej płytek (ryc. 58-10), tworząc kompleks z czynnikiem Xa i protrombiną. Następnie czynnik ten podlega inaktywacji wskutek dalszego działania trombiny, tym samym zapewniając ograniczenie konwersji protrombiny do trombiny. Protrombiną (masa cząsteczkowa 72 000, ryc. 58-1)) jest jednołańcuchową glikoproteiną syntetyzowaną w wątrobie. Region N-koricowy protrombiny (1 na ryc, 58-11) zawiera 10 reszt

Pretrombina

COO C32+ Ca2+

Btona Komórkowa płytki

Ryc. 58-10. Schematyczne przedstawienie wiązania się czynników Va, Xa, jonów wapnia i protrombiny z błoną komórkową zaktywowąnej płytki. Miejsca rozszczepienia cząsteczki protrombiny przez czynnik Xa są zaznaczone przez dwie strzałki. Część cząsteczki protrombiny, z której następnie powstaje trombina, jest oznaczona jako pretrombina.____________________________________________________

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 787 Gl a„ 1

> 2

:

rI

-SS

I B

A |

X. Frełromblna (przed rozszczepieniem przez czynnik Xa) Trombina (po rozszczepieniu przez czynnik Xa)

j i

Ryc. 58-11. Schematyczne przedstawienie protrombiny fragment N-końcowy znajduje sie po lewej stronie; obszar 1 zawiera wszystkie 10 reszt y-karboksygIutaminianowych Zaznaczono miejsca, w których cząsteczka jest rozszczepiana pod wpływem czynnika Xa, jak również produkty jej degradacji. Pozycja katalitycznie aktywnej seryny oznaczona jest za pomocą trójkącika. Łańcuchy A i B aktywnej trombiny (zacienione) są wzajemnie połączone za pomocą mostków dwusiarczkowych, ________________________________________________________________________________ F-1-2

y-karboksyglutaminianowych (Gla), zaś serynowo-zależne miejsce aktywne tej proteazy (zaznaczone czarnym trójkątem), umiejscowione jest na C-końcu cząsteczki. Po połączeniu z kompleksem czynników Va i Xa na powierzchni płytki, cząsteczka protrombiny ulega rozszczepieniu w dwóch miejscach przez czynnik Xa, co prowadzi do utworzenia aktywnej, dwułańcuchowej cząsteczki trombiny, która jest następnie uwalniana z powierzchni płytki. Łańcuchy A i B trombiny są ze sobą połączone wiązaniem dwusiarczkowym. Protrombina może być również uczynniona przez koagulazę gronkowcową na drodze prostej modyfikacji konformacyjnej, nie obejmującej rozszczepienia cząsteczki. Przekształcenie fibrynogenu do fibryny jest katalizowane przez trombinę Fibrynogen (czynnik I, masa cząsteczkowa 340000, ryc. 58-9 i tab. 58-7) jest rozpuszczalną

glikoproteiną osoczową o długości 47,5 nm, która składa się z trzech różniących się między sobą łańcuchów polipeptydowycłi (A a B p, y)2, kowalencyjnie połączonych ze sobą wiązaniami dwusiarczkowymi. Łańcuchy B p i y zawierają przyłączony do asparaginy kompleks oligosacharydowy. Wszystkie 3 łańcuchy są syntetyzowane w wątrobie; 3 odpowiedzialne za ich syntezę geny strukturalne są zlokalizowane na tym samym chromosomie, a ich ekspresja u ludzi podlega koordynacyjnej regulacji. Regiony N-końcowe 6 łańcuchów są utrzymywane w bliskim wzajemnym sąsiedztwie przez pewną liczbę wiązań dwusiarczkowych, podczas gdy regiony C-końcowe są od siebie znacznie oddalone, wskutek czego cząsteczka ma wydłużony i asymetryczny kształt (ryc. 58-12). Odcinki A i B znajdujące się w regionach N-końcowych łańcuchów A a i B p1, określane odpowiednio jako fibrynopeprydy A (FPA) i fibrynopeptydy

Łańcuch Aa

Łańcuch B/f Łańcuch y

0

■47.5 nm-

Ryc. 58-12. Schematyczne przedstawienie (bez zachowania proporcji) cząsteczki fibrynogenu, eks ponujące pary łańcuchów Aa, Bp i y połączonych przez wiązania dwusiarczkowe. FPA—fibrynopeptyd A, FPB — fibrynopeptyd B. _______________________________________________________________________________

788 / ROZDZIAŁ 58

B (FFB), mają nadmiar ładunków ujemnych spowodowanych obecnością reszt asparaginianowych i glutaminianowych, jak również nietypowego O-siarczanu tyrozyny w FPB. Wspomniane ładunki ujemne mają swój wpływ na rozpuszczalność fibrynogenu w osoczu, jak również zapobiegają agregacji jego cząsteczek dzięki elektrostatycznemu odpychaniu. Trombina (masa cząsteczkowa 34000) jest proteaza serynową występującą w osoczu i hydrolizującą 4 wiązania arginina-glicyna (Arg-Gly) zlokalizowane między fibrynopeptydami oraz odcinkami a i (! łańcuchów AaiB Pfibrynogenu(ryc. 58-13A). Uwolnienie fibrynopeptydów przez trombinę wyzwala monomery fibryny, mające strukturę podjednostkową (a, p, y)2. Ponieważ FPA i FPB zawierają odpowiednio tylko 16 i 14 reszt aminokwasowych, cząsteczka fibryny zachowuje 98% reszt obecnych w fibrynogenie. Usunięcie fibrynopeptydów odsłania miejsca wiązce, które umożliwiają cząsteczkom monomerów fibryny spontaniczną agregację w niestabilny kompleks tworzący z kolei nierozpuszczalny skrzep fibrynowy. Uformowany, nierozpuszczalny polimer

Trombina

Arg —*— Gly Flbrynopeptyd (A lub B)

fibryny zatrzymuje w swoim obrębie płytki, erytrocyty i inne składniki tworząc białe lub czerwone skrzepy. Utworzony początkowy skrzep fibrynowy jest raczej słaby i utrzymywany w całości jedynie przez niekowalencyjne połączenia monomerów fibryny. Trombina, poza konwersją fibrynogenu do fibryny, przekształca również czynnik XIII do czynnika XIJIa Czynnik ten jest bardzo swoistą transglutaminazą, która kowalencyjnie łączy cząsteczki fibryny na zasadzie tworzenia wiązań peptydowych między grupami y-karboksylowymi y-karboksyglutaminianu i e-aminowymi reszt lizyny (ryc, 58-13B). W ten sposób powstaje bardziej stabilny skrzep fibrynowy o zwiększonej odporności na proteolizę. Stężenie krążącej trombiny wymaga precyzyjnej kontroli wobec możliwości powstawania groźnych zakrzepów W warunkach fizjologicznej hemostazy stężenie aktywnej trombiny musi podlegać dokładnej kontroli, aby nie tworzyły się groźne zakrzepy. Cel ten osiągany jest w dwojaki sposób. Trombina krąży w postaci nieaktywnego preluirsora

Łańcuch fibryny (a lub 0)

Fibryna — CH;, — CH;> — CH;. — CHj — NH3 Reszta lizyny

NHJ

J

N —C —CH ? —CH;— Fibryna Reszta glutaminy 1

Czynnik Xllia (transglutamlnaza)

O II Fibryna — CH2 — CH2 — CH2 — CH2 — NH — C — CH2 — CHj — Fibryna

Ryc. 58-13. Tworzenie się skrzepu fibrynowego: A — indukowane przez trombtnę rozszczepienie wiązań Arg-Gly (arginina-glicyna) łańcuchów Aa i Bp fibrynogenu z powstaniem fibfynopeptydów (lewostronnie) oraz łańcuchów cc i p monomerów fibryny (prawostronnej). B — usieciowanie cząsteczek fibry fty przez aktywowany czynnik XIII (czynnik Xll(a).

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA

— protrombiny, która podlega uczynnieniu na drodze kaskady reakcji enzymatycznych, podczas których nieaktywne zymogeny są przekształcane do aktywnych enzymów, co w konsekwencji prowadzi do konwersji protrombiny w trombinę (ryc. 58-9). Na każdym etapie wspomnianej kaskady mechanizm ujemnego sprzężenia zwrotnego zapewnia istnienie precyzyjnej równowagi między aktywacją a hamowaniem. Stężenie czynnika XII yv osoczu wynosi ok. 30 ug/ml, natomiast fibrynogenu — 3 mg/ml, podczas gdy poziomy innych czynników kolejno działających w kaskadzie wykazują stały wzrost, co jednoznacznie wskazuje na występowanie mechanizmu zwielokrotnienia w obrębie kaskady. Drugi sposób kontroli aktywności trombiny polega na unieczynnianiu wszelkich tworzących się jej cząsteczek przez krążące inhibitory, z których najważniejsza jest antytrombina III (p. poniżej). Aktywność antytrombiny III, ważnego inhibitora trombiny, zwiększa antykoagulant — heparyna W warunkach fizjologicznych w osoczu istnieją 4 naturalne inhibitory trombiny. Najważniejszym z nich jest antytrombina III, której udział w całkowitej aktywności antytrombinowej wynosi 75%. Antytrombina III może również hamować aktywność czynników IXa, Xa, Xla i XIIa. a2-Makroglobulina ma największy udział w pozostałej aktywności antytrombinowej osocza, wraz z kotaktoran heparyny II i 01,-antytrypsyną (oCj-antyproteinazą) wykazującymi mniejsza aktywność hamującą w warunkach fizjologicznych. Endogenna aktywność antytrombiny III znacznie zwiększa się w obecności kwaśnych proteoglikanów, takich jak heparyna (p. rozdz. 57). Wiążą się one ze swoistymi miejscami kationowymi w obrębie cząsteczki antytrombiny III, indukując zmianę jej konformacji, ułatwiając tym samym jej wiązanie się z trombiną i innymi substratami. Mechanizm ten leży u podstaw stosowania heparyny w medycynie klinicznej w celu zahamowania krzepnięcia. Ponadto heparyna stosowana w małych dawkach ma zdolność wyścielania śródbłonka naczyń krwionośnych, przez co prawdopodobnie zmniejsza aktywację szlaku wewnatrzpochodnego. Antykoagulacyjne działanie heparyny może zostać zniesione przez działające przeciwstawnie silnie kationowe polipeptydy, jak pro tam i na, która mocno wiążąc się z z heparyną osłabia jej łączenie się

/ 789

z antytrombina IH^Osoby z wrodzonymi niedoborami antyirombiny IIJ wykazują predyspozycje do częstego tworzenia rozległych zakrzepów, co potwierdza fizjologiczne znaczenie antytrombiny III oraz wskazuje na fakt, iż układ krzepnięcia u ludzi jest w warunkach fizjologicznych układem dynamicznym. ■

Anty koagulanty pochodne kumaryny hamują zależną od witaminy K karboksylację czynników II, VII, IX oraz X Antykoagulanty kumarynowe (np.: dikumaroi) są lekami hamującymi zależną od obecności witaminy K karboksylację reszt glutaminianowych do y-karboksyglutaminianowych w regionach N-końcowyeh czymjjków II, VII, IX i X. Czynniki te, powstające w wątrobie, do spełnienia swej roli w procesie krzepnięcia wymagają obecności jonów wapnia. Te ostatnie zostają związane przez reszty y-karboksyglutaminianowe, z kolei uzależnione od karboksylacji reszt glutaminianowych wymienionych czynników krzepnięcia. Pochodne kumaryny hamują redukcję pochodnych chinonowych witaminy K do aktywnych jej form hydrochinonowych. W tym przypadku podanie witaminy K pozwala ominąć indukowaną kumaryną inhibicję i umożliwia powstanie czynników zawierających reszty Y-karboksyglutaminianowe. Odwrócenie inhibicji kumarynowej przez witaminę K trwa 12—14 h, podczas gdy wyeliminowanie efektów działania heparyny przez pro taminę jest prawie natychmiastowe. Hemofilia A jest spowodowana genetycznie uwarunkowanym niedoborem czynnika VIII U ludzi spotyka się wiele wrodzonych niedoborów w obrębie układu krzepnięcia. Najbardziej rozpowszechniony jest niedobór czynnika VIII wywołujący hemofilię A. Choroba ta, dziedzicząca się z chromosomem X, miała duże znaczenie w historii rodów królewskich w Europie. Hemofilia B jest spowodowana niedoborem czynnika IX i wykazuje niemalże identyczny obraz kliniczny jak hemofilia A. Obydwa stany chorobowe można jednak zróżnicować za pomocą swoistych testów laboratoryjnych. Gen ludzkiego czynnika VIII, poddany klonowaniu, okazał się być jednym z największych do tej pory poznanych, zawiera bowiem 186 kb i 26 eksonów. Wykryto wiele rozmaitych typów uszkodzeń, przejawiających się zmniejszoną ak-

790 / ROZDZIAŁ 58

tywnością czynnika VIII. Obejmują one częściowe delecje i punktowe mutacje prowadzące do przedwczesnego zakończenia tworzenia łańcucha polipeptydowego. Obecnie możliwa jest diagnostyka prenatalna polegająca na ocenie DNA z pobranych komórek kosmówki. W ostatnich latach leczenie pacjentów z hemofilią A obejmowało podawanie krioprecypitatów (wzbogaconych w czynnik VIII) otrzymywanych od indywidualnych dawców lub liofilizowanych koncentratów czynnika VIII przygotowywanych z puli osocza pochodzącego nawet od 5000 dawców. W niedalekiej przyszłości czynnik VIII będzie wytwarzany techniką rekombinacji DNA. Być może metoda ta pokryje zapotrzebowanie wszystkich pacjentów z hemofilią A. Problem ten nabrał znaczenia z chwilą pojawienia się u wielu pacjentów z hemofilią AIDS jako konsekwencji terapii substytucyjnej z wykorzystaniem koncentratów liofilizowanego czynnika VIII, przygotowanych z wielu próbek osocza; czynnik VIII otrzymany metodą rekombinacji DNA jest całkowicie bezpieczny w zastosowaniu klinicznym. Skrzepy fibrynowe są rozpuszczane przez plazminę Jak stwierdzono powyżej, układ krzepnięcia prawidłowo jest w stanie dynamicznej równowagi, w której skrzepy fibryny są stale tworzone i jednocześnie rozpuszczane. Plazmina— proteaza serynowa, odpowiedzialna w głównej mierze za degradację fibryny i fibrynogenu, krąży w osoczu w formie nieaktywnego zymogenu — plazminogenu (masa cząsteczkowa 90 000). Jeśli nawet niewielki*Uości plazminy powstają we krwi krążącej, w warunkach fizjologicznych podlegają one natychmiastowej inaktywacji przez szybko działający inhibitor plazminy — atj-antyplazminę. Plazminogen łączy się zarówno z fibrynogenem, jak i fibryną, i w ten sposób zostaje włączony w skfad skrzepu w trakcie jego tworzenia się. Plazmina powstająca w czasie jej związania z fibryną jest chroniona przed działaniem a2-an ty plazminy i pozostaje aktywna. Różnego rodzaju aktywatory plazminogenu występują w większości tkanek organizmu, rozszczepiając to samo wiązanie w cząsteczce plazminogenu — między argininą i waliną (Arg-Val) i tworząc tym samym dwułańcuchową proteazę serynowa — plazminę (ryc. 58-14) Tkankowy aktywator plazminogenu (TPA) jest

proteazą serynowa uwalnianą ze śródbłonka naczyniowego do krążenia w warunkach uszko-

Aktywatory plaż mtn □ gen u I-Val —i

NH:

rtiy—vai

r

\----s-S—' -pArg

PLAZMINOGEN

coo

I- -S PLAZMINA

Ryc. 58-14. Aktywacja plazminogenu coo To samo wiązanie Arg-Val (argininawalina) jest rozszczepiane przez wszystkie aktywatory plazminogenu, z utworzeniem dwulańcuchowej cząsteczki plazminy. Trójkącik oznacza resztę serynowa miejsca aktywnego. Dwa łańcuchy plazminy są połączone ze sobą za pomocą mostka dwusiarczkowego.

dzenia tkanki lub stresu, a następnie, jeśli nie zwiąże się z fibryną, podlega katalitycznej inak tywacji. Po połączeniu z fibryną TPA rozszczepia plazminogen w obrębie skrzepu z wytworzeniem plazminy, która z kolei rozkłada fibrynę z uwal nianiem rozpuszczalnych produktów jej degra dacji, co ostatecznie prowadzi do rozpuszczenia skrzepu. Zarówno plazmina, jak i aktywator plazminogenu, nie mogąc pozostać związane z produktami degradacji fibryny, są uwalniane do osocza, gdzie podlegają unieczynnieniu przez ich naturalne inhibitory. Prourokinaza jest pre kursorem kolejnego aktywatora piazminogenu — urokinitzy, która nie ma tak dużej swoistości dla fibryny jak poprzedni aktywator. Urokinaza jest wydzielana przez pewne komórki nabłon kowe wyścielające przewody wydzielnicze (np. kanaliki nerkowe) i prawdopodobnie bierze udział w rozpuszczaniu fibryny odkładającej się w tych przewodach. , TPA otrzymany techniką rekombinacji DNA badany jest pod kątem jego przydatności w leczeniu zakrzepów wieńcowych W chwili obecnej inny aktywator plazminogenu streptokinaza —-jest wykorzystywany w lecznictwie jako czynnik fibrynolityczny. Jednakże jest on mniej wybiórczy niż TPA, .ponieważ aktywuje zarówno plazminogen w osoczu (gdzie może on następnie degradować krążący tlbrynogen), jak również plazminogen związany ze

BIAŁKA OSOCZA, iMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 791

skrzepem fibrynowym. Ilość plazminy powstałej pod wpływem dawek terapeutycznych streptokinazy może przekroczyć zdolność neutralizacji przez krążącą a 2 -antyplazminę, powodując w konsekwencji degradację zarówno fibrynogenu, jak i fibryny, z następczymi krwawieniami często obserwowanymi w trakcie terapii fibry nolitycznej. Istnieje znaczne zainteresowanie wykorzystaniem terapeutycznym TPA otrzymanego metodą rekombinacji DNA z racji jego swoistości dla degradowanej fibryny i możliwości przywracania drożności tętnicom wieńcowym, objętym uprzednio zakrzepem. Pod warunkiem odpowiednio wczesnego podania (przed wystąpieniem nieodwracalnych uszkodzeń mięśnia sercowego), TPA może znacznie obniżyć współczynnik umieralności z powodu uszkodzenia mięśnia sercowego, będącego konsekwencją zakrzepicy wieńcowej. Dotychczas, w wielu próbach klinicznych, TPA wywoływał czasem krwawienia, tak więc pozostaje nadal pytanie, czy okaże się on korzystniejszym lekiem w terapii ostrej zakrzepicy wieńcowej od o wiele tańszej s trep toki nazy. Istnieje kilka stanów patologicznych, między innymi choroba nowotworowa i wstrząs, w których obserwuje się wzrost poziomu aktywatorów plazminogenu. Ponadto aktywność antyplazminy, na którą składają się arantytrypsyna i otj-antyplazmma może być zaburzona w pewnych stanach chorobowych, jak chociażby w marskości wątroby. Ponieważ pewne substancje pochodzenia bakteryjnego, jak na przykład streptokinaza, mają zdolność aktywowania plazminogenu, mogą one być odpowiedzialne za powstawanie rozległej skazy krwotocznej obserwowanej czasami u pacjentów z uogólnionymi infekcjami bakteryjnymi. Aktywacja płytek związana jest ze stymulacją metabolizmu poi ifosf oi nozytydów Płytki podlegają kolejno 3 procesom, zapewniającym ciągłość hemostazy: 1) adhezji do odsłoniętych włókien kolagenu w ścianie naczyniowej, 2) uwolnieniu zawartości ich ziarnistości oraz 3) agregacji. Adhezja płytek do kolagenu odbywa się z udziałem czynnika von Willebranda, glikoproteiny wydzielanej przez komórki śródbłonka do osocza. Białko to działa jak „most bezpieczeństwa" rozpięty między glikoproteiną powierzchni płytek a włóknami kolagenu w ścianie naczyń krwionośnych. Czynnik ten zapobiega

więc oderwaniu sięiplytek od ścian naczyń pod wpływem sił „strzygących" prądu krwi. Aktywacja płytek. Prawidłowe płytki znajdują się w stanie nie pobudzonym. Podczas krzepnięcia zaangażowane w ten proces trombocyty podlegają aktywacji. Aktywacja jest złożonym zjawiskiem, które obejmuje zmiany kształtu płytek, zwiększoną ich ruchliwość, uwalnianie zawartości ich ziarnistości oraz agregację. Trombina, utworzona w wyniku kaskady krzepnięcia, inicjuje aktywację płytek in vivo na drodze interakcji ze swoim receptorem na powierzchni błony cytoplazmatycznej trombocytów (ryc. 58-15). Kolejne zjawiska prowadzące do aktywacji płytek są przykładem sygnalizacji przez Mono w ej, w trakcie której chemiczny sygnał zawarty w przestrzeni poza komórkowej powoduje powstanie cząsteczek efektorowych we wnętrzu komórki. Na przykład trombina działa jako pozakomórkowy przekaźnik chemiczny (stymulant lub agonista). Oddziaływanie trombiny z iej receptorem wzmaga aktywność fosfolipazy C błony komórkowej. Enzym ten hy drolizuj e fosfaty dy loinozy tolo-4,5-bisfosforan (PIPj jest polifosfoinozytydem), prowadząc do powstania 2 wewnątrzkomórkowych cząsteczek efektorowych — diacyloglicerolu (DAG) oraz inozytolo-tri fosforanu (IPj). Hydroliza PIP2 uczestniczy również w mechanizmie działania wielu hormonów (p. rozdz. 45) i leków. DAG pobudza kinazę białek C, która z kolei fosforyluje białko płytkowe o masie cząsteczkowej 47 000. Fosforylacja tego białka powoduje uwolnienie zawartości różnego typu ziarnistości płytkowych (lizosomy, ziarnistości gęste i ziarnistości ot). ADP uwolniony z ziarnistości gęstych może również aktywować płytki, co przejawia się uczynnieniem dodatkowych krwinek płytkowych w otoczeniu. Ponadto ADP ma zdolność modyfikacji powierzchni płytki, co pozwala cząsteczkom fibrynogenu (utworzonym w kaskadzie krzepnięcia) na przyczepienie się do kompleksu glikoprotein (GPIIb oraz GPIIIa) na powierzchni trombocytu. Następnie cząsteczki fibry nogenu łączą ze sobą sąsiadujące płytki tworząc agregat płytkowy. 1P3 powoduje napływ jonów wapniowych do cytoplazmy i współdziałając z kalmoduliną oraz kinazą lekkich łańcuchów miozyny prowadzi do fosforylacji lekkich łańcuchów miozyny. Łańcuchy te następnie współdziałając z aktyną powodują przesunięcie i zmiany kształtu płytki. Aktywacja płytkowej fosfolipazy A2 przez zwiększone stężenie jonów wapnia jest przy-

792 / ROZDZIAŁ 58 TxAa

Trombina

+

0

I r^

Agregacja

ADP

©+ ©

Bfona komórkowa

Fosforylacja Watka o m. ra. 47 000 \

Fosfarylacja lekkiego łaficucha

Uwolnienie zawartości ziarnistości płytki (lizosomalnych. gęstych i łącznie z ADP

Aktyna Prostacyklina ^I --' Aktynomiozyna \ Przesunięcie, zmiana kształtu

Ryc. 58-15. Schematyczne przedstawienie aktywacji płytki. Środowisko zewnątrz kom orkowe* biona komórkowa i środowisko wewnątrzkomórkowe są przedstawione kolejno od góry do dołu. GP — glikoproteina, R\ R3, R3, R* — różne receptory, AC — cykłaza adenylanowa, PLA S — fosfolipaza A2, PL — fosfolipidy, PLC - fosfolipaza C, PtPs — fosfatydyloinozytofo-4,5 bisfosforan, cAMP — cykliczny adenozynomonofosforan, PKC — kinaza białek C, TxA; — tromboksan A^, IP3 — inozytolo-trifosforan, DAG — diacyloglicerol.

czyną uwolnienia kwasu arachidonowego z płytkowych fosfolipidów i powstania tromboksanu Aj (rozdz. 25), który z kolei ma zdolność dalszej aktywacji fosfoti^azy C, ułatwiając płytkową agregację. Uczynnione płytki, poza formowaniem c/opu płytkowego, są niezbędne, dzięki swoim fosfolipidom, do aktywacji czynników X i II w kaskadzie krzepnięcia (ryc. 58-9), Ściany naczyń krwionośnych syntetyzują prostacyklinę oraz inne substancje wpływające na krzepnięcie krwi i tworzenie zakrzepów Komórki śródbłonka ścian naczyń krwionośnych wnoszą istotny wkład do ogólnej regulacji krzepnięcia i powstawania zakrzepów. Jak opisano w rozdz. 25, komórki te wytwarzają prostacykliny (PGI2), które są silnymi inhibitorami płytkowej agregacji, antagonizując działanie tromboksanów. Prostacykliny działają prawdopodobnie na zasadzie pobudzania aktywno-

ści cyklazy adenylanowej na powierzchni błon płytek. Pojawiające się w następstwie tego zwiększenie stężenia wewnątrzpłytkowego cAMP przeciwdziała stymulowanemu przez IP3 wzrostowi stężenia wewnątrzkomórkowych jonów wapnia, i tym samym hamuje aktywację płytek (ryc. 58-15). Komórki śródbłonka spełniają też inne funkcje w regulacji powstawania skrzepu. Na przykład metabolizują ADP, znosząc jego działanie agregujące płytki. Ponadto, wytwarzają one również siarczan Iieparanu. który wiąże niektóre czynniki krzepnięcia, a także produkują aktywatory plazminogenu, które mogą wspomagać rozpuszczanie skrzepów. Analiza mechanizmów inkorporacji aterogennych lipoprotein, jak LDL, przez monocyty, komórki śródbłonka i mięśniówki gładkiej tętnic, wraz z precyzyjną oceną mechanizmów powstawania uszkodzeń wywoływanych przez lipoproteiny w obrębie tych komórek, są przedmiotem intensywnych badań w celu wyjaśnienia mechanizmów powstawania miażdżycy (rozdz. 28).

BIAŁKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNIĘCIA / 793 Tabela 58-8. Główne cechy hemostazy i krzepnięcia Naczynia krwionośne, płytki i czynniki osoczowe krzepnięcia są łącznie zaangażowane w całości procesu Wewnątrzpochodny układ krzepnięcia jest aktywowany przez odsłonięty kolagen na powierzchni naczyń krwionośnych Układ zewnątrz pochodny jest aktywowany przez czynnik tkankowy uwotniony w trakcie uszkodzenia tkanki Układ zewnątrzpochodny i wewnątrzpochodny prowadzą do powstania czynnika Xa, natomiast finalizują swoje działanie w końcowej, wspólnej fazie krzepnięcia, w której powstaje fibryna z fibrynogenu pod działaniem trombiny Wiele czynników krzepnięcia istnieje w postaci zymogenów proteaz serynowych; zymogeny te podlegają aktywacji na drodze proteotizy. Istnieją genetycznie uwarunkowane niedobory lub zmiany struktury czynników krzepnięcia, manifestujące się wieloma chorobami krwotocznymi, jak chociażby hemofilia A W osoczu występują inhibitory czynników krzepnięcia (np. antytrombina III), które biorą udział w regulacji krzepnięcia Wiele kluczowych reakcji w układzie krzepnięcia odbywa się na powierzchni płytek; płytki podlegają aktywacji wskutek działania trombiny, kolagenu i ADP, a ich agregacja jest zależna od interakcji z fibrynogenem Całość procesów krzepnięcia stanowi kaskadę, w ramach której następuje znaczne zwielokrotnienie działania Dla aktywacji czynników II, Vii, IX i X konieczna jest zależna od obecności witaminy K karboksylacja pewnych reszt glutaminianowych z utworzeniem reszt gamma-karboksyglutaminianowych (Gla); reszty te wiążą jony wapnia, będące ważnymi uczestnikami procesu krzepnięcia Ściany naczyń krwionośnych wytwarzają prostacyklinę, która hamuje aktywację i agregację płytek; w ścianie naczyń krwionośnych odbywa się także synteza innych związków, które biorą udział w regulacji krzepnięcia Skrzepy powstają z fibryny, wzmacnianej przez formowanie wiązań krzyżowych, katalizowane przez transglutaminazę, skrzepy fibrynowe są rozpuszczane przez plazminę powstającą z plazminogenu

LABORATORYJNE TESTY OCENY KRZEPNIĘCIA KRWI Obecnie dostępnych jest wiele różnorodnych testów laboratoryjnych służących do oceny 4 etapów hemostazy opisanych powyżej. Obejmują one oznaczanie liczby płytek, czasu krwawienia, czasu częściowej tromboplastyny (PTT), czasu protrombinowego (PT), czasu trombinowego, stężenia fibrynogenu, trwałości skrzepu fibrynowego oraz ilości produktów rozpadu fibryny. Szersze informacje na temat wymienionych badań znajdzie Czytelnik w podręcznikach fizjologii lub hematologii. Podstawowe dane dotyczące hemostazy i krzepnięcia zebrano w tab. 58-8.

PIŚMIENNICTWO Bloorn AL,Thomas DP (edkors): Haemostasis and Thrombosis, 2nd ed. ChurchiU Livingstone, 1987, Colman RW, Hirsh J, Marder VJ, Salzman EW (editors): Hemostasis and Thrombosis, 2nd ed. JB Lippincott Co, 1987. Dugaiczyk A, Law SW, Dennison OE: Nuclcotide seąuenee and the encoded amjno acids of human serum albumin raRNA. Proc Natl Acad Sci USA 1982; 79:71. Gitschier J et al: Characterization of the human factor VIII gene. Namre (London) 1984; 312:326. Handin RI. Chapter 54, Bleeding and thrombosis, p 266, in: Harrison's Principks of Interna! Medicine 11 th ed. Braunwald, E, Isselbachcr, KJ, Petersdorf RG et al (editors). McGraw-Hill, 1987. Mariani G (editor): Pathophysiology ofPlasma Protein Metabolizm, Plenum Press, 1984. McK.ee PA: Hemostasis and disorders of blood coagulation, in; The Metabolic Basis of Inherited Disease, 5th ed. Stanbury JB et al (editors). McGraw-Hill, 1983. Reed RG, Peters T Jr. Chapter 14, Plasma proteins, pp 435-464, in: Clinicat Biochemistry Reviews, Vol 3. Goldberg DM (editor). John Wiley & Sons, 1982. Ruffner DE, and Dugaiczyk A: Splicing mutation in human hereditary analbuminemia. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85:2125. Stamatoyannopoulos G, Nienhuis AW. Leder P, Majerus PW (editors): The Mo/ecular Basis of Blood Diseases. WB Saunders, 1987, Stites DP, Stobo JD, Wells JV: Basie & Clinkal Immunology, 6th ed. Appleton & Lange, 1987, Vogel F, Motulsky AG. Human Genetics, 2nd ed. Springer-Verlag, 1986.

5 9

Białka kurczliwe i strukturalne Victor W. Rodwell, PhD, Robert K. Murray, MD, PhD, Frederick W. Keetey, PhD

WPROWADZENIE Cząsteczki białek mogą pełnić funkcję nie tylko katalizatorów. W poprzednich rozdziałach opisano funkcje regulacyjne, przekazywania sygnałów i funkcje rozpoznawcze cząsteczek białkowych. Spełniają one również ważne funkcje przetworników i elementów strukturalnych. W tym rozdziale dokonano przeglądu niektórych z tych ostatnich funkcji zależnych od włóknistej struktury cząsteczek białkowych.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Rozwój naszej wiedzy o molekularnych podstawach głównych chorób genetycznych białek strukturalnych nabrał nowego rozpędu w 1986 r. wraz z pomyślnym klonowaniem genu dystrofii mięśniowej typu Diu-fcuinc'a. Było to osiągnięcie wielce obiecujące dla dokładnego rozpoznawania i ewentualnie leczenia tej choroby (p. przypadek nr 6, rozdz. 62). Podczas gdy wiele molekularnych schorzeń białek powstaje na skutek mutacji w genach, w których dane białko jest zakodowane (np. hemoglobina), białka poddane modyfikacji potranslacyjnej dostarczają dodatkowych możliwości powstawania chorób z defektu genetycznego. Na przykład wie\e chorób u ludzi wynika z genetycznych defektów w przetwarzaniu prekursorów kolagenu (osteogenesis imperfecta, zespół Ehlersa-Danlosa i Marfana). Defekty kolagenu mogą powstawać również na skutek zahamowania potranslacyjnej modyfikacji przez brak kofaktora, takiego jak kwas askorbinowy (witamina C), niezbędnego dla hydroksylacji związanych z białkiem reszt prolilowych i lizylowych do hydroksy-

proliny i hydroksylizyny. Takimi właśnie zaburzeniami można tłumaczyć objawy kliniczne pod postacią osłabienia tkanki łącznej typowe dla klasycznego szkorbutu (gnilca).

MIĘSIEŃ PRZETWARZA ENERGIĘ CHEMICZNĄ W MECHANICZNĄ Mięśnie należą do głównych przetworników biochemicznych (maszyn), które przetwarzają energię potencjalną (chemiczną) w kinetyczną (mechaniczną). Mięśnie, najobfitsza tkanka ciała ludzkiego, stanowią mniej niż 25% masy ciała przy urodzeniu, więcej niż 40% u młodych dorosłych i mniej niż 30% w starości. Efektywny przetwornik chemiezno-mechaniczny musi spełniać kilka warunków: 1. Musi mieć zapewniony stały dopływ energii. W mięśniach kręgowców energia chemiczna dostarczana jest w postaci ATP i fosfokreatyny. 2. W przypadku mięśnia musi być zapewniony sposób regulacji aktywności mechanicznej — tj. szybkości, czasu trwania i siły skurczu. 3. Maszyna musi być podłączona do operatora, którego rolę spełnia w układach biologicznych system nerwowy. 4. Musiiyć zapewniona możliwość powrotu maszyny do jej pierwotnego stanu. Mięsień jest maszyną ciągnącą, a nie pchającą. Dlatego mięsień musi mieć antagonistę w postaci grupy innych mięśni lub innych sił, jak grawitacja lub napięcie elementów sprężystych. U kręgowców powyższe warunki spełniane są przez 3 rodzaje mięśni: mięśnie szkieletowe, mięsień sercowy i mięśnie gładkie. Zarówno mięśnie szkieletowe, jak i mięsień sercowy wykazują w obrazie mikroskopowym poprzeczne praż-

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 795 kowanie; mięśnie gładkie prążkowania nie mają.

Podczas gdy mięśnie szkieletowe są sterowane (kontrolowane) w sposób świadomy, regulacja czynności mięśnia sercowego i mięśni gładkich odbywa się niezależnie od naszej woli.

Sarkoplazma komórek mięśniowych zawiera ATP, fosfokreatynę i enzymy glikolityczne Mięsień poprzecznie prążkowany sktada się z wielojądrzastych komórek (włókien) otoczonych pobudliwą na bodźce elektryczne btoną sarkolemmą. Pojedyncze włókno (komórka) mięśniowe, które może rozciągać się na całą długość mięśnia, zawiera pęczki złożone z wielu równolegle ułożonych miofibryli, zanurzonych w wewnątrzkomórkowym płynie, sarkoplazmie. Płyn ten zawiera glikogen, związki wysokoenergetyczne ATP i fosfokreatynę oraz enzymy glikolityczne. Sarkomer jest czynnościową jednostką mięśnia Sarkomer wielokrotnie powtarza się wzdłuż długiej osi fibrylico 1500 — 2300 nm(ryc. 59-1).

Oglądając miofibryje pod mikroskopem można zaobserwować naprzemiennie występujące ciemne i jasne prążki (prążki A i prążki I). Środek prążka A (strefa H) jest jaśniejszy niż jego reszta. Prążek I przedzielony jest w środku linią Z (ryc. 59-2). Prążkowanie mięśni dowolnych (szkieletowych) i mięśnia sercowego spowodowane jest wysokim stopniem organizacji ich struktury. Większość komórek ułożonych jest tak, że ich sarkomery tworzą równoległe szeregi (ryc. 59-1). Białkiem grubych filamentów jest miozyna Badanie poprzecznych przekrojów miofibryli za pomocą mikroskopu elektronowego wykazuje, że każda z nich zbudowana jest z 2 typów podłużnych filamentów. Jeden z tych typów (grube filamenty) ograniczony do prążka A, zawiera głównie białko miozynę. Filamenty te mają średnice ok. 16 nm i na przekrojach poprzecznych tworzą układ heksagonalny (ryc. 59-2).

Mięsień

Prążek Linia Prąiek Prążek H Z A Miofjbryla Z- Sarkomer-Z

Ryc. 59-1. Struktura mięśnia szkieletowego. (Rycina wykonana przez Sylwię Colard Keene, według Bloom W., Fawcett D. W,: A Textbook of Histology, Saunders, 1975, za zezwoleniem).

796 / ROZDZIAŁ 59

A. Rozkurczony

Strefa H

___A ______

Prążek I A ' yy*r*„ *

Linia Z

Prążek

,• ,-a.,-./-.

,/.,/,

,• —a^

\'.,Sf>'.*4*S...S«*.-S:«, *.*/'/ «W*/ '//

VA&x&AyZ&ttZZffl%&%&Z69%Pfl££&S!g%6i

- 2300 nm

a-Aktynina

Filament m lozyny o średnicy 16 nm

Filamenty aktyny; średnic a 6 nm

Przekroje poprzeczne B. Sk urczony Filament • cienki

Filamenł gruby

Średnica 6 nm

Średnica 16 nm L——--------1500 nm---------------'

Ryc. 59-2. Ułożenie filamentów w mięśniu poprzecznie prążkowanym A — wrozkurczu, B — w skurczu.

Cienkie f ilamenty zawierają aktynę, tropomiozynę i troponinę Filamenty drugiego typu (cienkie) leżą w prążku I, ale rozciągają się również na prążek A, z wyjątkiem jego strefy H (ryc, 59-2). Cienkie filamenty zawierają białka aktynę, tropomiozynę i troponine. W obrębie prążka A cienkie filameniy ułożone są wokół fiiamentów grubych tworząc wtórny układ heksagonalny. Każdy z cienkich filamentów leży symetrycznie między 3 grubymi, a każdy z grubych filamentów otoczony jest przez 6 cienkich (ryc. 59-2). Grube i cienkie filamenty współdziałają przez poprzeczne mostki, które co 14 nm wystają z filamentów grubych. Jak to pokazano na ryc. 59-2, mostki poprzeczne l,ub „groty strzał" leżące na 2 końcach filamentów skierowane są przeciwnie. Bieguny filamentu oddzielone są

odcinkiem o długości 150 nm (prążek M) wolnym od poprzecznych mostków. Zachodzące na siebie f i lamenty ślizgają się po sobie w czasie skurczu mięśnia W czasie skurczu mięśnia długość grubych i cienkich filamentów nie-imienia się, natomiast strefa H i prążek I się skracają. Tak więc układy zachodzących na siebie filamentów muszą przesuwać się w stosunku do siebie (ślizgać się po sobie) w czasie skurczu mięśnia. Mostki poprzeczne generują i podtrzymują napięcie. Napięcie gene-

rowane w czasie skurczu mięśnia jest proporcjonalne do stopnia zachodzenia na siebie grubych i cienkich filamentów, a więc do ilości tworzonych mostków poprzecznych. Każdy mostek poprzeczny połączony jest z grubym filaraentem nitkowatym odcinkiem, który może odginać się

BIAŁKA KURCZLIWE i STRUKTURALNE / 797

od grubego filamentu dostosowując ułożenie mostka do wielkości przestrzeni miedzy filamentami.

powtarzającą sięcojtażde 35,5 nm. Ani aktyna G, ani F nie maja żadnej aktywności katalitycznej.

Głównymi białkami mięśnia są aktyna i miozyna Masa świeżego mięśnia składa się w 70% z wody i w ponad 20% z białek. Aktyna i miozyna są dwoma głównymi białkami mięś-

Ważne funkcje pełnią (stery dodatkowe białka W mięśniu poprzecznie prążkowanym znajdują się 4 inne białka mające mały udział w jego masie, ale pełniące ważne funkcje. Tropomiosyna jest nitkowatą cząsteczką składającą się z 2 łańcuchów cc i p, przyłączoną do aktyny F w rowku między dwoma polimerami (ryc.

nia. Globularny mononjcr aktyny (G-aktyna) ma

masę cząsteczkową 43^000 i stanowi 25% masy białek mięśnia. W fizjologicznym zakresie siły jonowej i w obecności magnezu aktyna G polimeryzuje niekowalencyjnie tworząc nierozpuszczalny, podwójnie spiralny (podwójny heliks) filament zwany aktyna F (ryc. 59-3). Nitka aktyny F ma średnicę 6—7 nm i strukturę

59-3). Troponuozyna występuje we wszystkich

mięśniach i strukturach podobnych do mięśni. Układ trnponiny występuje tylko w mięśniach poprzecznie prążkowanych i składa się z 3 osobnych białek. Troponina ^fTpT) łączy się z tro-

o

Aktyna G

C D

O

Aktyna F

Tropom bzy na

35.5 nm

Troponina

Uformowany cienki filament

Ryc. 69-3. Schematyczna prezentacja cienkiego filamentu pokazująca przestrzenną konfigurację 3 głów nych składników biatkowych: aktyny, tropomiozyny i troponiny.______________________________

798 / ROZDZIAŁ 59

OD) 0. , 0 PAPA! NA

| HMM

HMM S-2

TRYPSYNA

LMM

85 nm

Ryc. 59-4. Diagram cząsteczki miozyny pokazujący 2 zwmięte ze sobą heliksy (część nitkowata), główkę (G), lekkie łaricuchy (L) i efekt trawienia przez trypsynę i papainę. HMM — ciężka meromiozyna; LMM — lekka meromiozyna; S-1 — podjęcinostka 1; S-2 — podjednostka 2,

pomiozyną oraz z dwoma pozostałymi składnikami troponiny (ryc. 59-3). Troponina I (Tpl) hamuje interakcję między aktyną F i miozyną, a także łączy się z' pozostałymi składnikami troponiny. Troponina C (TpC) jest białkiem wiążącym wapń o pierwszo- i drugorzędowej strukturze i funkcji analogicznej do szeroko w przyrodzie występującego białka, kalninduliny. Oba te białka mają masę cząsteczkową 17 000 i wiążą po 4 jony wapnia na cząsteczkę. Cienki filamcnt mięśnia poprzecznie prążkowanego składa się z aktyny F, tropomiozyny i 3 składników troponiny: TpC, Tpl oraz TpT (ryc. 59-3). Układ trop o mi ozyna-troponina powtarza się co 38,5 nm. Miozyna stanowi 55% masy białek mięśnia i tworzy grube filamenty. Jest ona asymetrycznym heksaniercm o masie cząsteczkowej 450 000. Miozyna ma część nitkowatą, składającą się z 2 zwiniętych ze sobą heliksów, z których każdy na jednym końcu ma globularną główkę

(ryc. 59-4). Heksamer składa się z jednej pary łańcuchów ciężkich (m.cz. 200 000) oraz z 2 par łańcuchów lekkich (m.cz. 15 000—27 000). Miozyna mięśnia szkieletowego hydrolizuje ATP (wykazuje aktywność ATP-azową) i łączy się z nierozpuszczalną cząsteczką aktyny F. Wiele nauczyliśmy się dokonując częściowego trawienia miozyny Trawienie miozyny fcrypsyną powoduje jej rozpad na 2 fragmenty (meromiozyny). Lekka meromiozyna (LMM) składa się z zagregowanych, nierozpuszczalnych nitek tworzących heliks ot (ryc. 59-14). LMM nie wykazuje aktywności ATP-azowej i nie wiąże się z aktyną F. Ciężka meromiozyna (HMM) jest białkiem rozpuszczalnym o masie cząsteczkowej 340 000, posiadającym zarówno fragment włókienkowy, jak i globularny (ryc. 54-14). HMM wykazuje aktywność ATP-azową i wiąże się z aktyną F. W wyniku trawienia HMM papainą powstają

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 799

Ryc. 59-5, „Dekorowanie" filamentów aktyny podjednostkami S-miozyny tworzącymi „groty strzał" (dzięki uprzejmości Profesor James Spudich, Uniwersytet Stanford)._________|**_ ____________________________________________________________

2 fragmenty określane jako S-l i S-2. Fragment S-2 ma charakter włókienkowy. Nie wykazuje on aktywności ATP-azowej, ani też nie wiąże się z aktyną F. S-l o masie cząsteczkowej 115000 wykazuje aktywność ATP-azową. a przy braku ATP wiąże się z aktyną F i „dekoruje" ją „grotami strzał"

(ryc. 59-5). Aczkolwiek zarówno S-l, jak i HMM wykazują aktywność ATP-azową, dodanie do nich aktyny F /większa ją 100 do 200

razy. Jak to będzie omówione poniżej, aktyną F bardzo zwiększa szybkość, z jaką produkty ATP-azy, ADP i Pi; są od niej odłączane. W ten sposób, chociaż aktyną F nie wpływa bezpośrednio na etap samej hydrolizy, dzięki zdolności do ułatwiania odłączania produktów ATP-azy znacznie zwiększa ona całkowitą szybkość katalizy.

ct-Aktynina jest białkiem linii Z, do którego przyłączone są końce cząsteczek aktyny F cienkich filamentów (ryc. 59-2). Energii do skurczu dostarcza zależna od ATP dysocjacja główek miozyny od cienkich filamentów

W jaki sposób hydroliza ATP powoduje powstanie makroskopowego ruchu? Skurcz mięśnia polega na cyklicznym przyłączaniu do i odłączaniu główek miozyny od filamentów aktyny F.

Przyłączenie powoduje zmianę interakcji aktyna-miozyna tak, że fiłamenty aktyny i miozyny przesuwają się w stosunku do siebie. Pośrednim źródłem energii jest hydroliza ATP. Jest ona bardzo przyspieszana przez związanie głó-

wek miozyny z aktyną F. Biochemiczny cykl skurczu mięśnia składa się z 5 etapów (ryc. 59-16): 1) główka miozyny może sama hydrolizować ATP do ADP + P ;, ale nie może odłączyć produktów hydrolizy. W ten sposób sama hydroliza ATP przez główkę miozyny ma charakter raczej stechiometryczny niż katalityczny; 2) główka miozyny zawierająca ADP i P: może swobodnie obracać się pod dużym kątem, co umożliwia jej odnalezienie aktyny F i związanie się z nią pod kątem ok. 90 stopni w stosunku do długiej osi grubego filamentu; 3) interakcja ułatwia odszczepienie ADP i P: od kompleksu aktyna-miozyna; ponieważ ustawienie wiązań aktomiozyny pod kątem 45 stopni jest konformacją o najwyższej energii, miozyna zmienia swój kąt z 90 stopni do ok. 45 stopni przez pociąganie aktyny (o 10—15 nm) w kierunku

środka sarkomeru; 4) nowa cząsteczka ATP wiąże się z kompleksem miozyna-aktyną F. Miozyna-ATP ma małe powinowactwo do aktyny, wobec czego główka miozyny (ATP) 5) oddziela się od niej. Ten ostatni etap decyduje rozkurczu, procesie, który w oczywisty sposób zależy od wiązania ATP z kompleksem aktyna-

-miozyna. ATP jest ponownie hydrolizowany przez główkę miozyny, bez odszczepienia ADP P, i w ten sposób cykl się powtarza. Jasne jest, że ATP powoduje odszczepienie główki miozyny od cienkiego filamentu i dostarcza energii skurczu. Wydajność energetyczna tego skurczu wynosi ok. 50%; dla porównania — wydajność silnika spalinowego wynosi mniej niż 20%.

800 / ROZDZIAŁ 59

Caz+ odgrywa główną rotę w regulacji skurczu mięśni Powyżej został opisany ogólny mechanizm skurczu mięśni pochodzących z różnych źródeł. Mięśnie pochodzące z różnych organizmów, a w danym organizmie z różnych narządów, mogą mieć różne mechanizmy molekularne odpowiedzialne za regulację ich skurczu i rozkurczu. We wszystkich układach rolę głównego regulatora odgrywa Ca2+. Istnieją 2 główne mechanizmy skurczu mięśni: oparty na aktynie i oparty na miozynie. W mięśniach poprzecznie prążkowanych występuje regulacja oparta na aktynie U kręgowców oparta na aktynie regulacja występuje w mięśniach szkieletowych i w mięśniu sercowym, z których oba są poprzecznie prąż-

kowane. W opisanym powyżej ogólnym mechanizmie jedynym czynnikiem ograniczającym w cyklu skurczu mięśnia może być ATP. Układ kurczliwy mięśnia szkieletowego pozostaje zahamowany w spoczynku mięśnia, a jego rozhamowanie powoduje aktywację skurczu. Inhibitorem w mięśniu poprzecznie prążkowanym

jest układ troponiny związanej z tropomiozyną i aktyną F cienkiego filamentu (ryc. 59-3). W mięśniu poprzecznie prążkowanym regulacja skurczu (lub ATP-azy jako biochemicznego wskaźnika skurczu) może się odbywać pod warunkiem obecności, wraz z filamentami nktyny i miozyny, układu tropomiozyną-troponina. Jak to opisano powyżej, tropomiozyną leży w rowku aktyny F, a z kompleksem aktyna F-tropomiozyna związane są 3 składniki troponiny — TpT, Tpl brąz TpC. Tpl zapobiega przyłączaniu główek miozyny do ich miejsc wiązania na aktynie F aibo przez zmianę konformacji aktyny F, albo przez przesunięcie tropomiozyny do pozycji, w której blokuje ona bezpośrednio miejsca wiązania główek miozyny na aktynie F. Oba mechanizmy zapobiegają aktywacji ATP-azy, która zależy od wiązania główek miozyny z aktyną F. Stąd system Tpl blokuje drugi etap cyklu skurczu przedstawionego na ryc. 59-6. Tłumaczy to stan hamowania układów kurczliwych w mięśniu znajdującym się w stanie spoczynku. Ca2* pośredniczy w aktywacji skurczu mięśnia Stężenie Ca2 + w sarkoplazmie mięśnia wynosi w spoczynku J0"7— 10"8 mol/l. Wapń jest

Aktyna

f

ATP-miozyna

H,0

ADP-P.-miozyna Aktyna

Aktyn a—m iozyn a AOP-P,

Ryc. 59-6. Hydroliza ATP jest źródłem napędu cyklicznego fączenia i rozłączania aktyny i miozyny w 5 reakcjach opisanych w tekście. (Według: Stryer L Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981, za zezwoleniem, zmodyfikowana).

magazynowany w siateczce sarkoplazmatycznej, sieci drobnych błoniastych pęcherzyków, przez aktywny układ transportujący wspomagany przez wiążące Ca2+ białko, kalsekwestryne. Komórka mięśniowa jest otoczona -pobud-

liwą błoną, która ma poprzeczne kanaliki (T), pozostające w ścisłej łączności z siateczką sarkoplazmatyczną. Gdy błona komórkowa zostaje pobudzona np. przez depolaryzację Wony post synaptycznej płytki motorycznej, Ca2 + jest gwałtownie uwalniany z siateczki sarkoplazmatycznej do sarkoplazmy. Stężenie Ca2 + w sarkoplazmie gwałtownie rośnie do 10 "5 mol/l. Miejsca wiązania Ca2* na TpC cienkich filamentów zostają przez niego szybko zajęte. TpC--4Ca2+ reaguje z Tpl oraz TpT zmieniając ich interakcję z tropomiozyną. W wyniku tego tropomiozyną po prostu usuwa się z drogi główek miozyny lub zmienia konformację aktyny F tak, że główki miozyny zawierające ADP i P| mogą z nią reagować rozpoczynając tym samym cykl skurczu. Rozkurcz zachodzi gtly: 1) stężenie Ca 2 + w sarkoplazmie spada poniżej 10~7 mol/l na skutek ponownego wyłapywania go przez energozależną pompę Ca2+ siateczki sarkoplazmatycznej;2) TpC-4Ca2+traci swójCa2+;3) troponina hamuje dalszą interakcję główek miozyny z aktyną F oraz 4) główka miozyny odłącza się od aktyny F, co zapoczątkowuje rozkurcz. W ten sposób Ca2+ kontroluje (reguluje) skurcz mięśnia poprzez aliosteryczny mechanizm, w

którym uczestniczą TpC, Tpl, TpT, tropomiozyną i aktyna F.

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 801 Wapń pochodzi z płynu pozakomórkowego

W mięśniu sercowym pozakomórkowy jest niezbędny dla aktywacji skurczu. Podczas gdy usunięcie Ca2 + z płynu pozakomórkowego powoduje natychmiastowe ustanie skurczów izolowanych komórek mięśnia sercowego, mięsień szkieletowy może się kurczyć bez obecności pozakomórkowego Ca2+ w ciągu wielu godzin. Utrata ATP z sarjtoplazmy pociąga za sobą 2 zasadnicze skutki: 1) pompa wapniowa siateczki sarkoplazraatyczncj nie może utrzymywać ruskiego stężenia Ca2* w sarkoplazmie, wobec tego ułatwiona jest interakcja główek miozyny z aktyną F; 2) nie może zachodzić zależne od ATP odszczepianie główek miozyny od aktyny F, wobec czego występuje sztywność pośmiertna {„rigor mortis"). Skurcz mięśnia, podlegający precyzyjnej regulacji przez układ nerwowy, polega na delikatnej dynamicznej równowadze między przyłączeniem główek miozyny do aktyny F i odłączaniem ich od niej. Ca* 1 reguluje skurcz również mięśniach gładkich

w

Podczas gdy wszystkie rodzaje mięśni zawierają aktynę, miozynę i tropomiozyne, tylko poprzecznie prążkowane mięśnie kręgowców zawierają układ troponiny. Tak więc mechanizmy

regulujące skurcz w różnych układach kurczliwych muszą być różne. Mięśnie gładkie mają strukturę molekularną podobną do mięśni poprzecznie prążkowanych, jednakże ich sarkomery nie są uporządkowane w sposób tworzący poprzeczne prążki. Podobnie jak mięśnie szkieletowe, mięśnie gładkie zawierają cząsteczki a-aktyniny i tropomiozyny. Nie zawierają one układu troponiny, a ich lekkie łańcuchy miozyny różnią się od lekkich łańcuchów w mięśniach poprzecznie prążkowa-

nych. Jednakże, podobnie jak w mięśniach poprzecznie prążkowanych, ich skurcz jest regulowany przez Ca2+, Skurcz mięśni gładkich inicjowany jest przez fosforylację lekkiego łańcucha miozyny

P

Gdy miozyna mięśnia gładkiego wiąże się z aktyną F przy nieobecności innych białek mięśniowych, takich jak tropomiozyna, aktywność ATP-azowa jest nie wy kry walna. Ta nieobecność aktywności ATP-azowej różni się dia31

Biochemia

metralnie od sytuacji w mięśniach poprzecznie prążkowanych, gdzie aktomiozyna ma dużą aktywność ATP-azową. Miozyna mięśnia gładkiego zawiera lekki łańcuch (lekki łańcuch P), który zapobiega wiązaniu główek miozyny z aktyną F, Fosforylowany lekki łańcuch pozwala na aktywację ATP-azy miozyny. Fosforylacja łańcucha P zapoczątkowuje skurczowy cykl przyłączania i odłączania (główek miozyny). Lekki łańcuch P miozyny jest fosforylowany przez swoją kinazę 2ł aktywowaną przez 4Ca -kalmodułinę

Sarkoplazma mięśni gładkich zawiera zależną

od wapnia kinazę lekkiego łańcucha. Aktywacja

kinazy lekkiego łańcucha zachodzi przez wiązanie 4Ca2+-kahnoduliny z podjednostką kinazy o masie cząsteczkowej ffl5 000 (ryc. 59-7). Aktywowana przez 4Ca3+-kalmoduline kinaza fosforyluje lekki łańcuch P, co znosi hamowanie interakcji miozyna-aktyną F. Rozpoczyna to cykl skurczu. Mięsień gładki rozkurcza się, gdy stężenie Ca a+ spada poniżej 10'"*

mol/l

Rozkurcz mięśnia gładkiego zachodzi, gdy: 1) stężenie Ca3+ w sarkoplazmie spada poniżej 10~7 mol/l; wapń dysocjuje od kahnoduliny, która z kolei dysocjuje od kinazy lekkiego łańcucha miozyny; 2) co powoduje jej inaktywację; 3) żadne nowe fosforany nie są przyłączane do lekkiego łańcucha P, a te, które już były przyłączone, są odłączane przez stale aktywną, niezależną od wapnia fosfatazę lekkiego łańcucha; 4) defosforylowany lekki łańcuch miozyny ponownie blokuje wiązanie główek miozyny z aktyną F oraz aktywność ATP-azową; 5) główka miozyny oddziela się od aktyny F w obecności ATP, ale nie może się do niego przyłączyć w obecności defosforylowanego lekkiego łańcucha P; wobec tego zachodzi rozkurcz. Tabela 59-1 podsumowuje i porównuje regulację interakcji aktyną-miozyna (aktywacja ATP-azy miozyny) w mięśniach poprzecznie prążkowanych i gładkich. Kinaza lekkiego łańcucha miozyny nie jest bezpośrednio aktywowana przez cAMP. Jednakże kinaza białek aktywowana przez cAMP (p. rozdz. 45) może fosforylować kinazę lekkiego łańcucha miozyny (ale nie sam lekki łańcuch). Fosforylowana kinaza lekkiego łańcucha miozyny wykazuje znacząco niższe powinowactwo do Ca2+-kalmoduliny, wobec czego

802 / ROZDZIAŁ 59 Kinaza miozynowa (nieaktywna) Kalmodulina

T0~ ; mol/l Ca 1 * ,

Ca2+ • Kalmodulina

10~7 mol/l CaI+

ATP Ca1*' KALMODULiNA — KIMAZA MIOZYNOWA (AKTYWNA)

pb-Mlozyna (hamuje Interakcje miozyna—aktyna)

ADP

H2POf — pL — rniozyna (nie hamuje interakcji miozyn a — aklyna)

Ryc. 59-7. Regulacja skurczu mięśnia gładkiego przez Ca21. (Według: Adelsiein R. S.; Regulation and kinetics of actin-myosin interaction; Annu. Rev. Biochem 1980, 49, 921).

jest mniej wrażliwa na aktywację. W wyniku tego zwiększenie stężenia cAMP tłumi odpowiedź skurczową mięśnia gładkiego na dany wzrost stężenia Ca2+ w sarkoplazmie. Ten molekularny mechanizm może tłumaczyć rozkurczający wptyw pobudzenia P-receptorów na mięsień gładki. Fenotiazyny wiążą kalmodulinę i rozkurczają mięśnie gładkie Fenotiazyny, będące szeroko używanymi lekami antypsychotycznymi, wiążą się z kalmodulina i zapobiegają jej wiązaniu z enzymami zależnymi od wapnia. Rozkurczają one również mięśnie gładkie. Mięśnie porzecznie prążkowane mięczaków, takich jak przegrzebek, wykazują regulację skurczu opartą na miozynie. Podobnie jak miozyna i aktyna F mięśni gładkich,'te białka przegrzebka nie wykazują aktywności ATP-azowej, co

wynika z hamujących właściwości „regulatorowego" lekkiego łańcucha miozyny tego gatunku. Usunięcie hamowania interakcji aktyna-miozyna przegrzebka zachodzi, gdy Ca2+ wiąże się bezpośrednio ze specyficznym miejscem na cząsteczce miozyny. Zależność tej regulacji od Ca2+ nie wymaga kowalencyjnej modyfikacji miozyny ani obecności osobnych białek, jak kalmodulina lub TpC. ,' Fosforylacja odgrywa główną rolę w skurczu mięśnia gładkiego Jak to opisano powyżej, fosforylacja lekkiego łańcucha miozyny mięśnia gładkiego usuwa jego hamujący wpływ na interakcję miozyny z aktyną F, a tym samym zapoczątkowuje skurcz. Fosforan przyłączony do lekkiego łańcucha miozyny może chelatować z Ca2+ związanym z kompleksem tropomiozyna-TpC-aktyna, co może prowadzić do zwiększenia szyb-

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 803 Tabela 59-1. Interakcje między aktyną a miozyną w mięśniu poprzecznie prążkowanym i gładkim* Mięsień prążkowany Białka filamentów mięśnia

Aktyną Miozyna (heksamer) Tropomiozyna Troponina (Tpl, TpT, TpC)

Mięsień gładki i komórki inne niż mięśniowe Aktyną Miozyna (heksamer)1 Tropomiozyna

Spontaniczna interakcja aktyny F i sa- Tak mej miozyny {spontaniczna aktywacja ATP-azy miozyr^y przez aktynę F)

Nie

Inhibitor interakcji aktyny F 2 miozyną Układ troponiny (Tpl) (inhibitor zależnej od aktyny F aktywacji ATP-azy)

Niefosforylowany łańcuch lekki P miozyny

Skurcz aktywowany przez Bezpośredni efekt Caa+

Ca2+ 4 Ca2 "^iwiązane z kalmodułiną

=+

Efekt Ca związanego z białkiem

Caa+ i+

4Ca związane z TpC TpC-4Ca2+ znosi hamowanie interakcji aktyny F z miozyną (pozwala na aktywację ATP-azy przez aktynę F)

Kalmodulina-4Caa+ aktywuje kinazę lekkiego łańcucha fosforylująca lekki łańcuch P miozyny. Fosforylowany łańcuch P przestaje hamować interakcję aktyny F z miozyną (umożliwia aktywację ATP-azy przez aktynę F)

* Łańcuchy lekkie miozyny mięśni poprzecznie prążkowanych różnią się od łańcuchów lekkich miozyny mięśni gładkich.

kości tworzenia poprzecznych mostków miedzy główkami miozyny i aktyną. Fosforylacja ciężkich łańcuchów miozyny jest prawdopodobnie warunkiem ich układania się w grube diamenty w mięśniach szkieletowych, mięśniach gładkich i w komórkach niemięśniowych. Tpl i peptydowy składnik pompy wapniowej siateczki sarkopiazmatycznej mogą być fosforylowane przez kinazę białek zależną od cAMP. Istnieje pewna korelacja między fosforylacja Tpl a zwiększoną siłą skurczu wywołaną w mięśniu sercowym przez katecholaminy. Jednakże mechanizm dodatniego efektu inotropowego katecholamin polega przede wszystkim na zwiększonej aktywacji kanałów wapniowych. Zapasy ATP w mięśniu odnawiane są przez wiele mechanizmów ATP. który jest stałym źródłem energii dla cyklu skurczowego mięśnia, może być generowany w toku glikolizy, fosforylacji oksydacyjnej, przez fosfokreatynę lub tworzony z 2 cząsteczek ADP (ryc. 59-8). Zapasy ATP w mięśniu

szkieletowym szybko się wyczerpują i są w stanie dostarczyć energię prawdopodobnie na mniej niż 1 s skurczu. W powolnych komórkach mięśni szkieletowych obfitujących w zapasy O: w mioglobinie, oksydacyjna fosforylacja jest głównym źródłem regeneracji ATP. „Szybkie" komórki mięśni szkieletowych regenerują ATP głównie na drodze glikolizy. Fosforan kreatyny stanowi główną rezerwę energii Fosfagen (fosforan kreatyny) zapobiega gwałtownemu wyczerpaniu ATP dostarczając łatwo dostępnego, bogatego energetycznie fosforanu, który jest potrzebny do tworzenia ATP z ADP. Fosfokreatyna jest tworzona z ATP i kreatyny w czasie rozkurczu mięśnia, kiedy zapotrzebowanie na ATP nie jest tak duże. Fosforylacja kreatyny następuje przez fosfokinazę kreatynową (CK), enzym specyficzny dla mięśni. W klinice jej oznaczanie jest wykorzystywane dla rozpoznawania ostrych i przewlekłych schorzeń mięśni.

804 / ROZDZIAŁ 59 Glikogen mięśnia.

Fosfok

FOSFOKINA2A KREATYNOWA

\ FOSFORYLAZA MIĘŚNIOWA

iy

reatyna

,^-ADP

Kreaiyna -"^

Glukoza "*~

~~"\

J GUKOLIZA

|\ ^_ Skurcz mięśnia

TP «H^ FOSFOflYLACJA OKSYDACYJNA

MIO2YNY

AMP-^—^

Ryc. 59-8. Źródła ATP w sercu

Mięsień szkieletowy zawiera duże zapasy glikogen u Sarkoplazma mięśnia szkieletowego zawiera, duże zapasy glikogenu zawartego w granulkach znajdujących się blisko prążka I. Oddzielanie glukozy od glikogenu zależy od specyficznej mięśniowej fosforylazy glikogenu (p. rozdz. 20). Aby powstał podlegający glikolizie glukozo-6-fosforan, fosforylaza b glikogenu w mięśniu szkieletowym musi być przekształcona w aktywną fosforylazę a na drodze fosforylacji przez kinazę fosforylazową b (p. rozdz. 20). Ca2 + ułatwia aktywację kinaąy fosforylazowej b, również na drodze fosforylacji. Tak więc Ca2+ nie tylko aktywuje skurcz mięśnia, ale również toruje drogę produkcji potrzebnej energii. Fosforylaza b nie występuje w mięśniach w chorobie McArdla (chorobie spichrzania glikogenu). Mięsień generuje ATP na drodze fosforyłacji oksydacyjnej Synteza ATP na drodze fosłbrylacji oksydacyjnej wymaga dostawy tlenu. Mięśnie o dużym zapotrzebowaniu na tlen w wyniku długo utrzymującego się skurczu (np. dla utrzymania postawy ciała), magazynują tlen w mioglobinie (p. rozdz. 7). Dzięki cząsteczce hemu, z którym tlen się wiąże, mięśnie zawierające mioglobinę są czerwone. W tabeli 59-2 porównano niektóre właściwości szybkich (białych) i powolnych (czerwonych) komórek mięśni szkieletowych.

V

ADP + Pj / "^ADP

Kl >JAZA ADENYLA MOWA MIĘŚNIA

Tabela 59-2. Właściwości szybkich i powolnych mięśni szkieletowych Mięśnie szybkie Aktywność ATP-azy Duża miozyny Zużycie energii Duże Kolor Biały Mioglobina Brak Szybkość skurczu Duża Czas trwania skur- Krótki

Mięśnie powolne Mała Małe Czerwony Obecna Mata Długi

czu

Miokinaza przekształca adenino-, mono-, di- i trifosforany Enzym miokinaza katalizuje tworzenie jednej cząsteczki ATP i jednej cząsteczki AMP z dwóch cząsteczek ADP. Reakcja ta (ryc. 59-8) jest związana z hydrolizą*ATP przez ATP-azę miozyny w czasie skurczu mięśnia. Deaminacja adeniny przez pracujący mięsień prowadzi do uwolnienia amoniaku Bezpośrednim źródłem amoniaku w mięśniu szkieletowym jest AMP deaminowany do IMP przez deaminazę adenylanowa. IMP może być z powrotem przekształcany w AMP na-drodze

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 805

reakcji z użyciem asparaginianu, katalizowanych przez syntazę adenylosukcynylową i adenylosukcynazę (p. rozdz. 36). MIĘŚNIE SZKIELETOWE STANOWIĄ GŁÓWNĄ REZERWĘ BIAŁKA USTROJU U ludzi białka mięśni szkieletowych stanowią główną nietłuszczo*ą rezerwę zmagazynowanej energii. Tłumaczy to, szczególnie u dorosłych, bardzo duże straty masy mięśniowej w wyniku długotrwałego kalorycznego niedożywienia. Badanie rozpadu białek tkankowych in vivo jest trudne, gdyż aminokwasy pochodzące z wewnątrzkomórkowego rozpadu białek mogą być w znacznym stopniu użyte do budowy innych białek w komórce lub przetransportowane do innych narządów, gdzie zostają włączone do reakcji anabolicznych. Jednakże aktyna i miozyna są po ich zsyntetyzowaniu metylowane z utworzeniem peptydyJo-3-metylohistydyny. W czasie wewnątrzkomórkowego rozpadu aktyny i miozyny 3-metylohistydyna jest wydzielana i wydalana z moczem. Wydalanie metylowanego aminokwasu stanowi wiarygodny wskaźnik szybkości rozpadu białek miofibrylarnych u ludzi. W mięśniach zachodzi aktywna degradacja pewnych aminokwasów i synteza innych. U ssaków mięsień okazuje się być głównym miejscem katabolizmu aminokwasów o rozgałęzionych łańcuchach. Mięsień utlenia leucynę do CO 2 i przekształca węglowe szkielety asparaginianu, asparaginy, glutaminianu, izoleucyny i waliny w amfiboliczne produkty pośrednie cyklu kwasów trik ar boksy lo wy ch. Zdolność mięśnia do rozkładania aminokwasów o rozgałęzionych łańcuchach wzrasta 3—5-krotnie w czasie głodowania i w cukrzycy. Mięsień syntetyzuje również i uwalnia duże ilości alaniny i glutaminy. Związki te są syntetyzowane dzięki grupom aminowym uzyskanym z rozpadu aminokwasów o rozgałęzionych łańcuchach, a aminowy azot jest przenoszony na ct-ketoglu taran lub pirogronian na drodze transami nacji. Glikoliza egzogennej glukozy dostarcza prawie całego pirogronianu potrzebnego do syntezy alaniny. Reakcje te stanowią tzw. cykl glukozowo-alaninowy, w którym alanina z mięśnia jest używana w glukoneogenezie wątrobowej dostarczając jednocześnie do wątroby grupy aminowe usuwane następnie jako mocznik.

CYTOSZKIELETY PEŁNIĄ WIELE FUNKCJI KOMÓRKOWYCH Komórki niemięśniowe wykonują pracę mechaniczną, włączając w to samodzielne przemieszczanie, morfogenezę, dzielenie się, wewnątrzkomórkowy transport, endocytozę, egzocytoze i zmianę kształtu komórki. Te funkcje komórkowe są pełnione przez rozległą sieć nitkowatych struktur stanowiących cytoszkielet. Cytoplazma komórkowa nie jest, jak to kiedyś myślano, woreczkiem płynu. W zasadzie wszystkie komórki eukariotyczne zawierają 3 typy struktur nitkowatych: filamenty aktyny (o średnicy 7—9,5 nm), mikrołubule (25 nm) i pośrednie

filamenty (10—12 nm). Każdy z tych typów filamentów różni się biochemicznie i w obrazach elektro nowo-mikroskopowych. Komórki niemięśniowe zawierają aktynę Białko aktyna G izolowane z komórek niemięśniowych ma masę cząsteczkową ok. 43 000 i zawiera reszty N-metylhistydylowe. W obecności wapnia i chlorku potasu ta aktyna spontanicznie polimeryzuje tworząc podwójne heliksy filamentów aktyny F, takie, jakie występują w mięśniach. W komórkach niemięśniowych występują co najmniej 2 typy aktyny: aktyna p i aktyna y. Oba typy mogą współistnieć w tej samej komórce, a nawet współpolimeryzować, tworząc wspólny filament. Aktyna tworzy W cytoplazmie komórkowej 7—9,5 nm mikrofilamenty, które często występują w pęczkach tworzących sieć. Pęczki mikro filamentów występują wyraźnie tuż pod błoną komórki w stanie spoczynku i są określane jako włókna napięciowe. Te włókna napięciowe są „dekorowane" podjednostkami S-l miozyny, co uwidacznia ich charakter podwójnego heliksu (ryc. 59-9), Włókna napięciowe znikają, gdy wzrasta ruchliwość komórki lub w czasie złośliwej transformacji komórki przez związki chemiczne lub pod wpływem onkogennych wirusów. Mikrowypustki komórkowe zawierają filamenty aktyny Mikro filamenty są również ciasno upakowane w postaci gęstej siatki pod prowadzącą krawędzią poruszającej się komórki (ryc. 59-10), Mikro filamenty aktyny występują we wszystkich mi kro wy pustkach komórkowych, takich jak filopodia i mikrokosmki. Na przykład mikrokosmki komórek błony śluzowej jelit

806 / ROZDZIAŁ 59

Ryc. 59-9. Replika liofilizowanego cytoszkieietu eksponowanego przed zamrożeniem na podjednostkę 1 (S-1) rniozyny. Prawie wszystkie filamenty w wydłużonych pęczkach i wiele wplecionych między nie filamentów uległo pogrubieniu i przekształceniu w podobne do łin podwójne heliksy (patrz fragment w kółku). Jednakże niektóre filamenty poruszające się samodzielnie między pęczkami, a będące prawdopodobnie filamentami pośrednimi, nie przyłączyły podjednostki S-1 (strzałka). Powiększenie 70000x, w kółku 200 000 x. (Według: Heuser J. E., Kirschner M. W.: Filament organization revealed in platinum replicas of freeze-dried cytoskeletons; J. Celi Biol. 1980, 86, 212, za zezwoleniem).

(enterocytów) zawierają 20—30 mikrofilamentów ułożonych równolegle do ich długiej osi (ryc. 59-11). W podstawie mikrokosmków znajdują się filamenty miozyny mogące ściągać centrycznie filamenty aktyny wystające do mikrokosmka. W procesie skurczu (kosmka) nie zachodzą żadne zmiany długości filamentów aktyny lub miozyny. Musi on być wobec tego powodowany przez przesuwanie się filamentów w stosunku do siebie, jak to ma miejsce w mięśniu. Podobnie jak w mięśniu gładkim, aktywacja interakcji aktyna-miozyna, a tym samym skurczu, zachodzi na drodze fosforylacji lekkiego łańcucha miozyny. Zarówno aktyna, jak i miozyna znajdują się między biegunami wrzecionka a chromosomami oraz wzdłuż rowka podziału w telofazie mitozy. Mikrofilamenty aktyny są również związane z innymi białkami komórek niemięśniowych. a-Aktynina znajduje się w tych miejscach błon komórkowych, do których przyczepione są mikrofilamenty, np. w końcach mikrokosmków. Geodom, rodzaj rusztowania otaczającego jąd-

ra komórek eukariotycznych, składa się z aktyny, a-aktyniny i tropomiozyny. a-Aktynina rozciąga się również wzdłuż samych mikrofilamentów aktyny. Miozyna również może występować między włókienkami aktyny, jednakże utworzone przez nią filamenty są krótsze i cieńsze niż w mięśniu i wydają się odgrywać jakąś rolę w utrzymywaniu włókienkowatego charakteru aktyny. Tropomiozyna uczestniczy w formowaniu geodomów otaczających jądra komórkowe. Tropomiozyna ułożona wzdłuż mi kro filamentów aktyny zdaje się odgrywajp rolę elementu raczej strukturalnego niż ruchowego. Poza mieś ni owa aktyna regulowana jest przez wyspecjalizowane białka Regulacja czynności pozamię śni owej aktyny zależy od wielu wyspecjalizowanych białek. Profilina zapobiega polimeryzacji aktyny G nawet w obecności odpowiednich stężeń magnezu i chlorku potasu. Filamina ułatwia tworzenie sieci mikro filamentów aktyny. Tropomiozyna ułatwia tworzenie pęczków aktywnych-włókien

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 807

r

Ryc. 59-10. Trzy średnio silnie powiększone obrazy krawędzi prowadzących lub lameMipodiów fibroblastów utrwalonych w całości (A), ekstrahowanych trytonem przed utrwaleniem (8) lub ekstrahowanych trytonem po utrwaleniu (C). W A błona komórkowa jest nienaruszona, a struktury wewnętrzne nie są widoczne. W B błona komórkowa została usunięta, co uwidoczniło leżącą pod nią pajęczynę „kędzierzawych" filamentów. W innych doświadczeniach te filamenty by)y „dekorowane" podjednostkami S-1, jednakże były one znacznie bardziej zagęszczone i znacznie bardziej intensywnie zachodzify na siebie niż aktyna w innych rejonach komórki. W C błona komórkowa również została usunięta, jednakże dopiero po utrwaleniu komórki aldehydem. Delikatna siatka leżących pod nią filamentów wygląda po chemicznym utrwaleniu mniej subtelnie. A— powiększenie 140 000 x. B i C — powiększenie 115000x. (Według: Heuser J. E., Kirschner M. W.: Filament organization revealed in platinum replicas oi freeze-dried cytoskeletons; J. Celi Biot. 1980, 86, 212, za zezwoleniem)

SOS / ROZDZIAŁ 59 Linia Z

Filament aktyny

Filament aktyny Filament miozyny

Mikrokosmek

Mięsień

Ryc. 59-11. Mikrokosmki są maleńkimi wyrostkami cytoplazmatycznymi wyrastającymi z komórek nabłonkowych wyściełających jelito cienkie, a ogromnie powiększającymi powierzchnię absorpcji składników odżywczych. Mikrokosmki zawierają filamenty zarówno aktyny, jak i miozyny. Ponieważ mogą się one kurczyć, stanowią przekonujący przykład niemięśniowego ruchu powodowanego przez ślizganie się po sobie filamentów aktyny i miozyny. Jak to pokazano w A, pęczki filamentów aktyny wystają w każdym mikrokosmku ku górze, a filamenty miozyny zlokalizowane są u jego podstawy. W B ułożenie filamentów aktyny spowodowane zostało potraktowaniem mikrokosmków izolowanymi główkami miozyny, zwanymi ciężką meromiozyną. „Główki" zachowują zdolność wiązania się zlilamentami aktyny. Gdy „główki" występują w komórkach mięśniowych, tworzą one „groty" strzał związane z filamentami aktyny. Góy gfówki dodano do mikrokosmków, utworzyły one z aktyną kompleksy, w których „groty strzał" skierowane by(y od koniuszka kosmka ku jego podstawie. Filamenty aktyny kosmków są zatem analogiczne do układu filamentów aktyny w komórkach mięśniowych. (Według: Lazarides E., Revel J. P.: The molecular basis of celt movement; Set. Arn. {May) 1979; 240, 100, za zezwoleniem).___________

Ryc. 59-12. Pojedyncze komórki hodowli tkankowej. Delikatna pierzasta struktura na dole po stronie prawej stanowi krawędź prowadzącą lub lamellipodium komórki. Komórkę poruszającą się RO podłożu i rozciągającą swoją krawędź „prowadzącą do uformowania nowych połączeń pokazano pod skośnym kątem. (Według: Lazarides E„ Revei J. P.: The molecular basis of celi movement; Sci. Am. (May) 197,9; 240, 100, za zezwoleniem)

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 809

napięciowych. oc-Aktynina ułatwia przyczepianie mikrofilamentów aktyny do błon, podłoża i innych organelli komórkowych. Cytochalazyna, naturalnie występujący peptyd, rozbija mikrofilamenty i zapobiega ich polimeryzacji. Ta reakcja służy jako diagnostyczny test na obecność lub czynność mikrofilamentów. Aktualny ruch komórki jest kierowany przez jej krawędź prowadzącą lub lamellipodiwn, która

zawiera palcowate**wyrostki nazywane filopodiami. Prowadząca krawędź przyczepia się do podłoża przez filopodia, a następnie komórka wydaje się podciągać swoją tylną część. Następnie krawędź prowadząca odrywa się i odgina z powrotem ponad wierzch komórki, a nowe filopodia przyczepiają się do podłoża (ryc. 5912).

Mikrotubule zawierają a- i p-tubulinę

Mikrotubule, integralny składnik szkieletu komórkowego, składają się z kanalików cytoplazmatycznych o średnicy 25 nm i nieokreślonej długości. Mikrotubule są potrzebne do tworzenia i funkcji wrzerionka mitotycznego i wobec tego są obecne we wszystkich komórkach eukariotycznych, Mikrotubułe pełnią również dodatkowe funkcje. Są one odpowiedzialne za -wewnątrzkomórkowe przesuwanie endoi egzocytotycznych pęcherzyków. Stanowią one jeden z głównych komórkowych komponentów rzęsek i ilagclii. Są one również głównym składnikiem białkowym aksonów i dendrylów. w któ-

rych utrzymują'one strukturę i uczestniczą w aksoplazmatycznym transporcie wzdłuż wypustek komórkowych. Mikrotubule są cylindrami zbudowanymi z 13 podłużnie ułożonych pro to fi lamentów, z których każdy składa sie z drmerów a-tubuliny i |ł-tubuliny (ryc. 59-13). a-Tubulina (m.cz. 53 000) i p-tubuhna (m.cz. 55 000) są bardzo do siebie podobnymi cząsteczkami białkowymi. Dimery tubuliny układają się w protofilamenty, najpierw płaszczyznowo, a potem w cylindry, jak to pokazano na ryc. 59-14. Do ułożenia tubuliny w mikrotubule potrzebne są 2 cząsteczki GTP na jeden dimer. Dwa białka nazywane białkami o dużej masie cząsteczkowej (HMW) i białka Tau ułatwiają formowanie mikrotubul, ale nie są do tego ^ezbędne. Kalmodulina i fosforylacje mogą również pełnić jakieś funkcje w formowaniu mikrotubul. Mikrotuble „rosną" w określonym kierunku od specyficznych miejsc (centrioJi) komórki. Na każdej chromatydzie chromosomu (p. rozdz. 37) znajduje się kinetochor służący jako miejsce początku wzrostu mikrotubuli. Wiek nieprawidłowości segregacji chromosomów wynika z nieprawidłowej struktury i funkcji kinetochoru. Centrosom, znajdujący się w środku biegunów mitozy, również może być ośrodkiem tworzenia mikrotubuli. Ruch chromosomów w czasie anafazy mitozy zależy od mikrotubuli, jednakże jego mechanizm nie został jeszcze określony.

Ryc. 59-13. Duże powiększenie mikrotubuli, która została rozłamana i głęboko wytrawiona po gwałtownym zamrożeniu. Lewa cześć pola pokazuje zewnętrzną powierzchnię mikrotubuli, na której widoczne są podłużne prążki guzków leżących 55 nm od siebie. Mogą one reprezentować protofi lamenty mikrotubuli. Po stronie prawej rozłamanie spowodowało otwarcie mikrotubuli, co uwidacznia jej wewnętrzne ściany. Wykazują one charakterystyczne skośne prążki ułożone co 40 nm. Siateczkowanie otaczające mikrotubule jest uważane za niespolimeryzowaną tubulinę i białka związane z mikrotubulą. (Według: HeuzerJ. E., Kirschner M. W.: Filament organization revealed in ptatinum replicas of freeze-dried cytoskeletons; J. Celi BiolA 980, 86, 212, za zezwoleniem). ________________________________________________________________________________

810 / ROZDZIAŁ 59

Hyc. 59-14. W pracowni budowa mikrotubuli rozpoczyna się od 2 globularnych cząsteczek białek, ottubuliny i p-tubuliny (w rzeczywistości są one prawdopodobnie bardziej owalne niż na schemacie). Tubuliny tworzą dimery albo podwójne cząsteczki. Jeśli stężenie dimerów jest wystarczająco duże, łączą się one ze sobą tworząc różne struktury pośrednie, jak podwójne pierścienie, spirale i połączone pierścienie; zależnie od warunków, równowaga sprzyja tworzeniu izolowanych dimerów lub struktur pośrednich. Następne etapy są dobrze poznane. Wydaje się, że pierścienie lubspirate otwierają się i tworzą nitki liniowo ułożonych dimerów zwane protof i lamentami. Układają się one bok do boku tworząc płytkę (A); czasami końce protof i lamentów zakrzywiają sie. Gdy płytka staje się dostatecznie szeroka, tworzy ona rurkę, jak to pokazano w (B). Rurka jest przedłużana przez dodawanie dimerów głównie do jednego końca (C). (Według: Dustin P,: Microtubules; Sci. AmA98Q,243, 67, za zezwoteniem).

Wiele alkaloidów blokuje tworzenie mikrotubul Ą Pewne alkaloidy mog& zapobiegać tworzeniu mikrotubul. Należą do nich kolchicyna i jej pochodna demekolcyna (używana jako lek w dnawym zapaleniu stawów), winblastyna (alkaloid Vinca używany jako lek przeciwrakowy) i gryzeofulwina (czynnik przeciwgrzybiczy). Komórkowe flagelle i rzęski są mikrotubułami wyspecjalizowanymi w funkcji ruchu U podstawy flagę!li i rzęsek komórek eukariotycznych znajduje się struktura zwana dałem podstawowym. Jest ona identyczna z centriolem i służy jako ośrodek formowania we flagellach i rzęskach 9-dubletowego układu mikrotubul. Te mikrotubularne struktury są wyspecjalizowane w funkcji ruchu. Każdy składnik dubletu ma wspólną ze swoim partnerem ścianę składającą się z 3 protofilamentów, a dubiety są

połączone giętkim białkiem, neksyoą Ruch następuje na skutek przesuwania się dubletów w stosunku do siebie, co powoduje falowe odkształcenie rzęski. Do jednego z dubletów przyłączone jest duże białko, dyneina, mająca ATP-azę konieczną dla ślizgowego ruchu dubletów mikrotubul. Filamenty pośrednie różnią się od mikrof i lamentów fmikrotubul W komórkach istnieje włókienkowy układ filamentów o period yczności osiowej 21 nm i średnicy 8—10 nm różniący się od mikrofilamentów (o średnicy 6 nm) i mikrotubul (o średnicy 23 nm). Istnieje 6 głównych klas tych filamentów mających wspólną determinantę antygenową i mających średnice o wielkościach pośrednich pomiędzy mikrofilamentami aktyny i mikrotubulami. Każdy filament pośredni skiada się z podjednostek różniących się biochemicznie i immunologicznie. Filamenty pośrednie

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 811 Tabela 59-3. Klasy filamentów pośrednich i ich rozmieszczenie

Białka

Masa cząsteczkowa

(tvs.) Keratyn a typu 1 i II {tonofilamenty) Desmina Wimentyna

40-65 (głównie białka 10-20) 50-55 52

f

200, 1 50, 70 51

Neurof i lament Filamenty gleju

*

Średnica (nm)

Rozmieszczenie

8 10

Komórki nabłonkowe (nigdy pochodzenia mezencfiymalnego) Mięśnie (prążki Z) Komórki mezenchymalne i niemezenchymalne, tj. mięśnie, komórki gleju, komórki nabłonkowe Neurony Komórki gleju

10 10 10

zdają się stanowić względnie stałe składniki szkieletu komórkowego rie podlegające szybkiemu tworzeniu i rozpadowi i nie znikające w czasie mitozy, jak się to dzieje z aktyną i wielu diamentami mikrotubinarnymi. Tabela 59-3 podsumowuje niektóre właściwości i rozmieszczenie filamentów pośrednich. Istnieją 2 typy keratyn, I i II, zawierające 10—20 różnych polipeptytlów różniących się od siebie i od 4 innych klas białek filamentów pośrednich — desminy, wimentyny, neurofilamentu i filamentu gleju. Te ostatnie 4 klasy są w wysokim stopniu homologiczne. Filament keratyny zawiera co najmniej 2 różne polipeptydy keratynowe, podczas gdy 4 pozostałe klasy filamentów pośrednich są homopolimerami. Każdy z filamentów pośrednich składa się z 4 domen o kształcie a-heliksu oddzielonych od siebie obszarami o strukturze pofałdowanej kartki i oflankowanych z obu końców domenami niehelikalnymi. Niehelikalne końcowe domeny są zaangażowane w łączenie koniec do końca proto filament ów oraz w interakcję bok do boku między protofibryłami. Końce mikrofibrylarnych keratyn mogą być połączone poprzecznymi mostkami dwusiarczkowymi, co powoduje powstanie filamentów nierozpuszczalnych, jak np. w wełnie.

ków zidentyfikowano ponad 10 różnych typów kolagenu. Chociaż mektóre z nich stanowią tylko znikomy procent całości, mogą one odgrywać ważną rolę w kształtowaniu się fizycznych właściwości tkanek. Wszystkie typy kolagenu mają strukturę potrójnego heliksu. Każda podjednostka polipeptydowa lub łańcuch a tworzy lewoskrętny łteliks o 3 resztach na jeden skręt fryc. 59-15). Trzy

KOLAGEN JEST NAJBARDZIEJ ROZPOWSZECHNIONYM W ŚWIECIE BIAŁKIEM ZWIERZĘCYM

Sekwencja -Gly-X-Y-Gly-X-Y-Gly-X-Yaminokwasó w Ryc. 59-15. Właściwości molekularnej struktury kolagenu od pierwotnej sekwencji do fibrylli. (Według: Eyre D. R.: Collagen: Molecular ciiversity in the bodys protein scaffold; Sc/ence1980, 207, 1315. Copyright © 1980 American Assoctation of the Advancement of Science, za zezwoleniem, nieznacznie zmodyfikowana).

Kolagen, główny składnik większości tkanek łącznych, stanowi ok. 25% białka ssaków. Zapewnia on zewnątrzkomórkowe rusztowanie wszystkich zwierząt metazoalnych i występuje w praktycznie każdej tkance. W tkankach ssa-

67 nrn Fibry la

300 nm '

Cząsteczka

• '\ \ 1.4 om Potrójny Łańcuch a

812 / ROZDZIAŁ 59

takie łańcuchy i zostają następnie zwinięte w prawoskrętny superhcliks^itóry tworzy pałeczkowatą cząsteczkę o średnicy 1,4 nm i o długości ok. 30 nm. Uderzającą cechą kolagenu jest występowanie reszt glicynowych w każdej trzeciej pozycji części helikalnej łańcucha a. Jest to potrzebne, ponieważ glicyna jest jedynym aminokwasem dostatecznie małym, aby mógł się zmieścić w ograniczonej przestrzeni centralnego rdzenia potrójnego heliksu. Ta powtarzająca się struktura określana jako (Gly-X-Y) jest bezwzględnym warunkiem formowania potrójnego heliksu. Mimo że X i Y mogą być jakimkolwiek aminokwasem, ok. 100 pozycji X jest zajętych przez prolinę i ok. 100 pozycji Y przez hydroksyproline. Hydroksyprolina jest tworzona przez pptraaslacyjną hydroksylach reszt prolino^^ckzMdazaiuujcii'w.iiperjt.ydzk. a katalizowaną przez enzym hydroksylaze prołilową. którego kofaktorami są kwas askorbinowy (witamina C) i a-ketoglutaran. Lizynaj^pozycii Y może być potranslacyjnie zmieniana w hydroksylizyne dzięki działaniu hydroksylazy lizylowej, enzymu o podobnych kofaktorach. Niektóre z tych hydroksylizyn mogą być również modyfikowane przez dodanie galaktozy lub galaktozylo-glukozy z utworzeniem wiązania O-glikozydowego. Jest to miejsce glikozytecji wyjątkowe dla kolagenu. Typy kolagenu tworzące długie, pałeczkowate włókienka powstają przez boczne połączenie jednost£k_potrójnego heliksu w taki sposób, że każda z nich jest przesunięta w stosunku do sąsiadki o nieco mniej niż jedna czwartą swojej długości (ryc. 59-15). To ułożenie jest odpowiedzialne za prążkowani tych włókien w tkankach łącznych. Włókna kolagenu są dalej stabilizowane przez tworzenie kowalencyjnych mostków poprzecznych zarówno wewnątrz potrójnych heliksów, jak i między nimi. Te poprzeczne mostki powstają dzięki działaniu oksyjiazx^t lowcj, enzymu zależnego od miedzi, który oksydacyjnie deaminuje grupy e-aminowe niektórych reszt lizynowych i hydroksylizynowych. w wyniku czego powstają reaktywne aldehydy. Takie aldehydy mogą tworzyć produkty kondensacji z innymi aldehydami pochodzącymi z lizyny lub hydroksylizyny lub tworzyć zasady Schiffa z grupami s-aminowymi nieutlenionych lizyn lub hydroksylizyn. W wyniku tych reakcji powstają po dalszych chemicznych przekształceniach stabilne kowalencyjne jnostkXj)ojHZ££zn.e_w*żne dla odporności włókien na rozciąganie.

