Gma5.docx

Saray Martínez González

Trabajo de fin del master: “Genética y Evolución” Granada 2015

Tutor: Juan Carlos Álvarez Merino Cotutor: María Saiz Guinaldo

ÍNDICE

1. ABSTRACT ............................................................................................................ 7 2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 98 3. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 10 3.1 LA MITOCONDRIA: generalidades ..................................................... 10 3.2 GENOMA MITOCONDRIAL HUMANO ............................................. 10 3.2.1 Organización y estructuraEstructura y organización del ADN mitocondrial ............................................................................. 10 3.2.2 Secuencia de referencia de ADN mitocondrial humano .. 14 3.3 CARACTERISTICAS DEL ADNmt HUMANO 3.32.13 Herencia del ADN mitocondrial humano..................... 15 3.32.24 Alto número de copias.................................................. 16 3.32.35 Tasa de mutación del ADN mitocondrial ..................... 16 3.32.46 Heteroplasmia............................................................... 17 3.43 ADNmt Y GENÉTICA DE POBLACIONES ............................................. 19 3.43.1 Polimorfismos del ADN mitocondrial .......................... 19 3.43.2 Haplogrupos ................................................................... 20 3.5 APLICACIONES DEL ADNmt 3.64 BASES DE DATOS DE ADNmt .................................................................... 3.64.1 Clasificación de las bases de datos..................................... 3.64.2 Bases de datos .................................................................... 3.75 REINO DE GRANADA ................................................................................. 3.75.1 Introducción ....................................................................... 3.75.2 Territorio del Reino Nazarí de Granada ............................. 3.75.3 Una época de prosperidad .................................................. 3.75.4 La edad dorada nazarí (S.XIV) .......................................... 3.75.5 Decadencia y caída del Reino ............................................ 4. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 28 4.1 PROTOCOLO GENERAL .................................................................... 29 4.2 ANÁLISIS GENÉTICO MOLECULAR................................................. 29 4.2.1 MuestrasProtocolo general de trabajo .......................... 29 4.2.2 Proceso de eExtracción del ADN ................................. 30 4.2.3 Proceso de cCuantificación del ADN ............................... 4.2.4 Proceso de amplificación del ADNPurificación del producto de PCR .............................................................................. 4.2.5 Purificacion del producto de PCRSecuenciación del ADN mitocondrial ...................................................................... 4.2.6 Purificación del producto de Ssecuenciación ................... 4.2.7 Purificacion del producto de secuenciaciónElectroforesis capilar ............................................................................... 4.2.8 Electroforesis capilar

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4.

................................................................................................................ 5 . ABSTRACT .................................................................................................................. 7 5. OBJETIVOS 8 6. INTRODUCCIÓN 10 3.1 LA MITOCONDRIA: generalidades 10 3.2 GENOMA MITOCONDRIAL HUMANO 10 3.2.1 Estructura y organización del ADN mitocondrial 10 3.2.2 Secuencia de referencia de ADN mitocondrial humano 3.2.3Herencia del ADN mitocondrial humano 3.2.4 Alto número de copias 3.2.5 Tasa de mutación del ADN mitocondrial 3.2.6 Heteroplasmia 3.3 ADNmt Y GENÉTICA DE POBLACIONES 3.3.1 Polimorfismos del ADN mitocondrial 3.3.2 Haplogrupos 3.4 BASES DE DATOS DE ADNmt 3.4.1 Clasificación de las bases de datos 3.4.2 Bases de datos 3.5 REINO DE GRANADA 3.5.1 Introducción 3.5.2 Territorio del Reino Nazarí de Granada 3.5.3 Una época de prosperidad 3.5.4 La edad dorada nazarí (S.XIV) 3.5.5 Decadencia y caída del Reino 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.3 PROTOCOLO GENERAL 4.4 ANÁLISIS GENÉTICO MOLECULAR 4.4.1 Protocolo general de trabajo 4.4.2 Extracción del ADN 4.4.3 Cuantificación del ADN 4.4.4 Purificación del producto de PCR 4.4.5 Secuenciación del ADN mitocondrial 4.4.6 Purificación del producto de secuenciación 4.4.7 Electroforesis capilar 9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL ADN MITOCONDRIAL RESULTADOS 10. ...................................................................................................................... 6.

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ABREVIATURAS ADN ADNmt ARN ATP BSA CE CODIS CRs dNTPs DTR DTT EDTA EMPOP FBI

Ácido desoxirribonucléico ADN mitocondrial Ácido ribonucleico Adenosíntrifosfato BovineSerumAlbumin (Albúmina Sérica Bovina) Capilar Electrophoresis (electroforesis capilar) Combined DNA IndexSystem (Sistema Combinado de Índice de ADN) Secuencia de Referencia de Cambridge desoxiribonucleósido 5’-trifosfato DyeTerminatorRemoval Ditiotreitol
 Ácido EtilenDiaminoTetracético Base de datos poblacional de ADNmt del European DNA ProfilingGroup Federal Bureau of Investigation (Buró Federal de Investigación de los Estados Unidos) Fw Forward gl Grados de libertad HV1 Región hipervariable 1 del ADNmt HV2 Región hipervariable 2 del ADNmt HV3 Región hipervariable 3 del ADNmt Kb Kilobases MME Membrana mitocondrial externa MMI Membrana mitocondrial interna min Minutos ml Mililitros mM Milimolar NCBI National Center for Biotechnology Information pb pares de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa RCC Región control completa RFLPs Fragmentos de restricción de longitud polimórfica RSRS Secuencia de Referencia Sapiens Reconstruida SNP Polimorfismo de un solo nucleótido r.p.m. Revoluciones por minuto SDS Dodecil Sulfato Sódico TBE Tris-Bórico-EDTA μl Microlitro VR1 Región variable 1 VR2 Región variable 2

A mis padres, A mi abuelo

Agradecimientos Ésta es una de las partes más difíciles de escribir del proyecto, quiero agradecer que me han aportado algunas personas de una forma u otra, sin ellas no hubiera sido podido realizar este trabajo. A José Antonio Lorente, Juan Carlos Álvarez y María Saiz Guinaldopor la confianza depositada en mí para formar parte de su equipo de investigación. Gracias José por darme la oportunidad de entrar en tu grupo, de otro modo no podría haber realizado uno de mis grandes sueños. Gracias Juan Carlos director de este trabajo, por depositar tu confianza en mi persona y por poner todos los medios disponibles a mi alcance. Gracias María por permitirme trabajar y aprender contigo y adentrarme en el mundo de la genética forense, por mostrarme tu amistad y valiosos consejos. A todos los que forman parten del Departamento de Medicina legal,Toxicología y Antropología Física de la Universidad de Granada, en especial a mis compañeras de laboratorio, a todas les debo algo porque durante estos meses cada uno de ellas me han ayudado de alguna forma, María y Nati, gracias por estar conmigo día a día trabajando y mostrarme vuestro ayuda y comprensión. A mis amigos, en especial a mis grandes amigas, “Mis florecillas”, Cristina, Inma, y Laura, por escucharme, aconsejarme, comprenderme y apoyarme tanto en los momentos gratificantes como en los difíciles. Por ser la parte de la familia que uno escoge. A mi pequeña Maite porque la distancia nunca ha sido problema para tener su apoyo y su cariño.A Ale por estar dispuesto a escucharme, tranquilizarme y a disfrutar conmigo, por estar ahí día a día. A Javi por confiar siempre en mí, escucharme, alegrarme y poder contar con el siempre que lo he necesitado. A mis compañeros demáster porque durante este año, siempre han estado apoyándome y animándome. A mi familia, que siempre se preocupa de cómo me va, por su amor, por sus palabras de alientoy por soportar mis largas ausencias. A mis padres, José y Montse, por confiar en mí, por vuestro cariño, porque siempre estáis apoyándome, sin dejarme retroceder y dándome el apoyo necesario para seguir hacia delante y no rendirme nunca en alcanzar mis metas. Por ser mi ejemplo de constancia, perseverancia y esfuerzo. Gracias por estar siempre y por poder contar con vosotros para todo. A mi hermana y mi cuñado, Delaya y Álvaro, por estar siempre a mi lado, por saber aguantarme en los momentos difíciles, por su paciencia,por su ayuda incondicional y por hacerme ver que en todo momento debía hacer aquello que me gustase, por ello hoy estoy aquí. A mis abuelos, por transmitirme sus valores y su filosofía de vida, en especial a mi abuelo Antonio, “Mi sheriff”, por creer siempre que podría llegar a donde quisiera en la vida y porque sé que estés donde estés, siempre estarás conmigo ayudándome a seguir adelante.

Gracias a todos

Abstract

7

Acuarela de la sala de las dos hermanas. Granada. La Alhambra. (EduardGerhardt)

2 Objetivosvos Formatted: Tab stops: 2.77", Left + Not at 2.95" + 5.91"

8

1. Caracterización de las líneas mitocondriales a través de la secuenciación de la región control completa del ADN mitocondrial de muestras del Reino de Granada.

2. Obtener los parámetros de interés en genética poblacional a partir de los datos calculados.

3. Calcular los diferentes haplogrupos de ADNmt presentes en la población de estudio.

4. Estudiar las relaciones existentes entre los haplogrupos encontrados en la población caracterizada con su posible origen.

5. Comparar la población de estudio con poblaciones que han influido en la estructura genética actual de la zona geográfica estudiada.

Formatted: Tab stops: 2.77", Left + Not at 2.95" + 5.91"

9

8

Acuarela de la sala de la justicia. Granada. La Alhambra. (Trevor Haddon).

3 Introducciónn

3.1

LA MITOCONDRIA: generalidades Las mitocondrias son orgánulos intracelulares cilíndricos y alargados, que presentan

un tamaño similar al de las bacterias, pero es variable según su origen y estado metabólico (miden aproximadamente 1 x 2 μm). Están presentes en prácticamente todas las células eucariotas, hay aproximadamente 2000 mitocondrias por célula, aunque las células con mayor actividad metabólica tienen un mayor número en comparación con las de menor actividad [1]. En cuanto a su estructura, se encuentran rodeadas por una membrana externa (MME) y una membrana interna (MMI), que separan el espacio intermembranal [2]. La membrana mitocondrial externa, lisa, se encuentra en contacto con el citoplasma, mientras que la membrana mitocondrial interna, muy plegada, presenta invaginaciones hacia la matriz mitocondrial, denominadas crestas mitocondriales. La función de estos orgánulos se basa en suministrar la mayor parte de la energía necesaria para la actividad celular; ya que, sintetizan ATP a expensas de glucosa, ácidos grasos y aminoácidos por medio de la fosforilación oxidativa [2,3]. En relación al origen de las mitocondrias, actualmente, se acepta la teoría endosimbionte presentada por Lynn Margulis en el año 1967, según la cual, las mitocondrias

Formatted: Highlight

son descendientes de las bacterias aeróbicas que, de alguna forma, sobrevivieron a la endocitosis y se incorporaron en el citoplasma [4,5]. Más tarde, el descubrimiento de los genomas mitocondriales y los resultados de reconstrucción filogenética apoyaron esta hipótesis endosimbionte, la cual podría dar explicación al hecho de que las mitocondrias posean su propio material genético, el ADN mitocondrial (ADNmt) y su maquinaria para expresarlo. Sin embargo, no son genéticamente autosuficientes ya que gran parte de sus proteínas funcionales y estructurales están codificadas por genes presentes en el núcleo celular [6].

3.2 GENOMA MITOCONDRIAL HUMANO 3.2.1 Organización y estructura El genoma humano está constituido, en su mayor parte, por el genoma nuclear, localizado en el núcleo de cada célula; y por el genoma mitocondrial, que se encuentra dentro de la mitocondria. El genoma nuclear es muy complejo, está formado por 26 000 genes, mientras que el genoma mitocondrial es muy simple, formado solo por 37 genes [7]. Ambos poseen características diferentes y son útiles en múltiples aplicaciones tanto en genética 10

Formatted: Font: 16 pt, Italic, Font color: Custom Color(RGB(75,172,198))

forense como en antropología molecular.

Formatted: Font: Times New Roman

Genoma nuclear

Genoma mitocondrial

Figura 1: Comparación de la organización del genoma nuclear y mitocondrial. Fuente propia.

