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RESUMEN 1- Las diferencias en el DNA que dan lugar a cambios en la expresión de genes, pueden afectar a la selección natural. 2- En este articulo se sustituye el promotor del gen Prx1 del locus de ratón por el de murciélago 3- La expresión de Prx1 en el promotor de murciélago da lugar al aumento de los niveles de transcripción en el desarrollo de los huesos de las extremidades. 4- La deleción del promotor de Prx1 de ratón da lugar a longitud normal de las extremidades y normal expresión de Prx1. 5- Mutaciones que se acumulan en secuencias reguladoras no codificantes afectan a la diferencias morfológicas.

INTRODUCCIÓN Cambios en el DNA que alteran elementos reguladores no codificantes y creaciones de otros nuevos ¿Influye en la selección natural o evolución? 1- Estas mutaciones: Alteran el patrón y expresión de genes 2- Mutaciones en secuencias codificantes: alteran la función de genes en tejidos donde se expresan.

RESULTADOS Se compara la morfogénesis de las extremidades de raton y murciélago:  -

Diferencias extremidad anterior: longitud relativa de dígitos anterior y posterior presencia o ausencia de tejido entre los dígitos y entre los miembros longitud proximal-distal de los 3 segmentos de las extremidades anteriores en relación con la longitud del cuerpo.

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Conservados entre murciélago y ratón La sincronización relativa Posicionamiento de la formación inicial de los brotes de las extremidades anteriores parecen estar.

1. Definición Prx1: gen que controla el desarrollo porque promueve el alargamiento del esqueleto en las extremidades. 2. Características: - Gen Homeobox - Relacionado con la expresión en somitas, en mesénquima craneofacial y mesodermo de la extremidad durante el desarrollo. 3. Resultados

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Los primeros eventos en el desarrollo de las extremidades son normales en mutantes nulos para Prx1 pero mueren al nacer con severos defectos craneofaciales y extremidades cortas, por lo tanto se demuestra que es un regulador esencial de la elongación de los huesos largos durante el desarrollo de las extremidades. Los huesos largos de extremidades anteriores de murciélago se alargan durante el desarrollo, pero en los ratones para Prx1 nulo, no se produce alargamiento.

Las diferencias en la actividad de Prx1 entre ratón y murciélago pueden contribuir a las diferencias morfológicas que se desarrollan en las extremidades anteriores de ambos.

 ORGANIZACIÓN Y EXPRESIÓN DEL GEN PRX1 EN MURCIÉLAGO Y RATÓN 1- Se aislaron y secuenciaron el locus Prx1 en murcielago y encontramos que su estructura está altamente conservada con ratón. 2- El alineamiento de secuencias de aa deducidos de Carollia PRX1A y B muestran más del 99% de identidad con la isoforma ortóloga de Prx1 en ratón 3- Se encontraron dos aa que difieren entre las proteínas de Prx1 de murciélago y ratón. 4- ¿Dónde? Se produce fuera de los homeodominios conservados, en los motivos PRX y OAR 5- Por lo que se deduce que estas proteínas de Prx1 no difieren en la actividad bioquímica 6- La expresión de Prx1 fue examinada por ISH utilizando una sonda de RNA (desde la etapa temprana de la yema de la extremidad), en ratón y en murciélago, a través de la aparición de la elongación del esqueleto.

Patrón de expresión es similar para ambos, pero difiere en algunas cosas: -Inicialmente la expresión de Prx1 en mesodermo de la yema de la extremidad se expresa igual en raton y en murciélago. -Pero a medida que se produce el desarrollo se puede ver una clara diferencia, viendo que los dominios de murciélago están mas expandidos. - En las primeras etapas no se puede diferenciar la expresión de Prx1 en la mano de ninguna de las especies, pero a medida que se produce el desarrollo se da mas expresión en murciélago. - Dado que las condensaciones digitales empiezan a diferenciarse en elementos condrogénicos, Prx1 se expresa en el pericondrio que rodea a estos elementos en ambas especies.

