Pfge
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ANÁLISIS DEL ADN CROMOSÓMICO MEDIANTE MACRORRESTRICCIÓN: ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE (PFGE) Q.C. Miguel Ángel Ortiz Gil. Instituto Nacional de Salud Publica – Centro de Investigación Sobre Enfermedades Infecciosas.
EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR • Se aplica en enfermedades infecciosas. • Combina los métodos epidemiológicos.
moleculares
y
• Su función es identificar agentes patógenos, su distribución y sus factores de riesgo.
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR ¿CUÁL ES LA IMPORTANCIA DE APLICAR PFGE? • Identificar el patógeno • Determinar el origen o fuente • Demostrar que el patógeno proviene de la fuente • Describir la transmisión • Dar información segura y a tiempo Desarrollar estrategias de intervención Reducir y controlar la presencia y diseminación del patógeno
TIPIFICACIÓN MOLECULAR
• Su función es comparar la composición de los ácidos nucleicos de dos o más microorganismos. • Para reconocer la relación entre aislamientos vinculados epidemiológicamente y, por tanto, derivados recientes de un microorganismo precursor común.
CLASIFICACIÓN DE MÉTODOS MOLECULARES •
Análisis de DNA extracromosómico
•
Restricción de DNA cromosómico y detección de secuencias por hibridación con sondas
•
Macrorrestricción de DNA cromosómico PFGE
•
Amplificación de secuencias genéticas con o sin restricción posterior del producto obtenido
•
Análisis de DNA por secuenciación
•
Perfil de hibridación de múltiples secuencias.
•
La elección de la técnica a aplicar dependerá de la capacidad técnica y
FUNDAMENTO DEL PFGE • Tiene como objeto reconocer la relación epidemiológica entre aislados y, por tanto, derivados recientes de un microorganismo ancestral común. • Mediante esta técnica separamos fragmentos de ADN cromosómicos de elevado tamaño mediante una técnica especial de electroforesis, en la que se aplican campos eléctricos de incidencia pulsante.
ETAPAS EN EL PFGE 1. Extracción del DNA cromosómico bacteriano. 2. Restricción del DNA, utilizando enzimas de restricción de baja frecuencia de corte. 3. Separación de los fragmentos obtenidos mediante PFGE.
EXTRACCIÓN DEL ADN CROMOSÓMICO BACTERIANO CRECIMIENTO BACTERIANO
• Los microorganismos se pueden obtener a partir de un cultivo. • Estandarizar el inoculo mediante espectrofotometría ésta será una medida indirecta de la concentración de DNA. • Se mezcla el inoculo con agarosa. De esta manera conseguimos inmovilizar un número de células bacterianas. • La agarosa en la que se encuentran embebidas las células permite fluir a su través las soluciones de lisis o restricción, y a la vez va a proteger las moléculas de DNA de
EXTRACCIÓN DEL ADN CROMOSÓMICO BACTERIANO LISIS • Los bloques se sumergen en una solución de lisis que contenga los enzimas precisos para romper las células. • La composición de la solución de lisis es variable en función de la especie bacteriana con la que estemos trabajando.
EXTRACCIÓN DEL ADN CROMOSÓMICO BACTERIANO. LAVADOS • Una vez que las células están lisadas es preciso someter a los bloques a sucesivos lavados con una solución TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ). • El objetivo de los lavados es arrastrar fuera del bloque de agarosa restos celulares procedentes de la lisis, así como eliminar componentes que puedan inhibir la restricción posterior (proteinasa K, detergente o EDTA).
RESTRICCIÓN DEL DNA • La actividad de los enzimas de restricción viene definida sobre ADN en ausencia de agarosa. • La presencia de agarosa conlleva inhibición de la reacción de digestión, por tanto es preciso aumentar el número de unidades de enzima y el tiempo de incubación. • Una enzima de restricción para PFGE debe generar pocos fragmentos de DNA y estos sean de gran tamaño. • Las enzimas con un lugar de restricción rico en G+C, son adecuados para tratar el DNA bacteriano de especies con genoma rico en A+T y, a la inversa.
