Ppt.pptx

Tumor penekan microRNA-375 mengatur onkogen AEG-1/MTDH di kepala dan leher sel skuamosa karsinoma (HNSCC) Nijiro Nohata1, 2, Toyoyuki Hanazawa2, Naoko Kikkawa1, 2, Muradil Mutallip1, 2, Daiju Sakurai2, Lisa Fujimura3, Kazumori Kawakami4, Takeshi Chiyomaru4, Hirofumi Yoshino4, Hideki Enokida4, Masayuki Nakagawa4, Yoshitaka Okamoto2 dan Naohiko Seki1 NURYAMSI TB.110713 BIOLOGO Va

ABSTRAK MicroRNA kami ( Mirna ) tanda tangan ekspresi karsinoma sel skuamosa hypopharyngeal , sinus maksilaris karsinoma sel skuamosa dan karsinoma sel skuamosa esofagus mengungkapkan bahwa mir - 375 berkurang secara signifikan pada jaringan kanker dibandingkan dengan epitel normal. Dalam studi ini , kami fokus pada makna fungsional mir - 375 pada sel kanker dan identifikasi mir - 375 - diatur jaringan kanker baru di kepala dan leher karsinoma sel skuamosa ( HNSCC ) . Restorasi mir - 375 menunjukkan penghambatan signifikan proliferasi sel dan induksi apoptosis sel di SAS dan Fadu baris sel , menunjukkan bahwa mir - 375 berfungsi sebagai penekan tumor . Kami mengadopsi analisis ekspresi gen genome-wide untuk mencari target molekul mir - 375 - diatur . Data ekspresi gen dan tes luciferase reporter mengungkapkan bahwa AEG-1/MTDH diatur langsung oleh mir - 375 . Proliferasi sel kanker secara signifikan menghambat dalam sel HNSCC transfected dengan si-AEG-1/MTDH . Selain itu, tingkat ekspresi AEG-1/MTDH secara signifikan diregulasi dalam jaringan kanker . Oleh karena itu , AEG-1/MTDH dapat berfungsi sebagai onkogen di HNSCC . Identifikasi penekan tumor baru Mirna dan jalur kanker diatur yang dapat memberikan wawasan baru ke dalam mekanisme molekuler potensi HNSCC onkogenesis

PENDAHULUAN Kepala dan leher karsinoma sel skuamosa ( HNSCC ) , yang paling keenam keganasan umum di seluruh dunia , muncul di rongga mulut , orofaring , laring atau hypopharynx.1 Meskipun kemajuan yang cukup besar dalam multimodality terapi termasuk pembedahan , radioterapi dan kemoterapi , keseluruhan tingkat kelangsungan hidup 5 tahun untuk pasien dengan HNSCC hanya 40-50 % . Ini adalah salah satu yang terendah dari jenis kanker utama dan belum meningkat secara dramatis untuk decades.2 HNSCC adalah penyakit yang ditandai oleh heterogenitas genetik dan biologis . Jalur sinyal menyimpang memiliki telah diidentifikasi dalam HNSCC dan penghambatan faktor pertumbuhan epidermal reseptor telah terbukti menjadi strategy.3 terapi sukses Namun,kebanyakan studi pada genom kanker telah difokuskan terutama pada proteincoding gen dan pemahaman kita tentang perubahan non – proteincoding urutan pada kanker sebagian besar tidak jelas . MicroRNAs ( miRNAs ) merupakan kelas kecil non – proteincoding Molekul RNA , 19-22 nukleotida dalam length.4 Mereka negatif mengatur ekspresi gen pada tingkat pasca-transkripsi melalui represi translasi dan / atau mRNA belahan dada . Mereka memiliki penting peran dalam