Pewne formy kolagenu nie tworzą włókien prążkowanych (tab. 59-4). Te kolageny charakteryzuje na poziomie molekularnym przerywanie potrójnego heliksu odcinkami białkowymi pozbawionymi sekwencji Gly-X-Y. Odcinki pozbawione sekwencji Gly-X-Y powodują powstawanie obszarów o strukturze globularnej, rozmieszczonych w strukturze potrójnego heliksu. Najlepiej scharakteryzowanym przykładem kolagenu o przerywanych potrójnych hełiksach jest kolagen typu IV, stanowiący ważny składnik błon podstawowych, w których tworzy on drobną siatkę. Kolagen przechodzi rozległe potranslacyjne modyfikacje Zanim nowo zsyntetyzowany kolagen stanie się częścią dojrzałego pozakomórkowego włókna kolagenowego, musi on przejść rozległą modyfikację potransłacyjną (tab. 59-5). Jak większość białek wydzielanych z komórki, kolagen jest syntetyzowany na rybosomach w prekursorowej formie preprokolagenu zawierającego sekwencję sygnałową lub prowadzącą (lider) kierującą łańcuch polipeptydowy do pęcherzykowej części siateczki sarkoplazmatycznej. Po wejściu do siateczki sarkoplazmatycznej ta prowadząca sekwencja (lider) jest enzymatycznie odszczepiana. W tymże miejscu zachodzi hydroksylacja reszt proliny i lizyny oraz glikozylacja hydroksylizyn cząsteczki prokolagenu. Cząsteczka prokolagenu zawiera zarówno na N-, jak i C-końcu peptydy wydłużające o m.cz. 20000—35000. Żadnego z nich nie ma w dojrzałym kolagenie. Oba te peptydy wydłużające zawierają reszty cysteiny. Podczas gdy Nkoń-"cowy propeptyd tworzy jedynie śródłańcucho-we wiązania dwusiarczkowe, propeptydy C-~ko-ńcowe tworzą zarówno śród-, jak i międzyłan-cuchówe wiązania dwusiarczkowe. Tworzenie tych wiązań dwusiarczku wy cli pomaga w ułożeniu 3 cząsteczek kolagenu tak, że tworzą potrójny heliks, którego zwijanie* rozpoczyna się od Ckońca. Po uformowaniu potrójnego heliksu żadna dalsza hydroksylacja proliny lub lizyny więcej nie zachodzi. Po wydzieleniu z komórki przez aparat Goigiego, wydłużające peptydy są usuwane z Ni C-końców prze2 zewnątrzkomórkowe enzymy zwane a mino proteina/ą i kar boksy protein azą prokoiagenową. Oddzielanie tych peptydów" może zachodzić w kryptach lub załamaniach błony komórkowej. Gdy tylko propeptydy zostaaą usunięte, potrójne heliksy cząsteczek ko-

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE /

813

Tabela 59-4. Niektóre przykłady różnych genetycznie kolagenów kręgowców. U zwierząt wyższych występuje co najmniej 10 różnych rodzajów cząsteczek zawierających 12 różniących się między sobą łańcuchów Typ

Natywn y polimer

Wzór

cząsteczki

IV

[od (1)1,0(2

Rozmi eszcze n ie tkankowe

Wyróżniające cechy

Włókna

Skóra, ścięgna, kości, zębina, powiezie

Włókna

Chrząstka, jądro galare - Duża zawartość hydroksylizyny; towate, notochord, ciało obficie glikozylowane; włókna szkliste zwykle cieńsze niż w typie I

[0(1(111)],

Włókna

Skóra (głównie płodowa), Duża zawartość hydroksyprolimacica, naczynia krwio - ny; niska zawartość riydroksylinośne; ogólnie włókna zyny; mało miejsc gltkozylacji „retikuliny" hydroksylizyny; międzyłartcuchowjtg wiązania dwusiarczkowe między cysteinami

oraz

Drobna siatka

Kłębuszki nerkowe, tore - Bardzo wysoka zawartość hy droksylizyny; prawie całkowicie bka soczewki, błona Descemeta, błony podstawo - glikozylowane; niska zawartość alaniny; zachowuje przedłużenia we wszystkich komórek prokolagenu nabionkowych i śródbłonkowych

Drobne włókna

Szeroko rozpowszech - Duża zawartość hydroksylizyny; nione w: Wonie podstawobficie glikozylowane; niska za nej naczyń krwionośnych wartość alaniny i komórek mięśni giadkich; egzoszkielecie fibroblastów i w innych ko mórkach mezenchymalnych

łańcuchy i 0(3(V); zmienna stechiometria

Mata zawartość hydroksylizyny; mało miejsc glikozylacji hydro ksyl izyny; szerokie włókna

Zmodyfikowane i reprodukowane za pozwoleniem z; Eyre DR; Collagen: Muscle ditfersity in the body's protein scaffold; Science, 1980; 207: 1315. Copyright 1980 by the American Association for the Advancement of Science.

Tabela 59-5. Kolejność i miejsce obróbki prekursora fibrylarnego kolagenu Obróbka wewnątrzkomórkowa

Obróbka zewnątrzkomórkowa

Oddzielenie peptydów sygnalnych

Oddzielenie peptydów wydłużających od ter minalnych grup aminowych i karboksylowych

Hydroksylacja reszt Y-prol iłowych i niektórych reszt hydroksyl i żyłowych Formowanie wewnątrzłańcuchowych i zew natrzłań cuch owych wiązań S-S w peptydach wydłużających Formowanie potrójnego heliksu

Ułożenie włókien kolagenowych z przesunię ciem o ',„ długości Oksydacyjna deaminacja grup s-aminowych reszt lizylowych i hydroksylizylowych do al dehydów Tworzenie wewnątrz- i międzyłańcuchowych połączeń poprzecznych za pośrednictwem zasa dy Schiffa i produktów kondensacji aldolowej

814 / ROZDZIAŁ 59

lagenu, zawierające ok. 1000 aminokwasów w Jednym łańcuchu, spontanicznie układają się we włókna kolagenowe. Są one dalej stabilizowane przez tworzenie, dzięki działaniu oksydazy lizylowej, zewnątrz- i wewnątrzłańeuchowych mostków poprzecznych.

Te same komórki, które wydzielają kolagen, wydzielają, również fibronektynę. wielką glikoproteinę występującą na powierzchni komórek, w macierzy zewnątrzkomorkowej oraz we krwi. Fibronektyna wiążąc się z agregującymi włóknami prokolagenu zmienia kinetykę formowania włókien w macierzy okołokomórkowej. Z fibronektyną i prokolagenem tej macierzy związane są również proteoglikany, takie jak siarczan heparyny i siarczan chondroityny (p. rozdz. 57). Małoczą steczko wy kolagen typu IX, pochodzący z chrząstki, zawiera przyłączone do niego łańcuchy proteoglikanu. Tego rodzaju interakcja może regulować tworzenie włókien kolagenowych i określać ich ułożenie w tkankach. Wiele chorób genetycznych wynika z nieprawidłowego tworzenia włókien, stabilizacji heliksu lub nieprawidłowego tworzenia mostków poprzecznych kolagenu Choroby wrodzone będące wynikiem zaburzeń kolagenu stanowią wzrastającą ilość odmian co najmniej 4 różnych typów zespołów: osteogenesis imperfecta, zespół Mariana, zespołu Ehlersa-Danlosa oraz zespołu Menkesa (kręco-

nych włosów). Każdy z tych zespołów ma kilka odmian. Początkowo choroby te były definiowane na podstawie podobnych fenotypów. Jed-

nakże w miarę poznawania struktury i funkcji kolagenu stało się jasne, że podobne defekty molekuiarne mogą powodować występowanie różnych zespołów klinicznych i odwrotnie, te same zespoły mogą być wynikiem różnych defektów molekularnych. W zasadzie defekty te dotyczą tworzenia włókien, stabilizacji potrójnego heliksu lub tworzenia mostków poprze-

cznych kolagenu. Defekty obejmują mutacje powodujące niewielką lub brak syntezy łańcuchów prokolagenu, produkcję skróconych włókien prokolagenu, nadmiernie wydłużonych włókien prokolagenu oraz defekty poddających je obróbce enzymów (tj. hydroksylazy lizynowej lub N-proteinazy pro kolagenowej). Dotychczas rozpoznano tylko defekty cząsteczek prokolagenu typu I i III. W zespole Menkesa występują zaburzenia metabolizmu miedzi (p. rozdz. 58), a tym samym wtórnie zaburzenia funkcji oksydazy lizynowej i defekty tworzonych przez nią mostków poprzecznych. W tabeli 59-6 podsumowano główne cechy 4 powyższych zespołów, a ryc. 59-16 pokazuje, jak w trzech z nich zmieniona jest struktura prokolagenu typu I. ELASTYNA NADAJE ROZCIĄGLIWOŚĆ I SPRĘŻYSTOŚĆ PŁUCOM, NACZYNIOM KRWIONOŚNYM 1 POWIĘZIOWI Elastyna jest białkiem tkanki łącznej odpowiedzialnym za rozciągliwość i sprężystość tkanek. Chociaż nie jest ona tak szeroko rozpowszechniona jak kolagen, występuje w dużych ilościach w niektórych tkankach, w których te

Tabela 59-6. Ogólne cechy 4 dziedzicznych chorób kolagenu Choroba Osteogenesis imperfecta (ró żne typy) Zespół Ehlersa-Danlosa (róż ne typy) Zespół Marfana

4. Zespół Menkesa

Objawy kliniczne

Przyczyny biochemiczne*

Różne nieprawidłowości genów kodujących prokofagen *1(l) Nadmierna ruchliwość stawów, Zmiany genów dla kolagenu ai (III), nienormalności skóry niedobór N-proteinazy prokolagenu i hydroksylazy Zaburzenia w kośćcu, oczach lizylowej i układzie sercowo-naczyniowym Mutacja genu dla prokolagenu v 2(1} powodująca wydłużenie łańcuchów Kręcone włosy, opóźnienia prokolagenu wzrostu Niedobór oksydazy lizylowej na skutek zaburzeń metabolizmu miedzi Nadmierna łamliwość kości

* Podano tylko niektóre najlepiej znane przyczyny tych chorób.

BIAŁKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 815 (EDS V I I ) i.ManjM

Ryc. 59-16. Przybliżona lokalizacja mutacji w strukturze prokolagenu typu I. EDS — zespół Ehlersa--Danlosa; MS zespół Marfana; 01 — osteogenesis imperfecta. Pro«lsi proa2s, skrócone łańcuchy proa; pro«2x, słabo określone mutacje zmieniające strukturę łańcuchów proa; proa2L, wydłużone łańcuchy proa; prooc2cx, mutacja zmieniająca strukturę propeptydów C łańcuchów proa. (Według: Prockup D. J., Kivirik-ko K. L: Heritable diseases of collagen; N. Engl. J. Med. 1984, 311, 376, za>Zezwoleniem).

fizyczne cechy są szczególnie potrzebne, tj. w płucach, dużych naczyniach tętniczych i niektórych sprężystych powięziach. W mniejszych ilościach elastyna znajduje się również w skórze, chrząstce ucha i w wielu innych tkankach. W przeciwieństwie do kolagenu, elastyna wydaje się występować w jednym tylko typie genetycznym, choć różnicowa obróbka hnKNA elastyny powoduje powstawanie jej odmian (p. rozdz. 39).

Elastyna jest syntetyzowana jako rozpuszczalny monomer o m.cz. 70 000, zwany tropoelastyną. Niektóre z reszt prolinowych tropoelastyny są hydroksylowane do hydroksyproliny przez hydroksylazę prolilową. Hydroksylizyna i glikozylowana hydroksylizyna w tropoelastynie nie występują. W przeciwieństwie do kolagenu tropoelastyną nie jest wytwarzana w postaci pro-i nie zawiera peptydów wydłużających. Ponadto elastyna nie ma powtórzeń sekwencji Gly-X-Y, struktury potrójnego heiiksu lub reszt węglowodanowych. Po wydzieleniu z komórki pewne reszty lizylowe tropoelastyny ulegają oksydacyjnej deaminacji do aldehydów przez oksydaze lizylową, enzym zaangażowany w ten proces również i w kolagenie. Jednakże główne połączenia poprzeczne formowane w elastynie są desmozynami, które powstają z kondensacji 3 pochodzących z lizyny aldehydów z nie zmodyfikowaną lizyną. Powstaje wówczas wyjątkowe dla elastyny czterofunkcyjne połączenie poprzeczne. W swojej zewnątrzkomórkowej, dojrzałej postaci elastyna jest wysoce nierozpuszczalna i sta-

bilna i wykazuje bardzo mały obrót. Elastyna

występuje w wielu odmianach bezładnych zwojów, które pozwalają tkance na rozciąganie i powrót do wyjściowego kształtu w czasie peł-

nienia jej funkcji fizjologicznych. W tabeli 59-7 podsumowano główne różnice miedzy kolagenem i elastyną. Kolagen Wiele różnych typów genetycznych Potrójny heliks

Elastyna Jeden typ genetyczny

Nie ma potrójnego heiiTabela 59-7. Główne różnice pomiędzy kolagenem a elastyrtą ksu; bezładne zwoje umożliwiające rozciąPowtarzana struktura ganie.
816 / ROZDZIAŁ 59

PIŚMIENNICTWO Adelstein RS, Eisenberg R: Regulation and kinetics of actino-myosin ATP interaction. Annu Rev Biochem 1980:49:921. Barany M, Barany K: Phosphorylation of the myofibrillar proteins. Annu Rev Physiol 1980;42:275. Caplan A: Cartilage. Sci Am (Oct) 1984;250:84. Eyre DR el al: Cross-linking in collagen and elastin. Annu Rev Biochem 1984:53:717. Fuchs E, Hanukoglu 1: Unraveling the structure of intermediate filaments. Celi 1983:34:332. Hcuser JE, Kirschner MW: Filament organization revealed in platinum replicas of freez-dried cytoskeletons. J Celi Bioł, J980;86:212.

Kleinman HK, Klebe RJ, Martin GR: Role of collagenous rnatrices in the adhesion and growth of cells. J Celi Biol m\WA12. Lazarides E: Intermediate filaments: A chemically heterogeneous. dcvelopmentally regulated class of proteins. Annu Rev Biochem 1981;51:219. Lazarides E, Revel JP: The molecular basis of celi moveraent. Sci am (May) 1979;240:100. Prockop DJ, Kivirikko KI: Heritable diseases ot' collagen. N Engl J Med 1984;311:376. Rosenbloom J: Elastin: relation of protein and gene structure to disease. Lab Invest 1984;5]:605, Sandberg LB, Soskel NT, Leslie JG: Elastin structure, biosynthesis, and relation to disease states, N Engl

--

,

Metabolizm ksenobiotyków Robert K. Murray, MD. Phb

WPROWADZENIE Człowiek jest coraz bardziej narażony na działanie związków obcych, egzogennych (ksenobiotyków) takich jak leki, środki konserwujące pokarmy lub zanieczyszczenia środowiska zewnętrznego itd. Ilustruje to najlepiej następujący cytat Rachela Carsona (żył w latach 1907—1964): „Fabryka życia została skonfrontowana z atakiem chemicznym podobnym do ataku z użyciem nieznanej dotychczas broni lub przez klub jaskiniowców". Carson był jednym z pierwszych, którzy dostrzegli niebezpieczeństwo grożące bytowi człowieka ze strony różnorodnych zanieczyszczeń środowiska lub wynikających z nadużycia bogactw ziemskich. Jest to prawdopodobnie najbardziej pilny problem do rozwiązania przez współczesnego człowieka. Nierozwiązanie tego problemu w sposób solidny i uczciwy grozi zagładą wszelkiej biochemii na ziemi. Poznanie mechanizmu działania ksenobiotyków na poziomie komórkowym stanowi podstawę prawidłowego przeciwdziałania atakowi chemicznemu.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Znajomość przemiany ksenobiotyków stanowi podstawę racjonalnej farmakologii, toksykologii, badań nad patomechanizmem powstawania nowotworów lub uzależnień od łęków. Cechą wspólną wszystkich wymienionych dziedzin jest podawanie ksenobiotyków lub ekspozycja człowieka na te substancje.

52

ffiocberoia

CZŁOWIEK STYKA SIĘ Z LICZNYMI KSENOBIOTYKAMI, KTÓRE MUSZĄ ULEC PRZEMIANt£ZANIM ZOSTANĄ WYDALONE Z USTROJU Ksenobiotyk (greckie słowo xenos oznacza obcy) jest substancją obcą dla człowieka. Wśród głównych grup ksenobiotyków dających znaczenie medyczne wymienić należy leki, kancerogeny chemiczne i różne związki znajdujące się w otaczającym nas środowisku (np. wielochlorowcowe pochodne bifenylu — PCB, niektóre insektycydy itd.) Większość wymienionych grup związków ulega przemianie (tj. przekształceniom chemicznym) w ustroju człowieka, w tym giównie w wątrobie. Tylko rzadko ksenobiotyk wydalany jest w postaci niezmienionej. Przemianę ksenobiotyków można podzielić na dwie fazy. W fazie pierwszej główną reakcją jest hydroksylacja katalizowana przez jeden z enzymów zaliczanych do monooksygenaz lub cytochromów P-450. Innymi rodzajami reakcji zachodzących w fazie pierwszej są redukcja i hydroliza. W fazie drugiej związki hydroksyl o wane lub zmienione w inny sposób w fazie pierwszej, ulegają przekształceniu przez swoiste enzymy do różnych metabolitów polarnych poprzez sprzęganie z kwasem glukuronowym, siarkowym lub octowym, glutationem lub pewnymi aminokwasami, lub też poprzez merylację. Głównym celem obu faz przemiany ksenobiotyków jest zwiększenie ich rozpuszczalności w wodzie (czyli zwiększenie ich poiarności), dzięki czemu ułatwione jest ich wydalanie z ustroju. Bardzo silnie hydrofobowe ksenobiotyki mogłyby przebywać w tkance tłuszczowej nieograniczenie długo, gdyby nie zostały przekształcone do postaci bardziej polarnych.

818 / ROZDZIAŁ 60

W określonych przypadkach w wyniku reakcji zachodzących w fazie pierwszej, pewne ksenobiotyki ulegają konwersji ze związków biologicznie nieaktywnych do aktywnych. W takich przypadkach pierwotny ksenobiotyk określany jest jako prekursor lękowy (pro-fck) lub prokancerogen. W innych przypadkach, w dodatkowych reakcjach zachodzących w fazie pierwszej (np. dalsze hydroksylacje) aktywne związki ulegają konwersji do postaci mniej aktywnych lub nieaktywnych zanim ulegają procesowi sprzęgania. W jeszcze innych przypadkach, w wyniku samego procesu sprzęgania aktywne metabolity fazy pierwszej ulegają przekształceniu do związków mniej aktywnych lub nieaktywnych oraz wydalaniu z moczem lub żółcią. Tylko w bardzo rzadkich przypadkach w wyniku procesu sprzęgania aktywność ksenobiotyku może wzrosnąć. Pojęcie „detoksykacja" (odtruwanie) używane jest czasem dla określenia licznych reakcji uczestniczących w przemianie ksenobiotyków. Jest to termin niewłaściwy, ponieważ, jak to wykazano wyżej, w reakcjach, którym poddawane są ksenobiotyki, mogą powstać związki biologicznie bardziej aktywne, a nawet toksyczne.

CYTOCHROM P-450 KATALIZUJE HYDROKSYLACJĘ KSENOBIOTYKÓW W PIERWSZEJ FAZIE ICH PRZEMIANY Hydroksylacja jest główną reakcją zachodzącą w fazie pierwszej. Jest ona katalizowana przez enzymy określane jako monooksygenazy lub enzymy grupy cytaphromu P-450. Reakcje katalizowaną przez monooksygenazę (lub enzymy grupy cytochromu P-450) przedstawia następujące równanie. H + ^ R—OH + H2O + NAOP (1)

RH oznacza szeroki zestaw związków, np. leki, kancerogeny i polutanty (np. PCB) oraz określone związki endogenne, np. steroidy. W wielu przypadkach nie poznano jeszcze endogennych substratów dla enzymów grupy cytochromu P450, wydaje się jednak nieprawdopodobne, by enzymy te powstały tylko po to, by reagować ze związkami egzogennymi. W rozdziale tym nie będzie przedstawiony złożony mechanizm działania enzymów tej grupy. Wspomnieć jednak trzeba, że w reakcji katalizowanej przez oma-

wiane enzymy jeden atom tlenu wchodzi do R—OH, zaś drugi do wody (patrz wyżej reakcja (1)). Dwoisty los tlenu w tej reakcji tłumaczy, dlaczego uczestniczące w niej monooksygenazy określano dawniej jako oksydazy o funkcji mieszanej (mixed function oxidases). Reakcję katalizowaną przez cytochrom P-450 można przedstawić następującym równaniem: Postać zredukowana cytochromu P-450

t

Postać utleniona cytochromu P-450 (2) R—OH + HjO RH + Oj

Głównymi monooksygenazami siateczki śródpiazmatycznej są enzymy grupy cytochromu P-450. Nazwa cytochrom P-450 jest historycznie uzasadniona następującym faktem. Enzym ten odkryto, kiedy preparaty mikrosomów poddanych chemicznej redukcji, a następnie ekspozycji na działanie tlenku węgla, wykazały szczytową absorpcję światła przy 450 nm. Enzym ten jest niezwykle ważny, wykazano bowiem, że ok. 50% leków zażywanych przez chorych jest metabolizowanych przez enzymy grupy cytrochromu P-450. Te same enzymy działają na kancerogeny i polutanty.

Ważne cechy enzymów grupy cytrochromu P-450

Wśród nich wymienić należy następujące: Podobnie jak hemoglobina, enzymy tej grupy są hemoproteinami. Największe stężenia tych enzymów stwier dza się w siateczce śródpiazmatycznej (we frakcji mikrosomalnej) wątroby. W błonach tych en zymy te stanowią w przybliżeniu 20% ogólnej zawartości w nich białka. Enzymy te występują również w innych tkankach. I tak w nadnerczach ich obecność stwierdza się zarówno w mitochondriach, jak i w siateczce śródpiazmatycz nej. Różnorodne hydrolazy występujące w tym gruczole odgrywają ważną rolę w biosyntezie steroidów (p. rozdz, 49). i W siateczce śródpiazmatycznej hepatocytów stwierdza się co najmniej 6 blisko ze sobą spokrewnionych rodzajów cytochromu P-450, odznaczających się szeroką i nakładającą się na siebie, swoistością substratową. Działają one na różnorodne leki, kancerogeny i inne ksenobio tyki oprócz endogennych związków (np. okreś lone steroidy). W ostatnich latach wyizolowano i szczegółowo scharakteryzowano geny kodują ce wymienione rodzaje cytochromu P-450. W reakcjach katalizowanych przez cyto-

METABOLIZM KSENOBIOTYKÓW / 819

chromy P-450 uczestniczy NADPH, a nie NADH. "Enzym redukujący cytochrom P-450 i współdziałający z NADPH określany jest jako reduktaza NADPH: cytochrom P-450. Składnikami układu cytochromu P-450 są również lipidy. Preferowanym lipidem jest fosfatydylochoLina, która jest głównym lipidem błon siateczki endoplazmatycznej. Syntezę większości rodzajów cytrochromu P-450 można indukować podawaniem okreś lonych związków, i tak podawanie fenobarbitalu i wielu innych leków przez zaledwie 4—5 dni powoduje przerost siateczki śródplazmatycznej gładkiej oraz 3—4-krotny wzrost ilości cytrochromu P-450. Mechanizm indukcji został dogłębnie przebadany i polega m.in. na wzroś cie transkrypcji mRNA kodującego cytochrom P-450. Możliwość indukcji tego enzymu ma ważne implikacje kliniczne, ponieważ stanowi jeden z mechanizmów interakcji zachodzącej między lekami. O interakcji mówimy wówczas, kiedy efekty działania jednego leku ulegają zmianie w wyniku uprzedniego lub równoczesnego stosowania innego leku. Dla przykładu przyjmijmy, że chory pobiera dikumarol w celu zmniejszenia krzepliwości krwi. Lek ten jest metabolizowąny przez układ cytochromu P-450. Następnie okazuje się, że chory wymaga stosowania fenobarbitalu z powodu pewnego rodzaju padaczki. Zgodnie z oczekiwaniami po 5 dniach stosowania fenobarbitalu stężenie cytochromu P-450 w hepatocytach wzrosło 3-—4-krotnie, co oznacza, że dikumarol ulega szybciej metabolizacji oraz, że zmniejszyło się jego działanie przeciwkrzepliwe. Aby więc uzyskać właściwy efekt przeciwkrzepliwy dawkę podawanego dikumarolu należy zwiększyć. Dalszy problem powstaje wtedy, kiedy pacjent przestaje zażywać fenobarbital, lecz kontynuuje zażywanie dikumarolu w zwiększonej dawce. U takiego chorego mogą wystąpić objawy skazy krwotocznej spowodowanej przedawkowaniem dikumaroiu i nagłym spadkiem stężenia cytochromu P-450 (inaktywującego ten lek). 7. Jeden rodzaj cytochromu P-450 wykazuje maksymalną absorpcję światła nie przy długości 450 nm, lecz 448 nm. Cytochrom ten określany jest jako cytochrom P-448. Jest on względnie swoisty dla przemiany policyklicznych aroma tycznych węglowodorów (PAH) i spokrewnio nych z nimi związków. Z tego powodu enzym ten określany jest jako hydroksylaza węglowodo rów aromatycznych (AHH — aromatic hydro-

carbon hydroxylase). Enzym ten odgrywa ważną rolę w przemianie policyklicznych węglowodorów aromatycznych oraz w kancerogenezie indukowanej przez te związki, np. enzym ten uczestniczy w konwersji nieaktywnych PAH (prokancerogenów) wdychiwanych w czasie palenia papierosów do aktywnych kancerogenów (powstających przez hydroksylację prokancerogenów). Palacze wykazują wyższe stężenia AHH w niektórych komórkach niż osoby niepalące. W niektórych pracach doniesiono o występowaniu wzmożonej aktywności AHH w łożysku kobiet palących. Ten fakt może sprawić, że płody tych kobiet mogą być eksponowane na działanie zwiększonych ilości PAH (niektóre z nich mogą być bardzo szkodliwe). PROCESY SPRZĘGANIA PRZYGOTOWUJĄ KSENOBIOTYK1 DO WYDALANIA Z USTROJU ODBYWAJĄCEGO SIĘ W DRUGIEJ FAZIE ICH PRZEMIANY W reakcjach fazy pierwszej ksenobiotyki ulegają zwykle konwersji do związków bardziej polarnych w wyniku ich hydroksylacji. W reakcjach fazy drugiej hydroksyl owa ne pochodne ulegają sprzęganiu z kwasem glukuronowym, siarczanami lub glutationem. W wyniku tych reakcji związki te stają się jeszcze bardziej rozpuszczalne w wodzie i mogą ewentualnie zostać wydalone z moczem lub żółcią. Istnieje co najmniej pięć rodzajów reakcji zachodzących w drugiej fazie przemiany ksenobiotyków Glukuronidacja. Proces ghikuronidacji bilirubiny został przedstawiony w rozdziale 34. Reakcje glukuronidacji ksenobiotyków są w zasadzie podobne do podanych dla bilirubiny. Donorem reszty gluktironylowej jest kwas UDP--glukuronowy, zaś enzymami katalizującymi reakcje glukuronidacji — transferazy glukurony-lowe występujące zarówno w siateczce śródplaz-matycznej, jak i w cytoplazmie. Wiek związków, takich jak 2acetyloaminofluoren (jest to kancerogen), anilina, kwas benzoesowy, mep-robamat, fenol i wiele steroidów wydalanych jest pod postacią glukuronidów. Reszta gluku-ronidowa może ulec związaniu przez tlen, azot lub grupę siarkową danego substratu. Glukuronidacja jest prawdopodobnie najczęściej spotykaną reakcją sprzęgania.

820 / ROZDZIAŁ 60

Sprzęganie z siarczanem (sulfatacja). Niektóre alkohole, aminy aromatyczne i fenole ulegają sprzęganiu z siarczanem. Nośnikiem reszty siarczanowej jest 3'-fosfoadenozyno-5'-fosfosiarczan (PAPS) (p. rozdz. 26) zwany również aktywnym siarczanem.

Sprzęganie z glutationem. Glutation (y--glutamylo-cysteinylo-glicyna) jest tripeptydem składającym się z kwasu glutaminowego, cys-teiny i glicyny (p. ryc. 4-4). Powszechnie używanym skrótem dla glutationu jest GSH. Reszta sulfhydrylowa SH cysteiny jest aktywną grupą wymienionego peptydu. Liczne potencjalnie toksyczne elektrolitowe kstnobiotyki (jak np. pewne kancerogeny) ulegają sprzęganiu z nukleofi-lowym GSH zgodnie z reakcją R + GSH-* R—S—G

gdzie R oznacza elektrofilowy ksenobiotyk. Enzymy katalizujące ww. reakcję określone są jako S-transferazy glutationowe. Występują one w dużych stężeniach w cytozolu hepatocytów zaś w mniejszych w innych tkankach. W tkankach człowieka stwierdza się różnorodne Stransferazy glutationowe. Odznaczają się one odmiennymi swotstościami substratowymi i można je rozdzielić metodą elektroforetyczną lub innymi technikami. Gdyby potencjalnie toksyczny ksenobiotyk nie uległ sprzęganiu z GŚH, mógłby się swobodnie połączyć kowatencyjnie z DNA, RNA lub białkami komórkowymi, stając się przyczyną poważnego uszkodzenia komórki. GSH jest więc ważnym ogniwem mechanizmu obronnego przed określonymi związkami toksycznymi, np. niektórymi lekami lub kancerogenami. Jeżeli stężenie GSH w takich narządach jak wątroba ulega obniżeniu (np. przez podanie szczurom pewnych związków wiążących GSH), wówczas narząd taki wykazuje zwiększoną wrażliwość na toksyczne działanie różnych związków chemicznych normalnie inaktywowanych przez GSH. Koniugaty glutationowe ulegają jeszcze dalszym przemianom zanim wydalane są z ustroju. Dochodzi bowiem do odszczepienia przez swoiste enzymy grup glutamylowej i glicynylowej glutationu oraz połączenia grupy aminowej pozostającej reszty cysteinyłowej z grupą acetylową (donorem grupy acetylowej jest acetylo-CoA). W wyniku tych reakcji powstaje kwas merkapturowy — koniugat Ł-acetylocysteiny. Glutation spełnia jeszcze inne ważne funkcje w komórkach ludzkich, oprócz udziału w prze-

mianie ksenobiotyków. Wśród nich wymienić należy następujące: Glutation uczestniczy w rozkładzie poten cjalnie toksycznego nadtlenku wodom. Reakcja

ta jest katalizowana przez peroksydazę glutationową (p. rozdz. 21). Glutation jest ważną środkom orkową substancją redukującą, pozwalającą utrzymać istotne grupy SH enzymów w postaci zreduko wanej. Kiedy GSH działa jako substancja redu kująca, jej grupa SH ulega utlenieniu i tworzy wiązanie dwusiarczkowe z drugą cząsteczką glutationu zgodnie z reakcją: GSH GSH G

-S—G

Produkt tej reakcji G—S—S—G jest glutationem utlenionym. Z kolei G—S—S—G może ulec redukcji do GSH przez reduktazę glutationową w reakcji, w której uczestniczy NADPH. Przedstawia ją następujące równanie: G—S—S—G + NADPH + H+-2GSH + NADP

Reakcja ta jest szczególnie ważna w "krwinkach czerwonych. Jeżeli stężenie NADPH w tych komórkach jest niskie, jak to ma miejsce przy niedoborze dehydrogenazy G—6—P (p. rozdz. 21), regeneracja zredukowanego GSH jest niedostateczna. W następstwie niskiego stężenia GSH w krwinkach czerwonych wzrasta stężenie nadtlenków. Te ostatnie, działając utleniająco na lipidy błon erytrocytarnych, mogą spowodować hemolizę krwinek czerwonych. 3. GSH uczestniczy jako substancja przenośnikowa w przezbłonowym transporcie amino-

kwasów w nerkach w tzw. cyklu y-glutamylowym. Pierwsza reakcja tego cyklu przedstawia się następująco: Aminokwas -GSH - -Glutamylo-pochodna aminokwasu + Cysteiny logi icy na

Reakcja ta jest pomocna w przezbłonowym transporcie pewnych aminokwasów. Z kolei aminokwas ulega odszczepieniu od kompleksu z GSH, po czym zachodzi resyntęza GSH z cysteinyloglicyny. Enzym, który katalizuje ww, reakcję nazywa się 7-glutamylotransferazą (GGT). Enzym ten występuje w błonach plazmatycznych komórek kanaiikowych.nefronów oraz w siateczce plazmatycznej hepatocytów. Oznaczanie tego enzymu ma znaczenie diagnostyczne, ulega on bowiem uwolnieniu z hepato-

METABOLIZM KSENOBIOTYKOW / 821

cytów do krwi w różnych chorobach wątroby i dróg żółciowych (patrz Dodatek pod hasłem: y- Gl u tamy 1 o transpep ty daza). Inne reakcje. Wśród innych reakcji fazy drugiej przemiany ksenobiotyków najważniejsze są reakcje acetyłacji i metylacji. Reakcje acetyłacji ilustruje równanie: X + Acetyf o-Co A -»Acety Io-X+Co A gdzie X oznacza ksenobiotyk. Podobnie jak w innych reakcjach acetyłacji donorem aktywnego octanu jest acetylo-CoA. Reakcje te są katalizowane przez acetylotransferazy występujące w cytoplazmie komórek różnych tkanek, a szczególnie wątroby. Izottiazyd — lek używany w leczeniu gruźlicy — ulega acetyłacji. Ponieważ istnieją polimorficzne postacie acetylotransferaz, wśród Judzi wyróżnia się osobników odznaczających niską lub dużą wydajnością procesu acetyłacji. W konsekwencji osobnicy o niskiej wydajności acetyłacji odznaczają się małym klirensem leków, takich jak izoniazyd, przez co są bardziej narażeni na toksyczne ich działanie. Mała liczba ksenobiotyków ulega metylacji przez metyl o tran sterazy. Donorem grupy metylowej w tych reakcjach jest S-adenozylometionina(p. ryc. 31-22).

NA AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW PRZEMIANY KSENOBIOTYKÓW WPŁYW MAJĄ WIEK, PŁEĆ I INNE CZYNNIKI Różne czynniki wpływają na aktywność enzymów metabolizujących ksenobiotyki. Wśród nich wymienić należy następujące: Aktywność tych enzymów różni się istot nie u poszczególnych gatunków zwierząt. Ozna cza to, że toksyczność lub kancerogenność określonego ksenobiotyku u jednego gatunku wcale nie oznacza, że jest równie toksyczny lub rakotwórczy u drugiego gatunku. Występują znaczne różnice (genetycznie uwarunkowane) w zakresie aktywności wymie nionych enzymów między osobnikami tego sa mego gatunku. Aktywność enzymów przemiany ksenobio tyków zależna jest od wieku i pici. Zażywanie różnych ksenobiotyków, takich jak fenobarbital, PCB lub pewne węglowodory, jest przyczyną indukcji enzymów. Ważna jest

więc informacja o-zażywaniu przez daną osobę związków indukujących syntezę enzymów przemiany ksenobiotyków. Informacja ta jest istotna dla oceny efektów biochemicznych ksenobiotyków. 5. Metabolity niektórych ksenobiotyków mogą hamować aktywność enzymów metabolizujących te związki. Powyższe fakty tłumaczą występowanie znacznych różnic gatunkowych lub między osobnikami tego samego gatunku w zakresie reakcji na ksenobiotyki (np. na leki i substancje toksyczne lub czynniki rakotwórcze).

REAKCJE NA KSENOBIOTYKI MOGĄ MIEĆ CHARAKTER FARMAKOLOGICZNY, TOKSYCZNY, IMMUNOLOGICZNY I RAKOTWÓRCZY W ustroju ksenobiotyki ulegają przemianie w reakcjach przedstawionych wyżej. Jeżeli ksenobiotyk jest lekiem, może on ulec aktywacji w wyniku reakcji fazy pierwszej. Jeżeli zaś lek był farmakologicznie aktywny bez uprzedniej metabolizacji, aktywność jego może ulec zmniejszeniu lub całkowitemu zniesieniu w następstwie reakcji fazy pierwszej. Ocena efektów działania leków jest przedmiotem badań farmakologicznych. Na tym miejscu ma być wyeksponowany fakt, że leki działają za pośrednictwem mechanizmów biochemicznych. Niektóre ksenobiotyki są niezwykle toksyczne nawet przy niskich stężeniach w płynach ustrojowych (np. cyjanki). Z drugiej strony istnieje kiłka ksenobiotyków, w tym również leków, które nie są toksyczne nawet wtedy, kiedy podane zostały w dużych ilościach. Efekty toksyczne ksenobiotyków są niezwykle różnorodne. Wśród nich omówione zostaną bardzo krótko tylko trzy ogólne rodzaje toksyczności związane z przemianą ksenobiotyków (ryc. 60-1). Pierwszy z nich to uszkodzenie komórek przez ksenobiotyki. Może ono być na tyle ciężkie, że kończy się śmiercią komórek. Istnieje wiele mechanizmów, za pośrednictwem których ksenobiotyki uszkadzają komórki. Wśród nich wymienić należy kowalencyjne wiązanie się reaktywnych postaci ksenobiotyków, powstałych w wyniku ich przemiany, z makrocząsteczkami komórkowymi. Tymi ostatnimi mogą być DNA, RNA i białka. Jeżeli tymi makrocząsteczkami są białka lub enzymy niezwykle ważne

822 / ROZDZIAŁ 60 Transferaza glutationowa

Ksenobiotyk

lub hydrolaza epoksydowe

Reaktywne metabolity

Nietoksyczne metabolity

Kowalencyjne wiązanie się z makrocząsteczkami

..

! Uszkodzenie komórak toksyczne

Hapten

1

Mutacja

Wytwarzanie przeciwciał

Rak

1

Immunologiczne uszkodzenie komórek

Ryc. 60-1. Uproszczony schemat przedstawiający, w jaki sposób metabolizm ksenobiotyku prowadzi do uszkodzenia toksycznego lub immunologicznego komórek, lub też do powstawania raka. W tych przypadkach konwersję ksenobiotyku do reaktywnego metabolitu katalizują enzymy grupy cytochromu P-450, zaś przekształcenie reaktywnego metabolitu (np. epoksydu) do metabolitu nieaktywnego — -S-transferaza glutalionowa aibo hydrolaza epoksydowa.

dla funkcji komórki, decydujących o jej przeżyciu, np. enzymy fosforylacji oksydacyjnej lub białka regulujące przepuszczalność błony plazmatycznej, wówczas łatwo wytłumaczyć szybkie wystąpienie objawów toksycznych spowodownych ksenobiotykiem. Po drugie, reaktywny ksenobiotyk wiążąc się z białkami może zmienić ich strukturę i antygenowość. Mówi się wówczas, że ksenobiotyk działa jako hapten. Oznacza to, że sam ksenobiotyk, jako mała cząsteczka, nie stymuluje powstawania przeciwciał (wiążących ten ksenobiotyk). Jeżeli jednak wytworzone zostały takie przeciwciała (dzięki połączeniu się ksenobiotyku z białkami), wówczas wiążą się one ze swoim antygenem. W wyniku różnych mechanizmów immunologicznych zachodzących pomiędzy tymi przeciwciałami a ksenobiotykiem związanym przez makrocząsteczki komórkowe, dochodzi do poważnych zaburzeń normalnych procesów biochemicznych komórki. Po trzecie, chemiczne kancerogeny po ich aktywacji mogą połączyć się z DNA. Uważa się, że taka reakcja może mieć duże znaczenie w kancerogenezie chemicznej (p. rozdz. 61). Niektóre związki chemiczne
że są pośrednio działającymi kancerogenami). Aktywność tych monooksygenaz i innych enzymów przemiany ksenobiotyków występujących w siateczce śródplazmatycznej decydują o tym, czy takie związki stają się kancerogenami czy też ulegają „detoksykacji". Inne związki chemiczne (np. substancje alkilujące) mogą bezpośrednio reagować z DNA, bez uprzedniej aktywacji w obrębie komórki (są to kancerogeny bezpośrednio działające). Enzym określany jako hydrolaza epoksydowa jest przedmiotem zainteresowania ze względu na to, że może mieć działanie ochronne w stosunku do niektórych kancerogenów. Produktami monooksygenaz działającymi na niektóre prokancerogeny są epoksydy. Epoksydy są wysoce reaktywne i dlatego wykazują działanie mutagenne i (lub) kancerogenne. Hydrolaza epoksydowa, podobnie jak cytochrom P-450, występuje w błonach siateczki śródplazmatycznej. Przekształca ona epoksydy do znacznie mniej reaktywnych dihydrodioli. Reakcję tę przedstawia następujące równanie:

I

I

—C—C—

+ H2O -* \/ O Epoksyd

I

I

OH OH Dihydrodiol

METABOLIZM KSENOBIOTYKÓW / 823 PIŚMIENNICTWO

Nebert DW, Gonzalez FJ: P450 genes: structure, evolution and regulation. Annu Rev Biochem 1987; Katzung BG (editor): Basie & Clinica} Pharmacołogy. 56:945. 4th cd. Appleton & Lange, 1989. Nebert DW, Gonzalez FJ:P450 genes and evolutionaIClaassen CD, Amdur MO, Doull J (editors): Casoi-etf ry geneties. Hosp Pract (March) 1987; 22:63. & DouWs Toxicology, 3rd ed, Macmillan, 1986.

6 1

Rak, onkogeny i czynniki wzrostowe Robert K. Munay, MD, PhD

WPROWADZENIE

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Komórki nowotoworowe cechują się 3 właściwościami: 1) zmniejszoną lub nie opanowaną kontrolą wzrostu; 2) inwazyjnością wobec tkanek, w których są zlokalizowane oraz 3) rozprzestrzenianiem się i zdolnością do wywoływania przerzutów w innych częściach organizmu. W tym rozdziale zostaną omówione niektóre biochemiczne aspekty procesu nowotworowego. Głównymi kwestiami wymagającymi wyjaśnienia w terminach biochemicznych są niekontrolowany wzrost komórek nowotworowych i ich zdolność do inwazji i tworzenia przerzutów. Prawdopodobnie struktura i właściwości regulacyjne genów, kontrolujących wzrost i interakcje między komórkami, nie są normalne w komórkach nowotworowych. Ograniczone są informacje o tym^w jaki sposób jest kontrolowany wzrost komórek, zarówno prawidłowych, jak i nowotworowych, a wiedza o specyficznych genach uczestniczących w regulacji wzrostu jest jeszcze bardzo uboga. Jak dotychczas niewiele wiadomo o biochemicznych podstawach tworzenia przerzutów, dlatego też temat ten zostanie przedstawiony skrótowo. Przynajmniej niektóre typy nowotworów (np. niektóre typy białaczek) mogą być traktowane jako przykłady nienormalnego różnicowania. Zdumiewająco mato wiadomo o molekularnych podstawach różnicowania. Jednak wielu badaczy tej dziedziny wiedzy przypuszcza, że dalsze badania nad onkogenami i czynnikami wzrostowymi rzucą światło na naturę zaburzonej kontroli wzrostu i różnicowania, a także na oddziaływania międzykomórkowe wywołane przez komórki nowotworowe. Dlatego też oba te tematy będą przedyskutowane w szczegółach.

Nowotwory są drugą z przyczyn zgonów w USA, po chorobach serca i naczyń. Rozwijają się u ludzi bez względu na ich wiek. Chorobą może być objętych wiele narządów. Częstość pojawiania się nowotworów rośnie z wiekiem tak, że ludzie żyjący dłużej częściej są. na nie narażeni. Niezależnie od indywidualnych cierpień, ekonomiczne straty ponoszone przez społeczeństwo są ogromne.

W LECZENIU CHORYCH Z NOWOTWORAMI BARDZO WAŻNE SĄ TESTY LABORATORYJNE Biochemiczne testy laboratoryjne pomagają w leczeniu chorych na nowotwór. Wiele nowotworów związanych jest z nieprawidłowym wytwarzaniem enzymów, białek i hormonów, których stężenie można mierzyć w osoczu lub surowicy krwi (p. dyskusja nad rozwojem choroby nowotworowej, poniżej). Związki te określa się jako markery nowotworowe. Pomiary stężeń niektórych markerów nowotworowych są dziś integralną częścią leczenia niektórych typów nowotworów (tab. 61-1). Zastosowanie markerów nowotworowych w diagnostyce i leczeniu nowotworów przedstawiono w tab. 61-2. Z badań nad markerami nowotworowymi wynikają 3 główne wnioski (Mclntire, 1984): 1) żaden pojedynczy marker nie jest użyteczny w ocenie wszystkich typów nowotworów lub u wszystkich chorych z danym rodzajem nowotworu; dlatego pożyteczne jest też oznaczanie wielu markerów nowotworowych; 2) markery

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 825 Tabela 61-1. Klinicznie użyteczne markery nowotworowe*. Marker Antygen rakowopłodowy (CEA)

Związany z nim nowotwór Okrężnica, płuca, piersi, trzustka

Wątroba, komórki Alła-fetoproteina (AFP) płciowe Ludzka gonadotropinźr kosmówkowa (hCG)' Kalcytonina (CT)

Trofoblast, komórki płciowe Tarczyca, rak rdzeniasty

Kwaśna fosfataza gruczołu krokowego (PAP) Gruczoł krokowy * Według Mclntire K.R.: Tumor Markers: How useful arethey? Hosp. Pract. (Dec) 1984; 19,55, za zezwoleniem. Tabela 61-Z. Zastosowanie markerów nowotworowych* Wykrywanie: skrining u osób nie wykazujących objawów Diagnostyka: rozróżnianie nowotworów złośliwych od łagodnych postaci Monitorowanie: śledzenie skuteczności leczenia i ocena nawrotu nowotworu Klasyfikacja: wybór terapii i przewidywanie reakcji nowotworu (rokowanie) Stadia: ocena zaawansowania choroby Lokalizacja: scyntygrafia po podaniu znakowanych pierwiastkami radioaktywnymi przeciwciał Leczenie: wprowadzenie cytotoksycznych czynników do komórek zawierających markery " Według Mclntire K.R.; Tumor Markers: How useful arethey?Wosp. Pract. (Dec) 1984,19,55, za zezwoleniem.

są czasami wykrywalne dopiero w zaawansowanych stadiach choroby nowotworowej, a rzadziej w początkowych stadiach jej rozwoju, gdzie ich użyteczność byłaby większa; 3) oceniając zastosowanie markerów przedstawionych w tab. 61-2 można stwierdzić, że najbardziej użyteczne są one w monitorowaniu skuteczności leczenia i przy wczesnym wykrywaniu nawrotów.

PRZYCZYNĄ NOWOTWORÓW MOGĄ BYĆ CZYNNIKI FIZYCZNE, CHEMICZNE I BIOLOGICZNE Czynniki wywołujące nowotwory należą do 3 wielkich grup: energia promieniowania, związki chemiczne i wirusy.

Energia promieniowania może być rakotwórcza

Promieniowanie ultrafioletowe, promieniowanie X i promieniowanie y są mutagenne i rakotwórcze. Promieniowanie ultrafioletowe może wywołać powstawanie dimerów. Leżące blisko siebie zasady azotowe mogą na drodze eliminacji być przyczyną powstawania miejsc apurynowych i apiryrnidynowych. Mogą nastąpić pęknięcia w pojedynczym lub podwójnym łańcuchu, a nawet sieciowanie (crosslinking). Uszkodzenia DNA uważa się za główny czynnik w mechanizmie powstawania nowotworów wywołanych energią promieniowania, ale szczegóły nie są jeszcze znane. Mechanizmy naprawy DNA omówiono w rozdz. 38. Niezależnie od bezpośrednich wpływów na DNA promieniowanie X i promieniowanie y mogą spowodować powstawanie wolnych rodników w tkankach. Powstające w wyniku tego oddziaływania wolne rodniki *OH, nadtlenki i inne rodniki mogą oddziaływać z DNA i innymi makromolekularni, prowadząc do uszkodzeń molekularnych i być może w ten sposób uczestniczą w kancerogenezie wywołanej energią promieniowania.

Wiele związków chemicznych jest rakotwórczych

Wiele związków chemicznych ma właściwości rakotwórcze (tab. 61-3); strukturę trzech najszerzej badanych pokazano na ryc. 61-1. Większość związków ujętych w tab. 61-3 testowano na gryzoniach i innych zwierzętach. Jednak wiele substancji chemicznych jest związanych z powstawaniem nowotworów u człowieka. Zakłada się, że niemal 80% nowotworów u ludzi wywołanych jest czynnikami środowiskowymi. Narażenie na te związki może być związane z charakterem pracy zawodowej (np. benzen,

azbest), dietą (np. aflatoksyna Bv która jest wytwarzana przez pleśń Aspergillus fłavus i czasem znajdowana jako zanieczyszczenie orzeszków ziemnych lub innych produktów spożywczych), stylem życia (np. palenie papierosów) lub z innymi drogami (np. niektóre substancje

826 / ROZDZIAŁ 61 Tabela 61-3. Wybrane chemiczne Klasa kancerogeny

Związek Poiicykliczne aromatyczne węglowodory Aromatyczne aminy

Benzo[a]piren, dimetylobenzo-antracen 2-Acetylami nof I uoren, (MAB) N-metylo-4-aminoazobsnzen

Nitrozoaminy

Dimetylonitrozoamina, dietylonitrozoamina Różne leki Czynniki slkilujące (np. cyklofosfamid), dietylostilbestrol Naturalnie wystęDaktynomycyna, pujące związki aflatoksyna B, Nieorganiczne Arsen, azbest, beryl, kadm związki chrom

lecznicze stosowane w terapii mogą być rakotwórcze). W tym rozdziale zostaną przedstawione tylko niektóre ważne uogólnienia, które wynikają z badań nad chemiczną kancerogenezą. Struktura. Rakotwórcze mogą być zarówno cząsteczki organiczne, jak i nieorganiczne (tab. 61-3). Rozmaitość tych związków wskazuje, że nie mają one jednej wspólnej cechy strukturalnej, która odpowiedzialna jest za te ich właściwości. Działanie. Najdokładniej zostały zbadane rakotwórcze związki organiczne. Niektóre, takie jak gaz musztardowy i p-propioJakton, oddziałują bezpośrednio z molekułą docelową (bezpośrednie kancęn>geny), inne wymagają uprzedniego metabóhzowania, aby stały się rakotwórcze (prokancerogeny) (p, rozdz. 60). Proces, w którym w wyniku jednej lub wielu enzymatycznych reakcji prokancerogeny zamieniają się w kancerogeny, nosi nazwę aktywacji metabolicznej. Każdy związek pośredni utworzony w wyniku przemian jest bliskim

—\

Benzo[i]piren

/=V

kancerogenem, a końcowy związek, który reaguje ze składnikami komórkowymi, np. z DNA, jest ostatecznym kancerogenem. Sekwencja wydarzeń jest następująca: Prokaneerogen . Bliski kancerogen A■ ■ > Bliski kancerogen B-*Ostateczny kancerogen

Prokancerogen sam w sobie nie jest związkiem reaktywnym chemicznie, podczas gdy kancerogen ostateczny jest zwykle bardzo reaktywny. Co najmniej 2 reakcje chemiczne są niezbędne w celu przekształcenia prokancerogenu, jakim jest 2-acetylo-amino-fIuoren (2-AAF), w kancerogen ostateczny, jakim jest siarczanowy ester N-hydroksy-AAF. Ważnym uogólnieniem jest, że ostateczny kancerogen jest zwykle związkiem elektrofilowym (tzn. cząsteczki są ubogie w elektrony), który łatwo atakuje nukleofilowe (bogate w elektrony) grupy w DNA, RNA i w białkach.

Metabolizm chemicznych kanceroge-

nów. Metabolizm pro kancerogen ów i innych ksenobiotyków związany jest z udziałem monooksygenaz i transferaz (p. rozdz. 60). Enzymy odpowiedzialne za metaboliczną aktywację prokancerogenów są z reguły określonymi rodzajami cytochromu P-450 zlokalizowanymi w siateczce śródplazmatycznej. Są to te same enzymy, które uczestniczą w przemianie innych ksenobiotyków, takich jak leki czy zanieczyszczenia środowiska (np. PCB). Poiicykliczne aromatyczne węglowodory są związkami, które wzbudzają duże zainteresowanie w chemicznej kancerogenezie. Specyficzna monooksygenaza uczestnicząca w ich metabolizmie nazywa się cytochromem P-448 lub hydroksylazą aromatycznych węglowodorów. Aktywność enzymów metabolizujących chemiczne kancerogeny jest uzależniona od wielu czynników, takich jak przynależność gatunkowa, uwarunkowania genetyczne, wiek lub płeć. Zmiany w aktywności tych enzymów pomagają wyjaśnić występowa-

COCH

3

2 - Acetam in of I u a ren

N-Metyla-4-am i n oazo Den zen

Ryc. 61-1. Struktura trzech ważnych stosowanych w doświadczeniach kancerogenów

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 827

nie znacznych czasem różnic w aktywności kancerogennej wielu związków chemicznych testowanych u różnych gatunków lub osobników tego samego gatunku. Wiele z wyżej wymienionych zagadnień jest szczegółowo omówionych w rozdz. 60.

Wiązania kowalencyjne. Gdy chemiczne

kancerogeny są podawane zwierzętom lub wprowadzane do kultur komórkowych (co można wykazać za pomocą radioaktywnych kancerogenów), kancerogeny te lub ich pochodne wiążą się zwykle kowalencyjnie z komórkowymi makromolekularni, w tym z DNA, RNA i białkami. Chemiczna natura adduktów powstałych przez interakcję ostatecznych kancerogenów z molekułami, z którymi docelowo mają się związać, została już wyjaśniona. Największe zainteresowania wywołały produkty powstałe z udziałem DNA. Wykazano, że kancerogeny oddziałują z purynami i pirymidynami lub z grupami fosfodiestrowymi DNA. Najczęściej atakowaną cząsteczką jest guanina, a różne kancerogeny są dołączane do atomów N2, N3, N7, O6 oraz O8 tej zasady azotowej. Uszkodzenia DNA. Kowalencyjne oddziaływania bezpośrednich lub pośrednich kancerogenów z DNA mogą być przyczyną wielu rodzajów uszkodzeń: wiek z nich może być naprawionych, jak opisano to w rozdz. 38. Niezależnie od istnienia systemów naprawczych określone modyfikacje w DNA spowodowane chemicznymi kancero genami istnieją przez stosunkowo długi czas. Nie można wykluczyć, że te długo trwające nie naprawione uszkodzenia odgrywają szczególną rolę w generowaniu mutacji istotnych w procesie kancerogenezy. Mutageny. Większość chemicznych kancerogenów jest mutagenami. Wykazano to dzięki zastosowaniu testu Amesa (p, niżej) i innych testów. Na poziomic molekularnym tranzycje, transwersje i inne typy mutacji (p. rozdz. 38 i 40) można wywołać przez ekspozycję niektórych bakterii na ostateczne kancerogeny. Założono, że niektóre typy nowotworów spowodowane są mutacjami zachodzącymi w głównych procesach regulacyjnych w komórkach somatycznych. Bezpośrednie dowody prawdziwości tego twierdzenia są dziś dostępne (p. dyskusja o onkogenach, poniżej). Badanie właściwości rakotwórczych związków chemicznych z użyciem zwierząt jest czasochłonne i drogie, dlatego też opracowano testy skriningowe do określania potencjalnej rako-

twórczości związków chemicznych. Wiele z nich opiera się na wykazaniu właściwości mutagennych chemicznych kancerogenów.Takie badania są znacznie szybsze i mniej kosztowne niż badania dotyczące wykrywania nowotworów u zwierząt. Żaden z tych testów nie jest idealny, ponieważ ostatecznym dowodem rakotwórczości każdego kancerogenu jest wykazanie, że wywołuje on nowotwory u zwierząt. Jedynie test Amesa, oparty na określaniu mutagenności, okazał się przydatny w wykrywaniu potencjalnych kanoerogenów. W teście tym stosuje się specjalnie skonstruowany szczep Salmonella typhimurium, który cechuje się obecnością mutacji (His") w genie, który koduje jeden z enzymów biorących udział w syntezie histydyny. Dzięki temu taki szczep Salmonella nie może syntetyzować histydyny, trz%ba ją więc dodawać do pożywki, aby komórki mogły rosnąć. Jeżeli kancerogen wywoła w miejscu odpowiedzialnym za mutację His~ kolejną mutację, to może ona odtworzyć właściwą sekwencję zamieniając to miejsce na His +. Potomstwo takiej bakterii z mutacją rewersyjną może teraz syntetyzować histydynę i rosnąć na pożywce pozbawionej tego aminokwasu. Takie bakterie można łatwo wykryć, a ich kolonie policzyć na płytkach agarowych. Jednym z problemów stosowania bakterii w testach wykrywania mutagenności związków jest fakt, że nie zawierają one całego spektrum monooksj genaz, które występują u wyższych organizmów. Dlatego też, jeżeli jakiś związek chemiczny wymaga aktywowania, aby nabył właściwości mutagennych lub rakotwórczych, wówczas nie można tego wykazać przy użyciu wymienionych bakterii. Ames przezwyciężył te trudność inkubując związki, które miały być testowane w postmitochondrialnym supernatancie komórek wątroby szczura (tj. we frakcji S-9, którą otrzymuje się jako supernatant wirując homogenat komórek wątroby przy 9000 g przez określony czas). Frakcja S-9 zawiera większość różnych monooksygenaz i innych enzymów potrzebnych do aktywacji potencjalnych mutagenów i kancerogenów. Za pomocą testu Amesa można zidentyfikować ok. 90% znanych kancerogenów. Dziś metoda ta należy do rutynowych testów stosowanych do testowania nowo syntetyzowanych związków chemicznych, szczególnie gdy przewiduje się ich handlowe przeznaczenie lub szerokie zastosowanie w przemyśle. Związki, które dają dodatnią reakcje, powinny być poddane

828 / ROZDZIAŁ 61

dalszym testom, w tym testom na rakotwórczość u zwierząt. Inicjacja i promocja. W niektórych narządach, takich jak skóra czy wątroba, wykazano, że kancerogeneza może przebiegać w co najmniej 2 etapach. Klasycznym przykładem jest skóra. Dwie identyczne powierzchnie skóry określonej grupy myszy powleka się jednokrotnie benzo[s]pirenem. Jeżeli te określone powierzchnie skóry nie są dodatkowo poddane działaniu innych czynników, nowotwory skóry nie rozwijają się (ryc. 61-2). Jeżeli jednak po za-

B

ł1

C

łP j ł _J_

P

P

P

P

P

1

ł t JL Czas

Nio ma nowotworu

Nowotwór

Nie ma nowotworu

Ryc. 61-2. Schematyczna prezentacja etapów inicjacji i promocji w chemicznej kancerogenezie skóry. A — jednorazowa aplikacja inicjatora (np. benzo[a]pirenu) naniesionego na skórę określonej iiczby myszy. B — po naniesieniu inicjatora stosuje się wiele aplikacji promotora {np. oleju krotonowego) w okresach np. tygodniowych, C — najpierw nanosi sie promotor, a potem inicjator. Niezłośliwe nowotwory skóry (brodawczaki) mogą pojawić się w okresie ok. 100 dni; złośliwe nowotwory (raki) wymagają rocznego okresu. Wyżej opisane doświadczenie zostało przeprowadzone w wielu innych wariantach, jecłnak wszystkie potwierdziły zasadniczą tezę inicjacji i promocji. I — inicjator, P — promotor.

stosowaniu benzo[a]pirenu zostanie kilkakrotnie naniesiony na te powierzchnię olej krotonowy, rozwija się stopniowo wiele nowotworów. Naniesienie na skórę jedynie oleju krotonowego (tzn. bez uprzedniego naniesienia benzo[a]pirenu) nie wywołuje nowotworów skóry. Wykonano wiele innych badań będących wariantami tego doświadczenia i wyciągnięto następujące wnioski: I) stadium kancerogenezy wywołane stosowaniem benzo[a]pirenu nazywane jest inicjacją; wydaje się, że jest ona osiągana szybko i jest nieodwracalna; przypuszcza sie, że stadium to związane jest z nieodwracalną modyfikacją DNA, wywołując jedną lub więcej muta-

cji. Dlatego benzo[cc]piren nazywany jest czynnikiem inicjującym; 2) drugie stadium kancerogenezy (trwające miesiące lub lata) jest rezultatem stosowania oleju krotonowego i nazywane jest promocją; olej krotonowy jest więc czynnikiem promocyjnym lub promotorem. Promotory nie są zdolne do wywołania inicjacji; 3) większość kancerogenów może działać zarówno jako czynniki inicjujące, jak i promocyjne. Duża liczba związków chemicznych, włączając fenobarbital i sacharynę, może działać jako promotory w różnych narządach. Aktywny składnik oleju krotonowego jest mieszaniną estrów forbołu. Najaktywniejszym estrem forbolu jest octan 12-0-tetradekanoy!oforbolu (TPA), który wywołuje wiele efektów. Najbardziej interesującym odkryciem było wykazanie, że kinaza białek C może być receptorem dla TPA. Stymulacja aktywności tego enzymu wywołana interakcją z TPA może spowodować fosforylację wielu białek błonowych, co z kolei może prowadzić do zmian w transporcie i w innych funkcjach komórki. Ta ważna obserwacja tłumaczy ścisły związek zachodzący między niektórymi promotorami nowotworowymi a procesami transmembranowej sygnalizacji (p. dyskusja o czynnikach wzrostowych, poniżej). Wiele promotorów nowotworowych działa przez wywołanie zmian w ekspresji genowej. Szczegółowy mechanizm wyjaśniający sposób, w jaki promotory wpływają na transformację komórki będącej w stadium inicjacji w komórkę nowotworową, nie został jeszcze wyjaśniony. Główną ma kro molekułą w procesie kancerogenezy jest DNA DNA jest krytyczną makromolekułą docelową w procesie kancerogenezy. Następujące fakty potwierdzają ten wniosek: 1) komórki nowotworowe rodzą komórki nowotworowe, tj. zasadnicze zmiany odpowiedzialne za cechy nowotworowe przekazywane są z komórek matczynych na komórki pptomne; 2) zarówno promieniowanie, jak i chemiczne kancerogeny są zdolne do wywołania zmian mutacyjnych w DNA; 3) wiele komórek nowotworowych ma nieprawidłowe chromosomy; 4) doświadczenia opisujące transfekcję (p. poniżej), wskazują, że oczyszczony DNA z komórek nowotworowych {onkogeny) może transformować prawidłowe komórki w komórki nowotworowe lub potencjalnie nowotworowe. W kancerogenezie mogą jednak także odgrywać role czynniki epjgenetyczne.

RAK, ONKOGENY 1 CZYNNIKI WZROSTOWE /

Niektóre DNA i RNA wirusy są rakotwórcze

Onkogenne wirusy zawierają DNA lub RNA jako swój genom (tab. 61-4). Tu zostanie opisanych jedynie kilka najważniejszych cech przedstawiciela tych dwóch klas. Tabela 61 -4. Niektóre ważne wirusy nowotworo we Klasa

*

-

Przedstawiciele

DNA wirusy P a po va wirusy

Adenowirusy Wirusy herpes Hepadnawirus

Wirus poty oma SV40 wirus Wirus brodawczaka Adenowirusy 72, 18131 Wirus Epstein-Barr, Wirus herpes-simplex łyp 2 Wirus hepatitis B

RNA wirusy Retrowirus typ C

Retrowirus typ B

Wirusy mięsaka mysiego i białaczki, wirusy mięsaka ptasiego i białaczki, wirusy ludzkiej białaczki komórekT Wirus nowotworu gruczołu piersiowego myszy

Wirus polyoma i wirusy SV40 odegrały ważną rolę w kształtowaniu się współczesnych poglądów na temat wirusowej onkogenezy. Oba są małymi wirusami (zawierają genom ok. 5 kb), a ich koliste genomy kodują tylko ok. 5—-6 białek. W określonych warunkach infekcja odpowiednich komórek tymi wirusami może prowadzić do transformacji nowotworowej. W procesie tym uczestniczą specyficzne białka wirusowe. W przypadku SV40 białka te (często nazywane antygenami, ponieważ wykryto je metodami immunologicznymi) znane są jako T (duże T) oraz t (małe t), a w przypadku wirusa polyoma nazywa się je T, mid-T oraz t. Litera T odnosi się do faktu, że białka te po raz pierwszy wykryto w nowotworach (tumor). Sposób, w jaki białka te powodują transformację nowotworową, jest stale jeszcze badany; antygeny T wiążą się silnie z DNA i wywołują zmiany w ekspresji genowej. Białka te wywierają wiele kooperatywnych zjawisk, co sugeruje, że zmiany te muszą dotyczyć więcej niż jednej reakcji lub procesów, aby wywołać transformację.

829

Niektóre odmiany adenowirusów są zdolne do transformacji określonych komórek zwierzęcych. Duże zainteresowanie wywołał wirus Epsteina-Barr, gdyż jest on związany z chłoniakiem Burkitta i rakiem jamy nosowo-gardłowej u ludzi. Wirus opryszczki (herpes simplex) typu 2 uczestniczy w patogenezie raka szyjki macicy, a wirus zapalenia wątroby (hepatitbi) B może być odpowiedzialny za niektóre przypadki raka wątroby u ludzi. Ze względu na fakt, że większa część wiedzy o onkogenach w ostatnich latach pochodzi z badań nad wirusami RNA, w dalszej dyskusji nad onkogenami często będzie o nich mowa.

W WYNIKU TRANSFORMACJI NOWOTWOROWEJ ZACHODZĄ ZMIANY ZARÓWNO MORFOLOGICZNE, JAK I BIOCHEMICZNE Gdy hodowle komórek zakażone są pewnymi onkogennymt wirusami, mogą one ulec transformacji nowotworowej. Najbardziej istotne zmiany morfologiczne i biochemiczne zachodzą przy transformacji opisanej w tab, 61-5. Zmiany te obejmują kształt komórki, ruchliwość, przyczepialność do ścianek naczynia hodowlanego, wzrost i wiele procesów biochemicznych. Są one interpretowane jako zmiany pierwotne powodujące przekształcenia ze stanu normalnego do stanu nowotworowego lub jako zmiany wtórne indukowane przez te pierwsze. Właściwość zrównania transformacji w przybliżeniu z nabywaniem cech nowotworowych ma niezwykłą wagę w badaniach nad nowotworami. Jednak poszukiwanie zmian w komórkach powszechnie uznawanych za transformacje niekoniecznie oznacza, że takie komórki będą wykazywały takie same biologiczne właściwości jak komórki nowotworowe in vivo; muszą one bowiem wywołać nowotwór, gdy zostaną wprowadzone do odpowiedniego zwierzęcego organizmu biorcy.

ONKOGENY ODGRYWAJĄ ISTOTNĄ ROLĘ W KANCEROGENEZIE Onkogeny są genami zdolnymi do wywołania nowotworów. Ich odkrycie wywarto ogromny wpływ na badania podstawowych mechanizmów związanych z kancerogenezą. Onkogeny początkowo uznano za specyficzne geny wiru-

830 / ROZDZIAŁ 61 Tabela 61 -5. Niektóre zmiany wykazywane przez komórki w hodowlach sugerujące transformację nowotworową (np. po infekcji wirusem onkogennym). Najważniejszym testem, dowodzącym zeztośliwienia komórek, jest zdolność komórek do wywołania nowotworu w warunkach in vivo Zmiany morfologiczne: transformowane komórki mają często znacznie bardziej zaokrąglone kształty niż komórki kontrolne Zwiększona gęstość komórek (utrata zdolności do hamowania wzrostu przez kontakt komórek): transformowane komórki często tworzą wielowarstwy, podczas gdy komórki kontrolne rosną w jednej warstwie Utrata przyczepia)ności: komórki transformowane mogą rosnąć bez przyczepiania się do powierzchni naczynia hodowlanego, a często mogą rosnąć w agarze Utrata zdolności zahamowania ruchu komórki wywołanego kontaktem z inną komórką: transformowane komórki rosną jedna na drugiej, podczas gdy prawidłowe zatrzymują swój ruch w momencie kontaktu między sobą Zmiana wielu procesów biochemicznych, w tym nasilenie glikolizy, zmiany na powierzchni komórek (np. zmiany w składzie glikoprotein lub glikosfingolipidów), a także wydzielanie niektórych protęaz Zmiany w strukturach cytoszkieletowych, takich jak filamenty aktyny. Zmniejszone zapotrzebowanie na czynniki wzrostowe i często zwiększone wydzielanie pewnych czynników wzrostowych do otaczającego środowiska

sów wywołujących .{\pwotwory odpowiedzialnych za proces transformacji (wirusowe onkoge«¥). Onkogeny wirusa mięsaka Rousa. Analiza onkogenu wirusa mięsaka Rousa i produktu działania tego genu była szczególnie ważna. Genom tego retrowirusa zawiera 4 geny o nazwach gag, poi, env i src. Zostało to pokazane schematycznie poniżej. poi

9*9 env

src

Gen gag koduje grupę specyficznych antygenów wirusa, poi jest odpowiedzialny za odwrotną transkryptazę charakterystyczną dla retrowirusów, zaś env za określone glikoproteiny otoczki wirusa. Wykazano,' że produktem genu src jest kina/a białkowo-tyrozynowa odpowie-

dzialna za transformację. Odkrycie to miało fundamentalne znaczenie. PozwoJiło bowiem na odkrycie specyficznego mechanizmu biochemicznego (tj. nienormalnej fosforylacji szeregu białek) mogącego wyjaśnić, przynajmniej częściowo, w jaki sposób wirus nowotworowy może spowodować efekty plejotropowe w transformacji. Te krytyczne białka komórkowe, których nienormalna fosforylacja prawdopodobnie prowadzi do transformacji, są stale jeszcze badane. Jednym z nich jest winkulina, białko znalezione w obszarach kontaktu jednej komórki z drugą w foci (w skupiskach komórkowych). Nienormalna fosforylacja win ku liny w foci pomogła wytłumaczyć zaokrąglanie się komórek i ich mniejszą adhezję do podłoża i do siebie samych, co obserwuje się w procesie transformacji (tab. 61-5). Niektóre enzymy gliko liryczne wydają się być białkami docelowymi dla src kinazy bialkowo-tyrozynowej; wyjaśnia to, dlaczego transformowane komórki często wykazują zwiększoną szybkość glikolizy. Produkt działania src mógłby również katalizować fosforylację fosfatydyloinozytolu do fosfatydyloinozytolo mono- i di-fosforanu. Gdy fosfatydyloinozytolo-4,5-difosforan jest hydrolizo wany przez fosfolipaze C, wyzwalają się 2 wtórne związki: trifosforan inozytolu i diacyloglicerol (p, rozdz. 45). Pierwszy z tych związków uczestniczy w uwalnianiu wapnia z wewnątrzkomórkowych miejsc jego spichrzania (tj. z siateczki śródplazmatycznej). Diacyloglicerol pobudza aktywność związanej z błoną plazmatyczną kinazy białek C, która z kolei fosforyluje szereg białek, z których niektóre mogą być składnikami pomp jonowych. W szczególności zaproponowano, że łagodna alkalizacja komórki wywołana aktywacją systemu antyportowego Na+/H+ (p. rozdz. 42) może odgrywać rolę w stymulowaniu mitozy. Dlatego też produkt działania src może oddziaływać na dużą liczbę procesów komórkowych przez jego zdolność do fosfory Iowa nia szeregu białek i enzymów, jak również przez stymulowanie przebiegu syntezy poltfosfoinozytydów.

Kinazy btałkowo-tyrozynowe w komórce normalnej i transformowanej. Obserwacja, że wirus mięsaka Rousa zawiera kinazę białkowo-tyrozynowa wpłynęła znacznie na badania nad fosforyJacją tyrozyny. Obecnie wiadomo, że szereg normalnych komórek cechuje się aktywnością kinaz białko w o-tyrozynowych. Ilość fosfotyrozyny w większości nor-

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 831

malnych komórek jest mała, lecz zwykle zwiększa się w. komórkach transformowanych wirusem onkogennym zawierającym kinazę białkowo-tyrozyn ową, chociaż jego ilość jest stale jeszcze względnie mała i wynosi ok. I % całkowitej ilości fosfoaminokwasów (przede wszystkim fosfoseryny, fosfotreoniny i fosfotyrozyny). Niektóre receptory (np. naskórkowego czynnika wzrostowego, insuliny i czynnika wzrostowego płytek krwi), występujące zarówno w normalnych,, jak i transformowanych komórkach, wykazują aktywność kinaz białkowo-tyrozyn owych, która jest stymulowana po interakcji z jej Ugandami (p. dyskusja o czynnikach wzrostowych, poniżej). Dlatego aktywności kinaz białkowo-tyrozyn owych odgrywają tak ważną rolę w normalnych i transformowanych komórkach.

Onkogeny innych retro wiru sów. Do

onkogenów wirusa mięsaka Rousa można dodać ok. 20 następnych poznanych onkogenów innych retrowirusów. Prawie poiowa produktów działania tych onkogenów wirusowych to kinazy białek, najczęściej typu tyrozynowego. Niektóre onkogeny wirusowe wymienione są w tab. 61-6, razem z ich produktami. Podczas gdy niektóre z umieszczonych w wykazie kodują, kinazy białek, pozostałe kodują różne inne białka cechujące się interesującymi właściwościami biologicznymi. Produkt genu erb-B wiru-

sa ptasiej erytroblastozy jest skróconą postacią receptora dla naskórkowego czynnika wzrostowego, a produkt onkogenu sis wirusa mięsaka małpy (simian sarcoma virus — ssv) jest skróconym łańcuchem B czynnika wzrostowego płytek krwi. Produkt wirusowego onkogenu (fms) wyizolowanego z jednego z wirusów kociego mięsaka jest czynnikiem stymulującym formowanie kolonii przez makrofagi. Z drugiej strony produkt onkogenu myc wykryty w wirusach białaczki mielocytowej kurcząt jest białkiem wiążącym się z DNA, które może kontrolować proces mitozy. Produkt onkogenu ras wirusa mięsaka mysiego wiąże GTP, ma aktywność GTP-azy i wydaje się być spokrewniony z białkami, które regulują aktywność ważnego enzymu błon plazmatycznych jakim jest cyklaza adenylanowa (p. rozdż^S). Protoonkogeny. Głównym problemem podnoszonym przy odkryciu wirusowych onkogenów jest ich pochodzenie. Dzięki technice hybrydyzacji kwasów nukleinowych (p. rozdz, 36) wykazano, że normalne komórki mają sekwencje DNA podobne, jeżeli nie identyczne, do tych jakie występują w wirusowych onkogenach. Widocznie wirusy wbudowywują geny komórkowe do swoich genomów w czasie przechodzenia przez komórki. Przechowywanie takich genów w ich genomach wskazuje, że muszą one wiązać się z pewnymi korzyściami dla tak

Tabela 61-6. Wybrane onkogeny retrowirusów Onkogen Retro wirus Pochodzenie Wirus białaczki mysiej AbeJsona Wirus ptasiej erytroblastozy

Mysz

fes

Wirus kociego mięsaka

Kot

fos

Mysz

myc

Wirus mięsaka myszy Wirus 29 białaczki mielocytowej

sis src

abl

erb-B

Produkt onkogenu

Lokalizacja s u

b komo rko wa

Kinaza białkowo-tyrozyn owa Skrócony receptor EGF Kinaza biafkowo-tyrozyn owa

Błona plazmatyczna Błona plazmatyczna Błona plazmatyczna Jądro

Kurczę

? Białko wiążące DNA

Wirus mięsaka małpy

Małpa

Skrócony PDGF Oańcuch B)

Błony (wydzielanie?)

Wirus mięsaka Rousa

Kurczę

Kinaza biafkowo-tyrozyn owa

Błona plazmatyczna

Kurczę

Jądro

Tyr-tyrozyna; EGF - naskórkowy czynnik wzrostowy; PDGF - czynnik wzrostowy płytek krwi Według Franks L.M., Teich N.M. (red.): Introduction to the Cellularand Motacular Biology of Cancer. Oxford Univ. Press, 1986, za zezwoleniem, zmodyfikowane.

S32 / ROZDZIAŁ 61

ukształtowanego wirusa, prawdopodobnie związanymi ze zmienionymi właściwościami wzrostu transformowanych komórek. Fakt stwierdzenia sekwencji homologicznych w licznych rodzajach komórek eukariotycznych sugeruje, że były one ważnymi składnikami normalnych komórek. Dodatkowo cząsteczki mRNA i białka powstałe z tych normalnych sekwencji wykryto na różnych etapach ich rozwoju lub ich cyklu życiowego. Takie geny, obecne w normalnych komórkach, zostały uznane za protoonkogeny, przy czym zakłada się, że ich produkty odgrywają ważną rolę w normalnym różnicowaniu i w innych procesach komórkowych.

przypadku regulacja ich ekspresji może nie być prawidłowa w komórkach nowotworowych. Skróty używane do określenia onkogenów komórkowych i wirusowych. Skróty c-onc (cellular oncogene, np. c-raś) używane są dla zaznaczenia, że onkogen obecny jest w komórce nowotworowej. Potencjalne onkogeny, obecne w prawidłowych komórkach, tj. ich proto-onkogen — mogą w sposób prosty być nazwane odpowiednio c-onc protoonkogenami (np. c-ras proto-onkogen). Podobnie wirusowe onkogeny oznaczane są jako \-onc (viral oncogene, np. v-ras), a ich pro to-onkogeny jako v-onc proto-onkogen (np. v-ras proto-onkogen).

wych. Doświadczenia, w których użyto DNA wyizolowanego z nowotworów, także dostarczyły dowodów na istnienie onkogenów. Metoda użyta do wykrywania takich komórkowych onkogenów nosi nazwę transferu genu lub transfekcji DNA. W metodzie tej wykorzystuje się fakt posiadania przez określone geny obecne w nowotworach zdolności do transformacji „normalnych" komórek w hodowlach. DNA izoluje się z komórek nowotworowych i dodaje do komórek biorców w hodowli, będących często linia mysich fibroblastów znanych jako komórki linii NIH/3T3. DNA z komórek nowotworowych jest wytrącany fosforanem wapnia (w celu ułatwienia endocytozy) i dodany do komórek N1H/3T3 w hodowli komórkowej. Komórki obserwuje się pod mikroskopem przez okres 1—2 tygodni, tj. czas potrzebny do wytworzenia kolonii komórek transformowanych. Jeżeli transformacja zachodzi, komórki NIH/3T3 zmieniają swój kształt — z płaskich do zaokrąglonych postaci, które rosną w charakterystycznych koloniach. Procedurę tę powtarza się kilkakrotnie, przy czym używa się DNA z komórek transformowanych, co prowadzi do zmniejszenia się ilości DNA nie uczestniczącego w transformacji, lecz który przeniesiono w wyniku transfekcji. Onkogenny DNA można identyfikować (np. metodą southern blotting, używając odpowiedniej sondy dla danego specyficznego genu — p. rozdz. 36). Tą metodą zidentyfikowano w przybliżeniu ok, 20 onkogenów, z których wiele odnosi się do onkogenu ras wirusa miesaka mysiego. Takie komórkowe onkogeny są albo identyczne z normalnymi genami, albo wykazują bardzo niewielkie różnice strukturalne w stosunku do swoich normalnych odpowiedników (p. niżej). W pierwszym

Protoonkogeny są aktywowane do onkogenów w różny sposób Zostanie tu omówionych 5 mechanizmów, które zmieniają ekspresję lub strukturę protoonkogenów, a tym samym uczestniczą w ich przemianie w onkogeny. Upraszczając, proces, w którym transkrypcja jest wzmożona (od zera lub względnie niewielkiego poziomu), określany jest mianem aktywacji. Znajomość mechanizmów związanych z aktywacją jest istotna dla zrozumienia współczesnych poglądów dotyczących kancerogenezy. Insercja promotora. Niektóre retrowirusy nie mają onkogenów (np. wirus małpiej białaczki), ale zdolne są do wywołania nowotworu po dłuższym czasie — miesiącach raczej niż dniach—w porównaniu do tych, które mają onkogeny. Podobnie jak przy innych retrowirusach, gdy te wirusy zakażają komórki, kopia DNA (cDNA) tworzona z ich genomu RNA syntetyzowana jest dzięki odwrotnej trans kry ptazie, a cDN A jest wbudowywany do genomu gospodarza. Ten zintegrowany dwuniciowy cDNA nazywa się prowirusem. Kopie cDNA retrowirusów są oflankowane na obu końcach przez sekwencje nazywane LTR (long terminal repeat), podobnie jak niektóre transpozony („jumping genes") znalezione w bakteriach i w roślinach (p. rozdz. 39). Sekwencje LTR okazały się istotne w mechanizmie prowirusowej intergracji, gdyż mogą one działać jako promotory transkrypcji (p. rozdz. 40). W następstwie infekcji limfocytów B kurcząt przez pewne wirusy białaczki ptasiej prowirusy zostają wbudowane w pobliżu genu myc. Gen myc jest aktywowany przez przylegającą powyżej niego sekwencję LTR działającą jako promotor. W wyniku tej aktywacji dochodzi zarówno do

Onkogeny z komórek nowotworo-

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 833 A

Prowirus LTR myc

LTR

i

myc

myc mRNA Ryc. 61-3. Schematyczne przedstawienie, w jaki sposób insercja promotora może aktywować protoonkogen. A — normalny chromosom kurczęcia mający nieaktywny gen myc. 8 — wirus białaczki ptasiej jest integrowany w chromosomie w postaci prowirusowej, przylegającej do genu myc. Znajdująca stę z jego prawej strony dtuga końcowa powtarzalna sekwencja (LTR — long terminal repeat), zawierająca silny promotor, leży bezpośrednio powyżej genu myc i aktywuje ten gen, wynikiem czego jest transkrypcja myc mRNA. Dla uproszczenia, na rycinie jest przedstawiona tylko jedna nić DNA, inne szczegóły zostały opuszczone.

myc

myc

Prcwirus I LTR i LTR

— myc mRNA Ryc. 61-4. Schemat pokazujący, w jaki sposób insercja sekwencji wspomagających może aktywować protoonkogen. A— normalny chromosom kurczęcia zawierający nieaktywny gen myc. B — wirus małpiej białaczki został zintegrowany w chromosomie w jego prowirusowej postaci, przylegając do genu myc. Jednak w tym przypadku miejsce integracji jest tuż poniżej genu myc i nie może ono działać jako promotor (fyc. 61 -6), Zamiast tego, określona prowirusowa sekwencja działa jako czynnik wspomagający prowadząc do aktywacji położonego wyżej genu myc i do jego transkrypcji. Dla uproszczenia na rycinie został przedstawiony tylko jeden łańcuch DNA, inne szczegóły zostały pominięte.

transkrypcji, w której powstaje myc mRNA, jak i do jego translacji z wytworzeniem odpowiedniego produktu (ryc. 61-3). Rezultatem tych procesów jest nowotwór komórek B, chociaż dokładna rola produktów genu myc w tym procesie nie jest jasna. Podobne zjawiska zachodzą po infekcji różnych komórek innymi retrowirusami.

Insercja sekwencji wzmacniających

transkrypcję. W niektórych przypadkach prowirus jest wbudowany poniżej genu myc, lub też powyżej niego, lecz w postaci odwróconej; pomimo tego gen myc zostaje aktywowany (ryc. 61-4). Taka aktywacja nie może być związana z insercja promotora, gdyż sekwencja promotora musi się znajdować powyżej genu, którego 53

Biochemia

transkrypcje wzmaga i być ustawiona we wiaściwym kierunku 5' do V, Zamiast tego, uczestniczą w tym procesie sekwencje wzmacniające (p. rozdz. 40 i 42) obecne w sekwencjach LTR omawianych retro wirusów. Opisane powyżej 2 mechanizmy, insercje promotora i sekwencji wzmacniających transkrypcje, działają wspólnie w procesie wirusowej kancerogenezy. Prawdopodobnie biorą w niej udział także inne protoonkogeny niż myc.

Transłokacje

chromosomalne.

Jak

wspomniano wyżej, wiele komórek nowotworowych cechuje się nieprawidłowościami chromosomowymi. Jednym z typów zmian chromosomowych w komórkach nowotworowych jest

834 / ROZDZIAŁ 61

translokacja. Podstawą translokacji jest fakt, że fragment jednego chromosomu może zostać oderwany i potem przyłączony do drugiego chromosomu. Jeżeli drugi chromosom oddaje materiał pierwszemu, jest to translokacja wzajemna (reciprocal). Charakterystyczne translokacje stwierdza się w wielu komórkach nowotworowych. Przykładem klinicznie ważnej translokacji jest chromosom Philadelphia, który stwierdza się w przewlekłej białaczce szpikowej. Translokacja obejmuje tu chromosomy 9 i 22.

Chłoniak Burkitta jest szybko rosnącym nowotworem rozwijającym się z ludzkich limfocytów B. W niektórych przypadkach tego nowotworu wykryto wzajemną translokację genów (ryc. 61-5). Wyjaśniła ona mechanizmy aktywacji potencjalnych onkogenów komórkowych. W procesie tym uczestniczą chromosomy 8 i 14. Segment chromosomu 8, który odłamuje się i przechodzi do chromosomu 14, zawiera gen myc. Jak pokazano na ryc. 61-6, transpozycja przesuwa uprzednio nieaktywny gen myc pod

-ł-Pęknięcia

14

14

-Pęknięcie

-Geny ciężkiego łańcucha H ■myc

Ryc. 61-5. Schemat obustronnej translokacjj występującej w chloniakach Burkitta, Chromosomami uczestniczącymi w tym procesie są chromosomy 8 i 14. Segment znajdujący się na końcu ramienia q chromosomu 8 odłamuje się i przemieszcza do chromosomu 14. Odwrotny proces przemieszcza mały fragment z ramienia q chromosomu 14 na chromosom 8. Gen myc zawarty jest w małym fragmencie chromosomu 8, który został przeniesiony do chromosomu 14; jest on umieszczony bezpośrednio przy genach przepisujących ciężkie iańcuchy immunoglobuiin i sam przez to ulega aktywacji, _______________________________________________________________________________

Geny ciężkiego łańcucha H

Geny ciężkiego łańcucha H myc

mRNA

mRJMA

Ry c . 6 1 -6 . Sch e ma t p rze d sta w i a , w ja ki sp o só b tra n sl o ka cj a zwi ą za n a z ch l o ni a ki e m B u rki tta mo że a k ty w o w a ć p ro to o n ko g e n my c. A — m a ł y Ir a g me n t c h r o m o s o m u 1 4 t u ż p r ze d tr a n sl o k a cj a . P o ka za n y s e g me n t zaw i e ra g e n y ko d u j ą ce re g i o n y ci ę żki ch ł a ń cu ch ów i mmu n o gl o b ul i n . B —w wyn i ku tra n sl o ka cji u p rze d ni o ni e a ktyw n y g e n fn yc zn al a zł si ę p o d w pł yw e m se kw e n cj i w sp o ma g a ją cych w g e ni e ko d u j ą cym cię żki e ła ńcuch y i mmun ogl ob ulin i stał się p rzez to a ktyw ny, co p owod uje tran skrypcję . Dla u proszcze nia n a ryci ni e zo sta ł p rze d sta w i on y tyl ko j e d en z d w ó ch ł ań cu ch ó w D NA , in n e szczeg ó ł y zo sta ł y'p o mi n i ę te .