Formatted: Font: Times New Roman

Formatted: Font: Times New Roman, 12 pt

En cuanto a su estructura, el ADNmt se caracteriza por ser una molécula de doble hebra, circular y cerrada. En las células humanas está presente en múltiples copias; pueden contener desde cientos a miles de moléculas de ADN mitocondrial [8–11]. La molécula de ADN mitocondrial humano presenta un tamaño de aproximadamente 16 569 pb (~ 16,6kb) [12,13], pero puede variar debido a pequeñas inserciones o deleciones. Un ejemplo que podemos destacar, encontrado al analizar las secuencias; es la repetición de dinucleótidos en las posiciones 514 a 524, que en la mayoría de los individuos es ACACACACAC o (AC)5 pero se ha observado que varían de (AC)3 a (AC)7 [14,15]. Sus dos cadenas son complementarias y antiparalelas. Éstas presentan una proporción muy diferente de bases: la cadena pesada (o H de “heavy”) del ADN codifica 2 ARNs ribosomales, 14 ARNs de transferencia y 12 polipéptidos y tiene una elevada proporción de bases purínicas (guanina y adenina). Por otro lado, la cadena ligera (o L, de “light”) contiene solamente información para 8 ARNs de transferencia y un polipéptido (ND6) y es rica en bases pirimidínicas (citosina y timina).

11

En relación a la organización del ADNmt, podemos decir que se encuentra dividido en dos

Formatted: Indent: Left: 0", Space After: 12 pt

regiones, una región codificante y una no codificante:

La región no codificante del genoma, denominada región control, es la responsable de la regulación del ADNmt. Contiene fundamentalmente los promotores de la

Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.49", Space After: 12 pt, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"

transcripción de ambas cadenas, el origen de replicación de la cadena pesada y secuencias de regulación [12]. Por su aspecto en microscopía electrónica durante la replicación del ADNmt, ha sido también llamada Asa de desplazamiento (D-Loop). El D-Loop es la región del genoma donde tiene lugar la separación inicial, o desplazamiento de las dos hebras de ADN durante la replicación [16,17]. ARNtPro ARNtPhe

ARNtThr

OH Citocromo b

ARNr 12s

ARNtGlu

ARNtVal

ND6

Genes ARN ribosomal

ARNr16s ARNtLeu

Genes ARN transferente Genes del complejo I (NADHdeshidrogenasa

ND1 ARNtIle

ND5 ARNtLeu ARNtSer ARNtHis

Genes del complejo III, coenzima Q citocromo c reductasa

ARNtMet ARNtGly

Genes del complejo IV citocromo c oxidasa ND2

ND4

ARNtTrp

Genes ATP sintasa

ARNtAla ARNtAsp

Región control

ARNtCys ARNtTyr

ND4L ARNtArg ARNtGly

Citocromo-oxidasa II ARNtLys

ARNtSer

Citocromo-oxidasa III

Citocromo-oxidasa II ARNtLeu

Figura 2: Ilustración del Genoma mitocondrial humano. Se observa la cadena pesada (H) representada mediante la línea exterior y la cual contiene una mayor cantidad de residuos de A y G que la cadena ligera (L). Fuente propia.

12

Formatted: Indent: Left: 0", Space After: 12 pt



La región codificante, que representa el 90% del genoma mitocondrial, contiene 37

genes, altamente empaquetados. Éstos se corresponden con dos ARN ribosómicos (rARN) componentes de los ribosomas mitocondriales (ARNr 12S y 16S), 22 ARNs de transferencia (ARNt) necesarios para la traducción dentro del orgánulo, y 13 polipéptidos [12,18] muchos de los cuales son subunidades de complejos multiméricos localizados en la membrana mitocondrial interna y que se encargan de catalizar la fosforilación oxidativa y participar en la producción de ATP [19]. Los 13 polipéptidos codificados por el ADNmt incluyen 7 de las 48 subunidades del complejo I (ND1-6 y ND4L), 1 de las 11 subunidades del complejo III (citocromo b), 3 de las 13 subunidades del complejo IV (COXI-III) y 2 de las 14 subunidades del complejo V (ATPasa 6 y 8) [20]. Se estableció una nomenclatura para referirse a las posiciones en el genoma siguiendo un criterio arbitrario, así: la posición 1 se encuentra en una región intermedia de la región control y se continúa en sentido 5’ – 3’ hasta la posición 16 569 [6].

0 16024

16365

73

HVI

340 440

HV2

342 pb

137pb

560

HV3 268pb

Figura 3: Región control completa: posiciones de las tres regiones hipervariables dentro de la región control.. Fuente propia.

De modo que, la región control se extiende desde la posición 16 024 hasta la 16 569 y desde la 1 hasta la 576 y es muy polimórfica. Dentro de ésta región, distinguimos dos regiones hipervariables bien caracterizadas, y conocidas como la región hipervariable I, HVI, (16 024-16 365) y la región hipervariable II, HVII (73-340) [21], y una tercera región hipervariable, menos utilizada, HV3, (440-560) [22]. Además, existen otras regiones que presentan menor grado de variabilidad conocida como región variable 1 (VR1), que se localiza desde la posición 16 366 hasta la 71 y la región variable 2 (VR2) que se encuentra

13

Formatted: No bullets or numbering

entre las posiciones 341 y 576 [6].

3.2.2 Secuencia de referencia de ADN mitocondrial humano La primera vez que se secuenció el ADNmt humano fue en el año 1981, en el laboratorio de Frederick Sanger en Cambridge, Inglaterra [12]. Durante muchos años se utilizó esta secuencia original “Anderson” o Secuencia de Referencia de Cambridge (CRs) [23] como secuencia de referencia para comparar con las nuevas secuencias. La secuencia de 1981 se derivó principalmente de un solo individuo de ascendencia europea; sin embargo, también contenía algunos HeLa y secuencias de la especie bovina para llenar los vacíos resultantes de procedimientos de secuenciación de ADN [12]. Debido a posibles errores en la secuencia, en el año 1999 ésta secuencia original fue resecuenciada (rCRs), por un equipo dirigido por Richard Andrews [18]. La revisión se basó en una nueva secuenciación de la misma muestra, se corrigieron 11 errores de la secuencia original y señalaron la ocurrencia de 7 polimorfismos raros [18]. Los errores consistían en substituciones de bases debidas a la contaminación de la muestra en la primera secuenciación, siendo el caso más problemático el de la posición 3107 de CRs, en el que se había insertado accidentalmente una citosina, añadiendo así 1 pb al número total que resultaba ser 16 558. Además, se presentaban 7 posiciones de nucleótidos, que presentaban polimorfismos raros: 263A, 311-315CCCCC, 750A, 1438A, 4769A, 8860A y 15 326A, los cuales son propios del haplogrupo europeo H al que pertenecía la muestra original [24]. Tabla 1: Comparación de las diferencias de nucleótidos observadas entre CRs y rCRs, Posición nucleotídica

Región de ADN mitocondrial

CRsoriginal

CRs revisada (rCRs)

Observaciones

3106-3107

16S rRNA

CC

C

Error

3423

ND1

G

T

Error

4985

ND2

G

A

Error

9559

COIII

G

C

Error

11335

ND4

T

C

Error

13702

ND5

G

C

Error

14199

ND6

G

T

Error

14272

ND6

G

C

14365

ND6

G

C

Error (Secuencia bovina insertada) Error (Secuencia bovina insertada)

14

14368

ND6

G

C

Error

14766

Cyt b

T

C

Error (Secuencia bovina insertada)

A pesar de los errores observados, al no encontrar cambios en la región control, tanto la secuencia original Anderson [12] y la secuencia de referencia de Cambridge revisada [18] eran idénticas en las regiones HV1 y HV2. Por otro lado, en el año 2012, Doron Behar propuso una nueva secuencia de ADN mitocondrial denominada RSRS (Reconstructed Sapiens Reference Sequence), es decir Secuencia de Referencia Sapiens Reconstruida. Esta nueva secuencia ancestral engloba todos los genomas mitocondriales a partir del Homo neanderthalensis [25]. Sin embargo, esta nueva secuencia no ha conseguido imponerse a la rCRs, que la cual sigue siendo la más ampliamente utilizada [26].

3.3 CARACTERISTICAS DEL ADNmt HUMANO 3.3.1 Herencia del ADN mitocondrial humano Desde hace años se conoce que el ADNmt tiene un patrón de herencia materna; mediante el cual la madre trasmite su genoma mitocondrial a todos sus hijos, pero solamente las hijas lo pasarán a todos los miembros de la siguiente generación y así sucesivamente. De modo que durante la fecundación, la pequeña cantidad de ADNmt del espermatozoide no penetra en el óvulo, o no llega a perdurar. Por ello, el genoma mitocondrial del cigoto procede en su totalidad del óvulo materno.

Formatted: Font: Not Bold

Figura 4: Herencia del ADN mitocondrial. A diferencia delADN nuclear (a la izquierda),

15materno (derecha).Fuente propia. el ADN mitocondrial se hereda por linaje

La primera evidencia de esta herencia uniparental se demostró en el año 1972 [27], en el género de ranas Xenopus. Fue a partir de entonces, cuando esta teoría comenzó a ganar popularidad y numerosos estudios demostraron que no había evidencias de transmisión del ADNmt paterno en una amplia gama de especies [28–31]. En el año 1980, Giles, observó por primera vez en humanos que la progenie presentaba siempre la misma variante materna mediante el análisis de polimorfismos RFLPs [28]. Más tarde, otros estudios confirmaron que las mitocondrias del esperma son selectivamente destruidas en el oocito y que el ADNmt paterno es marcado mediante ubiquitinación durante la espermatogénesis para su destrucción posterior en el oocito [32,33].

3.3.2 Alto número de copias Si lo comparamos con el ADN nuclear, el ADN mitocondrial presenta un alto número

Formatted: Highlight

de copias por célula. El ADN nuclear se encuentra en dos copias por célula en organismos diploides, mientras que un oocito maduro se estima que tiene miles de mitocondrias y más de 100 000 copias de ADN mitocondrial [34]. En células somáticas esta cantidad varía de 200 a 1700 copias de ADNmt dependiendo del tipo de tejido [9]. Esta característica permite que sea mucho más sencillo obtener ADN mitocondrial de una muestra que obtener ADN nuclear, lo que le confiere una gran utilidad en muestras de restos mínimos y/o antiguos.

3.3.3 Tasa de mutación del ADN mitocondrial El ADNmt, presenta como característica, la gran facilidad que tiene para acumular mutaciones. Diferentes estudios comparativos entre las secuencias de ADN de varios organismos han demostrado que la velocidad de sustitución nucleotídica durante la evolución ha sido de 5 a 10 veces mayor en los genomas mitocondriales que en los nucleares [35], pero parece que esta diferencia no se da a lo largo de toda la molécula [36]. (Esta alta tasa de mutación)Esto se debe a que no está recubierto por histonas (las

Formatted: Highlight

cuales desempeñan una función protectora del ADN nuclear), no dispone de un sistema de

Formatted: Highlight

reparación del ADN, no presenta intrones (lo que aumenta la probabilidad de que las mutaciones afecten a las secuencias codificantes) y se encuentra altamente expuesto a los radicales libres de oxígeno generados por la fosforilación oxidativa [16]. Esta peculiaridad hace que el ADN mitocondrial sea muy útil para diferentes estudios en genética evolutiva y genética forense [35]. La tasa de evolución varía en función de la frecuencia con la surgen nuevas

16

mutaciones en la molécula y la probabilidad de que estas nuevas mutaciones se fijen en la población (tasa de fijación). Para estimar la tasa de mutación del ADNmt pueden utilizarse diferentes aproximaciones: a través del estudio de pedigríes o a través del estudio de la filogenia. Para entender las diferencias existes en cada una de los tipos de aproximación, hay que considerar que existen posiciones dentro de la región control conocidas como “puntos calientes de mutación” cuya tasa de mutación es 4 o 5 veces mayor que la media [37]. Pero hay que destacar que la tasa de mutación no es igual en todas las regiones del ADN mitocondrial, ya que la región control se caracteriza por presentar una tasa de mutación más elevada que la región codificante, donde la tasa de mutación estimada es de 2-4% [38,39]. Los primeros estudios realizados sugieren datos cercanos a una tasa de mutación en el ADNmt de uno de cada treinta generaciones [40,41], pero a pesar de la herencia materna y de la ausencia de recombinación, las mutaciones posibilitan que se puedan encontrar una o más diferencias en la secuencia de ADNmt en la rama materna de una familia. Se ha estimado que entre dos individuos de origen europeo no relacionados por vía materna, hay una media de 8 diferencias en la secuencia de su ADNmt [42].

3.3.4 Heteroplasmia Se denomina heteroplasmia a la presencia de diferentes subpoblaciones de ADNmt en una mitocondria, célula, tejido, órgano o individuo [43,44]. Se produce debido(a causa) a la

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tasa de error de la polimerasa y a la aparente carencia de mecanismos de reparación implicados con la alta tasa mutacional, los cuales(que) dan lugar a una alta hipervariabilidad entre la población humana [45,46]. Normalmente se considera que todos los individuos son heteroplásmicos a algún nivel, ya que es casi improbable que todos los genomas mitocondriales dentro de un individuo, tejido o incluso de una célula sean iguales [35,47,48]. La heteroplasmia puede observarse en diferentes formas: 1. Un individuo puede presentar más de un tipo de ADNmt en un solo tejido. 2. Un individuo puede tener un tipo de ADNmt en un tejido y otro en otro tipo de tejido. 3. Un individuo puede ser heteroplásmico en un tejido y homoplásmico en otro tejido [49]. Existen dos tipos de heteroplasmias, de longitud y de secuencia [43,50,51]. Las heteroplasmias de secuencia ocurren cuando en una posición determinada de la secuencia del ADNmt hay más de una base, por ejemplo la existencia de C/T. Por otro lado, la heteroplasmia de longitud se manifiesta como la variación en el número de bases existentes en un fragmento homopolimérico de poli C; y son características en las posiciones 16 184-16 17

Formatted: Highlight

193 en HV1 y 303-310 en HV2 [52,53].

