Pengecatan Histopatologi Rutin Final.pptx

PENGECATAN HISTOPATOLOGI RUTIN / HE Penguji : dr. Meira Dewi Kusuma A Msi Med Sp.PA dr. Devia Ekalistiana Msi Med Sp.PA

Oleh : Franky Yusuf

PATOLOGI ANATOMIK UNIVERSITAS DIPONEGORO 2018

PENDAHULUAN  Latar 

Belakang

Histopatologi Cabang ilmu biologi tentang kondisi dan fungsi jaringan  suatu penyakit Pemeriksaan berdasarkan

histopatologi reaksi



memeriksa

perubahan

jaringan

penyakit dengan

membandingkan kondisi jaringan yang normal dengan

abnormal Pemeriksaan

histopatologi

metode histoteknik

dapat

dilakukan

dengan

 Tujuan

Teknik



Metode pembuatan sediaan dari spesimen tertentu



Melalui suatu rangkaian proses diperoleh suatu preparat histopatologi yang siap untuk dianalisa



Preparat patologis jaringan

histologi serta



mengetahui

perubahan

suatu

keadaan sel

atau



Rangkaian proses pembuatan sajian histopatologi terdiri atas : 

Fiksasi



Dehidrasi-Clearing-Impregnasi



Blocking



Sectioning



Floating



Staining –(Hematosiklin-Eosin)



Mounting dan Labelling

TINJAUAN PUSTAKA 

Sectioning 

Proses

pemotongan

blok

preparat

dengan

menggunakan

mikrotom 

Floating 

Memasukkan obyek glass ke dalam waterbath lalu digerakkan

kearah pita parafin yang akan direkatkan pada obyek glass 

Staining 

Pemberian warna pada jaringan yang telah dipotong agar unsur jaringan

mudah

dikenali

menggunakan mikroskop

pada

saat

pengamatan

dengan



Mounting 

Preparat di tetesi dengan entellan lalu ditutup dengan

deck

glass 

Labelling 

Ditempelkan label yang berisi nama pasien dan nomor

rekam medis

PRINSIP KERJA 1)

Sectioning 

Dengan menggunakan mikrotom



Tipe : rotary, rocking, sliding, ultra dan lain-lain



Jenis

pisau

mikrotom

:

diamond-kaca

dan

disposable (>murah, mudah digunakan, tajamnya konstan,

disesuaikan)

jenis

low/high

profile

bisa



Untuk jenis rotary mikrotom (di lab PA RSDK) : 

Clearance angle untuk blok parafin 2-4˚ dan FS 57˚



Tingkat akurasi dan keamanan tinggi, produktivitas tinggi serta mudah digunakan



Diputar 360˚  terpotong secara vertikal



Ketebalan bisa didapatkan 1-60 mikron



Bisa manual (lab PA RSDK), semi otomatis dan full otomatis



Manual Hand Operation  meningkatkan resiko terjadinya RMD ( Repetitive Motion Disorder) Co : carpal tunnel sindrom, bursitis, tendonitis dan ganglion cyst



Pemotongan dilakukan dengan memotong blok telah diletakkan pada holder



Hingga diperoleh pita-pita paraffin



Terlalu agresif  moth hole artefak

paraffin yang



Selanjutnya pita paraffin yang telah diperoleh diletakkan pada waterbath agar jaringan tidak berlipat

saat

ditempelkan pada glass objek 

Bila

sewaktu

pemotongan

terasa

keras



blok

dihangatkan dengan air hangat ± 30 menit, mengurangi sudut pisau atau dengan agen 

pelembut

Hasil yang baik bila ujung potongan nempel dengan dengan ujung potongan berikutnya

2)

Floating 

Memasukkan pita parafin ± 30 detik dalam waterbath suhu 10˚C dibawah titik cair parafin. (Suhu lab 50˚C)



Slide juga dimasukkan dalam waterbath lalu digerakkan kearah bawah pita paraffin sehingga menempel di slide



Hati-hati terbentuk gelembung gas dibawah pita



Setelah selesai, dilakukan pengeringan dengan menggunakan drying oven/hot plate. Durasi tergantung jenis jaringan, jumlah slide dan ukuran oven. (Di Lab RSDK

10-15 menit dan suhu

70 ˚Celcius). Tujuannya agar perlekatan menjadi lebih baik dan jaringan menjadi lebih rata.



Tidak kering  jaringan bisa terlepas dari slide pada waktu pewarnaan.