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 835

wpływ sekwencji wzmacniających transkrypcję genów kodujących ciężkie łańcuchy immunoglobulin. Taka translokacja powoduje aktywację transkrypcji genu myc. Widocznie synteza znacznie zwiększonych ilości białka wiążącego DNA, kodowanego przez gen myc, „napędza" lub „zmusza" komórki do przekształceń w kierunku złośliwie ni a, być może wpływając na regulacje mitozy. Mechanizm ten jest podobny do insercji sekwencji wzmacniających transkrypcję z tym wyjątkiem, że raczej chromosomalna translokacja niż integracja prowirusa sprawia, że protoonkogen (np. myc) dostaje się pod wpływem sekwencji wzmacniających transkrypcję. Amplifikacja genu. Amplifikacja niektórych genów (p. rozdz. 39) została wykryta w wielu nowotworach. Jedną z metod stymulacji amplifikacji genów w nowotworach jest podanie leku przeciwnowotworowego metotreksatu, który jest inhibitorem enzymu reduktazy dihydrofolianowej. Komórki nowotworowe mogą stać się odporne na działanie tego leku. Podstawą tego zjawiska jest fakt, że gen reduktazy dihydrofolianowej ulega amplifikacji, co powoduje wzrost aktywności tego enzymu (aż do 400 razy). Te zwielokrotnione kopie genów, których długość dochodzi nawet do 1000 kb lub więcej można wykryć jako homogennie barwiące się regiony w określonych chromosomach. Alternatywnie są one wykrywane jako chromosomopodobne twory określane jako chromosomy DM (double-minute), które są minichromosomami pozbawionymi centromerów. Ta ścisła zależność homogennie barwiących się regionów od obecności chromosomów DM jest stale jeszcze przedmiotem badań. Istnieją dowody sugerujące, że zwiększone ilości produktów określonych onkogenów (takich jak c-ras) wytworzone przez amplifikację genów mogą odgrywać rolę w przekształcaniu komórek nowotworowych w komórki bardziej złośliwe (p. dyskusja o progresji nowotworów, poniżej). Mutacje punktowe. Onkogen v-ras został wykryty w pewnych retro wirusach mysich i szczurzych. Jego produkt, białko p21 o m.cz. 21000 jest pokrewne białkom G, które modulują aktywność cyklazy adenylanowej (p. powyżej i rozdz. 45) i dlatego odgrywają główną rolę w odpowiedzi komórkowej na wiele hormonów i leków. Analiza sekwencji DNA c-ras proto-onkogenu z normalnych komórek ludzkich i z c-ras onkogenu z raka pęcherza ludzkiego wykazała, że różnią się one tylko jedną zasadą,

co powoduje zmianę jednego aminokwasu w pozycji 12 białka p21. Ten intrygujący wynik został potwierdzony analizą c-ras genów innych ludzkich nowotworów. W każdym przypadku wynik był zgodny; geny izolowane z nowotworów wykazywały tylko jedną mutację punktową w porównaniu do c-ras proto-onkogenów z prawidłowych komórek. Pozycja mutacji czasem się zmienia, tak że obserwowano również podstawienie innych aminokwasów. Mutacje w białku p21 wpływają na jego konformację i zmniejszają jego aktywność jako GTP-azy. Mniejsza aktywność GTP-azy może być spowodowana przewlekłą stymulacją aktywności cyklazy adenylanowej, która normalnie jest niewielka, gdy GDP powstaje z GTP (p. rozdz. 45). To pobudzenie aktywności cyklazy adenylanowej może spowodować wiefe zmian w metabolizmie komórki wywołanych zwiększoną ilością cAMP wpływającego na aktywność wielu zależnych od cAMP kinaz białek. Te zjawiska mogą towarzyszyć przechylaniu się równowagi metabolizmu komórkowego w kierunku stanu sprzyjającemu transformacji lub jej podtrzymywaniu.

Uwagi ogólne o aktywacji onkoge-

nów. Z 5 mechanizmów opisanych powyżej 4 pierwsze (insercja promotora, insercja sekwencji wzmacniających transkrypcję, translokacja chromosomu i amplifikacja genowa) wymagają zwiększenia ilości produktu danego onkogenu, co związane jest ze zwiększoną transkrypcją, lecz nie jest związane ze zmianami w strukturze produktu wytworzonego przez onkogen. Dlatego też, być może, zwiększona ilość produktu onkogenu może być wystarczająca do pchnięcia komórki w kierunku zezłośliwienia. Piąty mechanizm, mutacja punktowa, wymaga zmiany w strukturze produktu powstałego z onkogenu, lecz niekoniecznie związany jest ze zmianą ilości tego produktu. Te fakty wskazują, że obecność strukturalnie nienormalnego białka pełniącego funkcję głównego regulatora w komórce może być wystarczającą przyczyną przesunięcia równowagi w kierunku procesu nowotworowego. Oceniając rolę onkogenów w patogenezie nowotworów, należy przypomnieć, że onkogeny wyizolowano jedynie z ok. 15% ludzkich nowotworów. Jest prawdopodobne, że ich aktywacja w co najmniej kilku przypadkach może być jedynie wtórnym zjawiskiem, związanym z transformacją, a nie czynnikiem przyczynowym. Ich udział w chemicznie indukowanych nowotworach doświadczalnych jest dziedziną,

836 / ROZDZIAŁ 61

która dopiero się rozwija. Ostatnio wykazano jednak, że aktywacja c-ras w raku gruczołu piersiowego szczura wywołanego nitrozometyiomocznikiem jest związana w oczywisty sposób ze swoistą mutacją G-*A, co wskazuje, że onkogeny prawdopodobnie uczestniczą w chemicznej kancerogenezie. Ponieważ w badaniach tych użyto jedynie pojedynczej dawki nitrozometylomocznika (bez żadnego promotora) wydaje się, że opisana wyżej mutacja może być

ważnym czynnikiem chemicznej kancerogenezy na etapie jej inicjacji. Potwierdzenie prawdopodobnego udziału onkogenów w zjawiskach inicjacji, promocji, progresji nowotworowej i w powstawaniu przerzutów wymaga jeszcze wielu badań.

Mechanizmy działania onkogenów.

Poniżej opisano 3 mechanizmy, za pośrednictwem których produkty onkogenów mogą stymulować wzrost (ryc. 61-7): 1) mogą one działać S1S

Czynnik wzrostowy

Płyn zewn ątrz ko m ń rkowy

Ca1*

erb-B

Błona plazm styczna Dyla plaż ma

DNA Jądro Białka związane z DNA

t

myc

Prostaglandyny Leukotrieny

Ryc. 61-7. Schemat przedstawia mechanizmy, w wyniku działania których produkty określonych onkogenów mogą zmienić metabolizm komórkowy i tym samym stymulować

wzrost. Cykliczny AM P może wpływać na wieie procesów komórkowych aktywując zależne od cAMP kinazy białek. Kinaza białkowo-tyrozy nowa i kinaza C białek mogą wpływać na aktywność wielu białek docelowych. Jony wapnia wywierają wiele elektów komórkowych podobnie jak prostaglandyny i leukotrieny wytworzone z kwasu arachidonowego. R — receptor, G — białko G, AC — cyklaza adenylanowa, cAMP — cykliczny AMP. Pl — fosfatydyioinozytol, PKC — kinaza C białek, PTK — kinaza białkowo-tyrozynowa, IP a — inozytolo--trifosforan, DAG — diacyfoglicerol, ER — siateczka śródplazmatyczna.

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 837 na główne wewnątrzkomórkowe szlaki metaboliczne uczestniczące w kontroli wzrostu, uniezależ-

niając je od egzogennego czynnika stymulującego. Odpowiednimi przykładami (opisanymi powyżej) są: produkt src działający jako kinaza białko w o-tyrozy nowa, produkt rai- działający jako stymulator aktywności cykłazy adenylanowej i produkt myc działający jako białko wiążące DNA. Każdy z nich może wpływać na kontroJę mitozy, zaś pierwsze dwa przez zjawiska związane z fosfory lacją głównych białek regulacyjnych; trzeba przyznać, że wiedza o wzroście komórki jest niedostateczna, szczególnie w zakresie molekularnych aspektów regulacji mitozy, nawet w komórkach prawidłowych; 2) pro-

dukty onkogeuów mogą imitować działanie polipeptydowego czynnika wzrostowego lub 3) imitować swoisty receptor związany z jakimś czyn-

nikiem wzrostowym (p. poniżej). Badane sa także inne mechanizmy pobudzania wzrostu przez onkogeny.

POLIPEPTYDpWE CZYNNIKI WZROSTOWE SĄ MITOGENNE Badania naci czynnikami wzrostowymi należą do jednej z najszybciej rozwijających się dziedzin we współczesnych naukach biomedycznych. Wyizolowano i częściowo scharakteryzowano wiele różnych czynników (tab. 61-7). Do niedawna tylko niewielkie ilości większości czynników wzrostowych były dostępne dla badań. Dziś jednak geny dla większości czynników wzrostowych zostały sklonowane, potwierdzając ich różnorodność i umożliwiając uzyskiwanie ich w ilościach praktycznie użytecznych dzięki technice rekombinacji DNA. Znane dziś czynniki wzrostowe działają na wiele różnych rodzajów komórek, ną.na komórki krwi, układ nerwowy, tkanki mezehchymalne i nabłonkowe. Wywołują efekt mitogenny w komórkach docelowych, chociaż do wykazania takiego działania muszą być spełnione specjalne wa-

Tabela 61-7. Niektóre polipeptydowe czynniki wzrostowe* Czynnik wzrostowy Pochodzenie

Funkcja

Naskórkowy czynnik wzrostowy <EGF)

Slinianki myszy

Stymuluje wzrost wielu naskórkowych i nabłonkowych komórek

Erytro poety na

Nerka, mocz

Reguluje rozwój macierzystych komórek erytrocytów

Insulinopodobne czynniki wzrostowe 1 i II (IGF-I i IGF-II)

Surowica

Stymulują wbudowywanie siarczanu do chrząstki, są mitogenne dla chondrocytów i wywołują insulinopodobne efekty w wielu komórkach

lnterleukina-1 (IL-1)

Płyn po hodowlany (conditioned media)

Stymuluje produkcję IL-2

lnterleukina-2 (IL-2)

Płyn pohodowlany (conditioned media)

Stymuluje wzrost komórek T

Czynnik wzrostowy komórek nerwowych (NGF)

Mysie slinianki

Tropowe efekty na sympatyczne i niektóre sensoryczne neurony

Czynnik wzrostowy płytek krwi (POGF)

Płytki krwi

Stymuluje wzrost komórek mezynchymalnych i glejowych

Transformujący czynnik wzrostowy {TGF-<x)

Płyn pohodowlany {conditioned media) komórek transformowanych tub nowotworowych

Jest podobny do EGF

Transformujący czynnik wzrostowy (TGF-J3)

Nerka, płytki

Wywiera zarówno stymulujący, jak i hamujący wpływ na niektóre komórki

* Według: Franks L (W., Teich N. M, {red.): tntroduction to the celtuiarandMolecutarBiology otCancst, Oxford Univ, Press, 1986, za zezwoleniem, zmodyfikowane.

838 / ROZDZIAŁ 61

nmki, jak np. pozbawienie komórek w hodowli surowicy, aby stały się „spokojne" (nieruchome) przed eksponowaniem ich na czynnik wzrostowy. Czynnik wzrostowy płytek krwi (PDGF) uwolniony z ziarnistości płytek odgrywa prawdopodobnie rolę w normalnym gojeniu się ran. Różne czynniki wzrostowe wydają się odgrywać główną rolę w regulacji różnicowania się komórek macierzystych układu krwiotwórczego w kierunku różnego rodzaju dojrzałych komórek tego układu. Istnieją także czynniki hamujące wzrost (np. transformujący czynnik wzrostowy TGF-P może hamować wzrost określonych komórek). Dlatego też przewlekła ekspozycja na zwiększające się ilości czynnika wzrostowego lub na malejące ilości czynnika hamującego wzrost może zmienić równowagę wzrostu komórkowego. Czynniki wzrostowe działają endokrynnie, parakrynnie lub autokrynnie Czynniki wzrostowe mogą działać 3 ogólnymi drogami (p. także rozdz. 44): 1) ich efekty mogą być endokrynne, tj. podobne do działania hormonów; mogą one być syntetyzowane gdziekolwiek w organizmie i przemieszczać się drogą krążenia do komórek docelowych; 2) mogą one być syntetyzowane w określonych komórkach, po czym są wydzielane i działają na komórki sąsiednie; jednak komórki syntetyzujące takie czynniki wzrostowe nie są przez nie atakowane, ponieważ brakuje w nich odpowiednich receptorów; ten rodzaj działania nosi nazwę parakrynnego; 3) niektóre czynniki wzrostowe mogą działać na te same komórki, które je syntetyzują. Ten trzeci rodzaj działania nosi nazwę autokrynnego. Dla przykładu czynnik wzrostowy jest wydzielany, a potem przyłączany do tej samej komórki, w której powstał, przy założeniu, że posiada ona odpowiednie receptory. Jest również możliwe, że pewna ilość takiego czynnika nie jest w ogóle wydzielana, działając bezpośrednio w obrębie komórki. Czynniki wzrostowe wpływają na mitozę dzięki przezbłonowej transdukcji sygnałów Stosunkowo niewiele wiadomo o tym, jak czynniki wzrostowe działają na poziomie molekularnym. Podobnie jak hormony polipeptydowe (p, rozdz. 45), muszą one przekazać posłanie poprzez błonę plazmatyczną do wnętrza komórki (przezbłotiowa transdukcja sygnału). W przy-

padku czynników wzrostowych posłanie to będzie oddziaływało na jeden lub więcej procesów związanych z mitozą. Większość czynników wzrostowych posiada receptory białkowe o wysokim powinowactwie w błonach plazmatycznych komórek odbierających posianie. Geny receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i insuliny zostały sklonowane, opracowano także modele ich struktury. Mają one krótkie segmenty przezbłonowe oraz zewnętrzne i cytoplazmatyczne domeny o różnych długościach. Ugandy wiążą się do zewnętrznych domen. Wiele receptorów (np. dla EGF, insuliny czy PDGF) ma aktywność kinaz białkowo-tyrozynowych, przypominających produkt genu-src (p. wyżej). Ta aktywność kinazy zlokalizowana w cytoplazmatycznych domenach powoduje autofosforylację białka receptorowego i także fosforyluje inne białka docelowe. Kompleksy receptor-ligand ulegają endocytozie w opłaszczonych pęcherzykach (p. receptor LDL, rozdz. 27); nie wyjaśniono jeszcze, czy receptory te ponownie wracają do powierzchni komórki. Szczegółowa sekwencja wydarzeń związana z przezbłonowym przekazywaniem sygnałów jest stale jeszcze badana i jest różna dla różnych czynników. Zostanie ona opisana na przykładzie PDGF. Po ekspozycji komórek na PDGF, pobudzana jest fosfolipaza, po czym następuje hydroliza fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanu z wytworzeniem inozytolo-trisfosforanu i diacyloglicerolu (p, \-src, powyżej i ryc. 44-7). Te dwa wtórne przekaźniki mogą odpowiednio spowodować wewnątrzkomórkowe uwolnienie jonów wapnia i stymulować aktywność kinazy białek C przez co oddziałują na wiele reakcji komórkowych. Kolejna hydroliza diacyloglicerolu przez fosfolipazę A2 uwalniając kwas arachidonowy może również spowodować produkcję prostaglandyn i leukotrienów, które same przez się mogą wywołać wiele efektów biologicznych (p. rozdz. 24). Eksponowanie komórek na PDGF może wywołać szybką (minuty do 1-2 godzin) aktywację niektórych komórkowych proto-onkogenów (np. c-myc i c-fos). Wydaje się prawdopodobne, że aktywacja genów, niezależnie od tego, czy są to geny normalne czy protoonkogeny, uczestniczy w mechanizmie działania większości czynników wzrostowych.

RAK, ONKOGENY I CZYNNIK) WZROSTOWE / 839

Istnieją różne rodzaje interakcji między czynnikami wzrostowymi a onkogenami Produkty różnych onkogenów są albo czynnikami wzrostowymi, albo częściami receptorów dla czynników wzrostowych (tab. 61-6). Łańcuch B czynnika PDGF zawiera 109 aminokwasów. Wydaje się prawdopodobne, że łańcuch B jest biologicznie aktywny jako homodimer bez udziału łańcucha A. Odkrycie, że v-sis koduje 100 ze 109 aminokwasów łańcucha B czynnika PDGF ujawniało występowanie bezpośredniej zależności między onkogenami a czynnikami wzrostowymi. To także sugeruje, że autokrynna stymulacja przez PDGF — stanowiąc ciągły bodziec mitogenny — może być ważnym czynnikiem w mechanizmie transformacji komórek przez v~sis. Rzeczywiście, wiele komórek nowotworowych hodowanych w kulturach, wykazuje zdolność wydzielania czynników wzrostowych do otaczającego je środowiska, a także ma receptory dla tych cząsteczek. Analiza sekwencyjna v-erb-B wykazała, że koduje on skróconą postać receptora dla EGF, w którym znaczna cześć zewnętrznych domen została pominięta, lecz zachowana została aktywność kinazy białkowo-tyrozynowej. Sugeruje to, że nienormalna postać receptora EGF kodowana przez \-erb-B może być stale aktywna} jeśli obecna jest w komórkach, symulując obecność receptora związanego ze swoim czynnikiem wzrostowym. Jak w przypadku autokrynnej stymulacji wywołanej przez czynnik PDGF, może to stanowić ciągły mitogenny sygnał „przeprowadzający" komórkę do stanu transformowanego. Transformujący czynnik wzrostowy (TGF-P) początkowo uważano za pozytywny czynnik wzrostowy, gdyż zmuszał on fibroblasty do zachowywania się w taki sposób, jak gdyby były one transformowane. Obecnie wiadomo, że TGF-P hamuje wzrost większości komórek z wyjątkiem fibroblastów. Hamuje on również wzrost komórek nerki małpiej syntetyzujących ten hormon. TGF-fS może aktywować gen sis w fibroblastach. Nie wiadomo jeszcze, w jaki sposób wywołuje on efekt hamujący na inne komórki. Jak zaraz się dowiemy, istnieją inne dowody na to, że określone geny kodują produkty, które opóźniają wzrost komórki oraz, że istnieją geny hamujące powstawanie nowotworów. Tak więc kontrola wzrostu komórki jest bardzo złożona. Uczestniczą w niej bowiem

zarówno pozytywny jak i negatywne czynniki regulujące. W PEWNYCH RODZAJACH NOWOTWORÓW WAŻNA JEST UTRATA GENÓW HAMUJĄCYCH WZROST (ANTY-ONKOGENÓW) Ostatnio uznano, że geny inne niż onkogeny odgrywają istotną rolę w wywoływaniu co najmniej kilku rodzajów nowotworów. Są to geny hamujące wzrost (growth suppresor genes). Geny te działają w odmienny sposób niż onkogeny, gdyż utrata tych genów supresorowych powodu-

je zanik określonych mechanizmów kontroli wzrostu. Ważnym modelem dla zrozumienia działania takich genów jest siatkówczak (retinoblastoma). Retinoblasty są prekursorami komórek czopków siatkówki będących fotoreceptorowymi komórkami siatkówki. Cytologiczne analizy chromosomów ludzkiego siatkowczaka wykazały, że często obserwuje się w nim brak długiego ramienia chromosomu 13. To sugeruje, że doszło do utraty genu o istotnym znaczeniu w tej części chromosomu 13. Gen ten nazywano genem Rb. Przypuszcza się, że produkt tego genu wykazuje właściwości hamowania wzrostu w normalnych komórkach. Właśnie tego genu brak w siatkówczaku. Genetyczne badania wykazały, że do tego, aby powstał nowotwór, muszą zostać inaktywowanc obie kopie genu Rb.

Ostatnio okazało się, że być może istnieje dość znaczna liczba genów, których produkty działają jako ujemne regulatory wzrostu komórki i obie kopie tych genów muszą być inaktywowane, aby powstał nowotwór. Takie geny hamujące wzrost nazywa się także anty-onkogenami lub genami hamującymi wzrost nowotworu

(tumor-suppressing genes). Utratę anty-onkogenów uznano już za istotny czynnik w patogenezie jednego z rodzajów nowotworów gruczołu piersiowego, nowotworu Wilmsa w nerce i raka drobnokomórkowego płuc. Ostatnio udało się sklonować normalny gen Rb, dzięki czemu będzie możliwa dokładna analiza produktu tego genu. Inne badania sugerują, że produkt genu Rb zlokalizowany jest w jądrze i że może on działać jako czynnik modulujący ekspresję genów. Poszukiwanie anty-onkogenów i identyfikacja sposobów ich działania jest wielkim osiągnięciem współczesnych badań nad rakiem. Z terapeutycznego punktu widzenia pojawia się

840 / ROZDZIAŁ 61

podniecająca możliwość, że wprowadzenie normalnych chromosomów kodujących czynniki hamujące wzrost do określonych komórek nowotworowych mogłoby skorygować ich zmienioną szybkość wzrostu.

Tabela 61-8. Zmiany biochemiczne często wykrywane w szybko rosnących komórkach nowotworowych Zwiększona aktywność reduktazy nukleotydowej Zwiększona synteza RNA i DNA Zmniejszony katabolizm pirymidyn Nasilona glikoliza tlenowa i

ZŁOSLIWIENIE KOMÓREK NOWOTWOROWYCH WYDAJE SIĘ POSTĘPOWAĆ Jeżeli komórka raz stanie się komórką nowotworową, to skład i zachowanie się jej i komórek z niej powstałych nie jest cechą stałą. Zamiast tego nasila sie tendencja do zlośliwienia komórek. Przejawia się to wzrostem liczby nienormalnych kariotypów, nasileniem szybkości wzrostu, wzrastającą inwazyjnością i tworzeniem przerzutów. Zjawisko progresji znajduje swoje odbicie w niezwykłej niestabilności genomu komórek nowotworowych. Może ono być związane z aktywacją dodatkowych onkogenów. Komórki ze zwiększoną szybkością wzrostu korzystają ze szczególnych przywilejów. Ważne jest rozróżnienie profilów biochemicznych komórek, które dopiero co zostały transformowane, od tych, które cechuje szybki wzrost, a które są już wysoce złośliwymi komórkami nowotworowymi. Pierwsze mogą wykazywać kilka różnic w porównaniu z normalnymi komórkami niezależnie od ich zasadniczych zmian prowadzących do powstania nowotworu (np. aktywacja jednego lub kilku onkogenów) oraz cechy zwykle związane z transformacją (tab. 61-5). Analiza takich komórek może ujawnić główne biochemiczne zmiany wywołujące transformację. Biochemiczne profile wysoce zezłośliwionych komórek mogą być całkowicie odmienne od komórek normalnych. Opisano wiele zmian w profilach enzymatycznych i innych parametrach biochemicznych (tab. 61-8), przy czym niektóre z nich są wtórne, 2wiązane z szybkim wzrostem, inne zaś są prawdopodobnie związane z niestabilnością chromosomów. Szybko rosnące komórki wykazują tendencje do maksymalizowania procesów anabo licznych

związanych ze wzrostem (np. synteza DNA i RNA) i zmniejszania funkcji kata boi icznych (np. katabolizm pirymidyn), a także nie wykazują swoistych funkcji cechujących ich normalnych przodków. Innymi słowami wszystkie procesy toczące się w takich komórkach dotyczą prawie wyłącznie wzrostu. Wykazują one także zmiany biochemiczne, świadczące o zmienionej

anaerobowa Zmiany w profilach izoenzymów, często zbliżone do profilu płodowego Synteza białek pfodowych (np. antygen rakowo-- płodowy) Utrata zróżnicowanych funkcji biochemicznych (np. zmniejszona synteza wyspecjalizowanych białek) Nieodpowiednia synteza określonych czynników wzrostowych i hormonów

regulacji genów, np. syntetyzują niektóre białka płodowe (niektóre z nich mogą być użyte jako markery nowotworowe, p. tab. 61-1), czynniki wzrostowe lub hormony. Wydaje się nieprawdopodobne, że analizy takich komórelr mogą ujawnić pierwotne główne zmiany odpowiedzialne za transformację, częściowo dlatego, że są one zamaskowane przez współwystepujące liczne zmiany wtórne, związane z progresją. Pomimo tego jednak, znajomość biochemicznych profilów takich komórek jest niezwykle użyteczna przy wyborze chemioterapii, gdyż jest to dokładnie ten typ komórek, które chcieliby zwalczać onkolodzy.

NAJBARDZIEJ NIEBEZPIECZNĄ CECHĄ KOMÓREK NOWOTWOROWYCH JEST ZDOLNOŚĆ DO TWORZENIA PRZERZUTÓW Przerzutami określa cię rozsianie komórek nowotworowych z miejsca ich pierwotnego powstania do innych tkanek, gdzie mogą one rosnąć jako wtórne nowotwory. Przerzuty są największym problemem w chorobie nowotworowej. Analiza powstawania przerzutów u ludzi jest bardzo złożonym procesem, a wiedza o biochemicznych podstawach tego zjawiska jest bardzo ograniczona. Ponieważ proces ten jest wyrazem upośledzonych interakcji między komórkami, wiele uwagi poświęcono badaniu biochemii powierzchni komórek prawidłowych

RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 841 Tabela 61 -9. Niektóre zmiany wykryte na powierzchni komórek nowotworowych* Zmiany przepuszczalności Zmiany właściwości transportowych Zmniejszona adhezja Zwiększona zdolność do aglutynacji przez wiele lektyn Zmiany aktywności yielu enzymów (np. określone proteazy) Zmiany ładunku powierzchniowego Pojawienie się nowych antygenów Utrata określonych antygenów Zmiany w otigosacharydowych łańcuchach określonych glikoprotein Zmiany w składnikach glikolipidów * Według Robbins J.C., Nicolson G.L.: Surfaces of normal and adepted calls; w: Cancer: A Comprehensive Treatise. Vol 4. Becker Ff (red.). Plenum Press, 1975, za zezwoleniem.

i nowotworowych. Udokumentowano występowanie wielu zmian zachodzących na powierzchniach komórek nowotworowych (tab. 61-9), chociaż nie wszystkie z nich są bezpośrednio związane z procesem powstawania przerzutów. Obecnie prowadzi się wiele prac zmierzających do opracowania odpowiedniego modelu zwierzęcego, przydatnego do badań nad zjawiskiem powstawania przerzutów. Wykonano także wiele badań, aby wykazać prawdopodobną rolę wielu proteaz (np. kolagenazy typu 4) i wielu glikoprotein i glikosfingolipidów powierzchni komórek w procesie powstawania przerzutów. Dla przykładu, istnieje prawdopodobieństwo, że zmiany w łańcuchach oligosacharydowych glikoprotein komórkowych (będące

następstwem zrriian aktywności określonych glikozylotransferaz glikoproteinowych) mogą mieć kliniczne znaczenie w pojawianiu się przerzutów. Wyjaśnienie mechanizmów biochemicznych związanych z powstawaniem przerzutów może być podstawą racjonalnego opracowania skuteczniejszych form terapii przeciw nowotworowej.

PIŚMIENNICTWO Barbacid M: Oncogenes and human cancer: Cause or conseąuence? Carcinogenesis 1986;7:1037. Bishop JM: The molecular genetics of cancer. Science 1987; 235:305. Croce CM, Klein G: Chromosme translocations and human cancer. Sci Am (March) 1985; 252:54. Darnell J, Lodish H, Baltimore D: Molecular Celi Biology. Scientific American Books, 1986. Feldman M, Eisenbach L: What makes a tumor celi metastatic? Sci Am (Nov) J988;259:60. Franks LM, Teich N: Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer. Oxford Univ Press, 1986. Hunter T, Cooper JA: Protein-tyrosine kinases. Annu Rev Biochem 1985;54:897. Massague J: The transforming growth factors. Trends Biochem Sci 1985;10:237. Mclntire KR: Tumor markers: How useful are they? Hosp Prąci (Dec) 1984;19:55. Nicolson GL: Celi surface molecules and tumor metastasis: Regulation of raetaslatic phenotypic diversity. Exp Celi Res 1984;150:3. Pitot HC: Fundamentals of Oncology. 3rd ed, Marcel Dekker, 1986. Sporn MB, Roberts AB: Autocrine growth factors and cancer. Naturę 1985;3I3:745. Tannock IF, Hill R (editors): The Basie Science of Oncology. Pergamon Press, 1987. Weinberg, RA: Finding the anti-oncogene. Sci Am (Sept) 1988; 259:44.

6 2

Biochemia a choroby Robert K. Murray, MD, PhD

WPROWADZENIE W rozdziale 1 wyrażono opinię, że znajomość biochemii jest ważna nie tylko dla zrozumienia stanu i podtrzymywania zdrowia, ale również dla zrozumienia skutecznego leczenia chorób. Inaczej mówiąc, znajomość biochemii oferuje racjonalne podejście oparte na podstawach doświadczalnych (a nie na dogmatach) do problemów zdrowia i choroby. W dotychczasowym tekście niniejszego podręcznika przewijały się liczne zaburzenia biochemiczne będące przyczyną utraty zdrowia i powstawania choroby. Z konieczności pojawiały się one w sposób przypadkowy, a nie uporządkowany. Celem niniejszego rozdziału są: Ponowne silne podkreślenie znaczenia po trzeby precyzyjnego określenia nieprawidłowości biochemicznych prowadzących do utraty zdro wia lub rozwoju cfeęroby. Tylko znajomość tych zaburzeń może być podstawą racjonalnej terapii. Zwięzłe przedyskutowanie przyczyn cho roby z biochemicznego punktu widzenia oraz podkreślenie, że przyczyny te uszkadzają struk turę pewnych biologicznie bardzo ważnych cząs teczek (np. DNA) lub też reakcje biochemiczne i procesy, w których te cząsteczki uczestniczą. Przedstawienie kilku ważnych zagadnień dotyczących biochemicznych aspektów chorób w ogóle, w tym w szczególności chorób genetycz nie uwarunkowanych. Ilustracja praktycznego zastosowania bio chemii w medycynie przez przedstawienie wy branych historii chorób dotyczących głównych kategorii chorób. Wypełnianie luki dzielącej naukę bioche mii klasycznej z praktycznym jej wykorzy staniem dla dobra chorych.

WYJAŚNIENIE PODSTAW BIOCHEMICZNYCH STANÓW ZDROWIA I CHOROBOWYCH STANOWI PODSTAWĘ RACJONALNEJ TERAPII Wyjaśnienie podstaw biochemicznych stanów zdrowia i stanów chorobowych jest przeważnie podstawą racjonalnego leczenia. Z tekstu niniejszego rozdziału powinno wynikać, że utrzymywanie stanu zdrowia zależne jest od dostatecznej podaży wody, kalorii, witamin, pewnych składników mineralnych, aminokwasów i kwasów tłuszczowych. Dla przykładu należy przypomnieć, że poznanie fundamentalnej roli witamin w przemianie materii oraz następstw ich niedoboru zapoczątkowało racjonalną terapię szkorbutu - witaminą C, krzywicy - witaminą D, zaś choroby beri-beri - tiaminą. Te przykłady dobitnie ilustrują, że dla racjonalnej i skutecznej terapii chorób niezbędna jest znajomość przyczyny i mechanizmów ich powstawania. Przyznać jednak trzeba, że do dzisiaj nieznane są przyczyny takich chorób, jak choroba Alzheimera, miażdżyca i schizofrenia. Dlatego też, w tych stanach chorobowych leczenie jest zwykle objawowe i empiryczne, a więc nie mające na celu korekty występującej anomalii biochemicznej. Dlatego też leczenie tych chorób jest przeważnie mało skuteczne. Skutki ekonomiczne i ludzkie takiej niewiedzy są ogromne. Podkreślić jednak należy, że nawet znajomość istoty choroby na poziomie molekularnym nie zawsze pozwala na skuteczne jej leczenie albo z powodów technicznych, albo też niemożności pełnej korekty występujących anomalii biochemicznych. Przykładem tego jest niedokrwistośc sierpowata. W chorobie tej nie udało się jeszcze

BIOCHEMIA A CHOROBY / 843

skorygować występującego defektu genetycznego. Szybki postęp w zakresie terapii genowej zapewne sprawi, że twierdzenie o nieuleczalności defektu genetycznego warunkującego niedokrwistość sierpowatą lub inne choroby genetyczne już niedługo będzie historią.

WSZYSTKIE CHOROBY ODZNACZAJĄ SIĘ OKREŚLONYMI ZABURZENIAMI BIOCHEMICZNYMI W tabeli 1-1 przedstawiono główne przyczyny chorób. Jak wiemy, życie na ziemi zależne jest od reakcji biochemicznych. Ustanie tych reakcji prowadzi do śmierci. Zdrowie zależne jest od regulacji tysięcy reakcji biochemicznych przebiegających harmonijnie w komórkach i procesów czuwających nad stałością wewnętrznego środowiska (w odniesieniu do stężenia H+, molalności i składu elektrolitowego płynów ustrojowych itd.). Choroba charakteryzuje się zaburzeniami elementów strukturalnych (np. sekwencji nukleotydów w nici DNA u chorych z chorobami uwarunkowanymi genetycznie), ilością pewnych biocząsteczek albo też zaburzeniami przebiegu reakcji lub procesów biochemicznych. Zaburzenia te, o charakterze przejściowym lub stałym, wywołane są przez czynniki przyczynowe wymienione w tab. 1-1. Prowadzą one często do poważnych zmian środowiska wewnętrznego. Zmianom tym mogą przeciwdziałać mechanizmy wyrównawcze, skuteczne tylko przez określony czas. Opisy przypadków chorobowych podanych w dalszej części rozdziału ilustrują różne aspekty jednej choroby powstałej pod wpływem jednej z przyczyn wymienionych w tab. 1-1. Powyższe spojrzenie na chorobę jest z konieczności znacznym uproszczeniem. Dopatruje się ono przyczyny choroby w anomaliach strukturalnych i czynnościowych komórek, narządów i układów powstałych w następstwie mechanizmów biochemicznych. Chory natomiast przeżywa chorobę będącą nie tylko wynikiem określonych zaburzeń biochemicznych, lecz odbiciem zmian jego bycia, czynników kulturowych i innych. Lekarz musi leczyć całego chorego, uwzględniając czynniki socjalne, psychologiczne, kulturowe, ekonomiczne i inne. Jego postępowanie powinno być jednak zawsze oparte na rzetelnej wiedzy biochemicznej, fizjologicznej i znajomości mechanizmów chorobowych.

ROZPATRUJĄC CHOROBĘ Z PUNKTU WIDZENIA BIOCHEMICZNEGO NALEŻY UWZGLĘDNIĆ SZEŚĆ ASPEKTÓW W tym akapicie przedstawione zostaną ogólne zagadnienia, które są ważne przy rozpatrywaniu biochemicznych aspektów chorób. Wiele chorób jest genetycznie uwarunkowanych. Zagadnienie to jest tak ważne, że zostanie omówione oddzielnie w dal szej części rozdziału. W chorobach zaburzona jest struk

tura, funkcja lub też ilość wszystkich rodzajów biocząsteczek występują

cych w komórkach, Zagadnienie to jest krótko przedstawione1** tab. 62-1 na podstawie kilku przykładów. Biocząsteczki mogą być do tknięte pierwotnie lub wtórnie. W chorobach genetycznych pierwotny defekt znajduje się w DNA, zaś zmiany struktury, funkcji i ilości biocząsteczek są zjawiskami wtórnymi. Zaburzenia biochemiczne będące przyczyną choroby mogą się rozwijać szybko lub wolno. Niektóre choroby roz wijają się szybko, np. śmierć może wystąpić w ciągu minut lub krócej po masywnej zakrzepicy naczyń wieńcowych (patrz niżej przypadek nr 4). Dowodzi to, że niektóre tkanki (szczególnie tkanka mózgowa i mięsień sercowy) są bardzo wrażliwe na brak tlenu i substratów energodajnych (np. glukozy dla tkanki mózgowej). Najlepszym przykładem za leżności człowieka od tlenu jest fakt, że cyjanek (hamujący oksydazę cytochromową) zabija go w ciągu kilku minut. Masywna utrata wody i elektrolitów występująca u chorych zakażo nych przecinkowcami cholery (patrz niżej przypadek nr 3) zagraża życiu już w kilka godzin od wystąpienia choroby. Ogólnie mó wiąc, nagłe i znaczne zmiany w stężeniach i rozmieszczeniu pewnych elektrolitów (np. po tasu) są niebezpieczne ze względu na znaczną wrażliwość min. mięśnia sercowego na takie zmiany. Również znaczne zmiany pH płynów ustrojowych tolerowane są przez ustrój tylko przez krótki okres. Z drugiej strony potrzebne są lata zanim namagazynowane biocząsteczki (nie rozkładane z powodu braku enzymów łizosomalnych) uszkodzą czynność określonych komó rek i narządów. Tego przykładem jest względnie wolne nagromadzanie się sfingomieliny w ko mórkach wątroby i śledziony występujące w ła godnych postaciach choroby Niemanna-Picka.

844 / ROZDZIAŁ 62 Tabela 62-1. Przykłady udziału różnych biocząsteczek w patogenezie chorób

B i ocząsteczka

Zmiana dotyczy

Choroba

Podstawowa przyczyna

DNA

Struktury

Hemoglobinopatia HbS

Mutacja

RNA

Struktury

Określone typy ta łase mi i

Mutacja będąca przyczyną wadliwego „splicingu" mRNA

Białko

Struktury {czynności}

HbS

Mutacja

Lipidy {GMJ

Ilości (wzrost)

Choroba Taya-Sachsa

Mutacja będąca przyczyną nieprawidłowej heksozoaminidazy A

Wielocukier (glikogen)

Ilości (wzrost)

Choroba spichrzenia glikogenu

Mutacja genu kodującego enzym rozkładający glikogen (fosforylaza)

GAG {siarczan dermatanu i heparanu)

Ilości {wzrost)

Zespół Hurler

Mutacja będąca przyczyną nieprawidłowej i d u ron i d azy

Chlorki (Cl")

Stężenia (wzrost)

Mukowiscydoza

Mutacja dotycząca białka bło nowego uczestniczącego w tran sporcie cr

Woda

ilości (spadek)

Cholera

Infekcja Jelita cienkiego przez przecinkowiec cholery

w

pocie

Tabela 62-2- Udziat głównych organelli śród kom orkowych w różnych chorobach

Organełlum

Mechanizm

Choroba(y)

Jądro

Większość chorób genetycz nych

Mutacje DNA

Mitochondrium

Mutacje mttochondrialne DNA wpływające na strukturę Wiele chorób w tym wrodzona neurooatia nerwu wzrokowe - białek (np. dehydrogenazy NADH) kodowanych przez genom mitochondrialny go Lebera i miopatie mitochondriatne

Siateczka śródplazmatyczna

Objawy toksyczne spowodo - Enzymy siateczki śródplazmatycznej, takie jak cytochrom wane związkami chemicznymi P-450, atakują różne substancje chemiczne, przekształ np. CCI4 cając je w postacie toksyczne

Aparat Golgiego

„l-cell" disease

Błona plazmatyczna

Przerzuty komórek nowotwo - Zmiany w zakresie oligosacharydów glikoprotein błon rowych plazmatycznych mają odgrywać ważną rolę w powstawa niu przerzutów

-

Lizosomy

Choroby spichrzeniowe lizosomalne

Obniżona aktywność {spowodowana mutacjami) hydrolaz lizosomalnych jest przyczyną spichrzenia różnych bio cząsteczek

-

Peroksysomy

Zespół Zeilwegera (zespól mózgowo-wątrobowo-nerkowy) i inne

produkcja peroksysomów i mała aktywność pew nych enzymów peroksysomalnych, np. acylotrartsferazy d i h y d ro ksy a ceto n of o sio ra n o wej

-

Brak fosfotransferazy GIcNAc w aparacie Golgiego jest powodem nieprawidłowego transportu enzymów lizosomalnych i wydzielania tych enzymów przez dotknięte komórki

-

BIOCHEMIA A CHOROBY

Powyższe przykłady uzasadniają kliniczny podział chorób na ostre i przewlekłe.

4. Choroby mogą być spowodowane niedoborem lub nadmiarem pewnych

biocząsteczek. To twierdzenie można najlepiej zilustrować rozpatrując stany niedoboru i nadmiaru witaminy A (p. rozdz. 54). Niedobór tej witaminy jest przyczyną kurzej ślepoty (niedowidzenia nocnego). Z drugiej strony nadmiar witaminy A może^być przyczyną wystąpienia ostrych i przewlekłych objawów toksycznych. Podobnie niedobór witaminy D jest przyczyną krzywicy, zaś jej nadmiar niebezpiecznej hiperkalcemii. Mówiąc o niedoborach pokarmowych wskazane jest rozróżnienie niedoborów pierwotnych (spowodowanych podawaniem diety niedoborowej) od wtórnych. Przyczynami niedoborów wtórnych mogą być: 1) wadliwe wchłanianie pokarmów z przewodu pokarmowego, 2) zwiększone zapotrzebowanie, 3) niedostateczne zużytkowanie lub 4) wzmożone wydalanie z ustroju pewnych składników pokarmowych. Liczne choroby lub stany chorobowe mogą być

/ 845

przyczyną jednego lub kilku rodzajów ww. niedoborów pokarmowych. Prawie każde organellum sutakomo rk ow e u c ze s t n i cz y w p a to ge n e zi e

określonej choroby. Twierdzenie to ilust ruje tab. 62-2. W tabeli tej podane są organella komórkowe uczestniczące w patogenezie po szczególnych chorób. Różne mechanizmy biochemiczne mogą być przyczyną podobnych: 1) zmian chorobowych, 2) objawów klinicznych oraz 3) zmian wyników badań laborato ryjnych. Ustrój dysponuje raczej ograniczoną liczbą sposobów reakcji na czynniki patogenne podane w tab. 1-1. Te sposoby reakcji określa się ogólnie jako procesy chorobowe (tab. 62-3). Procesy te mogą jedęt^k być wywołane przez liczne i różnorodne czynniki chorobotwórcze, np. bardzo liczne i różnorodne rodzaje bakterii i wirusów mogą być przyczyną ostrych i prze wlekłych stanów zapalnych. Podobnie powięk szenie wątroby (hepatomegatia) może być spo wodowane spichrzeniem glukozyloceramidu,

Tabela 62-3. Główne procesy chorobowe będące reakcją ustroju na czynniki chorobotwórcze Proces chorobowy

Przykładowa choroba

Przykładowa biocząsteczka uczestnicząca w procesie chorobowym

Zapalenie pluć

Mediatory zapalenia (prostaglandyny leukotrieny)

Zm i a ny z wy rod n ie n i o we Różne czynniki ctiemtczne

Stłuszc2enie wątroby

Etanol

Powiększenie określonego Spichrzanie określonego narządu (np. wątroby) związku

Choroba Gauchera

Glukozy loceramid

Zmiany zanikowe (zmniejszenie wielkości)

Niedokrwienie narządu

Zanik nerki

Niedostateczna podaż składników odżywczych zawartych we krwi

Niedokrwistość

Niedobór witamin i pierwiastków śladowych

Niedokrwistość syderopeniczna

Żelazo

Zmiany nowotworowe

Naświetlania promieniami X

Różne białaczki

Uszkodzenie przez promienie X DNA

Obumarcie komórek

Niedostateczna podaż krwi

Zawał mięśnia sercowego

Brak tlenu

Włóknienie („librosis")

Często występuje po obumarciu komórek

Marskość wątroby

Gromadzenie się kolagenu

Tworzenie się Kamieni

Duże, miejscowe stężenie określonego związku

Tworzenie się kamieni nerkowych u chorych z dną

Kwas moczowy

Zmiany zapalne ostre ub przewlekłe

Przyczyna choroby

Infekcje bakteryjne lub wirusowe

846 / ROZDZIAŁ 62

lecz znacznie częściej uwarunkowane jest niewydolnością krążenia lub przerzutami nowotworowymi. Marskość wątroby może być spowodowana nadużyciem etanolu, spichrzeniem miedzi (choroba Wilsona) lub żelaza (hemochromatoza pierwotna lub wtórna) lub też niedoborem otj-antytrypsyny. Ponadto różnorodne wrodzone błędy metaboliczne mogą spowodować niedorozwoje umysłowe, zaś wiele czynników może wywołać ketozę. Innym przykładem tego, że różne zaburzenia biochemiczne mogą prowadzić do podobnego efektu końcowego, jest lokalne wytrącanie się określonych składników po przekroczeniu ich rozpuszczalności w płynach ustrojowych. Przekroczenie punktu rozpuszczalności tych składników może być spowodowane nadmiernym ich wytwarzaniem lub (i) upośledzonym wydalaniem z ustroju. Końcowym efektem wytrącania się pewnych składników może być np. kamień. Przyczynami kamicy nerkowej mogą być: szczawian wapniowy, fosforan magnezowo-amonowy, kwas moczowy i cystyna. Powodem wytrącenia się wymienionych związków są jednak odmienne mechanizmy biochemiczne. Reasumując należy powiedzieć, że różnorodne przyczyny biochemiczne mogą wywołać podobne zmiany chorobowe (np. marskość wątroby), podobne objawy kliniczne (np. upośledzenie umysłowe) lub podobne odchylenia w zakresie badań laboratoryjnych (np. ketozę). Pomimo tego możliwe jest. opierając się na wywiadach, wynikach badania fizykalnego i wynikach odpowiednich badań laboratoryjnych określenie czynnika wywołującego określoną chorobę lub objaw chorobowy. WCIĄGU NASTĘPNEJ DEKADY NAJPEWNIEJ ZOSTANIE WYJAŚNIONE MOLEKULARNE PODŁOŻE WIĘKSZOŚCI CHORÓB GENETYCZNYCH Ponad 3000 chorób ma podłoże genetyczne. Choroby genetyczne stanowią 10% wszystkich dzieci hospitalizowanych w wielu szpitalach. Również wiele chorób przewlekłych występujących u dorosłych (np. cukrzyca i miażdżyca) wykazuje istotny udział komponentu genetycznego. Wprowadzenie techniki rekombinacji genetycznej oraz metod sekwencjo no wani a DNA zrewolucjonizowały genetykę, w tym genetykę lekarską w szczególności. Przewiduje się, że dzięki tym technikom możliwe będzie wyjaś-

nienie do roku 2000 molekularnego podłoża większości chorób genetycznych. Główne klasy chorób genetycznych to zaburzenia chromosomalne, jednogenowe i zaburzenia wieloczynnikowe Choroby genetycznie uwarunkowane można podzielić na 3 klasy, a mianowicie na: 1) choroby chromosomalne, 2) choroby jednogenowe (dziedziczące się wg praw Mendla) i 3) wieloczynnikowe, w których uczestniczy wiele genów (choroby wielogenowe). Choroby chromosomalne nie zostaną omówione szczegółowo. Są one uwarunkowane brakiem lub nadmiarem chromosomów, delecją części chromosomu lub translokacją. Najlepiej poznaną chorobą chromosomalną jest trisomia 21 (zespół Downa). Choroby te można rozpoznać przez badanie kariotypu (określenie liczby chromosomów) u chorego. Wykazano, że translokacje chromosomalne odgrywają ważną rolę w aktywacji onkogenów (rozdz. 61). Choroby jednogenowe spowodowane są mutacją jednego genu. Mogą one dziedziczyć się 1) dominujące genem autosomalnym, 2) recesywnie genem autosomalnym lub też są 3) sprzężone z chromosomem X. Określenie „dominująco" oznacza, że choroba występuje również wówczas, kiedy z pary chromosomów tylko jeden chromosom dotknięty jest mutacją (czyli choroba występuje nawet u heterozygot). Określenie „recesywnie" oznacza, że choroba występuje tylko u homozygot (obydwa chromosomy jednej pary muszą być dotknięte mutacją). Określenie „sprzężony z chromosomem X" oznacza, że mutacja występuje na chromosomie płciowym X. Ponieważ kobiety posiadają dwa chromosomy X, mogą one być heterozygotami, albo też homozygotami w odniesieniu do zmutowanego genu. Tak więc u kobiet dziedziczenie sprzężone z chromosomem X może mieć charakter dominujący lub recesywny. Z cfrugiej strony, mężczyźni posiadają tylko jeden chromosom X, co oznacza, że zawsze chorują, jeżeli mutacja dotyczy tego właśnie genu. Każda z wymienionych trzech klas chorób genetycznych dziedziczy się wg własnego charakterystycznego sposobu dziedziczenia. Na tym miejscu należy sięgnąć po podręcznik genetyki lekarskiej, w celu uzyskania szczegółowych danych w tym.zakresie. Choroby genetyczne wieloczynnikowe spowodowane są działaniem kilku genów. Dziedziczenie tych chorób nie odbywa się wg klasycznych

BIOCHEMIA A CHOROBY / 847 Tabsla 62-4. Przykłady wszystkich trzech klas chorób genetycznych Klasa

Przykład

Wada chromosomalna

Wada jednogenowa * Wada jednogenowa Wada jednogenowa

Wada jednogenowa

Uwagi

Trisomia 21 (zespół Downa)

Częstość występowania wśród noworodków w miarę wzrostu wieku matki

Przewlekła białaczka szpikowa H i perchoiesterolemia rodzinna

Obecność chromosomu Philadefphta

Dziedziczy się genem autosomalnym jako cecha dominująca, mutacja dotyczy genu kodującego receptor dla LDL Pląsawica Huntingtona Dziedziczy się genem autosomalnym jako cecha dominująca, rozpoznanie prenatalne wady jest już możliwe

Dziedziczy się genem autosomalnym jako cecha ręcesywna, większość chorych wykazuje delecję reszty fenyloalaninowej w białku błonowym regulującym transport jonu chlorkowego^ Hemoglobinopatia HbS Dziedziczy się genem autosomalnym jak cecha recesywna. Mutacja dotyczy zamiany Gtu na Val w pozycji 6 łańcucha f) globiny Mukowiscydoza

Wada jednogenowa

Fenyloketonuria

Dziedziczy się genem autosomalnym jako cecha recesywna. Wada spowodowana jest mutacją genu kodującego hydroksylazę fenyloalaninową

Wada jednogenowa

Dystrolia mięśni typu Duchenne'a

Dziedziczy się genem X; wada dotyczy syntezy dystrofiny

Wada jednogenowa

Hemofilia

Dziedziczy się genem X. Wada dotyczy syntezy czynnika VIII krzepnięcia (AHG)

Wada wielogenowa

Choroba niedokrwien- Podłoże genetyczne choroby jest złożone; badania na serca polimorfizmu DNA kodującego lipoproteiny zapowiadają możliwość wykrywania osobników genetycznie predysponowanych

Wada wielogenowa

Samoistne nadciśnienie Sugerowana jest również teoria dopatrująca się przyczyny choroby w mutacji jednogenowej tętnicze

praw Mendla. O tej klasie chorób genetycznych wiadomo mniej niż o chorobach innych klas, chociaż odgrywają one coraz większe znaczenie w powstawaniu społecznych chorób wieka dorosłego, do których zalicza się niewydolność naczyń wieńcowych oraz nadciśnienie tętnicze. W tabeli 62-4 podano kilka ważnych przykładów chorób genetycznych dla każdej z wymienionych trzech klas. Mutacje genomu mitochondHalnego mogą być również przyczyną choroby Ludzki mitochondrialny DNA liczy w przybliżeniu 16,5 kilozasad i koduje 13 białek, przy czym wszystkie one są składnikami procesu fosforylacji oksydacyjnej. Mitochondrialny DNA różni się od DNA jądrowego trzema cechami: 1) przekazywany jest przez matkę,

2) zawiera mało intronów i 3) jego kod genetyczny różni się nieco od kodu DNA jądrowego. Ponadto odznacza się dużą częstością występowania mutacji oraz polimorfizmem. Stwierdzono, że mutacje mitochondrialnego DNA uczestniczą w patogenezie niektórych miopatii mitochondrialnych oraz we wrodzonej neuropatii nerwu wzrokowego Lebera (LHON). Miopatie mitochondrialne charakteryzują się osłabieniem mięśni szkieletowych, zmianami biochemicznymi mitochondriów oraz obecnością w bioptatach mięśniowych „nierównych" (poszarpanych) włókien czerwonych („ragged red fibers"), zaś LHON — szybko postępującą, obustronną utratą widzenia centralnego, spowodowaną zwyrodnieniem siatkówki i nerwu wzrokowego. W miopatiach mitochondrialnych stwierdzono występowanie różnych delecji

848 / ROZDZIAŁ 62

w mitochondrialnym DNA. Wykazano również, że przyczyną LHON jest tranzycja G na A w pozycji 11778 getiomu mitochondrialnego, w wyniku której dochodzi do zmiany struktury podjednostki 4 dehydrogenazy NADH. Choroby genetyczne wywołują zmiany wpływające na strukturę DNA, RNA lub białek oraz na czynność komórek Mutacja genu strukturalnego może być przyczyną zmiany struktury kodowanego przez niego białka, niezależnie od tego, czy białkiem tym jest enzym, czy białko pozbawione działania katalitycznego. Jeżeli białkiem tym jest enzym, występująca mutacja może być przyczyną wrodzonej wady metabolicznej. Koncepcję wrodzo-

nej wady metabolicznej po raz pierwszy zaproponował angielski klinicysta — Sir Archibald Garrod w pierwszych latach bieżącego stulecia, opierając się na wynikach badań alkaptonurii, bielactwa (albinizmu), cystynurii i pentozurii. Wrodzona wada metaboliczna jest zaburzeniem genetycznym, w którym dotknięty jest swoisty enzym. Ten ostatni jest przyczyną bloku metabolicznego, który może mieć następstwa chorobowe. Wyjaśnia to następujący przykład. Poniższe równania odzwierciedlają prawidłowy przebieg reakcji enzymatycznej oraz sytuację występującą w bloku metabolicznym:

T

T

I op

E*

Wzrost fenyloalaniny II—> Spadek syntezy tyrozyny

Z równania tego wynika, że chorzy na PKU syntetyzują mało tyrozyny oraz charakteryzują się wzrostem stężenia w osoczu krwi i w moczu fenyloalaniny i kwasu fenylopirogronowego oraz innych metabolitów fenyloalaniny. Niedobór tyrozyny (jest ona prekursorem melaniny) jest przyczyną jasnej karnacji skóry. Dokładny patomechanizm objawów klinicznych występujących w PKU nie jest jasny, chociaż przypuszcza się, że jest spowodowany niedoborem tyrozyny, niezbędnej do syntezy białek i neuroprzekaźników w ośrodkowym układzie nerwowym, lub też hamującym wpływem wysokich stężeń fenyloaiartiny na przezbłonowy transport innych aminokwasów w neurocytach. Krytycznymi momentami bloku enzymatycznego są: a) zmiana wydajności szlaku metabolicznego spowodowana niedostateczną syntezą odpowiedniego produktu lub (i) b) nagromadzenie się substratu znajdującego się przed blokiem Lub niefizjologicznych jego metabolitów oraz c) zmiany regulacji mechanizmu sprzężenia zwrotnego

(o ile mutacja dotyczy miejsca allosterycznego enzymu). Wszystkie wymienione skutki bloku enzymatycznego mogą mieć działanie patogenne. Ważne jest również zrozumienie, dlaczego niektóre wrodzone wady metaboliczne są nie-

Wzrost X, Y Sytuacja normalna

Wzrost kwasu fenyi rog r o no weg o

E*

Wzrost S I)-» Spadek P *V Blok

S oznacza substrat, P — produkt reakcji katalizowanej przez enzym prawidłowy, E, E* — enzym zmutowany, zaś X i Y — alternatywne produkty substratu S. Jak widać, blok enzymatyczny może być przyczyną: 1) zmniejszonej produkcji związku P, 2) nagromadzenia się substratu S znajdującego się przed blokiem oraz 3) wzmożonego wytwarzania i gromadzenia się metabolitów alternatywnych X lub Y substratu S. Wszystkie wymienione trzy skutki bloku enzymatycznego mogą mieć znaczenie patologiczne. W fenyloketonurii (PKU) (p. rozdz. 32) enzymem zmutowanym (Ex) jest hydroksylaza fenyloalaninowa. W wyniku- bloku enzymatycznego dochodzi do zmian metabolicznych przedstawionych niżej podanym równaniem:

szkodliwe. Dotyczą one najczęściej końcowych etapów metabolizmu. W tych wadach ani niedobór określonego produktu, ani też nagromadzenie się pewnego substratu (prekursora) reakcji katalizowanej przez zmutowany enzym nie mają szkodliwego wpływu na czynność komórek. Taka sytuacja ma miejsce u chorych z pentozurią. Z drugiej strony właściwie nieznane są wrodzone wady cyklu kwasu cytrynowego, odgrywającego główną rolęAv metabolizmie ustrojowym. Występowanie takiej wady mogłoby mieć zgubny wpływ na komórki i kończyć się śmiercią już na bardzo wczesnym etapie rozwojowym. Jeżeli mutacja dotyczy genu strukturalnego dla białka meenzymatycznego, wówczas w wielu

przypadkach syntetyzowane jest biatko zmutowane. Zamiana nawet jednego aminokwasu w sekwencji ani i no kwasowej (taka sytuacja zachodzi w hemoglobinopatii HbS) może mieć zgubne skutki chorobowe (p. rozdz. 7). Zmuto-

BIOCHEMIA A CHOROBY / 849 wane białka mogą wykazywać nieprawidłową

czynność (np. pewne zmutowane hemoglobiny), mogą ulec agregacji (np. hemoglobina HbS) lub też mogą przenikać bardzo wolno poprzez komó-

rki (np, arantytrypsyna). Tabela 62-5 przedstawia różne poziomy manifestacji zmian patologicznych występujących w chorobach genetycznych. Pokazane w tabeli poziomy nie wykluczają się nawzajem, wiadomo bowiem, że wszystkie choroby genetyczne zależne są od zmian strukturalnych DNA.

Tabela 62-6. „Poziomy" manifestacji zmian patologicznych w chorobach genetycznych. Wszystkie choroby genetyczne spowodowane są zmianami DNA. Jest jednak pożyteczne uwzględnienie „poziomu" manifestacji zmian patologicznych tych chorób. Jak widać w tabeli, niektóre choroby przejawiają się na dwóch poziomach i większość defektów w zakresie biosyntezy białek nieenzymatycznych wpływa na czynność narządów. Leczenie chorób genetycznych polega na oddziaływaniu na wymienione „poziomy" manifestacji poszczególnych defektów DNA Zmiany DNA jądrowego (różne rodzaje mutacji). Zmiany DNA mitochondHalnego (różne rodzaje mutacji) RNA Zmieniony „splicing" (pewne przypadki talasemii) Białka a. Zmutowane enzymy: obniżona aktyw ność enzymatyczna, brak enzymu, wzmo żona aktywność enzymatyczna (rzadko spotykana wada) b. Zmienione biatka nieenzymatyczne; Białka uczestniczące w transporcie różnych związków (anafbuminemia, hemogłobtnopatia HbS) Białka o działaniu ochronnym (agammaglobulinemia, afibrynogenemia) Białka strukturalne (zmiany strukturalne kolagenu w różnych chorobach tkanki łącznej) Hormony białkowe (niedobór tyreoglobuliny w pewnych postaciach wola rodzinnego) Białka kurczliwe (niedobór lub brak dystrofiny w dystrofii mięśni typu Duchenne'aDMD) Białko receptorowe (niedobór lub brak receptorów LDL w rodzinnej hipercholesterole-

cd. tab. 62-5 Skutki wrodzonych wad meta bo licznych na poziomie komórek lub narządów Niedobór produkcji reakcji katalizowanej przez zmutowany enzym (niedobór melaniny w bielactwie) Nagromadzenie toksycznych prekursorów reakcji enzymatycznej katalizowanej przez zmutowany enzym (np. fenyloałaniny i ketokwasów pochodnych fenyloałaniny u chorych z PKU) Zaburzona regulacja mechanizmu sprzężenia zwrotnego (wzmożona synteza metabolitów szlaku porf irynogenezy u chorych z porfirią ostrą przerywaną) Zmieniona czynność błon (brak receptorów LDL w rodzinnejsłsjpercholesierolemii, upośledzone wchłanianie zwrotne cysty ny w kanalikach nerkowych u chorych na cystynurię) Zmienione rozmieszczenie w przedziałach sub kom orkowych (obniżona aktywność fosfotransferazy Glc-NAc jest przyczyną niewłaściwego ukierunkowania sekrecji enzymów lizosomalnych w chorobie „I-celi disease" Zmiany architektury komórek i tkanek Zmiany kształtu komórek (krwinki czerwone kształtu sierpa w hemoglobin opatii HbS) Zmiany liczby organełli subkomórkowych (spadek biogenezy peroksysomów w zespole Zeilwegera) Zmieniona ilość poza kom orkowej matrix (zmieniony kolagen w chorobach kolagenowych)

W celu uniknięcia trwałych szkód niezbędne jest wczesne rozpoznanie pewnych wrodzonych wad metabolicznych Co należy zrobić przy podejrzeniu występowania wrodzonej wady metabolicznej? Odpowiedź na to pytanie jest ważna, gdyż w niektórych wadach metabolicznych zachodzi konieczność natychmiastowego rozpoczęcia leczenia w celu uniknięcia trwałych szkód (np. u chorych na PKU lub galaktozemię). W tabeli 62-6 podano kilka praktycznych wskazówek w tym zakresie. W tabeli 62-7 zestawiono materiały biologiczne, jakie należy badać oraz testy, jakie należy

850 / ROZDZIAŁ 62 Tabela 62-6. Praktyczne wskazówki w rozpoznawaniu wrodzonej wady metabolicznej

Tabela 62-7. Główne testy używane w diagnostyce chorób genetycznych

Zebranie dokładnego wywiadu dotyczącego występowania w rodzinie chorób genetycznych Wykonanie testów skriningowych w celu wykrycia „patologicznych" składników w płynach ustrojowych (np. oznaczenie kwasu fenylopirogronowego przy podejrzeniu PKU)

Materiały biologiczne poddane badaniom: Osocze, krwinki czerwone, leukocyty, fibroblasty, mocz, bioptaty z dotkniętych narządów, kosmówka (kosmki), komórki owodni

Wykluczenie innych przyczyn choroby u noworodka (stany zapalne, choroby sercowo-naczyniowe) Stwierdzenie w wywiadach upośledzonego rozwoju fizycznego i umysłowego Stwierdzenie powiększenia niektórych narządów (np, hepatomegalii w chorobie Gauchera lub Niemanna-Picka) Obecność niezwykłego zapachu powietrza wydechowego lub moczu (np. u chorych z „chorobą syropu klonowego") Stwierdzenie małego stężenia glukozy we krwi (np. u chorych z glikogenozą) Obniżone pH krwi (np. spowodowane nagromadzeniem się kwasów organicznych u chorych z „chorobą syropu klonowego")

wykonać u osób, a szczególnie płodów podejrzanych o wrodzoną wadę metaboliczną. Pobieranie kosmków kosmówki oraz wykonanie amniocentezy dla zbadania komórek owodni odnosi się tylko do płodów. NIEKTÓRE CHOROBY GENETYCZNE MOŻNA SKUTECZNIE LECZYĆ Ogólnie mówiąc przy leczeniu chorób genetycznych wykorzystuje się jedną z następujących czterech strategii: 1) próbuje się korygować skutki metaboliczne danej wady metabolicznej

podając brakujący produkt lub ograniczając dostępność substratu reakcji enzymatycznej katalizowanej przez zmutowany enzym, 2) podejmuje się próbę substytucji lub aktywacji niedoborowego enzymu względnie substytucji brakującego białka, 3) próbuje się wydalić z ustroju nagromadzony związek lub 4) korygować występującą anomalię genetyczną. W tabeli 62-8

podano przykłady dla każdej z wymienionych czterech strategii. Niektóre z wymienionych metod są bardzo skuteczne w określonych wadach metabolicznych, np. dietetyczne leczenie fenyloketonurii i galaktozemii, leczenie substytucyjne w hemofilii

Testy ogólne; Stężenie glukozy we krwi i w moczu, pH krwi, stężenie amoniaku we krwi, stężenie aminokwasów w osoczu i wydalanie tych związków z moczem, określenie kwasów organicznych w moczu, testy barwne na obecność różnych metabolitów we krwi i moczu Testy swoiste: Oznaczanie produktów (małe stężenie) lub prekursorów (duże stężenie) reakcji enzymatycznej (np, fenyloalaniny lub kwasu fenylopirogronowego w PKU) katalizowanej przez zmutowany enzym Oznaczanie aktywności zmutowanych enzymów w erytrocytach, krwinkach białych, lub bioptatach tkankowych Elektroforetyczne badanie białek (np, dla wykrycia HbS) Analiza metodą Southern blotting polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (restrietion fragment iength polymorphism-RFLP) lub innych anomalii struktury łańcuchów DNA wywołujących specyficzne choroby (np, hemoglobinopatta HbS, pląsawica Huntingtona, dystrofia mięśni typu Duchenne'a itd.) lub sprzężonych z tymi chorobami Identyfikacja dotychczas nieznanych metabolitów w moczu i osoczu metodą GLC-MS (gazowa wysokosprawna chromatografia cieczowa—spektrometria masowa)

i agammaglobulinemii lub usuwanie z ustroju nadmiaru żełaza u chorych na hemochromatozę przez okresowe upusty krwi. Niestety próby substytucji brakującego enzymu najczęściej zostały uwieńczone tylko niewielkim sukcesem. Powodami takiego stanwrzeczy są: a) trudności w uzyskaniu dobrego materiału pochodzenia ludzkiego, z którego można by wyizolować dostateczne ilości brakującego enzymu (w niektórych wadach do tego celu używano łożyska). trudności w dostarczaniu brakującego en zymu do właściwego narządu docelowego oraz trudności w utrzymywaniu enzymu w stanie aktywnym w określonej tkance, jeśli jenzym ten ulega szybkiej degradacji. Wymienione trudno ści są szczególnie duże, jeżeli narządem docelo wym dla brakującego enzymu jest mózg. W tych

BIOCHEMIA A CHOROBY / 8S1 Tabela 62-8. Główne metody dostępne w leczeniu chorób genetycznych. Podzielono je na 4 klasy: 1) próby korekcji skutków metabolicznych występującej wady przez podawanie brakującego produktu lub ograniczenie dostępności substratu dla reakcji katalizowanej przez zmutowany enzym, 2) substytucja lub aktywacja brakującego enzymu lub substytucja brakującego białka nieenzymatycznego, 3) usuwanie z ustroju nagromadzonego związku lub 4) korekcja anomalii genetycznej. (Według Stanbury i wsp.: Matabolic Basis of Inherited Diseases, wyd. 5. McGraw Hill, 1983). Klasa postępowania leczniczego 11 22 33 44

Choroba

Zasada Substytucja brakującego

Wole rodzinne

produktu Ograniczenie substratu Fenyloketonuria Substytucja zmutowanego białka Choroba Gauchera Substytucja brakującego białka Hemofilia Aktywacja zmutowanego enzymu przez podawanie ilości jego kofaktora

Acyduria metyiomalonowa

Zespól Crigglera-Aktywacja zmutowanego enzymu Najjara przez indukcję Galaktozemia* Zastąpienie chorego narządu będącego nosicielem wady przez Wiele możliwych kannarząd zdrowy dydatów Wprowadzenie enzymu do komórek somatycznych lub rozrodczych za pośrednictwem terapii genowej (np. używając wektora retrowirusowego)

Leczenie lub komentarz Podawanie ltyroksyny Dieta uboga w fenyloalaninę Iniekcje pglukozydazy Dożylne podawanie czynnika VII! (AHG) ^""Podawanie witaminy B12 Podawanie fenobarbitalu Transplantacja wątroby Metoda ma jak dotychczas charakter eksperymentalny

* Leczeniem pierwszego rzutu jest podawanie niemowlętom diety ubogiej w laktozę, jeśli rozpoznanie ustalono wcześnie.

przypadkach enzym musi być podany w postaci pokonującej barierę krew-mózg. Pomimo licznych prób dostarczania do narządów docelowych enzymów, DNA lub innych cząsteczek w postaci liposomów jak dotychczas nie zanotowano spektakularnych sukcesów. Dzięki ogromnym postępom na polu rekombinacji DNA (p. rozdz. 42) strategii czwartej, tj. korekcji anomalii genetycznej poświęcono wiele prac doświadczalnych i zasugerowano nowe rozwiązania. Ttrupia genowa mogłaby polegać na: 1) substytucji genowej, 2) korekcji nieprawidłowego genu lub 3) wzmocnieniu nieprawidłowego genu. Substytucja genowa (1) polegałaby na usunięciu całego zmutowanego genu i wprowadzeniu na jego miejsce genu prawidłowego, zaś korekcja genu na naprawie jedynie zmutowanego odcinka genu. Żadna z wymienionych dwóch metod nie doczekała się jeszcze praktycznego rozwiązania. Metoda trzecia polega na wprowadzeniu do komórki obcego materiału genetycznego w celu wyrównania niedoboru produktu spowodowanego genem zmutowanym, np. jest już możliwe

wprowadzenie normalnego genu do zmutowanej komórki (drogą transfekcji, mikroiniekcji lub za pomocą wektora wirusowego) oraz spowodowanie jego ekspresji. Należy jednak zauważyć, że taka komórka zawiera zarówno gen zmutowany, jak i gen obcy. Ponadto obcy gen wprowadzony w przypadkowe miejsce chromosomu może przerwać (przez mutagenezę insercyjną) ekspresję pewnych genów gospodarza i nie podlega normalnym mechanizmom regulacyjnym. Użyto wiele pomysłowych metod w celu umieszczenia genu we właściwym dla niego miejscu w komórce. Wiele uwagi poświęcono wektorom retrowirusowym w celu naprawienia wady genetycznej w komórkach szpiku kostnego, tj. w komórkach, z którymi łatwo manipulować zarówno in vivo, jak in vitro. Realna jest również metoda łransgeniczna, lecz również w tej metodzie występuje problem precyzji insercji materiału genetycznego oraz wiek innych problemów technicznych i etycznych. Pomimo tych trudności terapia genowa leży w centrum badań medycznych i rokuje szybki postęp.

852 / ROZDZtAŁ 62

OPIS PRZYPADKÓW Wprowadzenie W następnych podrozdziałach przedstawiono opis 8 przypadków, pr2y czym każdy z nich dotyczy jednaj z 8 przyczyn chorób wymienionych w tab. 1-1. Przewodnią ideą tych opisów jest przedstawienie znaczenia znajomości biochemii dla zrozumienia istoty chorób występujących u przedstawionych chorych. Listę przyczyn chorób podaną w tab. 1-1 można b\ rozszerzyć np. o przyczyny „nowotworowe" lub „psychologiczne". Z drugiej strony przyczyn} nowotworów można by omówić w punkcie ,.przyczyny fizyczne" (np. nowotwory wywołane napromieniowaniem promieniami X), „przyczyny biologiczne" (uwzględniając rolę wirusów onkogennych w patogenezie niektórych nowotworów) iub również w punkcie „prz\czyny chemiczne" (ok. 80% nowotworów występujących u człowieka jest pochodzenia „chemicznego"). Ponadto w ostatnich latach wykazano u niektórych chorych genetyczne uwarunkowanie schizofrenii i psychozy maniakalnej, co może mieć znaczenie dla klasyfikacji przyczyn wymienionych chorób. Większość opisanych przypadków dotyczy chorób często lub względnie często spotykanych. Tylko dwa z nich (przypadek I i 7) dotyczą chorób względnie rzadko występujących. Pomimo tego te ostatnie przypadki zostały włączone do niniejszego podrozdziału, ponieważ pięknie ilustrują a) przyczynę choroby, do której zostały zaszeregowane oraz b) dwa biologiczne zjawiska, tj. znaczenie naprawy DNA i przeciwciał jako mechanizmów ochronnych. Do opisu,każdego przypadku dołączono schematyczny diagram podsumowujący mechanizmy biochemiczne uczestniczące w patogenezie przedstawionych chorób. Przypadek 1. Skóra pergaminowa barwnikowa {xeroderma pigmentosum) (ryc. 62-1). Klasyfikacja. Przyczyna fizyczna, ekspozycja na światło ultrafioletowe. Wywiady i badanie fizyczne. Do Kliniki Dermatologicznej został przyjęty 12-letni chłopiec z powodu guza skóry na prawym policzku. Chłopiec ten ciągle unikał ekspozycji na promienie słoneczne z powodu tworzenia się pęcherzy na skórze. Na skórze stwierdzono nieregularnie rozrzucone obszary przebarwienia i lekkiego zaniku. Uwzględniając obecność guza skóry w tak młodym wieku, unikanie słońca w wywiadach oraz występowanie ww, pozostałych łago-

Ekspozycja na promienie ultrafioletowe (UV) jeal przyczyną tworzenia się dlmerćw tymlny w komórkach skóry (keratynocytach)

Dimery tyminy nie ulegają , wycięciu" lub nateżylej naprawie z powodu genetycznie uwarunkowanego defeklu (np. zmutowanej endonukleazy) w zakresie korekcji uszkodzeń DNA indukowanych promieniami UV

Utrzymywanie się uszkodzonego DNA; je^o replikacja prowadzi do syntezy DNA wykazującego mutację

Zmutowany DNA pośredniczy w karcynogenezle (być może przez aktywację onkogertów)

Powslawanle licznych guzów nowotworowych skóry

Ryc. 62-1. Zestawienie mechanizmów uczestniczących w powstawaniu skóry pergaminowej barwnikowej.

dniejszych zmian skórnych, dermatolog postawił wstępną diagnozę xeroderma pigmentosum. Badania laboratoryjne. Badanie histologiczne wyciętego guza wykazało obecność raka łuskowatego (jest to często spotykana postać raka skóry u starszych ludzi, a nie u chłopca w tak młodym wieku). Pobrano fragment skóry w celu uzyskania fibroblastów. W laboratorium naukowym szpitaia specjalizującego się w radiobiologii założono hodowlę fibroblastów chorego dziecka oraz osoby zdrowej w celu określenia zawartości dimerów tyminy po naświetlaniu promieniami UV. Zarówno fibroblasty chorego, jak i osoby zdrowej poddano działaniu światła UV pobierając próbki komórek w odstępach 8-godzinnych do 32 godziny po naświetlaniu. Z pobranych próbek zrobiono wyciągi DNA oznaczając w nich zawartość dimerów tyminy. Po 32%odzinach po naświetlaniu w komórkach osoby zdrowej stwierdzono zaledwie 24%, zaś w komórkach chorego chłopca aż 95% dimerów powstałych pod wpływem promieni UV. Ten wynik potwierdził słuszność rozpoznania xeroderma pigmentosum. Komentarz. Skóra pergaminowa barwnikowa (xeroderma pigmentosum — XP) jest względnie rzadką chorobą dziedziczącą się recesywnie genem autosomalnym. Choroba charakteryzuje się upośledzeniem mechanizmów naprawy uszkodzeń DNA indukowanych promieniami

BIOCHEMIA A CHOROBY / 853

UV. Główny defekt DNA indukowany promieniami UV polega na powstawaniu dimerów tyminy. Te ostatnie są wynikiem wiązań kowalencyjnych miedzy węglami tyminy w pozycji 5 i 5 oraz 6 i 6 dwóch przylegających do siebie łańcuchów DNA. Mogą one ulec likwidacji przez endonukleazę. Jedną z przyczyn XP wydaje się być defekt tego enzymu. Szczegółowe badania wykazały, że występują różne podgrupy XP oraz, że* nie określono dokładnie enzymów uczestniczących w naprawie DNA uszkodzonego przez promienie UV. W razie nienaprawienia defektu DNA indukowanego przez naświetlanie promieniami UV powstają mutacje DNA mogące być przyczyną raka skóry. U chorych na XP już od młodych lat stwierdza się różne postacie raka skóry. Rodziców chłopca pouczono, że dziecko wymagać będzie monitorowania lekarskiego przez całe życie z powodu możliwości tworzenia się nowych raków skóry. Ponadto rodzicom radzono, by dziecko w dalszym ciągu unikało słońca i stosowało na skórę właściwe maści chroniące przed działaniem promieni słonecznych. Chociaż XP jest rzadką chorobą, istnienie różnych mechanizmów naprawy uszkodzeń DNA indukowanych promieniami UV lub czynnikami chemicznymi ma wielkie znaczenie ochronne dla człowieka (chroni przed powstawaniem nowotworów skóry). W razie braku takich mechanizmów życiu na ziemskiej planecie groziłoby jeszcze więcej niż dotychczas niebezpieczeństw. Wykazano bowiem, że chorzy na XP mają

1000-krotnie większe prawdopodobieństwo zachorowania na raka skóry niż osoby zdrowe. Przypadek 2. Kwashiorkor (ryc.62-2). Klasyfikacja. Przyczyna: wadliwe odżywianie, niedobór białka.

Wywiady i badania fizyczne. W jednym

z krajów rozwijających się do ambulatorium przyszpitalnego matka przyniosła swoją 2-letnią córkę. Matka dziecka miała 4 dzieci, przy czym najmłodsze miało roczek i było karmione piersią. Rodzina żyła w zrujnowanym szałasie w odległości kilku mil poza miastem, zaś ojciec dziecka z wielkim trudem tylko okazyjnie zna-lazł zatrudnienie. Głównym pożywieniem rodziny była kaszka bogatowęglowodanowa, natomiast ubogobiałkowa. W ciągu ostatnich dwóch lat rodzinę tylkótfcardzo rzadko stać było na kupno mleka i mięsa. Matka podawała, że w czasie ostatniego miesiąca córka wykazywała słaby apetyt, miała okresowe biegunki i stała się drażliwa i apatyczna. Przy badaniu stwierdzono, że dziecko wykazuje niedowagę i mały wzrost w stosunku do swojego wieku. Było one blade, drażliwe i słabe. Obwód ramienia (mierzony w połowie kości ramieniowej) był znacznie obniżony, co pośrednio dowodziło wadliwego żywienia białkowo-kalorycznego (PEM) dziecka. Skóra była łuszcząca się, zaś włosy suche i łamliwe. Brzuch był wzdęty, wątroba zaś umiarkowanie powiększona. Ponadto stwierdzono uogólnione obrzęki. Lekarz dyżurny postawił rozpoznanie kwashiorkor i biegunki.

Dieta ubogobiałkowa, wysokowęglowodanowa

Niedobór aminokwasów

Wystarczająca iiość prekursorów syntezy tłuszczów u chorych z niedostateczną syntezą białek

Niedostateczna synteza Hb, tran sfery ny, albumin Stłuszczenię wątroby Występująca hlpoalbumlnsmia uczestniczy w powstawaniu ___________obrzęków__________

Umiarkowana riepatomegalia

Wodobrzusze

Ryc. 62-2. Mechanizmy uczestniczące w powstawaniu kwaahiorkor.

854 / ROZDZIAŁ 62

Badania laboratoryjne. Ze względu na

ograniczone możliwości techniczne wykonano tylko kilka badań laboratoryjnych. Stężenie Hb wynosiło 60 g/l (wartości prawidłowe 130—150 g/l), zaś stężenie białka ogólnego 44 g/l (wartości prawidłowe 60—80 g/l) i albumin 20 g/l (wartości prawidłowe 35—55 g/l). Po siew stolca ujawnił obecność bez tlenowca Gram- ujem ne-

Leczenie. W większości przypadków nie zaleca się leczenia w szpitalu chorych z objawami wadliwego żywienia białko w o-kalorycznego (PEM) ze względu na ryzyko zakażenia szpitalną florą bakteryjną. Uwzględniając jednak ogólne osłabienie dziecka oraz obecność uogólnionych obrzęków, dziecko przyjęto na oddział. Ze względu na biegunki podano odpowiedni antybiotyk o szerokim widmie działania. Równocześnie rozpoczęto karmienie dziecka małymi, lecz często podawanymi dawkami roztworu izotonicznego glukozy z chlorkiem sodowym zawierającego i inne skadniki minerajne. Po dwóch dniach dziecku podawano w odstępach czterogodzinnych dietę wysokokaloryczną opartą na mleku z dodatkiem, w okresie późniejszym, preparatu wielowitami nowego i brakujących składników mineralnych. Stan dziecka uległ stałej poprawie i po 10 dniach zostało wypisane ze szpitala. Matkę poinformowano, by raz w tygodniu zgłosiła się wraz z dzieckiem do kliniki, gdzie specjalista od żywienia udzielał porad, jak poprawić jakość diety. W czasie cotygodniowej wizyty dziecko mierzono i ważono oraz dokonano pomiaru obwodu ramienia. Ponadto w czasie każdej wizyty matka otrzymywała bezpłatnie kartony z mlekiem sproszkowanym. Dyskusja. Zespół PEM jest najczęściej spotykanym zaburzeniem żywieniowym w świecie. Oszacowano, że około miliard ludzi w świecie cierpi na PEM o różnym nasileniu. Kwashiorkor znajduje się na jednym końcu tego zespołu chorobowego i charakteryzuje się głównie nie* dożywieniem białkowym. Na drugim końcu znajduje się zespól ogólnego wyniszczenia (marazm, marasmus) spowodowanego przeważnie żywieniem ubogo kalorycznym. Granica między kwashiorkor i wyniszczeniem nie jest ostra, bowiem spotykane są postacie pośrednie określane jako kwashiorkor wyniszczający. Główne różnice między kwashiorkor i marazmem zostały wypunktowane w tab. 62-9. Objawami głównymi kwashiorkor są obrzęki, hipoalbuminemia i stłuszczenie wątroby.

Tabela 62-9. Różnice między kwashiorkor i marazmem (wyniszczeniem) Kwashiorkor Obrzęki

Są

Marazm Nie ma

Hipoalbuminemia Jest, może być Umiarkowaznacznego stop- na nia Stłuszczenie wą- Jest Nie ma troby Stężenie insuliny w osoczu Stężenie adrenaliny Zaniki mięśni szkieletowych

Duże

Małe

Prawidłowe lub małe

Wysokie

Nieobecny lub umiarkowany

Może być bardzo znaczny

Zawartość tłusz- Zmniejszona czów w ustroju

Krańcowo niska lub brak

Kwashiorkor jest terminem używanym przez członków szczepu Ga w Gawie dla okjeślenia „choroby występującej u starszego rodzeństwa po urodzeniu kolejnego dziecka". Występuje ona u dziecka po odstawieniu go od piersi i rozpoczęciu karmienia pokarmami ubogobiałkowymi i boga to węglowodanowymi. Zmiany włosów i na skórze oraz stłuszczenie wątroby występujące u chorych na kwashiorkor spowodowane są głównie niedoborem białkowym. U chorych tych stwierdza się często niedobory witamin i składników mineralnych. Również hormony są istotnym ogniwem w patogenezie PEM. Dieta wysoko węglowodanów a jest przyczyną występowania w kwashiorkor podwyższonego stężenia we krwi insuliny, zaś małego stężenia adrenaliny i kortyzolu. W odróżnieniu od kwashiorkor w marazmie stwierdza się niskie stężenie insuliny i wysokie stężenie kortyzolu. Takie zmiany hormonalne sprzyjają katabolizmowi białek, głównie mięśni i są przyczyną znaczniejszych zaników mięśniowych u chorych z wyniszczeniem niż z kwashiorkor. Ponadto dzięki niskim stężeniom adrenaliny w kwashiorkor nie dochodzi do tak dużej mobilizacji tłuszczów z tkanki tłuszczowej jak w marazmie. Dieta ubogobiałkowa jest przyczyną spadku syntezy białek osocza, w tym szczególnie albumin i transferyny oraz zmniejszonej syntezy hemoglobiny. W następstwie niedostatecznej syntezy białek w wątrobie oraz podaży węglowodanów w ilościach wystarczających rów-

BIOCHEMIA A CHOROBY / 855

nież do syntezy lipidów, dochodzi do akumulacji triglicerydów w hepatocytach oraz co za tym idzie, do stłuszczenia wątroby. W PEM upośledzona jest również funkcja układu immunologicznego, szczególnie czynność limfocytów T. Ten defekt jest przyczyną dużej podatności tych chorych na zakażenia (np. wywołujące biegunkę). Z kolei infekcje pogarszają istniejącą sytuacje metaboliczną, nasilają katabolizm ustrojowy (np. wywołując gorączkę). Rozwojowi kwashiorkor można całkowicie zapobiec podając dzieciom jakościowo i ilościowo wyważoną dietę zawierającą dostateczne ilości białka i egzogennych aminokwasów. Przypadek 3. Cholera (ryc. 62-3). Klasyfikacja. Przyczyna choroby — biologiczna, bakteryjna.

Zakażenie przecinkowcem cholery

Uwalnianie enterotoksyny (zawierającej podjednostki A„ ^ i B) do światła jelita cienkiego

Wiązanie się enteraloksyny z gangllozydem GM, za pośrednictwem swoich podjednostek

Uwalnianie się podjednoelki A, przechodzącej przez btony plazmatyozne enterocytów

Podjednostka A, katalizuje ADP-rybozylację białka G, błony plazmatyczne), pKez co białko to traci swoją aktywnoSt GTP-azową

Wywiady i badanie fizyczne. 21-letnia

studentka, pracująca w jednym z krajów rozwijających się, nagle zaczęła wydalać wodniste stolce prawie w sposób ciągły. Wkrótce do biegunek dołączyły się wymioty, co stało się przyczyną gwałtownego pogorszenia ogólnego stanu chorej i skierowania jej do miejscowego szpitala wiejskiego. Przy przyjęciu chora wykazała sinicę oraz obniżoną sprężystość skóry, obniżone ciśnienie tętnicze (70/56 mm Hg, wartość normalna 120/80 mm Hg) oraz przyspieszone i słabo napięte tętno. Lekarz dyżurny rozpoznał cholerę, pobrał próbkę stolca na posiew i natychmiast rozpoczął leczenie. Leczenie. Polegało na dożylnym podawaniu roztworu sporządzonego w szpitalu, a zawierającego 5 g NaCl, 4 g NaHCO 3 i lg KC1 w jednym litrze apirogennej wody destylowanej. Roztwór ten podawano początkowo szybko w ilości 100 ml/kg mc/h do chwili normalizacji ciśnienia tętniczego i uzyskania dobrze wypełnionego tętna. Równocześnie chorej podawano tetracyklinę. Począwszy od drugiego dnia chora była już zdolna do doustnego pobierania płynu zalecanego przez Światową Organizację Zdrowia do nawodnienia (ORS — orał rehydration solution). Składa się on z 20 gglukozy, 3,5 g NaCl, 2,5 g NaHCOs i ],5 g KG rozpuszczonych w 1 litrze wody pitnej. Począwszy od czwartego dnia do chwili przyjęcia do szpitala chorej włączono pokarmy stałe. Chora szybko wracała do zdrowia i została wypisana ze szpitala w 7 dniu po przyjęciu. Dyskusja. Cholera jest poważną chorobą zakaźną występującą endemicznie w niektórych krajach Azji i innych częściach globu ziems-

Przewlekła stymulacja cyklazy a de n/1 an owej

Wzrosl stężenia cAMP w enterocyiaeh Wony Śluzowej

cAMP aktywują jedną lub więcej cAMP-zależnych kinaz białek, przez co dochodzi do zmiany funkcji systemów Iran sportowych enterocytów przez fosforylację pewnych białek transportowych

Masywna utrata ze stolcem Janów Na + , Cr, HCO; K + I wody

Ryc. 62-3. Mechanizmy uczestniczące w patogenezie biegunek spowodowanych cholerą.

kiego. Wywołuje ją przecinkowiec cholery {Vibrio cholerne), wydzielający enterotoksynę, Enterotoksyna składa się z jednej podjednostki A (złożonej z peptydów Ai i A2 połączonych ze sobą wiązaniem dwusiarczkowym) oraz z 5 podjednostek B. Jej masa cząsteczkowa wynosi w przybliżeniu 84 000. W jelicie cienkim enterotoksyna wiąże się za pośrednictwem podjednostek B z gangliozydem GMr (strukturę GMi przedstawia ryc. 15-20), występującym w błonie plazmatycznej enterocytów błony śluzowej. Następnie odłącza się podjednostka A, po czym peptyd A| przenika przez błonę plazmatyczną do jej wewnętrznej powierzchni. Peptyd ten katalizuje ADP-rybozylację (donorem jest NAD) białka regulatorowego G51 przez co hamuje jego aktywność GTP-azową i utrwala

856 / ROZDZIAŁ 62

j e g o p o s t a ć a k t y w n ą . W t e n s p o s ó b c y k t Zmiany a z a rriiaidzycowe w obrębie naczyri wieńcowych a d e n y l a n o w a u le g a p r z e w l e k ł e j a k ty w a c j i ( p . (najczęściej uwarunkowane wielogenowo) r o z d z . 4 6 ) . W w y n i k u c i ą g łe j a k t y w a c ji c y k l a z y ad en y lan o w e j w zrasta śró d k o m ó rk o w e s tęże n ie Powstanie dużego zakrzepu w obrębie letnicy wieńcowej c A M P . T e n o s ta tn i z k o le i a k ty w u je k in a z ę b ia ł e k f o s f o r y l u ją c ą je d n ą lu b w i ę c e j b ia łe k b ł o n o w y c h u c z e s t n i c z ą c y c h w t r a n s p o -r c i e a k Pozbawienie mienia sercowego napływu krwi (niedokrwienie mięśnia sercowego) t y w n y m . K o n s e k w e n c j ą w y m i e n i o n e g o- ł a ń c u c h a z d a r z e ń je s t z a h a m o w a n ie w c h ła n i a n ia N a C l p r z e z e n te r o c y ty ( z a p o ś r e d n i c t w e m o b o j ę tn e g o przemian w kierunku glikotizy beztlenowej, k o s y s t e m u t r a n s p o r t u j ą c e g o N a C l ) o r- a z wPrzesunięcie y spadek syntezy ATP, zubożenie puli nukleotydów d z ie la n ia jo n ó w C i d o ś w ia tła je li ta c ie n k ie g o . W y m ie n i o n e z j a w is k a s ą p r z y c z y n ą m a s y w n e g o w y d z ie la n ia N a i w o d y d o ś w ia tła je lita i - w o d n isWzrost stężenia w kardiocytach MftDH z powodu ty c h s to lc ó w ch a rak te ry sty c zn y ch d la c h o le ry . braku fnsforylacji oksydatywfiej S t r u k t u r a h i s t o l o g i c z n a j e l i t a c i e n k i e g o- p o z o s taje zadz iw iają co n ien aruszo na p om im o strai n ie t y l k o N a i w o d y . a l e r ó w n i e ż C l , H C O ^ Gromadzenie i K. się kwasu mlekowego i innych metabolitów wzrost molainości ptynu śród kom orkowego U t r a t a t y c h s k ł a d n i k ó w j e s t p r z y c z y n ą - o g rpowodujących om n y c h s t r a t p ł y n ó w u s t r o j o w y c h , h i p o w o l e m oraz i i , zmianę przepuszczalności błon komórkowych kw asicy nieo dd echo w ej i zu bo żenia u stro ju w p o tas w y stę p u ją cy w cięż k ich p rz y p adk ach Spadek pH w kardiotitlocytach c h o l e r y . W y m i e n i o n e z m i a n y m o g ą b y- ć p r z y c z y n a z g o n u , j e ż e l i w ła ś c iw e l e c z e n ie s-u b s ty tu cy jn e (o p is an e w y żej) n ie zo s ta ło ro zp o cz ęte n a ty c h m i a s t . W y k r y c i e i ła tw a d o s tę p n o -ś ć wNarastająca ła ś nieskuteczność skurczów mięśnia sercowego c iw yc h p łyn ó w za stęp czy c h (n p. p łyn u O R S ) w b ard z o zn ac zn y m sto p n iu p o p raw iły w yn ik i le c z e n i a c h o le r y . N a le ż y z a u w a ż y ć , ż e is t o tn y m Zaprzestanie kurczenia SIĘ mięśnia sercowego s k ła d n i k ie m p ł y n u O R S je s t g l u k o z a . C h o c ia ż toksyna ch oleryczna ham uje w chłanianie N aC l przez enterocyty jelitow e, nie m a ona w pływ u na dokom Aktywacja ó rfosfolipaz błon komórkowych, degradacja białek przez prateazy, napływ Ca + do komórek k o w y tra n s p o rt N a u łatw io n y p rz e z g lu k o z ę . P r z y p a d e k 4Z. a w a ł s e r c a ( r y c . 6 2 - 4 ) . K l a s y f i k a c .j aP r z y c z y n a c h o r o b y — b r a k tl e n u , ■*"> Śmierć dotkniętych chorobą obszarów mięśnia sercowego

Wywiady i badanie fizyczne. Na Od-

dział Nagłej Pomocy lokalnego szpitala został przyjęty 46-letni człowiek interesu z powodu trwających od dwóch godzin silnych bólów zamostk owych. Uprzednio chory ten był już raz hospitalizowany w celu leczenia „małego" zawału serca (MI). Pomimo tego nie przestał palić papierosów. Jego ciśnienie tętnicze wynosiło 150/90 mm Hg {dla jego grupy wiekowej normalne ciśnienie tętnicze wynosi ! 40/80 mm Hg), zaś jego tętno 60 uderzeń na minutę. Skóra chorego była zlana potem. U pacjenta nie stwierdzono objawów niewydolności serca. Podejrzewając zawał serca choremu podano morfinę w celu zmniejszenia bólów j stanu lękowego, po czym przeniesiono go na oddział kardiologiczny, gdzie natychmiast rozpoczęto ciągłe monitorowanie EKG.