diferensiasi dan apoptosis.4 Mereka mengikat 3 wilayah ¢ - diterjemahkan ( UTR ) target mRNA dengan sempurna pasangan 7-8 mer dasar , jadi satu Mirna dapat mengatur beberapa gen target . prediksi bioinformatic menunjukkan bahwa miRNAs mengatur lebih dari 30 % dari protein – coding miRNAs genes.5 berkontribusi pada inisiasi dan pengembangan berbagai jenis miRNAs cancers.6 yang aberrantly diekspresikan dalam banyak kanker pada manusia , dan dapat berfungsi baik sebagai penekan tumor atau onkogen . MiRNAs menurunkan regulasi dalam sel-sel kanker bisa berfungsi sebagai penekan tumor dengan negatif mengatur onkogen , alternatif miRNAs diekspresikan bisa berfungsi sebagai onkogen dengan merepresi tumor supresor genes.7 Kami sebelumnya melaporkan aberrantly diekspresikan miRNAs berdasarkan ekspresi Mirna tanda tangan di beberapa kanker , dan mengidentifikasi miRNAs penekan tumor dan onkogen sasaran mereka . 8-12 Dalam HNSCC , kami menemukan bahwa miRNAs seperti mir 489 , Mir – 1 dan Mir - 133a yang menurunkan regulasi dalam sel kanker dan berpotensi memiliki fungsi penekan tumor melalui represi langsung dari beberapa oncogenes.11 ,13 – 15 mir - 375 secara signifikan menurunkan regulasi dalam skuamosa hypopharyngeal Karsinoma sel , esophageal squamous cell carcinoma dan maksila sinus karsinoma sel skuamosa ( data tidak dipublikasikan ) di Mirna kami ekspresi signatures.10 , 11 Menariknya , beberapa laporan menemukan bahwa mir - 375 adalah salah satu yang paling miRNAs menurunkan regulasi di HNSCC.16 , 17 Pada kanker lainnya , Mir - 375 juga dikenal berfungsi sebagai tumor penekan dengan menargetkan onkogen tertentu, termasuk PDK1 , YWHAZ / 14-3 - 3z , YAP dan JAK2.18 21 Jadi mir - 375 adalah tumor potensial calon penekan di HNSCC . Namun, fungsi mir – 375 dan gen target dalam HNSCC masih belum jelas . Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperjelas makna fungsional mir - 375 di HNSCC dan untuk mengidentifikasi jalur kanker diatur oleh mir - 375.We menganalisis pengaruh mir - 375 pada proliferasi sel dan sel apoptosis dalam baris sel HNSCC . Untuk gen target pencarian mir - 375 , kami melakukan analisis ekspresi gen genome . Kami fokus pada AEG-1/MTDH sebagai calon sasaran onkogen mir - 375 . itu identifikasi onkogen penekan tumor baru mir - 375 – diatur jalur lebih lanjut bisa mengungkap mekanisme molekuler HNSCC onkogenesis .

BAHAN DAN METODE Kultur sel HNSCC Baris sel HNSCC Manusia ( SAS , berasal dari lesi primer lidah karsinoma sel skuamosa , dan Fadu , berasal dari lesi primer hypopharyngeal karsinoma sel skuamosa ) yang digunakan . Kedua baris sel yang ditumbuhkan dalam media dimodifikasi Eagle Dulbecco itu ( DMEM ) dilengkapi dengan 10 % janin bovine serum dalam suasana lembab yang mengandung 5 % CO2 di 37 1C . isolasi RNA RNA total diisolasi menggunakan Trizol reagen ( Invitrogen , Carlsbad , CA , USA ) menurut protokol pabrik . Konsentrasi RNA ditentukan spektrofotometri , dan integritas molekul diperiksa oleh gel elektroforesis . Kualitas RNA dikonfirmasi menggunakan Agilent 2100 Bioanalyzer ( Agilent Technologies, Santa Clara , CA , USA ) . Mature Mirna transfeksi dan - kecil mengganggu pengobatan RNA Spesies RNA berikut digunakan dalam penelitian ini : miRNAs matang , Pre – mir prekursor Mirna ( hsa - mir - 375 , ID Pre - mir : PM10327 ) , Mirna – control ( P / N : AM17111 ) ( Terapan Biosystems , Foster City , CA , USA ) , campur kecil RNA ( RNAi Stealth Pilih siRNA ; si-AEG1/MTDH Cat # ; HSS150644 dan HSS150645 ) ( Invitrogen ) dan siRNA control ( Stealth RNAi Kontrol Negatif Sedang GC Duplex , 12935-300 ) . RNA diinkubasi dengan Opti – MEM ( Invitrogen ) dan Lipofectamine RNAiMax reagen ( Invitrogen ) seperti yang dijelaskan Efisiensi transfeksi previously