Conclusión: Hay similitudes y diferencias en la expresión de Prx1 en las extremidades entre ambos, siendo diferencias morfológicas en el desarrollo de las extremidades. Por lo tanto los cambios en la expresión de Prx1; pueden deberse: 1- Diferencias en las secuencias que regulan la transcripción 2- Efecto de diferencias morfologicas

 IDENTIFICACIÓN DEL PROMOTOR DE TRANSCRIPCIÓN DE LA EXTREMIDAD DE PRX1 DE MURCIÉLAGO Y RATÓN. Observaciones -Deleciones mapeadas identificaron una región aguas arriba del inicio de la transcripción de Prx1 capaz de dirigir la expresión del gen informador en las extremidades de ratones transgénicos. -Comparando la región en murciélago y ratón revelaron regiones homólogas no codificantes correspondientes con la región 1 conservada (CR1) Y CR2. Metodología Para investigar el desarrollo del patrón de expresión en la región cis-reguladora CONSTRUIMOS TRANSGENES

Combinando 1-kb de fragmentos genómicos CR1/2 homologas de ratón o murciélago con un promotor básico de lacZ-polyA y genera lineas de ratones transgénicos. Resultados Ratones y murciélagos transgénicos expresan actividad B- galactosidasa en un patrón similar a Prx1 durante el desarrollo. Para demostrar que estas regiones contienen un promotor se generan NUEVOS TRANSGENES.  REEMPLAZO DEL PROMOTOR DEL DESARROLLO DE MIEMBROS ENDÓGENO DE RATÓN POR EL CORRESPONDIENTE DE MURCIÉLAGO 1- Se generan ratones transgénicos que expresan el gen Prx1 de ratón utilizando un promotor de extremidad de murciélago (Prx1BatE). 2- Sustituimos la kb del promotor de murciélago el equivalente de una kb de la secuencia genómica de ratón. 3- Creamos unos clones a los que se introduce loxP y neomicina junto al promotor del murciélago, es decir Prx1BatE. 4- LoxP y neomicina se utilizan para resistencia y para comprobar que se produce, por lo tanto los que resisten tienen Prx1BatE introducido. Para eliminar loxP y neomicina se utiliza la recombinasa Cre. (las enzimas Cre tienen afinidad por LoxP, como lo que se ha introducido es el promotor +neomicina+LoxP+LoxP, como porque tiene que ir flanqueado por las dos zonas, al meterle Cre corta LoxP y LoxP, es decir se lleva LoxP/neomicina y LoxP, y deja dentro CR1BatE)  EL PROMOTOR DE PRX1 DE LA EXTREMIDAD DE MURCIÉLAGO INCREMENTA LA LONGITUD DE LA EXTREMIDAD ANTERIOR EN RATONES DURANTE EL DESARROLLO.

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BatE Presencia de ratones homocigotos o heterocigotos para el alelo Prx1 y el análisis morfométrico de las preparaciones esqueléticas revela que las extremidades

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BatE / BatE anteriores de mutantes Prx1 son ~ 6% más largas que las de tipo salvaje en E18.5. Al igual que los ratones de Prx1 nulos, el patrón de extremidad no presenta cambios a pesar de que se altera la longitud. (análisis estadístico de estos datos mediante la prueba t de Student, prueba de Kruskal-Wallis y Wilcoxon rango suma)

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Las extremidades anteriores de los homocigotos-Prx1 nulos son ~12.5% más cortas que los controles en E18.5.

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RATONES MUTANTES POR DELECION DEL PROTOMOR DE PRX1 TIENEN LONGITUD DEL MIEMBRO Y EXPRESION NORMAL

1- Se utilizan ratones que carecen de promotor de Prx1 utilizando la orientación de genes. 2- Estrategia similar a la de la sustitución del promotor (apartado anterior); excepto que no se elimina la región genómica de murciélago. 3- Los ratones homocigóticos para el alelo Prx1Enh no presentan defectos en las extremidades. 4- No hay diferencia significativa en comparación con los controles en la longitud de la extremidade (E18.5) 5- Se llevana cabo diferentes estudios por PCR, por ISH e inmunohistoquimica y no hay diferencias significativas. 6- Estos resultados demuestran que el locus Prx1 contiene reforzadores adicionales cuya actividad es redundante con el promotor de la extremidad se ha eliminado.