Ryc. 62-4. Mechanizmy uczestniczące w powstawaniu ostrego zawału mięśnia sercowego u osób dorosłych. Strzałki poniżej prostokątów nie zawsze wskazują na występowanie ścisłego przyczynowego powiązania . zjawisk wymienionych w obrębie prostokątów.

Badania laboratoryjne. W pierwszym

EKG stwierdzono uniesienie odcinka ST w pewnych odprowadzeniach oraz inne zmiany wskazujące na obecność przezściennego zawahi przedniej ściany lewej komory serca. Cztery godziny od wystąpienia bólów, a następnie w regularnych odstępach czasowych pobierano próbki krwi do oznaczenia izozymu MB fosfokinazy kreatynowej (CK). W czwartej godzinie

BIOCHEMIA A CHOROBY / 857

aktywność tego izozymu była lekko podwyższona, zaś w 12 godzinie 4-krotnie wyższa niż normalnie. Stężenie cholesterolu było umiarkowanie podwyższone (6,5 mmol/I), zaś triglicerydów normalne. Leczenie. Dyżurujący kardiolog, po uwzględnieniu wszystkich aspektów choroby, w tym szczególnie faktu stwierdzenia cech przezściennego zawału ściany przedniej mięśnia sercowego w 4 godziny po wystąpieniu pierwszych objawów zadecydował o podawaniu streptokinazy (SK) za pośrednictwem cewnika do naczyń wieńcowych. Po 12 godzinach bóle w klatce piersiowej zaczęły ustępować i chory czuł się coraz lepiej. Dziesięć dni później pacjent został wypisany do domu z zaleceniem dalszego nadzoru przez lekarza domowego i rozpoczęcia leczenia obniżającego stężenie cholesterolu we krwi (poprzez stosowanie diety ubogiej w nasycone kwasy tłuszczowe i inhibitora reduktazy HMG-CoA) oraz zaprzestania palenia papierosów. Dyskusja. Pelnościenny zawał mięśnia sercowego (MI) spowodowany jest najczęściej przez skrzep linę zamykającą lub prawie zamykającą światło naczynia wieńcowego, położoną w bliskim sąsiedztwie z blaszką miażdżycową. Najczęściej rozpoznanie można postawić na pods"tawie wywiadów, wyniku badania EKG oraz seryjnych wyników oznaczenia izozymu MB fosfokinazy kreatynowej (CK) (p. Dodatek). CeJem leczenia MI jest zapobieganie śmierci spowodowanej zaburzeniami rytmu przez podawanie odpowiednich leków oraz zmniejszenie obszaru objętego zawałem. W opisanym przypadku podjęto decyzję podawania streptokinazy do naczyń wieńcowych w celu ograniczenia obszaru zawałowego i rozpuszczenia skrzepimy (p. rozdz. 58). Enzym ten jest znacznie tańszy od tkankowego aktywatora plazminogenu (TPA) wykazując przy tym prawie taką samą skuteczność jak TPA. Dla terapii długofalowej przepisano lek obniżający stężenie cholesterolu w osoczu, mianowicie inhibitor reduktazy HMG-CoA. W tym miejscu tylko bardzo krótko omówione zostaną przyczyny zmian miażdżycowych tętnic wieńcowych, które były przyczyną powstania skrzepliny zamykającej światło naczynia. Po szczegóły na ten temat należy sięgnąć do podręcznika patologii. Rozwojowi miażdżycy sprzyjają wysokie stężenia LDL i małe stężenia HDL w surowicy, nieznane jeszcze czynniki genetyczne oraz różnorodne czynniki ryzyka,

takie jak nadciśnienie tętnicze, duże stężenie cholesterolu w surowicy oraz palenie papierosów. Opisany w tym podrozdziale chory wykazywał podwyższone stężenie cholesterolu oraz był nałogowym palaczem. Na początku uszkodzeniu ulega błona wewnętrzna naczynia (intima), w której gromadzą się makrofagi, lipoproteiny osoczowe, glukoza mi nogi i kany i sole wapnia tworząc zmiany określane jako pasma tłuszczowe (fatty streaks). Na luminalnej powierzchni tych zmian mogą się gromadzić płytki krwi i fibryna. Do tych zmian błony wewnętrznej naczynia wrastają monoklonalne miocyty naczyniowe przyciągane przez czynniki wzrostowe, uwalniane przez makrofagi i trombocyty. Te ostatnie uwalniają „płytkowy czynnik wzrostowy ". Tak tworzy jsię zmiana naczyniowa określana jako blaszka błony wewnętrznej (intimal plaque). Krwotoki do blaszki lub (i) zmiany zapalne sprawiają, że przerwana zostaje ciągłość nabłonka pokrywającego blaszkę i odsłonięciu ulegają jej składowe. Do tych ostatnich przylegają płytki tworząc początek skrzepliny (p. rozdz. 58). Jeżeli skrzeplina zamyka światło naczynia w 90%, wówczas ustaje krążenie przez dotknięte naczynie i krew włośniczkowa bardzo szybko zostaje pozbawiona tlenu. Normalna przemiana mięśnia sercowego ma charakter tlenowy i większość ATP wytwarzana jest w czasie fosforylacji oksydacyjnej. W razie wystąpienia anoksji spowodowanej niedokrwieniem dochodzi do przestawienia się przemiany materii mięśnia sercowego na glikoli* ę beztlenową. Wytwarza ona zaledwie '/n> ATP powstającego w procesie fosforylacji oksydacyjnej. W obszarze niedokrwionym dochodzi nie tylko do przestawienia się metabolizmu na glikolizę beztlenową, ale również do spadku substratów energodajnyeh oraz oczyszczania tkanek z końcowych produktów przemiany materii. Z kolei gromadzenie się metabolitów w obrębie komórek jest przyczyną wzrostu molalności płynu śródkomórkowego, co prowadzi do obrzęku komórek i zmian przepuszczalności błon komórkowych. Następstwami zawału serca są: utrttta ATP, nagromadzenie się kwasu mlekowego z następczą ciężką kwasicą metaboliczną oraz znaczna redukcja siły skurczowej kardiomiocytów. W takich warunkach metabolicznych całkowicie ustaje synteza makrocząsteczek i nukleotydów. Gromadzenie się w komórkach mleczanów i jonów H+ hamuje glikolizę na poziomie działania dehydrogenazy gliceroaldehydofosforanowej i jest

852 / ROZDZIAŁ 62

przyczyną niedoboru utlenionej postaci NAD normalnie regenerowanego w procesie fosforylacji oksydacyjnej. W miarę obniżenia się stężenia ATP wzrasta przynajmniej na początku stężenie ADP. Z kolei ADP ulega konwersji do AMP przez mięśniową kinazę adenylanową, po czym AMP jest przedmiotem dalszego rozkładu do adenozyny przez deaminazę adenozynową. W końcu adenozyna ulega przekształcaniu do inozyny i innych produktów katabolizmu puryn. Wszystkie wymienione reakcje w bardzo znacznym stopniu zmniejszają pulę mikleotydów adeninowych stanowiących główny składnik normalnej przemiany komórkowej. Wykazano, że po ciężkim niedokrwieniu mięśnia sercowego psa trwającym 40 minut zawartość w nim ATP spada do 10% v*artośd prawidłowej. Wyczerpanie się puli nukleotydów adeninowych odbywa się w tym samym czasie, w którym rozwija się nieodwracalne uszkodzenie komórek, co niekoniecznie oznacza przyczynowy związek między tymi zjawiskami. W chwili obecnej nie ustalono jeszcze, które z zaburzeń metabolicznych skazuje komórki .na umieranie. Wśród takich zaburzeń wymienia się wyczerpanie się zasobów ATP, aktywację śródkomórkowych fosfolipaz (są one przyczyną uszkodzenia błon komórkowych), aktywację proteaz oraz wzrost śródkomórkowego stężenia Ca2 + , Ogólnie mówiąc, im wcześniej podjęto próby przywrócenia perfuzji niedokrwionego mięśnia sercowego, tym lepiej. W 6 godzin po niedokrwieniu mięśnia sercowego prawdopodobnie dochodzi do nieodwracalnego jego uszkodzenia. Dodać jednak należy, że już po 1-godzinnym całkowitym niedpkrwieniu niektóre komórki ulegają nieodwracalnemu uszkodzeniu. Z tego wynika, że rozpoczęcie leczenia streptokinazą musi być możliwie wczesne. Przedmiotem dużego zainteresowania biochemików i klinicytów są również zjawiska biochemiczne występujące po reperfuzji (spowodowanej np. podaniem streptokinazy) uprzednio medokrwionego obszaru mięśnia sercowego. Reperfuzja może być również przyczyną śmierci komórek spowodowanej tzw, szkodą reperftizyjną (reperfusion injury). Jak o tym już wspomniano, niedokrwienie uszkadza błony plazm atyczne (będące miejscem działania różnych pomp jonowych), przez co dochodzi do głębokich zmian ich przepuszczalności i potencjału błonowego. W następstwie tych zmian w czasie reperfuzji nasila się napływ różnych związków do komórek, m.in. jonów Ca2 + . Wzrost śród-

komórkowego stężenia Cai+ wywołuje spustoszenie i dezorganizację wnętrza komórek poprzez aktywację lub hamowanie różnych enzymów w sposób nieuporządkowany. Wiele faktów sugeruje, że w powstawaniu szkody reperfuzyjnej uczestniczą również wolne rodniki, tj. wysoce reaktywne, częściowo zredukowane metabolity tlenu, takie jak rodniki nadtlenkowe (O2) i hydroksylowe (OH). Szczególnie reaktywne są rodniki OH. Mogą je wytwarzać komórki mięśnia sercowego lub krążące we krwi leukocyty wielojądrzaste (PMNL). Rodniki te uszkadzają komórki, wywołując peroksydację lipidów, przerywając łańcuchy DNA i utleniając grupy SH białek. Anion nadtlenkowy powstaje przez przeniesienie pojedynczego elektronu na cząsteczkę O2 zgodnie z równaniem: O2 + e" —*■ O 2

Generacja rodników O2 nie ma miejsca w reakcjach katalizowanych przez cytochrom P-450, oksydazę ksantynową oraz oksydazę NADPH, występujące w leukocytach wielojądrzastych. Enzym—dyzmutaza nadtlenkowa (SOD)—katalizuje następującą reakcję: O; + O" 2 + 2H + -► H 2 O 2 + O 2

Jak widać enzym ten likwiduje aniony nadtlenkowe przekształcając je do mniej toksycznego nadtlenku wodoru (wody utlenionej). Przeprowadzono doświadczenia, które miały odpowiedzieć na pytanie, czy podawanie dysmutazy ponadtlenkowej podczas reperfuzji chroni mięsień sercowy przed szkodą reperfuzyjną. Niestety, wyniki tych badań nie były jednoznaczne. Tak więc do wyjaśnienia pozostaje rola anionów ponadtlenkowych w patogenezie szkody reperfuzyjnej. Niemniej przedmiotem wielkiego zainteresowania jest obecnie rola wolnych rodników w licznych rodzajach uszkodzeń komórek oraz w patogenezie»chorób. Przypadek 5. Ostre zatrucie etanolem (ryc. 62-5). Klasyfikacja. Przyczyna choroby—chemiczna.

Wywiady i badanie fizyczne. Na oddział

intensywnej opieki lekarskiej przyjęty został 52-letni chory w śpiączce. Miesiąc wcześniej zmarła żona chorego. Po jej śmierci chory stał się coraz bardziej depresyjny. Przed śmiercią żony należał do umiarkowanych alkoholików. Konsumpcja alkoholu wzrosła jednak znacznie

BIOCHEMIA A CHOROBY / 859

Etanol ■

ADH MEOS Wnika do błon komórkowych

Zwiększa płynność błon

Aldehyd octowy

Tworzy adctukty z białkami i kwasami nukleinowymi

Pojawianie się objawów toksycznego działania, głównie ze strony mdzgu

Konwersja do kwasu octowego

AOH

Wzrost stosunku NAD H/N AO Wzrost stosunku mleczan/pirogronian Spadek g i uKaneogenezy Spadek spalania w/asów tłuszczowych Hamowanie dehydrogenazy glicei-ofosforanowej prowa dzące do wzrostu glicerofostoranu__________

Konwersja do acelyio-CoA

Wzrost syntezy kwasów tłuszczowych

Stłu szczenię wątroby

Ryc. 62-5. Mechanizmy uczestniczące w patogenezie toksyczności etanolowej

w ciągu ostatnich kilku tygodni. Ponadto chory odżywia! się siabo. Jego córka, mężatka, wpadła w niedzielę rano do domu ojca, znajdując go nieprzytomnego w saloniku na leżance. Na stole saloniku znajdowały się dwie puste butelki po whisky. Przy badaniu chorego nie udało się go wybudzić, jego oddechy były głębokie i głośne, zaś w powietrzu wydechowym czuć było alkohol. Temperatura ciała wynosiła 35,5°C (normalna ciepłota ciała mierzona w odbytnicy nie przekracza 37,43C). Rozpoznanie przy przyjęciu chorego brzmiało: śpiączka spowodowana nadmiernym spożyciem etanolu.

Badania laboratoryjne. Wśród ważnych

wyników badań laboratoryjnych wykonanych we krwi chorego wymienić należy następujące: stężenie etanolu 108,6 mmol/1 (500 mg/dl), stężenie glukozy 2,7 mmoi/1 (norma 3,6—6,1 mmol/1), stężenie mleczanów 8,0 mmol/1 (norma 0,5—2,2 mmol/1), oraz pH — 7,21 (norma 7,40). Wyniki tych badań potwierdziły rozpoznanie ustalone przy przyjęciu. Zatruciu etanolem towarzyszyła kwasica metaboliczna. Leczenie. Ze względu na wysokie stężenie etanolu we krwi oraz śpiączkę leczenie rozpoczęto od natychmiastowej hemodializy. Pozwala ona na bezpośrednią eliminację etanolu z ustroju, chociaż stosowana jest tylko w cięż-

kich zatruciach etanolem. W omawianym przypadku stężenie etanolu we krwi szybko spadło i jeszcze tego samego dnia chory odzyskał świadomość. Po zakończeniu hemodializy choremu zastosowano dożylny wlew z 5% roztworu glukozy w celu zwalczania występującej u niego hipoglikemń. Chory bardzo szybko odzyskał zdrowie. Skierowano go jednak na konsultację psychiatryczną. Dyskusja. Nadużywanie alkoholu jest dużym problemem służby zdrowia w większości społeczeństw. Przedstawiony przypadek dotyczy ostrych, toksycznych efektów spożycia nadmiernej ilości alkoholu. Innym problemem, związanym z nadużywaniem etanolu, które wykazuje wiele aspektów biochemicznych, lecz nie będzie przedmiotem dyskusji, jest poalkoholowa marskość wątroby. Rozwija się ona u osób spożywających duże dawki etanolu (tj. 80 g absolutnego etanolu na dobę) przez więcej niż 10 lat. Z biochemicznego punktu widzenia, głównym problemem, jaki pojawił się u opisanego chorego, była odpowiedź na pytanie, w jaki sposób etanol wywołuje tak różne efekty toksyczne, jak kwasica mleczanowa i hipoglikemia oraz śpiączka? Problemem klinicznym było, jak optymalnie leczyć chorego.

860 / ROZDZIAŁ 62

Przemiana etanolu przedstawiona została w rozdz. 27. Odbywa się ona głównie w wątrobie dwoma szlakami, W głównym szlaku uczestniczą dehydrogenaza alkoholowa i dehyd-rogenaza acetaldehydowa przekształcająca etanol poprzez aldehyd octowy w kwas octowy. Z kolei ten ostatni ulega konwersji do acetylo--CoA. W obu reakcjach powstaje NADH + i H+. Tak wiec duże spożycie alkoholu może w znacznym stopniu zmienić śródkomdrkowy iloraz NADH/NAD. Ten z kolei może wpłynąć na wartość K licznych i ważnych reakcji metabolicznych, w których uczestniczą te dwa kofaktory. Wysokie stężenie NADH sprzyja powstawaniu mleczanu z pirogronianu, co tłumaczy obecność kwasicy mleczanowej w zatruciu alkoholowym. Konsekwencją tych reakcji jest spadek stężenia pirogronianu (jest on niezbędny w reakcji katalizowanej przez kar-boksylazę pirogronianową) oraz zahamowanie glukoneogenezy. W ciężkich zatruciach etanolem, w których doszło do wyczerpania się zapasów glikogenu i praktycznie nie zachodzi glikogenoliza, pojawia się hipoglikemia. W drugim szlaku przemiany etanolu uczestniczy mikrosomalny cytochrom 450 (mikrosomalny układ utleniania etanolu — microsomal ethanol oxidizing system — MEOS) również wytwarzający aldehyd octowy. Aldehyd octowy jest wysoce reaktywnym związkiem tworzącym addukty z białkami, kwasami nukleinowymi i innymi cząsteczkami. Wydaje się prawdopodobne, że objawy toksyczne etanolu spowodowane są zdolnością wiązania się tego związku z innymi cząsteczkami. Etanol wykazuje również zdolność wnikania do Manjbiologicznych, wywołując ich ekspansje oraz zwiększając ich „płynność". Jeżeli błony te należą do pobudliwych, etanol zmienia ich potencjał czynnościowy, zaburza i przezbłonowy transport oraz wpływa na uwalnianie neuroprzekaźników. Wszystko to działa depresyjnie na czynność mózgu. Jeżeli wymienione zmiany toksyczne są dostatecznie duże, mogą one spowodować śpiączkę, a nawet śmierć (uwarunkowaną porażeniem ośrodków oddechowych). Przypadek 6. Dystrofia mięśni typu Duchenne'a (ryc. 62-6). Klasyfikacja. Przyczyna genetyczna.

Wywiady i badanie fizyczne. Do szpita-

la dziecięcego przyniesiono 4-letniego chłopca. Jego matka była bardzo zmartwiona tym, że dziecko poruszało się dziwnie, często przewracało się i miało trudności przy chodzeniu po

Delecja części genu strukturalnego ctyslrofiny, zlokalizowanego w chromosomie X

Obniżona synteza mRNA kodującego dystrofinę

Małe stężenie lub brak dystrofiny w komórkach mięśniowych

Zmiany skurczu I rozkurczu komórek mięśniowych (dokładny mechanizm nie jest znany)

Postępujące osłabienie mięśni szkieletowych, zwykle kończące się zgonem

Ryc. 62-6. Mechanizmy uczestniczące w powstawaniu dystrofii mięśni typu Duchenne'a.

schodach. Dziecko nie miało rodzeństwa, lecz brat matki zmarł w 19 roku życia z powodu dystrofii mięśni. Przy badaniu lekarz stwierdził osłabienie siły mięśni i obręczy barkowej"i miednicznej oraz lekkie powiększenie mięśni łydek. Uwzględniając osłabienie siły mięśniowej oraz rozmieszczenie dotkniętych mięśni pediatra postawił wstępne rozpoznanie dystrofii mięśni typu Duchenne'a (dystrophia musculomm m. Duchenne — DMD).

Badania laboratoryjne i inne testy

diagnostyczne. Aktywność fosfokinazy kreatynowej była znacznie podwyższona. Wynik badania etektromiograficznego potwierdził rozpoznanie dystrofii mięśni, podczas gdy przewodnictwo nerwowe było prawidłowe. W bioptacie z mięśnia łydkowego stwierdzono ogniskową martwicę oraz pewne odchylenia wielkości włókien mięśniowych. Używając sondy cDNA dla dystrofmy wykazano, posługując się metodą Southern blotting, brak genu kodującego to białko. Ponadto w bioptacie mięśnia wykazano brak dystrofiny używając metody elektroforezy dwukierunkowej. Dyskusja. Wywiad rodzinny, typowa topografia osłabienia mięśni, podwyższona aktywność fosfokinazy kreatynowej (CK) w surowicy krwi, wynik badania elektromiograficznego, obecność w bioptacie nieprawidłowego genu kodującego dystrofinę — wszystko potwierdziło wstępne rozpoznanie DMD postawione przez pediatre.BMD jest ciężką chorobą zwyrodnieniową mięśni związaną z chromosomem X.

BIOCHEMIA A CHOROBY / 861

Częstość jej występowania ocenia się na I przypadek na 3500 żywo urodzonych chłopców. Dotyczy ona chłopców w młodym wieku objawiając się najpierw utratą siły mięśni proksymalnych (dosiebnych), kaczkowatym chodem, trudnościami w stawaniu oraz w końcu bardzo znacznym osłabieniem. Liczne badania pozwoliły zlokalizować defekt w środkowym odcinku krótkiego ramienia chromosomu X oraz zidentyfikować segment DNA, który ulega delecji u chorych na DMD. Używając metody odwrotnej transkrypcji uzyskano za pomocą transkryptu mRNA, liczącego 14 kilozasad, a kodującego dystrofine u zdrowych, osób dorosłych i u płodów, odpowiadający mu cDNA. Ten ostatni sklonowano i uzyskano białko — dystrofinę o masie cząsteczkowej ok. 400 000, wykazujące kształt pręcików oraz składające się z 3 685 aminokwasów. W bioptatach mięśniowych pochodzących od chorych na DMD oraz od szczurów z dystrofią mięśni sprzężoną z chromosomem X (mdx), poddanych elektroforezie żelowej, nie stwierdzono obecności dystrofiny. W celu umiejscowienia dystrofiny w mięśniach wytworzono przeciwciała antydystrofinowe. Za ich pomocą wykazano, że dystrofina występuje w sarkolemie (błonie komórkowej miocytów) osób zdrowych, zaś jest nieobecna lub występuje w niewielkiej ilości w sarkolemie miocytów chorych na DMD. Niedobór dystrofiny wydaje się również uczestniczyć w etiologii dystrofii mięśni Beckera, będącej inną, łagodniejszą postacią dystrofii mięśni, najpewniej odmianą alieliczną DMD. Dystrofina wydaje się posiadać 4 domeny, Dwie z nich są podobne do domen występujących w ct-aktyninie i jedna do domeny spektryny. Spektryna jest białkiem błonowym cytoszkieletu, ułatwiającym krwinkom czerwonym zmianę kształtu przy przechodzeniu przez naczynia włosowate. Per analogiam spekulowano, że dystrofina może umożliwiać komórkom mięśniowym kurczenie lub rozkurczenie się za pośrednictwem zmian błonowych, lub też, że może uczestniczyć w stabilizacji sarkolemy (błony plazmatycznej miocytów). Dalsze badania wykazały, że gen kodujący dystrofine jest największym genem znanym u człowieka. Ten fakt ułatwia wyjaśnienie obserwacji, że u ok. ' < chorych, DMD spowodowana jest nowymi mutacjami. Podjęto już próby wytwarzania dystrofiny technologią rekombinacji DNA w celu ewentualnego podania tego białka chorym na

DMD. W diagnostyce prenatalnej oznaczanie dystrofiny jest bezcelowe, ekspresja tego białka występuje bowiem tylko w komórkach mięśniowych, a nie w komórkach owodniowych lub kosmówkowych. Dostępność cDNA kodującego dystrofmę ułatwia jednak prenatalną diagnostykę DMD w bioptatach kosmówki lub komórkach owodni uzyskanych drogą amnio-centezy. Oznaczenie dystrofiny ułatwi klasyfikację różnych postaci DMD na takie, w których dystrofina odgrywa rolę oraz inne,w których nie odgrywa żadnej roli. Udowodnienie udziału dystrofiny w powstawaniu DMD należy zaliczyć do jednego z największych osiągnięć bio- ' logii molekularnej w patologii ludzkiej. Leczenie. Do chwili obecnej nie ma skutecznego leczenia DMD. Stad też terapia tej choroby ma charakter objawowy. Dziecko zachęcano do wykonywania ćwiczeń i regularnego zgłaszania się do specjalistycznej kliniki dla chorych na dystrofię mięśni celem możliwie szybkiego leczenia powikłań mogących pojawić się u takich chorych. Matce poradzono, by sięgnęła po poradę genetyczną. Należy wyrazić nadzieję, że postępy w zakresie przyczyn choroby przyczynią się do bardziej swoistej i skutecznej terapii już w najbliższej przyszłości. Przypadek 7. Agammaglobulinemia sprzężona z chromosomem X (ryc. 62-7). Klasyfikacja. Przyczyna immunologiczna, genetyczna.

Wywiady i badanie fizyczne. Do szpita-

la dziecięcego skierowano 3-letniego chłopca z powodu podwyższonej temperatury, bólów

Nie poznana jeszcze zmiana DNA w chromosomie X, będąca przyczyną braku lub znacznego upośledzenia transkrypcji kodu dla łańcuchów H I L immunoglobutin

Brak lub znacznie zmniejszone stężenie Irrmunoglobutln w osoczu krążącym

Zmniejszona odporność na zakażenia pewnymi rodzajami bakterii

W wywiadach częste występowania zakażeń bakteryjnych

Ryc. 62-7. Mechanizmy uczestniczące w powstawaniu agammaglobulinemii sprzężonej z chromosomem X.

862 / ROZDZIAŁ 62

w klatce piersiowej i trudności oddychania. Lekarz domowy rozpoznał prawidłowo zapalenie pluć. Ponieważ uprzednio u starszego brata dziecka rozpoznano agammaglobulinemię sprzężoną z chromosomemX, u lekarza kierującego zrodziła się myśl, że występujące u młodszego brata zapalenie płuc mogło być spowodowane brakiem syntezy gammaglobulin. Badania laboratoryjne. Badaniem elektroforę tycznym białek surowicy wykazano prawidłowe stężenia albumin i globulin a i P, natomiast śladowe ilości y-globulin. Liczba limfocytów B we krwi była niezwykle niska (wynosiła ok. 1% wartości prawidłowej), natomiast limfocytów T — prawidłowa. W bioptacie węzła limfatycznego wykazano brak komórek plazmatycznych. Inne wskaźniki układu immunologicznego, np. składniki dopełniacza, były prawidłowe. W plwocinie wykryto obecność paciorkowca zapalenia płuc (Streptococcus pneumoniae). Dyskusja. Zaburzenia układu immunologicznego mogą dotyczyć limfocytów B (wytwarzających immunoglobuliny) lub T (warunkujących odporność komórkowozależną). W tym podręczniku dyskutowano jedynie humoralny układ immunologiczny (rozdz. 58). Przypadek przedstawiony w tym podrozdziale zademonstrowano ze względu na dramatyczną utratę odporności anty bakteryjnej (przeciwko pneumokokom) występującej przy bardzo znacznym spadku stężenia immunoglobulin osoczowych. Fenotypowo była to anomalia immunologiczna, chociaż jej przyczyną był defekt genetyczny. Wywiady rodzinne, obecność tylko kilku krążących limfocytów B, bardzo znaczna redukcja stężenia krążących immunoglobulin we krwi oraz brak komórek plazmatycznych — to wszystko potwierdziło rozpoznanie wstępne lekarza domowego, że chodzi o agammaglobulinemię sprzężoną z chromosomem X. Agammaglobulinemia sprzężona z chromosomem X dotyczy chłopców w młodym wieku (podobnie jak DMD, przypadek 6) i jest raczej bardzo rzadkim schorzeniem, bo stwierdzonym i opisanym u zaledwie 200 chorych. Dokładny charakter defektu nie jest znany, chociaż wiadomo, że jest on sprzężony z chromosomem X. Chociaż we krwi krążącej znajdowało się zaledwie kilka limfocytów B, w szpiku kostnym liczba prolimfocytów B (limfoblastów) była normalna. Jest rzeczą interesującą, że po fuzji limfocytów B, pochodzących od chorych zragammaglobułinemią, z komórkami szpiczakowymi myszy, po-

wstałe komórki hybrydowe wydzielają łańcuchy ciężkie (H) i lekkie (L) ludzkich immunoglobulin. Dowodzi to obecności w limfocytach B genów strukturalnych dla łańcuchów H i L, które z jakichś powodów nie ulegają ekspresji. Przypadek 8. Cukrzyca typu I z kwasicą ketonową (ryc. 62-8). Klasyfikacja. Przyczyna choroby — niedobór hormonu, brak insuliny.

Wywiady i badanie fizyczne. Do szpita-

la dziecięcego przyjęto 14-letnią dziewczynę w stanie śpiączki. Matka podawała, że córka czuła się dobrze jeszcze dwa tygodnie przed przyjęciem, kiedy to zachorowała na wrzodziejące zapalenie gardła i miała umiarkowaną gorączkę. Od tego czasu córka straciła apetyt i czuła się ogólnie źle. Kilka dni przed przyjęciem skarżyła się na nadmierne pragnienie oraz potrzebę kilkakrotnego wstawania w nocy, aby oddać mocz. Lekarz domowy wyjechałz miasta, zaś matka ociągała się z kontaktowaniem się z innym lekarzem. W dniu przyjęcia dziecko zaczęło wymiotować, było śpiące i trudne do obudzenia. Ten stan był przyczyną zgłoszenia się z dzieckiem na oddział nagłych przypadków chorobowych. Przy badaniu stwierdzono, że dziecko jest odwodnione, wykazuje zimną skórę ora2 pogłębiony oddech (oddech Kmsmaula). Ponadto powietrze wydechowe miało zapach owoców. Ciśnienie tętnicze wynosiło 90/60, zaś tętno 115 uderzeń na minutę. Dziecka nie udało się obudzić. Dyżurujący internista rozpoznał cukrzycę insulinozależną (cukrzycę typu I) powikłaną kwasicą ketonową ze śpiączką. Wyniki badań laboratoryjnych zestawiono poniżej: A. Badania osocza krwi Glikemia 35 mmol/l (norma: 3,6-6,1 mmol/i) p-Hydroksymaślan 13 mmol/l (norma: < 0,25 mmo!/l) Acetooctan 2,8 mmol/l (norma: < 0,2 mmol/l) Wodorowęglany 5 mmol/l (norma: 24-28 mmol/l) Mocznik 12 mmol/l (norma: 2,9-8,9 mmol/l) Stężenie H+ we krwi tętniczej 89 mmol/l {= pH 7,05), (norma 34,7-45,5 nmol/l = pH 7,45-7,35} Potas 5,8 mmol/l (norma: 3,5-5,0 mmol/l) Kreatynina 160 jimol/i (norma 60-132 jimol/l).

8. Mocz

Glukoza + + + + Ciała ketonowe ++ + +

Wyniki badań laboratoryjnych potwierdziły więc rozpoznanie wstępne.

BIOCHEMIA A CHOROBY / 863

Genetycznie uwarunkowana podatność na infek^s wirusowe z następującym auł o immunologicznym uszkodzeniem komórek 0 wysp trzustki

Zmniejszona synteza Insuliny przez komórki p trzustki

Liczne następstwa

Przemiana węglowodanowa Spadek poboru glukozy przez niektóre komórki Wzrost glukoneogenezy Wzrost glikogenolizy

Przemiana tłuszczowa Wzrost lipolizy Wzrost utleniania kwasów tłuszczowych Wzrost produkcji związków ketonowych

Przemiana białkowa Spadek synlezy białek Wzrost katabolizmu białkowego

Przemiana wodna potasowa i H ł Spadek napływu K+ do komórek Utrata wody s powód owa na diurezą osmotyczną (glikozurią) Kwasica spowodowana wzmożoną produkcją ciał ketonowych

Ryć. 62-8. Mechanizmy uczestniczące w powstawaniu kwasicy ketonowej u chorych na cukrzyce insulinozależną.

Leczenie. W leczeniu kwasicy ketonowej u chorych na cukrzycę (DKA) najważniejsze znaczenie ma dożylne podawanie insuliny i roztwofu fizjologicznego chlorku sodu. Chorej po-

dawano dożylnie insulinę w ilości 10 IU na godzinę wraz z 0,9% roztworem Nad Nie podano natomiast glukozy do chwili obniżenia się glikemii poniżej 13,8 mmol/1 (250 mg/dl). Podawano również bardzo ostrożnie chlorek potasu, określając co godzinę kaliemię. Stałe monitorowanie stężenia potasu w osoczu krwi jest niezwykle ważne w leczeniu DKA, zaburzenia bowiem bilansu potasowego są główną przyczyną zgonu u tych chorych. Podawanie wodorowęglanu nie jest stosowane rutynowo i zarezerwowane tylko dla przypadków bardzo ciężkiej kwasicy ketonowej w przebiegu cukrzycy. Dyskusja. Dotychczas nie wyjaśniono dokładnie przyczyny cukrzycy typu I (insulinozależnej). Jest ona najprawdopodobniej skutkiem następującego łańcucha zjawisk. Chorzy z tym typem cukrzycy wykazują genetycznie uwarunkowaną podatność sprzyjającą infekcjom wiruso-

wym. Infekcja oraz wywołana przez nią reakcja zapalna najpewniej zmieniają antygenowość błon komórek beta wysp trzustkowych inicjując

proces autoimmunologiczny, w którym uczest-

niczą zarówno przeciwciała cytotoksyczne, jak

i limfocyty T. Proces ten jest przyczyną rozległej destrukcji komórek p i powstania cukrzycy insulinozależnej. Być może czynnikiem zapoczątkowującym cukrzycę u chorej była wirusowa infekcja przebyta kilka tygodni wcześniej pod postacią wrzodziejącego zapalenia gardła. Znaczna hiperglikemia, glikozuria, ketonemia i ketonuria potwierdziły rozpoznanie DKA. Niskie pH krwi świadczyło o ciężkiej kwasicy spowodowanej wzmożoną produkcją kwasu acetooctowego i betahydroksymasłowego. Niskie stężenie wodorowęglanów i niskie ciśnienie cząstkowe dwutlenku węgla (pCO2) potwierdziły występowanie kwasicy metabolicznej częściowo wyrównanej oddechowo (hiperwentylacją). Lekko podwyższone stężenia kreatyniny i mocznika w surowicy krwi mogły być spowodowane nieco upośledzoną czynnością nerek (uwarunkowaną hipoperfuzją nerek jako następstwo hipowolemii), odwodnieniem oraz zwiększonym katabolizmem białek. W DKA często stwierdza się wzrost stężenia potasu w osoczu krwi, spowodowany zmniejszonym poborem tego elektrolitu przez komórki (uwarunkowanym brakiem insuliny). Tak więc obraz kliniczny DKA jest odzwierciedleniem zaburzeń gospodarki węglowodanowej, tipidowej i białkowej spowodowanych gwał-

townym spadkiem stężenia insuliny we krwi.

864 / ROZDZIAŁ 62 Przyczyny zaburzeń przemiany potasowej, wodnej i jonu H' występujące w DKA zestawione w ryc. 62-8, Wzrost molalności osocza uwarun-

kowany hiperglikemią również uczestniczy w powstawaniu śpiączki pojawiającej się w ciężkiej DKA. Jest jasne, że racjonalne leczenie DKA zależy od dogłębnej znajomości mechanizmów działania insuliny.

PIŚMIENNICTWO Connor JM, Ferguson-Smith MA: Essential Medical Geneńcs, 2nd ed. Blackwell Sci Pubi, 1987. Friedmann, T: Progress toward human gene therapy. Science 1989;244;1275. Halliwell B (editor): Oxygen Radicals and Tissue Injury. Proceedings of an Upjohn Symposium, 1988. Harding, AE; The mitochondrial genome— breaking ttemagicdrcle.JV£Mg//Medl989;320:L341.(.This

^

issue contains 3 other articles on mitochondrial DNA and human diseases.) Jennings RB, Reimer KA: Pathobiology of acute myocardial ischemia. Hosp Praa (Jan) 1989:24:89. Koenig M, Monaco AP. Kunkel LM: The complete seąuence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein. Celi 1988;53:219. Lieber CS: Biochemical and molecular basis of alcohol-induced injury io iiver and other tissues. New Robbins SL, Kumar V: Basie Palhotogy, 4th ed. WB SaundersCo, 1987. Rubin E, Farber, JL (editors): Pathology, lst ed. JB Lippincolt Co, 1988. Scriver CR, et at (editor): In: The Metabotic Basis of Inherited Disease. 6th cd. McGraw Hill Book Co, 1989. The Merck Manuał, 15th ed. Merck, Sharp & Dohme, 19S7. Toruń B, Viteri FE: In: Modern Mutrition in Health and Disease. 7th ed, Shils ME, Young VR (editors). Lea & Febiger, 1988. Vogel F, Motulsky AG: Human Cenetics, 2nd ed. Springer-Verlag, 1986. Weatheralt DJ: The New Genetics and Clinicał Practke, 2nd ed. Oxford Unrv Press, 1985.

Erytrocyty i leukocyty

6 3

Robert K. Murray, MD, PhD

i

WPROWADZENIE Krew składa się z osocza i różnych rodzajów komórek. Niektóre białka osocza opisane są w rozdz. 58. W niniejszym rozdziale omówione zostaną głównie biochemiczne cechy krwinek czerwonych (ery trocytów) ijednej grupy krwinek białych (leukocytów), a mianowicie granulocytów oboje, tnochłonnych (neutrofili). Krwinki białe dzielą się na 3 grupy: granulocyty, monocyty i limfocyty. Granulocyty (zwane również leukocytami o wielopostaciowym jądrze, ponieważ ich jądro jest wieiopłatowe) zawierają liczne lizosemy i ziarnistości (pęcherzyki wydzielnicze) i dzielą się na 3 klasy. Krwinki należące do tych klas (granulocyty obojętnochłonne — neutrofile, granulocyty zasadochlonne — bazofile i granulocyty kwasochlonne — eozynofile) różnią się między sobą budową i powinowactwem ziarnistości do barwników. Granulocyty obojętnochionne fagocytują bakterie i odgrywają główną rolę w ostrych procesach zapalnych. Granulocyty zasadocMonne, które przypominają komórki tuczne (mastocyty), zawierają histaminę i heparynę oraz biorą udział w niektórych rodzajach nadwrażliwości. Granulocyty kwasochłonne uczestniczą w reakcjach alergicznych i odpowiedzi ustroju na zakażenia pasożytnicze. Monocyty są prekursorami makrofagów, które podobnie jak granulocyty obojętnochłonne biorą udział w fagocytozie. Limfocyty dzielą się na limfocyty B i T. Limfocyty B wytwarzają przeciwciała (p. rozdz. 58). Limfocyty T odgrywają rolę w różnych formach odporności komórkowozależnej, takich jak zabijanie komórek zakażonych wirusami t niektórych komórek nowotworowych. Szczegóły tych zjawisk można znaleźć w podręcznikach immunologii. Granulocyty obojętnochłonne i limfocyty stanowią 55 — Bfodicoiia

dominujące ilościowo grupy krwinek białych obecnych we krwi w warunkach prawidłowych. Udział płytek krwi w fefzepnięciu został omówiony w rozdz. 58 i nie będzie przedstawiony w niniejszym rozdziale. Różnicowanie komórek krwi z komórki pnia (macierzystej komórki multipotencjalnej) jest ważnym zagadnieniem, które jest tylko skrótowo omówione w niniejszym rozdziale. Bardziej szczegółowe przedstawienie może Czytelnik znaleźć w podręcznikach histologii, biologii komórkowej lub hematologii.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Komórki krwi są intensywnie badane, ponieważ można je łatwo uzyskać, pełnią liczne funkcje biologiczne i biorą udział w wielu procesach chorobowych. Budowa i czynność hemoglobiny (Hb), porfirie, żółtaczka i aspekty gospodarki żelazem zostały omówione w poprzednich rozdziałach. Zmniejszenie liczby krwinek czerwonych i zawartej w nich Hb jest przyczyną niedokrwistości (anemii): ważnej i niejednolitej grupy schorzeń, przy czym niektóre rodzaje niedokrwistości są często spotykane w praktyce klinicznej. Wiele układów grupowych krwi obecnych w błonie erytrocytów i innych komórek krwi ma szczególnie istotne znaczenie w przetaczaniu krwi i przeszczepianiu tkanek. Tabela 63-1 zawiera przyczyny licznych, ważnych chorób dotyczących krwinek czerwonych; niektóre z nich są omówione w tym rozdziale, a pozostałe przedstawione w innych częściach książki. Zapaleniem może być objęty każdy narząd organizmu. Granulocyty obojętnochłonne odgrywają główną rolę w ostrym zapaleniu, a inne leukocyty, np. limfocyty od-

866 / ROZDZIAŁ 63 Tabela 63-1. Zestawienie przyczyn wybranych ważnych chorób dotyczących erytrocytów Choroba Wyłączna tub główna przyczyna Niedokrwistość z niedoboru żela- Niedostateczna podaż lub nadmierna utrata żelaza za Nadmierna podaż utleniaczy (różne związki chemiczne lub leki) Methemoglobinemia Genetycznie uwarunkowany niedobór układu zależnej od NADH reduktazy methemoglobiny Niedokrwistość sierpowata

Zmiana kodonu 6 odpowiedzialnego za syntezę łańcucha p-hemoglobiny, tj. zastąpienie trypletu GAG przez GTG, co powoduje zastąpienie reszty waliny resztą kwasu glutaminowego

K-Talasemie

Mutacje genów syntezy a-globiny, głównie nierównomierne crossing-over lub duże oderwania, a rzadziej obecność kodu nonsensownego lub mutacje zmiany fazy odczylu

p-Talasemie

Rozliczne mutacje genu syntezy (3-globiny, w tym oderwania, kod nonsensowny, mutacje, zmiany fazy odczytu i inne zmiany budowy genu (np. miejsce „splicingu", mutacje genu pro motorów eg o)

NiedokrwistOŚci megaloblastyczne Niedobór witaminy B^ Niedobór kwasu foliowego Dziedziczna sferocytoza

Zmniejszone wchłanianie witaminy B^ wywołane niedoborem czynnika wewnętrznego wydzielanego przez komórki okładzinowe żołądka Zmniejszona podaż, upośledzone wchłanianie lub zwiększone-zapotrzebowanie (np. w ciąży) folianów

Niedobór dehydrogenazy g lukozo - 6 -fosforan u

Różnorodne mutacje genu dla G6PD, sprzężonego z chromosomem X; najczęściej mutacje punktowe

Niedobór kinazy pirogronianowej (PK)

Prawdopodobnie różnorodne mutacje genu odpowiadającego za syntezę izoenzymu erytrocytarnego (R) PK

Niedobór ilościowy lub zaburzona budowa spektryny

grywają rolę w zapaleniach przewlekłych. Białaczki, określane jako złośliwe nowotwory tkanek wytwarzających krew, mogą dotyczyć komórek prckursorowych każdej głównej grupy krwinek białych. Najczęściej spotykanymi ich rodzajami są ostre i przewlekłe białaczki szpikowe, dotyczące komórek prekursorowych granulocytów obojętnochłonnych oraz ostre i przewlekle białaczki iimfatyczne. Złożona chemioterapia oparta na stosowaniu kombinacji różnych czynników chemioterapeutycznych, z których każdy działa na jeden lub wiele biochemicznych punktów uchwytu, jest znacznie skuteczniejsza w leczeniu wielu typów białaczek. Zrozumienie roli krwinek czerwonych i białych w stanach zdrowia r choroby wymaga wiedzy o licznych podstawowych aspektach ich metabolizmu.

ERYTROCYT CECHUJE SIĘ UPROSZCZONĄ BUDOWĄ I FUNKCJĄ Główne czynności erytrocytów są względnie proste i obejmują dostarczanie tlenu do tkanek i pomocy w wydalaniu dwutlenku węgla oraz protonów wytwarzanych ix metabolizmie tkankowym. Tak więc ma on znacznie uproszczoną strukturę niż większość komórek ludzkiego organizmu, a zbudowany jest z błony komórkowej, która otacza roztwór Hb (białko to stanowi 95% wszystkich białek wewnątrzkomórkowych erytrocytu). Erytrocyt nie ma takich organelli komórkowych, jak mitochondria, lizosomy lub aparat Golgiego. Ludzkie krwinki czerwone, podobnie jak erytrocyty większości zwierząt, pozbawione są jądra komórkowego. Nie są one jednak metaboiieznie obojętne. ATP

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 867

jest syntetyzowany w procesie glikolizy i stanowi to ważny proces, który ułatwia krwince utrzymanie kształtu dwuwklęsłego, a także ułatwia regulację transportu jonów (np. przy udziale Na+/Kł"-ATP-azy i białek wymiany anionów,

p. dalej) oraz ułatwia transport wody z i do komórki. Dwuwklęsly kształt zwiększa stosunek powierzchni do objętości krwinki i w ten sposób sprzyja wymianie gazów. Krwinka czerwona zawiera składniki cjjfoszkieletu (p. niżej), które odgrywają ważną rolę w utrzymaniu kształtu erytrocytu. Około 2 min erytrocytów dostaje się do krążenia w każdej sekundzie Prawidłowa liczba erytrocytów u dorosłych, mę-

żczyzn wynosi 4,6—6,2 mln/ul (4,6—6,2 • 10lz/l), a odpowiednia wartość dla kobiet wynosi 4,2 —5,4 mln/ul (4,2—5,4-1012/0- Całkowita liczba erytrocytów krążących wynosi ok. 2,5 x 1013. Prawidłowa zawartość Hb we krwi mężczyzn wynosi 14—18 g/dl (8,7—11,2 mmol/1), a dla kobiet wartość ta wynosi 12—-16 g/dl (7,5—9,5 mmol/1). Wartość hematokrytowa, tj.

względny stosunek objętości krwinek czerwonych do krwi pełnej wynosi dla mężczyzn 42 —52% (0,42—0,521/1), a dla kobiet 37-^7% (0,37—0,47 1/1). Czas życia prawidłowego erytrocytu wynosi 120 dni, co oznacza, że codziennie jest wymieniane nieco mniej niż 1% całej liczby krwinek (200 bln dziennie lub 2 min na sekundę). Pojawiające się w krążeniu nowe erytrocyty zawierają jeszcze rybosomy i składniki siateczki śródplazmatycznej. Kwas rybonukleinowy (RNA) rybosomów można wykryć za pomocą odpowiedniego barwienia (np. błękitem krezolowym), a komórki te określa się jako retykulocyty. W warunkach prawidłowych stanowią one ok. 1% wszystkich erytrocytów. Czas życia krwinek czerwonych może ulec dramatycznemu skróceniu w różnych rodzajach niedokrwistośri hemolitycznych. Liczba retyku-

locytów jest wtedy znacznie zwiększona, ponieważ szpik próbuje wyrównać szybki rozpad

Multipotencjalna , komórka pnia '

DFUC

""*

krwinek przez wzrpst wydzielania nowych, młodych krwinek do krążenia. Erytropoetyna reguluje wytwarzanie erytrocytów Ludzka erytropoetyna (Epo) jest glikoproteiną zbudowaną z 166 reszt aminokwasowych (masa cząsteczkowa ok. 34000). Jej stężenie w osoczu oznacza się metodami radioimmunologicznymi. Jest ona głównym czynnikiem regulującym u człowieka tworzenie krwinek czerwonych. Wyodrębniono cDNA kodujący Epo i określono jego sekwencje. Epo jest wytwarzana głównie przez nerki i uwalniana, w odpowiedzi na niedobór tlenu, do strumienia krwi, którym dostaje się do szpiku kostnego. Tam dochodzi do oddziaływania Epo z komórkami prekursorowymi krwinek czerwonych przez swoisty receptor. Receptor ten jest białkiem śródbłonowym zbudowanym z 2 podjednostek i licznych składników niebiałkowych. Może być on kinazą tyrozynową, ale nie zostało to ostatecznie ustalone. Nie zostały również zidentyfikowane związki biorące udział w dalszym przekazywaniu sygnału receptorowego oraz swoiste geny w komórkach docelowych. Epo działa na komórkę prekursorową krwinek czerwonych znaną jako jednostka erytroidalna rozrastająca się (burst fonning unit - erythroid; BFU-E) powodując jej proliferację i różnicowanie. Dodatkowo, Epo działa na dalszy prekursor erytrocytów znany jako jednostka erytroidalna tworząca kolonie (colony forming unit - erythroid; CFU-E) także powodując jego proliferację i różnicowanie się. Do tego działania Epo wymaga współdziałania z innymi czynnikami (np. interleukina 3 i podobnymi do insuliny czynnikami wzrostu, p. ryc. 63-1). Uzyskanie cDNA dla Epo umożliwiło produkcję znacznych ilości tego hormonu i wykorzystanie go do badań i celów leczniczych. Uprzednio wyodrębniono jedynie bardzo małe ilości tego białka z moczu. Głównym zastosowaniem rekombinowanej Epo (rEpo) jest leczenie niektó-

r CrU C

*" r r r °^" r ""'°_____■» Dodała krwinka erytrocytu ^^ czerwona

Ryc. 63-1. Znacznie uproszczony schemat różnicowania się komórek pnia do krwinek czerwonych, BFU-E=burst forming unit - erythroid; CFU-E=colony forming unit - erythroid; Epo=erytropoetyna; GM-CSF=czynnik pobudzający granulocyty i makrofagi; IL-3=interleukina 3.

868 / ROZDZIAŁ 63

rych rodzajów niedokrwistości, takich jak niedokrwistość spowodowana niewydolnością nerek.

WIELE CZYNNIKÓW WZROSTU REGULUJE WYTWARZANIE LEUKOCYTÓW W ostatnich latach wykryto, poza Epo, dużą liczbę hentopoetycznych czynników wzrostu. Badania te rozszerzyły wiedzę o różnicowaniu się komórek krwi, dostarczyły czynników, które mogą być użyteczne w leczeniu i pomagają zrozumieć nieprawidłowy wzrost komórek krwi (np. zachodzący w białaczkach). Podobnie jak Epo, większość wyodrębnionych czynników jest glikoproteinami, są one bardzo aktywne in vivo oraz in vitro, oddziałują z komórkami docelowymi przez swoiste receptory błony komórkowej oraz układ wewnątrzkomórkowego przenoszenia sygnału receptorowego zmieniając ekspresje genów. Docelowe działanie na ekspresję genową powoduje różnicowanie się komórek. Wiele z nich uzyskano drogą klonowania, co pozwoliło na ich produkcję we względnie dużych ilościach. Dwa z tych czynników są szczególnie interesujące; czynnik pobudzający tworzenie kolonii granulocytów (granulocyte colony-stimulating factor. G-CSF) i czynnik pobudzający tworzenie kolonii grsinuloc ytowo-makrofagowych (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; GM-CSF). G-CSF jest względnie swoistym czynnikiem działającym na granulocyty obojetnochłonne. GM-CSF działa na różne komórki progenitorowe i pobudza granuiocyty obojętnochłoBąe, makrofagi i granulocyty kwasochłonne. Zmniejszone wytwarzanie granulocytów obojętnochłonnych określa się jako neutropcnię. Występuje ona szczególnie często u pacjentów leczonych chemioterapeutykami lub u osób po przeszczepie szpiku. U takich pacjentów mogą występować niebezpieczne zakażenia. G-CSF podaje się takim chorym w celu stymulacji wytwarzania granulocytow obojętni (chłonnych. Niektóre badania wskazują, że jest on skuteczny. Jednym z czynników wymagających rozważenia jest podawanie GCSF pacjentom, u których wystąpiła neutropenia spowodowana leczeniem białaczki. Podawany czynnik G-CSF może pobudzać wzrost komórek białaczkowych. Ostatnie badania wskazują, że zjawisko tonie występuje, jeżeli dawki G-CSF są małe, mimo to nadzór nad chorymi musi być wzmożony.

ERYTROCYT MA WYJĄTKOWY, ALE WZGLĘDNIE PROSTY METABOLIZM W tabeli 63-2 przedstawiono różne aspekty metabolizmu erytrocytu, a wiele z nich omówiono w innych rozdziałach.

Erytrocyt ma w błonie komórkowej układ przenoszący glukozę

Stopień wnikania glukozy do erytrocytów jest znacznie większy niż wynikałoby to z prostej dyfuzji. Jest to raczej przykład ułatwionej dyfuzji (p. rozdz. 43). Swoiste białko biorące udział w tym procesie nazywane jest przenośnikiem glukozy lub permeazą glukozową. Niektóre jego właściwości zestawiono w tab. 63-3. Szczególnie ważny jest proces wnikania glukozy do erytrocytów, ponieważ stanowi główne źródło energii dla tych komórek. Z tkanek wyodrębniono 5 odmiennych, chociaż zbliżonych do siebie rodzajów białek przenoszących glukozę. W przeciwieństwie do białka z erytrocytów, niektóre z nich wykazują zależność od insuliny (np. białka obecne w mięśniach i tkane? tłuszczowej). Szczególnie te ostatnie budzą duże zainteresowanie, ponieważ upośledzenie przemieszczania tych białek ze skupisk wewnątrzkomórkowych do błony komórkowej komórek mięśni szkieletowych może tłumaczyć mechanizm oporności na insulinę stwierdzany u chorych z cukrzycą niezależną od insuliny (p. rozdz. 52).

W retykulocytach zachodzi synteza białek

Dojrzały erytrocyt nie ma zdolności syntezy białek. Czynne w tym procesie są natomiast retykulocyty. Po wejściu do krążenia, tracą one organelle wewnątrzkomórkowe (rybosomy, mitochondria itp.) i w ciągu 24 h, stając się młodymi erytrocytami, tracą zdolność do syntezy białek. Wyciąg z retykulocytów królika (uzyskanych przez podanie zwierzęciu fenylohydrazyny, która powoduje ciężka niedokrwistość hcmolityczną, co prowadzi do prawie całkowitego zastąpienia erytrocytów przez retykulocyty) jest powszechnie używany jako układ syntezy białek in vitro. Endogenny mRNA, obecny w retykulocytach, zostaje rozłożony za pomocą nukleazy, której aktywność jest później zahamowana przez dodanie jonów wapniowych. Układ ten następnie jest programowany przez dodanie oczyszczonego mRNA lub wy-

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 869 Tabela 63-2. Zestawienie istotnych aspektów metabolizmu erytrocytu . Erytrocyt pozostaje w silnej zależności od glukozy jako źródła energii; błona komórkowa erytrocytów zawiera białka transportujące glukozę o wysokim powinowactwie do glukozy Glikoliza, w wyniku której powstają mleczany, jest źródłem powstawania ATP ATP nie powstaje w wyniku losforylacji oksydacyjnej, ponieważ erytrocyt nie ma mitochondriów Erytrocyt ma zespół układów transportujących, co pozwala mu utrzymywać równowagę wodno-- elektrolitową Wytwarzanie 2,3-bisfbsfoglicerynianu w reakcjach ściśle związanych z glikoliza jest ważnym czynnikiem regulującym zdolność Hb do przenoszenia tlenu W erytrocycie zachodzą przemiany cyklu pentozo-fosforanowego (ok. 5-10% całkowitej ilości wchłoniętej glukozy jest w ten sposób metabolizowane), który wytwarza NADPH. Częstą chorobą jest niedokrwistość hemolityczna wywołana niedoborem aktywności dehydrogenazy glukoz o-6-fosforanowej W metabolizmie erytrocytu istotną rolę odgrywa zredukowany glutation (GSH), częściowo przeciwdziałający aktywności potencjalnie toksycznych nadtlenków. Krwinka czerwona może wytwarzać GSH przez redukcję utlenionego glutationu (GSSG), a proces ten wymaga NADPH Żelazo w Hb musi pozostawać w postaci żelazawej; jony żelazowe są redukowane do żelazawych w wyniku działania zależnego od NAOH układu reduktazy methemoglobiny przy udziale reduktazy cytochromu t>5 i cytochromu b5 Wytwarzanie glikogenu, kwasów tłuszczowych, białek i kwasów nukleinowych nie zachodzi w krwince czerwonej, choć niektóre lipidy (np. cholesterol) obecne w błonie komórkowej erytrocytu mogą ulegać wymianie z analogicznymi lipidami osocza Erytrocyt zawiera liczne enzymy metabolizmu nukleotydów (np. deaminazę adenozynową, nukleotydazę pirymidynową i kinazę adenylanową); niedobór tych enzymów może być przyczyną niektórych postaci niedokrwistości hemolitycznej Kiedy erytrocyt kończy swoje życie, globina jest rozkładana do aminokwasów, które są powtórnie zużywane przez organizm, żelazo zostaje uwolnione z hemu i powtórnie zużytkowane, a składowe czteropirolowe hemu ulegają przekształceniu w bilirubinę, która jest głównie wydalana drogą jelit za pośrednictwem żółci Tabela 63-3. Niektóre właściwości biaika transportującego glukozę zawartego w błonie komórkowej erytrocytów Stanowi ok. 2% białek błony komórkowej krwinki czerwonej Cechuje się swoistością w stosunku do glukozy i D-heksoz (L-heksozy nie są przenoszone) Przy fizjologicznym stężeniu glukozy we krwi {ok. 5mmol/l) białko transportujące pracuje w stanie ok. 75% jego Vmajt; może ulegać wysyceniu i może być hamowane przez niektóre analogi strukturalne glukozy Dotychczas wyodrębniono 5 różnych białek transportujących glukozę obecnych w tkankach ssaków, białko erytrocytów jest jednym z nich Białko nie jest zależne od insuliny w przeciwieństwie do analogicznych białek transportujących obecnych w mięśniach lub tkance tłuszczowej Ustalono pełny skład aminokwasowy (492 reszt aminokwasowych) białka transportującego Białko ma zdolność przenoszenia glukozy również jeżeli jest umieszczone w sztucznych liposomach Szacuje się, że zawiera ono 12 przezbłonowych fragmentów o budowie helikalnej Działanie białka transportującego polega na wytwarzaniu bramkowanych kanałów w błonie komórkowej, które umożliwiają przemieszczanie się glukozy; kanały zależą konformacyjnie od obecności glukozy i mogą zmieniać się szybko (ok. 900 razy na sekundę)

870 / ROZDZIAŁ 63

ciągu z całych komórek zawierającego mRNA, a radioaktywne białka są syntetyzowane w obecności 3SS-L-metioniny lub innych aminokwasów znakowanych izotopami radioaktywnymi. Wytwarzane w tym układzie białka radioaktywne są rozdzielane za pomocą elektroforezy SDSPAGE i wykrywane autoradiograficznie. Dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza i glutation chronią krwinki czerwone przed obciążeniem i uszkodzeniem tlenowym. W trakcie przemian zarówno w komórkach krwi, jak i w większości innych tkanek powstaje wiele si\nych utleniaczy. Należą do nich anion ponadtlenkowy O?, nadtlenek wodoru (H2O3), rodniki nadtlenkowe (ROO") i rodnik hydroksylowy (OH"). Ostatni z nich jest szczególnie aktywną cząsteczką i może reagować z białkami, kwasami nukleinowymi, lipidami i innymi cząsteczkami, co prowadzi do zmian strukturalnych i uszkodzenia tkanek. Reakcje zestawione w tab. 63-4 odgrywają istotną rolę w wytwarzaniu i unieczynnianiu utleniaczy. Zostaną one po kolei omówione. Ponadtlenki (reakcja 1) są wytwarzane w erytrocytach w wyniku autooksydacji Hb do met Hb (ok. 3% Hb w ludzkich erytrocytach ulega autooksydacji w ciągu doby). W pozostałych tkankach są one wytwarzane w wyniku działania takich enzymów, jak reduktaza cytochromu P-450 i oksydaza ksantynowa. Granulocyty

Tabela 63-4. ReakcjŚtnajace znaczenie w

obojętnochłonne pobudzone przez kontakt z bakteriami ulegają eksplozji oddechowe] (patrz niżej) i wytwarzają ponadtlenki w reakcji katalizowanej przez oksydazę NADPH (reakcja 2). Ponadtlenek samoistnie ulega przekształceniu w H2O2 i O2, a reakcja ta może zostać bardzo przyspieszona w wyniku działania enzymu dysmutazy nadtlenkowej (reakcja 3), Nadtlenek wodoru ulega dalszym przemianom. Enzym katala/a, występujący w wielu rodzajach komórek, katalizuje rozpad nadtlenku wodoru do H2O i O2 (reakcja 4), Granulocyty obojętnochłonne zawierają wyjątkowy enzym — mieloperoksydazę, dzięki której z HZO2 i halogenków powstają kwasy podhalogenawe (reakcja 5). To zagadnienie zostanie omówione poniżej. Zawierający selen enzym peroksydaza glutationowa (p. rozdz. 22) może f5wn1eż"działać na zredukowany glutation (GSH) i H2O2, w wyniku cz£go po_wstaje utleniony glutation^XGSSG]ULH<>Q (reakcja 6). Wspomniany enzym może użytkować także nadtlenki jako substraty. OH' i OH" mogą powstawać w nieenzymatycznej reakcji katalizowanej przez jony Fe2+ (reakcja Fentona, reakcja 7). O2 i H2O2 są substratami w katalizowanej przez żelazo reakcji Habera-Weissa (reakcja 8), w wyniku której również powstają OH' i OH". Ponadtlenek może uwalniać jony żelazowe z ferrytyny. Tak więc, produkcja OH" może być jednym z mechanizmów uszkadzających tkanki w stanach nadmiaru żelaza (np. w hemosyderozie).

obciążeniu tlenowym komórek krwi i tkanek

(1) Powstawanie ponadtlenków (jako produktów różnych reakcji)

02 +

(2) NADPH-oksydaza (3) Dysmutaza ponadtlenkowa

2O2 + NADPH -» 20; + NADP< + H

(4) Katalaza

0i + <2O2 H

B - Cli +

+

32+2H -» H 2O2 + O 2 -* 2H 2 O + O 2

(5) Mieloperoksydaza

H2O2 +■ X- + H + -* HOX + H 2 0 (X=CI ", Br, SCIM-)

(6) Peroksydaza glutationowa (selenozależna)

2GSH + R-O-OH -» GSSG + H

(7) Reakcja Fentona

Fe2+ -+ H2O -> Fe 3+ + OH- + OH"

(8) Katalizowana przez żelazo reakcja Ha-

O2 + ł H 2 O 2 -> O 2 + OH- + OH"

0)

G6P +

2

O + ROH

bera-Weissa

Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa (G6PD)

(10) Reduktaza glutationowa

NADP + -» 6-fosfoglukonian + NADPH + H

GSSG + NADPH + H

+

-> 2GSH + NADP+

+

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 871

Związki i reakcje chemiczne mogące uwalniać loksyczrie postacie tlenu są określane jako proutleniacze. Z drugiej strony, związki i reakcje chemiczne usuwające te postacie tlenu, „zmiatające" je, zmniejszające ich tworzenie lub przeciwdziałające ich działaniu określane są jako przeciwu tleni acze (antyoksydanty). Zalicza się do nich takie 2wiązki chemiczne, jak NADPH, GSH, kwas askorbinowy i witaminę E. W prawidłowej komórce występuje równowaga między proutleniaczami a przeciwu tleni aczami. Równowaga ta może być zaburzona na rzecz proutleniaczy, kiedy powstawanie toksycznych postaci tlenu znacznie wzrośnie (np. po wprowadzeniu niektórych związków chemicznych lub leków) lub gdy zawartość aniyoksydantów znacznie się zmniejszy (np. po unieczynnieniu enzytnów biorących udział w usuwaniu toksycznych postaci tlenu lub w warunkach obniżonej zawartości wymienionych przedwutleniaczy). Stan taki nazywamy obciążeniem (stresem) tlenowym i jeżeli jest on nasilony lub trwa dłużej, może być przyczyną poważnych uszkodzeń komórki. Postacie tlenu są obecnie uważane za ważny czynnik powodujący uszkodzenie komórek (np, w wyniku podawania różnych trujących substancji chemicznych lub niedokrwienia) niekiedy prowadzący do śmierci komórki. Pośrednim dowodem takiego działania tlenu jest ochronne oddziaływanie dysmutazy ponadtlenkowej lub katalazy w zapobieganiu uszkodzenia komórek w stanach wyżej opisanych. Niedobór dehydrogenazy glukozo-6fosforanowej jest częstą w niektórych obszarach i ważną przyczyną niedokrwistości hemolttycznej NADPH, który powstaje w cyklu pentozowo--fosforanowym w reakcji katalizowanej przez dehydrogennzę glukozo-6fosforattową (tab. 63--4, reakcja 9) enzym, którego synteza dziedziczy się w sprzężeniu z chromosomem X, odgrywa główną rolę w utrzymaniu równowagi czynników redukujących w krwince czerwonej i innych komórkach, takich jak hepatocyty. Ponieważ cykl pentozowo-fosforanowy jest wyłączną drogą powstawania NADPH w erytrocycie, jest ona bardzo podatna na uszkodzenia wywołane przez utleniacze, jeżeli dochodzi do upośledzenia cyklu pentozowo-fosforanowego (np. w wyniku niedoboru enzymów). Jedną z funkcji

NADPH,jest, redukowanie GSSG do GSH. Reakcja katalizowana jest przez reduktazę gluTationową (reakcja 10). Niedobór aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosfo ran owej w wyniku mutacji jest bardzo częsty w niektórych częściach świata (np. w Afryce równikowej, okolicach Morza Śródziemnego, niektórych częściach Azji, u Murzynów w Ameryce Północnej). Jest on najczęściej spotykaną enzymopatią, czyli chorobą spowodowaną przez zmiany enzymów. Wykazano ponad 300 genetycznie uwarunkowanych odmian wspomnianego enzymu. Obecność nieprawidłowych odmian dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej stwierdza się co najmniej u 100 min ludzi. Powoduje to chorobę określaną jako niedokrwistość hemotityczną. Spożywanie bobu (Kica faba) przez osoby z niedoborem aktywnego enzymu powoduje wystąpienie napadów niedokrwistości hemolitycznej (najprawdopodobniej dlatego, że bób zawiera silne utleniacze). Ponadto liczne leki (np. przeciwzimniczy lek prymachina — Primaquine) (tzw. niedokrwistość hemolityczna uwarunkowana prymachina) lub sulfonamidy oraz inne czynniki chemiczne (np. naftalen) mogą wywoływać napady, ponieważ ich zażycie powoduje wytwarzanie H2O2 lub O~^. W warunkach prawidłowych H2O2 jest rozkładany przez katalazę i peroksydazę glutationową (tab. 63-4, reakcje 4 i 6). Ostatnia z tych reakcji prowadzi do powstania GSSG. GSH jest regenerowany z GSSG w wyniku działania enzymu reduktazy glutationowej, której działanie zależy od dostępności NADPH (reakcja 10). Krwinki czerwone osób, u których występuje niedobór aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, nie mogą wytwarzać dostatecznych ilości NADPH do regeneracji GSH z GSSG. To z kolei upośledza zdolność krwinek do unieczynniania H2OZ i rodników tlenowych. Związki te mogą powodować utlenienie krytycznych grup SH w białkach i prawdopodobnie powodować peroksydację Lipidów błony krwinki czerwonej, co prowadzi do lizy krwinek. Utlenienie niektórych grup SH w Hb powoduje wytrącanie się tego białka wewnątrz erytrocytów i tworzenie się ciałek Heinza, które stwierdza sie po wybarwieniu na purpurowo za pomocą fioletu krezylowego. Obecność ciałek Heinza wskazuje, że krwinki czerwone znajdują się w stanie obciążenia (stresu) tlenowego. Rycina 63-2 zestawia łańcuch przyczynowy zaburzeń występujących u chorych na niedokrwistość hemolityczna.

872 / ROZDZIAŁ 63 Mutacje genu kodującego G6PD

Obniżona aktywność G6PD Obniżona zawarto&ć NADPH Obniżona regeneracja GSH z GSSG przez reduktazę glutationowa (Która wymaga udziatu NADPH) Utlenianie grup SH Hb (tworzenie ciatek Heinza) i biatek błony w wyniku zmniejszonej zawartości GSH i wzrosiu zawartości wewnątrzkomórkowych utleniaczy (np. 0^, co prowadzi do zmiany struktury ttony I wzrosiu podatności na strawienie przez makrotagi (możliwe Jest również uszkodzenie lipidfiw błony przez nadtlenki) Hemoliza

Rvc. 63-2. Podsumowanie prawdopodobnych zjawisk powodujących niedokrwistość hemolityczną w wyniku niedoboru aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD),

Met hemoglobin a nie bierze udziału w przenoszeniu tlenu Jony żelazawe z Hb są podatne na utlenienie przez ponadtlenki i inne utleniacze, w wyniku czego powstaje metHb, która nie posiada zdolności przenoszenia tlenu, W warunkach prawidłowych tylko bardzo mała ilość metHb znajduje się we krwi, ponieważ krwinka czerwona ma skuteczny układ redukujący jony żelazowe Fe3 k do żelazawych Fe^+ (układ reduktazy NADH-cytochrom b; met hemoglobina) Układ ten składa się z NADH (wytwarzanego w procesie glikolizy), flawofstpteiny nazwanej reduktazą cytochromu b; (zwanej także reduktazą metHb) i cytochromu b;. Jony żelazowe Fes + metHb są redukowane do żelazawych Fe2 + w wyniku działania zredukowanego cytochromu bj!

Zredukowany cytochrom b; jest następnie regenerowany w wyniku działania reduktazy cytochromu b;: Cyt b, „,, + NADH^Cyt b5 M + NAD+ + H+ Methemoglobinemia może być wrodzona lub nabyta f Methemoglobinemia może być podzielona na wrodzoną i nabytą. Ta ostatnia jest spowodowa-

na spożyciem licznych leków lub związków chemicznych. Żaden z rodzajów met hemoglobinemii nie występuje często, ale lekarz powinien być świadomy możliwości pojawienia się u chorego tego schorzenia. Wrodzona postać methemoglobinemii zwykle jest wynikiem niedoboru aktywności reduktazy methemoglobinowej, co jest przekazywane jako cecha autosomalna recesywna. Niektóre rodzaje nieprawidłowych hemoglobin (HbM) mogą stanowić rzadką przyczynę methemoglobinemii. W HbM mutacje prowadzą do zmian w składzie reszt aminokwasowych biorących udział w połączeniu z hemem, co zmienia powinowactwo Hb do tlenu i ułatwia proces utleniania. Zażycie wielu leków (np. sulfonamidów) lub substancji chemicznych (np. aniliny) może stanowić przyczynę nabytej methemoglobinemii. Sinica (niebieskosine zabarwienie skóry i błon śluzowych spowodowane wzrostem zawartości nieutlenowanej Hb we krwi tętniczej lub w omawianym przypadku wzrostem zawartości metHb we krwi) jest zwykle dominującym objawem, a jest ona wyraźna, jeżeli ponad 10% Hb występuje w postaci metHb. Rozpoznanie opiera się na spektroskopowym badaniu krwi, które uwidacznia typowe widmo absorpcyjne metHb. Dodatkowo, próbki krwi zawierającej metHb nie mogą być w pełni utlenowane przez przepuszczany przez nie tlen, w przeciwieństwie do nieutlenowanej prawidłowej krwi. Obecność nieprawidłowej Hb można wykazać za pomocą elektroforezy. W leczeniu lekkich postaci methemoglobinemii wywołanych niedoborem enzymu stosuje się błękit metylenowy lub kwas askorbinowy (czynniki redukujące). Ostra nasilona methemoglobinemia (wywołana spożyciem związków chemicznych) powinna być leczona dożylnymi podawaniami błękitu metylenowego.

O BŁONIE LUDZKICH ERYTROCYTÓW WIADOMO WIĘCEJ NIŻ O BŁONIE ZEWNĘTRZNEJ INNYCH KOMÓREK ORGANIZMU CZŁOWIEKA Do badania błony krwinek czerwonych stosuje się różne metody biochemiczne (p. rozdz. 43). Należy do nich rozdział białek błony za pomocą elektroforezy SDS-PAGE z zastosowaniem swoistych enzymów (proteinazy, glikozydazy i in.), aby zlokalizować białka i gliko-

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 873 Tabela 63-5. Zestawienie biochemicznej charakterystyki błony komórkowej krwinek czerwonych Błona jest dwuwarstwowa i składa się w 50% z lipidów i 50% z białek Główną grupę lipidów stanowią fosiolipidy i cholesterol; głównymi fosfolipidami są fosfatydylocholina (PC), etanoloamina (PE) i fosfatydyloseryna (PS) oraz sfingomielina (Sph) Fosfolipidy zawierające cholinę: PC i Sph przeważają w zewnętrznej warstwie błony, a fosfolipidy zawierające aminokwasy (PE i PS) w wewnętrznej warstwie błony Glikosfingolipidy (G^Ls) (obojętne GSLs, gangliozydy i związki złożone, w tym związki grupowe krwi ABO) stanowią oft. 5-10% wszystkich lipidów Rozdział za pomocą SDS-PAGE elektroforezy wykazuje, ze błona zawiera ok. 10 głównych białek i ponad 100 białek pomniejszych Główne białka błony (w tym spektryna, ankiryna, białko wymiany anionów, aktyna i białko 4.1) zostały intensywnie przebadane; ustalono ich rozmieszczenie (integralne lub peryferyjne białko), budowę oraz funkcję Wiele z białek błony to glikoproteiny (np. glikoferyny) zawierające łańcuchy o!?(fbsacłiarydowe związane za pomocą 0- i (lub) IM-wiązania i umieszczone na zewnętrznej powierzchni błony

proteiny w błonach, a także różne techniki badania zawartości i rozmieszczenia poszczególnych lipidów. Stosuje się także techniki morfologiczne (np. mikroskopia elektronowa, mikroskopia elektronowa mrożeniowego przełomu struktur biologicznych — freeze-fracture electron microscopy) oraz inne metody (np. użycie przeciwciał skierowanych przeciwko określonym składnikom) Rozpad erytrocytów w określonych warunkach prowadzi do powstania cieni krwinek o naturalnym układzie błony komórkowej. Zmiana warunków Sizy powoduje powstanie cieni krwinek mających cytozolową stron? błony umieszczoną na zewnątrz (odwrócone cienie krwinek). Oba rodzaje cieni są przydatne w analizie rozmieszczenia swoistych białek i lipidów błony komórkowej. W ostatnich, latach otrzymano cDNA dla wielu białek błony, co pozwoliło na określenie ich składu aminokwasowego i budowy, W sumie znacznie więcej wiadomo o błonie krwinek czerwonych niż o jakiejkolwiek błonie innych komórek organizmu człowieka (tab. 63-5), Za pomocą SDS-PAGE rozdziela się białka błony erytrocytów Zastosowanie elektroforezy SDS-PAGE pozwala na wyodrębnienie ok. 10 głównych białek obecnych w błonie krwinek czerwonych (ryc. 63-3). Wiele z nich okazało się być glikoproteinami, co wykazano za pomocą reakcji PAS (kwas nadjodowy — odczynnik Schiffa)

Spektryna Ankiryna .

, d

Białko wymiany / , ani onó w!

AKlyna S G9PD 6 7 Glob Ina

i

iH z —

Barwienie błękitem Coomasste

■ Glikoforyny

Barwienie metodą PAS

Ryc. 63-3. Diagram głównych biatek błony ludz kich krwinek czerwonych po rozdziale za pomocą SDS-PAGE. Białka wybarwiające się błękitem Co omassie przedstawiają dwa lewe słupki, prawy słupek przedstawia białka wybarwiające się kwa sem nadjodowym i odczynnikiem Schiffa. (Wed ług: Beck W. S., Tepper R.).: Hemolyticanemiaslll. Membranę disorders; w: Beck W. S. (red.): Hematoiogy. The MIT Press 1991, wyd, 5, za zezwole niem). ______________________________

J

874 / ROZDZIAŁ 63

(p. rozdz. 57). Białka określa się zgodnie z szybkością migracji elektroforetycznej, a najwolniej przesuwające się (a więc białko o największej masie cząsteczkowej) nazwane zostało białkiem pasma I lub spektryną. Wyodrębniono wszystkie główne białka, większość z nich została zidentyfikowana, a także poczyniono znaczny postęp w zrozumieniu ich czynności biologicz-

nych (tab. 63-6). Ustalono również skład aminokwasowy i sekwencję wielu białek. Poza tym ustalono, które z białek są integralnymi, a które peryferyjnymi białkami błony komórkowej, które białka znajdują się na zewnętrznej powierzchni, a które są umiejscowione na powierzchni cytoplazmatycznej lub zajmują całą szerokość błony (ryc. 63-4). Za pomocą czułych

Tabela 83-6. Główne białka błony komórkowej erytrocytu* Numar pasma** 1

2 2.1 2.2 2.3 2.6 3 4.1 5 6 7 8

Białko

Białko

Przybliżona

integralne {1) lub peryferyjna (P)

masa cząsteczkowa

Spektryną (a) Spektryną (J3) Ankiryna Ankiryna Ankiryna Ankiryna Białko wymiany anionów Nie nazwane Aktyna Dehydrogenaza gliceraldehydo-6-fosforanowa Tropom i ozyna Nie nazwane Glikoforyny A, B, C

P P P P P P 1 P P P P P 1

240 000 220 000 210 000 195 000 175 000 145 000 100 000 80 000 43 000 35 000 . -29 000 23 000 31 000, 23 000, 28 000

* Dane zaadaptowane z pracy: Lux SE, Becker PS: Disorders of the red celi membranę skeleton: Hereditary spherocytosis and hefeditary elliptocytosis; w. The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver CR i in. (red.), wydanie 6, McGraw-Hill, 1989. "* Numer pasma odnosi się do szybkości migracji w elektroforezie SDS-PAGE (p. ryc. 63-3). Glikoforyny są wykrywane za pomocą barwienia metodą PAS (kwas nadjodowy — odczynnik Schiffa). Liczne inne składniki pominięto w tabeli. Natywna spektryną ma budowę x$7 Oddziaływanie spektryny z ankiryna l Wątkiem 3

OddZfatywsme aktyny i spektryny z białkiem 4.1

Zewnętrzna strona błony Wewnętrzna strona btony

,Glikoforyna Dwuwarstwowa Wana --------lip Id owa— Spektryna

Połączenie cząsteczek spektryny

Ryc. 63-4. Diagram oddziaływań białek cytoszkieietu międzysobąizinnymi integralnymi białkami błony krwinki czerwonej. (Według: Beck W. S., Tepper R. i: Hemolytic anemias III: Membranę disorders; w: Beck W. S. (red): Hematology. The MiT Press 1991, wyd. 5, za zezwoleniem).

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 875

metod barwienia lub dwukierunkowej elektroforezy w błonie krwinek czerwonych można zidentyfikować wiele pomniejszych składników. Jednym z tych składników jest opisane uprzednio białko przenoszące glukozę. Głównymi integralnymi białkami błony komórkowej są białka wymiany anionów i glikoforyny Białko wymiany *anionów (pasmo 3) jest przezbłonową glikoproteiną. której C-koniec znajduje się na zewnętrznej powierzchni błony, a N-koniec na powierzchni cytoplazmatycznej błony. Jest ono przykładem wielokrotnie p rzeźbiono w ego (multipass) białka, które rozciąga się miedzy powierzchniami błony co najmniej 10 razy. Występuje ono prawdopodobnie w postaci dimeru. który tworzy kanał pozwalający na przemieszczenia i wymianę chlorków na wodorowęglany. Dwutlenek węgla wytwarzany w tkankach wnika do krwrnek czerwonych w postaci wodorowęglanów, które ulegają wymianie na chlorki w płucach, gdzie dwutlenek węgla jest wydalany z powietrzem wydychanym. N-koniec białka wiąże wiele innych białek, w tym Hb, białka 4.1 i 4.2, ankirynę i wiele enzymów glikolitycznych. Wykazano, że oczyszczone białko pasma 3, dodane do pęcherzyków lipidowych in vitro spełnia swoją czynność transportową w tym zrekonstruowanym układzie. Glikoforyny A, B i C są również białkami przezbłonowymi, ale rozciągają się między powierzchniami błony tylko raz (białka jednokrotnie przezbłonowe single-pass). Główną glikoforyną jest glikoforyna A; zbudowana jest z 131 reszt aminokwasowych i silnie glikozylowana (ok. 60% całej masy cząsteczkowej stanowią węglowodany). Jej N-koniec zawiera 16 łańcuchów oligosacharyd owych (15 z nich to Oglikany), które są wystawione na zewnątrz, ponad powierzchnię erytrocytu. W tym białku zawartych jest ok. 90% kwasów sjalowych błony krwinki czerwonej. Odcinek śródbłonowy białka (23 reszty aminokwasowe) ma strukturę heliksu a. Odcinek C- końcowy sięga cyt o plazmy i wiąże białko 4.1, które z kolei wiąże spektrynę. Polimorfizm omawianego białka leży u podstaw systemu grup krwi MN (p. dalej). Glikoforyna A zawiera miejsca wiążące wirusy grypy oraz zarodźce sierpowate (Plasmodium falciparum), pasożyty wywołujące zimnicę. Co ciekawe, brak glikoforyny A nie wydaje się zaburzać czynności erytrocytów.

Spektryna, ankiryna i inne peryferyjne białka błony wspomagają utrzymanie kształtu i elastyczności erytrocytu Krwinka czerwona musi mieć zdolność do przeciskania się przez wąskie obszary mikrokrażenia podczas niezliczonych przemieszczeń w całym ciele; szczególnie istotnym w tym aspekcie miejscem są naczynia zatokowe śledziony. Aby krwinka czerwona mogła łatwo i odwracalnie zmieniać swój kształt, jej błona komórkowa nrasi być płynna i elastyczna; musi także zachowywać kształt dwuwklęsły, ponieważ to ułatwia wymianę gazową. Lipidy błony komórkowej pozwalają na zachowanie płynności błony. Do wewnętrznej strony błony komórkowej krwinki czerwonej przyczepione są liczne peryferyjne białka cytfóżkieletu (tab. 63-6), które odgrywają ważną rolę w utrzymywaniu kształtu dwu wklęsłego i elastyczności krwinki. Zostaną one poniżej omówione. Spektryna jest głównym białkiem cytoszkieletu. Składa się ona z 2 polipeptydów: spektryny 1 (czyli łańcucha cc) i spektryny 2 (łańcucha fi). Łańcuchy te, mierzące ok. 100 nm długości, są ułożone nierównolegle i luźno ze sobą skręcone, tworząc dimer. Obydwa łańcuchy zbudowane są z 106 reszt aminokwasowych skręconych w postaci ot-heliksu i połączone fragmentami nieheliksowymi. Dimer spektryny łączy się z innym dimerem spektryny tworząc uporządkowany liniowy tetramer. Cały kształt białka umożliwia jego elastyczność, co z kolei udziela się całej błonie krwinki. W spektrynie zidentyfikowano co najmniej 4 miejsca wiążące: 1) dla wzajemnego połączenia, 2) dla ankiryny (pasmo 2.1 itp.), 3) dla aktyny (pasmo 5) i 4) dla białka 4.1. Ankiryna jest białkiem o kształcie piramidy, które wiąże spektrynę, z kolei ankiryna ściśle łączy się z pasmem 3 zabezpieczając w ten sposób związanie spektryny z błoną komórkową. Ankiryna jest wrażliwa na działanie proteolityczne, co jest powodem powstawania pasm 2.2, 2.3 i 2.6, które pochodzą z pasma 2.1. Aktyna (pasma 5) występuje w krwinkach czerwonych w postaci krótkich, podwójnych helikalnych segmentów F-aktyny. Końcowy odcinek spektryny wiąże się z aktyną. Aktyna wiąże się także z białkiem 4.1. Białko 4.1 jest białkiem globularnym ściśle związanym z końcowym odcinkiem spektryny w pobliżu miejsca, w którym spektryna wiąże aktynę. Tak więc białko 4.1 jest częścią trzyskładnikowego zespołu; białko 4.1 — spekt-

876 / ROZDZIAŁ 63

ryna-aktyna. Białko 4.1 wiąże się również z integralnymi białkami: glikoforyną A i C, w ten sposób także włączonymi do wspomnianego zespołu białek. Co więcej, białko 4.1 może oddziaływać z niektórymi fosfolipidami błony i w ten sposób dochodzi do połączenia dwuwarstwowe] błony lipidowej z cytoszkieletem.

Niektóre inne białka (4.9, addukcyna, tropomiozyna) także biorą udział w strukturach cytoszkieletu. Zaburzenia Mości i struktury spektryn są przyczyną dziedzicznej sferocytozy i eliptocytozy Dziedziczna sferocytoza (HS) jest genetycznie uwarunkowaną chorobą, przenoszoną jako cecha autosomalna dominująca. Dotyczy ona ok. I na 5000 mieszkańców Ameryki Północnej. Choroba charakteryzuje się obecnością we krwi obwodowej sferocytów (kulistych krwinek czerwonych, w których stosunek powierzchni do objętości jest obniżony). Towarzyszy temu niedokrwistość hemolityczna i powiększenie śledziony. Sferocyty nie są tak podatne jak krwinki prawidłowe na odkształcenia i są niszczone w śledzionie, co znacznie skraca ich czas życia w krążeniu. Dziedziczna sferocytoza może być wyleczona wycięciem śledziony, ponieważ przy braku śledziony sferocyty mogą dłużej pozostawać w krążeniu. Sferocyty są znacznie bardziej podatne na rozpad w warunkach obniżonego ciśnienia osmo-

tycznego (osmolizę) niż prawidłowe krwinki czerwone. Jest to wykorzystywane w teście oporności osmotycznej. w którym krwinki czerwone są poddawane iwitro działaniu obniżających się stężeń chlorku sodowego. Fizjologicznie stężenie chlorku sodowego wynosi 0,85 g/dl (0,85%). Kiedy prawidłowe krwinki czerwone poddaje się działaniu roztworu chlorku sodowego o stężeniu 0,50 g/dl (0,50%) tylko mała część krwinek ulega hemolizie, podczas gdy to samo stężenie chlorku sodowego powoduje rozpad ok. 50% sferocytów. Wyjaśnia się to faktem, że sferocyty będące komórkami kulistymi nie mają możliwości zwiększenia swej objętości przy wchłonięciu pewnej ilości wody, toteż ulegają rozpadowi po poddaniu ich działaniu lekko obniżonego ciśnienia osmotycznego. Przyczyną dziedzicznej sferocytozy (ryc. 63-5) jest niedobór ilościowy spektryny lub nieprawidłowości jej budowy,' co prowadzi do upośledzenia zdolności wiązania do innych białek, z którymi w warunkach prawidłowych

Mutacje DNA wpływające na Ilość lub budowę spektryny względnie Innych biatek cytoszkieletu (np. ankiryny) Osiabierife oddziaływań pomiędzy peryferyjnymi I integralnymi białkami błony komórkowa) krwinki czerwone]

I Osfabfenie struktury błony komórkowej krwinki czerwonej Osiągnięcie przez krwinkę czerwoną ksztatlu kulistego i niszczenie takich krwinek w śledzionie Miedokrwistość henno! I tycz na

Ryc. 63-5. Zestawienie przyczyn wywołujących dziedziczną sferocytozę.

oddziałuje. Prowadzi to do osłabienia błony i nadaje kulisty kształt krwinkom. Nieprawidłowości dotyczące innych białek {np. ankiryny) biorą udział w niektórych postaciach dziedzicznej sferocytozy. Dziedziczna eliprocytoza jest genetycznie

uwarunkowaną chorobą zbliżoną do dziedzicznej sferocytozy, a różnicą jest eliptyczny, zbliżony do dysku kształt krwinek czerwonych, który można stwierdzić pod mikroskopem. Przyczyną tego schorzenia jest również nieprawidłowość spektryny, a w niektórych przypadkach stwierdza się zaburzenia pasma 4.1. i glikoforyny C. WIELE JEST UKŁADÓW KRWI, W TYM UKŁADY ABO, Rh I MN Poznano co najmniej 21 układów grupowych krwi. Najlepiej znane z nich są układy ABO, Rh (Rhesus) i MN. Określenie grupa krwi oznacza system antygenów krwinki czerwonej (substancji grupowych krwi) określony przez genetyczny locus ze zmienną liczbą alleli (np. antygeny A, B i 0 w układzie grupowym ABO). Określenie typ krwi (blood type) odnosi się do fenotypu antygenowego zwykle rozpoznawanego przy użyciu właściwych przeciwciał. Do przetaczania krwi niezbędne jest poznanie podstaw układów grupowych ABO i Rh. Zainteresowanie grupami krwi dotyczy zagadnień biochemicznych, genetycznych, immunologicznych, antropologicznych, położniczych, patologicznych i medyczno-sądowych. W niniejszym opracowaniu krótko omówione zostaną główne cechy układu ABO i wspomniana natura biochemiczna ukła-

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 877

dów Rh i MN. Z biochemicznego punktu widzenia istotne jest wyodrębnienie i określenie budowy substancji grupowych ABO, określenie dróg ich biosyntezy i ustalenie charakteru produktów genów A, B i 0. Układ grupowy ABO ma ogromne znaczenie w przetaczaniu krwi Układ ABO został opisany po raz pierwszy przez Landsteinera^v 1900 r. podczas badania podstaw zgodności i niezgodności przetaczanej krwi ludzkiej. Błony krwinek czerwonych większości ludzi zawierają substancje układu grup krwi grupy A, B, AB lub 0. Osoby grupy A mają w osoczu krwi przeciwciała skierowane przeciwko grupie B, tak więc ich osocze aglutynuje (zlepia) krwinki osób grupy B lub AB. Osoby grupy krwi B mają przeciwciała skierowane przeciwko A w osoczu krwi i one aglutynują krwinki grupy A i AB. Osoby z grupą krwi AB nie mają w osoczu ani przeciwciał anty-A, ani przeciwciał anty-B i są dlatego określane jako uniwersalni biorcy. Osoby z grupą krwi 0 nie mają w krwinkach czerwonych ani substancji A, ani B i dlatego są określane jako uniwersalni dawcy. Wyjaśnienie tych zjawisk łączy się z faktem, że organizm zwykle nie wytwarza przeciwciał przeciwko własnym składnikom, tak więc osoby z grupą krwi A nie wytwarzają przeciwciał przeciwko substancji grupowej A, ale wytwarzają przeciwciała skierowane przeciwko obcym substancjom grupowym krwi, tj. substancji B prawdopodobnie w wyniku podobieństwa strukturalnego tej substancji do związków obecnych w niektórych mikroorganizmach, z którymi organizm człowieka styka się we wczesnych okresach życia. Ponieważ osoby z grupą krwi 0 nie mają w krwinkach ani substancji A, ani B, mają w osoczu przeciwciała przeciwko obu tym substancjom. Powyższy opis jest uproszczony, ponieważ występują dwie podgrupy w ramach grupy A. tj. AA i A2. Geny odpowiedzialne za wytwarzanie substancji układu ABO są zlokalizowane w długim ramieniu chromosomu 9. Wyróżniono trzy allele, dwa z nich są równocenne (kodominujące) (A i B), a pozostały jest recesywny (0). Daje to ostatecznie cztery możliwe fenotypy: A, B. AB iO.