SEPARACIÓN DE LOS FRAGMENTOS OBTENIDOS MEDIANTE PFGE.
• En un campo eléctrico, las moléculas de ADN se reorientaban y se desplegaban avanzando en dirección al polo positivo. • La aplicación de un segundo campo eléctrico, con una orientación distinta del primero, obligaba al DNA a cambiar su conformación y reorientarse de nuevo para poder avanzar en la dirección del segundo campo eléctrico. • Mientras los campos eléctricos que se alternen tengan la misma intensidad y voltaje, la migración final del ADN se recogerá en forma de línea recta.
SEPARACIÓN DE LOS FRAGMENTOS OBTENIDOS MEDIANTE PFGE.
• CHEF (clamped homogeneous electric field electrophoresis), sistema con veinticuatro electrodos y en un contorno hexagonal. • El voltaje generado por la fuente de electroforesis se divide entre los electrodos, crea un gradiente constante a lo largo de todo el gel. • El ángulo de reorientación debe ser superior a 90º, habitualmente se trabaja con ángulos de 120º
COMPONENTES DE UN SISTEMA DE PFGE. • Unidad de control de pulsos-generador de corriente., controla los 24 electrodos y la duración de la alternancia de los pulsos eléctricos. • Cubeta de electroforesis. Es una cubeta acrílica en la que se encuentran los 24 electrodos distribuidos en forma hexagonal. • Bomba de recirculación del tampón. Aspira el tampón de electroforesis de la cubeta, lo empuja a través de la unidad de refrigeración y lo devuelve a la cubeta. • Unidad de refrigeración. Suele ser un aparato de refrigeración portátil.
VARIABLES QUE AFECTAN A LA RESOLUCIÓN DEL PFGE • Las condiciones para obtener la mejor resolución por PFGE están, por supuesto, en función del rango de tamaño de las moléculas a separar y del enzima de restricción seleccionado. • También intervienen variables técnicas como la duración y alternancia de los pulsos eléctricos, el voltaje, la temperatura de la cubeta, el tiempo de electroforesis, el tampón utilizado o el ángulo de reorientación.
CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS • Examinar la colección completa de cepas a estudiar en busca de un patrón epidémico, que sería el más común entre los aislamientos. • A continuación todos los otros patrones deben compararse con éste y a la vez entre sí. Es preciso contabilizar el número de fragmentos distintos de cada cepa con todas las demás, fragmento a fragmento
CLASIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS BASAD0S EN PFGE • Idénticos. Cuando los dos aislamientos presentan el mismo número de bandas y éstas tienen aparentemente el mismo tamaño. • Genéticamente relacionados. Cuando el número de diferencias entre los dos aislamientos sea inferior o igual a 3. En este caso, un subtipo de la otra o ambas derivadas de un ancestro común.
CLASIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS BASAD0S EN PFGE • Posiblemente relacionados. el número de cambios puede llegar a ser hasta de 6. Aunque estos aislamientos puedan también corresponder a una línea evolutiva común, su relación genética no es tan cercana y por tanto, es menos probable su relación epidemiológica. • No relacionados. Un número de diferencias entre los dos patrones superior a 6. Sin relación epidemiológica.
INCONVENIENTES DE LA TÉCNICA • Existen algunas especies bacterianas en las que la degradación del ADN cromosómico hace que muchas de sus cepas sean "no tipables" por PFGE. Este es el caso de algunas subespecies de Salmonella, algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa, Clostridium difficile o algunos patógenos entéricos (E. coli). • Un inconveniente importante es el derivado de la interpretación de los patrones de bandas obtenidos, que es subjetiva en la mayoría de los casos, y de la ausencia de un
GRACIAS POR SU ATENCIÓN.