9 Pra - mir dalam baris sel dikonfirmasi berdasarkan pada downregulation TWF1 ( PTK9 ) mRNA setelah transfeksi dengan Mir – 1 seperti sebelumnya reported.8 , 10 Proliferasi sel dan apoptosis sel tes Sel transfected dengan 10 nM Mirna siRNA atau oleh transfeksi terbalik dan berlapis di piring 96 - baik pada 3 ? 103 sel per sumur . Setelah 72 jam , proliferasi sel adalah ditentukan oleh uji XTT , menggunakan Cell Proliferasi Kit II ( Roche Molekuler Biokimia , Mannheim , Jerman ) .10,11 sumur rangkap tiga yang diukur untuk kelangsungan hidup sel dalam setiap kelompok perlakuan . SAS dan Fadu sel transiently transfected dengan Mirna - kontrol atau mir - 375 dan dipanen setelah 72 jam oleh trypsinization . Pewarnaan ganda dengan FITC - annexin V dan propidium iodida ( PI ) dilakukan dengan menggunakan FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit ( BD Biosciences , Bedford , MA , USA ) sesuai dengan rekomendasi pabrikan . Sel dianalisis dengan aliran cytometry ( FACScan , BD Biosciences ) dilengkapi dengan CellQuest software ( BD Biosciences ) . Sel dibedakan menjadi sel-sel yang layak , sel-sel mati , awal sel apoptosis dan sel apoptosis , dan kemudian rasio relatif apoptosis dini sel untuk transfectants Mirna kontrol dari setiap percobaan dibandingkan. Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga .

Pencarian gen Target mir – 375 Layar genome menggunakan mir - 375 transfectants dilakukan untuk mengidentifikasi menargetkan gen mir - 375 dalam dua baris sel HNSCC , SAS dan Fadu . Oligomicroarray 44K manusia ( Agilent Technologies ) digunakan untuk ekspresi profiling dari transfectants dibandingkan dengan Mirna - negatif – control transfectant . Hibridisasi dan mencuci langkah-langkah yang dilakukan seperti sebelumnya described.22 Array dipindai menggunakan Packard GSI Lumonics ScanArray 4000 ( Perkin Elmer , Boston , MA , USA ) . Data dianalisis dengan cara DNASIS berbagai perangkat lunak ( Hitachi Software Engineering, Tokyo , Jepang ) , yang dikonversi intensitas sinyal untuk setiap tempat ke dalam format teks . Rasio log2 dari intensitas latar belakang median - dikurangi dianalisis . Data dari masing-masing studi microarray yang dinormalisasi dengan normalisasi method.22 global yang Diprediksi gen target dan target mereka Mirna mengikat daerah benih situs yang diselidiki menggunakan TargetScan ( rilis 5.1 , http://www.targetscan.org/ ) . itu Urutan dari miRNAs matang diprediksi dikonfirmasi menggunakan miRBase ( rilis 17.0 , http://microrna.sanger.ac.uk/ )

Real-time kuantitatif reverse transcription PCR

Pertama - untai DNA komplementer disintesis dari 1 mg total RNA menggunakan Kapasitas Tinggi komplementer Kit DNA reverse Transkripsi ( Terapan Biosystems ) . Produk PCR - gen tertentu diuji terus menerus menggunakan 7900 - HT Real-Time PCR System sesuai dengan protokol produsen. Itu awal langkah PCR terdiri dari 10 - min terus pada 95 1C , diikuti oleh 40 siklus terdiri dari denaturasi 15 - detik pada 95 1C dan 1 menit anil / ekstensi pada 63 1C . Probe TaqMan dan primer untuk HERPUD1 ( P / N : Hs00206652_m1 ) , LDHB ( P / N :Hs00929956_m1 ) , PSIP1 ( P / N : Hs00253515_m1 ) , AEG-1/MTDH ( P / N : Hs00757841_m1 ) , SLC7A11 ( Hs00204928_m1 ) dan GAPDH ( A / N : NM_002046 ) pengendalian internal diperoleh dari Applied Biosystems ( Assay -On -Demand Ekspresi Gen Produk ). Tingkat ekspresi mir - 375 ( Assay ID : 000564 ) dianalisis dengan TaqMan kuantitatif real-time PCR ( TaqMan microRNA Assay , Terapan Biosystems ) dan dinormalisasi RNU48 ( A / N : X96648 ). Semua reaksi dilakukan dalam rangkap tiga , dan termasuk reaksi kontrol negatif yang tidak memiliki DNA komplementer .

Western blot Sel dipanen 72 jam setelah transfeksi dan lisat disiapkan . ukuran A dari 50 mg protein dari masing-masing lisat dipisahkan oleh NuPAGE pada 4-12 % bis – tris gel ( Invitrogen ) dan ditransfer ke membran polyvinylidene difluoride . Imunoblotting dilakukan dengan diencerkan ( 1:200 ) poliklonal AEG - 1 / Antibodi MTDH ( HPA015104 , Sigma - Aldrich , St Louis , MO , USA ) , dengan antibodi b - aktin ( sc - 1615 , Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz , CA , USA ) digunakan sebagai kontrol internal . Membran dicuci dan diinkubasi dengan kambing anti - rabbit IgG ( H + L ) HRP conjugate ( Bio - Rad , Hercules , CA , USA ) . Kompleks tertentu divisualisasikan dengan echochemiluminescence ( GE Healthcare Bio- Sciences , Princeton , NJ , USA ) , dan tingkat ekspresi protein masing-masing adalah dievaluasi oleh perangkat lunak ImageJ ( ver.1.44 , http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html ) .