Substancje grupowe są glikosfingolipidami i glikoproteinami mającymi wspólne łańcuchy oligosacharydowe Substancje ABO są złożonymi oligosacharydarni obecnymi w większości komórek organizmu i występują w wielu wydzielinach. Oligosacharydy, które determinują swoistą naturę substancji ABO na powierzchni błon krwinek czerwonych, występują przede wszystkim w postaci głikosfingolipidów, podczas gdy w płynach ustrojowych te same oligosacharydy występują w postaci glikoprotein. Ich obecność w płynach ustrojowych jest zdeterminowana przez gen oznaczony jako Se (od angielskiego słowa secretor — wydzielacz), który koduje swoistą transferazę fukozylową (Fuc), występującą w narządach wydzielniczych, takich jak gruczoły wydzielania zewnętrznego, ale która nie jest czynna w krwinkach czerwonych. Osoby o genotypie SeSe lub Scse wydzielają antygen A lub B (względnie obydwa), podczas gdy osoby o genotypie sese nie wydzielają substancji A lub B, ale ich krwinki czerwone mają na swej powierzchni antygeny A i B. Substancja H jest biosyntetycznym prekursorem zarówno substancji A, jaki B Substancje ABO zostały wyodrębnione, określono też ich budowę. Rycina 63-6 przedstawia uproszczoną wersję (tylko nie dające się zredukować fragmenty końcowe) substancji układu ABO. Należy przede wszystkim zwrócić uwagę na strukturę substancji H, ponieważ jest ona prekursorem zarówno substancji A i B, jak i stanowi substancję grupową krwi stwierdzaną u osób z grupą krwi 0. Substancja H powstaje w wyniku działania transferazy fwkozylowej, która katalizuje przyłączenie fukozy występującej na końcu łańcucha oligosacharyd owego do reszty galaktozy za pomocą wiązania a 1,2 w następującej reakcji: GDP-Fuc -Gal-cc-R -Fuc-a1F2-Gal-p-R + GDP Prekursor

Substancja H

Wymienioną transferazę fukozyiową koduje gen H. Allel h w locus H koduje nieaktywną transferazę fukozyiową, tak więc osoby z genotypem hh nie mogą wytwarzać substancji H. Osoby z genotypem hh — mają krwinki czerwone grupy 0, mimo że posiadają enzymy niezbędne do wytwarzania substancji A lub B (p. niżej).

878 / ROZDZIAŁ 63 Fucal -> 2GafB1 -» 2GalNAcra — R Fucal -»2GalB1 -»3GalNAca —R Substancja H (lub O)

Substancja B GalNAc Substancja A Ryc. 63-6. Schematyczne 2GalB! -» 3GalNAca— R

przedstawienie struktury substancji grupowych krwi H, A i B. Substancja H jest długim łańcuchem oligosacharydowym typu kompleksowego, przyłączonym do ceramidu, kiedy substancje grupowe są glikosfingolipidami, lub też do łańcucha polipeptydowego białek poprzez resztę seryny, jeśli substancje grupowe są glikoproteinami Można zauważyć, ze struktury substancji grupowych krwi są dwuantenowe; tzn mają 2 rozgałęzienia, które mogą się rozwidlać (czego nie pokazano) w punkcie połączenia GalNAca-R; na rycinie tej pokazano tylko jedną z możliwości tego rozwidlenia. Każda z substancji H, A, B zawiera 2 odpowiednio krótkie łańcuchy oiigosacharydowe, pokazane powyżej. Substancja AB zawiera jeden typ łańcucha A i jeden typ łańcucha B.

GEN A KODUJE TRANSFERAZĘ GalNAc, GEN B — TRANSFERAZĘ Gal A GEN 0— NIECZYNNY PRODUKT W porównaniu z substancją H (ryc, 63-6) substancja A zawiera dodatkowo GalNAc, a substancja B zawiera Gal przyłączoną jak pokazano na rycinie. Przeciwciała przeciwko A są skierowane przeciwko dodatkowej reszcie GalNAc, która znajduje się w substancji A. Przeciwciała skierowane przeciwko B są skierowane przeciwko dodatkowej reszcie Gal obecnej w substancji B. Reszta cukrowcowa GalNAc jest immunodominującym ctfłfcrem (tj. jedynym determinującym swoistość przeciwciał skierowanych przeciwko substancjom grupowym krwi) dla grupy A, podczas gdy Gal jest immunodominującym cukrem dla substancji B, W świetle tych stwierdzeń strukturalnych nie jest zaskakujące, że substancja A może być syntetyzowana in vitro z substancji 0 w reakcji katalizowanej przez transferazę GalNAc, dla której dawcą cukru jest UDP-GalNAc, Podobnie substancja grupy krwi B może być wytworzona z substancji 0 w reakcji katalizowanej przez transferazę Gal z użyciem UDP-Gal. Należy więc przyjąć, że gen grupy krwi A koduje syntezę transferazy GalNAc, która przyłącza resztę GalNAc do substancji 0. Podobnie produktem genu grupy krwi B jest transfera/a Gal przytaczająca Gal do substancji 0. Osoby mające grupę krwi AB posiadają obydwa enzymy i dwa łańcuchy oligosacharydowe, jeden zakoń-

czony GalNAc, a drugi Gal (ryc. 63-6). Osoby z grupą krwi 0 wytwarzają jedynie nieaktywne białko enzymatyczne, które można wykryć za pomocą metod immunologicznych. Ich substancją grupową krwi w układzie ABO jest substancja H. W 1990 r. ustalono za pomocą kodowania i technologii określania sekwencji różnice między produktami glukozylotransferaz, tj. produktami genów A, B i 0. Różnica 4 nukleotydów jest wystarczająca, aby zróżnicować swoistość glukozylotransferazy A i B. Z drugiej strony, allel 0 cechuje się mutacją pojedynczej pary zasad powodującą zmianę fazy odczytu oraz produkcję białka pozbawionego enzymatycznej aktywności transferazy. Czynnik Rh (antygen D) jest integralnym białkiem błony komórkowej krwinek czerwonych i może powodować poważne problemy transfuzjo logiczne Układ grupowy Rh jest złożony i ani jego genetyczna ani biochemiczna natura nie została w pełni poznana. Jest on zdeterminowany przez 3 powiązane ze sobą geny umiejscowione na chromosomie 1. Produkty tych alleli zostały określone jako C lub c, E lub e oraz D lub d, ale biochemicznie produkty te nie zostały zidentyfikowane. Największe znaczenie i zainteresowanie budzi antygen D (Rha), który jest nazywany czynnikiem Rh. Jest on integralnym białkiem błony komórkowej krwinek czerwonych o ma-

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 879

sie cząsteczkowej ok. 30 000. Jego interakcje z fosfolipidami błony mogą mieć znaczenie dla ;ego antygenowości. Około 15% osób rasy kaukaskiej nie ma tego antygenu i są one określane jako Rh-ujemne. Jeżeli takiej osobie zostanie przetoczona krew Rh-dodatnia, będzie wytwarzać przeciwciała skierowane przeciwko antygenowi D {Rh0). Ważne jest więc, aby osoby te otrzymywały transfuzje krwi Rh-ujemnej, a szczególnie *jest to istotne dla kobiet w wieku prokreacyjnym, które mogą zajść w dążę. Jeżeli taka kobieta w wyniku niedopatrzenia otrzyma krew Rh-dodatnią, w jej krwi obecne będą przeciwciała przeciwko antygenowi D (Rho). Z kolei jeżeli jej dziecko będzie Rhdodatnie przeciwciała te mogą wywołać liżę krwinek dziecka, co określane jest jako hemolityezna choroba noworodków. Po porodzie lub po poronieniu kobieta Rh-ujemna powinna rutynowo otrzymać Rho (D) immunogłobuUnę, która skutecznie przeciwdziała tworzeniu przeciwciał przez matkę skierowanych przeciwko antygenom Rho (D), na które była narażona. Układ grupowy MNSs dotyczy polimorficznych postaci glikoforyn Ai B Układ grupowy MN jest rozpoznawany za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko polimorficznym formom glikoforyny A. Na poziomie genowym obecne są dwa rownocenne allele: M i N z trzema możliwymi genotypami M/M, M/N i N/N. Z koiei możliwe są 3 fenotypy: M, MN, N. Chociaż glikoforyna A zawiera znaczną ilość węglowodanów, polimorfizm nie dotyczy części oligosacharydowej, a jedynie reszt aminokwasowych w N-końcu łańcucha polipeptydowego. Różnice przedstawiają się następująco: reszta 1 Ser Leu

reszta 5 Gly Glu

Układ Ss jest podklasą układu grupowego MN i dotyczy polimorfizmu glikoforyny B. Formy S i s różnią się jedną reszta aminokwasową. Układ MNSs nie ma dużego znaczenia w transfuzjologii, ale jest przydatny w badaniach dziedziczenia jako układ genów ściśle powiązanych na jednym chromosomie.

NIEDOKRWISTOŚCI HEMOLITYCZNE MOGĄ BYĆ WYWOŁANE PRZEZ CZYNNIKI WYSTĘPUJĄCE NA ZEWNĄTRZ KOMÓRKI, W BŁONIE KOMÓRKOWEJ I WEWNĄTRZ ERYTROCYTU Zcwnątrzkomórkowe przyczyny niedokrwistości hemolitycznych obejmują hipersplenizm, tj. stan, w którym śledziona jest powiększona z różnych przyczyn i powoduje niszczenie krwinek czerwonych. Przyczyny immunologiczne (np. reakcje poprzetoczeniowe, obecność w osoczu ciepłych lub zimnych przeciwciał, które powodują liżę krwinek czerwonych i nadwrażliwość na dopełniacz\(pwnież zaliczają się do przyczyn zewnątrzkomorkowych, tak jak trucizny uwalniane przez niektóre mikroorganizmy, np. bakterie z rodzaju Ciostridium, Niektóre węże posiadają w jadzie substancje powodujące liżę krwinek w wyniku działania na błonę komórkową (np. przez aktywację fosfolipaz lub proteinaz). Przyczyny umiejscowione w błonie komórkowej dotyczą nieprawidłowej budowy białek. Najważniejszą przyczyną jest dziedziczna sferocytoza i dziedziczna eliptocytoza, głównie spowodowana przez nieprawidłowości spektryny (p. wyżej). Przyczyny niedokrwistości hemolitycznych zlokalizowane wewnątrz erytrocytu obejmują hemoglobinopatie i enzymopatie. Najważniejszą hemoglobinopatią jest niedokrwistość sierpowa ta. Najczęściej występującymi enzym opatiami są nieprawidłowości cyklu pentozowo-fosforanowego, szczególnie glikolizy. Przeważający w populacjach niektórych części świata niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej stanowi przyczynę niedokrwistości hemolitycznej (p. wyżej). Niedobór kjnazy pirogroniatiowej nie jest częsty, ale jest drugim co do częstości występowania niedoborem enzymatycznym powodującym niedokrwistość hemolityczną z powodu upośledzenia glikolizy. Powoduje to zmniejszone tworzenie ATP, co upośledza w różny sposób integralność błony krwinek czerwonych. Badania laboratoryjne pomocne w rozpoznawaniu niedokrwistości hemolitycznych zestawiono w tab. 63-7.

880 / ROZDZIAŁ 63 Tabeła 63-7. Badania laboratoryjne pomocne w rozpoznawaniu niedokrwistości hemolitycznej Badania ogólne Badania swoiste Wzrost stężenia we Elektroforeza Hb (np. wykrycie HbS), krwi nieskoniugowanej (pośredniej) bilioznaczanie aktywnośrubiny; ci enzymów krwinki skrócenie czasu życia czerwonej (np. dehydkrwinek czerwonych rogenazy giukozo-6-mierzone jako czas fosforanowej lub kiżycia podanych donazy pirogronianowej); żylnie autologiczzmniejszona oporność nych krwinek czerosmotyczna (np. w wonych znakowadziedzicznej nych s1Cr; sferocytozie), odczyn retikulocytoza; Coombsa; zimne aglutyniny hemoglobinemia; małe stężenie hapto- Bezpośredni odczyn Coombsa wykrywa obecglobiny w osoczu ność przeciwciał na krwinkach czerwonych podczas gdy pośredni odczyn Coombsa wykrywa obecność krążących przeciwciał przeciwko antygenom krwinek czerwonych

forylacja oksydacyjna (z powodu względnie małej liczby mitochondriów) oraz wysoka zawartość enzymów lizosomalnych. Wiele z tych enzymów, zestawionych w tab. 63-4, bierze udział także w tlenowym metabolizmie granulocytów obojętnochłonnych (p. niżej). Tabela 63-9 zestawia czynności biologiczne niektórych białek, które są względnie swoiste dla granulocytów obojętnochłonnych. Granuiocyty obojętnochłonne są głównymi obrońcami organizmu przed zakażeniami bakteryjnymi Granuiocyty obojętnochłonne są ruchliwymi komórkami żernymi, które odgrywają główną rolę w stanach ostrych zapaleń. Wniknięcie bakterii do tkanek wywołuje zespół zjawisk, które zbiorczo określa się jako ostra odpowiedź zapalna. Naieżą do nich: 1) wzrost przepuszczalności naczyń, 2) wnikanie uczynnionych (aktywowanych) granulocytów obojetnochłonnych do tkanek, 3) aktywacja płytek krwi, 4) samoistne ustąpienie tych zjawisk, jeżeli wnikające mikroorganizmy zostaną pokonane^ Wiele czynników jest uwalnianych z komórek i białek osocza podczas ostrego zapalenia, a czynniki te sumarycznie powodują wzrost przepuszczalności ściany naczyniowej, którego

GRANULOCYTY OBOJĘTNOCHŁONNE ODZNACZAJĄ SIĘ AKTYWNYM METABOLIZMEM I ZAWIERAJĄ WIELE WYJĄTKOWYCH ENZYMÓW I BIAŁEK Główne cechy biochemiczne granulocytów obojętnochłonnych zestawiono w tab. 63-8. Dominującymi w nich zjawiskami są aktywna glikoliza tlenowa, aktywne przemiany cyklu pentozowo-fosforanowego, umiarkowana fosTabela 63-8. Zestawienie głównych cech biochemicznych granulocytów obojetnochłonnych Aktywna glikoliza Aktywny

cykl

pentozowo-fosforan

o

wy

Umiarkowana fosforylacja oksydacyjna Liczne lizosomy bogate w enzymy degradujące Obecność licznych unikalnych enzymów (np. mieloperoksydaza i układ NADPH-oksydazy) oraz białek Zawierają CD11/CD18 integryny w błonie cytoplazmatycznej

wynikiem jest obrzęk tkanek (tab. 63-10). W stanach ostrego zapalenia granuiocyty obojętnochłonne pochodzą z krwi krążącej, skąd przechodzą do tkanek, aby pomóc w eliminowaniu obcych mikroorganizmów. Granuiocyty obojętnochłonne są przyciągane do tkanek przez czynniki chemo taktyczne, do których należą fragmenty dopełniacza C5a, małe peptydy pochodzenia bakteryjnego (np. N-formylo-metionylo-leucylo-fenyloalanina) i liczne leukotrieny. Aby dotrzeć do tkanek, krążący we krwi granulocyt obojętnochłonny musi przeniknąć przez ścianę naczynia włosowatego. W tym celu granulocyty układają się wzdłuż ścian naczynia (ulegają marginalizacji), a*następnie przylegają

do komórek śródbłonka naczyń włosowatych.

Integryny pośredniczą w przyleganiu granulocytów obojetnochłonnych do komórek śródbłonka Przyleganie granulocytów obojetnochłonnych do komórek śródbłonka wymaga udziału swoistych białek adhezyjnych (integryn) znaj-

dujących się na powierzchni granulocytów oraz swoistych białek receptorowych na powierzchni komórek śródbłonka.

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 881 Tabela 63-9. Wybrane ważne enzymy i białka granulocytów obojetnochłonnych. Ekspresja tych cząsteczek jest badana podczas różnych okresów różnicowania się prawidłowych granulocytów obojetnochłonnych lub odpowiadających im komórek białaczkowych. W badaniach używane są współczesne techniki biologii molekularnej (np. pomiar swoistego mRNA). Dla większości enzymów i białek wyodrębniono cDNA i określono jego sekwencje, a na tej podstawie ustalono sekwencje reszt aminokwasowych białek, ustalono lokalizację genu w chromosomie, jego budowę i układ aksonów i intronów. Niektóre ważne proteazy granulocytów obojetnochłonnych zestawiono w tab. 63-12. Enzym lub białko Mieloperoksydaza (MPO) NADPH-oksydaza

Reakcja katalizowana lub czynność biologiczna

Komentarz

H2O2 + X (halogenek) + H -» HOX + H2O

Odpowiedzialna za zielony kolor ropy

2O2 + NADPH - 202+ NADP+ + H+

Główny składnik eksplozji oddechowej. Dziedziczny niedobór może by<± przyczyną nawracających zakażeń

Lizozym

Hydrolizuje wiązanie pomiędzy kwa- Występuje w dużych ilościach w maksem N-acetylomuramtdowym i N-ace- rofagach **> tylo-D-glukozaminą znajdujące się w ścianie komórkowej bakterii

Defenzyny Laktoferyna

Zasadowe peptydy antybiotykowe Zabijają bakterie przez uszkadzanie ich zbudowane z 29-30 reszt aminokwa- ściany komórkowej sowych Białko wiążące żelazo Może hamować wzrost wielu bakterii przez wiązanie żelaza oraz brać udział w regulacji proliferacji komórek szpikowych

CD11b/CD,8*

Cząsteczki adhezyjne (natężą do integryn)

Niedobór przyczyną upośledzonej adhezji leukocytów

Receptory d ■ Fc frag- Wiąże fragmenty Fc immunoglobuliny Wiąże kompleksy antygen-przeciwciało do komórek szpikowych i limfoidalmentów lgG;t IgG nych, nasila fagocytozę i inne formy reakcji komórkowej * CD-C(US16T of differentiation (antygen różnicowania). Jest to określenie ujednoliconego systemu nazewnictwa powierzchniowych markerów leukocytów. Swoiste białka powierzchniowe (markery), które różnicują poszczególne linie iub stadia zróżnicowania leukocytów i są rozpoznawane za pomocą grupy przeciwciał mOnoklonalnych są zaliczane do antygenów różnicowania. Układ ten jest szczególnie pomocny w klasyfikowaniu podtypów limfocytów. Wiele antygenów różnicowania bierze udział w interakcjach komórka-komórka, adhezji i przekazywaniu sygnałów przez błony komórkowe. Tabela 63-10. Źródła wazoaktywnych cząsteczek biorących udział w ostrym zapaleniu Białka osocza Granulocyty Komórki tuczne Płytki krwi krwi obojetnochłonne Histamina

Serotonina

Czynnik aktywujący płytki (PAF) Eikozanoidy (różne prostaglandyny i ieukotrieny)

Intcgryny są nadrodziną białek powierzchniowych obecnych w różnorodnych komórkach. Biorą one udział w przyleganiu komórek do komórek oraz komórek do składników

C3a, C4a ł C5a układu dopełniacza Bradykinina i produkty rozpadu fibryny z układu krzepnięcia

substancji pozakomórkowej. Integryny są heterodimerami zbudowanymi z połączonych niekowalencyjnie podjednostek a i p. Podjednostki zawierają zewnątrzkomórkowe, śródbłonowe

882 / ROZDZIAŁ 63

i wewnątrzkomórkowe segmenty. Zewnątr/komórkowe segmenty wiążą różne iigandy, takie jak białka substancji po żakom orkowej i białka powierzchni innych komórek. Ligandy te często zawierają sekwencje Arg-Gly-Asp (R-G-D). Wewnątrzkomórkowe segmenty wiążą się do różnych składników cyt o szkieletu, takich jak aktyna lub winkulina. Integryny są białkami, które łączą składniki występujące na zewnątrz komórek ze składnikami ich wnętrza, a przez to pomagają integrować odpowiedź komórki na zmieniające się warunki otaczającego środowiska. Początkowo wyróżniono 3 podrodziny integryn. Integryny wchodzące w skład poszczególnych podrodzin różnią się podjednostką y., a zawierają wspólną dla każdej podrodziny podjednostkę p\ Z czasem wyróżniono więcej niż 3 rodzaje podjednostek P, co sprawiło, że klasyfikacja integryn stała się bardziej złożona. Niektóre integryny swoiście związane z czynnością granulocytów obojętnochlonnych są zestawione w tab. 63-11, Niedobór podjednostki p2 (zwanej także CD18) w LFA-1 i dwóch pokrewnych integrynach: Mac-] (CDllbCDlS) i pl50.95 (CDllcCD18) stwierdzono w granulocytach obojętnochłonnych i makrofagach; powoduje to upośledzenie adhezji (przylegania) leukocytów

— chorobę charakteryzującą się nawracającymi

zakażeniami bakteryjnymi i grzybicami. Wśród różnych skutków wymienionego niedoboru, upośledzone jest przyleganie białych krwinek do komórek śródbłonka, tak więc mniejsza liczba granulocytów obojętnochłonnych może wnikać do tkanek, aby zwalczać zakażenie. Po przeniknięciu przez ścianę małych naczyń, granulocyty obojętnochłonne migrując w kierunku największego stężenia czynników chemotaktycznych, napotykają wnikające bakterie i próbują je zaatakować oraz zniszczyć. Granulocyty obojętnochłonne muszą być w stanie aktywacji, aby uruchomić ciąg procesów metabolicznych biorących udział w fagocytozie i zabijaniu bakterii. Aktywacja granulocytów obojętnochłonnych jest podobna do aktywacji płytek krwi i wymaga hydrolizy bisfosforanu f osf atydyloi nozytoi u Mechanizmy biorące udział w aktywacji płytek krwi są omówione w rozdz. 58 (p. ryc. 58-9). Proces ten obejmuje oddziaływanie bodźca (np. trombiny) na receptor, aktywację białek G, pobudzenie aktywności fosfolipazy C i uwalnianie trifosforanu inozytolu i diacylglicerydu z bisfosforanu fosfatydyloinozytonu. Związki te, biorące udział w przenoszeniu 7/gnału, powodują wzrost wewnątrzkomórkię 'ego Ca2 +

Tabela 63-11. Przykłady integryn, które odgrywają ważną rolę w czynności granulocytów obojętnochłonnych, innych leukocytów oraz płytek krwi Integryna Komórka Podjednostki Ugand Czelność VLA-1 VLA-5

Leukocyty, inne komórki Leukocyty, inne komórki

«, P,

Kolagen, laminina

ae,P,

Fibronektyna

Adhezja komórek do substancji poza kom orkowej Adhezja komórek do substancji poza kom orkowej Adhezja komórek do substancji poza kom orkowej

VUA-6

Leukocyty, inne komórki

LFA-1 (CD11aCD18) Glikoproteina Ifb/llla

Leukocyty

«l.Pa

ICAM-1, ICAWI-2

Płytki krwi

%, Ps

Fibrynogen.łibronekty- Adhezja i agregacja na. czynnik von Wille płytek krwi branda

Laminina

Adnezja krwinek białych

LFA-1 — lymphocyte funetion-associated antigen 1 (antygen-1 związany z czynnością limfocytów); VLA —very late antigen (bardzo późny antygen), CD — ciuster of differentiation (antygen różnicowania); ICAM — intercellular adhesion molecule (międzykomórkowa cząsteczka przylegania). Niedobór LFA-1 i zbliżonych integryn stwierdzono u chorych z upośledzoną adhezja, leukocytów. Niedobór zespołu glikoprotein llb/llla wykazano w trombastenii Glanzmanna, chorobie cechującej się krwawieniami, prawidłową liczbą płytek krwi, ale nieprawidłową kurczliwością skrzepu Obserwacje te wskazują jak istotne Jest poznanie adhezyjnych białek powierzchni komórek w wyjaśnieniu przyczyn licznych chorób.

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 833

i aktywację kinazy białek C. Dodatkowo aktywacja fosfolipazy A2 wytwarza kwas arachidonowy, który jest produktem wyjściowym dla wielu biologicznie czynnych eikozanoidów. Proces aktywacji granulocytów obojetnochłonnych jest wyraźnie podobny. Są one pobudzone przez bakterie, wiązanie czynników chemotaktycznych lub kompleksy antygen-przeciwciało za pośrednictwem swoistych receptorów. Wytworzony w procesie aktywacji wzrost stężenia wewnątrzkomórkowych jonów Ca2+ wpływa na wiele procesów zachodzących w granulocytach obojetnochłonnych, takich jak łączenie się mikrotubul oraz układ aktyna-miozyna. Procesy te biorą udział, odpowiednio, w wydzielaniu zawartości ziarnistości oraz w ruchliwości komórek, co pozwala granulocytom obojętnochłonnym odszukiwać mikroorganizmy, które wtargnęły do ustroju. Aktywowane granulocyty obojętnochłonne są w tym stanie gotowe, aby zniszczyć mikroorganizmy za pomocą mechanizmów, które obejmują produkcję czynnych postaci tlenu. Eksplozja oddechowa komórek fagocytujących zachodzi przy udziale IMADPH-oksydazy i pomaga zabijać bakterie Kiedy granulocyty obojętnochłonne lub inne komórki fagocytujące wchłoną bakterie, wykazują szybki wzrost zużycia tlenu znany jako eksplozja tlenowa. Zjawisko to odzwierciedla szybkie zużywanie tlenu (następujące po 15 — 60 s) i wytwarzanie dużych ilości czynnych pochodnych tlenowych, takich jak O2 , H2O2, OH' i OCI ~ (jon podchlorawy). Niektóre z tych produktów są potencjalnymi czynnikami bakteriobójczymi. Łańcuch przenoszenia elektronów odpowiedzialny za wybuch tlenowy zawiera wiele składników, w tym flawoproteinę NADPH:O2oksydoreduktazę (często zwaną NADPH-oksydazą) i cvtochrom typu b (nazywany cytochromem bssgz powodu charakterystycznej długości spektralnej w odróżnieniu od cytoghromu bM5, którego potencjał oksydoredukcyjny wynosi 245 mV i jest najniższy ze wszystkich cytochromów b, co daje mu zdolność redukowania tlenu do ponadtlenków). Ten system katalizuje jednoełektronową redukcję tlenu do anionu ponadtlenkowego (p. tab. 63-4 pod NADPH-oksydaza). Oksydoreduktaza jest redukowana przez NADPH, a cytochrom b wykonuje jednoelektronową redukcję tlenu do postaci ponadtlenkowej.

Układ ten jest umiejscowiony w błonach plażmatycznych granulocytów obojętnochionnych i innych komórek fagocytujących. NADPH jest wytwarzany w cyklu pentozowo-fosforanowym, którego aktywność wzrasta znacznie podczas fagocytozy. W powyżej wymienionej reakcji następuje spontaniczne wytwarzanie (w procesie spontanicznej dysmutacji) nadtlenku wodoru z dwóch cząsteczek ponadtlenku: + O 2 ~ + 2H

Oz

Jonponadtlenkowyjest wydalany na zewnątrz komórki lub do fagolizosomów, w których znajdują się wchłonięte bakterie. Zabijanie bakterii w fagolizosomach zależy-od połączonego działania podwyższonego pH, jonu ponadtlenkowego i dalszych pochodnych tlenowych (H2O2, OH' i HOC1 czyli kwas podchlorawy, p. niżej) oraz działania wielu bakteriobójczych peptydów (defensyn) i innych białek (np. katepsyny G i kilku białek kationowych) obecnych w komórkach fagocytujących. Każdy ponadtlenek, który dostanie się do cytozolu komórki fagocytującej ulega przekształceniu w H2O2 w wyniku działania dysmutazy ponadtlenkowej, która katalizuje tę samą reakcję dysmutacji, jaka zachodzi spontanicznie, co opisano powyżej. Z kolei H2O2 jest zużywana przez mieloperoksydazę (p. niżej) lub zużywana w wyniku działania peroksydazy glutationowej lub katalazy. NADPH-oksydaza występuje w postaci nieczynnej w spoczynkowych komórkach fagocytujących i ulega aktywacji po kontakcie różnych ligandów (fragmenty C5a dopełniacza, peptydy chemotaktyczne itp.) z receptorami błony plazmatycznej. Zjawiska wynikłe z aktywacji układu oksydazy są przedmiotem wielu badań, chociaż stale nie są w pełni poznane i są zbliżone do uprzednio opisanego procesu aktywacji granulocytów obojętnochłonnych, czego można oczekiwać wobec faktu, że wybuch oddechowy jest integralną częścią procesu aktywacji. W zjawiskach tych biorą udział białka G, aktywacja fosfolipazy C i tworzenie inozytoio-l,4,5-trisfosforanu. Ostatni z wymienionych związków bierze udział w krótkotrwałym wzroście stężenia Ca2~, który jest istotnym elementem wywoływania eksplozji oddechowej. Wytwarzany jest również diacyloglycerol, który powoduje przemieszczenie kinazy białek C do błon plazmatycznych z cytoplazmy. Tam enzym ten katalizuje fosforylację różnych białek, które są prawdopo-

J

884 / R OZDZIAŁ 63

dobnie składnikami układu oksydazy. Powyższy obraz jest bardziej złożony na co wskazują dane o podwójnej drodze aktywacji także obejmującej przenoszenie sygnału niezależne od Ca2 + . Dodatkowo wykryto dwa polipeprydy cytoplazmatyczne jako ważne składniki pełnego układu N ADPH-oksydazy. Są one włączone do błon plazmatycznych podczas aktywacji i tworzą czynny układ enzymatyczny. Mutacje genów składników układu NADPH-oksydazy powodują przewlekłą chorobę ziarntczą Znaczenie układu NADPH-oksydazy jasno zostało ukazane w obserwacjach upośledzonej eksplozji oddechowej, jaka zachodzi w przewlekłej chorobie ziarniczej, rzadkim schorzeniu cechującym się nawracającymi zakażeniami i uogólnionymi ziarniniakami (przewlekłymi zmianami zapalnymi) skóry, płuc i węzłów chłonnych. Ziarniniaki są formą odgraniczenia bakterii, które nie mogą być zabite z powodu dziedzicznego niedoboru układu NADPH-oksydazy. Większość chorych to mężczyźni, ponieważ choroba jest dziedziczona w sprzężeniu z chromosomem X. Podstawowymi przyczynami choroby są mutacje genu dla cytochromu b. U innych pacjentów choroba występuje w postaci autosomalnej recesywnej, a mutacje dotyczą genów warunkujących budowę dwóch polipeptydów biorących udział w aktywacji granulocytów obojętnochłonnych. Niektórzy pacjenci dobrze reagują na podawanie y-interferonu, który powoduje wzrost ilości cytochromu b przez wpływ na transkrypcję właściwych genów. Prawdo pod o tSrte przyczyny wywołujące przewlekłą chorobę ziarniczą są przedstawione na ryc. 63-7. Mutacje genów składników białkowych (tj. cytochromu b,,, zwanego także bj,,} i dwćcn cytozolowych polipeptydow układu NADPH-oksydary Zmniejszone wytwarzanie jonu po nad tlenkowego i innych aktywnych pochodnych tlenowych Zmniejszone zabijanie wybranych bakterii Nawracające zakażenia i tworzenie w tkankach ziarniniaków w celu ograniczenia bakterii, które przeżyty

Ryc. 63-7. Uproszczony schemat kolejności zja wisk leżących u podstaw przewlekłej choroby ziar niczej. ___________

Granulocyty obojetnochłonne zawierają mieloperoksydazę, która katalizuje wytwarzanie utleniaczy zawierających chlor Enzym mieloneroksydaza, obecny w dużych ilościach w zianiistościach granulocytów obojętnochłonnych i odpowiedzialny za zielony kolor ropy, działa na H2O3 i powoduje powstanie jonu podchlorawego: Mieloperoksydaza

H 2O 2 + X +_H+j-------—----z --. HOX +H a O <X = Cl , Br , I lub SCN ; HOCI = kwas podchlorawy)

H2O; używany jako substrat reakcji jest wytwarzany przez układ NADPH-oksydazy. Cl" jest najczęściej wykorzystywanym chlorowcem, ponieważ jest on obecny w stosunkowo dużych stężeniach w osoczu i płynach ustrojowych. HOCI, czyli czynny składnik płynnych środków wybielających stosowanych w gospodarstwie domowym, jest silnym utleniaczem i jest silnie bakteriobójczy. Kiedy zostaje podany do niezmienionych tkanek, jego potencjalnie uszkadzające działanie jest osłabione przede wszystkim przez łączenie się z pierwszo rzędowym i i drugorzędowymi aminami obecnymi w granulocytach obojętnochłonnych i tkankach, w wyniku czego powstają różne produkty połączenia chlorku z azotem (N-Cl). Należą do nich chloraminy, które także, chociaż słabiej niż uprzednio wymienione substancje, działają bakteriobójczo (np. są stosowane w odkażaniu ran) nie powodując przy tym uszkodzenia tkanek, Proteinazy granulocytów obojętnochłonnych mogą powodować poważne uszkodzenia tkanek, jeżeli ich działanie nie jest kontrolowane Granulocyty obojętnochłonne zawierają liczne proteazy (tab. 63-12), które mają zdolność do hydrolizy elastyny, różnych typów kolagenu i innych białek obecnych w substancji pozakomórkowej. Działanie takie, jeżeli nie jest ograniczane, może powodować poważne uszkodzenia tkanek. Większość tych proteaz to enzymy lizosomalne występujące w prawidłowych granulocytach obojętnochłonnych głównie w postaci nieaktywnej. Małe ilości enzymów są uwalniane do prawidłowych tkanek, ale ilość ta znacznie wzrasta w stanach zapalnych. Aktywność elastazy i innych proteaz jest w stanach prawidłowych ograniczana przez liczne antyproteazy (także zestawione w tab. 63-12), które

ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 885 Tabela 63-12. Proteazy granulocytów obojętnochłonnych oraz antyproteazy osocza krwi i tkanek Proteazy Antyproteazy Elastaza OCT -Antyproteaz a tX2Kolagenaza Żelatyn a za

Makroglobulina Wydzielniczy inhibitor leukoproteaz

Aktywator plaz- o, -^ntyc h ym otry psy n a mmogenu lnhibitor-1 aktywatora plazminogenu Tkankowy inhibitor metaloproteaz Tabela zawiera wybrane ważne proteazy granulocytów oboje, tnochlonnych i niektóre białka, które hamują ich działanie. Większość wymienionych proteaz występuje wewnątrz granulocytów obojetnochłonnych w postaci prekursorowej. Aktywator plazminogenu nie jest proteazą, ale jest wymieniony, ponieważ aktywuje plazmtnę, która jest proteazą. Wymienione proteazy mogą rozkładać wiele białek substancji poza kom orkowej powodując w ten sposób uszkodzenie tkanek. Sumaryczna równowaga proteaz i antyproteaz może zostać zaburzona w wyniku zmienionej aktywacji prekursorów proteaz lub inaktywacji antyproteaz. Ostatnie z wymienionych zjawisk może zachodzić na drodze proteolitycznej degradacji antyproteaz lub ich chemicznej modyfikacji, np. palenie tytoniu powoduje utlenianie reszty metioninowej w pozycji 358 w ai-antyproteazie.

występują w osoczu krwi i pozakomórkowym płynie tkankowym. Każda z antyproteaz może hamować proteazę lub proteazy przez łączenie się z enzymem w niekowalencyjny kompleks. W rozdziale 58 wykazano, że dziedziczny niedobór <Xi-antyproteazy powoduje niekontrolowaną aktywność enzymatyczną elastazy, która degraduje tkankę płucną i w ten sposób staje sie przyczyną rozedmy tego narządu. a2-Makroglobulina jest wielkocząsteczkowym (masa cząsteczkowa ok. 725 000) białkiem osocza krwi, które odgrywa istotną rolę w ochronie ustroju przed nadmiarem proteaz. Ma ona zdolność łączenia się z enzymami i w ten sposób inaktywuje wiele proteaz. Wzrost ilości utleniaczy zawierających chlor, wytwarzanych w stanach zapalnych, zaburza równowagę proteazy-antyproteazy na korzyść enzymów. Przykładowo, wiele proteaz wymienionych w tab. 63-12 jest aktywowanych przez HOC1, podczas gdy liczne antyproteazy są inaktywowane przez ten związek. Dodatkowo, tkankowy inhibitor metaloproteaz i ot ranty-

chymotrypsyna mogą być hydrolizowane przez aktywną elastazę, a ai-antyproteaza może być hydroiizowana przez aktywną kolagenazę i żelatynazę. W większości przypadków zostaje ustalona właściwa równowaga proteaz i antyproteaz, chociaż w takich stanach, jak niedobór ot]-antyproteazy lub nagromadzenia znacznej liczby granulocytów obojetnochłonnych w tkankach z powodu niedostatecznego ich odpływu może dojść do znacznego uszkodzenia tkanek w wyniku działania nie ograniczanej aktywności proteaz. i

TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA MA WYRAŹNY WPŁYW NA ROZWÓJ HEMATOLOGII *♦ Technologia rekombinacji DNA wywiera istotny wpływ na wiele aspektów hematologii. Podstawy etiologiczne talasemii (p. rozdz. 42) i wiele zaburzeń krzepnięcia (p. rozdz. 58) zostało w znacznym stopniu wyjaśnionych za pomocą klonowania lub określania sekwencji. Badania onkogenów i translokacji chromosomalnych posunęły do przodu zrozumienie mechanizmów białaczek (p rozdz, 61). Jak wspomniano powyżej, techniki klonowania dostarczyły leczniczych ilości erytropoetyny i innych czynników wzrostowych. Niedobór deatninazy adenozynowej, który szczególnie dotyczy limfocytów, jest pierwszą chorobą leczoną za pomocą terapii genowej. Podobnie jak inne dziedziny biologii i medycyny, hematologia ulega i ulegać będzie dalszej rewolucji dzięki tyra zadziwiającym technologiom.

PODSUMOWANIE Erytrocyt ma prostą budowę i funkcje. Składa się przede wszystkim ze stężonego roztworu hemoglobiny otoczonego przez błonę komórkową. Wytwarzanie erytrocytów jest regulowane przez erytropoetynę, natomiast leukocytów przez inne czynniki wzrostowe (np. czynniki pobudzające tworzenie kolonii granulocytów oraz makrofagów). Erytrocyt zawiera cały arsenał enzymów cytoplazmatycznych, takich jak dysmutaza, kataiaza, peroksydaza glutationowa, aby eliminować silne utleniacze powstające podczas jego metabolizmu. Genetycznie uwarunkowany niedobór aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, która warunkuje pro-

8S6 / ROZDZIAŁ 63

dukcję NADPH, jest ważną przyczyną niedokrwistości hemolitycznej. Methemoglobina nie ma zdolności przenoszenia tlenu. Znane są zarówno dziedziczne, jak i nabyte przyczyny tej choroby. Istotne informacje uzyskano o białkach i lipidach budujących błonę komórkową erytrocytów. Liczne białka cy to szkieletu, takie jak spektryna, ankiryna i aktyna, oddziałują ze swoistymi białkami integralnymi błony i pomagają utrzymać krwince dwuwklesły kształt i podatność na odkształcenia. Niedobór spektryny powoduje dziedziczną sferocy toze, jedną z istotnych przyczyn niedokrwistości hemolitycznej. Substancje grupowe układu ABO są złożonymi glikosfingo lipidami występującymi w błonie krwinek; immunodominującym cukrem substancji A jest N-acetylogaiaktozamina, a substancji B — galaktoza. Antygeny układu Rh są integralnymi białkami Wony komórkowej, a substancje grupowe układu MN są polimorficznymi postaciami glikoforyuy A. Granulocyty obojętnochlonne odgrywają główną rolę w mechanizmach obronnych ustroju. Integryny obecne na powierzchni komórek determinują swoiste oddziaływanie różnych komórek i składników tkankowych. Leukocyty ulegają aktywacji w wyniku kontaktu z bakteriami oraz działania innych bodźców. NADPH-oksydaza odgrywa główną rolę w procesie aktywacji (eksplozja oddechowa). Mutacje enzymów i związanych z nimi białek są przyczyną przewlekłej choroby ziarniczej. Proteazy granulocytów obojętnochłonnych mogą rozkładać wiele białek tkankowych; w warunkach prawidłowych są pod kontrolą arsenału antyproteaz. Jednak ten nWfchamzm hamujący może być złamany w wielu okolicznościach, co prowadzi do rozległych uszkodzeń tkanek. Zastosowanie technologii rekombinacji DNA zrewolucjonizowało badania w hematologii.

PIŚMIENNICTWO Baggiolini M, Wymann MP: Turning on the respiratory burst. Trends Biochem Sci 1990;15:69. Beck WS (editor). Hematołogy, 5th ed. MIT Press, 1991. Junqueira LC, Carneiro J, Kelley RO: Chapiers 12 and 13 in: Basie Histology, 6th ed. Appleton & Lange, 1989. Krantz SB: Erythropoietin. Blood 1991;77:419. Lienhard GE et al: How cells absorb glucose. Sci Am (Jan) 1991;266:86. Lubbert M, Herrmann F, Koeffler HP: Expression and regulation of myeloid-specific genes in normal and leukemie myeloid cells, Blood 1991;77:909. Lux SE, Becker PS: Disorders of the red celi membranę skcleton: Hereditary spherocytosis and hereditary elliptocytosis. Chapter 95 in: The Metaboiic Basis of Inherited Disease, 6th ed. Scriver CR et al (editors}. McGraw-Hill, 1989. Luzzato L, Mehta A: Glucose-6-phosphate dehydrogenasc deficiency. Chapter 91 in: The Metaboiic Basis of Inherited Disease, 6th ed. Serwer CR et al {editors}. McGraw-Hill, 1989. Rapaport ST: Introduction to Hentatohgy, 2nd ed. Lippincott, 1987. Segal AW: The eleetron transport chain *of the microbicidal oxidase of phagocytic cells and its involvement in the molecularpathology of chronić granulomatous disease. JClin Invest 1989:83:1785. Smith RM, Curnutte JT: Molecular basis of chronić granulomatous disease. Blood 1991;77:673. Spitznagell JK: Antibiotic protcins of huraan neutrophils. J Clin Imest 1990;86:138I. Weatherall DJ et al: The hemoglobinopathies. Chapter 93 in: The Metaboiic Basis of Inherited Disease. 6th ed. Scriver CR et al (editors). McGraw-Hill, 1989. Yamamoto F et al: Molecular genetic basis of the histoblood group ABO system. Naturę 1990;345:229.

Podłoże biochemiczne niektórych schorzeń neuropsychiatrycznych

6 4

Robert K. Murray, MD, PhD

WPROWADZENIE Rozdział ten nie stanowi systematycznego opisu takich zagadnień, jak mechanizm neurotransmisji, cechy neuro transmiter ów, właściwości synaps, ani szczegółów, takich jak kanały jonowe w mózgu. Tematy te są dobrze przedstawione w wielu podręcznikach neurofizjologii, biologii molekularnej i neuro farmakologii. Niektóre z nich są wymienione w piśmiennictwie na końcu tego rozdziału. Zakładamy, że czytelnik ma pewną znajomość podstawowych pojęć neuro fizjologii i neuro anatomii. Zamiast tego przedyskutujemy 8 schorzeń {lub grup schorzeń) neuropsychiatrycznych: miastenię, chorobę Huntingtona, udary mózgu, choroby spowodowane mutacjami mitochondrialnego DNA, zespół łamliwego chromosomu X i inne schorzenia związane z powtórzeniem trypletowym, chorobę Parkinsona, chorobę Alzheimera i schizofrenię. Współczesne osiągnięcia biochemiczne, komórkowe i genetyczne rzuciły na te schorzenia pewne światło i w niektórych przypadkach stwarzają szansę na nowe sposoby leczenia. Jedne z tych schorzeń są bardziej pospolite, inne mniej, ale wszystkie dają nam cenny wgląd w biochemię mózgu i otwierają nowe perspektywy.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Główne dwa wyzwania, przed którymi staje współczesna biologia to określenie mechanizmów zaangażowanych w rozwój i różnicowanie i odkrycie działania układu nerwowego. Metody badawcze, które umożliwiła technologia rekombinowanego DNA, odgrywają ważną rolę w obu tych zagadnieniach. Klinicznie choroby

neuropsychiatryczne są^ważne m.in. dlatego, że są często przewlekłe (np. schizofrenia) i wyniszczające (np. udary, choroba Huntingtona, choroba Alzheimera i schizofrenia), ponieważ mogą niszczyć funkcje intelektualne. Badania neurobiologiczne nie tylko pozwalają nam na lepsze zrozumienie naszej własnej natury, ale także dostarczają racjonalnej podstawy skutecznej terapii wielu schorzeń prowadzących do kompletnego inwalidztwa. Według amerykańskiej Narodowej Fundacji Badań Mózgu koszta bezpośrednie schorzeń mózgu (choroby psychiatryczne i neurologiczne, alkoholizm i narkomanie) wynoszą ponad 401 mld dolarów rocznie. Koszt jednej tylko choroby, otępienia, czyli demencji (której najważniejszym przykładem jest choroba Alzheimera), przewyższa koszt leczenia raka i choroby wieńcowej serca. Koszta bezpośrednie w wysokości 401 mld dolarów stanowiły */? całkowitych wydatków służby zdrowia w USA w 1991 r. Obliczono też, że koszta pośrednie (np. utrata zarobków, system ścigania zbrodni) przewyższają koszta bezpośrednie. Na każde 100 dolarów wydanych na opiekę nad pacjentem z chorobą Alzheimera Stany Zjednoczone inwestowały tylko 50 centów na badania nad tym problemem, a w innych krajach nakłady na badania są z pewnością niższe.

ABY ZROZUMIEĆ MIASTENIĘ, TRZEBA ZROZUMIEĆ ZJAWISKA ZACHODZĄCE W ZŁĄCZU NERW0WO-M1ĘŚNI0WYM Miastenia (myasthenia gravis) charakteryzuje się nawracającymi epizodami słabości mięśnio-

wej, głównie dotyczącej mięśni unerwianych

888 / ROZDZIAŁ 64

przez nerwy czaszkowe. Stan chorego poprawia podawanie leków, które hamują acetylochoiinesterazo (patrz niżej) i fakt ten jest wykorzystany w rozpoznaniu i leczeniu. W miastenii z powodów, które nic są jasne, organizm wytwarza autoprzeci wdała skierowane przeciw receptorowi cholinergicznemu (AChR) w płytce nerwowo--mięśniowej; przeciwciała te powodują zniszczenie receptorów i prowadzą do znacznego zmniejszenia ich liczby. Tak więc, aby zrozumieć tę chorobę, trzeba koniecznie poznać podstawowe fakty dotyczące przekaźrrictwa ne-rwowo-mięśniowego. Schemat złącza nerwowo-mięśniowego i niektórych zachodzących w nim zjawisk przedstawia ryc. 64-1, Złącze to składa się z pojedynczego zakończenia nerwowego oddzielonego od obszaru pos[synaptycznego szczeliną synaptyczną. Płytka motoryczna jest wyspecjalizowaną

Zakończenie nerwowe

Bten a presynaptyezna

Ryc. 64-1- Schematyczne przedstawienie niektórych wydarzeń w złączu necwowo-mięśniowym. Część zakończenia nerwowego ukazano leżącą w ścisłym przyłożeniu do mięśniowej płytki końcowej. Cały proces, w którym acetylocholina pobudza receptor, może być traktowany jako zachodzący w sześciu etapach (patrz tekst). AcCoA — acetyloCoA, ACh — acetyl och ot i na; AChRs — receptory acetylocholinowe; Ac — octan

częścią błony mięśniowej biorącej udział w złączu. Wyraźnie widać fałdy złącza; zawierają one dużo receptorów cholinergicznych w bezpośredniej bliskości zakończenia nerwowego. Można uważać, że wszystkie zjawiska w złączu zachodzą w 6 etapach (ryc. 64-1). 1. Synteza acetyl och o liny zachodzi w cytoplazmie zakończenia nerwowego, w którym znajduje się enzym acetylotransferaza cho li no wa, katalizująca reakcję Acetyio - Co A ■:- Chol i na -> Acetylocholina+ + CoA

Zsyntetyzowana acetylocholina zostaje wbudowana do małych, związanych z błoną ziarnistości zwanych pęcherzykami synaptycz nymi i w nich składowana. Szczegóły tego proce su nie są dobrze poznane. Uwalnianie acetylocholiny z tych pęche rzyków do szczeliny synaptycznej jest następ nym etapem. Dochodzi do tego w procesie egzocytozy, w którym następuje fuzja pęcherzy ka z błoną pre&ynaptyczną. W stanie spoczyn kowym pojedyncze kwanty {ok. 10 000 cząs teczek neurotransmitera, prawdopodobnie od powiadające zawartości jednego pęcherzyka sy naptycznego) są uwamiane spontanicznie, w wyniku czego powstają niewielkie miniaturo we potencjały płytki końcowej (MEPP). Kiedy zakończenie nerwowe zostaje zdepoiaryzowane w wyniku dotarcia doń impulsu nerwowego, otwierają się zależne od napięcia kanały wap niowe, co pozwala na napływ jonów wapnia z przestrzeni synaptycznej do zakończenia ner wowego. Te jony wapniowe pełnią zasadniczą rolę w procesie egzocytozy, w którym acetylochoiina (zawartość ok. 200 pęcherzyków) zo staje uwolniona do przestrzeni synaptycznej. Uwolniona acetyl och oiina szybko dy fun duje przez szczelinę synaptyczną do jej recep torów w fałdach złącza, £iedy dwie cząsteczki acetylocholiny połączą się z receptorem, ten ulega zmianie konformacyjnej, otwierając kanał receptorowy pozwalający na przepływ jonów przez błonę, W wyniku tego dochodzi do na pływu jonu Na+. co prowadzi do depolaryzacji błony mięśniowej i powstania potencjału płyt kowego. Potencjał ten depolaryzuje z kolei sąsiednią błonę mięśniową i w ten sposób powstają i zostają przenoszone wzdłuż włókna potencjały czynnościowe, powodujące skurcz mięśni (p. rozdz. 59). Gdy kanał się zamyka, cząsteczka acetylocholiny oddysocjowuje i zo-

PODŁOŻE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYChHATRYCZNYCH / 889

staje zhydrolizowana przez acetyiocholinesterazę, która katalizuje reakcję Acety tocholina HxO-> Octan +- Cholina

Ten ważny enzym znajduje się w dużych ilościach w błonie podstawnej przestrzeni synaptycznej. 6. Cholina jest odzyskiwana przez zakończenie nerwowe dziękiunechanizmowi aktywnego transportu, i tam może być ponownie użyta do syntezy acetylocholiny. Receptor cholinergiczny złącza nerwowo-mięśniowego jest kanałem jonowym sterowanym przez neurotransmiter Receptor cholinergiczny w złączu nerwowo-mięśniowym intensywnie badano ze względu na rolę, jaką gra w przekaznictwie nerwowo-mięsniowym. Niektóre ważne właściwości tego receptora są wyliczone w tab. 64-1. Jak tam

Tabela 64-1. Niektóre własności receptora acetylocholinowego złącza nerwowo-mięśniowego" Receptor w złączu: Jest receptorem nikotynowym {tzn, agonistą tego receptora jest nikotyna) Jest błonową glikoproteiną o masie cząsteczkowej -275 000 Zawiera 5 podjednostek, ma skład Tylko podjednostka a wiąże acety I ochot i nę z dużym powinowactwem Dwie cząsteczki acetylocholiny muszą się związać, aby otworzyć kanał jonowy, który umożliwia przepływ jonów Na+ i K+; receptor jest więc kanałem jonowym regulowanym (bramkowanym) przez transmiter Jad węża a-bungarotoksyna wiąże się silnie do podjednostki % i może być użyta do znakowania receptora albo jako ligand o dużym powinowactwie do oczyszczania go Autoprzeciwciata przeciw receptorowi są podejrzane o powodowanie miastenii • Według: Kandełl E.R.. Schwarz J.H., Jessel T.M. (red,): Principles of Neural Scisnce. wyd. 3, Elsevier, 1991. " Przedstawiony skład dotyczy receptora płodowego U dorosłych pojedyncza podjednostka y jest zastąpiona przez podjednostke s Każdy typ podjednostki jest kodowany przez osobny gen.

wspomniano, jest on błonową glikoproteiną składającą się z 5 podjednostek, z których 2 (podjednostki a) są identyczne. cDNA dla różnych podjednostek został sklonowany i dla każdego z tych cDNA wydedukowano strukturę aminokwasową podjednostki. Fakt, że abungarotoksyna wiąże się mocno z tym białkiem został wykorzystany w wielu badaniach, takich jak pomiar liczby receptorów w próbkach normalnego i chorego mięśnia (p. niżej). Rozmieszczenie białek w błonie komórkowej przedstawia ryc. 64-2. Jak pokazano, wszystkie 5 podjednostek przechodzi przez błonę i bierze udział w tworzeniu kanału jonowego, W nieobecności acetylocholiny kanał jest zamknięty. Kiedy dwie cząsteczki neurotransmitera wiążą się do receptora, każda dpyednej podjednostki a, białko ulega zmianie konformacyjnej, która powoduje otwarcie się kanału na czas ok. jednej milisekundy. W tym czasie napływa do mięśnia Na+, a wypływa zeń K+. Jak wspomniano wyżej, to właśnie napływ Na+ powoduje depolaryzację błony mięśniowej i generuje potencjał płytki końcowej. Ponieważ obecność lub nieobecność acetylocholiny powoduje otwieranie i zamykanie kanału, receptor choiinergiczny określa się jako kanał jonowy regulowany („bramkowany") neurotransmiterem (w odróżnieniu od dwóch innych typów kanałów regulowanych — kanałów zależnych od potencjału [napięciowo-zależnych] oraz regulowanych mechanicznie). W miastenii autoprzeciwciała uszkadzają receptory cholinergiczne i zmniejszają ich liczbę Badania elektrofizjologiczne (np. elektromiografia) wskazują, że nienormalność w miastenii dotyczy płytki końcowej, a nie błony presynaptycznej. W rzeczy samej, w tej chorobie dochodzi do normalnego uwalniania się acetylocholiny. W przeciwieństwie do tego badania, w których używa się znakowanej bungarotoksyny dla pomiaru liczby receptorów cholinergicznych w próbkach mięśni, wykazały silny ich spadek u pacjentów cierpiących na miastenię. Wiele danych sugeruje udział zaburzeń układu immunologicznego w patogenezie miastenii. Obserwuje się np. często hiperpiazję grasicy i tkanek limfoidalnych, nie są też rzadkie guzy grasicy. Około 10% pacjentów cierpi na inne schorzenia autoimmunologkzne. Jest interesujące, że niekiedy chorobą może być dotknięty płód chorej matki in utero, co sugeruje przenika-

890 / ROZDZIAŁ 64

Acetytocholina nie związana: kanał zamknięty

B, Dwie cząsteczki acetytochollny związane: kanał otwarty

f

O Na'

V

7

;. 64-2. Struktura receptora dla acetylocholiny (ACh) w złączu nerwowo-mięśniowym. A — Trójwymiarowy model nikotynowego, aktywowanego przez acetylochotinę, kanału jonowego, oparty na f modelu Karlina i wsp. Kompleks receptor-kanał składa się z wielu podjednostek. Po jednej cząsteczce acetylocholiny łączy się do każdej podjednostki a. przed otwarciem kanału. Wszystkie podjednostki biorą udział w tworzeniu pory. B — Kiedy dwie cząsteczki acetylocholiny przyłączą się do części podjednostek a wystawionych na powierzchni błony, receptor-kanał zmienia konformację otwierając pory w części receptora zanurzonego w dwuwarstwie lipidowej. Przez otwarty kanał przepływają Na + i K+ zgodnie z ich własnymi gradientami stężeń. (Według: Kandel E. R., Schwartz J. H,, Jessel T. M. (red.): Principles of Neural Science, wyd. 3. Elsevier, 1991, za zezwoleniem).

nie przez łożysko jakiegoś czynnika, np. autoprzeciwcial. Wiele wyjaśniającym odkryciem było stwierdzenie, że wstrzykniecie oczyszczonego receptora cholinergicznego (otrzymanego z organu elektrycznego węgorza elektrycznego) królikom powoduje wystąpienie we krwi prze-

ciwciał skierowanych przeciw receptorowi i chorobę przypominającą miastenię. Wykazano następnie, że auto przeciwciała skierowane przeciw receptorowi można wykazać także u człowieka cierpiącego na miastenię; są one obecne u prawie 100% pacjentów z ciężką

PODŁOŻE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 891

postacią choroby. Auto przeciwciała przyczepiają się do receptorów cholinergicznych w złączu nerwowo-mięśniowym i uszkadzają je, co powoduje tzw. liżę ogniskową (p. ryc. 64-3). Uszkodzone receptory podlegają endocytozie, która przyspiesza ich obrót (tworzenie i ginięcie) i zmniejsza liczbę. Obecność układu dopełniacza (p. rozdz. 58) odgrywa istotną rolę w tym typie uszkodzeń komórkowych. Nie zostało dotąd dostatecznie jwyjaśnione, co jest pierwotną przyczyną powstawania autoprzeciwciał. Tworzenie przeciwciał przeciw receptorom acetylocholinowyrn obecnym w złączu nerwawo-mięśntowyrn

Uszkodzenie receptorów (lokalna liza) przez auloprzeciwciata, powodujące usieciowanie i endccytozę

i

Silne zmniejszenie liczby receptorów

I

Objawy kliniczne, zwłaszcza epizody słabości mięśni unerwianych przez nerwy czaszkowe

Ryc. 64-3. Schemat powstawania miastenii. Powody początkowego tworzenia przeciwciał skierowanych przeciw receptorom nie są jasne.

Inhibitory chotinesterazy zwiększają ilość acetylocholiny w złączu nerwowo-mięśniowym, pozwalając na leczenie miastenii Leki hamujące acetylocholinesterazę, enzym zaangażowany w niszczenie acetylocholiny, skutecznie zwiększają stężenie tego neurotransmitera przy płytce nerw owo-mięśniowej i przedłużają czas jego działania. Leki tego typu są podstawą leczenia miastenii. Istnieją 2 typy inhibitorów cholinesterazy: odwracalne i nieodwracalne. Zarówno krótko działające, jak i stosunkowo długo działające inhibitory są użyteczne w miastenii. Te pierwsze znalazły szczególnie zastosowanie w diagnostyce. Diagnozę stawia się na podstawie wywiadów, objawów klinicznych i pewnych testów laboratoryjnych (np. elektromiografii, pomiaru krążących autoprzeciwciał). Test diagnostyczny polega na podaniu odpowiedniej ilośri krótko działającego edrofoniiun (Tensilon). Jeżeli pacjent cierpi na miastenię, powinno to spowodować szybkie, choć krótkotrwałe, zwiększenie siły mięśni. Pirydostygmina i neostygmina są skutecznymi, dhiżej działającymi lekami, szeroko używanymi w le-

czeniu miastenii,- Di izopropyl ofluorofosforan (DFP) jest przykładem nieodwracalnego inhibitora cholinesterazy; tworzy on kowalentne wiązanie z resztą serynowa. w aktywnym centrum cholinesterazy (zob. omówienie proteaz serynowych w rozdz, 10). DFP jest trującym „gazem nerwowym" i jest też używany jako środek owadobójczy. Lecząc miastenię często trzeba dodatkowo stłumić nienormalną odpowiedź immunologiczną powodującą miastenię. Zazwyczaj używa się w tym celu kortykosteroidów. ale poważniejsze przypadki wymagają zastosowania cyt o toksycznych leków immunosupresyjnych, takich jak azatiopryna. Korzystne mogą być skutki usunięcia grasicy. Plazmafereza może przejściowo obniżyć poziom autoptfŁeeiwciął w osoczu. CHOROBA HUNTINGTONA JEST PRZENOSZONA DZIEDZICZNIE Choroba Huntingtona, zwana też pląsawicą Huntingtona, charakteryzuje się krótkimi, mimowolnymi ruchami (pląsawicą) i postępującym pogarszaniem wyższych czynności nerwowych. Zaczyna się zazwyczaj między 35 a 50 rż., nieubłaganie się pogłębia, i prowadzi do śmierci średnio w 15 lat po wystąpieniu pierwszych objawów. Choroba jest dziedziczona jako cecha autosomalna dominująca z całkowitą penetracją; zagrożonych jest 50% dzieci rodziców dotkniętych tą chorobą. Jest ona wyjątkowo stresująca, ponieważ do niedawna dzieci tych chorych nie mogły przewidzieć, czy zostaną nią dotknięte i czy nie przekażą jej swojemu potomstwu. Neurony w ciele prążkowanym (jądro ogoniaste i skorupa) są najbardziej dotknięte przez chorobę Huntingtona. Wiele z nich ginie i zostaje częściowo zastąpionych przez komórki glejowe (glejoza). Śmierć komórek dotyka jedne typy neuronów bardziej niż inne; interneurony zazwyczaj nie są naruszane. Obserwuje się spadki poziomu pewnych neurotransmiterow (np. kwasu y-aminomasłowego [GABA] i acetylocholiny), niektórych enzymów zaangażowanych w ich syntezę (np. dekarboksylazy glutaminianowej i acetyl o transfe razy cholinowej), niektórych neuropeptydów (np. substancji P, diolecystokininy i metenkefaliny) i pewnych receptorów (np. dopaminowych, cholinergicznych i serotoninowych). Wykazano również wzr«st stężeń innych przedstawicieli tych 4 klas

892 / ROZDZIAŁ 64

molekuł, np. dopaminy i noradrenaliny, somatostatyny i neurotensyny. Te rozmaite zmiany mają prawdopodobnie charakter wtórny, odzwierciedlający uszkodzenia komórek i śmierć komórkową wynikłą z defektów genetycznych, ale są ważne z tego powodu, że stanowią podstawę biochemiczną objawów, na które cierpi pacjent. Gen choroby Huntingtona został zlokalizowany na krótkim ramieniu chromosomu 4, ale dotychczas nie został wyizolowany W 1983 r. Gusella i współpracownicy opisaii występowanie RFLP ściśle związanego z genem odpowiedzialnym za chorobę Huntingtona. Była to jedna z pierwszych prac wykorzystujących RFLP w badaniach sprzężeń genetycznych i jej sukces dał olbrzymi napęd do tego typu badań. Badane przypadki obejmowały bardzo rozległą rodzinę (ok. 5000 osób) żyjącą w okolicy jeziora Maracaibo w Wenezueli. Około 300 członków tej rodziny cierpiało na chorobę Huntingtona, Użyto baterii 12 świeżo udostępnionych sond DNA. Przy olbrzymim szczęściu (jeżeli się uwzględni względnie niewielką liczbę sond i rozmiar ludzkiego genomu), stwierdzono, że jedna z tych sond, G8, wykryła dwa pohmorfizmy (RFLP) bardzo ściśle związane z genami kodującymi chorobę Huntingtona (w granicach ok. 3—5 cM). Te dwa polimorfizmy spowodowały rozpoznanie 4 kombinacji alleli, czyli haplotypów (A, B, C i D); haplotyp C dla G8 pojawiał się u członków wenezuelskiej rodziny dotkniętych chorobą. G8 pochodził 2 rekombinowanego bakteriofaga z biblioteki genomu ludzkiego. Zastosowanie hybrydyzacji komórek somatycznych oraz hybrydyzacji in situ wykazało, że wykryty locus znajdował się bardzo blisko końca krótkiego ramienia chromosomu 4. Niestety, sekwencje DNA blisko telomeru przy końcu chromosomu wydają się zawierać powtórzenia DNA i inne sekwencje trudne do interpretacji. Mimo tego, do końca 1989 r. sklonowano koniec chromosomu 4, w którym znajduje się locus choroby Huntingtona. Jednakże, dalsze dowody wykazały wówczas, i& locus ten w rzeczywistości znajduje się kilka milionów par zasad bardziej proksymalnie (tzn. w kierunku od końca chromosomu) niż pierwotnie sądzono. Nie został on nigdy precyzyjnie określony w tym sensie, że nie udało się określić regionu ograniczającego, definiującego dystalny koniec genu (w przeciwieństwie do przypadku

genu mukowiscydozy). Tak więc obecnie liczne laboratoria klonują i sekwencjonują rejon chromosomu, w którym przypuszcza się, że tkwi poszukiwany gen. Powinien on być zidentyfikowany w najbliższej przyszłości. Jeżeli uda się też wydedukowac, jakie białko wytwarza normalny gen, powinno to wyjaśnić mechanizm prowadzący do śmierci neuronalnej w ciele prążkowanym pacjentów z chorobą Huntingtona (patrz niżej) i doprowadzić do bardziej racjonalnych metod jej leczenia. Mimo rozczarowania, że gen choroby Huntingtona wciąż nie został zidentyfikowany, opisane wyżej badania umożliwiły, przy użyciu odpowiednich sond DNA, informowanie członków dotkniętych rodzin — jeżeli zechcą to wiedzieć — czy rozwinie się u nich choroba Huntingtona (testowanie przedobjawowe) i zaoferować diagnozę prenatalną. Obecnie nie ma żadnej swoistej terapii choroby Huntingtona, można tylko służyć doradztwem genetycznym, pomocą psychologiczną i leczeniem objawowym. Ekscytotoksyny mogą wywoływać śmierć neuronów w chorobie Huntingtona przez ich działanie na podtyp NMDA receptora glutamin łanowego Choroba Huntingtona charakteryzuje się wymieraniem pewnych neuronów (p. wyżej). Bez wyjaśnienia natury produktu genu zaangażowanego w chorobie Huntingtona (enzymu, receptora itp.) trudno o pewność, jak proces ten zachodzi. Jedna z hipotez zakłada, że jest on powodowany przez pewne substancje chemiczne (ekscytotoksyny), które mogą być egzogenne lub endogenne (normalne produkty metaboliczne). Aby w pełni zrozumieć tę koncepcję, trzeba coś wiedzieć o receptorach glutaminianowych. Glut;) minian i aspara ginian są pobudzającymi aminokwasami w mózgu; glutaminian może być odpowiedzialny za ok. ^75% neurotransmisji pobudzającej w mózgu. Przez stosowanie odpowiednich agonistów i antagonistów podzieiono receptory giutaminianowe na 5 klas: 1) NMDA (N-metylo-D-asparaginian); 2) AMPA (kwas a-amino-3-hydroksy-5 -metyl o-4-izoksazolopropionowy); 3) kainowe (związek izolowany z glonów morskich); 4) L-AP+ (syntetyczny agonista) i 5) metabotropowy. Pierwsze 4 receptory są kanałami kationowymi, podczas gdy receptor metabotropowy jest związany z wewnątrzkomórkowym wytwarzaniem diacy-

PODŁOŻE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 893

loglicerolu i trisfosforanu inozytolu na szlaku polifosfoinozytydowym (p. rozdz. 45). Szczególnie interesujące było odkrycie, że iniekcja kwasu kainowego do prążkowia szczurów powoduje śmierć neuronów, ale oszczędza komórki glejowe i aksony. Kwas kainowy działa powodując nadmierne uwalnianie glutaminianu. Faktycznie, inkubacja neuronów ze stosunkowo niskimi stężeniami giutaminianu może powodować śmiejt neuronów: jest to zależne od obecności Ca2+ w środowisku inkubacyjnym. Iniekcja chinolinianu, metabolitu tryptofanu, który stymuluje receptor NMDA, również powoduje śmierć neuronów, oszczędzając interneurony, w podobny sposób jak w chorobie Huntingtona. Tak działające związki chemiczne nazywamy ekscy to toksynami. Chociaż do chwili identyfikacji produktu wadliwego genu nie można wyznaczyć dokładnie łańcucha zdarzeń, szczególnie zaangażowany w uszkodzenia i śmierć neuronów obserwowane w chorobie Huntingtona wydaje się być receptor NMDA. Receptor ten (ryc. 64-4) jest złożony, ponieważ zawiera co najmniej 5 różnych miejsc wiążących (miejsce wiążące transmiter — glutaminian, miejsce regulatoro-

we wiążące glicynę, zakżne od potencjału miejsce wiążące Mg2 +, miejsce wiążące fencyklidynę oraz miejsce wiążące Zn2+). Kanał otwiera się, kiedy jest związany zagonistą, takim jak glutaminian, a po otwarciu zezwala na napływ Ca2 + i Na+ do komórki. Jeżeli receptor NMDA jest stymulowany przewlekle (np. w wyniku nadmiaru glutaminianu uwalnianego przez neurony w wyniku depolaryzacji ich błony plazmatycznej), prowadzi to do akumulacji Ca2 + , który w wysokich stężeniach jest toksyczny dla komórki i może spowodować śmierć komórki w sposób podobny do opisanego dla zawału serca (przypadek 4 w rozdz. 62). Co więcej, napływowi Ca2 + towarzyszy napływ Nar, powodujący osmotyczne pęcznienie i uszkodzenie komórki. Odkrycia te ustają implikacje terapeutyczne, ponieważ dzięki nim można częściowo blokować receptory NMDA, używając leków takich jak dekstrorfan, zmniejszając w ten sposób liczbę ginących komórek. Receptor NMDA jest interesujący również z innych względów. Sądzi się, że odgrywa on istotną rolę w długotrwałym wzmocnieniu, co powoduje zwiększoną wydajność synaptyczną w hipokampie i innych obszarach mózgu i może Błona

Wnętrze

Otoczenie

^pęcpoooo ■ ■ l! ': ■ ■ ' ■ ' ■

ÓOOCC Ryc. 64-4. Schematyczne przedstawienie receptora NMDA i punktów uchwytu różnych czynników na receptorze. Receptor NM DA kontrotuje kanai kationowy przepuszczalny dla Ca 2+ i Na+ i jest kontrolowany przez Mgił w sposób zależny od potencjału. Przed wjonem jest K+. Kana! receptora NMDA jest blokowany przez PCP i MK801, a cały kompleks jest regulowany w dwóch miejscach regulatorowych przez, glicyne iZn2+. AP5 jest kompetytywnym antagonistą w miejscu wiązania NMDA. PCP — fencyklidyna (Wediug: Cooper J B., Bloom F. £., Roth R. H.: The Biochemical Basis of Neuropharmacology, wyd. 6, Oxford University Press, za zezwo(eniem). ____

894 I ROZDZIAŁ 64

być związane ze zjawiskami pamięci i uczenia. Uważa się również, że aktywacja tego receptora może inicjować drgawki; ponadto powtarzane drgawki mogą wywołać śmierć neuronów prawdopodobnie związaną z uwalnianiem ekscytotoksyn. Proponowany schemat niektórych wydarzeń związanych z wywołaniem choroby Huntingtona przedstawia ryc. 64-5. Mutacja lub rnulacje jednego genu (genu Huntlngtona) w krótkim ramieniu chromosomu A

Zmiana struktury hipotetycznego produktu białkowego (np, enzymu, blatka strukturalnego, receptora)

Uwolnienie etecytotoksyn [np. nadmiar glutaminlanu) powodujące nadmierne pobudzenie receptora NMDĄ wewnątrzkomórkowe nagromadzenie toksycznych ilości Ca/ i Śmierć neuronów w prązkowlu i gdzie indzie]

Objawy choroby Huntingtona (pląsawlca, postępujące pogorszenie stanu neurologicznego)

Ryc. 64-5. Przypuszczalny schemat niektórych zjawisk zaangażowanych w wywoływanie choroby Huntingtona.

EKSCYTOCYNY I INNE MECHANIZMY BIOCHEMICZNE SĄ ZAANGAŻOWANE W USZKODZENIA MÓZGU SPOWODOWANE UDAREM Przy udarze mózgu pojawiają się lokalne uszkodzenia wywołans,zmniejszonym przepływem krwi. Skutki tego mogą być zabójcze (np. trwała utrata przytomności, paraliż, ślepota, utrata mowy), w zależności od umiejscowienia i wielkości dotkniętego udarem obszaru. Udary są trzecią główną przyczyną śmierci w USA i dotykają ok. 500000 Amerykanów rocznie. Podobnie jak w przypadku choroby Alzheimera, ekonomiczne koszty związane z opieką medyczną nad pacjentami z udarem są olbrzymie. Aby opracować odpowiednie metody leczenia udarów, trzeba koniecznie zrozumieć podstawowe mechanizmy zaangażowane w uszkodzenia okolic mózgu dotkniętych udarem. Omówimy tu kilka ważnych punktów. Większość udarów jest powodowanych zakrzepami w tętnicach mózgowych. Zmniejsza to podaż tlenu i glukozy, substancji podstawowych dla przemiany materii w mózgu, bez

których trwałe uszkodzenie komórek rozwija się szybko (poniżej godziny). Wyróżniamy trzy kolejne etapy w rozwoju uszkodzenia mózgu powodowane zakrzepem mózgowym. Indukcja. Niedotlenienie (ischemia) powo duje depolaryzację Won neuronalnych, powo dującą uwalnianie glutaminianu Podobnie jak w przypadku choroby Huntingtona, powoduje to nadmierne pobudzenie receptorów NMDA na przylegających neuronach, prowadzące do nienormalnie wysokiego napływu Ca2+ i Na+ i wynikające stąd uszkodzenie komórki lub jej śmierć. Co więcej, glutaminian pobudza recep tory AMPA/kainowe (prowadząc do dodat kowego napływu Na + ) i receptory metabotropowe, powodując wewnątrzkomórkowe tworzenie się trisfosforanu inozytolu i diacyloglicerolu. Amplifikacja. Dalsze nagromadzanie się Caz+ w komórce zachodzi przez następujące mechanizmy: a) zwiększone stężenie wewnątrz komórkowego Na+ aktywuje transporter Na+/Ca2+ , b) sterowane potencjałem kanały Ca2+ są aktywowane w wyniku depolaryzacji i c) trisfosforan inozytolu uwalnia Ca2+ z*siateczki śródplazmatycznej do cytoplazmy. Wszyst kie te trzy mechanizmy prowadzą do podwyż szenia wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2+, co powoduje dodatkowe uwalnianie się gluta minianu, pobudzającego w dalszym ciągu sąsie dnie neurony. Ekspresja. Duże stężenia wewnątrzkomó rkowego Ca2 + aktywują wapni owo-zależne nukleazy, proteazy i fosfolipazy. Degradacja fosfolipidów może też prowadzić do tworzenia czynnika aktywującego płytki (PAF) i uwal niania kwasu arachidonowego, którego meta bolizm prowadzi do tworzenia eikozanoidow; oba te typy lipidów mogą wywoływać skurcz naczyń, pogarszając efekt zakrzepu. W dodatku metabolizm eikozanoidow prowadzi do tworze nia wolnych rodników tlenowych, które powo dują trwałe nadtlenkowe ^uszkodzenia lipidów błon neuronalnych. Ponieważ glutaminian od grywa pierwszoplanową rolę w tej sekwencji wydarzeń, cały proces nazwano kaskadą glutaminianową. Wiele innych czynników jest jednak również zaangażowanych w ischemicznym uszkodzeniu mózgu. Leczenie udaru ma na celu ograniczenie uszkodzeń wywołanych zakrzepem. Wprowadzono doświadczalne terapie mające na celu zminimalizowanie efektów biochemicznych kaskady glutaminianowej (tab, 64-2). Podobnie

PODŁOŻE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 895 Tabela 64-2. Niektóre terapie doświadczalne testowane w celu ograniczenia kaskady glutaminianowej rozwijającej się w czasie udaru mózgu. (Trzy etapy kaskady opisano w tekście).' Etap kaskady Indukcja

Ampliftkacj a Ekspresja

Problem biochemiczny

Podejście lecznicze

Nadmierne uwalnianie gl u -tamirtianu

Hamowanie syntezy glutaminianu przez metioninową sulfoksyminę. Obniżenie temperatury ciała, jeżeli pacjent gorączkuje: obniża to metabolizm mózgu i może zahamować uwalnianie glutaminianu

Aktywacja receptorów NMDA Napływ Ca1+ przez kanały CaI+ regulowane potencjałem Tworzenie wolnych rodników

Antagoniści receptorów NMDA, tacy jak dekstrorfan, CGS 19755 i MK-801 Pochodne dihydropirydyny (np. nimodypina) w celu zablokowania tych kanałów Leki hamujące wolne rodniki (np. 21 -aminosteroidy)

Według: Zivin J.A., Choi D.W.: Stroke Therapy. Sci. Am. {lipiec) 1991, 26%, 56.

jak w przypadku zakrzepu w tętnicy wieńcowej (p. rozdz. 58) wczesne leczenie trombolityczne

może przywrócić przepływ krwi. Prowadzi się wiele zakrojonych na dużą skalę prób klinicznych z tPA. Do leczenia udaru tPA może być odpowiedniejsza niż streptokinaza, ponieważ ta ostatnia może łatwiej wywoływać krwotoki, które mogą być katastrofalne dla mózgu. Zapobieganie obejmuje również przeciwdziałanie czynnikom ryzyka, takim jak nadciśnienie, cukrzyca, palenie tytoniu i hiperlipidemia. Podawanie małych dawek aspiryny wydaje się zmniejszać ryzyko udaru u pacjentów cierpiących na przejściowe ataki niedotlenienia.

MUTACJE MITOCHONDRIALNEGO DNA POWODUJĄ PEWNE MIOPATIE ł SCHORZENIA NEUROLOGICZNE Mitochondria ludzkie zawierają 2—10 kopii niewielkich pierścieniowych dwuniciowych molekuł DNA, które składają się na ok. 1% całkowitego DNA w komórce (ryc. 64-6 i tab. 64-3). Istotną cechą ludzkiego mitochondrialnego (mt) DNA jest to, że jest ono dziedziczone na drodze matczynej, niemendlowskiej dziedzicz-

ności, ponieważ wszystkie mitochondria są dostarczane przez jajo w czasie tworzenia zygoty. Stąd przy chorobach powstałych w wyniku mutacji mtDNA, chora matka teoretycznie powinna przekazać chorobę wszystkim dzieciom, ale tylko córki będą dalej przenosiły chorobę. Jednakże, w niektórych przypadkach (p. niżej)

Tabela 64-3. Niektóre gtówne cechy struktury i funkcji ludzkiego mitochondrialnego DNA* Jest pierścieniowy, dwuniciowy i zawiera łańcuch ciężki (H) i lekki (L) Zawiera 16 569 par zasad, ich sekwencja jest w pełni poznana Koduje 13 (z ogólnej liczby — 67) podjednostek białkowych łańcucha oddechowego; 7 podjednostek dehydrogenazy NADH {kom pleks I) cytochrom b kompleksu III 3 podjednostki oksydazy cytochromowej (kom pleks IV) 2 podjednostki syntazy ATP Koduje duży (16s) i mały (12s) mitochondrialny rybosomalny RNA Koduje 22 molekuły mitochondrialnego tRNA Jego kod genetyczny różni się nieco od kodu standardowego: UGA (standardowy kodon stopu) jest czytany jako Trp AGA i AGG (standardowe kodony dla Arg) są czytane jako kodony stopu Zawiera bardzo niewiele sekwencji nie tłumaczonych Wysoka częstotliwość mutacji (5-10 razy większa niż w DNA jądrowym) Porównania sekwencji mtDNA dostarczają dowodów O ewolucyjnym pochodzeniu naczelnych i innych gatunków * Według: Harding A.E.: Neurological disease and mitochondrial genes; Trends ^ 14:132

896 / ROZDZIAŁ 64

ubytki w mtDNA mogą zachodzić w czasie oogenezy i nie są dziedziczone po matce. Wykazano obecnie, że wiele chorób powstaje w wyniku mutacji mtDNA (tab. 64-4), Jedna ich Tabela 64-4. Niektóre miopatie mitochondrialne i choroby spowodowane mutacjami genów mitochondrialnych* Kosmate Choroba Mutacja** czerwone włókna M łopat i a oczna

Tak

Deleeje

KSS

Tak

Delecje, duplikacje

MERRF

Tak

Mutacja punktowa w lizynowym tRNA (pozycja 8344

MELAS

Tak

Mutacja punktowa w leucyrtowym tRNA (pozycja 3423}

LHON

Nie

Mutacja punktowa w reduktazie NADH-CoE Q (pozycja 11 778)

Matczyny RP (jedna rodzina)

Nie

-O ,- CD 75 (U (O

(0■— »~O

O.

O 3 *~ -* N E

5 fe < £> -3; ^r °W

S ;-< ^Z C1

>■ o — » :-„,

a a n c tT^-

Mutacja punktowa w podjednostce 6 hT-ATPazy (pozycja 8993)

* Według: Harding A. E.: Neurological disease and mrtochondrial genes; Tr&nds Neurosci. 1991,14,132. ** W wymienionych chorobach mogą też występować dalsze mutacje. Występowanie mutacji w różnych typach tRNA wydaje się korelować z proliferacją mitochondriów obserwowaną w niektórych z tych chorób, podczas gdy mutacje w enzymach łańcucha oddechowego nie wykazują takiej korelacji. Miopatia oczna charakteryzuje się postępującą zewnętrzną oftalmoplegią {PEO), ujawniającą się zazwyczaj w dzieciństwie. KSS—zespół Kearns-Sayre'a, charakteryzuje się PEO, retinopatią pigmentową t zaburzeniami przewodnictwa sercowego pojawiającymi się w dzieciństwie. MERRF — padaczka miokfonalna z kosmatymi czerwonymi włóknami, charakteryzuje się mioklonusem, padaczką i ataksją występującymi w dzieciństwie lub w okresie dojrzałości. MELAS encefa I opatia mitochondrialna z kwasicą mleczanową i epizodami udaropodobnymi, charakteryzuje się okresowymi wymiotami, proksymalną słabością kończyn i epizodami przypominającymi udar; wy stępuje w okresie pokwitania lub później, LHON dziedziczna wzrokowa neuropatra Lebera, charak teryzuje się ostrą lub podostrą utratą wzroku u męż czyzn około 20 roku życia. Matczyny RP — matczyne pigmentowe zapalenie siatkówki, pojawiło się w jed nej rodzinie wraz z otępieniem, drgawkami, ataksją i słabością mięśniową.

<

CL'

-c o rs,

CD

U O. i

« g

0=

&5.238S

w

o

U>

c

O ■=

o U O Z O "S *Q-

CC =

PODŁOŻE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 897

grupa składa się z miopatii mitochondrialnych, Tabela 64-5. Testy laboratoryjne służące do rozcharakteryzujących się obecnością mitochond- poznawania chorób powodowanych przez mutacje riów o nienormalnym kształcie i wymiarach mtDNA w mięśniach szkieletowych. Te nienormalne Obecność czerwonych kosmatych włókien w próbmitochondria powodują, że włókna mięśniowe kach pobranych z mięśni (nie w przypadku LHON*) przybierają postać kosmatych czerwonych włó- Badania różnych enzymów łańcucha oddechowekien (ragged red fibers), które można wykryć go przy biopsji mięśni barwionych metodą Gomoriego lub innymi technikami. Pierwsze 4 jedno- Analiza mtDNA (np. z mięśni i, w niektórych stki chorobowe, wymienione w tabeli 64-4 są przypadkach, 2 ieukocytów) dziedziczna wzrokowa neuropatia przykładami miopatii mitochondrialnych, W miopatii ocznej (ocular miopathy) głównie dotknięte są mięśnie odpowiedzialne za ruchy Wiele dalszych punktów dotyczących chorób oczu; powoduje to postępującą zewnętrzną oftal- wynikających z mutacji mtDNA zasługuje na moplegię (progressive external ophthalmople- skomentowanie. %( gia, POE), która również występuje, wraz z inDNA u pacjentów cierpiących na te cho inymi nieprawidłowościami, w zespole Kearnsa- roby może się składać z mieszaniny zmutowaSayre'a. Padaczka mioklonafna z kosmatymi nego i normalnego DNA (heteroplazmia) lub 'czerwonymi włóknami (myoclonus epilepsy with całkowicie zmutowanego DNA (homo plazm i a) tfSgged red fibers, MERRF) i encefa I opatia Ilość zmutowanego DNA w zasadzie jest skore fftitochondrialna z kwasicą mleczanową i epizo- lowana ze stopniem choroby. dami udaropodobnymi (mitochondrial encephaWiększość polipeptydów mitochondrial lomyopathy with lactacidosis and stroke-like nych (~54/67) jest kodowanych przez geny episodes, MELAS) mogą być klasyfikowane jądrowe i wobec tego mutacje tych ostatnich jako encefalomiopatie mitochondrialne, ponie*LHO mogą również zaburzać strukturę i waż w ich przebiegu mózg jest zazwyczaj rów- N Lebera funkcje nież poważnie dotknięty. Dwa inne schorzenia mitocłiondriów. Przy pewnych wymienione w tab. 64-4, dziedziczna wzrokowa schorzeniach neuropatia Lebera (Leber's hereditary optic myo- (np. LHON) oddziaływania między genami pathy, LHON) i macierzyńskie pigmentowe jądrowymi i mitochondrialnymi mogą być waż zapalenie siatkówki (maternal retinitis pigmen- ne dla określenia fenotypu. tosa) są chorobami wynikającymi z mutacji W jaki sposób mutacje mitochondrialne mtDNA, ale nie są miopatiami mitochondrial- powodują swoiste efekty tkankowe? Na przy nymi, ponieważ uszkodzenia niekoniecznie do- kład, dlaczego nerw wzrokowy jest tak wybiór tyczą mięśni. czo dotykany przez LHON? Prawdopodobnie U wielu pacjentów z POE (łącznie z cier- odpowiedź kryje się w charakterystyce fizjo piącymi na zespół Kearnsa-Sayre'a) stwierdzo- logicznej zaatakowanej tkanki; można podej no detecje w mtDNA; u pacjentów z zespołem rzewać, że aktywność reduktazy NADH-koenKearnsa-Sayre'a stwierdzono również duplika- zymu Q (która jest zaburzona w LHON) jest cje (podwojenia). Stopień delecji często był szczególnie ważna właśnie dla tkanki nerwu skorelowany z natężeniem POE. Delecje te wzrokowego. Co ciekawe, przewlekłe podawa wydają się powstawać w czasie oogenezy i stąd nie nie azydku sodowego (który hamuje oksydazę są dziedziczone po matce. Co więcej, nie muszą cytochromu c u pewnych ssaków wywołuje one występować we wszystkich komórkach, np. neuropatię podobną do LHON. może ich nie być w leukocytach. Z drugiej Przypuszczano, że anomalie mtDNA wy strony, pacjenci z zespołami MERRF, MELAS, stępują u pewnych pacjentów z chorobą ParkinLHON i z rodzinnym przenoszonym przez sona i mogą przyczyniać się do starzenia. matkę pigmentowym zapaleniem siatkówki wykazują specyficzne mutacje punktowe (tab. 64-4). W odróżnieniu od delecji, takie mutacje punktowe są zwykle dziedziczone od matki. Testy laboratoryjne wykorzystywane w rozpoznawaniu chorób spowodowanych mutacjami mtDNA są wymienione w tab. 64-5. '•i

898 / ROZDZIAŁ 64

ZESPÓŁ ŁAMLIWEGO X, RDZENIOWO OPUSZKOWA ATROFIA MIĘŚNIOWA I DYSTROFIA MIOTONICZNA SĄ POWODOWANE PRZEZ MUTACJĘ POWTÓRZENIA TRYPLETOWEGO Zespól łamliwego X jest recesywną chorobą związaną z chromosomem X, charakteryzującą się łagodnym lub umiarkowanym niedorozwojem umysłowym oraz wielką głową, uszami i jądrami. Występuje on u jednego na 1250 mężczyzn w Ameryce Północnej i odpowiada częściowo za to, że mężczyźni stanowią większy niż kobiety odsetek pacjentów umieszczonych w domach opieki dla niedorozwiniętych. Zespól wykazuje pewne niezwykle cechy genetyczne jak na chorobę związaną z chromosomem X, a mianowicie 20—50% mężczyzn dotkniętych tą chorobą nie wykazuje jej objawów. Ci bezobjawowi nosiciele mogą przenieść wadliwy gen na swoje córki, które również nie wykazują objawów choroby. Jednakże w trzecim pokoleniu zarówno męskie, jak i żeńskie potomstwo tych córek może wykazywać objawy choroby. Sugeruje to, że pewne zmiany genu nastąpiły u córek, co umożliwiło wystąpienie choroby u dzieci. Może to być związane ze zwiększeniem wymiaru genu przez mutację powtórzenia trypletu (patrz niżej) lub przez matczyne wdrukowanie genomowe (zdefiniowanie poniżej), w którym to procesie zachodzi nadmierne metylowanie, powodujące inaktywację pewnych genów w łamliwym odcinku chromosomu X. Po zespole Downa, zespół łamliwego X jest główną przyczyną niedorozwoju umysłowegc?
liwym miejscu chromosomu. Umożliwiło to pozycyjne klonowanie genu. Gen został nazwany FMR-1 i zawiera silnie polimorficzne powtórzenia CGC, będące miejscem zwielokrotnienia trypletu (>200 powtórzeń u osoby chorej) powodujące łamliwość chromosomu. Uważa się, że ten gen właśnie jest odpowiedzialny za zespół łamliwego X, ale nie jest to całkiem pewne, ponieważ do tej pory nie można przewidzieć jego funkcji z sekwencji aminokwasów. Zidentyfikowanie zaangażowanych białek i ustalenie, jak zmiany ich funkcji wpływają na charakterystykę fenotypu, byłoby bardzo interesujące. Metylacja wyspy CpG blisko odcinka promotorowego (metylacja inaktywuje pewne geny) może pomóc w wyjaśnieniu, dlaczego u osób chorych obserwuje się niski poziom mRNA dla tego genu. Jak wspomniano wyżej, istnieją pewne dowody na to, że metylacja może zachodzić na matczynym chromosomie X, w obszarze łamliwym X, a to może wyjaśnić nienormalne dziedziczenie zespołu. Jeżeli tak jest w istocie, byłby to przypadek wdrukowania genomowego (genomic imprinting), zjawiska w którym wkład ojca i matki potomstwa jest zróżnicowany. Dwie inne choroby neurologiczne są powodowane przez mutacje powtórzenia trypletowego. Są to rdzeniowo-opuszkowa atrofia mięśniowa (spinał bulbar muscular atrophy, SBM A) i dystrofia miotoniczna (myotonic dystrophy, DM). SBMA jest to zależna od chromosomu X choroba recesywną, charakteryzująca się narastającą słabością mięśniową kończyn górnych i dolnych. Uszkodzonym genem jest gen receptora androgenowego (AR), a zwielokrotnianym trypletem jest CAG. Receptor androgenowy znajduje się w wysokich stężeniach w rdzeniowych i opuszkowych motoneuronach, które są obiektami zaatakowanymi w SBMA. Przypuszcza się, że defekt receptora androgenowego jest przyczyną słabości mięśniowej w tym schorzeniu. DM jest chorobą dziedziczoną przez autosomalny gen dominujący i charakteryzuje się miotonia (tzn. zmniejszonym rozkurczem mięśni po długotrwałym skurczu) i innymi cechami. Zaangażowany w DM gen został nazwany MT-PK (miotoninowa kinaza białek) i koduje kinazę białek najprawdopodobniej zaangażowaną w przekazywanie sygnałów. W komórkach pacjentów cierpiących na DM obserwowano nieprawidłową fosforylację białek. Zwielokrotnionym trypletem jest GCT. Niektóre cechy molekularne tych 3 schorzeń są pod-

PODŁOŻE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH /

Tabela 646. Choroba"

899

Niektóre cechy molekularne trzech chorób spowodowanych amplifikacją trypletową Lokalizacja na chromosomie

SMBA Xq 11-12 Zespół łamli - Xq27 19q13.2-13.3 wego X DM

Gen"

Zwielokrot niany tryplet

Liczba try płotów u osób normal nych

AR

CAG

11-31

FMR-1

CGG

5-54

MT-PK

GCT

30

Liczba trypietów związanych z chorobą 40-52

5-

>200 >100

"Według: Caskey i wsp.: Triplet repeat mutations in human diseases; Science 1992, 256, 784 "SBMA — rdzeniowo-opuszkowa atrolia mięśniowa; DM — dystrofia miotoniczna; AR — receptor androgenowy, MT-PK — miotoninowa kinaza białek

sumowane w tab. 64-6. Wszystkie powtórzenia trypletowe występujące w tych schorzeniach są bogate w CG i silnie polimorficzne u osobników normalnych. Fenotypowo osobnicy normalni będący heterozy go turni pod względem tych chorób wykazują allele premutacyjne, w których ilość powtórzeń jest znamiennie większa niż u osób zdrowych, ale mniejsza niż u chorych. Użycie odpowiednich technik biologii molekularnej (np. Southern blotting, łańcuchowa reakcja polimerazy [PCR], hybrydyzacja i sondy dla wykrycia zwielokrotnionych sekwencji) ułatwia diagnozowanie tych chorób i zastąpi techniki cytogenetyczne i inne stosowane dotycficzas. To poprawi diagnostykę prenatalną oraz identyfikację bezobjawowych nosicieli, któ-

rzy mogą przenosić choroby na swoje potomstwo. Mechanizmy zaangażowane w zwielokratnianie trypietów są obecnie intensywnie badane. Poszukiwania komputerowe wykazały, że powtarzania trypletów są całkiem częste w genomie ludzkim. Jest więc zupełnie możliwe, że ten nowy typ mutacji okaże się przyczyną jeszcze innych chorób.