• Bibliografía: -
Pere Coll et al. Métodos moleculares de tipificación epidemiológica en bacteriología. Procedimientos en Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/indice18.htm
EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR • Se aplica en enfermedades infecciosas. • Combina los métodos epidemiológicos.
moleculares
y
• Su función es identificar agentes patógenos, su distribución y sus factores de riesgo.
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR ¿CUÁL ES LA IMPORTANCIA DE APLICAR PFGE? • Identificar el patógeno • Determinar el origen o fuente • Demostrar que el patógeno proviene de la fuente • Describir la transmisión • Dar información segura y a tiempo Desarrollar estrategias de intervención Reducir y controlar la presencia y diseminación del patógeno
TIPIFICACIÓN MOLECULAR
• Su función es comparar la composición de los ácidos nucleicos de dos o más microorganismos. • Para reconocer la relación entre aislamientos vinculados epidemiológicamente y, por tanto, derivados recientes de un microorganismo precursor común.
CLASIFICACIÓN DE MÉTODOS MOLECULARES •
Análisis de DNA extracromosómico
•
Restricción de DNA cromosómico y detección de secuencias por hibridación con sondas
•
Macrorrestricción de DNA cromosómico PFGE
•
Amplificación de secuencias genéticas con o sin restricción posterior del producto obtenido
•
Análisis de DNA por secuenciación
•
Perfil de hibridación de múltiples secuencias.
•
La elección de la técnica a aplicar dependerá de la capacidad técnica y
FUNDAMENTO DEL PFGE • Tiene como objeto reconocer la relación epidemiológica entre aislados y, por tanto, derivados recientes de un microorganismo ancestral común. • Mediante esta técnica separamos fragmentos de ADN cromosómicos de elevado tamaño mediante una técnica especial de electroforesis, en la que se aplican campos eléctricos de incidencia pulsante.
ETAPAS EN EL PFGE 1. Extracción del DNA cromosómico bacteriano. 2. Restricción del DNA, utilizando enzimas de restricción de baja frecuencia de corte. 3. Separación de los fragmentos obtenidos mediante PFGE.
EXTRACCIÓN DEL ADN CROMOSÓMICO BACTERIANO CRECIMIENTO BACTERIANO
• Los microorganismos se pueden obtener a partir de un cultivo. • Estandarizar el inoculo mediante espectrofotometría ésta será una medida indirecta de la concentración de DNA. • Se mezcla el inoculo con agarosa. De esta manera conseguimos inmovilizar un número de células bacterianas. • La agarosa en la que se encuentran embebidas las células permite fluir a su través las soluciones de lisis o restricción, y a la vez va a proteger las moléculas de DNA de
EXTRACCIÓN DEL ADN CROMOSÓMICO BACTERIANO LISIS • Los bloques se sumergen en una solución de lisis que contenga los enzimas precisos para romper las células. • La composición de la solución de lisis es variable en función de la especie bacteriana con la que estemos trabajando.
EXTRACCIÓN DEL ADN CROMOSÓMICO BACTERIANO. LAVADOS • Una vez que las células están lisadas es preciso someter a los bloques a sucesivos lavados con una solución TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ). • El objetivo de los lavados es arrastrar fuera del bloque de agarosa restos celulares procedentes de la lisis, así como eliminar componentes que puedan inhibir la restricción posterior (proteinasa K, detergente o EDTA).
RESTRICCIÓN DEL DNA • La actividad de los enzimas de restricción viene definida sobre ADN en ausencia de agarosa. • La presencia de agarosa conlleva inhibición de la reacción de digestión, por tanto es preciso aumentar el número de unidades de enzima y el tiempo de incubación. • Una enzima de restricción para PFGE debe generar pocos fragmentos de DNA y estos sean de gran tamaño. • Las enzimas con un lugar de restricción rico en G+C, son adecuados para tratar el DNA bacteriano de especies con genoma rico en A+T y, a la inversa.