Konstruksi plasmid dan uji dualluciferase The wild type urutan AEG-1/MTDH 3 ¢ - UTR ( WT - 3 ¢ - UTR ) dan orang-orang dengan dihapus mir - 375 situs sasaran ( DEL - 3 ¢ UTR ) disisipkan antara Situs restriksi XhoI dan PmeI dalam 3 ¢ UTR dari gen hRluc di psiCHECK - 2 vektor ( Promega , Madison , WI , USA ) . Urutan oligonukleotida dijelaskan dalam Informasi Tambahan . DNA yang disintesis adalahkloning ke dalam psiCHECK 2 vektor . Sel Fadu kemudian transfected dengan 5 ng vektor , 10 nM dewasa molekul Mirna , Pre - Mirna mir - 375 ( Applied Biosystems ) , dan 1 ml Lipofectamine 2000 ( Invitrogen ) dalam 100 ml Opti – MEM ( Invitrogen ) . Firefly dan Renilla kegiatan luciferase dalam lisat sel yang ditentukan dengan menggunakan sistem dual – luciferase assay ( E1910 ; Promega ) . normalized Data yang dihitung sebagai hasil bagi Renilla / kunang kunang kegiatan luciferase .

Spesimen HNSCC Klinis Sebanyak 20 pasang HNSCC primer ( rongga mulut , enam , laring , tiga ; orofaring , lima , hipofaring , enam ) dan sesuai epitel yang normal Sampel diperoleh dari pasien di Chiba University Hospital ( Chiba , Jepang ) 2007-2011 . Semua spesimen jaringan yang diperoleh dari pasien menjalani perawatan bedah . Jaringan normal diperoleh jauh dari pusat kanker dalam spesimen bedah . Tidak ada sel-sel kanker yang terdeteksi di negara tetangga jaringan parafinembedded formalin - fixed . persetujuan tertulis untuk sumbangan jaringan untuk tujuan penelitian didapatkan dari setiap pasien sebelum koleksi jaringan . Protokol ini disetujui oleh Institutional Tinjau Dewan Chiba University. Spesimen direndam dalam RNAlater ( Qiagen , Valencia , CA , USA ) dan disimpan pada ? 20 1C sampai RNA diekstraksi.

analisis statistik Hubungan antara dua kelompok dan nilai-nilai numerik yang diperoleh real-time reverse transkripsi PCR dianalisis dengan menggunakan non – parametrik MannWhitney U tes atau uji t berpasangan. Hubungan antara lebih dari tiga variabel dan nilai-nilai numerik dianalisis menggunakan Bonferroni'sadjusted Mann Whitney U tes . Semua analisa dilakukan dengan menggunakan Expert StatView ( versi 4 , SAS Institute , Cary , NC , USA ) .

HASIL Ekspresi mir - 375 dalam spesimen klinis HNSCC Data karakteristik 20 pasien HNSCC disajikan pada Tabel 1 . itu tingkat ekspresi mir - 375 secara signifikan menurunkan regulasi dalam spesimen HNSCC klinis dibandingkan dengan jaringan normal yang berdekatan. 

Pengaruh mir - 375 transfeksi jalur sel HNSCC Untuk menentukan fungsi mir - 375 , kami melakukan gain -of –fungsi Analisis menggunakan mir - 375 atau Mirna kontrol transfectants . The XTT assay menunjukkan penghambatan yang signifikan secara statistik dari proliferasi sel di mir - 375 transfectants dibandingkan dengan kontrol mock setelah 72 jam . Kedua budaya mir 375 - transfected hanya tumbuh 70,5 % di SAS dan 74,0 % di Fadu sebanyak budaya mock (baik Po0.0001 , Gambar 1b ) . Sel apoptosis pada mir - 375 sel transfected dinilai dengan aliran cytometry . Fraksi sel apoptosis dini meningkat secara signifikan di mir - 375 transfectants , B1.7 kali lipat di SAS dan 2,0 kali lipat pada Fadu dibandingkan dengan kontrol mock