OBJAWY CHOROBY PARKINSONA ODZWIERCIEDLAJĄ DEFICYT DOPAMINY W ISTOCIE CZARNEJ I CIELE PRĄŻKOWANYM Choroba Parkinsona charakteryzuje się drżeniami, bradykinezją (spowolnieniem i ubogością ruchów), sztywnością i niestabilnością postawy. Pojawia się rzadko przed 40 rż. Ocenia się, że cierpi na nią 1% osób powyżej 50 rż., a w Stanach Zjednoczonych jest nią dotkniętych ponad milion łudzi. Omówiony zespól objawów nazywamy parkinsonizmem. choroba Parkinso-

na jest tylko jedną z przyczyn parkinsonizmu (patrz niżej). Główną cechą patologiczną choroby Parkinsona jest degeneracja pigmentowanych komórek

w istocie czarnej. W warunkach fizjologicznych komórki te syntetyzują dopaminę i wykorzystują ją jako neurotransmiter, i stąd nazywane są komórkami dopaminergicznymi. Neurony dopaminergiczne znajdują się w różnych obszarach mózgu, w tym w strukturach nigrostriatalnych, mezolimbicznych, mezokortykalnych i guzowo-przysadkowych. Rycina 64-7 ilustruje całość procesu, w którym dopamina bierze udział jako neurotransmiter. Podobnie jak w przypadku acetylocholiny można go wygodnie podzielić na 6 etapów. Podobny proces jest włączony w działanie innych neurotransmiterów (np. noradrenaliny i adrenaliny), chociaż czasami niektóre etapy istotnie się różnią. L Synteza dopaminy, rozpoczynająca się od tyrozyny, obejmuje kilka reakcji enzymatycznych. Reakcją ograniczającą szybkość syntezy jest reakcja katalizowana przez hydroksylazę tyrozynową. 2. Magazynowanie dopaminy w pęcherzy kach synaptycznych jest następnym etapem. Wnikanie do nich dopaminy jest napędzane przez gradient pH powstały w wyniku obecno ści pewnego białka, występującego w błonie pęcherzyka i pompującego protony do jego wnętrza kosztem energii uzyskiwanej z ATP. Uwalnianie dopaminy jest związane z egzocytozą. Mechanizm jest podobny do mechaniz mu opisanego dla acetylocholiny. Wiązanie dopaminy do receptorów postsynaptycznych jest następnym etapem. Amina dochodzi do receptora dyfundując przez szczeli nę synaptyczną. Jak opiszemy później w tym rozdziale, istnieje co najmniej 5 klas receptorów

900 / ROZDZIAŁ 64

L-OOPA \/* aromatycznych X aminokwasów

Produkty utleniania dopaminy

Antagoniści receptora do parni nowego

Ryc. 64-7. Schematyczny diagram przedstawiający uwalnianie dopaminy z neuronu w istocie czarnej i pokazujący miejsca działania leków, które łagodzą lub wywołują parkinsonizm. Sześć etapów wymienionych w tekście jest umieszczonych na rycinie, ale nie numerowanych. Pokazano również miejsca działania leków używanych w leczeniu parkinsonizmu (L-dopa, deprenil, amantadyna i agoniści receptora dopaminowego, np. bromokryptyna). Ogólnie leki te zwiększają miejscowe stężenie dopaminy, przeciwdziałając skutkom jej małego stężenia w parkinsonizmie. Pokazane są również miejsca działania niektórych leków, które indukują parkinsonizm, zmniejszając stężenie dopaminy lub rywalizując z nią (rezerpina i antagoniści receptora dopaminergjcznego, tacy jak liczne neuroleptyki). (Według: Sweeney P.: New concepts in Parkinson's disease; Hosp, Pract. (April) 1991, 26, 84, za zezwoleniem).

dopaminowych. Powodują one swoje efekty działając pobudzająco lub hamująco na cyklazę adenyjanową lub, przynajmniej w jednym wypadku, działając na inny system wtórnych przekaźników (tj. na fbsfolipazę C i cykl polifosfoinozytydów). 5. Wychwyt zwrotny dopaminy (ryc. 64-7) zachodzi w wyniku działania transportera o wy-

sokiej aktywności, używającego ATP, obecnego w błonie pre synaptycznej. Odzyskana tak dopamina może być z powrotem inkorporowana do pęcherzyków synaptycznych i ponownie użyta jako neurotransmiter. 6. Rozkład dopaminy może zachodzić bądź w szczdinie synaptycznej, bądź, po wychwycie zwrotnym, wewnątrz zakończenia presynapty-

PODŁOŻE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 901

cznego. Monoaminooksydaza B (MAO-B) znajduje się *na zewnętrznej błonie mitochondriów w zakończeniu presynaptycznym, a także w szczelinie synaptycznej. MAO-B i MAO-A różnią się od siebie preferencją do różnych substratów oraz wrażliwością na różne inhibitory. Oba enzymy mogą działać na dopaminę tworząc 3,4-dihydroksyfenyIoacetaldehyd (DOPAC), ten zaś jest dalej konwertowany do kwasu homo w anilinowego (HVA) działaniem katecholo-O-metylotransferazy (COMT) (p. ryc. 50-3). Fakt ten ma istotne znaczenie dla badań nad schizofrenią, gdyż poziom kwasu homowanilinowego w ptynie mózgowo-rdzeniowym może być wykorzystany do śledzenia metabolizmu dopaminy w mózgu. Deprenil działa jako inhibitor MAO-B, podczas gdy klorgilina jest swoistym inhibitorem enzymu typu A. Rycina 64-7 ukazuje również miejsca działania wielu leków używanych w terapii parkinsonizmu i wielu (patrz niżej) powodujących parkinsonizm jako niepożądany efekt uboczny; każdy z 6 etapów omówionych powyżej może być punktem działania różnych leków. Proces degeneracyjny, o którym tu mowa, powoduje znaczny spadek syntezy dopaminy i wynikający stąd spadek jej poziomu w istocie czarnej i ciele prążkowanym (jądro ogoniaste i skorupa). Obniżenie poziomu dopaminy podnosi stosunek acetylocholina/dopamina w komórkach systemu nigrostriatalnego, ponieważ poziomy acetyl och oliny nie są tak silnie naruszone. Tak powstała nierównowaga wnosi istotny wkład w różne zaburzenia motoryczne obserwowane w chorobie Parkinsona, Nie jest jasne, dlaczego komórki dopaminergiczne w istocie czarnej ulegają zniszczeniu. Nie ma dowodu na istotny czynnik genetyczny w chorobie Parkinsona. Po części uszkodzenia komórek mogą odzwierciedlać proces starzenia, ponieważ istota czarna traci ok. 13% swoich komórek w ciągu każdego dziesięciolecia, począwszy od 25 rż. Ocenia się, że objawy choroby Parkinsona pojawiają się wówczas, kiedy poziom dopaminy w systemie nigrostriatalnym spadnie o 80%. Zakażenia wirusowe mogą powodować parkinsonizm, ale dzisiaj sądzi się, że jest to przyczyna stosunkowo mało ważna. Mn2+ powodował parkinsonizm u górników narażonych na wysokie poziomy tego metalu. Leki (np. rezerpina lub neuroleptyki-antypsychotyki) są ważnymi przyczynami parkinsonizmu, który może się cofnąć przy zaniechaniu

kuracji. Jak pokazano na ryc. 64-7, rezerpina obniża stężenie dopaminy przez hamowanie magazynowania dopaminy w zakończeniach presynaptycznych, a wiele neuroleptyków blokuje receptor dopaminowy. Niezwykła pochodna aminokwasowa, p-N-inetylaniino-1 .-alanina (BMAA), obecna w nasionach sagowców, może powodować parkinsonizm i może być odpowiedzialna za częste występowanie tej choroby na wyspie Guam, której wielu mieszkańców używa nasion sagowca jako codziennego pożywienia. BMAA jest więc neurotoksyną. W ostatnich latach szczególnie zainteresowano się 1metylo--4-fenylo-1,3,4,6-terrahydropirydyną (MPTP) jako przyczyną ostrego parkinsonizmu u narkomanów stosujących narkotyki dożylnie. Związek ten jest produktem ubocznym przy syntezie meperydyny („heroiny ulicznej") i skaża preparaty meperydyny syntetyzowane nielegalnie. MPTP jest zmieniana przez monoaminooksydazę typu B do jonu l-metylo-4-fenylo-pirydoni o nowego (MPP+), który jest właściwym czynnikiem neurotoksycznym. MPP+ jest pobierany przez system wychwytu zwrotnego dopaminy komórek dopaminergicznych istoty czarnej i powoduje ich uszkodzenia. Ze względu na swoją naturę wolnego rodnika MPP+ może powodować uszkodzenia oksydacyjne (p. rozdz. 63). Na dodatek sama dopamina może być też utleniana do potencjalnie szkodliwych rodników. Wiedza zdobyta w badaniach tych neurotoksyn skłania do pytania, jak wiele neurotoksyn może współuczestniczyć w wywoływaniu choroby Parkinsona. L-Dopa przechodzi przez barierę krewmózg i jest przekształcana w mózgu w dopaminę; to stanowi podstawę terapii substytucyjnej w chorobie Parkinsona Kiedy w latach 60 okazało się, że w parkinsonizmie poziomy dopaminy w systemie nigrostriatalnym są obniżone, rozpoczęła się nowa era leczenia choroby Parkinsona. Wyróżnia się 3 różne sposoby leczenia. Terapia antycholintrgjczna była głównym leczeniem zanim nie zdobyto wiedzy dotyczącej niskiego poziomu dopaminy, a do dziś dnia jest stosowana przy leczeniu pewnych pacjentów. Podawanie prekursorów dopaminy przy wraca poziom dopaminy do prawie normal nego. Sama dopamina nie przechodzi przez barie rę krew-mózg i wobec tego nie może być efek tywnie używana. Lekiem z wyboru jest L-dopa

902 / ROZDZIAŁ 64

(L- 3,4-di hydroksy fenyl o alanina), która przechodzi przez barierę krew-mózg i następnie jest przekształcana w dopamine przez enzym dopa-dekarboksyłazę (zwany także dekarboksylazą aromatycznych aminokwasów; ryc. 64-7). Większość podawanej L-dopa jest jednakże Hekarboksylowana w tkankach obwodowych i tylko ok. 1% podanej dawki dochodzi do mózgu. Nie można stosować wyższych dawek L-dopa, ponieważ powodują one ciężkie nudności i wymioty. Rozwiązaniem jest podawanie L-dopa wraz z karbidopą, związkiem hamującym aktywność obwodowej dopadekarboksylazy, ale nie przechodzącym przez barierę krew-mózg i wobec tego nie hamującym przekształcenia L-dopa w dopamine w mózgu. Dieta wysoko białkowa dostarcza aminokwasów, które współzawodniczą z L-dopa o wychwyt przez komórki błony śluzowej jelita; dieta niskobiałkowa osłabia ten efekt. L-dopa stalą się podstawą leczenia pacjentów z chorobą Parkinsona od czasu jej wprowadzenia w latach 60. Obecnie rozpoznanie choroby Parkinsona wymaga wykazania korzystnej odpowiedzi na L-dopa, podczas gdy wielu pacjentów z innymi rodzajami parkinsonizmu nie bardzo reaguje na ten lek. Jednakże po upływie ok. 5 lat efekty L-dopa słabną i konieczna jest terapia alternatywna. 3. Agoniści receptora dop amin owego po podaniu naśladują efekty dopaminy (ryc. 64-7). Korzystne efekty uzyskiwano po bromokryptynie. Inne leki mogą być użyteczne w leczeniu choroby Parkinsona, jeżeli wpływają na metabolizm dopaminy lub wywierają działanie ochronne na tkankę nerwową Nasza wiedza o obniżeniu poziomu dopaminy oraz o mechanizmie uszkadzania istoty czarnej przez neurotoksyny umożliwiła wprowadzenie dalszych leków do leczenia choroby Parkinsona. Lek przeciw wirusowy amantadyna powoduje uwalnianie dopaminy z presynaptycznych zakończeń neuronów dopaminergicznych, zwiększając w ten sposób stężenie neurotransmitera w szczelinie synaptycznej (ryc. 64-7). Mazindol hamuje wychwyt dopaminy, w ten sposób również zwiększając stężenie dopaminy przy błonie post synaptycznej. Dużym zainteresowaniem cieszy się obecnie deprenil (selegilina). Jego wcześniejsze podawanie zapobiega rozwijaniu się parkinsonizmu u zwierząt po podaniu MPTP, co sugeruje, że deprenil może

mieć działanie neuroprotekcyjne, zmniejszając

zniszczenia komórki spowodowane uszkodzeniem oksydacyjnym. Zgodnie z tym, próby kliniczne wykazały, że deprenil opóźnia występowanie inwalidztwa w przebiegu choroby Parkinsona. Deprenil hamuje MAO-B (ryc. 64-7) hamując w ten sposób degradację dopaminy i zwiększając jej stężenie. Obecnie prowadzi się próby kliniczne z zastosowaniem Ćleprenilu i witaminy E (a-tokoferolu), użytej jako przeciwutleniaeza.

Chirurgiczne sposoby leczenia choroby Parkinsona obejmują podawanie zmielonych autoprzeszczepów nadnerczowych do jądra ogonias-

tego lub skorupy; rdzeń nadnercza syntetyzuje różne katecholaminy, między nimi i dopaminę.

Bada się również implantacje tkanek płodowych,

zawierających embrionalne komórki nigralne. Skuteczność tych dwóch sposobów może być mniejsza niż na to wskazywały początkowe wyniki. Inną metodą jest wstrzykiwanie flbroblastów zmodyfikowanych genetycznie tak, że produkują duże ilości hydroksylazy tyrozyno wej, enzymu regulującego szybkość syjitezy na drodze metabolicznej prowadzącej do dopaminy. ODKŁADANIE SIĘ BIAŁKA AMYLOIDOWEGO fi JEST ZWIĄZANE Z WYSTĘPOWANIEM PEWNYCH PRZYPADKÓW CHOROBY ALZHEIMERA Choroba Alzheimera jest nieuleczalnym schorzeniem neuropsychiatrycznym, w którym następuje postępujące uszkodzenie funkcji po-

znawczych, czemu zwykle towarzyszą zaburzenia afektu i zachowania. Około 2 młn ludzi w USA cierpi na chorobę Alzheimera, a jej częstość występowania zapewne będzie się zwiększać, ponieważ coraz więcej ludzi żyje dłużej. Niektóre przypadki wydają się mieć przyczyny rodzinne (genetyczne), ale większość jest sporadyczna. Choroba Alzheimera jest najczęstszą przyczyną otępienia (demencji), które można zdefiniować jako postępujący spadek sprawności intelektualnej powstały z przyczyn organicznych, który w istotny sposób zaburza aktywność osobniczą. Choroba Alzaheimera kładzie się olbrzymim ciężarem na rodzinę chorego i na system opieki zdrowotnej ponieważ, wcześniej czy później, większość pacjentów nie potrafi zadbać o siebie. Koszty ekonomiczne choroby

PODŁOŻE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 903

Ałzheimera w USA ocenia się na ok. 40 mld dolarów rocznie. Zazwyczaj choroba pojawia się powyżej 65 rż., aie może też pojawić się nawet niedługo po czterdziestce. Czas przeżycia waha się od 2 do 20 lat. Pierwszym objawem jest często utrata pamięci. Choroba z reguły posuwa się nieubłaganie, w stanach końcowych pacjenci są całkowicie niedołężni. Zasadniczy obraz patologiczny wskazuje na proces degeneracyjńy charakteryzujący się utratą komórek w pewnych obszarach mózgu (np. w korze i hipokampie). Na poziomie mikroskopowym probierzem choroby Alzheimera są tarczki amytoidowe otoczone przez komórki nerwowe zawierające splątki neuroflbrylarne (podwójne helikalne filamenty utworzone z hiperufo sforylowanych form białek tau, związanych z mikrotubulami). Obecnie prowadzi się intensywne badania, aby ustalić przyczynę choroby Alzheimera. W ostatnich czasach, jak się wydaje, dokonano znacznego postępu. Zainteresowanie zogniskowało się zwłaszcza na białku amyloidowym P (ApP), głównym składniku tarczek obserwowanych w chorobie Alzheimera. Określenie amylnid odnosi się do różnorodnej grupy pozakomórkowych złogów białkowych, spotykanych w rozmaitych chorobach. Białka amyloidowe barwią się zazwyczaj jodem na niebiesko, jak skrobia, skąd pochodzi ich nazwa (amyloidowy = skrobiopodobny). Jedna z hipotez (hipoteza kaskady amyloidowej) zakłada, że odkładanie się ApP jest powodem zmian patologicznych obserwowanych w mózgach ofiar choroby Alzheimera i że inne zmiany, takie jak splątki neuroflbrylarne i zmiany naczyniowe, mają charakter wtórny. ApP pochodzi z większego białka prekursorowego, nazwanego prekursorowym białkiem amytoidowym (APP), którego gen jest zlokalizowany na chromosomie 21, niedaleko miejsca, które jest dotknięte przy zespole Downa (trisomia 21). Te osoby z zespołem Downa, które dożywają 50 lat, często cierpią na chorobę Alzheimera. APP jest białkiem przezbłonowym składającym się z ok. 770 aminokwasów, ApP jest peptydem złożonym z 39—42 aminokwasów, powstałym z hydrolitycznego rozcięcia przy końcu węglowym APP. Tworzy ono nierozpuszczalne złogi pozakomórkowe. Wydaje się, że APP może być rozcięte przez co najmniej 2 różne proteazy. Pierwsza, nazwana sekretazą, generuje rozpuszczalny fragment zawie-

693 APP

Ryc. 64-8. Diagram hipotezy kaskady amyloidowej. Prekursorowe białko amyloidu (APP) może być przekształcone dwoma różnymi sposobami. W pierwszym bierze udział sekretaza, która wytwarza peptydy nie zawierające całej cząsteczki ApP, rozpuszczalne i nie wytrącające się, a więc nie produkujące amyloidu. W drugiej drodze uczestniczy endosomalna-lizosomatna proteaza (proteazy?} i zostaje wytworzone białko amyloidowe fj {ApP) lub peptydy je zawierające. Wytrącają się one tworząc amyloid Przypuszcza się, że prowadzi to do tworzenia się splątków neurofibrylarnych i śmierci komórki. W modelu tym precypitacja amyloidu wyprzedza tworzenie się splątków i prowadzi do ich powstawania. (Według: Hardy J. A., Higgins G. A.,; Alzheimer's disease: The amyloid cascade hypothesis; Ścierce 1992, 256, 184. Copyright © American Association for the Advancement Science, 1992, za zezwoleniem).

rający tylko część ApP (ryc. 64-8). Druga, proteaza lizozomalna, tworzy fragment zawierający pełną sekwencję ApP. Przypuszcza się, że ten właśnie fragment strąca się poza komórką i prowadzi do powstania splątków neurofibrylarnych i innych histopatologicznych objawów choroby Alzheimera. Mutacje zakończenia węglowego APP wykryto u niektórych chorych na chorobę Alzheimera (np. w kodonie 693 u pacjentów z dziedziczną, wcześnie występującą formą choroby i w kodonie 717 u pacjentów z rodzinną chorobą Alzheimera). Sądzi się, że te mutacje powodują

904/ ROZDZIAŁ 64

tworzenie się fragmentów zawierających Obecnie bada się ich znaczenie; mogą one np. chronić fragmenty zawierające ApP przed niszczeniem proteolitycznym, w ten sposób zwiększając odkładanie APP. Druga cześć hipotezy kaskady amyloidowej dotyczącej przyczyn choroby Alzheimera zakłada, że ApP lub fragmenty zawierające APP są pośrednio lub bezpośrednio neurotoksyczne. Istnieją dowody, że wystawienie neuronów na działanie APP może podnieść ich wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2+. Niektóre kinazy białek, łącznie z tymi, które powodują fosforylację białek tau, są regulowane przez poziom Ca2 + . Stąd wzrost poziomu Ca2+ może prowadzić do hiperfosforylacji białek tau i tworzenia sparowanych helikalnych diamentów obecnych w splątkach neurofibrylarnych. Rycina 64-9 przedstawia przypuszczalny schemat możliwej sekwencji zdarzeń w pewnych przypadkach choroby Alzheimera. Wartością dobrej hipotezy często nie jest to, czy jest ona prawdziwa czy nie, ale czy pobudza do dalszych badań. Wydaje się pewne, że ze Mutacja (w pewnych przypadkach) genu kodującego APP, zło kalkowanego na chromosomie 21

Proteoiiza APP. prowadząca do powstania nieprawidłowych fraomentow zawierających A/(P

Odkładanie się AjSP lub fragmentów zawierających AfiP, prowadząca do zwiększenia zawartości wewnątrz -komórkowego Ca141 w neuronie

Zwiększone stężenie Ca!+ powoduje aktywacje klnaz białek fosforylujących białko tau związane z mikratubułami, co powoduje tworzenie sparowanych helikalnych włókien występujących w splątkach neufofibrylarnyoh

Ryc. 64-9. Przypuszczalny schemat możliwej sekwencji zdarzeń związanych z powstawaniem pewnych przypadków choroby Alzheimera. Mutacje w genie kodującym APP stwierdzono tylko w niewielkiej liczbie przypadków. Schemat jest zarysem jednego z obecnych kierunków badań i ulegnie zmianom w miarę napływania dalszych wyników. Również inne mechanizmy prawdopodobnie są odpowiedzialne za wiele przypadków. Jednakże wiarygodne teorie muszą wyjaśniać tworzenie tarczek i splątków neurofibrylarnych. APP — prekursorowe białko amyloidu, ApT — białko amyloidowe p. (Według: Hardy J. A., Higgjns G. A.: Alzheimer's diseaae: The amyloid cascade hypothesis; Science 1992, 256, 184, za zezwoleniem).

względu na rozpowszechnienie i katastrofalne konsekwencje choroby Alzheimera, hipoteza amyloidowa będzie poddana intensywnemu sprawdzaniu doświadczalnemu. Głównym punktem, który wciąż pozostaje do ustalenia, jest pytanie, czy odkładanie się ApP jest czynnikiem pierwotnym w chorobie Alzheimera, czy jest to zjawisko pochodne w stosunku do innych, na razie nie znanych procesów? Istnieją i inne hipotezy na temat przyczyn choroby Alzheimera. Proponowano na przykład, że jest ona powodowana przez zakażenie powolnie działającym wirusem, chociaż żadnego takiego wirusa nie wyizolowano w sposób powtarzalny. Inny kierunek badań wytyczyło odkrycie, że tarczki u pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera często wykazują zwiększone stężenie glinu. Proponowano wobec tego, że jedną z przyczyn choroby Alzheimera może być spożywanie zwiększonych ilości glinu w diecie. Tu znów pojawia się pytanie, czy zwiększony wychwyt glinu do tarczek jest zjawiskiem pierwotnym czy wtórnym, to znaczy czy podniesiony poziom glinu może wywoływać chorobę Alzheimera u pewnych osobników, czy też zwiększone ilości głinu w tarczkach odzwierciedlają jego zwiększone pobieranie przez komórki uszkodzone przez jakiś inny proces? Odpowiedź na to pytanie nie jest jasna. Mózgi pacjentów zmarłych na chorobę Alzheimera często wykazują obniżenie aktywności acetylotransferazy cholinowej i poziomu ace ty locho liny Poziomy innych neurotransmiterów są też często obniżone. Zmiany te wydają się być wtórne, powodowane uszkodzeniami komórek, a nie pierwotnymi zdarzeniami inicjującymi rozwój choroby Alzheimera. Istnieją wielkie nadzieje, że badania nad mechanizmami zaangażowanymi w powstawanie choroby Alzheimera doprowadzą do opracowania lepszych testów diagnostycznych i skutecznej terapii. Na przykład związki, które mogą hamować tworzenie A0P lub utrzymywać je w formie rozpuszczalnej mogą mieć znaczenie terapeutyczne. Obecnie ostateczne, pewne rozpoznanie choroby Alzheimera jest możliwe często jedynie na sekcji, po znalezieniu charakterystycznych tarczek w preparatach z mózgu. Jeden z testów, obecnie w fazie opracowywania, opiera się na pomiarze ilości APP w płynie ntózgowo-rdzeniowym (CSF) przy użyciu swoistych przeciwciał monoklonalnych. Donoszono bowiem, że poziomy APP są znacznie niższe (około trzykrotnie) w CSF pacjentów z chorobą

PODŁOŻE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 9OB

Alzheimera niż u osób zdrowych. Obecnie nie istnieje żadna swoista terapia choroby Alzheimera, chociaż w końcu możliwa może się okazać farmakologiczna modyfikacja odkładania App w tkankach. Wykazano, że w niektórych obszarach mózgu pacjentów z chorobą Alzheimera występuje niedobór mózgowego czynnika wzrostu nerwów. Obecnie bada się, czy nie wywiera on korzystnego wpływu u zwierząt z degeneracjami peuronalnymi wywołanymi chirurgicznie. Obecnie opieka nad chorymi na chorobę Alzheimera koncentruje się nad leczeniem możliwych komplikacji zdrowotnych i prawidłowym odżywianiu. Ważną rolę odgrywa poradnictwo rodzinne, ale pacjenci najczęściej znajdują najlepsze warunki w domach opieki.

PRZYCZYNY SCHIZOFRENII MOGĄ BYĆ ZWIĄZANE Z CZYNNIKAMI GENETYCZNYMI, ROZWOJOWYMI I DOPAMINERGICZNYMI Schorzenia schizofreniczne są zaburzeniami umysłowymi, zazwyczaj charakteryzującymi się objawami psychotycznymi, odzwierciedlającymi zaburzenia myślenia, uczuć i zachowania. Istotne jest (p. niżej) rozróżnienie miedzy „objawami pozytywnymi" (np. halucynacje, omamy, zachowania dziwaczne) a „negatywnymi" (izolacja społeczna, stępienie emocji ttp.). Istnieje wiele podtypów schizofrenii, np. zdezorganizowana (hebefreniczna), katatoniczna i paranoidalna. Dla prostoty będziemy używać terminu schizofrenia mówiąc o całej grupie schorzeń. Schizofrenia występuje na całym świecie i dotyka ok. 1% populacji północnoamerykańskiej. Rozpoczyna się zazwyczaj ok. 45 rż., ale często występuje u nastolatków i ma tendencję do przebiegu przewlekłego. Stanowi ona poważny problem medyczny, często z niszczącymi konsekwencjami dla ofiar i ich rodzin; nawet obecnie, kiedy istnieją względnie skuteczne metody terapii farmakologicznej, schizofrenicy zajmują ok. 20% wszystkich łóżek szpitalnych. Przyczyna lub przyczyny schizofrenii są nieznane. Postulowano różne czynniki psychologiczne, społeczne, rozwojowe, środowiskowe, anatomiczne, genetyczne, biochemiczne i inne. Rozważymy tutaj, dlaczego tak trudno jest określić podstawy genetyczne schizofrenii, wskażemy na strukturalne anomalie mózgu schizofreników, które trzeba brać pod uwagę, i przedyskutujemy teorię dopaminową schizofrenii.

Badania sprzężenia genetycznego w schizofrenii są trudne z powodu braku powtarzalności wyników Różnorodne podejścia (np, wywiady rodzinne, analiza pokrewieństwa, badania nad adoptowanymi oraz nad bliźniętami mono- i dizygotycznymt) wskazują na istotny czynnik genetyczny w schizofrenii. Na przykład u dzieci, których oboje rodzice byli schizofrenikami, istnieje 39% prawdopodobieństwa zapadnięcia na tę chorobę. Zgodność miedzy bliźniętami homozygotycznymi wynosi 47%. Jednakże badania te nie odpowiedziały na pytanie, czy schizofrenia jest chorobą monogeniczną, poligeniczną czy wieloczynnikową. Jeżeli prawdziwa jest jedna z dwóch ostatnich możliwości, szukanie genetycznych podstaw schizofrenii będzie oczywiście bardziej złożone. Wysiłki zmierzające do określenia sprzężenia genów prawdopodobnie zaangażowanych w schizofrenii z określonym chromosomem doprowadziły do sprzecznych wyników. Doniesienie o obecności „miejsca podatności" na schizofrenię nie zastało potwierdzone w innych badaniach. Sprzeczne wyniki przyniosły także badania sprzężeń genetycznych innych ważnych schorzeń psychicznych (np. choroba afektywna jedno- i dwubiegunowa). Niektóre możliwe wyjaśnienia tego stanu rzeczy podaje tab. 64-7. Tabela 64-7. Niektóre powody trudności w lokalizacji genów odpowiedzialnych za schizofrenię (większość' punktów odnosi się również do innych schorzeń psychiatrycznych, takich jak choroba afektywna jedno- i dwubiegunowa)* Schizofrenia może mieć kilka przyczyn genetycznych (heterogenność genetyczna) Dla zwiększenia efektywności analizy sprzężeń potrzebne są duże, wielopokoleniowe rodziny Rozmycie kryteriów diagnostycznych w różnych krajach powoduje, m.in., fałszywe diagnozowanie krewnych Stosowanie nieodpowiedniej metodyki statystycznej (np. niewłaściwe stosowanie punktów Lod) Używanie do analizy biochemicznej {np, na dopaminę) próbek pobieranych pośmiertnie, zachowanych w różnym stopniu Wcześniejsze leczenia (np. neuroleptykami) może zmienić profil biochemiczny analizowanych próbek mózgu * Według: Barnes D.M.: Troubles encountered in gene linkage land; Science 1989, 243, 313

906 / ROZDZIAŁ 64

Fakt, że choroba pojawia się w rodzinie, nie musi koniecznie oznaczać, że ma ona podłoże genetyczne. Na przykład zła interakcja psychologiczna między członkami rodziny może doprowadzić do wytworzenia anormalnych wzorców zachowania. Najlepszym rozwiązaniem tych problemów przez analizę sprzężeniową jest znalezienie i dogłębne przeanalizowanie dużych rodzin wielopokoleniowych, u których występuje wspólny defekt genetyczny i podobne objawy. W przypadku schizofrenii, dopóki nie ustali się jasnych sprzężeń, prawdopodobnie wybierze się do badań i przeanalizuje wiele genów-kandydatów (np. kodujących receptory dopaminowe i enzymy uczestniczące w metabolizmie katecholamin), w poszukiwaniu mutacji mogących odgrywać rolę w tej chorobie. W mózgu schizofreników można wykazać anomalie strukturalne prawdopodobnie o naturze rozwojowej Anomalie strukturalne w środkowym płacie czołowym (zawój przyhipokampalny, hipokamp i ciało migdałowate) zaobserwowano w mózgach wielu schizofreników. Obszary te są zaangażowane w scalanie i obróbkę informacji płynących z kory asocjacyjnej. Tak na przykład występowanie zmienionej orientacji komórek piramidalnych hipokampa może odzwierciedlać wadliwy wzorzec migracji neuronów. Prawdopodobnie obserwowane zjawisko jest wynikiem anomalii genetycznej, która dotyczy cząsteczek biorących udział w migracji lub adhezji komórek. Z kolei zmieniona orientacja komórek może, jako efekt wtórny, zaburzać różne parametry neurochemięgne. Przypuszczenie, że mózgi wielu schizofreników wykazują anomalie strukturalne podkreśla fakt częstego występowania powiększenia komór, chociaż stopień tego powiększenia często nie jest na tyle znaczny, aby stanowił cechę diagnostyczną. Hipoteza dopaminowa schizofrenii została zmodyfikowana na podstawie nowych obserwacji Na brak biochemicznych teorii schizofrenii nie można się uskarżać. W różnych okresach za związki zaangażowane w etiologii schizofrenii uważano acetylocholinę, kwas y-aminomasłowy (GABA), noradrenalinę, opioidy, peptydy i inne molekuły. Jednakże w ciągu ostatnich 30 lat najwięcej uwagi poświęcono dopaminie. Było to uwarunkowane sukcesem wprowadzenia leków neuroleptycznych (antypsychotyków) we

wczesnych latach 50. do leczenia różnych psychoz, w tym schizofrenii. Zaobserwowano wówczas, że wielu schizofreników leczonych neuroleptykami zapada na parkinsonizm. To sugerowało, że neuroleptyki działają obniżając poziom dopaminy (p. omówienie choroby Parkinsona). Obserwację tę i inne odkrycia potwierdzające udział dopaminy w schizofrenii podsumowuje tab. 64-8. Oryginalna hipoteza doTabela 64-8. Obserwacje popierające dopaminową hipotezę schizofrenii* Leki neuroieptyczne (antypsychotyki) często wywołują parkinsonizm, co sugeruje, że obniżają poziom dopaminy Pierwotnym działaniem neuroleptyków zdaje się być obniżenie aktywności dopaminowej w mezolimbicznych neuronach dopaminowych Liczne inne leki {np. L-dopa, amfetamina) wpływające na metaboli2im dopaminy (dopaminomimetyki) wywołują oznaki i objawy schizofrenii Przewlekłe podawanie neuroleptyków prowadzi do spadku poziomu kwasu homowanilinowegow płynie mózgowo-rdzeniowym, co ogólnie jest skorelowane z pozytywną odpowiedzią na leczenie Siła działania antypsychotycznego większości neuroleptyków jest skorelowana z siłą ich wiązania do receptorów D2 Analiza próbek pobranych pośmiertnie i użycie przyżyciowe tomografii komputerowej wskazuje, że gęstość receptorów D2 w mózgu schizofreników jest podniesiona Objawy negatywne schizofrenii mogą być żwiązane z niską aktywnością dopaminowa w korze przedczotowej * Według: Seeman P.; Dopamine receptors and the dopamine hypothests of schizophrenia; Synapsę 19877, 1:133 i Davis K.L i wsp.: Dopamine in schizophrenia: A review and reconceptualization; Am. J. Psychiatr. 1991, 148:144

paminowa schizofrenii postulowała, że schizofrenia jest objawem hiperdopamtnergii, gdy, przez porównanie, choroba Parkinsona jest objawem hipodopaminergii. Obserwacje biochemiczne dotyczące roli dopaminy w schizofrenii można ogólnie podzielić na trzy kategorie. Pomiary ilości dopaminy w próbkach móz gu. Wielu badaczy doniosło o wzrostach, ale obserwowano znaczny rozrzut wyników. Pomiary metabolitów dopaminy w mózgu i płynach ustrojowych. Szczególną uwagę zwra-

PODŁOŻE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 907

cano na kwas homowanilinowy, główny metabolit dopaminy u człowieka. Zwiększenie stężenia tego metabolitu obserwowano w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów cierpiących na schizofrenię, a jego ilość zmniejszała się gdy pacjent reagował na terapię lekami. Tu jednak również obserwowano znaczny rozrzut wyników. 3. Pomiary receptorów dopaminowych (D).

Najbardziej stałym wynikiem była obserwacja, że ilość receptorów D2 (p. niżej) wydaje się być zwiększona w mózgu schizofreników, zwłaszcza u tych, którzy jeszcze nie byli traktowani lekami. Co więcej, badania wykazały, że siła działania antjpsychotycznego większości głównych neuroleptyków jest skorelowana z ich zdolnością do rywalizacji z dopaminą in vitro o receptory

D2. Powodami rozrzutów omówionych wyżej wyników może po części być używanie tkanek pobranych pośmiertnie oraz fakt, że większość schizofreników jest leczonych neuroleptykami, które same przez się (tzn. niezależnie od schizofrenii) mogą zmieniać poziom różnych receptorów j enzymów w mózgu. Wyniki uzyskane z receptorami D2 zogniskowały zainteresowanie na receptorach dopaminowych. Głównie dzięki klonowaniu genów wyróżniono do dziś 5 klas tych receptorów {tab. 64-9). Wszystkie one są białkami przezbłonowymi, co najmniej niektóre są glikoproteinami i większość z nich jest związana z białkami G. Receptory D2, D3 i D4 wydają się być wzajemnie podobne. Poza znaczeniem receptora D2 omówionym powyżej, najciekawszym odkryciem było, że receptor D4 wykazuje 5 polimorficznych wariantów. Jest to pierwszy z rodziny receptorów katecholaminowych, który wykazał zmienność polimorficzną w populacji ludzkiej. Głównym pytaniem jest, czy może istnieć korelacja między jednym z tych wariantów a podatnością na schizofrenię lub na działanie leków? Już obecnie wiadomo, że nietypowy neuroleptyk klozapina (która nie powoduje parkinsonizmu ani późnych dyskinez, poważnych niepożądanych elektów ubocznych większości neuroleptyków) wykazuje dziesięciokrotnie większe powinowactwo do receptora D4 niż do D2. Ze względu na pewne niespójności wyników omówionych powyżej, oryginalna hipoteza dopaminowa została przeformułowana tak, że postuluje ona nieprawidłową, choć niekoniecznie nadmierną aktywność dopaminergiczną w schizofrenii. W niektórych obszarach mózgu aktywność dopaminergiczna może być wysoka,

Tabela 64-9. Niektóre właściwości receptorów dopaminowych. Często donosi się o nowych receptorach, izolowanych z użyciem odpowiednich sond i bibliotek genomowych lub cDNA* Istnieje co najmniej 5 różnych większych klas (D1D5),z pod typami tworzonymi przez alternatywne rozcięcia Są to białka błonowe; przynajmniej niektóre z nich są glikozyiowane Większość ma 7 domen przezbłonowych i pętle w cytoplazmie Większość jest sprzężonych z białkami G Niektóre są pozytywnie sprzężone z cyklaza. adenylanową (np. Dl), co najmniej jeden (D2) jest sprzężony negatywnie Co najmniej jeden podtyp. (wywodzący się z receptora Dl) jest sprzężony Fiosfolipazą C Przynajmniej niektóre podtypy są regulowane w drodze fosforylacji Dla wielu neuroleptyków siła ich powinowactwa do receptora D2 odpowiada ich sile w leczeniu schizofrenii Różne receptory wykazują odmienne rozmieszczenie anatomiczne Receptor D4 wiąże nietypowy neuroleptyk kiozapinę z powinowactwem 10 razy większym niz receptor D2 Odkryto 5 różnych podtypów receptora D4. Jest to pierwszy przedstawiciel rodziny receptorów katecholaminowych wykazujący zmienność polimorficzną w populacji ludzkiej * Według: Strange P.G.: Interesting times for dopaminereceptors; TrendsNeurosci. 1991,14: 43 i iversen L: Which D4 do you have? Naturę 1992, 358, 109

a w innych niska. Pogląd ten podtrzymują obserwacje, że w korze przedczołowej schizofreników można obserwować obniżoną aktywność dopaminergiczną, prawdopodobnie skorelowaną z negatywnymi objawami tego schorzenia. Inne badania wykazują, że jeśli neurony dopaminowe kory przedczołowej w warunkach fizjologicznych normalnie hamują aktywność podkorowych neuronów dopaminowych, obniżenie poziomu dopaminy w korze przedczołowej może doprowadzić do zwiększenia aktywności podkorowych neuronów dopaminowych. Należy również pamiętać, że inne neurotransmitery mogą także odgrywać rolę w schizofrenii, albo same przez się, albo przez interakcję z systemem dopaminergicznym.

908 / ROZDZIAŁ 64

Powyższa dyskusja ilustruje fakt, że biochemia schizofrenii jest złożona. Wykazanie ewidentnych mutacji grających rolę przyczynową w schizofrenii — jeżeli takie istnieją — pomogłoby wyjaśnić role swoistych białek (np, receptorów, enzymów) w powstaniu i przebiegu tej choroby.

ZNANE SĄ JUŻ TECHNIKI, ZA POMOCĄ KTÓRYCH MOŻNA WYJAŚNIĆ PODSTAWY MOLEKULARNE WIELU SCHORZEŃ NEUROPSYCHIATRYCZNYCH Zastosowanie technologii rekombinowanego DNA umożliwiło ustalenie podłoża molekularnego każdej choroby o podłożu genetycznym. Badania nad mukowiscydozą wykazały, że można z powodzeniem przeszukiwać stosunkowo wielkie obszary DNA, by znaleźć nieprawidłowe geny. Prawdopodobnie w tym dziesięcioleciu uda sie określić podstawę molekularną większości schorzeń neuropsychiatrycznych pochodzenia genetycznego. Już obecnie poczyniono znaczne postępy co do chorób nie dyskutowanych w tym rozdziale. Wykazano na przykład, że mutacje genu kodującego rodopsynę są przyczyną barwnikowego zapalenia siatkówki (retinitis pigmemosa), stosunkowo częstej choroby powodującej ślepotę, a bada się obecnie wiele innych genów podejrzewanych o wywoływanie chorób okulistycznych (np. gen kodujący białko wiążące GTP, transducynę, gen kodujący fosfodiesterazę cGMP oraz peryferynę — białko uważane za konieczne^dja zachowania kształtu zewnętrznego segmentu błon tarczowych pręcików i czopków). Rozpoczyna się terapia genetyczna chorób neurologicznych. W przypadku guzów mózgu proponuje się wstrzykiwanie do nieoperowalnych guzów, przy użyciu aparatów stereotaktycznych pod kontrolą MRI (obrazowania przy użyciu rezonansu magnetycznego), fibroblastów mysich zawierających wektor retrowirusa zawierający gen kodujący kinazę tytnidynową z wirusa opryszczki. Ten retrowirus miałby zaatakować komórki sąsiadujące z guzem, wprowadzić do nich gen kinazy tymidynowej i w ten sposób uczynić te komórki guzowe wrażliwymi na lek przeciwwirusowy, gancyklowir, który nie wpływa na komórki zdrowe. Tego rodzaju podejście zostało nazwane „chirurgią molekularną".

PODSUMOWANIE Receptory acetylocholinowe w złączu mięśniowo-nerwowym są kanałami jonowymi regulowanymi (bramkowanymi) przez neurotransmiter. W miastenii tworzą się autoprzeciwciała przeciw tym receptorom i niszczą wieie z nich. Objawia się to epizodycznymi napadami słabości mięśniowej. Leki hamujące esterazę cholinową są skuteczne, ale często trzeba zahamować nieprawidłową aktywność immunologiczną stosując odpowiednie środki. Gen choroby Huntingtona jest umieszczony na krótkim ramieniu chromosomu 4, ale natura kodowanego przezeń produktu nie została jeszcze wyjaśniona. Jednakże, używając odpowiednich sond, można przewidzieć, u których członków rodzin, w których występuje ta przypadłość, rozwinie się pląsawica. Badania mechanizmu uszkodzeń i śmierci komórkowej w chorobie Huntingtona i udarze mózgu wykazały, że jednym z głównych czynników jest pobudzenie receptorów glutaminianowych typu NMDA. Wyjaśnienie tego i innych mechanizmów uszkodzenia komórek mózgowych powinno doprowadzić do postępu w leczeniu tych schorzeń neuropsychiatrycznych, których cechą są uszkodzenia komórkowe. Poznano już sekwencję ludzkiego mtDNA i wiadomo, że jest on odpowiedzialny za kodowanie mitochondrialnych rybosomalnych RNA, mitochondrialnych transferowych RNA i za kodowanie 13 peptydów łańcucha oddechowego. Opisano różne delecje, multiplikacje i mutacje punktowe mtDNA i wykazano, że powodują one różne mi opatie i choroby neurologiczne. Choroby mitochondrialne są dziedziczone po matce. Nowe mutacje, polegające na powtórzeniach obejmujących trypiety bogate w CG, są przyczyną zespołu łamliwego chromosomu X, atrofii rdzeniowo -opuszkowej i dystrofii miotonicznej. Użycie technik wykrywających takie mutacje ułatwi rozpoznawanie tych i pokrewnych schorzeń. Choroba Parkinsona jest powodowana przez degenerację komórek istoty czarnej, co powoduje niedobór dopaminy w układzie nigrostriatalnym. Skutecznym lekiem jest L-dopa. Korzystnymi wydają się również leki takie, jak deprenil, które mają działanie neuroprotekeyjne. Tarczki amyloidowe i splątki neuro fibry larne

PODŁOŻE BIOCHEMICZNE CHORÓB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 909

są zasadniczymi cechami choroby Alzheimera. Hipoteza kaskady amyloidowej zakłada, źe odkładanie białka amyloidowego % pochodzącego z białka prekursorowego amyloidu, jest procesem zapoczątkowującym chorobę, i że białko amyloidowe |ł lub jego fragmenty mają właściwości neurotoksyczne, prowadzące do powstawania splątków neurofilamentów i innych objawów. U niektórych pacjentów z chorobą Alzheimera wykryto mutacje genów kodujących białko prekursorowe amyloidu. Potrzebne są jednak dalsze dowody, aby ocenić poprawność tej hipotezy. Wprowadzenie leków neuroleptycznych do Jęczenia psychoz doprowadziło do zdobycia dowodów wskazujących na rolę dopaminy w powodowaniu schizofrenii. Liczne informacje popierają ten pogląd, ale dopaminowa hipoteza schizofrenii pozostaje na razie nie dowiedziona. Klonowanie receptorów dopaminowych doprowadziło do wykrycia 5 klas receptorów, wśród których podtyp EW ma wiele odmian polimorficznych.

PIŚMIENNICTWO Barnes DM: Troubles encountered in gene linkage land. Science 1989;243:313. [Dyskusja problemu trudności powtórzenia danych uzyskanych w pracach na temat sprzężenia genetycznego 4 różnych chorób psychicznych.] Cooper JR, Bioom FE, Roth RH. The Biochemkal Basis of Neuropharrwcołogy, 6th ed. Oxford Univ Press, 1991. Culver KW et ai: In vivo gene transfer wiih retroviral-producer oells for treatment of experimental brain tumors. Science 1992; 256:1550. Davis KL et al: Dopamine in schizophrenia: A review and reconceptualizauon. Am J Psychiatr 1991;]4ffcl474, Ganong WF: Review of Medkai Physiology, 15th ed. Apleton & Lange, 199J. Goldman HH (editor): Reviev of Generał Psychiatry, 3rd ed. Appleton & Lange, 1992. Goldstein M, Deutch AY: Dopaminergjc mechanisms in

the pathogenesis of schizophrenia. Fed Am Soc Exp BiolJ 1992;6:24f3. Gusella JF: Huntington's disease. Chapter 3 in: Advances in Human Genetks, Vol 20. Harris H, Hirschhorn K (edttors). Plenum Press, 1991. Hardy JA, Higgjns GA: Alzheimer's disease: The amyloid cascade hypotheśs. Science 1992; 25&184. Hoffinan M: Unraveliing the genetics of fragHe X syndrome. Science J991;252:100. Horn JP: The heroic age of neurophysiology. Hosp Pract (My) 1992;27:65. [Pierwszy z serii 6 artykułów na temat podstaw fizjologicznych zaburzeń przekaznictwa nerwowo-mięśniowego.] Humphries P, Kenna P, Farear GJ: On the molecular genetics of retinitis pigmeniosa. Science 1992:256:804, Iversen L; Which D4 do you have? Naturę 1992;3Sa-!09. Kandel ER, Schwartz JH, Jessell TM: Prmcipłes ofNeural Science, 3rd ed. Elsevier, 1991. Kapłan HI, Sadock BJ ^editors): Comprehensive Textbook of Psychiatry. 5thM. Vol 1. Wiltiams & Wilkins, 1989. Levitan IB, Kaczmarek LK: The Neuron: Celt and Mokcular Biohgy. Oxford Univ Press, 1991. Marun JB: Molecular genetic studies in the neuropsychiatric disorders. Trends Neurosci 1989;1Ł13O. Marx J: Alzheimer's debatę boils over. Science 1992;257:1336. Peariman AL, Collins RC: Neurobiołogy of Disease. Oxford Univ Press, 1990. Roberts L: Huntington's gene: So near, yet so far. Science 1990;247:ó24. Seeman P: Dopamine receptors and the dopamine hypolhesis of schizophienia. Synapsę 1987;1:133. Stone R: Molecular „surgery" for brain tumors. Science 1992^56:1513. Strauge PG: Interesting times for dopamine receptors. Trends Neurosci 1991; 14:43. Sweeney PJ: New concepts in Parkinson's disease. Hosp Pract (Aprit) 1991:26:84. Van Tol HM et al: Multiple dopamine D4 receptor variants in the human population. Naturę 1992^58:149. Wallace DC: Mitochoudrial DNA mutations and neuiomuscular disease. Trends Genet 1989;5S. Wright AF: New insighfs into genetic cye disease. Trends Genet 1992;&85. Zivin JA, Choi DW: Stroke therapy. Sci Am (My) 1991:265:56.

Dodatek

1

SKŁADNIKI CHEMICZNE KRWI I PŁYNÓW USTROJOWYCH Znaczenie wartości liczbowych dla wyrażenia wyników badań laboratoryjnych Wynik wydany przez laboratorium kliniczne, po oznaczeniu stężenia lub ilości substancji w określonym materiale, jest wartością najlepszą, możliwą do uzyskania przy użyciu określonej metody oraz określonych odczynników i przyrządów, przez personel techniczny obeznany z obróbką materiahi biologicznego. Dokładność określa stopień zgodności wyni ku otrzymanego z wartością prawdziwą (z wia domym stężeniem w próbce kontrolnej). Precy zja określa powtarzalność wyniku analitycz nego i wyraża się rozrzutem wielu wyników pomiarów otrzymanych w tej samej próbce (w tym samym materiale i tą samą metodą). Wiary godność jest miarą zgodności dokładności i pre cyzji. ^ Precyzja nie ma charakteru absolutnego, lecz podlega wahaniom, uwarunkowanym złożonością użytej metody analitycznej, stabilnością odczynników, dokładnością sporządzania pierwotnego wzorca, złożonością aparatury oraz wprawą personelu technicznego. Każde laboratorium powinno zbierać dane dotyczące precyzji (powtarzalności), nadające się do opracowania statystycznego, tj, do obliczania odchylenia standardowego (SD) od średniej, uzyskanej przy powtarzanym oznaczaniu tego samego parametru w tej samej próbce materiału i tą samą metodą, np. precyzja oznaczania stężenia cholesterolu w dobrym laboratorium powinna * Reprodukcja z: Krupp M.A., Schroeder S.A., Ticrney L.M. Jr: Current Medical Diagnosis and Treatment. Appieton and latige, 1987.

wynosić: wartość średnia ± 0,1293 mmol/l (± 5 mg/dl). 95% granice ufności wynoszą + 2 SD lub ± 0,2586 mmol/l (10 mg/dl). Tak więc każdą wartość należy uważać za „dokładną", jeśii wahanie nie przekracza 0,5172 mmol/l ( = 20 mg/dl). Jeżeli wynik oznaczenia stężenia cholesterolu brzmi 5,17 mmol/l ( = 200 mg/dl), to wartość prawdziwa leży między 4,91 mmol/l ( = 190 mg/dl) a 5,43 mmol/l (=210 mg/dl). Przy oznaczaniu stężenia potasu w surowicy z wariancją 1 SD wynoszącą 0,1 mmol/l, wyniki oznaczeń uzyskane dla tej samej próbki mogą się różnić o ± 0,2 mmol/l. Jeżeli średnie stężenie potasu w danej próbce wynosiło 5,5 mmol/l, wartości mogą się wahać od 5,3 mmoJ/1 do 5,7 mmol/l. Oznacza to, że jeśli wynik wynosi 5,3 mmol/l lub 5,7 mmol/l, to mieści się jeszcze w granicach precyzji metody. Laboratorium powinno dostarczyć lekarzowi wartości zmienności dla określonego oznaczenia. Pozwalają one określić, czy wynik podany różni się znamiennie od drugiego wyniku uzyskanego u tego samego chorego. Interpretacja testów laboratoryjnych Jako wartości prawidłowe określa się takie, które mieszczą się w granicach dwóch odchyleń standardowych od wartości średniej ustalonej dla „normalnej" populacji. Ten zakres normy obejmuje 95% populacji. Wartość „prawidłowa" zależy od wielu czynników. Oznacza to, że wiele czynników może być przyczyną różnych zakresów „normy". Ten fakt sprawia, że wartości mieszczące się w granicach normy w danych warunkach, mogą znajdować się poza granicami ufności 95%, określonymi w innych warunkach. Wśród tych czynników wymienić należy: wiek, rasę, środowisko zewnętrzne, pozycje ciała, rytmy dzienno-nocne lub inne zmiany cykliczne, czas jaki upłynął po ostatnim posiłku (stan na

DODATEK / 911

czczo lub po posiłku), rodzaj spożytych pokarmów, leki oraz nasilenie wykonanego wysiłku fizycznego.

Wartości „normalne" lub „referencyjne" zależne są od metody oznaczania danego parametru, pracowni. wykonującej badanie oraz od warunków pobierania i przechowywania materiahi biologicznego przeznaczonego do badań. Zakresy wartości prawidłowych powinny być jasno podane przez poszczególne laboratoria. Jest to niezbędne dfa prawidłowej interpretacji wyników badań laboratoryjnych. Interpretację wyniku należy zawsze przeprowadzić w kontekście ze stanem chorego, np. małe stężenie może być spowodowane niedoborem danej substancji, lub też jej rozcieńczeniem (np. małe stężenie sodu). Nieprawidłowe stężenie określonej substancji we krwi może być spowodowane chorobą lub podaniem leku. I tak np. podwyższone stężenie kwasu moczowego w surowicy może być spowodowane dną, lecz może być również wynikiem stosowania hydrochlorotiazydu, lub leków przeciwnowotworowych. Poleca się czytelnikowi zaznajomienie się z listą leków wpływających na wynik testów chemicznych. Na wynik testu chemicznego ma wpływ sposób pobierania materiału biologicznego. Wśród przyczyn błędnych wyników wymienić należy: niedokładne zbieranie dobowego moczu, zmiany stężenia określonej substancji w przypadkowo zebranych próbkach moczu, hemolizę krwi, dodanie do krwi niewłaściwego anty koagulantu lub użycie brudnego szkła lub zanieczyszczonej aparatury. Uwaga. W razie otrzymania nieprawidłowego wyniku, najpierw należy wykluczyć wszystkie możliwe źródła błędu mogące warunkować taki wynik, a dopiero potem przystąpić do leczenia opartego na prawidłowej interpretacji danej aberracji biochemicznej. Medycyna laboratoryjna jest oddzielną specjalnością. Należy zasięgnąć porady specjalistów tej dziedziny, jeśli wynik badania biochemicznego jest albo niezwykły albo wątpliwy. Wpływ posiłków i pozycji ciała na stężenia składników krwi. Posiłki. Większość wartości „normalnych" ustalono dla próbek pobranych na czczo, tj. 8—12 godzin po ostatnim posiłku. Zezwala się jednak na picie wody z kilkoma wyjątkami. Wyniki kilku testów chemicznych ulegają zmianie, jeśli krew pobrano 3—4 godziny po

śniadaniu (w porównaniu z wynikami uzyskanymi na czczo*). Jeżeli krew pobrano 3—-4 godziny po obiedzie, wzrasta prawdopodobieństwo uzyskania wyników odbiegających od tych, jakie otrzymano w próbkach pobranych na czczo, np. aktywność AspAT może być wyższa o 31%, zaś dehydrogenazy mkczanowej mniejsza o 5%; mniejsze odchylenia dotyczą innych składników krwi. Celem otrzymania wartościowych wyników oznaczenia triglicerydów w surowicy zachodzi konieczność wstrzymania się od pokarmów przez 10—14 godzin przed pobraniem krwi do badań. Pozycja ciała. U osoby przebywającej w pozycji leżącej przez kilka godzin objętość krążącego osocza jest o 12—15% wyższa niż u osoby chodzącej lub stojącej przez około godzinę. Z faktu tego^wynika, że wyniki oznaczeń biochemicznych wykonanych we krwi pobranej u osób leżących przez około godzinę są około 10% niższe niż u osób chodzących. Pośrednie wyniki uzyskuje się, jeśli krew pobrano od osób siedzących. Ważność testów laboratoryjnych* Wartość kliniczna testu biochemicznego zależy od jego swoistości i czułości oraz od częstości występowania choroby w populacji, w której jest ten test wykonywany. Czułość określa częstość występowania dodatnich wyników danego testu u wszystkich osób chorujących na tę samą chorobę. Test na fenyloketonurię jest wysoce czuły, ponieważ wypada on dodatnio u wszystkich chorych dotkniętych tym defektem (100% czułość). W odróżnieniu od testu na fenyloketonurię oznaczanie antygenu rakowo-płodowego (CEA) wykazuje małą czułość, wypada ono bowiem dodatnio tylko u 72% chorych z zaawansowanym rakiem jelita grubego, zaś zaledwie u 20% chorych z rakiem okrężnicy we wczesnym stadium. Czułość testów we wczesnych stadiach różnych chorób jest na ogół mniejsza niż w stadiach, kiedy choroba jest już w pełni rozwinięta. * Ten akapit jest skróconą wersją artykułu napisanego przez Krieg A.F., Gambino R., Galen R.S.: Why are dinical laboratory tests perfonned? When are they valid. JAMA 1975, 233, 76. Przedruk z Journal of the American Medical Association. Copyright 1975. American Medical Association. Patrz również: Galen R.S., Gambino S.R.: Beyond Normality: The Predictive Value and Efficiency of Medical Diagnosis, Wiley, 1975.

912 / DODATEK

Swoistość oznacza odsetek ujemnych wyników określonego testu wśród populacji nie cierpiącej na określoną chorobę. I tak np. test na fenyloketonurię jest wysoce swoisty, bowiem aż 99,9% zdrowych osób wykazuje wynik ujemny. W odróżnieniu od tego testu test na CEA (w celu wykrycia raka okrężnicy) wykazuje zmienną swoistość, mianowicie 3% osób niepalących wykazuje fałszywie dodatni wynik (swoistość testu wynosi 97%), podczas gdy aż u 20% palaczy stwierdza się fałszywie dodatni test (swoistość testu wynosi więc tylko 80%). Innym przykładem zmiany swoistości testu indukowanej lekami lub ciążą jest występowanie podwyższonego stężenia tyroksyny całkowitej w surowicy (podobnego do występującego w nadczynności tarczycy) u kobiet ciężarnych lub zażywających doustne leki antykoncepcyjne, pomimo obecności eutyreozy. U takich chorych swoistość tego testu jest bardzo niska, w porównaniu do swoistości tego samego testu dla populacji kobiet nieciężarnych lub nie zażywających doustnych leków antykoncepcyjnych. Wartość przepowiadająca dodatniego testu określa odsetek prawdziwie dodatnich wyników w stosunku do sumy prawdziwie dodatnich wyników i fałszywie dodatnich wyników (inaczej mówiąc wartość ta określa prawdopodobieństwo występowania choroby, jeśli test wypada dodatnio) — patrz niżej wzór. Wartość ta jest ściśle związana z częstością występowania choroby. W grupie chorych przebywających na oddziale urologicznym częstość występowania choroby nerek jest większa niż w ogólnej populacji, przez co stężenie kreatyniny w surowicy będzie miało większą wartość przepowiadającą dla wymienionej grupy chorych niż dla ogólnej populacji.

„informacja użyteczna" należy rozumieć, że wynik testu ma wpływ na rozpoznanie, rokowanie lub leczenie, przyczynia się do lepszego zrozumienia procesu chorobowego oraz chory odnosi inną korzyść z wykonania takiego testu. Jednostki Sl {układ międzynarodowych jednostek — Systeme International d'Unites) Międzynarodowa organizacja, określona ja* ko „Ogólna Konferencja Wag i Miar" (Generał Conference of Weights and Measures) opracowała swoisty system miar. Adaptację tego układu zaleciła, tytułem próby, „Komisja Ilości i Jednostek" (Commission on Quantities and Units), będąca Sekcją Chemii Klinicznej Międzynarodowej Unii Chemii Teoretycznej i Stosowanej (Section on Clinical Chemistry, International Union of Pure and Applied Chemistry). Jednostki SI używane są w kilku krajach Europy i należy się liczyć z całkowitym przechodzeniem na ten układ, jeśli okaże się, że jest użyteczny w rozumieniu mechanizmów fizjologicznych. Dla użytku klinicznego wybrano 8 mierealnych własności materii. Są nimi: długość — jednostką długości jest metr (m), masa — jednostką masy jest kilogram (kg), ilość substancji —jednostką ilości substancji jest mol (mol), czas — jednostką czasu jest sekunda (s), temperatura — jednostką temperatury jest Kelvin (K), natężenie prądu elektrycznego — jednostką jest amper (A), natężenie światła — jednostką światła jest kandela (cd), aktywność enzymatyczna —jednostką aktywności jest katal (kat) (w nawiasach podano autoryzowane skróty dla podanych jednostek).

Definicje wyrażono wzorami: W y n i k i p r a w d z iw i e d o d a t n i e 'W y n i k i f a ł s z y w i e u j e m n e

Pochodnymi wymieni o nych* własności są:

e + W y n ik i f a ł s z y w ie d o d a t n ie W a r to ś ć p r z e p o w ia d a ją c a W y n ik i p r a w d z iw ie d o d a t n ie W y n i k i p r a w d z iw i e d o d a t n ie ł W y n i k i f a ł s z y w i a

Przed zleceniem wykonania testu należy się zastanowić, czy jego czułość, swoistość oraz wartość przepowiadająca są wystarczające, by dostarczyć użytecznej informacji. Pod pojęciem

stężenie masy: kilogram/1 (kg/l), ułamek (frakcja) masy: kilogram/kilogram (kg/kg), d o dułamek a t n i e (frakcja) objętości: litr/litr (1/1), objętość: metr sześcienny (m3), dla potrzeb klinicznych jednostką objętości jest litr (1), stężenie substancji: mol/litr (mol/l), molalność: mol/kilogram (mol/kg), ułamek (frakcja) mola: mol/mol (mol/mol), ciśnienie: paskal (Pa) = niuton/m2

DODATEK / 913

Nazwy i symbole dla wielokrotności liczby 10: Nazwa Liczba tera 10" giga109 mega I O6 kilo IO3 hekto IO2 deka10' decyio-1 centy10" 2 mili10" 3 mikro io-6 nanoio-» piko femto atto10"

Symbol T G Vi

k h da d

c

m

u n P f

a

Określenie „na", na przykład „na sekundę", pisze się często używając ujemnego wykładnika. Tak wiec zamiast „na sekundę" pisze się ■ 8 1, zamiast „na metr kwadratowy" —■ • mr1, zamiast „na kilogram" — ■ kg"1. Przykład: cm/s = cm • s~1; g/m2 = g ■ m~2 itd. Przewidując, że układ SI zostanie zaakceptowany w USA w następnych kilku latach, w dalszej części niniejszego rozdziału wartości prawidłowe dla poszczególnych parametrów podSno zarówno w jednostkach układu SI, jak i tradycyjnych (w nawiasach). Wartości normalne dla rutynowo oznaczonych parametrów biochemicznych* Czytelnik powinien zasięgnąć konsultacji szpitalnego laboratorium biochemicznego, celem uzyskania informacji dotyczących zaleceń jakie należy realizować przy pobieraniu próbek krwi !ub zbieraniu moczu przeznaczonych do badań biochemicznych (należy dowiedzieć się, czy do badań potrzebna jest krew całkowita, osocze, surowica lub jakiego antykoagulantu należy używać itd.). Albuminy Patrz Białka

* Wartości podane w tym podrozdziale wzięto z wielu źródeł. Mogą one ulec zmianie w zależności od użytej metody analitycznej i pracowni wykonującej dane oznaczenie. Biochemia

Aminotransferazy (aktywnodć w surowicy) Normalna aktywność zależna jest od użytej metody i wynosi dla AspAT (AST, SGOT/6—25 IU/1 (przy oznaczeniu w temp. 30°C), 10—40 IU/1 (przy użyciu SMA i w temperaturze 37°C) oraz 0—41 IU/1 (przy użyciu SMAC i w temp. 37°C). Dla A1AT (ALT, SGPT) normalna aktywność wynosi 3—26 IU/1 (przy oznaczeniu w temp. 30°C) oraz od 0—45 IU/1 (przy użyciu SMAC i w temp. 37°C). A. Informacja patofizjologiczna. Aminotransferaza asparaginianowa (AspAT, AST, SGOT) i alaninowa (A1AT, ALT, SGPT) oraz i dehydrogenaza mleczanowa są enzymami śródkomórkowymi uczestniczącymi w przemianie aminokwasów i węglowodanów. Duże stężenia tych enzymów wystcpuj|"w mięśniach szkieleto wych, wątrobie i mózgu. Wzrost aktywności tych enzymów w surowicy krwi wskazuje na martwicę lub uszkodzenie wymienionych narzą dów. B. Interpretacja 1. Aktywność dużą stwierdza się w zawa le mięśnia sercowego (głównie Asp AT), ostrym zakaźnym (wirusowym) zapaleniu wątroby (głównie A1AT), w marskości wątroby (wzrost AspAT jest zwykle wyższy niż AJAT) oraz w pierwotnym lub przerzutowym nowotworze wątroby. Wysoką aktywność stwierdza się rów nież w wysiękach jam surowiczych o etiologii nowotworowej. Wzrost aktywności AspAT stwierdza się również w dystrofiach mięśni, w zapaleniu skóry i mięśni (dermatomyositis) oraz w mioglobimirii napadowej. 2. Małą aktywność aminotransferaz stwierdza się w niedoborze witaminy B6 (spowo dowanym powtarzanymi hemodializami), w niewydolności nerek i w ciąży. Amoniak (stężenie we krwi) Wartości prawidłowe (określone metodą Conwaya) dla krwi całkowitej: 5,9—65 umol/1 (10—UOug/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Amo niak obecny we krwi pochodzi z dwóch głównych źródeł: 1) w jelicie grubym w następstwie działania gnilnego bakterii na podłoża azotowe uwolnione zostają znaczne ilości amoniaku; 2) w procesie przemiany białkowej uwalnia się amoniak. Amoniak dostający się do krążenia wrotnego lub systemowego ulega szybkiej konwersji do mocznika w wątrobie. W niewydolno-

914 / DODATEK

ści wątroby stężenie amoniaku we krwi może być wysokie, szczególnie wtedy, kiedy spożycie białka jest wysokie lub doszło do krwawienia do światła przewodu pokarmowego. B. Interpretacja. Stężenie amoniaku we krwi jest wysokie u chorych z niewydolnością wątroby ktb z zespoleniem portokawalnym, szczególnie wtedy, kiedy spożycie białka jest wysokie lub doszło do krwawienia do światła przewodu pokarmowego. Amylaza (aktywność w surowicy)

Wartości prawidłowe mogą się wahać w zależności od metody oznaczania enzymu. Wahają się od 0,8 do 3,2 IU/1 (80—180 jednostek Somogyi/dl). Jedna jednostka Somogyi odpowiada ilości enzymu, pod wpływem której powstaje 1 mg cukru redukującego z rozpadu skrobi przy pH 7,2. A. Informacja patofizjologiczna. W wa runkach fizjologicznych w surowicy krwi obec ne są tylko niewielkie ilości amylazy ślinowej i trzustkowej o masie cząsteczkowej ok. 50000. W stanach zapalnych trzustki lub przy zamknię ciu światła dróg trzustkowych znaczne ilości enzymu dostają się do krwi, skąd wydalane są przez nerki, B. Interpretacja

Podwyższoną aktywność amylazy

stwierdza się w ostrym zapaleniu i w cystach rzekomych trzustki, przy zamknięciu przewo dów trzustkowych przez nowotwór, kamień, zwężenie lub skurcz zwieracza (wywołany poda niem morfiny) oraz w śwince. Sporadycznie aktywność amylazy może być podwyższona w niewydolności nert!łf? kwasicy cukrzycowej i w stanie zapalnym trzustki wywołanym drążą cym wrzodem trawiennym żołądka. Bardzo rzadko połączenie się amylazy z immunoglobuliną tworzy kompleks o masie cząsteczkowej przynajmniej 160 000 nie ulegający przesączeniu w kłębuszkach nerkowych. Jest on powodem wzrostu aktywności amylazy we krwi (makroamylazemia). Małą aktywność amylazy w surowicy stwierdza się w ostrym i przewlekłym zapaleniu wątroby w niewydolności trzustki i sporadycz nie w ciąży. Amylazę można również określić w moczu. Jej aktywność w moczu wzrasta w tych samych stanach chorobowych, w których stwierdza się wzrost aktywności tego enzymu w surowicy krwi.

Azot mocznikowy i mocznik, stężenie we krwi, osoczu lub surowicy

Wartości prawidłowe: azot mocznikowy we krwi 2,9—8,9 mmol/I (8—25 mg/dl), mocznik we krwi 3,5—9 mmoi/l (21 -53 mg/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Mo cznik, jako produkt końcowy przemiany biał kowej, jest wydalany przez nerki. Stężenie mo cznika w przesączu kłębuszkowym jest takie samo jak w osoczu krwi. Wchłanianie zwrotne mocznika w kanalikach nerkowych jest odwrot nie proporcjonalne do ilości wypływającego moczu. Ten fakt sprawia, że mocznik jest mniej użytecznym wskaźnikiem przesączania kłębuszkowego od kreatyniny, która nie ulega reabsorpcji w kanalikach nerkowych. Stężenie azotu mocznikowego we krwi jest proporcjonalne do ilości spożytego białka i odwrotnie proporcjo nalne do jego wydalania z moczem. B. Interpretacja

1. Wzrost stężenia azotu mocznikowego stwierdza się: a. w niewydolności nerek spowodowanej ostrym lub przewlekłym stanem zapalnym, ostrą niezapalną niewydolnością (martwica ka nalików nerkowych) lub obstrukcją dróg mo czowych. b. w stanach wzmożonej przemiany azoto wej, której towarzyszy spadek ukrwienia i nie wydolność wydalnicza nerek (stany odwodnie nia, krwawienia do światła przewodu pokar mowego — w tym ostatnim przypadku mamy do czynienia ze wzrostem wchłaniania amino kwasów pochodzących ze strawionych białek krwi oraz z hipoperfuzją nerek). c. w stanach chorobowych przebiegających ze spadkiem ukrwienia nerek (wstrząs, niewy dolność nadnerczy i czasami niewydolność zastoinowa serca). 2. Małe stężenia azotu mocznikowego stwierdza się w niewydolności wątroby, nerczycy niepowikłanej niewydolnością nerek oraz w wyniszczeniu (kacheksji). i

Białka (stężenie w surowicy lub osoczu) w tym również fibrynogen

Wartości prawidłowe: p. niżej — Interpretacja.

A. Informacja patofizjologiczna. Stęże-

nie białka determinuje ciśnienie koloidowo-osmotyczne (onkotyczne) osocza. Stężenie białka w osoczu zależne jest od stanu odżywiania, czynności wątroby i nerek, występowania chorób, takich jak szpiczak lub wady metaboliczne.

DODATEK / 915

Zmiany stężenia poszczególnych frakcji białkowych mogą być swoiste dla określonych chorób. B. Interpretacja

1. Całkowite stężenie białka w suro-

wicy. Wartości normalne 60—80 g/l (6—8 g/dl). Stężenie frakcji albumin i globulinowych - patrz niżej i tab. 1. Tabela 1. Frakcje elelftroloretyczne białek surowi cy krwi ■

ra °' a Albuminy a,-Globuliny ctj-Gtobuliny P-Globuliny y-Globuliny

Stężanie wyrażone w % całkowitego stężenia białka 52-68 2,4-4,4 6,1-10,1 8,5-14,5 10-21

2. Stężenie albumin w surowicy lub osoczu .Wartości prawidłowe: 33—55 g/l (3,3—5,5 g/dl). a. Wzrost stężenia albumin stwierdza się w stanach odwodnienia, we wstrząsie, w sta nach przebiegających z zagęszczeniem krwi oraz po dożylnym podaniu stężonych roztworów albumin. b. Obniżone stężenie albumin występuje w stanach wadliwego żywienia, w zespole wad liwego wchłaniania, w ostrym lub przewlekłym zapaleniu kłebuszków nerkowych, w zespole nerczycowym, w ostrej lub przewlekłej niewy dolności wątroby, w chorobach nowotworo wych i białaczkach. 3. Stężenie globulin w surowicy lub osoczu krwi. Wartości prawidłowe 20—36 g/l {2—3,6 g/dl) — p. tab. 2, 3.

a. Stężenia podwyższone stwierdza się

w chorobach wątroby (wirusowe zapalenie wątroby, marskość zanikowa lub żółciowa wątroby, hemochromatoza), toczniu trzewnym, szpiczaku, chorobach limfoproliferacyjnych, sarkoTabela 2. Stężenie immunoglobulin oznaczone metodą immunoelektroforezy IgA

0,9-4,5 g/l (90-450 mg/dl)

IgG

7,0-15 g/l (700-1500 mg/dl)

IgM

0,4-2,5 g/1 (40-250 mg/dl)

IgD

0,003-0,4 g/l (0,3-40 mg/dl)

IgE

0,00006-0,0016 g/l (0,006-0,16 mg/dl)

Tabela 3. Niektóre białka występujące w poszcze gólnych frakcjach elektroforeiycznych globulin Frakcja globulin

Białka zawarte w danej frakcji

«1

Globuliny wiążące tyroksyne, transkortyna, glikoproteina, lipoproteina, antytrypsyna Haptoglobina, glikoproteina, makroglobulina, ceruloplazmina Transferyna, lipoproteina, giikoproteina yG, yD, yM, yE, yA

a2 P '■!

idozie, w ostrych i przewlekłych chorobach zakaźnych, szczególnie w ziarnicy wenerycznej pachwin, tyfusie, leiszni^niozie, schistosomatozie i malarii.

b. Obniżone stężenie globulin stwierdza

się w stanach wadliwego odżywiania, w agammaglobulinemii wrodzonej, hipogammaglobulinemii nabytej i w białaczce limfatycznej.

4. Stężenie f ibrynogenu w osoczu. War-

tości normalne: 2—6 g/l (= 0,2—0,6 g/dl). a. Wzmożone stężenia fibrynogenu wy stępuj ą w zapaleniu kłebuszków nerek, nerczycy (czasami) oraz chorobach zakaźnych. b. Obniżone stężenia fibrynogenu stwier dza sie w rozlanym wykrzepianiu śródnaczyniowym—DIC (może wystąpić przy odklejeniu się łożyska, w zatorach spowodowanych płynem owodniowym, w przerzutach rakowych gruczo łu krokowego lub innych narządów, w białacz ce), w ostrej i przewlekłej niewydolności wątro by oraz we wrodzonej fibrynogenopenii.

Bilirubina (stężenie w surowicy) Wartości prawidłowe: bilirubina całkowita 3,5—20,4 umol/1 (0,2—1,2 mg/dl). Bilirubina sprzężona (glukuronidy bilirubiny) 1,7—6,8 umol/1 (0,1—-0,4 mg/dl), bilirubina wolna (nie sprzężona z kwasem glukuronowym 3,4—11,9 umol/1 (0,2—0,7 mg/dl).

A. Informacja patofizjologiczna. Bili-

rubina, powstająca z rozkładu hemoglobiny, ulega w wątrobie sprzężeniu z kwasem glukuronowym tworząc diglukuronid. Ten ostatni ulega wydalaniu z żółcią. Stężenie bilirubiny w surowicy wzrasta w niewydolności wątroby, przy obstrukcji dróg żółciowych oraz w razie wystąpienia znacznej hemolizy krwinek czerwonych. Tylko rzadko przyczyną hiperbilirubinemii są anomalie enzymów uczestniczących

916 / DODATEK

w przemianie bilirubiny (np. transferaza glukuronylowa). B. Interpretacja 1. Stężenie bilirubiny bezpośredniej (sprzężo nej) i pośredniej (wolnej, niesprzężonej) wzrasta w ostrym i przewlekłym zapaleniu wątroby, w razie zamknięcia światła dróg żółciowych (przewodzików żółciowych, przewodu wątro bowego lub żółciowego wspólnego), w następst wie reakcji toksycznych spowodowanych leka mi, chemikaliami lub toksynami oraz w ze społach Dubina-Johnsona i Rotora. 2. Stężenie bilirubiny pośredniej wzrasta w niedokrwistościacb bemolitycznych lub w na stępstwie reakcji hemol i tycznych, przy braku lub niedoborze transferazy glukuronylowej wy stępującej w chorobie Gilberta lub w zespole Criglera-Najjara. 3. Stężenie zarówno bilirubiny bezpośredniej, jak i całkowitej może znacznie wzrosnąć u osób zdrowych i chorych na żółtaczkę w następstwie głodzenia przez 24—48 godzin (czasami nawet tylko przez 12 godzin) lub długotrwałego gło dzenia kalorycznego. Ceruloplazmina i miedź (w surowicy krwi) Wartości prawidłowe: ceruloplazmina 1,7 —2,9 umol/1 f25—43 mg/dl); miedź 16—31 umol/1 (100—200 ng/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Oko ło 5% miedzi występującej w surowicy związane jest luźno z albuminami, zaś 95% z ceruloplazminą. Ta ostatnia jest oksydazą o zabarwieniu niebieskim, występującą w frakcji a2-globulin. W chorobie Wilsona stężenie miedzi i aktyw ność ceruloplazminy^w surowicy są małe, natomiast wydalanie miedzi z moczem wyso kie. B. Interpretacja 1. Wzrost aktywności ceruioplazminy i stężenia miedzi w surowicy krwi stwierdza się w ciąży, nadczynności tarczycy, infekcjach, niedokrwistości aplastycznej, ostrej białaczce, chorobie Hodgkina, marskości wątroby oraz u kobiet zażywających doustne leki antykoncepcyjne.

2- Obniżenie aktywności ceruloplazmi-

ny i stężenia miedzi w surowicy stwierdza się w chorobie Wilsona (towarzyszy jej wzmożone wydalanie miedzi z moczem), w zespole wadliwego wchłaniania i w nerczycy oraz w niedoborze miedzi, spowodowanyTm całkowitym odżywianiem pozajelitowym.

Chlorki (stężenie w surowicy lub osoczu) Wartości prawidłowe: 96—106 mmol/l. A. Informacja patofizjologiczna. Cl jest głównym nieorganicznym anionem płynu pozakomórkowego. Odgrywa ważną rolę w utrzymywaniu równowagi kwasowo-zasadowej, chociaż nie wykazuje własności buforujących. Przy utracie chlorków pod postacią HC1 lub NH4C1 rozwija się zasadowica, natomiast przy zatrzymywaniu Cl" w ustroju lub jego podaniu powstaje kwasica. Chlorki (wraz z sodem) odgrywają ważną roJę w regulacji osmolainości (molalności) płynów ustrojowych. B. Interpretacja Hiperchloremię stwierdza się w niewy dolności nerek (jeżeli spożywanie Cl przekracza jego wydalanie), w nerczycy (czasami), kwasicy kanalikowej, w nadczynności przytarczyc (cza sami), zespoleniu moczowodowo-esiczym (do chodzi do wchłaniania przez jelito chlorków zawartych w moczu), odwodnieniu (w niedobo rze wody) oraz nadmiernym podawaniu roz tworu soli Fizjologicznej, Hipochloremia występuje przy utracie soku żołądkowego i jelitowego (wymioty, bie gunki, odsysanie soku żołądkowego lub jelito wego), w niewydolności nerek (utrata Cl ~ przez nerki), przy nadmiernym stosowaniu diuretyków, w przewlekłej kwasicy oddechowej (spo wodowanej rozedmą płuc), kwasicy cukrzyco wej, przy nadmiernym poceniu się, w niewydol ności nadnerczy (dochodzi do utraty NaCl przez nerki), nadczynności kory nadnerczy (wy wołującej przewlekłą utratę K"*) oraz w zasadowicy metabolicznej (spowodowanej zażywa niem NaHCOj lub niedoborem K+). Cholesterol (stężenie w surowicy lub osoczu) Wartości prawidłowe: 3,9—7,2 mmol/l ( = 150—280 mg/dl), p. tab. 4. A. Informacja patofizjologiczna. Stę żenie cholesterolu w surowicy krwi zależy od wielu procesów metabolicznych, zależnych od czynników genetycznych, żywienia, czynności narządów wewnątrzwydzielniczych oraz integ ralności czynnościowej życiowo ważnych narzą dów takich jak wątroba i nerki. Przemiana cholesterolu jest ściśle związana z przemianą iipidów. B. Interpretacja 1. Wzrost stężania cholesterolu w surowicy krwi stwierdza się w hipercholesterolemii

DODATEK / 917 Tabela 4. Stężenie w surowicy krwi cholesterolu całkowitego (C), tri gliceryd ów (TG), cholesterolu frakcji LDL (lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL-C) i HDL (lipoproteiny o wysokiej gęstości) (HDL-C) w populacji USA* C mmol/l HDL-C Wiek TG LDL-C (mg/dl) mmol/l (mg/dl) mmol/l (mg/dl) g/i górna granica kobiety mężczyźni (mg/dl) wartości prawidłowych <29

30-39 40-49 >49

3,1,0-6,20 (120-240) 3,62-6,98 (140-270)

0,1-1,4 (10-140) 0,1-1,4 (10-150)

4,40 (170) 4.91 (190)

3,88-8,01 (150-310) 4,13-8,53 (160-330)

0,1-1,6 (10-160) 0,1-16 (10-190)

4,91 (190) 5,43 (210)

1,16+0,31 (45 + 12)

1,42+0,31 (55±12)

vi,

Według Krupp i wsp.: Physician's Handbook. Wyd. 21, Lange, 1985, za zezwoleniem

rodzinnej (xanthomatosis), niedoczynności tarczycy, słabo wyrównanej cukrzycy, zespole nerczycowym, przewlekłym zapaleniu wątroby, marskości żółciowej wątroby, żółtaczce zastoinowej, hipoproteinemii (samoistnej, lub spowodowanej zespołem nerczycowym względnie przewlekłym zapaleniem wątroby) i w biperlipidemii (samoistnej; rodzinnej). 2. Spadek stężenia cholesterolu w surowicy krwi stwierdza się w ostrym zapaleniu wątroby i w chorobie Gauchera, Może również występowaów nadczynności tarczycy, w ostrych infekcjach, niedokrwistości, wadliwym odżywianiu się oraz w niedoborze apolipoproteiny. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) w surowicy, w płynach surowiczych, płynie mózgowo-rdzeniowym lub moczu Wartości prawidłowe mogą być różne zależnie od metod oznaczania. Surowica; 55—140 IU/1 (aktywność oznaczona w temp. 3Q!1C), 100—225 IU/1 (aktywność oznaczona przy użyciu SMA w temp. 3TC) lub 60—200 IU/J (aktywność oznaczona przy użyciu SMAC w temp, 37°C). Płyn z jam surowiczych: aktywność jest mniejsza niż w surowicy. Płyn mózgowo-rdzeniowy; 15—73 jednostek (wg Wróblewskiego) lub 6,3—30 IU/1. Mocz: aktywność jest mniejsza niż 8300 jednostek/8 godzin (Wróblewski).

A. Informacja patofizjologiczna. LDH

katalizuje konwersję mleczanu do pirogronianu

(w obecności NAD+) i odwrotnie pirogronianu do mleczanu (w obecności NADH). Jest enzymem występującym we wszystkich komórkach i płynach ustrojowych. B. Interpretacja Aktywność LDH wzrasta we wszystkich stanach chorobowych przebiegających z martwicą tkanek, w tym szczególnie w ostrym uszkodzeniu mięśnia sercowego, krwinek czerwonych, nerek, mięśni szkieletowych, wątroby, płuc i skóry. Znaczne wzrosty aktywności LDH obserwuje się w niedokrwistościach hemolitycznych, w niedokrwistościach spowodowanych niedoborem witaminy B: 2 lub kwasu foliowego oraz w policytemii prawdziwej. Wzrost aktywności LDH w pierwszych 3—4 dniach z następczym spadkiem w kolejnych 5—7 dniach choroby może być dowodem potwierdzającym rozpoznanie zawaha serca po uprzednim wykluczeniu zawału płuc, choroby nowotworowej i niedokrwistości megalobiastycznej. Chociaż aktywność LDH jest podwyższona w ostrej fazie zakaźnego (wirusowego) zapalenia wątroby, w zapaleniu przewlekrym tego narządu jest tylko rzadko duża. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) — izoenzymy (aktywność w surowicy) Wartości prawidłowe: p. tab. 5 A. Informacja patofizjologiczna. LDH surowicy składa się z 5 izoenzymów będących tetramerami złożonymi z dwóch rodzajów podjednostek - H i M. Poszczególne izoenzymy

918 / DODATEK Tabela 5. Izoenzymydehydrogenazy mleczanowej (LDH). Rozdział elektroforetyczny Udział procentowy w Izoenzym

ogólnej aktywności

LDH surowicy (w nawiasach podano zakres wahań) Najszybcie j wędrujący

Najwolniej wędrujący

28 (15-30)

3(P)

36 (22-55) 23 (15-30)

4(Ti) 5(TI)

6 (0-15) 6 (0-15)

2(a2)

różnią się między sobą kinetyką enzymatyczną, ruchliwością elektroforetyczną, chromatograficznie i immunologicznie. Przy rozdziale elektroforetycznym ww. izoenzymy wykazują ruchliwość globulin a]S a2, |3, y1 i y2. Izoenzymy LDH oznacza się zwykle liczbami 1 fizoenzym 0 największej ruchliwości elektroforetycznej) 2, 3, 4 i 5 (izoenzym o najmniejszej ruchliwości elektroforę ty cznej). Izoenzym LDH-1 występu je w dużym stężeniu w mięśniu sercowym (jest to tetramer HHHH), w krwinkach czerwonych 1 korze nerek, zaś izoenzym LDH-5 w mięśniach szkieletowych (jest to tetramer MMMM) i wąt robie. B. Interpretacja. W zawale serca izoenzymy wędrujące z globulinami a są podwyższone, szczególnie izoenzym LDH-1, co sprawia, że iloraz LDH-l/LDH-2 jest wyższy od jedności. Podobny wzrost tego izoenzymu obserwuje się w zawale kory nerek oraz w niedokrwistościach hemolitycznych. Względny wzrost aktywności izoenzymów LDH-5 i LDH-4 stwierdza się w ostrym zapaleniu wątroby, w ostrym uszkodzeniu mięśni szkieletowych, w zapaleniu skóry i mięśni (dermatomyositis) oraz w dystrofiach mięśniowych. Fibrynogen Patrz Białka Fosfataza kwaśna (FK) Wartości prawidłowe mogą się różnić w zależności od metody oznaczania enzymu. Normalna aktywność wynosi 36—175 nmol/s/1 lub 0,1—0,63 jednostek Sigma.