Figura 5: Presencia de heteroplasmia de secuencia. Fuente propia

Cuando una célula heteroplásmica se divide, la herencia mitocondrial de las células

Formatted: Font: 8 pt

hijas es una cuestión de azar. Tras varios ciclos de división, el ADNmt puede derivar hacia el mutante puro o hacia el normal puro (homoplasmia) en un proceso conocido como segregación replicativa. Este proceso puede suceder durante la replicación de la célula somática o durante la proliferación de las células germinales femeninas.

Formatted: Underline Formatted: Not Highlight Formatted: Not Highlight

Figura 6: Posiciones de la secuencia del genoma mitocondrial donde se puede observar heteroplasmia de longitud. Imagen tomada y modificada de Butler, … (REF) 2012.

18

3.4 ADNmt Y GENÉTICA DE POBLACIONES Hay varias características de ADNmt que lo convierten en una herramienta útil para la investigación en genética de poblaciones. La primera y más importante es su estricta herencia materna [38,54–57]. Otro atributo del ADNmt es que las moléculas de ADNmt no sufren recombinación, de manera que las mutaciones son la única fuente de diversificación genética [37]. En relación con los estudios de genética de poblaciones, la tasa de mutación elevada de ADNmt es importante porque conduce a una fijación de polimorfismos de nucleótido único (SNPs) en y entre las poblaciones [35,58]. La variación en los perfiles de mutación del ADNmt es muy importante en los estudios filogeográficos de dispersiones humanas e interacciones, ya que permiten determinar el origen geográfico del genoma matrilineal de un individuo. La caracterización del ADNmt en poblaciones humanas, en los últimos años ha ayudado a aclarar cuestiones centrales sobre la evolución humana [59], siendo muy útil como herramienta filogenética [55,60–64]. Las variaciones presentes en el ADN mitocondrial pueden contribuir para la construcción de árboles filogenéticos o varios árboles alternativos dispuestos en red [65–68], que describen la relación entre secuencias individuales. La estructura de este árbol contiene información demográfica que, junto con una tasa de mutación calibrada para la secuencia en estudio, puede ser utilizada para estimar la datación de eventos prehistóricos. Actualmente aporta datos muy significativos en los estudios relacionados con la caracterización genética e inferencia del origen e historia demográfica de poblaciones antiguas y modernas de diferentes continentes.

3.43.1 Polimorfismos del ADN mitocondrial El término polimorfismo fue descrito por Ford en 1940 como la presencia en una población de dos o más formas alélicas discretas, de las que la de menor frecuencia no puede mantenerse soólo por mutación recurrente. Por lo tanto, se asume que un locus es polimórfico cuando el alelo más común para este locus tiene una frecuencia inferior al 99%. La mayor parte de los polimorfismos del ADNmt son sustituciones puntuales, aunque, también se han descrito deleciones e inserciones de una o varias pares de bases [52,69]. Los métodos para medir la variación del ADNmt han progresado en su capacidad para separar los linajes maternos no relacionados y estrechamente relacionados. Los primeros estudios con ADN mitocondrial en la década los 80 se realizaron por el análisis mediante

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Formatted: Font: 16 pt

“RFLP” usando cinco o seis enzimas de restricción [70]. Rápidamente, se incorporaron un mayor número de enzimas (12 o 14), aumentando con ello la resolución de la técnica (RFLPs de alta resolución) [38,54,71,72]. A principios de los 90, el análisis de secuencia de ADNmt a partir de porciones de la región de control comenzó a ser altamente aceptado. Finalmente con la introducción de la PCR [73] empezó a ganar importancia la secuenciación del ADNmt, posibilitando una nueva aproximación al estudio molecular de las poblaciones humanas. La resolución proporcionada por los nuevos análisis de secuenciación permitió realizar una disección más detallada de los tipos mitocondriales individuales. Inicialmente, los análisis se centraron en la región control o D-loop mitocondrial, ampliándose posteriormente a otras regiones no codificantes del genoma mitocondrial. La combinación de ambos procedimientos, RFLPs y la secuenciación de las regiones hipervariables, ha proporcionado ,buenas estimaciones filogenéticas, que han sido posteriormente confirmadas mediante la secuenciación del genoma mitocondrial completo [70]. De esta forma, los estudios filogeográficos del ADNmt humano han revelado una correlación significativa entre los linajes del ADNmt y los orígenes geográficos de las poblaciones humanas. Estos linajes se establecen sobre la base de grupos de secuencias de ADNmt individuales (o haplotipos) relacionadas, conocidos como haplogrupos.

3.43.2 Haplogrupos El análisis molecular de las secuencias de ADN mitocondrial ha revelado que la variación de las mismas se ha acumulado secuencialmente a partir de algunos linajes fundadores, durante el proceso de colonización humana de las regiones geográficas, por lo cual es posible establecer grupos de secuencias que se pueden asociar geográfica o étnicamente [74]. A partir del análisis filogenético de los linajes mitocondriales, se ha observado que los individuos a menudo se agrupan en haplogrupos. Se define haplogrupo como la agrupación de haplotipos que comparten ciertas sustituciones diagnósticas y que presentan un origen común. Algunos de ellos pueden ser definidos por los polimorfismos de un solo nucleótido [75,76] y son específicos para los Africanos, Europeos, Asiáticos o Amerindios [77]. Estos haplogrupos fueron definidos originalmente a finales de los años 80 y principios de los 90 mediante la agrupación de las muestras con patrones iguales o similares cuando se sometieron a una serie de enzimas de restricción que se utilizaron para separar los distintos tipos de ADN mitocondrial de poblaciones diversas de todo el mundo.

20

En 1996, Torroni muestra que existe una correlación entre los haplogrupos definidos por RFLPs y las secuencias para HVI y HVII. Así, Wallace y Torroni [78] propusieron una nomenclatura que identifica los clústeres principales designándolos con una letra mayúscula (Ej.: A, B, C, D, H, I, L, U, V). Los clústeres se dividen en sub-clústeres que se designan por su letra correspondiente seguida de un número (Ej.: L2). Las subdivisiones al nivel siguiente se realizan alternando letras minúsculas y números (Ej.: U5a1b). De este modo se definió que los haplogrupos A, B, C, D, E, F, G y H estaban típicamente asociados con poblaciones asiáticas, mientras que la mayoría de las poblaciones nativo americanas pertenecen a los haplogrupos A, B, C, y D, siendo el más frecuente en los grupos étnicos mesoamericanos el A [79,80]. Los haplogrupos L0, L1, L2 y L3 son exclusivamente africanos, y los haplogrupos H, I, J, K, T, U, V, W, y X están típicamente asociados con poblaciones europeas [75], siendo el haplogrupo mayoritario en la población española, el haplogrupo H [81,82].

Figura 7: Expansión de las poblaciones humanas siguiendo la distribución de haplogrupos de ADNmt. Fuente propia

21

Basándose en la teoría del reloj molecular [83–85] se estableció que la historia de la migración humana tendría su origen en África, continente en el que el Homo sapiens pudo surgir hace unos 150 000-200 000 años con el primer haplogrupo africano específico, L0 [60,86], y fue evolucionando dando lugar a la aparición de los linajes L1, L2 y L3. En el nordeste de África, L3 habría generado dos nuevos linajes, M y N, los cuales marcarían la salida del hombre moderno fuera de África, y por tanto, constituirían los antecesores de todos los linajes de ADNmt de Europa, Asia, América y Oceanía. Se estima que estos linajes pudieron haber colonizado Eurasia hace unos 65 000 años. Mientras que en Europa, N daría lugar a los haplogrupos H, I, J, U, K, T, U, V, W y X; en Asia, M y N originarían un diverso rango de haplogrupos. Finalmente, a partir de N surgirían A, B, F, C, D, y el haplogrupo G a partir de M [60,75,87–89].

3.5 APLICACIONES DEL ADNmt Las características que presenta el DNAmt permite que pueda ser muy útil en

Formatted: Left, Indent: First line: 0", Line spacing: single, Widow/Orphan control, Adjust space between Latin and Asian text, Adjust space between Asian text and numbers Formatted: Normal

diferentes campos: 

Formatted: Font: 16 pt, Italic, Font color: Accent 5

Criminalística: La utilización del análisis DNAmt con fines identificativos surgió a

Formatted: Justified

principio de los años 90. La primera opción utilizada suele ser el análisis de STRs autosómicos, pero normalmente en las investigaciones criminales las evidencias que se obtienen no suelen estar en condiciones óptimas o son muestras muy pequeñas. En estos casos es difícil obtener un perfil de marcadores autosómicos de DNA nuclear y por lo tanto el ADN mitocondrial es una buena alternativa. Los polimorfismos de ADNmt pueden ser utilizados para las comparaciones entre un sospechoso y una muestra. Se considera que cuando un sospechoso posee un haplotipo de ADNmt diferente al de la muestra biológica, presenta probabilidad de exclusión. En cambio no se puede considerar una inclusión mediante el estudio de DNAmt, ya que todos los familiares pertenecientes al mismo linaje materno comparten el mismo haplotipo y se encontrarían inexcusablemente implicados [6]. 

Maternidad y hermandad: El ADN mitocondrial presenta especial interés en el estudio de parentesco entre familiares relacionados por vía materna, cuando no se

Formatted: List Paragraph, Justified, Line spacing: 1.5 lines, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"

cuenta con familiares de primer grado y se ha de recurrir al estudio de familiares

Formatted: Font: Not Bold

lejanos o bien cuando se ha de realizar identificación de restos óseos contando con

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt

parientes maternos, donde habitualmente la cantidad de ADN nuclear esperada es baja

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

o muy baja [6]. Este estudio del ADNmt complementa el análisis de polimorfismos

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt

del ADN nuclear, proporcionando información adicional.

Formatted: Font: (Default) Times New Roman

Evolución y genética de poblaciones: Destaca por sus aplicaciones en Antropología

Formatted: Font: Times New Roman

Física o Biológica. La caracterización del ADNmt en poblaciones humanas, tanto

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt

actuales como antiguas, en otros primates, y en fósiles del género Homo, ha ayudado a lo largo de los años a aclarar cuestiones centrales de la evolución humana [59]. El ADNmt se puede usar para el cálculo de los polimorfismos genéticos de la población, estimando las distancias genéticas entre individuos, y construyendo un



Formatted: List Paragraph, Justified, Space Before: 0 pt, After: 0 pt, Line spacing: 1.5 lines, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5", No widow/orphan control, Don't adjust space between Latin and Asian text, Don't adjust space between Asian text and numbers Formatted: Font: Times New Roman

árbol filogenético [55,60–64]. Se puede trazar el ancestro de un grupo particular de

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personas y encontrar relaciones genéticas entre las poblaciones, reconstruyendo así, la

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historia genealógica y demográfica de la población. Además estos estudios son muy

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útiles para conocer la historia de las migraciones de poblaciones humanas.

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Estudios asociados a enfermedades: El estudio del DNAmt puede ayudar a asociar las enfermedades con haplogrupos o incluso con haplotipos particulares, para así

Formatted: Font: Times New Roman, 12 pt Formatted: Font: 12 pt, Not Bold Formatted: Font: Times New Roman, 12 pt

poder realizar un perfecto diagnóstico de los pacientes a la hora de realizar un panel de marcadores genéticos .

Formatted: Font: Times New Roman, 12 pt

Se ha demostrado por ejemplo, que el haplogrupo mitocondrial J es un factor protector frente al desarrollo de la artrosis de rodilla y de cadera. Otros estudios

Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: Not Bold

proporcionan información sobre el efecto protector de los clústeres UK y TJ sobre la

Formatted: Font: Not Bold

enfermedad de Parkinson [90], mientras que, parece ser que el clúster HV y el

Formatted: Font: Not Bold

haplogrupo H otorga una mayor predisposición a algunas enfermedades

Formatted: Font: Not Bold

neurodegenerativas como el Parkinson y el Alzheimer [91,92].

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt

Además, también se ha encontrado relación entre los haplogrupos y la probabilidad de padecer diferentes tipos de cáncer (mama, colorectal y tiroideo) [93] o incluso la asociación de los haplogrupos con el envejecimiento [94].