AEG-1/MTDH diatur langsung oleh mir – 375  

Kami fokus pada AEG-1/MTDH , karena AEG-1/MTDH telah dilaporkan menjadi onkogen di beberapa cancers.23 , 24 The tingkat ekspresi dari AEG-1/MTDH mRNA secara signifikan menurun pada kedua HNSCC baris sel ( SAS dan Fadu ) transfected dengan mir - 375 dibandingkan dengan mengolok-olok ( Gambar 3a ) . Tingkat ekspresi protein juga nyata berkurang pada mir - 375 transfectants dibandingkan dengan mengolok-olok ( Gambar 3b ) . Sel Fadu digunakan untuk menentukan mekanisme mir – 375 penekanan ekspresi AEG-1/MTDH . Database TargetScan mengidentifikasi satu situs target putatif dalam 3 ¢ - UTR dari AEG1/MTDH ( Gambar 4 , atas) . Kami melakukan uji reporter luciferase untuk menentukan apakah AEG-1/MTDH mRNA memiliki situs target untuk mir - 375 . Kami menggunakan pengkodean vektor baik urutan parsial 3 ¢ - UTR dari AEG1/MTDH mRNA , termasuk diprediksi mir 375 situs target , posisi 1454-1460 ( WT - 3 ¢ - UTR ) atau vektor kurang situs target mir - 375 ( DEL - 3 ¢ - UTR ) . Kami menemukan bahwa luminescence intensitas secara signifikan dikurangi dengan transfeksi dari WT - 3 ¢ - UTR sementara DEL - 3 ¢ - UTR diblokir penurunan luminescence ( Gambar 4 , yang lebih rendah ) .

PEMBAHASAN 

Artikel numerik telah melaporkan bahwa miRNAs yang aberrantly dinyatakan dalam banyak jenis cancers.25 manusia Selain itu , Mirna tanda tangan ekspresi HNSCC telah dilaporkan oleh banyak researchers.26 , 27 Baru-baru ini , kami juga melaporkan diferensial dinyatakan miRNAs pada karsinoma sel skuamosa hypopharyngeal dan esofagus karsinoma sel skuamosa berdasarkan ekspresi signatures.8 - 12 Ketika kita membandingkan data ekspresi kami dengan laporan terakhir dari peneliti lain , mir - 375 sering diamati untuk menurunkan regulasi di ,banyak jenis kanker termasuk HNSCC.16 - 20 metilasi DNA dan histone deasetilasi mungkin terlibat dalam downregulation Mir - 375 di cancer.18 lambung Menurut salah satu studi HNSCC , rasio ekspresi mir - 221 : mir - 375 memberikan biomarker yang berguna ( Sensitivitas 92 % dan 93% spesifisitas ) dalam tumor membedakan dari tissues.16 yang normal Laporan lain dari 51 spesimen HNSCC formalin – fixed menunjukkan bahwa mir - 375 berkurang secara signifikan , dan eksogen overekspresi Mir - 375 dalam baris sel HNSCC berkurang baik proliferasi dan clonogenicity.17 Dalam studi ini , kami bertanya apakah mir - 375 memiliki penekan tumor fungsi dalam sel HNSCC .

 







 

Jemal , A. , Siegel ,UCAPAN R. , Xu , TERIMA J. & Ward KASIH , statistik E. Kanker , 2010 . CA Kanker J. ini Clindidukung . 60 , 277-300 Penelitian oleh( 2010). KAKENHI ( C ) , 21592187 Hardisson , D. Molekuler patogenesis kepala dan leher karsinoma sel skuamosa . Eur . Arch . Otorhinolaryngol . 260 , 502-508 ( 2003). Leemans , CR , Braakhuis , BJ & Brakenhoff , RH The biologi molekuler kepala dan kanker leher . Nat . Rev Kanker 11 , 9-22 ( 2011) . Bartel , DP MicroRNAs : genomik , biogenesis , mekanisme , dan fungsi . Sel 116 , 281-297 ( 2004) . Filipowicz , W. , Bhattacharyya , SN & Sonenberg , N. Mekanisme pasca-transkripsi peraturan oleh microRNAs : adalah jawaban di depan mata? Nat . Rev Genet . 9 , 102-114 ( 2008) . Calin , GA & Croce , CM microRNA tanda tangan dalam kanker pada manusia . Nat . Rev Kanker 6 , 857-866 ( 2006) . Esquela - Kerscher , A. & Slack , FJ Oncomirs - microRNAs dengan peran dalam kanker . Nat . Rev Kanker 6 , 259-269 ( 2006) .

.