Kemudian dilakukan transkipsi nomor dari blok ke slide (di lab PA

RSDK secara manual dengan pensil 2b) 

Untuk slide : 

Ukuran 76x25mm, ketebalan 1-1,2mm dan bersih



Potongan jaringan dapat terlepas mungkin disebabkan :

 



Terpapar larutan alkali kuat , potongan cryostat, jaringan CNS



Terpapar suhu ekstrem, darah dan mukus, dekalsifikasi

Perekat seperti albumin, gelatin dan kanji bisa digunakan Perekat lain : PLL (Poly-L-Lysin), ethoxysilane), charge slide

APES (3 Amino Propyltri-

3)

Staining 

Zat warna rutin : Hematoxylin –Eosin (HE)



2 macam zat warna, yaitu 

hematoksilin : memberikan warna biru ( basofilik) pada inti sel



Eosin : memberikan warna merah muda pada sitoplasma sel

dan jaringan penyambung 

Mesin pewarnaan otomatis (tipe dip and dunk serta X-Y stainer) dan larutan HE serta esoin siap pakai

digunakan secara luas oleh laboratorium untuk pewarnaan rutin

Tahapan Staining 1. Deparafinasi

2. Rehidrasi 3. Infiltrasi warna

4. Dehidrasi 5. Clearing-Mounting

XYLOL II 10’

XYLOL I 10’

XYLOL III 10’

ETANOL 1’

ALKOHOL 96% 1’

I. Deparafinasi ALKOHOL 70% 1’

AQUADEST

HE

1’

10’

AQUADEST 5’

ALKOHOL 50% 1’

ALKOHOL 80% 1’

II. Rehidrasi

AQUADEST 1’

AQUADEST

BLUEING

1’

AQUADEST

5’

1’

ALKOHOL 50% 1’

ALKOHOL 70% 1’

III. Infiltrasi warna EOSIN 5’

XYLOL III 10’

V. Clearing Mounting

XYLOL II 10’

XYLOL I 10’

IV. Dehidrasi ETANOL 1’

ALKOHOL 96% 1’

ALKOHOL 70% 1’



EOSIN 

Asam

flourescent,

xanthene

yang

anionik/muatan mengikat

negatif,

dan

zat

membentuk

warna garam

dengan senyawa eosinofilik yang mengandung muatan positif 

Paling

sesuai

dikombinasikan

dengan

hematoksilin

untuk

menggambarkan arsitektur histologi umum dari jaringan 

Kebanyakan protein di sitoplasma sel sifat nya basa karena mengandung arginin dan lisin yang bermuatan positif,

akan

berikatan dengan senyawa asam yang mengandung muatan

negatif (co : Eosin) membentuk

warna pink



Yang tersering digunakan adalah Eosin Y (larut di air dan alkohol



Penambahan sedikit asam asetat (0,5 ml dalam 1000cc) untuk

mempertajam pewarnaan 

Hasil yang baik ketika diperoleh pewarnaan Eosin yang relatif kuat dan diferensiasi yang baik (alkohol 70%) untuk

membedakan sitoplasma dari jenis sel yang berbeda, serat jaringan ikat dan matriks. 

Co : Orange-pink: Red blood cells Light pink: Connective tissue Dark pink: Muscle fibers Varying shades of pink: Cytoplasm of the cells



HEMATOKSILIN 

Diperoleh dari ekstrak kayu Hematoxylon campechianum, berasal dari Campeche, negara bagian Meksiko



Kandungannya : hematein memberikan pewarnaan, dgn 2 cara : 

Oksidasi alami oleh paparan cahaya dan udara Waktu 3-4 bulan, kemampuan pewarnaannya bertahan lebih lama. Co : Ehrlich’s dan Delafield’s hematoksilin



Proses oksidasi kimia Dikonversi oleh agen kimiawai, siap pakai segera setelah di campur.

Co : Mayer’s hematoksilin menggunakan Sodium Iodate Harris’s hematoksilin menggunakan Mercuric Oxide Kemampuan pewarnaannya lebih singkat

 Hematein

bersifat anionik dan afinitasnya rendah

terhadap

jaringan

serta

inti,

sehingga

pewarnaan

tidak

adekuat

perlu

untuk

ditambahkan

Mordant 

Mordant : bahan kimia sebagai fiksator, dapat bereaksi dengan zat warna dan berupa logam kation (muatan positif), co: aluminum, besi dan tungsten/wolfram



Hematein

+

Mordant



larutan

hematoksilin

bermuatan positif / basa dan mengikat molekul asam/anionik/muatan negatif, co : kromatin inti



HEMATOKSILIN 

Larutan

Hematoksilin

dibedakan

berdasarkan

mordant menjadi : 1.

Alum Hematoxylins (digunakan di Lab PA RSDK)

2.

Iron Hematoxylins

3.

Tungsten Hematoxylins

4.