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt Formatted: Indent: Left: 0.5", First line: 0.44" Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt Formatted

3.4

3.6 BASES DE DATOS DE ADN MITOCONDRIAL

Formatted: No bullets or numbering Formatted: Font: 16 pt

3.64.1 Clasificación de bases de datos En las bases de datos se almacena de modo ordenado y coherente la información obtenida, importante en la estimación de la frecuencia esperada de los haplotipos de ADNmt que se observan en los casos cuando la secuencia de ADNmt de un sospechoso coincide con la de una muestra de una prueba. Permiten interpretar y dar un valor estadístico a la prueba del ADN, siempre que se encuentren perfectamente clasificadas y reguladas [95].

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Debido a la acumulación de datos de ADN, en la actualidad, en genética forense, se pueden clasificar de las bases de datos en base a su contenido y su finalidad: 

Clasificación según el contenido: las bases de datos solo pueden contener resultados y datos, es decir, solo se consideran bases de datos aquellas que en un soporte de papel o informático, contienen letras y números que identifican a una persona de entre todas las demás.



Clasificación según su finalidad: pueden ser generales (comprenden a toda una población o país), profesionales (archivo biológico que incluye a profesionales de riesgo), judiciales o forenses: forenses criminales (acumulan datos de personas que han sido condenadas o procesadas) y forenses civiles (identificación de personas desaparecidas). El ascendente número de secuencias de ADNmt poblacionales que se han ido

incorporando a la literatura y a las bases de datos, ha permitido mejorar nuestro conocimiento sobre la filogenia mundial del ADNmt, pero dicha cantidad de información también ha supuesto una serie de obstáculos para los laboratorios a la hora de su manejo. La interpretación de las secuencias de ADNmt puede ser complicada, y tanto las etapas de secuenciación como de documentación de los datos obtenidos pueden ser importantes fuentes de errores [96–99]. Actualmente existen bases de datos de más de 1000 individuos no relacionados que han sido recopiladas de varios grupos de población [42,100–103]. Unas de ellas son bases de datos activas y otras muchas en desarrollo.

3.64.2 Bases de datos A. Base de datos de ADNmt del FBI El FBI de Estados Unidos ha desarrollado una base de datos de poblaciones de ADN mitocondrial, denominada CODISmt [102], muy útil en la resolución de crímenes y en la identificación de los restos de personas desaparecidas. CODISmt contiene 4839 perfiles forenses de ADN mitocondrial de 14 poblaciones diferentes como Afroamericanos (1148 secuencias), Caucásicos (1655) e Hispanos (686), Koreanos (182), Pakistaníes (8) y Japonenes (163) entre otros [24].

B. EMPOP (EDNAP mtDNAPopulationDatabase)

Formatted: Justified Formatted: Underline

24

La base de datos EMPOP(EDNAP mtDNA Population Database),Esta base de

Formatted: Font: Not Italic

datos,[102]ha reunido a miles de secuencias de ADN mitocondrial y ha construido una base de datos ADNmt de alta calidad, la cual proporciona cuyo objetivo principal es ofrecer una colección de haplotipos de la región control mitocondrial a la comunidad científica [104]. La base de datos está diseñada de manera que intenta evitar la adición de perfiles

Formatted: Normal

erróneos en la medida de lo posible e intenta cubrir todas las poblaciones del mundo, donde la mayoría de los perfiles incluidos pertenecen a poblaciones de países del oeste de Europa[103]. Actualmente almacena 5173 secuencias forenses repartidas de la siguiente

Formatted: Font: Times New Roman

forma[104]: 4476 haplotipos del oeste de Europa, 162 haplotipos del este de Asia, 187

Formatted: Font: Times New Roman

haplotipos del sureste de Asia y 348 haplotipos de África.

Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: Times New Roman

C. DNAmt Manager Esta base de datos Ccontiene 9294 secuencias de la región de control del ADNmt agrupados en cinco subconjuntos: África (1496), de Eurasia occidental (3673), de Asia oriental (2326), de Oceanía (114), y se mezcla (1685). Muchas de estas secuencias son compartidas entre las bases de datos del FBI y EMPOP y por tanto no son de haplotipos "únicos" de individuos no relacionados [105]. Formatted: Justified

D. MitoVariome Se trata de una base de datos que se compone de más de 5000 secuencias humanas

Formatted: Justified, Indent: First line: 0.49"

completas de ADN mitocondrial [106]. Los datos se han obtenido desde GenBank, MITOMAP y MTDB, de modo que proporciona asignación de haplogrupo propocionada por

Commented [MSG1]: q significan estas siglas?

SNPs, utilizando la posición de nucleótidos y la anotación de genes correspondientes a las de rCRS [9]. Formatted: Justified

E. PhyloTree Muchas aplicaciones requieren un conocimiento altamente detallado acerca de la relación filogenética de variantes del ADN mitocondrial. La resolución filogenética de la diversidad de ADNmt humano mundial ha mejorado en gran medida por los avances en secuenciación de genomas completos de ADN mitocondrial. Para facilitar la información para el uso de la variación de ADNmt, se ha construido una filogenia integral actualizada de la variación de ADN mitocondrial humano, basada en datos de codificación y de la región control, incluyendo la nomenclatura del haplogrupo universal, y proporcionando referencias a los documentos consultados.

PhyloTreeRecoge ha recopilado información de 55 25

publicaciones basadas en las variaciones en la secuenciación del ADN mitocondrial completo para la realización de una versión actualizada y completa de un árbol filogenético . Para los casos en los cuales la información relativa a un mismo haplogrupo, phylotree elaboró una filogénia comparando el número máximo de secuencias de ADNmt disponibles del haplogrupo en particular, para obtener una imagen a tamaño real actualizada. Además utilizaron otras secuencias de ADNmt completo publicados, los cuales no han sido incorporados en los esquemas filogenéticos[64].

F. GOBASE

Formatted: Justified

Se trata de una base de datos, queFfue creada para abordar cuestiones específicas sobre los orígenes evolutivos y la bioquímica de los orgánulos, así como la relación entre la estructura del genoma y las funciones además de otras cuestiones de biología comparativa [107,108]. Proporciona datos sobre la secuencia, estructura secundaria del ARN e información bioquímica y taxonómica sobre la mitocondria y el cloroplasto . La versión 6 (2002) presenta secuencias analizadas y comentadas derivadas de GenBank[108] y contiene más de 130 000 secuencias mitocondriales, de las cuales 408 pertenece a genomas completos, un aumento del 37% con respecto a la versión anterior. Esta base de datos utiliza un sistema java para la verificación de datos de la población denominado GoPOP [109]. Formatted: Justified

G. HmtDB Es un recurso bioinformático destinado a apoyar la genética de poblaciones y los estudios de enfermedades mitocondriales, gracias a un nuevo enfoque basado en SNPs y la estimación de la variabilidad de aminoácidos. Contiene más de 17.000 genomas mitocondriales humanos. Se compone de 24 cuadros que almacenan secuencias del genoma mitocondrial humano y sus datos característicos tales como geográfica, étnica y / o de la población y la información lingüística, así como información acerca de la fuente de la que se extrajo el ADN y el método utilizado para extraer y la secuencia de la misma[105].

H.G.

HvrBase++

Formatted: Justified

Es una base de datos, la cual comprende 13 873 secuencias de la región hipervariable I (HVRI) y 4940 secuencias de la región hipervariable II (HVRII) e incluye 1376 genomas mitocondriales completos. HvrBase ++ se centra en los aspectos de la genética de poblaciones y recoge información de datos, como los grupos étnicos y las lenguas habladas por cada individuo [110]. 26

3.53.7

REINO DE GRANADA

Formatted: Font: 16 pt Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.49", Outline numbered + Level: 2 + Numbering Style: 1, 2, 3, … + Start at: 7 + Alignment: Left + Aligned at: 0.49" + Indent at: 0.99"

3.74.1 Introducción La dinastía Nazarí se formó en el S. XII debido a una situación histórica y unas circunstancias políticas que se produjeron tras un proceso de declive y desestructuración de Al-Andalus (derrota de las Navas de Tolosa, 1212), que precipitó la caída de las principales

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt

ciudades del Guadalquivir [111,112]. La dinastía Nazarí Ffue la última dinastía musulmana

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt

que dominó el Reino de Granada desde el año 1238 hasta Enero del año 1492 [113,114].. Su caída dio lugar al final de Al-Andalus. El creador del Reino de Granada fue La fundacióndel Reino Nazarí de Granada en el siglo XIII no habría sido posible sin una personalidad como la de su fundador, el emir Muh ̣ammad Ibn Yusuf Nars Ibn I (m. 1273), que hasta el año 1232 había sido solo señor de Arjona y el cual en poco tiempo, logró extender su autoridad a Jaén, Porcuna, Córdoba, Guadix y Baza. Fue conocido como “hijo del rojo”, el cual dio lugar al nombre de la alcazaba que escogió como residencia en Granada: “La Roja”, “La Alhambra” [115].

3.74.2 Territorio del Reino Nazarí de Granada En el año 1236, la conquista cristiana de Córdoba, provoca la aclamación de Muhammad I por parte de los habitantes de Granada, la cual queda a partir de ese momento como capital del nuevo reino [115]. Ésta ocupó durante generaciones el lugar de centro rector del reino como capital, sede y corte de los al-Ahmares. Era un centro comercial y cultural de primer orden, que llegó a contar con aproximadamente 165 000 habitantes y del que actualmente se conservan importantes conjuntos urbanísticos [116]. Años mas tarde se producen expansiones territoriales, que son determinantes en la configuración, política y geográfica del Reino nazarí: Málaga y Almería, con sus respectivas comarcas. Además comprendía la zona meridional de la provincia de Jaén y parte de la provincia de Cádiz [114]. Esta configuración geográfica facilitaba la relación con los pueblos norteafricanos y mediterráneos y quedó oficializada con la firma del célebre Tratado de Jaén en 1246 con Castilla. Se establecía así “el acta de nacimiento del emirato granadino”, que se mantendría durante 260 años, prolongando la existencia de la historia de Al-Andalus..

Formatted: Not Strikethrough Formatted: Normal, Justified, Indent: First line: 0.49", Line spacing: 1.5 lines, No widow/orphan control, Don't adjust space between Latin and Asian text, Don't adjust space between Asian text and numbers

27

Figura 8: Mapa territorio del Reino Nazarí de Granada. Fuente propia

3.74.3 Una época de prosperidad El 20 de enero de 1273, al caer de un caballo, murió Muhammad I, dejando como heredero a Si el emir Muh ̣ammad I había sido el artífice del establecimiento de un nuevo Estado en al-Andalus, a su hijo Muh ̣ammad II (1273-1302) el cual(que) logró la pacificación

Formatted: Highlight

del reino, la alianza con los mariníes y el recrudecimiento de la guerra contra Castilla

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline

centrada principalmente en la posesión de Gibraltar. se debe el mérito de apuntalar y desarrollar los logros conseguidos por su padre y de organizar este incipiente emirato, dotándolo de estructuras administrativas propias. Posteriormente, su hijo Muhammad III, conocido como erudito, poeta y constructor de la Gran Mezquita de la Alhambra, gobernó desde el año 1302 a 1309 y , fue reconocido como señor de Ceuta. y se preocupó de dotar a la Alhambra de unas dependencias apropiadas para una ciudad palatina.En Marzo de 1309 Nasr destronó a su hermano y accedió al trono en un momento de crisis que no consiguió resolver, incluso incrementándola debido a las batallas por el dominio del estrecho de Gibraltar.