A. Informacja patofizjólogiczna. Fos-

fatazy aktywne przy pH 4,9 występują w dużych

stężeniach w gruczole krokowym, krwinkach czerwonych, płytkach krwi, w komórkach siateczko wo-śród błonko wy ch, wątrobie, śledzionie i nerkach. Wiele izoenzymów FK stwierdzono w wymienionych narządach, komórkach i w surowicy, wykazujących różną, aktywność wobec różnych sub strato w. B. Interpretacja. U chorych z rakiem sterczą aktywność frakcji sterczowej fosfatazy kwaśnej w surowicy może być podwyższona, szczególnie wtedy, kiedy nowotwór sięga poza torebkę gruczołu lub występują przerzuty. Obmacywanie sterczą może być również przyczyną wzrostu (chociaż przejściowego) aktywności FK w surowicy. Wzrost całkowitej aktywności FK w surowicy stwierdza sie w chorobie Gauchera, w guzach złośliwych kości, w chorobach nerek, miąższu wątrobowego i dróg żółciowych, układu siateczkowo-śródbłonkowego oraz w chorobach zakrzepowo-zatorowych. Gorączka może być przyczyną rzekomego wzrostu FK. Fosfataza zasadowa (FZ) (aktywność w surowicy) Wartości prawidłowe zaieżne są od metody użytej do oznaczania tego enzymu. Przy użyciu metody Besseya-Lowryłego u dzieci wartości prawidłowe wynoszą 2,8—6,7 jednostek, natomiast u dorosłych 0,8—2,3 jednostek. Przy użyciu metody Kinga-Armstronga prawidłowa aktywność FZ oznaczona w temp. 30°C wynosi 24—71 IU/1 (5—13 jednostek tradycyjnych, przy użyciu SMA i przy temp. 37°C — 30-85 IU/1, zaś przy użyciu SMAC i przy temp. 37°C — 30—115 IU/1. A. Informacja patofizjólogiczna. FZ obecna jest w dużych stężeniach w kościach, żółci i łożysku. Występująca we krwi FZ jest mieszaniną izoenzymów, dotychczas bliżej nie poznanych. Można je rozdzielić elektroforetycznie. Izoenzym wątrobowy FZ wędruje szyb ciej niż izoenzym kostny i łożyskowy. Te dwa ostatnie wykazują taką samą ruchliwość elektroforetyczną. B. Interpretacja Podwyższoną aktywność FZ stwierdza się: a. U dzieci (w okresie wzrostu kości), b. W chorobach kości przebiegających ze wzmożoną aktywnością osteoblastów (nadczynność przytarczyc, krzywica u dzieci i osteomalacja u dorosłych, nowotworowe choroby kości, takie jak: pierwotny mięsak kości lub przerzuty nowotworowe do kości, choroba Pa-

DODATEK / 919

geta, sarkoidoza Boecka i zwapnienia pozakostne występujące np. w myositis ossificans). c. W obturacji dróg żółciowych spowodowa nej kamicą, zwężeniem lub nowotworem. d. W polekowym uszkodzeniu wątroby wy wołanym chloropromazyną Jub metylotestosteronem oraz e. W ciąży. 2. Obniżoną aktywność FZ w surowicy obserwuje się w niedpczynności tarczycy oraz u dzieci z opóźnionym wzrostem. Fosfokinaza krsatynowa (CPK, CK) (aktywność w surowicy) Wartości prawidłowe zależne są od metody oznaczania CPK i wahają się od 10 do 50 IU/1 (przy oznaczaniu enzymu w temp. 37°C). B. Informacja patofizjologiczna. CPK katalizuje rozpad fosfokreatyny w obecności ADP. Produktami tej reakcji są kreatyna i ATP. Mięśnie szkieletowe i mięsień sercowy oraz mózg są bogate w CPK. B. Interpretacja Wzmożoną aktywność enzymu stwier dza się w uszkodzeniach mięśni, np. w zawale serca, w urazach mięśni, w dystrofiach mięśni, w zapaleniu wielomięśniowym {połymyositiś) i po ciężkich ćwiczeniach fizycznych (jogging), w niedoczynności tarczycy i zawale mózgu. Po wystąpieniu zawału serca obserwuje się szybki wzrost aktywności CPK (3—5 godzin od po czątku zawału) utrzymujący się przez okres krótszy (2—3 dni) niż wzrost AspAT lub LDH. Niepodwyższoną aktywność CPK stwierdza się w zawale płuc i chorobach miąższu wątrobowego. Fosfokinaza kreatynowa — izoenzymy (aktywność w surowicy) Patrz tab. 6. A. Informacja patofizjologiczna. Obec na w surowicy krwi CPK składa się z trzech izoenzymów dających się rozdzielić elektroforetycznie. Mięśnie szkieletowe charakteryzują się izoenzymem MM, mięsień sercowy — izoenzymem MB, zaś mózg izoenzymem BB. B. Interpretacja. Wzrost aktywności izoenzymu CPK-MM stwierdza się w urazach mięśni szkieletowych przy uszkodzeniu mięśnia sercowego lub mózgu, w chorobach mięśni (dystrofia mięśni, niedoczynność tarczycy, za palenie skóry i mięśni, zapalenie wielomięśniowe) oraz w rabdomiolizie lub po ciężkich ćwiczeniach gimnastycznych. Wzrost aktywno-

Tabeta 6. Izoenzymy kinazy fosfokreatynowej (określone e lekt rof o rety cz n i e) Normalna aktywność Izoenzym wyrażona jako % aktywności ogólnej CPK (CK) w surowicy Frakcja najszybciej wędrująca Frakcja 1,BB Frakcja 2,MB Najwolniej wędrująca frakcja Frakcja 3,MM

0 0-3 97-100

ści izoenzymu CPK-MB obserwuje się w 2—4 godzin po wystąpieniu zawału mięśnia sercowego. Wzrost taki utrzymuje się do 72 godzin i może się wydłużyć w razie rozszerzenia się strefy martwiczej mięśnia sercowego. Wzrost aktywności tego izoenzymu stwierdza się też w rozległej rabdomiolizie lub po urazach mięśni szkieletowych, w ciężkich chorobach mięśni, w zespole Reye'a i gorączce gór skalistych. Aktywność izoenzymu CPK-BB jest czasami podwyższona we wstrząsie, w niektórych rodzajach raków (szczególnie w raku owsianokomórkowym, raku jajników, piersi i gruczołu krokowego) oraz w zarośnięciu dróg żółciowych. Fosfor nieorganiczny (stężenia w surowicy krwi) Wartości prawidłowe: u dzieci 1,3—2,3 mmol/1 (4,7 mg/dl), u dorosłych 1—1,5 mmol/1 (3—4,5 mg/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Na stężenie fosforu nieorganicznego w surowicy krwi wpływ mają: paraihormon, witamina D i jej aktywne metabolity, wchłanianie fosforanów w jelitach, czynność wydainicza nerek, przemiana kostna i żywienie. B. Interpretacja Wzrost stężenia fosforu nieorganicz nego stwierdza się w niewydolności nerek, nie doczynności przytarczyc i hiperwitaminozie D. Małe stężenie fosforanów nieorganicz nych w surowicy stwierdza się w nadczynności przytarczyc, hipowitaminózie D (krzywica, osteomalacja) i w zespole wadliwego wchłaniania (biegunki), przy zażywaniu związków wiążą cych fosforany w przewodzie pokarmowym (wodorotlenek glinu), przy głodzeniu, w krań cowym wyniszczeniu, w przewlekłym alkoholiz mie (szczególnie przebiegającym z uszkodzę-

920 / DODATEK

niem miąższu wątrobowego), w hiperalimentacji z użyciem płynów bez- lub ubogofosforanowych, przy dożylnym podawaniu dużych ilości węglowodanów, w tubulopatiach nerkowych, przy stosowaniu diuretyków tiazydowych, w zaburzeniach gospodarki kwasowo-zasadowej {w kwasicy cukrzycowej ketonowej szczególnie w okresie jej cofania się) oraz w hipofosfatemii genetycznie uwarunkowanej. Czasami hipofosfatemię stwierdza się w ciąży i w niedoczynności tarczycy. Globulina wiążąca tyroksynę (TBG) (stężenie w surowicy)

Wartości prawidłowe (określone metodą radio immunologiczną): 0,02—0,048 g/l (2—4.8 mg/di). A. Informacja patofizjologiczna.

TBG

jest głównym białkiem transportowym T4 i T3 w osoczu krwi. Zmianom stężenia TBG towarzyszą równolegle zmiany stężenia wolnej tyroksyny, tak że stężenia tej ostatniej są odpowiednie do stanu fizjologicznego ustroju, co zapewnia stan eutyreozy. Wrodzone anomalie w zakresie TBG dziedziczą się najpewniej genem na chromosomie X. B. Interpretacja

Duże stężenie TBG występuje w ciąży, w zakaźnym (wirusowym) zapaleniu wątroby i we wrodzonym wzroście stężenia tego białka. Obniżone stężenie TBG stwierdza się w stanach chorobowych przebiegających z nis kim stężeniem białek (globulin) w surowicy (zespół nerczycowy, marskość wątroby), w ak tywnej akromegalii, w niedoborze estrogenów oraz we wrodzonym<wjedoborze TBG. Glukoza (stężenie w surowicy lub osoczu krwi)

Wartości prawidłowe oznaczone na czczo: 3,6—6,1 mmol/1 (65—111 mg/dl). Wartości te dotyczą glukozy „prawdziwej1" oznaczonej swoistą metodą enzymatyczną. A. Informacja patof izjologiczna. W wa runkach prawidłowych stężenie glukozy w su rowicy jest dokładnie regulowane tak, by była ona dostępna tkankom jako źródło energii oraz by nie uległa wydalaniu z moczem. Zarów no hiper-, jak i hipoglikemia są nieswoistymi objawami zaburzonej przemiany węglowoda nowej. B. Interpretacja

1. Hiperglikemie stwierdza się w cukrzycy, nad czynności tarczycy, w nadczynności

przysadki mózgowej w zakresie sekrecji ACTH i hormonu wzrostu i w nadczynności glukokortykoidowej. Mniej regularnie wzrost stężenia glukozy we krwi obserwuje się w guzie chromochłonnym, w nadczynności mineralokortykotdowej i w chorobach wątroby, 2. Hipoglikemia występuje w hiperinsulinizmie, niewydolności nadnerczy i przysadki gruczołowej oraz w niewydolności miąższu wątrobowego (w ostrym żółtym zaniku wątroby). Może ona mieć również charakter czynnościowy (reaktywny) lub być spowodowana lekami o działaniu hipoglikemicznym. Immunoglobuliny

Patrz Białka Kreatyna (dobowe wydalanie z moczem)

Wartości prawidłowe: p. tab. 7. A. Informacja patof izjologiczna. Kre atyna jest ważnym składnikiem mięśni, mózgu i krwi. Jej pochodna fosforanowa — fosfokreatyna — stanowi związek fosforanowy o wy sokiej energii. W warunkach fizjologicznych ilość wydaJonej z moczem kreatyny jest niewiel ka, wzrasta ona natomiast w stanach wzmożo nego katabolizmu ustrojowego oraz w dystrofiach mięśni. B. Interpretacja

Wzrost wydalania kreatyny z moczem stwierdza się w dystrofiach mięśni (np. w po stępującej dystrofii mięśni, miotonii zanikowej, w ciężkiej miastenii), w zanikach mięśniowych (spowodowanych np. chorobą Heinego i Medina, występujących w stwardnieniu zanikowym bocznym lub zapaleniu mięśni), w głodzeniu i stanach wyniszczenia, w nadczynności tar czycy i chorobach przebiegających z gorączką. Zmniejszone wydalanie kreatyny z moczem obserwuje się w niedoczynności tar czycy, amiotonii wrodzonej i niewydolności nerek. > Kreatynina (stężenie w surowicy lub osoczu krwi)

Wartości prawidłowe: 62—132 umol/1 (0,7—1,5 mg/dl). A. Informacja patof izjologiczna. Kreatynina po przesączaniu w klębuszkach nerkowych i wydzielaniu przez kanaliki, nerkowe wydalana jest z moczem. Jej klirens nerkowy jest o ok. 20% wyższy od klirensu inuiiny. Klirens kreatyniny jest większy od klirensu

DODATEK / 921 Tabela 7. Dobowe wydalanie z moczem kreatyny i kreatyniny. Wartości'prawidłowe Kreatyna Kreatynina Noworodek

0,034 mmol/kg (4,5 mg/kg)

0,088 mmol/kg (10 mg/kg)

Niemowlęta 1-7 miesięcy

0,061 mmol/kg (8.1 mg/kg)

Dziecko w wieku 2-3 lat

0,060 mmol/kg (7,9 mg/kg) 0,034 mmol/kg (4,5 mg/kg)

0,111 mmol/kg 12,8 mg/kg 0,107 mmot/kg (12,1 mg/kg)

4-4Vs lat

0,129 mmol/kg (14,6 mg/kg)

9-9% lat

0,019 mmol/kg (2,5 mg/kg)

0,160 mmol/kg (18,1 mg/kg)

11-14 lat

0,020 mmol/kg (2,7 mg/kg) 0-0,382 mmol (0-50 mg) 0-0,763 mmol (0-100 mg)

0,178 mmol/kg (20,1 mg/kg)

Dorosły mężczyzna Dorosła kobieta

inulinowego z powodu wydzielania tego metabolitu przez kanaliki nerkowe. Należy wyjaśnić, że reakcji Jaffego (jest ona najczęściej używana do oznaczania kreatyniny) oznacza się oprócz kreatyniny również chromogeny nie będące kreatyniną. Te ostatnie nie są jednak wydaJane z moczem, co sprawia, że ilość kreatyniny wydalanej z moczeni jest przypadkowo o ok. 20% mniejsza od sumy nieswoistych chromogenów i kreatyniny docierających do nerek. W ten sposób kJirens nerkowy kreatyniny i inuiiny są wielkościami porównywalnymi. Dla celów klinicznych khrens nerkowy kreatyniny można przyjąć za miarę wielkości przesączania kłębuszkowego, z wyjątkiem przypadków, w których stwierdza się zaawansowaną niewydolność nerek. W tym ostatnim przypadku kJirens kreatyniny jest wyższy od kJirensu inuliny w następstwie wydzielania jej przez kanaliki nerkowe, lnulina jest wydalana przez nerki tylko drogą przesączania kłębuszkowego nawet u chorych z mocznicą. B. Interpretacja. Wzrost kreatyninemii stwierdza się w ostrej i przewlekłej niewydolności nerek, przy obstrukcji dróg moczowych lub w uszkodzeniach nerek spowodowanych niektórymi lekami. Niektóre substancje (acetooctan, aceton, {J-hydroksymaślan, a-ketoglutaran, pirogronian, glukoza, bilirubina, hemoglobina, mocznik i kwas moczowy) mogą reagować z zasadowym roztworem pikrynianu (reak-

T£221 mmot/kg (25 mg/kg) 0,186 mmol/kg (21 mg/kg)

cja Jaffego) stając się przyczyną fałszywie zawyżonych stężeń kreatyniny. Stężenia kreatyniny niższe niż 62 umol/1 (0,7 mg/dl) nie mają żadnego znaczenia. Kreatynina (wydalanie z moczem) Patrz tab. 7. Kwas moczowy (stężenie w surowicy i w osoczu) Wartości prawidłowe: mężczyźni —180—539 umol/1 (3—9 mg/dl), kobiety — 150-450 nmoi/1 (2,5—7,5 mg/dl). A. Informacja patoftzjofogiczna. Kwas moczowy, jako produkt końcowy przemiany purynowej, wydalany jest przez nerki. Dna jest defektem metabolicznym uwarunkowanym ge netycznie, charakteryzującym się podwyższo nym stężeniem kwasu moczowego w surowicy lub osoczu krwi, wzrostem ogólnej puli kwasu moczowego w ustroju oraz odkładaniem się tego metabolitu w tkankach. Wzrost stężenia kwasu moczowego w surowicy może być rów nież spowodowany zwiększonym katabolizmem purynowym (dyskrazje krwi, terapia far makologiczna białaczek), stosowaniem diuretyków ttazydowych lub niewydolnością nerek. B. Interpretacja 1. Hiperurykemię stwierdza się w skazie dnawej, w stanach przedrzucawkowych i rzu-

922 / DODATEK

cawkowych, w białaczkach, policytemii, po chemioterapii lub stosowaniu innych metod leczenia białaczek, w niewydolności nerek, w glikogenozie typu I, w zespole Lescha-Nyhana (jest spowodowany niedoborem fos fory boży lotransferazy hipoksantynoguaninowej) oraz w zespole Downa. Częstość występowania hiperurykemii jest większa u Filipińczyków niż u białych. 2. Hipourykemię stwierdza się sporadycznie w ostrym zapaleniu wątroby, po stosowaniu alopurynolu lub probenecydu. Oznaczanie wydalania kwasu moczowego z moczem ma również wartość diagnostyczną w niektórych stanach chorobowych, np. u chorych z dną.

Kwas moczowy (wydalanie z moczem)

Wartości prawidłowe: 2,1—3,6 mmol/24 godziny (350—600 mg/dobe) u osób przebywających na diecie bezpurynowej. Prawidłowy iloraz U„/Ukiim (U, — dobowe wydalanie kwasu moczowego z moczem, UŁrełi — dobowe wydalanie kreatyniny z moczem wyrażone w mmol) wynosi dla dorosłych 0,21—0,59, maksymalnie 0,75 (u osób będących na diecie bezpurynowej). A. Uwaga. Zarówno przed, jak i w czasie zbierania dobowego moczu przeznaczonego do oznaczania kwasu moczowego dieta nie powin na zawierać pokarmów bogato pury nowych. Wykonanie dużego wysiłku fizycznego może zwiększyć urykozurię. B. I nf ormacja patof i zjo logiczna. Zmiany wydalania kwasu moczowego z mo czem mogą być uwarunkowane jego nadprodu kcją (wówczas stwierdza się hiperurykozurię) lub upośledzonym jego wydalaniem z moczem (wówczas stwierdza się hipourykozurię).

C. Interpretacja

Hiperurykozurię stwierdza się u ok. 25—30% chorych na dnę uwarunkowaną nad produkcją puryn. Wzmożoną syntezę zasad pury nowych i zwiększone wydalanie kwasu moczowego z moczem stwierdza się w zespołach mieloproliferacyjnych. Hiperurykozuria wystę puje również w zespole Lesha-Nyhana (spowo dowanego niedoborem f osfory boży łotr ansferazy hipoksantyno-guaninowej) oraz w niektó rych przypadkach glikogenozy (choroba spichrzeniowa glikogenu). Zmniejszone wydalanie kwasu moczowego z moczem stwierdza się w niewy dolności nerek, w niektórych przypadkach gli kogenozy typu I oraz we wszystkich defektach

metabolicznych przebiegających z kwasicą mleczanową lub [J-hydroksymaślanową. Również podawanie salicylanów w dawkach mniejszych niż 2—3 g/d może być przyczyną zatrzymywania kwasu moczowego w ustroju.

Lipaza (aktywność w surowicy krwi) Wartości prawidłowe: 0,2—1,5 jednostek.

A. Informacja patofizjologiczna. We

krwi krążącej stwierdza sie tyiko małą aktywność enzymów lipolitycznych. Aktywność lipazy trzustkowej wzrasta w ostrym zapaleniu trzustiki, przy czym wzrost ten utrzymuje się dłużej niż amylazy. B. Interpretacja. Aktywność lipazy w su rowicy wzrasta w ostrym lub przewlekłym, zaostrzonym zapaleniu trzustki oraz przy za mknięciu światła przewodu trzustkowego przez kamień lub nowotwór.

Lipidy Patrz Cholesterol i Triglicerydy

Magnez (stężenie w surowicy krwi)

Wartości prawidłowe: 0,75—1,25 mmol/1 (1,8—3 mg/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Ma gnez jest elektrolitem głównie śródkomórkowym. Jego stężenie w płynie pozakomórkowym wpływa na pobudliwość i reakcję nerwowo-mięśniową, Ogólnoustrojowy niedobór mag nezu może przebiegać z prawidłowym lub nie wiele zmienionym stężeniem Mg w płynie poza komórkowym. Małym stężeniom magnezu w surowicy krwi mogą towarzyszyć: tężyczka, ogólne osłabienie, zaburzenia orientacji i sen ność.

B. Interpretacja

Hipermagnezemię stwierdza się w nie wydolności nerek oraz po nadmiernym poda waniu (pozajelitowym) soli magnezowych. Hipomagnezemia występuje u chorych z przewlekłymi biegunkami, w głodzeniu, w przewlekłym alkoholizmie, niewydolności wątroby, przy nadmiernym wydalaniu Mg przez nerki uwarunkowanym podawaniem feków moczopędnych oraz przy niedostatecznej podaży Mg chorym żywionym pozajelitowo. Stężenie Mg może być obniżone u chorych z hipokalcemią. W ostatnim przypadku hipo magnezemia może być przyczyną oporności hipokalcemii na leczenie dużymi dawkami wita miny D i soli wapniowych u chorych z niedoczynnością przytarczyc.

DODATEK / 923

Miedź Patrz Ceruloplazmina Mocznik Patrz Azot mocznikowy Potas (stężenie w surowicy lub osoczu krwi) Wartości prawidłowe: 3,5—5,0 mmol/1 A. Informacja patofizjologiczna. Stę żenie potasu w osoczu jest determinatorem pobudliwości nerwowo-mięśniowej i mięśnio wej. Zarówno duże, jak i małe stężenia K w su rowicy upośledzają kurczliwość mięśni. B. Interpretacja Hiperkalemię stwierdza się w niewydol ności nerek (szczególnie u chorych z hiperkatabolizmem białkowym), niewydolności nad nerczy (szczególnie w hipoaldosteronizmie), hipoaldosteronizmie hiporeninowym, u chorych zażywających spironolaktony lub leczonych szybkim dożylnym wlewem soli potasowych, triamterenem lub fenoforminą. Hipokalemię stwierdza się: a. Przy niedostatecznym poborze potasu (np. w głodzeniu). b. W upośledzonym wchłanianiu K w przewodzje pokarmowym (biegunki, wymioty, ze spół wadliwego wchłaniania, zażywanie żywicy polistyrenowej). c. Przy nadmiernej utracie potasu przez nerki (pierwotny lub wtórny hiperaldosteronizm, po dawanie mineralokortykoidów, zasad o wica metaboliczna, podawanie diuretyków tiazydowych, tiazydopodobnych i rtęciowych, defekty kanalikowe nerek takie jak zespól de Toni-Debre-Fanconiego i kwasica kanalikowa, tera pia antybiotykami wydalanymi przez nerki jako aniony np. karbenicylina i tikarcylina, leczenie fenotiazynami, amfoterycyną B i lekami zawie rającymi dużo sodu, stosowanie tetracyklin rozłożonych. d. W nieprawidłowej redystrybucji potasu między przestrzenią wodną śród- i pozakomórkową. (porażenie okresowe rodzinne, podawa nie testosteronu). Sód (stężenie w surowicy lub osoczu krwi)

Wartości prawidłowe: 136—145 mmol/1. A.

Informacja patofizjologiczna. Na 155 mEq kationów występujących w osoczu 140 stanowią j ony Na+. Sód wraz z towarzyszącymi mu anionami tworzą większość osmotycznie

aktywnych substancji osocza, decydujących 0 ruchu wody pomiędzy przestrzenią poza1śródkomórkową. Utrata sodu przez ustrój lub jego wnikanie z przestrzeni wodnej pozakomórkowej do śródkomórkowej są przyczyną zmnie jszenia objętości płynu pozakom orkowego, co z kolei wpływa na czynność układu krążenia, nerek i układu nerwowego. B. Interpretacja Hipernatremia występuje przy niedo borze wody, tj. w stanach odwodnienia, w ura zach lub chorobach ośrodkowego układu ner wowego, w stanach przebiegających z nadmier ną sekrecją aldosteronu lub kortykosteronu, Hiponatremię stwierdza się w niewydo lności nadnerczy, niewydolności nerek, szcze gólnie przy niedostatecznej podaży sodu, w kwasicy kanalikowej, urazach lub oparze niach (dochodzi do przemieszczenia sodu do komórek), przy dużych utratach sodu przez przewód pokarmowy (ostre i przewlekłe bie gunki, przetoki jelitowe, niedrożność jelit) oraz przy obfitych potach (jeżeli wyrównanie strat było niedostateczne). U niektórych chorych z obrzękami sercowo- lub nerkowopochodnymi stężenie sodu w osoczu jest niskie, pomimo prawidłowej ilości o gó Ino u strój owego Na. Ta paradoksalna sytuacja może być uwarunkowa na zwiększoną retencją wody (spowodowaną zwiększoną sekrecją wazopresyny) lub (i) prze mieszczeniem sodu pozakomórkowego do prze strzeni śródkomórkowej. Hiperglikemia spora dycznie może być przyczyną przechodzenia wody śródkomórkowej do przestrzeni pozakomórkowej wywołując hiponatremię z rozcień czenia. W końcu hiponatremia może być artefaktem (wówczas mówimy o hiponatremii rzekomej) spowodowanej hiperlipemią lub hiperproteinemią. W tych przypadkach miejsce części wody zajmują lipidy lub białka, przez co dochodzi do „rozcieńczenia" sodu zawartego w wodzie osoczowej o wartość wynikającą ze wzrostu lipemii czy proteinemii. W tych przypadkach stężenie sodu przeliczone na 1000 ml wody jest „prawidłowe". Przy oznaczaniu sodu jonoselektywną elektrodą stężenie Na w surowicach hiperlipemicznych lub hiperproteinemicznych jest prawidłowe, podczas gdy jest obniżone przy użyciu metody fotometrii płomieniowej. Przy wzroście glikemii o każde 5,6 mmol/1 (100 mg/dl) powyżej 11,1 mmol/1 (200 mg/dl) dochodzi do obniżenia się natremii o 1,6 mmol/1. Efekt ten jest następstwem przemiesz-

924 / DODATEK

czenia wody śródkomórkowej do przestrzeni pozakomórk owej. TBG Patrz Globulina wiążąca tyroksynę

Transferyną Patrz TIBC

Transpeptydaza tub transferaza -glutamylowa (y-GT) (aktywność TIBC — całkowita zdolność białek w surowicy krwi) surowicy do wiązania żelaza — (total Wartości prawidłowe (przy oznaczaniu eniron binding capacity) i stopień zymu w temp. 30°C): mężczyźni <30 mli/ml, wysycenia transferyny kobiety <25 mU/ml, młodzież <50 mU/ml. Wartości prawidłowe: 45—73 (imol/l A. Informacja patof Izjologiczna. y-GT (250—410 ng/dl). Saturacja transferyny żela- jest niezwykle czułym wskaźnikiem choroby zem: 20—55%. wątroby. Aktywność tego enzymu jest często A. Informacja patofizjologiczna. W su- podwyższona u osób wykazujących prawidłową rowicy krwi żelazo przenoszone jest białkiem aktywność aminotransferaz i fosfatazy zasadozwanym transferyną (lub syderofiliną). W wa- wej. Enzym ten uważa się za bardziej swoisty od runkach prawidłowych zaledwie 30—40% cał- wymienionych dwóch enzymów w celu wykrykowitej pojemności transferyny do wiązania wania poalkoholowego uszkodzenia wątroby. żelaza jest wykorzystane (stąd mówimy o pro- y-GT występuje w wątrobie, nerkach i trzustce. cencie wysycenia transferyny żelazem). Procent Katalizuje ona przemieszczenie N-końcowe-go saturacji transferyny oblicza się wg wzoru kwasu glutaminowego z jednego peptydu na drugi peptyd lub na L-aminokwasy. Ulega on TIBC xl00. indukcji pod wpływem etanolu. B. Interpretacja wyników B. Interpretacja. Aktywność tego enzymu oznaczeń jest podwyższona w ostrym zakaźnym (wiruso TIBC wym) lub toksycznym uszkodzeniu wątroby, Wzrost TIBC stwierdza się w niedow przewlekłym lub podostrym zapaleniu wątro krwistości syderopenicznej, u kobiet zażywają by, marskości wątroby, w zastoju żółci uwarun cych doustne leki antykoncepcyjne, w późnej kowanym przeszkodą śród- lub pozawątrobociąży i u niemowląt oraz sporadycznie również wą dróg żółciowych, w nowotworach pierwo w zapaleniu wątroby. tnych lub wtórnych wątroby oraz w alkoholo N iskie T IB C o b s e r w u j e s i ę w s t a n a c h wym uszkodzeniu wątroby. Sporadyczny c h o r o b o w y c h p r z e b i e g a j ą cz yhci hp o p r o t e i n e - wzrost aktywności y-GT stwierdza się w zam i ą ( n e r c z y c a , g ł o d z e n i e , n o w o t w o r y ) , w pstoinowej rze niewydolności krążenia i rzadko, w l e k ł y c h s t a n a c h z a p a l n y c h i w h e m o c h r o mwa po ł o - nekrotycznej fazie zawału mięśnia ser z i e ( i n d u k o w a n e j l i c z n y m i t r a n s f u z j a m i cowego, krw i w zapaleniu i w raku trzustki. lu b ta lasem ią). **<■ C. Interpretacja wyników ozaczeń Triglicerydy (stężenie w surowicy odsetka saturacji transferyny żelazem. krwi) Zwiększoną saturację stwierdza się Wartości prawidłowe: 1,65 g/l (165 mg/dl), p. w stanach chorobowych przebiegających z nad również tab. 4. miarem żelaza w ustroju (zatrucie żelazem, A. Informacja patofizjologiczna. Trigniedokrwistości hemolityczne, talasemią, helicerydy zawarte w pokarmach ulegają hydromochromatoza, niedobór pirydoksyny, zespół lizie w świetle jeiita cienkiego, następnie wchłanerczycowy i sporadycznie zapalenie miąższu nianiu i resyntezie przez enterocyty błony śluzowątrobowego). wej, a w końcu wydzieianiu do naczyń iimObniżoną saturację transferyny żela fatycznych pod postacią chylomikronów. Trigzem obserwuje się w stanach chorobowych licerydy zawarte w chylomi kro pach krwi ulegaprzebiegających z niedoborem żelaza, w prze ją klirensowaniu przez lipaze lipoproteinową wlekłych infekcjach, w nowotworach i później tkanek (głównie tkanki tłuszczowej). Powstałe ciąży. pod jej wpływem produkty rozpadu ulegają wchłanianiu przez komórki i magazynowaniu. Transaminazy -r Wolne kwasy tłuszczowe pochodzące głównie Patrz Aminotransferazy z tkanki tłuszczowej są prekursorami endogennych trigHcerydów wytwarzanych przez wąt-

DODATEK / 925

robę. W surowicy krwi endogenne triglicerydy transportowane są z frakcją p-lipoprotein, tworząc tzw, lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL). Do oznaczenia stężenia triglicerydów we krwi należy używać próbki krwi pobranej 10—12 godzin po spożyciu ostatniego posiłku. B. Interpretacja. Interpretacje stężenia triglicerydów, cholesterolu, cholesterolu frakcji lipoproteinowych (frakcji VLDL, LDL i HDL) należy przeprowadzić^łącznie. Zaburzenia w relacjach zachodzących między wymienionymi lipidami mogą mieć charakter pierwotny lub wtórny. 1. Wzrost stężenia triglicerydów stwier dza stę w: a. Hiperlipoproteinemiach pierwotnych tj. w hiperlipoproteinemii typu I, hiper- beta -lipoproteinemii typu Ilb, hiperiipoproteinemii typu III (jest to wzrost VLDL o ruchliwości elektro forę ty cznej beta-lipoprotein), hiperlipoprotei nemii typu IV (hiperlipemia endogenna) oraz w hiperlipoproteinemii typu V (hiperlipoproteinemia mieszana). b. Hiperlipoproteinemiach wtórnych wystę pujących w niedoczynności tarczycy, cukrzycy, zespole nerczycowym, przewlekłym alkoholiz mie przebiegającym ze sthiszczeniem wątroby, żółtaczce zastoinowej, u kobiet zażywających doustne leki antykoncepcyjne oraz po zadziała niu stresu. 2. Małe stężenie triglicerydów stwierdza się w hipolipoproteinemiach; a. Pierwotnych (choroba wyspy Tanger wy wołana niedoborem a-lipoprotein, abetalipoproteinemia oraz kilka rzadkich i słabo po znanych zespołów) oraz b. Wtórnych (spowodowanych wadliwym odżywianiem się, wadliwym wchłanianiem po karmów w jeiitach lub sporadycznie chorobą miąższu wątrobowego). Trijodotyronina (T 3) wychwyt przez białka surowicy. Określenie wychwytu T3 przez żywicę jonowymienną (RT3U), określenie globuliny wiążącej tyroksynę — TBG Prawidłowe wartości RT3U, wyrażające wychwyt 12S J-T3 przez żywicę jonowo wymienną, wahają się od 25 do 36%. Przez oznaczanie RT3U dla surowicy badanej oraz dla zlewek surowiczych pochodzących od osób zdrowych możliwe jest oznaczenie TBG metodą pośrednią. Iloraz złożony z wartości RT3U oznaczonej dla surowicy badanej do wartości RT3U zlewek

surowiczych określany jest dalej jako „iloraz RT3U". Normaine wartości dla tego ilorazu wahają się od 0,85 do 1,15. A. Informacja patofizjologiczna. U chorych na nadc2ynność tarczycy typu T4 liczba miejsc TBG zablokowanych przez endogenną T4 jest większa niż u osób zdrowych. W niedoczynności tarczycy zachodzi sytuacja odwrotna, tj. liczba miejsc TBG zablokowanych przez ten hormon jest mniejsza niż u ludzi zdrowych. Trijodotyronina znakowana USI, dodana do zawiesiny złożonej z surowicy badanej i żywicy jonowowymiennej {względnie węgla aktywnego lub talku) w pierwszej kolejności wysyca wolne jeszcze miejsca wiązania na TBG surowicy badanej, zaś pozostałe cząsteczki mI-T3 (nie związane przez TBj^f) ulegają związaniu przez żywicę lub inna substancję wiążącą. Po rozdzieleniu substancji wiążącej (żywica, talk, węgiel aktywny) od surowicy, oznacza się radioaktywność tej pierwszej wyrażając ją w % ogólnej radioaktywności dodanej do surowicy badanej (jest to tzw. wartość RT3U). Ponieważ żywica (lub węgiel, talk itd.) wiąże U!I-Tj nie wiązaną z TBG, aktywność tej żywicy jest tym większa, im bardziej wysycona jest TBG endogennym hormonem tarczycy (taka sytuacja zachodzi w nadczynności tarczycy) i odwrotnie, radioaktywność związku wiążącego ' 25I-T3 jest tym mniejsza, im słabiej wysycona jest TBG hormonami tarczycy. B. Interpretacja 1. Wzrost wartości RT,U ora2 ilorazu RT3 U stwierdza się przy dużym wysyceniu TBG hormonem tarczycy, tj. w nadczynności tarczycy, akromegalii, zespole nerczycowym, w ciężkiej marskości wątroby oraz we wrodzo nym niedoborze TBG. 2. Zmniejszenie wartości RT^U i ilorazu RT3 U stwierdza się przy małym wysyceniu TBG endogennymi hormonami tarczycy, tj. w niedoczynności tarczycy, w ciąży, u noworod ków, w zakaźnym (wirusowym) zapaleniu wąt roby oraz we wrodzonej nadprodukcji TBG. Tyroksyna (T4) całkowita (TT4) (stężenie w surowicy krwi) Stężenie prawidłowe oznaczone metodą radioimmu no logiczną wynoszą; 65—156 nrnol/1 (5—12 ng/dl), zaś metodą radiokompetycyjną 51—142 nmol/1 (4—11 ug/dl).

A. Informacja patofizjologiczna. Cał-

kowite stężenie tyroksyny w surowicy krwi niekoniecznie odzwierciedla efekt biologiczny

926 / DODATEK

tego hormonu. Stężenia tyroksyny mogą się zmieniać zależnie od zmian stężenia białek transportujących tyroksyny (globuliny wiążącej T4 i prealbumin), stanów fizjologicznych (ciąży) i chorobowych oraz pod wpływem niektórych leków. Prawidłowa interpretacja ogólnego stężenia T4 zależna jest od znajomości stężenia białek transportujących ten hormon, lub też wychwytu trijodotyroniny (T3) przez erytrocyty lub żywicę wymienną (p. niżej). Tylko stężenia wolnej T4 i T3 są determinantami efektu biologicznego tych hormonów. B. Interpretacja Wzrost TT4 stwierdza się w nadczynno ści tarczycy, w stanach chorobowych przebiega jących ze wzrostem stężenia białek transpor tujących dla tego hormonu (TBG) oraz czasami w fazie aktywnej zapalenia tarczycy i akromegalii. Stężenie TT^ jest obniżone w niedoczynności tarczycy (pierwotnej lub wtórnej) oraz w stanach chorobowych przebiegających i cha rakteryzujących się niskimi stężeniami białek wiążących T4. Tyroksyna wolna (fT 4 ) (stężenie w surowicy krwi) Wartości prawidłowe: 0,01—0,03 nmol/1 (0,8—2,4 ng/dl). Stężenie tyroksyny wolnej można określić, znając stężenie całkowite tyroksyny oraz wychwyt T3 przez żywicę. A. Informacja patofizjologiczna. Ak tywność metaboliczna T4 zależna jest od stęże nia wolnej tyroksyny. Większość T4 ulega kon wersji do T 3 w tkankach obwodowych (T 3 wydzielana jest równiaj przez tarczycę). Zarów no T 4 , jak i T 3 są biologicznie aktywnymi hormonami. B. Interpretacja Podwyższone stężenie fT 4 stwierdza się w nadczynności tarczycy oraz w aktywnej fazie zapalenia tego gruczołu. Małe stężenia fT4 obserwuje się w nie ci oczy nn ości tarczycy. Wapń (stężenie w surowicy) Wartości prawidłowe dla stężenia wapnia całkowitego: 2,1—2,6mmol/l (8,4—10,4mg/dl), dla stężenia wapnia zjonizowanego: 1,05—1,3 mmol/ł (4,2—5,2 mg/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Prawidłowe stężenie wapnia w ..surowicy krwi i innych płynych ustrojowych jest wynikiem precyzyjnej regulacji endokrynnej i nerkowej oraz

zależna od czynników żołądkowo-jelitowych i żywieniowych. Ponieważ znaczna część wapnia w surowicy krwi związana jest z białkami, a szczególnie albuminami, dokładne określenie znaczenia klinicznego wyniku kalcemii ogólnej nie jest możliwe przed oznaczeniem proteinemii lub albuminemii. B. Interpretacja Hiperkalcemię stwierdza się; w nad czynności przytarczyc, w nowotworach złoś liwych wydzielających PTH-podobną substan cję, przy zatruciu witaminą D, w „milk-alkali syndrome", w rozległej osteolizie spowodowa nej szpiczakiem lub przerzutami nowotworowy mi do kości, w chorobie Pageta, w sarkoidozie Boecka, po dłuższej immobilizacji ciała oraz w hipokalcjurii rodzinnej. Sporadycznie hiper kalcemię stwierdza się w nadczynności tarczycy lub po stosowaniu leków tiazydowych. Hipokalcemię obserwuje się w niedoczynności przytarczyc, w niedoborze witaminy D (u dzieci z krzywicą oraz u dorosłych z osteomalacją), w niewydolności nerek, w hipoproteinemii, w zespole wadliwego wchłaniania (sprue, zapalenie jelita krętego, celiakia, niewydolność trzustki), w ciężkim zapaleniu trzustki przebie gającym z martwicą oraz w rzekomej niedoczynności przytarczyc. Diagnostyczną wartość ma również oznaczanie kalcjurii przynajmniej w niektórych chorobach, np. w nadczynności przytarczyc. Wodorowęglany (stężenie w surowicy lub osoczu krwi) Wartości prawidłowe: 24—28 mmol/1. A. Informacja patofizjologiczna. Wodorowęglanowy układ buforowy jest jednym z najważniejszych układów buforowych ustroju czuwających nad normalnym pH płynów ustrojowych. Określenie stężenia wodorowęglanów i pH we krwi tętniczej stanowi podstawę oceny stanu równowagi kwasowo-zasadowej. B. Interpretacja t 1. Wzrost stężenia HCO~ stwierdza się: a. W zasadowicy metabolicznej (pH krwi jest podwyższone) spowodowanej zażywaniem du żych ilości wodorowęglanu sodowego, długo trwałymi wymiotami lub niedoborem potasu w ustroju. b. W kwasicy oddechowej (pH krwi jest obniżona) uwarunkowanej niedostatecznym wydalaniem przez płuca dwutlenku węgla, czyli wzrostem pCO2 krwi (rozedma płuc, uszkodze nie warstwy surfaktantu pęcherzyków płuc-

DODATEK / 927

nych, niewydolność krążenia przebiegająca z zastojem w phacach, zaburzenia wentylacji płuc o różnej etiologii np. po podaniu nadmiernej ilości leków uspokajających lub narkotycznych) lub niedostatecznym oddychaniu sztucznym. 2. Obniżenie stężenia HCO~ stwierdza sie:

a. W kwasicy metabolicznej (pH krwi tęt niczej jest obniżonej spowodowanej kwasicą ketonową u chorych na cukrzyce, kwasicę nileczanową, głodzeniem, uporczywymi biegunka mi, niewydolnością nerek, zażywaniem nadmie rnych ilości substancji zakwaszających, zatru ciem metanolem lub salicylanami. b. W zasadowicy oddechowej (pH krwi tęt niczej jest podwyższone) spowodowanej hiperwentylacją (pCO2 jest obniżone). Wychwyt trijodotyroniny Patrz Trijodotyronina

Żelazo (stężenie w surowicy krwi) Wartości prawidłowe: 9—31,3 u.mol/1. A. Informacja patofizjologiczna. Stęże nie żelaza w surowicy podlega wahaniom dzienno-nocnym, przy czym największe stężenie stwierdza się w godzinach rannych. Dlatego też oznaczanie syderemii należy wykonać w prób kach krwi pobranych rano na czczo. Wiele czynników wpływa na stężenie żelaza w surowi cy. Wśród nich wymienić należy: stopień wchła niania Fe przez nabłonek jelitowy, 2apasy żela za w jelitach, wątrobie, śledzionie i szpiku kostnym, nasilenie rozpadu lub utraty hemo globiny oraz synteza hemoglobiny de novo. B. Interpretacja Hipersyderemię stwierdza się w hemochromatozie, hemosyderozie (spowodowanej li cznymi transfuzjami krwi lub podawaniem du żych ilości żelaza), w chorobach przebiegają cych ze wzmożoną hemolizą, w niedokrwistośd złośliwej i w niedokrwistościach hipoplastycznych. Często stężenie żelaza w surowicy jest podwyższone w wirusowym zapaleniu wątroby. Rzekomą hipersyderemię stwierdza się u cho rych u których podawano żelazo dożylnie 2—3 miesiące przed pobraniem krwi do oznaczania Fe. Htposyderemię stwierdza się w niedo borze żelaza, w infekcjach, nerczycy, przewle kłej niewydolności nerek oraz w okresach wzmożonej hematopoezy (np. po podaniu erytropoetyny).

PRAWIDŁOWE.WARTOŚCI BADAŃ LABORATORYJNYCH Skróty: /B/ — krew, /P/ — osocze, /S/ — surowica, /U/ — mocz GŁÓWNE SKŁADNIKI CHEMICZNE KRWI, OSOCZA LUB SUROWICY Aceton i acetooctan: (S) 3-20 mg/l. Adrenalina — p. Epinefryna. Albuminy: (S) 35-55 g/l. Aminotransferazy: Amin otrą nsferaza asparaginianowa (AspAT, AST, SGOT). Wartości prawidłowe zależą od metody oznaczania. ($J 6 — 25 IU/1 w temp. 3CTC; SMA, 10-40 IU/1 w temp. 37°C; SMAC 0-41 IU/I w temp. 37X. Amin otrą nsferaza alaninowa (AIAT, ALT, SGPT). Wartości prawidłowe zależą od metody oznaczania. (S) 3-26 tU/l w temp. 30°C; SMAC 0-45 IU/I w temp. 37°C. Amoniak: (B)<65^moi/I (<110ng/dl) (metoda dyfuzyjna). Amylaza: (S) 80-180 jednostek/dl (Somogyi). Wartości zależne od metody oznaczania. jAntytrypsyna: (S)>1,80 g/l Azot mocznika: (S lub P) 2,9-8,9 mmol/l (8-25 mg/di) Białka całkowite: (S) 60-80 g/l (6-8 g/dl) Bilirubina: (S) całkowita 3,5-20,4 umol/l (0,2-1,2 mg/dl), estryfikowana < 7 u.mol/1 (0,4 mg/dl), wolna<12 umol/l (0,7 mg/dl). Ceruloplazmina: (S) 1,7-2,9 umol/l (25-43 mg/dl). Ciśnienie cząsteczkowe dwutlenku węgla we krwi tętniczej: 4,7-6 kPa {35-45 mm Hg) Ciśnienie cząstkowe tlenu — p. Tlen. Chlorki: (S lub P) 96-106 mmol/l. Cholesterol — całkowity: (S lub P) 3,9-6,85 mmol/l (150-265 mg/dl)(p. Lipidy — frakcje). Wartości zależne od wieku Cholestarol-estry: (S) 65-75% cholesterolu całkowitego. COa całkowity: (S lub P) 24-29 mmol/l. Cynk: (S) 7,65-22,95 u.mol/1 (50-150 ug/dt). Cyjanokobalamina: (S) 148 pmol/l (200 pg/ml). Dwutlensk węgla całkowity — p. C0 2 całkowity, Epinefryna (adrenalina): (P) <550 pmol/l (<100 pg/ml) w pozycji leżącej. Ferrytyna: (S) dorosłe kobiety 20-120 \ig/\; mężczyźni 30-300 |j.g/l, dzieci do lat 15, 7-140 ng/l. Fibrynogen: (P) 2-6 g/l (0,2-0,6 g/dl).

928 / DODATEK Fosfataza kwaśna: (S) 1 - 5 jednostek Kinga-Armstronga = 0,1-0,63 jednostek Besseya-Lowry'ego. Fosfataza zasadowa: (S) Dorośli 5-13 jednostek Kinga-Armstronga, 0,8-2,3 jednostek Bessę ya-Lowry'ego; SMA 30-85 IU/I w temp. 37eC; SMAC 30-115 IU/I w temp. 37CC. Fosfokinaza kreatynowa (CPK, CK): (5) 1050 IU/I w temp. 37°C. Fosfokinaza kreatynowa-izoenzymy — p. lab. 6. Fosfor nieorganiczny: (S, na czczo) 1-1.5 mmol/l (3-4,5 mg/dl). Gęstość względna: (B) 1,056 (wartość zależna od stężenia hemoglobiny i białek osocza krwi). (S) 1,0254-1,0288 {wartość zależna od stężenia białka w surowicy). Globuliny: (S) 20-36 g/l (2-3,6 g/dl). Glukoza: (S lub P) 3,6-6,1 mmol/l (65-110 mg/dl). Haptoglobiny: (S) 0,4-1,1 g/l, [3-Karoten: {S na czczo) 0,9-5,58 umol/l {50-300 ug/dl). Kortyzol: (P) 138-650 nmol/l (5-25 ug/dl) o godzinie ósmej rano, <275 nmol/l (<10 Ug/dl) o godzinie ósmej wieczorem. Kwas askorbinowy: (P) 23-85 umol/l (0,4-1,5 mg/dl). Kwas foliowy: (S) 4,5-45 nmol/l (2-20 mg/ml), w krwinkach czerwonych: > 318 nmol/l (>140ng/ml). Kwas moczowy: (S lub P) mężczyźni 180-540 umol/l (3-9 mg/dl), kobiety 150-450 umof/l (2,5-7,5 mg/dl). Lipaza: (S) <150 U/l. Lipidy całkowite: (S) 4,5-10 g/l (450-1000 mg/dl). Lipidy, frakcje: (S lub P), pożądane stężenia cholesterol frakcji HDL; >1,04 mmol/l(>40 mg/dl). •** cholesterol frakcji LDL: <4,68 mmol/l (<180 mg/dl) cholesterol frakcji VLDL <1,04 mmol/l (<40 mg/di), w celu przekształcenia stężenia wyrażonego w mg/dl na mmol/l, należy wartość pierwszą pomnożyć przez 0,026. Miedź: (S lub P) 16-37 umol/i (100-200jig/6l). Mocznik: p. Azot mocznika. Norepinef ryna (noradrenalina): (P, pozycja leżąca) <3 nmol/l ( <500 pg/ml). Osmolalność (molalnosć): (S) 280-296 mmol/kg H20 (280-296 mosm/kg H2O). P„C03 {B, krew tętnicza) — p. Ciśnienie cząstkowe dwutlenku węgla we krwi tętniczej. PBOa — p. Hen. pH: (B, krew tętnicza) 7,35-7,45 (45-35 nmol H+/I). Pirogronian: (B) 70-114 umol/t (0,6-1 mg/dt). Potas (S lub P) 3,5-5,0 mmol/l.

Saturacja krwi tlenem - p. Tlen. Sód: (S lub P) 136-145 mmol/l. TIBC{S—całko wita zdolność surowicy dowiązania Fe) 44,7-73,4 nmol/l (250-410 ng,/dl). Tlen: całkowita pojemność krwi do wiązania tlenu (B) 16-24 vot.%. Wartość zależna jest od stężenia hemoglobiny. Zawartość we krwi tętniczej 15-23 vol.% (wartość jest zależna od stężenia hemoglobiny). Wysycenie hemoglobiny tlenem w krwi tętniczej, 94-100% całkowitej pojemności. Ciśnienie cząstkowe tlenu w krwi tętniczej Pa0s10,67-13,33 kPa (80-100 mm Hg) na poziomie morza. Wartość zależna od wieku. Transferyna: (S) 23-45 umol/1 (200-400 mg/dl). Transferyna (S): % wysycenia żelazem, 20-55%. Trfglicerydy: {S) <1,9 mmol/l (<165 mg/dl). Wapń: (S) 2,1-2,6 mmol/l (8,5-10,3 mg/dl). Wartość zależna od stężenia albumin w surowicy. Wapń zjonizowany: (S) 1,05-1,3 mmol/l {4,25-5,25 mg/dl). Witamina A: (S) 0,53-2,1 j^mol/t (15-60 ug/dl). Witamina Bia: (S): >148pmol/t (> 200 pg/ml). Witamina C — p. Kwas askorbinowy. Witamina D: (S): cholekalcyferol (wit. D3) 1,3-47 nmol/l (0,5-18 ng/ml), 25-hydroksycholekalcyferol 19,4-137 nmol/i {8-55 ng/ml), 1,25-dihydroksycholekalcyferol62~155pmol/l (26-66 pg/ml), 24,25-dihydroksycholekalcyferol 2,4-12 nmol/l (1-5 ng/ml). Wodorowęglany: (S) 24-28 mmol/l. Zdolność wiązania żelaza przez surowicę — p. TIBC. Żelazo: (S) 9-31,3 umol/l (50175 ug/dl).

Hormony w surowicy lub osoczu krwi

W określonych stanach klinicznych zachodzi potrzeba oznaczania niżej podanych hormonów. W sprawie wartości prawidłowych dla tych hormonów należy zasięgnąć konsultacji laboratorium szpital neg«. Przysadka mózgowa Hormon wzrostu (GH) Hormon tyreotropowy (TSH) Folitropina (hormon pobudzający pęcherzyki Graafa) (FSH) Lutropina (hormon luteotfopowy) (LH) Kortykotroptna (ACTH) Pro I aktyn a Somatomedyna C {wytwarzana jest przez wątrobę i inne tkanki pod wpływem GH) Hormon antydiuretyczny (ADH, wazopresyna)

DODATEK / 929 Nadnercza: Aldosterori (wartości prawidłowe 56-250pmol/l), stężenie wzrasta w pozycji pionowej. Kortyzol Deoksykortyzol Dopamina Epinefryna (adrenalina) Norepinefryna (noradrenalina) Patrz również; Inne testy laboratoryjne Tarczyca: Tyroksyna wolna (fTJ _ Tyroksyna całkowita (TT,) Globulina wiążąca tyroksyne {TBG} Trijodotyronina (T3) Odwrotna trijodotyronina (rT3) Wychwyt trijodotyronin przez żywicę (RT3U) Kalcytonina Przytarczyce: Wartości prawidłowe zależne są od rodzaju przeciwciał anty-PTH użyte do oznaczania. Stężenie PTH w surowicy wykazuje korelację ze stężeniem wapnia w surowicy. Wyspy Langerhansa trzustki: Insulina Peptyd C Glukagon Żołądek: G astry na Nerki: Aktywność reninowa Erytropoetyna Gonady: Testosteron wolny (nie związany z białkami transportowymi) Testosteron całkowity Estradiol (Ej) Progesteron Łożysko: Estriol (E3) Gonadotropina łożyskowa

INNE TESTY LABORATORYJNE W odpowiednich stanach klinicznych zachodzi potrzeba oznaczania niżej podanych związków.

— Biochemia

W sprawie zakresu wartości prawidłowych dla tych związków należy zwrócić się do laboratorium szpitalnego. Hormony nadnerczy i ich metabolity Katechoiaminy 11,17- Hydroksykortykoidy 17-Ketosteroidy Metanefryna Kwas wanilinomigdałowy (VMA) Zawartość tłuszczów w kale Ołów Porfiryny Kwas delta-amino-lewulinowy Ko pro porfiryny Uroporfiryny Porfobilinogen Urobilinogen Urobilinogen w kale

PIŚMIENNICTWO Friedman RB et al: Effects of diseases on dinical laboratory tests. Clin Chem 1980;26(Suppl 4):1D. HanstenPD, Lybecker LA: Drug effects on laboratory tests. In: Basie & Clinicat Pharmacology, 2nd ed. Katzung BG (editor). Lange, 19S4. Lippert H, Lehmann HP: SI Units in Medicine: An Introduction to the International System of Units WitkConversion TablesandNormal Ranges. Urban & Schwarzenberg, 1978. Lundberg GD, Iverson C, Radulescu G (editors): New read this: The SI units are here. (Editorial). JAMA 1986;255:2329. Powsner EK: SI ąuantities and units for American medicine. JAMA 1984;252;1737. Scully RE et al: Nonnal reference laboratory values: Case records of the Massachusetts Generał Hospital. N Engt J Med 1986;314:39. Sonnenwirth AC, Jarett L: Gradwohfs Laboratory Metkods and Diagnosis, 8th ed. Vols 1 and 2. Mosby, 1980.

Skróty spotykane w biochemii

0

jednostka(i) Angstroma (10~ 10 m, 0,1 nm) aminokwas a-aminokwas hormon a dren o korty kot rop owy, adrenokortykotropina, kortykotr opina pochodna acylowa koenzymu A (np. butyrylo-CoA) dehydrogenaza alkoholowa hormon antydiuretyczny (wazopresyna) globulina antyhemofilowa (przeciwhemofilowa) alanina adenozynomonofosforan arginina asparagina kwas asparaginowy adenozyn ot r i f osf ora n dimerkaptopropanol (British anti-lewisite) cykliczny 3',5'-adenozynomonofosforan, cykliczny AMP globulina wiążąca kortykosteroidy karbobenzoksy m-chlorokarbonylocyjanofenylohydrazon cholecystokinina (pankreozymina) ceramid cykliczny 3',5'-guanozynomonofosforan, cykliczny GMP iniojącja łańcucha cytydynomonofosforan, 5'-fosforybozylocytozyna wolny koenzym A. Nukleotyd zawierający kwas pantotenowy i uczestniczący w przemianie kwasów tłuszczowych, związków ketonowych, octanu i aminokwasów

II

acetylo-CoA, aktywny octan. Postać, w jakiej octan jest aktywowany, by mógł

A (A) AA

a-AA ACTH Acyl-CoA ADH ADH AHG Ala AMP Arg Asn Asp ATP BAL

CAMP CB6 CBZ

CCCP CCK (PZ) Cer

cGMP Cl CMP

CoA-SH

CPK (CK) CRH (CRF) CRP CTP Cys D

Da( witamina) D3( witamina) 1,25/OH/a-D3 dA dC

dG

DNA DNP

uczestniczyć w różnych reakcjach fosfokinaza kreatynowa kortykoliberyna białko C-reaktywne cytydynotrifosforan cysiei na prawoskretny ergokalcyferol cholekalcyferol 1,25-dihydroksycholekalcyferoi deoksyadenozyna deoksycytgzyna deoksygua nożyna kwas deoksyrybonukleinowy dinitrofenol

^

SKRÓTY SPOTYKANE W BIOCHEMII / 931 Dopa DPG DPN dT dTMP dUMP E E.C. EDTA Enz Eq eu FAD FADHa FDA FFA Figlu FMN FP FSF FSH FSHRH (FSHRF) g g Gal GalNAc GDP GFR GH GKRH(GHRF) GHRIH GLC Glc GIcNAc GlcUA Gin Olu Gly GMP GnRH GTP Hb hCG hCS HDL H2folate H^folate His HMG-CoA

ICD IDL IDP IF Ile IMP INH ITP

W) — Iłincłiemia

3,4-dihydroksyfenyloalanina * difosfoglicerynian (nazwa bardziej prawidłowa — bisfosfoglicerynian) nukleotyd difosfopirydynowy (skrót najczęściej używany NAD) deoksytymidyna d eo ksy ty m id y n o mo n of osf of o ra n deoksyurydynomonofosforan enzym (lub Enz) układ numeracji enzymów ustalony przez IUB kwas etylenodiaminotetraoctowy. Odczynnik używany do chelatowania metali dwuwartościowych enzym (również używany skrót E) równoważnik jednostka enzymatyczna dinukleotyd flawinoadeninowy (postać utleniona) dinukteotyd flawinoadeninowy (postać zredukowana) Food and Drug Administration wolne kwasy tłuszczowe kwas formiminoglutaminowy mononukleotyd flawinowy flawoproteina czynnik stabilizujący fibrynę folitropina foliliberyna, hormon uwainiający FSH gram (y) przyspieszenie ziemskie (grawitacja) ga laktoza N-acetylogalaktozamina guanozynodifosforan przesączanie kłębuszkowe hormon wzrostu somatoliberyna somatostatyna, hormon hamujący uwalnianie hormonu wzrostu chromatografia gazowo-cieczowa glukoza N-acetyloglukozoamina kwas glukuronowy glutamina kwas glutaminowy glicyna guanozynomo nofosf o ra n gortadoliberyna g u a noży n ot ri f osf o ra n hemoglobina ludzka gonadotropina kosmówkowa ludzka somatomammotropina kosmówkowa lipoproteiny o wysokiej gęstości dihydrofolian tetrahydrofolian htstydyna fi-hydroksy-p-metyloglutarylo-CoA hydroksylizyna hydroksyprolina dehydrogenaza izocytrynianowa lipoproteiny o pośredniej gęstości inozynodifosforan czynnik inicjacji (w syntezie białek) izoteucyna inozynomonofosłoran, rybonukleotyd hipoksantyny hydrazyd kwasu i zo ni koty nowego (izoniazyd) inozynotrifosforan

932 / SKRÓTY SPOTYKANE W BIOCHEMII ITyr IU IUB ct-KA kcal exKG kJ Km L LCAT LDH LDL Leu LH LHRA (LHRF) LLF LTH Lys M MAO NICH MCHC W 1CV Met mol MRF MRH MRIH mRNA MSH MW (MAD IUADH NADP+ NADPH NDP NeuAc NTP OA OD P; PCV Pho PIH (PIF) PL PLP PPi PRH (PRF) PRIH (PRIF) PRL

Pro

PRPP PTA PTC RBC RDA RE RNA

monojodotyrozyna dijodotyrozyna jednostka (i) międzynarodowa (e) Międzynarodowa Unia Biochemii a-ketokwas kilokaioria a-ketoglutaran kilodzul stężenie substratu, przy którym reakcja chemiczna wykazuje połowę maksymalnej szybkości (stała Michaeiisa) lewoskrętny acylotransferaza lecytyna-cholesterol dehydrogenaza mleczanowa lipoproteiny o niskiej gęstości leucyna lutropina, hormon luteinizujący luliberyna, hormon uwalniający lutropinę czynnik Laki-Lorand hormon luteotropowy lizyna molarny oksydaza monoaminowa średnia zawartość hemoglobiny w krwince czerwonej średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej średnia objętość krwinki czerwonej metionina mol (e) czynnik uwalniający melanotropinę hormon uwalniający melanotropinę hormon hamujący uwalnianie melanotropiny informacyjny RNA hormon melanotropowy, melanotropina masa cząsteczkowa dinukleotyd nikotynamidoacfeninowy— postać utleniona dinukleotyd nikotynamidoadeninowy — postać zredukowana fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego — postać utleniona fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego — postać zredukowana jakikolwiek difosforan nukleozydu kwas N-acetyloneuraminowy jakikorWiek trifosforan nukleozydu kwas szczawiowooctowy gęstość optyczna fosforan nieorganiczny (orto-fosforan) wartość hematokrytowa fenyloalanina prolaktostatyna, hormon hamujący uwalnianie prolaktyny pirydoksal , fosforan pirydoksalu nieorganiczny pirofosforan prolaktoliberyna, hormon uwalniający proiaktynę prolaktostatyna, hormon hamujący uwalnianie prolaktyny prolaktyna prolina 5-fosforybozylo-i -pirofosforan czynnik krzepnięcia XI, czynnik przeciwhemofilowy C czynnik krzepnięcia IX, czynnik przeciwhemofilowy B krwinka czerwona zalecane normy żywieniowe równoważniki retinotu kwas rybonukleinowy

SKRÓTY SPOTYKANE W BIOCHEMII / RQ rRNA ■ S(Sf)units SDA SDS S«r SGOT SGPT SH SLR SPCA SRIH (SRIF) sRIMA STP T3 T4 TEBG TG Thr TLC TmCa TmG TPN TRH (TRF) Tris tRIMA Trp TSH Tvr UDP UDPGal UDPGIc UDPGIcUA UDPGIuc UMP UTP Vma , Val VHDL VMA Vol%

(

współczynnik oddechowy -t rybosomalny RNA jednostki flotacji Svedberga działanie swoisto dynamiczne sól sodowa siarczanu dodecylu seryna aminotransferaza glutaminowo-szczawiowooctowa aminotransferaza gl utamin owo-pirogronia nowa grupa s u (f hydry I owa Streptococcus actis R czynnik krzepnięcia VII somatostatyna, czynnik hamujący uwalnianie hormonu wzrostu rozpuszczalny RNA, bardziej używany termin to tRIMA temperatura standardowa (273 K) i ciśnienie standardowe {760 mm Hg) trijodotyronina tetrajodotyronina, tyroksyna globulina wiążąca hormony płciowe (testosteron i estrogeny) triacyloglicerole (dawniej określane jako triglicerydy) treonina J^, chromatografia cienkowarstwowa maksymalne wchłanianie wapnia przez kanaliki nerkowe maksymalne wchłanianie glukozy przez kanaliki nerkowe nukleotyd trifosfopirydyny (obecnie określany jako NADP) tyreoliberyna, hormon uwalniający tyreotropine Tris/hydroksymetylo/aminometan, substancja często używana jako bufor transferowy RNA (patrz sRNA) tryptofan tyreotropina tyrozyna difosforan urydyny urydynodifosfoga laktoza urydynodifosfoglukoza kwas urydynodifosfoglukuronowy kwas urydynodifosfogiukuronowy monofosforan urydyny, urydyno-5'-fosforan, kwas urydylowy urydynotrifosforan maksymalna szybkość walina lipoproteiny o bardzo wysokiej gęstości kwas wanilinomigdatowy % objętościowy

933

SKOROWIDZ / 935

Skorowidz Abetalipoproteinemia 301, 326 Acanthosis nigricans 582 Acetoacylokoenzym A 299 Aceton 266 — stężenie we krwi 927 Acetooctan 266, 269, 368 stężenie we krwi 927 — synteza 270 2-Aoetylaminofluoren 826 Acetylo-(acylo)-tnalonyloenzym 252 Acetylo-CoA patrz: Acetylokoenzym A Acelylocholina 585, 589 Acctylocholinesteraza 888 N-Acetylogalaktozamitia 171,751 N-Acetylogłukc-zamina 171, 751 N-Acetyloglukozoamina 751 Acctyloheksozaminy 171 p-iJ-Acetyloheksozoaminidaza 766 Acetylokoenzym A (Acetylo-CoA) 189, 190. 194. 198, 199, 204, 205, 213, 255, 256 — powstawanie z aminokwasów 368 Acetylotransferaza dihydrol ipon i a nowa 213, 214 karnitynowa 261 niedobór 767 Achlorhydria 734 ACP 698 ACTH patrz: Kortykotropina Acydemia, izowalerianowa 381, 384 propiomanowa 384 Acyduria 851 argininobursztynianowa 356 di kar boksy Iowa 265 metylom a I on owa 227, 384, 728 orotowa 441 Acyloglicerol(e) 189, 284 kalabolizm 284 Acylotransferaza, 1 -acyloglicerolo-3-fosforanowa 286 acylo-CoA: cholesterol 319 - diacyloglicerolowa 286 glicerolo-3-fosforanowa 286, 310 — lecytyna: cholesterol (LCAT) 289, 303, 319, 322 — niedobór rodzinny 328 Adenina 416, 419 Adenowirusy 829 Adenozy]o-5r-monofo5foran 430 5-Adenozylometionina 387, 421 Adenozyna 418, 419 konformacje 419 pochodne 420 Adenozyno-5'-di fosforan 421 Adenozyno-3r-fosfo-5'-fosfosiarczan421 Adenozyno-3'-monofosforan 420 Adenozyno- 5 '-monofosforan 421 Adenozyno-5'-trifosforan 421

Adenozynodifosforan (ADP) 135, 151 — a kontrola oddychania 152 Adenozynomonofosforan (AMP) 135 Adenozynomonofosforan cykliczny (cAMP) 197,220,421 AdenozynotTifosforan (ATP) 133, 134, 151 wytwarzanie 203 — źródła w sercu 804 Adenylobursztynian 430 ADH patrz: Wazopresyna ADP patrz: Adenozynodi fosforan Adrenalina 220, 231, 237, 259, 397 biosynteza 395 stężenie we krwi 927 Aflatoksyna B, 826 Aglikon 166 Aglutynina kiełków pszenicy 753 AHG 784 AHH 819 Akcelerator konwersji protrombiny 784 ds-Akonitan 199-201 Akonitaza 200, 201 Akromegalia 604 Aktyna 797, 805, 875

s-Aktynina 806 Aktywator plazminogenu tkankowy 790 Aktywność optyczna cząsteczki 163 Alanina 39, 204 biosynteza 339 transaminacja 363 a-Alanina 386 p-Alanina 43 - biosynteza 386 Albmizm oczno-skómy, tyrozynazo--dodatni 395 tyrozynazo-ujemny 393, 395 Albinoidyzm otzno-skórny 395 Albumma(y) 261, 298, 408, 773 stężenie we krwi 915 Albuminemia 774 Aldehyd(y), glicerynowy 161 izomery 162 D-gliterynowy 165 malonowy 184 tłuszczowe 178 Aldolaza 209. 210 B247 treoninowa 367 Aldosteron 632, 633 transport w osoczu 635 Aldosteronizm pierwotny 644 Ałdozy 161 Aifa-fetoproteina 825 Alkaptonuria 370 Alkohole 178 Alkoholizm przewlekły 308 Allopurynol 424, 436

Amantadyna 902 Amenorrhoea 605 Amid kwasu nikotynowego 696 Amidoimidazoloka rboksyamidorybozylo-5-fosforan 429 Aminoacydurie 35 Aminocukry 171 — metabolizm 249 - synteza 250 Aminoi midazolobursztynylokarboksyamidprybozylo-5-fosforan 427 Aminoitnfcazolokarboksyaraidorybozylo-5-fosforan 427 Amin oimidazolokarboksylo-rybozylo-5-fosfbran 427 Aminoimidazolorybozylo-5-fosforan 427 Aminokwasy) 13, 189, 190, 193, 234 — biosynteza 338 - częściowo niezbędne w pożywieniu 343 degradacja 344, 345 dysocjacja 37 egzogenne 35, 191, 331, 337 endogenne 191, 204 glukogenne 358 glukoneogeniczny 352 - grupa, a-aminowa 37 -----e-aminowa 37 -----fenolowa 37 -----funkcyjne 36 -----guanidynowa 37 -----imidazolowa 37 -----a-karboksylowa 37 -----nie ct-karboksylowa 37 -----słabokwaśne 37 — sulfhydrylowa 37 katabolizm 347 -----szkieletów węglowych 357 ketogenne 358 konfiguracja bezwzględna 36 ładunek całkowity 37 metabolizm 121, 190, 191 nie a ważne dla metabolizmu ssaków 43 niepolame 39 niezbędne 35, 191, 345, 724, 725 oznaczanie ilościowe 44 podstawowe 35 polarne 39 punkt izoelektryczny 37 rozdzielanie 44 rozgałęzione, katabolizm 378, 380 oksydacyjna dekarboksylacja 378 ------zaburzenia metabolizmu 383 rozpuszczalność 38 równowagi protonowe 36

936 / SKOROWIDZ Aminokwasy), sekwencja a struktura Haka 66 synteza 191 temperatura topnienia 38 właściwości a struktura 43 wymiana między narządowa 351 po posiłku 353 -----w stanie poresorpcyjnym 352 — z łańcuchem bocznym, alifatycznym 39 — z atomem siarki 40 - zgrupą.kwaśnąlubjcgoamid40 --------hydroksylową 40 --------zasadową 40 — zawierające, pierścień aromatyczny 41 -----siarkę, wady metabolizmu 365 znaczenie biomedyczne 35 zjonizowany 36 a-Aminokwasy 347, 348 — nie występujące w biaikach ale istot ne w metabolizmie 41 L-a-Aminokwasy 36 Aminolipidy 173 y-Aminomaślan, metabolizm 396, 397 Aminopeptydaza(y) 345, 739, 742

Aminoproteinaza 812 Aminotransferaza(y) 158, 204, 347, 396 aktywność w surowicy 913, 927 glutamylo-PRPP, regulacja aktyw ności 432 tyrozyna: a-ketoglu taran 368 Aminy 35 aromatyczne 826 Amobarbital 147 Amoniak 344, 346, 349, 748 cząsteczka, dipolama 27 tetraedryczna 27 przemiana w wątrobie 351 stężenie we krwi 913, 927 tworzenie w nerkach 350 wydalanie 350 zatrucie 349 Amoniako-liaza histydynowa 117, 121 AMP patrz: Adenozynomoiiofosforan Amylaza 734, 739 aktywność w surowicy 914, 927 trzustkowa 742 Amylo-(l-4)-(l-6)-transglukozydaza 219 Amylo-(l-6)-glukozydaza 220 Amyloid 903 Amylopektyna 169 Amylopektynoza 225 Amyloza 169 Anabolizm 132 Anaerobioza 199 Androgeny 585, 588, 630 biosynteza, schemat 655 mechanizm działania 657 przemiana i wydalanie 636 rola fizjologiczna 657 synteza 634 Androstendion 630, 632, 656, 660 Androsteron, a stężenie potasu 638 — mechanizm działania 642 Angiotensydaza 637 Angiotensyna II 585, 589, 636

Anhy draża węglanowa 735 Ankiryna 874, 875 Anoksja 199, 200 Anomery 163 Anseryna 3Sfi, 387 Antybiotyki 167 polipeptydowe 51 Antychymoirypsyna at- 885 Antygen, D 878 rakowo-płodowy 825 Anty koagulanty kumarynowe 789 Antymycyna A 152 Antyoksydanty 713, 716 ttj-Antyplazmina 790 3,Antyproteaza 885 Antyproteaza(y) 885 ctj-Antyproteinaza, niedobór 777 Antytrombina III 789 3,Antytrypsyna, niedobór 777 — stężenie we krwi 927 Aparat stop-flow 110 Apoenzym 83 Apolipoproteinemia C-II 302 Apolipoproteiny 295 C303 E3O3 Apomioglobina 72 Apoproteiny 295 APP 903 Arabinoza 171, 424 DArabinoza 165 Arabinozylocytozyna 424 Arginaza 361 Argimna 40, 204, 343, 355, 361, 397, metabolizm 388 L-Arginina, kalabolizm 360 Argininobursztynaza 355 brak aktywności 356 Argininobursztynian 355 Arsenin 201 Askorbinian 244 Asparagina 40, 350 deaminacja 359 Asparaginaza 350 L-Asparaginaza 351 Asparaginian 204, 355 biosynteza 339 transaminacja 359 L-Asparaginian 125 AspAT 913, 927 Aspiryna 895 AST 013, 927 Astma 583 ctj-AT patrz: dj-Antyproteinaza Ataxia teleangiectasia 475 ATP patrz: Adenozynotrifosforan Atraktylozyd 152, 159 Atrotla mięśniowa rdzeń i owo-opuszkowa 898 Autoantygeny 769 Autooksydacja lipidów 184 Autoprzeciwciała 890 Autoradiografia 547 Awidyna 703 Azacytydyna 5423 Azaguanina 8-423 Azaseryna 430

Azatiopryna 424 5-Azaurydyna 423 6-Azaurydyna 441 Azot, aminokwasowy, katabolizm 347 bilans, dodatni 344 ujemny 344 katabolizm 353 metabolizm 349 mocznikowy 914 — stężenie we krwi 927 — produkty końcowe przemiany 346 Bakterie jelitowe 748 Bakteriofag(i) 464, 547 — lambda 513 Barbiturany 152 Barwniki żółciowe, krążenie jelitowo--wątrobowe410 w moczu 412 Benzo-a-piren 826 Białaczka(i) 845, 885 szpikowa, przewlekła 847 Bialko(a) 189, 194 4.1 875 a mikrofotografia elektronowa 68 adhezyjne 880 amyliodowe p 902 błon komórkowych 749 — erytrocytów 873 ero 525

degradacja 344 - szlaki 346 ------szybkość 345 denaturacja 62, 66 funkcje 60 G883 globuiarne 59 grupy modyfikowane 67 — hemowe 70 - jakość 345, 725 katabolizm 344, 345 klasyfikacja 59 kompleksy wielkocząsteczkowe 66 monomery 66 niehemowe zawierające żelazo 117 okres połowicznego rozpadu 345 oligomery 65 osocza 193, 749 całkowite 771 oznaczanie masy, cząsteczkowej 68 pasma I 874 podjednostki 66 pokarmów 190 polimorficzne 773 protomery 66 przemiana, a insulina 681 — przenoszące, acyl 252 -----estry cholesterolu 303, 322 -----skwalen i sterole 318 rozpuszczalność 59 sekwencja aminokwasów 65 a struktura drugo- i trzeciorzę dowa 66 stężenie we krwi 914, 927 struktura, p 64, 65 czwartorzędowa 65, 69

SKOROWIDZ / 937 Biaiko(a), struktura, czynniki stabilizu jące 61,'62 ---------badanie 68 -----drugorzędowa 65 —■--------badanie 67 -----globularna 65 — — helikalna 62 heliks a 65 - — łańcucha pofałdowanego 64 pierwszorzędowa 60, 65 —---------oznaczanie 67 -----trójwymiarowa 60? -----trzeciorzędowa 65 —---------badanie 67 -----zakręty (3 65 —----zwoju przypadkowego 65 synteza, elongacja 502, 503 inicjacja 500 - terminacja 502, 504 tkankowe 190 wartość energetyczna 723 wiązania elektrostatyczne 62 wiążące, kwasy tłuszczowe 261, 299 właściwości fizyczne 60 ■ - włókienkowe 60 wymiana 344 anionów 874, 875 - zapotrzebowanie 725, 732 znaczenie biomedyczne 59 żelazosiarkowe 148, 149 Biblioteka genomowa 536, 547 Bielactwo oczne 395 Bilans azotowy, dodatni 344 ujemny 344 Bilirubina 407 bezpośrednia 409. 411 — ■ pośrednia 411 sprzężona 409, 411 stężenie we krwi 915, 927 transport 409 wolna 411 wychwytywanie przez wątrobę 408 — wydzielanie 409 Biliwerdyna IX-« 407 Bioenergetyka, znaczenie biomedyczne 131 Biofosfatydyloglicerol 179 Biomolekuly, analiza metabolizmu 22 izolowanie 20 metody, określania struktury 21 -----rozdziału 21 Biopolimery, główne 16, 17 Biotyna 227, 251,702 1,3- Bisfosfogljcerynian 210, 211, 212 2,3- Bisfosfoglicerynian 78 Blotling 537 Blona(y), komórkowe, budowa 172 lipidowe 186, 187 mitochondrialne 179 przenośniki 157 — równowaga, elektryczna 158 osmotyczna 158 -----transport, anionów 159 -------kationów i 60 —- — układy transportujące 159 — przewodzenie bodźców nerwowych 568

-

Blona(y), struktura 43 systemy transportowe 565 sztuczne 556 Błonica 507 Błonnik 170 BMAA 901 Bradykimna 51, 881 Brak miesiączki 605 Bromocyjan 55 Buforowanie 32 Bufory 31 a- Bungarotoksyna 889 Bursztynian 107, 199, 201

cAMP patrz: Adenozynomonofosforan cykliczny CAP 511 CBG 629 CCK patrz: Cholecystokinina CDP patrz: CyIydynodifosforan CDPDiacyloglicero lo- iransferaza inozytolowa 286 CEA 825 Celiakia 747 Celobioza 168 Celuloza 170 Centromer 460 Ceramid 181, 293 biosynteza 290 Cerebrozydy 290 w błonach 551 Ceruloplazmina 776 stężenie we krwi 916, 927 cGMF patrz: Guanozyno-3',5'-monofosforan Chimera 547 Chityna 170, 171 Chlorki 729 — stężenie we krwi 916, 927 Chlorofil 398 Chioniak(i), Burkttta 834 Cholecystokinina 585, 691 Cholekalcyferol synteza 714 Cholera 590, 844, 855 Cholestaza 328 Cholesterol 182,183.189,190,191,294, 631, 632,634, 660 biosynteza 314, 317 regulacja 318, 319 równowaga, w komórce 320 — w tkankach 319 stężenie we krwi 916, 927 a dieta 325 — a leki hipolipemizujace 326 --------a styl życia 326 — transport 320 — odwrócony 322 w błonach 552 wydalanie 322 Cholesterologeneza 190 Cholestyramina 326 Cholina 179, 181, 307, 889 Chondroityno-4-siarczan 764 Choriocarcinoma 669 Choroba(y), a biochemia 843

Choroba(y), Addisona 609, 643 Alzheimera 902 przyczyny 904 Andersena 225 autoimmunologiczne 889 beri-beri 694 chromosomalne 846 Cori 225 Crohna 773 Farbera292 Forbesa 225 Gauchera 292,845, 851 genetyczne, 848 -----diagnostyka 92 -----leczenie 850 -----testy 850 — von Gierkego 225, 440 - Gravesa-Basedowa 582, 618 — Hartnupów 377, 387, 698, 728, 734, 747 — - hemSStyczna noworodków 879 Hersa 225 Humingtona 892 jednogenowe 846 - Krabbego 292 miąższu wątrobowego 32S „moczu o zapachu syropu klonowe go" 383 niedokrwienna serca 325, 727, 847 Niemanna-Picka 292 Parkinsona 897, 899 Pompego 225 receptorowe 583 Refsuma 265 Sandhoffa 292, 766 - spichrzania cystyny 366 -----glikolipidów 284 -----lipidów 293 szerokiego pasma p 327 Tarui'ego 225 Tay-Sachsa 292, 766, 844 trzewna 747 - upośledzonego usuwania remnantów 327 wieńcowa 325, 727, 847 Wilsona 388, 776, 846 Wolmana 327 wtrętów komórkowych 761, 767, 844 wymiotna jamajska 265 wyspy Tangier 326 ziarnicza przewlekła 884 Chrom 730 zapotrzebowanie 732 Chromatografia 21, 44, 52 bibułowa 44 -----dwuwymiarowa 46 cieczowa, wysokociśnieniowa w fa zie odwróconej 52 cienkowarstwowa 46, 185, 186 gazowa 751 — - gazowo-cieczowa 185 hydrofobowa 88 jonowymienna 46, 87 podziałowa 45 powinowactwa 88, 751 z barwnikiem jako ligandem 88

938 / SKOROWIDZ Chromatydy 460 Chromatyna 456 Chromosom(y), PhiJadelphia 834 — politeniczne 459 Chrząstka 764 Chylomikrony 193, 295, 299 — katabolizm 301 resztkowe 302 Chyluria 746 Chymotrypsyna 738 działanie, etapy reakcji 111 mechanizm U0 system przekazywania ładunku 112 Ciałko(a) Heiza 871 Ciało(a) ketonowe 190, 191, 194, 260, 266—268, 331 utlenianie 334 Ciąża 664 stężenie, hormonów prawidłowe 665 Ciśnienie cząsteczkowe dwutlenku wę gla we krwi 927 CK. patrz: Fosfokinaza kreatynowa CLIP 607 Clomid 668 CMP patrz: Cytydynomonofosforan CoA patrz: Koenzym A COMT 645 CoQ patrz: Koenzym Q CPK patrz: Fosfokinaza kieatynowa CRBP 712 CRH patrz: Hormon uwalniający kortykotropinę Crossing-over 463 CS patrz: Somatomammotropina fcosmówkowa CT patrz: Kalcytonina CTP patrz: Cytydynotrifosforan Cukrzyca 237, 260, 267, 268, 298, 335, 678, 726, 734

a zaćma 247 niewyrównana 307 typu I z kwasicą ketonową 862 typu II 583 Cyjanki 147, 152 ^ Cyjankobalamina, stężenie we krwi 927 Cykl(e), adenozynotrifosforan/adenozynodi fosforan 135, 136 alaninowo-glukozowy 235 Cori 234 glukoza-alanina 234, 352 glukoza-kwasy tłuszczowe 333 hydroksylacyjny 144 koenzymu Q 155 kwasu cytrynowego 135, 148, 189, 191, 194, 198, 199, 200, 20i, 205, 216, 226, 271 -----a glikoliza 213 — rola w metabolizmie 203 ------wytwarzanie ATP 203 kwasu mlekowego 235 miesiączkowy 663 mocznikowy 353, 355 nukleotydów purynowych 422 pentozofosforanowy 189. 191, 87i, 883 substratowe 233

Cyklaza, adenylanowa 220, 311, 421, 589, 595, 792 -------w błonach 554 guanylanowa 595 guanylowa 422 Cykloheksymid 506 Cyklooksygenaza 279, 280 Cynk, rola, niedobór 731 stężenie we krwi 927 zapotrzebowanie 733 Cystationina 377 Cysteina 40, 204, 369, 388 biosynteza 340 transami nacja wstępna 365 zapotrzebowanie 725 L-Cysleina. katabolizm 364 Cystyna 40, 41, 363 Cystyno-lizynuria 365 Cystynoza 366 Cystynuria 365 Cytarabina 424 Cytochrom(y) 148, 199, 399 aa3 140 b-245 883 — b, 144 b-558 883 P-448 819, 826 P-450 139,144,631, 818 jako dehydrogenazy 142 Cytopiazma 194 Cytoszkielet 805 Cytozol 194 Cytozyna416, 419,449 — pochodne 423 Cytrulina 42, 355 Cytrulinemia 356 Cytrynian 159, 194, 198, 199,200,201, 204, 205, 258 klomifenn 668 translokacja 256 Cytydyna 418, 419 Cytydynodifosforan (CDP) 286 Cytydynomonofosforan (CMP) 286 Cytydynotrifosforan (CTP) 137, 286 Cząsteczka©, aktywność optyczna 163 amoniaku, dipolarna 27 tetraedryczna 27 biegunowa 27 asocjacja 28 dipolarna 27 dysocjacja 28 jonizowanie 28 -----tetraedryczna 27 Czółenko fosfokreatynowe 136 Czynnik(i), aktywujący płytki krwi (PAF)284, 287, 881,894 ------biosynteza 288 antyhemofilowy, A 784 B 784 chemotaktyczne 880 Christmasa 784 Hagematia 784 - krzepnięcia krwi 784, 785 — lipotropowy 307 poprzedzający tromboplastynę osoczową 784 Rh878

Czynnik(i), rho 479 stabilizujący, fibrynę 784 —- Stuarta-Prowera 784 układu dopełniacza 881 von WiUebranda 791, 882 wewnętrzny 704 brak 704 wzrostowe hemopoetyczne 868 fibroblastyczny 585 — insulinopodobne 585, 837 —■ — polipeptydowe 837 -----komórek nerwowych 585, 599, 837 ------naskórkowy 585, 837, 838 — nerwowy 585, 837 -----pochodzenia płytkowego 585, 838 -----transformujący 837 nerwów 585, 599, 837 DAG patrz: Diacyloglicerol Daktynomycyna 826 DBH645 Deaminacja 190, 191, 193, 203 — oksydacyjna 348 Deaminaza. adenozyn owa, niedobór 440, 542, 885 Defenzyny 881,883 Degradacja, Edmana 54 — enzymu 119 Dehydrataza, serynowa 121 7-Dehydrochoiesterol 714 Dehydroepiandrosteron (DHEA) 629, 630, 632, 666 Dehydrogenaza(y), acylo-CoA 142, 262, 695 a koenzymy nikotyn oamidowe 141 aldehydowa 140, 695 alkoholowa 117, 308 bursztynianowa 107, 142,201,202, 216 dihydrolipoilowa 696 dihydroorotanowa 434, 435 6-fosfoglukonianowa 241 gliceraldehyd o- 3- fosforanów a 1 57. 209,210, 212, 216 glicerolo-a-fosforanowa 121, 157, 209, 210, 212, 216 glicerolo-3-fosforanowa 157, 229, 595 — glukozo-6-fosforanowa 121, 241 niedobór 866, 871 glutaminianowa 338 L-glutaminianowa 349 glutaranowa 216 L{ + )-3-hydroksyacylo-CoA 264 3-hydroksymaślanowa 157 15-hydroksyprostaglandynowa 281 3p-hydroksysteroidowa 653 17-fMiydroksysteroidowa 654 1MP 429, 430 -----regulacja aktywności 432 — izocytrynianowa 200, 201, 216, 255 jabłczanowa 158, 201, 202, 216 dekarboksylująca 255 ot-ketoglutarowa 201, 202

SKOROWIDZ / 939 (>eh v d rogenaza(y), mi Eochondrialna glicerolo-3-fosforanowa 142 — mleczanowa 209, 212, 396, 696 - izoenzymy 90, 917 ------stężenie we krwi 917 — NADH 142. 150, 696 — pirogromanowa 128, 205, 213, 214, 232, 310, 595,685 - regulacja aktywności 214. 215, 258 przenoszenie wodoru 141 semialdehydu burszryniauowego 396 sorbitolowa 247 sukcynylowa 695 transport elektronów 141 utlenianie metabolitu 141 - zależne od, NAD 141 NAD+, oznaczanie 86 NADH 142, 150,696 NADP 142 -----ryboflawiny 142 Dekarboksylacja oksydacyjna 200 Dekarbok sy I aza, S- adenozyl ometion i -nowa 390 — L-aminokwasów aromatycznych 388 - DOPA 397 - rola 647 L-gLitaminianowa 396 histydynowa 388 a-ketokwasowa 383, 384 omitynowa 390 oro łydy la nowa, niedobór 441 pirpgronianowa 1 J7 — uroporfirygenowa 400, 402, 403, 404 Deksametazon 632 Dekstroza 164 Dekstrynoza, graniczna 225 Dekstryny 161, 170 Demekolcyna 810 Denaturacja, białka 66 DNA 447 enzymu 100 2-Deoksy-D-rybofuranoza 167 Deoksyadenozylokobalamirja 704 Deoksy adenozyna 419 2' -Deo ksyadenozyno- 5 - monofosforan 420 Deoksyadenylan 443 Deoksycukry 167 Deoksycytydylan 443 Deofcsycytydyna 419 Deoksyguanozyna 419 Deoksyguanylan 443 11Deoksykortykostcron 632 11Deoksykortyzol 632 Deoksynojirimycyna 761 Deoksynukleotydy 443 Deoksyrybonukłeazy 488, 739, 742 Deoksyrybonukleotydy 419 Deoksyryboza lf>6 Depreml 901, 902 Depurynacja DNA 473 A*-Desaluraza 275, 276 Desmina 811

Desmolaza, cholesterolowa, niedobór 644 Desmosterol 318 Detoksykacja 818 DHEA patrz: Dehydroepiandrosteron DHT patrz: Dihydrotestosteron Diacyloglicerol (DAG) 180, 597, 791, 883 Diagnostyka prenatalna 545 hemofilii 790 w chorobie Huntingtona 892 Diazonorleucyna 430 Dietylostylbestrol 667 Difosfohydroksyetylotiamina 214 Difosfotiamina 214 Diglukuronid, bilirubiny 409 Dihydrodiol 822 Dihydrofolian 435 Dihydroksyaceton 161, 164 Di hyd rok syacetono fosforan 157, 210, 286 1,25-Dihydroksycholekalcyferol 715 24,25-Dihydroksycholekalcyferol 715 3,4-Dihydroksyfenyloalanina 42 Dihydroorotaza 122, 434, 435 Dihydrotestosteron (DHT) 653, 656, 660 Diizopropylofluorofbsforan 891 Dijodotyronina (DIT) 3,5Dijorozyna 42 Dijodotyrozyna 612, 613 Dikumaroi 719, 789 Dimerkaptol 152 N6-NeDimetyloadenina 416 Di nitrofenol i 52 Dinukleotyd, adenin owy 696 flawinoadcninowy (FAD) 140, 203, 69i flawinowy 695 nikotynoamidoadeninowy (NAD+) 83, 141, 203 Dioksygenaza(y) 144 homogentyzynowa 144 3-hydroksyamranilanowa 144 4-hydroksyfenylopirogronianowa 368 — L-tryptofanowa 144 1,2-Dioksygeneza homogentyzynianowa 368, 370 2,3-Dtoksygenaza tryptofknowa 375, 399 Dipalmitoiiofosfatydylocholina287 Dipalmitoilo lecytyna 179 Dipeptydaza(y) 742 aminoacylohistydynowa, niedobór 387 Dipol 27 Disacharyduria 745 Disacharydy 161, 168, 169 Disulfiduria merkaplomleczano-cysteinowa 365 DIT patrz: Dijodotyromna DNA patrz: Kwas deoksyrybonukkotydowy Dolichol 184, 318, 756 — biosynteza 316 Dolicholo-Poligosacharyd 758

Dppa 42 Dopa a- 901 Dopamina 600 Dwutlenek węgla 189, 190, 194. 198, 205 Dyfrakcja, promieniami X 21 Dyfuzja, bierna 563 prosta 743 ułatwiona 565 Dyneina 810 Dysbetalipoproteinemia rodzinna 327 Dysgeneza gonad 669 Dyslipoprotcinemie 326 Dysmutaza, ponadtlenkowa 145, 146, 870, 883 Dysocjacja wody 28 Dystrofia, mięśniowa typu Duchenne'a 794, 847, 860 — miotoniczna 898 Dziedziczność 443 Edrofonium 891 Efekt, Bohra 77, 78 — buforujący 33 Pasteura 232 Efektor(y) allosteryczne 123, 125, 196 ujemny 124 EGF 585 Egzocytoza 571 Egzonukleaza 474, 547 Eikozanoidy 174,881, 894 biosynteza 279, 280 Ekscytytotoksyny 892 Eksony484, 491, 530, 547 Eksplozja tlenowa 883 Ekspresja genu 508 Elastaza 738, 885 Eiastyna8I4 a kolagen, różnice 815 Elektroforegram 47 Elektroforeza 21, 771 w żelu poliakryloamidowym 53 wysokonapięciowa 47, 52 na sitach molekularnych 53 SDS-PAGE 872 Elektrolity 26 Elektrony przenoszenie 141 przez cytochromy 142 w łańcuchu oddechowym 142 Eliptocytoza dziedziczna 876 Emulsje 186, 187 Encefalopatia 147 motochondialna 896 Wernickego 694 Endocytoza 569 Endoglikozydaza 752 Endonadtlenek 184 Endonukleaza(y) 488, 531, 547 apirymidynowa 474 apurynowa 474 restrykcyjne 92, 489 Endopeplydazy 345 p-Endorfiny 575, 607 Endorfiny, struktura i funkcja 609 Energia swobodna 131 Enkefaliny 691

940 / SKOROWfDZ Enolaza 209, 211 Entalpia 132 Enteroglukagon 691 Entropia 131 Etizym(y), aktywność, a jony metali 115, 116, 117 -----a modulatory 109 -----a oznaczanie ilości 86 -----a pH 100 -----a temperatura 100 -----hamowanie, kompetycyjne 108 ---------kooperatywne 135 -----kumulatywne 125 - — przez sprzężenie zwrotne 121 127 -----------wielowartokiowe 125 —inhibitor, allosteryczny 126 zwrotny 124 -----katalityczna, regulacja 122 -----regulacja 118 aktywowane przez metale 115 allosteryczne 125 -----kinetyka wiązania substratu 126 ■ wiązanie substratu, kooperaty wne 126, 127 analiza ilościowa 86, 87 biosyntezy hemu 404 degradacja 119, 345 regulowanie 121 denaturacja 100 działanie mechanizm 84 hydrolityczne, miejsca katalityczne 99 indukcja 118 inhibitory, kompetycyjne 107 -----niekompetycyjne 107 ---------nieodwracalne 109 ----— odwracalne 109 — jako katalizatory kwasowo-zasadowe 114, 115 — kinetyka nasycenia substratem 106 klasyfikacja 82 kobal amidowe 117 kompartmentacja 122 kompleksy wielkocząsteifcijowe 123 konstytutywne 120 mechanizm działania 110 -----a doświadczenia stop-flow 110 -----a jony metali ! 16. 117 - — miejsca aktywne 97 ------allosteryczne 124, 125 — ■-----a inhibitory 107 -----foslbrylacji 137 - katalityczne 97, 99, 125 ------a inhibitory 107 — model, indukowanego dopasowa nia się 98 -----zamka i klucza 98 modyfikacja kowaiencyjn a 196,197 nazewnictwo 82 obrót metaboliczny 120 oczyszczanie 87, 88 odgałęziający 220 oligomeryczne 90 osocza, analiza ilościowa 91 i -----niefunkcjonalne 91, 92 -----wykorzystaniediagnostyczne92

Enzymd1}, powinowactwo do substratu 106 procesów syntez 197 przekształcający angiotensynę 637 reakcja, zastąpienia 94 -----a stężenie substratu 101, 103 -----szybkość początkowa 103, 104 — regulacja, aktywności 118 przez modyfikację kowalencyj ną 127, 128 -----mechanizmy 119 -----nieprawidłowa w komórkach nowotworowych 118 — — przez efektory allosteryczne 123 -----przez kationy 123 — — przez koenzymy 123 przez metabolity 123 -----przez sprzężenie zwrotne 123, 124, 127 — — przez substraty 123 -----przez syntezę proenzymu 122 regulatorowe 123, 195 restrykcyjne 93 rozgałęziający 219 rozmieszczenie w komórce 89 rozszczepiający cytrynian 122 równowaga, dynamiczna 121 sprawność katalityczna 122 stan przejściowy 94, 95 zmiany wolnej energii 95 struktura czwartorzędowa 69 swoistość 85 ■----- optyczna 85 — synteza 119 derepresja 120 -----induktory, gratisowe 120 ----- korepresory 112 -----represja za pomocą, katabolitu 120 -----------produktu 120 szlaku degradacji 197 wątroby szczura, adaptacja do zmian w środowisku 121 wiązanie substratu 114 zmiana ładunku 101 znaczenie biomedyczne 82, 94 Epimeraza 248 urydynodifosfogalaktozowa 290 3-Epimeraza rybulozo- 5-fbsforan owa 241 Epimcry 164 Epinefryna, stężenie we krwi 927 Epoksydaza, skwalenowa 317 Epoksydy 822 Ergokalcyferol 714 Ergosterol 183 Ergotioneina 386, 388 Erytrocyt(y), białka błony 873 budowa i funkcja 866 metabolizm 869 sierpowaty 81 uwalnianie tlenu 213 Erytrokruoryny 399 Erytropoetyna 837, 867, 885 Erytroza 161 D-Erytroza 165

Erytruloza 161 Esteraza cholesterolowa 319 Estradiol 632, 653, 656 — rozwój gruczołu sutkowego 666 17-P-Estradiol 631, 661, 663 Estriol 632, 666 Estrogeny 585, 588, 660 biosynteza 660 funkcja 664 mechanizm działania 668 metabolizm 661 syntetyczne 667 Estron 632, 656 Estry cholesterolu 294, 295 osocza 322 Estryfikacja 190, 308 Etanol 307 zatrucie 858 Etanolamirta 180 Elanoloamina 180 Etiocholanon 632 N-Etylomaleimid 159 17ct-Etynyloestradiol 667 Euchromatyna 459 Eumelaniny 394 FAD patrz: Dinukleotyd flawinoadeninowy Fagi 534 Faza, folikularna. 663, 664 lutealna 663, 664 Fenolaza 140 Fenotiazyny 802 Fenyloalanina 41, 204 hydroksylacja 371 katabolizm szlaki alternatywne 373 zaburzenia 371 metabolity 372 — - zapotrzebowanie 725 Fenyloizotiocyjanian 56 Fenyloketonuria 13, 542, 847, 848, 851 — klasyczna 371, 372 Feomelaniny 394 Ferrechelataza 400, 401, 403, 404 Ferryna stężenie we krwi 927 Ferrytyna 775 FGF 585 Fibronektyna 814, 882 hibryna 787, 790 Fibrynogen 784, 785, 787 -- stężenie we krwi 927 Fibrynoligaza 784 Fibrynopeplydy A 787 Filamenty pośrednie 811 Fi lani i na 806 Filtracja żelowa 21, 52, 87 Flawina 695 Flawoproteina{y) 140, 148, 199, 202, 348 — przenosząca elektrony 142, 264 Horyzyna 237 Fluor 731 — zapotrzebowanie 732 ' Fluorescamina 44 l-Fluoro-2,4-di nitrobenzen 54 Fluorocytrynian 200, 201

9ct-Fluorokortyzol 632 5-Fluorouracyl 423, 436 FMN patrz: Mononukleotyd flawinowy Folacyna 705 Folkropina (FSH) 585, 599, 657, 784 -- działanie 606 — spermatogeneza 657 ł'ormamidaza 375 Fo rmyloglicynoatnid orybozy I o- 5-fosforan 427 Fosfagen(y) 135, S03 Fosfataza(y) 740 - białek 128 — białek-1 220, 221, 223, 224

—2,3-bisfo5foglicerynianowa212,213 fosfoprotein 594 2p-fosfoproteinowa 595 kwaśna, aktywność 918, 928 gruczołu krokowego 825 zasadowa aktywność 918, 928 Fosfatydan 286 5-Fosfatydylo-l-pirofosforan(PRPP) Fosfatydylocholiny 179 — metabolizm 289 Fosfalydyloetanoloamina 179 3-Fosfatydyloetanoloamina 180 Fosfatydyloglicerol 179 Fosfatydyloinozytol 180 Fosfatydyl o inozy tol o-4.5-bisfosforan 180, 791 Fosfatydyloseryna 180 Fosfodiesterazafy) 220. 422, 593, 685 CAMP421 — cyklicznego, 3', 5'-nukleotydu 311 ----- nukleotydu 595 Fosfoenoiopirogronian 194, 204, 211, 212, 226 Fosfofruktokinaza 209, 210, 212, 246 Fosfofruktokinaza-1 232 Fosfofruklokinaza-2 232 Fosfoglicerole biosynteza 286 Fosfoglicerydy 179, 180 2Fosfoglicerynian 211 3Fosfoglicerynian 210, 211, 212 Fosfoglukomutaza 217 Fosfohydrolaza fosfatydanowa 286 hosfoinozytydy 594, 596 Fosfokinaza kreatynowa 803, 919, 928 Fosfokreatyna 136 Fosfolipaza(y) 2S7, 289, 740, 742 A, 289 Aj 289, 595, 739 C289 C597 C791

C883

D 289

Fosfolipidy 173, 179,187, 289, 294, 302 glicerolowe biosynteza 287 płytkowe 7S4 w błonach 551 4'-Fosfopanteteina 698 Fosfoproteiny 592 Fosfor 729 nieorganiczny stężenie we krwi 919, 928 -łl- -.1 Jn I.