Molybdenum hematoxylins

5.

Lead Hematoxylins

6.

Hematoksilin tanpa mordant

penggunaan



Alum hematoxylins 

Paling sering digunakan dan menghasilkan pewarnaan inti sel yang baik



Mordant (potash

yang

digunakan

alum)

atau

:

aluminium

aluminium

potassium ammonium

sulfate sulfate

(ammonium alum) 

Inti sel terwarnai merah lalu dikonversi menjadi warna biru gelap ketika dibilas dengan larutan alkali lemah : air

kran,

saturated lithium carbonate, 0.05% ammonia in

distilled

water. Proses ini disebut “blueing” 

Bisa digunakan secara progresif atau regresif



Alum hematoxylins 

Waktu pewarnaan bervariasi tergantung dari jenis frekwensi penggunaan, metode

hematoksilin,

progresif/regresif, pre-treatment

dan post-treatment jaringan. Co : untuk FS  waktu lebih singkat dan untuk jaringan dekalsifikasi/terendam dalam NBF dalam waktu lama

waktu

pewarnaan lebih lama 

Kelemahan

utama



sensitif

terhadap

asam



dapat

melunturkan warna inti sehingga sedikit yang dapat dilihat. Dapat diatasi dengan menggunakan iron-mordanted

hematoksilin

 lebih resisten terhadap asam, atau kombinasi

dengan

celestine blue



Iron hematoxylins 

Garam besi, biasanya ferric chloride dan ferric ammonium

sulfate, merupakan agen pengoksidasi dan mordant 

Problem

utama

:

oksidasi

yang

berlebihan,

sehingga

pencampuran mordant dan hematoksilin dilakukan segera sebelum digunakan, co : Weigert’s atau penggunaannya secara teratur, co : Heidenhain’s dan Loyez 

Memperlihatkan

struktur

jaringan

lebih

luas

hematoxylins, tetapi waktu yang diperlukan lebih lama diperlukan kontrol mikroskopik supaya akurat 

Digunakan untuk identifikasi spesifik fosfolipid

>

alum dan



Tungsten hematoxylins 

Tahun 1897, Mallory menggabungkan hematoksilin dengan 1% aqueous phosphotungstic acid (mordant) disebut PTAH

(Phosphotungstic Acid Hematoxylins), dimana

dimungkinkan

penggunaan langsung hematein (tidak diperlukan

proses

oksidasi) 

Bila

menggunakan

pengoksidasi

hematoksilin,

seperti

perlu

potassium

ditambahkan

permanganate

agen (siap

digunakan dalam 24 jam) 

Bila dengan pengoksidasi alami (sinar dan udara) perlu

beberapa bulan untuk matang, tetapi bisa bertahan untuk beberapa tahun untuk penggunaannya 

Digunakan untuk sampel CNS, struktur jaringan lainnya.



Molybdenum hematoxylins 

Menggunakan molybdic acid sebagai mordant



Jarang digunakan untuk pewarnaan sekarang ini



Teknik Thomas  memperlihatkan kolagen, retikulin kasar dan granula sel argentaffin



Lead hematoxylins 

Menggunakan timbal sebagai mordant



Memperlihatkan granula sel endokrin pada saluran pencernaan dan regio lain



Untuk diagnosis identifikasi sel endokrin pada beberapa tumor



Sudah digantikan oleh pewarnaan IHC pada saat ini



Hematoksilin tanpa mordant 

Memperlihatkan

berbagai

mineral

dalam

potongan

jaringan 

Percobaan Mallory menunjukkan mineral timbal, besi dan tembaga pada jaringan tubuh



Kontrol kualitas pada pewarnaan rutin HE 

Saat ini hampir semua lab menggunakan mesin pewarnaan otomatis sehingga akurasi dan konsistensi

pewarnaan

dapat terjaga 

Tetapi variabilitas dalam larutan pewarna dapat terjadi biasanya lebih sering berhubungan dengan

dan

hematoksilin

dibanding eosin 

Variabilitas : batch number, supplier dan perbedaan PH, juga proses

fiksasi,

processing,

ketebalan

potongan

dan

pengaturan suhu, variabilitas individu, sering/tidak-nya penggunaan

4)

Mounting 

Setelah

proses

preparat

di

pewarnaan

tetesi

dengan

selesai

entellan

dilakukan,

lalu

ditutup

dengan deck glass 

Tujuan dari tahap ini agar preparat lebih tahan lama dan

tidak tergores 

Pada

saat

dipastikan

terbentuk

preparat bahwa

ditutup tidak

ada

deck

glass,

harus

gelembung

yang

5)

Labelling 

Pada preparat yang telah diberi cover, ditempelkan label yang berisi nama pasien dan nomer rekam medik (di lab PA RSDK dengan No PA)



Pemberian

label

penting

dilakukan

agar

diagnosis

pasien yang satu dengan yang lainnya tidak saling tertukar

KESIMPULAN DAN SARAN 

Di laboratorium PA RSDK untuk proses : 

Trimming Menggunakan

Microtome

Rotary

manual,

untuk

clearance angle bervariasi antara 4-10 derajat belum

optimal untuk mengurangi friksi ketika pisau melewati blok. 