3.74.4 3La edad dorada nazarí (S.XIV) En el siglo XIV, el Reino Nazarí alcanza su máximo esplendor. con la llegada al trono

28

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline, Font color: Auto

de Isma‘il I, sobrino de Nasr, por lo que se se da un cambio de rama familiar reinante dentro

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de la dinastía nazarí, dando además un otro giro a la política granadina. Tras ser asesinado por su primo, Muhammad b. Ismail, gobernador de Algeciras, el trono pasó a manos de su hijo Muhammad IV, que tenía solo 10 años de edad. Debido a su poca edad, quedó bajo la tutela del que fuera visir de su padre. Aprovechando la situación de enesmitad existente entre el visir y ´Utman b. Abi l-Ula, lo cual casi da lugar a una guerra civil en Granada, Alfonso XI se apoderó de alguna plaza y castillos en la frontera. Ante estos acontecimientos Muhammad IV solicitó ayuda a los meriníes y se hizo con Cabra y Priego, pero a su regreso de Gibraltar a Granada sufrió una emboscada y fue asesinado por dos hijos de ´Utman b. Abi l-Ula. De este cambio sería heredero su hijo Yusuf I, hijo menor del sultán Ismail I, fue al ser proclamado emir en 1333, con tan sólo 15 años de edad, y su reinado fue uno de los más fructíferos, ya que tuvo un gran apogeo político, cultural y económico.. El reinado de Yusuf I fue, uno de los más fructíferos.Se caracterizó por la firma de pacíficos tratados con los reinos de su tiempo, tanto cristianos (Castilla y Aragón) como musulmanes (el meriní de Fez); también por contar con grandes poetas áulicos y visires, entre

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline, Highlight Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline

los que despuntó el gran humanista lojeño Ibn al-Jatib ̣ (m. 1374); y, sobre todo, por sus grandes construcciones tanto en la propia Granada como en el perímetro de la Alhambra. Posteriormente, Muh ̣ammad V sucedió a su padre tras su muerte, protagonizando el reinado más esplendoroso de toda la dinastía. Yusuf II hijo de Muh ̣ammad V sucedió el trono y contribuyó al enriquecimiento cultural del Reino de Granada, pero murió asesinado por Muhammad VI, su hijo menor, que ocupó el trono sin corresponderle. Para ello encarceló a su hermano mayor, Yusuf, en el castillo de Salobreña durante diecisiete años. El principio de la decaída del reino de Granada se da con Muhammad VII, sucesor de Yusuf III, al cual arrebató el trono su primo Muhammad VIII.Hacia el S.XV, con el sultán

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt, Not Bold, No underline

Muhammad VII (1392-1408) se reemprendió la ofensiva contra Castilla. Este hecho debilitó su ejércitoque junto con la creciente estabilidad cristiana y su aumento de recursos y población, produjo una leve pero constante deriva en el Emirato Nazarí. En 1417 con la llegada al trono de Muhammad IX, se rompe de nuevo la línea de sucesión. Éste formó alianza con los reyes de Aragón y Navarra desencadenando una guerra contra Castilla.

3.74.5 Decadencia y caída del reino

29

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Esta dinastía tuvo un total de 20 sultanes o emires granadinos. Muley Hacén (que dió nombre al pico más alto de Sierra Nevada), el Zagal y Boabdil (conocido como “el Rey Chico”), fueron los últimos soberanos de la dinastía nazarí. Los tres se vieron implicados en la llamada "Guerra de Granada", que abarcó desde 1481 (con la toma de la plaza de Zahara, cerca de Ronda) hasta principios de 1492, cuando Boabdil entregó Granada a los Reyes Católicos. Este hecho puso fin a más de 260 años de reinado nazarí [117].

Figura 8: Mapa territorio del Reino Nazarí de Granada. Fuente propia

Formatted: Underline

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30

Litografía de acuarela del patio de los leones. La Alhambra, Granada. (Parcerisa, F. J.).

4 Materiales y métodos

4.1 PROTOCOLO GENERAL DE TRABAJO Una vez conocidaos las características y peculiaridades del los conceptos básicos del ADNm,tasí como y su útil las características de los fragmentos del ADN que se utilizan enaplicación en Genética Forense y Antropología Molecular, es necesario saber es destacable indicar que las estructuras de ADNmt se pueden extraer a través de muestras de piel, uñas, sangre, saliva, cabellos, huesos…, dientes… El procedimiento analítico en el laboratorio, siempre sigue unos unas pautas o pasos comunes: a. Proceso de extracción del ADN. b. Cuantificación del ADN extraído. c. Amplificación del ADN d. Proceso de electroforesis e. Análisis de los resultados

Extracción del ADN de la muestra

Cuantificación del ADN extraído

Amplificación de RCC

Purificación del ADN amplificado

Secuenciación de RCC

Comparación con CRs

Estimación de la frecuencia de haplotipos

Figura 9: Proceso de evaluación de una muestra de ADNmt. Fuente propia

Formatted: Underline

Se varían Llos protocolos se varían en los distintos pasos en función del tipo, calidad y cantidad de la muestra. Formatted: Normal, Line spacing: single

4.2ANÁLISIS GENÉTICO MOLECULAR 4.2.1 Muestras Para el desarrollo de este trabajo se ha procedido al análisis de marcadores de ADN mitocondrial en muestras no emparentadas, con fines genético-poblacionales. Para la realización de los estudios poblacionales se han utilizado muestras de empleado67 individuos de la provincia de Granada, 58 individuos de la provincia de Málaga y 60 individuos de la provincia de Almería. Todos los donantes fueron informados del 32

Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.49", Tab stops: Not at 0.15" + 0.5"

propósito de este estudio, aceptaron su participación y firmaron un consentimiento informado según la guía ética de la declaración de Helsinki. Formatted: Indent: Left: 0", Tab stops: Not at 0.15" + 0.5"

4.2.2 Proceso de extracción del ADN Se tomaron muestras del epitelio bucal de todos los individuos mediante hisopos

Formatted: Indent: First line: 0.49"

estériles de algodón. El ADN se obtuvo obtivo mediante extracción orgánica con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico, ya que es el método más utilizado en los laboratorios de genética forense, sobre todo para ADN que pueda estar parcialmente dañado, en pequeñas cantidades o con una elevada concentración de sustancias contaminantes. El protocolo es el siguiente: 1. Se cortacon un bisturíestérilla cabeza completa de algodón del hisopo y se introduce en un tubo eppendorf de rosca. 2. Se añadea cada una de las muestras 300 μl de buffer de extracción (10 mM Tris, 100 mMNaCl, 39 mM DTT, 10 mM EDTA, 2% SDS), 7,5 μl de proteinasa K (10 mg/ml) y 12 μl de DTT. 3. Se deja incubar a 56ºC toda la noche (18-24 horas), para conseguir la rotura de las membranas celulares y la liberación del ADN. 4. Una vez terminada la incubación, se elimina el hisopo de algodón con una punta de pipeta. 5. En la campana extractora, se añaden 300 μl de fenol/cloroformo/alcoholisoamilico 24:25:1 (saturado con 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA, Sigma) a cada muestra. 6. Se agita hasta conseguir una emulsión lechosa y se centrifuga en una microcentrífuga 3 minutos a máximarevolucion (13000 rpm). 7. Una vez separadas la fase fenólica y clorofórmica se recupera la fase acuosa o fenólica que es la contiene al ADN y se transfiere a un tubo Amicon-100 (Microcon YM-100, Millipore) al cual previamente se le ha añadido 100 μl de agua estéril. 8. Se centrifuga a 2500 rpm durante 20 minutos. 9. Se elimina el filtrado y se añaden 200 μl de agua estéril para limpiar la membrana, volviendo a centrifugar a 2.500 rpm durante 20 minutos. 10. Por último se añaden 100 μl de agua estéril, resuspendiendo varias veces con la pipeta, se invierte el filtro en un tubo limpio y se centrifuga a 3500 rpm durante 5 minutos. 11. Descartamos el filtro y cerramos el tubo. Formatted: Indent: First line: 0"

33

4.2.3 Proceso de cuantificación del ADN Una vez que se ha realizado la extracción de ADN, en mayor o menor cantidad y más o menos purificado, se debe comprobar la integridad y la cantidad del mismo. Se ha realizado mediante la separación por electroforesis en geles de agarosa al 0,8%, utilizando el colorante

Commented [MSG2]: Es mejor que pongas esta imagen en la cuantificación de la ampli o la comprobación de la amplificación

Gel Red para teñir el gel y comparando las muestras con los distintos controles según la

Formatted: Font: Times New Roman

intensidad de la fluorescencia que emiten al someterlos a luz ultravioleta.

Formatted: Normal (Web), Justified, Indent: Left: 0.5", Line spacing: 1.5 lines

Es importante determinar correctamente la concentración del ADN ya que, tanto un defecto como un exceso de ADN en la reacción de PCR pueden dar lugar a resultados negativos o a problemas a la hora de interpretar de los resultados.

Formatted: Normal (Web), Justified, Line spacing: 1.5 lines Formatted: Justified, Indent: First line: 0.49", Line spacing: 1.5 lines Formatted: Justified, Line spacing: 1.5 lines Formatted: Indent: First line: 0" Formatted: Justified, Line spacing: 1.5 lines Formatted: Font: 11 pt, Bold

Figura 10: Gel de agarosa al 0,8%.

Formatted: Widow/Orphan control, Adjust space between Latin and Asian text, Adjust space between Asian text and numbers Formatted: Font: 11 pt

4.2.4 Proceso de amplificación del ADN

Formatted: Font: 11 pt, Italic, No underline

En este trabajo se ha llevado a cabo Lla amplificación de las muestras se ha llevado a

Formatted: Font: 11 pt, Italic

cabo mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction)

Formatted: Left, Indent: Left: -0.25", Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"

[118]. En todas las reacciones realizadas, se han amplificado un control positivo, con el cual

Formatted: Font: 11 pt, Italic, No underline

podemos (para verificar que la reacción de amplificación ha sido correcta, ) y un control

Formatted Table

negativo, (para poder descartar posibles contaminaciones [119], además, todas ellas se han

Formatted: Font: 10 pt

llevado a cabo dentro de la campana de

Formatted: Font: 10 pt, Font color: Custom Color(RGB(49,132,155))

flujo laminar.

Formatted: Font: 10 pt

). La amplificación por PCR de ADNmt se hace generalmente con 34 a 38 ciclos. Algunos

Formatted: Font: 10 pt, Font color: Custom Color(RGB(49,132,155))

protocolos para muestras de ADN que están altamente degradadas piden 42 ciclos [111].En este proyecto, se han utilizado las siguientes condicionespara realizar el trabajo:

Formatted: Font: 10 pt Formatted: Font: 10 pt, Font color: Custom Color(RGB(49,132,155)) Formatted: Font: 10 pt

Tabla 2x: Cebadores empleados en la amplificación La amplificación se ha llevado a cabo utilizando los siguientes primers:

Formatted: Font: 10 pt, Font color: Custom Color(RGB(49,132,155)) Formatted: Font: 10 pt Formatted: Font: 10 pt

A1 (Cebador directo)L15997

5’-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3’

H17 (Cebador inverso)

5’-CCCGTGAGTGGTTAATAGGGT-3’

L165555(Cebador directo)

5’-CCCACACGTTCCTTAAAT-3’

34

Formatted: Font: 10 pt Formatted: Font: 10 pt Formatted: Font: 10 pt, Font color: Custom Color(RGB(49,132,155))

5’-GGTGATGTGAGCCCGTCTAA-3’

H619 (Cebador inverso)

Formatted: Left

Tabla 3X: Componentes del kit de amplificación

Formatted: Font: 11 pt, Bold Formatted: Font: 11 pt

COMPONENTE

CANTIDAD

Formatted: Font: 11 pt

Máster Mix

7,5 μl

Formatted: Font: 11 pt

Cebador

0,3 μl

H2O (estéril)

5,9 μl

ADN (1-3ng)

1 μl

Volumen final

15 μl Formatted: No Spacing, Indent: Left: 0.49", Widow/Orphan control, Adjust space between Latin and Asian text, Adjust space between Asian text and numbers

La amplificación se ha llevado a cabo en un termociclador 2720 [AppliedBiosystems]. Las condiciones de PCR se resumen en el siguiente gráfico:

Formatted: No Spacing, Widow/Orphan control, Adjust space between Latin and Asian text, Adjust space between Asian text and numbers Formatted: Font: Times New Roman Formatted: No Spacing, Indent: Left: -0.1", Widow/Orphan control, Adjust space between Latin and Asian text, Adjust space between Asian text and numbers

35

Figura 10: Condiciones de amplificación. Fuente propia

Condiciones de amplificación:

Formatted: Underline

Formatted: No underline

La amplificación se ha llevado a cabo en un termociclador 2720 [Applied Biosystems].Las condiciones utilizadas fueron: 95ºC durante 11 minutos, seguidos de 36 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos. Esta amplificación selectiva requiere alguna información previa acerca de las secuencias que flanquean el ADN blanco. Sobre la base de esta información se diseñan dos oligonucleótidos (primers)de alrededor de 15 a 25 pares de bases de longitud. Estos oligonucleótidos actúan como cebadores para la síntesis in vitro de ADN la cual está habitualmente catalizada por una

36 Figura 10: Condiciones de amplificación

Formatted: Indent: First line: 0"

enzima llamada Taq polimerasa. Dicha enzima, la cual permite el perfeccionamiento de la técnica, se aísla de una bacteria termófila, denominada Thermus Aquáticus. Esta enzima puede resistir a temperaturas de 95ºC, necesarias para la separación de las dos hebras de ADN y permite manejar temperaturas de alineamiento y amplificación que dejan margen para manejar la astringencia de la reacción y así acceder únicamente a las secuencias de ADN especificas para la sonda utilizada. La reacción se realiza cuando se mezclan el templado de ADN, dos iniciadores apropiados (primers), la polimerasa Taq, DNTPs y el buffer. Una vez mezclados se inician los ciclos, en los cuales se permite la desnaturalización del ADN, alineamientos de los iniciadores y la síntesis exponencial de los productos de amplificación (extensión): 1.