SEPARACIÓN DE LOS FRAGMENTOS OBTENIDOS MEDIANTE PFGE.
• En un campo eléctrico, las moléculas de ADN se reorientaban y se desplegaban avanzando en dirección al polo positivo. • La aplicación de un segundo campo eléctrico, con una orientación distinta del primero, obligaba al DNA a cambiar su conformación y reorientarse de nuevo para poder avanzar en la dirección del segundo campo eléctrico. • Mientras los campos eléctricos que se alternen tengan la misma intensidad y voltaje, la migración final del ADN se recogerá en forma de línea recta.
SEPARACIÓN DE LOS FRAGMENTOS OBTENIDOS MEDIANTE PFGE.
• CHEF (clamped homogeneous electric field electrophoresis), sistema con veinticuatro electrodos y en un contorno hexagonal. • El voltaje generado por la fuente de electroforesis se divide entre los electrodos, crea un gradiente constante a lo largo de todo el gel. • El ángulo de reorientación debe ser superior a 90º, habitualmente se trabaja con ángulos de 120º
COMPONENTES DE UN SISTEMA DE PFGE. • Unidad de control de pulsos-generador de corriente., controla los 24 electrodos y la duración de la alternancia de los pulsos eléctricos. • Cubeta de electroforesis. Es una cubeta acrílica en la que se encuentran los 24 electrodos distribuidos en forma hexagonal. • Bomba de recirculación del tampón. Aspira el tampón de electroforesis de la cubeta, lo empuja a través de la unidad de refrigeración y lo devuelve a la cubeta. • Unidad de refrigeración. Suele ser un aparato de refrigeración portátil.
VARIABLES QUE AFECTAN A LA RESOLUCIÓN DEL PFGE • Las condiciones para obtener la mejor resolución por PFGE están, por supuesto, en función del rango de tamaño de las moléculas a separar y del enzima de restricción seleccionado. • También intervienen variables técnicas como la duración y alternancia de los pulsos eléctricos, el voltaje, la temperatura de la cubeta, el tiempo de electroforesis, el tampón utilizado o el ángulo de reorientación.
CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS • Examinar la colección completa de cepas a estudiar en busca de un patrón epidémico, que sería el más común entre los aislamientos. • A continuación todos los otros patrones deben compararse con éste y a la vez entre sí. Es preciso contabilizar el número de fragmentos distintos de cada cepa con todas las demás, fragmento a fragmento
CLASIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS BASAD0S EN PFGE • Idénticos. Cuando los dos aislamientos presentan el mismo número de bandas y éstas tienen aparentemente el mismo tamaño. • Genéticamente relacionados. Cuando el número de diferencias entre los dos aislamientos sea inferior o igual a 3. En este caso, un subtipo de la otra o ambas derivadas de un ancestro común.
CLASIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS BASAD0S EN PFGE • Posiblemente relacionados. el número de cambios puede llegar a ser hasta de 6. Aunque estos aislamientos puedan también corresponder a una línea evolutiva común, su relación genética no es tan cercana y por tanto, es menos probable su relación epidemiológica. • No relacionados. Un número de diferencias entre los dos patrones superior a 6. Sin relación epidemiológica.
INCONVENIENTES DE LA TÉCNICA • Existen algunas especies bacterianas en las que la degradación del ADN cromosómico hace que muchas de sus cepas sean "no tipables" por PFGE. Este es el caso de algunas subespecies de Salmonella, algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa, Clostridium difficile o algunos patógenos entéricos (E. coli). • Un inconveniente importante es el derivado de la interpretación de los patrones de bandas obtenidos, que es subjetiva en la mayoría de los casos, y de la ausencia de un
GRACIAS POR SU ATENCIÓN.
• Bibliografía: -
Pere Coll et al. Métodos moleculares de tipificación epidemiológica en bacteriología. Procedimientos en Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/indice18.htm