Transkipsi nomor secara manual dari blok ke slide

ada kemungkinan bisa tertukar dengan yang lain

KESIMPULAN DAN SARAN 

Staining Menggunakan dip and dunk processor, kelemahannya : 

Kemampuan menyesuaikan pewarnaan terbatasi oleh durasi waktu yang sudah ditentukan sebelumnya



Penggunaan

konstan

dari

reagen

yang

sama

dapat

menyebabkan variasi pewarnaan seiring berjalannya waktu 

Belum sepenuhnya tertutup maka dapat terjadi penguapan,

kelembaban dan resiko peningkatan dengan petugas

kontak bahan kimia

KESIMPULAN DAN SARAN SARAN : 1.

Mengoptimalkan

clearance

angel

pada

penggunaan

mikrotom 2.

Dilakukan double check dan triple check pada saat transkipsi

nomor dari blok ke slide 3.

Penggunaan APD pada semua tenaga medis yang berada di laboratorium

4.

Modernisasi alat processing laboratorium

5.

Tetap melaksanakan SOP laboratorium

REFERENCES 1.

Bancroft’s theory and practice of histological techniques

(eighth edition) 2.

Normal Histology Linberg Lamps (second edition)

3.

http://www.utas.edu.au/health/community/openhealth/uniview/resources/courses/laboratorymedicine/c xa-121-histology-tutorial(University of Tasmania)

4.

SOP RSDK, 2014



Interaksi antara pewarna dengan jaringan Pewarnaan dapat terjadi dikarenakan adanya afinitas antara pewarna/reagen dengan jaringan  Beberapa faktor yang berkontribusi dalam afinitas ini adalah : 

a.

Interaksi reagen dengan jaringan, terbagi menjadi  Coulombic attractions  daya tarik listrik dari muatan positif dengan muatan negatif. Co : PAS untuk glikogen  Van Der Waal’s forces  daya tarik antara satu molekul dengan molekul yang lain /intermolekul. Co : pewarnaan elastic fiber dan Congo red  Hydrogen bonding  terjadi ketika atom hidrogen berada diantara dua atom elektronegatif. Co : Sirius Red untuk kolagen  Ikatan kovalen  kovalen polar mengikat diantara ion logam seperti mordanting

b. Interaksi antara pelarut dengan pelarut 

Tejadi hydrophobic effect  kecenderungan membentuk suatu kelompok hidrofobik di dalam lingkungan berair meskipun awalnya tersebar. Co : pada substrat enzim

c. Interaksi antara reagen dengan reagen 

Membentuk suatu agregasi yang mempunyai perbedaan spektral dari pewarna monomerik. Co : pewarnaan metakromatik dengan pewarna basa

A.

Proses deparafinasi 

B.

Cara preparat dimasukkan ke chamber 1 (xylol I)  chamber 2 (xylol II)  chamber 3 (xylol III) masingmasing 10 menit

Proses rehidrasi 



Masuk ke chamber 4  5 6 7 8 (alkohol 100%, 96%, 80%, 70%, 50%), masing-masing 1 menit, lalu chamber 9 (aquades) selama 5 menit Tujuan : agar kandungan air dalam jaringan preparat sama dengan pelarut Hematoksilin ( aquadest )

Proses infiltrasi zat warna

C. 

Preparat masuk ke chamber 10 (hematoksilin) selama 10 menit  chamber 11  12 13 (aquades) masing-masing 1 menit  chamber 14 tempat proses blueing 5 menit (menguatkan warna hematoksilin)



D.

Proses dehidrasi 

E.

Preparat masuk ke chamber 15 (aquades) selama 1 menit  chamber 16  17 (alkohol 50 % dan 70%) ,masing-masing selama 1 menit  chamber 18 (eosinpelarutnya alkohol 70%) selama 5 menit Preparat masuk ke chamber 19  20  21 (alkohol 70 %, 96%, 100%) masing-masing 1 menit

Proses clearing dan mounting  

Preparat masuk ke chamber 22  23 24 (Xylol) masing-masing 10 menit Untuk membersihkan alkohol dalam preparat dan sebagai pelekat dengan cover slip