Desnaturalización: Para que comience la reacción es necesario que las moléculas de

Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0"

doble cadena se desnaturalicen por calor; la temperatura, entre 92-95ºC, rompe los puentes de hidrogeno que mantiene unidas las dos cadenas complementarias y se separan entre si como cadenas sencillas de ADN que servirán de moldes para la amplificación. 2.

Hibridación: Es la fase de “annealing” o de emparejamiento. Una vez que el ADN

está desnaturalizado, dos tipos de moléculas cebadoras (primers), cuyas secuencias son complementarias a los extremos de las secuencia a amplificar en el ADN, hibridan específicamente con las secuencias presentes en las moléculas de ADN molde desnaturalizadas anteriormente. La temperatura de fusión o annealing depende de varios factores y es relativamente específica para cada primer, por lo que varia entre 60-40ºC. Una vez hibridadas las moléculas de los cebadores al ADN molde se generan cortos fragmentos de ADN de doble banda que sirven como puntos de partida para la posterior polimerización. 3.

Extensión: Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo

3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de 72ºC ya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su máxima actividad. Normalmente una extensión de 20 segundos es suficiente para fragmentos menores de 500 pb, y 40 segundos para fragmentos por encima de 1.2Kb. Formatted: Font: Times New Roman, Underline

Una vez finalizada la reacción de amplificación se han comprobado mostodas las la reacciones ón mediante la migración electroforética de los productos amplificados en geles de agarosa al 2% teñidos con Gel Red. De esta manera se ha comprobado es posible saber si

37 Figura 11: Gel de agarosa al 2%.. Fuente propia.

Formatted: Font: Times New Roman, 11 pt, Italic, Underline Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: Times New Roman, No underline Formatted: Font: Times New Roman, 11 pt, Italic, Underline

la amplificación ha sido positiva y nos indica si debemos aumentar o disminuir la cantidad de producto amplificado que emplearíamos se va a emplear en posteriores etapas.

4.2.6 Purificación del producto de PCR Para eliminar todos aquellos nucleótidos (dNTP’s) y cebadores primers que hayan podido quedar libres en la reacción de amplificación y puedan interferir negativamente en la reacción de secuenciación, se ha de purificar el producto resultante de la amplificación.. Una vez que se ha llevado a cabo la amplificación, para realizar la reacción de

Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Justified, Indent: First line: 0.49", Line spacing: 1.5 lines Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: Times New Roman

secuenciación de amplificaficados, estos deben estar previamente purificados, es decir, libres de restos de primers, dNTPs, enzimas y demás compuestos utilizados durante la PCR. La calidad de las secuencias está directamente relacionada con el proceso de purificación empleado, por lo que este proceso método interfiere directamente en el resultado final. En este caso, para la purificación se ha utilizado el protocolo de MicroElute® Cycle-Pure Kit:, técnica que está basado en la utilización de columnas de filtración. estéril Formatted: Normal (Web), Justified, Indent: First line: 0.49", Line spacing: 1.5 lines Formatted: Normal

4.2.7 Secuenciación La secuenciación es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas que permiten determinar el orden de nucleótidos que componen el fragmento de ADNmt que se quiere estudiara estudiar. Se Para ello se ha utilizado el método de secuenciación de Sanger o secuenciación ciclíca, que emplea sucesivos ciclos de desnaturalización, hibridación de cebadorprimer, y polimerización para crear grandes cantidades de producto en una única reacción, incrementándose linealmente el producto de ADN. El método está basado en la polimerización del ADN y el uso de dideoxinucleótidos (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP), marcados con un fluorocromo, que sirven como terminadores de la reacción. El sistema más utilizadoque y que se aplicó en este trabajo fue el desarrollado por AppliedBiosystems, mediante el kit kit ABI PRISM Big Dye v3.1 [120]. La preparación de la reacción de secuenciación se llevó a cabo utilizando los siguientes reactivos: - 2,5μl de producto de PCR purificado. - 0,52μl de kit de secuenciación BigDye v3.1. - 2,5μl de buffer_5X. - 0,7 de DMSO. - 3μl de cebador primer(directo o inverso).(forward o reverse)

38

Figura 121: Condiciones de la reacción de secuenciación. Fuente propia

Formatted: Underline Formatted: Underline


- 5,51,5μl de agua estéril.
 El programa utilizado en el termociclador fue: 96ºC durante 1 minuto, seguidos de 35 ciclos de 96ºC durante 10 segundos, 50ºC durante 5 segundos y

Formatted: Font: 8 pt Formatted: Indent: Left: 0.98"

60ºC durante 4 minutos. Formatted: Font: Times New Roman, 14 pt, Bold

4.2.8Purificación del producto de secuenciación Una vez concluido el proceso de secuenciación, se debe purificar el producto, con el fin de eliminar todos los nucleótidos y terminadores que no han sido incorporados, que dificultan la interpretación y visualización de los resultados. Para llevar a cabo el proceso de purificación del producto de secuenciación se ha utilizado el método de centrifugación mediante columnas DTR o Dye Terminator Removal. Éstas columnas contienen una resina que permite la eliminación de terminadores de secuenciación, sales, dNTPs, o proteínas presentes en la reacción de secuenciación [121].

4.2.9 Electroforesis capilar

39

Formatted: Indent: Left: 0.98", First line: 0" Formatted: Font: Cambria

Una vez que las secuencias están purificadas se han separado por electroforesis capilar mediante un secuenciador ABI PRISM 3130® Genetic Analyzer (AB). Los diferentes fragmentos de ADN se han separado en función del tamaño, dependiendo de la velocidad de migración de las moléculas cargadas bajo la acción de un campo eléctrico. La separación se lleva a cabo en un capilar de sílice fundido de pequeño diámetro y longitud variable. El capilar se encuentra cubierto por poliamida opaca excepto por una pequeña zona denominada “ventana del capilar” la cual es atravesada por el láser y permite que las muestras sean excitadas a su paso por la misma. Finalmente los datos analizados son enviados al ordenador el cual los transforma en secuencias de ADN. Las secuencias se han visualizado con el programa Sequencing Analysis (AB), que se encarga de asignar los nucleótidos en cada posición en las secuencias obtenidas. Posteriormente han sido comparadas con la Secuencia de Referencia de Cambridge revisada (rCRs) utilizando el programa SeqScape 5.2 (AB).

4.2.10 Análisis estadistico -

Todas los datos de los perfiles genéticos de los individuos que han participado en el estudio poblacional se han representado en tablas de Excel de forma anónima, es decir mediante su un código para cada individuo y su perfil genético.

-

Cada uno de los polimorfismos encontrados mediante la comparación de las secuencias con la Secuencia de Referencia de Cambridge revisada (rCRs) utilizando el programa SeqScape 5.2 han sido introducidos en la aplicación MITOMAP; disponible en www.mitomap.org/MITOMAP; en la que se ha comprado la frecuencia con la que se han encontrado los diferentes polimorfismos en base a referencias bibliográficas.

-

En el programa EMPOP; disponible en empop.org; se han analizado los posibles errores en el recuento de polimorfismos.

-

Las frecuencias de los haplotipos encontrados se han calculado mediante hojas de cálculo, donde se han introducido los diferentes polimorfismos y haplotipos encontrados en las poblaciones de Granada, Málaga y Almería. Además también han sido calculadas mediante Arlequin 3.5.2.1. [122].

-

Para determinar la subestructura genética de las poblaciónes del Reino de Granada, se testó la hipótesis de una distribución aleatoria de los individuos entre parejas de poblaciones mediante un test exacto de diferenciación de la población y el análisis de 40

la varianza molecular (AMOVA) con 10.000 repeticiones experimentales mediante Arlequin 3.5.2.1. Además, se utilizó STRUCTURE 2.3.4 [123,124]para inferir grupos de individuos a partir de los datos genéticos de loci no ligados. Para todas las simulaciones y cálculos, se asumieron los modelos de mestizaje y no mestizaje, incluyendo información poblacional y asumiendo un modelo de frecuencias alélicas independientes. Se estableció un periodo de burn-in de 50.000 iteraciones seguido de 100.000 iteraciones adicionales, estimando de 1 a 10 contribuciones (K). Cada carrera se repitió 10 veces y se calcularon las probabilidades para cada K en cada grupo de carreras. -

El calculo de los haplogrupos se obtuvo mediante la aplicación on-line: Haplogrep

Formatted: Font: Times New Roman

(haplogrep.uibk.ac.at/) basado en Phylotree.org; disponible en www.phylotree.org, en

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt

la cual al introducir los diferentes polimorfismos muestra el haplogrupo al que

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 12 pt Formatted: Font: Times New Roman

corresponde.

Formatted: Font: Times New Roman Formatted: List Paragraph

cálculoAlmería

Formatted: Font: Times New Roman

41

Acuarela del Generalife. Granada. La Alhambra. (EduardGerhardt)

6 Resultados 37

y discusión

H5'36 H7a2 L2a1 H2a2a H1b1+16362 U5a2a1+152 V+@72 H20a U5a2 K1a H10+(16093) J2b1a H1+16189 U4a2 H5 H3z

1,19 2,38 1,19 15,47 1,19 1,19 3,57 1,19 1,19 2,38 1,19 2,38 2,38 2,38 1,19 2,38

43

H3v+16093 T2b T2c1+146 HV4b J1c2e2

1,19 2,38 6.1 Análisis de ADN 1,19 1,19 mitocondrial 2,38 Para este trabajo se ha analizado la

Formatted: Font: 12 pt

región control completa de un total de 185 muestras, pertenecientes a 67 individuos de la provincia de Granada, 58 individuos de la provincia de Málaga y 60 individuos de la provincia de Almería. Todas ellas fueron cuantificadas correctamente, 141 se amplificaron de manera eficaz, pero finalmente se ha conseguido la secuencia completa de la región control, de 33 muestras de la población de Granada, 38 muestras de la población de Almería y 13 muestras de la población de Málaga. Para todas las muestras se ha considerado el rango de posiciones 16024-16569 de RC1 y 1-560 de RC2.

6.2 Estudio poblacionalHaplotípico Se han encontrado haplotipos únicos y coincidentes en cada una de las poblaciones. Se han calculado las posiciones polimórficas (sustituciones) encontradas en las 3 poblaciones, distinguiendo entre transversiones y transiciones, el número de deleciones y el número de inserciones. También se calcularon los índices de diversidad poblacional (dentro de cada población): H, diversidad haplotípica y, la capacidad de discriminación y la probabilidad de coincidencia. Todos los resultados se muestran en la tabla 4 y 5.1,5.2,5.3. Tabla 4: Estudio haplotípico de las poblaciones Población

Nº de Nº de muestras Haplotipos

Nº de sustit.

Nº de transic

Nº de transv.

Nº de delec.

Nº de inser.

Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold

Almería

38

35

77

70

7

3

8

Granada

33

29

70

66

4

3

9

Formatted: Font: Bold

Málaga

13

13

33

29

4

2

4

Formatted: Font: Bold

GMA

84

7465

111

97

14

4

10

Formatted: Font: Bold

Formatted: Font: Bold

Formatted: Font: Bold

En la población de Almería se encontraron un total de 88 polimorfismos diferentes, y de ellos los mas frecuentes observados fueron las sustituciones T16519C (9,93%), A73G (5,82%), A263G (10,95%), y las inserción -315.1C (10,95%). En la población de Granada se encontraron un total de 82 polimorfismos diferentes, y de ellos los mas frecuentes observados fueron las sustituciones T16126C (2,22%), T16519C

44

Formatted: Font: Bold Formatted: Highlight

(7,96%), A73G (4,77%), T152C (3,18%), A263G (12,10%), y las inserciones -309.1C (7,32%) y -315.1C (11,46%). En la población de Málaga se encontraron 39 polimorfismos, entre los cuales más frecuentes fueron las sustituciones T16311C (5,26%), T16519C (9,47%), A73G (6,31%), A263G (13,68%) y la inserción -315.1C (13,68%). En GMA se encontraron un total de 124 polimorfimos siendo los mas frecuentes T16519C (9,93%), A73G (5,82%), A263G (10,95%), y las inserción -315.1C (10,95%) al

Formatted: Font color: Yellow

igual que en las poblaciones individuales. Tabla 5.1: Estudio haplotípico de la población de Almería HAPLOTIPOS

N

F

Formatted: Font: Bold

A38, A52

1

2

0,05263

Formatted Table

A15, A16, A28

1

3

0,07894

Formatted: Font: Bold

Haplotipos únicos

33

1

0,02631

Formatted: Font: Bold

N

F

Total de individuos

38

Probabilidad de coincidencia

0,03185

Diversidad Haplotípica

0,9786

Capacidad de discriminación

92,10%

Tabla 5.2: Estudio haplotípico de la población de Granada HAPLOTIPOS

Formatted Table

G12, G21, G64, G67

1

4

0,1212

G35, G54

1

2

0,0606

Haplotipos únicos

27

1

0,0303

Total de individuos

33

Diversidad Haplotíipica

0,9365

Capacidad de discriminación

87,87%

Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold

Tabla 5.3: Estudio haplotípico de la población de Málaga HAPLOTIPOS Haplotipos unicosúnicos