Fosfor, zapotrzebowanie 733 Fosfbran(y). dinukleotydu nikotynoamid o-adeni nowego (NADP+) 141, 239,240, 241, 255,696 kreatyny 803 organiczne bogatoenergetyczne 133, 134, 199 -----energia swobodna hydrolizy 134 -----małoenergetyczne 134 — pirydoksalu 347, 700, 702 5-Fosforybozulo-l-pirofosforan 427 Fosforybozylacja wolnej puryny 430 Fosforybozylotransferaza, adeninowa 430 — hipoksantynowo-guaninowa 430, 431,440 — orotanowa 434, 435, 436 -----niedobór 441 Fosforylacja, oksydacyjna 135, 147, 151, 191, 199, 803 subsLratowa 216 wielomiejscowa 225 Fosforylaza 685 a 197, 225 b220 glikogenowa 128 nukleozydowa puryn niedobór 440 w mięśniu 222 Fosfotransferaza 117 Fragmenty Okazaki 468 Frakcja{e), cytoplazmy 20 jądrowa 20 mikrosomalna 20 mitochondrialna 20 wewnątrzkomórkowe 20 Frakcjonowanie, subkomórkowe 18 za pomocą soli 21 Fruktokinaza 247 Fruktoza 161, 247 — metabolizm 245, 246 — nietolerancja wrodzona 247 D-Fruktoza 164, 166 Fruktozo-1,6-bisfosfataza 121, 227, 243, 247 niedobór 237 Fruktozo- 1,6-bisfosforan 210, 227 fruktozo- 2,6- bisfosfataza 232, 685 Fruktozo-2,6-bisfosforan 232, 233 Fruktozo-6-fosforan 210, 227 6Fruktozo-2-kinaza 685 Fruktozobisfosfataza 121 Fruktozuria samoistna 239, 247 Fruktozydoza 292 FSH patrz: Folitropina Fukoza 751 L-Fukoza 167, 171, 172 Fukozydaza 767 Fumaran 107, 194, 199, 201, 202, 204, 355, 36S Fumaraza 202, 220

CAG patrz: Glikozaminoglikany Galactorrhoea 605 Galaktocerebtozyd 181 Galaktokinaza 248

J3 a laktoza 161. Ti szlak przemiaay 9BH — test tolerancji 14* D-Galaktoza 165, 166 a-D-Galakioza 164 Galaktozamina 167. 250 Galaktozemia(e) 239, 249, Ul Galaktozydaza 752 p-Ga laktozydaza 766 Galaktozydy 167 Galaktozyloceramid 181, 290 Galaktozylotransferaza 554 Gangliozydoza uogólniona 292 Gangliozydy 172, 181, 182, biosynteza 291 w błonach 551 GAP 599, 600 Gastroenteropatia z utraty białka 773 Gastryna 585, 691 Gemfibrozyl 326 Gen(yj^annplirikacja 835 chimeryczne 523 ekspresja 508 fuzyjne 523, 588 hamujące wzrost nowotworu 839 homologiczne polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych 93 indukowatny 510 insuliny 677 mapowanie 541 MT-PK 898 regulacja ekspresji 516, 518 metody 518 Z 512 Genom mitochondriaJny mutacje 847 Gęstość względna 928 GH patrz: Hormon wzrostu GHRH patrz: hormon uwalniający hormon wzrostu GHRIH patrz: Hormon hamujący uwalnianie hormonu wzrostu GIP patrz: Peptyd żołądkowy hamujmy Giraza bakteryjna 447 GIcNAcdifosfo-dolichol 757 Gliceraldehydo3-fosforan 210, 211, 239

Glicerofosfolipidy 173 Glicerofosforan 194 Glicerol 194, 227, 234, 334 Glicerolo-2,3,-bisfosforan 212 Glicerolo-3-fosforan 157, 308 Glicerolofosfolipidy degradacja 287 Ghcyna 39, 204, 363, 397, 400 — biosynteza 339 katabolizm 362 Glicynoami dorybozylo- 5-fosforan427 Glicynuria 362 Glikoforyna(y) 172, 874, 875, 879 Glikogen 161. 169, 170, 189, 191, 194, 207, 219, 227 biosynteza 217, 218 choroby spichrzania 217, 225 metabolizm, regulacja 220, 224 — w wątrobie 225 Glikogenogeneza 192, 218, 219 regulacja 220. 224

942 / SKOROWIDZ Glikogenoliza 192, 218, 219, 234 enzymy 230 pobudzanie 233 regulacja 220, 224 w mięśniu 221 w wątrobie 221 Glikogenoza typ I 225 typ II 225 typ III 225 typ IV 225 typ V 225 typ VI 225 — typ VII 225 - typ VIII 228 z niedoboru miofosforylazy 225 Glikokaliks 172 Glikokortykoidy a lipoliza 310 Glikokortykosteroidy 237 Glikolipidy 173, 181, 248 — choroby spichrzeniowe 284 Glikoliza 135, 189, 191. 207, 208,216, 226, 308 a cykl kwasu cytrynowego 213 enzymy 230 etapy 212 hamowanie 213, 231 pobudzanie 233 regulacja w wątrobie 228, 229, 233 Glikoneoseneza znaczenie biomedycz ne 226 Glikoproteiny 167, 171, 172, 248, 250, 749 degradacja 346 Funkcje 749 glikozydacja 760 klasy 753 Glikosfmgolipidy 173, 181, 250, 290, 291 — w błonach 551 Glikozaminoglikany (GAG) 171, 749, 761 — właściwości 763 Glikozuria 237 Glikozydacja giikoprotein 760 Glikozydazy 752 "**> Glikozydy 165 — nasercowe 167 Globina 407 Giobulina(y), antyhemofilowa 784 — stężenie we krwi 928 — wiążąca, hormony płciowe 655 -----kortykosteroidy 629, 635 -----testosteron i estrogeny 655 -----tyroksynę 616 ---------stężenie we krwi 920 Glukagon 220. 231, 236, 259, 585. 589, 671, 672 — rola 688 — sekwencja aminokwasowa 689 — synteza 68 Glukany 169 Glukokinaza 208, 209, 212, 217, 234, 236 Glukokortykoidy 585 efekty biologiczne 638 mechanizm działania 640 przemiana i wydalanie 635

Glukokortykoidy. regulacja syntezy 636 synteza 634 transport w osoczu 635 Glukoneogencza 192, 303, 204, 234, 331, 704 a insulina 680 enzymy 230 pobudzanie 231 regulacja w wątrobie 228, 229, 233 — z białek 334 D-Glukopiranoza stereoizomery 164 Giukoza 161, 189, 193, 194, 204, 205, 227, 308, 403, 751 a stężenie insuliny 677 epimeryzacja 164 izomery 162 metabolizm 191 zwiększony 309 postać, furanozowa 163 pirazonowa 163 próg nerkowy 237 stężenie, fizjologiczne we krwi 217 ---------we krwi 920, 928 ---------a hormony przedniego piąta przysadki 236 ---------a hormony tarczycy 237 ---------a insulina 236, 677 ---------regulacja 233, 234 tolerancja organizmu 237, 238 transport 568 przez błony 744 utlenianie minimalne 331 zapotrzebowanie 226 źródła 234 D-Glukoza 165, 166 2-D-Glukoza 164 Glukozami na 167 Glukozami nogi i kany 250 Glukozany 169 Glukozo fosforany 5 89 Glukozo-6-fosfataza 227, 554 Glukozo-1-fosforan 227 Glukozo-6-fosforan 208, 210, 220, 227, 239 Glukozoamina 250 Glukozuria 237 nerkowa 237 Glukozydy 166 Glukozyloceramid 181, 2.90 G luk uro niań 244 a-D-Glukuronian 165 Glukuronidacja 819 P-Glukuronidaza(y) 410 niedobór 767 Glukuronidy 239 sprzęgnięte 244 Glutamina 40, 204, 350, 427 biosynteza 339 deaminacja 359 Glutaminaza 350 Glutaminian !58, 204, 347 biosynteza 338 transaminacja 359 Ł-Glutaminian 348 Ghitation 51,870 Głodzenie 306

Głodzenie, parametry metaboliczne 333 Gnilec 709 GnRH patrz: Hormon uwalniający gonadotropinę Gonad oliberyna 585, 599, 600 Gonadotropina(y) 606, 663 — kosmówkowa (HCG) 575, 585, 589, 575, 585, 589, 599 -----działanie 606 -----funkcja 664 -----stężenie w ciąży 665 Granulocyty 865 — obojetnochłonne, cechy biochemi czne 880 -----enzymy i białka 881 GRH 599 Gruczolak przytarczyc 624 Gruczoi(y), Brunnera 739, 742 — Ebnera 734 języka 741 -- sutkowy 666 Grupa{y) 143 aminowa 36 —a-aminowa 347 - karboksylowa 36 krwi 876 Gryzeofulwina 819 Grzebień nerwowy 574 Guanaza 433 Guanina416, 419, 449 Guanozyna418, 419 pochodne 422 Guanozyno-3', 5r-monofosforan (cGMP) 422 Guanozynotrifosforan 137 Guz chromochlonny 651 Hamowanie kompetycyjne 108 Haptoglobina(y) 774 — stężenie we krwi 928 HDL patrz: Lipoproteiny o dużej gęstości Heksokinaza 136, 195, 208, 209, 212, 217,236 oznaczanie 87 Heksozoaminy 249, 250 Heksozy 161, 171 szlaki przemian 239 znaczenie fizjologiczne 166 Heliks a 62 Hem 70, 398 — biosynteza 385, 400, 401 enzymy 404 -----regulacja 404 katabolizm 407 metabolity 404 -----zaburzenia 405 Hematokryt 867 Hematyna 403 Hemina 407 Hemochromatoza 846 pierwotna 776 » Hemofilia 847,851 A 789 B789

SKOROWIDZ / 943 Hemoglobina(y), 70, 407 a transport dwutlenku węgla 77 A 74, 79 A, 74 F74 funkcje 74 krzywa dysocjacji tlenowej 73 M 79 mutacje 19 płodowa 74, 78, 79 podobieństwo do mioglobiny 74 postać R 75. 76 -----T 75, 76 ' ---------stabilizacja 78 powinowactwo do tlenu 74 S79 -----agregacja 80 -----lepkie miejsca 79 — utlenowanie 74 -----a zmiany konformacji 75, 76 właściwości aliostcryczne 74 zwiększenie powinowactwa do tle nu 79 Hemoglobitiopatia(e) 79 — HbS 847 Hemoliza 241 Hemopeksyna 775 Hemoproteiny 117, 398 Hemostaza etapy 783 Hemosyderyna 776 Heparyna 171, 302, a 763, 765, 768 jako anty koagulant 789 Hepatocyt szczura 18 Hepat omega lia 845 Heterocbromatyna 459 fakultatywna 459 konstytutywna 459 Hialuronidaza 766 Hiperalaninemia 728 Hiperalfalipoproteinemia rodzinna 328 Hiperamonemia(e) 355 z hiperlizynemią 375 Hipcrargininemia 356, 361 Hiper-p-alanincmia 386 Hiperbilirubinemia niesprzężona 411 retencyjna 411 sprzężona 411, 412 toksyczna 412 zwrotna 411 Hipercholesterolemia 325 rodzinna 303, 847 — typ II 327 Hiperfenyloalaninemie 371, 372 Hiperglikemia 678 Hiperhydroksyprolinemia 367 Hiperkalcemia 926 Hiperkalemia 923 Hiperlipoproteinemia(e) 327 rodzinna, typ III 327

----- typ V 327

Hiperlizynemią okresowa, bez hiperamonem ii 375 — z hiperamonemią 375 Hipermagnezemia 922 Hipernatremia 923 Hiperoksaluria pierwotna 362 Hiperprolinemie 359

Hipersyderemia 927 Hipertriacyloglicerolemia rodzinna 327 Hiperurykemia 439, 921 Hiperurykozuria 922 tfiperwalinemia 383 Hipobetahpoproteinemia rodzinna 326 Hipoglicyn 265 Hipoglikemia 236, 237, 238, 247 Hipogonadyzm 659 u kobiet, pierwotny 669 wtórny 669 u mężczyzn, pierwotny 659 -----wtórny 659 Hipokalcemia 926 Hipoka letnia 923 Hipoksantyna 416 — pochodne 422 Hipoksja 199, 200 Hipolipoproteincraia 326 Hipomagnezemia 922 Hiponatremia 923 Hiposyderemia 927 Hipourykemia(e) 439, 440, 922 Hipuran biosynteza 385, 386 Histamina 385, 881 Histony 456 Histydyna40. 41, 204,343 dekarboksylacja 388 katabolizm 361 zapotrzebowanie 725 Histydynemia 362 HMM 798 Holoenzym 83 Homeostaza 94, 118 fosforanowa rola paratbormonu 623 komórkowa 119 — wapniowa rola paralhormonu 623 Homocysteina 377, 41 Homocystynuna(e) 366, 728 Homogentyzynian 368 Homokarnozyna 386, 387 Homoseryna 41, 379 Hormon(y), adrenokortykotropowy patrz: Kortykotropina — antydiuretyczny (ADH) patrz: Wazopresyna charakterystyka układów 573 i— działanie 584 gJikoproteinowe 605 gonadalne 652 — hamujący uwalnianie, hormonu wzrostu (GHR1H) 599 -----proiak-tyny (PRIH) 600 jajnikowe 659 rola 662 katecholaminowe 645 kontrola metabolizmu 196 konwersja 575 - kortykotropowy (ACTH) patrz: Kortykotropina — kory nadnerczy 629 laktotropowy patrz: Prolaktyna luteinizujący patrz: Lutropina luteotropowy patrz: Prolaktyna łożyskowe 664 narządy docelowe 576

Hprmonfy), pobudzający melanocyty patrz: Melanotropina 609 podstawy klasyfikacji 584 przedniego ptata przysadki a stęże nie glukozy we krwi 236 przekaźniki działania wtórne 2S4 rdzenia nadnerczy 645 receptory 578 — tarczycy 612 a lipoliza 310 -----a stężenie glukozy we krwi -----mechanizm działania 617 — trzustki 671 tyreotropowy (TRH) p. Hormon uwalniający tyreotropinę tyreotropowy patrz: Tyreotropina uwalniający, gonadotropinę (GnRH) 599 -----hormon wzrostu (GHRH) 599 -----kortykotropine(CRH)589,599, 600 ------tyftotropinę (TRH) 585, 599, 600 — wzrostu (GH) 585, 599, 585, 599 budowa 603 -----działanie 603 -----efekty prolaktynopodobne 604 — — niedobór 542 patofizjologia 604 -----przemiana, elektrolitów 604 — ■-----lipidów 604 ---------węglowodanów 604 — struktura genu 602 — synteza 603 ---------białka 603 ------w karłowatości 604 — żołądkowo-jelitowe 671, 690 cechy 690 HVA 901 Hybrydyzacja 541, 547 Hydrataza, akonitowa 200. 201 — fumaranowa 202 Hydrataza-A7-enoilo-CoA 264 Hydrokorlyzon 600 3-Hydroksyantranilan 375 p-Hydroksy-p-metyloglutarylo-CoA 3S0 3-Hydroksy-3metyloglutaryto-CoA 268 25-Hydroksycholekalcyferol 715 Hydroksycynamonian 159 pHydroksyfenylopirogroman 368 fS-Hydroksyizobutyrylo-CoA 382 p-Hydroksyizomaślan 382 3Hydroksykinurenina 375 Hydroksykobabmina 704 Hydroksylacja, leków 144 steroidów 144 w mitochondriach 144 Hydroksylaza(y) 144 fenylo alanin owa 340, 342 tyrozynowa 646, 902 — węglowodorów aromatycznych 819, 826 21-Hydroksylaza 633,634 — niedobór 644 la-Hydroksylaza 626

944 / SKOROWIDZ 7a-Hydroksylaza 323, 324 17a-Hydroksylaza 654 11 p-Hydroksylaza 633, 634 niedobór 644 fi-Hydroksylaza dopaminowa 645 roia 643 Hydroksylizyna 342 Hydroksyloamina 55 D(-)-3-Hydroksymaślan 266, 267 5-Hydroksymetylocylozyna 416 Hydroksymetylotransferaza 341 serynowa 362 17-Hydroksyprogcsteron 663 Hydroksyprolina 204 biosynteza 341 katabolizm 367 5-Hydroksytryp tarnina 391 Hydrolaza, fumaryloaretooctanowa 368 giukonolaktonowa 241 Hydroliza, łagodna kwaśna 55 zasadowa peplydu 54 I celi disease patrz: Choroba wtrętów komórkowych pL-Iduronian 165 aL-Iduronidaza 766 niedobór 767 IGF 837 I 585, 599, 687, 837 II 585, 599. 687, 837 I i II 837 — porównanie z insuliną 687 Iloraz irtsulino-glukagonowy 689 Iminokwasy 41 Immunoglobiilma(y) 778 budowa cząsteczki 779 G, model cząsteczki 779

stężenie w osoczu 915 właściwości 780 IMP patrz: In ozynorn on o fosforan Informacja genetyczna 443 Inhibitory). 1, 221 allosteryczny 126 t% cholinesterazy 891 kompelycyjne 107 niekompetycyjne, nieodwracalne 109 i--------odwracalne 109 — zwrotny 124, 125 Inozynomonofosforan (IMP) 427 Inozylolo-l,4,5-tnslbsforan 791, 883 Insulina 223. 236, 237, 238, 259, 310—312, 671 czynniki farmakologiczne 677 czynniki hormonalne 677 ekspresja genów 685 gen 677 glukoneogeneza 680 metabolizm 677 niedobór 678 - patofizjologia 687 podziały komórkowe 682 przemiana, białek 681 * ■ glukozy 680 - tłuszczowa 680

Insulina, regulacja wydzielania 677 różnice miedzygatunkowe 673 struktura 672 translacja mRNA 685 utylizacja glukozy 679 wytwarzanie 675 znaczenie biomedyczne 672 Integryny 880, 882 Interleukina I i II 837 Introny 462, 484, 530, 547 In uli na 169 Iproniazyd 393 Izocytrynian 199, 200, 201 Izoenzymy 89 rozdzielanie 90 Izoleucyna 39, 204 katabolizm 377, 378, 380 reakcje swoiste 382 zapotrzebowanie 725 Izomaltaza 743 lzoineraza, 3-cis- 2-trans-enoilo-CoA 265 cis, transmaleiloacetooctanowa 368 fosfoheksozowa 209 (bsfotriozowa 209, 210 ksylozowa 117 Izomer(y), konstytucyjne 164 optyczny 163 Izoniazyd 698 Izopentenylopirofosforan 315 I2olopy, ciężkie 24 radioaktywne 24 trwale 24 w biochemii Izozym 89 Jabłczan 158, 15S, 199, 201, 202 Jajniki 659 Jądra 652 nadwzrokowe 609 przykomorowe 609 regulacja hormonalna 657 zespół feminizacji 659 Jądrzaki 669 Jednostki, enzymatyczne 86 SI 912 Jelito, cienkie 741 czcze 747 grube, rak 726 O-Jodobenzen 55 5-Jodo-2-deoksyurydyna 423 5-Jododeoksyurydyna 424 Jodotyrozyny, sprzęganie 616 Jodowanie tyrozyny 615 Jod, przemiana w pęcherzyku tarczycowym 614 rola, żródla 730 utlenianie 615 zagęszczanie w tarczycy 615 zapotrzebowanie 733 Jonofory 160 Jon(y). amonowy 349 — karboksylowe 36 metali regulacja aktywności enzy mów 123 sodowe 26

Kalcytonina 585, 589, 825 — homeostaza wapniowa 628 Kalcytriol 5S5. 624 - biosynteza 626 patofizjologia 627 regulacja syntezy i przemiany 626 wpływ na błonę śluzową jelita 627 Kalmodutina 221, 595, 798 Kamica, ksantynowa 440 nerkowa 846 Kamienie, moczowe 418 nerkowe 845 żółciowe 314, 734 Kancerogeneza 828 inicjator i promotor 828 onkogeny 829 Kancerogeny 822, 825 chemiczne 826 -----metabolizm 826 Karbamoiłoasparaginian 125, 434, 435 Karbatnoilofosforan 125, 355, 433 — biosynteza 354 Karbamoiłotransferaza, asparaginianowa 122, 125.434,435, 436 — ornitynowa, niedobór 441 Karbid opa 902 Karboksyklnaza fosFoenolopirogronianowa 203, 227 Karboksyłaza acetylo-CoA 128, 251, 252, 310,685, 703 regulacja aktywności 258, 2?9 fosfoenolopirogronianowa 204 0-metylokrotonylo-CoA 703 pirogronianowa 117, 204, 226, 231, 232, 595 — propionylo-CoA 227 Karboksyna 152 Karboksypeptydazall7, 345, 739, 742 Karboksyproteinaza prokola genowa 812 Kardiolipina 157, 179 biosynteza 287 Karłowatość, typu 1.armia 604 z niedoboru GH 604 Karnilyna 261, 262 Karnozyna 386, 387 p-Karoten 184, 711, 713 stężenie we krwi 928 Karotenoidy, działanie przeciwnowotworowe 713 Kaskada glutamin i anowa 895 Katabolizm 132 Katałaza 143, 349, 399, 870 Kataliza enzymatyczna 95 — kwasowo-zasadowa 114, 115 ogólna 114, 115 -----swoista 114, 115 mechanizm, działania 110 ------jony metali 116, 117 — wiązanie substratu 114 Katecholaminy, a-adrenergiczne 585 P-adrenergiczne 585 klasyfikacja 650 magazynowanie i uwalnianie 648 metabolizacja 648 — synteza 649 Katepsyna B i D 622

SKOROWIDZ I 945 Kationy, stężenie a aktywność enzymów 123 Kefalina 179 Keratyna 811 Ketogeneza 190, 260, 266, 334 regulacja 270 w wątrobie 268, 269 a-Ketoglutaran 159, 194, 199—202, 204,359, 361, 377 Ketoizomeraza rybozo- 5 -fosforanowa 241 i-Ketokwasy 347. 348 . — aminokwasów o rozgałęzionych łańcuchach bocznych 342 Ketonemia 267, 270 Ketonuria 267 — łańcuchów rozgałęzionych 383 — nawracająca 384 Ketony 161 Ketoza 267 bydła 307 — w okresie laktacji 335 — głodzenie 334 Kinaza 128 adenozynowa 430 — adenylanowa 117, 137, 157, 232 niedobór 225 — białek 591. 685 C 791 rodzaje 591 - zależna od, cAMP 197,221,234 — niedobór 225, 311 kalmoduliny 223 bialkowo-tyrozynowa 830 deoksycytydynowa 430, 435 difosfonukleozydowa 137, 202 dolicholowa 757 fosfoglicerynianowa 209, 210, 212, 216 -----fosforylazy 220, 595, 685

-----a 221 -----b 128

gUcerolowa 136. 229, 285, 286, 308 kreatynowa 136, 157 miozyny 595 monofosforanowa swoista 138 nukleozydoinonofosforanowa 430 pirogronianowa 117, 209, 212, 216, 231, 595, 685, 703 — niedobór 866, 879

pirydoksalowa 700 reduktazy HMG-CoA 128 -- tymidynowa 435 urydynowo-cytydynowa 435 Kinureninaza 375 Klatryna 319 Klofibrat 326 Klomifen 668 Klon 547 Klonowanie DNA 534 — wektory 534 Klozapina 907 Koagulaza gronkowcowa 787 Kobalamina 703, 704 Kobalt 730 Kod genetyczny 491 Kodony nonsensowne 492

Koenzym(y) 83 — A
— Q (CoQ) 149 - pochodne nukleotydów 422, 423 Kofeina 311, 417 Kolagen 811, 785 choroby 814

a elastyna, różnice 815 modyfikacje 812 typy 813 Kolagcnaza 885 Kolchicyna 810 Kolestypol 326 Kolipaza 739 Komórka(i), ciałka żółtego 606 eukariotyczna 18 komunikowanie się 291 Kupfera 622 Uydiga 606, 652, 658 nowotworowe, regulacja enzymaty czna nieprawidłowa 118 Sertolego 606, 653 Kompleks, dehydrogenazy pirogromanowej 213 enzym-inhibitor 107 enzym-substrat 97 enzymów wielkocząsteczkowy 123 hydroksylazy fenyloalaninowej 340 reduktazy rybonukleotydowej 4.12 syntazy kwasu tłuszczowego 252, 253, 259 Konformacja peptydu 51 Konkanawalina 753 — A 172 Kontakt międzykomórkowy 291 Konwersja, genu 465 — hormonów 575 Koproporfirynogeny 402 Koproporfiryny 399 Koprostanoi 183, 322 Koprosterol 183 Kora nadnerczy, hormony 629 niewydolność wtórna 643 patofizjologia 643 Kortykoliberyna (CRH, CRF) 585, 589, 599, 600 ludzka, struktura 600 owcza, struktura 600 Kortykosteron 630, 632 Kortykotropina (A.CTH) 599, 629 struktura i funkcja 608 Kortyzoi630, 631, 632,656 stężenie we krwi 928 Kortyzon 632 Kosmidy 534, 547 Kosyntaza uroporfirynogenowa 403, 404 Kotransport 213 Kotromboplastyna 784 Krasnoludkowatość 687

Krążenie wrotne 743 Kreatyna 136 biosynteza 3S6, 396, 397 wydalanie z moczem dobowe 920 Kreatynina, biosynteza 396 stężenie we krwi 920 wydalanie 397 — z moczem 921 Kretynizm 618 Krew, funkcje 700 — przetaczanie 876 ukiad(y) grupowy(e) 876 -----AB0 877 -----MNSs 879 Krystalografia 21 rentgenowska 67 Kryształy moczanowe 438 Krzepnięcie krwi, czynniki 784, 785 szlak, zewnątrzpochodny 786 — wewnątrzpochodny 784 - tes^laboratoryjne 793 Krztusiec 590 Krzywica 624, 627, 715 — typu 11 oporna na witaminę D 583 Ksantozynomono fosforan 430 Ksanturenian 375, 377 Ksantyna 416, 418 Ksantynuria 440 Ksantyny metylowane 417 Ksenobiotyki 817 elektrofilowe 820 toksyczność 821 Ksyloza 171 D-Ksyloza 165, 166 D-Ksyluloza 164 L-Ksyluloza 166, 244 Kwas(y), N-acetyloneuraminowy 171, 172,291, 751 acetylosalicylowy 280 p-anfun o benzoesowy 705

2-aminoetylosulfonowy 43 2-amino-4-hydroksymasłowy 41 p-am i noizo masłowy 43 y-aminotnasłowy 43 4-aminomaslowy 43 2-amino-4-merkaptomaslowy 41 3-ammopropionowy 43 2-aminoO-sulfinopropionowy 41 2-amino-5-ureidoamylowy 42 — arachidonowy 176, 282, 792, 836 przemiana 281 — arachidowy 175 argminobursztynowy 42 — askorbinowy 239, 708 -----niedobór 709 -----stężenie we krwi 928 - asparaginowy 40 behenowy 175 cerebronowy 181 cerwonowy 176 chenodeoksycholówy 323, 737 cholewy 322 cysteinosulfinowy 41 dekanowy 175 deoksyrybonukleinowy (DNA) 456 budowa 443, 444, 448 -----cząsteczka kolista 447

946 / SKOROWIDZ Kwasfy), deoksyrybonukleinowy (DNA), delecje 544 -----denaturacja 447 ---------efekt hiperchromiczny 447 -----depurynacja 473 —■ — insercje 544 ----- kancerogeneza 828 - — końce, lepkie 532

---------tępe 532, 547 -----mitochondrialny 895 — — naprawa 473

-----pasmo, kodujące 445 -----■ — matrycowe 445 -----postać, K 446 -----— B 445 ---------silnie skręcona 447 -----— Z 446 ----- rearanżacje 544 -----rekombinacja 529 -----replikacja 447—449, 469 -----rowki 447 -----rozwinięty 447 -----sekwencje, powtarzające 462

— —--------często 462 —----------— długie, końcowe 462

-----■-------------rozproszone 462 -----------krótkie 463 --------unikatowe 462 ---------wyciszające 530 ---------wzmacniające 522, 530 -----■ sekwencjonowanie 539

— — superzwoje ujemne 447 synteza 467 -----temperatura topnienia 447 -----transkrypcja 447, 448 2,5-diatnivioamylowy 42 dihydroorotowy 434, 435 elaidynowy 176, 177 ertlkowy 176 foliowy 84, 705 niedobór 706, 866 - - -stężenie we krwi 928 — zapotrzebowanie 733^. formitninoglulaminowy 706 fo&fatydowy 179,286 glutaminowy 40, 705 hialuronowy 171, 763, 764 homowanilinowy 901 ikozanowy 175 inozynowy 429 kainowy 893 kapronowy 175 kaprylowy 175 kaprynowy 175 kinurenowy 375 klupanodonowy 176 ksamurenowy 377 laurynowy 175 lignocerynowy 175 linoletiowy 275, 27S a-linolenowy 176, 275, 278 y-linolenowy 176 — lino Iowy 176 --niedobór 727 ------przemiana 277 — liponowy 214

Kwasfy), masłowy 175 merkapturowy 820 3-metoksy-4-hydroksyniigdak>wy 649 2-metylo-3-aminopropionowy 43 mikofenolowy 430 mirystycowy 175 mocne 29 moczowy 346, 416, 418, 427, 433 stężenie we krwi 921, 928 — wydalanie z moczem 922 -----wytwarzanie 426, 427 -----zaburzenia metabolizmu 440 monoetenowe 174 mrówkowy 175 nadjodowy 750 nerwonowy 176 neuraminowy 171 - nikotynowy 326, 696

nukleinowe, trawienie 425 octowy 175,434,435 — oktanowy 175 oleinowy 174, 176, 177 palmitynowy 175 — pal mi to oleinowy 176 pantotenowy 84, 203, 698 plazmenowy [80 podchlorawy 884 polienowe 174 propionowy 175

retinojowy 712 — retinolowy 588, 710 — rybonukleinowy (RNA) 476 -----budowa 448, 449 -----hydroliza 449 -----■ informacyjny (mRNA) 450, 451,486,489,491, 530 ------jądrowy, drobnocząsteczkowy 450 ---------hetcrogenny 453 -----rybosomalny (rRNA) 450, 454, 487 - splicing 530, 548 ----- synteza 478 -----transkrypcja 480 -----transportujący (tRNA) 450, 487 -----------budowa 453 sjalowy(e) 171, 181, 250, 291, 751 słabe 29 solny 735 sprzężony z zasadą 31 stearynowy 175 timnodonowy 176 - tłuszczowe 189, 190, 194, 722 -----aktywacja 261 -----biosynteza 205. 251, 254, 255 -----Ca 227 -----Cn 227 -----cis 278 -----dienowe 176 ■- - - -długolańcuchowe, transport do mitochondrium 262 -----------utlenianie w wątrobie 272 — egzogenne 275, 289 — metabolizm nieprawidłowy 278

K.was(y), tłuszczowe, egzogenne, niedobór 278 ---------a prostagtandyny 280 -----elongacja łańcucha 257 -----estryfikacja 270 -----heksaenowe 176 -----jednonienasycone 174 ---------w diecie 325 -----■ metabolizm 190 -----monoenowe 176 — — nasycone 174, 175 -----nienasycone 176, 275 ---------metabolizm 274 — — utlenianie 265, 266 -----p-oksydacja 262—264 -----pentaenowe 176 ----- synteza 191, 203 ----- tettaenowe 176 — trans 278 — transport 746 we krwi 260 — trienowe 176 -------tworzenie nazw 174 uruchomienie z tkanki tłuszczo wej 270 -----utlenianie 264 ■-----wadliwe 265 -----wielonienasycone 13, 173, 174, 274, 275, 727 ---------biosynteza 276 • ---------w diecie 325 —--------peroksydacja mikfosomalna 266

-----właściwości, fizjologiczne 177 --------- fizyczne 177

- wolne 174, 260, 331, 294, 298 obrót 299 ---------stężenie zwiększone 305 wychwytywanie przez tkan ki 310 tymidylowy 420 UDP-gl u kuro nowy 819 uronowe 171, 762 urydylowy 420 walerianowy 175 wanilino migdałowy 645, 649 żółciowe 322 — — biosynteza 323, 324 degradacja 323 ■----■ krążenie watro bowo-jelitowe 324 ■— wtórne 324 Kwashiorkor 338, 726, 853 Kwasica 26 i ketonowa 260, 267, S63

mleczanowa 147, 207, 214, 728 prioponowa 728

Laktacydoza 237 Laktaza 743 — niedobór 744 -----dziedziczny 745 ■- - - -wtórny 745 Lakloferyna 881 Laklogen łożyskowy (CS) patrz: Somatotnammotropina kosmówkowa

SKOROWIDZ / 947 Laktoza 161, 163, 169 — synteza 248 Laminina 882 Lanosterol 3J7 Lanosterolocyklaza 2,3-oksydoskwalenowa 317 LCAT patrz: Acylotransferaza lecytyna: cholesterol LDH patrz: Dehydrogenaza rnlec/anowa | LDL patrz: Lipoproteiny o małej gęstości Lecytyna 179 metabolizm 288 Leczenie trombolityczne 895 Lek(i), hipolipemizujące 326 przeciwnowotworowe 425 przeciwtarczycowe 615 Lektyna(y) 172, 753 sojowa 753 Leprechaunizm 687 „Leucine zipper" 526 Leucyna 39 katabolizm reakcje swoiste 381 zapotrzebowanie 725 Leukodystrofia metachromatyczna 292 Leukotrien(y) 174, 175, 278, 280, S80 A4 177 — biosynteza 282, 28.1 znaczenie 283 LH patrz: Lutropina Liaza 117 adenylobursztynianowa 422, 429, 430 ATP-cytrynianowa 205, 256 cytrynianowa 128 3-hydroksy-3-melyloglutarylo-CoA 26S Ligacja 547 DLiksoza 166 Limfocyty 865 Lipaza 284, 736 aktywność we krwi 922, 92 S działanie 739, 742 Językowa" 734

lipoproteinowa 193, 301, 308, 310, 768 niedobór rodzinny 327 „ślinowa" 736 triacyloglicerolowa 685 wątrobowa uwalniana heparyną 302 wrażliwa na hormony 308, 310 „żołądkowa" 736 Lipidoza iaktozydoceramidowa 292 Lipidy 193. 727 amfipatyczne 186, 187, 295 błon 552 choroby spichrzające 293 chromatografia 185 eterowe biosynteza 288 — synteza 286 metabolity, transport 193 metabolizm 122, 191, 173 obojętne 173 osocza 295 peroksydacja 184

Lipidy, pochodne 173 prekursory 173 proste 173 stężenie we krwi 928 transport 304 — w osoczu 294 złożone 173 znaczenie biomedyczne 173 Lipoamid 214 Lipogeneza 190—194, 251, 255, 256 enzymy 230 odżywianie organizmu 258 pobudzanie 259 regulacja 258 regulacja hormonalna 259 Lipoksygeneza 185 Lipołiza 190, 193, 308, 309 hamowanie 259 regulacja 311 Lipoprotemy 173, 193, 294 — o bardzo małej gęstości (VLDL) 194, 295, 299, 300 ----- biosynteza 306 -----katabolizm 301 -----a skład pokarmów 305 — o dużej geslości (HDL) 295, 303 metabolizm 304 o malej gęstości (LDL) 295, 303, 769 ix, niedobór rodzinny 326 osocza 296 — 298. 320, 321 blok wytwarzania 307 zaburzenia pierwotne 326 resztkowe 302 rozdział 295 Liposomy 186, 187, 739 Lipotropina (LPH) 585, 589, 599 — p 51 ----- struktura i funkcja 609 Lizofosfolipidy 180 Lizolecytyna 180, 289 Lizosomy 346, 563 Lizozym 881 miejsce katalityczne 99 Lizyna 40 katabolizm 373, 374 zapotrzebowanie 725 Locus operatora 512 Lowastatin 326 LPH patrz: Lipotropina Lutropina (LH) 575, 585, 589, 599 działanie 606 steroidogeneza 657

Łańcuch (y), oddechowy 141, 142, 147, 199—201, 216 -----hamowanie 152 -----inhibitory 152 — •— kompleksy lipid owo-bialkowe 150 magazynowanie energii chemi cznej 151 — miejsca hamowane przez sub stancje chemiczne 150

Łaricuch(y), oddechowy, mitochondrialny, składniki 148 -----medoczynnosc 160 -----związki rozprzęgajace 152, 156 — oligosacharydowe 171

MAB826 Macierz mitochondrialna 157 Magnez 729 — stężenie we krwi 922 - zapotrzebowanie 733 0,-Makroglobulina 789, 885 Malonian 108 Malonylo-CoA 251, 252, 271 Maltaza 740, 743 Maltotrioza 161 Maltoa^ćl, 168, 168 Mammotropina p. Prolaktyna Mangan 730 — zapotrzebowanie 732 Mannoza 171, 751 D-Mannoza 165, 166 a-D-Mannoza 164 Mannozamina 167, 250 Mannozydaza 767 MAO-A patrz: Monoaminooksygenaza A MAO-B patrz: Monoaminooksygena-

zaB

Mapowanie genów 541 Marazm 131, 726 Markery nowotworowe 824 Marskosc wątroby 307, 778, 845 Matołectwo 618 Mazindol 902 Mechanizm „ping-pong" 566 Melanina, biosynteza 393 typu mieszanego 394 Melanoproteina 393 Melanosomy 393 Melanotropina (MSH) 585, 589. 599 a 575 £575 struktura i funkcja 609 Melatomna, biosynteza 392, 393 metabolizm 392 Melonian 201 Menachinon 717 Menandion 717 Menopauza 667 3-Merkaptopirogronian 365 6-Merkaptopuryna 423, 430 Meromiozyna ciężka 798 Mestranol 668 Metabolity, przepływ, regulacja 128 — w komórce 118, 119 stężenie, a aktywność enzymów 123 — w komórce 119 Metabolizm 132 aminokwasów 190 hamowanie przez sprzężenie zwrot ne 124 integracja 329 kontrola hormonalna 196

948 / SKOROWIDZ Metabolizm, kwasów tłuszczowych 190 nieprawidłowości !18 prawidłowy 131 regulacja znaczenie biomedyczne 118 umiejscowienie w komórkach 122 węglowodanów 189 zależności między tkanką tłuszczo wą, wątrobą i tkankami pozawatrobowymi 332 Metaloenzymy 115 Metaloporfiryny 398 Metaloproteiny 368, 375 NJ, N'°-Metenylotctrahydrofo[ian427 Methemoglobina 872 Methemoglobinemia 79, 866. 872 Metimazol 615 Metionma 40. 204, 379, 397 — katabolizm 377, 378, 380 — zapotrzebowanie 725 Metotreksat 435 P- N - M etylami no- L-a I a u ina 901 otMetyloacetoacetylo-CoA 383 N°Metyloadenina 416 MetyloakryliloCoA 382 N-Metylo-4aminoazobenzen 826 5-Mety! ocytozyna 416 p-MetyloglutaronyloCoA 381 f>P-Metytoguanina 416 otMetylo-p-hydroksybutyrylo-CoA 383 Metyloko balami na 704 pMetylokrolonylo-CoA 381 Metylomalonylo-CoA. zaburzenia katabolizmu 384 Melylopentylozy 171 Metylotransferaza guanidynooctanowa396 N- Metylolransferaza, fenyloetano loaminowa 645 — rola 647 O-Metylotransferaza katecholowa 0 645 ^ — rola 648 Mewalonian. biosynteza 315 Mewastatin 326 Miastenia 887 Miażdżyca 173, 182, 327, 792 naczyń wieńcowych 303 tętnic 13, 173, 325 Micela(e) 186. 187, 522 Miedź 730 niedobór 777 — stężenie we krwi 916, 928 zapotrzebowanie 732 — zatrucie 776 Mieloperoksydaza 870, 881, 884 Miesiączka, brak 605 Mieszanina racemiczna 163 Mięśnie, gładkie 801 — skurcz 802 prążkowane 803 — szkieletowe 804 Mikrosomy 20 Mineralokortykoidy 585, 630 — nadmiar 644

Mineralokortykoidy, przemiana 636 a równowaga elektrolitowa 639 synteza 634 — regulacja 636 transport jonów 639 w osoczu 635 wydalanie 636 Miofosforylaza niedobór 225 Mioglobina 70, 399 budowa 71 funkcja 71 krzywa dysocjacji tlenowej 73 podobieństwo do hemoglobiny 74 ullenowanie 7] -----zmiana konformacji 72 wiązanie tlenu 72 wiązanie węgla 72 Miokinaza 137,430,804 Miopatia(e) 147 mitochondriaine 897 niemowląt 160 - oczna 896 Miozyna 795, 798 Mitochondnum 147, 194, 261, 354 budowa błon 155

gromadzenie kationów 158 rola w metabolizmie 195 układy, hydroksylacyjne 144 -----transportujące 156 MIT patrz: Monoj odo tyrozyna Mleczan 189. 194, 204, 207, 208, 212, 234 Mlekotok 605 Moczan(y) 418 kryształy 438 pula ogólnoustrojowa 438 Mocznik 190. 192, 344, 346, 351, 353, 355, 427 — biosynteza 347, 353, 354 - stężenie we krwi 914 — wytwarzanie 353, 354 Moczówka prosta nerkowopochodna 583 Modulatory, negatywne 109 pozytywne 109 Mola hydatidosa 669 Molibden 731 zapotrzebowanie 732 Monoaminooksygenaza 645 A (MAO-A) 901 B(MAO-B)901 Monocyty 865 Monoetenoidy 174 Monofosforan inozyny (IMP) 429 3-Monojodotyrozyna 42 Monojodotyrozyna (MIT) 612, 613 Mononukleotyd, [lawinowy (FMN) 140, 695 nikotyniami 697 Monooksygenaza(y) 144, 827 monofenolowa 393, 394 3-Monooksygenaza tytorynowa 397 Monosacharydy 161 wchłanianie wadliwe 745 Monosjalogangliozyd 182 Mostek, glicerolofosforanowy 157 glicerolofosforanowy 158

Mostek, jabiczanowo-asparaginianowy 158 MolyJma 6>J1 Mózg, udar 894 MPTP901 MSH patrz: Melanotropina 3MSH patrz: Melanotropina a pMSH patrz: Melanotropina p Mukolipidozy 765 testy diagnostyczne 767 Mukopolisacharydozy 749, 765 testy diagnostyczne 767 Mukopolisacharydy 171, 749 Mukoproteiny 171 Mukowiscydoza 14, 844, 847 Mutacje 495 punktowe 835, 897 sensu 496 -— — akceptowalne 497 -----częściowo akceptowalne 497 —■ — nie akceptowane 498 supresorowe 498 typu przesunięcia ramki 498 Mutageny 827 Mu ta rotacja 163 Mutaza, bisfodlbglicerynianowa 212, 213 — fosfogiicerynianowa 209, 211 Myasthenia gravis 583, 887 Nabłoniak kosmówkowy 669 Nadciśnienie tętnicze 847 reninozależne 637 Nadczynność, przytarczyc 623 — wtórna tarczycy 618 NAD-kinaza 595 Nadnercza, kora, hormony 629 niewydolność wtórna 643 rdzeń 397 — hormony 645 rozrost wrodzony 644 NAD+ patrz: Dinukleotyd nikotynoamido-adeninowy NADP+ patrz: Fosforan dinukleotydu nikotynoamido-adenin owego Nadtlenek, redukcja 143 wodoru rozkład 143 Naftochinon 717 Neksyna 810 Neomycyna 748 Neostygmina'891 Nerka(i), dysfunkcja 160 zanik 845 Neuraminidaza 752 Neurofizyny 609 Neuropatia nerwu wzrokowego wrodzona Lebera 844, 847, 896 Neuroprzekaźniki 385 Neurotensyna 691 Neutropenia 868 NGP 585 Niacyna 141, 203.696 brak 698

zapotrzebowanie 733 Niedobór, desmolazy cholesterolowej 644

SKOROWIDZ / 949 Niedobór. 1 Ip-hydroksylazy 644 Niedoczyrinosc przyiarczyc 624 izekoma 583. 59!, 624 Niedokrwiwosc S45. S65 Faoconiego 475 Nkdokrwiitość hemolityczna 207. 214, 239. 867. 871 — badania laboratoryjne 880 ------pizyczyny 879 megatoblaslyczna 706, 866 z niedoboru miedzi 777 z niedoboru żelaza 745, 860 u noworodków 717 sierpowata 70, 544, 866 syderopeniczna 845 złośliwa 704 Niedorozwój umysłowy 898 Niedotlenienie 207 tkanek 212 Niedożywienie 726 Nietolerancja, fruktozy wrodzona 247 mleka 734. 747 Nigerycyna 160 Nikotynamid 84, 375 Ninhydryna 44 Nilrozoaminy 826 NMN 697 Noradrenalina 31.1 — biosynteza 395 — stężenie we krwi 928 Norepinefryna patrz: Noradrenalina Noretyndron 668 Normy żywieniowe 731 Northern błot 537, 547 Nukfcazy 488 Nukleoplazmina 458 Nukieosom 457 Nukleotyd(y), adeninowc 133—135, 137 fławinowe 141 pirymidynowe 415 biosynteza 433, 434 —- — regulacja 436, 438 pochodne syntetyczne 423 — purynowe, biosynteza, w wątrobie 431 ---------blokada 429 --------regulacja 431 N uk leotydosacharydy 250 Nukleozydazy 740,743 Nukleozydy41S, 425

Oksydacja kwasów tłuszczowych 262, 263 [ł-Oksydaeja 148, 190. 191, 194 ^Oksydacja kwasów tłuszczowych 264 Oksydaza(y) 140. 143 aminokwasowa 348 a-aminokwasowa 695 2-aminokwasowa 140, 348 aminowa 392, 393 -■ cytochromowa 140 flawoproleiny 140 glukozowa 141 L-glukonolaktonowa 244 katecholowa 394 koproporfirynogenowa 400, 403, 404 ksantynowa 122, 140, 433, 695 niedobór 440 — lizylowa 815 monoaminowa 645 rola 648 NADPH 870 protoporfirynogenowa401,403,404 — zawierające miedź 140 Oksydoreduktaza 140 Oksygenaza(y) 139, 144 hemowa 407, 408 prawdziwe 144 Oksyhemoglobina, uwalnianie tlenu 213 Oksytocyna 585 mechanizm działania 610 regulacja sekrecji 610 Oligomery białkowe 65 Oligomycyna 152 Oligonukleotydy 547 Oligosacharydy 161 biosynteza 759 Onkogeny 14, 829, 83! aktywacja 835 z komórek nowotworowych 832 mechanizm działania 836 wirusa miesaka Rousa 830 Operon 510 lac 511 Opioidy 585, 589 Organełłe wewnątrzkomórkowe 18, 19 Organizm(y), amonoteliczne 346 autotrofkzne 133 skład chemiczny 16, 17 środowisko wewnętrzne 26

ureolityczne 427 ureoteliczne 346 Octan 259 — medroksyprogesteronu 668 p-nitrofenylu 110 -----hydroliza, etapy 111 Odczyn Coombsa 880 Odczynnik, Edmana 56 Sangera 54 Schiffa 750 Oddychanie, mitochondrialne, kontro la 151, 153, 205 ------teoria chemiosmotyczna 156 — tkankowe 139 Odżywianie prawidłowe 131

urykoteliczne 346, 427 Omityna 42, 355

metabolizm 388 transami nacja 361 Orolacyduria 441 Orotydynomo no fosforan 434, 435 Orotydynuna 441 Osroolalność 928 Osocze 386

Osteogenesis imperfecta 794, 814 Osteomalacja 625, 628, 715, 734 Ostcoporoza 747

Otyłość 173, 583 Ouabaina 167

PABA patrz: Kwas p-aminobenzoesowy Padaczka mioklonalna 896 PAF patrz: Czynnik aktywujący płytki krwi „Palec cynkowy" 525 Palindrom 547 PaJmitoilolransferaza kamitynowa 261, 271, 272

— niedobór 265 Palmitynian 255 PAP 825 Papovawirusy 829 Parathormon (PTH) 585, 589, 629 patofizjologia 624 regulacja, przemiany 621 sekrecji 623 -----syntezy 620 — rola w homeostazie, fosforanowej 623 - Vspniowej 623 rozpad 622 struktura 620 wytwarzanie ektopowe 624 Parkinsonizm 899 leczenie 900, 906 przyczyny 901 Pasmo Soreta 404 PCR 547 PDGF 585, 838 Pelagra 698 D-Fenicylamina 777 Pentozuria 239 samoistna 244 Peniozy 161, 171 znaczenie fizjologiczne 166 Pepsyna 735 Peptyd(y), aktywne fizjologicznie 51 — budowa 49 C 676 homogenne otrzymywanie 55 hydroliza zasadowa 54 insulinopodobne 676 jelitowy wazoaktywny 599. 691 konformacja 51 ładunek elektryczny 50 przedłużające 812 rozdzielnie 52 sekwencje nakładające sie 57 — sekwencjonowanie 54

-----fenyloizotiocyjanian 56 -----peptydów nakładających się 56

— Struktura pierws^orzędowa 50 a aktywność biologiczna 50 poznanie składu aminokwasowego 53 sygnałowe 560 synteza metodami automatycznymi 57 — znaczenie biomedyczne 49 — żołądkowy hamujący 691 Peptydaza 345 Peptydylo-3-metylom stydyna 805 Permeaza glukozowa 868 Peroksydacja lipidów 184 Peroksydaza 143 glutationowa 143, 243, 717. 870

950 / SKOROWIDZ Peroksydaza, tarczycowa 615 Peroksysomy 143, 264 Pęcherzyk żółciowy 742 Pętla oksydoredukcyjna przemieszczająca protony 154 pH, a aktywność enzymu 100 definicja 29 — znaczenie biomedyczne 26 Pierścień Kaysera-Fłeischera 777 Pierycydyna A 152 Pigmeje 604 PIH 599 Pinocytoza 570 absorpcyjna 570 piynnej fazy 570 Pirofosfataza. nieorganiczna 137, 218, 261 -dimetyloalilu 315 Pirofosforan, farnezylu 315, 318 — geranylu 315 Pirofosforylaza ury dyn odi fosfog luk ozy 218 Pirogronian 159, 189, 194. 204, 205, 213, 226, 362, 363 enzymy ulteniania 230 utlenianie 207 stężenie we krwi 928 Pirol 70, 398 Pirydoksal 700 Pirydoksamina 700 Pirydoksyna 700 Pirydostygmina 891 Pirymidyny 415 katabolizm 436 ~ nadmiar produktów 440 metabolizm 122 — zaburzenia wrodzone 441 pochodne 415 ■- - - -syntetyczne 423 postacie tautomeryczne 417 zapotrzebowanie organizmu 425 pI37 Plasmodium falciparum 875 Plazmalogeny 287 — biosynteza 288 "^*" Plazmidy 534, 547 Plazmina 790 Plazminogen 790 Plazmogeny 180 Pląsawica Humingtona 542, 546, 847, 892 Pl patrz: Somatomamrnotropma kosmówkowa Płyn, pozakomórkowy 26 — wewnątrzkomórkowy 26 Płytki aktywacja 791 PNMT 645 Poliaminy biosynteza 380, 390 budowa 389 katabolizm 391 prckursory 388 Policytemia 79 Polidystrofia pseudohurlerowska 767 Polienoidy 174 Polimeraza, DNA, a 469 - p 470

Polimeraza, DNA, RNA-zależna 451 - RNA DNA-zależna 477 klasy III 484 — — mianownictwo 480 Polimorfizm, białek 773 — długości fragmentów restrykcyj nych 93 DNA 542 Polinukleotydazy 740 Polipeptyd(y), z licznymi funkcjami ka talitycznymi 429 rola 690 struktura pierwszorzedowa, ozna cza nie 54 trzustkowy 671, 673, 691 wielkocząsteczkowe, rozszczepianie 55 Polipreonidy 183 Polisacharydy 161, 169 -— złożone 170, 171 PO MC patrz: Proopiomelanokortyna Pompa, protonowa w łańcuchu oddechowym 153 sodowa 744 Ponad tlenki 870 Porfiria(e) 398, 405 -- dziedziczenie 405 leczenie 407 — objawy, podstawy biochemiczne 406 Porfiryny, asymetria podstawnika 399 budowa 398 fluorescencja 404 z łańcuchami bocznymi 299 - pochodne biosynteza 403 spektrofotometria 404 widma absorpcji 404 znaczenie biomedyczne 398 zredukowane 401 Porfobilinogen 402 biosynteza 401 Poród 665 Potas 729 sekrecja aldosteronu 638 stężenie we krwi 923, 928 zapotrzebowanie 732 Potencjał, oksydoredukcyjny 139 przenoszenia grupy 135 PP patrz; Polipeptyd trzustkowy Prealbumina wiążąca tyroksynę 616 Prednizolon 632 Prednizon 632 Pregnandiol 632 Pregnantriol 632 Pregnenolon 631, 632, 654, 660, 661 Pre-[J-lipoproteiny 295 PRIH patrz: Hormon hamujący uwalnianie prolaktyny PRL patrz: Prolaktyna Proakceleryna 784 Probiałka 112 Probucol 326 Proces biochemiczny, analiza 23 Proenzym(y) 112 — przekształcenie w enzymy 113 Profilina 806

Progesteron 631, 632, 654, 656, 660 a gruczoł sutkowy 666 Progestyny 585, 588, 660 funkcja 664 mechanizm działania 668 metabolizm 662 syntetyczne 668 Proinsulina ludzka 674 Prokonwertyna 784 Prolaktostatyna 600 Prolaktyna 585, 599 laktacja 666 owcza 603 patofizjologia 605 rola fizjologiczna 605 synteza 605 Prolina41, 204, 359 biosynteza 339, 341 katabolizm 359, 360 metabolizm 388 Proopiomelanokortyna. 575, 599, 629 Propionian 204, 227. 234 Propylotiouracyl 615 Prostacykliny 174, 281, 792 Prostaglandyna{y) 174, 279-281, 636 E2 175 a kwasy tłuszczowe egzogenne 280 Prostanoidy 174, 281 biosynteza 279 Pro tarnina 789 Proteaza(y) 112,884 lizosomalna 903 wewnątrzkomórkowe 345 V8 55 Proteoglikany 171, 244, 248 biosynteza 749, 761, 762 funkcje 766 Protoonkogeny 831 aktywacja 832 Protoporfiryna 400 Protoporfirynogen 400 Protrombina 784, 786 Prourokinaza 790 Provera 668 Pro witamina A 184 Próg nerkowy dla glukozy 237 PRPP patrz: 5Fosforybozylo-l-pirofosforan Prymachina 87! Przemiana materii podstawowa 723 Przenośnik(i), energii 133 — pirogronianowy 213 Przerzuty 760i 840 Przewody żółciowe, niedrożność 412 Przysadka mózgowa, ptat, przedni 601 ---------hormony 236 -----tylny 609 Przy tarczyce, gruczolak 624 - nadczynność 623 -------wtórna 624 — niedoczynność 624 -----rzekoma 583, 591, 624 — rozrost 624 Pseudogen 548 Pseudourydyna 420, 436 PTA 784 PTH patrz: Para (hormon

SKOROWIDZ / 951 PUFA patrz: Kwasy tłuszczowe wielonienasycoue Puromycyna 506 Puryny 416 kiitiihohziii. zaburzenia 437 metabolizm 122 -----zaburzenia dziedziczne 439 niedobór 440 pochodne 415 syntetyczne 423 postacie tauromeryczne 417 redukcja 433 * zapotrzebowanie organizmu 425 Q„ 100 Racemaza metylomalonylo-CoA 227 Rak jelita grubego 726 Rakowiak złośliwy 393 Ramka Pribnowa 480 Reakcja(e), anaboiiczne 132 chemiczne, bariera energetyczna 96 — czynniki przyspieszające 96 -----teona kinetyczna (zderzeń) 96 -----szybkość początkowa 103, 104 egzoergiczne 132 — endoergiczne 132 -----sprzężenie z reakcjami egzoergicznymi 136 — enzymatyczne 97 -----hamowanie kompetycyjne 108 inhibitory niekompetycyjne od wracalne 109 -----kinetyka nasycenia enzymu substratem 106 -----kontrola, allosteryczna 196 ---------hormonalna 196 -----mechanizm 110 ---------doświadczenia stop-flow 110 ---------a jony metali 116, 117 -----a pH 100 -----poziom energetyczny 95 -----stała równowagi 102 -----stany przejściowe 94, 95 -----szybkość, maksymalna 106 ---------początkowa 103 — — — regulacja 119 ---------a stężenie substratów 101, 103 — a temperatura 100 —■ — wiązanie substratu 114 Fentona 870 Habera-Weissa B70 kataboliczne 132 - nierównowagi 195 powodująca przepływ 195 zastąpienia 94 Receptor{y), ot, 221 acetylooholinowy 582 p-adrenergiczny 650 androgenowy 898 - cholinergiczny 888, 890 - dopaminowy 907 -----agoniści 902 — EGF 683

Receptor(y), estrogenowe 668 glikokortykoidowy 640 glulamimanowy 892 hepatocytów asjaloglikoproteinowy 346 hormonalne 578 insulinowy 582, 682 kalcytriolowy 627 —LDŁ 319, 683 — — wadliwe 327 progesteronów^ 668 swoisty dla apo E 302 dla transferyny 775 Receptosomy 570 Redukiaza, biliwerdynowa 407 cystynowa 363, 364 cytochromu bs 872 dihydrofolianowa 435 glutationowa 243 HMG-CoA 122, 128 methemoglobinowa 772 rybonukleotydowa kompleks 432 tioredoksynowa 432 Reestryfikacja 309 Rekombinacja, chromosomalna 463 DNA 529 Remnanty 327 chylomikronów 302 Renina 637 uwalnianie 636 Renmas 736 Replikacja DNA 469 Retinal 710 Retinitis pigmentosa 908 Retinoidy działanie przeciwnowotworowe 713 Retinol 710 Retrowirusy 829, 831 Retykulocyty 868 RNA patrz: Kwas rybonukleinowy Rodnik(i) wolny(e) 184 — ponadilenkowy 145 Rodopsyna 712. 908 Rotenon 152 Rozedma pluć 7?7 Roztwór buforowy 32 Równanie, Hendersona-Hasselbalcha 31 Hilla 106 Michaeiisa-Menten 104 Równowaga, azotowa 344 kwasowo-zasadowa 26, 350 wodna 26 Równoważniki redukujące 147, 199, 200, 255 Rybollawina 84, 140, 203, 695 zapotrzebowanie 733 Ryboiiukleaza 488, 739, 742 miejsce katalityczne 99 Rybonukleoproteiny jądrowe małocząsteczkowe 455 Rybonukleotyd(y) 419 purynowe 415 uracylu 449 Rybonukleozydy 418, 419 Rybosomy 194, 195, 454, 492 D-Ryboza 165. 166

Ryboza 161, 239,241, 449 — synteza w tkankach 243 Rybozofosforan 189 Rybuloza 161 D-Rybuloza 164, 166

Sacharaza 742 — niedobór 745 Sacharoza 161, 168, 169 Sacharydy powierzchni komórki 181 Sarkolemma 795 Sarkomer 795 Sarkoplazma 795 Schizofrenia, przyczyny 905 DSedoheptuloza 164 Sekretaza 903 Sekwencjonowanie, biatka 54 DNA 54 Selen «3, 717 jako grupa prostetyczna 143 niedobór 731 rola 731 zapotrzebowanie 733 Semiaidehyd, bursztynianu 396, 397 malonianu 386 metylomalonianu 382 Serotonina 881 biosynteza 391 a rakoiwak złośliwy 393 Seryna40, 180, 204, 387 biosynteza 339, 340 kata boi izm 363 Sferocytoza dziedziczna 866, 876 Slingolipidozy 173,292, 293 Sfingolipidy 284 Sfmgomielma(y) 180, 181 biosynteza 290 w błonach 551 Sfingozyna 180 biosynteza 290 SGOT 927 SGPT 927 SHBG patrz: Globulina wiążąca hormony płciowe Siarczai], choudroityny 171, 763, 764 dermatanu 763, 765, 768 heparanu 763, 765, 792, 844 keracanu 763, 765, 768, 844 w moczu 388 Siarkowodór 152 Siateczka śród plazma tyczn a 194, 195 Siatkówka, zapalenie barwnikowe 908 Sinica 872 Sjalidoza 767 Skaza, krwotoczna 791 -----noworodków 719 moczanowa 425, 437, 438 Skład chemiczny organizmu 16, 17 Składniki, mineralne 730 pokarmowe interkonwersja 330 - — przekształcenia wzajemne 329, 330 Skóra, pergaminowa barwnikowa 475, 852 — synteza witaminy D hit

9S2 / SKOROWIDZ SkręcaUiość optyczna 163 Skrobia 161, 169 Skrzep 883 fibrynowy 788 Sk waleń 315 biosynteza 315. 316 Sok, trzustkowy 736, 738 żołądkowy 735 Sole kwasów żółciowych, krążenie jelitowo-wątrobowe 322 Somatoliberyna (GHRH) 600 Somatornarnmotropina kosmówkowa 585, 599 — stężenie w ciąży 665 Somatomedyna patrz: 1GF I Somatostatyna (GHRIH) 585. 589, 599.600, 671, 672,689, 691 a hormon wzrostu 689 sekwencja aminokwasów 689 Somatotropina 599 Sonda genetyczna 548 Sorbitol 247

Sód, stężenie we krwi 923, 928 — zapotrzebowanie 732 Spektrofotometria 404 Spektrometria masowa 21 Spektroskopia jądrowego rezonansu magnetycznego 21 Spektryna 874, 875 Sperma to geneza 657 Spermidyna 389, 390 Spermina 389, 390 Spliceosom 485 Splicing RNA 530 Spruć rodzima 746 SPRIN 500 Stała, dysocjacji 29. 31 — równowagi reakcji enzymatycznej 102 — sedymentacji 68 Stawy, zapalenie 769 Steroidogeneza 190. 634 Steroidy 182. 190, 191 - - cechy strukturalne 630 konfiguracja 183 konformacje 182 sekrecja 635 - stereoizomery 182 — transport w osoczu 635 Sterole w błonach 552 Stiuszczenie wątroby 305, 845 Stolce tłuszczowe 710, 747 Strącenie wybiórcze 87 Streptokina^a 790 Streptomycyna 167 Stres tlenowy 871 Stwardnienie rozsiane 292 Substancja, H 877 ■ - P 585, 691 Substrat(y), energetyczne kolejność utleniania 333 — powinowactwo do enzymu 106 stężenie, a aktywność enzymu 123 -----inhibitory kompetycyjne 107 — kinetyka nasycenia enzymu 106 ' -----oznaczanie 107 ----a szybkość reakcji 101, 103

Substrat(y), wiązanie, kooperatywne 127 ----- przez enzym 114 Suchość spojówek 710, 713 Sukcynylo-CoA 194, 199—201, 204, 400 Suliagalaktozyloceramid 290 Sulfataza, iduronianowa 766 — niedobór 293, 767 Sulfatyd 181 SulfogaJaktozyloceratnid 181 Sulfoglikozyloslingolipiu 181 Sulfolipidy 173 Sulfonylomocznik, pochodne 677 Surfaktant płucny 284, 287 Swainsonma 761 Symport 213 Syntaza, ALA 401, 400 — ATP 554

- ATP błonowa 153, 154 ------transportująca protony 156 — cytrynianowa 200, 201 —■ endoperoksydu prostaglandynyTT? — glikogenowa 128,197,219,595,685 a 221 -----b 221 -----w mięśniu 223 — hemowa 401 3-hydroksy- 3-metyloglu ta rylo-Co A 268 3-ketoacylowa 252 kwasu tłuszczowego 252 laktozowa 249 porfobilinogenowa 404

spermidynowa 390 sperminowa 390 — - tiroporfirynogenowa 402 —404 Syntetaza, acylo-CoA 137, 227, 261, 286, 309 adenylobursztynianowa 422, 429, 430 ------regulacja aktywności 432 aminoacylo-tRNA 494 argininobursztynianowa, brak ak tywności 356 asparaginowa 339 glutaminianowa 339 glutaminowa 350 karbamoilolbsforanowa 354, 433, 434, 436 kwasów tłuszczowych 122 PRPP431.436 sukcynylo-CoA 202 tymidylanowa 434, 435 Synteza, białka 491 — elongacja 502, 503 inicjacja 500

-----terminacja 502, 504

— DNA 467 peptydów metodą automatyczną 57 RNA 478 System cytochromu P-450 139 Szczawiobursztynian 200, 201 Szwawiooctan 158,194,198—202, 204, 205, 359 Szkorbut 709, 794

Szlak(i). amfiboliczne 188 anaboliczny 188 biosyniezy, nukleotydów pirymidynowych 434 — de novo puryn z 5-fosforybozy i ATP 428 2,3-bisfosfoglicerynianowy 212 cyklooksygenazy 279, 280 dihydroksyacetonofosforanowy 285 glicerolofosforanowy 285 kni.aholii.vnc 188 kelogenezy w wątrobie 269 kinureninowo-antranilanowy 375 - kwasu uronowego 244 — lipooksygenazy 279, 280, 283 — metaboliczne 188 analiza 23 -----poziomy organizacji 192 -----przeptyw metabolitów 195 -----rozgałęziona regulacja przez sprzężenie zwrotne 124 ------umiejscowienie w komórce 194 monoacyloglicerolowy 285, 286 pentozofbsforanowy 239, 240, 255 enzymy 230 -----etap, oksydacyjny 241 --------- nieoksydacyjny 241 -----a szlak glikolizy 242 — poliotowy 247

- przemiany galaktoiy 248 sorbitolowy 247 syntezy kwasów tłuszczowych 251 wydalanie azotu u ludzi 353 Szpiczak 783 Śledziona 876 Ślepota kurza 710 Ślina 734 Śliniąnki 741 Talasemie 70, 80, 542. 866, 885 Tarczyca, hormony 237, 612 — nadczynność 618 Tautyna 43 TBG patrz: Globulina wiążąca hormony tarczycy TBG patrz: Globulina wiążąca tyroksynę TBPA patrz: Prealbumina wiążąca tyToksynę TEBG patrz: Globulina wiążąca testosteron i estrogeny Teobromina 417

Teofilina 311, 417 Teoria chemiosmotyczna 153, 154 Terapia genowa 851 Termogeneza indukowana przez dietę 312, 313 Termogenina 313 Test, Amesa 827 oporności osmotycznej 876 tolerancji galaklozy 248 tolerancji glukozy 238 Testosteron 631,632, 652,654, 656,660 metabolity 656

SKOROWIDZ / 953 Testosteron, regulacja spermatogcnczy 657 . - szlaki metaboliczne 656 Tetrahydrobiopteryna 341 Tetrahydrofolian 706 3,5,3',5'Tetrajodotyronina 42 Tetrajodotyronina 599 Tetro2y 161 TGF 837 Tiamina 84, 203. 694 brak 694 zapotrzebowanie 732 TIBC 924 Tioesteraza 255 6-Tioguanina 423 Tiokinaza 261 bursztynianowa 201, 202, 216 Tiolaza 264, 268 Tiomocznik pochodne 615 Tioredoksyna 432 Tiouracyi 615 Tkanka tłuszczowa 173 brunatna 312 lipoliza 311 metabolizm 309 Tlenek węgla 147, 152 Tlen, toksyczność 145 Tłuszcze, mobilizacja 310 przemiana 680 — wartość energetyczna 723 — właściwe 173 a-Tokofero! 716 Tokoferol 716 Tolerancja glukozy 237, 238 Top,pizomerazy 447 TPA 790 T3 patrz: Trijodotyronina T4 patrz: Tyroksyna Transacylaza, acelylowa 252 -- malonylowa 252 Transaldolaza 241 Transamidynaza arginino-glicynowa 396 Transaminacja 190, 191, 203, 204, 347, 348 Transami n aza(y) 204, 347 alaninowa 347, 348 glutaminjanowa 347, 348 Transferaza, bursztynylo-CoA-acetoacetylo-CoA 268 fukozylowa 877 Gal 878 GalNAc 878 gtukanowa a-(l—*4)-a(l—»4) 219 glukuronylowa 819 — y-glutamylowa aktywność we krwi 924 terminalna 548 tlenu 144 Transferyna 775 stężenie we krwi 928 Transglutaminaza tiolowo-zależna 785 Transhydrogenaza 160 Transkarbamoilaza ornitynowa nie dobór 355 Transketolaza 241. 244

Transkobalamina II 704 Transkrypcja 451, 452 — RNA 480, 548 -----sygnały terminacji 483 Transkryptaza odwrotna 451, 471, 547 Translacja 452 Translokacja cytrynianu 256 Translokaza karnitynoacylokamitynowa261 Transmetylacja 307 Transpeptydaza aktywność we krwi 924 Transport aktywny 567 Transpozycja 465 Transwersja 495 Tranzycja 495 Trawienie 734 Trehalaza 743 Trehaloza 168, 169 Treonina 40, 204, 387 katabolizm 367 zapotrzebowanie 725 D-Treoza 165 TRH patrz: Hormon uwalniający tyreotropinę TriacylogliceroKe) 177, 178, 190, 194, 294,295 biosynteza 285, 286 chylomi tronów 301 katabolizm 284 lipoprotein o bardzo małej gęstości 301 magazynowanie 308 transport 299, 300 Triamcynolon 632 Trichochromy 394 Trifosfoadenozyna 133 Trifosfonukleozydy 137 Triglicerydy 178 stężenie we krwi 917, 924, 928 3,5,3'-Trijodotyronina 42 Trijodotyronina 575, 585. 599, 612 stężenie we krwi 616 wychwyt przez białka surowicy 925 Trikarboksylany 258 Trio-kinaza 245 Triozofosforan 189, 194 Triozy 161 Trombina 768, 788,791 Tromboksan 174, 175,279—281 Aj, 177. 792 Tropomiozyna 784, 797, 806 Troponina 797 C798 I 798 T797 Trypsyna 55, 738 Tryptofan4L 204, 391 absorpcja promieni nadfioletowych 43 katabolizm 375, 376 metabolity 393 — zapotrzebowanie 725 Trzustka 741 TSH patrz: Tyreotrapina TS1 612 Tuuikamycyna 760

.Tyglilo-CoA 383 Tymidylan 434, 435, 443 Tymidyna 419 Tymina416, 419 — związana z rybozomonofosforanem (TMP) 420 Tyreoglobulina, biosynteza 612 — hydroliza 613 Tyrcoliberyna. (TRH) patrz: Hormon uwalniający tyreotropinę Tyreotoksykoza 618 TyTeotropina (TSH) 51, 575, 585, 589, 599, 612 budowa i funkcja 606 Tyroksyna 42, 599 całkowita stężenie we krwi 925 stężenie we krwi 616 wolna stężenie we krwi 926 Tyrozyna 40, 41, 204, 371, 395 biosynteza 340 jofeyanie *•" katabolizm 369 transaminacja 368 Tyrozynemia 368 noworodków 370 Ubichinon 148, 149, 184,318 — biosynteza 316 Ubikwityna 346 Uchyikowatość jelit 726 Udar mózgu 894 UDP-glukoza 422 ŁJDP-glukuronozyloiransferaza 409, 411,412 UDP-kwas glukuronowy 422 Ukkd(y), dopełniacza 891 oksydoredukcyjne 139 reninowo-angiotensynowy 636 Ultrawirowanie 21 Uracyl386, 416, 419 pochodne 422 Urobilinogen 410 w moczu 413 Urokinaza 790 Uroporfirynogen 400 dekarboksylacja 402 Uroporftryny 399 Urydylilotransferaza. galaktozo-1-fosforanowa 248, 250 glukozo-1-fosforanowa 244 niedobór 249 Urydyna418, 419 Urydynodifosfogalakioza 248 Urydynodifosfoglukoza 24S U rydynod ifosfogiukuronozylotransferaza 409, 411, 412 Urydynodifbsforan 217 Urydynomonofosforan 434, 435 Urydynotri fosforan 137 Utlenianie, aminokwasów 147 biologiczne 139 kwasów tłuszczowych 147 pozamitochondrialnego NADH 157 przez dehydrogenazy 141 tkankowe 147 węglowodanów 147

954 / SKOROWIDZ U tlenowa nie, hemoglobiny 74 hemoglobiny zmiana konformacji 75, 76 mioglobiny 71 miglobiny zmiana konformacji 72

VIPpairz: Peptyd jelitowy wazuaktywny VLDL patrz: Lipoproleiny o bardzo malej gęstości VMA patrz: Kwas wanilino migdałowy

Wady metaboliczne wrodzone 14 Walina 39, 204 - katabolizm 377, 378, 380 — reakcje swoiste 383 zapotrzebowanie 725 Walinomycyna 160 Wapń 728 przemiana 594 rola w mięśniu 221, 800 stężenie we krwi 926, 928 Warfaryna719 Wazopresyna (ADH). 585,629 funkcja 609 mechanizm działania 611 patofizjologia 611 regulacja sekrecji 610 Wątroba 742 marskość 198, 778, 845 powiększenie 845 stłuszczenie 305, 845 synteza witaminy D 626 zapalenie ostre 198 Wchłanianie 734 Western błot 537, 548 Węglowodany 190 magazynowanie w organizmie 217 metabolity, transport 192 metabolizm 121. 189, 191 wartość energetyczna 72?** Wiązanie(a), amidowe 50 cystynowe 61 disiarczkowe 61 elektrostatyczne 62 fosforanowe bogatoenerEetyczne 135, 147, 202,216 - N-glikozydowe 754 (3-N-glikozydowe 433 O-glikozydowe 166, 754

kowalencyjne 61, 96 peptydowe 47, 48, 61 — wodorowe 28, 61 -----w DNA 444 Wielomocz w cukrzycy 678 Wimentyna 811 Winblastyna 810 Winkulina 830 Wirus(y), białaczki, mysiej Abelsona 831 -------mielocylowej 831 — Epsteina-Barr 829 — erytroblastozy ptasiej 83!

Wirus(y), grypy 875 herpcs 829 mięsaka, kociego 831 -----małpy 831 -----myszy 831 -----Rousa 830, 831 — polyoma 829 - rakotwórcze 829 SV- 40 829 zapalenie wątroby B 829 Witamina, A 710 -----metabolizm 712 - - -niedobór 710 -----stężenie we krwi 928 -----zapotrzebowanie 732 B 84, 692 B, 203 B« 700 -----niedobór 375, 377, 702 -----zapotrzebowanie 733 — BIŁ 227, 703 niedobór 704, 866 -----niewydolność przemiany do ko enzymu 384 ------zapotrzebowanie 733 — C 239, 708

-----niedobór 709 -----stężenie we krwi 928 -----zapotrzebowanie 732 — D 183, 624,710, 714

-----niedobór 627, 715 -----powstawanie 625 -----stężenie we krwi 928 -----synteza 714

— £716,902 niedobór 717 -------zapotrzebowanie 732 — K717 -----niedobór 720 ----- rola 718 -----zapotrzebowanie 732 — rozpuszczalne, w wodzie 693, 722, 727 ---------normy 733 -----w tłuszczach 710, 722, 728 ---------normy 732 WKT patr2: Kwasy tłuszczowe wolne Włókna pokarmowe 726, 741 Woda, asocjacja cząsteczek 28 cząsteczka, dipolarna 27 tetraedryczna 27 dysocjacja 28 jonizowanie 28 regulacja równowagi 26 struktura wielkocząsteczkowa 27 znaczenie biomedyczne 26 Wodorowęglany, stężenie we krwi 926, 928 Wole rodzinne 851 Woski 173 Współczynnik, przenikarności 553 temperatury 100 Wykres, Lineweavera-Burka 105 -----a hamowanie, kompetycyjne 109 niekompetycyjne odwra calne 109

Wykres, podwójnych odwrotności 105 -----a hamowanie, kompetycyjne 108 niekompetycyjne odwracalne 109 Wyniszczenie 338 Wyspy Langerhansa 671 Xeroderma pigmentosum 475, 852 Xerophtalmia 713 Zaburzenia krzepnięcia 8S5 Zaćma 250 cukrzycowa 247 Zakrzepicą 770 „Zamek leucynowy" 526 Zanik nerki 845 Zapalenie 865 płuc 845 siatkówki barwnikowe 908 stawów 769 -----moczanowe ostre 438 -----przewlekłe 438 Zapotrzebowanie energetyczne 723 Zarodźce sierpowate 875 Zasada(y), mocne 29 - piryroidynowe 42, 416 purynowe 416, 425 rozpuszczalność 417 słabe 29 sprzężona z kwasem 31 Zasadowica 26 Zaśniad groniasty 669 Zatrucie, amoniakiem 349 ciażowe u owiec 307, 335 etanolem 858 Zawał serca 845, 856 Zespół, Conna 644 Criglera-Najjara 851 ----- typ,I 412 ---------II 412 Cushinga 644 Downa 846, 847 Dubina-Johnsona 412 Ehlersa-Danlosa 794, 814 ektopowej syntezy hormonów 574 feminizujących jąder 583, 659 Gilberta 412 Huntera 767 Hurler 766, 767, 844 Kearnsa^ayre'a 896 łamliwego X 898 Lescha-Nyhana 425, 440, 542 Marfana 814 McArdle'a 225 MELAS 160 Menkesa777, 814 Morquio-podobny 767 Morteaux-Lamy 767 mózgowo-wątrobowo-nerkowy 844 — nadnerczowo-płciowy 644 - niedoboru a-glukuronidazy 767 policystycznych jajników 669 rakowiaka złośliwego 698

SKOROWIDZ / 95S Zespół, Reye'a 441 Richnera-Hanharta 368 Sanfilippo 767 Scheiego 767 Steina-Leventha.la 669 Turnera 669 Zellwegera 265, 844 Ziarniszczaki 669 „Zinc fmger" 525 Złącze nerwowo-mięśmowe S88 Związki, glukogenne 234 — ketonowe (ciała ketonowe) 190, 191, 194,260,266,287,268,331 -----utlenianie 334 — przeciwutleniające 185

Związki, rozprzegającc łańcuch oddechowy 152, 156 Zymogen 112 Żelatynaza 885 Żelazo, funkcja 775 hemowe 407 metabolizm 730, 775 zaburzenia 776 nadmiar 870 niedobór 775 stężenie we krwi 927

zapotrzebowanie 733 źródła 730

Żelazoporfiryna 375 Żółć 409, 736 — pęcherzykowa 737 - skład 736 wątrobowa 737 Żółtaczka{i) 398, 411 analiza biochemiczna 413 cholestatyczna 413 fizjologiczna noworodków 411

hemolityczna 413 mechaniczna 413 niehemolityczna wrodzona 412 samoistna przewlekła 412 Żywienie 721 normy 731

„Biochemia Harpera" to Jeden z najlepszych i najnowocześniejszych podręczników obejmujący całokształt przemian zachodzących w organizmie człowieka, Obecne, trzecie polskie wydanie tej książki jest całkowicie zmienione w stosunku do poprzednich wydań. Przedstawiony materiał ujęto w 7 podstawowych częściach, uwzględniając zarówno chemizm; Jak [ przemiany metaboliczne podstawowych substancji niezbędnych do życia i funkcjonowania każdego organizmu. Główny nacisk położono na prawidłowe przemiany biochemiczne organizmu, zwracając jednak uwagę na wszelkie skutki patologiczne wynikające z zaburzeń lub nieprawidłowości zaistniałych w poszczególnych szlakach metabolicznych, czyli na biochemiczne podstawy chorób człowieka. Książka ta ma podwójną wartość. Jest niezbędna dla lekarzy oraz studentów w zrozumieniu podstaw zjawisk patologicznych, ale jest także pasjonującą lekturą dla wszystkich zainteresowanych zagadnieniami biochemii w medycynie.

Cena zł 500000,zł 50,-

tSBN 83-200-1798-X