13

Total de individuos

13

N

F

1

0,0769

Formatted Table Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold

45

Diversidad Haplotíipica

1

Capacidad de discriminación

100% Formatted: Indent: First line: 0"

Tabla 5.4: Estudio haplotípico de GMA

Formatted: Indent: First line: 0", Line spacing: single

HAPLOTIPOS G12, G21, G64, G67

N

F

1

4

0,1212

G35, G54

1

2

0,0606

Haplotipos únicos

27

1

0,0303

Total de individuos

33

Diversidad Haplotípica

0,9365

Capacidad de discriminación

87,87%

Formatted Table

Formatted: Font color: Auto

En la tabla 6 se muestra el nombre de la muestra (A=Almería, G=Granada, M=Málaga), el número de individuos que comparten el haplotipo (N), la frecuencia de cada haplotipo, los haplotipos (polimorfismos) que se han obtenido para cada una de las poblaciones y los haplogrupos a los que pertenece cada una de ellas. Tabla 6: Haplogrupos y haplotipos para cada población MUESTRA

N

FRECUENCIA

HAPLOGRUPO

A8 G12 G21 G64 G67 A38 A52 M31 G35 G54 A15, A16, A28 A27, G55

5

0,0595

H2a2a

T16519C, A263G, -309.1C, -315.1C, -309.1C

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

5

0,0595

H2a2a

T16519C, A263G, -315.1C

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

3

0,0357

V+@72

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

2

0,0238

J2b1a

A41, G36

2

0,0238

J1c2e2

A57

1

0,0119

A2+(64)+16129

A29

1

0,0119

H1+16189

C16291T, T16298C, A263G, -309.1C, -309.2C, 315.1C C16069T, T16126C, C16193T, C16278T, A73G, C150T, T152C, A263G, C295T, 309.1C, -315.1C, T489C C16069T, T16126C, C16278T, C16366T, T16519C, A73G, G185A, A188G, G228A, A263G, C295T, -309.1C, -315.1C, C462T, T489C, A523DEL, C524DEL C16111T, G16129A, C16223T, C16290T, G16319A, T16362C, C64T, A73G, T146C, A153G, A235G, A263G, -309.1C, -315.1C, A523DEL, C524DEL A16183C, T16189C, A16293C, T16519C,

46

POLIMORFISMO

Formatted Table

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

G11

1

0,0119

H1+16189

A26

1

0,0119

H10+(16093)

G46

1

0,0119

H1a1

G66

1

0,0119

H1aj1

A10

1

0,0119

H1b1+16362

A47 M18

1 1

0,0119 0,0119

H1ba H1ba

G9 G68

1 1

0,0119 0,0119

H1e+16129 H1e+16129

A53

1

0,0119

H1e1a1

G7

1

0,0119

H1e1a1

G51

1

0,0119

H1e1a4

M6 A22

1 1

0,0119 0,0119

H1e1a6 H20a

A59 M53 G14 A43

1 1 1 1

0,0119 0,0119 0,0119 0,0119

H2a2a H2a2a H2a2a H32

A36

1

0,0119

H3v+16093

A34

1

0,0119

H3z

A50 A33 A1

1 1 1

0,0119 0,0119 0,0119

H3z H5 H5'36

A45

1

0,0119

H57

G19

1

0,0119

H6

M8 A3

1 1

0,0119 0,0119

H74 H7a2

A58

1

0,0119

H7a2

A51

1

0,0119

HV0

G25

1

0,0119

HV0

G49

1

0,0119

HV0

M23

1

0,0119

HV17

A40

1

0,0119

HV4b

47

A263G, -315.1C A16183C, T16189C, T16519C, A263G, 315.1C T16093C, G16129A, T16519C, G121C, A263G, -315.1C A16162G, T16209C, T16519C, A73G, A263G, -315.1C C16192T, T16519C, A263G, -309.1C, -309.2C, -315.1C T16189C, T16356C, T16362C, T16519C, A263G, 315.1C, A523DEL, C524DEL C16270T, T16519C, A263G, -315.1C A16051G, C16270T, T16311C, T16519C, A263G, -315.1C G16129A, T16519C, T146C, A263G, -315.1C G16129A, T16519C, T195C, A263G, -309.1C, -309.2C, -315.1C T16189C, T16311C, T16519C, A93G, A263G, -309.1C, -309.2C, -315.1C C16169T, T16519C, A93G, A200G, A263G, T279C, -315.1C T16311C, C16327T, T16519C, A263G, 309.1C, -309.2C, -315.1C T16519C, C150T, A263G, -315.1C T16136C, C16218T, C16328A,T16362C, A249DEL, A263G, T292C, -315.1C A16181G, T16519C, A263G, -315.1C 16188G, T16519C, A263G, -315.1C T16519C, A263G, -309.1C, -309.2C, -315.1C G16145A, T16519C, A73G, T152C, A263G, 315.1C T16093C, T16519C, T152C, C182T, A263G, 309.1C, -315.1C, T408A T16136C, T16519C, G207A, A263G, T293C, 309.1C, -315.1C T16519C, A263G, T293C, -315.1C T16304C, A263G, -309.1C, -315.1C, C456T T16189C, A263G, -309.1C, -309.2C, -315.1C, C456T T16519C, C64T, T152C, A263G, -309.1C, 315.1C T16093C, T16362C, A16482G, 239C, A263G, 309.1C, -315.1C T16311C, T72G, A263G, -315.1C T16519C, C16176T, T152C, A263G, -309.1C, 309.2C, -315.1C C16176T, T16519C, T152C, A263G, -309.1C, 315.1C G16129A, T16298C, T72C, A263G, -309.1C, 309.2C, -315.1C, -524.1A, -524.2C T16189C, T16298C, T16362C, T72C, A263G, 315.1C A16220C, T16298C, T16519C, T72C, A200G, A263G, -309.1C, -315.1C C16111T, T16519C, T152C, A263G, -315.1C, 524.1A, -524.2C C16069T, T16519C, T152C, A263G, -309.1C, -

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

A56

1

0,0119

I5a4

G69

1

0,0119

I5a4

G29

1

0,0119

J1c1

A48

1

0,0119

J1c3e

A42

1

0,0119

J2a1a1a

A25

1

0,0119

K1a

M17

1

0,0119

K1a

A6

1

0,0119

L2a1

M2

1

0,0119

L2a1+143

G61

1

0,0119

M5a1

A49

1

0,0119

T1

A37

1

0,0119

T2b

M38

1

0,0119

T2b

G63

1

0,0119

T2b13a

A39

1

0,0119

T2c1+146

G28 G60

1 1

0,0119 0,0119

U3 U3

G65

1

0,0119

U4a1

A30

1

0,0119

U4a2

G33

1

0,0119

U4a2

G57

1

0,0119

U4a3a

G53

1

0,0119

U5a1+@16192

48

315.1C, A523DEL, C524DEL G16129A, C16223T, T16311C, G16391A, T16519C, A73G, T199C, T204C, A263G, T250C, -309.1C, -315.1C, A574C G16129A, C16223T, T16519C, A73G, T199C, T204C, T250C, A263G, -315.1C, A574C C16069T, T16126C, T16519C, A73G, G185A, G228A, A263G, C295T, -309.1C, -315.1C, C462T, T482C, T489C C16069T, T16126C, G163690A, A73G, G185A, G228A, A263G, C295T, -309.1C, 315.1C, C462T, T489C C16069T, T16126C, G16145A, T16231C, C16261T, T16519C, A73G, C150T, T152C, T195C, A215G, A263G, C295T, -310.1T, -315.1C, T319C, T489C, G513A C16278T, T16311C, T16519C, A73G, A263G, -315.1C, C497T G16129A, T16224C, T16311C, T16519C, A73G, A263G, -315.1C, C497T, -524.1A, 524.2C T16189C, C16278T, C16294T, T16309G, T16362C, G163690A, A73G, T146C, C150T T152C, T195C, A263G, -309.1C, 315.1C C16223T, C16278T, C16294T, T16309G, G163690A, A73G, G143A, T152C, T195C, A263G, -309.1C, -315.1C, A523DEL, C524DEL G16129A, C16223T, C16291T, T16298C, T16362C, T16519C, A73G, A263G, -309.1C, 309.2C, -315.1C, T489C, -524.1A, -524.2C T16126C, A16163G, T16189C, C16294T, T16519C, A73G, A263G T16126C, C16294T, C16296T, T16304C, T16519C, A73G, A263G, -309.1C, -315.1C T16126C, C16294T, C16296T, T16304C, T16519C, A73G, A263G, -315.1C A16051G, T16126C, A16146G, C16294T, T16304C, T16519C, A73G, T195C, A263G, 315.1C T16126C, C16292T, C16294T, C16296T, T16422C, T16519C, A73G, T146C, A263G, 315.1C, C518T, A523DEL, C524DEL A16343G, A73G, C150T, A263G, -315.1C C16260T, A16343G, A73G, C150T, A263G, 315.1C C16134T, C16266T, T16325C, T16356C, T16519C, A73G, T152C, T195C, A263G, 315.1C, G499A, -524.1A, -524.2C T16356C, T16519C, A73G, T195C, A200G, A263G, T310C, G499A, -524.1C, -524.2A, 524.3C, -524.4A T16356C, T16519C, A73G, A153G, T195C, A263G, T310C, G499A A16265G, C16294T, T16356C, T16362C, T16519C, A73G, T195C, G247A, A263G, 309.1C, -315.1C, G499A, -524.1A, -524.2C, 524.3A, -524.4C, -524.5A, -524.6C G16129A, C16256T, C16270T, A16369G,

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

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Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

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Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

A23

1

0,0119

U5a2

A13

1

0,0119

U5a2a1+152

G22

1

0,0119

U5b1b1+@16192

G52

1

0,0119

U5b2a1a2

M46

1

0,0119

U5b2b3

M19

1

0,0119

U6a

M39

1

0,0119

U6a'b'd+16311

M21

1

0,0119

V10a

G20

1

0,0119

W

G62

1

0,0119

X3a

A73G, A263G, -315.1C C16192T, C16256T, C16270T, G16526A, A73G, A263G, -309.1C, -315.1C C16114A, C16192T, C16256T, C16270T, C16294T, T16311C, G16526A, A73G, T152C, A263G, -309.1C, -315.1C A16183C, T16189C, C16270T, T16519C, G71DEL, A73G, C150T, A263G, -309.1C, 309.2C, -315.1C G163690A, T16519C, C150T, A263G, -315.1C, A73G T16224C, C16270T, T16362C, T16519C, A73G, C150T, A263G, -309.1C, -315.1C, A517T T161T72C, A16129G, C16278T, C16290T, A73G, A263G, -315.1C T16172C, A16129G, T16311C, A73G, T152C, G207A, A263G, -309.1C, -315.1C C16261T, T16298C, T16311C, T16362C T16519C, T72C, A263G, -309.1C, 315.1C C16223T, C16292T, G16346A, T16519C, A73G , A189G, T195C, C198T, T204C, G207A, A263G, -309.1C, -315.1C A16182C, A16183C, T16189C, C16223T, C16278T, T16519C, A73G, T146C, A153G, C256T, A263G, -309.1C, -309.2C, -315.1C

En la tabla 7 se muestran todos los polimorfismos encontrados en las diferentes poblaciones. Tabla 7: Polimorfismos encontrados en las 3 poblaciones A16051G C16069T T16093C C16111T C16114A T16126C G16129A C16134T T16136C G16145A A16146G A16162G A16163G C16169T T16172C C16176T A16181G A16182C

A16265G C16266T C16270T C16278T C16290T C16291T C16292T A16293C C16294T C16296T T16298C T16304C T16309G T16311C G16319A T16325C C16327T C16328A

C64T G71DEL T72G T72C A73G A93G

G121C G143A T146C C150T T152C A153G C182T G185A A188G A189G T195C C198T T199C

A200G T204C G207A A215G G228A A235G T239C G247A A249DEL T250C C256T A263G T279C T292C T293C C295T

49

-309.1C -309.2C T310C -310.1T -315.1C T319C

T408A C456T C462T T482C T489C C497T G499A

G513A A517T C518T A523DEL C524DEL -524.1A -524.2C -524.3A -524.4C -524.5A -524.6C A574C

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: Not Bold, Font color: Auto

A16183C C16188G T16189C C16192T C16193T T16209C C16218T A16219G A16220C C16223T T16224C T16231C C16256T C16260T C16261T

A16343G G16346A T16356C T16362C C16366T G16390A G16391A A16399G T16422C A16482G T16519C G16526A

Formatted: Indent: First line: 0.49" Formatted: Font: Not Bold Formatted: Justified, Indent: First line: 0.49" Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: 11 pt Formatted: Font: 11 pt Formatted: Font: 11 pt Formatted: Font: 11 pt

En la población de Almería se encontraron un total de 88 polimorfismos diferentes, y de ellos los mas frecuentes observados fueron las sustituciones T16519C (9,93%), A73G (5,82%), A263G (10,95%), y las inserción -315.1C (10,95%).

Formatted: Font: 11 pt Formatted: Font: 11 pt, Bold, Font color: Custom Color(RGB(49,132,155)) Formatted: Font: 11 pt

En la población de Granada se encontraron un total de 82 polimorfismos diferentes, y de ellos los mas frecuentes observados fueron las sustituciones T16126C (2,22%), T16519C

Formatted: Font: 11 pt, Bold, Font color: Custom Color(RGB(49,132,155)) Formatted: Centered

(7,96%), A73G (4,77%), T152C (3,18%), A263G (12,10%), y las inserciones -309.1C (7,32%) y -315.1C (11,46%). En la población de Málaga se encontraron 39 polimorfismos, entre los cuales más frecuentes fueron las sustituciones T16311C (5,26%), T16519C (9,47%), A73G (6,31%), A263G (13,68%) y la inserción -315.1C (13,68%).

Formatted Table Formatted: Font: 11 pt, Bold, Font color: Custom Color(RGB(49,132,155)) Formatted: Font: 11 pt, Bold, Font color: Custom Color(RGB(49,132,155)) Formatted: Font: 11 pt, Bold, Font color: Custom Color(RGB(49,132,155))

6.3 Estructura de la población. Para determinar si el estudio de los polimorfismos permite establecer una subestructura de la población de estudio en función de las tres provincias de las que proceden

Formatted: Font: 11 pt, Bold, Font color: Custom Color(RGB(49,132,155)) Formatted: Centered Formatted: Font: 11 pt

las muestras, se realizaron estudios de AMOVA y STRUCTURE.

Formatted: Font: 11 pt, Not Bold Formatted: Font: 11 pt, Font color: Accent 5

Diseño

Fuente de variación

3 Grupos

Entre grupos

Grupo 1:

Dentro de los

Almería

grupos

Suma de

Componente

Porcentaje de

cuadrados

de varianza

fijación

Formatted: Font: 11 pt, Not Bold

2

10,129

0,00907

0,18756

Formatted: Font: 11 pt

81

391,157

4,82910

99,81244

d.f

Formatted: Font: 11 pt, Font color: Accent 5

Grupo 3 :

Formatted: Font: 11 pt Formatted: Font: 11 pt

Grupo 2: Málaga

Formatted: Font: 11 pt

Total

83

401,286

4,83818

Índice de

Formatted: Font: 11 pt, Not Bold

fijación FST:

Formatted: Font: 11 pt, Not Bold

0,00188

Granada

Formatted: Font: 11 pt, Font color: Accent 5 Formatted: Font: 11 pt

50

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

6.3 Calculo de Haplogrupos

Formatted

...

Los haplogrupos determinados mediante el programa Haplogrep, se han detallado en

Formatted Table

...

Formatted

...

Formatted

...

El haplogrupo predominante en GMA, en la población de Almería y en la población

Formatted

...

de Granada es el haplogrupo H2a2a. Este haplogrupo es común entre las tres poblaciones, y

Formatted

...

es predominante en la población de Armería y en la población de Granada pero en la

Formatted

...

población de Málaga todos los haplogrupos se encuentran en la misma frecuencia.

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

H1ba

Formatted

...

2,38%

Formatted

...

H32H2 a2a 15,47%1,19% 1,19%15 ,47% H6H57 H74H6

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

1,19%1,19%

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

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...

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...

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...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

Formatted

...

las tablas 8, 8.1, 8.2 y 8.3 con sus respectivas frecuencias en cada una de las poblaciones.

Tabla 8: Frecuencia de los haplogrupotipos en GMAlas tres poblaciones

A2+(64)+1612 9 1,19%

H1+16189

H1e+16129 2,38%

H1e1a1H1e +16129 2,38%2,38%

H3v+16093H3 2 1,19%1,19%

H3zH3v+16 093 2,38%1,19%

2,38%

H7a2H74

HV0H7a2

2,38%1,19%

3,57%2,38%

J1c3eJ1c2e2 1,19%2,38%

J2a1a1aJ1c 3e 1,19%1,19%

T1M5a1

T2bT1

1,19%1,19%

2,38%1,19%

U4a3aU4a2

1,19%2,38% U6aU6a

1,19%1,19 %

U5a1+@161 92U4a3a

1,19%1,19% U6a’b’d+163 11U6a’b’d+1 6311 1,19%1,19%

H10+(1609 3) 1,19%

H1a1

H1aj1

1,19%

1,19%

H1e1a4H1 e1a1 1,19%2,38 % H5H3z

H1e1a6H1e 1a4 1,19%1,19%

H20aH1e1 a6 1,19%1,19%

H5’36H5

H57H5’36

1,19%2,38 % Hv17HV0

1,19%1,19%

1,19%1,19%

1,19%3,57 % J2b1aJ2a1 a1a 2,38%1,19 % T2b13aT2 b 1,19%2,38 % U5a2U5a 1+@16192

1,19%1,1 9% V+@72V+ @72 3,57%3,57 %

H1b1+16362 1,19% H2a2aH20a

1,19%1, 19% HV4bHv17 I5a4HV4b J1c1I5a4 J1c2e2J 1c1 1,19%1,19% 2,38%1,19% 1,19%2,38% 2,38%1, 19% K1aJ2b1a L2a1K1a L2a1+143L2a1 M5a1L2 a1+143 2,38%2,38% 1,19%2,38% 1,19%1,19% 1,19%1, 19% T2c1+146T U3T2c1+146 U4a1U3 U4a2U4 2b13a a1 1,19%1,19% 2,38%1,19% 1,19%2,38% 2,38%1, 19% U5a2a1+152U5 U5b1b1+@ U5b2b3 a2 16192U5a2a U5b2a1a2U5 U5b2a1a 1+152 b1b1+@1619 2 2 1,19%1,19% 1,19%1,19% 1,19%2,3 2,38%1,19% 8% V10V10 WW X3a

1,19%1,19%

1,19%1,19%

Tabla 8.1: Frecuencias de los haplogrupotipos en la población de Almería

51

1,19%

H5'36

H7a2

L2a1

H2a2a

0,02633 596

0,0526

0,0263

0,1052

K1a

H10+(16093 ) 0,0263

J2b1a

T2c1+1 46 0,0263

H1b1+163 62 0,0263

U5a2a1+1 52 0,02631

V+@72

H20a

U5a2

0,0789

0,0263

0,0263

U4a2

H5

H3z

0,0263

0,0263

0,0263

HV4b

J1c2e2

J2a1a1a

H32

0,0263

0,0263

0,0263

0,0263

HV0

H1e1a1

I5a4

0,0263

0,0263

0,0263

A2+(64) +16129 0,0263

T2b

Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.02"

0,0526

H3v+1 6093 0,0263

0,0263

Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.02"

H57

H1ba

J1c3e

T1

Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.02"

0,0263

0,0263

0,0263

0,0263

Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.02"

Tabla 8.2: Frecuencias de los haplogrupotipos en la población de Málaga K1a 0,1

Formatted Table Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.02"

H1+161 89 0,0263

0,0263

Formatted: Indent: Left: 0", Hanging: 0.02"

H1ba 0,1

U6a 0,1

V10a 0,1

HV17 0,1

H2a2a 0,1

H2a2a 0,1

T2b 0,1

Formatted: No underline

U6a'b'd+16311 0,1

U5b2b3 0,1

Tabla 8.3: Frecuencias de los haplogrupostipos en la población de Granada

Formatted: Font: Not Bold, No underline Formatted: Font: Not Bold, No underline

Formatted: No underline Formatted: Font: Not Bold, No underline

H1e1a1

H1e+16129

0,0303

0,0606

H1+161 89 0,0303

H2a2a

H6

W

0,2121

0,0303

0,0303

U5b1b1+@ 16192 0,0303

HV0

Formatted: Font: Not Bold, No underline Formatted: No underline

0,0606 Formatted Table

U3

J1c1

U4a2

J1c2e2

H1a1

H1e1a4

U5b2a1a2

0,0606

0,0303

0,0303

0,0303

0,0303

0,0303

0,0303

0,0303 0,0303

M5a1J1 c2e2 0,0303 0,0303

X3aH1a 1 0,0303 0,0303

T2b13aH1e 1a4 0,0303 0,0303

U4a1U5b2a 1a2 0,0303 0,0303

H1aj1U5a1 +@16192 0,0303 0,0303

M5a1

X3a

T2b13a

U4a1

H1aj1

I5a4

0,0303

0,0303

0,0303

0,0303

0,0303

0,0303

U4a3aJ1 c1 0,0303 0,0303

J2b1aU4a2

U5a1+@161 92 0,0303

Formatted: Font: Not Bold

I5a4 U4a3a 0,0303 0,0303

Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: Not Bold

Formatted Table

52

Formatted: Font: (Default) Times New Roman

Formatted: Font: 12 pt

Formatted: Right

Acuarela del Patio de los Leones. Granada. La Alhambra. (EduardGerhardt)

Formatted: Right

7 Discusión

Formatted: Normal

Formatted: Indent: First line: 0"

7 Discusión Formatted: Indent: First line: 0"

7.1 Estudio poblacional genético de polimorfismos del ADNmt Se determinó la secuencia de ADNmt de la región control de 84 individuos Europeos, pertenecientes a las poblaciones de Alméria, Granada y Málaga. Se encontró un total de 65 haplotipos de ADNmt diferentes, de los cuales 4 fueron compartidos por mas de una persona. El estudio de polimorfismos genéticos en las poblaciones de Almería, Granada y Málaga nos revela que que los polimorfismos que se han encontrado 124 polimorfismos diferentes y que el haplotipo mas frecuente en fue T16519C, A263G, -315.1C, encontrado en 5 individuos y el haplotipo T16519C, A263G, -315.1C, -309.1C encontrado también en 5 individuoslos

correspondientes a T16519C, A73G, A263G, y -315.1C se encuentran de manera frecuente en las 3 poblaciones. El haplotipo T16519C, A263G, -315.1C es especialmente frecuente en Eurasia occidental y se produce con una frecuencia de 3-4% en muchas poblaciones Europeas [104,125] . Tras la realización del análisis estadístico en las poblaciones se ha podido observar que las capacidades de discriminación eran del 92,10% en la población de Almería, 87,87% en la población de Granada y 100% en la población de Málaga. La capacidad haplotipica de las poblaciones Poner tb diversidad haplotipica

Formatted: Font color: Accent 5

P ara pode r enten der bien como se distri buye n los poli morfi smos en cada una de las mues

Figura 132: Distribución de polimorfismos y haplogrupos en las muestas de Málaga.

tras de las poblaciones de estudio se han construido arboles filogenéticos indicando los polimorfismos que dan lugar a cada haplogrupo.

56

Formatted: Font: Bold, Underline Formatted: Underline

57

Formatted: Indent: First line: 0"

58

59

Formatted: Indent: First line: 0", Line spacing: single

7.2 Estudio de Haplogrupos El estudio de los haplogrupos presentes en las poblaciones de Almería, Granada y Málaga nos revela que el haplogrupo H es el mayoritario en la población del Reino de Granada con un 46,4%. Aparte de este haplotipo mayoritario, se observan otros haplotipos que también son frecuentes, como el Haplotipo U con un 16,6%. El haplogrupo H es el más frecuente en la población Europea. Este haplogrupo ha debido ser introducido desde Oriente Medio en diferentes sub-haplogrupos, siendo en este caso el mas frecuente observado el H2a2a con un 15,47 %. El Haplogrupo U es característico de Eurasia occidental y es descendiente del macrohaplogrupo R. Entre los sub-haplogrupos observados correspondientes a este haplogrupo, los máas frecuentes fueron U3, U4a2 y U5b2a1a2 con un 2,38%.

A 1,19%

H 46,4%

HV 5,95%

I 2,38%

J 8,33%

K 2,38%

L 2,38%

M 1,19%

T 5,95

U 16,6%

V 4,76%

W 1,19%

X 1,19%

Figura 142: Gráfico de sectores de haplogrupos presentes en las 3 poblaciones y sus frecuencias.. Fuente propia

60

Formatted: No underline

Figura 14: Gráfico de sectores de los sub-haplogrupos del haplogrupo H presentes en las 3 poblaciones y sus frecuencias.

Figura 15: Gráfico de sectores de los sub-haplogrupos del haplogrupo U presentes en las 3 poblaciones y sus frecuencias.

61

Formatted: Font: 11 pt Formatted: Font: 11 pt

62

Acuarela del peinador de la reina. Granada. La Alhambra. (Trevor Haddon).

7 Conclusiones

63

Acuarela del patio de la lindaraja. Granada. La Alhambra. (Trevor Haddon)

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